UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
MARINA AIELLO PADILLA
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS PRODUZIDOS DE BACTÉRIAS ISOLADAS E COLETADAS EM CUPINZEIROS FRENTE A VÍRUS DE IMPORTÂNCIA HUMANA E ANIMAL
ANTIVIRAL ACTIVITY OF EXTRACTS PRODUCED BY ISOLATED BACTERIA COLLECTED IN TERMITE MOUNDS AGAINST IMPORTANT HUMAN AND ANIMAL VIRUSES
CAMPINAS
2015
MARINA AIELLO PADILLA
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS PRODUZIDOS DE BACTÉRIAS ISOLADAS E COLETADAS EM CUPINZEIROS FRENTE A VÍRUS DE IMPORTÂNCIA HUMANA E ANIMAL
ANTIVIRAL ACTIVITY OF EXTRACTS PRODUCED BY ISOLATED BACTERIA COLLECTED IN TERMITE MOUNDS AGAINST HUMAN AND ANIMAL VIRUSES
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia Molecular na área de Microbiologia
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology in Microbiology area
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE PELA ALUNA MARINA AIELLO PADILLA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CLARICE WEIS ARNS
CAMPINAS 2015
Campinas, 04 de dezembro de 2015.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Clarice Weis Arns
Profa. Dra.Carmen Lucia Queiroga
Prof. Dr. José Luiz Proença Modena
Profa. Dra. Isabela Cristina Simoni
Prof. Dr. Eduardo Furtado Flores
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA À todos os meus amores.
AGRADECIMENTOS
À Deus por toda a força que me deu nessa jornada e por ter colocado pessoas tão especiais na minha vida. Meus pais, Telma e Miguel, agradeço simplesmente por ter o privilégio de ter vocês como pais. Nada seria possível, ou pelo menos não teria a mesma satisfação, se não pudesse ser compartilhado com vocês. “ Amo tanto e de tanto amar...” À toda a minha família: meus irmãos, cunhadas, minha avó Terezinha que acreditaram e me apoiaram nessa jornada, como em todas as outras. Vocês são essenciais! Aos meus sobrinhos lindos: Miguel, Alice e Bebel. Vocês me ensinam, me ajudam (mesmo sem perceber) e me mostraram um novo jeito de amar: o amor de tia coruja! Amo mais que demais. Ao Marco, principalmente pela “paciência com a Mari” (potássio), mas também pelos momentos de risadas, conselhos, companheirismo, cumplicidade...... Obrigada! Te quiero. À minha orientadora, profa. Dra. Clarice, pela oportunidade, confiança, incentivo, ensinamentos, conversas e convivência. Aprendi muito durante todo esse período que estamos trabalhando juntas. Muito obrigada! Aos meus amigos mais que especiais Matheus, Fernanda que sempre estiveram do meu lado e me ajudam em todos os sentidos para que as coisas dêem certo. Vocês são incríveis! Aos meus amigos lindos que eu amo tanto: Flora, Buchalla, Sônia, Henrique, Rodrigo, Priscila, Eduardo, Lara, Diego, Michele, Juliana. Obrigada pelo amor, pela amizade e cumplicidade. Aos meus amigos queridos e grande equipe do LVA. Não só companheiros de trabalho, mas também de boas risadas! Matheus, Juliana, Ana Paula, Ana Caroline, Raíssa, Paulo Simas, Leonardo, Paula, Luciana, Priscila e todos outros que passaram por lá. Aos meus pequenos: Wood e Erick, que apesar do trabalho que as vezes me dão, são meus companheiros de casa. A vida é melhor sabendo que quando estou em casa estarei na companhia de vocês. Aos meus anjinhos que olham e cuidam de mim: meus avôs Cadorna e Miguel, minha avó Catharina e o Kidinho. Aos amigos e colaboradores que ganhei com as etapas realizadas no CPQBA: toda a equipe do Dr. Rodney na DQPN e a equipe da Dra. Fabiana na DRM. Obrigada por me receberem tão bem, pela paciência, pelos ensinamentos, pelas ajudas, pelas conversas, risadas e cafés. Agradeço também aos professores que gentilmente se disponibilizaram a participar da avaliação da minha tese. Tenho grande admiração por vocês e os tenho como exemplos de profissionais. À coordenação do curso de pós graduação em Genética e Biologia Molecular
À FASPESP e CNPq pelo suporte financeiro. À UNICAMP pela formação científica. À todos que de alguma forma estão do meu lado e me ajudam a ser uma pessoa melhor,
MUITO OBRIGADA!!!!!
“A frase mais excitante que se pode ouvir na ciência, a que anuncia novos descobrimentos, não é Eureka! (o achei!) senão “é estranho”...” Issac Asimov
RESUMO As infecções virais acometem tanto humanos quanto animais. Problemas associados a falta de vacinas e o desenvolvimento de resistência aos medicamentos estimulam a pesquisa por compostos antivirais. As bactérias são responsáveis pela produção de inúmeros compostos com atividades biológicas importantes, portanto, esse trabalho teve como objetivo a busca por compostos antivirais produzidos por bactérias coletadas em cupinzeiros. Extratos provenientes de diferentes isolados de bactérias associadas ao cupim foram avaliados quanto a atividade antiviral in vitro frente a três vírus de importância para a saúde humana e animal: herpes humano tipo 1 (HHV-1), calicivírus felino (FCV)- modelo para o norovírus humano- e o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) – modelo para o vírus da hepatite C. Dos 90 extratos analisados, 10% apresentaram porcentagem de inibição (PI%) ≥ 98% contra pelo menos um dos vírus: cinco foram ativos frente ao HHV-1, três apresentaram atividade contra o FCV e dois foram ativos frente ao BVDV. Das espécies ativas, seis pertencem ao gênero Streptomyces , com uma delas identificada como S. chartreusis e quatro identificadas como sendo do gênero Achromobacter. Três extratos apresentaram índice de seletividade (IS) acima de 3,5 contra o HHV-1 com destaque ao CDPA10 ( Streptomyces sp) com IS=17,10. Frente ao FCV e o BVDV dois extratos foram considerados promissores: o LC22 (IS=11,00), identificado como Streptomyces sp e o CDPA27 ( S. chartreusis ) com IS=3,5, respectivamente. Os extratos que destacaram-se quanto aos valores e IS foram também avaliados em uma triagem de mecanismo de ação. Dos três extratos com IS acima de 3,5 frente ao HHV-1, um apresentou atividade antiviral no pós tratamento. Os outros,incluindo o CDPA10 agem como inativadores virais. O extrato LC22, ativo contra o FCV apresentou atividade no pós tratamento e também como inativador viral. Por fim, o extrato proveniente do S. chartreusis (CDPA27), agiu no pós tratamento frente ao BVDV. Esses três extratos, CDPA10, LC22 e CDPA27 foram selecionados para o fracionamento em coluna C 18 fase reversa em ordem crescente de metanol, originando seis frações. Todas as frações foram avaliadas contra seus respectivos vírus e como resultado foi possível observar que a fração 6 (100% metanol) foi a mais promissora dos três extratos. Essa fração do CDPA10 e do CDPA27, ativos contra o HHV-1 e BVDV respectivamente, apresentaram valor de PI=99%, enquanto a fração 6 do extrato LC22 (ativo contra o FCV) apresentou PI=90%. Nas avaliações quanto ao IS dessas frações promissoras, observou-se que os valores aumentaram consideravelmente tanto para o CDPA10 como para o CDPA27, já a fração do LC22 teve o valor de IS reduzido para 3,24. Finalmente, todos os extratos e suas frações promissoras foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-MS). Esta análise, quando comparada aos compostos já descritos na biblioteca NIST/2005, não permitiu a identificação dos compostos devido a baixa similaridade. Estudos mais detalhados devem ser realizados a fim de identificar as espécies bacterianas e seus respectivos compostos ativos. Os resultados obtidos revelam novas perspectivas para a pesquisa antiviral a partir de produtos naturais e demonstra o potencial antiviral de compostos produzidos por bacterias associadas ao cupim. Palavras-chave: atividade antiviral, cupinzeiro, bactérias, HHV-1, BVDV, FCV, Streptomyces
ABSTRACT Viral infections affect both humans and animals. Problems associated with a lack of vaccines and development of drug resistance stimulates the research for antiviral compounds. Bacteria are responsible for producing many compounds with important biological activities, so this study aimed to research for antiviral compounds produced by isolated associated bacteria. Extracts from different isolated termite associated bacteria were evaluated for in vitro antiviral activity against three important viruses to human and animal health: human herpesvirus type 1 (HHV-1), feline calicivirus (FCV) - surrogate model for human norovirus -and bovine viral diarrhea virus (BVDV) - surrogate model for hepatitis C virus. Of 90 extracts analyzed, 10% had percentage of inhibition (PI%) ≥ 98% against at least one virus: five were active against HHV-1, three showed activity against FCV and two were active against BVDV. Of the active species, six belong to Streptomyces genus, with one of them identified as S. chartreusis and four were identified as Achromobacter genus. Three extracts showed selectivity index (SI) above 3.5 against HHV-1, highlighting CDPA10 (Streptomyces sp) with SI = 17.10. Against the FCV and BVDV only two extracts were considered promising: LC22 (SI = 11.00), identified as Streptomyces sp and CDPA27 ( S. chartreusis ) with SI = 3.5, respectively. The extracts that stood out about the values of SI were also evaluated in a screening of mechanism of action. Of the three extracts with SI above 3.5 against HHV-1, only one showed antiviral activity in post-treatment, the others, including CDPA10 act as virus inactivation. The LC22, extract active against FCV, showed activity in the post-treatment as well as virus inactivation. Finally, the extract from S. chartreusis (CDPA27), acted in the post-treatment against BVDV. These three extracts CDPA10, LC22 and CDPA27 were then selected for fractionation on column C 18 phase reverse with ascending order of methanol, resulting in six fractions. All fractions were evaluated against the respective virus and as a result was observed that the fraction 6 (100% methanol) were the most promising of the three extracts. That fraction of CDPA10 and CDPA27, active against HHV-1 and BVDV respectively, presented value of PI = 99%, while the fraction 6 of LC22 extract (active against FCV) presented PI = 90%.The SI evaluations of these promising fractions showed that the values increased substantially for both CDPA10 and CDPA27; however the fraction of LC22 extract had reduced SI value to 3.24. Finally, all extracts and their promising fractions were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). This analysis, when compared to the compounds already described in the NIST / 2005 library, it was not possible to identify them due to low similarity. More detailed studies should be performed to identify the bacterial species and their active compounds.The result of the present study provide new information for antiviral research using natural sources and demonstratesantiviral potential of compounds produced by termite associated bacteria. Keyword: antiviral activity, termite mounds, bacteria, HHV-1, BVDV, FCV, Streptomyces
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...... 13 1.1 HERPESVÍRUS HUMANO TIPO 1 (HHV-1) ...... 13 1.1.1 Histórico ...... 13 1.1.2 Classificação e morfologia ...... 14 1.1.3 Replicação viral ...... 16 1.1.4 Manifestações clínicas ...... 18 1.1.5 Epidemiologia ...... 19 1.1.6 Profilaxia e tratamento ...... 20 1.2 CALICIVÍRUS FELINO (FCV)( modelo para o Norovírus humano (NoV)) ...... 21 1.2.1 Histórico ...... 21 1.2.2 Classificação e morfologia ...... 22 1.2.3 Replicação viral ...... 24 1.2.4 Manifestações clínicas ...... 25 1.2.5 Epidemiologia ...... 26 1.2.6 Profilaxia e tratamento ...... 27 1.3 VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA( modelo para o Norovírus humano (BVDV))...... 29 1.3.1 Histórico ...... 29 1.3.2 Classificação e morfologia ...... 30 1.3.3 Replicação viral ...... 32 1.3.4 Manifestações clínicas ...... 33 1.3.5 Epidemiologia ...... 35 1.3.6 Profilaxia e tratamento ...... 36 1.4 PRODUTOS NATURAIS ...... 37 2. OBJETIVOS ...... 40 2.1 OBJETIVO GERAL ...... 40 2.0 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 40 3. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 41 3.1 AMOSTRAS VIRAIS E LINHAGENS CELULARES ...... 41 3.2 PREPARO DOS EXTRATOS ...... 41 3.3 ENSAIO ANTIVIRAL ...... 43 3.4 TESTE DE CITOTOXICIDADE ...... 44
3.5 ENSAIO COLORIMÉTRICO COM SAL DE TETRAZOLIUM (MTT) ...... 45 3.6 CÁLCULO DO ÍNDICE DE SELETIVIDADE (IS) ...... 46 3.7 TRIAGEM DO MECANISMO DE AÇÃO ...... 46 3.8 IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA ATRAVÉS DO GENE 16S DO rRNA ...... 47 3.9 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ...... 48 3.10 ANÁLISE EM CG-MS ...... 49 4. RESULTADOS ...... 51 5. DISCUSSÃO ...... 66
6. CONCLUSÃO ...... 73 6.1 CONCLUSÃO GERAL ...... 73 6.2 CONCLUSÕES ESPECÍFICAS ...... 73
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 75 8. ANEXO I ('' Actinobacteria from Termite Mounds Show Antiviral Activity against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model for Hepatitis C Virus'’)...... 90
9. ANEXO II ...... 101
10. ANEXO III ...... 102
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1. INTRODUÇÃO
Os vírus são a entidade biológica mais abundante e mais diversificada da biosfera (Mokili et al.,2012) gerando anualmente diversos surtos que afetam tanto a saúde pública quanto animal.
Nos últimos anos foram registrados surtos associados ao vírus Ebola nos países ocidentais do continente Africano causando febre hemorrágica(Kadav et al., 2015) e outro com distribuição quase mundial relacionado ao vírus da síndrome respiratória do Oriente Médio, um coronavírus responsável por causar doença respiratória grave, febre, tosse e falta de ar (Jalal, 2015). Ambos provocaram diversas mortes e, até o momento, não apresentam vacinas nem tratamento antiviral disponíveis.
Os problemas relacionados aos vírus não se limitam somente a surtos, também existem aqueles que já estão estabelecidos mundialmente que causam graves problemas em grande parte da população animal e humana e que também não possuem vacinas nem tratamentos antivirais, como é caso dos herpesvírus, de algumas hepatites virais e dos norovírus, ainda que este último também seja responsável por surtos esporádicos.
Dentreos vírus já conhecidos e que ainda causam muitos problemas devido a ineficiência do tratamento, despertam interesse, devido ao grande pejuízo à saúde e alta prevalência: o herpesvírus humano tipo 1 (HHV-1) conhecido como herpes labial; o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) que, além dos problemas gerados em bovinos também é utilizado como vírus modelo para o estudo da hepatite C (VHC) e, ainda, o calicivírus felino (FCV), causador de doenças em felinos e também utilizado como modelo para o estudo dos norovirus humano(NoV).
1.1 HERPESVÍRUS HUMANO TIPO 1 (HHV-1)
1.1.1 Histórico Os herpesvírusafetam tanto vertebrados quanto invertebrados e convivem com os humanos desde a época do ancestral comum do homem com o chimpanzé (de Souza e Chiesse, 2014). Durante essa evolução, os vírus tornaram-se fortemente associados com seus hospedeiros e co-evoluíram com eles, o que justifica o seu alto grau de adaptação (Muylaert et al., 2011; Severini et al., 2013). 14
Os pimeiros registros documentados do HHV-1 foi por um médico grego Hipócrates(460/377 a.C.) que, ao observar o aspecto das vesículas na pele causadas pelo vírus, o batizou de herpes, do latim herpin significa rastejar.Pouco tempo depois, um historiador grego Heródoto (484/425 a.C.) nomeou a doença causada pelo herpes de herpes febrilis devido as lesões, como úlceras nos lábios, e o aparecimento de febre nos doentes (Miranda, 2002). Já no século XX, demonstrou-se através de estudos histológicos a presença de células gigantes multinucleadas relacionadas à infecção, além disso, comprovou-se a natureza infecciosa dessas lesões através da inoculação de material de vesículas herpéticas em córnea de coelhos (Goodpasture e Teague, 1923). Ainda nesse mesmo período, descobriu-se que esse vírus afeta uma variedade de hospedeiros um meio de cultivá-lo in vitro (Miranda, 2002). Atualmente,o HHV-1 continua sendo muito estudado devido aos problemas que ele ainda causa na saúde humana, principalmente em pacientes imunodeprimidos (Zuckerman e Limaye, 2013), a fim de conhecer melhor seus mecanismos de infeção e também na busca por novos tratamentos visto o rápido aparecimento de estirpes virais resistentes as drogas (Alvarez et al., 2015).
1.1.2 Classificação e morfologia Os herpesvírus são pertencentes a ordem Herpesvirales, família Herpesviridae (Tischer e Osterrieder, 2010). Essa família é subdividida em três subfamílias: Alphaherpevirinae , Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae, que diferenciam-se entre si quanto as propriedades biológicas, organização e conteúdo do genoma, tipo celular no qual estabelecem latência e na duração do ciclo replicativo (Pellett e Roizman, 2007; Tischer e Osterrieder, 2010). O HHV-1 pertence a subfamília Alphaherpesvirinae que apresenta como características específicas: latência nos gânglios sensoriais e autonômicos; ciclo replicativo curto e ampla gama de hospedeiros (Fauquet et al., 2005; Pomeranz et al., 2005).Em 1968, esse vírus foi classificado como sendo do gênero Simplexvirus por Nahmias e Dowdle, devido as suas características antigênicas e biológicas. As partículas virais do HHV-1, em escala macromolecular, possuem cerca de 125nm de diâmetro e em média 200 MM (massa molecular), sendo compostas por ~5000 moléculas de proteínas de diversos tipos diferentes (Cardone et al., 2012). 15
Na Figura 1, a estrutura do HHV-1 é representada. Esses vírions do HHV-1 apresentam uma organização em quatro camadas: (A) núcleo com DNA viral; (B) capsídeo icosaédrico que circunda o núcleo; (C) tegumento; (D) envelope externo (Scrima et al., 2015).
Figura 1: Estrutura do HHV-1. (A) Núcleo; (B) Capsídeo icosaédrico; (C) Tegumento; (D) Envelope externo, adaptado de www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/assets/bio307/jehodge/page01.html
• (A) – O núcleo contém uma cadeia dupla linear de DNA com extensão que varia entre 150-153kb com 68% de G+C (Miranda, 2002). O material genético desses vírus vem sendo estudado desde o início dos anos 1980 e hoje já existem sequências de genoma completas (McGeoch et al., 2006). O genoma desse vírus é constituido por duas regiões únicas e dois grandes conjuntos de repetições invertidas. A estrutura completa, representada na Figura2, inclui uma região única longa (UL) e outra região única curta (US) ambas revestidas por grandes cópias invertidas repetidas conhecidas como terminais e internas. Na UL, essas regiões são denominadas TRL (terminais repetidas longas) e IRL (seqüências internas repetidas longas), enquanto a US possui as TRS (terminais repetidascurtas) e IRS(seqüências internas repetidas curtas) (Szpara et al., 2014).
Figura 2: Organização genômica do HHV-1, adaptado de Szpara et al. (2014)
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• (B) – O caspídeo é composto de 162 capsômeros em simetria icosaédrica. A estrutura externa é formada por quatro proteínas virais estruturais: VP5 (a principal delas), VP26, VP23 e VP19 (Arduino e Porter, 2008). • (C) – O tegumento é uma camada proteica não estruturada localizada entre o envelope e o capsídeo composto por pelo menos 20 proteínas virais sendo a mais notável delas a VP16, uma proteína viral transativadora e a VP22 que está associada a disseminação do vírus de uma célula para outra. Além dessas, também estão presentes no tegumento a VHS, com capacidade de degradar RNA mensageiro viral e das células hospedeiras (Roizman et al., 2007). • (D) – O envelope externo possui de 600 a 750 espículas e é contituído por uma bicamada lipídica com cerca de 11 glicoproteínas sendo quatro delas (gD, gH, gL e gB) essenciais para a entrada do HHV-1 nas células (Arduino e Porter, 2008). Além disso, o envelope contém pelo menos duas proteínas intrínsecas não glicosiladas (Roizman et al., 2007).
1.1.3 Replicação viral O HHV-1 pode infectar diferentes tipos de células epiteliais e estabelecer infecções latentes em gânglios neuronais. A infecção lítica, ou seja aguda, requer a ativação da transcrição viral, a replicação do DNA e a produção de progênie viral, juntamente com a inativação das defesas do hospedeiro (Deng et al.,2014). Já a infecção latente está relacionada com a interrupção do ciclo replicativo, em outras palavras, não ocorre expressão gênica significativa permanecendo o genoma viral no núcleo dos neurônios (Franco et al., 2012).A replicação ocorre no núcleo da célula do hospedeiro e o HHV-1 caracteriza-se por estabelecer latência. A fase lítica inicia-se com a primeira exposição das células epiteliais do hospedeiro seguida pela replicação viral nestas células e nos neurônios sensoriais que inervam a pele. Nas mucosas ocorrem as manifestações clínicas da infecção que duram alguns dias. Esses sintomas da infecção lítica desaparecem, entretanto a infecção persiste em um estado de latência até que o vírus é reativado devido a uma variedade de estímulos como febres, queimaduras solares, inflamações e estresses fisiológicos e/ou psicológicos (Franco et al., 2012). A primeira etapa do ciclo replicativo inicia-se com a adsorção e penetração dos vírus às células. Esses processos estão associados a diferentes proteínas do envelope viral que interagem com os receptores celulares do hospedeiro. A adsorção, propriamente dita, ocorre 17
através de glicosaminoglicanas (sulfato de heparan) que aumentam a concentração de vírus na supercífie celular para que os ligantes virais encontrem os receptores. Essa interação vírus e sulfato de heparan ocorre pela ação da glicoproteína C (gC) e, em seguida, a proteína gD liga- se a correceptores da membrana plasmática. Esses correceptores podem ser da família de receptores do fator de necrose tumoral (TNF) como o HVEM, da família de receptores de poliovírus como as nectinas 1 e 2 ou ainda o receptor sulfato de heparina. Após as ligações, ocorre a fusão do envelope viral à membrana plasmática a partir da ação da gD, gH-gL e gB. Com essa fusão, algumas proteínas do tegumento se dissociam do nucleocapsídeo e permanecem no citoplasma da célula do hospedeiro enquanto outras se direcionam ao núcleo (Franco et al., 2012). Já no interior da célula infectada, o nucleocapsídeo é transportado para próximo do núcleo a partir de microtúbulos celulares, onde se associam aos poros nucleares ocorrendo a desintegração e liberação do genoma viral dentro do núcleo celular. Nesse momento, o genoma viral circulariza-se e inicia-se a transcrição através da RNA polimerase II da célula.A transcrição imediata ocorre assim que o genoma é liberado no núcelo e envolve os genes α. Esse processo depende da proteínas VP16 (do tegumento) e os produtos são as proteínas ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e ICP47 que tem a função de estimular a continuidade da transcrição pelos genes β(Franco et al., 2012). Dos produtos dos genes β destacam-se as enzimas timidina quinase (TK) e o ribonucleotídeo redutase (RR) que catalizam a síntese de nucleotídeos trifosfato. Além disso, também são produzidas as proteínas de ligação ao DNA: a helicase (UL9) e a DNA polimerase viral, ou seja, a expressão dos genes β possibilita uma intensa síntese de nucleotídeos e a replicação do genona viral, propriamente dito (Franco et al., 2012). Em seguinda, os genes β deixam de se expressar e os genes γ iniciam sua expressão originando principalmente as proteínas estruturais do núcleo, capsídeo e envelope para a formação das novas partículas virais. Juntamente com a expressão dessas três classes de genes , ocorre a inibição das atividades celulares do hospedeiro(Franco et al., 2012). A saída dos vírions infecciosos para o citoplasma celular envolve um processo de desenvelopamento e reenvelopamento: o primeiro envelope é formado a partir do brotamento do nucleocapsídeo pela membrana nuclear interna, entretanto esse envelope é perdido pela fusão do mesmo com a membrana nuclear externa. O reenvelopamento ocorre no complexo de Golgi para então serem transportadas por vesículas derivadas desse complexo (TGN) para a superfície celular sendo liberadas das células por exocitose (Melancon et al., 2004). 18
A infecção latente, é estabelecida após a infecção primária e ocorre nos neurônios sensoriais. Essa infecção caracteriza-se pela ausência de transcrição do genoma viral com exceção do transcrito LAT. Ainda que existam estudos que questionam a essencialidade desse transcrito para a latência, sabe-se que ele está relacionado com a eficiência e capacidade de reativação a longo prazo. A ação do transcrito LAT está associada a sobrevivência dos neurônios infectados e a inibição dos genes α, que são fundamentais para que haja a replicação lítica (Nicoll e Efstathiou, 2013).
1.1.4 Manifestações clínicas O herpes humano está associado a úlceras mucocutâneas recorrentes (Lee et al., 2015). No caso do HHV-1, devido ao tropismo, essas lesões ocorrem principalmente na região orolabial (Bedoui e Greyer, 2014). A maioria dos casos são autolimitados com presença de feridas e vesículas na região da face, boca e lábios (Reggiori et al., 2008). Entretanto, em alguns casos em pacientes imunocomprometidos, como recém nascidos, idosos ou portadores de doenças crônicas e transplantados, esse quadro pode ser agravado induzindo a situações clinicamente mais severas com manifestações neurológicas que podem ser fatais (Harden et al., 2009; Norberg, 2010). Além disso, apesar da maioria dos casos de herpes genital estar associado ao herpes humano tipo 2 (HHV-2), cerca de 30% dos casos tem sido relacionados ao HHV-1 (Singh et al., 2005). Contudo, nesses casos, a infecção é menos severa e tem menor taxa de recorrência sintomática quando comparada ao HHV-2 (Azwa e Barton, 2009). A infecção primária caracteriza-se por uma incubação de até 26 dias podendo ocorrer quadros de febre, náuseas, mal estar e dor de cabeça. O início da fase aguda é abrupta e, na mucosa afetada, desenvolvem-se vesículas. As lesões que apresentam-se mais brandas podem desaparecer em até 7 dias, mas em casos mais severos a recuperação pode durar até 3 semanas (Kolokotronis e Doumas, 2006). A partir desse momento, podem ocorrer reativações virais que são antecedidas por queimação, coceira e ou formigamento, em geral na região onde ocorreu a infecção primária, seguidas pela formação de vesículas até 48 horas após esses sintomas. Esse período tende a ser o de dor mais intensa. Em seguida, as vesículasse desenvolvem em úlceras na pele e posterior formação de uma crosta. O desaparecimento das manifestações clínicas se completa espontaneamente, na maioria dos casos, em até 10 dias após a infecção (Roizman et al., 2007). O estabelecimento e a infecção latente propriamente dita não estão associados a sinais clínicosexistindo muitos casos de reativação viral que apresentam-se assintomáticos 19
(Simmons, 2002). Por outro lado, também podem ocorrer muitas outras doenças relacionadas ao HHV-1 como encefalite, herpes neonatal, meningite, entre outras. A mais comum, chamada de gengivomastite herpética caracteriza-se por lesões típicas na região que envolve a mucosa da faringe. Além disso,o HHV-1 pode levar também a um quadro de ceratite herpética,ainda que menos frequente trata-se de uma doença grave que afeta o epitélio da córnea, sendo a principal causa de cegueira nos países desenvolvidos (Schleiss, 2009).
1.1.5 Epidemiologia
A infecção pelo vírus do herpes labial afeta de 45% à 98% da população mundial (Xiang et al., 2008). Essa prevalência varia consideravelmente de acordo com o grupo racial, localização geográfica (diferentes países ou até mesmo entre regiões do mesmo país), situação socioeconômica e idade (Liesegang, 2001; Miranda et al., 2002). Na infância, por exemplo, a soroprevalência pode chegar à 39% aumentando na fase adulta quando cerca de 60% à 95% dos indivíduos são afetados (Fatahzadeh e Schwartz, 2007; Conrady et al., 2010; Memish et al., 2015).
No Brasil, a prevalência de anticorpos para o HHV-1 chega a 67,2% não havendo distinção em relação ao gênero, mas aumentando conforme a idade. Além disso, essa soroprevalência não é homogênea havendo variações em relação a localização geográfica (Clemens e Farhat, 2010).
O vírus é transmitido por contato direto da mucosa ou pele não íntegra com secreções que apresentam partículas virais, ou seja, a transmissão ocorre de um indivíduoexcretando vírus para um indivíduo suscetível a partir do contato íntimo e pessoal (Rácz, 2008). O vírus também pode ser transmitido por gotículas respiratórias ou exposição à secreções mucocutâneas de uma pessoa assintomática. Além disso, cerca de 67% dos indivíduos com herpes labial carregam o vírus em suas mãos indicando a possibilidade de transmissão horizontal, apenas por contato próximo, ainda que não íntimo(Fatahzadeh e Schwartz, 2007).
Por fim, os poucos casos de infecções fatais e a capacidade de estabelecer latência contribuem para que mais da metade da população mundial apresente infecções recorrentes e, consequentemente, seja capaz de transmitir o vírus (Roizman et al., 2007).
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1.1.6 Profilaxia e tratamento O tratamento das infecções causadas pelo HHV-1 inicia-se na prevenção a partir da educação das pessoas sobre a natureza contagiosa da doença. Uma vez que a erradicação viral não é uma alternativa, tendo em vista que os agentes antivirais existentes não curam as infecções, apenas alteram o curso clínico da doença através da inibição da replicação viral diminuindo o dano epitelial, medidas para diminuir a transmissão, suprimir as recorrências, atenuar a evolução clínica, a excreção viral e suas complicações são prioridade(Fatahzadeh e Schwartz, 2007). Muitos indivíduos infectados pelo HHV-1 não requerem tratamento, sendo necessário apenas quando a taxa de recorrência é alta e nos pacientes imunodeprimidos. Ainda assim, todos os portadores do herpes labial devem ser cuidadosos nos aspectos de higiene a fim de evitar a contaminação de lugares e pessoas (Simón, 2012). Para os pacientes que necessitam, existem diversos antivirais para o tratamento do herpes labial. O mais conhecido deles é o Aciclovir (ACV ®), um análogo da deoxiguanosina (guanina+molécula acíclica) que tem sua ação baseada na fosforilação do antiviral pela timidina quinase viral inibindo a síntese de DNA total. Outro antiviral muito usado por via oral e que apresenta uma biodisponibilidade maior é o Valaciclovir ® que, após sua ingestão, é rapidamente convertido em aciclovir (Rácz, 2008). Entretanto, um dos maiores problemas relacionados ao tratamento do herpes labial é o aparecimento de cepas contendo mutações na timidina quinase e/ou na DNA polimerase, gerando estirpes virais resistentes a esses medicamentos (McClain et al., 2015). Por outro lado, existem também o Foscarnet ® e o Cidofovir ®, que por apresentarem mecanismo de ação diferentes do ACV, podem ser uma alternativa no tratamento do herpes labial causado por cepas virais que possuem resistência ao aciclovir e seus derivados(Miranda, 2002). Infelizmente, ambostêm uma fraca biodisponibilidade oral, têm de ser administrados por via intravenosa e já foi relatado resistência viral (Andrei e Snoeck, 2013). Além disso, mesmo com a utilização da dose recomendada de todos esses antivirais, foram relatados inúmeros efeitos colaterais, principalmente associados a neurotoxicidade e disfunção renal (Mancini et al., 2009; McClain et al., 2015). Com relação a vacinas, ainda que hajam muitos estudos em busca de uma vacina eficaz contra o herpes, não só labial causado pelo HHV-1 mas também pelo herpes genital, causado principalmente pelo HHV-2, até o momento não há nenhuma disponível contra esses vírus (Szpara et al., 2011). 21
Enfim, com toda essa problemática associada ao herpes labial, principalmente em pacientes imunodeprimidos, somado a resistência desse vírus contra os antivirais disponíveis comercialmente e a falta de vacinas, torna-se necessária a busca por novos compostos que apresentem atividade antiviral e que possam ser utilizados para a produção de novos fármacos, possivelmente com menores efeitos colaterais.
1.2 CALICIVÍRUS FELINO (FCV) ( modelo para o Norovírus humano (NoV))
1.2.1 Histórico
Os calicivírus possuem um amplo espectro de hospedeiros acometendo uma grande variedade de animais, incluindo o ser humano. O primeiro relato de um calicívírus foido vírus do exantema vesicular dos suínos (VESV) em meados de 1930 devido a uma epidemia associada aos suínos, nos Estados Unidos. Os sintomas eram muito semelhantes ao da febre aftosa, ainda que o hospedeiro fosse outro. Posteriormente, verificou-se que se tratava de um novo agente viral (Thiel e König, 1999; Neill e Bauermann, 2012).
O calicivírus felino (FCV) foi isolado pela primeira vez em cultura celular em 1957 na Nova Zelândia e classificado como membro da família Picornaviridae . No entanto,tornou-se evidente que esse novo vírus era diferente dos picornavírus em relação a sua estrutura, estratégia de replicação e propriedades físico-químicas. Com isso, em 1978 o FCV foi retirado da família Picornaviridae (Green et al., 2000).
A doença causada pelo FCV também foi confundida com a panleucopenia felina (FPLV), vírus este membro da família Parvoviridae . Entretanto notou-se que o vírus isolado causava um efeito citopático em cultivos celulares em um período muito curto após a inoculação questionando a atribuição da doença ao FPLV. Dessa forma, o FCV foi classificado como sendo da família Caliciviridae (Neill e Bauermann, 2012).
Em humanos, o primeiro caso associado aos calicivírus humanos ficou conhecido como “winter vomiting disease” que ocorreu em uma escola primária em Norwalk em Ohio (Estados Unidos), mas na época não foi atribuído ao surto nenhum agente etiológico. Em 1972, Kapikian e seus colaboradores demostraram por imunoeletromicroscopia que o agente era um vírus que ficou conhecido como “Norwalk virus” (NoV) (Hutson et al., 2004). Em 1977, outro surto de gastroenterite ocorreu no Japão, na cidade de Sapporo e foi descoberto 22
um outro vírus muito semelhante ao NoV mas antigenicamente distinto, chamado de “Sapporo virus” (SV) (Santos, 2002).
Atualmente, sabe-se que os calicivírus em humanos são os principais responsáveis pelas epidemias de gastroenterites.Entretanto, não existe uma terapia antiviral específica para o tratamento dos pacientes infectados (Garcicoechea et al., 2015). Além disso, o calicivírus de felinos (FCV) é um patógeno extremamente contagioso e está presente mundialmente nas populações de felinos (Radford, 2009). Também para esta infecção, não existe nenhum tratamento antiviral específico (Fenimore et al., 2015).
1.2.2 Classificação e morfologia
Os calicivírus são membros da família Caliciviridae que é composta por cinco gêneros que diferenciam-se entre si pelas diferenças genéticas e antigênicas: Lagovirus , Vesivirus , Nebovirus , Sapovirus e Norovirus (Sandoval-Jaime et al., 2012). Desses gêneros, os três primeiros são responsáveis por causar doenças principalmente em animais e os dois últimos estão associados a doenças em humanos (Neill e Bauermann, 2012).
O FCV pertence ao gênero Vesivirus que tem como importante característica, diferentes dos outros vírusda mesma família, a capacidade de afetar ao mesmo tempo animais terrestes e marinhos possuindo uma ampla variedade de hospedeiros de diferentes classes como mamíferos, aves, répteis, peixes e anfíbios (Sandoval-Jaime et al., 2012; Martella et al., 2015). Além disso, os membros desse gênero tem a capacidade de se replicarem em cultivo celular causando um efeito citopático visível em microscopia óptica (Miao et al., 2015).
As partículas virais do FCV, assim como dos outros vírus da família Caliciviridae são pequenas com cerca de 27-40nm, com diâmetro de 35nm e não envelopadas. O nome “calivírus” vem da conformação da superfície das partículas virais que possui depressões em forma de cálice (Neill e Bauermann, 2012).
Os vírions do FCV apresentam duas estruturas: (A)núcleo com o RNA viral (B) capsídeo icosaédrico(Figura 3).
23
B
A
Figura 3: Estrutura do FCV com seu capsídeo e genoma de RNA destacados . Adaptado de http://viralzone.expasy.org/all_by_species/197.html
• (A) – O genoma é RNA de cadeia simples com polaridade positiva. Apresenta comprimento de cerca de 7,7kb e possui uma proteína denominada VPg que liga -se através de uma ligação covalente na extremidade 5’ e que é poliadenilada na extremidade 3’ (Abente et al., 2010). Esse geno ma possui três diferentes ORFs (sequência aberta de leitura). A primeira delas (ORF 1) é responsável pela codificação das proteínas não estruturais (NS1 -NS6/7), entre elas a protease viral e a RNA polimerase. A ORF 2 codifica a principal proteína do caspídeo (VP1) . Por fim, a ORF 3 codifica outra proteína estrutural (VP2) (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010). Sua organização genômica se assemelha muito aos norovírus (NoV) e por este ser incapaz de ser cultivado in vitro , o FCV é amplamente utilizado para compreender a biologia e desenvolver novas drogas antivirais frente ao NoV , como inativadores virais para tratar águ as que podem estar contaminadas e, també m, para o tratamento de doentes (Bae e Schwab, 200 8; Shivanna et al., 2014 ). A Figura 4 demonstra semelhança da organização genônica do FCV (a) e, abaixo, do NoV (b).
a
b
24
Figura 4: Organizações genômicas dos vírus FCV (A) e NoV (B), adaptado de Neill e Bauermann , 2012
• (B) – O capsídeo é icosaédrico constituído por 90 dímeros da principal proteína estrutural (VP1) e cerca de 10 cópias de outra proteína estrutural (VP2) (Abente et al., 2010;Shivanna et al., 2014). A proteína VP1 é subdividida em seis regiões devido a diferenças quanto a conservação das sequências, sendo as regiões B, D e F as mais conservadas e as regiões C e E mais variáveis. Assim, a região E tem sido utilizada como base para diferenciar estirpes. Além disso, essas regiões hipervariáveis também estão associadas a ligação do vírus aos receptores celularespodendo definir as características antigênicas das diferentes cepas. Quanto a VP2, ainda não está muito clara a sua função, entretanto acredita-se que ela esteja envolvidacom a infectividade viral e, juntamente com a VP1, com a estabilidade do capsídeo. (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010; Shivanna et al., 2014).
1.2.3 Replicação viral
A penetração das partículas virais nas células envolve consecutivas interações entre os fatores virais e a célula, entre elas estão: a ligação dos vírus às células, mediada por receptores, a liberação do genoma viral e o início da replicação (Shivanna et al., 2014).
A etapa da penetração ocorre por endocitose e é um processo pH dependente, ou seja, a entrada dos vírions de FCV nas células exige uma acidificação do pH (Kreutz and Seal, 1995). Quanto a liberação do genoma viral, pode ocorrer na membrana plasmática, em caso de penetração direta, ou nos endossomas ou ainda em outros compartimentos celulares (Shivanna et al., 2014).
A replicação ocorre em vesículas da membrana formadas no citoplasma das células infectadas e o RNA, sendo de polaridade positiva, funciona como RNA mensageiro (Santos, 2002; Bailey et al., 2010).
Inicialmente a tradução do genoma é mediada por interações entre a proteína VPg com a maquinaria celular. O RNA genômico, como citado anteriormente, possui três ORFs. A tradução da primeira delas (ORF 1) produz uma poliproteína que posteriormente será clivada pela protease formando as proteínas não estruturais, como a replicase viral, a protease de cisteína e a helicase de RNA. A primeira delas é responsável pela síntese de uma cópia do 25
RNA com polaridade negativa, ou seja no sentido antigenômico. Esse RNA antigenômico é utilizado como molde para a síntese deum RNA mensageiro subgenômico (mRNAsg). A ORF 2 depende da ação desse mRNAsg, originado pelo RNA antigenômico e, dessa forma, se produz a principal proteínaestrutural do capsídeo, aVP1. A terceira e última ORF (ORF 3) também será traduzida a partir do mRNAsg e codifica a VP2, outra proteína estrutural que também faz parte do capsídeo. O empacotamento do RNA viral, a maturação e a liberação dos vírions ainda não está elucido. (Green, 2007; Neill e Bauermann, 2012). Contudo, sabe-se que replicação do FCV é lítica, ou seja, induz a apoptose das células infectadas permitindo a liberação e consequente disseminação dos vírions que podem infectar novas células (Alvarez- Sanchez et al., 2015).
O FCV, sendo um vírus de RNA e por não possuir um mecanismo de correção de possíveis erros durante a replicação, apresenta um elevado grau de mutações e, consequentemente, uma garnde capacidade adaptativa, tornando ainda mais difícil seu controle (Radford et al., 2007).
1.2.4 Manifestações clínicas
A doença causada pelo FCV é comum em gatos domésticos, mas acomete toda a população de felinos (Radford et al., 2009). Na maioria dos casos as infeções são moderadas e auto-limitadas. Entretanto, com a grande variabilidade genética, as manifestações clínicas variam entre os diferentes isolados e, em geral,incluem conjutivite, ulceração oral, doença das vias respiratórias superiores e, nos casos mais graves, pode se estabelecer uma doença sistêmica virulenta por FCV associada a uma alta taxa de morbidade e mortalidade (Abente et al., 2010; Burmeister et al., 2015).
O principal sítio de replicação do FCV é a orofaringe e a viremia acontece cerca de 3 – 4 dias após a infecção, quando o vírus também pode ser detectado em diferentes tecidos. Nesse momento, ocorre a necrose das células epiteliais e as vesículas que surgem as margens da língua tornam-se úlceras. A cura completa ocorre, aproximadamente, após 2 ou 3 semanasmas os gatos ainda continuam sendo transportadores do vírus por tempo variável, desde meses até anos. Nos casos do estabelecimento da doença sistêmica virulenta por FCV, a manifestação ocorre como vasculite generalizada envolvendo diversos orgãos, além dos possíveis quadros de pirexia, edema cutâneo, dermatite ulcerativa, anorexia e icterícia. Essa doença sistêmica pode causar a morte de até dois terços dos gatos infectados. Nos gatos que 26
se recuperam, a doença aguda desaparece em cerca de 30 dias, mas eles continuam portadores dos vírus por muito mais tempo (Radford et al., 2009; Henzel et al., 2012).
Apesar das semelhanças que permitem a utilização do FCV como modelo para o estudo dos nororvírus, as manifestações clínicas que eles causam em seus respectivos hospedeiros são diferentes, sendo o primeiro mais associado a doenças no trato respiratório e o segundo a males no trato gastrointestinal (Bae e Schwab, 2008).
Nos casos do calicivírus humano, os norovírus (NoV) são a principal causa de casos esporádicos e surtos de gastroenterites no mundo todo (Cancio-Lonches et al., 2011; Alvarez-Sanchez et al., 2015). O NoV é altamente infeccioso, ou seja, uma baixa dose infecciosa, menos de 10-100 partículas virais, é capaz de infectar um indivíduo e causar a doença gerando sintomas como náuseas, cólicas abdominais, vômitos e diarréia (Chiu et al., 2015).
A infeção pelo NoV pode ser também assintomática, cerca de 15-35% dos casos, naquelas sintomáticas, os primeiros sinais podem aparecer entre 24-48 horas após a exposição viral e inicialmente, pode se desenvolver um quadro febril (Newman e Leon, 2015).A fase aguda do NoV geralmente dura de 1 a 3 dias. Nos casos de pacientes imunocompetentes a recuperação é rápida, ainda que seja possível detectar partículas virais até 30 dias após a infecção. Entretanto a doença pode ser mais grave e tornar-se fatal em idosos e pacientes imunocomprometidos podendo a excreção viral persistir por meses ou até anos (Garaicoechea et al., 2015)
Nos últimos anos têm-se associado o desenvolvimento de doenças como a síndrome do intestino irritado ou mesmo a piora nos quadros de doença inflamatória intestinalcomo possíveis sequelas da doença causada pelo NoV(Newman e Leon, 2015).
1.2.5 Epidemiologia
O FCV é um vírus comum na população de gatos e não possui hospedeiros alternativos. O homem não pode ser infectado por ele. A prevalência é proporcional a quantidade de gatos no mesmo ambiente e é ainda maior se esses gatos vivem agregados, ou seja, em gatos domésticos que vivem em pequenos grupos é cerca de 10%, enquanto que em grandes grupos, como em abrigos, a prevalência pode chegar a 40% (Radford et al., 2009). 27
A excreção viral ocorre principalmente por secreções nasais e orais durante a fase aguda da doença, apesar de muitos gatos continuarem transmitindo o vírus após a recuperação (Radford et al., 2009). A transmissão ocorre pelo contato direto entre os gatos que estão infectados e aqueles que são susceptíveis. Casos de transmissão indireta também podem ocorrer através de secreções de animais infectados que podem contaminar comedouros, bebedouros entre outros objetos(Henzel et al., 2012).
Os norovirus (NoV), por sua vez, são a causa mais comum de casos esporádicos e epidemias de gastroenterites não bacterianas no mundo. Nos EUA, o número estimado de casos de contaminação é de cerca de 5,5 milhões de indivíduos anualmente, enquanto que na Ingraterra esse número é de 2 milhões por ano(Newman e Leon, 2015; Phumpholsup et al., 2015). Nos países em desenvolvimento o número de hospitalizações é de cerca de 1,1 milhão de indivíduos anualmente e cerca de 200.000 mortes de crianças de até 5 anos de idade (Fioretti et al., 2014). Em países com ainda menos recursos, como a África e o Sudeste da Ásia, a gastroenterite causada pelo NoV e outros agentes são as principais causas de morbidade e mortalidade, principalmente em crianças (Newman e Leon, 2015).
No Brasil, os NoV são prevalentes em surtos de gastroenterites. A infecção por esse vírus é muito comum já que ele é amplamente disseminado em diversos ecossistemas aquáticos brasileiros, como águas residuárias urbanas e hospitalares no Rio de Janeiro, Florianópolis e em águas costeiras na regiao Sul (Prado e Miagostovich, 2014).
Os NoV podem ser transmitidos de forma direta de indivíduo para indivíduo ou a partir de fezes e vômito de pessoas infectadas ou através da ingestão de alimentos ou água contaminada. A contaminação de alimentos pode ocorrer pela manipulação e preparação deles sem os devidos cuidados de higiene, ou ainda, estar relacionado ao ambiente que também pode estar contaminado e, assim, a ingestão deles cru, como no caso de peixes, moluscos e saladas pode também ser responsável pela transmissão do vírus. Além disso, a transmissão também pode ocorrer a partir da ingestão de gelo feito com água ou material contaminado(Richards, 2012).
1.2.6 Profilaxia e tratamento
A principal forma de profilaxia contra o estabelecimento da infecção causada pelo FCV em gatos é a utilização de vacinas, já aplicada a mais de 20 anos (Abente et al., 2010). 28
No caso dos gatos de estimação que não vivem em grandes populações, essa vacinação tem se mostrado, na maioria das vezes, eficaz. Entretanto, quando os gatos vivem em grupos maiores a vacinação deve ser cuidadosamente acompanhada devido a possíveis falhas vacinais causadas pela ausência do estabelecimento de uma imunidade esterelizante (Radford et al., 2007; Abente et al., 2010).
Todas as vacinas licenciadas contra o FCV são baseadas em antígenos virais produzidos em cultura celular. São de aplicação parenteral ou intranasal, mas esta última menos frequente, e a maioria delas são monovalentes, ou seja, possuem apenas uma estirpe viral com o vírus inativado ou atenuado. Contudo, o maior problema das vacinas utilizadas atualmente é a varibilidade antigênica das estirpes do FCV, pois nenhuma vacina é eficaz para neutralizar todos os isolados, portanto, é provável a ocorrência de um escape viral (Radford et al., 2007).
Quanto ao tratamento daqueles animais que já tem a infecção estabelecida, não há antivirais específicos. Nos últimos anos, a utilização de interferons tem sido aplicada para o redução dos sinais clínicos, mas esse tratamento não está disponível mundialmente. Além disso, existem relatos da utilização desses antivirais que não foram eficazes nem para o tratamento, nem para evitar a excreção viral pelos animais portadores do vírus (Fenimore et al., 2015)
A situação para o controle e tratamento dos calicivírus em humanos, no caso os norovírus (NoV), é ainda mais complicada, já que não existem vacinas nem tratamentos antivirais disponíveis. Vacinas compostas de vírus recombinantes estão sendo avaliadas, entretanto, apesar da necessidade de uma vacina polivalente, o número de componentes antigênicos necessários para que haja uma ampla proteção ainda não está estabelecido . Além disso, essa vacina apresenta uma proteção de curto intervalo, até 60 dias. (Garaicoechea et al., 2015).
Atualmente, a melhor maneira de evitar a propagação do vírusé a descontaminação de superfícies e ambientes, cuidados no contato com pessoas infectadas e a higienização para manipulação de alimentos (Glass et al., 2009).
Em casos de infecção pelo NoV, o tratamento é sintomático, pois ainda não foram desenvolvidos agentes antivirais específicos. Em geral, recomenda-se reidratação com líquidos e eletrólitos, seja por via oral ou intravenoso, em casos mais graves. Medicamentos 29
anti-motilidade e anti-secretores também podem ser utilizados para reduzir o quadro de diarréia em situações mais críticas (Glass et al., 2009).
Finalmente, com todos os problemas de falhas vacinais e ausência de vacina para a prevenção do FCV e do NoV respectivamente, e a falta de tratamento específico para ambos calicivírus, a busca por compostos que podem vir a ser utilizados pela indústria para a formulação de drogas antivirais é essencial para que haja o tratamento dos pacientes, principalmente nos quadros mais graves.
1.3 VÍRUS DIARRÉIA VIRAL BOVINA (BVDV) (modelo para o vírus da Hepatite C (VHC))
1.3.1 Histórico O primeirorelato da doença causada pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) foi no ano de 1946, em um rebanho em NovaYork e foi descrito por Olafson e seus colaboradores como uma doença infecciosa e aguda de bovinos. Após esse episódio, uma doença semelhante, mas mais grave foi relatada no Canadá, sendo considerada a primeira descrição da doença das mucosas em bovinos. Em 1953, foi observado que a doença das mucosas tinha algumas características em comum com a doença causada pelo BVDV, mas ainda acreditava-se que se tratavam de doenças distintas.No ano de 1957,o agente causadorda doença das mucosas foi isolado em cultivo celular causando efeito citopático e, no mesmo ano, isolou-seo vírus causador da doença do BVDVque não produziu efeito citopático.Poucos anos depois, pesquisadores da Universidade de Cornell isolaram um BVDV com efeito citopático e na tentativa de esclarecer a natureza dos vírus causadores das duas doenças, diarréia viral e doença das mucocas, estudos de caracterização viral e propriedades físicas e antigênicas foram analisados emambos e foi estabelecida a similaridade entre eles (Goens, 2002; Deregt, 2008). Mais tarde descobriu-se que essa dúvida sobre se tratarem de vírus diferentes foi devido a existência de dois biotipos diferentes:Um deles citopático e outro não citopático e pela capacidade do vírus de atravessar a placenta e estabelecer infecção e imunotolerância no feto que ao nascer continua infectado persistentemente (PI). Caso esses animais PI sofram uma nova infecção pelo BVDV, dessa vez citopático, o quadro se agrava e desenvolve-se a doença das mucosas. Nos casos onde não acontece essa infecção dos animais PI as 30
manifestações clinicas são mais brandas. De qualquer forma, o vírus responsável por ambas situações é oBVDV (Ridpath et al., 2012). No Brasil, os primeiros estudos sorológicos foram realizados na década de 70, no Rio Grande do Sul, mas há relatos clínico-patológicos e sorológicos que confirmaram a presença do BVDV no país desde o final dos anos 60 (Flores et al., 2005). Além de sua importância na veterinária, o BVDV apresenta grande similaridade quanto ao arranjo genômico com outro membro de sua família de muita importância para os seres humanos, o vírus da hepatite C (VHC)(Goens, 2002). Esse, por sua vez, só foi descoberto em 1989 após muitos anos de investigação que permitiu a identificação do seu genoma. O VHC foi o responsável por 80%- 90% das hepatites agudas e crônicas pós transfusionais não- hepatite A e não- hepatite B. Nesse mesmo ano, estabeleceu-se que o VHC possuia características biológicas peculiares que o diferenciava dos outros agentes hepatotrópicos (da Fonseca, 2010).
1.3.2 Classificação e morfologia O BVDV pertence a família Flaviviridae , responsável por doenças clinicamente significativas tanto em animais como em humanos. Todos os membros dessa família compartilham similaridades quanto a estrutura dos vírions, organização genômica e estratégias de replicação (Finkielsztein et al., 2010). Essa família possui três gêneros: Flavivirus , que são transmitidos principalmente por insetos, como o vírus da febre amarela e a dengue; Pestivirus , do qual o BVDV faz parte; Hepacivirus que tem como único membro o VHC, vírus exclusivamente humano. Os dois últimos gêneros compartilham um alto grau de similaridade(Sako et al., 2008; Lattwein et al., 2012; Ridpath et al., 2012). O gênero Pestivirus , inclui agentes patogênicos economicamente importantes exclusivamente de animais, entre eles, além do vírus da diarréia viral bovina (BVDV), também fazem parte o vírus da peste suína clássica (CSFV) e o vírus da doença da fronteira (BDV) (Wang et al., 2015). Todos esses vírus que compõe o genêro Pestivirus são antigenicamente relacionados ainda que a reatividade sorológica cruzada entre eles seja baixa, e isso pode acontecer também entre diferentes isolados do mesmo tipo de vírus (Ridpath et al., 2012). O BVDV apresenta grande variabilidade antigênica e pode ser dividido em dois grupos genética e antigenicamente distintos: BVDV-1 e o BVDV-2 , o primeiro esta associado a baixa/moderada virulência e, além disso, mais comumente utilizado como referência para a produção de vacinas por ser o mais prevalente. O genótipo 2 (BVDV-2) está 31
mais relacionado aos surtos com doença aguda e hemorrágica (Ridpath et al., 2012; Anziliero et al., 2015). As amostras do BVDV podem ainda ser classificados como citopatogênicos ou não-citopatogênicos, baseado nas suas características em cultura celular (Brodersen, 2014). Possuem em média diâmetro de 40-60nm, ou seja, são pequenos vírions e genomade RNA (Finkielsztein et al., 2010). Esse vírions possuem organização em 3 camadas: (A) núcelo com o RNA viral; (B) capsídeo icosaédrico que circunda o núcleo; (C) envelope externo (Figura 5).
B
C
A
Figura 5: Estrutura do BVDV. (A) Núcleo; (B) Capsídeo; (C) Envelope externo. Adaptado de http://viralzone.expasy.org/all_by_species/39.html
• (A) –O núcleo contém o genoma de RNA em cadeia simples e senso positivo de aproximadamente 12,3kb de extensão. Os genes C, Erns , E1 e E2 sãoestruturais enquanto os NS são não estruturais (Rice, 1996). O RNA genômico contém somente uma sequência aberta de leitura (ORF) e não é poliadenilado na extremidade 3’, nem tem uma proteína viral na extremidade 5’. Nessas regiões existem extensões nucleotídicas que não são traduzidas (5’UTR e 3’ UTR), que se dobram e formam estruturas secundárias que interagem com proteínas virais e celulares e, dessa forma, regulam a transcrição do RNA e a tradução da ORF(Neill, 2013).Essa estrutura genômica é semelhante ao VHC, além de compartilharem um elevado grau de homologia quanto as estratégias de expressão de proteínas e replicação (Grassman et al., 2005).Como o VHC não replica-sede maneira eficiente em cultivo, o BVDV tem sido amplamente utilizado para a avaliação de novos compostos com propriedades antivirais (Buckwold et al., 2003). A semelhança entre os genomasdo BVDV (a) e 32
VHC (b), i.e. a presença das UTRs e as regiões de codificação das proteínas NS, está ilustrada na Figura 6.
Figura 6: Orga nizações genômicas dos vírus BVDV (a) e VHC (b ), adaptado de Isken et al., 2015
• (B) – O capsídeo viral localiza-se em torno do RNA viral, no centro da partícula. Apresenta-se como uma estrutura eletrodensa de diâmetro de aproximadamente 30 nm e simetria icosaédrica , composto por várias cópias da proteína C (Ridpath, 2005; Finkielsztein et al., 2010 ).
• (C) – O envelope externo circunda o nucleocapsídeo e é co nstituido por uma bicamada lipídica derivada das membranas das células do hospedeiro possuindo três glicoproteínas associadas: E rns , E1 e E2(Ridpath, 2005; Ridpath et al., 2012 ).Essas glicoproteínas são as regiões de maior variabilidade e tem um papel importante nos estágios iniciais da infecção celular (Ronecker et al., 2008 ).A glicoproteína E1 funciona como âncora de membrana para a glicoproteína E2, que é a mais abundante e també m a mais variável e imunogênica . Juntas elas estão relacionadas a penetração dos vírions nas células ( Toth et al., 1999; Fu et al., 2014). Já a glicoproteína E rns se liga a glicosaminoglicanos, característica que indica uma participação no primeiro contato do vírus com as células permissivas (Wegelt et al., 2009 ).
1.3.3 Replicação viral As proteínas estruturais do BVDV (C, E rns , E1 e E2) estão associadas a entrada e saída das partículas virais da célula infectada.A primeira etapa da replicação, a adsorção viral, ocorre principalmente por meio da interação da glicoproteína E2 com receptores espec íficos nas superfícies das células permissivas(Fino et al., 2012).Em seguida, heterodímeros das 33
glicoproteínas E1 e E2 tem ação direta para a penetração dos vírions nas células, enquanto a Erns parece não ser fundamental para esse processo (Ronecker et al., 2008). Essa penetração ocorre por endocitose e com a dimuição do pH nos endossomas, ocorre a fusão do envelope viral com a membrana do endossoma seguida da dissociação do capsídeo e liberação do RNA genômico no citoplasma (Ridpath et al., 2012). Sendo o BVDV um vírus com genoma RNA de polaridade positiva, quando este é liberado no citoplasma, funciona como RNAm, portanto é imediatamente traduzido. No caso deste vírus, a tradução origina uma única poliproteína que devido a ação de proteases tanto celulares como virais, é clivada produzindo as proteínas estruturais e as não estruturais (NS) (Murray et al., 2008). Essas proteínas não estruturais estão envolvidas no processo de replicação do genoma viral agindo como proteases, helicase, cofatores e RNA polimerase. Dessa forma, ocorre a síntese de RNA complementar antigênico, ou seja, com polaridade negativa que, por sua vez, é utilizado como molde para a síntese dos RNA´s da progênie viral (Murray et al., 2008; Fino et al., 2012). Em seguida, inicia-se a montagem do nucleocapsídeo a partir da combinação das proteínas estruturais com o RNA genômico e a morfogênese viral, processo esse que ocorre em associação com o complexo de Golgi e retículo endoplasmático liso. Os novos vírions permanecem em vacúolos no citoplasma para então serem liberados por exocitose através da fusão desses vacúolos com a membrana celular (Ridpath et al., 2012) O VHC, além da semelhança na organização genômica, também apresenta estratégias replicativas muito similares ao BVDV, já que ambos utilizam como receptor o LDL para penetrar nas células hospedeiras e utilizam um IRES (“internal ribossome entry site”) similares quanto sua função para a realização da tradução. Ademais, ambos tem uma helicase NS3/ATPase, utilizam um NS4A com sua protease homóloga NS3 e uma RNA polimerase dependente de RNA NS5B, todas semelhantes entre si. Por fim, as etapas finais da replicação, ou seja, a maturação e liberação dos vírions, também parecem ser equivalentes. Dessa forma, justifica-se novamente a utilização do BVDV na busca por compostos bioativos contra o VHC (Buckwold et al., 2003).
1.3.4 Manifestações Clínicas
A infecção causada pelo BVDV pode ter uma grande variedade de manifestações clínicas. Nos casos dos imunocompetentes, os quadros são clinicamente discretos com recuperação do animal naturalmente. Nos demais, as manifestações são mais graves podendo, por vezes, ser fatal (Nishine et al., 2014). 34
Além da condição imunológica do animal, infecções simultâneas com outros patógenos, a cepa viral ou biótipo e, no caso das fêmeas, a fase de gestação também determinam a severidade da infecção aguda (Ridpath et al., 2012). Em geral, o vírus da diarréia viral bovina está associado a doença respiratória e reprodutiva, ainda que tenha sido inicialmente identificado em casos de doença gastroentérica (Flores et al., 2005). No caso de animais prenhes ocorre a infecção direta do feto e o dano da infecção será determinado pelo tempo de gestação. A infecção nos primeiros estágios são as que causam maior impacto reprodutivo (Ridpath, 2010).Nesses casos, podem ocorrer entre outras manifestações: reabsorção fetal, mumificação, mal formação congênita e desenvolvimento de animais PI (persistentemente infectado, portador do BVDV não citopático). O aborto pode ocorrer devido a infecção em qualquer momento da gestação e, no caso de infecções no terço final da gestação, em geral os bezerros nascem normais, livres do vírus e soropositivos (Ridpath et al., 2012). Os bezerros que nascem PI geralmente são soronegativos, imunotolerantes e clinicamente normais, entretanto excretam uma grande quantidade de vírus de maneira contínua e, a maioria, morre nos primeiros meses de vida. Caso esse animal seja infectado também por outro biótipo do vírus (BVDV citopático) desencadeia-se a doença das mucosas que, por sua vez, é fatal (Ridpath et al., 2012; Flores et al., 2005). No caso do vírus da hepatite C, o qual o BVDV é utillizado como modelo de estudo, os sinais clínicos são bem diferentes em humanos, espécie naturalmente hospedeira. Mesmo os sítios de replicação de cada um deles difere-se entre si, sendo que o BVDV tem como sítio de replicação as células do epitélio do trato respiratório superior, orofaringe e tecido linfóide regional, enquanto o VHC apresenta tropismo por hepatócitos e células mononucleares sangüíneas (Conte, 2000; Ridpath et al., 2012). A infecção aguda por VHC, quando sintomática são comuns o surgimento de febre, náuseas, vômitos, dores absominais e icterícia (Santos, 2002). Contudo, na maioria das vezes, apresenta-se como benigna e assintomática, entretanto, dos infectados cerca de 70% desenvolvem a infecção crônica (Lavanchy, 2011). Apesar desta infecção crônicageralmente não apresentar manifestações clínicas inicialmente, ela é uma das principais responsáveis pela cirrose hepática, carcinoma hepatocelular e transplantes de fígado, a longo prazo, ou seja, com a evolução da doença (Echevérria et al., 2015).
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1.3.5 Epidemiologia O BVDV apresenta distribuição mundial e, no Brasil, diversos estudos demonstram a ampla distribuição dele no rebanho bovino . Sua prevalência varia entre países e até mesmo entre as regiões. Estudos revelam que a soroprevalência dessa infecção entre diferentes países do mundo oscila de 18-93% e o índice de prevalência de animais PI na população bovina mundial varia de 0,2-7,1% (Brito et al., 2010), contudo, no Brasill, ainda não é conhecida sua real prevalência já que até o momento não foi realizado estudos específicos(Anziliero et al., 2015). Por outro lado, na grande maioria dos rebanhos da América do Norte e alguns países da Europa, essa prevalência de anticorpos pode chegar ate 80% dos animais, ou seja, nesses países o BVDV aparece como o agente viral mais importante visto que a febre aftosa já foi erradicada(Flores et al., 2005). Alguns países já estão em processo de erradicação do BVDV. Entretanto esse processo é dificil devido a grande população de bovinos e alta rotatividade de animais, o que pode a facilitar a transmissão. Os animais infectados podem ser assintomáticos, ainda que estejam excretanto vírus de forma contínua para o ambiente através de secreções nasais, saliva, sêmen e leitealém das excretas como urina e fezes. Ademais, foram relatados também casos de infecção pelo BVDV em animais silvestres, que podem ser transmissores do vírus.Entretanto a importância epidemiológica desses animais ainda é incerta (Ridpath et al., 2012). O VHCé um grave problema para a saúde pública mundial. Aproximadamente 170 milhões de pessoas, ou seja, cerca de 3% da população mundial, são portadores da infecção crônica (Chou et a., 2013). Somente no Brasil, são identificados por ano cerca de 10 mil novos casos (Pereira, 2012). Atualmente, o principal fator de risco associado a transmissão de VHC é a utilização de drogas injetáveis(McHutchison e Bacon, 2005). Estimativas recentes mostram um aumento de 2,8% na soroprevalência nos últimos 15 anos pelo mundo, ou seja o número de infecções causadas pelo VHC, tanto crônicas como agudas, já equivale a mais de 185 milhões. O problema torna-se ainda mais grave em caso de pacientes imunocomprometidos, como os HIV positivos sem tratamento. Além disso, estudos demonstram que o número de mortes provocadas por doença hepática secundária ao VHC vai continuar aumentando pelos próximos 20 anos. Entretanto, a taxa de incidência da infecção por VHC tem diminuido nos países mais desenvolvidos(Messina et al., 2015). 36
No Brasil, as taxas de incidência também variam de região para região, sendo a região Sudeste a que apresenta o maior número de infectados. Além disso, uma análise dos casos de infecções pelo VHC no período de 1997-2010 demonstrou um aumento significativo do número de infectados nas regiões Sudeste e Nordeste, enquanto nas regiões Sul e Centro- Oeste, esse número diminuiu. Por fim, na região Norte, a taxa de incidência permaneceu estável (Azevedo et al., 2015). As cepas do VHC são classificadas em 7 genótipos diferentes e os subtipos 1, 2 e 3 são os mais presentes mundialmente, sendo identificados como “subtipos epidêmicos”. As demais estirpes denominadas como “ estirpes endêmicas” são mais raras e circulam por regiões mais restritas. Essa distribuição global das diferentes estirpes tem provável influência na migração humana (Messina et al., 2015).
1.3.6 Profilaxia e tratamento A escolha quanto ao controle e profilaxia da infecção causada pelo BVDV está relacionada com o histórico do rebanho, a possibilidade de introdução do vírus, entre outros fatores epidemiológicos. A partir desses dados, defini-se se é necessária ou não a utilização de vacinas. Em casos de alta rotatividade de animais, histórico da doença comprovadamente causada pelo BVDV e soropositividade, a vacinação é indicada (Ridpath et al., 2012).No Brasil, as vacinas comerciais são constituídas apenas de suspensões virais inativadas sendo que a maioria delas contém o BVDV-1 e BVDV-2(Alzilieiro et al., 2015). Com a existência desses dois tipos antigênicos diferentese a grande variabilidade com baixa reatividade sorológica entre eles, o sucesso da vacinação é restrita (Alzilieiro et al., 2015). Portanto, se o rebanho apresenta baixo risco de introdução do vírus, a vacinação é dispensável, sendo recomendado somentre medidas básicas de biossegurança a fim de manter o rebanho livre do vírus (Ridpath et al., 2012). Quanto ao tratamento dos animais infectados pelo BVDV, até o presente momento, não existe nenhum antiviral específico disponível. Em geral o tratamento é de apoio e prevenção de infecções bacterianas secundárias a partir da utilização de antimicrobianos de amplo espectro juntamente com vitaminas, fluidoterapia e electrólitos suplementares (Canário et al., 2009). Já a erradicação do VHC está associada com a redução das complicações relacionadas com a infecção, incluindo a progressão para cirrose, descompensação hepática, hepatocarcinoma e morte (Gogela et al., 2015). A prevenção também é uma alternativa a partir de uma triagem e procedimentos de inativação de produtos potencialmente 37
contaminados como sangue, orgãos e tecidos, prevenção de atividades de alto risco como uso de drogas e sexo sem proteção, além de aumentar o cuidado de profissionais da saúde em procedimentos médicos (Ferreira e da Silveira, 2004). Não existem vacinas disponíveis para prevenção do VHC e a terapia antiviral habitual envolve a combinação de interferon alfa-peguilado com Ribavirina ®. Esse tratamento só é efetivo para pacientes portadores do genótipo 1 e, além do alto custo financeiro, apresenta inúmeros efeitos colateraiscomo possíveis distúrbios psiquiátricos, anemia hemolítica e alteração da quantidade de células sanguíneasque levam os pacientes a interromper o tratamento(Padilla et al., 2015). Outra opção recente para o tratamento de infectados pelo genótipo 1 do VHC são os inibidores de protease (IP), como Boceprevir ® e Telaprevir ®. No entanto, nesses tratamentos combinados também têm sido descrito efeitos adversos (Gogela et al., 2015). Por fim, devido às dificuldades significativas no tratamento e prevenção de VHC e também dos problemas associados ao controle e tratamento de bovinos frente ao BVDV, a pesquisa por compostos bioativos que podem ser utilizados para auxiliar no tratamento de ambas as infecções é de suma importância, seja para a saúde pública ou animal.
1.4 PRODUTOS NATURAIS
Os produtos naturais tem um papel significativo na descoberta e desenvolvimento de novas drogas. Cerca de 28% dos novos compostos químicos que foram introduzidos no mercado em todo o mundo entre 1981 e 2006, foram desenvolvidos a partir de produtos naturais e/ou de seus derivados (Subramani e Aaebersberg, 2013).
Além disso, um estudo realizado em 2013 demonstrou que de 1073 novos compostos, cerca de 64% são provenientes de algum tipo de produto natural. As principais fontes de obtenção desses compostos são as plantas, organimos marinhos, microorganismos e até mesmo de secreções animais, como veneno de serpentes, rãs e lagartos (Gragg e Newman, 2013).
Os produtos naturais são utilizadosno tratamento de cerca de 87% de todas as doenças que acometem os humanos, incluindo agentes antibacterianos, anticancerígeno, antiparasitário, antiviral, entre outros. Desses produtos naturais fonte de medicamentos, estão as plantas que tem uma longa história de utilização para o tratamento de uma grande variedade de doenças. Dessas espécies bem conhecidas, está a papoula ( Papaver somniferum ) 38
que tem registros datados desde a.c. (antes de Cristo) sendo utilizada até os dias atuais (Chin et al., 2006).
Além das plantas,outra alternativa de busca por novos compostos bioativos, que tem sido amplamente investigada nesses últimos anos, são os organismos marinhos que têm demonstrado um grande potencial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. Dentre eles, destacam-se o Ara-A (adenina-arabinosídeo/Vidarabina ®) e o Ara-C (citosina- arabinosídeo/Citarabina ®), ambos análogos sintéticos derivados de compostos produzidos por uma espécie de esponja ( Tethya crypta ) com atividade antiviral e anticâncer, respectivamente (Costa-Lotufo et al., 2009; Yasuhara-Bell e Lu, 2010).
Os fungos também ocupam um lugar relevante e, entre eles, aqueles que vivem em ambientes extremos e/ou em simbiose com outros seres vivos.Essas situações estão diretamente associadas a produção de compostos farmacologicamente ativos já que, devido a essas condições, esses fungos produzem uma grande variedade de metabólitos secundários que auxiliam na manutenção dos mesmos(Zhao et al., 2010; Gonçalvez et al., 2015). Um exemplo de medicamento proveniente de um composto produzido por um fungo endofítico é o Taxol ®, desenvolvido a partir do composto paclitaxel isolado do fungo Taxomyces andreanae que vive em simbiose com a planta Taxus brevifolia (Nisa et al., 2015). Outro exemplo, agora de um fungo que vive em ambiente extremo, como o Deserto do Atacama, é o Penicillium chrysogenum que produz os compostos α-ácido linoleico e ergosterol endoperóxido que foram descritos por apresentarem atividade contra fungos e bactérias, respectivamente (Gonçalvez et al., 2015).
Um outro produto natural com potencial de produzir compostos bioativos sãoas bactérias,tanto marinhas como terrestres. O avanço no estudo genômico dos microorganismos tem demonstrado que o potencial da biossíntese de produtos naturais em bactérias é muito superior do que acreditava-se anteriormente (Xie et al.,2014). Ao longo dos últimos 50 anos, compostos naturais produzidos por bactérias têm sido amplamente utilizadosno desenvolvimentode grande parte das drogas utilizadas pela indústria farmacêutica (Ginolhac et al., 2004).
Dentro dos medicamentos que já são utilizados atualmente de origem bacteriana, pode-se citar os antibióticos, como por exemplo a estreptomicina, isolada da espécie Streptomyces griseus ou a eritromicina, também isolada de uma espécie de Strpetomyces (S. erythreus ) (Guimarães et al., 2010). Além dessas, também existem as cianobactérias que 39
também são uma fonte rica de compostos bioativos com atividade antinfúngica, antiviral, anticancer, entre outras (Lau et al., 2015).
Existem bactérias, que assim como os fungos, também vivem em simbiose com outros seres vivos, como plantas e animais. Em geral, os compostos obtidos a partir desses microorganismos associados são conhecidos pela ampla gama de efeitos biológicos (Singh et al., 2014).
Dentre esses animais, destacam-se os cupins que pertencem a ordem Isoptera e são animais invertebrados de hábitos sociais organizado com trabalhadores, soldados, reprodutores e imaturos,que vivem em ambientes terrestres desde florestas úmidas até savanas. Isso deve-se à existência de simbiose com microorganismos como bactérias que auxiliam tanto na sua alimentação (solo, madeira e serrapilheira) como na organização social.Atualmente são conhecidas pelo mundo cerca de 2750 espécies e 300 delas estão presentes no Brasil (Ferreira et al., 2011).
Os cupins têm um papel muito importante na procura de alimentos e na degradação de biomassa vegetal, bem como no cultivo de microorganismos com capacidade de produzir compostos bioativos para a sua defesa. Estudos recentes descrevem o potencial biotecnológico dessas bactérias associadas aos cupins(Kurtböke et al., 2014). A microbiota do cupim é constituída de diferentes famílias de bactérias dentre elas as espécies dos filos Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Verrucomicrobia (Berlanga et al., 2012). Muitas dessas espécies encontradas já foram descritas por produzirem compostos bioativos com atividades biológicas importantes (Duda-Chodak et al., 2015).
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiviral de extratos obtidos de bactérias coletados em terras de cupinscontra três vírus de importância tanto para a saúde animal quanto para humanos: o herpes humano tipo 1 (HHV-1), calicivírus felino (FCV) e vírus da diarréia viral bovina (BVDV).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Avaliar qualitativa- e quantitativamente a atividade antiviral de extratos brutos e frações produzidas por bactérias que vivem em cupinzeiros • Caracterizar taxonomicamente as espécies bacterianas que apresentarem atividade antiviral frente aos vírus; • Caracterizar quimicamente, a partir do perfil cromatográfico, os extratos brutos e suas frações ativas a fim de identificar os possíveis compostos responsáveis pela atividade antiviral encontrada.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 AMOSTRAS VIRAIS E LINHAGENS CELULARES Os vírus utilizados nestre trabalho foram: o herpes humano tipo 1 (HHV-1), cepa KOS (Silva et al., 2010), o calicivírus felino (FCV), cepa SV65/90 (Henzel et al., 2012) e o vírus da diarréia viral bovina (BVDV), cepa Singer (Anziliero et al., 2015). As linhagens celulares utilizadas foram a Vero (African green monkey – ATCC CCL 81), cultura celular de rim de macaco para a propagação do HHV-1, a CRFK (Crandell reese feline kidney – ATCC CCL 94), células de rim de felino para a replicação do FCV e a MDBK (Mardin-Darby bovine kidney – ATCC CCL 22), linhagem celular de rim de bovino para a inoculação do BVDV. Todas as linhagens foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle (MEM(E) Nutricell®) suplementado com 10% de soro. No caso das culturas celulares Vero e CRFK, o soro utilizado foi de bovino (Nutricell ®), já para a linhagem MDBK o soro foi equino (Cripion ®).
3.2 EXTRATOS
Neste estudo foram avaliados um total de 90 extratos de diferentes espécies de bactérias coletadas em terras de cupinzeiros de três regiões da Bahia, no nordeste do Brasil. A primeira delas foi a Mata do Cipó, localizada no município de Lafaiete Coutinho (sudoeste baiano), zona de transição entre Floresta Estacional e Caatinga, com clima semi árido e subúmido a seco. A outra região foi Paraguaçu, no município de Feira de Santana, onde a vegetação predominante é de Floresta Estacional e o clima caracteriza-se por subúmido a seco. Por fim, a última região escolhida foi Piemonte da Diamantina, no Morro do Chapéu no qual o clima é também subúmido a seco e a vegetação típica é de Floresta Estacional. Os cupinzeiros, cinco em cada município, foram escolhidos de forma aleatória. Após a coleta, as amostras foram enviadas ao Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM), na Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) onde foi feito o plaqueamento e isolamento das espécies bacterianas. Finalmente, os micro-organismos já isolados foram enviados para a Divisão de Recursos Microbianos no CPQBA – Unicamp, onde foram submetidos a crescimento seguido de extração para a realização dos testes, conforme descrito na Figura 7 42
A extração, como descrito na metologia, foi relizada com solvente de acetato de etila devido a sua polaridade moderada que permite a maior solubilização de diferentes componentes e tem o seu ponto de ebulição relativamente baixo, de 77 °C.
Bactérias de Crescimento CMNT* e triagem Extração cupinzeiro bacteriano antiviral
Análise cromatográfica dos Identificação extratos e frações ativas bacteriana Extrato ativos (PI #≥98%) IS das frações com Índice de maiores valores de PI #% seletividade (IS)
Atividade antiviral IS≥3,5 das frações
Extratos com > SI Triagem de Fracionamento mecanismo de ação Figura 7: Fluxograma das atividades desenvolvidas nesse trabalho
*CMNT: Concentração máxima não tóxica; #PI%: Porcentagem de inibição
As bactérias foram coletadas entre outubro de 2008 e fevereiro de 2009em três municípios localizados na Bahia: Morro do Chapéu (11°33 ′08 ″S, 41°09 ′27 ″W), Lafaiete Coutinho (13°38 ′11 ″S, 40°12 ′43 ″W) e Feira de Santana (12°16 ′23 ″S, 38°57 ′19 ″W). Os micro-organismos foram isolados e mantidos à -80°C em 20% de glicerole enviadospela equipe da Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro da Universidade Estadual de Santa Cruz. As bactérias isoladas foram enviadas ao departamento de recursos microbianos (DRM) do CPQBA (Centro de Pesquisa Química, Biológica e Agrícola) da UNICAMP para a Dra. Fabiana Fantinatti Garboggini para que, em seguida, fossem iniciados os crescimentos e extrações. Para a obtenção dos extratos brutos um pré inóculo de 90µL dos isolados bacterianos foi feito em 7mL de Nutrient Broth (Oxoid ®) com água destilada e incubado a 30°C com rotação de 120rpm. Após 48 horas de crescimento, o volume total foi transferido para um erlenmeyer com 50mL do mesmo meio de cultura e mantidos na mesma temperatura e rotação por mais 48 horas. Em seguida, os 50mL da suspensão bacteriana foi transferido para uma garrafa de vidro de 1L (shott) contendo 500mL do mesmo meio e mantido nas mesmas 43
condições descritas anteriormente por um período de quatro semanas. Essa etapa foi realizada na Divisão de recursos microbianos (DRM) do CPQBA/UNICAMP.
Com o passar das semanas, os frascos contendo a suspensão bacteriana e consequentemente os derivados do metabolismo desses isolados, iniciou-se na Divisão de Química de Produtos Naturais (DQPN) do CPQBA/UNICAMP o processo de extração pelo método de separação líquido-líquido com o acetato de etila como solvente. Inicialmente, foi adicionado ao frasco de vidro com a suspensão bacteriana 500 mL de acetato de etila e essa mistura foi triturada no ultraturrax a alta velocidade de rotação por cerca de 2 minutos. Após 24 horas, a mistura foi filtrada utilizando um funil de Buchner contendo uma camada de Celite ® e papel filtro. O meio de cultura e os restos bacterianos ficaram retidos na fase aquosa e os possíveis metabólitos biologicamenre ativos foram recuperados na fase orgânica utilizando um funil de separação e transferidos para um balão de fundo redondo. Foram adicionados mais 500 mL de acetato de etila à fase aquosa e, novamente, as fases foram separadas, sendo a fase orgânica transferida para o mesmo balão de fundo redondo. Os extratos brutos foram concentrados utilizando um rotaevaporador (Rotavapor R-215 Buchi) com vácuo e temperatura de 30°C até a completa secagem do solvente para depois serem liofilizados.Para a divisão do extrato bruto, foi adicionado o solvente e dividido em dois frascos que foram novamenre concentrados em rotaevaporador sob as mesmas condições já descritas e liofilizados. Os extratos brutos que foram utilizados na atividade antiviral foram dissolvidos em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e mantidos a -4°C até sua utilização. O outro frasco com o mesmo extrato foi mantido seco nas mesmas condições de temperatura para possível identificação de espécie e análise cromatográfica, caso o extrato apresentasse atividade antiviral.
3.3 ENSAIO ANTIVIRAL
Para os bioensaios antivirais foram utilizadas microplacas de 96 orifícios com aproximadamente 30.000 células em cada orifício. Os ensaios com as amostras virais do HHV-1 foram realizados na linhagem celular Vero, já as amostras de FCV foram avaliadas na cultura celular de CRFK e a linhagem MDBK foi utilizada para os testes do BVDV. As microplacas com as células em suspensão foram incubadas por 24 horas a
37°C em ambiente de CO 2 para a formação de monocamada celular. Com o passar das 24 horas, o meio sobrenadante foi descartado e em cada orifício, em quadruplicatas, foi adicionado 100µL de extrato na concentração padrão de 50µg/mL.A concentração padrão foi 44
escolhida para a triagem inicial devido a realização de experimentos anteriores com extratos semelhantes aos avaliados nesse trabalho, na qual essa concentação foi majoriária para a identificação da atividade antiviral sem toxicidade para as células. Aqueles extratos que, ainda assim apresentaram toxicidade na concentração de 50µg/mL, foram avaliados quanto as concentrações máximas não tóxicas (CMNT) para que fosse possível a realização do ensaio antiviral.
Logo após a adição do extrato, foi inoculado 50µL de suspensão viral em diluições logarítmicas na base 10, variando de 10 -1 até 10 -7. A última linha da microplaca de 96 orifícios, na titulação viral, ficou destinada ao controle onde as células não foram expostas ao extrato nem ao vírus, somente com meio de cultura sem soro. Já na última linha das monocamadas infectadas e tratadas com extrato, ficaram como controle do extrato, ou seja, sem adição do vírus para garantir que o efeito celular verificado nos ensaios ocorreu devido à ação do vírus e não pela citotoxicidade do extrato. As microplacas foram incubadas na estufa de CO 2 a 5% e temperatura de 37°C. Foram realizadas leituras diárias em microscópio de luz para a observação do efeito citopático. Nos ensaios com o HHV-1, as leituras foram relizadas até 48 horas após o experimento. Com o FCV, o resultado foi obtido em 24 horas. Já com o BVDV, a observação do efeito citopático foi de até 72 horas após a realização do ensaio. O título viral foi calculado pelo método e Reed e Muench (1938) e expresso como dose infectante para 50% dos cultivos celulares (TCID 50 ). A avaliação da atividade antiviral foi calculada pela diferença entre o título do tratado, ou seja, células infectadas e tratadas com o extrato (T), pelo título do controle, apenas células infectadas e sem extrato (C). O resultado foi expresso pela porcentagem de inibição (PI% =[1-(antilog T/antilog C) X 100]) e foram considerados ativos os extratos que apresentaram PI% maior ou igual a 98% (Nishimura e Fukuyasu, 1997) Para os extratos que apresentaram atividade antiviral, ou seja, PI% ≥ 98%, a capacidade do extrato de inibir em 50% a replicação viral (IC 50 ) foi quantificada através do ensaio colorimétrico com MTT. Esse ensaio permite a quantificação da viabilidade celular e, indiretamente, permite quantificar a inibição do extrato frente ao vírus.
3.4 TESTE DE CITOTOXICIDADE
Esse ensaio foi realizado com os extratos que apresentaram toxicidade na concentração de 50µg/mL, concentração essa utilizada como padrão para iniciar os testes. 45
Essa concentração foi escolhida devido a inúmeros ensaios realizados rotineiramente no Laboratório de Virologia Animal (LVA) da UNICAMP com extratos produzidos da mesma maneira, com o mesmo solvente e provenientes também de bactérias que foram avaliados e permitiram identificar essa concentração como predominante para identificar atividade antiviral desses extratos sem apresentar citotoxicidade. O teste e citotoxicidade foi realizado nas diferentes linhagens celulares utilizadas neste trabalho em microplacas de 96 orifícios com aproximadamente 30.000 células em cada orifício. Com a formação da monocamada celular, após 24hs de incubação a 37°C em ambiente de CO 2 a 5%, o meio da microplaca foi descartado e as células foram expostas em quadruplicata as concentrações decrescentes na base 2 dos extratos, iniciando na concentração de 50µg/mL. Em seguida, as microplacas foram incubadas novamente durante pelo menos 48 horas. Foram realizadas leituras diárias das microplacas. A concentração dos extrato que não induziu alterações detectáveis ao microscópio de luz, foi considerada a concentração máxima não tóxica (CMNT) do extrato. Foram utilizadas como controle destes ensaios, monocamadas de células incubadas somente com meio de cultura (MEM) sem soro e sem extrato. Apesar do teste de citotoxicidade ter sido realizado somente naqueles extratos que apresentaram toxicidade na concentração escolhida como padrão, todos os extratos que apresentaram atividade antiviral foram submetidos ao ensaio com MTT a fim de quantificar a viabilidade celular em diferentes concentrações do extrato. Essa viabilidade celular foi calculada a partir de valores de absorbância em comparação com o controle celular, monocamada sem extrato. Com esses dados, foi realizada uma regressão linear que gerou um valor que corresponde a concentração do extrato capaz de reduzir em 50% o crescimento celular (CC 50 ).
3.5 ENSAIO COLORIMÉTRICO COM SAL DE TETRAZOLIUM (MTT)
Este teste foi realizado com os extratos que apresentaram PI% ≥ 98%.Para este procedimento, as linhagens celulares foram mantidas em placas de 96 orifícios. Após a formação da monocamada celular, em metade dos orifícios da microplaca as células foram expostas aos extratos em diferentes concentrações e amostra viral em concentração única de 100DI (doses infectantes)e na outra metade, somente células e diferentes concentrações do extrato. Além disso, alguns orifícios foram utilizados como controle. Foram realizadas leituras diárias em microscópio de luz e a microplaca permaneceu na estufa com ambiente CO 2 a 5% e 37°C até a monocamada do controle viral (células e 46
amostra viral) ser de 80-95% destruida. Com isso, foram adicionados 20µL da solução de MTT, na concentração de 5mg/mL, em cada orifício e a microplaca voltou para estufa nas mesmas condições citadas anteriormente por um período de 4 horas. Durante esse tempo ocorre a redução do MTT em cristais de formazan pelas células que estão metabolicamente ativas. Em seguida, as microplacas foram centrifugadas a 2000 rpm durante 10 minutos para a fixação dos cristais formados no fundo dos poços da microplaca. O sobrenadante foi retirado cuidadosamente sem afetar os cristais localizados ao fundo dos orifícios e então foi adicionado em toda placa 150µL de DMSO para a dissolução desses cristais e, assim, ser possível a posterior leitura da absorbância. A taxa de redução do tetrazolium corresponde a taxa de células viáveis, ou seja, metabolicamente ativas. As microplacas, após dissolver os cristais, foram agitadas por 10 minutos e, por fim, foi realizada a leitura em espectofotômetro a um comprimento de onda de 540 nm (Gerlier e Thomasset, 1986). Os resultados foram analisados comparando a absorbância do poços tratados com os controles celulares, por análise de regressão (Mosmann, 1983). Os valores obtidos foram representativos de uma média de três experimentos realizados com o mesmo extrato.
3.6 CÁLCULO DO ÍNDICE DE SELETIVIDADE (IS)
A partir da análise dos resultados obtidos no teste com MTT foi possível encontrar os valores de CC 50 , que corresponde a concentração do extrato que reduz em 50% o crescimento celular, e o IC 50 , concentração do extrato capaz de inibir em 50% a replicação viral. Com esses valores determina-se o índice de seletividade (IS= CC 50 /IC 50 ), que expressa o índice de seguranca do extrato ou fração testada e, dessa forma, possibilita a realização de estudos posteriores mais detalhados, tanto in vitro como in vivo (Coen e Richman 2007;
Dezengrini et al., 2009). Quanto maior é essa relação do CC 50 com IC 50 , ou seja, o valor de IS, mais promissor é considerado o extrato (Amoros et al., 1992).
3.7 TRIAGEM DO MECANISMO DE AÇÃO
Para identificar a fase do ciclo viral que podem interferiros extratos ativos, isto é que apresentaram PI% ≥ 98%, foram realizados experimentos com três diferentes tratamentos.
• Atividade virucida: os extratos avaliados foram mantidos por um período de 1 hora em contato com as amostras virais já diluídas de 10-1 até 10 -7, na ausência de células a fim de avaliar a capacidade do extrato de inativar a partícula viral ou interferir na habilidade viral de 47
iniciar o ciclo replicativo. Com o passar desse período de incubação do extrato e a amostra viral, essa mistura foi adicionada à microplaca contendo monocamada celular. Na última linha da microplaca ficaram os controles do experimento. • Pré-tratamento: as monocamadas celulares, em microplacas de 96 orifícios, foram expostas previamente aos extratos avaliados com o objetivo de verificar a capacidade destes de produzir um estado antiviral na célula. Após 1 hora de exposição aos extratos, foram adicionadas as amostras virais nas diluições de 10 -1 até 10 -7, sendo a última linha da microplaca destinada ao controle celular e controle do extrato. • Pós- tratamento: o extrato foi adicionado após 1 hora de exposição da monocamada celular a diluições virais de 10 -1 a 10 -7. Dessa forma é possível verificar se o extrato interfere nas etapas intracelulares da replicação viral. O controle de células e do extrato foram realizados na última linha da microplaca. Com a visualização do efeito citopático em cada um desses ensaios com cada um dos extratos ativos contra seus respectivos vírus, o título viral foi calculadoa partir da comparação entre o título viral do controle do vírus e do tratado, ou seja, células com vírus e tratadas com o extrato ativo. Dessa forma, foi determinada a atividade do extrato em cada tratamento e foram calculadas as porcentagens de inibição (PI%). Assim como citado anteriormente, a PI% foi calculada pela fórmula PI= (1- T/C)X100, onde T corresponde ao antilog do título viral tratado com extrato e C é o antilog do título viral controle. Foi considerado positivo o efeito dos extratos que geraram uma PI igual ou maior que 98%
3.8 IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
A espécies bacterianas que apresentaram PI% ≥98%, ou seja, que foram ativas na primeira triagem antiviral contra pelo menos um dos vírus estudados neste trabalho foram para a análise das sequências do gene 16S do DNA ribossomal a fim de serem identificadas.
Após o crescimento das bactérias em placas com ágar, o DNA genômico foi extraído de uma cultura pura de acordo com o protocolo descrito anteriormente porVan Soolingen, 1993. Os fragmentos do gene 16S do DNA ribossomal foram amplificados por PCR utilizando os primers p10f (5’ TTT GAT GAG CCT GGC TCA G 3’) e 1525r (5’ AAG GAG GTG CC 3 WTC CAR 3’), sequências essas que são homólogas a regiões conservadas do gene 16S do RNA ribossomal(rRNA)(Lane, 1991). 48
As seguintes condições foram utilizadas na reação de amplificação: 50-100ng de
DNA genômico, 2U de Taq polimerase (Invitrogen), 1X Taq tampão, 1,5mM de MgCl 2, 0,2mM de dNTP’s (GE Healthcare) e 0,4µM de cada primer específico, em um volume total de 50µL de reação.Para a amplificação foi realizada uma desnaturação inicial de 95°C por 2 minutos seguida de 30 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C em 3 minutos e uma extensão final a 72°C por 3 minutos utilizando um termociclador Eppendorf. A amplificação por PCR de fragmentos do gene 16S rRNA foi confirmada num gel de agarose a 1% corado com SYBR Safe (Invitrogen).
Os fragmentos do gene 16S rRNA foram ainda purificadas utilizando mini- colunas (GFX PCR DNA e gel band purification kit, GE Healthcare) e sequenciado utilizando um sequenciador automático (ABI3500XL Series- Applied Biosystems). As reações de sequenciamento foram realizadas com o kit BigDye ® Terminator v3.1 Sequencing Kit (Life Technologies).Os primers utilizados nas reações de sequenciamento foram o 10f (5’TTT GAT GAG CCT GGC TCA G 3’), p765f (5’ AGA TAC ATT CCT GGT AG 3’), p782r (5’ACC AGG GTA TCT AAT CCT GT 3’), 1100R (5’GGC CTC AGG GTT GTT G 3’) e 1525r (5’ GAG AAG GTG CC 3 WTC CAR 3’). As sequências obtidas foram processadas utilizando a versão do programa CONSED/Phrap/Linux phred para montagem de contigs (Ewing et al., 1998; Gordon et al., 1998). A sequência obtida de aproximadamente 110pb foi comparada com as seqeuências em GenBank ( http://www.nbci.nlm.nih.gov/BLAST/ ) e Ribossomal Data Project II 9.0 ( http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp ). As sequências recuperadas dos bancos de dados foram alinhadas no programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1997) e as análises filogenéticas foram realizadas no programa MEGA versão 5 (Tamura et al., 2011). A matriz de distância evolutiva foi calculada com o modelo de Kimura (Kimura, 1980) e a árvore filogenética foi construída com base nas distâncias evolutivas pelo método de Neighbor- Joining (Saitou e Nei, 1987), com valores de bootstrap calculados a partir de 1000 repetições (Felsenstein, 1985).
3.9 FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS Os extratos provenientes dos isolados bacterianos que apresentaram os maiores valores de índice de seletividade (IS) contra seus respectivos vírus, ou seja, cujo PI foi ≥ 98%, foram selecionados para a etapa de fracionamento, cujo objetivo foi obter um perfil cromatográfico das frações e associá-las à atividade antiviral encontrada. 49
Os extratos foram fracionados pela técnica SPE (solid phase extraction), ® utilizando-se cartuchos de fase reversa C 18-E Strata (Phenomenex ) contendo 500mg de adsorvente (lote número S201-141). O cartucho foi inicialmente precondicionado com 3mL de metanol e em seguida equilibrado com 3mL de água destilada. Em seguida, a amostra foi aplicada pela parte superior do cartucho, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, sendo que o extrato foi diluído em acetato de etila na concentração de 30mg/mL. Após o extrato ser aplicado, iniciou-se a eluição em gradiente, com 3mL de misturas de água e metanol em diferentes proporções para a coleta das frações. As frações originadas e o gradiente de eluição utilizado, estão descritos na Tabela 1. Gradiente de eluição Frações Água (%) Metanol (%) Fração 1 95 5 Fração 2 90 10 Fração 3 80 20 Fração 4 70 30 Fração 5 50 50 Fração 6 0 100 Tabela 1: Gradiente de eluição e frações obtidas durante o fracionamento em cartucho SPE
No final do procedimento, o cartucho foi lavado com 3mL de metanol para remover o material que ficou adsorvido, originando assim a fração 6. As frações foram concentrados individualemente, utilizando-se um rotaevaporador (Rotavapor R-215 Buchi) com vácuo e temperatura de 30°C até a eliminação parcial dos solventes para depois serem liofilizadas até completa remoção da água. Em seguida, ficaram armazenadas a 8°C até a utilização delas para os bioensaios antivirais, onde foram dissolvidas em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e mantidas a -4°C, e paralelamente para as análises em CG-MS, quando foram re-dissolvidas em acetato de etila.
3.10 ANÁLISE EM CG-MS Os extratos brutos que se destacaram quanto ao IS e as frações ativas desses extratos foram analisadas por cromatografia gasosa acoplada a espectometria de massas (CG- MS). Tanto a etapa de fracionamento, como as análises cromatográficas foram realizadas no CPQBA/UNICAMP, com supervisão do Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues, da Divisão de Química de Produtos Naturais (DQPN). 50
Os perfis cromatográficos dos extratos e frações foram realizados utilizando um cromatógrafo à gás, marca Agilent 6890N (Palo Alto, CA, USA) com detector de Massas Agilent 8975 e injetor automático HP7683B. A coluna empregada foi a HP-5MS (30m x 0,25µm de espessura de filme x 0,25mm de diâmetro interno) com fase estacionária quimicamente ligada, 5% difenil- 95% dimetilpolisiloxano. O gás hélio foi utilizado como fase móvel com fluxo de 1,0mL/min. A coluna foi mantida à temperatura inicial de 150°C por 2 min e posteriormente essa temperatura foi aumentada para 240°C em uma taxa de 5°C/min, seguido por um aumento para 300°C na taxa de 10°C/min para, então, ser mantida a temperatura constante por 34 min. A temperatura do injetor foi de 280°C e o modo de injeção empregado foi split com razão de 1:50. Os dados do espectro de massas (MS) foram obtidos nas seguintes condições: potencial de ionização de 70eV, 50-480 amutemperatura do detector de 300°C e atraso do solvente de 3 min. As amostras foram solubilizadas em acetato de etila na concentração de 20mg/mL e injetadas. Os fragmentogramas obtidos foram comparados com os espectros de massa da biblioteca NIST/2005 e a similaridade mínima utilizada como critério para identificação foi de 90% de concordância entre os fragmentogramas .
51
4 RESULTADOS Além da extração dos compostos produzidos pela fermentação dos isolados bacterianos, o meio de cultura sem crescimento também foi submetido a extração,utilizado como controle, para garantir que não houve interferência dos compostos dele nos testes dos metabólitos secundários bacterianos.O teste da atividade antiviral do meio de cultura controle demonstrou que sua a porcentagen de inibição (PI%) é de 0, ou seja, não interfere nos resultados obtidos nos testes dos extratos (dados não mostrados). Nas células Vero, utilizadas para a realização dos ensaios com o HHV-1, dos 90 extratos avaliados, seis deles foram tóxicos, dentre eles estão o CDPI07, LC32, MC24, CDPA07, CDPI08 e FS25. Para a propagação do vírus FCV foi utilizada a linhagem celular de felino CRFK e dos extratos avaliados três apresentaram toxicidade: CDPI07, CDPA30 e FS25. Por fim, nas células de bovino, MDBK, na qual o vírus BVDV se replica, os extratos CDPI07 e LC32 foram os dois únicos extratos que apresentaram toxicidade. Todos esses extratos foram submetidos a ensaios de determinação da CMNT e os resultados estão representados no gráfico(Figura 8)com as concentrações não tóxicas que foram utilizadas para os ensaios de atividade antiviral. Os extratos que não estão representados na Figura 8 foram avaliados na concentração de 50 µg/mL. 52
MDBK LC32
CDPI07
CRFK CDPA30 FS25 CDPI07
Linhagens celulares CDPI08 CDPA07 MC24 VERO LC32 FS25 CDPI07 Concentra ção (µg/mL) 0 5 10 15 20 25 30
VERO CRFK MDBK CDPI08 1,56
* * CDPA07 12,5 * * MC24 25 *
Extratos * LC32 25 * 25 CDPA30 * 25 * FS25 25 25 * CDPI07 1,56 25 1,56 Concentrações máximas não tóxicas (CMNT´s) (µg/mL) Figura 8: Gráfico e Tabela dos resultados obtidos a partir da análise das CMNT dos extratos que apresentaram toxicidade. *não foram avaliados devido a não toxicidade na concentração padrão
Observou-se que de todos os extratos, somente o CDPI07 apresentou toxicidade nas três linhagens celulares utilizadas e, dentre as linhagens, a VERO foi a que apresentou-se mais sensível, com seis extratos tóxicos, seguida da CRFK com três extratos tóxicos e, por último, a MDBK com somente dois extratos avaliados com concentração de CMNT menor que 50µg/mL. Com a determinação das CMNT dos extratos, iniciaram-se os testes de triagem antiviral. Esses ensaios mostraram os extratos que inibiram de alguma forma a infecção viral. De todos os extratos analisados nessa triagem, 10 deles (10%) apresentaram porcentagem de inibição (PI%) igual ou maior que 98% contra pelo menos um dos três vírus utilizados neste estudo (Figura 9).
53
Ativos LC04 10% CDPA10 CDPA22 CDPA26 CDPI92 CDPA27 MC51 Sem atividade LC16 90% LC22
LC32
Figura9: Resultado da triagem antiviral dos extratos com PI% igual ou maior que 98% contra pelo menos um dos três vírus estudados .
A maioria dos extratos considerados ativos nesta primeira etapa apresentou atividade contra o HHV-1: foram eles o LC04 com 98% de inibição e os extratos CDPA10, CDPA22, CDPA26 e CDPI92, cada um deles , com 99% de inibição. Em segui da, 30% dos ativos apresentaram inibição de 99% contra o FCV (LC16, LC22 e LC32). E, por fim foramativos contra o BVDV , o CDPA27 e o MC51 com inibição de 98% ( Figura10).
CDPA27 20% MC51 LC04 CDPA10 50% CDPA22 CDPA26 CDPI92
HHV-1 LC16 30% LC22 FCV LC32 BVDV
Figura10:Porcentagem e extratos ativos contra seus respectivos vírus HHV-1: Herpes humano tipo 1; FCV: C alicivírus felino ; BVDV: Vírus da diarréia viral bovina
Esses extratos que apresentaram atividade antiviral igual ou maior que 98% de PI% nessa primeira avaliaç ão foram selecionados para as próximas etapas de testes de identif icação das espécies bacterianas através de sequenciamento e análise filogenética conforme metodologia descrita no material e métodos. Além disso, também foram submetidos 54
ao ensaio colorimétrico com MTT a fim de identificar os valores deCC 50 , concentração capaz de reduzir em 50% o crescimento celular e o IC 50 , concentração capaz de inibir em 50% a replicação viral a fim de se determinar o índice de seletividade (IS), ou seja, o grau de segurança na utilização do extrato. Quanto à identificação, somente um isolado bacteriano foi identificado em nível de espécie sendo os demais classificados apenas quanto ao gênero (Tabela 2).
Tabela2: Identificação dos isolados ativos contra os diferentes vírus Isolado bacteriano (extrato) Gênero Espécie Vírus CDPA10 Streptomyces Streptomyces sp. CDPA22 CDPA26 HHV-1 LC04 Achromobacter Achromobacter sp. CDPI92 LC32 Achromobacter Achromobacter sp. LC16 FCV Streptomyces Streptomyces sp. LC22 MC51 Streptomyces sp Streptomyces BVDV CDPA27 Streptomyces chartreusis HHV-1: Herpes humano tipo 1; FCV: Calicivírus felino; BVDV: Vírus da diarréia viral bovina
Dos extratos que foram ativos contra o HHV-1, foi possível identificar que dois deles, CDPA10 e CDPA22 foram obtidos a partir de bactérias do gênero Streptomyces . O CDPA10 apresentou confiabilidade de ramo de 99% com a espécie S. diastaticus , entretanto, não é possível afirmar que sejam da mesma espécie (árvore A, Figura11). Além desses, o CDPA26, LC04 e CDPI92 foram identificados como pertencentes ai gênero Achromobacter e, segundo a árvore B da Figura11, fazem parte do mesmo cluster das espécies A. insuavis e A. xylosoxidans , ainda que não tenha sido possível identificar as espécies.
55
CDPA26
T Achromobacterinsuavis LMG 26845 (NR 117706) 88 Achromobacter xylosoxidans NBRC15126 T (NR 113733) LC04 61 A CDPI92 82 Achromobacteraegrifaciens LMG 26852 T(NR 117707) Achromobacterinsolitus LMG6003 T(NR 025685) Achromobacterspanius LMG5911 T(NR 025686) Erythrobacter aquimaris SW-110 T(AY461441.1)
T 99 Streptomyces diastaticus subsp. ardesiacus NRRL B-1773 (DQ026631 ) 0.02 87 CDPA10
T 98 Streptomyces coelicoflavus NBRC 15399 (AB184650) Streptomyces rubrogriseus NBRC 15455 T (AB184681) 99 Streptomyces albogriseolus 40003 T(AY177662) T B Streptomyces cellulosae NRRL B-2889 (DQ442495) Streptomyces capillispiralis NBRC14222 T(AB184577) 99 Streptomyces pseudogriseolus NRRL B-3288 T(DQ442541) 67 67 CDPA22
Gordonia terrae DSM 43249 T (X79286)
0.01
Figura 11: Árvoresde espécies bacterianas baseadas na análise filogenética da sequência do gene RNA ribossomal 16S da bactéria pertencente ao gênero Achromobacter e Streptomyces , respectivamente. Distâncias evolutivas baseadas no modelo de Kimura 2-p e construção da árvore pelo método Neigbor-Joining, com valores de bootstrap de 1000 repetições .
Dos extratos ativos frente ao FCV, o LC32 foi produzido a partir de uma bactéria do gênero Achromobacter e, segundo a árvore A da Figura 12, agrupa-se com maior confiança as espécies A. insuavis e A. xylosoxidans . Os isolados LC16 e LC22 foram obtidos de espécies de Streptomyces , sendo que o último apresentou confiabilidade de ramo de 99% com a espécie S. misionensis , ainda que não tenha sido possível identificá-lo como sendo dessa espécie(árvore B da Figura 12).
56
Achromobacterinsuavis LMG 26845 (NR 117706) 82 Achromobacterxylosoxidans DSM 10346 (Y14908) 62 LC32 60 Achromobacterruhlandii EY3918 (NR 027197) Achromobacter sp . LMG 6003 (AY170847) A Achromobacter sp . LMG 5911 (AY170848)
Erythrobacteraquimaris SW-110 (AY461441)
T 0.02 55 Streptomyces cinnabarinus NBRC13028 (AB184266) 26 Streptomyces caeruleatus GIMN4.002 T(GQ329712) 42 LC16 86 Streptomyces kunmingensis NRRL B-16240 T(DQ442513) 98 T Streptomyces atriruber NRRL B-24165 (EU812169) Streptomyces lanatus NBRC 12787 T(AB184845) B Streptomyces levis NBRC15423 T(AB184670)
Streptomyces phaeoluteichromatogenes NRRL B-5799 T(AJ391814) 99 LC22 99
97 Streptomyces misionensis NRRL B-3230 T(EF178678) Gordonia terrae DSM 43249 T (X79286)
0.01
Figura 12: Árvoresde espécies bacterianas baseadas na análise filogenética da sequência do gene RNA ribossomal 16S da bactéria pertencente ao gênero Achromobacter e Streptomyces , respectivamente. Distâncias evolutivas baseadas no modelo de Kimura 2-p e construção da árvore pelo método Neigbor-Joining, com valores de bootstrap de 1000 repetições.
Os isolados ativos contra o BVDV foram ambos identificados como sendo do gênero Streptomyces , com a identificação da espécie do CDPA27 como S. chartreusis , com confiabilidade de 100% (Figura 13).
57
T 92 Streptomyces aureofaciens KACC 20180 (AY207608) MC51 63
Streptomyces avellaneus NBRC 13451 T (AB184413)
T 100 99 Streptomyces psammoticus IFO 13971 (AY999862)
Streptomyces aburaviensis AS:4.1469 T (AY999886)
Streptomyces xanthocidicus IFO 13469 T (AY999858) 35 T 29 Streptomyces purpureus LMG 19368 (AJ781324) 81 Streptomyces chrysomallus NBRC 15394 T (AB184645)
Streptomyces canus NRRL B-1989 T (AY999775) T 41 Streptomyces pseudovenezuelae NBRC 12904 (AB184233) T 100 Streptomyces alboniger DSM 40043 (AY845349)
T 100 Streptomyces chartreusis NBRC 12753 (AB184839) 35 CDPA27
T 26 Streptomyces phaeoluteigriseus ISP 5182T (AJ391815) T 51 Streptomyces bobili NBRC 13199 (NR041121) T 90 Streptomyces galilaeus JCM 4757 (AB045878) Gordonia terrae DSM 43249 T (X79286)
0. 01
Figura13: Árvore de espécies bacterianas baseada na análise das sequências do gene RNA ribossomal 16S de bactérias do filo Actinobacteria (modelo Kimura 2-parâmetros; algoritmo Neighbor-Joining com bootstrap de 1000 re-amostragens). A sequência do gene RNA ribossomal 16S da Gordonia terrae T (X79286) foi utilizada como outgroup .
Concomitantementeas análises das sequências do gene RNA ribossomal 16S, as bactérias que apresentaram PI% igual ou maior a 98% foram analisadas quanto ao índice de
seletividade (IS). O IS é calculado pela razão entre o CC 50 (concentração do extrato capaz de
reduzir em 50% o crescimento celular) e o IC 50 (concentração do extrato capaz de inibir 50% da replicação viral). Quanto maior é a razão entre essas duas variáveis, mais promissor é considerado o extrato. Os resultados estão descritos na Tabela3.
58
Tabela3: Valores de CC 50 , IC 50 e IS dos extratos ativos.
* ** *** Vírus Extratos CC 50 IC 50 IS
LC04 3,564 2,229 1,598
CDPA10 57,71 3,374 17,10
HHV-1 CDPA22 98,11 8,625 11,37
CDPA26 19,76 5,144 3,841
CDPI92 141,4 2487,0 0,05
LC16 32,61 116,2 0,28
FCV LC22 244,4 22,20 11,0
LC32 54,20 60,38 0,89
CDPA27 490,3 139,8 3,50 BVDV MC51 32,31 16,99 1,90 HHV-1: Herpes humano tipo 1; FCV: Calicivírus felino; BVDV: Vírus da diarréia viral bovina; *CC50: concentração capaz de reduzir em 50% o crescimento celular; **IC50: concentração do extrato capaz de inibir em 50% a replicação viral; ***IS: Índice de Seletividade.
Os extratos que apresentaram valor de IS maior ou igual a 3,5 foram selecionados para uma triagem do mecanismo de ação para identificar em que fase da replicação o extrato esta agindo. Essa atuação pode ser diretamente na partícula viral, sendo o extrato de ação vírus inativador; pode estar envolvido nas etapas iniciais da replicação que correspondem a adsorção e/ou penetração do vírus nas células, ou seja o o extrato é efetivo no pré tratamento; ou ainda ter uma ação no pós-tratamento, que sugere que o extrato age na inibição das etapas da replicação propriamente dita (transcrição e tradução do material genético ou liberação das partículas virais). Os extratos selecionados para essa triagem (IS ≤3,5) foram o CDPA10, CDPA22 e CDPA26, ativos contra o HHV-1; o extrato LC22 ativo frente ao FCV e o extrato CDPA27, com atividade contra o BVDV. Os extratos CDPA10 e CDPA22 apresentaram 99% de inibição como inativadores das partículas virais, enquanto o CDPA26, também com 99% de inibição, foi ativo no pós tratamento. O extrato LC22 apresentou 98% de inibição em dois momentos: como vírus 59
inativador e também no pós tratamento. Por fim, o extrato CDPA27 inibiu em 98 % no pós tratamento (Figura14).
CDPA10 HHV -1 Virucida •ação direta na partícla viral CDPA22 LC22 FCV
•Adsorção Pré tratamento •Penetração
CDPA26 HHV -1 Pós tratamento •Etapas da replicação LC22 FCV CDPA27 BVDV
Figura14: Triagem do mecanismo de ação dos extratos contra seus respectivos vírus HHV-1: He rpes humano tipo 1; FCV: Calicivírus f elino; BDVD: Vírus da diarréia viral bovina
Para a continuidade dos experimentos, foram selecionados os extratos dos isolados CDPA10, LC22 e CDPA27. Esses extratos foram selecionados devido ao valor de IS, ou seja, os três apresentaram, entre os extratos ativos contra seus respetivos vírus, os maiores IS. Os extratos selecionados foram submet idos a um fracionamento em coluna C18 com diferentes proporções de água e metanol. Foram originadas seis frações, sendo a primeira fração composta por 95% de água e somente 5% de metanol, a fração 2 com 90% de água e 10% de metanol, a terceira fração constituída de 80% de água e 20% de metanol, a fração 4 com 70% de água e 30% de metanol, a quinta fração com metade de água e metade de metanol e, por fim, a fração 6 foi composta de 100% de metanol ( Figura 15).
95% H O 90% H O + 80% H O + 70% H 0 + 50% H 0 + Extrato bruto 2 2 2 2 2 100% MEOH +5% MEOH 10% MEOH 20% MEOH 30% MEOH 50% MEOH
Percolação do extrato
Figura 15: Representação esquemática da obtenção das frações dos extratos selecionados 60
As frações foram submetidas aos bioensaios de atividade antiviral a fim de identificar as porcentagens de inibição (PI%) delas e identificar as ativas, ou seja, aquelas que possuem os possíveis compostos ativos responsáveis pela atividade antiviral descrita anteriormente. A Tabela 4 mostra os resultados obtidos nos bioensaios das frações dos extratos selecionados . Nota-se que contra os três vírus estudados neste trabalho, as frações com 100% de metanol (frações 6) dos três diferentes extratos, CDPA10, LC22 e CDPA27, foram as que apresentaram os maiores valores de PI%, com 99% de inibição contra o HHV-1 e o BVDV e 90% contra o FCV. Tabela 4: Atividade antiviral das frações dos extratos ativos selecionados
Vírus Extrato PI% extrato bruto Frações PI%
1 (95:05) 0 2 (90:10) 0 3 (80:20) 0 HHV-1 CDPA10 99% 4 (70:30) 0 5 (50:50) 83 6 (100% metanol) 99 1 (95:05) 0 2 (90:10) 0 3 (80:20) 0 FCV LC22 99% 4 (70:30) 0 5 (50:50) 44 6 (100% metanol) 90 1 (95:05) 0 2 (90:10) 0 3 (80:20) 44 BVDV CDPA27 98% 4 (70:30) 44 5 (50:50) 0 6 (100% metanol) 99 HHV-1: Herpes humano tipo 1; FCV: Calicivírus felino; BVDV: Vírus da diarréia viral bovina; PI%: Porcentagem de inibição
Dos isolados avaliados, somente a fração 6 do extrato LC22 não apresentou atividade antiviral maior ou igual a do extrato bruto. Inicialmente, o LC22 apresentou 99% de inibição contra o FCV e, após o fracionamento, a fração 6 desse mesmo extrato que foi a mais inibidora, teve o potencial de inibição reduzido à 90%. Já a fração 6 do extrato CDPA10, ativo contra o HHV-1, manteve a inibição de 99% apresentada pelo extrato bruto nos 61
primeiros experimentos realizados neste trabalho. Por fim, a fração 6 do isolado CDPA27apresentou inibição maior que a encontrada nos ensaios com o extrato bruto frente ao BVDV. Na triagem inicial a inibição do extrato CDPA27 bruto era de 98% enquanto que a fração ativa desse mesmo extrato apresentou PI% de 99%. Com esses resultados as frações ativas, ou seja, com os maiores valores de PI% entre elas, foram submetidas a uma nova avaliação do CC 50 , IC 50 e consequentemente doíndice de seletividade (IS). Neste momento, esse ensaio foi realizado para verificar o grau de segurança da fração com o maior potencial de inibição viral . Novamente, quanto maior for o valor de IS, mais promissor é considerada a fração (Tabela5).
Tabela 5: Valores de IS das frações ativas Vírus Extrato IS do extrato bruto Fração ativa IS
HHV-1 CDPA10 17,10 6 101.16
FCV LC22 11,00 6 3.24
BVDV CDPA27 3,50 6 262.41
HHV-1: Herpes humano tipo 1; FCV: Calicivírus felino; BDVD: Vírus da diarréia viral bovina; IS: Índice de Seletividade.
Na tabela é possível identificar que o IS das frações ativas dos isolados CDPA10 e CDPA27 aumentaram consideravelmente, o que mostra que as frações 6 dos respectivos extratos apresentam-se ainda mais promissoras que os próprios extratos brutos. Entretanto, o extrato LC22, depois de fracionado, além de diminuir o valor de PI%, como foi citado acima, também teve o valor de IS reduzido. Esse resultado do isolado LC22 demostra que a razão entre a concentração capaz de reduzir em 50% o crescimento celular(CC 50 ) e a concentração capaz de inibir em 50% a replicação viral (IC 50 ) é menor,ou seja, a segurança na utilização da fração diminuiu drasticamente de 11,0 (IS do extrato de LC22 bruto) para 3,24. Apesar disso, todos os extratos e suas frações mais promissoras foram submetidas a análise cromatográfica por CG-MS, cromatografia gasosa acoplada a espectometria de massa, a fim de identificar possíveis compostos presentes tanto na fração ativa quanto no extrato bruto, aos quais poderia ser atribuída a atividade encontrada ou, no caso so extrato 62
LC22, tentar identificar a possível causa da diminuição da atividade antiviral da fração 6 quando comparada ao extrato bruto. Além dos extratos e frações, também foi analisado o perfil cromatográfico do meio de cultura controle, em outras palavras, o meio de cultura no qual não houve crescimento bacteriano, para que fosse possível identificar possíveis interferências de compostos do meio nos extratos. A análise dos perfis cromatográficos do extrato bruto do isolado CDPA10, da fração 6 do mesmo extrato e do controle do meio de cultura estão demonstrados na Figura 16. O pico localizado entre os momentos 24 e 25 é o mais evidente na fração 6 e está presente no extrato brutoe no controle do meio, dessa forma, não é possível entendê-lo como sendo proveniente da fermentação bacteriana. Por outro lado, osperfis mostram que dois pontos de retenção, nos picos 17 e 27, estão presentes somente no extrato bruto e na fração ativa, indicando que são provenientes exclusivamente do metabolismo bacteriano e que podem estar associados a atividade antiviral encontrada neste trabalho. A identificação de ambos os picos não foi possível devida a baixa porcentagem de similaridade com os compostos descritos na biblioteca utilizada, sugerindo que sejam compostos ainda não descritos.
Abundance
Controle
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> Abundance CDPA10 - Bruto
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> Abundance CDPA10 – Fração 6
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> 17 24 -25 27
Figura 16: Perfil cromatográfico do meio de cultura controle, do extrato bruto CDPA10 e da fração 6 do extrato CDPA10.
63
Os perfis cromatográficos do extrato bruto do LC22, da fração 6, que apresentou o maior PI% entre as frações, e do controle do meio estão apresentados na Figura 17. Segundo a análise cromatográfica da fração 6 é possível identificar o primeiro pico entre o momento 24 e 25, pico este que está presente no extrato bruto e também, ainda que pequeno, no controle do meio de cultura, descartando-o como o possível responsável pela atividade antiviral. Entretanto, é possível verificar dois picos muito evidentes entre os momentos 26 e 29 que não estão presentes no controle, mas estão tanto no extrato bruto como na fração 6. Novamente não foi possível, através de comparação com os compostos descritos na biblioteca utilizada, identificar os compostos responsáveis por esses picos. Já a redução da inibição viral pode ser justificada devido a presença de um pico logo no início da perfil do extrato bruto, no momento 5, que não está presente nem no controle nem na fração 6. A hipótese seria que esse composto agiria de forma sinérgica aos demais picos encontrados e dessa maneira o extrato bruto apresenta atividade antiviral mais potente que a fração, que nãopossui esse composto.
Abundance
Controle
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> Abundance LC22 - Bruto
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> Abundance LC22 – Fração 6
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> 5 24 -25 26 -29
Figura 17: Perfil cromatográfico do meio de cultura controle, do extrato bruto LC22 e da fração 6 do extrato LC22.
Por fim, as análises do extrato CDPA27, sua fração ativa e o controle estão representados na Figura 18. Assim como nos outros dois extratos, aqui também foi possível verificar o pico entre os momentos 24-25 nos três perfis, picos presentes também no meio de cultura sem crescimento bacteriano. Por outro lado, no início dos perfis do extrato bruto e da 64
fração 6 estão presentes dois picos, entre os momentos 5 e 6 que podem estar relacionados a atividade antiviral encontrada. Mais uma vez, não houve grande similaridade entre esses compostos e os descritos na biblioteca. Entretanto, como nesse caso foi possível identificar a espécie bacteriana do CDPA27 como S. chartreusis ,buscamos verificar se esses picos estavam relacionados aos compostos já descritos produzidos por essa espécie. Interessantemente, confirmou-se que os compostos dos picos presentes na fração com atividade antiviral não correspondem aos compostos descritos na literatura o que sugere que neste caso também sejam compostos novos.
Abundance
Controle
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> Abundance
CDPA27 - Bruto
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> Abundance
CDPA27 – Fração 6
80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 Time--> 5-6
Figura 18: Perfil cromatográfico do meio de cultura controle, do extrato bruto CDPA27 e da fração 6 do extrato CDPA27.
65
HHV-1 FCV BVDV
Streptomyces Streptomyces Streptomyces diastaticus misionensis chartreusis
extrato CDPA10 extrato LC22 extrato CDPA27
PI%= 99% PI%= 99% PI%= 98% IS= 17,1 IS= 11,0 IS= 3,5
Vírus inativador e pós Vírus inativador Pós tratamento tratamento
Fração ativa: metanólica Fração ativa: metanólica Fração ativa: metanólica (PI%=99%) (PI%=99%) (PI%=90%)
IS= 101,16 IS= 3,24 IS= 262,41
2 picos (compostos) 2 picos(compostos) 2 picos(compostos )
Figura 19: Fluxograma dos resul tados obtidos no presente estudo.
66
5 DISCUSSÃO
Os vírus são responsáveis por muitas infecções importantes causadas tanto em humanosquanto em animais (Yasuhara-Bell e Lu, 2010). Muitas delas não podem ser evitadas com a utilização de vacinas. Além disso, é comum a ineficiência dos tratamentos disponíveis, o desenvolvimento de cepas resistentes e até mesmo a inexistência de drogas efetivas (Ahmadi et al., 2015). Visto essa problemática, a utilização de produtos naturais para o tratamento de diversas infecções é uma alternativa interessante.Os cupins e cupinzeiros são comumente utilizados na medicina tradicional no Nordeste do Brasil e têm desempenhado um papel significante em práticas de cura (Coutinho et al., 2009)
O presente trabalho demonstrou a presença de compostos bioativos produzidos por bactérias que vivem em simbiose com o cupim com atividade antiviral contra três vírus de importância para a saúde humana e animal: o HHV-1, o FCV (modelo de estudo para os norovírus humano) e o BVDV (modelo de estudo para a hepatite C). Todos com problemas relacionados aos medicamentos utilizados ou até mesmo sem um fármaco específico para tratar os infectados.
Os cupins ou as terras dos cupinzeiros são muito utilizados popularmente para tratar uma ampla gama de doenças como bronquite, coqueluche, feridas, gripes e resfriados, hemorragias, entre outras (Costa Neto et al., 2006).Além disso, foram descritas a presença de espécies bacterianas que vivem em simbiose com insetos que são responsáveis pela produção de compostos com atividades biológicas como uma espécie do gênero Pseudonocardia que é produtora de um dipeptídeo cíclico, dentigerumicina, que apresenta atividade antifúngica ou até mesmo espécies que vivem diretamente com o cupim que produzem peptídeos antimicrobianos como a termicina e a espinigerina (Kurtböke et al., 2014).
Primeiramente foi realizado o teste de citotoxicidade com aqueles extratos que apresentaram-se tóxicos na concentração padrão inicial, ou seja, eles foram analisados quanto a concentração máxima não tóxica. Esse ensaio é muito importante pois permite avaliar a concentração na qual o extrato não induz alterações morfológicas na célula e, dessa forma, garante-se que o vírus tenha condições para sua replicação (Putman et al., 2002). Ao definir uma concentração padrão inicial para os testes alguns compostos promissores poderiam ter sido descartados, entretanto esse parâmetro é essencial pois fornece dados importantes quanto a segurança dos extratos já que na busca por um composto antiviral espera-se que esse seja mais tóxico para o vírus do que para as células (Flint et al., 2000). Além disso, neste trabalho, 67
todos os extratos que apresentaram toxicidade na concentração padrão e que foram reavalidas em suas concentrações máximas não tóxicas, não apresentaram atividade antiviral, o que demonstra que a concentração de 50µg/mL para a triagem inicial pode ser um parâmetro importante para descartar os prováveis extratos não promissores.
Os extratos que não apresentaram toxicidade na concentração de 50µg/mL e, posteriormente, apresentaram-se como extratos promissores, tiveram suas concentrações subtóxicas avaliadas a partir do CC 50 , ou seja, foi identificada sua concentração capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular (Abid et al., 2012).
Dos 90 extratos produzidos a partir do meio de crescimento de 90 isolados de bactérias coletadas em cupinzeiro, 10% deles apresentaram porcentagem de inibição(PI%) maior ou igual a 98%. Desses extratos, a maioria foi ativa frente ao HHV-1 (cinco deles), seguida do FCV que teve três extratos com atividade inibidora e, por fim, dois dos extratos que foram promissores, apresentaram atividade contra o BVDV.Assim como esse trabalho demonstrou atividade antiviral associada aos metabólitos secundários produzidos por espécies bacterianas, outros estudos tem relatado resultados promissores quanto a utilização das bactérias para a produção de compostos antivirais. Kang e colaboradores em 2015 descreveram atividade antiviral de duas espécies de bactérias probióticas, Lactobacillus sp. e Bifidobacterium sp., que agem inibindo a replicação do rotavírus humano tanto in vitro como in vivo . Além disso, Rutkowski e Brzezinski em 2013 descreveram um composto denominado SF-2487 que foi isolado da espécie Actinomadura sp. que apresenta atividade antiviral in vitro frente ao vírus da influenza.
Essas bactérias que produziram metabólitos secundários com propriedades antivirais foram selecionadas para serem identificadas a partir da análise filogenética pelo gene 16S do RNAr. Foi possível identificar que das dez bactérias isoladas que produzem compostos bioativos, quatro delas pertencem ao Filo Proteobacteria e gênero Achromobacter , entretanto, não foram identificadas em nível de espécie devido a baixa confiabilidade de ramo, porém estão proximamente relacionadas às espécies A. insuavis e A. xylosoxidans .Os membros desse gênero são bacilos gram-negativos não fermentarores de glicose(Dupont et al., 2015).Além do resultados promissores dessas bactérias demonstrados nesse estudo, em 1987, Boylan e Simpson descreveram um composto conhecido como xerosina, isolado de um membro desse mesmo gênero, da espécie A. xerosis , que apresenta atividade biológica in vivo frente a pnemonia viral causada pelo vírus da influenza A. Ademais, um estudo recente relatou a produção de dipeptídeos cíclicos por Achromobacter sp. e destacou esse gênero 68
como uma fonte muito promissora de metabólitos secundários bioativos, especialmente frente a bactérias patogênicas (Deepa et al., 2015).
As outras seis bactérias identificadas pertencem ao Filo Actinobacteria e gênero Streptomyces . As actinobactérias são capazes de produzir uma grande variedade de compostos secundários bioativos com atividades biológicas diversas e, além disso, cerca de 45% dos compostos bioativos produzidos por microorganismos são originadas a partir dos actinomicetos (Valli et al., 2012).
Ambas os filos, Proteobacteria e Actinobacteria já foram descritos anteriormente por viverem em simbiose com o cupim, como componentes de sua microbiota (Mickaelyan et al., 2015), ou seja, o resultado obtido com a identificação bacteriana neste estudo concorda com os trabalhos já publicados. Além disso, este estudo também está de acordo com a predominância do filo Actinobacteria como principal produtor de compostos ativos, visto que das 10 bactérias que produziram compostos com atividade antiviral na triagem inicial, 60% são actinomicetos do gênero Streptomyces. Essas bactérias são gram-positivas e foram inicialmente confundidas com fungos devido a sua morfologia e ciclo de vida (Doroghazi e Metcalf, 2013).
Desses estreptomicetos, somente um deles, o CDPA27 apresentou confibilidade de ramo de 100% com a espécie S. chartreusis . Com os cinco demais isolados, não foi possível realizar a diferenciação das espécies. Três deles apresentaram baixa confiabilidade de ramo e, os outros dois, o CDPA10 - com compostos ativos contra o HHV-1- e o LC22 - produtor de compostos ativos frente ao FCV - apresentaram confiabilidade de ramo de 99% com as espécies S. diastaticus e S. misionensis , respectivamente. Ainda que essa semelhança seja considerada alta, estudos relatam a presença de diferentes espécies de bacterías do mesmo ramo com semelhanças de 97,8% - 100%, ou seja, a análise do gene 16S do RNAr, pelo método Neigbor-Joining, não é o suficiente para permitir a diferenciação das espécies do gênero Streptomyces .(Goodfellow et al., 2007). Guo e seus colaboradores (2008)sugerem ainda que para a identificação correta dessas bactérias são necessários estudos de taxonomia polifásica com possível análise da sequência do gene rpoB .
Além da identificação bacteriana, os extratos que apresentaram atividade antiviral, demonstrado na triagem inicial, também foram avaliados quanto aos valores de índice de seletividade (IS), valor esse que está associado ao grau de segurança do extrato (Coen e Richman, 2007). Além disso, o IS indica a viabilidade de estudos posteriores mais detalhados 69
tanto in vitro , como in vivo (Dezengrini et al., 2010). Portanto, nesse ensaio destacaram-se aqueles que apresentaram índices iguais ou superiores a 3,5. Esses extratos foram avalidos em uma triagem de mecanismo de ação a fim de identificar em quais dos momentos da replicação dos vírus o extrato esta agindo.
O extrato CDPA10, além de se destacar com o mais alto valor de índice de seletividade entre os extratos ativos frente ao HHV-1 mostrou-se, nessa trigaem de mecanismo de ação, como inativador da partícula viral. Segundo Cagno (2015), nesses casos a ação inibidora do extrato depende da interação dele diretamente com as partículas virais e não com os componentes celulares e, dessa forma, se evita a adsorção dos vírus nas superfícies das células. Esse resultado pode ser positivo, já que HHV-1 possui mecanismos que conferem resistência à ele frente a medicamentos que tem ação em momentos da replicação do DNA viral, como o Aciclovir, análogo de nucleosídeo utilizado para tratar os infectados desse vírus (McClain et al., 2015).Além disso, visto a ausênsia de medidas profiláticas como vacinas(Szpara et al., 2011)somadosaos aspectos epidemiológicos dessa infecção(Memish et al.2015), seria vantajoso encontrar um composto com ação virucida.
Já os extratos CDPA27 e LC22 com os maiores valores de índice de seletividade contra o BVDV e FCV, respectivamente, demonstraram agir no pós tratamento. Como ambos têm como forma profilática a utilização de vacinas, ainda que possam haver falhas (Abente et al., 2010; Anziliero et al., 2015), e faltam medicamentos contra as infecções causadas por esses vírus e para os vírus dos quais eles são modelos de estudo (VHC e NoV) (Buckowold et al., 2003;Canário et al., 2009; Shivanna et al., 2014; Fenimore et al., 2015; Garaicoechea et al., 2015;Padilla et al., 2015).Além disso, o extrato LC22 também apresentou atividade virucida. Isso pode sugerir a presença de mais de um composto responsável pela atividade antiviral encontrada frente o FCV.
Com todos os resultados obtidos até esse momento do estudo, foi possível selecionar três extratosque se destacaram quanto aos resultados, o CDPA10, o LC22 e o CDPA27 ativos contra os vírus HHV-1, FCV e BVDV, respectivamente. A partir disso, foi iniciado o processo de fracionamento desses extratos. Segundo Freitas e seus colaboradores (2009), a partir do fracionamento é possível maximizar a descoberta de novos compostos com atividades biológicas. Portanto, os três extratos escolhidos foram fracionados utilizando cartuchos de fase reversa C 18-E, devido as características polares dos extratos brutos observadas no processo de extração inicial. 70
As frações de cada extrato foram avaliadas quanto à atividade antiviral frente aos seus respectivos vírus. Aquelas com maiores valores de porcentagem de inibição, foram submetidas ao ensaio com MTT. Asfrações mais promissoras dos três extratos foram as frações 100% metanólicas, ou seja, os compostos presentes nas frações mais promissoras são menos polares quando comparados com os compostos presentres na fração 1, cuja a concentração maior é de água. As frações metanólicas dos extratos CDPA10 e CDPA27 , quando avaliadas quanto ao índice de seletividade, mostraram um aumento considerável nesse valor, ou seja, com o fracionamento aumentou o potencial de aplicação desse extrato como agente antiviral (Faral-Tello et al., 2012). Ainda segundo esse autor, o teste do índice de seletividade é muito importante, pois permite avaliar se o composto combinamaior eficácia com menor citotoxicidade, situação essa encontrada com os testes das frações desses dois extratos quando comparadas aos valores dos extratos brutos.
Já a fração metanólica do extrato LC22, apesar de ser a mais promissora entre as frações desse extrato, teve sua porcentagem de inibição e valor de índice de seletividade reduzido quando comparada ao extrato bruto.Provavelmente, com o fracionamento, pode ter ocorrido a separação de compostos que podiam estar agindo em sinergismo, ou seja, compostos que apresentam melhor efeito terapêutico quando agem juntos, do que quando estão separados (Butassi et al., 2015). Além disso, esse resultado corrobora com a hipótese da possível presença de mais de um composto responsável pela atividade antiviral desse extrato, que foi sugerido anteriormente quanto aos resultados obtidos na triagem de mecanismo de ação.
Por fim, tanto os extratos brutos ativos quanto as suas frações metanólicas, foram avaliadas por cromatografia gasosa acoplada à espectometria de massas, CG-MS,na tentativa de encontrar os possíveis compostos responsáveis pela atividade antiviral. Essa metodologia foi escolhida levando em consideração a alta sensíbilidade para detecção além de possuir bibliotecas para comparação direta e possível identificação de compostos, se esses já tiverem sido descritos (Christou et al., 2014). Essa possível identificação ocorre a partir da comparação dos picos, que representam os compostos, com o que já está descrito no banco de dados da National Institute Standard and Technology (NIST), na qual estão descritos mais de 62 mil compostos (Ezhilan e Neelamegam, 2012).
Como foi descrito nos resultados, nenhum dos picos que se coincidiram entre os extrato brutos ativos e as frações promissoras teve seus compostos identificados através da comparação deles com os compostos presentes na biblioteca utilizada, ou seja, não houve 71
grande similaridade com o que já está descrito. Isso pode sugerir que esses compostos ainda não são conhecidos.Esse resultado colabora com outros trabalhos que descrevem a descoberta de novos compostos produzidos por espécies de Streptomyces , como Raveh e seus colaborados em 2013, que descreveram o isolamento de um composto denominado antimicina A1a a partir da espécie S. kaviengensis , presente em sedimentos marinhos. Segundo o mesmo estudo esse novo composto apresentou uma potente atividade antiviral frente ao vírus da encefalite equina ocidental, in vitro . Manivasagan e seus colaboradores (2014 ) também identificaram um novo composto, benzastatina C, produzido pela espécie S. nitrosporeus com atividade antiviral frente ao HHV-1, HHV-2 e VSV (vírus da estomatite vesicular).
Portanto, ainda que não tenha sido identificado os possíveis compostos responsáveis pela atividade antiviral descrita nesse trabalho, a identificação dos isolados como sendo do gênero Streptomyces e a alta confiabilidade de ramos desses isolados com as espécies S. diastaticus , S. misionensis e S. chartreusis , direciona o estudo para essas bactérias.
Essas três espécies já foram descritas por suas atividades biológicas e compostos ativos isolados. A espécie S. diastaticus , que apresentou confiabilidade de ramo de 99% com o CDPA10, teve isolado a partir de sua fermentação os compostos bioativos denominados de rimocidina e CE-18, ambos relacionados à propriedades antifúngicas e antimicrobianas (Seco et al., 2010; Escudero et al., 2015). Além disso, dessa espécie também foi isolado o diastaphenazine, um composto com atividade antibacteriana frente Staphylococcus aureus e Escherichia coli (Li et al., 2015).
A espécie S. misionensis, que está estreitamente relacionada com o isolado LC22, também foi encontrada vivendo em simbiose com formigas e o estudo realizado por Seipke e seus colaboradores (2012) sugere que essa espécie esteja associada a produção de metabólitos antifúngicos que conferem proteção à esses insetos. Complementando, Poomthongdee e seus colaboradores (2015) demostraram também uma ação antifúngica de compostos bioativos produzidos por essa bactéria com ação frente Cryptococcus neoformans e Candida albicans . Ademais, também já foi descrito o potencial de um extrato proveninente da fermentação dessa bactéria com potencial anti-oxidante de baixa citotoxicidade (Lee et al., 2014).
O isolado CDPA27 foi identificado como sendo um S. chartreusis , espécie descrita pela primeira vez em 1953 por Leach, responsável pela produção de um composto conhecido como chartreusina. Esse composto possui propriedades antibióticas frente a espécies de bactérias gram-positivas como Bacillus subtilis e Brucella bronchiseptica e, 72
também, contra espécies bacterianas gram-negativas, como Salmonella typhosa , Escherichia coli e Proteus vulgaris (Padilla et al., 2015). Em 1958, Miyakawa e seus colaboradores atribuiram a esse mesmo composto, atividade antiviral contra o vírus da influenza A. Trabalhos mais recentes conferem a compostos secundários da bactéria S. chartreusis atividade anti-tumoral (Venugopala et al., 2013) e atividade antibacteriana frente a uma cepa resistente de Staphylococcus aureus (Kwon et al., 2015).
Visto todos os resultados obtidos neste trabalho (Figura 19), comprova-se que os metabólitos produzidos por espécies de Streptomyces podem ser utilizados na busca por novos compostos antivirais contra infecções causadas por diferentes vírus. Além disso, ainda que sejam necessários análises mais detalhadas para confirmar as espécies produtoras de compospos bioativos, o trabalho demonstra que bactérias que vivem em simbiose com o cupim podem ser uma nova fonte de busca por moléculas com atividade antiviral. Por fim, estudos ainda devem ser realizados a fim e identificar os compostos (picos presentes nos perfis cromatográficos) responsáveis pela atividade antiviral encontrada.
73
6 CONCLUSÃO
6.1 CONCLUSÃO GERAL
Em virtude dos resultados obtidos, é possível afirmar que os extratos provenientes de bactérias, que vivem em simbiose com os cupins, possuem metabólitos secundários com atividade antiviral, tornando-os promissores na pesquisa de novas drogas para o tratamento e prevenção de infecções virais.
6.2 CONCLUSÕES ESPECÍFICAS
• Os extratos que apresentaram toxicidade na concentração padrão e que foram reavalidos em suas concentrações máximas não tóxicas, não apresentaram atividade antiviral, o que demonstra que a concentração de 50µg/mL para a triagem inicial pode ser um parâmetro importante para descartar os prováveis extratos não promissores; • • Na triagem inicial a atividade antiviral mais significativa ocorreu frente ao herpesvírus humano tipo 1 (HHV-1), seguida do calicivírus felino (FCV) e o vírus da diarréia viral bovina (BVDV), com 50%, 30% e 20% dos extratos com atividade antiviral, respectivamente;
• Os extratos que apresentaram toxicidade na concentração padrão e que foram reavalidos em suas concentrações máximas não tóxicas, não apresentaram atividade antiviral, o que demonstra que a concentração de 50µg/mL para a triagem inicial pode ser um parâmetro importante para descartar os prováveis extratos não promissores;
• Foi possível identificar os isolados bacterianos com atividade antiviral, sendo 60% deles provenientes do gênero Streptomyces e 40% do gênero Achromobacter ;
• Obteve-se índice de seletividade, com valores acima de 3,5 , para três extratos frente ao HHV-1 (CDPA10, CDPA22 e CDPA26) e um extrato frente ao FCV (LC22) e BVDV (CDPA27) o que demonstra o grau de segurança dos extratos ativos,devido a relação entre a diferença de toxicidade e efetividade do extrato como inibidor antiviral;
• Dois diferentes mecanismos de ação dos extratos foram observados: CDPA10, CDPA22 e LC22 atuam como inativadores da partícula viral, agindo de alguma forma sob as proteínas virais responsáveis pela adsorção do vírus na membrana celular; Por outro lado o LC22 também agiu no pós-tratamento, assim como os extratos CDPA26 e o CDPA27;
74
• Durante os testes antivirais das frações, as frações 6 - 100% metanólicas - apresentaram os melhores resultados e, por isso, possivelmente possuem compostos responsáveis pela atividade antiviral menos polares em relação a água;
• Após o fracionamento, os IS dos extratos brutos dos isolados CDPA10 e CDPA27 aumentaram; o que poderia ser justificado pela separação de compostos que poderiam estar aumentando a citotoxicidade dos extratos ou agindo de forma antagônica com os compostos ativos;
• Por outro lado, o IS do extrato bruto LC22 diminuiu após o fracionamento, ocasionado possivelmente pela possível separação de compotos que agem em sinergismo quanto a atividade antiviral encontrada;
• Os perfis cromatográficos dos extratos e frações que foram obtidos, ainda que não tenha sido possível identificá-los com exatidão através da comparação com os compostos presentes na biblioteca NIST, direcionam estudos futuros afim de conhecer os responsáveis pela atividade antiviral encontrada.
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8 ANEXO I
Research Article: Actinobacteria from Termite Mounds Show Antiviral Activity against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model for Hepatitis C Virus
Marina Aiello Padilla 1, Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues 2, Juliana Cristina Santiago Bastos 1, Matheus Cavalheiro Martini 1, Ana Caroline de Souza Barnabé 1, Luciana Konecny Kohn 1, Ana Paula Trovatti Uetanabaro 3, Getúlio Freitas Bomfim 4, Rafael Sanches Afonso 2, Fabiana Fantinatti-Garboggini 2, and Clarice Weis Arns 1
1Laboratory of Virology, Department of Genetics and Evolution and Bioagents, Institute of Biology, University of Campinas (UNICAMP), P.O. Box 6109, 13083-970 Campinas, SP, Brazil. 2Multidisciplinary Center for Chemical Biological and Agricultural Research, University of Campinas (UNICAMP), Avenid Alexandre Cazelatto 999, Betel, 13148-218 Paulínia, SP, Brazil 3University of Santa Cruz (UESC), Campus Soane Nazaré de Andrade, Rodovia Jorge Amado, km16, Salobrinho, 45662-900 Ilhéus, BA, Brazil. 4University of Feira de Santana (UEFS), Avenida Transnordestina, s/n, Novo Horizonte, 44036-900 Feira de Santana, BA, Brazil.
Correspondence should be addressed to Clarice Weis Arns; [email protected] Received 28 May 2015; Accepted 28 September 2015 Academic Editor: Nunziatina De Tommasi Copyright© 2015 Marina Aiello Padilla et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 91
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