BIOL201
Daniel Gautheret [email protected]
• Chapitre 1: Transcription et RNA polymérase • Chapitre 2: Initiation, élongation et terminaison • Chapitre 3: Régulation: l’exemple procaryote • Chapitre 4: Maturation de l’ARN chez les eucaryotes
V. 2012.0 Chapitre 1
Transcription et RNA polymérase
2 L’intuition de la transcription
Chez les eucaryotes:
ADN dans le noyau Machinerie de synthèse dans le cytoplasme
Hypothèse d’un l’intermédiaire ARN
3 Etapes-clé de la découverte de l’ARN messager
• 1957: concept d’un « adaptateur ARN » (Crick) • 1956-57: Découverte progressive d’une nouvelle fraction d’ARN, polymorphe • 1959-60: découverte d’une « ARN polymérase » capable de synthétiser de l’ARN à partir d’ADN. • 1961. Mise au point des techniques d’hybridation ADN- ARN sur filtre de nitrocellulose. -> l’ARN est complémentaire d’un seul brin d’ADN • 1961. Démonstration de l’existence d’un ARN messager (Jacob & Monod) • 1961. Purification d’ARN polymérase bactérienne et synthèse in vitro d’ARN à partir de matrice ADN
4 Rappel: différences ADN/ARN
ARN ADN
ribose désoxyribose
5 Bases de l’ADN et de l’ARN
Base puriques
ADN: T ARN: U
Base pyrimidiques
6 Structure des ARN
• Molécule ordonnée linéaire
O • Orientée 5’P->3’OH P • Grand nombre de O
H2C structures secondaires possibles
7 Décodage du gène dans la cellule bactérienne
ADN ARN polymérase
Ribosome grande sous-Unité
ribosome ARNm
Ribosome petite sous-Unité Protéine
ARNr
ARNt
aminoacides
Membrane cellulaire 8 Les principaux ARN dans une bactérie
• ARN ribosomiques (ARNr) – Grande sous-unité 23S (3000nt) et 5S (120nt) – Petite sous-unité 16S (1500nt) – Composition en bases: 25%A 21%U 32%G 22%C • ARN de transfert (ARNt) – 4S (70nt) • ARN messager (ARNm) – Instable (demi-vie courte) – Grande variété de molécules – Entre 300 et 5000 nt – Taux de synthèse élevé
9 Décodage du gène dans la cellule eucaryote
ADN ARN polymérase ARNr Pré-ARNm ARNt Maturation
ARNm ribosome
Protéine
Membrane cellulaire 10 Distribution des ARN dans une cellule eucaryote
Cytoplasme Noyau
• ARN ribosomiques (ARNr) • Distribution différente du – Grande sous-unité 28S et 5,8S cytoplasme – Petite sous-unité 18S • ARN « géants » (10000 à 100000nt) • ARN de transfert (ARNt) • Turn-over rapide – 4S • ARN messager (ARNm) – Plus stables qu’ARNm bactériens – Grande variété de molécules – Entre 300 et 5000 nt
Idée d’ARN précurseurs présents dans le noyau 11 ARN présents dans une cellule typique de mammifère (fibroblaste de souris en culture)
ARN cellulaire ARN total (%) à Synthèse l’équilibre totale (%)
Précurseurs nucléaires d’ARNr 4 39
ARNr cytoplasmique 71 - Pré-ARNm 7 58
ARNm cytoplasmique 3 ! - Petits ARN stables (surtout ARNt) 15 3
Toute la variété des ARNm est comprise dans ces 3% !
12 Comparaison transcription/réplication: copie des 2 brins d’ADN au cours de la réplication
From Wikipedia: DNA replication 13 Comme pour la réplication: polymérase synthétise de 5’ vers 3’
5’
ARN synthétisé Matrice ADN
3’
14 Copie d’un seul brin d’ADN par l’ARN polymérase
5’ T A G T A C G T C A A T A C T G G C C G T G T G A 3’ A T C A T G C A G T T A T G A C C G G C A C A C T 3’ 5’
T A A C A T G 5’ 5’ C T G 3’ T A G T A AC C G C C G T G T G A G U A T C A T G C C G G C A C A C T 3’ A G C 5’ A G U C T A Brin matrice = C A T U A brin transcrit G A T bulle
15 Les gènes peuvent résider sur un brin ou l’autre de l’ADN
• Exemple de transcription dans une région génomique: il y a des gènes sur les deux brins.
Sens de la transcription sur le brin matrice
ADN 5’ ATG 3’ 3’ 5’ AUG Sens de la transcription sur le brin matrice
16 Les étapes de la transcription
Site d’initiation Site de terminaison
Initiation
Elongation
Terminaison
17 Structure de l’ARN polymerase de T7
18 Structure de l’ARN polymerase bactérienne
bulle
19 Structure de l’ARN polymérase d’E. coli
β’ β’ α α α + σ α σ ω β ω β
Core enzyme Holoenzyme
7000 molécules/cellule alpha rpoA 36500 Coeur (Core) beta rpoB 151000 site catalytique beta’ rpoC 155000 liaison omega rpoZ 11000 assemblage du core Complet (Holo) sigma rpoD 70000 interaction avec promoteur 20 Les 3 ARN polymérases eucaryotes
21 Activités des 3 ARN polymérases eucaryotes
• Pol I: la plus active. Synthétise les ARNr sauf 5S. Dans le nucléole. • Pol II. Synthétise les précurseurs d’ARNm. Dans le noyau. • Pol III. Activité faible. Synthétise les ARNt et autres petits ARN nucléaires (snRNA), et ARNr 5S. Dans le noyau
22 Les 3 ARN polymérases de Saccharomyces cerevisiae
β ’−−> β −−>
α −−>
ω −−>
23 24 Pour la structure de la RNA polymérase II de levure en cours de transcription
25 Saccharomyces cerevisiae RNA POLYMERASE II de 26 27 Structure de l’ARN polymérase II : Longueur considérable du domaine C-terminal (queue CTD)
CTD: répétition d’une cinquantaine de séquences “Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser”
28 Initiation Début de transcription ARN polymérase
• La polymérase se fixe au promoteur sur l’ADN duplex promoteur
• La polymérase dénature le duplex. Formation de la bulle de transcription
• La polymérase catalyse la liaison phosphodiester des deux premiers rNTP
29 Elongation Zone hybride ADN/ARN • La polymérase avance 3’>5’ sur le brin matrice en dénaturant le duplex et en ajoutant des rNTP à l’ARN 5’ ARN natif
Terminaison Fin de transcription • Au site d’arrêt de transcription, la polymérase relargue l’ARN terminé et se dissocie de l’ADN
ARN terminé
30 Chapitre 2:
Initiation, Elongation et Terminaison de la transcription
31 Initiation Début de transcription ARN polymérase
• La polymérase se fixe au promoteur sur l’ADN duplex promoteur
• La polymérase dénature le duplex. Formation de la bulle de transcription
• La polymérase catalyse la liaison phosphodiester des deux premiers rNTP
32 Initiation chez les bactéries
33 Structure d’un promoteur bactérien
Promoteur -35 -10 Région transcrite
Séquence TTGACA N TATAAT N5-9 A/G consensus 17
αN β’ αC αN β αC σ
-35 -10 Reconnaissance du promoteur par le facteur sigma 34 Caractérisation de la région promotrice (Modification des bases, Mutations des paires de bases)
Modification empêchant Start la liaison de -35 -10 la RNA pol
Modification évitée en présence de RNA pol
Mutation nuisant à l’activité du promoteur
Points de contact déduits
La plupart des points de contacts se trouvent sur la même face de l’ADN 35 Reconnaissance d’un promoteur par l’ARN polymémase:
Affinités relatives du core enzyme et de l’holoenzyme pour l’ADN
Initiation Holoenzyme Fixation au promoteur Elongation Core Abandon promoteur terminaison Core+fact term Décrochage de l’ADN Core + sigma Recyclage 36 Exemples de facteurs sigma chez E. coli
37 Initiation chez les eucaryotes
38 RNA Pol-I
La synthèse du précurseur des ARN ribosomaux a lieu dans le nucléole
39 Initiation de la transcription par la RNA pol I (synthèse des ARN ribosomiques)
Les ARN pol. eucaryotes ne se fixent jamais seules: facteurs de transcription
Un « core factor » constitué de nombreux facteurs Core Factor
TBP + pol I et Rrn3p
Rrn3p Complexe d’initiation
Pol I 40 ARN pol III: le gène 5S n’est pas contrôlé par un promoteur en amont Mise en évidence d’une région interne de contrôle de la transcription activité délétions + + + + + + ICR=Internal control region - -
+1 +40 +80 +120 gène ARN 5S - - + + Mais comment la polymérase + Peut-elle se placer correctement? + délétions activité 41 Explication: le complexe d’initiation de la transcription de la pol-III
TFIIIC TFIIIB Gène tRNA Pol III A B
TFIIIC TFIIIB TFIIIA Gène ARNr 5S Pol III C
42 Séquence de la région ICR du gène codant pour l’ARN5S de Xenopus laevis et structure du facteur de transcription TFIIIA qui se fixe sur la région ICR
Région ICR
TFIIIA
12 acides aminés
43 Trois familles de doigts de zinc
44 Représentation schématique de l’interaction de l’ADN avec les doigts de Zinc en tandem contenus dans le facteur TFIIIA
45 La RNA pol. II
46 Détermination de la région promoteur d’un gène dépendant de l’ARN polymérase II
Les régions sont délétées
47 Identification de 3 Régions nécessaires à l’initiation de la transcription, en amont du gène codant pour la β-Globine
Expériences de mutations ponctuelles
Boite Boite Boite GC CAAT TATA
48 Les promoteurs utilisés par la pol-II sont des combinaisons variées de courtes séquences consensus
49 Formation du complexe de démarrage pol-II
Complexe préinitiation TATA
+ TBP + TFIIH
Transcription basale Sans activation
+ TFIIB Pol II + TFIIE TFIIF + CTD
50 Eléments de contrôle du promoteur pol-II : les éléments distants
enhancers promoteur gène enhancers
UAS= upstream activating sequence
51 Comment fonctionne un enhancer? Modèle simplifié d’activation de la transcription
Enhancer
Activateur de transcription Boucle d’ADN TBP RNA Pol
TATA box Site d’init.
52 TBP peut s’associer à des facteurs (les TAF) et former le complexe TFII-D: Activation de la transcription
TAF250 TAF80 TAF110 TAF60 TAF30α TAF30β TAF40 TBP TAF150 TATA Initiateur
TAF: TBP-Associated Factors : ouvrent la chromatine, acetylent histones etc. 53 Niveau basal / Niveau activé
interactions
TBP B F E H Transcription promoteur basale
Activateurs
TAF250 TAF80 TAF110 TAF60 TAF30αTAF30 β TAF40 TAF150
TBP B F E H Transcription activée promoteur 54 TBP est nécessaire à l’initiation de la transcription par chacune des 3 polymérases eucaryotes
TBP
TBP Pol III Pol II
TBP
Pol I
55 Structure de la TBP de levure en complexe avec une boite TATA
Structure en « selle de cheval » Fixation dans sillon mineur
56 Un mélange d’interactions:
- non-spécifiques (coller à l’ADN sur les groupements P)
- spécifiques (reconnaître la séquence TATA)
57 Torsion de la double hélice d’ADN
58 Elongation de la transcription: nécessité de quitter la région du promoteur
TFII B/D/E/F/J Pol II
TATA H Chez les bactéries : CTD relarguage du facteur sigma phosphorylation de la queue CTD Chez les eucaryotes : phosphorylation de la queue CTD par TFIIH TFII B/D/E/F/J Pol II
TATA H P Complexe P P d’élongation CTD P P P P 59 Elongation de la transcription
RNA pol
T A A C A T G 5’ C T G T A G T A AC C G bulle C C G T G T G A G U A T C A T G C C G G C A C A C T 3’ A 3’OH G C A G U C Matrice ADN T A C A T U A = brin non-codant G A T
NTP suivant
60 Procaryotes: la terminaison rho-indépendante
ADN
ARN
dissociation
From: www.vetmed.iastate.edu/departments/vmpm/ 61 Procaryotes: la terminaison rho- dépendante (modèle)
Blocage du ribosome sur codon Stop permet la fixation de la protéine Rho sur un site « Rho utilization site »
La fixation de Rho cause le décrochage de la polymérase
62 Terminaison chez les eucaryotes
• Arrêt causé par la polyadenylation (voir dernier cours). • Après arrêt: maturation de l’ARN
63 Chapitre 3:
Régulation de la transcription: le modèle procaryote
64 La régulation de l’expression
• Pourquoi l’expression des gènes doit-elle être régulée? – Division cellulaire – Différentiation – Réponses à l’environnement
65 Induction / Repression
• Induction/répression: réponses à l’apparition d’un substrat particulier • Induction: – En absence de lactose: pas besoin d’enzyme de métabolisme du lactose – En présence de lactose: induction. L’enzyme est produite • Répression – Une enzyme d’E.coli synthétise le tryptophane – En présence de Trp dans le milieu: pas besoin d’enzyme: répression
66 Métabolisme du lactose
67 Au départ: deux gènes connus Années 50 • Gène z (lac Z) : βgal • Gène i: – Souche inductible: i+ – Souche constitutive: i-
βgal i+ z+ inducteur βgal
βgal i- z+ inducteur βgal
68 Inducteur=lactose ou analogue L’expérience Pajama* (*Pardee, Jacob, Monod, 1959)
F
Donneur: bactérie F (pili) Receveur: bactérie F-
donneur i+ z+
X receveur i- z-
69 L’expérience Pajama
IPTG: inducteur analogue du lactose qui contrairement au lactose n’est pas reconnu par beta-gal. Donc reste dans la cellule.
donneur Ajout IPTG i+ z+
X receveur i- z-
Interprétation: 1- introduction du gène z+ dans receveur i- > fabrication Bgal 2- introduction i+ > bloque synthèse de βgal (i est un répresseur) 3- en présence d’inducteur, le répresseur ne fonctionne plus 70 Jacob, Monod, 1961: Fonctionnement de l’opéron (1)
71 Fonctionnement de l’opéron (2)
72 Les mutants qui ont permis d’établir le modèle d’opéron:
Genotype Non- induit induit I+,Z+ - + Sauvage I-,Z+ + + Pas de répression I-,Z+ / F I+,Z+ - + Restauration répression par action trans Is,Z+ - - Is: represseur insensible à l’induction Is,Z+ / F I+,Z+ - - Is agit encore en trans Oc,Z+ + + Oc: opérateur constitutif. Ne reconnait pas I O+,Z- / F Oc,Z+ + + O+ ne répare pas Oc: action en cis Is,O+,Z+ /F I+,Oc,Z+ + + Oc dominant sur Is
73 L’effet de l’inducteur sur le répresseur n’est pas absolu
Répresseur Répresseur +inducteur opérateur 2 x 1013 2 x 1010 Affinité autre DNA 2 x 106 2 x 106
Spécificité 107 104 Différence d’affinité
74 Symétrie de la séquence de l’opérateur de l’opéron lactose
Mutations rendant constitutive l’expression de l’opéron:
5’ TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT 3’ 3’ ACCTTAACACTCGCCTATTGTTAA 5’
O c mutations A TGTTA C T T ACAAT G A
75 Structure du complexe répresseur lac /opérateur
Le répresseur est un homodimère
Chaque sous-unité est représentée par une couleur différente.
76 77 Encombrement de l’ARN polymérase bactérienne, de l’ADN et du répresseur du phage λ
78 La répression catabolique
Le glucose (un catabolite) réprime la synthèse de βgal
Glucose
ATP cAMP CAP cAMP
CAP
En absence de glucose: augmentation du taux d’AMPc qui forme un complexe avec la protéine CAP et l’active. En présence de glucose: baisse du taux d’AMPc: empêche l’activation de CAP 79 une régulation positive
80 Site de fixation du complexe CAP-cAMP sur le promoteur
GTGAGTTAGCTCAC CACTCAATCGAGTG
Promoteur +1 lacI lacZ Site CAP Fixation répresseur Fixation RNA-polymérase
81 Conditions de régulation
82 Principes de régulation positive et négative
83 La régulation de la synthèse du tryptophane chez coli
1.Contrôle au niveau de l’initiation de la transcription
2.Contrôle au niveau de la terminaison de la transcription
84 Trp: contrôle de l’initiation
• Un répresseur, trpR se fixe sur 3 opérateurs et contrôle la transcription : – De l’opéron trpEDBCA qui code pour les enzymes de la voie de bioysynthèse du tryptophane à partir du chorismate – Du gène aroH qui code pour un enzyme impliqué dans la première étape de la voie de synthèse des acides aminés aromatiques – De son propre gène trpR (autocontrôle)
aroH GCCGAATGTACTAGAGAACTAGTGCATTAGGCTTATTTTTTTGTTATGATGCTAA Trp AATCATCGAACTAGTTAACTAAGTACGCA
trpR TGCTATCGTACTCTTTAGCGAGTACAACC 85 Contrôle au niveau de l’initiation de la transcription par le répresseur TrpR
86 Trp: contrôle de la terminaison
– La transcription de l’opéron peut s’arrêter précocément après la synthèse d’une séquence leader qui précède les régions codant pour trpEDBCA: mécanisme d’atténuation
87 Le modèle d’atténuation Peptide leader avec 2 codons trp
En présence de trp: • Passage du ribosome • Formation d’une structure terminatrice •Blocage transcription
En absence de trp: • Blocage du ribosome • Formation d’une structure anti-terminatrice •Poursuite de la transcription
88
trp trp Vue d’ensemble de l’opéron tryptophane d’ E. coli
ARNm de l’opéron Trp
ARNm du leader de Trp promoteur atténuateur
opérateur Terminaison Site d’initiation de Terminaison de la Tp la Tp de la Tp Composant I Composant II Anthranilate Tryptophane Tryptophane anthranilate anthranilate isomérase synthase β synthase α synthétase synthétase
Xie et al. Genome Biology, 2001:3 89 Et les eucaryotes?
90 Stratégies de régulation de la transcription chez les eucaryotes
• Stratégies plus complexes que chez les procaryotes – Transport des protéines cytoplasme>noyau – Modification/activation des protéines • Glycosylation, acétylation, etc… – ADN non nu: • Chromatine ouverte / fermée – Maturation variable des ARNm • Un préARNm peut donner des ARNm différents
91 Chapitre 4:
Maturation des ARN chez les eucaryotes Expression des gènes : eucaryotes et procaryotes Eucaryotes cytoplasme Procaryotes
noyau intron exon ADN ADN Transcription Transcription ARNm Pre-ARNm
Coiffe 5’ et queue polyA Traduction coiffe AAAAAA
Epissage
ARNm AAAAAA
Export
AAAAAA
Traduction
93 Boucles formées par hybridation d’un ARN messager eucaryote avec l’ADN génomique Les deux étapes de la réaction catalytique d’épissage
Pré-ARNm Exon 1 Intron Exon 2 AG GUAUGU UACUAAC YAG G Site 5’ Site de Site 3’ branchement Etape 1 ARNm mature Etape 2 Exon 1 Exon 1 Exon 2 AG Exon 2 AG G A AG G A AG G G U lasso U lasso final intermédiaire Epissage in vitro d’un ARN: Mise en évidence sur gel des produits intermédiaires Produits intermédiaires obtenus au cours de la maturation des ARN
Les deux réactions de transestérification
A du site de branchement GU du site 5’ intron U G
Lasso L’épissage est réalisé par un complexe ribonucléoprotéique: le spliceosome
Ux=snRNP =snRNA+Protéines
FORMATION ET RECYCLAGE DU SPLICEOSOME Catalyse et epissage par le complexe des snRNP U1,U2,U5,U4/U6 Retour sur les séquences consensus des introns à spliceosome
Pourquoi une telle conservation dans tous les gènes eucaryotes? Les snRNA U1 et U2 intéragissent avec les séquences consensus
(reference missing)
Mutation: blocage épissage Mutation compensatoire: restauration de l’épissage Autoepissage des introns de groupe I et de groupe II
(GMP exterieur)
Comparaison entre la structure des introns de groupe II et les snRNA du spliceosome Epissage alternatif
3 gènes de détermination du sexe chez la drosophile, épissés différemment chez les males et les femelles: L’épissage est co-trancriptionnel
Facteurs d’épissage Coiffe de l’extrémité 5’ du pré-ARNm La Coiffe est mise en place dès le début de la transcription
Ajout coiffe Mise en place de la queue poly-A en 3’ du messager Polyadenylation et terminaison
Les transcrits sont clivés et polyadénylés. CTD et Terminaison
Facteurs d’épissage Pré-mRNA (protéine SR, snRNP)
Cleavage/polyadenylation factors (CPSF, CstF)
Facteurs d’élongation CTD
Pol II
Elongation Etapes de transcription et Preinitiation complex maturation Complexe de coiffe + facteurs d’épissage (SF) sur queue CTD capping complex
spliceosome
spliceosome
ARNm mature + protéines fixées L’ARNm est en permanence recouvert de protéines
(heteronuclear RiboNucleoProtein complex) L ’export nucléaire par les pores Importance de coiffe et queue poly-A pour le démarrage de la traduction
Ribosome
elF3: facteur d’initiation -> démarrage traduction Maturation des ARN ribosomiques et assemblage des petites et grandes sous-unités du ribosome
Eucaryotes: ribosome = 5.8S+5S+28S+18S +protéines