Rafaela Duarte De Liz

CITOMETRIA DE FLUXO, ANÁLISES ULTRAESTRUTURAIS E BIOQUÍMICA DE ESTRUTURAS SEMELHANTES A PROTOCORMOS (ESPs) DE Cattleya tigrina A. Richard.

Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção do grau de Doutora em Ciências; área de concentração: Recursos Genéticos Vegetais.

Orientadora: Profª. Drª Rosete Pescador Co-Orientador: Profº. Dr. Paulo César Poeta Fermino Jr

Florianópolis 2017

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais Zauri Duarte de Liz (in memoriam) e Maria Leni de Liz, com todo meu amor e gratidão, por tudo que fizeram por mim ao longo de minha vida. Ao meu filho Nicolas Heráclito Liz de Lima pelo apoio e amor incondicional. Amo vocês!

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelo presente da vida, pelas pessoas que o Senhor tem colocado em meu caminho. Algumas delas me inspiram, me ajudam, me desafiam e me encorajam a ser cada dia melhor. Por todas as oportunidades que me fizeram chegar onde eu cheguei, e me fizeram ser quem eu sou. Foi nesta caminhada de tropeços, vitórias e derrotas, que pude enxergar o verdadeiro significado e beleza da Vida. Aos meus amados pais, Zauri Duarte de Liz (in memoriam) e Maria Leni de Liz, pelo amor incondicional. Gratidão eterna por tudo o que vocês sempre fizeram por mim. Por todo esforço para me dar o melhor, por me ensinar a viver com dignidade, por investirem na minha educação, pelas orações, carinho e dedicação que iluminam os meus caminhos. Amo muito vocês! Ao meu amado filho Nicolas Heráclito Liz de Lima, pelo amor incondicional, por compreender os momentos em que nos privamos de estarmos juntos. Suas palavras firmes e sinceras demonstram todo o seu carinho. Te amo filho! Aos meus queridos irmãos Zauri Duarte de Liz Jr, Nathan de Liz Pereira, Júlio Cesar de Liz, fontes de inspiração que eu carrego sempre comigo. E especialmente a minha querida irmã Raquel Duarte de Liz, minha companheira e protetora desde a infância e até os dias de hoje. Agradeço pelas suas orações, por todo amor, amizade e carinho que vocês sempre tiveram comigo. Aos meus amados sobrinhos Camila de Liz Pereira, Vinícius de Liz Pereira, Victória de Liz Arruda, Lucas Stalbaum de Liz e Julia Stalbaum de Liz que sempre me proporcionam muito orgulho e alegria. Ao querido Prof. Dr. Cassio Renato Montenegro de Lima pelo apoio e palavras de incentivo. Obrigada pela ajuda durante o desenvolvimento do trabalho. Por me ouvir nas horas de angústia e aconselhar nos momentos de decisão. Muito obrigada! A minha orientadora, Profa. Dra. Rosete Pescador, pela confiança em mim depositada e ao meu co-orientador Paulo César Poeta Fermino Jr, pela amizade, pelas oportunidades e as discussões sobre o trabalho de tese. Ao Prof. Dr. Jonny Everson Scherwinski Pereira, pela competência científica, pela dedicação ao desenvolvimento do ensino e pesquisa e pela oportunidade em realizar parte de meu trabalho na EMBRAPA - Cenargen em Brasília – DF e me orientar durante as

análises de citometria de fluxo, disponibilizando de seu tempo para contribuir com sugestões construtivas para o meu trabalho. A Prof. Dra. Marisa Santos por toda ajuda desde o mestrado, me acolhendo com carinho nos momentos em que precisei durante o doutorado e sempre me encorajando para mais conquistas. Seu amor pela profissão e dedicação são fontes de inspiração e exemplos a serem seguidos. Ao Prof. Dr. José Marcello Salabert Campos, pela oportunidade em fazer o curso de Citometria de Fluxo, na UFJF-MG, e por não medir esforços em transmitir seu conhecimento sobre citometria de fluxo e contribuir com as discussões do trabalho. Aos professores que aceitaram fazer parte da banca, Prof. Dr. Aparecido Lima da Silva, Prof. Dr. Jonny Everson Scherwinski Pereira, Prof. Dr. Lírio Luiz Dal Vesco, Prof. Dr. Luiz Antônio de Souza, Profa. Dra. Marisa Santos, agradeço pela disponibilidade em avaliar e contribuir com o trabalho. Aos professores do curso de Citogenética Vegetal, no qual eu tive a oportunidade de conviver durante 15 dias, na EMBRAPA-Cenargen, através de muito aprendizado e amizades conquistadas, em especial a Prof. Dra. Ana Claúdia Guerra pelos ensinamentos e pela forma divertida e espontânea de conquistar as pessoas ao seu redor. Ao Prof. Dr. Jose Francisco Montenegro Valls, por todo conhecimento e ensinamentos sobre a citogenética de plantas, a Dra. Adriana Custodio, Dra. Marisa Toniolo Pozzobon e Dr. Artur Fonseca pela contribuição e atenção disponibilizada durante o curso e também aos colegas que tive a oportunidade de conhecer e conviver durante estes dias. Aos professores da disciplina Célula Vegetal, Prof. Dra. Zenilda Laurita Bouzon, Prof. Dra. Luciane Cristina Ouriques, Dr. Eder Carlos Schmidt e Dra. Carmen Simioni pelas sugestões e ensinamentos durante a disciplina, que contribuíram muito para a elaboração da tese. Meu agradecimento aos professores e colaboradores da disciplina Ecofisiologia Vegetal, Prof. Dr. Aparecido Lima da Silva, Prof. Dr. José Afonso Voltolini e Dr. Alberto Fontanella Brighenti pelos conhecimentos que foram transmitidos, desde a utilização dos aparelhos fotossintéticos até a degustação dos vinhos. Aos colegas com quem eu tive a oportunidade de participar da disciplina e conhece-los um pouco mais, uma experiência incrível e enriquecedora ao lado de vocês, queridos Anyela Rojas Molina, Marcia Regina Faita, Marcos Leandro dos Santos, Tamara Cristina Campos, Tiago Camponogara Tomazetti,

Tomás Pellizzaro Pereira, Vivian Almeida, obrigada por compartilhar os momentos de aprendizado e diversão. Ao Prof. Dr. Marcelo Maraschin pela disponibilidade do uso dos aparelhos do Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal e a querida Eva Regina de Oliveira Rodrigues, pelo carinho e atenção disponibilizada durante as análises bioquímicas. Aos professores do programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, em especial ao Prof. Dr. Rubens Onofre Nodari e Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra, pelos ensinamentos passados durante os anos em que fiz parte do PPG RGV. E a secretária do programa, Bernadete Ribas, pela ajuda e disponibilidade em resolver dúvidas e questões burocráticas. Aos organizadores e palestrantes do Curso de Criopreservação em Recursos Genéticos Vegetais realizado na UFLA-MG, no qual obtive aprendizado e excelentes discussões, especialmente ao Prof. Dr. Diogo Pedrosa Corrêa da Silva pela atenção disponibilizada, ao Prof. Dr. Renato Paiva, Prof. Dr. Maurizio Lambardi, Prof. Dr. Bart Panis, Dr. Renato Fernandes Galdiano Júnior, pelas palestras proferidas e conhecimentos adquiridos, muito obrigada! E tambem aos colegas que conheci durante o curso, Jean Carlos Betoni, Juliana Aparecida Souza, Naiana Dinato e Kamila Antunes pela troca de experiencias, aprendizado e descontração durante os intervalos. À querida Gabriela Ferreira Nogueira, pela amizade e ajuda durante as análises de citometria de fluxo e durante as discussões do trabalho, muito obrigada Gabi! A querida Jennifer Nogueira, minha colega de apartamento, durante o tempo em que estive em Brasília, pela disponibilidade de me acolher e me situar em Brasília. E a todos os colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos II da EMBRAPA - Cenargen, por me receber com tanto carinho durante os dias em que estive trabalhando e utilizando o laboratório. E especial ao técnico André Luís Xavier de Souza, pela atenção e ajuda disponibilizada. Às queridas Aline Cristina Velho, Marília Shibata e Pâmela Dall'Asta, meus primeiros contatos quando entrei no PPG em Recursos Genéticos Vegetais, e desde então permaneceu uma grande amizade. O quarteto "Meninas do RGV" que pouco tempo dispõem para os encontros, mas graças a tecnologia, conseguimos manter as conversas em dia. À querida Daniela De Conti, que ocupa um espaço no meu coração, te agradeço pelas discussões, parceria nas viagens a congressos

e por compartilhar das informações e dificuldades do cultivo in vitro da Cattleya tigrina. E por sempre tem um tempo na sua agenda de professora, para me ouvir e me ajudar. Aos meus queridos estagiários voluntários, que tive a oportunidade conviver durante estes 4 anos de doutorado, Jessica Podeleski sempre determinada e confiante, Guilherme Sebold prestativo e dedicado, foram grandes parceiros na fase inicial de subcultivo das culturas das orquídeas. Agradeço por toda ajuda dedicada durante o tempo em que vocês estiveram comigo. Ao meu querido Rubens Cândido Zimmermann, pelas horas intermináveis na câmara de fluxo, que foi durante muito tempo, nossa câmara anti recalque, pelos feriados ensolarados no laboratório, almoçando pastel do Rosa e bebendo cajuína, mas que no final valeu a pena, pois "você supriu as minhas carências". Meus momentos de diversão, foram por conta de sua simplicidade e simpatia. Muito obrigada! À queridíssima Ana Paula Florindo, que aos poucos foi demonstrando interesse pelo trabalho. Obrigada pela companhia nas madrugadas no laboratório e por você ser a minha estagiária "ryca". Sempre disposta a aprender e ajudar no que foi preciso. Ao querido Stefano Gomes Kretzer pela ajuda disponibilizada nos experimentos de aclimatação de orquídeas, pelas conversas e discussões a respeito das orquídeas e ao Diogo Klock Ferreira, pelas conversas sobre Cattleya e pela cápsula de Cattleya tigrina, meu muito obrigada. Aos colegas do laboratório de Fisiologia do Metabolismo, Daniel Rosa, Jenny Paola Corredor Prado, Julia Zappelini, Lara Ribeiro de Carvalho, Luiza Giacomolli Polesi, Marcia Rossarola, Sebastian Montoya, Willian Goldoni Jr e aos IC's Bruno Bacheiga Navarro, Djalma Roecker Jr, pela amizade conquistada, parceria nos churrascos e ajuda disponibilizada. A todos os colaboradores do Laboratório Central de Microscopia Eletrônica e um obrigado especial à Eliana de Medeiros Oliveira, por seu olhar preciso, pela ajuda, pelas conversas e pela grande contribuição ao trabalho. A todos os colegas do Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal, em especial ao Dr. Ramon Felipe Scherer, pela disponibilidade em ajudar sempre que foi preciso e ao André Felipe Knop pela ajuda com equipamentos, reagentes e técnicas laboratoriais.

A todos os colegas do PPG RGV em especial, Ana Paula Lando, André Felipe Lohn, Daniela Werner Ribeiro, Fernando Sanchez, Gustavo Klabunde, Hugo Pacheco de Fraga, Liliana Quinga Pila, Luciano Saifert, Maiby Teodoro de Oliveira, Moisés Pollak Júnior, Morgana Elis Lopes, Thiago Ornellas, Tiago Montagna, Vanessa Samara Petry, Vanessa Tedesco, pelos momentos de descontração, conversas, companheirismo e ajuda durante o desenvolvimento do trabalho. Aos queridos alunos da disciplina prática de Biotecnologia vegetal, pela convivência e questionamentos durante a disciplina. Aos participantes do curso de cultivo in vitro de orquídeas e aos colaboradores, que se dispuseram em me ajudar durante os 3 anos consecutivos em que o curso foi oferecido. Meu muito obrigada a todos vocês, pelas idéias compartilhadas, pelo entusiasmo apaixonado e estimulante, que ampliaram meu conhecimento científico e me possibilitaram desenvolver e concluir este trabalho. Ao programa Zumba®, da qual eu participo, que me ajudou muito durante esses 4 anos de doutorado. Sou grata por ter conhecido e aprendido com o querido Prof. Leandro Porto, com quem eu tive a oportunidade de conhecer e conviver durante o tempo em que estava em Florianópolis e me proporcionou momentos inesquecíveis e verdadeiros, juntamente com minhas queridíssimas amigas da Zumba, com quem eu posso contar para sempre, Eliete Vaz, Marcia Romio, Maria Claudia Beirão Tonolli, Rosângela Loureiro, Rossana Valeria Chaya Piraccini. Amo vocês! A Universidade Federal de Santa Catarina, pelo ensino público e de qualidade. À CAPES pelo apoio financeiro através da bolsa de estudos, e ao CNPq e FAPESC pelos recursos financeiros que permitiram a realização de todo esse trabalho. A todos que os que conheci durante esses 7 anos em que estive na UFSC/CCA/CCB e direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho, o meu eterno muito obrigado! Gratidão a todos vocês!

Trem Bala Ana Vilela

Não é sobre ter todas pessoas do mundo pra si É sobre saber que em algum lugar alguém zela por ti É sobre cantar e poder escutar mais do que a própria voz É sobre dançar na chuva de vida que cai sobre nós

É saber se sentir infinito Num universo tão vasto e bonito, é saber sonhar Então fazer valer a pena Cada verso daquele poema sobre acreditar

Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu É sobre ser abrigo e também ter morada em outros corações E assim ter amigos contigo em todas as situações

A gente não pode ter tudo Qual seria a graça do mundo se fosse assim? Por isso eu prefiro sorrisos E os presentes que a vida trouxe para perto de mim

Não é sobre tudo que o seu dinheiro é capaz de comprar E sim sobre cada momento, sorriso a se compartilhar Também não é sobre correr contra o tempo pra ter sempre mais Porque quando menos se espera a vida já ficou pra trás

Segura teu filho no colo Sorria e abraça os teus pais enquanto estão aqui Que a vida é trem bala, parceiro E a gente é só passageiro prestes a partir

RESUMO

A orquídea Cattleya tigrina encontra-se dispersa no bioma Mata Atlântica sendo uma espécie considerada vulnerável à extinção segundo a Resolução da SMA do Estado de São Paulo e se encontra na lista vermelha da flora do Rio Grande do Sul. Devido ao seu valor ornamental, torna se alvo da ação predatória de colecionadores e orquidófilos. Com sua população em declínio reforça-se a necessidade de estudos para entendimento e conservação da espécie. A cultura de tecidos vegetais engloba um conjunto de ferramentas biotecnológicas que possibilitam a conservação e melhoramento genético de plantas. Por ser uma espécie vulnerável a extinção e endêmica da Mata Atlântica, C. tigrina foi utilizada como modelo nesse estudo. Uma das rotas morfogênicas de regeneração in vitro de orquídeas ocorre durante a formação de Estruturas Semelhantes a Protocormos (ESPs) e pode ser empregada para a propagação massal. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi caracterizar o padrão de desenvolvimento das ESPs através de análises ultraestruturais, citometria de fluxo (CF) e bioquímica em diferentes estádios de formação e regeneração de C. tigrina. Explantes foliares, obtidos de plantas in vitro foram inoculados em meio de cultura MS/2 suplementado com 9μM de TDZ, para a indução e desenvolvimento das ESPs. As culturas foram coletadas aos 7, 14, 21, 30, 60, 120 e 180 dias de cultivo para posteriores análises. As análises de CF foram realizadas mediante a combinação de observações durante a morfo histodiferenciação em diferentes regiões da planta. Durante a indução e desenvolvimento das ESPs foram realizadas análises histológicas em microscopia de luz (ML) e em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Adicionalmente, foram quantificados também, os carboidratos solúveis totais e amido, níveis de clorofilas a, b e carotenoides. A partir da CF foi possível verificar a estabilidade da espécie mantida in vitro, bem como as alterações anatômicas, bioquímicas e metabólicas durante a indução e desenvolvimento das ESPs. Os resultados alcançados permitiram inferir que as ESPs de C. tigrina possuem um conteúdo semelhante, do valor C de DNA, durante as primeiras semanas de indução. O estudo histológico revelou que as ESPs são estruturas formadas por células meristemáticas e a protoderme contém células que estão em constante divisão, com um citoplasma denso e núcleos proeminentes. Em MET observa-se que as células apresentam organelas como mitocôndrias de vários tamanhos e formas, núcleos grandes com nucléolo, abundância de amiloplastos nos estádios

iniciais de desenvolvimento das ESPs e cloroplastos. Durante o desenvolvimento das ESPs ocorreu uma diminuição no teor de clorofilas a e b, porém, a razão de clorofilas a/b se manteve em todos os tratamentos. Os maiores teores de amido nas células das culturas foram registrados aos 14 dias de cultivo em meio de cultura isento de regulador de crescimento vegetal (RCV). A partir disto, observou-se um decréscimo do teor de amido. Este evento pode estar relacionado com a degradação deste composto para o suprimento energético durante a manutenção do crescimento celular. Assim, as características celulares observadas nos estudos ultraestruturais e de CF descrevem e ampliam a base científica para a compreensão dos fatores que modulam o processo de indução e desenvolvimento das ESPs em C. tigrina. Além disso, estas informações são de grande importância para a otimização do processo de propagação e regeneração, principalmente, por se tratar de uma espécie de orquídea endêmica da Mata Atlântica do sul do Brasil, de grande valor ornamental e por ser considerada vulnerável à extinção.

Palavras-chave: Microscopia de Luz, Microscopia Eletrônica de Transmissão, orquídeas, pigmentos fotossintéticos, propagação in vitro, Valor C de DNA.

ABSTRACT

The Cattleya tigrina orchid is found in the Atlantic Forest biome. A species considered vulnerable to extinction, according to the SMA Resolution of the São Paulo State, and to the red list of the flora of Rio Grande do Sul. Due to its ornamental value, it has become a target of predatory actions of collectors and orchidophiles. Its declining population reinforces the studies to understand and to conserve the species. The plant tissue culture comprises a set of biotechnological tools that allows its genetic improvement and the conservation of the plants. Because it is a species vulnerable to extinction and endemic to the Atlantic Forest, C. tigrina was used as a model in this study. One of the morphogenetic route of in vitro regeneration of orchids occur during the formation of Protocorm-like bodies (PLBs), and can be used for mass propagation. In this context, the objective of the study was to define the pattern of development of PLBs by ultrastructural analysis, flow cytometry (FC) and biochemistry at different stages of formation and regeneration of C. tigrina. Leaf explants obtained from young plants micropropagated in vitro were inoculated into culture medium MS/2 supplemented with 9μM TDZ for the induction and development of PLBs. The cultures were collected after 7, 14, 30, 60, 120 and 180 days of cultivation for further analysis. FC analyses were performed with morphological histodifferentiation observations in different regions of the plant. During the induction and development of PLBs, histological analyses were performed in Light Microscopy (LM) and in Transmission Electron Microscopy (TEM). Total soluble carbohydrates and starch, levels of chlorophyll a, b and carotenoids were also quantified. In FC, the stability of the species maintained in vitro could be verified. Just as the anatomical, biochemical and metabolic alterations during the induction and development of PLBs. The results allowed to infer that the PLBs of C. tigrina have a similar content, of the C value of DNA, during the first weeks of induction. The histological study revealed that PLBs are structures formed by meristematic cells. And the protoderm contains cells that are in a constant division, with a dense cytoplasm and prominent nuclei. In TEM analyses, mitochondria of various sizes and shapes, large nuclei with nucleolus, amyloplasts in the early stages of development of PLBs and chloroplasts were observed. During the development of PLBs there was a decrease in chlorophyll a and b, and chlorophyll a/b ratio was maintained in all treatments. The highest levels of starch were recorded at 14 days of

culture in plant growth regulator (PGR) free medium. A decrease in the starch content was observed. May be related to the degradation of this compound to the energetic supply during cell growth maintenance. Cellular characteristics observed in ultrastructural and FC studies describe and extend the scientific basis for understanding the factors that modulate the induction and development process of PLBs in C. tigrina. This information is important for optimizing the process of propagation and regeneration. Mainly because it's an endemic orchid of the Atlantic Forest in southern Brazil, of great ornamental value and considered vulnerable to extinction.

Keywords: Light Microscopy, Transmission Electronic Microscopy, orchids, photosynthetic pigments, in vitro propagation, C Value DNA.

LISTA DE FIGURAS Revisão de Literatura

Figura 1 - (a) Aspecto geral da flor de Cattleya tigrina e (b) Planta de C. tigrina com cápsula madura...... 30 Figura 2 - Esquema da transformação da energia luminosa (fóton) em energia química (ATP) nas membranas tilacoides no cloroplasto...... 43

CAPÍTULO I Figure 1 - Protocorm-like bodies (PLBs) formed between 7 and 180 d after inoculation in Cattleya tigrina………………………………..….98 Figure 2 - Fresh mass increase and percentage of leaf explants oxidized in protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina at different in vitro culture times after inoculation. ……………………………………....100 Figure 3 - Histograms of relative fluorescence intensity obtained after the analysis of propidium iodide-stained nuclei isolated from Cattleya tigrina PLBs at different stages of development……………………..102 Figure 4 - Histograms of relative fluorescence intensity obtained after the analysis of propidium iodide-stained nuclei isolated from leaf (A) and root tip (B) of Cattleya tigrina cultivated in vitro without plant growth regulators……………………………………………..………103

CAPÍTULO II Figure 1 - Histological observation on the formation of PLBs of Cattleya tigrina…..……………….…………………………………..123 Figure 2 - Histological analysis in the formation of PLBs of Cattleya tigrina...... 124 Figure 3 - Analysis in TEM of foliar bases and ESPs of Cattleya tigrina...... 125 Figure 4 - Analysis in TEM of Cattleya tigrina with 9μM TDZ...... 126 Figure 5 - Total soluble carbohydrate contents during induction and development of Cattleya tigrina PLBs at different concentrations of TDZ...... Err o! Indicador não definido.28 Figure 6 - Starch contents during induction and developmen of Cattleya tigrina PLBs at different concentrations of TDZ...... Erro! Indicador não definido.29

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I Table 1 - Relative DNA content (pg) of leaves, leaf tips and leaf bases of Cattleya tigrina at 0 (control) and 30 d of cultivation………………………..…………………………..…….…101 Table 2 - Relative DNA content (pg) of protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina at different in vitro culture times…………………………….……………………………………103

CAPÍTULO II Table 1 - Mean values of the quantification of the photosynthetic pigments chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb), relation between chlorophyll a and chlorophyll b (Chla / Chlb), total chlorophylls (Chl T) and carotenoids (Carot) in μg / g -1 Of fresh matter of Cattleya tigrina PLBs………………….…...…..…………………………...... 127

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...... 23

2. REVISÃO DE LITERATURA...... 27 2.1 Família Orchidaceae...... 27 2.2 Formação de Protocormos em orquídeas...... 28 2.3 Gênero Cattleya...... 29 2.4 Conservação das Orquídeas do Gênero Cattleya...... 30 2.5 Padrões morfogênicos in vitro das estruturas semelhantes a protocormos...... 31 2.6 TDZ como Regulador de Crescimento Vegetal...... 34 2.7 Estimativa do valor C de DNA nuclear...... 35 2.8 Formação e desenvolvimento dos cloroplastos em ESPs...... 37 2.9 Fotossíntese e autofluorescência do Cloroplasto...... 43 2.10 Microscopia como ferramenta de análise no cultivo in vitro...... 44 2.11 Pigmentos fotossintéticos...... 49 2.12 Carboidratos e amido...... 53

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 55

3. CAPÍTULO I. Nuclear DNA content in in vitro morphogenesis of Cattleya tigrina A. Richard…………………………………………………………….93 3.1 Abstract…………………………………………………………….93 3.2 Introduction………………………………………………………...93 3.3 Materials and methods…………………..…………………………95 3.4 Results……………………………………………………………...97 3.5 Discussion………………………………………………………….104 3.6 Conclusions………………………………………………………...109 3.7 Perspectives………………………………………………………..109 3.8 References………………………………………………………….110

4. CAPÍTULO II. Ultrastructure and biochemistry in the induction and development of Protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina A Rich…..118 4.1 Abstract…………………………………………………………….118 4.2 Introduction………………………………………………………...119 4.3 Materials and methods……………………………………………..120 4.4 Results……………………………………………………………...122 4.5 Discussion………………………………………………………….129 4.6 Conclusion…………………………………………………………134 4.7 References………………………………………………………….136

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS...... 144

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Orchidaceae representa uma das famílias de plantas com flores mais diversificadas, com cerca de 899 gêneros, 27 mil espécies descritas e valorizadas por suas flores que exibem ampla diversidade, tamanhos e cores (Dressler 2005; Roberts e Dixon 2008; Souza e Lorenzi 2008, The Plant List 2017). Apresentam distribuição cosmopolita, embora sejam mais abundantes e diversificadas em florestas tropicais, especialmente da Ásia e das Américas (Dressler 1993, 2005). O Brasil detém uma das maiores diversidades de orquídeas do continente americano e do mundo (Barros et al. 2010). Estimativas atuais sugerem a ocorrência de 291 gêneros e 2539 espécies, distribuídas por todas as regiões do país, principalmente pela plasticidade adaptativa (Koch e Silva 2012). Destas, 1632 são endêmicas (Barros et al. 2017), 72 são relatadas como raras (Giulietti et al. 2005) e 34 constam na "Lista Oficial das Espécies Brasileiras Ameaçadas de Extinção" (MMA 2014). Fatores como mudanças climáticas, destruição de habitats, colheita excessiva e diminuição das populações de polinizadores contribuem para a suscetibilidade das orquídeas que pode levar à extinção (Houri et al. 2012). Orchidaceae tem uma alta proporção de gêneros e espécies ameaçados (Swarts e Dixon 2009). São plantas com alto valor ornamental, em virtude da beleza e diversidade morfológica de suas flores (Chai et al. 2007). A sua intensa exploração tem acarretado extinção de espécies, além da degradação do seu habitat natural (Hosomi et al. 2012). A exploração do habitat também é fator que colabora para o desaparecimento de muitas espécies (Koopowitz 2001). Assim, o monitoramento e as práticas de gestão podem ser a melhor forma de conservar orquídeas (Işık 2011, Houri et al. 2012). Orchidaceae tem fundamental importância para a manutenção da biodiversidade e várias espécies da família são consideradas bioindicadoras ambientais do estado de conservação das florestas, sendo sensíveis às interferências em matas primárias em virtude da ocupação de nichos especializados (Marrara et al. 2007). Em orchidaceae, muitas espécies são restritas a determinadas regiões do mundo, dependendo das condições climáticas e vegetacionais de cada local, sendo comum na família a alta representatividade de espécies endêmicas. As orquídeas são plantas herbáceas, perenes, terrícolas ou, mais comumente, epífitas, representando aproximadamente 73% das espécies (Rodrigues e Barros 2011). Dressler (1990, 1993) afirma que em média duas em cada três espécies de Orchidaceae são epífitas. As espécies 24 epífitas correspondem à parte significativa da diversidade vegetal e contribuem positivamente para tornar as florestas tropicais úmidas um dos mais complexos ecossistemas da biosfera (Kersten 2006). O gênero Cattleya foi estabelecido originalmente por John Lindney, em 1822, na obra “Collectanea Botanica”, ao descrever a espécie brasileira Cattleya labiata Lindney (Braem 1984). Fowlie (1977) descreveu que o centro de origem de Cattleya seria na região costeira entre o Litoral Norte Paulista e o Sul do Rio de Janeiro, e também o Vale do Paraíba e regiões montanhosas da Serra da Mantiqueira e Serra dos Órgãos. O gênero Cattleya está representado por duas espécies no Estado de Santa Catarina: C. leopoldii Versh. (Sinonímia de C. tigrina A. Rich) e C. intermedia Grah.; encontradas na Ilha de Santa Catarina, nos seus arredores e também em outros locais do Estado (Klein et al. 1977). Cattleya tigrina A. Rich. apresenta-se com comportamento epífita ou rupícola (Buzatto et al. 2010) e se distribui pelo bioma Mata Atlântica, nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, São Paulo, região Sul da Bahia e Pernambuco (Cruz et al. 2003). Embora C. tigrina não conste na lista de espécies ameaçadas de extinção do MMA (2014), é uma espécie considerada vulnerável à extinção, de acordo com a Resolução da Secretaria do Meio Ambiente (Resolução SMA 48/2004) e se encontra na lista vermelha da flora do Rio Grande do Sul (CONSEMA 42.099/2002). As orquídeas apresentam um padrão bastante uniforme de germinação e desenvolvimento (Arditti 2008). Elas possuem sementes extremamente diminutas e sem reservas nutritivas. A germinação inicia com o intumescimento da semente que rompe o tegumento seminal e libera o embrião (Liz 2013). Este se desenvolve numa estrutura tuberiforme, geralmente clorofilada, denominada protocormo (Arditti 1992). Devido a lenta e ineficiente multiplicação por via sexuada de propagação (Junghans e Souza 2013), a conservação de orquídeas depende de estratégias a longo prazo (Machado Neto e Custódio 2005). O cultivo in vitro é utilizado para a propagação de orquídeas, possibilitando obtenção de plantas tanto para a pesquisa, preservação das espécies ameaçadas ou não de extinção, ou para a produção massal (Sorgato et al. 2015). Estudos com finalidade de estabelecer processos de propagação das orquídeas são extremamente importantes para viabilizar a sua multiplicação em coleções vivas e possibilitar tanto a 25 reintrodução na natureza quanto à conservação das espécies ameaçadas de extinção (Ferreira e Suzuki 2008). Para a conservação e melhoramento genético das espécies diversas técnicas vêm sendo utilizadas. As biotecnologias compreendem um conjunto de técnicas que possibilitam o estudo de células, tecidos, órgãos ou organismos inteiros, por meio da indução e controle da morfogênese in vitro (Rao e Ravishankar 2002). Dentre estas, destaca-se a micropropagação, por ser uma ferramenta de larga aplicação para a conservação da biodiversidade. A micropropagação engloba um conjunto de técnicas que possibilitam a propagação massal de genótipos selecionados que permitem a captura e fixação de ganhos genéticos (Guerra et al. 1999). Pesquisas desenvolvidas para a propagação em larga escala de orquídeas cultivadas in vitro utilizam como fontes de explantes, hastes florais (Chen e Chang 2000; Chen et al. 2002); ápices meristemáticos (Malabadi et al. 2005); protocormos (Silva e Tanaka 2006; Naing et al. 2011; Ng e Saleh 2011); segmentos caulinares (Luo et al. 2008); segmentos foliares (George et al. 2008; Gantait e Sinniah 2012) e ápices de raiz (Manners et al. 2010). Estes explantes, quando submetidos ao cultivo in vitro, formam estruturas denominadas "estruturas semelhantes a protocormos” (ESPs), pois se assemelham aos protocormos obtidos pela germinação simbiótica (Arditti e Ernst 1993). Embora a morfologia e aspectos do desenvolvimento estrutural das ESPs sejam conhecidos, são poucos os estudos a respeito da ontogênese (Lee et al. 2013). Muitos autores afirmam que as ESPs são embriões somáticos (Steward e Mapes 1971; Begum et al. 1994; Ishii et al. 1998; Chen e Chang 2000; Huan et al. 2004; Hossain et al. 2013; Lee et al. 2013; Teixeira Da Silva 2013), ou que a embriogênese somática é um passo inicial na formação das ESPs (Arditti e Ernst 1993; Begum et al. 1994; Zhao et al. 2008). Liz (2013) estudando sobre a morfo- histodiferenciação de protocormos de C. amethystoglossa e ESPs de C. tigrina observou que os protocormos e as ESPs formadas, respectivamente, evidenciaram um padrão de morfogênese distinto. As ESPs são capazes de converter-se em plântulas facilmente, quando cultivadas em meio com regulador de crescimento (Ng e Saleh 2011). E, por isso, o estudo deste padrão de desenvolvimento é fundamental para o avanço das pesquisas em transformação genética de orquídeas (Liau et al. 2003). No entanto, o cultivo in vitro de algumas espécies tem sido limitado devido às mudanças anatômicas, morfológicas e fisiológicas inerentes ao processo de morfogênese 26

(Grattapaglia e Machado 1998; Louro e Santiago 2000; Chandra et al. 2010). Algumas pesquisas foram realizadas com o objetivo de compreender os fatores que modulam esse processo em C. tigrina. Fritsche (2012) estudou a regeneração de ESPs e CF aplicadas ao melhoramento genético e ao estudo do genoma nuclear de orquídeas. Liz (2013) elucidou aspectos envolvidos na morfo histodiferenciação do desenvolvimento de ESPs, e evidenciou a diferenciação dos tecidos na primeira semana de cultivo, onde as células epidérmicas de folhas utilizadas como fonte de explante, começaram a sofrer divisões mitóticas para formação dessas estruturas. No trabalho realizado por Almeida (2014) foi analisada a dinâmica das poliaminas, amido, proteínas totais e metilação do DNA durante 35 dias de cultivo das ESPs. Foi verificado que a ontogênese dessas estruturas está associada às alterações bioquímicas e eventos epigenéticos como a metilação do DNA. De Conti (2016) verificou reprogramação gênica durante a indução e desenvolvimento das ESPs. Na indução das ESPs verificou proteínas relacionadas ao metabolismo energético e carboidratos expressas ao zero dia de cultivo. Durante o desenvolvimento das ESPs, alterações na expressão de proteínas associadas aos processos metabólicos; metabolismo energético de carboidratos; ciclo celular; metabolismo secundário foram observados. Mesmo com alguns avanços na elucidação dos mecanismos associados à modulação desse sistema regenerativo em C. tigrina, a compreensão ultraestrutural dessas células com elevado potencial morfogênico que regulam esse sistema de regeneração foi proposta nesse estudo. O uso de análises da morfo histodiferenciação do material vegetal, utilizando técnicas de microscopias de luz, eletrônica confocal e de transmissão, foi de fundamental importância para a interpretação na identificação e caracterização na formação das ESPs, acompanhadas de alterações bioquímicas e metabólicas. A tese está organizada em dois capítulos, precedidos por uma revisão bibliográfica. O primeiro capítulo abrange o estudo da CF, durante a indução e regeneração das ESPs, enquanto o segundo refere-se à análise ultraestrutural dos cloroplastos no desenvolvimento das ESPs, e utiliza abordagens bioquímicas para compreender os fatores que modulam a indução e desenvolvimento das ESPs em C. tigrina.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Família Orchidaceae Orchidaceae é uma das famílias botânicas mais numerosas e diversificadas (Chase 2005), apresentando cerca de 27.801 espécies aceitas, distribuídas em 899 gêneros (The Plant List 2017). Seus representantes possuem diferentes hábitos, com espécies terrícolas, epífitas, rupícolas, escandentes ou até mesmo saprófitas. Isso possibilita uma distribuição cosmopolita, embora sejam mais abundantes e diversificadas em florestas tropicais (Pinheiro et al. 2004). Cada espécie de orquídea possui adaptações para ocupar um ambiente específico e, devido as suas especializações, muitas possuem distribuição restrita e o endemismo é bastante elevado (Pritchard 1989). As orquídeas apresentam frutos com milhares de sementes, contudo a germinação destas é pouco eficiente em condições naturais, chegando ao máximo em 5% (Stoutamire 1964). São cultivadas por suas belas flores e amplamente conhecidas por sua importância ecológica e econômica. Devido à sua gama de diversidade na forma, tamanho e cor das flores, caracterizada pela distinta morfologia floral, mecanismo de polinização, associação com fungos (micorrizas) e sementes minúsculas é considerada uma família evolutivamente avançada de monocotiledôneas (Linthoingambi et al. 2015). Não obstante, o fato de serem membros da maior família de plantas com flores, as orquídeas estão entre as mais seriamente ameaçadas de extinção, sendo que a vulnerabilidade resultaria de várias razões, as principais seriam: o ciclo de vida especializado, como por exemplo, longo período vegetativo até atingir o período reprodutivo, sementes com pouca ou nenhuma reserva, a germinação de sementes dependente da associação com fungos micorrízicos, e a ação do homem por meio da destruição do habitat, derrubando árvores e florestas, além da coleta indiscriminada de orquídeas na natureza (Ferreira & Suzuki 2008). No Brasil, não só com relação às orquídeas, mas também às demais espécies, a preocupação com o aumento do número de espécies ameaçadas de extinção é crescente. A possibilidade de produzir plantas de orquídeas em grandes quantidades poderia garantir que essas plantas ocupem um lugar no futuro, evitando sua extinção (Suzuki & Ferreira 2007). 28

No bioma Mata Atlântica, de acordo com a Lista Oficial das Espécies da Flora do Brasil (2017), ocorrem cerca de 2.550 espécies distribuídas em 238 gêneros, das quais 1.620 são endêmicas (Barros et al. 2010). Apesar de o bioma estar sob grande ameaça poucas espécies de orquídeas são consideradas em risco de extinção. Na Lista Nacional Oficial de Espécies da Flora Ameaçadas de Extinção, do Ministério do Meio Ambiente (MMA 2014), apenas 168 espécies de orquídeas estão listadas, 15 espécies do gênero Cattleya. Cattleya tigrina é listada como vulnerável. Taxonomicamente as orquídeas estão divididas em seis subfamílias: Apostasioideae, Cypripedioideae, Spiranthoideae, Orchidoideae, Epidendroideae e Vandoideae (Dressler 1990). Em Epidendroideae, encontra-se dentre outros, o gênero Cattleya, com enorme valor horticultural e ocorrência natural no Brasil, sendo muito utilizado para a produção de híbridos comerciais (Van Den Berg et al. 2009).

2.2 Formação de Protocormos em orquídeas As sementes de orquídeas, como as de outras plantas saprófitas ou semi-parasíticas, contêm um pequeno embrião de apenas cerca de 0,1 mm de diâmetro, sem tecido associado de armazenamento como o endosperma. Após a germinação, o embrião aumenta para formar uma pequena estrutura “como um corpo”, denominado protocormo. Na natureza, um protocormo torna-se verde e acumula reservas de carboidratos pela fotossíntese. Só quando cresce e tem matéria orgânica armazenada suficiente, dá origem a ápice caulinar e raiz (Arditti 1967; Churchill et al. 1973; Arditti e Krikorian 1996; Arditti e Ghani 2000; Yam et al. 2009; Arditti 2010). Corpos que em sua estrutura e crescimento são formados durante a cultura in vitro em diferentes tipos de órgãos e tecidos nas orquídeas, são denominados pelos pesquisadores de "protocorm-like bodies" (PLBs), devido à semelhança aos protocormos observados na germinação de orquídeas a partir de sementes. Estruturas semelhantes a protocormos também surgem diretamente em outros explantes de orquídeas e proliferam de outros ESPs de uma forma que é exatamente comparável à formação direta de embriões (Arditti 1967; Churchill et al. 1973; Arditti e Krikorian 1996; Arditti e Ghani 2000; Yam et al. 2009; Arditti 2010). Morel (1960) observou através de seus estudos que quando protocormos de Cymbidium foram divididos, formaram novos 29 protocormos, e quando não eram divididos, protocormos originais se regeneravam e desenvolviam em novas plântulas. Morel (1960, 1964) sugeriu que o meristema ou os explantes apicais poderiam ser utilizados para estabelecer culturas para a propagação de orquídeas, proporcionando assim a base do método que é agora muito usado para diversos gêneros de orquídeas. Hoje em dia as taxas de propagação foram melhoradas com a utilização de meios mais complexos, incluindo reguladores de crescimento (George 1996). Contudo, muitos laboratórios de micropropagação comerciais acabam não utilizando protocormos na micropropagação devido à falta de fidelidade clonal (Arditti 1967; Churchill et al. 1973; Arditti e Ghani 2000; Arditti e Krikorian 1996; Yam et al. 2009; Arditti 2010). Algumas orquídeas não formam apenas protocormos de meristemas apicais, mas também diretamente de explantes como folhas (Churchill et al. 1971, 1973; Tanaka et al. 1975), hastes florais (Flamée e Boesman 1977; Arditti et al. 1977).

2.3 Gênero Cattleya Cattleya Lindl. é um gênero de orquídeas exclusivamente neotropical que abrange aproximadamente 120 espécies principalmente epífitas, raramente, rupícolas e terrícolas. Este gênero se insere na subfamília Epidendroideae Lindl. tribo Epidendreae Kunth, subtribo Laeliinae Benth (Chase et al. 2003; Van Den Berg 2009). Cattleya é um gênero Neotropical com 113 espécies (Van Den Berg 2014; Chase et al. 2015). O gênero é dividido em diversos subgêneros e mais da metade das espécies são exclusivas do Brasil (Van Den Berg 2014). O restante é de distribuição nos Andes, estendendo-se no sentido Leste da Venezuela até Trinidad e no sentido Norte da América Central até o Sul do México (Van Den Berg 2005). A maioria das espécies encontra-se em habitats montanhosos e prefere o frio para se desenvolver, embora algumas tenham se adaptado ao calor e às condições de umidade das planícies (Withner 1988). A beleza de suas flores constitui o gênero, como um dos mais belos ornamentos das matas tropicais e subtropicais da América, tornando-se o mais popular e o mais cultivado gênero da família das orquídeas (Raposo 1993), conferindo-lhe considerável importância econômica. Cattleya é um gênero muito comercializado na atualidade, 30 agrupando inúmeras espécies e milhares de híbridos que apresentam flores grandes e coloridas (Paula e Silva 2006). No Brasil existem cerca de 20 espécies nativas de Cattleya (Zanenga-Godoy e Costa 2003) destacando-se a Cattleya tigrina (Fig. 1). Esta espécie é endêmica do bioma Mata Atlântica e habita trechos de matas ribeirinhas, caracterizados pela alta umidade, sendo encontrada nos estados do Rio Grande do Sul, São Paulo, região Sul da Bahia e Pernambuco (Cruz et al. 2003). Destaca-se pela coloração e número de flores, sendo muito cultivada e comercializada pelos orquidófilos devido ao seu alto valor comercial (Rocha 2008). Assim, devido à coleta indiscriminada, o ciclo de vida altamente especializado e a destruição dos seus habitats pela expansão humana, esta espécie está em constante declínio, sendo vulnerável à extinção, segundo o Livro Vermelho da Flora do Brasil (MMA 2013).

Figura 1 - (a) Aspecto geral da flor de Cattleya tigrina e (b) Planta de C. tigrina com cápsula madura.

2.4 Conservação das Orquídeas do Gênero Cattleya Este gênero é considerado um dos mais importantes da família, tendo em vista sua diversidade e seu elevado valor ornamental, além de seu uso no desenvolvimento de híbridos interespecíficos e intergenéricos para fins comerciais (Van Den Berg 2014). Quase todas as espécies do gênero têm sido coletadas intensamente na natureza para cultivo (CNCFlora 2017). A elevada frequência, com a qual vem ocorrendo essa procura, tem levado a uma redução e desaparecimento de várias populações e, consequentemente, várias destas espécies 31 apresentam-se ameaçadas de extinção (CNCFlora 2017; FZB e SEMA 2017). As orquídeas do gênero Cattleya que ocorrem na Mata Atlântica possuem alto valor comercial pelo seu atrativo ornamental (Pinheiro et al. 2012). Porém, as espécies do gênero são pouco representadas em coleções de herbário (Cruz et al. 2003). Especialistas em conservação, em um contexto nacional e regional (CNCFlora 2017; FZB e SEMA 2017), sugerem que as espécies alvo deste estudo necessitam de programas de conservação urgentes. Atualmente, estão incluídas nas listas vermelhas oficiais de espécies ameaçadas de extinção (CNCFlora 2017, FZB e SEMA 2017), porque enfrentam um risco muito elevado de extinção na natureza. O apelo para a conservação das orquídeas tem sido realizado mundialmente com diferentes opiniões, ideais e esforços para atacar o problema (Mirenda 2011). Cribb (2011) destaca que as mudanças climáticas têm uma grande probabilidade de ser um efeito dramático nas orquídeas do mundo.

2.5 Padrões morfogênicos in vitro das estruturas semelhantes a protocormos As técnicas de cultura in vitro, baseadas no princípio da totipotência das células vegetais, ou seja, na potencialidade de células se diferenciarem e regenerarem uma planta completa, têm gerado grandes avanços na pesquisa básica, principalmente na fisiologia, bioquímica e genética de plantas, fornecendo ferramentas de ação em áreas práticas como o melhoramento genético vegetal, a farmacologia, a micropropagação e a conservação de germoplasma (Kerbauy 2008). Na propagação in vitro, tecidos, órgãos ou células podem adquirir novas competências, geralmente pela ação de determinados sinais químicos (reguladores de crescimento) que ativam seletivamente determinados genes (epigênese). A resposta final é a expressão morfogenética em dois níveis básicos: organogênese direta ou indireta e embriogênese somática direta ou indireta (Reinert 1977). Na organogênese direta se obtém eixos caulinares monopolares originados de gemas pré-existentes. Quando é indireta ocorre a desdiferenciação do explante, resultando na formação de calos, que podem ser definidos como a proliferação de células não diferenciadas, originado meristemoides (Thorpe 1980). 32

A embriogênese somática é o processo pelo o qual se desenvolvem embriões a partir de uma célula simples ou um grupo de células que não resultaram da fusão de gametas e que se diferenciam nos mesmos estádios ontogenéticos observados na embriogênese zigótica (Maheswaran e Wiliams 1985). Este padrão de expressão da morfogênese é fundamentado pela totipotencialidade celular, postulado pelo fisiologista alemão Haberlandt, em 1902, para o qual, uma vez fornecidas às condições e estímulos adequados à célula nucleada, ela poderia originar uma planta completa (Zimmerman 1993). A formação de uma estrutura bipolar integrada em um único eixo, sem ligações vasculares com o tecido matriz, torna a embriogênese somática diferente do padrão organogênico (Guerra et al. 1999). Orchidaceae apresenta uma rota de desenvolvimento incomum às demais plantas com sementes. Confere um padrão uniforme de germinação e desenvolvimento, iniciando-se pelo intumescimento da semente que rompe o tegumento seminal e libera o embrião, desenvolvendo numa estrutura tuberiforme, geralmente clorofilada, denominada protocormo (Arditti 1992). Sob condições in situ, as sementes germinam e permanecem como um protocormo até que seja infectada por micorrizas, que fornecerão a nutrição inicial (Harrison 1977). George e Debergh (2008) afirmam que na fase de protocormo, a diferenciação do meristema apical e radicular ocorre em polos opostos, como constatado na histodiferenciação de protocormos em Cattleya amethystolossa, onde havia um ápice caulinar e um polo oposto na base do protocomo, que apresentava rizóides (Liz 2013). Tanto a germinação das sementes quanto o desenvolvimento dos protocormos in vitro não diferem dos mesmos eventos observados naturalmente (Arditti 1992). Kraus et al. (2006) postularam que o padrão de desenvolvimento dos protocormos in vitro deve ser similar ao dos protocormos desenvolvidos in situ, conforme proposto por Arditti (1992). Em orquídeas, além da germinação assimbiótica de sementes e da organogênese convencional existe uma rota morfogênica específica para a regeneração in vitro. Este tipo de propagação clonal de orquídeas pode ser realizado utilizando explantes somáticos de diferentes origens como, por exemplo, folhas (Chen e Chang 2001; Gow et al. 2008; Mayer et al. 2010), hastes florais (Chen e Chang 2000), raízes (Kerbauy e Estelita 1996) e ápices caulinares (Roy et al. 2007) com a obtenção de estruturas globulares similares aos embriões de origem zigótica. A 33 maioria dos trabalhos publicados refere-se a esta rota como sendo embriogênese somática, muito provavelmente devido às peculiaridades dos embriões de origem zigótica das orquídeas (Ishii et al. 1998; Huan et al. 2004; Lee et al. 2013). Muitos trabalhos sobre micropropagação de orquídeas citam Morel, que em 1960, informou que explantes de Cymbidium Sw. haviam sido cultivados em meio “Knudson III”, e cada broto originava várias plantas (Yan e Arditti 2009). No entanto a grande contribuição de Morel foi a introdução de uma nova terminologia para as estruturas que surgiam a partir de explantes inoculados de orquídeas, “protocorm like body” (PLB). O termo que traduzido para o português ficou conhecido como “Estruturas Semelhantes a Protocormos” (ESPs). Em tecidos ou calos de orquídeas cultivadas in vitro, formam estruturas similares aos protocormos, sendo por esta razão denominadas ESPs (Arditti e Ernst 1993). Este termo protocorm-like bodies é também utilizado para qualquer estrutura originada de orquídeas a partir de explantes meristemáticos (Kraus et al. 2006), como por exemplo mericlones (Kuehnle 2007), embriões somáticos (Chen e Chang 2004), brotos (Chen et al. 2004), segmentos nodais axilares (Shiau et al. 2005; Dohling et al. 2012) e a própria estrutura semelhante a protocormo (Young et al. 2000; Paek et al. 2011). Muitos autores afirmam que ESPs são embriões somáticos (Ishii et al. 1998; Huan et al. 2004; Lee et al. 2013), no entanto, evidências claras de embriogênese somática ainda são limitadas. Baseando-se no fato de que o termo protocormo foi proposto devido às sementes de orquídeas apresentarem um padrão de desenvolvimento inicial distinto das demais angiospermas, e específico para o grupo, sugere-se que este comportamento diferenciado perpetue na morfogênse in vitro, justificando neste trabalho o uso do termo ESPs, quando se refere às estruturas obtidas diretamente dos explantes foliares. Lee et al. (2013) verificaram com estudos histológicos e histoquímicos, que nos estágios iniciais de formação das ESPs, as células apresentam características citológicas e marcadores de membrana semelhantes ao desenvolvimento do embrião zigótico. No entanto, em estudos mais recentes sobre a expressão gênica de vários tecidos reprodutivos e eventos moleculares em Phalaenopsis aphrodite Rchb. f. foi observado que a regeneração das ESPs não segue o programa da embriogênese e possui um gene específico que desempenha o papel na regeneração das ESPs (Fang et al. 2016). 34

O estudo desafia a compreensão atual da origem embrionária das ESPs. Os dados obtidos estabelecem uma estrutura fundamental para o desenvolvimento reprodutivo das orquídeas e constituem um novo recurso para permitir a cadeia regulatória de genes que são necessárias para programas especializados no desenvolvimento de orquídeas (Fang et al. 2016). A propagação pela formação de ESPs é a opção preferida pelo grande número destas estruturas que podem ser obtidas dentro de um curto período de tempo. ESPs podem proliferar-se rapidamente e regenerar facilmente em plântulas completas, por isso é o alvo para estudos de transformação genética em orquídeas (Liau et al. 2003). ESPs são capazes de converter-se em plântulas facilmente quando cultivados em um meio com regulador de crescimento (Ng e Saleh 2011). Pouco tem se estudado sobre essas morfologias, havendo a necessidade de descrições para entender sua estrutura e a rota morfogênica in vitro em ESPs de C. tigrina.

2.6 TDZ como Regulador de Crescimento Vegetal Thidiazuron (N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) é uma feniluréia que mostra atividade citocinínica. As citocininas são substâncias que, entre outras coisas, em combinação com a auxina, estimulam a divisão celular nas plantas (Greene 1996). O potencial morfo-regulador do TDZ, têm levado à sua aplicação na cultura de tecidos vegetais, para o desenvolvimento de sistemas morfogenéticos (Guo et al. 2011). TDZ surgiu como um bioregulante eficaz na cultura de células e tecidos, em grande variedade de plantas (Li et al. 2000; Hosseini-Nasr e Rashid 2000; Svetla et al. 2003; Matand e Prakash 2007). As células vegetais têm o potencial de reproduzir plantas intactas pela organogênese ou embriogênese (George 1996). Reguladores de crescimento vegetal desempenham um papel de espinha dorsal nos processos de desdiferenciação e rediferenciação. Esses processos regenerativos em culturas de células e tecidos podem ser estimulados somente pelo TDZ ou em associação com outros reguladores de crescimento vegetal (Guo et al. 2011). Um sistema de regeneração in vitro eficiente na cultura de tecidos e células é um pré- requisito para a aplicação biotecnológica da planta (Confalonieri et al. 2003). 35

TDZ é um substituto da fenil ureia com atividade de citocinina. É usado para a regeneração de plantas de diversas espécies pela organogênese e promove a formação de brotos in vitro em várias espécies de orquídeas (Huetteman e Preece 1993). As citocininas podem mediar aspectos do desenvolvimento regulado pela luz, incluindo a diferenciação dos cloroplastos, o desenvolvimento do metabolismo autotrófico e a expansão de folhas e cotilédones (Taiz e Zeiger 2013). Durante sua ontogênese, uma célula inicial usa o seu potencial genético em divisões celulares complexas e consecutivas que resultam em um organismo pluricelular. Esse processo configura um modelo biológico importante para estudos associados à competência celular, histogênese e histodiferenciação (Cangahuala- Inocente 2007). De acordo com Gantait e Sinniah (2012), um sistema de propagação de sucesso depende da indução, assim como a regeneração de órgãos para formar plântulas. As citocininas, fitohormônio derivado da adenina (aminopurina), tem apresentado um papel fundamental na diferenciação e regeneração de plantas na maioria das espécies testadas (Santiago 2001). Pesquisas com orquídeas tem utilizado citocininas, como o TDZ, e verificado sua eficiência na indução da morfogênese in vitro para regeneração de ESPs de espécies de Phalaenopsis Blume e Doritaenopsis Guillaumin & Lami (Ernst 1994); Oncidium Sw. (Chen e Chang 2000); Vanda coerulea Griff. (Malabadi et al. 2004); Ansellia africana Lindl. (Vasudevan e Van Staden 2011); híbrido de orquídea (Gantait e Sinniah 2012). Os mecanismos de ação do TDZ ainda não são completamente conhecidos. Alguns estudos têm demonstrado sua ligação com modificações nas membranas, absorção e assimilação de nutrientes e a síntese e transporte de hormônios endógenos, como o AIA (Guo et al. 2011). A utilização de reguladores de crescimento pode induzir alterações no material de cultivo (Carvalho e Vidal 2003), para fazer um monitoramento dessas alterações, pode-se utilizar a quantificação do DNA. A quantidade de DNA nuclear (valor C) é um caráter de significado biológico fundamental e o conhecimento para um grupo de organismos pode ser útil em vários campos, como biologia molecular e celular, ecologia, fitogeografia e sistemática (Bennet e Leitch 1995).

2.7 Estimativa do valor C de DNA nuclear 36

As plantas obtidas por cultura de tecidos vegetais são em teoria, clones idênticos às matrizes, pois o crescimento de células in vitro e a sua regeneração é um processo assexuado, envolvendo somente divisões mitóticas que, de certo modo, não causam nenhuma variação genética (Bairu et al. 2011). Contudo, variabilidade genética tem sido observada em várias plantas durante o desenvolvimento in vitro (Rezende et al. 2008; Santana et al. 2008; Lima et al. 2008). Esse fenômeno é normalmente relacionado à falta de estabilidade genética do material produzido (Larkin e Scowcroft 1981), caracterizado por uma variação fenotípica de origem genética, ou seja, uma variação cromossômica que pode se tornar herdável nas gerações seguintes, ou epigenética, que é uma variação transitória devido ao estresse fisiológico que o material sofre, quando submetido ao cultivo in vitro (Illg 1990; Bairu et al. 2011). Os riscos de variações genéticas geralmente são maiores quando as plantas são micropropagadas, ou seja, originam-se por meio de calo, de protoplastos e de embriogênese somática (Cid e Teixeira 2014). Phillips et al. (1994) consideram esses aspectos e indicam que as variações decorrentes do cultivo in vitro apresentariam características de mutagênese auto-imposta devido à quebra do controle do ciclo celular normal. A indução de ESPs in vitro é a rota regenerativa mais utilizada na propagação clonal em larga escala de orquídeas (Murthy e Pyati 2001; Park et al. 2002; Chugh et al. 2009). Técnicas de melhoramento, como alterações do nível de ploidia (Chen et al. 2009) e eventos de transformação genética (Chai et al. 2002; Mishiba et al. 2005) vêm sendo utilizados no melhoramento genético de orquídeas com objetivos específicos. Nesse contexto a técnica da CF, que mede a intensidade da fluorescência de partículas em movimento, surge como uma alternativa a estes métodos clássicos de contagem, permitindo rapidamente a identificação de tetraplóides, haplóides, aneuplóides, alopoliplóides e a estimativa do conteúdo de DNA nuclear de amostras de tecido vivo (Loureiro e Santos 2004). O conteúdo de DNA nuclear em um cromossomo haplóide não replicado é denominado valor C de DNA (Swift apud Bennet et al. 2000). Portanto, um núcleo na fase G1 do ciclo celular contendo duas cópias do genoma não replicado possui um valor 2C de DNA (Doležel e Bartos 2005). O conhecimento do valor C de DNA é importante para diversos ramos da biologia como a taxonomia, ecologia e a genética molecular (Bennet et al. 2000). 37

Atualmente se conhece o conteúdo de DNA nuclear de um grande número de espécies. Bennet et al. (2000), em um trabalho de compilação de resultados de diversas pesquisas, reportaram que aproximadamente 2802 espécies de angiospermas têm seu conteúdo de DNA nuclear estimado, o que representa apenas 1% de todas as angiospermas. Em orquídeas 233 espécies possuem estimativas para o valor C de DNA (Plant DNA C-value database 2017). Os resultados sugerem que Orchidaceae, entre as angiospermas, é a família que possui maior variabilidade nos conteúdos de DNA nuclear com valores entre 0.33 e 55.4 pg (Leitch et al. 2009). A falta de estimativas utilizando a técnica da citometria de fluxo vem das dificuldades em se obter estimativas corretas para esta família (Leitch et al. 2009). Em um trabalho para estimar o valor C de 70 espécies de orquídeas, pertencentes a 26 gêneros distintos, Jones et al. (1998) utilizaram tanto estandardização interna quanto externa, além de utilizarem glóbulos vermelhos de galinha como padrão de referência, que pode levar a estimativas totalmente equivocadas (Doležel e Bartos 2005). De acordo com o Plant DNA C-value Database (2017) não existem estimativas do valor C de DNA para a maioria das espécies de orquídeas brasileiras, indicando a necessidade de pesquisas com esta abordagem. Fritsche (2012) pesquisou sobre a citometria de fluxo aplicada ao melhoramento genético e ao estudo do genoma nuclear de orquídeas. Para as análises dos regenerantes obtidos por meio da regeneração de ESPs de C. tigrina, foi constatado que todos apresentavam o dobro da ploidia em relação ao tecido das plantas utilizadas como fonte de explantes. Portanto, é essencial identificar e propor um conjunto de métodos confiáveis sobre a estimativa do valor C de orquídeas. Dentre as técnicas empregadas para analisar possíveis variações genéticas em plantas micropropagadas, está a CF que, além de poder proporcionar importantes informações a respeito das diferentes formações in vitro, também tem a capacidade de detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA nuclear das células, tecidos ou órgãos em cultivo, incluindo plantas completas (Orbovic et al. 2008).

2.8 Formação e desenvolvimento dos cloroplastos em ESPs Em 1848, os cloroplastos foram descritos pela primeira vez por Unger, como estruturas ligadas ao pigmento, mais tarde, no século XIX, Schimper (1883, 1885) caracterizou estas estruturas, que chamou de 38

“Chlorophyllkorner”, em maiores detalhes. Com a disponibilidade apenas da resolução do microscópio de luz, descreveu plastídios como componentes de células contendo clorofila ou outros pigmentos que se desenvolvem a partir de precursores incolores. Schimper percebeu a existência de vários tipos de plastídios e fez observações de que eles poderiam passar durante o seu desenvolvimento. Após a invenção do microscópio eletrônico, as primeiras micrografias eletrônicas de cloroplastos foram publicadas (Kausche e Ruska 1940), e logo depois, foi utilizado para os primeiros estudos detalhados do desenvolvimento dos plastídios (Lichtenthaler et al. 1984; Lichtenthaler 2007). Os cloroplastos são organelas intracelulares presentes em algas e plantas, responsáveis pelo processo fotossintético, desde a captação da energia luminosa até a formação de compostos orgânicos, participando também da assimilação do nitrogênio, na síntese e armazenamento de amido e na biossíntese de aminoácidos e lipídios (Carrer 1998; Staehelin e Newcomb 2000). Nas plantas, os cloroplastos se desenvolvem a partir de proplastídios, que não possuem membranas de tilacoides e estão presentes em todas as células vegetais, principalmente em células meristemáticas e em células pós-mitóticas jovens (Vothknecht e Westhoff 2001). Os proplastídios, são os precursores dos cloroplastos, são pequenos (0.5-1.0 µm de diâmetro), geralmente esféricos (Thomson 1980). Estas organelas normalmente têm origem durante a formação de zigotos e são mantidas num estado indiferenciado em células meristemáticas no desenvolvimento da planta (Kirk e Tilney-Bassett 1978). A membrana interna encontrada nos cloroplastos é quase ausente em proplastídios. No entanto, o proplastídio contém baixas quantidades de DNA plastidial, RNA ribossomal e proteínas solúveis (Newcomb 1967; Dyer e Miller 1971; Miyamura 1986). Os cloroplastos apresentam três principais regiões estruturais: (a) uma rede de membranas internas altamente organizada formada de vesículas, os tilacoides, (b) um fundo amorfo rico em proteínas solúveis e ribossomas, o estroma e (c) um par de membranas externas, o envelope do cloroplasto (Taiz e Zeiger 2013). O envelope do cloroplasto consiste em duas biomembranas: o envelope interno e o externo. A matriz interna do cloroplasto, o estroma, é caracterizado por dois grandes elementos estruturais: (1) os tilacoides fotoquimicamente ativos e (2) os plastoglóbulos osmiofílicos 39

(Lichtenthaler 2013). Além disso, cloroplastos nas condições de incidência de luz, por exemplo, nas folhas expostas ao sol, um terceiro componente estrutural aparece: grãos de amido. Os grãos de amido, não são encontrados em condições de pouca luz ou em plantas no escuro, enquanto que os tilacoides e os plastoglóbulos osmiofilicos são estruturas regulares dos cloroplastos (Lichtenthaler 1966, 1968, 2007). As biomembranas de tilacoides contendo pigmentos fotossintéticos (Lichtenthaler e Park 1963; Lichtenthaler e Calvin 1964) ligado a vários complexos de proteína clorofila-carotenoide (Thornber 1975, Lichtenthaler et al. 1982a, b; Bennett 1983; Lichtenthaler e Babani 2004) estão dispostas em maneiras particulares pelas quais se pode diferenciar entre livre, tilacoides do stroma e regiões de grana (Lichtenthaler e Babani 2004; Lichtenthaler et al. 1984; Lichtenthaler 2007), onde os tilacoides são empilhados formando pilhas de grana largas e altas (cloroplastos de sombra) ou pilhas de grana estreitas e baixas (cloroplastos de sol). As tilacoides estão associadas a reações de transporte de elétron, incluindo fotólise da água, que conduzem à formação de ATP (fotofosforilação) e a redução agente NADPH, que funcionam como coenzimas na assimilação do CO2 aos fosfatos de açúcar no estroma do cloroplasto. Este processo é conhecido como ciclo de redução de carbono, Ciclo de Calvin ou ciclo de Calvin-Benson (Lichtenthaler 2007; Rolland et al. 2009). Os cloroplastos, com os seus tilacoides fotoquimicamente ativos, são organelas essenciais de todos os tecidos de plantas verdes, como em folhas, frutos verdes e caules. Eles realizam o processo de fotossíntese, isto é, a indução da luz na transformação do CO2 inorgânico em compostos orgânicos ricos em energia, como açúcares, amido, glicero-lípidos e isoprenóide lípidos (Lichtenthaler 2013). Um elemento estrutural essencial nos cloroplastos são os plastoglóbulos osmiofilicos que funcionam como um local de armazenamento extratilacoidal para excesso de lípidos isoprenoides, tais como α-tocoferol (vitamina E) e plastoquinona-9, vestígios de xantofilas, mas estão praticamente livres de clorofila, β-caroteno e filoquinona K1 (Lichtenthaler 1964; Lichtenthaler e Sprey 1966; Grumbach e Lichtenthaler 1974; Lichtenthaler 2007). Estes "glóbulos osmiofilicos” são componentes regulares no estroma do cloroplasto e foram denominados "Plastoglóbulos osmiofilicos" por Lichtenthaler e Sprey (1966) que isolaram e analisaram plastoglóbulos de várias plantas (Billbergia, Eucharis, 40

Tradescantia). Cloroplastos de sol, possuem plastoglóbulos osmiofilicos de tamanho maior em comparação com os cloroplastos de sombra, que posssuem apenas alguns pequenos plastoglóbulos. Cloroplastos de sol exibem proeminentes grãos de amido e também vários tamanhos de plastoglóbulos que, embora presentes, são raros em cloroplastos de sombra (Lichtenthaler 2013). Quando as plantas são cultivadas no escuro, proplastídios de folhas primárias ou cotilédones se desenvolvem em etioplastos (Solymosi e Aronsson 2013), que são caracterizados por estruturas cristalinas, conhecidas como corpo prolamelar e possui pequenos plastoglóbulos osmiofílicos (Sprey e Lichtenthaler 1966). Após a iluminação do tecido foliar, inicia-se o processo de formação dos tilacoides. Isto é indicado pelo desaparecimento do corpo prolamelar e plastoglóbulos osmiofílicos (Lichtenthaler 2013). Nas micrografias eletrônicas é possível detectar estruturas longitudinais com vesículas que se ligam às extremidades dos tilacoides e os prolongam. Nesta fase de desenvolvimento, o sistema plastoglóbulos osmiofilicos praticamente desaparecem (Sprey e Lichtenthaler 1966). Durante esta fase induzida pela luz, aparentemente na biossíntese dos tilacoides, todos os lipídios depositados nos plastoglóbulos no escuro são usados para construção da bicamada lipídica de tilacoides ativos e seus complexos pigmentos de proteína (Lichtenthaler 2013). De fato, durante as primeiras horas de iluminação de plantas crescidas no escuro, os carotenoides (luteína, violaxantina) e prenilquinonas (plastoquinol-9, plastoquinona-9, α-tocoferol) que estão presentes nos plastoglóbulos não são acumulados, enquanto β-caroteno assim como a naftoquinona filoquinona K1 são acumuladas em níveis elevados (Lichtenthaler 1969). Esta observação é uma indicação adicional essencial de que os plastoglóbulos lípidos de etioplastos são consumidos na biossíntese dos primeiros tilacoides. Aproximadamente após um dia de iluminação, os etioplastos são totalmente convertidos em cloroplastos completamente funcionais com grana, estroma e tilacoides (Lichtenthaler 2013). O cloroplasto é uma organela fotossintética muito estudada de células de algas e plantas (Reinert 1980; Hoober 1984). Alguns trabalhos sobre a ultraestrutura de cloroplastos foram realizados em Sorghum, Paspalum dilatatum Poir e Glycine max (L) (Taylor e Craig 1971); Hordeum vulgare L. (Cohen et al. 1979); Rapbanus sativus L. (Meier e Lichtenthaler 1981); Liquidambar styraciflua L. (Lee at al. 41

1985); Nicotiana tabacum L. (Rensburg et al. 1993); Arabidopsis (Dörmann et al. 1995); Arachnis hookeriana Rchb. f. e Ascocenda Madame Kenny (Gouk et al. 1999); Gardenia jasminoides Ellis (Serret e Trillas 2000); Oryza sativa L. (Yamane et al. 2004); Tabaco (Polanská et al. 2007); Stevia rebaudiana Bertoni (Ladygin et al. 2008); Tomate cereja (XiaoYing et al. 2011); Hypericum perforatum L. (Stoyanova- Koleva et al. 2013); Milho (Li et al. 2013); Glechoma longituba (Zhang et al. 2015); Hypericum sp. (Stefanova et al. 2015). Cloroplastos diferem muito entre espécies de plantas, mas são relativamente uniformes no mesmo tecido (Li et al. 2013). O cloroplasto é uma organela instável, e pode se adaptar conforme as condições ambientais (Deng e Xiaoyang 2006). Estudos histológicos demonstram que os órgãos vegetativos de plantas desenvolvidas in vitro apresentam tecidos e estruturas pouco diferenciadas, se comparados às plantas cultivadas em casa de vegetação (Sutter e Langhans 1982; Louro et al. 2003; Arigita et al. 2005). A caracterização estrutural nas diferentes fases do desenvolvimento das culturas in vitro é determinante para o entendimento das rotas da morfogênese (Dal Vesco et al. 2011). A morfo-histogênese contribui com o entendimento dos sistemas de micropropagação, o estudo morfo-histológico permite analisar alterações estruturais e ultraestruturais que estão ocorrendo nos explantes e desta forma fornecem informações adicionais sobre o processo celular que está ocorrendo nas culturas (Yeung 1999). Os estudos histológicos são fundamentais para confirmar a rota morfogênica estabelecida e determinar os tipos celulares aos quais derivam os embriões somáticos ou brotos regenerados (Fermino Junior et al. 2009; Maciel et al. 2010). Durante o cultivo in vitro, as plantas crescem sob condições especiais de redução das trocas gasosas, alta umidade do ar, baixa intensidade luminosa e uso de açúcar como fonte de energia (Sciutti e Morini 1993; Pospísilová et al. 1999). Estas condições podem causar inibição da fotossíntese, estômatos anormais, maior acúmulo de reservas ou biomassa, dificultando a micropropagação e a aclimatização, proporcionando perdas elevadas de plantas na transferência para as condições ex vitro (Sciutti e Morini 1993; Pospísilová et al. 1999). O crescimento dos explantes depende da composição de nutrientes do meio de cultura e, é afetado pela composição gasosa da atmosfera no interior do recipiente de cultivo in vitro (Zobayed et al. 2008) e pela intensidade de luz (Ibaraki e Nozaki 2005). 42

Nas salas de crescimento são utilizadas lâmpadas fluorescentes (Bula et al. 1991). A luz fotossinteticamente ativa fornecida na sala de cultura afeta o desenvolvimento das plantas, principalmente por meio de alterações fotomorfogênicas, que são observadas, principalmente, na formação dos tecidos do mesofilo e na ineficiência do mecanismo de abertura e fechamento dos estômatos, afetando sua funcionalidade (Rezende et al. 2008). A luz é importante para a realização da fotossíntese pelas plantas e o seu controle tem influência direta na formação de brotações, na germinação de sementes, no crescimento e na multiplicação dos explantes durante a propagação in vitro. Três fatores devem ser levados em consideração no que diz respeito à iluminação do ambiente de cultivo: a irradiância, o fotoperíodo e a qualidade da luz (Hartmann et al. 2011). A qualidade espectral afeta também estruturalmente a anatomia das folhas, parecendo exercer maiores efeitos durante a expansão foliar, exibindo elevado potencial de plasticidade tanto anatômico quanto fisiológico (Sims e Pearcy 1992; Saebo et al. 1995; Schuerger et al. 1997; Dousseau et al. 2008). A qualidade da luz influencia a germinação, a biossíntese de pigmentos, o enverdecimento, a inibição de alongamento do hipocótilo, a expansão dos cotilédones e das folhas, o alongamento do caule e a indução ao florescimento em plantas propagadas convencionalmente (Saitou et al. 2004; Tsegay et al. 2005; Taiz e Zeiger 2013). Baseado em análises citológicas independentes realizadas por Schimper e Meyer na década de 1880. A formação de cloroplastos é iniciada a partir de proplastídios, um tipo de plastídio indiferenciado que é presente no meristema apical. Respondendo a luz, proplastídios desenvolvem grana, que são pilhas de membranas tilacoides, onde ocorre a transferência de elétrons é formada a síntese de ATP. Os cloroplastos não são organelas apenas para fotossíntese, mas também são responsáveis pelo armazenamento de amido e óleo, e para a síntese de aminoácidos, lipídios e fitohormônios (Sakamoto et al. 2008). O fitohormônio citocinina desempenha um papel importante na regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas (Mok e Mok 2001; Argueso et al. 2009). Os cloroplastos estão entre os principais alvos da ação da citocinina na célula vegetal. Citocininas participam no controle da biogênese do cloroplasto (Stetler e Laetsch 1965; Kusnetsov et al. 1994; Zavaleta-Mancera et al. 1999a), ativam a diferenciação de cloroplasto a partir de proplastídios (Khokhlova 1977; Longo et al. 43

1979), estimulam a proteína do cloroplasto e a biossíntese de pigmentos (Parthier 1979; Kusnetsov et al. 1994; Zavaleta-Mancera et al. 1999b), e ativam a expressão nuclear (Abdelghani et al. 1991; Kusnetsov et al. 1994; Chory et al. 1994).

2.9 Fotossíntese e autofluorescência do Cloroplasto A fotossíntese ocorre no cloroplasto, e nesta organela se encontra um sistema de membranas, os tilacoides, onde se ancoram os pigmentos fotossintetizantes, como a clorofila a (Larcher 2004). Na primeira fase da fotossíntese, nas reações dependentes de luz, a clorofila é excitada no centro de reação do fotossistema, que leva à perda de um elétron, o qual é utilizado para a redução do NADP+. Para a nova redução da clorofila é necessário um elétron, e este está disponível após a fotólise da água. Com a fotólise da água além de um próton (H+) também é produzido oxigênio molecular. Os prótons então se concentram no interior dos tilacoides e, desta forma, é formado um gradiente de prótons transmembrana. E esse gradiente eletroquímico permite a síntese de ATPs (Larcher 2004; Falkowsky e Raven 2007; Alberts et al. 2010). Apenas uma parte da energia luminosa que incide sobre os cloroplastos é absorvida e aproveitada no processo fotoquímico (fotossintético), o restante sendo convertido em radiação fluorescente e calor (Larcher 2004) (Fig. 2).

Figura 2 - Esquema da transformação da energia luminosa (fóton) em energia química (ATP) nas membranas tilacoides no cloroplasto. Adaptado a partir de: http://www.ears.nl/ppm/user_files/Measuring%20fluorescence%20and%20p hotosynthesis%20v2.pdf Acesso em: 26 de fevereiro de 2017 44

As membranas dos tilacoides contêm grandes quantidades do pigmento clorofila, os quais auto-fluorescem nos comprimentos de onda laranja e vermelho (Govindjee 1995). Estes pigmentos estão organizados em complexos proteína pigmento, os chamados fotossistemas. Os fotossistemas convertem a energia capturada da luz principalmente em corrente elétrica (Anderson e Anderson 1980). A clorofila a fluoresce fortemente no vermelho, quando excitado pela luz azul e verde, porém o pico de excitação corresponde ao intervalo de 440nm a 490 nm (luz azul) (Amos et al. 1987; Lichtenthaler e Babani 2000). A maior parte do conhecimento acerca da morfologia e estrutura dos cloroplastos descreve estas organelas a partir de micrografias de microscopia eletrônica de transmissão, e para isso os cloroplastos são fixados e contrastados. Entretanto, o uso do microscópio confocal, no entanto, permite imagens detalhadas de cloroplastos intactos dentro de células vivas (Hepler e Gunning 1998; Konishi et al. 2009), o que torna essa ferramenta fundamental para compreender a real forma dos cloroplastos. A avaliação da autofluorescência da clorofila é um dos métodos utilizados capaz de mensurar as atividades fotossintéticas de plantas, porque essa informação é obtida sem a necessidade de destruição de tecido vivo (Omasa et al. 1987; Lichtenthaler e Miehe 1997; Chaerle et al. 2007; Omasa et al. 2009). Além disso, o espectro de emissão de fluorescência indica a composição do fotossistema e são influenciadas pelo teor de clorofila por área foliar (Omasa et al. 2009).

2.10 Microscopia como ferramenta de análise no cultivo in vitro Além das aplicações clássicas em micropropagação destinadas à conservação de espécies ameaçadas de extinção e genótipos comerciais, células vegetais, tecidos e culturas de órgãos, tornaram-se uma plataforma para elucidar uma miríade de fundamentos fisiológicos e desenvolvimento de processos. Conjuntamente com técnicas microscópicas, a tecnologia do cultivo in vitro tem estado no centro de importantes avanços no crescimento e desenvolvimento das plantas. Aplicações de microscopia e cultura de tecidos vegetais incluíram elucidação de processos de crescimento e desenvolvimento, detecção de desordens fisiológicas induzidas in vitro, bem como localização subcelular utilizando sondas fluorescentes de proteínas. Microscopia de luz e eletrônica têm sido amplamente utilizadas na 45 confirmação da bipolaridade de embriões somáticos durante a embriogênese somática. A técnica destaca anatomia básica, evidências estruturais e histológicas de desordens fisiológicas induzidas in vitro durante o crescimento e desenvolvimento das plantas (Moyo et al. 2015). O conceito e a descoberta da microscopia datam de aproximadamente quatro séculos. Basicamente, a microscopia envolve o uso de microscópios para ampliar amostras ou objetos que originalmente estão além da resolução do olho humano (Shur e Price 2012; Thomasson e Macnaughtan 2013). Como uma indicação da grande importância e valor da microscopia, continua a ser uma ferramenta popular e vital, com uma vasta gama de aplicações em ciências básicas e aplicadas (Tranfield e Walker 2013; Zumbusch et al. 2013; El-Bakry e Sheehan 2014; Whited e Park 2014) bem como nos campos de engenharia médica e de materiais (Torrealba e Carrasco 2004; Shur e Price 2012; De Boer et al. 2013; Juszczyk et al. 2013). Estas publicações acima mencionadas também fornecem excelentes revisões de tendências e atualizações relacionadas com as especificidades e significados da microscopia nestes vários campos (Moyo et al. 2015). Além disso, detalhes sobre a teoria e prática de microscopia específica baseado em tecnologias e protocolos de preparação de espécimes são bem documentados (Chalfie e Kain 2005; Kuo 2007; Chandler e Roberson 2009; Murphy e Davidson 2013). Na ciência vegetal, a microscopia é usada para resolver e compreender vários aspectos do crescimento e os processos de desenvolvimento, incluindo propriedades funcionais e estruturais. Ela também fornece insights sobre interações de células e componentes subcelulares em plantas (Chandler e Roberson 2009; Domozych 2012). Ciência vegetal é um campo que engloba diversos aspectos do crescimento das plantas, desenvolvimento, ecologia, entre outros. Com um dos principais focos na propagação eficiente e melhorias nas instalações em termos de qualidade e quantidade, a biotecnologia vegetal continua a ser um dos campos fundamentais na ciência vegetal (Vasil 2008). Até certo ponto, a biotecnologia vegetal foi estabelecida com base nos princípios da totipotência celular e transformação genética. Inevitavelmente, o uso de técnicas básicas de cultivo in vitro é essencial e vital para o sucesso de várias biotecnologias vegetais (Moyo et al. 2015). Particularmente, sob uma perspectiva de conservação, o valor e o benefício dos sistemas de cultura de tecidos in vitro (micropropagação) 46 estão bem documentados (George 1993; Ramachandra Rao e Ravishankar 2002; Pence 2010). Os avanços tecnológicos recentes estão expandindo a capacidade das microscopias, que estão sendo usadas para entender e explicar as aparências morfológicas comumente observadas dos regenerantes obtidos in vitro. Assim, juntamente com a bioquímica, histologia e abordagens moleculares, as diversas tecnologias baseadas em microscopia podem melhorar o entendimento dos sistemas da cultura de plantas in vitro (Moyo et al. 2015). Além disso, os distúrbios fisiológicos em regenerantes muitas vezes são melhor elucidadas com o uso da microscopia (Chakrabarty et al. 2006; Jausoro et al. 2010a; Bairu et al. 2011). Baseado em evidências de sua crescente aplicação (Jahn et al. 2012; Picas et al. 2012; Thomasson e Macnaughtan 2013; Zumbusch et al. 2013; El-Bakry e Sheehan 2014; Whited e Park 2014), não há dúvida de que a microscopia é mais valiosa do que nunca e permanecerá relevante em todos as áreas de pesquisa em ciência vegetal. Num futuro próximo, a microscopia alcançará finalmente o objetivo de resolver características tridimensionais (3-D) estruturais e funcionais da vida celular (imagens de quatro dimensões ou 4-DI) (Domozych 2012). Apesar do potencial e dos avanços associados às técnicas microscópicas de pesquisa biológica, ainda existem algumas limitações inerentes. As duas principais verificações são: (1) microscopia de luz e microscopia de varredura a laser confocal (MVLC) usada em eventos nas células vivas são intrinsicamente limitados em resolução; (2) microscopia eletrônica que possui melhor resolução não pode ser usada para visualizar células vivas (Domozych 2012). Embora a microscopia de varredura exista como uma técnica diferente, óptica (luz) e microscopia eletrônica são os mais comumente utilizados em sistemas de cultura in vitro (Moyo et al. 2015). As técnicas convencionais de microscopia de luz são campo claro, polarizado e microscopia de luz de fluorescência, enquanto que a microscopia eletrônica inclui a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (MET) (Chandler e Roberson 2009, Domozych 2012). Além de outras diferenças básicas, como a preparação da amostra, a microscopia eletrônica tem uma resolução muito maior ≈ 0.1 a 5 nm do que a microscopia de luz com uma resolução de 0.2 mm (El- Bakry e Sheehan 2014). Embora a freqüência de aplicação possa ser diferente, são quatro métodos básicos utilizados para a micropropagação são proliferação axilar, cultura de nódulos, formação de brotos através 47 de organogênese e embriogênese somática (Kane 2005). Os detalhes destes procedimentos não estão no âmbito desta revisão, mas foram bem documentados nos trabalhos de Zimmerman (1993); Kane (2005) e Rout et al. (2006). Não há dúvida de que grande parte da evidência disponível e as teorias dos processos de desenvolvimento in vitro, foram obtidos através de abordagens histológicas utilizando as técnicas microscópicas (Trigiano et al. 2005). Embora grandes avanços foram registrados nos últimos tempos (Motte et al. 2014), são necessários estudos mais rigorosos para compreender os complexos eventos envolvidos no crescimento e desenvolvimento das plantas in vitro. Com a capacidade de gerar estruturas microscópicas e características celulares através das fases de iniciação, montagem e arranjo, pesquisadores adquiriram conhecimentos aprofundados devido à manipulação do crescimento de plantas utilizando as técnicas da cultura in vitro (Moyo et al. 2015). Técnicas de microscopia de luz e eletrônica tornaram-se componentes integrais no estudo de espécies vegetais. Os processos de crescimento e desenvolvimento das plantas são características dinâmicas, enquanto as técnicas histológicas, apenas um breve e momentâneo vislumbre do processo (Trigiano et al. 2005). Não obstante, reunindo uma série de observações microscópicas estáticas, biólogos são capazes de elucidar as alterações anatômicas envolvidos no desenvolvimento das plantas (Moyo et al. 2015). Técnicas microscópicas têm sido altamente valiosas para caracterizar a não-bipolaridade de estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) (Mayer et al. 2010; Huang e Chung 2011), estruturas globulares embrionárias (Woo e Wetzstein 2008; Sharifi et al. 2010) e meristemóides nodulares (Moyo et al. 2009; Rosa e Dornelas 2012), o que teria sido confundido com embriões somáticos. Assim, as técnicas de microscopia têm sido inestimáveis para confirmar e verificar a identidade bipolar de embriões somáticos ou sua ausência em estruturas embrionárias durante a organogênese (Moyo et al. 2015). Essas e outras descobertas semelhantes provem conhecimento e percepções críticas que permitem uma melhor compreensão dos processos organogênicos in vitro (Moyo et al. 2015). Além disso, a microscopia de luz e eletrônica contribuiu imensamente na avaliação dos efeitos de vários fatores fisiológicos nos processos de desenvolvimento celular (Moyo et al. 2015). Nakagawa et al. (2011) demonstraram que a distribuição de grãos de amido durante a ES foi induzida pela aplicação exógena de poliaminas. Além disso, espermina 48 tratada em plantas de Triticum aestivum apresentaram cloroplastos menores quando comparados com tratamentos de putrescina e espermidina, sugerindo que a resposta dependia do tipo de poliaminas (Redha e Suleman 2011). MET fornece detalhes ultraestruturais de células, quando as plantas são expostas a diferentes estímulos e condições fisiológicas. O escopo para elucidar padrões de desenvolvimento ultraestrutural decorrentes de estímulos permanece ilimitado. Apesar dos benefícios da micropropagação, o processo é muitas vezes envolvido por uma série de desafios induzidos in vitro, que podem ser de natureza anatômica, fisiológica e bioquímica (Kaeppler et al. 2000; Hazarika 2006; Bairu et al. 2011; Neelakandan e Wang 2012; Ruffoni e Savona 2013). O sucesso da cultura de tecidos vegetais, especialmente em grande escala, depende erradicar ou aliviar alguns desafios (Kozai et al. 1997; Hazarika 2006; Bairu e Kane 2011). Problemas recorrentes como a necrose dos brotos (Bairu et al. 2009), hiperidricidade (Ziv 1991; Rojas-Martınez et al. 2010), epigenética (Kaeppler et al. 2000; Smulders e de Klerk 2011) e variações somaclonais (Larkin e Scowcroft 1981; Bairu et al. 2011). A aplicação da microscopia pode auxiliar na compreensão destes desafios, assim como outras abordagens, como as ferramentas bioquímicas e moleculares podem fornecer evidencias para a elucidação global dos problemas (Moyo et al. 2015). Quando usado em conjunto com células vegetais, técnicas de cultura de tecidos e órgãos, as aplicações microscópicas têm fornecido uma visão crítica sobre a dinâmica do crescimento e desenvolvimento vegetal. A cultura de plantas in vitro proporciona um ambiente que pode ser precisamente controlado e modificado para atingir condições experimentais específicas. Assim, a aplicação de sondas fluorescentes em sistemas de cultura de tecidos vegetais tem elucidado o desenvolvimento e mecanismos moleculares envolvidos nos processos morfogênicos das plantas (Moyo et al. 2015). A descoberta e o avanço das tecnologias microscópicas provem aos pesquisadores uma ampla variedade de técnicas para explorar estruturas celulares, ampliando nosso conhecimento sobre o crescimento e o desenvolvimento vegetal. Em particular, a imagem ao vivo das possibilidades oferecidas pela microscopia confocal e sondas fluorescentes de proteínas (GFP e seus derivados) têm avançado os limites na pesquisa da morfogênese das plantas e expandiu as possibilidades do que pode ser alcançado futuramente com a melhora no poder de resolução da microscopia de luz (Moyo et al. 2015). 49

No futuro, os avanços das tecnologias microscópicas terão o potencial de desvendar os mistérios biológicos fundamentais das células vegetais e, portanto, fornecerem profundos insights sobre o desenvolvimento vegetal (Moyo et al. 2015).

2.11 Pigmentos fotossintéticos As clorofilas são os pigmentos naturais mais abundantes nas plantas, comuns em todas as células fotossintéticas (Streit et al. 2005). Os pigmentos envolvidos na fotossíntese são as clorofilas a e b, os carotenoides e as ficobilinas. A clorofila a é o pigmento utilizado na fase fotoquímica, enquanto os demais constituem os chamados pigmentos acessórios (Kluge 2005, Taiz e Zeiger 2013). Conforme o pigmento, diferente é a faixa espectral absorvida para desencadear o processo fotossintético. A clorofila a tem absorção máxima na faixa do azul e vermelho (400 a 700 nm), onde se localiza o espectro de ação para a fotossíntese. Os pigmentos acessórios, como os carotenoides, absorvem na faixa do azul e ultravioleta. A combinação das clorofilas (a e b) e dos pigmentos acessórios capacita as plantas a captarem a maior parte de energia luminosa (Lichtenthaler e Babani 2004; Taiz e Zeiger 2013), sendo esta absorção um dos fatores ligados à eficiência fotossintética das plantas, ao crescimento e à adaptabilidade a diversos ambientes (Valadares e Pearcy 2000; Lin e Hsu 2004; Ali et al. 2005; Bo e Qing 2008). Hiscox & Israelstam (1979) sugeriram que o DMSO é um método superior ao da acetona na extração de clorofila a e b em algas verdes e para extração de pigmentos de plantas superiores. O DMSO possui elevada capacidade de difusão através de membranas semipermeáveis, pois é altamente higroscópico e miscível em água em todas as proporções, sendo reconhecido também por sua eficácia como carreador de proteínas (Ronen e Galun 1984), o que proporciona agilidade no processo. O aumento do sombreamento pode provocar alterações, em nível de folha, como por exemplo, na relação dos complexos fotossintéticos, e consequente redução na razão de clorofila a/b (Lichtenthaler e Babani 2004; Lichtenthaler 2007). A diminuição da razão clorofila a/b pode ser considerada como uma adaptação cromática para ajudar no balanço da absorção de luz entre os PSI e PSII. A menor razão entre clorofila a/b, em folhas submetidas à baixa irradiância, deve-se a maior quantidade de membranas tilacoides (Larcher 2004). Assim, a mudança na razão clorofila a/b pode ser uma 50 indicação da variação do tamanho da unidade fotossintética. O aumento paralelo do teor de clorofila total e a diminuição na razão clorofila a/b, indicam um aumento do tamanho da unidade fotossintética, em consequência do maior desenvolvimento das antenas coletoras de luz dos PSII e PSI (Strasser et al. 2000; Strasser et al. 2004). A eficiência de absorção de luz pela folha depende do teor de clorofila por unidade de área, pois quanto maior o teor de clorofila maior será a proporção de luz incidente absorvida (Strasser et al. 2004; Stirbet e Govindjee 2011). Uma maior proporção relativa de clorofila b em plantas sombreadas é uma característica importante, pois possibilita a captação de energia de outros comprimentos de onda e transferência para uma molécula específica de clorofila a, que efetivamente toma parte das reações fotoquímicas da fotossíntese (Taiz e Zeiger 2013). A proporção de luz incidente que é refletida é maior quando a concentração de pigmentos na folha é baixa, porque a luz refletida de uma camada mais interna terá uma menor chance de ser recapturada no seu caminho de volta à superfície. Entretanto, quanto menor a concentração de clorofila na folha, maior será o aumento relativo da absorção de luz devido a um aumento nesta concentração inicial (Lichtenthaler e Babani 2004). Segundo Araújo e Demicinis (2009), a molécula de clorofila é constantemente sintetizada e destruída (foto-oxidação) em presença de luz, mas sob intensidades luminosas muito altas a velocidade de decomposição é maior, sendo o equilíbrio estabelecido a uma concentração mais baixa. Lichtenthaler e Babani (2004), salientam que as folhas de sombra apresentam maior concentração de clorofila (mg/g) do que folhas de sol. Porém, se o conteúdo for expresso por unidade de área foliar a concentração é menor nas folhas de sombra (Engel e Poggiani 1991). Além disso, folhas de sombra investem maior energia na produção de pigmentos fotossintetizantes, permitindo uma otimização na absorção da intensidade de luz incidente (Lichtenthaler 2007). A luz constitui um recurso natural indispensável às plantas (Murchie et al. 2005). A importância da energia solar para as plantas não se restringe apenas a sua fixação pela fotossíntese. Ela determina, também, o balanço energético nos ecossistemas. Para uma planta o balanço energético condiciona a sua temperatura e afeta processos fisiológicos como a transpiração, fotossíntese e respiração. Desta forma, a radiação solar pode atuar como: (1) desencadeador de fluxos de tecido, (2) de energia direcionada entre rendimentos quânticos fotoquímicos e emissão de fluorescência de clorofila a, (3) da emissão de energia livre 51 sob forma de calor, (4) da regulação fitocrômica pela expressão de desenvolvimento e de tropismos (Nobel 1991; Strasser et al. 2004). Estudos têm relatado alterações na ultraestrutura dos cloroplastos quando folhas são transferidas de baixa para alta irradiância (Prioul et al. 1980; Lichtenthaler et al. 1981; Sebaa et al. 1987) e, também movimentos dos tilacoides para uma condição desempilhada (Oukarroum et al. 2007; Yusuf et al. 2010; Zhang et al. 2010; Redillas et al. 2011) sob diferentes tipos de estresse. A capacidade fotossintética pode, também, ser determinado pela quantidade de Rubisco presente nos cloroplastos (Li et al. 2002; Van Heerden et al. 2007; Lin et al. 2009; Li et al. 2010). Oguchi et al. (2003) reforçam o fato que o aumento da capacidade fotossintética em condições de alta irradiância ser devido ao aumento da atividade da Rubisco ou da concentração de Rubisco nos cloroplastos. Consequentemente, existem estreitas correlações entre a capacidade fotossintética e a espessura foliar, entre a capacidade fotossintética e a superfície de área de células do mesofilo e entre a condutância interna de CO2 e a área de superfície de cloroplastos (Moreira et al. 2009). Folhas de orquídeas apresentam plasticidade fenotípica reconhecida, com maior espessamento de cutícula em ambientes com maior intesidade luminosa (Oliveira e Sajo 1999) e, desta forma, atributos biofísicos do fluxo de energia e bioquímicos da assimilação de CO2 podem ser ajustados de acordo com o estímulo externo do ambiente de luz. Orchidaceae apresenta diferentes estratégias de uso de energia fotoquímica em resposta ao ambiente, e neste contexto existe forte correlação com a anatomia foliar (Moreira et al. 2009). O gênero Cattleya apresenta grande diversidade em seus aspectos anatômicos foliares, que, no entanto, convergem para aspectos acentuadamente xeromorfos associados ao epifitismo (Zanenga-Godoy e Costa 2001) e a busca por condições ideais de luz por plantas epífitas em um ambiente notoriamente restritivo. Em seu ambiente natural, as plantas são expostas a intensidades de luz que flutuam consideravelmente ao longo do dia (Ali et al. 2005). Muitas das espécies de orquídeas tropicais são plantas de sombra (He et al. 1998) e, por isso, ocorrem em habitat sob baixas intensidades de luz (80 a 100 μmol m-2 s-1). Neste sentido, maior eficiência fotossintética é observada em orquídeas que vegetam sob baixas luminosidades. Por outro lado, altas irradiâncias reduzem a eficiência fotossintética das plantas, ocasionando a fotoinibição (Araújo e Demicinis 2009). Nestas condições, o aparato fotossintético torna-se ineficiente na absorção e uso 52 da energia de excitação, com acidificação do lúmen dos tilacoides, redução da atividade dos transportadores de elétrons fotossintéticos e acúmulo de energia de excitação, o que pode levar a danos oxidativos por meio do aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (Ali et al. 2005). A relação existente entre reações luminosas da fotoquímica da fotossíntese e a emissão de fluorescência da clorofila a pode ser investigada pela indução de cinética de elétrons nas unidades fotossintéticas em nível de ultra-estrutura de cloroplasto. A fotossíntese é, sem dúvida, o processo mais importante associado com a vida vegetal. Converte a energia da luz, em energia química, sustenta o crescimento das plantas. Nas plantas, ocorre a fotossíntese exclusivamente no cloroplasto, a organela derivada por endosimbiose de um parente das cianobactérias atuais. Isso foi Van Leeuwenhoek, na década de 1670, que primeiro descreveu cientificamente cloroplastos, como glóbulos verdes em Spirogyra (Wise e Hoober 2006). Ziv & Chen (2008), ao estabelecer uma comparação anatômica e histológica entre plantas de diversas espécies cultivadas in vitro e aclimatizadas ex vitro, destacam que os cloroplastos de culturas in vitro têm baixa clorofila, cloroplastos anormais não-funcionais e limitada formação de grana. Entretanto, aqueles formados nas plantas aclimatizadas mostram aumento do conteúdo de clorofila, cloroplastos normais e com típica estrutura de grana. Grout (1988) relata que existem dois tipos de plantas com relação à resposta fotossintética in vitro. Em um dos tipos, as folhas formadas in vitro nunca desenvolvem plenamente a capacidade fotossintética, e ao serem transferidas para casa de vegetação essas folhas servem como fonte de carbono para novas folhas e degeneram. Já o outro tipo de planta, seria aquela que possui folhas persistentes que se adaptam a condição ex vitro e vai aumentando a sua atividade fotossintética à medida que se adapta as condições ambientais naturais. O crescimento e a adaptação de plantas a diferentes condições ambientais relacionam-se a sua eficiência fotossintética que, por sua vez, está associada, entre outros fatores, tais como teores de clorofila foliar (Batagin 2008). Assim, a determinação do conteúdo de pigmentos foliares, como ressaltam Lambers et al. (1998), representa importante ferramenta para a distinção entre tratamentos ou interação entre plantas e fatores ambientais. 53

2.12 Carboidratos e amido Os açúcares solúveis totais (carboidratos) além do seu papel central no metabolismo também regulam muitos outros processos fisiológicos, pois atuam sobre um número significativo de genes (Gibson 2004). O amido desempenha a função exclusiva de reserva, sendo também o carboidrato mais comumente encontrado nas sementes (Amaral et al. 2001). No cultivo in vitro as plantas se desenvolvem em condições especiais, com a redução de trocas gasosas, alta umidade relativa do ar, baixa intensidade luminosa e a utilização de carboidratos presentes no meio de cultura como fonte de energia. Estes fatores podem causar a inibição da fotossíntese, presença de estômatos anormais, grande acumulação de reserva de biomassa, cutícula delgada, raízes frágeis, dificultando a aclimatização e causando perdas quando transferidas para uma condição ex vitro (Sciutti e Morini 1993; Pospíšilová et al. 1999). Os carboidratos são fontes de energia para células e fontes de carbono para processos biossintéticos (Zhang et al. 2012; Kubeš et al., 2014). Eles também atuam como agentes osmóticos, ajudando a manter a integridade da membrana plasmática, além de serem importantes moléculas de sinalização que modulam vários processos no desenvolvimento da planta (Paredes e Greyson, 1989, Tremblay e Tremblay, 1991, Kubešet, 2014, Lastdrager e Smeekens, 2014). A condução celular, a divisão e a expansão das redes moleculares funcionam em grande parte dependendo da disponibilidade de carboidratos para fornecer energia e biomassa (Lastdrager et al., 2013). Estudos durante a morfogênese in vitro em plantas revelam a dinâmica das alterações fisiológicas e bioquímicas, entre elas aquelas associadas ao metabolismo de carboidratos e proteínas ao longo dos processos organogênicos em Humulus lupulus (Fortes et al., 2008), Crocus sativus (Sharma et al., 2009) e Vanilla planifolia (Palama et al., 2010); durante o desenvolvimento da embriogênese somática em Musa spp. (Wang et al., 2013); Elaeis guineensis (Silva et al., 2014); Acca sellowiana (Cangahuala-Inocente et al., 2014) e Carica papaya (Vale et al., 2014); e durante a formação de ESPs em Cattleya tigrina (Almeida, 2014; De Conti, 2016) e na formação de culturas nodulares em Vriesea reitzii (Corredor-Prado, 2016). Nas plantas, os carboidratos desempenham inúmeras funções essenciais, sendo substratos para respiração e representando um importante papel na rota biosintética de diversos compostos (Calamar e 54

De Klerk, 2002). Também atuam como moléculas sinalizadoras, alterando a expressão gênica e influenciando nos processos de desenvolvimento e rotas metabólicas (Smeekens, 2000; Halford, 2010). Alguns dos efeitos sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas sugerem interação dos sinais dos açúcares com a regulação hormonal (Rolland et al., 2006). A transdução de sinais induzidos pelos açúcares controla a expressão de genes, através de diversos mecanismos, que incluem transcrição, tradução, modificação de mRNA e estabilidade de proteínas (Rolland et al., 2006). Segundo Millam (1994), os carboidratos apresentam uma interação significativa com as auxinas nas fases iniciais na cultura in vitro.

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3. CAPÍTULO I. Nuclear DNA content in in vitro morphogenesis of Cattleya tigrina A. Richard 3.1 Abstract

Cells from leaf explants of Cattleya tigrina are capable of forming Protocorm-like Bodies (PLBs) with differences in cell responsiveness according to location on the leaf blade. The aim of this study was to evaluate differences in DNA content in in vitro morphogenesis of C. tigrina using leaves obtained from plantlets generated from PLBs and leaves and roots obtained from seedlings generated from seeds. The culture medium was half-strength MS medium supplemented with sucrose, Morel vitamin and agar. For the induction of PLBs, soy peptone, sodium phosphate (NaH2PO4) and the plant growth regulator TDZ (9 µM) were added. The relative nuclear DNA content in cells from leaves, leaf bases and leaf tips, leaf explants, PLBs and root tips was evaluated. The DNA content of the leaves, leaf tips and leaf bases showed no differences. Also, leaf explants used for the induction of PLBs did not differ from PLB leaves regenerated after 180 days of cultivation. The DNA content of leaves and roots showed the formation of three peaks 2C, 4C and 8C. The formation and regeneration of PLBs of C. tigrina in a medium containing TDZ maintained a stable ploidy level stable compared to seedlings obtained from seed germination.

Additional key words: DNA C-value; Protocorm-like bodies PLBs; DNA content of orchids; flow cytometry; endopolyploidy.

Abbreviations: FC – flow cytometry; LM – light microscope; MS - Murashige and Skoog; PLB – protocorm like bodies; PGR - plant growth regulators; SM - stereoscope microscope; TDZ - Thidiazuron 3.2 Introduction Orchidaceae is the second largest family of flowering plants (Van den Berg et al. 2000, Dressler 2005, Official List of Brazilian Flora Species 2017) and represents approximately 7% of all flowering plant species on the planet (Altafin et al. 2003, Rech et al. 2011). However, due to their ornamental and landscape features, orchids are frequently removed from their natural habitats, leading some species to extinction and making it difficult to maintain their biodiversity (Swarts and Dixon 2009). Cattleya tigrina is an endemic orchid of the Atlantic Forest. It is found in the states of Rio Grande do Sul, São Paulo and the southern 94 portions of Bahia and Pernambuco (Official List of Brazilian Flora Species 2017). As with other orchids, it possesses features typical of traditional regenerative systems, when compared to response patterns of in vitro morphogenesis. Tissue culture has been successfully used for the propagation of different terrestrial and epiphytic orchid species (Díaz and Álvarez 2009). It allows rapid multiplication, which can facilitate the preservation and propagation of endangered species. Furthermore, tissue culture can be used as a model for studying metabolism and differentiation, by providing information on the physiological and biochemical events that lead to modulation during in vitro morphogenesis (Tran Thanh Van 1981). During in vitro establishment, a morphogenic response pattern termed protocorm-like bodies (PLBs) has been proposed for several orchid species (Arditti and Ernst 1993, Begum et al. 1994, Zhao et al. 2008, Arditti 2009), including Cattleya tigrina (Fritsche 2012). PLBs are globular structures so called because of their similarity to embryos (protocorms) of zygotic origin (Arditti and Ernst 1993, Arditti 2009). The induction of these structures has been reported using leaf-tips of Epidendrum (Churchill et al. 1973) and Dendrobium malones (Anjun et al. 2006); flower-stalk buds of Phalaenopsis and Doritaenopsis (Tokuhara and Mii 1993), and Phalaenopsis (Chai et al. 2002); root-tips of Catasetum pileatum (Kraus and Monteiro 1989), Catasetum fimbriatum (Colli and Kerbauy 1993); and foliar segments of Renanthera imschootiana (Seeni and Latha 1992), Dendrobium formosum (Nasiruddin et al. 2003), Aerides crispum (Sheelavanthmath et al. 2005), and Cattleya tigrina (Fritsche 2012). This morphogenic pathway has been studied in C. tigrina through morpho- and histodifferentiation (Liz 2013) and biochemical analyses (Almeida 2014, De Conti 2016), which have reported signaling events that promote and regulate the formation of PLBs. PLBs are composed of differentiated tissues (Sujjaritthurakarn and Kanchanapoom 2011) and are able to become pantlets when grown in a culture medium with a PGR (Ng and Saleh 2011). PLBs can proliferate rapidly and regenerate whole plants, and so are relevant objects for genetic transformation studies in orchids (Liau et al. 2003, Sreeramanan et al. 2008). In orchids, estimating nuclear DNA content can be a useful tool for understanding genomic diversity (Leitch et al. 2009). Therefore, it is essential to identify and propose a set of reliable methods for estimating 95 the C-value of orchids. Flow cytometry (FC) has been used to analyze genetic variation in micropropagated plants and has the ability to detect, early in morphogenesis, changes in the nuclear DNA content of cells, tissues or organs growing in vitro, including whole plants (Orbovic et al. 2008, Escobedo-GraciaMedrano et al. 2014). The DNA content of a haploid or gametic nucleus of an organism is called the DNA C-value (Bennett et al. 2008), whereas a nucleus in the G1 phase of the cell cycle containing two copies of the non-replicated genome has a DNA 2C value (Doležel and Bartoš 2005). The present study aims to use flow cytometry to test for differences in DNA content between leaves, leaf bases and leaf tips of C. tigrina, and estimate the DNA C-value during morphogenesis of PLBs, and in leaves and root tips from in vitro seed germination.

3.3 Materials and methods

3.3.1 Plant material and in vitro cultivation Seedlings of Cattleya tigrina A. Rich. were obtained by asymbiotic seed germination without plant growth regulator in half- strength Murashige and Skoog (1962) medium, with Morel vitamins (Morel and Wetmore 1951), sucrose (30 g dm-3), activated charcoal (1.5 g dm-3) and agar (7 g dm-3) for solidification. The cultures were incubated at a temperature of 25 ± 2 °C, with a 16-h photoperiod and irradiance of 50 - 60 µmol m-2 s-1. Plantlets were subcultured every 60 d. Leaves (± 1 cm) of C. tigrina extracted from in vitro plantlets were inoculated into a culture medium with half-strength MS supplemented with 9 μM of TDZ and Morel vitamins (Morel and -3 -3 Wetmore 1951), soy peptone (1 g dm ), NaH2PO4 (170 mg dm ), sucrose (20 g dm-3) and Phytagel (2 g dm-3) for solidification, to obtain PLBs (Chen and Chang 2006), adapted by Fritsche (2012). The cultures were incubated in BOD a temperature of 25 ± 2 °C, under a 16-h photoperiod and irradiance of 50-60 µmol m-2 s-1.

3.3.2 Morphological and histological analyses Representative samples of the cultures formed from PLBs were observed under a Leica EZ4 HD stereoscope microscope (SM) using an image capture system and the software LAS EZ 2.0, to record the most relevant morphological events at 0 (control), 7, 30, 60, 120 and 180 days of cultivation. 96

Samples were collected after 7, 30, 60, 120 and 180 d and fixed in 2.5 % (m/v) glutaraldehyde in a 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.2), and dehydrated in an ethanol series (Karnovsky 1965). For light microscope (LM) analysis the samples were infiltrated with hydroxyethyl methacrylate (Leica Historesin, Heidelberg, Germany) (Gerrits and Smid 1983), sectioned with a Slee Cut 4055 rotation microtome (Mainz, Germany) and stained with toluidine blue (O'Brien et al. 1964). After preparation, the sections were observed using an Olympus BX40 light microscope (LM). The relevant events were recorded using an attached DP71 digital camera and the software Image Q Capture Pro 5.1 (QImaging Corporation, Austin, TX, USA).

3.3.3 Increase in fresh mass and oxidation Increase in fresh mass of PLBs and oxidation percentage were measured and recorded at 7, 30, 60, 120 and 180 d of cultivation. The data were calculated using the following equations: 1. Increase in fresh mass = final fresh mass of PLB - initial fresh mass of PLB 2. Percentage of oxidized explants = number of oxidized explants x 100 / total number of cultured explants

3.3.4 Preparation and extraction of samples for estimating DNA content by FC Leaves, leaf tips and leaf bases were analyzed at 0 and 30 d of cultivation. Leaf explants and PLBs were analyzed at 0, 7, 30, 60, 120 and 180 d of cultivation. Leaves and root apices of C. tigrina maintained in vitro, without the addition of plant growth regulators (PGR), were also analyzed by flow cytometry to estimate the DNA content. Approximately 100-150 mg of leaf explants, PLBs, leaves and roots, and leaves of the standard external reference (i.e., pea, Pisum sativum) were used to prepare samples. To obtain the nuclei suspension, these tissues were crushed in petri dishes containing 1 mL of cold Marie extraction buffer (Marie and Brown 1993). After the extraction process, the suspended nuclei were aspirated with a Pasteur pipet and filtered with a 42 µm mesh (Millipore). The nuclei suspension was stained with 25 µL of 1 mg l-1 propidium iodide solution. Histograms were obtained in a BD Accuri C6 cytometer (BD Biosciences, California, USA) using the BD Accuri Cflow Plus software. DNA contents, in picograms (pg), were obtained by the equation: DNA content (pg) = (position of the G1 peak of the sample/position of the G1 97 peak of the reference) × reference DNA (Doležel et al. 2007). Twelve replicates for each sample were performed using the flow cytometer. The data obtained in this study were analyzed by statistical software Sisvar (Ferreira 2011). Means were compared by Tukey test at 5% probability. All cytometric analyses were performed at the Tissue Culture Laboratory II - LCTII Embrapa Genetic Resources and Biotechnology in Brasília, Federal District.

3.4 Results 3.4.1 Development of Protocorm-like Bodies (PLBs), increase in fresh mass and oxidation of explants Morphological and histological observations showed that the leaf base region is the most responsive to the formation of PLBs in Cattleya tigrina (Fig. 1). The leaf of C. tigrina exhibited evidence of PLB development at 7 d of culture (Fig. 1B). In foliar explants at 60 and 120 d of culture, proliferation of PLBs was observed at the leaf base and some in the initial PLBs (Figs. 1D and 1E), while undergoing oxidation. At 180 d of cultivation, leaf primordia were observed (Fig. 1F). An increase in fresh mass occurred with the proliferation of PLBs at the leaf base (Figs. 1 and 2A). PLBs exhibited a gradual increase in the oxidation of explants to the extent that they are subjected to in vitro culture for a longer period of time (Fig. 2B). During histodifferentiation, epidermal cells with periclinal and anticlinal divisions were observed (Fig.1H). At 30 d, cells with meristematic features are present characterized by conspicuous nuclei and few intercellular spaces in the leaf mesophyll (Fig.1I). PLBs, at 120 d, exhibited organization of the stem apical meristem (Fig.1K). PLBs apices with leaf primordia already developed and the formation of provascular tissue were observed a t 180 d (Fig.1L). Explants in the culture medium exhibited oxidation over time (Figs.1C, 1D, 1E, 2B), which influenced the quality of the peaks observed by FC.

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Figure 1 - Protocorm-like bodies (PLBs) formed between 7 and 180 d after inoculation in Cattleya tigrina. A-F. Stereoscopic microscopy images. G-L. Light microscopy images. A. Overview of the leaf (control), absence of PLBs at the leaf base (arrow). B. Leaf explant at 7 d with some PLBs (arrows). C and D. PLBs (arrow) at the leaf base at 30 and 60 d after cultivation. E. At 120 d, more PLBs at the leaf base (arrow). F. At 180 d PLBs at the regeneration phase. G. Cross section of the leaf (control), epidermis (arrows), leaf mesophyll (M), nuclei (N) and vascular bundle (Vb). H. Cross section of leaf explant at 7 d of culture, cells with mitotic activity (arrows and arrowheads). I. PLB at 30 d of cultivation, PLB with a peripheral layer of meristematic cells (arrow) and nuclei (N) of mesophyll cells. J. PLB with meristematic cells in the protoderm (arrows). K. At 120 d, PLB groupings, some with stem apex (arrow). L. Longitudinal section of PLBs and provascular tissues (arrowheads). Bars: A, B, C, D, E and F: 2 mm; H, I, K and L: 200 µm; G and J: 50 µm.

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Figure 2 - Fresh mass increase (A) and percentage of leaf explants oxidized (B) in protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina at different in vitro culture times after inoculation. (n = 10).

3.4.2 DNA content of leaves, leaf tips and leaf bases of Cattleya tigrina by FC Leaves, leaf tips and leaf bases did not differ in DNA content when analyzed at 0 (control) and 30 d (Table 1); however, they did differ significantly (p<0.05) when compared between different times (0 and 30 d). An average increase in the content of DNA (2C) of approximately 17.3% was observed in tissues between 0 d and 30 d. 101

Table 1. Relative DNA content (pg) of leaves, leaf tips and leaf bases of Cattleya tigrina at 0 (control) and 30 d of cultivation. Means ± SDs, n = 20. Means followed by the same letters do not differ significantly by Tukey test at 5% probability. (P <0.05).

Parameters Time 2C Value (pg) CV (%)

Leaves 0 (control) 4.99 a1 3.73

Leaf tips 0 (control) 5.04 a1 3.86

Leaf bases 0 (control) 5.06 a1 4.13

Leaves 30 d 5.84 a2 6.11

Leaf tips 30 d 5.72 a2 3.89

Leaf bases 30 d 6.14 a2 5.82

*Calculation from the peak G0/G1 average of C. tigrina compared to the standard external reference Pisum sativum.

3.4.3 Estimation of DNA content during the development of PLBs Analysis by flow cytometry resulted in DNA content histograms with distinct peaks representing leaf explants and PLBs and of Cattleya tigrina (Fig. 3). The DNA 2C value estimated for the leaf base of C. tigrina was 5.06 pg. Three peaks (2C, 4C and 8C) were observed in somatic tissues of this species. This is a common pattern for all the tissues analyzed (leaf explants, PLBs, leaves and root tips) (Table 2).

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Figure 3 - Histograms of relative fluorescence intensity (linear scale) obtained after the analysis of propidium iodide-stained nuclei isolated from Cattleya tigrina PLBs at different stages of development. Leaf base used as control (A), leaf base with PLBs at 7 d of cultivation (B), PLBs at 30 d of cultivation (C), PLBs at 60 d of cultivation (D), PLBs at 120 d of cultivation (E), Leaves of PLBs at 180 d of cultivation (F). The peak 1 of the histograms correspond to a 2C content, the peak 2 corresponds to 4C and the peak 3 corresponds to 8C.

The DNA content of 2C peaks did not differ statistically among PLBs of C. tigrina and they exhibited an effective increase in DNA content during the cultivation of PLBs (Table 2). After 30-120 d, the contents observed for DNA 2C peaks were on average approximately 9.8% higher than the value observed for the control (Table 2). Additionally, at 120 d of cultivation, PLBs exhibited variable relative contents of 2C, 4C and 8C nuclei when compared with other times; at this time 4C nuclei were proportionally predominant, while at all other times 2C predominated.

Table 2. Relative DNA content (pg) of protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina at different in vitro culture times. Means ± SDs, n = 20. Different letters in columns indicate significant differences between the means by Tukey’s test (P < 0.05).

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Development of PLBs (days) Quantity of DNA (picograms) 2C 4C 8C CV (%) Control (0) 5.06 b 10.09 c 20.35 c 3.53 7 5.56 a 11.04 ab 22.05 a 5.05 30 5.49 a 10.80 b 21.29 ab 4.51 60 5.49 a 10.73 b 21.17 ac 4.73 120 5.68 a 11.31 a 22.04 a 4.93 180 5.11 b 10.28 c 20.49 bc 4.10 * Calculation from the peak G0/G1 average of C. tigrina compared to the standard external reference Pisum sativum. Means followed by the same letters do not differ significantly by Tukey test at 5% probability.

3.3.4 Estimation of DNA content in leaves and root tips of Cattleya tigrina obtained by in vitro germination of seeds The flow cytometric analysis of leaves and root tips, without PGR, resulted in three peaks (Fig. 4) related to DNA content, a pattern similar to that observed for most of the analyzed PLBs, in which three peaks (2C, 4C and 8C) were observed in the somatic tissues.

Figure 4 - Histograms of relative fluorescence intensity (linear scale) obtained after the analysis of propidium iodide-stained nuclei isolated from leaf (A) and root tip of Cattleya tigrina cultivated in vitro without plant growth regulators. The peak 1 of the histograms correspond to a 2C content, the peak 2 corresponds to 4C and the peak 3 corresponds to 8C.

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3.5 Discussion Leaf explants of C. tigrina used for the development of PLBs showed that the leaf base is the region with the greatest activity of PLB morphogenic differentiation. Leaf bases can respond to the embryogenesis and/or organogenesis processes better than the median and apical regions of the leaf, as it is closer to the axillary meristem and may contain meristematic regions and newly formed tissues with significant metabolic activity (Firoozabady and Moy 2004). In this study, an increase in fresh mass occurred with the proliferation of PLBs at the leaf base. The onset of cell differentiation and the formation of PLB tissues of C. tigrina began after 7 d of culture. The histodifferentiation of leaf bases, forming lumps, began from the epidermal cells of the leaf. The higher volume of PLBs was determined by the proliferation of cells of the corpus and the secondary formation of new PLBs was formed from the tunica cells of the initial PLB (Liz 2013). Most PLBs are able to proliferate to produce secondary PLBs originated from cells interior or exterior to the embryogenic callus (Zhao et al. 2008). Due to cultivation time and the process of plant excision, the leaf explants of C. tigrina showed a gradual increase in oxidation to the extent that they became subjected to in vitro cultivation for a longer period of time. The development of PLBs was observed through analyses of morpho- and histodifferentiation. During this process, there was progressive oxidation of explants, probably due to the release of phenolic compounds by damaged tissues resulting from the excision of the explants. The tissue browning process, which results from the reaction of phenolic compounds released to the environment along with oxygen, is known as oxidation (Scherwinski-Pereira 2010). It produces toxic substances and inhibits the growth of explants, which then leads to plant death (Melo et al. 2001, Erig and Schuch 2003). The severity of oxidation varies depending on the species, tissue or organ, plant developmental stage, age of the plant material, nutrient medium used and other in vitro cultivation variables (Huang et al. 2001). The coefficients of variation observed in this study were lower than 5% for the PLBs obtained from explant inoculation. Several authors have demonstrated the importance of variation in G1 peak coefficients for good estimates of DNA contents. The value 5% was determined for the FC variation coefficient as a criterion for the acceptance of estimates of DNA contents (Galbraith et al. 2001). 105

Methodological problems such as the interference of secondary metabolites, which include phenolic compounds, may cause changes in peaks (Greilhuber et al. 2007). In this study, the explants at 30 d of culture, which had been oxidized, had variation coefficients higher than 5% because phenolic compounds resulting from excision caused more events and debris in the formation of peaks. With the presence of multiple peaks, as observed in this study, the FC analysis made the selection of the proper reference pattern to avoid overlapping peaks between the standard and the sample, difficult. The interpretation of DNA content histograms can be challenging for orchids. Three peaks were observed for all somatic tissues of C. tigrina, indicating endopolyploidy. The lack of data on the nuclear DNA content for one of the largest plant families may be partly attributed to methodological issues (Lee and Lim 2005) and difficulty in interpreting DNA content histograms (Trávníček 2015). In general, the estimate of the genome size using FC in orchids presents some challenges: (I) several peaks corresponding to different nuclei almost always appear in DNA content histograms; (II) fluorescence peaks in nuclei at the G1 phase with a DNA 2C content can be very small or even absent in some somatic tissues, resulting in overestimates of genome size. Despite the presence of multiple peaks, the FC analysis of orchids may, for example, hinder the selection of an appropriate reference pattern to avoid overlapping peaks between the standard and the sample (Trávníček 2015). No studies could be found in the literature that used FC to investigate development and regeneration of orchid PLBs in vitro. Therefore, this study is important because it elucidates the development pattern of C. tigrina. The estimation of ploidy level in explants, tissues and PLBs was effective for C. tigrina. Different levels of 2C, 4C and 8C DNA content were observed in nuclei extracted from leaves, leaf bases, leaf tips, root tips, explants and PLBs at different culture times in the presence or absence of PGR. Among the 105 described species of the genus Cattleya (Flora of Brazil 2017), for example, quantification of nuclear DNA content has been reported for only four (Bennett and Leitch 2016). The regeneration of C. tigrina by the development of PLBs, as analyzed by FC, showed that during morphogenesis and regeneration of PLBs, the DNA content of regenerated leaves remained stable when compared to the C-value of DNA of leaves used as explants. In the in vitro maintenance of the genotypes of C. tigrina during extended culture 106 periods and successive subcultures analyzed by DNA estimation, plant genome stability was observed, as detected by the maintenance of nuclear DNA in the induced and regenerated leaves of this species. In Dendrobium crumenatum, the value of DNA content does not change regardless of the origin of the material used both in plants grown in a greenhouse and plants grown in vitro (Meesawat et al. 2008). It can be stated that the values found for C. tigrina did not change when obtained by in vitro culture. In a study estimating the DNA C content of Dendrobium, regenerants obtained during first cultivation maintain the same ploidy of the parent plant, while in subsequent cultivars a large number of polyploids and chimeras were obtained (Meesawat et al. 2008). In a study on regenerants of C. tigrina, all were found to possess twice the ploidy level of the tissue of the plants used as a source of the explants. The histograms also had 3 fluorescence peaks relating to cells with DNA 2C, 4C and 8C (Fritsche 2012). The present study showed that PLBs obtained from C. tigrina leaves have three fluorescence peaks in leaves, leaf bases, leaf tips, explants, PLBs and PLB regenerants grown in the presence of a PGR, as well as leaves and root tips obtained by seed germination in vitro without adding PGR. In angiosperms and other plant species, the occurrence of different ploidy levels among cells of an organism is often organ-specific and related to plant development (Barow and Meister 2003, Barow 2006). For C. tigrina, estimating the C-value of different tissues of the same species and the avoidance of misinterpreting histograms of DNA content, were important. By analyzing six different types of somatic tissues, the occurrence of endopolyploid cells was documented. An understanding of endoreduplication patterns was attempted. In protocorms and PLBs of Phalaenopsis aphrodite, FC showed variation in ploidy levels and the presence of endopolyploid cells (Chen et al. 2009). The nuclear DNA content in various tissues of Cymbidium revealed polysomatism, with PLBs exhibiting four peaks estimated at 2C, 4C, 8C and 16C (Fukai et al. 2002).

3.5.1 Endopolyploidy and endoreduplication in orchids Endopolyploidy is the condition in which only certain cells in a diploid organism are polyploid. In these cells, the replication and separation of chromosomes occur without nuclear division (Klug et al. 2009). Endopolyploidy is generated by endoreduplication, a process in 107 which mitosis does not completely occur after DNA replication (Larkins et al. 2001, Barow 2006, Inze and De Veylder 2006). Endoreduplication is the synthesis of cyclic DNA without cell division leading to the existence of cells with different ploidy levels in a given tissue or organ, which is called polysomaty (Fukai et al. 2002). Endoreduplication is essentially the replication of a genome without the subsequent cell division. It is typically found in differentiated cells of specialized tissues (Masonbrink et al. 2013). The results of the FC analysis of C. tigrina found that PLBs at 120 d of cultivation exhibited an increase in the predominant ploidy of the material; the material that was predominantly diploid at earlier stages, exhibited tetraploidy as prevalent at 120 d. Some species undergoing endoreduplication may pose difficulties because nuclei at the G1 phase with DNA 2C content often constitute only a small fraction of differentiated somatic tissues and its peak can be neglected (Trávníček et al. 2015), as was observed for C. tigrina at 120 d of cultivation. Cells of several somatic tissues of orchids undergo endoreduplication events. Nuclei at the G1 phase with DNA 2C content may not exist in all or part of the genome, resulting in overestimated values of genome size (Trávníček 2015). Endopolyploidy is common in some families and the degree of endopolyploidy usually differs among the organs and the tissues of a plant (Barow et al. 2007). At 180 d, the diploid predominance of the species returns to the pattern observed for other PLB growth stages. Endoreduplication has been observed in several somatic tissues of various species of orchids, such as Epidendrum (Assis 2013) and Phalaenopsis equestris, in which it occurred in various tissues and the leaves contained more nuclei with a polyploidy of 8C to 16C than the flowers and roots (Lin et al. 2001), as was observed for C. tigrina. Endopolyploidy was studied at different developmental stages in embryonic tissues and protocorms of Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana by FC and light and fluorescence microscopy, with a high level of endopolyploidy being observed during seed development (Jean et al. 2011). The level of endopolyploidy usually differs between organs and tissues of an individual plant (Lee et al. 2004, , Emshwiller 2002, Loureiro et al. 2006, Barow and Jovtchev 2007). In the present study, the PLBs of C. tigrina presented endopolyploidy for the six cultivation times, with a maximum peak of 8C and a few differences between the control and the PLBs during the developing stage. 108

In the development of protocorms of Phalaenopsis, endopolyploidy was observed after germination, and different levels of DNA content were estimated for protocorms after 30 d of culture (Chen et al. 2009). These observations indicated the existence of different levels of endopolyploid cells in protocorms, as was observed for different tissues of Cattleya tigrina. Diploid plants maintain diploidy in their meristematic cells while endopolyploidy occurs during the process of differentiation (Teixeira da Silva et al. 2014). Through various biotic and abiotic factors, or stress conditions, endopolyploidy is an adaptive mechanism that maintains homeostasis of an organism for survival of stressful conditions by growing and regenerating tissues (Lee et al. 2009). This can be explained when found in in vitro cultures, as was the case with C. tigrina. The occurrence of endopolyploidy correlates with botanical family and is organ-specific (Barow and Jovtchev 2007). It may also vary within the same organ, such as in leaves of Spathoglottis plicata, where endopolyploidy decreases from the base to the apex of the leaf (Yang and Loh 2004). Endopolyploid cells grow mainly by cell expansion mediated or accompanied by endoreduplication (Valéri and Mártonfi 2011). Endoreduplication is well documented for endosperm and cotyledons during seed development (Lee et al. 2004). It is suggested that endoreduplication is related to developmental events such as cell expansion and differentiation (Kondorosi et al. 2000, Larkins et al. 2001). A constant characteristic of C. tigrina was the presence of endopolyploid tissue, with 2C, 4C and 8C peaks. This phenomenon has been reported for other species of Orchidaceae, for example Cymbidium (Fukai et al. 2002), Vanda (Lim and Loh 2003), Polystachya (Rupp et al. 2010), Spathoglottis (Yang and Loh 2004) and Vanilla (Lepers- Andrzejewski et al. 2011). It occurs as a result of the production of polyploid tissues and possibly the generation of polyploid descendants (Soltis et al. 2003, Bennett 2004, Lepers-Andrzejewski et al. 2011). Some authors relate this phenomenon to an increase in the expression of certain genes and the control of leaf growth (Larkins et al. 2001, Bourdon et al. 2011, Massonnet et al. 2011). However, many issues related to this specific endoreduplication function in vegetative development remain unknown. Polysomaty, indicating the occurrence of cells with different ploidies in the same tissue, such as in the leaves, roots and PLBs of C. tigrina, may be a preexisting feature in the parent plant (genotype) or type of explant (nature of the tissues, which may 109 involve replication cycles not followed by cell division), and also cultivation conditions (culture media, PGR, stress, light).

3.6 Conclusions Knowledge of endopolyploidy is important for understanding the regulation of gene expression in differentiated tissues and the nature of the tissues used for plant regeneration and transformation. Such an understanding can, for example, be helpful in decreasing the occurrence of somaclonal variation and polyploidy in in vitro cultures. The estimation of nuclear DNA content of the different tissues analyzed of Cattleya tigrina, in the presence or absence of PGR, clearly demonstrated a stability of this species when maintained in vitro. An efficient way to estimate the ploidy level of plants grown in vitro and during the development of PLBs in plant tissue cultures derived from long-term subcultures in the presence of a PGR was also presented.

3.7 Perspectives It should be emphasized that studies employing chromosome- counts to validate the occurrence of polysomaty are needed. Furthermore, the stability of ploidy of adult plants and in vitro plants obtained from zygotic embryos (ZE) opens new possibilities for further studies aiming to answer whether the polyploidy of this species has a genetic origin or whether it is induced by in vitro cultivation.

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4. CAPÍTULO II. Ultrastructure and biochemistry in the induction and development of Protocorm-like bodies (PLBs) of Cattleya tigrina A Rich. 4.1 Abstract

Cattleya tigrina A. Rich orchid occurring in the Atlantic Forest, endemic to the States of Santa Catarina, São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo and Bahia. For in vitro regeneration, orchids have a specific morphogenic route obtained from somatic explants forming protocorm-like bodies (PLBs). Orchids have a unique morphogenetic pattern and studies on the ultrastructure, biochemistry, and physiology of development in PLBs are relevant. The objective was to compare the ultrastructure of the cells in the induction and formation of PLBs, and to quantify the contents of total sugars, starch, chlorophyll a, b and carotenoids during the development stages in C. tigrina. Leaf extracts were cultivated in Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with TDZ. LM and TEM analyses were performed after 7, 14, 30 and 60 days of cultivation. The histological study revealed that PLBs are structures formed by meristematic cells and the protoderm contains cells that are in a constant division, with a dense cytoplasm and prominent nuclei. There was a reduction in chlorophyll a and b in all treatments in relation to the development stages. However, the proportion of chlorophyll a/b was maintained in all treatments. The highest starch content was recorded at 14 days of culture (6.71 μg.g-1 FM) in PLBs without an addition of PGR. A decrease in the starch content was observed. This event may be related to the degradation of this compound to the energetic supply during the maintenance of cell growth. This information is important for studies of developmental physiology and may assist in the establishment of plant propagation and regeneration processes. Mainly because it is an orchid of great ornamental value and considered vulnerable to extinction.

Keywords: orchids, starch, sugars, micropropagation, photosynthetic pigments, ultrastructure.

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4.2 Introduction Cattleya is a genus represented by native species from tropical America (Pridgeon and Morrison 2006), and Cattleya tigrina A. Rich, a Brazilian species (Musskopf 2006; Buzatto et al., 2007), occurring in the Atlantic Forest, endemic to the States of Santa Catarina, São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo and Bahia (Barros et al., 2017). In vitro cultivation techniques have been used in orchids both for mass propagation and for studying physiological aspects related to the plant development (Suzuki 2010). Species with a commercial interest and those which are in danger of extinction are both benefited by mass production (Faria et al., 2006). Studies aiming to improve the propagation process and the development of orchids are important to dominate their cultivation, preserve them and prevent their extinction (Torres et al., 1998). In orchids, there is a specific morphogenic route for the regeneration of plants in vitro. The clonal propagation of orchids, in general, is made from somatic explants of diverse origin such as roots (Kerbauy and Estelita 1996), floral stems (Chen and Chang 2000), leaves (Chen and Chang 2001; Gow et al., 2009) and shoot tip (Roy et al., 2007) to obtain globular structures similar to zygotic embryos origin known as protocorm-like bodies (PLBs). PLBs are unique to orchids and are used for the propagation of plants, resemble protocorms and are induced directly from explants or from callus (Jones and Tissera 1990; Chugh et al., 2009). The study of the development of PLBs is useful from a point of view as a model system for morphological, cellular, physiological, biochemical and molecular events that occur in this morphogenic orchid route (Fritsche 2012; Liz 2013; Almeida 2014; De Conti 2016). Morphological, cellular and ultrastructural analyses have been carried out in several biological systems of plants aiming to find parameters to identify developmental stages and cellular competence (Filonova et al., 2000; Larsson et al., 2008a, b Rogge -Renner et al., 2013). These analyses provide intercellular and intracellular characteristics that distinguish different cell types, providing data that define the capacity of cellular development (Verdeil et al., 2007). The ability to control cell growth through the use of tissue culture techniques allows an analysis of the relationship between the development of plastids and the differentiation of cultured cells (Sjolund and Weier 1971). The seedlings or shoots developed in vitro are 120 exposed to a single microenvironment, organized to generate minimum stress, but with excellent conditions for multiplication (Hazarika 2006). Histodifferentiation in the in vitro morphogenic process is associated with changes in the synthesis and mobilization of protein and carbohydrates. The levels of these substances act both in the signal transduction cascade and can serve as a substrate for respiration, leading to cell induction and differentiation (Lülsdorf et al., 1992). According to this information, the objective was to compare the ultrastructure of the cells at different concentrations of TDZ in the induction and formation of PLBs and quantify the contents of total sugars, starch, chlorophyll a, b and carotenoids during the stages of development in Cattleya tigrina.

4.3 Materials and methods 4.3.1 Plant material Leaf explants (±1cm) were obtained from young plants, micropropagated and maintained in vitro Development Physiology Laboratory and Plant Genetics (LFDGV), the Agricultural Science Center (CCA), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, Santa Catarina State, Brazil. The leaf explants were detached and inoculated MS medium (Murashige and Skoog 1962), supplemented with 9 μM TDZ (Thidiazuron) for PLBs induction (Chen and Chang 2006), adapted by Fritsche (2012). After inoculation of the explants, they were kept in BOD with an average temperature of 25±2°C, 16-h light and 8-h dark, with a light intensity of 50 μmol m-2 s-1. To 7º, 14º, 30º and 60º days of cultivation, plant materials were collected for histological, ultrastructural, sugars, starch, photosyntetic pigments analysis. For histological and ultrastructural studies the five explants of each culture time were collected. With regard to sugar analysis were collected biological three replicates for each cultivation time, each replica was formed by 500mg of fresh pasta starting from a pool of plant material, corresponding basically to 30 leaf explants and stored at -80°C for later analysis.

4.3.2 Light Microscopy (LM) Samples were collected after 7, 14, 30 and 60 days and fixed in 2.5 % (m/v) glutaraldehyde in a 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.2), and dehydrated in an ethanol series. For light microscope (LM) analysis the samples were infiltrated with hydroxyethyl methacrylate 121

(Leica Historesin, Heidelberg, Germany) (Gerrits and Smid 1983), sectioned with a Slee Cut 4055 rotation microtome (Mainz, Germany) and stained with toluidine blue (O'Brien et al. 1964). After preparation, the sections were observed using an Olympus BX40 light microscope (LM). The relevant events were recorded using an attached DP71 digital camera and the software Image Q Capture Pro 5.1 (QImaging Corporation, Austin, TX, USA).

4.3.3 Transmission Electron Microscopy (TEM) Aiming to evaluate the ultrastructural features of PLBs during cell proliferation, analysis of transmission electron microscopy (TEM) was performed. Representative samples of PLBs were fixed with 2.5 % glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) plus 0.09 M sucrose overnight. The material was post-fixed with 1% osmium tetroxide for 4 h, dehydrated in a graded ethanol series, and embedded in Spurr’s resin, according to the manufacturer's instructions. Thin sections were contrasted with aqueous uranyl acetate, followed by lead citrate, according to Reynolds (1963). The samples were then examined under TEM JEM 1011 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan, at 100 kV).

4.3.4 Total soluble carbohydrates content (TSC) Samples of 500 mg were ground to powder with the aid of liquid nitrogen and subsequently submitted to an 80% ethanol extraction at 70°C for 5 min. The extracts were centrifuged at 3 .000rpm, at 20°C, for 10 min and filtered through fiberglass. The extraction was repeated three times and the final volume adjusted to 5 mL with ethanol (80%). The total soluble carbohydrates content were determined using phenol- sulfuric method (Dubois et al. 1956), using glucose as standard. The absorbance was measured at 490 nm. The data were submitted to ANOVA and presented as means of three biological replicates.

4.3.5 Starch content The pellets used in the total soluble carbohydrates extraction received the addition of 1 mL of cold distilled water and 1.3 mL of 52% perchloric acid and was maintained in an ice bath with occasional agitation. Subsequently, 2.0 mL of water was added, and the material was centrifuged at 3.000rpm for 15 min. The extraction was repeated and the final volume adjusted to 10 mL with distilled water. The starch content was estimated by the phenol-sulfuric method (Dubois et al. 1956), using glucose as a standard, according to the method proposed by 122

McCready et al. (1950). The absorbance was measured at 490 nm. The data were submitted to ANOVA and presented as means of three biological replicates.

4.3.6 Chlorophyll a, b, total and carotenoid The concentration of chlorophyll a, b, total and carotenoid was determined by the dimethylsulfoxide (DMSO) method, using 100 mg of foliar tissue and incubated in a water bath with 7 mL DMSO at 65 ◦C for two hours without maceration. After filtering, the total volume was adjusted to 10 mL. The values obtained by spectrometry were used in equations Wellburn (1994) being data expressed in µ g mL: chlorophyll a = [12.19*(A665)−3.45*(A649)]; chlorophyll b = [21,99*(A649)−5.32*(A665)]. The total chlorophyll content was determined from the sum of Chl a and Chl b. The content of carotenoids was estimated from the formula: total carotenoids = [1.000*(A480)−2.14*(Chla) −70.16*(Chlb)] / 220.

4.3.7 Statistical analyses The data obtained in this study were analyzed by statistical software Assistat version 7.7 (Silva e Azevedo 2016). Means were compared by Tukey test at 5% probability.

4.4 Results 4.4.1 Light Microscopy (LM) In the analysis of the histodifferentiation of PLBs, from the basal foliar region of C. tigrina, it was observed that the process of induction and formation occurs in an asynchronous way. The proliferation of cells in the basal region of the leaf epidermis occurs in both the PGR-free culture medium (Fig. 1a) and the 9μm TDZ supplementation (Fig. 1b). The epidermis on both faces is unstratified and the mesophyll consists of large, vacuolated parenchyma cells. The formation pattern of PLBs was similar in the treatments used. The initial formation of PLBs was observed after 14 days of culture, with periclinal and anticlinal cell divisions in the leaf epidermal region, cells with high mitotic activity (Fig 1c-d). A small group of dividing cells with dense cytoplasm, very vacuolated and with nuclei, were observed in the leaf epidermis of the PLBs (Fig. 1c-d). The mesophyll is composed of chlorophyllic parenchyma (Fig. 1c-d) and contains idioblasts with raphides (Fig. 1d).

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Figure 1 - Histological observation on the formation of PLBs of Cattleya tigrina. Cross sections of the adaxial and abaxial epidermis of the foliar bases after 7 days of culture (a) free of PGR. (B) 9μm TDZ. Leaf mesophill cells, vacuolated and conspicuous nuclei. Cross sections of the adaxial and abaxial epidermis of leaf bases 14 days after cultivation. (C) free PGR. (D) 9μm TDZ. Cells of the epidermis in cell division (arrows). Bar: a, b, d = 100μm; C = 200μm. Ep (Epidermis), N (Nucleus), Vb (Vascular bundle), Sto (Stomata), Ra (Raphide), PLBs (Protocorm-like bodies)

The nucleus of PLBs are large, with evident nucleoli (Fig. 2). Idioblasts containing raphides were also visualized in this stage of development of the PLBs (Fig. 2a). Protoderm was observed after 30 days (Fig. 2a), and the volume of the meristematic portion was smaller in relation to the total ESP volume (Fig. 2b). In the images, we observe the meristematic cells with dense protoplast and conspicuous nuclei, characterizing the initial stages of PLBs morphogenesis (Fig. 2a-b). PLBs from 60 days of development show the presence of apical meristems (Fig 2c-d). The meristematic cells form a dome (Fig. 2c-d). This meristematic dome consists of meristematic cells with large nuclei. Pro-vascular tissues and leaf 124 primordia were observed in samples 60 days after the inoculation (Fig. 2c-d).

Figure 2 - Histological analysis in the formation of PLBs of Cattleya tigrina. Cross sections of the leaf base after 30 after cultivation. (A) without addition of PGR. Protoderm is indicated by the arrow. (B) 9μm TDZ. Cells of the epidermis in cell division (arrows). Cross sections of the leaf base after 60 days of cultivation in MS medium: (c) free of PGR. Cell division and development of foliar primordia. (D) 9μm TDZ. Bar: a, c = 100μm; A, b, d = 200μm. PLB (Protocorm-like bodies), N (Nucleus), Ra (Raphide), MC (Meristematic cells), Ep (Epidermis), Rhi (Rhizoids), LP (leaf primordia)

4.4.2 Transmission Electronic Microscopy - TEM TEM analysis of the cultures revealed the presence of mitochondria in the analyzed treatments. Proplastids and amyloplasts were characteristic in the early stages of PLBs morphogenesis. Leaf base cultured in PGR-free culture medium at 7 days of culture (Fig. 3), have mitochondria, vacuole, Golgi bodies, proplastids and amyloplasts (Fig. 3a-b). At 14 days of culture, PLBs present chloroplasts with an organization of thylakoid membranes (Fig. 3c) and 125 chloroplasts containing starch grains and osmiophilic plastoglobules (Fig. 3d). At 30 days of culture, many proplastids in the PLBs protoplast (Fig. 3e), detail of etioplasts presenting prolamellar body and starch grains (Fig. 3f). PLBs at 60 days had enough amyloplasts (Fig. 3g) and chloroplasts with plastoglobules (Fig. 3h).

Figure 3 - Analysis in TEM of foliar bases and PLBs of Cattleya tigrina. a-b) Leaf base at 7 days of cultivation in culture medium free of PGR. a) Dense protoplasm with mitochondria (M), Golgi bodies (G) and vacuoles (V). b) Proplastid near an amiloplast with starch grains (St). c and d) PLBs at 14 days of cultivation: c) Detail of proplastide with thylakoid (Thy) membranes and mitochondria. d) starch grains (St), plastoglóbulos (PG) and thylakoid membranes in organization in the chloroplasts. e-f) PLBs with 30 days of cultivation: e) Proplastids (PP) present in the PLBs cellular protoplast and provacuoles (PV). f) Etioplasts containing prolamellar bodies (PB), plastoglobules (PG). g-h) PLBs at 60 days of cultivation: g) Amyloplasts with starch grains. h) Cellular protoplast with chloroplasts containing starch grains (St) and plastoglóbulos (PG). Bar: g = 1μm; A, c = 0.2 μm; B, d, e, f, h = 0.5μm.

Leaf base with 9μm TDZ (Fig. 4) at the 7th day of culture, we observed organelles such as mitochondria, Golgi bodies, rough 126 endoplasmic reticulum, chloroplasts with starch grains (Fig. 4a) and proplastids (Fig. 4b). At 14 days of culture, it was possible to observe proplastids (Fig. 4c) and showed a nucleus with nucleolus and regions of heterochromatin and euchromatin (Fig. 4d). TEM analysis after 30 days of cultivation revealed ESPs with many mitochondria surrounding chloroplasts with starch grains (Fig. 4e). At 60 days, chloroplasts were observed with osmiophilic plastoglóbulos and grana (Fig. 4f).

Figure 4 - Analysis in TEM of Cattleya tigrina with 9μM TDZ. A and b leaf base at 7 days of cultivation. a) mitochondria (M) and chloroplasts with starch grains (St). b) Proplastids (PP). c) PLBs at 14 days of cultivation. Proplastids (PP) and mitochondria (M). d) nucleus (N) with nucleolus (Nu). PLBs with 30 days of cultivation. e) amyloplasts containing starch grains (St). f) PLBs at 60 days of cultivation. f) chloroplasts with plastoglobules (PG) and grana (Gr). Bar: a, c, e and f = 0.5μm; D = 2μm; B = 0.2μm

4.4.3 Pigments The amounts of photosynthetic pigments are shown in Table 1. The amount of chlorophyll a produced one week after the induction was dependent on the concentration of the PGR used. In the treatment free of PGR, the production of chlorophyll a and chlorophyll b was always lower when compared to treatment with 9μM TDZ, except after 60 days of cultivation. There were significant differences in the culture periods analyzed. The TDZ free treatment showed the lowest values in relation to the pigments analyzed. The highest levels of total chlorophyll were 127 detected in PLBs at 7 and 14 days of cultivation, while the lowest levels of total chlorophyll were detected in PLBs free of PGR at all cultivation times. The levels of extractable chlorophylls and carotenoids depended on the addition of PGR to the culture medium (Table 1). Treatments without PGR addition showed a lower chlorophyll level when compared to treatments that were added TDZ during the 7, 14 and 30 days of collection. PLBs collected at 60 days of cultivation did not present statistical differences when comparing the contents of chlorophyll and carotenoids among the treatments used.

Table 1 - Mean values of the quantification of the photosynthetic pigments chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb), relation between chlorophyll a and chlorophyll b (Chla / Chlb), total chlorophylls (Chl T) and carotenoids (Carot) in μg / g -1 Of fresh matter of Cattleya tigrina PLBs

Treatament (µM L-1 Chl a Chl b Chla/Chlb Chl T Carot TDZ) 7 d 0 16.88 6.01 ±0.13 2.80 ±0.08 22.89 2.67 ±0.25 ±0.61 b bc a ±0.69 b b 9 29.12 9.74 ±0.42 3.00 ±0.24 38.87 3.81 ±0.41 ±1.27 a a a ±0.93 a a 14 d 0 12.16 3.77 ±0.49 3.34 ±0.47 15.93 1.91 ±0.17 ±0.22 c c a ±0.64 c bc 9 29.98 8.14 ±0.92 3.79 ±0.49 38.13 4.62 ±0.29 ±0.22 a ab a ±0.85 a a 30 d 0 11.92 4.07 ±0.36 2.95 ±0.24 16.00 1.12 ±0.09 ±0.37 c c a ±0.60 c c 9 18.29 5.94 ±0.27 3.08 ±0.12 24.23 2.46 ±0.09 ±0.48 b bc a ±0.67 b b 60 d 0 17.41 4.07 ±1.02 5.00 ± 1.49 21.48 2.30 ±0.08 ±0.03 b c a ±0.99 b b 9 16.57 5.80 ±0.79 2.96 ± 0.42 22.38 2.34 ±0.15 ±0.28 b bc a ±1.03 b b CV (%) 5.13 18.38 31.63 5.69 14.72

4.4.5 Total soluble carbohydrate (TSC) and Starch The total soluble carbohydrate content (TSC) did not vary during the induction and development of PLBs during the collection times and the treatments used (Fig. 5). Larger amounts of TSC were 128 observed at 30 days of cultivation, in the treatment free from PGR, presenting statistical differences between the other growing times. The culture in PGR-free culture medium showed the highest amounts of TSC when compared to the other treatments, for example, at 30 days of culture (5.61 μg g-1 FM).

Figure 5 - Total soluble carbohydrate contents (μg.g-1 MF) during induction and development of Cattleya tigrina PLBs at different concentrations of TDZ (0 and 9 μM-1). Means followed by different letters indicate a significant difference according to the Tukey test (5%).

As for the starch content, it was verified that the higher concentrations of starch occurred in the treatment free of PGR (Fig. 6). At 14 days of cultivation (6.71 μg g-1 MF), differing statistically from the other treatments at this culture period. With the exception of 7, 30 and 60 days of cultivation, where there were no statistical differences when compared among all the treatments. 129

Figure 6 - Starch contents (μg.g-1 FM) during induction and development of Cattleya tigrina PLBs at different concentrations of TDZ (0 and 9 μM). Means followed by different letters indicate a significant difference according to the Tukey test (5%).

4.5 Discussion

4.5.1 Histodifferentiation of PLBs The histological observations of the PLBs showed similar characteristics in the treatments during the growing times. The highest percentage of induction for the species was the foliar basal region, as observed by Fritsche (2012), showing efficiency in the regeneration process for formation of PLBs in C. tigrina. Devi et al. (2013) also observed in the basal portion of Aerides odorata leaves the most significant response for PLBs formation when compared to the medial and apical leaf region. The meristems and tissues recently originated in plant shoots have high auxin synthesis (Taiz and Zeiger 2009), therefore, these endogenous levels of foliar tissues close to axillary meristems in C. tigrina should promote greater morphogenic activity in the differentiation of PLBs. According to Firoozabady and Moy (2004), the basal leaf region may respond better to the process of embryogenesis and/or organogenesis, because it is closer to the axillary meristem and may contain meristematic regions and newly formed tissues, with significant metabolic activity. 130

In this study, PLBs were observed in treatments without an addition of PGR, as well as in treatments with TDZ. PLBs can be induced to regenerate in whole seedlings in the absence of PGR. Shoots develop directly from primary and secondary meristem PLBs without an intervening organogenesis phase (Ng and Saleh 2011). In C. tigrina, leaf explants induced to PLBs formation when subjected to concentration 9μM TDZ have proven effective in the regeneration of shoots. Plant cells have the potential to reproduce intact plants via organogenesis or embryogenesis (George 2008). PGRs play an essential role in dedifferentiation and redifferentiation processes. These regenerative processes in tissue and cell cultures can be induced by the use of TDZ alone or in combination with other plant growth regulators (Guo et al., 2011). Cells with raphides were observed in LM, at 14 and 30 days of culture, in the PLBs of C. tigrina. Raphides are observed in young tissues and active growth (Prychid and Rudall, 1999), as well as PLBs of C. tigrina. These raphides act as deposits of calcium ions and metabolic residues (Sugimura et al., 1999).

4.5.2 Ultrastructure of PLBs In the ultrastructural analyses of PLBs, the presence of mitochondria and chloroplasts was observed. According to Gnasekaran et al. (2016), the presence of these organelles indicates that PLBs are differentiated organs and will function as a plant under natural conditions. This study showed proplastids, etioplasts, chloroplasts and amyloplasts. Amyloplasts were often seen in the cytoplasm of PLBs, this peculiarity was consistent with the ability of plastids to differentiate or dedifferentiate. Plastids are involved in energy metabolism, storage and plant reproduction (Possingham 1980). Amyloplasts are storage plastids in which the internal volume is filled with starch. Its function is to synthesize starch as a reserve material (Possingham 1980). A dense cytoplasm, rich in granular ER cisternae, was observed in this study. Appezzato-da-Gloria and Machado (2004) revealed a granular ER rich cytoplasm (RER) in the meristematic cells of Bauhinia forficata and Glycine max. The presence of these organelles indicated that these cells had high metabolic activity during plant cell growth, as they were able to synthesize cell wall components (Pihakaski- Maunsbach et al., 1993; Appezzato-da-Gloria and Machado 2004). This 131 high metabolic activity may be related to the differentiation and growth capacity of PLBs. PLBs cells showed intense activity, with the presence of organelles that reflect high metabolic activity, such as mitochondria and Golgi bodies. The PLBs exhibited numerous mitochondria, indicating a high cellular activity, as found in the embryogenic cells of Inga vera (Piéron et al., 1998, Stein et al., 2010). A large number of mitochondria indicate a high level of energy utilization by these cells and is characteristic of tissues undergoing differentiation (Rocha et al., 2012). Similar to LM observations, PLBs in TEM had nuclei with nucleoli, a distinct nuclear envelope and two types of chromatin (heterochromatin and euchromatin). These structures are related to the characteristics of totipotent embryogenic cells that have a nucleus containing less perinuclear heterochromatin and more euchromatin (Verdeil et al., 2007). The chloroplasts observed at the culture times analyzed for ESPs contain one or more prominent starch grains observed from the early stages. Chloroplasts were observed at 14 days in the treatment without an addition of PGR and in the treatment with 9μm of TDZ. PLBs showed developed chloroplasts, surrounded by an envelope consisting of two membranes. The inner membranes are organized into stacks of grana and interconnected by a series of membranes. In observing TEM, in the initial stages of formation of PLBs, there is a larger accumulation of cells with deposition of starch grains. Forters and Parents (2000) reported that starch accumulated in callus cells and pre-nodular structures of Humulus lupulus could provide large amounts of energy required for the onset of organs and development. One or more chloroplasts containing starch grains were clearly observed during the organogenesis of Glycine max and Bauhinia forficata (Appezzato-da-Gloria and Machado 2004) and Zea mays (Marín- Mendéz et al. 2009), indicating the relationship between these plastids and the organogenic potential of plant cells. In the PLBs of C. tigrina, the presence of a prolamellar body was observed in etioplasts. The development of the prolamellar body in etioplasts occurs by the accumulation of membrane materials due to blockage in the sequence of steps leading to the formation of grana (Weier et al., 1970). The appearance of a prolamellar body in PLBs may be indicative of slow-growing tissues, as observed in callus of Populus tremuloides (Blackwell et al., 1969).

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4.5.3 Photosynthetic pigments in PLBs The determination of pigments in the PLBs of C. tigrina, in treatments and growing times, was necessary to verify the photosynthetic capacity in the formation of these structures. The determination of the content of foliar pigments represents an important tool for the distinction between treatments or interaction between plants and environmental factors (Lambers et al., 1998). The growth and adaptation of plants to different environmental conditions are related to their photosynthetic efficiency, which, in turn, is associated, among other factors, such as foliar chlorophyll content (Batagin 2008). It is known that chlorophyll is responsible for the synthesis of food for optimal plant growth and development (Akram and Aftab 2015). In the present study, the chlorophyll content in the in vitro development of PLBs was accompanied by the decrease of chlorophyll content in all the treatments analyzed. In leaves of Cypripedium flavum, regarding chlorophyll content, a decrease was also observed at 30, 90 and 120 days (Zhang et al., 2008). In the PLBs, it was observed that the number of photosynthetic pigments differed among the treatments used. Chlorophyll b mainly works to absorb light and transfer it to chlorophyll a (Devesa-Rey et al., 2008). Chlorophyll a production was higher in PLBs at the start of induction, at 7 days, and also at 60 days of culture. While the lowest averages were verified in the absence of PGR, at all cultivation times, except at 60 days. This pigment acts with greater effectiveness in the photosynthetic activity, since unlike chlorophyll b and carotenoids (called accessory pigments), it performs light processing (Taiz and Zeiger 2009) and may present higher photosynthetic efficiency. The amounts of chlorophyll b in the ESPs of C. tigrina were significantly lower in the treatments without an addition of TDZ. However, on the 60th day of induction, these values were stable between the treatments. According to the data of the present study, Dignart et al. (2009) found smaller amounts of chlorophylls in Cattleya walkeriana in MS culture medium. Carotenoids production was repressed in all treatments, being lower in the control treatment, which did not differ significantly only at 60 days of culture. These pigments play an essential role as photoprotectors (Taiz and Zeiger 2009) and can be associated with an important strategy to overcome the acclimatization phase, a stage characterized by a greater availability of light in relation to the in vitro phase. 133

From these results, it can be inferred that photosynthesis through the formation of a greater amount of pigments was influenced by the addition of TDZ to the culture medium.

4.5.4 Total soluble carbohydrates and Starch During cultivation, the leaves of C. tigrina showed evidence of development and formation of PLBs, the epidermal cells began to undergo the mitotic division, initiating the cellular differentiation and the formation of the component tissues of the PLBs. In embryo development stage is the synthesis of total soluble sugars. These are important in several physiological processes, acting as an energy source, carbon skeletons and/or as flags, and are also indispensable for embryos to make them metabolically quiescent (Baud et al., 2002). The reduction of total carbohydrates at 60 days of cultivation is related to the increase in energy demand due to the metabolic processes that occur in the place. Cangahuala-Inocente et al. (2013), when working with the somatic embryogenesis of Acca sellowiana, observed that the levels of TSC differed in several stages of embryonic development. Soluble sugars influence the growth of plants in two ways, serving as carbon sources, from which energy is derived to glycolysis and respiration, and acting as signaling molecules through the action of receptor kinases (Rolland et al., 2006). Both forms lead to cell induction and differentiation (Lülsdorf et al., 1992) in the present study, it occurred during the formation of PLBs. Among the main reserve polysaccharides in plants, there is the starch (Buckeridge and Reid 1996). The C. tigrina species had higher total soluble sugars contents at 30 days of cultivation, however, the higher amount of starch was verified in the treatments without an addition of PGR. The same pattern is observed for the starch content and its increase on the 14th day of cultivation, and it can serve as a pool of temporary storage of carbon, which can be used later for the biosynthesis of other storage materials. He et al. (2011), when working with somatic embryogenesis in soybean, also found an increase in starch content in the development of embryogenesis, followed by a marked decrease. On the 60th day of cultivation, there was a significant decrease in starch content and this apparent catabolism may be associated with 134 cell proliferation and the occurrence of differentiation observed during this growing period. In the PLBs the decrease of the starch content occurs at the regeneration stage, which corroborates the data observed in the somatic embryos of Acca sellowiana, the starch content remained constant in the first 30 days in embryo development, although these values decreased significantly in relation to the initial inoculum (Cangahuala-Innocente et al., 2013). According to Silva et al. (1998), the decrease in starch content may be related to its degradation to produce glucose as an energy source for various metabolic reactions that occur during the growth and maintenance of vital cell metabolism. In the same way, the synthesis and accumulation of starch and the development of PLBs can be associated. In the present work, the starch contents at different stages of morphogenesis differed significantly, and the higher starch content was observed at 14 days of culture in the PLBs without an addition of PGR, in the period corresponding to the beginning of PLBs formation. Thereafter, there was a decrease, and at 30 days, the starch content did not differ statistically from the PLBs at 60 days of cultivation. The degradation of starch stored in PLBs may be related to the maintenance of cell growth. According to Martin et al. (2000), a large amount of carbon is essential in order to provide the necessary ATP for maintaining metabolism during cell division. The low starch content in the final stage of PLBs development may also be related to the maintenance of the osmotic potential of the culture medium throughout the induction process. In studies performed with embryogenic cultures of Ocotea catharinensis, Santa-Catarina (2001) and Olmedo (2005) observed that the reduction of the osmotic potential of the culture medium promoted an increase in fresh matter and accumulation of reserve substances, such as starch.

4.6 Conclusion Understanding the biology and ecology of orchids is an important tool for their conservation. The present study revealed data that contribute to the understanding of the histology, ultrastructure, and biochemistry of PLBs in C. tigrina species. C. tigrina PLBs are characterized by the presence of stomata, trichomes, raphides, mitochondria and chloroplasts that indicate a normal physiological process of the plant is supported by this morphogenic route. 135

The results of this study reveal the dynamics of physiological, ultrastructural and biochemical changes that occur during the induction and development of PLBs. The biochemical profiles of carbohydrates and starch indicate that these biomolecules play an important role in cellular events, as well as the levels of chlorophyll found in the research. The increase in TSC content and the decrease in starch content are strongly related to the morphogenic response. This study is the first to report the relationship between cell ultrastructure and chloroplast dynamics during induction and development of PLBs.

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4.7 References

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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

O presente estudo contribuiu para a ampliação dos conhecimentos sobre o desenvolvimento da rota morfogênica das ESPs em orquídeas, até então pouco compreendida. As abordagens bioquímicas, ultraestruturais e citométricas, foram fundamentais para descrever os processos de indução e regeneração das ESPs na orquídea C. tigrina. De modo geral, os resultados do capítulo 1, indicam que o conteúdo de DNA da folha, base e ápice foliar não apresentou diferenças, como também, o explante foliar utilizado na indução de ESPs, não diferiu da folha da ESP regenerada aos 180 dias de cultivo. O conteúdo de DNA de folhas e raízes apresentou a formação de picos 2C, 4C e 8C. A formação e regeneração de ESPs de C. tigrina em meio de cultura com TDZ mantém o nível de ploidia quando comparado às plântulas obtidas da germinação de sementes. O capítulo 2 apresenta o estudo histológico de formação das ESPs e revelou que são estruturas formadas por células meristemáticas e a protoderme contem células que estão em constante divisões, com um citoplasma denso e núcleos proeminentes. Organelas como mitocôndrias de vários tamanhos e formas, núcleos grandes com nucléolo, além da abundância de amiloplastos nos estádios iniciais de desenvolvimento das ESPs e cloroplastos foram revelados pelo microscópio eletrônico de transmissão. Os aspectos ultraestruturais até então nunca estudados em relação a formação e maturação dos cloroplastos envolvidos na formação de ESPs de C. tigrina demonstraram compreender a formação destas organelas e identificar as possíveis alterações na sua formação. Por fim, as avaliações bioquímicas apresentaram uma diminuição no teor de clorofila a e b em todos os tratamentos com o passar dos tempos de cultivo. A razão de clorofilas a/b se manteve em todos os tratamentos. O maior teor de amido foi registrado aos 14 dias de cultivo, nas ESPs sem adição de PGR, com decréscimo nas semanas seguintes. O posterior decréscimo do teor de amido, em todos os tratamentos, aconteceu no 30º dia de cultivo e pode estar relacionado com a degradação deste composto para o suprimento energético durante a manutenção do crescimento celular. Os resultados sugerem que o processo de indução de ESPs em C. tigrina, resulta de uma reprogramação gênica no explante, que leva a alterações morfológicas, bioquímicas e metabólicas. A análise citométrica realizada nesta tese levanta algumas limitações quanto à 145 pouca disponibilidade de sequências da família Orchidaceae nas bases de dados, que intervém na identificação da quantidade de DNA. Este cenário revela a importância de estudos gênicos de orquídeas que contribuam com esse tipo de informação. Adicionalmente o fato de ter encontrado 3 picos de quantidade de DNA, sugere a necessidade de aprofundar estudos utilizando abordagens complementares de citogenética, co-localização e contagem de cromossomos. E também analises de Citometria de Fluxo e Citogenética em plantas matrizes no ambiente in situ, com estudos em diferentes regiões da planta. O desenvolvimento da rota das ESPs em orquídeas é um processo complexo, uma vez que uma série de fatores diferentes age concomitantemente. Alguns componentes importantes foram abordados no presente trabalho. Contudo, a continuidade dos estudos permitirá elucidar as relações específicas entre as diferentes redes de sinalização que regulam as mudanças associadas à aquisição de competências para este desenvolvimento. Essas informações contribuíram para a delimitação das ESPs como uma rota da morfogênese in vitro ocorrente nas plantas, com alto potencial regenerativo. Além disto, pode, portanto, auxiliar nos estudos de outros grupos de espécies que apresentam limitações nas técnicas de micropropagação.