Carolina Rodrigues Lincoln De Carvalho Caracterização De Uma Amostra De Indivíduos Com Deficiência Intelectual De Origem

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CAROLINA RODRIGUES LINCOLN DE CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO DE UMA AMOSTRA DE INDIVÍDUOS COM DEFICIÊNCIA INTELECTUAL DE ORIGEM INDETERMINADA: ASPECTOS CLÍNICOS, CITOGENÉTICOS E MOLECULARES.

CAMPINAS 2017

CAROLINA RODRIGUES LINCOLN DE CARVALHO

CARACTERIZAÇÃO DE UMA AMOSTRA DE INDIVÍDUOS COM DEFICIÊNCIA INTELECTUAL DE ORIGEM INDETERMINADA: ASPECTOS CLÍNICOS, CITOGENÉTICOS E MOLECULARES.

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, Área de Concentração Genética Médica.

ORIENTADORA: PROF.ª DRª ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA. COORIENTADORA: PROF.ª DRª MARICILDA PALANDI MELLO.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINA RODRIGUES LINCOLN DE CARVALHO, ORIENTADA PELA PROF.ª DRª ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA.

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO CAROLINA RODRIGUES LINCOLN DE CARVALHO

ORIENTADOR: ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA

COORIENTADOR: MARICILDA PALANDI DE MELLO

MEMBROS:

1. PROF.ª DRª. ANTONIA PAULA MARQUES DE FARIA

2. PROF.ª DRª. ANA BEATRIZ ALVAREZ PEREZ

3. PROF.ª DRª. ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA

4. PROF.ª DRª. CARMEN SÍLVIA BERTUZZO

5. PROF.ª DRª. MARIA ISABEL DE SOUZA ARANHA MELARAGNO Souza Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas. A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: DATA DA DEFESA 25/08/2017

Dedico este trabalho ao meu filho Pietro, força que me move para frente e me faz prosperar. Razão pela qual luto diariamente em busca de um mundo melhor.

Ao meu marido Pedro, amor de vidas, minha fortaleza, e quem sensivelmente me escolheu como companheira nessa caminhada rumo ao amadurecimento espiritual.

Aos meus pais, Márcia e Marcel e meu irmão Lucas, Vocês são meu porto seguro, minha rede de apoio e meus exemplos de vida. Não poderia ter feito melhor escolha.

Aos meus filhos de pena Luna, Tchuco, Dino e Branquinha (in memoriam) e meus irmãozinhos de pena, Juvenal e Júnior. Com o carinho gratuito e sincero que vocês têm por mim, acredito em um mundo melhor.

AGRADECIMENTOS

Do curso de Aprimoramento Profissional ao Doutorado foram mais de 10 anos de Unicamp. Durante todo esse tempo tive a oportunidade de viver na prática o “mundo da genética”, passar pelas mais diversas experiências, conhecer pessoas que me fariam refletir sobre meu papel nesse mundo, evoluir pessoal e profissionalmente. Tornei-me assessora científica na técnica que desenvolvi no mestrado, biologista, professora universitária... Casei, tive um filho e agora, de certa maneira, outro. Enfim, foram tantos momentos bons e ruins também (afinal, eles também nos movem pra frente, não é mesmo?), que reafirmo - agora com mais convicção – aquilo que havia dito nos agradecimentos da dissertação: de que sozinho não fazemos nada. Se não fosse a colaboração de várias pessoas – desde a faxineira e o segurança do departamento (cada qual na sua função); pacientes e suas famílias nos confiando a pesquisa; orientadores me guiando profissionalmente; amigos e família ajudando no que fosse necessário e Deus me conduzindo sempre, eu não teria chegado onde cheguei. Por isso, todas as linhas do mundo não serão suficientes para expressar minha gratidão a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a construção e realização deste meu sonho, agora concretizado.

Primeiramente agradeço a Deus por guiar-me sempre pelos melhores caminhos, com saúde, sabedoria, paciência e força para enfrentar os desafios diários.

Aos meus pais Márcia e Marcel, irmão Lucas, meu marido Pedro e meu filho Pietro por tudo que fizeram e fazem por mim. Pela base sólida que tenho como família. Juntos somos um só, por isso esta vitória compartilho com vocês. Amo-os incondicionalmente.

Minhas avós Marina e Odete por serem exemplos em minha vida.

Meus padrinhos Neide e Mauri, tios, primos, sogros, cunhados e minha sobrinha Laís por me apoiarem e torcerem pelo meu sucesso.

À minha orientadora Profa. Dra. Antonia Paula Marques de Faria pela oportunidade de crescimento profissional, pessoal e pela sua orientação, amizade e pela confiança em mim para a condução deste trabalho.

À minha coorientadora Profa. Dra. Maricilda Palandi de Mello pela orientação, amizade, ajuda técnica e por ter me acolhido no CBMEG.

À Profa. Dra. Iscia Lopes Cendes, pelo apoio científico.

Ao Prof. Dr. Fábio Rossi, por sua amizade e auxílio nos testes de microarray.

Ao Dr. Fernando Marson e Henrique Lattanzi, pela amizade e auxílio na análise estatística.

Às Dras. Denise Cavalcanti e Carolina Moreno pelo encaminhamento dos e colaboração com os pacientes do CAISM.

À banca examinadora de exame de qualificação e defesa de dissertação Profes. Dres. Ana Beatriz Alvarez Perez, Andréa Trevas Maciel Guerra, Camila Andrea, Carmen Sílvia Bertuzzo, Danyella Dogini, Débora Gusmão, Mara Sangues Guaragna e Maria Isabel Melaragno pela contribuição na elaboração da minha tese de doutorado.

Aos pacientes e familiares que participaram deste estudo.

Às agências financiadoras CNPq, FAPESP e FAEPEX pelos auxílios concedidos.

À Universidade Santa Cecília (UNISANTA), em especial os Dres. Lúcia Teixeira, Sílvia Teixeira e Marcelo Teixeira, pela concessão da ajuda de custo. Agradeço também ao diretor do curso Prof. Roberto Patella e coordenadores Camilo Seabra e Jorge Santos também por todo o auxílio necessário para a realização deste estudo.

Às equipes de residentes da Genética Clínica, em especial à Elaine Lustosa, Joana Prota e Mireille Gomes; minha gratidão ainda maior à Joana Prota também pelo auxílio com o microarray e exoma.

À equipe de enfermeiras, por auxiliarem na consulta e coleta dos pacientes.

Às secretárias do Departamento de Genética Médica; do CBMEG e de pós-graduação - em especial à Márcia “Marcinha” - pela amizade e presteza em me auxiliar.

Às responsáveis pela limpeza, sem as quais não seria possível trabalhar no laboratório.

A todos os funcionários do CBMEG e DGM – FCM/UNICAMP.

Aos colegas do Departamento de Genética Médica e do CBMEG pela amizade construída, apoio e auxílio em todos esses anos.

A todos os professores que contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional.

E não menos importante...

Minhas amigas Célia Patriani e meninas do grupo “Sendo Mães” e meu amigo Daniel Siquieroli pela amizade, apoio e incentivo.

Minha amiga Laisa di Salvio pelo seu exemplo de força, coragem e determinação para conseguir seus objetivos. Te agradeço pelo incentivo em todos os momentos e por me ensinar que a amizade verdadeira se renova todos os dias, independente da distância.

Meus amigos Ilária, Társis e Luciana pela amizade, pelo auxílio, apoio, incentivo e torcida.

Minha amiga Pamela Pontes, minha eterna gratidão por toda a ajuda nesses anos. Especialmente sem você este trabalho não teria sido conduzido, tampouco concluído. Espero um dia poder retribuir à altura tudo que fez por mim.

Minha amiga Milena Simioni: uma pessoa como poucas. Muito obrigada por toda a ajuda, em todas as esferas deste trabalho.

“Veni, vidi, vici”

“Vim, vi, venci” Júlio César, 45 a.C.

RESUMO A deficiência intelectual (DI) ou transtorno do desenvolvimento intelectual, isolada ou associada a anomalias congênitas, corresponde a uma das categorias mais amplas de distúrbios, acometendo de 1% a 3% da população nos países industrializados, enquanto nos países em desenvolvimento estima-se prevalência cerca de três vezes maior. Devido à heterogeneidade de fatores causais associados a essa condição, sua investigação diagnóstica pode ser complexa e 40% dos casos não têm sua origem determinada. Recentemente, com a aplicação da tecnologia genômica, alterações cromossômicas crípticas, mutações gênicas e rearranjos genômicos diversos vêm sendo relacionados à DI, modificando as estratégias de pesquisa nessa área. Entre as mesmas, destacam-se as de Microarray-based Copy Number Variation (CNV), Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification (MLPA), a Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH), além de Next-Generation Sequencing (NGS). Em projeto anterior, a técnica de MLPA foi aplicada na investigação de rearranjos subteloméricos em 62 pacientes, com alteração em 3,2% deles. Diante da perspectiva de prosseguir na triagem por MLPA e, quando negativa, indicar a análise por microarray cromossômico ou o sequenciamento do exoma, foi proposta a continuidade do projeto, visando caracterizar uma amostra de indivíduos com DI de origem indeterminada quanto a aspectos clínicos e fatores causais. Sendo assim, 300 indivíduos foram avaliados clinicamente, submetidos a triagem por MLPA subtelomérico, com identificação de alterações patogênicas em 22 (7,3%) [del1p (2 casos), del1q, del4p, del6p, del18q, delXYp, dup7p, dup7q, dup11p, dup15p, dup17p, dupXYp (2 casos), del1p/dup4p, del4p/dup8p, del4p/dup12p, dup4p/del8p, dup4p/del13q, del5p/dup9p, del9p/dup19q e dup9p/del18p]. Entre os 278 restantes, 21 pacientes foram estudados pela a técnica de microarray, com detecção de variantes patogênicas em 11 [del1p36.33-p36.32/dup4p16.3-p15.33; del7p15.3-p15.2; del7q11.23; del15q21.2-q22.2; del22q11.21; delXq21.1-q21.33; dup6p11.2/dup10q26.3; dup12p13.2-p13.1; dup15q11.2- q13.1; dupXp22.33 e dupXq26.2). O sequenciamento do exoma foi realizado para outros 13 indivíduos, com alterações observadas em sete casos concluídos, envolvendo os genes KIRREL3/SHANK2, CTTNBP2, TCF4, PRKCG, RAI1, HTT e KMT2D. Considerando as 40 alterações identificadas pelas três técnicas utilizadas, em 36 casos foi estabelecida correlação genótipo-fenótipo, corroborando o diagnóstico laboratorial. Conforme verificado na literatura, a aplicação desses métodos, incluídos nos algoritmos atuais de investigação diagnóstica da DI, se mostram efetivos e complementares, ampliando consideravelmente as perspectivas de determinação do diagnóstico etiológico dessa condição.

Palavras chave: Deficiência intelectual. Aberrações cromossômicas. MLPA. Hibridização genômica comparativa. Sequenciamento completo de exoma.

ABSTRACT The intellectual disability (ID) or intellectual development disorder isolated or associated with congenital anomalies, is the most frequent disability and occurs 1% to 3% of general population in industrialized world, while in developing countries it is considered to be three times higher. The etiology is heterogeneous and includes multiple genetic and environmental factors, although its cause remains undetermined in about 40% of the cases. Recently, with the application of genomic technology, cryptic chromosomal alterations, gene mutations and several genomic rearrangements have been related to ID, modifying research strategies in this area. Among them, the most important are microarray, Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification (MLPA), Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), and Next Generation Sequencing (NGS). Lincoln-de-Carvalho (2009) applied the MLPA technique to investigate 62 patients for subtelomeric rearrangements and found copy number changes in 3.2% of cases. Considering the perspective of continuing the search for CNVs by MLPA and indicate the analysis by microarray or exome sequencing for negative cases, the present project followed with the propose of characterizing a sample with idiopathic ID regarding clinical aspects and genetic etiology. Therefore, the clinical characterization of 300 patients was performed based on their medical records. After screening using subtelomeric MLPA, pathogenic alterations were identified in 22 (7.3%) cases [del1p (2 cases), del1q, del4p, del6p, del18q, delXYp, dup7p, dup7q, dup11p, dup15p, dup17p, dupXYp (2 cases), del1p/dup4p, del4p/dup8p, del4p/dup12p, dup4p/del8p, dup4p/del13q, del5p/dup9p, del9p/dup19q e dup9p/del18p]. The microarray technique was performed for 20 patients, and pathogenic variants were detected in 11 of them [del1p36.33-p36.32/dup4p16.3-p15.33; del7p15.3-p15.2; del7q11.23; del15q21.2-q22.2; del22q11.21; delXq21.1-q21.33; dup6p11.2/dup10q26.3; dup12p13.2-p13.1; dup15q11.2-q13.1; dupXp22.33 and dupXq26.2). Whole exome sequencing was performed for 13 individuals with alterations observed in seven concluded cases involving the KIRREL3/SHANK2, CTTNBP2, TCF4, PRKCG, RAI1, HTT and KMT2D genes. Considering the total of 40 alterations detected by combining the three tecniques, the genotype-fenotype correlations were concluded in 36 cases, corroborating the laboratory diagnosis. As verified in the literature, the application of these methods, included in the current diagnostic algorithms of DI, are effective and complementary, considerably broadening the prospects for determining the etiological diagnosis of this condition.

Key words: Intellectual disability. Chromosome aberrations. Multiplex ligation-dependent probe amplification. Comparative genomic hybridization. Whole exome sequencing.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Técnica de MLPA e suas etapas. 33

Figura 2. Algoritmo para a investigação de DI (modificado de Miller et al.61. 37

Figura 3. Algoritmo proposto para a investigação de DI idiopática (adaptado de Galasso et al.60 e Miller et al.61). 42

Figura 4. Ciclos utilizados na amplificação da região de interesse dos genes alterados. 46

Figura 5. Ciclos utilizados nas reações de sequenciamento pelo método de Sanger. 47

Figura 6. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição numérica, dos pacientes incluídos no estudo. 60

Figura 7. Gráfico do resultado de MLPA para os indivíduos sem alteração (P) para o kit SALSA MLPA P036. 62

Figura 8. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 para os cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68). 64

Figura 9. Em azul, localização dos genes SLC6A12 e KDM5A (cromossomo 12p), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 12p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 64

Figura 10. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P070 para os cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68). 65

Figura 11. Sequenciamento do fragmento complementar à sonda 12p (kit SALSA MLPA P036) correspondente a uma porção da sequência do exon 18 do gene SLC6A12. 65

Figura 12. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 para os seis indivíduos (P74, P97, P108, P113, P122 e P257). 66

Figura 13. Em azul, localização dos genes POLR3K e DECR2 (cromossomo 16p), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 16p presentes nos kits MLPA P036 e P070, respectivamente108. 66

Figura 14. Gráfico do resultado de MLPA com o kit MLPA P070 para os seis indivíduos (P74, P97, P108, P113, P122 e P257). 67

Figura 15. Sequenciamento do fragmento complementar à sonda 16p (kit MLPA P036) correspondente à porção da sequência do exon 1 do gene POLR3K. 67

Figura 16. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070 para os casos P57 (Lincoln-de-Carvalho, 2009) e P98. 69

Figura 17. Em azul, localização dos genes TNFRSF4 e TNFRSF18 (cromossomo 1p36), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 1p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070 respectivamente108. 70

Figura 18. Resultado de FISH com sonda subtelomérica para a região 1p para o paciente P98, mostrando apenas um sinal (verde) no cromossomo 1 normal (seta branca). 70

Figura 19. Genes relacionados aos sinais clínicos da deleção 1p36 e sua localização no cromossomo 1, modificado de Jordan et al.133. 73

Figura 20. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 1p e duplicação 4p no paciente. 77

Figura 21. FISH com as sondas subteloméricas para 1p (marcadas em vermelho) e 4p (em verde), mostrando um sinal em vermelho no cromossomo 1 normal, nenhum sinal em vermelho no cromossomo 1 anômalo, três sinais em verde: dois para os dois cromossomos 4 normais e outro sinal no cromossomo 1 derivado. 77

Figura 22. Microarray mostrando a deleção em 1p36.3. Em vermelho a região deletada e abaixo, os genes localizados nesta região. 78

Figura 23. Microarray mostrando a duplicação em 4p16. Em azul a região duplicada em abaixo, os genes nesta região. 78

Figura 24. Representação esquemática mostrando CNVs patogênicas descritas na região identificada (14Mb de 4p16). 79

Figura 25. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção 4p no paciente. 80

Figura 26. Em azul, localização do gene PIGG (cromossomo 4p16.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 4p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 81

Figura 27. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 4p e duplicação 8p no paciente. 82

Figura 28. Em azul, localização do gene FBCO25 (cromossomo 8p23.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 8p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 82

Figura 29. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 4p e duplicação 12p no paciente. 83

Figura 30. Resultado de FISH com sondas subteloméricas para as regiões 4p (verde) e 12p (vermelho) para a paciente P124, mostrando apenas um sinal no cromossomo 4 normal (seta) e três sinais vermelhos para os cromossomos 4 (derivado) e 12 (sem alteração). 84

Figura 31. Resultado de FISH com sondas subteloméricas para as regiões 4p (verde) e 12p (vermelho) para a mãe da paciente P124, mostrando um rearranjo equilibrado entre os cromossomos 4 e 12. 84

Figura 32. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 4p e deleção 8p no paciente. 85

Figura 33. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 4p e deleção 13q no paciente. 86

Figura 34. Em azul, localização dos genes F7 e CDC16 (cromossomo 13q34), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 13q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 87

Figura 35. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção XYp no paciente. 97

Figura 36. Em azul, localização do gene SHOX (cromossomos X e Y, em região pseudoautossômica), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas XYp presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 97

Figura 37. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018 mostrando a deleção envolvendo as regiões Xp22.31 e Xp22.33. 98

Figura 38. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção 1q no paciente. 100

Figura 39. Em azul, localização do gene SH3BP5L ou KIAA1720 (cromossomo 1q44) cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 1q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 100

Figura 40. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção 18q no paciente. 104

Figura 41. Localização dos genes RBFA e CTDP1 (cromossomo 18q23), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 18q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 104

Figura 42. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 7p no paciente. 106

Figura 44. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P365 mostrando a duplicação envolvendo as regiões 7p22.1 e 7p22.3 no paciente. 107

Figura 45. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 11p no paciente. 109

Figura 46. Em azul, localização dos genes RIC8A e BET1L (cromossomo 11p15.5), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 11p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 109

Figura 47. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 15q-cen no paciente. 112

Figura 49. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P365 mostrando a duplicação envolvendo a região 15q11.2 com os genes MKRN3, MAGEL2 e SNRPN no paciente. 113

Figura 50. Representação esquemática mostrando o cromossomo 15 e, abaixo dele, um zoom da região duplicada na paciente P130, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (5,9 Mb em 15q11.2-13.1)108. 113

Figura 51. Mapa de expressão dos genes para a SPW e AS, bem como os pontos de quebra (BP1-BP5) comuns às condições. Na reta vermelha, a extensão da duplicação observada na paciente P130, com 5,9 Mb, entre BP2 e BP3. BP – ponto de quebra; Cen – Centrômero; Tel – telômero. 115

Figura 52. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 17p no paciente. 118

Figura 53. Em azul, a localização do gene RPH3AL (cromossomo 17p13.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 17p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 118

Figura 54. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação XYp nos pacientes P258 e P303. 121

Figura 55. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018. As setas em vermelho mostram a extensão da duplicação XYp na paciente P303. 121

Figura 56. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018. As setas em vermelho mostram a extensão da duplicação XYp no paciente P258. 123

Figura 57. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 7q no paciente. 125

Figura 58. Em azul, a localização do gene VIPR2 (cromossomo 7q36.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 7q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 126

Figura 59. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 9p e duplicação 19q na paciente. 128

Figura 60. Em azul, localização genes DMRT1 e DOCK8 (cromossomo 9p24.3), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 9p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 128

Figura 61. Em azul, a localização do gene CHMP2A (cromossomo 19q13.43), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 19q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108. 128

Figura 62. Resultado de FISH com sondas subteloméricas para as regiões 9p (vermelho) e 19q (verde) em núcleos interfásicos para a paciente P169, mostrando apenas um sinal vermelho e três sinais verdes. 129

Figura 63. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 9p e duplicação 18p no paciente. 132

Figura 64. Em azul, localização dos genes USP14 e THOC1 (cromossomo 18p11.32), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 18p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108. 132

Figura 65. Representação esquemática mostrando o cromossomo X e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P23, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (16,4 Mb em Xq21.1-q21.3)108. 139

Figura 66. Representação esquemática mostrando o cromossomo 15 e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P420, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (6,9 Mb em 15q21.2-q22.2) 108. 142

Figura 67. Representação esquemática mostrando o cromossomo X e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P81, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (1,4 Mb em em Xq26.2)108. 145

Figura 68. Representação esquemática mostrando o cromossomo 7 e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P108, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (2,4 Mb em 7p15.3p15.2)108. 148

Figura 69. Representação esquemática mostrando o cromossomo 22 e, abaixo dele, um zoom da região deletada na paciente P151, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (3,2 Mb em 22q11.21)108. 152

Figura 70. Representação esquemática mostrando o cromossomo 7 e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P152, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (1,4 Mb em 7q11.23)108. 156

Figura 71. Representação esquemática mostrando o cromossomo 6 e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P158, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (421 kb em 6p11.2)108. 162

Figura 72. Representação esquemática mostrando o cromossomo 10 e, abaixo dele, um zoom da região deletada no paciente P158, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (143 kb em 10q26.3)108. 163

Figura 73. Representação esquemática mostrando o cromossomo 12 e, abaixo dele, um zoom da região deletada na paciente P284, com os genes incluídos nessa alteração mostrados abaixo do mapa. A terceira parte da figura mostra algumas CNVs descritas na região identificada (664 kb em 12p13.2p13.1)108. 165

Quadro 1. Critérios para seleção de pacientes com rearranjos teloméricos submicroscópicos (adaptada de De Vries et al.100). 41

Quadro 2. Caracterização clínica dos pacientes com DI idiopática. 53

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. SALSA MLPA P036-E2 HUMAN TELOMERE-3. 43

Tabela 2. SALSA MLPA P070-B2 HUMAN TELOMERE-3. 45

Tabela 3. SALSA MLPA P365-A1 HUMAN TELOMERE-14. 50

Tabela 4. SALSA MLPA P018-F1 SHOX. 51

Tabela 5. Dados demográficos e clínicos dos pacientes incluídos no estudo. 54

Tabela 6. Variantes identificadas e confirmadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de MLPA subtelomérico. 56

Tabela 7. Variantes identificadas e não confirmadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de MLPA subtelomérico. 57

Tabela 8. Variantes identificadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de microarray. 57

Tabela 9. Variantes identificadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de sequenciamento de exoma. 58

Tabela 10. Alterações identificadas em seis indivíduos da casuística com triagem por MLPA subtelomérico dentro da normalidade que foram submetidos a outros protocolos investigativos. 58

Tabela 11. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição numérica, dos pacientes incluídos no estudo. 59

Tabela 12. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição categórica, dos pacientes incluídos no estudo. 61

Tabela 13. Alterações encontradas por meio do kit SALSA MLPA P036 e confirmação – ou não – por meio do kit SALSA MLPA P070. 63

Tabela 19. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes relacionados a doenças e envolvidos na alteração observada no caso P130. 114

Tabela 20. Características clínicas encontradas em pacientes com duplicação 9p, deleção 18p (adaptado de Guilherme et al.424, Sebold et al.432). 133

Tabela 21. Alterações presentes nos indivíduos da casuística investigados por meio da técnica de aCGH. 136

Tabela 22. Resultados obtidos nos testes de exoma. 137

Tabela 23. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P23. 139

Tabela 24. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P42. 142

Tabela 25. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P81. 145

Tabela 26. Região cromossômica, tamanho e número de genes OMIM situados nas regiões onde foram encontradas perda de heterozigosidade no caso P81. 146

Tabela 27. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P108. 149

Tabela 28. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P151. 153

Tabela 29. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P152. 157

Tabela 30. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P158. 163

Tabela 31. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P284. 166

Tabela 32. Alterações presentes nos seis indivíduos da casuística, com resultado por MLPA subtelomérico dentro da normalidade e que foram submetidos a outros protocolos investigativos. 168

Tabela 33. Dados do levantamento de prontuários dos 300 pacientes incluídos no estudo. 220

LISTA DE ABREVIATURAS

ACMG The American College of Medical Genetics and Genomics ACTB Actin beta ADAM10 A disintegrin and metalloproteinase domain 10 ADAP1 ArfGAP with dual PH domains 1 ADCYAP1 Adenylate cyclase activating polypeptide 1 ADNPM Atraso do desenvolvimento psicomotor aGH Hibridização Genômica em Arrays AKT3 V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3 ANS Agência Nacional de Saúde Suplementar array-CGH array Comparative Genomic Hybridization (Hibridização Genômica Comparativa baseada em plataforma array) ARSF Arylsulfatase F ASMT Acetylserotonin O-methyltransferase BAZ1B Bromodomain adjacent to zinc finger domain 1B BCL2L14 BCL2 like 14 BCL7B BCL tumor suppressor 7B BERA Brainstem Evoked Response Audiometry BET1L Bet1 golgi vesicular membrane trafficking protein like BRAT1 BRCA1 associated ATM activator 1 BRWD3 Bromodomain and WD repeat domain containing 3 CARD11 Caspase recruitment domain family member 11 CASZ1 Castor zinc finger 1 CBMEG Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética CDC16 Cell division cycle 16 CDC45 Cell division cycle 45 CDKN1B Cyclin dependent kinase inhibitor 1B CEP Comitê de Ética em Pesquisa CEPID-BRAINN Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão: Instituto Brasileiro de Neurociência e Neurotecnologia (Brazilian Institute of Neuroscience and Neurotechnology) CGG Citosina−Guanina−Guanina CGH Comparative Genomic Hybridization (Hibridização Genômica Comparativa) CHD7 Chromodomain helicase DNA binding protein 7 CHM CHM, Rab escort protein 1 CHMP2A Charged multivesicular body protein 2A CHST12 Carbohydrate sulfotransferase 12 CLDN3 Claudin 3 CLDN4 Claudin 4 CLIP2 CAP-Gly domain containing linker protein cm centímetro CNVs Copy Number Variations (Variações em número de cópias) COMT Catechol-O-methyltransferase CPLX1 Complexina 1 CpG ilhas ricas em Citosina e Guanina CREBL2 cAMP responsive element-binding protein-like 2 CRIPAK Cysteine rich PAK1 inhibitor CRK CRK proto-oncogene, adaptor protein

CRLF2 Cytokine receptor like factor 2 CSF2RA Colony stimulating factor 2 receptor alpha subunit CTDP1 CTD phosphatase subunit 1 CTTNBP2 Cortactin-binding protein 2 CYCS Cytochrome c, somatic CYP2E1 Cytochrome P450, subfamily IIE C7orf31 Chromosome 7 open reading frame 31 Del deleção DECIPHER DatabasE of genomiC varIation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources DECR2 2,4-dienoyl-CoA reductase 2 DFNA5 DFNA5, deafness associated tumor suppressor DGM Departamento de Genética Médica DGV Database of Genomic Variant DI Deficiência Intelectual DIAPH2 Diaphanous related formin 2 DILX Deficiência Intelectual Ligada ao cromossomo X DISAPRE Laboratório de Pesquisa em Distúrbios, Dificuldades de Aprendizagem e Transtornos de Atenção FCM-UNICAMP DMRT1 Doublesex and MAB3-related transcription fator 1 DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico) DOCK8 Dedicator of cytokinesis 8 Dup duplicação DUSP16 Dual specificity phosphatase 16 DYX1C1 Dynein axonemal assembly factor 4 ECE1 Endothelin converting enzyme 1 EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético EIF3B Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B EIF4H Eukaryotic translation initiation factor 4H ELN Elastin FAM36A (ou COX 20) COX20, cytochrome c oxidase assembly factor FAM62B (ou ESYT2) Extended synaptotagmin 2 FANCB Fanconi anemia complementation group B FAPESP Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo FBXL18 F-box and leucine rich repeat protein 18 FCM Faculdade de Ciências Médicas FGF2 Fibroblast growth factor 2 FGFR3 Fibroblast growth factor receptor 3 FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Hibridização in situ com Fluorescência) FKBP6 FK506 binding protein 6 FMR1 gene Fragile-X Mental Retardation 1 FMRP Fragile-X Mental Retardation Protein FSCN1 Fascin actin-bundling protein 1 FTSJ2 (ou MRM2) Mitochondrial rRNA methyltransferase 2 FZD9 Frizzled class receptor 9 F7 Coagulation factor VII g gramas GABRB3 Gamma-aminobutyric acid type A receptor beta3 subunit

GABRD Gamma-aminobutyric acid type A receptor delta subunit GATA6 GATA binding protein 6 GDI1 gene GDPdissociation inhibitor 1 GPC3 Glypican 3 GPC4 Glypican 4 GPER G protein-coupled estrogen receptor 1 GPR19 G protein-coupled receptor 19 GP1BB Glycoprotein Ib platelet beta subunit GTF2I General transcription factor III GTF2IRD1 GTF2I repeat domain containing 1 GTG bandamento G com Tripsina e corante Giemsa CTTNBP2 Cortactin-binding protein 2 HC Hospital de Clínicas HEATR2 (ou DNAAF5) Dynein axonemal assembly factor 5 HERC2 HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2 HNRNPU Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U HSBP1L1 Heat shock factor binding protein 1 like 1 HSPG2 heparan sulfate proteoglycan 2 HS6ST2 Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2 HTT Huntingtin HUWE1 gene HECT, UBA and WWE domain containing 1 IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística INTS1 Integrator complex subunit 1 IQCE IQ motif containing E ISCA Consortium International Standards for Cytogenomic Arrays JARID1A (ou KDM5A) Lysine demethylase 5A KAL1 (ou ANOS1) Anosmin 1 KANK1 KN motif and ankyrin repeat domain containing protein 1 kb kilobases KCNAB2 Potassium voltage-gated channel subfamily A regulatory beta subunit 2 KCNG2 Potassium voltage-gated channel modifier subfamily G member 2 KDM5A Lysine demethylase 5A KDM6A Lysine-specific demethylase 6A KIRREL3 Kin of irre-like 3 KMT2D Lysine methyltransferase 2D LAT2 Linker for activation of T-cells family member 2 LETM1 Leucine íper and EF-hand containing transmembrane protein 1 LFNG Fringe, Drosophila, Homolog of, Lunatic LIMK1 LIM domain kinase 1 LIPC Lipase C, hepatic type LOH12CR1 (ou BORCS5) BLOC-1 related complex subunit 5 LPIN2 Lipin 2 LRP6 Low Density Lipoprotein receptor-related protein 6 LUZP1 Leucine íper protein 1 LZTR1 Leucine zipper like transcription regulator 1 M Molar MAD1L1 MAD1 mitotic arrest deficient like 1

MAFK MAF bZIP transcription factor K MAGEL2 Mage-family member 2 Mb Megabases MECP2 Methyl CpG binding protein 2 MKRN3 Zinc finger protein 127 MLXIPL MLX interacting protein like MMP23B Matrix metallopeptidase 23B MPP6 Membrane palmitoylated protein 6 mRNA Ácido ribonucleico mensageiro MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Amplificação de Múltiplas Sondas Dependentes de Ligação) MSX1 Muscle segment homeobox 1 MYO5A Myosin VA MYO1E Myosin IE MYP2 ou Myopia 2 (high grade, autosomal dominant) NCBI National Center for Biotechnology Information ND não determinado NDN Necdin, MAGE family member NFATC1 Nuclear factor of activated T-cells 1 ng nanogramas NGS Next Generation Sequencing (Sequenciamento de nova geração) NIPA1 Non imprinted in Prader-Willi/Angelman syndrome 2 NLGN4X Neuroligin 4 NOTCH Notch 1 np braço curto do cromossomo n NPVF Neuropeptide VF precursor NPY Neuropeptide Y nq braço longo do cromossomo n NSD1 Nuclear receptor binding SET domain protein 1 NUDT1 Nudix hydrolase 1 OCA2 OCA2 melanosomal transmembrane protein OMIM Online Mendelian Inheritance in Man OMS Organização Mundial de Saúde OSBPL3 Oxysterol binding protein like 3 PAFAH1B1 (ou LIS1) Platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1 pb pares de base PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase) PDPN Podoplanin pH potencial Hidrogeniônico PIGG Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class G PI4KA Phosphatidylinositol 4-kinase alpha POF1B Premature ovarian failure, 1B POLR3K RNA polymerase III subunit K POU3F4 POU class 3 homeobox 4 PPP2R3B Protein phosphatase 2 regulatory subunit B''beta PQLC1 PQ loop repeat containing 1 PRDM16 PR/SET domain 16

PRIM2 Primase (DNA) subunit 2 PRKCG Protein kinase c, gamma PRKX Protein kinase, X-linked PRODH Proline dehydrogenase oxidase 1 PTEN Phosphatase and tensin homolog PTPRD Protein tyrosine phosphatase, receptor type D QI Quociente Intelectual qPCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa em Tempo Real) RAB27A RAB27A member RAS oncogene family RAI1 Retinoic acid-induced gene 1 RBFA Ribosome binding factor A (putative) RERE Arginine-glutamic acid dipeptide repeats RFC2 Replication factor C subunit 2 RIC8A RIC8 guanine nucleotide exchange factor A RPH3AL (ou NOC2) Rabphilin 3A like RM Ressonância Magnética RN Resolução Normativa RNF216 Ring finger protein 216 RS Rearranjos Subteloméricos RTN4R Reticulon 4 receptor SCARF2 Scavenger receptor class F member 2 SDK1 Sidekick cell adhesion molecule 1 SERPIND1 Serpin family D member 1 SHANK2 SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2 SHOX Short stature homeobox SH3BP5L SH3 binding domain protein 5 like SKI SKI proto-oncogene SLBP Stem-loop binding protein SLC6A8 gene Solute carrier family 6 member 8 SLC6A12 Solute carrier family 6 member 12 SLC25A1 Solute carrier family 25 member 1 SNAP29 Synaptosome associated protein 29 SNC Sistema Nervoso Central SNPs Single Nucleotide Polymorphisms SNRPN Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N SNV Single Nucleotide Variation SNX8 Sorting nexin 8 SPEN Spen íperxxiii transcriptional repressor SPRN Shadow of prion protein STK31 Serine/threonine kinase 31 STS Steroid sulfatase STX1A Syntaxin 1A SUN1 Sad1 and UNC84 domain containing 1 SXF Síndrome do X-Frágil SYCE1 Synaptonemal complex central element protein I TACC3 Transforming acidic coiled-coil containing protein 3 TANGO2 Transport and golgi organization 2 homolog

Taq Thermus aquaticus TBL2 Transducin beta like 2 TBX1 T-box1 TC Tomografia computadorizada TCF4 Transcription factor 4 TCF12 Transcription factor 12 TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TE Tris-EDTA TFDP3 Transcription factor Dp family member 3 THOC1 Tho complex, subunit 1 TNFRSF4 TNF receptor superfamily member 4 TNFRSF18 TNF receptor superfamily member 18 TRIM50 Tripartite motif-containing protein 50 TSHZ1 Teashirt zinc finger homeobox 1 TXNL4A Thioredoxin like 4A UBE3A Ubiquitin protein ligase E3A UBE4B Ubiquitination íper E4B UNICAMP Universidade Estadual de Campinas USP14 Ubiquitin-specific protease 14 USP18 Ubiquitin specific peptidase 18 USP26 Ubiquitin specific peptidase 26 UTI Unidade de Terapia Intensiva UTR Untranslated Region (Região não traduzida) VAMP7 Vesicle associated membrane protein 7 VCX3A Variable charge, X-linked 3A VIPR2 Vasoactive intestinal peptide receptor 2 VPS37D VPS37D, ESCRT-I subunit WBSCR22 (ou BUD23) rRNA methyltransferase and ribosome maturation factor WBSCR27 Methyltransferase like 27 WBSCR28 Transmembrane protein 270 WDR60 WD repeat domain 60 WDR72 WD repeat domain 72 WES Whole Exome Sequencing (Sequenciamento completo do exoma) WHO World Health Organization WHSCR-1 Região crítica para a síndrome de Wolf-Hirschhorn 1 WHSCR-2 Região crítica para a síndrome de Wolf-Hirschhorn 2 WHSC1 (ou NSD2) Nuclear receptor binding SET domain protein 2 WHSC2 (ou NELFA) negative elongation íper complex member A YWHAE Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein épsilon ZBED1 Zinc finger BED-type containing 1 ZNF24 Zinc finger protein 24 ZNF238 (ou ZBTB18) Zinc finger and BTB domain containing protein 18 ZNF711 Zinc finger protein 711  alfa μL microlitros

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 28 1.1. Fatores Genéticos associados à DI 29 1.1.1. Anomalias cromossômicas 29 1.1.1.1. Anomalias cromossômicas submicroscópicas 30 1.1.2. Síndromes monogênicas associadas à DI e à Deficiência Intelectual ligada ao X (DILX) 31 1.2. Investigação diagnóstica da DI 32 1.2.1. A técnica de MLPA 33 1.2.2. A técnica de microarray 34 1.2.3. Sequenciamento do exoma 36 1.2.4. Uso dos métodos apresentados na investigação diagnóstica da DI 37 2. OBJETIVOS 39 2.1. Objetivo Geral 39 2.2. Objetivos Específicos 39 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 40 3.1. Seleção dos pacientes 40 3.2. Estratégia de investigação 41 3.2.1. Triagem por MLPA 42 3.2.2. Validação dos resultados de MLPA 46 3.2.2.1. Validação pela técnica de sequenciamento pelo método de Sanger 46 3.2.2.2. Validação pela técnica de FISH 48 3.2.2.3. Validação pela técnica de MLPA 49 3.2.3. Técnica de microarray 51 3.3. Caracterização clínica da casuística e análise estatística 53 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 4.1. Caracterização da casuística 54 4.2. Resultados da Investigação Diagnóstica 56 4.3. Comparação da casuística conforme a presença ou não de alterações 58 4.4. Investigação de anomalias subteloméricas por MLPA 61 4.4.1. Alterações não confirmadas 63 4.4.1.1. Alteração del 12p 63 4.4.1.2. Alteração del 16p 66 4.4.2. Alterações confirmadas 68 4.4.2.1. Alteração del(1)(p36) 68 4.4.2.1.1. Paciente 57 (Lincoln-de-Carvalho, 2009) 68 4.4.2.1.2. Paciente P98 68 4.4.2.1.3. Paciente P136 76 4.4.2.2. Alteração em 4p 79 4.4.2.2.1. Paciente P316 79 4.4.2.2.2. Paciente P166 81

4.4.2.2.3. Paciente P124 82 4.4.2.2.4. Paciente P237 85 4.4.2.2.5. Paciente P164 86 Deleção 4pter e a síndrome de Wolf -Hirschhorn 87 Duplicação 4pter 92 4.4.2.3. Alteração del 6p 95 4.4.2.4. Alteração del XYp 95 4.4.2.4.1 Paciente P85 95 4.4.2.5. Alteração del 1q 99 4.4.2.5.1 Paciente P192 99 4.4.2.6 Alteração del 18q 103 4.4.2.6.1. Paciente P137 103 4.4.2.7. Alteração dup 7p 105 4.4.2.7.1 Paciente P161 105 4.4.2.8. Alteração dup 11p 108 4.4.2.8.1. Paciente P191 108 4.4.2.9. Alteração “dup 15p” (15q-cen) 111 4.4.2.9.1. Paciente P130 111 4.4.2.10. Alteração dup 17p 117 4.4.2.10.1. Paciente P236 117 4.4.2.11. Alteração dup XYp 120 4.4.2.11.1. Paciente P303 120 4.4.2.11.2. Paciente P258 122 4.4.2.12. Alteração dup 7q 125 4.4.2.12.1. Paciente P4 125 4.4.2.13. Alteração del5p/dup9p 127 4.4.2.13.1. Paciente P64 127 4.4.2.14. Alteração del9p/dup19q 127 4.4.2.14.1. Paciente P169 127 4.4.2.15. Alteração dup9p/del18p 131 4.4.2.15.1. Paciente P194 131 4.5. Investigação de alterações pelos métodos de microarray e sequenciamento de exoma 136 4.5.1. Paciente P23 137 4.5.2. Paciente P42 141 4.5.3. Paciente P81 144 4.5.4. Paciente P108 147 4.5.5. Paciente P151 150 4.5.6. Paciente P152 155 4.5.7. Paciente P158 161 4.5.8. Paciente P284 164 4.6. Outros resultados 167 5. CONCLUSÕES 169 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 170

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 171 8. ANEXOS 204 8.1. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos 204 8.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 206 8.3. Protocolo Padrão MLPA 207 8.4. Artigo 209 8.5. Planilha com dados da casuística 220

1. INTRODUÇÃO

A deficiência intelectual (DI) ou transtorno do desenvolvimento intelectual, isolada ou associada a anomalias congênitas, é um dos principais fatores de redução da qualidade de vida. Para o indivíduo e sua família representa limitação em diferentes graus, em geral determinando necessidade de supervisão e proteção permanentes. No âmbito populacional, é considerada problema de saúde pública, por sua prevalência e consequências negativas para a produtividade e relações sociais, além do aumento na demanda por serviços médicos e educacionais especializados1,2. Trata-se de condição complexa, identificada pela redução substancial das funções intelectuais, concomitante a déficits no comportamento adaptativo, envolvendo os domínios conceitual, social e prático. Uma forma objetiva de classificação baseia-se em testes psicométricos para determinação do quociente intelectual (QI), os quais, embora vistos como um instrumento imperfeito, são considerados satisfatórios na avaliação do potencial de inteli- gência, sendo utilizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS), que considera quatro níveis de gravidade: DI leve (QI entre 50-70), DI moderada (QI entre 35-49), DI grave (QI entre 20-34) e DI profunda (QI inferior a 20). Contudo, a maioria dos estudos sobre as causas de DI classifica os indivíduos apenas em dois grupos, o dos indivíduos com DI leve (QI entre 50 e 70) e os demais com DI grave (QI seja inferior a 50)2,3. A confirmação da DI costuma ser mais tardia, mas em muitos casos a suspeita diagnóstica surge antes dos cinco anos de idade, quando não é possível realizar avaliações sistemáticas do funcionamento intelectual, porém se observa que a criança não atinge os marcos esperados do desenvolvimento neuropsicomotor, caracterizando o atraso global do desenvolvimento, que pode resultar na deficiência intelectual no adulto1,2,4-6. A DI representa uma das categorias mais amplas de distúrbios, acometendo de 1% a 3% da população nos países industrializados, com aproximadamente um terço dos casos atribuídos a causas genéticas. Já nos países em desenvolvimento, estima-se prevalência três vezes maior, atribuída ao efeito de fatores ambientais adversos, como desnutrição proteico- calórica, infecções do sistema nervoso central, além de idade materna avançada, maior frequência de casamentos consanguíneos e carência de serviços de aconselhamento genético 7-9. Com relação à gravidade, os casos de DI leve são a maioria, com frequência de sete a oito vezes maior do que as formas mais graves, sendo caracterizadas muitas vezes como atraso na fala, alteração do comportamento e/ou baixo rendimento escolar10.

No Brasil, conforme dados do Censo Demográfico 2010, são mais de 45 milhões de pessoas com pelo menos uma forma de deficiência (física ou mental), o que representa aproximadamente 23% da população. Dentre esses, pelo menos 2,6 milhões ou 1,4% da população seriam deficientes intelectuais, o que deve corresponder a subestimativas, tendo em vista os índices propostos para países em desenvolvimento11. Entre os indivíduos encaminhados para avaliação em serviços de Genética Clínica, 60% a 70% apresentam algum grau de comprometimento intelectual e, tendo em vista a significativa heterogeneidade causal e fenotípica dessa condição, um dos grandes desafios é a determinação do diagnóstico etiológico, que permanece indeterminado em cerca de 40% dos casos1,12,13. Embora fatores não-genéticos estejam comumente associados à DI, com destaque para alguns teratógenos como álcool e outras drogas, infecções como rubéola e sífilis, além de complicações peri e(ou) neonatais, uma parcela significativa é atribuída a causas genéticas, incluindo desde anomalias cromossômicas a mutações de ponto, ou ainda fatores epigenéticos, em especial entre as formas mais graves. Entretanto, mesmo com o refinamento das técnicas de investigação diagnóstica, 60% dos casos de deficiência intelectual atribuída a causas genéticas permanecem de origem indeterminada4,6,14-16.

1.1. Fatores Genéticos associados à DI Entre as causas genéticas de DI destacam-se as cromossomopatias, em particular a síndrome de Down, as heredopatias de transmissão monogênica, incluindo diversos erros inatos do metabolismo e o grupo da DI ligada ao X. Além disso, mecanismos como dissomia uniparental e fatores epigenéticos, como erros na impressão genômica ou imprinting, também são descritos, por exemplo, em um percentual dos indivíduos com as síndromes de Angelman e Prader-Willi17-19.

1.1.1. Anomalias cromossômicas Estima-se que 15% dos casos de DI se relacionem a anomalias cromossômicas identificadas pelo exame de cariótipo convencional, com destaque para a trissomia do cromossomo 21 entre as aneuploidias, além de diversas cromossomopatias estruturais como deleções, translocações em geral desbalanceadas e cromossomos marcadores, envolvendo pelo menos 5 a 10 milhões de pares de bases. Mais recentemente, a aplicação de técnicas de citogenética molecular tem possibilitado a identificação de alterações cromossômicas inferiores a esse limite em indivíduos com DI classificada como idiopática, caracterizando

diversas síndromes de microdeleção ou duplicação submicroscópicas, parte delas relacionadas a rearranjos subteloméricos20-22.

1.1.1.1. Anomalias cromossômicas submicroscópicas Durante um período, parte dos estudos nessa área se concentraram nas regiões adjacentes aos telômeros, por características que as tornam candidatas a ocorrência de rearranjos, como a quase ausência de histonas e nucleossomos, riqueza em genes e ilhas CpG e probabilidade alta de recombinação23. Embora os rearranjos subteloméricos descritos em muitos estudos envolvam regiões específicas, é provável que a interação significativa de sequências subteloméricas homólogas inicie o processo de recombinação entre as mesmas. Apesar do mecanismo de duplicação e separação das regiões cromossômicas terminais não estar totalmente elucidado, já se sabe que erros podem ocorrer e que mutações envolvendo essas regiões podem ser herdadas, com ou sem consequências clínicas, e se associam a diversas condições, incluindo a DI24. De fato, diversos estudos demonstraram a relevância dos rearranjos subteloméricos entre os fatores relacionados à DI. Um dos principais foi o de Knight e colaboradores25 em indivíduos com DI idiopática, identificando essas alterações em 7,4% dos que apresentavam deficiência moderada ou grave e em 0,5% dos com DI leve. Estudos posteriores mostraram uma proporção maior de alterações subteloméricas em indivíduos com DI leve (10% a 33%), sendo essas variações possivelmente relacionadas a diferenças no tamanho da amostra e nos critérios de seleção da casuística. De todo modo, a revisão realizada por De Vries e colaboradores26, estabelecendo que uma amostra de 2.500 indivíduos com DI, 5% apresentavam rearranjos subteloméricos, colocou essas alterações como causa comum de DI idiopática, justificando sua inclusão na investigação diagnóstica dessa condição27-29. Posteriormente, com o desenvolvimento das técnicas de microarray foi possível identificar e mapear alterações como polimorfismos de nucleotídeo único ou simples (Single Nucleotide Polymorphisms ou SNPs) em indivíduos de diferentes grupos populacionais. A medida da associação entre os SNPs mapeados e diversas condições complexas, a partir da análise de grandes coortes de pacientes, tem revolucionado o estudo de numerosas características e doenças30-32. Inserções e deleções também são comuns, variando em tamanho desde um até milhares de pares de bases e, à semelhança dos SNPs, podem ou não ter efeito deletério sobre o fenótipo. Entre essas, incluem-se as chamadas variações no número de cópias de segmentos

de DNA do genoma humano (Copy Number Variations, CNV), definidas como sequências de DNA de 1 kb ou mais, nas quais há divergência no número de cópias observado entre os indivíduos33-35 e sendo classificadas como deleções, duplicações, repetições invertidas ou mesmo hotspots de rearranjo cromossômico, entre outras36-38. A relação entre CNVs e DI é relatada em vários estudos, permitindo estimar que seriam responsáveis por 5% a 20% dos casos de DI, sendo essa variação dependente dos critérios de seleção clínica utilizados39-44. Contudo, como a identificação de CNVs no genoma é recente, a confirmação de sua patogenicidade é complexa e requer investigação de aspectos como transmissão a partir de um genitor normal ou afetado, expressão variável conforme o sexo, caracterização do quadro clínico associado, identificação dos genes presentes na região e detecção (ou não) em indivíduos normais, justificando a ampliação dos estudos em indivíduos com DI de causa indeterminada.

1.1.2. Síndromes monogênicas associadas à DI e à Deficiência Intelectual ligada ao X (DILX) Numerosos erros metabólicos, predominantemente de transmissão recessiva, se relacionam a atraso global do desenvolvimento, assim como diversas síndromes monogênicas que são conhecidas pela determinação de DI em graus variados, como a distrofia miotônica, a síndrome de Noonan e condições correlatas e a esclerose tuberosa, entre outras4,15. Contudo, a maior parte dos estudos relacionados a heredopatias monogênicas associadas a DI tem como foco a identificação de genes do cromossomo X, ou a deficiência intelectual ligada ao X (DILX), pela peculiaridade de sua transmissão, em geral envolvendo várias genealogias. A DILX é uma das causas genéticas mais frequentes de DI, ocorrendo em 10-12% de todos os homens afetados, provavelmente pelo maior número de genes no cromossomo X em comparação a qualquer outro segmento autossômico45. As mulheres podem manifestar sintomas mais brandos, possivelmente pela inativação preferencial do cromossomo X. Nesse grupo, destaca-se a síndrome do X-frágil (SXF - MIM 300624), principal causa monogênica de DI, bem como muitas outras condições que se associam ou têm a DI como manifestação principal e são determinadas por genes do cromossomo X27,46-49. A SXF, somente menos frequente que a síndrome de Down, ocorre em aproximadamente 1:4.000 homens e 1:8.000 mulheres50-52.

Na SXF, a denominação “X-Frágil” se refere a uma região mais sujeita a quebras ou falhas, ou seja, um “sítio frágil”, no qual a cromatina não se condensa apropriadamente durante a mitose, situado em Xq27.3. Na quase totalidade dos casos, a SXF é causada por uma mutação dinâmica, caracterizada pela expansão de uma sequência de trinucleotídeos CGG, situada na região 5’ não-traduzida do primeiro exon do gene FMR1 (MIM 309550 - Fragile-X Mental Retardation). O número normal de repetições é aproximadamente 60, enquanto em pacientes com a SXF ocorrem centenas de repetições. Mais de 200 cópias da repetição levam a uma metilação excessiva de citosinas no promotor de FMR1, comprometendo o funcionamento normal (ou a transcrição) e silenciando o gene. A proteína codificada pelo gene FMR1, denominada FMRP, encontra-se expressa em vários tecidos, incluindo epitelial e Sistema Nervoso Central (SNC), sendo seu RNAm produzido em níveis elevados durante o desenvolvimento fetal, principalmente em neurônios colinérgicos e piramidais do hipocampo. Dessa forma, a deficiência funcional do gene é vinculada ao fenótipo da SFX, que inclui, além da DI (em geral de moderada a grave no sexo masculino), distúrbios de comportamento e linguagem, face alongada e mandíbula proeminente, orelhas grandes e/ou em abano e macrorquidia, comumente observados a partir da puberdade53-55.

1.2. Investigação diagnóstica da DI Recentemente, com a aplicação da tecnologia genômica, alterações cromossômicas crípticas, mutações gênicas e rearranjos genômicos diversos vêm sendo relacionados à DI, modificando as estratégias de pesquisa nessa área. Entre as mesmas, destacam-se a Hibridização Genômica em Arrays (aGH), a Multiplex Ligation Probe- dependent Amplification (MLPA), a Hibridização In Situ por Fluorescência (fluorescent in-situ hybridization ou FISH), além do sequenciamento do exoma15,24,56-59. Nos países industrializados vem sendo recomendado como procedimento inicial a realização de testes como “microarray cromossômico” ou “cariótipo molecular”, e mesmo o sequenciamento do exoma, pela maior resolução para detecção de alterações genômicas15,60-63. Já nos países em desenvolvimento, a análise cromossômica convencional ainda é a alternativa de investigação predominante, em geral com resolução que varia de 450-850 bandas por lote haploide, ou de 3-5 Mb, e dependendo da extensão, alterações como microduplicações e microdeleções intersticiais ou subteloméricas não são identificadas6,16,64.

1.2.1. A técnica de MLPA A técnica denominada Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação) é um método sensível, econômico e rápido, para a quantificação relativa do número de cópias de mais de 50 sequências de ácidos nucleicos em único experimento, permitindo detectar deleções e duplicações de diversos genes, além de mutações de ponto conhecidas64,65. Descrita por Schouten64, parte de um princípio simples, o de hibridizar uma mistura de sondas à amostra de DNA genômico a ser analisada, seguida da amplificação dos produtos de ligação por PCR, utilizando um par de primers universal. Os fragmentos finais são separados e lidos em aparelho de eletroforese capilar, sendo possível a quantificação relativa de cópias gênicas (Figura 1).

Figura 1. Técnica de MLPA e suas etapas.

Atualmente, a empresa MRC-Holland produz kits de MLPA para o estudo de várias condições genéticas. Segundo o fabricante, entre as vantagens dessa técnica em relação a outras utilizadas na identificação de alterações genômicas estão a detecção de muitas sequências do DNA genômico em uma mesma reação utilizando apenas 20 ng de DNA (rendimento alto), a disponibilização de resultados em 24 horas (praticidade alta e rapidez), a possibilidade de inclusão de muitas amostras em um mesmo ensaio, a capacidade de detectar sequências que diferem em apenas um nucleotídeo e o uso de protocolo único para muitas aplicações diferentes, com custo relativamente baixo. Entretanto, a técnica não permite identificar rearranjos cromossômicos equilibrados ou alterações externas à região de anelamento das sondas. Diversos estudos que aplicaram a técnica de MLPA na pesquisa de rearranjos subteloméricos (RS) em DI idiopática tiveram resultados similares aos que utilizaram outros métodos, identificando alterações subteloméricas em cerca de 10% dos pacientes29,58,66,67, percentual também verificado em estudo realizado por nosso grupo de pesquisa68. Segundo Rooms et al.69, Morozin Pohovski et al.29, Boggula et al.67, entre outros, os resultados obtidos por MLPA justificam sua inclusão como método de triagem de RS em indivíduos com DI de origem não esclarecida.

1.2.2. A técnica de microarray Embora técnicas como a de MLPA permitam a identificação de novas regiões cromossômicas associadas à DI, uma parcela significativa dos casos permanece de causa indeterminada. Pela necessidade de testar todo o genoma em um experimento único, técnicas baseadas em hibridação com fluorescência, como a hibridação genômica comparativa (Comparative Genomic Hybridization - CGH) e a hibridização genômica em arrays (aGH) foram desenvolvidas70. A técnica de aGH (Hibridização Genômica em array) é capaz de detectar perdas e ganhos de material genético e, ao contrário da análise citogenética convencional, dispensa a cultura celular. Além disso, não há desvio para a análise de uma região cromossômica específica, já que todo o genoma é analisado71. Foi descrita inicialmente no final da década de 90 por Pinkel et al.72 como arrayCGH (Hibridização Genômica Comparativa), uma variante da técnica de CGH utilizando sondas de DNA genômico imobilizadas em lâminas, sendo realizada a análise comparativa, com base nas intensidades de hibridização dos DNAs (referência e investigado) às sondas inseridas na lâmina. A resolução chega a alguns kb,

dependendo do tamanho e da distância entre as sondas, permitindo analisar ganhos e perdas genômicas, com alto grau de sensibilidade73. Frente a essa perspectiva, diversos estudos utilizaram formas variadas de aGH, analisando a viabilidade da técnica na investigação etiológica da DI idiopática41,44,62,74,75. Gijsbers et al.76 detectaram alterações cromossômicas submicroscópicas em 5% a 20% de pacientes com DI e cariótipo convencional normal. Tucker et al.75, em pesquisa comparativa entre as diversas plataformas de arrays utilizadas em estudos de DI idiopática, observaram resultados diferentes dependendo da plataforma utilizada, confirmando a distinção entre as mesmas e ressaltando a necessidade de validação dos resultados alterados por técnica independente, conclusão essa também atingida por Hills et al. 76. Wu et al.77, investigando alterações cromossômicas em DI de origem não esclarecida pelas técnicas de MLPA e aGH, detectaram alterações em 5,1% dos casos, contribuindo para a delimitação de regiões candidatas. Já Manolakos et al.57, utilizando as técnicas de FISH, MLPA e aGH em DI idiopática, salientaram a importância da aplicação de estratégias que associem várias técnicas, também em países menos desenvolvidos, pela possibilidade de redução de custos. Kriek et al.78, estudando indivíduos com atraso de desenvolvimento, combinou as técnicas de MLPA e aGH e concluiu que ambas são válidas, porém sugerem que sejam aplicadas em conjunto, pois alguns de seus achados por array não foram confirmados por MLPA ou FISH, provavelmente devido à longa distância entre as sondas utilidadas no aGH e MLPA. Coutton et al.44, analisando 66 pacientes com DI leve e sem alterações após estudo por MLPA e outros métodos, observaram alterações em cerca de 30% dos casos pela técnica de aGH, indicando mais uma vez a eficácia de se usar as duas técnicas no estudo de indivíduos com DI. A introdução de chips na técnica de aGH ampliou os limites da investigação genética em DI, pela possibilidade de estudar variações estruturais no genoma, como SNPs e CNVs36,44,79-84. Sobre as CNVs, vale destacar que a detecção em 14% a 18% de amostras não selecionadas de indivíduos com atraso do desenvolvimento, DI e outras alterações neurológicas geralmente são de novo, ou seja, não identificadas em indivíduos normais. Isso representa um impacto fenotípico significativo, por determinarem alterações de dosagem em múltiplos genes. Percentuais semelhantes também foram verificados entre autistas (5% a 10% dos casos não sindrômicos e 10% a 20% dos sindrômicos), pacientes com epilepsia idiopática generalizada e déficit de atenção, justificando sua indicação como teste inicial na investigação dessas condições85,86.

Em países desenvolvidos a recomendação de aGH como teste para diagnóstico clínico de alterações genéticas em indivíduos com DI e alterações congênitas múltiplas é reiterada por Galasso et al.60, Miller et al.61, Bi et al.62, Palmer et al.87 e Zilina et al.88, entre outros, sendo este teste competente em diagnosticar microdeleções/microduplicações cromossômicas associadas à DI idopática89. Segundo os autores, a ausência de alteração a partir desse teste orientará a realização de outras técnicas, como testes moleculares específicos para a SXF ou outras condições. Diante da observação de variantes com significância clínica desconhecida, a validação das mesmas, bem como sua pesquisa nos genitores, é necessária para a correlação genótipo-fenótipo.

1.2.3. Sequenciamento do exoma Sobre os métodos diagnósticos em DI já mencionados, vale mencionar que pela análise do cariótipo é possível identificar a origem do distúrbio em apenas 4% dos casos. Já a técnica de FISH permite detectar alterações em 5% dos pacientes não diagnosticados pelo primeiro exame, sendo o MLPA responsável pela elucidação em aproximadamente 10% dos casos remanescentes. Quanto as análises por microarray, uma vez que as plataformas de aGH contam com uma resolução de 10 a 100 kb, é possível a determinação do diagnóstico em mais 20% dos indivíduos com DI. Contudo, mesmo com todas as técnicas disponíveis atualmente, em percentual significativo de casos a origem da DI permanece inconclusiva, levando ao desenvolvimento de outros protocolos21,29,58,61,76,90. Como tanto os métodos citogenéticos tradicionais quanto os moleculares se limitam à detecção de alterações em poucos kb, impossibilitando a descoberta de variantes de uma ou poucas bases no genoma, o sequenciamento genômico torna-se necessário para a identificação de tais alterações. Os métodos de sequenciamento massivo em paralelo introduzidos em 2005, descritos também como tecnologias de sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing), consistem no sequenciamento do DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. Visando uma aplicação mais flexível e de custo mais reduzido dessa tecnologia, o sequenciamento do exoma (whole exome sequencing – WES) passou a ser destacado a partir de 2009, uma vez que seu custo é aproximadamente 5 vezes menor quando comparado com o sequenciamento de genoma total – WGS), além do fato de que técnicas que sequenciem só regiões codificadoras de DNA – 1 a 3% do genoma - podem ser mais eficientes91-96.

O sequenciamento completo do exoma tem por base a construção de bibliotecas a partir da fragmentação do DNA, seguida de ligação a sequências denominadas adaptadores e a geração de amplicons em clusters por meio de diversos métodos, como PCR em emulsão ou ponte. Tais fragmentos são posteriormente sequenciados em paralelo, gerando quantidades grandes de dados que por usa vez serão processados e analisados por bioinformática97. Essa abordagem, bem sucedida em laboratórios de pesquisa, vem sendo incorporada ao diagnóstico laboratorial da DI, com impacto significativo na identificação de genes relacionados a essa condição, tanto em síndromes específicas, como na identificação de possíveis genes associados à DI não sindrômica15,21,24,95,96,98,99.

1.2.4. Uso dos métodos apresentados na investigação diagnóstica da DI Concluindo, as técnicas apresentadas podem ser utilizadas levando em consideração o quadro clínico do paciente, sendo incluídas na maioria dos algoritmos de investigação da DI, como o apresentado na Figura 2.

Figura 2. Algoritmo para a investigação de DI (modificado de Miller et al.61.

Tal estratégia tem sido eficaz tanto na elucidação diagnóstica, quanto na seleção de regiões cromossômicas a serem investigadas, contribuindo na identificação de novos genes relacionados à DI. Em trabalho anterior (Lincoln-de-Carvalho)68, a técnica de MLPA foi padronizada no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) e aplicada a 62 pacientes

com DI de causa não esclarecida, utilizando kit para detecção de rearranjos subteloméricos. Foram encontradas alterações em 3,2% dos casos. Diante da perspectiva de triagem de alterações subteloméricas por MLPA e ainda da indicação de outras técnicas como a de arrayCGH, que permite a detecção de um número maior de variações de cópias gênicas, inclusive em regiões intersticiais, foi proposta a continuidade do trabalho mediante a associação dessas técnicas na investigação de indivíduos com DI de causa indeterminada.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral Caracterizar uma amostra de indivíduos com deficiência intelectual de origem indeterminada quanto a aspectos clínicos e fatores causais.

2.2. Objetivos Específicos  Caracterizar a casuística conforme idade, razão de sexo, dados anamnésticos indicativos de sofrimento fetal e(ou) exposição a fatores deletérios do ambiente, consanguinidade entre os genitores, recorrência familial de DI, ocorrência de crises convulsivas, antropometria e exame físico dismorfológico.  Triar alterações subteloméricas.  Realizar análise independente para confirmar as alterações subteloméricas.  Investigar CNVs em outras regiões do genoma em uma parcela de indivíduos sem diagnóstico nas etapas anteriores.  Analisar a correlação das CNVs detectadas com o fenótipo dos pacientes.  Fazer a correlação genótipo-fenótipo nos casos identificados como alterados pelos exames realizados.

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1. Seleção dos pacientes Os 300 indivíduos que constituem a amostra foram selecionados entre pacientes com atraso global do desenvolvimento e(ou) DI de origem não esclarecida, atendidos durante o período de execução do projeto nos ambulatórios do Serviço de Genética Clínica do Departamento de Genética Médica da FCM / Hospital de Clínicas (HC) da UNICAMP. Desses pacientes, 62 foram incluídos em estudo anterior (Lincoln-de-Carvalho 2009), sendo analisados pela técnica de MLPA subtelomérico, posteriormente aplicada a outros 238 pacientes, constituindo a amostra atual (109 do sexo feminino e 191 do sexo masculino). Todos foram previamente submetidos à avaliação clínica detalhada, exame de cariótipo convencional com bandas (resolução 550 bandas por lote haploide, coloração GTG), análise molecular para SXF e outros exames incluídos na rotina para investigação diagnóstica da DI utilizada no serviço (como exames para detecção de erros inatos do metabolismo), com resultados normais, não sendo possível considerar uma causa específica. Já quando o resultado da avaliação sugeria um diagnóstico específico, o respectivo paciente era excluído da presente pesquisa. O processo de avaliação clínica foi realizado sob a responsabilidade da Dra. Antonia Paula Marques de Faria, orientadora do projeto. Além disso, todos foram classificados conforme os critérios de De Vries et al.100 sugeridos na avaliação de indivíduos com rearranjos subteloméricos (Quadro 1). Esse checklist contém dados relativos à recorrência familial de DI, evidências pré-natais de alterações no desenvolvimento, anormalidades no crescimento pós-natal, dois ou mais dismorfismos faciais, dismorfismos não faciais e outras anomalias congênitas, tendo sido utilizado no estudo anterior acima mencionado.

Quadro 1. Critérios para seleção de pacientes com rearranjos teloméricos submicroscópicos (adaptada de De Vries et al.100). Dados Pontuação História familial de DI:  Distribuição sugestiva de herança monogênica. 1  Incompatível com herança monogênica (incluindo fenótipos 2 diferentes). Atraso de crescimento pré-natal 2 Anomalias de crescimento pós-natais (1 ponto para cada uma das seguintes [máximo 2]): 2  Microcefalia (1), Baixa estatura (1);  Macrocefalia (1), Estatura elevada (1) Dois ou mais dismorfismos faciais[máximo 2]: 2  Destaque para hipertelorismo (1), anomalias nasais (1) e auriculares (1). Dismorfismos não-faciais e anomalias congênitas (1 ponto para cada uma 2 [máximo2]):  Destaque para anomalias em mãos (1), cardíacas (1), hipospadia (1), criptorquidia (1).

3.2. Estratégia de investigação A estratégia utilizada está representada no algoritmo abaixo (Figura 3). Foram incluídos no presente estudo indivíduos com exame de cariótipo sem alterações numéricas ou estruturais que justificassem a DI e análise molecular para a mutação do X frágil negativa. A partir da investigação de rearranjos subteloméricos pela técnica de MLPA, os casos alterados foram estudados por outros kits de MLPA, escolhidos segundo o resultado anômalo. Nessa etapa, quando a alteração não pôde ser confirmada, foi realizado sequenciamento pelo método de Sanger para observação de polimorfismos, uma vez que as sondas de MLPA são sensíveis a pequenas alterações na sequência de anelamento ao DNA genômico, podendo resultar em falsos positivos (http://www.mlpa.com). Já nos casos em que a alteração foi confirmada, a estratégia adotada foi a validação por FISH, quando pertinente.

Figura 3. Algoritmo proposto para a investigação de DI idiopática (adaptado de Galasso et al.60 e Miller et al.61). ADNPM – atraso do desenvolvimento neuropsicomotor

Para realização dos exames, foram coletadas amostras de sangue venoso (aproximadamente 10 mL) dos pacientes e, quando necessário, de seus genitores, após apresentação e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 2), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da FCM-UNICAMP (N.º 629/06; 1166/2011) (Anexo 1). As amostras foram enviadas ao Laboratório de Genética Humana do CBMEG – UNICAMP, onde as atividades foram coordenadas pela Profª. Dra. Maricilda Palandi de Mello.

3.2.1. Triagem por MLPA A triagem de rearranjos subteloméricos foi feita por MLPA, utilizando o kit MLPA P036-E HUMAN TELOMERE (MRC – Holland, Amsterdã, Holanda - http//:www.mlpa.com), conforme recomendação do fabricante e padronização de Lincoln-de- Carvalho68 (Anexo 3), que utilizou planilhas específicas em programa Excel para análise dos dados obtidos (Tabela 1).

Tabela 1. SALSA MLPA P036-E2 HUMAN TELOMERE-3.

Os dados são normalizados, dividindo-se valores de altura ou área do pico de cada sonda pela soma dos picos de todas as sondas na amostra. Em seguida, o valor normalizado é dividido pela área ou altura do pico da sonda correspondente, obtida a partir do DNA controle. Na presença de deleções e duplicações em heterozigose, os valores são,

respectivamente, de 0,5 e 1,5, se comparados com a faixa de normalidade estabelecida entre 0,8 – 1,2. Os casos positivos detectados por MLPA foram confirmados pela mesma técnica, utilizando o kit P070-B2 HUMAN TELOMERE-5 (Tabela 2) - que contem sondas para as mesmas regiões subteloméricas investigadas pelo kit P036 - também segundo padronização de Lincoln-de-Carvalho68.

Tabela 2. SALSA MLPA P070-B2 HUMAN TELOMERE-3.

3.2.2. Validação dos resultados de MLPA

3.2.2.1. Validação pela técnica de sequenciamento pelo método de Sanger Quando a alteração foi detectada por apenas um dos kits, a validação foi feita pela técnica de sequenciamento pelo método de Sanger, rotineiramente utilizada no Laboratório de Genética Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) – UNICAMP, sendo desenhados primers para flanquear as regiões de interesse, conforme a alteração encontrada por MLPA. Para a amplificação dos fragmentos de DNA foi realizada a técnica de PCR, a partir do seguinte protocolo (Figura 4):  20,3 µL H20 deionizada  3,0 µL Tampão (10X) (Invitrogem)  0,7 µL MgCl2 (50 mM) (Invitrogem)  2,5 µL dNTP (2 µM) (Invitrogem)  1,0 µL primer direto (20 pmoles)  1,0 µL primer reverso (20 pmoles)  0,3 µL BSA 1%  0,2 µL enzima Taq DNA Polimerase (5U/ µL) (Invitrogem)  1,0 µL DNA genômico (200-500 ng) em 30,0 µL de reação de PCR

Figura 4. Ciclos utilizados na amplificação da região de interesse dos genes alterados.

A verificação do produto de amplificação foi realizada por meio de eletroforese em gel de agarose (Invitrogem Corporation, Estados Unidos) 1,0% em TBE 1x. A amostra foi aplicada no gel juntamente com tampão de corrida (0,25% de azul de bromofenol; 50% de glicose) na razão de 6:1. As condições de eletroforese variaram entre 90 V e 100 V. Os

marcadores de peso molecular utilizados foram DNA ladder de 1 Kb, 1 Kb plus ou 100 pb (Invitrogem Corporation, Estados Unidos), em concentração de 0,15 g/L. Após o tempo de eletroforese o gel foi imerso em solução diluída de brometo de etídio (0,5 L/mL de água destilada) durante 20 minutos, sendo, posteriormente, visualizado em transluminador de luz ultravioleta e fotografado, utilizando uma câmera digital acoplada ao microcomputador (Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System-EDAS, Kodak Digital Science, Estados Unidos). As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o kit ABI-PRISM Big Dye® Terminator Cycle v3.1 Sequencinq Kit (Applied Biosystems-Applera Corporation, Estados Unidos) e os componentes e volumes da reação foram os seguintes (Figura 5):  4,0 µL H2O deoinizada  2,0 µL Tampão Big Dye 5X  2,0 µL Big Dye®  1,0 µL Primer (direto ou reverso) (5 pmoles)  1,0 µL produto de PCR

Figura 5. Ciclos utilizados nas reações de sequenciamento pelo método de Sanger.

Após a reação de sequenciamento, as amostras foram purificadas com o intuito de remover o DNA fita simples residual e os dNTPs remanescentes, sendo precipitadas com 80 µL de etanol gelado a 80% e incubadas à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, foram centrifugadas por 45 minutos a 3700 rpm e o sobrenadante foi descartado, sendo adicionado 150 µL de etanol gelado a 70%. Nova centrifugação foi realizada, dessa vez por 10 minutos a 3700 rpm; o sobrenadante foi descartado e as amostrasarmazenadas a -20ºC.

O produto da reação de sequenciamento purificado foi ressuspendido em 10 µL de Formamida Hi-Di (Applied Biosystems-Applera Corporation, Estados Unidos), sendo vigorosamente agitado e em seguida, desnaturado a 94ºC por 5 minutos. Posteriormente, as reações de sequenciamento foram submetidas à eletroforese capilar, com o sequenciador ABI–PRISM® 3700 DNA Analyser (96 capilares) (Applied Biosystems-Applera Corporation, Estados Unidos). As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com as sequências normais do gene com o auxílio dos programas Chromas Lite® (173) para visualização do eletroferograma e Gene Runner® v3.01 (174) para confirmação das sequências obtidas com a sequência padrão do gene.

3.2.2.2. Validação pela técnica de FISH Já parte das alterações detectadas pelos dois kits de MLPA foram validadas por outra técnica, com destaque para a de FISH – protocolo modificado de Pinkel et al.101, rotineiramente utilizada no Laboratório de Citogenética Humana do Departamento de Genética Médica da FCM/UNICAMP – por meio de sondas comerciais do tipo lócus- específica para a região indicada pela técnica de MLPA. Para tanto, foram realizadas culturas de linfócitos do sangue periférico do indivíduo e seus genitores (quando pertinente), segundo a técnica rotineiramente utilizada no Laboratório de Citogenética Humana do Departamento de Genética Médica da FCM/UNICAMP102. As células permaneceram estocadas em solução de metanol e ácido acético na proporção 3:1 a -20°C e posteriormente utilizadas para preparação das lâminas. Para investigação das amostras foram utilizadas sondas do tipo lócus-específica para a região sutelomérica indicada a partir dos resultados alterados detectados pela técnica de MLPA (Aquarius® Cytocell®). Após a preparação das lâminas, as mesmas foram deixadas em estufa a 37°C overnight e analisadas em microscópio de contraste de fase para a seleção da área onde seria aplicada a sonda. A área delimitada foi marcada com o uso de uma caneta diamante. As lâminas foram colocadas em uma solução de 2x SSC (pH 7,0) a 37º C (+/- 1ºC) durante 20 a 60 minutos, posteriormente desidratadas em uma série de etanóis a 70%, 85% e 100% por 2 minutos cada e deixadas em temperatura ambiente para secar. As sondas utilizadas foram preparadas ficando, inicialmente, em temperatura ambiente por alguns minutos. Em seguida, para hibridizações com uma única sonda misturou-

se 3 µL da sonda com 7 µL do tampão de hibridização. Já para hibridizações com duas sondas, misturou-se 3 µL de cada sonda com 4 µL do tampão de hibridização. Para a etapa de pré-desnaturação, as lâminas e as sondas foram pré-aquecidas por 5 minutos a 37°C; em seguida aplicou-se 10 µl da sonda na área delimitada da lâmina, cobriu- se com lamínula de no máximo 22x22 mm, selando com cola especial. A desnaturação foi feita colocando-se as lâminas em uma placa aquecida a 75ºC (+/- 1ºC) por 2 minutos. Posteriormente, as mesmas foram acondicionadas em uma caixa úmida e escura e colocadas em estufa a 37ºC (+/- 1ºC) overnight. Ao final desse tempo, as lamínulas e a cola especial foram retiradas cuidadosamente e as lâminas colocadas em 0,4x SSC a 72ºC (+/- 1ºC) (pH 7,0) por 2 minutos e em uma solução de 2x SSC/0,05% Tween-20 (pH 7,0) em temperatura ambiente por 30 segundos. Em seguida, 10 µL do contracorante DAPI foi aplicado sobre a área selecionada, posteriormente coberta com lamínula, e após 10 minutos, a visualização dos cromossomos foi realizada em microscópio de epifluorescência (Olympus BX51-BF-II / BX2®) e as imagens fotografadas com o sistema de análise FISHView (Applied Spectral Imaging®).

3.2.2.3. Validação pela técnica de MLPA Devido a restrições orçamentárias, a validação dos resultados foi realizada ainda pela própria técnica de MLPA, utilizando kits específicos, como P365-A1 HUMAN TELOMERE-14 (Tabela 3) e P018-F1 SHOX (Tabela 4), separadamente tendo em vista a alteração encontrada e conforme padronização de Lincoln-de-Carvalho68 (Anexo 3). Tais kits foram escolhidos por conterem um número maior de sondas próximas à região alterada segundo a investigação pelos kits P036 e P070.

Tabela 3. SALSA MLPA P365-A1 HUMAN TELOMERE-14.

Tabela 4. SALSA MLPA P018-F1 SHOX.

3.2.3. Técnica de microarray Na sequência da investigação, visando ampliar a identificação para um número maior de pacientes houve a oportunidade de se fazer a análise por microarray (CGH ou SNP-

array) em laboratórios privados, solicitada para oito pacientes que dispunham de plano ou seguro de saúde e atendiam as Diretrizes de Utilização da ANS (Agência Nacional de Saúde Suplementar – Resolução Normativa – RNº338, de 21/10/2013 e RNº387, de 28/10/2015, conforme o Rol de Procedimentos e Eventos em saúde – ANEXO II – de 2014 e 2016). Outros 13 pacientes realizaram esse exame e em 11 deles foi feito o sequenciamento do exoma, pela participação em projeto de pesquisa da doutoranda Joana R. Marques Prota, do Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da FCM-Unicamp, sob orientação da Profa. Dra. Íscia Lopes-Cendes, pesquisadora principal do Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão: Instituto Brasileiro de Neurociência e Neurotecnologia (Brazilian Institute of Neuroscience and Neurotechnology - CEPID-BRAINN FAPESP; processo 201307559-3), que estuda grupos de indivíduos com suspeita de condições diversas de provável origem genética, incluindo DI de causa não esclarecida, aplicando técnicas de análise genômica. A técnica de arrayCGH foi realizada segundo a padronização previamente estabelecida no Laboratório de Genética Molecular Humana do Departamento de Genética Médica da FCM/UNICAMP e contou com a colaboração do Prof. Dr. Fábio Rossi Torres, pesquisador do mesmo Laboratório e também Pesquisador Associado do CEPID-BRAINN. Foi utilizada a plataforma SurePrint G3 Human CGH Microarray 8x60K - ISCA (Agilent, Santa Clara, CA) e o kit de reagentes compatível para a realização da técnica. Essa plataforma permite analisar amostras de oito pacientes em um único experimento, sendo possível detectar ganhos, e perdas de 180 kb. Já para regiões ISCA (Consortium International Standards for Cytogenomic Arrays), a densidade é de 8 kb, podendo identificar variações de 25 kb, sendo 500 as regiões ISCA disponíveis no array. O protocolo foi desenvolvido de acordo com as recomendações do fabricante e seguiu as seguintes etapas: 1. Digestão das amostras (paciente e controle normal) com as enzimas Alu I e Rsa I.

2. Marcação das amostras de DNA por fluorescência.

3. Purificação das amostras marcadas.

4. Hibridização das amostras de DNA marcadas às lâminas e posterior lavagem.

7. Varredura das lâminas por meio do GeneChip® Scanner 3000 7G

8. Escaneamento da lâmina e posterior análise das imagens e dados, por meio do programa Agilent Cytogenomics Software (Agilent ®). A análise foi descritiva, com auxílio de bases de dados como NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Ensembl Genome Browser, DECIPHER e DGV.

3.3. Caracterização clínica da casuística e análise estatística A caracterização clínica da amostra de 300 indivíduos incluídos no estudo foi realizada por meio da análise dos prontuários disponibilizados pelo Serviço de Genética Clínica do Departamento de Genética Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, levando-se em consideração os seguintes parâmetros (Quadro 2):

Quadro 2. Caracterização clínica dos pacientes com DI idiopática. Dados Idade ( por ocasião do encaminhamento) Sexo Idade dos genitores (ao nascimento do paciente) Consanguinidade entre os genitores Antecedentes familiais (recorrência de DI) Antecedentes gestacionais e perinatais Convulsões Sinais clínicos (pontuação segundo critérios de De Vries et al.100)

A análise estatística do estudo foi realizada no programa Statistical Package for the Social Sciences versão 23.0 e pelo teste de Mann-Whitney. Os dados positivos estão apresentados em negrito. Os dados numéricos estão apresentados pelo N; média ± desvio padrão; mediana (mínimo e máximo). A análise descritiva está apresentada pelo valor absoluto e porcentagem relativa para os dados categóricos e pelo tamanho da amostra; média ± desvio padrão; mediana (mínimo e máximo) para os dados numéricos. A comparação entre os pacientes com alteração e os sem alteração foi realizada pelo teste de Mann-Whitney para os dados numéricos, pelo teste exato de Fisher e pelo χ2 para os dados com distribuição categórica. Os dados numéricos não apresentaram distribuição normal pela análise de distribuição gráfica e pelos testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro- Wilk. Para os dados numéricos, foi realizada uma análise adicional comparando os grupos (com e sem alteração identificada) de acordo com os valores da mediana. Em todas as análises foi fixado o nível de significância de 5% ( = 0,05).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Caracterização da casuística Constituem a casuística deste estudo 300 indivíduos, com idades variando entre um mês e 42 anos, com média de 23 anos, por ocasião da primeira avaliação em ambulatórios do Serviço de Genética Clínica do DGM-FCM-Unicamp, para investigação diagnóstica de atraso do desenvolvimento ou DI, durante o período de 2007 a 2016, para os quais foi solicitada a pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas terminais pela técnica de MLPA subtelomérico. Foi feita a análise dos prontuários relativos à consulta genética desses indivíduos no arquivo do DGM, levando em conta os seguintes marcadores demográficos e clínicos: sexo, idade do paciente por ocasião do encaminhamento (meses), idade dos genitores por ocasião do nascimento do propósito (anos), consanguinidade entre os genitores (representada pelo coeficiente de consanguinidade), antecedentes gestacionais e perinatais, recorrência familial de DI, ocorrência de crises convulsivas em qualquer idade e pontuação representativa de sinais clínicos relacionados a alterações cromossômicas subteloméricas segundo os critérios de De Vries et al.100, conforme Tabela 5.

Tabela 5. Dados demográficos e clínicos dos 300 pacientes incluídos no estudo. Dado Grupo Distribuiçãoa Sexo Masculino 191/300 (63,7%) Consanguinidade Sim 17/272 (6,3%) Grupo de consanguinidade 0 255/272 (93,8%) 1//16 5 (1,8%) 1/32 5 (1,8%) 1/64 3 (1,1%) 1/128 3 (1,1%) Sim (primos) 1 (0,4%) Antecedentes familiais Sim 104/272 (61,8%) Antecedentes gestacionais / Sim 122/261 (46,7%) Antecedentes perinatais Não 125/261 (47,9%) Duvidoso 14/261 (5,4%) Convulsões Sim 70/268 (26,1%) Idade no encaminhamento (meses) 277; 95,31 ± 74,52; 84 (1 a 504) Idade materna (anos) 265; 26,62 ± 6,66; 26 (13 a 45) Idade paterna (anos) 253; 30,49 ± 7,40; 30 (16 a 56) Sinais clínicos (pontuação De Vries100) 277; 3,88 ± 1,91; 4 (0 a 10) a. Os dados categóricos estão apresentados pelo n (valor absoluto do grupo) / N (amostra total) e porcentagem. Os dados numéricos estão apresentados pelo N; média ± desvio padrão; mediana (mínimo e máximo).

Quanto à distribuição dos 300 pacientes conforme o sexo, foram incluídos 191 indivíduos do sexo masculino (64%) e 109 do feminino (36%). Esse desvio da razão de sexo (1,75M:1,0F), com predomínio do sexo masculino, vem sendo sistematicamente observado em pacientes com DI em diversos estudos, sendo atribuído principalmente a causas biológicas, como a participação de um contingente significativo de genes do cromossomo X na determinação desse fenótipo11,103. Com relação à idade dos genitores por ocasião do nascimento do propósito, a idade paterna média foi de 30,5 anos em 253 casos informativos, enquanto a idade materna foi de 26,6 anos para 265 casos informativos, estando essa última em conformidade com a média populacional, segundo dados do IBGE11. A verificação de casamentos consanguíneos entre os genitores de 17 indivíduos que compõem a amostra, em 272 casos informativos, correspondendo a 6,3% da amostra, supera a taxa média no Brasil que é de 1,6%104. Os dados obtidos permitiram o cálculo do coeficiente endocruzamento para os filhos desses casais, assim como a estimativa do coeficiente médio de endocruzamento (F) da amostra. Foram constatados cinco casais de primos em 1o grau (F=1/16), cinco de primos em 2o grau (F=1/32), três de primos em 3o grau (F=1/64), três de primos em 4o grau (F=1/128) e uma união de parentes em 1o grau (F=1/4). Com base em tais dados, o valor de F foi de 0,0029. Esse valor é superior ao estimado para a população brasileira, que é 0,00088, e também para a região sul do país incluindo os estados de São Paulo e Rio de Janeiro, cujo F é 0,00395 (Freire-Maia, 1989). Por outro lado, se aproxima ao observado em amostras de indivíduos com DI, como constataram Sena e Beiguelman105 e Marques-de-Faria106, com valores de F de 0,0041 e 0,0034, respectivamente. A recorrência familial de DI foi observada em 104 dos 272 casos informativos (61,8%), favorecendo a hipótese do predomínio de fatores hereditários na origem da DI dos pacientes estudados. Quanto aos dados anmnésticos indicativos de sofrimento fetal e/ou participação de fatores do ambiente possivelmente relacionados à DI, foram registradas ocorrências gestacionais e perinatais relevantes em 122 dos 261 casos informativos (46,7%), sendo ausentes em 125 (47,9%) e duvidosas em 14 casos (5,4%). Crises convulsivas estiveram presentes em 70 dos 268 casos informativos, equivalendo a 26%, valor alto, considerando a frequência de 1% , estimada para a população geral, porém esperado, considerando que parte das síndrome relacionadas à DI se associa a epilepsia.

4.2. Resultados da Investigação Diagnóstica Os 300 indivíduos da amostra foram submetidos à investigação de rearranjos subteloméricos por MLPA, com identificação de 22 alterações (7,3%), posteriormente confirmadas por outro kit do mesmo método ou por técnica independente. Esse resultado é condizente com a literatura no que concerne à pesquisa alterações subteloméricas em DI27-29. Dentre essas 22 alterações, 14 são isoladas (três delas confirmadas como sendo de novo – del1p e del6p) e oito correspondem a rearranjos, dos quais um foi reconhecido como de novo (del5p/dup9p) e outro herdado (del4p/dup12p). A descrição completa das alterações identificadas por meio da técnica de MLPA encontra-se na Tabela 6.

Tabela 6. Variantes identificadas e confirmadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de MLPA subtelomérico. Paciente Alteração P4 dup7p P57 del1p de novo P64 del5p/dup9p de novo P75 del6p de novo P85 delXYp P98 del1p de novo P124 del4p/dup12p herdado P130 dup15p P136 del1p/dup4p herdado P137 del18q P161 dup7p P164 dup4p/del13q P166 del4p/dup8p P169 del9p/dup19q P191 dup11p P192 del1q P194 dup9p/del18p P236 dup17p P237 dup4p/del8p P258 dup X/Yp P303 dup X/Yp P316 del4p del, deleção; dup, duplicação; MLPA, Multiplex ligantion-dependent probe amplification.

Nesse mesmo grupo foram detectadas variantes não patogênicas em 14/300 (4,7%) dos indivíduos, todas pela técnica de MLPA, evidenciando a necessidade de constante

atualização das sondas, a partir da observação de polimorfismos na região de anelamento delas ao DNA genômico58,66,107 (Tabela 7).

Tabela 7. Variantes identificadas e não confirmadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de MLPA subtelomérico. Paciente Alteração P38, P53, P56, P59 e P68 SNP12p P74, P97, P105, P113, P122 e P257 SNP 16p P275 SNP 19q P140 e P231 SNP 22q MLPA, Multiplex ligantion-dependent probe amplification; SNP, single nucleotide polymorphism

Dando continuidade à investigação, foi realizada a técnica de microarray para 21 indivíduos, com observação de alterações em 11 (Tabela 8). Duas foram identificadas no cromossomo X (P23 e P258), duas no cromossomo 15 (P42 e P130), duas no cromossomo 7 (P108 e P152) e as demais como um caso cada (cromossomo 1 – P136; cromossomo 4 – P136; cromossomo 6 – P158; cromossomo 10 – P158; cromossomo 12 – P284). Quanto número de alterações, nove casos apresentaram apenas uma, enquanto em dois indivíduos foram observadas duas alterações.

Tabela 8. Variantes identificadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de microarray. Paciente Alteração P23 delXq21.1-q21.33 P42 del15q21.2-q22.2 P81 dupXq26.2 P108 del7p15.3-p15.2 P130 dup15q11.2-q13.1 P136 del1p36.33-p36.32 e dup4p16.3-p15.33 P151 del22q11.21 P152 del7q11.23 P158 dup6p11.2 e dup10q26.3 P258 dupX/Yp P284 dup12p13.2p13.1 del, deleção; dup, duplicação

Já com relação ao sequenciamento de exoma, foram concluídos sete dos 12 casos submetidos ao exame, com a observação de SNVs nos seguintes genes (Tabela 9).

Tabela 9. Variantes identificadas nos indivíduos incluídos no estudo por meio da técnica de sequenciamento de exoma. Paciente SNV P46 KIRREL3 e SHANK2 P63 CTTNBP2 P160 TCF4 P170 HTT P182 PRKCG P198 RAI1 P258 KMT2D SNV, single nucleotide variation; HTT, Huntingtin; HUWE1, Hect, uba, and wwe domains-containing protein 1; KIRREL3, Kin of irre-like 3; SHANK2, SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2; CTTNBP2, Cortactin-binding protein 2; PRKCG, Protein kinase c, gamma; RAI1, Retinoic acid-induced gene 1; TCF4, Transcription factor 4.

Quanto à observação de alterações encontradas por meio de outros protocolos investigativos realizados por grupos de pesquisa do DGM-FCM-UNICAMP, quatro casos foram detectados pela técnica de MLPA, sendo um com del22q11.2, um dupX (gene HUWE ex61) e um dupX (gene SLC6A8 éxon 9 e gene GDI1 éxon 1 e 7). Os três casos remanescentes foram detectados pela técnica de microarray, sendo identificadas dup12q24.33, del22q11.2 e dup16p11.2, com um caso cada (Tabela 10).

Tabela 10. Alterações identificadas em seis indivíduos da casuística com triagem por MLPA subtelomérico dentro da normalidade que foram submetidos a outros protocolos investigativos. Paciente Alteração P131 dupX gene HUWE ex61 P242 dup12q24.33 P1391 dup X. gene SLC6A8 éxon 9 gene GDI1 éxon 1 e 7 P1632 del22q11.2 P1682 dup16p11.2 P1802 del2q36.3-q37.1 dup, duplicação; del, deleção; HUWE1, Hect, uba, and wwe domains- containing protein 1; SLC6A8, Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, creatine), member 8; GDI1, GDP dissociation inhibitor 1.

4.3. Comparação da casuística conforme a presença ou não de alterações Na comparação entre pacientes com e sem alteração, a idade média do propósito na primeira avaliação foi de 66,79 meses (5,6 anos) para o primeiro grupo e de 100 meses (8,3 anos para o segundo grupo. A diferença foi estatisticamente significante, quando considerada

a observação de que a idade menor no início do acompanhamento esteve associada à presença de alteração (OR = 2,45; IC95% = 1,214 a 4,946 – Tabela 11). Essa observação pode ser justificada pelo encaminhamento mais precoce dos pacientes com suspeita de DI sindrômica, ou seja sugestivo de condição geneticamente determinada, pelo maior número de dismorfismos secundários ou anomalias minor, incluídos no protocolo de De Vries. Já as idades dos genitores na ocasião do nascimento do propósito não apresentaram diferenças significativas entre os dois grupos; a idade materna média foi de 28,02 anos para aqueles com alteração e de 26,35 anos para os sem alteração; já a idade paterna média sendo de 31,63 e 30,26 anos para o primeiro e segundo grupos, respectivamente (Tabela 11). Como o estudo é voltado a alterações cromossômicas estruturais e não numéricas, sendo essas últimas as comumente relacionadas à idade materna avançada, esse resultado também era esperado.

Tabela 11. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição numérica, dos pacientes incluídos no estudo. Marcador Com alteração Sem alteração P 42; 15,69 ± 7,12; 15 236; 16,53 ± 7,51; 16,5 Idade (anos) 0,489 (3 a 34) (3 a 52) Idade acompanhamento 42; 66,79 ± 66,79; 42 235; 100,4 ± 74,81; 95 0,001 (meses) (1 a 276) (1 a 504) 42; 28,02 ± 6,04; 223; 26,35 ± 6,75; Idade materna (anos) 0,082 27,50 (17 a 37) 26 (13 a 45) 41; 31,63 ± 8,36; 31 212; 30,26 ± 7,2; Idade paterna (anos) 0,344 (18 a 56) 29,5 (16 a 55)

Ao mesmo tempo, na análise dos dados, considerando os valores numéricos utilizados para o registro de sinais clínicos, pacientes com alterações tiveram pontuação maior conforme os critérios de De Vries, quando comparados aos indivíduos sem alterações, cujos valores foram menores a (OR = 0,401; IC95% = 0,204 a 0,792) (Figura 6 e Tabela 12).

Figura 6. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição numérica, dos pacientes incluídos no estudo. (A) Associação com os valores do Vries. (Alterado) 40; 4,83 ± 1,77; 5 (2 a 8); (Não alterado) 237; 3,72 ± 1,89; 4 (0 a 10). B. Associação com a idade do início do acompanhamento (Alterado) 42; 66,79 ± 66,79; 42 (1 a 276); (Não alterado) 235; 100,4 ± 74,81; 95 (1 a 504). A análise estatística foi realizada pelo teste Mann-Whitney. Em todas as análises foi utilizado o valor de alpha igual a 0,05. Os dados numéricos estão apresentados pelo N; média ± desvio padrão; mediana (mínimo e máximo) na legenda e pelo intervalo de confiança de 95% da mediana no gráfico.

Tais valores discrepantes são possivelmente explicados pelo fato de que uma maior quantidade de sinais dismórficos, já observados em pouca idade, levaria ao encaminhamento mais precoce para investigação genética. De maneira análoga, é maior a probabilidade de detectar alterações cromossômicas em indivíduos que apresentem maior número de sinais dismórficos e maior comprometimento intelectual, e desta forma, também de valores maiores dos critérios de De Vries entre pacientes com rearranjos subteloméricos. Entretanto, com relação a esse aspecto do número de sinais dismórficos entre pacientes com ou sem alteração, de fato deveriam ter sido incluídos apenas os com alterações subteloméricas, tendo em vista que os critérios de De Vries são voltados para esse grupo. Além disso, como grande parte dos indivíduos sem alterações não realizou a investigação por microarray cromossômico, optou-se não considerar esses resultados.

Tabela 12. Associação da presença de alteração genética com marcadores demográficos, clínicos e laboratoriais, com distribuição categórica, dos pacientes incluídos no estudo. Marcador Grupo Alterado Sem Total P OR IC95% alteração Sexoa Feminino 17 92 109 - - 0,732 Masculino 26 165 191 - - Idade (anos)a ≤ 16 23 118 141 0,618 > 16 19 118 137 Idade na primeira ≤ 84 29 112 141 2,45 1,214 a avaliação (meses)a 0,012 4,946 > 84 13 123 136 1 - Mãe (anos)a ≤ 84 17 122 139 - - 0,095 > 84 25 101 126 - - Pai (anos)a ≤ 84 20 115 135 - - 0,609 > 84 21 97 118 - - Consanguinidadea Sim 2 15 17 - - 1 Não 40 215 255 - - Grau de 0 40 215 255 - - consanguinidadeb,1 1/8 1 4 5 - - 1/16 1 4 5 - - 1/32 0 3 3 0,775 - - 1/64 0 3 3 - - Sim 0 1 1 - - (primo) Antecedentes Sim 24 98 122 - - gestacionais/ Não 15 110 125 0,160 - - perinatais b,2 Duvidoso 1 13 14 - - Crises Sim 13 57 70 - - 0,440 convulsivasa Não 28 170 198 - - Antecedentes Sim 26 142 168 - - 0,863 familiaisa Não 15 89 104 - - OR, odds ratio; IC95%, intervalo de confiança de 95%; -, não foi possível o cálculo do OR devido a distribuição dos dados. a, análise estatística realizada pelo teste Exato de Fisher. b, análise estatística realizada pelo teste χ2 considerando a razão de verossimilhança. Em todas as análises foi considerado alpha de 0,05. Os dados com valor de associação positivo estão apresentados em negrito. 1, uma análise adicional foi realizada sem considerar o caso onde não foi possível determinar o grau de parentesco, sendo o valor de p encontrado de 0,704; 2, uma análise adicional foi realizada desconsiderando os casos duvidosos e foi identificado o valor de p de 0,117. Os dados numéricos para o Vries, idade do paciente, idade no encaminhamento, idade materna e idade paterna foram agrupados de acordo com a mediana para a realização dos testes estatísticos.

4.4. Investigação de anomalias subteloméricas por MLPA Conforme mencionado, foram estudados 300 pacientes no total, sendo 191 homens (64%) e 109 mulheres (36%). Pela análise com o kit P036, 263 pacientes (93 mulheres e 170 homens) não apresentaram alteração subtelomérica, equivalendo a 88% da amostra (Figura 7).

Figura 7. Gráfico do resultado de MLPA para os indivíduos sem alteração (P) para o kit SALSA MLPA P036.

Em 37 indivíduos foram encontradas alterações. Dentre essas, 14 não foram confirmadas pelo kit SALSA MLPA P070 (4,7%), sendo cinco caracterizadas como del12p, seis como del16p, uma como dup19q e duas como dup22q, sendo identificadas como polimorfismos pela técnica de sequenciamento de Sanger (del12p e del16p) ou pela informação do fabricante (dup19q e dup22q). Com exceção de uma alteração (del 4q) que ainda não pôde ser confirmada, as 22 remanescentes também foram observadas pelo kit de confirmação (7,3%), sendo consideradas como associadas ao fenótipo anômalo dos respectivos pacientes (Tabela 13).

Tabela 13. Alterações encontradas por meio do kit SALSA MLPA P036 e confirmação – ou não – por meio do kit SALSA MLPA P070. Confirmação Alteração Número de pacientes Alterações del12p 5 não confirmadas del16p 6 pelo kit dup19q 1 SALSA MLPA P070 dup22q 2 del1p 2 del4p 1 del6p 1 delXYp 1 del1q 1 del18q 1 dup7p 1 dup11p 1 Alterações dup15”p” 1 Confirmadas dup17p 1 pelo kit dupXYp 2 SALSA MLPA P070 dup7q 1 del1p/dup4p 1 del4p/dup8p 1 del4p/dup12p 1 del5p/dup9p 1 del9p/dup19q 1 dup4p/del8p 1 dup4p/del13q 1 dup9p/del18p 1 del, deleção; dup, duplicação; p, braço cromossômico p; q, braço cromossômico q

Entre as alterações observadas e confirmadas encontram-se duas del1p, uma del1q, uma del4p, uma del6p, uma del18q e uma delXYp. Duplicações foram observadas nas regiões 7p, 7q, 11p, 15p e 17p (um caso cada). Dup XYp foi detectada em dois indivíduos. Entre os rearranjos, foram verificados del1p/dup4p, del4p/dup8p, del4p/dup12p, dup4p/del8p, dup4p/del13q, del5p/dup9p, dup9p/del18p e del9p/dup19q, também com um caso de cada (Tabela 3). Já um caso de del4q não pôde ainda ser confirmado.

4.4.1. Alterações não confirmadas

4.4.1.1. Alteração del 12p Em cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68) foi identificada uma deleção da região subtelomérica do braço curto do cromossomo 12; del(12p) (Figura 8).

Figura 8. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 para os cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68).

Segundo o fabricante, no kit SALSA MLPA P036-E (Tabela 1) a sonda subtelomérica referente à porção 12p foi desenhada para o gene SLC6A12, pertencente à família 6 dos carreadores de soluto (transportador neuro-transmissor betaina/GABA), localizado em 12p13.33 (MIM 603080). Já para o kit de confirmação SALSA MLPA P070 (Tabela 2), o gene escolhido foi o JARID1A (KDM5A), associado à regulação de proliferação celular, também localizado em 12p13.33 (MIM 180202) próximo ao SLC6A12 (Figura 9).

Para confirmar a suposta alteração em 12p foi realizado o ensaio com o kit SALSA MLPA P070 e em todos os indivíduos testados houve amplificação da região, contrariando o resultado encontrado pelo kit SALSA MLPA P036 (Figura 10).

Figura 10. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P070 para os cinco indivíduos (P38, P53, P56, P59 e P68).

Nessa situação, foi realizado o sequenciamento do gene SLC6A12, para a região complementar à sonda contida no kit SALSA MLPA P036. A troca A>G encontrada na região (Figura 11) corresponde a um polimorfismo de base única SNP denominado rs60220187, descrito na base de dados Entrez SNP do NCBI, que compreende a região 3’UTR (região não traduzida) do exon 18 do gene SLC6A12. Segundo a mesma base de dados, não há associação entre esse polimorfismo e qualquer manifestação clínica.

Figura 11. Sequenciamento do fragmento complementar à sonda 12p (kit SALSA MLPA P036) correspondente a uma porção da sequência do exon 18 do gene SLC6A12. Em A a sequência normal, sem alteração. Em B a sequência encontrada nos indivíduos, cujo resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 mostrara deleção. No detalhe, a troca nucleotídica A>G, observada (SNP rs 60220187) (Ensembl).

A região 12p, embora rica em genes cuja correlação com DI já foi descrita109-111, também é associada a polimorfismos, desde que um segmento duplicado em 12p13.33 foi observado tanto em um paciente com sinais clínicos leves, quanto em um de seus genitores não afetados. Diante disso, a alteração nucleotídica na sequência de hibridização da sonda 12p observada foi interpretada como polimorfismo, não havendo registro de associação do mesmo às alterações fenotípicas na literatura, embora estudos mais extensos sejam necessários para estimar sua frequência na nossa população. Além disso, como os kits de MLPA são utilizados

por inúmeros grupos de pesquisa, as versões subsequentes do mesmo kit vieram com observações referentes à possibilidade de haver polimorfismo na região estudada58.

4.4.1.2. Alteração del 16p Em seis indivíduos (P74, P97, P105, P113, P122 e P257) foi identificada uma deleção da região subtelomérica do braço curto do cromossomo 16 [del(16p)] (Figura 12). Segundo o fabricante, no kit MLPA P036 a sonda subtelomérica referente à porção 16p foi desenhada para o gene POLR3K, localizado em 16p13.3. Já para o kit de confirmação MLPA P070, o gene escolhido foi o DECR2, também localizado em 16p13.3 próximo ao gene POLR3K (Figura 13).

Figura 12. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 para os seis indivíduos (P74, P97, P108, P113, P122 e P257).

Depois de observada a suposta alteração em 16p nesses seis indivíduos, foi feito novo ensaio de MLPA com o kit MLPA P070 para confirmação dos resultados e houve

amplificação da região em todos eles, contrariando o resultado encontrado pelo kit P036 (Figura 14).

Figura 14. Gráfico do resultado de MLPA com o kit MLPA P070 para os seis indivíduos (P74, P97, P108, P113, P122 e P257).

Nessa situação, foi realizado o sequenciamento do gene POLR3K, para a região complementar à sonda contida no kit MLPA P036. A troca C>G encontrada na região (Figura 15) corresponde a um polimorfismo de base única SNP denominado rs114777900 (c.111+135C>G), descrito na base de dados Entrez SNP do NCBI, que compreende à porção da sequência do exon 1 do gene POLR3K, não havendo registro de associação desse polimorfismo à DI.

Figura 15. Sequenciamento do fragmento complementar à sonda 16p (kit MLPA P036) correspondente à porção da sequência do exon 1 do gene POLR3K. Em A a sequência normal, sem alteração. Em B a sequência encontrada nos indivíduos, cujo resultado de MLPA com o kit MLPA P036 mostrara deleção. No detalhe, a troca nucleotídica C>G observada (SNP rs114777900).

Sob esse aspecto, é importante ressaltar que as sondas de MLPA são sensíveis a pequenas alterações na sequência de anelamento ao DNA genômico. Assim, mudanças nucleotídicas muito próximas (a uma distância de 10 pares de base) ao sítio de anelamento ou dentro do mesmo, inibem ou desestabilizam a ligação dos oligonucleotídeos na região em

questão66,112,113. Emparelhamentos errôneos de sonda também podem, teoricamente, resultar em falsos positivos. Sendo, assim, a deleção detectada por MLPA seria consequente a um artefato de técnica. A região 16p, embora rica em genes cuja correlação com DI já foi descrita114-117, também é associada a polimorfismos58. Nos quatro casos em questão, a alteração nucleotídica na sequência de hibridização da sonda 16p observada foi interpretada como um polimorfismo, pois não há registro na literatura de associação com alterações fenotípicas, embora estudos mais extensos sejam necessários para estimar sua frequência populacional.

4.4.2. Alterações confirmadas

4.4.2.1. Alteração del(1)(p36)

4.4.2.1.1. Paciente 57 (Lincoln-de-Carvalho, 2009) Paciente do sexo masculino, filho de casal não consanguíneo. O desenvolvimento neuropsicomotor foi atrasado; teve atraso de fechamento de fontanela bregmática e crises convulsivas. Ao exame físico, observados braquicefalia, occipital plano, frontal alto e abaulado, com implantação alta de cabelos, prega epicântica interna bilateral, estrabismo convergente bilateral, hipoplasia malar, face arredondada, bochechas proeminentes, ponte nasal baixa, comissuras bucais desviadas para baixo, filtro curto, palato alto, orelhas de implantação baixa, hérnia inguinal à direita, pés planos, com dedos mais alargados e acavalgados à direita.

4.4.2.1.2. Paciente P98 Paciente do sexo masculino, primeiro filho de casal jovem e não consanguíneo; mãe teve dificuldade de aprendizado. Gestação complicada por anemia crônica, febre no 3º mês; queda no 4º mês, metrorragia, trabalho de parto prematuro (6º mês) com pré-eclâmpsia; uso de corticoide para maturação pulmonar fetal. Parto vaginal com expulsivo prolongado, apresentação pélvica com distocia de bacia fetal, idade gestacional estimada em 33 semanas; peso ao nascer de 1505 g; comprimento 42 cm e perímetro cefálico 32 cm; não chorou e apresentou cianose generalizada; no período neonatal, evoluiu satisfatoriamente com icterícia tardia.

O desenvolvimento neuropsicomotor foi atrasado; apresentou atraso de fechamento de fontanela bregmática e da dentição decídua; desenvolveu alergia ao leite de vaca, teve diversas pneumonias e aos 12 meses teve episódio sugestivo de crise convulsiva. Ao exame físico, com três anos de idade, foram observados frontal alto e abaulado, retração bitemporal, face achatada com hipoplasia malar, orelhas dismórficas e em abano, ptose palpebral, estrabismo convergente, nariz com ponte baixa, narinas antevertidas e hipoplasia alar, filtro apagado, lábio superior arqueado, pés planos com acavalgamento de dedos e fóvea coccígea. Avaliação auditiva e oftalmológica, eletroencefalograma, ressonância magnética (RM) de crânio, ecocardiograma e ultrassom de abdômen sem alterações. A pesquisa de alterações subteloméricas pela técnica de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 mostrou microdeleção 1p36 confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa1p(P070)×1 (Figura 16).

Figura 16. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070 para os casos P57 (Lincoln-de-Carvalho68) e P98.

Para pesquisar alterações em 1p, a região escolhida no kit SALSA MLPA P036 (Tabela 1) para o desenho da sonda está em 1p36 (gene TNFRSF4), enquanto no kit de confirmação SALSA MLPA P070 (Tabela 2), o gene escolhido é o TNFRSF18, também situado em 1p36 (Figura 17).

A validação foi realizada pela técnica de FISH (Figura 18), corroborando com o resultado encontrado por meio do método de MLPA.

Figura 18. Resultado de FISH com sonda subtelomérica para a região 1p para o paciente P98, mostrando apenas um sinal (verde) no cromossomo 1 normal (seta branca). A ausência do outro sinal indica a deleção da região em 1p36 (seta amarela).

O teste de FISH também foi realizado nos genitores dos pacientes, com resultados normais. Assim, confirmada a deleção 1p36 de novo nos dois casos. Comparando-se as características dos pacientes P57 e P98 (Lincoln-de- Carvalho68) com outras descrições, foi constatada similaridade de sinais clínicos, conforme pode ser observado na Tabela 14.

Tabela 14. Características clínicas encontradas em pacientes com deleção terminal 1p36 (adaptado de Shapira et al.118, Heilstedt et al.119; Gajecka et al.120; Battaglia et al.121; Oiglane-Shlik et al.122). Características Outros estudos P57 P98 P136 Atraso do fechamento da fontanela + + + + Microcefalia + - + + Braquicefalia + + - + Occipital plano - + - + Fronte proeminente + + + - Sobrancelhas retificadas + + + + Hipertelorismo + - - + Enoftalmia + + + - Prega epicântica interna + + + + Estrabismo convergente + + + ? Ponte nasal baixa + + + + Hipoplasia malar + + + + Bochechas proeminentes + + - - Filtro longo + + + + Comissuras bucais desviadas para baixo + + - - Palato alto e arqueado + + + + Fenda palatina + - - - Queixo proeminente + - + + Orelhas dismórficas (baixas e inclinadas) + + + + Mãos pequenas + ND + + Clinodactilia + - - + Pés planos - + + + Cardiopatia + - - + Dificuldade de alimentação + - - + Hipotonia + + + + ADNPM + + + + Surdez neurosensorial + - - - Distúrbio na fala + + + + Distúrbios de comportamento + - + + Convulsões + + + + +, presença; -, ausência; ND, não determinado

A síndrome de deleção 1p36 (MIM 607872), determinada por deleção terminal do braço curto do cromossomo 1, com frequência estimada em 1:5.000 a 1:10.000 nascimentos, incide em ambos os sexos e em todas as etnias, sendo considerada a síndrome de deleção subtelomérica mais comum em humanos118,123,125. Com relação à origem, estima-se que 52% dos indivíduos com essa síndrome apresentem uma deleção terminal em 1p36; que 29% tenham uma deleção intersticial de tamanho variado; que em 12% sejam observados rearranjos complexos (que podem incluir mais do que a deleção 1p36 ou deleção 1p36 com duplicação 1p36) e que em aproximadamente 7% haja a presença de um cromossomo derivado 1, na qual a região telomérica 1p tenha sido substituída pela região terminal de outro cromossomo. Determinar o mecanismo de origem da alteração é necessário para que o aconselhamento genético seja realizado de forma adequada122,125,126. Indivíduos com essa síndrome em geral apresentam DI em graus variados, hipotonia, baixa estatura e dismorfismos craniofaciais, anomalias esqueléticas, cardíacas, gastrointestinais e oftalmológicas, além de manifestações neurológicas diversas e distúrbios de comportamento121,128,129. As características craniofaciais incluem fontanela bregmática ampla, microbraquicefalia, fronte proeminente, orelhas pequenas e(ou) dismórficas, sobrancelhas retificadas, olhos de localização profunda, ponte nasal baixa, filtro longo, boca pequena, comissuras bucais desviadas para baixo, palato alto e arqueado, fenda palatina e queixo pontudo. Hipotonia e convulsões são relatados em quase 50% dos casos; cardiopatias em 43% a 70% (incluindo desde anomalias valvares até cardiopatias complexas como tetralogia de Fallot); alterações oftalmológicas variadas como estrabismo, hipermetropia, nistagmo e catarata são descritas em 50% dos pacientes; surdez neurossensorial foi observada em 47% dos casos; malformações esqueléticas ocorrem nessa mesma proporção, com registro de baixa estatura, braquidactilia, escoliose e estenose espinhal congênita; também relatados anomalias geniturinárias, dificuldade de alimentação e hipotireoidismo118,120,121,122,124,130. A complexidade fenotípica parece estar diretamente relacionada à extensão do segmento deletado como resultado da haploinsuficiência de diferentes genes localizados na região. A expressividade é variável; alguns indivíduos têm fenótipo evidente e de reconhecimento clínico fácil, enquanto em outros o quadro pode ser bem sutil. A deleção também varia quanto ao tamanho e, frequentemente, não é detectada por exame de cariótipo

convencional, sendo necessária a aplicação de técnicas mais refinadas, como MLPA e microarray36,67,119,120,131,132. Desde os primeiros relatos, há interesse na correlação genótipo-fenótipo da deleção 1p36 e vários genes vêm sendo considerados associados às características fenotípicas dessa condição, baseados no padrão de expressão ou no fenótipo observado em pacientes ou modelos animais com mutação nesses genes. Entre os genes mais relacionados a essa condição estão MMP23B, GABRD, SKI, PRDM16, KCNAB2, RERE, UBE4B, CASZ1, PDPN, SPEN, ECE1, HSPG2 e LUZP1, apresentados na Figura 19 abaixo, modificada de Jordan et al.133.

Figura 19. Genes relacionados aos sinais clínicos da deleção 1p36 e sua localização no cromossomo 1, modificado de Jordan et al.133.

O gene MMP23B (Matrix metallopeptidase 23B; MIM 603321; chr1:1567560- 1570030) codifica um membro da família das metaloproteinases de matriz (MMP) envolvido na degradação da matriz extracelular em processos fisiológicos. A deleção é associada ao fechamento tardio da fontanela anterior119,120,133. O gene GABRD (Gamma-aminobutyric acid type A receptor delta subunit; MIM 137163; chr1:1950768-1962192) codifica para a subunidade delta dos receptores do tipo GABA e está relacionado a anomalias neuropsiquiátricas e convulsões130,133. Já haploinsuficiência do gene SKI (SKI proto- oncogene; MIM 164780; chr1:2160134-2241652), associado ao desenvolvimento de vários sistemas do corpo, poderia explicar manifestações diversas como DI, convulsões, defeitos cardíacos congênitos e alterações faciais130,132,134. Pela localização do gene TNFRSF4 (TNF receptor superfamily member 4; MIM 600315) – escolhido para o desenho da sonda dos kits de MLPA subteloméricos empregados e alterado nos pacientes estudados no presente estudo – e sua proximidade com os três genes acima descritos, podem se justificar os sinais observados nos pacientes com a haploinsuficiência dos mesmos. Já quanto aos demais genes relacionados à condição, apesar

de localizados downstream ao gene TNFRSF4, não há certeza de estarem alterados nos pacientes P57 e P98, porém podem justificar outros sinais encontrados nos pacientes. O gene PRDM16 (PR/SET domain 16; MIM 605557; chr1:2985742-3355185) codifica um fator de transcrição zinc finger e se relaciona a determinação e diferenciação do tecido adiposo. Conforme Gajecka et al.120, encontra-se na região crítica para cardiomiopatia, fato corroborado por Arndt et al.135 e pode explicar a alteração encontrada em pacientes com deleção 1p36. Segundo revisão realizada por Gajecka et al.120 e estudos conduzidos por Perkowski et al.136, o gene KCNAB2 (Potassium voltage-gated channel subfamily A regulatory beta subunit 2; MIM 601142; chr1:6052358-6161253) codifica uma proteína auxiliar que altera as propriedades da subunidade alfa e dos canais de potássio e sua alteração justificaria manifestações como atraso do desenvolvimento, deficiência intelectual e convulsões nos indivíduos com deleção 1p36. Vale mencionar que esse gene está na região crítica descrita por Wu et al.138, mas não na região relacionada a convulsões definida por Rosenfeld et al.130 e Shimada et al.132. O gene RERE (Arginine-glutamic acid dipeptide repeats; MIM 605226; chr1:8412464-8877699) codifica um regulador de receptores nucleares com papel importante no desenvolvimento embrionário, como regulador da cascata de sinalização do ácido retinoico. Fregeau et al.139 relataram 10 pacientes com NEDBEH (Neurodevelopmental Disorder with or without anomalies of the Brain, Eye or Heart) e mutações em heterozigose no gene RERE, sugerindo que a haploinsuficiência do mesmo esteja relacionada ao fenótipo associado à deleção 1p36 proximal (MIM 616975). Tais alterações (c.3466G-A, NM_012102.3; c.3785C-G, NM_012102.3; c.4293C-A, NM_012102.3 e c.2249_2270dup, NM_012102.3), detectadas por exoma e confirmadas por sequenciamento de Sanger, ocorreram de novo em todos os casos cujo material dos genitores foi investigado. Os mesmos pesquisadores, em estudos com modelos animais, observaram fenótipos similares em ratos, similarmente verificados por Plaster et al.139 e Kim et al.140 também em estudos animais, quando verificaram que deleções no mesmo gene podem levar a atraso no desenvolvimento, DI, alterações no desenvolvimento cerebral, problemas auditivos e oftalmológicos, cardiopatias, anomalias renais e baixa estatura. Estudos com modelos animais também mostraram que alterações no gene UBE4B (Ubiquitination híper E4B; MIM 613565; chr1:10093041-10241297) – que codifica um fator

de ubiquinização relacionado a união de cadeias de multiubiquitina – podem levar a miocardiopatia e a problemas de desenvolvimento neuronal142. O gene CASZ1 (Castor zinc finger 1; MIM 609895; chr1:10696666-10856733) codifica um fator de transcrição zinc finger altamente expresso no coração. Embora alterações nesse gene não tenham sido relatadas em humanos, ele está localizado em uma das regiões críticas para defeitos congênitos cardíacos, como observaram Zaveri et al.134. Situação similar também foi registrada pelos mesmos autores, dessa vez para os genes PDPN (Podoplanin; MIM 608863; chr1:13910252-13944452) – que codifica uma glicoproteína membrana integral – e SPEN (Spen 75íper75 transcriptional repressor; MIM 613484; chr1:16174359- 16266950), um repressor de transcrição, que também estão inseridos na região crítica para cardiopatias congênitas , apesar de mutações nesses genes ainda não terem sido descritas em humanos. A haploinsuficiência do gene SPEN também pode contribuir para alterações de desenvolvimento neuronal e baixa estatura em indivíduos com deleção 1p36. Hofstra et al.142 descreveram uma mutação missense em heterozigose do gene ECE1 (Endothelin converting enzyme 1; MIM 600423; chr1:21543740-21672034) em indivíduo com alteração cardíaca, (persistência do canal arterial e defeito de septo ventricular e atrial). Em 2014, Zaveri et al.134 descreveram esse gene como situado na região crítica para alterações cardíacas em pacientes com deleção 1p36, corroborando o registro feito pelos primeiros autores. Ele codifica uma metaloprotease envolvida no processo proteolítico dos precursores da endotelina, que em concentrações altas promove constrição dos vasos sanguíneos, levando a hipertensão arterial e doenças cardíacas134,142. O heparan sulfate proteoglycan 2 gene (MIM 142461; chr1:22148737-22263750) conhecido como gene HSPG2 codifica o perlecan, um proteoglicano de sulfato de heparan multidomínio que se liga a várias proteínas da membrana basal. Mutações recessivas nesses genes se associam a duas síndromes de displasia esquelética (Silverman-Handmaker – MIM 224410 – e Schwartz-Jampel tipo I – MIM 255800). Embora fendas palatais estejam relacionadas a essas síndromes, enquanto alterações cardíacas não, o fato de esse gene estar situado na região crítica para cardiopatias descrita por Zaveri et al.134 sugere que alterações no mesmo podem contribuir tanto para o desenvolvimento de fendas como para cardiopatias133,134,143. Por fim, o gene LUZP1 (Leucine íper protein 1; MIM 601422; chr1:23410516- 23495351), também situado na região crítica para defeitos cardíacos referida por Zaveri et al.134 ainda não foi descrito como mutado em humanos. Estudos em modelos animais mostram

que alterações nesse gene podem se relacionar a defeitos cardíacos, fendas palatinas e alterações no desenvolvimento cerebral134,144.

4.4.2.1.3. Paciente P136 Paciente do sexo feminino, nascida em 2002, única filha de jovem casal não consanguíneo; sem antecedentes familiais relevantes. Durante a gestação, a mãe relata baixo ganho ponderal e movimentos fetais fracos. Parto cesáreo, na 36a semana, com peso de 2600g (percentil 25); comprimento de 48 cm (percentil 50). Além da prematuridade, teve hipóxia neonatal grave, evoluindo satisfatoriamente, sem relato de problemas neonatais, exceto pela detecção de defeito de septo ventricular pelo ecocardiograma, sem repercussão hemodinâmica. Evoluiu com hipotonia e atraso global de desenvolvimento; andou após os 4 anos e não fala. A partir dos 12 meses, observadas crises convulsivas (tônicas), em geral de uma a duas vezes ao dia, muito rápidas e durante o sono. Devido a aversão significativa ao contato visual, inicialmente interpretada como fotossensibilidade, realizado exame oftalmológico que excluiu qualquer anormalidade, sendo feita correção de entropia congênita na ocasião. Observados bruxismo e briquismo; entre seis e nove anos apresentou períodos de seletividade alimentar, chegando a jejum prolongado, sendo excluídas quaisquer condições infecciosas ou metabólicas que justificassem essas manifestações. Ao exame físico com 10 anos e 10 meses, tinha peso de 24,5 kg, altura 122,5 cm e perímetro cefálico 49,5 cm. Observados ausência de contato visual, linguagem e comunicação não verbal. Chamavam atenção os dismorfismos craniofaciais, com orelhas de implantação baixa, olhos de localização profunda, sobrancelhas retificadas, cílios longos nasal, ponte nasal baixa, lábio inferior evertido, palato alto, dentes espaçados com diastema de incisivos centrais superiores, incisivo central esquerdo bífido e um dente extranumerário em localização posterior aos incisivos superiores, que foi removido. Pele pálida, frouxa e levemente ressacada; hipertricose mais evidente em membros e dorso. Iniciando puberdade, com telarca e pubarca em estágio II-III de Tanner II-III. Na investigação complementar, detectados refluxo vesico-ureteral direito com hidronefrose leve pela ultrassonografia abdominal, com cintilografia renal estática e dinâmica sem alterações. A RM do cérebro sugeria heterotopia laminar subcortical e anomalias do hipocampo, classificadas no complexo agiria-paquigiria. O quadro clínico era compatível com a deleção 1p36, porém com algumas manifestações não previamente descritas nessa condição. Após exame de cariótipo convencional normal, realizada pesquisa de alterações subteloméricas pela a técnica de MLPA

com o kit P036, que identificou deleção 1p36 e duplicação 4p ambas confirmadas pelo kit P070 – rsa(1p)×1,(4p)×3 (Figura 20).

Figura 20. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 1p e duplicação 4p no paciente.

Para a validação dos resultados identificados por MLPA realizada a técnica de FISH na paciente e sua genitora, sendo detectado apenas um sinal 1pter e três sinais 4pter (Figura 21) na propósita, enquanto na genitora foi observada a translocação balanceada t(1p;4p). Portanto, o cariótipo da paciente é 46,XX.ish der(1)t(1p;4p)(p36.33;p16.3)mat(D1S243-,D1S2515-;D4S166+).

Para a definição dos pontos de quebra neste rearranjo foi realizada a técnica de aGH, a partir do kit CytoScan HD Array (Affymetrix, CA, USA), em parceria com o grupo de pesquisa da Profª Dra. Iscia Cendes, seguindo o protocolo do fabricante. O resultado confirmou as alterações estruturais identificadas por MLPA e FISH (Figuras 22 e 23).

Figura 22. Microarray mostrando a deleção em 1p36.3. Em vermelho a região deletada e abaixo, os genes localizados nesta região.

Figura 23. Microarray mostrando a duplicação em 4p16. Em azul a região duplicada em abaixo, os genes nesta região.

A deleção em 1p36.33-1p36.32 (Figura 22) possui 4025 kb (chr1:1186633- 5258556) e perfaz 241 genes. Já a duplicação em 4p16.3-4p15.33 (Figura 23) possui 14138 kb (chr4: 68345–14206282) e inclui 128 genes; várias CNVs patogênicas localizadas nessas regiões foram relatadas (Figura 24) em pacientes com autismo, DI, dismorfismos craniofaciais e anomalias cardíacas145,146.

A combinação da deleção em 1p36 e duplicação ou deleção de diferentes cromossomos já foi descrita em diversos estudos. Muitos pacientes apresentam sinais clínicos compatíveis com a deleção 1p36 associados a outros, cuja frequência e variação podem ser atribuídos ao envolvimento dessas outras regiões cromossômicas147-151. A duplicação encontrada na paciente envolve a região característica da síndrome de Wolf-Hirschhorn, porém esta é causada pela a perda cromossômica em 4p. Os sinais associados a essa alteração são inespecíficos, como atraso do crescimento pré e pós-natal, deficiência intelectual e convulsões, além de alguns dismorfismos faciais. No presente caso, se destaca o fenótipo da deleção 1p36.

Figura 24. Representação esquemática mostrando CNVs patogênicas descritas na região identificada (14 Mb de 4p16).

4.4.2.2. Alteração em 4p

4.4.2.2.1. Paciente P316 Paciente do sexo masculino, encaminhado ao ambulatório de Genética aos 12 anos, com suspeita de síndrome de Down. Foi adotado pela tia biológica (paterna). É o 1o filho de casal jovem e não consanguíneo; tem um irmão mais novo cujo desenvolvimento é normal e ainda um meio-irmão paterno e duas meias-irmãs maternas, ambas fruto da segunda união materna, na qual ainda ocorreram três perdas gestacionais, todas no 1o trimestre. Referidos ainda uma prima em 1o grau supostamente com síndrome de Down, além de um

primo e uma prima em 1o grau falecidos no período neonatal, o primeiro com cardiopatia congênita, todos pelo lado paterno. Gestação não planejada e sem acompanhamento pré-natal; genitores usuários de álcool e diversas drogas ilícitas; o parto foi vaginal, com idade gestacional não especificada, peso ao nascimento de 1.600 g, sucção débil, hipotonia e icterícia neonatal; permaneceu 15 dias internado em fototerapia. Evoluiu com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor; desde os oito meses tem crises convulsivas tônico-clônicas generalizadas. Ao exame físico, observados obesidade e estatura no limite inferior para a idade, microcefalia, pit pré-auricular (bilateral), hipertelorismo, fendas palpebrais desviadas para cima com eversão leve do terço distal, nariz de base alargada e com desvio septal, filtro nasolabial curto e apagado, prega palmar anômala à direita, sopro holossistólico, criptorquidia esquerda, hipospadia peniana, acantose nigricante cervical. Realizado exame de cariótipo, com técnica de bandamento G, resolução 400-700 bandas, cujo resultado foi normal, 46,XY, em 50 células. Também solicitado ecocardiograma, indicativo de comunicação interatrial moderada e estenose pulmonar significativa, com indicação cirúrgica; aguarda ultrassom de abdômen total. Acompanhado em ambulatórios de Cardiologia, Cirurgia Pediátrica e Neurologia. Por meio da pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou-se uma microdeleção 4p, confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 - rsa4p(P070)×1 (Figuras 25 e 26).

Figura 25. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção 4p no paciente.

Figura 26. Em azul, localização do gene PIGG (cromossomo 4p16.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 4p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108.

4.4.2.2.2. Paciente P166 Paciente do sexo masculino, nascido em 09/02/2008, filho único de casal jovem e não consanguíneo; meia prima materna com ADNPM; sem outros antecedentes familiais relevantes. Gestação acompanhada por pré-natal, sem intercorrências, parto vaginal; peso 2180 g, comprimento 45,5 cm e perímetro cefálico 32,5 cm; choro demorado, cianose generalizada e sucção débil; teve icterícia a partir o 3º dia, com necessidade de fototerapia, recebendo alta aos nove dias de vida. Evoluiu com atraso do desenvolvimento, quatro episódios de pneumonia, constipação intestinal e convulsão febril. Ao exame físico, com dois anos e cinco meses, observados frontal alto e com implantação alta de cabelo, orelhas dismórficas de implantação baixa, com lóbulos hipoplásicos, hipertelorismo, telecanto e cílios longos, ponte nasal alta e larga, columela achatada, retrognatismo, boca pequena, palato alto, peito carenado, mãos mantidas em flexão, hipospadia balano-prepucial e hipotonia. O ecocardiograma indicou estenose pulmonar supravalvar com discreta repercussão hemodinâmica. A pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou um rearranjo del4p/dup8p, confirmado pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa(4p)×1,(8p)×3 (Figuras 27 e 28).

Figura 27. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 4p e duplicação 8p no paciente.

Figura 28. Em azul, localização do gene FBCO25 (cromossomo 8p23.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 8p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108.

4.4.2.2.3. Paciente P124 Paciente do sexo feminino, nascida em 25/10/2003, segunda filha de casal jovem e não consanguíneo, com histórico de óbitos neonatais de crianças polimalformadas pelo lado materno e uma prima com síndrome de Wolf-Hirschhorn (diagnóstico posterior ao da propósita). Gestação sem intercorrências; parto normal, a termo, com peso de 3010 g e comprimento de 47 cm; não chorou, era hipotônica, com sucção débil. Evoluiu com atraso global do desenvolvimento, associado à deficiência auditiva e visual. Ao exame físico, com 10 meses de idade, observados occipital plano, frontal alto e abaulado, aparente trigonocefalia, cabelos escassos, orelhas dismórficas e de implantação baixa, hipertelorismo, epicanto inverso bilateral, fendas palpebrais oblíquas para cima, estrabismo divergente, hemangioma em pálpebras superiores, nariz pequeno com ponte alta e hipoplasia alar, comissuras bucais desviadas para baixo, micrognatia, pescoço curto, diástase de músculos retos abdominais, hérnia umbilical, prega palmar de transição à esquerda, genitais externos com hemangioma em grandes lábios e hipoplasia de pequenos lábios, cútis marmorata, hipoplasia ungueal em 5o dedo das mãos e hipotonia. Na investigação complementar, o ecocardiograma mostrou persistência de canal arterial, comunicação interatrial, insuficiência tricúspide leve e dilatação de câmaras direitas;

teste de emissões otoacústicas indicando perda auditiva; avaliação oftalmológica e ultrassonografia abdominal sem alterações. O exame de cariótipo foi normal, 46,XX, com resolução de 500 bandas por lote haploide. Por meio da pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou-se um rearranjo del4p/dup12p, confirmado pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa(4p)×1,(12p)×3 (Figura 29).

Figura 29. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 4p e duplicação 12p no paciente.

Para pesquisar alterações em 4p e em 12p, as regiões escolhidas no kit SALSA MLPA P036 (Tabela 1) e no kit de confirmação SALSA MLPA P070 (Tabela 2), para o desenho da sonda estão em 4p16.3 (gene PIGG) e 12p13.33 (genes SLC6A12 e KDM5A), respectivamente (Figuras 9 e 26). O rearranjo del4p/dup12p observado na paciente por meio da técnica de MLPA foi validado por FISH (Figura 30), também realizado em seus genitores, sendo identificada translocação balanceada t(4p;12p) materna (Figura 31), herdada da avó materna. Esse rearranjo também foi transmitido à tia materna, cuja filha teve diagnóstico de síndrome de Wolf-Hirschhorn, em avaliação posterior à da propósita. Assim, a constituição cromossômica da propósita passa a ser 46,XX.ish der(4)t(4p;12p)(p16.3;p13.2)mat(D4S166-;D12S1697+,D12S98+,D12S850+).

Figura 31. Resultado de FISH com sondas subteloméricas para as regiões 4p (verde) e 12p (vermelho) para a mãe da paciente P124, mostrando um rearranjo equilibrado entre os cromossomos 4 e 12.

4.4.2.2.4. Paciente P237 Paciente do sexo masculino, nascido em 23/01/2004; primeiro filho de casal jovem e não consanguíneo; meio-irmão teve convulsões até os sete anos de idade, com desenvolvimento neuropsicomotor normal; sem outros antecedentes familiais relevantes. Gestação a termo; parto vaginal a fórceps, com peso 3580 g, comprimento 50,5 cm, perímetro cefálico 35 cm; Apgar 9/10; com torcicolo congênito. Evoluiu com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, amigdalites recorrentes (adenoamigdalectomia aos três anos), otite crônica com colocação de tubo de ventilação bilateral. Ao exame físico, com quatro anos e dois meses, observados peso 28 kg (>p97), altura 115,5 cm (>p97) e perímetro cefálico 51 cm (p50); obesidade, fronte proeminente (familial), occipital plano, implantação baixa de cabelos na fronte, fendas palpebrais levemente desviadas para cima, ponte nasal baixa, narinas antevertidas, filtro longo, palato alto, hipoplasia de quarto e quinto metacarpos, clinodactilia de 5o dedo (mão direita), prega palmar transversal única completa à esquerda e incompleta à direita, pés planos com acavalgamento de dedos e hipoplasia ungueal, háluces alargados, coxa valga, marcha de base alargada e musculatura hipotônica. Entre os exames complementares constam tomografia computadorizada (TC) de crânio, fundoscopia e ultrassom de abdômen total, todos normais. Devido à macrossomia, também realizada investigação molecular para a síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcalba (genes NSD1 e PTEN) também sem alterações. A pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou um rearranjo dup4p/del8p, confirmado pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa(4p)×3,(8p)×1 (Figura 32).

Figura 32. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 4p e deleção 8p no paciente.

4.4.2.2.5. Paciente P164 Paciente do sexo feminino, nascida em 14/06/2005, filha única de casal jovem e consanguíneo, sem antecedentes familiais relevantes. Gestação acompanhada por pré-natal em unidade básica de saúde, com relato de gripe e febre no primeiro trimestre. A ultrassonografia com 36 semanas identificou retardo de crescimento intrauterino; sinal da dupla bolha, artéria umbilical única, hipoplasia cerebelar, polidrâmnio. Parto normal, a termo, com peso 2145 g e 45 cm comprimento; Apgar 8/10; apresentou icterícia, síndrome colestática, membrana duodenal (corrigida aos dois dias de vida), hipertonia apendicular e agenesia parcial do corpo caloso. Ao exame físico, observado microcefalia, ptose palpebral à esquerda, cílios longos, occipital proeminente, ponte nasal baixa, filtro nasolabial curto, palato alto, orelhas dismórficas de implantação baixa, prega palmar transversal incompleta à esquerda, hipoplasia ungueal em 5º dedo (pés), membros inferiores assimétricos com pele de aspecto mosqueado, e marcha de base alargada. Realizados ultrassom transfontanela, que mostrou agenesia parcial de corpo caloso; TC de crânio com persistência do cavum de septo pelúcido, hipoplasia da porção inferior do vermis cerebelar, comunição do IV ventrículo com aumento de espaço do forame magno e fundo de olho com atrofia retiniana difusa bilateral. Ultrassom abdominal normal. O exame de cariótipo em sangue e em fibloblastos obtidos por biopsia de pele foi 46,XX, normal para o sexo feminino. Por meio da pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou-se um rearranjo dup4p/del13q, confirmado pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa(4p)×3,(13q)×1 (Figuras 33 e 34).

Figura 33. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 4p e deleção 13q no paciente.

Após o resultado do MLPA, foi realizado cariótipo dos pais sendo identificado rearranjo entre os cromossomos 4 e 13 no exame paterno – 46,XY,t(4;13)(p16.3;q32)(D4S166+;D13S1825-). Novo cariótipo da propósita, com maior resolução, mostrou o rearranjo desbalanceado, previamente detectado por MLPA, estendendo, porém, a deleção do cromossomo 13 para além da região subtelomérica: 46,XX,der(13)t(4;13)(p16.3;q32)pat(D4S166+; D13S1825-).

Rearranjos microscópicos envolvendo o braço curto do cromossomo 4 podem resultar em uma ampla variedade de condições clínicas, dependendo da extensão da região envolvida. Entretanto, elas podem ser resumidas basicamente em duas condições distintas: as síndromes de Wolf-Hirschhorn e da trissomia parcial 4p. Ambas compartilham sinais inespecíficos, como atraso no crescimento pré e pós natal, DI, microcefalia, orelhas de implantação baixa, geralmente atribuídos ao comprometimento da dosagem gênica. Por outro lado, características mais específicas se correlacionam à monossomia segmentar67,152-155.

Deleção 4pter e a síndrome de Wolf –Hirschhorn A síndrome de Wolf-Hirschhorn (MIM 194190) é uma síndrome de genes contíguos causada por deleção da região 4p16.3, com prevalência estimada em 1:50.000 nascimentos, sendo mais comum no sexo feminino (2F:1M). Cerca de 50% a 60% dos casos ocorrem por deleção pura 4p16 de novo. 40% a 45% dos indivíduos afetados têm uma translocação desequilibrada determinando deleção 4p e trissomia parcial de outro cromossomo – de novo ou herdada de um genitor com rearranjo equilibrado –, sendo o

restante causado por rearranjos mais complexos, tais como cromossomo 4 em anel, que levam a uma supressão dos genes situados na região146,156-167. O fenótipo clássico da síndrome de Wolf-Hirschhorn se caracteriza por dismorfismos craniofaciais, como ponte nasal alta e alargada se estendendo à fronte com a glabela proeminente (conhecido como nariz em “elmo de guerreiro grego”), microcefalia, hipertelorismo, prega epicântica interna, sobrancelhas arqueadas, filtro naso-labial curto, comissuras bucais desviadas para baixo, micrognatia e orelhas malformadas. Os indivíduos afetados apresentam atraso de crescimento pré e pós-natal, hipotonia, deficiência intelectual, e a maioria tem convulsões. Em frequência menor e conforme dos genes envolvidos na alteração, são observados anomalias esqueléticas (60%-70%), defeitos cardíacos congênitos (~50%), perda auditiva (> 40%), malformações do trato urinário (25%) e encefalopatias estruturais (33%)155,168. O refinamento das técnicas diagnósticas permitiu identificar duas regiões críticas para síndrome de Wolf-Hirschhorn: WHSCR-1 e WHSCR-2. WHSCR-1 se localiza a 2 Mb da região telomérica do cromossomo 4, tem 165 kb de tamanho e inclui os genes WHSC1 e WHSC2 (NELFA). Já WHSCR-2, que compreende um intervalo de 300-600 kb, se posiciona entre 1,9 e 1,6-1,3 Mb do telômero, sendo contíguo e telomérico em relação a WHSCR-1, incluindo genes como WHSC1, LETM1, FGFR3, TACC3, SLBP, HDNTNP, HSPX153, PIGG, FGFRL1, CTBP1 e CPLX1, entre outros155,170,171,172, 173,174. O gene WHSC1 (NSD2 – Nuclear receptor binding SET domain protein 2 – MIM 602952) codifica uma proteína que contém quatro domínios presentes em outras proteínas de desenvolvimento e se expressa de forma ubíqua no desenvolvimento inicial. A haploinsuficiência desse gene se associa tanto ao fenótipo facial quanto ao atraso no desenvolvimento, sinais também constatados nos casos apresentados174-176. Já o gene WHSC2 (NELFA – Negative elongation factor polypeptide A – MIM 606026) codifica uma proteína membro do complexo de proteínas NELF (fator de elongamento negativo) que atua na regulação do alongamento da transcrição da RNA polimerase II. Além disso, tal proteína é capaz de reagir com linfócitos T citotóxicos específicos, sugerindo uma possível utilização em imunoterapia para pacientes com câncer168,178. O gene LETM1 (Leucine íper-EF-hand-containing transmembrane protein 1 – MIM 604407) codifica uma proteína mitocondrial que desempenha um papel importante na troca de K(+)/H(+) e na homeostase de Ca(2+), sendo fortemente sugerido que, quando em

haploinsuficiência, o gene se relacione às manifestações neuromusculares e epilépticas da síndrome de Wolf-Hirschhorn155,174,176,178,179. Entretanto, Zollino et al.180 consideram que a haploinsuficiência não se limita ao LETM1, mas inclui outros genes, e dessa forma é que atua como um fator de risco para às convulsões, pela observação de casos com deleção na região 4p16.3 que preservam o gene LETM1 associado a convulsões e dificuldade de aprendizado180 Pela análise por MLPA dos casos com deleção 4pter aqui estudados não é possível afirmar que a alteração se estenda a esse gene, porém dada a observação de convulsões na paciente P124, é possível que o gene se encontre deletado. O gene FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3 – MIM 134934) é um regulador fisiológico negativo de crescimento ósseo. Durante o desenvolvimento embrionário, se expressa amplamente em tubo neural e ossos longos, durante a ossificação endocondral. Pelo menos 10 diferentes condições – incluindo câncer e síndromes envolvendo esqueleto e pele – são causadas por mutações nesse gene. A maior delas leva à ativação constitutiva da proteína, prejudicando o crescimento ósseo endocondral, e levando a deformidades ósseas181. O gene PIGG (Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class G – MIM 616918) codifica uma enzima envolvida na biossíntese da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), necessária para o transporte de algumas proteínas direcionadas a organelas e membrana citpoplasmáticas. Variantes alélicas desse gene foram associadas a DI, hipotonia e convulsões de início precoce183, e também foram observadas nos pacientes avaliados no presente estudo (pacientes P124 e P166)155. O gene CPLX1 (Complexina 1 – MIM 605032) codifica para uma das proteínas citosólicas que funcionam na exocitose das vesículas sinápticas, durante o desenvolvimento da região cortical183. Essa proteína desempenharia um papel importante na modulação da liberação de neurotransmissores, sendo sua desregulação observada em indivíduos com doenças neurodegenerativas e transtornos neuropsiquiátricos, justificando a associação com epilepsia em indivíduos com síndrome de Wolf-Hirschhorn180. Hannes et al.184 relatando um indivíduo com fenótipo facial compatível com a síndrome de Wolf-Hirschhorn e deleção de 432 kb localizada próxima às regiões críticas para a condição (WHSCR 1-2) sugeriram que a sequência flanqueadora às mesmas contribui direta ou indiretamente para a gravidade da síndrome, ou seja, que esse locus seja aditivo às deleções comuns à condição, aumentando sua expressão fenotípica, pois deleções nos genes adjacentes poderiam influenciar a expressão gênica nas regiões críticas por conter sequências reguladoras. Assim, outros genes, como o MSX1, têm sido referidos como responsáveis pelo

fenótipo da síndrome de Wolf-Hirschhorn – quando em haploinsuficiência – ainda que pesquisadores não o considerem como parte da região crítica de mesma184. O gene MSX1 (Muscle segment homeobox 1 – MIM 142983) desempenha papel importante nas interações do tecido epitelial-mesenquimal durante o desenvolvimento craniofacial, como regulador na proliferação, na diferenciação e na morte celular. Sua haploinsuficiência provavelmente afeta a regulação de outros genes envolvidos no desenvolvimento orofacial, levando aos dismorfismos observados na síndrome de Wolf- Hirschhorn185-189 observados em todos os pacientes aqui apresentados com deleção 4pter. Rearranjos envolvendo as regiões 4pter e 12pter já foram registrados na literatura190-192. A trissomia 12pter é caracterizada por atraso do desenvolvimento, convulsões, peso aumentado ao nascimento, hipotonia e dismorfismos craniofaciais, incluindo implantação baixa de orelhas, fronte alta, prega epicântica interna, nariz pequeno com ponte baixa, narinas antevertidas e filtro longo192-193. Entretanto, o quadro pode ser variável dependendo do tipo e da extensão da monossomia parcial determinada pelo rearranjo. Comparando-se o quadro clínico da paciente P124 com a descrição dos dismorfismos mais comuns em monossomia 4p e trissomia 12p, observam-se similaridades entre as condições (Tabela 15)154,155,172,194.

Tabela 15. Características clínicas encontradas na paciente P124 em comparação com sinais fenotípicos típicos em indivíduos com deleção 4p e duplicação 12p (adaptado Zollino et al. 172, Zumkeller et al.194, Battaglia et al.154, Battaglia et al.155). Características da paciente P124 Del(4p) Dup(12p) Atraso do desenvolvimento + + Deficiência intelectual + + Deficiência auditiva + + Deficiência visual + Hipotonia + + Epilepsia + + Occipital plano + Frontal alto e abaulado + Face arredondada com bochechas proeminentes + Implantação baixa das orelhas + + Epicanto inverso + + Hipertelorismo + + Fendas palpebrais oblíquas para cima + Estrabismo Hemangioma + Nariz pequeno com hipoplasia alar + Micrognatia + + Comissuras bucais desviadas para baixo + + Pescoço curto + + Hérnia umbilical Prega palmar transversal única + Unhas hipoplásicas Cardiopatia + +, presença

Quanto a rearranjos envolvendo as regiões 4pter e 8pter, há vários relatos na literatura168,195,196. A trissomia 8p é caracterizada por hipotonia, DI, baixa estatura, dificuldade de alimentação, hipertelorismo, ponte nasal alargada, lábios volumosos, dentição anormal e orelhas dismórficas197. Tönnies et al.198 observaram que as características clínicas em indivíduos com monossomia 4p isolada e síndrome de Wolf-Hirschhorn resultante de translocação desequilibrada 4p/8p não são específicas o suficiente para a distinção dos fenótipos. Assim, comparando-se o quadro clínico da paciente P166 com a descrição dos dismorfismos del 4p e dup8p também se observam similaridades (Tabela 16).

Tabela 16. Características clínicas encontradas no paciente P166 em comparação com sinais fenotípicos típicos em indivíduos com deleção 4p e duplicação 8p (adaptado de Zollino et al.168, South et al.161, Midro et al.195, Dai et al. 196). Características do paciente P166 Del(4p) Dup(8p) Atraso do desenvolvimento / DI + + Hipotonia + + Convulsão + + Frontal alto + + Orelhas de implantação baixa + + Orelhas com lóbulos hipoplásicos + Hipertelorismo + Ponte nasal proeminente + + Nariz pequeno com hipoplasia alar Retrognatismo Boca pequena Palato alto + Peito carenado Mãos mantidas em flexão Hipospadia bálano-prepucial + Cardiopatia congênita + + +, presença

Duplicação 4pter A trissomia 4pter, descrita primeiramente por Wilson et al.199 é associada a atraso do crescimento, DI, microcefalia, anomalias congênitas múltiplas e anomalias minor craniofaciais como glabela proeminente, nariz bulboso, ponte nasal alargada e orelhas dismórficas, além de pescoço curto e contraturas em flexão de dedos das mãos, entre outros sinais. A variabilidade fenotípica está relacionada ao tamanho e à posição do segmento cromossômico alterado, normalmente referido entre as bandas 4p15.2 e 4p16.3152,153. Já foi observada na forma pura200, em mosaico201 ou como rearranjos envolvendo outra região cromossômica, como os descritos por Takeno et al.202, Beaujard et al.203, Roselló et al.204, Hemmat et al.164, Kim et al.205, Iype et al.166 e Puvabanditsin et al.206 entre outros. Schönewolf-Greulich207 relatou, em três gerações de uma mesma família, indivíduos com duplicação 4p16.3 com extensão de 3 Mb, que apresentavam macrocefalia, atraso na fala e DI leve. Teoricamente, como um rearranjo equilibrado pode resultar em deleção e duplicação na mesma proporção, mas considerando serem poucos os casos de duplicação 4pter na literatura, os mesmos autores inferem que sejam subdiagnosticados, tendo em vista que duplicações pequenas são associadas a DI mais leve e, em geral, parecem ter consequências clínicas mais brandas do que as microdeleções.

Cyr et al.200 avaliaram um indivíduo do sexo masculino com microduplicação em 4pter e sinais como macrocefalia e pigmentação irregular da irís, além das características sobrepostas à trissomia 4p como convulsões, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dismorfismos craniofaciais (glabela proeminente, implantação baixa de orelhas e pescoço curto). Os mesmos autores verificaram que cinco genes estão contidos na região da microduplicação observada no paciente. São eles CRIPAK, SLBP, TACC3, FGFR3 e LETM1, alguns tidos como sensíveis à dosagem e assim podendo desempenhar papel importante no fenótipo da trissomia 4p. Um deles é o TACC3 (Transforming acidic coiled-coil containing protein 3 – MIM 605303) que tem papel crítico na separação dos cromossomos durante a divisão celular, principalmente durante a neurogênese. Ainda segundo Cyr et al.200 e ainda Hannes et al.209, o aumento da dosagem gênica contribui para o atraso no desenvolvimento, observado em indivíduos com a condição. Puvabanditsin et al.206 registraram o primeiro caso de um rearranjo com trissomia 4p e monossomia 13q em um gêmeo dizigótico que apresentava atraso de crescimento intrauterino, microcefalia, colpocefalia, ausência de corpo caloso, nariz com ponta bulbosa, orelhas proeminentes e de implantação baixa, macroglossia, lábio superior fino, dupla saída de ventrículo direito, defeito do septo ventricular, valva mitral fendida, estenose pulmonar, artéria umbilical única, rim displásico multicêntrico (à esquerda), fóvea coccígea, ânus anteriorizado, sulcos frontais, polegares fletidos, acavalgamento de dedos dos pés e hipotireoidismo congênito. Comparando essas características com as observadas na paciente P164 observa-se similaridade de alguns (poucos) sinais, porém seria necessária análise de outros casos com o mesmo rearranjo para caracterização clínica mais adequada (Tabela 17).

Tabela 17. Características clínicas encontradas no paciente P164 em comparação com sinais fenotípicos observados em rearranjo similar (duplicação 4p e deleção 13q), (Puvabanditsin et al.206). Características do rearranjo 4p+/13q- Paciente 164 Atraso de crescimento intra-uterino + Microcefalia + Colpocefalia + Agenesia corpo caloso Sulcos frontais Orelhas proeminentes e de implantação baixa + Nariz de ponta bulbosa Lábio superior fino Macroglossia Dupla saída de ventrículo direito Defeito de septo atrial/ventricular Fenda de valva mitral Estenose pulmonar Fóvea coccígea Ânus anteriorizado Polegares aduzidos Sobreposição dos dedos dos pés Parcial Artéria umbilical única + Displasia renal multicística Hipotireoidismo congênito +, presença

Sagar et al.209 descreveram um indivíduo do sexo masculino com autismo, transtorno obsessivo-compulsivo e déficit de atenção e hiperatividade com uma translocação desbalanceada de novo der(8)t(4;8)p(16.1;23.1). Segundo esses autores, as características do paciente em questão coincidem com os principais sinais descritos na literatura para as duas condições. À conclusão similar chegaram Skrlec et al.210, comparando o quadro clínico da duplicação 4pter e da deleção 8pter com o apresentado pelo indivíduo estudado pelo grupo. Confrontando as características levantadas pelos autores acima com as observadas na paciente P237 observa-se similaridade de alguns sinais (Tabela 18) 209,210

Tabela 18. Características clínicas encontradas no paciente P237 em comparação com sinais fenotípicos típicos em mesmo rearranjo (duplicação 4p, deleção 8p) (adaptado de Sagar et al., 209; Skrlec et al.210). Características do caso rearranjo 4p+/8p- Paciente 237 Atraso do desenvolvimento + Obesidade + Implantação baixa de cabelos na fronte + Frontal alto e proeminente + Retração bitemporal Occipital plano Fendas palpebrais oblíquas para cima + Narinas antevertidas + Raiz nasal baixa Filtro longo + Palato ogival/alto + Prega palmar transversal única + Hipoplasia de quarto e quinto metacarpianos Clinodactilia de quinto dedo (mãos) Coxa valga Pés planos Acavalgamento de dedos dos pés Hipoplasia ungueal em pés Háluces alargados Assimetria em membros inferiores Marcha de base alargada Criptorquidia + Torcicolo congênito +, presença

4.4.2.3. Alteração del 6p Como o presente caso (P75) foi submetido à revista científica em forma de artigo e será incluído conforme enviado (Anexo 8.4.).

4.4.2.4. Alteração del XYp

4.4.2.4.1 Paciente P85 Paciente do sexo masculino, nascido em 1989, genitores não consanguíneos; mãe com 34 anos e pai com 56 anos por ocasião do nascimento; sem antecedentes familiais relevantes. Encaminhado ao ambulatório de Erros Inatos do Metabolismo aos 19 anos, com diagnóstico de epilepsia, atraso do desenvolvimento neuromotor, distúrbio de comportamento,

ictiose, hipogonadismo hipogonadotrófico, rim único e baixa estatura; até então, era acompanhado no ambulatório de Neuroepilepsia na Infância (Neurologia-HC-Unicamp). Não referidas intercorrências gestacionais ou perinatais dignas de nota; em boas condições ao nascimento, com peso e estatura adequados. Evoluiu com atraso leve do desenvolvimento neuropsicomotor, com involução a partir dos sete anos, quando passou a apresentar quedas frequentes e iniciou avaliação neurológica com hipótese de síndrome epiléptica. Submetido à investigação extensa que incluiu exame de cariótipo e pesquisa da mutação do X frágil, eletroneuromiografia, eletroencefalograma, potenciais evocados auditivos e somatosensitivos, todos com resultados normais. Também realizados triagem para erros inatos do metabolismo, cromatografia de aminoácidos, dosagens de ácidos orgânicos, ácidos graxos de cadeia muito longa, beta- galactosidase, hexosaminidase, ácido fitânico, arilsulfatase A, entre outras, sem alterações relevantes. Entre os exames alterados, estavam os potenciais evocados visuais, com suspeita de comprometimento bilateral das vias visuais, a avaliação radiográfica com osteopenia difusa, a RM de coluna com redução de diâmetro craniocaudal de corpos vertebrais torácicos inferiores e lombares (aspecto em “vértebras de peixe”) e a RM encefálica sugestiva de leucoencefalopatia desmielinizante ou isquêmica. A biopsia de pele identificou alterações compatíveis com ictiose do tipo de retenção. Ao exame físico, observados estatura abaixo de 3%, braquicefalia, implantação baixa de cabelos em fronte e nuca, face triangular, hipoplasia malar, orelhas proeminentes, sobrancelhas em “V” invertido com rarefação lateral, olhos de localização mais profunda, fendas palpebrais levemente alongadas, nariz com columela proeminente e hipoplasia alar, filtro longo, lábio superior fino e inferior levemente evertido, pescoço curto, flexão redutível de articulações interfalangeanas em 3º e 4º dedos, distância aumentada entre háluces e 2º artelhos, clinodactilia acentuada em 5º dedos (pés); microrquidia à esquerda e criptorquidia à direita; hiperreflexia em membros inferiores, pés cavos e sinal de Babinski bilateral. No exame da pele, apresentava ictiose folicular generalizada (poupando apenas face) e hiperceratose plantar. Observadas ainda alterações de comportamento com agitação psicomotora, déficit de atenção, dificuldade de comunicação e interação social. Frente a tal quadro clínico, sugerido dar seguimento à investigação diagnóstica com o teste de MLPA subtelomérico, por meio do kit P036.

Pela técnica foi possível visualizar alteração no braço curto do cromossomo X (Figura 35) em região pseudoautossômica X/Y, que foi confirmada a partir do teste com o kit P070. Assim, a notação do cariótipo desse paciente passa a ser P070 – rsaXYp(P070)×1.

Figura 35. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção XYp no paciente.

Para pesquisar alterações na região pseudoautossômica de X/Y, a região escolhida no kit SALSA MLPA P036 (Tabela 1) para o desenho da sonda está em Xp22.33 (gene SHOX, marcado em azul na Figura 36), enquanto no kit de confirmação SALSA MLPA P070 (Tabela 2), o gene escolhido é o mesmo, porém provavelmente em outro éxon que o escolhido para o kit anterior (Figura 36).

Figura 36. Em azul, localização do gene SHOX (cromossomos X e Y, em região paseudoautossômica), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas XYp presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente. Em vermelho, extensão da alteração encontrada no paciente, por meio do kit SALSA MLPA P018; em roxo, primeira

sonda também presente no kit SALSA MLPA P018 encontrada dentro da normalidade no paciente108.

Para melhor definição dos pontos de quebra foi realizado teste de MLPA também com o kit P018 (Tabela 4), que inclui sonda específica para cada éxon do gene SHOX (alterado nos testes anteriores), de genes adjacentes tais como PPP2R3B (mais telomérico) e VAMP7 (mais centromérico) (Figura 36). Essa análise (Figura 37) possibilitou determinar a extensão da deleção a partir dos sinais alterados nas sondas complementares aos genes PPP2R3B e KAL1 (ANOS1), delimitados pelo retângulo vermelho. Vale acrescentar que o número de cópias do gene FANCB encontra-se dentro da normalidade, porém entre esse gene e o KAL1 há cerca de 30 genes que não foram investigados pelos testes realizados, não sendo possível afirmar que estejam alterados no paciente (Figura 37).

Figura 37. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018 mostrando a deleção envolvendo as regiões Xp22.31 e Xp22.33.

A diferença nos padrões típicos dos sinais de deleção e duplicação nesse paciente deve-se ao fato de parte da alteração se localizar na região pseudoautossômica (PAR1) do braço curto dos cromossomos X e Y. Tal deleção envolve as regiões Xp22.31 e Xp22.33, onde estão genes importantes como SHOX, STS, NLGN4X e VCX3A, e o cariótipo do paciente passa a ser rsaXYp(SHOX1- 5,CRLF2,CSF2RA,ILR3A,ASMT,ZBED1,ARSF,PRKX,NLGN4X, KAL1)×1 . Frente a esse resultado, o quadro clínico do paciente pode ser definido como a síndrome da microdeleção Xp22.31 ou síndrome de genes contíguos, com haploinsuficiência de genes como o STS (Steroid sulfatase; MIM 300747), NLGN4X (Neuroligin 4, X-linked; MIM 300427) e VCX3A (Variable charge, X-linked 3A; MIM 300533). Entre os demais genes contíguos a essa região encontram-se NLGN4X e VCX3A, previamente propostos como candidatos à DI ligada ao X (não específica) em pacientes com ictiose ligada ao X (ILX)211- 217.

A ictiose ligada ao X (MIM 308100) é uma genodermatose causada pela deficiência da enzima arilsulfatase C (STS)218,219, codificada pelo gene de mesmo nome, localizado na parte distal do braço curto do cromossomo X (Xp22.3-pter), próximo à região pseudoautossômica. Muitos dos indivíduos com a doença manifestam apenas ictiose, porém acredita-se que a deleção de genes contíguos nessa região explique a presença de outros sinais, incluindo DI220. O gene NLGN4X codifica uma proteína da família das carboxilaesterase/lipase de tipo B, que são proteínas de superfície das células neuronais. Os membros dessa família podem atuar como ligantes específicos para beta-neurexinas, participando da formação e da remodelação de sinapses do sistema nervoso central. Variantes patogênicas desse gene já foram associadas a transtornos do espectro autista222-226. O gene VCX3A é da família de genes VCX/Y, com múltiplos membros nos cromossomos X e Y, todos expressos em células germinativas masculinas, exclusivamente. Os membros ligados ao X estão agrupados em Xp22, enquanto os ligados a Y correspondem a duas cópias idênticas do gene dentro de uma região palindrômica em Yq11. Eles compartilham um alto grau de identidade de sequência, exceto pela ocorrência de uma unidade de 30 pb altamente repetida em membros ligados ao X, a qual ocorre apenas uma vez em membros ligados a Y. O conjunto de genes VCX é polimórfico quanto ao número de cópias, ou seja, pode haver variação individual quanto ao número de genes VCX. Os genes VCX/Y codificam proteínas pequenas de função desconhecida, porém há indícios fortes de que codifiquem proteínas nucleares213,228, 229,230. Finalizando, as alterações do número de cópias do gene KAL1 é relacionada a hipogonadismo gonadotrófico230, presente no propósito.

4.4.2.5. Alteração del 1q

4.4.2.5.1 Paciente P192 Paciente do sexo masculino, cinco anos e sete meses, encaminhado aos três meses para investigação de quadro sindrômico. É fruto da segunda gestação de casal não consanguíneo, ambos com 37 anos por ocasião de seu nascimento, com relato de um aborto espontâneo anterior e recorrência de perdas gestacionais na irmandade materna (quatro), sem outros antecedentes familiais relevantes. Sua gestação transcorreu bem, exceto pelo registro

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de polidrâmnio. Parto cesáreo, na 38a semana, com antropometria normal, Apgar 8/9. Evoluiu com atraso global do desenvolvimento (sem convulsões) e déficit pondero-estatural. Ao exame físico, observados microcefalia, sobrancelhas arqueadas, epicanto interno bilateral, coloboma de íris à direita, retrognatia, hálux direito mantido em adução e hipoplasia ungueal leve, pênis com chordee e prepúcio alado. A investigação complementar mostrou comunicação interatrial com repercussão hemodinâmica leve, dilatação de sistema coletor renal bilateral, disgenesia de corpo caloso e acentuação de sulcos em região frontal, coloboma de coróide à direita e hipoplasia de nervo óptico bilateral. O exame de cariótipo convencional foi normal. Pela hipótese inicial da síndrome CHARGE, realizado sequenciamento do gene CHD7, que não mostrou alterações. Na sequência, pesquisadas alterações submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036, que identificou heterozigose da deleção 1q na região do gene SH3BP5L, confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa1q(P070)×1 (Figuras 38 e 39).

Figura 38. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção 1q no paciente.

Figura 39. Em azul, localização do gene SH3BP5L ou KIAA1720 (cromossomo 1q44) cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 1q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108.

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Descrita primeiramente em 1976 por Mankinen et al.230, a síndrome de deleção 1q foi registrada em pelo menos 30 indivíduos, decorrendo de deleções puras ou rearranjos complexos em extensões variadas. O quadro clínico varia conforme a extensão da deleção, que pode incluir apenas alguns kb da região q44 ou se estender a q43 em direção ao centrômero. Quanto ao quadro clínico, destacam-se atraso global de desenvolvimento ou deficiência intelectual, presentes em todos os pacientes, além de microcefalia, convulsões e alterações no corpo caloso, descritos em 85% deles. Também relatados baixa estatura, face arredondada, orelhas dismórficas e de implantação baixa, pregas epicânticas, micrognatia, lábio superior fino, filtro naso-labial apagado, comissuras bucais desviadas para baixo, anomalias cardíacas e de genitais em graus variados231-243. Mais de 100 genes estão descritos na região 1q44, mas apenas quatro deles foram relacionados à síndrome 1q (AKT3, ZNF238, FAM36A – ou também chamado de COX20 – e HNRNPU108, se considerarmos todos estes genes deletados no paciente P192, a deleção pode ter cerca de 5 Mb. O gene AKT3 (V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3; MIM 611223) codifica um membro da família das proteínas AKT, cuja função está relacionada a diversos processos biológicos, como proliferação celular, apoptose, diferenciação de células musculares e adiposas, síntese de glicogênio e absorção de glicose. Boland et al.244, ao estudarem um indivíduo com microcefalia e agenesia de corpo caloso com translocação t(1;13)(q44;q32), observaram ponto de quebra situado a 20 kb de distância do gene AKT3; em estudo paralelo o mesmo grupo confirmou a expressão de AKT3 no desenvolvimento do SNC durante a embriogênese de cobaias, indicando esse gene como potencial candidato à determinação de microcefalia e agenesia do corpo caloso, quando em haploinsuficiência244 fato que foi corroborado em estudos subsequentes245,246. Entretanto, publicações posteriores mostraram que pacientes com a microdeleção 1q44 sem envolvimento do gene AKT3 também apresentavam microcefalia242,247 e ainda que indivíduos com deleção do gene não manifestavam o fenótipo248. Esses dados são indicativos de que, além da haploinsuficiência, outros genes e mecanismos devem estar envolvidos nas alterações de sistema nervoso central observadas nessa deleção. O gene ZNF238 (ou ZBTB18 – zinc finger and BTB domain containing protein 18; MIM 608433) participa da diferenciação de células cerebrais mediando o controle do ciclo

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celular. Sendo assim, tem sido relacionado à microcefalia e às alterações no corpo caloso em pacientes com microdeleção 1q249,250. Munnik et al. 249, investigando por sequenciamento de exoma uma paciente com microdeleção 1q43q44 e fenótipo que inclui estatura baixa, microcefalia, atraso global do desenvolvimento, distúrbio de fala e dismorfismos faciais, detectaram mutação sem sentido de novo no gene ZNF238, fato consistente com o papel da haploinsuficiência do mesmo na determinação do fenótipo dessa condição. Estudos em cobaias demostraram que há anomalias de corpo caloso em concomitância a alterações nesse gene. Similarmente, na maior parte dos indivíduos com deleção 1q44, são observadas alterações nessa região. Entretanto, a paciente estudada pelo grupo apresentava mutação no gene e não tinha anormalidades no corpo caloso, fato que pode ser explicado como penetrância incompleta ou haploinsuficiência de outros genes situados na região crítica para a deleção249. Ehmke et al. 250 chegaram à mesma conclusão no caso de uma paciente com microdeleção 15q13.3 e ainda uma mutação sem sentido de novo no gene ZNF238, que apresentava atraso global de desenvolvimento, ausência de linguagem, hipotonia, ataxia, convulsões e dismorfismos faciais, porém sem alterações de corpo caloso. Em 2012, Thierry et al.237, analisando por aCGH 11 indivíduos com microdeleção 1q44 que apresentavam deficiência intelectual e convulsões, sem alterações no corpo caloso e microcefalia, observaram dois genes codificantes (HNRNPU; MIM 602869 e FAM36A; MIM 614698) e um não codificante (HNRNPU-AS1; MIM 602869), na região crítica para a deleção. Tais genes se expressam normalmente em diferentes tecidos humanos, incluindo o encefálico, com níveis mais altos no cerebelo. A triagem mutacional para os genes codificantes em 191 pacientes com deficiência intelectual idiopática não revelou variantes deletérias. Por outro lado, nove dos 11 pacientes sem microcefalia ou alterações no corpo caloso investigados apresentaram uma deleção pequena, contendo os três genes acima, mas não os genes AKT3 e ZNF238. Com base nesses resultados, o grupo sugere que os genes HNRNPU, FAM36A e HNRNPU-AS1 não seriam os principais genes relacionados a microcefalia ou alterações no corpo caloso, mas seriam potenciais candidatos à determinação de deficiência intelectual e convulsões237. A ampliação do espectro clínico e de mutações relacionadas ao gene HNRNPU foi realizada recentemente por Bramswig et al.251 em indivíduos com variantes desse gene e com fenótipo que incluía hipotonia, convulsões, deficiência intelectual grave e dificuldade de fala, além de alterações cardíacas e renais. Considerando que esse gene também se expressa em coração, rins e fígado, além de cérebro e cerebelo, como mencionado anteriormente, e os

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pacientes investigados apresentaram variantes do mesmo e fenótipo concordante, os autores demonstraram que as alterações no HNRNPU causam epilepsia, deficiência intelectual grave com distúrbios de fala, anormalidades em rins, coração e no SNC em graus variados251. Para o presente caso, como a técnica de MLPA evidenciou alteração na sonda correspondente ao gene SH3BP5L – distante cerca de quatro megabases da região crítica para a síndrome – pode se considerar que a deleção tenha extensão maior do que a assinalada, tendo em vista as características clínicas observadas e os genes relatados como candidatos aos fenótipos apresentados. Como mencionado, o espectro fenotípico da microdeleção 1q44 é bem variável e nem todas as características estão presentes em um mesmo caso. O paciente P192 apresenta atraso do desenvolvimento, microcefalia e disgenesia de corpo caloso, sinais relevantes nessa condição. Por outro lado, coloboma de íris e coroide não estão descritos. A análise por outro método, como o microarray seria oportuna na determinação dos limites dessa alteração. De um modo geral, vale acrescentar que tal variabilidade fenotípica corrobora a interpretação frequente de que outros mecanismos como pleiotropismo, expressividade variável, penetrância incompleta e fatores multigênicos participem desse processo235.

4.4.2.6 Alteração del 18q

4.4.2.6.1. Paciente P137 Paciente do sexo masculino, segundo filho de casal jovem e não consanguíneo; o único irmão é hígido; o pai tem epilepsia secundária à neurocisticercose; nos antecedentes familiais, relatados um primo em 1o grau (lado materno) com óbito neonatal por malformação cardíaca e outro com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor. Após gestação sem intercorrências relevantes, nasceu de parto cesáreo, com peso 2750 g; comprimento 46 cm; relato de aspiração de líquido amniótico. Evoluiu com atraso DNPM, predominantemente da fala, com primeiras palavras aos 15 meses e frases curtas aos cinco anos. Ao exame físico, observados implantação baixa de cabelos na nuca, hipoplasia malar, orelhas em abano e levemente dismórficas, sinofre discreta, estrabismo convergente, miopia, ponte nasal baixa, lábios volumosos, filtro curto e apagado, prognatismo, tórax levemente assimétrico, escápulas proeminentes, flexão redutível de falanges médias de 1º, 2º, 3º e 5º dedos de mãos (mais evidente à direita), polegares de implantação anômala,

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baqueteamento de dedos, pés cavos com valgismo leve e camptodactilia de 2º e 5º dedos, com aspecto em martelo e aparente retração tendínea. A microdeleção 18q foi detectada pela técnica de MLPA com o kit SALSA MLPA P036 e confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa18q(P070)×1 (Figuras 40 e 41).

Figura 40. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra deleção 18q no paciente.

Figura 41. Localização dos genes RBFA e CTDP1 (cromossomo 18q23), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 18q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente108.

A alteração observada no presente caso envolveu seis genes (CTDP1, KCNG2, PQLC1, HSBP1L1, TXNL4A e RBFA). O envolvimento de outros genes não pode ser afastado, estando indicado detalhadamento da região por outra técnica independente. Dois desses genes, o CTDP1 e o TXNL4A se relacionam a fenótipos patológicos. O gene CTDP1 (CTD phosphatase subunit 1; MIM 604168; chr18:79679800-79754509) codifica uma fosfatase específica para o domínio C-terminal para a subunidade A da RNA polimerase II, necessária para a síntese de RNA252. Mutações nesse gene seriam relacionadas a catarata congênita, dismorfismos faciais e neuropatia. Entretanto, Kim et al.253 descrevem indivíduo apenas com dismorfismos faciais252,253. No presente caso, pode ser determinado neuropatia periférica, pela descrição de camptodactilia e retração de tendões.

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Reuter et al.254, em estudo com S. cerevisiae, mostraram que o gene TXNL4A (Thioredoxin like 4A; MIM 608572; chr18:79972220-79988591) – que tem 66% de identidade com o gene Dib1 de S. cerevisae) – codifica uma proteína chamada Dib1, estritamente necessária para o splicing do pré-mRNA. Mutações nesse gene são responsáveis pela síndrome de Burn-McKeown ou displasia oculootofacial (MIM 608572), condição autossômica recessiva caracterizada pela associação de anomalias craniofaciais como fendas palpebrais estreitas, coloboma de pálpebras inferiores, ponte nasal alta, atresia de coanas, orelhas proeminentes, apêndices pré-auriculares, além de perda auditiva mista, anomalias cardíacas e baixa estatura, quadro não observado no paciente P137255. A deleção 18q (MIM 601808) foi descrita por de Grouchy et al. em 1964256 e desde então mais de 350 relatos permitiram ampla caracterização dessa condição253,258-263. Sua incidência é estimada em 1 para 40.000 nascimentos, ocorrendo em ambos os sexos e diversas etnias, com quadro clínico variando conforme a extensão da deleção. Entre as características clínicas mais comuns estão DI, baixa estatura, hipotonia, dismorfismos faciais, estrabismo, fenda lábio-palatina, deformidades em pés e defeitos cardíacos202,261,264,265. Apesar de a extensão da deleção variar de 60 kb a 30 Mb, extendendo-se da porção terminal até a intersticial do cromossomo, duas regiões em 18q não aparecem em hemizigose em nenhum dos casos relatados, mostrando que podem ser letais quando em cópia única. Uma delas é adjacente ao centrômero (17000000-19667062) e a segunda está em 18q21.1 (45578734-46739965), delimitando duas porções com hemizigose em potencial, denominadas região 18q proximal e 18q distal, respectivamente. Juntas, essas regiões incluem 196 genes, alguns já relacionados a sinais clínicos quando em haploinsuficiência, tais como GATA6, ZNF24, TSHZ1 e NFATC1, entre outros261,266,267.

4.4.2.7. Alteração dup 7p

4.4.2.7.1 Paciente P161 Paciente do sexo masculino, nascido em 15/03/2009, filho de casal jovem e não consanguíneo; uma prima em 1º grau, quatro primos em 3º grau (lado materno) com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor; um primo e três primas – duas delas gêmeas monozigóticas – com autismo, também pelo lado materno.

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Desde o nascimento foram observados hipertelorismo e pés planos. Evoluiu com baixo ganho de peso pôndero-estatural e atraso global do desenvolvimento; em exames complementares, detectados laringomalácia e dilatação ventricular. A pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036, o qual identificou uma microduplicação em 7p terminal, foi confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa7p(P070)×3 (Figuras 42 e 43).

Figura 42. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 7p no paciente.

Figura 43. Em azul, localização dos genes ADAP1 e SUN1 no cromossomo 7p22.3, cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 7p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente. No retângulo vermelho, a extensão envolvendo os genes analisados por meio do kit SALSA MLPA P365 (HEATR2, SUN1, ADAP1, GPER, MAFK, MAD1L1, LFNG, CARD11, SDK1 e ACTB) e que se encontram alterados no paciente.

Para melhor definição dos pontos de quebra foi realizado teste de MLPA também com o kit P365 (Tabela 3), que inclui além das sondas complementares aos genes ADAP1 e SUN1, sondas para genes adjacentes tais como HEATR2 (mais telomérico) e ACTB (mais centromérico) (Figura 43). Por este novo kit P365 observou-se duplicação em todas as sondas 7p analisadas (Figura 44).

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Figura 44. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P365 mostrando a duplicação envolvendo as regiões 7p22.1 e 7p22.3 no paciente.

Duplicações terminais envolvendo o braço curto do cromossomo 7 foram registrados em cerca de 60 casos, a maioria associada a rearranjos complexos de tamanhos variados envolvendo translocações parentais balanceadas ou mesmo inversões. Entre os sinais mais comuns são incluídos hipotonia, dismorfismos craniofaciais, alterações esqueléticas e cardiovasculares, além de DI268-275. O espectro fenotípico se associa à extensão da microduplicação, que pode envolver desde poucos kb até toda a região 7p22275-278). Vulto-van Silfhout et al.273 relataram um paciente com síndrome de Asperger e uma duplicação de novo com extensão de 380 kb em 7p22.3 envolvendo pelo menos nove genes conhecidos (MAD1L1, FTSJ2, NUDT1, SNX8, EIF3B, CHST12, LFNG, BRAT1 e IQCE), também encontrados na alteração do paciente P161. Goitia et al.275, em relato de um paciente com microduplicação 7p, refinaram a região crítica como tendo extensão de 330 kb e englobando quatro genes conhecidos, FBXL18, ACTB, FSCN1 e RNF216, dentre os quais apenas RNF216 e ACTB seriam conhecidos como responsáveis por alterações em seres humanos. Sendo assim, analisando globalmente os resultados encontrados para o presente caso por meio dos testes de MLPA, existem ao menos 40 genes envolvidos na alteração. Entre os mesmos, destacam-se na correlação genótipo-fenótipo: O gene INTS1 (Integrator complex subunit 1; MIM 611345), codifica uma proteína que se associa ao domínio C-terminal da subunidade maior da RNA polimerase II, intermediando o processamento final de pequenos RNAs nucleares278. Nagase et al.280 identificaram a proteína altamente expressa em regiões cerebrais de adultos e em células de tecidos de adultos e fetos.

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Já o gene LFNG (Fringe, Drosophila, Homolog of, Lunatic; MIM 602576) codifica a enzima fucose-específica-1,3-beta-N-acetilglucosamina transferase, que modula a atividade de outro gene (NOTCH) e se expressa particularmente durante a neurogênese em seres humanos. Assim, segundo pesquisadores, parece provável que sua duplicação determine um aumento da dosagem da proteína, resultando no aumento do volume cerebral e do perímetro cefálico nos indivíduos afetados. Além disso, predisporia o paciente ao transtorno do especto autista273-280. O gene ACTB (Actin beta; MIM 102630) codifica uma proteína da família das actinas, sendo provável candidato a determinação de dismorfismos craniofaciais, como sobrancelhas arqueadas e nariz proeminente, relacionados à duplicação 7p22.1, além de dilatação ventricular e surdez neurosensorial bilateral274,276,277,281. O gene FSCN1 (Fascin actin-bundling protein 1; MIM 602689) codifica uma proteína da família das fascinas – proteínas de ligação com actinas – cujo papel é crucial para a neurogênese eficiente. Nesse sentido, o gene estaria mais fortemente expresso em células dendríticas, gliais e neurônios282. O gene RNF216 (Ring finger protein 216; MIM 609948) codifica a proteína ubiquitina 3 ligase e encontra-se altamente expresso em diversos tecidos humanos – como no cérebro – em todos os estágios de desenvolvimento. Alterações nesse gene estariam associadas a uma série de doenças neuropsiquiátricas, tais como esquizofrenia e transtorno bipolar, além de autismo e DI283.

4.4.2.8. Alteração dup 11p

4.4.2.8.1. Paciente P191 Paciente do sexo feminino, nascida em 17/06/2007, terceira filha de casal não consanguíneo. Na gestação, mãe informa movimentos fetais fracos, tabagismo (10 cigarros/dia), exposição ocasional a álcool e uso de heparina de baixo peso molecular. Parto cesáreo, no 7o mês, com peso 2215 g, comprimento 44 cm e perímetro cefálico 30,5 cm (adequados para a idade gestacional), Apgar 5/8, sucção débil; teve taquipnéia transitória do recém-nascido, hipoglicemia e icterícia fisiológica. Evoluiu com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, especialmente de marcha; diagnóstico de catarata (lamelar bilateral) aos 12 meses, sendo submetida a

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fotoestimulação e implantação de lente; crises convulsivas a partir dos cinco anos, com uso de fenobarbital. Ao exame físico com quatro anos e 10 meses, observados antropometria normal, filtro apagado, lábios volumosos, clinodactilia de 5o dedo (mãos), hipoplasia de quarto e quinto metacarpianos (leve), distância aumentada entre hálux e 2o dedo, pés equinos redutíveis, manchas hipercrômicas de aspecto rendilhado em região interna de coxas; nistagmo, abasia, hemiparesia à esquerda. RM de crânio com alterações sugestivas de encefalomalacia. A pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou uma duplicação 11p, confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa11p(P070)×3 (Figuras 45 e 46). Pela posição dos genes no cromossomo 11 a extensão da duplicação pode ser estimada em, no mínimo, 47,3 kb.

Figura 45. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 11p no paciente.

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Alterações envolvendo a região 11p15.5 – mais precisamente genes regulados por imprinting, que é um mecanismo no qual a expressão do gene varia de acordo com a herança (materna ou paterna) e é mediado por um processo epigenético envolvendo metilação diferencial do DNA e modificações das histonas nos dois alelos parentais284 – causam duas síndromes: Silver–Russell (MIM 180860) e Beckwith–Wiedemann (MIM 130650). A primeira é caracterizada por atraso de crescimento pós-natal e dismorfismos craniofaciais, enquanto a segunda se caracteriza por desenvolvimento pré e pós natal acelerado, macroglossia, defeitos da parede abdominal, visceromegalia, hemi-hiperplasia, hipoglicemia e aumento do risco de desenvolvimento de tumores na infância. A maior parte dos pacientes com essas condições tem alterações nos centros de imprinting localizados na região 11p15.5 – ICR1 e ICR2 – mas duplicações, embora raras, também foram descritas em uma parcela de indivíduos com essas condições285-291. Considerando o fenótipo divergente apresentado pela paciente P191 em relação ao quadro clínico das duas condições mencionadas e a extensão entre esses centros de imprinting e os genes alterados observados no caso, a correlação genótipo-fenótipo foi realizada a partir da busca por alterações associadas aos genes RIC8A e BET1L na literatura, além da comparação com casos depositados no banco de dados DECIPHER. O gene RIC8A (RIC8 guanine nucleotide exchange factor A; MIM 609146) codifica proteína altamente conservada, necessária para a orientação do fuso mitótico e divisão celular durante os primeiros estágios da embriogênese em C. elegans, D. melanogaster e também em mamíferos292. Além disso, ela atua como uma chaperona que regula a síntese de proteínas-G, essas envolvidas na transdução de sinais celulares293. Segundo Kask et al.294, estudando o papel do gene na neurogênese em modelos animais, sugerem a importância desse gene no desenvolvimento neuronal em mamíferos, por meio da manutenção da integridade da membrana basal, assim como na modulação da divisão celular. Também utilizando modelos animais, Ruisu et al.295 observaram que a atividade do gene RIC8A em neurônios é essencial para a sobrevivência e que a sua haploinsuficiência causa um fenótipo neuromuscular grave. Entretanto, em se tratando de duplicação, a dificuldade de marcha observada na paciente P191 provavelmente não pode ser explicada pela haploinsuficiência do gene RIC8A. Edwards et al.296 estudando SNPs para genes como BET1L (Bet1 golgi vesicular membrane trafficking protein like; MIM 615417) – rs2280543 – sugeriram que estas variantes

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comuns aumentam o risco de fibrose uterina na população europeia e japonesa, sendo necessárias mais pesquisas para avaliar o papel dos mesmos genes em outros grupos raciais. A busca na base de dados DECIPHER indicou que há quase 20 casos de duplicação envolvendo a região alterada na paciente P191. Entre os mesmos, apenas 10 têm descrição de sinais clínicos. Além de atraso de desenvolvimento e deficiência intelectual (7/10), os sinais mais frequentemente observados foram obesidade (2/10) e hipotonia muscular (2/10). Clinodactilia de 5º dedo – sinal encontrado na paciente P191 – também foi descrita em um caso de mesma alteração. Nesse caso, seria necessária análise por outro método, preferencialmente microarray, para detalhamento da alteração e melhor orientação para a correlação genótipo- fenótipo.

4.4.2.9. Alteração “dup 15p” (15q-cen)

4.4.2.9.1. Paciente P130 Paciente do sexo feminino, nascida em 27/01/2002, encaminhada aos sete anos por suspeita de síndrome do X frágil; é fruto da 4a gestação de casal jovem e não consanguíneo, tem duas irmãs com desenvolvimento normal, além de um aborto espontâneo na irmandade; recorrência de DI em um tio, quatro primos e três primas em segundo grau, todos pelo lado materno. A gestação transcorreu bem, com relato de movimentos fetais fracos; parto vaginal, a termo; sem intercorrências relevantes; peso 2.645 g e comprimento 48,5 cm; com relato de hiponia, sem outros dados neonatais; alta no 2o dia de vida. Evoluiu com atraso leve do desenvolvimento neuromotor; alguns episódios de bronquite asmática; sem convulsões ou alterações oftalmológicas, audição normal e comportamento sociável, porém com agitação psicomotora. Ao exame físico, peso em 10%, estatura e perímetro cefálico em 50%; índice de massa corporal 12,4 (indicativo de baixo peso); sem alterações cardiovasculares, respiratórias e abdominais; occipital proeminente, frontal alto, face triangular, sinofre, olhos de localização mais profunda, ptose palpebral leve, comissuras bucais desviadas para baixo, palato alto, má oclusão dentária, aumento da distância intermamilar, cifoescoliose, diástase de músculos retos abdominais, joelhos valgos e musculatura hipotrófica.

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Realizados exame de cariótipo, pesquisa da mutação do X frágil e ecocardiograma, com resultados normais; a radiografia de coluna vertebral mostrou vértebra transversal dorso-lombar, escoliose dorsal dextro-convexa e lombar dextro-côncava. Por meio da pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou-se uma duplicação 15q-cen, confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa15qcen(P070)×3 (Figuras 47 e 48).

Figura 47. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 15q-cen no paciente.

Figura 48. Em azul, localização dos genes MKRN3 e NDN no cromossomo 15q-cen (15q11.2), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas “15p” presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070, respectivamente. No retângulo vermelho, a extensão envolvendo os genes analisados por meio do kit SALSA MLPA P365 (MKRN3, MAGEL2 e SNRPN) e que se encontram alterados no paciente108.

Com o intuito de definir melhor a extensão da duplicação foi realizada a técnica de MLPA com o kit 365 (Tabela 3), pelo qual se observou duplicação nas três sondas relacionadas à porção 15q11.2 (Figura 49).

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Figura 49. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P365 mostrando a duplicação envolvendo a região 15q11.2 com os genes MKRN3, MAGEL2 e SNRPN no paciente.

Posteriormente, como parte do projeto da doutoranda Joana R. Marques Prota, foi realizado o teste de microarray por meio da plataforma SurePrint G3 Human CGH Microarray 8x60K - ISCA (Agilent®, Santa Clara, CA). Pela análise do teste a alteração observada pelo método de MLPA foi confirmada como duplicação 15q11.2-q13.1, arr[hg19]15q11.2q13.1(22765628_28691460)×3, que possui 5,9 Mb e envolve 16 descritos no OMIM, sendo nove relacionado a doenças (Figura 50 e Tabela 19).

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Tabela 19. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes relacionados a doenças e envolvidos na alteração observada no caso P130. Localização Gene Nome OMIM cromossômica Non imprinted in Prader-Willi/Angelman NIPA1 15:23004684-23034427 608145 syndrome 2 MKRN3 15:23810454-23873064 Zinc finger protein 127 603856 MAGEL2 15:23888691-23891175 Mage-family member 2 605283 NDN 15:23930565-23932450 Necdin, MAGE family member 602117 Small nuclear ribonucleoprotein SNRPN 15:25068794-25223870 182279 polypeptide N UBE3A 15:25582381-25684128 Ubiquitin protein ligase E3A 601623 Gamma-aminobutyric acid type A receptor GABRB3 15:26788693-27184686 137192 beta3 subunit OCA2 15:28000021-28344504 OCA2 melanosomal transmembrane protein 611409 HECT and RLD domain containing E3 HERC2 15:28356186-28567298 605837 ubiquitin protein ligase 2

A extremidade proximal do cromossomo 15, mais precisamente a região 15q11- 13, é suscetível a rearranjos genômicos, tendo em vista a quantidade grande de repetição com baixo número de cópias (do inglês low copy repeats), que geram desalinhamento da região durante a meiose, levando a recombinações desiguais. Tais rearranjos genômicos geralmente ocorrem em pontos de quebra conhecidos, numerados de 1 a 5 – BP1-BP5 –298,299, resultando em deleções e duplicações. Além disso, a mesma região concentra diversos genes regulados por impressão genômica ou imprinting. Assim, como resultado de deleções ou duplicações nessa região, três distúrbios distintos podem ocorrer: as síndromes de Prader-Willi (MIM 176270), Angelman (MIM 105830) e a de duplicação 15q11-13 (MIM 608636)299-301. Cada uma destas condições resulta de perda de função ou superexpressão de pelo menos um gene presente na região, ocorrendo com frequência de 1/15000 a 1/30000 nascidos vivos. 70% dos casos de SPW e SA ocorrem por deleção na região; quando a alteração acontece no cromossomo de origem paterna resulta na síndrome de Prader-Willi; quando herdado da mãe, na síndrome de Angelman302. Já a superexpressão leva à dup15q11-13, com fenótipo distinto e correspondente à alteração e origem do distúrbio. Desde a primeira descrição da síndrome de duplicação 15q11-13 com dados moleculares303, muitos casos já foram publicados, ampliando o espectro fenotípico da condição. Com certa variabilidade, são descritos hipotonia, ataxia, atraso do desenvolvimento motor e da fala, DI, convulsões, e distúrbios de comportamento, incluindo transtorno do espectro autista304-306.

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Na maioria dos casos, o segmento duplicado é de origem materna307-314, enquanto herança paterna geralmente se associa a fenótipo normal315-320. Entretanto, há descrição de pacientes apresentando duplicação de origem paterna, com fenótipo variando desde a normalidade até DI com convulsões305. A análise por arrayCGH definiu a região duplicada entre os pontos de quebra BP2 e BP3, a qual inclui diversos genes, conforme apresentado na Figura 51.

Figura 51. Mapa de expressão dos genes para a SPW e AS, bem como os pontos de quebra (BP1-BP5) comuns às condições. Na reta vermelha, a extensão da duplicação observada na paciente P130, com 5,9 Mb, entre BP2 e BP3 (adaptado de Smith & Hung, 2017). BP – ponto de quebra; Cen – Centrômero; Tel – telômero.

O gene NIPA1 (MIM 608145) altamente expresso em tecidos neuronais, codifica uma proteína transportadora de membrana com papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. Mutações nesse gene estão associadas a paraplegia espástica autossômica dominante 6 (MIM 600363)322,323. O gene MKRN3 (MIM 603856) codifica uma proteína makorin zinc finger 3, que tem sido proposta como tendo um efeito inibitório sobre a secreção do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), ainda que seus mecanismos de ação não sejam completamente conhecidos324. Nesse sentido, mutações no gene vêm sendo relacionadas à puberdade precoce central323,325. O gene MAGEL2 (MIM 605283) codifica um potenciador da ubiquitina ligase, necessária na reciclagem de proteínas endossomais. Mutações nesse gene causam síndrome Schaaf-Yang (MIM 615547) e artrogripose grave325,326. Além disso, o gene tem sido proposto como candidato a distúrbios do espectro autista, e ainda como contribuindo para o fenótipo de síndrome de Prader-Willi327.

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O gene NDN (MIM 602117) codifica uma proteína denominada necdin, com presença predominante em células pós-mitóticas como neurônios, inibindo o crescimento neuronal. Estudos relatam que a expressão desse gene encontra-se diminuída em várias neoplasias, como câncer de mama, ovário e próstata, indicando provável atuação como supressor tumoral328-332. O gene SNRPN (MIM 182279) codifica dois tipos diferentes de proteína, Snurf e SmN, essa última é relacionada ao processamento pré-mRNA e pode contribuir para o splicing alternativo tecido-específico333. Em condições normais, esse gene encontra-se metilado no alelo materno, com metilação diferenciada de acordo com a idade, sugerindo uma função adicional no processo de envelhecimento334-335. O gene UBE3A (MIM 601623) codifica um membro da família das proteínas E3 ubiquitina ligase e está sujeito ao imprinting genômico, com expressão materno-específica no cérebro, mais especificamente, nos neurônios336. Sua deleção está associada à síndrome de Angelman, enquanto a superexpressão, observada em indivíduos com dup15q, tem sido relacionada a autismo, como sugerem Noor et al.337. Esses autores investigaram uma paciente com atraso no desenvolvimento e distúrbios neuropsiquiátricos, com duplicação de 129 kb em 15q, envolvendo apenas o gene UBE3A, de herança materna e recorrente em quatro gerações, segregando junto com o distúrbio337,339. A proteína codificada pelo gene GABRB3 (MIM 137192) atua como receptor GABA (ácido gama aminobutírico), o principal neurotransmissor inibidor do sistema nervoso central de mamíferos. Alterações no mesmo se associam a diversas condições, como síndrome de Angelman e Prader-Willi, sinais orofaciais não sindrômicos, epilepsia e autismo339-343. O gene OCA2 (MIM 611409) codifica uma proteína de membrana integral envolvida no transporte de moléculas pequenas, especificamente a tirosina, precursora da síntese de melanina. Sendo assim, o gene estaria envolvido na pigmentação de pele e íris. Mutações nesse gene (c.2139G>A, p.K713K, p.T404M) resultam no albinismo oculocutâneo tipo 2 (MIM 203200)344. Finalizando, CNVs observadas no gene HERC2 (MIM 605837) estão associadas a DI não sindrômica, autismo e distúrbios de marcha345,346 , assim como a variação no padrão de pigmentação de pele, olhos e cabelo347,348. Como mencionado, os genes descritos acima estão presentes entre os pontos de quebra BP2-BP3 em 15q11-13 e são candidatos a fatores determinantes de transtornos do espectro autista349.

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Conforme Urraca350, duplicações derivadas ou herdadas maternalmente que incluam as regiões BP2 e BP3 (como a da paciente P130) são suficientes para produzir o fenótipo do espectro autista, segundo resultado observado nos nove pacientes com duplicação materna avaliados no estudo350. O autismo também é mais frequentemente observado em indivíduos com síndrome de Prader-Willi por dissomia uniparental materna do que por deleção paterna351, confirmando que gene(s) nessa região aumenta(m) o risco para autismo352. Segundo Moreno-de-Luca et al.353, duplicações em 15q são a segunda causa mais comum de autismo, com frequência estimada em 1 para cada 500 casos353. Isso decorre, principalmente, da presença de gene ou genes sensíveis a dosagem, como o UBE3A, cuja sobreexpressão estaria associada ao fenótipo em indivíduos com duplicação 15q11q13337,349. O excesso de genes expressos maternalmente contidos nessa região estaria envolvido também na origem da psicoses, fato corroborado por Derks et al.355, estudando indivíduos com DI sem sintomas psiquiátricos e indivíduos com DI e esquizofrenia, encontrando deleções 15q nesse último grupo. Mais de 300 descrições de alteração similar à da paciente P130 foram incluídas na base de dados DECIPHER, sendo que em cerca de 200 indivíduos foram registrados sinais clínicos diversos. Entre esses constam além da própria DI, agitação psicomotora, estatura baixa, hipotonia, frontal alto, comissuras bucais desviadas para baixo e palato alto, presentes na paciente.

4.4.2.10. Alteração dup 17p

4.4.2.10.1. Paciente P236 Paciente do sexo feminino, nascida em 07/03/2012, terceira filha de casal jovem e não consanguíneo; meio-irmão (materno) com DI e prima em 1º grau (lado paterno) com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor. Exceto por movimentos fetais fracos, a gestação transcorreu bem, com parto cesáreo, a termo; peso, comprimento e perímetro cefálico normais; Apgar 9/10; relato de sucção débil e tônus diminuído, sem outras alterações. Evoluiu com atraso do desenvolvimento neuromotor; devido a vômitos pós- prandiais frequentes com perda ponderal, indicada endoscopia digestiva alta, que mostrou estenose péptica de esôfago, hérnia de hiato, refluxo gastroesofágico e limitação a ingesta de alimentos sólidos. Ao exame físico, observados peso, comprimento e perímetro cefálico

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normais, braquicefalia, fendas palpebrais oblíquas para cima, pregas epicânticas internas, nariz bulboso com narinas antevertidas, palato alto, clinodactilia de 5º dedo (mãos), prega palmar transversal única incompleta (bilateral), limitação para extensão do joelho esquerdo. Frente a tal quadro clínico, sendo o exame de cariótipo normal, indicada análise por MLPA subtelomérico, com o kit P036, que identificou uma microduplicação em região 17p terminal, confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa17p(P070)×3 (Figuras 52 e 53).

Figura 52. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 17p no paciente.

Figura 53. Em azul, a localização do gene RPH3AL (cromossomo 17p13.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 17p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108.

O gene Rabphilin 3A like (RPH3AL; MIM 604881), também conhecido como NOC2, codifica uma proteína com função reguladora da exocitose dependente de cálcio, tanto em glândulas endócrinas quanto exócrinas. Além disso, ela também teria papel regulador na secreção de insulina pelas células pancreáticas. Também considerado que atuaria como supressor tumoral e poderia se relacionar a casos de autismo355. Pela análise dos resultados de MLPA do presente caso, não foi possível estimar a extensão da região envolvida na duplicação 17p. Acredita-se que outros genes possam estar

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envolvidos na alteração, os quais poderiam estar relacionados às demais manifestações fenotípicas. A síndrome de microduplicação 17p (MIM 613215) é uma condição rara e a relativa variabilidade clínica pode estar atribuída à extensão da região ou mesmo à função dos genes envolvidos na duplicação, que pode se estender de 17p11 a 17p13. Contudo, ainda é possível delinear um espectro clínico comum que inclui atraso neuropsicomotor leve a moderado, autismo, distúrbio na fala, disfagia oro-faringeana, refluxo gastroesofágico, dificuldade de alimentação, baixa estatura, contraturas nos joelhos, deformidades em pés, hipotonia e características dismórficas craniofaciais, incluindo frontal alto, nariz e boca pequenos356-363. Ela representa uma síndrome de duplicação de genes contíguos envolvendo os genes PAFAH1B1 (LIS1) e/ou YWHAE. Esta mesma região 17p13.3 encontra-se deletada na síndrome de Miller-Dieker (MIM 247200). Bruno et al.357 analisando 7678 indivíduos com dificuldades de aprendizado e/ou autismo por meio microarray, identificaram microduplicações e microdeleções na região 17p13.3, sugerindo duas classes de alterações nesta região: classe I envolvendo o gene YWHAE mas não o gene PAFAH1B1, enquanto que a classe II envolveria o gene PAFAH1B1, CRK e YWHAE357. O gene YWHAE (Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein épsilon; MIM 605066) codifica um proteína altamente conservada entre mamíferos, cuja função estaria relacionada à divisão celular e regulação da sensibilidade à insulina. Polimorfismos neste gene (rs28365859) estariam relacionados à esquizofrenia364. Já o gene CRK (CRK proto-oncogene, adaptor protein; MIM 164762) codifica uma proteína envolvida em várias vias de sinalização, enquanto que o gene PAFAH1B1 (Platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1; MIM 601545) tem sido sugerido como potencial oncogene no câncer de pulmão. Segundo Bi et al.365 duplicações envolvendo concomitantemente os genes YWHAE e CRK levariam a um crescimento excessivo ou peso corporal/comprimento maior. Duplicações apenas para o gene YWHAE levariam à macrossomia, alterações neurocognitivas leves e dismorfismos craniofaciais, como sinofre leve, columela pendente, lábio superior fino e queixo inclinado. Esse fenótipo seria contrastante com o observado em indivíduos com duplicação em PAFAH1B1, que apresentariam atraso grave no desenvolvimento, microcefalia, craniossinostose, anomalia cardiovascular, malrotação intestinal, escoliose e deformidade das pernas tipo geno varo.

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Curry et al.360 caracterizando clinicamente 34 indivíduos de 21 famílias quanto à duplicação 17p13.3 observaram uma grande variedade de sinais fenotípicos, sendo mais específico entre aqueles com duplicações envolvendo os genes YWHAE e LIS1. Tais pacientes apresentaram anormalidades cerebrais envolvendo o corpo caloso. Distúrbios do espectro autista foram observados em um terço dos casos, sendo mais frequente entre aqueles com duplicações entre YWHAE e genes flanqueadores como o CRK. Tucker et al. 367 descreveram dois casos de duplicação 17p13.3 envolvendo o gene YWHAE e não o gene PAFAH1B1 com fissura labiopalatina, sugerindo a relação entre esse gene e o fenótipo. Como dito anteriormente, a técnica de MLPA foi efetiva para detecção da alteração na paciente P236, entretanto outros métodos, em especial o microarray, seriam pertinentes para se estimar o tamanho da alteração e eventualmente detectar outro rearranjo associado. A comparação entre os sinais clínicos apresentados pela paciente com os relacionados na síndrome da microduplicação 17p permite concluir que a que a alteração ora descrita se extenda além do gene RPH3AL, em especial pela constatação de de refluxo gastroesofágico e contratura de joelhos.

4.4.2.11. Alteração dup XYp

4.4.2.11.1. Paciente P303 Paciente do sexo feminino, 29 anos, avaliada aos 25 anos, durante a investigação de filho recém-nascido com hipotonia e algumas anomalias minor similares às da mãe. Ela referia dificuldade escolar, apresentava avaliação psicométrica indicando DI moderada (QI=46), com boa funcionalidade em atividades cotidianas e sociais; também informava uso de prótese auditiva devido a perda mista profunda bilateral, diagnosticada aos cinco anos; também informados infecções urinárias recorrentes associadas a refluxo vesicoureteral. Ao exame físico, observados ptose palpebral à direita, nariz bulboso, palato alto, braquidactilia e limitação para extensão de membros superiores; sem anomalias cardíacas e de sistema nervoso central. Como o exame de cariótipo convencional foi normal, a investigação prosseguiu com análise de rearranjos subteloméricos pela técnica de MLPA por meio do kit P036, que detectou alteração no braço curto do cromossomo X (Figura 54) em região

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pseudoautossômica X/Y, confirmada pelo teste com o kit P070, indicativa de duplicação do gene SHOX (Short stature homeobox; MIM 400020), uma vez que em ambos os kits as sondas para a região referem-se a este gene, respectivamente (Tabelas 1 e 2, Figura 36). Assim, a notação do cariótipo desse paciente passa a ser rsaXYp(P070)×3 (Figura 54).

Figura 54. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação XYp nos pacientes P258 e P303.

Visando melhor definição dos pontos de quebra foi realizado teste de MLPA também com o kit SALSA MLPA P018 (Tabela 4), que inclui sonda específica para cada éxon do gene SHOX (alterado nos testes anteriores), de genes adjacentes tais como PPP2R3B (mais telomérico) e do gene VAMP7 (mais centromérico) (Figura 36). A partir dos sinais alterados nas sondas delimitadas pelas setas vermelhas, essa análise possibilitou determinar a extensão da duplicação, sendo de no mínimo 319 kb a no máximo 656 kb (Figura 55).

Figura 55. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018. As setas em vermelho mostram a extensão da duplicação XYp na paciente P303.

Ao contrário da haploinsuficiência do SHOX que tem quadro clínico bem definido, as duplicações dessa mesma região do cromossomo X, que compreendem apenas o gene SHOX, são eventos raros e de repercussão clínica ainda controversa. No entanto, considera-se que essa duplicação tenha algum efeito sobre a estatura em humanos, o que não foi constatado na paciente. Casos semelhantes de duplicação do SHOX em meninas com

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síndromes malformativas foram descritos, mas há consenso de que, a despeito de o SHOX ser um gene sensível a dosagem e estar na região pseudoautossômica do X, sua regulação é complexa, não havendo explicação biológica que permita correlacionar eventuais variantes a DI ou quadros correlatos, apesar do registro de associação estatística com autismo e transtornos do neurodesenvolvimento. Sendo assim, o que pode justificar tal fato é a combinação com outros eventos genéticos, ou seja, a duplicação do SHOX per se não determinaria um quadro sindrômico específico, mas eventualmente seria capaz de modelá-lo e, sobretudo, aumentar a suscetibilidade para uma segunda alteração genética, essa por sua vez patogênica e responsável pelo fenótipo.

4.4.2.11.2. Paciente P258 Paciente do sexo feminino, 17 meses, pais jovens e não consanguíneos, sem antecedentes familiais relevantes. Gestação sem intercorrências; nascida a termo, por cesárea eletiva, com 2935 g, 48,5 cm de comprimento, perímetro cefálico 32 cm; hipotonia e sucção débil no período neonatal. Evoluiu com atraso global do desenvolvimento, disfagia e constipação intestinal. Ao exame físico, observados microcefalia e microftalmia à direita, face triangular, orelhas proeminentes, fendas palpebrais oblíquas para cima e alongadas, rarefação do terço distal de sobrancelhas, narinas antevertidas, comissuras bucais desviadas para baixo, filtro apagado, palato alto e estreito, peito escavado, pregas palmares pouco marcadas, finger pads, pés planos com calcâneos proeminentes. Entre os exames complementares, o videodeglutograma detectou disfagia leve, com comprometimento predominante de fase oral e a RM de encéfalo mostrou alteração sugestiva de coloboma pequeno em nervo óptico. Considerada inicialmente a hipótese de síndrome Kabuki, porém como a estatura era normal e o fenótipo facial dessa condição é descrito em várias outras afecções, incluindo várias síndromes cromossômicas, após o exame de cariótipo normal, realizada análise de rearranjos subteloméricos pela técnica de MLPA por meio do kit P036. Pela técnica foi possível visualizar uma alteração no braço curto do cromossomo X (Figura 54) em região pseudoautossômica X/Y, confirmada pelo teste com o kit P070, indicativa de duplicação do gene SHOX (MIM 400020), como anteriormente citado para a P303. Assim, a notação do cariótipo dessa paciente passa a ser rsaXYp(P070)×3. Visando a definição dos pontos de quebra, foi realizado teste de MLPA também com o kit SALSA MLPA P018 (Tabela 4), conforme descrito para a paciente anterior. Pelo

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resultado foi possível estimar a extensão da alteração que inclui todo o gene SHOX, delimitada pelas setas em vermelho, com tamanho entre 126 kb e 444 kb (Figura 56).

Figura 56. Gráfico do resultado de MLPA com o kit SALSA MLPA P018. As setas em vermelho mostram a extensão da duplicação XYp no paciente P258.

Posteriormente, foi realizado teste de microarray (SNP-array), cujo resultado arr[GRCh37] Xp22.33(568604_728449)×3, confirmou uma duplicação intersticial Xp22.33, com 160 Kb, incluindo todo o gene SHOX. Como mencionado no caso anterior (P303), essa variante é classificada como de significado incerto e não justificaria o fenótipo da paciente, cujo diagnóstico etiológico permanecia indeterminado. Assim, optou-se pelo sequenciamento completo do exoma, realizado via protocolo de pesquisa da doutoranda Joana R. Marques Prota, que revelou uma variante “stop gain” patogênica do gene KMT2D (Lysine-specific methystranferase 2D; MIM 602113), confirmando a hipótese inicial de síndrome Kabuki.

A síndrome Kabuki (MIM 147920) se associa a malformações múltiplas determinadas por variantes patogênicas nos genes KMT2D ou KDM6A (Lysine-specific demethylase 6A; MIM 300128). Como foi primeiramente descrita em indivíduos japoneses367,368 acreditava-se que fosse mais comum nessa população, fato não confirmado pela constatação posterior em diversas outras etnias369. Destaca-se pelos dismorfismos faciais que remetem à maquiagem utilizada pelos atores do teatro japonês Kabuki – eversão da porção distal da pálpebra inferior, sobrancelhas arqueadas e com rarefação de terço médio a distal, ponte nasal baixa e orelhas proeminentes - além de atraso no desenvolvimento, DI, alterações esqueléticas e estatura baixa. Outros achados incluem ptose palpebral, estrabismo, hipodontia, dentes espaçados, fenda de lábio e/ou palato, cardiopatia, anomalias geniturinárias e gastrointestinais (incluindo atresia anal), suscetibilidade a infecções, convulsões, distúrbios alimentares e perda auditiva370-373.

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Após a primeira descrição, o fenótipo Kabuki vem se expandindo, assim como os achados mutacionais. Em 2010, Ng et al.374 sequenciando o exoma de 10 indivíduos com a síndrome, observaram mutações envolvendo o gene KMT2D, concluindo que variantes patogênicas desse gene sejam a principal causa da síndrome, fato corroborado em estudos posteriores375-377. O referido gene, amplamente expresso em tecidos adultos e essencial para o desenvolvimento embrionário, tem participação importante também na regulação do metabolismo e na supressão tumoral378. Deleções em heterozigose no gene KDM6A também foram relacionadas à síndrome Kabuki 379-381. Tal gene, juntamente com o KMT2D, atua na regulação de genes expressos em tecidos musculares durante a embriogênese. Além disso, genes de outra família (genes T-box, cuja função está relacionada à formação de vertebras e do coração) recrutam o KDM6A para a ativação de genes alvo, fato que reforça o papel do mesmo no desenvolvimento382. Na maioria dos pacientes, as variantes patogênicas são de novo, consistentes com a ocorrência esporádica. O espectro clínico é amplo, mas em geral a hipótese de SK se relaciona aos sinais faciais peculiares, apesar do amplo espectro clínico. Recentemente, o fenótipo expandido passou a incluir microftalmia, sobrepondo-se ao da síndrome CHARGE, que deve ser considerada como diagnóstico diferencial. O sequenciamento do exoma evidenciou uma variante “stop gain” no gene KMT2D, previamente registrada na literatura como patogênica e relacionada à microftalmia, confirmando a hipótese inicial. A estatura dentro da normalidade é incomum nessa condição, sendo plausível supor, conforme mencionado, que a duplicação do SHOX tenha contribuído para melhorar a estatura final da propósita, reduzindo a tendência à baixa estatura relacionada à SK. Esse caso ilustra a importância da avaliação genético-clínica para a interpretação adequada dos resultados dos testes genômicos e, obviamente, o impacto da introdução dessa modalidade diagnóstica. Por outro lado, reforça a discussão antiga, ainda não encerrada, sobre o eventual efeito de uma primeira alteração genética que, agindo como fator de risco, aumentaria a suscetibilidade para um segundo evento genético.

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4.4.2.12. Alteração dup 7q

4.4.2.12.1. Paciente P4 Paciente do sexo feminino, nascida em 20/09/1992, filha de casal jovem e não consanguíneo; dois primos em 1º grau (lado materno) com déficit de atenção e aprendizado; sem outros antecedentes familiais relevantes. É fruto de gestação gemelar, que transcorreu sem alterações, com parto vaginal no 8º mês; a propósita pesou 2140 g e teve Apgar 9/10 (sem outros dados neonatais); o irmão gêmeo encontrava-se igualmente em boas condições e ambos receberam alta aos três dias de vida. Evoluiu com atraso do desenvolvimento neuromotor, baixa estatura e amenorreia primária sem desenvolvimento de caracteres sexuais secundários. Não conseguiu ser alfabetizada, frequentando instituição para educação especial dos oito aos 17 anos. Ao exame físico, com 17 anos e nove meses, observados face triangular, pescoço curto, implantação baixa de cabelos na nuca, retrognatia leve, palato alto, má oclusão dentária, tórax alargado, cúbito valgo, mãos com retificação de borda ulnar e hipoplasia leve de 4º e 5º metacarpos, desenvolvimento mamário e pilificação pubiana respectivamente nos estágios III e IV de Tanner. O ultrassom de abdômen total foi normal, enquanto o pélvico mostrou útero em anteverso flexão com 9 cm3 , com ovários não visualizados. O exame de cariótipo revelou a constituição 45,X[26]/47,XXX[24], indicativa de mosaicismo com uma linhagem monossômica e outra trissômica para o cromossomo X, definindo o diagnóstico de síndrome de Turner. Porém, frente ao déficit intelectual significativo e incomum nessa condição, indicada complementação da investigação citogenética, pela pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036, o qual identificou uma microduplicação em 7q terminal, confirmada pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa7q(P070)×3 (Figuras 57 e 58).

Figura 57. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. A seta em vermelho mostra duplicação 7q no paciente.

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Figura 58. Em azul, a localização do gene VIPR2 (cromossomo 7q36.3), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 7q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108.

Deleções envolvendo a região 7q36 já foram registradas na literatura, inclusive em associação com outros fenótipos, entretanto microduplicações da mesma região são raras 384-387. Novales et al.384, relatando o caso de uma paciente com duplicação 7q32→qter, concluíram que indivíduos com essa condição apresentam atraso no desenvolvimento, baixo peso, anomalias esqueléticas e hipotonia, entre outros. Posteriormente, Shojaei et al.385, descrevendo um paciente com rearranjo dup7q/del13q, mencionaram dismorfismos como implantação baixa de cabelo na nuca, hipertelorismo, epicanto interno, microretrognatia e má- oclusão dentária como relacionados à trissomia parcial 7q. Bartsch et al.386, a partir de uma paciente com neurofibromatose tipo 1 com dois rearranjos independentes, incluindo uma microduplicação de 550 kb em 7qter, observaram que a região contém genes funcionais tais como FAM62B, WDR60 e VIPR2, que não trariam consequências fenotípicas quando em dose extra. Entretanto, estudos subsequentes relacionam alguns genes dessa região, como o Vasoactive intestinal peptide receptor 2 (MIM 601970) ou VIPR2, a alterações do sistema nervoso central e psiquiátricas, entre as quais agenesia de corpo caloso, autismo e esquizofrenia. O gene VIPR2 - utilizado para confecção da sonda de MLPA utilizada no presente estudo - codifica uma proteína com diversos papéis no desenvolvimento neural embrionário, neuroproteção e resposta a lesões neurais e processos inflamatórios387,388. Diante dessa informação, apesar das dificuldades para se estabelecer a correlação genótipo-fenótipo e de grande parte do fenótipo da pacientese justificar pela monossomia do X, a alteração encontrada merece registro, pela eventual associação ao distúrbio do desenvolvimento intelectual apresentando pela mesma.

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4.4.2.13. Alteração del5p/dup9p

4.4.2.13.1. Paciente P64 Publicado por Lincoln-de-Carvalho et al.389.

4.4.2.14. Alteração del9p/dup19q

4.4.2.14.1. Paciente P169 Paciente do sexo feminino, nascida em 1994, segunda filha de casal não consanguíneo; um meio-irmão materno e uma irmã, ambos hígidos; quanto aos demais familiares, referidos quatro primos em 1o grau (lado materno) falecidos no período neonatal com anomalias congênitas não especificadas. Gestação na vigência de uso de anticoncepcional injetável e, exceto por tabagismo (cinco cigarros/dia), transcorreu bem; parto cesáreo, a termo, com peso 3.000 g e comprimento 48 cm; aparentemente sem intercorrências neonatais; alta no 2o dia de vida. Mãe refere que ao nascimento tinha uma pequena abertura em região sacro-coccígea que fechou espontaneamente. Evoluiu com atraso global do desenvolvimento (leve), sem intercorrências mórbidas relevantes, exceto por sinusopatia e hipertrofia de adenóides (submetida a adenoidectomia); menarca aos 12 anos; tem estereotipias motoras, mordedura de mãos e aderência a rotinas Ao exame físico, com 15 anos, foram observados baixa estatura, braquicefalia, assimetria de fronte com implantação baixa de cabelos, cristas supraorbitárias salientes com olhos de localização mais profunda, sobrancelhas retificadas com rarefação distal leve, fendas palpebrais oblíquas para cima, comissuras bucais desviadas para baixo, filtro longo, lábio superior fino, má oclusão dentária, dentes pequenos, prognatismo, pescoço curto e levemente alado, ombros caídos, desvio ulnar das mão e marcha de base discretamente alargada; contato visual presente e boa comunicação verbal. Na investigação complementar, a tomografia de coluna (2010) não detectou espinha bífida e a de crânio identificou pequena calcificação de aspecto residual, enquanto duas RM-encefálicas não mostraram alterações (2011/2015). A pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou um rearranjo del9p/dup19q, confirmado pelo kit SALSA MLPA P070 – rsa(9p)×1,(19q)×3 (Figuras 59, 60 e 61).

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Figura 59. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram deleção 9p e duplicação 19q na paciente.

Figura 60. Em azul, localização genes DMRT1 e DOCK8 (cromossomo 9p24.3), cujas sequências foram utilizadas para a confecção das sondas 9p presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070108.

Figura 61. Em azul, a localização do gene CHMP2A (cromossomo 19q13.43), cuja sequência foi utilizada para a confecção das sondas 19q presentes nos kits SALSA MLPA P036 e P070 (https://decipher.sanger.ac.uk/).

A validação realizada pela técnica de FISH em núcleos interfásicos (Figura 62) confirmou o resultado da análise por MLPA. Os genitores realizaram exame de cariótipo, com resultado normal para ambos. Assim, o cariótipo da propósita passa a ser 46,XX.ish der(9)t(9;19)(p24.3;q13.43)(RH65569;RH102404).

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A síndrome da deleção 9p (MIM 158170) é uma condição clinicamente heterogênea com um amplo espectro fenotípico, proporcional à extensão da região deletada (com pontos de quebra ocorrendo em 9p22 e 9p24), em geral resultante de deleções terminais de novo ou translocações envolvendo outro cromossomo390-403. Foi descrita inicialmente por Alfi et al.404 e, entre as manifestações mais comuns, são referidos atraso do desenvolvimento, hipotonia, DI, trigonocefalia, hipoplasia da face média, ponte nasal baixa, filtro longo, microstomia, microrretrognatia, anomalias cardíacas (como defeito de septo atrioventricular), hérnia inguinal e/ou umbilical, além de anomalias genitais em meninos que variam de distúrbios do desenvolvimento gonadal a anomalias da diferenciação dos genitais393,405. Entre os genes relacionados a essa alteração e possivelmente também ao fenótipo da propósita estão DOCK8, KANK1 e DMRT1. O gene DOCK8 (Dedicator of cytokinesis 8; MIM 611432), que se expressa em vários tecidos, incluindo o cerebral (fetal e adulto), está envolvido em processos que afetam a organização dos filamentos de actina e tem papel importante na regulação de morfologia, crescimento, adesão e migração celular. Pode estar relacionado a atraso no desenvolvimento e

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DI (MRD2; MIM 611432), assim como observado na paciente392,402 e na forma autossômica recessiva à síndrome de hiper-IgE406. O gene KANK1 (KN motif and ankyrin repeat domain containing protein 1; MIM 607704) tem diversas funções biológicas e fisiológicas. Seu produto atua na formação do citoesqueleto e na motilidade celular, regulando a polimerização da actina407. Além disso, se expressa em vários locais, como cérebro fetal, células tubulares renais, células glandulares do cólon e estômago. Deleções deste gene têm sido associadas a vários tipos de câncer, como nasofaríngeo, gástrico, pancreático e pulmonar408-410, assim como a uma forma de paralisia cerebral congênita, a quadriplegia espástica, tipo 2 (MIM 612900)411. Tassano et al.401, a propósito de dois pacientes com deleção 9p envolvendo apenas os genes DOCK8 e KANK1, observaram fenótipos não sobrepostos, como por exemplo ausência de fala e movimentos estereotipados no caso 1 e fala bem desenvolvida e desenvolvimento motor dentro da normalidade no caso 2. Comparando esses dois indivíduos à propósita, observa-se que ela apresenta sinais descritos em ambos, como estereotipia motora (jactatio corporis) (caso 1) e fala desenvolvida (caso 2). Segundo os mesmos autores, a diferença em tais fenótipos pode ser explicada por expressividade variável, penetrância reduzida ou mesmo presença de modificadores genéticos e/ou epigenéticos. Já o gene DMRT1 (Doublesex and MAB3- related transcription fator 1; MIM 602424), localizado em 9p23 está envolvido na determinação e diferenciação sexual, sendo associado a disgenesia gonadal, observada em indivíduos 46,XY com microdeleção 9p 404,412. Lopes et al.413 também identificaram deleções 9p incluindo esse gene em indivíduos com azoospermia idiopática, sugerindo que a haploinsuficiência do mesmo seja relacionada a essa condição414. Como mencionado anteriormente, a deleção 9p pode resultar de translocações envolvendo outros cromossomos396,415. Porém, até o momento, registros de rearranjos resultando em monossomia 9p e trissomia 19q são raros na literatura416,417. Su et al.417 descreveram seis indivíduos de uma mesma família (três homens e três mulheres) com der(9)t(9;19)(p24.1;q13.4), todos com deficiência intelectual e dismorfismos craniofaciais diversos, incluindo trigonocefalia. Já Resta et al.416 relataram um paciente do sexo feminino com microdeleção 9p (8,9 Mb) e microduplicação 19q (4,8 Mb) e vários sinais da deleção 9p, porém sem trigonocefalia. Segundo tais autores, o fato de a deleção nesse caso englobar o gene PTPRD (Protein tyrosine phosphatase, receptor type D; MIM 601598) – proposto por Shimojima e Yamamoto418 como candidato para o fenótipo trigonocefalia – e a

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paciente não manifestar essa alteração, sugere que o referido gene não se relaciona de fato ao dismorfismo em questão. Com relação à paciente P169, apenas a análise por MLPA não foi suficiente para determinar a extensão da deleção em 9p, mas considerando as observações de Resta et al.416, a não manifestação de trigonocefalia não exclui a possibilidade de que a deleção tenha incluindo o gene PTPRD. Rearranjos não balanceados envolvendo o cromossomo 19 têm sido relatados na literatura416,417,420. Até o momento, não são conhecidos os genes responsáveis pelo fenótipo da trissomia 19q13.3→ter. Comparando-se os sinais apresentados pela paciente P169 e não relacionados ao fenótipo da deleção 9p, se verifica razoável similaridade, em especial quanto a baixa estatura e manifestações faciais como comissuras bucais desviadas para baixo, dentes pequenos e espaçados, e pescoço curto419,420. De todo modo, em seu conjunto, o quadro clínico da paciente é compatível com as alterações identificadas.

4.4.2.15. Alteração dup9p/del18p

4.4.2.15.1. Paciente P194 Paciente do sexo masculino, nascido em 09/03/2000, primeiro filho de casal não consanguíneo; histórico familial de pai e primo paterno com dificuldades de concentração e primo paterno com deficiência visual importante. Pré-natal e parto sem intercorrências; evoluiu com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade escolar. Infecções respiratórias de repetição, com realização de amigdalectomia e adenoidectomia. Segundo avaliação no ambulatório DISAPRE, apresenta deficiência intelectual leve. Ao exame físico, com 13 anos de idade, observados peso 54 kg, e estatura 155,3 cm (p75), escoliose leve, prega palmar única completa à direita e incompleta à esquerda, sem outros dismorfismos relevantes. Genitália típica masculina P4, testículo direito com 20 cm3 e esquerdo 25 cm3; comportamento infantilizado. Realizados TC de crânio (sem alterações); ressonância magnética de crânio com sinais de má rotação dos giros hipocampais, hipoplasia de joelho do corpo caloso, presença de cavum do septo pelúcido e cavum vergae. Radiografia de coluna lombar identificou espinha bífida em L5. O exame de cariótipo foi 46,XY, normal para o sexo masculino. Por meio da pesquisa de alterações cromossômicas submicroscópicas por MLPA subtelomérico com o kit SALSA MLPA P036 identificou-se um rearranjo dup9p/del18p, confirmado pelo kit SALSA MLPA – rsa(9p)×3,(18p)×1 (Figuras 63 e 64).

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Figura 63. Gráfico do resultado de MLPA com os kits SALSA MLPA P036 e P070. As setas em vermelho mostram duplicação 9p e duplicação 18p no paciente.

A duplicação 9p, primeiramente descrita por Rethoré et al.421, é uma das mais frequentemente observadas em neonatos, juntamente com as trissomias 13, 18 e 21. Até o momento, foram registrados mais de 150 casos, incluindo duplicações puras422-425, mosaicos426 e rearranjos427, sendo esses últimos mais comuns. Quanto aos sinais clínicos, apesar de estarem diretamente relacionados à extensão da região duplicada, há um possível fenótipo comum aos indivíduos portadores dessa alteração, incluindo atraso do desenvolvimento neuromotor, DI em graus variáveis, estatura baixa, dismorfismos craniofaciais (microbraquicefalia, hipertelorismo, fenda palpebrais para baixo, enoftalmia, implantação baixa de orelhas, nariz bulboso, filtro curto, comissuras bucais desviadas para baixo), pescoço curto, anomalias digitais (clinodactilia em quinto dedo, braquidactilia, unhas displásicas) e cardiopatia424,428. Como mencionado, a maior parte dos casos de trissomia 9p relatados na literatura são concomitantes a monossomia em outro cromossomo – rearranjo desbalanceado –

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determinando significativa variabilidade fenotípica, fato que eventualmente dificulta uma correlação genótipo-fenótipo adequada429 Quanto ao rearranjo dup9p/del18p observado no paciente P194, assim como os relatados por Guilherme et al.424 e Fryns et al. 431, tanto há diversos sinais comuns à trissomia 9p e à monossomia 18p, tais como microcefalia, pregas epicânticas e atraso na fala, quanto há outros específicos de cada condição, como pode ser verificado na Tabela 20.

Tabela 20. Características clínicas encontradas em pacientes com duplicação 9p, deleção 18p (adaptado de Guilherme et al.424, Sebold et al.432). Guilherme Guilherme Características 9p+ 18p- et al., 2014 et al., 2014 P194 (P4) (P5) Microcefalia + + - Braquicefalia + + Pregas epicânticas + + + + Micrognatia + Fendas palpebrais para baixo + + + Nariz proeminente + + + Nariz bulboso + + + Olhos proeminentes + Hipertelorismo + + + Estrabismo + Erros de refração + + Ptose palpebral + Orelhas de implantação baixa + + + Orelhas proeminentes + Orelhas dismóficas + Comissuras bucais voltadas para baixo + + + Lábio superior fino + Filtro longo + Pescoço curto + + + + Clinodactilia + + + + Braquidactilia + Unhas displásicas + Peito escavado + Atraso neuropsicomotor + + + + + Hipotonia + + + + Atraso de fala + + + + + Pênis hipoplásico + + - Cardiopatia + + - Disfunção endócrina + - +, presença

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Para o paciente P194, segundo o resultado de MLPA, a alteração em 9pter envolve, no mínimo, os genes DOCK8, KANK1 e DMRT1. O gene DOCK8 (Dedicator of cytokinesis 8; MIM 611432) altamente expresso em cérebro de fetos e adultos, codifica um membro da família DOCK180 de fatores de troca de nucleotídeos de guanina e são componentes de redes de sinalização intracelular. Mutações nesse gene já foram descritas em indivíduos com DI e atraso no desenvolvimento392, além de resultar na forma autossômica recessiva da síndrome de hiper-IgE432. O gene KANK1 (KN motif and ankyrin repeat domains 1; MIM 607704) codifica uma proteína da família das proteínas Kank, cuja função reside na formação do citoesqueleto, regulando a polimerização da actina. Além disso, esse gene é candidato a supressor de tumor de células renais, com variantes patogênicas associadas a transtorno de desenvolvimento do sistema nervoso central411. Já o gene DMRT1 (Doublesex and mab3 transcription factor 1; MIM 602424) está envolvido na determinação e diferenciação sexual. Ying et al.433 por análise imunohistoquímica em amostras de testículo humano adulto observaram a proteína DMRT1 em núcleos de células de Sertoli, espermatogônia e espermatócitos. Quando em haploinsuficiência, tal gene leva a reversão sexual, disgenesia gonadal e alteração nos genitais externos424. Contudo, é oportuno salientar que os genes acima causam alterações quando em haploinsuficiência. No presente caso (P194), é plausível supor a um provável aumento da expressão gênica, e é possível que tais genes sejam sensíveis à dosagem e a interação com outros fatores, tais como elementos regulatórios, porém não há dados suficientes para estabelecer uma correlação com o fenótipo do paciente424. Outros dismorfismos, não relacionados à duplicação 9p, foram encontrados no paciente, provavelmente em decorrência da deleção 18p também observada no caso, como por exemplo alterações visuais. A monossomia 18p (MIM 146390) foi primeiramente descrita por Grouchy256 e desde então mais de 150 casos já foram relatados, com frequência de 1:50.000 nascimentos e proporção de três mulheres para cada homem. Entre os sinais fenotípicos mais comuns, destacam-se atraso de crescimento e fala, DI leve a moderada, estatura baixa, microcefalia, implantação baixa de orelhas, hipertelorismo, ptose palpebral, pregas epicânticas, ponte nasal baixa, peito escavado e alterações visuais. Outros dismorfismos menos comuns são doenças

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autoimunes, holoprosencefalia, alopecia, distonia, perda auditiva, cifose e/ou escoliose e anormalidades em pés431,434. Aproximadamente 2/3 dos casos de monossomia 18p são de novo; o restante é devido a rearranjos desbalanceados, cromossomo em anel ou inversão pericêntrica levando à monossomia 18p associada à trissomia 18q435-437. Na deleção 18p observada no presente caso, ao menos dois genes estão envolvidos (USP14 e THOC1). O gene USP14 (Ubiquitin-specific protease 14; MIM 607274) codifica um membro da família de proteases de processamento específico de ubiquitina (UBP) que é uma enzima “desubicitante” (DUB) com domínios His e Cys. Essa proteína se localiza no citoplasma e cliva a fração ubiquitina de precursores condensados à mesma e proteínas “ubiquitiniladas”. Estudos com ratos mostraram que quando há mutação nesse gene, a expressão dessa proteína se reduz, levando a atraso no crescimento, além do desenvolvimento de tremores poucas semanas após o nascimento, seguidos de paralisia dos membros posteriores e morte com 6 a 10 semanas de idade438. Já o gene THOC1 (Tho complex, subunit 1; MIM 606930) faz parte do complexo TREX (transcrição / exportação), que inclui outros genes. Strasser et al. (2002), em estudo funcional de leveduras, observaram que esse complexo é recrutado especificamente para o gene de transcrição e migra com a polimerase durante o alongamento transcricional. Os mesmos autores sugeriram que ele se liga a proteínas que funcionam na exportação de mRNA ou na transcrição439. Como o paciente tem hipótese diagnóstica do distúrbio da percepção visual conhecido como síndrome de Meares-Irlen, ou síndrome da sensibilidade escotópica de Irlen, foram avaliados possíveis genes incluídos na deleção 18p que pudessem se relacionar a esse tipo de manifestação. Vale acrescentar que ele não apresenta alterações visuais incluídas na síndrome da deleção 18p, como blefaroptose, erros de refração, estrabismo, hipoplasia de nervo óptico e catarata congênita. Entre os genes analisados, apenas o MYP2 (MIM 160700), relacionado a alta miopia e descolamento de retina poderia ser considerado, com a ressalva de que o mesmo também é associado a inteligência superior. Além disso, não é possível afirmar que a deleção observada se estenda à região desse gene, mais centromérico em relação aos dois genes acima (USP14 e THOC1) em haploinsuficiência no paciente440,441.

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4.5. Investigação de alterações pelos métodos de microarray e sequenciamento de exoma Na sequência da investigação houve a oportunidade de fazer a análise por microarray (CGH ou SNP-array) em laboratórios privados, solicitada para oito pacientes que dispunham de plano ou seguro de saúde e atendiam as Diretrizes de Utilização da ANS (Agência Nacional de Saúde Suplementar – Resolução Normativa – RNº338, de 21/10/2013, e RNº387, de 28/10/2015, conforme o Rol de Procedimentos e Eventos em saúde – ANEXO II – de 2014 e 2016). Outros 13 pacientes realizaram esse exame, sendo que 12 deles também foram submetidos a sequenciamento do exoma, pela oportunidade de participação em projeto da aluna Joana R. Marques Prota, doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da FCM-Unicamp, sob orientação da Profa. Dra. Íscia Lopes-Cendes, pesquisadora Principal do Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão: Instituto Brasileiro de Neurociência e Neurotecnologia (Brazilian Institute of Neuroscience and Neurotechnology - CEPID- BRAINN FAPESP; processo 201307559-3), o qual estuda grupos de indivíduos com suspeita de condições diversas de provável origem genética, incluindo DI de causa não esclarecida. A Tabela 21 abaixo descreve as regiões cromossômicas onde foram detectadas as alterações genômicas, o tipo de alteração encontrada (perda ou ganho em cada região), o tamanho das mesmas e a localização específica de acordo com o braço cromossômico (p ou q), banda e sub-banda.

Tabela 21. Alterações presentes nos indivíduos da casuística investigados por meio da técnica de aCGH. Paciente Região cromossômica Evento Tamanho Citobanda P23 ChrX:79658583-96048052 Perda 16,4 Mb q21.1-q21.33 P422 Chr15:52654281-59511540 Perda 6,9 Mb q21.2-q22.2 P812 ChrX:132087424-133441978 Ganho 1,4 Mb q26.2 P1082 Chr7:23771527-26142303 Perda 2,4 Mb p15.3-p15.2 P130 Chr15:22765628-28691460 Ganho 5,9 Mb 15q11.2-q13.1 P1361 Chr1:1186633-2056696 perda 870 kb p36.33-p36.32 Chr1:2103939-5258556 perda 3,1 Mb Chr4:68345-14206282 ganho 14,1 Mb p16.3-p15.33 P1512 Chr22 perda P1522 Chr7:72726487-74144481 perda 1,4 Mb q11.23 P1582 Chr6:57349434-57770309 ganho 421 kb 6p11.2 Chr10:135252931-135396275 ganho 143 kb 10q26.3 P258 ChrX:585079-620146 Ganho 35 kb p22.33 P2842 Chr12:12203966-12868098 Ganho 664 kb 12p13.2p13.1 1- Refinamento das alterações identificadas no MLPA. 2- Laboratórios privados diversos.

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Para os pacientes P46, P63, P156, P160, P170, P172, P182, P198, P235 e 239 a análise não pôde ser concluída até o fechamento desta tese.

Quanto aos testes de sequenciamento de exoma, foram investigados doze pacientes no total, com seis casos concluídos até o momento. A Tabela 22 abaixo descreve os genes identificados, tipo de alteração, variante, fenótipo associado, herança, zigosidade e a classificação ACMG (The American College of Medical Genetics and Genomics).

Tabela 22. Resultados obtidos nos testes de exoma. Fenótipo Gene Variante/ Classificação Caso Alteração associado Herança Zigosidade (OMIM) efeito ACMG (MIM) Patogênica P46 KIRREL3 C/T SNV DI-AD AD Het Variante de

significado SHANK2 C/T SNV Autismo AD Het incerto Variante de P63 SNV CTTNBP2 C/T Autismo AD Het significado Missense incerto P160 TCF4 SNV Pitt-Hopkins C/T AD Het Patogênica (*602272) Missense

Variante de P182 PRKCG T/G SNV SPG14 AD Het significado incerto Variante de P198 Smith RAI1 G/A SNV AD Het significado Magenis incerto P258 KMT2D SNV G/A Kabuki AD Het Patogênica (*602113) StopGain

4.5.1. Paciente P23 Paciente do sexo masculino, nascido em 1997, terceiro filho de casal não consanguíneo, sem antecedentes familiais relevantes. Gestação com risco de abortamento na 12º semana, com várias internações após o sexto mês, devido a trabalho de parto prematuro, inclusive com uso de terbutalina. Parto cesáreo, na 39a semana, com peso 3340 g, comprimento 47 cm, perímetro cefálico 35 cm e Apgar 4/6. Nas primeiras horas, apresentou taquipnéia transitória do récem nato, necessitando internação UTI neonatal. Desenvolveu infecção neonatal, com uso de ampicilina e gentamicina, e icterícia após 48 horas, necessitando de fototerapia; alta com 10 dias de vida.

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Evoluiu com infecções recorrentes de vias aéreas, foi submetido a hermiorrafia inguinal e colocação de tubo de ventilação em ambos os ouvidos; pelo diagnóstico de refluxo gastroesofágico grave, realizada fundoplicatura de Nissen. Ao exame físico, com dois anos, observados peso de 12 kg (3º-10º percentil), 90 cm de estatura (média) e perímetro cefálico de 51 cm (+1DP), dolicocefalia, espessamento da sutura metópica, implantação alta de cabelos na fronte, orelhas proeminentes, hipertelorismo, fendas palpebrais alongadas e com eversão do terço distal, cílios longos, ponte nasal alta com ponta voltada para baixo, columela curta, filtro curto e bem marcado, lábio superior em arco de cupido, palato alto, tórax escavado com aumento da distância intermamilar, mamilo esquerdo invertido, fóvea coccígea, finger pads, esboço de sulco plantar, genitais externos masculinos normais. Na investigação complementar, realizados radiografia de coluna total, eletrocardiograma, ecocardiografia e tomografia computadorizada de crânio, ultrassom abdominal, dosagem de imunoglobulinas audiometria e avaliação oftalmológica com fundoscopia, todos sem alterações. O eletroencefalograma mostrou atividade sugestiva de epileptogenicidade focal e generalizada. Em reavaliação em 2015, aos 17 anos, apresentava DI grave, ausência de linguagem, agitação psicomotora; asma persistente com pneumonias recorrentes e disfagia. Houve suspeita inicial de hipogonadismo, não confirmado pelas dosagens de gonadotrofinas e testosterona. A RM de crânio na ocasião evidenciou anomalia de sinal parenquimatosa córtico-subcortical temporal anterior à direita, possivelmente relacionada a encefalomalácia/gliose pós-traumática; ventrículos laterais assimétricos e semi-verticalização dos sulcos colaterais, por provável má-rotação parcial hipocampal bilateral. Na ocasião, observados peso abaixo de 3%, estatura em 50%; perímetro cefálico acima 98%; testículos tópicos com 12 cm3; face alongada, nariz e orelhas proeminentes, além dos dismorfismos descritos anteriormente. O teste de microarray foi realizado por meio da plataforma SurePrint G3 Human CGH Microarray 8x60K - ISCA (Agilent, Santa Clara, CA). Pela análise do teste foi observada deleção de 16,4 Mb em Xq21.1-q21.3, arr[hg19]Xq21.1q21.3(79658583_96048052)×1, que envolve 18 genes descritos no OMIM, seis deles relacionados a fenótipos patológicos (Figura 65 e Tabela 23)108.

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Tabela 23. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P23. Localização Gene Nome OMIM cromossômica Bromodomain and WD repeat domain BRWD3 X:79926353-80065187 300553 containing 3 POU3F4 X:82763269-82764775 POU class 3 homeobox 4 300039 ZNF711 X:84498997-84528368 Zinc finger protein 711 314990 POF1B X:84532402-84634748 Premature ovarian failure, 1B 300603 CHM X:85116185-85302566 CHM, Rab escort protein 1 300390 DIAPH2 X:95939662-96859996 Diaphanous related formin 2 300108

O gene BRWD3 (MIM 300553) se expressa de forma ubíqua em todos os tecidos, incluindo o cerebral, desde a fase embrionária até a adulta. Foi primeiramente descrito por Kalla et al.442 ao investigar pacientes com leucemia linfocítica crônica com translocação t(X;11)(q13;q23) cujo pronto de quebra no cromossomo X ocorreu no gene BRWD3,

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provocando uma diminuição da expressão do gene. Desde então estudos posteriores têm associado mutações no gene com deficiência intelectual de graus variados (MIM 300659) e dismorfismos, como macrocefalia e nariz e orelhas proeminentes443. Grotto et al.444 comparando os sinais clínicos de indivíduo de sexo masculino apresentando uma deleção de novo, com extensão de 74 kb, envolvendo os éxons 11 a 41 do gene BRDW3 – de novo – a quatro indivíduos com mutação sem sentido p.Tyr1131* no mesmo gene, observaram similaridades fenotípicas, incluindo DI leve a moderada, atraso de fala, distúrbios comportamentais, macrocefalia e dismorfismos faciais, como frontal proeminente, olhos de localização profunda, orelhas anormais, mãos e pés grandes, sinais também observados no paciente P23. Já o gene POU3F4 (MIM 300039) codifica um membro da classe POU-III de fatores de transcrição expressos durante o desenvolvimento neural inicial, desempenhando um papel importante no desenvolvimento da orelha interna. CNVs envolvendo este gene (deleções, inversões, duplicações) estão associadas à surdez ligada ao X (MIM 304400)445. O gene ZNF711 (MIM 314990) codifica um fator de transcrição de diversos genes altamente expressos no cérebro. Van der Werf et al.446 identificaram mutações em homozigose nesse gene em indivíduos com DI não sindrômica, cujas células neuronais apresentaram níveis de expressão diferentes de diversos genes, em relação a controles normais. O gene DIAPH2 (MIM 300108) é conhecido por atuar no desenvolvimento e controle da função ovariana. Mutações nesse gene são associadas à insuficiência ovariana precoce, por interferir na divisão celular folicular, e também à estatura baixa447. De forma similar, o gene POF1B também se relaciona à insuficiência ovariana precoce (MIM 300604), sendo expresso em tecidos epiteliais e, quando alterado (p.Arg329Gln), provocando mudanças na ciliogênese e cistogênese celular448. Por fim, o gene CHM (MIM 300390) codifica uma proteína regulatória do tráfico intracelular. Variantes diversas nesse gene já foram descritas, tais como mutações sem sentido, missense, frameshift, e até mesmo deleção envolvendo todo o gene, que se relaciona a coroideremia, uma forma de atrofia retiniana progressiva (MIM 303100)449. A busca na base de dados DECIPHER indicou que há quase 70 casos de deleção envolvendo a região alterada no presente caso. Além de atraso de desenvolvimento e deficiência intelectual, convulsões e macrocefalia estão entre os sinais mais frequentemente

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observados, todos constatados no paciente P23, além dos dismorfismos faciais, possibilitando estabelecer a correlação genótipo-fenótipo.

4.5.2. Paciente P42 Paciente do sexo masculino, nascido em 1987, segundo filho de casal jovem e não consanguíneo; a única irmã é hígida; referida recorrência de DI em três primos em quarto grau (lado paterno); sem informações relevantes na linhagem materna. A gestação transcorreu bem, parto cesáreo por pós-datismo (43a semana); líquido amniótico meconial; peso 3650 g; comprimento 48 cm e perímetro cefálico 36 cm; relato de cianose generalizada, choro demorado, sucção débil; hipotonia, dificuldade de alimentação com perda significativa de peso no período neonatal. Evoluiu com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor, mais acentuado na fala; apresenta déficit cognitivo, ansiedade e agitação psicomotora ocasionais, comportamento manipulador e crises de birra. Obesidade a partir dos cinco anos. Avaliação oftalmológica mostrou hipermetropia e astigmatismo, com fundoscopia normal; ecocardiograma, radiografia de coluna e ultrassom de rim e vias urinárias sem alterações. Ao exame físico, com sete anos, observado peso de 34,2 kg (p>97), estatura 124 cm (p75) e perímetro cefálico 52 cm (p50), obesidade, implantação baixa de cabelos na nuca, pregas epicânticas internas, fendas palpebrais curtas e desviadas para cima, ptose palpebral bilateral (discreta), filtro curto, lábios finos, incisivos centrais proeminentes, protrusão lingual, hipoplasia de 4 e 5º metacarpianos, prega palmar transversal única incompleta bilateral, finger pads, aparente braquidactilia (mãos), pés planos, acavalgamento leve de 2º sobre 1º e 3º dedos dos pés. O teste de microarray realizado evidenciou a deleção de 6,9 Mb em 15q21.2- q22.2, arr[hg19]15q21.2q22.2(52654281_59511540)×1, envolvendo 26 genes depositados no OMIM, oito deles relacionados a doenças (Figura 66 e Tabela 24).

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Tabela 24. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P42. Localização Gene Nome OMIM cromossômica MYO5A 15:52599480-52821247 Myosin VA 160777 WDR72 15:53805938-54055075 WD repeat domain 72 613214 RAB27A 15:55495164-55611311 RAB27A, member RAS oncogene family 603868 DYX1C1 15:55702723-55800432 Dynein axonemal assembly factor 4 608706 TCF12 15:57210821-57591479 Transcription factor 12 600480 LIPC 15:58702768-58861151 Lipase C, hepatic type 151670 A disintegrin and metalloproteinase ADAM10 15:58887403-59042177 602192 domain 10 MYO1E 15:59427113-59665099 Myosin IE 601479

O gene WDR72 (MIM 613214), está relacionado a proteínas que atuam no processo de mineralização do esmalte dentário, em especial no período de maturação,

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promovendo a remoção de amelogeninas450. É associado a amelogênese imperfeita tipo IIA3. El-Sayed et al.451 identificaram uma mutação sem sentido (p.R897X) nesse gene, relacionando-a a essa condição. O gene RAB27A (MIM 603868) codifica uma GTPase (Rab27a) que atua no transporte intracelular de melanosomas e também tem papel importante na exocitose de grânulos citolíticos em linfócitos T citotóxicos e células natural killer e vesículas secretoras em células endócrinas. Mutações nesse gene (c.136T>A p.F46I) determinariam a síndrome de Griscelli tipo 2 (MIM 603868)452. O gene DYX1C1 (MIM 608706), cujo nome oficial é DNAAF4, está envolvido na migração neuronal durante o desenvolvimento do neocórtex cerebral, função sugerida a partir da análise de modelos animais e linhagens celulares humanas453, e CNVs neste gene têm sido relacionadas à dislexia454). O gene TCF12 (MIM 600480) é um regulador de transcrição e está envolvido na inicialização da diferenciação neuronal. Sharma et al.455, realizando sequenciamento de exoma em indivíduos com craniossinostose, observaram 36 mutações diferentes no gene TCF12, sendo 15 frameshift, 14 nonsense, sete de splicing e duas missense, sugerindo o mecanismo de perda de como causador desse fenótipo. O gene LIPC (MIM 151670) codifica a enzima lipase de triglicerídeos, que se expressa no fígado e tem função importante no metabolismo das lipoproteínas. Wang et al.456 investigando polimorfismo C-514T em crianças chinesas, observaram relação do mesmo com obesidade e sexo, pois meninos portando o alelo T apresentam tendência à obesidade, enquanto as meninas com o mesmo alelo são menos obesas. O gene ADAM10 (MIM 602192) codifica uma proteína da família ADAM, que corresponde a proteínas de superfície celular, cuja função se relaciona à clivagem de outras proteínas, incluindo as citocinas TNF-alfa e E-caderina. Níveis elevados de expressão do gene são observados em diversos tipos de câncer, tais como pulmonar, gástrico, pancreático, melanoma, de mama e bexiga457,458. O gene MYO1E (MIM 601479) codifica um membro das miosinas não musculares classe I (subgrupo da família de proteínas de miosina não convencional), encontrado no citoplasma e possivelmente envolvido no movimento intracelular e no tráfico de membrana. Mutações sem sentido em homozigose nesse gene foram associadas à glomeruloesclerose segmentar focal 6459. Já o gene MYO5A codifica uma das proteínas da classe de miosinas, proteínas motoras envolvidas no transporte de vesículas citoplasmáticas e de ancoragem,

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alinhamento e translocação do mRNA, encontrada em níveis elevados em melanócitos e células nervosas460. Na base de dados DECIPHER, são descritos pelo menos 30 casos com perda de CNVs similares. As características mais frequentemente observadas foram deficiência intelectual (10/22) e obesidade (2/22), também presentes no paciente P42.

4.5.3. Paciente P81 Paciente do sexo masculino, nascido em 1999, segundo filho de casal jovem e consanguíneo (primos em 1º grau). Sua irmã apresenta baixa estatura e teve atraso para andar (1 ano e 9 meses); recorrência familial de blefaroptose (pai e tio paterno), orelha em abano (pai tia e primos em 1o grau pelo lado paterno); além de primo em 1o grau (lado paterno) com hipospadia e um tio (lado materno) com dificuldade de aprendizado (chegou a frequentar instituição especializada). Gestação com movimentos fetais fracos e tardios, sem outras intercorrências relevantes; parto vaginal, a termo, peso 2.305 g 45 cm (ambos ~5%); perímetro cefálico 33 cm e Apgar 8/9; referidos hipotonia, choro demorado e sucção débil. Evoluiu com atraso leve do desenvolvimento psicomotor, teve dificuldade escolar, além de alteração de fala; atraso de dentição decídua (início aos 19 meses) e alterações ortodônticas; hipotireoidismo (faz reposição hormonal regularmente). Ao exame físico, com um ano e oito meses, observados baixa estatura, frontal alto, retração bitemporal, implantação alta dos cabelos em fronte e baixa em nuca; orelhas de implantação baixa, em concha e com relevo pobre; sobrancelhas esparsas, arqueadas e de orientação anômala; ptose palpebral bilateral (pai tem unilateral); cílios longos; nariz de base alargada e ponta bulbosa; prognatismo leve; palato alto; língua plicada; respirador oral, voz anasalada, clinodactilia de 5º dedo (mãos), falanges distais algo alargadas; acavalgamento de artelhos (bilateral); pés valgos, inversão peno-escrotal parcial discreta, hipospadia balano- prepucial; algumas manchas hipercrômicas (região supra-púbica e pé esquerdo) e efélides (face e membros; semelhante à mãe); unhas quebradiças. Ecocardiograma sem anormalidade e atraso de idade óssea. O teste de microarray foi realizado por meio da plataforma CS3000 da Affymetrix e chip CytoScan® 750K Cytogenetics Solution, que contém 750.000 oligonucleotídeos distruídos por todo o genoma humano, sendo composto por 200.000 SNP e 550.000 marcadores não polimórficos. Pela análise do teste foi observada a duplicação de 1,4

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Mb em Xq26.2, arr[hg19]Xq26.2(132087424_133441978)×2, que envolve cinco genes descritos no OMIM, sendo um deles relacionado à morbidade – GPC3 (Figura 67 e Tabela 25108.

Tabela 25. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P81. Gene Localização cromossômica Nome OMIM HS6ST2 X:131760044-132095423 Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2 300545 USP26 X:132158659-132231137 Ubiquitin specific peptidase 26 300309 Transcription factor Dp family member TFDP3 X:132350697-132352376 300772 3 GPC4 X:132434131-132549518 Glypican 4 300168 GPC3 X:132669773-133119922 Glypican 3 300037

Além disso, foram detectadas 20 regiões com perda de heterozigosidade (LOH), 19 delas com genes associados à doença genética com padrão de herança recessiva, conforme Tabela 26.

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Tabela 26. Região cromossômica, tamanho e número de genes OMIM situados nas regiões onde foram encontradas perda de heterozigosidade no caso P81. Número Região Resultado Tamanho de genes cromossômica OMIM 1p35.1p32.3 arr[hg19]1p35.1p32.3(34444229_53139066) hmz 18,7 23 1p36.33p36.23 arr[hg19]1p36.33p36.23(888658_7617555) hmz 6,7 10 3q11.1q11.2 arr[hg19]3q11.1q11.2(93558925_96787677) hmz 3,2 2 arr[hg19]4q32.2q34.3(163999754_179902229) 4q32.2q34.3 15,9 4 hmz 4q25q28.3 arr[hg19]4q25q28.3(108540496_132266908) hmz 23,7 16 4q22.1q23 arr[hg19]4q22.1q23(90248526_100746497) hmz 10,4 4 6p22.2p22.1 arr[hg19]6p22.2p22.1(25871043_29669964) hmz 3,8 1 arr[hg19]6p21.31p21.1(35213539_43957326) 6p21.31p21.1 8,8 12 hmz 8p23.1p21.3 arr[hg19]8p23.1p21.3(10760510_19869471) hmz 9,1 6 arr[hg19]8p11.23p11.1(37473069_43776654) 8p11.23p11.1 6,3 7 hmz arr[hg19]8q11.11q12.1(46919156_58414693) 8q11.11q12.1 11,5 5 hmz arr[hg19]8q24.22q24.3(134525140_140340906) 8q24.22q24.3 5,8 - hmz arr[hg19]9q34.11q34.3(132669499_137447946) 9q34.11q34.3 4,8 10 hmz arr[hg19]10q22.1q22.2(73731650_77659243) 10q22.1q22.2 3,9 6 hmz arr[hg19]11q13.4q23.3(70937213_117225134) 11q13.4q23.3 46,2 38 hmz 11p12.11.12 arr[hg19]11p12.11.12(41603184_51550787) hmz 9,9 11 11q11q13.2 arr[hg19]11q11q13.2(54827207_67878545) hmz 13,0 36 arr[hg19]14q24.3q32.33(76232469_107279475) 14q24.3q32.33 31,0 26 hmz 15q14q22.31 arr[hg19]15q14q22.31(34426501_66456770) hmz 32,0 40 17q11.1q12 arr[hg19]17q11.1q12(25309336_34942870) hmz 9,6 5

O gene HS6ST2 (MIM 300545) codifica proteoglicanos que interagem com diversos ligantes celulares, resultando em diferenciação, adesão, migração, inflamação, coagulação do sangue e outros processos diversos. A superexpressão deste gene está associada à progressão de diversos tumores malignos, como câncer coloretal, de ovário e mama461. O gene USP26 (MIM 300309) codifica um membro da família de proteases de processamento específico de ubiquitina (UBP), sendo bastante expresso no testículo. Mutações nesse gene têm sido associadas a infertilidade masculina462.

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O gene TFDP3 (MIM 300772) codifica um membro da família DP dos fatores de transcrição, exercendo um papel inibitório de moléculas de E2F, que estimulam a transcrição de genes envolvidos na progressão do ciclo celular. Variantes patogênicas desse gene estariam associadas a altas taxas de expressão do mesmo em neoplasias como câncer de próstata463. O gene GPC3 (MIM 300037) codifica um membro das proteoglicanas de sulfato de heparan de superfície celular, com provável atuação no controle da divisão celular. Esse gene encontra-se expresso em embriões humanos, regulando a morfogênese ou o crescimento, possivelmente por um fator de crescimento semelhante à insulina, proteína morfogênica óssea, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) ou sinalização hedgehog464. Deleções, duplicações e mutações de ponto em GPC3 estão associadas à síndrome de Simpson-Golabi- Behmel (MIM 312870). Além disso, se por um lado a expressão desse gene é verificada no fígado durante desenvolvimento embrionário (18º a 30º dia), sendo nula em adultos, em carcinomas hepáticos níveis elevados da proteína GPC3 são comuns, sendo identificada como marcador tumoral465. Já GPC4, da mesma família de GPC3, está envolvido no desenvolvimento cerebral, regulando a expressão do gene FGF2 (MIM 134920)466. De acordo com Xiong et al.467 níveis elevados de expressão de GPC4 (MIM 300168) estariam associados a epilepsia, a partir da observação do aumento da expressão do gene em pacientes com essa condição. O paciente P81 não apresentou crises convulsivas até o momento, manifestação que poderia ser explicada pela superexpressão advinda de uma duplicação do referido gene. Na base de dados DECIPHER são descritos cerca de 40 casos com ganho de CNVs como as do paciente P81. O sinal mais frequentemente observado foi DI (10/26); outras manifestações incluem hipotonia, micro/macrocefalia e estatura baixa (descrita no paciente), além de convulsões, obesidade e infeções respiratórias recorrentes.

4.5.4. Paciente P108 Paciente do sexo masculino, nascido em 1997, filho único de casal jovem não consanguíneo. Foi adotado aos 10 meses de idade; o pai adotivo é seu primo em segundo grau; tem uma meia-irmã materna supostamente normal; pelo lado paterno, referida recorrência de DI em dois tios e um primo em 1º grau (lado paterno), além de uma tia com dificuldade de alfabetização. Gestação não desejada com provável tentativa de interrupção. Sem informações sobre antecedentes gestacionais; nasceu por cesárea iterativa, com peso

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3200 g e comprimento 49 cm, recebendo alta no 3º dia, sem outros dados neonatais. Por ocasião da adoção, estava desnutrido e ainda não apresentava sustento cefálico. Evoluiu com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor; atualmente apresenta linguagem bem desenvolvida, porém não foi alfabetizado; tem alterações de comportamento, com aderência a rotinas, crises de birra, auto e heteroagressividade; por volta dos oito anos de idade passou a apresentar compulsão alimentar que levou à obesidade, controlada após orientação alimentar. Ao exame físico, com 10 anos, observados obesidade centrípeta (grau I), hipoplasia malar, dismorfismo auricular leve, estrabismo convergente, filtro naso-labial curto, hipermobilidade articular (discreta), e canície (fios brancos esparsos difusamente distribuídos, observados desde os três anos de idade). Em avaliação posterior, aos 17 anos, constatados os mesmos dismorfismos, com puberdade normal. Na investigação complementar, constatada perda auditiva neurossensorial bilateral (leve a moderada); pela avaliação oftalmológica detectados alta miopia e astigmatismo, além do estrabismo, com fundoscopia sem alterações; inventário ósseo mostrando nódulos de Schmorl em coluna lombar, sem outras alterações. A análise molecular para pesquisa de síndrome de Prader-Willi/Angelman (por PCR) foi negativa. O teste de microarray foi realizado por meio da plataforma Agilent® com 180.000 sondas, com detecção de deleção com 2,4 Mb de extensão em 7p15.3p15.2, arr[hg18]7p15.3p15.2(23771527_26142303)×1, envolvendo 14 genes, sendo oito descritos no OMIM, com dois deles relacionados a doenças – CYCS e DFNA5 (Figura 68 e Tabela 27)108.

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Mb em 7p15.3p15.2) (https://decipher.sanger.ac.uk/). Barras em tons de azul representam ganhos; em tons de vermelho representam perdas de sequências.

Tabela 27. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P108. Localização Gene Nome OMIM cromossômica NPVF 7:25264189-25268105 Neuropeptide VF precursor 616984 C7orf31 7:25174316-25219975 Chromosome 7 open reading frame 31 606071 CYCS 7:25159710-25164980 Cytochrome c, somatic 123970 OSBPL3 7:24836158-25021253 Oxysterol binding protein like 3 606732 DFNA5, deafness associated tumor DFNA5 7:24737972-24809244 600994 suppressor MPP6 7:24612887-24733812 Membrane palmitoylated protein 6 606959 NPY 7:24323782-24331484 Neuropeptide Y 162640 STK31 7:23749786-23872132 Serine/threonine kinase 31 605790

O gene NPVF (MIM 616984) codifica uma proteína que atua como regulador negativo de síntese e secreção de gonadotrofina468. Em ratos, a proteína codificada por esse gene induz a secreção de prolactina. Segundo Lima et al.469, essa proteína pode desempenhar papeis secundários e moduladores no desenvolvimento puberal. O gene C7orf31 (MIM 606071), altamente expresso em testículos de mamíferos, codifica proteína cuja função está associada a centrossomos, conforme estudo em espermatozoides humanos470. O gene CYCS (MIM 123970) codifica uma proteína heme altamente conservada e com diversas funções. Uma delas seria atuar como componente central da cadeia de transporte de elétrons nas mitocôndrias, quando associada à membrana interna dessa organela, aceitando elétrons do citocromo b e os transferindo para o complexo da citocromo-oxidase. Essa proteína também está envolvida no início da apoptose, saindo da mitocôndria e se associando a fatores de ativação da apoptose no citosol471. Mutações nesse gene, como a c.145T>C, observada por De Rocco et al.472, estão associadas a trombocitopenia não sindrômica autossômica dominante (MIM 612004). O gene OSBPL3 (MIM 606732) codifica um membro da família OSBP de receptores lipídicos intracelulares, atuando na coordenação lipídica de diversos processos celulares473. O gene DFNA5 se expressa em altas taxas na cóclea durante o desenvolvimento fetal, porém a função da proteína produzida por ele ainda não está completamente elucidada. Foi identificado em 1998, a partir da deteccão de variante patogênica em uma família

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holandesa com deficiência auditiva não sindrômica474. Desde então, diversas publicações apontam variantes desse gene como causadoras dessa condição, cuja transmissão é autossômica dominante (MIM 608798)475,476. Além disso, por suas propriedades indutoras de apoptose, o DFNA5 é um gene supressor tumoral com papel importante nos principais tipos de tumores477, sendo, portanto, um marcador para os mesmos. A perda auditiva neurossensorial bilateral observada no paciente pode ser explicada pela haploinsuficiência desse gene. O gene MPP6 (MIM 606959) é membro da subfamília MAGUK (peripheral membrane-associated guanylate kinase), supressores tumorais e codificadores de proteínas que formam complexos contendo conjuntos de sinalização transmembranar, citoesquelética e citoplasmática478. Assim como o descrito para o gene NPVF, o gene NPY (MIM 162640) codifica uma proteína que atua sobre a secreção de gonadotrofina e no controle de alimentação. Serra- Juhé et al.479, investigando CNVs em 157 crianças hispânicas com obesidade precoce não sindrômica analisaram genes relacionados à obesidade, como NPY e GRPR. Segundo os autores, a superexpressão do NPY em neurônios noradrenérgicos provocaria ganho induzido por dieta e estresse na massa gorda, fato observado por Vahatalo et al.480 em estudos com ratos. O paciente P108 tem obesidade, entretanto não caberia a explicação dos autores acima, pois ele teria haploinsuficiênncia do gene em decorrência da microdeleção e não uma superexpressão. Finalizando, o gene STK31 (MIM 605790), altamente expresso no testículo e restrito às espermatogônias, participa da espermatogênese humana. Entretanto, estudos apontam para sua super expressão em câncer colorretal e de tecido epitelial481. Foram encontradas 15 descrições de alteração similar à do paciente P108 na base de dados DECIPHER. Desse grupo, apenas nove tem descrição de sinais clínicos. Comparando essas informações às características apresentadas pelo paciente, apenas perda auditiva e orelhas dismórficas também foram registradas e em indivíduos diferentes.

4.5.5. Paciente P151 Paciente do sexo feminino, nascida em 6/5/2000, encaminhada por atraso neuropsicomotor, hipotireoidismo central com suspeita de pan-hipopituitarismo, hemiparesia esquerda, malformação cerebral (esquizencefalia e polimicrogiria), e hemoglobinopatia C. É

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fruto da terceira gestação de casal não consanguíneo, pai com 37 anos e mãe com 30 anos por ocasião do nascimento; a primeira gestação foi tubária; tem uma irmã mais velha hígida, sem antecedentes familiais relevantes. Durante a gestação, houve metrorragia no 3o mês, hipertensão arterial a partir do 6o mês e recorrência de infecções de trato urinário; parto cesáreo, a termo, sem intercorrências; peso 2.640 g, comprimento 46,5 cm, perímetro cefálico 33,5 cm, Apgar 9/9, alta com três dias de vida, sem alterações neonatais. Evoluiu com atraso do desenvolvimento neuropsicomotor; teve recorrência de infecções (otites, amigdalites, conjuntivites e de trato urinário), obstipação intestinal e refluxo gastroesofágico; sem convulsões. Ao exame físico, observados peso e estatura abaixo de 3%, perímetro cefálico em 50%, frontal alto e abaulado, com implantação alta de cabelo, orelhas normoimplantadas, pequenas com hélices sobredobradas e lóbulos hipoplásicos, sobrancelhas esparsas, raiz nasal baixa, filtro nasolabial plano, comissuras bucais desviadas para baixo, mamilo direito invertido, prega palmar transversal única completa bilateral, nevus pigmentados em membros inferiores e hemiparesia esquerda. A RM de crânio evidenciou esquizencefalia de lábios fechados à direita, polimicrogiria frontoparietal e perisilviana bilateral; inventário ósseo com 13 pares de costelas e vértebra supra-numerária. As dosagens hormonais confirmaram o pan- hipopituitarismo, sendo tratada com hormônio de crescimento e levotiroxina. Em reavaliação aos 16 anos, apresentava baixa estatura e hipogonadismo com amenorreia primária. Solicitado microarray, sendo realizada técnica de SNP-array e marcadores não polimórficos, que identificou variante patogênica correspondente a perda de material do braço longo do cromossomo 22, arr[hg19] 22q11.21(18631364_21800471)×1, com 3,2 Mb de tamanho, contendo 1.196 marcadores do chip, envolvendo 95 genes, sendo 44 depositados no OMIM e 14 relacionados a doenças (Figura 69; Tabela 28).

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Tabela 28. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P151. Localização Gene Nome OMIM cromossômica USP18 22:18632666-18660164 Ubiquitin specific peptidase 18 607057 PRODH 22:18900294-18924066 Proline dehydrogenase oxidase 1 606810 SLC25A1 22:19163095-19166343 Solute carrier family 25 member 1 190315 CDC45 22:19466982-19508135 Cell division cycle 45 603465 Glycoprotein Ib platelet beta GP1BB 22:19710468-19712294 138720 subunit TBX1 22:19744226-19771116 T-box1 602054 COMT 22:19929130-19957498 Catechol-O-methyltransferase 116790 Transport and golgi organization 2 TANGO2 22:20004537-20053449 616830 homolog RTN4R 22:20228938-20270769 Reticulon 4 receptor 605566 Scavenger receptor class F member SCARF2 22:20778874-20792146 613619 2 PI4KA 22:21061979-21213705 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha 600286 SERPIND1 22:21128167-21142008 Serpin family D member 1 142360 SNAP29 22:21213271-21245506 Synaptosome associated protein 29 604202 Leucine zipper like transcription LZTR1 22:21333751-21353327 600574 regulator 1

A síndrome de deleção 22q11.2 é a síndrome de microdeleção mais comum em humanos, com frequência estimada entre 1:4000 a 6000 nascimentos. Estima-se que seja resultado, principalmente, de eventos de recombinação meiótica não homóloga, sendo agora reconhecida por ter uma apresentação heterogênea que inclui múltiplas anomalias congênitas adicionais e condições de início posterior, como anormalidades palatinas, endócrinas, gastrointestinais e renais, doenças autoimunes, atrasos cognitivos variáveis, fenótipos comportamentais e doenças psiquiátricas - ampliando a descrição original das síndromes de DiGeorge (MIM 188400) e Velocardiofacial (MIM 192430). Dessa forma, os diagnósticos clínicos anteriormente descritos eram na verdade de uma mesma condição, com uma etiologia comum482,483. A região 22q11.2 onde ocorre a deleção típica de ~3 Mb contém quatro blocos de sequências de DNA repetitivo de baixo número de cópias (LCRs), nomeados de LCRs A-D, sendo a LCR A a mais proximal. São extensas e guardam entre si uma maior homologia do que qualquer uma das outras LCRs no genoma associadas com síndromes de deleções cromossômicas humanas482.

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Como dito anteriormente, a deleção apresentada pela paciente P151 envolve 14 genes depositados no OMIM relacionados a fenótipos anômalos. As descrições dos genes mais correlacionados ao fenótipo seguem abaixo. O gene USP18 (MIM 607057), altamente expresso no fígado e timo, codifica uma enzima que cliva especificamente a ubiquitinina ISG15, atuando como um regulador negativo da via de sinalização do interferon tipo I. Estes são citocinas secretadas em resposta à infecção viral e regulam todos os aspectos da resposta imune484. Desta forma, o gene poderia estar relacionado com o fenótipo de imunodeficiência presente nos indivíduos com a síndrome de velocardiofacial. Além disso, Meuwissem et al.485, estudando indivíduos com síndrome pseudo-TORCH (Toxoplasmose, outro [sífilis, varicela, parvovírus e HIV], rubéola, citomegalovírus e herpes simples) observaram mutações de perda de função neste gene em cinco pacientes de duas famílias não relacionadas. O gene SLC25A1 (MIM 190315) codifica proteína necessária para a síntese endógena de ácidos graxos e colesterol. A haploinsuficiência deste gene levaria a uma baixa concentração deste nos indivíduos portadores da condição. Entretanto, Napoli et al.486 observaram níveis de colesterol plasmático e ácidos graxos elevados em indivíduos com a síndrome, sendo inferido que possa haver um desvio metabólico via mitocôndrias, processo menos eficiente, mas que proporcionaria uma compensação para a haploinsuficiência. Conforme Lin et al.487, os genes 22q11.2 e os seus alvos co-expressos desempenham provavelmente dois papéis distintos durante o desenvolvimento do cérebro, com uma via do ciclo celular mediada por CDC45 (MIM 603465) envolvida no desenvolvimento do cérebro embrionário e uma sub-rede modulada por PRODH (MIM 606810) que contribui para as funções do cérebro adolescente. Deste modo, na síndrome de del22q11, a haploinsuficiência do gene PRODH resultaria na impossibilidade de degradar prolinas, assim como a do gene COMT (MIM 116790), para dopaminas, afetando a função cerebral. Estudos mostram que o gene SCARF2 (MIM 613619) estaria relacionado com vias de sinalização celular ainda não completamente esclarecidas, provavelmente desempenhando um papel importante no desenvolvimento de diversos órgãos. Mutações neste gene estariam associadas à síndrome de Van Den Ende-Gupta, uma condição autossômica recessiva caracterizada por malformações craniofaciais e esqueléticas488. O gene TBX1 (MIM 602054), altamente expresso no cérebro, codifica um membro dos fatores de transcrição que compartilham um domínio comum de ligação ao DNA conhecido como T-box envolvidos na regulação dos processos de desenvolvimento. Esse gene é o principal candidato para síndrome 22q11.2, pois segundo os achados de Yagi et al.489,

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mutações neste gene podem ser responsáveis por cinco características fenotípicas principais da síndrome: dismorfismos faciais, defeitos cardíacos, hipoplasia tímica, insuficiência velofaríngea com fissura de palato e disfunção na glândula paratireóide com hipocalcemia. Além disso, conforme Ping et al.490 a haploinsuficiência ou mutação nesse gene é suficiente para causar uma diminuição da inibição do prepulso, uma anormalidade comportamental associada ao endofenotipo da esquizofrenia. Existem sintomas sobrepostos entre autismo e esquizofrenia, o que pode sugerir que essas duas doenças compartilham alguma base biológica comum em sua patogênese. Na base de dados DECIPHER são descritos mais de 300 casos com perda de CNVs similares. Desses, cerca de 200 possuem fenótipo descrito. As características presentes na paciente P151 e mais frequentemente observadas neste grupo foram baixa estatura, microcefalia, comissuras bucais desviadas para baixo, mamilos invertidos, infecções recorrentes, refluxo gastroesofágico e amenorreia primária, além da própria DI.

4.5.6. Paciente P152 Paciente do sexo feminino, nascida em 1983, terceira filha de casal jovem e não consanguíneo, sem recorrência familial de casos semelhantes; tia avó paterna com DI. Gestação sem intercorrências; movimentos fetais tardios; parto cesáreo, a termo, peso 2.450 g; comprimento 48 cm; perímetro cefálico 32 cm; alta com três dias de vida, sendo re-internada por icterícia tardia durante cinco dias, para fototerapia. Evoluiu com atraso neuropsicomotor leve; tem insuficiência discreta sem repercussão hemodinâmica, constipação intestinal e hérnia umbilical corrigida aos 3 meses. Ao exame físico, com cinco anos e 11 meses, foram observados face pequena com hipoplasia da porção média, retração lateral da região orbitária, protrusão de globo ocular, escleras levemente azuladas, micrognatia, narinas antevertidas, filtro curto, lábios volumosos, pescoço alargado, ombros estreitos e rodados, cúbitos valgos, hipoplasia discreta de 4º e 5º metacarpianos, pregas palmares anormais e hiperextensibilidade articular discreta, mais evidente em dedos e cotovelo. Em avaliação posterior, já na idade adulta, destacavam-se a voz roufenha, o desenvolvimento da linguagem e o comportamento sociável. O teste de microarray foi realizado por meio da tecnologia CytoSure Constitutional v3 4x180k (Agilent), que contem 180.000 sondas por lâmina de array. Pela análise do teste foi observada a deleção de 1,4 Mb em 7q11.23,

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arr[hg19]7q11.23(72726487_74144481)×1, que envolve 22 genes descritos no OMIM, sendo apenas 1 deles relacionados à morbidade (Figura 70 e Tabela 29108, em conformidade com a síndrome de Williams-Beuren (MIM 194050).

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Tabela 29. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P152. Localização Gene Nome OMIM cromossômica TRIM50 7:72726535-72742085 Tripartite motif-containing protein 50 612548 FKBP6 7:72742167-72772634 FK506 binding protein 6 604839 FZD9 7:72848109-72850450 Frizzled class receptor 9 601766 Bromodomain adjacent to zinc finger BAZ1B 7:72854728-72936608 605681 domain 1B BCL7B 7:72950686-72972332 BCL tumor suppressor 7B 605846 TBL2 7:72983262-72993121 Transducin beta like 2 605842 MLXIPL 7:73007524-73038873 MLX interacting protein like 605678 VPS37D 7:73082155-73086442 VPS37D, ESCRT-I subunit 610039 BUD23, rRNA methyltransferase and WBSCR22 7:73097355-73119491 615733 ribosome maturation factor STX1A 7:73113536-73134002 Syntaxin 1A 186590 CLDN3 7:73183328-73184600 Claudin 3 602910 CLDN4 7:73213872-73247014 Claudin 4 602909 WBSCR27 7:73248920-73256865 Methyltransferase like 27 612546 WBSCR28 7:73275489-73280223 Transmembrane protein 270 612547 ELN 7:73442119-73484237 Elastin 130160 LIMK1 7:73497263-73536855 LIM domain kinase 1 601329 Eukaryotic translation initiation factor EIF4H 7:73588575-73611431 603431 4H Linker for activation of T-cells family LAT2 7:73613982-73644161 605719 member 2 RFC2 7:73645829-73668774 Replication factor C subunit 2 600404 CAP-Gly domain containing linker CLIP2 7:73703805-73820273 603432 protein GTF2IRD1 7:73868120-74016931 GTF2I repeat domain containing 1 604318 GTF2I 7:74071994-74175026 General transcription factor III 601679

A síndrome de Williams-Beuren (MIM 194050) é um distúrbio do desenvolvimento causado pela haploinsuficiência de genes situados em 7q11.23. É considerada uma síndrome de microdeleção de genes contíguos, que pode variar desde 1,5 Mb na maior parte dos casos – envolvendo de 26 a 28 genes em sua região crítica, até 1,8 Mb em cerca de 5% dos indivíduos afetados491. Desde sua primeira descrição em indivíduos com alterações cardiovasculares e deficiência intelectual, muitos foram os casos descritos, aumentando o espectro fenotípico da doença 492-494. Entre os principais sinais característicos da condição estão DI em graus variados; atraso de crescimento, hipotonia, hiperextensibilidade articular, doenças cardiovasculares – particularmente a estenose supravalvar e arteriopatia –, dismorfismos faciais, como fronte proeminente, protrusão globo ocular, filtro longo e lóbulos da orelhas grandes, hiperacusia, distúrbios endócrinos e habilidades cognitivas irregulares, como hiper sociabilidade, empatia

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e amabilidade se contrapondo a dificuldade na visão espacial, ansiedade generalizada, fobias específicas495. Conforme mencionado, na paciente P152, a alteração em 7q11.23 possui 1,4 Mb e envolve 22 genes depositados no OMIM, todos descritos abaixo. Segundo Nishi et al.496, o gene TRIM50 (MIM 612548) é expresso em células parietais gástricas e sua expressão está predominantemente localizada nas membranas tubulovesicular e canalicular. promovendo a formação de canalículos e microvillis sofisticados durante a secreção ácida em células parietais. A proteína codificada pelo gene FKBP6 (MIM 604839) está associada à imunorregulação e processos celulares básicos envolvendo dobramento e tráfico de proteínas. Alterações neste gene, que se expressa em testículos, podem causar infertilidade masculina humanos497, mas também observada em animais498. O gene FZD9 (MIM 601766), que também se expressa nos testículos, além de cérebro, olhos, músculos esqueléticos e em rins, encontra-se associado à regulação da divisão celular e morte celular programada em diferentes tipos celulares. Zhang et al.499, investigando o envolvimento deste gene na leucemia mieloide aguda, sugeriram-no como gene candidato a supressor tumoral. O gene BAZ1B (MIM 605681) codifica um membro da família das proteínas de bromodomínio, envolvidas na regulação da transcrição. Ele está relacionado à diferenciação neuronal e quando em haploinsuficiência, como na síndrome de Williams-Beuren, contribui para o fenótipo neurológico observado na condição500. O gene BCL7B (MIM 605846) codifica um membro da família BCL7 – que inclui também as proteínas BCL7A e BCL7C – cuja deficiência, como na SWB, implica o risco de cânceres hematológicos, tais como Linfoma de Burkitt e Leucemia linfoblástica aguda501. O gene TBL2 (MIM 605842) codifica um membro da família de proteínas beta- transducina, envolvidas em funções reguladoras, que nesse caso específico, está envolvida em via de sinalização intracelular, importante para a sobrevivência da célula em condições de estresse ou falta de nutrientes502. O gene MLXIPL (MIM 605678) codifica uma proteína que desempenha papel fundamental na regulação do metabolismo da glicose e lipogênese em tecidos e células cancerígenas. Segundo Cherniske et al.503, a haploinsuficiência desse gene pode estar envolvida na baixa tolerância à glicose e a diabetes mellitus em indivíduos com a síndrome de Williams-Beuren. O gene VPS37D (MIM 610039) codifica uma proteína vacuolar homóloga a proteínas endossomais de transporte, que desempenha, dentre outras, a função de deformação

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da membrana endossomal504. O gene WBSCR22 (MIM 615733), que codifica uma proteína com sinal de localização nuclear típica de metiltransferases, encontra-se altamente expresso no coração, músculos esqueléticos, rim e testículo505. Jangani et al.506 concluíram que esse gene regula a estrutura da cromatina e afeta o recrutamento e a função dos receptores de glicocorticoides, sugerindo uma contribuição para a perda de sensibilidade aos glicocorticóides em inflamações. O gene STX1A (MIM 186590), altamente expresso no cérebro, codifica um membro da superfamília da sintaxina, proteínas específicas do sistema nervoso implicadas no encaixe de vesículas sinápticas com a membrana plasmática pré-sináptica. Tropeano et al.507 examinando a associação de SNPs nesse gene com formas de enxaqueca, reforçam a hipótese do mesmo determinar susceptibilidade a essa condição. Os genes CLDN3 (MIM 602910) e CLDN4 (MIM 602909) codificam proteínas chamadas claudinas, importantes para a formação de junções de células epiteliais, que regulam o movimento de solutos e íons através do espaço existente entre as células508. O gene WBSCR27 (MIM 612546), também conhecido por METLL27, codifica proteína pertencente à família de ubiE/COQ5 metiltransferase. Já o gene WBSCR28 (MIM 612547), altamente expresso em testículos, pode estar envolvido em câncer de próstata, segundo Prescott et al.509. Maicher et al.510, comparando níveis de expressão de diversos genes incluindo o WBSCR28 em indivíduos com e sem azoospermia obstrutiva idiopática, observaram que há uma regulação positiva desse gene no primeiro grupo, sugerindo-o como biomarcador em potencial para essa condição. O gene ELN (MIM 130160), que codifica as fibras elásticas da matriz extracelular em todo o corpo, é o mais crítico e extensivamente explorado na origem da síndrome de Williams-Beuren. A hemizigosidade do gene ELN nesta condição contribui para o desenvolvimento de anormalidades cardiovasculares e do tecido conjuntivo, como a estenose aórtica supravalvar, hérnias (como observada na paciente P152), divertículo da bexiga ou do intestino e cutis laxa511. Wan et al.512 postularam que a hemizigosidade do gene ELN aumenta a susceptibilidade para o desenvolvimento de enfisema pulmonar em indivíduos com a síndrome de Williams-Beuren, uma vez que a elastina é o componente chave das fibras elásticas e progressivamente destruída nesta doença pulmonar obstrutiva crônica. Recentemente, Wojcik et al.513 descreveram o segundo caso de enfisema pulmonar em portadores da síndrome de Williams-Beuren, fornecendo evidências adicionais de que esta

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doença deve ser considerada em pacientes com a síndrome e sintomas respiratórios, pois pode não ser reconhecida nesses pacientes. O gene LIMK1 (MIM 601329) codifica uma proteína reguladora da polimerização da actina via fosforilação. Essa proteína é expressa de forma ubíqua durante o desenvolvimento e atua em muitos processos celulares associados à estrutura do citoesqueleto. Ela também estimula o crescimento do axônio e pode ter participação no desenvolvimento cerebral. A haploinsuficiência desse gene está relacionada à cognição construtiva visuoespacial, comprometida na síndrome de Williams-Beuren514-516. O gene EIF4H (MIM 603431) tem expressão ubíqua e codifica um dos fatores de iniciação da tradução, estimulando o início da síntese proteica517. Sua superexpressão se relaciona ao carcinoma de pulmão sendo, segundo Vaysse et al.518, um alvo em potencial para terapia desse tipo de câncer, fato corroborado por Bai et al.519. O gene LAT2 (MIM 605719) codifica uma proteína adaptadora, expressa em linfócitos B e células mieloides, que funciona como regulador da ativação de mastócitos. Thomé et al.520 estudando o papel dessa proteína em leucemias, concluíram que pode ser usada como alvo para o desenvolvimento de medicamentos antineoplásicos, tendo em vista que o decréscimo das suas concentrações diminuiu a proliferação celular e aumentou a sensibilidade ao alquifosfolipídeo, um indutor de apoptose em células leucêmicas. O gene RFC2 (MIM 600404) que codifica proteína de reparo de DNA, juntamente com outros genes (CDK7, DDB2, RNH1 e FAH), foi testado e validado, a partir de seus níveis de expressão, sendo classificado entre os genes que podem auxiliar no estabelecimento do prognóstico para pacientes com glioblastoma multiforme, o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos521. A proteína codificada pelo gene CLIP2 (MIM 603432) pertence à família das proteínas ligantes citoplasmáticas, que foram propostas para mediar a interação entre organelas membranosas específicas e microtúbulos. Altamente expresso no cérebro, esse gene tem sido relacionado às alterações cognitivas e motoras observadas em indivíduos com a síndrome de Williams-Beuren522. O gene GTF2IRD1 (MIM 604318) codifica uma proteína que atua como fator de transcrição, estando envolvido no desenvolvimento cognitivo e craniofacial523,524. Howard et al.525, estudando alterações nesse gene em modelos animais, concluiram que a insuficiência da proteína GTF2IRD1 contribui para as anormalidades do desenvolvimento facial, e das

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funções motoras, e ainda para os distúrbios comportamentais que acompanham a síndrome de Williams-Beuren. Por fim, o gene GTF2I (MIM 601679) codifica um fator de transcrição que se liga a elementos promotores de diversos genes, sendo considerado um candidato em potencial entre as causas de ansiedade, característica também comum da síndrome de Williams- Beuren526,527. Segundo a base de dados DECIPHER, há cerca de 90 descrições de alteração envolvendo a região alterada na paciente P152. Desse grupo, há descrição de sinais clínicos para 50 indivíduos. Comparando essas informações com as características apresentadas pela paciente, micrognatia, lábios volumosos e hérnia umbilical foram os achados mais comuns, além da própria DI.

4.5.7. Paciente P158 Paciente do sexo masculino, encaminhado aos 23 anos devido a deficit intelectual de causa não esclarecida, filho de casal jovem e não consanguíneo; o único irmão teve dislexia leve, sem comprometimento cognitivo ou outras alterações. Sem antecedentes familiais e gestacionais relevantes. Parto cesáreo, com peso 2.780 g; comprimento 45 cm; perímetro cefálico 33,5 cm, Apgar 6/9. Evoluiu com atraso do desenvolvimento, mais significativo de fala, e crises convulsivas tônico-clônicas. Apresenta prolapso mitral, refluxo valvar mitral e tricúspide mínimo. Ao exame físico, observados face alongada, frontal algo abaulado, sobrancelhas esparsas e retificadas, olhos de localização mais profunda, micrognatia discreta, comissuras bucais desviadas para baixo, filtro apagado, palato alto, orelhas de implantação baixa e inclinada, pescoço algo alargado, polegares levemente aduzidos, eversão peno-escrotal parcial, escoliose e tremor de extremidades. Na investigação complementar, radiografia de tórax e EEG sem alterações; RM- encefálica mostrou aumento do diâmetro ântero-posterior e redução do diâmetro biparietal do crânio, proeminência dos sulcos corticais, cisternas da base e fissuras com aspecto não habitual para a faixa etária do paciente, sinais de redução discreta do hipocampo esquerdo com proeminência dos sulcos adjacentes e sinais de má rotação do mesmo. O teste de microarray foi realizado por meio da plataforma CS3000 da Affymetrix e chip CytoScan® 750K Cytogenetics Solution, que contem 750.000

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oligonucleotídeos distribuídos por todo o genoma humano, sendo composto por 200.000 SNP e 550.000 marcadores não polimórficos. Pela análise do teste foram observadas duplicações em 6p11.2 e 10q26.3. A duplicação de 421 kb em 6p11.2 (6:57349434_57770309) contem um gene (PRIM2). Já a duplicação em 10q26.3, com 143 kb (10:135252931_135396275) inclui três genes (CYP2E1, SYCE1 e SPRN) (Figuras 71 e 72; Tabela 30).

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Tabela 30. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P158. Localização Gene Nome OMIM cromossômica

PRIM2 7:57179603-57513375 Primase (DNA) subunit 2 176636 CYP2E1 10:135333910-135374724 Cytochrome P450, subfamily IIE 124040 Synaptonemal complex central element SYCE1 10:135367404-135382876 611486 protein I SPRN 10:135234170-135382916 Shadow of prion protein 610447

O gene PRIM2 (MIM 176636) codifica uma proteína envolvida no metabolismo de purinas e pirimidinas e em processos como replicação e transcrição gênica, sendo crucial para o desenvolvimento e crescimento normais528,529. Sofre processo de imprinting - estando ativo no alelo materno - e se expressa em diversos tecidos, como encefálico, muscular, hepático, sanguíneo e placentário530,531.

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O gene CYP2E1 (MIM 124040) codifica uma enzima envolvida no metabolismo de drogas, hormônios e toxinas, com forte expressão no fígado e mais baixa em tecidos extra- hepáticos532. Polimorfismos nesse gene têm sido relacionados a neoplasias induzidas por agentes químicos e hepatopatia alcoólica, principalmente cirrose, sendo, portanto, importantes na determinação do risco relativo de hepatotoxicidade mediada por álcool, câncer ou suscetibilidade à toxicidade medicamentosa533. Por essas características, ele vem sendo estudado no contexto da farmacogenômica, sendo recomendada a detecção de CNVs previamente à administração de medicamentos534,535. O gene SYCE1 (MIM 611486) codifica um dos membros do complexo sinaptonêmico, ligando os cromossomos homólogos durante a prófase I da meiose, atuando no processo recombinação genética536. Níveis elevados de expressão desse gene são encontrados em próstata, testículos, ovários, placenta e cérebro. Variantes alélicas já foram descritas em indivíduos com insuficiência ovariana primária e azoospermia não obstrutiva537- 539. Por fim, o gene SPRN (MIM 610447) encontra-se expresso em diversos tecidos, com predominância no cérebro540. Codifica uma proteína extracelular e GPI ancorada que atua na proteção celular contra a toxicidade induzida pelo estresse541. Variantes neste desse gene têm sido relacionadas à suscetibilidade para a doença de Creutzfeldt Jakob, uma variante da doença priônica542. Segundo busca à base de dados DECIPHER, há registro de duplicação concomitante em 10q26.3 e 6p11.2, com características similares às observadas no paciente P158, incluindo atraso de desenvolvimento/DI e de fala, convulsões, implantação baixa de orelhas, palato alto e escoliose, entre outros.

4.5.8. Paciente P284 Paciente do sexo masculino, nascido em 19/02/2004,encaminhado por atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e distúrbio de comportamento com traços autistas. É o segundo filho de casal não consanguíneo; irmão mais velho hígido; referidos tio-avô materno com distúrbio psiquiátrico, primo em 2º grau (lado materno) com epilepsia e primo em 3º grau (lado materno) com hidrocefalia, falecido no período neonatal, sem outros antecedentes familiais relevantes. Sua mãe é hipertensa e fez tratamento com medicação não especificada durante a gestação; desenvolveu edema e pré-eclâmpsia no 7o mês, sendo internada por 21

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dias até a indicação de cesárea no 8o mês. Nasceu em condições satisfatórias, com peso 3.500 g e comprimento 49 cm; sem intercorrências neonatais. Evoluiu com atraso do desenvolvimento; andou aos 24 meses e chegou a pronunciar algumas palavras aos 12 meses, porém parou logo após, reiniciando aos quatro anos; sem controle esfincteriano; nunca teve convulsões, porém usa carbamapezina, segundo a mãe, pelo comportamento agitado. Ao exame físico, com quatro anos, foram observados peso de 29,2 kg (P>97); estatura de 113,5 cm (P75-P97); perímetro cefálico 53 cm (P50-P98); obesidade, orelhas proeminentes, filtro longo e lábio superior fino, mamilos invertidos, hiperextensibilidade articular em dedos e três manchas café com leite em flanco direito. Foram realizados BERA, TC de crânio, eletroencefalograma, ecocardiograma, ultrassonografia de abdômen total, cromatografia de aminoácidos na urina e avaliação oftalmológica, todos sem alterações relevantes. Em investigação complementar, realizada análise dos genes FMR1 e SNRPN, com resultados normais, sendo afastadas as síndromes do X-frágil e de Prader Willi/Angelman, no caso das duas últimas, considerando ocorrência de deleção ou dissomia uniparental. O teste de microarray foi feito pela plataforma CytoSure Constitutional v3 4x180k (Agilent), que contem 180.000 sondas. Pela análise do teste foi observada duplicação em 12p13.2p13.1, arr[hg19] 12p13.2p13.1(12203966_12868098)×3, que possui 664 kb e inclui oito genes codificantes (Figura 70; Tabela 31108).

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(664 kb em 12p13.2p13.1) (https://decipher.sanger.ac.uk/). Barras em tons de azul representam ganhos; em tons de vermelho representam perdas de sequências.

Tabela 31. Nome, localização cromossômica e MIM dos genes envolvidos na alteração observada no caso P284. Localização Gene Nome OMIM cromossômica CDKN1B 12:12867992-12875305 Cyclin dependent kinase inhibitor 1B 600778 GPR19 12:12813825-12849141 G protein-coupled receptor 19 602927 cAMP responsive element-binding CREBL2 12:12764761-12798042 603476 protein-like 2 DUSP16 12:12628829-12715317 Dual specificity phosphatase 16 607175 LOH12CR1 ou 12:12510013-12619840 BLOC-1 related complex subunit 5 616598 BORCS5 Low Density Lipoprotein receptor- LRP6 12:12268959-12419946 603507 related protein 6 BCL2L14 12:12202778-12364018 BCL2 like 14 606126

O gene CDKN1B (MIM 600778) codifica um importante regulador de progressão de ciclo celular. Seu produto é um inibidor de quinase dependente de ciclina que bloqueia o ciclo celular na fase G0/G1, após sinais de diferenciação celular, regulando também a mobilidade celular e a apoptose. Alterações nesse gene foram observadas em amostras de tumores neuroendócrinos do intestino543-544. Além disso, Grey et al.545 descreveram um paciente do sexo masculino com deleção materna e atraso do desenvolvimento, sugerindo-o como gene candidato para esse fenótipo. O gene GPR19 (MIM 602927) codifica uma proteína incluída no grupo dos receptores acoplados à proteína G (GPCR), cuja função ainda não foi elucidada totalmente546. Kastner et al.547 observaram super-expressão desse gene em amostras de carcinoma pulmonar de pequenas células, embora suas funções biológicas não tenham sido completamente elucidadas. O gene CREBL2 (MIM 603476) codifica uma proteína reguladora de atividade transcricional CREB1, envolvida na diferenciação de células adiposas. Outra função atribuída a essa proteína é a regulação do ciclo celular. A observação de deleções envolvendo esse gene em células cancerosas também sugere que a proteína seja um supressor tumoral548.

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O gene DUSP16 (MIM 607175) codifica uma proteína pertencente a uma classe de DUSPs, designadas MKPs, que atuam em cascata, mediando vários processos fisiológicos, como proliferação, diferenciação celular e apoptose549. Já o gene LOH12CR1 (MIM 616598) codifica uma proteína do complexo BLOC1 (ou BORC), associada à regulação do posicionamento do lisossoma na célula550. O gene LRP6 (MIM 603507) por sua vez codifica um membro da família dos receptores de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR), que são proteínas da superfície celular envolvidas na endocitose mediada pelo receptor de ligantes específicos. Mutações nesse gene foram relacionadas a atraso no processo de ossificação ao nascimento e massa óssea baixa em adultos551, doença arterial coronária precoce e síndrome metabólica552,553, além de agenesia dentária seletiva554. O gene BCL2L14 (MIM 606126) codifica um membro da família das proteínas BCL2, que atuam como reguladores anti ou proapoptose, em uma variedade ampla de atividades celulares. A expressão aumentada desse gene tem sido relacionada à indução de apoptose celular555. Segundo a base de dados DECIPHER, há pelo menos 20 relatos de duplicação em 12p13.2p13.1, com descrição de algumas características observadas no presente caso, como autismo (ID 274364), atraso do desenvolvimento (IDs 295002, 296420, 270414, 267792, 249683), deficiência intelectual (IDs 284998, 287287), ausência de fala (ID 295002) e obesidade (ID 287287), entre outros. Entretanto, exceto pelo gene CDKN1B, cuja morbidade já foi observada, ainda não foi estabelecida uma correlação genótipo-fenótipo considerando os demais genes envolvidos na duplicação.

4.6. Outros resultados Como os indivíduos que compõem a presente casuística e não tiveram resultados alterados têm a oportunidade de seguirem em investigação no mesmo grupo de pesquisa – por meio do projeto de mestrado da aluna Pamela Pontes Henrique – assim como de grupos colaboradores no DGM-FCM/UNICAMP, sete deles deram continuidade à investigação diagnóstica por diferentes exames, pelos quais foi possível identificar alterações genômicas, que são apresentadas na Tabela 32, onde constam o tipo de alteração encontrada (perda ou ganho em cada região), o tamanho das mesmas, a localização específica de acordo com o braço cromossômico (p ou q), banda e sub-banda e o método investigativo.

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Tabela 32. Alterações presentes nos seis indivíduos da casuística, com resultado por MLPA subtelomérico dentro da normalidade e que foram submetidos a outros protocolos investigativos. Paciente Região cromossômica Evento Tamanho Citobanda Método P131 Chr X. gene HUWE ex61 ganho - p11 MLPA P242 Chr12:131963230_132479079 ganho 500 kb q24.33 aGH P1391 Chr X. Gene SLC6A8 éxon 9 ganho ~790 kb q28 MLPA Gene GDI1 éxon 1 e 7 P1632 Chr22:19179473_21024663 perda ~2 Mb q11.2 MLPA P1682 Chr16:32860753_33815401 ganho 955 kb p11.2 aGH P1802 Chr2:230779356_235312634 perda 4,53 Mb q36.3-q37.1 aGH 1. Henrique, PP (2015) 2. Grupo de pesquisa da Profª Vera Lúcia Gil da Silva Lopes (comunicação pessoal)

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5. CONCLUSÕES

Considerando os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:

 Conforme a caracterização clínica dos indivíduos, houve predomínio do sexo masculino; recorrência familial de DI em mais de 60% dos casos; idade dos genitores por ocasião do nascimento similar a da população geral; taxa média de casamentos consanguíneos e coeficiente de endocruzamento superiores aos valores de referência; registro de eventos gestacionais e perinatais relevantes em quase 50% dos casos, sugerindo eventual contribuição de fatores ambientais; e crises convulsivas com frequência superior a estimada na população geral (1%).  A triagem por MLPA para pesquisas de alterações subteloméricas relacionadas à DI identificou alterações em 37 casos, 22 delas confirmadas, com elucidação de 7,3% dos casos, percentual similar ao registrado na literatura.  A ampliação da análise a outras regiões do genoma, pelas técnicas de microarray e sequenciamento do exoma, permitiu identificar variantes genômicas em todos os casos concluídos, as quais explicam total ou parcialmente as manifestações clínicas observadas, conforme a literatura e bancos de dados públicos para registro de variações genômicas humanas e fenótipos associados, confirmando a relevância desses dois métodos para a identificação e a compreensão dos mecanismos patogênicos da DI e justificando sua inclusão nos algoritmos de investigação dessa condição.  Considerando as 40 alterações identificadas pelas três técnicas utilizadas, em 36 dos 300 casos (12%) foi estabelecida correlação genótipo-fenótipo, corroborando o diagnóstico laboratorial.  Conforme verificado na literatura, a aplicação desses métodos, incluídos nos algoritmos atuais de investigação diagnóstica da DI, se mostram efetivos e complementares, ampliando consideravelmente as perspectivas de determinação do diagnóstico etiológico dessa condição, com destaque para o microarray como método de 1ª linha na investigação.

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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A DI é considerada problema de saúde pública, por sua prevalência e consequências negativas para a produtividade e relações sociais, além do aumento na demanda por serviços médicos e educacionais especializados. No Brasil ao menos 1,4% da população possui deficiência intelectual, provavelmente correspondendo a subestimativas, tendo em vista os índices propostos para países em desenvolvimento. Mesmo para a parcela que consegue encaminhamento para serviços de genética clínica, o diagnóstico etiológico permanece um desafio, tendo em vista o percentual considerável de casos que permanece de origem indeterminada. Entretanto, a aplicação dos algoritmos atuais de investigação diagnóstica em países em desenvolvimento como o Brasil ainda é limitado e depende de apoio logístico para estruturação dos centros e serviços que atuam na área, além de suporte financeiro, os quais, na atual conjuntura nacional e ainda frente a outras tantas demandas na área de Saúde, acabam não acontecendo. Tal situação aumenta as proporções já desafiadoras desse processo e estimulam a busca por alternativas viáveis, como ocorreu no desenvolvimento desse projeto, permitindo que um contigente significativo de indivíduos acompanhados no Serviço de Genética Clínica da FCM-Unicamp fosse investigado e que parte deles tivesse o diagnóstico etiológico da DI estabelecido.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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204

8. ANEXOS

8.1. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos

205

206

8.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas (FCM) Departamento de Genética Médica

Título do projeto: AMPLIAÇÃO DA INVESTIGAÇÃO GENÉTICA EM INDIVÍDUOS COM DEFICIÊNCIA INTELECTUAL DE ORIGEM INDETERMINADA: ASSOCIAÇÃO DE ESTRATÉGIAS CITOGENÉTICAS E MOLECULARES.

Responsáveis: Carolina Rodrigues Lincoln de Carvalho, Pamela Pontes Henrique, Antonia Paula Marques de Faria e Maricilda P. de Mello.

Eu entendo que eu fui ou meu/minha filho(a) foi convidado(a) a participar de projeto de pesquisa envolvendo pessoas com deficiência intelectual (DI) ou atraso do desenvolvimento neuromotor de causa não esclarecida. O objetivo geral do estudo é investigar alterações nos cromossomos pelas técnicas de MLPA e aGH. Concordando em participar, responderei perguntas sobre nosso histórico familial e médico. Será coletada uma amostra de sangue de meu/minha filho(a) e, quando necessário, minha e do(a) pai(mãe). A amostra terá de 10 a 15 ml (ou uma colher de sopa); a coleta será feita por profissional habilitado, em geral no braço; os riscos são mínimos, como dor e manchas roxas (equimoses) no local. Conforme os resultados, será feita outra coleta para confirmação. Fui informado(a) que a única vantagem dessa participação será conhecer uma possível alteração nos cromossomos do meu filho(a) ou mesmo nos meus, a qual poderá se relacionar ao problema que ele(a) apresenta. Sendo encontrada alguma alteração, logo serei comunicado(a) e orientado(a) sobre as consequências da mesma. A esse respeito, fui informado(a) que na rotina do atendimento do Serviço de Genética Clínica do HC-UNICAMP é realizado o aconselhamento genético, por médicos especialistas em Genética Médica e que, caso tenha interesse, serão agendadas consultas específicas para complementar esse procedimento, que inclui explicações detalhadas sobre a condição genética que meu filho(a) apresenta, as alternativas para melhorar seu desenvolvimento e qualidade de vida, prevenir eventuais complicações relacionadas a seu problema e ainda as chances de recorrência em outros familiares. Em caso de dúvida, a qualquer momento poderei contatar a FCM-UNICAMP, na pessoa da Dra. Antonia Paula Marques de Faria (fones: 19-3521.8908 ou 3521.8907). Estou ciente que a participação é voluntária e não haverá nenhuma despesa, pois a coleta será feita durante consultas regulares no HC-UNICAMP. Posso recusar ou retirar meu consentimento e interromper a participação do meu/minha filho(a) a qualquer momento (incluindo a retirada da amostra de sangue), sem interromper os cuidados médicos que ela(a) recebe ou receberá nesse hospital. Entendo que toda informação médica, assim como os resultados deste estudo serão sigilosos; se resultados, informações e fotografias forem utilizados em publicação científica, não serão identificados de qualquer forma. Confirmo que a Dra. Antonia P. Marques de Faria ou o(a) médico(a) responsável Dr.(a).______explicou objetivos e procedimentos, além de riscos ou desconfortos advindos deste projeto. Li, ou me foi explicado, e compreendi este formulário e concordo com a participação de meu/minha filho(a). Assinarei duas vias deste termo, uma ficará comigo e outra com os pesquisadores responsáveis. Em caso de dúvidas ou reclamações, fui informado que poderei contatar o Comitê de Ética da FCM-UNICAMP, Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 – CEP 13083-887 Campinas, SP; fones:19-3521.8936 ou 3521-7187, e-mail: [email protected].

AUTORIZAÇÃO PARA ARMAZENAMENTO DA AMOSTRA ( ) Concordo em participar desta pesquisa, porém NÃO AUTORIZO o armazenamento do material biológico, que deverá ser descartado ao final da mesma. ( ) Concordo em participar desta pesquisa e AUTORIZO o armazenamento do material biológico, mediante o meu consentimento a cada nova pesquisa, que deverá ser aprovada pelo CEP institucional e, se for o caso, pela CONEP. ( ) Concordo em participar desta pesquisa e AUTORIZO o armazenamento do meu material biológico, dispensando o meu consentimento a cada nova pesquisa, desde que a mesma seja aprovada pelo CEP institucional e, se for o caso, pela CONEP.

______Nome do sujeito da pesquisa RG

______Nome do responsável legal RG

______Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal Local e Data

RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR Eu expliquei o objetivo deste estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos que poderão advir da pesquisa e me comprometo a fornecer uma cópia deste formulário de consentimento ao responsável pelo(a) participante.

______Nome e assinatura do pesquisador RG Local e Data

207

8.3. Protocolo padrão - MLPA (Lincoln-de-Carvalho, 2009)

Data: __/__/____ Operador(es): ______

Kit lote nº ______

Tabela 1.: Pacientes estudados Diluição 50ng/µL K D T O Nº Paciente (nome) Kit Conc. DNA TE Vol. Final RES. MLPA DNA (µL)

1. Desnaturação e hibridização das sondas SALSA MLPA (DIA 1)

a. Diluir as amostras de DNA (20 – 500 ng DNA) em TE para a concentração desejada. ( ) b. Acrescentar 2 µL de TE em tubos novos. ( ) c. Colocar 3 µL de DNA (na concentração desejada) em cada tubo. ( ) d. Acertar no termociclador o Programa MLPA 1. ( ) e. Desnaturar as amostras a 98ºC por 5 min; resfriar para 25ºC, antes de abrir o termociclador (opcional retirar as amostras da máquina). ( ) f. Preparar a solução de Anelamento. ( )

Solução de Anelamento Reagente Para 1 reação Para 8 reações Probe Mix (tampa preta) 1,5 µL 12 µL Salsa Buffer (tampa amarela) 1,5 µL 12 µL Total 3,0 µL 24 µL

g. Adicionar 3,0 µL da solução de Anelamento em cada tubo. ( ) h. Misturar com cuidado. Incubar a 95ºC por 1 min e em seguida, a 60ºC overnight (entre 16 e 20hs). ( )

2. Reação de ligação (DIA 2)

i. Reduzir a temperatura do termociclador para 54ºC. ( ) j. Preparar o Mix ligase-65. ( )

Mix ligase-65 (pode ser preparado com até uma hora de antecedência, estocando-o em gelo)

208

Reagentes Para 1 amostra Para __ amostras Água deionizada Ligase-65 buffer A (tampa transparente) Ligase-65 buffer B (tampa branca) Ligase-65 (tampa verde) Total k. Adicionar 32,0 µL do Mix ligase-65 em cada tubo, misturando-o bem. ( ) l. Incubar a 54ºC por 15 min e, em seguida, aquecer a 98ºC por 5 min e 20ºC até que seja retirado da máquina. ( )

3. Reação de PCR (DIA 2)

Obs.: Protocolo novo, a partir de Jun/2011 (atenção para a marcação no tubo de Mix Primer PCR MLPA). Obs.: Pode ser feito em temperatura ambiente. m. Passe o SALSA PCR primer Mix no vortex antes de usar. Acondicione a Polimerase por 10s na mão para diminuir a viscosidade. ( ) n. Preparar o Mix SALSA. ( )

Mix SALSA Polimerase Reagentes Para 1 amostra Para _ amostras Água deionizada 7,5 µL SALSA PCR primer mix (tampa marrom) 2,0 µL SALSA Polimerase (tampa laranja) 0,5 µL Total 10,0 µL o. Em temperatura ambiente, adicionar e homogeneizar gentilmente 10,0 µL do Mix SALSA em cada tubo. ( ) p. Acertar no termociclador o Programa MLPA 2. ( )

Programa de PCR: 95ºC por 30 seg 60ºC por 30 seg 72ºC por 1 min (35 ciclos) 72ºC 20 min 15ºC “for ever” ∞ q. Retirar os tubos do termociclador. r. Preparar a solução de corrida (para separação dos fragmentos de amplificação por eletroforese), segundo protocolo específico do aparelho de eletroforese capilar. s. Estocar as reações em refrigerador (para armazenamento em curto período) ou freezer (longos períodos). t. Realizar a análise das corridas, utilizando o programa compatível com o sequenciador utilizado, seguido do Coffalyser ou planilha específica para cada kit.

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Anexo 8.4. Artigo

SUBTELOMERIC 6P DELETION: CASE REPORT AND REVIEW EMPHASIZING CEREBRAL, OPHTHALMIC AND SKELETAL FEATURES.

Lincoln-de-Carvalho1,2, Carolina; Moreno1, Carolina; Sgardioli1, Ilária Cristina; Gil-da-Silva- Lopes1, Vera; de Mello2, Maricilda; Marques-de-Faria1, Antonia.

1Departamento de Genética Médica, Faculdade de Ciências Médicas (FCM), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil. 2 Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.

RESUMO Relatamos o caso de um paciente com deleção 6p24-6pter de novo apresentando atraso do desenvolvimento, deficiência intelectual, distúrbio de linguagem, dismorfismos craniofaciais e anomalias oculares, que estão entre as principais manifestações da síndrome da deleção 6p. Esses aspectos são destacados, em particular os relacionados a caraterísticas neurológicas, oftalmológicas e esqueléticas, visando contribuir para o delineamento do espectro fenotípico dessa condição. Palavras-chave: deleção 6p, MLPA, FISH, Deficiência Intelectual

ABSTRACT We report one patient bearing a de novo 6p24-6pter deletion associated with developmental delay/intellectual disability, language impairment, craniofacial dysmorphisms, structural eye abnormalities, which are among the main clinical features of the subtelomeric 6p deletion syndrome. Some clinical aspects are emphasized; particularly those related to cerebral, ophthalmic and skeletal features, in order to better characterize the phenotypic spectrum of this condition. KEY-WORDS: 6p deletion, MLPA, FISH, Intellectual Disability

INTRODUCTION The 6p subtelomeric deletion currently corresponds to a recognizable phenotype1-5 due to advances in molecular methods, such as fluorescent in situ hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and array genomic Hybridization (aGH).

210

Here we report a Brazilian male patient with a de novo terminal 6p deletion detected by MLPA subtelomeric screening using FISH as a confirmation method. Main clinical features identified in the patient are presented here in order to contribute to the understanding of phenotypic spectrum of this condition.

CLINICAL REPORT This male patient was the only child of healthy and unrelated parents, both were 35 years old by the time of his birth; the family history was unremarkable. During pregnancy, the mother smoked and reported a slight vaginal bleeding in the first trimester, without other abnormalities. He was born at term by cesarean section; his birth weight was 3,800 g (50-90th centile), length was 51 cm (50th centile) and occipital-frontal-circumference (OFC) was 36 cm (50-90th centile) and there was no report of neonatal complications. Hypotonia and global developmental delay were observed in the first year. Subsequently, learning disabilities and intellectual disability were noticed. At 18 years of age, his weight was 76.4 kg (90-97th centile), height 165.5 cm (3rd-10th centile), and OFC 56.5 cm (50th centile). He showed flat occiput, brachycephaly, high forehead, hypertelorism, down-slanting palpebral fissures, mild ptosis and proptosis, midface hypoplasia, high nasal bridge, everted lower lip, high palate, low-set and dysmorphic ears, short neck (Figure 1), scoliosis, short fingers, hallux valgus, asymmetry of lower limbs length (right

MATERIALS AND METHODS Subject The study was approved by the Ethical Commitee and written informed consent was obtained from patient’s parents.

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Karyotype and MLPA analyses Routine chromosome analysis showed a normal male karyotype (46,XY). Genomic DNA was screened for subtelomeric rearrangements by MLPA using the “SALSA P036-E1 and SALSA P070-A2 human telomere test kits”, according to the manufacturer’s instructions (MRC- Holland, Amsterdam, the Netherlands) and carried out as described by Schouten et al.6 with minor modifications. Capillary electrophoresis was performed on an ABI-PRISM 3500-XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and analyzed by a spreadsheet based on Microsoft Excel® (Microsoft Corporation, Washington DC, USA).

FISH analyses The chromosome abnormality identified by MLPA analysis was validated by FISH analysis on cultured peripheral blood lymphocytes using commercial 6p subtelomeric FISH probes (Aquarius®/Cytocell®), following standard protocols. FISH analysis was carried out for both parents as well.

RESULTS MLPA subtelomeric analysis demonstrated a terminal deletion on 6p (Figure 2). FISH analysis on cultured peripheral blood lymphocytes using commercially subtelomeric FISH probes (Aquarius®/Cytocell®) for 6p confirmed the deletion indicating the breakpoint at band 6p24 (LPT 06PR/G) (Figure 3). Therefore, the propositus’ karyotype is 46,XY,del(6)(p24).ish del(6)(pter)(62I11-). FISH analyses for both parents using same subtelomeric probes resulted in normal signals (data not shown), indicating a de novo deletion.

DISCUSSION Similar clinical phenotypes encompassing interstitial either deletions within the 6p22-p24 region or terminal deletion involving the 6p24-6pter region has recently been outlined7,8. Developmental delay/intellectual disability, language impairment, hearing loss, craniofacial dysmorphisms, including prominent forehead, hypertelorism, midface hypoplasia, ophthalmologic abnormalities ocular such as malformation of the anterior eye chamber are among the main clinical features of this condition4,5,8-10. Although more than 30 cases with deletions involving the 6pter region have already been reported, it is worth to mention here

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that part of them has resulted from complex rearrangements, which certainly determine an overlap of phenotypes, hampering the genotype-phenotype correlation on the ‘pure’ 6p deletion4,11,12. A summary of clinical findings is presented on Table 1, covering a literature review1-3,5,8-10,12- 20 and the one described here. It should be noted that they share most conspicuous features as developmental delay and ocular and craniofacial abnormalities. Ocular anomalies, especially those in the anterior chamber, are major features of 6p terminal deletions when the critical 6p25 region that contains the FOXC1 gene, a transcription factor involved in anterior chamber development, is included21,22. Retinal abnormalities have been also described, including a case with crescentic hyperpigmentation reported by Gould et al.23. Besides embryotoxon posterior defect in the anterior chamber, the patient described here also showed evident retinal abnormalities, with atrophy and diffuse pallor of optic papilla. Regarding these findings, it is probable the involvement of ELOVL2 gene located in the 6p24 region, which belongs to the elongation of very long chain fatty acids (ELOVL) gene family. In animal models, the Elovl2 expresses at retina in a very high level24 and mutations in the human ELOVL4 gene were identified in cases of Stargardt-like macular dystrophy and autosomal dominant macular dystrophy25. Those findings pointed to the possibility that mutations in other genes within the ELOVL family would be able to produce retinal abnormalities. Therefore, it seems plausible to infer that haploinsufficiency of ELOVL2 gene might potentially cause retinal abnormalities in a patient with 6p terminal deletion. Brain anomalies formerly reported in patients with 6p deletion including hydrocephalus and Dandy-Walker malformation highlight the clinical overlap with the Cranio-Cerebello-Cardiac (or 3C) syndrome4. The MRI findings such as white matter T2 signal hyperintensities and thin corpus callosum observed in the present patient had been described previously in at least one case of 6p deletion17. In that report, the MRI was performed at the age of 13 months and there was no evidence of lesion progression after one year, when a second MRI showed only a slight increase in the white matter signal abnormalities. By the time of the report, the patient was six years old, presented mild developmental delay without neurological regress and metabolic tests for leukodystrophies were negative. The authors suggested that some genes responsible for normal white matter development could be located at 6p terminal region. A similar pattern of white matter abnormality observed in the case we present here reinforces this hypothesis and suggests that a nonprogressive leukoencephalopathy may be an additional abnormality in the central nervous system presented by individuals with 6p terminal deletion,

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besides corpus callosum hypoplasia17. Caluseriu et al.20 reported a different case of white matter changes in an adult with 6p25 deletion syndrome and schizophrenia. They described that MRI at age 36 showed diffuse moderate supratentorial atrophy and confluent and punctate white matter changes with small foci of encephalomalacia, however they did not show an image of these findings to compare with present case. They discussed that the schizophrenia might be coincidental, despite negative family history of psychiatric disorder and a possible schizophrenia susceptibility locus in 6p terminal region20. However, in this case, it is not possible to exclude that the observed abnormalities have been a consequence of psychiatric disease, since there is evidence of gray and white matter reduction in schizophrenic adult patients when compared with healthy subjects26. Many skeletal abnormalities were identified in patients with confirmed 6p terminal deletion, including epiphyseal delay19, malformations of backbone, hands and feet23 and hip dislocation secondary to bilateral Perthes disease18. Kannu et al.27 identified epiphyseal anomalies especially in femoral location among others skeletal anomalies. These authors suggested that an epiphyseal delay, especially of the proximal femora, detected in infancy or early childhood, might be a significant finding and needs to be followed up for possible development of epiphyseal dysplasia. In the present case, a skeletal survey was not performed in childhood, but the current femoral impairment reinforces the hypothesis that an epiphyseal dysplasia, particularly of the hip, could be part of the natural history and also a significant complication of 6p terminal deletion syndrome, justifying the inclusion of this specific follow-up in the anticipatory guidance for these patients. There are some evidences of collagen abnormality related to disrupted genes in 6p terminal region and some features of this syndrome might be related to collagen or connective tissue alteration. Two patients with multiple dislocations reported by Pierquin et al.28 carried an unbalanced translocation resulting in partial 1q trisomy and 6p monosomy. An analysis of skin collagen from one of the probands disclosed a decreased alpha 1/alpha 2 chain ratio of collagen type I and they suggested that the deleted 6p segment would be the responsible for the collagen abnormality, because the breakpoints on chromosome 1 were different in each case (1q32 and 1q42). Multiple dislocations were also observed by James et al.29 in a patient with an unbalanced translocation resulting in distal 6p deletion and proximal trisomy 10q, supporting that the terminal 6p region may be in fact involved in skeletal anomalies related to collagen disturbance. Smith et al.30 demonstrated that FoxC1 haploinsufficiency in mouse model - homolog to FOXC1 gene in humans - cause anterior chamber abnormalities with

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paucity of extracellular matrix components and very little collagen and elastic tissue in the affected eye.

CONCLUSION The monosomy involving 6p24 region has emerged as a clinically recognizable syndrome, although the lack of information still affects the establishment of a specific diagnosis, as well as a more complete delineation of its phenotype. The description of additional cases, properly evaluated using molecular techniques to define chromosomal regions involved, as well as the monitoriament of patients with confirmed subtelomeric 6p deletion, particularly considering their ophthalmological, brain and skeletal abnormalities, certainly will contribute for refining the phenotypic spectrum of this condition.

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217

Table 1: Patients with 6p subtelomere deletion syndrome. THIS REFERENCE REVIEW REPORT Female (22/30); Male Sex Male (8/30) Craniofacial anomalies

Frontal prominent / high forehead YES 07/07 Midface hypoplasia YES 05/05 Downslanting palpebral fissures YES 19/21 Ptosis YES 01/04 Proptosis YES 03/03 Hypertelorism YES 23/24 Epicanthal folds NO 03/08 Ear anormalies YES 17/21 Philtrum (short and / or smooth) NO 06/06 Flat / high nasal bridge YES 15/16 High palate YES 09/17 Structural eye abnormality

Chamber dysgenesis of the eyes YES 11/15 Posterior embryotoxon YES 11/13 Iris hypoplasia NO 05/07 Refractive error YES 13/14 Eye motility disorder YES 04/05 Heart defect. NO 17/21 Brain abnormalities YES

Dandy – Walker malformation NO 09/11 Hydrocephalus NO 10/16 Cognitive development

Developmental delay / mental retardation YES 25/25 Hypotonia YES 15/18 Hearing loss ? 15/18 Hand anomaly YES 12/15 Foot anomaly YES 08/13 Genital anomaly YES 05/10 Hernia (umbilical / inguinal) NO 05/14

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Figure 1: Frontal view of patient showing characteristic facial features of subtelomeric 6p deletion syndrome.

Figure 2: Detection of subtelomeric anomaly by MLPA. Red arrow shows the 6p deletion in this patient. C: normal control; P036 and P070: results of respective MLPA kits for the present case.

219

Figure 3: FISH with subtelomeric probe for 6p (labeled in green), showing only one green signal on one normal chromosome 6 (LPT 06PR/G, Aquarius®/Cytocell®).

8.5. Dados de levantamento da casuística Tabela 33. Dados do levantamento de prontuários dos 300 pacientes incluídos no estudo. Caso Resultado / técnica S DN I IE DV IM IP C AF AG/AP ADNPM CC P1 NL F 14/10/1993 24 144 6 17 25 0 Sim Sim Sim Sim P4 dup7q (MLPA) F 20/09/1992 25 115 6 37 37 0 Sim Não Sim Não P3 NL M 04/08/1993 24 132 3 28 32 0 Não Não Não Não P5 NL M 24/10/1999 18 71 2 23 22 0 Não Não Não Não P6 NL M 28/10/2003 14 32 5 15 SD 0 Sim Sim Sim Não P7 NL M 16/10/1999 18 84 3 28 34 0 Não Sim Sim Não P9 NL M 03/07/1995 22 110 5 18 21 0 Não Não Sim Não P10 NL M 04/05/1989 28 124 6 19 24 0 Não Duvidoso Sim Não P11 NL M 09/04/2004 13 101 1 23 24 0 Sim Sim Sim Não P12 NL M 21/03/1997 20 95 4 19 19 0 Não Sim Sim Não P13 dupXp11 HUWE1 ex61 (MLPA) M 26/04/1994 23 12 3 27 34 0 Não Sim Sim Sim P14 NL F

P15 NL F 22/07/1999 18 93 8 44 30 0 Não Sim Sim Não P16 NL M 10/01/1994 23 108 4 34 40 0 Não Duvidoso Não Não P17 NL F 24/07/2002 15 54 0 42 43 0 Não Duvidoso Sim Não P18 NL M 25/05/2002 15 47 4 21 26 0 Sim Sim Sim Não P20 NL F 25/02/1995 22 144 2 23 28 0 Não Sim Sim Não P21 NL M 02/10/2000 17 84 2 31 32 0 Sim Não Sim Sim P22 NL M 20/05/2000 17 91 1 30 29 0 Não Não Sim Sim P23 delq21.1-q21.33 (microarray) M 13/05/1997 20 30 4 34 35 0 Não Não Sim Não P24 dup12q24.33 (microarray) M 2005 12 22 7 35 35 0 Sim Sim Sim Sim P25 NL M 12/03/2009 8 60 1 31 36 1/16 Não Sim Sim Não P26 NL M 02/02/1997 20 130 7 33 20 0 Não Não Sim Sim P27 NL F 19/08/1988 29 156 5 37 39 0 Sim Sim Sim Sim P28 NL M 15/02/1999 18 48 3 24 24 0 Sim Sim Sim Não P29 NL F 21/08/1996 21 120 4 31 31 0 Não Duvidoso Sim Não

221

P30 NL M

P31 NL M 1988 29 156 8 34 35 0 Sim Sim Sim Sim P33 NL F 00/00/1965 52 504 5 SD SD 0 Não Não Sim Não P34 NL M 05/09/1986 31 72 3 22 24 SD Sim Sim

P35 NL M 22/02/1997 20 120 4 19 23 0 Sim Sim Sim Não P36 NL M 17/02/1997 20 10 5 19 20 0 Não Sim Sim Não P37 NL M 12/04/1999 18 96 4 25 21 0 Não Sim Sim Não P38 NL SNP12p M 24/06/1982 35 288 2 19 20 0 Sim Sim Sim Não P39 NL M 17/12/1994 23 153 3 22 17 0 Sim Não Sim Não P40 NL M 27/09/1990 27 132 3 24 24 0 Sim Não Sim Não P41 NL F 11/07/2002 15 60 5 21 21 0 Sim Não Sim Não P42 del 15q 21.2q22.2 (microarray) M 07/08/1999 18 84 4 25 29 0 Sim Sim Sim Não P43 NL M 26/05/2001 16 49 5 31 27 0 Não Sim Sim Não P44 NL F

P45 NL F 13/11/1995 22 48 4 38 38 0 Não Sim Sim Sim SNV KIRREL3 / SHANK2 P46 M 22/10/2001 16 57 5 30 45 0 Não Sim Sim Sim (exoma) P47 NL M 1993 24 120 2 32 27 0 Não Não Sim Não P48 NL M 07/05/1993 24 108 4 SD 30 1/16 Sim

P49 NL M 13/09/1993 24 156 2 25 29 0 Não Não Sim Não P50 NL M 04/03/1998 19 59 3 22 23 1/64 Não Sim Sim Não P51 NL M 25/07/1997 20 120 3 25 29 0 Não Sim Sim Não P52 NL M 01/01/1977 40 348 4 24 28 0 Não Não Sim sim P53 NL SNP12p M 01/04/1995 22 132 6 27 27 0 Sim Não Sim Não P54 NL M 16/11/1996 21 72 5 31 35 0 Não Não Sim Não P55 NL M 15/11/1994 23 48 3 22 33 0 Não Não Sim Não P56 NL SNP12p F 10/08/1997 20 108 2 27 33 0 Sim Não Sim Não P57 del1p (MLPA) M 14/12/2005 12 30 SD 20 23 0 Sim Não Sim Sim P58 NL M 13/10/1997 20 60 5 31 34 0 Não Sim Sim Não

222

P59 NL SNP12p F 12/03/1998 19 51 6 26 29 0 Sim Sim Sim Sim P60 NL M 14/08/2002 15 60 4 29 26 Não Sim

P62 NL M 04/09/2002 15 38 6 34 24 0 Não Duvidoso Sim Não P63 SNV CTTNBP2 (exoma) F 25/10/1995 22 20 5 34 30 0 Não Sim Sim Não P64 del5p/dup9p (MLPA) M 11/07/2008 9 3 8 22 22 0 Não Sim Sim Não P65 NL M 08/05/1995 22 96 4 19 24 0 Não Não Sim Sim P66 NL M 30/12/2003 14 37 5 27 35 0 Não Sim Sim Não P67 NL M 26/09/1995 22 128 1 21 41 1/16 Sim Sim Sim Sim P68 NL SNP12p F 19/03/2001 16 82 6 23 31 1/32 Não Não Sim Sim P69 NL M 08/12/1994 23 120 3 38 39 0 Não Não Sim Não P70 NL F 10/04/1999 18 107 3 29 40 0 Sim Não Sim Não P71 NL M 05/12/1985 32 161 6 SD SD 0 Não Sim Sim Não P72 NL F 17/02/2005 12 26 5 23 35 0 Não Não Sim Sim P73 NL M 02/01/1997 20 132 2 18 SD 0 Sim Sim Sim Não P74 NL SNP 16p M 07/11/1994 23 96 6 30 30 0 Sim Não Sim Não P75 del6p (MLPA) M 1993 24 162 4 35 35 0 Não Sim Sim Não P76 NL M

P77 NL M 15/12/1997 20 120 3 21 24 0 Sim Sim Sim Não P78 NL M 05/02/2010 7 60 2 21 19 0 Não Sim Sim Sim P79 NL M 22/02/2000 17 38 4 23 37 0 Não Sim Sim Não P80 NL F 16/01/1981 36 312 2 30 32 0 Não Não Não Não P81 dupXq26.2 (microarray) M 10/11/1999 18 20 8 19 18 1/8 Sim Sim Sim Não P82 NL M 18/08/1998 19 53 5 15 18 0 Sim Duvidoso Sim Sim P83 NL M

P84 NL M 1991 26 96 3 SD SD 0 Não Não Não Não P85 delXYp (MLPA) M 04/08/1989 28 228 2 34 56 0 Não Não Sim Sim P86 NL M 25/09/1992 25 188 3 29 29 0 Sim Sim Sim Não P89 NL F 12/05/1989 28 228 6 32 SD 0 Não Sim Sim Não P90 NL M

223

P91 NL F 02/03/1996 21 144 5 25 25 0 Sim Sim Sim Não P92 NL F 4

P93 NL M 26/01/1997 20 124 3 26 29 0 Sim Sim Sim Não P95 NL F 24/09/1992 25 24 5 21 25 0 Não Sim Sim Não P96 NL M 05/08/1994 23 156 0 33 30 0 Não Sim Sim Não P97 NL SNP16p M

P98 del1p (MLPA) M 09/03/2004 13 36 4 18 21 0 Sim Sim Sim Sim P99 NL M 22/01/2004 13 30 5 20 20 0 Sim Não Sim Não P100 NL M 25/01/1998 19 124 3 27 36 0 Não Sim Sim Não P102 NL M 26/06/1996 21 150 4 24 33 0 Não Não Sim Sim P103 NL M 06/10/2005 12 36 1 35 38 0 Não Sim Sim Não P104 NL F 18/12/2001 16 84 5 25 32 1/64 Sim SD Sim

P105 NL SNP16p M 23/09/2005 12 33 5 33 27 0 Sim SD Sim

P106 NL F 17/10/2001 16 84 1 28 28 0 Não Não Sim Sim P107 NL M 22/11/1993 24 176 6 21 29 0 Não Não Sim Não P108 del7p15.3 p15.2 (microarray) M 25/06/1997 20 120 5 23 20 0 Sim Sim Sim Não P109 NL M

P110 NL F 15a 15 180 3 0 Não Sim Não

P111 NL F 25/08/1996 21 120 2 28 36 0 Não Sim Sim Não P112 NL M 03/10/2003 14 60 4 19 25 0 Não Não Sim Não P113 NL SNP16p F 02/12/1999 18 72 2 SD SD 0 Não Não Sim Não P114 NL M 20/01/1997 20 144 5 18 33 Sim

P115 NL M 25/08/1993 24 170 3 21 40 * Não Não Sim Não P116 NL M 04/05/1986 21 3 SD 0 Não Sim

P117 NL F 01/09/1997 20 132 2 28 28 0 Não Não Sim Não P118 NL F 09/01/2005 12 50 3 35 36 0 Não Sim Sim Não P119 NL F 22/03/1999 18 120 18 23 0 Não Não Sim Não

P120 NL M 26/06/1999 18 119 36 41 0 Não Não Sim Não

P121 NL M 18/02/1998 19 43 7 41 43 1/8 Sim Não Sim Sim

224

P122 NL SNP16p M 13/08/1995 22 168 2 16 19 0 Não Não Sim Sim P123 NL M 02/01/1988 29 96 2 23 25 0 Não Sim Não Não P124 del4p/dup12p (MLPA) F 25/10/2003 14 10 7 25 29 0 Sim Sim Sim Sim P128 NL M 06/02/2001 16 84 6 23 27 0 Sim Sim Sim Não P129 NL M 1994 23 30 4 SD SD SD SD SD Sim Não P130 dup15p (MLPA) F 27/01/2002 15 84 2 24 29 SD SD SD SD SD P131 NL M 11/08/2006 11 33 2 32 39 Sim

P132 NL M 17/07/1994 23 133 4 20 29 0 Não Não Não Não P133 NL M 27/04/1993 24 96 4 30 36 0 Sim Não Sim Não P134 NL M 28/07/1997 20 132 1 16 21 0 Não Não Sim Sim P135 NL M 05/06/1997 20 96 6 30 27 0 Sim Sim Sim Não P136 del1p/dup4p (MLPA) F 8 0

P137 del18q (MLPA) M 09/11/1997 20 144 5 26 28 0 Sim Sim Sim Não P138 NL M 12/02/1995 22 110 2 17 0

dupXq28 SLC6A8 ex9 GDI1 P139 M 31/01/2002 15 29 7 29 26 0 Não Não Sim Não exon1 7 (MLPA) P140 NL SNP 22q F 19/12/2007 10 24 4 26 28 0 Sim Não Sim Não P141 NL F 15/04/1998 19 3 30 41 0 Não Não Sim Não

P142 NL M 1 33 38 0 Não Sim

P143 NL F 11/01/2000 17 115 3 40 37 1/32 Não Sim Sim

P144 NL F 10/08/1999 18 48 5 21 30 0 Não Não Sim Não P145 NL M

P146 NL F 07/06/2002 15 95 4 32 FIV 0 Não Não Sim Não P148 NL M 07/02/2003 14 67 3 37 39 0 Não Não Sim Sim P149 NL M 11/02/2005 12 54 6 19 29 0 Sim Sim Sim Não P150 NL M 16/05/1996 21 156 4 29 30 0 Sim Não Sim Não P151 del22q (microarray) F 06/05/2000 17 33 2 30 37 0 Não Não Sim Não P152 del7q11.23 (microarray) F 23/06/1983 34 71 5 28 25 0 Não Não Sim Não P153 NL F 29/08/1997 20 144 3 29 28 0 Não Sim Sim Não

225

P154 NL F 23/01/2007 10 39 6 21 25 1/64 Não Sim Sim Não P155 NL F 11/07/2003 14 72 3 13 19 0 Não Sim Sim Não P156 NL M 11/12/1997 20 132 3 34 36 0 Sim Não Sim Não P157 NL M 25/04/2005 12 48 5 22 31 0 Não Não Sim Não dup6p11.2 e dup10q26.3 P158 M 11/09/1987 30 276 5 29 26 0 Não Não Sim Não (microarray) P159* NL M 31/07/2001 16 132 2 39 32 0 Não Não Sim Não P160 SNV TCF4 (exoma) F 07/01/1998 19 48 4 20 19 0 Sim Não Sim Sim P161 dup7p (MLPA) M 15/03/2009 8 24 5 18 28 0 Sim Não Sim Sim P162 NL M 28/03/2006 11 1 2 28 33 0 Não Não Sim Sim del22q (MLPA grupo P163 F 14/01/2000 17 120 3 36 41 0 Não Não Não Não colaborador) P164 dup4p/del13q (MLPA) F 14/06/2005 12 1 8 23 27 0 Não Sim Sim Sim P165 NL F 2004 13 58 5 SD SD SD SD SD Sim Sim P166 del4p/dup8p (MLPA) M 09/02/2008 9 29 7 18 21 0 Sim Não Sim Não P167 NL F 28/10/2007 10 60 6 19 35 1/32 Sim Sim Sim Não dup16p11.2 (microarray grupo P168 F 01/07/2008 9 2 5 27 33 1/16 Não Não Não Não colaborador) P169 del9p/dup19q (MLPA) F 24/10/1994 23 180 5 31 39 0 Não Sim Sim Não P170 SNV HTT (exoma) M 18/01/1998 19 2 3 17 19 0 Sim Duvidoso Sim Não P171 NL M 14/06/1995 22 192 7 44 50 0 Sim Não Não Não P172 NL F 04/11/2004 13 60 1 26 30 0 Não Não Não Não P173 NL M 14/02/2003 14 84 4 19 25 0 Sim Não Não Não P174 NL M 2008 9 48 7 22 28 0 Sim Sim Sim Sim P175 NL F 17/08/1998 19 132 2 29 35 0 Sim Sim Sim Sim P176 NL M 12/08/2009 8 21 6 23 29 0 Não Sim Sim Não P177 NL M 29/06/1995 22 156 5 30 32 0 Sim Sim Sim Não P178 NL F 1997 20 180 4 SD SD 0 Não Sim Sim Não P179 NL M 2004 13 96 5 41 52 0 Não Sim Sim Não P180 del2q36.3-2q37.1 (microarray M 2011 6 12 7 34 31 0 Sim Sim Sim Não

226

grupo colaborador) P181 NL F 2007 10 15 5 36 27 0 Não Duvidoso Sim Não P182 SNV PRKCG (exoma) F 1995 22 13 4 35 39 0 Não Sim Sim Não P183 NL M 10/10/2001 16 39 3 19 25 0 Não Não Sim Não P184 NL M 2008 9 48 8 21 21 0 Não Não Sim Não P185 NL F 2001 16 132 4 30 37 0 Não Sim Sim Não P186 NL M 2007 10 13 8 20 28 0 Sim Não Sim Não P187 NL M 07/07/2000 17 120 3 26 22 0 Não Não Sim Não P188 NL M 20/01/2012 5 7 6 24 22 0 Sim Sim Sim Não P191 dup11p (MLPA) F 17/06/2007 10 48 3 34 36 0 Não Sim Sim Sim P192 del1q (MLPA) M 2012 5 2 6 37 37 0 Não Não Sim Não P193 NL F 02/01/2007 10 74 2 22 SD 0 Não Sim Sim Não P194 dup9p/del18p (MLPA) M 09/03/2000 17 156 3 30 41 0 Não Não Sim Não P195 NL M 1975 42 432 2 SD SD 0 Não SD Sim Não P196 NL M 22/06/2008 9 60 3 31 36 0 Sim Não Sim Não P197 NL F 1980 37 372 4 SD SD 0 Não SD Sim Não P198 SNV RAI1 (exoma) F 1998 19 103 2 32 36 0 Não Sim Sim Não P199 NL F 2013 4 12 7 16 16 0 Não Duvidoso Sim Não P200 NL M 2008 9 60 6 18 24 0 Não Sim Sim Não P201 NL F 21/10/2010 7 24 2 25 23 0 Não Sim Sim Não P202 NL M 2003 14 5 6 20 20 0 Não Sim Sim Sim P203 NL M 2009 8 26 5 24 35 0 Não Sim Sim Não P206 NL F 19/06/2002 15 132 4 25 24 0 Não Não Sim Não P207 NL M

P208 NL M 25/04/2010 7 31 5 33 55 0 Não Não Sim Não P209 NL F 03/05/1999 18 143 6 26 SD 0 Não Não Sim Não P210 NL F 29/07/2007 10 72 3 15 30 0 Sim Sim Sim Não P211 NL M 09/11/1990 27 20 3 SD SD 0 Não Duvidoso Sim Não P212 NL M 13/03/1999 18 90 3 20 27 0 Não Duvidoso Sim Não

227

P213 NL M 01/02/2010 7 11 4 38 51 0 Não Não Sim Sim P214 NL M 27/06/2005 12 24 5 25 29 0 Não Sim Não Não P215 NL M 01/12/1994 23 144 1 26 33 0 Sim Sim Sim Não P216 NL F 2011 6 24 4 35 41 0 Não Sim Sim Sim P217 NL M 2012 5 12 4 16 20 0 Não Sim Sim Sim P218 NL F 17/06/2002 15 120 5 SD 31 0 Sim Sim Sim Não P219 NL F 2013 4 12 1 29 33 0 Não Sim Não Sim P220 NL M 09/03/1995 22 96 4 22 27 0 Sim Não Sim Não P221 NL M 19/04/2006 11 87 7 26 26 0 Sim Não Não Não P222 NL M

P223 NL M 2012 5 24 4 18 42 0 Não Sim Sim Sim P224 NL F falecida SD SD 4 30 32 0 Não Duvidoso Sim Não P225 NL M 2002 15 60 35 41 0 Não Não Sim Não

P226 NL M 2013 4 12 8 26 33 0 Sim Duvidoso Sim Sim P228 NL F 2008 9 69 3 SD SD 0 Não Não Sim Não P229 NL F 16/06/1997 20 180 3 27 35 0 Sim Sim Sim Não P230 NL M 15/11/1994 23 216 2 27 36 0 Sim Sim Sim Não P231 SNP dup22q M 21/11/2001 16 143 1 25 24 0 Não Não Não Não P232 NL M 2012 5 24 7 31 42 0 Sim Sim Sim Não P233 NL M 03/04/2006 11 84 1 31 SD 0 Sim Sim Sim Não P234 NL M 28/05/2003 14 84 1 20 22 0 Não Sim Sim Sim P235 Sd. Epiléptica (exoma) M 15/11/2005 12 96 SD 27 38 0 Não SD Sim Sim P236 dup17p (MLPA) F 07/03/2012 5 24 5 27 28 0 Sim Sim Sim Não P237 dup4p/del8p (MLPA) M 23/01/2004 13 50 5 25 47 0 Não Sim Sim Não P238 NL M 25/04/2002 15 132 6 26 28 0 Não Não Não Sim P239 NL F 21/10/2003 14 72 2 37 19 0 Sim Sim Sim

P240 NL F 14/07/2004 13 111 1 36 42 0 Sim Não Sim Não P241 NL F 22/05/2004 13 120 1 23 34 0 Não Não Sim Não P242 NL F 19/10/1991 26 252 3 27 34 0 Sim Duvidoso Sim Não

228

P243 NL F 14/06/1999 18 3 7 26 27 0 Sim Sim Sim Sim P244 NL F

P245 NL M 06/04/2010 17 83 2 36 36 0 Não Não Sim Não P246 NL F 31/03/2002 15 84 3 18 20 0 Sim Não Sim Não P247 NL M 08/05/2008 9 36 4 28 29 0 Não Não Sim Não P248 NL F 22/11/1992 25 216 3 21 22 0 Sim Não Não Não P249 NL M 30/04/2008 9 70 5 27 28 0 Não Sim Sim Não P250 NL F 01/03/1998 19 60 3 22 26 0 Sim Não Não Não P251 NL M 2012 5 5 4 SD SD 0 Não Não Sim Não P252 NL F 27/03/1998 19 144 1 19 23 0 Não Sim Sim Não P253 NL M 22/04/2001 16 158 3 31 36 0 Não Não Não Não P254 NL M 29/09/1999 18 172 2 27 23 0 Sim Não Sim Sim P255 NL F 05/05/2009 8 36 3 19 27 1/8 Sim Sim Sim Não P256 NL M 08/01/1984 33 360 2 19 36 1/16 Sim Não Sim Sim P257 NL SNP 16p M 21/12/2011 6 27 4 24 22 0 Não Sim Sim Não dup X/Yp (MLPA, microarray, P258 F 23/01/2013 4 12 4 35 36 0 Não Sim Sim Não exoma) P259 NL M 20/10/2000 17 165 0 23 25 0 Não Não Sim Não P260 NL M 1997 20 204 2 23 29 0 Não Não Sim Não P261 NL M 20/12/1999 18 156 5 30 41 0 Sim Sim Sim Não P262 NL M 1994 23 252 10 22 23 0 Sim Sim Sim Sim P263 NL M 2009 8 84 8 39 40 0 Não Sim Sim Sim P264 NL F 10/03/2009 8 60 1 25 25 0 Não Sim Sim Não P265 NL M 09/12/2001 16 144 5 36 40 1/8 Sim Sim Sim Sim P266 NL F 01/04/2002 15 120 4 22 31 0 Sim Não Sim Não P267 NL M 2013 4 12 5 22 24 0 Sim Sim Sim Não P268 NL M 10/03/2003 14 132 1 33 30 0 Não Sim Sim Não P269 NL M 30/04/2010 7 45 2 23 20 0 Não Não Sim Não P270 NL M 08/09/1999 18 144 2 18 SD 0 Sim Não Sim Sim

229

P271 NL F

P272 NL F 28/04/2001 16 138 0 27 31 0 Não Não Sim Não P273 NL F 22/03/2012 5 26 1 18 23 0 Sim Não Sim Sim P274 NL F

P275 NL SNP 19q F 05/11/2000 17 168 4 30 31 0 Não Não Sim Não P276 NL M 17/03/2002 15 144 5 20 22 0 Sim Sim Sim Sim P278 NL M 02/08/2005 12 108 5 32 24 0 Sim Não Sim Sim P279 NL M 03/07/2001 16 156 0 19 0 Não Não Sim Não

P280 NL F 06/09/2013 4 19 2 21 23 0 Não Não Sim Não P281 del 4q (MLPA não confirmado) M 18/01/2014 3 13 4 25 34 0 Não Sim Sim Não P283 NL M 28/11/2011 6 31 4 17 21 0 Não Sim Sim Sim P284 dup12p13.2p13.1(microarray) M 19/02/2004 13 48 2 36 38 0 Não Sim Sim Não P285 NL M 07/04/2004 13 130 3 19 26 0 Sim Não Sim Não P286 NL F 16/04/2000 17 168 1 27 35 0 Não Não Sim Sim P287 NL M 21/06/2014 3 4 7 29 38 0 Sim Não Sim Não P288 NL M 19/06/2005 12 120 3 22 34 0 Não Não Sim Não P289 NL M 07/10/2003 14 132 5 18 36 0 Não Não Sim Não P290 NL F 19/08/2003 14 132 3 38 32 0 Não Não Sim Não P291 NL M 16/04/1996 21 216 1 20 SD 0 Não Não Não Sim P292 NL M 16/02/2000 17 93 5 45 31 0 Sim Sim Sim Sim P293 NL F 26/04/2000 17 180 2 30 36 0 Não Não Sim Não P294 NL F 2012 5 19 4 27 40 0 Não Sim Sim Não P295 NL M 10/08/2003 14 144 2 26 35 0 Sim Sim Sim Sim P296 NL M 17/06/2006 11 96 2 22 22 0 Sim Sim SD

P297 NL F

P298 NL M 26/11/2008 9 82 3 32 32 0 SD SD Sim Sim P299 NL F 23/03/2000 17 180 4 20 38 0 Sim Não Sim Não P300 NL M 2002 15 12 4 37 38 0 Não Sim Sim Sim P301 NL F

230

P302 NL M 2013 4 24 6 24 0 Não Sim Sim Não

P303 dupXYp (MLPA) F 2005 12 120 4 25 26 0 Não Não Sim Não P304 NL F 2012 5 36 6 39 36 0 Não Não Sim Não P305 NL M 2008 9 84 4 29 32 0 Sim Não Não Não P306 NL M 2005 12 108 5 20 24 0 Sim Não Sim Não P307 NL M 2014 3 12 6 30 32 0 Sim Sim Sim Sim P308 NL F 2014 3 12 4 35 38 0 Não Sim Sim Não P309 NL M 2010 7 6 2 22 28 0 Não Não Sim Não P310 NL M 1997 20 108 1 24 26 1/8 Sim Não Sim Não P311 NL F 2006 11 110 4 44 48 0 Sim Não Não Não P312 NL M 01/07/2013 31 9 29 32 0 Sim Sim Sim Não

P313 NL F 2013 4 26 2 22 36 Sim Não Não Sim Sim P315 NL M 2005 12 120 4 37 38 0 Sim Sim Sim Sim P316 del4p (MLPA) M 07/07/2003 14 149 SD 31 SD 0 Não Sim Sim Sim P317 NL F 2014 3 16 1 31 41 0 Não Sim Sim Sim P318 NL F 2010 7 60 3 16 24 0 Não Não Sim Não P319 NL F 1990 27 300 3 20 24 0 Não Não Sim Não P320 NL F 2003 14 156 4 35 SD SD Sim Sim Sim SD P323 NL M

Legenda: S, sexo; DN, data de nascimento; I, idade atual em anos; IE, idade no encaminhamento em meses; DV, pontuação segundo critério de De Vries et al. (2003); IM, idade materna na ocasião do nascimento do propósito em anos; IP, idade paterna na ocasião do nascimento do propósito em anos; C, consanguinidade entre os genitores; AF, antecedentes familiais quanto à recorrência de DI; AG, antecedentes gestacionais; AP, antecedentes perinatais; ADNPM, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor; CC, crises convulsivas; del, deleção; dup, duplicação; p, braço cromossômico p; q, braço cromossômico q; SD, sem dados; MLPA, Multiplex Ligation-dependent probe amplification; CTTNBP2, Cortactin-binding protein 2; GDI1, GDP dissociation inhibitor 1; HUWE1, Hect, uba, and wwe domains-containing protein 1; KIRREL3, Kin of irre-like 3; PRKCG, Protein kinase c, gamma; RAI1, Retinoic acid-induced gene 1; SHANK2, SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2; SLC6A8, Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, creatine), member 8; TCF4, Transcription factor 4; 0, não; 1/8, primos em primeiro grau; 1/16, primos em segundo grau; 1/32, primos em terceiro grau; 1/64, primos em quarto grau; *fruto de possível relação incestuosa; SNP, single nucleotide polymorphism; SNV, single nucleotide variation.

Santos, 10 de novembro de 2017.

À Câmara de pós-graduação em Genética Médica – FCM/UNICAMP:

O artigo intitulado “Subtelomeric 6p deletion: case report and review emphasizing cerebral, ophthalmic and skeletal features”, de autores Lincoln-de-Carvalho, Carolina; Moreno, Carolina;

Sgardioli, Ilária Cristina; Gil-da-Silva-Lopes, Vera; de Mello, Maricilda e Marques-de-Faria,

Antonia, presente na tese de doutorado da aluna Carolina R. Lincoln de Carvalho, não foi aceito pela revista científica São Paulo Medical Journal, razão pela qual não é possível incluir a carta sobre direitos autorais – solicitação da presente câmara – entre os documentos necessários na submissão da versão final da tese.

Sendo o que se apresenta no momento, fico à disposição para os esclarecimentos que se façam necessários.

Atenciosamente,

Carolina Rodrigues Lincoln de Carvalho.