ISOLASI SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN PUTAT (PlanchoniavalidaBlume)

SKRIPSI

NUR ADAWIYAH KAFFAH HASIBUAN 140802009

PROGRAM STUDI S1 KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2018

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA ISOLASI SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN PUTAT (PlanchoniavalidaBlume)

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains

NUR ADAWIYAH KAFFAH HASIBUAN 140802009

PROGRAM STUDI S1 KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2018

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : Isolasi Senyawa Fenolik Dari Daun Tumbuhan Putat ( valida Blume) Kategori : Skripsi Nama Mahasiswa : Nur Adawiyah Kaffah Hasibuan Nomor Induk Mahasiswa : 140802009 Program Studi : Sarjana (S1) Kimia Fakultas : MIPA - Universitas Sumatera Utara

Disetujui di Medan, Oktober 2018

Ketua Program Studi Pembimbing

Dr. Cut Fatimah Zuhra, M.Si Dr. Sovia Lenny, M.Si NIP: 1974 0405 1999 032001 NIP. 1975 1018 2000 032001

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

PERNYATAAN ORISINALITAS

ISOLASI SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN PUTAT (Planchonia valida Blume)

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, Oktober 2018

Nur Adawiyah Kaffah Hasibuan 140802009

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA PENGHARGAAN

Bismillahirrahmannirrahim,

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunianya serta nikmat yang tak terhingga dan salawat kepada rasulullah Muhammad SAW yang menjadi panutan sehingga penulis dapat menyelesaikan perkuliahan, penelitian dan penulisan skripsi ini dengan judul Isolasi Senyawa Fenolik dari Daun Tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume) Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan yang sebesarnya kepada Ibu Dr. Cut Fatimah Zuhra, M.Si dan Ibu Dr. Sovia Lenny, S.Si, M.Si selaku Ketua dan Sekertaris Departemen Kimia FMIPA USU; Ibu Dr. Helmina Br. Sembiring, S.Si, M.Si dan Bapak Drs. Albert Pasaribu, M.Sc selaku Kepala dan Ketua Bidang Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam Hayati FMIPA USU dan kepada Bapak Prof. Dr Harlem Marpaung selaku dosen wali serta Seluruh Dosen Departemen Kimia FMIPA USU yang telah memberikan waktunya dan membimbing penulis dalam menyelesaikan studi selama perkuliahan dan penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih yang tulus juga penulis sampaikan yang sebesarnya kepada Dr. Sovia Lenny, S.Si, M.Si selaku dosen pembimbing serta Bapak Lamek Marpaung, M.Phil, Ph.D yang telah banyak membimbing, mengajari, menasehati, mengarahkan, memotivasi, memberi ilmu dan waktu bagi penulis selama melakukan penelitian dan penulisan skripsi. Secara khusus, penulis mengucakan terima kasih yang tulus dan tak terhingga kepada kedua orang tua tercinta, untuk Ayahanda Alm.Muhammad Yamin Hasibuan dan Ibunda Asnah Hutauruk Yang telah memberikan kasih sayang dan doa yang tak terhingga serta dukungan moral dan material bagi penulis selama ini serta Abangda Muhammad Ichsan Hasibuan dan seluruh keluarga tercinta yang senantiasa memberikan doa dan dukungan bagi penulis . Ucapan terima kasih yang tulus juga penulis sampaikan kepada sahabat- sahabat terbaik. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada rekan-rekan assisten Lab Kimia Organik Bahan Alam Hayati,dan Abang- kakak 2011-2013 beserta adik- adik stambuk 2015-2017serta teman-teman seperjuangan stambuk 2014. Terima kasih atas kenangan semasa perkuliahan serta doa, dukungan dan bantuannya kepada penulis selama ini. Semoga Allah SWT selalu memberikan rahmat dan karunianya kepada kita semua. Amiin Yaa Rabbal’Alamin.

Medan, September 2018

Nur Adawiyah Kaffah Hasibuan

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA ISOLASI SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN PUTAT (Planchonia valida Blume)

ABSTRAK

Telah dilakukan isolasi senyawa Fenolik dari 1700 g daun tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume). Tahapan Isolasi meliputi metode maserasi dengan metanol, partisi dan pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom dengan eluen kloroform : metanol (90: 10) v/v ; (80:20) v/v ; (70:30) v/v ; (60:40) v/v. Senyawa yang diperoleh berupa pasta berwarna kuning sebanyak 11 mg dengan harga Rf = 0,27. Identifikasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometer resonansi magnetik inti proton (1H-NMR). Dari data analisis dan interpretasi spektroskopi, diduga bahwa senyawa hasil isolasi yang diperoleh adalah senyawa fenolik yaitu asam galat.

Kata Kunci : Asam Galat, Fenolik, Putat, Planchonia valida Blume

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA ISOLATION OF PHENOLIC COMPOUNDS FROM PUTAT LEAVES (Planchonia valida Blume)

ABSTRACT

Isolation of phenolic compounds 1700 g leaves of Putat (Planchonia valida Blume) has been done.Isolation stages included maceration with methanol, partition and separation using column chromatography with eluent chloroform : methanol (90: 10) v/v ; (80:20) v/v ; (70:30) v/v ; (60:40) v/v. The compound was yielding yellow paste with weight 11 mg with Rf = 0,27.Identification of isolated compounds was carried out using Ultraviolet Visible Spectrophotometer, Fourier Transform Infra Red ( FT-IR) Spectrophotometer and Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H- NMR) Spectrophotometer was estimated that isolated compound as Phenolic Gallic acid.

Keyword : Gallic acid, Phenolic, Putat, Planchonia valida Blume

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA DAFTAR ISI

Halaman

PENGESAHAN SKRIPSI i PERNYATAAN ORISINALITAS ii PENGHARGAAN iii ABSTRAK iv ABSTRACT v DAFTAR ISI vi DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR ix DAFTAR LAMPIRAN x

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1 1.2 Permasalahan 2 1.3 Tujuan Penelitian 2 1.4 Manfaat Penelitian 3 1.5 Metodologi Penelitian 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tumbuhan Putat 4 2.1.1 Morfologi Tumbuhan Putat 5 2.2 Senyawa Bahan Alam 5 2.3 Senyawa Metabolit Sekunder 6 2.3.1 Penggolongan Berdasarkan Biogenesis 7 2.4 Senyawa Fenolik 8 2.4.1 Biosintesis Senyawa Fenolik 9 2.4.2 Asam Fenolat 10 2.4.2.1 Asam Galat 10 2.4.2.2 Asam Salisilat 11 2.4.3 Asetofenon dan Asam Fenilasetat 11 2.4.4 Fenilpropanoid 11 2.4.5 Flavonoid 12 2.4.6 Xanton 12 2.5 Metode Pemisahan 13 2.5.1 Ekstraksi 13 2.5.2 Partisi 14 2.5.3 Kromatografi 14 2.5.3.1 Kromatografi Lapis Tipis 15 2.5.3.2 Kromatografi Kolom 16 2.5.3.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 17 2.5.3.4 Adsorben 17 2.6 Teknik Spektroskopi 19

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2.6.1 Spektroskopi Ultra Violet (UV-Vis) 20 2.6.2 Spektroskopi Infra Merah (FT-IR) 21 2.6.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) 22

BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat 24 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat 24 3.2.2 Bahan 25 3.3 Penyediaan Sampel 25 3.4 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Putat 26 3.5 Ekstraksi Daun Tumbuhan Putat 26 3.6 Analisis Kromatografi Lapis Tipis 27 3.7 Isolasi Senyawa Fenolik dengan Kromatografi Kolom 27 3.8 Pemurnian 28 3.9 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis 28 3.10 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 29 3.10.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UltravioletVisible (UV-Vis) 29 3.10.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) 29 3.10.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) 29 3.11 Bagan Penelitian 30 3.11.1 Bagan Uji Ekstrak Metanol 30 3.11.2 Bagan Uji Ekstrak Etil Asetat 31 3.11.3 Bagan Isolasi 32

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian 34 4.2 Pembahasan 37

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan 5.2 Saran 39

DAFTAR PUSTAKA 40 LAMPIRAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman Tabel

2.1 Kelas-Kelas Utama Senyawa Fenolik Pada Tanaman 8 4.1 Panjang Gelombang UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi 35 4.2 Hasil Analisis Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi 36

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman Gambar

2.1 Tumbuhan Putat ( Planchonia valida Blume) 4 2.2 Biosintesis Fenolik dari jalur sikimat dan fenilalanin 9 4.1 Spektrum Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Senyawa Hasil Isolasi 34 4.2 Spektrum Infra Merah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi 35 4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 36 4.4 Struktur Asam Galat 38

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman Lampiran 1. Gambar Proses Pengerjaan Dalam Penelitian 44 2. Hasil Determinasi Tumbuhan Putat ( Planchonia valida Blume) 46 3. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Pekat Metanol Daun Tumbuhan Putat ( Planchonia valida Blume) sebelum Kromatografi Kolom 47 4. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Daun Tumbuhan Putat ( Planchonia valida Blume) penggabungan fraksi 48 5. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Daun Tumbuhan Putat ( Planchonia valida Blume) fraksi III Sebelum KLT preparatif 49 6. Kromatogram Lapisan Tipis senyawa hasil Isolasi setelah KLT Preparatif 50 7. Spektrum UV-Visible senyawa asam galat 51 8. Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 52 9. Ekspansi spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi pada δ= 7-8 ppm 53 10. Spektrum 1H-NMR Senyawa Pembanding 54

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Penggunaan tumbuhan baik sebagai obat, bahan makanan, bumbu, kosmetik telah dikenal sejak zaman kuno seperti yang ditemukan dalam berbagai catatan bangsa Cina, Mesir, Mesopotamia, Yunani dan Roma. Perhatian terhadap penelitian tumbuhan sangat luas, baik dalam bidang maupun kedalaman penelitian. Hampir separuh dari obat yang digunakan sekarang adalah bahan alam (Widyowidagdo, 2008). Metabolit sekunder merupakan senyawa yang disintesis dari tumbuhan.Keanekaragaman struktur kimia metabolit sekunder yang tinggi mengidentifikasikan potensi efek farmakologinya. Contoh dari metabolit sekunder antara lain terpenoid, steroid, alkaloid dan fenolik (Saifudin, 2014). Senyawa fenolik telah ditemukan dalam sejumlah kingdom tumbuhan tetapi jenis senyawa yang ada bervariasi.Pada tumbuhan berpembuluh sejumlah besar fenolik ditemukan. Semua tumbuhan pakis, gymnospermae dan angiospermae mempunyai lignin dalam dinding sel. Asam-asam hidrobenzoat, asam hidrosinamat dan flavonoid ada secara universal tetapi beberapa jenis fenolik terdistribusi secara terpisah (Harbone, 1989). Senyawa Fenolik merupakan salah satu kategori terbesar dari fitokimia. Tumbuhan yang digunakan sebagai makanan kaya akan senyawa fenolik. Beberapa senyawa fenolik berperan sebagai antioksiosidan. Hal ini dikarenakan memiliki properti penangkap radikal yang menghasilkan aktifitas antioksidan yang berperan sebagai agen pereduksi dan antioksidan pendonor atom hidrogen (Yuslianti, 2018). Asam galat merupakan jenis senyawa fenolik yang dapat diisolasi dari tumbuhan yang mana memiliki efek anti inflamasi dan anti kanker. Asam galat menunjukkan selektif toksik terhadap sel-sel kanker secara apoptosis pada sel MiaPaCa-2 melalui mitokondria dan berpotensi untuk terapi kanker pankreas (Liu, et al., 2012) Tumbuhan putat (Planchonia valida Blume) merupakan tumbuhan yang termasuk dalam keluarga .Lecythidaceae merupakan pepohonan,

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA memiliki daun sederhana, bunga epigynous, memiliki 4-6 helai kelopak dan mahkota bunga, dan merupakan tanaman tropis dan memiliki sekitar 20 genus (Benson, 1979).Genus Planchonia memiliki 10 spesies dan tersebar dari Asia Tenggara ke Pasifik barat termasuk Australia.Spesies utama adalah P. valida Blume yang terdapat di Malaysia, Sumatera, Borneo, Jawa dan Sulawesi (Ogata, 2008). Tumbuhan putat tumbuh subur dikawasan pantai dan dataran rendah. Bunganya berwarna putih dengan tangkainya yang panjang dan apabila menjadi buah akan terurai ke bawah seperti kacang. Daun putat yang muda berasa kelat tetapi lemak. Tumbuhan ini berkhasiat merawat gatal-gatal pada kulit dan mengobati cacar air (Dasuki, 2011). Crublet et al., (2003) telah melakukan penelitian terhadap tumbuhan bergenus Planchonia yaitu Planchonia grandis. Identifikasi daun tumbuhan Planchonia grandis menunjukkan ada nya senyawa flavonoida yaitu golongan flavonol glikosida. McRae et al., (2007) telah melakukan penelitian terhadap senyawa antibakteri dari Planchonia careya. Terdapat 6 senyawa yang telah diisolasi dan diidentifikasi yaitu 1.(+)-Galokatekin 2.Galokatekin-(4α→8)-galokatekin 3.Asam α-dimorfenolik 4.Asam Hiptatic 5.Asam 3β-O-trans-p coumaroyltormentic 6.Asam 3β-O-cis-p coumaroyltormentic, dimana senyawa–senyawa ini dapat digunakan sebagai penyembuh luka. Pada tahun 2008, McRae et al., kembali melakukan penelitian terhadap tumbuhan Planchonia careya.Penelitian pada ekstrak daun dari Planchonia careya yang menunjukkan dua flavonol glikosida yaitu isoqercitrin dan kaemferol 3-O- gentobiosida. Sejauh ini penelitian terhadap kandungan senyawa fenolik dari daun tumbuhan Putat belum ada literatur, Oleh karena itu peneliti tertarik meneliti dan mengisolasi kandungan senyawa fenolik dari daun tumbuhan Putat.Dari uji pendahuluan yang peneliti lakukan yaitu dengan uji skrining fitokimia dengan pereaksi FeCl3 5% menunjukkan bahwa ektrak metanol dan etil asetat daun ini positif mengandung senyawa fenolik.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 1.2. Permasalahan Permasalahan dalam penelitian ini adalah untuk menentukan senyawa fenolik yang terdapat dalam daun tumbuhan Putat

1.3. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengetahui senyawa fenolik dari daun tumbuhan Putat

1.4. Manfaat penelitian Dari hasil penelitian diharapkan dapat memberikan sumber informasi ilmiah pada bidang Kimia Bahan Alam Hayati khususnya tentang senyawa fenolik yang terkandung dalam tumbuhan Putat

1.5. Metodologi Penelitian Dalam penelitian ini, isolasi senyawa fenolik dilakukan terhadap daun tumbuhan putat berupa serbuk kering halus sebanyak 1700 gram.Tahap awal dilakukan uji skrinning fitokimia untuk senyawa fenolik yaitu dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%. Tahap isolasi yang dilakukan adalah ekstraksi maserasi dengan menggunakan pelarut metanol, kemudian ekstrak pekat metanol dilarutkan dengan aquadest.Kemudian tahap pemisahan tanin dilakukan dengan ekstraksi partisi dengan etil asetat.Ekstrak bebas tanin dilarutkan dengan pelarut metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan pelarut n-Heksan.Kemudian dianalisa dengan kromatografi lapis tipis dan pemisahan dilakukan dengan kromatografi kolom sehingga dihasilkan fraksi-fraksi fenolik.Fraksi-fraksi fenolik yang dihasilkan kembali dianalisa dengan kromatografi lapis tipis, kemudian dimurnikan dengan kromatografi lapis tipis preparatif sehingga dihasilkan senyawa fenolik yang murni, yang kemudian dianalisa dengan kromatografi lapis tipis.Identifikasi struktur senyawa murni hasil isolasi dilakukan dengan Spektrofotometer UV-VIS, Spektrofotometer FT-IR, dan Spektrofotometer 1H-NMR.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume) 2.1.1 Morfologi Tumbuhan Putat Planchonia valida Blume, nama umumnya adalah putat, penyebaran alami terdapat di Malaysia, Sumatera, Kalimanta, Jawa dan Sulawesi. Spesies ini banyak ditemukan didaerah lembab,disepanjang tepi sungai atau didataran rendah alluvial. P. valida Blume mempunyai tinggi yang dapat mencapai 50 m dan diameter 150 cm. Warna batang bervariasi dari cokelat abu-abu ke cokelat tua.Bagian dalam kayu berwarna merah muda hingga orange kemerahan.

Gambar 2.1 Tumbuhan Putat (Planchonia Valida Blume)

Bunganya berkelompok, mempunyai 4 helai kelopak dan 4 helai mahkota bunga, dan mekar dimalam hari.Periode berbunga pada bulan Februari-Maret dan berbuah pada bulan April-mei.Buah nya berbentuk lonjong, keras dan berserat.Biji yang mengandung hingga 10 biji dan biji nya berbentuk bulat. Kayu dari tumbuhan ini keras dan berat, dan biasanya digunakan untuk konstruksi rumah, lantai dan dapat juga sebagai kayu bakar (Hardiyanto, 2008).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Sistematika Tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume) Kingdom : Plantae Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae Ordo : Famili : Lecythidaceae Genus : Planchonia Spesies : Planchonia valida Blume. Nama lokal : Daun Putat (Herbarium Medanense Biologi – USU)

2.2 Senyawa Bahan Alam Pada hakikatnya kimia bahan alam merupakan pengetahuan yang dikenal sejak peradaban manusia tumbuh.Contoh yang dapat segera diketahui adalah pembuatan bahan makanan, pewarnaan benda, obat-obatan atau stimulan dan sebagainya (Sastrohamidjojo, 1995). Bahan alam didefenisikan sebagai senyawa organik dengan bobot molekul antara 100 hingga 2000.Bahan alam telah menjadi dasar pengobatan, dan bahkan sekarang banyak senyawa yang penting bagi farmasi dan kedokteran diperoleh dari sumber alam. Keuntungan senyawa yang berasal dari alam adalah zat-zat ini ramah lingkungan dan dapat diproduksi sebagai sumber yang dapat diperbaharui dengan cara menanam tumbuhan atau memfermentasikan mikoorganisme senyawa alam (Heinrich, 2010). Senyawa alam ada yang digunakan sebagai zat essensial untuk hidup dan zat yang mendukung kehidupan.Zat essensial untuk hidup digunakan untuk dasar-dasar kehidupan. Sedangkan zat pendukung kehidupan digunakan sebagai zat pertahanan dari gangguan makhluk lain, menarik makhluk lain dan untuk mendominasi suatu kawasan dan menentralkan racun. Senyawa alam secara umum adalah molekul kimia berupa mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder.Bahan alam dibedakan menjadi dua berdasarkan fungsinya terhadap makhluk hidup yakni metabolit primer dan metabolit sekunder (Saifudin, 2014).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2.3 Senyawa Metabolit Sekunder Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh tumbuhan, mikroba atau hewan melewati proses biosintesis yang digunakan untuk menunjang kehidupan namun tidak vital sebagaimana asam amino dan asam lemak. Metabolit ini memiliki aktifitas farmakologi dan biologi.Sifat-sifat kimiawi metabolit sekunder umumnya memiliki berat molekul yang kecil, umumnya tidak larut dalam air karena bersifat semi polar, dan sturuktur kimianya yang sangat beragam (Saifudin, 2014). Pengelompokan senyawa kimia tanaman berdasarkan sifat khas yang dimilikinya (antara lain warna, rasa, bau, Ph, kelarutan), merupakan hal penting sehingga sampai sekarang masih banyak dipakai. Berikut ini contoh pengelompokan senyawa kimia yaitu : Minyak Atsiri. Baunya khas dan dapat dipisahkan dari senyawa kimia tanaman lainnya, karena sukar larut dalam air dan dapat menguap bersama uap air. Alkaloid. Senyawa yang bersifat basa dapat dipisahkan dari netral dan asam, dengan cara ekstraksi cair-cair antara fase air dan pelarut organik. Pada umumnya dimiliki oleh senyawa kimia yang mengandung atom N. Zat Pahit. Berpedoman pada rasa pahit adalah suatu metode yang mudah untuk memisahkan senyawa kimia tanaman, perlu waktu yang cukup hingga seluruh rasa pahit dalam sari menjadi zat yang dapat dikristalkan. Zat Warna. Jumlah zat warna pada tanaman diperkirakan ±2000 jenis. Pigmen tanaman mempunyai struktur kimia yang berlainan, begitu juga sifat fisika, kelarutan, warna , fluoresensi dan sebagainya. Tannin.Tannin ditandai oleh sifatnya yang dapat menciutkan dan mengendapkan protein dari larutan dengan membentuk senyawa yang tidak larut. Glikosida.Sari tanaman pada umunya mengandung senyawa bersifat alkohol atau fenol yang cukup larut sampai larut baik dalam air; tetapi gugus hidroksi dari alcohol atau fenol tidak bebas, kebanyakan terikat pada satu atau lebih gula.Dan sifat kimia suatu senyawa yang baru diisolasi sering tidak dikenal lagi, setelah dihidrolisis menjadi bagian gula dan bagian bukan gula.Karena itu senyawa ini dimasukkan kedalam golongan “glikosida”. Resin. Resin adalah hasil ekskresi tanaman, yang secara kimia merupakan campuran asam organik, ester, dan alkohol yang sukar dikristalkan. Sifatnya tidak larut dalam

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA air, kelarutannya yang baik dalam pelarut organik, dan meleleh pada suhu yang relatif rendah.(Sirait, 2000).

2.3.1 Penggolongan berdasarkan Biogenesis Saat ini telah dikenal sekitar 8000 senyawa kimia tanaman.Hasil perbandingan struktur kimia senyawa alam memberikan dugaan bahwa beberapa elemen dasar tertentu yang berpartisipasi pada pembentukan rumus dasar senyawa kimia tanaman, yang berbeda hanya dalam susunannya. Empat elemen dasar yang terpenting adalah Inti-C2 (elemen asetat), Inti-C5 ( elemen isoprene), Inti-Cg (elemen fenilpropana) dan asam amino. Senyawa kimia tanaman hanya dapat terjadi melalui polimerisasi elemen identik atau elemen campuran. Nama biosintesis digunakan karena penggolongannya berdasarkan kemiripan struktur pembentukannya yang berkaitan dengan proses biosintesis dalam tanaman hidup. Sistem penggolongan biogenesis senywa kimia tidak hanya membandingkan strukturnya, tetapi juga harus memperhatikan proses biosintesis, biokimia dinamis, dan fisiologi metabolisme tanaman. Penggolongan biogenesis metabolit sekunder bermolekul kecil yaitu : 1. Poliasetat(asetogenin) 2. Isoprenoida 3. Fenilpropana 4. Senyawa kimia tanaman yang mengandung N (alkaloid, amin, dan glikosida sianogen) 5. Senyawa dengan prinsip bentuk campuran a. Tanpa N dalam molekul (missalnya flavonoid) b. Dengan N dalam molekul (misalnya alkaloid)(Sirait, 2000).

2.4 Senyawa Fenolik Senyawa fenolik dapat didefenisikan sebagai suatu senyawa yang memiliki cincin aromatik yang memiliki substituen hidroksil, termasuk turunan fungsional (ester, metil ester, glikosida dan sebagainya).Fenol merupakan bahan alam tetapi kebanyakan fenolik mempunyai satu atau lebih gugus hidroksil.Sejumlah golongan polifenol seperti tanin, mempunyai beberapa katekol dan floroglusinol dalam

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA strukturnya.Senyawa fenolik umunya ditemukan pada tumbuhan dan tidak umum ditemukan pada bakteri, jamur dan alga.

Tabel 2.1 Kelas-kelas utama senyawa fenolik pada tanaman Jumlah Kerangka Jenis Contoh Atom Dasar Karbon 6 C6 Fenol Katekol , hydroquinon sederhana 2,6-dimetoksi benzoqinon Benzoquinon 7 C6-C1 Asam fenolat p-Hidroksibenzoat , salisilat

8 C6-C2 Asetofenon 3-Asetil-6-metoksibenzaldehid Asam p-Hidroksil fenil asetat fenilasetat 9 C6-C3 Asam Caffeic, Ferulat hidrosinamat Myristin, eugenol Fenilpropanoid Umbelliferon, Askuletin Kumarin Bergenin Isokumarin Eugenin Kromon 10 C6-C4 Naptoquinon Juglone, Plumbagin

13 C6-C1-C6 Xanton Mangiferin

14 C6-C2-C6 Stilbena Asam lunularat Antraquinon Emodin 15 C6-C3-C6 Flavonoid Quercetin, Sianidin Isoflavonoid Genistein 18 (C6-C3)2 Lignan Pinoresinol Neolignan Eusiderin 30 (C6-C3- Biflavonoid Amentoflavon C6)2

n (C6-C3)n Lignin _ (C6)6 Katekol _ (C6-C3- melanin C6)n Flavolan

(Harbone, 1989).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Senyawa fenolik dalam beberapa hal hampir sama dengan struktur alkohol alifatik dimana gugus hidroksil berikatan dengan atom karbon. Gugus hidroksil pada senyawa fenolik dipengaruhi oleh cincin aromatis.Karena adanya cincin aromatis, atom hidrogen dari hidroksil fenolik adalah labil, yang mana ini menjadikan fenolik sebagai asam lemah.Senyawa fenolik umumnya ditemukan sebagai ester atau glikosida daripada senyawa bebas (Vermerris and Nicholson, 2007). Banyaknya variasi gugus yang mungkin tersubstitusi pada kerangka utama fenolik menyebabkan fenolik banyak sekali anggota.Terdapat lebih dari 8000 jenis senyawa yang termasuk dalam golongan senyawa fenolik.Anggota senyawa fenolik mulai dari yang paling sederhana dengan berat molekul yang kecil hingga senyawa yang kompleks dengan berat molekul lebih dari 30.000 Da (Andarwulan, 2012).

2.4.1 Biosintesis Senyawa Fenolik Secara alami fenol tumbuhan secara biogenesis melalui dua jalur utama yaitu jalur sikimat yang secara langsung menghasilkan fenilpropanoid seperti hidrosinamat dan kumarin dan jalur poliketida yang mana menghasilkan senyawa fenol sederhana dan quinon. Jalur biosintesis fenolik dari sikimat dan fenilalanin ditunjukkan pada gambar 2.2 berikut :

Gambar 2.2 Biosintesis fenolik dari sikimat dan fenillalanin (Harbone, 1989).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2.4.2 Asam Fenolat Senyawa fenolik dari golongan fenolat adalah fenol yang tersubstitusi oleh gugus karboksil, contoh asam fenolat adalah asam galat.Asam galat merupakan trifenol yang biasa terdapat di daun teh dalam bentuk teresterifikasi bersama dengan katekin.Selain gugus karboksil, gugus lainnya seperti aldehid juga dapat tersubstitusi digugus fenol. Contoh senyawa jenis ini adalah vanillin.Vanillin berasal dari kacang vanilla dan merupakan flavor paling terkenal di dunia (Andarwulan, 2012). Hidrolisis jaringan tumbuhan dalam suasaa asam membebaskan sejumlah asam fenolat yang larut dalam eter. Senyawa asam fenolat ada hubungannya dengan lignin yang terikat pada ester atau terdapat pada daun didalam fraksi yang tak larut dalam etanol maupun dapat larut dalam etanol sebagi gilosida sederhana. Asam p- hidroksi benzoat, asam protokatekuat, dan asam siringat terdapat umum pada tumbuhan angiospermae (Harbone, 1987).

2.4.2.1 Asam Galat Asam galat terdapat dalam tumbuhan berkayu, asam galat merupakan senyawa yang reaktif.Senyawa ini lebih lazim terdapat dalam tumbuhan yang sudah dihidrolisis dalam suasana asam (Harbone, 1987).Asam galat terdapat dalam beberapa tanaman dalam bentuk molekul bebas atau sebagai bagian dari molekul galotanin. Asam galat mempunyai gugus hidroksil dan gugus karboksilat dalam molekul yang sama dan dua molekul nya dapat bereaksi dengan yang lainnya membentuk ester (Tricone, 2013). Asam galat potensial digunakan sebagai efek anti kanker dan juga dapat digunakan sebagai bahan terapi untuk kulit yang terkena kanker. (Kamatham et al, 2014). Asam galat merupakan sebuah fenol tumbuhan alami dengan aktivitas antioksidant, yang ditemukan dapat menstimulasi sel mati secara apoptosis pada sel HL-60 RG promielositik leukemia (Inoue et al., 1994). Asam galat dapat berguna dalam proses pewarnaan, tinta kering, yang baik dalam industri kertas. Asam galat merupakan senyawa yang memiliki beberapa fungsi dalam fitokimia.Dalam pengerjaan spektroskopi resonansi paramagnetik elektron (EPR) yang digunakan untuk mendeteksi radikal bebas yang dihasilkan oleh udara-oksidasi oleh asam galat (Eslami et al., 2010).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2.4.2.2 Asam Salisilat Asam salisilat dikenal juga dengan asam 2-hidroksibenzoat memiliki struktur kimia C7H6O3. Asam salisilat berupa bubuk kristal putih dengan rasa manis, tidak berbau dan stabil pada udara bebas. Bubuk asam salisilat sulit larut dalam air dan mudah larut dalam lemak.Sifat lipofilik asam salisilat membuat efek klinis terbatas pada lapisan epidermis. Asam salisilat merupakan bahan keratolitik tertua.Selain memiliki efek keratolitik asam salisilat juga memiliki efek keratoplastik, anti-pruritus, anti- inflamasi, analgetik, bakteriostatik, fungistatik dan tabir surya.Asam salisilat telah teruji dalam berbagai terapi penyakit kulit, dan kerusakan akibat sinar matahari. (Sulistyaningrum dkk, 2012)

2.4.3 Asetofenon dan Asam Fenilasetat Asetofenon dan asam fenil asetat adalah golongan senyawa fenolik yang jarang ditemukan dialam.Asetofenon dikenali dengan adanya gugus aseton yang tersubsitusi difenol.Asam fenilasetat juga memiliki gugus karboksil, namun berbeda dengan asam fenolat, gugus karboksil pada asam fenilasetat tidak berikatan langsung dengan cincin benzene.Contoh senyawa dari golongan asam asetofenon adalah 2- hidroksiasetofenon dan contoh senyawa dari asam fenilasetat adalah asam 2- hidroksifenil asetat (Vermerris and Nicholson, 2007). Beberapa senyawa dari golongan asetofenon seperti aposinin dan bentuk glikosidanya memiliki kemampuan sebagai antiasmatik. Kedua senyawa tersebut dapat ditemukan pada tanaman Pichorhiza Kurroa (Andarwulan, 2012).

2.4.4 Fenil Propanoid Fenilpropanoid adalah senyawa fenol alam yang mempunyai cincin aromatik dengan rantai samping terdiri atas tiga atom karbon.Secara biosintesis senyawa ini turunan asam amino protein aromatik yaitu fenilalanin.Yang paling tersebar luas adalah asam hidroksisinamat, suatu senyawa yang penting yang berkaitan dengan pengaturan tumbuh dan pertahanan terhadap penyakit.Yang termasuk kedalam fenilpropanoid, antara lain, hidroksikumarin, fenilpropena, dan lignin.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Empat macam asam hidroksisinamat terdapat umum dalam tumbuhan.Keempat asam itu ialah asam ferulat, asam sinapat, asam kafeat dan asam p-kumarat. Asam hidroksisinamat biasanya terdapat sebagai ester dan dapat diperoleh dengan cara hidrolisis basa lemah karena dengan hidrolisis asam bahan akan hilang akibat dekarboksilasi menjadi hidroksistirena (Harbone, 1987) .

2.4.5 Flavonoid Flavonoida merupakan golongan terbesar.Semua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon yang terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan Primula, dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama (Harbone, 1987). Senyawa flavonoida juga berperan dalam memberikan banyak warna lain di alam, terutama daun mahkota kuning dan jingga, bahkan flavonoida yang tidak berwarna menyerap cahaya pada spektrum UV (karena banyak gugus kromofor ) dan dapat dilihat oleh banyak serangga (Heinrich, 2005). Flavonoid adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon.(Manitto, 1981).Flavonoid memainkan peranan penting dalam kaitan penyerbukan oleh serangga.Sejumlah Flavonoid memiliki rasa pahit hingga dapat menolak sejenis ulat tertentu (Sastrohamidjojo, 1996).

2.4.6 Xanton Xanton merupakan pigmen berwarna kuning yang biasanya terdapat di bunga-bungaan.Xanton ditemukan ditanaman Garcinia dulcis diketahui memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan Plasmodium falciparum (Li, 2008). Hampir semua xanton yang diketahui terdapat terbatas pada empat suku : Guttiferae, Gentianaceae, Moraceae dan Polygalaceae. Tetapi satu jenis xanton yaitu mangiferin yang ter-C-glikosilasi sangat tersebar luas, Terdapat baik dalam paku-pakuan maupun dalam tumbuhan tinggi. Xanton dapat dideteksi dengan memakai sinar UV yang menghasilkan warna dengan atau tanpa ammonia atau dengan pereaksi fenol umumnya.Mangiferin

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA berbeda dengan semua xanton karena larut dalam air dan dapat dipisahkan dengan baik menggunakan kromatografi kertas (Harbone, 1987).

2.5 Teknik Pemisahan Pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dalah hal yang penting dalam semua bidang kimia dan tidak kalah pentingnya dalam banyak bidang lain dimana teknik-teknik kimia digunakan untuk memecahkan berbagai macam masalah. Dampak dari suatu teknik pemisahan yang serbaguna dirasakan oleh seluruh ilmu pengetahuan modern (Underwood, 1998). Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak bercampur dengan komponen- komponen lainnya ada 2 jenis teknik pemisahan : 1. Pemisahan kimia dalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat kimia komponen dalam campuran yang akan dipisahkan. 2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam satu golongan (Muldja,1995).

2.5.1 Ekstraksi Metode ektraksi paling sederhana dan menjadi pilhan adalah maserasi yakni merendam material didalam pelarut.Maserasi adalah metode ekstraksi pilihan pada tahap pendahuluan ataupun ekstraksi perbanyakan, selain karena sederhana juga tidak banyak gangguan fisis. Adapun metode dasar yang lain seperti perkolasi, sokletasi, gas superkritikal dan lain-lain digunakan menyari bahan yang targetnya sudah jelas. Tahapan ekstraksi melewati dua mekanisme yakni : a. Disolusi : Proses terendanmnya senyawa target oleh pelarut b. Difusi : Proses terbawanya senyawa-senyawa oleh pelarut keluar sel atau matriks alami. Agar pelarut bisa menjangkau tempat senyawa didalam sel atau ruang sel maka penyerbukan harus dilakukan. Serbuk yang terlalu halus menyebabkanlarutan keruh

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA dan mengganggu kedua proses itu. Pembatas proses difusi adalah gradien difusi yang mendekati ~1. Artinya kadar senyawa didalam pelarut dan didalam material alami sama (Saifudin, 2014). Ragam ekstraksi yang tepat bergantung pada tekstur dan kandungan bahan tumbuhan yang diekstraksi dan pada jenis senyawa yang diisolasi.Alkohol adalah pelarut serbaguna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan (Harbone, 1987).

2.5.2 Partisi Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tesebut; hal ini dapat dilakukan secara terus-menerus dengan menggunakan pelarut tak bercampur yang kepolarannya meningkat. Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap : 1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar dilapisan organik 2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi sedikit polar dilapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich ,2010). Metode pemisahan ini dapat dilakukan baik dalam tingkat mikro maupun makro.Pemisahannya tidak memerlukan alat khusus atau canggih, melainkan hanya menggunakan corong pisah.Seringkali untuk melakukan pemisahan hanya dilakukan dalam beberapa menit.Dalam industri metode ini banyak digunakan untuk menghilangkan zat-zat yang tidak diinginkan dalam hasil (Yazid, 2005).

2.5.3 Kromatografi Kromatografi merupakan suatu teknik analisis berdasarkan metode pemisahan yang memerlukan waktu relatif singkat dan tidak membutuhkan alat yang lebih rumit dibandingkan dengan metode pemisahan lainnya. Pada prinsipnya, teknik ini untuk memisahkan suatu senyawa dengan struktur yang sama atau berbeda sedikit, dengan cara adsorpsi secara selektif pada adsorban yang berbeda. Dikenal

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA dua fase pada kromatografi yaitu fase gerak yang membawa sampel dan fase diam yang menahan sampel (Bintang, 2010). Ada beberapa kelebihan metode kromatografi dibandingkan metode pemisahan lain. Beberapa keuntungan adalah bahwa metode ini dapat dilakukan untuk jumlah sampel yang konstituennya sangat kecil.Jika sampel yang dimiliki jumlahnya tidak banyak atau memang kelimpahannya dialam sangat kecil, maka metode ini jauh lebih efisien.Metode kromatografi disukai karena sifat selektif untuk senyawa organik multikomponen karena interaksi fase diam dan fase gerak secara simultan terhadap senyawa-senyawa organik yang dipisahkan dapat memberikan perbedaan distribusi dan berakhir pada pemisahan senyawa-senyawa yang secara struktural sangat mirip sekalipun (Wonorahardjo, 2013). Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya kromatografi dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi ekslusi ukuran; dan (f) kromatografi afinitas. Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis; (c) kromatografi cair kinerja tinggi; dan (d) kromatografi gas (Sudjadi, 2007).

2.5.3.1 Kromatografi Kolom Ada empat jenis kromatografi yang dapat dimasukkan dalam kromatografi kolom yaitu kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pertukaran ion, dan kromatografi filtrasi gel.Secara umum dapat digambarkan, bahwa kromatografi kolom dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi dengan fase diam yang berpori.Cairan dipakai sebagai fase gerak untuk mengelusi komponen sampel keluar melalui kolom (Adnan, 1997). Kromatografi kolom biasanya terbuat dari kaca. Panjang kolom biasanya disesuaikan dengan jumlah komponen yang akan dianalisis dalam suatu senyawa, sedangkan lebar kolom disesuaikan dengan jumlahh senyawa yang akan dianalisis. Bahan pengisi kolom cukup banyak jenisnya. Sebagai contoh adalah beberapa jenis gel yang dapat menyerap air; suatu matriks yang dapat aktif dengan pemanasan atau perlakuan dengan asam. Metode pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA perbedaan distribusi molekul-molekul komponen diantara fase gerak dan fase diam. Komponen akan bergerak lebih cepat meninggalkan kolom bila molekul-molekul tersebut berinteraksi secara lemah dengan fase diam. Daya interaksi komponen yang akan dipisahkan dengan fase diam sangat menentukan tingkat keberhasilan kromatografi (Bintang, 2010). Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan ekstrak kasar maupun halus.Untuk pemisahan kasar, fase diam umumnya terbuat dari serbuk silika yang dimasukkan ke dalam kolom dalam bentuk larutan dalam pelarut organik atau serbuk kering.Sedangkan pemisahan halus biasanya melibatkan fase diam non polar misal oktadesil silika atau polisakarida misal Sephadex (Saifudin, 2014).

2.5.3.2 Kromatografi Lapis Tipis Pemisahan senyawa dengan kromatografi lapis tipis dalam medium secara prinsip sama dengan kromatografi kertas, tetapi mempunyai beberapa keuntungan tambahan, misalnya lebih banyak campuran medium tambahan dan senyawa yang digunakan. Senyawa fluoresensi dapat digabungkan dalam medium untuk memudahkan identifikasi noda.Pemisahan dapat dilakukan dengan adsorpsi, pertukaran ion, kromatografi partisi, atau filtrasi gel pada medium yang digunakan.Metode ini sangat cepat dan dapat dilakukan kurang dari 1 hari.Noda yang dihasilkan sangat rapat, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi senyawa dalam konsentrasi rendah. Senyawa yang dipisahkan dapat dideteksi dengan semprotan korosif pada suhu tinggi, dimana hal ini tidak dapat dilakukan pada kromatografi kertas. Nilai Rf dipengaruhi oleh ketebalan lapisan dan hal yang harus diperhatikan adalah atmosfer ruang pemisahan harus jenuh dengan pelarut karena menentukan besar kecilnya nilai Rf (Bintang, 2010). Fase diam yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja kromatografi lapis tipis dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa. Fase gerak pada kromatografi lapis tipis dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba, sistem yang paling sederhana adalah campuran 2 pelarut

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga dapat terjadi secara optimal. (Sudjadi, 2007).

2.5.3.3Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah yang banyak lalu senyawa yang telah dipisahkan ini dianalisis lebih lanjut, misal dengan spektrofotometri atau dengan teknik kromatografi lain. Pada KLTP, sampel ditotolkan dalam plat dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non-destruktif. Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikeringkan dan dilakukan analisis lebih lanjut (Sudjadi, 2007). Tebal lapisan adsorben dibuat sekitar 1-1,5 mm. Makin tebal, pemisahannya makin sukar. Larutan adsorben dilapiskan, plat harus dikeringkan pada suhu kamar sebelum diaktifkan, untuk mencegah terjadinya retak-retak pada adsorben. Sampel diaplikasikan dengan cara menggariskannya melebar 5-8 mm pada garis dasar dengan tidak merusak lapisan adsorben. Sebelum dikembangkan, pelarut yang dipakai harus dikeringkan terlebih dahulu.Pengembangan dikerjakan seperti dalam kromatografi lapis tipis lainnya.KLTP harus dikerjakan secepat mungkin untuk tidak terjadi kerusakan pada masing-masing komponen penyusun (Adnan, 1997). Kromatografi ini dilakukan dengan lapisan tebal sebagai pengganti penjerap yang tipis. Kandungan yang sudah dipisahkan dapat diperoleh kembali dengan cara mengerok penjerap ditempat yang sesuai pada plat yang telah dikembangkan, lalu serbuk dielusi dengan pelarut dan akhirnya dikeringkan. Demikian kuatnya lapisan penjerap yang melekat pada kaca sehingga memungkinkan pengembangan plat berulang-ulang dengan pengembang yang sama atau beberapa pengembang yang berbeda, dengan mengeringkan plat sebelum pengembangan berikutnya (Harbone, 1987).

2.5.3.4 Adsorben Adsorben adalah partikel padat yang mempunyai aktifitas permukaan dalam kromatografi.Adsorben harus mempunyai luas permukaan dan mempunyai aktivitas kimia.Adsorben dapat bersifat polar atau non polar.Silika gel dan alumina adalah

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi, keduanya bersifat polar.Sebagai contoh adsorben yang nonpolar adalah arang.Perlu diketahui bahwa silika gel bersifat asam, sedangkan alumina bersifat basa. Oleh karena itu senyawa yang bersifat asam harus dipisahkan oleh silika gel, sedangkan yang bersifat basa harus dipisahkan dengan alumina sebagai adsorben. Urutan adsorben dari yang mempunyai kemampuan adsorbsi besar ke yang kecil yaitu alumina, arang, silika gel, magnesium, kalium karbonat, sukrosa, serbuk pati, dan serbuk selulosa (Adnan, 1997). Berikut ini merupakan beberapa jenis adsorben yang sering digunakan untuk kromatografi kolom: 1. Selulosa Selulosa digunakan untuk memisahkan glikosida yang satu dari glikosida yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon, serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. 2. Silika Silika digunakan untuk memisahkan aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon, dan flavonol. 3. Poliamida Poliamida digunakan untuk memisahkan semua flavonoida, juga untuk memisahkan glikosida. 4. Gel Sephadex (deret G) Gel sephadex digunakan untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada ukuran molekul; molekul besar terelusi lebih dahulu. Gel sephadex untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot molekulnya. 5. Gel Sephadex (LH-20) Sephadex LH-20 dirancang khusus untuk digunakan memakai pelarut organik, dan dapat digunakan dua cara. Sephadex LH-20 digunakan untuk pemurnian akhir aglikon flavonoida dan glikosida yang telah diisolasi dari kertas, selulosa, silika, atau poliamida. Umumnya pelarut yang cocok adalah metanol (Markham, 1988).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Ada beberapa jenis silika gel, yaitu: a. Silika gel G Silika gel G adalah silika gel yang mengandung 13% kalsium sulfat sebagai zat perekat. Jenis silika ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi. b. Silika gel H Perbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidak mengandung perekat kalsium sufat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yang bersifat spesifik, terutama lipida netral.Dengan menggunakan silika gel ini dapat dipisahkan berbagai digliserida. c. Silika gel PF Jenis silika gel ini ditemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupa sehingga senyawa-senyawa organik yang terikat pada plat ini dapat mengadakan fluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat yang telah dikembangkan didalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang bergelombang pendek (Adnan, 1997).

2.5.4 Teknik Spektroskopi Spektroskopi adalah suatu studi mengenai interaksi cahaya dan atom dan molekul.Radiasi cahaya dapat dianggap menyerupai gelombang. Beberapa sifat fisika cahaya paling baik diterangkan dengan ciri gelombangnya sedangkan sifat lain diterangkan dengan sifat partikel. Jadi cahaya dapat dikatakan bersifat ganda. Radiasi elektromagnet dibagi dalam beberapa daerah gelombang radio,gelombang mikro, sinar tampak, ultraviolet dan sinar-X. Beberapa gelombang cahaya berinteraksi dengan dan terabsorpsi oleh atom atau molekul yang terdapat dalam sel. Panjang gelombang yang hilang dapat dideteksi dengan menjatuhkan sinar yang keluar dari sel sampel pada pelat fotografi. Prosedur ini disebut dengan spektroskopi absorpsi dan gambar yang tercatat disebut dengan spektrum.Suatu garis spektrum adalah panjang gelombang dimana cahaya telah diabsorpsi (Cresswell, 2009). Dikenal dua kelompok utama spektroskopi yaitu spektroskopi atom dan spektroskopi molekul.Dasar dari spektroskopi atom adalah tingkat energi elektron

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA terluar suatu atom atau unsur, sedangkan dasar dari spektroskopi molekul adalah tingkat energi molekul yang melibatkan energi elektronik, nergi vibrasi dan energi rotasi (Bintang, 2010). Data spektrum, seperti spektrum Ultraviolet-Visible (UV-Vis), spektrum inframerah (FT-IR), spektrum massa, spektrum resonansi magnetik inti proton (1H- NMR)dan spektrum magnetik inti karbon (13C-NMR) dapat digunakan untuk menentukan struktur atau rumus bangun sebuah senyawa organik. Data spektrum spektroskopi saling mendukung satu sama lain (Harmita, 2009).

2.5.4.1 Spektroskopi Ultraviolet (UV-Vis) Spektroskopi UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel.Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini.Tetapi spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif.Konsentrasi dari analit didalam larutan ini biasa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm (Dachriyanus, 2004). Bila cahaya UV-Vis dikenakan pada senyawa maka sebagian dari cahaya tersebut akan diserap oleh molekul yang mempunyai tingkat energi yang spesifik. Setiap molekul mempunyai tingkat energi dasar yang spesifik.Sinar yang diserap adalah untuk menaikkan elektron ikatan ketingkat energi eksitasi. Karena level energi dasar ke energi eksitasi setiap molekul spesifik maka sinar yang diserap juga spesifik yang merupakan dasar analisa kualitatif (Sitorus, 2009). Kegunaan utama spektroskopi UV-Vis adalah untuk identifikasi jumlah ikatan rangkap/konjugasi aromatik.Misalnya untuk membedakan diena terkonjugasi dan tidak dan sebagainya. Spektrum UV biasanya diukur dalam larutan yang sangat encer, dengan syarat pelarut harus tidak menyerap pada λ, dimana dilakukan pengukuran,agar tidak ada serapan. Hal ini berarti ada batas λ terendah untuk pelarut tertentu, misalnya pelarut air memiliki λ min = 250 nm; etanol 95% dan etanol absolut, λ min = 210 nm; heksan, λ min = 210 nm; dan sebagainya (Panji, 2002).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Spektroskopi UV-Vis merupakan teknik yang umum untuk deteksi senyawa fenolik dan juga untuk melihat kemurnian dalam pemisahan kromatografi.Semua senyawa fenol, tanpa terkecuali menunjukkan satu atau lebih karakteristik maksimum dalam daerah UV antara 230 dan 290 nm (Harbone, 1989).

2.5.4.2 Spektroskopi Inframerah (FT-IR) Spektoskopi inframerah merupakan spektroskopi vibrasional.Spektroskopi IR merupakan teknik analisis yang sangat popular untuk analisis berbagai jenis sampel, baik sampel produk farmasetik, makanan, cairan biologis, maupun sampel lingkungan. Spektrum IR merupakan jenis spektrum yang bersifat (1) spesifik terhadap suatu molekul; yang akan memberikan informasi tentang gugus fungsional yang ada dalam molekul; (2) sidik jari; (3) kuantitatif; (4) non destruktif dan (5) bersifat universal, dalam persyaratan pengambilan sampelnya, baik sampel padat, cair, gas, sampel antara padat dan cair atau gas. Salah satu keunggulan utama spektroskopi IR dengan spektroskopi lainnya adalah karena sifatnya sebagai spektrum sidik jari, dimana tidak ada dua senyawa yang berbeda mempunyai spektrum IR yang sama (Rohman, 2014). Spektroskopi inframerah pada umumnya digunakan untuk : 1. Menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik 2. Mengetahui informasi struktur suatu senyawa organik dengan membandingkan daerah sidik jarinya Jika suatu frekuensi tertentu dari radiasi inframerah dilewatkan pada sampe senyawa organik maka akan terjadi penyerapan frekuensi oleh senyawa tersebut. Banyaknya frekuensi yang melewati suatu senyawa akan diukur sebagai persen transmitan. Persen transmitan 100 berarti tidak ada frekuensi IR yang diserap oleh senyawa.Transmitan 5% berarti bahwa hamper seluruh frekuensi yang dilewatkan diserap senyawa. Serapan yang sangat tinggi ini akan memberikan informasi penting tentang ikatan dalam senyawa ini (Dachriyanus, 2004). Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi frekuensi vibrasi : 1. Penggandengan vibrasi Penggandengan vibrasi adalah gejala yang biasa dihubungkan dengan sistem

AX2(-CH2, -NH2, -NO2, SO2, dan sebagainya. Syarat terjadi penjodoan

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA vibrasi yaitu untuk vibrasi-vibrasi dengan frekuensi yang mirip, penjodohan makin mudah dan letak didalam molekul harus tidak terlalu jauh. 2. Ikatan hidrogen Senyawa dengan gugus –OH dan –NH dapat mengadakan ikatan hidrogen.Hal ini harus diperhatikan dalam memeriksa spektrum IR. Untuk meniadakan Ikatan hidrogen dapat dilakukan dengan cara menyeleksi pelarut yaitu menggunakan pelarut non polar dengan konsentrasi larutan serendah mungkin. 3. Efek elektron Efek elektron meliputi efek resonansi dan efek induksi dalam suatu ikatan. 4. Efek sudut ikatan 5. Efek medan Efek medan adalah efek listrik dengan mekanisme induksi melalui ruang atau pelarut (Panji, 2012). Sinar inframerah mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang dibandingkan dengan UV-Vis, sehingga energinya lebih rendah dengan bilangan gelombang 600-4000 cm-1.Sinar inframerah dapat menyebabkan vibrasi pada ikatan baik berupa rentangan maupun bengkokan.Interpretasi terhadap spektra biasaya disajikan dalam bentuk narasi dan analisis yang dimulai dari kiri ke kanan.Analisis difokuskan pada gugus-gugus fungsi utama.Daerah sidik jari yaitu daerah dibawah 1000 cm-1 digunakan sebagai konformasi gugus-gugus fungsi utama (1000-4000 cm- 1).Serapan yang kurang spesifik seperti C-C tunggal dan C-H juga digunakan sebagai pelengkap karena hampir semua senyawa organik mempunyai serapan tersebut (Sitorus, 2009).

2.5.4.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) didasarkan pada kenyataan bahwa setiap kelompok proton dalam molekul organik akan beresonansi pada frekuensi yang spesifik. Hal ini disebabkan kelompok proton suatu molekul organik dikelilingi oleh elektron yang berbeda. Karena setiap atom proton suatu

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA molekul organik mempunyai lingkungan kimia berbeda maka akan menyebabkan frekuensi resonansi yang berbeda (Sitorus, 2009). Spektroskopi 1H-NMR dapat memberikan informasi adanya gugus-gugus fungsi yang dinyatakan dalam bentuk yang khas seperti jumlah dan posisi gugus fungsi (orho, meta, para) dengan melihat nilai pergeseran kimia (δ) dan konstanta koplingnya (J). Jumlah proton dapat dilihat dari hasil integrasinya dan dapat menentukan bentuk konformasinya. Hal yang paling penting dalam mengidentifikasi atau elusidasi struktur molekul suatu senyawa organik adalah asal usul senyawa sedapat mungkin diketahui.Hal ini sangat membantu dalam menentukan jenis atau golongan senyawanya, misal flavonoid, xanton, kumarin atau streroid. Pergeseran kimia (δ) suatu inti adalah perbedaan resonansi suatu inti terhadap standar, dengan satuan ppm.Perbedaan frekuensi diukur dari resonansi suatu senyawa standar.Tetrametilsilen (TMS) digunakan sebagai standar karena larut dalam semua pelarut organik, bersifat inert, mudah menguap dan mempunyai 12H dan 4C yang ekuivalen. Nilai δ disebabkan oleh adanya elektron dalam suatu molekul yang membentuk shielding effect pada spin inti karena mempunyai arah medan magnetik yang berlawanan dengan Bo sehingga mempunyai nilai δ yang rendah. Suatu atom yang mempunyai nilai δ daerah rendah (dekat TMS) disebut dengan shielded ( high shielded field) dan sebaliknya bila nilai δ nya semakin jauh dari TMS maka disebut deshielded ( low shielded field) (Jenie dkk, 2014).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Sampel yang digunakan diperoleh dari desa Sei Kepayang, Kabupaten Asahan, Sumatera Utara. Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati dan Laboratorium Pascasarjana, FMIPA , Universitas Sumatera Utara (USU) pada bulan Desember sampai Juni 2018. Analisis Spektrofotometer Inframerah (FT- IR) dilakukan di Laboratorium Kimia Organik FMIPA UGM pada bulan Juli 2018, Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) pada bulan Juli 2018 dan Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratoriun Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Utara Yogyakarta pada bulan Agustus 2018.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat Penelitian Nama Alat Ukuran Merek 1. Spektroskopi UV-VIS 2. Spektroskopi 1H-NMR 500MHZ Jeol/Delta2NMR 3. Spektroskopi FT-IR Shimadzu 4. Rotarievaporator Bűchi R-114 5. Labu Rotarievaporator 1000ml Shoot/Duran 6. Ekstraktor 5000ml Schoot/Duran 7. Kolom Kromatografi Pyrex 8. Alat destilasi 9. Lampu UV 254/356nm UVGL 58 10. Neraca Analitis Mettler AE 200 11. Corong Kaca Pyrex 12. Corong Pisah 1000ml Pyrex 13. Gelas Ukur 100ml/10ml Pyrex 14. Labu Takar 250ml Pyrex

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 15. Tabung Reaksi Pyrex 16. Botol Vial 10ml 17. Gelas Erlenmeyer 250ml Pyrex 18. Beaker Gelas 500ml/1000ml Pyrex 19. Statif dan Klem 20. Penangas Air 21. Batang Pengaduk 22. Chamber 23. Pipa Kapiler 75mm Nesco 24. Spatula 25. Pipet Tetes 26. Pinset 27. Penjepit Tabung

3.2.2 Bahan Penelitian Nama Bahan Ukuran Merek 1. Daun Tumbuhan Putat 1700g 2. Metanol Destilasi 3. Etil Asetat Teknis 4. Aquadest Teknis 5. N-Heksan Teknis 6. Silika Gel 40 (70-230 mesh) ASTM

7. FeCl3 5% 8. Kapas 9. Kloroform p.a.E.Merck

10. Plat KLT Silika Gel 60 F254 E.Merck.Art 554 11. Plat KLT Preparatif

3.3 Penyedian Sampel Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Putat yang diperoleh dari desa Sei Kepayang, Kabupaten Asahan, Sumatera Utara.Daun tumbuhan Putat dikeringkan,

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA diudara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk kering halus daun Putat sebanyak 1700 g.

3.4 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Putat Serbuk kering halus daun tumbuhan Putat diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrinning Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa fenolik yang terdapat dalam daun tumbuhan Putat maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut : 1. Dimasukkan 10 g serbuk kering halus daun tumbuhan Putat kedalam gelas Erlenmeyer 2. Ditambahkan 50 ml metanol kedalam gelas Erlenmeyer 3. Didiamkan selama 1 malam 4. Disaring 5. Dimasukkan kedalam tabung reaksi

6. Ditambahkan dengan pereaksi FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam 7. Dilakukan perlakuan yang sama dengan menggunkan pelarut etil asetat dan diperoleh hasil yang sama

3.5 Ekstraksi Daun Tumbuhan Putat Serbuk kering halus daun tumbuhan Putat ditimbang sebanyak 1700 g, kemudian dimaserasi ±10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Perendaman dilakukan sampai sampel negatif terhadap FeCl3 5%.Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan dengan penangas air hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan aquadest lalu dipartisi berulang-ulang dengan etil asetat, hingga negatif senyawa fenolik diuji dengan FeCl3 5%. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan dengan penangas air hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu ekstrak pekat etil asetat diuji dengan FeCl3 5%.Ekstrak pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-Heksan sampai lapisan n-Heksan bening. Lapisan metanol

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA dipisahkan dari lapisan n-Heksan, lalu diuji dengan FeCl3 5% dan dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 15,11 g . 3.6 Analisis Kromatografi Lapis Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fase diam silika gel 60F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 (v/v). Sebanyak 10 ml campuran larutan fase gerak kloroform : metanol 90:10 (v/v) dimasukkan kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi, dikeluarkan dari bejana,lalu dikeringkan. Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, Kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 (v/v).

3.7 Isolasi Senyawa Fenolik dengan Kromatografi Kolom Isolasi senyawa fenolik dilakukan dengan kolom kromatografi terhadap ekstrak pekat metanol. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu kloroform 100%, campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 (v/v). Dirangkai alat kromatografi kolom.Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan homogen. Sebanyak 6,25 g ekstrak pekat metanol ditambahkan dengan 15 g silika gel kemudian ditambahkan dengan pelarut metanol, lalu dikeringkan sampai berbentuk bubuk. Kemudian dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA gel, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : metanol 90:10 (v/v) secara perlahan- lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak kloroform : metanol dengan perbandingan 80:20; 70:30; dan 60:40 (v/v).Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl3 5%. Kemudian diuapkan sampai terbentuk gum.

3.8 Pemurnian Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan metanol lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk KLT preparatif.Kloroform : etil asetat 40:60 (v/v) adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan yang paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Sedangkan pasta yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV . Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusi dengan metanol : etil asetat 1:1 (v/v). Hasil elusi diuapkan lalu dikristalisasi menggunakan pelarut aseton dan n-Heksan hingga diperoleh pasta kuning.

3.9 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak etil asetat : kloroform 70:30 (v/v). Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kedalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi lapis tipis,lalu dijenuhkan. Setelah pelrut fasa gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati dibawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5% dalam metanol menghasilkan bercak

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa fenolik dan dihitung harga Rf yang diperoleh.

3.10 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan uji tiga jenis spektroskopi yaitu Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Infra Merah (FT- IR), dan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1HNMR).

3.10.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari di Laboratoriun Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Utara Yogyakarta dengan menggunakan pelarut metanol.

3.10.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik UGM FMIPA Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Utara Yogyakarta dengan menggunakan plat KBr.

3.10.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1HNMR) Analisis dengan alat Spektrofotometer 1HNMR diperoleh dari di Laboratoriun Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Utara Yogyakarta dengan menggunakan pelarut metanol.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 3.11 Bagan Skrining Fitokimia 3.11.1 Maserasi Dengan Menggunakan Pelarut Metanol

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 3.11.2 Maserasi dengan Menggunakan Pelarut Etil Asetat

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 3.11.3 Bagan Penelitian

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lanjutan

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari dari daun tumbuhan putat (Planchonia valida Blume) menggunakan pereaksi FeCl3 5% menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat positif mengandung senyawa fenolik (Lampiran 1.a). Hasil elusi pada fraksi 139-210, dilakukan KLT Preparatif dengan eluen kloroform : etil asetat (40:60)v/v untuk mendapatkan senyawa hasil isolasi yang lebih murni. Sehingga diperoleh senyawa hasil isolasi berupa pasta berwarna kuning , seberat 11 mg, dengan Rf = 0,27. Spektrum UV-Visibel senyawa hasil dengan menggunakan pelarut metanol ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini :

Gambar 4.1 Spektrum UV-Visibel Senyawa Hasil Isolasi

Dari hasil karakterisasi dan elusidasi menggunakan Spektrofotometer UV- Visibel pada gambar 4.1 senyawa hasil isolasi menunjukkan dua serapan panjang gelombang maksimum (λ maks) yang ditunjukkan pada table 4.1 berikut :

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Tabel 4.1 Panjang Gelombang UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi Panjang gelombang (nm) Absorbansi 270 1,019 215 2,977

Spektrum FT-IR dari pasta hasil isolasi menghasilkan puncak-puncak serapan pada daerah bilangan gelombang (cm-1) ditunjukkan pada Gambar 4.2 sebagai berikut:

Gambar 4.2 Spektrum Infra Merah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Hasil analisis Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) dari pasta hasil isolasi menghasilkan pita serapan pada daerah bilangan gelombang (cm-1) ditunjukkan pada tabel 4.2 dibawah ini: Tabel 4.2 Hasil Analisis Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi Bilangan Intensit Gugus fungsi Bilangan Gelombang( as Gelombang cm-1) (cm1)(Pavia,1979) 3271,27- Tinggi Vibrasi ulur -OH 3200-3600 3410,15 1697,36 Sedang Vibrasi ulur –C=O 1630-1740 1450,47- Sedang Vibrasi ulur–C=C aromatis 1400-1600 1543,05 1249,87 Sedang Vibrasi ulur –C-O 1000-1300 871,82 Rendah Vibrasi ulur =C-H benzena 675-1000

Hasil analisis Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) terhadap senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol dan TMS pergeseran kimia pada daerah (ppm) sebagai standart seperti Gambar 4.3 sebagai berikut:

Gambar 4.3 Spektrum1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Hasil Analisis Spektroskopi 1H-NMR senyawa hasil isolasi memberikan satu sinyal pada pergeseran kimia 7,044 ppm dengan puncak singlet yang menunjukkan adanya 2 proton yaitu H-2 dan H-6 pada lingkungan kimia yang sama.

4.2 Pembahasan Dari hasil isolasi senyawa fenolik dari daun tumbuhan putat (Planchonia valida Blume) mulai dari proses ekstraksi maserasi diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 134,16 g. Kemudian dilarutkan dengan menggunakan pelarut aquadest (Lampiran 1.b) untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat non polar lalu dipartisi dengan menggunakan pelarut etil asetat (Lampiran 1.c ) untuk pemisahan senyawa-senyawa yang diduga merupakan tanin dan diperoleh ekstrak pekat etil asetat sebanyak 15,11 g. Ekstrak pekat etil asetat yang diperoleh lalu dipartisi kembali dengan n-Heksan. Dari Hasil analisis kromatografi lapis tipis sebelum kolom didapat bahwa perbandingan pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa fenolik dari daun tumbuhan putat adalah kloroform : metanol 70:30 (v/v) yang menunjukkan pemisahan yang lebih baik dari noda yang dihasilkan (Lampiran 3). Setelah pemisahan dengan kromatografi kolom kemudian dilakukan analisis KLT untuk penggabungan fraksi dengan menggunakan eluen kloroform : etil asetat 70:30 (v/v) dan didapatkan 5 fraksi (Lampiran 4), dimana noda yang dihasilkan pada plat kromatografi lapis tipis untuk fraksi 139-210 dengan pereaksi FeCl3 5% menghasilkan pemisahan noda yang paling baik dengan jarak Rf adalah 0,34 dengan berat 590 mg, lalu dianalisis KLT kembali dengan kloroform : etil asetat 40:60 (v/v) (Lampiran 5), yang selanjutnya dikromatografi lapis tipis preparatif dengan sistem pelarut yang sesuai adalah kloroform : etil asetat 40:60 (v/v), diamati dengan lampu UV, lalu diambil noda kedua dari batas atas, kemudian silika gel digerus dan dielusi dengan perbandingan metanol : etil asetat 1:1 (v/v). Senyawa yang diperoleh dilakukan pemurnian kembali dengan rekristalisasi menggunakan pelarut aseton dan n-Heksan, kemudian diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan eluen kloroform: etil asetat 30:70 (v/v) yang menunjukkan hanya satu noda yang dihasilkan dengan Rf sebesar 0,27 (Lampiran 6). Dari hasil interpretasi spektrum UV-Vis dengan pelarut metanol (Gambar 4.1) memberikan serapan dengan panjang gelombang (λ maks) 270 nm. Hasil isolasi

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA sesuai dengan spektrum UV-Visible dari senyawa pembanding asam galat (Lampiran 7). Asam galat atau asam 3,4,5-trihidroksibenzoat dimana pada Dachriyanus (2004) sistem induk benzoat memiliki λ maks = 230 nm, subtituen OH pada posisi para memiliki λ maks = 25 nm dan pada posisi meta memiliki λ maks = 7 nm sehingga keseluruhan memiliki λ maks = 269 nm. Dari hasil interpretasi Spektrum Inframerah (FT-IR) (Gambar 4.2), Pada bilangan gelombang 3271,27-3410,15 cm-1 puncak melebar dengan intensitas tinggi menunjukkan adanya vibrasi ulur dari –O-H, pada bilangan gelombang 1697,36 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur –C=O ,pada bilangan 1450,47- 1543,05 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur –C=C aromatis dan pada bilangan 1249,87 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur –C-O serta pada bilangan gelombang 871,82 cm-1 menunjukkan adanya =C-H benzena sesuai dengan data Spektrum Inframerah (FT-IR) (Gambar 4.2). Dari hasil interpretasi Spektrum 1H-NMR dengan pelarut metanol dalam standar TMS,Pasa pergeseran kimia pada daerah δ = 7,046 ppm dengan puncak singlet menunjukkan adanya proton dengan lingkungan kimia yang sama yaitu proton pada H-2 dan H-6 pada cincin aromatis yang sesuai dengan spektrum senyawa pembanding asam galat pada Lampiran 10. Berdasarkan analisis data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UV-Visible, Spektrum Inframerah (FT-IR), Spektrum 1H-NMR disimpulkan bahwa kemungkinan pasta yang diisolasi dari daun tumbuhan putat (Planchonia valida Blume) adalah senyawa fenolik golongan Asam Galat seperti pada gambar 4.4 berikut :

Gambar 4.4 Struktur Asam Galat

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. KESIMPULAN 1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 1700 g Daun Tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume) merupakan pasta berwarna kuning, sebanyak 11 mg, Rf = 0,27 dan

berdasarkan uji pendahuluan menggunakan preaksi FeCl3 5% menunjukkan hasil postif mengandung senyawa fenolik. 2. Hasil analisis dengan Spetrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi dari Daun Tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume) diduga adalah senyawa fenolik yaitu Asam galat.

5.2. SARAN Untuk lebih mendukung struktur senyawa fenolik hasil isolasi, maka sebaiknya perlu dilakukan analisis Spektrofotometer Karbon (13C-NMR) dan Spektrofotometer Massa (MS).

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA DAFTAR PUSTAKA

Andarwulan, N. 2012.Senyawa Fenolik Pada Beberapa Sayuran Indegenous dari Indonesia.Sefast center. Bogor. Adnan, R. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit Andi. Yogyakarta.

Arapitas,P. 2012. Hydrolyzable Tannin Analysis In Food. Elsevier. Italy.

Benson, L. 1979. Classification. D.C.Heathand Company. Boston. Bintang, M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Penerbit Erlangga. Jakarta. Creswell, C.2009. Analisis spektrum senyawa organik. Penerbit ITB. Bandung. Crublet M, Long C, Sevenet T, Hadi, H. 2003. Acylated Flavonol Glycosides From Leaves of Planchonia grandis. Elsevier. France. Dasuki,S.2011.202 Khasiat Herba : Kaedah Alternatif Rawat Penyakit. Grup Buku Karangkraf,BHD.Selangor. Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik. Andalas University Press. Padang. Eslami AC, Pasanphan W, Wagner B. 2010. Free Radical Produced By The Oxidation Of Gallic Acid : An Electron Paramagnetic Resonance Study. Spinger Internasional Publishing. USA.

Hardiyanto,E.B.2008.Seed Collection and Handling Putat (Planchonia valida (Blume)Blume).Directorate General of Land Rehabilitation and SocialForestry.Jakarta. Harbone, J. B. 1987. Metode Fitokimia. Terbitan Kedua. Penerbit. ITB. Bandung. Harbone, J.B. 1989. Methods In Plant Biochemistry. Academic Press. London. Harmita. 2009. Analisis Fisikokimia. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Heinrich, M.Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, E.M. 2010. Farmakognosi dan Fitoterapi. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Inoue M, Suzuki R, Koide T. 1994. Antioxidant Gallic Acid Induces Apoptosis In HC-60 RG Cells. Biochemical and Biophysicals Research Communication. Japan. Jennie A,Kardono LD,Hanafi M. 2014. Teknik Modern Spektroskopi NMR:Teori dan Aplikasi Dalam elusidasi struktur molekul organik. Lipi Press. Jakarta. Kamatham S, Kumar N, Gudipalli. 2014. Isolation And Characterization Of Gallic Acid And Methyl Gallate From Seeed Coats Givotia Rottleriformis Griff, And

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Their Antipolliferrative Effect On Human Epidermoid Carcinoma A-431 Cells.Elsevier.Telangana. Liu Z, Li D , Yu L. 2012. Gallic Acid as Cancer-Selective Agent Induces Apoptosis In Pancreatic Cancer Cells. Chemotherapy.Tongliao. Markham,K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasi Padmawinata. ITB Press. Bandung. Mc.Rae M, Yang Q, Crawford RJ. 2007. Acylated Flavonoid Tetraglycoside From Planchonia careya Leaves.Elsevier.Victoria. Mc.Rae M, Yang Q, Crawford RJ. 2008.Antibacterial Compound From Planchonia Careya Leaf Extrac.Elsevier.Victoria. Muldja MH, 1995. Analisis Instrumental. Cetakan Pertama. Universitas Airlangga Press. Surabaya. Ogata, K. 2008. Identification of The Timbers of Southeast Asia and Western Pasific. Japan. Panji, T. 2012. Teknik Spektroskopi Untuk Elusida Struktur Molekul. Graha Ilmu.Yogyakarta Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS, 1979. Introduction to Spectroscopy: A Guide for Students of Organic Chemistry. Saunders College. Philadelphia.

Rohman, A . 2014. Spektroskopi Inframerah Dan Kemometrika Untuk Analisis Farmasi. Tata Aksara.Yogyakarta.

Saifudin, A. 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder. Deepublish. Yogyakarta Sarria R, Gallo J, Isabel M. 2017. Isolation Of Catechin And Gallic Acid From Colombian Bark Of Pinus Patula. CSJ. Columbia Sastrohamidjojo,H. 1996. SintesisBahanAlam. GadjahMada University Press.Yogyakarta Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia Farmasi. ITB Press. Bandung. Sitorus, M. 2013. Spektroskopi Elusidasi Struktur Molekul Organik. Graha Ilmu. Yogyakarta. Sudjadi, 2007.Kimia Farmasi Analisis.Pustaka Pelajar.Yogyakarta. Sulistyaningrum S, Nilasari H, Effendi E. 2012. Penggunaan Asam Salisilat Dalam Dermatologi. Jakarta. Tricone, A. 2013.Maryne Enzymes For Biocatalysis. Woodhead Publishing. Cambridge. Underwood, A.L. 1998. Analisis Kimia Kuantitatif. Penerbit Erlangga. Jakarta.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Vermerris, W and Nicholson R. 2007.Phenolic Compound Biochemistry.Spinger. Florida. Wonoraharjo, S. 2013. Metode-Metode Pemisahan Kimia.Pt.Indeks. Jakarta. Yuslianti, E. 2008.Pengantar Radikal Bebas dan Antioksidan.Deepublish.Yogyakarta.

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 1. Gambar Proses Pengerjaan Dalam Penelitian

a.Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Daun Tumbuhan Putat Dengan Menggunakan

Pereksi FeCl3 5%

b.Ekstrak Metanol Dilarutkan Dengan Aquadest

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

c. Ekstrak aquadest dipartisi dengan etil asetat

d. Proses Kromatografi Kolom

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 2.Hasil Determinasi Daun Tumbuhan Putat (Planchonia valida Blume)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 3. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Pekat Metanol Daun Tumbuhan Putat sebelum Kromatografi Kolom

E

Keterangan :

Fase diam : Kieselgel 60 F254

E : Ekstrak Pekat Lapisan Metanol Daun Tumbuhan Putat

No Fasa Gerak Jumlah Noda Rf

I Kloroform : Metanol (70 : 30) v/v 4 0,91 0,64 0,4 0,25

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 4. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Daun Tumbuhan Putat Fraksi I-V Sesudah Kromatografi Kolom

Keterangan :

Eluen : Kloroform : Etil Asetat 70:30 (v/v)

Fase diam : Kieselgel 60 F254

No Fraksi Jumlah Noda Rf

I 67-103 1 0,46

II 104-138 3 0,95 0,64 0,45 III 139-210 2 0,95 0,27 IV 211-251 1 0,22

V 252-283 2 0.04 0,31

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 5. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Daun Tumbuhan Putat pada fraksi III sebelum KLT preparatif

E

Keterangan:

Fasa diam : Kieselgel 60 F254 E : Fraksi III Ekstrak Daun Tumbuhan Putat No Fasa Gerak Jumlah Noda Rf 1 Kloroform : Etil Asetat 40 : 60 (v/v) 1 0,29

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 6. Kromatogram Lapis Tipis Senyawa Hasil Isolasi Setelah KLT Preparatif

E

Keterangan :

Fase diam : Silika Gel 60 F254 E : Pasta Hasil Isolasi No Fasa Gerak Jumlah Noda Rf I Kloroform : Etil Asetat 70:30 (v/v) 1 0,27

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 7. Spektrum UV-Visible Senyawa Pembanding Asam Galat

(Arapitsas, 2012)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 8. Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi pada δ = 0-7 ppm

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 9. Ekspansi spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi pada δ= 7-8 ppm

H-2

H-6

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA Lampiran 10. Spektrum 1H-NMR Senyawa Pembanding

(Sarria et al., 2017)

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA