Aus dem Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin, der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover
Die Nitrat- und Nitritreduktion bei Mykobakterien
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Torsten Jäger
aus Lüneburg
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. med. vet. P. Valentin-Weigand für die Tierärztliche Hochschule Hannover
Priv.-Doz. Dr. med. F.-C. Bange für die Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. P. Valentin-Weigand
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. I. Greiser-Wilke
Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2003
Meinem Vater
I Inhaltsverzeichnis ______
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ...... VIII Abbildungsverzeichnis ...... XI Tabellenverzeichnis ...... XVI
1. Einleitung ...... 1 2. Literaturübersicht 2.1 Mykobakterien ...... 3 2.1.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie ...... 3 2.1.2 Vorkommen und Bedeutung ...... 5 2.2 Tuberkulose 2.2.1 Tuberkulose beim Menschen ...... 6 2.2.1.1 Epidemiologie und Bedeutung ...... 6 2.2.1.2 Ätiologie und Pathogenese ...... 8 2.2.1.3 Klinik ...... 9 2.2.1.4 Diagnostik ...... 10 2.2.1.5 Therapie ...... 12 2.2.1.6 Impfung ...... 13 2.2.2 Tuberkulose bei Tieren 2.2.2.1 Epidemiologie und Bedeutung ...... 15 2.2.2.2 Ätiologie und Pathogenese ...... 17 2.2.2.3 Klinik ...... 18 2.2.2.4 Diagnostik ...... 19 2.2.2.5 Therapie und Bekämpfung ...... 20 2.3 Nitrat- und Nitritstoffwechsel ...... 20 2.3.1 Nitratstoffwechsel bei Bakterien ...... 21 2.3.2 Nitratstoffwechsel bei Mykobakterien ...... 23 2.3.2.1 Aerobe (assimilatorische) Nitratreduktion ...... 23 2.3.2.2 Anaerobe Nitratreduktion ...... 24 2.3.3 Nitritstoffwechsel bei Bakterien ...... 25 2.3.4 Nitritstoffwechsel bei Mykobakterien ...... 26 2.3.4.1 Aerobe (assimilatorische) Nitritreduktion ...... 26 2.3.4.2 Anaerobe Nitritreduktion ...... 27 II Inhaltsverzeichnis ______
2.4 Zielsetzung der Dokorarbeit ...... 28 3. Material und Methoden 3.1 Material ...... 29 3.1.1 Plasmide ...... 29 3.1.2 Bakterienstämme ...... 29 3.1.3 Nährmedien ...... 30 3.1.4 Lösungen und Puffer ...... 32 3.1.4.1 Allgemeine Lösungen und Puffer ...... 32 3.1.4.2 Lösungen und Puffer für die Tierexperimente ...... 33 3.1.5 Sonstige Materialien ...... 34 3.2 Methoden 3.2.1 Transformation von DNA in langsamwachsende Mykobakterien ...... 34 3.2.1.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen ...... 34 3.2.1.2 Transformation durch Elektroporation ...... 34 3.2.2 Kultivierung langsamwachsender Mykobakterien unter aeroben Bedingungen ...... 35 3.2.2.1 Kultivierung in 7H9-Nährmedium ...... 35 3.2.2.2 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitrit- bzw. Nitratzusatz ...... 35 3.2.3 Kultivierung langsamwachsender Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen ...... 36 3.2.3.1 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz ...... 36 3.2.3.2 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz ...... 36 3.2.3.3 Kultivierung in Kaliumphospatmedium ...... 37 3.2.4 Konservierung und Lagerung von Kulturen ...... 37 3.2.5 Nitratreduktasetest ...... 37 3.2.6 Ammoniumtest ...... 39 3.2.7 Bestimmung der Keimdichte ...... 40 3.3 Methoden für die Tierexperimente ...... 40 3.3.1 Anzucht und Aufbereitung des Infektionsmaterials ...... 40 3.3.2 Infektion der Versuchstiere ...... 41 3.3.3 Haltung der Versuchstiere ...... 41 3.3.4 Tötung und Sektion der Versuchstiere ...... 41 3.3.5 Aufarbeitung des Sektionsmaterials ...... 42 3.3.6 Bestimmung der Keimdichte in den Organen ...... 42 III Inhaltsverzeichnis ______
4. Ergebnisse 4.1 Untersuchung der Nitratreduktasemutante (∆narG-Mutante von M. bovis BCG) komplementiert mit dem narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis in vitro und in vivo ...... 43 4.1.1 Komplementation der ∆narG-Mutante von M. bovis BCG mit dem narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis ...... 43 4.1.2 In-vitro-Experimente ...... 43 4.1.2.1 Kultivierung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116)unter aeroben Bedingungen ...... 43 4.1.2.2 Analyse der anaeroben Nitratreduktaseaktivität der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) ...... 45 4.1.2.3 Kultivierung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) unter anaeroben Bedingungen ...... 47 4.1.3 Untersuchung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) im Tiermodell mit Balb/c Mäusen ...... 49 4.1.3.1 Pathologisch-anatomische Organbefunde ...... 49 4.1.3.2 Quantitative Analyse der Keimdichte der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) in Balb/c Mäusen ...... 50 4.1.3.2.1 Keimdichte in der Leber ...... 50 4.1.3.2.2 Keimdichte in der Lunge ...... 52 4.1.3.2.3 Keimdichte in der Niere ...... 53 4.1.3.2.4 Keimdichte in der Milz ...... 54 4.2 Untersuchung der Nitratreduktasemutante (∆narG-Mutante von M. bovis BCG) komplementiert mit dem narGHJI-Gencluster von M. bovis BCG in vitro und in vivo ...... 56 4.2.1 Komplementation der ∆narG-Mutante von M. bovis BCG mit dem narGHJI-Gencluster von M. bovis BCG ...... 56 4.2.2 In-vitro-Experimente ...... 56
IV Inhaltsverzeichnis ______
4.2.2.1 Kultivierung der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) unter aeroben Bedingungen ...... 56 4.2.2.2 Analyse der anaeroben Nitratreduktaseaktivität der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) ...... 58 4.2.2.2 Kultivierung der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) unter anaeroben Bedingungen ...... 59 4.2.1 Untersuchung der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) im Tiermodell mit Balb/c Mäusen ...... 61 4.2.1.1 Pathologisch-anatomische Organbefunde ...... 61 4.2.1.2 Quantitative Analyse der Keimdichte der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) in Balb/c Mäusen ...... 63 4.2.1.2.1 Keimdichte in der Leber ...... 63 4.2.1.2.2 Keimdichte in der Lunge ...... 64 4.2.1.2.3 Keimdichte in der Niere ...... 65 4.2.1.2.4 Keimdichte in der Milz ...... 66 4.3 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in vitro und in vivo ...... 68 4.3.1 Kultivierung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) unter aeroben Bedingungen ...... 68 4.3.2 Analyse der anaeroben Nitritreduktaseaktivität der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 70 4.3.2.1 Ammoniumakkumulation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Minimalnährmedium ...... 70 4.3.2.2 Vergleich der Ammoniumakkumulation des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium und in Phosphatpuffer ...... 72 4.3.2.3 Ammoniumakkumulation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Phosphatpuffer ...... 73
V Inhaltsverzeichnis ______
4.3.2.4 Abnahme der Nitritkonzentration bei der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Phosphatpuffer ...... 75 4.3.3 Kultivierung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium ...... 76 4.3.4 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) im Tiermodell ...... 78 4.3.4.1 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in SCID-Balb/c Mäusen ...... 78 4.3.4.2 Unterschiede in den Überlebenszeiten von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) ...... 78 4.3.4.3 Pathologisch–anatomische Organbefunde ...... 79 4.3.4.4 Quantitative Analyse der Keimdichte der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in SCID-Balb/c Mäusen ...... 80 4.3.4.4.1 Keimdichte in der Leber ...... 80 4.3.4.4.2 Keimdichte in der Lunge ...... 81 4.3.4.4.3 Keimdichte in der Niere ...... 82 4.3.4.4.4 Keimdichte in der Milz ...... 83 4.3.4.5 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in Balb/c Mäusen ...... 84 4.3.4.6 Pathologisch-anatomische Organbefunde ...... 84 4.3.4.7 Quantitative Analyse der Keimdichte der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in Balb/c Mäusen ...... 85 4.3.4.7.1 Keimdichte in der Leber ...... 85 4.3.4.7.2 Keimdichte in der Lunge ...... 86 4.3.4.7.3 Keimdichte in der Niere ...... 87 4.3.4.7.4 Keimdichte in der Milz ...... 88 4.4 Untersuchung der Nitrat- und Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen ...... 90 4.4.1 Vergleich der Nitratassimilation bei M. tuberculosis und M. bovis BCG ....91
VI Inhaltsverzeichnis ______
4.4.2 Bedeutung des nirBD-Gens für die Nitritassimilation von M. bovis BCG ..93 4.4.2.1 Abhängigkeit der Nitritassimilation von der Nitritkonzentration ...... 93 4.4.2.2 Untersuchung der Nitritassimilation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 94 4.4.2.3 Untersuchung der Nitritassimilation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps im Vergleich zu M. tuberculosis ...... 95 4.4.2.4 Untersuchung der Nitritassimilation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2), dem M. bovis BCG Wildtyp und der mit nirBD von M. tuberculosis komplementierten ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG ...... 97 4.4.2.5 Vergleich der Nitritassimilation mit der gleichzeitigen Reduktion von Nitrit bei der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und dem M. bovis BCG Wildtyp ...... 99 4.4.2.6 Unterschiede in der Nitrat- und Nitritreduktion zwischen M. tuberculosis und M. bovis BCG ...... 100 4.4.3 Nitritakkumulation von M. bovis BCG und dessen ∆nirB-Mutante jeweils komplementiert mit dem narGHJI von M. tuberculosis im Vergleich zur ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und zum M. bovis BCG Wildtyp ...... 103 5. Diskussion 5.1 Untersuchung der Funktion des narGHJI-Gens von M. tuberculosis und M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen in vitro und in vivo ...... 107 5.2 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen in vitro und in vivo ...... 108 5.3 Nitrat- bzw. Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen von M. bovis BCG und M. tuberculosis in vitro ...... 110 5.4 Ausblick ...... 111 6. Zusammenfassung ...... 112 7. Summary ...... 114 8. Literaturverzeichnis ...... 115 9. Anhang 9.1 Geräte ...... 131 9.2 Chemikalien ...... 131 VII Inhaltsverzeichnis ______
9.3 Antibiotika ...... 132 9.4 Gebrauchsmaterialien ...... 132 9.5 Rohdaten ...... 133 VIII Abkürzungsverzeichnis ______
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung ADS Albumin Dextrose Salz (Albumin Dextrose Saline) AIDS Erworbenes Immundefizienz Syndrom (Acquired immuno-deficiency syndrome) AG Arbeitsgruppe Aqua bidest. Aqua bidestillata Aqua dest. Aqua destillata ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphoshorsäure BCG Bacille Calmette-Guérin bzw. beziehungsweise ca. circa ∆ deletiert d.h. das heißt DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen DNA Desoxyribonukleinsäure (-acid) DOTS Direkt beobachtende Behandlungsstrategie (directly observed treatment strategy) E. coli Escherichia coli EIA Enzym-Immun-Assay Fa. Firma FAD Flavin-adenin-dinucleotid GlDH Glutamat- Dehydrogenase HIV Humanes immune deficiency virus I.E. Internationale Einheiten IFNγT Interferon-γ-Test IX Abkürzungsverzeichnis ______inakt. hitzeinaktiviert KBE Koloniebildende Einheiten l Liter M. Mycobacterium MAC M. avium-Komplex (-complex) MB-Medium Mycobacterium-Basalsalz-Medium MB-Medium/ADS Minimalnährmedium min Minute MOTT Mykobakterien außer Tuberkulosebakterien (mycobacteria other than tubercle bacilli) MW Mittelwert M. tb. Mycobacterium tuberculosis NAD Nicotinamidadenindinucleotid NADH reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid
NAD(P)H2 reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat narGHJI Gene für die Nitratreduktase NarGHJI Nitratreduktase nirBD Gene für die Nitritreduktase NirBD Nitritreduktase NTM Nicht tuberkulöse Mykobakterien (non tuberculous mycobacteria)
ODxxx Optische Dichte, der Wert XXX steht für den Wellenlängenbereich in nm PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaktion) pH Negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration rpm Umdrehungen in der Minute (rounds per minute) (r)RNA (ribosomale) Ribonukleinsäure ((ribosomal) ribonucleic acid) X Abkürzungsverzeichnis ______
SCID Schwere kombinierte Immundefizienz (Severe combined immunodeficiency) SD Standardabweichung (standard deviation) ssp. Subspeziees Staph. carn. Staphylococcus carnosus STIKO Ständige Impfkommision Tab. Tabelle u.a. unter anderem USA Vereinigte Staaten von Amerika (United States of America) UV-Licht Ultraviolettes Licht WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation) z.B. zum Beispiel
XI Abbildungsverzeichnis ______
Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Organisation der α-, β- und γ-Unterein- heiten der anaeroben Nitratreduktase NarGHJI von E. coli ...... 22 Abb. 3.1: Eichkurve zur photometrischen Bestimmung der Nitritmengen im Absorptionsbereich von 440 nm ...... 38
Abb. 4.1.A: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 44
Abb. 4.1.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 45
Abb. 4.2: Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 46
Abb. 4.3.A: Keimdichte (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 47
Abb. 4.3.B: Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 48 Abb. 4.4: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 51 Abb. 4.5: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c-Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 52 Abb. 4.6: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 53 XII Abbildungsverzeichnis ______
Abb. 4.7: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 54
Abb. 4.8.A: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 57
Abb. 4.8.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 57
Abb. 4.9: Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 58
Abb. 4.10: Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 60 Abb. 4.11: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen 6 . infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 63 Abb. 4.12: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 64 Abb. 4.13: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen 6 . infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 65 Abb. 4.14: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 66
Abb. 4.15.A: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 69
XIII Abbildungsverzeichnis ______
Abb. 4.15.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 69 Abb. 4.16: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG . Wildtyps in Minimalnährmedium mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen unter anaeroben Bedingungen ...... 71 Abb. 4.17: Ammoniumakkumulation von M. bovis BCG Wildtyp und Staphylococcus carnosus in Minimalnährmedium bzw. in Kaliumphosphatpuffer mit 5,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 72 Abb. 4.18: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 5,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 74 Abb. 4.19: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 74 Abb. 4.20: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,5 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 74 Abb. 4.21: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 74 Abb. 4.22: Nitritreduktion der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 75 Abb. 4.23: Keimdichte (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 77 Abb. 4.24: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 80 Abb. 4.25: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 81
XIV Abbildungsverzeichnis ______
Abb. 4.26: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 82 Abb. 4.27: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 83 Abb. 4.28: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 85 Abb. 4.29: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 86 Abb. 4.30: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen . infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 87 Abb. 4.31: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 88
Abb. 4.32: Wachstum (OD600) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren ∆narG-Mutanten in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 91 Abb. 4.33: Wachstum (KBE/ml) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren ∆narG-Mutanten in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 92
Abb. 4.34: Wachstum (OD600) des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen unter aeroben Bedingungen ...... 93
Abb. 4.35.A: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 94 Abb. 4.35.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 95
Abb. 4.36: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2), des M. bovis BCG Wildtyps und des M. tuberculosis in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz XV Abbildungsverzeichnis ______
unter aeroben Bedingungen ...... 96
Abb. 4.37.A: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG::nirBD M. tb. (TJ-4), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 97
Abb. 4.37.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG::nirBD M. tb. (TJ-4), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 98 Abb. 4.38: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 99 Abb. 4.39: Abnahme der Nitritkonzentration durch die Verstoffwechselung der ∆nirB- BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 100 Abb. 4.40: Darstellung der hypothetischen Unterschiede in der Nitratassimilation von M. bovis BCG und M. tuberculosis ...... 101
Abb. 4.41.A: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 102
Abb. 4.41.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 102 Abb. 4.42: Darstellung der hypothetischen Unterschiede in der Aktivität der aeroben . Ntratreduktase von M. bovis BCG und M. tuberculosis ...... 103
Abb. 4.43: Nitritakkumulation der BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der
∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps und in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 104
Abb. 4.44: Wachstum (OD600) der BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2),der
∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps und in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 105
XVI Tabellenverzeichnis ______
Tabellenverzeichnis
Tab. 3.1: Verwendete Plasmide ...... 29 Tab. 3.2: Verwendete Bakterienstämme ...... 29 Tab. 9.1: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 134
Tab. 9.2: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 134
Tab. 9.3: Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 134
Tab. 9.4: Keimdichte (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 135
Tab. 9.5: Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 135 Tab. 9.6: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 135 Tab. 9.7: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 136 Tab. 9.8: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c-Mäusen
infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI (SR116), M. tb. der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 136 Tab. 9.9: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 136 XVII Tabellenverzeichnis ______
Tab. 9.10: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 137
Tab. 9.11: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 137
Tab. 9.12: Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG
(SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 137
Tab. 9.13: Keimdichte (KBE/ml) der narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der
∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 138 Tab. 9.14: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen . infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI (TJ-1), der BCG ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 138 Tab. 9.15: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen
infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI (TJ-1), der BCG ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 138 Tab. 9.16: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen . infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI (TJ-1), der BCG ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 139 Tab. 9.17: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen 6 infiziert mit je 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1),der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps ...... 139
Tab. 9.18: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der
∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in
7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 139 Tab. 9.19: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der
∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen ...... 140
XVIII Tabellenverzeichnis ______
Tab. 9.20: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG . Wildtyps in Minimalnährmedium mit unterschiedlichen
Nitritkonzentrationen unter anaeroben Bedingungen ...... 141 Tab. 9.21: Ammoniumakkumulation von M. bovis BCG und Staphylococcus carnosus
in Minimalnährmedium bzw. in Kaliumphosphatpuffer mit
5,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 142 Tab. 9.22: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG
Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 5,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 142 Tab. 9.23: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 143 Tab. 9.24: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,5 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 143 Tab. 9.25: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 144 Tab. 9.26: Nitritreduktion der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in
Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen ...... 144 Tab. 9.27: Keimdichte (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG . Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter
anaeroben Bedingungen ...... 144 Tab. 9.28: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von SCID-Balb/c Mäusen
infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 145 Tab. 9.29: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von SCID-Balb/c Mäusen
infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 145 Tab. 9.30: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von SCID-Balb/c Mäusen
infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 145
XIX Tabellenverzeichnis ______
Tab. 9.31: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von SCID-Balb/c Mäusen
infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 145 Tab. 9.32: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert
mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 146 Tab. 9.33: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert
mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 146 Tab. 9.34: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert . mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1)
bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 146 Tab. 9.35: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert
mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps ...... 147
Tab.9.36: Wachstum (OD600) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren
∆narG-Mutanten in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 147 Tab. 9.37: Wachstum (KBE/ml) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren
∆narG-Mutanten in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 147
Tab. 9.38: Wachstum (OD600) des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium
mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen unter aeroben Bedingungen ...... 148
Tab. 9.39: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in
Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben
Bedingungen ...... 148 Tab. 9.40: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 149
Tab. 9.41: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2), des M. bovis BCG Wildtyps
und M. tuberculosis in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 149
XX Tabellenverzeichnis ______
Tab. 9.42: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆nirB-BCG::nirBD M. tb. (TJ-4)
und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 149
Tab. 9.43: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆nirB BCG::nirBD M. tb. (TJ-4)
und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 150 Tab. 9.44: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in
Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben
Bedingungen ...... 150 Tab. 9.45: Abnahme der Nitritkonzentration durch die Verstoffwechselung der ∆nirB-BCG
(IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit
1,0 mmol/l Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 150
Tab. 9.46: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ..151
Tab. 9.47: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ..151
Tab. 9.48: Nitritakkumulation der BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der
∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 151
Tab. 9.49: Wachstum (OD600) der BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der
∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen ...... 152
1 Einleitung ______
1. Einleitung
Seit seiner Entdeckung im Jahr 1882 durch Robert Koch ist M. tuberculosis als Erreger der Infektionskrankheit Tuberkulose bekannt. Trotz milliardenfacher Impfung mit dem vor 82 Jahren entwickelten Impfstamm M. bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) konnte die Erkrankung bisher nicht eradiziert werden. Vielmehr nimmt die Zahl der an Tuberkulose gestorbenen Menschen infolge von Infektionen mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) und vermehrtem Auftreten multiresistenter Mykobakterienstämme seit Beginn der 90er Jahre deutlich zu. Die Weltgesundheitsorganisation WHO rief 1993 für die Tuberkulose den Notstand aus, da nicht nur besonders prägnante Regionen wie Afrika und Südamerika, sondern auch industrialisierte Länder eine steigende Inzidenz der Tuberkulosefälle verzeichnen. Bei den Infektionskrankheiten mit Todesfolge steht Tuberkulose nach dem erworbenen Immundefizienz Syndrom (AIDS) weltweit an zweiter Stelle. Jährlich sterben ca. drei Millionen Menschen an Tuberkulose. Ein Drittel der Weltbevölkerung ist latent mit M. tuberculosis infiziert. Während die BCG-Vakzine die meningeale Form sowie die Miliartuberkulose bei Kleinkindern verhindern kann, ist die Effektivität dieses Impfstoffes bei der Lungentuberkulose des Erwachsenen, die die weltweit häufigste Form darstellt, umstritten. Der in Studien ermittelte Impfschutz liegt zwischen 0 und 80 %. Zudem kann die BCG- Impfung bei immunsupprimierten Patienten, insbesondere bei HIV-Infizierten, zu einer disseminierten BCGitis mit meist tödlichem Ausgang führen. Die Entwicklung eines neuen und sicheren Impfstoffes ist daher dringend erforderlich.
Diesem Ziel dient die Erforschung der mykobakteriellen Stoffwechselwege. Besonders bedeutsam ist der anaerobe Nitrat- und Nitritmetabolismus, weil dieser die jahrelange mykobakterielle Latenz in den Granulomen ermöglichen könnte. Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurde eine Homologie zu dem Genort der anaeroben Nitratreduktase NarGHJI sowie zu einem nirBD-Gen entdeckt. Die Nitratreduktase katalysiert die Reduktion von Nitrat zu Nitrit und dient unter anaeroben Bedingungen durch Aufbau eines Protonengradienten der ATP-Synthese. Die Funktion des nirBD-Gens ist bei Mykobakterien zu Beginn dieser Arbeit noch unbekannt. Bei anderen Bakterien, wie z.B. E. coli, kodiert es eine dissimilatorische Nitritreduktase, die eine Detoxifikation des Nitrits und die Regeneration von NAD+ bewirkt.
2 Einleitung ______
Obwohl die Fähigkeit der aeroben Nitratreduktion bei einigen Mykobakterien lange bekannt ist und als Unterscheidungskriterium zwischen M. tuberculosis und M. bovis bzw. M. bovis BCG in der Diagnostik eingesetzt wird, sind bislang keine Gensequenzen mit einer Homologie zu einer aeroben, assimilatorischen Nitrat- bzw. Nitritreduktase gefunden worden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der Nitratreduktase NarGHJI und des nirBD-Gens für den Stickstoffstoffwechsel von M. tuberculosis und M. bovis BCG unter aeroben und anaeroben Bedingungen untersucht. Dabei dienen die Experimente in vitro der Bestimmung der Funktion der beschriebenen Enzyme. In vivo wurden Deletionsmutanten untersucht, um die Bedeutung der Enzyme für die Pathogenität der Mykobakterien festzustellen.
3 Literaturübersicht ______
2. Literaturübersicht
2.1 Mykobakterien
2.1.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie
Mykobakterien sind unbewegliche, gerade oder leicht gebogene, ca. 0,2 – 0,6 x 1,0 – 10 µm große, nicht sporenbildende Stäbchen [SALFINGER u. KAFADER 1992, BÖTTGER 2001]. Obwohl eine Differenzierung durch die nur schwache Gramfärbung nicht eindeutig ist, werden sie den grampositiven Bakterien zugeordnet. Ihre Zellwand mit einem Lipidgehalt von 13 bis 23 % [METCHOCK et al. 1999] ist für viele ihrer Eigenschaften wie Virulenz, intrazelluläre Persistenz, Resistenz gegen einige Desinfektionsmittel sowie für die als diagnostisches Mittel verwendete Säurefestigkeit verantwortlich. Die Mykolsäuren [BÖTTGER 2001] bilden mit Karbolfuchsin einen durch salzsauren Alkohol nicht entfärbbaren Komplex [SALFINGER u. KAFADER 1992]. Das Mycosid Trehalose-6,6- dimykolat, auch Cordfaktor genannt, sorgt neben einer Phagozytosehemmung und einer Gewebeschädigung [COLLINS 1989] auch für eine zopf- bzw. strangartige Zusammenlagerung der Bakterien in der Kultur. Nach Extraktion des Lipids verlieren die Bakterien ihre Virulenz [HAHN et al. 2001].
Mykobakterien wachsen unter aeroben bis mikroaerophilen Bedingungen (5 – 10 % CO2) bei 37 °C auf komplexen Nährböden in variabler Kolonieform mit unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten [HAHN et al. 2001]. Direktes Sonnen- und UV-Licht sowie oxidierende Verbindungen [DEDIÉ et al. 1993] führen ebenso zu ihrem Absterben wie hohe Temperaturen (100 °C) [SELBITZ 2002].
Die Familie der Mycobacteriaceae umfasst lediglich die Gattung Mycobacterium, die 1896 von LEHMANN und NEUMANN zum ersten Mal beschrieben wurde. Um der Gattung Mycobacterium zugeschrieben zu werden, müssen langsamwachsende Stämme folgende Mindestanforderungen erfüllen:
4 Literaturübersicht ______
1. Säurefestigkeit 2. DNA-G/C-Gehalt von 61 – 71 % 3. Anwesenheit von Mykolsäure bestehend aus 60 – 90 Kohlenstoffatomen, die durch Pyrolyse in Fettsäuremethylester mit 22 – 26 Kohlenstoffatomen gespalten werden können
Für schnellwachsende Mykobakterien sind solche Kriterien bisher nicht aufgestellt worden [LEVY-FREBAULT u. PORTAELS 1992].
Die Einteilung der Mykobakterien kann nach unterschiedlichen Kriterien erfolgen: Aufgrund der Wachstumsgeschwindigkeit und ihrer Pigmentation wurden die Mykobakterien 1959 von RUNYON und TIMPE in vier sogenannte Runyon-Gruppen unterteilt. Dieses einfache Schema genügt jedoch nicht den Ansprüchen einer eindeutigen Klassifizierung, da die Pigmentisierung innerhalb einer Spezies variieren kann. Heute wird die Einteilung nach Runyon nur ergänzend verwendet, wenn molekularbiologische Methoden zur Differenzierung der einzelnen Spezies nicht ausreichen. Mit Hilfe molekularbiologischer Techniken, beispielsweise der Sequenzanalysen des 16S- (r)RNA-Gens, wurden Verwandtschaften zwischen den verschiedenen Spezies aufgedeckt und ein phylogenetischer Baum erstellt [ROGALL et al. 1990, PITULLE et al. 1992]. Hierdurch lassen sich Mykobakterien in eine schnell- und eine langsamwachsende Gruppe einteilen. Langsamwachsende Mykobakterien benötigen zum Wachstum zwischen 7 Tagen und mehreren Wochen, während schnellwachsende innerhalb von 7 Tagen sichtbare Kolonien auf festen Nährböden bilden [METCHOCK et al. 1999]. Im diagnostischen Bereich werden Mykobakterien nach ihrer Pathogenität klassifiziert. In die Gruppe des M. tuberculosis-Komplexes gehören die langsamwachsenden, obligat pathogenen Spezies wie M. tuberculosis, M. bovis (einschließlich des Impfstammes M. bovis BCG) und M. africanum. Ihnen gegenübergestellt ist die Gruppe der als NTM („non- tuberculous-bacilli“) oder MOTT („mycobacteria other than tubercle bacilli“) bezeichneten fakultativ pathogenen Bakterien wie M. avium, M. intracellulare, M. marinum und M. xenopi [SALFINGER u. KAFADER 1992]. Aufgrund der großen strukturellen Übereinstimmung werden M. avium und M. intracellulare auch als M. avium-Komplex (MAC) zusammengefasst. Eine weitere „Gruppe“ besteht aus dem Erreger der Lepra, M. leprae [DEDIÉ et al. 1993]. 5 Literaturübersicht ______
Die unterschiedliche Pathogenität erlaubt die Einteilung der Mykobakterien in Risikogruppen [BÖTTGER 2001]:
• Risikogruppe I: nichtpathogene, ubiquitäre, saprophytäre Mykobakterien, z.B. M. vaccae (Nachweis praktisch ohne klinische Relevanz) • Risikogruppe II: fakultativ pathogene, ubiquitäre Mykobakterien, z.B. M. abscessus (Nachweis insbesondere bei Vorliegen typischer Symptome und Risikofaktoren wie Immunsuppression bedeutsam) • Risikogruppe III: obligat pathogene, nicht ubiquitäre, meist den Menschen infizierende Mykobakterien, z.B. M. tuberculosis (Nachweis mit einer Erkrankung verbunden und behandlungspflichtig)
2.1.2 Vorkommen und Bedeutung
Mykobakterien sind weltweit verbreitet und können unter den unterschiedlichsten Bedingungen überleben. Man kann sie nach ihrer Lebensweise in drei Gruppen einteilen: Die obligat pathogenen Keime, zu denen M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. avium und M. leprae gehören [SCHULZE-RÖBBECKE 1993], sind aufgrund ihrer parasitären Lebensweise auf einen Wirt angewiesen. Menschen und Primaten können sowohl von M. bovis als auch von M. tuberculosis infiziert werden. M. leprae konnte bisher nur aus menschlichem Material isoliert werden [HAHN et al. 2001]. M. tuberculosis, M. bovis und M. avium werden von Rindern, Ziegen, Schafen, Schweinen, Hunden und Katzen auf den Menschen übertragen [HAWTHORNE u. LAUDER 1962, WILESMITH u. CLIFTON- HADLEY 1994]. Besonders immunsupprimierte Personen, z.B. mit M. bovis infizierte HIV- Patienten, sind von Zoonosen betroffen [COSIVI et al. 1998]. Die größte Gruppe der Mykobakterien ist die der saprophytären Umweltkeime. Diese kommen in Acker- und Waldböden (z.B. M. smegmatis), natürlichen und künstlichen Gewässern (M. marinum, Verursacher des Schwimmbadgranuloms und der Fischtuberkulose), Aquarien (M. fortuitum) und Wasserleitungen (z.B. M. gordonae) vor [DEDIÉ et al. 1993, SZEWZYK et al. 2000]. Auch in Staub konnten Mykobakterien (M. fortuitum) nachgewiesen werden. Dort können diese sich zwar nicht vermehren, jedoch über mehrere Monate infektionsfähig bleiben. Zudem können Mykobakterien in Klärschlamm und in Abwässern bis 6 Literaturübersicht ______zu sechs Monate überleben [DEDIÉ et al. 1993] und durch Ausbringen auf Felder und Wiesen in die Nahrungskette von Mensch und Tier gelangen [SCHULZE-RÖBBECKE 1993]. Der M. avium-Komplex (MAC) nimmt eine Zwischenrolle ein. Während M. avium hauptsächlich parasitär lebt, aber auch bis zu vier Jahre in der Umwelt überleben kann, findet man M. intracellulare überwiegend im Boden von Weiden, in geerntetem Grünfutter und nur selten im tierischen Organismus oder in Kuhmilch [DEDIÉ et al. 1993]. Aufgrund von DNA-DNA-Hybridisierung und taxonomischer Analysen lässt sich M. avium zudem in die drei Subspezies M. avium ssp. avium, M. avium ssp. paratuberculosis und M. avium ssp. silvaticum unterteilen. M. avium ssp. paratuberculosis unterscheidet sich phänotypisch durch seine Abhängigkeit von dem Stoff Mycobactin und genotypisch durch die Anwesenheit meherer Kopien des Insertionselementes IS900 von den beiden anderen Subspezies [HARRIS u. BARLETTA 2001].
2.2 Tuberkulose
2.2.1 Tuberkulose beim Menschen
2.2.1.1 Epidemiologie und Bedeutung
Die Tuberkulose ist nach AIDS die Infektionserkrankung mit den häufigsten Todesfällen. Ein Drittel der Weltbevölkerung ist latent mit M. tuberculosis infiziert [KURTH u. HAAS 2002]. Etwa 60 Millionen Menschen sind an Tuberkulose erkrankt. Pro Jahr kommen 9 – 10 Millionen Neuerkrankungen hinzu, und etwa 3 Millionen Menschen sterben durch pathogene Mykobakterien. Während in den Entwicklungsländern überwiegend junge Erwachsene und Kinder von dieser Erkrankung betroffen sind, ist es in den Industrienationen eher eine Krankheit der älteren Bevölkerung [BÖTTGER 2001]. In den Industrienationen war seit Beginn des vorigen Jahrhunderts eine kontinuierliche Abnahme der Inzidenz der Tuberkuloseerkrankungen zu verzeichnen, aber die Verbreitung in den weniger entwickelten Ländern blieb unverändert [BÖTTGER 2001]. Im Jahr 2000 lag die durchschnittliche Inzidenzrate in den Industrienationen bei ca. 100 pro 100.000 Einwohner. In den Ländern der Dritten Welt betrug sie etwa 500 pro 100.000 Einwohner, wobei die Anzahl der nicht aufgeführten Fälle die Inzidenz wahrscheinlich noch steigern würde [WHO 2002]. In den letzten Jahren ist ein Anstieg der Erkrankungen allerdings auch in den Industriestaaten und in den Ländern der ehemaligen Sowjetunion zu verzeichnen 7 Literaturübersicht ______
[RAVIGLIONE et al. 1995]. Die World Health Organisation (WHO) rief im Jahr 1993 deshalb für die Tuberkulose den gesundheitlichen Notstand aus. Durch epidemiologische Untersuchungen wurde festgestellt, dass in New York im Jahr 1992 dreimal mehr Tuberkulosefälle auftraten als 1978 [FRIEDEN et al. 1995]. 1995 starben seit der Entdeckung der Tuberkulose durch Robert Koch im Jahr 1882 in einem Jahr mehr Menschen an Tuberkulose als jemals zuvor [PELICIC et al. 1997]. Diese Entwicklung ist durch schlechte medizinische Versorgung, rasches Bevölkerungswachstum unter Bedingungen von Armut, Krieg und Migration, durch soziale Missstände und vor allem durch die weltweite HIV- Epidemie bedingt [ROBERT-KOCH-INSTITUT 2000]. Die Infektion mit HIV und den Tuberkuloseerregern bildet eine meist tödliche Kombination; 11 % aller AIDS-Patienten sterben an Tuberkulose. Durch den drastischen Anstieg der HIV-Infektionen in den letzten 10 Jahren ist besonders Afrika südlich der Sahara von der hohen Sterblichkeitsrate der an Tuberkulose erkrankten AIDS-Patienten betroffen [CORBETT et al. 2003]. Eine zunehmend hohe Übertragungsgefahr existiert in den teilweise überfüllten Gefängnissen in der ehemaligen Sowjetunion. Es wird vermutet, dass 10 – 20 % der dort Inhaftierten mit M. tuberculosis infiziert sind [PERELMAN 2000]. Die hohe Inzidenz der Tuberkulose in Russland und Osteuropa stellt insbesondere durch die Migration und den internationalen Reiseverkehr eine Gefahr für Westeuropa dar [DEUTSCHES ZENTRALKOMITEE ZUR BEKÄMPFUNG DER TUBERKULOSE 2002]. Deutschland zählte im europäischen Vergleich im Jahr 2001 mit 9,6 Fällen pro 100.000 Einwohner zu den Ländern mit einer relativ geringen Rate an Erkrankungen. Gegenüber dem Vorjahr konnte ein Rückgang der Fälle um 13 % verbucht werden. Innerhalb Deutschlands ist die Inzidenz in Hamburg mit 16,1 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner fast dreimal so hoch wie in Schleswig-Holstein (5,9 pro 100.000 Einwohner). Der Anteil der erkrankten Ausländer, meist aus den Nachfolgestaaten der ehemaligen Sowjetunion, nahm in Deutschland leicht zu und lag 2001 bei 43 % aller Erkrankten [ROBERT-KOCH-INSTITUT 2002]. Ein aktuelles Problem besteht in den zunehmenden Multiresistenzen der Tuberkuloseerreger, hervorgerufen durch den vorzeitigen Abbruch der Medikamenteneinnahme und durch mangelhafte Kontrollen des Therapieerfolges [WHO 2002]. In Deutschland wurden im Jahr 2001 bei 2,7 % aller infizierten Personen multiresistente Isolate gefunden [ROBERT-KOCH-INSTITUT 2002]. Diese Werte sind im Vergleich zu anderen Staaten wie Russland (7 %), Teilgebieten von Indien (14 %) oder Estland (22 %) sehr niedrig [STOKSTAD 2000]. 8 Literaturübersicht ______
Seit dem 1. Januar 2001 wird die Meldepflicht der Tuberkulose nicht mehr durch das Bundesseuchengesetz sondern durch das Infektionsschutzgesetz geregelt. Danach muss die Erkrankung und der Tod durch Tuberkulose, nicht aber der Verdachtsfall beim Menschen gemeldet werden [BUNDESGESETZBLATT 2000].
2.2.1.2 Ätiologie und Pathogenese
Die Tuberkulose wird beim Menschen in 99 % aller Fälle durch M. tuberculosis hervorgerufen. Infektionen mit M. africanum spielen lediglich in Westafrika eine Rolle. [MATTHIESSEN u. RADENBACH 1992]. Durch Bekämpfung der Rindertuberkulose und Pasteurisierung der Milch ist auch die Infektion des Menschen mit M. bovis sehr selten geworden [HAHN et al. 2001]. Die Übertragung erfolgt fast immer durch an einer „offenen“ Tuberkulose erkrankte Personen [HAHN et al. 2001]. Ein Patient gilt als ansteckungsfähig, wenn im Direktpräparat säurefeste Stäbchen nachgewiesen werden (ca. 5.000 Bakterien pro ml Sputum) [MAGNUSSEN u. KANKOW 2001]. In Deutschland infiziert jeder kontagiöse Patient mit einer „offenen“ Tuberkulose zwischen zwei und zehn Personen [HAHN et al. 2001]. Solange ein kultureller oder molekularer Nachweis einer Infektion, nicht jedoch die Erkrankung vorliegt, ist die Infektiosität deutlich geringer [VELCOVSKY u. SEEGER 1998]. Generell hängt das Infektionsrisiko von der Häufigkeit und Dichte des Kontaktes zu kontagiösen Menschen, von der Virulenz und Menge der aufgenommen Bakterien und der Resistenzlage der exponierten Person ab [ROBERT-KOCH-INSTITUT 2002]. Es besteht eine erhöhte Ansteckungsgefahr unter anderem für Kleinkinder, ältere Menschen, Alkoholabhängige und AIDS-Patienten [MAGNUSSEN u. KANKOW 2001]. Nach einer Infektion mit M. tuberculosis liegt das Erkrankungsrisiko für immunkompetente Menschen bei etwa 10 %. Bei HIV-Patienten erhöht sich dieses Risiko in den ersten zwei Jahren nach einer Infektion mit M. tuberculosis auf 30 – 50 % [BÖTTGER 2001].In 95 % aller Fälle werden erregerhaltige Sputumtröpfchen oder Staubpartikel mit einem Durchmesser von maximal 10 µm inhaliert [HAHN et al. 2001]. Die Tuberkuloseerreger gelangen über eine Lungenläsion in den Körper und werden dort von Makrophagen in Phagosomen aufgenommen. Allerdings verhindern Mykobakterien die Umwandlung des Phagosoms in ein Phagolysosom, wodurch sie der Zerstörung durch bakterizide Sauerstoff- und Stickstoffmetabolite sowie Verdauungsenzyme entgehen. Die Keime drosseln ihren 9 Literaturübersicht ______
Metabolismus und können in Makrophagen jahrelang überleben [KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002]. Durch Absterben von Makrophagen entsteht nach 10 – 14 Tagen an der Eintrittsstelle der Mykobakterien eine Entzündungsreaktion, der sogenannte Primärherd. Einige erregerhaltige Makrophagen gelangen in den lokalen Lymphknoten, wo sie eine T-Zellvermehrung auslösen. Primärherd und der lokale, durch Mykobakterien aktivierte Lymphknoten bilden zusammen den Primär- oder Ghon-Komplex [SHAH 2001, JUNGBLUT u. KAUFMANN 2002]. Die aktivierte zelluläre Immunantwort bewirkt einen Tropismus von Epitheloidzellen, Langhans- Riesenzellen, Fibroblasten, Lymphozyten und Makrophagen. Diese Zellen gruppieren sich um die käsige tuberkulöse Nekrose [SCHULZ u. TRAUTWEIN 1990] und bilden einen Abwehrwall um die zentral gelegenen Mykobakterien [FRIEDLAND 1999]. Je nach Inkubationszeit unterscheidet man die Primärtuberkulose, die durch eine Immundefizienz kurz nach einer Infektion auftritt, und die Postprimärtuberkulose, die häufiger bei Erwachsenen lange Zeit nach einer Infektion (> 5 Jahre) zu beobachten ist [GRANGE 1998, HAHN et al. 2001]. Bei der Primärtuberkulose kann es durch lymphogene und/oder hämatogene Ausbreitung der Bakterien im gesamten Körper zur Frühgeneralisation in Form einer akuten Miliartuberkulose mit zahlreichen, hirsekorngroßen Läsionen in den befallenen Organen kommen [BÖTTGER 2001, HAHN et al. 2001]. Diese Form tritt vor allem bei HIV-Patienten und Kindern auf und führt ohne Behandlung häufig zum Tod [MC KINNEY et al. 1998]. Meistens beschränkt sich aufgrund der günstigen Immunabwehr die Infektion auf den Primärherd bzw. -komplex. Trotzdem können in den verkalkten und vernarbten Herden lebenslang vermehrungsfähige Bakterien persistieren, die bei Schwächung des Immunsystems einen Ausgangsherd für eine postprimäre Tuberkulose bilden [HAHN et al. 2001]. Nach Reaktivierung der Herde kann im Inneren der Granulome eine bakterienhaltige Kaverne entstehen, die durch Einbruch in das Bronchialsystem eine offene Lungentuberkulose hervorruft oder durch Entleerung in das Blut- bzw. Lymphsystem in verschiedene Organe streut (Organtuberkulose) [HAHN et al. 2001]. Je nach Abwehrlage des Patienten kann es auch zu einer Spätgeneralisation kommen [GRANGE 1998].
2.2.1.3 Klinik
In der ersten Phase der Infektion mit Ausbildung des Primärkomplexes treten keine Krankheitssymptome auf. Im weiteren Verlauf können sich nach Streuung der Erreger in den 10 Literaturübersicht ______gesamten Körper unspezifische Symptome wie mäßiges Fieber, Appetitlosigkeit, Nachtschweiß, Gewichtsverlust und vermindertes Leistungsvermögen zeigen [NETTER 2001]. Je nach Lokalisation entwickelt der Patient im fortgeschrittenen Krankheitsstadium organbezogene Symptome [MAGNUSSEN u. KANKOW 2001]. Die häufigste Tuberkuloseform (> 90 %), die Lungentuberkulose, fällt je nach Schweregrad durch persistierenden Husten mit schleimig-eitrigem oder blutigem Auswurf auf. Im Krankheitsverlauf kann es zu einer Belastungsdyspnoe und durch Vergrößerung des Hiluslymphknotens zur Kompression der Bronchien kommen [MATTHYS 2000]. Gelangen Mykobakterien in den großen Körperkreislauf, können nach Manifestation in anderen Organen sogenannte extrathorakale Organtuberkulosen auftreten. Durch bevorzugten Befall des Ileocaecalbereichs kann es bei der Darmtuberkulose zu uncharakteristischen abdominalen Schmerzen, Ileus, Durchfall und Blut im Stuhl, aber auch zu einem Malabsorptionssyndrom kommen [DIETRICH et al. 2000]. Die urogenitale Form der Tuberkulose manifestiert sich meist durch eine rezidivierende Pyelonephritis mit späterer Niereninsuffizienz sowie durch eine Hämaturie [NETTER 2001]. Eine Meningitis tuberculosa äußert sich in Benommenheit, Kopfschmerzen, Schwindel und häufig Nackensteifigkeit. Da im Gegensatz zu anderen bakteriellen Meningitiden meist die Schädelbasis betroffen ist, kommt es zudem zu Ausfallerscheinungen basaler Gehirnnerven [BÖTTGER 2001]. Auch nach erfolgreicher Therapie können neurologische Schäden zurückbleiben [MALTEZOU et al. 2000]. Bei einer Knochen- oder Gelenkmanifestation ist oft die Wirbelsäule betroffen (Spondylitis tuberculosa). Aufgrund der Kompression des Rückenmarks durch Zerstörung von Wirbelkörpern treten Rückenschmerzen und - in schweren Fällen - eine Querschnittslähmung auf [DIETRICH et al. 2000, NETTER 2001]. Die Hauttuberkulose ist charakterisiert durch papulöse Entzündungen (Lupus vugaris) oder granulomatöse, warzenähnliche Läsionen (Tuberculosis verrucosa cutis) [DIETRICH et al. 2000]. Bei der tuberkulösen Perikarditis kommt es durch einen massiven Perikarderguss zur Reduzierung des Herzminutenvolumens [DEDIÉ et al. 1993]. Beide Formen treten sehr selten auf.
2.2.1.4 Diagnostik
Eine Anamnese mit sorgfältigem Hinterfragen der Familien- und Sozialverhältnisse im Zusammenhang mit den klinischen Symptomen kann eine Verdachtsdiagnose und Aufschluss 11 Literaturübersicht ______
über das Expositionsrisiko ergeben [MATTHYS 2000]. Die Verdachtsdiagnose lässt sich durch unterschiedliche bildgebende Verfahren wie Röntgen, Computertomographie und Sonographie erhärten [MAGNUSSEN u. KANKOW 2001]. Eine häufig eingesetzte Methode zur Feststellung einer spezifischen T-Zellaktivierung durch Mykobakterien ist der Tuberkulintest. Er kann entweder als Stempeltest (Tine-Test) oder als Intrakutantest nach Mendel-Mantoux durchgeführt werden. Beide Tests beruhen auf einer zellvermittelten Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV). Da es aufgrund einer BCG-Impfung oder durch Kreuzreaktionen mit apathogenen Mykobakterien zu falsch positiven Ergebnissen kommen und keine genaue Aussage über das Infektions- oder Krankheitsstadium gemacht werden kann, wird die Diagnose durch einen direkten Erregernachweis gesichert [MATTHYS 2000]. Für den bakteriellen Nachweis werden verschiedene Se- und Exkrete wie Bronchialsekret, Sputum, Liquor oder Stuhl verwendet. In diesem Material können durch eine licht- bzw. fluoreszenzmikroskopische Untersuchung mit Färbung nach Ziehl-Neelsen oder durch Auramin (Fluoreszenzfarbstoff) säurefeste Stäbchen nachgewiesen werden [FRIEDLAND 1999, HAHN et al. 2001]. Diese schnelle Methode ermöglicht die Beurteilung der Infektiosität anhand der Keimzahlbestimmung. Nachteilig ist die geringe Spezifität des Nachweises [MATTHYS 2000, HAHN et al. 2001]. Zusätzlich sollte daher ein kultureller Erregernachweis durchgeführt werden. Bei 37 °C und einer Bebrütungsdauer von maximal acht Wochen [HAHN et al. 2001] erfolgt die Kultivierung in Nährmedien auf Kartoffel- oder Eibasis (Löwenstein-Jensen-Medium, Middlebrook oder 7H10/11-Agar) [FRIEDLAND 1999, SALFINGER u. KAFADER 1992]. Während M. tuberculosis auf festen Nährböden krümelige, weiß-gelb-orange Kolonien bildet, wächst M. bovis mit glatten, flachen, pigmentlosen Kolonien. M. bovis BCG unterscheidet sich u.a. von M. bovis durch sein Oberflächenwachstum im Niveau-Agartest [SALFINGER u. KAFADER 1992]. Zur weiteren Differenzierung der Mykobakterienspezies werden biochemische Verfahren angewendet. So unterscheidet sich M. tuberculosis von M. bovis und den Mykobakterien der MOTT-Gruppe im Niacintest durch die Fähigkeit, Nikotinsäure zu bilden. Eine zweite Möglichkeit, Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplexes voneinander zu unterscheiden, ist der Nitratreduktionstest. Nur M. tuberculosis kann unter aeroben Bedingungen Nitrat zu Nitrit reduzieren. Ein dritter Test beruht auf der Eigenschaft einiger Mykobakterien, eine hitzesensitive Katalase zu bilden [VIRTANEN 1960, BÖTTGER 2001].
12 Literaturübersicht ______
Ein diagnostisches Schnellverfahren ist das BACTEC-System. Dabei wird die Eigenschaft 14 der Mykobakterien ausgenutzt, aus radioaktiv markierter Palmitinsäure [ C]CO2 freizusetzen, das sich radiometrisch messen lässt [FRIEDLAND 1999, BÖTTGER 2001]. Molekularbiologische Nachweismethoden nehmen in der Diagnostik einen zunehmend größeren Anteil ein. So kann das Genom der Mykobakterien durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit anschließender Detektion, beispielsweise durch Agarosegelelektrophorese, auf bestimmte DNA-Sequenzen hin untersucht werden [FRIEDLAND 1999]. Eine Weiterentwicklung des PCR-Verfahrens gelang mit dem LightCycler Real Time PCR-System der Fa. Roche [WITTWER et al. 1997]. Dieses System beruht auf einer PCR mit anschließender Detektion der PCR-Amplifikate durch DNA-DNA-Hybridisierung. Zum PCR- Ansatz werden fluoreszenzmarkierte Sonden hinzugefügt, die während der PCR und der anschließenden Schmelzkurvenanalyse eine Detektion des Fluoreszenzsignals ermöglichen. Während durch Einzelmessungen eines jeden PCR-Zyklus quantitative Informationen über die in der Probe enthaltene Targetmenge gewonnen werden, erhält man durch die Messung bei der Schmelzkurvenanalyse qualitative Aussagen über die Sequenz der Zielstuktur. Vorteil dieser Neuentwicklung ist die Zeitersparnis gegenüber anderen Verfahren, eine hohe Spezifität und ein geringeres Kontaminationsrisiko im Vergleich zu kulturellen Nachweisverfahren [LACHNIK 2002, STERMANN et al. 2003].
2.2.1.5 Therapie
Die Tuberkulose kann chemotherapeutisch (konservativ) oder chirurgisch behandelt werden. Die medikamentöse Therapie wird in der Regel ambulant durchgeführt. Eine stationäre Aufnahme kommt bei bakterienausscheidenden Patienten bis zur kulturellen Sputumkonversion, bei reaktiver Tuberkulose mit multiresistenten Erregern oder bei mangelhafter Kooperation des Patienten in Betracht [SHAH 2001]. Die Tuberkulostatika Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid, Streptomycin und Ethambutol stehen für die medikamntöse Therapie zur Verfügung. In der mindestens zweimonatigen Anfangsphase erhält der Patient eine Tripeltherapie aus Rifampicin, Isoniazid und Pyrazinamid [MATTHYS 2000]. Die Stabilisierungsphase erstreckt sich über vier bis sechs Monate, kann aber auch, z.B. bei der tuberkulösen Meningitis, bis zu insgesamt zwei Jahre dauern [SHAH 2001]. In dieser Phase werden Rifampicin und Isoniazid eingesetzt, da von 13 Literaturübersicht ______
Rifampicin die wenigsten primären Resistenzen und Rückfälle beschrieben werden. Bei schweren Krankheitssymptomen oder Unverträglichkeiten werden Streptomycin oder Ethambutol verwendet [MATTHYS 2000]. Die antibiotische Behandlung kann erheblich durch Resistenzen erschwert werden. Man spricht von multiresistenten Stämmen, wenn diese nicht mehr auf die beiden wichtigsten Tuberkulostatika Rifampicin und Isoniazid ansprechen [KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002]. Reservemittel mit schlechterer Verträglichkeit sind u.a. p-Aminosalicylsäure, Cycloserin und Ethionamid [LÜLLMANN et al. 1996]. Die Einsatz der Medikamente in der Langzeittherapie wird häufig durch deren Nebenwirkungen limitiert. Pyrazinamid, Rifampicin und Isoniazid können Hepathopathien verursachen. Zusätzlich kommt es gelegentlich zu einer Thrombopenie (Rifampicin), zu Polyneuropathien und epileptiformen Krämpfen (Isoniazid), zu allergischen Reaktionen (Isoniazid, Streptomycin), zur Einschränkung des Sehvermögens (Ethambutol) und zur Photosensibilisierung (Pyrazinamid) [SHAH 2001]. Die chirurgische Therapie wird mit Ausnahme von Notoperationen (Lungenbluten, spondylitische Lähmungen) meist nach medikamentöser Vorbehandlung durchgeführt. Sie ist indiziert, wenn der Restbefund in den Organen zu einem Rezidiv führen kann oder eine progressive Gewebszerstörung (z.B. bei Knochen- oder Gelenkstuberkulose) zu verhindern ist [MATTHYS 2000]. Zusätzlich sollte durch die Abgrenzung der Ansteckungsquelle eine weitere Übertragung verhindert werden. Aufgrund weltweit steigender Tuberkulosefälle, der Zunahme multiresistenter Mykobakterienstämme sowie der teilweise gravierenden Nebenwirkungen bei der Chemotherapie wird die Entwicklung neuer Medikamente vorangetrieben [BUTLER 2000]. Mit dem Wirkstoff Nitroimidazopyran, der die Synthese von bakteriellen Proteinen und Zellwandlipiden hemmt, wurden erste Untersuchungen im Tiermodell durchgeführt [STOVER et al. 2000].
2.2.1.6 Impfung
Derzeit ist lediglich ein Lebendimpfstoff gegen Tuberkulose zugelassen. Der BCG (Bacille Calmette-Guérin)-Impfstamm wurde von Albert Calmette und Camille Guérin zwischen 1908 und 1919 durch 230 Kulturpassagen aus einem pathogenen M. bovis Stamm entwickelt. Seit seinem ersten Einsatz 1921 wurde er an weltweit 3 Milliarden Menschen und jährlich 100 Millionen Neugeborene verabreicht und ist damit die am weitesten verbreitete 14 Literaturübersicht ______
Vakzine überhaupt [MC KINNEY et al. 1998, KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002]. Die BCG-Vakzine erschien ideal aufgrund geringer Kosten und Nebenwirkungen, einen zehn Jahre anhaltenden Impfschutz und ihrer Hitzestabilität. [STOVER et al. 1991, BÖTTGER 2001]. Die Effektivität dieses Impfstoffes ist jedoch umstritten. Während die BCG-Vakzine die meningeale Form sowie die Miliartuberkulose bei Kleinkindern verhindern kann, lag der Impfschutz bei der Lungentuberkulose des Erwachsenen in klinischen Studien zwischen 0 und 80 % [BLOOM u. FINE 1994, KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002]. Waren die Studienteilnehmer vor Beginn der Studie bereits apathogenen Mykobakterienstämmen exponiert, wurde durch den BCG-Impfstoff nur ein geringer Impfschutz erzielt. Demnach vermitteln auch apathogene Mykobakterien einen Schutz vor Tuberkuloseinfektionen [WILSON et al. 1995]. Dies wurde durch Untersuchungen im Mausmodell bestätigt, in denen M. kansasii und M. avium 85 % des BCG-Impfschutzes aufbauen [PALMER u. LONG 1966]. Nachteilig an einer BCG-Impfung ist die Tuberkulinkonversion: Der Tuberkulintest verliert seine Aussagekraft, da nicht zwischen einer T-Zellaktivierung durch Infektion bzw. infolge einer Impfung unterschieden werden kann [BÖTTGER 2001]. Eine Schutzimpfung mit M. bovis BCG ist zudem bei immunsupprimierten Patienten, insbesondere bei HIV-infizierten Kindern, problematisch. Aufgrund ihrer schlechten Immunabwehr kann es zu einer generalisierten Infektion, der disseminierten BCGitis mit meist tödlichem Ausgang, kommen [WELTMAN u. ROSE 1993, NEWPORT et al. 1996, BÖTTGER 2001]. Für Länder mit einer hohen Tuberkuloseprävalenz und -inzidenz wird eine BCG- Schutzimpfung von der WHO empfohlen. Bei HIV-positiven Patienten wird dagegen von einer Immunisierung abgesehen [WHO 1987]. Aufgrund der nicht sicher belegbaren Wirksamkeit des Impfstoffes sowie der günstigen epidemiologischen Situation empfehlen die WHO und die ständige Impfkommission (STIKO) des Robert-Koch-Instituts seit 1998 die BCG-Impfung in Deutschland nicht mehr [ROBERT- KOCH-INSTITUT 2002]. Weiterhin strebt die WHO weltweit neben der Impfung eine effektive Tuberkulosebekämpfung durch die sogenannten DOTS-Strategien (directly observed treatment, short-course) an. Dazu gehören die Entdeckung Infizierter mittels bakteriologischer Sputumuntersuchungen, eine standardisierte Chemotherapie mit überwachter Medikamenteneinnahme sowie die Registrierung von Patienten und Behandlungsergebnissen 15 Literaturübersicht ______
[ROBERT-KOCH-INSTITUT 2000]. Hierdurch sollen 70 % aller Neuinfektionen aufgedeckt und 85 % dieser Fälle geheilt werden [WHO 2002]. Die Entwicklung eines neuen Impfstoffes ist insbesondere für Länder mit einer hohen Tuberkuloseprävalenz und -inzidenz dringend erforderlich. Dieser Impfstoff sollte die Infektion und die Ausbreitung des Erregers im Körper verhindern sowie die Effizienz der medikamentösen Behandlung verbessern [GINSBERG 2002]. Die sich derzeit in der Entwicklung befindenden Impfstoffe sind Spaltvakzinen und Lebendimpfstoffe. Spaltvakzinen bestehen aus Antigenen, die von T-Zellen erkannt werden und zur Ausbildung einer Immunantwort führen [JUNGBLUT u. KAUFMANN 2002]. Als Antigene werden nackte DNA-Konstrukte oder mykobakterielle Komponenten, wie Proteine, selten auch Lipid- oder Kohlenhydratuntereinheiten, genutzt [GINSBERG 2002]. Durch Lebendimpfstoffe kann eine höhere Aktivierung der T-Zellen erreicht werden [KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002]. Untersucht werden attenuierte und apathogene Mykobakterien, genetisch veränderte BCG-Impfstämme sowie Vakzinen, die lebende, attenuierte, nicht mykobakterielle Vektoren wie z.B. Salmonella enthalten. Seit 1997 wurden bereits 170 in Frage kommende Impfstoffe im Tiermodell getestet [GINSBERG 2002]. Aufgrund der ausstehenden klinischen Studien wird voraussichtlich mindestens ein Jahrzehnt vergehen, bis ein neuer Impfstoff zur Marktreife gelangt [KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002].
2.2.2 Tuberkulose bei Tieren
2.2.2.1 Epidemiologie und Bedeutung
Bei Tieren wird die Tuberkulose in der Regel durch M. bovis, seltener durch M. tuberculosis oder M. avium, verursacht [TRAUTWEIN 2002]. Im Jahre 1882 entdeckte Robert Koch die Tuberkelbakterien. Allerdings gelang ihm erst 1901 der Nachweis, dass zwei unterschiedliche Stämme für die Erkrankung des Menschen und des Tieres verantwortlich sind [SELBITZ 2002]. Die am weitesten verbreitete Form der Tuberkulose bei Tieren ist die in Deutschland anzeigepflichtige Rindertuberkulose. Tierseuchenrechtlich fällt darunter allerdings nur die Infektion mit M. bovis, auch wenn Rinder für Infektionen mit M. tuberculosis, M. africanum, M. avium und einigen atypischen Mykobakterienstämmen empfänglich sind [SELBITZ 2002]. 16 Literaturübersicht ______
Obwohl in vielen Industrienationen wie Kanada und Deutschland die Tuberkulose des Rindes als ausgelöscht gilt [HUNTER 1996, SELBITZ 2002], kommt es in Deutschland immer wieder zu einzelnen Erkrankungen. Die letzten drei Fälle wurden im März 2003 in Niedersachsen und Baden-Württemberg gemeldet [BUNDESMINISTERIUM FÜR ERNÄHRUNG, LANDWIRTSCHAFT UND FORSTEN 2003]. In Entwicklungsländern ist der Durchseuchungsgrad mit M. bovis wesentlich höher. Dort ist eine Bekämpfung durch unzureichende Kontrollen bei den Haustieren [COSIVI et al. 1998] und durch eine umfangreiche Wildtierpopulation, die ein Reservoir für M. bovis bildet, erschwert [DE LISLE et al. 2002]. Auch in Industrienationen tritt die Tuberkulose in der Wildtierpopulation gelegentlich auf [HUNTER 1996]. So wurde eine weite Verbreitung von M. bovis in Dachsen in England nachgewiesen. In Neuseeland können kleine Beuteltiere (Fuchskusus, Trichosurus vulpecula) diese Bakterien übertragen [CLIFTON-HADLEY u. WILESMITH 1991, SELBITZ 2002]. M. bovis kann nicht nur Rinder und andere Wiederkäuer wie Schafe und Ziegen [MORRIES et al. 1994], sondern auch Monogastrier wie Schweine [ARANAZ et al. 1996], Pferde, Hunde und seltener Katzen infizieren. Auch Zootiere [THOREL et al. 1998] und viele Wildtierspezies sind von Infektionen mit M. bovis betroffen [CLIFTON-HADLEY u. WILESMITH 1991, MORRIES et al. 1994, COSIVI et al. 1995, O´REILLY u. DABORN 1995, SELBITZ 2002]. Die bovine Tuberkulose ist eine der wichtigsten Zoonosen. Liegt eine aktive Rindertuberkulose vor, so kann sich der Mensch mit M. bovis infizieren [TRAUTWEIN 2002]. Auch die Übertragung von M. bovis durch Seehunde, Elche und Nashörner auf den Menschen wurde beobachtet [FANNING u. EDWARDS 1991, DALOVISIO et al. 1992, THOMPSON et al. 1993].
Neben der bovinen Tuberkulose spielt bei den Nutztieren die durch M. avium ssp. paratuberculosis verursachte, meldepflichtige Paratuberkulose eine bedeutende Rolle. Die auch als Johnesche Krankheit bekannte Paratuberkulose ist weltweit, vor allem aber in Ländern mit intensiver Rinderhaltung, verbreitet [KLEE 2002]. In den Vereinigten Staaten liegt die Prävalenz in Betrieben mit mehr als 300 Tieren bei annähernd 40 % [MANNING u. COLLINS 2001]. Betroffen sind neben den großen und kleinen Wiederkäuern auch Kamele, Schweine, Affen und Kaninchen [KLEE 2002]. Durch den Nachweis von M. avium ssp. paratuberculosis wurde 2002 in Deutschland der erste Fall einer Erkrankung an Paratuberkulose beim Menschen diagnostiziert [RICHTER et al. 2002]. 17 Literaturübersicht ______
Vögel erkranken an der durch M. avium ssp. avium verursachten Geflügeltuberkulose. Durch diese in Deutschland meldepflichtige Tierkrankheit sind vor allem kleine, überalterte Hühnerbestände, die unter schlechten hygienischen Bedingungen extensiv gehalten werden, gefährdet. Aber auch Wildvögel, insbesondere Greifvögel, und Ziervögel werden von diesem Erreger infiziert [HOOP et al. 1996, SELBITZ 2002]. M. avium ssp. avium kann für den Menschen pathogen sein. Eine Erkrankung setzt jedoch eine vorherige Immunsuppression, z.B. durch AIDS, voraus [SCOPE 1999].
Seltener, aber durchaus bekannt, sind Infektionen mit M. tuberculosis bei Tieren, beispielsweise bei Papageien, Affen und Elefanten [SELBITZ 2002].
2.2.2.2 Ätiologie und Pathogenese
Der häufigste Übertragungsweg von M. bovis ist, wie bei der humanen Tuberkulose, die Tröpfcheninfektion. Auch Kontakt mit infektiösen Ausscheidungen wie Faeces, Urin, Gebärmutterausfluss, Ejakulat oder Milch kann zur Ansteckung führen [COSIVI et al. 1995, SELBITZ 2002]. Meist infizieren sich Rinder direkt oder mittelbar durch Artgenossen ihrer Herde. Seltener kommt es dagegen zur Ansteckung durch Wildtiere (z.B. Rotwild) [TRAUTWEIN 2002] oder durch mit M. bovis infizierte Menschen [GRANGE u. YATES 1994]. Darüber hinaus kann aufgrund der hohen Tenazität des Erregers eine Infektion durch Aufnahme kontaminierter Kadaver, Beutetiere [WHIPPLE et al. 1997] oder durch kontaminiertes Weidefutter nicht ausgeschlossen werden [MORRIES et al. 1994]. Die Pathogenese der Tuberkulose bei Tieren ist der humanen Tuberkulose sehr ähnlich (siehe 2.2.1.2). Beim Rind befindet sich der tuberkulöse Primärherd zu 90 % in der Lunge, bei Hunden und Katzen ist er dort in ca. 50 % der Fälle lokalisiert. Bei Pferden und Schweinen sowie bei Kälbern (80 %) und Vögeln (100 %) sitzt der Primärherd hauptsächlich im Verdauungstrakt. Bei Katzen konnte ein Primärherd auch am Auge oder in der Haut beobachtet werden [SCHULZ u. TRAUTWEIN 1990]. In der sogenannten Erstinfektionsperiode kommt es je nach Resistenzlage der Tiere zur bindegewebigen Abkapselung noch lebender infektionsfähiger Tuberkelbakterien oder zur Frühgeneralisation. Eine Heilung ist bei Tieren außerordentlich selten. Durch Schwächung des Immunsystems oder durch eine Superinfektion kommt es zur Ausbreitung der Erreger, die eine chronische Organtuberkulose oder eine Spätgeneralisation zur Folge hat [SCHULZ u. TRAUTWEIN 1990]. 18 Literaturübersicht ______
Abhängig von der Tierart, der Art der Erreger und der Reaktionslage des Organismus ist entweder eine vorwiegend exsudative oder eine proliferative, granulomatöse Entzündung zu beobachten [BUCHAN u. GRIFFIN 1990, WEISS u. RUDOLPH 1999]. Während für die exsudative Entzündung eine massive Ansammlung von eiweißreichem Exsudat mit einer Koagulationsnekrose (primäre Verkäsung) charakteristisch ist, führt die proliferative Entzündungsreaktion zur Ausbildung der typischen Granulome [SELBITZ 2002]. Die exsudative Form wird häufig bei Pferden und Fleischfressern angetroffen, die proliferative Entzündung steht bei den Wiederkäuern (Rind, Schaf, Ziege) im Vordergrund. [SCHULZ u. TRAUTWEIN 1990].
2.2.2.3 Klinik
Eine klinisch manifeste Rindertuberkulose tritt in Deutschland selten auf. Meist wird nur aufgrund von Schlachtbefunden ein Verdacht ausgesprochen [SELBITZ 2002]. Durch die lange Inkubationszeit können bis zum Auftreten erster Krankheitssymptome mehrere Jahre vergehen. Erst in der Früh- oder Spätgeneralisation (Niederbruchphase) treten Anzeichen wie Fieber, Inappetenz, Mattigkeit und/oder rasche Abmagerung auf. Die Tiere sterben dann innerhalb weniger Wochen. Bei der chronischen Organtuberkulose können je nach befallenem Organ weitere spezifische Merkmale hinzukommen. Bei der chronischen bovinen Lungentuberkulose zeigt das erkrankte Tier fortschreitenden Husten mit schleimigem Auswurf sowie verstärkte Atemgeräusche [TRAUTWEIN 2002]. Auch insbesondere Euter, Nieren, Darm und Gebärmutter können von der Tuberkulose betroffen sein [SELBITZ 2002]. Wie beim Rind dominiert bei Schafen und Ziegen die Lungentuberkulose. Bedingt durch die alimentäre Infektion findet man bei Schweinen, Pferden, Hunden und Katzen dagegen häufiger die Darmtuberkulose mit den entsprechenden Symptomen vor [SELBITZ 2002].
Auch die Geflügeltuberkulose, ausgelöst durch M. avium ssp. avium, beginnt mit einer Manifestation im Darm. Nach der hämatogenen Generalisation zeigen die Vögel uncharakteristische Symptome wie Abmagerung, Durchfall und Lahmheit [SELBITZ 2002].
Eine Infektion mit M. tuberculosis löst bei Rindern normalerweise keine Erkrankung aus. Allerdings entwickelt sich ein Primärkomplex und eine mehrmonatige Tuberkulinsensitivität [SELBITZ 2002].
19 Literaturübersicht ______
2.2.2.4 Diagnostik
In der Bundesrepublik Deutschland begann 1952 die Tuberkulosebekämpfung beim Rind mit Hilfe des Tuberkulintests. Bereits zehn Jahre später galt die Rindertuberkulose als ausgerottet [SELBITZ u. BISPING 1995]. Seit wenigen Jahren wird auf die regelmäßige Tuberkulinuntersuchung verzichtet. Die Kontrolle beschränkt sich auf die Untersuchung des Schlachttieres. Im Verdachtsfall werden Proben veränderter Organe entnommen und nach einer Ziehl-Neelsen-Färbung mikroskopisch untersucht [SELBITZ 2002]. Beim Nachweis säurefester Stäbchen wird nach kultureller Anzucht durch molekularbiologische Verfahren eine Speziesdiagnose erstellt [TRAUTWEIN 2002]. Am lebenden Rind wird zum Tuberkulosenachweis der Tuberkulintest durchgeführt. Die Anwendung des Tests ist in den Anlagen der VERORDNUNG ZUM SCHUTZ GEGEN DIE TUBERKULOSE DES RINDES (Neufassung vom 13.07.1997) festgelegt. Mindestens 5.000 Internationale Einheiten (I.E.) Rindertuberkulin werden intrakutan an Hals oder Schulter des Rindes injiziert. Liegt eine mykobakterielle Infektion vor, wird in immunkompetenten Tieren eine allergische Reaktion vom verzögerten Typ (Typ IV) ausgelöst [SCHULZ u. TRAUTWEIN 1990]. Es kommt zu einer umschriebenen Entzündungsreaktion mit Schwellung, Rötung und Druckempfindlichkeit [TRAUTWEIN 2002]. Bei einer Zunahme der Hautdicke von mehr als 4 mm sowie bei Entzündungsreaktionen liegt eine mykobakterielle Infektion vor. Nimmt die Hautdicke innerhalb von 72 Stunden weniger als 2 mm zu und ist keine Gewebsreaktion festzustellen, ist der Test negativ. Eine Hautdickenzunahme zwischen 2 und 4 mm ohne klinische Anzeichen lässt keine klare Bewertung zu [VERORDNUNG ZUM SCHUTZ GEGEN DIE TUBERKULOSE DES RINDES 1997]. Diese Tiere können sechs Wochen nach dem ersten Test durch eine simultane Untersuchung mit bovinem und aviärem Tuberkulin auf eine Infektion mit M. avium überprüft werden [TRAUTWEIN 2002]. Die Aussage des Tuberkulintests ist vorsichtig zu interpretieren, weil durch Infektionen mit anderen Mykobakterien Kreuzreaktionen auftreten können, die zu falsch positiven Ergebnissen im Sinne der Tuberkulose-Verordnung führen [TRAUTWEIN 2002]. Das zur Zeit zuverlässigste immunologische Verfahren zum Nachweis der Rindertuberkulose am lebenden Tier ist der als Ergänzung zu der Tuberkulinprobe entwickelte Interferon-γ-Test (IFNγT). Nach 24stündiger Inkubation von Blutleukozyten des tuberkuloseverdächtigen Tieres mit bovinem Tuberkulin kann man im Zellüberstand freigesetztes IFN-γ mittels Enzym-Immun-Assay (EIA) quantifizieren. Diese Methode wird u.a. in Australien, USA und Irland zur Diagnostik eingesetzt [TRAUTWEIN 2002]. 20 Literaturübersicht ______
Die Diagnose der Geflügeltuberkulose lässt sich meist durch den mikroskopischen Nachweis säurefester Stäbchen im Zusammenhang mit dem klinischen Bild stellen. Gestützt wird sie durch den Nachweis tuberkulöser Granulome, beispielsweise im Darm der Tiere. Am lebenden Tier wird die Erkrankung mit Hilfe des aviären Tuberkulintests diagnostiziert [SELBITZ 2002].
2.2.2.5 Therapie und Bekämpfung
Durch Tuberkulostatika wäre eine Heilung der Tuberkulose auch bei Tieren möglich [TRAUTWEIN 2002]. Therapieversuche oder Impfungen mit dem M. bovis BCG Impfstamm werden aber nur in Ausnahmefällen und bei seltenen Tierarten (Zoo) vorgenommen [SELBITZ 2002], da die Verordnung zum Schutz gegen die Tuberkulose diese Maßnahmen in Deutschland normalerweise verbietet [TRAUTWEIN 2002]. In dieser Verordnung sind die Schutzmaßregeln, die bei Verdacht oder amtlicher Feststellung der durch M. bovis verursachten Tuberkulose ergriffen werden, festgelegt. Seuchenkranke Tiere müssen, seuchenverdächtige Tiere können getötet werden. Auch Wildtiere können in die Bekämpfungsmaßnahmen mit einbezogen werden [SELBITZ 2002]. Seit 1962 gilt Deutschland als Rindertuberkulose-freies Land. Nach dem Tierseuchengesetz (2001) dürfen Rinder in Deutschland nur mit amtstierärztlicher Bescheinigung über die Tuberkulosefreiheit des Herkunftsbetriebes zu Nutz- bzw. Zuchtzwecken importiert oder innerhalb Deutschlands verkauft werden. Bestände aus Betrieben, die als nicht tuberkulosefrei gelten, dürfen lediglich zur Schlachtung abgegeben werden [TRAUTWEIN 2002].
Die meldepflichtige Geflügeltuberkulose wird in der Regel nicht therapiert. Der Bestand wird ausgetauscht und die kontaminierten Ausläufe langfristig gesperrt. Zur Prophylaxe sollten verstärkt Hygiene- und Desinfektionsmaßnahmen ergriffen sowie eine kontinuierliche Gesundheitsüberwachung angestrebt werden [SELBITZ 2002].
2.3 Nitrat- und Nitritstoffwechsel
Für die Entwicklung eines neuen Impfstoffes ist die Kenntnis der mykobakteriellen Stoffwechselwege unverzichtbar. Besondere Bedeutung kommt dabei dem Nitrat- und Nitritstoffwechsel zu. Dieser ist für viele Bakterien ein Weg zur alternativen 21 Literaturübersicht ______
Energiegewinnung und könnte bei Mykobakterien eine jahrelange Latenz in den Granulomen ermöglichen. Im Folgenden soll auf diese Stoffwechselwege bei Bakterien im Allgemeinen und bei Mykobakterien im Speziellen eingegangen werden.
2.3.1 Nitratstoffwechsel bei Bakterien
Neben Ammonium dient insbesondere Nitrat den Bakterien und Pflanzen als Stickstoffquelle [SCHLEGEL 1992, LIN u. STEWART 1998]. Nitrat kann mit Hilfe einer Nitratreduktase zur Assimilation, zur Respiration oder zur Dissimilation verwendet werden.
Bei der Assimilation wird mit Hilfe einer im Zytoplasma lokalisierten Nitratreduktase Nitrat zu Nitrit umgesetzt. Dieses wird zu Ammonium reduziert, das den Bakterien zur Synthese von stickstoffhaltigem Zellmaterial und Aminosäuren dient. Die für die Reduktion benötigten Elektronen stammen aus NAD(P)H [SCHLEGEL 1992]. Die assimilatorische Nitratreduktase ist bei vielen Bakterien vorhanden und bereits, z.B. als NasAB bei Bacillus subtilis oder NasAC bei Klebsiellla oxytoca (pneumoniae), klassifiziert worden. Das in vitro labile Enzym besteht aus einem Molybdän-Cofaktor und je vier Eisen- und Schwefelatomen [LIN u. STEWART 1998]. Es wird sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen gebildet, wenn lediglich Nitrat als Stickstoffquelle vorhanden ist. In Anwesenheit von Ammonium wird in der Regel die Bildung des assimilatorisch- nitratreduzierenden Enzyms gesenkt [SCHLEGEL 1992].
Bei der Respiration sowie bei der Dissimilation kommt es mit Hilfe eines Reduktaseenzyms zum Aufbau eines elektrochemischen Gradienten durch eine Membrantransferkette. Im Rahmen der Respiration ist der Elektronenfluss an einen protonentransportierenden Komplex gekoppelt und wird zur Bildung von ATP verwendet. Werden die reduzierenden Äquivalente ohne Kopplung an eine Protonentransportkette umgesetzt und folgt keine ATP-Bildung, spricht man von der Dissimilation [MORENO- VIVIAN u. FERGUSON 1998]. Fakultativ anaerob wachsende Bakterien (E. coli, Staphylococcus carnosus) und strikt aerobe Bakterien (Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa) besitzen eine anaerobe, respiratorische Nitratreduktase NarGHJI [NAKANO u. ZUBER 1998, PANTEL et al. 1998, PHILIPPOT u. HØJBERG 1999]. 22 Literaturübersicht ______
Die einzelnen Untereinheiten dieses membrangebundenen Enzyms sowie dessen Funktion sind für E. coli detailliert beschrieben worden [PHILIPPOT u. HØJBERG 1999]. Die Nitratreduktase besteht aus den zytoplasmatischen Untereinheiten alpha und beta, der menbranständigen gamma-Untereinheit sowie einigen Cofaktoren. Die α-Untereinheit ist narG-kodiert. Sie enthält ein Eisen-Schwefel-Zentrum sowie einen Molybdän-Cofaktor. Die durch narH kodierte β-Untereinheit besitzt speziesabhängig zwischen einem und drei Eisen- Schwefel-Zentren, die durch Cystein verankert sind. Die α- und die β-Untereinheit sind reversible Redoxsysteme, die ein katalytisches Zentrum für die Elektronenübertragung von Nitrat auf Nitrit bilden. Die narI-kodierte γ-Untereinheit ist ein hydrophobes Protein mit fünf transmembranalen α-Helices, einem periplasmatischen N-Terminus und einem cytoplasmatischen C-Terminus. Die Helices umgeben zwei über Histidin verankerte Häm- Moleküle. Das narJ-Gen kodiert ein Protein, das für die Reifung der α- und β-Untereinheit sowie für die Bereitstellung des α-β-γ-Komplexes benötigt wird.
Abb.2.1: Schematische Darstellung der Organisation der α-, β- und γ-Untereinheiten der anaeroben Nitratreduktase NarGHJI von E. coli [PHILIPPOT u. HØJBERG 1999]
Die Abbildung zeigt den Elektronenfluss innerhalb der Untereinheiten. Durch verschiedene Cofaktoren werden die Elektronen in der Bakterienmembran auf Chinone (in der 23 Literaturübersicht ______
Abbildung als Q dargestellt) übertragen. Von diesen erfolgt ein Transfer auf die Häm- Gruppen der γ-Untereinheit, die die Elektronen zur β-Untereinheit leiten. Die Eisen-Schwefel- Zentren dieser Untereinheit übertragen die Elektronen auf die α-Untereinheit, wo die Reduktion des Nitrats zu Nitrit erfolgt. Gleichzeitig mit dem Elektronentransport wird ein Protonengradient aufgebaut. Einerseits werden durch die Oxidation der Chinone Protonen an die periplasmatische Seite der Bakterienmembran abgegeben, andererseits werden Protonen bei der Reduktion von Nitrat im Zytoplasma verbraucht. Der Protonengradient an der Zellmembran dient der Synthese von ATP für den bakteriellen Stoffwechsel unter anaeroben Bedingungen [PHILIPPOT u. HØJBERG 1999]. Die Bildung der anaeroben Nitratreduktase wird durch die Nitratkonzentration beeinflusst. Bei niedrigen Konzentrationen ist das narGHJI-Gencluster in E. coli nur schwach, bei hohen Nitratkonzentrationen dagegen maximal exprimiert [WANG et al. 1999]. Die Nitratreduktase ermöglicht unter anaeroben Bedingungen das Wachstum der obligat aeroben Bakterien Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa [NAKANO u. ZUBER 1998].
Es ist durchaus möglich, dass ein Enzym unter verschiedenen metabolischen Bedingungen alle drei Varianten der Nitratreduktion katalysiert, andererseits können verschiedene, durch unterschiedliche Gene kodierte Nitratreduktasen in einem Bakterium vorkommen [MORENO-VIVIAN u. FERGUSON 1998]. Die periplasmatische Nitratreduktase NapABC von E. coli besitzt respiratorische und dissimilatorische Funktionen. Sie dient im Allgemeinen der Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichtes unter anaeroben Bedingungen [LIN u. STEWART 1998], jedoch kann sie unter bestimmten Voraussetzungen auch an der Erzeugung einer protonentransportierenden Kraft beteiligt sein und respiratorische Aufgaben erfüllen [MORENO-VIVIAN u. FERGUSON 1998].
2.3.2 Nitratstoffwechsel bei Mykobakterien
2.3.2.1 Aerobe (assimilatorische) Nitratreduktion
Einige Mykobakterien (M. tuberculosis und M. smegmatis) können durch die Nitratassimilation Nitrat als alleinige Stickstoffquelle verwenden [HEDGECOCK u. COSTELLO 1962, RATLEDGE 1982]. VIRTANEN stellte 1960 in seinen Untersuchungen bei M. tuberculosis, nicht jedoch bei M. bovis BCG, eine Reduktion von Nitrat unter aeroben 24 Literaturübersicht ______
Bedingungen fest. Er widersprach damit den Beobachtungen von DE TURK u. BERNHEIM aus dem Jahre 1958, wonach auch M. bovis BCG Nitrat assimiliert. Daraufhin wurde der Nitratreduktasenachweis von VIRTANEN zur Unterscheidung dieser beiden Spezies in die mikrobielle Diagnostik eingeführt; noch heute wird er unter aeroben Bedingungen angewendet. Ferner lässt sich die Nitratreduktaseaktivität einiger Mykobakterien unter aeroben Bedingungen durch Elektronendonatoren (z.B. Fettsäuren) steigern [BÖNICKE et al. 1970, ESCOTO u. DE KANTOR 1978]. Bei der DNA-Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurden allerdings keine Gensequenzen gefunden, die eine Homologie zu den Genen einer assimilatorischen Nitratreduktase anderer Bakterien, wie NasAB bei Bacillus subtilis, besitzen [COLE et al. 1998]. Bis zu Beginn dieser Arbeit war unklar, welche Gene von M. tuberculosis und M. bovis BCG die assimilatorische Nitratreduktase kodieren.
2.3.2.2 Anaerobe Nitratreduktion
Bei den obligat aeroben Mykobakterien ist eine Kultivierung unter anaeroben Bedingungen bislang nicht gelungen. Es werden dennoch anaerobe Stoffwechselwege vermutet, da Mykobakterien in Granulomen, in denen ein anaerobes bzw. mikroaerophiles Milieu zu herrschen scheint [BARCLAY u. WHEELER 1989], über Jahre hinweg überleben können. MANABE und BISHAI 2000 sowie WAYNE und SOHASKEY 2001 stellten die These auf, dass die Anpassung an anaerobe bzw. mikroaerophile Bedingungen in vivo eine Voraussetzung für die mykobakterielle Latenz ist. Die Beobachtung, dass in chronisch infiziertem Gewebe hohe Nitratkonzentrationen vorkommen [BOGDAN 2001], und der Nachweis von Nitrat in Makrophagen während einer M. bovis BCG Infektion [STUEHR u. MARLETTA 1987] zeigen, dass Substrat für eine anaerobe Nitratreduktion auch in vivo vorhanden ist. Bei M. tuberculosis wurden bei der Sequenzierung des Genoms Gene mit einer 55%igen Homologie zu denen der anaeroben Nitratreduktase NarGHJI von Bacillus subtilis und E. coli gefunden. [COLE et al. 1998]. Der Beweis, dass das narGHJI-Gen von M. tuberculosis eine anaerobe Nitratreduktase kodiert, wurde 2001 durch FRITZ erbracht. Die Genome von M. tuberculosis und M. bovis stimmen zu mehr als 99,9 % überein [GARNIER et al. 2003]. Auch M. bovis BCG verfügt über das narGHJI-Gencluster [WEBER 2000]. Anhand der Attenuierung einer narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG konnte 25 Literaturübersicht ______geschlossen werden, dass die anaerobe Nitratreduktase NarGHJI für die Pathogenese einer Infektion im Mausinfektionsmodell eine entscheidene Rolle spielt [FRITZ et al. 2002].
2.3.3 Nitritstoffwechsel bei Bakterien
Grundsätzlich sind zwei unterschiedliche Wege des Nitritstoffwechsels bekannt: Einige aerobe, strikt respiratorische Bakterien (Bacillus licheniformis, Pseudomonas aeruginosa) vermögen unter anaeroben Bedingungen durch Denitrifizierung Nitrit über Stickstoffmonoxid (NO) zu den gasförmigen Verbindungen Distickstoffoxid und Stickstoff zu reduzieren und freizusetzen (NO2 NO N2O N2). Jeder Reaktionsschritt wird durch ein eigenes Enzym katalysiert [SCHLEGEL 1992, PHILIPPOT u. HØJBERG 1999]. Für die Reduktion von Nitrit zu Stickstoffmonoxid wurden bei den denitrifizierenden Bakterien zwei strukturell unterschiedliche Nitritreduktasen, kodiert durch nirK bzw. durch nirS, beschrieben [CASCIOTTI u. WARD 2001]. Bei dem zweiten Weg wird Nitrit durch eine Nitritreduktase über Stickstoffmonoxid und
Hydroxylamin zu Ammoniak reduziert (NO2 HNO NH2OH NH3) [SCHLEGEL 1992, PHILIPPOT u. HØJBERG 1999].
Man unterscheidet analog der Nitratreduktion auch bei der Nitritreduktion drei unterschiedliche Formen: Eine assimilatorische Nitritreduktase, bei der das aus Nitrit gebildete Ammonium zum Einbau in Proteine und damit zum Wachstum verwendet wird, wurde bei einigen obligat aeroben Bakterien (Bacillus subtilis) und bei den aerob bis fakultativ anaerob wachsenden Klebsiella oxytoca (pneumoniae) beschrieben [LIN et al. 1993, NARKANO et al. 1998]. Während Klebsiella oxytoca (pneumoniae) ein nasB-Gen besitzt, das eine aerobe NADH- abhängige Nitritreduktase kodiert [LIN et al. 1993], wird eine analoge Nitritreduktase in Bacillus subtilis durch den Genort nasDEF kodiert. Die Besonderheit des zuletzt genannten Gens ist, dass es durch unterschiedliche Regulatorgene sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen aktiviert werden kann. TnrA reguliert die Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen. Bei Sauerstofflimitierung und Anwesenheit von Nitrit wird die anaerobe Nitritreduktase durch das aus zwei Komponenten bestehende System ResDE reguliert [NAKANO et al. 1998].
26 Literaturübersicht ______
Bei der anaeroben Nitritreduktion wird je nach Nutzung des Nitrits zwischen der respiratorischen und der dissimilatorischen Nitritreduktion unterschieden. Bei Enterobakterien (z.B. E. coli) ist jeweils eine respiratorische und eine dissimilatorische, anaerobe Nitritreduktase bekannt. Die respiratorische Nitritreduktion dient der Energiegewinnung. Die entsprechende Nitritreduktase wird bei E. coli durch das Gen NrfAB kodiert [PAGE et al. 1990]. Die für E. coli bedeutendere anaerobe, dissimilatorische Nitritreduktase wird durch das Gen nirBD kodiert. Ihre Aufgabe besteht in der Detoxifikation des Nitrits, das im Rahmen der Nitratrespiration akkumuliert, und in der Regeneration von NAD+ [PAGE et al. 1990]. NADH überträgt Elektronen auf FAD; von dort werden sie über einen Eisen-Schwefel-Cluster und das Hämderivat Sirohäm auf Nitrit übertragen, das zu Ammonium reduziert wird [COLANDENE u. GARRETT 1996]. Diese beiden anaeroben Nitritreduktasen werden in E. coli unter unterschiedlichen Bedingungen exprimiert. Generell bewirkt die Anwesenheit von Nitrat und/oder von Nitrit unter anaeroben Bedingungen die Expression beider Gene. Bei geringen Nitratmengen wird das nrfAB-Gen vermehrt transkribiert, während bei hohen Nitratmengen eine nrfAB- Expression zugunsten der von nirBD unterdrückt wird [WANG u. GUNSALUS 2000].
2.3.4 Nitritstoffwechsel bei Mykobakterien
2.3.4.1 Aerobe (assimilatorische) Nitritreduktion
Bei den Mykobakterien sind die Beobachtungen hinsichtlich der Nitritassimilation widersprüchlich. Bereits 1958 wurde sie bei M. bovis BCG beschrieben [DE TURK u. BERNHEIM 1958]. Jedoch vermochten keine der von VIRTANEN 1960 untersuchten saprophytären und pathogenen Mykobakterien Nitrit zu assimilieren. Stattdessen führte die Zugabe von Nitrit zu einem Sistieren des Wachstums. In diesen Untersuchungen wurde ein Phosphatpuffer und eine Nitritkonzentration von 1,25 mmol/l eingesetzt. HEDGECOCK und COSTELLO stellten 1962 fest, dass M. tuberculosis (H37Ra) Nitrit als alleinige Stickstoffquelle im Kirchnermedium zum Wachstum nutzen kann. Sie zeigten, dass lediglich geringe Nitritkonzentrationen (5µg/ml) dieses Wachstum ermöglichen, höhere dagegen inhibierend wirken. Diese Ergebnisse bestätigten WAYNE und DOUBEK 1965, indem sie eine Inhibition des Wachstums von M. tuberculosis mit Nitritzusätzen von 10 mmol/l zeigten. Auch schnellwachsende Mykobakterien wie M. smegmatis, M. phlei oder M. vaccae können 27 Literaturübersicht ______in Phosphatpuffer mit Kohlenhydraten wie Glycerin oder Glukose unter aeroben Bedingungen Nitrit reduzieren [BÖHNICKE u. KADZA 1970]. M. avium wächst in Anwesenheit von bis zu 2 mmol/l Nitrit [MC CARTHY 1987]. Trotz dieser Beobachtungen, die für eine Nitritassimilation durch Mykobakterien sprechen, wurde bei der DNA-Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis kein Gen mit einer Homologie zu dem Genort einer assimilatorischen Nitritreduktase anderer Bakterien (z.B. NasDEF) gefunden [COLE et al. 1998]. Zu Beginn dieser Arbeit war unklar, welche Gene von M. tuberculosis und M. bovis BCG unter aeroben Bedingungen die Reduktion von Nitrit zu Ammonium ermöglichen.
2.3.4.2 Anaerobe Nitritreduktion
Bei Mykobakterien ist bisher wenig über eine anaerobe Nitritreduktase bekannt. Im Rahmen ihrer Studien stellten WAYNE und HAYES 1998 bei der Untersuchung der Nitratreduktase von M. tuberculosis eine Nitritakkumulation durch die Nitratreduktion beim Übergang von aeroben zu anaeroben Bedingungen fest. In höheren Konzentrationen führt Nitrit zum Sistieren der Nitratreduktion. Auch in den Arbeiten von FRITZ 2001 und PUNCKEN 2002 wurde bei der Untersuchung der anaeroben Nitratreduktase von M. tuberculosis und M. bovis BCG eine Akkumulation des Nitrits gezeigt. Eine Nitritreduktion unter anaeroben Bedingungen konnte dagegen bei Mykobakterien noch nicht beobachtet werden. Da es zur Extrusion des Nitrits in die Umgebung kommt, könnte vermutet werden, dass Mykobakterien keine anaerobe Nitritreduktase besitzen. Bei der DNA- Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurde jedoch eine Gensequenz mit Homologie zu den Genen einer dissimilatorischen Nitritreduktase NirBD anderer Bakterien (E. coli, Staphylococcus carnosus) gefunden [COLE et al. 1998]. In Makrophagen konnte neben Nitrat auch Nitrit während einer Infektion mit M. bovis BCG nachgewiesen werden [STUEHR u. MARLETTA 1987]. Demnach steht Nitrit in vivo den Bakterien als Substrat zur Verfügung. Nachdem gezeigt wurde, dass auch M. bovis BCG eine Gensequenz mit einer Homologie zu dem nirBD-Gen anderer Bakterien besitzt, wurde eine nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG hergestellt.
28 Literaturübersicht ______
2.4 Zielsetzung der Arbeit
Thema der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung des aeroben und anaeroben Nitrat- und Nitritmetabolismus von M. tuberculosis und M. bovis BCG in vitro und in vivo. Dabei sind folgende Fragen zu klären:
• Wie verhält sich die mit narGHJI von M. bovis BCG bzw. von M. tuberculosis komplementierte narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG im Vergleich zur narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG in vitro und in vivo?
• Kodiert das nirBD-Gen von M. bovis BCG wie bei anderen Bakterien (E. coli) unter anaeroben Bedingungen eine Nitritreduktase?
• Welche Bedeutung hat das nirBD-Gen für die Pathogenese einer Infektion mit M. bovis BCG in immundefizienten und in immunkompetenten Mäusen?
• Ermöglicht die narGHJI-kodierte Nitratreduktase von M. tuberculosis und M. bovis BCG neben der Nitratreduktion unter anaeroben Bedingungen eine Nitratassimilation unter aeroben Bedingungen? Sollte dies der Fall sein, ist das nirBD-Gencluster von M. bovis BCG bzw. von M. tuberculosis an der Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen beteiligt? 29 Material und Methoden ______
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Plasmide
Plasmid / repliziert repliziert in integriert in Selektions- Herkunft Cosmid in E.coli Mykobakterien Mykobakterien marker
AG Bange, Institut für Medizinische Mikrobiologie und pAP8 + - + Kanamycin Krankenhaushygiene, Medizinische Hochschule Hannover pCF3 + - + Kanamycin siehe pAP8 pSM22 + - + Hygromycin siehe pAP8
Tabelle 3.1: Verwendete Plasmide
3.1.2 Bakterienstämme
Gattung Spezies Stamm Herkunft
Statens Serum Institut, Kopenhagen, Mycobacterium bovis BCG Pasteur Dänemark
BCG::narGHJI M. tb. in dieser Arbeit neu erstellt (TJ-2)
AG Bange, Institut für Medizinische ∆narG-BCG Mikrobiologie und Krankenhaushygiene,
(SR106) Medizinische Hochschule Hannover, unveröffentliche Ergebnisse
∆narG-
BCG::narGHJI M. tb. siehe ∆narG-BCG (SR106) (SR116) 30 Material und Methoden ______
∆narG-
BCG::narGHJI BCG in dieser Arbeit neu erstellt (TJ-1)
∆narG/∆nirB-BCG siehe ∆narG-BCG (SR106) (CD-1)
∆nirB-BCG siehe ∆narG-BCG (SR106) (IJ-2)
∆nirB-BCG siehe ∆narG-BCG (SR106) (IJ-1) ∆nirB-
BCG::nirBD M. tb. in dieser Arbeit neu erstellt
(TJ-4) ∆nirB-
BCG::narGHJI M. tb. in dieser Arbeit neu erstellt (TJ-3) American Type Culture Collection tuberculosis H37RV (ATCC) 25618 ∆narG-M. tb. siehe ∆narG-BCG (SR106) (MS-1) Deutsche Sammlung für Staphyloccocus carnosus ssp. carnosus Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) 20501
Tabelle 3.2: Verwendete Bakterienstämme
3.1.3 Nährmedien
Middlebrook 7H9-Nährmedium (1000 ml)
4,7 g Middlebrook 7H9-Nährmedium wurde in 900 ml Aqua dest. gelöst und nach Zugabe von 100 ml ADS, 2,5 ml 20 % Tween 80 und 10 ml 50 % Glycerin sterilfiltriert.
31 Material und Methoden ______
Middlebrook 7H10-Agar (1000 ml)
19 g Middlebrook 7H10-Agar wurde in 960 ml Aqua dest. gelöst und autoklaviert. Nach Zugabe von 10 ml 50 % Glycerin und 40 ml Middlebrook OADC wurde der auf 50 °C abgekühlte Nährboden in Petrischalen gegossen.
ADS (Albumin Dextrose Salt) (1000 ml)
8,1 g Natriumchlorid (NaCl), 50 g Rinderalbumin und 22 g D-Glukose-Monohydrat
(C6H12O6 x 1H2O) wurden nacheinander in 950 ml Aqua dest. gelöst und unter Verwendung eines Vorfilters sterilfiltriert.
Mykobakterien-Basalsalz-Medium (MB-Medium) für langsamwachsende Mykobakterien (1000 ml)
885 ml Aqua dest. wurden mit 100 ml 10 x Basissalzlösung, 2 ml Spurenelementen, 10 ml
50 % Glycerin, 2,5 ml 20 % Tween 80, 0,5 ml 1 mol/l Magnesiumchlorid (MgCl2)-Lösung und 0,5 ml 1 mol/l Calciumchlorid (CaCl2)-Lösung gemischt und sterilfiltriert.
Kaliumphosphatmedium (1000 ml)
Das Kaliumphosphatmedium besteht aus Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)-Lösung mit einem pH < 4 und Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)-Lösung mit einem pH > 9.
Aus der 1 mol/l KH2PO4-Lösung und der 1 mol/l K2HPO4-Lösung wurden jeweils 1 Liter 100 mmol/l Lösungen hergestellt. Diese Lösungen wurden so auf ein Endvolumen von 1 Liter miteinander vermischt, dass sich der pH auf 7,2 einstellte. Anschießend wurden 2,5 ml 20 % Tween 80 hinzugefügt und das Medium sterilfiltriert.
10 x Basissalzlösung (ohne Stickstoffquelle für MB-Medium) (1000 ml)
Die Grundlage des MB-Mediums ist eine Nährsalzlösung. Es enthält alle wachstumsfördernden Komponenten mit Ausnahme der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle.
10 g KH2PO4, 25 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) und 20 g Kaliumsulfat (K2SO4) wurden nacheinander in 950 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert. 32 Material und Methoden ______
500 x Spurenelemente
40 mg Zinkchlorid (ZnCl2), 200 mg Eisen(III)chlorid-hexahydrat (FeCl2 x 6H2O), 10 mg
Kupfer(II)chlorid-tetrahydrat (CuCl2 x 4H2O), 10 mg Manganchlorid-tetrahydrat (MnCl2 x
4H2O), 10 mg Natriumborat-decahydrat (Na2B4O7 x 10H2O) und 10 mg
Ammoniummolybdat-tetrahydrat ((NH4)6Mo7O24 x 4H2O) wurden nacheinander in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
3.1.4 Lösungen und Puffer
3.1.4.1 Allgemeine Lösungen und Puffer
10 % Glycerin-Lösung (1000 ml)
100 ml Glycerin wurden mit 900 ml Aqua dest. vermischt und autoklaviert.
50 % Glycerin-Lösung (1000 ml)
500 ml Glycerin wurden mit 500 ml Aqua dest. vermischt und sterilfiltriert.
20 % Tween 80 (1000 ml)
200 ml Tween 80 wurden durch dreistündiges Schwenken mit 800 ml Aqua dest. vermischt und sterilfiltriert.
1 mol/l Calciumchlorid-Lösung (1000 ml)
111,0 g CaCl2 wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
1 mol/l Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung (1000 ml)
174,18 g K2HPO4 wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
33 Material und Methoden ______
0,5 mol/l Glukose-Lösung (1000 ml)
90,1 g Glukose (wasserfrei) wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
1 mol/l Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (1000 ml)
136,09 g KH2PO4 wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
1 mol/l Kaliumnitrat-Lösung (1000 ml)
101,1 g KNO3 wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
1 mol/l Magnesiumchlorid-Lösung (1000 ml)
95,2 g MgCl2 wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
1 mol/l Natriumnitrit-Lösung
69,05 g NaNO2 wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und sterilfiltriert.
3.1.4.2 Lösungen und Puffer für die Tierexperimente
10 x PBS (phosphate buffered saline) (1000 ml)
80 g NaCl, 2 g Kaliumchlorid (KCl), 11,5 g Dinatriumhydrogenphosphat-heptahydrat
(Na2HPO4 x 7H2O) und 2 g KH2PO4 wurden nacheinander in 1000 ml Aqua dest. gelöst und autoklaviert. Die eingesetzte PBS-Gebrauchslösung wurde noch einmal 1:10 verdünnt und enthielt einen Zusatz von 0,05 % Tween 80.
Alle Medien und Lösungen wurden durch Autoklavieren (T = 121 °C, t = 20 min, p = 2,1 bar) sterilisiert oder sterilfiltriert (Sterilfiltrationseinheiten der Fa. Corning incorporated).
34 Material und Methoden ______
3.1.5 Sonstige Materialien
Alle weiteren Geräte, Chemikalien und Gebrauchsmaterialien sind im Anhang aufgeführt.
3.2 Methoden
3.2.1 Transformation von DNA in langsamwachsende Mykobakterien
3.2.1.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen
M. bovis BCG bzw. dessen Mutanten wurden in 50 ml 7H9-Nährmedium in Roller bottles bei 37 °C bis zu einer OD600 zwischen 0,8 und 1,0 inkubiert. Die Bakterien wurden dreimal mit 10 %igem Glycerin bei Raumtemperatur gewaschen (2.500 rpm, 10 min). Nach dem letzten Waschen wurde das Pellet in 5 ml 10 %igen Glycerin resuspendiert.
3.2.1.2 Transformation durch Elektroporation
400 µl der elektrokompetenten Zellen wurden mit 1 µl DNA (0,1 – 1 µg) in auf 50 °C vorgewärmten Elektroporationsküvetten vermischt und sofort bei einem Widerstand von 1 KΏ elektroporiert. Die Bakterien wurden in 1 ml 7H9-Nährmedium resuspendiert und für 3 – 24 Stunden bei 37 °C im Schüttelinkubator inkubiert, um die Antibiotikaresistenz zu exprimieren. Um positiv (transformierte) Bakterien von negativen zu unterscheiden, wurden die Bakterien auf 7H10/OADC/Glycerin-Platten mit einem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen und für ca. 3 Wochen bei 37 °C bebrütet. Die Wahl des Antibiotikums richtete sich nach der Antibiotikaresistenz des Vektors. Zur Überprüfung des Transformationserfolges wurden eine Positiv- sowie eine Negativkontrolle (Aqua bidest.) ebenfalls transformiert. Die Transformationseffizienz wurde nach folgender Formel berechnet:
x ml Nährmedium + y ml Bakterien × Anzahl Bakterien / ml z ml ausplattiertes Volumen
35 Material und Methoden ______
3.2.2 Kultivierung langsamwachsender Mykobakterien unter aeroben Bedingungen
3.2.2.1 Kultivierung in 7H9-Nährmedium
Eine Vorkultur von M. bovis BCG oder dessen Mutanten wurde bei Volumina bis ca. 15 ml 7H9-Nährmedium in Square media bottles, bei Volumina von mehr als 20 ml 7H9- Nährmedium in Roller bottles bei 37 °C angezüchtet. Bei einigen M. bovis BCG Mutanten wurde ein Antibiotikum, dessen Substanzklasse sich nach der Resistenz des hinzugefügten Vektors richtete, zugegeben. Beim Zusatz von Hygromycin B wurde eine Konzentration von
50 µg/ml, bei Kanamycin 20 µg/ml hinzugefügt. Nach 5 – 7 Tagen, mit einer OD600 von 0,8 – 1,2, wurden die Zellen zentrifugiert (2.500 rpm, 10 min, 37 °C). Anschließend wurde der
Überstand verworfen und die Bakterien, abhängig von der OD600 der Vorkultur, in 1 – 2 ml 7H9-Nährmedium resuspendiert. Danach wurden die Zellen in 50 ml 7H9-Nährmedium in
Roller bottles inokuliert, wobei die OD600 zwischen 0,02 und 0,03 eingestellt wurde, und bei 37 °C inkubiert. Die Bestimmung der Keimdichte (siehe 3.2.7) erfolgte zwischen Tag 0 und Tag 8.
3.2.2.2 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitrit- bzw. Nitratzusatz
Die Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in Minimalnährmedium entsprach einschließlich der Zentrifugation der Vorkultur dem Protokoll der Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in 7H9- Nährmedium (siehe 3.2.2.1). Die Zellen wurden nun dreimal mit MB-Medium gewaschen, d.h. der Überstand der zentrifugierten Bakterien wurde verworfen, die Bakterien wurden in MB-Medium resuspendiert und zentrifugiert. Anschließend wurden die Bakterien in MB- Medium mit 10 % ADS-Zusatz (Minimalnährmedium) und mit einer Stickstoffquelle (0,001 mol/l Nitrit bzw. 0,01 mol/l Nitrat) inokuliert. Je nach Volumina wurde der Versuch in Roller bottles bzw. in Square media bottles durchgeführt, wobei die OD600 zu Beginn zwischen 0,02 und 0,03 lag. Es wurde bei 37 °C inkubiert. Die Keimdichtebestimmung erfolgte analog der Kultivierung in 7H9-Nährmedium (siehe 3.2.2.1).
36 Material und Methoden ______
3.2.3 Kultivierung langsamwachsender Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen
3.2.3.1 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz
Die Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz entsprach einschließlich des Waschschritts der Vorkultur analog dem Protokoll der Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in Minimalnährmedium (siehe 3.2.2.2). Nach dem Waschen wurden die Bakterien, abhängig von der OD600 der Vorkultur, in 1 – 2 ml MB-Medium resuspendiert. Danach wurden die Zellen in Kunststoffröhrchen PP Tubes in 10 ml MB-
Medium mit 10 % ADS-Zusatz (Minimalnährmedium) und 0,01 mol/l KNO3 inokuliert, wobei die OD600 der Bakterien zu Beginn zwischen 0,2 und 0,3 lag. Die Bebrütung erfolgte bei 37 °C in einem Anaerobentopf, in dem die anaeroben Bedingungen mit dem Anaero GenTM System erreicht wurden. Zur Überprüfung der anaeroben Bedingungen wurde ein
Anaerobenindikator verwendet. Die Bestimmung der Keimdichte, die Überprüfung der OD600 und der Nitratreduktase-Test wurden zwischen Tag 0 und Tag 25 durchgeführt.
3.2.3.2 Kultivierung in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz
Die Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz entsprach dem Protokoll der Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz (siehe 3.2.3.1). Sie unterschied sich lediglich durch einen darüber hinausgehenden Glucosezusatz von 0,014 mol/l sowie der je nach Versuch unterschiedlichen
Zugabe von NaNO2. Der Versuchsansatz wurde in Kunststoffröhrchen PP Test-Tubes angesetzt. Die OD600 der Bakterien beim Versuchsbeginn lag zwischen 0,5 und 0,7. Um die anaeroben Bedingungen in dem Anaerobentopf auch in der Kultur zu erreichen, wurde eine Injektionskanüle durch den Deckel des PP Test-Tubes gestochen. Zur Bestimmung des Ammoniumgehaltes wurden bei den langsamwachsenden Mykobakterien zwischen Tag 3 und Tag 60 Proben aus dem Überstand der Bakterienkultur entnommen und in sterile Reagiergefäß überführt. Die Proben wurden 5 min bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Ammoniumtest wurde entweder im Anschluß durchgeführt oder die Proben wurden zur späteren Verwendung bei –20 °C eingefroren. 37 Material und Methoden ______
3.2.3.3 Kultivierung in Kaliumphospatmedium
Die Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter anaeroben Bedingungen in Kaliumphosphatmedium entsprach einschließlich der Zentrifugation der Vorkultur dem Protokoll der Kultivierung von M. bovis BCG und dessen Mutanten unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz (siehe 3.2.3.2). Die Zellen wurden nun dreimal mit Kaliumphosphatmedium gewaschen. Anschließend wurden die Bakterien in
Kaliumphosphatmedium mit 0,025 mol/l Glucose und unterschiedlicher NaNO2
Konzentrationen inokuliert. Auch hier lag die Start-OD600 der Bakterien bei 0,5 – 0,7. Die Bebrütung in einem Anaerobentopf und die Probenentnahme erfolgten analog der Kultivierung unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz (siehe 3.2.3.2).
3.2.4 Konservierung und Lagerung von Kulturen
Von allen verwendeten Bakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen angelegt. Zur Konservierung der Bakterien wurde eine flüssige Bakterienkultur, die sich in der Wachstumsphase befand, herunterzentrifugiert (2.500 rpm, 10 min, 37 °C), der Überstand verworfen und das Bakterienpellet in 7H9-Nährmedium resuspendiert. Nach einer weiteren Zentrifugation mit Verwerfen des Überstandes wurden die Bakterien in 7H9-Nährmedium mit 15 % Glycerinzusatz resuspendiert, in je 1 ml Portionen in Mikroschraubröhren abgefüllt und bei –70 °C eingefroren.
3.2.5 Nitratreduktasetest
Das Vermögen einiger Mykobakterien, durch eine Nitratreduktase Nitrat zu Nitrit zu reduzieren, wurde durch die Diazotierungsreaktion mit nachfolgender Azokupplung nachgewiesen. Nach Mischen von Essigsäure und Natriumnitrit entsteht durch Protonierung salpetrige Säure, die ihrerseits in Wasser und ein Stickstoffmonoxid-Kation (NO+) zerfällt. Das NO+ bildet mit einem primären aromatischen Amin in Form der Sulfanilsäure ein Diazoniumion. Dieses reagiert mit Dimethylnaphtylamin an der elektronenreichen para- Position zu einem roten Azofarbstoff. Die Rotfärbung ist der Nachweis für die Anwesenheit von Nitrit und ein direkter Hinweis auf das Vermögen der Mykobakterien, Nitrat mittels der Nitratreduktase zu Nitrit zu reduzieren. 38 Material und Methoden ______
Zur Durchführung dieses Testes wurden in Reagiergefäßen zu 1 ml Bakteriensuspension jeweils 50 µl Sulfanilamid (NIT 1) und N-N-dimethyl-1-naphthylamin (NIT 2) gegeben und bei Raumtemperatur für 7 Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die Absorption des Überstandes wurde bei langsamwachsenden Mykobakterien aufgrund des ADS-Zusatzes bei
440 nm gemessen. Zur Errechnung des produzierten Nitrits aus den OD 440-Werten wurde für den Absorptionsbereich eine Eichkurve erstellt. Aus deren Steigung konnte die Nitritmenge in µmol/l, die bei der Reaktion gebildet bzw. bei Untersuchung der Nitritassimilation noch vorhanden ist, berechnet werden.
2,75
2,50
2,25
2,00
1,75
1,50
440 1,25 OD 1,00
0,75
0,50 µM NO 0,25 2 Ausgleichsgrade 0,00
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 Nitritgehalt (µmol/l)
Abb. 3.1: Eichkurve zur photometrischen Bestimmung der Nitritmenge im Absorptionsbereich von 440 nm.
Durch folgende Formel wurde die Nitritmenge (µmol/l) berechnet:
Absorption (OD ) - Y - Achsenabschnitt 440 = Nitritmenge (µmol/l) Steigungsgerade (µmol/l)
Steigung : 0,00956 Y-Achsenabschnitt : - 0,01663
39 Material und Methoden ______
Die Fähigkeit der Mykobakterien, Nitrit aerob und anaerob umzusetzen, wird ebenfalls mit Hilfe des Nitratreduktase-Tests bestimmt, indem die Abnahme des Nitrits in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt wird.
3.2.6 Ammoniumtest
Das Vermögen einiger Mykobakterien, durch eine Nitritreduktase Nitrit zu Ammonium zu reduzieren, wird durch den Ammoniak-UV-Test (Fa. Roche) nachgewiesen. Bei diesem Test setzt Ammonium 2-Oxoglutarat in Gegenwart der Glutamat-Dehydrogenase (GlDH) und reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) zu L-Glutamat um, wobei NADH verbraucht wird.
+ GLDH + 2-Oxoglutarat + NADH + NH4 → L-Glutamat + NAD + H2O
Die während der Reaktion verbrauchte molare NADH-Menge ist der molaren Menge Ammonium äquivalent. NADH wird durch seine Absorption von ultraviolettem Licht bei 340 nm photometrisch quantitativ bestimmt. Die aus den Ansätzen (siehe 3.2.3.2 und 3.2.3.3) entnommenen Proben wurden bei Raumtemperatur 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Für den Test wurden der Anzahl der Proben entsprechende Mengen Reagenzgläser mit je 1ml Triethanolaminpuffer/2-Oxoglutarat (Lösung 1) befüllt und ca. 5 min stehengelassen, bis der Puffer Raumtemperatur angenommen hatte. Zu dem Puffer wurde in jedes Reagenzglas eine NADH-Tablette (Lösung 2) gegeben und bis zu ihrer Auflösung gerührt. Nun wurden von dem Überstand der Probe, je nach zu erwartender Ammoniummenge, zwischen 0,1 – 1,5 ml hinzupipettiert. Da das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches 3 ml betragen sollte, wurde die Differenz mit Aqua dest. aufgefüllt. Das Reaktionsgemisch wurde mindestens 5 min stehengelassen, bevor je 1 ml des Reaktionsgemisches in Küvetten umpipettiert wurde. Die Probe wurde bei 340 nm im Photometer gegen Luft als Nullwert gemessen und anschließend der Küvetteninhalt wieder in das entsprechende Reagenzglas zurückgegeben. Durch die Zugabe von je 20 µl GLDH- Lösung (Lösung 3) wurde die Reaktion gestartet. Nach Zugabe der Lösung 3 wurde jede Probe kurz gemischt. Die Extinktion wurde erneut nach einer Stunde bei 340 nm gemessen. Die Messungen wurden solange wiederholt, bis sich der Wert nicht mehr änderte. Der Extinktionskoeffizient jeder Probe wurde wie folgt berechnet:
40 Material und Methoden ______
Extinktionskoeffizient = Extinktion vor der Reaktion – Extinktion nach der Reaktion
Der Extinktionskoeffizient des Leerwertes (Probe ohne Bakterien) wurde nun von dem Extinktionskoeffizient jeder Probe abgezogen. Dieser bereinigte Extinktionskoeffizient wurde in folgender Formel eingesetzt:
17,03× bereinigter Extinktionskoeffizient = Ammoniumgehalt in g/l 2100× Probevolumen (ml)
Ammoniumgehalt (g/l) × 1000 = Ammoniumgehalt in mg/l Ammoniumgehalt in mg/l ÷ 0,01703 g/mol = Ammoniumgehalt in µmol/l
3.2.7 Bestimmung der Keimdichte
Die Keimdichte (Titerbestimmung) erfolgte mittels abgestufter Verdünnungsreihen mit Verdünnungsstufen von 100 bis 10-7. Dazu wurden in ein Reagiergefäß jeweils 900 µl 7H9- Nährmedium und 100 µl der jeweils vorhergehenden Verdünnungsstufe hineinpipettiert. Anschließend wurden je 10 µl einer Verdünnungsstufe auf ein 7H10/OADC-Plattenviertel aufgetropft und mit Kunststoff-Impfschlingen ausgestrichen. Die Agar-Platten wurden bei 37 °C inkubiert. Die Bebrütungsdauer betrug bei langsamwachsenden Mykobakterien 14 – 21 Tage. Die Keimdichte (Koloniebildende Einheiten, KBE) wurde folgendermaßen errechnet:
KBE/ml = gezählte Kolonien × 100 × Verdünnungsstufe
3.3 Methoden für die Tierexperimente
3.3.1 Anzucht und Aufbereitung des Infektionsmaterials
Das Infektionsmaterial (M. bovis BCG Wildtyp, ∆nirB BCG, ∆narG BCG, ∆narG/∆nirB
BCG, ∆narG BCG::narGHJI M. tb., ∆narG BCG::narGHJI BCG) wurde in 50 ml 7H9-
Nährmedium in Roller bottles bei einer Temperatur von 37 °C bis zu einer OD600 von 1,0 – 1,2 inkubiert. Von dieser Kultur wurde je 1 ml in Reagiergefäße gegeben, die anschließend für 2 Tage bei –70 °C eingefroren wurden. Nach dieser Zeit wurden die Zellen aufgetaut und 3 x 45 Sekunden mit je einminütiger Pause dazwischen im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurde die Keimdichte (siehe 3.2.7) bestimmt. Die Einstellung der 41 Material und Methoden ______
Lebendkeimzahl des portionierten Infektionsmaterials auf 1 x 106 KBE erfolgte mit der PBS- Gebrauchslösung mit 0,05 % Tween 80.
3.3.2 Infektion der Versuchstiere
Die Versuchstiere wurden für 5 – 10 min zur besseren Darstellung der Schwanzvene mit einer Rotlichtlampe bestrahlt. Dann wurden die Tiere in einen Metalltrichter gesetzt, aus dessen kleiner Öffnung der Schwanz der Versuchstiere gezogen wurde. Den Tieren wurden jeweils 200 µl des Infektionsmaterials, das auf 1 x 106 KBE eingestellt war, mittels Injektion in die Schwanzvene verabreicht.
3.3.3 Haltung der Versuchstiere
Die Tiere wurden in den Tierräumen des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. Für die Tierexperimente wurden immundefiziente SCID (severe combined immunodeficiency)-Balb/c Mäuse und immunkompetente Balb/c Mäuse verwendet. Die Tiere stammten aus der Zucht des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover. Maximal sechs Tiere wurden in einem Kunststoffkäfig mit Filterhaube gehalten. Die Tierräume wurden durch Hygieneschleusen nur von den Experimentatoren betreten, die zuvor immer Einmalschutzkleidung angelegen mußten. Die Käfige wurden nur zur Säuberung und Fütterung sowie zur Entnahme der Tiere zwecks Sektion geöffnet. Gefüttert wurden die Mäuse ad libitum mit einer pelletierten Alleindiät. Aus Kunststofftränkflaschen stand kontinuierlich Leitungswasser zur Verfügung. Die Weichholzgranulat-Einstreu wurde wöchentlich gewechselt.
3.3.4 Tötung und Sektion der Versuchstiere
Zunächst wurde das Gewicht der Mäuse vor der Sektion bestimmt. Die Tiere wurden mit Diethylether betäubt, durch Genickbruch getötet und anschließend seziert. Nach Eröffnung von Thorax und Abdomen mittels Paramedianschnitt erfolgte eine Begutachtung aller inneren Organe unter besonderer Berücksichtigung der pathologisch-anatomischen Veränderungen der Milz. Zur genaueren makroskopischen Untersuchung und zur Keimdichtebestimmung wurden Milz, Leber, Nieren und Lunge entnommen.
42 Material und Methoden ______
3.3.5 Aufarbeitung des Sektionsmaterials
Die entnommenen Organe (Leber, Milz, Niere, Lunge) wurden jeweils in 1 ml PBS- Gebrauchslösung mit 0,05 % Tween 80 aufgenommen, mit einem Homogenisator zerkleinert und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gekühlt. Zusätzlich wurden für eine eventuelle patho-histologische Untersuchung vorgesehene Organteile für die histologische Aufbereitung unverzüglich für mindestens 24 Stunden in 10 %igem gepufferten Formalin (pH 7,0) fixiert.
3.3.6 Bestimmung der Keimdichte in den Organen
Zur Bestimmung der Keimdichte in den Organen wurden abgestufte Verdünnungsreihen hergestellt (siehe 3.2.7). Das Volumen der Organhomogenisate (= Organvolumen) betrug für die einzelnen Organe: • Leber 1,5 ml • Milz 1,2 ml • Niere 1,2 ml • Lunge 1,2 ml
Je 100 µl Organhomogenisat wurde für die Verdünnungsreihe verwendet. Die Keimdichte in den Organen wurde wie folgt berechnet:
KBE/Organ = gezählte Kolonien × Organvolumen × Verdünnungsstufe 43 Ergebnisse ______
4. Ergebnisse
4.1 Untersuchung der Nitratreduktasemutante (∆∆∆narG-Mutante von M. bovis BCG) komplementiert mit dem narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis in vitro und in vivo
4.1.1 Komplementation der ∆∆∆narG-Mutante von M. bovis BCG mit dem narGHJI- Gencluster von M. tuberculosis
In vorangegangenen Studien in unserem Labor wurde eine narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG erstellt [WEBER et al. 2000]. Die Mutante war im Tiermodell attenuiert [WEBER et al. 2000, FRITZ et al. 2002]. Zunächst sollte im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob sich die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG [∆narG-BCG] (SR106) mit dem Wildtyp-narG- Gen von M. tuberculosis komplementieren lässt. Zu Beginn konnte auf das narGHJI- Gencluster von M. tuberculosis, kloniert in den Expressionsvektor pMV306, zurückgegriffen werden. Dieses Konstrukt mit der Bezeichnung pCF3 wurde in die narG-Deletionsmutante (SR106), die ebenfalls aus früheren Arbeiten in unserem Labor zur Verfügung stand, transformiert. Die neu entstandene komplementierte Deletionsmutante [∆narG-
BCG::narGHJI M. tb.] wurde als SR116 bezeichnet.
4.1.2 In-vitro-Experimente
4.1.2.1 Kultivierung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆∆∆narG- Mutante von M. bovis BCG (SR116) unter aeroben Bedingungen
Zunächst wurde das Wachstum der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106), der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) und des M. bovis BCG Wildtyps in vitro unter aeroben Bedingungen in 7H9-Nährmedium verglichen. Dieses kommerziell erhältliche und für die Kultivierung von langsamwachsenden Mykobakterien besonders gut geeignete Medium enthält Glutamin und Ammoniak als Stickstoffquellen. Da die Bakterien deshalb nicht auf die Nitratreduktion zur Bereitstellung von Stickstoff angewiesen sind, sollten sich gemäß unseren Erwartungen die Mutanten (SR106, SR116) und der Wildtyp gleich gut vermehren. 44 Ergebnisse ______
Der Wachstumsverlauf der neu transformierten Mutante (SR116) im Vergleich zur narG- Deletionsmutante (SR106) und zum M. bovis BCG Wildtyp wird in den Abbildungen 4.1.A und 4.1.B veranschaulicht. Dargestellt sind die Mittelwerte und deren Standardabweichungen aus drei Experimenten:
2,0 BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116)
1,5 (nm) 1,0 600 OD
0,5
0,0
02468 Zeit (Tage)
Abb. 4.1.A:
Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in 7H9-Nährmedium inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
45 Ergebnisse ______
109 BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116)
108 KBE/ml 107
106
100 02468
Zeit (Tage) Abb 4.1.B:
Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in 7H9-Nährmedium inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
Die Expression des narGHJI-Genclusters von M. tuberculosis in der narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG hatte offenbar keinen nennenswerten Einfluss auf das Wachstum, auch wenn die Wachstumsgeschwindigkeit des komplementierten Stammes (SR116) minimal verzögert zu sein schien. Gleiches Wachstumsverhalten in vitro ist Voraussetzung dafür, dass die Stämme im Mausinfektionsmodell miteinander verglichen werden können. Ein unspezifischer Wachstumsdefekt, der im Mausinfektionsmodell zu nicht interpretierbaren Ergebnissen geführt hätte, konnte somit ausgeschlossen werden.
4.1.2.2 Analyse der anaeroben Nitratreduktaseaktivität der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116)
Das narGHJI-Operon kodiert sowohl bei obligat aeroben Bakterien (Bacillus subtilis) als auch bei fakultativ anaeroben Bakterien (E. coli) eine Nitratreduktase, die ausschließlich unter anaeroben Bedingungen exprimiert wird [BLASCO et al. 1989, HOFFMANN et al. 1995]. 46 Ergebnisse ______
Aus diesem Grund wurde als nächstes die Nitritakkumulation der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit einer definiert zugegebenen Nitratmenge als alleinige Stickstoffquelle gemessen. Als Positivkontrolle wurde der M. bovis BCG Wildtyp, als Negativkontrolle die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) verwendet. Die komplementierte Deletionsmutante (SR116) sollte den gleichen Phänotyp besitzen wie der Wildtyp. Anhand der Mittelwerte und deren Standardabweichungen aus drei Experimenten sind die Ergebnisse in Abbildung 4.2 dargestellt:
200
150
BCG Wildtyp 100 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) Nitrit (µmol/l) Nitrit
50
0
0 5 10 15 20 25 Zeit (Tage) Abb.4.2:
Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitrat inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
Das Experiment zeigte, dass das narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis den Phänotyp der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG komplementiert. Sowohl der M. bovis BCG Wildtyp als auch die komplementierte Deletionsmutante (SR116) zeigten eine deutliche Nitritakkumulation, wobei diese bei der komplementierten Deletionsmutante 10- bis 20-fach größer war. Die narG-Deletionsmutante (SR106) akkumulierte erwartungsgemäß kein Nitrit. 47 Ergebnisse ______
4.1.2.3 Kultivierung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG- Mutante von M. bovis BCG (SR116) unter anaeroben Bedingungen
Nachdem gezeigt wurde, dass mit dem narGHJI von M. tuberculosis die narG-Mutante von M. bovis BCG (SR106) komplementiert wird, wurde die Keimdichte des M. bovis BCG Wildtyps, der narG-Deletionsmutante (SR106) und der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) unter anaeroben Bedingungen in vitro in Minimalnährmedium mit Nitratzuzsatz untersucht. Bis heute ist es unter anaeroben Bedingungen noch nicht gelungen, Mykobakterien zu vermehren. Es stellte sich nun die Frage, ob die vermehrte anaerobe Nitritakkumulation mit einem kürzeren Überleben der Bakterien assoziiert ist. Die Keimdichte der beiden Mutanten (SR106, SR116) und des M. bovis BCG Wildtyps werden in den Abbildungen 4.3.A und 4.3.B anhand von Mittelwerten und deren Standardabweichungen aus drei Experimenten miteinander verglichen:
BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) 0,3 ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116)
0,2 (nm) 600 OD
0,1
0,0
0 5 10 15 20 25
Zeit (Tage) Abb. 4.3.A:
Keimdichte (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitrat inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
48 Ergebnisse ______
108 BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) 107
106 KBE/ml
105
104
100 0 5 10 15 20 25
Zeit (Tage) Abb. 4.3.B:
Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitrat inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
In diesem Experiment kam es unter anaeroben Bedingungen zu einer vergleichbaren Abnahme der Keimdichte der komplementierten Deletionsmutante (SR116), der narG- Deletionsmutante (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Unter anaeroben Bedingungen konnte damit kein Unterschied im Wachstumsverhalten in vitro nachgewiesen werden.
49 Ergebnisse ______
4.1.3 Untersuchung der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG- Mutante von M. bovis BCG (SR116) im Tiermodell mit Balb/c Mäusen
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG gegenüber dem M. bovis BCG Wildtyp im Tiermodell deutlich attenuiert ist [WEBER et al. 2000, FRITZ et al. 2002]. In dem folgenden Experiment sollte untersucht werden, ob die mit narGHJI von M. tuberculosis transformierte narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG sich phänotypisch wie der Wildtyp verhält. Dazu wurden Balb/c Mäuse intravenös mit dem M. bovis BCG Wildtyp, der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) oder der komplementierten Deletionsmutante (SR116) infiziert. Leber, Milz, Niere und Lunge wurden zu verschiedenen, definierten Zeitpunkten über einen Versuchszeitraum von 364 Tagen auf ihre Keimdichte hin untersucht. Alle mit den Mykobakterienstämmen infizierten Tiere zeigten über den gesamten Versuchszeitraum keinerlei klinische Krankheitssymptome. Es konnte zu jeder Zeit ein glattes Haarkleid und lebhaftes Verhalten beobachtet werden. Auch ein Gewichtsverlust wurde nicht festgestellt.
4.1.3.1 Pathologisch-anatomische Organbefunde
Im Rahmen der Sektionen wurden die Organe der Balb/c Mäuse zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten makroskopisch betrachtet. An Leber, Lunge und Niere konnten zu keinem Zeitpunkt äußerlich sichtbare Veränderungen festgestellt werden. An der Milz wurde 28 Tage post infectionem eine hochgradige Splenomegalie diagnostiziert. Diese Vergrößerung der Milz konnte bei allen infizierten Tieren an jedem weiteren Untersuchungszeitpunkt nachgewiesen werden.
Die Größenveränderungen der Milz der Tiere stellten sich wie folgt dar:
• Größe der Milz 24 Stunden post infectionem: ca. 1,2 x 0,6 x 0,3 cm
• Größe der Milz ab 28 Tage post infectionem: ca. 1,8 x 1,1 x 0,5 cm
50 Ergebnisse ______
4.1.3.2 Quantitative Analyse der Keimdichte der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (SR116) in Balb/c Mäusen
4.1.3.2.1 Keimdichte in der Leber
In der Leber der Mäuse, die mit dem M. bovis BCG Wildtyp infiziert wurden, konnte in den ersten 119 Tagen post infectionem eine kontinuierliche Abnahme der Bakterienlast festgestellt werden. Mit zunehmender Versuchsdauer wurden jedoch in der Leber keine nennenswerten Veränderungen mehr bezüglich der Keimdichte beobachtet; die Bakterien persistierten mit 3,0 x 103 Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Organ auf geringem Niveau. In der Leber der mit der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) infizierten Mäuse zeigte sich, mit Ausnahme einer Persistenz zwischen Sektionstag 200 und 280 post infectionem, eine kontinuierliche Abnahme der Bakterienlast bis auf 100 KBE pro Organ nach einem Jahr. Bei den mit der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) infizierten Balb/c Mäusen konnte in der Leber ebenfalls eine kontinuierliche Abnahme der Bakterienlast beobachtet werden. 280 Tage post infectionem wurden bei diesem Stamm keine Bakterien mehr in der Leber nachgewiesen. In der Abbildung 4.4 werden Mittelwerte und deren Standardabweichungen der Keimdichten aus der Leber von je drei Mäusen dargestellt:
51 Ergebnisse ______
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) 105
104
103
KBE/Organ Leber KBE/Organ 102
101
100
0 100 200 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.4: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
52 Ergebnisse ______
4.1.3.2.2 Keimdichte in der Lunge
Die Untersuchung der Keimdichte in der Lunge zeigte bei den mit M. bovis BCG infizierten Balb/c Mäusen eine nahezu unveränderte Bakterienlast. Die Bakterien persistierten über den gesamten Versuchszeitraum. Im Gegensatz zu dem M. bovis BCG Wildtyp nahm die Anzahl der KBE in der Lunge der mit der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) infizierten Tiere deutlich ab. Bis zum Versuchsende am 364. Tag waren nur noch 3,0 x 100 KBE pro Organ nachweisbar. Bei den mit der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) infizierten Mäusen waren nach kontinuierlicher Abnahme der Bakterienlast ab Tag 119 post infectionem keine Erreger in der Lunge mehr festzustellen. In Abbildung 4.5 sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Keimdichten aus den Lungen von je drei Mäusen dargestellt:
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) 105
104
103
2 KBE/Organ Lunge KBE/Organ 10
101
100
0 100 200 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.5: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
53 Ergebnisse ______
4.1.3.2.3 Keimdichte in der Niere
Wie schon in der Lunge persistierte der M. bovis BCG Wildtyp in der Niere der infizierten Versuchstiere über den gesamten Versuchszeitraum. Die mit der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) sowie die mit der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) infizierten Mäuse zeigten eine kontinuierliche Abnahme der Bakterienlast. Während jedoch in der Niere der Versuchstiere, die mit der komplementierten Deletionsmutante (SR116) infiziert wurden, ab Tag 280 post infectionem keine Mykobakterien mehr nachzuweisen waren, konnten bei den mit der narG-Deletionsmutante (SR106) infizierten Tieren am Versuchsende noch 1,2 x 101 KBE pro Organ festgestellt werden. In Abbildung 4.6 werden Mittelwerte und deren Standardabweichungen der Keimdichten der Nieren von je drei Mäusen dargestellt:
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) 105
104
103
KBE/Organ Niere KBE/Organ 102
101
100
0 100 200 300 400
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.6: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
54 Ergebnisse ______
4.1.3.2.4 Keimdichte in der Milz
Bei der bakteriologischen Untersuchung der Milz der Balb/c Mäuse konnte zwischen den Mäusen, die mit dem M. bovis BCG Wildtyp, der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) oder der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) infiziert wurden, kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Nach geringgradigem Abfall der KBE pro Organ bis zum Tag 200 post infectionem konnte bei der quantitativen Analyse der Keimdichte in der Milz über den gesamten Versuchszeitraum keine Veränderung in der Bakteriendichte beobachtet werden. In Abbildung 4.7 werden Mittelwerte und Standardabweichungen der Keimdichten der Milz von je drei Mäusen dargestellt:
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) 105
104
103
KBE/Organ Milz KBE/Organ 102
101
100
0 100 200 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.7: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
Entgegen den Erwartungen war die Keimdichte in den mit der komplementierten Deletionsmutante (SR116) infizierten Versuchstieren und damit die Virulenz in den Balb/c Mäusen sehr viel geringer als nach Infektion mit der narG-Deletionsmutante (SR106). Dies wurde am deutlichsten in der Abnahme der Keimdichte in der Lunge, der Leber und der Niere. Möglicherweise erklärt die in vitro auffällig hohe Nitritakkumulation der 55 Ergebnisse ______komplementierten Deletionsmutante (SR116) deren geringe Virulenz in vivo, da Nitrit in hohen Konzentrationen auf Bakterien toxisch wirkt.
Die Ergebnisse aus der Untersuchung der narG-Deletionsmutante, komplementiert mit narGHJI von M. tuberculosis (SR116), zeigen:
• Durch die Komplementation des narGHJI-Genclusters von M. tuberculosis in die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG wird unter anaeroben Bedingungen der Phänotyp des M. bovis BCG Wildtyps wiederhergestellt
• Das narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis in der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG steigert unter anaeroben Bedingungen die Nitritakkumulation auf das 10- bis 20-fache des M. bovis BCG Wildtyps
• Die komplementierte Deletionsmutante (SR116) unterscheidet sich im Wachstumsverhalten in vitro weder unter aeroben noch unter anaeroben Bedingungen vom M. bovis BCG Wildtyp und dessen narG-Deletionsmutante
• Die komplementierte Deletionsmutante (SR116) verhält sich im Balb/c Mausinfektionsmodell im Vergleich zum M. bovis BCG Wildtyp und zu dessen narG-Deletionsmutante attenuiert
56 Ergebnisse ______
4.2 Untersuchung der Nitratreduktasemutante (∆narG-Mutante von M. bovis BCG) komplementiert mit dem narGHJI-Gencluster von M. bovis BCG in vitro und in vivo
4.2.1 Komplementation der ∆narG-Mutante von M. bovis BCG mit dem narGHJI- Gencluster von M. bovis BCG
Im Rahmen der Dissertationsarbeit von A. Puncken 2002 aus unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Nitratreduktase des M. bovis BCG Wildtyps in vitro unter anaeroben Bedingungen eine deutlich geringere Aktivität besitzt als die von M. tuberculosis. Es wurde daher als nächstes eine narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG [∆narG-BCG] (SR106) mit dem Wildtyp-narG-Gen von M. bovis BCG komplementiert. Für die Transformation konnte auf das narGHJI-Genclusters von M. bovis BCG, kloniert in den Expressionsvektor pMV306, aus der Arbeit von A. Puncken zurückgegriffen werden. Dieses Konstrukt mit der Bezeichnung pAP8 wurde in die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106), die ebenfalls aus früheren Arbeiten in unserem Labor zur Verfügung stand, transformiert. Die daraus entstandene komplementierte Deletionsmutante [∆narG-
BCG::narGHJI BCG] wurde als TJ-1 bezeichnet und analog zu den bisherigen Versuchen in vitro und in vivo charakterisiert.
4.2.2 In-vitro-Experimente
4.2.2.1 Kultivierung der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG- Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) unter aeroben Bedingungen
Zunächst wurde das Wachstum der narG-Deletionsmutante (SR106), der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in vitro unter aeroben Bedingungen in 7H9-Nährmedium, in dem verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten sind, verglichen. Die Abbildungen 4.8.A und 4.8.B zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten:
57 Ergebnisse ______
Abb. 4.8.A:
2,0 BCG Wildtyp
∆narG BCG (SR106)
∆narG BCG::narGHJI (TJ-1) BCG 1,5
(nm) 1,0
600
OD
0,5
0,0
0246
Zeit (Tage)
Abb. 4.8.B:
109 BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1)
108 KBE/ml 107
106
100 0123456 Zeit (Tage) Abb. 4.8.A und 4.8.B: Wachstum (OD600 und KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in 7H9-Nährmedium inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 58 Ergebnisse ______
Mit diesem Experiment konnte ein unspezifischer Wachstumsdefekt bei allen drei Stämmen ausgeschlossen werden. Damit wurde im Folgenden eine Untersuchung der oben genannten Stämme im Mausinfektionsmodell möglich.
4.2.2.2 Analyse der anaeroben Nitratreduktaseaktivität der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1)
Als nächstes wurde die Nitritakkumulation der mit dem narGHJI-Gencluster von M. bovis BCG transformierten narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (TJ-1) in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz untersucht. Um einen möglichen bakteriotoxischen Effekt des Nitrits für den Tierversuch auszuschließen, sollte unter anaeroben Bedingungen die Nitritakkumulation der Mutante (TJ-1) die des Wildtyps nicht übersteigen. Die Abbildung 4.9 zeigt durch Mittelwerte und deren Standardabweichungen aus drei Experimenten die Nitritakkumulation der Mykobakterien:
50
40
30
20 Nitrit (µmol/l)
10
0
0 5 10 15 20 25 Zeit (Tage)
BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1)
Abb. 4.9:
Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. 59 Ergebnisse ______
Analog zu den Ergebnissen, die mit der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) erhoben wurden, zeigte dieses Experiment, dass das narGHJI-Gencluster von M. bovis BCG den Phänotyp der narG- Deletionsmutante (SR106) komplementiert. Die Nitritbildung der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) lag in diesem Fall um den Faktor zwei bis drei höher als beim M. bovis BCG Wildtyp. Eine Erklärung für die Unterschiede in der Nitritbildung zwischen dem Wildtyp und der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) gibt es bisher nicht. Trotz dieser leicht stärkeren Nitritakkumulation wurde eine weitere Untersuchung im Tiermodell durchgeführt, da die Nitritbildung und damit die Gefahr eines bakteriotoxischen Effekts im Vergleich zu den Ergebnissen in Abschnitt 4.1.2.2 deutlich reduziert war.
4.2.2.3 Kultivierung der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG- Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) unter anaeroben Bedingungen
Es stellte sich die Frage, ob die geringere anaerobe Nitritakkumulation der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (TJ-1) gegenüber der mit narGHJI von M. tuberculosis transformierten narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR116) mit einem veränderten Wachstumsverhalten der Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitratzusatz assoziiert ist. Daher wurde im folgenden Experiment die Keimdichte der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1), der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Abhängigkeit von der Zeit unter anaeroben Bedingungen in vitro untersucht und in Abbildung 4.10 dargestellt. Gezeigt werden die Mittelwerte und deren Standardabweichungen aus je drei Experimenten. 60 Ergebnisse ______
109
BCG Wildtyp 108 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1)
107
106
KBE/ml KBE/ml 105
104
103
100 0 5 10 15 20 25 Zeit (Tage) : Abb. 4.10:
Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
In diesem Experiment kam es unter anaeroben Bedingungen zu einer vergleichbaren Abnahme der Keimdichte des Wildtyps, der narG-Deletionsmutante (SR106) und der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1). Es konnte also wiederum in vitro kein Unterschied in der Überlebenszeit der drei Mykobakterienstämme festgestellt werden.
61 Ergebnisse ______
4.2.3 Untersuchung der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG- Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) im Tiermodell mit Balb/c Mäusen
In dem folgenden Tierexperiment mit Balb/c Mäusen sollte untersucht werden, ob sich die mit narGHJI von M. bovis BCG transformierte narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (TJ-1) im Hinblick auf die Keimdichte in den untersuchten Organen phänotypisch wie der M. bovis BCG Wildtyp verhält. Insbesondere stellte sich die Frage, ob ein möglicher durch Nitrit verursachter toxischer Effekt in vivo auftritt. Aufgrund der in vitro niedrigeren Nitritakkumulation der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) im Vergleich zu der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten Deletionsmutante (SR116) war dies jedoch nicht zu erwarten. Alle mit den unterschiedlichen Mykobakterienstämmen (M. bovis BCG Wildtyp, narG- Deletionsmutante (SR106), komplementierte Deletionsmutante (TJ-1)) infizierten Versuchstiere zeigten über den gesamten Versuchszeitraum keinerlei klinische Krankheitssymptome. Weder Gewichtsverlust noch struppiges oder stumpfes Fell konnten festgestellt werden. Die Tiere verhielten sich über den gesamten Versuchszeitraum von 276 Tagen lebhaft.
4.2.3.1 Pathologisch-anatomische Organbefunde
Zu verschiedenen Untersuchungszeitpunkten wurden im Rahmen der Sektionen die Organe der Balb/c Mäuse makroskopisch begutachtet. An Leber, Lunge und Niere konnten zu keinem Zeitpunkt äußerlich sichtbare Veränderungen festgestellt werden. An der Milz wurde dagegen 42 Tage post infectionem eine hochgradige Splenomegalie diagnostiziert. Die Vergrößerung der Milz konnte auch bei allen mit den drei verschiedenen Mykobakterienstämmen infizierten Tieren an jedem späteren Untersuchungszeitpunkt nachgewiesen werden. Allerdings war die Splenomegalie bei den mit der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) infizierten Tieren weniger stark ausgeprägt.
62 Ergebnisse ______
Die Größenveränderungen der Milz der Tiere stellten sich wie folgt dar:
• Größe der Milz 24 Stunden post infectionem: ca. 1,3 x 0,7 x 0,3 cm
• Größe der Milz bei der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG und dem M. bovis BCG Wildtyp ab Tag 42 post infectionem: ca. 1,8 x 1,1 x 0,5 cm
• Größe der Milz bei der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG (TJ-1) ab Tag 42 post infectionem: ca. 1,3 x 1,0 x 0,5 cm
63 Ergebnisse ______
4.2.3.2 Quantitative Analyse der Keimdichte der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten ∆narG-Mutante von M. bovis BCG (TJ-1) in Balb/c Mäusen
4.2.3.2.1 Keimdichte in der Leber
In der Leber der Versuchstiere, die mit dem M. bovis BCG Wildtyp infiziert wurden, nahm die Bakterienlast bis zum Tag 120 kontinuierlich ab. Im weiteren Versuchsverlauf konnte keine Veränderung der Keimdichte in diesem Organ festgestellt werden. Die Erreger persistierten seit dem 120. Tag post infectionem mit der gleicher Zahl an KBE pro Organ. Die mit der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) infizierten Mäuse zeigten eine kontinuierliche Abnahme der Keimdichte bis zum Versuchsende. Im Vergleich zu diesen Mäusen konnte in der Leber der Tiere, welche mit der mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) infiziert wurden, eine noch stärkere kontinuierliche Abnahme der Bakterienlast beobachtet werden. Wie in Abbildung 4.11 dargestellt, wurden bei diesen Tieren am Tag 276 post infectionem in der Leber keine KBE mehr festgestellt. Gezeigt sind die Mittelwerte und deren Standardabweichungen der Keimdichte in den Lebern von je drei Mäusen.
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1) 105
104
103
KBE/Organ Leber 102
101
100
0 50 100 150 200 250
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.11: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. 64 Ergebnisse ______
4.2.3.2.2 Keimdichte in der Lunge
In der Lunge konnte bei den mit M. bovis BCG infizierten Versuchstieren über den gesamten Versuchszeitraum bis auf einen geringen Anstieg der Keimdichte am 42. Tag post infectionem keine wesentliche Veränderung in der Bakterienlast beobachtet werden. Die Bakterien zeigten in der Lunge ein Persistenzverhalten. Die Mäuse, die mit der narG-Deletionsmutante (SR106) infiziert wurden, zeigten bis zum 120. Tag eine kontinuierliche Abnahme der Bakterienlast in der Lunge. Im Anschluss war auch bei dieser Mutante bis zum Versuchsende ein Persistenzverhalten zu beobachten. Im Gegensatz zur narG-Deletionsmutante (SR106) war bei den mit der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) infizierten Tieren eine kontinuierliche Keimzahlabnahme feststellbar. Am 276. Tag post infectionem konnten in der Lunge keine KBE mehr nachgewiesen werden. In Abbildung 4.12 werden die Resultate der Analyse der Keimdichte veranschaulicht. Gezeigt sind die Mittelwerte und deren Standardabweichungen der Keimdichten in den Lungen von je drei Mäusen.
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1) 105
104
103
2 KBE/Organ Lunge KBE/Organ 10
101
100
0 50 100 150 200 250
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.12: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps. 65 Ergebnisse ______
4.2.3.2.3 Keimdichte in der Niere
Der M. bovis BCG Wildtyp persistierte über den gesamten Versuchszeitraum in der Niere. Die Bakterienlast der mit der narG-Deletionsmutante (SR106) infizierten Balb/c Mäuse nahm bis Tag 120 post infectionem kontinuierlich ab und bewegte sich im weiteren Verlauf mit 6,6 x 101 KBE pro Organ auf einem geringen Persistenzniveau. Die bakteriologische Untersuchung der Niere von Balb/c Mäusen, die mit der narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. bovis BCG (TJ-1) infiziert wurden, ergab einen kontinuierlichen Rückgang der Keimdichte. Ab Tag 120 waren in der Niere dieser infizierten Tiere keine Mykobakterien mehr nachweisbar. In Abbildung 4.13 sind die Mittelwerte und deren Standardabweichungen der Keimdichte in den Nieren von je drei Mäusen dargestellt: :
107
BCG Wildtyp 106 ∆narG BCG (SR106) ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1) 105
104
103
KBE/Organ Niere 102
101
100
0 50 100 150 200 250
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.13: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps.
66 Ergebnisse ______
4.2.3.2.4 Keimdichte in der Milz
Bei den mit M. bovis BCG Wildtyp infizierten Kontrolltieren wurde über den gesamten Versuchszeitraum in der Milz eine Persistenz der Mykobakterien beobachtet. Die mit der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) sowie die mit der narG- Deletionsmutante (SR106) infizierten Versuchstiere zeigten nach einer Persistenzphase in den ersten 42 Tagen des Tierversuchs einen ähnlich verlaufenden geringgradigen Abfall der Bakterienlast bis auf etwa 1,1 x 103 (SR106) bzw. 1,3 x 102 KBE pro Organ (TJ-1) am 276. Tag. In Abbildung 4.14 sind Mittelwert und Standardabweichung der Keimdichten aus je drei Organen dargestellt.
107
106
105
104
103 KBE/Organ Milz 102 BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) 101 ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1)
100 0 50 100 150 200 250
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.14: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der
∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps.
In allen untersuchten Organen nahm die Keimdichte beider Mutanten deutlicher ab als die des Wildtyps. In Leber, Lunge und Niere konnte zudem eine geringere Keimdichte der komplementierten Deletionsmutante (TJ-1) gegenüber der narG-Deletionsmutante (SR106) festgestellt werden. 67 Ergebnisse ______
Da die komplementierte Deletionsmutante von M. bovis BCG (TJ-1) eine geringere Virulenz als der M. bovis BCG Wildtyp und die narG-Deletionsmutante (SR106) zeigte, konnte auch bei der Verwendung des narGHJI-Genclusters von M. bovis BCG für die Transformation der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG eine Wiederherstellung des Phänotyps des M. bovis BCG Wildtyps in vivo nicht festgestellt werden.
Die Ergebnisse aus der Untersuchung der narG-Deletionsmutante, komplementiert mit narGHJI von M. bovis BCG (TJ-1), zeigen:
• Durch die Komplementation des narGHJI-Gens von M. bovis BCG in die narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG wird in vitro der Phänotyp des M. bovis BCG Wildtyps wiederhergestellt
• Die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. bovis BCG weist eine um das 2 – 3 fach stärkere Nitritakkumulation auf als der M. bovis BCG Wildtyp. Gegenüber der mit narGHJI von M. tuberculosis komplementierten Deletionsmutante ist jedoch eine schwächere Nitritakkumulation festzustellen
• Die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. bovis BCG zeigt in vitro sowohl unter anaeroben als auch unter aeroben Bedingungen keine Unterschiede in Wachstum und Überleben zum M. bovis BCG Wildtyp und zur narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG
• Die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. bovis BCG verhält sich im Balb/c Mausinfektionsmodell im Vergleich zu der M. bovis BCG Wildtyp und der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG attenuiert
68 Ergebnisse ______
4.3 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in vitro und in vivo
In unserer Arbeitsgruppe wurden bereits zwei nirB-Deletionsmutanten von M. bovis BCG hergestellt. In der ersten Mutante IJ-1 umfaßt eine größere Deletion (3476 Basenpaare) das gesamte nirB-Gen und das sich anschließende nirD-Gen. In der zweiten Mutante IJ-2 beschränkt sich eine kleinere Deletion (1177 Basenpaare) auf das nirB-Gen. Eine Doppelmutante von M. bovis BCG mit einer Deletion im narG-Gen und der kleinen Deletion im nirB-Gen (CD-1) wurde von C. Diephaus im Rahmen ihrer Dissertation erstellt.
4.3.1 Kultivierung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) unter aeroben Bedingungen
Zunächst wurde das Wachstum beider nirB-Deletionsmutanten (IJ-1, IJ-2) und der narG/nirB-Doppeldeletionsmutante (CD-1) mit dem des M. bovis BCG Wildtyps in vitro unter aeroben Bedingungen in 7H9-Nährmedium verglichen. In den Abbildungen 4.15.A und 4.15.B sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten dargestellt:
69 Ergebnisse ______
Abb. 4.15.A:
2,0 BCG Wildtyp ∆nirB BCG (gr. Deletion) (IJ-1) ∆nirB BCG (kl.Deletion) (IJ-2) ∆ ∆ 1,5 narG/ nirB BCG (CD-1)
(nm) 1,0 600 OD
0,5
0,0
0246 Zeit (Tage) Abb. 4.15.B:
109
BCG Wildtyp ∆nirB BCG (gr.Deletion) (IJ-1) ∆nirB BCG (kl.Deletion) (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1) 108
KBE/ml 107
106
100 0123456 Zeit (Tage) Abb. 4.15.A und Abb. 4.15.B:
Wachstum (OD600 und KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in 7H9-Nährmedium inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 70 Ergebnisse ______
Wie erwartet zeigten alle Stämme unter diesen für Mykobakterien optimalen Bedingungen ein sehr ähnliches Wachstumsverhalten. Damit konnte ein genereller Wachstumsdefekt ausgeschlossen werden, der im Mausinfektionsmodell zu nicht interpretierbaren Ergebnissen geführt hätte. Bei allen weiteren Experimenten wurde ausschließlich die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) mit der kleinen Mutation untersucht. Die narG/nirB- Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG (CD-1) wurde bei den abschließenden tierexperimentellen Arbeiten erneut miteinbezogen.
4.3.2 Analyse der anaeroben Nitritreduktaseaktivität der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps
4.3.2.1 Ammoniumakkumulation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Minimalnährmedium
Das nirBD-Operon kodiert bei allen bisher bekannten Bakterienstämmen eine Nitritreduktase, die Nitrit zu Ammonium reduziert und ausschließlich unter anaeroben Bedingungen exprimiert wird [STOLZ u. BASU 2002]. Zunächst wurde deshalb die Ammoniumakkumulation der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) im Vergleich zum M. bovis BCG Wildtyp unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitritzusatz getestet. Da zu Beginn dieser Arbeit nicht feststand, bei welcher Substratkonzentration ein messbarer Effekt eintritt, wurden unterschiedliche Konzentrationen von Nitrit eingesetzt. In Abbildung 4.16 wird die Ammoniumakkumulation bei Zugabe von unterschiedlichen Nitritkonzentrationen gezeigt: 71 Ergebnisse ______
120
100
80
60
40 Ammonium (µmol/l) Ammonium
20
0
0204060 Zeit (Tage)
BCG Wildtyp ohne Nitritzusatz BCG Wildtyp mit 0,2 mmol Nitrit BCG Wildtyp mit 0,3 mmol Nitrit BCG Wildtyp mit 0,5 mmol Nitrit BCG Wildtyp mit 1 mmol Nitrit BCG Wildtyp mit 3 mmol Nitrit BCG Wildtyp mit 5 mmol Nitrit BCG Wildtyp mit 10 mmol Nitrit ∆nirB BCG (IJ2) mit 0,2 mmol Nitrit ∆nirB BCG (IJ2) mit 1 mmol Nitrit ∆nirB BCG (IJ2) mit 10 mmol Nitrit. ∆nirB BCG (IJ2) hitzeinaktiviert mit 10 mmol Nitrit BCG Wildtyp hitzeinaktiviert mit 10 mmol Nitrit
Abb. 4.16: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
Bei einer Zugabe von 10 mmol/l Nitrit wurde eine Ammoniumakkumulation sowohl bei M. bovis BCG als auch bei dessen nirB-Deletionsmutante (IJ-2) beobachtet. Es handelte sich dabei nicht um einen unspezifischen Effekt, weil bei den mitgeführten Kontrollen, in denen hitzeinaktivierte Bakterien verwendet wurden, weder beim Wildtyp noch bei der Mutante eine Ammoniumakkumulation auftrat. Diese Akkumulation bei hohen Nitritkonzentrationen ist offensichtlich nicht mit der Expression des nirB-Gens assoziiert. Zudem kam es im Laufe des Versuchs zur leichten Gelbfärbung des Minimalnährmediums, was auf eine Reaktion des 72 Ergebnisse ______
Nitrits mit dem Medium hindeuten könnte. Bei niedrigeren Nitritkonzentrationen war weder beim Wildtyp noch bei der Mutante (IJ-2) eine Ammoniumakkumulation zu beobachten.
4.3.2.2 Vergleich der Ammoniumakkumulation des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium und in Phosphatpuffer
Staphylococcus carnosus reduziert unter anaeroben Bedingungen große Mengen Nitrit zu Ammonium. NEUBAUER und GÖTZ konnten 1996 in einem Phophatpuffer bei geringen Nitritkonzentrationen (1 mmol/l) eine Ammoniumakkumulation dieses Stammes nachweisen. Im folgenden Experiment wurde dieser Phosphatpuffer mit dem Minimalnährmedium verglichen. Staphylococcus carnosus wurde dabei als Positivkontrolle verwendet. In Abbildung 4.17 wird die Ammoniumakkumulation des M. bovis BCG Wildtyps unter Verwendung der beiden unterschiedlichen Medien verglichen:
200
150
100 Ammonium (µmol/l)Ammonium 50
0
0 1020304050 Zeit (Tage)
BCG Wildtyp mit 5 mmol Nitrit in Minimalnährmedium Staphylococcus carnosus mit 5 mmol Nitrit in Minimalnährmedium
BCG Wildtyp mit 5 mmol Nitrit in Phosphatpuffer (K2HPo4 / KH2Po4)
Staphylococcus carnosus mit 5 mmol Nitrit in Phosphatpuffer (K2HPo4 / KH2Po4)
Abb. 4.17: Ammoniumakkumulation von M. bovis BCG und Staphylococcus. carnosus. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium bzw. in Kaliumphosphatpuffer mit 5,0 mmol/l Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. 73 Ergebnisse ______
Mit diesem Experiment wurde deutlich, dass bei Verwendung des Kaliumphosphatpuffers auch beim M. bovis BCG Wildtyp eine Ammoniumakkumulation nach Zugabe niedriger Nitritkonzentrationen nachweisbar ist.
4.3.2.3 Ammoniumakkumulation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Phosphatpuffer
In weiteren Experimenten sollte daher untersucht werden, ob sich bei niedrigeren Nitritkonzentrationen ein Unterschied im Phänotyp zwischen M. bovis BCG und dessen nirB- Deletionsmutante (IJ-2) zeigt. Dazu wurden zu der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) und dem Wildtyp in Kaliumphosphatpuffer 5,0 mmol/l, 1,0 mmol/l, 0,5 mmol/l bzw. 0,1 mmol/l Nitrit gegeben und unter anaeroben Bedingungen bebrütet. Als Maß für die Nitritreduktion wurde erneut die Ammoniumakkumulation bestimmt. Die Abbildungen 4.18 – 4.21 zeigen die Ammoniumakkumulation in Phosphatpuffer bei unterschiedlichen Nitritkonzentrationen:
74 Ergebnisse ______
5,0 mmol/l Nitritzusatz 1,0 mmol/l Nitritzusatz
160 140 140 120 120 100 100
80 80
60 60
40 40 Ammonium (µmol/l) Ammonium (µmol/l) Ammonium 20 20
0 0
0 1020304050 0 1020304050 Zeit (Tage) Zeit (Tage)
0,5 mmol/l Nitritzusatz 0,1 mmol/l Nitritzusatz
60 60
50
40 40
30
20 20
Ammonium (µmol/l) Ammonium (µmol/l) Ammonium 10
0 0
0 1020304050 0 1020304050 Zeit (Tage) Zeit (Tage)
BCG Wildtyp ∆nirB BCG (IJ-2) BCG Wildtyp hitzeinaktiviert ∆nirB BCG (IJ-2) hitzeinaktiviert
Abb. 4.18 – 4.21: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps nach Zusatz unterschiedlicher Nitritkonzentrationen. Die Bakterien wurden in Kaliumphosphatpuffer mit Nitritkonzentrationen zwischen 5,0 mmol/l und 0,1 mmol/l Nitrit inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
Bei Verwendung von Kaliumphosphatpuffer konnte selbst bei 100 µmol/l Nitrit eine Ammoniumakkumulation nachgewiesen werden. Bei allen eingesetzten Nitritkonzentrationen war die von M. bovis BCG und der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) gebildete kumulative Ammoniummenge annähernd gleich. Auffällig war, dass bis zu einer Nitritzugabe von 1,0 mmol/l steigende Nitritkonzentrationen mit einer steigenden Ammoniumproduktion 75 Ergebnisse ______korrelierten. Bei höheren Nitritzugaben (5,0 mmol/l) blieb die gebildete Ammoniummenge annähernd konstant.
4.3.2.4 Abnahme der Nitritkonzentration bei der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Phosphatpuffer
Um zu zeigen, dass in Phosphatpuffer nachgewiesenes Ammonium tatsächlich aus dem hinzugefügten Nitrit gebildet wird, wurde in dem folgenden Experiment die Abnahme der Nitritkonzentration in Kaliumphosphatpuffer gemessen. Für diese Untersuchung wurden erneut der M. bovis BCG Wildtyp und die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Kaliumphospatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz inokuliert. Zur Messung der Nitritkonzentration wurde der in Abschnitt 4.1.2.2 und 4.2.2.2 genutzte Nitratreduktasetest verwendet. In Abbildung 4.22 dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
100
80 Nitrit (µmol/l)
60 BCG Wildtyp ∆nirB BCG (IJ-2) BCG Wildtyp hitzeinaktiviert ∆ 0 nirB BCG (IJ-2) hitzeinaktiviert
0 5 10 15 20 25
Zeit (Tage) Abb. 4.22: Nitritreduktion der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
76 Ergebnisse ______
In diesem Experiment fand sowohl beim Wildtyp als auch bei der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) eine Verminderung der Nitritkonzentration in Kaliumphosphatpuffer statt. Das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Abnahme der Nitritkonzentration entsprach der Ammoniumakkumulation aus dem Versuch in Abschnitt 4.3.2.3. Aus diesem Experiment kann geschlossen werden, dass die Ammmoniumakkumulation durch die Umwandlung des zugesetzten Nitrits hervorgerufen wird.
4.3.3 Kultivierung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium
Im nächsten Experiment sollte die Keimdichte von M. bovis BCG und dessen nirB- Deletionsmutante (IJ-2) unter anaeroben Bedingungen in Minimalnährmedium mit Nitrat als alleinige Stickstoffquelle untersucht werden. Durch diesen Versuch sollte festgestellt werden, ob die nirB-Deletionsmutante (IJ-2) gegenüber dem Wildtyp durch den Verlust des nirB-Gens ein verändertes Wachstumsverhalten zeigt bzw. ob dieser Gendefekt mit einem kürzeren Überleben der Bakterien assoziiert ist. Dargestellt in Abbildung 4.23 sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
77 Ergebnisse ______
108
BCG Wildtyp ∆nirB BCG (IJ2)
107 KBE/ml
106
100 0 5 10 15 20 25
Zeit (Tage) Abb. 4.23: Keimdichte (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitrat inokuliert und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert.
Die Keimdichte der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps nahm unter anaeroben Bedingungen in gleichem Ausmaß ab. Auch hier konnte in vitro kein Unterschied zwischen dem Wildtyp und der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) gezeigt werden.
78 Ergebnisse ______
4.3.4 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) im Tiermodell
4.3.4.1 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in SCID-Balb/c Mäusen
Um den Einfluss der Deletion des nirB-Gens auf die mykobakterielle Pathogenese zu untersuchen, wurde das Wachstum und die Überlebenszeit des M. bovis BCG Wildtyps mit der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der narG/nirB- Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG (CD-1) in immundefizienten SCID-Balb/c Mäusen verglichen. Bei einer Infektionsdosis von 1 x 106 Bakterien pro Tier führt M. bovis BCG in SCID-Balb/c Mäusen aufgrund der fehlenden Lymphozytenantwort zu einer progredienten Infektion, die durch kontinuierliches Keimwachstum in allen Organen charakterisiert ist. Das stärkste Wachstum ist dabei in der Lunge zu beobachten. Typischerweise versterben die Tiere innerhalb von drei Monaten, wobei in histopathologischen Untersuchungen eine vollständigen Zerstörung des Lungengewebes zu sehen ist [NORTH u. IZZO 1993, FRITZ et al. 2002].
4.3.4.2 Unterschiede in den Überlebenszeiten von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1)
49 Tage post infectionem zeigten die mit dem M. bovis BCG Wildtyp infizierten SCID- Balb/c Mäuse erste Krankheitssymptome. Das Fell wurde stumpf und struppig, die Tiere verhielten sich ruhiger. Ab dem 75. Tag post infectionem kamen eine deutliche Abmagerung und Flankenatmung als Symptome hinzu. Nach 105 Tagen verendeten die letzten der mit dem Wildtyp infizierten Mäuse mit einem von durchschnittlich 28 g auf ca. 12 g reduzierten Lebendgewicht. Die mit der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) infizierten Mäuse zeigten nach 70 Tagen post infectionem dieselben Symptome wie die Mäuse, die mit dem Wildtyp infiziert wurden. Eine deutliche Abmagerung kam ab Tag 111 post infectionem hinzu. Nach 126 bzw. 143 Tagen verendeten die letzten der mit der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) infizierten Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 11,3 g. Auch bei den SCID-Balb/c Mäusen, die mit der narG/nirB-Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG (CD-1) infiziert wurden, zeigten sich 63 Tage post infectionem die ersten 79 Ergebnisse ______
Krankheitserscheinungen. Zusätzlich zu dem stumpfen, struppigen Fell und dem zunehmend apathischen Verhalten wurde bei einigen Tieren eine Schiefhaltung des Kopfes beobachtet. Die Abmagerung der Tiere wurde ab Tag 96 post infectionem deutlich. Mit einem durchschnittlichen Gewicht von 11,9 g verendeten die immundefizienten Mäuse zwischen Tag 119 und Tag 125.
4.3.4.3 Pathologisch–anatomische Organbefunde
Im Rahmen der Sektionen wurden die Organe der immundefizienten Mäuse zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten makroskopisch begutachtet. An der Leber, der Lunge und der Niere konnten zu keinem Zeitpunkt äußerlich sichtbare Veränderungen festgestellt werden. Dagegen wurde 14 Tage post infectionem bei allen infizierten Tieren eine Splenomegalie diagnostiziert, die bis zum Versuchsende nachweisbar war.
Die Größenveränderungen der Milz der Tiere wird im folgenden dargestellt. Es wurden je drei Organe untersucht; angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Messwerte.
• Größe der Milz 24 Stunden post infectionem: 1,4±0,24 cm x 0,7±0,084 cm x 0,32±0,053 cm • Größe der Milz ab Tag 14 post infectionem: 2,37±0,288 cm x 0,73±0,052 cm x 0,43±0,082 cm
Zusätzlich wurde bei der Sektion der Organe beobachtet, dass die Organgewebe der mit den unterschiedlichen Bakterienstämmen infizierten Tiergruppen im Verlauf des Tierversuches immer fester wurden und schwerer zu homogenisieren waren.
80 Ergebnisse ______
4.3.4.4 Quantitative Analyse der Keimdichte der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in SCID-Balb/c Mäusen
4.3.4.4.1 Keimdichte in der Leber
In der Leber konnte bei den SCID-Balb/c Mäusen, die mit dem M. bovis BCG Wildtyp, der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) oder der narG/nirB- Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG (CD-1) infiziert wurden, gleichermaßen ein kontinuierliches Wachstum der Bakterien bis zum Tod der Versuchstiere beobachtet werden. Die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Keimdichte in der Leber sind in Abbildung 4.24 dargestellt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden.
109
108
107
106
105
KBE/Organ Leber KBE/Organ BCG Wildtyp 104 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
103
100 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.24: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
81 Ergebnisse ______
4.3.4.4.2 Keimdichte in der Lunge
Auch bei der Bestimmung der Keimdichte in der Lunge sah man ein kontinuierliches Wachstum aller untersuchten Bakterienstämme bis zum Verenden der Tiere. Auffällig war das im Vergleich zur Leber stärkere Wachstum der Bakterien in der Lunge. Die Keimdichte lag am Versuchsende bei allen untersuchten Stämmen bei etwa 2,8 x 107 bis 8,9 x 107 KBE pro Organ. In der Abbildung 4.25 sind die Mittelwerte und Standardabweichungen dargestellt, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden:
109
108
107
106
105
KBE/Organ Lunge KBE/Organ BCG Wildtyp 104 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
103
100 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.25: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
82 Ergebnisse ______
4.3.4.4.3 Keimdichte in der Niere
Aus Abbildung 4.26 ist ersichtlich, dass sich die Anzahl der KBE pro Organ auch über den gesamten Zeitverlauf in der Niere bei den Tieren, die mit der nirB-Deletionsmutante (IJ-2), der narG/nirB-Doppeldeletionsmutante (CD-1) bzw. dem M. bovis BCG Wildtyp infiziert wurden, nicht unterscheidet. Die höchsten Keimdichten am Ende des Tierversuches lagen unter den in der Leber und der Lunge ermittelten. Durch die Mittelwerte und Standardabweichungen, die durch die Untersuchung von je drei Organen erhoben wurden, wird die Entwicklung der Keimdichte in der Niere dargestellt.
109
108
107
106
105
KBE/Organ Niere KBE/Organ BCG Wildtyp 104 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
103
100 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.26: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
83 Ergebnisse ______
4.3.4.4.4 Keimdichte in der Milz
Auch in der Milz war ein kontinuierliches Wachstum des M. bovis BCG Wildtyps und der beiden Mutanten (IJ-2, CD-1) festzustellen. Wie in Abbildung 4.27 veranschaulicht, überstieg die Keimbelastung der Mutanten mit ca. 3,3 x 108 KBE pro Milz die des M. bovis BCG Wildtyps mit etwa 4,4 x 107 KBE pro Organ. Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden.
109
108
107
106
105
KBE/Organ Milz BCG Wildtyp 104 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
103
100 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.27: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
Der Verlust des nirB-Gens verhinderte oder verzögerte nicht das Keimwachstum in SCID- Balb/c Mäusen, sondern hatte lediglich einen geringen Einfluss auf die Lebensdauer der immundefizienten Versuchstiere. Sowohl die mit der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) als auch die mit der narG/nirB-Doppeldeletionsmutante (CD-1) infizierten SCID-Balb/c Mäuse überlebten länger als die mit dem M. bovis BCG Wildtyp infizierten Tiere. Aus diesem Mausmodell lässt sich daher nur eine geringfügige Attenuierung der Mutanten herleiten.
84 Ergebnisse ______
4.3.4.5 Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in Balb/c Mäusen
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG in Balb/c Mäusen gegenüber dem Wildtyp deutlich attenuiert ist [FRITZ et al. 2002]. In dem folgenden Experiment sollte untersucht werden, ob sich die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) und die narG/nirB-Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG (CD-1) ebenfalls in immunkompetenten Balb/c Mäusen attenuiert verhalten. Für diesen Zweck wurden Balb/c Mäuse mit der gleichen Bakterienmenge von dem M. bovis BCG Wildtyp, der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) bzw. der narG/nirB- Doppeldeletionsmutante (CD-1) intravenös infiziert. Die Keimdichte in der Leber, Lunge, Niere und Milz wurde zu definierten Zeitpunkten untersucht. Alle mit den drei unterschiedlichen Mykobakterien infizierten Mäuse zeigten über den gesamten Versuchszeitraum keinerlei klinische Krankheitssymptome. Es konnte immer ein glattes Haarkleid und ein lebhaftes Verhalten festgestellt werden.
4.3.4.6 Pathologisch-anatomische Organbefunde
Im Rahmen der Sektionen wurden die Organe der Balb/c Mäuse zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten makroskopisch begutachtet. An Leber, Lunge und Niere konnten zu keinem Zeitpunkt äußerlich sichtbare Veränderungen festgestellt werden. Dagegen wurde 14 Tage post infectionem bei allen mit den drei Mykobakterienstämmen (BCG Wildtyp, IJ-2, CD-1) infizierten Tieren eine Splenomegalie diagnostiziert, die bis zum Versuchsende nachweisbar war.
Die Größenveränderungen der Milz der Tiere wird im folgenden dargestellt. Es wurden je zwei bis drei Organe untersucht; angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Messwerte.
• Größe der Milz 24 Stunden post infectionem: 1,36±0,163 cm x 0,68±0,075 cm x 0,3±0,06 cm • Größe der Milz ab 14 Tage post infectionem: 1,68±0,31 cm x 1,07±0,10 cm x 0,5±0,06 cm
85 Ergebnisse ______
4.3.4.7 Quantitative Analyse der Keimdichte der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und der ∆narG/∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (CD-1) in Balb/c Mäusen
4.3.4.7.1 Keimdichte in der Leber
In der Leber der Tiere, die mit dem M. bovis BCG Wildtyp infiziert wurden, konnte bis Tag 204 eine kontinuierliche Abnahme der Keimdichte registriert werden. Anschließend war bis zum Versuchsende nach 300 Tagen post infectionem eine Phase der Persistenz dieser Mykobakterien in der Leber zu beobachten. Die Untersuchung der Leber der mit der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) und der narG/nirB- Doppeldeletionsmutante (CD-1) infizierten Balb/c Mäuse ergab einen fortschreitenden Rückgang der Keimdichte von Versuchsbeginn an. Am Versuchsende war jeweils ein geringer Bakteriengehalt von ca. 9,0 x 101 KBE pro Leber nachzuweisen. In Abbildung 4.28 sind die Mittelwerte und Standardabweichungen, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden, dargestellt:
107 BCG Wildtyp ∆nirB BCG (IJ-2) 6 10 ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
105
104
103 KBE/Organ Leber KBE/Organ 102
101
100 0 50 100 150 200 250 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.28: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
86 Ergebnisse ______
4.3.4.7.2 Keimdichte in der Lunge
Die Bakterienlast in der Lunge nahm bei allen mit den Mutanten bzw. dem Wildtyp infizierten Mäusen bis zum Tag 204 ab und blieb im weiteren Verlauf auf unverändertem Niveau. Der Unterschied zwischen den mit den Mutanten und dem Wildtyp infizierten Versuchstieren bestand lediglich in dem unterschiedlichen Persistenzniveau am Versuchsende. Der M. bovis BCG Wildtyp persistierte mit etwa 5,0 x 103 KBE pro Organ. Die nirB-Deletionsmutante (IJ-2) bzw. die narG/nirB-Doppeldeletionsmutante (CD-1) persistierten mit ca. 6,0 x 101 KBE/Lunge. In Abbildung 4.29 sind Mittelwerte und Standardabweichungen dargestellt, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden:
107
BCG Wildtyp 106 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
105
104
103 KBE/Organ Lunge KBE/Organ 102
101
100 0 50 100 150 200 250 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.29: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
87 Ergebnisse ______
4.3.4.7.3 Keimdichte in der Niere
In der Niere der Versuchstiere, welche mit dem M. bovis BCG Wildtyp infiziert wurden, konnte über den gesamten Beobachtungszeitraum keine signifikante Veränderung in der Bakterienlast festgestellt werden. Abbildung 4.30 zeigt, dass der Erreger seit Beginn des Experiments mit etwa gleicher Anzahl an KBE in der Niere persistierte. Die mit der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) bzw. der narG/nirB-Doppeldeletionsmutante (CD-1) infizierten Mäuse zeigten bis zum Tag 150 post infectionem in der Niere ebenfalls eine Phase der Persistenz der Bakterien. Im weiteren Verlauf nahm die Keimdichte in den mit den Mutanten infizierten Balb/c Mäusen deutlich ab. Am Tag 300 post infectionem waren allerdings auch hier noch geringe Bakterienmengen pro Niere nachweisbar. In Abbildung 4.30 werden die Resultate der Analyse der Keimdichte durch Mittelwerte und Standardabweichungen, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden, dargestellt:
107
BCG Wildtyp 106 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
105
104
103 KBE/Organ Niere KBE/Organ 102
101
100 0 50 100 150 200 250 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.30: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
88 Ergebnisse ______
4.3.4.7.4 Keimdichte in der Milz
Der M. bovis BCG Wildtyp persistierte bis zum Tag 42 post infectionem in der Milz und zeigte keine nennenswerte Veränderung der Keimdichte. Mit zunehmender Versuchsdauer wurde dann eine sehr geringfügige Abnahme der Bakterienlast in diesem Organ beobachtet. Ebenso verhielten sich die Mutanten. Wie aus Abbildung 4.31 ersichtlich, war am Tag 300 post infectionem die Bakterienlast in der Milz bei den mit der nirB-Deletionsmutante (IJ-2) bzw. der narG/nirB- Doppeldeletionsmutante (CD-1) infizierten Mäusen mit ca. 3,3 x 103 KBE annähernd gleich. Die Keimdichte der Tiere, die mit dem M. bovis BCG Wildtyp infiziert wurden, lag am Tag 300 mit 3,05 x 104 KBE pro Milz leicht darüber. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen, die durch die Untersuchung von je drei Organen ermittelt wurden.
107
106
105
104
103 KBE/Organ Milz 102
BCG Wildtyp 101 ∆nirB BCG (IJ-2) ∆narG/∆nirB BCG (CD-1)
100 0 50 100 150 200 250 300
Zeit (Tage post infectionem) Abb. 4.31: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps.
Sowohl die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) als auch die narG/nirB- Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG (CD-1) waren im Mausmodell mit Balb/c Mäusen 89 Ergebnisse ______gegenüber dem M. bovis BCG Wildtyp attenuiert. Dies war mit Ausnahme der an der Lunge erhobenen Ergebnisse allerdings erst ab Tag 150 post infectionem zu beobachten und weniger deutlich erkennbar als bei der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. tuberculosis (Abschnitt 4.1.3). Eine aufgrund der doppelten Deletion erwartete stärkere Attenuierung der narG/nirB-Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG im Vergleich zu einer Mutante mit einer einzelnen Deletion im nirB- bzw. narG-Gen konnte in diesem Versuch nicht beobachtet werden.
Die Ergebnisse aus der Untersuchung der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) ergeben zusammenfassend:
• Die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG und der M. bovis BCG Wildtyp unterscheiden sich in ihrem Wachstumsverhalten unter anaeroben Bedingungen in vitro nicht voneinander
• Die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG und der M. bovis BCG Wildtyp unterscheiden sich unter anaeroben Bedingungen im Hinblick auf die Ammoniumakkumulation und in ihrer Fähigkeit, Nitrit zu reduzieren, nicht signifikant voneinander
• Die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG und die narG/nirB- Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG sind gegenüber dem M. bovis BCG Wildtyp in SCID-Balb/c attenuiert (verlängerte Überlebenszeit der Mäuse)
• Die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG und die narG/nirB- Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG sind gegenüber dem M. bovis BCG Wildtyp in Balb/c Mäusen deutlich attenuiert (geringere Keimdichte der Mutanten)
90 Ergebnisse ______
4.4 Untersuchung der Nitrat- bzw. Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen
In allen vorangegangenen Untersuchungen zur Funktion des nirBD-Genprodukts in vitro wurde davon ausgegangenen, dass das nirBD-Gencluster die Nitritreduktion nur unter anaeroben Bedingungen vermittelt. Diese Theorie ließ sich jedoch bislang nicht beweisen. In unserer Arbeitsgruppe wurde zwischenzeitlich herausgefunden, dass die Nitratreduktion durch das narGHJI-Gencluster bei M. tuberculosis nicht nur unter anaeroben, sondern auch unter aeroben Bedingungen stattfindet [STERMANN et al. 2003]. M. tuberculosis kann unter aeroben Bedingungen Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum verwenden [RATLEDGE 1982]. Diese als Nitratassimilation bezeichnete Stoffwechselleistung erfordert neben der Reduktion von Nitrat zu Nitrit die weitere Reduktion von Nitrit zu Ammonium. Ammonium kann weiter, z.B. über α-Ketoglutarat (2-Oxogluterat) bzw. Glutamat, dem bakteriellen Substratstoffwechsel zugeführt werden. Es stellte sich daher die Frage, ob das nirBD-Gen bei M. bovis BCG unter aeroben Bedingungen die Reduktion von Nitrit zu Ammonium kodiert und somit die Nitrat- bzw. Nitritassimilation von M. bovis BCG ermöglicht.
91 Ergebnisse ______
4.4.1 Vergleich der Nitratassimilation bei M. tuberculosis und M. bovis BCG
Zunächst wurde daher das Wachstum von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren narG-Deletionsmutanten in Minimalnährmedium mit Nitrat als alleiniger Stickstoffquelle verglichen. In Abbildung 4.32 und 4.33 wird dieser Wachstumsvergleich anhand von Mittelwerten und Standardabweichungen aus je drei Experimenten veranschaulicht:
BCG Wildtyp 1,0 ∆narG BCG (SR106) M. tuberculosis (H37RV) ∆narG M. tuberculosis (MS-1) 0,8
0,6 (nm) 600
OD 0,4
0,2
0,0
0246810
Zeit (Tage) Abb. 4.32:
Wachstum (OD600) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren ∆narG-Mutanten (MS-1, SR106). Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 92 Ergebnisse ______
108
107
KBE/ml 106
105
100 02468101214 Zeit (Tage)
BCG Wildtyp ∆narG BCG (SR106) M. tuberculosis (H37RV) ∆narG M. tuberculosis (MS-1)
Abb. 4.33: Wachstum (KBE/ml) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren ∆narG-Mutanten (MS-1, SR106). Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
Der M. bovis BCG Wildtyp und die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (SR106) wuchsen mit Nitrat als alleiniger Stickstoffquelle nicht. Diese Bakterienstämme persistierten lediglich und begannen am 11. Tag des Versuches zu verklumpen. M. tuberculosis konnte mit Hilfe der narGHJI-kodierten Nitratreduktase unter aeroben Bedingungen Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum verwenden (Nitratassimilation). Im Vergleich zu M. tuberculosis zeigte M. bovis BCG keine narGHJI- abhängige Nitratassimilation.
93 Ergebnisse ______
4.4.2 Bedeutung des nirBD-Gens für die Nitritassimilation von M. bovis BCG
4.4.2.1 Abhängigkeit der Nitritassimilation von der Nitritkonzentration
Die Nitratassimilation erfordert neben der Nitratreduktion die Reduktion von Nitrit zu Ammonium. Auch wenn der M. bovis BCG Wildtyp unter aeroben Bedingungen kein Nitrat assimilieren kann, so besteht doch die Möglichkeit, dass das nirBD-Gen den zweiten Schritt der Nitratassimilation (Reduktion von Nitrit zu Ammonium Nitritassimilation) vermittelt. Um die optimale Konzentration für die Nitritassimilation zu bestimmen, wurden in dem folgenden Experiment mit 0,01 mmol/l, 0,03 mmol/l, 0,1 mmol/l, 0,3 mmol/l, 1,0 mmol/l, 3,0 mmol/l, 10,0 mmol/l bzw. 30,0 mmol/l Nitrit die Nitritassimilation von M. bovis BCG bestimmt. Alle bisher durchgeführten Experimente zeigten eine gute Korrelation zwischen der
Messung der OD600 und der tatsächlichen Anzahl der Bakterien, die durch deren Kultur auf Agarplatten ermittelt wurde. Aus diesem Grund wurde bei diesem und einigen nachfolgenden Versuchen auf die Untersuchung der KBE pro ml verzichtet und das Wachstum durch die Optische Dichte in Abbildung 4.34 veranschaulicht. Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
BCG Wildtyp 10,0 µmol/l Nitrit 0,6 BCG Wildtyp 30,0 µmol/l Nitrit BCG Wildtyp 0,1 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp 0,3 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp 3,0 mmol/l Nitrit 0,4 BCG Wildtyp 10,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp 30,0 mmol/l Nitrit (nm) 600 OD 0,2
0,0
02468
Zeit (Tage) Abb. 4.34:
Wachstum (OD600) des M. bovis BCG Wildtyps mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium in Square media bottles inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 94 Ergebnisse ______
Das Experiment zeigte, dass der M. bovis BCG Wildtyp in der Lage ist, Nitrit zu assimilieren. Offensichtlich stellt dabei 1,0 mmol/l die opimale Nitritkonzentration für das Wachstum der Bakterien dar. Diese Nitritkonzentration wurde deshalb bei den weiteren Versuchen zugesetzt.
4.4.2.2 Untersuchung der Nitritassimilation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps
Es sollte nun untersucht werden, ob das nirBD-Gen die Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen vermittelt. Wie in Abbildung 4.35.A und 4.35.B gezeigt, wurde deshalb das Wachstum des M. bovis BCG Wildtyps und der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Minimalnährmedium mit Nitrit als alleiniger Stickstoffquelle miteinander verglichen. Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit 1,2 BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit 1,0 ∆nirB BCG (IJ-2) ohne Nitrit
0,8 (nm)
600 0,6 OD 0,4
0,2
0,0
02468
Zeit (Tage) Abb. 4.35.A
Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 95 Ergebnisse ______
108
107 KBE/ml
106
BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) ohne Nitrit
100 0123456
Zeit (Tage) Abb. 4.35.B: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
Das Experiment bestätigte, dass der M. bovis BCG Wildtyp in der Lage ist, Nitrit zu assimilieren. Dagegen vermag die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG Nitrit nicht zum Wachstum zu nutzen. Das nirBD-Gen ermöglicht somit unter aeroben Bedingungen die Nitritassimilation von M. bovis BCG.
4.4.2.3 Untersuchung der Nitritassimilation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps im Vergleich zu M. tuberculosis
Es stellte sich daraufhin die Frage, ob M. tuberculosis, ebenso wie M. bovis BCG, Nitrit assimilieren kann. Es wurde daher das Wachstum von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) in Minimalnährmedium mit Nitrit als alleiniger Stickstoffquelle verglichen. In Abbildung 4.36 wird dies anhand von Mittelwerten und Standardabweichungen aus je drei Experimenten dargestellt: 96 Ergebnisse ______
1,0 BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit 0,8 M.tuberculosis (H37RV) 1,0 mmol/l Nitrit
0,6 (nm) 600 0,4 OD
0,2
0,0
02468
Zeit (Tage) Abb. 4.36:
Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2), des M. bovis BCG Wildtyps und des M. tuberculosis. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
Auch M. tuberculosis konnte Nitrit als alleinige Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen zum Wachstum nutzen. Bemerkenswert ist zudem, dass M. tuberculosis und M. bovis BCG Nitrit gleich gut assimilierten. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass die Aktivität des Enzyms, dass durch das nirBD-Gen kodiert wird, unter aeroben Bedingungen bei M. tuberculosis und M. bovis BCG annähernd gleich ist. Eine nirB-Deletionsmutante von M. tuberculosis wird gegenwärtig in der Arbeitsgruppe erstellt. Es wird erwartet, dass diese Mutante, genau wie die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG, nicht in der Lage ist, Nitrit zu assimilieren.
97 Ergebnisse ______
4.4.2.4 Untersuchung der Nitritassimilation der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG (IJ-2), des M. bovis BCG Wildtyps und der mit nirBD von M. tuberculosis komplementierten ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG
Um zu beweisen, dass die Nitritassimilation von M. bovis BCG und M. tuberculosis durch das nirBD-Genprodukt vermittelt wird, wurde eine komplementierte Deletionsmutante untersucht. Dazu konnte auf das nirBD-Gen von M. tuberculosis, kloniert in den Expressionsvektor pMV206, zurückgegriffen werden. Dieses Konstrukt mit der Bezeichnung pSM22 wurde in die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) transformiert und das
Wachstum dieser komplementierten Deletionsmutante [∆nirB-BCG::nirBD M. tb.] (TJ-4) mit dem der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) und dem M. bovis BCG Wildtyp verglichen. Die Abbildungen 4.37.A und 4.37.B zeigen das Wachstum anhand von Mittelwerten und Standardabweichungen aus je drei Experimenten:
1,2
1,0
0,8 (nm)
600 0,6 OD 0,4
0,2
0,0
02468 Zeit (Tage)
BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit ∆ nirB BCG::nirBD M. tb. (TJ-4) 1,0 mmol/l Nitrit
Abb. 4.37.A:
Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG::nirBD M. tb. (TJ-4), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 98 Ergebnisse ______
108
107 KBE/ml
106 BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit ∆ nirB BCG::nirBD M. tb. (TJ-4) 1,0 mmol/l Nitrit
100 0123456
Zeit (Tage) Abb. 4.37.B:
Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG::nirBD M. tb. (TJ-4), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
Die Transformation des nirBD-Gens von M. tuberculosis in die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG stellte den Phänotyp des M. bovis BCG Wildtyps wieder her. Bemerkenswert an diesen Ergebnissen war einerseits die Feststellung, dass das nirBD-Gen die Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen vermittelte. Zum anderen war die Wachstumsgeschwindigkeit der komplementierten Deletionsmutante (TJ-4) und des M. bovis BCG Wildtyps mit Nitrit als alleiniger Stickstoffquelle annähernd gleich. Dies bedeutet, dass die Aktivität des Enzyms, das durch das nirBD-Gen kodiert wird, bei M. bovis BCG bzw. bei M. tuberculosis ähnlich hoch ist.
99 Ergebnisse ______
4.4.2.5 Vergleich der Nitritassimilation mit der Reduktion von Nitrit bei der ∆nirB- Mutante von M. bovis BCG (IJ-2) und dem M. bovis BCG Wildtyp
Um zu zeigen, dass der Abbau von Nitrit zum Wachstum der Bakterien führt, wurde im nächsten Experiment neben dem Keimwachstum die Abnahme der Nitritkonzentration in einer Kultur mit dem M. bovis BCG Wildtyp bzw. mit der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) gemessen. Durch die Abbildungen 4.38 und 4.39 kann das Wachstum dieser Bakterienstämme mit der Abnahme der Nitritkonzentration in Minimalnährmedium verglichen werden. Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit 8 10 BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) ohne Nitrit
107 KBEml /
106
100 012345
Zeit (Tage) Abb. 4.38: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
100 Ergebnisse ______
1200
1000
800
600 BCG Wildtyp 1,0 mmol/l Nitrit BCG Wildtyp ohne Nitrit ∆nirB BCG (IJ-2) 1,0 mmol/l Nitrit 400 ∆nirB BCG (IJ-2) ohne Nitrit Nitrit (µmol/l) Nitrit
200
0
02468
Zeit (Tage) Abb. 4.39: Abnahme der Nitritkonzentration durch die Verstoffwechselung der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
Bei einer Anfangskonzentration von 1000 µmol/l war am 4. Tag das gesamte Nitrit durch den M. bovis BCG Wildtyp verbraucht worden. Mit diesem Tag kam auch das Wachstum des Wildtyps zum Stillstand. Durch dieses Experiment konnte ein direkter Zusammenhang zwischen dem Bakterienwachstum und der Verstoffwechselung von Nitrit nachgewiesen werden.
4.4.2.6 Unterschiede in der Nitrat- und Nitritreduktion zwischen M. tuberculosis und M. bovis BCG
Die vorhergehenden Experimente lassen vermuten, dass das Unvermögen von M. bovis BCG, Nitrat zu assimilieren (siehe Abschnitt 4.4.1), beim ersten Schritt der Nitratassimilation auftritt, nämlich bei der Reduktion von Nitrat zu Nitrit. Innerhalb des zweiten Schritts der Nitratassimilation, der Reduktion von Nitrit zu Ammonium, scheinen sich der M. bovis BCG Wildtyp und M. tuberculosis nicht zu unterscheiden. Diese Hypothese wird in Abbildung 4.40 verdeutlicht: 101 Ergebnisse ______
M. bovis BCG
keine/geringe Aktivität hohe Aktivität Nitrat Nitrit Ammonium kein Wachstum
NarGHJI BCG NirBD BCG
M. tuberculosis
hohe Aktivität hohe Aktivität Nitrat Nitrit Ammonium Wachstum
NarGHJI M. tb. NirBD M. tb.
Abb. 4.40: Darstellung der hypothetischen Unterschiede in der Nitratassimilation von M. bovis BCG und M. tuberculosis.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde das narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis in die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG transformiert und das Wachstum dieser komplementierten Deletionsmutante (SR116) mit dem des M. bovis BCG Wildtyps nach Zugabe von Nitrat unter aeroben Bedingungen verglichen. Als Kontrolle wurde die mit dem narGHJI von M. bovis BCG komplementierte narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG (TJ-1) mitgeführt. In Abbildung 4.41.A und 4.41.B wird das Wachstum dieser drei Mykobakterienstämme veranschaulicht. Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
102 Ergebnisse ______
Abb. 4.41.A:
2,0 BCG Wildtyp ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1) ∆ narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116) 1,5
(nm) 1,0 600 OD
0,5
0,0
0246810 Zeit (Tage) Abb. 4.41.B:
109 BCG Wildtyp ∆ narG BCG::narGHJI BCG (TJ-1) 8 ∆ 10 narG BCG::narGHJI M. tb. (SR116)
107
KBE/ml 106
105
100 0246810 Zeit (Tage) Abb. 4.41.A und 4.41.B:
Wachstum (OD600 und KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 103 Ergebnisse ______
Die Transformation des narGHJI-Genclusters von M. tuberculosis in die narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG versetzte diese in die Lage, Nitrat unter aeroben Bedingungen zu assimilieren. Die mit narGHJI von M. bovis BCG komplementierte narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG besaß dagegen diesen Phänotyp nicht. Damit ist die Unfähigkeit der Nitratassimilation in dem narGHJI-Gen von M. bovis BCG begründet.
4.4.3 Nitritakkumulation von M. bovis BCG und dessen ∆nirB-Mutante jeweils komplementiert mit dem narGHJI von M. tuberculosis im Vergleich zur ∆nirB- Mutante von M. bovis BCG und zum M. bovis BCG Wildtyp
Im folgenden Versuchsansatz sollte bewiesen werden, dass unter aeroben Bedingungen die durch das Genprodukt von narGHJI von M. tuberculosis kodierte Nitratreduktase eine höhere Aktivität besitzt als das entsprechende Enzym NarGHJI von M. bovis BCG. Da die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) kein Nitrit zu assimilieren vermag, wird angenommen, dass sie unter aeroben Bedingungen keine Nitritreduktase besitzt. Je nach Aktivität der aeroben Nitratreduktase von M. bovis BCG bzw. von M. tuberculosis müssten die nirB-Mutanten demnach in hohem oder geringem Ausmaß Nitrit bei der Reduktion von Nitrat akkumulieren. Zur Verdeutlichung wird diese Hypothese durch die Abbildung 4.42 veranschaulicht:
∆nirB M. bovis BCG
keine/geringe Aktivität Nitrat Nitrit keine/geringe Nitritakkumulation
NarGHJI BCG kein NirBD BCG
∆nirB M. bovis BCG::narGHJI M. tb.
hohe Aktivität Nitrat Nitrit hohe Nitritakkumulation
NarGHJI M. tb. kein NirBD BCG
Abb. 4.42: Darstellung der hypothetischen Unterschiede in der Aktivität der aeroben Nitratreduktase von M. bovis BCG und M. tuberculosis. 104 Ergebnisse ______
Um diese Überlegungen näher zu untersuchen, wurde zunächst in den M. bovis BCG Wildtyp bzw. in die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) das Wildtyp-narG-Gen von M. tuberculosis transformiert. Dazu konnte auf das narGHJI-Gencluster von M. tuberculosis, kloniert in den Expressionsvektor pCF3 zurückgegriffen werden. Der M. bovis BCG Wildtyp komplementiert mit narGHJI von M. tuberculosis [BCG::narGHJI M. tb.] bekam den Namen TJ-2, die komplementierte nirB-Deletionsmutante [∆nirB-BCG::narGHJI
M. tb.] den Namen TJ-3. Um den Aktivitätsunterschied deutlich zu machen, wurde die nirB- Deletionsmutante von M. bovis BCG (IJ-2) sowie der M. bovis BCG Wildtyp mitgeführt. Diese vier Bakterienstämme wurden in Minimalnährmedium mit Nitrat als alleiniger Stickstoffquelle inokuliert. Dabei wurde die Nitritakkumulation gemessen. In Abbildung 4.43 und 4.44 wird die Nitritakkumulation mit dem Wachstumsverhalten der vier Stämme unter aeroben Bedingungen verglichen. Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus je drei Experimenten.
150
100 BCG Wildtyp ∆nirB BCG (IJ-2)
Nitrit (µmol/l)Nitrit ∆ nirB BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3 )
50 BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2)
0
02468
Zeit (Tage) Abb. 4.43
Nitritakkumulation der BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der ∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. 105 Ergebnisse ______
BCG Wildtyp ∆nirB BCG (IJ-2) 0,6 ∆ nirB BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3)
BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2)
0,4 (nm) 600 OD
0,2
0,0
0246810
Zeit (Tage) Abb. 4.44:
Wachstum (OD600) der BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der ∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps. Die Bakterien wurden in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz inokuliert und bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert.
In diesem Experiment war die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. tuberculosis (TJ-3) der einzige Nitrit akkumulierende Stamm. Der M. bovis BCG Wildtyp und dessen nirB-Deletionsmutante vermögen, da sie mit der Nitratreduktase NarGHJI von M. bovis BCG ausgestattet sind, kein Nitrat zu reduzieren. M. bovis BCG mit narGHJI von M. tuberculosis (TJ-3) hat eine funktionsfähige aerobe Nitratreduktase sowie eine nirBD-kodierte aerobe Nitritreduktase und kann somit Nitrat als Substrat zum Wachstum nutzen. Entsprechend zeigte nur dieser Stamm in diesem Experiment einen Anstieg der Optischen Dichte.
Durch dieses Experiment wurden somit zweierlei Ergebnisse erhoben: Zum einen konnte gezeigt werden, dass narGHJI von M. tuberculosis, nicht jedoch narGHJI von M. bovis BCG unter aeroben Bedingungen die Reduktion von Nitrat zu Nitrit vermittelt und nur M. tuberculosis durch diese Nitratreduktaseaktivität in der Lage ist, Nitrat zu assimilieren. 106 Ergebnisse ______
Zum anderen liegt nun ein Hinweis vor, dass nirBD der Genort einer aeroben Nitritreduktase sein könnte. Während M. bovis BCG mit narGHJI von M. tuberculosis das im Stoffwechsel anfallende Nitrit zum Wachstum nutzt, akkumuliert die nirB-Deletionsmutante dieses Stammes Nitrit.
Die Ergebnisse zur Untersuchung der Nitrat- bzw. Nitritassimilation von M. bovis BCG und M. tuberculosis unter aeroben Bedingungen in vitro zeigen:
• M. tuberculosis, nicht jedoch M. bovis BCG, assimiliert unter aeroben Bedingungen Nitrat. Die Nitratassimilation bei M. tuberculosis wird durch narGHJI und nirBD vermittelt
• Das narGHJI von M. tuberculosis ermöglicht die Nitratassimilation in der narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG
• Infolge der fehlenden Nitratreduktaseaktivität unter aeroben Bedingungen kann M. bovis BCG kein Nitrat assimilieren. Die Nitritassimilation bei M. bovis BCG wird durch nirBD vermittelt
• Es gibt keinen Unterschied in der Aktivität des nirBD-Gens bei M. bovis BCG und M. tuberculosis unter aeroben Bedingungen
• Es kommt durch den Gendefekt bei der mit narGHJI von M. tuberculosis transformierten nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG unter aeroben Bedingungen zur Nitritakkumulation; dies ist ein Hinweis auf eine durch das nirBD-Gen kodierte aerobe Nitritreduktase
107 Diskussion ______
5. Diskussion
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der Nitratreduktase NarGHJI und des nirBD-Gens für den Stickstoffstoffwechsel der Mykobakterien untersucht. In-vitro- Experimente dienten der Bestimmung der Funktion der beschriebenen Enzyme. In vivo wurden Mutanten untersucht, um die Bedeutung der Enzyme für die Pathogenität der Mykobakterien festzustellen. Die experimentellen Befunde zeigten, dass die Nitratreduktase NarGHJI von M. tuberculosis unter anaeroben Bedingungen eine höhere Aktivität als die von M. bovis BCG besitzt. Zudem wurde neben der anaeroben auch eine aerobe, narGHJI-vermittelte Nitratreduktaseaktivität von M. tuberculosis gefunden. Bei M. bovis BCG hingegen bedingt narGHJI lediglich eine anaerobe Nitratreduktaseaktivität. Eine aerobe Nitritreduktase wird bei M. bovis BCG und bei M. tuberculosis durch den Genort nirBD kodiert. Unter aeroben Bedingungen vermag M. tuberculosis Nitrat und Nitrit zu assimilieren, während M. bovis Nitrit, nicht jedoch Nitrat, zum Wachstum nutzen kann. Eine Komplementation des narGHJI-Genclusters von M. tuberculosis bzw. von M. bovis BCG in die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG bewirkte eine Attenuierung des Stammes im Mausmodell. Ebenso verhielt sich die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG attenuiert. Nicht nur die Nitratreduktase NarGHJI, sondern auch der Genort nirBD ist essentiell für die Pathogenese einer Infektion mit dem M. bovis BCG Wildtyp in vivo.
5.1 Untersuchung der Funktion des narGHJI-Gens von M. tuberculosis und M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen in vitro und in vivo
Bei E. coli kodiert das narGHJI-Operon eine respiratorische, anaerobe Nitratreduktase [PHILIPPOT u. HØJBERG 1999]. Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurde eine Homologie zu diesem narGHJI-Operon gefunden [COLE et al. 1998]. Auch der M. bovis BCG Wildtyp besitzt eine anaerobe Nitratreduktase NarGHJI [WEBER et al. 2000]. Wird diese durch eine Deletion im narG-Gen ausgeschaltet, verhält sich M. bovis BCG im Mausmodell attenuiert [FRITZ et al. 2002]; in vitro erlischt seine Fähigkeit zur Nitritakkumulation [FRITZ 2001]. Dies schließt aus, dass neben NarGHJI eine zweite Nitratreduktase zur Nitritakkumulation unter anaeroben Bedingungen beiträgt. 108 Diskussion ______
In der vorliegenden Arbeit wurde jeweils das narGHJI-Gen von M. tuberculosis und von M. bovis BCG in eine narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG transformiert. Diese Mutanten wurden unter anaeroben Bedingungen in vitro und in vivo untersucht. Die narG-Deletionsmutante mit narGHJI von M. bovis BCG zeigt gegenüber dem Wildtyp eine um den Faktor zwei bis drei erhöhte Nitritproduktion. Verwendet man zur Transformation narGHJI von M. tuberculosis, steigert dies die Nitritproduktion um den Faktor zehn bis zwanzig. Warum selbst beim Vorliegen einer Kopie des narGHJI-Gens von M. bovis BCG in der komplementierten Deletionmutante von M. bovis BCG eine höhere Aktivität der Nitratreduktase als beim Wildtyp auftritt, ist bislang unklar. Möglicherweise führt die Transformation des narGHJI von M. bovis BCG auf einem integrativen Plasmid zu einer höheren Expression, obwohl der homologe narGHJI-Promotor von M. bovis BCG verwendet wurde. Der Unterschied in der Aktivität der Nitratreduktasen innerhalb der beiden untersuchten Mykobakterienspezies (M. bovis BCG, M. tuberculosis) ist auf eine Punktmutation an Position 215 vor dem Translationsstart von narG zurückzuführen [STERMANN et al. 2003]. Beide komplementierten Deletionsmutanten von M. bovis BCG verhielten sich im Mausmodell attenuierter als die narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG selbst. Ein Vermehrungsdefekt der komplementierten Deletionsmutanten konnte durch Wachstumsuntersuchungen ausgeschlossen werden. Offenbar führte die gegenüber dem Wildtyp erhöhte Nitritakkumulation beider transformierter Deletionsmutanten von M. bovis BCG zu einem toxischen Effekt in vivo. Interessanterweise zeigt auch der virulente M. tuberculosis in vitro eine vergleichsweise hohe Nitritproduktion, die seine eigene Vermehrungsfähigkeit in vivo jedoch nicht beeinträchtigt. Die durch narGHJI von M. tuberculosis bedingte hohe Nitritproduktion schränkt jedoch die Wachstumsrate der komplementierten Deletionsmutante von M. bovis BCG in vivo ein. Scheinbar ist gerade diese Indifferenz von M. tuberculosis gegenüber seiner eigenen hohen anaeroben Nitritproduktion ein Grund für dessen Virulenz.
5.2. Untersuchung der ∆nirB-Mutante von M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen in vitro und in vivo
Zu Beginn der Untersuchungen war in Bezug auf den Nitritstoffwechsel der Mykobakterien lediglich die Existenz eines Genorts in M. tuberculosis bekannt, der eine Homologie zu dem der anaeroben Nitritreduktase NirBD von E. coli aufweist [COLE et al. 109 Diskussion ______
1998]. Auch bei M. bovis BCG konnte die Existenz eines nirBD-Gens durch unsere Arbeitsgruppe gefunden und eine nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG erstellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des durch nirBD-kodierten Enzyms in Mykobakterien untersucht. Von dem M. bovis BCG Wildtyp und dessen nirB- Deletionsmutante wurde nach Nitritzugabe die Ammoniumakkumulation unter anaeroben Bedingungen in vitro gemessen sowie deren Wachstumsrate in vivo bestimmt.
Im Vorfeld der Untersuchungen wurden die Reaktionsbedingungen für die Bestimmung der Ammoniumakkumulation optimiert. Nach Zugabe von Nitrit in das Minimalnährmedium verfärbte sich dieses langsam gelb. Auch konnte erst nach Zugabe hoher Substratkonzentrationen eine Ammoniumakkumulation gemessen werden. Dies lässt auf eine Reaktion des Nitrits mit dem Nährmedium schließen. Die Versuche wurden daher in Kaliumphosphatpuffer durchgeführt, der sich gegenüber Nitrit indifferent verhält.
Unter anaeroben Bedingungen produzieren der M. bovis BCG Wildtyp und dessen nirB- Deletionsmutante Ammonium jeweils in einem vergleichbaren Ausmaß. Durch Zerstörung des nirBD-Genclusters kann die Ammoniumproduktion offenbar nicht unterbunden werden. Dementsprechend kodiert der Genort nirBD in M. bovis BCG keine anaerobe Nitritreduktase. Da beide Stämme geringe Ammoniummengen bilden, muss die anaerobe Nitritreduktase eine geringe Aktivität besitzen und auf einem bisher unbekannten Gen lokalisiert sein. Die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG verhält sich im Mausmodell attenuiert, ebenso die narG/nirB-Doppeldeletionsmutante von M. bovis BCG. Die Expression des nirBD-Gens ist daher in vivo bedeutsam für die Pathogenese einer Infektion mit M. bovis BCG im Mausmodell.
Möglicherweise gibt die fehlende Nitritreduktaseaktivität unter anaeroben Bedingungen eine Erklärung für die mykobakterielle Latenz in vivo. Gäbe es unter anaeroben Bedingungen eine Nitritreduktase mit hoher Aktivität, so würde keine Nitritakkumulation bei M. tuberculosis und M. bovis BCG zu beobachten sein. Nitrit würde zu Ammonium umgesetzt und - sofern entsprechende Enzyme zur Verfügung ständen - zum Wachstum unter anaeroben Bedingungen genutzt werden können. Dies ist eine Erklärung dafür, dass Mykobakterien unter anaeroben Bedingungen persistieren, jedoch nicht wachsen können.
110 Diskussion ______
5.3. Nitrat- bzw. Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen von M. bovis BCG und M. tuberculosis in vitro
Sowohl M. tuberculosis als auch M. bovis BCG besitzen eine anaerobe Nitratreduktase NarGHJI. M. tuberculosis zeigt zudem unter aeroben Bedingungen eine Nitratreduktaseaktivität [VIRTANEN 1960, HEDGECOCK u. COSTELLO 1962, RATLEGDE 1982]. Der Reduktion von Nitrat zu Nitrit folgt dessen Reduktion zu Ammonium, welches im bakteriellen Stoffwechsel als Stickstoffquelle dient. Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis konnten allerdings keine Gene mit einer Homologie zu aeroben Nitrat- bzw. Nitritreduktasen anderer Bakterien identifiziert werden.
Zunächst wurde die Bedeutung des nirBD-Genclusters für die Nitritassimilation betrachtet. Entfernt man den Genort nirB aus dem M. bovis BCG Wildtyp, so verliert der Stamm in Anwesenheit von Nitrit als alleiniger Stickstoffquelle in vitro seine Wachstumsfähigkeit. Durch Komplementation der nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit nirBD von M. tuberculosis wird der Phänotyp von M. bovis BCG wiederhergestellt: Das nirBD-Gen erfüllt also in beiden Mykobakterienstämmen dieselbe Funktion. Eine Beteiligung des nirBD-Gens an der Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen ist somit bewiesen. In Wachstumsversuchen in vitro erfolgte eine Nitratassimilation unter aeroben Bedingungen nur mit Hilfe des narGHJI-Gens von M. tuberculosis, nicht jedoch mit narGHJI von M. bovis BCG. Eine narG-Deletionsmutante von M. tuberculosis konnte Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum nicht nutzen. Durch die Komplementation der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. tuberculosis bekam der Stamm die Fähigkeit der Nitratassimilation. Damit ist bewiesen, dass die narGHJI-kodierte Nitratreduktase von M. tuberculosis neben ihrer respiratorischen auch eine assimilatorische Funktion hat. In anderen Bakterienspezies sind die Gene für assimilatorische und respiratorische Enzyme deutlich voneinander getrennt. Neben der narGHJI-kodierten Nitratreduktase von M. tuberculosis konnte eine entsprechende Doppelfunktion auch bei dem Gencluster nasDE von Bacillus subtilis festgestellt werden. In den abschließenden Experimenten wurde überprüft, ob M. bovis BCG ebenfalls unter aeroben Bedingungen Nitrat reduzieren kann. Dazu wurde nach Nitratzusatz die Nitritakkumulation von M. bovis BCG und von verschiedenen Mutanten von M. bovis BCG unter aeroben Bedingungen betrachtet. 111 Diskussion ______
Bei den Stämmen mit intaktem nirBD-Gen wurde keine Nitritakkumulation festgestellt. Auch die nirB-Deletionsmutante von M. bovis BCG akkumulierte kein Nitrit. Dies zeigt, dass die narGHJI-kodierte Nitratreduktase von M. bovis BCG keinerlei Aktivität unter aeroben Bedingungen besitzt. Interessanterweise sah man jedoch eine deutliche Nitritakkumulation bei einer Mutante von M. bovis BCG ohne nirB-Gen, in die ein narGHJI-Gen von M. tuberculosis transformiert worden war. Dies ist ein Hinweis darauf, dass das nirBD-Gen an dem Abbau von Nitrit beteiligt ist: Möglicherweise ist nirBD der Genort einer assimilatorischen Nitritreduktase.
5.4 Ausblick
Die vorliegende Arbeit trägt zur Aufklärung des Nitrat- und Nitritstoffwechsels von langsamwachsenden Mykobakterien bei. Insbesondere im Rahmen der Erforschung des Nitritstoffwechsels gibt es diverse Ansätze für weiterführende Untersuchungen.
Der Genort nirBD vermittelt die Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen. Wahrscheinlich ist, dass dieser eine aerobe, assimilatorische Nitritreduktase kodiert. In folgenden Arbeiten ist diese Hypothese durch Untersuchung der Ammoniumakkumulation von M. bovis BCG Wildtyp und dessen nirB-Deletionsmutante unter aeroben Bedingungen zu überprüfen. Gegebenenfalls müssen dafür Gene, die die Ammonium umsetzenden Enzyme kodieren, deletiert werden. Auch stellt sich die Frage, welche Funktion das nirBD-Gen unter anaeroben Bedingungen erfüllt. In diesem Zusammenhang ist zu untersuchen, ob und auf welchem Genort eine anaerobe Nitritreduktase kodiert wird.
Die Untersuchung des Stickstoffstoffwechsels der Mykobakterien liefert Aufschluss über die Faktoren, die eine Attenuierung von dem Impfstamm M. bovis BCG im Vergleich zu M. tuberculosis bedingen. Kenntnisse der genetischen Unterschiede zwischen diesen beiden Stämmen helfen bei der Entwicklung eines neuen, effizienten und sicheren Impfstoffes für Mensch und Tier, um agrarwirtschaftliche und humanpathologische Schäden vor allem in den Entwicklungsländern in Zukunft zu mindern. .
112 Zusammenfassung ______
6. Zusammenfassung
Die Nitrat- und Nitritreduktion bei Mykobakterien
Torsten Jäger
Bakterien können die Nitrat- und Nitritreduktion unter anaeroben Bedingungen zur Energiegewinnung nutzen. In Mykobakterien wird die anaerobe Nitratreduktase durch das Gen narGHJI kodiert, während der Genort der anaeroben Nitritreduktase auf nirBD vermutet wurde. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung dieser Gene für den Stickstoffstoffwechsel untersucht.
Die respiratorische Nitratreduktion von M. tuberculosis und M. bovis BCG wurde mit Hilfe von verschiedenen Mutanten verglichen. Eingesetzt wurden eine narG- Deletionsmutante von M. bovis BCG mit narGHJI von M. bovis BCG bzw. von M. tuberculosis komplementierte narG-Deletionsmutanten von M. bovis BCG. In vitro besaß die Nitratreeduktase von M. tuberculosis unter anaeroben Bedingungen eine deutlich höhere Aktivität als das entsprechende Genprodukt von M. bovis BCG. In vivo zeigten beide komplementierten Mutanten eine Attenuierung gegenüber der narG-Deletionsmutante von M. bovis BCG und dem Wildtyp. Eine hohe Nitritakkumulation in vitro vermindert vermutlich die Wachstumsfähigkeit von M. bovis BCG in immunkompetenten Mäusen.
Die Funktion des Gens nirBD sowie dessen Bedeutung für die Pathogenese einer Infektion mit M. bovis BCG wurden untersucht. M. bovis BCG und dessen nirB- Deletionsmutante produzierten in vitro unter anaeroben Bedingungen Ammonium in einem vergleichbaren Umfang. NirBD kodiert somit keine anaerobe Nitritreduktase. In vivo führte die Deletion des nirB-Gens zu einer Attenuierung von M. bovis BCG. Die Expression des Gens nirBD trägt daher zu der Pathogenität dieses Stammes bei.
Im dritten Teil wurde die assimilatorische Nitrat- und Nitritreduktion untersucht. M. tuberculosis, nicht jedoch M. bovis BCG, reduziert Nitrat unter aeroben Bedingungen. Durch eine Deletion im narG-Gen verliert M. tuberculosis seine Vermehrungsfähigkeit, wenn ihm nur Nitrat als Stickstoffquelle zur Verfügung steht. Damit konnte gezeigt werden, dass das narGHJI-Gencluster eine assimilatorische Nitratreduktase kodiert. Durch die Deletion des 113 Zusammenfassung ______nirB-Gens verliert M. bovis BCG seine Wachstumsfähigkeit in Anwesenheit von Nitrit als alleiniger Stickstoffquelle, während die mit nirBD von M. tuberculosis komplementierte nirB- Deletionsmutante von M. bovis BCG in vitro wächst. NirBD trägt somit zur Nitritassimilation unter aeroben Bedingungen in M. bovis BCG bei.
114 Summary ______
7. Summary
Nitrate and nitrite reduction by mycobacteria
Torsten Jäger
Bacteria commonly use nitrate and nitrite reduction to gain energy under anaerobic conditions. In mycobacteria, the anaerobic nitrate reductase is encoded by the gene narGHJI, while nirBD was assumed to encode an anerobic nitrite reductase. In this study, we aimed to find out the relevance of these genes for the nitrogen metabolism.
Nitrate reduction in M. tuberculosis and in M. bovis BCG was compared under anaerobic conditions. We investigated several mutants of M. bovis BCG: the narG mutant, the narG mutant with narGHJI by M. tuberculosis and the narG mutant with narGHJI by M. bovis BCG. In vitro, the nitrate reductase of M. tuberculosis displays a remarkably higher activity than the gene product of M. bovis BCG. In vivo, both the narG mutant with narGHJI of M. tuberculosis and the narG mutant with narGHJI of M. bovis BCG showed higher attenuation than M. bovis BCG wildtype and the narG mutant itself. Presumably, excess nitrite production decreases growth of M. bovis BCG in immunocompetent mice.
The function of the nirBD gene and its impact on the pathogenity of M. bovis BCG was assessed. In vitro, wildtype and nirB mutant showed a similar amount of ammonia production. Thus, nirBD does not encode an anaerobic nitrite reductase. In vivo, the deletion in the nirB gene lead to attenuation of M. bovis BCG, which means that the expression of nirBD adds to the pathogenity of M. bovis BCG.
In the third part, nitrate and nitrite reduction was investigated under aerobic conditions. In contrast to M. bovis BCG, M. tuberculosis reduces nitrate under aerobic conditions. The narG mutant of M. tuberculosis is not able to grow in the presence of nitrate as single nitrogen source. The narGHJI operon encodes an assimilatory nitrite reductase. After deletion of nirB, M. bovis BCG loses its ability to grow in the presence of nitrite as single nitrogen source, whereas the nirB mutant with nirBD of M. tuberculosis grows in vitro. Thus, nirBD contributes to nitrate assimilation under aerobic conditions in M. bovis BCG. 115 Literaturverzeichnis ______
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131 Anhang ______
9. Anhang
9.1 Geräte
Gerät Firma und Ort Brutschrank Modell B5090 E Heraeus, Osterode Cellroll-System mit Antriebseinheit Cellroll Omnilab, Gehrden integra Bioscience Elektroporationsgerät Gene Pulser Biorad, München Homogenisator Ultra-Turrax T 8 Ika-Werke, Staufen Photometer Ultrospec III Pharmacia Biotech, Freiburg Pipettierhilfe Pipettman Gilson, Bad Camberg Rolleinheit Gilson, Bad Camberg Schüttelinkubator Incubator Shaker Model New Brauswick Scientific, New Jersey, USA G25 Sterilbank hera safe 32 Heraeus, Osterode Ultraschallbad Bandelin Sonovex TK 52 Bandelin, Berlin Zentrifuge Biofuge pico Heraeus, Osterode Zentrifuge Rotanta 96 RSC Hettich, Tuttlingen
9.2 Chemikalien
Substanzen Firma und Ort Bestellnummer Ammoniummolybdat-tetrahydrat Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 09880 Bovine Albumin Fraktion V Appli Chem, Darmstadt A1391.0500 Calciumchlorid Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 21097 D (+) Glukose (wasserfrei) Appli Chem, Darmstadt A1422.1000 D-Glukose-Monohydrat Appli Chem, Darmstadt A1349 Diethylether Merck, Darmstadt 100-921 Di-Kaliumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt 105-104 Di-Natriumhydrogenphosphat- Sigma Chemical, St. Louis, USA S9390 heptahydrat Eisen(III)chlorid-hexahydrat Merck, Darmstadt 103-943 Glycerin (wasserfrei) Appli Chem, Darmstadt A1123.2500 Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt 104-873 Kaliumchlorid Merck, Darmstadt 104-936 Kaliumnitrat Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 63063 Kaliumsulfat Merck, Darmstadt 105-153 Kupfer(II)chlorid-tetrahydrat Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 61174
132 Anhang ______
Magnesiumchlorid (wasserfrei) Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 60419 Mangan(II)chlorid-tetrahydrat Sigma Chemical, St. Louis, USA M3634 Middlebrook OADC Enrichment Becton Dickinson, Sparks, USA 211886 Difco Laboratories, Detroit, USA Middlebrook 7H9 Broth 0713-17 Becton Dickinson, Sparks, USA Difco Laboratories, Detroit, USA Middlebrook 7H10 Agar 0627-17-4 Becton Dickinson, Sparks, USA Natriumborat Sigma Chemical, St. Louis, USA S9640 Natriumchlorid Merck, Darmstadt 106-404 Natriumnitrit Sigma Chemical, St. Louis, USA S-2252 Bio Mérieux, Marcy I`Etoile, Nit 1 + Nit 2 70442 Frankreich Tween 80 Sigma Chemical, St. Louis, USA P-8074 (Polyoxyethylensorbitan) Zinkchlorid Fluka Chemie, Buchs, Schweiz 96469
9.3 Antibiotika
Substanzen Firma Bestellnummer Hygromycin B Roche, Mannheim 843555 Kanamycin Sigma Chemical, St. Louis, USA K4000
9.4 Gebrauchsmaterialien
Artikel Firma Bestellnummer Roche, Mannheim/R-Biopharm, Ammoniak UV Test 1 112 732 Darmstadt Anaerobenindikator Oxoid, Hampshire, Großbritannien BR 55 Anaerobentopf Merck, Darmstadt 116.387 Anaero GenTM Papierbeutel Oxoid, Hampshire, Großbritannien ANO 35 A Columbia Agar mit 5 % Schafblut Becton Dickinson, Heidelberg 254071 Einmal-Injektionskanülen Gr 2 Braun, Melsungen 4657527 Einmal-Insulinkanülen Braun, Melsungen 4665406 Einmal-Insulinspritze 1 ml Braun, Melsungen 09161309 Elektroporationsküvetten Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf 748020 Haltungsfutter Ratten/Mäuse Altromin GmBH, Lage 1324 Standard Diät Impfschlingen (10 µl) Sarstedt, Nürnbrecht 861.562 Mikro-Schraubröhre 1,5 ml PP Sarstedt, Nürnbrecht 72.692 Petrischalen 92 x 16 mm Sarstedt, Nürnbrecht 82.1473
133 Anhang ______
Photometerküvetten Sarstedt, Nürnbrecht 67.742 Pipettenspitzen 1000µl Sarstedt, Nürnbrecht 70.762 Pipettenspitzen 200µl Sarstedt, Nürnbrecht 70.760 Reagiergefäße 1,5 ml Sarstedt, Nürnbrecht 72.690 Röhrchen PS – Tube TC 4,5 ml Greiner bio one, Frickenhausen 120.160 steril Röhrchen PP – Tube 14 ml steril Greiner bio one, Frickenhausen 187.261 Röhrchen PP – test tubes 50 ml Greiner bio one, Frickenhausen 227.261 steril Corning incorporated, New York, Roller bottles (490 cm2) 430195 USA Serologische Pipetten 1 ml Sarstedt, Nürnbrecht 86.1251 Serologische Pipetten 10 ml Sarstedt, Nürnbrecht 86.1254 Serologische Pipetten 25 ml Sarstedt, Nürnbrecht 86.1685 Nalge Nunc international, Rochester, Sterile Square media bottles 2019-0030 USA Nalge Nunc international, Rochester, Sterilfilter 0,2µl 190-2500 USA Corning incorporated, New York, Sterilfiltrationseinheit 1 l 430517 USA
9.5 Messwerte
Im Folgenden werden die Messwerte aller im 4. Kapitel aufgeführten Graphen aufgeführt. Mittelwerte bzw. Standardabweichungen wurden nach den im Folgenden dargestellten
n 1 Formeln errechnet: Mittelwert (MW) x = n ∑ x i i=1
Standardabweichung (SD) s = s 2 Bei den in vitro-Versuchen wurden die Parameter aus je drei Experimenten, bei den in vivo- Versuchen wurden die Parameter nach der Sektion von je drei Mäusen bestimmt.
BCG: M. bovis BCG Wildtyp SR106 ∆narG-BCG
SR116 ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. TJ-1 ∆narG-BCG::narGHJI BCG
TJ-2 BCG::narGHJI M. tb. TJ-3 ∆nirB-BCG::narGHJI M. tb.
TJ-4 ∆nirB-BCG::nirB M. tb. IJ-1 ∆nirB-BCG (gr. Deletion) IJ-2 ∆nirB-BCG (kl. Deletion) CD-1 ∆narG/∆nirB BCG H37RV M. tuberculosis (H37RV) MS-1 ∆narG M. tuberculosis (H37RV) Staph. carn. Staphylococcus carnosus MB-Medium Minimalnährmedium
134 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 0 0,0403 0,00149 0,0453 0,00149 0,0382 0,00121 1 0,0853 0,00043 0,1018 0,00109 0,0950 0,00158 2 0,1508 0,00232 0,1716 0,00233 0,1564 0,00338 3 0,3357 0,00160 0,3852 0,00219 0,3063 0,00249 4 0,5358 0,00414 0,6152 0,00324 0,4198 0,00037 6 1,4095 0,01357 1,5355 0,01163 0,9835 0,00407 7 1,7883 0,01250 1,8633 0,00754 1,3803 0,00047 8 1,9947 0,01497 2,0420 0,00455 1,8580 0,00238
Tab. 9.1: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 0 3.500.000 498.887,65 3.266.000 410.960,93 4.733.000 498.887,65 1 4.886.600 646.288,55 4.600.000 432.049,38 6.600.000 1.451.436,07 2 7.533.000 1.359.738,54 10.130.000 2.317.086,29 9.400.000 1.275.408,43 3 32.330.000 5.312.459,15 33.660.000 8.730.533,9 - - 4 35.330.000 2.494.438,26 60.000.000 10.033.278 19.866.000 9.289.898,93 6 473.300.000 365.543.735 450.000.000 106.144.556 103.300.000 33.993.463,4 7 620.000.000 50.990.195,1 1.006.600.000 79.302.515 286.660.000 47.842.333,6 8 966.000.000 181.169.043 973.300.000 89.566.859 1.026.600.000 131.993.266
Tab. 9.2: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 0 2,6106 1,95420 3,1682 1,83790 5,6078 2,21463 2 5,5033 2,04713 3,7604 1,93647 136,0564 2,72746 4 9,1163 2,25896 4,2486 1,90975 162,7176 3,12675 7 10,7000 2,43461 3,4122 2,47869 182,5473 5,35845 10 13,2402 3,11320 2,85491 2,09470 168,6416 3,96109 14 13,3099 2,73609 2,85457 1,86973 169,7572 2,366646 17 13,5887 3,15842 3,02882 2,06252 175,1940 1,843877 21 14,7388 3,04613 2,88941 1,82469 167,3002 1,896154 24 14,5994 3,30414 2,68031 1,73932 168,7117 2,680307
Tab. 9.3: Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Nitritakkumulation wurde photometrisch bei 440 nm gemessen und in µmol/l umgerechnet
135 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 0 0,3387 0,00478 0,2987 0,00704 0,3263 0,00263 2 0,2947 0,01541 0,2710 0,01639 0,3127 0,01678 4 0,3130 0,01738 0,2703 0,00602 0,2753 0,01367 7 0,2270 0,01512 0,2217 0,01936 0,2217 0,03356 10 0,1967 0,02953 0,1900 0,00787 0,1903 0,03502 14 0,1890 0,01131 0,1627 0,02229 0,1355 0,00250 17 0,1633 0,00806 0,1373 0,01266 0,1215 0,01250 21 0,1007 0,00450 0,0853 0,01974 0,0630 0,00100 25 0,0510 0,00455 0,0497 0,01733 0,0350 0,00500
Tab. 9.4: Keimdichte (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 0 58.000.000 1.414.213,56 67.330.000 22.691.163,2 55.660.000 5.734.883,51 2 58.660.000 10.873.004,3 45.330.000 5.906.681,72 21.000.000 9.626.352,72 4 48.300.000 5.312.459,15 42.330.000 2.867.441,76 13.660.000 5.185.449,73 7 13.300.000 1.699.673,17 6.633.000 579.271,57 6.566.000 2.430.820,62 10 6.633.300 94.280,90 2.100.000 57.1547,61 2.316.600 1.908.023,99 14 2.533.000 78.573,49 1.016.600 60.184,90 1.436.600 813.237,70 17 1.733.000 188.561,81 420.000 130.213,5 1.529.000 1.471.000 21 950.000 450.000 69.333 19.754,04 27.000 1.000 25 520.000 228.667,64 52.333 3.299,83 30.500 6.500
Tab. 9.5: Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 1 1.427.500 7.500 654.250 244.250 2.450.000 1.250.000 28 417.500 37.500 247.500 12.500 157.500 67.500 48 290.000 55.000 171.000 34.000 77.500 3.000 119 3.000 0 65.750 64.250 - - 200 26.500 12.500 161,25 78,15 3,75 3,75 280 6.575 6.425 240 1 1 1 350 576,67 303,46 14,33 11 1 1 364 - - - - 1 1
Tab. 9.6: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
136 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 1 24.130 8.870 10.755 6.745 38.750 16.250 28 185.000 25.000 38.775 16.725 17.000 8.500 48 46.300 13.800 13.450 3.550 1.650 150 119 16.300 6.700 120 120 1 1 200 12.175 4.325 18 18 1 1 280 11.300 300 6 6 1 1 308 - - 7 5 - - 350 8.773,33 7.231,51 3,33 3,33 1 1 364 - - - - 1 1
Tab. 9.7: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 1 4.445 1.705 1.480 1.020 10.825 8.475 28 39.100 4.400 4.175 2.225 1.850 50 48 25.550 17.450 2.190 1.710 5.875 975 119 15.910 11.590 120 120 - - 200 17.750 2.750 66 54 87 87 280 6.006 1.599,4 - - 1 1 308 - - 7 3 - - 350 45.666,67 8.013,88 12,5 4,5 1 1 364 - - - - 1 1
Tab. 9.8: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 SR116 SR116 1 104.415 9.735 102.090 63.910 340.000 145.000 28 292.500 42.500 277.500 57.500 134.000 56.000 48 257.500 77.500 155.000 40.000 135.250 64.750 119 109.500 47.500 31.000 13.000 - - 200 52.000 28.000 2.690 1.910 4.560 600 280 11.350 5.650 6.300 900 1.303 113 308 - - 794 434 - - 350 40.333,33 471,405 2.574 2.534 967,2 867,8 364 - - - - 171,25 122,75
Tab. 9.9: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG (SR106) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
137 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 0 0,042 0 0,041 0 0,041 0 1 0,135 0 0,135 0 0,124 0 2 0,254 0 0,25 0 0,216 0 3 0,537 0 0,509 0 0,448 0 4 0,921 0 0,838 0 0,754 0 5 1,328 0 1,235 0 1,076 0 6 1,818 0 1,803 0 1,744 0 7 1,909 0 1,909 0 1,872 0
Tab. 9.10: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 0 4.133.333,33 329.983,17 4.366.666,67 1.164.369,17 4.386.666,67 511.490,20 1 7.066.666,67 736.357,40 7.373.333,33 832.239,28 5.720.000 1.000.000 2 10.733.333,3 4.290.558,11 9.666.666,67 2.379.542,44 7.900.000 100.000 3 39.666.666,7 11.025.223,6 37.333.333,3 12.970.051 26.333.333,3 4.496.912,52 4 111.333.333 18.372.685 132.333.333 9.741.092,8 87.333.333,3 5.249.338,58 5 423.333.333 106.562.449 330.000.000 12.192.941 164.333.333 20.434.176,2 6 663.333.333 148.847.424 830.000.000 66.833.125,5 586.666.667 75.865.377,8
Tab. 9.11: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 0 2,6100 2,08400 2,5758 1,96519 1,7393 1,73930 2 5,1547 1,91700 2,7152 1,86970 10,7658 2,06250 4 7,8731 2,20950 2,1924 2,01370 16,3768 5,73158 7 10,2430 2,61547 2,4712 1,91006 29,3415 2,72383 10 12,5780 2,59440 1,7393 1,73930 37,9149 2,82923 14 14,5990 2,97936 2,0878 1,95416 43,7002 4,52699 17 13,1008 3,00649 1,8787 1,93647 40,0409 4,82240 21 11,3930 2,95960 1,7393 1,73930 36,7648 5,08800 24 15,6100 2,98327 3,6561 2,06252 42,2016 5,62988
Tab. 9.12: Nitritakkumulation der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Nitritakkumulation wurde photometrisch bei 440 nm gemessen und in µmol/l umgerechnet
138 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 0 56.666.666,7 20741798,9 181.333.333 154.698.273 71.333.333,3 8.730.533,9 2 56.333.333,3 9741092,8 78.666.666,7 36.745.370,1 51.500.000 6.500.000 4 42.000.000 23930454,8 35.000.000 5.354.126,13 26.666.666,7 2.494.438,26 7 11.666.666,7 2357022,6 23.333.333,3 4.921.607,69 12.000.000 2.828.427,12 10 4.433.333,33 555777,733 8.400.000 1.845.715,76 4.666.666,67 1.613.140,48 14 1.533.333,33 188561,808 3.433.333,33 2.028.683,21 566.666,67 368.178,70 17 546.666,67 155848,93 1.550.000 441.588,04 258.000 85.525,83 21 243.333,33 49216,0769 420.000 72.571,80 40.000 2.943,92 24 223.333,33 53124,5915 296.666,67 77.602,98 2.900 1.067,71
Tab. 9.13: Keimdichte (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 1 845.625 726.375 750.000 499.500 71.625 7.875 42 167.250 72.750 172.875 49.875 32.250 5.250 120 9.000 3.000 3.075 75 900 450 204 5.190 3.615 161,25 78,15 5 3,54 276 5.850 3.435 74 75,31 1 1
Tab. 9.14: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 1 10.230 8.970 15.690 10.890 3.570 690 42 40.800 3.480 9.600 2.880 2.010 8.790 120 5.100 720 120 60 120 120 204 2.001 1.599 58 32 8 11,31 276 1.920 480 72 60 1 1
Tab. 9.15: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG- BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps
139 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 1 1.110 90 1.435 185 990 330 42 4.020 480 450 150 60 60 120 8.250 5.670 90 30 1 1 204 10.296 2.136 66 54 1 1 276 8.580 1.020 51 27 1 1
Tab.9.16: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 TJ-1 TJ-1 1 251.100 74.700 13.700 72.900 81.000 6.000 42 232.800 133.800 238.800 66.600 63.000 22.800 120 82.800 30.600 13.330 5.170 3.720 1.380 204 57.220 20.212,45 2.690 1.910 614 471,33 276 13.350 6.150 1.180 157,48 129 103,28
Tab. 9.17: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 6 1 x 10 KBE der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1), der ∆narG-BCG (SR106) und des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 IJ-1 IJ-1 0 0,042 0 0,041 0 0,044 0 1 0,135 0 0,124 0 0,145 0 2 0,250 0 0,216 0 0,274 0 3 0,509 0 0,448 0 0,583 0 4 0,838 0 0,754 0 0,976 0 5 1,235 0 1,076 0 1,413 0 6 1,818 0 1,808 0 1,842 0 7 1,909 0 1,909 0 1,951 0
Zeit MW SD MW SD (Tage) IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 0 0,039 0 0,040 0 1 0,125 0 0,135 0 2 0,227 0 0,229 0 3 0,468 0 0,457 0 4 0,780 0 0,757 0 5 1,116 0 1,108 0 6 1,780 0 1,790 0 7 1,872 0 1,909 0
Tab. 9.18: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
140 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG SR106 SR106 IJ-1 IJ-1 0 4.133.333,33 329.983,17 4.366.666,67 1.164.369,17 4.860.000 1.420.000 1 7.066.666,67 736.357,40 7.373.333,33 832.239,28 7.800.000 1.608.311,74 2 10.733.333,3 4.290.558,11 9.666.666,67 2.379.542,44 12.400.000 326.598,63 3 39.666.666,7 11.025.223,6 37.333.333,3 12.970.051 34.000.000 3.000.000 4 111.333.333 18.372.685 132.333.333 9.741.092,8 240.666.667 20.677.416 5 423.333.333 106.562.449 330.000.000 121.928.941 313.333.333 93.926.685,4 6 663.333.333 148.847.424 830.000.000 66.833.125,5 693.333.333 140.791.414
Zeit MW SD MW SD (Tage) IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 0 5.013.333,33 593.595,45 4.666.666,67 1.798.765,01 1 7.906.666,67 571.625,36 7.880.000 40.000 2 9.666.666,67 1.746.106,78 8.200.000 1.070.825,23 3 24.000.000 816.496,58 22.266.666,7 4.502.838,61 4 87.333.333,3 8.993.825,04 86.000.000 11.518.101,7 5 199.000.000 21.416.504,5 182.000.000 32.782.108,9 6 400.000.000 141.421.356 340.000.000 120.277.457
Tab. 9.19: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-1 und IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in 7H9-Nährmedium unter aeroben Bedingungen
141 Anhang ______
Zeit BCG BCG BCG BCG BCG BCG (Tage) 0,0 mmol/l 0,2 mmol/l 0,3 mmol/l 0,5 mmol/l 1,0 mmol/l 3,0 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0 0 0 0 0 0 0,25 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 - - - 29 0 0 0 0 0 0 43 0 0 0 0 0 0 57 0 0 0 0 0 0
Zeit BCG BCG IJ-2 IJ-2 IJ-2 IJ-2 inakt. BCG inakt. (Tage) 5,0 mmol/l 10,0 mmol/l 0,2 mmol/l 1,0 mmol/l 10,0 mmol/l 10,0 mmol/l 10,0 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0 0 0 0 0 0 0 0,25 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2,54 0 3 0 9,21 0 0 0 3,1 1,5 6 0 25,84 0 0 16,5 1,27 5,08 8 0,89 43,45 - 0 18,2 6,46 15 15,47 59,89 - 0 28,77 0 0 22 22,74 - - 0 46,98 0 1,17 29 0,36 85,12 0 0 - - - 36 0 91,67 - 0,79 63,69 5,36 0 43 - 92,86 0 12,38 67,26 0 0 50 - 99,4 - 0 - 7,74 0 57 0 116,07 0 2,65 78,57 0 3,57 64 - 100,6 - 19,78 70,83 0 13,69
Tab. 9.20: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 340 nm und wurde in µmol/l Ammonium umgerechnet
142 Anhang ______
Zeit BCG Staph. carn. BCG Staph. carn. (Tage) MB-Medium MB-Medium K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 0 0 5,08 0 19,37 0,3 0 40,63 0 35,87 0,75 0 49,80 4,76 31,11 1 0 49,52 7,30 45,70 4 0 41,30 25,40 62,54 7 0 33,02 38,42 110,48 14 0,95 33,65 60,95 202,54 21 15,24 45,40 75,87 140,95 27 22,86 67,22 87,94 117,14 35 0,32 62,22 96,20 135,56 42 0 88,57 109,52 109,84 49 0 82,14 123,42 102,78 56 0 97,62 138,89 111,51
Tab. 9.21: Ammoniumakkumulation von M. bovis BCG und Staphylococcus carnosus in Minimalnährmedium bzw. in Kaliumphosphatpuffer mit 5,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 340 nm und wurde in µmol/l Ammonium umgerechnet
Zeit BCG IJ-2 BCG inakt. IJ-2 inakt. (Tage) K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 0 0 0 0 0,32 1 9,21 8,89 0 0,95 5 26,67 29,21 0 0 8 33,65 37,14 - - 15 53,57 58,07 15,78 0 21 70,16 79,68 - - 29 94,29 101,27 14,95 3,81 36 108,89 120,63 - - 43 122,54 77,46 2,73 4,44 50 116,51 86,98 - - 57 139,05 158,10 7,74 6,35
Tab. 9.22: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 5,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 340 nm und wurde in µmol/l Ammonium umgerechnet
143 Anhang ______
Zeit BCG IJ-2 BCG inakt. IJ-2 inakt. (Tage) K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 0 0,32 0 0 0,36 1 5,08 0,32 0 0,98 5 22,54 33,65 0 0 8 35,56 60,63 - - 15 53,33 62,22 15,56 0 21 92,06 65,71 - - 29 91,75 102,86 14,6 3,78 36 112,70 116,19 - - 43 125,71 - 2,86 4,38 50 129,54 123,49 - - 57 140,63 142,86 7,62 6,45
Tab. 9.23: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 1,0 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 340 nm und wurde in µmol/l Ammonium umgerechnet
Zeit BCG IJ-2 BCG inakt. IJ-2 inakt. (Tage) K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 0 0 0 0 0 1 6,40 0 0 0 5 19,68 17,78 3,81 2,54 8 18,73 17,46 0 1,59 13 20,63 14,29 4,20 1,27 20 39,68 26,03 6,35 8,89 27 33,00 42,54 0 2,22 42 48,57 53,65 2,54 5,08 50 61,90 56,37 0 - 57 61,91 61,27 8,89 4,13
Tab. 9.24: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,5 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 340 nm und wurde in µmol/l Ammonium umgerechnet
144 Anhang ______
Zeit BCG IJ-2 BCG inakt. IJ-2 inakt. (Tage) K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 K2HPO4 / KH2PO4 0 0 0 7,94 2,54 1 3,17 0 6,03 2,54 6 18,41 11,75 3,49 4,44 9 21,90 17,14 9,21 2,86 13 24,44 23,17 12,06 7,62 21 26,98 23,17 0 5,08 28 33,33 24,76 4,44 4,44 35 34,92 28,89 2,22 4,44 42 50,79 33,97 8,57 7,62 50 46,67 34,29 6,35 6,67 57 48,89 34,29 7,30 12,06
Tab. 9.25: Ammoniumakkumulation der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte bei 340 nm und wurde in µmol/l Ammonium umgerechnet
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG inakt. BCG inakt. IJ-2 IJ-2 IJ-2 inakt. IJ-2 inakt. 0 98,8349 2,86641 98,6251 2,05874 99,5319 1,86005 99,1485 4,75884 3 81,2002 4,69610 96,1859 3,62226 89,0417 3,07008 98,6251 3,37362 7 71,7642 3,71539 100,7343 4,70849 87,8916 4,36915 102,2328 4,26844 14 72,6268 10,28502 92,5617 7,50054 75,0663 10,19480 97,0575 9,23105 21 71,3721 9,87170 92,3526 4,77379 74,7179 10,10170 97,9636 8,31902 28 68,4446 8,68881 92,8057 4,30888 69,2811 8,44300 98,8349 8,05798
Tab. 9.26: Nitritreduktion der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Kaliumphosphatpuffer mit 0,1 mmol/l Nitritzusatz unter anaeroben Bedingungen; die Nitritakkumulation wurde photometrisch bei 440 nm gemessen und in µmol/l Nitrit umgerechnet
Zeit MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 0 27.333.333,3 9.177.266,6 38.333.333,3 12.657.891,7 2 30.333.333,3 3.299.831,65 34.333.333,3 6.944.222,22 5 10.166.666,7 3.408.160,14 18.000.000 8.286.535,26 7 8.233.333,33 1.065.624,49 7.500.000 3.153.833,65 9 4.400.000 1.704.894,91 3.100.000 550.010,75 13 2.766.666,67 1.189.771,22 3.666.666,67 1.977.091,02 16 2.300.000 571.547,61 1.933.333,33 634.209,92 20 763.333,33 522.834,16 943.333,33 488.284,98 24 831.666,67 1.038.268,54 396.666,67 96.724,12
Tab. 9.27: Keimdichte (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter anaeroben Bedingungen
145 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 879.000 401.000 898.750 546.250 1.201.750 548.250 14 2.837.500 662.500 12.900.000 100.000 2.782.500 7.500 42 3.440.000 477.510,91 10.251.666,7 916.609,09 5.030.000 1.462.036,25 105 24.975.000 16.500.000 40.183.333,3 19.758.809,6 39.233.333,3 17.574.239,4 125 - - 36.600.000 19.859.003 195.750.000 82.244.969,5 145 - - 86.550.000 16.913.456,2 - -
Tab.9.28: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 21.700 8.700 22.615 17.335 29.200 200 14 133.000 67.000 53.400 38.400 48.900 5.100 42 3.400.000 432.049,38 810.666,67 268.091,2 800.666,67 160.867,1 105 28.390.000 11.110.000 47.030.000 24.982.349,8 58.793.333,3 0 125 - - 126.000.000 22.594.247,1 71.633.333,3 29.377.353,3 145 - - 89.700.000 19.284.363,3 - -
Tab. 9.29: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 10.845 2.305 19.950 5.300 39.890 31.010 14 102.600 17.400 180.500 33.500 98.650 63.850 42 3.779.333,33 2.016.789,75 480.000 203.705,67 293.333,33 48.835,32 105 3.390.000 390.000 8.046.666,67 3.820.168,7 12.460.000 0 125 - - 2.936.000 2.339.750,41 18.533.333,3 1.238.176,7 145 - - 12.960.000 3.309.511,55 - -
Tab. 9.30: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 133.050 56.950 202.750 115.250 471.000 27.000 14 600.500 19.500 2.787.500 87.500 2.607.500 252.500 42 3.506.666,67 184.451,14 38.400.000 9.797.958,97 30.000.000 12.812.493,9 105 44.350.000 2.100.000 171.766.667 38.970.979,2 240.233.333 83.318.518,7 125 - - 373.833.333 38.992.164,5 294.000.000 57.071.592,5 145 - - 284.000.000 66.499.373 - -
Tab. 9.31: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von SCID-Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
146 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 1.281.250 128.750 1.603.750 271.250 2.092.500 907.500 14 1.053.750 66.250 8.450.000 2.150.000 2.250.000 600.000 30 466.250 24.250 4.255.000 2.195.000 623.000 124.000 42 316.875 66.375 814.250 350.750 609.750 280.250 150 20.662,5 16.837,5 6.600 5.400 4.762,5 3.712,5 207 1.500 675 300 0 153,75 146,25 300 7.470 3.656,88 53,33 49,89 37,5 38,24
Tab. 9.32: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Leber von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 19.900 500 31.450 950 32.215 7.265 14 42.000 20.400 35.150 3.750 21.400 8.200 30 76.300 17.300 52.250 50 19.975 9.475 42 40.400 23.100 29.450 17.350 6.870 870 150 4.980 120 450 210 - - 207 1.584 1.056 66 54 55,5 46,5 300 5.976 716,06 108 86,60 42,67 34,31
Tab. 9.33: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Lunge von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 9.400 80 7.980 1.020 11.810 5.390 14 35.850 5.650 42.725 1.575 16.125 2.825 30 12.000 4.200 14.550 4.250 24.125 6.675 42 6.780 4.620 20.250 18.750 3.150 150 150 11.770 1.930 8.055 7.875 10.205 9.845 207 19.500 0 - - 3.930 3.930 300 9.111 3.321 282 282 82 115,97
Tab. 9.34: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Niere von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
147 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG IJ-2 IJ-2 CD-1 CD-1 1 134.250 26.750 534.000 6.000 212.000 16.000 14 764.500 74.500 1.980.000 18.0000 1.920.000 360.000 30 338.250 4.750 865.000 278.000 736.250 283.750 42 1.010.250 789.750 799.750 520.250 409.750 16.250 150 125.500 50.500 88.350 12.150 94.200 49.800 207 65.100 5.100 3..960 240 12.900 2.100 300 30.500 17.137,28 4.920 224,5 1.680 1.412,23
Tab. 9.35: Quantitative Analyse der Keimdichte in der Milz von Balb/c Mäusen infiziert mit je 1 x 106 KBE der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆narG/∆nirB-BCG (CD-1) bzw. des M. bovis BCG Wildtyps
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG SR106 SR106 H37RV H37RV MS-1 MS-1 0 0,0215 0,0005 0,0210 0 0,0220 0,0010 0,0215 0,0005 2 0,0910 0,0010 0,0775 0,0005 0,0805 0,0015 0,0365 0,0115 4 0,1435 0,0005 0,1675 0,0015 0,2125 0,0065 0,0645 0,0897 7 0,0905 0,0015 0,1335 0,0035 0,6220 0,0040 0,0655 0,0035 9 0,0775 0,0025 0,0720 0,0010 0,9370 0,1250 0,0450 0,0030 11 0,0830 0,0020 0,0575 0,0005 1,0410 0,0900 0,0385 0,0035
Tab. 9.36: Wachstum (OD600) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren ∆narG-Mutanten in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG SR106 SR106 H37RV H37RV MS-1 MS-1 0 635.000 516.188 785.000 445.477 940.000 84.852,82 250.000 113.844 2 5.050.000 777.817 5.000.000 0 13.600.000 7.636.753 6.650.000 2.333.453 4 2.000.000 707.106 10.150.000 1.202.082 62.000.000 1.414.214 6.450.000 2.050.610 7 1.800.000 565.685 385.000 190.919 120.000.000 141.421.356 270.000 113.137 9 2.750.000 1.343.503 545.000 91.924 180.000.000 141.421.356 115.000 707,07 11 2.800.000 1.131.370 600.000 56.569 110.000.000 0 95.000 7.071 14 - - - - 230.000.000 141.421.356 60.000 14.142
Tab. 9.37: Wachstum (KBE/ml) von M. tuberculosis und M. bovis BCG sowie deren ∆narG-Mutanten in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen
148 Anhang ______
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG BCG BCG BCG BCG 10 µmol/l 10 µmol/l 30 µmol/l 30 µmol/l 0,1 mmol/l 0,1 mmol/l 0,3 mmol/l 0,3 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0,0250 0,00268 0,0223 0,00033 0,0227 0,00034 0,0223 0 1 0,0650 0,00500 0,0563 0,00275 0,0570 0,00050 0,0515 0,00350 2 0,1198 0,00775 0,1235 0,00700 0,1375 0,00175 0,1175 0,04803 3 0,1120 0 0,1148 0,00375 0,1408 0,00575 0,1470 0,01750 4 0,0873 0 0,1008 0,00175 0,1615 0,00150 0,2200 0,01200 5 0,0403 0,0075 0,0513 0,00125 0,0998 0,00125 0,2613 0,00075 7 0,0343 0,00075 0,0323 0,00075 0,0583 0,00525 0,2005 0,01050 8 0,0298 0,00125 0,0360 0 0,0418 0,00025 0,1168 0,00725
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG BCG BCG BCG BCG 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 3,0 mmol/l 3,0 mmol/l 10 mmol/l 10 mmol/l 30 mmol/l 30 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0,0220 0,00003 0,0217 0,00234 0,0218 0 0,0210 0,00100 1 0,0543 0,00025 0,0503 0,00025 0,0378 0,00025 0,0258 0,00025 2 0,1255 0,00900 0,1130 0,00300 0,0760 0,00050 0,0463 0,00025 3 0,1613 0,00675 0,1423 0,00075 0,0778 0,00125 0,0308 0,00075 4 0,2578 0,01025 0,2038 0,00125 0,0888 0,00125 0,0273 0,00225 5 0,3310 0,01050 0,2885 0,00200 0,1105 0,00150 0,0230 0,00150 7 0,5728 0,00525 0,3605 0,02450 0,1288 0,00425 0,0298 0,00025 8 0,5553 0,00525 0,6170 0,01400 0,1678 0,00975 0,0280 0,00200
Tab. 9.38: Wachstum (OD600) des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 IJ-2 IJ-2 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0,0223 0,00192 0,0243 0,00217 0,0253 0,00148 0,0258 0,00130 1 0,0620 0,00212 0,0670 0,00212 0,0673 0,00335 0,0688 0,00239 2 0,1465 0,00087 0,1370 0,00141 0,1348 0,00148 0,1445 0,00287 3 0,3200 0,00123 0,2388 0,00249 0,2390 0,00071 0,2418 0,00164 4 0,7043 0,00295 0,3493 0,00043 0,3548 0,00415 0,3425 0,00304 5 0,9730 0,00274 0,3663 0,00179 0,3805 0,00180 0,3458 0,00148 6 1,1388 0,01625 0,3258 0,00192 0,3303 0,00083 0,2758 0,00192 7 1,2173 0,01031 0,2605 0,00456 0,2503 0,00192 0,2240 0,00292 8 1,1675 0,01919 0,1920 0,00187 0,1683 0,00109 0,1638 0,00377
Tab. 9.39: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
149 Anhang ______
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 IJ-2 IJ-2 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 2.940.000 260.000 2.380.000 100.000 2.000.000 0 2.240.000 160.000 1 4.500.000 400.000 3.250.000 350.000 3.800.000 200.000 5.600.000 400.000 2 8.450.000 350.000 8.550.000 50.000 8.900.000 1.500.000 7.050.000 1.050.000 3 30.000.000 0 9.900.000 100.000 9.200.000 900.000 7.150.000 2.850.000 4 47.500.000 2.500.000 9.150.000 850.000 8.000.000 700.000 5.250.000 3.950.000 5 55.500.000 15.500.000 5.550.000 50.000 4.850.000 450.000 4.900.000 200.000 6 37.000.000 4.000.000 445.000 5.000 375.000 55.000 395.000 105.000
Tab. 9.40: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 H37RV H37RV 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0,019 0 0,019 0 0,025 0,0005 0,022 0,0003 2 0,077 0,0007 0,079 0,0035 0,077 0,0075 0,087 0,0028 3 0,144 0,0002 0,106 0,0050 0,117 0,0120 0,165 0,0037 6 0,796 0,0003 0,071 0,0005 0,150 0,0030 0,689 0,0077 7 0,915 0,0060 0,056 0,0035 0,122 0 0,773 0,0093 8 0,962 0,0028 0,050 0,0005 0,107 0,0020 0,861 0,0083
Tab. 9.41: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2), des M. bovis BCG Wildtyps und M. tuberculosis in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 TJ-4 TJ-4 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 0,0223 0,00192 0,0243 0,00217 0,0253 0,00148 0,0245 0,00206 1 0,0620 0,00212 0,0670 0,00212 0,0673 0,00335 0,0578 0,00083 2 0,1465 0,00087 0,1370 0,00141 0,1348 0,00148 0,1228 0,00192 3 0,3200 0,00123 0,2388 0,00249 0,2390 0,00071 0,2610 0,00831 4 0,7043 0,00295 0,3493 0,00043 0,3548 0,00415 0,5423 0,00303 5 0,9730 0,00274 0,3663 0,00179 0,3805 0,00180 0,7983 0,00043 6 1,1388 0,01625 0,3258 0,00192 0,3303 0,00083 1,0603 0,00109 7 1,2173 0,01031 0,2605 0,00456 0,2503 0,00192 1,1758 0,00634 8 1,1675 0,01919 0,1920 0,00188 0,1683 0,00109 1,0978 0,01052
Tab. 9.42: Wachstum (OD600) der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆nirB-BCG::nirBD M. tb. (TJ-4) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
150 Anhang ______
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 TJ-4 TJ-4 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 2.940.000 260.000 2.380.000 100.000 2.000.000 0 3.440.000 120.000 1 4.500.000 400.000 3.250.000 350.000 3.800.000 200.000 6.100.000 400.000 2 8.450.000 350.000 8.550.000 50.000 8.900.000 1.500.000 8.300.000 300.000 3 30.000.000 0 9.900.000 100.000 9.200.000 900.000 23.000.000 0 4 47.500.000 2.500.000 9.150.000 850.000 8.000.000 700.000 45.500.000 12.500.000 5 55.500.000 15.500.000 5.550.000 50.000 4.850.000 450.000 78.500.000 9.500.000 6 37.000.000 400.000 445.000 5.000 375.000 55.000 10.600.000 1.400.000
Tab. 9.43: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2), der ∆nirB-BCG::nirB M. tb. (TJ-4) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 IJ-2 IJ-2 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 3.493.333 438.586 2.380.000 100.000 2.000.000 0 2.240.000 160.000 1 6.133.333 498.888 3.250.000 350.000 3.800.000 200.000 5.600.000 400.000 2 17.000.000 4.082.483 8.550.000 50.000 8.900.000 1.500.000 7.050.000 1.050.000 3 37.000.000 6.683.313 9.900.000 100.000 9.200.000 900.000 7.150.000 2.850.000 4 92.666.666 13.199.326 9.150.000 850.000 8.000.000 700.000 5.250.000 395.000 5 65.500.000 1.500.000 5.550.000 50.000 4.850.000 450.000 4.900.000 200.000
Tab. 9.44: Wachstum (KBE/ml) der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG BCG BCG IJ-2 IJ-2 IJ-2 IJ-2 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne 1,0 mmol/l 1,0 mmol/l ohne ohne Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit Nitrit 0 1.000 0 0 0 986 0 0 0 1 972 0 0 0 1.000 0 0 0 2 879 6,5 0,05 0,05 998 4 7 0,9 3 443 5 0 0 - - 7,4 0,39 4 3,4 0,7 6,63 2,59 838,5 24,5 14,2 0,69 5 3,9 0 1,3 0,2 899,5 9,5 7,5 0,09 6 4,6 0,3 1,4 0,4 885,5 24,5 8,45 0,25 7 2,2 0,1 0,45 0,05 825,5 15,5 8,1 0,2 8 3,5 0,15 0 0 764 12 6,75 0,15
Tab. 9.45: Abnahme der Nitritkonzentration durch die Verstoffwechselung der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 1,0 mmol/l bzw. ohne Nitritzusatz unter aeroben Bedingungen; die Nitritakkumulation wurde photometrisch bei 440 nm gemessen und in µmol/l Nitrit umgerechnet
151 Anhang ______
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG TJ-1 TJ-1 SR116 SR116 0 0,0188 0,00160 0,0193 0,00111 0,01967 0,00197 1 0,0216 0,00287 0,0212 0,00214 0,0200 0,00335 4 0,0505 0,00112 0,0543 0,00192 0,0715 0,00087 5 0,0558 0,00217 0,0590 0,00235 0,1458 0,00130 6 0,0616 0,00186 0,0658 0,00387 0,3462 0,00299 7 0,0525 0,00260 0,0613 0,00433 0,5688 0,00884 8 0,0463 0,00043 0,0510 0,00071 0,9745 0,00844 9 0,0405 0,00050 0,0448 0,00259 1,4583 0,00189 11 0,0334 0,00268 0,0310 0,00123 1,9933 0,00622
Tab. 9.46: Wachstum (OD600) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Zeit MW SD MW SD MW SD (Tage) BCG BCG TJ-1 TJ-1 SR116 SR116 0 560.000 80.000 160.000 40.000 360.000 40.000 1 570.000 30.000 51.000 18.000 325.000 5.000 4 835.000 15.000 490.000 70.000 7.500.000 500.000 5 680.000 0 100.000 0 11.500.000 2.500.000 6 288.000 8.000 104.000 0 27.000.000 0 7 230.000 130.000 - - - - 8 360.000 40.000 190.000 10.000 110.000.000 10.000.000 9 420.000 140.000 72.000 0 420.000.000 140.000.000 11 640.000 0 156.000 12.000 285.000.000 45.000.000
Tab. 9.47: Wachstum (KBE/ml) der ∆narG-BCG::narGHJI M. tb. (SR116), der ∆narG-BCG::narGHJI BCG (TJ-1) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG IJ-2 IJ-2 TJ-3 TJ-3 TJ-2 TJ-2 0 0,0035 0,0035 0 0 2,1575 1,9484 1,7393 1,7393 3 0 0 0,0185 0,0005 159,6155 7,8034 3,0462 2,1053 5 0 0 0,0215 0,0045 171,0641 2,8371 3,3076 1,7393 7 0 0 0,0230 0 167,1956 3,2554 3,0985 1,7393 9 0,0010 0 0,0260 0,0040 167,0911 2,4189 3,3076 1,7393
Tab. 9.48: Nitritakkumulation von BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der ∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen; die Nitritakkumulation wurde photometrisch bei 440 nm gemessen und in µmol/l Nitrit umgerechnet
152 Anhang ______
Tag MW SD MW SD MW SD MW SD BCG BCG IJ-2 IJ-2 TJ-3 TJ-3 TJ-2 TJ-2 0 0,0261 0,0014 0,0202 0,0002 0,0200 0 0,0182 0,0006 1 0,0588 0,0023 0,0495 0,0015 0,0568 0,0033 0,0558 0,0003 4 0,0308 0,0063 0,0328 0,0074 0,0463 0,0023 0,1625 0,0020 6 0,0188 0,0028 0,0183 0,0018 0,0293 0,0003 0,3185 0,0195 8 0,0035 0,0015 0,0060 0,0020 0,0135 0,0005 0,4585 0,0355 11 0,0055 0,0005 0,0178 0,0018 0,0135 0,0030 0,6702 0,0372
Tab. 9.49: Wachstum (OD600) von BCG::narGHJI M. tb. (TJ-2), der ∆nirB-BCG::narGHJI M. tb. (TJ-3), der ∆nirB-BCG (IJ-2) und des M. bovis BCG Wildtyps in Minimalnährmedium mit 10 mmol/l Nitratzusatz unter aeroben Bedingungen; die Messung der Optischen Dichte erfolgte photometrisch bei 600 nm
Danksagung
An erster Stelle gilt der ganz herzliche Dank Herrn PD Dr. med. Franz-Christoph Bange, der durch Überlassen des Themas nicht nur die Voraussetzung für diese Arbeit geschaffen, sondern durch seine intensive und gute Betreuung mit vielen Anregungen und Ratschlägen das Gelingen dieser Dissertation ermöglicht hat.
Ein großer Dank richtet sich an Prof. Dr. vet. med. Peter Valentin-Weigand für die Übernahme der Betreuung der Arbeit an der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover anzufertigen, möchte ich mich bei Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann bedanken.
Ein besonderer Dank geht an Silvia Maaß aus meiner Arbeitsgruppe für ihre unendliche Geduld sowie für ihre Hilfestellung und Tipps im Laboralltag.
Neben allen anderen Doktoranden und Mitarbeitern der Mikrobiologie der Medizinischen Hochschule möchte ich ein besonderes Dankeschön an meine Arbeitsgruppe (Franz Bange, Silvia Maaß, Jacquline Lachnik, Axel Puncken, Marion Stermann, Antje Bohrßen, Claudia Röhker, Ludwig Sedlacek, Sonja Schulze, Mareike Möller und Michael Sürken) richten, mit denen ich nicht nur während der Laborarbeit, sondern auch bei manchem Treffen außerhalb des Labors viel Spaß hatte.
Vielen Dank sage ich meiner Familie, besonders meiner Mutter und meinem Vater, die mich während des Studiums jahrelang unterstützt und zu der Doktorarbeit ermuntert haben. Insbesondere Doro danke ich für ihr unermüdliches Verständnis, ihre Geduld, ihre Anregungen, ihr tatkräftiges Korrekturlesen und die gelegentlich nötigen Aufmunterungen.
Zuletzt danke ich meinen Freunden Doris Jordan für die willkommenen Ablenkungen von der Arbeit, Gesa Meyer für ihr Korrekturlesen und Magnus Brandenburger für so manchen guten Ratschlag bei Computerproblemen.
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Die Nitrat- und Nitritreduktion bei Mykobakterien“ selbstständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir mittelbar oder unmittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder zu einem ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Hannover, den 24.11.2003
Torsten Jäger