Étude Du Potentiel Nutraceutique De La Culture Du Houblon Au Québec

Étude du potentiel nutraceutique de la culture du houblon au Québec

Thèse

Christiana Sarraf

Doctorat en biologie végétale Philosophiæ doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

Résumé

Le houblon (Humulus lupulus L.) est cultivé essentiellement pour ses inflorescences femelles appelées cônes et est utilisé dans les domaines brassicole et nutraceutique. Les principaux constituants des cônes sont les acides amers (acides α et β), connus comme agents d'amertume de la bière et ayant des propriétés anti-microbiennes, et le xanthohumol connu comme agent chimiopréventif du cancer. De plus, les cônes contiennent des composés phénoliques dont des proanthocyanidines connus pour leurs propriétés préventives contre les maladies chroniques. Bien que ces composés s'accumulent essentiellement dans les cônes, ils peuvent aussi s'accumuler sur la face inférieure des jeunes feuilles dans les poils glandulaires. Les feuilles et les tiges sont considérées comme des co-produits et sont très peu utilisées. Ce projet nous a permis d'étudier le potentiel agronomique et de quantifier les molécules reconnues pour leur action bénéfique sur la santé, de neuf cultivars de houblon cultivés pour la première fois au Québec. Nous avons étudié l'effet de la méthode de conservation sur le contenu en molécules bioactives des cônes et des feuilles après 12 mois d'entreposage. En plus, nous avons réussi à valoriser les co-produits du houblon et à produire des extraits de cônes, de feuilles et de tiges. Nos résultats ont montré que les feuilles et les tiges représentent plus de 50 % du poids sec total des plants et contiennent des quantités importantes de composés phénoliques dont des proanthocyanidines. Après 12 mois d'entreposage, des pertes importantes de xanthohumol et d'acides α et β ont été détectées dans les cônes secs. Par contre, la composition des cônes congelés est restée constante. La congélation n'est pas nécessaire pour conserver les feuilles puisque les concentrations de composés phénoliques totaux et de proanthocyanidines ne diminuent pas significativement dans les feuilles sèches. Les conditions optimales d'extraction ont été déterminées et sont de deux heures à 30 °C avec de l'éthanol 70 %, pour un ratio solide:liquide de 1:15 pour les cônes et les tiges et un ratio de 1:40 pour les feuilles. Les extraits ont été concentrés en utilisant une résine adsorbante et en utilisant l'huile comme co-solvant et trois extraits différents ont été obtenus.

iii

Abstract

Hops (Humulus lupulus L.) is grown primarily for its female inflorescences known as hop cones and is used for nutraceutical purposes and for brewing. Cones contain mainly hop bitter acids (α- and β- acids) and xanthohumol. Hop bitter acids are known for their bitter taste in beer and for their anti-microbial properties while xanthohumol is known for its chemopreventive properties. In addition, cones contain proanthocyanidins and polyphenols known for their preventive properties against chronic diseases. Although these compounds accumulate mainly in the cones, they can also accumulate on the underside of young leaves. Leaves and stems are considered as co-products and are rarely used. In this work, we studied the agronomic potential and we quantified the bioactive molecules present in cones, leaves and stems of nine hop cultivars, grown for the first time in Quebec. We also studied the effect of the storage method on cones and leaves bioactive content after 12 months of storage. In addition, we successfully valorized hop co-products and we produced cones, leaves and stems extracts. Our results showed that leaves and stems represent more than 50 % of the total dry weight of plants and contain substantial amounts of total polyphenols and proanthocyanidins. After 12 months of storage, significant losses of xanthohumol and α- and β- acids were detected in dried cones. In contrast, the composition of frozen cones remained constant. Freezing was not necessary to store leaves since the concentrations of total polyphenols and proanthocyanidins did not decrease, significantly, in dried leaves. The extraction parameters were optimized and the maximum extraction yield for the molecules of interest were obtained at 30 °C, 2 h of extraction, an ethanol concentration of 70 % and a solid: liquid ratio of 1:15 for cones and stem and 1:40 for the leaves. Extracts were concentrated by adsorbtion and by using oil as co-solvent and three different hop extracts were obtained.

Table des matières

Résumé ...... iii

Abstract ...... v

Table des matières ...... vii

Liste des tableaux ...... xi

Liste des figures ...... xiii

Liste des abréviations ...... xvii

Remerciements ...... xix

Avant-propos ...... xxi

Chapitre 1 : Introduction ...... 1 1.1 Le houblon ...... 1 1.1.1 Composés du houblon ...... 2 1.1.1.1 Acides α et β ...... 3 1.1.1.2 Xanthohumol et prénylflavonoïdes connexes ...... 4 1.1.1.3 Proanthocyanidines ...... 5 1.1.2 Effets bénéfiques du houblon sur la santé ...... 6 1.1.2.1 Phytothérapie ...... 6 1.1.2.2 Fabrication de la bière ...... 7 1.1.2.3 Antibactérien et antiviral ...... 8 1.1.2.4 Prévention du cancer ...... 8 1.1.2.5 Phytoestrogène ...... 9 1.1.2.6 Antioxydant ...... 9 1.1.3 Culture du houblon ...... 10 1.1.3.1 Biomasse végétale...... 10 1.1.3.2 Systèmes de culture ...... 12 1.1.3.3 Conditions de culture ...... 14 1.1.4 Procédés de transformation ...... 15 1.1.4.1 Séchage ...... 15 1.1.4.2 Entreposage ...... 16 1.1.4.3 Extraction ...... 17 1.2 Les composés phénoliques ...... 18 1.2.1 Rôle des composés phénoliques dans les plantes ...... 19 1.2.2 Classification des composés phénoliques ...... 20 1.2.2.1 Flavonoïdes ...... 21 1.2.2.1.1 Flavonols ...... 22 1.2.2.1.2 Flavones ...... 23

vii 1.2.2.1.3 Flavan-3-ols ...... 23 1.2.2.1.4 Anthocyanes ...... 26 1.2.2.1.5 Flavanones ...... 27 1.2.2.1.6 Isoﬂavones ...... 27 1.2.2.2 Non flavonoïdes ...... 27 1.2.2.2.1 Acides phénoliques simples ...... 28 1.2.2.2.2 Acides hydroxycinnamiques ...... 29 1.2.2.2.3 Stilbènes ...... 30 1.2.3 Voies de synthèse ...... 31 1.2.3.1 Biosynthèse des flavonoïdes ...... 33 1.2.3.2 Biosynthèse des non flavonoïdes ...... 35 1.2.4 Effets sur la santé ...... 35 1.2.4.1 Activité antioxydante ...... 36 1.2.4.2 Activité anticancéreuse ...... 37 1.2.4.3 Prévention des maladies cardiovasculaires ...... 39 1.3 Hypothèses et objectifs ...... 39

Chapitre 2 : Yield and chemical composition of cones and leaves of hops (Humulus lupulus L.) grown in Québec, Canada ...... 41 2.1 Résumé ...... 43 2.2 Abstract ...... 45 2.3 Introduction ...... 47 2.4 Materials and methods ...... 48 2.4.1 Plant material ...... 48 2.4.2 Chemicals ...... 48 2.4.3 Extraction ...... 48 2.4.4 Analytical procedure ...... 49 2.4.4.1 Total polyphenols ...... 49 2.4.4.2 Xanthohumol, desmethylxanthohumol, α- and β-acids ...... 49 2.4.4.3 Proanthocyanidins ...... 49 2.4.5 Statistical analysis ...... 50 2.5 Results ...... 50 2.5.1 Yield ...... 50 2.5.2 Prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols content in cones ...... 51 2.5.3 Prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols content in leaves ...... 52 2.6 Discussion and conclusion ...... 53 2.7 Acknowledgements ...... 54

Chapitre 3 : Yield and chemical composition of cones, leaves and stem of nine hop (Humulus lupulus L.) cultivars ...... 55 3.1 Résumé ...... 57 3.2 Abstract ...... 59 3.3 Introduction ...... 61 3.4 Materials and methods ...... 62

viii

3.4.1 Plant material and growing conditions ...... 62 3.4.2 Chemicals ...... 63 3.4.3 Extraction ...... 63 3.4.4 Analytical procedure ...... 64 3.4.4.1 Total polyphenols ...... 64 3.4.4.2 Xanthohumol, desmethylxanthohumol, 8-prenylnaringenin and α- and β- acids 64 3.4.4.3 Proanthocyanidins ...... 65 3.4.5 Statistical analysis ...... 65 3.5 Results ...... 65 3.5.1 Yield ...... 65 3.5.2 Chemical composition of cones ...... 66 3.5.3 Chemical composition of leaves ...... 67 3.5.4 Chemical composition of stems ...... 68 3.5.5 Yield and chemical composition ...... 69 3.5.6 Effect of the conservation method on cones composition ...... 70 3.5.7 Effect of the conservation method on leaves composition ...... 71 3.6 Discussion and conclusion ...... 73 3.7 Acknowledgements ...... 76

Chapitre 4 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 1: Optimization of prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols extraction ...... 77 4.1 Résumé ...... 79 4.2 Abstract ...... 81 4.3 Introduction ...... 83 4.4 Materials and methods ...... 84 4.4.1 Plant material ...... 84 4.4.2 Chemicals ...... 85 4.4.3 Extraction optimization ...... 85 4.4.3.1 Cones extraction ...... 85 4.4.3.1.1 Experiment 1: Grinding and number of extraction ...... 85 4.4.3.1.2 Experiment 2: Solid:liquid ratio and ethanol concentration ...... 85 4.4.3.1.3 Experiment 3: Extraction time and temperature ...... 86 4.4.3.2 Leaves and stems extraction and optimization of the solid:liquid ratio ..... 86 4.4.4 Analytical procedure ...... 86 4.4.4.1 Total polyphenols ...... 86 4.4.4.2 Desmethylxanthohumol, xanthohumol, α- and β-acids ...... 87 4.4.4.3 Proanthocyanidins ...... 87 4.4.5 Statistical analysis ...... 87 4.5 Results and discussion ...... 88 4.5.1 Cones extraction ...... 88 4.5.1.1 Effect of grinding and number of extraction ...... 88 4.5.1.2 Effect of solid:liquid ratio and ethanol concentration ...... 90 4.5.1.3 Effect of extraction time and extraction temperature ...... 95 4.5.1.4 Validation of the optimal conditions ...... 99

ix 4.5.2 Leaves and stems extraction ...... 99 4.5.2.1 Comparison of ethanol extraction and water extraction of proanthocyanidins and total polyphenols in leaves and stems ...... 103 4.5.2.2 Optimization of the solid:liquid ratio ...... 104 4.6 Acknowledgements ...... 106

Chapitre 5 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 2: Concentration of hop extracts by adsorption and oil ...... 107 5.1 Résumé ...... 109 5.2 Abstract ...... 111 5.3 Introduction ...... 113 5.4 Materials and methods ...... 114 5.4.1 Plant material ...... 114 5.4.2 Chemicals ...... 114 5.4.3 Separation of cones compounds ...... 115 5.4.4 Leaves and stem extract ...... 115 5.4.5 Cones extract ...... 115 5.4.6 Whole plant extract ...... 116 5.4.7 Pilot scale essay ...... 116 5.4.8 Canola oil reuse ...... 117 5.4.9 Analytical procedure ...... 117 5.5 Results and discussion ...... 117 5.5.1 Separation of cones compounds ...... 117 5.5.2 Leaves and stem extracts ...... 118 5.5.3 Cones extract ...... 121 5.5.4 Whole plant extract ...... 123 5.5.5 Polyphenol profile of pilot scale extracts ...... 124 5.5.6 Oil reuse ...... 125 5.6 Acknowledgments ...... 130

Chapitre 6 : Conclusion générale ...... 131

Annexe : Optimization of hot air drying of hop leaves ...... 137

Bibliographie ...... 141

Liste des tableaux

Table 2.1. Fresh and dry weight (FW and DW) and percentage of dry matter (% DM) of cones, leaves and stems of the plants of each cultivar...... 51

Table 2.2. Amounts (% DM) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in cones...... 51

Table 2.3. Amounts (%DM) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in leaves. .... 52

Table 3.1. Yield (kg/ha) of dried cones, leaves and stem of each cultivar ...... 66

Table 3.2. Significance levels of the content of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), humulone + adhumulone (α-2), colupulone (β-1), lupulone + adlupulone (β-2), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in cones, leaves and stem of the 9 cultivars ...... 67

Table 3.3. Concentrations of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), humulone + adhumulone (α-2), colupulone (β- 1), lupulone + adlupulone (β-2), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in cones ...... 67

Table 3.4. Concentrations of 8-prenylnaringenin (8-PN), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), α-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in leaves ...... 68

Table 3.5. Concentrations of proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in stem ...... 69

Table 3.6. Yield of cones (kg/ha) and content (kg/ha) of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) ...... 69

Table 3.7. Yield of leaves and stem (kg/ha) and content (kg/ha) of proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) ...... 70

Table 3.8. ANOVA of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β- acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in dried and frozen cones ...... 70

Table 3.9. ANOVA of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β- acids, total polyphenols (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in dried and frozen leaves ...... 72

xi Table 3.10. Comparison of the degree of polymerization of proanthocyanidins (concentrations in ppm) in dried leaves of Brewers Gold and Nugget before and after 12 months of storage ...... 73

Table 4.1. ANOVA results for desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in cones extraction ...... 88

Table 4.2. Concentration (%DW) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in cones extract using ethanol and methanol as solvents ...... 99

Table 4.3. ANOVA results for the total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in the ethanol extraction of leaves and the water extraction of leaves and stem experiments ...... 100

Table 4.4. Effect of extraction temperature and time on the extraction of proanthocyanidins of different degree of polymerization (concentrations in ppm) from hop leaves using water as solvent ...... 101

Table 4.5. Concentrations (%DW) of total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in leaves and stems using water or ethanol as a solvent ... 103

Table 4.6. Comparison between water and ethanol extraction of proanthocyanidins of different degree of polymerization (concentrations in ppm) ...... 104

Table 4.7. Effect of solid:liquid ratio on the concentrations of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) and on the total extraction yield in cones, leaves and stems extracts ...... 105

Table 5.1. Comparison of the concentrations of xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC), and proanthocyanidins (PAC) in the oil extracts and in the enriched by XAD7HP resin extracts of cones and whole plants ...... 124

Table 5.2. Phenolic composition (mg/g) of leaves and stem extract and cones concentrated extract ...... 125

xii

Liste des figures

Figure 1.1. Structure des acides α et β (De Keukeleire et al., 2003) ...... 3

Figure 1.2. Isomérisation des acides α en acides iso-α (De Keukeleire, 2000) ...... 4

Figure 1.3. Isomérisation des chalcones en flavanones ...... 5

Figure 1.4. Plant de houblon ...... 11

Figure 1.5. Différentes parties d'un cône de houblon; 1: cône entier, 2: bractées, 3: bractéoles, 4: glande lupuline, 5: axe central (Rybacek, 1991) ...... 12

Figure 1.6. Structure de base d'un flavonoïde (1) et structures chimiques des différentes sous-classes des flavonoïdes (2-13) (Crozier et al., 2009) ...... 22

Figure 1.7. Structures chimiques de certains flavan-3-ols (Crozier et al., 2009) ...... 24

Figure 1.8. Structure des procyanidines A2 et B2 (Hummer and Schreier, 2008) ...... 25

Figure 1.9. Acides phénoliques de la série benzoïque (Crozier et al., 2009) ...... 28

Figure 1.10. Acides phénoliques de la série cinnamique (Crozier et al., 2009) ...... 30

Figure 1.11. Structure du resvératrol (Moreno and Peinado, 2012) ...... 31

Figure 1.12. Schéma représentant les principales voies de biosynthèse et les enzymes clés impliquées dans la biosynthèse des tanins hydrolysables, de l'acide salicylique, des acides hydroxycinnamique et 5-caffeoylquinique (PAL: phénylalanine ammonia-lyase ; BA2H: acide benzoïque 2-hydroxylase ; C4H: cinnamate 4-hydroxylase ; COMT-1: acide cafféique/5-hydroxyférulique O-méthyltransférase ; 4CL: p-coumarate:CoA ligase ; F5H: férulate 5-hydroxylase ; GT: galloyltransférase ; ACoAC: acétylCoA carboxylase) (Crozier et al., 2006) ...... 32

Figure 1.13. Origine de la biosynthèse des flavonoïdes (Crozier et al., 2006) ...... 33

Figure 1.14. Schéma simplifié de la biosynthèse de différentes classes de flavonoïdes (Morreel et al., 2006) ...... 34

Figure 2.1. Correlation between total polyphenols content (TPC) and yield of dried cones (a) and leaves (b) ...... 53

Figure 3.1. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (a), xanthohumol (b), α-acids (c), β-acids (d), total polyphenols (e) and proanthocyanidins (f) in the dried

xiii cones of Brewers Gold and Nugget after 12 months of storage. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 71

Figure 3.2. Comparison of the concentrations of xanthohumol, β-acids and proanthocyanidins in the dried (a, b and c) and in the frozen (d, e and f) leaves of Brewers Gold and Nugget after 12 months of storage. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 72

Figure 4.1. Concentrations of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in whole cones (a) and in ground cones (b) using one step (0.5 g + 15 mL) or two-step extraction (0.5 g + 2x7.5 mL). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 89

Figure 4.2. Effect of ethanol concentration on the concentration (%DW) of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) for solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 91

Figure 4.3. Effect of ethanol concentration on the concentration (%DW) of α- and β-acids for solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 92

Figure 4.4. Effect of ethanol concentration on the concentration (%DW) of total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) for solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 93

Figure 4.5. Effect of extraction time on the concentration of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) for extraction temperatures of 30 °C, 40 °C, 50 °C and 60 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 96

Figure 4.6. Effect of extraction time on the concentration of α- and β-acids for extraction temperatures of 30 °C, 40 °C, 50 °C and 60 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 97

Figure 4.7. Effect of extraction time on the concentration of total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) for extraction temperatures of 30 °C (a), 40 °C (b), 50 °C (c) and 60 °C (d). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 98

Figure 4.8. Effect of extraction time on the concentration of total polyphenols content (TPC) (a) and proanthocyanidins (PAC) (b) in leaves for water extraction temperatures

xiv

of 60 °C, 70 °C, 80 °C and 90 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 100

Figure 4.9. Effect of extraction temperature (a) and extraction time (b) on the concentration of total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in stems for water extraction. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 102

Figure 5.1. Concentrations of desmethyxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) (a), α- and β-acids (b), and total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) (c) in water, ethanol 40 % and ethanol 70 % extracts. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 119

Figure 5.2. Enrichment of leaves and stem extracts in total polyphenols content (TPC) (a) and proanthocyanidins (PAC) (b) by Amberlite XAD-7HP resin. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 120

Figure 5.3. Concentrations of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) (a), α- and β-acids (b), and total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) (c) in the ethanolic cones extract (initial extract) and in the oil and concentrated extract fractions after ethanol evaporation. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 122

Figure 5.4. Enrichment of cones concentrated extract in xanthohumol (XN), α-acids, β- acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) by Amberlite XAD-7HP resin. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 123

Figure 5.5. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) (a), α- and β-acids (b), and total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) (c) in cones oil extract with oil reuse...... 126

Figure 5.6. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in concentrated whole plant extracts (a, c and e) and in whole plant oil extract (b,d and f) with oil reuse. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars)...... 128

Liste des abréviations

8-PN : 8-prénylnaringénine

α-1 : Cohumulone

α-2 : Humulone + adhumulone

β-1 : Colupulone

β-2 : Lupulone + adlupulone

CO2 : Dioxyde de carbone

CoA : Coenzyme A

DMX: Desméthylxanthohumol

HPLC : High-performance liquid chromatography

INAF : Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels

LC-TOF-MS : Liquid chromatography - time-of-flight - mass spectrometry

MeOH : Méthanol

PAC : Proanthocyanidines

PAL : Phénylalanine ammonia-lyase

TPC : Total polyphenols content (contenu en composés phénoliques totaux)

UHPLC-PDA : Ultra-high-performance liquid chromatography with photo-diode array detection

UPLC-MS/MS : Ultra-performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry

UV : Ultra violet

VIH : Virus de l'immunodéficience humaine

XN: Xanthohumol

xvii

Remerciements

Je tiens à remercier mon directeur de recherche, Dr. Yves Desjardins, de m'avoir accueillie dans son laboratoire. Je vous remercie pour vos judicieux conseils et votre vision critique de mes travaux. Je vous remercie également d’avoir dirigé, orienté et suivi la progression de mon projet de recherche. Mon travail avec vous m'a permis d'acquérir une expérience enrichissante et précieuse dans le domaine de la recherche.

Je tiens aussi à remercier mon codirecteur, Dr. André Gosselin, pour son soutien et sa disponibilité. Je vous remercie pour votre encouragement continuel et pour votre présence, surtout dans les moments difficiles. Je vous remercie d'avoir pris le temps de m'écouter et de me comprendre. Discuter avec vous dans votre bureau, pour quelques minutes, était suffisant pour que je reparte avec beaucoup d'optimisme et de courage. C’est votre aide et votre encouragement qui m'ont permis de persévérer et de finir mon doctorat. J’ai appris énormément de vous, tant au niveau professionnel qu'au niveau personnel. Vous m'avez montré comment organiser les priorités et comment confronter les problèmes avec un esprit positif pour que tout aille bien.

Je tiens aussi à remercier Dr. Paul Angers de codiriger une partie de mes travaux et d'avoir partagé avec moi ses connaissances en chimie. Je voudrais, de même, remercier Monsieur Jean Gosselin et Monsieur Guillaume Gosselin, propriétaires de Houblonnière Gosselin, d'avoir accepté que je réalise une partie de mon projet dans leur houblonnière et d'apporter une attention particulière à mes parcelles expérimentales.

J'ai eu l'occasion de travailler au sein d'une équipe de recherche riche et dynamique. Je voudrais remercier Pascal Dubé, professionnel de recherche dans le laboratoire de Dr. Yves Desjardins, pour son aide précieuse, sa gentillesse et sa disponibilité à partager ses compétences et son expérience en chimie. Mes remerciements vont aussi à Sébastien Léonhart, directeur scientifique de Nutra Canada, pour ses conseils et ses directives et d'avoir guidé l'aspect industriel du projet. Je voudrais, de même, remercier Dr. Ashraf Badr et Dr. Stéphanie Dudonné, professionnels de recherche, pour leur support scientifique et d'avoir pris le temps de répondre à mes questions. Je suis particulièrement reconnaissante de l’aide que m’ont apporté Thomas Lécurieux et Margot Delfour dans mes travaux lorsque

xix je les ai encadrés dans leurs stages. Je tiens aussi à nommer les autres membres de mon équipe, avec qui j’ai partagé de bons moments : Véronique, Maëlle, Minty, Kevin, Ana Sofia, Jérémie et Neda.

Ces travaux ont été réalisés grâce à une aide financière du programme de soutien à l’innovation en agroalimentaire du Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation (MAPAQ) et d'Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC), et grâce à deux partenaires industriels : Nutra Canada et Houblonnière Gosselin. Je suis reconnaissante aussi au FQRNT-CRSNG pour leur soutien financier et de m'avoir attribuée la bourse BMP Innovation.

Je voudrais aussi remercier mes parents, Lucia et Toufic, pour être toujours à mes côtés. Je vous remercie pour votre support, votre confiance et votre amour. C'est grâce à vous que je suis devenue la personne que je suis aujourd'hui. Je vous dédie ce mémoire et je vous promets d'apporter toujours le succès et la fierté. Je remercie aussi mes soeurs Marianne, Luciana et Zeina qui me donnent plein d'énergie, de joie et d'amour.

Durant ces quatre années d'études, j'ai rencontré un homme formidable qui a changé ma vie et m'a donné l'amour, la sécurité et la confiance. Merci Alexey de m'avoir choisi pour bâtir ensemble notre château, notre famille, qui est plus forte que tout. Notre amour a fructifié rapidement en un beau garçon qui soufflera sa première bougie bientôt. Serge, tu m'as appris la vraie signification du bonheur et qu'un sourire peut faire toute la différence. Je remercie Dieu chaque jour de m'avoir donné un mari si compréhensif et chaleureux et un enfant si heureux et intelligent.

Je remercie aussi tous mes amis pour leur support, leur gentillesse et leur aide. Je tiens surtout à remercier Catherine, Stéphanie et Ysela pour être non seulement des amies mais des soeurs pour moi. Je nomme aussi Julien, Shyam, Cheslav, Alina, Sergey et Robert. J'apprécie notre sincère amitié malgré que nous venions de sept pays différents.

Bonne lecture!

Avant-propos

Cette thèse comprend une introduction et une conclusion générale (chapitres 1 et 6), ainsi que quatre chapitres principaux (2 à 5) rédigés et présentés sous forme d’articles scientifiques et une annexe. Ma contribution à chacun des articles se résume comme suit :

Chapitre 2 : Agronomic and nutraceutical potential of hops (Humulus lupulus L.) grown in Québec, Canada. (2013) Acta Hort. (ISHS) 1010:155-161. J'ai récolté les plants qui ont été plantés, avant le début de mon projet, à la Houblonnière Gosselin. J'ai mesuré les poids frais et sec de chaque partie des plants après les avoir séparés manuellement à la salle d'empotage au Pavillon Des Services et j'ai effectué la partie analytique dans le laboratoire de Dr. Desjardins à l'INAF. J'ai analysé les données, effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon codirecteur de recherche. Cet article a été publié en 2013.

Chapitre 3 : Yield and chemical composition of cones, leaves and stem of nine hop (Humulus lupulus L.) cultivars. Cet article a été corrigé par Dr. André Gosselin et Dr. Yves Desjardins et est en cours de soumission à la revue Scientia Horticulturae. J'ai établi mes parcelles expérimentales, planté les rhizomes avec l'aide de Thomas Lécurieux, récolté et analysé les plants. J’ai analysé les données, effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon co-directeur de recherche.

Chapitre 4 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 1: Optimization of prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols extraction. Cet article a été corrigé par Dr. André Gosselin et Dr. Yves Desjardins et est en cours de soumission à la revue Journal of Agricultural and Food Chemistry. J'ai réalisé les expériences, analysé les données, effectué les analyses statistiques à partir des données brutes obtenues et j’ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon co-directeur de recherche et la contribution de Dr. Paul Angers.

xxi Chapitre 5 : Production of ethanolic extracts from hop (Humulus lupulus L.) cones, leaves and stems - Part 2: Concentration of hop extracts by adsorption and oil. Cet article a été corrigé par Dr. André Gosselin et Dr. Yves Desjardins et est en cours de soumission à la revue Journal of Agricultural and Food Chemistry. J'ai planifié et supervisé les expériences. Une grande partie des expériences a été faite par Margot Delfour dans le cadre de son stage de Maîtrise. J'ai effectué les analyses statistiques et j'ai rédigé entièrement l'article sous la supervision de mon directeur et de mon co-directeur de recherche et la contribution de Dr. Paul Angers.

xxii

Chapitre 1 : Introduction

1.1 Le houblon Le houblon (Genre Humulus L.) est une plante pérenne faisant partie de la famille des Cannabinacées dans l’ordre des Urticales. Le houblon sauvage a été classifié, en fonction de la morphologie des feuilles et de la distribution géographique, en 5 groupes taxonomiques: l’espèce lupulus pour le houblon Européen, l’espèce cordifolius pour le houblon Japonais et les espèces neomexicanus, pubescens et lupuloides pour le houblon Nord Américain (Patzak et al., 2010). Seul Humulus lupulus var. lupulus L. a un usage brassicole (Neve, 1991).

C'est une plante dioïque cultivée dans la plupart des zones tempérées du monde, essentiellement pour ses inflorescences femelles appelées cônes (Callemien et al., 2005; Li and Deinzer, 2006). Les éléments essentiels des cônes matures sont les trichômes glandulaires, appelées glandes lupulines, qui contiennent le lupulin, une poudre jaunâtre et résineuse (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006). Cette substance contient des acides amers, des huiles essentielles et des flavonoïdes utilisés principalement dans l'industrie brassicole, mais aussi dans les recherches biomédicales (Kavalier et al., 2011).

La culture du houblon est connue en Europe depuis des milliers d'années. On pense que le houblon a été cultivé pour la première fois en Allemagne au 8ème siècle après J.C. (Gerhauser, 2005b). La culture du houblon en Amérique du Nord a débuté au 17ème siècle et la première brasserie commerciale au Canada a été fondée à Québec vers 1668 (Small and Catling, 2000). À la fin de la Deuxième Guerre mondiale, la culture du houblon a presque disparu à cause des maladies fongiques, principalement (Small and Catling, 2000). Présentement, la culture du houblon se répand dans plusieurs pays du monde. En 2013, les États unis étaient le leadeur en terme de production de houblon avec 27 782 tonnes suivie de l'Allemagne, de l'Éthiopie, et de la Chine avec 27 533, 21 600 et 11 300 tonnes, respectivement (FAOSTAT, 2015).

Les cônes du houblon constituent une matière première essentielle dans l'industrie brassicole (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006). L'utilisation du houblon comme

1 additif lors de la fabrication de la bière remonte aux moines allemands au 12ème siècle (Gerhauser, 2005b). De nos jours, il est ajouté au cours du processus de brassage, non seulement pour procurer l'amertume et l'arôme à la bière, mais aussi pour son rôle important comme agent de conservation. De plus, environ 20 à 30 % des composés phénoliques de la bière proviennent du houblon (Gerhauser, 2005a).

Les propriétés antiseptiques du houblon ont été décrites pour la première fois par Brown and Clubb (1913). Des recherches récentes ont démontré que certains composés du houblon ont des propriétés bénéfiques pour la santé. Les acides α et β (humulones et lupulones), constituants essentiels de la résine, auraient des propriétés antibiotiques contre les bactéries à Gram-positif (Gerhauser, 2005b). Le xanthohumol et son isomère l’isoxanthohumol sont des flavonoïdes prénylés synthétisés par les glandes lupulines et présentent des activités anti-inflammatoires et anti-tumorales (Nagel et al., 2008). Ces molécules préviendraient notamment la formation de la tumeur en inhibant la croissance des cellules précancéreuses (Gerhauser et al., 2002), en inhibant l'activation métabolique des procarcinogènes, en induisant les enzymes de détoxification de substances cancérigènes et en inhibant l'angiogenèse et les signaux inflammatoires (Stevens and Page, 2004).

1.1.1 Composés du houblon Le houblon est une plante cultivée essentiellement pour ses métabolites secondaires utilisés en brasserie, les acylphloroglucinols prénylés (acides α et β), qui sont responsables de l'amertume de la bière (Nagel et al., 2008). De plus, le houblon constitue une source importante des composés phénoliques (Ceh et al., 2007). Les cônes de houblon séchés contiennent de 4 à 14 % de composés phénoliques, principalement des acides phénoliques, des chalcones prénylés, des flavonoïdes, des catéchines et des proanthocyanidines (Kavalier et al., 2011). Ces auteurs ont identifié et quantifié 7 terpénophénols et 21 composés phénoliques présents dans les cônes de houblon.

Collin and Crouzet (2011) ont divisé les composés phénoliques du houblon en 3 grandes catégories: les flavonoïdes, les acides hydroxybenzoïques et hydroxycinnamiques et les stilbènes. Les flavonoïdes se divisent eux mêmes en 5 groupes: les flavonols (mono, di et triglycosides de quercétine et de kaempférol et des traces de myricétine), les flavan-3-ols,

les proanthocyanidines, les prénylchalcones (xanthohumol et desméthylxanthohumol) et les flavanones dérivés (isoxanthohumol et hopéine (8-prényl-naringénine)).

1.1.1.1 Acides α et β

Les acides du houblon, appelés aussi résines molles, se composent de deux séries connexes, les acides α (humulone, cohumulone et adhumulone) et les acides β (lupulone, colupulone et adlupulone) (Zanoli et al., 2007) (Figure 1.1). Les formes humulone et lupulone sont dominantes dans la plupart des cultivars (Priest and Stewart, 2006). Les acides α et β possèdent tous la structure alicyclique de base (2,4-cyclohexadiene-1-one) mais les analogues diffèrent par la nature de la chaîne latérale acylée (Larson et al., 1996). Il existe également certains acides mineurs dans la plante comme les posthumulones, les postlupulones, les préhumulones et les prélupulones. Ceux-ci sont présents sous forme d'un mélange complexe de composition et de concentration variables. Les proportions relatives des acides α et des acides β ainsi que le contenu de co-homologues dépendent du cultivar de houblon et, pour un cultivar donné, des conditions de croissance (Garcia-Villalba et al., 2006). Des cultivars particuliers de houblon peuvent contenir jusqu'à 19 % de la matière sèche d'acides α d'où leurs noms ''houblon super α'' (De Keukeleire et al., 2003).

Figure 1.1. Structure des acides α et β (De Keukeleire et al., 2003)

Les acides α et β sont connus comme agents d'amertume et d'arômes de la bière. Au cours du processus du brassage, les acides α sont transformés en acides iso-α (Figure 1.2) identifiés comme les principales substances amérisantes (Khatib et al., 2010; Larson et al.,

3 1996). Les acides β sont beaucoup moins solubles et pratiquement indétectables dans la bière (Priest and Stewart, 2006). De plus, les acides α et β sont très sensibles à l'oxydation et à la dégradation durant l'entreposage. Leurs produits d'oxydation affectent significativement la saveur de la bière parce qu'une fois les acides α ont été oxydés, ils ne peuvent plus être isomérisés en acides iso-α; Ainsi, le potentiel amérisant du houblon diminue et les arômes deviennent désagréables (Garcia-Villalba et al., 2006).

Figure 1.2. Isomérisation des acides α en acides iso-α (De Keukeleire, 2000)

1.1.1.2 Xanthohumol et prénylflavonoïdes connexes

Les flavonoïdes prénylés sont sécrétés par les glandes lupulines des inflorescences femelles de houblon, conjointement avec les acides amers et les huiles essentielles. Les glandes lupulines produisent exclusivement les flavonoïdes du type chalcone, tel que le xanthohumol, puisqu'elles ne possèdent pas l'enzyme nécessaire pour la conversion des chalcones en leurs flavanones correspondantes (Gerhauser, 2005a). Le xanthohumol (3'-[3, 3-diméthyl allyl] -2', 4', 4-trihydroxy-6'-méthoxychalcone) a été isolé pour la première fois et nommé par Power et al. (1913). Le xanthohumol est le flavonoïde prénylé le plus abondant dans les cônes (0,1 à 1 % du poids sec) (Miranda et al., 1999; Stevens and Page, 2004) où il est accompagné d'au moins 13 chalcones connexes qui se produisent à des concentrations inférieures de 10 à 100 fois par rapport au xanthohumol (Ceh et al., 2007; Magalhaes et al., 2007; Stevens and Page, 2004). La plupart des chalcones contiennent un groupe 2'-hydroxy libre et peuvent donc s'isomériser en leurs flavanones correspondantes (Stevens and Page, 2004).

4 !

Au cours du processus de brassage, le xanthohumol est converti sous l'effet de la haute température en son isomère prénylflavanone, l'isoxanthohumol, lors de l'ébullition du moût (Figure 1.3). C'est la raison pour laquelle l'isoxanthohumol est le prénylflavonoïde le plus abondant dans la bière (Gerhauser, 2005a; Magalhaes et al., 2007; Miranda et al., 1999). On trouve aussi dans les cônes le desméthylxanthohumol considéré comme le précurseur de la plupart des flavonoïdes. Le desméthylxanthohumol donne par isomérisation la 8- prénylnaringénine, un phytooestrogène puissant (Zanoli and Zavatti, 2008). L'exposition humaine au xanthohumol et aux prénylflavonoïdes connexes, tels que la 8- prenylnaringénine et l'isoxanthohumol, se fait principalement par la consommation de la bière (Stevens and Page, 2004).

Figure 1.3. Isomérisation des chalcones en flavanones

1.1.1.3 Proanthocyanidines

Le houblon est considéré comme une source riche de proanthocyanidines. Selon le cultivar et l'origine géographique, les cônes de houblon contiennent 0,5 à 5 % en matière sèche de proanthocyanidines (Li and Deinzer, 2007). Les proanthocyanidines du houblon sont essentiellement la catéchine, l'épicatéchine, l'épicatéchine-(4β-8)-catéchine (procyanidin B1), l'épicatéchine-(4β-8)-épicatéchine (procyanidin B2), la catéchin-(4β-8)-catéchine

5 (procyanidin B3) et la catéchin-(4β-8)-épicatéchine (procyanidin B4) (Li and Deinzer, 2006).

1.1.2 Effets bénéfiques du houblon sur la santé

1.1.2.1 Phytothérapie

Le houblon est considéré comme une plante médicinale depuis des siècles (Callemien et al., 2005; Nagasako-Akazome et al., 2007). Au cours du 8ème et du 9ème siècle, le houblon a été utilisé dans les cloîtres et les monastères pour ces propriétés pharmacologiques (Larson et al., 1996). Dans la phytothérapie moderne, les cônes entiers sont utilisés comme sédatifs pour traiter l'anxiété, les troubles de sommeil et les douleurs de la menstruation (Hall et al., 2008). Ils sont aussi utilisés comme analgésiques (Hall et al., 2008), ainsi que pour leurs effets sur le système endocrinien, et leurs propriétés antitumorales (Zanoli et al., 2007). D'après Hall et al. (2008), les acides rho iso-α produits par la réduction du carbone C6 carbonyl de l'acide iso-α par du borohydrure de sodium sont efficaces pour soulager la douleur associée aux réactions inflammatoires. Le houblon a aussi un effet sur le système nerveux central. Il a été démontré qu'un produit dérivant de la dégradation des constituants du houblon durant l'entreposage, le 2-méthyl-3-buten-2-ol, réduit la motilité des rats lorsqu'il est injecté par voie intrapéritonéale (Wohlfart et al., 1983). Zanoli et al. (2007) ont constaté un effet pentobarbital favorisant l'endormissement après l'administration orale d'un extrait de houblon enrichi en acides β. Cet effet s'explique par une réduction de l'activité gabanergique. Les molécules responsables de l'effet sédatif du houblon sont les acides β, le 2-méthyl-3-buten-2-ol résultant de la dégradation des acides α et les huiles essentielles qui réduisent l'activité locomotrice et augmente la durée du sommeil induit par la kétamine (Schiller et al., 2006). Une étude clinique menée par (Koetter et al., 2007) a prouvé que le houblon agit en synergie avec la valériane pour diminuer le temps d'endormissement. Un mélange de 500 mg d'extrait de valériane avec 120 mg d'extrait de houblon était plus efficace que l'utilisation de l'extrait de valériane seul. Les composés du houblon possèdent un effet similaire à la mélatonine et peuvent régulariser le rythme circadien (Koetter et al., 2007).

1.1.2.2 Fabrication de la bière

La valeur économique du houblon provient essentiellement de son application dans le monde entier comme un ingrédient essentiel dans l'industrie brassicole (De Keukeleire et al., 2003). Le houblon a été utilisé pour la fabrication de la bière depuis plus de 500 ans (Nagasako-Akazome et al., 2007). Traditionnellement, la bière était ''houblonnée'' en ajoutant des cônes de houblon séchés lors de l'ébullition du moût. Seules les inflorescences femelles sont utilisées et les cônes non fertilisés sont préférés parce que les acides gras des graines peuvent donner des saveurs indésirables à la bière (Kavalier et al., 2011). La qualité de la bière dépend partiellement du houblon utilisé lors du processus de brassage. C'est pour cela que les brasseurs ont une tendance à utiliser du houblon d'un cultivar et d'origine déterminés afin de maintenir la qualité de leur bière (Kovacevic and Kac, 2002).

Le houblon est responsable des principales caractéristiques de la qualité de la bière, soit le goût, l'arôme, la formation de la mousse, la couleur et la durée de vie (Jaskula et al., 2010). L'amertume provient des acides α et β, ainsi que de certains prénylflavonoïdes, tels que le xanthohumol (Haseleu et al., 2009). Pendant le processus de brassage, les acides α contenus dans les poils glandulaires des cônes mûrs, pratiquement insolubles, sont convertis en composés plus solubles qui sont les acides iso-α (Garcia-Villalba et al., 2006). Plusieurs études ont porté sur la transformation des acides α en acides cis-iso-α et trans-iso-α correspondants au cours du processus d'ébullition du moût (Haseleu et al., 2009; Jaskula et al., 2010). Ces études montrent que ces isomères contribuent plus à l'amertume de la bière que les acides α (Haseleu et al., 2009; Jaskula et al., 2010). Outre l'amertume, ces composés améliorent la qualité et augmentent la durée de vie de la bière, grâce à leurs activités bactériostatique et antimicrobienne (Haseleu et al., 2009; Larson et al., 1996; Royle et al., 2001). De plus, les acides amers peuvent interagir avec les protéines de différentes façons et sont responsables de la formation de la mousse (Fung et al., 1997).

Dans le procédé de brassage moderne, il est plus courant d'utiliser des extraits de houblon et de les ajouter après la fermentation pour mieux contrôler le goût (Royle et al., 2001). De plus, les grands brasseurs sont devenus intéressés non seulement aux terpènes et aux huiles essentielles comme des composantes de la saveur de la bière, mais aussi par la contribution des composés phénoliques du houblon à la stabilité de la mousse et aux effets bénéfiques

7 sur la santé des ingrédients (Kavalier et al., 2011). Le rapport xanthohumol : acides α détermine la valeur brassicole d'un cultivar ou d'un produit de houblon (Ceh et al., 2007).

1.1.2.3 Antibactérien et antiviral

L’activité antibactérienne est la propriété anti-infectieuse la mieux étudiée des constituants du houblon. Les acides amers du houblon inhibent principalement les bactéries à Gram- positif, y compris certaines espèces de Bacillus, de Micrococcus, de Staphylococcus, de Mycobacterium et de Streptomycètes. Les acides β sont environ deux fois plus actifs que les acides α (Gerhauser, 2005b). Les acides iso-α inhibent aussi la croissance des ces bactéries Gram-positif (Garcia-Villalba et al., 2006). Larson et al. (1996) ont démontré que des extraits de houblon, contenant certaines concentrations d'acides α et β, peuvent inhiber la croissance de Listeria monocytogenes dans les milieux de culture ainsi que dans certains aliments. En général, l'activité antibactérienne des extraits de houblon dans les aliments augmente avec l'acidité et le faible contenu en matière grasse (Larson et al., 1996).

Le xanthohumol s'est révélé efficace contre le virus de l'immunodéficience humaine (VIH- 1). Il peut alors représenter un nouvel agent chimiothérapeutique pour les infections par le VIH-1 (Magalhaes et al., 2007). Cette molécule n'inhibe pas l'activité de la transcriptase inverse recombinante du VIH-1, ni l'entrée de ce virus dans les cellules. Il cible plutôt les mécanismes de transcription post-inverse (Gerhauser, 2005b). De plus, le xanthohumol peut inhiber la réplication de Plasmodium falciparum, l'agent responsable du paludisme (malaria).

1.1.2.4 Prévention du cancer

L'exposition, à long terme, à des agents non toxiques, préférablement dans le cadre de certains produits alimentaires peut aider à prévenir le cancer (Stevens and Page, 2004). Le xanthohumol a été caractérisé comme un agent chimiopréventif du cancer à large spectre (Ceh et al., 2007; De Keukeleire et al., 2003; Gerhauser, 2005b; Miranda et al., 1999). Il a montré une activité antiproliférative contre les lignées de cellules cancéreuses provenant des cancers de sein, du colon et de l'ovaire in vitro (Magalhaes et al., 2007; Miranda et al., 1999).

Le xanthohumol agit à divers niveau de la carcinogenèse (Gerhauser, 2005a). Il inhibe l'activation métabolique des procarcinogènes, induit les enzymes de détoxification de substance cancérigène et arrête la croissance de la tumeur en inhibant l'angiogenèse et les signaux inflammatoires (Stevens and Page, 2004). Le xanthohumol exerce aussi des effets cytoprotectifs, en induisant des protéines qui métabolisent les radicaux libres et qui possèdent des propriétés antioxydantes. De plus, le xanthohumol inhibe la prolifération des cellules du fibrosarcome et induit l'apoptose dans les cellules du cancer de la prostate (Nagel et al., 2008). Ces activités biologiques suggèrent que les prénylflavonoïdes du houblon ont un potentiel d'application dans des programmes de prévention du cancer (Stevens and Page, 2004).

1.1.2.5 Phytoestrogène

La 8-prenylnaringénine, produit de l'isomérisation du desméthylxanthohumol, est identifiée comme étant le phytoestrogène le plus puissant connu à ce jour (De Keukeleire et al., 2003; Stevens and Page, 2004). Grâce à ses propriétés oestrogéniques, la 8-prenylnaringénine agit comme un modulateur sélectif des récepteurs œstrogènes. Il a été démontré que cette molécule prévient l'ostéoporose chez les rats et inhibe l'angiogenèse et la métastase (Possemiers et al., 2005). Récemment, la 8-prenylnaringénine a été l'objet des recherches en génétique moléculaire et dans le domaine biomédical, en raison de ses propriétés contraceptives et pro-oestrogéniques (Kavalier et al., 2011). Notons que cette molécule peut, dans certains cas, avoir des effets indésirables puisqu'elle peut favoriser la prolifération cellulaire des cancers hormono-dépendants. Une étude clinique menée par (Heyerick et al., 2006) a montré qu'un extrait enrichi en 8-prenylnaringénine (100 et 250 microgrammes) est efficace pour diminuer les inconforts liés à la ménopause, notamment les bouffées de chaleur mais que l'effet n'est pas dose-dépendant.

1.1.2.6 Antioxydant

Les composés phénoliques sont les antioxydants naturels les plus efficaces. Lermusieau et al. (2001) ont montré que les acides α ne contribuent pas de façon significative au pouvoir réducteur du houblon. Les extraits de houblon avec un niveau élevé de substances amères et un niveau très faible en composés phénoliques ont un pouvoir réducteur faible. L'activité

9 antioxydante du houblon dépend des concentrations en composés phénoliques totaux et en flavonoïdes et non pas de la concentration en acides α et β (Lermusieau et al., 2001). Wang et al. (2014) ont montré que les composés phénoliques du houblon possèdent une activité antioxydante plus élevée que celle des composés phénoliques du thé vert, in vitro et in vivo. Ces auteurs ont montré que la capacité de l'extrait de houblon à piéger les radicaux libres (dOH et O2d−) in vitro et à inhiber la peroxydation lipidique induite par le bromobenzène dans le foie de souris est plus élevée que celle d'un extrait de thé ayant la même concentration en composés phénoliques.

1.1.3 Culture du houblon Il existe plusieurs cultivars de houblon, chacun possédant sa propre teneur en molécules actives et ses propres caractéristiques agronomiques. Traditionnellement, les cultivars de houblon ont été divisés en deux groupes (aromatiques ou amers), selon leur contenu en acides α et leur flaveur caractéristique (Garcia-Villalba et al., 2006). Les cultivars de houblon peuvent être différenciés alors selon les métabolites secondaires (résines, huiles essentielles, composés phénoliques) localisés essentiellement dans les glandes lupulines. Ces dernières peuvent contenir 3 à 6 % de composés phénoliques totaux selon le cultivar, l'origine géographique et les techniques de récole, de séchage et d'emballage utilisées (Callemien et al., 2005).

1.1.3.1 Biomasse végétale

Les terpénophénols et les huiles essentielles s'accumulent essentiellement dans les trichômes glandulaires qui se trouvent entre les bractées des cônes (Priest and Stewart, 2006; Rybacek, 1991), mais également sur la face inférieure des jeunes feuilles (Kavalier et al., 2011; Stevens and Page, 2004). Chaque kg de cônes frais génère au moins 1 kg de matériel résiduel (feuilles, tige, branches et cônes désintégrés), ce qui constitue une perte agronomique importante (Grilc and Dabrowski, 1994). Les feuilles contiennent principalement des protéines (23 %), ce qui justifie leur utilisation en alimentation animale (Grilc and Dabrowski, 1994). Elles contiennent aussi des quantités faibles mais décelables de xanthohumol (Nagel et al., 2008). D'après Ceh et al. (2007), les feuilles peuvent contenir 0.009 à 0.08 % de matière sèche de xanthohumol. De plus, les feuilles contiennent plus d’acides β que d’acides α (De Keukeleire et al., 2003). Ces travaux montrent que les

composés responsables du goût de la bière et ayant des effets bénéfiques sur la santé sont répartis sur différentes parties du plant du houblon.

Cône Feuilles

Tige

Figure 1.4. Plant de houblon

Des travaux effectués par De Keukeleire et al. (2003) et Kavalier et al. (2011) ont montré que les acides α et β, le desméthylxanthohumol et le xanthohumol sont présents dès le début de l’inflorescence mais leurs quantités augmentent significativement d’un stade de développement à un autre. Ces composés s'accumulent, pratiquement, au fur et à mesure

11 que les cônes s'allongent, ce qui correspond à l'élongation des bractées et des bractéoles. À noter que les terpénophénols s'accumulent dans les trichômes glandulaires alors que les composés phénoliques s'accumulent dans les tissus verts des bractées et des bractéoles (Kavalier et al., 2011). De Keukeleire et al. (2003) ont montré que les teneurs en xanthohumol et en acides α et β augmentent, considérablement, au cours du développement des inflorescences femelles en cônes et que les feuilles des plants bien développés (à la fin de la saison) contiennent des niveaux faibles mais détectables d'acides et même des chalcones.

Figure 1.5. Différentes parties d'un cône de houblon; 1: cône entier, 2: bractées, 3: bractéoles, 4: glande lupuline, 5: axe central (Rybacek, 1991)

1.1.3.2 Systèmes de culture ! Le houblon cultivé biologiquement représente un faible pourcentage de la production mondiale de houblon. La culture biologique du houblon se fait principalement en Nouvelle- Zélande. D'autres pays, comme la Chine, commencent à adopter ce mode de production (Turner et al., 2011). Aux États-Unis, 114,8 tonnes de houblon biologiques ont été produites en 2013 (AOHGA, 2013). La culture biologique est devenue une nécessité de nos jours en raison d'une tendance mondiale à réduire l'utilisation des pesticides horticoles et à utiliser des fertilisants biologiques (De Keukeleire et al., 2007). Les principaux défis de la culture biologique du houblon sont le contrôle des mauvaises herbes, des insectes et des

maladies et la gestion de la fertilisation et de l'irrigation (Turner et al., 2011). Les consommateurs de la bière sont de plus en plus intéressés par la bière 'biologique' et il y a une demande accrue de houblon biologique dans l'industrie brassicole. En revanche, peu de travaux de recherche scientifique se sont intéressés à la culture biologique du houblon. La culture biologique est une nécessité dans une perspective d'extraction des molécules bioactives afin d'éviter la concentration des contaminants comme les pesticides dans les extraits.

C'est une plante grimpante qui se développe à partir des rhizomes. En culture conventionnelle, les tiges de houblon sont supportées par des cordes fixées à des câbles qui sont soutenus solidement par des poteaux de bois de 6 mètres de hauteur (Priest and Stewart, 2006). En Europe, un système de croissance simplifié, connu sous le nom de culture de houblon bas-treillis ou nain, a été mis en place. Ce système implique la croissance du houblon à seulement 2,5-3 m de hauteur, plutôt qu'à 5-6 m de hauteur comme dans la culture conventionnelle. La basse hauteur facilite le dépistage et rend possible la surveillance de toute la hauteur des plants, alors que seuls quelques échantillons peuvent être évalués périodiquement à une hauteur de 5-6 m dans une culture conventionnelle (Darby, 2004). En outre, en production de houblon nain, l'utilisation des pesticides est réduite de plus de 50 % par rapport à une culture conventionnelle; la plus basse hauteur et la plus grande densité de feuillage dans une culture de houblon nain produisent un microclimat plus frais et plus humide qui est plus propice à l'activité des insectes bénéfiques. Cette culture offre alors la possibilité de réduire l'utilisation de pesticides en favorisant le développement des espèces prédatrices, naturelles ou introduites, ce qui renforce le potentiel de lutte biologique (Darby, 2004).

Bien que ce système de culture soit moins productif (63 % de la production conventionnelle) que le système traditionnel (Darby, 1999), il se rentabilise par la diminution des coûts de l'installation et des coûts de main-d’œuvre qui peuvent atteindre 45 %. Le principal avantage de ce système de culture est la facilité de la récolte. Cette dernière sera effectuée par une moissonneuse qui récolte les cônes et les feuilles des branches latérales. Par contre, en croissance de houblon classique, les branches sont coupées, chargées sur une remorque et retirées du champ pour les transporter vers une

13 machine statique de cueillette. Un autre avantage est la diminution du volume des feuilles récoltées (Darby, 2004).

1.1.3.3 Conditions de culture

Le houblon est cultivé dans un sol profond, fertile, et ayant des bonnes propriétés physiques. Le système racinaire des plants est bien développé et peut atteindre 7 à 8 m de longueur. La plante consomme une quantité importante d'eau et d'éléments nutritifs pendant la période de croissance ainsi qu'à la période de floraison-fructification (Lipecki and Berbec, 1997). Le houblon a tendance à produire plus de cônes dans les sols contenants des concentrations moyennes en phosphore et en nitrate de potassium. Autrement dit, une fertilisation enrichie en azote n’accroit pas la production. De plus, le houblon réagit bien à de petites quantités de bore (Kuepper, 2005).

Des maladies fongiques comme le mildiou et la verticilliose causent des dommages importants à de nombreuses houblonnières. Le mildiou, en particulier, peut se répandre très rapidement dans le sol (Kuepper, 2005). Les champignons du genre Verticillium et Fusarium causent une diminution du rendement et engendrent des coûts additionnels pour désinfecter le sol et replanter des nouveaux plants. Il n'y a pas de produits chimiques pour contrôler ces maladies. Il faut alors prendre des mesures préventives telles que l'utilisation d'une fertilisation minérale bien balancée et l'application fréquente de fertilisants organiques (Lipecki and Berbec, 1997).

Les pucerons sont les insectes nuisibles les plus couramment trouvés dans un champ de houblon. Leur présence est habituellement limitée par des prédateurs naturels (Kuepper, 2005). Les cultivars de houblon actuels sont souvent susceptibles à l'attaque par le puceron Phorodon humuli qui peut inhiber la croissance et réduire le nombre de fleurs. La présence de pucerons dans les cônes de houblon peut, dans certains cas, causer une diminution importante du rendement (Lorenzana et al., 2010). D'après ces auteurs, la contamination par les pucerons n'affecte ni le contenu en acides α, ni le poids sec des cônes mais réduit la valeur économique de la culture.

Les acariens constituent une autre source de problèmes, particulièrement lorsque le climat est chaud et sec. Il existe certains ennemis naturels des acariens, mais le moyen de contrôle

naturel le plus efficace est un arrosage abondant avec de l’eau froide. Une irrigation suffisante lors des périodes de sècheresse permettra, d'une part, de réduire les dommages causés par les acariens, et d'autre part, de diminuer les problèmes physiologiques causés par la sècheresse (Kuepper, 2005).

1.1.4 Procédés de transformation

1.1.4.1 Séchage

Au moment de la récolte, les cônes de houblon contiennent environ 75 à 80 % d’eau (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Pageau, 1951; Thompson et al., 1985). Ils doivent être séchés immédiatement après la récolte pour empêcher le phénomène d'oxydation qui endommage leur apparence et leur qualité (Pageau, 1951). En fait, le séchage inhibe la respiration des cônes et réduit leur humidité à un niveau auquel les microorganismes sont inactifs (Rybacek, 1991). L'humidité des cônes secs doit diminuer à 8-12 % d’eau pour qu’ils soient conservés dans des conditions convenables (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985).

La qualité du houblon séché peut être déterminée par sa couleur, sa texture, ses arômes et son contenu en acides α (Doe and Menary, 1979). Lors du séchage, les facteurs qui influencent la qualité du houblon sont les conditions physiques tels que l’épaisseur de la couche à sécher, la température de l’air, sa vitesse et son humidité (Doe and Menary, 1979). La majorité des températures de séchage citées dans la littérature se situent entre 40 à 60 n . Tous les auteurs confirment qu’au-delà de 65 n , la qualité du houblon sera affectée négativement (Rybacek, 1991). D'après Burgess (1931), le contenu en acides α diminue d’environ la moitié en augmentant la température de 40 à 100 n . Notons que la température de séchage peut être séparée en plusieurs composantes : la température de l’air du séchoir, la température de la couche en surface et la température individuelle de chaque cône. Durant les premières étapes du séchage, le taux d’évaporation est élevé ce qui cause un refroidissement de la couche en surface et retarde l’augmentation de sa température (Bruce and Sykes, 1983; Henderson and Miller, 1972).

La température de l’air utilisé pour le séchage du houblon doit être déterminée en fonction de la vitesse et du flux de l’air (Rybacek, 1991). Burgess (1964) a montré que des

15 températures constantes au-dessus de 40 n =ouplées à un flux d’air de 0.19 m3.s-1.m-2 causent une détérioration de la qualité. Par contre, Zeisig (1970) a montré que des températures élevées (68 à 74 n ;==IGJ;AHY?M>OH@FOR>kair élevé (0.3 - 0.4 m3.s-1.m-2) donnent du houblon de bonne qualité. La circulation de l’air joue alors un rôle important dans le séchage du houblon. Ce n’est pas tant la chaleur elle-même qui sèche le houblon, c'est surtout le passage rapide de l’air chaud à travers les couches qui les sèchent (Pageau, 1951). L’air en mouvement doit transférer aux cônes la chaleur nécessaire pour l’évaporation de l’eau, et assurer une évacuation rapide de l’humidité libérée. Un processus d’évacuation lent cause une augmentation de l’humidité relative dans les couches de houblon et par la suite une perte de l’éclat et un changement de la couleur des cônes (Rybacek, 1991). Donc, améliorer l’efficacité du séchage signifie diminuer la durée du séchage (Neve, 1991). Rybacek (1991) a défini la durée du séchage comme étant l’intervalle de temps avant que la température interne des cônes n’atteint celle de l’air du séchoir. D'après Thompson et al. (1985), la durée de séchage peut être diminuée de 32 à 35 % en utilisant une température élevée au début du séchage et en la diminuant ensuite graduellement. De même, Henderson and Miller (1972) ont montré que des débits et des températures d’air graduels sont nécessaires pour améliorer la qualité du houblon séché.

1.1.4.2 Entreposage

Une fois séchés, les cônes de houblon doivent être entreposés d'une façon appropriée. Les cônes secs sont hygroscopiques et absorbent rapidement l’humidité de leur environnement. Il faut alors stocker le houblon dans un endroit où l’humidité relative ne dépasse pas 65 % pour assurer aux cônes une humidité d’environ 10 %. Les cônes sont aussi photosensibles : une longue exposition à la lumière cause des changements dans leur structure biochimique qui se révèle par une couleur rouge-brun. De plus, les cônes sont capables d’absorber les odeurs de leur environnement. Des travaux effectués par Canbas et al. (2001) et Rybacek (1991) ont montré qu'un entreposage de 6 mois à l’obscurité à température ambiante cause une perte d’acides α et β et une augmentation significative des résines dures. De même, après une période d'entreposage de 1 an, seulement 46 % du contenu original en proanthocyanidines pouvait être détecté (Hummer and Schreier, 2008). Hormis les conditions de stockage, chaque cultivar a une tendance particulière à s'oxyder. L'état

d'oxydation du houblon est donc un facteur important qui doit être surveillé constamment pour s'assurer de la qualité du houblon utilisé dans l'industrie brassicole (Garcia-Villalba et al., 2006).

1.1.4.3 Extraction

L'extraction des composés du houblon implique le passage d'un solvant à travers le matériel broyé pour recueillir le contenu des cônes, et enfin l'élimination du solvant pour produire un extrait. La solubilité des composés phénoliques dépend du type et de la polarité du solvant utilisé, du degré de polymérisation de ces composés phénoliques, ainsi que des interactions qui se produisent entre ces derniers et les autres constituants des cônes et qui se traduisent par la formation de complexes insolubles (Magalhaes et al., 2007). Une élimination préalable de ces composés indésirables est probablement nécessaire pour récupérer le plus possible de composés phénoliques (Callemien et al., 2005). Il n'y a donc aucune procédure complètement satisfaisante pour extraire tous les composés phénoliques ou une classe spécifique de ces substances phénoliques (Magalhaes et al., 2007).

Des solvants comme le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle et, dans une moindre mesure, le propanol et le diméthylformamide sont fréquemment utilisés pour l'extraction des composés phénoliques (Collin and Crouzet, 2011). Le méthanol semble être le solvant le plus efficace pour l'extraction du xanthohumol avec un facteur de récupération de 90 à 92 % (Magalhaes et al., 2007). Néanmoins, l'éthanol a été l'un des premiers solvants utilisés pour extraire les composants aromatiques et amers du houblon. Bien qu'il soit très puissant, l'éthanol possède une faible sélectivité et mène à l'extraction non- sélective de pratiquement tous les composants de la lupuline, les chlorophylles et les cires cuticulaires. Par conséquent, l'extrait éthanolique présente une impureté élevée, une couleur sombre et une consistance visqueuse (Magalhaes et al., 2007). Le dioxyde de carbone

(CO2) supercritique est actuellement un des solvants utilisés pour la fabrication d'extraits de houblon. Ses extraits contiennent presque toutes les huiles essentielles du houblon, un ratio élevé d'acides α (humulones) : acides β (lupulones), une petite quantité de résines dures et des traces de triglycérides, de cires, de chlorophylle et de sels inorganiques (Magalhaes et al., 2007). Par contre, l'extraction par le CO2 supercritique est une technique très dispendieuse.

17 Le houblon est vendu sous différentes formes à savoir des cônes entiers, des granulés, des extraits et des extraits isomérisés (Canbas et al., 2001). Les extraits de houblon sont obtenus, essentiellement, en utilisant l'éthanol ou le CO2 supercritique comme solvants (Magalhaes et al., 2007). À l'échelle industrielle, seuls les solvants organiques non toxiques sont utilisés pour l'extraction (Kowalczyk et al., 2013). Afin de maximiser le rendement de l'extraction des composés phénoliques, il faut déterminer les conditions optimales d'extraction du matériel végétal (Amado et al., 2014).

L'éthanol est un solvant écologique qui peut être produit à partir des ressources agricoles renouvelables (da Silva et al., 2010). En revanche, ce solvant a une faible sélectivité et une étape supplémentaire de purification est souvent nécessaire, d'une part, pour augmenter la concentration des composés phénoliques dans les extraits, et d'autre part, pour éliminer les impuretés qui peuvent accélérer la dégradation des composés phénoliques et altérer leurs activités (D’Alessandro et al., 2013). L'adsorption est la technique la plus utilisée pour séparer, d'une façon sélective, les composés phénoliques des autres molécules dans les extraits liquides. Les résines échangeuses d'ions sont formées d'une matrice de polymère (composés inorganiques, polysaccharides, ou résines synthétiques) et d'un groupe fonctionnel. La charge et l'affinité pour les contre-ions du groupe fonctionnel déterminent le mode d'action de la résine échangeuse d'ions (Soto et al., 2011). En plus d'être facile à utiliser, cette technique est peu coûteuse et peut être utilisée dans les secteurs alimentaires et pharmaceutiques (Soto et al., 2011). Plusieurs composés phénoliques, tels que l'hespéridine, la génistéine, l'apigénine, la quercétine et les anthocyanes ont été purifiés par l'adsorption (Chandrasekhar et al., 2012)

1.2 Les composés phénoliques Les plantes synthétisent une large gamme de composés organiques. Ces composés sont divisés en 2 classes : les métabolites primaires et les métabolites secondaires. Les métabolites primaires sont les composés qui possèdent des rôles essentiels dans la photosynthèse, la respiration, la croissance et le développement de la plante tels que les lipides, les nucléotides, les acides aminés, les phytostérols et les acides organiques (Crozier et al., 2006). Les métabolites secondaires sont des molécules produites en grande quantité chez certaines espèces et dont la fonction primaire est de protéger les plantes contre les

stress biotique et abiotique. De plus, ils sont connus pour leur utilisation comme des colorants, des colles, des huiles, des cires, des aromatisants, des parfums et des médicaments naturels (Crozier et al., 2006).

Les composés phénoliques ou les composés phénoliques constituent une partie importante des métabolites secondaires. Le terme ''composé phénolique'' peut être défini, de point de vue chimique, comme une substance qui possède un noyau aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles (Crozier et al., 2006; Moreno and Peinado, 2012). Les composés phénoliques peuvent avoir une structure simple ou une structure très complexe résultant de la polymérisation de ces composés. Certains composés phénoliques hydrosolubles sont largement distribués dans le règne végétal. Pourtant, il existe des composés phénoliques spécifiques à des familles ou à des genres déterminés, ce qui justifie l'utilisation des composés phénoliques comme biomarqueurs dans les études taxonomiques (Boudet, 2007). Ces dernières années, les composés phénoliques sont de plus en plus utilisés pour leurs propriétés antioxydantes et comme colorants (Murkovic, 2003).

Le corps humain possède des mécanismes spécifiques pour l'accumulation et la rétention des molécules essentielles comme les vitamines, par exemple. Quant aux composés phénoliques, ils sont métabolisés afin d'être éliminés rapidement (Crozier et al., 2009). Des études récentes ont montré qu'une consommation des composés phénoliques peut avoir, à long terme, des effets préventifs contre certains cancers et de nombreuses maladies chroniques telles que les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2 (Crozier et al., 2009). Les composés phénoliques agissent en modulant plusieurs processus physiologiques à la fois et sont qualifiés de molécules pléiotropiques (Weseler and Bast, 2012).

1.2.1 Rôle des composés phénoliques dans les plantes Les composés phénoliques sont impliqués dans de nombreux aspects fonctionnels chez les plantes. Ils sont des constituants importants de différents tissus de support ou de protection. De plus, ils jouent un rôle primordial dans les mécanismes de défense et dans les processus de signalisation, surtout dans l'interaction entre les plantes et leur environnement (Boudet, 2007). Les composés phénoliques sont des molécules clés dans la réponse et la résistance des plantes à l'infection par des micro-organismes pathogènes et participent aux

19 mécanismes de régulation des plantes (Moreno and Peinado, 2012). De plus, grâce à leurs couleurs et à leurs arômes, ils attirent les pollinisateurs et les animaux qui dispersent les graines. Ils peuvent protéger les plants contre le rayonnement UV, et agissent comme agents allélopathiques, pour empêcher le développement des autres espèces qui peuvent entrer en concurrence avec la plante pour les nutriments et l'eau. Ces composés stimulent aussi la formation des nodosités fixatrices d'azote chez les légumineuses (Crozier et al., 2006).

La couleur des fruits et des légumes est un des attributs importants pour évaluer leur qualité. Elle peut être utilisée comme un indicateur de leur développement et de leur maturité et peut être un signe de dommages potentiels causés par des facteurs physiologiques, microbiologiques, chimiques ou biochimiques (Moreno and Peinado, 2012). La couleur des fruits est déterminée par la présence de chlorophylles, de caroténoïdes et des composés phénoliques. Les flavonoïdes contribuent aux couleurs jaunes, rouges et bleues des fleurs, des feuilles et des fruits (Swanson, 2003). Les anthocyanes sont responsables de la coloration rose, rouge, orange, violette et bleue alors que les chalcones et les aurones contribuent à la couleur jaune (Moreno and Peinado, 2012).

Les composés phénoliques contribuent également aux saveurs sucrées, amères ou astringentes des fruits. Les proanthocyanidines sont particulièrement responsables de l'astringence et de l'amertume du vin (Swanson, 2003). L'astringence dépend du nombre de groupes hydroxyles qui peuvent réagir avec les protéines dans la salive. Les proanthocyanidines les plus amers sont formés à partir de quatre sous-unités de flavan-3- ols, alors que ceux qui sont astringents sont formés d'une dizaine de sous-unités de flavan- 3-ols (Moreno and Peinado, 2012).

1.2.2 Classification des composés phénoliques Il existe plus de 8000 composés phénoliques largement distribués dans le règne végétal. Ces composés peuvent aller des acides phénoliques simples, de faible poids moléculaire, aux tanins complexes. Les formes simples sont généralement hydrosolubles, alors que les formes polymérisées ont des solubilités variables (Murkovic, 2003). Ils peuvent être classés

selon le nombre et l'arrangement de leurs atomes de carbone en différents groupes (Murkovic, 2003). Les composés phénoliques présents naturellement dans les tissus végétaux sains peuvent être classés en deux grands groupes : les flavonoïdes et les non flavonoïdes (Crozier et al., 2006). À noter que la transformation alimentaire peut affecter la nature et la fonction des composés phénoliques (Crozier et al., 2009)

1.2.2.1 Flavonoïdes

Les flavonoïdes représentent la plus grande classe des composés phénoliques. Dans la plante, les flavonoïdes sont présents essentiellement dans l'épiderme des feuilles et l'épicarpe des fruits (Crozier et al., 2006; Crozier et al., 2009). Ce sont des composés polyphénoliques formés de 15 atomes de carbone (C6-C3-C6). La structure de base d'un flavonoïde est formée de deux noyaux aromatiques (noyaux A et B) reliés par une chaîne de trois atomes de carbone (l'hétérocycle C) tel qu'illustré dans la Figure 1.6 (1) (Moreno and Peinado, 2012).

La structure de base des flavonoïdes peut subir plusieurs modifications suite aux réactions d'hydroxylation, de méthylation et de glycosylation. Dans les plantes, la majorité des flavonoïdes sont présents naturellement sous forme glycosylée. À noter que la présence de sucres et de groupes hydroxyles rend les flavonoïdes plus hydrophiles, alors que la présence des groupes méthyles les rend lipophiles (Crozier et al., 2006; Crozier et al., 2009).

Les principales sous-classes des flavonoïdes sont les flavonols, les flavones, les flavan-3- ols, les anthocyanes, les flavanones et les isoflavones (Figure 1.6: (2) à (7)). Les flavonoïdes qui se trouvent à des concentrations relativement faibles dans les aliments sont les dihydroflavonols, les flavane-3,4-diols, les coumarines, les chalcones, les dihydrochalcones et les aurones (Figure 1.6: (8) à (13)).

21 Figure 1.6. Structure de base d'un flavonoïde (1) et structures chimiques des différentes sous-classes des flavonoïdes (2-13) (Crozier et al., 2009)

1.2.2.1.1 Flavonols

Les flavonols contiennent un hétérocycle pyrone. Les flavonols alimentaires principaux sont le kaempférol, la quercétine, l'isorhamnétine et la myricétine (Crozier et al., 2006; Crozier et al., 2009). Ce sont des pigments jaunes qui se trouvent sous forme glycosylée (Moreno and Peinado, 2012). La glycosylation se produit généralement à la position 3 du noyau C mais elle peut également se produire sur les carbones C5, C7, C4', C3' et C5' (Crozier et al., 2006; Crozier et al., 2009). Les flavonols glycosylés sont présents dans l'épicarpe des raisins rouges et blancs. Jusqu'à présent, 8 monoglycosides, 3 diglycosides et plusieurs glucuronides ont été identifiés chez le raisin, les principaux sucres étant l'arabinose, le xylose et le galactose (Moreno and Peinado, 2012). La concentration des

flavonols dans le raisin est de 10 à 100 mg/kg de matière fraîche. Le vin blanc contient 1 à 3 mg/L de flavonols et le vin rouge en contient jusqu'à 100 mg/L (Moreno and Peinado, 2012). Pendant le processus de vinification, les hétérosides sont hydrolysés pour libérer l'aglycone (Moreno and Peinado, 2012).

1.2.2.1.2 Flavones

La structure des flavones ressemble à celle des flavonols (Crozier et al., 2006). L'hétérocycle est formé de 3 atomes de carbones non saturés avec une double liaison entre les carbones 2 et 3, comme les flavonols, avec lesquels ils diffèrent par l'absence du groupement OH en position 3 (Murkovic, 2003). Les flavones, tels que l'apigénine et la lutéoline, peuvent être hydroxylés, méthylés, et glycosylés. La plupart des flavones sont acylées sous forme de 7-O glycosides. Les flavones se trouvent essentiellement dans le céleri, le persil et quelques fines herbes. Les flavones polyméthoxylés, tels que la tangérétine et la nobilétine, se trouvent dans les agrumes (Crozier et al., 2009).

1.2.2.1.3 Flavan-3-ols

Les flavan-3-ols représentent la sous-classe de flavonoïdes la plus complexe allant des simples monomères, la (+)-catéchine et son isomère l'(-)-épicatéchine (Figure 1.7), aux oligomères et polymères de proanthocyanidines qui sont aussi appelés tanins condensés. Contrairement aux flavones, aux flavonols, aux isoflavones et aux anthocyanidines qui sont des molécules planes, les flavan-3-ols, les proanthocyanidines et les flavanones possèdent un carbone C3 saturé dans l'hétérocycle C et ne sont pas alors planes. Les deux centres chiraux C2 et C3 de la flavan-3-ol produisent quatre isomères pour chaque niveau d'hydroxylation de l'anneau B; deux d'entre eux, la (+)-catéchine et l'(-)-épicatéchine, sont très répandus dans la nature alors que les deux autres isomères, la (-)-catéchine et l'(+)- épicatéchine sont relativement rares (Ho, 1992). Contrairement aux autres classes de flavonoïdes, les monomères de flavan-3-ols se retrouvent dans les fruits sous forme libre, plutôt que sous forme glycosylée ou estérifiée (Murkovic, 2003). Cela est dû à leur tendance à se combiner entre eux pour former des polymères (Moreno and Peinado, 2012). Une seule exception est la (-)-épicatéchine-3-O-gallate qui a été identifiée dans plusieurs cultivars de raisins rouges (Murkovic, 2003).

23 Figure 1.7. Structures chimiques de certains flavan-3-ols (Crozier et al., 2009)

Les flavan-3-ols ont tendance à former des oligomères et des polymères appelés proanthocyanidines (PAC). Les polymères de PAC peuvent regrouper jusqu'à 50 unités (Crozier et al., 2006; Crozier et al., 2009). Les unités monomériques de flavan-3-ol sont principalement liées à travers des liaisons carbone-carbone C4-C8 ou parfois C4-C6. Ces composés sont tous deux appelés PAC de type B. Quand une liaison éther supplémentaire est créée entre le carbone C2 et l'oxygène O7, les composés sont appelés des PAC de type A. Ces derniers manquent deux atomes d'hydrogène par rapport aux PAC de type B (Hummer and Schreier, 2008; Kelm et al., 2006; Li and Deinzer, 2007).

Les proanthocyanidines sont largement réparties dans le règne végétal et représentent le 2ème composé phénolique naturel le plus abondant après la lignine (Hummer and Schreier, 2008; Kelm et al., 2006; Li and Deinzer, 2007). Ce sont des molécules ayant un poids moléculaire relativement élevé allant de 600 et 3500 kDa (Moreno and Peinado, 2012). Les proanthocyanidines sont des substances capables de produire des complexes stables avec les protéines et d'autres polymères végétaux tels que les polysaccharides (Ho, 1992; Moreno and Peinado, 2012). Le terme ''proanthocyanidines'' dérive du fait que l'hydrolyse de ces molécules, en milieu acide, produit des carbocations très instables qui se

transforment en produits de couleur brun-grisâtre et, en particulier, la cyanidine, qui est de couleur rouge (Moreno and Peinado, 2012).

Il existe différentes classes de PAC, selon le modèle de substitution des unités monomères flavan-3-ol. Les PAC qui sont constitués exclusivement de sous-unités épicatéchine et catéchine sont nommés les procyanidines (Hummer and Schreier, 2008; Kelm et al., 2006). Les proanthocyanidines les moins communs, formés des sous-unités d'(épi)afzelechine et d'(épi)gallocatéchine, sont appelés propelargonidines et prodelphinidines, respectivement (Crozier et al., 2006; Crozier et al., 2009). Toutefois, le terme procyanidines est généralement utilisé pour désigner tous les tanins condensés (Moreno and Peinado, 2012).

Les dimères de procyanidines peuvent être classés en deux catégories : Les procyanidines de type B et les procyanidines de type A (Figure 1.8). De même, les trimères de procyanidines sont classés en deux catégories : les procyanidines de type C liés par des liaisons interflavanes, et les procyanidines de type D liés par une liaison interflavane et une autre liaison flavano-éther (comme dans les procyanidines de type A). Les oligomères de procyanidines contiennent entre trois et dix sous-unités de flavan-3-ols, et les centres chiraux présents dans les monomères permettent de former beaucoup d'isomères. Les procyanidines condensés sont formés de plus de dix sous-unités de flavan-3-ols et ont une masse moléculaire de plus de 3000 kDa (Moreno and Peinado, 2012).

Figure 1.8. Structure des procyanidines A2 et B2 (Hummer and Schreier, 2008) !

25 On trouve des proanthocyanidines dans la pomme, le raisin, la fraise, la prune, le sorgho et l'orge (Ho, 1992). Le bleuet et la canneberge contiennent aussi des quantités importantes de procyanidines (4.5 mg/g MS) (Khanal et al., 2014). Le vin rouge contient des oligomères de procyanidines et de prodelphinidines provenant principalement des pépins des raisins noirs (Crozier et al., 2006). Le chocolat noir est considéré comme une source importante de procyanidines dérivés des graines grillées de cacaoyer. De plus, le thé vert contient des niveaux élevés en flavan-3-ols, principalement l'(-)-épigallocatéchine, l'(-)- épigallocatéchine gallate et l'(-)-épicatéchine gallate (Crozier et al., 2009).

1.2.2.1.4 Anthocyanes

Le terme anthocyane est un terme général qui désigne les anthocyanidines et les anthocyanosides. Les anthocyanidines sont des flavonoïdes contenant un hétérocycle pyrrole, alors que les anthocyanosides s sont constitués d'une anthocyanidine liée à un sucre par une liaison glycosidique (Swanson, 2003). Les anthocyanosides forment aussi des conjugués avec les acides hydroxycinnamiques et les acides organiques, tels que les acides malique et acétique. L'hydroxylation peut survenir sur les positions 3, 5 et 7 dans l'anneau A et sur les positions 3' et 5' dans l'anneau B. Les groupes méthoxyl peuvent être attachés aux positions 3' et 5'. Les anthocyanosides se trouvent principalement sous forme de 3- monosides, de 3-biosides et de 3-triosides, ainsi que sous forme de 3,5-diglycosides et, dans certains cas, de 3,7-diglycosides. Les principaux sucres qui peuvent se lier aux positions 3, 5 et 7 sont le glucose, le galactose, le rhamnose, l'arabinose et le xylose (Murkovic, 2003). Les anthocyanidines les plus courantes sont la pélargonidine, la cyanidine, la péonidine, la delphinidine, la pétunidine et la malvidine (Crozier et al., 2006).

Les anthocyanosides se trouvent particulièrement dans les tissus des fruits et des fleurs. Le bleuet peut contenir jusqu'à 28,7 mg/g MS d'anthocyanes (Khanal et al., 2014). Ils sont responsables des couleurs orange, rose, rouge, mauve, violette et bleue des pétales et des fruits des plantes supérieures (Crozier et al., 2006; Ho, 1992; Murkovic, 2003). Ils se trouvent, également, dans les feuilles, les tiges, les graines et les tissus racinaires où ils s'accumulent dans les vacuoles des cellules épidermiques ou sous-épidermiques (Murkovic, 2003). Les différentes couleurs des anthocyanes reflètent leurs différences structurales

(nombre de groupements hydroxyles, présence ou absence de méthylation et de glycosylation) (Swanson, 2003).

1.2.2.1.5 Flavanones

La structure des flavanones se caractérise par l'absence de la double liaison dans l'hétérocycle C, et la présence d'un centre chiral au carbone C2. L'anneau aromatique B est lié à l'hétérocycle C selon une configuration α. Les flavanones peuvent être hydroxylés, glycosylés et O-méthylés. Les flavanones sont présents à des concentrations élevées dans les agrumes. Le flavanone glycoside le plus connu est l'hesperetin-7-O-rutinoside (hespéridine). En ce qui concerne le goût, les flavanones rutinosides n'ont pas de saveur caractéristique. Par contre, les conjugés de flavanone néohespéridoside, comme la néohespéridine qui se trouve dans l'orange amère et la naringine qui se trouve dans le pamplemousse, ont un goût extrêmement amer. De plus, la néohespéridine dihydrochalcone est un édulcorant autorisé pour l'utilisation dans les bières sans alcool (Crozier et al., 2006).

1.2.2.1.6 Isoﬂavones

La structure des isoflavones diffère de celle des autres flavonoïdes, par le fait que l'anneau B est attaché à l'hétérocycle C à la position C3, et non pas à la position C2 (Crozier et al., 2006). Les isoflavones peuvent porter plusieurs substituants, ainsi que des noyaux hétérocycliques supplémentaires (Murkovic, 2003). L'enzyme isoflavone synthase est responsable de la transformation des flavones en isoflavones. Cette enzyme catalyse l'isomérisation des deux flavones, la (2S)-naringénine et la (2S)-liquiritigénine, en génistéine et daidzéine, respectivement (Murkovic, 2003). Les isoflavones se trouvent, presque exclusivement, chez les légumineuses, et surtout chez le soja. Les isoflavones (génistéine et daidzéine) possèdent une activité oestrogénique importante et peuvent affecter gravement la reproduction des ruminants, comme les vaches et les moutons, et sont qualifiés de phyto-oestrogènes. La structure de ces isoflavonoïdes imite l'œstradiol qui bloque l'ovulation (Crozier et al., 2006).

1.2.2.2 Non flavonoïdes

Les phénols non flavonoïdes comprennent les acides phénoliques simples de structure C6- C1, plus particulièrement, l'acide gallique qui est le précurseur de la biosynthèse des tanins

27 hydrolysables, les acides hydroxycinnamiques de structure C6-C3 et leurs dérivés conjugués, et les stilbènes C6-C2-C6 (Crozier et al., 2006).

1.2.2.2.1 Acides phénoliques simples

Les phénols simples regroupent les mono-, les di- et les triphénols. Les monophénols les plus connus sont le p-crésol, isolé de certains fruits (framboise, mûre), le 3-éthylphénol et le 3,4-diméthylphénol qui se trouvent dans les fèves de cacao. Le sésamol est un dérivé de l'hydroquinone (diphénols) qui se trouve dans l'huile de sésame. L'acide gallique est un triphénol qui est présent sous forme estérifiée dans les catéchines du thé (Ho, 1992). Les acides phénoliques sont présents dans les vacuoles des cellules de la pulpe et de l'épicarpe des fruits, comme le raisin par exemple. Ils sont incolores en solution aqueuse et peuvent devenir jaunâtres lorsqu'ils sont oxydés (Moreno and Peinado, 2012).

Figure 1.9. Acides phénoliques de la série benzoïque (Crozier et al., 2009)

L'acide gallique est l'acide phénolique le plus fréquent (Figure 1.9). Il se trouve généralement sous forme d'esters de sucres complexes dans les gallotannins, comme le 2- O-digalloyl-tetra-O-galloyl-glucose par exemple (Crozier et al., 2009). Le dimère d'acide gallique, l'acide hexahydrodiphénique, et la dilactone connexe, l'acide ellagique, sont aussi des constituants végétaux courants (Murkovic, 2003). Les principales sources alimentaires d'acide gallique sont le raisin, le vin, la mangue, le thé vert et le thé noir. L'acide ellagique et les ellagitanins connexes se trouvent dans la framboise, la fraise, la grenade, les mûres sauvages, le kaki, ainsi que dans les noix et les noisettes (Crozier et al., 2009).

Les acides hydroxybenzoïques ont une structure générale du type C6-C1, dérivée directement de l'acide benzoïque, avec des hydroxylations et des méthoxylations du cycle aromatique (Figure 1.9). Les principaux acides hydrobenzoïques sont l'acide p- hydroxybenzoïque, l'acide vanillique, l'acide syringique et l'acide protocatéchuique (Murkovic, 2003). La teneur en acides hydroxybenzoïques dans les aliments d'origine végétale est généralement faible, mais dans certains fruits et légumes, comme les oignons et le raifort, la teneur en acides hydroxybenzoïques peut être très élevée (Murkovic, 2003).

1.2.2.2.2 Acides hydroxycinnamiques

Les acides hydroxycinnamiques proviennent de l'acide cinnamique qui est un composé de structure C6-C3 (Crozier et al., 2006). Les acides hydroxycinnamiques les plus courants sont l'acide p-coumarique, l'acide caféique, l'acide férulique et l'acide sinapique (Figure 1.10). Les acides hydroxycinnamiques se présentent généralement sous diverses formes conjuguées, surtout sous forme d'esters (Ho, 1992). L'acide caféique est l'acide hydroxycinnamique prédominant dans beaucoup de fruits. Il représente plus de 75 % du total des acides hydroxycinnamiques présents dans les prunes, les pommes, les abricots, les bleuets et les tomates. Cependant, l'acide p-coumarique est l'acide hydroxycinnamique dominant dans les agrumes et les ananas. Les acides hydroxycinnamiques sont souvent présents sous forme liée et sont rarement trouvés en forme libre. La transformation des fruits et des légumes (congélation, stérilisation et fermentation) contribue à la formation d'acides hydroxycinnamiques libres dans ces produits (Murkovic, 2003).

29 Figure 1.10. Acides phénoliques de la série cinnamique (Crozier et al., 2009)

La conjugaison des acides hydroxycinnamiques avec l'acide tartrique ou l'acide quinique forme l'acide chlorogénique qui est le substrat clé dans le brunissement enzymatique des pommes et des poires (Ho, 1992). Les acides chlorogéniques, principalement les acides 3- O-, 4-O- et 5-O-cafféoylquiniques, représentent environ 10 % des grains de café robusta vert. Les consommateurs réguliers de café peuvent avoir une dose quotidienne supérieure à 1 g (Crozier et al., 2009).

1.2.2.2.3 Stilbènes

Les stilbènes ont une structure C6-C2-C6 formée de deux noyaux benzéniques liés par une molécule d'éthanol ou d'éthylène (Moreno and Peinado, 2012). Ce sont des phytoalexines produites par les plantes en réponse à des maladies, à des blessures et au stress. Le resvératrol (3,5,4'-trihydroxystilbène) (Figure 1.11) se retrouve dans le vin rouge et l'arachide, mais aussi dans le chou rouge, les épinards et certaines herbes aromatiques (Crozier et al., 2009). Le resvératrol est localisé principalement dans l'épicarpe des raisins. Il est donc extrait lors de la production des vins rouges où sa concentration est de quelques dizaines de milligramme à quelques milligrammes par litre (Moreno and Peinado, 2012).

Le resvératrol se présente sous forme d'isomères cis et trans. Le trans-resvératrol et le trans- resvératrol-3-O-glucoside (trans-picéide) ont été détectés dans les pistaches. De plus, la racine ligneuse de la mauvaise herbe Polygonum cuspidatum (renouée du Japon ou bambou

mexicain) contient des niveaux très élevés de trans-resvératrol et de son glucoside, avec des concentrations pouvant atteindre 377 mg par 100 g de matière sèche (Crozier et al., 2009).

Figure 1.11. Structure du resvératrol (Moreno and Peinado, 2012)

1.2.3 Voies de synthèse La biosynthèse des différents composés phénoliques débute par la dégradation des glucides produits lors du métabolisme primaire. La Figure 1.12 représente les principales voies et les enzymes clés impliquées dans la synthèse des composés phénoliques.

La phénylalanine ammonia-lyase (PAL) est une des enzymes clés les plus importantes dans la biosynthèse des composés phénoliques. Cette enzyme joue également un rôle important dans la synthèse des protéines. Par conséquent, une concurrence se produit entre la synthèse des composés indispensables pour la croissance des plantes d'une part, et celle des composés phénoliques d'autre part. L'activité de l'enzyme PAL varie selon le cycle de croissance de la plante, les conditions climatiques, et la fertilité et la disponibilité de l'eau dans le sol. L'activité de cette enzyme augmente lors du mûrissement des fruits, de l'allongement de la photopériode et de l'augmentation de la température. De plus, dans un terrain très fertile et où l'eau est disponible, la croissance végétative prend le dessus et la synthèse des protéines est très active. Dans ces conditions, la phénylalanine est utilisée pour synthétiser des protéines et les fruits récoltés sont nombreux mais contiennent de très faibles quantités de composés phénoliques. En revanche, un manque d'eau ou de nutriments aboutit à la formation de fruits riches en composés phénoliques (Moreno and Peinado, 2012).

31 Figure 1.12. Schéma représentant les principales voies de biosynthèse et les enzymes clés impliquées dans la biosynthèse des tanins hydrolysables, de l'acide salicylique, des acides hydroxycinnamique et 5-caffeoylquinique (PAL: phénylalanine ammonia-lyase ; BA2H: acide benzoïque 2-hydroxylase ; C4H: cinnamate 4-hydroxylase ; COMT-1: acide cafféique/5- hydroxyférulique O-méthyltransférase ; 4CL: p-coumarate:CoA ligase ; F5H: férulate 5- hydroxylase ; GT: galloyltransférase ; ACoAC: acétylCoA carboxylase) (Crozier et al., 2006)

1.2.3.1 Biosynthèse des flavonoïdes

Les flavonoïdes de structure C6-C3-C6 proviennent de deux voies de biosynthèse. Le noyau aromatique B est produit par la voie de l'acide shikimique, tandis que l'anneau aromatique A est formé par la voie de l'acide malonique (Figure 1.13) (Moreno and Peinado, 2012).

Figure 1.13. Origine de la biosynthèse des flavonoïdes (Crozier et al., 2006)

Dans la voie de l'acide shikimique, les glucides se dégradent par la voie des pentoses phosphate et par la glycolyse pour donner l’érythrose 4-phosphate et le phosphoénol pyruvate qui se transforment en acide 3-déhydroshikimique. Cet acide se transforme en L- phénylalanine qui donne l'acide cinnamique sous l'action de la PAL. L'acide cinnamique se transforme par la suite en acide p-coumarique puis en p-coumaroyl-CoA (Akroum, 2011).

Quant à la voie de l'acide malonique, la glycolyse des glucides et la β-oxydation des acides gras donnent l'acétyl-CoA qui sera carboxylé pour produire le malonyl-CoA (Akroum, 2011). L'union de trois molécules de malonyl-CoA avec la p-coumaroyl-CoA conduit à la formation d'une chalcone. Cette réaction est catalysée par la chalcone synthase (Moreno and Peinado, 2012).

33 Les différentes sous-classes des flavonoïdes se forment à partir des chalcones (Figure 1.14). Les chalcones peuvent s'isomériser en aurones ou en flavanones. Ces derniers peuvent, soit s'isomériser en flavones, soit donner des isoflavones qui s'isomérisent eux-mêmes en flavones. Les flavones se transforment en flavonols puis en anthocyanidols. Ces derniers peuvent se transformer en anthocyanes ou s'isomériser en flavan-3,4-diols. !

Figure 1.14. Schéma simplifié de la biosynthèse de différentes classes de flavonoïdes (Morreel et al., 2006)

1.2.3.2 Biosynthèse des non flavonoïdes

Les phénols simples ou les composés non flavonoïdes sont synthétisés à partir de la L- phénylalanine produite via la voie de l'acide shikimique. L'acide cinnamique produit par la PAL peut se transformer en acide benzoïque suite au clivage de la chaîne latérale. L’acide salicylique est formé par hydrolyse de l'acide benzoïque. La cinnamate-4-hydroxylase transforme l'acide cinnamique en acide p-coumarique (Moreno and Peinado, 2012). L'acide p-coumarique est également métabolisé par une série de réactions d'hydroxylation et de méthylation menant aux acides caféique, férulique, 5-hydroxyférulique et sinapique. Les acides sinapique et férulique sont les précurseurs des lignines. L'acide 5-O- cafféoylquinique, composé commun des fruits et des légumes, est produit à partir de la p- coumaroyl-Coenzyme A par l'intermédiaire de l'acide 5-O-p-coumaroylquinique (Crozier et al., 2006).

L'acide gallique se forme directement à partir de l'acide 3-déhydroshikimique. Il est converti par la suite en β-glucogalline qui, à son tour, est transformé par une série d'étapes en penta-O-galloyl-glucose. Le penta-O-galloyl-glucose est un intermédiaire essentiel pour la synthèse des gallotanins et des ellagitanins qui sont des tanins hydrolysables (Crozier et al., 2006). Le stilbène trans-resvératrol est également synthétisé par condensation de p- coumaroyl CoA avec trois unités de malonyl CoA dans une réaction catalysée par la stilbène synthase. La stilbène synthase est induite par les stress biotique ou abiotique, tels que le rayonnement UV et les infections par des micro-organismes (Crozier et al., 2006).

1.2.4 Effets sur la santé Une alimentation riche en fruits et en légumes peut réduire l'incidence de certaines maladies, telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, l'hypertension, le cancer et l'accident vasculaire cérébral (Crozier et al., 2009; Makena and Chung, 2007). Les composés phénoliques, la vitamine C, la vitamine E et les caroténoïdes qui se trouvent dans l'alimentation protègent les tissus de l'organisme contre le stress oxydatif (Makena and Chung, 2007; Soobrattee et al., 2005). Il est recommandé de consommer quotidiennement cinq portions de fruits et de légumes d'au moins 80 g chacune (Crozier et al., 2009). L'apport alimentaire de composés phénoliques varie considérablement d'une région

35 géographique à une autre. L’apport quotidien est généralement de 20 mg à 1,8 g de composés phénoliques (Saura-Calixto, 2012; Soobrattee et al., 2005).

1.2.4.1 Activité antioxydante

Les radicaux libres, tels que les espèces réactives de l'oxygène et les espèces réactives de l'azote, sont produits en plus grandes quantités dans les cellules lorsque les maladies chroniques dégénératives, comme les maladies cardiovasculaires et le cancer, se développent (Stratil et al., 2006). Le stress oxydatif, résultant de ces espèces réactives, est associé à un déséquilibre de l'état oxydant/antioxydant de la cellule, ce qui affecte l'intégrité structurelle et fonctionnelle au niveau de la membrane cellulaire (Makena and Chung, 2007). Le corps humain possède des défenses primaires et secondaires contre les radicaux libres. Le système de défense primaire est représenté par les enzymes, telles que le superoxyde dismutase, la catalase et la glutathion peroxydase. Le système de défense secondaire est composé des vitamines A, C et E, des β-carotènes, des urates, des bilirubines et d'autres molécules qui peuvent agir comme des antioxydants (Makena and Chung, 2007). Les composés phénoliques sont les antioxydants les plus abondants dans l'alimentation ; leur consommation est 10 fois plus élevée que celle de la vitamine C et 20 fois plus élevée celle de la vitamine E ou les caroténoïdes. Par contre, ils ne sont pas absorbés et leur concentration dans le sang est faible comparativement aux autres antioxydants (Hollman et al., 2011). Certains aliments sont extrêmement riches en composés phénoliques et possèdent, par conséquent, une activité antioxydante importante. Parmi ces aliments on cite le thé, le vin et le cacao (Quinones et al., 2013). Les sources les plus importantes de composés phénoliques dans l'alimentation sont les légumes, les fruits, les céréales et les boissons légèrement alcoolisées (Stratil et al., 2006). Proteggente et al. (2002) ont évalué les activités antioxydantes des principaux fruits et légumes dans l'alimentation. Les résultats ont montré que les fruits et les légumes riches en anthocyanines (fraise, framboise et prune rouge) possèdent les activités antioxydantes les plus importantes, suivis de ceux riches en flavonones (orange et pamplemousse) et en flavonols (oignon, poireau, épinards et chou vert). En outre, les fruits riches en acides hydroxycinnamiques (pomme, tomate, poire et pêche) ont les activités antioxydantes les plus faibles. De même, Soobrattee et al. (2005) ont classés les composés phénoliques suivants selon l'ordre décroissant de leur

activité antioxydante: dimères de procyanidines, flavan-3-ols, flavonols, acides hydroxycinnamiques et acides phénoliques simples.

L'implication du stress oxydatif dans la progression des maladies chroniques dégénératives a conduit à l'hypothèse que les antioxydants peuvent être utilisés comme des agents prophylactiques (Soobrattee et al., 2005). Par contre, aucune relation directe n'a été trouvée, jusqu'à présent, entre l'activité antioxydante des composés phénoliques et leur effet bénéfique sur la santé cardiovasculaire (Hollman et al., 2011). Après leur ingestion, les composés phénoliques sont absorbés, distribués dans différents tissus, métabolisés et éliminés par le système urinaire ou par le foie. Les composés phénoliques subissent une transformation par la microflore intestinale et des acides monophénoliques sont libérés (Khanal et al., 2014). La concentration des composés phénoliques et de leur métabolites dans le sang et dans les tissus est très faible (quelques nanomoles à quelques micromoles). Ainsi, la contribution directe des composés phénoliques à neutraliser les espèces réactives d'oxygène est peu probable (Hollman et al., 2011). Une nouvelle hypothèse a été proposée par cet auteur; les composés phénoliques peuvent activer les voies de signalisation, ce qui résulte en l'augmentation de l'expression des gènes cytoprotecteurs. Les composés phénoliques qui se trouvent dans l'alimentation peuvent également influencer la composition de la microbiote intestinale et rétablir la fonction barrière de l’intestin. La microbiote intestinale peut moduler le métabolisme du glucose et l'inflammation chronique associée à l'obésité et aux maladies métaboliques (Anhe et al., 2015).

Les composés phénoliques sont utilisés comme antioxydants dans l'industrie alimentaire pour augmenter la durée de conservation des aliments, en limitant la détérioration dûe aux réactions d'oxydation (l'oxydation des graisses en particulier). De cette manière, on conserve les aliments d'une part, et on diminue l'exposition des humains aux radicaux libres qui peuvent augmenter le risque des maladies dégénératives d'autre part (Murkovic, 2003).

1.2.4.2 Activité anticancéreuse

De nombreuses études ont montré qu'une alimentation riche en composés phénoliques peut avoir un effet protecteur contre le cancer. Les composés phénoliques sont qualifiés d'agents chimiopréventifs et agissent à différents niveaux de la carcinogenèse soit à l'initiation, à la

37 promotion et à la progression du cancer. Les composés phénoliques inhibent la croissance des cellules en provoquant l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose, empêchent la prolifération, l'angiogenèse, et/ou les métastases et présentent des effets anti-inflammatoires et/ou antioxydants (Araujo et al., 2011). Hou et al. (2004) ont montré que les composés phénoliques peuvent être impliqués dans l'inhibition des activités des protéines kinase spécifiques, dans le blocage des fonctions médiées par les récepteurs et dans l'inhibition des protéases. Ces mécanismes se traduisent par la régulation du cycle cellulaire, l'inhibition de la croissance, l'augmentation de l'apoptose, l'inhibition de l'angiogenèse et l'inhibition de l'invasion et des métastases. D'après ces auteurs, plusieurs voies de transduction du signal sont probablement impliquées dans l'inhibition de la cancérogenèse par les constituants du thé.

Les cibles moléculaires potentielles des composés phénoliques sont nombreuses. Des études moléculaires ont montré que les composés phénoliques peuvent exercer des actions modulatrices dans la cellule, en interagissant avec un large éventail de cibles moléculaires clés des voies de signalisation. Il s'agit de l'activation de la protéine kinase mitogène- activée, de la protéine kinase C, de la sérine/thréonine protéine kinase, des enzymes antioxydantes détoxifiantes de la phase II, et de la diminution de l'expression des enzymes pro-inflammatoires (Soobrattee et al., 2005). L'activité de la protéine kinase C, un récepteur intracellulaire important pour un promoteur de tumeurs de peau de souris, peut être modulée par des acides phénoliques végétaux, en particulier l'acide tannique (Szaefer et al., 2007).

Le cancer colorectal est le deuxième type de cancer le plus mortel, et le troisième type de cancer le plus diagnostiqué dans le monde entier. Les causes de ce cancer sont multifactorielles, mais dans la plupart des cas, ce type de cancer est principalement causé par des facteurs alimentaires (Araujo et al., 2011). Il a été démontré que dans un régime alimentaire contenant une quantité faible de matières grasses, la quercétine et la rutine peuvent freiner la prolifération des cellules épithéliales du côlon, réduisant ainsi les principaux domaines d'action de la dysplasie et, par conséquent, l'incidence des tumeurs du côlon (Ho, 1992). Le thé a des effets protecteurs contre le cancer de la peau, des poumons, de la cavité buccale, de l'œsophage, de l'estomac, de l'intestin grêle, du côlon, du foie, du

pancréas, de la vessie et de la prostate (Hou et al., 2004). De plus, Haddad et al. (2006) ont montré l'effet antiprolifératif de cinq flavonoïdes sur des lignées cellulaires du cancer de la prostate chez l'humain.

1.2.4.3 Prévention des maladies cardiovasculaires

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde. Une alimentation riche en composés phénoliques végétaux aide à maintenir une bonne santé et à réduire l'incidence des maladies cardiovasculaires (Quinones et al., 2013). Il a été démontré que la consommation modérée de boissons alcoolisées, riches en composés phénoliques, réduit le risque des maladies cardiovasculaires, cérébrovasculaires, et des maladies vasculaires périphériques. Entre outre, les composés phénoliques du vin rouge semblent interférer avec les mécanismes moléculaires responsables de l'initiation, la progression et la rupture des plaques athérosclérotiques (Szmitko and Verma, 2005).

1.3 Hypothèses et objectifs Le projet vise à concevoir et à développer un procédé de transformation et de valorisation du houblon pour des usages alimentaires et nutraceutiques. Le but est de maximiser l'utilisation de la biomasse des plants de houblon et d'optimiser les procédés d'extraction et de les appliquer à l'échelle industrielle. Une contrainte dans le développement d’un procédé d’extraction est celle d’employer des technologies écologiques, et des biomasses et des excipients biologiques.

Nos objectifs spécifiques étaient de :

Ø Déterminer les cultivars ayant les meilleurs rendements agronomiques et dont les cônes, les feuilles et les tiges contiennent le plus de xanthohumol, d'acides α et β, de proanthocyanidines et de composés phénoliques totaux.

Ø Valoriser les co-produits du houblon en fonction de leur contenu en composés phénoliques.

Ø Déterminer la meilleure méthode de conservation du matériel végétal avant l'extraction.

39 Ø Optimiser les conditions d'extraction des molécules d'intérêt.

Ø Obtenir des extraits des différentes parties du plant de houblon.

Ø Purifier les extraits de houblon.

Le projet a été divisé en 3 volets principaux:

Dans le premier volet, nous avons étudié le potentiel agronomique et nous avons quantifié les molécules bioactives qui se trouvent dans les cônes, les feuilles et les tiges du houblon. De plus, nous avons étudié l'effet de la méthode de conservation sur les teneurs en molécules bioactives des feuilles et des cônes. Nos hypothèses étaient :

Il est possible de cultiver, biologiquement, certains cultivars de houblon au Québec.

Les feuilles et les tiges contiennent des quantités exploitables de composés phénoliques.

Les concentrations en biomolécules dans les cônes et les feuilles secs diminuent significativement après 1 an d'entreposage.

Dans le deuxième volet, nous avons optimisé les conditions d'extraction des molécules bioactives des cônes, des feuilles et des tiges. Notre hypothèse était :

Il est possible d'obtenir des extraits riches en biomolécules en optimisant les conditions d'extraction et en utilisant l'éthanol comme solvant.

Dans le troisième volet, nous avons purifié les extraits obtenus dans le deuxième volet. Nos hypothèses étaient :

L'adsorption sur colonne d'échange d'ions est une méthode efficace pour concentrer les extraits de houblon.

Il est possible d'obtenir un extrait très riche en xanthohumol.

Chapitre 2 : Yield and chemical composition of cones and leaves of hops (Humulus lupulus L.) grown in Québec, Canada

Christiana Sarraf1, Sébastien Leonhart1,2, Guillaume Gosselin3, Yves Desjardins1 and André Gosselin1,2

1. Horticulture Research Center, Faculty of Agriculture and Food Sciences, Université Laval, Québec (Québec city), Canada.

2. Nutra Canada, Champlain, Québec, Canada.

3. Houblonnière Gosselin, Plessisville, Québec, Canada.

2.1 Résumé Le houblon (Humulus lupulus L.) est une plante dioïque, cultivée dans la majorité des zones tempérées du monde, principalement pour ses inflorescences femelles appelées cônes. Les cônes de houblon contiennent des acides amers (acides α et β) et des composés phénoliques, tels que des chalcones prénylées et des proanthocyanidines. Les feuilles de houblon peuvent également contenir des composés phénoliques. Cette étude visait à déterminer le rendement et la teneur en acides α et β, en desméthylxanthohumol, en xanthohumol et en proanthocyanidines dans les cônes et les feuilles de 5 cultivars de houblon (Cascade, Galena, Nugget, Willamette et Brewers Gold) plantés au Québec, Canada. Les teneurs en acides α et β, en desméthylxanthohumol, en xanthohumol, en proanthocyanidines et en composés phénoliques totaux dans les feuilles et les cônes des différents cultivars ont été déterminées. Nos résultats ont montré que le cultivar Nugget avait le rendement de cônes le plus bas (113,5 g de cônes secs / plant) et que Galena avait le rendement le plus élevé (603,5 g de cônes secs / plant). Les concentrations les plus élevées en acides α (10,8 % MS), en proanthocyanidines (1,7 % MS) et en composés phénoliques totaux (4,6 % MS) ont été mesurées dans les cônes de Nugget. Les concentrations les plus élevées en acides β (6,7 % MS) et en xanthohumol (0,6 % MS) ont été mesurées dans les cônes de Galena et les cônes de Brewers Gold, respectivement. Les feuilles de Nugget avaient la concentration la plus élevée en acides α (0,1 % MS), tandis que ceux de Galena avaient les concentrations les plus élevées en proanthocyanidines (1,1 % MS) et en composés phénoliques totaux (3,2 % MS). Les feuilles de Brewers Gold avaient la concentration la plus élevée en xanthohumol (0,01 % MS). Aucune corrélation n'a été détectée entre le rendement de cônes et la teneur en composés phénoliques dans les cônes et les feuilles. En outre, les feuilles de houblon contenaient des quantités faibles de xanthohumol et des acides α et β mais des quantités importantes de proanthocyanidines et composés phénoliques totaux.

2.2 Abstract Hop (Humulus lupulus L.) is a dioecious plant cultivated in most temperate areas of the world, mainly for its inflorescences known as hop cones. Hop cones contain hop bitter acids (α- and β-acids), and polyphenols such as prenylated chalcones and proanthocyanidins. Hop leaf may also contain polyphenols. The present work was conducted to determine the yield and the content of α- and β-acids, desmethylxanthohumol, xanthohumol and proanthocyanidins in cones and leaves of 5 cultivars (Cascade, Galena, Nugget, Willamette and Brewers Gold) grown in Québec, Canada. α- and β-acids, desmethylxanthohumol and xanthohumol, proanthocyanidins and total polyphenols in the leaves and cones of the different cultivars were determined. Our data showed that Nugget had the lowest cone yield (113.5 g of dry cones / plant) and Galena had the highest (603.5 g of dry cones / plant). Cones of Nugget had the highest concentration of α-acids (10.8 % DM), proanthocyanidins (1.7 % DM) and total polyphenols (4.6 % DM) whereas cones of Galena had the highest content of β-acids (6.7 % DM) while cones of Brewers Gold had the highest concentration of xanthohumol (0.6 % DM). Leaves of Nugget had the highest concentration of α-acids (0.1 % DM), while those of Galena had the highest content of proanthocyanidins (1.1 % DM) and total polyphenols (3.2 % DM). Leaves of Brewers Gold had the highest concentration of xanthohumol (0.01 % DM). No correlation was found between yield of cones and cones and leaves polyphenol content. Moreover, hop leaf contained small amounts of xanthohumol, α- and β-acids but higher amounts of proanthocyanidins and total polyphenols.

2.3 Introduction The hop (Humulus lupulus L.) is a dioecious plant cultivated in most temperate areas of the world, mainly for its female inflorescences known as hop cones (Callemien et al., 2005; Li and Deinzer, 2006). The essential elements of mature cones are glandular trichomes, the lupulin glands, which contain the lupulin, a yellowish resinous powder (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006). The lupulin contains hop bitter acids, essential oils and flavonoid used primarily in the brewing industry, but also in the biomedical research (Kavalier et al., 2011). Hop is used in brewing for its secondary metabolites, the prenylated acylphloroglucinols (α- and β-acids), which are responsible for bitterness of beer (Nagel et al., 2008). In addition, hop is an important source of phenolic compounds (Ceh et al., 2007). Dried hop cones may contain 4 to 14 % of polyphenols such as phenolic acids, prenylated chalcones, flavonoids, catechins and proanthocyanidins (Kavalier et al., 2011). Moreover, hop is considered as a rich source of proanthocyanidins. Depending on the variety and the geographical origin, the hop cones contain 0.5 to 5 % dry matter (DM) of proanthocyanidins (Li and Deinzer, 2007).

Bitter acids and prenylflavonoids accumulate mainly in the lupulin glands that lie between the bracts of cones (Priest and Stewart, 2006; Rybacek, 1991) but also on the underside of young leaf (Kavalier et al., 2011; Stevens and Page, 2004). Each kg of fresh cones generates at least 1 kg of residual material (leaves, stem, branches and disintegrated cones) which is a significant biomass loss (Grilc and Dabrowski, 1994). Leaf mostly contains proteins (23 %) and can be used in animal feeding (Grilc and Dabrowski, 1994). It also contains small but detectable amounts of xanthohumol (Nagel et al., 2008). According to Ceh et al. (2007), leaf may contains 0.009 to 0.08 % DM of xanthohumol. Furthermore, leaf contains more β-acids than α-acids (De Keukeleire et al., 2003). These works show that the molecules used in brewing and having beneficial effects on health are spread over different parts of the plant.

The aim of the present study was to determine the yield and the content of α- and β-acids, desmethylxanthohumol, xanthohumol and proanthocyanidins in cones and leaves of five hop cultivars (Cascade, Galena, Nugget, Willamette and Brewers Gold) grown in Québec, Canada. This was achieved mainly by using HPLC coupled to UV and fluorescence

47 detections. Further on, we wanted to know if cones and leaves content of the studied compounds was correlated to cone yield. The premiss of the work is that hop leaf can be valorized for its polyphenol content.

2.4 Materials and methods

2.4.1 Plant material Five hop cultivars were investigated (Cascade, Galena, Nugget, Willamette and Brewers Gold). Rootstocks of these cultivars were planted in 2009. In September 2011, plants of each cultivar have been harvested and transported on the same day to Université Laval where leaves, cones and stem of each plant were separated carefully. Fresh and dry weights of these parts were measured to determine the yield of each cultivar. Dry materials were stored in a cold storage room until analysis.

2.4.2 Chemicals Xanthohumol and desmethylxanthohumol, epicatechin, gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent were purchased from Sigma Aldrich (Missouri, USA). International Calibration Extract ICE-2 [14.45 % cohumulone, 34.94 % (humulone + adhumulone), 12.92 % colupulone, 12.02 % (lupulone + adlupulone)] was purchased from The American Society of Brewing Chemists (Minnesota, USA). Acetonitrile HPLC grade and methanol HPLC grade were purchased from EMD chemicals Inc. (New Jersey, USA). Glacial acetic acid 99.7 % and formic acid 88 % were purchased from Anachemia Canada Co. (Montreal, Canada). Sodium carbonate was purchased from Fisher Scientific (Ottawa, Canada).

2.4.3 Extraction Dry hop cones and leaves were ground and sieved (0.5 mm). Extraction was conducted at room temperature by adding 10 mL of methanol 100 % to 0.5 g of cones or leaves measured into 50 mL centrifuge tubes. The tubes were then vortexed for 1 min, sonicated for an hour and centrifuged at 3500 rpm for 15 min. The supernatant was collected and the residue was re-extracted with 10 mL methanol 80 % for an hour. After centrifugation (3500 rpm, 15 min), the supernatant was collected and mixed with the first supernatant. Sample of the supernatant (1 mL) was withdrawn and filtered through non-sterile 0.45 µm

13 mm nylon syringe filter (Chromatographic Specialties Inc., Brockville, ON, Canada) prior to analysis by HPLC.

2.4.4 Analytical procedure

2.4.4.1 Total polyphenols

Total polyphenols content was determined by the Folin-Ciocalteu assay. 100 µL of the sample, the standard or the control, 2 mL of water and 200 µL of Folin-Ciocalteu reagent were mixed for 1 to 8 min in a UV cuvette then 900 µL of sodium carbonate 20 % were added. The mixture was incubated for 2 hours at room temperature. The absorbance of the solution was then measured at 765 nm in a spectrometer (Thermo Spectronic). The standard curve was drawn using the absorbance obtained for standards of gallic acid of 50, 100, 250 and 500 ppm. Concentrations of samples are then calculated using the standard curve.

2.4.4.2 Xanthohumol, desmethylxanthohumol, α- and β-acids

Prenylated chalcones and bitter acids were analysed by HPLC coupled to UV according to the method of De Keukeleire et al. (2003) with modifications. Quantitative analyses were performed using a Waters 600-MS control system, a Waters 717 Plus injector and a Waters 996 photodiode-array detector with a reverse phase C18 column (Synergi Hydro-RP). Solvent A was water and solvent B was methanol. Both solvents were acidified with 0.025 % (v/v) formic acid. Gradient profile was: 0-20 min, 25 % A and 75 % B; 20-35 min, 10 % A and 90 % B; 35-50 min, 25 % A and 75 % B. Volume of injected sample was 10 µL, flow of solvents was 1 mL/min and temperature of the column was 30 °C. The detection was done at 314 and 370 nm for α- and β-acids and desmethylxanthohumol and xanthohumol respectively. The peaks were identified by comparing the retention time with those of the standard for each of these compounds and the quantification was carried out by measuring the area under the peaks of the chromatograms compared to the standard curves.

2.4.4.3 Proanthocyanidins

49 normal phase column Develosil Diol. The solvents used were acetonitrile acidified with 2 % acetic acid (solvent A) and methanol:water:acetic acid 95:3:2. The separation was performed by a linear gradient of the solvent B: 0 to 40 % from 0 to 35 min, 40 to 100 % from 35 to 40 min, 100 to 100 % from 40 to 45 min and 100 to 0 % from 45 to 50 min. The flow of these solvents was maintained to 0.8 mL/min, the injection volume was 5 µL and the temperature of the column was 35 °C. Fluorescence was detected at excitation and emission wavelengths of 230 and 321 nm respectively. The quantification was done using an external calibration curve of epicatechin, taking into account their relative response factors in fluorescence (Dudonne et al., 2014).

2.4.5 Statistical analysis Analyses of variance (ANOVA) of replicated samples were performed using the PROC GLM of SAS (release 9.2 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). When a significant difference was detected, means were compared using the F-protected least significant difference (LSD) test (p < 0.05).

2.5 Results

2.5.1 Yield The results show that Nugget had the lowest yield of cones (27.1 %DM) while Galena had the highest (44 %DM) (Table 2.1). Galena had also the highest fresh weight of stem (945.0 g / plant), while Nugget had the lowest fresh (260.7 g / plant) and dry weight (89.7 g / plant) of stem (Table 2.1). Plants of Brewers Gold had the most of leaves (661.7 g of fresh leaves / plant ; 257.7 g of dry leaves / plant) whereas plants of Cascade had the lowest (222.5 g of fresh leaves / plant ; 78.2 g of dry leaves / plant). Percentage of dry matter varied from 27.1 to 44.0 % for cones, from 33.6 to 39.0 % for leaves and from 30.2 to 40.2 % for stems (Table 2.1).

Table 2.1. Fresh and dry weight (FW and DW) and percentage of dry matter (% DM) of cones, leaves and stems of the plants of each cultivar.

Cones Leaves Stem

FW DW DM FW DW DM FW DW DM (g) (g) (%) (g) (g) (%) (g) (g) (g) C 542.5bc 158.2b 28.0b 222.5d 78.2d 35.1b 424.2c 128.7c 30.2c W 817.0b 289.5b 34.6ab 538.0ab 182.2b 33.6b 658.0b 216.0b 32.7bc N 427.5c 113.5b 27.1b 321.2cd 109.5cd 34.1b 260.7c 89.7c 34.6b B 1243.0a 540.5a 43.7a 661.7a 257.7a 39.0a 808.2ab 327.5a 40.2a G 1321.7a 603.5a 44.0a 434.7bc 151.7bc 35.3b 945.0a 297.2a 32.1bc C: Cascade, W: Willamette, N: Nugget, B: Brewers Gold, G: Galena. Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test.

2.5.2 Prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols content in cones Table 2.2 presents the amounts of desmethylxanthohumol, xanthohumol, α- and β- acids, proanthocyanidins and total polyphenols in cones. Cones of Nugget had the highest content of α-acids (10.8 % DM), proanthocyanidins (1.7 % DM) and total polyphenols (4.6 % DM). Cones of Cascade had the highest content in desmethylxanthohumol (0.1 % DM) but the lowest content of xanthohumol (0.3 % DM), proanthocyanidins (1.0 % DM) and total polyphenols (3.8 % DM). Cones of Willamette had the lowest content of desmethylxanthohumol (0.03 % DM), α-acids (3.7 % DM) and β-acids (3.5 % DM) while cones of Brewers Gold had the highest xanthohumol content (0.6 % DM); cones of Galena had the highest content of β-acids (6.7 % DM).

Table 2.2. Amounts (% DM) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in cones.

DMX XN α-acids β-acids PAC TPC Brewers Gold 0.04b 0.6a 6.3b 3.9c 1.3a 4.1a Nugget 0.08a 0.5ab 10.8a 4.1c 1.7a 4.6a Galena 0.07a 0.3c 6.7b 6.7a 1.6a 4.5a Cascade 0.10a 0.3c 5.4bc 5.4b 1.0a 3.8a Willamette 0.03b 0.4bc 3.7c 3.5c 1.7a 4.6a Treatments with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test.

51 2.5.3 Prenylated chalcones, bitter acids, proanthocyanidins and total polyphenols content in leaves Table 2.3 presents the amounts of desmethylxanthohumol, xanthohumol, α- and β-acids, proanthocyanidins and total polyphenols in leaves. Leaves of Brewers Gold had the highest content of xanthohumol (0.01 % DM) and β-acids (0.07 % DM), while leaves of Nugget had the highest content of α-acids (0.09 % DM). Leaves of Galena had the highest content of proanthocyanidins (1.1 % DM) and total polyphenols (3.2 % DM), but the lowest content of xanthohumol (0.01 % DM) and α-acids (0.08 % DM). Leaves of Cascade had the lowest contents of proanthocyanidins (0.3 % DM) and total polyphenols (1.1 % DM). Leaf contained very low amounts of xanthohumol and α-acids in comparison with cones, but contained almost the half of proanthocyanidins and total polyphenols amounts found in cones (Table 2.2 and Table 2.3). Moreover, no correlation was found between yields of cones and leaves and their total polyphenol content (Figure 2.1).

Table 2.3. Amounts (%DM) of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in leaves.

DMX XN α-acids β-acids PAC TPC Brewers Gold 0.008a 0.014a 0.08a 0.07a 0.6cb 2.04bc Nugget 0.008a 0.011b 0.09a 0.06ab 0.9ab 2.9ab Galena 0.008a 0.010b 0.08a 0.05bc 1.1a 3.2a Cascade 0.008a 0.011b 0.08a 0.07a 0.3c 1.1c Willamette 0.008a 0.010b 0.08a 0.04c 0.8ab 2.5ab Treatments with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test.

6! (a) y = 0.0001x + 4.2848! R² = 0.00413! 5!

3! TPC (%DM) ! 2!

0! 0! 100! 200! 300! 400! 500! 600! 700! Yield (g/plant)!

4! (b)

y = 0.0021x + 2.0209! R² = 0.03134! 3!

2! TPC (%DM) !

0! 0! 50! 100! 150! 200! 250! 300! Yield (g/plant)!

Figure 2.1. Correlation between total polyphenols content (TPC) and yield of dried cones (a) and leaves (b) !

2.6 Discussion and conclusion Leaves and stems represented 24.5 % and 30.5 % of the dry weight of the plant, respectively. Hop by-product are usually burned or land filled (Gardea-Torresdey et al., 2002), which is a huge loss of this biomass. Leaves contained small but detectable amounts of desmethylxanthohumol (0.008 %), xanthohumol (0.010-0.014 %), α-acids (0.08-0.09 %) and β-acids (0.04-0.07 %). However, they contained higher amounts of proanthocyanidins (0.3-1.1 %) and total polyphenols (1.1-3.2 %). De Keukeleire et al. (2003) also reported a similar concentration of xanthohumol in leaves. However, we found that β-acids did not predominate over the α-acids. Xanthohumol, α-acids, proanthocyanidins and total polyphenols contents in leaves are correlated to its contents in cones; cones and leaves of Brewers Gold had the highest content in xanthohumol, cones and leaves of Nugget had the

53 highest content of α-acids and cones and leaves of Cascade had the lowest content of proanthocyanidins and total polyphenols. In conclusion, hop is a source of important compounds for brewing and biomedical applications. Cones of Nugget contained the highest concentrations of xanthohumol and α-acids. Nugget's cones extracts may be used in anti-viral treatments, anti-cancer therapies and in the brewing industry. Galena and Brewers Gold were the most productive cultivars. Hop leaf represent a large proportion of plant, which could be valorized especially for its proanthocyanidins and total polyphenols contents.

2.7 Acknowledgements The research was funded by the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation (MAPAQ), Nutra Canada and Houblonnière Gosselin. Christiana Sarraf gratefully acknowledges the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT) and the Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et Génie (CRSNG) du Canada for BMP-Innovation PhD fellowship. The authors would like to thank Pascal Dubé, Chemist, M.Sc. for his technical laboratory assistance, and Dr. Dudonné for a scientific support.

Chapitre 3 : Yield and chemical composition of cones, leaves and stem of nine hop (Humulus lupulus L.) cultivars

Christiana Sarraf1, Sébastien Leonhart1,2, Paul Angers1, André Gosselin1,2 and Yves Desjardins1

1. Horticulture Research Center, Faculty of Agriculture and Food Sciences, Université Laval, Québec (Québec city), Canada.

2. Nutra Canada, Champlain, Québec, Canada.

3.1 Résumé Le but de cette étude était de déterminer le rendement et la teneur en 8-prenylnaringénine (8-PN), en desméthylxanthohumol (DMX), en xanthohumol (XN), en acides α et β, en proanthocyanidines (PAC) et en composés phénoliques totaux (CPT) dans les cônes, les feuilles et les tiges de 5 cultivars de houblon provenant des États-Unis (Cascade, Galena, Nugget, Willamette et Brewers Gold) et de 4 cultivars provenant de l'Europe (Admiral, Vital, Agnus et Herald) cultivés biologiquement au Québec, Canada. Nos résultats ont montré que les cultivars provenant des États-Unis produisent plus de cônes que les cultivars provenant de l'Europe. En revanche, les cônes des cultivars européens ont une teneur plus élevée en molécules bioactives. Les feuilles et les tiges contenaient des quantités faibles, mais décelables de 8-PN, de DMX, de XN et d'acides α et β. Toutefois, ils contenaient des concentrations élevées de PAC et de CPT. Nos résultats montrent également que, après 12 mois d'entreposage, il y eu des pertes substantielles de XN et d'acides α et β dans les cônes secs de Brewers Gold, alors que les concentrations de ces molécules ont augmenté dans les cônes secs de Nugget. La composition des cônes congelés est demeurée constante. En outre, les concentrations de XN et d'acides β ont diminué, alors que la concentration de PAC a augmenté dans les feuilles sèches des deux cultivars après 12 mois d'entreposage.

3.2 Abstract The present work was conducted to determine the yield and the content of 8- prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α- and β- acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in cones, leaves and stems of 5 hop cultivars purchased from United States (Cascade, Galena, Nugget, Willamette and Brewers Gold) and 4 hop cultivars purchased from Europe (Admiral, Vital, Agnus and Herald) organically grown in Québec, Canada. Our data showed that cultivars purchased from United States produced more cones than cultivars purchased from Europe. In contrast, cones of the European cultivars had higher contents of bioactive molecules. Leaves and stems contained small, but detectable amounts of 8-PN, DMX, XN, α-acids and β-acids. However, they contained high concentrations of PAC and TPC. Our data showed also that, after 12 months of storage, there were substantial XN and α- and β-acids losses in dried cones of Brewers Gold whereas the content these molecules increased in dried cones of Nugget. The composition of frozen cones remained constant. In addition, concentration of XN and β-acids decreased while concentration of PAC increased in dried leaves of both cultivars after 12 months of storage.

3.3 Introduction Hop (Humulus lupulus L.) is a dioecious plant cultivated in most temperate areas of the world, mainly for its female inflorescences known as cones (Callemien et al., 2005; Li and Deinzer, 2006). These cones possess distinct glandular trichomes, the lupulin glands, which contain the lupulin, a yellowish resinous powder (Hampton et al., 2002). The lupulin contains hop bitter acids, essential oils and flavonoids used primarily in the brewing industry, but also in the biomedical field (Kavalier et al., 2011). Hop is used in brewing for its secondary metabolites, the prenylated acylphloroglucinols (α- and β-acids), which are responsible for the bitterness of beer (Nagel et al., 2008). Humulone and lupulone are the dominant forms of α- and β-acids in most cultivars (Priest and Stewart, 2006). The ratio α- acid : β-acid depends on the cultivar, and for a given cultivar, on growth conditions (Garcia-Villalba et al., 2006). Some hop cultivar s can contain up to 19 % of their dry matter (DM) as α-acids. These are qualified as "super-α-hops" (De Keukeleire et al., 2003). In addition, hop is a significant source of phenolic compounds (Ceh et al., 2007). Dried hop cones contain between 4 and 14 % DM of total polyphenols content (TPC) such as phenolic acids, prenylated chalcones, flavonoids, catechins and proanthocyanidins (PAC) (Kavalier et al., 2011). The lupulin glands produce flavonoids of the chalcone type, such as xanthohumol (XN), exclusively since they do not have the enzyme required for the conversion of chalcones into corresponding flavanones (Gerhauser, 2005a). Xanthohumol is the most abundant prenylated flavonoid in cones (0.1 to 1% DM) (Miranda et al., 1999; Stevens and Page, 2004). More than 13 related chalcones were found in cones at concentrations 10 to 100 times lower than the concentration of xanthohumol (Ceh et al., 2007; Magalhaes et al., 2007; Stevens and Page, 2004). Desmethylxanthohumol (DMX) is also present in hop cones and is considered as the precursor of the majority of flavonoids. DMX gives by isomerization a potent phytoestrogen, the 8-prenylnaringenin (8-PN) (Zanoli and Zavatti, 2008). Moreover, hop is considered as a rich source of PAC. Depending on the cultivar and the geographical origin, hop cones contain 0.5 to 5 % DM of PAC (Li and Deinzer, 2007).

Hop bitter acids and prenylflavonoids accumulate mainly in the lupulin glands that lie between the bracts of cones (Priest and Stewart, 2006; Rybacek, 1991) but also on the

61 underside of young leaf (Kavalier et al., 2011; Stevens and Page, 2004). Each kg of fresh cones generates at least 1 kg of residual material (leaves, stem, branches and disintegrated cones) which is a significant biomass loss (Grilc and Dabrowski, 1994). Leaves mostly contain proteins (23 %) and can be used in animal feeding (Grilc and Dabrowski, 1994). They also contain small, but detectable amounts of XN (Nagel et al., 2008). According to Ceh et al. (2007), leaves may contain 0.009 to 0.08 % DM of XN. Furthermore, leaves contain more β-acids than α-acids (De Keukeleire et al., 2003).

At harvest, hop cones contain near 80 % of water (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985). Humidity content of cones should decrease to 8-12 % water before storage (Henderson and Miller, 1972; Neve, 1991; Thompson et al., 1985). Once dried, hop cones must be placed under suitable conditions for long-term storage. In addition, cones may absorb off-odors from their environment. Canbas et al. (2001) and Rybacek (1991) showed that 6 month storage in the dark at ambient temperature causes a significant loss of α- and β-acids and an increase in xanthohumol. Similarly, after a year storage period, only 46 % of the initial content in PAC could be detected (Hummer and Schreier, 2008). The oxidation of hop cones is therefore an essential factor to control to preserve the quality of hops used in the brewing industry (Garcia-Villalba et al., 2006).

The aim of the present work was to determine the yield and the content of 8-PN, DMX, XN, α- and β-acids, PAC and TPC in cones, leaves and stems of nine hop cultivars (Cascade, Galena, Nugget, Willamette, Brewers Gold, Admiral, Vital, Agnus and Herald) grown in Quebec, Canada. Further on, we wanted to know if stem and leaves content of the studied compounds might be sufficiently high to justify their extraction. We also determined the effect of conservation method (drying and freezing) on the chemical composition of hop cones and leaves after 12 months of storage.

3.4 Materials and methods

3.4.1 Plant material and growing conditions The hopyard is located at Ste-Sophie d'Halifax, Quebec, Canada (46° 09′ 12″ N 71° 42′ 28″ W). Nine hop cultivars were investigated; five of them were obtained from United States (Cascade, Galena, Nugget, Willamette and Brewers Gold), two from Czech Republic

(Agnus and Vital) and two from United Kingdom (Admiral and Herald). In May 2012, rootstocks of the 9 cultivars were planted according to an experimental design with 3 blocks. Experimental plots contained 5 plants of the same cultivar. Distance between plants was 4 feet. Plants were grown organically; fertigation consisted of converted organics 3-2-1, potassium sulphate (0-0-50) OMRI and Asco SSP soluble algae at a rate of 250 lbs/ha. Amblyseius fallacis was used to prevent and control two-spotted spider mite.

In September 2013, plants of each cultivar were harvested and leaves, cones and stem of each plant were separated carefully. Fresh and dry weights of these parts were measured to determine the yield of each cultivar. Dry materials were stored at 10 °C until analyzed. In August 2012, leaves and cones of two cultivars (Brewers Gold and Nugget) were harvested then divided into two groups; the first was frozen at -20 °C shortly after harvest and the second was air-dried (50 °C), then stored at 15 °C. All samples were stored in the dark and analyzed after 12 months of storage.

3.4.2 Chemicals Xanthohumol, (+/-) 8-prenylnaringenin, desmethylxanthohumol, epicatechin, gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent were purchased from Sigma Aldrich (Missouri, USA). International Calibration Extract ICE-2 [14.45 % cohumulone, 34.94 % (humulone + adhumulone), 12.92 % colupulone, 12.02 % (lupulone + adlupulone)] was purchased from The American Society of Brewing Chemists (Minnesota, USA). Acetonitrile HPLC grade and methanol HPLC grade were purchased from EMD chemicals Inc. (New Jersey, USA). Glacial acetic acid 99.7 % and formic acid 88 % were purchased from Anachemia Canada Co. (Montreal, Canada). Sodium carbonate was purchased from Fisher Scientific (Ottawa, Canada).

3.4.3 Extraction Dry hop cones, leaves and stems were ground and sieved (0.5 mm for cones and leaves and 1 mm for stems) while frozen material was ground in liquid nitrogen. Extraction was conducted at room temperature by adding 10 mL of methanol 100 % to 0.5 g (or 1 g of frozen materials) of cones, leaves or stem measured into 50 mL centrifuge tubes. The tubes were then vortexed for 1 min, sonicated for an hour and centrifuged at 3500 rpm for

63 15 min. The supernatant was collected and the residue was re-extracted with 10 mL methanol 80 % for an hour. After centrifugation (3500 rpm, 15 min), the supernatant was collected and mixed with the first supernatant. Sample of the supernatant (1 mL) was withdrawn and filtered through non-sterile 0.45 µm 13 mm nylon syringe filter (Chromatographic Specialties Inc., Brockville, ON, Canada) prior to analysis by HPLC.

3.4.4 Analytical procedure

3.4.4.1 Total polyphenols

Total polyphenols content was determined by the Folin-Ciocalteu assay. 100 µL of the sample, the standard or the control (water), 2 mL of water and 200 µL of Folin-Ciocalteu reagent were mixed for 1 to 8 min in a UV cuvette prior to the addition of 900 µL of sodium carbonate 20 %. The mixture was incubated for 2 hours at room temperature. The absorbance of the solution was then measured at 765 nm in a spectrometer (Thermo Spectronic). The standard curve was drawn using the absorbance obtained for standards of gallic acid of 50, 100, 250 and 500 ppm. Concentrations of samples are then calculated using the standard curve.

3.4.4.2 Xanthohumol, desmethylxanthohumol, 8-prenylnaringenin and α- and β-acids

Xanthohumol, desmethylxanthohumol, 8-prenylnaringenin, and bitter acids were analyzed by HPLC coupled to UV according to the method of De Keukeleire et al. (2003) with modifications. Quantitative analyses were performed using a Waters 600-MS control system, a Waters 717 Plus injector and a Waters 996 photodiode-array detector with a reverse phase C18 column (Synergi Hydro-RP). Solvent A was water and solvent B was methanol. Both solvents were acidified with 0.025 % (v/v) formic acid. Gradient profile was: 0-20 min, 25 % A and 75 % B; 20-35 min, 10 % A and 90 % B; 35-50 min, 25 % A and 75 % B. Volume of injected sample was 10 µL, flow of solvents was 1 mL/min and temperature of the column was 30 °C. The detection was done at 314 and 370 nm for α- and β-acids and desmethylxanthohumol and xanthohumol respectively. The peaks were identified by comparing the retention time with those of the standard for each of these

compounds and the quantification was carried out by measuring the area under the peaks of the chromatograms compared to the standard curves.

3.4.4.3 Proanthocyanidins

Proanthocyanidins were fractionated according to their degree of polymerization (DP) and analyzed by HPLC coupled to fluorescence according to the method of Wallace and Giusti (2010). The analyses were performed using an Agilent 1260 infinity system equipped by a normal phase column Develosil Diol. The solvents used were acetonitrile acidified with 2 % acetic acid (solvent A) and methanol:water:acetic acid 95:3:2. The separation was performed by a linear gradient of the solvent B: 0 to 40 % from 0 to 35 min, 40 to 100 % from 35 to 40 min, 100 to 100 % from 40 to 45 min and 100 to 0 % from 45 to 50 min. The flow of these solvents was maintained to 0.8 mL/min, the injection volume was 5 µL and the temperature of the column was 35 °C. Fluorescence was detected at excitation and emission wavelengths of 230 and 321 nm respectively. The quantification was done using an external calibration curve of epicatechin, taking into account their relative response factors in fluorescence (Dudonne et al., 2014).

3.4.5 Statistical analysis Analyses of variance (ANOVA) of replicated samples were performed using the PROC GLM of SAS (release 9.2 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). When a significant difference was detected, means were compared using the F-protected least significant difference (LSD) test (p < 0.05).

3.5 Results

3.5.1 Yield Brewers Gold had the highest yield of cones (1996 kg/ha), followed by Willamette (1818 kg/ha) and Galena (1803 kg/ha) (Table 3.1). Agnus had the lowest yield of cones (276 kg/ha). No significant difference was detected for the yields of leaves and stems of the 9 cultivars. Hop cultivars produced 290 to 887 kg/ha of leaves and 361 to 1041 kg/ha of stems (Table 3.1). Plants bred in United States produced more cones, leaves and stems than

65 the plants bred in Europe. In addition, the percentage of dried cones was higher for the plants originating from United States (49 %) than those developed in Europe (38 %).

Table 3.1. Yield (kg/ha) of dried cones, leaves and stem of each cultivar

Origin Cultivar Cones1 Leaves2 Stem2 Brewers Gold 1996.3±945.6a 720.9±276.3 990.9±472.4 Nugget 580.2±297.2c 541.7±282.7 945.7±566.4 United States of America Galena 1802.6±453.7ab 491.1±103.8 894.7±74.1 Cascade 937.2±475.9bc 290.0±56.4 615.5±249.1 Willamette 1817.9±1192.9ab 887.2±602.9 1041.3±492.3 Admiral 869.4±601.9bc 512.9±206.0 758.5±253.9 United Kingdom Herald 583.2±556.8c 348.1±181.1 375.7±243.7 Agnus 276.2±29.0c 308.2±25.6 361.0±4.9 Czech Republic Vital 796.8±601.2bc 639.2±460.2 780.5±610.2 Pr>F 0.02 0.4 0.4 1:Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test. 2: No significant difference. Results are expressed as mean of triplicate ±standard deviation.

3.5.2 Chemical composition of cones Except for PAC, concentrations of the bioactive molecules in cones differed significantly between the 9 cultivars (Table 3.2). Cones of Galena had the highest content of β-1 (5.3 % DM), while cones of Admiral had the highest contents of 8-PN (15.6 ppm), XN (1.2 % DM) and α-1 (5.1 % DM) (Table 3.3). Cones of Herald had the highest contents of TPC (7.1 % DM) and cones of Vital had the highest contents of DMX (48.8 ppm), α-2 (10.4 % DM), β-2 (4.2 % DM), α-acids (13.5 % DM) and β-acids (8.2 % DM). Otherwise, cones of Willamette had the lowest contents of 8-PN (1.1 ppm), DMX (10.2 ppm), α-1 (2.2 % DM), α-2 (2.7 % DM), β-1 (2.3 % DM), β-2 (1.1 % DM), α-acids (4.9 % DM), β- acids (3.4 % DM) and TPC (3.8 % DM) and cones of Cascade had the lowest content of XN (0.6 % DM). The concentrations of bioactive molecules were 1.2 to 3.5 times higher in cones of the cultivars bred in Europe than in cones of the cultivars bred in United States of America.

Cones Leaves Stem

8-PN <0.0001 0.01 NS DMX <0.0001 NS - XN <0.0001 <0.0001 - α-1 <0.0001 0.0001 NS α-2 <0.0001 NS NS β-1 <0.0001 NS NS β-2 <0.0001 NS NS α-acids <0.0001 0.0006 NS β-acids <0.0001 NS NS PAC NS 0.0003 0.05 TPC 0.0003 0.008 0.04

Table 3.3. Concentrations of 8-prenylnaringenin (8-PN), desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), humulone + adhumulone (α-2), colupulone (β-1), lupulone + adlupulone (β-2), α- and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in cones

8-PN DMX XN α-1 α-2 β-1 β-2 α-acids β-acids PAC TPC (ppm) (ppm) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) B 5.5bc 12.3f 0.7cd 2.3e 3.1d 2.5d 1.3e 5.4e 3.8ed 0.7 4.1d N 1.5d 27.0c 0.8c 3.1d 7.8b 2.4d 2.0d 10.9c 4.4d 1.1 5.4bc G 1.8cd 18.6e 0.6d 3.7c 4.9c 5.3a 2.9b 8.6d 8.2a 1.3 5.6bc C 4.9bcd 31.2b 0.6d 2.5e 5.1c 3.1c 2.5c 7.6d 5.6c 1.5 5.3c W 1.1d 10.2f 0.7cd 2.2e 2.7d 2.3d 1.1e 4.9e 3.4e 0.6 3.8d Ad 15.6a 18.5e 1.2a 5.1a 7.9b 3.4c 2.0d 13.0ab 5.4c 0.9 6.2abc H 6.6b 24.3cd 0.7cd 4.5b 8.2b 3.1c 2.1d 12.7ab 5.2c 1.9 7.1a Ag 12.5a 21.4de 1.0b 4.3b 7.8b 4.0b 2.7bc 12.1bc 6.8b 1.1 6.1abc V 6.8b 48.8a 0.7cd 3.1d 10.4a 4.0b 4.2a 13.5a 8.2a 1.0 6.5ab Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test. B: Brewers Gold, N: Nugget, G: Galena, C: Cascade, W: Willamette, Ad: Admiral, H: Herald, Ag: Agnus, V: Vital.

3.5.3 Chemical composition of leaves No significant differences were detected for the concentrations of DMX (2.0 ppm), α-2 (0.05 % DM), β-1 (0.03 % DM), β-2 (0.03 % DM) and β-acids (0.06 % DM) in leaves (Table 3.2). Concentration of 8-PN ranged from 0.1 ppm (Cascade) to 0.7 ppm (Vital) while concentration of XN ranged from 2.1 ppm (Vital) to 3.6 ppm (Brewers Gold) (Table

67 3.4). Concentration of α-1 varied from 0.02 % DM (Cascade) to 0.1 % DM (Herald). The highest concentrations of α-acids (0.2 % DM) and β-acids (0.2 % DM) were detected in the leaves of Herald. Leaves of Galena had the highest content of PAC and TPC (3.4 and 8.4 % DM respectively) while leaves of Cascade had the lowest content of PAC and TPC (0.6 and 3.0 % DM respectively) (Table 3.4).

Table 3.4. Concentrations of 8-prenylnaringenin (8-PN), xanthohumol (XN), cohumulone (α-1), α- acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC) in leaves

8-PN XN α-1 α-acids PAC TPC (ppm) (ppm) (%DM) (%DM) (%DM) (%DM) Brewers Gold 0.2c 3.6a 0.03b 0.08b 0.9b 4.3b Nugget 0.4bc 2.4d 0.03b 0.09b 1.1b 5.1b Galena 0.4bc 2.1d 0.05b 0.09b 3.4a 8.4a Cascade 0.1c 3.2ab 0.02b 0.07b 0.6b 3.0b Willamette 0.2c 3.4ab 0.03b 0.08b 0.7b 3.7b Admiral 0.5ab 2.3d 0.05b 0.09b 1.1b 4.1b Herald 0.6ab 3.0bc 0.13a 0.18a 1.2b 4.0b Agnus 0.3bc 2.6cd 0.03b 0.08b 1.0b 4.4b Vital 0.7a 2.1d 0.03b 0.07b 1.3b 4.9b Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test.

3.5.4 Chemical composition of stems No significant difference was detected for the concentrations of 8-PN (0.2 ppm), DMX (2.0 ppm), XN (2.0 ppm), α-1 (0.02 % DM), α-2 (0.04 % DM), β-1 (0.02 % DM), β-2 (0.02 % DM), α-acids (0.06 % DM) and β-acids (0.04 % DM) in stems (Table 3.2). Stems of Herald had the highest content of PAC and TPC (3.0 and 6.9 % DM respectively) while stems of Cascade had the lowest content of PAC and TPC (1.5 and 4.0 % DM respectively) (Table 3.5).

Table 3.5. Concentrations of proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in stem

PAC TPC (%DM) (%DM) Brewers Gold 2.4ab 6.0ab Nugget 2.1bc 5.2bc Galena 2.4ab 5.4abc Cascade 1.5c 4.0c Willamette 2.2bc 5.8ab Admiral 2.4ab 6.0ab Herald 3.0a 6.9a Agnus 2.3ab 6.2ab Vital 2.5ab 5.2bc Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test

3.5.5 Yield and chemical composition In order to determine the cultivars that give, simultaneously, high yield and high contents of XN, bitter acids and polyphenols, we multiplied the concentrations of the studied molecules (% DM) by the yield (kg/ha). Cones of Brewers Gold contained the highest amount of XN per hectare and cones of Galena contained the highest amounts of α-acids, β- acids, PAC and TPC per hectare (Table 3.6). In addition, leaves and stem of Galena had the highest amounts of PAC and TPC (Table 3.7).

Cultivar Yield 8-PN DMX XN α-acids β-acids PAC TPC Brewers Gold 1996.3a 0.4ab 1.0 14.4 104.8 72.9b 14.9 79.0 Nugget 580.2c 0.03c 0.6 4.9 61.0 25.4bc 5.8 30.4 Galena 1802.6ab 0.1c 1.3 10.5 155.6 148.2a 20.6 98.4 Cascade 937.2bc 0.2bc 1.2 5.2 70.8 52.5bc 13.8 49.3 Willamette 1817.9ab 0.07c 0.7 13.2 87.7 61.3bc 12.0 70.2 Admiral 869.4bc 0.5a 0.6 10.4 111.0 46.3bc 7.8 53.4 Herald 583.2c 0.1c 0.5 4.0 76.4 31.2bc 8.8 38.5 Agnus 276.2c 0.1c 0.2 2.7 33.4 18.6c 3.1 16.8 Vital 796.8bc 0.2bc 1.5 6.1 107.2 66.2bc 7.3 51.0 Pr>F 0.02 0.02 0.2 0.1 0.3 0.01 0.2 0.1 Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test.

69 Table 3.7. Yield of leaves and stem (kg/ha) and content (kg/ha) of proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols (TPC)

Leaves Stems Cultivar Yield PAC TPC Yield PAC TPC Brewers Gold 720.9 5.9bc 28.4 991.9 21.1 54.4 Nugget 541.7 6.03bc 27.2 945.7 22.3 54.6 Galena 491.1 16.1a 39.9 894.7 21.2 48.6 Cascade 290.0 1.7c 8.9 615.5 9.2 25.0 Willamette 887.2 6.2bc 33.5 1041.3 21.6 58.8 Admiral 512.8 5.7bc 20.7 758.4 18.3 45.7 Herald 348.0 3.8bc 12.7 375.7 11.4 25.9 Agnus 308.2 3.0bc 13.3 361.0 8.3 22.4 Vital 639.2 8.8b 32.2 780.5 20.3 41.8 Pr>F 0.4 0.01 0.2 0.4 0.4 0.4 Cultivars with the same letter are not different at P <0.05 according to F-protected LSD test

3.5.6 Effect of the conservation method on cones composition After 12 months of storage, the concentrations of DMX, XN, α-acids and β-acids varied significantly in dried cones while they remained constant in frozen cones (Table 3.8). In dried cones, the effect of the conservation time on the chemical composition varied between cultivars. Concentrations of XN, α-acids, β-acids decreased in dried cones of Brewers Gold after 12 months of storage while they increased in the dried cones of Nugget (Figure 3.1). Concentration of DMX decreased in the dried cones of both cultivars while concentrations of TPC and PAC remained constant (Figure 3.1).

Table 3.8. ANOVA of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in dried and frozen cones

DMX XN α-acids β-acids PAC TPC Cultivar (C) 0.0003 NS 0.0004 0.002 NS NS Dry Time (T) 0.0005 NS NS 0.002 NS NS C x T NS 0.0001 0.01 0.0001 NS NS Cultivar (C) NS NS NS NS 0.004 NS Frozen Time (T) NS NS NS NS NS NS C x T NS NS NS NS NS NS

!!!!!!!

DMX! XN! 0.15! (a) 1.00! (b)

0.75! 0.10!

0.50!

0.05! Concentration (%DW) ! Concentration (%DW) ! 0.25!

0.00! 0.00! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! Brewers Gold! Nugget! Brewers Gold! Nugget! α-acids! (c) β-acids! (d) 15! 8!

6! 10!

Concentration (%DW) ! Concentration (%DW) ! 2!

0! 0! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! Brewers Gold! Nugget! Brewers Gold! Nugget!

TPC! PAC! 10.0! (e) 4! (f)

7.5! 3!

5.0! 2!

Concentration (%DW) ! 2.5! Concentration (%DW) ! 1!

0.0! 0! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! Brewers Gold! Nugget! Brewers Gold! Nugget! Figure 3.1. Variation of the concentrations of desmethylxanthohumol (a), xanthohumol (b), α-acids (c), β-acids (d), total polyphenols (e) and proanthocyanidins (f) in the dried cones of Brewers Gold and Nugget after 12 months of storage. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).

3.5.7 Effect of the conservation method on leaves composition No interaction was detected between cultivars and storage time (Table 3.9). After 12 months of storage, concentrations of XN and β-acids decreased in dried leaves while they increased in frozen leaves for both cultivars (Figure 3.2). In addition, concentration of PAC in dried leaves increased after 12 months of storage (Figure 3.2). A further investigation on the degree the polymerization of PAC in dried leaves showed that the concentration of PAC polymers (DP>10) increase greatly (3.9 to 8.7 times) during storage (Table 3.10).

71 Table 3.9. ANOVA of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in dried and frozen leaves

DMX XN α-acids β-acids PAC TPC cultivar (C) NS NS NS NS NS NS Dry Time (T) NS 0.003 NS 0.03 0.01 NS C x T NS NS NS NS NS NS cultivar (C) Not detected NS NS NS NS NS Frozen Time (T) Not detected 0.02 NS 0.046 NS NS C x T Not detected NS NS NS NS NS

! XN! (a) XN! (d) ! 0.02! 0.0100 ! !!!

0.01! 0.005! Concentration (%FW) ! Concentration (%DW) !

0.00! 0.000! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! Brewers Gold! Nugget! Brewers Gold! Nugget! β-acids! (b) β-acids! (e) 0.15! 0.060 !

0.10! 0.04!

0.05! 0.02! Concentration (%FW) ! Concentration (%DW) !

0.00! 0.00! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! Brewers Gold! Nugget! Brewers Gold! Nugget! PAC! (c) PAC! (f) 1.00! 0.200 !

0.75! 0.15!

0.50! 0.10! Concentration (%FW) ! Concentration (%DW) ! 0.25! 0.05!

0.00! 0.00! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! 0 month! 12 months! Brewers Gold! Nugget! Brewers Gold! Nugget! Figure 3.2. Comparison of the concentrations of xanthohumol, β-acids and proanthocyanidins in the dried (a, b and c) and in the frozen (d, e and f) leaves of Brewers Gold and Nugget after 12 months of storage. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).

Table 3.10. Comparison of the degree of polymerization of proanthocyanidins (concentrations in ppm) in dried leaves of Brewers Gold and Nugget before and after 12 months of storage

Brewers Gold Nugget 0 month 12 months 0 month 12 months Monomers 16.4±2.2 34.6±6.3 Monomers 17.1±6.0 28.8±8.0 Dimers 23.8±10.3 23.8±3.7 Dimers 28.7±13.1 37.2±13.1 3-mers 2.5±2.7 5.7±1.7 3-mers 5.8±3.8 10.3±3.4 4-mers 6.1±1.3 4.7±1.3 4-mers 3.0±1.6 6.1±1.6 5-mers 3.8±1.5 3.4±1.3 5-mers 12.4±17.8 4.4±1.2 6-mers 0.9±1.1 1.1±0.3 6-mers 1.1±0.3 3.0±1.3 7-mers 26.0±3.7 1.4±0.4 7-mers 16.3±13.6 1.4±0.6 8-mers 0.5±0.5 0.5±0.0 8-mers 0.8±0.9 1.1±0.6 9-mers 0.4±0.3 0.5±0.2 9-mers 0.4±0.1 1.2±0.5 10-mers 0.9±1.0 1.9±0.2 10-mers 0.7±0.5 1.4±0.7 Polymers 35.5±34.5 139.9±12.1 Polymers 13.1±15.5 113.7±21.2 Total 117.0±48.7 217.6±25.9 Total 99.6±45.1 208.6±49.1 Results are expressed as mean of triplicate ±standard deviation.

3.6 Discussion and conclusion Hop is grown primary for its cones used in brewing and pharmaceutical industries. Leaves and stems are considered as by-product and have limited applications (Reddy and Yang, 2009). After harvest, they are usually burned or land filled (Gardea-Torresdey et al., 2002). Since leaves and stems represent more than 50 % of the total dry weight of the plants, there is an interest in determining the content of beneficial compounds in different parts of the plants.

The bittering power of hop is based on the α- and β-acids contents (Wample and Farrar, 1983). In addition, these compounds improve the quality and increase the shelf life of beer due to their bacteriostatic and antimicrobial activities (Haseleu et al., 2009; Larson et al., 1996; Royle et al., 2001). The hop bitter acids mainly inhibit Gram-positive bacteria, including some species of Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Mycobacterium and Streptomycetes. β-acids are twice more active than α-acids (Gerhauser, 2005b). Our results showed that cones contained 4.9 to 13.5 % DM of α-acids and 3.4 to 8.2 % DM of β-acids. Leaves and stems contained small amounts of α- and β-acids but leaves did not contain more β-acids than α-acids as reported by De Keukeleire et al. (2003).

73 Xanthohumol is efficient against the human immunodeficiency virus (HIV-1) and is a potential chemotherapeutic agent for HIV infections (Magalhaes et al., 2007). Otherwise, xanthohumol has been characterized as a chemopreventive agent against cancer (Ceh et al., 2007; De Keukeleire et al., 2003; Miranda et al., 1999). An antiproliferative activity against breast, colon and ovarian cancer cell lines in vitro was shown by Magalhaes et al. (2007) and Miranda et al. (1999). Our results showed that xanthohumol was concentrated mainly in cones (0.6 to 1.2 % DM). These concentrations are comparable to those reported by Miranda et al. (1999), De Keukeleire et al. (2003), Li and Deinzer (2007) and Kavalier et al. (2011). In addition, leaves contained small amounts of xanthohumol as reported by Nagel et al. (2008) and Ceh et al. (2007).

8-Prenylnaringenin is the most powerful phytoestrogen known to date and is produced by isomerization of desmethylxanthohumol (De Keukeleire et al., 2003; Stevens and Page, 2004). This molecule is a potential selective modulator of estrogen receptors and can be used for treating hot flashes and for preventing osteoporosis in postmenopausal women (Stevens and Page, 2004). According to our results, 8-prenylnaringenin is present primarily in cones (1.1 to 15.6 ppm) but also in leaves (0.1 to 0.7 ppm) and stems (0.2 ppm).

Proanthocyanidins are widely distributed in the plant Kingdom and represent the 2nd most abundant natural phenolic compound after lignin (Kelm et al., 2006; Li and Deinzer, 2007). Procyanidins are known for their antiviral, antimicrobial, anti-oxidative and anti-tumor promoting properties (Hummer and Schreier, 2008). They play also an important role in the protection against cardiovascular diseases (Rasmussen et al., 2005). Hop proanthocyanidins can prevent Alzheimer's and Parkinson's diseases (Olsovska et al., 2013). Hop cones contain mainly B-type proanthocyanidins (Stevens et al., 2002). A-type proanthocyanidins, found in cranberry, are used to prevent urinary tract infection (Roopchand et al., 2013). To our best knowledge, this is the first study that reports the presence of PAC in leaves and stems of hop. Leaves contained almost as much PAC as cones while stems contained 2 times more PAC than cones approximately. Leaves and stems contained also high concentrations of total polyphenols. Extraction efficiency on a dry weight matter was on average 22.4 % and 21.4 % for leaves and stems respectively compared to 36.7 % for cones.

Hop material must be stored because it is not practically possible to extract it shortly after harvest. Handling and storage may cause a loss of α- and β-acids which can affect the extraction yield, the quality of extracts and consequently the quality of beer (Daoud and Kusinski, 1992). Daoud and Kusinski (1992) studied the effect of storage on the degree of deterioration of hop and showed that cold storage can prevent the loss of α- and β-acids. Our results showed that by freezing hop cones, we prevent the DMX, X, α- and β-acids losses that occur in some cultivars. The increase of the concentration of XN in the dried cones of Nugget can be explained by the transformation of DMX into XN by the O- methyltransferase (Stevens and Page, 2004). Intelmann et al. (2009) also detected an increase of the concentration of XN in beer after 8 months of storage. The intensity of the oxidation process varies between cultivars (Garcia-Villalba et al., 2006). It seems that the cultivar Brewers Gold is much more prone to oxidation than the cultivar Nugget.

Proanthocyanidins are unstable after harvest and may bind to proteins and to cell walls in dried leaves (Martin-Cabrejas et al., 1997). They are then known as polyphenols fibers and are difficult to extract. During storage, small molecular weight non-tannin compounds can be transformed in proanthocyanidins, which can explain the increase of the concentration of proanthocyanidins (Martin-Cabrejas et al., 1997). These authors reported an increase of 11.8 % to 49.9 % of tannins in beans after 5 years of storage. Our results showed that the polymerization of proanthocyanidins could occur in dried leaves during storage. This might be of interest to the functional value of hop polyphenol since high DP PAC reach the gut microbiota and have an effect at the level of the microbiome. The synthesis of proanthocyanidins starts on the cytosolic face of the endoplasmic reticulum. Then, proanthocyanidins are transported into the vacuole for accumulation (Marles et al., 2003). The mechanism of polymerization of proanthocyanidins and the nature of the molecular species (enzymatic or non-enzymatic) that catalyzes the polymerization were unknown for a long time (Marles et al., 2003; Xie and Dixon, 2005). Brillouet et al. (2013) showed, recently, that proanthocyanidins are polymerized inside the tannosome (a new chloroplast- derived organelle). Polymerization begins from the inner face of the thylakoidal membrane of the tannosome. These organelles are then encapsulated in shuttles that ensure the transportation of proanthocyanidins into the vacuole (Brillouet et al., 2013). In dried material, proanthocyanidins are brought into close proximity and can probably react despite

75 lack of water. Since leaves contained mainly TPC and PAC and concentrations of PAC and TPC did not decrease for both conservation methods, we suggest drying leaves before storage. The optimized conditions for leaf drying were determined in a supplementary experiment (Annexe).

In conclusion, hop is a source of important compounds for brewing and biomedical applications. In this project, we are presenting new information on the content of these compounds in different plant parts of nine hop cultivars. Cultivars purchased from United States produced more cones than cultivars purchased from United Kingdom and Czech Republic. In contrast, cones of the European cultivars had higher contents of the studied molecules. Hop leaves and stems represent a large proportion of the whole plant and could be valorized especially for their high proanthocyanidins and total polyphenols contents. Freezing was a useful technique to prevent losses of bioactive molecules in hop cones. Variations of the chemical composition during storage depended on cultivar. No significant losses were detected when the dried leaves of both cultivars were stored for 12 months. Freezing is not necessary to protect bioactive molecules in hop leaves from degradation. Further studies will be conduct to obtain organic hop products using a green extraction technique.

3.7 Acknowledgements The research was funded by the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation (MAPAQ), Nutra Canada and Houblonnière Gosselin. Christiana Sarraf gratefully acknowledges the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT) and the Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et Génie (CRSNG) du Canada for BMP-Innovation PhD fellowship. The authors would like to thank Pascal Dubé, Chemist, M.Sc. for his technical laboratory assistance, Stéphanie Dudonné, PhD for her scientific support, Thomas Lécurieux and Margot Delfour for their technical laboratory support.

Christiana Sarraf1, Sébastien Leonhart1,2, Paul Angers1, André Gosselin1,2 and Yves Desjardins1

1. Horticulture Research Center, Faculty of Agriculture and Food Sciences, Université Laval, Québec (Québec city), Canada.

2. Nutra Canada, Champlain, Québec, Canada.

4.1 Résumé Cette étude rapporte les conditions optimales de l'extraction de desméthylxanthohumol, de xanthohumol, des acides α et β, des proanthocyanidines et des composés phénoliques totaux des cônes de houblon, et les conditions optimales de l'extraction des proanthocyanidines et des composés phénoliques totaux des feuilles et des tiges de houblon. L'extraction a été réalisée dans une perspective alimentaire avec uniquement de l'eau et de l'éthanol comme solvants. Les résultats des expériences factorielles ont montré que le rendement maximal d'extraction des molécules étudiées a été obtenu à 30 °C, 2 h d'extraction, une concentration d'éthanol de 70 % et un ratio solide:liquide de 1:15 pour les cônes et les tiges et de 1:40 pour les feuilles. Les paramètres optimaux de l'extraction à l'eau des proanthocyanidines et des composés phénoliques totaux des feuilles et des tiges ont été de 6 h d'extraction à 90 °C et de 1 h d'extraction à 90 °C, respectivement.

4.2 Abstract This study reports the best conditions for desmethylxanthohumol, xanthohumol, α- and β- acids, proanthocyanidins and total polyphenols extraction from hop cones, and the best conditions for proanthocyanidins and total polyphenols extraction from hop leaves and stems. The extraction was performed in a generally recognized as safe (GRAS) concept using only water and ethanol as solvents. The results of factorial experiments showed that the maximum extraction yield of the studied molecules was obtained at 30 °C, 2 h of extraction, an ethanol concentration of 70 % and a solid: liquid ratio of 1:15 for cones and stems and 1:40 for leaves. The optimal water extraction parameters of proanthocyanidins and total polyphenols from leaves and stems were 6 h of extraction at 90 °C and 1 h of extraction at 90 °C, respectively.

4.3 Introduction Hop is cultivated mainly for its female inflorescence called cones (Callemien et al., 2005; Li and Deinzer, 2006). The essential elements of cones are lupulin glands (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006) that contain bitter acids, essentials oil and flavonoids (Kavalier et al., 2011). Hop cones are an important raw material in brewing (Hampton et al., 2002; Li and Deinzer, 2006). Nowadays, hop cones are added during the brewing process not only to provide the bitterness and aroma to beer, but also to improve beer shelf-life. In addition, hop is an important source of phenolic compounds (Ceh et al., 2007). Dried hop cones contain 4 to 14 % of polyphenols, primarily phenolic acids, prenylated chalcones, flavonoids, catechins and proanthocyanidins (Kavalier et al., 2011).

The antiseptic properties of hop were described for the first time by Brown and Clubb (1913). Recent researches have shown that hop compounds have beneficial effects on health. α- and β-acids (humulones and lupulones) have antibacterial effect against Gram positive bacteria (Gerhauser, 2005b). Xanthohumol and its isomer, isoxanthohumol, have anti-inflammatory and anti-tumor activities (Nagel et al., 2008). These molecules prevent tumor formation by inhibiting the growth of pre-cancerous cells (Gerhauser et al., 2002).

Solvents such as methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate and, to a lesser extent, propanol and dimethylformamide are frequently used for the extraction of phenolic compounds (Collin and Crouzet, 2011). Methanol seems to be the most effective solvent to extract xanthohumol with a 90 to 92 % recovery factor (Magalhaes et al., 2007). However, supercritical CO2 and ethanol are the only two safe and eco-friendly solvents (Kowalczyk et al., 2013). Ethanol is an environmentally friendly solvent with high extraction efficiency and low toxicity and cost (Amado et al., 2014). It was one of the first solvents used to extract the aromatic and bitter hops components. Although ethanol is a powerful solvent, it has a low selectivity and extracts almost all components of the lupulin, chlorophylls, and cuticular waxes (Magalhaes et al., 2007). Therefore, the ethanol extract presents a high percentage of impurity, a dark color and a viscous consistency. Due to its polarity, ethanol is used to produce polyphenol-rich extracts (Formato et al., 2013; Kowalczyk et al., 2013).

Supercritical CO2 is currently one of the most used solvents in the manufacture of hop extracts. Supercritical CO2 extracts contain almost all the essential oils of hops, a high ratio

83 of α-acid: β-acids, a small amount of hard resins and traces of triglycerides, waxes, chlorophyll and inorganic salts (Magalhaes et al., 2007). Supercritical CO2 is selective for apolar substances (Kowalczyk et al., 2013). Due to its non-polarity, supercritical CO2 extract the ''soft resin'' and the aromatic compounds but do not extract polyphenols. In addition, supercritical CO2 extraction can be a quite expensive technique, while not being as efficient as ethanol to extract xanthohumol (Magalhaes et al., 2007).

A major aspect of the extraction of antioxidant compounds from plant materials is to determine the appropriate extraction conditions (Amado et al., 2014). In industrial conditions, for the production of food ingredients non-toxic organic solvents are preferred (Kowalczyk et al., 2013). The aim of this project was to develop a green extraction technology of hop material by using biomass and excipients approved by Ecocert Canada. The extraction was performed in a generally recognized as safe (GRAS) concept using only water and ethanol as solvents. More specifically, the objective was to determine the optimal extraction parameters that can be successfully applied at an industrial scale. Ethanol was selected as a solvent because it is environmentally friendly and relatively safe to human health. The extraction conditions (grinding, number of extraction, solid: liquid ratio, ethanol concentration, extraction temperature and extraction time) were studied to optimize the yields of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids and β-acids, proanthocyanidins (PAC) and total polyphenols content (TPC) in cones extracts. In addition, the extraction conditions (solvent, extraction temperature and extraction time) for PAC and TPC extraction from hop leaves and stems were also investigated. As it is likely that the effect of one parameter depends on the other, interactions between factors was taken into account.

4.4 Materials and methods

4.4.1 Plant material The hopyard is located at Ste-Sophie d'Halifax, Quebec, Canada (46° 09′ 12″ N 71° 42′ 28″ W). In September 2011, plants of Brewers Gold were harvested and transported on the same day to Université Laval where leaves, cones and stems of each plant were separated carefully then dried at 50 °C. Dry materials were stored at 10 °C until analyzed.

4.4.2 Chemicals Desmethylxanthohumol, xanthohumol, epicatechin, gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent were purchased from Sigma Aldrich (Missouri, USA). International Calibration Extract ICE-2 [14.45 % cohumulone, 34.94 % (humulone + adhumulone), 12.92 % colupulone, 12.02 % (lupulone + adlupulone)] was purchased from The American Society of Brewing Chemists (Minnesota, USA). Acetonitrile HPLC grade and methanol HPLC grade were purchased from EMD chemicals Inc. (New Jersey, USA). Ethanol (Alcool 95 %) was purchased from Alcool de commerce inc. (Boucherville, QC, Canada). Glacial acetic acid 99.7 % and formic acid 88 % were purchased from Anachemia Canada Co. (Montreal, Canada). Sodium carbonate was purchased from Fisher Scientific (Ottawa, Canada).

4.4.3 Extraction optimization

4.4.3.1 Cones extraction

Extraction parameters are usually optimized using one factor at a time approaches. However, it is well known that optimal conditions or interactions between variables cannot be predicted with this methodology (Amado et al., 2014). Six parameters were tested in three consecutive experiments. Parameters with the highest extraction yield were fixed for the next experimental step in the optimization process.

4.4.3.1.1 Experiment 1: Grinding and number of extraction

In this experiment, 0.5 g of whole cones or ground and sieved cones (0.5 mm) were extracted by one-step or two-step extraction using 15 mL of ethanol 70 % for 1h at ambient temperature. In two-step extraction, the volume of ethanol was divided in two equal volumes and the whole or ground cones were extracted by 7.5 mL of ethanol 70 % for 30 min. After centrifugation, the supernatant was collected and the residue was re-extracted with 7.5 mL of ethanol 70 % for 30 min. After centrifugation the two supernatants were mixed.

4.4.3.1.2 Experiment 2: Solid:liquid ratio and ethanol concentration

Solid: liquid ratios of 1:10, 1:20 and 1:40 were studied. Extractions were conducted by adding 5, 10 or 20 mL of ethanol 0, 30, 50, 70 and 95 % to 0.5 g of ground and sieved

85 cones measured in 50 mL tubes. The tubes were then vortexed for 1 min and sonicated for 1h at ambient temperature.

4.4.3.1.3 Experiment 3: Extraction time and temperature

Extraction was conducted by adding 20 mL of ethanol 70 % to 0.5 g of ground and sieved cones. Extraction times were 30 min, 1, 2, 4 and 6 hours and extraction temperatures were 30, 40, 50 and 60 °C.

4.4.3.2 Leaves and stems extraction and optimization of the solid:liquid ratio

Extraction was conducted by adding 20 mL of water to 1 g of ground and sieved leaves and stems. Extraction times were 1, 2, 4 and 6 hours and extraction temperatures were 60, 70, 80 and 90 °C. Solid:liquid ratio of 1:15, 1:20, 1:30 and 1:40 were investigated in order to reduce the quantity of ethanol used compared to that of methanol used in the analytical procedure without compromising the extraction yield. 1 g of ground and sieved cones, leaves or stems was extracted by 15, 20, 30 or 40 mL of ethanol 70 % for 2 h at 30 °C.

In all experiments, the tubes were centrifuged (3500 rpm, 5 min) after extraction and the supernatant was collected. Sample of the supernatant (1 mL) was withdrawn and filtered through non-sterile 0.45 µm 13 mm nylon syringe filter (Chromatographic Specialties Inc., Brockville, ON, Canada) prior to analysis by HPLC.

4.4.4 Analytical procedure

4.4.4.1 Total polyphenols

4.4.4.2 Desmethylxanthohumol, xanthohumol, α- and β-acids

Desmethylxanthohumol, xanthohumol and bitter acids were analyzed by HPLC coupled to UV according to the method of De Keukeleire et al. (2003) with modifications. Quantitative analyses were performed using a Waters 600-MS control system, a Waters 717 Plus injector and a Waters 996 photodiode-array detector with a reverse phase C18 column (Synergi Hydro-RP). Solvent A was water and solvent B was methanol. Both solvents were acidified with 0.025 % (v/v) formic acid. Gradient profile was: 0-20 min, 25 % A and 75 % B; 20-35 min, 10 % A and 90 % B; 35-50 min, 25 % A and 75 % B. Volume of injected sample was 10 µL, flow of solvents was 1 mL/min and temperature of the column was 30 °C. The detection was done at 314 and 370 nm for α- and β-acids and desmethylxanthohumol and xanthohumol, respectively.

4.4.4.3 Proanthocyanidins

Proanthocyanidins were fractionated according to their degree of polymerization (DP) and analyzed by HPLC coupled to fluorescence according to the method of Wallace and Giusti (2010). The analyses were performed using an Agilent 1260 infinity system equipped by a normal phase column Develosil Diol. The solvents used were acetonitrile acidified with 2 % acetic acid (solvent A) and methanol:water:acetic acid 95:3:2. The separation was performed by a linear gradient of the solvent B: 0 to 40 % from 0 to 35 min, 40 to 100 % from 35 to 40 min, 100 to 100 % from 40 to 45 min and 100 to 0 % from 45 to 50 min. The flow of these solvents was maintained to 0.8 mL/min, the injection volume was 5 µL and the temperature of the column was 35 °C. Fluorescence was detected at excitation and emission wavelengths of 230 and 321 nm, respectively. The quantification was done using an external calibration curve of epicatechin, taking into account their relative response factors in fluorescence (Dudonne et al., 2014).

4.4.5 Statistical analysis For cones extraction, the three experiments had 2x2, 3x5 and 4x5 factorial designs, respectively. For leaves ethanol extraction and leaves and stems hot water extraction 4x5 and 4x4 factorial designs were used, respectively. Analyses of variance (ANOVA) for each factor and for the interaction between the two factors were performed using the PROC

87 GLM of SAS (release 9.2 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). When a significant difference was calculated, means were compared using the F-protected least significant difference (LSD) test (p < 0.05).

4.5 Results and discussion

4.5.1 Cones extraction The ANOVA results (Table 4.1) showed that the studied parameters had a significant effect on the concentrations of DMX, XN, α-acids, β-acids, TPC and PAC. Interaction between these parameters also significantly affected the concentrations of the studied molecules. In the next section, will be presented the effect of each parameter as well as the interactions between extraction parameters.

Table 4.1. ANOVA results for desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β- acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in cones extraction

DMX XN α-acids β-acids TPC PAC Experiment 1 Grinding (G) <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 Number of extraction (N) NS NS NS NS 0.0079 NS G x N NS NS 0.0366 0.0451 0.0002 NS Experiment 2 Ethanol concentration (C) <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 Solid:liquid ratio (R) <0.0001 0.003 0.0004 0.02 <0.0001 <0.0001 C x R 0.003 0.02 NS 0.01 <0.0001 NS Experiment 3 Extraction temperature (Tp) 0.009 <0.0001 <0.0001 <0.0001 NS <0.0001 Extraction time (T) 0.02 NS 0.04 0.005 0.0008 NS Tp x T 0.02 0.003 0.03 0.006 0.0007 0.009

4.5.1.1 Effect of grinding and number of extraction

The interaction between the number of extraction and grinding significantly affected the concentrations of α-acids, β-acids and TPC (Table 4.1). The concentrations of these compounds in two-step extraction were higher than in one-step extraction for whole cones but lower for ground cones (Figure 4.1). No interaction was found between the number of extraction and grinding for DMX, XN and PAC and the number of extraction had no

significant effect on the concentrations of these molecules (Table 4.1). By grinding the cones, the concentrations of all the studied molecules were 2 to 3-times higher in the ! extract (Figure 4.1).

6! Whole cones (a)

3! One-step! Two-step!

2! Concentration (%DW) !

0! DMX! XN! α-acids! β-acids! TPC! PAC! 6! Ground cones (b)

3! One-step! Two-step!

2! Concentration (%DW) !

0! DMX! XN! α-acids! β-acids! TPC! PAC!

Figure 4.1. Concentrations of desmethylxanthohumol (DMX), xanthohumol (XN), α-acids, β-acids, total polyphenols content (TPC) and proanthocyanidins (PAC) in whole cones (a) and in ground cones (b) using! one step (0.5 g + 15 mL) or two-step extraction (0.5 g + 2x7.5 mL). Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars). ! ! !

Hop bitter acids, prenylflavonoids and the essential oils accumulate mainly in the glandular trichomes that lie between the bracts of cones (Priest and Stewart, 2006; Rybacek, 1991). By grinding the cones, lupulin glands and its content are more exposed to the solvent,

89 which facilitate their extraction. By adding one more step of extraction, concentrations of the studied molecules remained constant or decreased slightly (Figure 4.1 (b)). Our results are contradictory to those of Yang et al. (2009) who reported an increase of the extraction rate of polyphenols from the bark of P. emblica by using multiple-step extraction. Usually, using two equal volumes of a solvent increase slightly the extraction yield in comparison with using all the solvent in one volume (Magalhaes et al., 2007). In the next experiments, the cones were grinded and the extraction was done in one step.

4.5.1.2 Effect of solid:liquid ratio and ethanol concentration

Interaction between solid: liquid ratios and ethanol concentrations significantly affected the concentrations of DMX, XN, β-acids and TPC (Table 4.1). For the ratio of 1:10, the concentration of DMX and XN increased as the concentration of ethanol increased (Figure 4.2). In contrast, for the ratios of 1:20 and 1:40, concentration of DMX increased with the increase of ethanol concentration until the concentration of 70 % ethanol then it decreased. For xanthohumol, the concentration reached a plateau after ethanol concentration of 70 % for the ratios 1:20 and 1:40. The concentration of β-acids increased with the increase of the ethanol concentration (Figure 4.3). In addition, the concentration of β-acids increased when the solid:liquid ratio increased from 1:10 to 1:40 for all ethanol concentrations except for the ethanol concentration of 50 % where the concentration of β-acids was higher in ratio 1:20 than in ratio 1:40. The concentration of TPC varied significantly between solid: liquid ratios (Figure 4.4). For the ratio of 1:10, the concentration of TPC was almost constant for all ethanol concentrations. For the 1:20 ratio, a peak was reached for ethanol concentration of 50 %, then the concentration of TPC decreased. For the 1:40 ratio, a maximum value was reached between 50 and 70 % ethanol, then the concentration of TPC decreased. No interaction was found between solid: liquid ratio and ethanol concentration for α-acids and PAC. The concentrations of α-acids and PAC increased significantly when the solid: liquid ratio increased. Concentration of α-acids increased with the increase of ethanol concentration until 70 % ethanol. Concentration of PAC increased from 0 to 50 % ethanol then it decreased for all solid: liquid ratio.

0.7! Solid :liquid ratio of 1:10 0.6! !

0.5!

0.4!

DMX (x10)! 0.3! XN!

Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

0.7! Solid :liquid ratio of 1:20

0.6!

0.5!

0.4!

DMX (x10)! 0.3! XN!

Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

0.7! Solid :liquid ratio of 1:40

0.6!

0.5!

0.4!

DMX (x10)! 0.3! XN!

Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

91 6! Solid :liquid ratio of 1:10

5! !

3! α-acids! 2! β-acids! Concentration (%DW) !

0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)! !

6! Solid :liquid ratio of 1:20

3! α-acids! β-acids! 2! Concentration (%DW) !

0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

6! Solid :liquid ratio of 1:40

3! α-acids! β-acids! 2! Concentration (%DW) !

0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

6! Solid :liquid ratio of 1:10

5! !

3! TPC! PAC! 2! Concentration (%DW) !

0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

6! Solid :liquid ratio of 1:20

3! TPC! PAC! 2! Concentration (%DW) !

0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

6! Solid :liquid ratio of 1:40

3! TPC! PAC! 2! Concentration (%DW) !

0! 0! 10! 20! 30! 40! 50! 60! 70! 80! 90! 100! Ethanol concentration (%)!

93 In general, the concentrations of the studied molecules increased when the solid:liquid ratio increased from 1: 10 to 1:40. For the ratio 1:40, the concentration of DMX, XN, α-acids and β-acids increased as the concentration of ethanol reached 70 %. Concentrations of TPC and PAC decreased significantly when ethanol concentration was above 70 %. The highest concentrations of DMX (0.03 %DW), XN (0.5 % DW), α-acids (4.3 % DW) and TPC (4.9 % DW) were obtained with a solid: liquid ratio of 1:40 and an ethanol concentration of 70 %. The highest concentration of β-acids (2.8 % DW) was obtained with a solid: liquid ratio of 1:40 and an ethanol concentration of 95 %. The highest concentration of PAC was obtained with a solid: liquid ratio of 1:40 and an ethanol concentration of 50 %. Based on the results of the experiment 2, a ratio of 1:40 and an ethanol concentration of 70 % were chosen for the next experiment.

In plant cells, soluble phenolic compounds are usually present in the vacuoles while flavonoids and insoluble polyphenols are combined to proteins and polysaccharides in the cell walls (Dixon and Paiva, 1995). A very high concentration of ethanol can decrease the extraction yield of polyphenols because it can denature the protein to which the polyphenols are bound (Jiang et al., 2007). By using alcoholic solvents, and particularly mixtures of alcohols and water, a high yield of phenolic compounds can be obtained (Pinelo et al., 2005; Yilmaz and Toledo, 2006). Kowalczyk et al. (2013) showed that the concentrations of total phenols and total flavonoids in hydroalcoholic extracts were higher than the concentrations of these molecules in aqueous extracts. Solvent concentration was found to have significant effect on polyphenols extraction from the bark of Phyllanthus emblica L. (Yang et al., 2009). Using organic solvents without water decreased the extraction yield of polyphenols (Kowalczyk et al., 2013). Our results agree with those of Yang et al. (2009) who reported that extraction rate of polyphenols decreased when ethanol concentration was more than 70 % and with the results obtained by Yang et al. (2009) and Jiang et al. (2007) who measured an increase of the extraction rate of polyphenols with the increase of solid:liquid ratio.

4.5.1.3 Effect of extraction time and extraction temperature

Interaction between extraction time and extraction temperature significantly affected the concentrations of all the studied molecules (Table 4.1). For the extraction temperatures of 30, 40 and 50 °C, the concentrations of DMX, XN, α-acids and β-acids increased between 30 min and 2 h of extraction then it decreased (Figure 4.5 and Figure 4.6). At 60 °C, the concentrations of those molecules continued to increase after 2 h of extraction. Concentration of DMX, XN, α-acids and β-acids decreased as the extraction temperature increased. At 30 °C, concentration of TPC increased between 30 min and 1 h, then it decreased between 1 and 6 h, while at 40 and 50 °C, it increased from 30 min to 4 h, then it decreased between 4 and 6 h (Figure 4.7). At 60 °C, the concentration of TPC increased between 30 min and 1 h, decreased from 1 to 2 h then increased again between 2 and 6 h. Concentration of PAC decreased between 30 min and 6 h at 50 and 60 °C while it increased between 2 and 6 h at 30 °C and between 4 and 6 hours at 40 °C. The highest concentrations of DMX (0.06 % DW), XN (0.7 % DW), α-acids (6.0 % DW) and β-acids (3.5 % DW) were obtained at 30 °C for 2 h extraction. The highest concentration of TPC (5.8 % DW) were obtained at 50 °C for extraction time of 4 h and the highest PAC (2.0 % DW) concentration was obtained in 2 h extraction at 40 °C.

The yield of extraction of natural compounds depends on temperature (Yang et al., 2009). Increasing the extraction temperature was an important factor to improve extraction yield of polyphenols. Due to high temperature, polysaccharides of the cell walls dissolved in solvent which weakened the bond between the polyphenols and the cell walls and consequently, the polyphenols were more exposed to solvents (Sun et al., 2002). According to Yang et al. (2009), the extraction rate of polyphenols increases from 20 to 50 °C, then it decreases between 50 and 60 °C. Hop components are sensitive to temperature; high temperatures cause the isomerization of hop compounds and especially xanthohumol

(Karabin et al., 2013). In addition, a long extraction time increases the chance of oxidation of phenolics if no reducing agents are added to the solvent (Naczk and Shahidi, 2004).

95 0.9! Tp = 30ºC 0.8!

0.7! !

0.6!

0.5!

0.4! DMX (x10)! XN! 0.3! Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! Extraction time (h)!

0.9! Tp = 40ºC 0.8!

0.7!

0.6!

0.5!

0.4! DMX (x10)! XN! 0.3! Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! Extraction time (h)!

0.9! Tp = 50ºC 0.8!

0.7!

0.6!

0.5!

0.4! DMX (x10)! XN! 0.3! Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! Extraction time (h)!

0.9! Tp = 60ºC 0.8!

0.7!

0.6!

0.5!

0.4! DMX (x10)! XN! 0.3! Concentration (%DW) ! 0.2!

0.1!

0.0! 0! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! Extraction time (h)! Figure 4.5. Effect of extraction time on the concentration of desmethylxanthohumol (DMX) and xanthohumol (XN) for extraction temperatures of 30 °C, 40 °C, 50 °C and 60 °C. Results are expressed as mean of triplicate ± standard deviation (represented by the error bars).

8! Tp = 30ºC 7! ! 6!

4! α-acids! 3! β-acids!

Concentration (%DW) ! 2!