UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE Ecole doctorale Science Technologie Santé

THESE pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE MENTION : PHARMACIE Spécialité : Phytochimie

présentée et soutenue publiquement par Ilhem ZEBIRI le 07 Décembre 2015

ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE CINQ ESPECES DE LA FLORE PERUVIENNE. EVALUATION DE LEURS PROPRIETES ANTILEISHMANIENNE ET CYTOTOXIQUE

Sous la direction du Pr. Laurence VOUTQUENNE-NAZABADIOKO

JURY Dr. Sylvie MICHEL-Université Paris Descartes Rapporteur, Président du Jury Dr. Corine GIRARD-THERNIER-UFR Pharmacie (Besançon) Rapporteur Dr. Olivier GROVEL-UFR Pharmacie (Nantes) Examinateur Dr. Laurent DUCA-URCA (MEDyC) Examinateur Dr. Mohamed HADDAD-IRD (Toulouse) Co-encadrant de thèse Pr. Laurence VOUTQUENNE-NAZABADIOKO (Reims) Directeur de thèse

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Remerciements

C’est avec une grande émotion que je tiens à remercier tous ceux qui m’ont apporté leur soutien, professionnellement ou personnellement, tout au long de mes travaux de thèse. Je tiens à adresser mes remerciements les plus sincères à Sylvie MICHEL, Professeur à l’UFR Pharmacie (Paris Descartes), et Corine GIRARD –THERNIER, Professeur à l’UFR Pharmacie (Besançon) d’avoir accepté de relire cette thèse et d’en être rapporteurs en apportant des remarques très pertinentes. Je remercie également Olivier GROVEL, Maître de Conférences à l’UFR Pharmacie (Nantes) d’avoir examiné mon travail. Je voudrais remercier très chaleureusement Laurence VOUTQUENNE- NAZABADIOKO, Professeur à l’ICMR (Reims), ma directrice de thèse. Elle a été d’un très grand soutien moral et professionnel au cours de ces trois années de thèse. Elle m’a accordée une très grande confiance que je me suis efforcée à ne pas décevoir et que j’espère, de tout mon cœur, avoir satisfait. Merci d’avoir partagé tes compétences en pharmacognosie et surtout en RMN et de m’avoir laissé une liberté d’action qui m’as permis d’évoluer constamment et d’acquérir de nouvelles compétences. Un grand merci pour ta disponibilité lors de la rédaction où on a formé une belle et efficace équipe et si j’ai pu finir à temps c’est en grande partie grâce à toi. Travailler à tes cotés a été un vrai plaisir et je ne garderais que de très bons souvenirs de ces trois années avec ta gentillesse, ta bonne humeur et surtout tes câlins. J’adresse mes sincères remerciements à Mohamed HADDAD, Chargé de Recherche à l’IRD (Toulouse), pour avoir co-encadré ce travail de thèse. Merci pour toutes les plantes que tu nous as apporté ces dernières années et surtout merci pour tes conseils précieux, pour ton écoute durant la thèse, pour tes déplacements depuis Toulouse et pour ton soutien et tes encouragements. Je remercie Laurent DUCA, Maître de Conférences à l’unité MEDyC (Reims), de m’avoir donné libre accès aux équipements de son laboratoire afin de pouvoir réaliser des tests de cytotoxicité, de sa disponibilité et de m’avoir apporté de précieuses connaissances dans le domaine de la biologie cellulaire. Je joins à ces remerciements, Carine CHAINTREUIL et Amandine SCANDOLERA qui m’ont chaleureusement accompagnée et formée lors de la réalisation de ces tests. Je remercie Catherine LAVAUD, Professeur à l’ICMR (Reims), et Jean-Marc NUZILLARD, directeur de recherche à l’ICMR (Reims), de m’avoir si bien accueillie au sein

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du groupe Isolement et Structure, pour leur amabilité et surtout pour les échanges scientifiques que nous avons eu durant ces années de thèse. Je souhaite remercier Michel SAUVAIN et Lucie PALOQUE de l’IRD de Toulouse pour leur collaboration et d’avoir accepté de réaliser les tests antileishmaniens sur tous mes échantillons. Je présente toute ma gratitude au Pr. Jean-Hugues RENAULT de m’avoir offert l’opportunité de participer au projet européen Natprotec en réalisant une mobilité internationale chez les laboratoires Camag (Muttenz, Suisse). D’ailleurs, je tiens à remercier le Dr. Eike REICH de m’avoir bien accueillie au sein de son laboratoire et plus spécialement Anita ANKLI qui m’a formée et m’a accompagnée pendant les 2 mois. Je n’oublie pas, bien sur le reste de l’équipe (Debora, Eliezer et Ilona) qui ont toujours répondu à mes questions et avec qui j’ai partagé de très bons moments. Je remercie tous les professeurs du Master 1 CSNM et du Master 2 PROVALI (à Reims) qui ont toujours répondu à mes très nombreuses questions et m’ont donné envie de persévérer dans la chimie qui n’était pas mon domaine de prédilection. Je présente mes sincères remerciements au Pr. Arnaud HAUDRECHY qui m’a beaucoup conseillé et encouragé dans les moments de doutes que j’ai traversés. Ta confiance en moi m’a toujours portée et travailler avec toi m’a permis d’acquérir, non seulement des compétences professionnelles, mais aussi une envie de continuer dans le domaine de la recherche. Je tiens à remercier Agathe MARTINEZ et Charlotte SAYAGH ou, autrement dites, « Chagathe » qui, en plus d’être de très bonnes collègues, ont été, et seront, des amies que j’affectionne particulièrement. Merci à toutes les deux de m’avoir tant aidé professionnellement et personnellement. Je n’oublierai jamais les très bons moments de rire que nous avons partagés durant ces années mais aussi les très bon plats et desserts que vous nous avez fait découvrir. A Agathe, je présente une immense gratitude pour m’avoir appris à faire du vélo en étant très patiente avec moi. La réalisation de ce travail s’appuie également sur un environnement qui est essentiel. Ainsi je remercie profondément les personnes que j’ai côtoyées (Groupe IS et l’ICMR) et qui ont fait que mes journées soient joyeuses. A ce titre, je remercie énormément Nicolas BORIE pour sa bonne humeur, son humour « spécial » mais surtout d’avoir supporté mes « petites crises » pour le rangement de sa paillasse et de son bureau et j’espère qu’il ne m’en veut pas beaucoup. Je tiens aussi à remercier Audrey HOTTIN, Chantal BARBEROT, Sébastien CHOLLET, Audrey GRATIA, Marie BUCHOTTE, Berengère MENOT et Ali BAKERI avec qui j’ai partagé d’agréables moments et qui m’ont fait oublier les moments durs. Je remercie également toutes les autres personnes de l’ICMR qui ont fait partie de mon quotidien : Jane, 3

Jeff, Patricja, Dam, Tram, Pedro, Bastien, Christelle, Magid, Apostolis, Iordanis, Abbes, Meryem, Naïma, Martine, Malik, Diane, Dima, Amin, Benjamin, … Je voudrais adresser mes plus vifs remerciements à mes amis que j’ai rencontrés à mon arrivée à Reims, il y a plus de onze ans de cela. Tout d’abord, je remercie du fond du cœur Elodie PEROUMAL, avec qui j’ai passé des années d’études incroyables, pleines de fous rires et de professeurs inventés (par Elodie). On a pu traverser ces années ensemble en se soutenant mutuellement lors des moments durs et ton soutien n’a jamais défailli et m’a toujours portée et motivée. Un grand merci à mes autres amis : Lan Hoang LA, Hassan AMNAY, Lequyen Dang TRAN, Karima ABDALLAH, Rabab LADJMI, Sanae DJILALI, Walid DARWICH, Suleiman, Akli, Fadhila et Linda MESSAOUDI. Vous avez tous été d’un grand soutien moral et d’une amitié solide qui j’espère durera à l’infini. Pour finir, je remercie ma famille en commençant par mes sœurs Samia et Zahia qui m’ont toujours soutenue et encouragée dans toutes les étapes que j’ai traversées. Merci Samia pour nos discussions interminables (sur Skype) où tu as su m’écouter et me conseiller et surtout beaucoup fait rire avec ta folie jamais égalée. Je remercie aussi mes quatre frères : Hadi, Ryad, Oussama et Abdelhack pour leurs encouragements et leur soutien infaillible. Je remercie particulièrement Hadi et Ryad grâce à qui j’ai pu faire des études en France et qui m’ont beaucoup aidé financièrement. A Hadi, ou petit papounet, à qui je décerne la palme du meilleur frère au monde. Dès petite, tu m’as prise sous ton aile en m’enseignant le français, la nage, en me transmettant la passion de la lecture et surtout la confiance en soi alors je te dis Merci. Merci également à Oussama, ou Chatout, qui m’a beaucoup aidé pour les problèmes informatique et logiciel que j’ai rencontrés pendant la rédaction et m’a beaucoup encouragée. Pour finir, je remercie les deux personnes qui ont fait de moi ce que je suis : Mes parents. Votre amour, votre confiance m’ont toujours motivée à me surpasser. Les mots ne me suffiront pas à exprimer ma gratitude envers vous et mon amour. Vous avez tout fait pour que vos enfants aient accès à l’éducation et puissent aller au bout de leurs projets et c’est à vous que je dédie mes travaux de thèse. Merci à toi, maman, qui m’a apprise à être patiente, à toujours garder espoir et qui m’as transmis l’amour des plantes. A toi, papa, qui m’a appris à ne jamais baisser les bras et à toujours me battre pour réaliser mes projets. Je vous aime.

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Table des matières

Table des matières ...... 5

Liste des Abréviations...... 12

Introduction générale ...... 14

Etude bibliographique de la leishmaniose ...... 15

I. Description générale et historique ...... 16

I.1 L’agent pathogène ...... 16

I.2 Cycle parasitaire ...... 18

Phase extracellulaire : Promastigote ...... 18

Phase intracellulaire : Amastigote ...... 19

II. L’insecte vecteur...... 20

II.1 Taxonomie ...... 20

II.2 Morphologie ...... 21

II.3 Habitat ...... 22

II.4 Distribution géographique ...... 22

III. Formes cliniques de la leishmaniose ...... 23

III.1 La leishmaniose viscérale (LV) ...... 24

III.2 La leishmaniose muco-cutanée (LMC) ...... 25

III.3 La leishmaniose cutanée ...... 26

La leishmaniose cutanée locale (LCL) ...... 26

La leishmaniose cutanée diffuse (LCD) ...... 27

IV. Diagnostic ...... 28

IV.1 Tests parasitologiques et moléculaires ...... 28

IV.2 Tests Immunologiques ...... 28

V. Traitement des leishmanioses ...... 29

V.1 Les traitements de première intention ...... 29

V.2 Les traitements de seconde intention ...... 30

L’amphotéricine B ...... 30

La pentamidine ...... 30

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V.3 Les nouveaux traitements...... 31

La miltéfosine ...... 31

La paromycine ...... 31

La sitamaquine ...... 31

L’imiquimod ...... 32

L’interféron γ ...... 32

V.4 Les traitements physiques ...... 32

V.5 Les molécules actives issues de la biodiversité ...... 33

Les alcaloïdes ...... 33

Les terpénoïdes ...... 35

Les chalcones...... 39

Les flavonoïdes ...... 39

Les lactones ...... 40

VI. Leishmanioses et médecines traditionnelles ...... 41

VI.1 Au Maroc ...... 41

VI.2 En nouvelle Calédonie ...... 41

VI.3 Au Pérou ...... 41

VII. La leishmaniose au Pérou ...... 43

VIII. Objectifs de l’étude ...... 45

Les Primulaceae ...... 46

I. Etude bibliographique ...... 47

I.1 Description générale des Myrsinoideae ...... 47

I.2 Usages traditionnels et activités des Myrsinoideae ...... 48

Le genre Embelia ...... 48

Le genre Ardisia ...... 49

Le genre Myrsine ...... 50

I.3 Composition chimique des Myrsinoideae ...... 50

Les terpènes ...... 51

Les flavonoïdes ...... 55

Les dérivés benzoquinoïques ...... 56

Les acides benzoïques ...... 57

Lactones et dérivés ...... 57 6

Lignanes et dérivés...... 58

Les alcaloïdes ...... 58

Les dérivés phénoliques ...... 59

Les dérivés résorcinols ...... 60

II. Plantes étudiées ...... 61

II.1 Le genre Myrsine ...... 61

Taxonomie ...... 61

Description générale ...... 61

Composition chimique et activités biologiques du genre Myrsine ...... 62

II.2 Myrsine congesta ...... 67

II.3 Myrsine latifolia ...... 67

II.4 Myrsine sessiliflora ...... 68

III. Travaux réalisés et résultats ...... 69

III.1 Myrsine latifolia ...... 69

Extraction et purification des tiges et feuilles ...... 69

Elucidation structurale ...... 72

III.2 Myrsine congesta et Myrsine sessiliflora ...... 86

Fractionnement et purification ...... 86

Elucidation structurale ...... 88

III.3 Activités biologiques...... 96

Test de cytotoxicité ...... 96

Test antileishmanien ...... 98

IV. Activités potentielles ...... 98

IV.1 Activité antioxydante ...... 99

IV.2 Activité anticancéreuse ...... 99

IV.3 Activité antiinflammatoire ...... 99

IV.4 Activité antimicrobienne ...... 100

IV.5 Activité antidiabétique et antidiabétogène ...... 100

V. Conclusion ...... 102

Les Icacinaceae ...... 103

I. Introduction ...... 104

I.1 Présentation des Icacinaceae ...... 104 7

I.2 Utilisations traditionnelles et études biologiques...... 105

Utilisation des Icacinaceae en Afrique ...... 105

Utilisation des Icacinaceae en Amazonie ...... 106

Utilisation des Icacinaceae en Asie...... 107

I.3 Composition chimique des Icacinaceae : ...... 107

Le genre Nothapodytes : ...... 107

Le genre Icacina ...... 108

Le genre Pyrenacantha ...... 109

Le genre Discophora ...... 110

Le genre Apodytes ...... 110

Le genre Emmotum ...... 110

Le genre Mappia ...... 111

Le genre Poraqueiba ...... 111

II. Présentation des plantes étudiées ...... 112

II.1 Le genre Poraqueiba ...... 112

II.2 Poraqueiba sericea Tul...... 112

Taxonomie et nomenclature ...... 112

Habitat ...... 113

Description botanique ...... 113

Utilisations ...... 114

II.3 Le genre Dendrobangia ...... 115

II.4 Dendrobangia boliviana ...... 116

Taxonomie et nomenclature ...... 116

Habitat ...... 117

Description botanique ...... 117

Utilisation ...... 119

III. Travaux réalisés et résultats ...... 120

III.1 Poraqueiba sericea ...... 120

Extraction et fractionnement ...... 120

Elucidation structurale ...... 120

III.2 Dendrobangia boliviana ...... 139

Purification ...... 139 8

Elucidation structurale ...... 140

III.3 Activités biologiques...... 168

Test de cytotoxicité ...... 168

Test antileishmanien ...... 170

Activité hémolytique ...... 171

Test anti-élastase ...... 172

IV. Activités potentielles ...... 173

IV.1 Activité antioxydante ...... 173

IV.2 Activité anti-inflammatoire ...... 173

IV.3 Activité anti-mycobactérienne ...... 174

IV.4 Activité anti-nociceptive ...... 174

IV.5 Activité anti-cancéreuse ...... 174

IV.6 Activité hypoglycémiante et hypolipidémiante ...... 174

IV.7 Hépato- et gastro-protection ...... 175

V. Apports technologiques ...... 176

V.1 Couplage LC-SPE-RMN ...... 177

Appareillage ...... 177

Applications ...... 178

V.2 Bioautographie par HPTLC ...... 189

Test anti-tyrosinase ...... 190

Test α et β-glucosidase...... 192

Test anti-acétylcholinestérase ...... 194

VI. Conclusion ...... 196

Conclusion générale et perspectives ...... 197

Matériels et méthodes ...... 201

I. Méthodes chromatographiques analytiques ...... 202

I.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) ...... 202

I.2 Chromatographe liquide de haute performance (CLHP)...... 203

II. Méthodes chromatographiques de fractionnement ...... 204

II.1 Chromatographie liquide sous vide (CLV) ...... 204

II.2 Chromatographie flash ...... 204

II.3 Chromatographie de partage centrifuge (CPC) ...... 205 9

Appareillages...... 205

Méthodologie ...... 206

III. Méthodes chromatographiques de purification ...... 207

III.1 CLHP semi-préparative ...... 207

III.2 CLHP préparative ...... 208

IV. Méthodes physicochimiques ...... 208

IV.1 Spectrométrie de masse ...... 208

IV.2 Spectrométrie de résonnance magnétique (RMN) ...... 208

V. Extraction et purification ...... 210

V.1 Collecte et identification des plantes ...... 210

V.2 Myrsine latifolia (tiges et feuilles) ...... 210

V.3 Myrsine congesta (feuilles et racines) ...... 213

V.4 Myrsine sessiliflora ...... 214

V.5 Poraqueiba sericea ...... 215

V.6 Dendrobangia boliviana ...... 216

V.7 Caractérisation structurale ...... 218

3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol (ML01) ...... 218

(+)-catéchine (ML02) ...... 218

3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline (ML03) ...... 219

3-O-α-L-rhamnopyranosyl-quercétine (ML04) ...... 219

5-heptadec-12’-enyl-résorcinol (ML05) ...... 220

3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine (ML06) ...... 220

Viburnitol (ML07) ...... 221

Niga-ishigoside F1 (PS01) ...... 223

Trachelosperoside B1 (PS02) ...... 224

Secologanoside (PS03) ...... 224

Acide 19-α-hydroxyasiatique (PS04) ...... 225

Acide myrianthique (PS05) ...... 226

Acide hyptatique (PS06) ...... 226

Trachélosperogénine B1 (PS07) ...... 227

Acide arjunolique (PS08) ...... 228

Trachélosperogénine E (PS09) ...... 228 10

4-épi-niga-ishigoside F1 (PS10) ...... 229

Secoxyloganine (PS11) ...... 230

Composé DB01 ...... 230

Composé DB02 ...... 231

Composé DB03 ...... 233

Composé DB04 ...... 234

Composé DB05 ...... 235

Composé DB06 ...... 236

Composé DB07 ...... 237

Composé DB08 ...... 238

Composé DB09 ...... 239

Composé DB10 ...... 240

Composé DB11 ...... 241

Composé DB12 ...... 242

Composé DB13 ...... 243

Composé DB14 ...... 244

VI. Tests biologiques : ...... 245

VI.1 Tests de cytotoxicité ...... 245

Mise à confluence des cellules ...... 245

Préparation des plaques ...... 245

Préparation des échantillons et du témoin positif ...... 246

Mise en contact avec les drogues ...... 246

Révélation des plaques ...... 247

VI.2 Tests hémolytiques ...... 247

Préparation des échantillons ...... 247

Préparation de la gamme de concentration ...... 248

Test d’hémolyse ...... 248

VI.3 Tests anti-élastase ...... 249

Préparation des solutions ...... 249

Test anti-élastase ...... 249

Bibliographie ...... 250

Annexes ...... 250 11

Liste des Abréviations

Extraits et produits isolés

ML Produit isolé de Myrsine latifolia MS Produit isolé de Myrsine sessiliflora MC Produit isolé de Myrsine congesta DB Produit isolé de Dendrobangia boliviana PS Produit isolé de Poraqueiba sericea

Solvants et réactifs

AcOEt Acétate d’éthyle ACN Acétonitrile BuOH Butanol CD3OD Méthanol deutéré CHCl3 Chloroforme CDCl3 Chloroforme deutéré DMSO-d6 Diméthylsulfoxyde deutéré D2O Eau deutérée HCl Acide chlorhydrique MeOH Méthanol MtBE Méthyl tert-butyl éther PBS Phosphate Buffer Saline, (tampon phosphate salin) TFA Acide trifluoroacétique

Technique chromatographique

CCM Chromatographie sur Couche Mince CLHP Chromatographie Liquide Haute Performance CLV Chromatographie liquide sous vide CPP Chromatographie sur Plaque Préparative CPC Chromatographie de Partage Centrifuge CF-Si Chromatographie Flash sur silice normale CF-C18 Chromatographie Flash sur silice greffée C18 EPC Extracteur de Partage Centrifuge HPTLC Chromatographie sur Couche Mince Haute Performance C18 Silice greffée g Gramme l Litre ml Millilitre min Minute SPE Extraction su Phase Solide

Leishmanioses LC Leishmaniose cutanée LCL Leishmaniose cutanée locale LCD Leishmaniose cutanée diffuse 12

LDPKA Leishmaniose dermique post Kala-Azar LV Leishmaniose viscérale

Activités biologiques

IC50 Concentration inhibitrice médiane IL Interleukines LD50 Dose létale médiane L-DOPA 3,4-dihydroxyphénylalanine MIC50 Concentration minimale inhibitrice requise pour inhiber la croissance de 50% MTT bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

Détermination structurale

COSY COrrelated SpectroscopY d doublet dd doublet de doublets ddd doublet de doublets de doublet dm doublet de multiplet dq doublet de quadruplet dt doublet de triplet HMBC Heteronuclear Multiple Bonding Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Connectivity J (Hz) Constante de couplage exprimée en Hertz m multiplet NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY ppm parties par million qt quintuplet RMN Résonance Magnétique Nucléaire RMN 13C Résonance Magnétique Nucléaire du carbone RMN 1H Résonance Magnétique Nucléaire du proton ROESY ROtating Overhauser Effect SpectroscopY s singulet sl singulet large t triplet td triplet de doublet TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY tqt triplet de quintuplet δC Déplacement chimique du carbone en ppm δH Déplacement chimique du proton en ppm ESI ElectroSpray Ionization (ionisation par électrospray)

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Introduction générale

La leishmaniose représente un vrai problème de santé publique dans plusieurs pays (Soudan, Algérie, Pérou, etc…). Touchant principalement des populations pauvres, elle est associée à la malnutrition, aux mauvaises conditions de logement, aux systèmes immunitaires fragilisés, mais aussi liée aux facteurs environnementaux comme la déforestation. Malheureusement, il n’existe aucun vaccin ou médicament prophylactique permettant de prévenir cette maladie. Les traitements antimoniés disponibles sont souvent très couteux et provoquent des effets secondaires très lourds à supporter. De plus, le diagnostic des leishmanioses est compliqué car les signes cliniques ne se manifestent pas directement après l’infection avec une latence qui peut durer plusieurs années et une fois exprimés, ces signes cliniques sont souvent confondus avec d’autres parasitoses généralisées (comme la lèpre). C’est dans ce contexte que différentes équipes de recherche tentent de trouver de nouveaux traitements qui seront accessibles aux populations concernées et surtout dont les effets secondaires seraient moindres. Les plantes, première source vers laquelle se tournent les chercheurs, regorgent de métabolites secondaires dotés de diverses propriétés biologiques. On estime que 50 à 70 milles plantes possèdent des propriétés médicinales et que seulement 15% de ces plantes ont été étudiées [Brower 2008], ce qui laisse de grandes possibilités d’études pour la recherche de nouvelles substances actives. Comme nous le verrons, des études portant sur des espèces des familles des Primulaceae et des Icacinaceae ont mis en évidence des activités leishmanicides intéressantes dont les entités responsables étaient des saponosides triterpéniques dotées de ponts 13β-28 oxido ou 13β-28 epoxy, c’est ce type de molécules que nous avons tenté d’isoler. Nous nous sommes intéressés à la famille des Primulaceae en étudiant trois plantes appartenant au genre Myrsine, et la famille des Icacinaceae, avec l’étude de deux espèces : Poraqueiba sericea et Dendrobangia boliviana. Ces 5 espèces ont été collectées au Pérou et nous avons mené à la fois une étude phytochimique et des tests d’activité biologiques dont la recherche d’une activité antileishmaniose. Dans une première partie nous présenterons la Leishmaniose et ces traitements, en seconde partie nous développerons les travaux antérieurs réalisés sur les Primulaceae et les résultats de nos travaux sur Myrsine latifolia, M. congesta et M. sessiliflora. La troisième partie sera consacrée à la présentation des Icacinaceae et à l’étude phytochimique et biologique de Poraqueiba sericea et Dendrobangia boliviana.

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Etude bibliographique de la leishmaniose

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I. Description générale et historique

Les leishmanioses sont des maladies parasitaires qui se manifestent chez les mammifères et dont le parasite est transmis par la piqûre d’insectes appelés phlébotomes (vecteur). Elles existent sous trois formes : cutanée (cutanée et cutanée diffuse), muco-cutanée et viscérale. Elles étaient connues autrefois sous différents noms : bouton d’orient, clou de Biskra, bouton d’Alep, kala azar, fièvre noire, fièvre dum-dum ou espundia. C’est l’anatomologiste écossais William Boog Leishman qui a médicalement décrit la maladie et son parasite en 1900, en observant des frottis de rate d’un soldat décédé des suites d’une fièvre dum-dum en Inde. Trois ans après, Charles Donovan identifia le même parasite dans une biopsie de rate dans un service médical indien, ainsi le parasite fut nommé Leishmania donovani en leur honneur [Larry et al. 2000]. La relation entre le vecteur de ce parasite (phlébotome) et les symptômes de cette maladie a été établie grâce à l’équipe des frères Sergent (Edmond et Pierre) en 1921 à l’institut Pasteur d’Algérie [Larry et al. 2000]. I.1 L’agent pathogène La première classification du genre Leishmania fut établie par Ross en 1903, mais celle-ci a subi quelques modifications par Levine et ses collaborateurs en 1980 comme indiqué sur le Tableau 1 [Dedet 1999, Larry et al. 2000].

Tableau 1: Classification du genre Leishmania Règne Protista Sous-règne Protozoa Embranchement Sacromastigophora Classe Zoomastigophora Ordre Kinetoplastida Sous-ordre Trypanosomatina Famille Trypanosomatidae Genre Leishmania

La famille des Trypanosomatidae regroupe des espèces avec un seul noyau et ayant une forme allongée prolongée par un seul flagelle. Plusieurs d’entre elles sont hétéroxènes, c’est-à-dire qu’elles effectuent leur cycle de vie sur plusieurs hôtes. Ainsi durant un stade de

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leur vie, elles vont vivre dans le sang et/ou les tissus des vertébrés et pendant les autres stades, elles vivent dans l’intestin d’invertébrés « suceurs de sang ». Elles sont désignées comme « Hémoflagellées » car elles ont besoin d’avoir du sang dans leur milieu de culture pour croître in vitro. Le genre Leishmania a été divisé en deux sous-groupes : Leishmania et Viannia. Cette division est due à la différence de développement du parasite dans le tube digestif du vecteur. En effet, le sous-genre Leishmania est caractérisé par une multiplication située dans l’intestin moyen et antérieure. Quant à Viannia, la multiplication s’effectue dans la partie postérieure suivie d’une migration antérieure. Ces deux sous-genres regroupent 28 espèces mais qui ne sont pas toutes impliquées dans les phénomènes pathologiques chez l’Homme. Le Tableau 2 présente une classification pratique des espèces réparties dans les deux sous-genres et les tropismes dans lesquels elles sont impliquées [Dedet 1999, Botero 2006]. Une autre notion est intégrée et souvent mentionnée dans la distribution des leishmanioses, c’est celle de l’ancien et du nouveau monde. L’ancien monde se réfère aux parties du monde connues par les européens depuis l’antiquité et avant les découvertes de Christophe Colomb, il englobe l’Eurasie et l’Afrique. Le nouveau monde, quant à lui, regroupe les terres découvertes par les européens au de-là de l’océan atlantique, on y retrouve l’Amérique, l’Océanie et l’Australie.

Tableau 2: Classification pratique des espèces de Leishmania

Sous-genre Leishmania Viannia L. donovani L. major Ancien monde L. infantum L. tropica L. aethiopica L. infantum L. mexicana L. guyanensis L. braziliensis L. chagasi L. amazonensis L. pananensis Nouveau L. venezuelensis L. shawi monde L. naiffi L. lainsoni L. peruviana

Tropisme Viscéral Cutané Muco-cutané

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I.2 Cycle parasitaire Le cycle de ce parasite hétéroxène se déroule en deux phases, une phase extracellulaire chez l’insecte sous une forme dite promastigote et une phase intracellulaire chez l’hôte mammifère sous une autre forme dite amastigote (Figure 1). Le parasite se transmet lors d’une succion du sang d’un mammifère contaminé par l’insecte. Lors de ce repas sanguin, l’insecte ingère la forme amastigote qui sera transformée dans son intestin en forme promastigote. Une seconde succion permettra de transmettre au mammifère la forme promastigote qui sera phagocytée par les macrophages et transformée en forme amastigote. Sous cette forme, le parasite peut se localiser dans différents tissus ou organes du mammifère et provoquer les symptômes de la maladie.

Figure 1: Cycle parasitaire de la leishmaniose [Reithinger et al. 2007]

I.2.1 Phase extracellulaire : Promastigote

La forme promastigote se trouve dans le tube digestif du vecteur (les phlébotomes) ; c’est un corps allongé de 15 à 30 µm de longueur et 5 µm de largeur, avec une forme de fuseau effilé aux deux extrémités. Il possède un long flagelle (d’environ la longueur du corps)

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constituant une extension vers l’avant comme un organite fonctionnel, le noyau est antérieur et fait face au cinétoplaste et au cinétosome (corps basal) (Figure 2). Dans leur hôte, ces formes promastigotes se fixent à l’intestin et se reproduisent par scissiparité. Au quatrième ou cinquième jour après la succion, les promastigotes progressent vers l’œsophage et le pharynx en se fixant sur la paroi et forment des plaques qu’on appelle « hémidesmosomes ». Au huitième jour, ces flagellés se transforment en promastigotes minces, actifs et métacycliques qui seront injectés avec le prochain repas sanguin [Dedet 1999, Vannier-Santos et al. 2002].

I.2.2 Phase intracellulaire : Amastigote

C’est un petit corpuscule arrondi ou ovoïde de 2 à 6 µm de diamètre, il est situé dans les cellules mononuclées du système phagocytaire des vertébrés mammifères. Sa multiplication s’effectue par scissiparité dans la ou les vacuoles du macrophage où ils seront phagocytés pour évoluer dans d’autres phagocytes. Ils sont véhiculés vers différents organes du mammifère. Au microscope avec la coloration MGG (May-Grünwald Giemsa), on observe deux inclusions pourpres caractéristiques qui sont le noyau arrondi et le blépharoplaste en bâtonnet d’où sera amorcé le flagelle (forme promastigote). Le noyau est décentré par rapport au corps avec une mitochondrie renfermant le cinétoplaste (Figure 2) [Dedet 1999, Vannier-Santos et al. 2002].

Figure 2: Les formes amastigotes et promastigotes des leishmanies [ANOFEL]

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La forme amastigote va atteindre différents tissus selon l’espèce de Leishmania impliquée ce qui fait qu’on retrouve des manifestations cliniques différentes reflétant l’équilibre qui s’établit entre la multiplication du parasite, la réponse immunitaire de l’hôte mammifère et des altérations dégénératives qui en résultent.

II. L’insecte vecteur

II.1 Taxonomie Le vecteur des leishmanies est un moucheron phlébotome appartenant à la famille des Psychodidae et à la sous-famille des Phlebotominae qui regroupe 700 à 800 espèces réparties dans cinq genres (certains en décrivent jusqu’à 24 genres) [Killick-Kendrick 1999]. Leur classification a été établie comme suit : Ordre : Diptera Sous-ordre : Nematocera Famille : Psychodidae Sous-famille : Phlebotominae Genres : Brumtomyia ; Lutzomyia ; Phlebotomus ; Sergentomyia ; Wariteya

On dénombre environ 70 espèces de phlébotomes capables de transmettre les leishmanies. De façon générale, dans le nouveau monde le vecteur principal est le genre Lutzomyia et dans l’ancien monde c’est le genre Phlebotomus. Ces deux genres comportent plusieurs sous-genres dont les espèces vont être responsables de la transmission des différentes leishmanies (Tableau 3) [Bañuls et al. 2010, Colange 2011].

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Tableau 3: Vecteurs responsables des leishmanies de l’ancien et du nouveau monde Genre Sous-genre Espèce incriminées Leishmanies Plebotomus papatasi, duboscqi major sergenti, alexendri, tropica, Paraphlebotomus caucasius donovani, major martini, guggisbergi, donovani, Synphlebotomus ansarii tropica Phlebotomus ariasis, rangeroni, neglectus, perfiliewi, infantum, Larroussius perniciosus, tobbi, aethiopica longipes, pedifer Alerius chinensis infantum Euphlebotomus argentipes donovani Infantum (=chagasi), Lutzomiya Longipalpis, diabolica mexicana olmeca olmeca mexicana, Flaviscute//alfa amazonensis, olmeca bicolor venezuelensis, Nyssomiya Lutzomiya intermedia, umbratilis, braziliznsis, anduzei, whitmani, guyanensis, trapidoi panamensis wellcomei, braziliensis, Psychodopygus panamensis panamensis Helcocyrtomiya peruensis peruviana Pintomiya pessoai braziliensis

II.2 Morphologie Ce sont de petits insectes de 2 à 5 mm, de couleur brunâtre, au corps velu (soies recouvrant le thorax) ; leurs pattes sont longues et leurs ailes sont lancéolées et poilues.

Figure 3: Phlébotome femelle gorgée de sang

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La distinction entre l’imago (stade final du développement de l’insecte) mâle et femelle réside dans la forme de l’abdomen dont les segments terminaux vont être différents en fonction de l’appareil génital externe (Figure 4) [Dolmatova et al. 1971].

Figure 4: Différences entre les segments terminaux chez les imagos mâle et femelle

II.3 Habitat Durant toute l’année, ces phlébotomes se retrouvent dans les zones tropicales et de mai à octobre on les retrouve aussi dans les zones tempérées. Ils recherchent les endroits humides de 70 à 90 %, une température avoisinant 25°C et un vent faible ; leur habitat ne dépasse presque pas les 100 m d’altitude. Ces conditions font qu’ils nichent, de façon générale, dans les grottes, les cavités rocheuses, les creux d’arbres, les anfractuosités de vieux murs,… [Dolmatova et al. 1971]. Ces petits insectes ne supportent pas les rayons du soleil, ce qui fait qu’ils ont une activité crépusculaire voire nocturne, cependant, on peut les observer lors de temps nuageux et orageux (sans vent). Ils se nourrissent de sève de plante ou de miellat des pucerons, seules les femelles sont hématophages afin d’assurer le développement des œufs.

II.4 Distribution géographique La leishmaniose est distribuée dans les zones tropicales à subtropicales et est déclarée dans 88 pays répartis dans cinq foyers : méditerranéen, chinois, indien, africain, centre- et

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sud-américain (Figure 5). L’incidence de cette maladie est estimée à 2 millions de nouveaux cas par an dans le monde; 500 000 sont des cas de leishmanioses viscérales dont 90 % des cas sont recensés dans cinq pays : l’Inde, le Bengladesh, le Népal, le Brésil et le Soudan ; les 1,5 millions restants sont des cas de leishmanioses cutanées dont 90 % sont observés en Algérie, en Afghanistan, en Arabie Saoudite, au Brésil, en Iran, au Pérou et en Syrie [Desjeux 1996, W.H.O 2007]. On estime que 350 millions de personnes seraient exposées à cette infection, avec une prévalence de 12 millions de cas. Pour les spécialistes, ces estimations restent plus faibles que la réalité car les données officielles sont peu existantes et surtout que le diagnostic est très compliqué à établir même dans les pays développés [ Desjeux 2004].

Figure 5: Distribution géographique de la leishmaniose dans le monde (zone en rouge)

En France métropolitaine, la leishmaniose, notamment la leishmaniose viscérale, est présente dans les départements méditerranéens (Pyrénées Orientales, Cévennes, Provence, Côte d’Azur et Corse) où l’espèce incriminée est L. infantum, également responsable de l’enzootie canine. Les voyageurs français peuvent également être infectés par d’autres espèces lors des déplacements en pays d’endémie.

III. Formes cliniques de la leishmaniose

Comme déjà cité, la leishmaniose s’exprime sous trois formes cliniques : cutanée, muco- cutanée et viscérale. La leishmaniose cutanée est souvent divisée en deux sous-formes : la leishmaniose cutanée locale et la leishmaniose cutanée diffuse.

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III.1 La leishmaniose viscérale (LV) Connue en Inde sous le nom de Kala-Azar (= fièvre noire), elle touche principalement les enfants mais celle-ci peut s’étendre à des sujets plus âgés (certains cas allaient jusqu’à 35 ans). C’est la forme la plus grave de la maladie avec une mortalité de 100 % de six mois à quelques années après l’infection en cas d’absence de traitement [Safi et al. 1996]. Après la piqûre de l’insecte infecté, les parasites migrent vers les organes lymphoïdes : le foie, la rate et la moelle osseuse [Larry et al. 2000]. Cette forme est causée par deux sous- espèces du complexe Leishmania donovani : L. d. infantum et L. d. donovani. On retrouve aussi L.d. chagasi qui a été découvert par Charles Chagas dans la forêt amazonienne en 1911, mais qui s’est avéré être identique à L. d. donovani. Néanmoins, les deux espèces sont parfois citées de façon distincte [Dedet 1999]. La leishmaniose viscérale (LV) est caractérisée par trois signes cliniques qui sont retrouvés chez tous les patients : des fièvres irrégulières, une pâleur cutanéo-muqueuse (teint blafard témoin de l’anémie) et la splénomégalie qui peut aller d’un simple débord costal à une énorme rate dépassant l’ombilic (Figure 6) [Safi et al. 1996].

Figure 6: Enfant souffrant d’une hépatosplénomégalie due à une LV (OMS-Ethiopie)

En Inde, des cas de ce qu’on appelle leishmaniose dermique post Kala-Azar (LDPKA) sont observés et les symptômes débutent six mois à plusieurs années après la guérison de la LV. La LDPKA se présente sous forme de macules hypopigmentées ou érythémateuses ou des érythèmes pouvant évoluer en papules ou en nodules ce qui fait qu’elle peut être confondue avec la lèpre (Figure 7).

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Figure 7: Patient présentant une LDPKA (OMS-Ethiopie)

La transmission de la LV s’effectue principalement par piqûre du vecteur infecté par le parasite. Les réservoirs de L. d. infantum sont le chien et le renard (parfois d’autres membres des Canidae), alors que pour L.d. donovani, l’Homme est le seul réservoir [Singh and Sundar 2014].

III.2 La leishmaniose muco-cutanée (LMC) Connue sous le nom d’Espundia, cette forme est endémique de l’Amérique du sud dont 90% des cas sont recensés en Bolivie, au Brésil et au Pérou [Desjeux 2004]. Un seul pathogène est responsable de cette forme : L. braziliensis ; elle se manifeste initialement par une ulcération qui se résorbe en quelques mois (= phase quiescente) pour développer ultérieurement une infection secondaire (quelques mois à quelques années) au niveau des muqueuses : le nez, la bouche et même le palais et la gorge. Ces lésions sont extrêmement défigurantes (Figure 8) et peuvent présenter des handicaps sévères [Dedet 1999, Desjeux 2004].

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Figure 8: Déformations des muqueuses (nez et bouche) provoquées par la LMC

Les réservoirs de L. braziliensis sont des rongeurs forestiers ainsi que d’autres petits mammifères [Brandao-Filho et al. 2003] mais une autre étude a démontré que le chien peut aussi être un réservoir plus important pour ce parasite [Dantas-Torres 2007].

III.3 La leishmaniose cutanée III.3.1 La leishmaniose cutanée locale (LCL) Dans l’ancien monde, cette forme est connue sous le nom de « Bouton d’Orient ». Elle est causée principalement par L. major et rarement par L. tropica et peut être due à L. infantum en méditerranée occidentale [Aubry 2014]. Les réservoirs sont les rongeurs sauvages (LC zoonotique pour L. major) ou strictement humains (LC anthroponotique pour L. tropica). Dans le nouveau monde, elle est connue comme « Pian Bois » et est causée par L. amazonensis dans la forêt amazonienne. Le principal réservoir de cette espèce est le paresseux mais aussi des rongeurs et des marsupiaux. Dans les forêts d’Amérique centrale, elle est nommée « Chicleros ulcer » (= ulcère des gommiers) et l’agent pathogène est L. mexicana [Aubry 2014]. La LCL se manifeste par des formes cliniques multiples : . La forme classique ou Bouton d’orient qui est une lésion papulo-nodulaire rouge qui finit par se couvrir d’une croûte épaisse. (Figure 9A) . La forme ulcéro-croûteuse qui est un papulo-nodule rouge plus ou moins squameux de un à plusieurs cm à fond croûteux et aux bords épais et sombres. (Figure 9B)

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. Une forme avec des satellites peri-lésionnels où on observe une dissémination dermique des nodules et qui présente un risque de dissémination lymphatique des leishmanies. (Figure 9C)

Figure 9: Formes cliniques de la LCL [Schmoor 2009] A : bouton d’orient, B : forme ulcéro-croûteuse et C : satellites peri-lésionnels

Toutes les formes de la LCL sont indolores et finissent par se résorber spontanément en quelques mois et jusqu’à deux ans après l’inoculation. Néanmoins celles-ci laissent des cicatrices à vie [Weigle and Saravia 1996, Hassam et al. 1998, Schmoor 2009].

III.3.2 La leishmaniose cutanée diffuse (LCD)

C’est une forme peu fréquente, causée par L. aethiopia en Afrique de l’est et par L. amazonenzis en Amérique du sud. Elle se manifeste, au niveau du visage et des membres, sous formes de nodules disséminés ou en forme de plaques très similaires aux formes léporides ce qui cause des problèmes dans le diagnostic (Figure 10). Ces lésions ne guérissent pas spontanément et ont tendance à récidiver, elles touchent principalement les individus souffrant de déficiences immunitaires [Dedet 1999, Desjeux 2004].

Figure 10: Nodules disséminés d’une LCD

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IV. Diagnostic

Le polymorphisme exprimé par les différentes formes de leishmaniose pose problème lors de l’établissement du diagnostic (confusion avec la lèpre par exemple) et différentes méthodes ont été développées afin de confirmer le diagnostic et déterminer le type de parasite impliqué. Ces méthodes sont des tests parasitologiques et moléculaires ou immunitaires.

IV.1 Tests parasitologiques et moléculaires Ce test est réalisé par un prélèvement au niveau de la crête iliaque, du sternum ou une ponction splénique pour le cas d’une LV et au niveau des plaies (par vaccinostyle ou à la curette) pour les LC et LMC. Après coloration au MGG, ce prélèvement est observé au microscope à la recherche des formes amastigotes du parasite. Pour les individus séropositifs, on favorise l’analyse du sang (après leuco-cyto-centrifugation), les biopsies cutanée et digestive ou encore le lavage bronchoalvéolaire (seulement pour la LV) [Guerin et al. 2002]. Une autre méthode a démontré son efficacité et permet d’éviter de réaliser des ponctions, c’est la PCR (Polymerisation Chain reaction) sur le sang périphérique. Cette méthode est sensible à 100% et permet un diagnostic précoce et est valable pour toutes les formes de leishmaniose [Salotra et al. 2001]. Une culture du parasite peut être effectuée si l’analyse au microscope ne permet pas une analyse claire car l’absence de parasite au microscope n’exclue pas forcément l’infection (stade précoce). Cette culture est réalisée sur des milieux spéciaux comme le NNN (Novy-Mc Neal-Nicole) avec des délais de réponse allant de une à quatre semaines [Larry et al. 2000].

IV.2 Tests Immunologiques Ces tests sont dits indirects et se basent sur la mise en évidence des anticorps sériques ; différentes techniques sont utilisées : l’immunofluorescence indirecte, le test d’ELISA ou encore le Western Blot [Guerin et al. 2002]. D’autres méthodes sont utilisées sur le terrain comme le DAT (Direct Agglutination Test), la bandelette d’immunochromatographie à l’antigène rK39. Ces méthodes sont faciles à réaliser sur les zones endémiques éloignées. Elles sont effectuées en cas de doute dans l’établissement du diagnostic avant de réaliser des biopsies plus coûteuses et difficiles à mettre en place [Sundar et al. 1998, Boelaert et al. 1999].

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V. Traitement des leishmanioses

Il n’existe pour l’instant aucun vaccin ni traitement prophylactique. Il consiste à administrer aux malades des médicaments antiparasitaires mais qui possèdent de nombreux effets secondaires.

V.1 Les traitements de première intention Deux sels d’antimoines sont utilisés en traitement de première intention : le N- méthylglucamine 1 (Glucantime®) et le stibogluconate de sodium 2 (Pentosan®). Le premier contient 8,5% (85 mg/ml) d’antimoine et le deuxième est à 10% (100 mg/ml). Leur action se fait sur la synthèse de l’ADN et l’oxydation glycosidique et des acides gras. In vivo, une conversion en antimoine trivalent est nécessaire pour leur activité [W.H.O 1990, Dedet 1999].

Le premier problème que posent ces traitements c’est qu’ils nécessitent une hospitalisation à cause de leur administration qui se fait par voie intraveineuse ou intramusculaire et doit être échelonnée sur une durée de 20 à 28 jours [Berman 2003]. En deuxième lieu, le prix de ces traitements est très élevé, compris entre 100 et 150 US$ ce qui limite leur accès aux populations pauvres les plus touchées par cette maladie. En dernier lieu, ces médicaments antimoniés causent des effets secondaires important qui sont divisés en deux catégories. Tout d’abord les effets de stibio-tolérance qui sont de type anaphylactiques et se manifestent dès les premières injections : fièvre, éruption cutanée, tachycardie, lipothymie, hémorragie et vomissements. Ensuite viennent, en fin de cure, les effets de stibio-intoxication dus au surdosage et sont responsables de troubles cardiaques, hépatiques, pancréatiques, rénaux et hémorragiques [Dedet 1999].

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V.2 Les traitements de seconde intention Deux médicaments sont souvent utilisés en cas d’échec avec les premiers traitements : l’amphotéricine B et la pentamidine.

V.2.1 L’amphotéricine B C’est un polyène antifongique (3) utilisé pour les mycoses systémiques, il inhibe la méthylation du lanostérol qui va s’accumuler dans le parasite et induire sa mort [Dedet 1999]. Ce médicament est très efficace avec un taux de guérison de 97% et avec, jusque-là, aucune résistance rapportée [Thakur et al. 1996].

L’amphotéricine B 3 est administrée quotidiennement ou trois fois par semaine par perfusion, pendant 4 heures, en solution dans le dextrose à 5%. La dose est augmentée progressivement de 0,5-1 mg/kg de poids corporel jusqu’à 1-3 g/kg, la durée varie en fonction de la réaction du patient aux doses administrées car les effets secondaires sont très importants : fièvre, toxicités rénale et hématologique. Pour diminuer cette toxicité, différentes formulations ont été mises en place comme l’Ambisome®, forme liposomiale, qui n’a pratiquement pas d’effets secondaires mais dont le coût est très élevé (à partir de 1500 US$) [W.H.O 2007].

V.2.2 La pentamidine C’est une diamine aromatique commercialisée sous forme de sel : l’isoéthionate de sodium 4 (Pentacarinat®) dont l’action est de bloquer la synthèse de l’ADN par blocage de la thymidine synthase, elle se fixe aussi sur l’ARNt. L’administration (4 mg/kg de poids corporel) se fait par perfusion trois fois par semaine nécessitant une prise en charge hospitalière avec une durée de traitement de 5 à 25 jours. Là encore, les effets secondaires sont considérables. De plus, des résistances à ce traitement ont été observées en Inde [Dedet 1999, Sundar et al. 2001]. La pentamidine a été testée en association avec l’allopurinol 5 afin

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de diminuer les effets secondaires. Cette association a démontré une efficacité de l’ordre de 90% alors que la pentamidine seule n’assurait qu’un taux de 74% de guérison [Berman 2003].

V.3 Les nouveaux traitements La recherche de nouveaux médicaments continue et a menée a des produits qui ont démontré des résultats intéressants.

V.3.1 La miltéfosine La miltéfosine 6 est un hexadécylphosphocholine qui interviendrait dans un mécanisme de mort cellulaire mais dont le mode d’action exact n’est pas encore déterminé [Paris et al. 2004]. L’avantage de cette molécule c’est son administration par voie orale et donc pas d’hospitalisation nécessaire. La dose utilisée est de 25 mg/kg/jour pendant 28 jours avec une efficacité estimée à 98% avec de faibles effets secondaires [Berman 2003]. Elle est approuvée en inde, pour le traitement de LV depuis 2002 et en Colombie contre les LC depuis 2005 [Croft et al. 2006].

V.3.2 La paromycine La paromycine 7 est un antibiotique aminoglycosidique inhibant la synthèse protéique en se fixant sur les ribosomes [Moskowitz and Kurban 1999]. Elle a été brevetée en Inde pour traiter les LV en 2007. Elle peut être administrée par voie parentérale et peut aussi être associée aux antimoniés aves des efficacités rapportées de 94% en Inde [Berman 2003]. En Colombie des formulations sous formes de crème sont utilisées pour les lésions cutanées avec un succès de 64% [Croft and Coombs 2003].

V.3.3 La sitamaquine La sitamaquine 8 est un dérivé 8-aminoquinolone qui a été développé par Walter Reed Army Institute of Research et GlaxoSmithKline pendant la seconde guerre mondiale et dont l’administration s’effectue par voie orale. Au Kenya et en Inde, cette molécule a démontré

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une efficacité de plus de 83% avec une dose de 0,75-1 mg/kg/jour pendant 28 jours mais des effets secondaires de nephrotoxicité ont été observés [Croft and Coombs 2003, Jha et al. 2005, Wasunna et al. 2005].

V.3.4 L’imiquimod C’est une imidazoquinoline 9 induisant la production d’oxyde nitrique. Initialement, elle était utilisée contre les verrues génitales sous forme de crèmes. Des tests in vivo sur des souris BALB/c infectées par L. donovani ont démontré une guérison de 60% à une dose de 5 mg/kg par administration orale [Croft and Coombs 2003].

V.3.5 L’interféron γ C’est une cytokine pouvant activer les mécanismes de défense intracellulaire des macrophages. Elle a démontré de bons résultats en combinaison avec des antimoniés par voie parentérale surtout sur les LV et les LMC récidivantes [Dedet 1999].

V.4 Les traitements physiques Différents traitement physiques peuvent être appliqués comme la cryothérapie, la thermothérapie, la chirurgie et l’électrothérapie. Le problème de ces traitements c’est qu’il n’existe pas d’essais cliniques randomisés permettant d’évaluer efficacement leurs effets. Les effets de la thermothérapie (39-40°C) peuvent être expliqués par la sensibilité du parasite à la chaleur, de même que pour la cryothérapie (CO2 solide ou azote liquide) qui a

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aussi démontré des effets bénéfiques mais qui provoque des hypopigmentations [Moskowitz and Kurban 1999]. L’électrothérapie a démontré des résultats intéressants similaires au stibogluconate de sodium. Les patients sont soumis à des courants de 5 à 15 mA pendant 10 minutes et ceci une fois par semaine avec un taux de guérison de 92,5% [Sharquie et al. 1998]. Quant à la chirurgie, il s’agit d’exciser la partie affectée mais son intérêt est limité aux petites lésions simples.

V.5 Les molécules actives issues de la biodiversité Plusieurs études phytochimiques menées sur la recherche de nouvelles molécules actives biologiquement ont révélé différentes molécules avec des propriétés leishmanicides. Nous n’allons citer que les plus importantes d’entre elles. Un tableau récapitulatif des études menées et des molécules actives découvertes est consultable en annexe 1.

V.5.1 Les alcaloïdes Une étude phytochimique a été menée sur les extraits éther de pétrole et chloroforme des tiges, des feuilles et des écorces de racines de Glipea longiflora. C’est une plante de la famille des Rutaceae qui est utilisée par les Chimanes (populations indigènes vivant au pied des Andes aux limites des départements du Beni et de la Paz en Bolivie). Cette étude a mis en évidence la présence de 13 alcaloïdes de type quinoléine. Quatre de ces alcaloïdes nommés « chimanines A-D » 10-13 (en hommage aux Chimanes) [Fournet et al. 1993a] ont été testés in vivo sur des souris BALB/c infectées par L. amazonensis et L. venezuelensis. Les chimanines B 11 et D 13 et le 2-n-propylquinoléine se sont révélés aussi actifs, voire plus que la Glucantime® 1 [Fournet A. et al. 1994a]

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La conodurine 14, un alcaloïde indolique, isolée à partir des feuilles et des écorces de tiges de Peschiera van heurkii (Apocynaceae) a démontré une activité leishmanicide in vitro avec un indice de survivance de 47% à 100 µg/ml sur des souris BALB/c infectées par L. amazonensis (93% pour la Glucantime®) cependant elle a des effets bénéfiques sur les lésions en injection intra-lésionnelle [Muñoz et al. 1994].

La berbérine 15, alcaloïde isoquinoléique, a été identifiée dans différentes familles botaniques (Ranunculaceae, Papaveraceae, Annonaceae, Berberidaceae et Menispermaceae) [Sharma et al. 2015]. Cet alcaloïde a été testé dans un modèle de LC (L. panamensis) et de LV (L. donovani) sur des hamsters in vivo avec une dose de 52 mg/kg/jour. La charge parasitaire hépatique a été réduite à 36% (64% pour la Glucantime®) et la taille des lésions a été réduite de 56% (66% pour la Glucantime®) [Vennerstrom et al. 1990].

L’Isotetrandrine 16, un alcaloïde bisbenzylisoquinolinique a été isolé de Lamaciopsis loangensis (Menispermaceae) [Fournet 1979]. Cette molécule a été testée en voie sous- cutanée et en application locale sur des souris BALB/c infectées par L. amazonensis ou L. braziliensis. Le traitement sous-cutané (100 mg/kg/jour) pendant six semaines a eu pour effet la diminution de la taille des lésions causées par L. braziliensis de 2,14 mm à 1,15 mm (contre 2,35 mm à 1,67 mm pour la Glucantime® à 200 mg/kg/jour). Le même effet est observé pour les plaies causées par L. amazonensis et pour le traitement local des deux leishmanies [Fournet et al. 1993b ].

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L’harmine 17, un alcaloïde de type β-carboline, a été isolé de Peganum harmala

(Zygophyllaceae). Il a révélé une activité contre les promastigotes (IC50=3,7 µM) et les amastigotes (IC50=0,23 µM) de L. infantum (comparé à 0,036 et 0,023 µM pour l’amphotéricine B) [Di Giorgio et al. 2004]

Deux autres alcaloïdes de la famille des β-carbolines ont été isolés à partir de plusieurs familles de plantes : Rutaceae, Simaroubaceae et Zygophyllaceae. Ces deux alcaloïdes sont la canthin-6-one 18 et la 5-méthoxy-canthin-6-one 19. Elles ont été testées sur des souris BALB/c infectées par L. amazonensis traitées pendant 4 jours à 10 mg/kg. La diminution de la charge parasitaire a été de 77,6% pour la canthin-6-one 18 et de 21,6% pour la 5-méthoxy- canthin-6-one 19 [Ferreira et al. 2002].

V.5.2 Les terpénoïdes La jatrophone 20, un diterpène isolé de Jatropha isabelli (Euphorbiaceae), a démontré une IC100 de 5 µg/ml sur des promastigotes de trois différentes leishmanies (L. amazonensis, L. braziliensis et L. chagasi) sur des modèles de souris BALB/c par voie sous-cutanée. Un autre diterpène, la jatrogrossidione 21 isolée de J. grossidentata, a révélé une IC100 de 0,75 ® µg/ml alors que la pentamidine 4 présente une IC100 de 1 µg/ml et celle de la Glucantime 1 est supérieure à 100 µg/ml [Schmeda-Hirschmann et al. 1996].

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La déhydrozaluzanine C 22 est une lactone sesquiterpénique qui a été isolée à partir de l’extrait éther de pétrole de Munnozia maronii (Asteraceae) et qui a été testée sur les promastigotes de 15 leishmanies différentes sur des souris BALB/c à 100 mg/kg/jour pendant

14 jours. Pour 10 espèces testées, cette molécule a démontré une IC90 de 2,5 µg/ml comparée

à la pentamidine dont l’IC90 varie de 0,5 à 2,5 µg/ml pour ces espèces [Fournet et al. 1993c].

Le limonène 23 qui est un monoterpène a démontré une activité antileishmanienne intéressante in vitro (IC50=252 µM) et in vivo (IC50=147 µM) contre les promastigotes de L. amazonensis. Il a aussi démontré une bonne efficacité contre les promastigotes de L. braziliensis, L. major et L. chagasi [Arruda et al. 2009].

L’étude phytochimique de l’extrait méthanolique de Pourouma guianensis a mis en évidence la présence de plusieurs triterpènes sont les acides ursolique et oléanolique. Ces deux acides triterpéniques ont révélé une activité contre les amastigotes intracellulaires de L. amazonensis avec des IC50 de 2,7 µg/ml (acide ursolique 24) et de 11 µg/ml (acide oléanolique 25) supérieures à celle de la Glucantime® (83 µg/ml). Cependant cette activité est non sélective et présente une toxicité vis-à-vis des macrophages [Torres-Santos et al. 2004].

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Parmi les terpénoïdes, les saponines sont une classe importante largement représentée dans le règne végétal. Ce sont des métabolites secondaires souvent impliqués dans les mécanismes de défense des plantes contre les agents pathogènes extérieurs [Hostettmann and Marston 1995]. Les saponines ont des propriétés amphiphiles dues à leur constitution d’une partie lipophile (génine de type triterpénique ou stéroïdique) sur laquelle s’accrochent un ou plusieurs fragments glycosidiques (hydrophiles). Ainsi, elles sont capables d’interagir avec les surfaces physique ou biologique telles que les membranes cellulaires et induire une hémolyse ou une cytotoxicité [Böttger et al. 2012]. Plusieurs études ont révélé diverses propriétés des saponines comme les activités antibactérienne [Kannabiran et al. 2009], antifongique [Tsuzuki et al. 2007] et antioxydante [Chen et al. 2014]. Parmi ces recherches, trois ont révélé des saponines avec des activités leishmanicides intéressantes : . Un fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des feuilles d’Apodytes dimidiata (Icacinaceae) a permis la purification de six saponines triterpéniques : Apodytines A-F 26-31. Ces apodytines ont été testées in vitro

sur des amastigotes de L. infantum et ont révélé des IC50 comprises entre 0,3 et

6 µM alors que le témoin positif (la miltéfosine 6) présente une IC50 de 7,2 µM. Cependant l’activité de ces saponines est non sélective vu leur propriété hémolytique [Foubert et al. 2011].

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. A partir de Maesa balansae (Primulaceae/Maesoideae) ont été isolé les maesabalides I-VI, saponines triterpéniques dotées d’un pont 13β,28-oxido. Ces saponines se sont révélées très actives sur les promastigotes et les

amastigotes de L. infantum avec des IC90 de 0,012 à 0,125 µg/ml (comparé à 0,037 µg/ml pour l’amphotéricine B). In vivo, le maesabalide III 32 a été le plus actif en réduisant la charge parasitaire hépatique (amastigotes de L. infantum) de 90% après une seule injection sous-cutanée de 0,2 mg/kg (tests sur souris BALB/c) [Germonprez et al. 2004, Germonprez et al. 2005].

D’autres plantes de la famille des Primulaceae : Myrsine coriacea et M. andina (sous- famille des Myrsinoideae) ont révélé la présence de saponines triterpéniques avec un pont 13β,28-epoxy dans l’extrait éthanolique de leurs racines. Une de ces saponines : l’ardisiacrispine A 33 a démontré une activité leishmanicide intéressante avec une IC50 de 16 µg/ml contre les amastigotes de L. amazonensis [Girardi 2012].

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V.5.3 Les chalcones Une chalcone oxygénée : licochalcone A 34 isolée des racines d’une réglisse chinoise, Glycyrrhiza inflata (Fabaceae), a révélé une activité inhibitrice de la croissance des formes promastigotes de L. major (IC100=5 µg/ml) [Chen et al. 1993]. In vivo, l’administration intrapéritonéale de cette chalcone a des doses de 2,5 à 5 µg/kg à complétement inhibé le développement des lésions chez les souris BALB/c infectées par L. major. De plus, un traitement de 20 mg/kg pendant six jours sur des hamsters infectés de L. donovani a permis la réduction de la charge parasitaire hépatique de plus de 90%. Au vu de ces résultats très prometteurs, cette molécule fait l’objet d’essai clinique (phase III) en chine [Chen et al. 1994]. Le 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxychalcone 35 (DMC) a été isolé à partir de l’extrait dichlorométhane des inflorescences de Piper adumcum. In vitro, cette chalcone a démontré une IC50 de 0,5 µg/ml contre les promastigotes de L. amazonensis et de 24 µg/ml contre les promastigotes intracellulaires de la même leishmanie [Torres-Santos et al. 1999].

V.5.4 Les flavonoïdes Le premier flavonoïde-glycoside révélant une activité leishmanicide est la quercitrine

36. Testée sur les amastigotes de L. amazonensis, elle a démontré une IC50 de 1 µg/ml alors ® que le médicament de référence, le Pentosan , présente une IC50 de 20 µg/ml. De plus la cytoxicité de la quercitrine est très faible avec seulement 17% de mort cellulaire à 100 µg/ml ce qui est cent fois plus que sa concentration active [Muzitano et al. 2006]. D’autres flavonoïdes, l’apigénine 37, le kaempférol 38, le crysoériol 39 et la lutéoline 40, ont démontrés des activités antileishmaniennes à prendre en considération. En effet, à une concentration de 84 µg/ml la lutéoline a induit une diminution de la croissance des amastigotes axéniques de L. amazonensis de 83,7%, le kaempférol de 79% et l’apigénine de 83,8%. Pour le crysoériol, il induit une inhibition de 95,7% mais seulement à 500 µg/ml comparé à l’amphotéricine B dont l’efficacité est de 96,6% à 20 µg/ml. Le problème posé par ces flavonoïdes est leur cytoxicité qui est importante [Schinor et al. 2007].

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V.5.5 Les lactones Une γ-lactone α-β insaturée a été isolée à partir des racines d’Annona haematantha (Annonaceae), l’argililactone 41, et a démontré une activité, in vitro, contre différentes souches de Leishmania à 10 µg/ml. Administrée par voie sous-cutanée à des souris infectées par L. amazonensis à une concentration de 25 mg/kg/jour pendant 15 jours, son activité est comparable à celle de la Glucantime® avec une toxicité faible [Waechter et al. 1997]. Une autre lactone, la 4-hydroxy-1-tetralone 42, isolée de l’écorce des tiges d’Amplocera edentula (Ulmaceae) a démontré une activité in vitro sur les formes promastigotes de différentes leishmanies avec une IC90 de 10 µg/ml. In vivo, son activité est légèrement plus faible que la Glucantime® contre L. amazonensis et L. venezuelensis [Fournet et al. 1994b].

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VI. Leishmanioses et médecines traditionnelles

VI.1 Au Maroc Une étude ethnobotanique a été menée sur l’utilisation des plantes pour soigner la LC dans la région de Tafilalet (Province d’Errachidia). Un total de 61 plantes appartenant à 31 familles botaniques dont les Lamiaceae, les Asteraceae, les Cupressaceae, les Lythraceae, les Euphorbiaceae, les Liliaceae, les Ranunculaceae, les Cucurbitaceae et les Chenopodiaceae sont les plus représentées. Ces plantes sont utilisées sous forme de préparations simples pour des usages externes (84% de cas d’utilisations) [El Rhaffar et al. 2002]. Parmi ces plantes, Artemisia herba-alba, appartenant à la famille des Asteraceae, pour laquelle l’extrait aqueux a démontré une activité antileishmanienne contre les promastigotes de L. tropica et L. major à 4 µg/ml ; son huile essentielle est aussi active à 2 µg/ml [Hatimi et al. 2000].

VI.2 En nouvelle Calédonie Trente plante utilisées en médecine traditionnelle en Nouvelle Calédonie pour traiter les fièvres, les inflammations et pour la cicatrisation ont été testées pour leur activité antiprotozoaire contre L. donovani et L. amazonensis. Deux plantes se sont révélées actives contre ces leishmanies : Pagiantha cerifera (Apocynaceae) et Garcinia pedicillata

(Clusiaceae) avec une IC50 de 12 µg/ml contre les amastigotes intracellulaire de L. amazonensis et une EC50 de 5 µg/ml de l’extrait de P. cerifera sur les promastigotes de L. donovani [Billo et al. 2005].

VI.3 Au Pérou Une première étude ethnopharmacologique a été menée par une équipe de l’Institut de Recherche et Développement (IRD) auprès des communautés Chayahuita avec le but de recenser les différentes plantes utilisées par ces populations pour traiter les LC et les LMC. En tout, 50 plantes ont été listées, parmi celles-ci, 31 ont été testées in vitro contre les amastigotes axéniques de L. amazonensis. Six espèces ont révélé une bonne activité avec des

IC50 comprises entre 10 et 20 µg/ml et sont : Cybianthus anthuriophyllus Pipoly (Myrsinaceae), Piper sanguineispicum Trel., Piper loretoanum Trel. (Piperaceae), Desmodium axillare Sw. DC. (Fabaceae), Clibadium sylvestre (Aubl.) Baill. (Asteraceae) et

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une espèce de la famille des Clusiaceae hemi-epiphytique indéterminée [Estevez et al. 2007, Odonne et al. 2009 ]. De plus, l’étude phytochimique de deux espèces du genre Piper : Piper heterophyllum et P. aduncum a révélé la présence d’un acide benzoïque prénylé qui est l’acide 3-(3,7- diméthyl-2,6-octadienyl)-4-methoxy-benzoïque 43 qui a démontré, in vitro, une IC50 de 6,5 µg/ml sur les formes promastigotes de L. braziliensis, celle-ci est intéressante comparée à la pentamidine dont l’IC50 est de 10 µg/ml [Flores et al. 2009].

Une autre étude a été effectuée au département de Madre de Dios (entre la ville de Puerto Maldonado et le village de Yanapari). Il en est ressorti sept plantes utilisées traditionnellement pour traiter les LC et LMC : Brunfelsia grandiflora D. Don (Solanaceae), Capirona decorticans Spruce (Rubiaceae), Cyathea sp., (Cyatheaceae), Dracontium loretense K. Krause, (Araceae), Himatanthus sucuuba Woodson (Apocynaceae), Paullinia bracteosa Radlk (Sapindaceae) et Zamia sp. (Cycadaceae). Seul l’extrait hydroéthanolique d’H sucuuba a révélé une bonne activité leishmanicide in vitro contre les promastigotes et les amastigotes axéniques de L. amazonensis. L’étude bioguidée de cet extrait a mené à la purification de deux iridoïdes spirolactones, la pluméricine 44 et l’isopluméricine 45. La pluméricine a révélé une IC50 de 0,9 µM similaire à celle de l’amphotéricine B (1 µM) [Castillo et al. 2007].

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VII. La leishmaniose au Pérou

La présence de la leishmaniose au Pérou remonte aux civilisations précolombiennes Mochica (330 à 500 ans après J-C) et Chimù (1000 à 1400 ans après J-C). En effet, plusieurs céramiques (Figure 14) de ces deux cultures représentent des personnes avec des visages portant des déformations du nez ou de la bouche [Torres et al. 2011].

Figure 11: Céramiques Chimù et Mochica A : Photo du Musée de l'Amérique à Madrid B,C: Photos du Musée Ethnographique de Berlin

Les premières descriptions cliniques de la leishmaniose au Pérou remontent au XVIe siècle lors de la conquête espagnole. Fernando de Oviendo (1935), Pedro Pizarro (1971) et Fernando de Santillan (1972) l’ont décrite comme étant une maladie qui détruit le nez et les cavités nasales et qui touchent les populations autochtones vivants dans le versant oriental des Andes [Sánchez-Saldaña et al. 2004]. Au Pérou, seules les leishmanioses tégumentaires (LC et LMC) sont présentes et aucun cas de LV n’a été rapporté jusque-là. Selon des critères clinico-géographiques, deux formes sont décrites : la leishmaniose sylvatique (LMC) endémique de la forêt amazonienne et la leishmaniose andine (LC) endémique des vallées andines entre 600 et 3000 m d’altitude [Guerra 1988]. Dans la forêt amazonienne, plus de 26 espèces de phlébotomes sont des vecteurs de leishmanies dont le réservoir serait le paresseux et les rongeurs. Dans les Andes, seules trois espèces ont été recensées : Lutzomyia peruensis, Lu. Verrucarum et Lu. ayacuchensis pour lesquelles le chien semble être le réservoir [Perez et al. 1991, Dujardin et al. 1993].

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Une étude visant à identifier les parasites responsables des leishmanioses dans ces deux régions a été menée sur 350 isolats (de 15 départements différents). Il en résulte que 79,5 % des cas étaient dus à L. (V.) braziliensis, 6,8% à L. (V.) guyanensis, 10% à L. (V.) peruviana, 2% à L. (V.) lainsoni et 1,7 % à L. (V.) amazonensis [Lucas et al. 1998].

La leishmaniose en ces deux formes représente la troisième cause de morbidité par maladie transmissible au Pérou après la malaria et la tuberculose [Ministerio de Salud del Perú 2005]. Entre 1979 et 1989, l’incidence de la leishmaniose est passée de 7,6 pour 100 000 à 24,7 pour 100 000 selon le ministère de la Santé du Pérou. En 2003, 6318 cas de LC ont été rapportés dont la plupart étaient originaires d’Ancash, Cusco et Madre de Dios. Pour la LMC, 327 cas ont été recensés provenant majoritairement du départements de Cusco, Huanico et Loreto (Figure 12) [Ministerio de Salud del Pérù 2003].

Figure 12: Distributions des cas des leishmanioses tégumentaires au Pérou de 1999 à 2003 [Ministerio de Salud del Pérù 2003]

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VIII. Objectifs de l’étude

La leishmaniose constitue un problème de santé de plus en plus important particulièrement pour les pays pauvres les plus touchés par cette parasitose. De plus, les traitements actuels sont très couteux et présentent des effets secondaires importants et difficiles à supporter pour les patients. C’est dans ce contexte que nous avons élaboré un projet de recherche portant sur la recherche de nouvelles molécules actives contre la leishmaniose. Les cibles principales de notre étude sont les saponines qui représentent une des thématiques majeures du groupe Isolement et Structure à l’ICMR (Institut de Chimie Moléculaire de Reims). Des saponines triterpéniques dotées, pour certaines d’entre elles, des ponts 13β-28 époxy ou 13β-28 oxido (comme exposé dans le premier chapitre), ont démontré des activités leishmanicides intéressantes ce qui nous a conforté dans notre choix des saponines comme cible moléculaire. Ces saponines actives ont été isolées à partir de différentes plantes appartenant aux familles des Primulaceae et des Icacinaceae et plus particulièrement des genres Maesa et Myrsine (Primulaceae) et Apodytes (Icacinaceae). Notre choix c’est donc porté sur ces deux familles avec trois plantes du genre Myrsine (Primulaceae) : Myrsine latifolia, M. congesta et M. sessiliflora et deux plantes de la famille des Icacinaceae : Poraqueiba sericea et Dendrobangia boliviana. Les plantes étudiées ont été collectées au Pérou puis mises à notre disposition sous forme de poudre de différentes parties (tiges et/ou feuilles et/ou racines). Notre but est de déterminer la composition chimique de ces plantes et de les évaluer pour leurs activités antileishmanienne et cytotoxique. Pour chaque plante, un protocole d’extraction et de purification a été mis en place. L’élucidation structurale des composés isolés a été effectuée par étude des spectres de masse et surtout par les spectres de RMN 1D et 2D.

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Les Primulaceae

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I. Etude bibliographique

La famille des Primulaceae, selon la classification APG III [Stevens 2012] est une famille de plantes dicotylédones appartenant à l’ordre des Ericales. Cette famille a subit des remaniements et se trouve divisée en quatre sous-familles : Maesoideae, Theophrastoideae, Primuloideae et Myrsinoideae. Elle inclue désormais d’anciennes familles comme les Primulaceae stricto sensu, les Myrsinaceae et les Theophrastaceae. Ainsi, les espèces de la famille des Myrsinaceae sélectionnées dons notre étude sont désormais incluses dans la sous famille des Myrsinoideae.

I.1 Description générale des Myrsinoideae Les Myrsinoideae regroupent 1435 espèces distribuées dans 41 genres [Stevens 2012] dont les genres principaux dont Ardisia (150 espèces), Myrsine (155 espèces), Lysimachia (150 espèces), Discocalyx (115 espèces), Oncostemum (110 espèces) et Embelia (100 espèces) [Stevens 2012]. Le genre Maesa (150 espèces) qui était inclus dans l’ancienne famille des Myrsinaceae se retrouve désormais dans la sous-famille des Maesoideae. Ce sont des plantes qui sont réparties dans les zones tempérées à tropicales principalement dans l’hémisphère australe (Figure 13) à l’exception de certaines espèces retrouvées au sud de la Nouvelle-Zélande, au nord du Japon et en Floride.

Figure 13: Localisation géographique des Myrsinoideae (ex. Myrsinaceae) [Stevens 2012]

Les Myrsinoideae sont des arbres, grands ou petits, des arbustes, des lianes ou des plantes herbacées. Leurs feuilles sont simples, alternes subopposées, opposées ou pseudo- verticillées ; les stipules sont absents et les pétioles sont soit de courte durée soit complétement absents. Les fleurs sont bisexuées ou unisexuées. Elles sont regroupées en inflorescences terminales ou axillaires, de type grappe, panicule, corymbes, fascicules, verticilles simples ou

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composées, ou parfois en fleurs solitaires. Les 4-6 sépales sont libres ou connées à la base, généralement persistants et glandulaires ; les 4-6 pétales sont fossiles à la base et rarement libres. Les cinq staminodes (pour les fleurs femelles) ou cinq pistillodes (pour les fleurs mâles) sont libres ou plus ou moins soudés entre elles ou aux pétales ; l’ovaire est supère, plus rarement semi-infère ou infère, uniloculaire, à placentation centrale ou parfois basale avec un à plusieurs ovules ; le style libre est unique. Le fruit est une drupe charnue avec une seule graine ou une capsule contenant peu ou beaucoup de graines. Les graines possèdent un embryon droit ou légèrement courbé et un albumen charnu.

I.2 Usages traditionnels et activités des Myrsinoideae Plusieurs plantes de cette sous-famille sont utilisées en médecines traditionnelles (Chinoise, indienne et africaine). Nous allons nous intéresser à trois genres les plus répandus et les plus utilisés : Embelia, Ardisia et Myrsine. I.2.1 Le genre Embelia Ce genre regroupe des plantes ligneuses et grimpantes qui poussent jusqu’à une altitude de 1600 m. certaines espèces comme Embelia ribes et E. drupacea sont très répandues dans toute l’Inde ; elles sont connues dans la médecine ayurvédique sous les noms de « Vidanga » et « Ambat » respectivement. Le fruit de Vidanga est la partie la plus utilisée pour des propriétés vermifuge, carminative, hypoglycémiante et stérilisante. Pour Ambat, plusieurs parties sont exploitées : les fruits comme laxatif et antiseptique ; l’écorce comme antihelminthique et les racines pour les maux dentaires [Sathe 2015 ]. Le composé actif de ces deux plantes a été identifié comme étant l’embeline 46 [Rani 2007, Sathe 2015 ] qui a démontré une activité antiinflammatoire et s’est révélé être un médicament anticancéreux potentiel en inhibant l’enzyme de conversion du TNF-α (facteur de nécrose tumorale) [Dhanjal et al. 2014]. De plus, une activité antibactérienne a été mise en évidence contre Bacillus subtilis et Streptococcus nitis [Sidana 2012]. Deux autres espèces sont retrouvées en Afrique : E. shimperi qui est utilisée au Kenya et en Tanzanie, par le peuple Masay, comme traitement antimicrobien et antihelminthique [Bogh et al. 1996, Ladogana 2003] ; à Madagascar, les racines d’E. barbeyana sont utilisées comme vermifuge [Paris 1950].

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I.2.2 Le genre Ardisia Ce genre est très utilisé dans les médecines traditionnelles. En voici quelques exemples : I.2.2.1 Ardisia squamulosa Appelée « Tagpo » aux Philippines, elle est utilisée en cuisine pour aromatiser les plats de poisson mais aussi pour guérir les plaies en application externe des feuilles. Le peuple malais, utilise une décoction des feuilles pour traiter les douleurs de poitrine, la fièvre, la diarrhée et les problèmes de parturition [Raga 2013].

I.2.2.2 Ardisia pusilla C’est une herbe médicinale chinoise appelée « Jiu-Jie-Long » et prescrite pour le traitement de différents cancer [Lou et al. 2012]. Une étude a confirmé cette propriété sur des cellules cancéreuses du carcinome mucoépidermoïde [Xu et al. 2013].

I.2.2.3 Ardisia tinctoria Cette plante entre dans la composition d’une préparation en médecine traditionnelle chinoise prévue pour le traitement de maladies inflammatoires [Kim 2014]. Une activité antiinflammatoire a bien été démontrée sur l’extrait méthanolique de cette plante induite par blocage de l’activité des facteurs NF-κB [Kim 2014].

I.2.2.4 Ardisia kivuensis Répandue aux monts Kupé et Oku, elle est nommée « Afrardisia cymosa » ; ses parties aériennes sont utilisées contre les maladies vénériennes [Ndonsta 2011].

I.2.2.5 Ardisia crispa Connue chez les communautés malaises sous le nom « hen’s eyes », elle est utilisée sous forme de décoction bouillie des racines pour traiter les maux auriculaires, la toux, la fièvre, la diarrhée, les douleurs de gorge et thoracique, la dysménorrhée chez les femmes et pour « laver le sang sale ». Une étude a démontré l’activité antiinflammatoire des extraits éthanolique et héxanique des racines dans un modèle d’angiogenèse induite par inflammation [Hamsin et al. 2013].

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I.2.2.6 Ardisia elliptica Cette plante est utilisée dans la péninsule malaise pour soulager les douleurs thoraciques, le traitement des complications dues à l’accouchement, la fièvre et la diarrhée. A partir de l’extrait hydroéthanolique, la β-amyrine 47 a été mise en évidence et a révélé une activité inhibitrice de l’agrégation plaquettaire, induite par collagène, plus importante que celle de l’aspirine [Ching 2010].

I.2.3 Le genre Myrsine I.2.3.1 Myrsine africana En Afrique, on trouve encore plusieurs communautés rurales qui vivent isolées et qui ont développé leur propres traitement à partir des plantes qui les entourent. Parmi ces plantes, on retrouve Myrsine africana qui est largement distribuée en Afrique orientale et centrale mais aussi en Himalaya et en Chine. Cette plante est utilisée dans le district Loitoktok, au Kenya, pour le traitement de la constipation, la gonorrhée et comme anthelminthique [Gathuma et al. 2004, Muthee 2011]. Elle est aussi utilisée en médecine traditionnelle chinoise contre le rhumatisme, la tuberculose pulmonaire, les douleurs dentaires et pour soulager les hémorragies [Azam et al. 2011].

I.2.3.2 Myrsine seguinii M. seguinii, que l’on retrouve dans les zones tempérées et subtropicales, est utilisée au Myanmar, en Birmanie, pour traiter les maladies infectieuses et inflammatoires [Yang 2014].

I.3 Composition chimique des Myrsinoideae Au vu de leurs utilisations en médecines traditionnelles, plusieurs équipes de recherche se sont intéressées aux plantes de cette famille à la recherche de molécules actives biologiquement. Nous allons voir les différentes familles de métabolites secondaires qui ont pu être isolés à partir des Myrsinoidae.

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I.3.1 Les terpènes

I.3.1.1 Les saponines Cette famille s’est révélée très riche en saponines ; en effet, cinq groupes de saponines triterpéniques ont été isolées et identifiées pour la première fois à partir des plantes de la sous- famille des Myrsinoidae.

I.3.1.1.1 Les ardisicrénosides : Ces saponines ont été isolées à partir du genre Ardisia qui est le plus important de cette sous-famille, regroupant environ 500 espèces réparties dans les régions tropicales à subtropicales [Kobayashi and de Mejia 2005]. Quatorze ardisicrénosides, notés de A à N, ont été isolées à partir des racines d’Ardisia crenata [Jia et al. 1994a, Jia et al. 1994b, Jia 1994c, Zheng et al. 2008, Liu 2011a, Liu 2011b]. L’ardisicrénoside A 48 a aussi été trouvée dans A. punctata [Ma et al. 2012] et A. japonica [Chang et al. 2007] ; l’ardisicrénoside B 49 a été identifié à partir d’autres genres : Labisia pumilla (dans les racines, les tiges et les feuilles) [Avula 2011] et Lysimachia (dans les parties souterraines de plusieurs espèces) [Podolak 2013a].

I.3.1.1.2 Les ardisipullosides : Ce sont des saponines triterpéniques isolées pour la première fois à partir de la plante entière d’A. pusilla, on en trouve cinq : Ardisipulloside I à V [Zhang 1993, Wang 1996, Miao 2000, Wang 2000, Tang 2009, Tian 2009]. L’ardisipulloside I 50 est considéré comme possédant un potentiel anticancéreux car il a démontré une activité inhibitrice du facteur de croissance endothélial (VGEPR), induisant l’apoptose cellulaire [Zhang 2010].

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I.3.1.1.3 Les ardisiacrispines : Représentées par deux monodesmosides (avec quatre sucres en C-3 de la génine), les ardisiacrispines A et B. L’ardisiacrispine A 33 a été identifiée dans A. pusilla (plante entière) [Tian 2009], dans six espèces du genre Lysimachia [Podolak 2013a] et dans différentes parties (racines, feuilles et tiges) de Labisia pumila dont c’est le composé majoritaire [Avula 2011]. L’ardisiacrispine B 51 a été retrouvée dans les plantes entières d’A. punctata [Ma et al. 2012] et A. pusilla [Tang et al. 2009] et dans les racines d’A. crenata [Liu 2011a].

I.3.1.1.4 Les ardisimamillosides : Au nombre de huit : Ardisimamillosides A à H, ce sont des monodesmosides, avec trois ou quatre sucres sur le C-3 de la génine de type oléanane, isolées à partir des racines d’A. mamillata [Huang et al. 2000a, Huang et al. 2000b, Huang et al. 2003]. Certaines de ces saponines, ardisimamilloside C 52, F 53 et H 54, ont aussi été isolées à partir d’A. japonica (plante entière) [Chang et al. 2007].

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I.3.1.1.5 Les ardisianosides : Ce sont onze monodesmosides (A à K) avec un pont 13β-28 epoxy (ardisianosides A- G) ou 13β-28 carboxylate (ardisianosides H-J) isolées d’A. japonica (plante entière). La partie glycosidique peut contenir jusqu’à sept sucres (ardisianosides A 55 et H 56). Certaines de ces saponines ont démontré une activité puissante (de 0,92 à 4,46 mM) antiproliférative contre les cellules Bel-7402 du cancer du foie [Li et al. 2012].

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D’autres saponines dotées d’un pont 13β-28 epoxy ont été isolées des plantes de la sous famille des Myrsinoidae comme l’angallisine C 57, l’angallosaponine IV 58, le lysikokianoside 1 59 et la cyclaminorine 60 dans les parties souterraines de six espèces de genre Lysimachia [Podolak 2013a]. La cyclaminorine a aussi été retrouvée dans A. crenata avec une autre saponine à pont 13β-28 oxo : la primulanine [Zheng et al. 2008] que l’on retrouve aussi dans A. japonica en plus de la cyclamine [Chang et al. 2007]. Bien d’autres saponines triterpéniques ont été identifiées et découvertes chez les Myrsinoidae mais nous avons choisi de ne citer que les plus importantes.

I.3.1.2 Les terpénoïdes

Le bauerenol 61 a été isolé de l’extrait méthanolique de la plante entière d’Ardisia japonica [Dat 2007] ; de l’extrait dicholorométhane des feuilles d’A. elliptica en plus de l’α- et la β-amyrine 47 [Raga 2014] ; dans les écorces et les feuilles de Tapeinosperma pseudojambosa [Baigent 1978 ] et d’A. maculosa [Zheng and Wu 2007]. La friedeline 62, l’épi-friedeline 63 et le bauerenylacétate 64 ont été identifiés dans la plante entière d’A. japonica [Dat 2007]. Des feuilles d’Embelia ribes ont été purifiés le taraxérol 65, l’acide ursolique 25 et le lupeylacétate 66 [Dang et al. 2015]. L’embelinone 67 a été isolée à partir de l’extrait hydroéthanolique de la plante entière d’Aegiceras corniculatum [Wang 2014]. Pour finir, le lupéol 68 a pu être isolé à partir de l’extrait méthanolique des feuilles et des tiges d’A. kivuensis [Ndonsta 2011].

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I.3.1.3 Les phytostérols

Le stigmastérol, le β-sitostérol 69 et l’α-spinastérol 70 ont été isolés à partir de l’extrait hydroéthanolique d’Aegicera corniculatum [Wang 2014] et dans les racines d’Ardisia cornudentata [Chang et al. 2011]. Le β-sitostérol a aussi été purifié à partir de l’extrait méthanolique des feuilles et des tiges d’Ardisia kivuensis [Ndonsta 2011]. On retrouve aussi le fucostérol 71 dans Aegiceras corniculatum [Wang 2014].

I.3.2 Les flavonoïdes La quercétine 72 a été identifiée dans plusieurs plantes de la sous-famille des Myrsinoidae : dans les feuilles d’Embelia ribes [Dang et al. 2015], dans les écorces et les feuilles de Tapeinosperma pseudojambosa [Baigent 1978 ], dans les fruits d’Ardisia colorata [Sumino et al. 2002] et dans la plante entière d’Ardisia japonica [Dat 2007].

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A partir des feuilles d’E. ribes ont été isolés d’autres flavonoïdes qui sont le kaempférol 38, la quercitrine, l’afzéline 73, la taxifoline 74 et l’épicatéchine 75 [Dang et al.

2015]. Le kaempférol (R1 = R2 = R3 = H) a aussi été trouvé dans les fruits d’A. colorata en plus de la myricétine 76 et la quercétine-3-O-β-D-glucopyranoside 77 [Sumino et al. 2002].

I.3.3 Les dérivés benzoquinoïques Dans le genre Ardisia, A. kivuensis (extrait méthanolique des feuilles et des tiges) et A. teysmaniana (extrait chloroforme des feuilles), une série d’alkylbenzoquinones a été découverte et nommée : Ardisiaquinones A-P [Yang et al. 2001, Ndonsta 2011, Ndontsa 2012]. Les ardisiaquinones J 76 et K 77 ont démontré une activité antiproliférative intéressante contre les lignées cellulaires cancéreuses Ishikawa (adénocarcinome de l'endomètre), HeLa (adénocarcinome du col de l'utérus), MCF7 (adénocarcinome du sein) et

A431 (carcinome épidermoïde de la peau) avec des IC50 comprises entre 6,64 et 15,4 µM [Ndonsta 2011]. Dans ce genre, on a aussi pu isoler des benzoquinones comme : l’ardisianone 78, à partir d’A. quinquegona [Kusumi 1978 ] et des racines d’A cornudentata avec la cornudentanone 79 [Tian et al. 1987] ; la rapanone 80 à partir des racines d’A. colorata dans lesquelles elle est majoritaire à 1% [Kanchanapee 1967]. A partir de l’extrait hydroéthanolique (95%) de la plante entière d’Aegiceras corniculatum a été isolé le 5-O- méthyl embeline 81 [Wang 2014]. Le 5-O-méthyl rapanone 82 a été identifié, quant à lui, dans les tiges d’Embelia ribes [Dang et al. 2014]; la rapanone et l’embéline 46 ont été isolées à partir de l’extrait éther de pétrole des graines de Rapanea laetevirens [Madrigal 1977].

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Pour finir, deux dérivés quinoïques ont été identifiés dans les branches de Parathesis amplifolia et nommés Parathesiquinones A 83 et B 84 [Solis 2006].

I.3.4 Les acides benzoïques Les acides myrsinoïques A 85 et B 86 ont été isolés à partir de l’écorce des tiges de Rapanea ferruginea [Zermiani 2015] et ont démontré des activités antiinflammatoire [Hirota et al. 2002], anticholinestérasique [Gazoni 2009] et antimicrobienne [Bella-Cruz et al. 2013].

I.3.5 Lactones et dérivés L’étude phytochimique des branches de Parathesis amplifolia a mis en évidence la présence de trois dérivés lactones nommés : Parathésilactones A-C 87-89 [Solis 2006]. L’ardimérine 90 et un dimère lactone nommé ardimérine digallate 91 ont été isolés à partir de la plante entière d’Ardisia japonica. Ce dimère a démontré une activité inhibitrice de la

RNase des VIH-1 et 2 in vitro avec des IC50 comprises entre 1,1 et 1,5 pM [Dat 2007].

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I.3.6 Lignanes et dérivés Deux lignanes : (+)-syringarésinol-β-D-glucoside 92 et le (+)-syringarésinol 93 ont été isolés des feuilles d’Embelia ribes avec d’autres composés (flavonoïdes et triterpènes) qui ont tous démontré une activité inhibitrice de l’α-glucosidase avec des IC50 entre 1,3 et 155,0 µM plus efficaces que l’acarbose (214,5µM) [Dang et al. 2015]. A partir des tiges de cette même plante, deux néolignanes ont été isolées dont l’eupomatenoïd-8 94 qui inhibe aussi l’α- glucosidase (IC50 = 222,6 µM) [Dang et al. 2014].

I.3.7 Les alcaloïdes A partir de cette sous-famille, un seul alcaloïde de type C-glycoside alcaloïde : 1-(2′- deoxy-α-D-ribopyranosyl)-β-carboline 95 a été isolé à partir des feuilles de d’Embelia ribes [Dang et al. 2015].

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I.3.8 Les dérivés phénoliques Plusieurs espèces du genre Ardisia ont révélé la présence de dérivés phénoliques à partir de différentes parties. Les racines d’A. cornudentata ont été étudiées et ont révélées la présence de trois alkylphénols dont le cornudoside 96 [Chang et al. 2011] ; un fractionnement bioguidé des racines et des tiges d’A. virens a permis d’identifier 19 alkyls phénoliques comme les virenols A-C 97-99 et l’ardisianol 100 qui a démontré une propriété cytotoxique in vitro (IC50 < 64 µg/ml) contre les lignées cellulaires MCF-7 (cancer du sein), NCI-H460 (cancer du poumon) et SF-268 (cancer du système nerveux central) [Chang et al. 2009], ce dernier a aussi été isolé à partir d’A. quinquegona [Kusumi 1978 ]. Dans les fruits d’A. colorata, ont été isolés quatre alkylphénols qui sont les ardisiaphénols A-C 101-103 et l’embeline 46 avec trois acides phénoliques : démethoxybergénine 104, norbergénine 105 et la bergénine 106 [Sumino et al. 2002]. Cinq diaryl-undecanones : les ardisinones A-E 107- 111 ont été isolés à partir de l’extrait hydroéthanolique (95%) de la plante entière d’A. arborescens [Zheng 2004].

Pour les autres genres, une étude phytochimique portant sur l’extrait hydroéthanolique (95%) de la plante entière d’Aegiceras corniculatum a permis la mise en évidence de la

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présence de trois acides phénoliques qui sont l’acide syringique 112, l’acide protocatéchique 113 et l’acide vanillique 114 [Wang 2014]. A partir des tiges d’Embelia ribes ont été identifié deux phénylpropanes dont la myristicine 115 [Dang et al. 2015].

I.3.9 Les dérivés résorcinols

Treize alkylrésorcinols dont les kusukuenols A1/A2 116/117, B1/B2 118/118 et C1/C2 120/121 ont été isolés des racines d’A. cornudentata [Chang et al. 2011]. D’autres alkylrésorcinols sont présents dans les graines de Rapanea laetevirens [Madrigal 1977]. Les oncotemonols 1-8 isolés par fractionnement bioguidé sur l’extrait méthanol/chloroforme des feuilles d’Oncostemon bojerianumont ont démontré une cytotoxicité contre la lignée cellulaire

A2780 (cancer ovarien) avec des IC50 de 9 à 11 µg/ml [Chaturvedula et al. 2002]. Différents alkylrésorcinols ont été isolés à partir des feuilles de Styglone turbacensis [Jimenez-Romero et al. 2007], des branches de Parathesis amplifolia [Solis 2006], des graines de Rapanea laetevirens [Madrigal 1977] et des tiges d’Embelia ribes dont l’embeliphénol A 122 [Dang et al. 2014].

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II. Plantes étudiées

II.1 Le genre Myrsine II.1.1 Taxonomie La classification des Myrsine a été établie en 1981 par Arthur John Cronquist, botaniste nord-américain, comme suit : Règne Plantae Sous-règne Tracheobionta Division Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Sous-classe Dilleniidae Ordre Primulales Famille Myrsinaceae

Selon la classification phylogénétique APGIII [Stevens 2012] , ce genre est maintenant classé comme suit : Règne Plantae Sous-règne Tracheobionta Clade Angiospermes Clade Dicotyledones vraies Clade Astéridées Ordre Ericales Famille Primulaceae Sous-famille Myrsinoideae

II.1.2 Description générale Ce genre rassemble environ 134 espèces qui poussent dans toutes les régions tropicales. Ce sont des arbrisseaux ou de simples arbustes à feuilles alternes et coriaces, concentrées au sommet des axes ou échelonnées le long des rameaux. Les fleurs sont petites ou très petites, généralement unisexuées, groupées en inflorescence que l’on retrouve parfois sous forme d’ombelle. Le calice est monosépale à quatre ou cinq divisions profondes ; la corolle, monopétale régulière, a quatre ou cinq lobes dressés. Les étamines sont placées à la base et opposées aux pétales (en face de chaque lobe de la corolle). Les anthères sont

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cordiformes et presque sessiles. L’ovaire est libre, ovoïde à une seule loge, contenant quatre ou cinq ovules attachés à un gros trophosperme central remplissant toute la cavité de l’ovaire. Le fruit est une drupe globuleuse ou subovoïde avec un exocarpe peu charnu et croustillant et renferme une seule graine [Audouin 1827, De Candolle 1841]. II.1.3 Composition chimique et activités biologiques du genre Myrsine Plusieurs plantes de ce genre ont fait l’objet d’études phytochimiques et ont révélé la présence de différentes familles de composés chimiques : flavonoïdes, composés phénoliques, terpènes,… souvent responsables d’activités biologiques.

II.1.3.1 Les flavonoïdes L’étude phytochimique des tiges de M. africana a permis de mettre en évidence la présence de dix flavonoïdes dont la quercitrine 36, la mearnsetine 123, la myricitrine 124, l’épicatéchine 75, le (-)-épigallocatéchine 125, le (-) épi-gallocatéchine-3-O-gallate 126 et le mearnsetin-3-(2",4"-diacetylrhamnoside) 127 qui a été testé pour son activité antioxydante par piégeage de radicaux libres (DPPH) et a montré une IC50 intéressante de 14,5 µM [Yanping et al. 2009]. Deux autres flavonoïdes ont été isolés à partir de cette plante et qui sont nommé Myrsininone A 128 et B 129 ; ces deux composés ont montrés une forte activité contre les bactéries anaérobiques comparé au Triclosan® qui est très utilisé dans les produits cosmétiques [Kang et al. 2007]. Une autre Myrsine, M. senguinii, a révélé la présence de plusieurs flavonoïdes dans ses feuilles dont la quercitrine 36, la myricitrine 124 et leurs dérivés glycosylés [Zhong et al. 1997].

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II.1.3.2 Les acides benzoïques prénylés A partir des parties aériennes de M. senguinii, on a pu mettre en évidence la présence de plusieurs acides benzoïques comme l’acide myrsinoïque E 130 [Makabe et al. 2003] et l’acide myrsinoïque B 86 qui a montré une bonne activité inhibitrice de la méthioninase [Ito et al. 2008]. On a aussi pu en isoler l’acide 3-geranyl-4-hydroxy-5-(3’-methyl-2’-butenyl) 131 benzoïque et quatre dérivés de ce dernier qui ont démontré une activité anti-inflammatoire en inhibant l’ADN polymérase [Dong et al. 1999, Mizushina et al. 2000]. On retrouve les acides myrsinoïques A 85 et B 86 dans les fruits de M. coriacea avec un autre acide benzoïque prénylé comme le Myrsicorianol 132 [Amaro-Luis et al. 2008].

II.1.3.3 Les benzo- et hydroquinones : Trois benzoquinones ont été isolées à partir des fruits de M. coriacea et qui sont : l’embeline 46, la rapanone 80 et l’homorapanone 133 [Amaro-Luis et al. 2008]. Des fruits de M. africana des dérivés benzoquinones ont été isolés telles que la méthylvilangine 134 et la méthylanhydrovilangine 135 [Arot Manguro et al. 2003] avec deux autres benzoquinones majoritaires : la myrsinone 136 (0.2 %) et la 5-O-méthylembéline 81 (0.1%) [Midiwo 1992].

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L’étude phytochimique de M. senguinii a révélé la présence de plusieurs hydroquinones dans l’extrait des feuilles comme l’arbutine 137, le tachioside 138, l’isotachioside 139 et les seguinoside A 140 et B 141 en plus de plusieurs dérivés des esters d’acides tiglique, furoïque et méthiafolique nommés seguinosides C à K [Zhong et al. 1998, Zhong et al. 1999].

II.1.3.4 Les phénols Deux phénols nommés myrsinosides A 142 et B 143 ont été purifiés à partir de l’extrait hydroéthanolique de M. africana [Yan-Ping et al. 2008].

II.1.3.5 Les lignanes A partir de la fraction butanolique des tiges de M. africana trois glycosides de lignane qui sont l’isolarisirésinol-9’-O-β-D-xylopyranoside 144, l’isolarisirésinol-9’-O-β-D- glucopyranoside 145 et le lyoniresinol-9’-O-β-D-glucopyranoside 146 ont été isolés [Yan- Ping et al. 2008].

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II.1.3.6 Les terpènes II.1.3.6.1 Les Monoterpènes Un glucoside monoterpénique a été isolé pour la première fois à partir des fruits de M. senguinii et a été nommé myrseguinoside A 147 [Matsunami et al. 2011].

II.1.3.6.2 Les norisoprénoïdes A partir des feuilles de M. senguinii ont été isolé huit glycosides megastigmanes ; trois étaient connus (ampelopsisionoside 148, alangionoside J 149 et linarionoside A 150) et les cinq autres étaient nouvellement découverts et nommés Myrsinionosides A à E 151-155 [Otsuka et al. 2001].

II.1.3.6.3 Les triterpènes Un fractionnement bioguidé, mesurant l’activité anti-spasmodique, de l’extrait éthanolique des feuilles de M. africana, a mené à la purification d’un nouveau triterpène stéroïdique nommé Myrsigénine 157 [Azam et al. 2011]. Un autre a été découvert dans les parties aériennes de cette même plante : le Myrsinène 158 [B. et al. 2011].

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II.1.3.6.4 Les saponines Le genre Myrsine s’est avéré riche en saponines. Dans M. senguinii, les Myrseguenosides D 159 et E 160 ont été isolés en plus de l’ardisiacrispine B 51 et l’ardisicrénoside A 48 [Matsunami et al. 2011]. Dans M. australis, les ardisiacrispines A 33 et B et six saponines de type oléanane ont été isolées [Bloor and Qi 1994]. D’autres Myrsines ont révélé la présence de saponines triterpéniques comme M. africana [Yan-Ping et al. 2008] et M. pellucida dont les écorces des tiges ont donné, en plus des deux ardisiacrispines, la primulanine 161 et d’autres saponines triterpéniques [Lavaud et al. 1994].

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II.2 Myrsine congesta C’est un arbre de 1 à 1,5 m de haut, il possède des branches terminales de 2 mm de diamètre, pileuses et roussissantes. Les feuilles sont coriaces, velues, lisses, ovales à elliptiques, de 1,5 à 2 cm de long, 1 cm de large, le pétiole est pileux d’1 mm de long. Leurs inflorescences sont courtes, 1 mm de long, avec des bractéoles de 1 à 1,5 mm de long, les cavités sécrétoires sont triangulaires à ovoïdes avec de long trichomes. Les fleurs sont pentamères de 3,5 à 4 mm de long, avec des pédicelles de 0,5 à 1 mm de long ; les sépales font 1 à 2 mm, sont ovales avec des trichomes longs et denses et des cavités sécrétoires globulaires ; les pétales font 2,5 à 3 mm de long et 1 mm de large, globulaires et elliptiques. Les fruits sont globuleux, 3 à 4 mm de long, 2 à 3 mm de large, le péricarpe du fruit vert immature possède des petites cavités sécrétoires visibles (Figure 14) [Freitas and Kinoshita 2015].

Figure 14: Myrsine congesta [Freitas and Kinoshita 2015] A : Branches portant les fruits, B : Fleur avec étamines, C : Fleur avec pistil, D : Fruit

II.3 Myrsine latifolia Présent au Pérou (Madre de Dios), en Bolivie (départements de La Paz, Cochabamba et Santa Cruz), en Colombie (Antioquia) et en Equateur (Morona-Santiago), c’est un arbre d’environ 7 m de haut vivant à des altitudes comprises entre 200 à 250 m. Il pousse sur des sols boueux et marécageux, toujours sombres, profonds, acides, généralement saturés avec un débit d’eau minimal [Janovec 2008]. 67

Cet arbre est caractérisé par des fruits cauliflore ; les feuilles sont regroupées en cluster sur les branches et sont dotées de ponctuations linéaires ; l’écorce interne et d’une couleur rosâtre.

Figure 15: Myrsine latifolia [J. E. Householder 256] A : Branche portant les feuilles, B : Feuilles, C : Branche portant les fruits

II.4 Myrsine sessiliflora C’est un arbuste glabre de 2 à 3 m de hauteur, ces rameaux sont cylindriques et squarreux ; les feuilles sont elliptiques, rigides et aigues à la base ; les inflorescences sont disposées en rameaux d’environ cinq fleurs capitulées, pentamères, sessiles à la floraison, de couleur verdâtre ; l’ovaire est globuleux et les fruits font 3 mm de largeur [M.N.H 1909].

Figure 16: Myrsine sessiliflora (branches avec les inflorescences et les feuilles)

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Pour cette plante ainsi que pour les deux autres myrsines étudiées (M. congesta et M. latifolia) il n’existe aucune étude phytochimique répertoriée et sont très peu décrites.

III. Travaux réalisés et résultats

III.1 Myrsine latifolia III.1.1 Extraction et purification des tiges et feuilles Nous avons travaillé à partir des tiges broyées et séchées de M. latifolia mais aussi à partir d’une fraction butanolique issue des feuilles de M. latifolia. La fraction butanolique (notée MLFB) provient d’une extraction liquide-liquide réalisée sur un extrait éthanolique des feuilles, réalisé par l’équipe du Laboratoire de Recherche et de développement de la Faculté des Sciences à Lima (Pérou). A partir des tiges broyées, une macération hydrométhanolique a été réalisée et l’extrait brut obtenu a été fractionné, après évaporation du méthanol, en réalisant une extraction liquide-liquide avec de l’acétate d’éthyle puis du butanol. Ainsi, trois fractions sont obtenues pour les tiges : acétate d’éthyle, butanolique et aqueuse (Figure 19). Les profils des analyses chromatographiques sur couche mince (CCM) montrent clairement une grande proportion de tanins dans ces fractions caractérisés par des trainées marron. Dans la fraction butanolique (notée MLTB) on constate une tache de couleur bleutée après révélation qui nous fait penser à des triterpènes. Plusieurs essais ont été menés pour purifier cette fraction. Tout d’abord nous avons testé un fractionnement sur résine Sephadex LH-20 non concluant car les tanins étaient toujours en mélange avec le reste des composés (Figure 106 en partie expérimentale). Les dernières fractions, éluées au méthanol, ont été passées sur silice greffée C-18 et cette fois encore, les résultats obtenus restent insatisfaisant quant à la séparation des tanins des autres composés. Notre laboratoire disposant de systèmes de purification liquide-liquide, un extracteur de partage centrifuge (EPC) et une chromatographie de partage centrifuge (CPC), nous avons testé ces deux méthodes sur la fraction butanolique des tiges. En premier lieu, nous avons réalisé une CPC en utilisant un mélange biphasique constitué avec les systèmes ternaires AcOEt/BuOH/H2O 4/1/5 à 1/4/5, nous donnant onze fractions. Deux de ces fractions (S-9 et S-10) semblent contenir un produit majoritaire mais avec un peu de tanins condensés polaires (Figure 17). L’analyse RMN de ces dernières nous a permis d’identifier le composé ML01.

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ML01

Figure 17: Plaque CCM des fractions obtenues par CPC biphasique

CCM-SiOH, CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

En deuxième lieu, nous avons testé une EPC éluée avec un mélange triphasique préparé avec un système quaternaire n-heptane/MTBE/ACN//H2O 1/1/1/1 en éluant d’abord avec la phase supérieure (Upper phase) puis avec la phase du milieu (Middle phase). Ce système avait bien fonctionné pour séparer les tanins d’Anogeissus leiocarpus [Hamzaoui et al. 2013] mais dans notre cas les tanins trainent tout au long de l’élution. Par contre, nous avons aussi testé en parallèle ce même système triphasique en EPC sur la fraction MLFB (feuilles), ce qui nous a donné dix fractions MLFBF1 à MLFBF10. Cette fois, le fractionnement c’est mieux déroulé et la fraction MLFB-F3a été purifiée par chromatographie flash sur silice greffée C-18 donnant les composés ML02 et ML03 (Figure 18). D’un autre côté, une autre partie de la fraction MLFB a été soumise à une chromatographie liquide sous vide (CLV) à polarités de phases inversées avec une élution de polarité décroissante de MeOH/H2O 2/8 à 100% MeOH nous donnant cinq fractions MLFBV1 à MLFBV5. La fraction MLFBV2 a été purifiée par une chromatographie flash à polarités de phases inversées donnant six fractions MLFBV2-a à MLFBV2-f. Une purification par CLHP semi-préparative de la fraction MLFBV2-e nous a permis d’isoler les composés ML03 et ML04. La purification par CLHP semi-préparative de la fraction MLFBV5 donna accès au composé ML05. Un schéma global des fractionnements réalisés à partir des tiges de M. latifolia est résumé dans la Figure 18.

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Figure 18: Schéma d’extraction et de purification des feuilles de M. latifolia

Les différentes étapes réalisées jusque-là sur les fractions de M. latifolia nous posent toujours un problème qui est la présence permanente des tanins dans les différentes fractions. Nous avons donc essayé de trouver un autre protocole qui nous permettrait de soustraire les tanins de nos fractions et ainsi nous faciliter le travail de fractionnement. Un protocole de précipitation des tanins a retenu notre attention ; il s’agit de solubiliser notre échantillon dans un volume minimum de MeOH et ensuite de précipiter les tanins dans du CHCl3, le volume du MeOH ne devant pas excéder 20% du volume total. Ce protocole a été appliqué sur les fractions solubles AcOEt et H2O. Le filtrat de la fraction AcOEt (notée MLTA), obtenu après précipitation des tanins, a été fractionné par CLV sur silice greffée C-18 pour donner huit fractions (MLTA-1 à 8). La fraction MLTA-4 a été purifiée par chromatographie flash en phase normale pour donner les composés ML04 et ML06. Finalement, le filtrat obtenu après précipitation des tanins de la fraction aqueuse a été fractionné par chromatographie flash en phase normale donnant deux fractions dont la première qui, après une chromatographie semi-préparative en phase inverse, a donné le composé ML01. Lors de la préparation du dépôt de cette chromatographie flash, dans un 71

mélange MeOH/CHCl3, un précipité blanc est apparu. Une filtration a été réalisée avant l’injection en chromatographie flash. Ce précipité a été par la suite analysé en RMN et nous a donné le composé ML07. Un schéma global des fractionnements réalisés à partir des tiges de M. latifolia est résumé dans la Figure 19.

Figure 19: Schéma d’extraction et de purification des tiges de M. latifolia

III.1.2 Elucidation structurale La détermination des structures des composés purifiés a été réalisée par étude des spectres de RMN mononucléaires et héteronucléaires, monodimensionnels (1H et 13C) et bidimensionnels (COSY, HSQC, HMBC, TOCSY et NOESY). Une analyse en spectroscopie de masse HRSM est aussi réalisée pour confirmer la structure en apportant des données supplémentaires (masse molaire et formule brute). III.1.2.1 Elucidation structurale du composé ML01 Le spectre de masse HR-ESI-SM effectué en mode positif nous révèle deux ions pseudo-moléculaires [M+Na]+ à m/z 605,2210 et [M+H]+ à m/z 583,2391 correspondants à la formule brute C28H38O13.

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III.1.2.1.1 Analyse du spectre de RMN 1H Sur le spectre de RMN 1H (Figure 20) obtenu dans du méthanol deutéré les signaux suivants sont observés : . Deux signaux résonnants sous la forme de singulets dans la zone des protons aromatiques. Le premier à 6,58 ppm intègre pour un proton et le deuxième à 6,43 intègre pour deux protons. . Deux doublets à 4,42 ppm (J=6,3 Hz) et 4,28 ppm (J=7,8 Hz). . Dans la zone des protons reliés à des carbones portant des hydroxyles (entre 3,2 et 4,0 ppm), nous observons un massif de plusieurs protons. Parmi ce massif, les signaux de trois singulets intégrants pour 3 protons à 3,34 ppm et 3,85 ppm et 6 protons à 3,75 ppm (deux groupements superposés) indiquent 4 méthoxy. . Deux protons résonnant entre 2,60 et 2,74 ppm. . Deux signaux multiplets à 2,08 ppm et 1,70 ppm.

Figure 20: Spectre de RMN 1H du composé ML01 (MeOD, 500 MHz)

III.1.2.1.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC En prenant en considération les signaux observés sur le spectre de RMN 1H et les spectres de RMN 13C (Figure 21) et HSQC, nous distinguons les signaux caractéristiques suivants (Tableau 4) :

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. Douze carbones aromatiques, suggérant deux noyaux aromatiques dans cette structure. Seuls trois de ces carbones portent des protons dont deux se superposent en RMN 13C et 1H caractéristique d’une symétrie dans un noyau. . Un carbone anomérique résonnant à 103,4 ppm, dont le proton anomérique est attribué à 4,28 ppm sur le spectre HSQC. Sept carbones hydroxylés (60-78 ppm) ; quatre portent un seul proton et trois portent deux protons (δc 61,4, 64,8 et 70,0 ppm). . Quatre groupements méthoxy à δc 58,7 ; 55,5 (2C) et 55,2. . Quatre carbones aliphatiques, un méthylène à δc 32,4 et trois méthynes à δc 39,2, 41,4 et 45,3.

Figure 21: Spectre de RMN 13C du composé ML01 (MeOD, 125 MHz)

Le signal large (2,60-2,74 ppm) observé sur le spectre de RMN 1H correspond à deux protons géminés car ils couplent sur le spectre HSQC avec un carbone à 32,4 ppm. Ce signal peut être divisé en un doublet dédoublé (2,62 ppm, J= 15,2-11,0 Hz) et un triplet dédoublé (2,70 ppm ; J=15,2-4.9 Hz). III.1.2.1.3 Analyse du spectre COSY A partir du proton anomérique à 4,28 ppm, des corrélations successives sont observées sur le spectre COSY ce qui nous permet d’attribuer les systèmes de spins des protons de l’unité osidique (Tableau 4). La mesure des constantes de couplages sur le spectre de RMN 1H indique une position trans-diaxiale des protons H-1’’, H-2’’, H-3’’, H-4’’ et H-5’’ (J>7,8

Hz), caractéristique d’un β-D-glucopyranose. Les déplacements chimiques des carbones,

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attribués par analyse du spectre HSQC, sont en accord également avec un β-D-glucopyranose [Bock and Pedersen 1983 ].

En partant du signal du second proton déblindé résonnant sous forme de doublet à 4,42 ppm (H-4), deux corrélations sont observées, l’une avec un multiplet intégrant pour un proton à 2,08 ppm (H-3) et l’autre avec le signal singulet correspondant à deux protons aromatiques superposés à 6,43 ppm. Ceci nous signifie que le H-4 est porté par un carbone substitué par un noyau aromatique d’un côté. Le proton H-3 présente trois autres corrélations avec : le multiplet à 1,70 ppm (H-2) et les protons géminés hydroxylés Hα-3a (3,89, dd, J=10,0-5,6 Hz) et Hβ-3a (3,45, dd, J=10,0- 4,1Hz). Le proton H-2, couple avec les deux protons géminés Hα-1 et Hβ-1 (2,62-2,71 ppm) et les deux protons géminés hydroxylés Hα-2a (3,62, dd, J=11,3-5,1 Hz) et Hβ-2a (3,55, dd, J=11,3-6,7 Hz). 4 La seule autre corrélation en JH-H qui reste pour les protons géminés H-1 se fait avec le proton aromatique (H-8) qui ne corrèle pas avec les deux précédents et concerne le deuxième noyau aromatique. Ces observations nous ont permis de construire le fragment représenté dans la figure 22. Ce fragment suggère que nous sommes en présence d’un lignane constitué par la fusion entre deux molécules en C6-C3.

Figure 22: Corrélations COSY du fragment constitué de ML01

Les déplacements chimiques 1H et 13C, attribués par analyse du spectre HSQC, de ce fragment sont reportés dans le tableau 4. Les constantes de couplages et les valeurs des déplacements chimiques sont en accord avec une position trans-diaxiale des protons H-2, H-3 et H-4.

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III.1.2.1.4 Analyse du spectre HMBC

Nous avons précédemment détecté la présence de 2 noyaux en C6-C3, d’un glucose et de 4 groupements méthoxy. Ces informations nous dirigent vers une structure de type lignane monoglycosylé. L’analyse des corrélations observées sur le spectre HMBC vont nous permettre d’identifier les carbones appartenant à chaque noyau aromatique et la structure de l’aglycone ainsi que le point de fixation du glucose. Le signal des deux protons superposés H-2’ et H-6’ à 6,43 ppm corrèle avec cinq carbones dont le C-4 déjà identifié. Les autres sont quaternaires à δc 147,6 (2 carbones hydroxylés qui se superposent), 137,9 et 133,0 ce qui nous permet de constituer le premier 2 groupement aromatique. Le signal à 137,9 est attribué à C-1’ car il corrèle en JH-C avec le H- 4 et les deux protons aromatiques H-2’ et H-6’ qui se positionnent de part et d’autre de ce 3 dernier. Les protons H-2’ et H-6’ corrèlent également en JH-C avec le carbone à 133,0, attribué au C-4’. Le signal à 147,7 (2 carbones) corrèle avec les deux groupements méthoxy superposés à 3,75 ppm. Ce sont les C-3’ et C-5’ portants une substitution méthoxy en meta du noyau aromatique ce qui explique la symétrie observée. En plus de corréler avec les carbones déjà attribués, le proton H-4 couple avec trois autres carbones à 125,0, 128,8 et 146,2 ppm. Ces derniers font partie du deuxième noyau aromatique. Le signal à 125,0, en plus de corréler avec le H-4, couple avec le proton H-3, il est donc relié directement au C-4 et on l’attribue à C-10. Les protons géminés H-1 corrèlent avec les carbones déjà attribués C-2, C-3, C-2a, C-8 et C-10 mais aussi avec le carbone à 128,7 ppm qui serait le C-9. Ce dernier corrèle avec les protons H-8 et H-4 de qui confirme sa 4 position. On remarque une faible corrélation en JH-C entre les protons géminés H-1 et les carbones hydroxylés non attribués à δc 146,2 et 147,2. Celui à 146,2 ppm étant corrélé avec le proton H-4 est attribué au carbone C-5 et le second à 147,2 au carbone C-7. Le proton H-8 corrèle avec les carbones C-10, C-9, C-7 et un carbone hydroxylé non identifié à δc 137,5, attribué au carbone C-6 restant. Les protons des groupements méthoxy à 3,85 ppm et 3,34 ppm corrèlent respectivement avec les carbones C-7 et C-5, ce qui place les deux méthoxy en meta sur le second noyau aromatique. Les corrélations observées en HMBC nous ont permis de confirmer la structure du glucose et de définir son point de fixation sur le C-3a du lignane par la présence d’une tache de corrélation observée entre ce carbone à 70,0 ppm et le proton anomérique H-1’’. L’ensemble de ces données nous a permis d’établir la structure du composé ML01 comme étant le 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol (Figure 23). La comparaison de nos

76

données expérimentales avec des données de la littérature [Szakiel et al. 2011] a confirmé nos conclusions.

Tableau 4: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) du composé ML01 (DMSO)

N° δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) Hα : 2,71 td, J=15,2 ; 4,9 1 32,4 Hβ : 2,62 dd, J=15,2 ; 11,0 2 39,2 1,70 m Hα : 3,62 dd, J=11,3 ; 5,1 2a 64,8 Hβ : 3,55 dd, J=11,1 ; 6,7 3 45,3 2,08 m Hα : 3,89 dd, J= 10,0 ; 5,6 3a 70,0 Hβ : 3,45 dd, J= 10,0 ; 4,2 4 41,4 4,42 d, J= 6,3 5 147,2 6 137,5 7 146,2 8 106,4 6,58 s 9 128,8 10 125,0 1’ 137,9 2’ 105,5 6,43 s 3’ 147,6 4’ 133,0 5’ 147,6 6’ 105,5 6,43 s 1’’ 103,4 4,28 d, J=7,8 2’’ 73,8 3,24 dd, J=8,8-7,8 3’’ 76,8 3,38 t, J=8,8 4’’ 70,2 3,29 t, J=8,8 5’’ 76,5 3,26 nd Hα : 3,83 dd, J=12,1 ; 6,2 6’’ 61,4 Hβ : 6,69 dd, J=12,1 ; 3,6 OMe1 58,7 3,34 s/ OCH3 OMe2 55,5 3,75 s/ OCH3 OMe3 55,5 3,75 s/ OCH3 OMe4 55,2 3,85 s/ OCH3

Figure 23: Structure du composé ML01

77

III.1.2.2 Elucidation structurale du composé ML02 III.1.2.2.1 Analyse du spectre de RMN 1H

Dans la zone entre 6,7 à 6,9 ppm nous avons trois protons aromatiques, un doublet à δH

6.85 (1H, J=1,9 Hz), un doublet à 6,78 ppm (1H, J=8,1 Hz) et un doublet dédoublé à δH 6.73 (1H, J=8,1-1,9Hz). Un peu plus blindé, entre 5,8 et 6,0 ppm, deux autres protons aromatiques résonnant sous la forme de doublets sont observés (δH 5,94, 1H, J=2,3 Hz et δH 5,87, 1H, J=2.3 Hz).

Nous distinguons aussi un signal sous forme de doublet à δH 4,58 intégrant pour un seul proton (J=7,8 Hz) ; un doublet dédoublé à δH 3,99 (J=13,4-7,8 Hz) ; un doublet dédoublé

à δH 2,86 (J=16,2-6,1 Hz) et un autre doublet dédoublé à δH 2,52 (J=16,2-8,3 Hz). III.1.2.2.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC Nous observons dans la zone comprise entre 130 à 160 ppm, six carbones quaternaires dont deux se superposent. Un autre carbone quaternaire résonne à δC 99,5. Les trois protons situés entre 6,7-6,9 ppm sont portés par des carbones dont le déplacement chimique est compris entre 113 et 120 ppm ce qui confirme la structure aromatique. Les deux protons situés vers 5,9 ppm sont portés par des carbones à δC 93- 94 et sont aussi des protons aromatiques. Nous remarquons la présence de deux carbones oxygénés à 66,9 et 81,4 ppm corrélant, pour le premier, avec le proton à δH 3,99 et pour le deuxième avec celui à δH 4,58.

Enfin les deux doublets dédoublés à δH 2,86 et 2,52 sont des protons géminés qui sont portés par le carbone à δC 28,3 (Tableau 5). Tableau 5: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) du composé ML02 (MeOD)

N° δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) 2 81,4 4,58/1H d, J=7,8 3 66,8 3,99/1H dd, J=13,4-7,8 Hα : 2,86 dd, J=16,2-6,3 4 28,3 Hβ : 2,52 dd, J=16,2-8,3 5 156,6 6 95,5 5,94/1H d, J=2,3 7 156,9 8 94,3 5,87/1H d, J=2,3 9 155,8 10 99,5 1’ 131,0 2’ 114,9 6,85/1H d, J= 1,9 3’ 145,3 4’ 145,3 5’ 115,5 6,78/1H d, J=8,1 6’ 118,8 6,73/1H dd, J=8,1-1,9

78

III.1.2.2.3 Analyse du spectre COSY On observe trois parties de corrélations distinctes :

. Les protons géminés H-4α et β corrèlent avec le signal à δH 3,99 qui lui-même

corrèle avec le doublet à δH 4,58. . Les deux signaux doublets vers 5,9 ppm corrèlent entre eux seulement avec une constante de couplage de J=2,3 Hz suggérant une position meta entre les deux protons comme dans le noyau A d’un squelette flavane. . Les trois protons dans la zone la plus déblindée corrèlent entre eux et forment un système ABX, nous pouvons déduire un couplage ortho avec une constante de

couplage de 8,1 Hz entre les protons à δH 6,73 et δH 6,78 et un couplage meta

avec une constante de couplage de 1,9 Hz entre les protons à δH 6,73 et δH 6,85 Hz. Ils appartiennent au noyau B. Ces données nous laisse penser à un squelette flavane et avec les corrélations observées sur le spectre HMBC, nous avons pu établir que le composé ML02 est la (+)- catéchine (Figure 24) [Stöggl et al. 2004]. La position trans des protons H-2 et H-3 a été déduite par la valeur de leur constante de couplage qui est de 7,8 Hz et par l’absence de corrélation Noe entre ces deux protons.

Figure 24: Structure du composé ML02

III.1.2.3 Elucidation structurale du composé ML03 L’analyse du spectre de masse ESI-SM en mode positif de ce composé nous révèle des ions pseudo-moléculaires [M+Na]+ à m/z 473,40 et [M+H]+ à m/z 451,12 soit une masse molaire de 450 qui correspond à une formule brute en C21H22O11.

III.1.2.3.1 Analyse des spectres de RMN 1H et COSY Comme nous l’avons observé avec le composé ML02, nous observons sur le spectre de RMN 1H les signaux caractéristique d’un noyau flavane :

79

. Trois signaux intégrants pour un proton chacun à δH 6,97 (d, J=1,9 Hz), δH 6,86

(dd, J=8,1-1,9 Hz) et δH 6,83 (d, J=8,1 Hz) formant un système ABX caractéristique du noyau B trisubstitué ;

. Deux protons à δH 5,94 et 5,92 sous forme de doublet avec une constante de couplage de 2,2 Hz, caractéristique du noyau A.

. Deux autres doublets sont observés à δH 5,08 et δH 4,59, intégrants chacun pour un proton et avec une constante de couplage de 10,7 Hz chacun, appartenant au noyau C. En plus de ces signaux, les protons d’une unité osidique sont observés dans la zone de

3,0 à 4,5 ppm à δH 4,27 (dq, J=9,4-6,3 Hz), δH 4,07 (d, J=1,5 Hz), δH 3,68, (dd, J=9,5-3,2 Hz) et δH 3,56 (dd, J=3,2-1,5 Hz) et un signal qui se superpose avec celui du solvant (MeOH) ainsi qu’un doublet à δH 1,20 (J=6,2 Hz). L’analyse du spectre COSY permet de relier les protons entre eux et d’identifier le système de spins d’un rhamnopyranose caractérisé par son méthyle en position 6 et la petite constante de couplage de 1,5 Hz entre les protons H-1’’ et H-2’’ et celle de 3,2 Hz entre les protons H-2’’ et H-3’’. III.1.2.3.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC L’analyse des spectres de RMN 13C et HSQC combinée aux résultats précédents nous dirige vers une structure de type flavonoïde monoglycosylé. En effet, plusieurs signaux caractéristiques sont observés (Tableau 6) :

. Un carbonyle à δC 194,6 . Cinq carbones quaternaires aromatiques oxygénés et cinq carbones sp2 aromatiques.

. Un carbone anomérique à δC 100,7, quatre carbones oxygénés entre 69 et 73 ppm

et un carbone blindé à δC 16,4, confirmant la présence d’un 6-desoxy hexose. Les déplacements chimiques de l’unité osidique attribués après analyse du

spectre HSQC sont en accord avec un l’α-L-rhamnopyranose. III.1.2.3.3 Analyse du spectre HMBC L’insertion de l’unité osidique sur le carbone C-3 de l’aglycone est établie via l’analyse des corrélations HMBC qui montre une tache de corrélation entre le H-1’’ et le C-3. La grande constante de couplage entre les protons H-2 et H-3 de 10,7 Hz, suggère une position trans entre les deux protons et la taxifoline comme génine [Jung et al. 2012]. Le composé ML03 est donc identifié comme étant le 3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline (Figure 25) [Jung et al. 2012].

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Figure 25: Structure du composé ML03

Tableau 6: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) du composé ML03 (MeOD)

N° δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) 2 82,6 5,08/1H d, J=10,7 3 77,2 4,59/1H d, J=10,7 4 194,6 5 164,1 6 94,9 5,94/1H d, J=2.2 7 167,2 8 94,8 5,92/1H d, J=2,2 9 162,7 10 101,1 1’ 128,8 2’ 114,1 6,97/1H d, J= 1,9 3’ 145,1 4’ 145,9 5’ 114,9 6,83/1H d, J=8,1 6’ 119,1 6,86/1H dd, J=8.1-1,9 1’’ 100,7 4.07/1H d, J=1,5 2’’ 70,4 3.56/1H dd, J=3,2-1,5 3’’ 70,7 3.68/1H dd, J=9,5-3,2 4’’ 72,4 3.31/1H m 5’’ 69,1 4,27/1H dq, J=9,4 ; 6,2 6’’ 16,4 1.20/1H d, J=6,2

III.1.2.4 Elucidation structurale des composés ML04 et ML06 Sur le spectre de masse HR-ESISM du composé ML04 nous observons les ions pseudo-moléculaires [M+Na]+ à m/z 471,09 et [M+H]+ à m/z 449,10 correspondants à une

formule brute déduite de C21H18O11 et une masse molaire de 448, soit 2 uma de moins que le composé ML03. L’analyse des spectres de RMN 1H, COSY et RMN 13C nous permet de déduire une structure de type flavonoïde monoglycosylé car nous observons (Tableau 7) : . Cinq protons aromatiques dont deux doublets intégrants pour un seul proton et couplant ensemble avec une constante de couplage de 2,1 Hz ce qui correspond 81

aux H-6 et H-8 du cycle A d’un flavonoïde. Les trois autres signaux sont caractéristiques des protons aromatique du cycle B avec le H-2’ à 7,36 ppm (d, J=2,1 Hz) ; le H-6’ à 7,33 ppm (dd, J=8,3-2,1 Hz) et le H-5’à 6,93 ppm (d, J=8,3 Hz).

. Les protons osidiques d’un rhamnose dont le proton anomérique est à δH 5,36 (d,

J=1,4 Hz) et le méthyle doublet à δH 0,96. . Le carbonyle qui résonne cette fois à 178,2 ppm indiquant une cétone conjuguée. En effet les protons H-2 et H-3 ont disparus et deux carbones oléfiniques supplémentaires sont observés à 157,1 ppm et 133,5 ppm, indiquant un squelette flavonol pour la génine. L’ensemble des données spectrales obtenues à partir des spectres 2D HSQC et HMBC et la comparaison de nos données avec celles de la littérature nous ont permis d’identifier la génine comme étant la quercétine. La corrélation HMBC observée entre le proton H-1’’ du rhamnose et le C-3 nous permette d’établir la structure du composé ML04 comme le : 3-O-α- L-rhamnopyranosyl-quercétine ou quercitrine 36 (Figure 26) [Arot Manguro et al. 2004].

Tableau 7: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) des composés ML04 (A) et ML06 (B) (MeOD)

A δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) B δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) 2 157,1 2 157,1 3 133,5 3 134,8 4 178,2 4 178,2 5 161,8 5 161,8 6 98,4 6,23/1H d, J=2,1 6 98,4 6,23/1H d, J=2,2 7 164,5 7 164,4 8 93,3 6,40/1H d, J=2,1 8 93,3 6,40/1H d, J=2,2 9 157,9 9 158,0 10 104,5 10 104,6 1’ 121,5 1’ 121,6 2’ 115,5 7,36/1H d, J= 2,1 2’ 115,5 7,36/1H d, J= 2,2 3’ 145,0 3’ 145,0 4’ 148,4 4’ 147,9 5’ 114,9 6,93/1H d, J=8,3 5’ 114,9 6,93/1H d, J=8,3 6’ 121,4 7,33/1H dd, J=8,3-2,1 6’ 121,4 7,33/1H dd, J=8.3-2,2 1’’ 102,1 5,36/1H d, J=1,4 1’’ 102,0 5,36/1H d, J=1,7 2’’ 70,5 4,24/1H dd, J=3,3-1,7 2’’ 70,5 4,24/1H dd, J=3,3-1,7 3’’ 70,7 3.76/1H dd, J=9,4-3,3 3’’ 70,6 3.76/1H dd, J=9,3-3,3 4’’ 71,8 3.35/1H nd 4’’ 71,8 3.35/1H t, J=9,4 5’’ 70,6 3,44/1H dq, J=9,6-6,3 5’’ 70,7 3,44/1H dq, J=9,5 ; 6,1 6’’ 16,3 0,96/3H d, J=6,1 16,4 0,96/3H d, J=6,3 6’’ OMe 55,5 3,95/1H s

82

La structure du composé ML06, a été établie par comparaison des spectres de RMN 1D et 2D avec ceux du composé ML04, qui montrent deux signaux supplémentaires caractéristiques de la présence d’un groupement méthoxy (δH 3,95 et δC 55,5). La position du méthoxy a été déterminée par analyse du spectre HMBC qui présente une tache de corrélation entre le C-4’ à δC 147,9 et les protons à δH 3,95. Le changement entre les composés ML04 et ML06 se situe donc au niveau de la génine qui est l’isorhamnétine. Le composé ML06 est le

3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine [Arot Manguro et al. 2004] (Figure 26).

Figure 26: Structure des composés ML04 (R=H) et ML06 (R=CH3)

III.1.2.5 Elucidation structurale du composé ML05 Le spectre de masse ESI-SM du composé ML05 montre deux ions pseudo- moléculaires [M+Na]+ à m/z 355,3 et [M+H]+ à m/z 333,3 dont est déduite une formule brute de C22H36O2. III.1.2.5.1 Analyse du spectre de RMN 1H Sur le spectre de RMN 1H de ce composé on distingue les signaux de trois protons aromatiques, un doublet intégrant pour 2 protons à δH 6,14 (J=2,2 Hz) et un triplet intégrant pour 1 proton à δH 6,09 (J=2,3 Hz) suggérant un noyau aromatique trisubstitué avec des couplages meta et une symétrie. En plus de ces signaux, un multiplet intégrant pour 2 protons

à δH 5,36 est observé.

Dans la zone plus blindée nous observons un triplet intégrant pour 2 protons à δH 2,45

(J=7,3 Hz) ; un multiplet intégrant pour 4 protons à δH 2,06 ; un multiplet intégrant pour 2 protons à δH 1,58 ; un multiplet à δH 1,36 intégrant pour 4 protons ; un massif entre 1,34 et

1,30 ppm intégrant pour 20 protons et enfin un triplet à δH 0,93 intégrant pour 3 protons (J=7,0 Hz). Ces signaux sont caractéristiques d’une chaîne aliphatique.

83

III.1.2.5.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC Nous observons les signaux suivants (Tableau 8) :

. 3 carbones à δC 157,8 (2C) et δC 144,9 qui correspondent à des carbones aromatiques oxygénés

. 2 carbones à δC 129,3 et δC 129,4 qui portent les protons superposés à 5,36 ppm

. 2 carbones à δC 106.5 qui portent les protons à 6,14 ppm

. Un carbone à δC 99,6 portant le proton triplet à 6,09 ppm

. Dans les zones plus blindées, à part le méthyle observé à δC 12,9, il n’y a que des

groupements CH2 dont les déplacements chimiques s’étendent entre 21,9 et 35,6 ppm avec un massif entre 28,5 et 30,0 ppm. Le carbone le plus déblindé à

δC 35,6 porte le triplet à 2,45 ppm, ce qui signifie qu’il est en début de chaine. Ces observations font penser à la présence d’une chaîne alkyle et d’un noyau aromatique et deux carbones éthyléniques avec une symétrie car des superpositions sont observées.

Tableau 8: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) du composé ML05 (MeOD)

N° δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) 1 157,8 2 99,6 6,09/1H t, J=2,2 3 157,8 4 106,5 6,14/1H d, J=2,2 5 144,9 6 106,5 6,14/1H d, J=2,2 1’ 35,6 2,45/2H t, J=7,3 2’ 31,0 1,58/2H m 3’-10’ 28,5-30,0 1,30-1,34/20H m 11’ 26,7 2,06/2H m 12’ 129,4 5,36/1H m 13’ 129,3 5,36/1H m 14’ 26,7 2,06/2H m 15’ 31,7 1,36/2H m 16’ 21,9 1,36/2H dd, J=8,3-2,1 17’ 12,9 0,93/3H d, J=7,0

III.1.2.5.3 Analyse des spectres de RMN 2D Les taches de corrélations observées sur le spectre COSY nous permettent de conclure à une unité aromatique sur laquelle s’insère une chaîne carbonée portant une insaturation car :

. les deux protons aromatiques (H-4 et H-6) superposés dans le signal doublet à δH 6,14 corrèlent entre eux et avec le proton H-2 et couplent entre eux avec une constante de couplage (meta) de 2,2 Hz.

84

3 . La chaîne carbonée s’insère sur l’aromatique via le C-1’ car un couplage JH-H est observé entre les protons H-4 et H-6 et le proton H-1’.

. Les protons éthyléniques à 5,36 ppm ne corrèlent qu’avec des groupements CH2 et sont donc positionnés au milieu de la chaîne, signifiant un alcène accroché à l’aromatique. Le spectre HMBC permet d’identifier les autres carbones de l’aromatique et de l’alcène : . Les protons H-4 et H-6 présentent des corrélations HMBC avec le carbone C-2

et les deux carbones superposés δC 157,8 (C-1 et C-3). . Le proton H-1’ de l’alcène corrèle avec le carbone C-5 à 145,1 ppm et les carbones C-4 et C-6. Il couple aussi avec le carbone C-2’ (31,1 ppm).

. Les protons éthyléniques couplent avec les carbones superposés à δC 26,7 que l’on positionne de part et d’autre de cette insaturation. La position de la double liaison est établie après analyse combinée des spectres COSY et HMBC qui permettent de relier le méthyle terminal aux protons et carbones éthyléniques. Avec ces différentes observations nous concluons à la présence d’un dérivé du résorcinol avec un alcène de 17 carbones. Nous avons comparé nos données expérimentales avec la littérature et ceci nous a confirmé que le composé ML05 était le 5-heptadec-12’-enyl- résorcinol (Figure 27) [Zhu et al. 2012].

Figure 27: Structure du composé ML05

III.1.2.6 Elucidation structurale du composé ML07 Les spectres de RMN du composé ML07 ont été réalisés dans du DMSO à 600 MHz. Le spectre de RMN 1H montre cinq doublets résonnants entre 4,2 et 4,7 ppm ce qui correspond à des protons portés par des oxygènes (cinq groupement OH visibles dans le DMSO). Un peu plus blindé, entre 3,2 et 3,7 ppm, les signaux de cinq multiplets intégrant chacun pour un seul proton correspondent à des protons portés par des carbones oxygénés comme pour un sucre. Enfin, nous avons un signal multiplet intégrant pour 2 protons à δH 1,61. Ces déplacements nous font penser à un sucre mais sans proton anomérique.

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L’expérience Dept-135 montre cinq carbones hydroxylés (CHOH) entre 68,5 et 75,5 ppm et un CH2 à δC 35,3. L’analyse des spectres COSY et HMBC nous a permis de dessiner une structure cyclique polyhydroxylée identifiée au viburnitol (Figure 28) pour le composé ML07 en comparaison avec les données de la littérature [Boutaghane et al. 2013].

Figure 28: Structure du composé ML07

III.2 Myrsine congesta et Myrsine sessiliflora III.2.1 Fractionnement et purification III.2.1.1 M. congesta (feuilles et racines) Nous avons réalisé les extractions à partir des racines et des feuilles séchées et broyées. Pour chacune des deux parties, un extrait hydrométhanolique a été préparé par macération pendant 24h à température ambiante. Le profil chromatographique sur CCM semble similaire à celui de M. latifolia quant à la quantité de tanins contenus dans ces extraits. Une partie de ces extraits est mise de côté et le reste est soumis à une extraction liquide- liquide d’abord à l’AcOEt puis au BuOH. On obtient donc, en plus de l’extrait brut, trois fractions : AcOEt (MCRA), BuOH (MCRB) et H2O (MCRH) pour chaque partie (feuilles et racines). Pour chacune de ces fractions, une précipitation des tanins a été réalisée et les filtrats débarrassés des tanins mis à sec (Figure 29). Le filtrat débarrassé des tanins de l’extrait brut des racines a été purifié par CLHP semi-préparative sur silice greffée RP-18 donnant les composés MC01 et MC02. Une partie du filtrat de la fraction aqueuse des racines (notée MCRH) a été fractionnée par chromatographie flash à polarités de phases inversées donnant huit fractions dont l’une contenait un seul produit majoritaire déjà isolé de M. latifolia : le composé ML01.

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Figure 29: Schéma d’extraction et de purification de M. concongestagesta

Les profils CCM des fractions BuOH (MCFB) et AcOEt (MCFA) des feuilles, après précipitation des tanins, étant assez similaires à ceux obtenus pour M. latifolia le fractionnement n’a pas été poursuivi. C’est l’extrait brut qui, après précipitation des tanins, a été fractionné par chromatographie flash pour donner les composés ML02, ML04 et ML06, déjà isolés de M. latifolia.

III.2.1.2 M. sessiliflora Le même protocole d’extraction et fractionnement a été appliqué sur les feuilles de M. sessiliflora. A partir du filtrat de la fraction aqueuse, une chromatographie flash a été réalisée en phase normale pour donner 7 fractions MSF1 à MSF7. La fraction MSF6 a été purifiée par CLHP semi-préparative donnant les composés MS01 et MS02. La fraction MSF7 a été fractionnée par chromatographie flash à polarités de phases inversées donnant accès à deux produits purs : ML02 et ML01.

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Peu de composés ont pu être purifiés et identifiés à partir de ces trois espèces. En effet, seules les fractions contenant un ou deux produits majoritaires ont été purifiées. Les autres fractions, que ce soit pour M. latifolia, M. congesta ou M. sessiliflora, n’ont pas été traitées car soit (i) le fractionnement n’a pas donné de résultats satisfaisants soit (ii) il y avait trop de tanins soit (iii) la quantité était très faible pour établir une structure. Ceci peut être dû à la précipitation des tanins qui entrainerait d’autres composés en plus des tanins.

III.2.2 Elucidation structurale III.2.2.1 Elucidation structurale des composés MC01 et MC02 La comparaison des spectres de RMN 1D et 2D des composés MC01 et MC02 montre qu’ils sont quasiment superposables hormis la présence sur les spectres de MC02 de signaux supplémentaires attribuables à un groupement methoxy (δC 50,8 et δH 3,88) (Tableau 9).

III.2.2.1.1 Analyse des spectres de RMN 1H Sur les spectres de RMN 1H nous observons les signaux suivants (Figure 30) :

. Deux protons aromatiques résonnant sous forme de doublets (J=1,7 Hz) à δH 7,70 et 7,65 ; . Deux protons éthyléniques résonnants sous la forme de triplet de quintuplet 2 3 (J=7,5-1,5 Hz) à δH 5,31 et 5,17 (voisins avec des groupements sp ou sp ) ;

. Un doublet dédoublé à δH 4,76 (J=9,6-7,6 Hz) intégrant pour un proton ; . Un massif de 3,2 à 3,3 ppm intégrant pour quatre protons ; . Un multiplet à 2,16 ppm intégrant pour un proton . Cinq singulets intégrant pour 3 protons chacun correspondant à 5 groupements

CH3 dont 4 sont déblindés entre 1,66 et 1,76 ppm suggérant qu’ils sont portés par une double liaison ;

. Un signal triplet à δH 1,59 (J=8,4 Hz).

88

Figure 30: Spectre de RMN 1H du composé MC01 (MeOD, 600 MHz)

III.2.2.1.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC-Jmod de MC01

Les spectres de RMN 13C (Figure 31) et HSQC-Jmod donnent les informations suivantes sur la structure (Tableau 9) :

. Un carbonyle à δC 169,1 et un aromatique oxygéné à δC 161,9 ; . Cinq carbones quaternaires résonnants entre 120 et 135 pm, aromatiques ou éthyléniques ;

. Deux protons aromatiques à δH 7,65 et 7,70 portés par des carbones résonnants à

δC 130,2 et 124,2, et deux protons éthyléniques (δH 5,17 et 5,31) sont portés par

les carbones à δC 124,1 et 121,5 ;

. Un carbone à δC 88,7 correspondant à un groupement CH-OR couplé au proton

doublet à δH 4,76 ;

. Un carbone quaternaire oxygéné à δC 72,9 ;

. Dans la zone blindée inférieure à 40 ppm, nous observons 4 groupements CH2 et

5 groupements CH3

89

169.10 161.96 132.37 131.01 130.21 127.10 124.17 124.07 122.72 122.48 121.47 88.74 72.90 38.53 29.40 27.70 24.51 24.46 21.53 20.08 16.50 16.30

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm Figure 31: Spectre de RMN 13C du composé MC01 (MeOD)

Le massif de 4 protons résonnant entre 3,2 et 3,3 ppm sur le spectre de RMN 1H peut

être, grâce aux corrélations HSQC, scindé en deux parties. Corrélé au carbone à δC 29,4 sont identifiés deux protons géminés à δH 3,22 et 3,29 qui résonnent sous la forme de doublet dédoublé (Figure 30) et corrélé au carbone à δC 27,7 sont identifiés deux protons superposés d’un groupement CH2 (m, δH 3,31).

III.2.2.1.3 Analyse du spectre COSY de MC01 Grâce à l’analyse des corrélations observées sur le spectre COSY en partant des protons individualisés à δH 4,67, 5,17 et 5,31, nous avons pu construire deux fragments.

. Le proton H-2 (CHOR) corrèle avec les protons géminés H-3α et H-3β à δH 3,22 et 3,29 ; 4 . Les protons H-3 couplent à leur tour en JH-H avec l’un des deux protons

aromatiques (H-4) à δH 7,70 qui couple avec l’autre proton aromatique (H-6) à

δH 7,65. Ce dernier est en position meta par rapport au H-4 car leur constante de couplage est de 1,6 Hz ; 4 . Le proton H-6 corrèle en JH-H avec les protons H-1’ qui est un groupement

CH2 à δH 3,31.

. Le proton éthylénique H-2’ (δH 5,31) couple avec les protons H-1’ et fait une 4 corrélation à longue distance JH-H à travers la double liaison avec deux

méthyles à δH 1,75 (C-4’) et δH 1,76 (C-5’).

90

Le premier fragment identifié est un noyau aromatique substitué en quatre positions dont l’une est un groupement prényle (Figure 32).

Figure 32: Corrélations COSY du fragment A du composé MC01

En partant du second proton éthylénique à δH 5,17 (H-a), nous observons trois taches de corrélations dont deux se font à longue distance avec les deux autres méthyles déblindés à

δH 1,66 et 1,71 ce qui nous donne l’extrémité du deuxième fragment. La troisième corrélation concerne les protons multiplet H-b (CH2) à δH 2,15, qui couplent avec les protons résonnant sous forme de triplet à δH 1,59. Nous arrivons donc à dessiner un deuxième fragment (Figure 33) à partir des corrélations observées.

Le dernier méthyle résonnant à δH 1,20, ne corrèle avec aucun autre proton ce qui signifie qu’il est porté par un carbone quaternaire.

Figure 33: Corrélations COSY du fragment B du composé MC01

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Tableau 9: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) des composés MC01 (A) et MC02 (B) (MeOD)

A δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) B δC ppm δH ppm Multiplicité/J (Hz) 2 88,7 4,76/1H dd, J=9,6-7,7 2 88,8 4,76/1H dd, J=9,8-7,8 Hβ: 3,22 dd, J=16,2-9,8 Hβ : 3,21 dd, J=16,0-9,6 3 29,4 3 29,4 Hα : 3,29 dd, J=16,2-7,7 Hα: 3,28 dd, J=16,0-7,8 4 124,2 7,70/1H d, J=1,7 4 124,2 7,70/1H d, J=1,7 5 122,5 5 121,9 6 130,2 7,65/1H d, J=1,7 6 129,9 7,65/1H d, J=1,7 7 127,1 7 127,3 8 161,9 8 161,1 9 122,7 9 122,7 10 169,1 10 169,1 1’ 27,7 3,31/2H m 1’ 27,7 3,31/2H m 2’ 121,5 5,31/1H tqt, J=7,5-1,5 2’ 121,4 5,31/1H tqt, J=7,5-1,5 3’ 132,4 3’ 132,5 4’ 24,5 1,76/3H s 4’ 24,5 1,76/3H s 5’ 16,5 1,75/3H s 5’ 16,5 1,75/3H s 1’’ 72,9 1’’ 72,9 2’’ 38,5 1,59/2H t, J=8,4 2’’ 38,5 1,59/2H t, J=8,3 3’’ 21,5 2,16/2H m 3’’ 21,5 2,16/2H m

4’’ 124,1 5,17/1H tqt, J=7,5-1,5 4’’ 123,8 5,17/1H tqt, J=7,5-1,5 5’’ 131,0 5’’ 131,0 6’’ 24,4 1,71/3H s 6’’ 24,5 1,71/3H s 7’’ 20,1 1,20/3H s 7’’ 20,1 1,20/3H s 8’’ 16,3 1,66/3H s 8’’ 16,3 1,66/3H s OMe 50,8 3,88/3H s

III.2.2.1.4 Analyse du spectre HMBC de MC01 Les corrélations HMBC vont nous permettre de relier les fragments A et B. En effet les

protons H-3 (fragment A) corrèlent avec un signal à δC 72,9 qui est quaternaire et oxygéné.

Ce dernier (C-1’’) forme des taches de corrélations avec le groupement CH3 à δH 1,20 mais aussi avec les protons H-a déjà attribués au fragment B 4(H- ’’). Le carbone C-3 corrèle également avec le proton H-2 porté par un carbone oxygéné, et

ce dernier corrèle avec le carbone à δC 161,9 (C-8) qui correspond à un aromatique oxygéné. De ce fait nous pouvons former un cycle furane en reliant le C-2 au C-8 de l’aromatique, ceci

est confirmé par une corrélation entre le proton H-2 avec un autre carbone aromatique à δC 127,1 (C-7).

Les deux protons aromatique H-4 et H-6 corrèlent avec le carbonyle à δC 169,1, ce dernier s’insère donc sur l’aromatique via le C-5.

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Ces informations et les autres corrélations observées nous indiquent une structure de type acide benzoïque prénylé pour le composé MC01 que nous avons identifié comme étant l’acide myrsinoïque B 86 (Figure 34) en comparaison avec des données de littérature [Hirota et al. 2002]. Le composé MC02 diffère du composé MC01 par la présence d’un groupement méthoxy (Tableau 9) supplémentaire dont les protons (δH 3,88) corrèlent avec le carbonyle (δC 169,1) en HMBC. Le composé MC02 est donc identifié comme l’acide myrsinoïque B méthyl ester (Figure 34) [Hirota et al. 2002].

Figure 34: Structure des composés MC01 (R=H) et MC02 (R=CH3)

III.2.2.2 Elucidation structurale du composé MS01 En spectrométrie de masse ESI-SM, l’analyse de ce composé montre deux ions pseudo-moléculaires [M+H]+ à m/z 435,09 et [M+Na]+ à m/z 457,07 à partir desquels on déduit une formule brute en C20H18O11. L’analyse des spectres de RMN indique qu’ils sont similaires à ceux observés pour le composé ML04 pour la partie génine mais qu’ils diffèrent pour la partie osidique. En effet, sur le spectre de RMN 1H, nous retrouvons les protons caractéristiques des flavonoïdes (Tableau 10). Ceci est confirmé avec les déplacements chimiques observés sur les spectres de RMN 13C et HSQC qui sont identiques à ceux de la quercétine.

Pour la partie osidique, nous observons un carbone anomérique à δC 103,2 (δH 5,18 ppm, d, J=6,7 Hz) et un système de spin à six protons osidiques suggérant un pentose et non un hexose comme pour le composé ML04. L’ensemble des protons ont été attribués par analyse du spectre COSY et la mesure des constantes de couplages entre les protons osidiques montre que les protons H-1’’, H-2’’ et H-3’’ sont en position axiale (J > 6,7 Hz) alors le proton H-4’’ est en position équatoriale (J = 3,2 Hz). Les protons Hα et β-5’’ de ce pentose donnent deux doublets dédoublé ce qui veut dire qu’ils sont impliqués dans une structure rigide et

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couplent différemment avec le proton H-4’’ ; le C-5’’ est donc impliqué dans une forme pyranose. Ces données ainsi que les déplacements chimiques des carbones correspondant déterminés par analyse du spectre HSQC nous laisse conclure que le sucre est un α-L- arabinopyranose (Tableau 10). L’insertion de ce pentose sur l’aglycone se fait via le carbone C-3 du cycle C comme le montre la tache de corrélation observée sur le spectre HMBC. Des données de littérature [Zhu et al. 2013] nous ont permis de confirmer la structure du composé MS01 comme étant le 3-O-α-L-arabinopyranosyl-quercétine (Figure 35).

III.2.2.3 Elucidation structurale du composé MS02 Le spectre de masse ESI-SM du composé MS02 donne les mêmes ions pseudomoléculaires que le composé MS01 indiquant une molécule isomère. Les spectres de RMN 1D et 2D sont très similaires à ceux du composé MS01 (Tableau 10). La différence entre ces deux composés concerne la partie osidique, les protons Hα et β- 5’’ ne donnent plus un doublet dédoublé mais un triplet ; ceci nous indique que leur environnement a changé et qu’ils couplent de la même manière avec le H-4’’. Nous avons donc perdu la rigidité due au cycle pyranose et, dans ce cas, nous sommes en présence d’un cycle furanose ou le C-5’’ est en dehors du cycle par rapport aux autres carbones osidiques. Les déplacements chimiques des carbones correspondants nous laissent conclure que le sucre est un α-L-arabinofuranose (Tableau 10).

Le composé MS02 est donc le 3-O-α-L-arabinofuranosyl-quercétine (Figure 35) dont les données expérimentales obtenues concordent avec des données de la littérature [Zhu et al. 2013].

Figure 35: Structure des composés MS01 (A) et MS02 (B)

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Tableau 10: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des composés MS01 (A) et MS02 (B) (MeOD)

A δC δH Multiplicité/J (Hz) B δC δH Multiplicité/J (Hz) 2 157,2 2 157,9 3 133,5 3 133,5 4 178,6 4 178,6 5 161,7 5 161,7 6 98,5 6,23/1H d, J=2,0 6 98,5 6,23/1H d, J=1,8 7 164,6 7 164,6 8 93,3 6,43/1H d, J=2,0 8 93,3 6,40/1H d, J=1,8 9 157,9 9 157,1 10 104,2 10 104,2 1’ 120,9 1’ 121,7 2’ 115,4 7,67/1H d, J= 2,2 2’ 115,4 7,55/1H d, J= 2,0 3’ 144,9 3’ 145,9 4’ 148,5 4’ 148,4 5’ 115,7 6,89/1H d, J=8,5 5’ 115,0 6,92/1H d, J=8,3 6’ 122,0 7,60/1H dd, J=8,5-2,2 6’ 121,5 7,52/1H dd, J=8,3-2,0 1’’ 103,1 5,18/1H d, J=6,7 1’’ 108,1 5,49/1H s 2’’ 71,4 3,91/1H dd, J=8,4-6,7 2’’ 81,9 4,35/1H d, J=2,6 3’’ 72,7 3,67/1H dd, J=8,4-3,2 3’’ 77,2 3,93/1H dd, J=5,0-2,6 4’’ 67,7 3,84/1H m 4’’ 86,6 3,88/1H dt, J=5,0-4,3 3,46/1H dd, J=13,5-3,1 5’’ 65,5 5’’ 61,1 3,42/2H t, J=4,3 3,84/1H dd, J=13,5-3,7

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III.3 Activités biologiques III.3.1 Test de cytotoxicité Les composés purifiés ont été testés pour leur toxicité cellulaire et nous avons choisi de travailler sur des fibroblastes humains (cellules de la peau) car en cas d’activité antileishmanienne, nos composés peuvent entrer dans des formulations sous forme de crème pour une application externe. Ainsi en cas d’activité leishmanicide nos composés ne doivent pas présenter de cytotoxicité contre les cellules normales. Ces tests ont été réalisés au sein de l’unité Matrice Extracellulaire et DYnamique Cellulaire (MEDyC) à la faculté des sciences de l’Université de Reims Champagne-Ardenne sous l’encadrement du Dr. Laurent Duca. Pour la révélation nous avons utilisé une méthode colorimétrique à l’Uptiblue qui va nous permettre de mesurer quantitativement la viabilité cellulaire. L’Uptiblue se compose d’un indicateur d’oxydo-réduction produisant un changement colorimétrique et un signal fluorescent en réponse à des réactions métaboliques. Une fois à confluence les cellules sont mises à adhérer dans des plaques 96 puits à raison de 2500 cellules par puit pendant 48h avant d’être mise en contact avec les drogues pendant 24h. La lecture des absorbances est effectuée à 560 nm (forme réduite-violet) et à 600 nm (forme oxydée-rouge). Avant leur purification, certains extraits et fractions des trois Myrsine étudiées ont été testé pour leur cytotoxicité à une concentration de 10 µg/ml préparée à partir d’une solution mère à 1 mg/ml (Tableau 11). Pour Myrsine latifolia nous avons testé les filtrats après précipitation des tanins des fractions AcOEt (MLTA-f), BuOH (MLTB-f) et aqueuse (MLTH-f) obtenues à partir des tiges ainsi que les cinq fractions MLFBV1 à 5 obtenues suite à une CLV-C18 sur la fraction BuOH des feuilles. Pour M. congesta, nous avons testé les filtrats sans tanins des fractions AcOEt (MCFA-f) et BuOH (MCFB-f) des feuilles. Et pour M. sessiliflora, l’extrait brut des feuilles (MSF), le filtrat (MSF-f) ainsi que le précipité (MSF-p) de ce dernier après précipitation des tanins ont été testés. Nous avons aussi testés les composés purs qui sont communs aux trois Myrsine et dont nous disposions des quantités suffisantes car ils sont majoritaires. Ces composés sont la (+)- catéchine (ML02), le 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol (ML01), le 3β-O-α-L- rhamnopyranosyl-taxifoline (ML03) et le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine (ML06)

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pour lesquels une gamme de concentration (10 ; 7,5, 5 ; 2,5 ; et 1 µg/ml) a été préparée afin de déterminer une valeur d’IC50 (Tableau 12). Nous constatons (Tableau 11) que l’extrait MLTA présente une cytotoxicité proche de celle du témoin positif (80,3 %). Cette activité peut être due au 3α-O-β-D-glucopyranosyl- lyonirésinol (ML01) qui présente une IC50 de 7,1 µg/ml (Tableau 12) (3,1 µg/ml pour l’α- héderine). Le filtrat de l’extrait brut de M. sessiliflora (MSF-f) présente aussi un pourcentage de mort cellulaire significatif de 60,5% qui est deux fois supérieur à celui de l’extrait brut avec les tanins. A partir de cet extrait ont été extraits le 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol

(ML01) et la (+)-catéchine (ML02) qui présentent des IC50 de 7,8 et 7,1 µg/ml respectivement.

Tableau 11: Pourcentage d’inhibition des fractions des Myrsine sur fibroblastes Fraction % de mort cellulaire MLTA-f 59,2 MLTB-f 21,0 MLTH-f 15,3 MLFBV1 12,5 MLFBV2 13,9 MLFBV3 17,4 MLFBV4 13,2 MLFBV5 35,4 MCF 29,3 MCFA-f 30,7 MCFB-f 21,2 MSF 31,9 MSF-f 60,5 MSF-p 20,9 α-héderine 80,3

L’extrait brut de M. congesta ne présente qu’une faible cytotoxicité (29,3 %) à 10 µg/ml alors qu’il contient le 3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline (ML03) et le 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-isorhamnétine (ML06) qui ont des IC50 de 7,6 et 8,7 µg/ml respectivement ce qui peut être dû à une interférence causée par les tanins.

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Tableau 12: Valeur des IC50 des composés ML01, ML02, ML03 et ML06 isolés des trois Myrsine (toxicité sur les fibroblastes)

Composés ML01 ML02 ML03 ML06 α-héderine

IC50 µg/ml 7,1 7,8 7,6 8,7 3,1

IC50 µM 12 26 16 18 4,1

III.3.2 Test antileishmanien Ces tests ont été réalisés dans l’équipe du Dr Mohamed Hadad à l’Institut de Recherche et Développement (IRD) de Toulouse. Ils ont été effectués sur des cultures de promastigotes de L. infantum responsables de la forme viscérale de la leishmaniose. Ces promastigotes ont été transfectés avec le gène de la luciférase, ce qui va nous permettre d’évaluer leur activité biologique en suivant la dégradation de la luciférine par la luciférase en présence d’ATP (Adénosine Tri-Phosphate). Cette dégradation est accompagnée d’une émission de photon directement liée à la concentration en parasites. Les promastigotes sont maintenus en culture à une température de 36°C selon la méthode décrite en littérature [Sereno and Lemesre 1997, Sereno et al. 2001]. Une fois dénombré sur une cellule de Malassez, les parasites sont ensemencés dans une microplaque 96 puits à une concentration de 1000 parasite par puit dans 90 µl de milieu. Chaque échantillon est testé aux concentrations suivantes : 0,1 ; 1 ; 10 et 100 µg/ml et le témoin positif, la pentamidine à des concentrations de 0,01 ; 0,1 ; 0,5 ; 1 et 10 µM. Après 72 heures d’incubation, 50 µl de tampon luciférase est ajouté pour effectuer par la suite une lecture de la luminescence (Lecteur Victor). Les composés purifiés des trois Myrsine étudiées n’ont pas démontré d’activité antileishmanienne contre les amastigotes axéniques de L. infantum avec des IC50 supérieure à

50 µg/ml. Seule la catéchine présente une IC50 comprise entre 86,6 et 172,2 µM mais ceci reste non significatif par rapport à la pentamidine dont l’IC50 est de 1,7 µM.

IV. Activités potentielles

Les composés purifiés à partir des trois Myrsine sont très connus et certains d’entre eux sont très étudiés pour leurs activités biologiques. Nous allons donc discuter de ces activités en ne citant que les principales et les plus importantes d’entre elles.

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IV.1 Activité antioxydante Les flavonoïdes et les flavanols sont connus pour leur propriété antioxydante comme la catéchine ML02 qui a démontré une activité importante de piégeage des radicaux libres

DPPH (IC50= 6,7 µM) et du peroxynitrile (IC50=55,7 µM) [Iacopini et al. 2008]. On retrouve aussi la quercitrine (3-O-α-L-rhamnopyranosyl-quercétine) ML04 qui in vivo sur des souris traitées par 10, 20 et 40 µM, pendant 1h, a permis de les protéger des dommages oxydatifs, inflammatoires et apoptotiques provoqués par l’exposition aux UVB. L’activité de la quercitrine est induite par une réduction des espèces réactives de l’oxygène (ROS), l’inhibition de l’activation du NF-κB (protéine impliquée dans la réponse immunitaire) mais aussi en restaurant l’expression d’enzymes antioxydantes comme la catalase de la superoxyde dismutase (SOD) [Yin et al. 2013].

Le 3-O-α-L-arabinofuranosyl-quercétine MS02 a démontré une activité antioxydante moyenne en piégeant 35% de radicaux libres DPPH à 25 µM et après seulement 50 secondes de réaction [Bernardi et al. 2007]. Le 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol ML01 a aussi démontré une activité de piégeage de radicaux libres avec 51 % de radicaux DPPH piégé à 1µg/ml comparé aux contrôles positif BHTQ (2,6-Di-tert-butyl-p-cresol) et TBHQ (tert-butylhydroquinone) avec des pourcentages de piégeage de 42 et 49 % respectivement. Ce composé a aussi démontré une activité réductrice des ions férriques FeCl3 dans un modèle FRAP (Ferric Reducing/Antioxydant Power) plus forte que celle du trolox (témoin positif) [Sun et al. 2013]. IV.2 Activité anticancéreuse La quercitrine ML04 a démontré une bonne activité inhibitrice de la prolifération cellulaire cancéreuse avec des IC50 de 50 µM sur les cellules A459 et NCI-H358 qui sont des lignées cellulaires cancéreuses pulmonaires. Cette activité passe par une augmentation de l’activité de la caspase-3 qui est une enzyme impliquée dans le processus de l’apoptose cellulaire [Cincin et al. 2014]. IV.3 Activité antiinflammatoire L’acide myrsinoïque B MC01 a démontré 83% de suppression d’œdème induit par le promoteur tumoral 12-O-tetar-decamoylphorbol-13-acetate par prolifération cellulaire chez des modèles de souris [Hirota et al. 2002].

Le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine ML06 répond à la définition des AINS (Anti-Inflammatoire Non Stéroïdien) ciblant les cyclo-oxygénases (COX) intervenants dans la formation de composés pro-inflammatoires. Cette distinction est due à son activité inhibitrice 99

de la COX-1 d’environ 90% à une concentration de 100 µg/ml qui est supérieure à celle de l’aspirine [Dongmo et al. 2007]. IV.4 Activité antimicrobienne

Le 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol ML01 a démontré une très bonne activité contre des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthiciline avec des IC50 de 5 ; 2,5-5,5 ; 2,5 et 2,5 µg/ml sur les souches MRSA1, MRSA2, MRSA3 et MRSA4, respectivement, qui semblent résistantes à la céfotaxine car elle ne montre aucune activité avant 40 µg/ml [Lee et al. 2005].

Les composés 3-O-α-L-arabinopyranosyl-quercétine MS01 et 3-O-α-L- arabinofuranosyl-quercétine MS02 ont démontré des zones d’inhibition de 20 et 17 mm contre Escherichia coli et de 18 et 17 mm sur Candida albicans lors d’un test utilisant la technique de diffusion sur gélose. Sur chaque disque de 8 mm a été déposé 3 mg de chacun des deux composés. L’ampicilline est utilisée comme témoin positif pour E. coli (10 mg/disque) avec une zone d’inhibition de 11 mm et le clotrimazole (10 mg/disque) pour C. albicans avec une zone d’inhibition de 24 mm [Metwally et al. 2010].

De plus, le 3-O-α-L-arabinopyranosyl-quercétine s’est révélé être un potentiel remède contre la plaque dentaire. En effet, ce dernier inhibe la croissance et le développement de Streptococcus mutans (arrêt de la croissance à 2 mg/ml) qui est une bactérie Cocci gram+ de la flore commensale de la cavité buccale. Cette dernière étant responsable de l’acidité buccale et de la formation de la plaque dentaire [Prabu et al. 2006]. IV.5 Activité antidiabétique et antidiabétogène

Le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine ML06 et la quercitrine ML04 ont démontré une activité intéressante pour l’inhibition de l’α-glucosidase qui est responsable du passage des oses des microvillosités intestinales vers la circulation générale. Cette activité a

été estimée avec une IC50 de 39,0 et 38,4 µM qui reste plus faible que l’acarbose (médicament de référence ; IC50=23 nM) mais intéressante vu l’abondance de ces composés dans la nature [Lai et al. 2012]. A partir de Salacia reticulata, plante utilisée en médecine traditionnelle ayurvédique comme antidiabétique, le 3-O-α-L-arabinofuranosyl-quercétine MS02 a été isolé des fractions actives avec d’autres composés. Ce flavonoïde a démontré une activité intéressante contre l’enzyme aldolase-réductase in vivo chez des rats avec une IC50 de 0,18 µM comparé au témoin positif qui est l’epalrestat (IC50 de 0,072 µM). L’aldolase-réductase est une enzyme clé dans la voie des polyols catalysant la réduction du glucose en sorbitol. Ce dernier, ne

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diffusant pas à travers les membranes cellulaires, va s’accumuler dans les cellules et induire des complications chroniques du diabète comme la néphropathie périphérique, la rétinopathie et les cataractes [Matsuda et al. 2002]. Le traitement de souris diabétiques avec des lésions rénales (induites par la streptozotocine) par le 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol ML01 (20, 40, 80 mg/kg/jour) pendant 14 jours a permis la réduction de l’hyperglycémie et de l’expression des protéines liées à celle-ci tels que le facteur nucléaire NF-κB, les caspases-3, -8, -9 et les protéines associées BCl (Bax). La diminution des altérations diabète-dépendantes du rein a aussi été observée (néphropathie glomérulaire, accumulation excessive de la matrice extracellulaire et épaississement de la membrane basale). Ce composé peut être considéré comme un potentiel médicament pour le traitement ou la prévention de la néphropathie diabétique [Wen et al. 2013].

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V. Conclusion

L’étude phytochimique de ces trois Myrsine nous a permis d’isoler et d’identifier onze composés dont la (+)-catéchine ML02; cinq flavonoïdes (3β-O-α-L-rhamnopyranosyl- taxifoline ML03, 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-quercétine ML04 , 3-O-α-L-rhamnopyranosyl- isorhamnétine ML06, 3-O-α-L-arbinopyranosyl-quercétine MS01 et 3-O-α-L- arbinofuranosyl-quercétine MS02) ; un dérivé résorcinol (5-heptadec-12’-enyl-résorcinol ML05) ; une lignane (3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol ML01) ; deux chromanes (acide myrsinoïque B MC01 et acide myrsinoïque B méthyl ester MC02) et le viburnitol (ML07). Des difficultés ont été rencontrées lors de cette étude à cause d’un grand pourcentage de tanins contenus dans ces plantes. Après avoir testé plusieurs méthodes, nous avons opté pour un protocole de précipitation des tanins dans du chloroforme. L’absence des saponines dans ces trois plantes pourrait être due à la précipitation qui les entraînerait avec le précipité. Les composés isolés sont déjà connus et étudiés pour différentes activités (Paragraphe IV, pages 95-98). Nous les avons testés pour leur activité antileishmanienne et leur cytotoxicité sur des fibroblastes. Aucune activité leishmanicide n’a été révélée mais quatre composés (ML01, ML02, ML03 et ML06) ont démontré une cytotoxicité moyenne avec des

IC50 comprises entre 12 et 26 µM (4,1 µM pour l’α-héderine). Les résultats de cette étude phytochimique ont fait l’objet d’une publication dans le journal « Natural Product Research ». Cet article a été publié en collaboration avec l’IIAP (Instituto de Investigaciones de la Amazonia Peruana) dont l’un des sujets d’étude portait sur une autre plante de la sous-famille des Myrsinoïdeae (Cybianthus magnus) à partir de laquelle un nouveau dérivé du résorcinol a été isolé (Annexe II). Au vu de ces résultats nous nous sommes tournés vers d’autres plantes péruviennes appartenant à d’autres familles que celle des Primulaceae dont l’étude phytochimique sera traitée dans le chapitre suivant.

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Les Icacinaceae

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I. Introduction

Suite à l’absence de saponosides dans les trois espèces de la famille des Myrsinaceae précédemment étudiées, nous avons orienté notre travail vers l’étude d’espèces appartenant à la famille des Icacinaceae, une autre famille de plantes issue de la forêt amazonienne. Deux espèces Poraqueiba sericea et Dendrobangia boliviana étaient disponibles auprès de notre collaborateur Mohamed Haddad (IRD, Toulouse). I.1 Présentation des Icacinaceae

La famille des Icacinaceae regroupe des plantes dicotylédones et comprend environ 220 espèces réparties en 35 genres [The Plant List 2013]; seulement dix genres et 15 espèces ont fait l’objet d’études phytochimiques. Sa classification phylogénétique est encore incertaine et selon la classification phylogénétique APGIII [Stevens 2012], cette famille pourrait être classée comme suit : Règne Plantae Sous-règne Tracheobionta Clade Angiospermes Clade Dicotyledones vraies Clade EuAstéridées Ordre Icacinales Famille Icacinaceae

Les Icacinaceae sont originaires des régions tropicales et subtropicales (Figure 36). Ce sont des arbres de taille moyenne, des lianes et parfois des arbustes avec des feuilles simples, alternes et sans stipule. Les fleurs sont très petites avec un pédoncule articulé à la base. Elles sont caractérisées par un ovaire uniloculaire et rarement loculaire avec deux ovules pendants ; le fruit est une drupe globuleuse ou subglobuleuse qui peut être comprimée latéralement, il contient une graine solitaire avec un endosperme qui est souvent abondant [Plantes & botanique 2011].

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Figure 36: Localisation des Icacinaceae [Stevens 2012]

I.2 Utilisations traditionnelles et études biologiques Plusieurs espèces de cette famille sont utilisées en médecine traditionnelle que ce soit en Afrique, en Asie ou en Amazonie. Nous allons voir quelles sont ces utilisations et les activités biologiques étudiées à travers ces trois continents. I.2.1 Utilisation des Icacinaceae en Afrique

Quatre espèces de cette famille sont utilisées par différentes communautés africaines en médecine traditionnelle pour soigner différentes maladies. I.2.1.1 Pyrenacantha staudtii Appelée « yoruda » ou « nhia » au Nigéria, cette plante herbacée de 6 m de long et 5 à 10 cm de large est retrouvée en Afrique tropicale et dans les jungles secondaires du Nigéria. Elle est traditionnellement utilisée pour le traitement de la blennorragie, les hernies, les douleurs intestinales et la diarrhée [Falodun and Usifoh 2006]. L’extrait des feuilles est reconnu pour ses activités anti-inflammatoire, anti-ulcérogène, anticonvulsive et analgésique. Cette plante a fait l’objet de plusieurs études d’activités biologiques. L’équipe d’Awe a évalué l’activité anti-diarrhéique de l’extrait aqueux des feuilles, les tests étaient effectués sur des rats et ont démontré une protection dose-dépendante et significative (p<0.05-0.01) contre la diarrhée (induction par l’huile de ricin) en inhibant le transit intestinal et en ralentissant la vidange gastrique [Awe et al. 2011]. Avant cela, une autre équipe avait déjà établi une activité anti-ulcérogène de l’extrait aqueux obtenu à partir des feuilles. L’extrait ayant été testé sur différents modèles de l’ulcère gastrique [Aguwa and Mittal 1981].

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I.2.1.2 Icacina senegalensis C’est une plante coriace, très ramifiée, qui se présente en bouquets de tiges buissonnantes ; ses fruits comestibles sont des baies de couleur rouge vif et duveteuses. Dans la médecine traditionnelle sénégalaise, elle est utilisée dans le traitement du paludisme, du diabète et en prévention du rachitisme. L’activité antidiabétique a été étudiée à partir des extraits aqueux, éthanolique et héxanique sur des rats normo-glycémiques, un modèle d’hyperglycémie (provoquée par voie orale par administration de glucose) et chez des rats diabétiques de type 2. L’extrait éthanolique a démontré une action préventive de l’hyperglycémie provoquée ainsi qu’une activité anti-hyperglycémiante chez les rats diabétiques de type 2 [N’diaye et al. 2008]. Une autre équipe a évalué l’extrait ainsi que différentes fractions de cette plante pour leur activité antipaludique ; ceux-ci ont révélé une activité intéressante avec une IC50<5 µg/ml et sans cytotoxicité [Sarr et al. 2011]. Cette activité antipaludique a été confirmée sur Plasmodium berghei par l’extrait de I. senegalensis pour lequel une suppression dose dépendante du parasite a été observée [David-Oku et al. 2014]. I.2.1.3 Cassinopsis ilicifolia et C. tinifolia Ces sont des arbres ou des arbustes à feuilles persistantes et longilignes utilisées en médecine traditionnelle Zulu en Afrique du Sud dans le traitement de la dysentérie [Würger et al. 2014,].

I.2.1.4 Apodytes dimidiata C’est un arbre de taille moyenne atteignant 25 m de hauteur et fortement ramifié ; il est répandu dans de nombreuses régions tropicales et subtropicales d’Afrique et d’Asie ainsi qu’au Queensland (Australie). Dans les pays du sud de l’Afrique, il est utilisé pour des propriétés antimolluscicides. Cette activité a fait l’objet d’études biologiques qui ont prouvé cette propriété (différents extraits avec des IC50 de 0,22 à 2,62 g/l) et d’autres études ont pu démontrer la non toxicité de cette plante [Brackenbury and Appleton 1997a, Brackenbury et al. 1997b, Brackenbury 1999]. On lui connait aussi d’autres utilisations traditionnelles comme tonique à Madagascar et il entre dans la composition de médicaments destinés aux maux d’estomac au Kenya.

I.2.2 Utilisation des Icacinaceae en Amazonie Dans la région amazonienne on retrouve Humirianthera ampla qui est populairement connue sous les noms de « surucucaína » ou « surucaína » dans la vallée Purus. Les

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communautés rurales utilisent l’extrait éthanolique des racines de cette plante comme traitement immédiat contre la morsure du serpent pour ralentir l’effet des toxines et apporter un peu de soulagement à la victime. Cette propriété a été appuyée par les résultats d’une étude pharmacologique qui a démontré une activité inhibitrice de l’extrait éthanolique (30 mg/Kg) sur le processus inflammatoire causé par le venin de serpent [Luiz et al. 2007]. I.2.3 Utilisation des Icacinaceae en Asie La médecine traditionnelle asiatique est bien développée et regorge de plantes qui intéressent de plus en plus les équipes de recherche et les laboratoires pharmaceutiques. En voici quelques exemples.

I.2.3.1 Nothapodytes nimmoniana Plus connue sous le nom « Amruta », cette plante indienne est utilisée en médecine traditionnelle pour diverses activités : anti-cancéreuse, antibactérienne, anti-oxydante, anti- malariale. Elle a été testée pour différentes activités (différents extraits de différentes parties testées) et s’est montrée très prometteuse pour une utilisation pharmacologique [Khan et al. 2013].

I.2.3.2 Pyrenacantha volubilis Cette plante est présente sur les côtes Est de l’Inde et s’est avérée être une source importante de la camptothécine qui est un très bon anti-cancéreux. L’extrait des graines a démontré une bonne efficacité (IC50 allant de 4,0 à 25 µg/ml) contre les cellules cancéreuses des cancers des poumons, de l’ovaire, du colon et du carcinome [Suma et al. 2014].

I.3 Composition chimique des Icacinaceae : Au vu des utilisations traditionnelles de certaines espèces de cette famille, plusieurs équipes scientifiques ont mené des études phytochimiques sur cette famille afin de déterminer les composés actifs et de mieux comprendre leurs activités. Différentes familles de composés chimiques sont rencontrées chez les Icacinaceae, des alcaloïdes indolomonoterpéniques, des terpènes et des flavonoïdes…, comme nous allons l’illustrer en présentant quelques exemples de ces composés et les plantes à partir desquelles ils ont été isolés. I.3.1 Le genre Nothapodytes : Trois espèces de ce genre ont fait l’objet d’études phytochimiques. La première, suscitée pour son utilisation en médecine traditionnelle, est Nothapodytes nimmoniana à partir

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de laquelle a été isolé la camptothécine 162 avec d’autres dérivés comme le topotecan 163 et l’irinotecan 164 [Khan et al. 2013]. La 2ème espèce est N. pittosporoides qui s’est révélée être une autre bonne source d’alcaloïdes indoliques monoterpéniques (12 au total) dont un était nouvellement découvert : le O-acetyl-7-methoxycamptothécine 165. Ces alcaloïdes sont appelés « camptothécines » et ont démontrés de bonnes activité anti-cancéreuses [Guo et al. 2015]. Enfin, on retrouve N. foetida dont la première étude phytochimique remonte à 1988, où à partir du bois a été isolé la camptothécine et 3 dérivés de celle-ci dont un était nouveau : le (20S)-18,19-dehydrocamptothécine 166 [Aiyama et al. 1988]. Ensuite, l’équipe du Pr. Wu a étudié les tiges de cette plante et a isolé 4 camptothécines dont une était nouvelle : O- acétylcamptothécine 167 en plus de 13 autres composés déjà connus [Wu et al. 1995]. Des tiges ont été isolé un alcaloïde minoritaire : la 9-methoxy-20-O-acétylcamptothécine 168 [Srinivas and Das 2003 ]. Une autre équipe a étudié les racines et a pu isoler cinq alcaloïdes en plus de la camptothécine 162 [Pirillo et al. 1995]. L’équipe du Pr. Wu a mené une étude plus poussée sur les tiges et a pu identifier deux autres alcaloïdes nommés Apodytines A 169 et B 170 [Wu et al. 1996].

I.3.2 Le genre Icacina La première plante concernée est I. senegalensis qui est utilisée en médecine traditionnelle sénégalaise. Une étude de jeunes feuilles a permis d’isoler deux flavones C-glycosides 171- 172 et le trans (-) clovanide 173 [Manga et al. 2013]. A partir des racines d’une autre espèce, I. claessensis, quatre diterpènes ont été isolés dont l’icacinol 174 [On'okoko et al. 1985]. Cette même équipe avait aussi étudié les racines d’une autre espèce : I. guesfeldtii, ceci a permis de mettre en évidence trois alcaloïdes diterpéniques : icaceine 175, icacine 176 et le De-N- methylcaceine 177 [On'okoto and Vanhaelen 1980]. 108

I.3.3 Le genre Pyrenacantha Une première équipe s’est intéressée à ce genre et a étudié l’extrait méthanolique des feuilles de P. staudtii révélant la présence d’un alcaloïde : le 3-carbomethoxypyridine 178 [Falodun and Usifoh 2006] ; le taraxérol 65 ; deux phytostérols: le β-sitostérol 69 et le sitostérol 3-O-β-D-glucopyranoside 179 ; l’acide nicotinique 180 et deux nouveaux composés : le kaempférol 3-O-α-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside 181 et le 4-β-

D-glucopyranosyl-(2-furyl)-5-methyl-1,2-glucopyranoside phenylmethanone 182 [Falodun et al. 2009]. Une deuxième équipe a étudiée P. volubilis qui s’est révélée être aussi une bonne source de camptothécine 162 [Suma et al. 2014].

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I.3.4 Le genre Discophora La seule plante étudiée de ce genre est D. guianensis qui est répandue dans les zones tropicales. A partir des feuilles ont été isolés trois triterpènes : taraxerone 183, multiferonone 184 et le bauerenone 185 et d’un diterpène linéaire : le phytol 186 [Calderón et al. 2013].

I.3.5 Le genre Apodytes On retrouve deux études concernant A. dimidiata ; la première portait sur les écorces de cette plante et a permis de mettre en évidence la présence d’un iridoïde la génipine 187 et son dérivé la génipine-10-monoacétate 188 [Drewes et al. 1996]. La deuxième étude concernait, quant à elle, les parties aériennes d’A. dimidiata à partir desquelles ont pu être isolés la génipine et son dérivé comme dans les écorces avec en plus un sesquiterpène de type eudesmane glucoside acétylé 189 [Harinantenaina et al. 2006]. D’autres études ont révélé la présence de saponines anti-protozoaires comme cité précédemment (Chapitre 1, paragraphe V.5.2, pages 34-35).

I.3.6 Le genre Emmotum L’équipe du Pr. Braga de Oliveira s’est beaucoup intéressée aux plantes de ce genre qui regroupe treize espèces poussant exclusivement en Amérique du Sud. En premier lieu, ils ont étudié le bois d’E. nitens qui a révélé la présence de 21 sesquiterpènes à noyau eudesmane 110

nommés « Emmotines » [Braga-de-Oliveira et al. 1974, Braga de Oliveira 1995]. De plus, le β-sitostérol 69 et un sesquiterpène tetraline : le (+)-rishitinol 190 ont été isolés. Cette même équipe a aussi étudié deux autres espèces de ce genre qui sont : E. orbiculatum et E. glabrum dans lesquelles différentes emmotines déjà isolées de E. nitens sont identifiées avec d’autres dérivés [Braga de Oliveira 1995].

I.3.7 Le genre Mappia Une seule espèce de ce genre a fait l’objet d’une étude phytochimique : M. foetida. Des différentes parties de cette plante (feuilles, racines et écorces) ont été isolés le β-sitostérol 69, le lupéol 68, la camptothécine 162 et trois de ses dérivés [Govindachari and Viswanathan 1972]. Une autre équipe a mis en évidence la présence d’un alcaloïde minoritaire nommé « Foetidine I » 191, soluble dans l’eau, et que l’on retrouve dans toutes les parties de M. foetida. Cet alcaloïde fait l’objet d’un brevet pour son utilisation dans des formulations antivirale et anticancéreuse [Bombardelli et al. 1996].

I.3.8 Le genre Poraqueiba Des études ont été menées sur le bois du tronc de P. guianensis et ont révélées la présence de l’acide icacinique 192, de deux emmotines : l’emmotine Z 193 et son éther 6-O- methyl 194 [Braga de Oliveira 1995] en plus du β-sitostérol 69 et d’une lignane rare : le 1- hydroxypinoresinol 195 [Goulart et al. 1994]. Le Pr. Goulart avait aussi isolé un sécoiridoïde monoterpénique : le secologanoside 196 comme constituant majeure à 0,1% dans le bois du tronc [Goulart 1983].

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II. Présentation des plantes étudiées

II.1 Le genre Poraqueiba Ce genre regroupe trois espèces : P. sericea Tul., P. guianensis Aubl. et P. paraensis Ducke qui poussent de façon exclusive en Amazonie. Il est très peu décrit dans la littérature et regroupe des arbres de grande taille avec des fleurs caractérisées par un calice très petit à cinq dents, une corolle hypogyne, cinq étamines hypogynes à anthères articulées ; un seul style ; trois stigmates ; le fruit est en général une drupe ressemblant à une mangue avec une grosse graine [Paytán and Amazónic 2009] II.2 Poraqueiba sericea Tul. II.2.1 Taxonomie et nomenclature

Selon la classification phylogénétique APGIII [Stevens 2012], cette espèce est classée comme suit : Règne Plantae Sous-règne Tracheobionta Clade Angiospermes Clade Dicotyledones vraies Clade EuAstéridées Clade Lamiidées Ordre Icacinales Famille Icacinaceae Miers Genre Poraqueiba Aubl. Espèce P. sericea Tul.

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On trouve un synonyme de cette plante qui est : Poraqueiba acuminata Miers. Cette plante est connue sous différents noms vernaculaires selon les régions, on trouve umari (Pérou) ; umaro do Amazonas, umari roxo, mari, umari (Brésil) ; umari, guacure, yuri, teechi (Colombie).

II.2.2 Habitat C’est un arbre dont l’origine exacte n’est pas déterminée, au départ cultivé par les amérindiens, il a été propagé par ces derniers en Bolivie, Brésil et Pérou. En plus de sa forme sauvage cet arbre est aussi exploité dans son habitat naturel au Pérou (département du Loreto et d'Ucayali) pour la culture de ses fruits comme nous le détaillerons plus loin. Il pousse dans des zones tempérées de 23 à 25°C, dans des sols profonds d’une texture variable du sable à l’argile, bien arrosés mais non inondables car il ne résiste pas à l’engorgement. Il a besoin d’une pluviométrie d’environ 2000 mm avec une courte ou sans période de sécheresse. II.2.3 Description botanique C’est un arbre à feuilles persistantes, d’une hauteur de 15 à 25 m mais qui descend à 4 à 8 m dans certains cultivars. Le tronc droit et cylindrique a un diamètre compris entre 28 à 35 cm, qui, à l’état sauvage, peut atteindre 60 cm, il est doté de ramifications de 60 cm ou plus de hauteur. L’écorce extérieure est orange-brun claire, couverte de lenticelles et l’écorce intérieure est jaune-crème. Les feuilles sont simples, alternes, sans stipules, 10-35 cm de long et 7 à 20 cm de large, la surface inférieure est poilue, au moins lorsque l’arbre est jeune, avec 7-10 paires de veines saillantes. L’inflorescence est sous forme de panicule de 3-7 cm de long ; les fleurs sont bisexuées, jaunes, 1-2 mm de diamètre, caractérisées par un calice à 5 lobes portant 5 pétales et 5 étamines. Le fruit est une drupe obovoïde de 5-10 cm de long, 4-6 cm de diamètre ; l’exocarpe est fin, lisse et brillant, jaune à orange ou pourpre foncé à noirâtre ; le mésocarpe est jaune, 2- 5 cm d’épaisseur, caractérisé par une texture grasse comme du beurre froid ; l’endocarpe, quant à lui, est dur, boisé et contient une grosse graine [F.A.O. 1986].

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Figure 37: Planche botanique de Poraqueiba sericea [Martius et al. 1840]

II.2.4 Utilisations Le fruit Umari est un des fruits les plus populaires dans la région amazonienne. Différentes parties de ce fruit sont utilisées par les locaux [Huamán et al. 2001] : . La pulpe, avec un gout agréable est fort caractéristique, peut être consommée telle quelle ou accompagnée de manioc. Elle entre aussi dans la composition de boisson gazeuse appelée « Cahuana » avec de l’amidon de manioc. . L’huile extraite industriellement du mésocarpe constitue une matière première pour cette région ce qui fait qu’on voit apparaître de plus en plus des cultures de cet arbre.

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. De l’endosperme des graines on extrait un amidon utilisé pour la préparation du Casave ou pain de jungle en mélange avec l’amidon de manioc. . En industrie la farine d’Umari remplace la farine de blé dans la production d’adhésifs pour les bois stratifiés. . Le bois, dur est résistant, est utilisé dans la construction mais aussi comme charbon. . La seule utilisation médicinale, concerne les feuilles qui sont utilisées par certaines tribus en infusion pour se soigner contre la dysenterie.

Figure 38: Branches et fruits de Poraqueiba sericea A : jeunes branches, B : Fruits mûrs, C : coupe transversale du fruit, D : pâte du fruit consommée comme du beurre

II.3 Le genre Dendrobangia

Ce genre regroupe trois espèces : D. multinerva Ducke, D. tenuis Ducke et D. boliviana Rusby qui fait l’objet de notre étude. Ce sont des arbres pouvant atteindre 40 m de haut avec un tronc cylindrique ; les jeunes branches cylindriques sont caractérisées par des écailles (ou lépidotes) étoilées sur toutes les parties qui deviennent glabres avec le temps, ils sont revêtus par des poils minuscules et simples. Les feuilles sont simples, coriaces à subcoriaces avec des lépidotes étoilés sur la face abaxiale, avec 5 à 9 (jusqu’à 22) paires de nervures secondaires et un pétiole pouvant atteindre 25 cm de long. Les inflorescences sont axillaires, en panicules composées de fleurs en grappes à l’extrémité des branches. Les fleurs sont pentamères et actinomorphes [De Stefano 2007]. Aucune étude phytochimique n’a été réalisée sur ce genre jusqu’à présent.

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II.4 Dendrobangia boliviana Rusby II.4.1 Taxonomie et nomenclature

La première description de cette plante a été faite en 1896 par Rusby qui l’avait collecté entre Tipuani et Guanai (département de la Paz, Bolivie) et la liée à d’autres taxons néotropicaux des Icacinaceae, il lui a aussi désigné trois plantes synonymes qui sont : Clavapetalum surinamense Pulle (Suriname), Asterolepidion elatum Ducke (Rio de Janeiro, Brésil) et Dendrobangia tenuis Ducke (Sao Paulo, Brésil). Rusby a réexaminé les caractères morphologiques de cette plante en 1897 et a confirmé sa position dans ce groupe. De plus, l’équipe de Howard & Bailey en 1941 s’est intéressé aux caractéristiques du bois (types des vaisseaux vasculaires, le xylème et le parenchyme) et ont aussi confirmé la classification de Rusby. En 2001, Kârehed a mené une étude cladistique basée sur les caractères morphologique et biologique (analyse des séquences ADN), qui divise les Icacinaceae « sensu lato » en 4 familles réparties dans 3 ordres : les Icacinaceae « sensu stricto » (ordre des Garryales), les Cardiopteridaceae et Stemonuraceae (ordre des Aquifoliales) et les Pennantiaceae (ordre des Apiales). Cette étude déplace le genre Dendrobangia des Icacinaceae vers les Cardiopteridaceae (Tableau 13) [Karehed 2001].

Tableau 13: Classification des Icacinaceae sensu lato et sensu stricto Icacinaceae sensu lato Euasterids I/Garryales Euasterids II/Aquifoliales Icacinaceae sensu stricto Cardiopteridaceae Icacina group (incl. Leptaulaceae, Metteniusaceae?) : Alsodeiopsis, Casimirella, Chlamydocarya, Desmostachys, Hosiea, Icacina, Iodes, Lavigeria, Cardiopteris, Citronella, Dendrobangia, Gonocaryum, Leretia, Mappia, Mappianthus, Merilliodendron, Leptaulus, Metteniusa?, Pseudobotrys? Miquelia, Natsiatopsis, Natsiatum, Nothapodytes, Phytocrene, Pittosporopsis?, Pleurisanthes, Polycephalium, Polyporandra, Pyrenacantha, Stemonuraceae Rhyticaryum, Sarcostigma, Stachyanthus Cantleya, Codiocarpus, Discophora, Gastrolepis,

Gomphandra, Grisollea, Hartleya, Irvingbaileya, Cassinopsis Lasianthera, Medusanthera, Stemonurus, Whitmorea Cassinopsis Euasterids II/Apiales Emmotum group Emmotum, Oecopetalum, Ottoschulazia, Pennantiaceae Poraqueiba, Calatola?, Platea? Pennantia

Apodytes group Apodytes, Raphiostylis

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Selon la classification phylogénétique APGIII [Stevens 2012], la classification actuelle de cette plante est donc la suivante : Règne Plantae Sous-règne Tracheobionta Clade Angiospermes Clade Dicotyledones vraies Clade Astéridées Clade Campanulidées Ordre Aquifoliales Senft Famille Cardioptericaceae Blume Genre Dendrobangia Rusby Espèce D. boliviana Rusby

La famille des Cardiopteridaceae regroupe des plantes à fleurs dicotylédones, elle comporte 6 genres (en comptant Dendrobangia) et 43 espèces. Le genre le plus important est Citronella qui compte à lui seul 21 espèces. Elles sont de façon générale, distribuée dans les tropiques mais on peut trouver quelques membres dans des zones tempérées. Cet arbre est connu sous différents noms vernaculaires selon les pays : aceituno, cugao, dáagui-masacao, jocodoai, jubuo (en Colombie) ; piritjalopo, apiritjalopo (au Suriname) ; taapoutiki (Guyane française) ; palta caspi (Equateur) ; DUQUE & al. (2001) a ajouté daayigü et quiiquiniime ; HOWARD (1942) a ajouté pau de cubi ; JANSEN-JACOBS (1979) a ajouté les noms suivants : jakanta", rode bast jakanta, tajakoe, wajaballi, wajaballi kharemeroe, dakara konokodikoro, arawata andekere et konoto epoewewe.

II.4.2 Habitat Dendrobangia boliviana est largement distribuée dans la région néotropicale du Costa- Rica et du Panama, au Brésil et en Bolivie. Il pousse généralement dans les forêts de montagne et rarement dans les forêts inondables entre 100 et 1200 m d’altitude, il tolère une large gamme de sols.

II.4.3 Description botanique C’est un arbre de 5 à 30 m de haut et 50 cm de diamètre ; les jeunes rameaux sont cylindriques avec des lépidotes stellaires qui, avec le temps, deviennent glabres.

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Les feuilles sont coriaces ou subcoriaces ; avec un pétiole de 0,8 à 2 cm de long ; des sillons dans une ligne forte à la base d’abscission ; la base est atténuée, avec des lépidotes sur la surface abaxiale qui deviennent glabre avec le temps ; l’apex est aigu, acuminé ou obtus ; on retrouve 5 à 9 (jusqu’à 11) paires de nervures secondaires visibles ou à peine visibles [De Stefano 2007].

Figure 39: Planche botanique de Dendrobangia boliviana [De Stefano 2007]

Les inflorescences sont sous forme de panicules composés ; 1, 2 ou 3 fois ramifiées ; 3 à 9 fleurs sont regroupées sous forme de glomérules à l’extrémité des rameaux ; à la base des rameaux on trouve des bractées de 0,5*0,3-0,5 mm avec des lépidotes stellaires externes et glabre intérieurement ; les fleurs sont pentamères avec 2 à 6 bractées par fleur disposées par paires ; le calice est constitué de sépales de 1,0-2,0*0,5 mm, ovales à triangulaires, légèrement concaves. La corolle est composée de pétales blancs soudés en un tube jusqu’à 1,0 mm de long ; les étamines font de 1,0 à 1,5 mm de long ; les anthères 0,5 mm de long ; les pistils de 0,5-1,0 mm de hauteur, l’ovaire est conique avec peu de lépidotes stellaires et parfois glabres. 118

Les fruits sont d’une taille de 1,5 à 2,0*0,8*0,6 cm, allongés et aplatis, légèrement triangulaires en coupe transversale ; l’apex est aigu, légèrement apiculé ; caractérisés par un exocarpe mince, jaune à maturité ; un mésocarpe mince et un endocarpe dur avec une graine solitaire [De Stefano 2007].

Figure 40: Photos de Dendrobangia boliviana [Aguilar 2011] (A : Branches portant les fleurs, B : Feuilles,C : Fruits, D : Tronc)

II.4.4 Utilisation

En Colombie, la communauté de la région Hibito consomme l’amende des fruits comme fruit sec. Le bois de cet arbre est exploité pour sa robustesse dans la construction, le mobilier, les articles de sport, les manches d’outils, les revêtements intérieures… Dans la littérature on ne lui trouve aucune utilisation en médecine traditionnelle ce qui contraste avec sa réputation et le nombre important de noms vernaculaires qui le désigne.

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III. Travaux réalisés et résultats

III.1 Poraqueiba sericea III.1.1 Extraction et fractionnement

Les tiges séchées et broyées en poudre sont macérées dans un mélange méthanol-eau (80-20, v-v) pour obtenir un extrait total. Après évaporation à sec de cet extrait, une analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) met en évidence la présence de tanins qui sont éliminés par précipitation, pour faciliter le fractionnement et l’étude phytochimique. Le filtrat sans tanins est mis à sec puis fractionné en 3 fois par chromatographie flash (CF) automatisée (System Grace Reveleris) sur gel de silice avec un système d’élution composé de cyclohexane/chloroforme puis chloroforme/méthanol. Les fractions sont regroupées en suivant leur profil chromatographique par CCM pour donner 9 regroupements (A à I) (Figure 41). Les fractions B à E ont été fractionnées par CF sur silice greffée C-18 à polarité de phases inversées avec comme éluant un gradient méthanol-eau puis purifiées par CLHP préparative à polarité de phases inversées (silice greffée C-18) pour donner 6 triterpènes PS04, PS05, PS06, PS07 et PS08 ; une saponine PS10 et un iridoïde PS11. Les fractions G et H ont été purifiées par CF sur silice greffée C-18 éluée avec un gradient méthanol-eau. La fraction G a donné directement la saponine PS01 et la fraction H, la saponine PS02 et l’iridoïde PS03.

III.1.2 Elucidation structurale L’analyse combinée des spectres de RMN 1D et 2D et de masse ESI-SM et la comparaison aux données de la littérature nous ont permis de déterminer que les composés purs isolés de Poraqueiba sericea étaient tous de structures connues. Il s’agit de six triterpènes à squelette ursane (PS01-PS02, PS04-PS07, PS10) dont trois sont glucosylés en C-28 (PS01-PS02 et PS10), de deux triterpènes à squelette oléanane (PS08-PS09) et de deux iridoïdes (PS03, PS11) (Figure 42). Pour illustrer le raisonnement de l’élucidation structurale, nous allons expliquer comment la structure des génines a été établie, puis celle du sucre, le glucose, et nous terminerons par l’analyse des iridoïdes.

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Figure 41: Schéma d’extraction et de purification de Poraqueiba sericea 121

Figure 42: Structures des composés PS01-PS10 isolés de Poraqueiba sericea

III.1.2.1 Elucidation structurale des génines Le profil d’un spectre de RMN 1H de triterpènes pentacycliques est caractérisé par la présence : . de plusieurs signaux résonnants sous la forme de singulets intégrants pour 3H

entre 0,8 et 1,2 ppm correspondants aux méthyles angulaires (jusqu’à 8 CH3

singulets pour les noyaux oléananes et 6 CH3 singulets et 2 CH3 doublets pour les noyaux ursanes) 3 . du bloc des CH2 et CH (sp ) entre 0,8 et 2,2 ppm ; . des protons portés par des carbones hydroxylés entre 3,0 et 4,50 ppm, . du proton éthylénique H-12 entre 5,10 et 5,40 ppm caractéristique de

l’insaturation 12-13 des noyaux ursène et oléanène (Figure 43) Nous pouvons visualiser le signal du proton H-18, qui est soit doublet pour le noyau ursane soit doublet dédoublé pour le noyau oléanane, déblindé entre 2,60 à 2,71 ppm par la

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présence d’une fonction carbonyle en C-28. En effet le proton H-18 se retrouve dans le cône d'anisotropie du carbonyle ce qui le déblinde par rapport aux autres protons aliphatiques du triterpène. De même le spectre de RMN 13C de ces composés montre les signaux de 30 carbones répartis sur 4 zones :

. la première de 10 à 55 ppm correspond aux CH3, CH2 et CH aliphatiques (22 carbones) . la seconde de 60 à 80 ppm (4 carbones) correspond aux carbones reliés à des oxygènes . la troisième, plus déblindée, de 125 à 145 ppm, est caractéristique des deux

carbones éthyléniques 12-13, . et enfin, vers 180 ppm le signal d’un carbonyle d’acide.

Figure 43: Structure des noyaux oléanane (A) et ursane (B)

III.1.2.1.1 Elucidation structurale des composés PS04 et PS08

a) Analyse du spectre de RMN 1H du composé PS04 Le spectre de RMN 1H du composé PS04 présente de 0,7 à 2,6 ppm les signaux de six méthyles, cinq résonnant sous la forme de singulets et un sous la forme d’un doublet. Cela indique que deux des méthyles du squelette ursane sont substitués. On observe aussi dans cette zone des signaux CH, CH2 avec différentes multiplicités. Le signal du proton H-18 résonne sous la forme d’un singulet à δH 2,52, suggérant un carbone quaternaire en position C-19 avec un substituant. Dans la zone de 3,2 ppm à 4,0 ppm, les signaux de 4 protons portés par des carbones oxygénés sont observés : un triplet dédoublé (td) à 3,71 ppm (J=9,7-4,5 Hz), un doublet à 3,8 ppm (J=9,7 Hz), et deux doublets qui semblent être portés par le même carbone car en plus d’avoir la même constante de couplage (J=11,0 Hz) ils présentent un effet de « toit ». Ces données suggèrent la présence de deux CHOH et d’un CH2OH dans la molécule. Pour finir, 123

un triplet à 5,31 ppm intégrant pour un proton est caractéristique du proton éthylénique H-12 (Figure 44).

Figure 44: Spectre de RMN 1H du composé PS04 (MeOD, 600 MHz)

b) Analyse du spectre de RMN 13C du composé PS04 Sur le spectre de RMN 13C de ce composé, les signaux de 22 carbones résonnent entre

10 à 55 ppm correspondant aux CH3, CH2, CH et C aliphatiques. A l’aide du spectre de RMN 13 C Dept sont distingués 6 CH3, 8 CH2 et 4 CH et on déduit 4 carbones quaternaires (signaux disparus par rapport au spectre 13C normal).

Dans la zone des carbones reliés à des oxygènes, on a un CH2 (66,4 ppm), deux CH (69.7 ppm et 78,3 ppm) et un carbone quaternaire (73,6 ppm) (Figure 45). Les carbones éthyléniques sont observés à 129,2 ppm pour celui qui porte un proton (CH-12) et à 140,2 ppm pour celui qui est quaternaire (C-13). Enfin, le signal du carbonyle est observé à 182,3 ppm.

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Figure 45: Spectre de RMN 13C du composé PS04 (MeOD, 600 MHz)

c) Analyse des spectres COSY et HSQC du composé PS04 L'analyse combinée des spectres HSQC (Figure 46) et COSY (Figure 47) de cette molécule, nous a conduit à un noyau ursane caractérisé par les éléments suivants :

. Le proton éthylénique H-12 (δH 5,32 (t, J=5,3Hz) dont le carbone est à δC 129,2,

corrèle avec les protons H-11 (δC 24,8 ; δH 2,04 (2H, m)) en COSY, eux-mêmes

corrélés avec le proton H-9 (δH 1,81 (1H, m); δC 48,5);

. Le carbone C-3 (δC 78,3) qui porte un hydroxyle voit son proton H-3 (δH 3,38 (d,

J=9,7Hz)) corréler en COSY avec le proton H-2 (δH 3,71 (td, J=9,7 ; 4,5 Hz) dont

le carbone est également hydroxylé (δC 69,7) et le proton H-2 corrèle avec les protons H-1. La constante de couplage de 9,7 Hz qui relie les protons H-2 et H-3 indique qu’ils ne sont pas du même côté du plan et sont en position trans-diaxiale, ce qui suggère une position 3-OH β et 2-OH α pour les hydroxyles. . Comparé à un noyau ursane simple, nous observons seulement 6 méthyles (au lieu de 8), ceci nous indique que deux méthyles ont été substitués ; en effet, un signal à

66,4 ppm nous indique un CH2OH à la place d’un méthyle, l’autre méthyle devant être substitué par le carbonyle en position 28.

. Les protons du méthyle doublet H-30 résonnant à δH 0,95 (J=6,7 Hz) corrèlent avec

le proton H-20 à δH 1,37, lui-même corrélé avec les deux protons H-21 qui corrèlent avec les deux protons H-22 du cycle E (Figure 49).

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Figure 46: Spectre HSQC du composé PS04 (MeOD, 600 MHz)

Figure 47: Spectre COSY du composé PS04 (MeOD, 600 MHz) 126

d) Analyse du spectre HMBC du composé PS04 L’analyse du spectre HMBC (Figure 48) permet de compléter la structure et de placer le reste des substituants (Figure 49).

. Le signal du CH2OH à 66,4 ppm corrèle avec les protons du méthyle (Me-24) déblindé à 0.72 ppm, ce qui nous permet de placer l’hydroxyle sur le C-23, ceci est

confirmé par les corrélations HMBC observées entre les protons du CH2OH (δH 3,29 et 3,52) et les carbones C-3, C-5 et C-4.

. Le proton H-5 corrèle avec un méthyle à δC 17,5, attribué au C-25. Les protons H- 25 correspondant corrèlent avec les carbones C-1, C-5, C-10 et C-9 déjà attribués.

. Le carbone C-9 corrèle avec les protons du méthyle H-26 à δH 0,82 (C-26, δC 17,6) et ces derniers corrèlent avec les carbones C-7, C-8 et C-14. L'attribution des carbones quaternaires C-8 et C-14 se fait via la corrélation HMBC observée entre le proton éthylénique H-12 et le carbone C-14. Ces deux carbones C-8 et C-14

corrèlent avec les protons H-27 d'un second méthyle (C-27, δC 24,9) et ces derniers corrèlent avec le carbone éthylénique quaternaire C-13 et le carbone C-15. . Le proton H-12 corrèle également avec les carbones C-9, C-11 et C-13 déjà attribués ce qui nous permet de placer le carbone C-18.

. Le proton H-18 résonne sous la forme d’un singulet à δH 2,52, ce qui indique que le C-19 est quaternaire, ce dernier, repéré par sa corrélation HMBC avec H-18, ne montre en effet aucune tache de corrélation en HSQC et résonne à 73,6 ppm, suggérant qu’il est hydroxylé. De plus il corrèle avec les protons d’un méthyle

singulet à δH 1,21 (C-29, δC 27,1) et les protons du méthyle doublet H-30 (C-

30, δC 16,6). La présence de l’hydroxyle en C-19 induit également un déblindage des signaux du proton H-16 (axial) confirmant sa position alpha- axiale.

. Le carbonyle est attribué en position C-28 (δC 182,3) car il se fixe sur le carbone C- 3 17 (δC 48,9) comme l'indique le couplage JH-C observé entre ce carbone et les

protons H-18 et H-16 (équatorial, δH 1,53).

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Figure 48: Spectre HMBC (sans la zone éthylénique) du composé PS04

Figure 49: Corrélations COSY et HMBC du composé PS04

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L’ensemble de toutes ses données (Tableau 14) nous a conduit à élucider la structure de PS04 comme étant l’acide 19-α-hydroxyasiatique, ceci a été confirmé par comparaison aux données bibliographiques [Bowen-Forbes et al. 2009 ]. De plus, la position α de l’hydroxyle sur le C-19 est confirmée par une tache de corrélation reliant les protons H-29 (portés par le même carbone que l’hydroxyle) avec le H-18 ce qui signifie que le C-29 est en position β.

Tableau 14: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS04

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 0,93 1H, m 1,53 1H, dm, J=13,3 (eq) 1 47,9 16 26,6 1,96 1H, dd, J= 12,5-4,5 2,60 1H, td, J=13,3-4,6 (ax) 2 69,7 3,71 1H, td, J=9,7-4,5 17 48,9 3 78,3 3,38 1H, d, J=9,7 18 55,1 2,52 1H, sl 4 44,1 19 73,6 5 48,2 1,32 1H, m 20 43,1 1,37 1H, m 1,43 1H, m 1,25 1H, m 6 19,2 21 27,3 1,49 1H, m 1,75 1H, m 1,30 1H, m 1,64 1H, m 7 33,5 22 39,0 1,69 1H, td, J=13,7-4,2 1,75 1H, m 3,29 1H, d, J=11,0 8 41,1 23 66,4 3,52 1H, d, J=11,0 9 48,5 1,81 1H, m 24 13,9 0,72 3H, s 10 39,0 25 17,5 1,05 3H, s 11 24,8 2,04 2H, m 26 17,6 0,82 3H, s 12 129,2 5,31 1H, t, J=3,4 27 24,9 1,37 3H, s 13 140,2 28 182,3 14 42,7 29 27,1 1,21 3H, s 1,03 1H, m 15 29,6 30 16,6 0,95 3H, d, J= 6,7 1,82 1H, m

e) Elucidation structurale du composé PS08 Dans le cas du composé PS08 les cycles A, B et C sont identiques à l’acide 19-α- hydroxyasiatique (PS04) ; les changements observés se situent au niveau des cycles D et E (Tableau 15). Le carbone C-18 est plus blindé et donne un signal en RMN 13C à 43,0 ppm (55,1ppm dans PS04) et un signal en RMN 1H à 2,88 ppm doublet dédoublé (J= 14,3-4,5 Hz) indiquant deux protons voisins non équivalents et donc l’absence de substituants en position 19 suggérant un squelette oléanane. Ceci correspond avec le fait qu’il n’y ait plus de méthyles doublets mais deux méthyles singulets à 0,96 ppm (C-30, 23,9 ppm) et 0,93 ppm (C-29, 33,5 ppm).

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Le signal du carbone quaternaire hydroxylé à 73,6 ppm, correspondant au C-19 dans PS04, a disparu également et les protons H-16 ne donnent pas un signal déblindé car ils ne subissent plus l’effet de cet hydroxyle. Nous en avons déduit que nous n'étions plus en présence un dérivé d’acide ursolique mais un dérivé d’acide oléanolique. La comparaison de nos données spectrales avec celles des données bibliographiques [Bowen-Forbes et al. 2009 ], nous ont permis d'identifier ce triterpène comme étant l’acide arjunolique hydroxylé en position 2α, 3β et 23α.

Tableau 15: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS08

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 0,90 1H, m 1,61 1H, m 1 47,9 16 24,0 1,96 1H, m 2,04 1H, td, J=15,8-4,0 2 69,7 3,71 1H, m 17 49,0 3 78,2 3,38 1H, d, J=9,5 18 43,0 2,88 1H, dd, J=14,3-4,5 1,16 1H, m 4 44,1 19 47,2 1,71 1H, m 5 48,2 1,31 1H, m 20 31,6 1,42 1H, m 1,56 1H, m 6 19,1 21 34,9 1,48 1H, m 1,76 1H, m 1,31 1H, m 1,23 1H, m 7 33,3 22 33,8 1,64 1H, m 1,41 1H, m 3,29 1H, d, J=10,9 8 40,4 23 66,4 3,53 1H, d, J=10,9 9 48,7 1,69 1H, m 24 13,8 0,72 3H, s 10 39,0 25 17,5 1,06 3H, s 11 24,6 1,97 2H, m 26 17,8 0,84 3H, s 12 123,4 5,27 1H, t, J=3,7 27 26,4 1,20 3H, s 13 145,4 28 nd 14 42,7 29 33,5 0,93 3H, s 1,10 1H, dm, J=13,4 15 28,8 30 23,9 0,96 3H, s 1,80 1H, td, J=13,4-4,0 nd : non détécté

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III.1.2.1.2 Elucidation structurale du composé PS05 Le composé PS05, comparé à PS04, présente des différences uniquement au niveau du cycle A. En effet, le proton H-3 est plus déblindé résonnant à 3,63 ppm (3,38 ppm dans PS04) avec une constante de couplage de 2,5 Hz ce qui indique que le proton H-3 est du même côté du plan que le proton H-2 (3,91 ppm, ddd, J= 11,7 ; 4,1 ; 3,0 Hz). L'hydroxyle en position C-3 n'est plus en position beta mais en position alpha. Ceci est confirmé par le déplacement chimique du méthyle C-24 qui se trouve déblindé (17,6 ppm) vu qu’il ne subit plus l’effet de l’hydroxyle porté par le C-3. Le carbone C-23 va être également plus déblindé à cause de l’OH en position α et résonne à 71,3 ppm (66,4 ppm dans le cas de PS04). Ces éléments et la comparaison avec des données bibliographiques [Hirai et al. 2000], nous permette d’identifier le composé PS05 comme étant l’acide myrianthique (Tableau 16).

Tableau 16: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS05

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 1,35 1H, m 1,54 1H, m 1 42,2 16 26,6 1,61 1H, m 2,61 1H, td, J=13,1-4,8 2 67,2 3,91 1H, ddd, J= 11,7-4,1-3,0 17 49,0 3 78,5 3,63 1H, d, J= 2,5 18 54,8 2,53 1H, sl 4 42,5 19 73,3 5 44,2 1,59 1H, m 20 43,1 1,37 1H, m 1,75 1H, m 6 19,1 1,40 2H, m 21 27,3 1,25 1H, m 1,67 1H, m 1,75 1H, m 7 33,7 22 38,7 1,30 1H, m 1,65 1H, m 3,42 1H, d, J=11,0 8 40,8 23 71,3 3,56 1H, d, J=11,0 9 48,4 1,92 1H, dd J=10,7-7,2 24 17,6 0,81 3H, s 10 38,8 25 17,3 1,05 3H, s 11 24,7 2,05 2H, m 26 17,6 0,82 3H, s 12 129,3 5,33 1H, t, J=3,6 27 24,9 1,38 3H, s 13 140,1 28 182,3 14 42,7 29 27,0 1,22 3H, s 1,02 1H, m 15 29,6 30 16,7 0,95 3H, d, J= 6,7 1,82 1H, td, J=14,0 ; 4,5

131

III.1.2.1.3 Elucidation structurale du composé PS06 Le composé PS06, lui aussi, se différencie de l’acide 19-α-hydroxyasiatique (PS04) par des changements sur le cycle A (Tableau 17). Les hydroxyles en positions C-2 et C-3 sont toujours en position α et β, respectivement, vu la constante de couplage de 9,5 Hz entre les protons H-2 et H-3, mais cette fois le carbone C-3 est plus déblindé (86,0 ppm au lieu d’environ 79 ppm pour PS04 et PS05), c’est-à-dire qu’il subit l’effet d’un groupement en β (du même côté du cycle que lui). Ceci suggère un changement au niveau des méthyles 23 et 24. Sur le spectre de RMN 13C le signal blindé du Me-24 à 17,6 ppm (0,81 ppm, s) dans PS05 à disparu et un méthyle à 23,8 ppm (1,25 ppm, s) est observé dans PS06, identifié au C- 23; l’hydroxyle est donc positionné sur le carbone C-24 (66,2 ppm). Le composé PS06 est identifié à l’acide hyptatique B [Bowen-Forbes et al. 2009 ].

Tableau 17: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS06

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 0,93 1H, m 1,53 1H, m 1 47,8 16 26,6 1,98 1H, dd, J=12,4 -4,4 2,60 1H, td, J=13,3- 4,4 2 69,6 3,81 1H, td, J= 11,3-4,4 17 49,0 3 86,0 3,08 1H, d, J=9,5 Hz 18 55,1 2,52 1H, sl 4 44,4 19 73,6 5 57,2 1,01 1H, m 20 43,1 1,36 1H, m 1,44 1H, td, J=12,4- 3,2 1,24 1H, m 6 19,9 21 27,3 1,65 1H, m 1,75 1H, m 1,34 1H, m 1,64 1H, m 7 34,4 22 39,1 1,55 1H, m 1,75 1H, m 8 41,1 23 23,8 1,26 3H, s 3,41 1H, d, J=11,2 9 48,7 1,76 1H, m 24 66,2 4,05 1H, d, J=11,2 10 39,0 25 17,5 1,01 3H, s 11 25,0 2,04 2H, m 26 17,4 0,80 3H, s 12 129,1 5,31 1H, t, J=3,4 27 24,8 1,35 3H, s 13 140,1 28 182,3 14 42,6 29 27,1 1,22 3H, s 1,02 1H, m 15 29,6 30 16,6 0,95 3H, d, J= 6,7 1,81 1H, td, J=13,7-4,7

132

III.1.2.1.4 Elucidation structurale du composé PS07 Le composé PS07 (Figure 42, Tableau 18) a été identifié comme étant la trachélosperogénine B1 [Abe and Yamauchi 1987] par comparaison avec les spectres de PS04. En effet, les spectres de RMN 13C et HSQC montrent un méthyle (3,9 ppm, Me-24) en moins et un méthylène hydroxylé (CH2OH) à 62,7 ppm en plus, indiquant que le méthyle manquant a été hydroxylé. Cette fois, les positions 23 et 24 sont toutes les deux hydroxylées.

Tableau 18: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS07

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 0.80 1H, t, J=11.9 1.41 1H, dm ; J=13.2 1 47.7 16 26.6 1.84 1H, dd, J= 12.4- 4.5 2.48 1H, td, J=13.2 ; 4.6 2 69.9 3.74 1H, ddd, J= 11.3- 9.6-4.5 17 49.0 3 79.5 3.37 1H, d, J=9.6 18 55.1 2.40 1H, sl 4 48.2 19 73.6 5 48.3 1.30 1H, m 20 43.1 1.25 1H, m 1.31 1H, m 0.89 1H, m 6 19.8 21 27.3 1.50 1H, m 1.62 1H, m 1.17 1H, m 1.52 1H, m 7 33.9 22 39.0 1.52 1H, m 1.63 1H, m 3.42 1H, d, J=11.6 8 41.1 23 64.5 3.96 1H, d, J=11.6 3.53 1H, d, J=11.4 9 48.7 1.69 1H, t, J=9.2 24 62.7 3.95 1H, d, J= 11.4 10 38.8 25 17.4 0.93 3H, s 11 25.0 1.93 2H, m 26 17.3 0.68 3H, s 12 129.1 5.19 1H, t, J=3.4 27 24.8 1.24 3H, s 13 144.1 28 182,3 14 42.7 29 27.1 1.09 3H, s 1.13 1H, m 15 29.6 30 16.6 0.83 3H, d, J= 6.7 1.69 1H, m

III.1.2.1.5 Elucidation structurale du composé PS09 L'élucidation structurale du composé PS09 (Figure 42, Tableau 19) a été réalisée par comparaison des données spectrales de ce composé avec celles des composés PS07 et PS08. Les signaux des cycles A, B et C sont identiques à ceux de PS07, suggérant des hydroxylations en C-23 et C-24. Comme pour le composé PS08, nous sommes en présence d'un dérivé de l’acide oléanolique car les signaux des méthyles Me-29 et Me-30 sont portés par le même carbone C- 20 (déduction des corrélations COSY et HMBC). La présence d’un signal à 81,0 ppm (CHOH) corrélant avec le C-18 en HMBC indique que le C-19 est hydroxylé. La petite constante de couplage (J = 3,8 Hz) entre les protons H-18 et H-19 suggère que les protons sont du même côté et donc que l'hydroxyle est en position alpha axiale. De plus, en ROESY,

133

nous observons une tache de corrélation entre le H-18 et H-19 ce qui les place du même côté β et l’hydroxyle en α. Ces éléments nous ont permis d’identifier le composé PS09 comme la trachélosperogénine E [Nasser et al. 2006].

Tableau 19: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS09

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 0,91 1H, dd, J= 12,6-9,5 1,62 1H, m 1 47,5 16 28,5 1,93 1H, dd, J= 12,6-4,5 2,31 1H, td, J=14,2-3,6 2 69,5 3,86 1H, td, J= 9,6-4,5 17 46,7 3 79,2 3,49 1H, d, J=9,7 18 45,1 3,07 1H, d, J=3,8 Hz 4 48,1 19 82,1 3,28 1H, d, J= 3,8 5 48,4 1,43 1H, m 20 36,0 1,45 1H, m 1,65 1H, m 6 19,8 21 29,5 1,62 1H, m 1,78 1H, td, J=10,0-3,4 1,27 1H, m 1,64 1H, m 7 33,7 22 34,0 1,60 1H, m 1,80 1H, td, J=13,2-3,4 3,54 1H, d, J=11,6 8 40,7 23 64,2 4,08 1H, d, J=11,6 3,65 1H, d, J=11,6 9 49,4 1,86 1H, d, J=9,2 24 62,4 4,07 1H, d, J=11,6 10 38,9 25 17,3 1,04 3H, s 11 25,0 2,01 2H, m 26 17,6 0,77 3H, s 12 124,3 5,34 1H, t, J=3,2 27 25,1 1,33 3H, s 13 144,7 28 182,3 14 42,6 29 28,7 0,95 3H, s 1,02 1H, m 15 29,4 30 25,0 0,99 3H, s 1,64 1H, m

III.1.2.1.6 Elucidation structurale des génines des composés PS01, PS02 et PS10 En ce qui concerne les composés PS01, PS02 et PS10 ce sont, respectivement des glucosides de la trachélosperogénine B1 (PS07), de l’acide hydroxyasiatique (PS04) et de l’acide hyptatique B (PS06) (Figure 42). Pour chacun de ces composés, une unité osidique est attachée sur le carbonyle en position C-28 comme le montre le blindage de ce dernier à 178,6 ppm (au lieu de 182 ppm). Nous allons voir l’élucidation du sucre ci-après.

III.1.2.2 Élucidation structurale des sucres : La présence d’un β-D-glucose dans les 3 composés PS01, PS02 et PS10 (Tableau 20) a été établie par la présence de signaux supplémentaires dont ceux d’un proton anomérique à 5,22 ppm (1H, d, J=8,2 Hz) sur le spectre de RMN 1H (pour PS01) et ceux d’un carbone

134

anomérique à 95,8 ppm sur le spectre de RMN 13C (pour PS01). Le blindage du carbone anomérique (< 98 ppm) est caractéristique d'une unité osidique engagée dans une liaison ester. Les autres signaux du sucre sont localisés dans une région entre 3,22 ppm à 3,60 ppm (C-2’ à C-6’) (Tableau 20). La nature du sucre a été déduite par l’analyse des spectres COSY et HSQC et par la mesure des constantes de couplage sur le spectre de RMN 1H. Les constantes supérieures à 8 Hz pour les protons H-2, H-3 et H-4 indiquent que les protons sont en position trans-diaxale, caractéristiques d’un glucopyranose. Ceci est confirmé par les déplacements chimiques des carbones [Bock and Pedersen 1983 ]. Pour les trois composés une corrélation HMBC est observée entre le proton H-1’ (δ 5,22) du glucose et le carbone C-28 (δ 178,6) de l’aglycone confirmant la liaison glycosidique ester. Les composés PS01, PS02 et PS10 ont été identifiés comme étant respectivement le niga-ishigoside F1, le trachelosperoside B1 et le 4-epi-niga-ishigoside F1 (Figure 42) [Bowen-Forbes et al. 2009 ]. Tableau 20: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz)

du β-D-glucopyranose des composés PS01, PS02 et PS10

N° δC δH Multiplicité/J PS02 1’ 95,4 5,34 1H, d, J=8,2 Hz 2’ 73,2 3,33 1H, m 3’ 77,9 3,42 1H, t, J= 8,4 Hz 4’ 70,7 3,38 1H, t, J= 8,2 Hz 5’ 78,2 3,35 1H, m 3,69 1H, dd, J=11,9-4,5 HZ 6’ 62,1 3,81 1H, dd, J=11,9-1,8 HZ PS10 1’ 95,7 5,22 1H, d, J=8,2 2’ 73,8 3,22 1H, m 3’ 78,3 3,30 1H, t, J=8,8 4’ 71,0 3,26 1H, m 5’ 78,6 3,22 1H, m 3,58 1H, dd, J=12,1-4,6 6’ 62,5 3,70 1H, dd, J=12,1-2,0 PS01 1’ 95,8 5,22 1H, d, J=7,5 2’ 73,9 3,21 1H, m 3’ 78,3 3,30 1H, t, J=8,6 4’ 71,1 3,25 1H, m 5’ 78,6 3,23 1H, m 3,57 1H, dd, J=12,0-4,7 6’ 62,4 3,70 1H, dd, J=12,0-1,9 III.1.2.3 Elucidation structurale des séco-iridoïdes glycosides Les composés PS03 et PS11 montrent des spectres de RMN 1H identiques à part pour trois protons d’un singulet à 3,70 ppm découlant d’un méthyle d’une fonction méthoxycarbonyle pour PS11 (Tableau 21).

135

III.1.2.3.1 Analyse des spectres de RMN 1H du composé PS11 Sur le spectre de RMN 1H (Figure 50) de ce composé sont observés : . Un fin doublet à 7,49 ppm (J=1,8 Hz) indiquant la présence d’un proton éthylénique dont le carbone est oxygéné.

. Quatre protons déblindés à δH 5,65 (1H, dt, J=17,1-10,0 Hz), 5,50 (1H, d, J=3,8

Hz), 5,28 (dd, J=17,1-10,0-1,5 Hz) et 5,26 (dd, J=17,1-1,5 Hz). Le proton à δH

5,65 couple avec les protons à δH 5,26 et 5,28 indiquant une double liaison

terminale (CH=CH2). . Les protons d'un hexose (entre 3,3 et 3, 8 ppm) dont le proton anomérique

résonne à δH 4,67 (d, J=7,8 Hz) (Tableau 21). . Un singulet intense intégrant pour trois protons à 3,70 ppm.

. Un doublet dédoublé à δH 2,95 (J=16,6-5,0 Hz) intégrant pour un proton, couplé

au proton à δH 2,28 (dd, J=16,6-9,0 Hz).

. Un doublet de doublet dédoublé à δH 2,83 (ddd, J=10,0-5,6-3,8 Hz) intégrant pour un proton.

Figure 50: Spectre de RMN 1H du composé PS11 (600 MHz)

III.1.2.3.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC du composé PS11 Sur le spectre de RMN 13C (Figure 51) du composé PS11, 16 carbones sont identifiés dont 6 sont assignés à la partie glucidique et 10 à l’aglycone.

136

Pour l'unité osidique, nous observons le C-1’ à δC 99,9 portant le proton anomérique

(δH 4,67) et cinq carbones entre 60 et 76 ppm : C-5’ à 78,4 ppm (δH 3,37); C-3’ à 77,9 ppm

(δH 3,37); C-2’ à 74,6 ppm (δH 3,23); C-4’ à 71,5 ppm (δH 3,31) et C-6’ à 62,7 ppm (H-6’α à

δH 3,91 et H-6’β à δH 3,68). Ces déplacements chimiques et les constantes de couplage attribuées sur le spectre de RMN 1H indiquent que nous avons un β-D-glucopyranose [Bock and Pedersen 1983 ]. Pour l'aglycone sont assignés les carbones suivants :

. Deux carbonyles à δC 168,9 (C-11) et 176,2 (C-7) indiquant respectivement un groupement ester carboxylique et une fonction acide carboxylique.

. Quatre carbones éthyléniques à δC 153,6 (C-3, δH 7,49), δC 134,4 (C-8, δH 5,65),

δC 120,6 (C-10) et δC 110,1 (C-4, quaternaire). Le carbone à δC 120,6 porte les

deux protons géminés à δH 5,26 (H-10α) et δH 5,28 (H-10β).

. Un carbone hémi-acétalique à δC 97,6 (C-1) portant le proton à δH 5,50.

. Un carbone appartenant à groupement méthoxy à δC 51,6 (C-12) portant les

protons du méthyle à δH 3,70. . Un méthyne déblindé à 45,3 ppm (C-9) portant le doublet de doublet dédoublé à

δH 2,83.

. Un méthylène à 35,0 ppm qui porte les deux doublets dédoublés à δH 2,95 et 2,28.

. Un méthyne à δC 28,5 portant un proton dont le signal se superpose avec celui du solvant (MeOD) à 3,33 ppm.

Figure 51: Spectre de RMN 13C (150 MHz) du composé PS11 Ces informations (Tableau 21) indiquent que nous sommes en présence d'un sécoiridoïde glycosylé de type sécologanine.

137

III.1.2.3.3 Analyse des spectres COSY et HMBC du composé PS11 . Les protons géminés H-6α et β corrèlent sur le spectre COSY avec le proton H-5

(δH 3,33) qui couple aussi avec le proton H-9 (δH 2,83), ce qui situe le carbone C-5 entre les carbones C-6 et C-9. Sur le spectre HMBC les protons H-6

corrèlent avec le carbonyle d'acide à δC 176,2 (C-7) et les carbones C-5 (δC

28,5), C-9 (δC 45,3), et le carbone éthylénique quaternaire C-4 (δC 110,1). . Le proton H-9 corrèle sur le spectre COSY, en plus du proton H-5, avec les

protons H-1 (δH 5,50) et H-8 (δH 5,65) et ce dernier corrèle avec les protons géminés H-10, ces trois protons constituent le groupement vinylique accroché sur le carbone C-9. Le proton H-9 donne sur le spectre HMBC des corrélations

avec les carbones C-5, C-1 (δC 97,6), C-4, C-8 (δC 134,5) et C-10 (δC 120,6). De même le proton H-8 corrèle en HMBC avec les carbones C-9, C-1 et C-10, confirmant la structure vinylique. . Le proton H-5 corrèle sur le spectre HMBC, en plus des carbones C-6, C-7 et C-

9, avec les carbones éthyléniques C-3 (δC 153,6) et C-4.

. Le proton H-3 (δH 7,49) corrèle en HMBC avec les carbones C-5, C-1, C-4 et le carbonyle d'ester à 168,9 ppm (C-11) et le proton H-1 corrèle en HMBC avec 3 les carbones C-5, C-8 et C-3. La constante de couplage JH-C entre H-3/C-1 ou H-1/C-3 se fait à travers un oxygène et confirme la structure hétérocylique du loganoside. . Le proton H-1 corrèle également avec le carbone C-1’ du glucose ce qui nous permet de fixer le sucre sur l'hydroxyle en position 1 de la génine. L'ensemble de ces corrélations nous ont permis d’établir que le composé PS11 était la secoxyloganine [Calis and Sticher 1984]. Le composé PS03 quant à lui est le secologanoside [Calis and Sticher 1984] dont la seule différence avec PS11 est l’absence du groupe méthoxycarbonyle (Figure 52).

Figure 52: Structure des composés PS11 (R=Me) et PS03 (R=H)

138

Tableau 21: Déplacements chimiques RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé PS11

δC δH Multiplicité/J Hz δC δH Multiplicité/J Hz 1 97,6 5,50 1H, d, J=3,8 1’ 99,9 4,67 1H, d, J=7,85 3 153,6 7,49 1H, d, J=1,8 2’ 74,6 3,23 1H, dd, J= 9,0-7,9 4 110,1 3’ 78,0 3,37 1H, t, J=8,7 5 28,5 3,33 1H, m 4’ 71,5 3,31 1H, t, J=9,6 2,95 1H, dd, J=16,6-5,0 6 35,0 5’ 78,4 3,32 1H, m 2,28 1H, dd, J=16,6-9,0 7 176,2 8 134,5 5,65 1H, dt, J=17,1-10,0 9 45,3 2,83 1H, ddd, J=10,0-5,6-3,8 3,68 1H, dd, J=11,9-5,7 5,26 1H, dd, J=10,0-1,5 6’ 62,7 10 120,6 3,91 1H, dd, J=11,9-1,9 5,28 1H, dd, J=17,1-1,5 11 168,9 12 51,6 3,70 3H, s

III.2 Dendrobangia boliviana III.2.1 Purification

Après macération (MeOH/H2O 80/20 v/v) des racines broyées, une analyse par CCM de l'extrait hydromethanolique montre la présence de tanins qui se manifestent sous forme d’une tache brunâtre avec un Rf nul en phase normale, et de composés dont la couleur violacée après révélation est en général caractéristique des saponines. Afin d'enrichir l'extrait en saponines, nous avons appliqué un protocole de purification spécifique aux saponines qui consiste à les faire précipiter dans l’acétone. Le précipité (DBP) enrichi en saponines a ensuite été passé sur une résine Amberlite IRN77, échangeuse d’ions, pour faire passer toutes les saponines sous leur forme protonée et ainsi faciliter leur purification. Un fractionnement a été réalisé avec une CLV sur silice greffée C-18 (élution avec

MeOH/H2O de polarité décroissante) pour donner 9 fractions, désignées DB-A à DB-I, après regroupement des fractions selon leurs profils chromatographiques (CLHP et CCM). Les fractions DB-A à DB-D ne contenaient que les composés très polaires comme les tanins et les sucres et n’ont pas été purifiées. Les fractions DB-E à DB-H contenant les saponines ont été

fractionnées par chromatographie flash soit sur silicagel (gradient CHCl3/MeOH de polarité

croissante), soit sur silice greffée C-18 (gradient MeOH/H2O de polarité décroissante) et la purification a été finalisée par une CLHP semi-préparative ce qui nous a permis d’obtenir 14 saponines notées DB01 à DB14. Le protocole d’extraction et de purification est représenté dans la figure 53.

139

III.2.2 Elucidation structurale Les composés isolés ont été analysés en RMN 1D et 2D et en spectrométrie de masse afin de pouvoir établir leurs structures et les nommer.

III.2.2.1 Elucidation structurale des composés DB11 et DB07 Le spectre de masse HR-ESI-SM effectué en mode positif du composé DB07 nous a révélé les ions pseudo-moléculaires [M+H]+ à m/z 839,4429 et [M+Na]+ à m/z 861,4249 dont la formule correspondante est de C43H66O16, ce qui suggère que nous avons une génine et deux unités osidiques.

III.2.2.1.1 Analyse du spectre de RMN 1H du composé DB11 Le spectre de RMN 1H (Figure 54) du composé DB11 présente différents signaux caractéristiques d'un squelette oléane-12-ène : . Six groupements méthyles de 0,70 à 1,10 ppm dont les signaux sont singulets et

correspondants aux CH3 angulaires ; . Un bloc de signaux dans la zone entre 0,8 et 1,9 ppm qui sont les groupements

aliphatiques CH et CH2 de la génine ; . Le proton H-18 résonnant sous la forme d'un doublet dédoublé (J=13,8-4,5 Hz) à

δH 2,58, déblindé car dans le cône d'anisotropie du carbonyle en position C-28 ;

. Le proton H-3 résonnant à δH 3,07 sous la forme d'un doublet dédoublé (J=11,5- 4,2 Hz) indiquant l’absence de substitution en position 2 ;

. Le proton éthylénique H-12 à δH 5,21 (J=3,3 Hz) caractéristique de l’insaturation

12-13.

. La présence d’un singulet intégrant pour trois protons à δH 3,59 et appartenant à un groupement méthoxy est également observé (Figure 54).

140

Figure 53: Schéma d’extraction et de purification de Dendrobangia boliviana 141

En plus des signaux de la génine, nous observons le signal d’un proton anomérique à 4,28 ppm (d, J=7,1 Hz) et les signaux de quatre méthines hydroxylés résonnant entre 3,0 et 3,7 ppm suggérant un acide uronique avec une fonction acide en position 6 du sucre. L’attribution des protons H-2’ à H-5’ est établie par analyse du spectre COSY et la mesure des constantes de couplages supérieures à 8 Hz oriente vers un acide glucuronique.

Figure 54: Spectre de RMN 1H du composé DB11 (MeOD, 600 MHz)

III.2.2.1.2 Analyse des spectres de RMN 13C et HSQC du composé DB11 Sur le spectre de RMN 13C (Figure 55) nous distinguons 25 signaux compris entre 15 et 57 ppm correspondants aux groupements aliphatiques CH, CH2 et CH3 de la génine en plus d’un groupement méthoxy à δC 52,3 portant les protons à 3,59 ppm. Les carbones C-12 et C-

13 de l’insaturation 12-13 résonnent à δC 124,2 (δH 5,20) et 144,7. Nous observons aussi deux carbonyles à δC 181,3 et 178,8.

Pour la partie osidique, le carbone anomérique est repéré à δC 107,0 portant le proton à

4,28 ppm et quatre carbones osidiques à δC 77,8 (C-3’, δH 3,26) ; 76,3 (C-5’, δH 3,64) ; 75,3

(C-2’, δH 3,14) et 76,3 (C-4’, δH 3,39). Ces déplacements chimiques sont similaires à ceux de l’acide β-D-glucuronique [Bock and Pedersen 1983 ].

142

Figure 55: Spectre de RMN 13C du composé DB11 (MeOD, 150 MHz)

III.2.2.1.3 Analyse du spectre HMBC du composé BD11 Les corrélations HMBC observées à partir des protons des différents méthyles angulaires nous permettent d’attribuer pratiquement l’ensemble des carbones de la génine comme nous l’avons décrit dans le cas des triterpènes isolés de Poraqueiba sericea. Ainsi sont confirmés la double liaison 12-13, l’hydroxyle en position 3 et l’acide carboxylique en position C-28. L’autre groupement carbonyle à δC 178,8 corrèle avec les protons H-19β (δH

1,57) ; H-21α (δH 1,27) et le méthyle H-29 (δH 1,03) ce qui le place en position C-30, porté par le carbone quaternaire C-20 (δC 45,0). Une dernière corrélation entre ce carbone C-30 et les protons du groupement méthyle à δH 3,59 indique qu’il s’agit d’une fonction ester méthylique en cette position. Ces données sont en accord avec l’acide serjanique ou acide 3β- hydroxy-30-carboxylate de méthyle oléane-12-ène-28-carboxylique [Montoya Pelaez et al. 2013]. La structure de l’acide β-D-glucuronique est confirmée par les corrélations HMBC, mais nous n’observons aucun signal correspondant au C-6’ qui est une fonction acide dont le signal résonne vers 172 ppm. L’absence de ce signal et la faible intensité des signaux des carbones C-5’ et C-4’ de l’unité osidique nous indique une forme ionisée de l’acide. Une corrélation est observée entre H-1’du sucre et C-3 de la génine ce qui nous donne la position du sucre sur la génine.

Ces données expérimentales (Tableau 22) comparées aux données de la littérature nous ont permis d’établir la structure du composé DB11 comme étant l’acide 3-O-β-D- glucuronopyranosyl serjanique [Jayasinghe et al. 1998].

143

Figure 56: Structure du composé DB11

III.2.2.1.4 Analyse des spectres de RMN 1D et 2D du composé DB07 En comparaison avec ceux du composé DB11, les signaux en RMN 1H (Figure 57) et RMN 13C (Tableau 22) correspondant à la génine du composé DB07 sont identiques sauf pour le C-28 qui est plus blindé et résonne à δC 178,7 (au lieu de 181,3 pour DB11) indiquant une liaison ester en cette position.

Pour la partie osidique, le proton anomérique à δH 4,28 et son carbone à δC 107,0 et les autres carbones osidiques correspondants à l’acide β-D-glucuronique sont retrouvés.

Figure 57: Spectre de RMN 1H du composé DB07 (MeOD, 600MHZ)

144

La différence entre ces composés est la présence d’une deuxième unité osidique dont le proton anomérique est à δH 5,25 (d, J=8,2 Hz) et le carbone anomérique à δC 95,8. Les corrélations COSY et HSQC nous ont permis d’identifier un β-D-glucopyranose attaché à la génine via une liaison ester [Bock and Pedersen 1983 ]. Ceci est confirmé par la corrélation HMBC observée entre le proton anomérique H-1’’ du β-D-glucopyranose et le C-28.

La comparaison avec des données de littérature nous a permis d’élucider la structure du composé DB07 comme étant le talunùmoside I (Figure 58) ou acide 3-O-β-D- glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique [Kohda et al. 1992].

Figure 58: Structure du composé DB07

145

Tableau 22: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des composés DB11 et DB07

DB11 DB07 DB11 DB07 δC δH δC δH δC δH δC δH 0,89 0.89 1,55 1.67 1 39,7 39.8 16 24,2 24.2 1,51 1.52 1,90 1.95 1,59 1.60 2 27,0 27.0 17 47,0 47.4 1,76 1.75 3 91,1 3,07 91.2 3.06 18 44,0 2,59 43.9 2.60 1,57 1.59 4 40,1 40.2 19 43,3 43.3 1,83 1.85 5 56,9 0,69 57.0 0.69 20 45,0 45.0 1,30 1.31 1,27 1.28 6 19,3 19.4 21 31,3 31.3 1,45 1.44 0,89 1.90 1,21 1.21 1,48 1.45 7 34,0 34.0 22 35,0 34.4 1,40 1.39 1,51 1.61 8 40,5 40.7 23 28,5 0,95 28.4 0.95 9 48,9 1,50 49.0 1.49 24 16,9 0,75 16.9 0.75 10 37,9 37.9 25 15,9 0,85 16.0 0.85 11 24,5 1,81 24.5 1.81 26 17,7 0,70 17.7 0.69 12 124,3 5,20 124.4 5.21 27 26,3 1,07 26.2 1.06 13 144,7 144.4 28 181,3 178.7 14 42,7 42.8 29 28,7 1,03 28.6 1.04 0,99 1.00 30 178,8 177.5 15 28,8 28.9 1,65 1.68 31 52,3 3,59 52.4 3.59 Unités osidiques DB07 DB11 1’ 107.0 4,28 1’’ 95,8 5,25 1’ 107,0 4,28 2’ 75,3 3,14 2’’ 73,9 3,19 2’ 75,3 3,14 3’ 77,6 3,25 3’’ 78,3 3,29 3’ 77,8 3,26 4’ 73,2 3,41 4’’ 71,1 3,24 4’ 73,3 3,39 5’ 76,5 3,67 5’’ 78,8 3,22 5’ 76,3 3,64 3,57 6’ 172,6 6’’ 62,4 6’ nd 3,70

III.2.2.2 Elucidation structurale du composé DB10 Le composé DB10 possède l’acide serjanique comme génine, comme pour DB11, et le déplacement chimique du C-28 à δC 181,3 signifie qu’il n’y a pas de substitution sur cette position. Sur le spectre de RMN 1H (Figure 59), nous observons la présence de deux unités osidiques repérées par deux protons anomériques résonnants à δH 4,41 (d, J=7,9 Hz) et δH 5,19 (d, J=1,7

Hz) ainsi qu’un méthyle doublet à δH 1,25 (d, J=6,2 Hz) suggérant un desoxy-6-hexose. Le signal à δH 4,41 (δC 106,8) correspond au proton anomérique H-1’ de l’acide β-D- glucuronique comme pour le composé DB11 et dans ce cas, ce sucre est sous forme protonée car nous arrivons à bien distinguer tous les signaux protons et carbones de cette unité osidique

(Tableau 23). Le proton anomérique H-1’’ qui résonne à δH 5,19 (δC 102,8) sous la forme d’un doublet avec une petite constante de couplage de 1,7 Hz appartient à un desoxy-6 hexose dont les protons H-6’’ résonnent sous la forme d’un doublet à 1,25 ppm. Grâce aux corrélations COSY (Figure 60) et HSQC nous arrivons à attribuer l’ensemble du système de spin (Tableau 23) d’un α-L-rhamnopyranose [Bock and Pedersen 1983 ]. 146

Figure 59: Spectre de RMN 1H du composé DB10 (MeOD, 600 MHz)

L’enchaînement des deux unités osidiques entre-elles et sur la génine est établie par analyse du spectre HMBC qui montre des corrélations HMBC entre : . Le proton H-1’ de l’acide β-D-glucuronique (GlcA-H-1’) et le carbone C-3 de

la génine à δC 91,2 ce qui indique la position de ce sucre sur l’acide serjanique,

. Le proton H-1’’ de l’α-L-rhamnopyranose (Rha-H-1’’) et un carbone à δC 83,4 identifié comme étant le C-3’ (GlcA-C-3’) de l’acide β-D-glucuronique. Ce carbone est déblindé par comparaison aux composés DB07 et DB11 (~78 ppm) confirmant la substitution en cette position. Ces données expérimentales nous ont permis d’établir la structure du composé DB10 comme un acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl serjanique (Figure 61). La recherche bibliographique montre qu’il s’agit d’un nouveau glycoside de l’acide serjanique. Tableau 23: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques du composé DB10

N° δC δH Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 106,8 4,41 1H, d, J=7,9 2’ 76,0 3,36 1H, t, J=8,2 3’ 83,4 3,54 1H, t, J=9,0 4’ 71,9 3,58 1H, t, J=9,1 5’ 76,6 3,82 1H, d, J=9,3 6’ 172,6 α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 102,8 5,19 1H, d, J=1,7 2’’ 72,4 3,96 1H, dd, J=3,3-1,7 3’’ 72,3 3,71 1H, dd, J= 9,5-3,3 4’’ 74,0 3,41 1H, t, J= 9,5 5’’ 70,0 4,02 1H, dq, J=9,5-6,2 6’’ 17,9 1,25 1H, d, J=6,2 147

Figure 60: Corrélations COSY des unités osidiques du composé DB10

Figure 61: Structure du composé DB10

148

III.2.2.3 Elucidation structurale du composé DB04

La génine du composé DB04 est l’acide serjanique estérifié en position C-28 (δC 177,6) comme pour le composé DB07. C’est au niveau de la partie osidique que nous observons des changements. Sur le spectre de RMN 1H (Figure 62) de ce composé nous distinguons trois protons anomériques à

δH 4,59 (d, J=7,7 Hz, δC 106,8); 5,19 (d, J=1,5 Hz, δC 102,8) et 5,36 (d, J=8,2 Hz, δC 95,8).

Figure 62: Spectre de RMN 1H du composé DB04 (MeOD, 600 MHz) L’analyse des spectres 2D COSY (Figure 63), HSQC et HMBC nous ont permis d’identifier les carbones et les protons de chaque unité osidique (Tableau 24). Les données obtenues nous ont permis d’identifier l’acide β-D-glucuronique (H-1’ à δH 4,59) substitué en position C-3’comme le suggère le déplacement chimique de ce carbone (δC 83,4), l’α-L- ’’ ’’’ rhamnopyranose (H-1 à δH 5,19) et le β-D-glucopyranose (H-1 à δH 5,36) [Bock and Pedersen].

Les taches de corrélation observées en HMBC entre GlcA-H-1’/C-3 (δC 91,2), Rha-H- ’’ ’’’ 1 /GlcA-C-3’ (δC 83,4) et Glc-H-1 /C-28 (δC 177,6) nous ont permis de relier ces sucres entre eux et avec la génine. Grâce à ces données le composé DB04 a été identifié comme étant l’acide 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique (Figure 64) qui est de structure nouvelle.

149

Figure 63: Spectre COSY (de 3,2 à 4,5 ppm) du composé DB04 (MeOD, 600 MHz)

Figure 64: Structure du composé DB04

150

Tableau 24: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques du composé DB04

N° δC δH Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 106,8 4,59 1H, d, J=7,8 2’ 76,0 3,36 1H, m 3’ 83,4 3,53 1H, t, J=8,9 4’ 71,9 3,58 1H, t, J=9,1 5’ 76,6 3,82 1H, d, J=9,5 6’ 172,6 α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 102,8 5,19 1H, d, J=1,5 2’’ 72,4 3,96 1H, dd, J= 3,3-1,5 3’’ 72,3 3,71 1H, dd, J=9,6-3,3 4’’ 74,0 3,41 1H, t, J=9,6 5’’ 70,0 4,02 1H, dq, J=9,6-6,2 6’’ 17,9 1,25 1H, t, J=6,2 β-D-glucopyranosyl 1’’’ 95,8 5,36 1H, d, J=8,2 2’’’ 73,9 3,32 1H, dd, J= 9,0-8,2 3’’’ 78,3 3,42 1H, t, J=9,0 4’’’ 71,1 3,36 1H, m 5’’’ 78,8 3,35 1H, m 3,69 1H, dd ; J=12,3-4,4 6’’’ 62,3 3,83 1H, dd, J=12,3-2,0

III.2.2.4 Elucidation structurale des composés DB12, DB14 et DB06 Pour ces trois composés la génine reste inchangée, il s’agit de l’acide serjanique avec la fonction acide en position 28 libre chez DB12 et DB14 ou glucosylée pour DB06. La partie qui varie entre ces composés et en comparaison avec les molécules déjà résolues, concerne les unités osidiques attachées à la génine dont nous allons discuter les éléments important qui nous ont permis de les identifier et de les relier au reste de la molécule.

III.2.2.4.1 Etude des spectres de RMN 1D et 2D du composé DB12 La partie glycosidique du composé DB12 comporte trois sucres :

. La première unité osidique avec son proton anomérique à δH 4,58 (H-1’, d, J=7.7 Hz) et le carbone porteur à 105,4 ppm a été identifié à l’acide β-D-glucuronique à partir des corrélations observées en COSY, TOCSY (Figure 65) et HSQC. Le déblindage des carbones C-2’ (78,1 ppm) et C-3’ (86,1 ppm) indique qu’il est disubstitué en ces positions. Celui-ci est toujours accroché à l’acide serjanique sur la position 3. . La deuxième unité osidique correspond à l’α-L-rhamnopyranose dont le proton anomérique H-1’’ résonne à 5,07 ppm (d, J=1,9 Hz). Ce dernier présente une

151

tache de corrélation en HMBC avec le carbone C-3’ (86,1 ppm) de l’acide β-D- glucuronique. ’’’ . La troisième unité osidique présente un proton anomérique H-1 à δH 4,62 (d, J=7,7 Hz) porté par un carbone anomérique à 103,8 ppm. Grâce aux corrélations TOCSY et COSY nous avons identifié un β-D-glucopyranose. Nous constatons des différences entre ce β-D-glucopyranose et celui observé dans le composé DB04, le carbone anomérique est déblindé et le proton anomérique est blindé et corrèle en HMBC avec le carbone C-2’ (78,1 ppm) de l’acide β-D-glucuronique et non plus avec le C-28 de l’acide serjanique.

Nous avons donc deux sucres, l’α-L-rhamnopyranose et le β-D-glucopyranose qui sont tous les deux accrochés à l’acide β-D-glucuronique via respectivement le C-3’ et le C-2’. Ce complexe tri-glycosidique est attaché à la génine sur le C-3. Le composé DB12 est donc l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-]β-D- glucuronopyranosyl serjanique (Figure 66), de structure nouvelle.

Figure 65: Spectre TOCSY du composé DB12 (MeOD, 600 MHz)

152

Figure 66: Structure du composé DB12

III.2.2.4.2 Etude des spectres de RMN 1D et 2D du composé DB14 Pour ce composé nous observons trois unités osidiques dont deux ont déjà été rencontrés précédemment : l’acide β-D-glucuronique (H-1’ à δH 4,54 ; C-1’ à δC 105,5) ’’ substitué en positions C-2’ et C-3’ et l’α-L-rhamnopyranose (H-1 à δH 5,07; C-1’ à δC 103,5) qui est relié au précédent par une liaison α (1→3). Néanmoins, les protons de l’acide β-D- glucuronique ne résonnent pas de la même façon que dans le composé DB12 ce qui signifie que son environnement a changé. Cette variation est due au troisième sucre qui est accroché à l’acide β-D-glucuronique par une liaison β (1→2) mais il ne s’agit plus du β-D-glucopyranose. Le proton anomérique de ’’’ ’’’ ce sucre donne un signal H-1 à δH 4,52 et un signal C-1 à δC 104,8. L’analyse des corrélations sur les spectres COSY (Figure 67) et HMBC indiquent un système de spins à 6 protons et cinq carbones soit un pentose. Les déplacements chimiques et les constantes de couplages indiquent un β-D-xylopyranose [Bock and Pedersen 1983 ] caractérisé par un hydroxyle en position 4 équatoriale et donc une grande constante avec les protons H-3’’’ et H- 5’’’ trans diaxiaux (Tableau 25). Avec ces données concernant la génine et la partie glucidique nous avons pu identifier le composé DB14 comme étant l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D- xylopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl serjanique (Figure 68).

153

Figure 67: Spectre RMN COSY du composé DB14

Figure 68: Structure du composé DB14

154

Tableau 25: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques des composés DB12 et DB14

DB12 DB14 δC δH Multiplicité / J Hz δC δH Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 105,3 4,58 1H, d, J=7,7 1’ 105,5 4,54 1H, d, J=7,8 2’ 78,1 3,80 1H, dd, J=8,8-7,7 2’ 79,2 3,67 1H, m 3’ 86,0 3,72 1H, dd, J=9,6-8,8 3’ 86,2 3,68 1H, m 4’ 72,0 3,65 1H, t, J=9,3 4’ 72,0 3,64 1H, m 5’ 76,7 3,86 1H, d, J=9,3 5’ 76,4 3,84 1H, m 6’ 172,3 6’ 172,3 α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 103,5 5,07 1H, d, J=1,9 1’’ 103,5 5,07 1H, d, J=1,9 2’’ 72,2 4,06 1H, dd, J= 3,4-1,9 2’’ 72,2 4,07 1H, dd, J= 3,4-1,9 3’’ 72,3 3,70 1H, dd, J=9,5-3,4 3’’ 72,2 3,69 1H, m 4’’ 73,7 3,44 1H, t, J= 9,5 4’’ 73,8 3,43 1H, t, J= 9,5 5’’ 70,7 3,96 1H, dq, J=9,6-6,3 5’’ 70,7 3,94 1H, dq, J= 9,5-6,2 6’’ 17,8 1,23 1H, t, J=6,3 6’’ 17,9 1,27 1H, t, J= 6,2 β-D-glucopyranosyl β-D- xylopyranosyl 1’’’ 103,7 4,62 1H, d, J=7,7 1’’’ 104,8 4,52 1H, d, J= 7,8 2’’’ 75,6 3,22 1H, dd, J=9,9-7,3 2’’’ 75,6 3,20 1H, dd, J= 9,3-7,7 3’’’ 77,8 3,38 1H, t, J=9,1 3’’’ 77,9 3,34 1H, m 4’’’ 72,4 3,10 1H, dd, J=9,6-9,0 4’’’ 71,3 3,36 1H, ddd ; J= 10,4-8,8-5,4 5’’’ 78,6 3,28 1H, ddd, J=9,6-7,8-2,3 3,82 1H, dd, J= 11,5-10,4 5’’’ 67,0 6’’’ 63,5 3,57 1H, dd, J= 12,1-7,8 3,14 1H, dd, J= 11,5-5,4 3,86 1H, dd, J= 12,1-2,3 III.2.2.4.3 Etude des spectres 1D et 2D du composé DB06 Par comparaison des spectres de RMN 1D et 2D de ce composé avec ceux de DB14 nous constatons que les signaux de la chaîne trisaccharidique (Tableau 26) attachée en position 3 de la génine sont identiques et que le composé DB06 est estérifié sur l’acide en position 28. Apparaisse en plus les signaux d’une quatrième unité osidique dont le proton IV anomérique H-1 résonne à δH 5,36 et son carbone C-1’ à δC 95,7 et identifiée à un β-D- glucopyranose après analyse du spectre TOCSY (Figure 69). Ce dernier est relié à la génine via le carbonyle en position 28 comme le confirme la corrélation HMBC entre le proton anomérique H-1IV et le carbone C-28 (177,5 ppm). Le composé DB06 est donc le dérivé glucosylé en C-28 de DB14.

155

Figure 69: Spectre RMN TOCSY (zooms) du composé DB06

Le composé DB06 correspond à l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D- xylopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique (Figure 70).

Figure 70: Structure du composé DB06

156

Tableau 26: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques du composé DB06

N° δC δ H Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 105,5 4,53 1H, d, J=7,3 2’ 79,1 3,67 1H, m 3’ 86,2 3,69 1H, m 4’ 72,0 3,65 1H, t, J=9,6 5’ 76,4 3,83 1H, m 6’ 172,5 α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 103,5 5,06 1H, d, J=1,9 2’’ 72,2 4,07 1H, dd, J= 3,4-1,9 3’’ 72,1 3,68 1H, m 4’’ 73,8 3,43 1H, m 5’’ 70,6 3,94 1H, dq, J=9,5-6,2 6’’ 17,8 1,27 1H, t, J=6,2 β-D- xylopyranosyl 1’’’ 104,7 4,52 1H, d, J=7,7 Hz 2’’’ 75,6 3,20 1H, m 3’’’ 77,9 3,33 1H, m 4’’’ 71,3 3,46 1H, m 3,14 1H, m 5’’’ 66,9 3,83 1H, m β-D-glucopyranosyl 1IV 95,7 5,36 1H, d, J=8,2 2IV 73,9 3,32 1H, m 3IV 78,3 3,41 1H, m 4IV 71,0 3,36 1H, m 5IV 78,7 3,35 1H, m 3,70 1H, m 6IV 62,3 3,83 1H, m

III.2.2.5 Elucidation structurale des composés DB13 et DB05 Les spectres de RMN 1D et 2D obtenus pour ces deux composés sont très similaires, la génine étant toujours l’acide serjanique. La différence entre eux réside dans la partie glucidique où le composé DB13 comporte quatre unités osidiques alors que le composé DB05 en possède cinq et ce sucre supplémentaire dont le proton anomérique résonne à δH 5,36 (H- 1V, d, J=8,2 Hz) est attaché en position C-28 (177,5 ppm) de la génine. Comme précédemment, le composé DB05 est donc le dérivé glucosylé en C-28 du composé DB13. Nous retrouvons chez les deux composés les trois sucres décrits précédemment pour DB06 :l’acide β-D-glucuronique substitué en positions C-2’ et C-3’, respectivement par le β- D-xylopyranose et l’α-L-rhamnopyranose mais ce dernier est cette fois substitué en position ’’ C-3 par la quatrième unité osidique comme le montre le déblindage de ce carbone à δC 81,6 (Rha-C3’’) (Tableau 27). Le sucre relié en (1→3) avec l’α-L-rhamnopyranose est présent dans les deux composés. A l’aide des corrélations observées en COSY (Figure 71), TOCSY (Figure 72) et

157

IV HMBC, à partir du proton anomérique résonant à δH 4,56 (H-1 , d, J=7,5 Hz), nous avons pu l’identifier comme étant un second β-D-xylopyranose en position terminale. Les corrélations HMBC GlcA-H-1’/C-3, Rha-H1’’/GlcA-C-3’, Xyl-H-1’’’/GlcA-C-2’ et Xyl’-1IV/Rha-C-3’’ confirment l’enchaînement osidique.

Figure 71: Spectre COSY (3,1-5,2 ppm) du composé DB13 (MeOD, 600MHz)

Le composé DB13 est donc identifié comme l’acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α- L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl serjanique (Figure 73).

Pour le composé DB05, en plus de ces quatre sucres, il comporte un β-D- glucopyranose (Tableau 27) relié sur l’acide serjanique en position 28 comme le confirme la corrélation HMBC H-1V /C-28. Ceci nous permet d’établir sa structure comme suit : acide 3- O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-]β-D- glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique.

Les composés DB05 et DB13 sont de structure nouvelle.

158

Figure 72: Spectre TOCSY (3,1-4,4 ppm) des composés DB13 et DB05 (MeOD, 600 MHz)

Figure 73: Structure des composés DB13 (R=H) et DB05 (R=β-D-glucopyranosyl)

159

Tableau 27: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques du composé DB05

N° δC δH Multiplicité / J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 105,4 4,54 1H, d, J=7,0 2’ 78,8 3,67 1H, m 3’ 86,9 3,70 1H, m 4’ 72,0 3,66 1H, m 5’ 76,3 3,84 1H, m 6’ 172,6 α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 103,4 5,03 1H, d, J=1,8 Hz 2’’ 71,8 4,29 1H, dd, J=3,0-1,8 3’’ 81,6 3,81 1H, m 4’’ 72,8 3,62 1H, t, J= 9,5 5’’ 70,5 3,98 1H, m 6’’ 17,9 1,28 1H, t, J=6,2 β-D- xylopyranosyl 1 1’’’ 106,5 4,56 1H, d, J=7,5 2’’’ 75,3 3,31 1H, m 3’’’ 77,6 3,37 1H, m 4’’’ 71,2 3,51 1H, ddd, J=10,4-9,1-5,4 3,28 1H, m 5’’’ 67,0 3,98 1H, m β-D- xylopyranosyl 2 1IV 104,8 4,52 1H, d, J=7,6 2IV 75,5 3,19 1H, m 3IV 77,9 3,33 1H, m 4IV 71,4 3,47 1H, ddd, J= 10,2-9,3-5,6 3,14 1H, m 5IV 67,0 3,84 1H, m β-D-glucopyranosyl 1V 95,8 5,36 1H, d, J=8,2 2V 73,9 3,32 1H, m 3V 78,3 3,41 1H, t, J=8,5 4V 71,0 3,35 1H, m 5V 78,8 3,35 1H, m 3,69 1H, m V 62,3 6 3,83 1H, m

III.2.2.6 Elucidation structurale des composés DB09 et DB02 Ces deux composés sont aussi des glycosides de l’acide serjanique avec quatre unités osidiques attachées en position 3 de la génine (Tableau 28) : . Le composé DB09 présente sur son spectre de RMN 1H quatre protons ’’ ’’’ IV anomériques à δH 4,59 (H-1’) ; 5,04 (H-1 ) ; 4,57 (H-1 ) et 5,04 (H-1 ) qui correspondent respectivement à l’acide β-D-glucuronopyranosique substitué en positions C-2’ et C-3’, à l’α-L-rhamnopyranose substitué en position C-3’’, au β-D- xylopyranose et au β-D-glucopyranose. Chaque unité osidique a pu être identifiée grâce aux corrélations observées sur les spectres COSY, TOCSY (Figure 75) et HMBC. Les corrélations HMBC GlcA-H-1’/C-3, Rha-H1’’/C-3’

160

Glc-1’’’/C-2’ et Xyl-1IV/C-3’’ nous ont permis de relier les sucres entre eux et avec la génine. La structure du composé BD09 ou acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl serjanique (Figure 74) est nouvelle. . Le composé DB02, quant à lui, en plus des quatre unités osidiques observées précédemment, présente un cinquième sucre dont le proton anomérique (Figure V 75) résonne à 5,36 ppm (H-1 , δC 95,8) correspondant au β-D-glucopyranose relié à la génine en position 28 comme le confirme la tache de corrélation observée en HMBC entre H-1V /C-28 (177,5 ppm). Ceci nous permet d’identifier ce composé DB02 comme l’acide 3-O-β-D- xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl- (1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique (Figure 74), de structure nouvelle.

Figure 74: Structure des composés DB09 (R=H) et DB02 (R=β-D-glucopyranosyl)

161

Figure 75: Spectre RMN TOCSY (3,0-4,3 ppm) des composés DB09 et DB02 (MeOD, 600 MHz)

162

Tableau 28: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques des composés DB09 et DB02

DB02 DB09 δC δH Multiplicité/ J Hz δC δH Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranose 1’ 105,3 4,59 1H, d, J=7,7 1’ 105,3 4,59 1H, d, J=7,7 2’ 77,7 3,81 1H, m 2’ 77,7 3,81 1H, dd, J=8,9-7,7 3’ 86,9 3,72 1H, t, J=9,0 3’ 81,9 3,72 1H, t, J=8,9 4’ 72,1 3,67 1H, t, J=9,0 4’ 72,1 3,66 1H, t, J=9,0 5’ 76,6 3,85 1H, m 5’ 76,6 3,88 1H, m 6’ 172,6 6’ 172,1 α-L-rhamnopyranose 1’’ 103,5 5,04 1H, d, J=1,9 1’’ 103,5 5,04 1H, d, J=1,9 2’’ 71,9 4,29 1H, dd, J=3,2-1,9 2’’ 71,8 4,29 1H, dd, J= 3,2-1,9 3’’ 81,5 3,82 1H, m 3’’ 81,5 3,82 1H, dd, J= 9,4-3,2 4’’ 72,8 3,62 1H, t, J= 9,5 4’’ 72,8 3,62 1H, t, J= 9,4 5’’ 70,5 3,90 1H, m 5’’ 70,5 3,90 1H, m 6’’ 17,9 1,28 1H, d, J=6,3 6’’ 17,9 1,28 1H, d, J= 6,2 β-D- xylopyranose 1’’’ 106,5 4,57 1H, d, J=7,5 1’’’ 106,5 4,57 1H, d, J=7,4 2’’’ 75,3 3,31 1H, m 2’’’ 75,3 3,30 1H, m 3’’’ 77,6 3,37 1H, m 3’’’ 77,6 3,37 1H, t, J= 8,5 4’’’ 71,2 3,51 1H, ddd, J=8,8-5,4 4’’’ 71,2 3,51 1H, ddd, J= 10,2-8,5-5,3 3,29 1H, m 3,28 1H, dd, J=11,4-10,2 5’’’ 67,1 5’’’ 67,1 4,01 1H, m 4,00 1H, dd, J=11,4-5,3 β-D-glucopyranose 1 1IV 103,8 4,63 1H, d, J=7,7 1IV 103,8 4,63 1H, d, J=7,8 2IV 75,5 3,23 1H, dd, J=9,3-7,7 2IV 103,8 4,63 1H, d, J=7,8 3IV 77,9 3,41 1H, m 3IV 77,9 3,40 1H, t, J=9,1 4IV 72,4 3,10 1H, t, J=9,2 4IV 72,4 3,11 1H, dd, J= 9,6-9,1 5IV 78,8 3,28 1H, m 5IV 78,8 3,28 1H, m 3,57 1H, dd, J=12,3-8,2 3,57 1H, dd, J=12,1-7,9 IV 63,6 IV 63,6 6 3,87 1H, dd, J=12,3-2,4 6 3,87 1H, dd, J=12,1-2,4 β-D-glucopyranose 2 1V 95,8 5,36 1H, d, J=8,2 2V 73,9 3,32 1H, m 3V 78,3 3,41 1H, t, J=9,0 4V 71,0 3,35 1H, m 5V 78,8 3,35 1H, m 3,69 1H, dd, J=12,2-4,6 6V 62,3 3,83 1H, dd, J=12,2-2,0

III.2.2.7 Elucidation structurale des composés DB01, DB03 et DB08 Ces trois composés sont des mono- ou des bi-desmonsides d’une génine qui est différente de l’acide serjanique. Nous allons donc discuter de l’élucidation structurale de la génine commune aux trois composés pour, ensuite, discuter des différences constatées entre eux et qui ne concerne que les unités glucidiques.

163

III.2.2.7.1 Elucidation structurale de la génine des composés DB01, DB03 et DB08 Sur les spectres RMN 1H, 13C et HSQC (du composé DB03) nous observons les différences suivantes par rapport aux autres composés à acide serjanique (Tableau 29) :

. Cinq singulets au lieu de six correspondants aux groupements méthyles à δH 0,72 (H-24); 0,82 (H-26); 0,99 (H-25); 1,15 (H-29) et 1,20 (H-27) portés

respectivement par les carbones à δC 13,4 (C-24); 17,9 (C-26); 16,4 (C-25); 28,7 (C-29) et 26,4 (C-27). Le singulet correspondant au méthyle en position C-23 a disparu et le carbone C-24 est plus blindé ce qui signifie que son environnement est modifié (Figure 76).

. Deux doublets supplémentaires correspondants à des protons géminés à δH 3,62 et 3,30 avec une constante de couplage de 11,5 Hz chacun, portés par un carbone résonnant à 64,6 ppm indiquant une oxygénation de ce dernier et la présence d'un hydroxyle sur le carbone C-23. Ceci est confirmé par les

corrélations HMBC observées entre les protons H-24 (δH 0,72) et les carbones à

δC 44,0 (C-4), 48,0 (C-5), 83,4 (C-3) et 64,6 (C-23). Les corrélations observées sur les spectres COSY, HMBC (Figure 77) et TOCSY entre les protons et les carbones de cette génine nous ont permis de les relier les uns aux autres et d'identifier l’acide phytolaccinique [Johnson and Shimizu 1974] comme génine, qui ne diffère de l’acide serjanique que par l’hydroxylation de la position 23.

Figure 76: Spectre de RMN 1H du composé DB03 (MeOD, 600 MHz) 164

Figure 77: Spectre HMBC du composé DB03 (MeOD, 600 MHz)

Tableau 29: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) de la génine du composé DB03

δC δH Multiplicité/ J Hz δC δH Multiplicité/ J Hz 0,99 1H, m 1,67 1H, m 1 39,5 16 24,2 1,63 1H, m 2,02 1H, td, J=13,2-3,6 1,75 1H, m 2 26,4 17 47,0 1,88 1H, m 3 83,4 3,65 1H, dd, J=11,8-4,5 18 44,0 2,71 1H, dd, J=13,5-3,2 1,69 1H, m 4 44,0 19 43,4 1,95 1H, m 5 48,0 1,27 1H, m 20 45,0 1,39 1H, m 1,39 1H, m 6 18,8 21 31,3 1,51 1H, m 2,01 1H, dm, J=13,2 1,28 1H, m 1,58 1H, td, J=13,8-4,2 7 33,4 22 35,0 1,63 1H, dm, J=12,6 1,61 1H, m 3,30 1H, d, J=11,5 8 40,5 23 64,6 3,62 1H, d, J=11,5 9 49,0 1,67 1H, m 24 13,4 0,72 3H, s 10 37,7 25 16,4 0,99 3H, s 11 24,5 1,93 2H, m 26 17,9 0,82 3H, s 12 124,2 5,32 1H, t, J=3,6 27 26,4 1,20 3H, s 13 144,8 28 181,3 14 42,9 29 28,7 1,15 3H, s

1,12 1H, dt, J=13,9-3,5 30 178,8 15 28,9 1,77 1H, td, J=13,9-4,0 31 52,3 3,72 3H, s

165

III.2.2.7.2 Elucidation structurale des composés DB03 et DB01 En plus des déplacements chimiques propres à l’acide phytolaccinique, nous distinguons les signaux d'un β-D-glucuronopyranose substitué en position C-2' et d'un α-L- rhamnopyranose, comme pour le composé DB10 (Tableau 30). Les taches de corrélations HMBC observées entre H-1’/C-3 (83,4 ppm) et H-1’’/C-3’ (83,2 ppm) confirment l’enchaînement osidique et nous permettent d’établir la structure du composé DB03 comme l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl phytolaccinique (Figure 78), qui est nouvelle. Le composé DB01 est le dérivé glucosylé en C-28 du composé DB03. Il présente, en plus de l’acide phytolaccinique, trois unités osidiques : un β-D-glucuronopyranose substitué en position C-3’, un α-L-rhamnopyranose et un β-D-glucopyranose relié à la génine via une liaison ester (Tableau 30). Les corrélations HMBC H-1’’/C-3’, H-1’/C-3 et H-1’’’/C-28 confirment la structure de ce composé comme étant l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-

β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl phytolaccinique (Figure 78). Sa structure est nouvellement décrite.

Tableau 30: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques des composés DB03 et DB01

DB01 DB03 δC δH Multiplicité/ J Hz δC δH Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 105,9 4,48 1H, d, J=8,0 1’ 105,9 4,49 1H, d, J=7,9 2’ 75,9 3,34 1H, m 2’ 75,8 3,34 1H, m 3’ 83,2 3,54 1H, t, J=9,0 3’ 83,4 3,54 1H, m 4’ 71,8 3,57 1H, t, J=9,1 4’ 71,9 3,57 1H, m 5’ 76,7 3,89 1H, d, J=9,5 5’ 76,7 3,84 1H, d, J=7,4 6’ 172,5 6’ 172,7 α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 102,8 5,19 1H, d, J=1,3 1’’ 102,7 5,19 1H, d, J=1,2 2’’ 72,3 3,96 1H, dd, J=3,3-1,3 2’’ 72,4 3,96 1H, dd, J= 3,6-1,2 3’’ 72,2 3,71 1H, m 3’’ 72,3 3,71 1H, dd, J=9,5-3,6 4’’ 74,0 3,40 1H, t, J=9,6 4’’ 74,0 3,40 1H, d, J=9,5 5’’ 70,0 4,01 1H, dq, J=9,5-6,2 5’’ 70,0 4,02 1H, dq, J=9,5-6,2 6’’ 17,8 1,25 3H, d, J=6,2 6’’ 17,7 1,26 1H, d, J=6,2 β-D-glucopyranosyl 1’’’ 95,7 5,36 1H, d, J=8,0 2’’’ 73,9 3,32 1H, dd, J=9,1-8,0 3’’’ 78,3 3,41 1H, m 4’’’ 71,0 3,36 1H, m 5’’’ 78,7 3,35 1H, m 6’’’ 62,3 3,69 1H, dd, J=11,7-4,3 3,82 1H, dd, J=11,7-2,0

166

III.2.2.7.3 Elucidation structurale du composé DB08 Les spectres de RMN 1D et 2D du composé DB08 montrent que nous avons les mêmes unités osidiques que le composé DB06 mais l’enchainement est différent et ils sont attachés sur l’acide phytolaccinique. Nous repérons les signaux du β-D-glucuronopyranose, de l’α-L-rhamnopyranose relié au précédent par une liaison (1→3), et le β-D-xylopyranosyl relié au α-L-rhamnopyranosyl par une liaison (1→3) (Tableau 31) comme le confirme les corrélations HMBC. Le composé DB08 est donc l’acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl phytolaccinique (Figure 78). Comme les composés précédents, il est de structure nouvelle.

Tableau 31: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) des unités osidiques du composé DB08

δC δH Multiplicité/ J Hz β-D-glucuronopyranosyl 1’ 105,4 4,47 1H, d, J=8,1 2’ 75,8 3,36 1H, m 3’ 83,1 3,56 1H, m 4’ 72,2 3,55 1H, m 5’ nd 3,95 1H, m 6’ nd α-L-rhamnopyranosyl 1’’ 102,3 5,22 1H, d, J=1,37 2’’ 72,0 4,14 1H, m 3’’ 82,3 3,83 1H, dd, J=9,5-3,1 4’’ 72,9 3,58 1H, t, J=9,6 5’’ 69,6 4,14 1H, m 6’’ 17,9 1,26 1H, d, J= 6,2 β-D- xylopyranosyl 1’’’ 106,5 4,52 1H, d, J=7,24Hz 2’’’ 75,3 3,31 1H, m 3’’’ 77,6 3,34 1H, m 4’’’ 71,1 3,51 1H, ddd, J=10,2-8,4-5,3 3,23 1H, dd, J=11,4-10,1 5’’’ 66,8 3,88 1H, dd, J=11,4-5,3

Figure 78: Structures des composés DB03 (R1=R2=H), DB01 (R1=H, R2= β-D-

glucopyranose) et DB08 (R1= β-D- xylopyranose, R2=H) 167

III.2.3 Hydrolyse acide Pour vérifier l’identification des unités osidiques des saponines isolées une hydrolyse acide a été effectuée. Les composés purs étant obtenus avec des masses assez faibles, nous avons réalisé une hydrolyse à l’acide chlorhydrique sur le précipité DBP enrichi en saponines. L’hydrolysat a été ensuite analysé en CLHP analytique (avec un détecteur RI) sur une colonne chirale et comparé avec les différents sucres témoins (L-glucopyranose, D-glucopyranose, L- xylopyranose, D-xylopyranose, L-rhamnopyranose et D-glucuronopyranose) ce qui nous a permis de confirmer la série des unités osidiques identifiées. III.3 Activités biologiques III.3.1 Test de cytotoxicité Nous avons testés les composés purifiés à partir des deux plantes pour évaluer leur cytotoxicité sur les fibroblastes. Ces tests ont été réalisés au sein de l’unité MEDyC à la faculté des sciences (URCA). Cette fois nous avons utilisé une méthode colorimétrique au MTT (bromure de 3-(4,5- diméthyl thiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium) qui est réduit en formazan (Figure 79) par les enzymes réductases mitochondriales des cellules vivantes. Ainsi, la quantité du formazan pourpre mesurée par absorbance va nous permettre de quantifier les cellules viables.

Figure 79: Réduction du MTT en formazan par les réductases mitochondriales

L’α-héderine est utilisée comme témoin positif avec une IC50 de 3,5 µg/ml (4,6 µM).

Chaque composé purifié de Poraqueiba sericea, a été testé pour leur cytotoxicité à une concentration de 10 µg/ml (Tableau 32). Le composé PS10 (4-épi-niga-ishigoside F1) n’a pu être testé car nous ne disposions pas d’une masse suffisante.

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Tableau 32: Cytotoxicité des composés purifiés de P. sericea Composé PS01 PS02 PS03 PS04 PS05 PS06 PS07 PS08 PS09 PS11 % de mort 19,5 24,6 9,6 5,4 6,9 12,9 4,9 11,9 1,1 22,4 cellulaire % de mort cellulaire de l’α héderine 71,3

Parmi les composés testés, seuls trois ont démontré une cytotoxicité modérée avec une inhibition de 19,5 ; 22,4 et 24,6% pour PS01, PS11 et PS02. Les autres composés ne semblent présenter aucune cytotoxicité en comparaison à l’α-héderine.

Pour les composés purifiés de Dendrobangia boliviana, ils ont aussi été testés à une concentration de 10 µg/ml et ensuite des gammes de concentration ont été réalisées uniquement pour les composés dont l’activité est constatée à cette concentration (Tableau 33).

Tableau 33: Pourcentage d’inhibition de prolifération cellulaire des composés DB01 à DB14

Fraction % de mort cellulaire Fraction % de mort cellulaire DB01 6,3 DB08 12,5 DB02 <0 DB09 9,5 DB03 12,4 DB10 <0 DB04 14,0 DB11 15,3 DB05 47,1 DB12 54,8 DB06 23,9 DB13 39,2 DB07 8,9 DB14 17,6 α-héderine 71,3

Nous constatons que deux saponines (DB05 et DB12) présentent une cytotoxicité significative de 47,1 et 54,8 % de mort cellulaire. Pour ces derniers, nous avons réalisé une gamme de concentration (10 ; 7,5 ; 5 ; 2,5 et 1 µg/ml) et nous les avons testé dans les mêmes conditions afin de déterminer leurs IC50 (Tableau 34). Deux autres saponines présentent une cytotoxicité moyenne avec un pourcentage de mort cellulaire de 23,9% pour DB06 et 39,2% pour DB13.

169

Tableau 34: Cytotoxicité (IC50 en µg/ml et en µM) des composés DB05 et DB12

Composé DB05 DB12 Témoin

IC50 (µg/ml) 8,0 5,5 3,5

IC50 (µM) 6,4 5,6 4,6

Les saponines DB05 et DB12 démontrent des cytotoxicités significatives comparées à celle de l’α-héderine. Ces activités peuvent être dues au pouvoir hémolytique qui est caractéristique des saponosides. Elles possèdent l’acide serjanique comme génine et au moins trois sucres en position 3 de la génine. Le composé DB12 le plus actif possède un glucose relié à l’acide glucuronique en position 2’ à la place d’un xylose dans DB05. La présence du glucose estérifiant la position 28 ne semble pas avoir d’effet négatif sur l’activité quand on compare les activités des deux composés.

III.3.2 Test antileishmanien Nous avons testé les composés purifiés de Poraqueiba sericea et de Dendrobangia boliviana contre les promastigotes axéniques de L. infantum dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment (Chapitre 2, paragraphe III.3, page 93). Aucune des saponines

170

ou des autres composés isolés de ces deux plantes n’a démontré d’activité antileishmanienne avec des IC50 supérieure à 50 µg/ml.

III.3.3 Activité hémolytique Les saponines isolées de D. boliviana ont été testées pour leur activité hémolytique sur des hématies de mouton à 10%. Pour chaque composé, nous avons préparé une gamme de concentration allant de 1 à 100 µg/ml et le témoin positif utilisé est un mélange de saponines commercialisé de chez Sigma-Aldrich qui a été dialysé. Après la réaction entre les hématies et les saponines testées, le milieu réactionnel est centrifugé afin de récupérer le surnageant pour une lecture des absorbances à 540 nm qui est proportionnelle à la quantité d’hématies hydrolysées. La figure 80 représente les activités hémolytiques mesurées pour nos saponines ainsi que pour le témoin positif. Nous constatons qu’aucune des saponines isolées de D. boliviana ne représente un pouvoir hémolytique. Ceci est intéressant en particulier pour les saponines qui présentent une cytotoxicité sur les fibroblastes, cela implique un mécanisme d’action intracellulaire et non un effet de détérioration de la membrane cellulaire causée comme c’est le cas par les saponines de façon générale.

Figure 80: Activité hémolytique mesurée des saponines purifiées de D. boliviana

171

III.3.4 Test anti-élastase Les résultats négatifs pour l’activité leishmanicide des composés purifiés à partir de P. sericea nous ont amené à les tester pour d’autres activités biologiques afin de mieux les valoriser. En voulant rester sur des applications concernant la peau, nous avons choisi de tester nos composés contre l’élastase. L’élastase est une protéase produite dans le pancréas et qui dégrade des liaisons peptidiques, amides et esters de certaines protéines comme l’élastine de la peau et d’autres tissus conjonctifs lors des processus inflammatoires. De plus, plusieurs triterpènes ont été répertoriés comme inhibiteur de cette enzyme avec des IC50 intéressantes comme l’acide oléanolique (6,4 ±1,0 µM); le lupéol (1,9 µM); le canophyllol (2,5 µM); l’acide ursolique (0,9 à 4,4 µM)… [Siedle et al. 2007]. Nous avons réalisé ces tests par une méthode spectrophotométrique suivant la méthode décrite par Kraunsoe [Kraunsoe et al. 1996]. Le substrat utilisé est le N-succ-(ala)3-p- nitroanilide (SANA) qui va être dégradé par l’élastase et libérer le p-nitroaniline. Cette dégradation est suivie par la mesure de l’absorbance à 410 nm. Les échantillons sont testés à des concentrations de 5, 10, 25 et 50 µg/ml ainsi que pour le témoin positif qui est l’acide ursolique dans un tampon Tris-HCl à pH 8,0. Les composés PS05 (acide myrianthique) et PS10 (4-epi-niga-ishigoside F1) n’ont pas pu être testés car leurs masses étaient insuffisantes. L’enzyme, le substrat et les drogues sont mis en contact et la lecture des absorbances est réalisée après 10 minutes d’incubation à 37°C. Le calcul des pourcentages d’inhibition sont effectué selon l’équation suivante :

La densité optique DOblanc correspond au blanc réalisé dans les mêmes conditions avec seulement du tampon (1% du DMSO) mis en contact avec les cellules. Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 35. Nous constatons que quatre composés (PS02, PS03, PS08 et PS09) présentent des pourcentages d’inhibition entre 13 et 16% à 50µg/ml ce qui est moitié moins actif que l’acide ursolique avec un pourcentage d’inhibition de 31% à la même concentration. Les autres composés ne sont pas actifs.

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Tableau 35: Pourcentage d’inhibition de l’élastase des composés de P. sericea % d'inhibition 5 µg/ml 10 µg/ml 25 µg/ml 50 µg/ml Niga-ishigoside F1 PS01 0,9 1,7 -0,8 -3,3 Trachelosperoside B1 PS02 -9,4 4,0 9,2 13,2 secologanoside PS03 2,6 5,7 9,7 16,2 acide hydroxyasiatique PS04 0,8 0,5 0,9 0,3 Acide Hyptatique PS06 3,0 2,8 2,2 0,0 Trachelosperogenine B PS07 3,1 4,9 7,0 0,8 Acide arjunolique PS08 4,9 9,8 10,1 16,9 Trachelosperogenine E PS09 -2,9 5,5 5,6 14,5 secoxyloganine PS11 1,6 0,8 7,1 5,6

IV. Activités potentielles Les composés purifiés de Poraqueiba sericea sont tous connus et ont déjà fait l’objet de plusieurs études ayant révélées leurs activités biologiques dont nous ne citerons que les principales. IV.1 Activité antioxydante Certains des triterpènes isolés ont été testés pour leur activité inhibitrice de la peroxydation lipidique responsable des dommages tissulaires dus à la formation de radicaux libres. L’acide 19-α-hydroxyasiatique PS04, le niga-ichigoside F1 PS01 et le 4-epi-niga- ichigoside F1 PS10 ont démontré des pourcentages d’inhibition de 60, 53 et 68 % respectivement à une concentration de 25 µg/ml [Bowen-Forbes et al. 2009 ]. Quant au trachelosperoside B1 PS02, l’acide myrianthique PS05 et l’acide hyptatique PS06 une activité moyenne a été démontrée avec un pourcentage d’inhibition compris entre 28 et 32 % toujours à 25 µg/ml [Bowen-Forbes et al. 2009 ].

IV.2 Activité anti-inflammatoire L’acide 19-α-hydroxyasiatique PS04 a démontré un effet d’inhibition similaire voir supérieure à celui de l’hydrocortisone (témoin positif) sur la production de l’oxyde nitrique, le TNF-α, l’IL-1β, l’IL-6 et l’IL-10 à une concentration de 50 µg/ml. Le même effet a été observé pour l’acide myrianthique PS05 avec en plus une inhibition de l’activité transcriptionnelle du facteur NF-κB avec une IC50 de 23,2 µM [Zeng et al. 2011, Yan et al. 2013].

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Une activité inhibitrice moyenne entre 25 et 32% a été révélée pour les composés PS04, PS05 et PS06 sur l’activité des coenzymes COX-1 et COX-2 à une concentration de 25 µg/ml [Bowen-Forbes et al. 2009 ].

IV.3 Activité anti-mycobactérienne L’acide arjunolique PS08 a démontré une activité intéressante contre Mycobacterium tuberculosis avec une MIC (Minimum Inhibition Concentration) de 4,9 µg/ml [Yong and Ntie-Kang 2014] et une activité modérée de 150 µg/ml contre Mycobacterium bovis (78 µg/ml pour le contrôle positif) [Mann et al. 2012].

IV.4 Activité anti-nociceptive Le niga-ichigoside F1 PS01 a été testé sur deux modèles de nociception qui sont la contorsion et le test à la formaline en démontrant de bonne activité avec des ID50 (Inhibition Dose) de 3,1 mg/kg et 2,7 mg/kg respectivement pour les deux modèles alors que le témoin positif (le paracétamol) présente des ID50 de 19,0 mg/kg et 18,1 mg/kg [Niero et al. 1999]. Le mécanisme d’action de cette activité semble être relié à différents systèmes comme les systèmes dopaminergique, L-Arg-oxyde nitrique, tachykininergique et glutamatergique ce qui en fait un bon candidat pour le développement de médicaments analgésiques pour différents types de douleur [Ardenghi et al. 2006].

IV.5 Activité anti-cancéreuse L’acide arjunolique PS08 a révélé des activités cytotoxiques contres différentes lignées cellulaires cancéreuses comme les cellules NCI-460 (cancer du poumon); HT-29

(adénocarcinome colorectal) et CEM (leucémie) avec des IC50 de 1,64; 2,11 et 1,73 µM respectivement [Zhang et al. 2012]. Les acides myrianthique PS05 et hyptatique PS06 ont démontré une activité inhibitrice de la prolifération des cellules cancéreuses du colon de 40 et 56% à une concentration de 25 µg/ml [Bowen-Forbes et al. 2009 ]. IV.6 Activité hypoglycémiante et hypolipidémiante Le traitement de rats diabétiques (diabète induit par streptozotocine) avec 20 mg/kg de niga-ichigoside F1 PS01 a induit une inhibition de 20,6% la concentration du glucose dans le sang et de 22 % la concentration du LDL-cholestérol dans le sérum [Choi et al. 2008].

174

IV.7 Hépato- et gastro-protection Le niga-ichigoside F1 PS01 a démontré une inhibition de 98 % des lésions d’ulcères gastriques chez des souris avec une disparition quasi complète des lésions [Berte et al. 2014]. Dans le cas d’une cytotoxicité induite par le cis-platine, ce composé agit en diminuant le stress oxydatif cellulaire. Cette activité passe par la modulation des enzymes anti-oxydantes à travers l’activation du facteur nucléaire erythroïde Nrf-2 dans les cellules épithéliales LLC- PK1 [Kim et al. 2011]. L’Atorvastatine (ATO) utilisée pour le traitement de l’hyperglycémie et l’hypercholestérolémie provoque différents effets secondaires aigus et chroniques. Le traitement de souris (traitées à l’ATO 30 mg/kg/jour pendant 8 semaines) avec 20 m/kg/jour d’acide arjunolique PS08 pendant 4 jours induit une réduction du stress oxydatif provoqué par l’ATO. Il peut donc être utilisé parallèlement au traitement à l’ATO pour protéger les reins et le foie des patients [Pal et al. 2015]. Une autre étude a démontré l’effet de protection de ce triterpène contre les ulcères gastriques provoqués par l’aspirine [Sherif and Hassanin 2014].

175

V. Apports technologiques

L’accès à différents équipements initialement non disponible au laboratoire ou lors d'une mission au sein des laboratoires CAMAG nous a permis d’apporter de nouvelles informations et de mieux valoriser les résultats de nos travaux. Nous avons essayé de valoriser principalement les saponines de D. boliviana qui sont nouvellement décrites en évaluant plusieurs activités biologiques par bioautographie en HPTLC (Société CAMAG). Certains composés purifiés de P. sericea dont nous disposions une quantité suffisante ont aussi pu être testés sur ces mêmes cibles. Afin de finaliser la caractérisation de toutes les saponines purifiées, nous devons effectuer de nouvelles purifications pour constituer un stock suffisant de chacune des saponines. Pour cela, une nouvelle extraction a été réalisée à partir des racines de D. boliviana. Comme précédemment, un extrait brut hydrométhanolique a été obtenu par macération pour être ensuite passer sur résine Amberlite IRN-77. Cette fois-ci nous n’avons pas effectué une précipitation des saponines car cette opération ne nous permettait pas d’élimer les tannins qui précipiter aussi avec les saponines. Ensuite, une étape de fractionnement sur chromatographie flash sur silice-C18 à polarité de phases inversées nous a permis d’obtenir 14 fractions (DBP01 à DBP14) et une distribution des saponines entres les fractions DBP07 à DBP14 (Figure 81). L'acquisition récente au laboratoire (ICMR) d'un équipement de chromatographie liquide couplée au spectromètre de RMN à 600 MHz (LC-RMN) nous a permis d'analyser des fractions de D. boliviana en LC-RMN afin de détecter les saponines identifiées précédemment et dont nous n’avons plus de stock disponible en plus de vérifier si d’autres saponines de structures nouvelles et minoritaires étaient présentes. Ce travail fut le premier à être réalisé sur cet équipement et a permis de tester différentes méthodes et de mettre au point les protocoles d'utilisation.

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Figure 81: Plaque HPTLC des fractions DBP01 à DBP14 Paque en verre Si CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

V.1 Couplage LC-SPE-RMN La chromatographie liquide CLHP est une technique de fractionnement et séparation très utilisée et incontournable pour l’étude des plantes. Seule, cette technique ne nous donne pas accès à l’identité des composés détectés et d’autres techniques sont nécessaire pour la caractérisation structurale. Pour un gain de temps et d’efficacité différents couplages ont été mis en place comme la LC-SM et la LC-RMN. Notre laboratoire a fait l’acquisition d’un système de LC-RMN ce qui nous a permis d’analyser certaines fractions de D. boliviana afin de vérifier leurs composition et surtout de détecter si d'autres composés minoritaires peuvent être identifiés en plus de ceux déjà caractérisés. V.1.1 Appareillage Avec le système LC-RMN il est possible d’avoir un raccordement plus ou moins direct au spectromètre RMN via des boucles intermédiaires grâce auxquelles trois procédures de travail sont possible : 177

. Le mode « sur flux » où l’analyse RMN est effectuée directement en sortie de colonne et tout au long de l’analyse CLHP. . Le mode « stop flux » où à chaque pic détecté l’analyse CLHP se met en pause afin de l’analyser en RMN pour reprendre ensuite . Nous pouvons aussi stocker tous les pics d’intérêt dans les boucles intermédiaires et ne les analyser en RMN qu’à la fin de l’analyse CLHP. Le souci avec ce raccordement direct c’est les problèmes de diffusion qui peuvent être observés, la faible concentration des composés collectés et surtout le coût élevé car l’utilisation de solvants deutérés est nécessaire. C’est pour ces raisons que nous avons choisi de passer par le système SPE qui va nous permettre de recueillir les pics d’intérêt sur des cartouches SPE et même de les concentrer en réalisant plusieurs cycles de piégeage. L’autre intérêt de ce système c’est de pouvoir réaliser les analyses CLHP avec des solvants normaux non deutérés donc beaucoup moins chers. Les composés piégés sur les cartouches sont récupérés par la suite par désorption pour les analyser en RMN (Figure 82).

V.1.2 Applications Nous avons choisi de travailler sur les fractions DBP08 à DBP12 car certains composés issus de ces fractions avaient été obtenus avec de faibles rendements et l’analyse en spectrométrie de masse n’a pas pu être réalisée sur ses produits car nous avions favorisé les tests d’activité biologique.

178

Figure 82: Couplage LC-SPE-RMN et méthodologie utilisée

Après mise au point des profils chromatographiques, nous avons pu analyser les pics majoritaires de ces fractions et repérer les saponines déjà identifiées et surtout celles dont la caractérisation structurale n’a pas été complétée. V.1.2.1 Analyse LC-SPE-RMN de la fraction DBP08 A partir du chromatogramme de cette fraction trois pics ont pu être récoltés et le contenu analysé en RMN 1H (Figure 83).

Figure 83: Chromatogramme de la fraction DBP08

179

Le composé appartenant au pic A minoritaire n’a pas donné de résultat exploitable.

L’analyse des spectres de RMN 1H des composés piégés à partir des pics B et C nous a permis d’établir des structures approximatives en comparaison avec les spectres de RMN 1H des saponines déjà caractérisées. Sur le spectre de RMN 1H (Figure 84) du composé isolé du pic B nous détectons des

éléments caractéristiques de l’acide serjanique avec le proton H-12 de l’insaturation 12-13 à δH

5,29 (t, J=3,5 Hz), le proton H-18 donnant un doublet dédoublé à δH 2,66 (J=13,0-3,7 Hz) et les six groupements méthyles singulets entre 0,7 et 1,6 ppm en plus d’un groupement méthoxy à 3,67 ppm. Nous détectons également la présence de quatre sucres que nous identifions par l’étude de leurs déplacements chimiques et par comparaison avec les spectres des composés déjà isolés comme étant le β-D-xylopyranose, l’α-L-rhamnopyranose, le β-D- glucopyranose et le β-D-glucuronopyranose. Cette structure semble similaire à celle du composé DB06 qui est l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)- ]β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique. Avec ce composé, nous rencontrons un problème quant au rattachement du β-D-xylopyranose aux autres unités osidiques puisqu'il ne peut être déterminé avec le spectre de RMN 1H seul. Nous avons repiégé ce composé pour avoir une concentration plus importante nous permettant de réaliser des expériences de RMN 2D (HSQC, HMBC et ROESY).

1 Figure 84: Spectre de RMN H du composé extrait du pic DBP08-A (CD3CN, 600 MHz)

Après concentration, seule l’expérience ROESY a répondu de manière satisfaisante (Figure 85). L’étude des taches de corrélations observées entre les protons anomériques des 180

unités osidiques nous indique que l’acide glucuronique est relié à la génine via la position 3 comme pour les autres saponines par la corrélation H-1’/H-3 et que le rhamnose est aussi relié à l’acide glucuronique par une liaison (1→3). Le β-D-xylopyranose serait attaché cette fois au à l’α-L-rhamnopyranose car son proton anomérique couple avec les protons H-2’’ et H-3’’ du rhamnose. L’attribution de la substitution du rhamnose a été établie par la valeur des ’’ déplacements chimiques du carbone C-3 du rhamnose qui est plus déblindé (δC 77,7) que ’’ dans le cas où ce dernier est libre (δC 72,3) et du carbone C-2 qui est plus blindé (δC 70,7) à cause de la substitution en C-3’’. Ces informations nous indiquent que nous sommes en présence de l’acide 3-O-β-D- xylopyranosyl (1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D- glucopyranosyl serjanique noté DB15 qui est différent du composé DB06 par le fait que le xylose n’est plus porté par le C-2’ de l’acide glucuronique mais par le C-3’’ du rhamnose. Cette nouvelle structure ne fait pas partie de celles que nous avons préalablement purifiées et caractérisées.

Figure 85: Spectre ROESY (zoom) du pic B de la fraction DBP08 (CD3CN, 600 MHz)

Le composé piégé à partir du pic C de la fraction DBP08 a été analysé de la même façon. En comparant son spectre de RMN 1H aux saponosides déjà identifiés, celui-ci se rapproche du composé DB01 (Figure 86) qui est un bidesmoside avec un glucose relié au C- 28 de la génine et un disaccharide attaché sur le C-3.

181

1 Figure 86: Comparaison des spectres de RMN H de DB01 (CD3OD, 600 MHz) et du

composé issu du pic C de la fraction DBP08 (CD3CN, 600 MHz)

Nous constatons (Figure 86) que les deux composés ont les mêmes unités osidiques mais que la génine est différente. En effet, les méthyles aliphatiques ne résonnent pas de la même manière que pour le composé DB01 alors que ces groupements devraient donner des signaux similaires même si nous avons utilisé des solvants différents. Ce changement peut signifier que l’hydroxyle n’est plus porté par la position 23 mais par la position 24. De plus, nous observons la présence de deux groupements méthoxy à δH 3,67 et 3,72 alors que jusque- là nous n’avions qu’un seul groupement porté par la fonction carbonyle en C-30, nous supposons que le deuxième groupement méthoxy serait porté par le carbonyle de l’acide glucuronique. Ce composé est donc une nouvelle structure que nous noterons DB16 et qui doit être reconcentré afin de réaliser des expériences de RMN 2D et d’établir sa structure. V.1.2.2 Analyse LC-RMN de la fraction DBP09 Le profil chromatographique de cette fraction laisse apparaître 10 pics (A-J) qui ont été piégés et les composés correspondants analysés en RMN 1H. L’analyse des spectres obtenus nous ont permis d’identifier les composés appartenant aux pics D, E, F, G et H comme étant les saponosides DB04 (forme ionisée), DB01, DB04 (forme protonée), DB08 et DB03 (Figure

182

87) respectivement. Les composés issus des pics A et C n’ont pas donnés des résultats exploitables et ceux des pics I et J sont des acides gras.

Figure 87: Chromatogramme de la fraction DBP09 et structure des composés identifiés

Pour le composé correspondant au pic B, nous obtenons un spectre de RMN 1H identique à celui du composé DB15 (pic B de la fraction DBP08), il s’agit donc d’une nouvelle structure que nous devons confirmer par une analyse complète en RMN 1D et 2D et en spectrométrie de masse (SM).

V.1.2.3 Analyse LC-SPE-RMN de la fraction DBP10 A partir de cette fraction, sept pics (A-G) ont pu être analysés. Les composés extraits des pics A, B, C, D et F ont pu être identifiés comme étant les saponosides DB04, DB06, DB03, DB08, et DB09 respectivement (Figure 88).

183

Figure 88: Chromatogramme de la fraction DBP10 et structure des composés identifiés

Le composé appartenant au pic E de la fraction DBP10 semble être aussi une nouvelle structure que nous n’avions pas pu isoler. Il montre un spectre de RMN 1H proche de celui du composé DB07 (Figure 89) qui est connu (acide 3-O-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D- glucopyranosyl serjanique) avec une différence au niveau des méthyles aliphatiques de la génine qui ne serait plus l’acide serjanique mais l’acide phytolaccinique. Nous pensions donc qu’il s’agissait de l’acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl phytolaccinique mais l’analyse en HRMS nous a démontré que nous avons un mélange de deux monodesmosides de l’acide phytolaccinique. L’un portant un acide glucuronique sur la position 3 et qui est noté DB17, l’autre est estérifié sur la position 28 par un β-D- glucopyranose non identifié encore et que nous notons DB18. Ces déductions ont pu être faite grâce au ions pseudo-moléculaires [M+Na]+ (m/z 715,3 pour DB17 et 701.3 pour DB18) correspondants à chacune des deux saponines .

184

1 Figure 89: Comparaison des spectres de RMN H de DB14 (CD3OD, 600 MHz) et du pic E

de la fraction DBP10 (CD3CN, 600 MHz)

V.1.2.4 Analyse LC-SPE-RMN de la fraction DBP11 A partir de cette fraction, 11 pics (A-K) ont été piégés sur cartouches SPE et le contenu analysé ensuite en RMN 1H. Les composés appartenant aux pics B, C, D, F et H ont donné des spectres identiques à ceux des composés DB09, DB12, DB13, DB03 et DB10 respectivement (Figure 90). Le composé du pic G est un mélange d’au moins deux saponines et les composés extraits des trois derniers pics I, J et K correspondent à des acides gras.

185

Figure 90: Chromatogramme de la fraction DBP11 et structure des composés identifiés

Le premier composé (pic A), donne un spectre de RMN 1H similaire à celui du composé DB04 concernant sa composition en unités osidiques (Figure 91). Ce qui différencie ces deux composés, c’est la présence dans le composé appartenant au pic A d’un deuxième groupement méthoxy avec des déplacements chimiques (δH 3,75) similaires à ceux du groupement méthoxy porté par le carbonyle en C-30 de l’acide serjanique. Comme pour le composé DB16 ce composé aurait un groupement méthoxy porté par le carbonyle en C-6’ de l’acide glucuronique. Pour établir la structure de ce composé DB19, d’autres expériences de RMN doivent être réalisées. Le spectre de RMN 1H du composé extrait du pic E est similaire à celui du composé DB14 (Figure 92) sauf que nous constatons des différences concernant les signaux des protons anomériques du xylopyranose et de l’acide glucuronique qui se superposent dans le cas de ce nouveau composé (pic E). Ceci peut être dû à l’effet de solvant (MeOD vs CD3CN) mais avec seulement le spectre de RMN 1H nous ne pouvons conclure quant à l’arrangement des unités osidiques entre elles. D’autres expériences de RMN 2D sont à prévoir.

186

1 Figure 91: Comparaison des spectres de RMN H de DB04 (CD3OD, 600 MHz) et du composé

extrait du pic A de la fraction DBP11 (CD3CN, 600 MHz)

187

1 Figure 92: Comparaison des spectres de RMN H de DB14 (CD3OD, 600 MHz) et du composé

appartenant au pic E de la fraction DBP11 (CD3CN, 600 MHz) V.1.2.5 Analyse LC-RMN de la fraction DBP12 Cette fraction nous a permis de piéger et d’analyser le contenu de six pics (A-F). Seuls les composés des pics B et C ont pu être identifiés comme étant les saponosides DB03 et DB11 respectivement (Figure 93). Les autres pics sont des mélanges de deux ou plusieurs saponines.

Figure 93: Chromatogramme de la fraction DBP12 et structure des composés identifiés

Ces résultats nous prouvent l’efficacité du couplage LC-SPE-RMN dans l’étude phytochimique des fractions de plantes ; ce qui est intéressant avec ce couplage c’est de pouvoir analyser les composés majoritaires mais surtout les composés minoritaires difficiles à purifier. De plus, nous avons obtenu des spectres de RMN très bien résolu alors que les quantités injectées n’excédaient pas 10 µl (à partir de solutions à environ 10 mg/ml). Le système SPE est aussi très avantageux car il offre la possibilité d’accumuler plusieurs fois un pic sur la même cartouche et d’avoir des concentrations plus importantes afin de réaliser des expériences de RMN 2D. L’analyse LC-RMN des nouvelles fractions de D. boliviana nous a permis, non seulement, de repérer les saponines déjà purifiées mais aussi de détecter 4 autres saponines (DB15 à DB19) (Figure 94) dont deux, DB17 et DB18, sont déjà connues et identifiées dans Diploclisia glaucescens (Menispermaceae ; 3 références) pour DB17 [Jayasinghe et al., 1993] 188

et dans Cornulaca monacantha (Chenopodiaceae ; une seule référence) pour DB18 [Kamel et al. 2000]. De plus, la structure de DB16 présente, non seulement un enchaînement osidique original, mais aussi une génine originale non décrite dans la littérature.

Figure 94: Structure des saponines détectées par LC-SPE-NMR

V.2 Bioautographie par HPTLC Dans le cadre du projet NATPROTEC auquel participent notre laboratoire et le laboratoire de Pharmacognosie de l'Université d'Athènes (dirigé par le Pr Leandros Skaltsounis), nous avons eu accès à une mobilité internationale d’une durée de 2 mois au sein des laboratoires Camag (Muttenz, Suisse), également impliqués dans ce projet. Le projet NATPROTEC est un projet européen qui vise la valorisation de la flore européenne dans le développement de produits innovants dans le domaine des cosmétiques. Ceci est fondé sur un régime équilibré des échanges de chercheurs entre les secteurs industriels et universitaires. Les missions de cet échange étaient de mettre au point un test anti-tyrosinase par bioautographie avec un prototype de dérivatisation pour ensuite réaliser le screening de 225 189

fractions provenant de 5 plantes (fractions réalisées par l’équipe d’Athènes) pour leur activité anti-tyrosinase. Ceci nous permettant par la suite de comparer nos résultats avec ceux obtenus in vitro pour ces mêmes fractions (tests réalisés par l’équipe d’Athènes). En parallèle de ces missions, j’ai pu tester certains composés et fractions obtenus lors des travaux de thèse pour différentes activités biologiques. L’HPTLC ou High Performance Thin Layer Chromatography (Chromatographie sur couche mince haute performance) est une forme améliorée de la CCM utilisant des plaques CCM sur support en verre de qualité supérieure. Elle donne accès à une meilleure séparation et permet une économie importante en solvant en comparaison avec la CLHP. Cette technique a été instrumentalisée, par les laboratoires Camag, à chaque étape allant du dépôt des échantillons à la révélation des plaques (Figure 95) ce qui fait d’elle un concept complet permettant des analyses quantitatives et qualitatives et répondant aux exigences de qualités des laboratoires d’analyses (Camag.com).

Figure 95: Système complet HPTLC (camag.com)

V.2.1 Test anti-tyrosinase La tyrosinase est l’enzyme responsable de la catalyse par oxydation des phénols comme la tyrosine. Elle intervient dans l’étape initiale de formation des pigments de la mélanine à partir de la tyrosine. La recherche d’inhibiteurs de la tyrosinase est en expansion pour développer des traitements de l’hyperpigmentation de la peau qui est associée à une surproduction de la mélanine mais aussi pour des formulations sous forme de crème dans le domaine des cosmétiques. Après préparation et développement, la plaque est mise en contact avec le substrat qui est la L-DOPA (2,5 ml) puis avec l’enzyme (3ml) à une concentration de 400U/ml appliqué aussi par le prototype de dérivatisation (Protocole annexe III). La plaque est ensuite incubée 10 min avant d’être séchée. Cette méthode nous permet d’avoir un fond noir du à la dégradation de la L-DOPA par la tyrosinase et l’inhibition de cette activité se manifeste par des tache blanches. 190

Le résultat du test bioautographique avec les fractions DBP01 à DBP14 (Figure 96) ne révèle pas d’activité anti-tyrosinase. En effet, nous n’observons aucune tache blanche sur les fractions testées alors que le témoin positif, acide kojique, montre clairement une zone d’inhibition (à gauche).

DBP-01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 Figure 96: Bioautographie tyrosinase des fractions BDP01 à DBP14 Plaque en verre Si CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

Nous avons pu aussi tester certains composés purifiés de D. boliviana (DB01, DB02, DB04, DB09 et DB10) mais aussi de P. sericea (le Niga-ishigoside F1 PS01, le Trachelosperoside B1 PS02, le secologanoside PS03, l’acide hydroxyasiatique PS04, l’acide hyptatique PS06, l’acide arjunolique PS08 et la trachélosperogénine E PS09). Pour chaque composé un dépôt de 2 µl est réalisé à partir d’une solution à 1 mg/ml préparée dans du MeOH. Nous constatons que deux produits montrent une activité antityrosinase mais qui reste plus faible que celle de l’acide kojique qui est à la même concentration (Figure 97).

Figure 97: Bioautographie tyrosinase des composés de P. sericea et D. boliviana

191

Pour valoriser au mieux ces composés, des tests in vitro sont envisageables afin de déterminer la valeur de leur IC50 et la comparer avec celle de l’acide kojique.

V.2.2 Test α et β-glucosidase Les glucosidases se situent dans la bordure en brosse de l’intestin grêle et catalysent l’hydrolyse des liaisons (1→4) entre les unités glucosidiques (α (1→4) pour les α- glucosidases et β (1→4) pour les β-glucosidases. Elles vont ainsi permettre la dégradation de l’amidon pour l’α-glucosidase et de la cellulose pour la β-glucosidase. Le dysfonctionnement de ces enzymes intervient dans plusieurs maladies et la recherche de leurs inhibiteurs intéresse beaucoup les firmes pharmaceutiques pour le développement de traitement pour le diabète de type 2 et les infections virales [Simoes-Pires et al. 2009]. Pour la préparation et le développement des plaques HPTLC, la même procédure que pour les tests anti-tyrosinase est utilisée. Les solutions d’enzymes sont préparées à une concentration de 200 U/ml dans un tampon acétate de sodium à pH 7,5. Le substrat utilisé est le 2-naphthyl-(alpha ou béta)-glucopyranoside préparé dans du Fast Blue B. le témoin positif est l’acarbose obtenu par solubilisation d’un comprimé Glucobay® (traitement du diabète) dans du méthanol. Cette méthode nous permet de repérer les activités inhibitrices de ces enzymes grâce au complexe Azo dye qui se forme entre le 2-naphthol et le sel Fast Blue B (Figure 98) et qui donne une coloration pourpre à la plaque avec des zones blanches correspondantes à une inhibition de l’enzyme.

Figure 98: Formation du complexe Azo dye formé après hydrolyse de 2-naphthyl-alpha glucopyranoside

192

V.2.2.1 Test β-glucosidase Nous avons pu tester les fractions DBP01 à DBP14 pour leur activité inhibitrice de la β-glucosidase. Nous avons rencontré un souci lors de la dérivatisation car ce protocole n’a pas été mis au point. Les essais que nous avons effectué n’étaient pas satisfaisants car nous n’obtenions pas la couleur pourpre attendue, néanmoins ils nous ont permis de détecter des activités intéressantes en comparaison avec l’acarbose (Figure 99).

Figure 99: Bioautographie β-glucosidase des fractions DBP01 à DBP14 Plaque en verre Si CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1 Nous constatons la présence de zones d’inhibition sur les fractions DBP06 à DBP14 qui contiennent majoritairement les saponines. Ce qui signifie que les saponines de cette plante présentent une activité inhibitrice de la β-glucosidase. Ces activités doivent être vérifiées in vitro tout d’abord sur les fractions puis sur les composés purs. Les composés testés pour l’activité anti-tyrosinase cités précédemment ont été testés pour leur activité inhibitrice de la β-glucosidase (Figure 100). Nous observons des zones d’inhibition pour cinq d’entre eux. Deux ont été isolés de D. boliviana et sont des bidesmosides de l’acide phytolaccinique (DB01) et de l’acide serjanique (DB02). Les trois autres composés proviennent de P. sericea et sont le niga-ishigoside F1 PS01, le trachelosperoside B1 PS02 et le trachélosperogénine F1 PS09. Ces résultats sont intéressants et devront être complété par des tests supplémentaires in vitro afin de quantifier les activités détectées.

193

Figure 100: Bioautographie β-glucosidase des composés de P. sericea et D. boliviana

V.2.2.2 Test α-glucosidase Les mêmes fractions ont été testées pour l’activité inhibitrice de l’α-gluccosidase et des résultats similaires ont été observés quant aux fractions DBP06 à DBP14 (Figure 101). Concernant les composés purs par manque de temps, nous n’avons pas pu avoir des résultats exploitables car la mise au point n’a pu être finalisée.

Figure 101: Bioautographie α-glucosidaseglucosidase des fractions DBP01 à DBP14 Plaque en verre Si CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

V.2.3 Test anti-acétylcholinestérase L’acétylcholinestérase est une enzyme qui se trouve dans de nombreux types de tissus conducteurs comme les nerfs, les muscles et les tissus centraux et périphériques. Elle est impliquée dans la fin de transmission des impulsions par hydrolyse rapide de l’acétylcholine qui est un neurotransmetteur impliqué dans différentes voies cholinergiques. L’inhibition de cette enzyme conduit à l’accumulation de l’acétylcholine qui se traduit par une hyperstimulation des récepteurs nicotiniques et muscariniques. Ainsi, les inhibiteurs

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de cette enzyme sont très recherchés pour leur application dans le domaine pharmaceutique comme pour la maladie d’Alzheimer [Čolović et al. 2013]. Nous avons utilisé le même principe pour la préparation et le développement des plaques HPTLC avec cette fois-ci une solution d’acétylcholinestérase à 500U/ml dans un tampon Tris-HCl à pH 7,9 et une solution de substrat qui est le 1-naphthyl-acétate préparée dans du sel Fast Blue B. Le témoin positif utilisé est la convallatoxine à 1 mg/ml dans du méthanol (dépôt de 2 µl). Là encore les fractions contenant les saponines de D. boliviana semblent être actives contre cette enzyme (Figure 102). Quant aux composés purs testés, seuls six (DB02, DB09, PS01, PS02, PS06, PS09) ont pu être appliqués par manque de quantité. Parmi ces composés, une saponine bidesmosidiquee DB02 semble présenter une activité ainsi que deux autres saponines monodesmosidiques (PS01 et PS02) de P. sericea (Figure 103).

Figure 102: Bioautographie acétylcholinestérase des fractions DBP01 à DBP14 Plaque en verre Si CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

PS06 PS09

DB09

PS02 PS01 DB02

Figure 103: Bioautographie acétylcholinestérase des composés de P. sericea et D. boliviana

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Ce test acétylcholinestérase n’a pas pu être optimisé et pour confirmer et quantifier les activités observées d’autres tests sont à prévoir.

VI. Conclusion

Nous avons mené l’étude phytochimique de deux plantes péruviennes. Premièrement, Poraqueiba sericea (Icacinaceae) qui, à partir de ses tiges, nous a permis de purifier six triterpènes (quatre ursènes et deux oléanènes) ; trois saponines triterpéniques avec un noyau ursène et deux sécoiridoïdes. Nous avons aussi pu tester ces composés en bioautographie pour les activités anti- tyrosinase, anti-acétylcholinestérase et inhibitrice des α- et β-glucosidases. Seules les deux saponines PS01 (niga-ichigoside F1) et PS02 (trachelosperoside B1) semblent présenter des activités inhibitrices de l’acétylcholinestérase et de la β-glucosidase. En deuxième lieu, l’étude phytochimique des racines de Dendrobangia boliviana (Cardiopteridaceae ex Icacinaceae) a été réalisée. Cette plante s’est révélée très riche en saponines triterpéniques mono- et bidesmosididiques avec un à cinq sucres. Les méthodes classiques de fractionnement et de purification nous ont permis de purifier 14 saponines dont deux seulement sont connues dans la littérature comme étant le talunùmoside I DB07 et le 3-

O-β-D-glucuronopyranosyl serjanique DB11. Les autres composés sont sept monodesmosides (1 à 4 sucres) et cinq bidesmosides (2 à 5 sucres). De plus l’analyse de certaines fractions de cette plante en LC-SPE-RMN a révélé la présence de cinq autres saponines (DB15 à DB19) toutes de structures nouvelles. Là encore, aucune activité antileishmanienne n’a été détectée mais certaines de ces saponines (DB05 et DB12) ont démontré une cytotoxicité significative contre les fibroblastes alors qu’aucune des saponines DB01 à DB14 n’a révélé de pouvoir hémolytique. Les fractions contenant ces saponines ont été aussi testées en bioautographie pour les mêmes activités citées précédemment. Alors qu’aucune activité anti-tyrosinase n’est constaté, ces saponines semblent toutes actives contre l’acétylcholinestérase et les α- et β-glucosidases.

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Conclusion générale et perspectives

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Notre sujet de thèse porte sur l’étude phytochimique de plantes péruviennes inconnues et non étudiée jusqu’à présent visant la recherche de nouvelles molécules avec des activités antileishmaniennes. Les travaux de recherche ont été menés au sein du laboratoire Isolement et Structure à l’Institut de Chimie Moléculaire de Reims et en collaboration avec le Dr. Mohamed Hadad de l’IRD de Toulouse et du Dr. Laurent Duca de l’unité MEDyC à la faculté des sciences (URCA). Dans un premier temps, notre étude concernait trois plantes du genre Myrsine : M. latifolia (tiges et feuilles), M. congesta (feuilles et racines) et M sessiliflora (feuilles) qui semblent similaires du point de vue de la composition chimique et surtout très riche en tanins. Ce grand pourcentage de tanins contenu dans ces plantes a constitué un problème quant à leur étude phytochimique. Nous avons pu contourner ce problème par une méthode de précipitation des tanins dans le chloroforme. Au final, onze composés ont pu être isolés de ces Myrsine dont un flavan-3-ol : (+)- catéchine ML02; cinq flavonoïdes : 3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline ML03, 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-quercétine ML04, 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine ML06, 3-O-α- L-arbinopyranosyl-quercétine MS01 et 3-O-α-L-arbinofuranosyl-quercétine MS02 ; un dérivé résorcinol (5-heptadec-12’-enyl-résorcinol ML05) ; une lignane (3α-O-β-D-glucopyranosyl- lyonirésinol ML01) ; deux chromanes (acide myrsinoïque B MC01 et acide myrsinoïque B méthyl ester MC02) et le viburnitol (ML07). Tous ces composés sont déjà connus. Nous n’avons détecté aucune saponine alors que cette famille de plantes est reconnue pour la présence de saponosides biologiquement actives. Cette absence peut être due au protocole de précipitation utilisé qui entrainerait aussi les saponines et autres composés. Pour vérifier cela, nous envisageons d’analyser différentes fractions de ces plantes en LC-RMN qui peut nous apporter des informations supplémentaires quant à la composition chimique de ces plantes. Testés contre les promastigotes de Leishmania infantum ces composés n’ont révélé aucune activité leishmanicide. Nous avons aussi testé ces composés pour leur cytotoxicité contre des fibroblastes mais seules des activités moyennes ont été démontrées pour ML01,

ML02, ML03 et ML06 avec des IC50 comprises entre 12 et 26 µM (4,1 µM pour l’α- héderine). En deuxième lieu, au vu des résultats obtenus avec les Myrsine, nous nous sommes tournés vers une autre famille de plantes que sont les Icacinaceae. La plante choisie est Poraqueiba sericea collectée au Pérou (à Iquitos) dont aucune étude phytochimique n’a été répertoriée.

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A partir des tiges de cette plante onze composés ont été isolés dont sept triterpènes ou monoglucosides à noyau ursène : le niga-ichigoside F1 PS01, le trachelosperoside B1 PS02 l’acide 19α-hydroxyasiatique PS04, l’acide myrianthique PS05, l’acide hyptatique PS06, la trachélosperogénine B PS07 et le 4-épi-niga-ichigoside F1 PS10 ; deux triterpènes à noyau oléanène : l’acide arjunolique PS08 et la trachélosperogénine E PS09 : et deux sécoiridoïdes : le secologanoside PS03 et la secoxyloganine PS11. A part pour les deux sécoiridoïdes il s’agit de la première description de ces triterpènes et de leurs glucosides dans cette famille de plantes. Ces composés ont été testés pour différentes activités biologiques (leishmanicide, cytotoxicité, anti-élastase, anti-acétylcholinestérase et anti- α- et β-glucosidases). Seules les saponines PS01 et PS02 ont présenté des activités inhibitrices de l’acétylcholinestérase et de la β-glucosidase en bioautographie. Pour l’activité anti-élastase, nous ne constatons que des activités moyennes pour les composés PS02, PS03, PS08 et PS09 avec une inhibition comprise entre 13 et 16% à 50µg/ml ce qui reste plus faible que le témoin positif dont l’inhibition est à 31 % à la même concentration. Afin de vérifier l’activité anti-acétylcholinestérase des deux saponines des tests in vitro sont à prévoir pour vérifier l’activité et déterminer la valeur de leur IC50. En dernier lieu, les racines d’une cinquième plante Dendrobangia boliviana appartenant à la famille des Cardiopteridaceae (ex Icacinaceae) a été étudiée. Ce travail nous a permis d’isoler 14 saponines (DB01 à DB14) en utilisant des méthodes classiques de fractionnement et de purifications. Parmi ces saponines, deux sont connues comme étant le talunùmoside I DB07 et le 3-O-β-D-glucuronopyranosyl serjanique DB11. Pour les 12 autres saponines, nous avons identifiés trois mono-ou bidesmosides de l’acide phytolaccinique et neuf mono- ou bidesmosides de l’acide serjanique de structures nouvelles. De plus, l’analyse de certaines fractions de cette plante en LC-SPE-RMN nous a permis d’identifier d’autres saponines minoritaires toutes de structures nouvelles. La confirmation des structures de ces saponines est en cours de réalisation et une purification et à prévoir afin de pouvoir effectuer leur caractérisation structurale complète et aussi de les tester pour différentes activités biologiques afin de mieux les valoriser. Les saponines DB01 à DB14 n’ont démontré aucune activité leishmanicide et aucun pouvoir hémolytique. Les saponines DB05 et DB12 ont révélé une cytotoxicité significative contre les fibroblastes avec des IC50 respectivement de 6,4 et 5,6 µM comparée à celle de l’α- héderine qui est de 4,6 µM. Des tests en autobiographie, pour les activités anti-tyrosinase, anti-acétylcholinestérase et anti- α- et β-glucosidases, ont été réalisés pour les fractions contenant les saponines. Ces 199

fractions semblent actives contre l’acétylcholinestérase et les α- et β-glucosidases. Pour vérifier ces activités, nous envisageons de tester ces fractions et les saponines purifiées in vitro afin de quantifier leurs activités.

200

Matériels et méthodes

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I. Méthodes chromatographiques analytiques

I.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) La CCM est une méthode analytique que nous utilisons à chaque étape de fractionnement et de purification afin de suivre la présence et la pureté des produits isolés. Selon la polarité des fractions et des composés étudiés, deux types de plaques CCM prêtes à l’emploi sont utilisées : . Plaques de silice (phase normale) sur support aluminium de chez Merk ® (Silicagel 60 F254) ou Macherey-Nagel (ALUGRAM Xtra Sil G/UV254) pour les fractions moyennement apolaires à apolaires.

. Plaques silice greffée C18 (phase inverse) sur support aluminium de chez Merk ® (Silicagel 60 RP-18 F254S ou Macherey-Nagel (ALUGRAM RP-18W/UV254) pour les fractions moyennement polaires à polaires. Les dépôts sont réalisés à l’aide d’un capillaire et séchés avec un sèche-cheveux avant le développement dans une cuve CCM en verre saturée avec l’éluant adapté. La phase mobile utilisée est constituée d’un mélange de solvants binaire, tertiaire ou quaternaire choisis en fonction du type de la fraction étudiée. Nous avons utilisés différents systèmes de solvants selon la séparation souhaitée :

. CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

. CHCl3/MeOH/H2O 70/30/5 Silicagel . CHCl3/MeOH 70/30

. CHCl3/MeOH 80/20

. MeOH/H2O 50/50 RP-18 . MeOH/H2O 70/30 Après le développement les plaques sont séchées sous hotte et/ou à l’aide d’un sèche- cheveux puis observées en lumière visible et sous lampes UV (lampe Vilber Lourmat VL- 6.MC) à 254 et 366 nm avant la révélation. Le révélateur utilisé est l’acide sulfurique 50% ® (H2SO4-96%/H2O 50/50 v/v ; chambre de dérivatisation Camag TLC spray) suivi d’un chauffage au décapeur thermique.

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I.2 Chromatographe liquide de haute performance (CLHP) Les analyses par CLHP ont été réalisées sur une chaîne CLPU (chromatographie liquide ultra-performante) Dionex U3000 dotée d’une pompe LPG-3000 SD, d’un détecteur à barrettes de diodes DAD-3000, d’un échantillonneur automatique WPS-3000 et d’un four TTC-3000 (réglé généralement à 30°C). Les analyses ont été effectuées avec deux colonnes CLHP à polarité de phases inversées :

. Colonne Interchim C18-2 5 µm, 100 A°, 250*4,6 mm

. Colonne Phenomenex C18-2 5 µm, 100 A°, 250*4,5 mm Pour chaque analyse, nous avons utilisé des gradients d’ACN (qualité CLHP-Carlo Erba) et d’eau acidifiée (0,025 % TFA) avec un débit de 1 ml/min pour toutes les analyses. L’utilisation de l’eau acidifiée nous permet d’obtenir une meilleure résolution des pics chromatographiques. Nous utilisons de l’eau permutée et osmosée que nous filtrons sur une membrane de cellulose régénérée RC55 de 0,45 µm (Whatman) puis sur une membrane de polyvinylIdene fluoride hydrophile GVWP de 0,22 µm (Durapore®, Millipore) afin d’éviter toute contamination de la chaine de CLHP.

Pour chaque première analyse, un gradient ACN/ H2O-TFA 0,025% très large (Tableau 36) est utilisé pour avoir un chromatogramme avec tous les composés de la fraction étudiée. C’est à partir de ce chromatogramme que nous réalisons des ajustements pour les étapes suivantes (fractionnement et/ou purification).

Tableau 36: Gradient utilisé pour les premières analyses en CLHP

Temps (min) 0 5 25 35 40

% ACN 10 10 100 100 10

% H2O-TFA 90 90 0 0 90

Pour le couplage LC-SPE-RMN, nous utilisons une chaîne CLHP classique Agilent Technologies 1260 infinity reliée à un système SPE Spark et un collecteur Foxy R1 de chez Teledyne ISCO. La colonne utilisée est une PRONTOSIL en C18 5,0 µm 4,0*125 mm. La chromatographie chirale 5(analyse des sucres hydrolysés) a été réalisée sur un appareil Waters avec un échantillonneur automatique 717 Plus, un four de colonne CO-965, un contrôleur de système 600E, une pompe 60F, un détecteur à barrette de diodes Waters- 996, un réfractomètre RI Waters-410 et le logiciel Empower®. 203

II. Méthodes chromatographiques de fractionnement

II.1 Chromatographie liquide sous vide (CLV) C’est une méthode chromatographique simple, rapide, efficace et peu couteuse permettant des fractionnements grossiers. Selon le fractionnement souhaité nous avons utilisé soit de la silice normale (Merk, Silicagel 60 40-43µm) soit de la silice greffée C18 (Merk, Lichroprep RP-18 43-60 µm) avec un rapport 10/1 masse de silice/masse de l’échantillon. Une fois choisie, la phase stationnaire est suspendue dans le solvant adéquat puis déposée dans un verre fritté cylindrique de porosité n°4. Elle est ensuite tassée et séchée par application du vide (utilisation d’une trompe à eau). Une fois conditionnée l’échantillon est déposé à la surface de la phase stationnaire puis une élution par palier est réalisée (soit

MeOH/H2O pour la phase inverse soit CHCl3/MeOH pour la phase normale).

II.2 Chromatographie flash Pour le fractionnement par chromatographie flash, nous utilisons un système Grace® Reveleris® (Figure 104) qui est un système automatisé sur lequel nous pouvons programmer un gradient (4 lignes de solvants disponibles) et collecter directement les fractions grâce à un collecteur automatique intégré.

Figure 104: Système Grace® Reveleris® et cartouches Grace® [grace.com]

La collecte se fait en suivant le chromatogramme obtenu avec un détecteur DEDL (Détecteur évaporatif à diffusion de Lumière) et d’un détecteur UV (2 longueurs d’ondes programmable entre 200 et 400 nm). Un écran associé au système avec le logiciel Grace®

204

Reveleris® Flash System permet de piloter et de suivre le fractionnement en cours et d’apporter des modifications si nécessaire sans arrêter l’élution. La phase stationnaire utilisée est conditionnée sous forme de cartouches en plastiques de différentes tailles prêtes à l’emploi qui seront choisies en fonction du type d’échantillon (phase normale /inverse) et de la masse de l’échantillon à déposer, selon le tableau 37 suivant.

Tableau 37: Différentes cartouches Grace® et les paramètres adaptés

Taille de la Poids du dépôt conseillé Débit conseillé colonne (g) (mg) (mL/min) 4 4-800 18

12 12-2 400 36 40 40-8 000 40 80 80-16 000 60 120 120-24 000 80 Phase normale 330 330-66 000 120

4 5-200 18 12 19-600 30 40 45-1 350 40 80 93- 2800 60

Phase inverse 120 150-6 000 80

II.3 Chromatographie de partage centrifuge (CPC) La CPC est une chromatographie liquide-liquide dont le principe est fondé sur la différence de partage des solutés entre deux phases liquides non miscibles préparées par mélange de 2, 3 ou plus de solvants et/ou de solutions. Une phase est maintenue stationnaire dans la colonne (rotor) par un champ de forces centrifuges constant, l’autre phase (la phase mobile) est pompée au travers. Cette méthode n’utilise pas de support solide nous permettant de récupérer l’intégralité de l’échantillon injecté (pas d’adsorption réversible des solutés) et limitant les dégradations des solutés. En fonction du type de la phase stationnaire, nous allons avoir deux modes d’élution : un mode dit ascendant lorsque la phase stationnaire est constituée de la phase la plus dense et un mode descendant dans le cas contraire. II.3.1 Appareillages Notre laboratoire est équipé de chaines chromatographiques : CPC et EPC (extracteur de partage centrifuge) avec des capacités différentes :

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II.3.1.1 Chaîne EPC : Il s’agit d’une chaîne FPCE300 de chez Kromaton Technologies® avec une colonne d’un volume de 300 ml comportant 7 disques de 250 mm de diamètre contenant chacun 33 cellules de partage connectées par des conduits de 0,8 mm. Ce rotor est intégré dans un système complet muni de différents éléments : . Pompe gradient 1800-V7115 . Système d’injection Isco 500D (Teledyne IsoInc) . Détecteur UVD170s (Dionex) . Collecteur de fraction Pharmacia Superfrac Ces différentes composantes sont manipulées grâce au logiciel Chromeleon® II.3.1.2 Chaîne CPC Il s’agit d’un appareil de chez Kromaton Technologies® (FCPC) dont le rotor est d’un volume de 200 ml constitué par 20 disques comportant chacun 66 cellules de partages. Cette chaîne chromatographique est pilotée par le logiciel Armen Glider® et comporte les éléments suivants : . Pompe gradient haute pression P580HPG (Dionex) . Valve d’injection « Dual Mode » préparative PEEK 3125 Rheodyne . Détecteur UV-vis Dionex . Collecteur de fractions Pharmacia Superfrac II.3.2 Méthodologie II.3.2.1.1 Préparation du système solvant

Dans notre cas deux type de CPC ont été réalisées : triphasique et biphasique pour lesquelles différents systèmes de solvants ont été préparés : . CPC triphasique : nous avons préparé un mélange quaternaire avec

Heptane/MtBE/ACN/H2O dans des volumes équivalents. Ce mélange forme trois phases (Upper phase UP / Middle phase MP / Lower phase LP) dont la phase supérieure UP constitue la phase mobile n°1 de notre expérience. Les deux autres phases (MP et LP) sont récupérées et avant de les séparer, enrichies par ajout de MtBE (au même volume qu’au départ). La phase MP résultante constituera notre phase mobile n°2 alors que la phase LP résultante sera notre phase stationnaire. . CPC biphasique : deux solvants biphasiques tertiaires ont été préparés

AcOEt/BuOH/H2O 4/1/5 (S1) et 1/4/5 (S2). La phase aqueuse du système S1

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représente la phase stationnaire ; la phase organique du système S1 la phase mobile n°1 et la phase organique du système S2 la phase mobile n°2.

II.3.2.1.2 Remplissage de la colonne Le rotor est rempli par la phase stationnaire adéquate en pompant le double du volume de la colonne (200 ml pour la CPC et 300 ml pour l’EPC) à un débit de 20 ml/min et une vitesse de rotation de 1000 rpm.

II.3.2.1.3 Injection : L’échantillon est préparé dans le mélange 6/2/1 LP/MP/UP pour la CPC triphasique et 1/1 phase mobile/phase stationnaire pour la CPC biphasique.

II.3.2.1.4 Elution La phase mobile n°1 est pompée au travers de la phase stationnaire pendant 45 min puis la phase mobile n°2 pendant 45 min aussi. Ces temps sont utilisés de façon générale mais on peut les changer en fonction du type d’échantillons et en fonction du déroulement de la séparation.

II.3.2.1.5 Extrusion : Pour chasser la phase stationnaire de la colonne et tout récupérer nous pompons un mélange MeOH/H2O en utilisant un mode d’élution contraire à celui utilisé lors de l’élution.

III. Méthodes chromatographiques de purification

III.1 CLHP semi-préparative Pour la purification des composés en CLHP semi-préparative, nous avons utilisé une chaîne chromatographique Dionex constituée d’une pompe LPG-3400 A, d’un détecteur UV à barrettes de diodes UVD-340U, d’un échantillonneur ASI-100, d’un four STH-585 (réglé en général à 30°C) et d’un collecteur automatique AFC-3000. Ces composantes sont toutes pilotées grâce au logiciel Chromeleon®. Les colonnes utilisées sont en phase inverse au nombre de trois : . Colonne Interchim C18-2 5µm 250*10,0 mm . Colonne Phenomenex Luna 5 µm C18 100 A° 250*10,0 mm . Colonne Interchim Luna 5 µm C18 100 A° 250-15,0 mm. Les solvants utilisés sont de l’ACN de qualité CLHP de chez Carlo Erba et de l’eau acidifiée à 0,025% de TFA filtrée préalablement sur une membrane de cellulose régénérée RC55 0,45 µm (Whatman) 207

Les gradients sont, pour chaque fraction, mis au point en CLHP analytique avant l’injection en CLHP semi-préparative.

III.2 CLHP préparative La chaîne de chromatographie préparative que nous utilisons est constituée d’une pompe Armen ACC 250/500, d’un détecteur Merk UV-detector K2501 Knauer et d’un collecteur Buchi Fraction Collector C-660. Le pilotage de ces instruments s’effectue manuellement et le suivi de l’élution (chromatogramme) est réalisé via un enregistreur Kipp & Zonen. La colonne utilisée a été conditionnée au laboratoire avec de la silice greffée Lichrospher RP-18 100 A° 12 µm (Merk). Les solvants (MeOH) sont de qualité normale de chez Carlo Erba et l’eau est osmosée et permutée mais non filtrée.

IV. Méthodes physicochimiques

IV.1 Spectrométrie de masse Les expériences HRSM (High Resolution Mass Spectrometry) ont été menées sur un instrument hybride en tandem Quadripôle/Temps de Vol (Q-TOF) équipé d’une source d’ion Electrospray ESI (Micromass) à assistance pneumatique (Z-spray) fonctionnant en mode positif. Les conditions générales d’analyses sont : . Tension capillaire de 3500 V . Tension d’extraction de cône variant de 30 à 60 V avec un débit d’injection de 5 µl/min . Température source de 80°C . Température de désolvatation de 100°C

IV.2 Spectrométrie de résonnance magnétique (RMN) Chaque composé purifié a été analysé en RMN afin de pouvoir établir sa structure. Pour cela, nous avons utilisé soit un appareil à 500 MHz pour la RMN 1H et à 125 MHz pour la RMN 13C Brüker Avance DRX-500 soit un appareil à 600 MHz pour la RMN 1H et à 150

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MHz pour la RMN 13C Brüker Avance DRX-600 équipé d’une cryosonde. Les données obtenues sont traitées et exploitées par le logiciel TopSpin 2.1 ou 3.2. Les échantillons sont préparés dans des tubes analytiques de 5 mm de diamètre dans des solvants deutérés CD3OD, CDCl3 ou DMSO-d6 selon la solubilité du composé analysé. Les déplacements chimiques δ sont donnés en ppm par rapport au TétraMéthylSilane (TMS) et les constantes de couplages J en Hz. Les programmes de séquences impulsionnelles standard fournies par Brüker nous ont permis de réaliser, en plus des expériences monodimensionnelles 1H et 13C, différentes expériences bidimensionnelles : . Corrélations Homonucléaires : COSY (COrrelation SpectroscopY) permet d’observer les couplages scalaires 2J/3J entre les protons géminés et vicinaux TOCSY (Total COrrelation SpectroscopY) permet de voir les corrélations entre tous les protons d’un même système de spin (tous les protons d’un cycle par exemple) ROESY (Rotating frame Overhauser Effect SpectrocopY) permettant l’observation des corrélations entre les protons proches dans l’espace même s’ils ne sont pas directement liés. . Corrélations hétéronucléaires : HSQC (Heteronuclear Simple Quantum Coherence) permet de mettre en 1 évidence des couplages JH-C et de relier chaque carbone aux protons qu’il porte HMBC (HeteronuclearMultiple Bond SpectroscopY) met en évidence des couplages proton-carbone à longue distance en 2J et 3J.

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V. Extraction et purification

V.1 Collecte et identification des plantes Les trois plantes étudiées, M. latifolia (racines et feuilles), M. congesta (tiges et feuilles) et M. sessiliflora (tiges), ont été collectées au district d’Oxapampa, Chacos, au Pérou par C. Amasifusen, M. Haddad, J. Perea et J. Mateo en juillet 2010. Elles ont été identifiées par les botanistes C. Amasifusen et J. Mateo. Un échantillon de chaque plante (N° 3476 pour M. latifolia, N° 3479 pour M. sessiliflora et N°3477 pour M. congesta), a été réalisé et déposé à l’herbier national de l’université nationale San Marcos de Lima au Pérou (UNMSM). Les plantes P. sericea (Tiges) et D. boliviana (racines) ont été collectées et identifiées à Iquitos, au district du Loreto, au Pérou par C. Amasifusen, E. Rengifo et M. Haddad, en septembre 2011. Un échantillon de chaque plante (N° CA3236 pour P. sericea et N° CA3240 pour D. boliviana) a été réalisé et déposé à l’herbier national de l’université nationale San Marcos de Lima au Pérou (UNMSM). V.2 Myrsine latifolia (tiges et feuilles)

Les tiges séchées et broyées de M. latifolia (500g) ont été macéré avec du MeOH/H2O (8/2, 5 L) à température ambiante pendant 24h pour donner un extrait hydrométhanolique après évaporation sous vide du MeOH (à environ 500 ml). Cet extrait a été partagé

successivement avec de l’AcOEt saturé en H2O et du n-BuOH saturé en H2O (3 x 750 ml chacun) pour avoir au final, une phase AcOEt (4,85 g), une phase BuOH (8,37 g) et une phase aqueuse (31,01 g). Les profils des analyses chromatographiques sur couche mince (CCM) montrent clairement une grande proportion de tanins dans ces fractions : trainée marron tout au long de la migration (Figure 105).

A B C

Figure 105: Plaque CCM des fractions AcOEt (A), BuOH (B) et H2O (C) des tiges de M. latifolia CCM-C18, MeOH/H2O 1/1

210

Une partie de la phase soluble dans le n-BuOH (1,1 g) a été passée sur une résine Sephadex LH-20 (10 g). Le dépôt a été réalisé en solubilisant la fraction avec 10 ml d’un mélange hydrométhanolique (MeOH/H2O 1/9). La colonne a été éluée avec un gradient allant de 100% H2O au mélange hydrométhanolique (MeOH/H2O 25/75, 50/50, 75/25) pour finir à 100% MeOH (30 ml pour chaque élution). Après regroupement, on a obtenu quatre fractions MLTBS1 à 4 (168, 292, 178 et 176 mg respectivement) (Figure 106).

Figure 106: Plaque CCM de l’élution sur résine Sephadex LH-20 de MLTB CCM-C18, MeOH/H2O 1/1

Les fractions MLTBS3 et 4 ont été rassemblées, éluées avec MeOH/H2O 75/25 et

MeOH 100%,et soumises à une CLV sur RP-18 éluée avec le mélange H2O/MeOH (8/2, 7/3, 6/4, 5/5, 4/6, 2/8) et 100% MeOH, 3 x 20 ml chacun, pour obtenir, après regroupement suivant les profils CCM, cinq fractions MLTBS4-a à MLTBS4-e (145, 192, 170, 42 et 6,3 mg respectivement) dans lesquelles la séparation des tanins des autres composés était insatisfaisante. Plusieurs essais de purification de la phase soluble dans le n-BuOH des tiges ont été menés en utilisant soit l’Extracteur de Partage Centrifuge (EPC) soit la Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC). Le premier essai, sur 407 mg, a été réalisé par CPC en utilisant un système de solvants biphasique EtOAc / BuOH / H2O (4/1/5 et 1/4/5 v / v / v). La colonne a été remplie avec la phase aqueuse du système 4/1/5 et maintenue stationnaire à une vitesse de rotation de 1000 tours par minute. L'élution a été réalisée par pompage de la phase organique du système 4/1/5 et la phase organique du système 1/4/5, à une vitesse de 5 ml / min de débit ; pour donner le composé ML01 (3α-O-β-D-glucopyranosyl-yoniresinol) dans les fractions n°8 (15 mg) et n°9 (20 mg). Le seconde essai a été réalisé par CPE en utilisant un système de solvant triphasique n- heptane/ MtBE/ACN/H2O (1/1/1/1, v/v/v/v). 396 mg de la fraction ont été solubilisés dans 26 ml de phase inférieure (PI) / phase intermédiaire (PIn)/ phase supérieure P/S (22/5/1, v/v/v) du système de solvant triphasique. La colonne de CPE a été remplie par la phase stationnaire 211

aqueuse (PI). La phase supérieure a été pompée à 5 ml/min avec une vitesse de rotation de 1000 rpm pendant 30 min et après la phase intermédiaire a été éluée pendant 90 min pour donner, après rassemblement, les fractions MLTB1 à MLTB9 (13, 2, 2, 9, 4, 4, 15, 11 et 283 mg respectivement) dans lesquelles la séparation des tanins des autres composés était insatisfaisante. La fraction butanolique obtenue par extraction liquide-liquide de l’extrait hydroéthanolique des feuilles de M. latifolia (MLFB) a été fractionnée par CPE en utilisant un système de solvant triphasique n-heptane/MtBE/ACN/H2O (1/1/1/1, v/v/v/v). 2 g d’extrait ont été solubilisés dans 8 ml de phase inférieure/phase supérieure (2/8, v / v) du système de solvant triphasique. La colonne de CPE a été remplie par la phase stationnaire aqueuse (phase inférieure). La phase supérieure a été pompée à 10 ml/min avec une vitesse de rotation de 1000 rpm pendant 60 min et après la phase intermédiaire a été éluée pendant 60 min pour donner des fractions de MLFBF1 à MLFBF10 (132,8 ; 61,7 ; 1095,2 ; 57,8 ; 62,3 ; 15,5 ; 89,6 ; 174,9 ; 75,7 et 10,7mg respectivement). La fraction MLFBF3 (1 g) a été séparée sur gel de silice par chromatographie flash haute performance (CFHP) en utilisant un gradient de

CHCl3/MeOH (95/5 à 0/100) pour donner le composé ML02 ((+)-Catéchine, 34 mg) et le composé ML03 (3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline, 500 mg). Une autre partie (2 g) de cette fraction butanolique a été fractionnée par CLV sur RP-

18 éluée avec le mélange H2O/MeOH (8/2, 6/4, 4/6, 2/8) et 100% MeOH, 3 x 400 ml chacun, pour obtenir cinq fractions MLFBV1 à MLFBV5 (581, 256, 657, 113 et 102 mg respectivement). La fraction MLFBV3 (209 mg) a été purifiée par CFHP sur RP-18 en utilisant un gradient de MeOH/H2O (2/8 à 1/0) pendant 30 min pour donner des fractions de MLFBV2-a à MLFBV2-g (120, 70, 22, 6, 25, 39 et 5 mg respectivement). La fraction MLFBV2-e (25 mg) a été soumise à une CLHP semi-préparative sur RP-18 éluée avec un mélange isocratique d'ACN / H2O-TFA 0,025% (25/75) pendant 20 min pour donner le composé ML03 (3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline, 2 mg, Rt = 6,3 min) et le composé ML04 (Quercétine-3- O-α-rhamnopyranoside, 4 mg, Rt = 9 min). La fraction MLFBV5 (102 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur RP-18 en utilisant un gradient de ACN /

H2O-TFA 0,025% (1/9 à 10/1) pendant 5 min puis un mélange isocratique à 100% d’ACN en 10 min pour donner le composé ML05 (dérivé résorcinol, 2 mg, Rt = 9,5 min).

Après évaporation à sec, la phase soluble de l'AcOEt (4 g) des tiges a été dissoute dans un mélange de CHCl3/MeOH (92/8, 300 ml) puis placer 12h à 4 ° C pour précipiter les tanins (Figure 107). L'extrait brut sans tanins (3,6 g), obtenu après filtration et mise à sec, a été fractionné par chromatographie liquide sous vide (CLV) sur silice greffée RP-18 éluée 212

successivement avec MeOH/H2O 2/8 (4 x 40 ml), 3/7 (6 x 40 ml), 4/6 (4 x 40 ml), 5/5 (6 x 40 ml), 6/4 (4 x 40 ml), 8/2 (4 x 40 ml) et 100% MeOH (500 ml) pour donner, après regroupement, les fractions MLTA1 à MLTA8 (1048, 266, 165, 147, 232, 245, 528 et 471 mg respectivement). La fraction MLTA4 a été purifiée par CFHP sur gel de silice éluée avec un gradient binaire de CHCl3/MeOH (1/0-0/1) pendant 25 min pour donner le composé ML04 (Quercétine-3-O-α-rhamnopyranoside, 5 mg) et le composé ML06 (3-O-α-L- rhamnopyranosyl-isorhamnétine, 5 mg).

A B C Figure 107: Plaque CCM après précipitation des tanins de la fraction AcOEt de M. latifolia A : fraction AcOEt au départ, B : filtrat, C : Précipité- CCM-SiOH CHCl3/MeOH/H2O/HCOOH 61/32/7/1

Le résidu aqueux (31,7 g) des tiges a été également soumis à la précipitation des tanins

(CHCl3 /MeOH 92/8, 12h à 4 ° C). Après concentration, le filtrat (116 mg) a été fractionné par

CFHP avec un gradient de CHCl3/MeOH (1/0 à 0/1) pour donner deux fractions MLTH1 (78 mg) et MLTH2 (28 mg). La fraction MLTH1 a été purifiée par CLHP semi-préparative sur

RP-18 avec un système isocratique ACN/H2O-TFA 0,025% (3/7) pendant 12 min et un gradient ACN/H2O-TFA 0,025% (3/7-10/1) pendant 15 min pour donner le composé ML01 (dérivé du résorcinol, 4mg, Rt = 23,5 min). Lors de la préparation du dépôt de cette chromatographie flash, dans un mélange MeOH/CHCl3, un précipité blanc est apparu. Une filtration a été réalisée avant l’injection en chromatographie flash et a donné le composé ML07 (10 mg).

V.3 Myrsine congesta (feuilles et racines)

Les racines séchées de M. congesta (650 g) ont été macérées dans MeOH/H2O (8/2, 6,5 L, 24h) à température ambiante pour donner un extrait brut qui a été réduit à un volume de 800 ml (évaporation du MeOH au Rotavapor). Une partie cet extrait hydrométhanolique concentré (2 g) a été mise en suspension dans un mélange CHCl3/MeOH (9/1, 12h à 4 ° C) 213

pour précipiter les tanins. Le filtrat sans tanins (60 mg) a été purifié par CLHP semi- préparative sur RP-18 avec un gradient d’ACN/H2O-TFA 0,025% (5/95 à 1/0) pendant 17 min puis 100% ACN en 10 min, pour donner le composé MC01 (Acide myrsinoïque B, 5 mg, Rt = 21 min) et le composé MC02 (Acide myrsinoïque B méthyl ester, 4 mg, Rt = 22,5 min). Le reste de l’extrait hydrométhanolique a été partagé successivement avec de l’AcOEt et du n-BuOH (saturés par H2O) pour donner la phase AcOEt (3,6 g), la phase n-BuOH (14 g) et la phase aqueuse (55 g). Une partie de la phase aqueuse (2 g) a été soumise à la précipitation des tanins par reprise dans le mélange CHCl3/MeOH (9/1, 12h à 4 ° C). La fraction aqueuse sans tanins, récupéré par filtration, a été séparée par CFHP sur gel de silice avec un gradient de CHCl3/MeOH (1:0 à 0:1) pour donner le composé ML01 (lyoniresinol, 4 mg) dans la première fraction.

Les feuilles séchées de M. congesta (30 g) ont été macérées dans MeOH/H2O (8/2, 6,5 L, 24h) à température ambiante pour donner 9,7 g d’extrait brut. Une partie cet extrait hydrométhanolique concentré (489 mg) a été mise en solution dans un mélange CHCl3/MeOH (92/8, 12h à 4 ° C) pour précipiter les tanins. Le filtrat concentré (49 mg) a été fractionné par

CFHP sur gel de silice avec un gradient de CHCl3 /MeOH (1/0 à 0/1) pour donner les composés ML04 (Quercétine-3-O-α-rhamnopyranoside, 3 mg), ML06 (3-O-α-L- rhamnopyranosyl- isorhamnétine, 3 mg) et ML02 (Catéchine, 5 mg).

V.4 Myrsine sessiliflora Les feuilles séchées de M. sessiliflora (30 g) ont été macérées dans un mélange

MeOH/H2O (8/2, 3 x 24h, 3 x 50 ml) à température ambiante pour donner un extrait hydrométhanolique. Après concentration sous vide, cet extrait (8,3 g) a été soumis à la précipitation des tanins dans CHCl3/MeOH (92/8, 12h à 4 ° C). L’extrait sans tanins a été fractionné par CFHP sur gel de silice avec un gradient de CHCl3/MeOH (1/0 à 0/1) pour donner sept fractions : MSF1 à MSF16 (11, 12, 6, 8, 40, 21, 5, 15, 19, 50, 18, 10, 9, 8 et 31 mg respectivement). La fraction MSF6 (21 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur

RP-18 en utilisant un mélange isocratique d'ACN/H2O-TFA 0,025% (1/4) pendant 15 min pour donner le composé MS01 (Quercétine-3-O-arabinofuranoside, 2 mg, Rt = 8 min) et le composé MS02 (Quercétine-3-O-arabinopyranoside, 2 mg, Rt = 8,4 min). La fraction MSF10

(50 mg) a été purifiée par CFHP sur RP-18 avec un gradient de MeOH/H2O (9/1 à 0/10) pour donner les composés ML02 (catéchine, 4 mg) et ML01 (Lyoniresinol, 3 mg).

214

V.5 Poraqueiba sericea Les tiges séchées et broyées de Poraqueiba sericea (856 g) ont été extraites par macération dans le mélange MeOH/H2O (8/2 v/v, 4,3 l) à température ambiante pendant 24h. Après filtration et évaporation sous vide, l’extrait hydrométhanolique (54,3 g) a été dissous dans le mélange CHCl3/MeOH (92/8) puis placer pendant 12 h à 4°C pour précipiter les tanins. Après filtration le précipité (11,3 g) et le filtrat (19,05 g) sont mis à sec. Le filtrat (7.5 g) a été fractionné, en 3 fois 2,5 g, par CFHP sur gel de silice éluée avec un gradient binaire de CHCl3/Cyclohexane (1/1 à 1/0) pendant 15 min puis CHCl3/MeOH (1/0 à 0/1) pendant 25 min pour donner les fractions PS-A à PS-I. La fraction PS-B (386 mg) a été fractionnée par CFHP sur RP-18 avec un gradient de

MeOH/H2O (9/1 à 0/10) pour donner 9 fractions (PS-B1 à PS-B9). La fraction PS-B6 (78 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur RP-18 en éluant avec un mélange isocratique d'ACN/H2O-TFA 0,025% (85/15) pendant 20 min avec un débit de 4 ml/min pour donner le composé PS04 (2 mg, Rt = 7,3 min), le composé PS05 (2 mg, Rt = 7,6 min) et le composé PS06 (8 mg, Rt = 7,9 min). La fraction PS-C (422 mg) a été fractionnée par CFHP sur RP-18 avec un gradient de

MeOH/H2O (9/1 à 0/10) pour donner 10 fractions (PS-C1 à PS-C10). Les fractions PS-C7 (109 mg), PS-C8 (114 mg) et PS-C9 (197 mg) ont été purifiées successivement par CLHP semi-préparative sur RP-18 en éluant avec un gradient ACN/H2O-TFA 0,025% (1/9 à 8/2) pendant 3 min puis en isocratique (8/2) pendant 20 min pour donner le composé PS02 (2 mg, Rt = 5,9 min), le composé PS04 (13 mg, Rt = 6,2 min), le composé PS06 (10 mg, Rt = 6,5 min), le composé PS07 (6 mg, Rt = 5,8 min) et le composé PS08 (2 mg, Rt = 7,0 min). La fraction PS-D (374 mg) a été fractionnée par CFHP sur RP-18 (cartouche 12 g) avec un gradient MeOH/H2O (9/1 à 0/10) et un débit de 30 ml/min pour donner 17 fractions (PS-D1 à PS-D17). La fraction PS-D10 (61 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur

RP-18 éluée avec un gradient ACN/H2O-TFA 0,025% (2/8 à 4/6) pendant 20 min puis (4/6 à 1/0) pendant 5 min et 100% ACN pendant 6 min avec un débit de 4 ml/min pour donner le composé PS02 (3 mg, Rt = 27,0 min) et le composé PS09 (13 mg, Rt = 27,5 min). La fraction PS-E (605 mg) a été fractionnée par CFHP sur RP-18 (cartouche 12g) avec un gradient MeOH/H2O (9/1 à 0/10) et un débit de 30 ml/min pour donner 12 fractions (PS- E1 à PS-E12). La fraction PS-E1 contenait le composé PS02 (30 mg). La fraction PS-E5 (127 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur RP-18 éluée avec un gradient ACN/H2O- TFA 0,025% (1/9 à 25/75) pendant 18 min puis (25/75 à 10/0) pendant 3 min avec un débit de 4 ml/min pour donner le composé PS11 (13 mg, Rt = 12,1 min). La fraction PS-E9 (41 mg) a

215

été soumise à une CLHP semi-préparative sur RP-18 en éluant avec un gradient ACN/H2O- TFA 0,025% (35/65 à 45/55) pendant 20 min avec un débit de 4 ml/min pour donner le composé PS10 (2 mg, Rt = 10,3 min) et le composé PS02 (3 mg, Rt = 15,2 min). La fraction PS-G (358 mg) a été fractionnée par CFHP sur RP-18 (cartouche 12 g) avec un gradient MeOH/H2O (9/1 à 0/10) et un débit de 30 ml/min pour donner 12 fractions (PS-G1 à PS-G12). La fraction PS-G6 contenait un seul produit : le composé PS01 (34 mg). La fraction PS-H (825 mg) a été fractionnée par CFHP sur RP-18 (cartouche 12g) avec un gradient MeOH/H2O (9/1 à 0/10) et un débit de 30 ml/min pour donner 12 fractions (PS- H1 à PS-H12). Les fractions PS-H4 et PS-H8 contenaient respectivement les composés purs PS03 (25 mg) et PS02 (56 mg).

V.6 Dendrobangia boliviana Les racines séchées et broyées de Dendrobangia boliviana (150 g) ont été extraites par macération dans MeOH/H2O (8/2 v/v, 1,5 l) à température ambiante pendant 24h. Après filtration et évaporation sous vide, l’extrait hydrométhanolique (18,6 g) a été repris dans le minimum de MeOH (100 ml) et précipité dans 15 fois son volume en acétone. Après filtration le précipité (PDB) est mis à sec (11,4 g) sous vide sur KOH. Une partie du précipité enrichi en saponines (3,5 g) a été passée sur une résine Amberlite IRN77 (activation avec HCl/H2O

30/60 puis élution 100 % H2O) pour n’avoir que des formes protonées des saponines puis mise à sec sous vide (2.7 g). Cet extrait a été fractionné par chromatographie liquide sous vide

(CLV) sur silice greffée RP-18 éluée successivement avec le mélange MeOH/H2O 2/8 (3 x 200 ml), 4/6 (3 x 200 ml), 6/4 (3 x 200 ml) et MeOH 100%, (3 x 200 ml) pour donner les fractions DB-A à DB-I. La fraction DB-E (438 mg) a été fractionnée par chromatographie flash haute performance (CFHP) sur gel de silice (cartouche 4 g) éluée avec un gradient binaire de

CHCl3/MeOH (10/0 à 6/4) pendant 10 min, puis en isocratique 6/4 pendant 20 min et en gradient (6/4 à 0/10) pendant 17 min à 18 ml/min pour donner 6 fractions (DB-E1 à DB-E6). La fraction DB-E4 (245 mg) a été à nouveau fractionnée dans les mêmes conditions que pour DB-E pour donner 8 fractions DB-E4a à DB-E4h. Les fractions DB-E4d (18 mg), DB-E4f (69 mg) et DB-E4g (30 mg) ont été purifiées par CLHP semi-préparative sur RP-18 avec un mélange isocratique d’ACN/H2O-TFA 0,025% (35/65) pendant 20 min à 5 ml/min pour donner les composés DB01 (54mg, Rt=5.05 min) et DB02 (25mg, Rt=5.6 min). La fraction DB-F (193 mg) a été fractionnée par CFHP sur gel de silice (cartouche 4 g) avec un gradient binaire de CHCl3/ACN (10/0 à 0/10) pendant 30 min à 18 ml/min pour 216

donner 9 fractions : DB-F1 à DB-F9. Les fractions DB-F5 (9 mg) et DB-F6 (35 mg) ont été purifiées par CLHP semi-préparative sur RP-18 avec un mélange isocratique ACN/H2O-TFA 0,025% (45/55) pendant 20 min à 5 ml/min pour donner les composés DB03 (14 mg, Rt=8,7 min) et DB04 (8 mg, Rt=7,4 min). La fraction BD-F7 (108 mg) a été purifiée par CLHP semi- préparative sur RP-18 avec un gradient ACN/H2O-TFA 0,025% (30/70 à 38/62) pendant 30 min à 5 ml/min pour donner les composés DB02 (13 mg, Rt=5,4 min), DB05 (4 mg, Rt=5,8 min), DB06 (3 mg, Rt=5,9 min), DB04 (15 mg, Rt=6,5 min), DB07 (2 mg, Rt=7,7 min), DB08 (2 mg, Rt=11,1 min) et DB03 (14 mg, Rt=12,1 min). La fraction DB-G (63 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur RP-18 avec un gradient ACN/H2O-TFA 0,025% (1/9 à 4/6) pendant 5 min puis en isocratique (4/6) pendant 15 min à 5 ml/min pour donner les composés DB04 (11 mg, Rt=8,4 min), DB07 (3 mg, Rt=8,8 min), DB03 (7 mg, Rt=11,4 min) et DB09 (5 mg, Rt=12,1 min). La fraction DB-H (197 mg) a été fractionnée par CFHP sur gel de silice (cartouche 4 g) avec un gradient binaire de CHCl3/MeOH (1/9 à 6/4) pendant 15 min, puis 6/4 pendant 10 min et (6/4 à 0/10) pendant 10 min à 18ml/min pour donner 9 fractions : DB-H1 à DB-H9. Les fractions DB-H5 (15 mg) et DB-H6 (25 mg) ont été purifiées par CLHP semi-préparative sur RP-18 avec un gradient ACN/H2O-TFA 0,025% (45/55 à 5/5) pendant 15 min à 5 ml/min pour donner les composés DB10 (13 mg, Rt=9,9 min) et DB11 (4 mg, Rt=12,3 min). La fraction BD-H7 (50 mg) a été purifiée par CLHP semi-préparative sur RP-18 avec un gradient

ACN/H2O-TFA 0,025% (4/6 à 45/55) pendant 30 min à 5 ml/min pour donner les composés DB09 (13 mg, Rt=8,4 min), DB12 (6 mg, Rt=8,8 min), DB13 (7 mg, Rt=9,3 min), DB14 (7 mg, Rt=9,8 min) et DB10 (11 mg, Rt=14,4 min). V.7 Hydrolyse acide Le précipité des saponines PDB (1,08 g) a été dissous dans 25 ml de TFA à 2 M et chauffé à reflux pendant 4 h. Le mélange a ensuite été partagé avec de l'EtOAc (3 x 30 ml) et la phase aqueuse a été lavée avec de l'eau distillée jusqu'à pH neutre. Pour identifier les sucres obtenus, la couche aqueuse a été analysée par Chromatographie analytique chirale en utilisant une colonne Chiralpack IC (5 um, 4,6 x 250 mm) avec un isocratique hexane/EtOH/ TFA 50/50/0,1 à 0,5 ml/min et à 35°C. Le chromatogramme a été obtenu avec un réfractomètre RI (Waters 410) et comparés aux sucres témoins (L-xylose, le D-xylose, le L-glucose, le D- glucose, le L-rhamnose et acide D-glucuronique).

217

V.8 Caractérisation structurale

V.8.1 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol (ML01)

+ + HR-ES+-SM m/z 583,23 [M+H] ; 605,22 [M+Na] ; C28H38O13. RMN 1H (500 MHz; Methanol-d4) δ 6,58 (1H; s; H-8); 6,43 (2H; s; H-2'; H-6'); 4,42

(1H; d; J = 6,3 Hz; H-4); 4,28 (1H; d; J = 7,8 Hz; H-1"); 3,89 (2H; dd; J = 10,0-5,6 Hz; Hα-

3a); 3,85 (3H; s; O-CH3); 3,83 (1H; dd; J =12,1-6,2 Hz; Hα-6"); 3,75 (6H; s; 2 O-CH3 ); 3,65

(1H; dd; J = 12,1-3,6 Hz; Hβ-6"); 3,62 (1H; dd; J =11,3-5,1 Hz; Hα-2a); 3,55 (1H; dd; J =

11,3-6,7 Hz; Hβ-2a); 3,45 (1H; dd; J = 10,0; 4,1 Hz; Hβ-3a); 3,38 (1H; t; J = 8,8 Hz; H-3");

3,34 (3H; s; O-CH3); 3,29 (1H; t; J=8,8 Hz; H-4"); 3,26 (1H; m; H-5"); 3,24 (1H; dd; J=8,8-

7,8 Hz; H-2"); 2,71 (1H; td; J=15,2-4,9 Hz ; Hα-1); 2,62 (1H; dd; J=15,2-11,0 Hz; Hβ-1); 2,08 (2H; m; H-3); 1,70 (2H; m; H-2). RMN 13C (126 MHz; MeOD) δ 147,6 (C-5'; C-3'); 147,2 (C-5); 146,2 (C-7); 137,9 (C- 1'); 137,5 (C-6); 133,0 (C-4'); 128,8 (C-9); 125,0 (C-10); 106,4 (C-8); 105,5 (C2'; C-6'); 103,4 (C-1"); 76,8 (C-3"); 76,5 (C-5"); 73,8 (C-2"); 70,2 (C-4"); 70,0 (C-3a); 64,8 (C-2a); 61,4 (C-

6"); 58,7 (O-CH3) ; 55,5 (2 O-CH3); 55,2 (O-CH3); 45,3 (C-3); 41,4 (C-4); 39,2 C-2); 32,4 (C- 1). V.8.2 (+)-catéchine (ML02)

1 RMN H (500 MHz; DMSO-d6) δ 6,85 (1H; d; J=1,9 Hz; H-2'); 6,78 (1H; d; J=8,2 Hz; H-5'); 6,73(1H; dd; J=8,1-1,9 Hz; H-6'); 5,94 (1H; d; J=2,3 Hz; H-6); 5,87 (1H; d; J=2,3 Hz; H-8); 4,58 (1H; d; J=7,8 Hz; H-12); 3,99 (1H; dd; J=13,4-7,8 Hz; H-3); 2,86 (1H; dd; J=16,2-

6,3 Hz; Hα-4); 2,52 (1H; dd; J = 16,2-8,3 Hz; Hβ-4). RMN 13C (125 MHz; DMSO) δ 156,9 (C-7); 156,6 (C-5); 155,8 (C-9); 145,3 (C-4'; C- 3'); 131,0 (C-1'); 118,8 (C-6'); 115,5 (C-5'); 114,9 (C-2'); 99,5 (C-10); 95,5 (C-6); 94,3 (C-8); 81,4 (C-2); 66,8 (C-3); 28,3 (C-4).

218

V.8.3 3β-O-α-L-rhamnopyranosyl-taxifoline (ML03)

+ + HR-ES+-SM m/z 451,12 [M+H] ; 473,40 [M+Na] ; C21H22O11. RMN 1H (500 MHz; Méthanol-d4) δ 6,97 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-2'); 6,86 (1H; dd; J=8,1-1,9 Hz; H-6'); 6,83 (1H; d; J=8,1 Hz; H-5'); 5,08 (1H; d; J = 10,7 Hz; H-2); 4,59 (1H; d; J = 10,7 Hz; H-3); 4,27 (1H; dd; J=9,4-6,2 Hz; H-5"); 4,07 (1H; d; J = 1,5 Hz; H-1"); 3,68 (1H; dd; J = 9,5-3,2 Hz; H-3"); 3,56 (1H; dd; J = 3,2-1,5 Hz; H-2"); 3,31 (1H; m; H-4"); 1,20 (3H; d; J = 6,2 Hz; H-6"). RMN 13C (125 MHz; MeOD) δ 194,6 (C-4); 167,2 (C-7); 164,1 (C-5); 162,7 (C-9); 145,9 (C-4'); 145,1 (C-3'); 128,8 (C-1'); 119,1 (C-6'); 114,9 (C-5'); 114,1 (C-2'); 101,1 (C-10); 100,7 (C-1"); 94,9 (C-6); 94,8 (C-8); 82,6 (C-2); 77,2 (C-3); 72,4 (C-4"); 70,7 (C-3"); 70,4 (C-2"); 69,1 (C-5"); 16,4 (C-6").

V.8.4 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-quercétine (ML04)

+ + HR-ES+-SM m/z 449,10 [M+H] ; 471,09 [M+Na] ; C21H18O11. RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 7,36 (1H; d; J = 2,1 Hz; H-2'); 7,33 (1H; dd; J = 8,3-2,1 Hz; H-6'); 6,93 (1H; d; J = 8,3 Hz; H-5'); 6,40 (1H; d; J = 2,1 Hz; H-8); 6,23 (1H; d; J = 2,1 Hz; H-6); 5,36 (1H; d; J = 1,5 Hz; H-1"); 4,24 (1H; dd; J = 3,3-1,7 Hz; H-2"); 3,76 (1H; dd; J = 9,4-3,3 Hz; H-3"); 3,44 (1H; dd; J = 9,6-6,3 Hz; H-5"); 3,35 (1H; m; H-4"); 0,96 (3H; d; J = 6,3 Hz; H-6"). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,2 (C-4); 164,5 (C-7); 161,8 (C-5); 157,9 (C-9); 157,1 (C-2); 148,4 (C-4'); 145,0 (C-3'); 133,5 (C-3); 121,5 (C-1'); 121,4 (C-6'); 115,5 (C-2'); 114,9 (C-5'); 104,5 (C-10); 102,1 (C-1"); 98,4 (C-6); 93,3 (C-8); 71,8 (C-4"); 70,7 (C-3"); 70,6 (C-5"); 70,5 (C-2"); 16,4 (C-6").

219

V.8.5 5-heptadec-12’-enyl-résorcinol (ML05)

+ + HR-ES+-SM m/z 333,3 [M+H] ; 355,3 [M+Na] ; C22H36O2. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 6,14 (2H; d; J = 2,2 Hz; H-1; H-5); 6,09 (1H; t; J = 2,2 Hz; H-2); 5,36 (2H; m; H 12'; H-13'); 2,45 (1H; t; J = 7,3 Hz; H-1'); 2,05 (2H; m; H-11'; H-14'); 1,58 (2H; m; H-2'); 1,36 (4H; m; H-15'; H-16'); 1,34–1,30 (20H; m; H-3' à H-10'); 0,93 (3H; m; H-17'). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 157,8 (C-1; C-3); 144,9 (C-5); 129,4 (C-12'); 129,3 C- 13'); 106,5 (C-4; C-6); 99,6 (C-2); 35,6 (C-1'); 31,7 (C-15'); 31,0 (C-2'); 21,5-30,0 (C-3' à C- 10'); 26,7 (C11'; C-14') ; 21,9 (C-16'); 12,9 (C-17').

V.8.6 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-isorhamnétine (ML06)

1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 7,36 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-2'); 7,33 (1H; dd; J = 8,3-2,2 Hz; H-6'); 6,93 (1H; d; J = 8,3 Hz; H-5'); 6,40 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-8); 6,23 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-6); 5,36 (1H; d; J = 1,7 Hz; H-1"); 4,24 (1H; dd; J = 3,3-1,7 Hz; H-2" ); 3,95

(3H; s; O-CH3); 3,76 (1H; dd; J = 9,4-3,3 Hz; H-3"); 3,44 (1H; dd; J = 9,5-6,1 Hz; H-5"); 3,36 (1H; t; J = 9,4 Hz; H-4"); 0,96 (3H; d; J = 6,1 Hz; H-6"). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,2 (C-4); 164,4 (C-7); 161,8 (C-5); 158,0 (C-9); 157,1 (C-2); 147,9 (C-4'); 145,0 (C-3'); 134,8 (C-3); 121,5 (C-1'); 121,4 (C-6'); 115,5 (C-2'); 114,9 (C-5'); 104,6 (C-10); 102,0 (C-1"); 98,4 (C-6); 93,3 (C-8); 71,8 (C-4"); 70,7 (C-5");

70,6 (C-3"); 70,5 (C-2"); 55,5 (O-CH3); 16,3 (C-6").

220

V.8.7 Viburnitol (ML07)

RMN 1H (600 MHz; DMSO-d6) δ 4,66 (1H; d; J = 3,4 Hz; OH-5); 4,49 (1H d; J = 3,7 Hz; OH-4); 4,42 (1H; d; J = 4,2 Hz; OH-2); 4,36 (1H; d; J = 4,8 Hz; OH-1); 4,27 (1H; d; J = 5,8 Hz; OH-3); 3,66 (1H; q; J = 3,5 Hz; H-5); 3,58 (1H; q; J = 3,6 Hz; H-4); 3,50 – 3,44 (1H; m; H-1); 3,41 (1H; ddd; J = 9,0-5,9-3,1 Hz; H-3); 3,28 (1H; td; J = 8,8-4,1 Hz; H-2); 1,66 – 1,55 (2H; m; H-6). RMN 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 75.5 (C-2), 73.3 (C-4), 71.8 (C-3), 69.3 (C-1), 68.9 (C-5), 35.3 (C-6). V.8.8 Acide myrsinoïque B (MC01)

RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 7,70 (1H; s; H-4); 7,65 (1H; d; J = 1,7; H-6); 5,31

(1H; tqt; J = 7,5-1,5 Hz; H-2'); 5,17 (1H; tqt; J = 7,5-1,5 Hz; H-4''); 4,76 (1H; dd; J = 9,6-7,7

Hz; H-2); 3,31 (2H m; H-1'); 3,29 (1H; dd; J =16,2-9,8 Hz; Hα-3); 3,22 (1H; dd; J =16,2-7,7

Hz; Hβ-3); 2,16 (1H; m; H-3''); 1,76 (3H; s; H-4'); 1,75 (3H; s; H-5'); 1,71 (3H; s; H-6''); 1,66 (3H; s; H-8''); 1,59 (2H; t; J =8,4 Hz; H-2''); 1,20 (3H; s; H-7''). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 169,1 (C-10); 161,9 (C-8); 132,4 (C-3'); 131,0 (C-5''); 130,2 (C-6); 127,1 (C-7); 124,2 (C-4); 124,1 (C-4''); 122,7 (C-9); 122,5 (C-5); 121,5 (C-2'); 88,7 (C-2); 72,9 (C-1''); 38,5 (C-2''); 29,4 (C-3); 27,7 (C-1'); 24,5 (C-4'); 24,4 (C-6''); 21,5 (C- 3''); 20,1 (C-7''); 16,5 (C-5'); 16,3 (C-8''). V.8.9 Acide myrsinoïque B methyl ester (MC02)

RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 7,70 (1H; s; H-4); 7,65 (1H; d; J = 1,7; H-6); 5,31

(1H; tqt; J = 7,5-1,5 Hz; H-2'); 5,17 (1H; tqt; J = 7,5-1,5 Hz; H-4''); 4,76 (1H; dd; J = 9,8-7,8

221

Hz; H-2); 3,88 (3H; s; OCH3); 3,31 (2H m; H-1'); 3,28 (1H; dd; J =16,0-9,6 Hz; Hα-3); 3,22 (1H; dd; J =16,0-7,8 Hz; Hβ-3); 2,16 (1H; m; H-3''); 1,76 (3H; s; H-4'); 1,75 (3H; s; H-5'); 1,71 (3H; s; H-6''); 1,66 (3H; s; H-8''); 1,59 (2H; t; J =8,3 Hz; H-2''); 1,20 (3H; s; H-7''). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 169,1 (C-10); 161,1 (C-8); 132,5 (C-3'); 131,0 (C-5''); 129,9 (C-6); 127,3 (C-7); 124,2 (C-4); 123,8(C-4''); 122,7 (C-9); 122,5 (C-5); 121,4 (C-2');

88,8 (C-2); 72,9 (C-1''); 50,8 (OCH3); 38,5 (C-2''); 29,4 (C-3); 27,7 (C-1'); 24,5 (C-4'); 24,5 (C-6''); 21,5 (C-3''); 20,1 (C-7''); 16,5 (C-5'); 16,3 (C-8'').

V.8.10 3-O-α-L-arabinopyranosyl-quercétine (MS01)

NMR 1H (500 MHz; Methanol-d4) δ 7,67 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-2'); 7,60 (1H; dd; J = 8,5-2,2 Hz; H-6'); 6,89 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-5'); 6,43 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-8); 6,23 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-6); 5,18 (1H d; J = 6,7 Hz; H-1"); 3,91 (1H dd; J = 8,4-6,7 Hz; H-2"); 3,84 (1H; m; H-4"; 1H; dd; J= 13,5-3,7 Hz; Hα-5"); 3,67 (1H; dd; J = 8,4-3,2 Hz; H-3"); 3,46 (1H; dd; J=13,5-3,1 Hz; Hβ-5"). NMR 13C (126 MHz; MeOD) δ 178,6 (C-4); 164,6 (C-7); 161,7 (C-5); 157,9 (C-9); 157,2 (C-2); 148,5 (C-4'); 144,9 (C-3'); 133,5 (C-3); 122,0 (C-6'); 120,9 (C-1'); 115,4 (C-2'); 115,7 (C-5'); 103,1 (C-1"); 104,2 (C-10) 98,5 (C-6); 93,3 (C-8); 67,7 (C-4"); 71,4 (C-2"); 72,7 (C-3"); 65,5 (C-5").

V.8.11 3-O-α-L-arabinofuranosyl-quercétine (MS02)

1 NMR H (500 MHz; Methanol-d4) δ 7,55 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-2'); 7,52 (1H; dd; J = 8,3-2,0 Hz; H-6'); 6,92 (1H; d; J = 8,3 Hz; H-5'); 6,40 (1H; d; J = 1,8 Hz; H-8); 6,23 (1H; d; J = 2,1 Hz; H-6); 5,49 (1H; s; H-1"); 4,35 (1H; d; J = 2,6 Hz; H-2"); 3,93 (1H; dd; J = 5,0-2,6 Hz; H-3"); 3,88 (1H; dt; J = 5,0-4,3 Hz; H-4"); 3,42 (2H; t; J = 4,2 Hz; H-5"). 222

NMR 13C (126 MHz; MeOD) δ 178,6 (C-4); 164,6 (C-7); 161,7 (C-5); 157,1 (C-9); 157,9 (C- 2); 148,4 (C-4'); 145,9 (C-3'); 133,5 (C-3); 121,7 (C-1'); 121,5 (C-6'); 115,4 (C-2'); 115,0 (C- 5'); 108,1 (C-1"); 104,2 (C-10); 98,5 (C-6); 93,3 (C-8); 86,6 (C-4"); 81,9 (C-2"); 77,2 (C-3"); 61,1 (C-5"). V.8.12 Niga-ishigoside F1 (PS01)

+ HR-ESI+-SM m/z 689,38 [M+Na] ; C36H58O11. RMN 1H (600 MHz; Methanol-d4) δ 5,22 (1H; d; J =7,5 Hz; H-1'); 5,21 (1H; d; J =3,4

Hz; H-12); 3,70 (1H; dd; J = 12,0-1,9 Hz; Hα-6'); 3,59 (1H; m; H-2); 3,58 (1H; dd; J = 12,0-

4,7 Hz; Hβ-6'); 3,40 (1H; d; J = 11,1 Hz; Hα-23); 3,30 (1H; t; J = 8,6 Hz; H-3'); 3,25 (1H; m; H-4'); 3,24 (1H; d; J = 8,3 Hz; H-3); 3,23 (1H; m; H-5'); 3,21 (1H; m; H-2'); 3,17 (1H; d; J =

11,0 Hz; Hβ-23); 2,51 (1H; td; J = 13,2-4,3 Hz; Hα-16); 2,41 (1H; sl; H-18); 1,91 (2H; m; H-

11); 1,84 (1H; dd; J = 12,6-4,6 Hz; Hα-1); 1,73 (1H; td; J = 13,9-5,0 Hz; Hα-15); 1,68 (1H; m;

Hα-22); 1,67 (1H; m; H-9); 1,63 (1H; m; Hα-21); 1.55 (1H; m; Hα-7); 1,53 (1H; m; Hβ-16);

1,52 (1H; m; Hβ-22); 1,33 (2H; m; H-6); 1,24 (4H; s; H-20; H-27); 1,19 (2H; m; H-5; Hβ-7);

1,14 (1H; m; Hβ-21); 1,10 (3H; s; H-29); 0,93 (3H; s; H-25); 0,91(1H; m; Hβ-15); 0,83 (3H; d;

J = 6,9 Hz; H-30); 0,79 (1H; m; Hβ-1); 0,67 (3H; s; H-26); 0,60 (3H; s; H-24). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,6 (C-28); 139,6 (C-13); 129,5 (C-12); 95,8 (C-1'); 78,6 (C-3; C-5'); 78,3 (C-3'); 73,9 (C-2'); 73,7 (C-19); 71,1 (C-4'); 69,7 (C-2); 66,4 (C-23); 62,4 (C-6'); 55,0 (C-18); 49,5 (C-17); 48,6 (C-9); 48,2 (C-5); 48,0 (C-1); 44,1 (C-4); 43,0 (C- 20); 42,8 (C-14); 41,3 (C-8); 39,0 (C-10); 38,3 (C-22); 33,5 (C-7); 29,7 (C-15); 27,2 (C-21); 27,0 (C-29); 26,5 (C-16); 24,8 (C-11); 24,7(C-27); 19,3 (C-6); 17,5 (C-25); 17,6 (C-26); 16,6 (C-30); 13,9 (C-24).

223

V.8.13 Trachelosperoside B1 (PS02)

+ HR-ESI+-SM m/z 705,38 [M+Na] ; C36H58O12. RMN 1H (500 MHz; Methanol-d4) δ 5,34 (H; d; J =8,2 Hz; H-1'); 5,28 (1H; d; J =3,8 Hz; H-12); 4,08 (1H; d; J = 11,6 Hz; Hα-23); 4,07 (1H; d; J = 11,4 Hz; Hα-24); 3,91 – 3,84 (1H ; ddd; J=11,3-9,6-4,4 Hz; H-2); 3,82 (1H; dd; J = 11,9-1,8 Hz; Hα-6'); 3,69 (2H; dd; J = 11,9-4,5 Hz; Hβ-6'); 3,64 (1H; d; J = 11,4 Hz; Hβ-24); 3,52 (1H; d; J = 11,6 Hz; Hβ-23); 3,48 (1H; d; J = 9,6 Hz; H-3); 3,42 (1H; t; J = 8,4 Hz; H-3'); 3,38 (1H; t; J=8,2 Hz; H-4'); 3,35 (1H; m; H-5'); 3,33 (1H; m; H-2'); 2,63 (1H; td; J = 13,4-4,3 Hz; Hα-16); 2,54 (1H; s; H-18); 2,02 (2H; m; H-11); 1,97 (1H; dd; J = 12,4-4,4 Hz; Hα-1); 1,81 (1H; m; Hα-15); 1,80 (1H; m; Hα-22); 1,79 (1H; m; H-9); 1,74 (1H; m; Hα-21); 1,65 (2H; m; Hβ-16; Hβ-22); 1,61 (1H; m; Hα-7); 1,59 (1H; m; Hα-6); 1,42 (2H; m; H-5; Hβ-6); 1,36 (4H; s; H-20; H-27); 1,28 (1H; m; Hβ-7); 1,26 (1H; m; Hβ-15); 1,22 (3H; s; H-29); 1,04 (3H; s; H-25); 1,02 (1H; m; Hβ-21); 0,95 (3H; d; J = 6,8 Hz; H-30); 0,92 (1H; m; Hβ-1); 0,78 (3H; s; H-26). RMN 13C (126 MHz; MeOD) δ 178,5 (C-28); 139,7 (C-13); 129,0 (C-12); 95,4 (C- 1'); 79,2 (C-3); 78,2 (C-5'); 77,9 (C-3'); 73,6 (C-19); 73,5 (C-2'); 70,7 (C-4'); 69,5 (C-2); 64,2 (C-23); 62,3 (C-24); 62,1 (C-6'); 54,6 (C-18); 49,5 (C-17); 48,7 (C-9); 48,4 (C-5); 48,2 (C-4); 47,4 (C-1); 42,9 (C-20); 42,7 (C-14); 41,2 (C-8); 38,9 (C-10); 38,3 (C-22); 33,8 (C-7); 29,6 (C-21); 27,2 (C-15); 27,0 (C-29); 26,5 (C-16); 24,9 (C-11); 24,7 (C-27); 19,7 (C-6); 17,5 (C- 25; C-26); 16,6 (C-30). V.8.14 Secologanoside (PS03)

+ HR-ESI+-SM m/z 413,10 [M+Na] ; C16H22O11. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 7,50 (1H; d; J=1,8 Hz; H-3); 5,66 (1H; dt; J

=17,3-10,0 Hz; H-8); 5,50 (1H; d; J = 3,6 Hz; H-1); 5,27 (1H;dd; J =17,3-1,3 Hz; Hβ-10); 5,25

224

(1H;dd; J = 10,0-1,3 Hz; Hα-10); 4,68 (1H; d; J =8,0 Hz; H-1'); 3,91 (1H; dd; J =12,0-1,8 Hz;

Hβ-6'); 3,68 (1H; dd; J =12,0-5,4 Hz; Hα-6'); 3,37 (1H; t; J =8,3 Hz; H-3'); 3,33 (1H; m; H-5');

3,32 (1H; t; J =9,3Hz; H-4'); 3,31 (1H; m; H-5); 3,24 (1H; dd; J =9,0-8,0 Hz; H-2'); 3,08 (1H; dd; J =16,7-4,4 Hz; Hβ-6); 2,84 (1H; ddd; J =10,0-5,5-3,8 Hz; H-9); 2,26 (1H; dd; J =16,7-9,7

Hz; Hα-6). RMN 13C (MeOD; 600 MHz) δ 176,4 (C-7); 170,4 (C-11); 153,5 (C-3); 134,6 (C-8); 120,5 (C-10); 110,3 (C-4); 99,8 (C-1'); 97,5 (C-1); 78,2 (C-5'); 77,8 (C-3'); 74,5 (C-2'); 71,4 (C-4'); 62,6 (C-6'); 45,1 (C-9); 34,9 (C-6); 28,4 (C-5). V.8.15 Acide 19-α-hydroxyasiatique (PS04)

+ + HR-ESI+-SM m/z 505,35 [M+H] ; 527,33 [M+Na] ; C30H48O6. RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,31 (1H; t; J = 3,4 Hz; H-12); 3,71 (1H; td; J = 9,7-4,5 Hz; H-2); 3,52 (1H; d; J = 11,0 Hz; Hα-23); 3,38 (1Hd; J = 9,7 Hz; H-3); 3,29 (1H; d; J = 11,0 Hz; Hβ-23); 2,60 (1H; td; J = 13,3-4,6 Hz; Hα-16); 2,52 (1H; sl; H-18); 2,04 (2H; m; H-11); 1,96 (1H; dd; J = 12,5-4,5 Hz; Hα-1); 1,82 (1H; m; Hα-15) ; 1,81 (1H; m; H-9); 1,75 (2H; m; Hα-21; Hα-22); 1,69 (1H; td; J=13,7- 4,2; Hα-7); 1,64 (1H; m; Hβ-22); 1,53 (1H; dm; J=13,3 Hz; Hβ-16); 1,49 (1H; m; Hβ-6); 1,43 (1H; m; Hα-6); 1,37 (1H; m; H-20; 3H; s; H- 27); 1,32 (1H; m; H-5); 1,30 (1H; m; Hβ-7); 1,25 (1H; m; Hβ-21);1,21 (3H; s; H-29); 1,05 (3H; s; H-25); 1,03 (1H; m; Hβ-15); 0,95 (3H; d; J = 6,7 Hz; H-30); 0,93 (1H; m; Hβ-1); 0,82 (3H; s; H-26); 0,72 (3H; s; H-24). RMN 13C (151MHz; MeOD) δ 182,3 (C-28); 140,2 (C-13); 129,2 (C-12); 78,3 (C-3); 73,6 (C-19); 69,7 (C-2); 66,4 (C-23); 55,1 (C-18); 48,9 (C-17); 48,5 (C-9); 48,2 (C-5); 47,9 (C-1); 44,1 (C-4); 43,1 (C-20); 42,7 (C-14); 41,1 (C-8); 39,0 (C10; C-22); 33,5 (C-7); 29,6 (C-15); 27,3 (C-21); 27,1 (C-29); 26,6 (C-16); 24,9 (C-27); 24,8 (C-11); 19,2 (C-6); 17,6 (C- 26); 17,5 (C-25); 16,6 (C-30); 13,9 (C-24).

225

V.8.16 Acide myrianthique (PS05)

+ + HR-ESI+-SM m/z 505,35 [M+H] ; 527,33 [M+Na] ; C30H48O6. RMN 1H (500 MHz; Méthanol-d4) δ 5,33 (1H; t; J = 3,6 Hz; H-12); 3,91 (1H; ddd;

J=11,7-4,1-3,0 Hz; H-2); 3,63 (1H d; J = 2,5 Hz; H-3); 3,56 (1H; d; J = 11,0 Hz; Hα-23); 3,42

(1H; d; J = 11,0 Hz; Hβ-23); 2,61 (1H; td; J = 13,1-4,8 Hz; H α -16); 2,53 (1H; sl; H-18); 2,05

(2H; m; H-11); 1,92 (1H; dd; J = 10,7-7,2 Hz; H-9); 1,82 (1H; td; J=14,0-4,5 Hz; Hα-15);

1,75 (2H; m; Hα-21; Hα-22); 1,67 (1H; m; Hα-7); 1,65 (1H; m; H-β22) ; 1,61 (1H; m; Hα-1) ;

1,59 (1H; m; H-5) ; 1,54 (1H; m; Hβ-16); 1,40 (2H; m; H-6); 1,38 (3H; s; H-27); 1,37 (1H; m;

H-20); 1,35 (1H; m; Hβ-1); 1,30 (1H; m; Hβ-7); 1,25 (1H; m; Hβ-21); 1,22 (3H; s; H-29); 1,05

(3H; s; H-25); 1,02 (1H; m; Hβ-15); 0,95 (3H; d; J = 6,7 Hz; H-30); 0,82 (3H; s; H-26); 0,81 (3H; s; H-24). RMN 13C (126 MHz; MeOD) δ 182,3 (C-28); 140,1 (C-13); 129,3 (C-12); 78,5 (C-3); 73,3 (C-19); 71,3 (C-23); 67,2 (C-2); 54,8 (C-18); 49,0 (C-17); 48,4 (C-9); 44,2 (C-5); 43,1 (C-20); 42,7 (C-14); 42,5 (C-4); 42,2 (C-1); 40,8 (C-8); 38,8 (C10); 38,7 (C-22); 33,7 (C-7); 29,6 (C-15); 27,3 (C-21); 27,0 (C-29); 26,6 (C-16); 24,9 (C-27); 24,7 (C-11); 19,1 (C-6); 17,6 (C-24; C-26); 17,3 (C-25); 16,7 (C-30). V.8.17 Acide hyptatique (PS06)

+ + HR-ESI+-SM m/z 505,35 [M+H] ; 527,33 [M+Na] ; C30H48O6. RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,31 (1H; t; J = 3,4 Hz; H-12); 4,05 (1H; d; J =

11,2 Hz; Hα-24); 3,81 (1H; td; J = 11,4-4,4 Hz; H-2); 3,41 (1H; d; J = 11,2 Hz; Hβ-24); 3,08

(1H; d; J = 9,5 Hz; H-3); 2,60 (1H; td; J = 13,3-4,4 Hz; Hα-16); 2,52 (1H; sl; H-18); 2,04 (2H; m; H-11); 1,98 (1H; dd; J = 12,4-4,4 Hz; Hα-1); 1,81 (1H; td; J = 13,7-4,7 Hz; Hα-15); 1,76

(1H; m; H-9) ; 1,75 (2H; m; Hα-21; Hα-22); 1,65 (1H; m; Hα-6); 1,64 (1H; m; Hβ-22); 1,55

226

(1H; m; Hα-7); 1,53 (1H; m; Hβ-16); 1,44 (1H; td; J = 12,4-3,2 Hz; Hβ-6); 1,35 (4H; s; H-20;

H-27); 1,34 (1H; m; Hβ-7); 1,26 (3H; s; H-23); 1,24 (1H; m; Hβ-21); 1,22 (3H; s; H-29); 1,02

(1H; m; Hβ-15); 1,01 (4H; s; H-25; H-5); 0,95 (3H; d; J = 6,7 Hz; H-30); 0,93 (1H; m; Hβ-1); 0,80 (3H; s; H-26). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 182,3 (C-28); 140,1 (C-13); 129,1 (C-12); 86,0 (C-3); 73,6 (C-19); 69,6 (C-2); 66,2 (C-24); 57,2 (C-5); 55,1 (C-18); 49,0 (C-17); 48,7 (C-9); 47,8 (C-1); 44,4 (C-4); 43,1 (C-20); 42,6 (C-14); 41,1 (C-8); 39,1 (C-22); 39,0 (C10); 34,4 (C-7); 29,6 (C-15); 27,3 (C-21); 27,1 (C-29); 26,6 (C-16); 25,0 (C-11); 24,8 (C-27); 23,8 (C-23); 19,9 (C-6); 17,5 (C-25); 17,4 (C-26); 16,6 (C-30). V.8.18 Trachélosperogénine B1 (PS07)

HR-ESI+-SM m/z 521,34 [M+H]+ ; 543,32 [M+Na]+ ; C30H48O7. RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,19 (1H; t; J = 3,4 Hz; H-12); 3,96 (1H; d; J =

11,6 Hz; Hα-23); 3,95 (1H; dd; J = 11,4 Hz; Hα-24); 3,75 (1H; ddd; J = 11,3-9,6-4,5 Hz; H-

2); 3,53 (1H; d; J = 11,4 Hz; Hβ-24); 3,42 (1H; d; J = 11,6 Hz; Hβ-23); 3,37 (1H; d; J = 9,6

Hz; H-3); 2,48 (1H; td; J = 13,2-4,6 Hz; Hα-16); 2,40 (1H; sl; H-18); 1,93 (2H; m; H-11);

1,84 (1H; dd; J = 12,4-4,5 Hz; Hα-1); 1,69 (2H; m; H-9; Hα-15); 1,63 (1H; m; Hα-22); 1,62

(2H; m; Hα-21); 1,52 (2H; m; Hα-7; Hβ-22); 1,50 (1H; m; Hα-6); 1,41 (1H; d; J=13,2Hz; Hβ-

16); 1,31 (1H; m; Hβ-6); 1,30 (1H; m; H-5); 1,25 (1H; m; H-20); 1,24 (3H; s; H-27); 1,17

(1H; m; Hβ-7); 1,13 (1H; m; Hβ-15); 1,09 (3H; s; H-29); 0,93 (3H; s; H-25); 0,92 – 0,87 (1H; m; Hβ-21); 0,83 (3H; d; J = 6,7 Hz; H-30); 0,80 (1H; t; J=11,9 Hz; Hβ-1); 0,68 (3H; s; H-26). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 182,3 (C-28); 144,1 (C-13); 129,1 (C-12); 79,5 (C-3); 73,6 (C-19); 69,9 (C-2); 64,5 (C-23); 62,7 (C-24); 55,1 (C-18); 49,0 (C-17); 48,7 (C-9); 48,3 (C-5); 48,2 (C-4); 47,7 (C-1); 43,1 (C-20); 42,7 (C-14); 41,1 (C-8); 39,0 (C-22); 38,8 (C-10); 33,9 (C-7); 29,6 (C-15); 27,3 (C-21); 27,1 (C-29); 26,6 (C-16); 25,0 (C-11); 24,8 (C-27); 19,7 (C-6); 17,4 (C-25); 17,3 (C-26); 16,6 (C-30).

227

V.8.19 Acide arjunolique (PS08)

+ + HR-ESI+-SM m/z 489,35 [M+H] ; 511,33 [M+Na] ; C30H48O5. RMN 1H (500 MHz; Méthanol-d4) δ 5,27 (1H; t; J = 3,7 Hz; H-12); 3,71 (1H; m; H-

2); 3,53 (1H; d; J = 10,9 Hz; Hα-23); 3,38 (1H; d; J = 9,5 Hz; H-3); 3,29 (1H; d; J = 10,9 Hz;

Hβ-23); 2,88 (1H; dd; J = 14,3-4,5 Hz; H-18); 2,04 (1H; td; J = 15,8-4,0 Hz; Hα-16); 2,00 –

1,91 (3H; m; Hα-1; H-11); 1,80 (1H; td; J = 13,4; 4,0 Hz; Hα-15); 1,76 (1H; m; Hα-21) ; 1,71

(1H; m; Hα-19) ; 1,69 (1H; m; H-9) ; 1,64 (1H; m; Hα-7) ; 1,61 (1H; m; Hβ-16) ; 1,56 (1H; m;

Hβ-21); 1,48 (1H; m; Hα-6); 1,42 (1H; m; Hβ-6) ; 1,41 (1H; m; Hα-22); 1,31 (2H; m; H-5; Hβ-

7); 1,23 (1H; s; H-β22); 1,20 (3H; s; H-27); 1,16 (1H; m; Hβ-19); 1,10 (1H; m; Hβ-15); 1,06 (3H; s; H-25); 0,96 (3H; s; H-30); 0,93 (3H; s; H-29); 0,84 (3H; s; H-26); 0,72 (3H; s; H-24). RMN 13C (126 MHz; MeOD) δ 145,4 (C-13); 123,4 (C-12); 78,2 (C-3); 69,7 (C-2); 66,4 (C-23); 49,0 (C-17); 48,7 (C-9); 48,2 (C-5); 47,9 (C-1); 47,2 (C-19); 44,1 (C-4); 43,0 (C- 18); 42,7 (C-14); 40,4 (C-8); 39,0 (C-10); 34,9 (C-21); 33,8 (C-22); 33,5 (C-29); 33,3 (C-7); 31,6 (C-20); 28,8 (C-15); 26,4 (C-27); 24,6 (C-11); 24,0 (C-16); 23,9 (C-30); 19,1 (C-6); 17,8 (C-26); 17,5 (C-25); 13,8 (C-24). V.8.20 Trachélosperogénine E (PS09)

+ + HR-ESI+-SM m/z 521,34 [M+H] ; 543,35 [M+Na] ; C30H48O7. RMN 1H (500 MHz; Méthanol-d4) δ 5,34 (1H; t; J = 3,7 Hz; H-12); 4,08 (1H; d; J =

11,6 Hz; Hα-23); 4,07 (1H; d; J = 11,6 Hz; Hα-24); 3,86 (1H; td; J = 9,6-4,5 Hz; H-2); 3,65

(1H; d; J = 11,6 Hz; Hβ-24); 3,54 (1H d; J = 11,6 Hz; Hβ-23); 3,49 (1H; d; J = 9,7 Hz; H-3); 3,28 (1H; d; J = 3,8 Hz; H-19); 3,07 (1H; d; J=3,8 Hz; H-18); 2,31 (1H; td; J = 14,2-3,6 Hz;

H α -16); 2,01 (2H; m; H-11); 1,93 (1H; dd; J = 12,6-4,5 Hz; Hα-1); 1,86 (1H; D; J = 9,2 Hz;

H-9); 1,80 (1H; td; J=13,2-3,4 Hz; Hα-22); 1,78 (1H; td; J=10,0-3,4 Hz; Hα-21); 1,64 (2H; m; 228

H-β22; Hα-15); 1,65 (1H; m; Hβ-21); 1,62 (2H; m; Hα-6; Hβ-16); 1,60 (1H; m; Hα-7); 1,45

(1H; m; Hβ-6); 1,43 (1H; m; H-5); 1,33 (3H; s; H-27); 1,27 (1H; m; Hβ-7); 1,04 (3H; s; H-25);

1,02 (1H; m; Hβ-15); 0,99 (3H s; H-30); 0,95 (3H; s; H-29); 0,91 (1H; dd; J=12,6-9,5 Hz; Hβ- 1); 0,77 (3H; s; H-26). RMN 13C (126 MHz; MeOD) δ 182,3 (C-28); 144,7 (C-13); 124,3 (C-12); 82,1 (C-19); 79,2 (C-3); 69,5 (C-2); 64,2 (C-23); 62,4 (C-24); 49,4 (C-9); 48,4 (C-5); 48,1 (C-4); 47,5 (C- 1); 46,7 (C-17); 45,1 (C-18); 42,6 (C-14); 40,7 (C-8); 38,9 (C-10); 36,0 (C-20); 34,0 (C-22); 33,7 (C-7); 29,5 (C-21); 29,4 (C-15); 28,7 (C-29); 28,5 (C-16); 25,1 (C-27); 25,0 (C-11); 25,0 (C-30); 19,8 (C-6); 17,6 (C-26); 17,3 (C-25). V.8.21 4-épi-niga-ishigoside F1 (PS10)

+ + HR-ESI+-SM m/z 667,40 [M+H] ; 689,38 [M+Na] ; C36H58O11. RMN 1H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,22 (H; d; J =8,2 Hz; H-1'); 5,21 (H; d; J =3,7

Hz; H-12); 3,93 (1H; d; J = 11,2 Hz; Hα-24); 3,70 (1H; dd; J = 12,1-2,0 Hz; Hα-6'); 3,68 (1H ; m; H-2); 3,58 (2H; dd; J = 12,1-4,6 Hz; Hβ-6'); 3,30 (1H; t; J = 8,8 Hz; H-3'); 3,29 – 3,21

(4H; m; H-2'; Hβ-24; H-4'; H-5'); 2,95 (1H; d; J = 9,5 Hz; H-3); 2,52 (1H; td; J = 13,2-4,5 Hz;

Hα-16); 2,41 (1H; sl; H-18); 1,90 (2H; m; H-11); 1,85 (1H; dd; J = 12,9-4,7 Hz; Hα-1); 1,73

(1H; td; J = 14,2-4,7 Hz; Hα-15); 1,68 (1H; dm; J=13,0 Hα-22); 1,64 (1H; dm; J=11,8 Hz Hα-

21) 1,63 (1H; m; H-9); 1,53 (3H; m; Hβ-16); 1,52 (1H; m; Hβ-22); 1,51 (1H; m; Hα-6); 1,43

(1H; td; J =13,2-4,5 Hz; Hα-7); 1,30 (1H; m; Hβ-6); 1,24 (1H; m; Hβ-7); 1,23 (4H; m; H-20;

H-27); 1,13 (4H; s; H-23; Hβ-21); 1,10 (3H; s; H-29); 0,90 (1H; m; Hβ-15); 0,89 (3H; s; H-

25); 0,86 (1H; m; H-5); 0,83 (3H; d; J = 6,8 Hz; H-30); 0,81 (1H; m; Hβ-1); 0,66 (3H; s; H- 26). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,5 (C-28); 139,7 (C-13); 129,4 (C-12); 95,7 (C-1'); 86,0 (C-3); 78,6 (C-5'); 78,3 (C-3'); 73,8 (C-2'); 73,6 (C-19); 71,0 (C-4'); 69,6 (C-2); 66,3 (C- 24); 62,5 (C-6'); 57,2 (C-5); 55,0 (C-18); 49,6 (C-17); 48,9 (C-9); 47,9 (C-1); 44,4 (C-4); 42,9 (C-20); 42,6 (C-14); 41,3 (C-8); 39,0 (C10); 38,3 (C-22); 34,4 (C-7); 29,6 (C-15); 27,2 (C- 21); 27,0 (C-29); 26,5 (C-16); 25,0 (C-11); 24,6 (C-27); 23,8 (C-23); 20,0 (C-6); 17,6 (C-25); 17,5 (C-26); 16,6 (C-30).

229

V.8.22 Secoxyloganine (PS11)

+ HR-ESI+-SM m/z 427,1216 [M+Na] ; C17H24O11. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,65 (1H; dt; J =17,1-10,0 Hz; H-8); 7,49 (1H; d;

J =1,8 Hz; H-3); 5,50 (1H; d; J = 3,8 Hz; H-1); 5,28 (1H; dd; J =17,1-1,5 Hz; Hβ-10); 5,26

(1H; dd; J =10,0-1,5 Hz; Hα-10); 4,67 (1H; d; J =7,8 Hz; H-1'); 3,91 (1H; dd; J =11,9-1,9 Hz;

Hβ-6'); 3,70 (3H; s; COOMe); 3,68 (1H; dd; J = 11,9-5,7 Hz; Hα-6'); 3,37 (1H; t; J =8,7 Hz;

H-3'); 3,33 (1H; m; H-5); 3,32 (1H; m; H-5'); 3,31 (1H; t; J =9,6 Hz; H-4'); 3,23 (1H; dd; J

=9,0-7,8 Hz; H-2'); 2,95 (1H; dd; J =16,6-5,0 Hz; Hβ-6); 2,83 (1H; ddd; J =10,0-5,6-3,8 Hz;

H-9); 2,28 (1H; dd; J =16,6-9,0 Hz; Hα-6). RMN 13C (600 MHz; MeOD) δ 176,2 (C-7); 168,9 (C-11); 153,6 (C-3); 134,5 (C-8); 120,6 (C-10); 110,1 (C-4); 99,9 (C-1'); 97,6 (C-1); 78,4 (C-5'); 78,0 (C-3'); 74,6 (C-2'); 71,5

(C-4'); 62,7 (C-6'); 51,6 (COOCH3); 45,3 (C-9); 35,0 (C-6); 28,5 (C-5). V.8.23 Composé DB01

Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-]β-D- glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl phytolaccinique

+ HR-ESI+-SM m/z 1023,4786 [M+Na] ; C49H76O21. 1 ’’’ RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,36 (1H; d; J = 8,2 Hz; H-1 ); 5,33 (1H; t; J = 3,3 Hz; H-12); 5,19 (1H; d; J = 1,3 Hz; H-1’’); 4,48 (1H; d; J = 8,0 Hz; H-1’); 4,01 (1H; dq; J =9,5-6,2 Hz; H-5’’); 3,96 (1H; dd; J = 3,3-1,3 Hz; H-2’’); 3,89 (1H; d; J = 9,5 Hz; H-5’); 3,82 (1H; dd; J = 11,7-2,0 Hz; Hα-6’’’); 3,71 (4H; m; H-31/H-3’’); 3,69 (1H; dd; J = 11,7-4,3

230

Hz; Hβ-6’’’); 3,65 (1H; dd; J = 10,9-4,6 Hz; H-3); 3,61 (1H; d; J = 11,5 Hz; Hα-23); 3,57 (1H; t; J = 9,1 Hz ; H-4’); 3,54 (1H; t; J = 9,0 Hz ; H-3’); 3,41 (1H; m; H-3’’’); 3,40 (1H; t; J = 9,6 Hz; H-4’’); 3,36 (1H; m; H-4’’’); 3,35 (1H; m; H-5’’’); 3,34 (1H; m; H-2’); 3,32 (1H; dd; J = 9,1-8,0 Hz; H-2’’’); 3,29 (1H; d; J = 11,5 Hz; Hβ-23); 2,72 (1H; dd; J = 13,7; 3,7 Hz; H-18); 2,07 (1H; td; J = 14,5-3,6 Hz; Hα-16 ); 2,02 (1H; m; Hα-21); 1,97 (1H; m; Hα-19); 1,93 (2H; m; H-11); 1,86 (1H; dq; J =13,8-4,3 Hz; Hα-2); 1,79 (2H; m; Hα-15/Hβ-16); 1,75 (1H; m; Hβ-2); 1,73 (1H; dt; J =13,9-3,8 Hz; Hα-22); 1,71 (1H; m; Hβ-19) ; 1,66 (1H; m; H-9) ; 1,63 (1H; m; Hα-1); 1,62 (1H; m; Hα-7); 1,55 (1H; td; J = 13,9-3,9 Hz; Hβ-22); 1,48 (1H; m; Hα- 6); 1,40 (1H; td; J = 13,6-3,7 Hz; Hβ-21); 1,37 (1H; m; Hβ-6); 1,29 (1H; m; Hβ-7); 1,26 (1H; m; H-5); 1,26 (3H; d; J = 6,2Hz; H-6’’) ; 1,20 (3H; s; H-27); 1,16 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; dt; J = 13,9-3,1 Hz; Hβ-15); 0,99 (3H; s; H-25); 0,98 (1H; m; Hβ-1) ; 0,80 (3H; s; H-26); 0,71 (3H; s; H-24). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,8 (C-30); 177,6 (C-28); 172,6 (C-6’); 144,5 (C- 13); 124,4 (C-12); 105,9 (C-1’); 102,8 (C-1’’); 95,8 (C-1’’’); 83,4 (C-3); 83,2 (C-3’); 78,8 (C- 5’’’); 78,3 (C-3’’’); 76,7 (C-5’); 75,9 (C-2’); 74,0 (C-4’’); 73,9 (C-2’’’); 72,4 (C-2’’); 72,3 (C- 3’’); 71,9 (C-4’); 71,1 (C-4’’’); 70,0 (C-5’’); 64,6 (C-23); 62,4 (C-6’’’); 52,4 (C-31); 49,0 (C-9); 48,0 (C-5); 47,4 (C-17); 45,0 (C-20); 43,9 (C-18); 43,9 (C-4); 43,3 (C-19); 42,9 (C-14); 40,6 (C-8); 39,5 (C-1); 37,7 (C-10); 34,4 (C-22); 33,4 (C-7); 31,3 (C-21); 29,0 (C-15); 28,6 (C- 29); 26,4 (C-2); 26,3 (C-27); 24,6 (C-11); 24,2 (C-16); 18,8 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 13,4 (C-24). V.8.24 Composé DB02

Acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D- glucopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 1301.5768 [M+Na] ; C60H94O29.

231

1 V RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,36 (1H, d; J = 8,2 Hz; H-1 ); 5,33 (1H; t; J = 3,5 Hz; H-12); 5,04 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-1’’); 4,63 (1H; d; J = 7,7 Hz; H-1IV); 4,59 (1H; d; J = 7,7 Hz; H-1’); 4,57 (1H; d; J = 7,5 Hz; H-1’’’); 4,29 (1H; dd; J = 3,2-1,9 Hz; H-2’’); 4,01 (1H; m; Hα-5’’’); 3,90 (1H; m; H-5’’); 3,87 (1H; dd; J = 12,3-2,4 Hz; Hα-6IV); 3,85 (1H; m; H- 5’); 3,83 (1H; dd; J = 12,2-2,2 Hz; Hα-6V); 3,82 (1H; m; H-3’’); 3,81 (1H; m; H-2’); 3,72 (1H; t; J = 9,0 Hz; H-3’); 3,71 (3H; s; H-31); 3,69 (1H, dd; J = 12,2-4,6 Hz; Hβ-6V); 3,67 (1H; t; J = 9,0 Hz; H-4’); 3,62 (1H; t; J = 9,5 Hz; H-4’’); 3,57(1H; dd; J = 12,3-8,2 Hz; Hβ- 6IV); 3,51 (1H; ddd; J = 10,2-8,8-5,4 Hz; H-4’’’); 3,41 (1H, t; J = 9,0 Hz; H-3V); 3,41 (1H; m; H-3IV); 3,37 (1H; m; H-3’’’); 3,35 (2H; m; H-4V/H-5V); 3,32 (1H; m; H-2V); 3,31 (1H; m; H- 2’’’); 3,29 (1H; m; Hβ-5’’’); 3,28 (1H; m; H-5IV); 3,23 (1H; dd; J = 9,3-7,7 Hz; H-2IV); 3,22 (1H; dd; J = 12,3-4,3 Hz; H-3); 3,10 (1H; t; J = 9,2 Hz; H-4IV); 2,72 (1H; dd; J = 13,5-3,5 Hz; H-18); 2,06 (1H; td; J = 14,4-3,5 Hz; Hα-16 ); 2,02 (1H; m; Hα-21); 1,97 (1H ; m; Hα-19); 1,93 (2H; dd; J = 9,1-3,7 Hz; H-11); 1,90 (1H; m; Hα-2); 1,80 (2H; m; Hα-15/Hβ-16); 1,75 (1H; m; Hβ-2); 1,74 (1H; dt; J = 14,1-3,4 Hz; Hα-22); 1,71 (1H; t; J = 13,8 Hz; Hβ-19); 1,66 (1H; m; Hα-1); 1,61 (1H; t; J = 9,1 Hz; H-9); 1,55 (1H; td; J = 14,1-4,0 Hz; Hβ-22); 1,55 (1H; m; Hα-6); 1,49 (1H; dd; J = 12,5-3,6 Hz; Hα-7); 1,41 (1H; m; Hβ-6); 1,40 (1H; m; Hβ-21); 1,33 (1H; m; Hβ-7); 1,28 (3H; t; J = 6,3 Hz; H-6’’) ; 1,18 (3H; s; H-27); 1,15 (3H; s; H-29); 1,11 (1H; m; Hβ-15); 1,03 (3H; s; H-23); 1,01 (1H; td; J = 15,4-4,2 Hz; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H-25); 0,87 (3H; s; H-24); 0,81 (3H; s; H-26); 0,80 (1H; m; H-5).

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 177,5 (C-28); 178,7 (C-30); 172,6 (C-6’); 144,4 (C- 13); 124,4 (C-12); 106,5 (C-1’’’); 105,3 (C-1’); 103,8 (C-1IV); 103,5 (C-1’’); 95,8 (C-1V); 92,5 (C-3); 86,9 (C-3’); 81,5 (C-3’’); 78,8 (C-5IV/5V); 78,3 (C-3V); 77,9 (C-3IV); 77,7 (C-2’); 77,6 (C-3’’’); 76,6 (C-5’); 75,5 (C-2IV); 75,3 (C-2’’’); 73,9 (C-2V); 72,8 (C-4’’); 72,4 (C-4IV); 72,1 (C-4’); 71,9 (C-2’’); 71,2 (C-4’’’); 71,0 (C-4V); 70,5 (C-5’’); 67,1 (C-5’’’); 63,6 (C-6IV); 62,3 (C-6V); 57,0 (C-5); 52,4 (C-31); 49,0 (C-9); 47,4 (C-17); 45,0 (C-20); 43,9 (C-18); 43,3 (C- 19); 42,8 (C-14); 40,7 (C-8); 40,5 (C-4); 39,8 (C-1); 37,9 (C-10); 34,4 (C-22); 33,9 (C-7); 31,3 (C-21); 29,0 (C-15); 28,6 (C-29); 28,4 (C-23); 27,0 (C-2); 26,2 (C-27); 24,6 (C-11); 24,1 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,9 (C-24); 16,0 (C-25).

232

V.8.25 Composé DB03

Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl phytolaccinique.

+ HR-ESI+-SM m/z 861,4241 [M+Na] ; C43H66O16. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) 5,32 (1H; t; J = 3,6 Hz; H-12); 5,19 (1H; d; J = 1,2 Hz; H-1’’); 4,49 (1H; d; J = 7,9 Hz; H-1’); 4,02 (1H; dq; J =9,5-6,2 Hz; H-5’’); 3,96 (1H; dd; J = 3,6-1,2 Hz; H-2’’); 3,84 (1H; d; J = 7,4 Hz; H-5’); 3,71 (1H; dd; J = 9,5-3,6 Hz; H-3’’); 3,72 (3H; s; H-31); 3,65 (1H; dd; J = 11,8-4,5 Hz ; H-3); 3,62 (1H; d; J = 11,5 Hz; Hα-23); 3,57 (1H; m; Hz ; H-4’); 3,54 (1H; m ; H-3’); 3,40 (1H; t; J = 9,5 Hz ; H-4’’); 3,34 (1H; m; H-2’); 3,30 (1H; d; J = 11,5 Hz; Hβ-23); 2,71 (1H; dd; J = 13,5; 3,2 Hz; H-18); 2,02 (1H; td; J = 13,2-3,6 Hz; Hα-16 ); 2,01 (1H; dm; J = 13,2 Hz; Hα-21); 1,95 (1H; m; Hα-19); 1,93 (2H; m; Hα-11); 1,88 (1H; m; Hα-2); 1,77 (1H; m; td; J = 13,9-4,2 Hz; Hα-15); 1,75 (1H; m; Hβ-2); 1,69 (1H; m; Hβ-19); 1,67 (2H; m; H-9/Hβ-16); 1,64 (1H; m; Hα-22); 1,63 (1H; m; Hα-1; 1H; dm; J=12,6 Hz; Hα-7); 1,58 (1H; td; J = 13,8-4,2 Hz; Hβ-22); 1,51 (1H; m; Hα-6); 1,39 (2H; m; Hβ-21/Hβ-6); 1,28 (1H; m; Hβ-7); 1,27 (1H; m; H-5); 1,26 (3H; d; J = 6,2 Hz; H-6’’); 1,20 (3H; s; H-27); 1,15 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; dt; J = 13,9-3,5 Hz; Hβ-15); 0,99 (4H; s; H-25 (3H)/Hβ-1); 0,82 (3H; s; H-26); 0,72 (3H; s; H-24). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 172,7 (C-6’); 144,8 (C- 13); 124,2 (C-12); 105,9 (C-1’); 102,8 (C-1’’); 83,4 (C-3); 83,2 (C-3’); 76,7 (C-5’); 75,8 (C- 2’); 74,0 (C-4’’); 72,4 (C-2’’); 72,3 (C-3’’); 71,9 (C-4’); 70,0 (C-5’’); 64,6 (C-23); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 48,0 (C-5); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 44,0 (C-4); 43,4 (C-19); 42,9 (C-14); 40,5 (C-8); 39,5 (C-1); 37,7 (C-10); 35,0 (C-22); 33,4 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C- 15); 28,7 (C-29); 26,4 (C-2); 26,4 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 18,8 (C-6); 17,7 (C-6’’); 17,9 (C-26); 13,4 (C-24).

233

V.8.26 Composé DB04

Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D- glucopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 1007,4835 [M+Na] ; C49H76O20. 1 ’’’ RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,36 (1H; d; J = 8,2 Hz; H-1 ); 5,33 (1H; t; J = 3,6 Hz; H-12); 5,19 (1H; d; J = 1,5 Hz; H-1’’); 4,59 (1H; d; J = 7,8 Hz; H-1’); 4,02 (1H; dq; J =9,6-6,2 Hz; H-5’’); 3,96 (1H; dd; J = 3,3-1,5 Hz; H-2’’); 3,83 (1H; dd; J = 12,3-2,0 Hz; Hα- 6’’’); 3,82 (1H; d; J = 9,5 Hz; H-5’); 3,72 (3H,s, H-31); 3,71 (1H; dd; J = 9,6-3,3 Hz; H-3’’); 3,69 (1H; dd; J = 12,3-4,4 Hz; Hβ-6’’’); 3,58 (1H; t; J = 9,1 Hz ; H-4’); 3,53 (1H; t; J = 8,9 Hz; H-3’); 3,42 (1H; t; J = 9,0 Hz ; H-3’’’); 3,41 (1H; t; J = 9,6 Hz ; H-4’’); 3,36 (2H; m; H- 4’’’/H-2’); 3,35 (1H; m; H-5’’’); 3,32 (1H; dd; J = 9,0-8,2 Hz; H-2’’’); 3,19 (1H; dd; J = 11,5- 4,3 Hz ; H-3); 2,72 (1H; dd; J = 13,7-4,0 Hz; H-18); 2,08 (1H; td; J = 15,0-3,8 Hz ; Hα-16 ); 2,02 (1H; m; Hα-21); 1,97 (1H; ddd; J = 13,7-4,4-2,6 Hz; Hα-19); 1,93 (2H, dd; J = 8,9-3,4 Hz; H-11); 1,86 (1H; dq; J =13,5-4,3 Hz; Hα-2); 1,80 (2H; m; Hα-15, Hβ-16); 1,74 (1H; dt; J =13,8-3,4 Hz; Hα-22); 1,71 (1H; t; J = 13,7 Hz; Hβ-19); 1,70 (1H; m; Hβ-2); 1,64 (1H; dt; J =13,4-3,5 Hz; Hα-1); 1,61 (1H; m; H-9); 1,56 (2H; m; Hβ-22/Hα-6); 1,51 (1H; m; Hα-7); 1,41 (1H; m; Hβ-6); 1,33 (1H; m; Hβ-7); 1,40 (1H; td; J = 9,9-3,3 Hz; Hβ-21); 1,25 (3H; d ; J = 6,2Hz; H-6’’); 1,19 (3H; s; H-27); 1,16 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; dt; J = 14,5-3,4 Hz; Hβ- 15); 1,07 (3H; s; H-23); 1,00 (1H; m; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H-25); 0,86 (3H; s; H-5/H-24); 0,86 (1H; m; H-5); 0,80 (3H; s; H-26). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,8 (C-30); 177,6 (C-28); 172,6 (C-6’); 144,4 (C- 13); 124,4 (C-12); 106,8 (C-1’); 102,8 (C-1’’); 95,8 (C-1’’’); 91,2 (C-3); 83,4 (C-3’); 78,8 (C- 5’’’); 78,3 (C-3’’’); 76,6 (C-5’); 76,0 (C-2’); 74,0 (C-4’’); 73,9 (C-2’’’); 72,4 (C-2’’); 72,3 (C- 3’’); 71,9 (C-4’); 71,1 (C-4’’’); 70,0 (C-5’’); 62,3 (C-6’’’); 52,4 (C-31); 49,0 (C-9); 57,0 (C-5); 47,4 (C-17); 45,0 (C-20); 43,9 (C-18); 40,2 (C-4); 43,3 (C-19); 42,8 (C-14); 40,7 (C-8); 39,8 (C-1); 37,9 (C-10); 34,4 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 29,0 (C-15); 28,6 (C-29); 28,5 (C-

234

23); 27,0 (C-2); 26,2 (C-27); 24,5 (C-11); 24,1 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 17,0 (C-24). V.8.27 Composé DB05 Acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D- xylopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 1247,5773 [M+Na] ; C59H92O28. 1 V RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,36 (1H, d; J = 8,2 Hz; H-1 ); 5,33 (1H; t; J = 3,5 Hz; H-12); 5,03 (1H; d; J = 1,8 Hz; H-1’’); 4,56 (1H; d; J = 7,5 Hz; H-1’’’); 4,54 (1H; d; J = 7,0 Hz; H-1’); 4,52 (1H; d; J = 7,6 Hz; H-1IV); 4,29 (1H; dd; J = 3,0-1,8 Hz; H-2’’); 3,98 (1H; m; Hα-5’’’/H-5’’); 3,84 (2H; m; Hα-5IV/H-5’); 3,83 (1H; m; Hα-6V); 3,81 (1H; m; H-3’’); 3,71 (3H; s; H-31); 3,70 (1H; m; H-3’); 3,69 (1H, m; Hβ-6V); 3,67 (1H; m; H-2’); 3,66 (1H; m; H-4’); 3,62 (1H; t; J = 9,5 Hz; H-4’’); 3,51 (1H; ddd; J = 10,4-9,1-5,3 Hz; H-4’’’); 3,47 (1H; ddd; J = 10,2-9,3-5,5 Hz; H-4IV); 3,41 (1H; t; J = 8,5 Hz; H-3V); 3,37 (1H; m; H-3’’’); 3,35 (2H; m; H-4V/H-5V); 3,33 (1H; m; H-3IV); 3,32 (1H, m; H-2V); 3,31 (1H; m; H-2’’’); 3,28 (1H; m; Hβ-5’’’); 3,19 (1H; m; H-2IV); 3,14 (1H; m; Hβ-5IV); 3,13 (1H; m; H-3); 2,72 (1H; dd; J = 13,5-3,3 Hz; H-18); 2,06 (1H; m; Hα-16 ); 2,02 (1H; m; Hα-21); 1,97 (1H; m; Hα-19); 1,92 (2H; dd; J = 9,0-3,5 Hz; H-11); 1,86 (1H; m; Hα-2); 1,80 (1H; m; Hα-15); 1,79 (1H; m; Hβ-16); 1,73 (1H; m; Hα-22); 1,72 (1H; m; Hβ-2); 1,70 (1H; m; Hβ-19); 1,64 (1H; m; Hα-1); 1,60 (1H; m; H-9); 1,55 (2H; m; Hβ-22/Hα-6); 1,50 (1H; m; Hα-7); 1,41 (1H; m; Hβ-6); 1,40 (1H; m; Hβ-21); 1,33 (1H; m; Hβ-7); 1,28 (3H; d; J = 6,2 Hz; H-6’’); 1,18 (3H; s; H-27); 1,15 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; m; Hβ-15); 1,06 (3H; s; H-23); 1,00 (1H; m; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H- 25); 0,86 (3H; s; H-24); 0,80 (3H; s; H-26); 0,79 (1H; m; H-5).

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 177,5 (C-28); 178,7 (C-30); 172,6 (C-6’); 144,4 (C- 13); 124,4 (C-12); 106,5 (C-1’’’); 105,4 (C-1’); 104,8 (C-1IV); 103,4 (C-1’’); 95,8 (C-1V); 91,9

235

(C-3); 86,9 (C-3’); 81,6 (C-3’’); 78,8 (C-5V/C-2’); 78,3 (C-3V); 77,9 (C-3IV); 77,6 (C-3’’’); 76,3 (C-5’); 75,5 (C-2IV); 75,3 (C-2’’’); 73,9 (C-2V); 72,8 (C-4’’); 72,0 (C-4’); 71,8 (C-2’’); 71,4 (C-4IV); 71,2 (C-4’’’); 71,0 (C-4V); 70,5 (C-5’’); 67,0 (C-5’’’/C-5IV); 62,3 (C-6V); 57,1 (C- 5); 52,4 (C-31); 49,0 (C-9); 47,4 (C-17); 45,0 (C-20); 43,9 (C-18); 43,3 (C-19); 42,8 (C-14); 40,7 (C-8); 40,4 (C-4); 39,8 (C-1); 37,9 (C-10); 34,4 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 29,0 (C- 15); 28,6 (C-29); 28,4 (C-23); 27,1 (C-2); 26,2 (C-27); 24,5 (C-11); 24,1 (C-16); 19,4 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,7 (C-24); 16,0 (C-25). V.8.28 Composé DB06 Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-]β-D- glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 1139.5260 [M+Na] ; C54H85O24. 1 IV RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,36 (1H; d; J = 8,2 Hz; H-1 ); 5,33 (1H; t; J = 3,7 Hz; H-12); 5,06 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-1’’); 4,53 (1H; d; J = 7,3 Hz; H-1’); 4,52 (1H; d; J = 7,7 Hz; H-1’’’); 4,07 (1H; dd; J = 3,4-1,9 Hz; H-2’’); 3,94 (1H; dq; J =9,5-6,2 Hz; H-5’’); 3,83 (3H; m; H-5’/H-5’’’/ Hα-6IV); 3,71 (3H,s, H-31); 3,70 (1H; m; Hβ-6IV); 3,69 (1H; m; H- 3’); 3,68 (1H; m; H-3’’); 3,67 (1H; m; H-2’); 3,65 (1H; t; J=9,6 Hz; H-4’); 3,46 (1H; m; H- 4’’’); 3,43 (1H; m; H-4’’); 3,41 (1H; m; H-3IV); 3,36 (1H; m; H-4IV); 3,35 (1H; m; H-5IV); 3,33 (1H; m; H-3’’’); 3,32 (1H; m; H-2IV); 3,20 (1H; m; H-2’’’); 3,14 (2H; m; H-3/Hβ-5’’’); 2,72 (1H; dd; J = 13,6-4,2 Hz; H-18); 2,07 (1H; m; Hα-16 ); 2,02 (1H; m; Hα-21); 1,93 (1H ; m; Hα-19); 1,92 (2H; dd; J = 9,1-3,7 Hz; H-11); 1,87 (1H; m; Hα-2); 1,80 (2H; m; Hα-15/Hβ- 16); 1,73 (1H; m; Hα-22); 1,71 (1H; m; Hβ-2); 1,70 (1H; m; Hβ-19); 1,63 (1H; m; Hα-1); 1,60(1H; m; H-9) 1,55 (2H; m; Hβ-22/Hα-6); 1,50 (1H; m; Hα-7); 1,41 (1H; m; Hβ-6); 1,40 (1H; m; Hβ-21); 1,33 (1H; m; Hβ-7); 1,27 (3H; d; J = 6,2 Hz; H-6’’); 1,18 (3H; s; H-27); 1,16 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; m; Hβ-15); 1,06 (3H; s; H-23); 1,00 (1H, m; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H- 25); 0,86 (3H; s; H-24); 0,80 (3H; s; H-26); 0,78 (1H; m; H-5). 236

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 177,5 (C-28); 178,7 (C-30); 172,5 (C-6’); 144,7 (C- 13); 124,3 (C-12); 105,5 (C-1’); 104,7 (C-1’’’); 103,5 (C-1’’); 95,7 (C-1IV); 91,8 (C-3); 86,2 (C-3’); 79,1 (C-2’); 78,7 (C-5IV); 78,3 (C-3IV); 77,9 (C-3’’’); 76,4 (C-5’); 75,6 (C-2’’’); 73,9 (C-2IV); 73,8 (C-4’’); 72,2 (C-2’’); 72,1 (C-3’’); 72,0 (C-4’); 71,3 (C-4’’’); 71,0 (C-4IV); 70,6 (C-5’’); 66,9 (C-5’’’); 62,3 (C-6IV); 57,0 (C-5); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C- 20); 43,9 (C-18); 43,3 (C-19); 42,7 (C-14); 40,5 (C-8); 40,4 (C-4); 39,8 (C-1); 37,9 (C-10); 34,9 (C-22); 33,9 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,6 (C-29); 28,3 (C-23); 27,0 (C-2); 26,2 (C-27); 24,5 (C-11); 24,1 (C-16); 19,3 (C-6); 17,8 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,6 (C-24); 15,9 (C- 25). V.8.29 Composé DB07

Acide 3-O-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 861,1992 [M+Na] ; C43H66O16. 1 ’’ RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,25 (1H; d; J = 8,2 Hz; H-1 ); 5,21 (1H; t; J = 3,7 Hz; H-12); 4,28 (1H; d; J = 7,8 Hz; H-1’); 3,70 (1H; dd; J = 12,1-1,5 Hz; Hα-6’’); 3,67 (1H; d; J = 9,6 Hz; H-5’); 3,59 (3H; s; H-31); 3,57 (1H; dd; J = 12,1-4,3 Hz; Hβ-6’’); 3,41 (1H; td; J = 9,6-9,2 Hz ; H-4’); 3,29 (1H; t; J = 8,6 Hz ; H-3’’); 3,25 (1H; t; J = 9,2 Hz ; H-3’); 3,24 (1H; m; H-4’’); 3,22 (1H; m; H-5’’); 3,19 (1H; t; J = 8,8 Hz; H-2’’); 3,14 (1H; dd; J = 9,2-7,8 Hz; H-2’); 3,06 (1H; dd; J = 11,5-4,61 Hz; H-3); 2,60 (1H; dd; J = 13,5-4,5 Hz; H- 18); 1,95 (1H; td; J = 15,2-3,5 Hz; Hα-16 ); 1,90 (1H; m; Hα-21); 1,85 (1H; dd; J = 13,7-4,2 Hz ; Hα-19); 1,81 (2H, dd; J = 9,1-3,7 Hz, H-11); 1,75 (1H; m; Hα-2); 1,68 (1H; m; Hα-15); 1,67 (1H; dm; J = 14,0 Hz; Hβ-16); 1,61 (1H, dt; J =12,8-3,2 Hz; Hα-22); 1,60 (1H; m; Hβ- 2); 1,59 (1H; t; J = 13,9 Hz; Hβ-19); 1,52 (1H; td; J = 13,2-3,6 Hz; Hα-1);1,49 (1H; m; H-9) ; 1,45 (1H; td; J = 13,7-2,9 Hz; Hβ-22); 1,44 (1H; m; Hα-6); 1,39 (1H; td; J = 12,3-3,7 Hz; Hα- 7) ; 1,31 (1H; m; Hβ-6); 1,28 (1H; td; J = 13,6-3,1 Hz; Hβ-21); 1,21 (1H; m; Hβ-7); 1,06 (3H; s; H-27); 1,04 (3H; s; H-29); 1,00 (1H; m; Hβ-15); 0,95 (3H; s; H-23); 0,89 (1H; td; J = 12,8- 3,2 Hz; Hβ-1); 0,85 (3H; s; H-25); 0,75 (3H; s; H-24); 0,69 (4H; s; H-26 (3H)/H-5). 237

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 178,7 (C-28); 177,5 (C-30); 172,6 (C-6’); 144,4 (C- 13); 124,4 (C-12); 107,0 (C-1’); 95,8 (C-1’’); 91,2 (C-3); 78,8 (C-5’’); 78,3 (C-3’’); 77,6 (C- 3’); 76,5 (C-5’); 75,3 (C-2’); 73,9 (C-2’’); 73,2 (C-4’); 71,1 (C-4’’); 62,4 (C-6’’); 57,0 (C-5); 52,4 (C-31); 49,0 (C-9); 47,4 (C-17); 45,0 (C-20); 43,9 (C-18); 43,3 (C-19); 42,8 (C-14); 40,7 (C-8); 40,2 (C-4); 39,8 (C-1); 37,9 (C-10); 34,4 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,6 (C-29); 28,4 (C-23); 27,0 (C-2); 26,2 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,4 (C-6); 17,7 (C-26); 16,9 (C-24).

V.8.30 Composé DB08 Acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D- glucuronopyranosyl phytolaccinique.

+ HR-ESI+-SM m/z 993,4673[M+Na] ; C48H74O20. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,32 (1H; t; J = 3,4 Hz; H-12); 5,22 (1H; d; J = 1,4 Hz; H-1’’); 4,52 (1H; d; J = 7,2 Hz; H-1’’’); 4,47 (1H; d; J = 8,1 Hz; H-1’); 4,14 (2H; m; H-2’’/H-5’’); 3,95 (1H; m; H-5’); 3,88 (1H; dd; J = 11,4-5,3 Hz; Hα-5’’’); 3,83 (1H; dd; J = 9,5-3,1 Hz; H-3’’); 3,72 (3H; s; H-31); 3,67 (1H; m; H-3); 3,64 (1H; d; J = 11,7 Hz; Hα-23); 3,58 (1H; t; J = 9,6 Hz; H-4’’); 3,56 (1H; m; H-3’); 3,55 (1H; m; H-4’); 3,51 (1H; ddd; J = 10,4-8,4-5,3 Hz; H-4’’’); 3,36 (1H; m; H-2’); 3,34 (1H; m; H-3’’’); 3,31 (1H; m; H-2’’’); 3,29 (1H; d; J = 11,7 Hz; Hβ-23); 3,23 (1H; dd; J = 11,4-10,1 Hz; Hβ-5’’’); 2,71 (1H; dd; J = 13,6- 3,6 Hz; H-18); 2,03 (1H; dd; J = 13,8-4,1 Hz; Hα-16 ); 2,01 (1H; m; Hα-21); 1,95 (1H ; m; Hα-19); 1,93 (2H; dd; J = 8,8-2,6 Hz; H-11); 1,92 (1H; m; Hα-2); 1,77 (1H; m; Hα-15); 1,76 (1H; m; Hβ-2); 1,68 (1H; m; Hβ-19); 1,67 (2H; m; Hβ-16/H-9); 1,64 (1H; m; Hα-7); 1,63 (2H; m; H-22); 1,62 (1H; m; Hα-1); 1,50 (1H; m; Hα-6); 1,39 (2H; m; Hβ-2/Hβ-6); 1,28 (2H; m; H-5/Hβ-7); 1,26 (3H; d; J = 6,2 Hz; H-6’’); 1,21 (3H; s; H-27); 1,16 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; m; Hβ-15); 0,99 (1H; m; Hβ-1); 0,99 (3H; s; H-25); 0,82 (3H; s; H-26); 0,72 (3H; s; H-24).

238

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 124,2 (C-12); 106,5 (C-1’’’); 105,4 (C-1’); 102,3 (C- 1’’); 83,1 (C-3’); 82,8 (C-3); 82,3 (C-3’’); 77,6 (C-3’’’); 75,8 (C-2’); 75,3 (C-2’’’); 72,9 (C-4’’); 72,2 (C-4’); 72,0 (C-2’’); 71,1 (C-4’’’); 69,6 (C-5’’); 66,8 (C-5’’’); 64,5 (C-23); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 48,0 (C-5); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 43,9 (C-4); 43,3 (C-19); 42,8 (C-14); 40,6 (C-8); 39,5 (C-1); 37,6 (C-10); 35,0 (C-22); 33,4 (C-7); 31,3 (C-21); 28,8 (C- 15); 28,7 (C-29); 26,4 (C-2); 26,3 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 18,8 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,4 (C-25); 13,4 (C-24). V.8.31 Composé DB09 Acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D- glucopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 1139,5242 [M+Na] ; C54H84O24. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,32 (1H; t; J = 3,8 Hz; H-12); 5,04 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-1’’); 4,63 (1H; d; J = 7,8 Hz; H-1IV); 4,59 (1H; d; J = 7,7 Hz; H-1’); 4,57 (1H; d; J = 7,4 Hz; H-1’’’); 4,29 (1H; dd; J = 3,2-1,9 Hz; H-2’’); 4,00 (1H; dd; J = 11,4-5,3 Hz; Hα-5’’’); 3,90 (1H; m; H-5’’); 3,88 (1H; m; H-5’); 3,87 (1H; dd; J = 12,1-2,4 Hz; Hα-6IV); 3,82 (1H; dd; J = 9,4-3,2 Hz; H-3’’); 3,81 (1H; dd; J = 8,9-7,7 Hz; H-2’); 3,72 (3H; s; H-31); 3,72 (1H; t; J = 8,9 Hz; H-3’); 3,66 (1H; t; J = 9,0 Hz; H-4’); 3,62 (1H; t; J = 9,4 Hz; H-4’’); 3,57 (1H; dd; J = 12,1-7,9 Hz; Hβ-6IV); 3,51 (1H; ddd; J = 10,2-8,5-5,3 Hz; H-4’’’); 3,40 (1H; t; J = 9,1 Hz; H-3IV); 3,37 (1H; t; J = 8,5 Hz; H-3’’’); 3,30 (1H; m; H-2’’’); 3,28 (1H; m; H-5IV); 3,28 (1H; dd; J=11,4-10,2; Hβ-5’’’); 3,23 (1H; dd; J = 12,1-4,6 Hz; H-3); 3,21 (1H; dd; J = 9,1-7,8 Hz; H-2IV); 3,11 (1H; dd; J = 9,6-9,1 Hz; H-4IV); 2,71 (1H; dd; J = 13,4-4,1 Hz; H-18); 2,03 (1H; dd; J = 13,4-3,5 Hz; Hα-16 ); 2,01 (1H; m; Hα-21); 1,95 (1H; m; Hα-19); 1,93 (2H; dd; J = 9,2-3,8 Hz; H-11); 1,90 (1H; m; Hα-2); 1,77 (1H; m; Hα-15); 1,75 (1H; m; Hβ-2); 1,69 (1H, t; J = 13,9 Hz; Hβ-19); 1,67 (1H; m; Hβ-16); 1,66 (1H; m; Hα-1); 1,64 (1H; m; Hα-22); 1,62 (1H; m; H-9); 1,60 (1H; m; Hβ-22); 1,57 (1H; m; Hα-6); 1,52 (1H; td; J = 12,7-4,1 Hz; Hα- 7); 1,43 (1H; m; Hβ-6); 1,39 (1H; td; J = 13,4-4,6 Hz; Hβ-21); 1,33 (1H; m; Hβ-7); 1,28 (3H ; d; J = 6,2 Hz ; H-6’’); 1,19 (3H; s; H-27); 1,15 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; td; J = 14,1-3,5 Hz; 239

Hβ-15); 1,09 (3H; s; H-23); 1,03 (1H; td; J = 13,2-3,4 Hz; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H-25); 0,89 (3H; s; H-24); 0,82 (3H; s; H-26); 0,81 (1H; m; H-5). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 172,1 (C-6’); 144,7 (C- 13); 124,3 (C-12); 106,5 (C-1’’’); 105,3 (C-1’); 103,8 (C-1IV); 103,5 (C-1’’); 92,5 (C-3); 86,9 (C-3’); 81,5 (C-3’’); 78,8 (C-5IV); 77,9 (C-3IV); 77,7 (C-2’); 77,6 (C-3’’’); 76,6 (C-5’); 75,5 (C- 2IV); 75,3 (C-2’’’); 72,8 (C-4’’); 72,4 (C-4IV); 72,1 (C-4’); 71,9 (C-2’’); 71,2 (C-4’’’); 70,5 (C- 5’’); 67,1 (C-5’’’); 63,6 (C-6IV); 56,9 (C-5); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 43,4 (C-19); 42,8 (C-14); 40,7 (C-8); 40,5 (C-4); 39,7 (C-1); 37,9 (C-10); 35,0 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,7 (C-29); 28,4 (C-23); 27,0 (C-2); 26,3 (C- 27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,9 (C-24); 15,9 (C-25).

V.8.32 Composé DB10 Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl serjanique.

+ HR-ESI+-SM m/z 845,4290 [M+Na] ; C43H66O15. 1 RMN H (600 MHz; Methanol-d4) δ 5,32 (1H; t; J = 3,4 Hz; H-12); 5,19 (1H; d; J = 1,7 Hz; H-1’’); 4,41 (1H; d; J = 7,9 Hz; H-1’); 4,02(1H; dq; J =9,5-6,2 Hz; H-5’’); 3,96 (1H; dd; J = 3,3-1,7 Hz; H-2’’); 3,82 (1H; d; J = 9,3 Hz; H-5’); 3,72 (3H; s; H-31); 3,71 (1H; dd; J = 9,5-3,3; Hz; H-3’’); 3,58 (1H; t; J = 9,1 Hz ; H-4’); 3,54 (1H; t; J = 9,0 Hz ; H-3’); 3,41 (1H; t; J = 9,5 Hz ; H-4’’); 3,36 (1H; t; J = 8,2 Hz ; H-2’); 3,19 (1H; dd; J = 11,8-4,5 Hz ; H-3); 2,71 (1H; dd; J = 13,8; 4,5 Hz; H-18); 2,03 (1H; td; J = 13,6-3,5 Hz ; Hα-16 ); 2,01 (1H; m; Hα-21); 1,96 (1H ; m ; Hα-19); 1,93 (2H, dd; J = 9,3-3,6 Hz, H-11); 1,87 (1H; dd; J =13,5-4,5 Hz; Hα-2); 1,78 (1H; td; J = 13,6-4,3 Hz; Hα-15); 1,70 (1H; m; Hβ-2); 1,69 (1H, m ; Hβ-19); 1,67 (1H ; m ; Hβ-16); 1,64 (1H; m; Hα-1); 1,63 (1H; m; H-22) ; 1,62 (1H ; m ; H-9) ; 1,58 (1H; m; Hα-6); 1,54 (1H ; td; J = 12,4-4,1 Hz ; Hα-7) ; 1,44 (1H; m; Hβ-6); 1,39 (1H; td; J = 13,5-4,4 Hz; Hβ-21); 1,33 (1H ; m ; Hβ-7) ; 1,25 (3H ; t ; J = 6,2Hz ; H-6’’) ; 1,19 (3H; s; H- 27); 1,16 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; dt; J = 13,6-3,6 Hz; Hβ-15); 1,07 (3H; s; H-23) ; 1,01 (1H, td; J = 13,3-3,6 Hz, Hβ-1) ; 0,97 (3H; s; H-25); 0,82 (3H; s; H-26 ; 1H; m; H-5); 0,87 (3H; s; H-24). 240

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 172,6 (C-6’); 144,7 (C- 13); 124,3 (C-12); 106,8 (C-1’); 102,8 (C-1’’); 91,2 (C-3); 83,4 (C-3’); 76,6 (C-5’); 76,0 (C- 2’); 74,0 (C-4’’); 72,4 (C-2’’); 72,3 (C-3’’); 71,9 (C-4’); 70,0 (C-5’’); 57,0 (C-5); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 40,2 (C-4); 43,4 (C-19); 42,8 (C-14); 40,5 (C-8); 39,7 (C-1); 37,9 (C-10); 35,0 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,7 (C- 29); 28,5 (C-23); 27,0 (C-2); 26,4 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 17,0 (C-24). V.8.33 Composé DB11

Acide 3-O-β-D-glucuronopyranosyl serjanique

+ HR-ESI+-SM m/z 699,3823 [M+Na] ; C37H56O11. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,20 (1H; t; J = 3,3 Hz; H-12); 4,28 (1H; d; J = 7,1 Hz; H-1’); 3,64 (1H; m; H-5’); 3,59 (3H; s; H-31); 3,39 (1H; m; H-4’); 3,26 (1H; t; J = 8,5 Hz ; H-3’); 3,14 (1H; t; J = 7,2 Hz; H-2’); 3,07 (1H; dd; J = 11,5-4,2 Hz; H-3); 2,59 (1H; dd; J = 13,8-4,5 Hz; H-18); 1,90 (1H; m; Hα-16 ); 1,89 (1H; m; Hα-21); 1,83 (1H; m; Hα-19); 1,81 (2H; m; H-11); 1,76 (1H; m; Hα-2); 1,67 (1H; m; Hβ-16); 1,65 (1H; td; J = 13,7-3,7 Hz; Hα- 15); 1,59 (1H; m; Hβ-2); 1,57 (1H; m; Hβ-19); 1,51 (2H; m; Hα-22/Hα-1); 1,50 (1H; m; H-9); 1,48 (1H; td; J = 13,7-3,9 Hz; Hβ-22); 1,45 (1H; m; Hα-6); 1,40 (1H; m; Hα-7); 1,30 (1H; m; Hβ-6); 1,27 (1H; m; Hβ-21); 1,21 (1H; m; Hβ-7); 1,07 (3H; s; H-27); 1,03 (3H; s; H-29); 0,99 (1H; m; Hβ-15); 0,95 (3H; s; H-23); 0,89 (1H; m; Hβ-1); 0,85 (3H; s; H-25); 0,75 (3H; s; H- 24); 0,70 (3H; s; H-26); 0,69 (3H; m; H-5). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 144,7 (C-13); 124,3 (C- 12); 107,0 (C-1’); 91,1 (C-3); 77,8 (C-3’); 76,3 (C-5’); 75,3 (C-2’); 73,3 (C-4’); 56,9 (C-5); 52,3 (C-31); 48,9 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 43,3 (C-19); 42,7 (C-14); 40,5 (C-8); 40,1 (C-4); 39,7 (C-1); 37,9 (C-10); 35,0 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,8 (C-15); 28,7 (C-29); 28,5 (C-23); 27,0 (C-2); 26,3 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,3 (C-6); 17,7 (C-26); 16,9 (C-24). 241

V.8.34 Composé DB12 Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D- glucuronopyranosyl serjanique

+ HR-ESI+-SM m/z 1007,4832 [M+Na] ; C49H76O20. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,32 (1H; t; J = 3,5 Hz; H-12); 5,07 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-1’’); 4,62 (1H; d; J = 7,7 Hz; H-1’’’); 4,58 (1H; d; J = 7,7 Hz; H-1’); 4,07 (1H; dd; J = 3,4-1,9 Hz; H-2’’); 3,96 (1H; dq; J =9,6-6,3 Hz; H-5’’); 3,86 (1H; dd; J = 12,1-2,3 Hz; Hα- 6’’’); 3,86 (1H; d; J = 9,3 Hz; H-5’); 3,80 (1H; dd; J = 8,8-7,7 Hz; H-2’); 3,72 (3H,s, H-31); 3,72 (1H; dd; J = 9,6-8,8 Hz ; H-3’); 3,70 (1H; dd; J = 9,5-3,4 Hz; H-3’’); 3,65 (1H; t; J = 9,3 Hz ; H-4’); 3,57 (1H; dd; J = 12,1-7,8 Hz; Hβ-6’’’); 3,44 (1H; t; J = 9,6 Hz ; H-4’’); 3,38 (1H; t; J = 9,1 Hz ; H-3’’’); 3,28 (1H; ddd; J = 9,6-7,8-2,3 Hz; H-5’’’); 3,10 (1H; dd; J = 9,6-9,0 Hz; H-4’’’); 3,23 (1H; m; H-3); 3,22 (1H; dd; J = 9,3-7,7 Hz; H-2’’’); 2,72 (1H; dd; J = 13,5-3,6 Hz; H-18); 2,03 (1H; td; J = 13,4-3,3 Hz; Hα-16 ); 2,02 (1H; m; Hα-21); 1,95 (1H; m; Hα- 19); 1,93 (2H; m; H-11); 1,91 (1H; m; Hα-2); 1,77 (1H; td; J = 13,5-4,1 Hz; Hα-15); 1,75 (1H; m; Hβ-2); 1,69 (1H; t; J = 13,7 Hz; Hβ-19); 1,67 (1H; m; Hβ-16); 1,66 (1H; m; Hα-1); 1,64 (1H; m; Hα-22) ; 1,62 (1H; m; H-9); 1,60 (1H; m; Hβ-22); 1,57 (2H; m; Hα-6); 1,52 (1H; m; Hα-7); 1,42 (1H; m; Hβ-6); 1,39 (1H; td; J = 13,4-4,5 Hz; Hβ-21); 1,33 (1H; dt; J = 12,7-3,9 Hz; Hβ-7); 1,27 (3H; d; J = 6,3 Hz; H-6’’) ; 1,19 (3H; s; H-27); 1,15 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; dt; J = 13,5-3,7 Hz; Hβ-15); 1,09 (3H; s; H-23); 1,02 (1H; m; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H-25); 0,89 (3H; s; H-24); 0,82 (3H; s; H-26); 0,81 (1H; m; H-5). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 172,3 (C-6’); 144,7 (C- 13); 124,3 (C-12); 105,4 (C-1’); 103,8 (C-1’’’); 103,5 (C-1’’); 92,4 (C-3); 86,1 (C-3’); 78,7 (C- 5’’’); 78,1 (C-2’); 77,9 (C-3’’’); 76,7 (C-5’); 75,6 (C-2’’’); 73,8 (C-4’’); 72,3 (C-4’’’); 72,2 (C- 2’’); 72,2 (C-3’’); 72,1 (C-4’); 70,7 (C-5’’); 63,5 (C-6’’’); 56,9 (C-5); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 43,4 (C-19); 42,8 (C-14); 40,5 (C-8); 40,4 (C-4); 37,9

242

(C-10); 39,7 (C-1); 35,0 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,7 (C-29); 28,4 (C- 23); 27,0 (C-2); 26,3 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,9 (C-24).

V.8.35 Composé DB13

Acide 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D- xylopyranosyl-(1→2)-]β-D-glucuronopyranosyl serjanique

+ HR-ESI+-SM m/z 1109,5149 [M+Na] ; C53H82O23. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,31 (1H; t; J = 3,7 Hz; H-12); 5,03 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-1’’); 4,56 (1H; d; J = 7,5 Hz; H-1IV); 4,54 (1H; d; J = 7,1 Hz; H-1’); 4,52 (1H; d; J = 7,6 Hz; H-1’’’); 4,29 (1H; dd; J = 3,2-1,9 Hz; H-2’’); 3,99 (1H; dd; J = 11,4-5,4 Hz; Hα-5IV); 3,98 (1H; m; H-5’’); 3,84 (1H; dd; J = 11,4-5,4 Hz; Hα-5’’’); 3,83 (1H; m; H-5’); 3,81 (1H; dd; J = 9,5-3,2 Hz; H-3’’); 3,72 (3H; s; H-31); 3,71 (1H; m; H-3’); 3,67 (1H; m; H-2’); 3,66 (1H; m; H-4’); 3,62 (1H; t; J = 9,5 Hz; H-4’’); 3,51 (1H; ddd; J = 10,2-8,6-5,4 Hz; H-4IV); 3,47 (1H; ddd; J = 10,4-8,8-5,4 Hz; H-4’’’); 3,36 (1H; m; H-3IV); 3,33 (1H; m; H-3’’’); 3,32 (1H; dd; J = 9,3-7,5 Hz; H-2IV); 3,28 (1H; dd; J = 11,4-10,2 Hz; Hβ-5IV); 3,20 (1H; dd; J = 9,3-7,6 Hz; H-2’’’); 3,14 (1H; dd; J = 13,8-3,7 Hz; H-3); 3,14 (1H; m; Hβ-5’’’); 2,71 (1H; dd; J = 13,4- 4,1 Hz; H-18); 2,02 (1H; dd; J = 13,8-4,1 Hz; Hα-16 ); 2,01 (1H; m; Hα-21); 1,95 (1H; m; Hα-19); 1,92 (2H; dd; J = 9,2-3,8 Hz; H-11); 1,87 (1H; dq; J = 13,8-3,7 Hz; Hα-2); 1,77 (1H; td; J = 14,1-4,4 Hz; Hα-15); 1,71 (1H; m; Hβ-2); 1,69 (1H, m; Hβ-19); 1,67 (1H; m; Hβ- 16); 1,63 (1H; m; Hα-22/Hα-1); 1,61 (1H ; m ; H-9); 1,60 (1H; m; Hβ-22); 1,57 (1H; m; Hα- 6); 1,52 (1H; td; J = 12,7-4,1 Hz; Hα-7); 1,42 (1H; m; Hβ-6); 1,39 (1H; td; J = 13,4-4,6 Hz; Hβ-21); 1,32 (1H; m; Hβ-7); 1,28 (3H; d; J = 6,2 Hz ; H-6’’); 1,18 (3H; s; H-27); 1,16 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; td; J = 14,1-3,5 Hz; Hβ-15); 1,08 (3H; s; H-23); 1,00 (1H, td; J = 13,2-3,4 Hz; Hβ-1); 0,97 (3H; s; H-25); 0,86 (3H; s; H-24); 0,82 (3H; s; H-26); 0,79 (1H; m; H-5). RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 172,5 (C-6’); 144,7 (C- 13); 124,3 (C-12); 106,5 (C-1IV); 105,4 (C-1’); 104,8 (C-1’’’); 103,4 (C-1’’); 91,9 (C-3); 87,0

243

(C-3’); 81,6 (C-3’’); 78,8 (C-2’); 78,7 (C-5IV); 78,3 (C-3IV); 77,9 (C-3’’’); 76,6 (C-5’); 75,5 (C- 2’’’); 75,3 (C-2IV); 72,8 (C-4’’); 71,8 (C-2’’); 71,4 (C-4’’’); 71,2 (C-4IV/C-4’); 70,5 (C-5’’); 67,1 (C-5’’’); 57,0 (C-5); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 43,4 (C- 19); 42,8 (C-14); 40,5 (C-8); 40,4 (C-4); 39,7 (C-1); 37,9 (C-10); 35,0 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,7 (C-29); 28,3 (C-23); 27,0 (C-2); 26,3 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,7 (C-24); 15,9 (C-25).

V.8.36 Composé DB14 Acide 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-]β-D- glucuronopyranosyl serjanique

+ HR-ESI+-SM m/z 977,4727 [M+Na] ; C48H74O19. 1 RMN H (600 MHz; Méthanol-d4) δ 5,32 (1H; t; J = 3,4 Hz; H-12); 5,07 (1H; d; J = 1,9 Hz; H-1’’); 4,54 (1H; d; J = 7,8 Hz; H-1’); 4,52 (1H; d; J = 7,8 Hz; H-1’’’); 4,07 (1H; dd; J = 3,4-1,9 Hz; H-2’’); 3,94 (1H; dq; J =9,5-6,2 Hz; H-5’’); 3,84 (1H; m; H-5’); 3,82 (1H; dd; J = 11,5-5,4 Hz; Hα-5’’’); 3,72 (3H; s; H-31); 3,69 (1H; m; H-3’’); 3,68 (1H; m; H-3’); 3,67 (1H; m; H-2’); 3,64 (1H; m; H-4’); 3,46 (1H; ddd; J = 10,4-8,8-5,4 Hz; H-4’’’); 3,43 (1H; t; J = 9,5 Hz ; H-4’’); 3,34 (1H; m; H-3’’’); 3,20 (1H; dd; J = 9,3-7,8 Hz; H-2’’’); 3,14 (1H; dd; J = 11,7-4,5 Hz; H-3); 3,14 (1H; dd; J = 11,5-10,4 Hz; Hβ-5’’’); 2,71 (1H; dd; J = 13,5-4,3 Hz; H- 18); 2,02 (1H; td; J = 13,5-3,8 Hz; Hα-16 ); 2,01 (1H; m; Hα-21); 1,95 (1H ; m; Hα-19); 1,92 (2H; dd; J = 9,0-3,7 Hz; H-11); 1,87 (1H; dq; J = 13,5-3,6 Hz; Hα-2); 1,77 (1H; td; J = 14,2- 4,4 Hz; Hα-15); 1,71 (1H; m; Hβ-2); 1,68 (1H; t; J = 13,5 Hz; Hβ-19); 1,67 (1H; m; Hβ-16); 1,63 (1H; m; Hα-1); 1,62 (1H; m; H-22); 1,61 (1H; m; H-9); 1,57 (1H; m; Hα-6); 1,51 (1H ; td; J = 12,3-4,1 Hz; Hα-7); 1,41 (1H; m; Hβ-6); 1,39 (1H; td; J = 13,5-4,6 Hz; Hβ-21); 1,32 (1H; dt; J = 12,3-2,6 Hz; Hβ-7); 1,27 (3H; d; J = 6,2 Hz; H-6’’); 1,18 (3H; s; H-27); 1,15 (3H; s; H-29); 1,12 (1H; dt; J = 14,2-3,7 Hz; Hβ-15); 1,07 (3H; s; H-23); 1,00 (1H, dd; J = 13,5-3,3 Hz; Hβ-1); 0,96 (3H; s; H-25); 0,86 (3H; s; H-24); 0,82 (3H; s; H-26); 0,80 (1H; m; H-5).

244

RMN 13C (151 MHz; MeOD) δ 181,3 (C-28); 178,8 (C-30); 172,3 (C-6’); 144,7 (C- 13); 124,3 (C-12); 105,5 (C-1’); 103,5 (C-1’’’); 104,8 (C-1’’); 91,9 (C-3); 86,2 (C-3’); 79,2 (C- 2’); 77,9 (C-3’’’); 76,4 (C-5’); 75,6 (C-2’’’); 73,8 (C-4’’); 72,2 (C-2’’); 72,2 (C-3’’); 72,0 (C-4’); 71,4 (C-4’’’); 70,7 (C-5’’); 67,0 (C-5’’’); 57,0 (C-5); 52,3 (C-31); 49,0 (C-9); 47,0 (C-17); 45,0 (C-20); 44,0 (C-18); 43,4 (C-19); 42,8 (C-14); 40,5 (C-8); 40,4 (C-4); 39,7 (C-1); 37,9 (C- 10); 35,0 (C-22); 34,0 (C-7); 31,3 (C-21); 28,9 (C-15); 28,7 (C-29); 28,3 (C-23); 27,0 (C-2); 26,3 (C-27); 24,5 (C-11); 24,2 (C-16); 19,3 (C-6); 17,9 (C-6’’); 17,7 (C-26); 16,6 (C-24).

VI. Tests biologiques :

VI.1 Tests de cytotoxicité Le test de cytotoxicité cellulaire est réalisé sur des fibroblastes issus de biopsie de sujets sain de l’hôpital Maison Blanche de Reims. Ces explants sont conservés dans des cryotubes dans un milieu de culture DMEM 10% SVF/DMSO 9/1 à -80°C (dans un bain d’éthanol) avec une charge cellulaire de 1 million. VI.1.1 Mise à confluence des cellules Le cryotube contenant les fibroblastes est décongelé dans un bain marie à 37°C. Le volume (1 ml) est complété à 8 ml avec du milieu DMEM à 20 % de SVF que nous disposons ensuite dans une boite de pétri B10 ou dans un flasque T75 selon la disponibilité pour être incubé à 37°C pendant 48h. Le milieu de culture est changé tous les 2 jours avec du milieu DMEM à 10 % de SVF pendant 7 à 10 jours environ jusqu’à confluence des cellules (vérification de l’état des cellules par observation sous microscope). VI.1.2 Préparation des plaques Lorsque les cellules sont à confluence, nous les récupérons afin de réaliser un comptage selon la procédure de la Figure 108. Après comptage, les cellules sont ensemencées en plaques 96 puits. Le calcul du nombre des cellules se fait grâce à l’équation suivante :

x étant le nombre de cellules comptées dans 9 petits carreaux. Pour la révélation à l’Uptiblue, nous préparons des plaques à 2500 cellules par puit alors que pour la révélation au MTT, nous utilisons une concentration de 500 cellules par puit. 245

Figure 108: Procédure de préparation des plaques 96 puits pour les tests cytotoxiques

VI.1.3 Préparation des échantillons et du témoin positif Chaque composé ou fraction a été dissous dans du DMSO à une concentration donnée (selon la masse disponible mais en général 1 mg/ml). Ensuite nous avons réalisé des dilutions à partir des solutions mères avec du milieu DMEM sans SVF. Des solutions à 10 µg/ml sont préparées pour chaque échantillon et une gamme de concentrations comprise entre 1 et 10 µg/ml (1 ; 2,5 ; 5 ; 7,5 et 10 µg/ml). Le témoin positif est l’α-héderine commerciale (Sigma) à une concentration de 5 µg/ml préparée dans du milieu DMEM sans SVF à partir d’une solution mère à 1 mg/ml dans du DMSO (dilution au 1/200ème).

VI.1.4 Mise en contact avec les drogues Après les 24 heures d’incubation des plaques 96 puits, le milieu de culture est éliminé par aspiration (sans toucher aux cellules qui adhèrent au fond des puits) et après rinçage des

246

cellules au PBS nous remplissons les puits avec 200 µl d’échantillon en solution dans le milieu de culture. Chaque concentration est testée en quadruplicate. Dans chaque plaque, nous réservons une ligne pour le témoin positif (l’ α-héderine) et une ligne pour un témoin négatif contenant du milieu DMEM avec 1% de DMSO. Les plaques préparées sont ensuite incubées à 37°C pendant 24h.

VI.1.5 Révélation des plaques VI.1.5.1 Révélation à l’Uptiblue Pour chaque puit nous retirons 10 µl à l’aide d’une micropipette et nous ajoutons ensuite 10 µl d’Uptiblue (Interchim). La lecture des absorbance à 560 et à 600 nm est réalisée après 4h d’incubation avec le réactif à 37°C. Pour avoir une valeur d’absorbance nette, nous soustrayions la valeur obtenue à 600 nm à celle obtenue à 560 nm. Le calcul du pourcentage d’inhibition est obtenu avec l’équation suivante :

DOblanc= Densité optique nette du témoin négatif

DOEch= Densité optique nette des drogues et le témoin positif

VI.1.5.2 Révélation au MTT Dans chaque puit nous ajoutons 15 µl de MTT (6mg/ml dans du DMSO) puis nous incubons à 37°C pendant 4 h. Après incubation et agitation (pendant 10 min sur un agitateur de plaque) le milieu est supprimé par aspiration et est remplacé par 200 µl de DMSO dans chaque puit afin de dissoudre le formazan formé. Ensuite une lecture des absorbances est réalisée à 540 nm et le calcul des pourcentages d’inhibition est réalisé suivant la même équation que précédemment avec l’Uptiblue.

VI.2 Tests hémolytiques VI.2.1 Préparation des échantillons VI.2.1.1 La solution tampon La solution tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) a été préparée par mélange de

145 mM de NaCl (8,5 g/l) ; 5 mM de KCl (372,75 g/l) ; 4mM de Na2HPO4, 12H2O (1,433 g/l) et 1 mM de NaH2PO4, 2H2O (156 mg/l), le tout est dissous dans 1 litre d’eau permutée.

247

VI.2.1.2 La solution des saponines Pour chaque saponine à tester, ainsi que pour le témoin positif, nous avons préparé une solution mère de 500 µg/l à partir de laquelle deux autres solutions à 50 µg/l et 5 µg/l sont préparées par dilution. Le témoin positif est un mélange de saponines commercialisées par Sigma Aldrich que nous avons dialysé pour améliorer son pouvoir hémolytique (indice hémolytique de 30 000).

VI.2.1.3 Les hématies de mouton La solution d’hématies de mouton à 10% est préparée par dilution dans du tampon PBS de la solution d’hématies à 15% commerciale de chez Eurobio. VI.2.2 Préparation de la gamme de concentration Une gamme de concentration croissante comprise entre 1 et 100 µg/l est préparée (Tableau 38) dans un volume de 500 µl de chaque composé et pour le témoin positif et chaque concentration est réalisée en triplicate. Un témoin négatif est réalisé avec la solution tampon PBS (blanc).

Tableau 38: Procédure de préparation de la gamme de concentration pour le test d’hémolyse

Concentrations 1 2,5 5 7,5 10 20 25 30 40 50 75 100 µg/ml 500 µg/ml 75 100 50 µg/ml 75 100 200 250 300 400 500 5 µg/ml 100 250 500 PBS 400 250 425 400 300 250 200 100 425 400

VI.2.3 Test d’hémolyse A chaque tube, nous ajoutons 25 µl de la solution d’hématies à 10 %. Nous agitons ensuite chaque tube pendant quelques secondes à l’aide d’un Vortex® puis nous les incubons pendant 1 h à 37°C (Etuve Thermosi SR 3000). Pendant cette incubation les tubes sont agités toutes les 20 minutes. Après incubation les tubes sont centrifugés (Centrifugeuse ProLabo X230) à 3000 rpm pendant 5 minutes. Nous récupérons 200 µl de surnagent obtenus que nous transférons dans une plaque 96 puits pour effectuer la lecture des absorbances à 540 nm à l’aide d’un lecteur de plaque FLUOSTAR Omega (BMG LabTech).

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VI.3 Tests anti-élastase VI.3.1 Préparation des solutions VI.3.1.1 Solution tampon Une solution Tris-HCl à 1 mM à pH 8,0 a été préparée en dissolvant 121,14 g de Tris base (Merk) dans 800 ml d’eau permutée. Le pH est ajusté avec du HCl (37,2%) à 8,0 et le volume est ensuite complété à 1 l. VI.3.1.2 Solutions des échantillons et du témoin positif Pour chaque échantillon à tester et pour l’acide ursolique (témoin positif) une solution mère à 1 mg/ml dans du tampon Tris-HCl a été réalisée. Ensuite une dilution au 1/200ème est effectuée pour obtenir une solution à 50 µg/ml qui est à son tour diluée au 1/2 pour donner une solution à 25 µg/ml à partir de laquelle une dilution au 2/5ème est réalisée pour obtenir une solution à 10 µg/ml. Enfin cette dernière solution est aussi diluée au 1/2 pour donner une solution à 5 µg/ml. Nous avons donc pour chaque échantillon et pour le témoin positif quatre concentrations : 50 ; 25 ; 10 et 5 µg/ml. VI.3.1.3 Solution du substrat Le SANA (N-Succ-(Ala)3-3p-nitroanilide) de chez Sigma-Aldrich est préparé dans du tampon Tris-HCl à une concentration de 1,015 mM (0,6246 g/l). VI.3.1.4 Solution d’enzyme Nous avons préparé une solution d’élastase à 0,05 U/ml à partir d’une élastase pancréatique porcine de chez Sigma-Aldrich qui est à 32 U/mg.

VI.3.2 Test anti-élastase Les tests sont réalisés dans une microplaque (96 puits) où chaque puit contient 200 µl de la solution du substrat SANA à laquelle on ajoute 20 µl de chaque échantillon et de l’acide ursolique, chaque concentration étant réalisée en triplicate. Un blanc est réalisé avec du tampon Tris-HCl à pH 8,0. La plaque est placée à 37°C pendant 10 minutes ensuite 10 µl de la solution d’enzyme sont ajoutés à chaque puit suivi d’une agitation et d’une autre incubation à 37°C pendant 10 min. Après incubation, la lecture des absorbances est effectuée à 410 nm. Ces opérations d’incubations, d’ajout de l’enzyme (10 µl) et d’agitation sont réalisées automatiquement par le lecteur de plaque FLUOSTAR Omega (BMG LabTech) qui permet de choisir une température d’incubation et qui est équipé d’un injecteur automatique.

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Annexes

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Annexe 1: Substances naturelles issues de plantes latino-américaines avec des activités leishmanicides [Acebey & al, 2008]

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Annexe 2: Article A new 5-alkylresorcinol glucoside derivative from Cybianthus magnus

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Annexe 3: Protocole générale Bioautographie-CAMAG

Optimized and validated HPTLC screening method with plant extracts

A. Tyrosinase activity 1. Phosphate buffer (PB) 0.02M, pH=6.8

 Solution A: Give 0.34836 g K2HPO4 in a 100 mL volumetric flask, complete with ionized water

 Solution B: Give 0.27598 g NaH2PO4·H2O in a 100 mL volumetric flask, complete with ionized water Mix 4 parts of solution A with 6 parts of solution B to reach a pH of 6.8. Adjust pH if necessary by adding a few drops of solution A or B.

2. Enzyme solution  Stock solution: prepare a stock solution with an activity of 12’000 U/mL by dissolving the needed amount of mushroom tyrosinase in PB. Ten aliquots of 100 µL are made and kept at -20°C. Before use an aliquot is filled up to 3 ml PB to reach an activity of 400 U/mL.

(Example: 3.83 mg of tyrosinase (activity: 3130 U/mg) are dissolved in 1 ml of phosphate buffer 0.02 M, pH 6.8)

3. Substrate solution  L-DOPA 12 mmol/L: dissolve 0.0473 g of L-DOPA in 20 mL PB containing 1% Triton X 100 and sonicate for ca. 40 min. Store at 4°C protected from light for later use during three days maximum. Before use, ensure that auto-oxidation is not too developed; a light red-brownish solution is still working.

B. Acetylcholinesterase activity

1. TrisHCl-buffer 0.05 M pH 7.9 (08.07.2015) 605.7 mg TrisHCl in 100 ml Water [adjusted with 2 M NaOH (8g in 100ml water)] with bovine serum albumin (75 mg)

2. Enzyme solution (08.07.2015) 500 U Acetylcholinesterase in 75 ml 0.05 M TrisHCl-buffer

3. Substrate solution (09.07.2015) a) 1-Naphythl acetate 125 mg in 50 ml of ethanol b) Fast Blue B Salt 400 mg in 160 ml of demin. water Reagent preparation: a) (10mL) and b) (40mL) mixed it just before use

C. α/β–glucosidase activity

1. SAB) Sodium acetate buffer pH 7.5 (08.07.2015) 10.25 g of sodium acetate in 250 ml with addition of acetic acid 0.1 M to pH 7.5 [0.6005 g HAc in 100 ml of water]

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2. Enzyme solution (08.07.2015) 200 U of alpha/beta-D-glucosidase (≈ 33 mg) is dissolved in 20 ml sodium acetate buffer

3. Substrate solution (09.07.2015) a) 10 mg of 2-naphthyl-beta/alpha-glucopyranoside is dissolved in 5 ml of ethanol b) 50 mg of Fast Blue B Salt is dissolved in 20 ml of demin. Water => a) and b) are mixed at a ratio of 1:4

D. Standard solution For each standard prepare a solution of 1 mg/mL in MeOH.

E. Extracts solutions For each extract prepare a solution of 1 mg/mL in its extraction solvent, if the extract is not soluble sonicate the solution.

F. First application Apply on a Merck HPTLC Si 60 F254 20x10 cm glass plate standards and extracts using the Automatic TLC Sampler ATS 4 by CAMAG. Use standard settings and apply 15 tracks, use first and last track for standard application. Application volume: 2 µL for standards, 15 µL for EtOAc (or DCM)-extracts and 25 µL for MeOH- extracts. If non-consecutive extraction of the plants is performed then 15 µL of the MeOH-extracts are applied instead of 25 µL.

G. Development Plates are developed with an Automatic Development Chamber ADC 2 by CAMAG using standard settings. Depending on extraction solvent use one of the following systems: I) for polar extracts like methanol extracts: dichloromethane, methanol, water 70:30:4, II) for extracts with very polar compounds: ethylacetate, methanol, water, formic acid* 50:10:7:1, III) for lipophilic extracts like dichloromethane or ethylacetate extracts: toluene, ethylacetate, formic acid* 80:20:2

When formic acid* is used in the mobile phase neutralize plate with ammonia steam (ammonia solution 32%, 10 min glass chamber), afterwards dry plate for 10 min for mobile phase II and 20 min for mobile phase III using the hairdryer.

H. Derivatization method A For an HPTLC plate 20 x 10 cm first spray successively and homogeneously 2.5 mL substrate solution (containing 1% Triton X 100) and then 3 mL of enzyme solution (400 U/ml) onto the entire plate using the rubber pump. If plate gets too wet and liquid films appear, stop spraying and let it dry before further spraying. Incubate plate for 10 minutes at room temperature, in a closed recipient where the plate does not get dry (e.g. Bioluminizer), then dry plate using the molecular sieve (5 min). Document the results after spraying, incubation, and drying.

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I. Visualizer Documentation method A Using Visualizer by Camag, take pictures of plates after spraying, incubation and drying using the white lamp WT, (white transmission), WR (white remission), WRT and UV 366 nm.

Additional documentation and derivatization:

J. Scanner Documentation Scan a developed plate at different wavelengths of 200, 210, 230, 254, 287, 310, 350, 366, 380 and 400 nm. At 366 nm set the measurement mode as “Fluorescene”.

K. Derivatization method B Heat developed (but not enzymatic derivatized) plate for 3 minutes at 100°C, dip it in NP (natural product) reagent, take pictures, let it dry and subsequently dip plate in Anisaldehyde-reagent and put it on the plate heater at 100°C until plate background begins to turn slightly purple (around 3 minutes).

L. Visualizer Documentation method B Using Visualizer by Camag, take pictures after first dipping step at 366 nm, and after the second step with white light (WT, WR, WRT).

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Ce travail présente l’étude phytochimique de cinq plantes péruviennes, Myrsine latifolia, M. congesta et M. sessiliflora (Primulaceae ex Myrsinaceae), Poraqueiba sericea (Icacinaceae) et Dendrobangia boliviana (Cardiopteridaceae ex Icacinaceae).

L’étude des trois Myrsine nous a permis d’isoler onze composés déjà connus dans la littérature qui ont été testés pour leurs activités antileishmanienne (criblage sur Leishmania infantum promastigotes en luminescence) et cytotoxique (test in vitro sur des fibroblastes). Les résultats étaient négatifs pour les deux activités.

A partir des tiges de Poraqueiba sericea nous avons pu isoler onze composés dont six triterpènes et trois saponines monodesmosides décrits pour la première fois dans cette famille de plante et deux sécoiridoïdes. Différentes activités biologiques ont été évaluées pour ces molécules : activités leishmanicide, cytotoxique et anti- élastase. Seuls les derniers tests ont révélés des activités pour deux tripterpénoïdes et pour le secologanoside.

A partir de Dendrobangia boliviana quatorze saponines ont pu être isolées dont douze sont de nouveaux glycosides des acides serjanique ou phytolaccinique. L’analyse en LC-RMN a permis d’identifier cinq autres saponines de structures nouvelles. Ces composés ont été testés pour leurs activités biologiques et n’ont démontré aucune activité hémolytique et trois d’entre eux ont révélé une cytoxicité sur les fibroblastes. Les tests antileishmaniens n’ont révélé aucune activité. En bioautographie (HPTLC) ces saponines présentent un potentiel intéressant pour différentes activités biologiques (tyrosinase, α et β-glucosidases et acétylcholinestérase).

PHYTOCHEMICAL AND BIOLOGICAL STUDIES OF FIVE OF THE PERUVIAN FLORA SPECIES. ASSESSMENT OF THEIR CYTOTOXIC AND ANTILEISHMANIAL PROPERTIES

This work presents the phytochemical study of five Peruvian plants, Myrsine latifolia, M. congesta and M. sessiliflora (Primulaceae ex Myrsinaceae), Poraqueiba sericea (Icacinaceae) and Dendrobangia boliviana (Cardiopteridaceae ex Icacinaceae).

The study of the three Myrsine enabled us to isolate eleven compounds already known in the literature which were tested for their antileishmanial (screening of Leishmania promastigotes luminescence) and cytotoxic activities (in vitro test on fibroblasts). The results were negative for both activities.

From the stems of Poraqueiba sericea we were able to isolate eleven compounds including six triterpenes, three monodesmosides saponins described for the first time in this plant family and two secoiridoides. Various biological activities have been evaluated for these molecules: leishmanicidal, cytotoxic and anti-elastase activities. Only the last testing has suggested activities for two tripterpénoïdes and the secologanoside.

From Dendrobangia boliviana fourteen saponins have been isolated including twelve novel glycosides of the serjanique or phytolaccinique acids. The analysis by LC-NMR allowed us to identify five other saponins with new structures. These compounds were tested for their biological activities and showed no hemolytic activity and three of them showed a cytotoxicity on fibroblasts. The antileishmanial test showed no activity. In bioautography (HPTLC) these saponins showed an interesting potential for different biological activities (tyrosinase, α and β-glucosidase and acetylcholinesterase).

Discipline: Pharmacie – Phytochimie / Pharmacy-Phytochemistry

Mots clé: Substances Naturelles, Leishmaniose, Cytotoxicité, Saponines, Myrsines, activités biologiques,

Key words: Natural Substances, Leishmaniasis, Cytotoxicity, saponins, Myrsines, biological activities

Institut de Chimie Moléculaire de Reims CNRS UMR 7312 UFR des Sciences Exactes et Naturelles BP1039 51 687 REIMS Cedex 2 (France)