Luiza De Moraes Magaldi Filogenia Molecular E a Delimitação

Luiza de Moraes Magaldi

Filogenia Molecular e a Delimitação Taxonômica das Espécies do Gênero Stalachtis Hübner, 1818

CAMPINAS 2015

III

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer ao meu orientador, o Prof. André Freitas, por ter me orientado desde a iniciação científica com muita paciência e empenho, me ensinando com entusiamo sobre as borboletas e sobre a ciência. Essa empolgação pela ciência me contagiou e permitiu que eu gostasse muito mais dela. Também gostaria de agradecer minha Co-orientadora a Profa. Ana Maria Espin, que também me acolheu no seu laboratório desde a iniciação científica, permitindo que eu aprendesse os mistérios da genética molecular.

Quero agradecer também a todos os meus colegas do LABBOR, agradeço ao Lucas Kaminski, que me apresentou as Stalachtis, me ensinou sobre a história natural desses borboletas, além de sempre me incentivar a pensar e ir além. Agradeço a Noemy Seraphim por ter sido uma ótima professora e me ensinado desde a alinhar as sequências até as análises filogenéticas. Quero agradecer também ao Eduardo Barbosa que me ensinou as técnicas de dissecção de genitálias das borboletas. A Tamara Aguiar, que montou todas as Stalachtis coletadas para essa dissertação. A Karina Silva-Brandão, que também me ensinou sobre as técnicas moleculares e me ajudou desde a minha iniciação. Além deles, quero também agradecer aos colegas do laboratório que coletaram Stalachtis e outras borboletas para mim: Luísa Mota, Poliana Felix, Junia Yasmin, Jessie Pereira, Danilo Ribeiro, Ana Kristina Silva, Mario Alejandro, André Tacioli, Cristiano Iserhard e ao Renato Rogner. E ao Scott Carrara que me ajudou no laboratório e me deixou ensinar um pouquinho do que eu aprendi para ele.

Agradeço a todos do LABGEA, a Rosangela Rodrigues, por pacientemente ter me ensinado desde a iniciação as técnicas moleculares e sempre me auxiliar com as dúvidas e problemas que surgiram nesse caminho. Aos colegas que também me ensinaram e me ajudaram Luana Bergamo, Daniel Paulo, Rogério Gonçalves e a Ana Carolina Junqueira. A Ana Claudia Lessinger e ao projeto Brbol.

Aos professores Olaf Mielke e Mirna Casagrande que me receberam no museu de lepidópteros em Curitiba, e a todos os alunos que me acolheram por lá. A curadora Blanca Huertas e ao curador John Chainey por permitir que eu examinasse os indivíduos de Stalachtis da coleção do museu de História Natural de Londres. Aos fótografos que V publicaram suas fotos no Flickr, que tiraram fotos de Stalachtis por toda a América do Sul e deixaram eu utilizar os seus registros. Aos coletores que me doaram borboletas para essa dissertação: Diego Dolibaina, Márcio Uehara-Prado, Keith Wilmott, Mauro Costa, Gustavo Acácio, Elias Araújo e ao Prof. Brown.

Agradeço aos membros da pré-banca e banca, que com suas sugestões valiosas para essa dissertação enriqueceram o meu conhecimento, Prof. Sérgio Reis, Prof. Marcelo Duarte, a Karina Silva-Brandão, e ao Simeão Moraes.

Muito importantes para essa dissertação também, foram os meus amigos e familiares, que sempre me apoiaram e incentivaram eu a avançar na minha jornada científica. Quero agradecer ao Matheus Jardim, por sempre me apoiar, me amar e cuidar de mim todos os dias. Agradeço imensamente aos meus pais, Helena e Cezar, que desde pequena me ensinaram e se esforçaram para que eu chegasse aqui. Aos meus irmãos, Cézar e Victor, por estarem comigo sempre. E a toda a minha família, desde os meus queridos avós, tios e tias e meus primos. Todos vocês fazem parte de mim e me ajudaram muito. Aos meus amigos, que sempre me trouxeram ajuda e alegria, Veridiana Jardim, Amanda Eid, Henrique Calado, João Garbelloto, Adriano Messias, Hans Müller, Hugo Alvarez, Natália Angeluzzi, Lucas Monteiro, Gustavo Angeluzzi, Vinicius Amaro, João Preturlan e todos os amigos do FAM.

E por fim, não menos importantes, as borboletas Stalachtis que se tornaram parte da minha vida acadêmica, que permitiram eu fazer essa dissertação, estudar e entender um pouco mais sobre a vida e sua evolução.

RESUMO

O gênero Stalachtis pertence à família Riodinidae e apresenta borboletas aposemáticas com padrões alares miméticos. Essas borboletas ocorrem desde o Panamá até o sudeste do Brasil, sendo restritas à região Neotropical. As suas lagartas comem plantas da família Simaroubaceae com fitoquímicos tóxicos e de sabor amargo, sugerindo que as borboletas de Stalachtis possam ser impalatáveis. Nesse trabalho é proposta uma filogenia para Stalachtis com base em marcadores moleculares – um gene mitocondrial (COI) e três genes nucleares: GAPDH, CAD e o RPS5. Foi investigada a distribuição geográfica das espécies do gênero Stalachtis e também foram delimitadas com base em evidências moleculares, biogeográficas e morfológicas. As análises de distância genética aqui utilizadas – Neighbor-Joining, rede de haplótipos, distância genética – mostraram padrões similares que levam as mesmas conclusões. As três análises filogenéticas feitas – Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana – recuperaram o gênero Stalachtis como monofilético (separado do grupo irmão Protonymphidia senta) e produziram topologias iguais no que se refere as relações internas do gênero. Os 100 indivíduos amostrados de Stalachtis se organizaram em 11 clados bem definidos e com alto valor de probabilidade posterior e de bootstrap, que podem ser atribuídos a 10 espécies diferentes. Todos os indivíduos se separam formando dois grandes clados irmãos. O primeiro clado inclui S. phegia + Stalacthis susanna stat. rev.. O segundo clado inclui todas as espécies restantes, com S. lineata aparecendo como grupo irmão das restantes. Estas outras se organizam em dois clados irmãos: 1) S. halloweeni + S. phaedusa (uma relação inesperada porém congruente com os padrões alares), e 2) S. euterpe, grupo irmão de S. magdalena, Stalacthis terpsichore stat. rev., S. calliope e uma nova espécie não descrita. A espécie revalidada Stalachtis susanna, apresenta várias características distinguíveis da espécie irmã S. phlegia, desde o padrão alar, caracteres na genitália masculina e números cromossômicos diferentes. Junto a isso, as análises moleculares propostas mostram essas espécies como entidades distintas (clados bem definidos nas filogenias, alta distância genética, rede de haplótipos desconectadas). Adicionalmente, temos as evidências biogeográficas, sendo S. phlegia uma espécie relacionada com a Floresta Amazônica e Cerrado, e S. susanna com a Mata Atlântica. Interessantemente, no clado de S. magdalena, os indivíduos se separaram em dois clados

VII distintos e com alto suporte, mas não foi encontrada nenhuma evidência morfológica que sugira que existam duas espécies distintas. Essa divisão no DNA mitocondrial pode ter sido causada por: uma barreira no fluxo gênico; pela existência de duas espécies crípticas; ou pela seleção do genoma mitocondrial por parasitas citoplasmáticos. A segunda espécie aqui revalidada é S. terpsichore, que apresenta características morfológicas (genitália masculina e padrão alar) e dados genéticos que a definem como uma espécie válida. Além das espécies revalidadas, foram obtidos dados moleculares para a descrição de uma nova espécie de Stalachtis do Equador que apresenta diferenças genéticas e morfológicas de S. calliope. Não foi encontrada estruturação genética ou geográfica entre as subespécies amostradas, sugerindo que as subespécies atuais não são unidades evolutivas distintas.

VIII

ABSTRACT

Stalachtis genus belongs to the Riodinidae family, these butterflies have aposematic wings with mimetic patterns. They can be found from Panama to the southeast of Brazil, being restricted to the Neotropics. Their caterpillars eat Simaroubaceae plants with toxic phytochemicals and bitter taste, suggesting that Stalachtis butterflies can be unpalatable. In this paper, we propose a phylogeny for Stalachtis based on molecular markers - one mitochondrial gene (COI) and three nuclear genes: GAPDH, CAD and RPS5. We investigated the geographic patterns of the species, and delimited this species based on molecular, morphological and biogeographic evidence. The genetic distance analysis used here - Neighbor-Joining, Minimum Spanning network, COI genetic distance - showed similar patterns that lead to the same conclusions. Three phylogenetic hypotheses were made - Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inference – and they recovered the Stalachtis genus as monophyletic (separated from the sister group Protonymphidia senta) and produced the same topologies regarding the internal relationships between species. The 100 sampled individuals of Stalachtis organized into 11 clades with high posterior probability and bootstrapping, corresponding to 10 different species. All individuals are divided into two major sister clades. The first clade includes S. phegia + Stalacthis susanna stat. rev.. The second clade includes all other species, with S. lineata as a sister group to the other. These others are organized into two sister clades: 1) S. halloweeni + S. phaedusa (an unexpected relationship but congruent with the wing patterns), and 2) S. euterpe, sister group of S. magdalena, S. terpsichore stat. rev., S. calliope and a new undescribed species. The revalidated species Stalachtis susanna has several distinguishable characteristics from the sister species S. phlegia, such as the wing pattern, characters of male genitalia and different chromosome numbers. Furthermore, the molecular analysis proposals show these species as distinct entities (well-defined clades in the phylogeny, high genetic distance and disconnected haplotypes network). Additionally, we have the biogeographic evidence, because S. phlegia is more related to the Amazon and the Cerrado, and S. susanna with the Atlantic Forest. Interestingly, the S. magdalena individuals are divided into two distinct clades with high support, but we did not find morphological evidence to corroborate that there are two distinct species. This division in mitochondrial DNA may

IX have been caused by a barrier in gene flow; the existence of two cryptic species; or by the selection of mitochondrial genome by cytoplasmic parasites. The second species revalidated S. terpsichore, presented morphological characters (male genitalia and wing patterns) and genetic data that define it as a valid species. In addition to the revalidated species, molecular data were collected to describe a new species of Stalachtis from Ecuador, which has genetic and morphological differences from the S. calliope. There was no genetic or geographical evidences that suggests structure between the subspecies sampled from the Stalachtis species, suggesting that these current subspecies are not distinct evolutionary units.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura I-1. Desenho adaptado de Harvey (1987) da asa de Stalachtis susanna com a nomenclatura proposta por Miller (1970)...... 16 Figura I-2. Fotos de vouchers utilizados representando as espécie do gênero Stalachtis...... 17 Figura I-3. Filogenias para o gênero Stalachtis, primeiro a classificação de Stichel (1910- 1911) e o segundo apresentando a hipótese filogenética de Hall (2006)...... 18

Figura II-1. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para a região barcode...... 34 Figura II-2. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para a segunda metade do gene COI...... 35 Figura II-3. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear CAD...... 36 Figura II-4. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear GAPDH...... 37

Figura II-5. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear RPS5...... 38

Figura II-6. Análise de “Minimum spanning network” para a região barcode (gene COI)...42

Figura II-7. Análise de “Minimum spanning network” para a segunda metade do gene COI...... 43

Figura II-8. Análise de “Minimum spanning network” para o gene RPS5...... 44

Figura II-9. Análise de “Minimum spanning network” para o gene GAPDH...... 45

Figura II-10. Análise de “Minimum spanning network” para o gene CAD...... 46

Figura II-11. Distâncias genéticas baseadas nas sequências para a região barcode...... 47

Figura II-12. Boxplots para as distâncias genéticas, baseados nas sequências para a região barcode...... 48

Figura II-13. Árvore consenso das árvores mais parcimoniosas, baseada nos dados concatenados de três genes (COI, RPS5 e GAPDH)...... 54

Figura II-14. Árvore de Máxima Verossimilhança, baseada nos dados concatenados de três genes (COI, RPS5 e GAPDH)...... 55

Figura II-15. Inferência bayesiana feita a partir dos dados de 3 genes (COI, GAPDH e RPS5)...... 56

Figura II-16. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos previamente identificados como Stalachtis calliope...... 59

Figura II-17. Caracteres morfológicos diagnósticos das espécies S. calliope e S. terpsichore...... 59

Figura II-18. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos de S. lineata...... 60

Figura II-19. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos previamente identificados como Stalachtis phlegia...... 60

Figura II-20. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos de S. phaedusa.61

Figura II-21. Distribuição geográfica encontrada para o gênero Stalachtis...... 64

Figura II-22. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis susanna e S. phlegia...... 65

Figura II-23. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis lineata...... 66

Figura II-24. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis phaedusa e S. halloweeni...... 67

Figura II-25. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis euterpe...... 68

Figura II-26. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis magdalena....69

Figura II-27. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis calliope, S. terpsichore e Stalachtis sp...... 70

XII

LISTA DE TABELAS

Tabela II-1. Dados de coleta dos indivíduos de Stalachtis utilizados...... 22 Tabela II-2. Lista dos primers desenhador por Wahlberg & Wheat (2008)...... 26 Tabela II-3. Distâncias genéticas calculadas para a região barcode...... 48

XIII

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ...... 1 A família Riodinidae ...... 1 O gênero Stalachtis ...... 2 Stalachtis e o Mimetismo ...... 6 Referências ...... 10 Figuras ...... 16 CAPÍTULO ÚNICO ...... 19 FILOGENIA MOLECULAR E DELIMITAÇÃO DAS ESPÉCIES DO GÊNERO STALACHTIS HÜBNER, 1818 (LEPIDOPTERA: RIODINIDAE) ...... 19 INTRODUÇÃO ...... 19 MATERIAL E MÉTODOS ...... 21 Amostragem taxonômica ...... 21 Técnicas moleculares ...... 24 Análises de distância genética ...... 27 Análises filogenéticas ...... 28 Estudo dos padrões alares ...... 29 Distribuição geográfica das espécies ...... 29 RESULTADOS ...... 29 Marcadores moleculares: análises exploratórias ...... 30 Árvores de Distâncias genéticas (NJ) ...... 31 Rede de haplótipos - “Minimum spanning network” ...... 39 Distâncias genéticas para o Barcode ...... 47 Análises filogenéticas ...... 53 Relações internas do gênero Stalachtis ...... 53 Padrões alares ...... 57 Distribuição geográfica ...... 62 DISCUSSÃO ...... 71 Filogenia do gênero Stalachtis ...... 71 O uso de marcadores moleculares para a delimitação taxonômica das espécies do gênero Stalachtis ...... 75 CONCLUSÃO GERAL ...... 80 REFERÊNCIAS ...... 82

XIV

“It is paradoxical, yet true, to say, that the more we know, the more ignorant we become in the absolute sense, for it is only through enlightenment that we become conscious of our limitations. Precisely one of the most gratifying results of intellectual evolution is the continuous opening up of new and greater prospects.” - Nikola Tesla

INTRODUÇÃO GERAL

A família Riodinidae

Dentre as sete famílias de borboletas reconhecidas, Riodinidae é uma das mais diversas em morfologia de adultos e imaturos, incluindo grande diversidade de formas e tamanhos (algumas das menores borboletas conhecidas são riodinídeos) e de coloração das asas (Stichel 1910–1911, d’Abrera 1994). Muitas espécies apresentam manchas metálicas nas asas (douradas ou prateadas), por isso receberam o nome metalmarks em inglês. Uma característica visível de alguns riodinídeos é a redução das pernas anteriores nos machos, similar às borboletas da família Nymphalidae (Hall 2004). A família Riodinidae possui uma grande riqueza de espécies, sendo a segunda maior família de borboletas, somente menor que Nymphalidae (Heppner 1991, Robbins 1993). No entanto, ainda é a menos conhecida e estudada entre as famílias de borboletas, apesar do recente aumento de interesse nesse grupo (Kaminski 2008, Hall & Harvey 2002, Allen 2010, Callaghan 2010). Possivelmente, essa falta de conhecimento se deve à dificuldade na identificação de muitos grupos com taxonomia ainda pouco estudada. Outro fator importante é a dificuldade de detectar as espécies de Riodinidae, pois muitas são pouco abundantes e erráticas no tempo e espaço, além de geralmente possuírem um pequeno tamanho, dificultando a sua observação (Harvey 1987). Apesar de ser distribuída em quase todos os continentes, a família Riodinidae é essencialmente Neotropical, região onde ocorrem mais de 1.300 espécies, ou seja, cerca de 95% da riqueza da família (DeVries 1997, Callaghan & Lamas 2004). A história natural e a biologia da maioria das espécies ainda são desconhecidas (Hall et al. 2004, Kaminski 2008), todavia, a taxonomia e a sistemática de Riodinidae têm sido mais estudadas nas últimas décadas (Harvey 1987, Callaghan & Lamas 2004, Hall 2005, Penz & DeVries 2006, Siewert et al. 2014). Os riodinídeos apresentam uma grande diversidade ecológica (Callaghan 1982). Junto com a família irmã Lycaenidae (Campbell et al. 2000, Heikkilä et al. 2012) são as únicas borboletas que possuem lagartas capazes de interagir com formigas (mirmecofilia) (Fiedler 1991, Pierce et al. 2002, Kaminski 2008). As lagartas de um modo geral produzem secreções açucaradas que atraem as formigas, enquanto que as formigas protegem as

1 lagartas de inimigos naturais. Essa associação mutualística com as formigas é muito benéfica para as lagartas, e existem muitas adaptações envolvidas nessa interação, como a presença de papilas vibratórias que produzem som (DeVries 1990, 1991). A mirmecofilia ocorre principalmente em espécies da tribo Nymphidiini (Riodininae), sendo encontrada em cerca de 30% das espécies da subfamília Riodininae (DeVries 1997). Já existem algumas hipóteses filogenéticas para Riodinidae (Harvey 1987, Campbell & Pierce 2003, Saunders 2010), porém as relações não estão ainda totalmente esclarecidas dentro da família. Atualmente, são reconhecidas três subfamílias em Riodinidae: Riodininae, Euselasiinae e Nemeobiinae; sendo Riodininae a que possui a maior riqueza (Hall 2004). Atualmente, Riodininae está dividida em sete tribos, entre elas a tribo Stalachtini, composta apenas pelo gênero Stalachtis (= Nerias Boisduval, 1836) Hübner 1818 (Callaghan & Lamas 2004, Hall 2006). Mesmo assim, o status da tribo Stalachtini provavelmente será alterado, já que alguns estudos moleculares mais recentes mostram que Stalachtis está dentro da tribo Nymphidiini (Saunders 2010, Seraphim et al. in prep.).

O gênero Stalachtis

Stalachtis é um gênero de borboletas que ocorre na América Central e do Sul, sendo portanto restrita à região Neotropical. Todas as espécies do gênero Stalachtis apresentam padrões aposemáticos, e participam de anéis miméticos com outras espécies de borboletas (Seitz 1916–20, D'Abrera 1994). O gênero possui sete espécies descritas atualmente (Callaghan & Lamas 2004), entretanto já foram reconhecidas até 10 espécies dentro de Stalachtis. Isso demonstra uma certa incerteza taxonômica, em especial no caso de espécies previamente sinonimizadas por Stichel (1910-11) e Callaghan & Lamas (2004). Bates em 1861, propôs uma subfamília dentro de Erycinidae, chamada Stalachtinae. A característica que definia essa subfamília era a presença de uma “pupa não achatada inferiormente, firmemente fixadas pela cauda em uma posição inclinada, sem cinta”, entretanto o próprio Bates em 1868 descobriu que esses caracteres não eram informativos para a classificação taxônomica das subfamílias em Riodinidae (Hall 2006). E mais recentemente, Callaghan (1985) mostrou que a pupa de Stalachtis susanna possui sim uma cinta. 2

Já a tribo Stalachtini foi definida por Stichel (1910-11), que inclui apenas o gênero Stalachtis, assim como Bates (1861). Stichel definiu duas seções dentro do grupo, sendo a primeira chamada “Adiorati” e dividida em dois subgrupos assim constituídos: 1) S. calliope (Linnaeus, 1758) e S. magdalena Westwood, 1851; e 2) S. phlegia (Cramer, 1779), S. susanna (Fabricius, 1787) (que foi sinonimizada com S. phlegia) e S. euterpe (Linnaeus, 1758). A segunda seção foi denominada “Diaphanes”, e incluia S. phaedusa (+ S. zephyritis (Dalman, 1823), sinonimizada com S. phaedusa) e S. lineata (Guérin-Méneville, [1844]). Em 1987, Harvey definiu uma sinapomorfia para a tribo: a presença de um tufo de cerdas longas em torno da margem posterior do oitavo segmento abdominal nos machos (muitas vezes também presente nas fêmeas). Foi sugerido que essas cerdas modificadas tenham uma função de defesa, pois são presentes tanto em machos quanto fêmeas (Müller 1877, Hall & Harvey 2002), entretanto não foram feitos estudos aprofundados sobre essas cerdas ou suas funções em Stalachtis. Hall e Harvey em 2002 mostraram a presença de escamas androconiais pretas na face dorsal das asas posteriores dos machos da sub-espécie Stalachtis phaedusa zephyritis (Dalman,1823), as escamas androconiais têm função de liberar odores ou ferômonios que modificam o comportamento das fêmeas (Hall 2002). Outra característica que diferencia as Stalachtis de outros riodinídeos ocorre nas asas posteriores, as veias Rs e a M1 se iniciam unidas na célula discal, enquanto que na maioria dos riodinídeos essa veias são separadas (Harvey 1987, Bates 1868, Stichel 1910– 11). A figura I-1 (adaptada de Harvey, 1987) mostra o padrão de venação alar de S. susanna. Entretanto, essa característica também ocorre em Hamearinae e nos gêneros Corrachia (Corrachiinae) e Styx (Styginae), grupos de riodinídeos filogeneticamente distantes de Stalachtis, por isso presume-se que esse caráter em Stalachtis seja uma homoplasia (Harvey 1987). As lagartas de Stalachtis são gregárias e se alimentam de plantas da família Simaroubaceae (Callaghan 1985), entretanto na literatura já surgiram registros de outras plantas hospedeiras, tais como Sapotaceae (Harvey 1987) e Andira sp. (Leguminosae) (Callaghan 1985), porém esses registros possivelmente são má identificação taxonômica da planta hospedeira (Kaminski, com. pess.). As plantas da família Simaroubaceae apresentam fitoquímicos tóxicos e de sabor amargo (Alves 2014), sugerindo que as lagartas de Stalachtis podem ser impalatáveis. Kaminski et al. (in prep.), encontraram

3 evidências de mirmecofilia em Stalachtis phlegia e Stalachtis lineata, enquanto que Callaghan em 1985 não encontrou formigas junto com os indivíduos de Stalachtis phlegia susanna. Não existem informações sobre mirmecofilia para outras espécies do gênero. Entretanto, é importante ressaltar que muitas das borboletas da tribo Nymphidiini são mirmecófilas (DeVries 1997), e essa seria uma característica em comum entre Nymphidiini e Stalachtini (considerendo-se que Stalachtini é parte de Nymphidiini). Callaghan em 1985 verificou que as lagartas de S. susanna sem alimento empuparam antes do tempo esperado e quando os adultos emergiram eram menores do que aqueles que tiveram acesso normal ao alimento. Esse fenômeno pode explicar a grande variação no tamanho de borboletas adultas encontradas no gênero, sendo que indivíduos “anões” já foram encontrados para a maioria das espécies, e até nomeados (como S. susanna pygmaea descrita por d’Almeida 1922). Hall e Willmott (2000) fizeram um estudo sobre a alimentação de borboletas adultas Riodinidae no Equador. Nele, as borboletas estudadas do gênero Stalachtis apresentaram a maior área alar por volume do tórax entre todos os riodinídeos. Essa alta proporção está relacionada com borboletas que voam devagar, como já foi descrito para Stalachtis phlegia susanna (Callaghan 1986), e que provavelmente tem uma menor taxa metabólica enquanto voam. Em geral, esse grupo de borboletas vive no sub-bosque e não possuem grandes áreas territoriais. Além disso, essa alta taxa área alar: volume torácico está relacionada com os riodinídeos aposemáticos ou miméticos como: Ithomiola (incertae sedis), Themone (Riodinini), Pheles (Riodinini), Xynias, Mesene (Symmachiini), e Stalachtis (Stalachtini). A figura I-2 apresenta exemplares das espécies de Stalachtis obtidas para ilustrar a diversidade de padrões alares encontrados dentro do gênero. Atualmente são reconhecidas 7 espécies no gênero com suas 19 subespécies (Callaghan & Lamas 2004, Warren et al. 2013), o tipo do gênero foi definido por Hemming (1967) que escolheu Stalachtis phaedusa (Hübner, [1813]):

Stalachtis Hübner, 1818  Nerias Boisduval, 1836 Stalachtis calliope (Linnaeus, 1758) (Papilio) Stalachtis calliope calliope (Linnaeus, 1758) (Papilio)

 eugenia (Cramer, 1777) (Papilio)  f. crocota Stichel,1911  f. terpsichore Seitz, 1917  f. melini Bryk, 1953 Stalachtis calliope bicoler Staudinger, [1887]  calliope var. bicolor Staudinger, 1888 Stalachtis calliope voltumna Stichel, 1911  f. picturata Stichel, 1911 Stalachtis magdalena (Westwood, [1851]) Stalachtis magdalena magdalena (Westwood, [1851]) Stalachtis magdalena cleove Staudinger, 1888 Stalachtis phlegia (Cramer, 1779) (Papilio) Stalachtis phlegia phlegia (Cramer, 1779) (Papilio) Stalachtis phlegia nocticoelum Seitz, 1917 Stalachtis phlegia phlegetontia (Perty, 1833) (Acraea)  phlegia f. irion Seitz, 1917  phlegia coronis Stichel, 1929 Stalachtis phlegia susanna (Fabricius, 1787) (Papilio)  meriana (Eschscholtz, 1821) (Mechanitis)  ab. pygmaea d’Almeida, 1922 Stalachtis phlegia venezolana Seitz, 1917 Stalachtis euterpe (Linnaeus, 1758) (Papilio) Stalachtis euterpe euterpe (Linnaeus, 1758) (Papilio) Stalachtis euterpe adelpha Staudinger, 1888 Stalachtis euterpe latefasciata Staudinger, 1888 Stalachtis phaedusa (Hübner, [1813]) (Nëreis [sic]) Stalachtis phaedusa phaedusa (Hübner, [1813]) (Nëreis [sic]) Stalachtis phaedusa duvalii (Perty, 1833) (Heliconius)  phaedusa var. egaensis H. W. Bates, 1861 Stalachtis phaedusa exul Seitz, 1917 Stalachtis phaedusa phaloe Staudinger, [1887]  phaedusa f. vidua Stichel, 1916

Stalachtis phaedusa trangeri Schaus, 1928 Stalachtis phaedusa zephyritis (Dalman, 1823) (Papilio)  margarita (C. Felder & R. Felder, 1865) (Nerias)  evelina Butler, 1870 Stalachtis lineata (Guérin-Méneville, [1844]) (Nerias)  trailii Butler, 1877  f. boyi Stichel, 1925 Stalachtis halloweeni Hall, 2006

Em vermelho estão as sinonímias.

Hall (2006) propôs uma hipótese filogenética para o gênero com base em caracteres morfológicos de asa e genitália masculina. Neste trabalho, S. phlegia foi sugerida como sendo espécie irmã de todas as outras, devido as características da genitália e da asa consideradas plesiomórficas. Adicionalmente, S. calliope e S. magdalena foram consideradas espécies irmãs com base na similaridade de padrão alar e das genitálias masculinas. As espécies Stalachtis euterpe, S. phaedusa e S. lineata foram agrupadas em um clado com base também no padrão alar (o padrão raiado), com S. phaedusa e S. lineata consideradas espécies irmãs por apresentarem esse padrão mais similar. Finalmente, S. halloweeni foi posicionada como grupo irmão do clado acima. Baseado nessa hipótese, Hall (2006) definiu três grupos dentro de Stalachtis: 1) o “grupo phlegia”, constituído apenas por S. phlegia; 2) o “grupo calliope”, para S. calliope e S. magdalena; e 3) o “grupo euterpe”, constituído por S. halloweeni, S. euterpe, S. phaedusa e S. lineata. Para efeitos de comparação, a figura I-3 mostra dois cladogramas um representando a organização de Stichel (1910-1911) e outro para a hipótese de Hall (2006).

Stalachtis e o Mimetismo

Em 1862, H. W. Bates publicou um artigo clássico sobre mimetismo, no qual ele demonstrou a semelhança nos padrões de coloração ou em voo, entre borboletas

6 amazônicas não aparentadas. Neste estudo, foi sugerido que algumas borboletas poderiam imitar os padrões de coloração de outras espécies que tivessem características desagradáveis (impalatáveis), sendo que as primeiras enganariam assim seus predadores, ganhando uma vantagem óbvia sobre as não imitadoras (menor taxa de predação). Assim o mimetismo seria uma adaptação dos organismos ao ambiente que permitiria uma maior sobrevivência, mostrando como a seleção natural pode agir selecionando caracteres morfológicos adaptativos (Joron 2008). Ainda que muitos estudos sobre o mimetismo batesiano tenham sido realizados após Bates, poucos estudos de campo conseguiram efetivamente demonstrar a proteção que o mimetismo batesiano confere contra predadores (Jeffords et al. 1979). Por outro lado, muitos estudos mostraram que predadores que experimentaram modelos impalatáveis aprendem a evitar mímicos palatáveis (Brower 1958, Platt et al. 1971). Um ponto importante é que a eficiência do mimetismo batesiano é dependente da abundância dos modelos e mímicos, sendo que o mímico deve ser mais raro que o modelo (Ruxton et al. 2004). Dezesseis anos depois de Bates publicar seu artigo, Müller (1878) publicou uma explicação sobre a presença de diversas espécies impalatáveis que vivem juntas e apresentam o mesmo padrão de coloração: espécies impalatáveis não aparentadas também poderiam convergir para um mesmo padrão aposemático para dividir os custos do aprendizado do predador, ou seja, o predador teria que aprender menos padrões, consequentemente o aprendizado dele seria mais rápido, de forma que menos indivíduos seriam atacados das duas espécies co-miméticas. Vários estudos com borboletas neotropicais provaram em campo que há benefício em manter o mesmo tipo de coloração em espécies impalatáveis. Um dos primeiros estudos nessa linha foi o trabalho de Benson (1972) na Costa Rica com a espécie Heliconius erato. Seguem-se a este o importante trabalho de Mallet e Barton (1989), com diferentes formas de H. erato, e o experimento de Kapan (2001) com as formas amarela e branca de H. cydno e os seus co-modelos amarelo (H. eleuchia) e branco (H. sapho). Embora o mimetismo batesiano e o mülleriano sejam geralmente considerados fenômenos diferentes, é importante ressaltar que essa divisão pode ser artificial, como sugerem alguns trabalhos que propõem o mimetismo quasi-Batesiano, que mostram que existe um espectro de palatabilidade entre os indivíduos (Turner 1984,

Huheey 1988, Speed & Turner 1999). Para definir formalmente o mimetismo, Vane-Wright (1980) propôs uma definição ampla separando mimetismo da camuflagem (uma adaptação que é muitas vezes confundida com o mimetismo). No trabalho acima, mimetismo foi definido como envolvendo um organismo (doravante mímico), o qual simula algum sinal de um outro organismo (o modelo), sendo que esse sinal deve ser importante para um terceiro organismo (o operador). Assim o mímico tem sua adaptabilidade aumentada, pois o operador o confunde com o modelo. A camuflagem é definida como a simulação de algo desinteressante ao operador, o que permite ao organismo camuflado passar despercebido. O exemplo mais estudado de mimetismo mülleriano é a similaridade entre as borboletas impalatáveis do gênero Heliconius e da subtribo Ithomiini (Nymphalidae: Danainae) na América do Sul. Nesse gênero ocorrem várias formas e espécies que se assemelham entre si localmente. Esses conjuntos de borboletas são chamados de “anéis miméticos”, sendo que nos neotrópicos existem diversos anéis diferentes, os mais comuns sendo o ‘tigrado’, o ‘vermelho’, o ‘azul’, o ‘laranja’, o ‘transparente’ e o ‘verde’ (Papageorgis 1975, Mallet & Gilbert, 1995, Beccaloni 1997) Esses anéis contêm além de borboletas Heliconius, outras espécies de lepidópteros e até outras ordens de insetos (Beccaloni 1997). DeVries (1997) sugere que muitas borboletas da família Riodinidae participem de anéis miméticos, sendo elas tanto modelos impalatáveis quanto mímicos palatáveis, embora poucos estudos rigorosos sobre mimetismo em riodinídeos tenham sido feitos até agora. O gênero neotropical Stalachtis apresenta algumas características típicas de borboletas miméticas: os adultos são aposemáticos, possuem voo lento e são acompanhados localmente por outras espécies de lepidópteros com padrões alares similares. Como exemplo, as espécies S. calliope e S. magdalena apresentam padrão tigrado similar ao de diversos itomíneos e heliconíneos simpátricos a estas (D’Abrera 1994). Outras espécies como S. euterpe, S lineata e S. phaedusa têm asas raiadas com listras pretas em fundo branco ou azul claro, ou mesmo transparentes, similar ao padrão encontrado em diversos Ithomiini de subbosque. Kaye (1904) mostrou um anel mimético em Potaro Road, na Guiana, no qual participavam diversos itomíneos transparentes, algumas mariposas Dioptinae (Lepidoptera: Noctuoidea: Notodontidae), e também

Stalachtis phaedusa e S. evelina (esta última sinonimizada com S. phaedusa). Finalmente, o padrão laranja e preto com pontos brancos de S. phlegia é imitado por riodinídeos do gênero Lemonias (L. sontella e L. stalachtioides) em áreas de cerrado aberto, configurando um possível caso de mimetismo (D’Abrera 1994). Bates já sugeria que muitas borboletas amazônicas deveriam ser miméticas do gênero Stalachtis, incluindo Ithomeis aurantiaca mimica H. Bates, 1862 (Riodinidae) que possui cores muito parecidas com S. euterpe, e Dismorphia theucharila lysinoe (Hewitson, [1853]) (Pieridae) que deveria quando em voo, imitar Stalachtis phaedusa duvalii (Perty, 1833). Também foi reportada a semelhança entre a rara Eueides lampeto lampeto H. Bates, 1862 (Nymphalidae: Heliconiinae) e a comum S. calliope. A maioria dos exemplos de mimetismo apresentados por Bates tinham como modelo espécies de itomíneos, entretanto esses exemplos com modelos do gênero Stalachtis chamaram a atenção de Bates, pois mostravam que o padrão de coloração do mímico depende principalmente da localidade, sendo que a borboleta modelo poderia variar até de família de acordo com a região. Ainda que a natureza do mimetismo de Stalachtis não seja conhecida, algumas evidências apontam para estas como modelos impalatáveis. Uma evidência é o gregarismo das lagartas de S. phlegia e S. susanna, as quais se alimentam de plantas hospedeiras da família Simaroubaceae que sabidamente possuem compostos secundários tóxicos (Callaghan 1985, Hall 2006). Outra evidência (já citada acima) é o voo lento de todas as espécies conhecidas (Callaghan 1986), um comportamento típico de borboletas impalatáveis. Por fim, o fato de que muitas espécies são localmente abundantes (incluindo a rara e localizada S. halloweeni) se encaixa com a possibilidade de que estas sejam modelos. Como apresentado até aqui, existe muito pouca informação sobre o gênero Stalachtis em todos os níveis (ecologia, taxonomia e história natural). Por isso, o primeiro objetivo do presente trabalho é esclarecer as relações filogenéticas dentro de Stalachtis. Com isso poderemos rever a taxonomia e as sinonimizações específicas feitas, mantendo a taxonomia adequada à evolução do gênero. Com a hipótese filogenética produzida, será possível se propor uma hipótese para a evolução dos padrões de coloração aposemáticos dentro de Stalachtis, avaliando se as espécies mais próximas possuem o mesmo padrão filogenético – ou seja, o padrão evoluiu apenas uma vez – ou se não há relação entre os

9 padrões aposemáticos e a filogenia – os padrões similares são convergentes.

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Figuras

Figura I-1. Desenho adaptado de Harvey (1987) da asa de Stalachtis susanna com a nomenclatura proposta por Miller (1970).

Figura I-2. Fotos de vouchers utilizados representando as espécie do gênero Stalachtis.

Figura I-3. Filogenias para o gênero Stalachtis, primeiro a classificação de Stichel (1910- 1911) e o segundo apresentando a hipótese filogenética de Hall (2006).

CAPÍTULO ÚNICO

FILOGENIA MOLECULAR E DELIMITAÇÃO DAS ESPÉCIES DO GÊNERO

STALACHTIS HÜBNER, 1818 (LEPIDOPTERA: RIODINIDAE)

INTRODUÇÃO

Atualmente, Stalachtis Hübner, 1818 é o único gênero da tribo Stalachtini, dentro da subfamília Riodininae (Riodinidae) (Callaghan & Lamas 2004). Todas as espécies do gênero Stalachtis apresentam padrões aposemáticos, e participam de anéis miméticos envolvendo outras espécies de lepidópteros (Seitz 1916–20, D'Abrera 1994). O gênero possui sete espécies descritas atualmente (Callaghan & Lamas 2004), entretanto já foram reconhecidas até 10 espécies dentro de Stalachtis (Hall 2006). O gênero Stalachtis ocorre desde o Panamá até o sudeste do Brasil, sendo restrito à região Neotropical. Ele foi caracterizado pela presença de um tufo de longas cerdas em volta da margem posterior do oitavo segmento abdominal nos machos (Harvey 1987). As lagartas conhecidas de Stalachtis são gregárias e se alimentam de plantas da família Simaroubaceae (Callaghan 1986) que apresentam fitoquímicos tóxicos e de sabor amargo (Alves 2014), sugerindo que as lagartas de Stalachtis poderiam ser impalatáveis. Desde Bates (1861), já existem trabalhos que sugerem que as borboletas do gênero Stalachtis seriam modelos miméticos impalatáveis (Seitz 1916–20, D'Abrera 1994), mas esse fato carece de comprovação. As borboletas desse gênero apresentam um certo grau de variação nos padrões alares dentro das espécies, por isso, mesmo sendo um gênero pequeno de riodinídeos, 19 subespécies são reconhecidas para Stalachtis (Callaghan & Lamas 2004, Warren et al. 2013), sendo que algumas dessas foram descritas originalmente como espécies. Este é o caso de Stalachtis phlegia susanna (Fabricius, 1787) e Stalachtis phaedusa zephyritis (Dalman, 1823). Além disso, algumas espécies foram sinonimizadas como o caso de Stalachtis terpsichore Seitz, 1917 que atualmente é um sinônimo de Stalachtis calliope calliope (Linnaeus, 1758) (Callaghan & Lamas 2004). Esses exemplos mostram que apesar de ser um gênero pequeno e relativamente bem conhecido, ainda existem questões básicas taxonômicas a serem investigadas em Stalachtis.

O primeiro trabalho taxonômico sobre Stalachtis foi publicado em 1861 (Bates 1861), no qual o autor propôs uma subfamília dentro de Erycinidae (= Riodinidae), chamada Stalachtinae. Esta subfamília foi proposta com base em características da pupa que o próprio autor posteriormente indicou como não informativos para classificação de Riodinidae (Bates 1867-1868, Hall 2006). Após esse primeiro estudo, Stichel (1910-11) definiu a tribo Stalachtini, contendo apenas o gênero Stalachtis, assim como Bates (1861). No trabalho mais recente sobre Stalachtis, Hall (2006) descreveu uma nova espécie - Stalachtis halloweeni - além de propor uma hipótese filogenética baseada em caracteres das asas e da genitália masculina para o gênero. Nessa hipótese, ele dividiu o gênero em três grupos: 1) grupo “phlegia” composto apenas pela espécie S. phlegia, 2) grupo “calliope” para S. calliope e S. magdalena, e 3) grupo “euterpe” composto por S. euterpe, S. phaedusa, S. lineata e S. halloweeni. Ainda não existe uma filogenia formal proposta para Stalachtis, e filogenias moleculares são ótimas ferramentas para resolver problemas taxonômicos em grupos pouco conhecidos (Damm et al. 2010). Mais ainda, marcadores moleculares têm sido amplamente utilizados para identificação de novas espécies de borboletas (alguns exemplos são: Burns et al. 2013, Aguila et al. 2013, Seraphim et al. 2014). Por isso, o objetivo desse trabalho é inferir uma hipótese filogenética molecular adequada para o gênero, que também poderá ser usada para delimitar as espécies descritas. Entre os animais, um dos marcadores mais utilizados para identificação e delimitação de espécies é a porção 5’ do gene mitocondrial citocromo oxidase sub- unidade I (COI) – a “região barcode”. Hebert et al. (2003) propuseram o uso desse marcador devido a região ser codificante de uma proteína com a sequência de aminoácidos razoavelmente conservada, e por possuir diferenças suficientes para separar espécies próximas, com a premissa que a variação intraespecífica nesta região seria menor que aquela entre espécies (Hebert et al. 2003 e 2004). Desde então, a região barcode têm sido utilizada como marcador molecular em muitos trabalhos taxonômicos e filogenéticos, entretanto existe um grande debate e críticas com relação a utilização e eficiência deste marcador como delimitador e identificador de novas espécies (Williams & Knowlton 2001, Meyer & Paulay 2005, Brower 2006, Hickerson et al. 2006, Wiemer & Fiedler 2007, Townzen et al. 2008, Brower

2010). É importante ressaltar que para borboletas em particular e Lepidópteros em geral, as revisões mais recentes mostram o uso da região barcode – aliada com outros marcadores ou caracteres morfológicos – como uma ferramenta adequada para a identificação de espécies e para estudos de sistemática molecular (Silva-Brandão et al. 2009). Atualmente a forma mais aceita de se delimitar e descrever espécies é o uso de várias fontes de evidências – morfológicas, ecológicas, biogeográficas, reprodutivas e genéticas – na delimitação de espécies, denominada taxonomia integrativa (DeSalle et al. 2005, Dayrat 2005, Will et al. 2005, Padial et al. 2010). Visto isso, esse trabalho propõe o uso de caracteres tanto morfológicos quanto moleculares para delimitar as espécies de Stalachtis. Nessa conjuntura, esse trabalho tem como objetivo propor uma filogenia para as espécies do gênero Stalachtis com base em marcadores moleculares – o gene COI e três genes nucleares. Como esse é o primeiro estudo desse tipo para Stalachtis, nossos objetivos específicos são: 1) inferir uma hipótese filogenética molecular para o gênero; 2) avaliar se o gênero é monofilético; e 3) investigar a distribuição geográfica das espécies do gênero. Com esses dados, podemos testar os grupos propostos baseados em caracteres morfológicos por Hall (2006) para o gênero Stalachtis. Além do estudo filogenético proposto, será avaliada a variabilidade genética das espécies do gênero Stalachtis e será proposta uma classificação das espécies do gênero com base nas evidências moleculares, biogeográficas e morfológicas.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem taxonômica

Foram obtidos 100 indivíduos adultos de todas as sete espécies descritas para o gênero, representando pelo menos 10 subespécies (Tabela II-1). Os padrões alares dos indivíduos foram comparados com as fotos dos tipos das espécies no site “Illustrated lists of American butterflies” (Warren et al. 2013) além dos tipos encontrados no museu de História Natural de Londres, Inglaterra (BMNH). Assim foi possível uma identificação morfológica das subespécies presentes. Todos os indivíduos coletados foram armazenados em freezer a -20 °C até o momento do processamento, quando duas pernas foram removidas para a extração do

DNA total. Após a obtenção do DNA, todos os indivíduos foram montados e receberam um código único de identificação, sendo depois depositados no Museu de Zoologia da Universidade Estadual de Campinas, Unicamp, Campinas, São Paulo (ZUEC) como material testemunho. Material adicional também foi obtido das seguintes coleções: ZUEC-AVLF - Coleção André V. L. Freitas, UFMG - Coleção Entomológica da Universidade Federal de Minas Gerais, e DZUP - Departamento de Zoologia da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná. Algumas das amostras procedentes da Colômbia estão depositadas no “Museo Entomológico Francisco Luis Gallego” (UNCM— Universidad Nacional de Colombia) em Medellín, na Colômbia.

Tabela II-1. Dados de coleta dos indivíduos de Stalachtis utilizados. Extração Espécie Coletor Localidade BLU-164 Stalachtis calliope AVL Freitas Foz do Acúria, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-165 Stalachtis calliope AVL Freitas Foz do Breu, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-166 Stalachtis euterpe AVL Freitas Foz do Breu, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-167 Stalachtis euterpe AVL Freitas Foz do Breu, Marechal Thaumaturgo - AC BLU-168 Stalachtis phlegia LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-169 Stalachtis phlegia LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-170 Stalachtis phlegia LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-171 Stalachtis phaedusa LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-172 Stalachtis phaedusa LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-173 Stalachtis lineata LA Kaminski Porto de Moz – PA BLU-175 Stalachtis phlegia AVL Freitas Mata do Jiqui Parnamirim, Natal - RN BLU-176 Stalachtis phlegia AVL Freitas Mata do Jiqui Parnamirim, Natal - RN BLU-182 Stalachtis euterpe D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-183 Stalachtis euterpe D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-184 Stalachtis euterpe D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-185 Stalachtis calliope D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-186 Stalachtis calliope D Dolibaina Mâncio Lima – AC BLU-228 Stalachtis phlegia M Uehara-Prado Aragão, Paranaíta – MT BLU-229 Stalachtis lineata M Uehara-Prado Nilo, Paranaíta – MT BLU-253 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Caraça, Catas Altas - MG BLU-254 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Caraça, Catas Altas - MG BLU-255 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Caraça, Catas Altas - MG BLU-306 Stalachtis phlegia LA Kaminski Serra do Amolar, Cáceres – MS BLU-307 Stalachtis phlegia M Uehara-Prado Três Lagoas – MS BLU-347 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-348 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-349 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-350 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA

BLU-351 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-352 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-353 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-354 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-355 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-356 Stalachtis lineata DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-357 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-358 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-359 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-360 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-361 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-362 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-363 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-364 Stalachtis terpsichore DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-365 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-386 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-387 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-388 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-389 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-437 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-438 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-439 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-440 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-441 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-443 Stalachtis euterpe AVL Freitas Pq. Nac. Serra do Divisor, Mâncio Lima - AC BLU-458 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-459 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-460 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-461 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-473 Stalachtis calliope KS Brown Alto do Cristalino, Alta Floresta - Mt BLU-491 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-492 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-503 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-504 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-505 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-506 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-507 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-508 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-509 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-513 Stalachtis phaedusa DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-514 Stalachtis terpsichore DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-515 Stalachtis euterpe DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-516 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Rola-Moça, Ibirité - MG BLU-517 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Rola-Moça, Ibirité - MG

BLU-518 Stalachtis susanna LA Kaminski Serra do Rola-Moça, Ibirité - MG Pq. Nac. da Chapada dos Guimarães, BLU-519 Stalachtis phlegia LA Kaminski Chapada dos Guimarães – MT BLU-520 Stalachtis phlegia LA Kaminski Est. Eco. Serra das Arararas, Cáceres - MT BLU-521 Stalachtis phlegia LA Kaminski Panamirim, Natal – RN BLU-537 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-538 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-539 Stalachtis terpsichore DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-540 Stalachtis calliope DB Ribeiro Rio Tapajós, Itaituba – PA BLU-611 Stalachtis magdalena M Marín Puerto Berrio, Antioquia - Colômbia BLU-647 Stalachtis sp. K Willmott Morona-Santiago, Macas - Equador BLU-648 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA BLU-649 Stalachtis lineata R Rogner Oriximiná – PA BLU-650 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA BLU-651 Stalachtis phlegia R Rogner Pto Parada, Lagoa Seca, Manaus - AM BLU-652 Stalachtis euterpe R Rogner Rio Tapajós, Itaituba - PA BLU-653 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA BLU-654 Stalachtis lineata R Rogner Oriximiná – PA BLU-655 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA BLU-656 Stalachtis calliope R Rogner Reserva da Campina, Manaus - AM BLU-657 Stalachtis phlegia R Rogner Oriximiná – PA BLU-673 Stalachtis susanna KS Brown Pindamonhangaba - SP BLU-691 Stalachtis phlegia LA Kaminski Mata do Jiqui Parnamirim, Natal - RN BLU-692 Stalachtis susanna G Acácio Reserva Biológica de Uma - BA BLU-693 Stalachtis phlegia E Araújo Fazenda Buritirana, Peri Mirim - MA BLU-694 Stalachtis phlegia E Araújo Fazenda Buritirana, Peri Mirim - MA BLU-695 Stalachtis phlegia E Araújo Fazenda Buritirana, Peri Mirim - MA BLU-698 Stalachtis halloweeni M Costa Serra de Lema, Bolivar - Venezuela BLU-699 Stalachtis halloweeni M Costa Serra de Lema, Bolivar - Venezuela BLU-704 Stalachtis susanna KS Brown Serra Grande, Uruçuca - BA

Técnicas moleculares

O DNA genômico total foi extraído utilizando três kits de extração diferentes. Nas primeiras amostras extraídas, até março de 2014, foi utilizado o kit e o protocolo do Invisorb Spin Tissue Mini Kit, e para as amostras extraídas mais recentemente o kit illustra tissue and cells genomic Prep Mini Spin Kit da GE foi utilizado, enquanto que o kit DNeasy Blood & Tissue Kit da Qiagen foi utilizado para amostras de exemplares mais antigos ou de museus. O uso de kits para a extração de DNA é comum entre os estudos moleculares com borboletas (Wahlberg et al. 2003). O DNA purificado foi armazenado em tampão TE a – 20 °C.

Quatro marcadores moleculares foram utilizados neste estudo: um gene mitocondrial, citocromo oxidase sub-unidade I (COI) (1.500 pares de bases (pb)), e três genes nucleares codificantes de proteínas; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (691 pb), o domínio proteico da carbamoil-fosfato sintase (CAD) (803 pb) e a proteína ribossomal S5 (RPS5) (613 pb). Esses quatro marcadores foram escolhidos por serem amplamente utilizados em estudos filogenéticos com borboletas (Leneveu et al. 2009, Kondaramaiah & Wahlberg 2009). A tabela II-2 exibe os primers utilizados para cada gene nas reações de amplificação. Os primers para os genes nucleares e a segunda metade do COI têm adicionado as caudas universais T7 (Direto) e T3 (Reverso), apresentadas na tabela. Isso permite que o sequenciamento seja feito utilizando as caudas independente do marcador, facilitando a reação de sequenciamento. Os primers aqui utilizados e os seus protocolos foram descritos em Wahlberg & Wheat (2008). As reações de PCR para a amplificação da região terminal 5’ do COI (região de aproximadamente 640pb chamada de DNA Barcode) foram padronizadas para um volume final de 25μL. A soluções continham 14,3μL de H2O milli-q, 2,5μL de solução tampão (500 mM KCl), 0,5μL de DNTPs com a concentração final de 40μM, 2,5μL de BSA (0,5mg/mL), 2μL de MgCl2 (2mM), 0,5μL de cada primer (5pMol), 0,2μL de Taq DNA- Polimerase (Invitrogen) (1U) e 2 μL do DNA extraído. A amplificação no termociclador era iniciada por 95°C por 5 minutos, depois 35 ciclos com três temperaturas, sendo elas 94°C por 30 segundos, 45°C por um minuto e 72°C por um minuto e meio, após os ciclos uma extensão final de 72°C por 10 minutos era feita. Para os genes nucleares GAPDH e RPS5 e para a segunda região do gene COI, as reações de PCR foram padronizadas para um volume final de 20μL. As soluções continham 9,6μL de H2O, 2,0μL de solução tampão (500 mM KCl), 1,0μL de DNTPs (40μM), 2,0μL de BSA (0.5mg/mL), 1,2μL de MgCl2 (2mM), 0,4μL de cada primer (0.2pMol), 0,4μL de Taq DNA-Polimerase (Invitrogen) (2U) e 3 μL do DNA extraído. O programa no termociclador era iniciado por 95°C por 5 minutos, depois 35 ciclos com três temperaturas, sendo elas 94°C por 30 segundos, 52°C por um minuto (50° C para a segunda metade do COI) e 72°C por um minuto e meio, após os ciclos uma extensão final de 72°C por 10 minutos era feita. Para o gene CAD, a reação de PCR tinha um volume final de 20μL. As soluções continham 9,1μL de H2O, 2,0μL de solução tampão NH4, 1,6μL de DNTPs, 2,4μL de MgCl2

(4mM), 0,8μL de cada primer (0,4pMol), 0,3μL de Taq DNA-Polimerase (Invitrogen) (1,5U) e 3μL do DNA extraído. O programa da reação foi 95° C por 5 minutos, 40 ciclos de três temperaturas sendo elas, 95°C por 45 segundos, 55°C por um minuto, 72°por um minuto e meio e uma extensão final de 10 minutos a 72°. Para verificar o resultado das reações foi feita uma eletroforese em gel de agarose 1%, utilizando 3 μL de cada reação de PCR corado com uma solução de azul de metileno e GelRed™ (Biotium). O produto final dos PCRs foi purificado com dois protocolos diferenciados, para o COI e para as amplificações com alto rendimento aplicou-se o protocolo Exonuclease-1 e Fast-AP (Werle et al. 1994). Enquanto que para reações com menor rendimento foi empregado o kit illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification da GE de purificação, que permite concentrar a amostra em menor volume. O sequenciamento foi feito tanto no sentido direto quanto reverso para todos os genes analisados. A reação de sequenciamento possuía um volume final de 3μL do PCR purificado, e 1μL do primer (5mMol). As sequências obtidas foram visualizadas no programa FinchTV (Geozpisa), além disso foram analisadas no programa Geneious versão 6 (http://www.geneious.com, Kearse et al. 2012), as sequências foram alinhadas diretamente no programa BioEdit (Hall 1999), já que todos os marcadores utilizados são genes codificantes de proteínas e apresentam a estrutura de códons conservada (Wahlberg 2014).

Tabela II-2. Lista dos primers desenhador por Wahlberg & Wheat (2008) utilizados para amplificação dos genes neste trabalho.

Gene Nome Sequência 5’-3’ LCO F GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Nancy- Barcode (COI) R CCTGGTAAAATTAAAATATAAACTTC mod HCO R TAAACTTCAGGGTGACCAAAAA ATCA

HybJerry F CAACAYTTATTTTGATTTTTTGG Segunda região do COI HybPat R ATCCATTACATATAATCTGCCATA HibFrigga F AARGCTGGRGCTGAATATGT GAPDH HibBurre R GWTTGAATGTACTTGATRAGRTC RPS5 HibRPS5F F ATGGCNGARGARAAYTGGAAYGA

HibRPS5R R CGGTTRGAYTTRGCAACACG CAD743nF F GGNGTNACNACNGCNTGYTTYGARCC CAD CAD1028R R TTRTTNGGNARYTGNCCNCCCAT Caudas para T7 F TAATACGACTCACTATAGGG Sequenciamento T3 R ATTAACCCTCACTAAAG

Análises de distância genética

Para uma análise inicial das sequências e dos marcadores utilizados, foram estimadas árvores de Neighbor-Joining (doravante NJ) para cada marcador separadamente no programa Mega versão 6.0 (Tamura et al. 2013). Os modelos evolutivos foram testados no próprio programa utilizando o critério de informação Bayesiano. O suporte de cada ramo foi determinado com o procedimento não paramétrico boostrapping (Felsenstein, 1985), com 5000 réplicas. As medidas de distância genética da região barcode foram feitas entre todos os indivíduos também no programa Mega versão 6.0 (Tamura et al. 2013), utilizando o modelo sugerido pelo Barcode of Life Data System (BOLD) para essa região (Ratnasingham & Hebert 2007), Kimura-2-Parâmetros (K2P; Kimura 1980). Todas as posições nas quais haviam bases faltando foram removidas da matriz. Além disso uma análise para medir as distâncias entre espécies e intraespecífica foi feita também no programa Mega versão 6.0, com os mesmos parâmetros. O programa R foi utilizado para a produção dos histogramas da distribuição das frequências intraespecífica e interespecífica para verificar se há um gap entre essas distâncias (Meyer & Paulay 2005). Outro método que foi utilizado para se avaliar a variabilidade genética das espécies foi o uso de redes de haplótipos – “minimum spanning network”, estas foram construídas para cada marcador utilizando o programa TCS 1.21 (Clement et al. 2000), seguindo as configurações padrões do programa. O programa TCS faz uma análise de parcimônia que estima as relações entre os haplótipos, a rede produzida mostra as diferenças mutacionais entre eles. Essa análise usa o critério de parcimônia, por isso ela resulta no número máximo de mutações que poderiam conectar as sequências abaixo do limite de 95% (Clement et al. 2000).

Análises filogenéticas

A matriz total incluiu 100 indivíduos de Stalachtis, além de três indivíduos para serem usados como grupos externos, incluindo Protonymphidia senta, o grupo irmão de Stalachtis (Saunders 2010, Seraphim et al. In prep.). Além das sequências obtidas no presente trabalho, foram selecionadas sequências de alguns riodinídeos disponíveis no GenBank (Benson et al. 2005,). Nenhuma sequência atribuída ao gênero Stalachtis foi encontrada no banco de sequências GenBank (Benson et al. 2005) ou mesmo no Barcode of Life Data System (BOLD) (Ratnasingham & Hebert, 2007). Infelizmente, poucas sequências foram obtidas para o gene CAD, devido a problemas na reação de amplificação desse gene, pois para algumas espécies, os primers para essa região amplificaram uma região diferente do genoma com um tamanho similar ao esperado para o CAD. Por isso, as sequências obtidas do gene CAD foram utilizadas apenas para as análises de distância genética, pois a falta de sequências para muitas amostras poderia interferir nas análises filogenéticas. Três métodos de análises filogenéticas foram empregados nesse trabalho: Máxima Parcimônia (MP), Máxima Verossimilhança (ML, do inglês Maximum Likelihood) e inferência bayesiana (BI, bayesian inference). As análises de parcimônia utilizaram todos os marcadores com as sequências concatenadas. Elas foram realizadas usando-se o comando New Technology Search, implementado no programa TNT (Goloboff et al. 2000), empregando-se todos os quatro métodos de busca - ratchet, tree-fusing, tree- drifting e sectorial – e com 1000 replicações com adição aleatória de táxons e TBR branch- swapping. Por fim, foi gerada uma árvore de consenso estrito e utilizou-se o método estatístico bootstraping com 1000 réplicas para averiguar a consistência dos ramos. A análise de máxima verossimilhança foi feita no programa RAxML versão 8 (Stamatakis 2014) utilizando o modelo evolutivo GTR e com o parâmetro gamma.

A inferência bayesiana foi elaborada no programa MrBayes 3.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2001) usando duas partições definidas pelo programa Tiger (Cummins & McInerney 2011) que divide os nucleotídeos em partições baseadas na sua taxa de evolução, nessa análise todos os parâmetros do modelo de substituição (distribuição gama, frequência dos nucleotídeos e taxa de substituição) poderiam variar entre as partições. A escolha do modelo evolutivo foi feita através da ferramenta model-jumping

28 do MrBayes, assim todos os possíveis sub-modelos do GTR foram amostrados de acordo com sua probabilidade posterior (Ronquist et al. 2012), o modelo com maior probabilidade posterior encontrada foi o sub-modelo [rAC = 1, rAG= 2, rAT = 1, rCG = 3, rCT = 4, rGT =5], ou seja, as taxas de mutação de A <-> C e A <-> T foram iguais, enquanto que todas as outras taxas tiveram valores únicos. O parâmetro alfa da distribuição gama também foi incluso, permitindo que a taxa de mutação varie entre os sítios. Quatro cadeias foram corridas para 10×106 gerações, amostrando árvores a cada 1000 ciclos. As primeiras 2500 árvores são descartadas como "burn in" baseado em quando as corridas convergem e chegam ao equilíbrio. O valor de ESS (tamanho efetivo amostral) foi avaliado das duas corridas independentes com o programa Tracer v1.5, e todos os valores dos parâmetros ficaram acima de 200 o que indica que todos foram suficientemente amostrados para estimar as distribuições posteriores (Drummond et al. 2006). Estudo dos padrões alares

Foram tiradas fotos das faces ventral e dorsal de todos os indivíduos utilizados nesse estudo e o padrões foram comparados com as fotos dos tipos apresentadas no site Butterflies of America (Warren et al. 2013) e também aos indivíduos que fazem parte dos mesmos clados encontrados nas filogenias. Dessa maneira, foi possível identificar as subespécies presentes e as variações morfológicas dentro dos padrões alares de cada clado.

Distribuição geográfica das espécies

Para se obter a distribuição geográfica de cada uma das espécies foram estudados todos os exemplares obtidos nos museus já citados na amostragem taxonômica, além de alguns dos indivíduos do museu de História Natural de Londres, Inglaterra (BMNH). Outros registros foram obtidos a partir de fotos nas quais era possível a identificação da espécie, além de todos os dados de localidade, encontrados no site flickr (https://www.flickr.com/search/?q=stalachtis). Os mapas foram construídos no programa DIVA-GIS v 7.1.6 (Hijamans 2009).

RESULTADOS

Marcadores moleculares: análises exploratórias

O alinhamento final para a região barcode (COI) é composto por 99 indivíduos do gênero Stalachtis, os fragmentos possuem 676 bases, sendo dessas 483 pares de bases conservadas dentro do gênero, portanto, 193 sítios são variáveis e desses 175 (25,9%) são informativos sobre o critério de parcimônia. Para as sequências traduzidas, dos 224 aminoácidos, 11 deles são variáveis. Foram obtidos 78 fragmentos para a segunda metade do gene COI com 824 pb, 594 sítios conservados e 230 variáveis com 185 (22,5%) informativos sobre o critério de parcimônia. As sequências quando traduzidas apresentam 23 aminoácidos variáveis entre os 274 nessa região. Para os outros marcadores moleculares, alguns dos indivíduos não foram sequenciados pois estes apresentaram problemas na amplificação ou sequenciamento, provavelmente decorridos da falta de especificidade dos primers utilizados. Para o gene nuclear RPS5 foram sequenciados 92 indivíduos e os fragmentos obtidos possuem 613 pb. Essas sequências possuem 559 sítios conservados versus 54 variáveis, sendo 47 (7,7%) informativos sobre o critério de parcimônia. Apenas 2 dos 204 aminoácidos são variáveis e são eles: 1) uma base citosina em todas as S. phlegia e S. susanna no sítio 15, resultando em uma alteração no quinto resíduo de Glicina para Alanina; 2) uma base timina no sítio 562 em todos os indivíduos de S. magdalena, levando a uma modificação no resíduo 188 de Alanina para Serina. Para outro marcador nuclear, o GAPDH, foram obtidas sequências para 56 indivíduos com 691 pb. Dessas, 629 são sítios conservados e 62 sítios variáveis, com 56 (8,1%) informativos sobre o critério de parcimônia. Na tradução dos fragmentos, foram encontrados 6 aminoácidos variáveis: 1) uma base adenina na posição 128 nas S. susanna amostradas altera o resíduo 43 de Ácido Aspártico para Asparagina; 2) todos os indivíduos sequenciados de S. phlegia e S. susanna apresentam uma adenina no sítio 137, transformando o resíduo 45 também de Ácido Aspártico para Asparagina; 3) para S. phaedusa e S. halloweeni, uma guanina na posição 143, leva a uma mudança no resíduo 48 de Serina para Alanina; 4) para um dos dois indivíduos – BLU699, no BLU698 há uma ambiguidade (W) nessa posição – de S. halloweeni, foi encontrada uma adenina na base 153, alterando o resíduo 51 para Ácido Aspártico ao invés de Valina como nas outras espécies; 5) nas espécies irmãs S. phlegia e S. susanna, uma timina na posição 546, altera

30 o resíduo 152 para Valina, ao invés de Alanina; 6) para essas mesmas duas espécies, outra timina na posição 494 gera o aminoácido Serina ao invés de Alanina no resíduo 165. Para o último marcador amostrado, o gene nuclear CAD, foram adquiridas 21 sequências com um fragmento de 803 nucleotídeos. Nesses fragmentos, foram localizados 732 sítios conservados e 71 variáveis, com 57 (7,1%) informativos sobre o critério de parcimônia. Na tradução dessas sequências, 11 aminoácidos são variáveis dos 267 que compõem o fragmento, 7 delas são exclusivas das espécies irmãs S. phlegia e S. susanna e ocorrem em todos os indivíduos amostrados, uma é exclusiva do único indivíduo sequenciado de S. lineata – uma Serina no resíduo 57 ao invés de Asparagina, e outra ocorre em três espécies S. phlegia, S. susanna e S. lineata – uma Lisina no resíduo 55 diferente das outras espécies que possuem Glutamina. Além disso duas mutações não sinônimas foram encontradas em alguns dos indivíduos de S. phlegia - uma Isoleucina no resíduo 112 ao invés de Treonina e outra em apenas um indivíduo - uma Fenilalanina no resíduo 151 ao invés de Tirosina.

Árvores de Distâncias genéticas (NJ)

As árvores de distância Neighbor-Joining feitas para cada marcador separadamente resultaram em padrões distintos, mostrando que a taxa de mutação de cada marcador é diferente, como era esperado baseado no estudo feito sobre esses marcadores (Wahlberg & Wheat 2008). Para essas análises, as sequências foram editadas, e aquelas que apresentavam muitas bases faltantes foram removidas, pois foi percebido que a falta de bases afetava os resultados diminuindo a resolução das árvores. Todas as árvores de NJ feitas resultaram em Stalachtis como um gênero monofilético, enquanto que as relações internas variaram entre os genes. Na árvore de NJ da região barcode (Figura II-1), todas as espécies apresentarem valores altos de bootstrap, sendo o menor valor para S. magdalena (82). Alguns ramos apresentaram alto suporte dentro das espécies, esses ramos apresentam certa congruência geográfica, porém a espécie S. magdalena apresenta seus indivíduos agrupados em dois clados bem definidos, mesmo que todos esses indivíduos sejam da mesma localidade (Figura II-26). Algumas relações apresentaram diferenças notáveis entre essa árvore e as análises filogenéticas obtidas: 1) S. lineata aparece como grupo

31 irmão do clado S. phlegia + S. susanna com alto suporte (91). 2) S. phaedusa foi posicionada como grupo irmão do clado composto por S. euterpe, S. halloweeni, S. magdalena, S. terpsichore, S. calliope e Stalachtis sp. com baixo suporte. 3) Também com baixo suporte (40), S. euterpe aparece como espécie irmã de S. halloweeni. Outra árvore de NJ foi feita para a segunda metade do COI (Figura II-2), nessa árvore todas as espécies amostradas (apenas o indivíduo BLU654 foi sequenciado da espécie S. lineata e o indivíduo BLU647 da espécie ainda não descrita também não foi sequenciado) exibiram alto suporte, o menor encontrado foi para S. calliope (89). As relações dessa árvore são equivalentes com aquelas da primeira metade do COI, porém algumas relações não foram congruentes: 1) o indivíduo sequenciado de S. lineata está posicionado como grupo irmão do clado composto por S. euterpe, S. halloweeni, S. magdalena, S. terpsichore, S. calliope, S, magdalena e S. phaedusa com alto suporte (91). 2) S. euterpe foi encontrado como grupo irmão do clado com as espécies S. halloweeni, S. magdalena, S. terpsichore, S. calliope, e S. phaedusa. 3) S. magdalena aparece como grupo irmão do clado S. phaedusa + S. halloweeni. Com exceção dessas duas últimas relações, a árvore de NJ da segunda metade do COI foi a mais consistente com as hipóteses filogenéticas produzidas. A árvore de NJ (Figura II-3) mostrou que o gene CAD é entre os genes nucleares analisados neste trabalho, aquele com a maior capacidade de separar as espécies, todavia algumas relações não foram resolvidas. Essa árvore apresentou algumas relações interessantes, mesmo com metade das espécies ausentes – S. halloweeni, S. phaedusa, S. magdalena, S. terpsichore e Stalachtis sp. – devido a dificuldades citadas no sequenciamento: 1) uma clara divisão entre os indivíduos de S. phlegia e S. susanna. 2) um alto suporte (96) no clado que une os indivíduos das espécies S. calliope e S. euterpe. Isso é interessante pois a posição de S. euterpe nas hipóteses filogenéticas não possuiu alto suporte, e essa relação aqui apresentada indica que a posição nas filogenias obtidas está correta, devido à esse agrupamento das sequências do gene CAD entre as espécies S. calliope e S. euterpe. A análise de NJ do gene GAPDH (Figura II-4) não formou clados separados para todas as espécies como o COI, porém ela mostrou as relações de parentesco entre as espécies irmãs encontradas nas hipóteses filogenéticas, e só foi capaz de distinguir em clados bem definidos as espécies S. susanna e S. lineata. O clado formado pelos indivíduos de S.

32 phlegia inclui os indivíduos de S. susanna, enquanto que as outras espécies formaram um outro clado com alto suporte (99). A árvore possui um clado composto por S. euterpe + S. magdalena + S. calliope + S. terpsichore e outro clado formado por S. phaedusa e S. halloweeni. Esses dois clados formados mostram as relações de proximidade entre as espécies que os compõem, que podem ser visualizadas devido a taxa de mutação mais baixa (se comparada ao COI mitocondrial) desse marcador nuclear dentro do gênero Stalachtis. O gene RPS5 (Figura II-5) é o marcador que apresentou menor variação entre as sequências obtidas dentre os amostrados para Stalachtis, e os ramos com alto suporte foram aqueles mais externos na árvore, como a relação entre os clados S. susanna + S. phlegia e S. euterpe + S. lineata + S. halloweeni + S. magdalena + S. terpsichore + S. calliope + S. phaedusa (99). Apenas S. terpsichore e S. halloweeni mostraram clados monofiléticos, enquanto que as outras espécies formaram dois grandes clados um deles S. susanna + S. phlegia e o outro S. euterpe + S. lineata + S. magdalena + S. calliope + S. phaedusa + Stalachtis sp. Esse clado monofilético para S. terpsichore é uma das evidências moleculares para a revalidação dessa espécie.

Figura II-1. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para a região barcode, estimada com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2- Parâmetros. Os números ao lado dos nós são os valores de 5.000 réplicas Bootstrap.

Figura II-2. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para a segunda metade do gene COI, estimada com o modelo de substituição nucleotídica Kimura- 2-Parâmetros. Os números ao lado dos nós são os valores de 5.000 réplicas Bootstrap.

Figura II-3. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear CAD, estimada com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros. Os números ao lado dos nós são os valores de 5.000 réplicas Bootstrap.

Figura II-4. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear GAPDH, estimada com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2- Parâmetros. Os números ao lado dos nós são os valores de 5.000 réplicas Bootstrap.

Figura II-5. Árvore de distância Neighbor-Joining, baseada nas sequências para o gene nuclear RPS5, estimada com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2- Parâmetros. Os números ao lado dos nós são os valores de 5.000 réplicas Bootstrap.

Rede de haplótipos - “Minimum spanning network”

A conexão máxima estabelecida na rede de haplótipos da região barcode foi de 8 passos mutacionais (a rede de haplótipos está na Figura II-6). Cada uma das espécies apresentou a sua própria rede desconectada das outras, contudo a espécie S. magdalena apresentou duas redes distintas. As duas espécies aqui revalidadas e a nova espécie que será descrita também apresentaram redes desconexas das supostas espécies das quais pertenceriam. No total, foram observados 53 haplótipos, distribuídos dessa maneira entre as espécies: 8 haplótipos entre os indivíduos de S. phlegia, 3 para S. susanna, 7 para S. lineata, 11 para S. phaedusa, 2 para S. halloweeni, 9 para S. euterpe, 1 em uma rede e 2 em outra para S. magdalena, 3 para S. terpsichore, 6 para S. calliope e 1 para a nova espécie Stalachtis sp. Para S. calliope é notável que todos os haplótipos amostrados estão conectados por no mínimo 3 passos mutacionais, sendo que alguns indivíduos de localidades próximas (BLU-164 e BLU-165; Foz do Rio Acuriá e Foz do Rio Breu no Acre, respectivamente) estão conectados por 5 passos mutacionais. Enquanto que os haplótipos da região do rio Tapajós no Pará, estão conectados por no mínimo 6 passos. Para S. magdalena como já foi mencionado anteriormente, duas pequenas redes foram formadas, ainda que todos os indivíduos amostrados são da mesma localidade. A mesma análise foi aplicada para a segunda metade do COI com resultados similares (a rede de haplótipos está na Figura II-7), a conexão máxima estabelecida foi de 11 passos mutacionais. Todas as espécies apresentaram redes desconectadas uma das outras e como na primeira metade, a espécie S. magdalena apresenta dois haplótipos desconectados. No total, foram observados 49 haplótipos, distribuídos dessa maneira entre as espécies: 11 haplótipos entre os indivíduos de S. phlegia, 4 para S. susanna, apenas 1 para S. lineata (devido aos problemas de amplificação dessa região para essa espécie), 10 para S. phaedusa, 1 para S. halloweeni, 10 para S. euterpe, 1 em cada uma das duas redes para S. magdalena, 3 para S. terpsichore e 7 para S. calliope. Na rede para o gene nuclear RPS5 (Figura II-8), a conexão máxima estabelecida é de 8 passos mutacionais e apenas três redes foram produzidas, o que é esperado já que a taxa mutacional dos genes nucleares é mais baixa que dos genes mitocondriais. A primeira rede é formada pelos 4 haplótipos exclusivos para a espécie S. phlegia e outro

39 haplótipo para as S. susanna amostradas com no mínimo dois passos mutacionais separando essas espécies, com exceção dos indivíduos de S. susanna BLU254 e BLU255 que apresentam o haplótipo mais comum para S. phlegia. A segunda rede é destinada aos dois haplótipos encontrados para S. lineata, sendo a única espécie com uma rede para o gene RPS5 separada dos outros. A terceira e maior rede conecta todas as outras espécies amostradas: três dos haplótipos são exclusivos da espécie S. phaedusa e se distanciam no mínimo por 3 passos mutacionais dos haplótipos de outras espécies; um haplótipo para S. halloweeni com no mínimo 4 passos mutacionais entre ele e outras espécies; dois haplótipos para S. euterpe separados por apenas 1 passo das outras espécies; o mesmo ocorre para os três haplótipos de S. magdalena; e também ocorre para o único haplótipo de S. terpsichore e todos os indivíduos de S. calliope e o único amostrado de Stalachtis sp. possuem o mesmo haplótipo, totalizando 18 haplótipos. A conexão máxima estabelecida na rede para o gene nuclear GAPDH (Figura II-9) é de 9 passos mutacionais, e apenas duas redes foram formadas: uma para as espécies S. susanna e S. phlegia e outra composta pelas espécies restantes. Os 17 haplótipos encontrados foram distribuídos dessa maneira: na primeira rede, 5 haplótipos para S. phlegia e um para as S. susanna, separado dos outros por no mínimo 4 passos mutacionais; na segunda rede, S. lineata apresenta dois haplótipos separados das outras espécies por 4 mutações, um haplótipo para todos os indivíduos de S. phaedusa, com pelo menos 3 mutações de distância das outras espécies, 1 para S. halloweeni com pelo menos 4 passos de distância das outras espécies, 4 haplótipos para S. euterpe separados por pelo menos 3 passos mutacionais das outras espécies, um para S. magdalena com apenas uma mutação para S. terpsichore – também com um haplótipo – com todas as S. calliope em um haplótipo conectado por uma mutação do haplótipo de S. terpsichore. A última das análises feitas foi para o gene nuclear CAD (Figura II-10), com poucas sequências (21), foram obtidos 12 haplótipos diferentes, com uma conexão máxima de 11 passos mutacionais. Foram adquiridas três redes separadas na análise, similar as outras análises para os genes nucleares. A primeira rede contêm as espécie S. phlegia – 5 haplótipos distintos – conectada por 4 passos mutacionais a o único haplótipo da espécie S. susanna. A segunda rede possui um único haplótipo para S. lineata. A terceira rede, conecta a espécie S. calliope – com 3 haplótipos – com S. euterpe – 2 haplótipos – com 6 passos mutacionais entre elas.

Com essas redes, podemos observar a variação na taxa de mutação entre os marcadores utilizados, além disso, as duas espécies que estão sendo revalidadas – S. susanna e S. terpsichore – apresentam para o gene COI redes distintas das espécies nas quais estão atualmente sinonimizadas, e para todas as outras análises produzidas haplótipos distintos dessas espécies. Para a espécie nova Stalachtis sp., o único indivíduo amostrado está separado das outras espécies na análise da região barcode, contudo seu haplótipo nuclear – gene RPS5 – é o mesmo das borboletas de S. calliope. Isso pode sugerir uma separação mais recente entre essas duas espécies, do que por exemplo, entre S. calliope e S. terpsichore. Além das espécies revalidadas e a nova, S. magdalena apresenta uma padrão incomum dentro do gênero, com duas redes desconectadas no COI e haplótipos diferentes nucleares.

Figura II-6. Análise de “Minimum spanning network” para a região barcode (gene COI). As cores representam as espécies. O tamanho das circunferências é diretamente proporcional ao número de indivíduos. Cada reta é equivalente a uma mudança de base e os valores nas retas são a posição nucleotídica na qual a mutação ocorre. Os códigos dos indivíduos estão representados ao lado dos seus respectivos haplótipos.

Figura II-7. Análise de “Minimum spanning network” para a segunda metade do gene COI. As cores representam as espécies. O tamanho das circunferências é diretamente proporcional ao número de indivíduos. Cada reta é equivalente a uma mudança de base e os valores nas retas são a posição nucleotídica na qual a mutação ocorre. Os códigos dos indivíduos estão representados ao lado dos seus respectivos haplótipos.

Figura II-8. Análise de “Minimum spanning network” para o gene RPS5. As cores representam as espécies. O tamanho das circunferências é diretamente proporcional ao número de indivíduos. Cada reta é equivalente a uma mudança de base e os valores nas retas são a posição nucleotídica na qual a mutação ocorre. Os códigos dos indivíduos estão representados ao lado dos seus respectivos haplótipos.

Figura II-9. Análise de “Minimum spanning network” para o gene GAPDH. As cores representam as espécies. O tamanho das circunferências é diretamente proporcional ao número de indivíduos. Cada reta é equivalente a uma mudança de base e os valores nas retas são a posição nucleotídica na qual a mutação ocorre. Os códigos dos indivíduos estão representados ao lado dos seus respectivos haplótipos.

Figura II-10. Análise de “Minimum spanning network” para o gene CAD. As cores representam as espécies. O tamanho das circunferências é diretamente proporcional ao número de indivíduos. Cada reta é equivalente a uma mudança de base e os valores nas retas são as posições nucleotídicas na quais as mutações ocorrem. Os códigos dos indivíduos estão representados ao lado dos seus respectivos haplótipos.

Distâncias genéticas para o Barcode

A região barcode tem sido utilizada como uma ferramenta molecular para delimitar espécies, para averiguar se existe um “barcode gap” – uma variação genética interespecífica discriminatoriamente maior que a intraespecífica, permitindo uma fácil identificação específica aos indivíduos baseada nas suas sequências (Hebert et al. 2003, Meyer & Paulay 2005). Para as sequências obtidas do gênero Stalachtis, foi feito um gráfico (Figura II-11) e as medidas de distância foram calculadas (Tabela II-3). A distância genética média obtida dentro das espécies foi de 0,87%, sendo a menor distância genética média intraespecífica encontrada em S. susanna (0,13%). A maior distância genética intraespecífica absoluta foi encontrada entre indivíduos de S. magdalena (4,2%). A menor distância interespecífica foi encontrada entre a nova espécie Stalachtis sp. e S. calliope, e o valor mínimo foi de 4,5%. Em contrapartida, a maior distância interespecífica foi encontrada entre indivíduos de S. phlegia com S. halloweeni (16,1%). Portanto, as distâncias genéticas intra e interespecíficas não se sobrepõem, existindo então um gap, como é esperado para a região barcode. É importante ressaltar aqui que as distâncias genéticas obtidas para as espécies revalidadas suportam as decisões: S. susanna apresenta uma distância mínima de S. phlegia de 5,5% e média de 5,9%, valores razoavelmente acima do mínimo encontrado entre espécies de Lepidoptera (Hebert et al. 2003). O mesmo ocorre entre as espécies irmãs S. terpsichore e S. calliope, a distância mínima encontrada foi de 6,3% e a média de 6,8%. Além desses casos, a espécie de Stalachtis ainda não descrita também apresenta valores mínimo 4,5% e médio de 5,5% com Stalachtis calliope, valores considerados adequados para delimitar uma nova espécie baseada nas premissas dos valores considerados para o DNA Barcode (Hebert et al. 2003) (a Figura II-12 apresenta boxplots para essas relações.).

Tabela II-3. Distâncias genéticas calculadas para a região barcode, estimadas com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros. São apresentados a média, desvio-padrão (DP), valores mínimos e máximos entre as espécies. Valores intra- específicos em negrito.

S. euterpe S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,1103 0,0065 0,1425 0,1008 0,1215 DP 0,0071 0,0047 0,0040 0,0065 0,0054 Mínima 0,0970 0,0000 0,1370 0,0900 0,1150 Máxima 0,1240 0,0130 0,1560 0,1190 0,1380

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,1290 0,0862 0,1050 0,0987 0,1093 DP 0,0044 0,0039 0,0116 0,0058 0,0061 Mínima 0,1250 0,0790 0,0870 0,0940 0,1040 Máxima 0,1440 0,0940 0,1240 0,1080 0,1190

S. calliope S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,0178 0,1103 0,1386 0,1144 0,1371 DP 0,0082 0,0071 0,0085 0,0090 0,0077 Mínima 0,0000 0,0970 0,1140 0,0930 0,1220 Máxima 0,0290 0,1240 0,1490 0,1300 0,1490

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,1334 0,0687 0,0841 0,0550 0,1200 DP 0,0052 0,0040 0,0048 0,0053 0,0033 Mínima 0,1250 0,0630 0,0770 0,0450 0,1150 Máxima 0,1450 0,0800 0,0940 0,0590 0,1270

S. terpsichore S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,0687 0,0862 0,1493 0,1136 0,1236 DP 0,0040 0,0039 0,0029 0,0044 0,0078 Mínima 0,0630 0,0790 0,1440 0,1080 0,1110 Máxima 0,0800 0,0940 0,1560 0,1260 0,1340

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,1410 0,0020 0,0650 0,0743 0,1243 DP 0,0022 0,0017 0,0031 0,0023 0,0021 Mínima 0,1370 0,0000 0,0590 0,0730 0,1230 Máxima 0,1440 0,0030 0,0690 0,0770 0,1270

S. susanna S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,1334 0,1290 0,0592 0,1216 0,1327 DP 0,0052 0,0044 0,0027 0,0042 0,0066 Mínima 0,1250 0,1250 0,0550 0,1180 0,1220 Máxima 0,1450 0,1440 0,0690 0,1360 0,1440

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,0013 0,1410 0,1217 0,1294 0,1322 DP 0,0025 0,0022 0,0078 0,0013 0,0023 Mínima 0,0000 0,1370 0,1110 0,1290 0,1260 Máxima 0,0060 0,1440 0,1290 0,1330 0,1330

S. phlegia S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,1386 0,1425 0,0033 0,1188 0,1095 DP 0,0085 0,0040 0,0037 0,0053 0,0038 Mínima 0,1140 0,1370 0,0000 0,1040 0,1000 Máxima 0,1490 0,1560 0,0160 0,1330 0,1180

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,0592 0,1493 0,1330 0,1371 0,1557 DP 0,0027 0,0029 0,0049 0,0019 0,0030 Mínima 0,0550 0,1440 0,1220 0,1360 0,1490 Máxima 0,0690 0,1560 0,1410 0,1400 0,1610

S. phaedusa S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,1144 0,1008 0,1188 0,0057 0,1183 DP 0,0090 0,0065 0,0053 0,0047 0,0068 Mínima 0,0930 0,0900 0,1040 0,0000 0,1070 Máxima 0,1300 0,1190 0,1330 0,0190 0,1340

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,1216 0,1136 0,1022 0,1165 0,0935 DP 0,0042 0,0044 0,0083 0,0043 0,0050 Mínima 0,1180 0,1080 0,0890 0,1120 0,0830 Máxima 0,1360 0,1260 0,1190 0,1260 0,1040

S. magdalena S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,0841 0,1050 0,1330 0,1022 0,1348 DP 0,0048 0,0116 0,0049 0,0083 0,0110 Mínima 0,0770 0,0870 0,1220 0,0890 0,1110 Máxima 0,0940 0,1240 0,1410 0,1190 0,1500

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,1217 0,0650 0,0240 0,0831 0,1097 DP 0,0078 0,0031 0,0202 0,0015 0,0030 Mínima 0,1110 0,0590 0,0000 0,0800 0,1040 Máxima 0,1290 0,0690 0,0420 0,0840 0,1120

S. lineata S. calliope S. euterpe S. phlegia S. phaedusa S. lineata Média 0,1371 0,1215 0,1095 0,1183 0,0092 DP 0,0077 0,0054 0,0038 0,0068 0,0062 Mínima 0,1220 0,1150 0,1000 0,1070 0,0000 Máxima 0,1490 0,1380 0,1180 0,1340 0,0190

S. susanna S. terpsichore S. magdalena S. spn1 S. halloweeni Média 0,1327 0,1236 0,1348 0,1337 0,1403 DP 0,0066 0,0078 0,0110 0,0040 0,0066 Mínima 0,1220 0,1110 0,1110 0,1300 0,1300 Máxima 0,1440 0,1340 0,1500 0,1410 0,1500

Figura II-11. Distâncias genéticas baseadas nas sequências para a região barcode, estimadas com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros. O eixo X representa a distância genética entre os indivíduos, o eixo Y apresenta a frequência de cada distância. Em branco estão as distâncias intraespecíficas, e barras em cinza representam as distâncias interespecíficas.

Figura II-12. Boxplots para as distâncias genéticas, baseados nas sequências para a região barcode, estimadas com o modelo de substituição nucleotídica Kimura-2- Parâmetros. O primeiro mostra a distância entre S. phlegia e S. susanna, o segundo S. calliope e S. terpsichore e o terceiro S. calliope e a nova espécie de Stalachtis.

Análises filogenéticas

Todas as análises filogenéticas recuperaram o gênero Stalachtis como monofilético, bem separado de Protonymphidia e com altos valores de suporte (Figuras II-13 a 15). Na inferência bayesiana, Protonymphidia senta aparece como um ramo muito longo, resultado encontrado em outras filogenias moleculares (Saunders, 2010). As três análises filogenéticas feitas produziram topologias iguais no que se refere as relações internas do gênero. Todos os valores de suporte – bootstrap e probabilidade posterior na BI – foram altos exceto em dois casos: a posição da espécie S. euterpe como grupo irmão de S. magdalena, S. calliope e S. terpsichore que apresentou baixo suporte, mesmo sendo uma relação constante em todas as análises feitas; e na análise de MP houve suportes medianos com relação a monofilia da espécie S. calliope (61) e na relação entre as espécies irmãs S. calliope e S. terpsichore (80).

Relações internas do gênero Stalachtis

Todas as três análises feitas recuperaram as mesmas relações entre as espécies. Nas três análises, os indivíduos de Stalacthis se organizaram em 11 clados bem definidos e com alto valor de probabilidade posterior e de bootstrap (Figuras II-13 a 15). Estes 11 clados podem ser atribuídos a 10 espécies diferentes do gênero. Todos os indivíduos se separam formando dois grandes clados irmãos. O primeiro inclui S. phegia + Stalacthis susanna stat. rev. Estas duas espécies apresentam padrão alar semelhante, mas suficientemente diferentes entre os clados correspondendo à cada uma das duas espécies. O segundo clado inclui todas as espécies restantes, com S. lineata aparecendo como grupo irmão das restantes. Estas outras se organizam em dois clados irmãos: 1) S. halloweeni + S. phaedusa, e 2) S. euterpe, grupo irmão de S. magdalena, Stalacthis terpsichore stat. rev., S. calliope e uma nova espécie não descrita (K. R. Willmott in prep.). Chama-se atenção para o clado de S. magdalena, onde os indivíduos se separam em dois clados distintos e com alto suporte, mas ainda não foi encontrada nenhuma evidência morfológica que sugira que existam duas espécies distintas neste clado.

Figura II-13. Árvore consenso das árvores mais parcimoniosas, baseada nos dados concatenados de três genes (COI, RPS5 e GAPDH). Os números juntos aos nós são os valores de Bootstrap com 5.000 réplicas. As espécies estão identificadas pelos nomes ao lado dos clados junto com a fotografia de um dos indivíduos.

Figura II-14. Árvore de Máxima Verossimilhança, baseada nos dados concatenados de três genes (COI, RPS5 e GAPDH). Os números juntos aos nós são os valores de Bootstrap com 5.000 réplicas. As espécies estão identificadas pelos nomes ao lado dos clados junto com a fotografia de um dos indivíduos.

Figura II-15. Inferência bayesiana feita a partir dos dados de 3 genes (COI, GAPDH e RPS5), utilizando duas partições estimadas pelo programa Tiger, com um sub-modelo nucleotídico de GTR. Números juntos aos nós representam as probabilidades posteriores. E as espécies estão delimitadas pelas barras ao lado junto com o nome e uma fotografia de um dos indivíduos.

Padrões alares

Os 15 indivíduos previamente identificados como Stalachtis calliope, foram separados em quatro padrões alares distintos, sendo dois deles correspondentes a duas das subespécies descritas: S. calliope calliope e S. calliope bicoler. O terceiro padrão encontrado se assemelha com aquele conhecido para S. terpsichore, e o quarto padrão foi representado por apenas um indivíduo de uma localidade ainda não amostrada para S. calliope – Morona no Equador – e provavelmente pertencerá a uma nova espécie ainda não descrita (K. R. Willmott in prep.). A figura II-16 mostra esses diferentes padrões. As espécies S. calliope e S. terpsichore podem ser diferenciadas por alguns caracteres morfológicos: o primeiro observado e considerado o mais estável é a presença de cerdas da cor laranja na região posterior do tórax nas borboletas de S. calliope, enquanto que em borboletas de S. terpsichore essas cerdas são pretas. Outra característica diagnóstica é o padrão das manchas pretas no par de asas anteriores na face dorsal: em S. terpsichore essas manchas são contínuas formando uma banda preta nas asas anteriores, enquanto que em S. calliope essas manchas raramente se tocam e próximo as veias as escamas são laranjas (na Figura II-17, esses caracteres estão marcados). Outra característica menos relevante observada é a maior pigmentação – cores mais escuras – em S. terpsichore. Todos os indivíduos estudados de S. magdalena apresentam o padrão da sub-espécie S. magdalena magdalena e não foram encontradas diferenças entre os clados encontrados com base nos marcadores moleculares. Similarmente, todos os indivíduos S. euterpe podem ser considerados da mesma subespécie, S. euterpe latefasciata, pois apresentam o padrão descrito por Staudinger (1888) para este taxon. Os dois indivíduos de Stalachtis halloweeni obtidos apresentam o mesmo padrão, congruente com a descrição da espécie (Hall 2006). A espécie S. lineata não apresenta atualmente subespécies, entretanto, dentre as borboletas obtidas foram encontradas variações na forma e largura da mancha laranja das asas anteriores (a Figura II-18 mostra esses padrões). Em geral, essas borboletas apresentam uma mancha laranja preenchendo a margem externa da asa anterior, enquanto que em algumas borboletas as células brancas são maiores e invadem essa região, diminuindo a mancha laranja. Em algumas há a perda do laranja na parte apical da asa, sendo o laranja apenas presente na parte mediana da margem externa da asas

57 anterior (tanto dorsal quanto ventralmente). Este fenótipo foi descrito previamente como Stalachtis trailii A. Butler, 1877. A espécie Stalachtis phlegia possui cinco subespécies (Callaghan & Lamas 2004). Para este estudo, foram obtidos indivíduos de três dessas subespécies, a S. phlegia susanna, descrita originalmente como uma espécie, S. phlegia phlegia e S. phlegia phlegetontia. A principal diferença entre essas duas últimas é a quantidade de preto no fundo das asas no lado dorsal: enquanto que na subespécie S. phlegia phlegia o preto se estende até a margem externa da asas, em S. phlegia phlegetontia a margem das asas é laranja, assim como o fundo das asas na região basal das asas (a Figura II-19 mostra esses padrões). A espécie revalidada Stalachtis susanna, apresenta um padrão de coloração distinto da espécie irmã S. phlegia. Todas as S. susanna apresentam um padrão de coloração bem uniforme: faixas pretas contra o fundo laranja tanto nas asas anteriores quanto posteriores, bem marcadas na face dorsal. Já em S. phlegia existe um gradiente na quantidade de preto nas asas, sendo que uma das subespécies possui asas quase totalmente pretas (Stalachtis phlegia nocticoelum Seitz, 1917). Contudo, o caráter mais estável para diagnosticar as duas espécies é distribuição das pintas brancas: em S. susanna todas as pintas estão restritas à área preta, não avançando nas áreas laranja. Por outro lado, S. phlegia apresenta essas pintas tanto nas áreas pretas quanto nas áreas laranjas. A espécie mais diversa do gênero é Stalachtis phaedusa, fato espelhado na variação apresentada entre as seis subespécies atualmente válidas (Callaghan & Lamas 2004). A espécie apresenta dois principais caracteres variáveis: 1) a quantidade de azul nas asas anteriores, e 2) a largura das faixas laranjas na margem externa das asas posteriores. Além desses, outros caracteres variáveis são a presença do laranja na parte mediana da margem externa das asas anteriores e a quantidade de preto na face ventral das asas. Os indivíduos coletados foram organizados em três padrões correspondentes a três das subespécies atualmente reconhecidas: Stalachtis phaedusa duvalii, Stalachtis phaedusa trangeri e Stalachtis phaedusa phaedusa (Figura II-20).

Figura II-16. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos previamente identificados como Stalachtis calliope. a) S. calliope calliope (BLU365), b) S. calliope bicoler (BLU165), c) S. terpsichore (BLU514), d) Stalachtis sp. (BLU647).

Figura II-17. Caracteres morfológicos diagnósticos das espécies S. calliope e S. terpsichore. As setas brancas apontam para as cerdas na região posterior do tórax nas borboletas e os retângulos enquadram as manchas pretas nas asas anteriores na face dorsal. A foto da esquerda é uma S. calliope calliope (BLU365) e a da direita é uma S. terpsichore (BLU514).

Figura II-18. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos de S. lineata. a) S. lineata (BLU354), b) S. lineata (BLU355), c) S. lineata “trailii” A. Butler, 1877 (BLU353).

Figura II-19. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos previamente identificados como Stalachtis phlegia. a) S. phlegia phlegia (BLU737), b) S. phlegia phlegetontia (BLU168), c) S. susanna.

Figura II-20. Diferentes padrões alares encontrados entre os indivíduos de S. phaedusa. a) S. phaedusa phaedusa (BLU349), b) S. phaedusa duvalii (BLU350), c) S. phaedusa trangeri (BLU172).

Distribuição geográfica

Stalachtis é um gênero Neotropical, e na distribuição atualmente conhecida, o limite sul é próximo ao trópico de Capricórnio e ao norte um pouco acima da linha do equador, nesse contexto, as borboletas do gênero estão restritas ao clima tropical. A maioria das espécies é restrita às terras baixas da floresta Amazônica. Entretanto, S. phlegia e S. susanna ocorrem em outros dois biomas brasileiros – Cerrado e Mata Atlântica – sendo que a última é restrita a estes biomas, sendo a única espécie de Stalachtis restrita à região Atlântica da América do Sul (o mapa da Figura II-21 mostra todas as localidades nas quais foram encontradas Stalachtis). Stalachtis phlegia é a espécie com maior distribuição conhecida, ocorrendo em boa parte do Brasil, além de um registro na Bolívia. Essa espécie ocorre na floresta Amazônica (associada à clareiras e vegetação secundária), e em muitas fisionomias abertas de Cerrado, além da Mata Atlântica (na região Nordeste). Esta espécie ocorre principalmente em baixas altitudes, mas existem registros em altitudes de até 1.300 m em Alto Paraíso de Goiás – GO. Já a espécie irmã Stalachtis susanna é restrita a uma área geográfica bem menor, ocorrendo na Mata Atlântica (em florestas abertas e restinga) do litoral de São Paulo até a Bahia, adentrando também em regiões de Cerrado e campos rupestres em Minas Gerais. Os registros mostram também uma distribuição altitudinal ampla, desde o nível do mar até altas altitudes como no Parque Nacional do Itatiaia e na Serra do Caraça – MG. Como pode ser visualizado no mapa (Figura II-22), as distribuições das duas espécies não são completamente disjuntas, porém são diferentes o bastante para serem consideradas distintas. Foram encontrados poucos registros para Stalachtis lineata, e todos são em estados brasileiros: Amazonas, Pará, Rondônia e o Mato Grosso (Paranaíta) (Figura II-23). Essa espécie é restrita a Amazônia, e ocorre apenas nas regiões de planície com baixas altitudes (até 200 m). A espécie S. halloweeni foi descrita recentemente por Hall em 2006, e para este estudo foram obtidos um casal de indivíduos da Serra de Lema na Venezuela, próximo do Monte Ayanganna, localidade tipo da espécie. Até o momento, a espécie é a única do gênero que ocorre somente em altas altitudes (Hall 2006) - os dois registros são acima de 1.000 m - e provavelmente pode ocorrer em outros Tepuis na região norte da América do Sul. 62

Stalachtis phaedusa é encontrada em uma ampla distribuição geográfica na Amazônia, e possui registros no Peru e na Colômbia. Todavia a maior parte dos registros para essa espécie ocorrem no norte da floresta Amazônica, na região das Guianas e dos estados do Pará e Amazonas. A espécie ocorre inclusive em regiões próximas as da região onde S. halloweeni se encontra (Figura II-24), entretanto em altitudes mais baixas, de até 800 m no Suriname. Para S. euterpe, os registros encontrados mostram uma distribuição separada em duas regiões amazônicas distintas, a primeira entre os estados do Amazonas e Pará e a segunda entre o Equador, Peru e o estado do Acre no Brasil. Entretanto, essa distribuição aparentemente disjunta pode ser reflexo da pequena amostragem na região oeste do estado do Amazonas (Figura II-25). S. euterpe ocorre principalmente nas planícies amazônicas em baixas altitudes de até 250 m, entretanto no Equador, ela ocorre em elevações de até 950 m em Puyo. As borboletas S. magdalena apresentam uma distribuição registrada pequena, ocorrendo desde o Panamá – em Cerro Jefe – até o Chocó na Colômbia. A sua distribuição altitudinal é bem variada, ocorrendo em baixas altitudes na cidade colombiana de Barranquilla (40 m) e em altitudes maiores no Valle del Cauca (1400 m) também na Colômbia Figura II-26). As espécies Stalachtis calliope e S. terpsichore apresentam uma distribuição geográfica um pouco diferenciada entre si. Apesar das duas espécies serem restritas a Floresta Amazônica, S. calliope apresenta uma distribuição mais ampla, sendo seu limite Oeste amostrado (província de Napo, Equador) quase na cordilheira dos Andes e o seu limite ao Sul (Barra do Garças, no Mato Grosso), bem abaixo do limite da espécie irmã S. terpsichore (Porto Velho, em Rondônia) (Figura II-27). Por sua vez, S. terpsichore tem a maioria dos seus registros na região mais norte da floresta Amazônica, nas Guianas e nos estados brasileiros do Amazonas e Pará. Além disso, a distribuição altitudinal também é diferente entre as duas, enquanto que S. terpsichore vive em regiões mais baixas – do nível do mar até 300 m – S. calliope ocorre em algumas localidades com altas altitudes como Palcazú (2.600 m) no Peru e Napo (quase 3.000 m) no Equador. Para a nova espécie ainda não descrita (K. R. Willmott in prep.) a única localidade conhecida é em Morona no Equador (latitude: 3°37'43''S; longitude: 78°23'40''W) com altitude de cerca de 1800 m.

Figura II-21. Distribuição geográfica encontrada para o gênero Stalachtis. Os pontos representam cada localidade na qual foram encontrados registros para uma da espécies de Stalachtis.

Figura II-22. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis susanna e S. phlegia. Os pontos verdes escuros (S. susanna) e verde claros (S. phlegia) representam cada localidade na qual foram encontrados registros para essas espécies.

Figura II-23. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis lineata. Os pontos turquesas representam cada localidade na qual foram encontrados registros para essa espécie.

Figura II-24. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis phaedusa e S. halloweeni. Os pontos azuis escuros (S. phaedusa) e roxos (S. halloweeni) representam cada localidade na qual foram encontrados registros para essas espécies.

Figura II-25. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis euterpe. Os pontos rosas representam cada localidade na qual foram encontrados registros para essa espécie.

Figura II-26. Distribuição geográfica encontrada para a espécie Stalachtis magdalena. Os pontos amarelos representam cada localidade na qual foram encontrados registros para essa espécie.

Figura II-27. Distribuição geográfica encontrada para as espécies Stalachtis calliope, S. terpsichore e Stalachtis sp. Os pontos vermelhos (S. calliope), os triângulos laranjas (S. terpsichore) e o losango marrom (Stalachtis sp.) representam cada localidade na qual foram encontrados registros para essas espécies.

DISCUSSÃO

Filogenia do gênero Stalachtis

Todos as evidências adquiridas nesse estudo mostraram o gênero Stalachtis (e portanto a tribo Stalachtini) como monofilético. As espécies deste gênero apresentam padrões aposemáticos e parecem ser muito distintas do grupo irmão Protonymphia senta, portanto este resultado não é surpreendente. De fato, essa singularidade morfológica foi em parte responsável pela manutenção de um táxon contendo este único gênero desde Stichel (1910-11) até os dias de hoje. Entretanto, as filogenias moleculares mais recentes para Riodinidae (Saunders 2010, Seraphim et al. in prep.) mostram que Stalachtis está dentro da tribo Nymphidiini, e como já discutido anteriormente, a presença de mimercofilia no gênero parece concordar com essa hipótese. Nesse contexto, é razoável supor que o status da tribo Stalachtini será modificado no futuro próximo. Tanto na filogenia de Saunders (2010) como no presente trabalho, o ramo que separa Stalachtis de Protonymphidia é muito longo. Esse longo comprimento de ramo ocorre principalmente nos marcadores nucleares, e pode sugerir que a diversificação entre Stalachtis e Protonymphidia ocorreu rapidamente ou que as linhagens irmãs tenham sido extintas antes de serem estudadas. Todas as espécies reconhecidas atualmente foram recuperadas formando clados monofiléticos. Adicionalmente, foi encontrado suporte molecular e morfológico para a revalidação de duas espécies: 1) Stalachtis susanna stat. rev. deixa de ser subespécie de S. phlegia, e 2) S. terpsichore stat. rev. deixa de ser subespécie de S. calliope. Adicionalmente, os dados moleculares suportam uma nova espécie não descrita para o gênero (K. R. Wilmott in prep.). Todas as relações entre espécies tiveram alto suporte nos três métodos filogenéticos utilizados com exceção da posição de S. euterpe. Por isso podemos inferir que as relações explicitadas aqui são a melhor hipótese atual para a evolução do gênero Stalachtis. A ramificação profunda em dois grupos dentro de Stalachtis - 1) o clado composto pelas espécies irmãs S. phlegia + S. susanna e 2) o clado com as espécies restantes S. lineata, S. phaedusa, S. halloweeni, S. euterpe, S. magdalena, S. terpsichore, S. calliope e

Stalachtis sp. – é espelhada no padrão de coloração das asas desses clados. No primeiro a coloração é de pontos brancos sobre fundo laranja e preto, um padrão bem distinto dos padrões apresentados pelas espécies do segundo clado. A relação de espécies irmãs entre S. phlegia e S. susanna não foi uma surpresa, dada a grande similaridade morfológica entre essas duas espécies, o que que levou à sinonimização das duas (Callaghan & Lamas 2004). O mesmo pode-se dizer do clado formado por S. terpsichore, S. calliope e a espécie nova do Equador, embora espécie irmã de S. calliope apresente padrão menos parecido com esta. A espécie Stalachtis lineata (Guérin-Méneville, [1844]) foi recuperada como monofilética, e apesar de pequenas variações no padrão alar, os indivíduos aqui estudados formaram um clado coeso. Esta espécie não possui subespécies (Lamas e Callaghan, 2004), fato corroborado pelos presentes resultados. Entretanto, os indivíduos amostrados se organizaram em dois clados distintos, um representando as amostras de Oriximiná (PA) e outro com as amostras do rio Tapajós (PA) e de Paranaíta (MT), sugerindo que possa existir estruturação genética baseada na distribuição geográfica. A espécie Stalachtis halloweeni Hall, 2006 foi recuperada monofilética e grupo irmão da espécie Stalachtis phaedusa (Hübner, [1813]). Essa relação é interessante pois as duas espécies possuem padrões alares superficialmente muito distintos. Entretanto, um olhar cuidadoso mostra similaridades nos elementos de padrão de asa, como as listras pretas próximas das veias. A espécie S. phaedusa também foi recuperada como monofilética apesar de sua grande variação em coloração de asas. A espécie Stalachtis euterpe (Linnaeus, 1758) foi encontrada como monofilética nas nossas análises, mas infelizmente, todos os indivíduos estudados pertenciam à uma única subespécie: Stalachtis euterpe latefasciata Staudinger, 1888. Mesmo assim, os indivíduos estudados são de áreas geográficas bem distantes, e se mantiveram em um clado coeso. A posição de S. euterpe como grupo irmão das espécies que apresentam padrões miméticos “tigrados” – S. magdalena, S. terpsichore, S. calliope e Stalachtis sp. – não apresentou alto suporte, mas foi encontrada inclusive no gene CAD (não utilizado para as filogenias), além do que, em análises com menor amostragem, essa relação aparecia com alto suporte. Os dois clados formados pela espécie Stalachtis magdalena magdalena (Westwood, [1851]) tem forte influência do gene mitocondrial COI. Na literatura, já foram descritos

72 casos onde o COI se mostrou ineficiente em agrupar indivíduos da mesma espécie (Dasmahapatra et al. 2010), porém no caso de S. magdalena, os indivíduos aqui estudados são poucos e de localidades muito próximas. Essa incongruência entre o DNA mitocondrial e os marcadores nucleares não é incomum (Dupuis et al. 2012), e essa diferença encontrada no DNA mitocondrial pode mostrar alguma barreira para o fluxo gênico que não podemos observar no DNA nuclear por causa do tamanho efetivo populacional ser menor (Funk & Omland 2003, Hudson & Turelli 2003). Outra possibilidade é que muitas vezes, os caracteres morfológicos evoluem mais devagar que os dados genéticos, resultando em espécies crípticas (Joyce et al. 2009). Porém, uma explicação alternativa – ainda não testada – para a causa desses dois clados distintos é a seleção do genoma mitocondrial por parasitas citoplasmáticos. As bactérias do gênero Wolbachia afetam o fenótipo dos seus hospedeiros, podendo matar embriões machos, causar incompatibilidade citoplasmática entre cepas diferentes de Wolbachia, levando a formação de clados distintos de hospedeiros, ou mesmo transformando machos em fêmeas (indivíduos geneticamente machos se desenvolvem em fêmeas funcionais) (Werren 1997). A infecção por Wolbachia (ou outras bactérias mitocondriais) explicaria o padrão encontrado em S. magdalena aqui, muito similar ao padrão que foi estudado para Coenonympha tullia em Kodandaramaiah et al. 2013. Também explicaria porque em um dos clados só existe um haplótipo em todos os indivíduos amostrados, devido ao fato que essas bactérias são capazes de fixar um haplótipo rapidamente na população do seu hospedeiro (Jiggins 2003, Hurst & Jiggins

2005). Dentro dos indivíduos anteriormente identificados como Stalachtis calliope (Linnaeus, 1758), foram encontrados 3 clados distintos, sendo que um deles é formado unicamente por um indivíduo com padrão alar distinto e de altas altitudes do Equador, esse que pode ser de uma espécie diferente. É interessante encontrar uma segunda espécie em altas altitudes do gênero, como S. halloweeni, já que a maioria das espécies estudadas são de áreas de menor altitude. Isso pode ser consequência da dificuldade logística de se estudar essas espécies de altas altitudes. Porém serão necessários mais estudos taxonômicos e provavelmente uma maior coleta na localidade para a descrição dessa espécie. O segundo clado é formado pelos indivíduos da espécie aqui revalidada S. terpsichore que apresenta caracteres morfológicos alares e da genitália diferentes da

73 espécie S. calliope. E o terceiro é composto pelos indivíduos que serão mantidos como pertencentes a espécie S. calliope. Quando Stichel (1910-11) propôs a tribo Stalachtini, ele a organizou em duas seções Adiorati e Diaphanes. Contudo, essas seções não são condizentes com a filogenia aqui proposta, sendo grupos não naturais. O grupo Diaphanes formado pelas espécies atuais, S. phaedusa e S. lineata, apesar de congruente com os padrões alares similares das duas espécies, não foi confirmado, pois a espécie S. phaedusa foi encontrada como irmã de S. halloweeni, e S. lineata como um grupo irmão do clado com essas espécies e S. euterpe, S. calliope, S. magdalena e S. terpsichore. O grupo Adiorati, composto pelas espécies S. phlegia, S. susanna, S. euterpe, S. calliope e S. magdalena também não foi encontrado monofilético, já que as espécies S. phlegia e S. susanna são um clado externo a todas as outras espécies de Stalachtis. Mais recentemente, Hall (2006) propôs uma hipótese filogenética para o gênero Stalachtis. Comparando-se a hipótese dele com a inferida nesse trabalho, existem alguns pontos de similaridade e outros de incongruência. Nas duas filogenias, a espécie S. phlegia, no caso desse trabalho o clado Stalachtis susanna e S. phlegia, é o grupo irmão de todas as outras espécies, de modo que o “grupo phlegia” por ele proposto pode ser mantido com a inserção da espécie revalidada S. susanna. O segundo grupo proposto por Hall (2006) foi denominado “grupo calliope”, contendo as espécies S. calliope e S. magdalena. Entretanto, na hipótese filogenética inferida aqui, a espécie S. euterpe foi encontrada mais próxima do clado no qual as espécies S. calliope e S. magdalena se encontram. Deste modo, para que o “grupo calliope” se mantenha monofilético, é necessário a inclusão de S. euterpe, da nova espécie de Stalachtis da Venezuela e de S. terpsichore O terceiro grupo proposto por Hall (2006), “grupo euterpe”, é o que apresenta maiores incongruências com a nossa hipótese filogenética. Esse grupo foi proposto para incluir as espécies - S. halloweeni, S. euterpe, S. phaedusa e S. lineata. Entretanto, sendo que S. euterpe é mais próxima filogeneticamente das espécies do “grupo calliope”, a definição deste grupo não se sustenta. Além disso, em todas as análises aqui feitas, a espécie S. lineata foi definida como grupo irmão do clado no qual estão todas as espécies exceto S. phlegia e S. susanna. Outra diferença é que a espécie S. phaedusa foi encontrada aqui como espécie irmã de S. halloweeni, sendo que Hall (2006) havia

74 proposto que S. phaedusa e S. lineata seriam espécies irmãs. Levando isso em consideração, para manter a classificação em grupos naturais, os seguintes grupos de espécies são propostos: 1 - “Grupo phlegia” – para S. phlegia e S. susanna. 2 - S. lineata em um grupo composto apenas por esta espécie 3 - “Grupo calliope” – para S. calliope, S. terpsichore, S. magdalena, S. euterpe e a espécie ainda não descrita 4 - “Grupo phaedusa”, para S. phaedusa e S. halloweeni.

O uso de marcadores moleculares para a delimitação taxonômica das espécies do gênero Stalachtis

Os marcadores moleculares aqui utilizados apresentam funções filogenéticas diferentes entre si. Como visto em todas as análises, o gene mitocondrial COI é capaz de separar todas as espécies do gênero Stalachtis – seja a primeira metade barcode ou mesmo a segunda parte – enquanto que os marcadores nucleares amostrados não apresentam essa divisão tão explícita, sendo que o gene CAD é o que chega mais perto disso. Vale ressaltar entretanto, que esses marcadores com taxa de mutação nucleotídica mais lenta são importantes para a construção filogenética já que são capazes de resolver as relações mais ancestrais na filogenia. Com isso, podemos afirmar que a região barcode é capaz de separar e identificar as espécies de Stalachtis com alta confiança, mostrando sua utilidade como ferramenta taxonômica. O gap esperado entre as distâncias intra e interespecíficas foi encontrado (Meyer & Paulay 2005), e provavelmente seria maior se não houvessem dois clados distintos dentro de S. magdalena. Como explicado para essa espécie, a história evolutiva dos genes mitocondriais nem sempre é congruente com aquela dos genes nucleares, e isso mostra que o uso de marcadores moleculares tanto nucleares quanto mitocondriais parece ser uma abordagem mais confiável para filogenias e a taxonomia molecular. As análises de distância genética aqui utilizadas – NJ, rede de haplótipos, distância genética – mostraram padrões similares que levam as mesmas conclusões. Focando na região barcode, as três análises separam todas as espécies, formando redes distintas, clados ou mesmo valores de distância acima do esperado entre espécies. Essas espécies

75 aqui delimitadas apresentam características distinguíveis morfológicas, genéticas e biogeográficas, como é sugerido pela taxonomia integrativa (DeSalle et al. 2005, Dayrat 2005, Will et al. 2005, Padial et al. 2010). Com essa visão, o gênero Stalachtis apresenta 10 espécies distintas. Em geral, não houve estruturação genética entre as subespécies amostradas, resultado já encontrado em trabalhos com outras borboletas (Brower & Jeansonne 2004) entretanto no trabalho de Silva-Brandão et al. 2008 houveram diferenças significativas entre subespécies com os mesmos marcadores aqui utilizados. Isso gera algumas dúvidas sobre a validade das subespécies descritas, principalmente devido a variação local dos padrões alares. Como alguns padrões considerados de subespécies diferentes encontram-se na mesma localidade, e não foram encontradas diferenças genéticas, ou ecológicas dessas subespécies parapátricas, é provável que elas não se encaixem em conceitos modernos de subespécie (Braby et al. 2012) ou mesmo no conceito de raças geográficas, pois habitam a mesma localidade (Brown 1975). Desse modo, as variações encontradas seriam apenas uma variação morfológica que ocorre dentro das populações, não sendo distinta entre populações de localidades diferentes.

S. phlegia + S. susanna

Todas as análises propostas mostram espécies irmãs S. phlegia e S. susanna como entidades distintas, com exceção da árvore de NJ para o gene o RPS5 (Figura II-5). A distância genética média entre essas espécies é de 5,9% (Tabela II-3), acima do limite definido para delimitar espécies nessa região (Hebert et al. 2003). Além disso, não apresentam nenhum haplótipo em comum, com exceção do gene RPS5, e para as redes mitocondriais, duas redes distintas são formadas (Figuras II- 6 e 7). Outra característica importante é que para S. phlegia não foi detectada estruturação congruente com nenhuma das outras duas subespécies reconhecidas. Adicionalmente a essas evidências moleculares, temos as evidências biogeográficas reforçando essa separação das duas espécies, pois suas distribuições são distintas, sendo S. phlegia uma espécie mais relacionada com áreas abertas da Floresta Amazônica e Cerrado, e S. susanna por sua vez, uma espécie relacionada com áreas abertas principalmente da Mata Atlântica (Figura II-22). Além disso, os padrões alares são distintos (Figura II-19), e elas apresentam alguns

76 caracteres distinguíveis na genitália masculina – não apresentados aqui – que também são capazes de delimitar as duas espécies. Além das evidências obtidas por esse trabalho, no trabalho de Brown et al. (2012) sobre a evolução cromossômica em Riodinidae, é mostrado que S. phlegia e S. susanna possuem números cromossômicos diferentes (28 e 36, respectivamente), isso é importante pois a mudança cromossômica é considerada um dos fatores que leva a especiação (Coghlam et al. 2005), o que sugere que essas espécies estão isoladas reprodutivamente. Sendo assim, S. phlegia é composta pelas subespécies aqui estudadas Stalachtis phlegia phlegia (Cramer, 1779) e Stalachtis phlegia phlegetontia (Perty, 1833), além de Stalachtis phlegia nocticoelum Seitz, 1917. Todavia, a sub-espécie da Venezuela Stalachtis phlegia venezolana Seitz, 1917 (não amostrada), apresenta um padrão alar distinto das outras três sub-espécies de S. phlegia, e muito similar ao de S. susanna. Portanto, a identidade deste táxon não pode ser determinada sem evidências adicionais. Como foi dito, não houve estruturação genética entre as subespécies amostradas, além de não parecer haver diferença na distribuição geográfica delas, isso indica que as variações morfológicas atualmente organizadas em subespécies não parecem ser unidades taxonômicas distintas. Por sua vez, Stalachtis susanna apresenta todas as características demonstradas para ser uma espécie válida, e como não foi encontrado nenhuma variação importante entre os seus indivíduos, deve ser mantida sem subespécies.

Stalachtis lineata

A espécie Stalachtis lineata (Guérin-Méneville, [1844]) foi recuperada como monofilética em todas as hipóteses filogenéticas (Figuras II- 13, 14 e 15), e apesar de pequenas variações no padrão alar, os indivíduos aqui estudados formaram um clado coeso. Esta espécie não possui sub-espécies (Lamas e Callaghan, 2004), fato corroborado pelos presentes resultados.

S. phaedusa + S. halloweeni

As espécies irmãs S. phaedusa e S. halloweeni, são facilmente distinguíveis morfologicamente e apresentam distribuições geográficas separadas. A distância genética média entre elas é bem alta 8,2% (Tabela II-3), notavelmente, o marcador GAPDH na análise de NJ não distingue as duas espécies (Figura II-4), formando apenas um clado, já a análise de NJ do RPS5 apresenta um clado distinto para S. halloweeni (Figura II-5). As S. phaedusa utilizadas nesse estudo apresentam os padrões de três sub-espécies (Stalachtis phaedusa duvalii, Stalachtis phaedusa phaedusa e Stalachtis phaedusa trangeri) entretanto todos eles são de localidades muito próximas no estado do Pará e não houve estruturação filogenética dessas subespécies.

S. euterpe

Nas análises de ML e bayesiana houve uma pequena estruturação genética congruente com a distribuição geográfica de S. euterpe, entre os indivíduos do estado do Acre e do Pará, entretanto como já dito anteriormente, não foram encontradas diferenças morfológicas entre os indivíduos das duas regiões. Essa estruturação e o alto valor de distância genética máxima (5,5%, Tabela II-3) podem refletir principalmente a distância geográfica entre as populações amostradas, o que pode estar interferindo no fluxo gênico, mas não existem evidências aqui para se organizar em diferentes táxons essas populações.

Stalachtis magdalena

Os indivíduos da espécie Stalachtis magdalena formaram dois clados com alto suporte, inclusive duas redes distintas foram formadas nas análises para o COI. Entretanto os indivíduos desses clados não apresentam diferenças morfológicas alares aparentes e indivíduos da mesma localidade participam de clados diferentes. Como foi discutido anteriormente, isso pode ser um artefato do uso dos genes mitocondriais, ou devido a um processo de especiação por parte de bactérias citoplasmáticas. Stalachtis

78 magdalena é uma boa espécie para exemplificar como a confiabilidade da delimitação taxonômica por barcode pode ser afetada por esses efeitos, baseando-se apenas no COI poderíamos separar esses clados em duas espécies, porém não existem evidências de outras fontes como a morfologia ou a biogeografia – mesmo os genes nucleares não mostram esse padrão. Por isso, seria interessante estudar em nível populacional essa espécie, além de testar a presença de bactérias citoplasmáticas no futuro e estudar mais atentamente a morfologia, como avaliar se há diferenças na genitália masculina entre os dois clados.

S. calliope + S. terpsichore + Stalachtis sp.

A espécie S. calliope é amplamente distribuída, e obtivemos indivíduos de localidades desde o estado do Acre até o Pará, e mais ao sul até o Mato Grosso (Figura II-27). Não houve estruturação bem definida geograficamente ou pelas subespécies. O indivíduo BLU-647 que foi coletado em altas altitudes do Equador se mostrou externo as outras S. calliope e provavelmente devido ao seu padrão alar distinto é uma unidade evolutiva diferente. Além disso nas análises de distância genética e na rede de haplótipos para o COI, ele mostrou um padrão congruente com uma nova espécie. Por isso, além das diferenças morfológicas deverá ser descrita uma nova espécie na qual esse indivíduo se encaixa. Os indivíduos de S. terpsichore formaram um clado distinto com alto suporte, eles apresentam padrões similares aos de S. calliope, entretanto, as duas apresentam características morfológicas distintas e apresentam características da genitália masculina que permitem distinguir S. terpsichore de S. calliope. Isso é importante pois, todos os dados moleculares obtidos revelaram que esses indivíduos eram de uma espécie diferente da dos outros, como a rede de haplótipos distinta, as análises de NJ do COI e do RPS5 e a distância genética média de 6,2% entre S. calliope e S. terpsichore. As evidências moleculares e morfológicas sugerem que entre os 4 padrões alares de indivíduos previamente identificados como Stalachtis calliope, dois deles realmente correspondem a esta espécie, os padrões identificados das duas sub-espécies descritas, S. calliope calliope e S. calliope bicoler. Não houve uma estruturação genética clara entre os indivíduos das duas subespécies, apesar de haver congruência com a biogeografia, os

79 indivíduos encontrados de S. calliope que não apresentam pontos brancos na região apical da asa anterior, ou seja, Stalachtis calliope bicoler (Staudinger, 1888) são do estado do Acre, próximos de onde a subespécie foi descrita. Todavia, a distribuição das duas subespécies não é descontínua, e um indivíduo fotografado do Acre apresenta manchas brancas fracas apenas no lado ventral das asas. Isso sugere que essa caráter possa apresentar um contínuo de formas, de maneira que as subespécies seriam apenas os extremos dele, não podendo ser consideradas válidas como subespécies (Brown 1975, Braby et al. 2012).

CONCLUSÃO GERAL

Neste estudo, foi proposta uma hipótese filogenética molecular cuidadosa para o gênero Neotropical Stalachtis, que mostrou-se monofilético e além disso, evidenciou a existência de pelo menos nove espécies dentro do gênero, mas podendo atingir até 11 espécies baseando-se nos resultados obtidos neste trabalho. As relações evolutivas entre as espécies foram resolvidas e a distribuição biogeográfica conhecida para essas espécies foi estudada. Podemos dividir as espécies em quatro clados distintos: 1) as espécies irmãs S. phlegia e S. susanna; 2) a espécie S. lineata sozinha; 3) as espécies irmãs S. phaedusa e S. halloweeni; 4) e as espécies S. euterpe, S. magdalena, S. calliope, S. terpsichore e Stalachtis sp. compondo o último clado. É interessante ressaltar aqui que, a utilização de marcadores moleculares neutros permitiu uma hipótese filogenética livre dos padrões morfológicos alares, que como mostrado levaram alguns autores anteriormente a conclusões provavelmente incorretas sobre o gênero. Duas espécies são revalidadas – S. susanna e S. terpsichore – e uma espécie nova deverá ser descrita para o genêro Stalachtis. DeSalle et al. 2005, propôs o uso de várias fontes de evidência para a delimitação de espécies – taxonomia integrativa – nesse estudo, evidências moleculares, morfológicas e biogeográficas foram utilizadas para delimitar essas espécies. Adicionalmente, foi mostrado que o marcador barcode (Hebert et al. 2003) é uma bom marcador para essa delimitação se utilizado junto com outras fontes de evidência – genes nucleares, morfologia, biogeografia, ecologia, etc. Seu uso sozinho na delimitação de espécies poderia trazer erros como no caso da espécie S. magdalena.

Alguns estudos ainda devem ser feitos, principalmente em nível populacional quanto a espécie S. magdalena. Ademais um estudo detalhado sobre a nova espécie deverá ser feito. Quanto as subespécies, não foi encontrado nenhum padrão que as delimitasse, tanto genético quanto biogeográfico, por isso, um estudo com mais indivíduos e outros marcadores moleculares para as subespécies seria interessante para se avaliar se elas são ou não unidades taxonômicas distintas.

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