Inaugural-Dissertation Zur Erlangung Des Grades Eines Doktors Der
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Aus dem Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin, der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover Die Nitrat- und Nitritreduktion bei Mykobakterien INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Torsten Jäger aus Lüneburg Hannover 2003 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. P. Valentin-Weigand für die Tierärztliche Hochschule Hannover Priv.-Doz. Dr. med. F.-C. Bange für die Medizinische Hochschule Hannover 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. P. Valentin-Weigand 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. I. Greiser-Wilke Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2003 Meinem Vater I Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ VIII Abbildungsverzeichnis .................................................................................................XI Tabellenverzeichnis ...................................................................................................XVI 1. Einleitung ........................................................................................................................1 2. Literaturübersicht 2.1 Mykobakterien ............................................................................................................3 2.1.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie ....................................................3 2.1.2 Vorkommen und Bedeutung ...........................................................................5 2.2 Tuberkulose 2.2.1 Tuberkulose beim Menschen ..........................................................................6 2.2.1.1 Epidemiologie und Bedeutung .................................................................6 2.2.1.2 Ätiologie und Pathogenese .......................................................................8 2.2.1.3 Klinik ........................................................................................................9 2.2.1.4 Diagnostik ...............................................................................................10 2.2.1.5 Therapie ..................................................................................................12 2.2.1.6 Impfung ..................................................................................................13 2.2.2 Tuberkulose bei Tieren 2.2.2.1 Epidemiologie und Bedeutung ...............................................................15 2.2.2.2 Ätiologie und Pathogenese .....................................................................17 2.2.2.3 Klinik ......................................................................................................18 2.2.2.4 Diagnostik ...............................................................................................19 2.2.2.5 Therapie und Bekämpfung .....................................................................20 2.3 Nitrat- und Nitritstoffwechsel ...................................................................................20 2.3.1 Nitratstoffwechsel bei Bakterien ...................................................................21 2.3.2 Nitratstoffwechsel bei Mykobakterien .........................................................23 2.3.2.1 Aerobe (assimilatorische) Nitratreduktion .............................................23 2.3.2.2 Anaerobe Nitratreduktion .......................................................................24 2.3.3 Nitritstoffwechsel bei Bakterien ...................................................................25 2.3.4 Nitritstoffwechsel bei Mykobakterien ..........................................................26 2.3.4.1 Aerobe (assimilatorische) Nitritreduktion ..............................................26 2.3.4.2 Anaerobe Nitritreduktion ........................................................................27 II Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________ 2.4 Zielsetzung der Dokorarbeit .....................................................................................28 3. Material und Methoden 3.1 Material .....................................................................................................................29 3.1.1 Plasmide ........................................................................................................29 3.1.2 Bakterienstämme ..........................................................................................29 3.1.3 Nährmedien ..................................................................................................30 3.1.4 Lösungen und Puffer ....................................................................................32 3.1.4.1 Allgemeine Lösungen und Puffer ...........................................................32 3.1.4.2 Lösungen und Puffer für die Tierexperimente .......................................33 3.1.5 Sonstige Materialien .....................................................................................34 3.2 Methoden 3.2.1 Transformation von DNA in langsamwachsende Mykobakterien ...............34 3.2.1.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen ..................................................34 3.2.1.2 Transformation durch Elektroporation ...................................................34 3.2.2 Kultivierung langsamwachsender Mykobakterien unter aeroben Bedingungen .................................................................................................35 3.2.2.1 Kultivierung in 7H9-Nährmedium .........................................................35 3.2.2.2 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitrit- bzw. Nitratzusatz ......35 3.2.3 Kultivierung langsamwachsender Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen .................................................................................................36 3.2.3.1 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz ..........................36 3.2.3.2 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz ...........................36 3.2.3.3 Kultivierung in Kaliumphospatmedium .................................................37 3.2.4 Konservierung und Lagerung von Kulturen .................................................37 3.2.5 Nitratreduktasetest ........................................................................................37 3.2.6 Ammoniumtest .............................................................................................39 3.2.7 Bestimmung der Keimdichte ........................................................................40 3.3 Methoden für die Tierexperimente ...........................................................................40 3.3.1 Anzucht und Aufbereitung des Infektionsmaterials .....................................40 3.3.2 Infektion der Versuchstiere ..........................................................................41 3.3.3 Haltung der Versuchstiere ............................................................................41 3.3.4 Tötung und Sektion der Versuchstiere .........................................................41 3.3.5 Aufarbeitung des Sektionsmaterials .............................................................42 3.3.6 Bestimmung der Keimdichte in den Organen ..............................................42 III Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________________ 4. Ergebnisse 4.1 Untersuchung der Nitratreduktasemutante (∆narG-Mutante von M. bovis BCG) komplementiert mit dem narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis in vitro und in vivo .......................................................................................................................43 4.1.1 Komplementation der ∆narG-Mutante von M. bovis BCG mit dem narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis ....................................................43 4.1.2 In-vitro-Experimente ....................................................................................43 4.1.2.1 Kultivierung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116)unter aeroben Bedingungen ...........................................................................................43 4.1.2.2 Analyse der anaeroben Nitratreduktaseaktivität der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) .........................................................................................45 4.1.2.3 Kultivierung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) unter anaeroben Bedingungen ...........................................................................................47 4.1.3 Untersuchung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) im Tiermodell mit Balb/c Mäusen ..........................................................................................................49 4.1.3.1 Pathologisch-anatomische Organbefunde ..............................................49 4.1.3.2 Quantitative Analyse der Keimdichte der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) in Balb/c Mäusen ............................................................50 4.1.3.2.1 Keimdichte in der Leber .............................................................50