Lesson 10bis: Western

➢ Principio ➢ Rilevamento con anticorpi ➢ Esempi e applicazioni ➢ Immunoprecipitazione “Western blot” Trasferimento di proteine su membrana dopo elettroforesi

Gel E Membrana Prima del trasferimento Dopo il trasferimento

Si usano membrane che legano qualunque proteina venga in contatto con esse Immunoblotting Rilevamento di proteine con anticorpi specifici

Migrazione

Gel Membrana Western blot

Lo scopo è quello di identificare una proteina specifica tra le proteine separate sul gel

Una volta che le proteine sono esposte sulla superficie di una membrana possono essere fatte reagire, ad esempio, con un anticorpo specifico

È presente proteina riconosciuta da Ab? Quale banda/e (spot/spots) risultano positive? : trasferimento su filtro di DNA dopo elettroforesi (Inventato da Southern) : trasferimento su filtro di RNA dopo elettroforesi Western Blot: trasferimento su filtro di proteine Sir Edwin Mellor Southern dopo elettroforesi Eastern blot: tecnica per l'analisi delle modificazioni post traduzionali delle proteine. Northwestern blot: per l'analisi delle interazioni tra RNA e proteine Southwestern blot: per l'analisi delle interazioni tra DNA e proteine

Passaggi chiave del WB

➢ Trasferimento ➢ Lavaggio (SDS) ➢ Saturazione ➢ Anticorpo primario ➢ Lavaggio (interazioni aspecifiche) ➢ Anticorpo secondario ➢ Lavaggio (interazioni aspecifiche) ➢ Sviluppo (substrati cromogenici o luminescenti) separation 1

2 «Sandwich» 3 Protein transfer preparation Protein transfer – WB sandwich Side view Before transfer: After transfer: + +

Direction of - - transfer Bands in (electric field) Gel Bands on nitrocellulose gel

Note: all the layers are tightly pressed together Protein transfer – WB sandwich

Note: all the layers are tightly pressed together Scelta della membrana Legame aspecifico con proteine mediante interazioni elettrostatiche e idrofobiche

• Nitrocellulose • Nylon • PVDF (Polyvinylidene Fluoride) Protein separation 1

2 «Sandwich» 3 Protein transfer preparation Wet protein transfer Semi-dry transfer Protein transfer

➢ Il trasferimento delle proteine su di una membrana viene fatto avvenire mediante applicazione di una differenza di potenziale. La direzione di migrazione dipende dalla carica delle proteine ➢ Per proteine già separate mediante SDS PAGE, la migrazione verso la mambrana è anodica, dal momento che recano una carica netta negativa data dall’SDS ➢ Lavaggi della membrana dopo il trasferimento per allontanare SDS ➢ Per trasferimento di proteine dopo gel non-denaturante possibile sfruttare tampone di trasferimento con pH basico e migrazione verso anodo, oppure tampone di trasferimento con pH acido e migrazione verso catodo. Saturazione della membrana con latte o BSA (blocking)

Prima di aggiungere l’anticorpo, il filtro va saturato con proteine (latte scremato o BSA) per non avere rumore di fondo

Blocking Lavaggi e incubazione con anticorpo

4 5 6 7 8 WB con anticorpi Iari e IIari

Anticorpi primari: anticorpi che Anticorpi secondari: anticorpi che riconoscono come antigene la riconoscono come antigene la regione proteina di interesse (o un suo tag) costante delle immunoglobuline di una determinata specie WB con proteina A radioattiva

La proteina A (o proteina G) si lega alla regione costante delle immunoglobuline +

Possibile usare proteina A (o proteina G) radioattiva per sviluppare con autoradiografia WB con anticorpi IIari coniugati ad un enzima

Detection signal (colorimetric or chemiluminescent) Enzyme covalently attached to 2ari antibody Enzyme substrate

Secondary antibody Anti-target protein antibody against 1ari antibody (IgG)- primary antibody

Membrane blot Target protein Substrati cromogenici Fosfatasi alcalina (AP)

BCIP (5-bromo-4-chloro-3´-indolylphosphate)

Perossidasi (horseradish peroxidase, HRP)

tetramethylbenzidine 4-chloro-l-naphthol diaminobenzidine Substrati della perossidasi

Il prodotto colorato della reazione è insolubile e precipita in situ e fa visualizzare le bande

Prodotto attività AP o HRP Un’alternativa all’uso di anticorpi Luminolo

425 nm

Luminol is oxidized in the presence of horseradish peroxidase and hydrogen peroxide to form an excited state product (3-aminophthalate*). The 3-aminophthalate* emits light at 425 nm as it decays to the ground state. Luminolo Riassumendo, i passaggi chiave del WB

➢ Trasferimento ➢ Lavaggio (SDS) ➢ Saturazione ➢ Anticorpo primario ➢ Lavaggio (interazioni aspecifiche) ➢ Anticorpo secondario ➢ Lavaggio (interazioni aspecifiche) ➢ Sviluppo (substrati cromogenici o luminescenti) Esempi di analisi WB .1

HeLa Cell lysate SDS-PAGE Western blot 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Chemiluminescent Chemiluminescent detection of CDK7 protein marker (BioRad Bulletin 2032) Esempi di analisi WB .2

Estratto totale di lievito

Colorazione proteine totali Anti-pTyr Ab + Coomassie [I125]protein A

Come evidenziare lo standard di MW sul filtro? Esempi di analisi WB .3

Espressione di proteina eterologa in cellule di E. coli

Western blot con anticorpi anti 6X His-tag (HIS.H8 Abcam 1/1000 dilution)

Lane 1 : 6x His-tagged protein expressed in BL21 (pET15b) at 1 µg Lane 2 : 6x His-tagged protein expressed in BL21 (pET15b) at 0.1 µg

Secondary IRDye® 800CW goat anti-mouse IgG (H+L) polyclonal at 1/5000 dilution

Performed under reducing conditions.

Exposure time : 5 minutes This image is courtesy of an Abreview submitted by Rachel Loh 2D western blotting IEF IEF

Colorazione proteine totali Anticorpi dal siero di pazienti affetti da malattia autoimmune Isolation of antibody-reactive by 2D and immunoblotting. (a) Two-dimensional gel electrophoresis of HeLa-cell nuclear extract. Molecular-weight marker positions are indicated on the left. Isoelectric focusing was in the horizontal dimension with the anode on the left. The gel is silver-stained. (b) Immunoblot from a separation similar to the one shown in (a), developed with the patient serum diluted 1:200. (Arthritis Res 2000, 2:407-414) Direct Antibody- Antibodies specific for a given protein (or group of agarose bead proteins) are immobilized on a solid-phase substrate such as superparamagnetic microbeads or on Antigen agarose beads. The beads with bound antibodies are then added to the protein mixture, and the proteins that are targeted by the antibodies are captured onto the beads via the antibodies; in other words, they become immunoprecipitated

Protein complexes bound to the beads are harvested by centrifugation or through the use of a magnetic bar Centrifuge to harvest the pellet Indirect immunoprecipitation Protein A- Antibodies that are specific for a given protein, or a agarose bead group of proteins, are added directly to the mixture of protein. The antibodies are not attached to a solid- phase support yet and are free to float and bind their Antigen targets. Then beads coated with protein A/G are added to the Antibody mixture of antibody and protein. At this point, the antibodies, which are now bound to their targets, will stick to the beads.

Protein complexes bound to the beads are harvested by centrifugation or through the use of a magnetic bar Centrifuge to harvest the pellet Steps of immunoprecipitation

• Lyse cells and prepare sample for immunoprecipitation. • Pre-clear the sample by passing the sample over beads alone • Incubate solution with antibody against the protein of interest. • Precipitate the complex of interest, removing it from bulk solution. • Wash precipitated complex several times. After the final wash, remove as much supernatant as possible. ➢ Euizione specifica • Elute proteins from the solid support (low-pH or SDS sample ➢ SDS-PAGE loading buffer. • Analysis can be done in a variety of ways: ➢ Colorazione Coomassie - SDS-PAGE & gel staining. - SDS-PAGE followed by MALDI-Mass Spectrometry - Western Blot using another antibody Nota bene:

• Western: Prima denaturazione, poi reazione con Ab

• Immunoprecipitazione: Prima reazione con Ab, poi denaturazione  co-precipitazione di interattori dell’antigene Co-immunoprecipitazione

Protein A- InteractorInteractor agarose bead Antibody Antigen

Centrifuge to harvest the pellet Co-immunoprecipitazione

➢ Euizione specifica Antigene Antigene Catena H ➢ SDS-PAGE Interattore Interattore ➢ Colorazione coomassie Catena L

• Elution of proteins from the solid support • Again, analysis of proteins involved in the complex can be done in a variety of ways: - SDS-PAGE & gel staining. - SDS-PAGE followed by MALDI-Mass Spectrometry - Western Blot using another antibody Immunoprecipitazione

MW

Catena H anticorpo

Antigene

Catena L anticorpo

Analisi mediante WB di proteine eluite dopo immunoprecipitazione