Doctorado En Ciencias Y Biotecnología De Plantas
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DOCTORADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS Análisis genómico del /ocus MATen Mycosphaerella fijiensis Tesis que-para obtener el grado de: Doctor en Ciencias Presenta: Biol. Laura Conde Ferráez Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Mérida, Yucatán, México 2007 CONTENIDO Reconocimientos Usta de figuras V Lista de tablas vii 1 Lista de abreviaturas ix Resumen xi Abstract xii INTRODUCCIÓN 1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3 OBJETIVOS 5 OBJETIVO GENERAL 5 OBJETIVOS PARTICULARES 5 REFERENCIAS 5 CAPITULO 1: ANTECEDENTES GENERALES 7 1.1 Antecedentes Parte 1: Generalidades de la Sigatoka negra y otras enfermedades foliares 7 1.1.1 LAS ENFERMEDADES DE MANCHA FOLIAR DEL BANANO 7 1.1.2 DISTRIBUCIÓN DE LA SIGATOKA NEGRA 8 1.1.3 DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA SIGATOKA NEGRA 9 1.1.4 TAXONOMÍA DE Mycosphaerella fijiensis 10 1.1 .5 BIOLOGÍA Y CICLO DE VIDA DE Mycosphaerella fijiensis 11 1.1.6 GENÉTICA Y GENÓMICA DE Mycosphaerella fijiensis 13 1.2 Antecedentes parte 2: Ellocus MAT (mating-type) dede los ascomicetos: su evolución, estructura y regulación. 15 1.2.1 INTRODUCCION 15 1.2.2 LOS GENES DEL LOCUS MAT 15 1.2.3 EVOLUCIÓN DEL LOCUS MAT 16 1.2.4 ESTRUCTURA DEL CONTEXTO GENÓMICO DEL LOCUS MAT 17 1.2.5 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES MAT 19 1.2.6 LOS GENES MAT EN HONGOS ANAMÓRFICOS 20 1.2.7 CONSIDERACIONES FINALES 21 1.3 REFERENCIAS 22 CAPITULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES 29 2.1 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 29 2.2 OBTENCIÓN DEL GEN DNA LIASA 29 2.3 OBTENCIÓN DEL GEN sla2 30 2.4 ESCRUTINIO DE UNA BIBLIOTECA BAC DE M. FIJIENSIS POR PCR E HIBRIDACION 31 2.5 PREPARACION E HIBRIDACION DE MEMBRANAS DEL CARIOTIPO MOLECULAR DE M. fijiensis 31 2.6 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES MAT POR PCR 32 2.6.1 OBTENCION DE LA CAJA HMG DE M. MUS/COLA 35 2.7 OBTENCION DE LOS IDIOMORFOS COMPLETOS 35 2.8 REFERENCIAS 36 CAPITULO 3: ANÁLISIS DEL CARIOTIPO MOLECULAR Y DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA BAC DE MYCOSPHAERELLA FIJIENSIS 39 3.1 INTRODUCCION 39 3.2 MATERIALES Y METODOS 40 3.2.1 Análisis del cariotipo molecular 40 3.2.1.1 Obtención de "Piugs" de micelio 40 3.2.1.2 Resolución de los cromosomas por PFGE 41 3.2.1.3 Southern Blot e Hibridaciones del cariotipo 41 3.2.1.4 Preparación de las Sondas utilizadas en las hibridaciones 42 3.2.2 Análisis de una biblioteca BAC 42 3.2.2.1 Elaboración de filtros de alta densidad 42 3.2.2.2 Escrutinio de la biblioteca por hibridación 42 3.3 RESULTADOS 43 3.3.1 Análisis del cariotipo 43 3.3.1.1 Hibridaciones del cariotipo 45 3.3.2 Obtención de fragmentos de genes flanqueantes 47 3.3.3 Escrutinio de una biblioteca BAC 4 7 3.4 DISCUSION 49 3.4.1 Análisis del cariotipo molecular 49 3.4.2 Hibridaciones del cariotipo y escrutinio de una biblioteca BAC 50 3.5 CONCLUSIONES 51 3.6 REFERENCIAS 51 CAPITULO 4: ISOLATION ANO CHARACTERIZATION OF THE MATING TYPE LOCUS OF MYCOSPHAERELLA F/J/ENSIS, THE CAUSAL AGENT OF BLACK LEAF STREAK DISEASE OF BANANA 53 4.1 INTRODUCTION 53 4.2 EXPERIMENTAL PROCEDURES 54 4.2.1 Fungal isolates and DNA extraction 54 4.2.2 PCR and DNA walking strategies 56 4.2.3 PCR confirmation of inverted sequences within the idiomorphs 56 4.2.4 Bioinformatic analyses 56 4.3 RESUL TS 57 4.3.1 PCR amplification of the HGM box and flanking genes 57 4.3.2 Long -range PCR isolation of the mat1-1 idiomorph 59 4.3.3 Characterization of the idiomorphs 59 4.3.4 ORF finding and gene prediction 63 4.3.5 Comparative analysis 63 4.4 DISCUSSION 63 4.4.1 Amplification of the HMG box 63 4.4.2 Characterization of the idiomorphs 65 4.4.3 Comparative analysis 65 4.4.4 Synteny amongst ascomycetes 66 4.4.5 The use of the idiomorphs for the study of populations and evolution.67 4.5 ACKNOWLEDGEMENTS 67 4.6 REFERENCES 67 CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS 71 ANEXOS 73 RECONOCIMIENTOS Este trabajo fue posible gracias a la Beca de Doctorado, CONACYT 70133, y fue desarrollado en su mayor parte en las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología Molecular del CICY. Agradezco profundamente a: Mi director de tesis Dr Andrew James, por su apoyo y confianza; Dra Blondy Canto Canché, por sus valiosas enseñanzas, aportaciones científicas y discusiones; Dr Edwin C.A. Abeln y Dr Cees Waalwijk por sus contribuciones en el desarrollo de este trabajo, Dr Gert H.J. Kema por discusiones y apoyo durante la estancia en su laboratorio. A la QFB Rosa Grijalva Arango y al Biol Néstor Raigosa Flores por su gran apoyo técnico , aportaciones científicas y compañerismo. En general a todos mis compañ-eros del laboratorio, por su disponibilidad, ayuda y compañerismo, sobre todo a la M.C. Leticia Peraza Echeverría, por su apoyo incondicional y por sus aportaciones al trabajo expuesto en el capítulo 3, al igual que a la Ora Cecilia Rodríguez García y la M.C. Diana Guillén Maldonado. Al personal de Plant Research lnternational por su apoyo durante la estancia realizada en el desarrollo de este trabajo, en particular a lneke de Vries, Odette Mendes y Theo Van der Lee. A mi comité tutora! y predoctoral, a los revisores de tesis, por sus comentarios y sugerencias para mejorar este trabajo: Dr Jean Philippe Vielle Calzada, Dr Alfredo Herrera Estrella, Ora Caroline Burgeff D'Hondt, Ora Aileen O'Connor Sánchez, Dr Osear Moreno Valenzuela y Ora Renata Rivera Madrid. Dedico este trabajo y mis logros a mi familia y a Dios, ya que sin ellos nada hubiera sido posible. 11 "Si no quieres perderte en el olvido tan pronto como estés muerto y corrompido, escribe cosas dignas de leerse, o haz cosas dignas de escribirse': Benjamin Franklin " .. .Debemos estudiar para saber, y debemos saber para servir[. ..] Si un necio lee muchos libros, al final sólo será un necio que ha leído muchos libros. Léelos tú, porque eso te dará conocimiento. Pero acércate con amor a la gente, y escúchala, porque eso te dará sabiduría. Y la sabiduría es más importante que el puro conocimiento, porque es conocimiento con amor''. Armando Fuentes Aguirre 111 iv LISTA DE FIGURAS Figura 1.1. Expansión de la Sigatoka negra en México y Centro América (Tomado de Orozco-Santos, 1998). 9 Figura 1.2. Etapas de Desarrollo de los síntomas de la Sigatoka negra; (a) elapas 1 y 2, (b) etapas 3 y 4, (e) etapas 5 y 6 (tomado de Mourichon et al., 1997). 10 Figura 1.3. Ciclo de vida de Mycosphaerella fijiensis (Tomado de Manzo- Sánchez et al., 2005) 12 Figura 1.4. Esporas de Mycosphaerella fijiensis: a: (1) peritecio, (2) aseas, (3) ascosporas; b: (1) estroma, (2) células conidiogenas (3) conidio (Tomado de Pons, 1987). 12 Figura 1.5. Comparación dellocus MATen cinco especies de hongos. 17 Figura 2.1. Diagrama de flujo de las reacciones de PCR que se realizan utilizando el kit DNA walking SpeedUp (Seegene ®). Figura tomada del manual del usuario. · 36 Figura 3.1 . "Piugs" de micelio incluido en agarosa 41 Figura 3.2. a) Separación de los cromosomas de M fijiensis tamaño pequeño por medio de electroforesis de campo pulsante, y teñido con SYBR green; las condiciones electroforéticas son específicas para cromosomas pequeños y se describen en materiales y métodos. b) Hibridación del los cromosomas pequeños de M fijiensis y d) de los cromosomas grandes, empleando como sonda el telómero (TTAGGG) 18 , para verificar el patrón de bandeo del cariotipo. e) Separación de los cromosomas grandes de M fijiensis por PFGE con tinción con SYBR green. 44 Figura 3.3. Autorradiografías obtenidas al hibridar con las sondas de 7 kb , mat1-1 (a) y mat1-2 (b). 45 Figura 3.4. Autorradiografías obtenidas al hibridar con las sondas de 7 kb, mat1-1 (a) y mat1-2 (b). La hibridación se realizó a 48 oc, al igual que los lavados; dos de 30 min con 2x SSC, 0.1% SOS; de 30 min y 1.5 hr con 1x SSC, 0.1% SOS y uno de 0.1x SSC, 0.1% SOS 1.5 hr. 45 Figura 3.5. a) Gel de agarosa teñido con SYBR Green, en el que se resolvieron los cromosomas de M fijiensis de hasta 2,200 kb, b) Autorradiografía obtenida al hibridar los cromosomas de 200- 2,200 kb de M fijiensis con la caja la caja HMG de M graminicola, a 48° C. Los lavados fueron a 48° C, dos de 30 m in con 2xSSC. 0.1 %SOS; y uno de 15 m in con 1 x SSC, 0.1% SOS. El film se expuso 24 hr. e) Autorradiografía obtenida al hibridar con la misma sonda a 55 °C. 46 Figura 3.6. Amplicones obtenidos utilizando oligos degenerados para la DNA liasa (a) y sla2 (b). 47 Figura 4.1. Multiple sequence alignments of predicted amino acids from a) the HMG box and b) the alpha box, of Mycosphaerella fijiensis, · Mycosphaerella musicola, Septoria passerinii, Cochliobolus V heterostrophus, Sordaria macrospora, Alternaría alternata, Colletotrichum musae, Coch/iobolus sativus, Fusarium oxysporum, Leptosphaeria maculans, Neurospcra crassa, Podospora anserina and Pyrenopeziza brassicae. 58 Figura 4.2. Diagram of the mat locus organization in Mycosphaerella fijiensis. The boxes labeled mat1-1 and mat1-2 represent the idiomorphs; the adjacent genes are labeled APC (Anaphase Promoting Complex) and DNA lyase. 60 Figura 4.3. Dotplot graph of both idiomorphs of M.