210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:41 Str. 2

Šestnáctý ročník B Číslo 3 – 4/2006 I PRO SPECT

Adresa společnosti: VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel.: 220 443 151, fax: 233 334 769, e-mail: Danka Pokorná@vscht.cz, IČO 00570397, číslo účtu: 19534-061/0100 Komerční banka Praha 6, Dejvická 52, SWIFT CODE: COMBCZTPP

Redakční rada

RNDr. Tomislav Barth, DrSc ÚOCHB AVČR, Flemingovo n. 2, 166 10 Praha 6 (Editor)

RNDr. Milan Fránek, DrSc Výzkumný ústav veterinárního lékařství Hudcova 70, 621 32 Brno BULLETIN Ing. Petra Lipovová, Ph.D. BIOTECHNOLOGICKÉ VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6 (Editor) SPOLEČNOSTI Prof. Ing. Jan Káš, DrSc VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6 zakládajícího člena Českého svazu Doc. Ing. Ladislav Fukal, CSc vědeckotechnických společností VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6 (ČSVTS) (Editor in Chief) a Ing. Pavel Ulbrich, Ph.D. člena „European Federation VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6 of “ (EFB) (Editor)

RNDr. Vladimír Vala Ivax, Ostravská 29, 747 70 Opava

RNDr. Tomáš Vaněk, CSc ÚOCHB AVČR, Flemingovo n. 2, 166 10 Praha 6

Bc. Pavel Jenč VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6

http://bts.vscht.cz 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:34 Str. 3

16th Volume B No. 3 – 4/2006 I PRO SPECT

Society address: ICT, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel.: 420-220 443 151, fax: 420-233 334 769, e-mail: [email protected], IČO 00570397, account No.: 19534-061/0100 Komerční banka Praha 6, Dejvická 52, SWIFT CODE: COMBCZTPP BULLETIN OF CZECH research and practice in our biotechnology. The Bulletin should facilitate the exchange and BIOTECHNOLOGY targeted delivery of information. In each issue SOCIETY there will be advertisements of products such as chemicals, diagnostics, equipment and apparatus, which have already appeared on the member of European Federation Czech and Slovak market, or are projected of Biotechnology enter it. Services, free R&D or production facilities can also be advertised. The editorial board, together with the executive commitee of the Biotechnology Society, hope that maybe some information published in the Bulletin, SUMMARY or some new contacts based on it, will give birth to new cooperations with domestic Bioprospect, the bulletin of the Biotechnolo- or foreign research teams, to collaborations, gy Society is a journal intended to inform the joint ventures or strategic alliances providing society members about the most recent deve- access to expertise and financing in interna- lopments in this field. The bulletin should sup- tional markets. ply the vitaly important knowledge directly The editorial board invites all of You, who to those who need it and to those who are able are involved in the field called biotechnology, to use it properly. In accordance with the rules and who are seeking contacts in Czech and of the Society, the Bulletin also deals with both Slovak Republic, to advertise in the Bulletin theoretical and practical questions of biotech- BIOPROSPECT, which is mailed directly nology. Articles will be published informing to more than one and a half thousand Czech about the newest theoretical findings, but many and Slovak biotechnologists. planned papers are devoted to fully practical For more information contact the editorial topics. In Czech and Slovak Republic there is board or directly: a growing gap between basic research and pro- Ladislav Fukal, Ph.D. (editor in chief) duction. It is extremely important to reverse ICT, Technická 3 as soon as possible the process of further open- 166 10 Prague 6, Czech Republic ing of the scissors, and we hope the Bulletin Phone +420 220 445 137 will help in this struggle by promoting both e-mail: [email protected]

http://bts.vscht.cz 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 6

ÚVODEM

Vážení přátelé,

ke konci letošního roku jsme pro Vás připravili spolupráce, nabídkách podpory podnikatelům a další dvojčíslo (č. 3 – 4) 16. ročníku našeho Bioprospectu. zajímavosti. V tomto směru spolupracujeme s řadou Doufám, že se Vám bude líbit stejně jako předchozí partnerů jako jsou např. CzechInvest (http://www.cze- dvě letošní čísla. Připravili jsme pro Vás opět řadu chinvest.org), CzechTrade (www.czechtrade.cz), Inova- informačních článků z různých oblastí biotechnologie, Pro (www.inovapro.cz), Ministerstvo životního prostředí tak snad každý z Vás zde najde něco co ho zaujme. (www.env.cz), Ministerstvo zemědělství (www.mze.cz), Jedná se např. o tato témata: geneticky modifikované Jihomoravské inovační centrum (www.jic.cz plodiny, biotechnologie v chemickém průmyslu, bio- a www.gate2biotech), Biotrin (www.biotrin.cz), univer- mikronanotechnologie, enzymové modifikace fosfolipi- sity, výzkumné ústavy i sesterské společnosti. dů, acylace proteinů, oxidační stres a cytokiny v relaci Rád bych využil této příležitosti a pozval Vás s protinádorovou imunitní odpovědí. Po delší době na 13. Evropský biotechnologický kongres organi- jsme také zařadili jen článek v angličtině, jehož jedním zovaný Evropskou biotechnologickou federací z autorů je hostující vědecký pracovník ve Výzkumném ve dnech 17. – 19. září 2007 ve španělské (katalán- ústavu veterinárního lékařství v Brně a týká se popu- ské) Barceloně. Hlavním tématem kongresu je symbi- lárního tématu bioanalysy. Nechybí ani aktuální osa mezi vědou, průmyslem a občanskou společností. informace, i když těžiště takovýchto příspěvků se Bližší informace naleznete na webových stránkách chystáme přesunout jednak na naše webové stránky http://www.ecb13.eu. Vložné je přijatelné (300 EURO http://bts.vscht.cz nebo do e-mailového servisu. pro členy EFB, t.j.členy Biotechnologické společnosti V současnosti již pracujeme na přípravě Bioprospec- a 200 EURO pro studenty, pokud se vložné zaplatí tu 17. ročníku a uvítáme Vaše náměty, aby náš bulletin do 30. 6. 2007). byl pro Vás ještě přítažlivější a samozřejmě se těšíme O dalších akcích Vás budeme průběžně informovat na Vaše příspěvky i krátké informace z Vašeho oboru či na našich webových stránkách a/nebo e-mailovým profesního okolí. Doufám, že jste si již prohlédli naši servisem. zpřístupněnou webovou stránku http://bts.vscht.cz, Závěrem bych Vás rád požádal abyste laskavě infor- na které stále pracujeme. Je však řada informací, které movali o činnosti naší společnosti všechny jednotlivce, přicházejí na poslední chvíli a vystavovat je na webu podniky i instituce zajímající se o biotechnologie nemá valný význam, neboť asi nikdo z nás neotevírá a požádali je o spolupráci. Děkuji Vám všem za pří- webové stránky každý den. Pro tento účel je nejvhod- zeň v r. 2006, přeji Vám přijemné prožití vánočních nější odeslání zprávy e-mailem. Máte-li zájem o infor- svátků a po celý rok 2007 mnoho úspěchů v soukro- mace („last moment“) sdělte nám to, a my Vás zařadí- mém i profesním životě. me do našeho e-mailového informačního servisu. V rámci tohoto servisu zasíláme zájemcům měsíční Váš internetový bulletin Evropské federace biotechnologií, informace o přednáškách, kursech, oznámení Jan Káš o grantových projektech, možnostech mezinárodní

1 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 7

Projekt JPD3 CZ04.3.07/4.2.01/0009 Senzory a biosenzory pro lékařskou diagnostiku Spolufinancovaný ze státního rozpočtu ČR a Evropského sociálního fondu www.sbb.cz Projekt Biotechnologie pro Prahu bilancuje

Přes sedm stovek osob z více než 50 organizací covaný z Evropského sociálního fondu a státního roz- navštívilo během posledních dvanácti měsíců odborné počtu ČR je zaměřený na oblast Prahy a odstartoval semináře, semestrální kurzy, přednášky, praktické kurzy v říjnu 2005. a další akce pořádané v rámci projektu Senzory a bio- Řešiteli projektu, koordinovaného společností VIDIA senzory pro biotechnologie, lékařskou diagnostiku spol. s r.o., jsou dále ÚRE AV ČR, ÚMCH AV ČR, MFF UK, a životní prostředí. Dvouletý vzdělávací projekt, finan- VŠCHT Praha, Inova Pro, s.r.o a Safibra, s.r.o.

Koho projekt oslovuje:

Nejpočetnější cílovou skupinou jsou studenti (43 %), z převážné většiny studenti vysokých škol – hlavně VŠCHT Praha a Matematicko fyzikální fakulty Univerzity Karlovy. Přes 40 % účastníků některé z akcí projektu představují zaměstnanci výzkumných ústavů nebo vysokých škol. Zhruba každý desátý účastník byl zaměstnancem malého či středního podniku (MSP).

Některé z uskutečněných akcí: Značnému zájmu odborné veřejnosti se těšily dva diagnostiky systémem antigen-protilátka. Ve dvou odborné semináře Optické biosenzory a jejich vy- laboratořích si vyzkoušeli různé imunoanalytické meto- užití, pořádané Ústavem radiotechniky a elektroniky AV dy a polymerázovou řetězovou reakci. ČR. Více než stovka účastníků na nich získala přehled Pro potřeby účastníků Laboratorního kurzu vydala o tom, jak daleko dospěl výzkum, vývoj a komerciona- VŠCHT Praha obsáhlá skripta. Jde o jeden ze čtyř prak- lizace optických senzorů. Na každou přednášku nava- tických kurzů organizovaných v rámci projektu. zoval diskusní panel, v jehož rámci odpovídali odbor- Seminář na téma „Jak chránit duševní vlastnictví níci z vysokých škol, Akademie věd i firem a diskuto- v oblasti biotechnologií“ organizovaný společností vali mimo jiné o tom, jak a kde využít biosenzorické Inova Pro, byl příležitostí získat informace o licenční technologie v moderní analytice. politice, o tom, jak podávat patent, ochrannou známku Velmi příznivý ohlas měla též tříhodinová seminární či užitný vzor, jakož i o úskalích patentování a jeho přednáška Mikrofluidní systémy, popis konstrukce financování ochrany duševního vlastnictví. Tři desítky a výroby mikrostruktur, vybrané biosenzorové účastníků z řad vysokých škol, výzkumných ústavů i bio- a další aplikace pořádaná VŠCHT Praha. Každý z 40 technologických firem vyslechly několik případových přítomných dostal k tomuto účelu vytvořený tištěný studií a v diskusi řešili další konkrétní příklady z oblasti učební materiál v rozsahu 90 stran. duševního vlastnictví. Na dvoudenním praktickém laboratorním kurzu se Více informací o pořádaných akcích na www.sbb.cz seznámila dvacítka účastníků s moderními metodami Ing. Jiřina Shrbená, Ing. Daniela Vojtová, Inova Pro, s.r.o.

Mezinárodní konference New aspect in aquaculture (11. – 13. 10. 2005, Plovdiv, Bulharsko) Konference byla uspořádána ke 40. výročí založení excretion in intesivly cultured African catfish /Clarias plovdivského rybářského ústavu, který je nyní poboč- gariepinus/ at different water temperatures). Jednání kou ústavu ve Varně (Institut of Fisheries and Aquacul- konference probíhalo v sekcích: Kvalita rybího masa ture, Varna, Branch of Freshwater Fisheries, Plovdiv). a výživa ryb (celkem 8 příspěvků), Akvakultura a envi- Konference se zúčastnilo 60 osob, z toho 10 zahranič- ronment (7), Chov ryb (9), Nemoci ryb (4) a Genetika ních účastníků z celkem 7 zemí (ČR 3, SRN 2, Maďar- ryb (4). Všechny příspěvky byly prezentovány formou sko 1, Bělorusko 1, Řecko 1, Chile 1, Makedonie 1). přednášek. Z konference nebyl vydán sborník abstrak- Prezentováno bylo celkem 32 příspěvků. Účastníci tů, plné znění příspěvků bude prezentováno v Bulga- z VÚRH JU Vodňany prezentovali celkem 3 příspěvky rian Journal of Agricultural Science. Na závěr konferen- (J. Hamáčková, J. Kouřil, Z. Stupka: Clove oil utilisation ce byla uspořádána exkurse na farmu firmy Oscietra as an anaesthetic in aquaculture; J. Kouřil, J. Hamáčko- commerce Ltd. v Boliartzi u Plovdivu. Farma je zamě- vá, P. Lepič, A. Lepičová, T. Barth: Semiartificial and arti- řena na chov generačních ryb 6 druhů jeseterů, pro- ficial propagation of European perch /Perca flviatilis/ dukci násadového materiálu, kaviáru a tržních ryb. with GnRH analogues; Z. Stupka, O. Valentová, J. Ha- Tomislav Barth, máčková, P. Lepič, J. Kouřil: Total ammonium nitrogen Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Praha 6

2 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 8

ODBORNÉ PŘÍSPĚVKY BIOTECHNOLOGIE PŘI VÝROBĚ BATERIÍ Jiří Patočka Zdravotně sociální fakulta Jihočeské univerzity, České Budějovice

Biotechnologie pronikají do stále nových oblastí byl M13 (bakteriofág). Za to, že se virus obaluje a přináší dříve netušené možnosti. Takovou oblastí jsou vrstvičkou kovu, je zodpovědná uměle vložená DNA, např. elektrické baterie a akumulátory, kde podle nej- respektive povrchový , který se podle ní synteti- novějších výzkumů by se mohly uplatnit bakterie zuje. Nejdříve byly vyzkoušeny proteiny, které umožňu- a možná i viry. Nápad na využití bakterií pro produkci jí živočišným buňkám vázat vápník a pak byly hledány elektrického proudu není nový, ale takovéto baterie další, vážící i jiné kovy. Zatím vyzkoušené modifikace zatím nedoznaly praktického využití (1 – 4). Bakterie umožňují virům vychytávat z okolí kobalt a zlato, před- Rhodoferax ferrireducens, objevená v sedimentech ve pokládá se ale, že jiné dodané řetězce DNA povedou Virginii, funguje jako mikrobiální palivový článek a pře- ke vzniku struktur, které budou vykazovat afinitu i k dal- měňující energii cukrů na elektrickou energii s účinnos- ším kovům. DNA požadovaných vlastností se zjišťuje tí 81 %. Chaudhuri a Lovley z Massachusettské univer- jednoduše tak, že směs různě modifikovaných virů se zity použili R. ferrireducens k sestrojení unikátní „bak- nalije na vrstvičku kovu na níž zůstanou nadějné teriální baterie“. Kultura bakterií v nádobě s grafitovými varianty „přilepeny“, zatímco ostatní se odplaví. Elektro- elektrodami, živících se glukózou, produkovala dlouho- du s tenkým kovovým povlakem lze ze záporně nabi- době stabilní elektrický proud (5). Bakterie konvertova- tých komplexů viru a kovu vytvořit tak, že se nechá ly v elektrický proud i další cukry: fruktózu, xylózu tvarovat na kladně nabitém podkladu z plastu (6). a sacharózu. Tato cesta nabízí možnost zužitkování nej- Nová technologie má oproti stávající výrobě baterií různějšího bioodpadu k výrobě elektrické energie. celou řadu výhod. Proces výroby probíhá za pokojové Neobyčejně zajímavé možnosti nabízí některé modi- teploty a normálního tlaku a bez použití nebezpečných fikované viry, zejména při výrobě miniaturních baterií chemikálií, což zlevňuje výrobu. Takto vytvořené baterie pro speciální účely. Bioinženýři z Massachusetts Institu- by mohly být lehčí a menší než jsou současné výrobky te of Technology (MIT) zveřejnili objev geneticky modi- odpovídající energetické kapacity (7). Předností je, fikovaného viru, který na sebe „nabaluje“ atomy kovu že viry mohou vytvářet elektrody od nanometrových a může fungovat jako kovová elektroda. Takto uprave- měřítek až po centimetrové tyčinky. Uvažuje se také né viry by mohly najít uplatnění i v tak odlehlém oboru, o tom, že by geneticky modifikované viry mohly být jako je výroba baterií. Základem pro genetickou úpravu v budoucnu využity i ke stavbě solárních článků.

Literatura 1. Daumas S., Massiani Y., Crousier J., Sci. 28: 5. http://www.sciam.com/ 1041-1050, 1988. article.cfm?articleID=00054931-E680-1F58- 2. Scholz F., Schroder U., Nature Biotechnol. 21: 1151- 905980A84189EEDF&sc=I100322 1152, 2003. 6. Nam K.T. et al., Science 312: 885-888, 2006. 3. Whitehouse D., 7. Nanotechweb. http://www.nanotechweb.org/ http://news.bbc.co.uk/1/low/sci/tech/3092754.stm articles/news/5/4/4/1. (10/09/2003). 4. http://www.sciencentral.com/articles/ view.php3?article_id=218392129 (23/04/2004).

3 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 9

BIOMIKRONANOTECHNOLOGIE Boris Bartoš Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Biomikronanotechnologie je vědním oborem, který BioMEMs se za posledních deset let rapidně rozvinul v jednu Sdružují mikrostrojové elementy, většinou ze siliko- z nejdůležitějších a do budoucna potenciálně význam- nových materiálů, obsahující různé převody, mikromo- ných výzkumných a průmyslových oblastí. Zjednoduše- tory, akční členy a další. Takové vysoce integrované ně by se tento obor dal definovat jako soubor techno- mikrosystémy mohou vyřešit mnoho technických logií umožňujících práci v mikroskopických až nanosko- problému, které jsou běžnými metodami neřešitelné. pických měřítcích a kombinující přitom biologické Příkladem takového zařízení jsou mikročerpadla růz- materiály se zákonitostmi fyziky, chemie a genetiky ných typů a velikostí, ale také mnohem sofistikovanější a tvořící synthetické struktury analogické živým tkáňím. mikročipy, tzv. „lab-on-chip“ zařízení. Jedná se o jedno- Jelikož se jedná o soubor interdisciplinárních odvětví, tku, kombinující reakční komory s detektory, schopné není jednoduché je striktně rozdělit. Jednotlivá odvětví vlastní analýzy, vstupy a výstupy, vybavené i připojením plynule přechází do druhých a vzájemně se prolínají. na externí zařízení. Zjednodušeně řečeno, schopné Velmi zhruba tedy můžeme biomikronanotechnologii nahradit celou laboratoř. rozdělit do několika velmi příbuzných kategorií: nano- biotechnologie, bioMEMs (biological micro-electrome- Mikrofluidní systémy chanical systems), mikrofluidní systémy, biosenzory, Jsou to zařízení kontrolující tok plynných nebo kapal- bio(mikro)čipy a tkáňové inženýrství. ných látek v malých množstvích a v miniaturních systé- mech. Jedná se obor úzce související s ostatními obory. Nanobiotechnologie Můžeme pod něj zahrnout mikrozařízení jako mikromí- Lze je definovat jako výrobu zařízení z organických siče, ať už pasivní, míchající pomocí různých štěpení nebo biologických materiálů, kde alespoň jedna funkč- a rotací tekutiny, nebo aktivní, využívající magnetohyd- ní komponenta svou velikostí odpovídá molekulárním rodynamického vlivu, elektroosmózy a dalších jevů. nebo dokonce atomárním rozměrům. Právě takové Dále sem patří tepelné mikrovýměníky, jejichž výhodou funkční rozměry nám mohou umožnit hlouběji porozu- je ohřátí či ochlazení v řádech milisekund, chemické mět biochemickým procesům dalo by se říci atom mikroreaktory, umožňující podstatně vyšší stupeň kon- po atomu. To skýtá obrovské možnosti využití v medicí- verze a vyšší selektivitu, ale můžeme sem zařadit i již ně a diagnostice. Dlouhodobým cílem, který si nano- zmíněná mikročerpadla, mikroventily atd. biotechnologie ukládá, je sestavení vysoce funkčního systému biosenzorů, elektronických okruhů, nanosko- Biosenzory pických čipů a molekulárních přepínačů a dále tkáňo- Tak se nazývají zařízení kombinující element biologic- vých analogů schopných nahrazovat nebo opravovat ký jako prvek detekční a element fyzikální jako prvek například poničené původní tkáně jako pokožka, kosti, převádějící měřený signál na zpracovatelné pulsy. svaly a další tělesné orgány. V rámci tohoto odvětví Biosenzory mají široké uplatnění v biomedicíně, moni- existují dva základní přístupy řešení problému. Prvním torování životního prostředí nebo při kontrole kvality je tzv. „bottom up“. Tento typ využívá znalostí struktury produktů ve výrobě. Kromě notoricky známých biosen- a biochemických procesů biomolekul k vytváření zorů, například na principu enzym – elektroda existuje nových funkčních materiálů, biosenzorů a bioelektroni- celá řada dalších, často ještě experimentálních přístro- ky pro biologické a biomedicínské využití. Příkladem jů tohoto typu. Takovým příkladem je tzv. biolaser, takového postupu jsou tzv. proteinové motory, které někdy též biokavitační . Jedná se o ultramalý laser mohou umožnit chemicky poháněný pohyb dalším kombinovaný s dalšími mikrostrukturami, případně mikro- nebo nano- zařízením jako nanoskopické pře- biologickými prvky. V praktickém použití se využívá tzv. našeče nebo sondy pro povrchové skenování. Druhým „smart scalpel“. Je to vlastně online průtokový cytome- typem je tzv. „top down“. V tomto případě se jedná tr, využívaný zejména na operačních sálech. Jeho výho- o aplikaci nástrojů a postupů nano- a mikro- technolo- dou jsou oproti běžným průtokovým cytometrům velmi gie k vytvoření zařízení pro studium nejrůznějších bio- malé rozměry. Díky němu je možné rozeznat u operací systémů. Příkladem takového zařízení je separace dlou- rakovinných nádorů, kde nádor končí a kde již začíná hořetězcových polymerů pomocí mikrodestičky s hus- zdravá tkáň. Dále je možné podobně detegovat poru- tou sítí tzv. nanopilířů. Poté se aplikuje dělená směs chy imunity skenováním povrchu buněk. za působení elektrického proudu. Podle délky pulsu a podmínek během reakce se kratší molekuly plně Mikro(bio)čipy inkorporují do sítě nanopilířů a delší jen částečně nebo Jsou jednou z nejkomerčnějších technologií poslední vůbec. Přestane-li poté působit elektrické pole, málo doby. Opět, podobně jako u mikrofluidních systémů se inkorporované nebo neinkorporované proteiny se sbalí jedná o obor velmi úzce spjatý s ostatními obory. Výho- a z destičky snadno odstraní. dou mikročipu jsou opět velmi malé dávky vzorků

4 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 10

a u některých také možnost urychlení reakce pomocí etherketo (PEEK) nebo kapalné krystalické polymery elektrického proudu. Velmi známým příkladem jsou tzv. (LCP). DNA biočipy (DNA ). Na definované ploše Zvláštní a v poslední době hojně využívanou skupi- (čipu) jsou navázány řetězce oligonukleotidů, k nimž se nou jsou tzv. fotorezisty. Jedná se o materiály citlivé selektivně váží komplementární fragmenty DNA tzv. na některé druhy elektromagnetického záření. Dělí se hybridizační reakcí. Dnes se jedná o standardní vybave- na dva typy, a to fotorezisty negativní a fotorezisty pozi- ní pro charakterizaci DNA. Existují i proteinové biočipy, tivní. Negativní fotorezisty se působením záření „vytvr- využívající metod ELISA nebo western blotting, na prin- dí“, dochází k zesíťování vazeb. Pozitivní fotorezisty se cipu interakcí antigen – protilátka a dalších. naopak dají odstranit lépe než neexponované části, vazby se působením záření narušují. Příkladem negativ- Tkáňové inženýrství ního fotorezistu je například komerční materiál SU8. Jeho cílem je vytvoření plně funkční a kontrolovatel- Pozitivním fotorezistem je třeba komerční né mikrostruktury analogické živé tkáňi. Kombinuje při- nebo polyimidy (PI). tom synthetické a biologické materiály, mikrostruktury Fotolitografie. Jedná se o metodu, při které dochází a zařízení. Nachází uplatnění při přípravě umělých k selektivnímu ozáření fotorezistu, ať už pozitivního implantátů, regenerační medicíně, ale i při přípravě nebo negativního, naneseného na povrch substrátu nový biosenzorů nebo mikročipů. Zajímavým příkla- a následné odleptání exponované (pozitivní fotorezist) dem je koncept „Animal-on-chip“. Jedná se o integraci nebo neexponované (negativní fotorezist) části. Celý mnoha tkáňových kultur jednoho organismu (včetně postup se dá zhruba shrnout do těchto kroků: Prvním člověka) na jeden mikročip. Výsledkem by mohla být je čištění substrátu, kdy se odstraní veškeré nečistoty reprodukce možné odpovědi vlastního organismu na z povrchu materiálu třemi po sobě jdoucími chemický- různá farmařila nebo látky, přítomné v životním pro- mi čistěními. Druhým je nanesení fotorezistu na sub- středí. Zde se ještě stručně pozastavím nad výběrem strát pomocí tzv. spin coateru. Třetím krokem je vlastní materiálů pro tkáňové inženýrství. Mohou být tři typy expozice fotorezistu většinou UV zářením přes masku požadavků na materiál. Prvním je schopnost indukovat s požadovaným vzorem a konečně čtvrtým krokem je buněčnou migraci a tkáňovou regeneraci. Druhým je tzv. vývoj fotorezistu, kdy se odstraní nejčastěji leptá- schopnost vytvořit tzv. imunoisolační bariéru, která by ním. Fotolitografie je často používanou metodou při dovolila přístup k dané struktuře jen některým moleku- výrobě mikročipů různých druhů a mikrofluidních lám. Konečně třetí typ pak slouží jako podpůrná matrix, zařízení. O něco preciznější, ale také podstatně náklad- poskytující nosnou kostru a organizaci, jako jsou napří- nější metodou je rentgenová litografie (RTG litografie). klad vlákna lakto/glykolátového kopolymeru. Zde je rezist senzitivní na rentgenové záření, kterému je opět vystaven přes masku s požadovaným vzorem. Materiály a technologie pro přípravu mikro- Nutností je však působení kolineárního svazku RTG a nanostruktur záření, produkovaného synchrotronem. Právě kvůli Co se týče základních materiálů, má výsostné posta- tomu je použití této metody značně omezené. Její vení křemík. Jako monokrystalové jednotky má význam výhodou jsou však nižší vlnové délky záření a z toho zejména v mikroelektronice. Ještě širší použití však mají vyplývající větší rozlišení při výrobě. silikony, a to při výrobě mikročipů a dalších mikrostruk- Další metodou je tzv. anizotropní mokré leptání. Zde tur. Výhodou je hlavně obrovská variabilita silikonů se substrát vloží do roztoku, kde dochází k leptání. různých vlastností. U krystalických materiálů, jako je například křemík, Sklo je jedním z nejstarších využívaných materiálů. závisí rychlost leptání na krystalografických rovinách., Je biologicky i chemicky stabilní, je transparentní. Nevý- tzn. Dutiny se vytváří jen podél určitých rovin. K leptání hodou je vyšší křehkost. Často využívaná je také kera- se využívá různých činidel, například KOH. Naproti mika, která je značně chemicky a mechanicky odolná. tomu u izotropního mokrého leptání je rychlost leptání Kovy se používají zejména k vytvoření aktivních vrstev ve všech směrech stejná, zejména u amorfních materi- například při galvanickém pokovování. Obtížně se álů jako sklo. s nimi pracuje při vytváření 3D struktur. Z oxidů kovů se Tzv. suché leptání se provádí pomocí toku vysoce

nejčastěji používá tzv. alumina (Al2O3), ale i některé reaktivního ionizovaného plynu, plasmy. Jako masky se

další jako BeO. používá například SiO2 nebo fotorezisty. Velmi používaným materiálem jsou polymerní plasty. Jako už bylo zmíněno výše, galvanické pokovování se Jsou poměrně levné a tudíž snadno dostupné. Jejich používá k vytváření aktivních kovových vrstev. Jedná se nevýhodou je však nízká tvrdost a tepelná stabilita. o elektrolytické nanášení kovů ( hlavně Ni nebo Cu) na K dispozici je řada plastů, od běžných plastů jako pol- substrát, který tvoří jednu z elektrod. vinylchlorid (PVC), polyethylen (PE) nebo polypropylen Mikroobrábění se může provádět několika způsoby. (PP), přes technicko-inženýrské, které mají lepší vlast- Mechanicky, laserem nebo pomocí elektrojiskry. nosti než běžné plasty, hlavně vyšší tepelnou odolnost, Mechanicky se provádí pomocí různých mikrofréz což jsou například polyethylentereftalát (PET), polyami- a mikrovrtaček, nevýhodou je však limitace rozlišení, dy (PA) nebo polybutylentereftalát (PBT), až po speci- která je maximálně v řádech stovek mikrometrů. ální plasty jako polysulfonáty (PSU), polyether- O něco lepší je obrábění laserem, kdy se materiál

5 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 11

vpodstatě odpaří přes masku nebo přímo. Elektrojis- potřeba vyrobit formu jako primární matrici, nejčastěji krové mikroobrábění využívá erozivního působení elek- z kovu. Ta se poté zalije tekutým polymerem a nechá trického výboje na svrchní vrstvy materiálu. ztuhnout. Poté se finální struktura oddělí od matrice. Je Existuje také celá řada metod replikace již hotových to tudíž velmi jednoduchá metoda, která nevyžaduje výrobků. Jedná se zejména o vtlačování nebo vytlačo- žádné zvláštní vybavení. vání za tepla, vstřikování nebo odlévání. Při vtlačování Další metody většinou spočívají v modelování 3D nebo vytlačování je forma vtisknuta do filmu z termo- struktur pomocí nanášení a zápisu (vytvrzení) vrstvy za plastu, přičemž jak forma, tak termoplast jsou předem vrstvou jako například 3D printing (3DPTM), selektivní zahřáty na teplotu blízkou skelnému přechodu plastu. slinování laserem (SLS) – zde je vrstva nanesena ve Příkladem může být výroba mikrokanálků. Provádí se formě prášku a některé další. Také existují i kombino- tak, že mezi dvě polymerní destičky se vloží tenký kovo- vané technologie, tzv. „LIGA“ (lithografie), „Galvanofor- vý drátek. Pak je sestava sevřena mezi dvě skleněné mung“ (pokovování) a „Abformung“ (otisk). Souhrnně desky a zahřáta na teplotu 90 °C. Destičky se spojí se dá říci, že se jedná o různé variace výše uvedených a drát se vtiskne do nich. Metoda vstřikování je velmi technik a samozřejmě některých dalších jako třeba podobná výrobě plastů v makrosvětě. Do vakuově uza- elektrodepozice. vřené formy se vstřikuje polymer, který se opět zahřívá. Závěrem lze shrnout, že biomikronanotechnologie Při tomto způsobu replikace je potřeba udržovat vyso- jsou v současné době nesmírně dynamicky se rozvíjejí- ký stupeň čistoty, ale jinak jsou náklady na replikaci cí oblastí s obrovskými možnostmi. nízké. Odlévání je standardní metodou. Samozřejmě je

Literatura 1. Šnita, D.: Mikrofluidní systémy, popis konstrukce 5. He, X., Zhao, X.J., Drake, T.: Med. Res. Rev., 24, 621 a výroby mikrostruktur, vybrané senzorové a další (2004). aplikace. Odborný seminář, VŠCHT Praha, 2006. 6. Sharma, G., Mavroidis, C., Ferreira, A.: Handbook of 2. Goodsell, D.S.: Nature, 430, 20 (2004). Theoretical and Computational Nanotechnology, 3. Langer, R., Peppas, N.A.: AIChE J., 49, 2990 (2003). Vol X, 1-33 (2005). 4. Gourley, P.L.: Biotechnol. Prog., 21, 2, (2005).

BIOTECHNOLOGIE JAKO ALTERNATIVA PRO CHEMICKÝ PRŮMYSL Pavel Vopálenský, VŠCHT Praha Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Na počátku 20. století, dříve než byla ropa označena definován pojem udržitelný rozvoj: „Udržitelný rozvoj za univerzální surovinu a zdroj energie, se chemický znamená zlepšování životní úrovně a blahobytu lidí průmysl opíral o uhlí a obnovitelné zdroje. Do třicátých v mezích kapacity ekosystémů při zachování přírodních let byla běžná výroba paliv a základních chemikálií jako hodnot a biologické rozmanitosti pro současné a příští ethanol, butanol a různých organických kyselin usku- generace.“ (Nařízení Evropského parlamentu a Rady tečňována biotechnologickými postupy. S nástupem číslo 2493/2000 a číslo 2494/2000) Zachování udrži- petrochemického průmyslu bylo však mnoho těchto telného rozvoje znamená využívat co nejvíce obnovitel- postupů nahrazeno chemickou syntézou. V sedmdesá- ných zdrojů, snížit produkci odpadů a přiblížit se tak co tých letech, po první ropné krizi, začaly biotechnologie nejvíce přírodním dějům na Zemi. Jediným prvotním opět přitahovat pozornost. Dle prognóz by mělo být zdrojem energie na Zemi je Slunce a všechny přírodní dosaženo maximální produkce ropy během příštích děje jsou dlouhým vývojem postaveny tak, aby co nej- desetiletí, přičemž se snižující se dostupností ropy efektivněji tuto energii využívaly a transformovaly. Pře- budou její ceny vzrůstat. Společně s tímto ekonomic- měny látek v živých systémech jsou tak jedny z nejúčin- kým faktorem vstupuje do popředí i faktor „ekologic- nějších, které známe. Proto je zřejmé, že vhodně navr- ký“. Lidé „prostřednictvím svých ekonomických aktivit žený biotechnologický proces by, ve srovnání s tradiční a jednostranné environmentálně a sociálně bezohled- chemickou technologií, měl být teoreticky vždy účinněj- né honbě za ekonomickým prospěchem zničili ší a ekonomičtější, zejména pak při použití organizmů významnou část svých existenčních podmínek“. (Návrh využívajících přímo energie Slunce. Z níže uvedených strategie udržitelného rozvoje České republiky, Český příkladů biotechnologických výrob je však patrné, že ekologický ústav). Lidé si začali uvědomovat, že zatím- v současné době zatím není biotechnologie většinou co jejich pohodlí je robustně zabezpečeno materiálně schopna ekonomicky konkurovat tradičním chemickým a ekonomicky, environmentální a zdravotní podmínky výrobám. To je dáno špatným konceptem tzv. tržní eko- se stávají neudržitelnými. V roce 1987 byl poprvé nomiky, která „nepřisuzuje hodnotu věcem o sobě

6 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 12

(včetně přírodních zdrojů), ale pouze věcem pro nás, k markantnímu snížení procesních nákladů. Další věcem, které mohou mít pro nás nějaký konzumovatel- slibnou technologií je extrakce butanolu biodieslem ný význam a v důsledku toho se mohou stát komodi- z palmového oleje, poskytující biodiesel s obsahem tou a je k nim možné explotací či zpracováním přidat 18 % ABE. Tato směs může být bez dalšího čištění hodnotu“ (Návrh strategie udržitelného rozvoje České použita jako palivo. republiky, Český ekologický ústav), tedy v tržní ceně není nijak započítávána „vzácnost“ suroviny, dopad výroby na životní prostředí a příspěvek k udržitelnému vývoji. Tato situace se začíná pozvolna měnit např. zaváděním různých ekologických daní, které upravují cenu výrobku na základě dopadu jeho výroby, likvidace a recyklace na ekologii, a dále nalézáním nových, efek- tivnějších a ekonomicky výhodnějších biotechnologic- kých procesů. Uvedené příklady ilustrují některé již používané a nově navržené biotechnologické postupy nahrazující tradiční průmyslovou výrobu.

Paliva Paliva jsou jednou z nejdiskutovanějších otázek ve věci udržitelného rozvoje. Petrochemický průmysl v současné době produkuje tisíce barelů nafty a jiných Zemědělství fosilních paliv denně, nicméně již z podstaty těžby ropy Agrochemikálie, zejména pesticidy a hnojiva jsou je zřejmé, že nejde o obnovitelnou surovinu, navíc spa- hojně využívány po celém světě ke zvýšení výnosů. lováním fosilních paliv vznikají organické polutanty. Kvůli tomuto masivnímu užívání představují agroche- Proto je stále větší důraz kladen na vývoj a používání mikálie důležitý zdroj znečištění, zdravotní riziko biopaliv. V dnešní době je podíl paliv pocházejících a jejich výroba je spojena s velkou spotřebou energie. z biomasy na celkové produkci světové energie pouze Proto je značná pozornost věnována přípravě tzv. bio- 1 %, dle prognóz uvedených v grafu by však měl pesticidů a biofertilizérů. Biopesticidy jsou mikrobiální během sta let dosáhnout až 50 %. Nejpoužívanějším agens nebo látky odvozené od mikroorganismů, které biopalivem je ethanol. Ten používal již Henry Ford regulují hmyzí škůdce, plevely nebo hlodavce. Jejich ve svém prvním autě, v Brazílii tvoří 20 % obsahu aplikace je podobná aplikaci chemických pesticidů. pohonných hmot a v Evropské unii je na základě Biopesticidy obecně vykazují vyšší specifitu, nezane- Kyotského protokolu stanoven cíl zvýšit obsah bioetha- chávají v prostředí škodliviny a snižují riziko vzniku resi- nolu ve všech pohonných hmotách na 5,75 % do roku stence u škůdců. Z mikrobiálních biopesticidů je nej- 2010. Ethanol je vyráběn biotechnologicky kvasným používanější Bacillus thuringiensis, který brání rostliny procesem pomocí buněk Saccharomyces cerevisiae. před napadením hmyzem. Vnesením jeho genu, jehož Jako substrát se používá hydrolyzovaný kukuřičný nebo produkt je pro hmyz toxický, do rostlinného genomu obilný škrob, v jihoamerických státech cukrová třtina. byly vytvořeny plodiny, které se samy brání napadení. Obrovské úsilí je vynakládáno na vývoj technologické- Dále jsou používány tzv. biochemické pesticidy na bázi ho postupu štěpení celulózy (biotechnologicky pomocí feromonů, které působí na škůdce odpudivě. enzymu celulázy), který by umožnil použití velkého Většina biofertilizérů funguje na principu přeměny množství levných rostlinných odpadů na produkci etha- vzdušného dusíku na amonné soli v půdě a zvýšení nolu, žádná vhodná technologie však dosud nalezena dostupnosti fosforu pro plodiny. V praxi se využívá nebyla. Genetickými manipulacemi byla připravena zejména mykorhiza – symbióza plísně s kořeny rostliny. transgenní bakterie Zymomonas mobilis, která je vedle Rostlina poskytuje plísni některé intermediáty metabo- hexóz schopna využívat i pentózy, a tak poskytuje vyso- lizmu a plíseň umožňuje rostlině lepší příjem fosforu ké výtěžky ethanolu nejen ze škrobových hydrolyzátů, a zajišťuje jistou ochranu proti suchu a vysoké salinitě ale např. z rýžových stébel. půdy. Dalším používaným systémem je symbióza Jiné možnosti přípravy biopaliva jsou anaerobní pro- bakteriálního kmene Rhizobium s kořeny bobovitých cesy rozkladu biologických materiálů na tzv. bioplyn rostlin, při které bakteriální buńky fixují vzdušný dusík (přibližně 55 % methanu a 45 % oxidu uhličitého). a poskytují jej rostlině. Pro zůrodnění alkalických zemin Tyto anaerobní procesy zároveň slouží při čištění v Indii byly úspěšně použity modrozelené řasy. Bylo tak odpadních vod a jiných organických odpadů. Tzv. Weiz- využito jejich schopnosti fixovat vzdušný dusík a sou- mannovým procesem, vyvinutém na počátku dvacáté- časně fotosynteticky produkovat organické látky ho století, může vznikat ethanol, butanol a aceton a dodávat je do půdy. (ABE). Butanol může být přidáván do paliv, v porovná- ní s ethanolem má dokonce výhodnější vlastnosti (vyšší Polymery spalné teplo, nižší tlak nasycených par a nižší rozpust- Plasty jako velkovýrobní produkty petrochemického nost ve vodě). Zlepšování Weizmannova procesu vedlo průmyslu a současně špatně degradovatelné sloučeni-

7 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 13

ny jsou pro biotechnologii velikou výzvou. V roce 1941 Vybrané průmyslové enzymy a jejich aplikace (dle Gavrilescu M., Christi Y., 2005) známý americký vynálezce Henry Ford představil proto- typ vozu, jehož karoserie byla kompletně vyrobena Enzymy Katalyzovaná reakce Průmyslová aplikace z plastů pocházejícího ze sojových bobů. Fordovi se Detergenty, potravinářství, bohužel nikdy nepodařilo uvést do provozu výrobu Proteázy Proteolýza farmaceutický a chemický plastu ze sojovových bobů tak, aby mohl cenou konku- průmysl rovat plastům petrochemického průmyslu. Hydrolýza tuků na mastné Lipázy Potravinářství, detergenty Produkce biodegradovatelných polymerů – polyhyd- kyseliny a glycerol roxyalkanoátů (PHA) – v bakteriích (Rastonia eutrop- Pektinázy Klarifikace ovocných šťáv Potravinářství ha) byla dobře známa již ve 20. letech minulého stole- Detergenty, krmivářství, Celulázy Hydrolýza celulózy tí. Japonští vědci vnesli vybrané geny této bakterie do E. textilní průmysl coli, ve kterých poté tvořil PHA 96 % sušiny. V porovná- Amylázy Hydrolýza škrobu na cukru Potravinářství ni např. s polypropylenem (cena 1 USD za kg) je pro- dukce tohoto biopolymeru (cca 4 USD za kg) stále eko- nomicky nevýhodná. Redukci nákladů na výrobu by Další výhodou použití biokatalyzátorů je jejich ste- mohlo přinést vnesení potřebných genů do rostlin, reospecifita umožňující selektivní produkci enantio- které, na rozdíl od bakterií vyžadujících vhodný dodáva- merů. Různé enantiomery mají obecně i různé biolo- ný substrát, získávají všechny potřebné organické látky gické účinky – jedna forma vykazuje požadovanou akti- pomocí fotosyntézy. Firmy DuPont a Genencor připravi- vitu, zatímco druhá může být nebezpečná. Známý je ly geneticky modifikovanou bakterii E. coli (do níž byly příklad thalidomidu, jehož jeden enantiomer pomáhá vneseny geny ze tří různých organizmů), která je schop- těhotným ženám při ranních potížích, zatímco druhá ná fermentačním procesem produkovat propan-1,3- forma zapříčiňuje deformace vyvíjejícího se plodu. diol z glukózového sirupu získaného z kukuřičného Jiným příkladem aplikace enzymů je syntéza antibioti- škrobu. Propan-1,3-diol je používán k výrobě kopoly- ka cephalexinu. Chemická syntéza vyžaduje 10 kroků merního polyesteru Sorona, v němž druhou monomer- za vzniku cca 50 kg odpadu na kilogram vyrobeného ní složku tvoří tereftalát, dosud získávaný z ropy. Tento antibiotika. Použití čtyřkrokového enzymového postu- nový typ polyesteru vykazuje dobré vlastnosti – pruž- pu produkuje pouze 15 kg odpadu na kilogram anti- nost, pevnost a je lehce barvitelný. Cargill-Dow Chemi- biotika a nově vyvinutý fermentační proces produkuje cal Company otevřela v roce 2002 továrnu na Ingeo pouze 2 kg odpadu na kg výrobku. Dalším úspěš- (polymléčná kyselina – PLA), jejíž monomery jsou pro- ným použitím biotechnologického postupu namísto dukovány bakteriemi využívajícími opět jako substrát chemického je výroba akrylamidu. Namísto tradiční kukuřičný škrob. Tento bioplast nebyl taktéž schopen chemické výroby vyžadující velké množství energie je cenou konkurovat petrochemickým plastům, nicméně používán imobilizovaný enzym nitrilhydratáza. Z násle- společnost jej uvedla na trh jako zboží šetrné k životní- dující tabulky jsou zřejmé výhody bioprocesu. mu prostředí, které je standardně prodáváno s vyšší Porovnání parametrů chemické a biotechnologické výroby cenou. akrylamidu (dle Gavrilescu M., Christi Y., 2005) Parametr Chemický proces Bioproces Enzymy Enzymy jsou biokatalyzátory vykazující oproti tradič- Reakční teplota 70 °C 0 – 15 °C ním katalyzátorům vyšší selektivitu a účinnost za mír- Výtěžek 70 – 80 % 100 % nějších reakčních podmínek. Ačkoliv jejich použití např. Koncentrace 30 % 48 – 50 % v produkci sýrů je známo už mnoho let, kvůli jejich slo- akrylamidu žité a nákladné izolaci došlo k širší aplikaci enzymů Požadovaná energie 1.9 0.4 v průmyslu až v posledních 20. letech. V roce 1988 byl (MJ/kg akrylamidu) připraven první transgenní enzym (lipáza pro použití Produkce CO /kg 2 1.5 0.3 v detergentech) a byla tak zahájena éra využití metod akrylamidu genového inženýrství k rychlé a méně náročné přípravě enzymů v transgenních bakteriálních buňkách. Dnes již Stále větší uplatnění v průmyslu nacházejí enzymy existuje ohromný celosvětový trh s enzymy a dle před- izolované z extremofilních organismů, které mají pokladů poroste každý další rok o 5 – 10 %. V tabulce schopnost udržet si aktivitu i za nepříznivých podmínek jsou uvedeny nejvýznamnější průmyslové enzymy (vyšší teplota, vyšší iontová síla). Enzymy vykazující a jejich aplikace. Většina z průmyslových enzymů jsou aktivitu v nevodných prostředích našly použití v pro- hydrolázy, přičemž kolem 75 % je slouží k výrobě deter- dukci modifikovaných tuků a olejů. Při hledání dalších gentů, v potravinářství a zpracování škrobu. Přibližně enzymů extremofilních organizmů může v budouc- 10 % trhu s enzymy tvoří speciální enzymy, které mají nosti pomoci i nově vzniklá disciplína – metagenomika. význam zejména ve farmacii a syntéze organických látek. Jejich aplikace výrazně snižuje počet reakčních Metagenomika kroků, které by byly vyžadovány při tradiční syntéze, Výzkumníci na palubě lodi Sorcerer II plující kolem a zvyšuje účinnost výroby. východního břehu USA, skrz Panamský průplav a dále

8 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 14

kolem Galapág, odebírají každých 200 mil 200 litrů Závěr mořské vody, jejíž filtrací získávají mikroorganismy Uvedené příklady ukazují postupné úspěšné začleňo- a posílají je do laboratoře v USA. Cílem projektu je vání biotechnologie do výrobních procesů. Současný sekvenace genomu každého organismu v každém vzor- mohutný rozvoj biologických věd a technik vede k dal- ku. Zjištění DNA organismů v jednotlivých životních šímu usnadňování zavádění biotechnologií do velko- prostředích – metagenomika – pomůže lepšímu poro- provozních měřítek. Tento proces však vyžaduje zumění vztahů mezi organizmy a projevy jejich genů. i změnu dosavadního ekonomického náhledu na svět Na živiny chudý vzorek vody ze Sargasového moře byl směrem k doceňování dopadů výroby na životní již touto technikou zpracován: bylo objeveno 1800 prostředí, neboť zatím v mnoha případech není bio- druhů (z toho 150 dosud neznámých) a 1,2 milionu technologie schopna konkurovat zavedeným, k životní- nových genů. Díky metagenomice mohou být objeveny mu prostředí však zcela nešetrným postupům. Biotech- geny, jejichž projevy najdou využití v nových průmyslo- nologie nabízí velmi slibnou cestu k udržitelnému vých aplikacích, výrobě antibiotik (nové antibiotikum rozvoji. turbomycin bylo objeveno právě díky metagenomice) a nových degradačních drahách.

Literatura 1. Gavrilescu M., Chisti Y.: Biotechnol. Advance, 23, 471 3. Willke T., Vorlop K. D.: Appl. Microb. Biotechnol. 66, (2005). 131 (2004). 2. Sasson A.: Biotechnology: Current Achievments and 4. Návrh strategie udržitelného rozvoje ČR, Český eko- Prospect, Social Acceptance of Biotechnology-deri- logický ústav (www.ceu.cz). ved Products, 2004.

GENETICKY MODIFIKOVANÉ PLODINY Jana Zlámalíková Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Geneticky modifikované plodiny – ano či ne? čitelným. To se může stát jen ve zvláštním případě, Na naší planetě žije v současné době asi 6 miliard lidí protože většina geneticky modifikované zeleniny je a toto číslo neustále stoupá. Již nyní existují oblasti zcela odlišná od plevele, který je likvidován při jejím trpící hladomorem. Bude v budoucnu dostatek potravy pěstování. V úvahu to přichází u řepky olejky, která se pro všechny? Idea geneticky modifikovaných organis- může zkřížit s planou ředkvičkou, planou vodnicí nebo mů (GMO) vznikla, aby bylo v zemědělství dosaženo planou kapustou. Ve Velké Británii byla objevena planá co nejlepších výsledků, tj. kvality a výnosů. Při klasic- odrůda řepky olejky odolná proti třem herbicidům. kém šlechtění dochází k nekontrolované změně sta To se mohlo stát pouze nesprávným zacházením až tisíce genů na náhodném úseku DNA šlechtě- s touto plodinou, protože řepka se sklízí po prvním ného jedince, zatímco u metody genetické modifi- roce pěstování a nevykvete. Také u geneticky modifiko- kace je modifikovaný organismus obohacen o jeden, vané rýže je hlavní problém v tom, že rýže má mnoho maximálně několik genů, které jsou vkládány na urče- planých odrůd. né místo molekuly DNA. Jde tedy o urychlené Druhým problémem je zkřížení geneticky modifiko- šlechtění. vané zeleniny s nemodifikovaným druhem. Proto jsou Geny, které se vkládají do GMO, dávají většinou pevně stanoveny hranice mezi poli s geneticky modifi- modifikovanému jedinci odolnost proti chemikáliím kovanou a nemodifikovanou zeleninou. užívaných v zemědělství (herbicidy, pesticidy) nebo Další otázkou je, zda si plevel nemůže častým použí- vyvolávají tvorbu látek, které jsou toxické pro škůdce váním herbicidů vytvořit odolnost proti těmto látkám. dané plodiny. Většina herbicidů však pracuje na systému, kterému si GMO se po genetické modifikaci dlouho sledují. Gen, plevel nikdy nemůže přivyknout. První GMO byl který má být vnesen do molekuly DNA modifikované vyšlechtěn asi před 20 lety a dosud nebyl zjištěn jediný zeleniny, nesmí být podobný žádnému genu pro známý případ nebezpečnosti1. toxin. Po modifikaci má upravená molekula DNA své Současné formy GMO zajišťují především zvýšení původní vlastnosti, ale nový gen zajišťuje při proteosyn- výnosů. V budoucnosti přijdou na řadu také typy s vyšší téze vznik bílkoviny, která v plodině dříve nevznikala. kvalitou. Nové GM odrůdy budou např. odolnější k bio- Tato bílkovina se zkoumá. Všechny GMO, u kterých se tickým i abiotickým stresovým faktorům, přijdou na objeví jakákoliv vada, jsou zlikvidovány. řadu plodiny se zvýšenou nutriční hodnotou (vitaminy, Nebezpečí geneticky modifikované zeleniny rezis- antioxidanty aj.), transgeny pro farmakologické využití tentní vůči herbicidu spočívá v tom, že se tato zelenina produkující protilátky a samozřejmě transgeny pro prů- může zkřížit s plevelem, který by se tak mohl stát nezni- myslové využití2.

9 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 15

Geneticky modifikovaná kukuřice MON810 kukuřice. K dalším evropským státům pěstující Tato kukuřice si díky genetické modifikaci vyrábí tzv. geneticky modifikovanou kukuřici patří Španělsko Bt-toxin a je proto odolná proti zavíječi kukuřičnému. (cca 50 000 ha), Portugalsko (cca 750 ha), Francie Pokud housenka tohoto motýla napadne rostlinu, (cca 500 ha) a Německo (cca 360 ha)6. otráví se. Zavíječe kukuřičného není snadné zničit - jeho housenky se brzy zavrtají do rostliny a jsou tam Geneticky modifikované brambory dokonale chráněny. Člověk se Bt-toxinu nemusí bát. Geneticky modifikované brambory obsahující vakcínu Důkladné testy prokázaly, že škodí právě jen housen- proti hepatitidě typu B úspěšně zvýšily imunitu při prv- kám motýlů. Lidem ani zvířatům neubližuje ani ních pokusech na lidech. Při testování efektivity vakcíny v nejmenším. Navíc když kukuřice není prožraná zavíje- v bramborách se jednoznačně ukázalo, že pozměněné čem, tak se do ní nepouštějí plísně a rostlina díky tomu plodiny dokážou výrazně zvýšit množství protilátek neobsahuje mykotoxiny, které jsou na rozdíl od Bt-toxi- v krevním oběhu. Všichni testovaní lidé však byli před- nu skutečně nebezpečné. Jejich konzumace je totiž tím proti hepatitidě B konvenčně očkováni, tedy bram- spojena kromě jiného se vznikem rakoviny jater. borová vakcína výrazně posílila konvenčně získanou Bt-toxin byl objeven na počátku 20. století v bakterii imunitu. GM plodiny by se tak staly levným zdrojem Bacillus thuringiensis. Už desetiletí se používá v podo- vakcíny, který by se mohl pěstovat a upravovat také bě sušených spor bakterií jako ekologický pesticid, kte- v chudších oblastech světa. Výrobci léků jsou proti rým se „práškují“ rozsáhlé plochy. V bakterii vzniká tomuto způsobu šíření vakcíny, hlavně pomocí dalších v netoxické formě. Na toxickou se přeměňuje ve střevu tržních plodin jako jsou banány, rajčata nebo právě hmyzu (zásaditém prostředí). Účinným se stává po brambory. Důvodem, proč s touto formou výrobci vazbě na receptor, který má ve střevní stěně jen vybra- a jejich vývojové týmy nesouhlasí je to, že pokud by ná skupina organismů. Dnes je k dispozici široké spekt- k distribuci došlo, plodiny by mohly být konzumovány rum Bt-toxinů, které mají specifický účinek (na housen- v neuvážených množstvích s těžko odhadnutelnými ky motýlů, na brouky, na háďátka, aj.). Běžné insektici- následky. V současnosti se výzkumné týmy zaměřují na dy takovou specifitu nevykazují a účinkují tak na velké tvorbu vakcín v jedlých listech rostlin, které by se množství hmyzu. Díky tomu nenarušuje pěstování neprodávaly jako potravina. Listové pletivo by bylo poté tzv. Bt-kukuřic biodiverzitu polí. Na polích s geneticky uzavřeno v želatinových kapslích. Nejlepší výsledky se modifikovanou Bt-kukuřicí žije pestřejší společenství projevily zatím u rostliny Nicotiana benthamiana7. organismů než na polích s tradičními odrůdami kukuři- ce. Prokázaly to výzkumy ve Velké Británii a potvrdila to Geneticky modifikované brambory v ČR pro naše středoevropské podmínky i studie Entomolo- Šlechtitelé Sativy Keřkov navázali spolupráci s Ústa- gického ústavu AV ČR3. vem experimentální botaniky AV ČR, který měl k dispo- V letošním roce bylo zahájeno pěstování Bt-kukuřice zici gen z Francie pocházející z bakterie Lactobacillus také v České republice. Byla vyseta na celkovou plochu bulgaricus. Tento gen kóduje enzym fosfofruktokinázu, 270 ha půdy. Jde jen o nepatrnou plochu, ale v příštím který působí v cytoplazmě při odbourávání cukrů glyko- roce by se tato plocha mohla rozšířit. Geneticky upra- lytickou drahou. Enzym z bakterie má jednu podstat- venou kukuřici zkusilo jen několik pěstitelů, největší nou odlišnost, nevadí mu chlad. Rostlina bramboru má plochy jsou na jižní Moravě, některé také ve středních vlastní enzymy s aktivitou fosfofruktokinázy, ale oba Čechách. Zemědělci museli plnit předepsaná pravidla, jsou citlivé na chlad, takže při nízkých teplotách přestá- zejména dodržovat vzdálenosti mezi dvěma poli, vají fungovat. Konzumní brambory se skladují při níz- na kterých se pěstovala geneticky modifikovaná plodi- kých teplotách, aby neklíčily. V hlízách pak dochází na a plodina konvenční nebo v režimu ekologického k hromadění jednoduchých cukrů, protože enzymy zemědělství4. Pěstitelé čekají skvělou první úrodu. s fosfofruktokinázovou aktivitou nepracují, a proto Na čtyřiceti hektarech kukuřičného pole u Čejče jsou brambory sládnou. Při smažení pak brambory obsahu- rostliny jako ze škatulky. Ani jedna z nich není poláma- jící více jednoduchých cukrů hnědnou, a to je jeden ná a napadená škůdci. Právě na tomto poli bez vědomí z problémů při výrobě lupínků. Byl připraven konstrukt majitele pana Oldřicha Horáka Greenpeace modifiko- vhodný k použití u brambor a po mnoha experimen- vanou kukuřici otestovalo. Modifikovanou kukuřicí krmí tech se podařilo vnést jmenovaný gen z Lactobacillus svá prasata, také on podporuje tvrzení, že tato kukuřice bulgaricus do dvou odrůd brambor - Kamýk a Korela8. je ještě zdravější, protože neobsahuje nebezpečné V roce 2001 byly různé transgenní klony těchto odrůd mykotoxiny. Geneticky upravená kukuřice by se pěstovány v malém polním pokusu na Šlechtitelské v budoucnu mohla uplatnit při výrobě bioethanolu - stanici v Keřkově. Do pokusu byly vysázené pro kontro- alternativy pohonných hmot z ropy. V tomto případě lu i netransformované odrůdy Kamýk a Korela. opravdu nezáleží na tom, zda je kukuřice geneticky Ve spolupráci s VÚB v Havlíčkově Brodě byla prove- modifikovaná5. dena analýza obsahu jednoduchých cukrů u transgen- Čeští zemědělci letos poprvé sklízeli geneticky modi- ních klonů. První analýza byla provedena jeden měsíc fikovanou kukuřici. V rámci EU jsme se připojili k dal- po sklizni, kdy teplota při skladování hlíz neklesla pod ším čtyřem státům, kde zemědělci zaseli kromě 10 oC. U Kamýku vykazovalo 5 klonů nižší hladinu tradičních odrůd také geneticky modifikované odrůdy cukrů než kontrola. U Korely neměl žádný transgenní

10 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 16

klon nižší hladinu cukrů než kontrola. Druhá odrůda ny i ovoce. Na základě poznatků získaných na rajčatech má však vyšší přirozený obsah cukrů v hlízách a větší se očekává mnohem rychlejší postup při modifikacích množství cukrů může být výrazněji změněno při déle melounů, banánů a dokonce kávových bobů10. trvajícím působení bakteriálního enzymu. Můžeme tedy očekávat, že výraznější změny v transgenních Zlatá rýže klonech obou odrůd nastanou až při dlouhodobém Nový druh geneticky modifikované „zlaté rýže“ tvoří, skladování při 4oC, což je konečná teplota skladování. ve srovnání se svojí čtrnáct let starou předchůdkyní, Tato teplota nevadí enzymu bakterie, ale vyřazuje z čin- mnohonásobně více provitaminu A (ß-karotenu). Zla- nosti oba enzymy rostliny8. tou rýži poprvé připravili v roce 1999 švýcarští a němeč- tí vědci (I. Potrykus z Technical University ve švýcarském Rajčata produkující více ß-karotenu Zurichu s kolegou P. Beyerem z německé University of Mezinárodní výzkumný tým zahrnující pracovníky Freiburg)11. Byla vytvořena, aby produkovala ß-karoten, ze Spojeného království, Japonska a Německa, vyvinul ze kterého vzniká v těle vitamin A. Tento vitamín má odrůdu rajčat s trojnásobným množstvím ß-karotenu antioxidační účinky, chrání zejména buňky sliznice proti běžným odrůdám. ß-karoten patří do skupiny karo- a kůže, kde se podílí na ochraně před UV zářením. ß- tenoidů - rostlinných pigmentů, které jsou příčinou žlu- karoten je také důležitou látkou v obraně organismu tého až červeného zbarvení ovoce, zeleniny a květin. proti nádorům, infekčním chorobám, dně, překyselení ß-karoten se v lidském těle mění na vitamin A, jehož organismu a je nezbytný pro správnou funkci zraku. nedostatek může být příčinou poruch oběhového systé- Hladina provitaminu v této rýži dosahuje 1,6 Ķg/g rýže. mu, některých druhů rakoviny a rovněž degeneračních Nová odrůda ho vytvoří více - 37 Ķg/g rýže. Vyšší výkon- změn očí, které mohou vést až k oslepnutí. Vyšší příjem nost nové rýže byla dosažena výměnou genu. Původně ß-karotenu může příznivě ovlivňovat imunitní systém byl do rýže vložen gen pro tvorbu ß-karotenu z narcisu. a snižovat případné poškození kůže slunečním zářením. Zmíněný gen má však svůj protějšek také v kukuřici Jedna z možností zvýšení příjmu karotenoidů je zvý- a vědci zjistili, že právě ten dokáže u rýže výrazně zvý- šit jejich obsah v ovoci a zelenině. Skupina vědců pod šit produkci provitaminu. Tvrdí to Rachel Drakeová, vedením prof. P. Bramleye z Londýna (Royal Holloway, která pracuje ve firmě Syngenta Seeds v anglickém Univ. of London) pozměnila syntézu karotenoidů rajča- Cambridge, a jejíž tým novou rýži vytvořil. Rýže vznikla ty přenosem genu jisté bakterie do rostliny. Tento gen na požadavek humanitární organizace Humanitarien mění sloučeninu phytoen na lykopen, který je příčinou Rice Board, která se snaží řešit problémy s nedostat- jasně červené barvy rajčat a dále se účastní syntézy kem potravy v nejchudších částech naší planety11. ß-karotenu. Rajčata poté obsahují až 3,5krát více ß-karotenu. Modifikace nemá vliv na růst nebo vývoj Rýže odolná vůči hmyzím škůdcům rostlin a přenáší se i na další generace. Dalším zjiště- Pěstování geneticky modifikované rýže odolné vůči ním je, že tepelně zpracovaná rajčata a výrobky z nich hmyzím škůdcům přináší čínským farmářům nejen vyšší mají zvýšenou nutriční hodnotu, protože umožňují úrodu a dramaticky nižší výdaje za insekticidy, ale záro- lepší absorpci karotenoidů v zažívacím traktu9. veň jim šetří zdraví. Výzkum provedli vědci z čínské aka- demie věd s americkými kolegy z University of California Genetická modifikace rajčat v Davisu a Rutgers University v New Brunswicku. Využili První geneticky modifikovaná rajčata byla vypěstová- „poloprovozních“ zkoušek geneticky modifikované rýže na v polovině 90. let. Měla delší skladovací dobu a prověřili nejen ekonomické, ale i zdravotní následky a údajně lepší chuť. Na trh se dostala pod názvem pěstování GM rýže pro čínské farmáře. Šlo o linie Xia- „Flavr Savr“. V současné době se pracuje na širší modi- nyou 63 a Youming 86, které jsou odolné vůči hmyzím fikaci, která má dát rajčatům a jiným plodům látky škůdcům díky modifikovanému genu pro trypsinový důležité pro lidské zdraví. inhibitor. Výnosy jsou u geneticky modifikované rýže jen Mezinárodní vědecké konsorcium se snaží získat nepatrně vyšší, ale náklady za insekticidy jsou podstatně úplný genom rajčete. Rajče se má stát modelem pro nižší. Také šetří čas čínským farmářům, který by strávili práci na jiných plodech. V čele projektu stojí vědečtí postřikováním rýžoviště (viz. následující tabulka). pracovníci z Cornell University (Ithaca, stát New York) Ukazatel Pěstitelé GM rýže Pěstitelé konvenční rýže ve spolupráci s vědci z Kanady, Evropy i Číny. V roce Počet ošetření pesticidy 2003 začala práce na „Mezinárodním projektu pro stu- 0,5krát 3,7krát (kolikrát se za rok stříkalo) dium genomu rodu Solanacea“. Podle Jima Giovanno- Výdaje za pesticidy niho, amerického zemědělského molekulárního biolo- 31 243 ga, by měl být znám úplný genom do 2 let. Cílem (v juanech na hektar) Množství spotřebovaných následné modifikace je, aby rajčata produkovala větší 2,0 21,2 množství vitaminů a antioxidantů jako jsou např. karo- pesticidů (kg/ha) tenoidy, které pozitivně působí proti vzniku rakoviny. Práce vynaložená 0,73 9,1 Plody jiných rostlin mají vyšší obsah těchto látek, rajča- na postřiky (dny/ha) ta však byla vybrána pro poměrně jednoduchou struk- Výnos rýže (kg/ha) 6 364 6151 turu své DNA a pro podobnost s mnoha druhy zeleni- Počet zúčastněných farmářů 123 224

11 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 17

Farmáři pěstující konvenční odrůdy trpí mnohem více látky méně než zrna pocházející z klasické rostliny. chorobami vyvolanými otravou pesticidy. V následující Káva vyrobená ze zrn geneticky modifikované rostliny tabulce jsou procenta farmářů, kteří utrpěli újmu by se dostala obsahem kofeinu na hladinu prodáva- na zdraví v důsledku používání pesticidů (počítají se ných produktů u nichž je kofein odstraňován fyzikál- jen problémy, které měl farmář bezprostředně po ními metodami. postřiku rýžoviště, nezapočítávají se možné trvalejší Extrakci kofeinu z kávy je možné dělat dvěma způ- následky na zdraví). Pěstitelé geneticky modifikované soby. Buďto levnou procedurou s organickými rozpou- rýže na tom byli výrazně lépe12. štědly (používaná organická rozpouštědla jsou ale kar- cinogenní a v takto připravované kávě stopy rozpou- Farmáři pěstující Farmáři Farmáři štědla mohou zůstávat), nebo technologicky náročným pěstující GM i konvenční rýži pěstující ROK postupem pomocí CO , kdy je získáván zdravotně zcela výhradně Na pozemcích Na pozemcích výhradně 2 GM rýži s GM rýží s konvenční rýží konvenční rýži nezávadný a aromaticky bohatší produkt. Při výrobě 2002 0 0 7,7 8,3 kávy bez kofeinu z geneticky modifikovaného kávov- 2003 0 0 10,9 3,0 níku by nevznikaly další vedlejší náklady oproti její výrobě z klasické plodiny. Autoři výzkumu jsou z Nara Káva bez kofeinu Institute of Science and Technology v Japonsku, vedou- O kávu bez kofeinu je na světovém trhu stále větší cím týmu je Shinjiro Ogita. Kávovníkové keře se sníže- zájem, spotřebitel požaduje kávu, která by mu nezvyšo- ným obsahem kofeinu náleží ke kávovníku Coffea vala krevní tlak, a po které by bez problémů usnul, canephora. Na tvorbě kofeinu v rostlinách se podílí tři i když si ji dá večer před spaním. V roce 2002 byly vysá- enzymy. Výzkumníci zabránili expresi genu pro theob- zeny geneticky modifikované kávovníky, které budou rominsyntázu, neboli CaMXMT1. Nyní Japonci již pra- produkovat kávová zrna s minimálním obsahem cují na tom, aby stejnou metodou upravili rostliny kávy kofeinu. Tyto rostliny nemají gen pro tvorbu kofeinu náležející ke Coffea arabica13. a kávová zrna obsahují o 50 až 70 % této stimulační

Literatura 1. http://www.vupp.cz 8. http://www.agroweb.cz (zdroj: Úroda, 18. 2. 2002). (zdroj: Spolana noviny č.7, červenec 2005). 9. http://www.vupp.cz 2. Geneticky modifikované organismy – současnost (zdroj: FOODTODAY–EUROPIAN FOOD a perspektivy (editor: J. Káš, 2004). INTERNATIONAL COUNCIL NEWSLETTER, č. 23, 3. http://www.osel.cz (J. Petr, 10. 9. 2004). září 2000). 4. http://www.agris.cz (zdroj: ČTK, 28.07.2005). 10. Britské listy, 16. 7. 2004. 5. Mladá fronta Dnes, 03.10.2005. 11. http://www.osel.cz (J. Pazdera, 3. 4. 2005). 6. http://www.agris.cz k (11.10.2005). 12. http://www.osel.cz (J. Petr, 2. 5. 2005). 7. http://www.uzpi.cz. 13. http://www.osel.cz (J. Pazdera, 25. 6. 2003).

GENETICKY MODIFIKOVANÁ JABLKA Jitka Najmanová Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

V posledních letech a hlavně v posledním roce se nou barvu před žlutou a zelenou. Červená barva jablka hned několik vědeckých pracovišť zabývá výzkumem je podmíněna množstvím antokyaninu, zelená a žlutá jabloní. Tento ovocný druh mírného pásma má několik množstvím a poměrem karotenoidů a chlorofylu. podstatných nevýhod pro šlechtění, jako je vysoce Barva je u jabloní řízena jedním genem a přítomnost heterozygotní charakter genomu a dlouhý reprodukční červeného pigmentu je dominantní. Na chromozomu cyklus. Na molekulární bázi se vědci snaží vylepšovat jsou přítomny dva fragmenty kódující červenou barvu plodů, odolnost vůči patogenům, ale třeba barvu – A1 (1160 bp) a A2 (1180 bp) a dva fragmenty i zavést přesné metody pro určování původu nových kódující žlutou barvu - a1 (1230 bp) a a2 (1320 bp). odrůd vzniklých křížením. Melounová a kol.1 kontrolovali pomocí PCR zbarvení u 21 českých odrůd jabloní s cílem ověřit - Alely kontrolující barvu jablek tický původ jednotlivých barev, neboť variabilita Barva je jedním z nejdůležitějších parametrů pro červené či žluté barvy je velmi často geneticky obchod s jablky, neboť zákazník upřednostňuje červe- nepodmíněna.

12 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 18

Tab. 1: Charakteristika barev pokožky jablek a detekované složení A-alel.

klasifikace podle varianta barva pokožky detekovaný genotyp Cheng a kol.

Aneta převážně tmavě červená červená A1a2 Angold žlutozelená s červeným nádechem žlutá a2a2 Biogolden čistě žlutá žlutá a1a2 Goldstar čistě žlutá žlutá a1a1 James Grieve Red převážně tmavě červená červená A1A1 Jantar převážně šarlatově červená červená A1a1 Jonalord převážně tmavě červená červená A1A1 Julia převážně tmavě červená červená A1A1 Karmína šarlatově červená po celém ovoci červená A1A1 Klára převážně tmavě červená červená A1a2 Melodie převážně nachově červená červená A1A1 Nabella převážně karmínově červená červená A1A1 Nela převážně tmavě červená červená A1A1 Otava žlutá s oranžovým nádechem žlutá a1a2 Rajka převážně jasně červená červená A1a1 Rosana převážně karmínově červená červená A1a1 Šampion červenopruhovaná červená A1a2 Selena převážně tmavě červená červená A1a1 Sparjon převážně tmavě červená červená A1a1 Vanda převážně jasně červená červená A1a1 Zuzana převážně oranžovočervená červená A1a1

Zbarvení jablek bylo hodnoceno podle Cheng a kol.2. mají S5 alelu. Z určených odrůd lze následně vybrat ty, V Tab. 1 vidíme, že pouze u 4 odrůd byla zjištěna žlutá které mají ojedinělou S-alelu, neboť ty budou dobrými barva. Z toho 2 jablka měla červený nebo oranžový opylovači pro druhy s obvyklou S-alelou. nádech, ačkoli PCR analýza neprokázala A-alelu. Tmavě červené zbarvení bylo typické pro homozygoty A1A1. Alely kontrolující rezistenci vůči strupovitosti Alela A2 se v žádné z 21 testovaných českých odrůd Další trend ve šlechtění jabloní je získávání odrůd, jablek nevyskytovala. Tato alela pochází z odrůdy White které jsou rezistentní vůči strupovitosti. Původcem stru- Angel z Asie. povitosti jabloní je vřeckovýtrusná houba Venturia ina- equalis. Houba napadá listy i plody jabloní. Na plodech Alely kontrolující neslučitelnost stejných genů se objevují různě velké šedočerné skvrny, pokožka Neslučitelnost genů je způsob, jak se rostliny chrání v místě napadení korkovatí a někdy praská. Silně napa- před opylením jejich vlastním nebo příbuzným pylem. dené listy, květy a mladé plůdky předčasně opadávají. Neslučitelnost je řízena skupinou S-alel, které jsou K získání této rezistence se používá dominantní lokalizovány na multifunkčním lokusu (S-lokus) na pes- Vf-alela. Častý donor této alely je Malus floribunda tíku. Opylení a růst je inhibován, pokud pyl a pestík Sieb. klon 821 (Vejl a kol.4). Pro detekci tohoto genu se mají ty samé S-alely. Do dnešní doby bylo na světě používá PCR metoda navržena Vejl a kol.4 a Melounová popsáno 25 typů S-alel. Běžně se vyskytují S1 – S11, a kol.1. Opět 21 českých odrůd jabloní bylo podrobeno ostatní pouze u samostatných kultivarů. Pomocí PCR této analýze. U všech rezistentních odrůd Melounová analýzy Melounová a kol.1 zjišťovali typ S-alely jednotli- a kol.1 detekovali heterozygotní genotyp Vfvf. Ve všech vých odrůd, aby tak ověřili pravost rodičovských odrůd. citlivých odrůdách a v odrůdách s částečnou polygenní Např. u odrůdy Jantar byly zjištěny alely S3S7. Jako rodi- tolerancí vůči strupovitosti detekovali genotyp vfvf. čovské odrůdy jsou udávány Golden Delicious x Jonat- Homozygotní genotyp VfVf není popsán u žádné české han, tomu odpovídá známé složení S-alel: S2S3 x S7S9. odrůdy jabloní. Obě dvě rodičovské odrůdy se však podařilo ověřit Další možností jak vyšlechtit rezistentní odrůdu, pouze ve dvou případech. U většiny odrůd byl ověřen je vložení Vm genu z odrůdy OR 45 T 132. Tento gen jeden z rodičů (11 odrůd), u zbylých se nepodařilo ově- však nebyl nalezen v žádné z nových českých odrůd řit původ S-alel vůbec. jabloní. Pomocí této analýzy je možné také určit ty odrůdy jabloní, které jsou si navzájem špatnými opylovači. Bla- Identifikace podnoží jabloní pomocí SSR-markerů žek3 popsal odrůdy Vanda a Rosana jako špatné opylo- SSR („simple sequence repeat“) isolované z jabloní vače, což se také PCR analýzou prokázalo. Obě odrůdy se používají pro identifikaci kultivaru, pro posouzení

13 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 19

genetické rozmanitosti a k sestavování genetických amplifikovat homologní fragment u ESFY fytoplazmy. map potomků roubování. Kvůli nekontrolovanému vol- U ní však nebyly zjištěny žádné rozdíly v DNA isolátů nému opylování, nesprávnému určování štěpů a jedno- z devíti podtypů (rozděleny podle druhu rostliny, duchosti s jakou se rostlinný materiál přenáší mezi na kterou působí). V roce 2000 analyzovali Jarausch zeměmi, je složité určit pravou identitu mnoha klonů a kol.7 175 fytoplazem (izolovaných ze čtyř jihoevrop- a podnoží. Oraguzie a kol.5 provedli PCR analýzu se ských zemí, z různých druhů rodu Prunus). Jeden sedmi SSR-markery u šedesáti šesti podnožních klonů primer se ukázal vhodný pro všechny druhy, tvoří pro- jabloní z celého světa. Sedm SSR-lokusů dávalo jeden dukt o velikosti 237 bp. Tento produkt tvořily všechny až dva slabé produkty u všech testovaných podnoží. analyzované vzorky, což prokázalo infekci ESFY fytop- Analýza původu ukázala, že všechny hybridní klony zís- lazmou, ačkoliv se charakteristické letní symptomy kaly po jedné alele z každého rodiče, kdežto subklony u nich neobjevily. Tím byl také potvrzen výskyt této měly identický genotyp s jejich virem infikovaným rodi- nemoci v zemích, kde se zatím neobjevila (např. Tu- čem. Výsledky také ukázaly, že klon Mpumila M1, který recko). Jelikož byla infekce prokázána u všech vzorků, byl považován za rodiče klonu USA Mac1, jím pravdě- vyplývá z toho, že nemoci meruněk a slivoní ve Španěl- podobně není, neboť se lišil ve čtyřech ze sedmi alel. sku a Itálii (fytoplazma chlorotického svinování listů Tento výzkum prokázal, že SSR-markery mohou být meruněk, leptonekróza slivoní) jsou také způsobeny užitečné při ověřování původu klonů, a že příbuznost fytoplazmou ESFY. Tento výsledek je překvapující, podnoží je primárně založena spíš na genetickém než neboť se předpokládalo, že se fytoplazma u různých na geografickém původu podnože. Tento výsledek druhů a různých symptomů bude geneticky lišit stejně koresponduje s faktem, že se pro šlechtění využívá jako AP fytoplazma. Do dnešní doby není znám pouze několik běžných druhů. Některé klony se a rezistence vůči ESFY fytoplazmě. bohužel nepodařilo zařadit vůbec. Pro vylepšení metody je pravděpodobně zapotřebí optimální počet Závěr SSR-markerů. Velkým problémem pěstitelů jsou stále více se rozši- řující nemoci téměř všech ovocných stromů. To může PCR-RFLP analýza DNA z Candida phytoplasma být způsobeno křížením malého počtu odrůd mezi prunorum sebou. Nové odrůdy jsou méně vitální, mají abnormál- Candidatus phytoplasma prunorum neboli fytoplaz- ní morfologii květů, jsou snadněji napadnutelné pato- ma evropské žloutenky peckovin („European stone fruit geny a stávají se až neplodnými. Genetické manipulace yellows“ – ESFY) infikuje různé druhy rodu Prunus. poskytují nové možnosti, jak vylepšit požadovanou V minulosti dostala několik jmen podle druhu a rozdíl- vlastnost bez výše zmíněných negativních dopadů. ných symptomů (leptonekróza slivoní, Molierova Naděje svítá i pro alergiky, neboť se začalo pracovat nemoc u třešní, fytoplazma chlorotického svinování na potlačení exprese genu kódujícího alergen Mal d 1, listů meruněk). Příbuzná fytoplazma je známá také na který se váží protilátky IgE, a tím aktivuje alergickou u hrušek (pear decline) a u jabloní (proliferace jabloní reakci. Studie Gilssen a kol.8 prokázala významně vyšší - AP). Běžné symptomy ESFY jsou žloutnutí a svinutí alergickou reakci na původní klíční rostlinu než na jimi listů v létě, mimosezónní růst v zimě, odumírání až připravené transformanty. Úplně jiné potlačení exprese úplný rozklad rostliny. Hlavním přenašečem je člověk genu se podařilo Bulley a kol.9. Potlačením exprese při vegetativním rozmnožování. genu pro enzym syntetizující gibberelin (gibberelin- Poprvé identifikoval primery pro PCR a RFLP analýzu 20-oxidasa) se vědcům podařilo výrazně snížit výšku fytoplazmy u ovocných stromů Jarausch a kol.6 v roce jabloně za použití minimálního množství chemických 1994. Použil k tomu chromozomání fragment retardantů růstu. Potomek zůstane zakrslý i po narou- (1–8 kbp) z AP fytoplazmy. PCR ukázala, že AP fytop- bování na normální specielně vyšlechtěnou podnož, lazma může být rozdělena do třech podtypů s odlišnou která může nést například rezistenci vůči patogenu či DNA. Některé z těchto primerů se ukázaly být schopné pesticidu.

Literatura 1. Melounová M. et al., Plant Soil Environ. 51, 65 6. Jarausch W. et al., Appl. Environ. Mikrob. 60, 2916 (2005). (1994). 2. Cheng F.S. et al., Theor. Apll. Genet. 93, 222 (1996). 7. Jarausch W. et al., Mol. Cell. Probe 14, 171 (2000). 3. Blažek J.: Pěstujeme jabloně, Brázda, s.r.o., Praha 8. Gilissen L.J.W.J. et al., J. Allergy Clin. Immun. 115, 364 2001. (2005). 4. Vejl P. et al., Plant Soil Environ. 49, 427 (2003). 9. Bulley S.M. et al., Plant Biotechnol. J. 3, 215 (2005). 5. Oraguzie N.C. et al., Plant Breeding 124, 197 (2005).

14 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 20

BIO-RECEPTOR BASED METHODS (BIO-ASSAYS) FOR FOOD, ENVIRONMENT AND CLINICAL ANALYSIS Vivek Babu Kandimalla, Nagamani Kandimalla, Milan Fránek Veterinary Research Institute, Hudcova 70, Brno 621 00, Czech Republic, e-mail: [email protected]

Abstract Enzymes An escalating demand exists for simple, quick and Enzymes are globular that serve as catalysts. reliable screening methods in food and environment Their folded conformation creates an area known as monitoring. Although several chemical methods such the active site. The nature and arrangement of amino as gas chromatography (GC), high performance liquid acids in the active site make it specific for only one type chromatography (HPLC), GC-MS etc. have been intro- of substrate. Once the enzyme has bound its substrate duced for trace level detection of analytes, bio-analyti- (much like a key in a lock), a reaction occurs to modi- cal methods holds an advantage in that they are fas- fy the substrate in some way. The modified substrate is ter and cheaper. In bio-analysis, enzymes, antibodies, then released as a „product“ and the enzyme is free to aptamers, peptides, microbial, plant and animal cells catalyse another reaction. are employed as bio-receptor molecules. Advances in Enzymes are the most commonly used bio-receptors , molecular , and immunochemist- in bioassays. The analyte can be the enzyme, whose ry have expanded the range of biological recognition enzymatic activity is determined, or the substrate or the elements. To design the biosensors, bio-receptor mole- enzyme cofactors. Enzymatic assays are mainly based cules are interfaced with various transducing surfaces. on either inhibition of the enzyme activity or catalysis. By employing these receptor molecules quick detection For example variety of enzymes such as organophosp- tools such as dipstick and protein microarrays have horous hydrolase (OPH), alkaline phosphatase, ascor- been introduced. bate oxidase, tyrosinase and acid phosphatase have been employed in design of pesticide bioassays and Introduction biosensors. Cholinesterases, acetylcholine esterase The importance of environmental and food analysis (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE), have been has become increasingly evident during the last deca- widely used in bioassays due to their stability and sen- de for many purposes, such as the diagnosis of patho- sitivity and are used in bioassays against pesticides and gens, toxins, pollutants etc. The most commonly used insecticides based on the pollutants inhibiting action. methods for the detection of harmful chemical residu- The reaction is monitored by measuring the color es are Gas Chromatography (GC), High Pressure Liquid intensity in spectrophotometer, by measuring acid pro- Chormatography (HPLC), GC-Mass Spectroscopy (GC- duction in potentiometric systems or direct oxidation of MS), LC-MS/MS etc. These methods are highly sensiti- thiocholine on the electrode surface in amperometric ve and reliable, however, costly and time-consuming detection systems (Kandimalla and Ju, 2006). Some because they usually require complicated sample pre- amperometric based methods use duel enzyme sys- paration steps. The development of new methods for tems such as AChE and choline oxidase. OPH catalyzes rapid and inexpensive determination of analytes is the- the hydrolysis of a wide range of organophosphate refore required. (OP) pesticides, and as a result of its versatility, this Bioassays are a potential alternative to the expensive enzyme has been incorporated into a number of assays chemical methods, as they are reliable, accurate, rapid, and sensors for the detection of OP compounds and inexpensive and simple. Bioreceptors can be divided nerve destroying agents. Additional enzymes can be into three distinct groups: biocatalytic, bioaffinity, and used to detect other environmental and food contami- microbe/cell-based systems and play a key role in bio- nants such as nitrate, nitrite, sulfate, phosphate, heavy assays as they recognize the target analyte. Biocataly- metals and phenols. Tyrosinase is frequently used to sis-based bioassays depend on the use of enzymes to determine phenols, chlorophenols, cyanide, carbama- moderate a biochemical reaction. Bioaffinity-based tes and atrazine. biosensors rely on the use of proteins or DNA to recog- nize and bind a particular target. Microbial / cell based Aptamers biosensors use microorganisms as the biological recog- Aptamers are oligonucleic acid (DNA or RNA) sequen- nition element. These cell based systems generally ces that bind a non- targets with high speci- involve the measurement of microbial respiration, or its ficity and affinity. Aptamers are generally produced inhibition, using the analyte of interest. Compared to through an in vitro evolutionary process called „systema- enzyme-based approaches, microorganism-based bio- tic evolution of ligands by exponential en-richment“ assays / biosensors are relatively inexpensive to con- (SELEX) (Hamula, 2006). In many cases RNA libraries struct and can operate over a wide range of pH and yield aptamers with higher binding affinities than DNA temperature. libraries due to the ability of RNA to take on a wider

15 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 21

variety of conformations than DNA. In 1990, the discove- a wide range of ligand receptor systems. Enander et al., ry of aptamers by Tuerk and Gold and subsequently by (2002) reported a folded ligand modified helix-loop- Ellington and Szostak spawned significant interest and helix polypeptide scaffold for the detection of human were entered into therapeutic and diagnostic applicati- carbonic anhydrase II (HCAII), which catalyses the rever- ons and emerged as a valuable research tools. Aptamers sible hydration of carbon dioxide. The of have been selected for a wide array of targets including the peptide modified with a benzenesulfonamide (inhi- proteins, carbohydrates, lipids or small molecules. Apta- bitor of HCAII) derivative and a fluorescent probe was mers may mimic antibodies in a number of applications, monitored as a function of HCAII concentration and the such as flow cytometry, ELISA, cell sorting, fluorescence dissociation constant (Kd). The fluorescence of polypep- microscopy, western blotting, and biosensors or chips. tide increases in the presence of HCAII, due to a change Aptamers have a number of advantages compared to in the molecular environment of the dansyl group upon antibodies as they are smaller in size, their sensitivity can binding with HCAII, whereas the probe is partially quen- be increased, the possibility for in vitro production, and ched in the absence of the HCAII. thus lack of immunization and animal hosts. The binding affinity, specificity and stability of aptamers can be Antibodies improved by rational design or molecular evolution tech- Antibodies have made a substantial contribution niques (Kandimalla and Ju, 2004). Due to specificity and towards the advancement of diagnostic assays and have ease in labeling with fluorescence, radio isotope, or become indispensable in most diagnostic tests that are modification of nucleic acid sequence, aptamers are used routinely today. Antibodies are capable of exhibi- excellent receptor candidates for bioassays and biosen- ting very specific binding capabilities for desired structu- sors. One of the best approaches is the development of res. The past few years have seen an increase towards molecular aptamer beacon (MAB), with which real time greater use of antibody based assays such as enzyme- target recognition and quantification is possible. In linked immunosorbent (ELISA) in the field of food ELISA, immunoglobulins are the primary recognition and environmental monitoring (Fránek et al., 2006). agents; using the same principle, enzyme linked oligo- The efficiency and accuracy of the immunoassay (IA) is assay (ELONA) can be prepared using apta- dependant on the stability and affinity of the employed mers as the recognition agents. MABs are similar to the antibody (Tetin and Stroupe 2004). Antibodies are molecular beacons (MBs). Like MBs the 5 and 3 ends in highly complex and made up of hundreds of individual MABs can also be tagged or conformationally changed amino acids arranged in a highly ordered sequence. The and/or a distance increase between quencher and fluo- immune system of mammals and other vertebrates is rophore, leading to a detectable signal. The fluorescence able to recognize an extremely large number of different signal increased or quenched is directly proportional to molecules and respond to immunogenic stimuli by sec- the target concentration. Li et al., (2002) reported an reting specific antibodies into the blood stream. When anti-thrombin aptamer beacon capable of recognizing animals are immunized with a strong immunogen for thrombin, with a detection limit of 112 pM in a homoge- a relatively long period of time their blood serum will neous solution. contain high concentrations of highly specific polyclonal antibodies. Introduction of hybridomas for monoclonal Polypeptides / Protein scaffold antibody production in the mid 1970s revolutionized Natural biopolymers such as proteins and frequ- immunochemistry and brought antibody-based techni- ently have helical conformations that contribute to the ques to a higher level of specificity, sensitivity and of key three-dimensional ordered structure and the specific importance, manufacturability. The recent progress in function of the biopolymer. As a part of the construction of recombinant antibodies leads to exciting pathways and enzymatic reactions, conformational alte- new fields of antibody design. In addition, plants and rations of biomolecules are very important in biological crop species in particular, have the potential to enable systems. Likewise the artificially and specifically folded extremely cost-effective and efficient production of anti- polypeptide structures are other attractive receptor bodies (plantibodies). Phage display technology has molecules in biosensing and screening systems. These proved to be robust and is able to produce the recombi- are robust and easily synthesized by well-established nant antibody fragments, for example single-chain methods and because of the huge chemical diversity antibody variable region fragment (ScFv) and fragment that can be generated in a short time with modest synt- antigen binding region (Fab) (variable domains plus the hetic cost and effort. The amino acid sequence can be two of the constant domains). varied over a wide range to provide access to a variety of Some IAs work in homogeneous phases (in solution scaffold (binding domain) structures, and highly specific or gels), whereas the majority are heterogeneous assays, recognition sites and reporter groups can be introduced involving the adhesion of antibodies and/or antigens to post-synthetically by orthogonal (controlled synthesis) a solid surface. The surfaces used in the heterogeneous strategies on the solid phase. Fluorescent probes, chro- assays are usually the walls of microtiter plates with 96 mophores, , sugars, lipids etc can be or more wells. Some assays are competitive, in which introduced in different configurations, turning into a very labeled analyte competes for the binding sites of antibo- attractive and general tool for the development of dies with analyte in samples, where the decrease in

16 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 22

bound (or increase in free) labeled antigen is measured. Plant cells (tissues) have also been employed in bio- Noncompetitive (sandwich) IAs, which are based on two assays, for the determination or organophosprorous antibodies to different epitopes, are known to work well pesticides. A study of cucumber tissue scrapings for high-molecular-weight analytes. Compared with (oscorbate oxidase) were interfaced with an oxygen competitive immunoassays they have many advantages, electrode. In the presence of pesticide, the reduced for example improved speed, sensitivity, and specificity. enzyme activity was measured amperometricllay. The first IA used iodine radioisotopes (125I or 131I), The output voltage of the biosensor is proportional to however enzymatic labels are now more common such the pesticide concentration (Rekha et al., 2000). as, horse radish peroxidase, ß-D-glucoseoxidase and The physiology of the some animal cell lines changes alkaline phosphatase. Enzymatic labels are eco-friend- in the presence of ligands / pathogens / . The ly whereas radioisotopes are toxic and have a short physiological changes in presence of viruses in African halflife. Fluorescent materials such as fluorescene isot- green monkey kidney cell lines were correlated using hiocyanate (FITC) etc are employed as labels in fluores- Bioelectric Recognition Assay (Kintzios et al. 2004). cence based assays. Recombinant Mouse hepatoma cells have been Chiefly, IAs provides a rapid and cost effective analy- employed for the direct detection of halogenated and sis for the determination of a variety of environmental polycyclic aromatic hydrocarbons such as dioxines. contaminants. In addition IA provides high sensitivity In this system, the induction of firefly luciferase takes and specificity due to the powerful catalytic ability of place in presence of halogenated and polycyclic enzyme and the extraordinary discriminatory capabiliti- aromatic hydrocarbons (Ziccardi et al., 2000) es of antibodies. IA methods are fast and relatively easy, compared to conventional GC/MS and HPLC as Applications of Bioreceptors they don’t require a multi-step cleanup process. One Biosensors disadvantage is that ELISA is usually performed in For practical food and environmental monitoring, a laboratory using microtitre plates and, thus are not health protection and medical applications, the deve- suitable for on-site monitoring. lopment of low cost, rugged and practical biosensors Polyclonal and monoclonal antibodies have been that can be used in the field can be a major driving successfully developed in the Department of Analytical force for the expansion of biosensors. A biosensor is Biotechnology, Veterinary Research Institute (VRI). made from a biological sensing element attached to Their application in ELISA and immunosensor develop- a signal transducer. The sensing element may be an ment has been directed especially towards phenoxya- enzyme, antibody, DNA fragment, or microorganism, cetic acid herbicides, s-triazine herbicides, sulfonylurea whereas the transducer may be electrochemical, opti- herbicides, polychlorinated biphenyls, surfactants cal, piezoelectrical or acoustic. Electrochemical trans- (linear alkylbenzene sulphonates) and toxic metaboli- ducers measure changes in current or voltage, optical tes (nonylphenol), and selected veterinary drugs transducers measure changes in fluorescence, absor- (namely nitrofurans and sulfonamides). More informa- bance or reflectance, and acoustic transducers measu- tion and technical discussion can be found in papers re changes in frequency resulting from small changes by Fránek, 1998 and Fránek and Hruska, 2005. in the mass bound to their surface. Immunosensors transduce antigen-antibody interacti- Whole cells ons directly into physical signals. The design and prepa- For the biological assay of antibiotics, cup plate bio- ration of an optimum interface between the biocompo- assay was widely used. In this method the added anti- nents and the detector material is a key part of sensor biotic inhibits the growth of microorganisms, seeded in development. Most of immunosensors require the labe- the agar. The resulting inhibition zone (in the agar) is ling of antigen or antibody, whereas piezoelectric immu- directly proportional to the logarithm of the concentra- nosensors allow direct label-free and real-time monito- tion of antibiotic. In recent years, luminescent bacteria- ring of affinity interactions and is the economic alterna- based bioassays have been introduced for the detecti- tive to the overpriced optical systems. Distinct immobili- on of various compounds such as drugs or toxins. zation methods can be employed for the attachment of Depending upon the analyte action on the microbial biomolecules to the transducer surface such as cross-lin- cell, luminescence may increase or decrease. The king, covalent binding, entrapment etc. The immobiliza- major advantage with whole cell bioassay is that they tion method must be mild, should reduce steric hindran- can act as a bag of enzymes, whereas protein confor- ce and be biocompatible (Kandimalla et al., 2006). mation of the enzyme is more stable, as they are in a native environment. At the same time this technique Microarrays can reduce the purification costs and the ease of Microarray technology offers the opportunity to rapid- encapsulation. Recombinant luminescent bacteria are ly and cost-effectively test for a wide variety of gene and generally used in environmental pollutants analysis e.g protein targets on a platform little bigger than a postage dioxines. Stability of the cell can be increased by stamp, using extremely small sample volumes. Protein entrapping it in a suitable matrix (i.e sol-gel etc), which arrays are rapidly becoming established as a powerful allows for the repeated use of whole cells. means to detect proteins, pathogens and other contami-

17 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 23

nants. Protein arrays have been designed as a miniaturi- Dipstick immunoassays also follow the standard ELISA zation of familiar immunoassay methods such as ELISA procedure, but use a membrane as the antibody-coating and dot blotting, often utilizing a fluorescent readout, support and the color development (colored spot or and facilitated by robotics and high throughput detecti- line) can be visualized with an unaided eye. Their use as on systems to enable multiple assays to be carried out a diagnostic tool for detecting pesticides and other in parallel. Commonly used physical supports include groups of contaminants is becoming more common. slides, , microwells, nitrocellulose membra- A substantial limitation of these rapid dipstick immuno- nes, and magnetic amongst other microbeads. Miniatu- assays, however, is usually their low sensitivity. risation of detection tools facilitates easy transportation, onsite analysis, cost reduction, improved detection limits Conclusion and low volumes of reagents. DNA arrays are based on Enzyme and antibody-based assays have been exten- the hybridisation technique. Oligonucleotides or PCR sively used in clinical applications since the early- probes are immobilized on a solid support (the matrix) 1970’s. Countless studies have demonstrated the cor- and due to their specificity to a target gene they detect relation between immunoassay results and traditional complementary sequences present in the sample to be methodologies based on the instrumental analysis analyzed. Hybridization signals are detected, depending such as gas chromatography (GC) and high performan- upon the type of labeling, by either radiography or fluo- ce liquid chromatography (HPLC). Immunoassays have rescence, then quantified. Microarrays are not limited to proven to be simple, rapid and inexpensive methods DNA analysis; , antibody microarray, for monitoring harmful residues. Further development and chemical compound microarray can also be produ- in food and environmental screening depends almost ced using . It depends on the used bioreceptor entirely on the ability to develop novel antibodies in molecule. A consists of an array of individual bio- a more cost effective way. Other bioreceptors i.e apta- sensors that can be individually monitored and are mers (DNA / RNA), polypeptides, whole cells (microbi- generally used for the analysis of multiple analytes. As al, plant and animal) are also offering excellent detec- previously mentioned a bioreceptor can be a biological tion capabilities in clinical, food and environmental molecular species (e.g., an antibody, an aptamer, an analyses, however constructive efforts are needed to enzyme etc) that utilizes a biochemical mechanism for improve bioreceptor sensitivity and stability. This may recognition. be possible through recombinant DNA technology, allowing effective changes in the protein active site. An Dipstick assay increased interest in the development of class-specific On-site analysis is a more efficient approach than (generic) bioreceptor reagents is also being observed. taking a sample, transporting it to a laboratory and Currently one of the focuses is to develop on-site devi- then performing the determinations, as is the common ces, as seen in the present trend in instrumentation practice. On-site analysis can reduces errors and elimi- research and developments in imaging monitoring, nate the possibility of sample change and time delays miniaturisation, integration, nanotechnology, compute- which are associated with both sample transport and rised and wireless communication. storage, resulting in more accurate, precise and rapidly available analytical data. Although most biosensors Acknowledgements offer quick and fast analysis within a laboratory, they The authors acknowledge the financial support from are typically poorer at on-site determination due to the the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (Project influence of environmental factors i.e temperature, No. MZE 0002716201) and from the European Commis- humidity etc. Compared to biosensors, the dipstick sion (Project No. NMP4-CT-2006-017333, CARE-MAN), method is simple, and an instrument-independent and wish to thank Eloise H. Kok for careful reading of the method for the visual detection and highly amicable at manuscript to improve the quality of article. on-site identification / semi quantification of analytes.

References 1. Enander K. et al., 2002, J. Org. Chem.67: 3120-3123. 8. Kandimalla V. B. and Ju H. X. 2006, Chem. Eur. J. 12: 2. Fránek M., 1998, In Biosensors for direct monitoring 1074-080. of environmental pollutants in field, Kluwer publis- 9. Kintzios S. et al. 2004, Biosens. Bioelectron. 20: hers, Netherlands, 115-126. 907– 916. 3. Fránek M. and Hruska K., 2005, Vet. Med. 50: 1-10. 10. Li JJ. et al. 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 4. Fránek et al., 2006, Anal. Chem. 78: 1559-1567. 292: 31-40. 5. Hamula C. L. A. et al., 2006, Trends Anal. Chem. 25: 11. Rekha K et al., 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 681-691. 499–502. 6. Kandimalla V. B. and Ju H. X. 2004, Anal. Lett. 37: 12. Tetin S.Y. and Stroupe S. D. 2004, Curr. Pharmaceu. 2215–2233. Biotechnol. 5: 9-16. 7. Kandimalla V. B. et al., 2006, Crit. Rev. Anal. Chem. 13. Ziccardi M. H. et al., 2000, Toxicological Sci. 36:73 –106. 54:183–193.

18 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 24

CYTOKÍNY V CHARAKTERIZÁCII PROTINÁDOROVEJ IMUNITNEJ ODPOVEDE V UNIKÁTNOM ŽIVOČÍŠNOM „MeLiM“ MODELI MELANÓMU Ján Strnádel1,2, Hana Reisnerová2, Jana Hlučilová1, Dušan Usvald1, Vratislav Horák1 1Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Liběchov 2Česká zemědělská univerzita v Praze

Úvod systému. Podstatnú úlohu v procese imunologickej Nádorové choroby ročne spečatia osudy miliónov odpovede na nádory zohrávajú cytokíny – malé proteí- ľudí na celom svete. Vo vyspelých krajinách sú v poradí nové molekuly, sekretované leukocytmi a inými bunka- druhou najčastejšiou príčinou úmrtia hneď po kardio- mi. Podľa účinku na rast nádoru ich možno principiál- vaskulárnych chorobách. I napriek snahe veľkého ne rozdeliť na dve skupiny – na cytokíny, ktoré posobia množstva výskumných onkologických pracovísk sa na imunostimulačné (prozápalové cytokíny, so stimulač- tomto fakte za posledných niekoľko desaťročí nič ným účinkom na bunky imunitného systému), a imu- podstatné nezmenilo – naopak, podľa údajov z Ameri- nosupresívne (protizápalové, potláčajúce vývoj imunit- can Cancer Society a Svetovej zdravotnej organizácie nej odpovede). (WHO) sa incidencia nádorov za posledných dvadsať Vzájomný pomer imunostimulačných a imunosupre- rokov zvýšila z 238 registrovaných prípadov (rok 1980) sívnych cytokínov rozhoduje o úspešnosti protinádoro- na 668 prípadov (rok 2004) na 100 000 obyvateľov. vej liečby. Pokiaľ je tento pomer v prospech imunosti- Každoročne pribudne 160 000 nových prípadov mulačných cytokínov, je prognóza vo vačšine prípadov nádorov u detí. V dosledku chýbajúcich onkologických dobrá. Imunologické štúdie ukázali, že progresia nádo- registrov v niektorých krajinách je toto číslo pravdepo- rov závisí na interakcii zložiek imunitného systému dobne orientačné a skutočný počet detí s nádormi je s nádorovými bunkami. Pomer cytokínov produkova- ešte vačší. Výskyt niektorých nádorov má v celosveto- ných pri imunologickej odpovedi bunkami imunitného vom meradle neustále stúpajúcu tendenciu. Typickým systému a cytokínov produkovaných samotnými nádo- príkladom je malígny melanóm, zhubný nádor kože, rovými bunkami može rozhodnúť o postupujúcej pro- u ktorého je každoročný nárast novo diagnostikova- gresii alebo naopak regresii nádoru. Imunosupresívne ných prípadov v belošskej populácii takmer 5 percent! cytokíny – IL-8 (interleukín 8), IL-10, TGF-β1 (transfor- Počet nádorových ochorení v Českej a Slovenskej ming growth factor) – sú produkované nádorovými republike, spolu s percentom mortality, zaraďuje tieto bunkami a majú významnú úlohu pri prekonávaní imu- krajiny na popredné miesta v svetovom rebríčku. Štan- nitného dozoru (inhibujú proliferáciu T-lymfocytov – IL- dardné prístupy k liečbe nádorov ako chirurgická excí- 10, TGF-β1) a posobia ako angiogénne faktory pri neo- zia, chemoterapia, rádioterapia, či novšie tzv. bioche- vaskularizácii rastúceho nádoru (IL-8, TGF-β1). Naproti moterapeutické prístupy (chemoterapia kombinovaná tomu protinádorové cytokíny – TNF-α („tumour necro- s niektorými cytokínmi alebo protilátkami proti cytokí- sis factor alpha“), IFN-γ (interferon gamma), IL-4, IL-12 nom) sú účinné predovšetkým v začiatočných štádiách – inhibujú rast nádoru, zvyšujú jeho antigénne vlast- ochorenia. K manifestácii prejavov nádorového ochore- nosti a potencujú diferenciáciu imunokompetent- nia však často dochádza až v štádiu diseminácie pri- ných buniek. Sledovanie pomeru hladín prozápa- márneho nádoru a tvorby sekundárnych nádorových lových a protizápalových cytokínov v priebehu terapie ložísk (metastáz), ktoré postihujú životne doležité orgá- a po nej má aj doležitý význam v určení prognózy ny. Mnoho pacientov tak vyhľadáva pomoc lekára až ochorenia. v okamihu, kedy je už akákoľvek forma terapie neúčin- V posledných rokoch sa cieľom zásahu v rámci proti- ná. Vzniká tak neustála potreba hľadať nové prístupy nádorovej terapie stáva mikroprostredie obklopujúce k liečbe rakoviny a poznávania ich účinkov na viacerých nádor (tzv.“tumour microenvironment“). To produkuje zvieracích modeloch pred ich zavedením do štádia kli- celé spektrum cytokínov, ktorých prítomnosť je výsled- nického skúšania. kom zložitých interakcií medzi nádorom, stromatickými a endoteliálnymi bunkami, fibroblastmi a zložkami Cytokíny v imunoterapii nádorov zápalového infiltrátu. Pokusy, pri ktorých sa pomocou Do centra pozornosti sa v poslednom období dostá- umele pripravených špecifických protilátok zablokoval va výskum terapií, pri ktorých dochádza k modulácii VEGF (vascular endothelial growth factor) alebo recep- imunitného systému – tzv. imunoterapií. Vhodnou sti- tor viažúci VEGF, viedli k indukcii imunitnej odpovede muláciou prirodzenej protinádorovej imunity napr. na bunkovej aj hormonálnej úrovni. Konečný terapeu- pomocou nádorových vakcín, či aplikáciou autológnych tický efekt takýchto postupov na pacientoch však imunitných buniek (dentritických buniek a cytotoxic- mnohokrát zlyháva v dosledku zložitých autoregulač- kých T-lymfocytov) aktivovaných in vitro dochádza ných mechanizmov v organizme. Zásahom do jednej k aktivácii bunkovej a hormonálnej zložky imunitného zložky (cytokínu) sa totiž zvyčajne vyvolá odozva

19 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 25

v celej kaskáde funkčne podobných, ale i proti- namské prasatá, ďalej jedince plemena Landrace chodne posobiacich komponentov cytokínovej siete. a Cornwall. V roku 1989 došlo k udalosti, ktorá viedla Posobenie určitého cytokínu može byť aj celkom pro- k ustanoveniu línie MeLiM. Bol pozorovaný výskyt nie- tichodné v závislosti od podmienok, v ktorých dochád- koľkých jedincov s kožnými nádormi. Čiastočným prí- za k jeho produkcii. Typickým príkladom je TNF-α, kto- buzenským krížením (inbreedingom) sa vytvorila origi- rého vysoké lokálne koncentrácie v nádore (indukova- nálna línia MeLiM vyznačujúca sa genetickou predispo- né napr.hypoxiou) ničia cievny systém nádoru, ale na zíciou k tvorbe malígneho melanómu. druhej strane, nízke hodnoty chronicky sa tvoriaceho Melanóm sa v tejto línii vyskytuje u takmer 50 % zvi- TNF-α (pri chronickom zápale) prispievajú k remodelá- erat vo forme mnohopočetných, tmavo pigmentova- cii a rozvoju stromatickej matrice, potrebnej na rast ných kožných nádorov na roznych častiach tela. Približ- a šírenie nádoru. TNF-α okrem toho stimuluje rast fib- ne jedna tretina zvierat uhynie v dosledku rozsiahlej roblastov, ktoré následne produkciou rastových fakto- diseminácie melanómu a vzniku metastáz predovšet- rov možu potencovať i rast samotného nádoru v mies- kým na slezine, pľúcach a lymfatických uzlinách počas te chronického zápalu. Spomenutá vlastnosť cytokínov prvých dvoch mesiacov života. Pokiaľ sa však na takéto tak značne komplikuje snahu o charakterizáciu ich úloh jedince aplikuje devitalizácia, dojde k vymiznutiu pri- v imunoterapiách. márneho nádoru i orgánových metastáz. Vyliečené jedince sa stávajú základom pre ďalší chov. Devitalizácia - jedna z možností, ako stimulovať V línii MeLiM je však možné pozorovať i druhú skupi- protinádorovú odpoveď nu zvierat, u ktorej dochádza k neskoršiemu vývinu Medzi experimentálne študované terapeutické postu- nádoru s jeho následnou spontánnou regresiou. py so stimulačným účinkom na imunitný systém V porovnaní s ľudskými melanómami, pri ktorých sa a následnou deštruktívnou odozvou na niektoré typy uvádza jedno percento spontánne regredujúcich nádo- nádorov, kde zásadnú úlohu pravdepodobne hrajú rov, v prípade línie MeLiM k tomuto javu dochádza tak- cytokíny, možno zaradiť aj devitalizáciu. Tento originál- mer u dvoch tretín postihnutých jedincov. Podobne ako ny prístup k terapii solídnych nádorov vyvinul český chi- u devitalizovaných jedincov, aj pri spontánnej regresii rurg MUDr.Karel Fortýn. Spočíva v ischemizácii nádoru melanómu dochádza k lokálnemu vybieleniu kože - podviazaním jeho arteriálneho a venózneho krvného tzv.vitiligu. Pravdepodobne ide o autoimunitný proces zásobenia. Takto ošetrený nádor sa ponechá in situ bez (pozorovaný aj u ľudských pacientov), ktorý je možno následnej excízie. Účinok devitalizácie bol experimen- sekundárne iniciovať u prvej (devitalizáciou ošetrenej) tálne testovaný na miniatúrnych prasatách línie MeLiM skupiny zvierat a ktorý sa zatiaľ neznámym mechaniz- (Melanoma-bearing Libechov Minipigs) s dedičným mom uplatňuje aj v druhej skupine zvierat, spontánne malígnym melanómom na Ústavu živočišné fyziologie regredujúcich. Mechanizmus spontánnej regresie a genetiky (ÚŽFG) Akademie věd ČR. Nádor zbavený nádoru na MeLiM modele skúmajú na molekulárno- krvného zásobenia postupne zanikal bez toho, aby genetickej úrovni v spolupráci s liběchovským sposobil sepsu alebo smrť jedinca. Doposiaľ získané pracoviskom vedci z ústavu CEA-INRA v Jouy-en-Josas experimentálne výsledky svedčia o tom, že devitalizácia (Francúzsko). vedie k aktivácii bunkami sprostredkovanej protinádo- V ÚŽFG v Liběchove sa výskumná činnosť pracovní- rovej imunitnej odpovede. kov Laboratoře biologie nádorů sústreďuje na histopa- tologickú, imunohistochemickú a biochemickú charak- Prasa línie MeLiM v biomedicínskom výskume terizáciu línie MeLiM a na analýzu imunitnej odpovede melanómu organizmu po devitalizácii melanómu. Fenotypizáciou Vo výskume maligného melanómu sa vo svete použí- lymfocytov v krvi a tumor-infiltrujúcich lymfocytov va viacero živočíšnch modelov. Medzi najčastejšie v nádore pomocou CD povrchových antigénov sa na modelové zviera patrí myš a potkan, ale používa sa prietokovom cytometri zisťujú zmeny v zastúpení CD8+ i morča (Cavia porcellus) a dokonca akvarijné rybky (cytotoxických T-lymfocytov) a CD4+ (pomocných, hel- (rod Xiphophorus). Miniprasa línie Sinclair (odvodené per T-lymfocytov) po devitalizácii. Pracuje sa na rozšíre- od kmeňa Hormel) je model podobný MeLiM, ale na ní použitia cytometrie na detekciu niektorých intracelu- rozdiel od MeLiM v tejto línii spontánne regreduje až lárnych antigénov a cytokínov. Nepriamym imunofluo- 100% postihnutých zvierat s nádorom. MeLiM minipra- rescenčným značením kryorezov nádorov sa detekujú sa je preto na výskum melanómu vhodnejšie. zmeny v expresii proteínov teplotného šoku (HSP-70, Línia miniatúrnych prasiat MeLiM vznikla cielenou gp96 - pre ich významnú úlohu pri zahájení imunitnej selekciou jedincov, u ktorých sa pozoroval spontánny odpovede), niektorých cytokínov (napr. IFN-gamma – výskyt maligného melanómu. Chov miniprasiat na podporuje Th1 bunkovú odpoveď proti nádoru) a pro- ÚŽFG v Liběchove začal v roku 1967 importovaním teínov extracelulárnej matrix (uplatňujúcich sa v metas- a krížením miniatúrnych prasiat kmeňa Hormel (Hor- tatickom procese). Kvantifikácia relevantných cytokínov mel Institute, University of Minnesota, USA) s göttin- v krvnom sére a lyzátoch z nádorov sa realizuje pomo- genským miniatúrnym kmeňom (University of Göttin- cou sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent gen, Germany). Postupne sa do chovu (primárne kvoli Assay) súprav. V procese optimalizácie je aj metóda výskumu dedičnosti krvných skupín) introdukovali viet- Western-blottingu na potvrdenie zmien v expresii vyš-

20 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 26

šie spomenutých proteínov. Pokusným zvieratám sa mer neliečiteľnú, je snaha o nájdenie nových terapeu- počas celého experimentu sledujú základné hematolo- tických prístupov veľmi aktuálna. Prítomnosť vhodných gické parametre (množstvo lymfocytov, erytrocytov, živočíšnych modelov vo výskume melanómu hrá hodnota hematokritu, množstvo hemoglobínu ) a časti v tomto procese kľúčovú úlohu. Miniprasatá línie odobraných nádorov sa spracuvávajú aj štandardnými MeLiM spĺňajú vďaka histopatologickej a biochemickej histologickými technikami. podobnosti nádoru s ľudským melanómom požiadavky na takýto model. V budúcnosti može tento model slú- Záver alebo „Quo vadis, MeLiM?“ a budúcnosť žiť na vývoj a testovanie nových terapeutických postu- prasačieho melanómového modelu pov. Vačšie nároky na chov, manipuláciu i operačný Incidencia ľudského melanómu má zrejme „vďaka“ personál pri štúdiu na tomto modeli (v porovnaní enviromentálnym faktorom (zvýšené hodnoty UV žiare- s drobnými laboratórnymi hlodavcami) vyvažuje vačšia nia v dosledku defektov v ozónovej vrstve) neustále miera podobnosti a prenositeľnosti výsledkov na ľud- stúpajúcu tendenciu. Kedže ide o veľmi agresívnu ských pacientov. formu nádoru, v štádiu metastáz (štádium III a IV) tak-

Literatúra 1. http://www.cancer.org. 8. Huang, S., Mills, L., Mian, B. et al., Am. J. Pathol. 2. Atkins, M.B., Clin. Cancer Res. 12, 2353s-2358s 161, 125-34 (2002). (2006). 9. Fortýn, K., Hradecký, J. et al., Z. Exp. Chir.Trans- 3. Crowe, N.Y.,Coquet, J.M. et al., Exp. Med. 202, plant. Knstl. Organe 18, 42-50 (1985). 1279-1288 (2005). 10. Fortýn, K., Hruban, V., Hradecký, J., Tichý, J., Klin. 4. Riemer, A.B., Forster-Waldl, E. et al., Eur.J.Immunol. Onkol. 2, 7-10 (1989). v tisku (2006). 11. Fortýn, K., Hruban, V., Horák, V., Tichý, J., Klin. 5. Atkins, M.B.:Semin. Oncol. 29 (Suppl.7), 12-17 Onkol. 1,11-15 (1995). (2002). 12. Horák, V., Soukupová, P., Šinkora, J. et al., Pigment 6. Atkins, M.B., et al., Cancer J. Sci. Am. 6 (Suppl.1), Cell Res. 16, 583 (2003). S11-14 (2000). 13. Strnádel, J., Hradecký, J. et al., J. Appl. Biomed., 7. Bar-Eli, M., 67: 12-18 (1999). (Suppl.1), 3, 44-45 (2005).

Táto práca bola podporená finančnými prostriedkami z Výzkumného záměru MSM č.6046070901, Výzkumného záměru ÚŽFG AV ČR č. AV0Z50450515, projektu GAČR 524/04/0102 a projektu IGA ÚŽFG/06/03.

ENZYMOVÉ MODIFIKACE FOSFOLIPIDŮ Tomáš Podzimek Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Lipidy tvoří velkou skupinu látek vyznačující se boha- systémy lipas a fosfolipas. Fosfolipidy jsou používány tou strukturní různorodostí. Kromě energetické role v potravinářství jako emulsifikátory a ve formě liposo- hrají, také důležitou roli u řady buněčných pochodů mů ve farmaceutickém odvětví a v kosmetice (součást (buněčné rozpoznávání, intracelulární komunikace pleťových vod). Jsou získávány z přírodních zdrojů jako apod.). Tato velká skupina látek se dělí na podskupiny směs látek obsahující různé mastné kyseliny. Příkladem (např. fosfolipidy, lipoproteiny, mastné kyseliny atd.). je směs fosfolipidů zvaná lecithin isolovaná z vaječ- Fosfolipidy se vyskytují jak u savců, rostlin a kvasinek, ného žloutku a sojových bobů. tak i u prokaryot. Zajišťují stabilitu buněčných mem- brán a pomáhají vykonávat jejich funkce. Jejich Charakteristika fosfolipidů významnost je dána také tím, že poruchou jejich meta- Fosfolipidy lze rozdělit podle toho, jaký páteřní alkohol bolismu vznikají různé metabolické a neurologické obsahují. V případě, že jsou tvořeny glycerolem, nazýva- nemoci, které mohou být i dědičné. Dále se účastní jí se fosfoacylglyceroly, jestliže obsahují sfingosin, nazý- regulace některých biologických procesů jako signální vají se sfingolipidy. Do skupiny fosfoacylglycerolů patří molekuly. Proto je jejich výzkum důležitý pro lékařství etherové fosfolipidy, u kterých je jeden alifatický řetězec a farmaceutický průmysl. připojen na glycerol etherovou vazbou namísto esterové. Velký zájem průmyslu je dnes zaměřen na vývoj Všechny fosfolipidy se vyznačují amfifilní povahou, nových derivátů lipidů a procesů s tím spojených. kterou způsobují na jedné straně dlouhé řetězce mast- Výzkum je zaměřen hlavně na enzymové modifikace ných kyselin a na straně druhé fosfátová polární hlavice, lipidů. Pro průmyslové účely se používají imobilisované na kterou lze navázat další molekuly.

21 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 27

Fosfoacylglyceroly, jak už bylo řečeno obsahují troj- reakce je mezi bakteriální a savčí PLC. Zatímco sytný alkohol glycerol. V poloze sn-1 a 2 je navázán bakteriální PLC se skládá z jedné domény, savčí zbytek mastné kyseliny (nasycený nebo nenasycený) PLC má několik různých domén. Eukaryotický enzym esterovou vazbou a v poloze sn-3 je vázán fosfát. používá ke stabilizaci transitního stavu Ca2+, kdežto U etherových fosfolipidů se nachází etherová vazba u bakteriálního tuto funkci vykonává arginin v analogic- (O-alkyl nebo O-alkenyl) v poloze sn-1. Vazbou různých ké poloze. Jedna z katalytických aminokyselin je molekul (např. cholinu, serinu, ethanolaminu atd.) u PLC histidin. na fosfátovou skupinu vznikají látky s různými biologic- Fosfolipasa D (PLD) – štěpí vazbu mezi fosfátovou kými účinky. skupinou a alkoholem (např. cholin, ethanolamin). Sfingolipidy jsou odvozeny od alkoholu sfingosinu, Předpokládá se, že konservativní aminokyseliny což je dvojsytný alkohol s dlouhým nenasyceným řetěz- His-Lys-Asp jsou katalytickými skupinami. Téměř cem a jednou aminoskupinou. Hydroxylové skupiny všechny PLD jsou závislé na Ca2+ iontech a vzájemně se jsou v poloze 1, 3 , a aminoskupina v poloze 2. Pokud liší potřebnou koncentrací tohoto iontu. PLD má je aminoskupina acylována mastnou kyselinou, nazývá afinitu k fosfatidylcholinu (PC), fosfatidylethano- se tento derivát ceramid. Ceramidy pak mohou být laminu (PE), fosfatidylinositolu (PI), fosfatidylserinu fosforylovány v poloze 1. Pokud je na fosfátu navázán (PS) atd. cholin, pak se taková molekula nazývá sfingomyelin. Sfingomyelinasa (SM), sfingomyelinasa D (SMD) Je součástí myelinového pouzdra, které chrání axony a ceramidasa –SM hydrolysuje vazbu mezi fosfátem nervových buněk. a sfingosinem. SM lze rozdělit na kyselé s pH optimem Z těchto strukturních poznatků vyplývá ohromné kolem 4,5 , neutrální s pH optimem 7,5 a basické množství kombinací, z kterých vznikají strukturně s pH optimem 9,0. Pro katalysu je důležitý histidin. podobné, ale vlastnostmi se lišící molekuly. Stejnou specifitu k sfingolipidům vykazuje i PLC, která rovněž obsahuje katalytický histidin. SMD štěpí vazbu Něco o enzymech mezi fosfátovou skupinou a alkoholem. Tutéž reakci Enzymům, které štěpí fosfoacylglyceroly se říká fos- provádí i PLD. Ceramidasa odštepuje zbytek mastné folipasy. K nim ještě můžeme přiřadit lipasy, které sice kyseliny z aminoskupiny sfingosinu. Tímto způsobem obvykle štěpí triacylglyceroly (TAG), ale mají afinitu je možné synthesovat různé ceramidy nebo sfingo- i k fosfolipidům (obsahují stejně vázané mastné kyseli- lipidy. ny jako TAG). Nejznámější fosfolipasy jsou fosfolipasa Lipasy – představují velmi různorodou skupinu enzy- mů používaných v průmyslu. Jedná se o potravinářský A1, A2, B, C, D a lysofosfolipasa. Enzymy, které zpraco- vávají sfingolipidy jsou např. sfingomyelinasa, sfingo- průmysl (modifikace tuků a olejů), výroba detergentů, myelinasa D, ceramidasa. papírenský a farmaceutický průmysl. Katalytická triáda Fosfolipasa A (PLA ) – odštěpuje zbytek mastné se obvykle skládá z Ser-His-Asp/Glu. Tyto enzymy mají 1 1 čtyři vazebná místa pro TAG. Tři z nich jsou pro jednot- kyseliny z polohy sn-1 fosfoglycerolu. PLA z bakterie 1 livé mastné kyseliny vázané na glycerol. Zajímavým E. coli je dimer s katalytickou triadou His-Ser-Asn. Patří strukturním prvkem aktivního místa je „víčko“, které do rodiny serinových hydrolas. K tvorbě dimeru uzavírá aktivní místo v inaktivním stavu enzymu. Lipasy 2+ a ke katalyse potřebuje Ca ionty. Tato hydrolasa má bývají specifické pro polohy 1,3 TAG, což znamená, že širokou substrátovou specifitu (štěpí fosfolipidy i lyso- mohou štěpit esterovou vazbu v poloze sn-1 také u fos- fosfolipidy). folipidů. Fosfolipasa A2 (PLA2) – odštěpuje zbytek mastné Některé z těchto enzymů (hlavně PLA1, PLA2, lysofos- kyseliny z polohy sn-2 fosfoglycerolu. Byla první objeve- folipasy a lipasy) mají za určitých podmínek také trans- nou a popsanou fosfolipasou. Přednostním substrátem acylasovou aktivitu, tzn., že jsou schopny esterovou je pro ni fosfolipid mající v poloze sn-2 navázanou vazbu tvořit. Tento proces má velké uplatnění v prů- kyselinu arachidonovou. Ta po uvolnění působí jako myslu k výrobě nových látek s odlišnými vlastnostmi “druhý posel“ nebo slouží jako prekursor k synthese než mají původní molekuly. ikosanoidů. PLA2 tvoří skupinu enzymů, které se dají rozdělit podle toho, jestli používají katalytickou amino- Faktory ovlivňující aktivitu enzymů kyselinu serin nebo histidin. Štěpí nejenom fosfolipidy, Zásadní význam pro reakce fosfolipas a lipas má ale i lysofosfolipidy. obsah vody v reakční směsi, která se vyjadřuje jako Fosfolipasa B (PLB) a lysofosfolipasa – oba enzy- aktivita vody. Je to vlastně procento vody obsažené my hydrolysují fosfolipidy i lysofosfolipidy. Napřík- ve směsi. Pro enzymy štěpící tuky je, v porovnání lad PLB z Cryptococcus neoformans je extracelu- s ostatními hydrolasami (glykosidasy, proteasy) výhod- lární enzym, nezávislý na iontech, hydrolyzující nější přítomnost menšího množství vody z důvodu všechny fosfolipidy, s výjimkou kyseliny fosfati- reversní hydrolysy. Zatímco glykosidasy vyžadují hod- dové. notu vodní aktivity nejméně 0,6 , lipasy a fosfolipasy Fosfolipasa C (PLC) – hydrolysuje vazbu mezi fosfá- se mohou přiblížit téměř k 0. Samozřejmě je vždy tem a glycerolem. Vyskytuje se u mnoha organismů. nutný určitý obsah vody k udržení enzymu v aktivním Významný rozdíl ve struktuře a mechanismu stavu.

22 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 28

U lipas z Rhizopus oryzae a Candida rugosa byla stu- 50 % (v/v) terc-butanolu za přítomnosti vinylesteru dována transesterifikace ethyldekanoátu na hexyldeka- kyseliny laurové jako donoru acylu. V přebytku donoru noát s hydrolysou na kyselinu dekanovou jako kompe- a za vhodné teploty lze dosáhnout vysokého výtěžku. titivním procesem. Jako reakční prostředí byl použit dii- Limitujícím faktorem zde je reakční doba. Pokud je sopropylether se stanoveným množstvím vody. Lipasa reakce prováděna více než 24 hodin, dochází ke vzniku z Rhizopus oryzae měla nejvyšší transesterifikační akti- většího množství PC v důsledku migrace acylu vitu při aktivitě vody 0,06. Lipasa z Candida rugosa v molekule. měla nejvyšší aktivitu při aktivitě vody 0,53 a nejvyšší Migrace acylu – bývá nežádoucím aspektem reakcí. poměr transesterifikace/hydrolysa při aktivitě 0,11. Může totiž probíhat neenzymaticky, jen za katalysy V podobných podmínkách byly testovány některé gly- kyselinami nebo basemi. Někdy tento děj podporují kosidasy, jejichž nejvyšší aktivita byla při aktivitě vody i nosiče, na kterých jsou imobilisovány příslušné enzy- blízko 1,0. my. Jednou z možností jak toto potlačit je přidání borá- Dále záleží na tom, jestli je reakce řízena termo- tu, dále je možné produkt konvertovat do pevného dynamicky nebo kineticky. Při esterifikaci nebo transes- stavu během reakce. Ukázalo se, že 1-acyl lyso-PC je terifikaci mohou vznikat lysofosfolipidy, jejichž stabilnější než 2-acyl lyso PC. rovnovážná konstanta ovlivňuje výtěžek plně acylova- Alkoholysa – alkoholysou PL můžeme získat lyso-PL ných fosfolipidů. Rovnovážné konstanty nejsou pro a estery mastných kyselin. Akceptorem zbytků mast- všechny fosfolipidy stejné. Znamená to, že některé ných kyselin může být např. glycerol, methanol nebo se budou modifikovat s lepším výtěžkem a jiné ethanol. Alkoholysou pomocí lipasy z Thermomyces s horším. Vliv zde má opět aktivita vody a také kon- lanuginosa bylo dosaženo dobrého výsledku. Akcepto- centrace mastných kyselin. V souladu s výše uvedený- rem byl oktanol. Zajímavostí je, že aktivita lipasy klesa- mi skutečnostmi, by měla být koncentrace mastných la s kratší délkou akceptorového alkoholu. kyselin vyšší a aktivita vody nižší. Reakce, které jsou z hlediska termodynamického nevýhodné, jsou řízeny Další příklady kineticky. To je případ PLD a znamená to, že lze Kombinací dvou enzymů (PLD a PLC) byly připraveny dosáhnout dobrého výtěžku i při vyšší aktivitě vody. tyto lyso-PL: 1-lauroyl-rac-glycerofosfát (1-LGP) a 1-lau- Tyto reakce se dějí ve dvoufázovém systému voda- royl-dihydroxyacetonfosfát (1-LDHAP). Reakce probíha- organické rozpouštědlo. la ve dvou krocích. Nejprve byla použita PLD ze Strep- Ostatními faktory jsou vhodná teplota pro enzym, tomyces sp. na reakci PC s 1-monolauroyl-rac-glycero- která i ovlivňuje migraci acylů a snižuje viskozitu reakč- lem. Vznikl 1-lauroyl-fosfatidylglycerol (1-LPG) a cholin. ního média, reakční doba, donor acylu apod. 1-LPG byl hydrolysován PLC z Bacillus cereus na 1-LGP a diacylglycerol. Stejným postupem vznikl 1-LDHAP. Modifikace fosfolipidů Dále byly studovány PLD z hlávkového zelí a burských V případě výměny jedné mastné kyseliny za jinou je oříšků. Obě se efektivně účastnily transfosfatidylační možné použít jednokrokovou nebo dvoukrokovou reakce. Aplikace PLC je omezena úzkou specifitou metodu. První metoda je založena na transesterifikaci a neschopností štěpit syntetické substráty. Substrát musí obsahovat etherovou nebo esterovou vazbu přidáním volné mastné kyseliny do reakční směsi. v pozici sn-1, esterovou vazbu v pozici sn-2 a fosfocho- K tomuto účelu jsou vhodné hlavně lipasy (např. lin v pozici sn-3. z Rhizopus arrhizus), které jsou specifické pro polohu K přípravě lysofosfatidové kyseliny byl použit sn-1 fosfolipidů a také PLD. Principem druhé metody je také systém dvou enzymů. Mastná kyselina byla nejprve hydrolysa a poté reesterifikace fosfolipidu. odštěpena PLA a lyso-PL byl potom hydrolysován Zde se využívají také lipasy. 2 Lysofosfolipidy (lyso-PL) je možné připravit pomocí PLD. Pokud je substrátem přírodní fosfatidylcholin, hydrolysy, esterifikace, migrace acylu nebo alkoho- získáme směs fosfatidátů s různými mastnými lysy. kyselinami. Hydrolysa – pro tento děj jsou důležité typ enzymu, Jiným příkladem přípravy lysofosfatidové kyseliny je koncentrace substrátu a aktivita vody. Protože PLA je využití lipasy specifické pro polohy 1,3 (lipasa 1 z Rhizopus arrhizus). Esterifikací glycerol-3-fosfátu termolabilní, používají se k tomuto účelu PLA a lipasy. 2 vinyl esterem kyseliny laurové při aktivitě vody 0,53 Porovnáním 19 komerčních lipas bylo zjištěno, že nej- docházelo k přednostní tvorbě lysofosfatidové kyseliny vhodnějšími jsou enzymy z plísní Mucor a Rhizopus. (lysoPA) a ke spontánní migraci acylu v molekule. Co se týče polární hlavice lyso-PL, ta může být modifi- Následnou acylací vznikla kyselina fosfatidová (PA), kována PLC nebo PLD. také ve velkém množství. Konverse činila > 95 %. Esterifikace – esterifikací glycerofosfocholinu lipasou Jestliže se kyselina laurová zaměnila za kyselinu olejo- lze získat 1-acyl lyso-PC, totéž provedené enzymem vou, konverse byla 55 %. Zvýšením zastoupení PLA2 povede k 2-acyl lyso-PC. Udržování aktivity vody glycerol-3-fosfátu ve směsi se zvýšil poměr lysoPA/PA, a odstraňování produktů je důležité pro posunutí rov- ale zároveň se snížilo jeho zreagované množství. novážného stavu. K této reakci bývá používána PLB Lysofosfatidovou kyselinu se podařilo přečistit jedno- z Candida antarctica. Reakce je prováděna v prostředí duše precipitací.

23 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 29

Zpracováním lecithinu z vaječného žloutku se dnes Zmínil jsem zde dobré uplatnění fosfolipidů v prů- získává mnoho užitečných produktů, hlavně lysofosfoli- myslu, ale zatím jde především o fosfoacylglyceroly.

pidů. Používají se enzymy PLA1 a PLA2. Přitom se zlep- Nynější studie o sfingolipidech se spíše zabývají jejich šují emulsifikační, teplotní a viskozní vlastnosti produk- buněčnými funkcemi, metabolismem a regulacemi, tů, což zvyšuje jejich aplikovatelnost v průmyslu. Jiné stejně tak jako purifikací a charakterisací příslušných uplatnění těchto enzymů se nachází při rafinaci olejů. enzymů (sfingomyelinasy) a proto zatím neexistuje širší využití těchto látek v průmyslu. K tomuto účelu byly vybrány PLA2 z vepřového pankre-

atu a bakteriální PLA1.

Literatura 1. Zheng Guo, Anders F. Vikbjerg, Xuebing Xu: Biotech- 5. Virto C., et al., Enzyme Microb. Technol. 24, 651 nology Advances 203-259, 23 (2005). (1999). 2. Adlercreutz P. et al., J. Molec. Catal. B: Enzymatic 6. Virto C., et al., Enzyme Microb. Technol. 26, 630 11, 173 (2001). (2000). 3. Xu X. , in Lipid Technology and Enzymology. 7. Virto C., et al., Chem. Phys. Lipids 104, 175 (2000). 4. Ma L., Persson M., Adlercreutz P., Enzyme Microb. Technol. 31, 1024 (2002).

OXIDAČNÍ STRES, LIDSKÉ CHOROBY A BIOMARKERY Alžběta Havelková Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Organismy žijící v aerobním prostředí jsou neustále K endogenním příčinám patří tvorba VR abnormál- vystavovány celé řadě reaktivních molekul - volným ním působením cytochromoxidasy v dýchacím řetězci radikálům (VR). Tyto částice, vznikající různými způso- (uvolnění meziproduktů z aktivního centra enzymu). by, napadají intracelulární biomakromolekuly, modifi- VR dále vznikají při zánětlivé odpovědi organismu, kují je a tím poškozují organismus. Organismy jsou např. fagocyty a makrofágy využívají VR k usmrcování proti tomuto nebezpečí vyzbrojeny efektivním a sofisti- bakterií, virů a kvasinek. kovaným antioxidačním systémem. Volné radikály Oxidační stres VR jsou atomy nebo molekuly s jedním či více nepá- Oxidační stres vzniká v buňkách a tkáních v důsledku rovými elektrony ve vnějších orbitalech. Jedná se porušení rovnováhy mezi oxidačním a antioxidačním o velmi reaktivní sloučeniny s krátkým poločasem roz- systémem. Výsledkem nerovnováhy je vznik volných padu. VR vznikají získáním či uvolněním elektronu radikálů, které napadají organismus a způsobují závaž- nebo reakcí s nějakou další sloučeninou (iniciace). ná poškození buněk. Oxidační stres je spojen s progre- Výsledkem je vždy další VR a rozbíhá se řetězová reak- sí řady onemocnění jako jsou kardiovaskulární choroby, ce (propagace), která je ukončena ve chvíli reakce dvou atherosklerosa, poruchy centrální nervové soustavy VR za vzniku stabilní molekuly (terminace), či přítom- (Parkinsonova a Alzheimerova choroba), diabetes mel- ností zhášeče VR (scavengera), který je schopen řetězo- litus, záněty, nádorové bujení, poškození jater, ledvin vou reakci ukončit. a další. Aktivní formy kyslíku (ROS – reactive oxygen Příčiny vzniku volných radikálů species) Mezi exogenní příčiny vzniku VR patří γ-záření, UV Hlavní sloučeninou, která iniciuje reakce VR je mole- záření, sluneční světlo, radiové frekvence, mikrovlny. kulární kyslík, který je konečným akceptorem elektronů

Rentgenovo a radioaktivní záření při normálním ozařo- v dýchacím řetězci. Přeměnu O2 na H2O katalyzuje vání v malých dávkách nepředstavuje závažné nebez- metaloenzym cytochromoxidasa tvořící IV. kotvený pečí, avšak při intenzivním ozařování může vzniknout komplex v membráně mitochondrií. Tato přeměna je tzv. radiační syndrom, což je soubor pathologických uskutečněna čtyřmi po sobě jdoucími kroky, kdy v kaž- jevů připomínající zrychlené stárnutí. Podle teorie Den- dém kroku dochází k redukci kyslíku jedním elektro- hama Harmana (1956, 1984, 1987) jsou VR primární nem za vzniku velmi reaktivních meziproduktů příčinou stárnutí organismu. K zevním vlivům je nutno (Obr. 1)1. Za normálních podmínek ale nejsou mezi- započítat i výživu. produkty reakce uvolňovány z aktivního místa enzymu.

24 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 30

Obr. 1: Čtyřelektronová redukce molekuly kyslíku včetně meziproduktů.

Antioxidační obranné mechanismy molekul v organismech, modifikují je a výsledky napa- Jako obrana proti VR v organismu slouží sofistikova- dení lze detegovat. Příkladem biomarkerů jsou napří- ný antioxidační systémem, který zahrnuje tyto enzymy klad produkty lipoperoxidace. Vysokoúčinnou kapali- (Obr. 2)2: superoxiddismutasa (SOD), glutathionperoxi- novou chromatografii lze využít pro analýzu konjugova- dasa (GSHPx) a katalasa (CAT). A dále se obrany účast- ných dienů a aldehydů po derivatizaci 2,4-dinitrofenyl- ní celá řada dalších sloučenin (tzv. zhášeče nebo hydrazinem (DNPH). Alkany (ethan, pentan), další pro- také lapače volných radikálů): vitamín C, A a E, glutat- dukty lipoperoxidace, se stanovují plynovou chromato- hion, flavonoidy, fenoly, karotenoidy, ferritin a meta- grafií.1 Výsledkem modifikace proteinů jsou nově vznik- lothionein. lé karbonylové skupiny v postranních aminokyselino- vých řetězcích proteinu. V neposlední řadě dochází i k napadení nositelky genetické informace – DNA. Hlavní poškození DNA je rozpletení dvouvláknové struktury a vznik modifikovaných purinových a pyrimi- dinových bazí. Nejpoužívanějším biomarkerem je 8-oxo-2ę-deoxyguanosin. K účinnému monitorovaní oxidačního poškození organismů lze využít FORM systém3 zahrnující tzv. FORT Obr. 2: Enzymový obranný mechanismus buňky. test. Metoda měření je založena na schopnosti chro- mogenní látky tvořit barevné produkty po reakci s VR. Monitorování oxidačního poškození, biomarkery Intenzita zabarvení je mírou oxidačního stavu měřené- Měření volných radikálů je velmi problematické kvůli ho vzorku. Výsledky lze interpretovat jako ekvivalenty

jejich krátké životnosti. Mezi metody využívané k měře- koncentrace H2O2. Tato metoda je dobře reprodukova- ní aktivity VR se řadí elektronová paramagnetická reso- telná a není časově náročná (cca 8 minut). Lze ji využít nance (EPR). Jedná se však o velice pracnou a časově pro testy v klinických laboratořích a hlavně pro monito- i finančně velmi náročnou metodu. rování rizikových kategorií pacientů, kterými jsou Další metodou je monitorová biomarkerů, produktů kuřáci, diabetici a pacienti s vysokým krevním tlakem. vzniklých působením VR. VR napadají celou řadu bio-

Literatura 1. Joseph M.: Immunopharmacology of Platelets, 3. Torri C.: Oxidative stress, human diseases and bio- s. 209, Academic Press, New York 1996. markers, INT- Sept. 2003. 2. Holeček V., Racek J.: Klin. Biochem. Met. 2, 137 (1994).

25 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 31

ACYLACE PROTEINŮ A JEJÍ TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ Aleš Hnízda Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Úvod 44 %).Tato rozdílná specifita umožňuje selektivní inhi- Acylací se na proteiny připojují zbytky kyseliny myri- bici myristoylace, čehož se může využít při léčbě někte- stové (14:0), palmitové (16:0), stearové (18:0), arachi- rých onemocnění. Tato možnost se úspěšně studovala nodové (20:4) a dalších mastných kyselin. Nejčastěji se na dvou rodech kvasinek, které způsobují úmrtí lidí vyskytuje modifikace kyselinou myristovou a palmito- s oslabenou imunitou – Candida albicans a Cryptoco- vou. Dochází tím ke zvýšení hydrofobicity modifikova- ccus neoformans. ných molekul, a to často vede k jejich nasměrování Myristoylace je také důležitá při replikaci virových čás- a inkorporaci do biomembrán. Acylace bývá také přiči- tic, čehož se dá využít při antivirové terapii. Znalosti této nou konformačních změn proteinů, někdy se tím zvyšu- modifikace se také dají využít při vývoji chemoterapeu- je jejich odolnost vůči nespecifické proteolyse. tik, zvláště při léčbě karcinomu tlustého střeva. Candida albicans Terapeutické využití myristoylace Jedním z významných patogenů mezi kvasinkami je Nejprostudovanějším mechanismem acylace je Candida albicans, jež bývá častou příčinou úmrtí pacien- myristoylace. Mezi takto modifikované proteiny patří tů s AIDS. K léčbě se používají hlavně fungistatické tria- např. protein kinasa A, NADH – cytochrom b5 redukta- zoly, hrozí ale vytvoření rezistentního kmene. Alternativ- sa, jedna z NO synthas, většina α-podjednotek G-prote- ním terapeutickým přístupem je inhibice právě NMT. Stu- inů a také strukturní proteiny retrovirů (např. Gag). die se značenou [3H] kyselinou myristovou totiž ukázaly, Modifikace potom hraje zásadní roli při onkogenezi, že NMT je důležitá pro životaschopnost Candida albi- buněčné signalizaci nebo skládání retrovirů. cans. Byl kultivován kmen, u něhož byl v jednom chro- Mechanismus mozomu gen pro NMT deletován, v druhém potom byla N-myristoylace je specifická k N-koncovému glycinu, zavedena mutace Gly447 ¡ Asp. Tato záměna aminokyse- probíhá kotranslačně v endoplazmatickém retikulu. lin způsobila snížení katalytické aktivity NMT, způsobená N-myristoyltranferasa (NMT) je monomerní enzym sníženou afinitou enzymu k myristoyl-CoA. Kmen (50 – 60 kDa). Mechanismus enzymové reakce je násle- s mutací potom potřebuje ke svému růstu médium dující: 1. vazba myristoyl-CoA na NMT, 2. vazba proteinu obsahující kyselinu myristovou. Tak se prokázalo, že živo- na enzym, 3. přenos myristoylu na glycin proteinu taschopnost kmene koreluje s mírou N-myristoylace pro- 4. uvolnění CoA z aktivního centra enzymu, 5. uvolnění teinů C. albicans. Snížila se také její patogenita v oslabe- modifikovaného proteinu. Kyselina myristová se vždy ném hostiteli. Nemutovaný kmen způsobil smrt imuno- specificky váže na N-konec za vzniku amidové vazby. deficientní myši za 7 dní, zatímco kmen s mutací nebyl Na NMT se váže také stearoyl-CoA, nedochází ale k acy- letální ani 21 dnů po intravenozním podání. laci proteinu. Jako inhibitory NMT byly navrženy jak analogy myristyl- Specifita CoA, tak molekuly peptidové povahy. Ukázalo se, že Substrát NMT převážně obsahuje sekvenci Met-Gly-X- doména rozpoznávající acyl-CoA je velmi konzervovaná X-X-Ser(Thr) (menší část myristoylovaných proteinů a selektivní inhibici tímto způsobem není možné pro- může obsahovat v pozici 5 některou další aminokyseli- vést. V úvahu tedy připadá působení molekuly podobné nu). Počáteční methionin je odstraněn aminopeptida- peptidu, který rozpoznává NMT Candidy albicans, zatím- sou a Gly se tedy stává N- koncovou aminokyselinou. co aktivita lidské formy zůstává zachována. Při návrhu Některé proteiny (např. G-proteiny) mají v sekvenci a syntéze inhibitorů se vycházelo z N-koncového frag- mezi Gly a Ser zbytky cysteinů, které mohou podléhat mentu Arf2p (ADP ribosylační faktor), neboť myristoyla- palmitoylaci. To pak hraje důležitou úlohu při inkorpo- ce je pro biologickou funkci tohoto proteinu klíčová. raci do membrány. Specifita myristoylace výrazně Kromě inhibitorů vycházejících z koncového oktapetidu odlišuje savce od ostatních organismů, přestože NMT byly nedávno navrženy sloučeniny obsahující jádro benz- vykazuje vysokou míru homologie (savci s kvasinkami pyranu. (Příklady látek z obou skupin níže).

Inhibitor na bázi benzfuranu a inhibitor odvozený z oktapeptidu

26 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 32

Junin virus Jejich podání inhibovalo krysí karcinom tlustého Junin virus, který řadíme mezi RNA viry, je původcem střeva. argentinské hemoragické horečky. Ta se dnes léčí pomocí ribavirinu, který má ale jako analog nukleosidů Terapeutické využití palmitoylace řadu vedlejších účinků. Jako alternativní antivirální pro- Připojení kyseliny palmitové na proteiny není ve srov- středky byly zkoumány analogy kyseliny myristové, nání s kyselinou myristovou tak důkladně prostudováno. 2-hydroxymyristová kyselina a 13-oxamyristová kyseli- Nedaří se totiž izolovat všechny odpovědné enzymy, na. První z nich působí jako kompetitivní inhibitor NMT, zároveň také dochází v buňce k nespecifické reakci. druhá ovlivňuje strukturu modifikovaných proteinů – Palmitoylace – mechanismus a specifita znemožňuje inkorporaci do biomembrán. Obě látky Je známo, že palmitoyl se většinou váže na thiolovou inhibovaly replikaci virů a in vitro nebyly pozorovány skupinu cysteinu za vzniku thioesterové vazby. Modifi- žádné negativní účinky na hostitelské buňky. kovaný zbytek se v primární struktuře nachází blízko N- Myristoylace a boj s HIV nebo C-konce a zároveň musí být součástí nebo blízko Myristoylace hraje také důležitou roli během rozmno- transmembránové domény. žování viru HIV, modifikují se takto virové proteiny p17gag Zároveń je známo, že palmitoyl-transferasa preferuje a Nef. Proteinu Nef se využívá při snahách o vyvinutí vak- myristoylované proteiny. Připojení je dynamické, může cíny proti HIV. Jedná se o 30 kDa molekulu, která se být odstraněno protein palmitoyl protein thioesterasou inkorporuje do cytoplazmatické memrány. Nef zajišťuje (PPT). PPT štěpí thioesterovou vazbu v proteinech řadu biologických dějů, souvisejících s patogenitou viru: navázaných na plazmatickou membránu a ty jsou mění transdukci signálu, aktivuje T-lymfocyty a snižuje potom transportovány do lysozomu. expresi CD4 a MHC I. Tyto vlastnosti znemožňují použít Biologické důsledky nezměněný Nef jako imunogenní látku. Byl proto izolo- Změny modifikace kyselinou palmitovou mají také ván rekombinantní protein, u něhož byl akceptorový gly- významné biologické důsledky. Deficience PPT způso- cin zaměnen za alanin (nemůže tak docházet k myristo- buje metabolické změny, které negativně ovlivňují ner- ylaci) a dileucinový motiv byl deletován. Takto změněný vovou činnost (onemocnění vede ke slepotě a nakonec Nef nevykazoval vlastnosti důležité pro patogenitu viru. k úmrtí ve věku 3 let). Příčinou onemocnění je akumu- Naneštěstí měl i nižší imunogenní reakci, což by měla lace palmitoylovaných proteinů, které se se nacházejí vyřešit fúze s TPA (tissue plasminogen activator). NMT je hlavně v lysozomální frakci a jejich přítomnost snižuje poteciálním cílem antivirálních látek i sama o sobě, aktivitu proteas v organele. Inhibitory tohoto enzymu neboť snížením její aktivity způsobuje nižší viabilitu hos- mohou být také použity k destrukci nádorových buněk titelské buňky. Využívá se skutečnosti, že během chronic- lokalizovaných v mozku. Palmitoylace též hraje důleži- ké i akutní formy infekce HIV se snižuje hladina exprese tou roli při replikaci virů způsobujících chřipku. Znalos- NMT v napadených T-lymfocytech. Působením derivátu ti v této oblasti však dosud nepostačují k tomu, aby se serinalu docházelo k selektivnímu zneškodnění hostitel- daly použít k lékařským účelům. ských buněk HIV, neboť vzhledem ke snížení exprese jsou napadené buňky k působení inhibitoru citlivější. Inhibitory PPT jako chemoterapeutika pro nádory mozku Karcinom tlustého střeva Inhibice depalmitoylace vede k porušení mezibuněč- Karcinom tlustého střeva je jedno z nejčastěji se vysky- ných signálů a buněčné smrti. Jako inhibitory se použí- tujících nádorových onemocnění a Česká republika drží vají nehydrolyzovatelné analogy palmitoyl-thioesterů smutný primát země s nejvyšší incidencí. V buňkách (AcG-alfa-ketoamido-palmitoyl diamino propionát- tlustého střeva bylo definováno několik myristoylova- VKIKK; zkráceně DAPKA (viz strukturní vzorec na obráz- ných proteinů. Zdravé buńky obsahují například pp60src, ku). Působení této látky zvyšovalo účinek doposud pp60c-yes a anexiny. Na význam myristoylace při onkoge- používaných chemoterapeutik (etoposid, adriamycin). nezi upozornila práce, jež se zabývala myristoylací viro- Ty vyvolávají apoptosu a aktivita PPT ji inhibuje. Sníže- vého onkogenního produktu pp60 v-src. Ta je nezbytná ní aktivity PPT tedy zvyšuje účinek terapie. Nevýhodou pro inkorporaci do membrány a následnou transformaci inhibitorů PPT jsou jejich vedlejší účinky, mezi něž patří buněk. Protein potom zůstává v cytoplazmatické mem- hlavně poškození myokardu. bráně a nemůže vykonávat svoji regulační funkci. Bloko- vání modifikace lidského proteinu pp60src také vede k potlačení růstu a proliferace buněk. To, že myristoylo- vané proteiny pp60src a pp60c-yes hrají významnou úlohu při při patogenezi nádorových onemocnění, potvrdilo zjištění, že jejich tyrosin kinasová aktivita je vyšší v nádo- rových buńkách v porovnání se zdravými. Dalším důležitým objevem je to, že už v časných stá- diích karcinomu dochází ke zvýšení aktivity NMT, což je způsobeno zvýšením exprese enzymu. Nedávno pak byly izolovány endogenní inhibitory z hovězího mozku. DAPKA

27 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 33

Závěr benou imunitou. Myristoylace se také studuje v souvis- Výše uvedené přiklady ukazují, že poznaní acylace losti s léčbou infekce HIV nebo karcinomu tlustého má velké uplatnění ve vývoji nových léčiv proti řadě střeva. Důležitá je také modifikace kyselinou palmito- onemocnění. Byly vyvinuty inhibitory myristoylace, vou. Poznání tohoto problému má potenciál hlavně které potlačují růst Candidy albicans u pacientů s osla- v léčbě nádorů mozku.

Literatura 1. Resh, M.D., Biochimica et Biophysica Acta 1451 5. Liang, X. et al., Vaccine 20 (2002), 3413-3421. (1999), 1-16. 6. Cordo, S.M et al., Microbes and Infection 1 (1999), 2. McWherter, C.A. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 609-614. 11874-11880. 7. Raju, R.V.S. et al., Experimental Cell Research 235 3. Sogabe, S. et al., Chemistry & Biology 9 (1997), 145-154. (2002),1119-1128. 8. Dawson, G. et al., Cancer Letters 187 (2002), 4. Takamune, N. et al., FEBS Letters 527(2002), 163-168. 138-142.

28 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:35 Str. 4

V TOMTO ČÍSLE NAJDETE ÚVODEM 1 PROJEKT BIOTECHNOLOGIE PRO PRAHU BILANCUJE 2 MEZINÁRODNÍ KONFERENCE NEW ASPECT IN AQUACULTURE 2 BIOTECHNOLOGIE PŘI VÝROBĚ BATERIÍ 3 BIOMIKRONANOTECHNOLOGIE 4 BIOTECHNOLOGIE JAKO ALTERNATIVA PRO CHEMICKÝ PRŮMYSL 6 GENETICKY MODIFIKOVANÉ PLODINY 9 GENETICKY MODIFIKOVANÁ JABLKA 12

BIO-RECEPTOR BASED METHODS (BIO-ASSAYS) FOR FOOD, 15 ENVIRONMENT AND CLINICAL ANALYSIS CYTOKÍNY V CHARAKTERIZÁCII PROTINÁDOROVEJ IMUNITNEJ 19 ODPOVEDE V UNIKÁTNOM ŽIVOČÍŠNOM „MeLiM“ MODELI MELANÓMU ENZYMOVÉ MODIFIKACE FOSFOLIPIDŮ 21 OXIDAČNÍ STRES, LIDSKÉ CHOROBY A BIOMARKERY 24 ACYLACE PROTEINŮ A JEJÍ TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ 26

POKYNY PRO AUTORY

Vážení přátelé, aby byla technická úprava našeho časopisu co nejlepší a s minimálním množstvím chyb, uvítali bychom dodržování některých dále uvedených zásad.

1. Texty zasílejte elektronickou formou jako “attachment” spolu s tištěnou verzí, aby bylo možno opravit chyby způsobené přenosem. 2. Texty pište v editoru WORD (formát .doc), písmo Arial, velikost 11. Nerozdělujte slova na konci řádků. V textu lze používat zvýraznění některých termínů tučným písmem či kurzívou, a také horní a dolní index. Řádkování jednoduché. Odsazení odstavců a mezery mezi nimi nepoužívejte (nastavení = 0). 3. Nepoužívejte automatické číslování, tabulátory, ani „tvrdé“ definice stránek. 4. Obrázky zasílejte zásadně zvlášť v některém z běžných formátů (.jpg, .tif). 5. Připojte vždy svojí e-mailovou adresu či číslo telefonu, aby případné problémy bylo možno rychle řešit.

Děkuji L. Fukal 210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:33 Str. 1

BIOTECHNOLOGICKÁ SPOLEČNOST 166 28 Praha 6, Technická 3

ISSN 1210-1737

Neprodejné – jen pro členy Biotechnologických společností

Podávání novinových zásilek povoleno Ředitelstvím pošt Praha, čl. NP 1177/1994 ze dne 13. 6. 1994