Sirlei Sayomi Hayashi

SIRLEI SAYOMI HAYASHI

DETERMINAÇÃO QUALITATIVA E QUANTITATIVA DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE Malva sylvestris EM EXTRATOS E ESPECIALIDADES FARMACÊUTICAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Insumos, Medicamentos e Correlatos, Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr Roberto Pontarolo

Co orientadora: Profa. Dra Francinete Ramos Campos

CURITIBA 2012

Hayashi, Sirlei Sayomi Determinação qualitativa e quantitativa de metabólitos secundários da Malva sylvestris em extratos e especialidades farmacêuticas / Sirlei Sayomi Hayashi – Curitiba, 2012. 121 f.: il. (algumas color.); 30 cm.

Orientador: Professor Dr. Roberto Pontarolo Co-Orientadora: Professora Dra. Francinete Ramos Campos Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná.

Inclui bibliografia

1. Malva sylvestris. 2. Controle de Qualidade. 3. Fitoterápicos.4. CLAE-DAD. 5. Fingerprint. I. Pontarolo, Roberto. II. Campos, Francinete Ramos. III. Universidade Federal do Paraná. IV. Título. CDD 615.53

AGRADECIMENTOS

À agência de fomento à pesquisa CAPES pela concessão da bolsa de estudos. À Universidade Federal do Paraná e ao Programa de Pós graduação de Ciências Farmacêuticas por possibilitar o acesso ao conhecimento. Ao meu orientador Prof. Dr. Roberto Pontarolo pela oportunidade, pelo acolhimento, orientação e incentivo. À minha coorientadora Profa. Dra. Francinete Ramos Campos, pelas incansáveis discussões, pela dedicação com que me orientou e também pelo incentivo. À minha família, pelo apoio, incentivo e torcida. Aos amigos que fiz e aos amigos que me acompanham a tanto tempo que com toda a certeza torceram por este momento. A todos aqueles que diretamente ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. Ao Laboratório Herbarium pelo fornecimento dos padrões.

A mente que se abre com uma nova idéia, jamais voltará ao seu tamanho original.

Albert Einstein

RESUMO

Malva é o nome polular de Malva sylvestris, planta medicinal utilizada para tratamento de afecções bucais devido a ação antiinflamatória. A fitoterapia atualmente no Brasil vem ganhando força com a implementação da Politica Nacional de Plantas medicinais e Fitoterápicos, de modo que muitas espécies presentes na RENISUS podem ser encontradas nas Unidades de Saúde, entre elas a M. sylvestris. Considerando a nova legislação de registro para medicamentos fitoterápicos, faz-se necessário aprofundar o conhecimento sobre as plantas com utilização terapêutica, bem como definir o metabólito responsável e a quantidade encontrada na espécie, para assegurar a qualidade do fitoterápico. Tendo estas informações definiu-se como objetivo do trabalho desenvolver e validar um método quantitativo para metabólitos da espécie Malva sylvestris por CLAE-DAD, mesmo porque na monografia apresentada pela Farmacopéia Brasileira 4 edição, não consta nenhum método quantitativo para eles. Dentre os metabólitos já relatados na espécie destacam-se os da classe dos flavonóides, cumarinas, compostos fenólicos e antocianidinas. Os metabólitos quantificados foram: ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico. O método cromatográfico foi definido e validado com coluna C18 XBridge (4,6 x 150 mm; 5 µm), pré coluna C18 XBridge (4,6 x 20 mm; 5 µm), temperatura 25˚C, sistema de fase móvel: Canal A água + ácido fórmico 10% v/v, canal B metanol + ácido fórmico 10% v/v e canal D acetonitrila, fluxo 0,8 mL/minuto e volume de injeção de 5µL. As amostras de extratos secos (M50, M70, M80, M90, M100, S70 e T70) foram pesadas e diluídas em metanol/água 9:1 v/v na concentração de 20 mg/mL de extrato e filtrados em 0,45 µm, enquanto que as amostras comerciais de extratos glicólicos (EC1, EC2, EC3, EC4, EC5, EC6, EC7 e EC8) foram somente filtradas em 0,45 µm. O extrato S70 foi o que apresentou maior concentração de ácido cafeico (17,46 µg/mg), escopoletina (8,09 µg/mg) e ácido ferúlico (15,32 µg/mg). O extrato M50 entre os extratos de maceração foi o que apresentou a maior concentração de escopoletina (4,52 µg/mg). Entre os extratos comerciais que apresentaram maior concentração dos metabólitos foram EC6 e EC7. As analises comparativas dos extratos realizada através das técnicas de CCD, RMN de 1H, CLAE-DAD e CLAE-EM associada a PCA demonstraram que as variações de proporções de etanol e água utilizadas na maceração influenciou na extração de compostos polares, que foi maior nas proporções com maior quantidade de água, enquanto modo de extração avaliados, turbólise seguido de maceração e por fim soxhlet são melhores métodos para compostos polares. O método desenvolvido mostrou-se eficiente para a caracterização e quantificação de três dos metabólitos da M. sylvestris e este pode ser aplicado em análises de controle de qualidade dos extratos comercializados contribuindo para a qualidade dos produtos manipulados e industrializados que contem extrato de malva na sua composição.

Palavras chaves: Malva sylvestris. Controle de Qualidade. Fitoterapicos. CLAE- DAD. Fingerprint

ABSTRACT

Malva is the popular name of Malva sylvestris, herb medicinal used for treatment of oral disease, due to anti-inflammatory action. The growth of phytotherapy in Brazil is due to the implementation of government program called Politica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Many species of plants that are available to the population are present in list RENISUS, between them, M. sylvestris. Considering the new legislation of register for herbal medicines in Brazil, becomes necessary to deepen the knowledge about plants with therapeutic use, define this responsible metabolite and the amount found in the species to ensure the quality of the herbal medicine. Therefore, was defined as objective of the work to development and validation of analytical quantitative method for metabolites of M. sylvestris species by HPLC-DAD. Moreover, there is no reported assay method for malva metabolites in Brazilian pharmacopoeia 4th edition monograph. Between the metabolites reported in this species are flavonoid, phenolic compound, coumarins and antocyanidin. The quantified metabolites had been: caffeic acid, scopoletin and ferulic acid. The chromatographic method was defined and validated with column C18 XBridge (4,6 x 150 mm; 5 µm), column guard C18 XBridge (4,6 x 20 mm; 5 µm), temperature 25˚C, system of mobile phase: A - 10% (v/v) formic acid solution, B – methanol/formic acid (90:10, v/v) and D - acetonitrila, at a flow rate 0,8 mL/min gradient elution mode, the detection wavelength was set as 348 nm and the injection volume of 5µL. The dry extract samples (M50, M70, M80, M90, M100, S70 and T70) had been weighed and diluted in (9:1, v/v) methanol/water solution the concentration of 20 mg/mL and filtered in 0,45 µm, and the glycolic extract samples (EC1, EC2, EC3, EC4, EC5, EC6, EC7 and EC8) only had been filtered in 0,45 µm. The S70 extract was what presented greater concentration of caffeic acid (17.46 µg/mg), scopoletin (8.09 µg/mg) and ferulic acid (15.32 µg/mg). The M50 extract presented high er concentration of scopoletin (4.52 µg/mg). Between the commercial extracts, EC6 and EC7 presented greater concentration of the metabolites. Comparative analysis of the extracts was carried through by TLC, RMN of 1H, HPLC-DAD and HPLC-EM associated the PCA. The results had demonstrated that variations of ethanol/water ratio in the maceration affect polar compounds extraction. Higher amounts of water extracted more compounds. Comparing the different methods of extraction turbo extraction was better method followed by maceration and soxhlet. The method developed has provided a efficient for the characterization and quantification of three M. sylvestris’s metabolites. Furthermore, quality control analysis of commercial extracts can apply this method as routine, contributing to quality of medicines products that will countains of malva extract in its composition.

Key words: Malva sylvestris. Quality Control. Herbal Medicines. HPLC-DAD. Fingerprint

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - MALVIDINA 3-O-GLICOSÍDEO ...... 25

FIGURA 2 - MALVIDINA 3,5 – DIGLICOSÍDEO ...... 27

FIGURA 3 - QUERCETINA (3,3-4-5,7-PENTAHIDROXIFLAVONA) ...... 28

FIGURA 4 - KAEMPFEROL (3,4’,5,7-TETRAHIDROXIFLAVONE) ...... 28

FIGURA 5 – APIGENINA (4’,5,7-TRIHIDOXIFLAVONA) ...... 29

FIGURA 6 – GLICINOBETAÍNA (TRIMETILGLICINA)...... 30

FIGURA 7 – TRIGONELINA (1 – METILPIRIDINIUM 3 CARBOXILADO) ...... 30

FIGURA 8 – ÁCIDO CAFEICO (ÁCIDO 3-(3,4-DIHIDROXIFENIL-2-PROPENÓICO) ...... 32

FIGURA 9 – ÁCIDO FERÚLICO (ÁCIDO (E)-3-(4-HIDROXI-3- METOXIFENOL)PROP-2-ENOICO) ...... 32

FIGURA 10 – ESCOPOLETINA (6-METOXI-7-HIDROXICUMARINA) ...... 34

FIGURA 11 – ESQUEMA DE MONTAGEM DO SISTEMA DE MACERAÇÃO, MODO CORRETO A, B E C MODO ERRÔNEO D (PRISTA ET AL., 2008) ...... 35

FIGURA 12 – ESQUEMA DO SOXHLET MODIFICADO FARMACOTÉCNICO ONDE A REPRESENTA O SISTEMA SOXHLET E B A PLACA DE TEFLON UTILIZADA PARA APOIAR A DROGA NO SISTEMA (CARVALHO ET AL., 2009) ...... 36

FIGURA 13 – CROMATOGRAMAS DE SOLUÇÕES PADRÃO DE ESCOPOLETINA (1), ÁCIDO FERÚLICO (2), QUERCETRINA (3), QUERCETINA (4), GENISTEÍNA (5), KAEMPFEROL (6), APIGENINA (7), MALVIDINA 3-5, DIGLICOSILADA (8) E MALVIDINA-3-O-GLICOSIDEA (9) NOS COMPRIMENTOS DE ONDA DE 348, 528 E 280 NM...... 65

FIGURA 14 – CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO NO MÉTODO 1 EM 348 NM ...... 66

FIGURA 15 – CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO EM 348 NM MÉTODO 2 ...... 67

FIGURA 16 – CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO NO MÉTODO 3 EM 348 NM...... 68

FIGURA 17 - CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO NO MÉTODO 4 E EM 348 NM ...... 68 FIGURA 18 – CROMATOGRAMAS EM 280 NM DO EXTRATO M50 E MISTURA DE SOLUÇÕES PADRÃO, DESTAQUE PARA TEMPO DE RETENÇÃO DE 5,2 MIN REFERENTE A MALVIDINA 3,5 - DIGLICOSÍDEA ...... 70

FIGURA 19 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 5,2 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS OBTIDOS DE SOLUÇÕES DE PADRÃO DE MALVIDINA 3,5-DIGLICOSIDEO (LINHA CHEIA) E EXTRATO M50 (LINHA PONTILHADA) EM 280 NM ...... 71

FIGURA 20 - CROMATOGRAMAS EM 528 NM DO EXTRATO M50 E MISTURA DE SOLUÇÕES PADRÃO, DESTAQUE PARA TEMPO DE RETENÇÃO DE 8,9 MIN REFERENTE A MALVIDINA 3-O GLICOSÍDEA ...... 71

FIGURA 21 – ESPECTRO DE MASSAS DO EXTRATO M50, EXTRAÍDO NO TR = 5,0 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM ...... 72

FIGURA 22 - ESPECTRO DE MASSAS DO PADRÃO DE MALVIDINA 3,5- DIGLICOSIDEO, EXTRAÍDO NO TR = 5,0 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM ...... 72

FIGURA 23 - ESPECTRO DE MASSAS DO EXTRATO M50, EXTRAÍDO NO TR = 5,2 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM ...... 73

FIGURA 24 - ESPECTRO DE MASSAS DO PADRÃO DE MALVIDINA 3-O- GLICOSIDEO, EXTRAÍDO NO TR = 5,2 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM ...... 74

FIGURA 25 – CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ESCOPOLETINA E DA SOLUÇÃO DO EXTRATO M100 OBTIDOS EM 348 NM, TR = 9,5 MINUTOS ... 75

FIGURA 26 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 9,5 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS OBTIDOS DE SOLUÇÃO PADRÃO DE ESCOPOLETINA (LINHA CHEIA) E DE EXTRATO M100 (LINHA PONTILHADA) EM 348 NM ...... 75

FIGURA 27 – EXPERIMENTO DE FRAGMENTAÇÃO DO ÍON DE M/Z 193 [M + H]+ CORRESPONDENTE A ESCOPOLETINA DETECTADA NO EXTRATO M50, OBTIDO POR INFUSÃO DIRETA ...... 76

FIGURA 28 – CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO FERÚLICO E DO EXTRATO M100 OBTIDOS EM 348 NM, TR = 9,9 MINUTOS ...... 76

FIGURA 29 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 9,9 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS, OBTIDOS DE SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO FERÚLICO (LINHA CHEIA) E SOLUÇÃO DE EXTRATO M100 (LINHA PONTILHADA) EM 348 NM, ...... 77

FIGURA 30 – EXPERIMENTO DE FRAGMENTAÇÃO DO ÍON DE M/Z 195 [M + H]+ CORRESPONDENTE AO ÁCIDO FERÚLICO DETECTADO NO EXTRATO M50

OBTIDO POR INFUSÃO DIRETA ...... 77

FIGURA 31 – FRAGMENTO DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO CAFEICO E DA SOLUÇÃO DO EXTRATO M100 OBTIDOS EM 348 NM, EM DESTAQUE OS PICOS DE ÁCIDO CAFEICO...... 78

FIGURA 32 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 5,9 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS, OBTIDOS DE SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO CAFEICO (LINHA CHEIA) E SOLUÇÃO DE EXTRATO M100 (LINHA PONTILHADA) EM 348 NM ...... 78

FIGURA 33 – EXPERIMENTO DE FRAGMENTAÇÃO DO ÍON DE M/Z 181,6 [M + H]+ CORRESPONDENTE AO ÁCIDO CAFEICO DETECTADO NO EXTRATO M50, OBTIDO POR INFUSÃO DIRETA ...... 79

FIGURA 34 – GRÁFICO DAS CONCENTRAÇÕES DETERMINADAS DOS EXTRATOS HIDROALCOOLICOS DE M. SYLVESTRIS ...... 80

FIGURA 35 – CURVA ANALÍTICA DE ÁCIDO CAFEICO, OBTIDO POR CLAE-DAD PARA A AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE ...... 82

FIGURA 36 – CURVA ANALÍTICA DE ESCOPOLETINA, OBTIDA POR CLAE-DAD PARA A AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE ...... 82

FIGURA 37 - CURVA ANALÍTICA DE ÁCIDO FERÚLICO, OBTIDA POR CLAE-DAD PARA A AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE ...... 82

FIGURA 38 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV (200 A 400 NM) NO TR = 5,2 MINUTOS DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO CAFEICO (A) E DO EXTRATO M80 (B) ...... 83

FIGURA 39 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV (200 A 400 NM) NO TR = 9,4 MINUTOS DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ESCOPOLETINA (A) E DO EXTRATO M80 (B) ...... 84

FIGURA 40 - PERFIS ESPECTRAIS DE UV (200 A 400 NM) NO TR = 9,8 MINUTOS DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO FERÚLICO (A) E DO EXTRATO M80 (B) ...... 84

FIGURA 41 – CROMATOGRAMAS DO EXTRATO DE MACERAÇÃO M80 E SOLUÇÃO DOS PADRÕES DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO, DESTACANDO OS PICOS NOS TEMPOS DE RETENÇÃO CORRESPONDENTE...... 85

FIGURA 42 – CURVA DE CALIBRAÇÃO DO ÁCIDO CAFEICO POR CALIBRAÇÃO EXTERNA ...... 86

FIGURA 43 – CURVA DE CALIBRAÇÃO DA ESCOPOLETINA POR PADRONIZAÇÃO EXTERNA ...... 87

FIGURA 44 – CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA ÁCIDO FERÚLICO POR PADRONIZAÇÃO EXTERNA ...... 87 FIGURA 45 – CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO DETERMINADO POR CLAE-DAD NOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO, SOXHLET E TURBÓLISE ...... 95

FIGURA 46 – PLACA CROMATOGRÁFICA SOB REVELADOR: LUZ UV DE 365 NM E FASE MÓVEL 1 TENDO AS BANDAS DE PQ (PADRÃO QUERCETINA), PM (PADRÃO MALVIDINA 3-O-GLICOSIDEA), M70, I, S70 E T70...... 96

FIGURA 47 – ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS DIFERENTES EXTRATOS DE MALVA SYLVESTRIS NA REGIÃO ESPECTRAL CORRESPONDENTE A COMPOSTOS ALIFÁTICOS (0,6 A 3,0 PPM) ...... 97

FIGURA 48 - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS DIFERENTES EXTRATOS DE MALVA SYLVESTRIS NA REGIÃO ESPECTRAL CORRESPONDENTE AOS AÇUCARES (3,2 A 5,0 PPM) ...... 98

FIGURA 49 - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS DIFERENTES EXTRATOS DE MALVA SYLVESTRIS NA REGIÃO ESPECTRAL DE AROMÁTICOS (4,5 A 9,5 PPM) ...... 99

FIGURA 50 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS M100, M50, M70, M80 E M90, RESPECTIVAMENTE, OBTIDOS EM 348 NM...... 100

FIGURA 51 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS M70, S70 E T70, OBTIDOS EM 348 NM ...... 100

FIGURA 52 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS GLICÓLICOS COMERCIAIS DE MALVA SYLVESTRIS, DE LOTES DIFERENTES E FORNECEDORES DIFERENTES OBTIDOS EM 348 NM...... 101

FIGURA 53 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS M50, M70, M80, M90 E M100 GERADOS POR CLAE-EM, TIC MODO POSITIVO...... 102

FIGURA 54 – GRÁFICO DE SCORES DOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO M50 (1, 2 E 3), M70 (4, 5 E 6), M80 (7, 8 E 9), M90 (10, 11, E 12) E M100 (13, 14 E 15) APÓS PRÉ PROCESSAMENTO ALISAMENTO REPRESENTADO EM PC1 X PC2 EXPLICANDO 98,33% DOS DADOS ...... 103

FIGURA 55 – GRÁFICO DE LOADING DE PC 1 (LINHA CHEIA) E PC2 (LINHA PONTILHADA) DOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO...... 104

FIGURA 56 – GRÁFICO DE SCORES DOS EXTRATOS DE S70 (1 A 3), T70 (4 A 6) E M70 (7 A 9), APÓS PRÉ PROCESSAMENTO ALISAMENTO REPRESENTADO EM PC2 X PC1 EXPLICANDO 99,26% DOS DADOS ...... 104

FIGURA 57 - GRÁFICO DE LOADING DE PC 1 (LINHA CHEIA) E PC2 (LINHA PONTILHADA) DOS EXTRATOS DE SOHXELT, TURBÓLISE E MACERAÇÃO. .. 105

FIGURA 58 – GRÁFICO DE SCORES DOS EXTRATOS COMERCIAIS (+) E EXTRATOS DE MACERAÇÃO (●) APÓS PRÉ PROCESSAMENTO ALISAMENTO, SENDO UTILIZADO PC1, PC2 E PC3 PARA EXPLICAR 99,17% DOS DADOS ... 106

FIGURA 59 – GRÁFICO DE LOADING DE PC1 (LINHA CHEIA), PC2 (LINHA PONTILHADA) E PC3 (LINHA TRACEJADA) DOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO E EXTRATOS COMERCIAIS DE MALVA SYLVESTRIS ...... 106

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – CONCENTRAÇÃO DOS PADRÕES DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO ADICIONADOS AOS EXTRATOS M80 PARA A AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE...... 55

TABELA 2 – CONCENTRAÇÕES DOS METABÓLITOS ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO UTILIZADAS NA AVALIAÇÃO DE LINEARIDADE ...... 56

TABELA 3 – VALORES DE ÁREAS, EQUAÇÕES DA RETA E CONCENTRAÇÕES OBTIDAS DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO NO EXTRATO M80 SEM FORTIFICAÇÃO ...... 57

TABELA 4 – VALORES CORRESPONDENTE A 25, 50 E 100% DA CONCENTRAÇAO DOS METABÓLITOS ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO OBTIDOS NO EXTRATO M80 SEM FORTIFICAÇÃO ...... 57

TABELA 5 – CONCENTRAÇÕES DAS AMOSTRAS TRABALHADAS NOS PARAMETROS DE PRECISÃO E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA ...... 58

TABELA 6 – CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS DA ROBUSTEZ ...... 59

TABELA 7 – SISTEMAS PARA ANÁLISE EM CCD ...... 60

TABELA 8 – RENDIMENTO OBTIDO NOS DIFERENTES MODOS EXTRATIVOS . 63

TABELA 9 – INCLINAÇÃO DO GRADIENTE: MÉTODO 1 ...... 66

TABELA 10 – INCLINAÇÃO DO GRADIENTE: MÉTODO 2 ...... 67

TABELA 11 – SISTEMA GRADIENTE MÉTODO 3 ...... 67

TABELA 12 – SISTEMA GRADIENTE DO MÉTODO 4 ...... 68

TABELA 13 – TEMPO DE RETENÇÃO E COMPRIMENTO DE ONDA DE MONITORAMENTO DOS METABÓLITOS PESQUISADOS ...... 69

TABELA 14 – FAIXA DE TRABALHO ATRIBUIDA PARA ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO ...... 80

TABELA 15 – NÍVEIS DE CONCENTRAÇÃO AVALIADOS NA ESPECIFICIDADE, VALORES: BAIXO, MÉDIO E ALTO E AS ÁREAS OBTIDAS NO CROMATOGRAMA DE CADA UMA DAS AMOSTRAS...... 81

TABELA 16 – RESULTADOS DE LD E LQ DETERMINADOS PARA ÁCIDO

CAFEÍCO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO ...... 85 TABELA 17 – ANÁLISE DE PRECISÃO DO ÁCIDO CAFEICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO ...... 88

TABELA 18 - ANÁLISE DE PRECISÃO DO ESCOPOLETINA EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO ...... 89

TABELA 19 - ANÁLISE DE PRECISÃO DO ÁCIDO FERÚLICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO ...... 89

TABELA 20 - ANÁLISE DE PRECISÃO ANALISTA 2 DO ÁCIDO CAFEICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO ...... 90

TABELA 21 - ANÁLISE DE PRECISÃO ANALISTA 2 DO ESCOPOLETINA EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO ...... 90

TABELA 22 - ANÁLISE DE PRECISÃO ANALISTA 2 DO ÁCIDO FERÚLICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO ...... 90

TABELA 23 – DESVIO PADRÃO RELATIVO ENCONTRADO ENTRE AS PRECISÕES EM CADA UMA DAS CONCENTRAÇÕES ANALISADAS ...... 91

TABELA 24 – DADOS DA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO PARA ÁCIDO CAFEICO. .... 92

TABELA 25 – DADOS DA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO PARA ESCOPOLETINA ..... 92

TABELA 26 – DADOS DA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO PARA ÁCIDO FERÚLICO ... 92

TABELA 27 – ANÁLISE DE ROBUSTEZ – DADOS DE RECUPERAÇÃO DO ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO ...... 93

TABELA 28 – CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO DETERMINADO POR CLAE-DAD NOS EXTRATOS COMERCIAIS ..... 95

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÔNIMOS

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária CCD: Cromatografia em camada delgada CE: Collision energy CEP: Cell entrance potencial CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-DAD: CLAE com detector de arranjo de diodos CLAE-EM/EM: CLAE acoplada ao espectrometro de massas com recursos tandem CLAE-EM: CLAE acoplada ao espectrometro de massas CUR: Curtain gas CV: Coeficiente de variação CXP: Cell exit potencial DP: Declustering potencial DPR: Desvio padrão relativo EC: Extrato glicólico de Malva sylvestris adquirido comercialmente EP: Entrance potencial EPM: Escola Paulista de Medicina ESI: Ionização por eletrospray GS1: Nebulizer gas GS2: Turbo gas I: Extrato aquoso de infusão ICH: International Conference on Harmonisation IS: Ionization spray voltage LD: Limite de detecção LQ: Limite de quantificação m/z: Razão massa carga M100: Extrato hidroalcoolico de maceração extraído com etanol 100% (v/v) M50: Extrato hidroalcoolico de maceração extraído com etanol 50% (v/v)

M70: Extrato hidroalcoolico de maceração extraído com etanol 70% (v/v) M80: Extrato hidroalcoolico de maceração extraído com etanol 80% (v/v) M90: Extrato hidroalcoolico de maceração extraído com etanol 90% (v/v) OMS: Organização Mundial da Saúde PC: Componente Principal PCA: Análise de Componente Principal PM: Padrão de malvidina 3-O-glicosideo PQ: Padrão de quercetina Q: Quadrupolo RDC: Resolução da Diretoria Colegiada RE: Resolução RENAFITO: Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos RENISUS: Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS RMN de 1H: Espectrometria de ressonância magnética nuclear de 1H S/N: Relação sinal ruído S70: Extrato hidroalcoolico via soxhlet extraido com etanol 70% (v/v) SUS: Sistema Único de Saúde T70: Extrato hidroalcoolico via turbólise extraido com etanol 70% (v/v) TEM: Temperatura da fonte Tr: Tempo de retenção UV: Ultravioleta

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 18 1.1 OBJETIVO GERAL ...... 20

1.2 Objetivos específicos ...... 20

2 REVISÃO DA LITERATURA ...... 22 2.1 Malva sylvestris ...... 22

2.1.1 Aspectos botânicos e etnobotânicos ...... 22 2.1.2 Constituição fitoquímica ...... 24 2.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO ...... 34

2.2.1 Maceração ...... 35 2.2.2 Soxhlet modificado ...... 35 2.2.3 Turbólise ou Turbo extração ...... 36 2.2.4 Infusão ...... 37 2.3 ANÁLISES DE CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS – Fingerprint ...... 37

2.3.1 Cromatografia de Camada Delgada – CCD ...... 38 2.3.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE ...... 38 2.3.3 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H – RMN de 1H42 2.3.4 Análise de Componentes Principais – PCA ...... 43 2.4 ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DOS EXTRATOS ...... 43

2.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ...... 45

2.5.1 Especificidade...... 45 2.5.2 Linearidade ...... 46 2.5.3 Intervalo ...... 46 2.5.4 Precisão ...... 47 2.5.5 Exatidão ...... 48 2.5.6 Robustez ...... 49 3 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 50 3.1 MATERIAL VEGETAL ...... 50

3.2 EXTRATOS ...... 50

3.2.1 Extração por Maceração ...... 50 3.2.2 Extração por Soxhlet modificado ...... 51 3.2.3 Extração por Turbólise ...... 51 3.2.4 Extração por Infusão ...... 52 3.3 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALITICO POR CLAE-DAD...... 52

3.3.1 Equipamento, colunas, sistema cromatográfico ...... 52 3.3.2 Seleção dos metabólitos a serem pesquisados ...... 53 3.3.3 Preparo dos extratos ...... 53 3.4 PADRÕES ANALITICOS ...... 54

3.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALITICO...... 54

3.5.1 Especificidade...... 55 3.5.2 Limite de detecção e quantificação ...... 55 3.5.3 Linearidade ...... 56 3.5.4 Exatidão ...... 56 3.5.5 Precisão e precisão intermediária ...... 57 3.5.6 Intervalo ...... 58 3.5.7 Robustez ...... 58 3.6 ANÁLISES DE CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS – ANÁLISE DE FINGERPRINT ...... 59

3.6.1 Análise em cromatografia em camada delgada - CCD ...... 59 3.6.2 Análise em Espectrômetro de RMN de 1H ...... 60 3.6.3 Análise em CLAE-DAD ...... 60 3.6.4 Análise em CLAE-EM, CLAE-EM/EM e Quimiometria - PCA ...... 61 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 63 4.1 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ...... 63

4.2 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO EM CLAE-DAD64

4.2.1 Seleção dos metabólitos a serem monitorados por CLAE-DAD ...... 69 4.2.2 Determinação da faixa de trabalho ...... 79 4.3 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO...... 80

4.3.1 Especificidade...... 80

4.3.2 Limite de detecção e limite de quantificação ...... 85 4.3.3 Linearidade ...... 86 4.3.4 Intervalo ...... 88 4.3.5 Precisão ...... 88 4.3.6 Exatidão ...... 91 4.3.7 Robustez ...... 93 4.4 QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO NOS EXTRATOS DE Malva sylvestris ...... 94

4.5 ANALISE DE CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS – ANÁLISE DE FINGERPRINT ...... 96

4.5.1 Análises em CCD ...... 96 4.5.2 Análise em RMN de 1H ...... 97 4.5.3 Análise comparativa dos extratos através de CLAE-DAD ...... 99 4.5.1 Análise comparativa dos extratos através CLAE-EM ...... 101 5 CONCLUSÃO ...... 108 REFERÊNCIAS ...... 111

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais e fitoterápicos, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico foi oficialmente reconhecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1978, quando realizou uma conferência em Alma-Ata, antiga União das Repúblicas Socialistas Soviéticas. A OMS reconhece que 80% da população dos países em desenvolvimento são usuários de práticas tradicionais nos cuidados básicos em saúde. Estima-se que 85% dessa população utiliza plantas medicinais ou produtos relacionados (ALONSO, 1998). O governo brasileiro, na figura do Ministério da Saúde e tendo em vista a falta de informação a respeito das plantas medicinais, implantou em 1973 o primeiro projeto de pesquisa intitulada “Screening Farmacológico de Plantas Brasileiras”. Este projeto foi realizado pela Escola Paulista de Medicina (EPM) com o objetivo de estudar a ocorrência de eventual atividade farmacológica em extratos de espécies vegetais brasileiras (BRASIL, 2006b). O governo federal aprovou o Decreto N˚ 5.813, de 22 de junho de 2006, que apresenta a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos visando “garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional”. Para promover esta política está sendo elaborada a Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (RENAFITO) disponibilizados no âmbito do SUS, onde a prioridade está em espécies da flora brasileira sem risco de extinção e plantas que se adaptaram ao ecossistema nacional. Paralelamente, existe a Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) constituída de espécies vegetais com potencial de avançar nas etapas da cadeia produtiva e de gerar produtos de interesse ao SUS e auxiliar na elaboração da RENAFITO. A RENISUS é constituída por plantas medicinais que interessam ao SUS por serem nativas ou exóticas adaptadas, amplamente utilizadas pela população brasileira, e apresenta também evidências para indicação de uso na atenção básica da saúde (BRASIL, 2006a).

A RENISUS é composta por 71 espécies de plantas medicinais no qual está a Malva sylvestris, alvo do presente estudo. No entanto, nem todas as plantas que compõem a RENISUS apresentam estudos que asseguram a livre utilização, para isso é necessário confirmar a segurança e a eficácia, a indicação de uso, a forma farmacêutica mais adequada e também viabilizar a possibilidade de cultivo e produção. No anexo I da resolução ANVISA - RDC de 10 de março de 2010, consta uma lista de plantas medicinais notificadas como produtos de venda isenta de prescrição médica com informações do uso tradicional. A M. sylvestris consta nessa lista, com a indicação terapêutica de tratamento de afecções respiratórias, como expectorante via oral, e também para tratamento de contusões e processos inflamatórios da boca e garganta, uso tópico bochechos e gargarejos. As partes utilizadas são unicamente as folhas e flores preparadas em forma de infusão (BRASIL, 2010c). Existem no mercado nacional alguns medicamentos para tratamento de afecções bucais, por exemplo, a Malvatricim® para o tratamento da gengivite, que possui extrato fluido de M. sylvestris em sua composição. Assim como os produtos industrializados, os produtos de origem vegetal também tem a necessidade de comprovação da sua qualidade. O controle de qualidade é realizado desde a droga vegetal, sendo estendido aos produtos intermediários ou derivados vegetais, como extratos, além do produto acabado. Para isto, é necessário um ou mais métodos para análise. De acordo com a resolução que dispõe sobre as Boas práticas de fabricação de medicamentos, RDC n˚ 17 de 16 abril de 2010 (ANVISA), no que se refere ao controle de qualidade para medicamentos fitoterápicos, quando não há monografias farmacopêicas disponíveis com marcadores químicos definidos para quantificação é necessário selecionar e identificar marcadores adequados. A escolha dos marcadores deve ser justificada, pelos seguintes critérios: ser característico ou único para o extrato vegetal, estando este relacionado ao efeito terapêutico, ser uma substância com estrutura química estabelecida, estar presente na preparação da droga vegetal e no produto acabado em quantidade suficiente para permitir a sua quantificação e ser suficientemente estáveis sob as condições de armazenamento e uso do produto final e não estar presente em outras plantas contidas no produto

acabado. Quando é necessário quantificar seletivamente o conteúdo de uma planta ou preparado vegetal em um produto com multicomponentes, o marcador deve estar comercialmente disponível ou ser passível de isolamento. Na ausência de uma substância específica selecionada, devem-se quantificar vários marcadores e estabelecer uma relação fixa entre eles, que caracterize o extrato (BRASIL, 2010a). Sabendo da inexistência de um método quantitativo para o marcador indicado pela farmacopéia brasileira na monografia das folhas de Malva sylvestris, e também a crescente utilização da malva como componente de formulações farmacêuticas e, ainda, para que estes produtos possam ser registrados como fitoterápicos e desta forma garantir sua qualidade, este trabalho teve como objetivo determinar o perfil cromatográfico do extrato seco obtido a partir das folhas, e desenvolver e validar um método analítico quantitativo para os metabólitos presente nos extratos hidroalcoolicos de folhas de Malva sylvestris e também nos extratos comercializados. Desta forma, este estudo buscou contribuir para a qualidade e segurança dos produtos fitoterápicos o que vem de encontro com a política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos do Ministério da Saúde, cujo objetivo não é só disponibilizar uma alternativa terapêutica de menor custo, mas também de qualidade.

1.1 OBJETIVO GERAL

Identificar e quantificar alguns dos metabólitos secundários da Malva sylvestris presente no extrato de folhas e em especialidades farmacêuticas.

1.2 Objetivos específicos

 Obter extratos por diferentes técnicas e com líquidos extratores diferentes. E compará-los através de análises por: cromatografia em camada delgada (CCD), espectrometria de ressonância magnética nuclear de 1H (RMN de 1H),

cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de fotodiodos (CLAE-DAD) e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada em espectrômetro de massas (CLAE-EM) associada a análise quimiométrica;  Avaliar a qualidade dos extratos pelo perfil cromatográfico;  Desenvolver em validar um método por CLAE-DAD para quantificação de metabólitos presentes no extrato de Malva sylvestris;  Aplicar o método em extratos glicólicos, tinturas e hidroalcoolicos de Malva sylvestris comercializados.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Malva sylvestris

2.1.1 Aspectos botânicos e etnobotânicos

A planta estudada pertence à classe Equisetopsida, subclasse Magnollidae, super ordem Rosanae, ordem Malvales, família Malvaceae, gênero Malva e espécie Malva sylvestris L. (TROPICOS.ORG, 2010). A família Malvaceae está distribuída em praticamente toda região tropical, incluindo cerca de 250 gêneros e 4.200 espécies. No Brasil, ocorrem cerca de 80 gêneros e 400 espécies sendo a família uma valiosa fonte de fibras, alimentos, bebidas, fármacos, madeira e paisagismo (EMBRAPA, 2010). Originalmente encontrada na Europa e norte da Ásia, a M. sylvestris é uma planta herbácea, que cresce em encostas e solos modificados devido ao poder de penetração das suas raízes e também exige clima temperado para seu desenvolvimento. Dentro dos países da América ela se desenvolve espontaneamente sendo cultivada nos países europeus, onde é largamente utilizada para fins medicamentosos ou como alimento (QUAVE et al., 2008). Segundo monografia da planta, a droga vegetal M. sylvestris é constituída de folhas, contendo de 6,0 a 8,0% de mucilagem. Possui nomes populares malva selvagem, malva maior, malva branca, malva grande, malva das boticas, malva de casa, malva verde, malva oficial, malva vulgar e malva silvestre (BRASIL, 2000). A droga apresenta odor fraco característico. A descrição mascroscópica das folhas apresenta as seguintes características: folhas simples, membranáceas, pubescentes em ambas as faces, aveludadas, verdes mesmo quando secas, longamente pecioladas, orbiculares a reniformes, palminérveas, lobadas com 3,5,7- 9 lóbulos pouco profundos, de ápice arredondado ou agudo, de base truncada a subcordiforme, margem dentadocrenada, medindo 7 cm a 15 cm de diâmetro. Como descrição microscópica apresenta na secção transversal, epiderme uniestratificada e mostra-se anfiestomática, apresenta nas duas faces células

diferenciadas contendo mucilagem e drusas de oxalato de cálcio ocorrendo nas camadas parenquimáticas. Na secção frontal, ambas as faces da epiderme apresentam células poligonais de paredes marcadamente sinuosas, células mucilaginosas, estômatos anomocíticos e tricomas (PHARMACOPOEIA, 1993; BRASIL, 2000). Segundo estudos etnobotânicos a planta pode ser utilizada inteira, as partes aéreas, somente as folhas, flores ou raízes isoladamente. A M. sylvestris é utilizada na forma de decocto, infusão, cataplasma e também associada a outras espécies de plantas medicinais, potencializando desta forma os efeitos terapêuticos esperados (PIERONI et al., 2004; MOTTI;ANTIGNANI;IDOLO, 2009). A utilização da M. sylvestris, tem como principal aplicação tratamentos contra distúrbios gastrointestinais como diarréia e dores estomacais, (LEPORATTI;CORRADI, 2001; ISHTIAQ et al., 2007; PASSALACQUA;GUARRERA;DE FINE, 2007; CONFORTI et al., 2008; CORNARA et al., 2009; JEAMBEY et al., 2009), problemas dermatológicos como irritações de pele, (LOI et al., 2004; GONZALEZ-TEJERO et al., 2008; LEONTI et al., 2009; CAUCHARD et al., 2010) desordens urogenitais e cólicas abdominais, (SCHERRER;MOTTI;WECKERLE, 2005; LARDOS, 2006; CORNARA et al., 2009; IDOLO;MOTTI;MAZZOLENI, 2010) distúrbios respiratórios (FRANOVA;NOSALOVA;MOKRY, 2006) e inflamações superficiais, entre estas bucais (CONFORTI et al., 2008; MARC et al., 2008; POLLIO et al., 2008; IDOLO;MOTTI;MAZZOLENI, 2010). Estudos que relacionam a M. sylvestris com a inflamação mostram que a espécie possui atividade antiinflamatória comprovada pelo modelo de indução do edema de patas com carragenina, dando indícios de que a planta na concentração de 5% é suficiente para redução do edema, quando aplicada topicamente (CHICLANA;ENRIQUE;CONSOLINI, 2009). Ainda com relação a atividade biológica de M. sylvestris foi realizado estudo onde verificou-se o efeito bacteriostático das antocianidinas existente na espécie, frente a Staphylococcus aureus, quando utilizadas em alta concentração em torno de 30 g/L. Enquanto que para Escherichia coli e Aspergillus niger as antocianidinas, mostraram efeito inverso, um aumento do crescimento das colônias (CHENG;WANG, 2006). Outro estudo envolvendo atividade antimicrobiana testando

extrato etanólico de malva demonstrou eficiência apenas para Saccharomyces cerevisiae (COELHO DE SOUZA et al., 2004) A M. sylvestris é indicada no meio odontológico para o tratamento de inflamações gengivais, o extrato de M. sylvestris é frequentemente utilizado na composição de enxaguatórios bucais com finalidade de tratamento de genvite. Em trabalho envolvendo o extrato hidroalcoólico de M. sylvestris no modelo animal de ratos foram induzidas doenças periodontais e foi constatado que a planta estudada apresentou melhoras consideráveis no que diz respeito a estas patologias (LODDI, 2008). Ainda no campo odontológico, foi testado in vitro o extrato de M. sylvestris no controle do crescimento de bactérias de placa dentária, demonstrando que esta possui propriedades bacteriostáticas sob a placa bacteriana (BUFFON et al., 2001). Também foi estudada a atividade antimicrobiana, antiaderente e antifúngica in vitro de M. sylvestris sobre microrganismos do biofilme dental e cepas do gênero Candida. Neste estudo a malva mostrou-se efetiva na inibição da síntese de glucanos, sobre todos os microrganismos analisados e apresentou atividade antifúngica frente as quatro cepas testadas (ALVES et al., 2009). Já em estudos comparativos de dentifrícios contendo extrato de malva frente aos microrganismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli não foi atribuído o efeito antimicrobiano a presença de extrato de malva, e sim a outros compostos utilizados na formulação que são reconhecidamente antimicrobianos de amplo espectros como o triclosan e própolis (SOUZA-GUGELMIN et al., 2006; DITTERICH et al., 2007).

2.1.2 Constituição fitoquímica

A Farmacopéia Brasileira 4˚ edição no fascículo 2, apresenta a monografia para as folhas de M. sylvestris, onde descreve aspectos morfológicas e microscópicas das folhas, e apresenta como marcador fitoquímico para identificação da espécie o composto malvidina monoglicosídeo (Malvidina 3-O-glicosídeo) Figura 1 - MALVIDINA 3-O-GLICOSÍDEO , pertencente a classe das antocianidinas.

OCH3

+ HO O OCH3

O OH HO

OH HO OH FIGURA 1 - MALVIDINA 3-O-GLICOSÍDEO

Diferentes estudos relatam a presença de outros compostos na M. sylvestris entre metabólitos primários e secundários: flavonoides (TAKEDA et al., 1989; POURRAT;TEXIER;BARTHOMEUF, 1990; SIKORSKA;MATLAWSKA;FRANSKI, 2004), derivados de aminoácidos (BLUNDEN et al., 2001; CLASSEN;BLASCHEK, 2002), açúcares (BARROS;CARVALHO;FERREIRA, 2010), terpenóides (REDZIC;HODZIC;TUKA, 2005; CUTILLO et al., 2006), ácidos fenólicos (CUTILLO et al., 2006; BARROS;CARVALHO;FERREIRA, 2010), ácidos graxos (EMETS et al., 1994), cumarinas (TOSI et al., 1995; ALESIANI et al., 2007) e elementos químicos inorgânicos (GUERRERO;MADRID;ISASA, 1999; HICSONMEZ et al., 2009; DESIDERI;MELI;ROSELLI, 2010).

2.1.2.1 Flavonóides

De modo geral, flavonóides constituem uma importante classe de polifenóis, presentes em relativa abundância entre os metabólitos vegetais, além de representar um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural (SIMÕES et al., 2000). Constituem um grupo de pigmentos vegetais de ampla distribuição na natureza. Sua presença nos vegetais parece estar relacionada com funções de defesa (proteção contra raios ultravioleta, ações antifúngica e antibacteriana) e de atração de polinizadores. As principais categorias

estruturais gerais são flavonas, isoflavonas, flavanonas, flavonóis, antocianidinas, antocianinas, derivados glicosilados, metilados, acilados, prenilados ou sulfatados (ROBBERS;SPEEDIE;TYLER, 1997). Entre os flavonóides que são encontrados na M. sylvestris estão as antocianidinas: malvidina 3-O-glicosídeo; cloridrato de malvina; malvidina 3,5- diglicosideo; delfinidina 3-O-glicosídeo; (TAKEDA et al., 1989; POURRAT;TEXIER;BARTHOMEUF, 1990; SCHULZ;BARANSKA, 2007); e flavonóides agliconas, como a quercetina; apigenina; genisteina e miricetina (FARINA et al., 1995; SIKORSKA;MATLAWSKA;FRANSKI, 2004; DANIELA et al., 2007); As antocianidinas estão distribuídas em diversas famílias vegetais, são em grande parte responsáveis pelas cores laranja, rosa, escarlate, vermelho, violeta e azul das pétalas das flores e frutos de vegetais superiores. Os flavonóides agliconas são flavonóides sem o açúcar, representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificado entre os produtos de origem natural. O interesse econômico dos flavonóides é decorrente de suas diferentes propriedades e utilizações como em tanagem do couro, na fermentação do chá e contribuições em nutrição, além disso possui importância farmacológica, resultado de algumas propriedade importantes atribuídas a alguns representantes da classe, como por exemplo: anticarcinogênico, antiinflamatório, antialérgico, antiulcerogênico, antivirais entre outros (SIMÕES et al., 2000). Alguns compostos encontrados na M. sylvestris foram particularmente pesquisados por demonstrar interesses farmacológicos dentro do propósito do estudo.

2.1.2.1.1 Malvidina 3-O-glicosideo e Malvidina 3,5-diglicosideo

A malvidina 3-O-glicosideo (oenin, figura 1) e malvidina 3-5-diglicosideo (malvin, figura 2) são relatados como agentes de ação antiinflamatória por inibir a liberação da IL-6 (LIN;LI;HWANG, 2008). O composto monoglicosilado apresenta ainda ação hipoglicemiante quando testado em ratos (GRACE et al., 2009).

A malvidina 3,5-diglicosideo foi considerada com melhor ação antitumoral em carcinoma gástrico, quando comparada com a malvidina 3-O-glicosideo, por induzir mais eficazmente a apoptose das células neoplásicas (SHIH;YEH;YEN, 2005). Este composto possui também atividade antimicrobiana frente a Streptococcus mutans responsável pela formação de biofilme e desenvolvimento de cáries (ESMAEELIAN et al., 2007).

OCH3

+ HO O OCH3

O HO HO O O O OH OH

HO HO OH OH FIGURA 2 - MALVIDINA 3,5 – DIGLICOSÍDEO

2.1.2.1.2 Quercetina

Quercetina (3,3’-4’,5-7-pentahidroxilflavona), representada na Figura 3, (The Merck Index 1996) é um flavonóide encontrado em diversas famílias de plantas. Apresenta ação antioxidante (IOKU et al., 1995) e hepatoprotetora contra agentes agressores externos (LIU et al., 2010). Em tratamento de lesões gástricas apresentou ação antihistamínica através da redução da sua liberação. Foi observada também, ação antioxidante da substância sobre lesões induzidas por etanol (KAHRAMAN et al., 2003). Em estudo como antiinflamatório a quercetina apresentou ainda leve efetividade quanto a redução de edemas e nódulos (GUARDIA et al., 2001).

HO O

OH O FIGURA 3 - QUERCETINA (3,3-4-5,7-PENTAHIDROXIFLAVONA)

2.1.2.1.3 Kaempferol

Kaempferol (3,4’5,7 – tetrahidroxiflavone), representada na figura 4 (The Merck Index 1996) é um dos flavonóides comuns encontrados em diversas plantas sendo um dos componentes ativos, tem seu uso associado à atividade antitumoral, demonstrou-se como um inibidor de crescimento tumoral quando utilizado no tratamento de câncer bucal (HELTON et al., 2008). Em outro estudo kaempferol apresentou-se como um excelente agente químico de prevenção ao câncer de pele (LEE et al., 2010). OH

HO O

OH O

FIGURA 4 - KAEMPFEROL (3,4’,5,7-TETRAHIDROXIFLAVONE)

2.1.2.1.4 Apigenina

Apigenina (4’-5,7 trihidroxiflavona), representada na Erro! Fonte de referência ão encontrada., (The Merck Index 1996). Dentre as diferentes atribuições farmacológicas especificamente a apigenina inibe os mediadores da inflamação, tais como óxido nítrico e prostaglandina E2, em inflamação periodontal (JEONG et al., 2009). Ainda induz o relaxamento gástrico em ratos adultos machos, bloqueando o influxo de íon cálcio (ROTONDO;SERIO;MULE, 2009). Outro estudo relaciona apigenina a prevenção de complicações da diabetes como doenças vasculares ateroscleróticas por regulação da ativação de NF-kB (YAMAGATA et al., 2010)

HO O

OH OH

FIGURA 5 – APIGENINA (4’,5,7-TRIHIDOXIFLAVONA)

2.1.2.2 Alcalóides derivados de aminoácidos

Os alcalóides formam um grande grupo de produtos naturais de grande interesse farmacológico, muitos destes compostos exercem potentes efeitos fisiológicos nos mamíferos. A ação farmacológica dos alcalóides varia muito, podendo ter ação analgésica, estimulante do sistema nervoso central e elevação da pressão sanguinea. A biossíntese de muitas estruturas alcaloídicas pode ser representada por reações químicas simples com aminoácidos, os mais freqüentes são a fenilalanina, tirosina, triptofano, histidina, ácido antranilico, lisina e ornitina (ROBBERS;SPEEDIE;TYLER, 1997) Os derivados de aminoácidos observados na M. sylvestris são a

glicinobetaína (Figura 6) e a trigonelina (Figura 7) (BLUNDEN et al., 2001; CLASSEN;BLASCHEK, 2002);

O O H C H C 3 3 + N O- + N O-

H3C CH3 FIGURA 6 – GLICINOBETAÍNA FIGURA 7 – TRIGONELINA (1 – (TRIMETILGLICINA) METILPIRIDINIUM 3 CARBOXILADO)

2.1.2.3 Açúcares

Os polissacarídeos são produzidos em grande quantidade nas folhas dos vegetais como forma de armazenamento. Os açucares são citados como os principais componentes da mucilagem foliar, compreendendo a glicose, frutose, sucralose, trealose, arabinose, galactose, ácido glucurônico e ácido galacturônico (FRANZ, 1966; TOMODA et al., 1989; CLASSEN;AMELUNXEN;BLASCHEK, 1998; FRANOVA;NOSALOVA;MOKRY, 2006; BARROS;CARVALHO;FERREIRA, 2010).

2.1.2.4 Terpenóides

Os terpenóides distribuem-se amplamente na natureza e são encontrados em abundância nas plantas, além de ocorrerem também em fungos e organimos marinhos. São encontrados em ferormônios de insetos e em suas secreções de defesa. Os terpenóides são subdivididos de acordo com o numero de unidades de isoprenos podendo ser monoterpenóides com duas unidades de isoprenos, sesquiterpenóides com três unidades de isopreno, diterpenóides com 4 unidades, triterpenóides com 6 unidades e os tetraterpenóides ou carotenóides com 8

unidades de isopreno (ROBBERS;SPEEDIE;TYLER, 1997). Os terpenóides encontrados na M. sylvestris abrangem os compostos (6R,7E,9S)-9-hidroxi-4-7-megastigmadien-3-one blumenol A, (+)-dehidrovomfoliol, licopeno, β-caroteno, linalool e xantofila (CUTILLO et al., 2006; BARROS;CARVALHO;FERREIRA, 2010);

2.1.2.5 Ácidos fenólicos

Ácidos fenólicos caracterizam-se por apresentarem um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila ou metoxila na molécula, conferindo propriedades antioxidantes. Ácidos fenólicos ocorrem abundantemente em diferentes espécies vegetais, na forma de éteres, ésteres e também na forma livre, farmacologicamente ativos são reconhecidos como antioxidantes, antimutagênicos e agente anticarcinogênico (SHAHRZAD;BITSCH, 1996). Os principais compostos desta classe de metabólitos são ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido clorogênico. Derivados fenólicos encontrados na espécie estudada são constituídos pelos ácidos: 4-hidroxibenzóico, 4-metoxibenzóico, 4-hidroxi-3-metoxibenzóico, 2- hidroxibenzóico, 4-hidroxi-2-metoxibenzóico, 4-hidroxi dihidrocinamico, 4-hidroxi-3- metoxi dihidrocinamico, , 4-hidroxicinamico e ácido ferúlico e os álcools 4- hidroxibenzílico e 4-hidroxibenzil tirosol (CUTILLO et al., 2006); Alguns desses compostos de interesse farmacológico foram pesquisados em maiores detalhes como o ácido cafeico e o ácido ferúlico.

2.1.2.5.1 Ácido cafeico

Ácido cafeíco (Figura8) é um produto intermediário da biossíntese da lignina, um dos principais componentes da biomassa. Apresenta in vitro efeito antioxidante, contribuindo desta forma para a prevenção de acidentes cardiovasculares. Estudos

in vitro, mostraram ainda que o ácido cafeíco inibe a produção de compostos de indução carcinogênico e mutagênico protegendo desta forma o DNA (ZITKA et al., 2011). OH

O OH

OH FIGURA 8 – ÁCIDO CAFEICO (ÁCIDO 3-(3,4-DIHIDROXIFENIL-2-PROPENÓICO)

2.1.2.5.2 Ácido ferúlico

Ácido ferúlico (Figura 9) [ácido (E)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)prop-2-enoico], como muitos compostos fenólicos, apresentam efeitos antioxidantes em termos de inibição da peroxidação lipídica. Além disso, as propriedades fotoprotetoras do ácido ferúlico, sobre os queratinócitos humanos, ajudam a prevenir os danos causados por radiação ultravioleta e a carcinogênese da pele (ZITKA et al., 2011).

O H3C OH

HO FIGURA 9 – ÁCIDO FERÚLICO (ÁCIDO (E)-3-(4-HIDROXI-3-METOXIFENOL)PROP-2-ENOICO)

2.1.2.6 Ácidos graxos

Ácidos graxos saturados e poliinsaturados de cadeia longa ou curta, ocorrem principalmente em óleo das sementes da M. sylvestris. Entre os ácidos encontrados podemos citar: linoléico (ômega 6), α-linoléico (ômega 3), palmítico, láurico,

esteárico, capróico, aracdônico e tricosanóico (MUKARRAM;AHMAD;AHMAD, 1984; EMETS et al., 1994; BARROS;CARVALHO;FERREIRA, 2010).

2.1.2.7 Cumarinas

As cumarinas são amplamente distribuídas nos vegetais, mas também podem ser encontradas em fungos e bactérias, são derivadas do metabolismo da fenilalanina, sendo um dos seus primeiros precursores o ácido ρ-hidroxicinâmico. As cumarinas simples possuem odor característico, sendo aplicadas como aromatizante em alimentos industrializados, prática esta considerada adulteração, porém na área de cosméticos e produtos de limpeza ainda são largamente empregadas. Do ponto de vista farmacológico as cumarinas possuem ação anticoagulante, atividade imunossupressora, relaxante vascular, hipolipidêmica e antiespasmódica (SIMÕES et al., 2000) Entre as cumarinas relatadas como identificadas na malva, estão a 5,7- dimetoxicumarina e a escopoletina, encontradas em extratos de folhas de M. sylvestris (TOSI et al., 1995; DANIELA et al., 2007).

2.1.2.7.1 Escopoletina

Escopoletina (6 metoxi-7-hidroxicumarina), representada na figura 10, (The Merck Index 1996) é um composto farmacologicamente ativo. Apresenta ação antiinflamatória, podendo ser isolada de diversas espécies de plantas. Seu mecanismo de ação é diretamente ligada às citocinas que regulam a cascata sinal de inflamação, podendo ser uma excelente opção para o tratamento de inflamações crônicas (MOON et al., 2007). Escopoletina possui ação espamolítica e seu mecanismo é, em partes, atribuído à capacidade de inibir a mobilização de cálcio pelos tecidos sensíveis à norepinefrina (OLIVEIRA et al., 2001). Em estudo realizado por Kim e colaboradores (KIM et al., 2005) a escopoletina mostrou-se uma

alternativa para tratamento de tumores, devido a sua habilidade para induzir apoptose em células leucêmicas. Também nesta mesma linha de tratamentos antitumorais Manuele e colaboradores (MANUELE et al., 2006) afirmaram que a escopoletina possui a propriedade de induzir a proliferação de linfócitos.

CH3 O

HO O O FIGURA 10 – ESCOPOLETINA (6-METOXI-7-HIDROXICUMARINA)

2.1.2.8 Outras substâncias

Foram relatados também, na espécie Malva sylvestris, elementos químicos inorgânicos como cobre, zinco, alumínio, manganês, ferro, cloro, enxofre e iodo (DESIDERI;MELI;ROSELLI, 2010). Além de vitaminas como o retinol (vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e tocoferol (vitamina E) (BARROS;CARVALHO;FERREIRA, 2010);

2.2 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO

Segundo a Farmacopéia Brasileira extrato consiste em uma preparação de consistência líquida, sólida ou intermediária, obtida a partir de material animal ou vegetal. O material utilizado na preparação de extratos pode sofrer tratamento preliminar, tais como, inativação de enzimas, moagem ou desengorduramento. O extrato pode ser preparado por percolação, maceração ou outro método adequado, utilizando como solvente álcool etílico, água ou outro sistema de solvente adequado. Após a extração, materiais indesejáveis podem ser eliminados (BRASIL, 2000).

2.2.1 Maceração

Consiste no processo de extração no qual a droga rasurada, no contato da droga com o solvente extrator durante um período de tempo determinado, sob temperatura ambiente e mediante agitação em intervalos regulares, sem renovação do líquido extrator, não conduz ao esgotamento da planta (SIMÕES et al., 2000). Após o período de maceração, o resíduo é filtrado e prensado, separando-se o extrato do resíduo. O tempo de extração depende da natureza do material vegetal e também do solvente a ser utilizado. Na montagem do sistema, esquematizada na figura11, é necessário que toda a droga esteja embebida pelo líquido extrator, para essa segurança coloca-se o solvente até 3 cm acima do nível da planta, já que este processo destina-se a dissolução dos respectivos constituintes, devendo ser suficientemente prolongada para que os fenômenos de difusão se dêem até se obter igualdade de concentração entre os líquidos situados dentro e fora das células (PRISTA et al., 2008). Após o tempo de maceração o solvente é separado da droga embebida e então é realizado o enxágüe das folhas para que tudo o que foi dissolvido no solvente seja extraído.

FIGURA 11 – ESQUEMA DE MONTAGEM DO SISTEMA DE MACERAÇÃO, MODO CORRETO A, B E C MODO ERRÔNEO D (PRISTA ET AL., 2008)

2.2.2 Soxhlet modificado

Consiste na exaustiva passagem de solvente através da droga triturada, é

realizada em aparelho apropriado, obtém-se facilmente a completa exaustão da droga, o extrato sofre aquecimento durante todo o processo extrativo, é muito útil em processos de extração em laboratório. A figura 12 detalha a montagem do aparato de extração via soxhlet.

FIGURA 12 – ESQUEMA DO SOXHLET MODIFICADO FARMACOTÉCNICO ONDE A REPRESENTA O SISTEMA SOXHLET E B A PLACA DE TEFLON UTILIZADA PARA APOIAR A DROGA NO SISTEMA (CARVALHO ET AL., 2009)

2.2.3 Turbólise ou Turbo extração

A técnica baseia-se na extração com simultânea redução do tamanho de partícula, resultado da aplicação de elevadas forças de cisalhamento, geradas no pequeno espaço compreendido entre o extrator e um rotor de alta velocidade (5000 a 20000 rpm). A redução drástica do tamanho de partícula e o consequente rompimento das células favorecem a rápida dissolução das substâncias ativas. Nessas circunstâncias, a difusão das substâncias dissolvidas através da membrana celular fica relegada a um plano secundário, resultado em tempos de extração da ordem de minutos e o quase esgotamento da droga. A esse incremento da eficiência somam-se a simplicidade, rapidez e versatilidade da técnica, que permitem a fácil utilização dessa técnica em processamentos em pequena e média escala (SIMÕES et al., 2000). O extrato obtido após 15 minutos sob turbólise é equivalente a 5 dias sob maceração seguida de percolação. Algumas desvantagens são observadas nesta técnica, como a dificuldade de separação da droga do solvente por filtração, o próprio movimento do rotor gera

atrito e calor, sendo necessário o controle de temperatura.

2.2.4 Infusão

Trata-se do método macerativo onde o material vegetal entra em contato com água a altas temperaturas, a infusão é mantida a 100˚C durante 15 a 30 minutos.

2.3 ANÁLISES DE CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS – Fingerprint

Perfil cromatográfico de compostos característicos fingerprint é uma das estratégias adotadas para análises de identificação, conhecimento da droga vegetal e avaliação da qualidade, desta forma pode-se dizer que se trata da impressão digital da espécie vegetal ou extrato vegetal. Para este tipo de análise os métodos cromatográficos são altamente recomendados, segundo LIU (2007) a CLAE está envolvida neste tipo de caracterização. A análise cromatográfica para obtenção de fingerprint tem a finalidade de elucidar múltiplos compostos da droga vegetal em um único cromatograma, onde podem ser identificados os marcadores os quais comprovam a qualidade e a autenticidade do material apresentado. A análise de fingerprint é também associada a outras técnicas como Cromatografia em Camada Delgada (CCD), Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN de 1H), Cromatografia Líquida acoplada ao Espectrômetro de Massas (CLAE-EM) entre outras (LIU et al., 2007; LU et al., 2009; WANG et al., 2009; ZHU et al., 2009; TANG et al., 2010). Tendo o perfil cromatográfico ou fingerprint da droga pode ser definido em quais condições de armazenamento e sazonalidade que a droga apresenta o maior número de compostos de interesse farmacológico. Desta forma esta informação pode ser adotada como padrão de qualidade da droga vegetal, comparando apenas os perfis cromatográficos.

2.3.1 Cromatografia de Camada Delgada – CCD

A cromatografia em camada delgada é uma técnica de separação líquido sólido baseada na adsorção entre sólidos e líquidos. Neste caso a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária (DEGANI;CASS;VIEIRA, 1998). O método de cromatografia em camada delgada é destinado, principalmente, a análises qualitativas. Trata-se de um método clássico e largamente utilizado, devido a sua rapidez no tempo de análise para demonstrar os vários constituintes de drogas vegetais, em alguns casos essas análises podem ser ditas semi quantitativas, já que pode ser identificada a classe de substâncias que se tem em maior quantidade (WAGNER;BLADT, 1996). Atualmente esta técnica tem tido avanços, apresentando sistemas de melhores resolução e sensibilidade, como placas para CCD de alta performance com partículas menores compondo a fase estacionária, ou ainda composto por micro emulsão o qual promete reduzir o limite de detecção para análises com plantas medicinais e ainda softwares que calculam a concentração da banda de absorção por densitometria, sendo possível dessa forma torná-la uma técnica quantitativa e é justamente por esse motivo que a CCD é considerada ainda uma ótima ferramenta para o controle de qualidade de drogas vegetais (TISTAERT;DEJAEGHER;HEYDEN, 2011). A análise de fingerprint por CCD, realizada no presente trabalho, teve por finalidade demonstrar as diferenças ou semelhanças entre os métodos de extração empregados na obtenção dos extratos de Malva sylvestris, utilizando-se de métodos específicos para o reconhecimento de diferentes classes de compostos já identificados na espécie em estudo como antocianidinas, flavonóides agliconas e cumarinas.

2.3.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE

A CLAE é uma técnica que a um longo período vem sendo utilizada devido a sua variada abrangência e aplicabilidade (FARIA;COLLINS;JARDIM, 2009).

Consiste em uma das mais importantes técnicas de análise qualitativa de marcadores e nas determinações quantitativas, pois trata-se de uma técnica separativa rápida e robusta, em consequência das colunas cromatográficas e equipamentos de alta tecnologia que se encontram disponíveis. O princípio da cromatografia está baseado nas diferentes interações dos compostos com a fase móvel e a fase estacionária. Estas interações podem ser de natureza física como a sorção, adsorção ou absorção, e são baseados principalmente nas atrações moleculares de intensidades variadas as quais estão sujeitos os diferentes compostos presentes na mistura. De acordo com a natureza desta interação os modos de separação são classificados em cromatografia de fase reversa, de fase normal, de troca iônica e por exclusão (COLLINS;BRAGA;BONATO, 2006; HARRIS, 2008). À medida que estes compostos vão percorrendo o interior da coluna essas interações vão se desfazendo, deste modo ocorre a separação (HARRIS, 2008). O equipamento é composto por alguns módulos como bombas de fluxo constante, injetor de amostra, forno da coluna, detector, interface de dados e computador. Na atualidade, estes módulos são totalmente computadorizados e permitem que alguns parâmetros como temperatura da coluna, vazão de fluxo, e alteração na composição da fase móvel (eluição gradiente) sejam controlados individualmente no equipamento. Os sistemas de detecção utilizados são os mais diversos. Alguns parâmetros como alta sensibilidade, alta seletividade, rapidez de resposta são alguns dos cuidados que se tem na escolha de um sistema de detecção, os detectores mais utilizados são o arranjo de foto diodos, fluorescência, índice de refração, infravermelho, polarímetro e dicroismo circular, eletroquímicos, espalhamento de luz (light-scattering), ressonância magnética nuclear e espectrômetro de massas (CASS;DEGANI, 2001). Para este estudo foi utilizado o detector de arranjos de fotodiodos. As fases estacionárias mais utilizadas em CLAE consistem de cadeias orgânicas de baixa polaridade, octadecilsilano (C18) e octilsilano (C8), e sílica quimicamente ligada. São chamadas colunas de fase reversa, pois consistem de uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas devido à inversão da

seletividade. Representam aproximadamente 85% de todas as aplicações de CLAE. A fase reversa apresenta várias vantagens, tais como: uso de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, como água e metanol; fases estacionárias estáveis de muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel; facilidade de empregar eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boa reprodutibilidade dos tempos de retenção. Além disso, são muito aplicadas à separação de solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas (TONHI et al., 2002; MALDANER;COLLINS;JARDIM, 2010). Em análises de fingerprint a CLAE é uma ferramenta importante justamente por tudo o que esta técnica representa, já foi utilizada para determinar o perfil cromatográfico de espécies como Ginkgo biloba (DING et al., 2008), Hypericum japonicum (YANG et al., 2005) e Salvia miltiorrhiza (LIU et al., 2007).

2.3.2.1 CLAE – DAD

A técnica de CLAE-DAD trata-se da CLAE equipada com detector de absorbância de arranjo de diodos que detecta vários comprimentos de onda simultanemente, na região do UV e visível. O sistema detector são os olhos do cromatógrafo, o funcionamento dos detectores espectrofotométricos baseia-se na absorvância da luz por parte da amostra, ao passar através dela qualquer radiação eletromagnética. Maior parte dos compostos absorvem a radiação UV, incluindo todas as substâncias que tem elétrons π e elétrons desemparelhados, uma dupla ligação adjacente a um átomo contendo elétrons desemparelhados, compostos contendo bromo, iodo ou enxofre, grupo carbonila, grupo nitro, íons orgânicos e duas duplas conjugadas. Este detector em particular possui comprimento de onda variável, devido a composição do arranjo de fotodiodos o qual permite detecção em vários comprimentos de onda simultaneamente. É possível detectar quantidades de amostras da ordem de décimos de nanograma (COLLINS;BRAGA;BONATO, 2006). Em análises de fingerprint a CLAE é uma ferramenta importante justamente por tudo o que esta técnica representa, já foi utilizada para determinar o perfil cromatográfico de espécies como Ginkgo biloba (DING et al., 2008), Hypericum

japonicum (YANG et al., 2005) e Salvia miltiorrhiza (LIU et al., 2007).

2.3.2.2 CLAE-EM

A CLAE-EM é uma técnica em que a cromatografia líquida está hifenada com o espectrômetro de massas que dessa forma combina as vantagens da cromatografia, alta seletividade e eficiência de separação com as vantagens da espectrometria de massas, que é a obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento adicional da seletividade, sendo possível diferenciar íons específicos e amostras na faixa de nanogramas (CHIARADIA;COLLINS;JARDIM, 2008). A técnica de espectrometria de massas está baseada na produção de íons, que são posteriormente separados e filtrados através dos analisadores de acordo com a sua razão massa carga m/z detectada. O espectro de massas resultante é um gráfico da abundância (relativa) dos íons gerados como uma função de m/z (NIESSEN, 2006). Para que amostras liquidas eluidas da CLAE pudesse ser ionizada foi desenvolvida a técnica de ionização por nebulização, nesta técnica o analito encontra-se diluído na fase móvel e passa por um capilar sob pressão atmosférica e alta voltagem, na saída do capilar são formadas pequenas gotas altamente carregadas que são dessolvatadas graças a um fluxo contínuo de gás nitrogênio na saída do capilar. Este processo de dessolvatação tem a finalidade de reduzir ainda mais o tamanho da gota até o ponto em que a força de repulsão entre as cargas similares fica maior que as forças de coesão da fase líquida, ou seja, capaz de promover a “explosão coulômbica” que dará origem a gotas com tamanhos equivalentes a 10% do tamanho original das gotas de onde são produzidos os íons do analito, os quais são transferidos para o interior do espectrômetro de massas por uma série de dispositivos de focalização. Esta técnica pode ser utilizada por compostos com massas molares relativamente grandes, altamente polares que podem ser facilmente ionizáveis (CHIARADIA;COLLINS;JARDIM, 2008). Trata-se de uma técnica destrutiva, e o custo para se manter um equipamento na rotina laboratorial ainda é muito elevada, desse modo neste

trabalho a técnica será apenas mais uma ferramenta de caracterização dos extratos, apesar da sua excelente seletividade.

2.3.3 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H – RMN de 1H

A espectrometria de ressonância magnética nuclear é uma técnica não destrutiva que se baseia na absorção de energia na zona de radiofreqüência, por parte dos núcleos de alguns átomos, quando colocado frente a um campo magnético intenso e de alta homogeneidade. É uma técnica utilizada para identificar compostos, a posição dos sinais e deslocamento químico, estes são dependente do ambiente químico onde o hidrogênio se encontra, o sinal pode ser visto na forma de singleto, dupleto e tripleto este sinal indica o número de hidrogênios vizinhos ao núcleo considerado e a distância entre os sinais informa a intensidade da interação do spin do núcleo considerado em relação aos seus vizinhos. Com estas informações, é possível saber se o hidrogênio está ligado a carbono do tipo sp3, sp2 ou sp, se existe proximidade com grupo hidroxila, carbonila, ligação dupla e etc. Também é possível definir a disposição de hidrogênios cis ou trans em sistemas olefínicos, axial-axilal, axial-equatorial, equatorial-equatorial em sistemas cíclicos, orto, meta e para em anéis aromáticos entre outros. Além disso, adquire-se muitas outras informações estruturais (GÜNTHER, 2001). Vários estudos citam a espectroscopia em RMN de 1H como mais uma ferramenta para a caracterização de extratos, já que esta técnica está intimamente ligada a estudos de caracterização e diferenciação, como apresentado no estudo de Arabidopsis thaliana (WARD et al., 2003) e de Piper regnellii (PESSINI et al., 2005). No presente trabalho esta técnica foi utilizada para diferenciar os extratos obtidos por técnicas diferentes de extração.

2.3.4 Análise de Componentes Principais – PCA

A análise quimiométrica é a aplicação de métodos matemáticos e estatísticos a dados de origens distintas para a obtenção de informação química. A Análise de Componentes Principais (PCA) é um método estatístico multivariado, utilizado para compressão de dados sem perda de informações relevantes. A análise é desenvolvida de maneira que os conjuntos de dados possam ser representados por um número reduzido de novas variáveis chamadas de componentes principais (PC), que são combinações lineares das variáveis originais. A primeira componente (PC1) é definida na direção de máxima variância do conjunto de dados. A PC2 é definida na direção que descreve a máxima variância no espaço da PC1, de forma que cada componente principal (PC1, PC2, PC3 entre outros) é responsável pela fração sucessiva de variância de dados, consistindo em um sistema de coordenadas ortogonais entre si e, portanto, não correlacionadas. As primeiras PC’s, explicam a maior parte da variância total contida nos dados e podem ser usadas para representá-los. Na análise exploratória são examinadas as relações entre as amostras e entre as variáveis, através de gráficos de escores e “loadings” respectivamente, os quais permitem avaliar a influência de cada variável em cada amostra, encontrando similaridades ou diferenças nos dados (FERREIRA, 2002). A análise PCA é uma ferramenta alternativa muito utilizada em estudos em que são avaliadas similaridades, quando os dados espectrométricos ou cromatográficos não são suficientes para explicar diferenças. Sendo desta forma mais uma ferramenta para a análise de diferenciação dos extratos.

2.4 ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DOS EXTRATOS

No desenvolvimento do método analítico devem ser observados: composição da fase estacionária, fase móvel, temperatura do forno e vazão de fluxo da fase móvel. A temperatura do forno afeta diretamente o perfil cromatográfico dos compostos, favorece na redução do tempo de retenção sendo muito útil para

melhorar a resolução de picos, sem necessidade de mudança de coluna ou fase móvel. Já a vazão de fluxo da fase móvel atua diretamente no tempo de retenção dos analitos e na pressão do sistema. Um modo de otimização do sistema é trabalhar com modo de eluição gradiente, trabalha com a resolução e a seletividade do método, favorecendo adicionalmente na separação de macromoléculas e na sua diminuição do tempo de corrida em amostras que contenham analitos com ampla faixa de retenção (K). As desvantagens da utilização deste sistema estão principalmente em sua maior complexidade, pois possui um maior número de variáveis, o que dificulta a reprodutibilidade dos dados (MALDANER;JARDIM, 2009; BORGES;BOTTOLI;COLLINS, 2010). O sistema cromatográfico possui variáveis que permitem um ajuste final possibilitando desenvolver métodos eficientes para as análises de misturas complexas como, por exemplo, o conjunto de metabólitos presente em um extrato vegetal (COLLINS;BRAGA;BONATO, 2006). Para este estudo é necessário que se faça uso de uma técnica de separação eficiente, onde seja possível quantificar isoladamente os componentes majoritários, selecionados, da planta estudada. Entre os metabólitos secundários da M. sylvestris que foram pesquisados neste estudo, estão os compostos fenólicos quercetina e malvidina 3-O-glicosídeo (VALLS et al., 2009) e a cumarina escopoletina (BAYOUMI et al., 2010). Estes compostos foram facilmente separados pela por CLAE em estudo de Valls e colaboradores (2009) e de Bayoumi e colaboradores (2010), utilizando em fase reversa e diferentes composições de fase móvel. O principal objetivo do desenvolvimento de métodos analíticos por CLAE é obter um método que proporcione uma separação satisfatória dos compostos de interesse em um tempo adequado e também que este seja robusto, ou seja, não é afetado drasticamente por pequenas variações nas condições de operação (HARRIS, 2008). Para que ao final da etapa de desenvolvimento, a metodologia proposta seja eficiente para o fim a que se destina é necessário um prévio conhecimento do material a ser estudado. São relevantes informações como a massa molecular, a solubilidade e polaridade, dos compostos que serão determinados, já que o conjunto das informações, aplicado aos parâmetros do sistema cromatográfico, determina a

eficiência da separação, ou seja, da metodologia analítica. Para tanto é primeiramente definido o objetivo do método e o procedimento para preparo de amostra, ainda são determinados os parâmetros de análise tais como: o instrumento a ser utilizado; o detector; o tipo de coluna; o diluente da amostra; composição da fase móvel; temperatura de análise e definição do sistema de eluição.

2.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODO

O objetivo de uma validação é assegurar que o método utilizado fornece dados confiáveis para o fim a que se propõe, podendo ser qualitativo ou quantitativo. Segundo a resolução da ANVISA RE-899 de 29 de março de 2003, Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, de acordo com cada finalidade de análise é exigido um determinado conjunto de parâmetros que devem ser avaliados. Métodos quantitativos são em geral classificados como sendo da categoria I, para a sua validação os parâmetros: especificidade; linearidade; intervalo; precisão; repetibilidade; precisão intermediária; exatidão; robustez são exigidos (BRASIL, 2003).

2.5.1 Especificidade

É a capacidade de um método analítico distinguir o analítico de interesse de todos os demais que possam estar presente na amostra. Quando é desenvolvido um método analítico, deve ser decidido previamente quais possíveis impurezas devem ser deliberadamente adicionadas para testar a especificidade. A avaliação do resultado é feita comparando resultados obtidos de amostras contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não contaminadas. Na análise da formulação de uma droga deseja-se comparar a droga pura com outra contendo adições de todos os possíveis subprodutos de síntese,

intermediários, produtos de degradação e excipientes. Os produtos de degradação podem ser introduzidos por meio da exposição do material puro ao calor, luz, umidade, ácidos, bases e oxidantes de modo a decompor aproximadamente 20% do material original. Em métodos cromatográficos, devem-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos sendo a utilização do teste de pureza de pico interessante para demonstrar que o pico cromatográfico é atribuído a um só componente (BRASIL, 2003; HARRIS, 2008).

2.5.2 Linearidade

É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. A resolução da ANVISA recomenda que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, cinco concentrações diferentes. Estas concentrações devem seguir os intervalos de 80% a 120% da concentração do analito esperada na amostra (BRASIL, 2003). A avaliação é realizada tomando como ferramenta as curvas de calibração obtidas, examinando visualmente o gráfico e tratando os dados por métodos estatísticos apropriados para determinação do coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Onde o valor aceitável da avaliação de coeficiente de correlação (r) é de = 0,99 (BRASIL, 2003).

2.5.3 Intervalo

O intervalo corresponde à faixa de concentração do analito, do maior ao menor nível que pode ser determinado com precisão e exatidão, usando a linearidade do método. É estabelecido pela confirmação de que o método apresenta exatidão, precisão e linearidade adequadas quando aplicados a amostras contendo

quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado de 80% a 120% da concentração teórica do teste (BRASIL, 2003).

2.5.4 Precisão

É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Usualmente, é expressa como o desvio padrão, variância ou coeficiente de variação (CV) das medidas obtidas. A precisão é considerada em três níveis: repetibilidade ou precisão intra-corrida, precisão intermediária ou precisão inter-corridas e reprodutibilidade ou precisão inter-laboratorial (BRASIL, 2003).

2.5.4.1 Repetibilidade

A repetibilidade avalia a variação nas mesmas condições de análise, o mesmo equipamento, analista, reagentes, dia e mesmas condições ambientais em pequeno espaço de tempo.

2.5.4.2 Precisão intermediária

Avalia a variação entre os resultados obtidos em análises realizadas no mesmo laboratório em dias diferentes, analistas diferentes e se possível equipamento diferente, sendo recomendado pela RE 899 dois dias de intervalo entre as duas análises a serem comparadas.

2.5.4.3 Precisão interlaboratorial ou reprodutibilidade

Este nível é recomendado quando o objetivo do método a ser validado é a inclusão da mesma em farmacopéias, existe necessidade da colaboração de outros laboratórios, não sendo, portanto aplicável a este trabalho. O coeficiente de variação pode ser calculado pela fórmula abaixo:

2.5.5 Exatidão

Segundo a RE-899 a exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. Existem algumas formas de realizar esta avaliação, a escolha desta depende da natureza do material a ser analisado. O presente estudo enquadra-se no caso em que as amostras de todos os componentes do medicamento estão indisponíveis comercialmente. Deste modo, se aceita a análise pelo método de adição de padrão, no qual se adicionam quantidades conhecidas de padrão de referencia ao objeto de estudo. A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida de padrão de referência adicionado à amostra, ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança, e determinada com no mínimo nove amostras contemplando intervalo linear do procedimento, ou seja, três concentrações, baixa, média e alta, com três réplicas cada (BRASIL, 2003). A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, conforme equação abaixo.

2.5.6 Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal. Para análise em CLAE as variações recomendadas são: do pH da fase móvel, da composição da fase móvel, diferentes lotes ou fabricantes de coluna, temperatura e fluxo da fase móvel. Toda e qualquer observância de resultados diferentes ou inesperados devem ser registrados e constar como observação na metodologia analítica (BRASIL, 2003). Desta forma a robustez deve ser considerada durante o desenvolvimento da metodologia, e não somente na validação.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAL VEGETAL

Folhas secas de M. sylvestris foram adquiridas comercialmente com o fornecedor Quimer Ervas e Especiarias lote 001 com a data de colheita de 01/2008 e validade 01/2013. As folhas foram primeiramente moídas em moinho de martelo e facas para posterior extração.

3.2 EXTRATOS

Extratos hidroalcoolico foram produzidos por diferentes métodos extrativos via maceração, soxhlet e turbólise utilizando diferentes proporções de etanol e água. Foi obtido também extrato aquoso via infusão. Amostras de extratos glicólicos, tinturas e hidroalcoólico de Malva sylvestris foram adquiridas de diferentes fornecedores, denominadas por EC1, EC2, EC3, EC4, EC5, EC6, EC7 e EC8 para o desenvolvimento do trabalho.

3.2.1 Extração por Maceração

O processo de extração por maceração foi realizado em diferentes proporções de etanol e água, como solvente extrator. As proporções de etanol foram: 100% v/v, 90% v/v, 80% v/v, 70% v/v e 50% v/v, gerando extratos M100, M90, M80, M70 e M50, respectivamente. A maceração foi realizada utilizando uma proporção de 1:6 p/v de material vegetal e solvente extrator, que ficou em contato por uma semana, ao abrigo da luz, sendo agitado uma vez ao dia. Ao final do tempo decorrido o material vegetal foi separado do líquido extrator por meio de filtração simples, e posteriormente, o

extrato filtrado teve o solvente alcoólico evaporado por pressão reduzida utilizando rotaevaporador, Fisaton®, com temperatura controlada de 50˚C. Após a retirada do solvente o extrato foi congelado a - 80˚C para posterior liofilização. Os extratos secos foram armazenados em frascos de vidro à temperatura de - 40˚C. Os rendimentos dos extratos foram calculados partindo da quantidade de material vegetal empregado pela quantidade de extrato seco obtido, o resultado foi expresso em porcentagem.

3.2.2 Extração por Soxhlet modificado

O sistema de extração por soxhlet modificado foi montado adicionando ao sistema extrator 350 g do material vegetal e 3,9 litros de etanol e água na proporção de etanol 70% v/v. O processo foi realizado a 60˚C com duração aproximada de 8 horas. Após este período o extrato foi filtrado por algodão, teve o solvente evaporado por rotaevaporador a 50˚C e liofilizado para a obtenção do extrato seco, codificado como S70. O rendimento foi obtido calculando a razão do extrato obtido pela quantidade de matéria vegetal utilizado na extração.

3.2.3 Extração por Turbólise

Para o procedimento de extração por turbólise foi utilizado o equipamento Ultra Turrax Polytron PT 45/80 Kinematica AG, velocidade de rotação v = 6200 rpm no tempo de extração de 60 minutos. Para este procedimento foi utilizado a proporção de 1:8 p/v de material vegetal e solvente extrator etanol 70% v/v. O extrato bruto obtido após a filtração foi concentrado em rotaevaporador a 50˚C e posteriormente, liofilizado para obtenção do extrato seco T70. O rendimento foi obtido calculando a razão do extrato obtido pela quantidade de matéria vegetal utilizado na extração.

3.2.4 Extração por Infusão

A infusão foi feita de acordo com a posologia da planta para uso interno, retirado do formulário de fitoterapia da farmacopeia brasileira, utilizando água como solvente extrator, sendo a proporção de 1:25 p/v de material vegetal e solvente extrator. A extração foi realizada durante 15 minutos, sob fervura. Após este período o extrato foi filtrado ainda quente, após resfriar o extrato foi congelado a -80˚C, e posteriormente liofilizado para a obtenção do extrato seco codificado como “I”. O rendimento foi obtido calculando a razão do extrato obtido pela quantidade de matéria vegetal utilizado na extração. Com o extrato de infusão foram realizadas análises comparativas por CCD e por RMN de 1H.

3.3 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALITICO POR CLAE-DAD

3.3.1 Equipamento, colunas, sistema cromatográfico

As análises cromatográficas foram realizadas utilizando um cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca Agillent 1100, composto por: injetor automático G1329A ALS; bomba G1311A Quat Pump; desgaseificador G1379A ; detector DAD G1115B e para análise e compilação dos resultados foi utilizado o software ChemStation® versão A1.02. Foram utilizadas colunas de fase reversas C18: X-BridgeTM (4,6 x 150 mm, 5,0 µm de tamanho de partícula) com pré coluna C18 X-BridgeTM (4,6 x 20 mm, 5,0 µm de tamanho de partícula) e C18 Spherisorb® ODS2 (4,0 x 250 mm, 5,0 µm de tamanho de partícula) ambas do fabricante Waters. A separação cromatográfica foi avaliada utilizando fase móvel em diferentes composições das misturas de água, metanol e acetonitrila, com variação de 1% a 10% v/v de ácido fórmico, em sistema gradiente e isocrático. Foram testadas diferentes temperaturas da coluna e variações de fluxo e volume de injeção. O

monitoramento dos cromatogramas foram realizados nos comprimentos de onda no intervalo de 190 a 700 nm.

3.3.2 Seleção dos metabólitos a serem pesquisados

O critério adotado para a escolha dos metabólitos para fins de quantificação está na existência destes nos extratos analisados e também na ocorrência de estudos que relacionam a substância com atividade farmacológica comprovada para inflamação e principalmente pela possibilidade de quantificar o mesmo no extrato, obedecendo os parâmetros analíticos para um método por CLAE-DAD. As classes de metabólitos encontradas na M. sylvestris e que apresentam atividade farmacológica estudadas são principalmente antocianidinas, flavonóides, ácidos fenólicos e cumarinas.

3.3.3 Preparo dos extratos

Para o preparo das amostras de extratos utilizou-se os extratos secos M50, M70, M80, M90, M100, S70 e T70. Foi pesado quantitativamente 300 mg de cada extrato, transferiu-se a massa pesada para um balão volumétrico de 10 mL onde foi adicionado 6 mL de metanol grau CLAE, os balões foram levado ao banho de ultrassom por 30 minutos, foi adicionado volumetricamente 1 mL de água MilliQ a cada balão, agitou-se e foi completado o volume dos balões com metanol. Após a homogeneização a solução foi filtrada em filtro de seringa de 0,45 µm para um vial.

3.4 PADRÕES ANALITICOS

Para o desenvolvimento do trabalho, foram adquiridos padrões dos metabólitos selecionados como possíveis marcadores para M. sylvestris ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido transcinâmico, ácido trans O-cumárico, ácido 5- hidroxibenzóico, apigenina (Sigma Aldrish), daidzina, escopoletina (Sigma Aldrish), genisteína, quercetina (Sigma Aldrish), kaempferol (Sigma Aldrish), malvidina 3- Oglicosideo (oenina) (Extrasyntese), malvidina 3,5-diglicosidea (malvidina) (Extrasyntese), genistina, ácido gálico e apigenina 7-glicosideo, todos com grau de pureza conhecidos. Os padrões foram quantitativamente pesados em balança analítica, e diluídos em metanol para produção da solução estoque na concentração de 1 mg/mL. Os padrões foram diluídos em solução de metanol e água 9:1 v/v até a concentração de 25 µg/mL. As soluções estoque de padrão permaneceram sob refrigeração a 4˚C durante todo o andamento do trabalho.

3.5 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALITICO

A validação do método analítico foi baseada na legislação brasileira vigente para validação a Resolução da Anvisa RE 899 – de 29 de março de 2003, e normas internacionais como a International Conference for Harmonisation (ICH). Dentro da classificação das categorias de métodos analíticos este método enquadra-se na categoria I que dispõe sobre testes quantitativos para a determinação de princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias primas. Os ensaios preconizados para a validação de um método da categoria I são: especificidade, linearidade, intervalo, exatidão, robustez e precisão. O limite de detecção apesar de não exigido para fins de validação foi determinado para que fosse possível estabelecer uma referência mínima de detecção em função da concentração de cada composto. O extrato utilizado para a validação foi o extrato M80, preparados de acordo com a necessidade de cada parâmetro a que foi utilizada.

3.5.1 Especificidade

A especificidade foi determinada de duas maneiras, pelo método da adição do padrão e pelo uso de detector de arranjo de diodo. O método da adição do padrão foi determinado através da comparação de duas curvas analíticas, uma obtida através de soluções padrão e outra pela adição de padrão aos extratos. As amostram foram analisadas em quatro níveis de concentração dos três metabólitos quantificados, conforme mostrado na Tabela 1.

TABELA 1 – CONCENTRAÇÃO DOS PADRÕES DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO ADICIONADOS AOS EXTRATOS M80 PARA A AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE. [ ] Ácido cafeico µg/mL [ ] Escopoletina µg/mL [ ] Ácido ferúlico µg/mL 100 10 25 500 50 100 1200 100 500 1800 150 750 NOTA: As amostras foram preparadas a partir das soluções de estoque de padrão diluídas em solução diluente (solução metanol e água (9:1) v/v)

3.5.2 Limite de detecção e quantificação

Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram determinados experimentalmente, com sucessivas diluições dos padrões de ácido ferúlico, ácido cafeico e escopoletina. O LD foi determinado quando o sinal obtido, para o analito, apresentou altura de pico igual a 3 vezes o valor da relação sinal/ruído (S/N) e o LQ determinado quando o sinal obtido pelo analito apresentou altura de pico 10 vezes superior ao valor da relação (S/N).

3.5.3 Linearidade

A linearidade foi determinada através do método de padronização externa em 8 níveis de concentração, os quais estão apresentadas na Tabela 2. Destas soluções foi obtidas curvas de analíticas. As amostras para análise de linearidade foram preparadas, em triplicata, a partir de solução estoque dos padrões de ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico e foram diluídas com solução de metanol e água (9:1) v/v.

TABELA 2 – CONCENTRAÇÕES DOS METABÓLITOS ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO UTILIZADAS NA AVALIAÇÃO DE LINEARIDADE Amostra [ ] ácido cafeico µg/mL [ ] escopoletina µg/mL [ ] ácido ferúlico µg/mL 1 50 2 2 2 100 10 25 3 250 25 50 4 500 50 100 5 750 80 250 6 1200 100 500 7 1500 120 650 8 1800 150 750

3.5.4 Exatidão

A exatidão foi avaliada pelo método de adição de padrão. Este ensaio consistiu na determinação da percentagem de erro relativo entre a concentração teórica (concentração do metabólito no extrato + adicional de padrão) e a concentração experimental dos analitos. O extrato M80 sem fortificação foi preparado na concentração de 3,34 mg/mL de extrato, diluído em solução diluente composto de metanol/água (9:1) v/v. Utilizando curva de calibração, gerada no ensaio de linearidade, dos três metabólitos foi possível determinar a concentração inicial conforme indicado na Tabela 3.

TABELA 3 – VALORES DE ÁREAS, EQUAÇÕES DA RETA E CONCENTRAÇÕES OBTIDAS DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO NO EXTRATO M80 SEM FORTIFICAÇÃO EXTRATO M80 ÁREAS EQUAÇAO DA RETA [ ] µg/mL Metabólito 1 2 3 MÉDIA Ácido cafeico 397.2 372.6 370.7 180.17 y = 15,053x – 53,103 28,78 Escopoletina 57.9 59.1 60.2 59.067 y = 25,312x – 132,84 7,58 Ácido ferúlico 167.6 174.5 177.4 173.17 y = 14,604x – 147,03 21,93

As amostras de extrato M80 receberam um adicional de padrão dos metabólitos correspondente a 25, 50 e 100% da quantidade encontrada originalmente no extrato sem fortificação. As soluções amostras e padrões de exatidão foram preparadas em triplicata nas concentrações conforme segue na Tabela 4 e analisadas também em triplicata.

TABELA 4 – VALORES CORRESPONDENTE A 25, 50 E 100% DA CONCENTRAÇAO DOS METABÓLITOS ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO OBTIDOS NO EXTRATO M80 SEM FORTIFICAÇÃO Quantidade de metabólitos a serem adicionados (µg/mL) Solução 25% 50% 100% Ácido cafeico 7,195 14,39 28,78 Escopoletina 1,895 3,79 7,58 Ácido ferúlico 5,325 10,65 21,93 NOTA: Diluente solução metanol/água (9:1), v/v.

3.5.5 Precisão e precisão intermediária

A precisão foi determinada utilizando soluções diluídas das soluções estoque de padrões em três níveis de concentrações diferentes, conforme mostrado na Tabela 5. As amostras foram preparadas em triplicata, em período curto de tempo, em um mesmo dia, pelo mesmo analista. As injeções foram realizadas em um mesmo equipamento e em condições analíticas idênticas de uso. Para avaliar a precisão dos resultados foi determinado o coeficiente de variação (CV%).

TABELA 5 – CONCENTRAÇÕES DAS AMOSTRAS TRABALHADAS NOS PARAMETROS DE PRECISÃO E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA Níveis de concentração (µg/mL) baixo médio alto Ácido cafeico 20,76 64,87 106,54 Escopoletina 4,55 14,74 24,42 Ácido ferúlico 15,65 40,09 64,89

A precisão intermediária ou intra dias foi realizada por outro analista nas mesmas condições da primeira precisão, inclusive, mesmo sistema cromatográfico e equipamento. A avaliação dos resultados foi feita calculando o coeficiente de variação obtido e também avaliando a dispersão entre os dois ensaios analíticos.

3.5.6 Intervalo

Este parâmetro é avaliado utilizando a análise de linearidade, onde as amostras são injetadas em triplicata, é estabelecido pela confirmação de que o método apresenta exatidão, precisão e linearidade adequada dentro do intervalo especificado.

3.5.7 Robustez

A robustez de um método cromatográfico é a medida da sensibilidade frente a pequenas alterações que as quais um método pode sofrer durante a execução da análise, apesar deste parâmetro ser frequentemente avaliado durante o desenvolvimento do método, atendendo à legislação regulatória para validação foram realizados ensaios onde foram variados parâmetros de lote de coluna, fluxo, quantidade de ácido fórmico na fase móvel e temperatura de forno, conforme consta na Tabela 6. As análises de robustez foram realizadas utilizando solução de extrato M80 na concentração de trabalho.

TABELA 6 – CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS DA ROBUSTEZ Parâmetro Condição original Variação Coluna X-Bridge lote: 0115370591 X-Bridge lote: 01153700598 Dimensões: 4,6 x 150 mm e 5,0 µm Dimensões: 4,6 x 150 mm e 5,0 µm de diâmetro de particula de diâmetro de particula Fluxo de eluição 0,800 mL/min 0,700 mL/min e 0,900 mL/min Quantidade de ácido 10% v/v 10% p/v fórmico Temperatura do forno 25˚C 23˚C e 27˚C

Um método é considerado robusto se os limites de precisão, exatidão e seletividade não forem superiores aos limites de aceitação quando comparados aos resultados obtidos na condição original com método modificado.

3.6 ANÁLISES DE CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS – ANÁLISE DE FINGERPRINT

3.6.1 Análise em cromatografia em camada delgada - CCD

Na análise de caracterização por CCD, foram aplicadas solução padrão de quercetina (PQ), solução padrão de Malvidina 3-O-glicosilada (PM) e soluções dos extratos de maceração (M70), infusão (I), soxhlet (S70) e turbólise (T70). A concentração das soluções padrões trabalhado foi de 1 mg/mL e para os extratos foi de 4 mg/mL. As soluções padrão e amostras foram solubilizados em solução de metanol 10% v/v.

Foi utilizado como suporte sílica gel 60 F254, revelação em luz UV 365, anisaldeído sulfúrico e luz visível. As fases móveis foram selecionadas de acordo com a finalidade da análise conforme Tabela 7, foram utilizados os reveladores: Luz UV no comprimento de onda de 254 nm e 365 nm e solução de anisaldeído sulfúrico.

TABELA 7 – SISTEMAS PARA ANÁLISE EM CCD

Fase móvel Finalidade Composição da FM Referência (FM) Separação de n-butanol / metanol / ácido acético 1 (BRASIL, 2000) antocianidina glacial (50:10:20) Separação de Acetato de etila / ácido acético (WAGNER;BLADT, 2 flavonóides glacial / ácido fórmico / água 1996) glicosilados (100:11:11:26) Separação de Clorofórmio / acetona / ácido (WAGNER;BLADT, 3 escopoletina fórmico (75:16.5:8,5) 1996) Separação de (WAGNER;BLADT, 4 flavonóides Clorofórmio / acetato de etila (60:40) 1996) agliconas

3.6.2 Análise em Espectrômetro de RMN de 1H

Para as análises de ressonância magnética nuclear foi utilizado equipamento Bruker AVANCE 400, operando a 9,4 Tesla, observando o núcleo de hidrogênio a 400,13 MHz, equipado com uma sonda multinuclear de observação direta de 5 mm no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná. Para tanto, 15 mg de extratos foram diluídos em 600 µL de dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6). Os espectros foram processados utilizando o programa TOPSPIN com 64K pontos.

3.6.3 Análise em CLAE-DAD

Para a análise de comparação dos extratos por CLAE-DAD foi utilizado o mesmo método desenvolvido para quantificação dos extratos, cuja condição cromatográfica foi: Coluna XBridge – C18 dimensões: 150 mm x 4,6 mm e 5 µm de diâmetro interno Pré coluna XBridge – C18 Temperatura 25 ˚C

Detecção DAD 348 nm Fluxo 0,8 mL/minuto Sistema fase móvel: Canal A Água purificada + ácido fórmico 10% (v/v) Canal B Metanol + ácido fórmico 10% (v/v) Canal D Acetonitrila Volume de injeção 5 µL

Os extratos foram preparados pesando-se 200 mg de extrato seco solubilizados em 10 mL de solução diluente metanol/água (9:1, v/v), filtrou-se a 0,45 µm e tranferiu-se para vial. Os extratos comerciais, glicólicos, hidroalcoolicos e tintura, foram filtrados em filtro de seringa de 0,45 µm e transferidos para vial. Para o preparo das amostras foram utilizados os seguintes equipamentos: balança analítica Mettler Toledo Classic plus AB204-S/Fact; banho ultrassônico Branson 2510; pipetador automático Gilson; sistema de filtração de fase móvel e capela de exaustão. Os reagentes requeridos no preparo das amostras analíticas são todos de grau CLAE e os mesmos utilizados na composição da fase móvel: água ultrapura, acetonitrila, metanol e ácido fórmico.

3.6.4 Análise em CLAE-EM, CLAE-EM/EM e Quimiometria - PCA

As análises foram realizadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência Agilent 1200, bomba binária G1312B, desgaseificador G1379B, forno G 1316B e injetor automático CTC Waters 2777 Sample Manager, acoplado ao espectrômetro com analisador do tipo triplo quadrupolo (Applied Biosystems®) modelo API 3200 equipado com bomba de infusão (Havard 22 Apparatus) e fonte de ionização por eletrospray (ESI). Os dados obtidos foram processados através do software Analyst versão 1.4.2. Nas análises por CLAE-EM e CLAE-EM/EM utilizou-se como fase móvel uma solução de ácido fórmico 0,05% (v/v) no canal A e acetonitrila no canal B, em modo de eluição gradiente: 5 - 20% B em 2 minutos, 20% B por 13 minutos, 20 –

30% B em 10 minutos, 30 – 50% B em 10 minutos, 50 – 5% B em 5 minutos e 5% B por 5 minutos. A coluna utilizada foi C18 X-BridgeTM (4,6 x 150 mm; 5 µm), acoplada a uma pré coluna C18 X-BridgeTM (4,6 x 20 mm; 5 µm). A temperatura do forno da coluna foi estabilizada a 35˚C, fluxo de eluição de 0,4 mL/min e volume de injeção de 20 µL. Os parâmetros otimizados no espectrômetro de massas foram: Ion spray voltage (IS) 5500 V, temperatura da fonte (TEM) 400˚C, nebulizer gas (GS1) 45 psi, turbo gas (GS2) 45 psi, declustering potencial (DP) 25 eV, curtain gas (CUR) 10 psi e entrance potencial (EP) 10 eV, cell entrance potencial (CEP) 12,3 eV, cell exit potencial (CXP) 3,8 eV e collision energy (CE) 22 eV para ácido cafeico, 30 eV para ácido ferúlico e escopoletina. Para análise comparativa dos extratos os dados de CLAE-EM foram processados pelo software Analyst versão 1.4.2, posteriormente tabulados no software OriginPro 8 RS0 versão 8.0724 tendo na linha as intensidades de sinais e na coluna o tempo de retenção, estas matrizes foram exportados para o software Matlab versão 7.01.24704 para aplicação da PCA. Os dados foram pré-processados por alisamento no Matlab e então analisados em gráficos de scores e loadings. Para o preparo das soluções padrões e soluções de extratos, o diluente consistiu de solução de metanol/água (90:10, v/v) acidificado com 0,5% de ácido fórmico. Pesou-se quantidade suficiente de padrão e dilui-se até chegar a concentração de 500 ηg/mL. Para os extratos pesou-se quantidade suficiente para concentração de 10 mg/mL, diluído também com a solução diluente. As soluções de extratos foram filtradas em filtro seringa de 0,45 µm.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS

Foram utilizadas técnicas de maceração, via soxhlet e turbólise com solvente composto por etanol e água, para avaliar o método extrativo mais adequado, em termos de rendimento e qualidade. Nos métodos via soxhlet e turbólise foi utilizado apenas etanol e água na proporção de 70:30 v/v. Na maceração foram utilizados diferentes proporções de etanol água conforme mostrado na Tabela 8 que também mostra os rendimentos obtidos em cada modo de extração.

TABELA 8 – RENDIMENTO OBTIDO NOS DIFERENTES MODOS EXTRATIVOS Extrato Maceração Soxhlet Turbólise

Etanol:água M50 M70 M80 M90 M100 S70 T70 (50:50) (70:30) (80:20) (90:10) (100:0) (70:30) (70:30) Rendimento - 9,67% 9,55% 10,57% 9,14% 22,67% 15,66%

Os extratos obtidos através do método de maceração não apresentaram diferenças significativas entre as diferentes proporções de etanol e água testados. Comparando os métodos extrativos de maceração, soxhlet e turbólise pode ser observado que o método de maior rendimento foi o de soxhlet seguido por turbólise. Para fins de comparação de rendimento foi ainda realizada a extração por infusão utilizando água deionizada como líquido extrator, a preparação foi de acordo com a posologia indicada para a utilização popular, o rendimento obtido foi de 15,27%, este procedimento além de ter etapas a menos, ou seja menos perda, também pelas folhas de malva serem ricas em mucilagem, compostas principalmente de açúcares, são as causas de se obter um rendimento maior que na maceração.

4.2 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO EM CLAE-DAD

Primeiramente foi realizado o levantamento bibliográfico de métodos utilizados para a separação de compostos de interesse relacionados a espécie Malva sylvestris, como flavonóides e antocianidinas. O método inicial do desenvolvimento foi baseado no trabalho de Downey e Rochfort (2008), no qual utilizou para a separação de: malvidina-3- Oglicosídeo, ciainidina e quercetina 3- Oglicosídeo, solução de ácido fórmico a 10% v/v e metanol acidificado nas mesmas condições, trabalhado em modo gradiente em fluxo de 1,0 mL/min. Foi utilizada uma coluna C18 SS Wakosil (150 mm x 4,6 mm e 3 µm de diâmetro de partícula) na temperatura de 40 ˚C. O monitoramento para os flavonóides foi em 353 nm e antocianidinas em 520 nm (DOWNEY;ROCHFORT, 2008). A análise inicial foi com uma coluna C18 XBridge (Waters Corporation) (150 x 4,6 mm, 5,0 µm de tamanho de partícula) composta de sílica hibrida endcapped trifuncional com pH de trabalho variando de 1 a 12, devido a alta concentração de ácido fórmico, comumente utilizada para separação de antocianidinas (DE VILLIERS et al., 2004; DOWNEY;ROCHFORT, 2008; VERGARA et al., 2010). Entretanto, após a reprodução do método de Downey e Rochfort (2008), utilizando o extrato T70 na concentração de 30 mg/mL, o resultado apresentou-se insatisfatório, tanto na separação dos metabólitos quanto no tempo para a eluição dos mesmos. Para que fosse possível obter a melhor separação dos metabólitos este método foi modificado. Adicionalmente, foi observado que a temperatura exerce influencia na assimetria do pico, quanto maior a temperatura maior a assimetria observada para os solutos ionizáveis (BORGES;BOTTOLI;COLLINS, 2010), desta forma foi realizado teste na temperatura de 25˚C, condição que apresentou o melhor resultado. Na análise do extrato de M. sylvestris a seleção do comprimento de onda de monitoramento teve como critério a natureza dos metabólitos de interesse já relatados na espécie que são da classe dos compostos fenólicos, flavonóides e antocianidinas. O melhor comprimento de onda é o que apresenta a maior absorbância, para estas classes de metabólitos as absorbâncias máximas apresentadas por literaturas científicas foram de aproximadamente 240 a 300 nm

para compostos fenólicos, 500 a 560 nm para antocianidinas e 340 nm a 370 nm para flavonóides (LIU;CAI;SHAO, 2008; MUNOZ et al., 2008; TAN et al., 2008). Para as análises dos extratos foram selecionados os comprimentos de onda de 280, 348 e 528 nm, pois estes abrangem os máximos de absorção de um grande número de metabólitos pesquisados na espécie. Conforme observado na Figura 13, o comprimento de onda selecionado para as análises quantitativas foi o de 348 nm, por se mostrar o mais adequado para os compostos encontrados nos extratos, ou seja, apresentam sinais de maior intensidade, quando analisados na mesma concentração.

Após definir alguns parâmetros cromatográficos como temperatura e comprimento de onda, foi otimizado os sistemas de fase móvel. Primeiramente foi testado método onde o sistema cromatográfico era composto por fase móvel água e metanol, ambos acidificados com ácido fórmico a 1% v/v em diferentes inclinações de gradientes. Ao modificar a concentração de ácido fórmico foi testado também a coluna tipo C18 de revestimento interno com sílica comum do tipo, trimetilsilano com faixa de pH de 2 a 8 (Spherisorb ODS2 – Waters Corporation). Foi verificada no entanto por diferentes testes que a acidificação do meio em 10% v/v de ácido fórmico favorece a separação deste extrato, devido a própria característica dos

metabólitos encontrados no extrato, desta forma sendo determinado que seria trabalhado nesta concentração de ácido fórmico, foi adotada consequentemente a coluna C18 XBridge. Várias inclinações dos sistemas para a composição da fase móvel foram testados, utilizando o extrato T70 na concentração de 30 mg/mL, sendo definido que canal A: água + ácido fórmico 10% v/v e canal B: metanol + ácido fórmico 10% v/v. As diferentes inclinações do gradiente foram apresentados nas Tabelas 9, 10, 11 e 12 e os resultados destes diferentes gradientes nas Figuras 14, 15, 16 e 17.

TABELA 9 – INCLINAÇÃO DO GRADIENTE: MÉTODO 1 Tempo (min) 0 5 14 16 18 23 28 29 39 B (%) 10 10 18 28 41 50 90 10 10 NOTA: Fluxo: 1 mL/min; temperatura do forno da coluna: 25˚C e volume de injeção: 20 µL.

FIGURA 14 – CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO NO MÉTODO 1 EM 348 NM

No cromatograma apresentado na figura 14 os compostos apresentaram tempo de retenção superior a 15 minutos, e não houve separação dos picos utilizando o método 1 (Tabela 9). Para que os picos de interesse saíssem com tempo de retenção menor o sistema gradiente foi alterado, reduzindo o número de etapas entre 10% e 90% de fase orgânica, no mesmo intervalo de tempo, dando origem ao método 2, conforme mostrado na Tabela 10. O cromatograma apresentado na Figura 15, mostra que o tempo de retenção dos metabólitos reduziu para 10 minutos, mas não houve melhora em se tratando de resolução, havendo uma coeluição dos picos.

TABELA 10 – INCLINAÇÃO DO GRADIENTE: MÉTODO 2 Tempo (min) 0 5 7 9 29 31 35 40 B (%) 10 10 20 50 90 90 20 10 NOTA: Fluxo: 1 mL/min; temperatura do forno da coluna: 25˚C e volume de injeção: 20 µL.

FIGURA 15 – CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO EM 348 NM MÉTODO 2

Para resolver o problema da coeluição dos picos conforme observado na Figura 15, o gradiente de eluição foi novamente modificado aumentando-se gradativamente a proporção de orgânico na fase móvel e tempo de corrida (Tabela 11). Conforme observado no cromatograma da Figura 16 obteve-se uma separação significativa dos metabólitos ao longo de todo o tempo de corrida, ou seja uma resolução melhor dos picos. Com o intuito de melhorar ainda mais o sistema de separação foi incorporado ao método 3 a acetonitrila, conforme apresentado na Tabela 11.

TABELA 11 – SISTEMA GRADIENTE MÉTODO 3 Tempo (min) 0 2 3 13 18 21 23 26 28 30 35 40 45 46 46 48 51 [ ] B (%) 10 10 20 30 36 38 40 42 44 46 60 70 90 50 25 10 10 NOTA: Fluxo: 0,8 mL/min; temperatura do forno da coluna: 25˚C e volume de injeção: 20 µL.

FIGURA 16 – CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO NO MÉTODO 3 EM 348 NM. Após a modificação do sistema gradiente (Tabela 12), pode-se observar conforme Figura 17, que a adição de acetonitrila ao sistema cromatográfico melhorou a resolução de alguns picos, nos tempos de retenção entre 20 e 30 minutos em relação ao método da Figura 16.

TABELA 12 – SISTEMA GRADIENTE DO MÉTODO 4 Tempo (min) 0 2 3 13 18 20 22 24 26 28 33 38 43 44 45 46 48 50 52 [ ] B (%) 10 10 20 30 36 38 40 42 44 46 50 69 89 89 49 24 9 4 10 [ ] D (%) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 5 NOTA: Fluxo: 0,8 mL/min; temperatura do forno da coluna: 25˚C e volume de injeção: 5 µL.

FIGURA 17 - CROMATOGRAMA DO EXTRATO T70 MONITORADO NO MÉTODO 4 E EM 348 NM O sistema cromatográfico considerado para as análises qualitativas e quantitativas adotado para os estudos de M. sylvestris apresenta-se conforme segue: Coluna XBridge – C18 dimensões: 150 mm x 4,6 mm e 5 µm de diâmetro interno Pré coluna XBridge – C18

Temperatura 25 ˚C Detecção DAD 348 nm Fluxo 0,8 mL/minuto Sistema fase móvel: Canal A Água purificada + ácido fórmico 10% (v/v) Canal B Metanol + ácido fórmico 10% (v/v) Canal D Acetonitrila Volume de injeção 5 µL

4.2.1 Seleção dos metabólitos a serem monitorados por CLAE-DAD

Para a análise de fingerprint e quantificação dos metabólitos de interesse nos extratos de M. sylvestris foram selecionados alguns padrões que estão listados na Tabela 13, que foram analisados em seus respectivos comprimentos de onda na de concentração de 25 μg/mL e volume de injeção de 5 μL.

TABELA 13 – TEMPO DE RETENÇÃO E COMPRIMENTO DE ONDA DE MONITORAMENTO DOS METABÓLITOS PESQUISADOS

Metabólito Comprimento de onda (nm) Tempo de retenção (min) Ácido gálico 280 2,59 Ácido 4 hidroxibenzóico 280 4,78 Malvidina 3,5-diglicosideo 528 e 280 5,02 Ácido cafeico 348 e 280 5,22 Daidzina 280 7,00 Malvidina 3-Oglicosideo 528 e 280 8,90 Escopoletina 348 e 280 9,67 Genistina 348 e 280 9,79 Ácido ferúlico 348 e 280 10,00 Ácido transcinâmico 280 e 348 11,35 Quercetrina 348 e 280 13,25 Ácido trans o-cumárico 348 e 280 14,15 Quercetina 348 e 280 19,91 Genisteína 280 e 348 24,47 Kaempferol 348 26,80 Apigenina 348 27,41

A identificação dos metabólitos de interesse foram realizadas através da comparação dos picos cromatográficos dos padrões nos mesmos tempos de retenção (Tr) com aqueles picos correspondentes nos extratos (M50, M70, M80, M90, M100, S70 e T70), seguido pela avaliação dos espectros de UV extraídos dos respectivos picos tanto para o padrão como para os extratos. Tendo os resultados destas avaliações também foram analisadas por CLAE-EM, por se tratar de um método mais sensível e seletivo, como um método de confirmação. Na comparação dos cromatogramas dos extratos e padrão de malvidina 3,5– diglicosilada observou-se que os mesmos apresentaram picos cromatográficos no mesmo tempo de retenção, quando o cromatograma é monitorado no comprimento de onda de 280 nm (Figura 18), no comprimento de onda de 528 nm não pode ser evidenciado nenhum sinal cromatográfico no tempo de retenção correspondente ao do padrão. Na Figura 19 apresenta-se a comparação dos espectros de UV extraídos destes cromatogramas no Tr = 5,2 minutos. Entretanto, quando se comparou os espectros de UV evidenciou-se se tratar de substâncias diferentes, pois em 500 nm o espectro do padrão apresenta uma máxima de absorção que não é evidenciado no espectro do extrato.

FIGURA 18 – CROMATOGRAMAS EM 280 NM DO EXTRATO M50 E MISTURA DE SOLUÇÕES PADRÃO, DESTAQUE PARA TEMPO DE RETENÇÃO DE 5,2 MIN REFERENTE A MALVIDINA 3,5 - DIGLICOSÍDEA

DAD1, 5.214 (66.9 mAU, - ) of 010-0101.D DAD1, 5.214 (116 mAU, - ) of 017-0601.D Norm.

-20

-40 250 300 350 400 450 500 550 600 650 nm FIGURA 19 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 5,2 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS OBTIDOS DE SOLUÇÕES DE PADRÃO DE MALVIDINA 3,5-DIGLICOSIDEO (LINHA CHEIA) E EXTRATO M50 (LINHA PONTILHADA) EM 280 NM

. O metabólito malvidina 3-O-glicosideo também foi avaliado no mesmo extrato, porém não foi encontrado nenhum pico correspondente no cromatograma quando comparado com o padrão que apresentou pico no Tr = 8,9 minutos, conforme mostrado na Figura 20.

FIGURA 20 - CROMATOGRAMAS EM 528 NM DO EXTRATO M50 E MISTURA DE SOLUÇÕES PADRÃO, DESTAQUE PARA TEMPO DE RETENÇÃO DE 8,9 MIN REFERENTE A MALVIDINA 3-O GLICOSÍDEA

Para confirmação das análises de pesquisa dos marcadores referidos pela farmacopeia brasileira, todos os extratos foram avaliados quanto a presença de malvidina 3,5–diglicosilada e malvidina 3-O-glicosideo através de CLAE-EM, por tratar-se de uma técnica mais sensível e seletiva. As Figuras 21 e 22 mostram os espectros de massas extraídos dos cromatogramas analisados por CLAE-EM no tempo de retenção de 5,0 minutos, da solução de extrato M50 e padrão de malvidina 3,5 – diglicosideo respectivamente.

FIGURA 21 – ESPECTRO DE MASSAS DO EXTRATO M50, EXTRAÍDO NO TR = 5,0 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM

FIGURA 22 - ESPECTRO DE MASSAS DO PADRÃO DE MALVIDINA 3,5-DIGLICOSIDEO, EXTRAÍDO NO TR = 5,0 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM

Pode ser observado na Figura 21 que não existe íon equivalente a substância pesquisada no espectro de massas da solução de extrato no mesmo tempo de retenção, dessa forma não se confirma a presença de malvidina 3,5 - diglicosídeo nos extratos de folhas de malva. Para a pesquisa do marcador malvidina 3 – O-glicosídeo estão apresentadas as Figuras 23 e 24, correspondendo respectivamente aos espectros de massas da solução de extrato M50 e da solução padrão de malvidina 3 – O-glicosídeo. Os espectros de massas foram extraídos no tempo de retenção de 5,2 minutos. Na Figura 23 pode ser observado que não mostra os íons equivalentes a fragmentação da substância pesquisada, dessa forma também não se confirma a presença de malvidina 3-O -glicosídeo nos extratos de folhas de malva.

FIGURA 23 - ESPECTRO DE MASSAS DO EXTRATO M50, EXTRAÍDO NO TR = 5,2 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM

FIGURA 24 - ESPECTRO DE MASSAS DO PADRÃO DE MALVIDINA 3-O-GLICOSIDEO, EXTRAÍDO NO TR = 5,2 MINUTOS, DO CROMATOGRAMA OBTIDO ATRAVÉS DE CLAE-EM

Pesquisando outros metabólitos possivelmente presentes nos extratos das folhas de malva seguiu-se o mesmo raciocínio para os demais metabólitos. Iniciando as análises por CLAE-DAD e confirmando em CLAE-EM. Foram analisados todos os extratos, apresenta-se resultados referente ao extrato M100. Os cromatogramas CLAE-DAD da solução padrão de escopoletina e das soluções dos extratos quando comparados apresentaram o mesmo pico no Tr = 9,5 minutos e quando analisado o espectro de UV destes respectivos picos, estes foram semelhantes, conforme apresentado pelas Figuras 25 e 26 que mostra o extrato M100 e a solução padrão.

FIGURA 25 – CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ESCOPOLETINA E DA SOLUÇÃO DO EXTRATO M100 OBTIDOS EM 348 NM, TR = 9,5 MINUTOS

DAD1, 9.541 (116 mAU, - ) of 002-0201.D DAD1, 9.569 (196 mAU, - ) of 003-0301.D Norm.

150

100

-50 200 300 400 500 600 nm FIGURA 26 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 9,5 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS OBTIDOS DE SOLUÇÃO PADRÃO DE ESCOPOLETINA (LINHA CHEIA) E DE EXTRATO M100 (LINHA PONTILHADA) EM 348 NM

Esta substância foi confirmada também através de experimento de fragmentação no espectrômetro de massas por infusão direta selecionando íon de m/z 193.1 correspondente a escopoletina (Figura 27) nos extratos.

FIGURA 27 – EXPERIMENTO DE FRAGMENTAÇÃO DO ÍON DE M/Z 193 [M + H]+ CORRESPONDENTE A ESCOPOLETINA DETECTADA NO EXTRATO M50, OBTIDO POR INFUSÃO DIRETA NOTA: perfil de fragmentação da escopoletina íon de m/z 193.0178.0 e 193.0 133.0

Os cromatogramas da solução padrão de ácido ferúlico e soluções de extratos quando comparados evidenciaram a presença de picos no mesmo Tr = 9,9 minutos e quando analisado o espectro de UV destes respectivos picos, estes foram semelhantes, conforme apresentado pelo extrato M100 nas Figuras 28 e 29. Esta substância foi confirmada também através do experimento de fragmentação no espectrometro de massas obtido por infusão direta, selecionando o íon de m/z 195.1 e corresponde ao ácido ferúlico no extrato M50 conforme mostrado na Figura 30.

FIGURA 28 – CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO FERÚLICO E DO EXTRATO M100 OBTIDOS EM 348 NM, TR = 9,9 MINUTOS

DAD1, 9.958 (139 mAU, - ) of 002-0201.D DAD1, 9.974 (1055 mAU, - ) of 003-0301.D Norm. 1000

800

600

400

200

200 300 400 500 600 nm FIGURA 29 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 9,9 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS, OBTIDOS DE SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO FERÚLICO (LINHA CHEIA) E SOLUÇÃO DE EXTRATO M100 (LINHA PONTILHADA) EM 348 NM,

FIGURA 30 – EXPERIMENTO DE FRAGMENTAÇÃO DO ÍON DE M/Z 195 [M + H]+ CORRESPONDENTE AO ÁCIDO FERÚLICO DETECTADO NO EXTRATO M50 OBTIDO POR INFUSÃO DIRETA NOTA: perfil de fragmentação ácido ferúlico íon de m/z 195.2 177.2

Da mesma forma foram avaliados os cromatogramas da solução padrão de ácido cafeico e soluções de extratos quando comparados evidenciaram a presença de picos no mesmo Tr = 5,9 minutos e quando analisado o espectro de UV destes

respectivos picos, estes foram semelhantes, conforme apresentado pelo extrato M100 nas Figuras 31 e 32 Esta substância foi confirmada também nos extratos através do experimento de fragmentação no espectrômetro de massas obtido por infusão direta selecionando o íon m/z 181,6 correspondente ao ácido cafeico conforme mostrado na Figura 33 no extrato M50.

FIGURA 31 – FRAGMENTO DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO CAFEICO E DA SOLUÇÃO DO EXTRATO M100 OBTIDOS EM 348 NM, EM DESTAQUE OS PICOS DE ÁCIDO CAFEICO.

*DAD1, 5.856 (73.0 mAU, - ) Ref=4.478 & 6.674 of 006-0201.D *DAD1, 5.943 (141 mAU, - ) Ref=5.735 & 6.378 of 012-0101.D Norm .

120

100

-20

-40 200 300 400 500 600 nm FIGURA 32 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV EXTRAÍDOS NO TR = 5,9 MINUTOS DE CROMATOGRAMAS, OBTIDOS DE SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO CAFEICO (LINHA CHEIA) E SOLUÇÃO DE EXTRATO M100 (LINHA PONTILHADA) EM 348 NM

FIGURA 33 – EXPERIMENTO DE FRAGMENTAÇÃO DO ÍON DE M/Z 181,6 [M + H]+ CORRESPONDENTE AO ÁCIDO CAFEICO DETECTADO NO EXTRATO M50, OBTIDO POR INFUSÃO DIRETA NOTA: Perfil de fragmentação ácido cafeico íon m/z 181.2162.1, 162.1145.0 e 145,0135.2

Tendo em vista os resultados apresentados os metabólitos selecionados para a quantificação nos extratos de M. sylvestris foram ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico.

4.2.2 Determinação da faixa de trabalho

Para a determinação da faixa de trabalho dos metabólitos selecionados foi realizada análise de doseamento comparando diretamente as áreas das soluções dos padrões de metabólitos com as áreas dos metabólitos nos extratos (Figura 34). Foram considerados os menores e os maiores valores de concentração encontrados nos extratos para atribuir a faixa de trabalho (Tabela 14).

FIGURA 34 – GRÁFICO DAS CONCENTRAÇÕES DETERMINADAS DOS EXTRATOS HIDROALCOOLICOS DE M. SYLVESTRIS

TABELA 14 – FAIXA DE TRABALHO ATRIBUIDA PARA ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO Metabólito Faixa de trabalho [ ] µg/mL

Ácido cafeico 50,00 – 1800,00

Escopoletina 2,00 – 150,00

Ácido ferúlico 2,00 – 750,00

4.3 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO

4.3.1 Especificidade

4.3.1.1 Método de adição de padrão

Para a análise de especificidade pelo método de adição de padrão as curvas

obtidas com amostras fortificadas com os padrões de ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico foram comparadas, em relação ao coeficiente angular, apresentados pela curva de calibração do padrão com da amostra fortificada. As amostras foram preparadas em triplicata, em 4 níveis de concentração, sendo originadas de uma mesma solução mãe, portanto seguindo sucessivas diluições, de modo que na mesma amostra encontra-se os três padrões monitorados. As soluções preparadas conforme a Tabela 1 deram origem as curvas analíticas de cada um dos metabólitos pesquisados. Na Tabela 15 estão mostradas as concentrações das amostras e as respectivas áreas obtidas. Nas Figuras 35, 36 e 37 estão apresentadas as curvas analíticas, de onde foram calculados os coeficientes angulares. Os desvios dos coeficientes angulares de ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico foram respectivamente de: 2,42%, 1,45% e 0,99%. Confirmando tratar-se de retas paralelas, portanto o método contempla a quesito seletividade.

TABELA 15 – NÍVEIS DE CONCENTRAÇÃO AVALIADOS NA ESPECIFICIDADE, VALORES: BAIXO, MÉDIO E ALTO E AS ÁREAS OBTIDAS NO CROMATOGRAMA DE CADA UMA DAS AMOSTRAS. ÁREAS níveis de concentração (µg/mL) Soluções Padrões Amostras fortificadas 50 790,9923 1029,0009 250 3797,8021 4123,0002 Ácido cafeico 500 7942,1912 7905,8021 1200 18125,9911 18961,5047 10 167,5512 219,9123 25 522,1435 584,3213 Escopoletina 50 1018,8121 1120,2021 80 1854,0124 1857,0134 25 286,9724 344,1211 100 1359,7311 1369,2112 Ácido ferúlico 500 6756,4143 7222,0243 750 11389,0131 11080,6135

FIGURA 35 – CURVA ANALÍTICA DE ÁCIDO CAFEICO, OBTIDO POR CLAE-DAD PARA A AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE

FIGURA 36 – CURVA ANALÍTICA DE ESCOPOLETINA, OBTIDA POR CLAE-DAD PARA A AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE

FIGURA 37 - CURVA ANALÍTICA DE ÁCIDO FERÚLICO , OBTIDA POR CLAE -DAD PARA A AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE

4.3.1.2 Utilizando detector de Arranjo de Diodos

Na análise de especificidade utilizando o detector de arranjo de diodos, foram extraídos os espectros de UV dos metabólitos pesquisados, foi levado em consideração que os picos apresentados nos cromatogramas com o mesmo tempo de retenção, apresentassem também o mesmo perfil espectral, esta confirmação encontra-se nas Figuras 38, 39 e 40.

FIGURA 38 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV (200 A 400 nm) NO Tr = 5,2 MINUTOS DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO CAFEICO (A) E DO EXTRATO M80 (B)

FIGURA 39 – PERFIS ESPECTRAIS DE UV (200 A 400 NM) NO TR = 9,4 MINUTOS DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ESCOPOLETINA (A) E DO EXTRATO M80 (B)

FIGURA 40 - PERFIS ESPECTRAIS DE UV (200 A 400 NM) NO TR = 9,8 MINUTOS DOS CROMATOGRAMAS DA SOLUÇÃO PADRÃO DE ÁCIDO FERÚLICO (A) E DO EXTRATO M80 (B)

Os tempos de retenção identificados como sendo dos metabólitos pesquisados foram: Tr = 5,1 minutos para o ácido cafeico, Tr = 9,4 minutos para a

escopoletina e Tr = 9,8 minutos para o ácido ferúlico, conforme apresentado na Figura 41.

Ácido cafeico Extrato M80 Malva sylvestris

Escopoletina Ácido ferúlico

Padrões Ácido cafeico

Escopoletina

Ácido ferúlico

FIGURA 41 – CROMATOGRAMAS DO EXTRATO DE MACERAÇÃO M80 E SOLUÇÃO DOS PADRÕES DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO, DESTACANDO OS PICOS NOS TEMPOS DE RETENÇÃO CORRESPONDENTE.

4.3.2 Limite de detecção e limite de quantificação

Os limites de detecção e quantificação para cada um dos metabólitos foram determinados experimentalmente tendo como base a S/N e os resultados obtidos encontram-se na Tabela 16.

TABELA 16 – RESULTADOS DE LD E LQ DETERMINADOS PARA ÁCIDO CAFEÍCO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO Metabólito Limite de Detecção Limite de Quantificação Ácido cafeico 1 µg/mL 2,5 µg/mL Escopoletina 0,25 µg/mL 2,0 µg/mL Ácido ferúlico 0,5 µg/mL 2,0 µg/mL

4.3.3 Linearidade

A linearidade foi determinada fazendo uma diluição seriada dos padrões de ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico para obtenção das curvas de calibração com 8 níveis de concentração. Tomando como base as concentrações já expostas na Tabela 2. As curvas de linearidades para ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico estão apresentadas nas figuras 42, 43 e 44, respectivamente. Os valores dos coeficientes de correlação para ácido cafeico foi de 0,9988, para escopoletina de 0,9907 e para ácido ferúlico de 0,9935. O valor referência para o coeficiente de correlação para uma curva linear é de no mínimo de 0,99, conforme consta na legislação brasileira, portanto o método proposto na concentração trabalhada é linear.

FIGURA 42 – CURVA DE CALIBRAÇÃO DO ÁCIDO CAFEICO POR CALIBRAÇÃO EXTERNA `

FIGURA 43 – CURVA DE CALIBRAÇÃO DA ESCOPOLETINA POR PADRONIZAÇÃO EXTERNA

FIGURA 44 – CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA ÁCIDO FERÚLICO POR PADRONIZAÇÃO EXTERNA

4.3.4 Intervalo

O método mostrou-se adequado quanto a exatidão, precisão e linearidade, desse modo pode-se dizer que o intervalo de trabalho estipulado está adequado para o tipo de análise ao qual o método proposto se destina.

4.3.5 Precisão

A avaliação da precisão foi realizada em duas etapas, os resultados obtidos foram comparadas individualmente e também entre os resultados apresentados nas diferentes etapas conforme segue.

4.3.5.1 Precisão – repetibilidade

A análise de precisão tem como parâmetro o desvio padrão relativo (DPR) expresso em porcentagem entre as repetições. Foram considerados precisos os resultados de DPR (%) inferior a 5% seguindo a legislação vigente. Os resultados de precisão para ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico estão apresentados nas Tabelas 17, 18 e 19, respectivamente.

TABELA 17 – ANÁLISE DE PRECISÃO DO ÁCIDO CAFEICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Ácido cafeico [ ] baixa [ ] média [ ] alta 376,5845 1197,0354 2017,4811 378,7917 1190,4409 2044,9290 370,0721 1183,0870 2040,8727 áreas 374,5017 1222,6068 2196,2117 361,3634 1218,7854 2194,6655 366,5436 1198,7332 2198,0288 média 371,3095 1201,7815 2115,3648 DPR (%) 1,77 1,31 4,21

TABELA 18 - ANÁLISE DE PRECISÃO DO ESCOPOLETINA EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Escopoletina [ ] baixa [ ] média [ ] alta 106,5195 329,6209 549,7645 106,1046 328,5956 551,9548 107,1507 324,7181 554,8050 áreas 109,9300 350,1656 551,8104 107,0418 347,7873 542,7766 108,9323 342,1397 547,9509 média 107,6131 337,1712 549,8437 DPR (%) 1,39 3,23 0,76

TABELA 19 - ANÁLISE DE PRECISÃO DO ÁCIDO FERÚLICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Ácido ferúlico [ ] baixa [ ] média [ ] alta 263,4919 603,5349 1006,9634 261,9759 607,8118 1006,9560 262,5696 605,4633 1007,6309 áreas 261,3653 642,8843 1039,6998 256,9754 639,8286 1022,8909 262,9509 635,1581 1036,8022 média 261,5549 622,4468 1020,1572 DPR (%) 0,90 3,00 1,50

Como pode ser observado nas tabelas apresentadas, todos os DPR (%) estão abaixo do valor máximo de 5,00%, desse modo pode-se dizer que o método apresenta precisão dentro da faixa de trabalho estabelecida visto que apresentou precisão nos três níveis de concentração para os três metabólitos quantificados.

4.3.5.2 Precisão intermediária

Assim como na precisão a precisão intermediária segue o mesmo parâmetro para aprovação. As análises foram realizadas seguindo os mesmos critérios da precisão, por um segundo analista. Os resultados do segundo analista estão dispostos nas Tabelas 20, 21 e 22, sendo respectivamente relativos ao ácido cafeico,

escopoletina e ácido ferúlico.

TABELA 20 - ANÁLISE DE PRECISÃO ANALISTA 2 DO ÁCIDO CAFEICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Ácido cafeico [ ] baixa [ ] média [ ] alta 373,4383 1241,8821 2259,8101 364,8378 1223,9977 2263,2273 365,4118 1224,0203 2254,3909 áreas 365,7809 1217,8248 2275,7510 367,2099 1213,5566 2278,4097 370,5416 1207,9249 2316,7327 média 367,8701 1221,5344 2274,7203 DPR (%) 0,93 0,96 0,99

TABELA 21 - ANÁLISE DE PRECISÃO ANALISTA 2 DO ESCOPOLETINA EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Escopoletina [ ] baixa [ ] média [ ] alta 106,6394 348,7198 610,3165 107,3233 343,8893 616,6722 105,0852 344,4835 608,2168 áreas 107,9067 352,4081 619,5309 106,8066 349,3434 620,2433 104,6994 347,4592 629,2313 média 106,4101 347,7172 617,3685 DPR (%) 1,19 0,92 1,23

TABELA 22 - ANÁLISE DE PRECISÃO ANALISTA 2 DO ÁCIDO FERÚLICO EM 3 PONTOS DE CONCENTRAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Ácido ferúlico [ ] baixa [ ] média [ ] alta 244,8978 650,7965 1031,0769 241,0287 645,4221 1033,2031 239,3426 642,8768 1027,0389 áreas 245,5295 650,4266 1079,1757 244,5418 640,7269 1077,6891 246,5158 649,0568 1097,5919 média 243,6427 646,5509 1057,6293 DPR (%) 1,15 0,65 2,90

Como pode ser observado todos os DPR (%) estão abaixo do valor máximo de 5,00 %, desse modo confirma-se a precisão do método para os três metabólitos nos três níveis de concentração avaliados.

4.3.5.3 Comparação entre as Precisões

Para avaliar os diferentes resultados obtidos entre as duas precisões estes foram analisados em termos de DPR (%), calculados pelas 6 concentrações encontradas por cada um dos analistas, o critério de aceitação adotado foi o mesmo valor máximo de 5,00 % entre as amostras, o resultado está apresentado na Tabela 23.

TABELA 23 – DESVIO PADRÃO RELATIVO ENCONTRADO ENTRE AS PRECISÕES EM CADA UMA DAS CONCENTRAÇÕES ANALISADAS

Concentração média Concentração média Metabólito DPR % Analista 1 (μg/mL) Analista 2 (μg/mL) 19,72 19,05 1,43 Ácido Cafeíco 71,57 72,81 2,63 110,80 132,82 4,72 5,70 5,63 1,36 Escopoletina 14,10 15,88 2,75 24,17 26,28 3,43 20,33 19,26 3,83 Ácido Ferúlico 41,87 43,07 2,84 68,19 71,75 2,91

Não foi observado nenhum valor de DPR (%) superior a 5,00 % dessa forma podemos dizer que o método é preciso dentro do intervalo de trabalho para os três metabólitos quantificados.

4.3.6 Exatidão

Na análise de exatidão foi levado em conta os valores de recuperação obtidos nas amostras em que foram adicionadas quantidades conhecidas de padrões dos metabólitos: ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico. Os valores de recuperação para o ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico encontram-se nas Tabelas 24, 25 e 26, respectivamente. Os valores referentes ao extrato são os valores quantificados da solução de extrato M80, anterior as adições de padrões.

TABELA 24 – DADOS DA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO PARA ÁCIDO CAFEICO.

ÁCIDO CAFEICO Extrato Extrato + 25 % Extrato + 50 % Extrato + 100 % 353.548 626.249 985.451 1653.498 Áreas 351.440 624.428 985.924 1652.281 349.332 622.608 986.398 1651.065 Média das áreas 351.440 624.428 985.924 1652.281 Concentração (µg/mL) 20,76 39,04 63,26 107,89 Recuperação (%) 103,29 103,83 92,74

TABELA 25 – DADOS DA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO PARA ESCOPOLETINA

ESCOPOLETINA Extrato Extrato + 25 % Extrato + 50 % Extrato + 100 % 63.556 156.941 269.548 504.055 Áreas 63.480 156.410 271.431 504.477 63.403 155.880 273.314 504.899 Média das áreas 63.480 156.410 271.431 504.477 Concentração (µg/mL) 4,55 8.61 13,63 23,82 Recuperação (%) 103,54 100,00 105,48

TABELA 26 – DADOS DA AVALIAÇÃO DE EXATIDÃO PARA ÁCIDO FERÚLICO

ÁCIDO FERÚLICO Extrato Extrato + 25 % Extrato + 50 % Extrato + 100 % 174.432 320.107 520.957 892.593 Áreas 173.647 320.658 522.342 891.748 172.861 321.209 523.726 890.904 Média das áreas 173.647 320.658 522.342 891.748 Concentração (µg/mL) 16,65 25,98 40,15 66.11 Recuperação (%) 94,06 98,54 98,94

Todos os valores de recuperação encontram-se dentro dos parâmetros determinados para a exatidão, de 85% a 115% estabelecido pela RE 899 para matrizes complexas, sendo considerado, portanto um método exato, para o fim a que se destina.

4.3.7 Robustez

Esta etapa da validação poderia estar presente na fase de desenvolvimento do método, já que essas deliberadas alterações aos quais se submeteu o analito já foram estudadas durante o desenvolvimento do método. O critério de aprovação para cada modificação testada é de no máximo 5,00% de variação de recuperação em relação ao controle, ou seja, valores entre 95,00% a 105,00% de recuperação. Os resultados de robustez encontram-se na Tabela 27.

TABELA 27 – ANÁLISE DE ROBUSTEZ – DADOS DE RECUPERAÇÃO DO ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO Ácido cafeico Escopoletina Ácido Ferúlico Parâmetro de [ ] Média Recuperação [ ] Média Recuperação [ ] Média Recuperação Robustez (µg/mL) % (µg/mL) % (µg/mL) %

Controle 143,49 28,88 83,11

Temp. coluna 141,16 98,38 28,72 99,47 81,40 97,95 25˚ C - 2˚ C Temp. coluna 141,78 98,41 28,85 99,91 81,80 98,42 25˚ C + 2˚ C Coluna lote 142,94 99,62 29,19 101,07 82,62 98,92 diferente Fluxo 144,06 100,40 29,13 100,87 82,94 99,80 (0,8 – 0,1mL/min)

Modificações como o fluxo de eluição para 0,9 mL/min e o preparo da fase móvel para proporção em p/v acarretaram na mudança do tempo de retenção dos metabólitos, sendo consideradas desta forma estas modificações inadequadas para o bom andamento das análises neste método. Ao realizar análise em fluxo de eluição de 0,7 mL/min os resultados de recuperação apresentados encontraram-se dentro do intervalo de aceitação. O método mostrou-se também robusto para as variações na temperatura de forno para 23˚C e 27˚C, para os três metabólitos analisados. Avaliando colunas de diferentes lotes os resultados obtidos foram muito semelhantes apresentaram percentagem de recuperação inferior a 105,00% sendo robusto para colunas de lotes diferentes. Na analise de robustez os resultados não conformes são descritos nos métodos como observação para que o método não seja modificado. Portanto um

resultado não conforme de robustez não invalida o método.

4.4 QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO NOS EXTRATOS DE Malva sylvestris

Os extratos hidroalcoolicos obtidos (M50, M70, M80, M90, M100, S70, T70) e os extratos comerciais (EC1, EC2, EC3, EC4, EC5, EC6, EC7 e EC8) foram quantificados, por CLAE-DAD, utilizando o método desenvolvido e validado. As amostras de extratos obtidos por maceração, via soxhlet e turbólise foram pesados e diluídos em solução de metanol/ água 9:1 v/v, até concentração de 20 mg/mL de extrato, filtrados em filtro de seringa 0,45 µm. Os extratos comerciais foram filtrados em filtro de seringa 0,45 µm e analisados sem qualquer outro procedimento. Os resultados de doseamento dos extratos hidroalcoolicos estão dispostos na Figura 45. O extrato S70 foi o que apresentou a maior concentração dos três metabólitos pesquisados, quando comparado os métodos macerativos em diferentes proporções de etanol água a escopoletina foi melhor extraída no extrato M50, os compostos fenólicos ácido cafeico e ácido ferúlico foram melhor extraídos em maiores proporções de etanol.

FIGURA 45 – CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO DETERMINADO POR CLAE-DAD NOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO, SOXHLET E TURBÓLISE

As concentrações dos extratos glicólicos comerciais estão apresentados na Tabela 28. Os extratos comerciais são provenientes de diferentes fornecedores, deste modo a origem da planta e o método extrativo é desconhecido. Nem todos os metabólitos puderam ser quantificados em todos os extratos. Os extratos com as maiores concentrações dos metabólitos: ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico foram os extratos EC6 e EC7.

TABELA 28 – CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO CAFEICO, ESCOPOLETINA E ÁCIDO FERÚLICO DETERMINADO POR CLAE-DAD NOS EXTRATOS COMERCIAIS

Concentração (µg/mL) ± DP Extratos Ácido cafeico Escopoletina Ácido ferúlico EC 1 Não detectado 4,895 ± 0,021 Não detectado ÈC 2 Não detectado 2,990 ± 0,007 4,880 ± 0,014 EC 3 0,135 ± 0,059 1,940 ± 0,000 10,645 ± 1,633 EC 4 traços 2,485 ± 0,021 8,155 ± 0,120 EC 5 traços 6,330 ± 0,001 7,130 ± 0,028 EC 6 21,545 ± 0,332 12,890 ± 0,580 20,055 ± 0,771 EC 7 61,865 ± 5,650 31,605 ± 0,049 44,675 ± 0,007 EC 8 9,040 ± 0,099 2,460 ± 0,014 27,080 ± 0,325

4.5 ANALISE DE CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS – ANÁLISE DE FINGERPRINT

4.5.1 Análises em CCD

A análise em CCD com finalidade de caracterizar os extratos através do perfil cromatográfico, foi realizada utilizando diferentes condições cromatográficas para que fossem evidenciadas características diferentes dos extratos obtidos por maceração, via soxhlet modificado, turbólise e infusão. Os extratos não apresentaram diferenças significativas, quando analisadas sob diferentes condições cromatográficas. Utilizando a fase móvel 1 (separação de antocianidinas) foi observado que os diferentes extratos de maceração, turbólise e soxhlet apresentam perfil cromatográfico semelhantes, sendo que possuem apenas intensidades diferentes nas bandas reveladas, já a infusão apresenta menor número de bandas de absorção, sugerindo que esta extração não foi efetiva para antocianidinas quando comparadas aos outros métodos empregados. Quando comparado com o padrão de antocianidina (PM) apresentou mancha no mesmo tempo de retenção para todos os extratos, mas não apresentou a mesma coloração, conforme pode ser observado na Figura 46.

FIGURA 46 – PLACA CROMATOGRÁFICA SOB REVELADOR: LUZ UV DE 365 NM E FASE MÓVEL 1 TENDO AS BANDAS DE PQ (PADRÃO QUERCETINA), PM (PADRÃO MALVIDINA 3-O- GLICOSIDEA), M70, I, S70 E T70.

Em análise cromatográfica específica para a separação de flavonóides glicosilados (FM - 2), flavonóides agliconas (FM - 4) e escopoletina (FM - 3) as cromatoplacas obtidas nestas análises demonstraram semelhanças entre os extratos, ou seja, as mesmas manchas são vistas em todos os extratos. A partir deste resultado podemos supor que a técnica analítica de cromatografia em camada delgada, não pode ser utilizada como única ferramenta na caracterização do extrato e para a construção de um padrão fingerprint, já que a diferenciação entre os diferentes modos de extração não pode ser elucidado, esta técnica associada a análise de CCD em 2D poderia ser uma interessante saída.

4.5.2 Análise em RMN de 1H

A análise comparativa por RMN de 1H foi realizada utilizando os espectros na sua totalidade e também região por região. Na Figura 47, região ampliada de 0,6 a 3,0 ppm referente aos alifáticos, pode ser observado que os extratos possuem perfis semelhantes sendo que os extratos de maceração e turbólise apresentam-se mais semelhantes e com número maior de compostos, diferenciando do extrato de infusão e soxhlet.

FIGURA 47 – ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS DIFERENTES EXTRATOS DE MALVA SYLVESTRIS NA REGIÃO ESPECTRAL CORRESPONDENTE A COMPOSTOS ALIFÁTICOS (0,6 A 3,0 PPM)

Na região ampliada de 3,2 a 5,0 ppm, região de açucares, apresentada pela Figura 48, verificamos maiores detalhes nos espectros dos extratos de turbólise seguido pelo de maceração, o extrato de infusão foi o que apresentou menos detalhes no espectro desta região analisada. O perfil espectral entre os extratos apresentam-se semelhantes, apresentam apenas um desvio da linha de base, dado pela grande concentração de água presente nos extratos de infusão e maceração conforme apresentado na figura 48.

FIGURA 48 - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS DIFERENTES EXTRATOS DE MALVA SYLVESTRIS NA REGIÃO ESPECTRAL CORRESPONDENTE AOS AÇUCARES (3,2 A 5,0 PPM)

Na região espectral referente aos compostos aromáticos (4,5 a 9,5 ppm), mostrado na Figura 49, os extratos não apresentaram diferenças em relação ao número de sinais espectrais, diferindo apenas na intensidade dos picos apresentados. Tendo picos de maior intensidade o extrato de turbólise, seguido pelo extrato de sohxelt, maceração e infusão.

FIGURA 49 - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS DIFERENTES EXTRATOS DE MALVA SYLVESTRIS NA REGIÃO ESPECTRAL DE AROMÁTICOS (4,5 A 9,5 PPM)

4.5.3 Análise comparativa dos extratos através de CLAE-DAD

A comparação dos perfis cromatográficos foi realizada com os extratos M50, M70, M80, M90, M100, S70 e T70, sendo observada uma semelhança muito grande entre os extratos, conforme mostrado nas Figuras 50, 51 e 52. A figura 47 mostra a comparação entre os extratos obtidos por maceração utilizando diferentes proporções de etanol. Foi observado que os cromatogramas apresentam-se bastante parecidos, diferindo em intensidade de pico e no número de compostos eluidos na região entre 10 e 35 minutos. Pode-se dizer que os metabólitos eluidos nestes Tr são compostos mais apolares e desta forma quando comparamos as proporções de etanol e água utilizados na extração, o extrato M100 foi aquele que apresentou o menor número de metabólitos, enquanto que M50 apresentou mais metabólitos e em intensidade maior que os extratos M70, M80 e M90.

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FIGURA 50 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS M100, M50, M70, M80 E M90, RESPECTIVAMENTE, OBTIDOS EM 348 NM.

Além da proporção de etanol, foi comparada o método utilizado para a extração dos metabólitos, conforme mostra a Figura 51, que trás três diferentes extratos obtidos a partir das folhas de M. sylvestris utilizando o etanol a 70% v/v como solvente extrator. A diferença observada entre os métodos de maceração (M70), soxhlet (S70) e turbólise (T70) foi na eficiência de extração dos metabólitos, sendo observado esse fato pelo surgimento de outros picos cromatográficos.

FIGURA 51 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS M70, S70 E T70, OBTIDOS EM 348 NM

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A Figura 52 mostra as diferenças observadas entre os extratos glicólicos comerciais de M. sylvestris comercializados, a diferença está na intensidade e na quantidade de picos cromatográficos apresentados, o que representa a inexistência da uniformidade na composição, nos solventes de extração e também nos métodos utilizados para a extração. Comparando os cromatogramas dos extratos comerciais, glicólicos, hidroalcoólicos e tinturas pode-se dizer que o método desenvolvido foi eficiente para análise e comparação visual destes extratos.

FIGURA 52 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS GLICÓLICOS COMERCIAIS DE MALVA SYLVESTRIS, DE LOTES DIFERENTES E FORNECEDORES DIFERENTES OBTIDOS EM 348 NM.

4.5.1 Análise comparativa dos extratos através CLAE-EM

A análise comparativa dos extratos, M50, M70, M80, M90, M100, S70 e T70, também foi realizada através de análise por CLAE-EM, associada a análise quimiométrica por análise de componentes principais (PCA). Na análise do cromatograma pode ser observado um perfil muito semelhante entre os extratos, conforme verificado na Figura 53. Uma vez que não pode ser observada diferença entre os perfis cromatográficos foi utilizado o software Matlab como ferramenta estatística para tentar evidenciar as diferenças entre os extratos deste modo, foram

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utilizados recursos de análise multivariada de dados para evidenciar possíveis semelhanças e diferenças entre as amostras.

FIGURA 53 – CROMATOGRAMAS DOS EXTRATOS M50, M70, M80, M90 E M100 GERADOS POR CLAE-EM, TIC MODO POSITIVO.

Para a aplicação da PCA aos dados cromatográficos, estes foram tabulados no Origin, onde as linhas corresponderam ao tempo de retenção e as colunas as intensidades dos sinais cromatográficos, posteriormente foram exportados para o Matlab, todos os dados foram utilizados na análise após transposição dos dados e pré processamento alisamento, para redução do sinal de ruído. Quando foi aplicada a PCA aos dados cromatográficos não foi observada uma separação entre os extratos. Mostrando que os extratos são semelhantes qualitativamente conforme mostra a Figura 53. Na Figura 54 estão plotados os scores dos extratos de maceração. Os dados cromatográficos passaram por alisamento como pré processamento, e foi analisado em 2 componentes principais os quais explicaram 98,33 % da variabilidade total dos dados.

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Pode-se observar, na Figura 54, que a distribuição das amostras no gráfico de scores PC1 x PC2, mostrou se pouco disperso. Ao considerar PC1 e PC2 podemos verificar que as amostras estão dispostas perto umas das outras, ver escala, por mais que pareça ser dois grupos diferentes, os valores expressos nos dois eixos perpendiculares são baixos, ou seja, qualitativamente são amostras muito parecidas. Pertencentes portanto ao mesmo grupo de extratos. O gráfico de loading apresentado na figura 55 representa PC1 e PC2 x Variável (tempo de retenção), pode ser verificado que nas duas componentes principais consideradas nesta análise de PCA, considerou-se importante à região próxima a variável 100 e também à região de variável 600, regiões em que todos os cromatogramas dos extratos apresentam os picos de maior intensidade. Estes picos intensos acabaram mascarando os sinais de menor intensidade. Portanto foi utilizado regiões dentro do intervalo entre a variável 100 e 600, os quais foram submetidos ao mesmo tratamento estatístico, não sendo novamente possível a diferenciação entre os grupos de extratos. Os extratos de maceração mesmo utilizando diferentes proporções de solventes para extração, oferecem extratos semelhantes.

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FIGURA 55 – GRÁFICO DE LOADING DE PC 1 (LINHA CHEIA) E PC2 (LINHA PONTILHADA) DOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO.

No gráfico de scores, da Figura 56, foram plotadas amostras S70 (1, 2 e 3), T70 (4, 5 e 6) e M70 (7, 8 e 9) com alisamento como pré processamento dos dados e avaliados em PC2 x PC1, tendo 99,26% dos dados explicados. Pode ser verificada que os extratos apresentam grande semelhança entre eles. Os valores de PC1 apresentados são pequenos mostrando que as amostras são pertencentes a um mesmo grupo, quando avaliado PC2 podemos verificar uma pequena dispersão, onde o primeiro grupo corresponde ao S70 seguido por T70 e M70 com uma amostra de T70, ou seja, há semelhança ainda maior entre os extratos T70 e M70, não sendo possível distinguir completamente um do outro.

FIGURA 56 – GRÁFICO DE SCORES DOS EXTRATOS DE S70 (1 A 3), T70 (4 A 6) E M70 (7 A 9), APÓS PRÉ PROCESSAMENTO ALISAMENTO REPRESENTADO EM PC2 X PC1 EXPLICANDO 99,26% DOS DADOS

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O gráfico de loading apresentado na figura 57 representa PC1 e PC2 x Variável, da mesma forma que foi apresentada na Figura 55, tendo como regiões primordiais para esta análise próximos a variável 100 e 600 para as duas componentes principais. As amostras obtidas por diferentes métodos de extração e com o mesmo sistema de solvente, fornecem extratos de mesmo perfil, diferenciados apenas na intensidade dos metabólitos obtidos.

FIGURA 57 - GRÁFICO DE LOADING DE PC 1 (LINHA CHEIA) E PC2 (LINHA PONTILHADA) DOS EXTRATOS DE SOHXELT, TURBÓLISE E MACERAÇÃO.

Quando comparou-se os dados cromatográficos, submetidos a PCA, dos extratos comerciais com os extratos de maceração foi possível diferenciá-los, utilizando alisamento como pré processamento dos dados e 3 componentes principais PC1, PC2 e PC3 para a análise sendo explicado 99,17% dos dados. Na Figura 58 os extratos de maceração estão sinalizados por + enquanto que os extratos comerciais por ●.

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FIGURA 58 – GRÁFICO DE SCORES DOS EXTRATOS COMERCIAIS (+) E EXTRATOS DE MACERAÇÃO (●) APÓS PRÉ PROCESSAMENTO ALISAMENTO, SENDO UTILIZADO PC1, PC2 E PC3 PARA EXPLICAR 99,17% DOS DADOS

FIGURA 59 – GRÁFICO DE LOADING DE PC1 (LINHA CHEIA), PC2 (LINHA PONTILHADA) E PC3 (LINHA TRACEJADA) DOS EXTRATOS DE MACERAÇÃO E EXTRATOS COMERCIAIS DE MALVA SYLVESTRIS No gráfico de loading da Figura 59, quando analisamos PC1 verificamos que as regiões de maior importância dos dados foram as regiões próximas a variável 100, esta região no cromatograma aparece muito semelhantes em qualquer um dos extratos analisados, desta forma considerando PC1, não houve separação efetiva entre os grupos de extratos. Analisando PC2 podemos verificar que na Figura 58, o gráfico de scores, os valores de PC2 encontram-se mais espaçados, dando uma noção de separação

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entre os grupos, enquanto na Figura 59, o gráfico de loading, PC2 apresenta além das regiões de variável 100 e 600, um detalhamento no intervalo entre 100 e 600, o que pode ser um dos motivos da separação dos grupos de extratos. Avaliando PC3 no gráfico de scores (Figura 58) podemos verificar que os extratos de maceração apresentam valores positivos enquanto que os extratos comerciais apresentam valores negativos, sendo possível demonstrar a separação entre os dois grupos de extratos. O gráfico de loading (figura 59) relaciona PC3 com as regiões de variável 100 e 600, com detalhamento nos valores negativos de PC3 na região próxima a variável 150, desta forma separando os grupos de extratos.

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5 CONCLUSÃO

A espécie Malva sylvestris é relatada nos estudos etnobotânicos com ampla utilização no tratamento de inflamações bucais e superficiais, e também como expectorante. Alguns estudos foram realizados e comprovaram que esta planta possui atividade antiinflamatória e bacteriostática, justificando seu uso popular. Ainda esta espécie está entre as plantas relacionadas na RENISUS. Além disso, na Farmacopéia Brasileira 4a edição em que a malva está incluída não descreve análise quantitativa para o marcador fitoquímico. Portanto, para contemplar legislações regulatórias na questão de registro de medicamentos contendo M. sylvestris foi desenvolvido no presente trabalho, estudo de caracterização de extratos secos de M. sylvestris e desenvolvimento de método quantitativo para análise de antocianidinas, cumarinas e fenólicos em extratos secos e comerciais de malva. O método qualitativo e quantitativo desenvolvido por CLAE-DAD para a determinação de ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico pode ser considerado adequado para o fim a que se destina para os diferentes extratos de M. sylvestris. O método foi validado, tendo se mostrado robusto para variações de fluxo para 0,7 mL/min, alterações de temperatura e coluna, preciso, exato e o intervalo trabalhado mostrou se seguro, atendendo aos parâmetros de validação. Os extratos obtidos M50, M70, M80, M90, M100, S70 e T70 tiveram três metabólitos quantificados, sendo que o extrato S70 foi o que apresentou maior concentração de ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico, respectivamente 17,46, 8,09 e 15,32 µg/mg de extrato seco. Quando foi comparado os extratos macerativos de diferentes proporções de etanol e água o extrato M50 apresentou maior concentração de escopoletina 4,52 µg/mg de extrato seco, os demais extratos apresentaram valores entre 2,40 a 2,90 µg/mg de extrato seco, para o metabólito ácido cafeico os extratos apresentaram concentrações entre 11,03 e 13,54 µg/mg de extrato seco e para ácido ferúlico os valores de concentração variaram de 7,98 a 13,44 µg/mg de extrato seco. O extrato T70 apresentou resultados próximos aos extratos de maceração. A associação ácido cafeico, escopoletina e ácido ferúlico pode estar relacionada com a atividade antiinflamatória da Malva sylvestris, o que justifica sua aplicação como marcadores para a espécie. Pode-se dizer que o extrato

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S70 foi o melhor extrato em relação a concentração dos marcadores, quando comparado com os demais extratos obtidos na mesma proporção de etanol e água. Os extratos comerciais foram analisados por CLAE-DAD, mas nem todos os extratos apresentaram ácido cafeico e ácido ferúlico em quantidade suficiente para a quantificação, os extratos que apresentaram maior concentração dos metabólitos foram EC6 e EC7. Esta variabilidade pode ser devido as diferentes condições de extração como solvente extrator e métodos desconhecidos, além da concentração em que é comercializada, já que os extratos foram apenas filtrados. Além dos metabólitos quantificados foi pesquisado nas folhas de M. sylvestris o marcador farmacopêico para identificação, a malvidina 3–O glicosideo. Nos resultados de CCD, CLAE-DAD e CLAE-EM, não foi confirmada a presença deste metabólito nos extratos analisados, malvidina 3-O glicosideo pertencente a classe das antocianidinas é uma substância de cor púrpura, facilmente encontrada em flores de malva. Na farmacopéia brasileira 4 edição a parte utilizada da M. sylvestris são as folhas, conforme o estudo realizado o marcador de identificação não foi detectado provavelmente por tratar-se de folhas. Outros compêndios como a Farmacopéia européia e helvética trazem como parte utilizada folhas e flores, e mais recentemente foi publicada pela Anvisa o Formulário de Fitorerápicos Farmacopéia Brasileira (2011) que adicionou também como parte utilizada flores, pode-se dizer que não é possivel a identificação do marcador fitoquimico da espécie utilizando somente as folhas, conforme descrito pela Farmacopeia Brasileira 4 ed. As análises de caracterização dos extratos por CCD, RMN de 1H, CLAE- DAD e CLAE-EM associada a PCA, demonstraram que as diferentes proporções de etanol e água utilizadas no método de maceração fornecem extratos de perfis bastante semelhantes, diferem apenas na intensidade dos picos eluídos, sugerindo que quanto maior a quantidade de água utilizada na proporção do solvente extrator mais eficiente é a extração dos compostos polares, bem como para os diferentes métodos extrativos testados, maceração, via soxhlet e turbólise, também apresentaram perfis semelhantes tendo T70 e M70, respectivamente apresentado picos mais intensos que S70. Neste estudo foi demonstrado que o método desenvolvido foi eficiente para a qualificação dos extratos e a quantificação de três dos metabólitos da Malva sylvestris, pode-se dizer que este método pode ser aplicado para a análise de

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controle de qualidade dos extratos comercializados contribuindo para a qualidade dos produtos manipulados e industrializados, que contem extrato de malva na composição.

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