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http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/fr UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1 FACULTE DE PHARMACIE INSTITUT DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES

2014 THESE n°176

T H E S E

pour le DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE

présentée et soutenue publiquement le 18 décembre 2014

par

M. FOUREL Matthieu

Né le 25 décembre 1988

à Rillieux-la-Pape

*****

TEST D'ACTIVATION DES BASOPHILES ET ALLERGIE ALIMENTAIRE :

Aide à la décision de réalisation d'un Test de Provocation Orale ?

*****

JURY

M. BIENVENU Jacques, Professeur des Universités - Praticien hospitalier

M. ROUZAIRE Paul, Maître de Conférences des Universités - Praticien Hospitalier

M. PAILLER-MATTEI Cyril, Maître de Conférences des Universités

Mme. ANDRE GOMEZ Sylvie Anne, Pédiatre

M. VIEL Sébastien, Assistant Hospitalo-Universitaire UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

• Président de l’Université M. François-Noël GILLY • Vice-Président du Conseil d’Administration M. Hamda BEN HADID • Vice-Président du Conseil Scientifique M. Germain GILLET • Vice-Président du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire M. Philippe LALLE

Composantes de l’Université Claude Bernard Lyon 1

SANTE

• UFR de Médecine Lyon Est Directeur : M. Jérôme ETIENNE • UFR de Médecine Lyon Sud Charles Directeur : Mme Carole BURILLON Mérieux • Institut des Sciences Pharmaceutiques et Directrice : Mme Christine VINCIGUERRA

• Biologiques • UFR d'Odontologie Directeur : M. Denis BOURGEOIS • Institut des Techniques de Réadaptation Directeur : M. Yves MATILLON • Département de formation et centre de Directeur : Anne-Marie SCHOTT recherche en Biologie Humaine

SCIENCES ET TECHNOLOGIES

• Faculté des Sciences et Technologies Directeur : M. Fabien DE MARCHI • UFR de Sciences et Techniques des Directeur : M. Yannick VANPOULLE Activités Physiques et Sportives (STAPS) • Ecole Polytechnique Universitaire de Lyon Directeur : M. Pascal FOURNIER (ex ISTIL) • I.U.T. LYON 1 Directeur : M. Christophe VITON • Institut des Sciences Financières et Directeur : M. Nicolas LEBOISNE d'Assurance (ISFA) • ESPE Directeur : M. Alain MOUGNIOTTE

Fourel Matthieu - Décembre 2014 2 UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1 ISPB -Faculté de Pharmacie Lyon

LISTE DES DEPARTEMENTS PEDAGOGIQUES

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DE SCIENCES PHYSICO-CHIMIQUE ET PHARMACIE GALENIQUE

• CHIMIE ANALYTIQUE, GENERALE, PHYSIQUE ET MINERALE Monsieur Raphaël TERREUX (Pr) Monsieur Pierre TOULHOAT (Pr - PAST) Madame Julie-Anne CHEMELLE (MCU) Monsieur Lars-Petter JORDHEIM (MCU) Madame Christelle MACHON (AHU)

• PHARMACIE GALENIQUE -COSMETOLOGIE Madame Marie-Alexandrine BOLZINGER (Pr) Madame Stéphanie BRIANCON (Pr) Madame Françoise FALSON (Pr) Monsieur Hatem FESSI (Pr) Monsieur Fabrice PIROT (PU - PH) Monsieur Eyad AL MOUAZEN (MCU) Madame Sandrine BOURGEOIS (MCU) Madame Ghania HAMDI-DEGOBERT (MCU-HDR) Monsieur Plamen KIRILOV (MCU) Monsieur Damien SALMON (AHU)

• BIOPHYSIQUE Monsieur Richard COHEN (PU – PH) Madame Laurence HEINRICH (MCU) Monsieur David KRYZA (MCU – PH) Madame Sophie LANCELOT (MCU - PH) Monsieur Cyril PAILLER-MATTEI (MCU-HDR) Madame Elise LEVIGOUREUX (AHU)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE PHARMACEUTIQUE DE SANTE PUBLIQUE

• DROIT DE LA SANTE Monsieur François LOCHER (PU – PH) Madame Valérie SIRANYAN (MCU - HDR) · ECONOMIE DE LA SANTE Madame Nora FERDJAOUI MOUMJID (MCU - HDR) Madame Carole SIANI (MCU – HDR) Monsieur Hans-Martin SPÄTH (MCU)

• INFORMATION ET DOCUMENTATION Monsieur Pascal BADOR (MCU - HDR)

• HYGIENE, NUTRITION, HYDROLOGIE ET ENVIRONNEMENT Madame Joëlle GOUDABLE (PU – PH)

Fourel Matthieu - Décembre 2014 3 • DISPOSITIFS MEDICAUX Monsieur Gilles AULAGNER (PU – PH) Monsieur Daniel HARTMANN (Pr)

• QUALITOLOGIE – MANAGEMENT DE LA QUALITE Madame Alexandra CLAYER-MONTEMBAULT (MCU) Monsieur Vincent GROS (MCU-PAST) Madame Audrey JANOLY-DUMENIL (MCU-PH) Madame Pascale PREYNAT (MCU PAST)

• MATHEMATIQUES – STATISTIQUES Madame Claire BARDEL-DANJEAN (MCU) Madame Marie-Aimée DRONNE (MCU) Madame Marie-Paule PAULTRE (MCU - HDR)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE SCIENCES DU MEDICAMENT

• CHIMIE ORGANIQUE Monsieur Pascal NEBOIS (Pr) Madame Nadia WALCHSHOFER (Pr) Monsieur Zouhair BOUAZIZ (MCU - HDR) Madame Christelle MARMINON (MCU) Madame Sylvie RADIX (MCU -HDR) Monsieur Luc ROCHEBLAVE (MCU - HDR)

• CHIMIE THERAPEUTIQUE Monsieur Roland BARRET (Pr) Monsieur Marc LEBORGNE (Pr) Monsieur Laurent ETTOUATI (MCU - HDR) Monsieur Thierry LOMBERGET (MCU - HDR) Madame Marie-Emmanuelle MILLION (MCU)

• BOTANIQUE ET PHARMACOGNOSIE Madame Marie-Geneviève DIJOUX-FRANCA (Pr) Madame Marie-Emmanuelle HAY DE BETTIGNIES (MCU) Madame Isabelle KERZAON (MCU) Monsieur Serge MICHALET (MCU)

• PHARMACIE CLINIQUE, PHARMACOCINETIQUE ET EVALUATION DU MEDICAMENT Madame Roselyne BOULIEU (PU – PH) Madame Magali BOLON-LARGER (MCU - PH) Madame Christelle CHAUDRAY-MOUCHOUX (MCU-PH) Madame Céline PRUNET-SPANO (MCU) Madame Catherine RIOUFOL (MCU- PH-HDR)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DE PHARMACOLOGIE, PHYSIOLOGIE ET TOXICOLOGIE

• TOXICOLOGIE Monsieur Jérôme GUITTON (PU – PH) Madame Léa PAYEN (PU-PH) Monsieur Bruno FOUILLET (MCU) Monsieur Sylvain GOUTELLE (MCU-PH)

Fourel Matthieu - Décembre 2014 4 • PHYSIOLOGIE Monsieur Christian BARRES (Pr) Monsieur Daniel BENZONI (Pr) Madame Kiao Ling LIU (MCU) Monsieur Ming LO (MCU - HDR)

• PHARMACOLOGIE Monsieur Michel TOD (PU – PH) Monsieur Luc ZIMMER (PU – PH) Monsieur Roger BESANCON (MCU) Madame Evelyne CHANUT (MCU) Monsieur Nicola KUCZEWSKI (MCU) Monsieur Olivier CATALA (Pr-PAST) Madame Corinne FEUTRIER (MCU-PAST) Madame Mélanie THUDEROZ (MCU-PAST)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DES SCIENCES BIOMEDICALES A

• IMMUNOLOGIE Monsieur Jacques BIENVENU (PU – PH) Monsieur Guillaume MONNERET (PU-PH) Madame Cécile BALTER-VEYSSEYRE (MCU - HDR) Monsieur Sébastien VIEL (AHU)

• HEMATOLOGIE ET CYTOLOGIE Madame Christine TROUILLOT-VINCIGUERRA (PU - PH) Madame Brigitte DURAND (MCU - PH) Monsieur Olivier ROUALDES (AHU)

• MICROBIOLOGIE ET MYCOLOGIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE AUX BIOTECHNOLOGIE INDUSTRIELLES Monsieur Patrick BOIRON (Pr) Monsieur Jean FRENEY (PU – PH) Madame Florence MORFIN (PU – PH) Monsieur Didier BLAHA (MCU) Madame Ghislaine DESCOURS (MCU-PH) Madame Anne DOLEANS JORDHEIM (MCU-PH) Madame Emilie FROBERT (MCU - PH) Madame Véronica RODRIGUEZ-NAVA (MCU-HDR)

• PARASITOLOGIE, MYCOLOGIE MEDICALE Monsieur Philippe LAWTON (Pr) Madame Nathalie ALLIOLI (MCU) Madame Samira AZZOUZ-MAACHE (MCU - HDR)

DEPARTEMENT PEDAGOGIQUE DES SCIENCES BIOMEDICALES B

• BIOCHIMIE – BIOLOGIE MOLECULAIRE - BIOTECHNOLOGIE Madame Pascale COHEN (Pr) Monsieur Alain PUISIEUX (PU - PH) Monsieur Karim CHIKH (MCU - PH) Madame Carole FERRARO-PEYRET (MCU - PH-HDR) Monsieur Boyan GRIGOROV (MCU)

Fourel Matthieu - Décembre 2014 5 Monsieur Olivier MEURETTE (MCU) Madame Caroline MOYRET-LALLE (MCU – HDR) Madame Angélique MULARONI (MCU) Madame Stéphanie SENTIS (MCU) Monsieur Anthony FOURIER (AHU)

• BIOLOGIE CELLULAIRE Madame Bénédicte COUPAT-GOUTALAND (MCU) Monsieur Michel PELANDAKIS (MCU - HDR)

• INSTITUT DE PHARMACIE INDUSTRIELLE DE LYON Madame Marie-Alexandrine BOLZINGER (Pr) Monsieur Daniel HARTMANN (Pr) Monsieur Philippe LAWTON (Pr) Madame Sandrine BOURGEOIS (MCU) Madame Marie-Emmanuelle MILLION (MCU) Madame Alexandra MONTEMBAULT (MCU) Madame Angélique MULARONI (MCU) Madame Valérie VOIRON (MCU - PAST)

• Assistants hospitalo-universitaires sur plusieurs départements pédagogiques Madame Emilie BLOND Madame Florence RANCHON

• Attachés Temporaires d’Enseignement et de Recherche (ATER) Madame Sophie ASSANT 85ème section Monsieur Benoit BESTGEN 85ème section Madame Marine CROZE 86ème section Madame Mylène HONORAT MEYER 85ème section

Pr : Professeur PU-PH : Professeur des Universités, Praticien Hospitalier MCU : Maître de Conférences des Universités MCU-PH : Maître de Conférences des Universités, Praticien Hospitalier HDR : Habilitation à Diriger des Recherches AHU : Assistant Hospitalier Universitaire PAST : Personnel Associé Temps Partiel

Fourel Matthieu - Décembre 2014 6 Remerciements.

Je tiens tout d'abord à remercier les membres de mon jury,

Professeur Jacques Bienvenu Professeur d'Immunologie à la Faculté de Pharmacie de Lyon, Chef du Service d'Immunologie du Centre Hospitalier Lyon Sud (HCL). Pour l'honneur que vous me faites de présider ce jury. Pour votre disponibilité, votre vision experte, vos conseils avisés, vos bons mots ainsi que pour l'intérêt que vous porté à ce travail.

Docteur Paul Rouzaire Practicien Hospitalier au service d'Immunologie Biologique de Clermont-Ferrand. Pour l'honneur que vous m'avez fait d'avoir accepter ce travail. Pour l'immense patience dont vous avez fait preuve tout au long de ce périple, pour votre disponibilité sans faille, pour vos nombreux discours de motivation, pour vos corrections précises et justifiées, pour l'encadrement épanouissant de cette épopée, sans lequel je n'aurais probablement pas eu le courage de finir cette thèse.

Professeur Cyril Pailler-Mattei Professeur de Biophysique à la Faculté de Pharmacie de Lyon, Pour l'honneur que vous me faites en acceptant de juger ce travail. Pour toute l'aide que vous m'avez apporté durant mon cursus de Pharmacien-Ingénieur, tant sur le plan universitaire que sur le plan humain.

Docteur Sylvie Anne André-Gomez Pédiatre à l'Hopital Femme Mère Enfant, Service de Pneumologie Allergologie Mucoviscidose Pour l'honneur que vous me faites de juger ce travail. Pour m'avoir permis de mener ce travail à bien en acceptant de collaborer avec le Service d'Immunologie.

Docteur Sébastien Viel Assistant hospitalo-universitaire à la Faculté de Pharmacie de Lyon et au Service d'Immunologie du Centre hospitalier Lyon Sud (HCL) Pour l'honneur que vous me faites en acceptant de juger ce travail. Pour votre disponibilité, l'intérêt que vous porté à ce travail et votre bonne humeur durant toute notre collaboration.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 7 Je remercie aussi :

Mes grands parents, Pour leur bienveillance, pour le partage de leurs expériences, et pour leurs délicieux repas qui font de moi le jeune homme que je suis aujourd'hui.

Mes parents, Pour la transmission de leurs valeur et pour mon éducation, pour la confiance qu'ils ont eu et qu'ils ont en moi, malgré surement quelques doutes quant à la soutenance de cette thèse. Merci de m'avoir permis de m'épanouir dans ce monde et pour tout ce que vous avez fait et faites pour moi, je vous en suis et serais éternellement reconnaissant.

Ma sœur, Pour ce soutien indéfectible depuis que nous sommes enfants, pour tous ces instants passer ensemble, pour ton regard franc et honnête sur ma vie, qui m'aide à avancer.

Mon frère, Pour pimenter notre vie depuis son arrivée.

L'ensemble de ma famille, Pour être toujours là pour moi le jour de mon anniversaire, pour m'avoir fait grandir dans un environnement prônant l'amour, l'humour et les bons repas, qui sont à n'en pas douter les trois piliers sur lesquels repose une vie réussie.

Edouard, Yoan et Sylvestre, Pour n'avoir cru qu'à moitié en l'aboutissement de cette thèse, en essayant envers et contre tous de m'éloigner du droit chemin, mais en étant cette bouffée d'oxygène me permettant d'éviter l'asphyxie universitaire.

Chloé, Pour avoir endurer à mes côtés quelques unes des dures étapes de la rédaction de cette thèse, pour ton rire enjôleur perçant la bulle de ma concentration, certes, mais me rappelant la chance que j'ai de te conter parmi mes amis.

A mes amis, Qui de tous bords réunis, Contribuent à la richesse de ma vie, Et qui me permettent de traverser sans ennui, Les flots tumultueux que représente le chemin de la vie. Et c'est pour une fois sans aucune moquerie, aucun second degré, aucune ironie Que je vous remercie, les potos.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 8 Je remercie aussi :

Docteur Françoise Bienvenu Praticien Hospitalier au Service d'Immunologie du Centre hospitalier Lyon Sud (HCL) Pour votre accueil, votre encadrement, votre bienveillance et vos conseils lors de la réalisation de mon stage.

Janine, Marie-Alice, Josyane, Carmen, Danièle, Elisabeth, Lorna et Emily, Pour votre accueil chaleureux, pour l'excellente ambiance qui réside au sein du Service d'Immunologie, ainsi que pour vos conseils nutritionnels qui m'ont permis de me nourrir pendant ces six mois de stage.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 9

Table des matières

Introduction ...... 15 I.1 Présentation des hypersensibilités...... 16 I.1.1 Nomenclature des Hypersensibilités : Allergiques/Non Allergiques...... 16 I.1.2 Physiopathologie des hypersensibilités allergiques...... 17 I.1.2.1 Les réactions d'hypersensibilité...... 17 I.1.2.2 Hypersensibilité allergique de type I (induite par l'IgE)...... 17 I.1.2.3 Hypersensibilité de type II...... 19 I.1.2.4 Hypersensibilité de type III...... 20 I.1.2.5 Hypersensibilité de type IV (médiation cellulaire) ...... 21 I.2 Allergie Alimentaire...... 23 I.2.1 Physiopathologie...... 23 I.2.2 Allergie aux protéines du lait de vaches...... 28 I.2.3 Allergie à l’arachide...... 31 I.2.4 Diagnostic...... 34 I.2.4.1 Skin Prick Test...... 35 I.2.4.2 IgE spécifiques...... 35 I.2.4.3 TPO...... 39

II. Le Test d'activation du basophile...... 43 II.1 Les Basophiles...... 43 II.1.1 Description générale...... 43 II.1.2 De la circulation à l'inflammation : parcours d'un basophile...... 44 II.1.3 Dégranulation des basophiles : Les médiateurs sont dans la place...... 46 II.1.3.1 Activation IgE dépendante...... 47 II.1.3.2 Activation IgG dépendante ...... 48 II.1.3.3 Activation par le complément...... 49 II.1.3.4 PAMPs...... 49 II.1.3.5 Les sécrétions et le relargage...... 50 II.2 Le Test d'activation des basophiles ...... 55 II.2.1 Principe du TAB...... 55 II.2.2 La Cytométrie en flux...... 56 II.2.2.1 Un test, deux contrôles...... 57 II.2.2.2 Stratégies d'identification...... 58 II.2.3 Marqueurs d'activation...... 60

Fourel Matthieu - Décembre 2014 10 II.2.3.1 CD63...... 60 II.2.3.2 CD203c...... 61 II.2.3.3 Autres marqueurs...... 62 II.2.4 Interprétation : Du cas par cas...... 62

III. Partie Expérimentale ...... 65 III.1 Objectifs...... 65 III.2 Patients et Méthode ...... 65 III.2.1 Méthode...... 65 III.2.1.1 Matériel...... 65 III.2.1.2 Réactifs ...... 66 III.2.1.3 Protocole...... 66 III.2.2 Patients...... 69 III.2.2.1 Patients allergiques à l’arachide...... 69 III.2.2.2 Patients allergiques aux protéines de lait de vache...... 70 III.3 Résultats...... 71 III.3.1 Résultats concernant l'allergie à l'arachide...... 71 III.3.1.1 TAB à l'arachide : Courbes, CDmax, CDsens et AUC...... 71 III.3.1 Résultats concernant l'APLV...... 75 III.3.1.1 TAB pour l'APLV : Courbes, CDmax, CDsens et AUC...... 75

IV. Discussion...... 80

Bibliographie ...... 85

Fourel Matthieu - Décembre 2014 11 Table des figures

Figure 1 : Nomenclature des hypersensibilités3 ...... 16 Figure 2 : Déroulement de l'hypersensibilité de type I6 ...... 18 Figure 3 : Rupture d'équilibre et sensibilisation18 ...... 24 Figure 4 : Réalisation et lecture d'un Skin Prick Test (Source : Service d'immunologie et allergie CHUV, Lausanne) ...... 35 Figure 5 : fig : Observation au microscopique optique d’un basophile (coloration May- Grunwald-Giemsa) ...... 44 Figure 6 : Voie de signalisation en aval du FcεRI et activation des basophiles et des mastocytes (Adapté de Kumer97)...... 47 Figure 7 : Les récepteurs de l'histamine et leurs actions110 ...... 52 Figure 8 : Fonctionnement général d'un cytomètre126 ...... 56 Figure 9 : Schéma du mode opératoire général du test d’activation des basophiles130 .....58 Figure 10 : Détermination des basophiles CCR3 / SSC (Tiré de la procédure Flow Castde de Bühlmann133) ...... 60 Figure 11 : Protocole de préparation des échantillons aux TAB...... 68 Figure 12 : Résultats des TAB à l'arachide - CD203c...... 71 Figure 13 : Résultats des TAB à l'arachide - CD63...... 72 Figure 14 : Résultats des TAB pour l'APLV- CD203c ...... 76 Figure 15 : Résultats des TAB pour l'APLV- CD63 ...... 76

Fourel Matthieu - Décembre 2014 12 Table des tableaux

Tableau 1 : Classification selon Gell & Coombs4 ...... 17 Tableau 2 : Tableau clinique de l'APLV, selon Fiocchi et al.40 ...... 28 Tableau 3 : Signes cliniques de l'allergie à l’arachide54 ...... 32 Tableau 4 : Grandes familles d'allergènes moléculaires67 ...... 37 Tableau 5 : Avantages et inconvénients de la CMF ...... 57 Tableau 6 : Différences entre les marqueurs CD63 et CD203c141 ...... 61 Tableau 7 : Réactifs Bühlmann utilisés pour les TAB ...... 66 Tableau 8 : Préparation des tubes pour le TAB...... 67 Tableau 9 : CDsens des patients allergiques à l'arachide...... 73 Tableau 10 : CD Max des patients allergiques à l'arachide...... 73 Tableau 11 : AUC des patients allergiques à l'arachide ...... 74 Tableau 12 : Dosage des IgE spécifiques à l'arachide...... 74 Tableau 13 : CDsens des patients ayant une APLV...... 77 Tableau 14 : CDmax des patients ayant une APLV...... 78 Tableau 15 : AUC des patients ayant une APLV...... 78 Tableau 16 : Dosage des IgE spécifiques - APLV ...... 79

Fourel Matthieu - Décembre 2014 13 Liste des abréviations.

Ac Anticorps ADCC Cytotoxicité Cellulaire Dépendante des Anticorps Ag Antigène AMM Autorisation de Mise sur le Marché APLV Allergie aux Protéines du Lait de Vache C5a Facteur 5 du complément activé CD Cluster of differentiation CFU Colony Forming Unit CHLS Centre Hospitalier Lyon Sud CMH Complexe Majeur d' Histocompatibilité CPA Cellule Présentatrice d'Antigène Dc Cellules dendritiques EDTA Acide Ethylène-diamine-tétracétique FCERI Récepteur à fragment Fe epsilon 1 FcyR Récepteur à fragment Fe gamma FITC lsothiocyanate de flu orescéine FSC Forward Scatter GM-CSF Granulocyte/Monocyte - Colony Stimulating Factor HSA Hypersensibilité Allergique HSNA Hypersensibilité Non Allergique lDR Intradermo-réaction IgE Immunoglobuline E lgG1-4 Immunoglobuline G, sous-classe 1 - 4 lgM Immunoglobuline M IL-X Interleukine-X IT Induction de Tolérance ITAM lmmunoreceptor Tyrosine-based Activating Motif Ko Constante de dissociation kDa kilo Daltons LIR Leukocyte lmmunoglobulin-like Receptor LPS Lipopolysaccha ride LTC4 Leucotriène C4 MAPK Mitogen-Associated Proteine Kinase MO Moelle Osseuse PAF Platelet Activating Factor PGD Prostaglandine SSC Side Scatter TAB Test d'Activation des basophiles TC Tests cutanés TGI Tractus Gastro-Intestinal Th1/Th2 lymphocyte T-helper 1 / 2 TLR Toll Like Receptor TNF Tumor Necrosis Factor TPO Test de Provocation Orale

Fourel Matthieu - Décembre 2014 14 Introduction

Les allergies alimentaires sont fréquentes : elles touchent environ 3,5% de la population mondiale, avec une prévalence plus importante chez les enfants : 5 à 8% chez les moins de 4 ans contre 1 à 2% chez les adultes1. Cette forte prévalence pédiatrique est d'autant plus inquiétante qu'elle a augmenté de près de 20% entre 1997 et 20072. La fréquence élevée, conjuguée à la gravité de certaines réactions allergiques - pouvant conduire à un choc anaphylactique -, confèrent aux méthodes diagnostiques une importance toute particulière.

Un panel de tests permet aujourd'hui de caractériser une hypersensibilité allergique avec précision : les tests cutanés, le dosage des IgE spécifiques, le test d'activation des basophiles (TAB) et les tests de provocation orale (TPO). Le test d'activation des basophiles, faisant l’objet de notre travail, est un test fonctionnel, ayant pour but de reproduire in vitro la réaction d'hypersensibilité allergique se déroulant in vivo, par mise en contact de cellules sanguines avec l'allergène incriminé.

Dans l’étude bibliographique constituant la première partie de notre travail, nous décrirons tout d’abord les réactions d’hypersensibilité, notamment les allergies alimentaires, en accentuant sur les réactions à l'arachide et l'allergie aux protéines du lait de vache. S'en suivra une présentation des polynucléaires basophiles. Le TAB, ainsi que les méthodes d'expression de ses résultats, seront enfin développés, afin d’en cerner l'intérêt dans l'aide à la prise en charge de l'allergie alimentaire, notamment au niveau de la décision de réalisation d'un TPO.

La partie expérimentale de cette thèse, réalisée au Centre Hospitalier Lyon Sud, en collaboration avec l'Hôpital Femme-Mère-Enfant de Lyon, aura pour objectif d'évaluer l'intérêt du TAB dans la prise en charge de l'allergie alimentaire, en le confrontant aux résultats des TPO et des IgE spécifiques. Elle portera sur deux populations pédiatriques : la première constituée de 4 patients allergiques à l'arachide (de 4 à 11 ans), et la seconde comportant 8 patients présentant une allergie aux protéines du lait de vache (APLV), âgés de 7 mois à 7 ans.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 15 I.1 Présentation des hypersensibilités.

I.1.1 Nomenclature des Hypersensibilités : Allergiques/Non Allergiques

Les hypersensibilités se caractérisent par la présence de signes induits par un stimulus précis, à une dose qui ne provoque pas de réactions dans la population générale. Il est nécessaire de séparer les hypersensibilités résultant de mécanismes immunologiques (immunité adaptative), appelées hypersensibilités allergiques, dont les symptômes sont reproductibles, des hypersensibilités non-allergiques qui dépendent de mécanismes non immunologiques, ou bien font appel à l'immunité innée (fig.1). Ces dernières, non spécifiques et non reproductibles, sont également qualifiées d'intolérances, de réactions pseudoallergiques ou réactions anaphylactoïdes.

Cette nomenclature s'applique ainsi aux hypersensibilités alimentaires : le terme d' « allergie alimentaire » n'est donc approprié que dans le cas où les mécanismes immunologiques adaptatifs sont avérés. Dans le cas contraire, le terme d' « hypersensibilité alimentaire non-allergique » doit être employé.

Hypersensibilité

Hypersensibilité allergique Hypersensibilité non allergique (mécanisme immunologique) (mécanisme non immunologique)

Hypersensibilité type Intolérance I (induite par IgE) alimentaire

Hypersensibilité type II Réaction pseudoallergique (induite par IgG)

Hypersensibilité type Réaction III (complexe immun) anaphylactoïde

Hypersensibilité type IV (médiation cellulaire)

Figure 1 : Nomenclature des hypersensibilités3

Fourel Matthieu - Décembre 2014 16 I.1.2 Physiopathologie des hypersensibilités allergiques

I.1.2.1 Les réactions d'hypersensibilité

Les réactions d’« hypersensibilités allergiques » ont été décrites par Gell & Coombs en 1968, et séparées en quatre types de réponses (Tableau 1), que nous allons maintenant détailler.

Tableau 1 : Classification selon Gell & Coombs4

Effecteurs Délai Mécanismes Aspects cliniques Pontage par l’Ag** des Erythème IgE fixées sur • immédiat Œdème Type I HS* à IgE mastocytes et basophiles • 5-30 min Prurit : libération de • Anaphylaxie médiateurs vasoactifs • • Transfusion Ac*** dirigés contre Ag incompatible semi- cellulaires : Anémie Type HS médiée par • retardée destruction cellulaire hémolytique II IgM, IgG 5-8 h (Complément ou autoimmune ADCC) • Incompatibilité foetomaternelle Dépôt tissulaire Arthus localisé semi- • Type HS à d’immuncomplexes : Maladie sérique retardée • III immuncomplexes activation Complément Glomérulonéphrit 2-8 h • et réponse inflammatoire • Lupus Induration, T sensibilisés à l’Ag • Nodule HS libèrent des cytokines • Type retardée tuberculinique HS cellulaire qui activent des IV 24-72 h Dermatite de macrophages ou des • contact cellules T cytotoxiques • Rejet de greffe * HS = Hypersensibilité. ** Ag = Antigène. *** Ac = Anticorps.

I.1.2.2 Hypersensibilité allergique de type I (induite par l'IgE)

L'hypersensibilité allergique de type I, également appelée hypersensibilité allergique immédiate, est médiée par les immunoglobulines de type E (IgE). Comme toute réaction d’hypersensibilité allergique, elle requiert une phase de sensibilisation - asymptomatique - déclenchée par une première exposition à un allergène. S'en suit une réponse humorale, caractérisée par la sécrétion d'IgE spécifiques de l’antigène par des plasmocytes, grâce à l'activation de cellules Th2. Les IgE possèdent une forte aptitude à

Fourel Matthieu - Décembre 2014 17 se lier avec le récepteur de haute affinité FcεRI, présent à la surface des mastocytes tissulaires et des basophiles circulants. Cela a pour conséquence d'augmenter la demi-vie des immunoglobulines - qui est de l'ordre de deux jours sous forme libre -, et de stabiliser le récepteur FcεRI5.

Lors de la phase de réintroduction de l’allergène, les IgE agissent alors comme un intermédiaire entre les antigènes et les cellules effectrices sur lesquelles elles sont fixées. Grâce à leurs domaines variables, les IgE pourront en effet reconnaître spécifiquement les épitopes des allergènes. Ces liaisons provoquent alors le pontage des IgE liées, et la transmission de signaux intracellulaires. Cela aboutit à la dégranulation cellulaire et à la libération de nombreux médiateurs de l'inflammation - préformés (histamine majoritairement) ou néoformés (phospholipides membranaires) - responsables des symptômes de l’allergie : contraction des muscles lisses, augmentation de la perméabilité vasculaire et vasodilatation (fig.2).

Figure 2 : Déroulement de l'hypersensibilité de type I6

Fourel Matthieu - Décembre 2014 18 Les conséquences de l'hypersensibilité immédiate peuvent être localisées ou systémiques, bénignes ou potentiellement mortelles. Le panel des symptômes ainsi engendrés comprend l'asthme, la rhinite allergique (rhume des foins), la dermatite atopique (eczéma atopique) ou encore l'allergie alimentaire. Les cas les plus graves se traduisent par un choc anaphylactique, potentiellement létal. Il se caractérise, dans sa forme la plus sévère, par de sévères bronchospasmes accompagnés d'une hypotension engendrant un arrêt respiratoire et/ou un arrêt circulatoire7. Ce sont les conséquences des contractions des muscles lisses (dont les bronchioles) et de la vasodilatation excessives.

L'hypersensibilité de type I présente également une phase tardive sous la forme d'une réaction inflammatoire localisée, survenant de 4 à 6 heures après la réaction initiale, et qui peut persister entre 1 et 2 jours. Cette phase correspond à une migration d'éosinophiles au niveau du site inflammatoire, causée par la libération de facteurs chimiotactiques par les mastocytes pendant la réaction initiale. Cette phase peut être responsable de lésions tissulaires étendues (inflammation et remodelage des muqueuses bronchiques notamment).

Les mécanismes de l'hypersensibilité immédiate sont toutefois moins schématiques et plus complexes que la simple interaction IgE-FcεRI : il existe, en plus de la voie IgE-médiée, d'autres signaux et d'autres stimulations dont l'action peut être inhibitrice ou stimulatrice. Les IgG par exemple, peuvent agir sur les mastocytes et les basophiles via d'autres récepteurs : FcγRI et FcγRII. Le premier étant impliqué dans la libération de l'histamine tandis que le deuxième régule l'activation IgE-dépendante8. Des IgG spécifiques du même antigène que les IgE pourraient alors compléter la réaction IgE- médiée, notamment via la libération du facteur d'activation plaquettaire (PAF), déclenchée par la liaison IgG1-Récepteur Fcγ du basophile et qui sera évoquée plus loin.

I.1.2.3 Hypersensibilité de type II.

Cette hypersensibilité se caractérise par son caractère cytotoxique induit par les anticorps via l'activation du système du complément ou via le phénomène d'ADCC (Cytotoxicité Cellulaire Dépendante des Anticorps). Elle résulte en effet de la fixation d'anticorps à des membranes cellulaires, étrangères ou non. La cellule sur laquelle se sont fixés ces anticorps devient alors une cible opsonisée : la région Fc des anticorps va être

Fourel Matthieu - Décembre 2014 19 reconnue par les protéines à l’origine de la voie classique d’activation du complément, par des cellules cytotoxiques ou encore par des cellules phagocytaires9.

Un cas typique d'hypersensibilité de type II se trouve au niveau des réactions transfusionnelles. Les individus présentent en effet des anticorps contre les antigènes des autres groupes sanguins (ABO, Rhésus, Kidd, Kell et autres) et dans le cas de transfusions d'un sang aux épitopes différents, ceux-ci seront reconnus comme étranger par l'organisme et les anticorps du Soi engendreront la destruction des globules rouges transfusés (majorité des cas et le plus grave, mais aussi par les éventuels Ac du donneur contre les Ag du receveur). Cependant, l'incidence de ces accidents transfusionnels a fortement diminué compte tenu du bilan immuno-hématologique quasiment systématique opéré à chaque don de sang10.

Un second exemple de manifestation de l'hypersensibilité de type II est la maladie hémolytique du nouveau-né, qui peut avoir des conséquences fatales sur le nourrisson. L'anémie hémolytique peut aussi être provoquée par des médicaments, notamment la pénicilline, qui est capable d'induire d'autres types d'hypersensibilité, dont celle de type III11.

I.1.2.4 Hypersensibilité de type III

Les anticorps jouent également un rôle dans cette hypersensibilité, qui est induite par les complexes immuns (association anticorps-antigène spécifique). La formation de ces complexes permet d'éliminer plus aisément les antigènes exogènes qui, sous ces formes, sont reconnus et supprimés par les phagocytes ou les globules rouges. Cependant, en trop grande quantité, la présence des complexes immuns devient pathologique et entraîne des lésions tissulaires. Cette manifestation s'appelle hypersensibilité de type III. Elle résulte de l'activation du système du complément par les complexes immuns, ce qui engendre la dégranulation des mastocytes et la présence de facteurs chimiotactiques qui recrutent des polynucléaires neutrophiles. Ces derniers reconnaissent le composant du complément C3b, fixé sur les complexes immuns, et libèrent des enzymes lytiques. Le nombre important de neutrophiles, des enzymes et la proximité tissulaire provoquent des lésions, des œdèmes, des érythèmes9.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 20

Ces réactions peuvent être localisées ou disséminées. Dans le premier cas, il se déclenche une réaction d'Arthus localisée, que ce soit au niveau pulmonaire lors de la respiration de spores bactériens ou de champignons, ou au niveau cutané lors d'une piqûre d'insecte par exemple. L'hypersensibilité disséminée survient lorsque les complexes immuns se retrouvent dans la circulation sanguine, où ils s'accumulent sur les parois vasculaires et peuvent atteindre les membranes glomérulaires du rein ou les membranes synoviales des articulations. Il en résulte respectivement une vascularite, une gloméronéphrite ou une arthrite. Ces symptômes sont ceux de la maladie sérique, qui survient de 7 à 21 jours après l'exposition antigénique (de 1 à 13 jours lors de la seconde exposition)12.

Cette hypersensibilité intervient dans le développement de maladies auto- immunes comme le lupus érythémateux disséminé. Les anticorps sont alors dirigés contre des protéines du Soi, ou même contre l'ADN (cas du lupus). On la retrouve également dans plusieurs maladies infectieuses, notamment dans les méningites, les hépatites ou les mononucléoses13.

I.1.2.5 Hypersensibilité de type IV (médiation cellulaire)

La dernière classe d'hypersensibilité est dite hypersensibilité retardée et est à médiation cellulaire. Elle a lieu après la rencontre entre des allergènes - antigènes de contact ou agents pathogènes intracellulaires (bactérie, champignon ou virus) - et une sous-population de lymphocytes T via les cellules présentatrices d'antigènes. Comme dans le cas des autres hypersensibilités exposées précédemment, il y a une première phase de sensibilisation qui dure de 7 à 14 jours à partir du premier contact avec l'antigène, et qui consiste en l’activation et la différenciation en lymphocytes T spécifiques après avoir été en contact avec les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) - macrophages et cellules dendritiques.

S'en suit la phase effectrice, lors d'un contact ultérieur avec l'antigène. Elle se déclenche 48 et 72 heures après le contact antigénique. Le mécanisme de l'hypersensibilité retardée fait appel à différentes cytokines qui ont pour but principal de recruter des macrophages qui, une fois activés, seront les acteurs principaux de cette

Fourel Matthieu - Décembre 2014 21 réaction. L'interleukine-1 initie tout d'abord l'activation du lymphocyte, qui secrète alors l'IL-2, des facteurs actifs sur les cellules endothéliales (TNF, IFN-γ, IL-4) et des facteurs chimiotactiques. L'IFN-γ participe à l'extravasation des monocytes et d'autres acteurs de l'inflammation non spécifiques en plus de permettre l'activation des macrophages.

L'hypersensibilité de type IV n'est pas majoritairement pathologique et est importante dans la défense immunitaire, la plupart du temps, les éléments pathogènes (ex: bacilles tuberculeux) sont éliminés avec pour conséquences de simples lésions mineures. Cependant, dans certains cas, ils ne sont pas totalement éliminés ; la réponse inflammatoire s'intensifie et il y a développement de la réponse granulomateuse qui peut aboutir à de graves lésions vasculaires ou pulmonaires. En effet, les macrophages s'accumulent au niveau de l'inflammation, fusionnent et donnent naissance à des cellules géantes multinuclées, qui finissent par former un nodule. L'intense activité de ces nombreux macrophages a pour conséquence une forte concentration d'enzymes lytiques, responsables des lésions tissulaires.

Les manifestations cliniques de l'hypersensibilité retardée peuvent également se retrouver dans les dermatites de contact, dans lesquelles les antigènes de contact se situent au niveau de la peau et provoquent, 48 à 72 heures après une nouvelle exposition, un nécrose cutanée, causée essentiellement par le recrutement macrophagique à ce niveau.

Les différents hypersensibilités allergiques ayant été décrites, il convient maintenant de s'intéresser aux allergies alimentaires afin de préciser des mécanismes qui se révèleront utiles pour le diagnostic et qui permettront de comprendre la pertinence du test d'activation des basophiles pour ce type d'allergie.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 22 I.2 Allergie Alimentaire.

Les allergies alimentaires touchent approximativement 3,5% de la population mondiale, avec une prévalence plus importante chez les enfants : 5 à 8% chez les moins de 4 ans contre 1 à 2% chez les adultes1. Cette forte présence pédiatrique est d'autant plus inquiétante qu'elle a augmenté de près de 20% entre 1997 et 2007 - études effectuées aux Etats-Unis2. Le fait que les enfants soient plus touchés que les adultes s'explique par l'induction de tolérance survenant lors du développement de l'individu, qui se libère alors de cette pathologie. En effet, environ 80% des patients allergiques à l'œuf se trouvent être tolérants après 5 ans14. Ce constat se retrouve dans le cas de l'allergie aux protéines du lait de vache (APLV) - 80% de tolérance après 3 ans15. Cependant, il existe des allergies plus récalcitrantes, comme l'allergie à l’arachide face à laquelle seulement 20% des patients développent une tolérance16.

Il existe deux principales catégories de réactions allergiques alimentaires : les allergies IgE-médiée, caractérisées par une apparition immédiate des symptômes, incluant ou non une anaphylaxie, tandis que l'allergie non IgE-médiée, est engendrée par des réactions cellulaires avec des symptômes plutôt retardés2. L'allergie alimentaire peut faire appel à une combinaison de ces deux catégories, complexifiant davantage son exploration.

I.2.1 Physiopathologie

Tolérance

La tolérance orale est un mécanisme physiologique complexe, que l'on peut tenter de simplifier comme suit : une protéine ingérée interagit avec une population de cellules présentatrices d'antigènes (CPAs) ; cela induit alors une suppression de la réponse inflammatoire humorale et cellulaire17. La réaction allergique intervient en cas de rupture d'équilibre au niveau de cette tolérance : cela favorise l'activité des lymphocytes Th2, responsables du changement de classe des immunoglobulines en faveur des IgE et de la

Fourel Matthieu - Décembre 2014 23 sensibilisation des cellules B et T mémoires (fig.3). Cette déviation de la réponse immunitaire vers ce type de réponse entraine l'apparition des symptômes de l’allergie.

Figure 3 : Rupture d'équilibre et sensibilisation18

La tolérance orale résulte d'une pluralité interactionnelle entre les cellules dendritiques, les cellules T régulatrices, les cellules B mémoires qui déplacent l'équilibre vers une réponse Th1 et ainsi contrebalance l'effet des cytokines IL-4 et IL-1319.

Un aspect aussi intéressant qu'important dans la recherche de traitement contre l'allergie est le phénomène d'induction de tolérance. Différentes méthodes existent actuellement, dont l'immunothérapie spécifique (ITS) qui permet une induction de tolérance clinique via l'administration répétée de doses croissantes d'allergènes, ainsi que l'induction d'une tolérance immunologique via une "reprogrammation" du système immunitaire en modulant la fonction des cellules présentatrices d'antigènes (CPA)18.

La modulation des fonctions des CPA s'obtient par la stimulation répétée des cellules T par des cellules dendritiques immatures tolérogènes, ayant pour conséquence la prolifération de cellules "Tr1-Like", qui inhibent la réponse inflammatoire en favorisant notamment la production de cytokine IL-10 (inhibition des cytokines pro-inflammatoires,

Fourel Matthieu - Décembre 2014 24 diminution de la production d'IgE et induction de celle d'IgG4) ainsi que d'un autre facteur soluble, le TGF-β, qui induit la différenciation de lymphocytes Th320.

D'autres cytokines jouent également un rôle dans l'induction de tolérance via l'inhibition de la voie Th2 : TNF-α21 et IFN-γ22. Conjuguée à la production d'IL-12, cela permet une réorientation des lymphocytes en faveur de la voie Th1, et ainsi une réduction des symptômes allergiques.

La réorientation en faveur de la production d'IgG et d'IgA provoque une diminution de la réaction inflammatoire grâce à la compétition entre les IgE et les IgG4 pour le site de fixation à l'allergène, et à la fixation de ceux-ci sur le récepteur FcεRI des basophiles et des mastocytes, ce qui inhibe leurs dégranulations23.

Une forte dose d'allergène possède également cette capacité d'induction de tolérance, mais par un tout autre mécanisme : elle provoque une anergie lymphocytaire par inhibition des interactions et des costimulations qui existent entre les cellules T et les cellules présentatrices d'antigènes. Cela interfère dans la synergie intercellulaire présente à l'état sain et, couplée à l'apoptose FAS médiée des cellules T24, induirait une tolérance . D'autres acteurs immunitaires additionnels jouent un rôle dans le phénomène de tolérance, tels que les cellules T régulatrices Foxp3+, les cellules T γδ et les cellules NKT20. Les cellules épithéliales des muqueuses intestinales comme la lymphopoiétine TSLP - Thymic Stromal Lymphopoietin - auraient également une place de choix dans l'induction de la tolérance, en plus de leur rôle de barrière physique20. La TSLP orienterait vers une réponse Th2 et serait impliquée dans les réactions inflammatoires ; Cependant, elle posséderait également un rôle régulateur au niveau gastro-intestinal.

De nombreuses zones d'ombres planent encore sur la compréhension de l'induction de la tolérance dans sa globalité.

Rupture de la tolérance orale

La rupture de la tolérance a pour conséquence le développement de l'allergie alimentaire. Trois phénomènes principaux semblent être particulièrement impliqués dans

Fourel Matthieu - Décembre 2014 25 ce phénomène de rupture de tolérance25 : l'augmentation de la perméabilité intestinale que l'on retrouve chez les patients allergiques ; le passage de la voie orale à la voie cutanée ou respiratoire, qui peuvent entraîner une sensibilisation ; ou encore une régulation défectueuses des cellules T . C'est ainsi que des personnes se trouvent sensibilisées à 26 l’arachide sans aucune ingestion antérieure .

Facteurs prédisposant à l’allergie.

Facteurs extrinsèque : les trophallergènes. L'allergie alimentaire est provoquée par des protéines exogènes présentant d'importantes similitudes avec les protéines endogènes humaines. En effet, il a été montré que l'ingestion d'une protéine possédant moins de 62% d'homologie avec une protéine humaine n'a que très peu de probabilité de sensibiliser son hôte27.

Cependant, l'homologie n'est pas le seul élément : la capacité de la protéine alimentaire à passer le tractus gastro-intestinal (TGI) est également à prendre en compte. En effet, l'allergène ne peut induire de réaction inflammatoire que s'il est pris en charge par les cellules présentatrices d'antigènes, et présenté aux cellules T, qui se trouvent au delà de la barrière intestinale. Malgré les mécanismes protecteurs du système digestif de l'hôte - qui seront évoqués dans le prochain point - certains peptides arrivent à pénétrer le TGI. Certains de ces peptides renferment des épitopes séquentiels ou conformationnels plus ou moins importants qui peuvent alors être reconnus par les cellules impliquées dans l'allergie.

Il existe à ce niveau deux types de reconnaissance épitopique : conformationnelle (en trois dimensions) ou séquentielle. Le premier se retrouve principalement dans l'allergie transitoire tandis que le second est un indicateur de persistance et de sévérité allergique28. En effet, la conformation des épitopes est modifiée de manière physiologique - maturation enzymatique principalement - ou physique - par la cuisson par exemple - ce qui supprime la reconnaissance du peptide allergénique par le système immunitaire. Il en résulte que la grande majorité (80%) des personnes allergiques à l'œuf ou au lait de vache peuvent ingérer ces aliments s'ils sont cuits29,30. En revanche, l'épitope séquentiel persiste malgré la cuisson et ne permet la consommation de l'aliment allergénique sous aucune de ses formes.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 26

Un autre facteur alimentaire augmentant l'allergénicité des protéines alimentaires est la famille des hydrates de carbone, présents par exemple dans les cacahuètes grillées, aliment très présent outre-Atlantique31. Cela est du à la capacité des déterminants carbohydratés à induire la production d'IgE à forte réactivité croisée32.

En revanche, il existe des facteurs propres aux aliments qui font varier la sensibilisation. Le soja par exemple, malgré sa proximité avec l'arachide, possède un seuil relativement élevé pour le déclenchement des symptômes33 car il possède des isoflavones qui suppriment les cellules dendritiques gastro-intestinales, ce qui inhibe la présentation antigénique34.

Facteurs intrinsèques à l'hôte. Outre les facteurs alimentaires, différents éléments prédisposent le patient à développer une allergie alimentaire. Tout d'abord, l'influence génétique a été mise en évidence par une étude américaine concernant la proportion de jumeaux présentant une allergie à l’arachide, dans le cas de jumeaux monozygotes et de jumeaux dizygotes. Les résultats révèlent une concordance de 64% chez les premiers contre seulement 7% chez les seconds35.

Les autres facteurs sont essentiellement chronologiques. La maturité du tractus gastro-intestinal en est un exemple majeur : la perméabilité intestinale est importante à la naissance et diminue avec le temps, de concert avec le passage des protéines allergènes dans la circulation sanguine36. En outre, la maturation enzymatique et l'augmentation de la présence des IgA et IgE spécifiques des antigènes réduit la capacité des protéines à traverser le TGI37. Un facteur sujet à controverse est l'introduction précoce de la nourriture, qui favorise la tolérance. Cela est révélateur de la complexité du système immunitaire et de la capacité de l'organisme à induire une tolérance.

Le système digestif est au cœur de la tolérance alimentaire, et les perturbations de la barrière intestinale, du pH gastrique ou de la flore intestinale sont autant de facteurs favorisant l'apparition des réactions allergiques. Ces réactions se trouvent être renforcées par d'autres éléments, tels que la consommation d'alcool, la prise excessive de

Fourel Matthieu - Décembre 2014 27 médicaments, les infections diverses ou encore un déficit d'activation de la PAF acétylhydrolase38.

L'importante prévalence couplée aux nombreux facteurs potentiellement déclencheurs de l'allergie rendent son diagnostic précis impératif.

Les deux allergies étudiées au cours de ces travaux sont l'allergie aux protéines du lait de vache (APLV) et l'allergie à l’arachide. Ce sont en effet deux des principales allergies touchant la population pédiatrique.

I.2.2 Allergie aux protéines du lait de vaches.

Compte tenu de la précocité de l'introduction du lait dans le régime alimentaire du nourrisson, l'allergie aux protéines de lait de vache (APLV) est souvent la première à faire son apparition. Elle touche environ 7,5% des nouveaux-nés, tandis que sa prévalence dans la population générale n'est que de 0,1% dans certaines études. Cependant, sa prévalence précise est délicate à établir car les symptômes cliniques de l'APLV sont variés et peu spécifiques (tableau 2). Comme l'ensemble des hypersensibilités, l'APLV peut faire appel à des réactions IgE ou non-IgE médiées. Cette dernière forme étant responsable de l'hypersensibilité retardée provoquant l'apparition des symptômes, majoritairement gastro-intestinaux et cutanés, entre une heure à plusieurs jours après l'ingestion de lait de vache.

Tableau 2 : Tableau clinique de l'APLV, selon Fiocchi et al.40

Signes cliniques de l'allergie aux protéines du lait de vache Gonflement des lèvres Vomissement Réactions gastro-intestinales Diarrhée (retardée en général) Syndrome oral d'allergie (rare chez enfants) Rhinite (dans 70% des TPO) Asthme (8% des TPO mais souvent sévère) Réactions respiratoires IgE- Evolution possible vers allergie respiratoire dépendantes Si évolution vers maladie pulmonaire chronique

Syndrome de Heiner (forme rare d'hémosidérose pulmonaire) Urticaire aigue (par inhalation ou par contact) Réactions cutanées IgE- Angio-oédème dépendantes Dermite de contact systémique

Fourel Matthieu - Décembre 2014 28 Lésion après contact ou ingestion IgE ou non IgE-dépendant Eczéma Sévérité corrélée avec la précocité de l'apparition Nausées, vomissement Douleurs abdominales, diarrhées Si évolution vers maladie chronique, malabsorption, retard de croissance, perte de poids : Syndromes gastro-intestinaux Syndrome d'entérocolite, d'entéopathie, de

protocolite Symptome de reflux gastro-oesophagien, constipation Oesophagite à éosinophiles Syndrome du colon irritable Symptomes identiques aux évolutions Réactions retardées respiratoires, gastro-intestinales, accompagné d'eczéma.

Afin de comprendre l'APLV, il faut connaître la composition du lait de vache. Ce dernier contient de 30 à 35g/L de protéines. Elles sont toutes potentiellement allergisantes, mais deux grandes catégories dominent : les caséines, représentant 80% de la masse protéique, et la famille des protéines du lactosérum, comptant pour environ 20%. Cette dernière contient trois protéines majeures : la β-lactoglobuline, la α- lactalbulmine et la sérumalbumine bovine. Des sensibilisations pour plusieurs d'entre elles sont communément impliquées dans l'APLV41.

La diversité symptomatique, exposée dans le tableau 2, complique le diagnostic et peu prêter à confusion. La symptomatologie digestive de l'APLV, par exemple, est commune avec l'intolérance au lactose. Les deux pathologies sont des hypersensibilités, immunologique pour l'APLV et non-immunologique dans le cas de l'intolérance. Le problème est que malgré leur clinique semblable, leurs traitements divergent. Celui de l'APLV est plus contraignant, du fait de l'éviction totale des produits à base de lait de vache, tandis que dans le cas de l'intolérance au lactose, seuls les aliments riches en lactose sont à proscrire.

Dans les cas où l'historique clinique est fortement évocateur, un Skin Prick Test (SPT) et un dosage des IgE spécifiques permettent généralement de retenir ou d'écarter le diagnostic de l'APLV. Cependant, il devient nécessaire d'entreprendre un test de provocation orale (TPO) dans les cas ambigus, car les moyens diagnostics non invasifs ne

Fourel Matthieu - Décembre 2014 29 permettent pas actuellement de prédire de manière formelle la présence ou non d'une hypersensibilité allergique.

Dans un cas d'allergie avérée dans le passé mais dont les tests (SPT + IgE) sont devenus négatifs ou dont les valeurs ont diminué significativement, le TPO est employé avant de procéder à une réintroduction progressive de l'allergène dans la vie du patient.

Une fois l’APLV diagnostiquée, la seule prise en charge efficace aujourd'hui reste l'éviction totale de l'allergène, c’est-à-dire l'éviction de tout produit contenant des protéines de lait de vache. Ce régime est très contraignant, notamment chez les enfants, grands consommateurs de produits laitiers. Les nourrissons de moins de 2 ans reçoivent quant à eux des préparations lactées adaptées à leur jeune âge (hydrolysats poussés de protéines de lait de vache). Si ces dernières préparations ne sont pas supportées par le patient, des acides aminés de synthèse sont alors administrés.

Lors d'un allaitement maternel, la mère se doit de surveiller son alimentation seulement dans le cas de la survenue d'une réaction allergique chez le nourrisson allaité exclusivement. Si l'APLV est considérée sévère, c’est-à-dire à risque anaphylactique, le patient doit porter sur lui (ou avoir à proximité dans le cas d'un nourrisson) un stylo auto- injectable d'adrénaline. Il est à noter que des protocoles d'immunothérapies spécifiques peuvent également être mis en place dans le but d'induire une tolérance42.

Le suivi de l'APLV s'effectue via le dosage des IgE spécifiques - caséine, β- lactoglobuline et α-lactalbumine principalement - appuyé par les tests cutanés. Cette réévaluation régulière conduit, si les résultats le permettent, à une réintroduction après 6 mois d'éviction. Si ce dernier est supporté avec succès, l'enfant pourra de nouveau suivre un régime normal, évitant ainsi de vivre en suivant des restrictions nutritionnelles importantes.

Il convient de faire un bref rappel sur le lait maternel, pouvant également provoquer une APLV par passage paracellulaire ou transcellulaire des protéines allergisantes dans le lait maternel. Ce lait humain présente une composition protéique différente de celle du lait de vache, d'un point de vue quantitatif (environ 9g/L de protéine contre 30g/L pour le lait de vache) et qualitatif, avec l'absence de β-lactoglobuline par

Fourel Matthieu - Décembre 2014 30 exemple. Les protéines du lait maternel ont un potentiel tolérogène plus important, notamment en apportant une importante quantité d'IgA intestinales au nourrisson43 , ce qui diminuerait le risque de survenue d'une APLV mais également des autres allergies alimentaires44. De plus, ces protéines aident à dans la maturation immunitaire du nouveau-né via les Ig sécrétoires, les cytokines, les facteurs de croissances. Parmi ces composants, le TGF-β s'est imposé comme un acteur important d'évolution immunitaire du nourrisson : il inhibe la réponse inflammatoire des cellules épithéliales et des cellules T, il possède un rôle dans l'induction et la fonctionnalisation des Treg, en plus d'induire la production d'IgA45.

Malgré tous ces avantages, les résultats des études sur le sujet divergent. Cela peut être du à la physiologie unique de chaque individu, femme comme enfant, cumulé aux historiques cliniques personnels et à l'exclusivité difficilement vérifiable de l'allaitement. La dernière étude d'envergure date de 1988, où l'équipe de Høst trouve une prévalence des APLV de seulement 0,5% chez les nourrissons allaités46. Malgré l'absence de données non biaisées sur le sujet, les bénéfices de l'allaitement font consensus dans les communautés pédiatriques - française, européenne et nord-américaine - ainsi qu'à l'OMS45.

L'APLV est une allergie alimentaire précoce avec une prévalence importante, mais qui ne persiste pas à l'âge adulte dans plus de 80% des cas, ce qui n'est pas le cas dans d'autres allergies, notamment celle à l’arachide.

I.2.3 Allergie à l’arachide.

L'allergie à l’arachide est une hypersensibilité sévère IgE-médiée responsable de la majorité des cas d'anaphylaxie47. Elle présente une prévalence de 1% dans la population générale48, relativement stable chez l'adulte depuis 199749. Cependant la prévalence pédiatrique est passée de 0,6% en 1997 à 2,1% en 200849. Cette évolution est inéquitable car 20% des individus allergiques induisent une tolérance48.

Cette augmentation du nombre d'enfants présentant des hypersensibilités n'a pas encore trouvé d'explication précise, plusieurs facteurs pourraient entrer en jeu, notamment au niveau des procédés de préparation50 et de l'augmentation de la

Fourel Matthieu - Décembre 2014 31 consommation, que ce soit de manière directe ou indirecte avec l'ensemble des produits contenant des traces d'arachides50. D'autres facteurs propres aux allergies en général entrent également en jeu, comme l'ingestion maternelle51, la période d'introduction ou les réactions croisées - notamment avec les noix, le sésame, le soja, les caroubes, ou encore la farine de lupin48,50.

Au niveau de la clinique - résumée dans le tableau 3 - il est important de noter que plusieurs systèmes biologiques sont souvent impliqués simultanément : deux dans presque un tiers des cas et trois systèmes dans environ 20% des cas52. Les symptômes apparaissent entre quelques secondes et deux heures après l'ingestion d'arachide, avec toutefois une grande majorité (95%) dans les vingt premières minutes53. Il convient de prendre en compte une possible récurrence entre une et huit heures après dans le cas des réactions biphasiques54.

Tableau 3 : Signes cliniques de l'allergie à l’arachide54

Signes cliniques de l'allergie à l’arachide Urticaire aigue Réactions cutanées Angio-œdème (89% des cas) Prurit érythémateux Dermatite atopique Symptômes des voies aériennes supérieures et inférieures Toux répétées Réactions respiratoires Œdème laryngé (52% des cas) Asthme Changement de voix Sifflement (Respiration sifflante) Vomissement Réactions gastro-intestinales Diarrhées (34% des cas) Douleurs abdominales Symptomes cutanées (ci-dessus) Symptomes respiratoires (ci-dessus) Symptomes gastro-intestinaux (ci-dessus) Anaphylaxie (5% des cas) Symptomes cardiaques Hypotension Dysrythmies

Le diagnostic de l'allergie est d'autant plus important que de graves conséquences peuvent être induites par simple contact avec l'arachide. L'historique médical est une nouvelle fois très important et constitue le premier élément de la démarche diagnostique.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 32 Les IgE spécifiques, combinées au SPT, sont utilisées en routine. Ce dernier possède une VPN de 95% pour une papule supérieure à 8mm - ou 3mm de plus que le contrôle négatif -, mais a une faible spécificité (30-60%)55. Il est important de rappeler que la valeur des IgE spécifiques, même si elle fournit une indication quant à la probabilité de déclenchement d'une réaction, elle ne renseigne en rien sur la gravité de cette dernière. Des IgE spécifiques (pour l’allergène natif) supérieures à 15kUA/L présentent une VPP de 95%55.

Malgré ces résultats satisfaisants, la variabilité individuelle et l'absence de normes spécifiques selon l'âge des patients posent problème car les seuils peuvent varier selon la croissance des individus. Le diagnostic "gold standard" reste donc le TPO en double aveugle contre placebo. Il est réalisé dans les cas ambigus, avec introduction de doses croissantes à des intervalles de 15 ou 30 min48. Il n'est en effet pas nécessaire de pratiquer un TPO chez un enfant dont l'historique clinique est évocateur, couplé à un SPT positif et des IgE spécifiques élevées, compte tenu du risque important de réactions, plus ou moins sévères54.

Concernant les traitements, l'éviction des arachides du régime alimentaire reste le principal moyen permettant d'éviter la survenue de nouveaux symptômes. Le nombre important de produits contenant de l'arachide ou renfermant des traces d'arachides, notamment en pâtisserie, nécessite une vigilance de tous les instants pour l'individu allergique et son entourage. L'huile d'arachide raffinée, grâce aux nombreuses transformations nécessaires à son élaboration, ne provoque pas de réaction allergique, contrairement aux huiles artisanales qui doivent être évitées56. En cas de réaction aigue, le patient se doit d'avoir sur lui de l'épinéphrine auto-injectable. Ce sont les premiers soins à apporter en attendant une prise en charge médicale en urgence où les soins adéquats d’urgence seront apportés.

Des traitements à long terme sont en train d'être développés, dans le but d'induire une tolérance, ce qui est le cas de seulement 20% des patients allergiques à l'arachide. Blumchen et Al. ont réalisé une étude prometteuse sur l'immunothérapie orale57, qui s'avère être bien supportée (symptômes légers dans 2,3% des cas) et qui a permis , aux 23 patients, de voir leur tolérance passée de 0,19g à 1g d'arachide en moyenne. Des protocoles d'induction de tolérance orale, longtemps écartés des traitements concernant

Fourel Matthieu - Décembre 2014 33 l'arachide à cause de la récurrence des effets secondaires, ont fonctionné en Espagne en 2010 chez un enfant allergique sévèrement allergique58, puis sur 24 patients en Californie en 201259, avec des résultats encourageant sur la sécurité de l'immunothérapie orale. D'autres traitements sont également en cours de développement, notamment le FAHF-2, une molécule issue d'une herbe médicinale chinoise qui présente des résultats encourageant chez le modèle murin60, et récemment en phase I chez l'homme61.

Ainsi, il n'existe pas encore de traitements aboutis permettant une prise en charge systématique de l'hypersensibilité à l’arachide, mais de nombreuses voies sont actuellement explorées afin d'augmenter la qualité de vie des individus allergiques, qui doivent aujourd'hui pour la plupart se cantonner à l'éviction des aliments contenant ou pouvant contenir des arachides.

I.2.4 Diagnostic

La première étape jalonnant la démarche diagnostique pure est l'analyse de l'historique clinique du patient. Le recours à l'historique clinique prend tout son sens lorsqu'il est fortement évocateur (en faveur de - ou contre - l'allergie). Il existe cependant plusieurs réactions d'hypersensibilités non allergiques pouvant prêter à confusion. C'est, par exemple, le cas de l'intolérance au lactose ou du syndrome d'entérocolite induite par les protéines alimentaires, présentant des vomissements et des diarrhées retardées, mais des tests diagnostiques allergiques négatifs. Il est donc essentiel de se rapporter à la clinique du patient lors de la suspicion d'une allergie afin d'éviter la prescription de tests inutiles62,63.

Les outils diagnostiques de l'allergie alimentaire se divisent en deux catégories, les tests in vitro - dosage des IgE spécifiques et TAB - et in vivo - Skin Prick Test (SPT) et Test de Provocation Orale (TPO). Les analyses in vitro n'étant pas invasives, elles sont plus facilement supportées par les patients, notamment les enfants.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 34 I.2.4.1 Skin Prick Test

Le principe du SPT est relativement simple : une goutte du ou des allergènes suspectés sont déposées sur la peau désinfectée du patient, au niveau des avant bras. Puis une légère piqûre est effectuée à l'aide d'une aiguille - ou lancette - à travers la goutte afin de faire pénétrer l'allergène dans l'épiderme. Le test se compose, en plus des allergènes, d'un contrôle positif (Histamine, Codéine) et d'un contrôle négatif (Diluant des allergènes) afin de pouvoir valider le test, déterminer la réactivité de la peau, et comparer les papules induites par l'allergène avec le contrôle positif. Après quinze minutes, les diamètres des papules formées sont observés et analysés (fig. 4). Le consensus actuel concernant le calcul du diamètre des papules préconisent de mesurer le plus grand diamètre ainsi que le diamètre orthogonal correspondant. La réaction est considérée positive si le diamètre de la papule est supérieur au contrôle négatif de plus de 3 mm.

Figure 4 : Réalisation et lecture d'un Skin Prick Test (Source : Service d'immunologie et allergie CHUV, Lausanne)

Les avantages de ce test sont la rapidité d'obtention des résultats, la facilité et le caractère indolore de sa réalisation ainsi que sa sensibilité et sa bonne valeur prédictive négative (95%)2 permettant d'écarter l'allergie lors d'un historique clinique peu alarmant. Cependant, même si la positivité d'un SPT montre une probable sensibilisation, il n'est pas suffisant pour confirmer l'allergie. Et lorsque la clinique du patient relève des réactions sévères causées par les IgE, le dosage des IgE spécifique doit être réalisé en première intention.

I.2.4.2 IgE spécifiques.

Comme son nom l'indique, ce moyen diagnostic ne trouve son utilité que dans le cas d'allergie IgE-dépendantes. Il convient de noter que ces tests étaient appelés RAST (Radio Allergo-Sorbent Test), au principe similaire mais dont le procédé technique n'est

Fourel Matthieu - Décembre 2014 35 aujourd'hui quasiment plus utilisé. Le principe de ce test est celui du test immunologique "en sandwich". Il consiste tout d'abord en la liaison de l'allergène suspecté à une phase solide, mise en contact avec le sérum du patient à tester. Il y a alors formation de complexes immuns antigène-IgE. Puis, après rinçage, des anticorps anti-IgE marqués - de manière enzymatique généralement - sont ajoutés et forment un nouveau complexe avec les IgE du patient. Il convient ensuite d'activer le marquage par l'incubation avec le substrat de l'enzyme, afin de détecter la fluorescence émise, qui sera proportionnelle à la quantité d’IgE sériques spécifique du patient.

De plus, de nombreuses études ont mis en relation la concentration sérique en IgE spécifiques et la probabilité de déclencher une réaction allergique64,65 ce qui fait de test le complément idéal du SPT. Il convient toutefois de faire attention aux réactions croisées, du fait de l'hétérospécificité des IgE.

Ce dosage s'est installé progressivement dans la routine diagnostique allergique de part la relative simplicité de sa réalisation et sa validité, corroborée au fil des publications. Ces dernières permettent d'affiner les valeurs seuils des IgE spécifiques, qui existent dorénavant pour la majorité des allergènes. Cependant les comparaisons inter tests sont ininterprétables compte tenu de la variabilité individuelle et de l'historique propre à chaque patient.

Les techniques de détection d’IgE spécifiques ont bénéficié des avancées en biologie moléculaire de ces dernières années, avec l'apparition des allergènes recombinants disponibles en tests unitaires ou en micro-arrays à des fins diagnostiques. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement standardisés contrairement aux extraits naturels et leur spécificité permet la détermination des profils de sensibilisations66, comme évoqué précédemment dans le cas de l'allergie à l'arachide. Ces allergènes moléculaires représentent précisément le fragment protéique de l'aliment reconnu par les IgE. Ils sont reconnaissable à leur dénomination particulière avec la présence d'un "r" devant le nom de l'allergène moléculaire (ex : Ara h2 devient rAra h2). Il est à noter que des allergènes moléculaires peuvent également être obtenus par purification à partir d'un allergène naturel, et comporte alors un « n » devant leur nom.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 36 Il existe plusieurs familles d'allergènes moléculaires dont les principales sont les suivantes :

67 Tableau 4 : Grandes familles d'allergènes moléculaires

Famille d'allergène Stabilité Gravité Pathogenesis Related - 10 (PR-10) Thermosensibles Syndromes modérés Protéines de transfert lipidiques Stable et résistants Léger, voir asymptomatique (LTPs) Profilines - Syndrome oral majoritaire Protéines de stockage Résistants Systémiques, sévère. Résidus CCD et Broméline - -

IgE spécifiques à l'arachide

De ces familles, il se dégage pour l'arachide treize allergènes dits moléculaires. Seulement six sont cependant disponibles pour effectuer les tests courant (IgE spécifique, TAB) :

4 protéines de stockage : Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 et Ara h 6 1 protéine PR10 betv1-like : Ara h 8 1 LTP (Protéine de Transfert Lipidique) : Ara h 9

Parmi ces familles, les plus pertinentes concernant l'hypersensibilité à l'arachide sont les protéines de stockages (Ara h 1, 2, 3 et Ara h 6). Ces dernières sont en effet responsables de réactions systémiques et leur détection présente un intérêt diagnostic permettant de mettre en évidence un profil de sensibilisation sévère68. Ces protéines sont également utilisées dans la détermination d'allergie croisée, notamment entre l'arachide et les fruits à coque et à graine.

Le pouvoir allergisant des arachides réside dans les protéines du cotylédon, parmi lesquelles le premier allergène majeur, "peanut 1", fut découvert en 198169. Depuis, 8 allergènes glycoprotéiques ont été mis en évidence, de Ara h1 à Ara h870–73. Ara h1 et Ara h2 sont des protéines de stockage qui se retrouvent impliquée dans 90% des patients

Fourel Matthieu - Décembre 2014 37 sensibilisés, ainsi que les anticorps IgE anti Ara h3 qui se retrouvent chez 45 à 95% des patients53.

Les épitopes allergisants de l'arachide sont majoritairement résistants à l'acide, à la chaleur et à la dégradation enzymatique48, ce qui les rend résistants. Cependant, la manière de les préparer peut les affecter. Par exemple, les cacahuètes grillées sont plus allergisantes - quantité de Ara h1 multipliée par 2274 - et peuvent provoquer une réaction de Maillard (Processus non enzymatique menant à la glycosylation des groupements amines des protéines ce qui donne un produit fini plus stable, et par conséquent plus allergisant).

Ces dernières années, les avancées en biologie moléculaire ont permis de cibler des molécules spécifiques de l'arachide. Des IgE spécifiques dirigées contre ces molécules permettent de définir un profil de sensibilisation d'un patient et ainsi orienter le traitement66. Différents profils de sensibilisations en découlent. La présence d'IgE spécifiques anti Ara h 2 par exemple, est prédictive d'une réaction d'hypersensibilité allergique75. Différents seuils de positivité prédictifs ont ainsi été définis : 0,35kU/L pour Nicolaou68, avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 96,1% ; et 0,23kU/L pour Codreanu et al.76 (sensibilité de 93% pour une spécificité de 96%).

La sévérité de l’allergie des patients peut également être déduite du profil de sensibilisation. En effet, une positivité associée des allergènes Ara h 1, Ara h 2 et Ara h 3 est synonyme de gravité. La détermination de ce profil est pertinente dans la prise de décision concernant le TPO. Ce dernier sera, par exemple, à éviter dans le cas de la positivité multiple aux trois protéines de stockage. En revanche, la positivé unique à l'Ara h 8 (protéine PR10) permet d'envisager un TPO car celle-ci n'est pas corrélée à un risque sévère de réaction, mais à une sensibilisation souvent asymptomatique.

Il en va de même pour la positivité à l'Ara h 9, si le patient de présente pas de symptômes cliniques suite à l'ingestion de fruit à coque, car la présence d'IgE anti-Ara h 9 n'est pas associée à des réactions sévères77.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 38 Il est donc très intéressant sur le plan diagnostic de déterminer le profil de sensibilisation des patients afin d'orienter les traitements et de limiter les risques lors des tests de provocation.

IgE spécifiques aux protéines du lait de vache.

Concernant les hypersensibilités aux protéines du lait de vache, l'allergène moléculaire le plus pertinent est la caséine (nBosd8) qui est un facteur de discrimination permettant de différencier allergie transitoire et allergie persistante. En outre, la présence de la caséine est également un facteur de sévérité lorsqu'elle est associée à la présence d'IgE spécifique contre le lait de vache (béta-lactoglobuline et alpha-lactalbumine notamment). Le pronostic et le suivi de l'APLV se sont donc vus améliorés par le recours aux allergènes moléculaires77.

Ainsi, les allergènes recombinants, standardisés, permettent d'orienter le diagnostic de manière fiable et précise, de différencier les profils de sensibilisation primaire et de sensibilisation croisée, et de donner une indication sur le risque potentiel de réaction sévère. Cette avancée concernant la détermination de profils types donne la possibilité de cibler les profils et d'adapter une immunothérapie spécifique66.

Ces deux tests conventionnels servent principalement à mesurer le rapport bénéfice / risque entourant la réalisation d'un TPO. S'il est entrepris, le TPO sera dans un premier temps réalisé soit en simple aveugle, soit en test ouvert. Si les résultats obtenus sont ambigus, il faudra alors faire appel au gold standard : le test de provocation orale en double aveugle sous contrôle placebo.

I.2.4.3 TPO.

Il existe trois types de Test de Provocation Orale : ouvert, simple aveugle et double aveugle contre placebo. Le dernier étant encore aujourd'hui considéré comme le "gold standard", mais dont la réalisation s'avère être la plus lourde. Le principe de ce test réside dans la réintroduction progressive de l'aliment concerné, en commençant par une

Fourel Matthieu - Décembre 2014 39 faible dose jusqu'à une dose cumulée considérée comme étant la dose journalière typique ingérée par jour.

• Pré requis chez le patient. Différentes conditions sont à réunir afin de s'assurer du bon déroulement du TPO :

Régime d'éviction Le patient, généralement un enfant, doit suivre un régime d'éviction de l'allergène depuis une période allant de 2 semaines - dans le cas de réactions IgE-dépendantes avérées - à 12 semaines dans le cas de manifestations digestives78.

Stabilité clinique Il se doit de présenter une stabilité clinique notamment par une absence de manifestations infectieuses ou inflammatoires.

Traitement de fond compatible La prise en compte des traitements de fond pose également problème pour certaines familles médicamenteuses comme les neuroleptiques, les immunosuppresseurs, les béta- bloquants et les IEC (inhibiteur de l'enzyme de conversion) qui sont des contres indications à la réalisation d'un TPO.

Arrêt des antihistaminiques. Les antihistaminiques doivent être également arrêtés depuis un laps de temps allant de 3 jours pour les dernières générations à 5 semaines pour les premières79.

• Préparation des aliments : Les différentes recettes. Les aliments, sauf dans le cas du TPO ouvert, ne sont pas administrés tels quels mais doivent être dissimulés autant que possible, aussi bien au niveau de leurs aspects que de leurs goûts ou de leurs odeurs. Plusieurs astuces se sont alors développées, avec des recettes variant selon l'aliment et l'âge du patient. La notion de véhicule alimentaire entre alors en jeu. Cela consiste à masquer l'aliment à réintroduire dans un volume plus important de nourriture, telle qu'une compote, une purée ou encore un jus de fruit. Le véhicule se doit naturellement d'être le même lors du TPO avec le placebo.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 40 Outre la présentation, la forme et la cuisson de l'aliment doivent être prise en compte. L'allergénicité varie en effet selon la durée, le mode de cuisson et l'aspect de celui-ci. L'œuf cru par exemple, est plus allergisant que l'œuf cuit tandis que l'arachide grillée possède un pouvoir allergène plus important que l'arachide. Le lait lyophilisé ou en poudre présente quant à eux dix fois plus de protéines que le lait entier liquide. Il convient donc de jouer sur ces facteurs afin d'adapter le TPO au patient en réintroduisant, par exemple, la forme que celui-ci a l'habitude de consommer, ou la plus allergisante afin de s'assurer de la tolérance du patient.

• Le déroulement d'un TPO. La réalisation du test se fait généralement à l'hôpital, encadré par du personnel spécialisé et à proximité d'une unité de soin intensif, nécessaire à la prise en charge des réactions sévères. Une hospitalisation de jour est suffisante dans la plupart des cas. L'enfant doit arriver à l'hôpital en début de matinée et être à jeun depuis au moins deux heures, afin d'éviter des interférences avec l'aliment réintroduit. Lors de TPO en aveugle, deux sessions ont lieu, une le matin et l'autre dans l'après midi, espacée de deux heures. Le TPO peut également se dérouler sur plusieurs jours, en alternant journée avec placebo et journée avec aliment.

• Risques et prises en charge. L'inconvénient majeur complexifiant la prise de décision de TPO se situe au niveau des risques de réactions systémiques sévères - respiratoires et/ou cardiovasculaires - allant jusqu'au choc anaphylactique. C'est pourquoi les recommandations préconisent la présence d'une équipe médicale et paramédicale spécialisée et prête à intervenir, d'un chariot d'urgence complet comprenant entre autres des doses d'adrénaline, d'antihistaminiques, de corticoïdes et de béta2-mimétiques. Des études reportent l'utilisation de ces deux derniers dans 5 à 8% des cas, et de l'adrénaline - utilisée face à l'anaphylaxie - dans 1% des cas.

Malgré la présence de 3% de faux positifs80, le TPO en double aveugle contre placebo reste le "gold standard" du diagnostic de l'allergie alimentaire. Un TPO ouvert est réalisé le lendemain des TPO négatifs afin de diminuer le risque de faux négatifs, car la survenue d'éventuelles réactions immédiates au domicile de l'enfant peut avoir de graves conséquences. En outre, une étude montre que quel que soit le résultat du TPO, la qualité

Fourel Matthieu - Décembre 2014 41 de vie de l'enfant comme des parents augmentent après la réalisation d'un TPO, même si une certaine angoisse le précède81.

Cependant, la nécessité d'une prise en charge conséquente ne permet pas de réaliser ce diagnostic en routine, et seuls les cas les plus complexes ou ambigus y ont recours. C'est pourquoi il est nécessaire d'orienter le plus précisément possible les praticiens dans leur prise de décision. Le test d'activation des basophiles, couplé au dosage des IgE spécifiques et au SPT, est donc une voie qu'il convient d'explorer.

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II. Le Test d'activation du basophile.

II.1 Les Basophiles

II.1.1 Description générale

Découverte

Les basophiles ont été découverts par Paul Ehlrich à la fin du XXème siècle, au même titre que les mastocytes82. Mais ce n'est qu'en 1953 que J. Riley et G.B.West montrent que l'histamine est stockée de manière prédominante dans les basophiles (au niveau sanguin) et les mastocytes (au niveau tissulaire)83. Jusqu'à cette découverte, les fonctions de ces cellules étaient inconnues. Leurs rôles dans l'anaphylaxie et les hypersensibilités sont maintenant bien cernés.

En 1971, l'équipe d'Ishizaka a démontré l'existence de sites de fixation des IgE à la surface des basophiles, ainsi que le fait que l'agrégation par des anticorps anti-IgE provoque leur dégranulation84.

Différenciation

Le basophile est une cellule hématopoïétique et dérive, à ce titre, d'un précurseur myéloïde pluripotent. On retrouve ce progéniteur dans la moelle osseuse ainsi que dans le sang du cordon ombilical.

Il reste encore quelques zones d'ombre concernant les précurseurs hématopoïétiques du basophile, notamment au niveau de son caractère multipotent ou bipotent82, générant des basophiles et des éosinophiles85, ou des mégacaryocytes ou encore des mastocytes86. Il existe donc plusieurs voies de différenciations possibles. C'est cependant la voie bipotente (basophile / mastocyte) qui semble être la plus probable, aux vues des différentes études réalisées, notamment sur le modèle murin86,87.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 43 Le progéniteur se différencie complètement au niveau de la moelle osseuse et du sang du cordon ombilical. Le basophile est donc entièrement mature avant de passer dans la circulation sanguine, où il est présent à l'état basal. Il représente de 0,5 à 1% de la population leucocytaire circulante, ce qui en fait le leucocyte le moins représenté. Les basophiles ne sont pas cantonnés à la circulation. En effet, suite à un stimulus - réaction inflammatoire ou hypersensibilité -, le basophile migre vers les tissus concernés et leurs présences sur les sites d'inflammation témoignent d'une importante activité anti- inflammatoire.

Aspect cytologique

Les basophiles sont des cellules rondes à noyau polylobé, à chromatine condensée et d'un diamètre allant généralement de 10 à 14µm (fig.5). Ils possèdent des granules cytoplasmiques métachromatiques, ronds ou ovalaires, moins nombreux, mais de plus grands diamètres que les granules des mastocytes. Leur sensibilité aux colorants basiques est à l'origine de leur nom.

Figure 5 : fig : Observation au microscopique optique d’un basophile (coloration May-Grunwald-Giemsa)

II.1.2 De la circulation à l'inflammation : parcours d'un basophile.

Les basophiles résident dans la population circulante à l'état basal. Leur action au niveau de la réaction allergique, et donc de l'inflammation, ne peut avoir un impact significatif qu'après une migration vers les tissus concernés88. Différents acteurs entrent alors en jeu afin de permettre aux basophiles d'atteindre leur lieu d'action.

Comme l'ensemble des leucocytes, le basophile ne reste pas cantonné dans la circulation et migre vers les tissus inflammatoires. Ce trajet se déroule selon trois étapes : l'adhésion à l'endothélium vasculaire, la migration transendothéliale, et l'acheminement extravasculaire jusqu'au site inflammatoire.

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Adhésion

Chacune de ces étapes nécessite marqueurs et médiateurs, afin de guider le basophile à partir de la circulation sanguine. Le premier acteur est la L-sélectine (ou CD62L), un récepteur membranaire ayant pour ligand CD34 et MAdCAM-1, avec qui la liaison permet d'initier l'adhésion à l'endothélium vasculaire. Comme son étymologie l'indique, elle permet de sélectionner le basophile dans la population circulante. L'adhésion est ensuite confirmée par des β1- et β2- intégrines ayant pour ligand ICAM-1 (Intracellular Cell Adhesion Molecule), commun aux éosinophiles et aux cellules Th2.

Elle devient irréversible après la liaison entre le récepteur VLA-4 (Very Late Antigen) et VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule)89 . La famille des intégrines regroupe des glycoprotéines membranaires composé d'hétérodimères (sous unités α et β) formant des liaisons non covalentes avec des éléments de la matrice extracellulaire (MEC), notamment via la laminine, le collagène, ou la fibronectine. Cette dernière prédomine dans le cas des basophiles. L'adhésion est induite par des médiateurs tels que les cytokines IL-3 et IL-5, le GM-CSF et les anticorps anti-IgE90. L'IL-3, qui se lie au récepteur CD123, agit sur la maturation des basophiles, ainsi que sur la sécrétion des médiateurs chimiotactiques.

Migration transendothéliale

Vient ensuite la migration transendothéliale, nécessaire au passage de la circulation sanguine au milieu extravasculaire où se déroule l'inflammation. D'autres familles sont alors sollicitées, notamment celle des récepteurs CCR, liant les chimiokines CC - dont des membres de la famille MCP (Monocyte Chemokine Protein) - et dominée par le CCR3. Ce dernier, dont les ligands significatifs sont l'Eotaxine (CCL11) et RANTES/CCL5, induit une importante migration91. Son action est soutenue par les récepteurs de la famille CXC (principalement le CXCR4) via la liaison au SDF-1 (Stromal cell-Derived Factor-1). Plus modestes, les couples récepteurs ligand CXCR1/IL- 8(CXCL8)) et CCR2/MCP-1(CCL2) contribuent eux aussi à l'efficacité de la migration.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 45 Des études (Uguccioni et al., 1997 ; Jinquan et al., 2000 ; Krieger et al., 1992) ont montré que nombre de ces ligands (respectivement MCP-1,-3,-4 ; SDF-1 et IL-8) provoquaient également la libération d'histamine92.

Un autre type de récepteur, couplé aux protéines G, joue un rôle important dans la sélectivité de la migration : le CRTH2 (Chemoattractant Receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells). Découvert sur les cellules Th2, il est également présent chez les basophiles et les éosinophiles. Il possède une forte affinité pour les prostaglandines D2 (PGD2), sécrétées par les mastocytes. Outre la migration, PGD2 augmente la sécrétion de médiateurs de la dégranulation (cytokines IL-4, -5 et -13)93 de par l'augmentation de l'influx calcique94. Le rôle de ce récepteur se poursuit au niveau de la polarisation de la réponse Th2 dans le cas des inflammations chroniques allergiques qui ne seront pas traitées dans cette thèse.

Les chimiokines citées précédemment permettent l'acheminement final du basophile jusqu'au site inflammatoire par chimiotactisme.

II.1.3 Dégranulation des basophiles : Les médiateurs sont dans la place.

Une fois sa migration terminée, le basophile doit être activé afin d'enclencher sa dégranulation. Cette dernière a pour conséquence trois phénomènes principaux : la sécrétion de médiateurs préformés dans les granules cytoplasmiques (amines vasoactives, protéases neutres, protéoglycanes, certaines cytokines et facteurs de croissance) ; la synthèse de novo de médiateurs lipidiques pro-inflammatoires (leucotriène LTC4) ; et la synthèse et la sécrétion de cytokines et de chimiokines (IL-4 et IL-13 majoritairement).

L'activation des basophiles peut être induite par différents déclencheurs, spécifique avec les IgE et les IgG, ou plus général avec l'anaphylatoxine C5a ou encore les PAMPs (Pathogen Associated Patterns).

Fourel Matthieu - Décembre 2014 46 II.1.3.1 Activation IgE dépendante

La réaction allergique sollicite l'activation IgE dépendante, commune aux mastocytes, et enclenchée par le récepteur FcεRI. Ce récepteur de haute affinité pour les -9 -10 95 IgE (Kd=10 -10 M) est la clef de voûte de la dégranulation des basophiles. Il présente, en plus de sa forte capacité de fixation - nécessaire étant donnée la faible concentration sérique des IgE - un faible taux de dissociation. La liaison des IgE au FcεRI provoque l'agrégation de ces récepteurs, suivi de l'activation de protéines tyrosine-kinases (PTK), notamment des familles SRC (protéine LYN), TEC et SYK96. Ces protéines phosphorylent les résidus tyrosine des motifs ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) des sous unités β et γ du récepteur FcεRI. Ces phosphorylations amplifient le recrutement des PTKs (LYN et SYK). S'en suit une cascade de phosphorylations, empruntant différents courants de signalisation, mais se concluant tous par la dégranulation, à la production de cytokines et des facteurs de croissance24 (fig. 6).

FcεRI

Figure 6 : Voie de signalisation en aval du FcεRI et activation des basophiles et des mastocytes (Adapté de Kumer97)

Fourel Matthieu - Décembre 2014 47 II.1.3.2 Activation IgG dépendante

En plus du récepteur FcεRI, les basophiles expriment également à leur surface les récepteurs de faible affinité pour les IgG : FcγRII- FcγRIII. C'est à ceux-ci que se sont intéressées des études japonaises effectuées sur des modèles murins en 200898. Il en résulte que le basophile serait au cœur du déclenchement de l'anaphylaxie systémique causée par la voie des IgG. En effet, la liaison IgG1-Récepteur Fcγ du basophile (et des neutrophiles) déclenche la libération du facteur d'activation plaquettaire : le PAF99.

Le récepteur FcγRIIA - présent sur les basophiles, les neutrophiles, les mastocytes et les macrophages - contribuerait également au déclenchement des réactions anaphylactiques, de par la libération de médiateurs anaphylactogènes100.

Le PAF (Platelet-Activating Factor) est un médiateur augmentant la perméabilité vasculaire avec une puissance 1000 à 10 000 fois supérieure à l'histamine. Cette efficacité permet ainsi de déclencher l'anaphylaxie systémique malgré l'effectif réduit de la population des basophiles ; tandis que les mastocytes, plus nombreux, libèrent majoritairement de l'histamine par la voie de signalisation IgE-FcεRI. Il en ressort une action complémentaire des mastocytes et des basophiles lors des réactions anaphylactiques systémiques, les uns agissant respectivement par la voie des IgE et les autres majoritairement par celle des IgG101.

Il existe une régulation très complexe - dont tous les rouages n'ont pas encore été élucidés - des activations leucocytaires. Concernant les anaphylaxies systémiques passives (PSA) contrôlées par la voie des IgG, une récente étude (Falanga et al., 2012) met en évidence les actions antagonistes des protéines kinases de la famille Src, LYN et FYN, au niveau de régulation du relargage des cytokines (Histamine, IL-6 -13, TNF-α) et de la dégranulation des basophiles, des mastocytes et des macrophages. La FYN kinase régule ces actions de manière positive et permet une activation cellulaire optimale, tandis que la LYN kinase possède une action antagoniste au niveau des récepteurs FcγR. Cependant, seule cette dernière joue un rôle dans la régulation de la PSA en augmentant la libération des médiateurs vasoactifs et en exacerbant la réponse des cellules endothéliales au PAF et à l'histamine102. Cela met en évidence la complexité inhérente à la régulation de la majorité des phénomènes biologiques.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 48 II.1.3.3 Activation par le complément.

Afin de parachever la description des différentes voies d'activation du basophile, il convient de s'intéresser aux anaphylatoxines issues du système du complément. En effet, la sécrétion de l'histamine, des leucotriènes C4 (LTC4) ainsi que des cytokines IL-4 et IL-13 peut être stimulée par les anaphylatoxines C3a et C5a (C5a seulement pour les cytokines)88. Ces voies de signalisation nécessitent cependant l'amorçage par les cytokines IL-3103 - sécrétées par les cellules T et les basophiles activés - exceptée pour la libération de l'histamine par C5a.

La régulation négative de ces anaphylatoxines se fait par des protéines kinases du groupe GRK104: GRK2 et 3 agissent sur C3a tandis que C5a est inhibée par GRK6 via la phosphorylation et la désensibilisation de leurs récepteurs (respectivement C3aR et C5aR).

Du coté pharmacocinétique, les données sont en adéquation avec les rôles des basophiles : il existe un premier pic de réponses induit par le C5a, 5 à 15minutes après la stimulation, correspondant à l'hypersensibilité immédiate, et dont l'amorçage par IL-3 serait provoqué par sa phosphorylation via la cPLA2 (cytosolic phospholipase A2)105 . Il y a ensuite un second pic, plus important, 18 à 24 heures plus tard pouvant évoquer l'hypothèse d'une génération continue de C5a et de IL-3 au niveau du site de l'inflammation, nécessaire à la participation du basophiles dans l'inflammation allergique chronique, possible grâce à une modification qualitative de la réponse calcique cytosolique - via la synthèse d'une nouvelle protéine non constitutive.

II.1.3.4 PAMPs

Toll-Like Receptor

En plus des anaphylatoxines, les basophiles sont capables de réagir à l'interaction des Toll-Like Receptors (TLR) avec leurs ligands. Les TLR sont apparus récemment comme étant des acteurs clefs de l'immunité innée - et au cœur de l'obtention du prix Nobel de médecine 2011 par le professeur français Jules Hoffmann. En tant que granulocytes, les basophiles se doivent de jouer un rôle dans la réponse immunitaire, et

Fourel Matthieu - Décembre 2014 49 plusieurs études92,106,107 mettent en évidence la présence de ces récepteurs à la surface des basophiles : TLR2 - ainsi que ses corécepteurs TLR1 et TLR6 -, TLR4, TLR9 et TLR10. Cependant, seul le TLR2, via la liaison à ses ligands spécifiques - peptidoglycane et lipopeptide Pam3Cys, permettrait d'une part d'augmenter la sécrétion de IL-4 dans la réponse IgE-médiée et d'autres part d'accroître la sécrétion de IL-13 dans la réponse indépendante aux IgE107.Cependant, contrairement aux mastocytes, ces ligands n'ont pas la capacité d'induire directement la libération des médiateurs.

Leukocyte immunoglobulin-like receptors (LIR)

Les recherches sur cette famille de récepteurs n'ont pas encore abouti à la découverte de leurs ligands. En revanche, leurs rôles ont pu être établis grâce à leurs stimulations par des anticorps spécifiques108. Ces récepteurs présentent une dualité intéressante : LIR7 posséderait une activité stimulatrice, couplée au récepteur FcγRII tandis que LIR3, via des motifs ITIMs intracytoplasmique serait un inhibiteur de la libération d'histamine et de la génération d'IL-4. Cependant, le faible nombre d'études sur le sujet ne permet pas encore de préciser le mécanisme d'action précis et les ligands mis en cause dans leur activité.

Après avoir décrit l'ensemble des voies d'activation des basophiles, il convient d'exposer l'aboutissement final : la dégranulation des basophiles et le panel de médiateurs libérés.

II.1.3.5 Les sécrétions et le relargage.

L'histamine

Parmi la gamme de médiateurs libérés lors de la dégranulation des basophiles, l'histamine - 2-(1H-imidazol-4-yl) éthanamine - est le principal acteur de la réaction inflammatoire allergique9. Il est donc indispensable de s'attarder sur cette amine capable de moduler l'activité cellulaire de nombreux tissus, du cerveau au derme, en passant par les poumons, l'estomac et les intestins. Si elle n'est stockée que dans les granules cytoplasmiques des mastocytes et les basophiles, l'histamine se trouve être synthétisée par

Fourel Matthieu - Décembre 2014 50 un grand nombre de cellules - monocytes, plaquettes, neutrophiles, cellules nerveuses et gastriques - qui possède l'histidine décarboxylase, l'enzyme nécessaire à sa synthèse9.

Le rôle de l'histamine dans l'initiation de la réponse inflammatoire est décrit depuis plus de 100 ans, et ses effets sont multiples et bien connus. Ces derniers font leur apparition quelques minutes après le contact avec l'allergène - moitié de la réponse maximale entre 5 et 10 minutes, et quasiment totale après environ 20 minutes89. Les voies aériennes sont les plus touchées, via l'induction d'une bronchostriction, associée à une augmentation de la production et de la viscosité de mucus, pouvant être couplées à une recrudescence de l'activation macrophagique pulmonaire et au remodelage des voies aériennes, ceci en plus des symptômes classiques de la phase aigue allergique. L'histamine joue également un rôle dans la réponse tardive, notamment en amplifiant la présence de molécules d'adhésion au niveau des cellules épithéliales, ainsi qu'en permettant la libération de cytokines et de chimiokines contenus dans les lymphocytes - B et T - afin d'entretenir l'activation des mastocytes.

L'amplitude des effets induits par l'histamine ne pourrait être si importante sans une diversité au niveau des récepteurs. À ce jour, quatre récepteurs ont été découverts109 :

H1, H2, H3 et H4. Les deux premiers présentent une affinité intermédiaire (Ki de 2 à 10 µmol/l) tandis que l'affinité de l'histamine pour H3 et H4 est de l'ordre du nanomolaire. Les zones d'actions majoritaires et les voies de signalisation assignées à chacun des récepteurs procurent à l'histamine une grande diversité d'action et de mécanismes, qui sont majoritairement liés à la modulation du flux calcique intracellulaire et du second messager AMPc (Adénosine monophosphate cyclique), qui agissent sur les protéines kinases A et C (fig. 7)

Fourel Matthieu - Décembre 2014 51

Figure 7 : Les récepteurs de l'histamine et leurs actions110

Le récepteur H1 agit sur l'inositol 1,4,5-triphosphate et le flux calcique intracellulaire via la voie de signalisation de l'inositol. Cela aboutit à une vasodilatation, des érythèmes et une augmentation de la perméabilité vasculaire.

Le récepteur H2 possède trois zones privilégiées : l'environnement gastrique, les muscles lisses et les cellules. Les actions principales concernent la régulation de la mobilité gastro-intestinale, la relaxation musculaire, ainsi qu’effet immunosuppresseur.

Le récepteur H3 se concentre quant à lui au niveau cérébral, notamment en inhibant la libération de l'histamine auprès des neurones histaminergiques et en régulant la libération de certains neurotransmetteurs dont la dopamine, la noradrénaline et la sérotonine. Enfin, le récepteur H4, exprimé au niveau de la moelle osseuse, contribue à la chimiotaxie des éosinophiles ainsi que des mastocytes vers le site inflammatoire.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 52 Les Cytokines

L'importance des cytokines dans la réaction inflammatoire allergique. Cependant, étant donné le nombre important de ces molécules, les détails de leurs implications dans l'allergie ne sont pas encore tous déterminés.

IL-4 L'interleukine-4 (IL-4) est une cytokine autocrine sécrétée notamment par les basophiles et les lymphocytes Th2 CD4+, qui agit au niveau de l'induction de la réponse immunitaire. Elle présente ainsi une réponse maximale relativement rapide : environ 4h après (50% à 2h) l'activation des basophiles. Cette rapidité s'explique en partie par l'expression constitutive de l'ARNm codant pour l'IL-4 dans le noyau des basophiles89, ainsi que par une éventuelle préformation antérieure à l'activation - sujet à controverse .

De nombreux récepteurs permettent la production d'IL-4, et donc d'IgE. Ainsi, certaines cytokines comme l'IL-3, le GM-CSF ou l'IL-33 sont capables de promouvoir la synthèse d'IL-4, comme les "super antigènes", qui se lient au récepteur FcεRI111. En outre, la stimulation des Toll-Like Receptors - TLR2 et TLR4 -106 ainsi que les LIR, exposés précédemment, aboutit a la production d'IL-4 . Enfin, cette dernière peut être stimulée des protéases dérivées des parasites ou des allergènes. Cette production est en revanche inhibée par la Cyclosporine A (CsA), et FK506, qui sont des inhibiteurs de la voie de signalisation par la calcineurine92.

L'interleukine-4 est indispensable à la croissance et au développement des cellules Th2. Ce rôle de facteur de croissance se retrouve au niveau de la lignée B, en plus de promouvoir leur différenciation. La production d'IL-4 existe de concert avec la sécrétion des IgE, via la transmission d'un signal activateur au noyau : Le STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription). Ce dernier participe fortement à la commutation isotypique vers les IgE112. L'IL-4 régule de manière positive le facteur de transcription GATA-3, impliqué dans la différenciation Th2, la croissance sélective des cellules Th2, la production de cytokines Th2 et l'inhibition des facteurs spécifiques Th1113.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 53 IL-13 L'interleukine-13 (IL-13) est une cytokine autocrine sécrétée par les basophiles, les lymphocytes Th2 CD4+, les cellules NK et les mastocytes. Elle agit au niveau de l'induction de la réponse immunitaire et parasitaire114. Cette cytokine a longtemps été en retrait de l'IL-4 car les études sur cette dernière sont plus nombreuses et ses mécanismes d'action sont connus depuis longtemps. L'IL-13 et l'IL-4 possèdent une analogie structurale, et leurs récepteurs partagent une sous-unité : IL-4Rα115. Les cellules T possèdent également un récepteur à l'IL-13116 qui permet, comme dans le cas de l'IL-4, la transmission d'un signal activateur au noyau via le STAT6117.

Malgré ces similitudes, qu'elles soient structurales ou mécanistiques, l'IL-13 se différencie partiellement lors de son rôle dans la réponse IgE médiée ainsi que le développement des cellules B. En effet, des études ont montré que l'IL-13 utilisait une voie indépendante de l'IL-4 sur le modèle murin118. Ces résultats méritent toutefois un approfondissement. C'est également le cas du rôle probable de l'IL-13 dans le développement des lymphocytes Th2119.

Un autre rôle important de cette cytokine se situe au niveau de l'asthme. En effet, les macrophages alvéolaires sécrètent l'IL-13120 en plus de présenter le récepteur IL-4Rα à leur surface. Il en résulte un rôle de l'IL-13 dans l'hyperréactivité des voies aériennes ainsi que dans la surproduction de mucus121.

Des études récentes précisent donc les différents mécanismes d'action de cette cytokine, qui se révèlent être plus important et variés que ce qui était admis dans la communauté scientifique encore récemment. Le rôle de l'IL-13 sort de l'ombre de son homologue IL-4 mais nécessite encore des précisions afin de compléter les connaissances actuelles.

En effet, des traitements anti IL-13 - et anti IL-5 - agissant notamment sur la périostine, ont vu le jour dans le traitement des hyperéosinophilies allergiques122,123, se manifestant principalement par de l'asthme, des rhinoconjonctivites ou encore des dermatites atopiques. Les patients hyperéosinophiles ont tendance à avoir un taux élevé d'IL-13, d'IL-5 et de périostine épithéliale, responsables de l'inflammation Th2124.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 54

Après avoir détaillé les caractéristiques du basophile - son rôle dans l'allergie, au niveau de sa migration, de son adhésion puis de son activation - et des différents acteurs entrant en scène afin de lui permettre de jouer son rôle, il convient de décrire le test d'activation des basophiles in vitro.

II.2 Le Test d'activation des basophiles

II.2.1 Principe du TAB.

Le test d'activation des basophiles est un test fonctionnel ayant pour but de reproduire in vitro la réaction d'hypersensibilité allergique se déroulant in vivo. Ce test se déroule en deux étapes : la première consiste à identifier les basophiles parmi l'ensemble des cellules du sang total, et la seconde étape permet d'identifier les basophiles activés. La compréhension de cette dernière étape nécessite d'effectuer un bref rappel sur l'activation des basophiles afin de cerner les caractéristiques qui seront utilisées pour les identifier.

Les basophiles expriment de manière constitutive le récepteur de forte affinité pour les IgE (FcεRI). Lors de la phase de sensibilisation à un allergène, des IgE spécifiques de ce dernier sont synthétisées et se fixent sur les récepteurs FcεRI des basophiles.

Le principe du TAB consiste alors à mettre en contact le sang du patient avec l'allergène suspecté afin de provoquer, si l'individu est sensibilisé, un pontage des récepteurs FcεRI par l'intermédiaire des IgE fixées, et ainsi engendrer in vitro une dégranulation des basophiles. En plus de la libération des médiateurs inflammatoires, l'activation engendre d'importantes modifications phénotypiques membranaires du basophiles. C'est grâce à ces changements phénotypiques, notamment la surexpression du marqueur CD203c ou l'expression de CD63, que les basophiles activés seront identifiés grâce à la cytométrie en flux.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 55 II.2.2 La Cytométrie en flux.

La cytométrie en flux (CMF) est une technique analytique permettant d'analyser de manière automatisée des cellules individuellement. Les cellules de l'échantillon sont entraînées par un flux de liquide, appelé liquide vecteur (ou liquide de gaine), afin de formé un "faisceau" central dans lequel cellule sont alignées : c'est le principe de la focalisation hydrodynamique125. Les cellules peuvent ainsi passées individuellement devant une source lumineuse (un laser, par exemple) qui les excite. Elles émettent alors différents signaux (diffusion, réflexion, fluorescence) relatifs à leur taille, leur granulosité et aux différents marqueurs qu'elles contiennent.

La mesure et l'analyse de ces signaux permettent de caractériser chaque cellule et de mettre en évidence les différentes populations cellulaires. Le fonctionnement général d'un cytomètre est résumé dans la figure 8 :

Figure 8 : Fonctionnement général d'un cytomètre126

Les principaux avantages de la CMF proviennent de cette capacité d'analyse rapide et multiparamétrique permettant la détection d'évènements rares (tableau 5).

Fourel Matthieu - Décembre 2014 56 Tableau 5 : Avantages et inconvénients de la CMF

Avantages Inconvénients Analyse multiparamétrique de cellules Difficulté de la quantification des isolées molécules d'intérêt Analyse rapide d'un grand nombre de Nécessité d'avoir les cellules en suspension cellules => forte fiabilité statistique Détection possible d'évènements rares

II.2.2.1 Un test, deux contrôles.

Comme la majorité des tests biologiques, des contrôles négatifs et positifs sont nécessaires afin de valider les résultats obtenus. Ceux-ci sont réalisés pour chaque patient, en même temps que les conditions avec les différents allergènes à tester.

Pour le contrôle négatif, la solution d'allergène est remplacée par le même volume de tampon seul. Ce tampon est propre à chaque test et peut influencer l'activation cellulaire. L'IL-3 par exemple permet d'augmenter l'expression surfacique de CD63 chez les basophiles, ce qui augmente la sensibilité des TAB faisant appel à ce protocole127. L’IL-3 est, par contre, décrite comme augmentant l’expression basale de CD203c127.

Ce contrôle négatif permet de définir le seuil de positivité en évaluant l'activation spontanée des basophiles. Il arrive que des individus présentent un niveau d’activation basale spontanément très élevé. Cela peut survenir suite à une exposition récente à l'allergène, comme le pollen pendant la saison à risque, ou alors suite à une erreur de protocole : contamination de l'eau, des réactifs ou du matériel par des toxines128.

Concernant le contrôle positif, plusieurs options sont possibles : un anticorps anti- IgE, un anticorps anti-FcεRI ou bien le fMLP. Les deux premiers stimulent l'activation des basophiles via la voie IgE dépendantes, qui est la voie des hypersensbilités allergiques. Malgré un suivi protocolaire exact, il arrive que les contrôles positifs se révèlent négatifs. Cela vient du fait qu'il existe 5 à 10% de non répondeurs dans la population (déficit en LYN)129. Cela rend le test ininterprétable car un TAB négatif perdrait tout son sens. Le troisième contrôle positif (fMLP) provoque quant à lui une activation via la voie des MAPK et de la phospholipase C, ce qui ne reproduit pas

Fourel Matthieu - Décembre 2014 57 l'activation IgE médiée intervenant dans l'hypersensibilité. Il ne doit donc pas être utilisé seul. Cependant, il permet de vérifier la viabilité cellulaire.

Le schéma réactionnel est simplifié dans la figure 9 : L'échantillon contient le sang du patient, l'allergène et les anticorps marqués. Les contrôles remplacent l'allergène.

Figure 9 : Schéma du mode opératoire général du test d’activation des basophiles130

II.2.2.2 Stratégies d'identification.

L'absence de marqueurs spécifiques de la seule population des basophiles rend leur identification délicate. Plusieurs approches ont alors été expérimentées, en commençant par l'utilisation d'anticorps anti-IgE monoclonaux puis polyclonaux, plus efficaces. Toutefois, les IgE se retrouvent également à la surface des monocytes et des éosinophiles, ce qui nécessite l'emploi d'un marqueur supplémentaire.

Outre sa non-spécificité, le marqueur anti-IgE possède un deuxième inconvénient au niveau de sa variabilité. La densité des récepteurs FcεRI ainsi que le taux de fixation des IgE sur ceux-ci varient beaucoup, que ce soit de manière interindividuelle ou intra individuelle, c'est-à-dire sur les basophiles d'un même individu.

La combinaison avec le marqueur de classe II HLA-DR est alors possible. Ce dernier ayant pour cible les cellules présentant à leur surface l'antigène des leucocytes humains : le marqueur HLA. Ce dernier est présent sur les monocytes (HLA-DR+) tandis que les basophiles sont HLA-DR-131.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 58 Une autre stratégie concernant les anticorps anti-CD203c a également été mise au point. Elle permet de supprimer les contaminations cellulaires car le marqueur CD203c n'est présent, au niveau sanguin, que chez les basophiles. Le marqueur 203c peut s'utiliser seul car en plus d'être présent seulement sur la surface des basophiles, il est surexprimé lors de leur activation. Cela permet l'utilisation d'un seul marqueur. Cependant, la faiblesse de son expression basale rend son identification délicate. C'est pourquoi il est recommandé de l'utiliser avec des combinaisons132.

Une autre combinaison d’identification est possible, en alliant les marqueurs CRTH2 et CD3128. Comme nous l’avons décrit précédemment, CRTH2 est le deuxième récepteur de la prostaglandine D2 (PGD2), présente aux sites d'inflammation, et CRTH2 participe ainsi à l'extravasation des leucocytes, dont les lymphocytes Th2, les éosinophiles et les basophiles. Ces trois populations sont CRTH2+, d'où la nécessite du second marqueur CD3, permettant de distinguer les lymphocytes Th2 (CD3+), des basophiles (CD3-). Quant aux éosinophiles, ils présentent un side scatter (SSC) plus important que les basophiles, permettant ainsi leur exclusion. Le side scatter représente la granularité de la cellule. Plus celle-ci est granuleuse, plus son side scatter est élevé.

Enfin, l'identification des basophiles peut se baser sur la présence du récepteur de l'éotaxine : CCR3, exprimé sur basophiles ainsi que sur les lymphocytes Th2 et les éosinophiles. Tout comme dans le cas du CRTH2, la combinaison avec le marqueur CD3 est requise pour différencier les lymphocytes, ainsi que le side scatter pour les éosinophiles.

C'est la combinaison side scatter SSCfaible / CCR3positifqui a été retenue lors des manipulations effectuées dans le travail expérimental de cette thèse (fig. 10).

Fourel Matthieu - Décembre 2014 59

Figure 10 : Détermination des basophiles CCR3 / SSC (Tiré de la procédure Flow Castde de Bühlmann133)

Une fois identifiés par l'une ou l'autre de ces stratégies d'identification, il reste à déterminer si les basophiles sont activés ou non. Il convient donc d'observer les marqueurs d'activations qui permettent de mettre en évidence la présence ou l'absence de l'activation des basophiles.

II.2.3 Marqueurs d'activation.

II.2.3.1 CD63.

Le marqueur CD63 (gp53 ou LAMP-3) est une protéine appartenant à la famille LAMP (Lysosyme-associated membrane proteins). Il est situé au niveau des granules intracytoplasmiques du basophile lorsque celui-ci est à l'état basal, ainsi qu'au niveau des mastocytes, des plaquettes et des macrophages. Cette localisation intracellulaire explique qu'il soit absent lors de l'observation des basophiles quiescents par cytométrie en flux.

Il apparaît lors de leur dégranulation : les granules fusionnent alors avec la membrane des basophiles afin de libérer leur contenu, ce qui permet la présence transitoire de CD63 à la surface des basophiles activés uniquement. C'est ce que l'on appelle une expression bimodale. L'expression transitoire de CD63 peut être augmentée par une pré-incubation avec la cytokine IL-3134. Cette dernière est présente dans les

Fourel Matthieu - Décembre 2014 60 tampons d'incubations de kit de TAB tels que le Flow Cast du laboratoire Bühlmann, que nous avons utilisé dans cette étude.

Le CD63 est un marqueur de choix dont l'utilité est connue depuis le début des années 1990135 et qui est aujourd'hui utilisé en routine pour la réalisation des TAB, tout comme le marqueur CD203c.

II.2.3.2 CD203c.

Ce marqueur, découvert dans les années 2000 136,137, a vite présenté un vif intérêt dans la réalisation des TAB138. C'est une molécule transmembranaire de type II de la famille des ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase, aussi appelée E-NPP3. Contrairement à l'expression bimodale de CD63, celle du CD203c est unimodale : il est déjà présent à la surface des basophiles à l'état quiescent. Cependant, l'activation des basophiles génère une surexpression de ce marqueur suffisamment importante pour la distinguer à l'aide de la cytométrie en flux. L'avantage de ce marqueur est qu'il permet d'allier identification des basophiles et activation au sein de ceux-ci. Des études publiées en 2010 mettent en évidence le potentiel du marqueur CD203c dans le suivi de l'allergie alimentaire, que ce soit au lait de vache, aux œufs de poule139 ou à l’arachide140.

Tableau 6 : Différences entre les marqueurs CD63 et CD203c141

CD63 CD203c Synonyme Gp53, LAMP-3 E-NPP3 Famille Tetraspanines, LAMP NPP Expression chez les OUI (Expression NON basophiles quiescents constitutive) Type d'expression Bimodale Unimodale Présence sur d'autres Plaquettes, macrophages, Spécifique du basophile populations circulantes mastocytes Expression induite par IL-3 NON OUI Expression induite par NON OUI PGD2 Influence de traitements Significative Non significative antiallergiques Temps d'incubation 20 minutes préconisé Marqueurs ayant la même CD107a, CD107b CD13, CD164 expression Libération simultanée de OUI NON médiateurs.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 61 À ce jour, ces deux marqueurs sont utilisés en routine, seuls ou couplés, et la communauté scientifique n'est pas arrivée à un consensus concernant la supériorité de l'un sur l'autre. Cela peut s'expliquer par les différences intrinsèques des fluorochromes, qui diffèrent selon les études142. L'importante variabilité individuelle et les aspects techniques propres à chaque protocole peuvent éventuellement expliquer ces divergences. Si certains auteurs accordent une plus grande spécificité au CD203c74,75, ce n'est pas le cas d'autres équipes qui affirment le contraire144.

Un avantage supplémentaire de ces marqueurs est que contrairement au Prick Test, les TAB utilisant le CD203c et le CD63 peuvent être effectué même dans le cas d'un traitement antiallergique (corticostéroïdes ou antihistaminiques)145.

II.2.3.3 Autres marqueurs

Il existe d'autres marqueurs, que ce soit au niveau membranaires avec le CD164, le CD107a, le CD107b, le CD13146,147 ou le CD69148 ou au niveau des molécules intracellulaires avec des cytokines149 ou des protéines de signalisations150 (Pp38 MAPK) qui peuvent être marqués par des fluorochromes. Certains de ces marqueurs présentent un mode d'expression bimodal identique au CD63, c'est le cas de CD107a et CD107b, tandis que d'autres, le CD13 et le CD64, ont un comportement plus proche du CD203c. Cependant le manque d'études approfondies, notamment sur leur spécificité et leur sensibilité, ne permet pas encore de se prononcer sur leurs éventuels apports en allergologie.

II.2.4 Interprétation : Du cas par cas.

CDMax Le TAB est un test dont les résultats s'expriment généralement en pourcentage de basophiles activés, dénommé « CDmax ». Ce pourcentage dépend du contrôle négatif, ajusté pour chaque patient, de telle façon qu'il y ait moins de 5% de basophiles activés. Les seuils de positivité varient également selon les études, les allergènes. Les recommandations vont de 5% pour certains médicaments à 15% pour les allergies alimentaires131,151.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 62 Le seuil de positivité est plus faible pour les médicaments car ces molécules sont des haptènes, qui engendrent une plus faible activation des basophiles. En revanche, les allergènes protéiques des aliments provoquent une activation plus importante.

Il reste encore des progrès à faire au niveau de l'adaptabilité des seuils de positivité, non seulement en fonction des allergènes, mais également en fonction de l'âge des patients. La population pédiatrique présente une immaturité immunologique, avec une population sanguine de basophile réduite, en plus de présenter moins d'IgE de surface et de récepteurs FcεRI152.

Concernant les aliments, certaines études commencent à préciser les seuils en fonction des aliments, c'est le cas d'une étude allemande153 a fixé des seuils de positivité spécifiques à la carotte : 6,3%, au céleri : 6,7%, et la noisette : 8,9%, ceci après avoir analysé les courbes ROC des TAB effectués chez 40 patients par allergène (dont 20 contrôles). Dans ses travaux, A.Rubio détermine un seuil de 6% pour l'APLV en milieu pédiatrique sur une cohorte de 53 patients, et envisage un seuil de positivité entre 5 et 12% pour les hypersensibilités à l'arachide et à l'œuf.

Toutefois, dans la majorité des études154–156, les seuils de positivité pour les aliments restent à 10 ou 15% et aucune étude à ce jour n'a été réalisée pour spécifier les seuils de la population pédiatrique. Il est indispensable de fixer le plus précisément ces seuils afin d'augmenter la sensibilité et la spécificité des TAB.

CD-sens La méthode d’expression des résultats dénommée « CD-sens » a également été évaluée dans la partie expérimentale. Le CD-sens est lié au LC-50, correspondant à la dose d'allergène minimale engendrant la dégranulation de 50% des basophiles. Plus cette dose est faible, plus la sensibilité à l'allergène est sévère car cela signifie qu'une très faible dose provoque une activation massive des basophiles, et par conséquent une réaction d'hypersensibilité allergique.

Le CD-sens est calculé en multipliant par 100 l'inverse de la valeur du LC-50157. Il y a ainsi une corrélation directe entre le CD-sens et la sévérité : un CD-sens élevé correspond à une sévérité importante. Différentes études appuient la bonne corrélation

Fourel Matthieu - Décembre 2014 63 entre les résultats des Skin Prick Test, des IgE spécifiques, du CD-sens et la sévérité des réactions anaphylactiques158–160 ce qui en fait un outil important dans l'analyse des résultats du test d'activation des basophiles.

Aire sous la courbe (AUC) Enfin, la méthode de l'aire sous la courbe (AUC) a été utilisée. Elle permet, en mesurant selon une unité arbitraire, la surface présente entre la courbe et l'axe des abscisses. Cette valeur permet de quantifier de l'évolution de l'activation des basophiles tout au long des dilutions, regroupe la spécificité du CDmax et la sensibilité CD-sens.

L'analyse de ces résultats a pour objectif d'établir un lien entre la clinique des patients, leurs TPO, le dosage de leurs IgE spécifiques et les résultats des tests d'activations des basophiles, quantifiés par le CDmax ,le CD-sens et l'aire sous la courbe.

Il convient maintenant de décrire la méthodologie utilisée pour la réalisation des TAB, puis d'analyser les résultats expérimentaux.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 64 III. Partie Expérimentale

III.1 Objectifs

L'objectif principal des manipulations de notre étude préliminaire est de comparer les résultats des tests d'activation des basophiles (selon les trois modes d’expression que nous venons de décrire) avec les résultats des tests de provocation orale effectués le même jour que le TAB, dans le but de mettre en évidence une corrélation entre ces données.

Dans un second temps, les résultats des tests d'activation des basophiles seront comparés aux dosages des IgE spécifiques, afin d'analyser la corrélation entre les différentes analyses biologiques et de voir si celles-ci corroborent les résultats des TPO.

L'objectif à long terme est d’évaluer si les TAB pourrait limiter le recours aux TPO chez des enfants à risque ; risques qui seraient déterminés entre autres par les TAB, en complément des autres tests de routines (SPT, IgE spé, ...).

III.2 Patients et Méthode

III.2.1 Méthode

Toutes les expériences ont été réalisées au Laboratoire d'Immunologie et d'Allergologie du Centre Hospitalier Lyon Sud du Pr. Jacques Bienvenu, sous la direction du Dr. Paul Rouzaire.

III.2.1.1 Matériel

Le sang des patients a été collecté dans des tubes pour ponctions veineuses traitées K- EDTA. Une centrifugeuse pour centrifugation à 500 g a été utilisée. Les prélèvements dans les tubes ont été réalisés grâce à un panel de pipettes de précision avec pointes apyrogènes à usage unique (1-100 µL, 20-200µL, 100-1000 µL, 1-5 mL) Le bain marie était à une température validée de 37°C. L'eau stérile, ultra pure et apyrogène était qualifiée.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 65 Le cytomètre sur lequel les basophiles ont été analysés est un cytomètre Navios (Beckman Coulter), et les échantillons se trouvaient dans des tubes en polypropylène apyrogène compatibles. Les dosages des IgE ont été réalisés sur un ImmunoCap 250 (Phadia Thermofisher).

III.2.1.2 Réactifs

Les réactifs utilisés pour les TAB proviennent du kit Flow Cast du laboratoire Bühlmann, contenant les composants suivants :

Tableau 7 : Réactifs Bühlmann utilisés pour les TAB

Réactifs Composition Forme Code Reconstitution Galénique Tampon de Calcium, héparine, flacon STB Reconstituer avec 50 stimulation IL-3 lyophilisé. mL d'eau Contrôle de Ac anti-FcεRI flacon STCON Reconstituer avec 1,5 stimulation lyophilisé. mL de STB Contrôle de fMLP flacon FMLP Reconstituer avec 1,5 stimulation fMLP lyophilisé. mL de STB Réactif de coloration Mélange anticorps : flacon 2.2 mL SR Prêt à l'emploi anti-CD63-FITC et anti-CCR3-PE Mélange anticorps : flacon 2.2 mL SR203 Prêt à l'emploi anti-CD203c- PE-Dy647 Réactif de lyse - flacon 25 mL LYR Diluer avec 225 mL d'eau déionisée Tampon de lavage - flacon 100 WB Prêt à l'emploi mL

Allergènes Arachide Extrait total flacon F13 Reconstituer avec lyophilisé. 250µL de STB PLV Extrait toal flacon F2 Reconstituer avec lyophilisé. 250µL de STB

III.2.1.3 Protocole

Cette procédure s'applique aux échantillons de sang total, collectés dans les tubes EDTA et acheminés de l'Hopital Femme-Mère-Enfant au laboratoire du CHU Lyon Sud dans les six heures précédant la réalisation du TAB.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 66 III.2.1.3.1 Préparation des tubes

Pour chaque patient, 13 tubes sont préparés et marqués au préalable, selon le schéma suivant :

Tableau 8 : Préparation des tubes pour le TAB

# Tube Description Composition (en µL) CSB STCON fMLP Antigène 1 Témoin Négatif 50 - - - 2 Témoin Positif anti-FcεRI - 50 - - 3 Témoin Positif fMLP - - 50 - 4 Allergène Pur - - - 50 5-13 Dilution au 5ème - - - 501 1 50µL de la solution diluée.

Afin de déterminer la quantité minimale d'allergène nécessaire pour laquelle les basophiles étaient activés, une succession de dilutions au 5ème a été réalisé dans le tampon de stimulation (CSB).

Le but de cette manipulation est d'analyser une éventuelle corrélation entre la sévérité des réactions d'hypersensibilité et la dose minimale nécessaire à l'activation cellulaire.

III.2.1.3.2 Mode opératoire.

Les tubes étant préparés, voici le mode opératoire qui a été suivi pour chacun des tubes :

Fourel Matthieu - Décembre 2014 67 !"#$%&'(#)*#!++#,-#)*#./0#

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Figure 11 : Protocole de préparation des échantillons aux TAB.

Ce mode opératoire permet de stimuler les basophiles contenus dans l'échantillon sanguin, puis de les marquer via les mélanges d'anticorps SR et SR203. Cela permet - après incubation au bain marie, lyse des globules rouges, et centrifugation - de récupérer les leucocytes, incluant les basophiles marqués, à l'état basal ou activé.

L'analyse des basophiles par cytométrie est ensuite réalisée dans les deux heures suivant la préparation des tubes.

III.2.1.3.3 Acquisition et analyses des données.

Le cytomètre Navios utilisé comporte notamment une diode laser à l'argon opérant à 488nm (correspondant à une lumière d'excitation bleu-verte). Il lui est également nécessaire de pouvoir détecter la diffraction aux petits angles, appelée FSC, ainsi que la réfraction à 90°C (SSC) et les deux fluorochromes utilisés ici, à savoir FITC, PE et PE-Dy647.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 68 Dans l'idéal, l'acquisition des données ne doit être stoppée qu'après le passage de 500 à 600 basophiles, afin de fournir un échantillon représentatif. Du point de vue de la population leucocytaire global, cela représente de 50 000 à 100 000 cellules par échantillon.

III.2.2 Patients

L'intégralité des patients provient du pôle Femme-Mère-Enfant de Lyon, avec la collaboration des Docteurs Sylvie-Anne André-Gomez, Florence Villard-Truc.

III.2.2.1 Patients allergiques à l’arachide

Les résultats présentés dans notre étude préliminaire portent ainsi sur 4 patients, âgés de 11 à 14 ans au moment des tests (TPO et TAB). Cette population homogène est composée uniquement d'individus étant affectés par une allergie sévère à l’arachide et ayant déjà subi un échec à un TPO classique. Tous les patients étaient au moment de l'étude, sous un régime d'éviction totale de l'arachide ainsi que des aliments pouvant contenir des traces d'arachides. Les tests de provocation orale réalisés chez ces patients dans cette étude ont donc été exclusivement des TPO « Traces » à l’arachide.

La population de patients allergiques à l’arachide de notre étude était à l'origine composée de 7 patients. Cependant, trois patients ont dû être exclus pour cause de contrôles défaillants. En effet, un patient présentait une activation spontanée des basophiles avec un témoin négatif engendrant 74% d'activation en CD203c (pour un seuil acceptable d'expression de 5%161), et deux patients sont hyporéactifs avec un pourcentage de basophiles activés dans leurs contrôle positifs en dessous de 15%161 (12 % pour CD203c, et de 3 à 9 % pour le CD63).

Le protocole est semblable à celui des TPO classiques, avant l'administration de doses progressives dans un environnement permettant la prise en charge rapide en cas d'incident, mais avec des doses plus faibles, correspondant à celles que l'on peut retrouver dans les aliments comportant des traces d'arachides.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 69 Trois des quatre patients ont réussi leurs tests de réintroduction. Il y a donc un seul échec à déplorer, et il concerne le patient 1. Les résultats des tests d'activations des basophiles réalisés le même jour et leurs analyses seront présentés dans la partie "Résultats".

III.2.2.2 Patients allergiques aux protéines de lait de vache.

Concernant les APLV, la population initiale de patients était composée de 10 patients. Mais là encore, deux patients ont été exclus pour cause de contrôles défaillants : un des patient est sujet à une activation spontanée des basophiles avec un témoin négatif engendrant 46% d'activation des basophiles en CD203c (pour un seuil acceptable d'expression de 5%161), et un autre patient hyporéactif avec un pourcentage de basophiles activables en dessous de 15% dans le contrôle positif (2 % pour le CD203c, et moins de 1% pour le CD63).

Huit patients ayant une APLV ont donc finalement été inclus dans ce travail. Ils étaient âgés de 7 mois à 7 ans aux moments des tests. Le bas âge de certains patients s'explique par le fait que l'APLV se déclenche généralement très tôt, lors des premiers biberons à base de lait de vache.

Contrairement à l'arachide, les TPO effectués chez les patients présentant une APLV sont des TPO classiques. Aucun TPO « Traces » n'a ainsi été réalisé. Sur les huit patients, seulement deux ont échoué à leurs TPO (Patients 1 et 2), déclenchant des symptômes allergiques après de l'administration de 2 mL de lait. La dose finale ingérée sans réaction par les six autres patients allait de 80 à 180ml selon les protocoles effectués162.

Les résultats des tests d'activations des basophiles réalisés le même jour et leurs analyses seront présentés dans la partie "Résultats".

Fourel Matthieu - Décembre 2014 70 III.3 Résultats

III.3.1 Résultats concernant l'allergie à l'arachide.

III.3.1.1 TAB à l'arachide : Courbes, CDmax, CDsens et AUC.

Des tests d'activations des basophiles ont été effectués chez les quatre patients ayant subit un TPO Traces à l’arachide. Pour chaque patient, deux paramètres d'activations des basophiles ont été étudiés : CD203c et CD63. Voici les résultats obtenus (en pourcentage de cellules activées) pour ces deux marqueurs, en fonction des concentrations d’arachide utilisées :

Patient 1 (échec) 100 Patient 2 90 Patient 3 Patient 4 80

70

60

50

40

30

20 % basophile activé via CD203c 10

0

Concentration en arachide Figure 12 : Résultats des TAB à l'arachide - CD203c

Fourel Matthieu - Décembre 2014 71 80 Patient 1 (échec) Patient 2 70 Patient 3

60 Patient 4

50

40

30

20 % basophile activé via CD63

10

0

Concentration en arachide Figure 13 : Résultats des TAB à l'arachide - CD63

Les TAB des quatre patients sont positifs, ce qui signifie que les basophiles ont été activés, à plus ou moins grande échelle, chez la totalité des individus étudiés (fig. 12 et 13).

Le patient 1, en rouge, est celui pour lequel le test de provocation orale a échoué. Les pourcentages de ses basophiles activés sont les plus importants jusqu'à une concentration d'allergène de 0,036ng/mL, puis, pour des concentrations plus faibles, c'est l'activation des basophiles du patient 2 qui est la plus forte. Ce dernier présente un pic d'activation à la concentration de 1,44 pg/mL pour le CD203C, et de 0,036ng/mL pour le CD63.

Le patient 3 possède le même profil de sensibilisation classique que le patient 1, avec un pourcentage d'activation moyen de 40 à 50 % plus faible pour le CD203c, et de 10 à 20 % plus faible pour le CD63.

Concernant le patient 4, ses basophiles ne sont plus activés pour une stimulation inférieure à 0,9 ng/mL, ce qui est en cohérence avec sa réussite au TPO. Il présente

Fourel Matthieu - Décembre 2014 72 également le profil typique des personnes peu sensibilisées. Les données pour les marqueurs CD203c et CD63 sont corrélées pour ces deux patients, avec toutefois des pourcentages d'activations plus importants pour la surexpression du CD203c.

L’analyse du CDsens pour les différents patients est présentée dans le tableau 8. Selon ce mode d’expression, le patient le plus sensibilisé est le patient 2, avec une concentration d'IgE engendrant 50% d'activation des basophiles oscillant entre 10-8 et 10-6 ng/mL suivi du patient 1 (10-5 à 10-3 ng/mL), puis des patients 3 et 4.

Tableau 9 : CDsens des patients allergiques à l'arachide.

CD203c CD63 Patients Conc. 50% Max Conc. 50% Max CDsens CDsens (ng/mL) (ng/mL) 1 7.106 1,4.10-5 1.105 1,1.10-3 2 1.109 9,9.10-08 2.107 4,0.10-06 3 1.104 1,0.10-2 2.103 4,6.10-2 4 27 3,7 20 5,1

L'étude du CD Max renseigne sur le pourcentage maximale d'activation des basophiles mais n'est pas, dans la littérature, directement corrélé à la sensibilité du patient159. Présentées dans le tableau 10, les valeurs de CD Max suivent l'ordre de numérotation des patients pour le marqueur CD63, allant de 68,18 % pour le patient 1 à 20,93% pour le patient 4. En revanche, l'importante valeur obtenue par le patient 4 pour la concentration la plus forte (22,5 ng/mL) lui confère un CD Max plus important que le patient 3. En étudiant ce paramètre, le patient ayant échoué à son TPO présente bien le plus fort pourcentage d'activation maximale.

Tableau 10 : CD Max des patients allergiques à l'arachide

CD Max (%) Patients CD203c CD63 1 82,63 68,18 2 79,06 51,44 3 41,98 44,68 4 49,77 20,93

Fourel Matthieu - Décembre 2014 73 Le dernier paramètre étudié est l'aire sous la courbe, AUC, permettant de juger de l'évolution de l'activation des basophiles tout au long des dilutions. Il a été calculé selon la méthode des trapèzes, qui fourni une estimation de l'aire sous la courbe entre deux valeurs. La somme de ces aires segmentées permet ensuite d'avoir une valeur approchée de l'AUC globale. Les résultats sont présentés dans une unité arbitraire, permettant de comparer les différentes valeurs entre elles (tableau 11).

Tableau 11 : AUC des patients allergiques à l'arachide

AUC Patients CD203c CD63 1 619 394 2 540 305 3 188 214 4 69 27

Comme pour le CD Max, le patient 1, ayant échoué à son TPO, possède l'AUC la plus importante, pour le CD203c comme pour le CD63. Au sein d'un marqueur, les écarts relatifs des AUC entre les différents patients sont conservés, avec des valeurs plus importantes pour le CD203c.

Sur ces quatre patients, la clinique (TPO) et les paramètres CD Max et AUC semblent varier dans le même sens. En revanche, l'étude des courbes en elles-mêmes et du CD-sens ne permettent pas de lier de manière fiable les résultats des TPO et des TAB.

Afin d'affiner ces résultats, il est pertinent de comparer les résultats des TAB avec le dosage des IgE spécifiques obtenus pour les différents patients.

Tableau 12 : Dosage des IgE spécifiques à l'arachide

Délai IgE IgE spécifiques à l'arachide (kU/L) Patients - TPO f13 Ara h1 Ara h2 Ara h3 Ara h8 Ara h9 1 2 ans >100 84,9 96,7 10,4 0,19 2 2 ans >100 97.3 43.5 >100 <0.1 0.33 3 8 mois 14,8 0,12 3,18 0,92 0,51 4 2 mois 18,1 11,8 3,17 0,32 40,8 0,14

Fourel Matthieu - Décembre 2014 74 Les valeurs résumées dans le tableau 12 mettent en évidence une corrélation entre les IgE spécifiques à l’arachide, notamment le rAra h2, facteur de sévérité, et les tests d'activation des basophiles. En effet, les patients 1 et 2 présentent les valeurs d'IgE les plus importantes, tout comme les pourcentages d'activations des basophiles. Cependant, il convient de relativiser ces résultats compte tenu des dates de réalisation du dosage des IgE, qui précède le TPO et le TAB de deux ans pour les patients 1 et 2. En effet, les valeurs des concentrations d'IgE ont pu varier de manières importantes pendant ces deux dernières années.

Les IgE des patients 3 et 4 ont été dosés de façon concomitante à la réalisation du TPO, et sont faibles (excepté Ara h8 pour le patient 4). Ils sont en corrélation avec la clinique et les TAB.

III.3.1 Résultats concernant l'APLV.

III.3.1.1 TAB pour l'APLV : Courbes, CDmax, CDsens et AUC.

Le même protocole de TAB a été utilisé pour les 8 patients allergiques aux protéines du lait de vache, via l’étude de la surexpression des marqueurs CD203c et l'expression de CD63. Voici les résultats obtenus avec, en rouge, les patients ayant échoué au test de provocation orale.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 75 70 Patient 1 (échec) Patient 2 (échec) 60 Patient 3 Patient 4 Patient 5 50 Patient 6 Patient 7 40 Patient 8

30

20 % basophiles activés via CD203c 10

0

Concentration en lait de vache Figure 14 : Résultats des TAB pour l'APLV- CD203c

50 Patient 1 45 (échec) Patient 2 40 (échec) Patient 3 35 Patient 4 30 Patient 5 25

20

15

10 % basophiles activités via CD63

5

0

Concentration en lait de vache Figure 15 : Résultats des TAB pour l'APLV- CD63

Fourel Matthieu - Décembre 2014 76 Les patients 1 et 2, ayant échoué leur TPO, présente une activation de leur basophiles en présence de PLV, en CD203c et en CD63. Cependant, le patient 3, pour le CD203c (fig. 14), présente un taux d'activation plus fort encore. Il en va de même pour le patient 5 par rapport au patient 2 (CD203c uniquement).

Concernant l'expression du CD63, seul le patient 3 se situe au dessus des patients ayant échoué au TPO (fig. 15). Le patient 5 n'exprime aucune expression du CD63 (% d'activation inférieur à 5%), tandis que le patient 2 peut être considéré comme positif, par rapport aux nombreux patients négatifs en dessous du seuil de 5%.

Malgré l'apparente absence de corrélation entre résultats des TPO et des TAB, il est tout de même possible de déduire que les patients qui ont eu un échec au TPO présentent tous une activation des basophiles.

Comme pour l'arachide, l'étude du CD sens, du CD max et des AUC va permettre d'affiner cette analyse.

Tableau 13 : CDsens des patients ayant une APLV.

CD203c CD63 PATIENT Conc. 50% Max Conc. 50% Max CDSENS CDSENS (ng/mL) (ng/mL) 1 1522 0,07 1692 0,06

2 502 0,20 411 0,24

3 1028 0,10 295 0,34 5 1124 0,09 - -

Le tableau 13 présente les résultats du CD-sens uniquement pour les patients 1, 2, 3, et 5. En effet, le CD sens n'a de sens que lorsqu'il y a une activation. Il est lié à la dose d'IgE pour laquelle 50% du maximum des basophiles est activé. Cela explique que la valeur la plus importante soit trouvée pour le patient 1, et la plus faible pour le patient 2, tout deux ayant échoué à leurs TPO. Les patients 3 et 5 (succès au TPO) présentant des valeurs intermédiaires, il n’y a pas de corrélation avec la clinique concernant le CD sens des TAB.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 77 Le CD max (tableau 14) ne fournit pas non plus d'argument pouvant aller dans le sens d'une corrélation TAB / TPO. En effet, comme illustré sur les courbes, les patients 1 et 2 ne se démarquent pas par le pourcentage maximum, étant donné que le patient 3 possède le CD max le plus important pour le CD203c, et similaire au patient 1 pour le CD63.

Tableau 14 : CDmax des patients ayant une APLV.

CD Max Patient CD203c CD63 1 45,38 45,38 2 15,66 7,93 3 64,53 45,32 4 3,9 3,02 5 30,83 2,51 6 2,41 7,14 7 6,01 3,14 8 4,65 2,89

Le calcul des AUC (tableau 15) ne permet pas non plus de mettre en évidence une corrélation entre TAB et TPO. Comme précédemment, les valeurs des AUC des patients ayant échoué au TPO sont encadrées par d'autres patients pour lesquels le TPO s'est bien déroulé. En effet, les valeurs des AUC des patients 1 et 2 sont plus faibles que celles du patients 3, et plus forte que les patients 4, 6, 7, et 8. Logiquement par rapport aux courbes, le patient 5 se situe entre les patients 1 et 2 pour le CD203c, et en dessous pour le CD63.

Tableau 15 : AUC des patients ayant une APLV.

AUC Patient CD203c CD63 1 169 145 2 49 35 3 259 153 4 26 19 5 149 13 6 15 31 7 40 21 8 24 9

Fourel Matthieu - Décembre 2014 78 Au regard de l’absence de corrélation reliant TAB et TPO pour le cas de l'APLV, il convient de s’intéresser aux relations TAB - IgE spécifiques.

Tableau 16 : Dosage des IgE spécifiques - APLV

Délai IgE - IgE spécifiques - Arachides Patients TPO f2 α-lactalbumine β-lactoglobuline Caséine 1 < 1 mois 1,86 3,64 0,16 0,54 2 < 1 mois 0,95 1,11 0,27 0,18 3 6 mois 29,9 7,77 6,51 24,4 4 5 mois 2,46 1,23 4,6 0,3 5 5 mois 0,6 0,11 <0.10 0,47 6 5 mois 0,18 <0.1 0,23 <0.1 7 < 1 mois 0,32 0,22 <0.10 0,28 8 4 mois 0,14 <0,10 <0,10 <0,10

Les IgE spécifiques des patients 1 et 2 figurent parmi les plus élevées, avec ceux des patients 3 et 4 (tableau 16). Ces résultats sont en corrélation avec les TAB, excepté pour le patient 4 chez qui il n'y a pas d'activation des basophiles.

Le patient 3 possède ainsi les valeurs les plus importantes au niveau des CD sens, CD Max, de l'AUC ainsi que des IgE spécifiques, suivi par le patient 1. Ces paramètres montrent donc la cohérence entre TAB et dosage des IgE spécifiques. Le patient 3 et 5 corroborent ces résultats si l'on se réfère à l'expression du marqueur CD63. En revanche, les valeurs du CD sens et de l'AUC obtenues pour le patient 5 avec le CD203c ne vont pas dans le même sens que les IgE.

La discussion qui suit analyse notamment les forces et les faiblesses des différentes méthodes utilisées (TAB, TPO et IgE), la pertinence des paramètres calculés, et l'impact du faible nombre de patients.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 79 IV. Discussion

Les résultats obtenus ne semblent pas montrer de corrélation entre les résultats des TAB et l'issue du TPO, pour les personnes allergiques à l’arachide comme pour celles atteintes d'APLV. Les discordances entre les courbes de pourcentage d'activation des basophiles, des différents paramètres calculés qui en sont issus, et les résultats des TPO montrent en effet qu'à l'échelle de notre étude préliminaire, ces deux résultats ne sont pas liés.

En revanche, une corrélation peut être établie entre le dosage des IgE spécifiques à l'arachide et les TAB. Corrélation à relativiser compte tenu de l'importante période séparant le dosage des IgE spécifiques et la réalisation des TAB et des TPO. De plus, cette relation ne se retrouve pas pour l'APLV alors que les délais entre dosages des IgE spécifiques et TAB sont plus courts (entre 1 et 6 mois).

Avant d'étayer l'étude des différents résultats, il convient d'analyser une des principale faiblesse de l'étude : la taille de l'effectif. En effet, le petit nombre de patients inclus dans l'étude (4 pour l'arachide et 8 pour l'APLV) est insuffisant pour affirmer ou infirmer les hypothèses de manière définitive, ni pour extrapoler les résultats obtenus. Plus un échantillon est faible, plus la marge d'erreur est importante et moins les différences significatives n'ont de pertinence.

C'est pourquoi aucun résultat n'est exprimé pourcentage de patients, et que ceux-ci sont comparés un à un, pour rendre compte de la réalité de nos résultats, et ne pas prétendre les extrapoler à la population générale des patients allergiques. De plus, des paramètres comme la cinétique de modifications de réactivité du basophile doivent être étudiés sur une cohorte significative afin de pouvoir analyser les résultats avec un risque d'erreur acceptable.

Cet échantillon permet toutefois d'avoir une première ébauche de l'orientation que peuvent prendre, à plus grande échelle, l'étude d'une corrélation entre les TAB et les TPO. Corrélation qui, aux vues des résultats, semble ne pas exister, pour l'arachide

Fourel Matthieu - Décembre 2014 80 comme pour l'APLV. Cette conclusion doit cependant être étoffée par une étude plus fournie.

Outre la taille de l'échantillon, la fiabilité des TPO peut également être discutée : l'effet psychosomatique peut en effet interférer avec le test de provocation orale. En effet, un patient ayant déjà eu des crises allergiques, des réactions anaphylactiques à un allergène peut déclarer des symptômes lors de l'administration d'un placebo. C'est la psychologie du traumatisme qui est responsable de ces réactions, entraînant notamment des symptômes subjectifs comme les douleurs abdominales163.

En revanche, l’une des forces de notre étude réside dans le mode d'expression des résultats. Malgré l'absence de consensus sur le sujet, la combinaison des trois paramètres utilisés dans notre travail (CDsens, CDmax et AUC), qui sont reconnus comme fiables164, permet d'analyser de manière précise les données obtenues par l'évolution du pourcentage de basophiles activés en fonction de la concentration en antigène. Contrairement au TPO, la méthodologie employée est factuelle et n'est pas influencée par la psyché du patient.

Sans se focaliser sur l'obtention des résultats, un avantage non négligeable de l'analyse des TAB par rapport aux TPO se trouve dans le caractère non invasif de la méthode, pour lequel une simple ponction veineuse suffit. Cela supprime les risques d'œdèmes, de rougeurs, de douleurs abdominales voir de chocs anaphylactiques pouvant survenir lors d’un test de provocation orale. Ceci est un argument de poids notamment chez les enfants en bas âge chez qui le traumatisme engendré par l'échec à un TPO peut empirer les symptômes allergiques chroniques, comme vu dans l'historique clinique de certains patients.

Il faut souligner la positivité systématique du TAB des patients ayant échoué à leurs TPO ainsi que la bonne tolérance au TPO chez tous les patients dont le TAB est négatif. En revanche, dans le cas d'un TAB positif, aucune valeur prédictive sur le bon déroulement ou non du TPO ne peut être évoquée, en se basant sur les résultats de cette étude.

Concernant la corrélation entre les résultats des TAB et le dosage des IgE spécifiques, une relation apparaît au niveau des patients allergiques à l'arachide, avec des

Fourel Matthieu - Décembre 2014 81 valeurs significativement plus élevées pour les patients dont les basophiles sont le plus activés. Exception faite pour le patient 4, mais pour lequel la sensibilisation globale à l’arachide est dûe à une sesnibilisation au composant rAra h 8, appartenant à la famille des PR-10, et associé à de légers ou à l'absence de symptômes165,166.

Cependant, comme cité dans les résultats, l'importante variation temporelle des IgE spécifiques rend l'interprétation de ces valeurs délicates. Afin de fournir des résultats fiables et extrapolables, il aurait fallu que le dosage des IgE se déroule dans les quelques mois (jusqu'à 6 mois)55 précédents le TPO et les prélèvements pour les TAB.

Une étude récente de Glaumann et al.167 publiée en 2012 et effectuée sur 38 patients, établit une corrélation entre les CD-sens et les IgE spécifiques. Elle corrobore ainsi les premiers résultats de notre étude. Le fait que les patients ne présentant pas d'activation des basophiles aient un TPO négatif se vérifie également dans les résultats de l'équipe de S.Glaumann. Dans cette étude cependant, une corrélation existe également entre les résultats des TPO positifs, qui ont été effectués en double aveugle, et des CD- sens élevés, à hauteur de 92%167. En cela elle diffère de nos résultats. L'importance de la taille de l'effectif et la méthodologie peuvent entre autres expliquer ces divergences de résultats.

Au niveau des patients allergiques aux protéines du lait de vache, une corrélation semble également apparaître entre les IgE et les résultats des TAB. En effet, les patients dont les basophiles n'ont pas été activés présentes des IgE spécifiques faibles, tandis qu'au contraire, les patients aux basophiles activés ont les valeurs des IgE les plus élevées. En revanche, le profil du patient 4 ne cadre pas dans le tableau dessiné par le reste de la cohorte (pas d'activation des basophiles mais IgE spécifiques élevés). Cela peut être du à la période de prélèvement : si le prélèvement a été effectué proche d'un épisode allergique chez le patient, pouvant potentiellement expliquer une anergie transitoire des basophiles du patient.

A plus grande échelle, Rubio et al. ont publié une étude en 2013168 incluant une centaine de patients, mettant en relation le dosage des IgE et l'activation des basophiles. Lors de cette étude, les TAB sont également corrélés au bon déroulement des TPO, avec des valeurs de prédictions positives et négatives de respectivement 96% et 81%168. Cela

Fourel Matthieu - Décembre 2014 82 signifie que selon cette étude, lorsque le TAB d'un patient est positif, il a 96% de chance d'être allergique, et à l'inverse, un TAB négatif signifie 81% de chance de ne pas être allergique.

La corrélation entre IgE spécifiques et TAB se retrouve également dans une autre étude de 2010, qui met en parallèle la sévérité clinique de l'hypersensibilité allergique et la valeur des IgE et le pourcentage d'activation des basophiles169.

En résumé, la corrélation entre IgE spécifiques et les paramètres (CDsens, CDmax et AUC) se retrouve dans plusieurs études portant sur des cohortes de patients plus importantes et qui confirment ainsi ces résultats.

Concernant les TPO en revanche, les résultats présentés dans cette thèse ne se recoupent pas avec ceux obtenus dans les études citées précédemment, qui mettent en évidence un lien apparent entre TAB et clinique via les TPO. La source de cette différence peut se trouver dans les faiblesses exposées ci-dessus, à savoir le faible effectif de patients inclus dans l'étude entraînant un nombre restreint de données et la subjectivité des TPO simples par rapport aux doubles aveugles.

Cependant, la démarche diagnostique cumulant les données factuelles recueillies par les IgE spécifiques, les SPT et les TAB semble avoir de l'avenir afin de prévenir les échecs traumatisants aux TPO, qui sont également plus invasifs, coûteux et chronophages que les tests biologiques.

Fourel Matthieu - Décembre 2014 83 CONCLUSION

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La Faculté de Pharmacie de Lyon et l'Université Claude Bernard Lyon 1 n'entendent donner aucune approbation ni improbation aux opinions émises dans les thèses ; ces opinions sont considérées comme propres à leurs auteurs

Fourel Matthieu - Décembre 2014 94 FOUREL Matthieu Test d'activation des basophiles et allergie alimentaire : Aide à la décision dans la réalisation d'un test de provocation orale ?

Th. D. Pharm., Lyon 1, 2014, 86 p.

RESUME

Les allergies alimentaires sont très fréquentes et touchent environ 3,5% de la population mondiale, avec une prévalence plus importante chez les enfants : 5 à 8% chez les moins de 4 ans contre 1 à 2% chez les adultes. Cette forte prévalence pédiatrique est d'autant plus inquiétante qu'elle a augmenté de près de 20% entre 1997 et 2007. La fréquence élevée conjuguée à la gravité de certaines réactions allergiques - pouvant conduire à un choc anaphylactique -, confèrent aux méthodes diagnostiques une importance toute particulière. Un panel de tests permet aujourd'hui de caractériser une hypersensibilité allergique avec précision : les tests cutanées (Skin Prick Test), le dosage des IgE spécifiques, le test d'activation des basophiles (TAB) et les tests de provocation orales (TPO). Le test d'activation des basophiles est un test fonctionnel ayant pour but de reproduire in vitro la réaction d'hypersensibilité allergique se déroulant in vivo par mise en contact de cellules sanguines avec l'allergène incriminé.

L'étude décrite dans cette thèse porte sur deux populations pédiatriques : la première intéresse 4 patients allergiques à l'arachide, âgés de 4 à 11 ans, et la seconde comporte 8 patients présentant une allergie aux protéines du lait de vache (APLV), âgés de 7 mois à 7 ans. L'originalité de l'étude réside dans l'analyse des résultats des TAB, qui a utilisé trois modes d'expression : le CDsens, le CDmax et l'AUC (Aire sous la courbe).

Les résultats de cette étude préliminaire ne semblent pas montrer de corrélation évidente entre les résultats du TAB et l'issue du TPO, pour l'allergie à l'arachide comme pour l'APLV. Il faut cependant souligner la positivité systématique du TAB des patients ayant échoué à leurs TPO ainsi que la bonne tolérance au TPO chez tous les patients dont le TAB est négatif. Ces résultats sont, bien sûr, à nuancer du fait du faible échantillon de patients. Malgré des résultats mitigés, la démarche de prise en charge associant les données factuelles recueillies par les IgE spécifiques, les tests cutanés et les TAB semble encourageante pour une prise de décision raisonnée dans la réalisation d'un TPO.

MOTS CLES Basophiles Allergie alimentaire Arachide Lait Test de Provocation Orale

JURY M. BIENVENU Jacques, Professeur - Praticien hospitalier M. ROUZAIRE Paul, Maître de Conférence - Praticien Hospitalier M. PAILLER-MATTEI Cyril, Maitre de Conférence Universitaire Mme. ANDRE GOMEZ Sylvie-Anne, Pédiatre M. VIEL Sébastien, Assistant Hospitalo-Universitaire

DATE DE SOUTENANCE

Jeudi 18 décembre 2014

ADRESSE DE L’AUTEUR

24, Chemin du moulin – 69160 Tassin la demi lune

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