Oreochromis Niloticus, Linn.)

ใบรับรองวิทยานิพนธ์ บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (เพาะเลี้ยงสัตว์น้ า) ปริญญา เพาะเลี้ยงสัตว์น้ า เพาะเลี้ยงสัตว์น้ า สาขา ภาควิชา

เรื่อง ผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต ระบบภูมิคุ้มกัน และความต้านทานโรคของปลานิล (Oreochromis niloticus, Linn.)

Effect of Mannan-oligosaccharide on Growth, Immunity and Disease Resistance of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus, Linn.)

นามผู้วิจัย นางสาวจิณณพัต ส ารองพันธุ์

ได้พิจารณาเห็นชอบโดย อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก รองศาสตราจารย์นนทวิทย์ อารีย์ชน, Ph.D. วิทยา ( ) อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม ( ผู้ช่วยศาสตราจารย์เรืองวิชญ์ ยุ้นพันธ์, D.Tech.Sc. ) หัวหน้าภาควิชา ( ) ศาสตราจารย์อุทัยรัตน์ ณ นคร, Ph.D.

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์รับรองแล้ว

( รองศาสตราจารย์กัญจนา ธีระกุล, D.Agr. ) คณบดีบัณฑิตวิทยาลัย

วันที่ เดือน พ.ศ.

วิทยานิพนธ์

เรืTอง

ผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต ระบบภูมิคุ้มกนั และความต้านทานโรคของปลานิล (Oreochromis niloticus, Linn.)

Effect of Mannan-oligosaccharide on Growth, Immunity and Disease Resistance of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus, Linn.)

โดย

นางสาวจิณณพัต สํารองพันธุ์

เสนอ

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เพืTอความสมบูรณ์แห่งปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (เพาะเลีNยงสัตว์นํNา) พ.ศ. 2553

จิณณพัต สํารองพันธุ์ 2553: ผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตอการเจริญเติบโต่ ระบบภูมิคุ้มกนั และความต้านทานโรคของปลานิล (Oreochromis niloticus, Linn.) ปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (เพาะเลีNยงสัตว์นํNา) สาขาเพาะเลีNยงสัตว์นํNา ภาควิชาเพาะเลีNยงสัตว์นํNา อาจารย์ทีTปรึกษาวิทยานิพนธ์ หลัก: รองศาสตราจารย์นนทวิทย์ อารีย์ชน, Ph.D. 132 หน้า

การทดลองเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ทีT 0, 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ในอาหารลูก กุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α–methyl testosterone ในการอนุบาลลูกปลานิล (Oreochromis niloticus Linn.) ขนาดนํNาหนัก 0.013 กรัมเป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปลอย่ 100, 200 และ 300 ตัวตอตู้่ บรรจุนํNา 80 ลิตร พบวาทีTระดับ่ 4 และ 6 กรัม ส่งผลให้มีนํNาหนักและความยาวมากกวาชุดควบคุมในทุกอัตราปล่ อย่ อยางมี่ นัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 และ 6 กรัม มีผลตออัตรา่ การเจริญเติบโตตอวัน่ (ADG) อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ทีTอัตราปลอย่ 100 ตัวตอตู้เท่ ่านัNน ส่วนการ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT 4 และ 6 กรัมกบปลาั 200 ตัวตอตู้่ และทีT 6 กรัมกบปลาั 300 ตัว ตอตู้ตามลําดับมีผลต่ ออัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนื่ Nอ (FCR) อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) การเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกความเข้มข้นไมมีผลต่ ออัตรารอดของลูกปลานิลเมืTอสิ่ Nนสุดการอนุบาล 21 วัน การศึกษาทางพยาธิสภาพพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 4 และ 6 กรัม ส่งผล ให้ microvilli ทีTผนังลําไส้ส่วนต้นสมบูรณ์และมีพืNนทีTในการดูดซึมอาหารเพิมขึT Nน และมีการสะสมไขมันทีTตับ เพิมขึT Nน นอกจากนีNการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกระดับมีผลช่วยให้ลูกปลานิลทีTอัตราปลอย่ 100 ตัวตอตู้มีความต้านทานต่ อเชื่ Nอ Streptococcus agalactiae ได้ดีกวาชุดควบคุมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ส่วนทีTอัตราปลอย่ 200 และ 300 ตัวตอตู้พบว่ าเฉพาะทีTระดับ่ 4 และ 6 กรัมเท่านัNนทีTมีความต้านทาน ตอเชื่ Nอ S. agalactiae ได้ดีกวาชุดควบคุมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์ทีTระดับเดียวกนในปลานิลวัยรุั ่นนํNาหนักเฉลีTยประมาณ 60 กรัม พบวาทีTระดับ่ 6 กรัม มีผลให้มีการตอบ- สนองตอวัคซีนแบบ่ secondary immune response ได้เร็วและสูงกวาชุดการทดลองอืTนอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) แตการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกระดับไม่ มีผลต่ อค่ าต่ าง่ ๆ ทางโลหิตวิทยาและ กิจกรรมทีTเกีTยวข้องกบกระบวนการั phagocytosis ส่วนการศึกษาการแสดงออกของยีนทางภูมิคุ้มกนในกลุั ม่ Cytokines คือ Transforming Growth Factor β1, Interleukin 1 β, Interleukin 8 และ Tumor necrosis Factor α จากม้ามและไตส่วนหน้า พบวาให้ผลไม่ ชัดเจนซึTงอาจเก่ ิดจากระยะเวลาของการตอบสนองของแตละยีนทีT่ แตกตางก่ นั

จากการศึกษาครัNงนีNแสดงให้เห็นวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 4 กรัมต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ช่วยเสริมการเจริญเติบโต และความต้านทานตอเชื่ Nอ S. agalactiae ในการอนุบาลลูกปลานิล ส่วนการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารปลาวัยรุ่น พบวาให้ผลไม่ ชัดเจนในการยกระดับการทํางาน่ ของระบบภูมิคุ้มกนแบบไมั จําเพาะ่ และแบบจําเพาะ

/ / ลายมือชืTอนิสิต ลายมือชืTออาจารย์ทีTปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

Chinnapat Samrongpan 2010: Effect of Mannan-oligosaccharide on Growth, Immunity and Disease Resistance of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus, Linn.). Master of Science (Aquaculture), Major Field: Aquaculture, Department of Aquaculture. Thesis Advisor: Associate Professor Nontawith Areechon, Ph.D. 132 pages.

Supplementation of mannan-oligosaccharide (MOS) in diet of Nile tilapia (Oreochromis niloticus Linn.) fry (average weight of 0.013 gm) at 0, 2, 4 and 6 gm per kg feed and mixed with 60 mg per kg 17 α– methyl testosterone was conducted for 21 days in glass tank holding 80 liters of water with stocking rate of 100, 200 and 300 fry per tank. The study on growth indicated that the 4 and 6 gm MOS tilapia fry had significantly higher weight and length than the control at all stocking rate (P<0.05), however these MOS levels could significantly enhance the average daily growth (ADG) of 100 fry per tank only. For feed conversion rate (FCR), it was found that only 4 and 6 gm per kg MOS for 200 fry per tank and 6 gm per kg MOS for 300 fry per tank did show significantly better FCR than other treatments. However, supplementation of MOS at all concentrations and stocking rates did not have any significant impact on the survival rate of tilapia fry after 21 day feeding trial. Histopathological study revealed that tilapia fry fed with 4 and 6 gm per kg MOS for 21 days had better development of microvilli in the intestine and higher amount of fat accumulation in the liver. Supplementation of MOS at all levels did significantly enhance the resistance against pathogenic Streptococcus agalactiae of tilapia fry at 100 fry per tank while at 200 and 300 fry per tank, it required 4 and 6 gm MOS to achieve the same resistance level (P<0.05). The study on the effect of MOS on specific immune response of juvenile tilapia with average weight of 60 gm indicated the significant improvement of secondary immune response in fish fed with 6 gm MOS in term of antibody titer and time of response. However, MOS did not have significant impact on some hematological parameters and phagocytic- related activities. The study on cytokine gene expression including Transforming Growth Factor β1, Interleukin 1 β, Interleukin 8 and Tumor Necrosis Factor α from spleen and anterior kidney did not show a clear pattern of improvement of gene expression after MOS treatment for one month. This might be due to the different period of expression of each gene.

This study clearly indicated the benefits of MOS at 4 gm per kg which could significantly enhance the growth and disease resistance of tilapia fry after 21 days of feed supplementation. However, the supplementation of MOS in juvenile tilapia diet did not show a significant improvement of immunity for both non-specific and specific immune response.

/ / Student’s signature Thesis Advisor’s signature

กิตติกรรมประกาศ

ผู้วิจัยขอกราบขอบพระคุณรองศาสตราจารย์ ดร.นนทวิทย์ อารีย์ชน อาจารย์ทีTปรึกษา วิทยานิพนธ์หลัก ทีTให้คําปรึกษา ความรู้ และคําแนะนําในการตรวจแกไขวิทยานิพนธ์จนกระทั้ งT เสร็จสมบูรณ์ อีกทัNงให้คําปรึกษาในด้านการเรียน การค้นคว้าวิจัย ตลอดจนการดําเนินชีวิต รวมถึง เป็นกาลังใจํ สนับสนุนและส่งเสริมให้ผู้วิจัยได้มีโอกาสทางด้านการศึกษา และการทํางานมากขึNน

ขอกราบขอบพระคุณผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร. เรืองวิชญ์ ยุ้นพันธ์ อาจารย์ทีTปรึกษา วิทยานิพนธ์ร่วม ทีTกรุณาให้คําปรึกษาแนะนําในการตรวจแกไขวิทยานิพนธ์ให้มีความถูกต้อง้ สมบูรณ์มากยิงขึT Nน ขอกราบขอบพระคุณรองศาสตราจารย์ส่งศรี มหาสวัสดิt ผู้แทนบัณฑิตวิทยาลัย ในการสอบประมวลความรอบรู้ ขอกราบขอบพระคุณรองศาสตราจารย์ ดร. วราห์ เทพาหุดี ประธานการสอบขัNนสุดท้าย และ ดร. ปกรณ์ อุนประเสริฐ่ ผู้ทรงคุณวุฒิภายนอกในการสอบปาก เปล่าขัNนสุดท้าย ขอกราบขอบพระคุณอาจารย์ ดร.ประพันธ์ศักดิt ศีรษะภูมิ อาจารย์ ดร.ดุจฤดี ปานพรหมมินท์ และอาจารย์ ดร. กิตติมา วานิชกุล ทีTให้คําปรึกษาและแนะนําความรู้ทีTเป็น ประโยชน์ในระหวางการค้นคว้าวิจัย่ ขอกราบขอบพระคุณอาจารย์ภาควิชาเพาะเลีNยงสัตว์นํNาทุกทาน่ ทีTอบรมสังสอนT และมอบความรู้อันเป็นประโยชน์อยางยิ่ งแกT ่ผู้วิจัย และขอกราบขอพระคุณบริษัท Alltech Biotechnology จํากดั ทีTเอืNอเฟืNอตัวอยางแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในการวิจัยครั่ NงนีN

ขอขอบคุณสถานีวิจัยประมงกาแพงแสนและเกษตรกรผู้เลีํ Nยงปลานิล ทีTให้ความเอืNอเฟืNอ และสนับสนุนตัวอยางปลานิลในการวิจัย่ ขอขอบคุณห้องปฏิบัติการสุขภาพสัตว์นํNา และห้อง ปฏิบัติการพันธุศาสตร์สัตว์นํNา ภาควิชาเพาะเลีNยงสัตว์นํNา ทีTเอืNอเฟืNออุปกรณ์และสถานทีTในการ ทํางานวิจัย และขอขอบคุณเพืTอน พีT น้อง สมาชิกห้องปฏิบัติการสุขภาพสัตว์นํNาทีTคอยแนะนํา และให้ความช่วยเหลือในการทําวิจัยครัNงนีN

ขอกราบขอบพระคุณ คุณพอ่ คุณแม ่ ทีTได้ให้ชีวิต อบรม เลีNยงดู ให้คําปรึกษา เป็นกาลังใจํ สนับสนุน ให้โอกาสในชีวิตและการศึกษากบลูกคนนีั Nตลอดจนสําเร็จการศึกษา รวมถึงญาติ อาจารย์ เพืTอนกลุ่มโรงเรียนสระบุรีวิทยาคม เพืTอน ๆ มีนกร 53 และทุก ๆ คนทีTให้ความรู้ คําปรึกษา ให้กาลังใจํ ให้ความช่วยเหลือ ความห่วงใย และคอยอยูเคียงข้างก่ นเสมอั

จิณณพัต สํารองพันธุ์ พฤษภาคม 2553

(1) (4) สารบัญ

หน้าหน้า

สารบัญ (1) สารบัญตาราง (2) สารบัญภาพ (4) คํานํา 1 วัตถุประสงค์ 3 การตรวจเอกสาร 4 อุปกรณ์และวิธีการ 23 อุปกรณ์ 23 วิธีการ 26 ผลและวิจารณ์ 44 ผลการทดลอง 44 วิจารณ์ผลการศึกษา 94 สรุปและข้อเสนอแนะ 107 สรุป 107 ข้อเสนอแนะ 108 เอกสารและสิTงอ้างอิง 109 ภาคผนวก 127 ประวัติการศึกษา และการทํางาน 132

(2) (5) สารบัญตาราง

ตารางทีM หน้า

1 Gene specific primers เพืTอใช้ในการศึกษา RT-PCR 39 2 ส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR เพืTอหาปริมาตรของ Magnesium chloride ทีTเหมาะสม 40

3 ปริมาตรของ MgCl2 และจํานวนรอบในการทํา PCR ทีTเหมาะสม 41 4 อัตรารอดของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา ไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้ 45 5 นํNาหนักเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนน- โอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้ 47 6 ความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนน โอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้ 49 7 อัตราการเจริญเติบโตต่อวันเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ ตู้ 51 8 อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหาร เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้ 53 9 อัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ ตู้ หลังแช่ด้วยเชืNอ S. agalactiae ทีT 108 CFU/ml 61 10 คาเฉลีTย่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลอง่ 64 11 คาเฉลีTยสูงสุดของ่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลองหลังได้รับ่ วัคซีนทัNง 2 ครัNง 66 12 คาเฉลีTย่ ปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม (Total red blood cells) ของปลานิลทีTได้รับ อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ ( x 108 cells/ml) 69

(3) (6) สารบัญตาราง (ต่อ)

ตารางทีM หน้า

13 คา่ Hematocrit เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (เปอร์เซ็นต์) 71 14 คา่ Hemoglobin เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (g/dL) 73 15 คาเฉลีTย่ ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด (Peripheral blood leukocytes) ของ ปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีT กาหนดํ ( x 107 cells/ml) 75 16 คาเฉลีTย่ percent phagocytosis ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ 77 17 คาเฉลีTย่ phagocytic index ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ 79 18 คาเฉลีTย่ superoxide anion ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (O.D.) 81

(4) (7) สารบัญภาพ

ภาพทีM หน้า

1 อัตรารอดเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน 46 2 นํNาหนักเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน 48 3 ความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน 50 4 อัตราการเจริญเติบโตตอวัน่ เฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน 52 5 อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหาร เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน 54 6 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับ อาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ใน อัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม 55 7 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับ อาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ใน อัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบการฉีกขาดของ microvilli (Laceration; L) 56 8 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับ อาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ใน อัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบการฉีกขาดของ microvilli (Laceration; L) 57

(5) (8) สารบัญภาพ (ต่อ)

ภาพทีM หน้า

9 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับ อาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ใน อัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ชุดควบคุม) พบการฉีกขาดของ microvilli (Laceration; L) 58 10 เซลล์ตับ (Hepatocyte; H) มีการสะสมของไขมัน (Fat droplet; F) อยูในเซลล์่ 59 11 อัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน หลังแช่ด้วยเชืNอ S. agalactiae ทีT 108 CFU/ml 62 12 คาเฉลีTย่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลอง่ 65 13 คาเฉลีTย่ สูงสุดของ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลอ่ งหลังได้รับ วัคซีนทัNง 2 ครัNง 67 14 คาเฉลีTย่ ปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม (Total red blood cells) ของปลานิลทีTได้รับ อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ 70 15 คา่ Hematocrit เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (เปอร์เซ็นต์) 72 16 Hemoglobin เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (g/dL) 74 17 คาเฉลีTย่ ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด (Peripheral blood leukocytes) ของ ปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีT กาหนดํ ( x 107 cells/ml) 76 18 คาเฉลีTย่ percent phagocytosis ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ 78 19 คาเฉลีTย่ phagocytic index ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ 80

(6) (9) สารบัญภาพ (ต่อ)

ภาพทีM หน้า

20 คาเฉลีTย่ superoxide anion ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (O.D.) 82 21 การแสดงออกของยีน Interleukin 1 β จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิล 83 22 การแสดงออกของยีน Interleukin 8 จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิล 84 23 การแสดงออกของยีน Transforming growth factor β 1 จากไตส่วนหน้าและม้าม ของปลานิล 85 24 การแสดงออกของยีน Tumor necrosis factor α จากไตส่วนหน้าและม้ามของ ปลานิล 86 25 การแสดงออกของยีน β-actin จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิล 87 26 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Interleukin 1 β ในปลานิลทีTได้รับ อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั 88 27 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Interleukin 8 ในปลานิลทีTได้รับอาหาร เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั 90 28 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Transforming growth factor β 1 ใน ปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั 91 29 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Tumor necrosis factor α ในปลานิลทีT ได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั 93 1

ผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต ระบบภูมิค้มกันุ และความต้านทานโรคของปลานิล (Oreochromis niloticus, Linn.)

Effect of Mannan-oligosaccharide on Growth, Immunity and Disease Resistance of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus, Linn.)

คํานํา

ปลานิล (Oreochromis niloticus Linnaeus) เป็นปลานํNาจืดทีTมีการเลีNยงอยูทั่ วทุกภูมิภาคของT ประเทศ มีความสําคัญตอเศรษฐก่ ิจและมีผลผลิตเป็นอันดับหนึTงของประเทศไทย ดังเห็นได้จาก สถิติผลผลิตของการเพาะเลีNยงปลานิลปี 2548 มีปริมาณ 244,300 ตัน คิดเป็นมูลคา่ 7,254.1 ล้านบาท (ข้อมูลจากศูนย์สารสนเทศ, กรมประมง) หากพิจารณาถึงสถานการณ์ปลานิลของไทยปัจจุบัน ใน ส่วนของระดับความนิยมหรือภาคการตลาด มีแนวโน้มทีTยังเป็นไปในด้านบวก คือ ยังเป็นทีTนิยม อันดับต้น ๆ สําหรับผู้บริโภคและราคากอยู็ ในระดับทีTผู้บริโภครับได้่ ปลานิลเป็นปลาทีTเลีNยงง่ายและ เจริญเติบโตได้อยางรวดเร็ว่ สามารถกินอาหารได้หลากหลายดํารงชีวิตอยูได้ทั่ NงในนํNาจืดและ นํNากร่อยอีกทัNงยังเป็นปลาทีTมีรสชาติดีสามารถนํามาประกอบอาหารได้หลากหลาย ธุรกิจการเลีNยง ปลานิลนัNนใช้ระยะเวลาไมนานก่ สามารถมีผลผลิตออกสู็ ่ตลาดได้ ตลอดจนปัจจุบันได้มีการพัฒนา ระบบการเลีNยงให้เลีNยงได้หนาแน่นเพืTอเพิมผลผลิตให้มากขึT Nน หากยิงสามารถควบคุมและจัดการT ผลผลิตให้มีคุณภาพดีและได้มาตรฐานในเรืTองของขนาด และนํNาหนัก รวมถึงความสามารถในการ ต้านทานโรคด้วยแล้วกยิ็ งกT ่อให้เกิดประโยชน์แก่ผู้ประกอบการ

ในขณะเดียวกนจากการขยายตัวของการเลีั NยงทีTเพิมขึT Nนและการจัดการของผู้เลีNยงในบางครัNง ทีTยังไมดีพอ่ ทําให้เกิดปัญหาการระบาดของโรคตามมา โดยเฉพาะโรคทีTเกิดจากเชืNอแบคทีเรียชนิด Streptococcus agalactiae (ดริญญา และคณะ, 2550) ซึTงสร้างความเสียหายต่อธุรกิจการเพาะเลีNยง ปลานิลเป็นอยางมาก่ ทําให้เกษตรกรหันมาใช้ยาปฏิชีวนะและสารเคมีเพืTอจัดการกบปัญหาทีTเกั ิดขึNน ซึTงในบางครัNงการแกไขปัญหาด้วยวิธีดังกล้ ่าวนัNนเกษตรกรบางส่วนยังขาดความรู้และความเข้าใจ ทําให้ไมได้ผลเท่ าทีTควรและยิ่ งไปกวT านั่ Nนอาจก่อให้เกิดปัญหาการดืNอยาตามมา นอกจากนัNนแล้วอาจ ก่อให้เกิดสารตกค้างในแหล่งนํNาและในเนืNอปลา ซึTงส่งผลกระทบตอสิ่ Tงแวดล้อมและผู้บริโภคอีก ด้วย ด้วยเหตุนีNการศึกษาถึงคุณสมบัติขององค์ประกอบของจุลชีพ หรือจากสมุนไพรธรรมชาติเพืTอ

เป็นสารกระตุ้นภูมิคุ้มกนั (Immunostimulants) จึงเป็นอีกทางเลือกหนึTงทีTน่าสนใจ เนืTองจากไม่ ก่อให้เกิดสารพิษและสิTงตกค้างทีTเป็นอันตราย

แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ (Mannan-oligosaccharide) เป็นองค์ประกอบของจุลชีพทีTได้ จากผนังเซลล์ยีสต์ และมีคุณสมบัติในการเสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกนในสัตว์มีกระดูกสันหลังั ดังนัNน การศึกษาครัNงนีNจึงมีวัตถุประสงค์ทีTจะศึกษาถึงระดับความเข้มข้นทีTเหมาะสมของแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ทีTผสมในอาหาร ตอการเจริญเติบโต่ อัตรารอด และความต้านทานโรคของลูกปลานิล และระบบภูมิคุ้มกนของปลานิลวัยรุั ่น เพืTอเป็นแนวทางทีTช่วยเพิมศักยภาพในการเพาะเลีT Nยงปลานิล ตอไปในอนาคต่

วัตถุประสงค์

1. ศึกษาผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต อัตรารอด และความต้านทานต่อเชืNอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ของลูกปลานิล

2. ศึกษาผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตอระบบภูมิคุ้มก่ นของปลานิลวัยรุั ่น

3. ศึกษาการแสดงออกของยีนในกลุ่ม Cytokines ของปลานิลวัยรุ่นทีTได้รับอาหารผสม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับทีTแตกตางก่ นั

การตรวจเอกสาร

ปลานิล

อนุกรมวิธานของปลานิล

ปลานิล (Oreochromis niloticus) เป็นพันธุ์ปลาหนึTงใน 16 ชนิดของครอบครัว Cichlidae รูปร่างและการดํารงชีวิตคล้ายคลึงกบปลาหมอเทศั (Tilapia mossambica Peters) หรือ Java tilapia โดยมีถิTนฐานดัNงเดิมของปลาในครอบครัวนีNอยูในทวีปแอฟริกา่ พบทัวไปตามหนองT บึง และ ทะเลสาบในประเทศซูดาน อูแกนดา แทนแกนยิกา เป็นต้น (ชาญชัย, 2522) สําหรับประเทศไทย เจ้าฟ้าชายอาคิฮิโตได้จัดส่งปลานิลจํานวน 50 ตัว มาทูลเกล้าฯถวายพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยูหัว่ เมืTอปี พ.ศ. 2508 (สุปราณี, 2550) และเนืTองจากปลานิลเป็นปลาทีTเลีNยงง่าย ทนตอสภาพแวดล้อม่ ตาง่ ๆ ได้ดี พระบาทสมเด็จพระเจ้าอยูหัวจึงมอบหมายให้กรมประมงเป็นผู้เผยแพร่ ่ และส่งเสริมให้ มีการเลีNยงปลานิลจนมีการเลีNยงอยางแพร่ ่หลายในปัจจุบัน

อนุกรมวิธานของปลานิล

Kingdom Animalia

Phylum Chordata

Class Actinopterygii

Order Perciformes

Family Chichlidae

Genus Oreochromis

Species niloticus

ชืTอวิทยาศาสตร์ Oreochromis niloticus

ลักษณะทัMวไปของปลานิล

ปลานิลมีรูปร่างลักษณะคล้ายกบปลาหมอเทศั ลําตัวสัNน แบนข้าง แตลักษณะพิเศษของ่ ปลานิลคือ ริมฝีปากบนและล่างเสมอกนั ซึTงปลาชนิดอืTน ๆ มักจะมีริมฝีปากบนสัNนกวาริมฝีปากล่ ่าง บริเวณแกมมีเกล็ด้ 4 แถว สีของลําตัวเปลีTยนไปตามสภาพแวดล้อมของแหล่งทีTอยูอาศัยคือตั่ Nงแตสี่ ดําออนจนถึงสีเขียวดํา่ ท้องสีขาว ทีTลําตัวมีลายพาดขวางประมาณ 9-10 แถบตัNงแตหัวจรดโคนหาง่ แม้แตลูกปลาก่ มีลายพาดขวางนี็ Nเห็นชัดเจนไมน้อยกว่ า่ 7 แถบทัNงเพศผู้และเพศเมีย แต่เพศเมียสีจะ จางกวาเพศผู้มาก่ ครีบหลัง ครีบกน้ และครีบหางมีจุดสีขาวและเส้นสีดําตัดขวาง มีเกล็ด 3 แถวทีT บริเวณแกม้ และอีก 1 แถวทีTบริเวณเหนือเส้นข้างลําตัวเล็กน้อย ครีบหลังมีอันเดียวยาวจรดถึงคอด หาง ครีบหลังประกอบด้วยกานครีบแข็ง้ 15-18 อัน และกานครีบอ้ อน่ 12-14 อัน ครีบกน้ ประกอบด้วยกานครีบแข็ง้ 3 อัน และกานครีบอ้ อน่ 9-10 อัน ครีบหางตัดตรง บนแถบเส้นข้างลําตัว มีเกล็ด 33 เกล็ด ทางด้านข้างมีเกล็ดตามแนวเฉียงจากตอนต้นของครีบหลังลงมาถึงเส้นข้างลําตัว 5 เกล็ด และจากเส้นข้างลําตัวลงมาถึงส่วนหน้าของครีบกน้ 13 เกล็ด ตรงกลางเกล็ดมีสีเข้ม บริเวณ ปลายออนของครีบหลัง่ ครีบกน้ และครีบหางมีจุดสีขาวและเส้นสีดําตัดขวางดูคล้ายลายข้าวตอกอยู่ โดยทัวไปT ทีTกระดูกแกมมีจุดสีเข้มอยู้ ่ 1 จุด ลักษณะฟันบริเวณขากรรไกรและคอหอยจะมีหลาย ขนาด ตัNงแตค่ อนข้างหยาบจนถึงละเอียด่ เหงือกมีซีTกรองประมาณ 15-17 อัน ปลานิลเมืTอมีอายุได้ ประมาณ 3 เดือนเศษจะเริTมมีลักษณะแตกตางทางเพศ่ ปลานิลทีTพบมีขนาดใหญทีTสุดมีนํ่ Nาหนัก ประมาณ 2.5 กิโลกรัม (อุดม, 2549)

ปลานิลมีนิสัยชอบอยูรวมก่ นเป็นฝูงั มีความอดทนและปรับตัวเข้ากบสภาพแวดล้อมได้ดีั ตามปกติรูปร่างภายนอกของปลานิลเพศผู้และเพศเมียจะมีลักษณะคล้ายคลึงกนมากั แตจะสังเกต่ ลักษณะเพศได้โดยการดูอวัยวะเพศทีTบริเวณใกล้กบชั ่องทวาร โดยเพศผู้จะมีอวัยวะเพศลักษณะ เรียวยาวยืTนออกมา สําหรับเพศเมียมีลักษณะของอวัยวะเพศเป็นรูค่อนข้างใหญและกลม่ ขนาดปลา ทีTจะแยกเพศได้ชัดเจนต้องเป็นปลาทีTมีขนาดยาวตัNงแต ่ 10 เซนติเมตรขึNนไป สําหรับปลาทีTมีขนาดโต เต็มทีTสามารถสังเกตเพศได้ด้วยการดูสีทีTลําตัว โดยสีบริเวณใต้คางและลําตัวของปลาเพศผู้จะมีสีเข้ม กวาปลาเพศเมีย่ เมืTอถึงฤดูผสมพันธุ์สีจะยิงเข้มขึT Nน (สุปราณี, 2550)

ตามธรรมชาติแล้วปลานิลชอบอาศัยอยูรวมก่ นเป็นฝูงั (ยกเว้นเวลาสืบพันธุ์) ตามแม่นํNา บึง ลําคลอง ทะเลสาบ ทีTเป็นแหล่งนํNาจืด แตสามารถนําไปเลี่ NยงในบริเวณทีTเป็นนํNากร่อยได้ เนืTองจากมี มีความทนทานต่อการเปลีTยนแปลงของสภาพแวดล้อมได้ดี สามารถมีชีวิตอยูได้ในช่ ่วงการ

เปลีTยนแปลงของอุณหภูมิกว้างมากคือตัNงแต ่ 11-42 องศาเซลเซียส แตในอุณหภูมิตํTากว่ า่ 10 องศา- เซลซียส พบวาปลานิลปรับตัวและเจริญเติบโตได้ไม่ ดีนัก่ ทัNงนีNเป็นเพราะถิTนกาเนิดเดิมของปลาํ ชนิดนีNอยูในเขตร้อน่ ส่วนความทนทานของปลานิลต่อความเป็นกรดเป็นด่างของนํNา (pH) โดย เจริญเติบโตได้ดีในช่วง 6.5-8.5 ปลานิลจะเริTมตายในนํNาทีTมี pH 6.5-5.5 เฉลีTย 10% และทีT pH 5.5-4.5 เฉลีTย 70% และตายหมดทีT pH 4.5-3.5 นอกจากนีNปลานิลยังมีความทนทานตอความเค็ม่ กล่าวคือ ปลานิลสามารถอยูได้ปกติในนํ่ NาทีTมีความเค็มสูงสุด 20 ส่วนในพันส่วน ซึTงนับวาเป็นปลา่ ทีTเหมาะจะนําไปเลีNยงในบอดินได้เป็นอย่ างดี่ (อุดม, 2549)

การแพร่ขยายพันธ์ุ

ปลานิลสามารถผสมพันธุ์ได้ตลอดปี โดยปกติวงจรการสืบพันธุ์วางไขของปลานิลจะใช้่ เวลาประมาณ 1 เดือน แต่อาจจะไมได้เก่ ิดขึNนทุกเดือน ขึNนอยูก่ บความสมบูรณ์ของแมั ปลาและ่ สภาพแวดล้อม (คีรี, 2542) เนืTองจากขนาด อายุและช่วงการสืบพันธุ์ของปลาแตละตัวจะแตกต่ างก่ นั ไปตามสภาพแวดล้อม และสภาพทางสรีรวิทยาของปลาเอง โดยพบวาปลานิลจะเริ่ Tมมีพัฒนาการ ของไขและนํ่ NาเชืNอเมืTอมีความยาวประมาณ 6.5 เซนติเมตร

ในช่วงผสมพันธุ์วางไข ่ ปลานิลเพศผู้จะแยกออกจากฝูงแล้วเริTมสร้างรัง โดยเลือกบริเวณ เชิงลาดหรือกนบ้ อทีTมีระดับนํ่ Nาลึกระหวาง่ 0.5-1 เมตร วิธีการสร้างรังนัNนปลาจะปักหัวลงโดยตัว ของมันจะอยูในระดับตั่ Nงฉากกบพืั Nนดิน แล้วใช้ปากพร้อมกบการเคลืTอนไหวของลําตัวเขีTยดินั ตะกอนออก จากนัNนจะอมดินตะกอนและงับเศษสิTงของต่าง ๆ ออกไปทิงนอกรังN ทําเช่นนีNจนกวาจะ่ ได้รังทีTมีลักษณะคอนข้างกลม่ เส้นผานศูนย์กลางประมาณ่ 20-25 เซนติเมตร ลึกประมาณ 3-6 เซนติเมตร ความกว้างและความลึกของรังทีTใช้วางไขขึ่ Nนอยูก่ บขนาดของพั อปลา่ หลังจากสร้างรัง เสร็จเรียบร้อยแล้ว มันจะไล่ปลาตัวอืTน ๆ ให้ออกไปนอกรัศมีของรังประมาณ 2-3 เมตร ขณะเดียวกนพั อปลาทีTสร้างรังจะแผ่ ครีบหลัง่ และอ้าปากกว้างในขณะทีTมีปลาเพศเมียวายนํ่ Nาเข้ามา ใกล้ ๆ รัง และเมืTอเลือกปลาเพศเมียได้ถูกใจแล้ว จะแสดงอาการจับคูก่ นั โดยใช้หางดีดและกดกั นั เบา ๆ การเคล้าเคลียดังกล่าวใช้เวลาไมนานนัก่ ปลาเพศผู้จะใช้บริเวณหน้าผากดุนทีTใต้ท้องของปลา เพศเมียเพืTอเป็นการกระตุ้นเร่งเร้าปลาเพศเมียให้วางไข ่ ซึTงปลาเพศเมียจะวางไขครั่ Nงละ 10-15 ฟอง ปริมาณไขทีTวางรวมก่ นแตั ละครั่ Nงมีประมาณ 50-600 ฟอง ทัNงนีNขึNนอยูก่ บขนาดของแมั ่ปลา เมืTอปลา เพศเมียวางไขแต่ ละครั่ Nง ปลาเพศผู้จะวายนํ่ Nาไปเหนือไขพร้อมก่ บปลั ่อยนํNาเชืNอลงไป จากนัNน ปลาเพศเมียจะเกบไข็ ทีTได้รับการผสมแล้วไว้ในปาก่ ทําเช่นนีNจนกวาการผสมพันธุ์แล้วเสร็จ่

โดยใช้เวลา 1-2 ชัวโมงT ปลาเพศเมียจะวายออกจากรังส่ ่วนปลาเพศผู้จะคอยหาโอกาสเคล้าเคลียกบั ปลาเพศเมียตัวอืTนต่อไป

ไขทีTปลาเพศเมียอมไว้ในปากจะมีพัฒนาการขึ่ Nนเป็นลําดับ ไขปลานิลเป็นประเภทไข่ ่จม มี ขนาดเส้นผานศูนย์กลางประมาณ่ 1.8-2.0 มิลลิเมตร ถุงไขแดงมีขนาดใหญ่ ่ ไขจะฟักเป็นตัวภายใน่ เวลา 4 วัน ในนํNาทีTอุณหภูมิ 27-28 องศาเซลเซียส ไขปลานิลจะพัฒนาเป็นปลานิลตัวอ่ ่อน 5 ระยะ คือ

ระยะทีT 1 ไมมีตา่ (Uneyed) ระยะนีNไขยังคงเป็นสีเหลืองอ่ อนตลอดทั่ Nงฟอง ยังไมมี่ พัฒนาการใด ๆ ให้เห็น ระยะทีT 2 มีตา (Eyed) ไขยังคงมีสีเหลือง่ และมีจุดดํารอบ ๆ ไข ่ ระยะทีT 3 ก่อนฟักเป็นตัว (Pre-hatch) เป็นระยะทีTไขเปลีTยนเป็นสีนํ่ Nาตาล มีการพัฒนาจน สังเกตเห็นส่วนตาและหางชัดเจน ระยะทีT 4 ฟักเป็นตัวออน่ (Hatch fry หรือ Yolk sac fry) เป็นระยะทีTลูกปลาฟักออกเป็น ตัวแตยังมีถุงไข่ แดงติดอยู่ ่ ระยะทีT 5 ตัวอ่อนทีTวายนํ่ Nา (Swim-up fry) เป็นระยะทีTถุงไขแดงยุบและลูกปลาสามารถ่ วายนํ่ Nาได้

แม่ปลาฟักไข่ในปากโดยการขยับปากให้นํNาไหลเข้าออกในช่องปากอยูเสมอ่ เพืTอช่วยให้ ไขทีTอมไว้ได้รับนํ่ NาทีTสะอาดทัNงยังเป็นการป้องกนศัตรูทีTจะมากั ินไขด้วย่

ไขจะพัฒนาเป็นลูกปลาทีTถุงอาหารยังไม่ ยุบ่ ภายใน 8 วันลูกปลานิลจะเกาะรวมกนเป็นั กลุ่มโดยวายวนเวียนอยู่ บริเวณหัวของแม่ ปลาและเข้าไปหลบซ่ ่อนอยูในช่ ่องปากเมืTอมีภัย เมืTอมีอายุ ครบ 13-14 วัน นับจากวันทีTแมปลาวางไข่ ่ ลูกปลานิลจะเริTมกินอาหารจําพวกพืชและไรนํNาขนาดเล็ก และหลังจากมีอายุ 3 สัปดาห์ขึNนไป ลูกปลาจะกระจายแตกฝูงไปหากินเลีNยงตัวเองได้โดยลําพัง (สุปราณี, 2550)

อาหารและการกินอาหาร

นิสัยการกินอาหารของปลานิลสามารถกินได้ทัNงสัตว์และพืชรวมทัNงซากทีTเน่าเปืTอย ปลานิล กินซากพืช สาหร่าย โรติเฟอร์ สัตว์หน้าดิน และแพลงค์ตอนสัตว์ เช่น ตัวอ่อนของแมลงนํNาและไร- นํNา กินอาหารตัNงแต่ระดับผิวนํNาไปถึงพืNนท้องนํNา นอกจากนีNยังสามารถฝึกให้ปลานิลกินอาหารเม็ด หรืหรืออาหารผสมและเศษอาหารได้ง่าย (อุดม, 2549) การเลีNยงปลานิลในบอนั่ Nนนิยมให้อาหาร จําพวก รํา เศษอาหาร พืชจําพวกแหน รวมทัNงมูลสัตว์และปุ๋ยวิทยาศาสตร์ เป็นต้น ต่อมาได้มีการ ปรับปรุงคุณภาพของอาหารปลานิลโดยเน้นรายละเอียดเกีTยวกบปริมาณโปรตีนในอาหารผสมั ให้ ได้ระดับทีTต้องการเพืTอช่วยให้ปลาโตเร็วขึNน และใช้ส่วนผสมของรํา ปลายข้าว กากถัวเหลืองT ใบ กระถินแห้ง ปลาป่น เกลือแร่และวิตามิน เป็นต้น (ชาญชัย, 2522)

โรคและปรสิตทีMพบในปลานิล

สุปราณี (2550) รายงานวา่ ส่วนใหญ่เป็นโรคทีTเกิดจากปรสิตภายนอกและปรสิตภายใน แบคทีเรีย และเชืNอรา

โรคจุดขาว เกิดจากโปรโตซัวชนิด Ichthyophthirius multifilis ส่วนใหญจะพบในปลานิล่ วัยออน่ โดยจะพบจุดขาวกลมขนาดเล็กเทาปลายเข็มหรือเล็กกว่ าหัวเข็มหมุดกระจายอยู่ ตามตัว่ ช่องปาก จมูก และเหงือก ปลาจะขับเมือกออกมามาก มีสีผิวซีด ครีบเปืTอย วายนํ่ NาเฉืTอยชา และมี อัตราการตายสูงมากภายในเวลา 2-3 วัน โรคนีNสามารถแพร่กระจายได้อยางรวดเร็ว่

โรคเห็บระฆัง เกิดจากโปรโตซัวชนิด Trichodina spp.ปลานิลจะมีอาการลอยหัว เหงือกซีด ผิวตัว ครีบ และรอบปากเปืTอย มีแผลเลือดออกขนาดเล็กกระจายอยูตามลําตัว่ มีคราบขาว ๆ เกาะ ตามผิวตัวปลา โรคนีNมักเกิดกบปลาวัยอั อนทีTเลี่ Nยงอยางหนาแน่ ่นโดยจะทําให้ปลาตายอยางรวดเร็ว่ ในระยะเวลาอันสัNน

โรคทีTเกิดจากปรสิตกลุ่มครัสเตเชียน มักพบเกาะตามเหงือกของปลานิล สามารถเคลืTอนทีT ได้เร็วมาก อาจทําให้ปลานิลตายหรือเจริญเติบโตช้า บริเวณทีTเกาะจะมีอาการบวม มีแผลเลือดออก ขนาดเล็ก ตัวอยางปรสิตกลุ่ ่มครัสเตเชียนทีTพบในปลานิล เช่น หนอนสมอ (Lernaea sp.) พบเกาะทีT เพดานปากและตามโคนครีบตาง่ ๆ ของปลานิล เห็บกามปู้ (Ergasilus sp.) พบเกาะตามเหงือกและ

ฝังตัวอยูในปากปลานิล่ ปลิงใส (Monogenea) พบเกาะตามเหงือกและผิวหนัง พยาธิตัวแบน (Trematode) พบเกาะตามตัว เหงือก หรือตาของปลานิล

โรคทีTเกิดจากปรสิตภายใน ส่วนใหญ่จะเป็นพวกโปรโตซัวและเมตาซัวทีTพบภายในลําไส้ ของปลานิล ทําให้ปลาผอม วายนํ่ Nาช้า และสีตามลําตัวปลาอาจมีสีเข้มขึNน แตไม่ ทําให้ปลาตาย่

โรคทีTเกิดจากแบคทีเรีย มักพบในบอทีTมีอินทรีย์วัตถุสะสมมาก่ ๆ ชนิดของแบคทีเรียทีTทํา ให้เกิดโรคในปลานิลได้แก่ Streptococcus agalactiae ปลามีอาการวายลอยหัวทีTผิวนํ่ Nา เสียการทรงตัว วายนํ่ Nาหมุน แบบควง สวาน่ ตาโปนหรือขุนขาวทั่ Nงสองข้างหรือเพียงข้างเดียว โคนครีบหูบวม มักพบร่วมกบั อาการภายใน ได้แก่ ตับบวมและมีสีซีด ม้ามโต ถุงนํNาดีโต มีของเหลวอยูมากในลําไส้และช่ ่อง ท้อง (ดริญญา และคณะ, 2550) Aeromonas spp. และ Pseudomonas spp. ทําให้เกิดแผลเลือดออกขนาดเล็กในอวัยวะและ เนืNอเยืTอตางๆ่ Mycobacterium spp. ทําให้เกิดอาการอักเสบแบบเรืNอรัง พบกอนสีขาวครีมขนาดเล็ก้ บริเวณตับ ไต ม้าม และกล้ามเนืNอลําตัวจํานวนมาก Flavobacterium columnaris ทําให้ลําตัวปลาเป็นแผลสีเทาทีTมีลักษณะลึกลงแบบอานม้า ลําตัวคลํNา ครีบหลังเน่า วายนํ่ Nาช้าลง และตายในทีTสุด

โรคทีTเกิดจากเชืNอรา ไมได้ก่ ่อให้เกิดโรคโดยตรง แต่จะทําให้เกิดอาการแทรกซ้อนในกรณี ทีTปลาออนแอหรือมีบาดแผลบริเวณลําตัว่

ระบบภูมิค้มกันของปลาุ

เอกพล (2551) รายงานวา่ ปลาเป็นสัตว์มีกระดูกสันหลัง (Vertebrate) ทีTมีวิวัฒนาการตํTา ทีTสุดทีTมีระบบภูมิคุ้มกนคล้ายคลึงกั บสัตว์มีกระดูกสันหลังชัั Nนสูงอยางเช่ ่น สัตวเลีNยงลูกด้วยนม (Mammals) โดยเฉพาะปลากระดูกแข็ง (Teleost fish) จัดเป็นกลุ่มของสัตว์มีกระดูกสันหลังทีTมี ระบบภูมิคุ้มกนทีTพัฒนาคั ่อนข้างดี (Zarkadis et al., 2001) ซึTงระบบภูมิคุ้มกนปลาสามารถแยกั ออกเป็น 2 ส่วน(Magor and Magor, 2001) คือ

1. ระบบภูมิคุ้มกนทีTมีมาตัั Nงแตก่ าเนิดํ (Innate Immunity)

ปลากระดูกแข็งเป็นสิTงมีชีวิตทีTพบอาศัยอยูได้ทั่ NงในนํNาจืดและนํNาเค็ม ระบบภูมิคุ้มกนทีTมีมาั มาตัNงแตก่ าเนิดของสัตว์ในกลุํ ่มนีNถือได้วามีความสําคัญต่ ่อการอยูรอดอย่ างมาก่ เนืTองจากปลาอาศัย อยูในนํ่ NาทีTเป็นแหล่งแพร่กระจายและอยูอาศัยของเชื่ Nอโรคหลายชนิด ดังนัNนสิTงป้องกนทางกายภาพั จึงเป็นองค์ประกอบหรือด่านแรกทีTทําหน้าทีTในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนั (Jones, 2001) นอกจากนีNยังมีการทํางานของเซลล์บางกลุ่มและการหลังสารโปรตีนบางชนิดในระบบการT ตอบสนองแบบนีNด้วย ซึTงส่วนใหญพบว่ าเป็นการตอบสนองแบบไม่ จําเพาะเจาะจง่ (Non specific response) และไมมีการจดจํา่ (No memory) (Bols et al., 2001) กลไกทีTทําหน้าทีTในการป้องกนเชืั Nอ โรคเข้าสู่ร่างกายในระบบนีNแบงได้เป็น่ 3 กลไก (Magnadottir, 2006) ได้แก่

1.1 กลไกการป้องกนตัวโดยโครงสร้างทางกายภาพั (Physical defenses)

ผิวหนัง (Skin)

ผิวหนังของปลาถือเป็นด่านแรกทีTป้องกนเชืั NอโรคหรือสิTงแปลกปลอมทัNงหลายไมให้่ เข้าสู่ร่างกาย ซึTงโดยทัวไปแบT งเป็น่ 4 ชัNน ได้แก่ Cuticle, Epidermis, Dermis และ Hypodermis โดย ชัNน Cuticle จะอยูชั่ Nนนอกสุดมีลักษณะเป็นชัNนบาง ๆ โครงสร้างส่วนใหญจะเป็นเยืTอเมือก่ (Mucus) ซึTงถูกขับออกมาจากเซลล์ชนิด Mucus หรือ Goblet cell (Bols et al., 2001) ในชัNน Epidermis ของ ปลาบางชนิดจะมีส่วนของผิวหนังทีTคอนข้างหนาและแข็งแรงทําให้ยากต่ อการทําอันตรายของเชื่ Nอ- โรคปลาบางชนิด เช่น ปลากลุ่ม Catfish (Yoakim and Grizzle, 2006) จะมีเซลล์ชนิดพิเศษเรียกวา่ Alarm substance cell หรือ Club cell ในชัNน Epidermis ทีTทําหน้าทีTในการสร้างสารเตือนภัย (Alarm substance) ออกมาเมืTอมีการบุกรุกหรือถูกทําร้ายด้วยศัตรู (Chivers et al., 2007)

เมือก (Mucus)

เมือกจัดเป็นองค์ประกอบทีTอยูนอกสุดของผิวหนัง่ ซึTงสัมผัสกบสภาพแวดล้อมโดยตรงั ด้วยคุณสมบัติทีTเหนียว จึงมีคุณสมบัติในการดักจับเชืNอโรคอยางไม่ จําเพาะเจาะจงและยังพบว่ าปลา่ มีการขับเมือกออกมาตลอดเวลาทําให้เชืNอโรคทีTติดมากบเมือกหลุดลอกออกไปั ทําให้ไมสามารถ่ เข้าสู่ตัวปลาได้ นอกจากนีNจากการศึกษายังพบวามีการเคลืTอนตัวไปมาระหว่ างชั่ Nนผิวหนังของ

โปรตีนและเซลล์เม็ดเลือดขาวบางชนิดในชัNนนีN ทําให้เป็นการเพิมความสามารถในการป้องกT นเชืั Nอ โรคหรือสิTงแปลกปลอมได้ดียิงขึT Nน (Bols et al., 2001)

เกล็ด (Scale)

เกล็ดถือเป็นโครงสร้างพิเศษของปลาทีTใช้ป้องกนอันตรายตั าง่ ๆ ทัNงทีTเป็นของแข็งและ เชืNอโรคหรือสิTงแปลกปลอมชนิดตาง่ ๆ เนืTองจากมีลักษณะแข็ง ซึTงทําให้ยากตอการบุกรุก่ นอกจาก นีNยังมีเมือกปกคลุมโครงสร้างนีNด้วย (Magnadottir, 2006)

1.2 กลไกการป้องกนตัวโดยใช้เซลล์ั (Cellular defenses)

กลไกการป้องกนตัวในระบบนีั Nจะเป็นส่วนสําคัญในการตอบสนองตอเชื่ NอโรคหรือสิTง แปลกปลอมภายหลังจากทีTเชืNอโรคหรือสิTงแปลกปลอมได้ผานกลไกทางกายภาพเข้ามา่ โดยเซลล์ทีT ทําหน้าทีTสําคัญในระบบนีNได้แก่ Phagocytes ทัNงหลาย เช่น Macrophage และ Polymorphonuclei (PMN) cells ทีTมีโครงสร้างคล้าย ๆ กบั Neutrophils (Ellis, 2001) ของสัตว์ชัNนสูง โดยเซลล์ในกลุ่ม นีNจะทําหน้าทีTจับกิน (Engulfment) เชืNอโรคและสิTงแปลกปลอมอยางไม่ จําเพาะเจาะจง่ โดย ขบวนการ Phagocytosis อยางไรก่ ตามในสัตว์ชั็ Nนสูงมีการศึกษาพบวาเซลล์เหล่ ่านีNมีความจดจําใน การตอบสนองต่อสิTงแปลกปลอมได้ด้วย เซลล์ในกลุ่มนีNยังทําหน้าทีTในการเตรียมแอนติเจน (Antigen) สําหรับเซลล์บางกลุ่ม เพืTอตอบสนองในขบวนการตอบสนองสิTงแปลกปลอมอยาง่ จําเพาะเจาะจงจึงเรียกเซลล์กลุ่มนีNอีกชืTอวา่ Antigen presenting (processing) cells

1.3 กลไกการป้องกนตัวโดยผั านสารนํ่ Nา (Humoral defenses)

ปลากระดูกแข็งโดยทัวไปมีการหลัT งสารโปรตีนสําคัญออกมาในระบบหมุนเวียนของT เลือดเช่นเดียวกบสัตว์ชัั Nนสูง เพืTอทําหน้าทีTสําคัญในการทําลายเชืNอโรคหรือสิTงแปลกปลอม โดยมี ฤทธิtทําให้เกิดการแตกสลาย (Lysis) ของเซลล์เชืNอโรคอยางไม่ จําเพาะเจาะจงทีTสําคัญได้แก่ ่ Complements ซึTงเป็นโปรตีนทีTมีอยูทั่ วไปในรT ่างกาย สามารถกาจัดสิํ Tงแปลกปลอมได้อยางไม่ ่ จําเพาะเจาะจงโดยทําให้เกิดการสลายตัวของเซลล์และเสริมขบวนการ Phagocytosis รวมทัNงยัง เกีTยวข้องกบการอักเสบั (Inflammatory) ของร่างกาย (Zarkadis et al., 2001) Lytic enzyme ชนิด ตาง่ ๆ เช่น Lysozyme เป็นโปรตีนทีTสําคัญในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนของสัตว์ทัั NงพวกทีTมี

กระดูกสันหลังและไมมีกระดูกสันหลัง่ โดยสามารถยอยผนังเซลล์ของแบคทีเรียและกระตุ้นระบบ่ Complement system และ Phagocytosis ได้อีกด้วย (Magnadottir, 2006) นอกจากนีNยังมีเอนไซม์ทีT สําคัญอืTน ๆ ในกลไกการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกนอีกหลายชนิดั เช่น Agglutinin และ Precipitins ซึTงเป็นเอนไซม์ทีTทําหน้าทีTคล้ายกบั Lectin และ Pentraxins ซึTงสามารถทําปฏิกริยากบั คาร์โบไฮเดรตได้ และสามารถกระตุ้นระบบ Opsonization, Phagocytosis และ Complement system ได้อีกด้วย (Arason, 1996) นอกจากนีNยังมีสารทีTสําคัญทีTถูกสร้างขึNนในการกระตุ้นภูมิคุ้มกนั คือ Cytokines และ Chemokines ซึTงถือได้วาเป็นตัวควบคุม่ (Control) และเป็นสัญญาณโมเลกุล (Signaling molecules) ในการทํางานร่วมกนระหวั างระบบภูมิคุ้มก่ นแบบั Innate immunity และ Acquire หรือ Adaptive immunity (Secombes et al., 1996)

2. ระบบภูมิคุ้มกนทีTเกั ิดขึNนภายหลังจากทีTได้รับการกระตุ้น (Adaptive or Acquired Immunity)

การตอบสนองทางภูมิคุ้มกนประเภทนีั Nถือได้วาเป็นระบบทีTมีการพัฒนาดีทีTสุด่ พบได้ตัNงแต่ ในปลากระดูกออนไปจนถึงมนุษย์่ ซึTงยังไมปรากฏในสัตว์ไม่ มีกระดูกสันหลัง่ (Invertebrate) ทัNงใน ส่วนของแมลงและสัตว์จําพวกกุงหรือปู้ (Pasquier, 2001) ระบบการตอบสนองแบบนีNจะเกิดขึNนก็ ตอเมืTอมีการกระตุ้นด้วยสิ่ Tงแปลกปลอมและการตอบสนองจะมีความรุนแรงและรวดเร็วกวาการ่ ตอบสนองในครัNงแรกเมืTอเซลล์ของระบบภูมิคุ้มกนพบกั บสิั TงแปลกปลอมชนิดเดิมอีกครัNง เนืTองจาก เป็นระบบการตอบสนองต่อสิTงแปลกปลอมทีTมีความสามารถในการจดจําและมีความจําเพาะเจาะจง สูงมาก การตอบสนองในระบบนีNจะอาศัยการทํางานร่วมกนของกลุั ่มเซลล์เม็ดเลือดขาวหลาย ๆ ชนิด และอาศัยโปรตีนบนผิวเซลล์เป็นสืTอกลางในการติดตอสืTอสารเพืTอการจดจําเชื่ NอโรคหรือสิTง แปลกปลอมทีTบุกรุกเข้ามาในร่างกาย (Miller and Clem, 1984) ระบบการตอบสนองนีNสามารถแบง่ ออกเป็น 2 ส่วนทีTสําคัญคือ

2.1 การตอบสนองโดยผานสารนํ่ Nาหรือของเหลวในเลือด (Humoral immune response)

การตอบสนองทางภูมิคุ้มกนแบบนีั Nจะมีเซลล์เม็ดเลือดขาว (Leukocytes) หลายชนิดเข้า มาร่วมกนทํางานั ซึTงผลของการตอบสนองจะมีการสร้างโปรตีนทีTสามารถทําหน้าทีTในการจดจํา เชืNอโรคหรือสิTงแปลกปลอมอยางจําเพาะเจาะจง่ ทีTเรียกวา่ Antibody หรือ Immunoglobulin (Ig) ใน สัตว์เลีNยงลูกด้วยนมจะมี Ig อยู ่ 5 ชนิด ซึTงได้แก่ IgM, IgD, IgG, IgA และ IgE การศึกษาในช่วง แรก ๆ พบวาปลากระดูกแข็งมีการสร้าง่ Ig เพียงสองชนิดเทานั่ Nนคือ IgM และ IgD (Warr, 1995) แต่

ในปัจจุบันมีการศึกษาพบวาในปลากระดูกแข็งมีการสร้าง่ IgT ได้อีกชนิดหนึTง (Raida and Buchmann, 2008) โดยเซลล์เม็ดเลือดขาวทีTทําหน้าทีTในการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกนในั ระบบนีN ได้แก่

Antigen presenting cell (APC)

ในสัตว์ชัNนสูงโดยทัวไปเซลล์กลุT ่มนีNได้แก่ Neutrophils, Monocytes (Macrophages) และ Dendritic cell ซึTงจะทําหน้าทีTในการดักจับเชืNอโรคหรือสิTงแปลกปลอมทีTเข้ามาในร่างกายด้วย ขบวนการ Phagocytosis แล้วทําการยอยสลายและตกแต่ งโครงสร้าง่ Antigen โดยเลือกเอาเฉพาะ ส่วนทีTมีคุณสมบัติดีทีTสุดในการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกนทีTเรียกวั า่ Epitope หรือ Antigenic determinant ไปแสดงไว้ทีTผิวเซลล์ โดยอาศัยโปรตีนบนผิวเซลล์ (Surface protein) ทีTเรียกวา่ Major histocompatibility complex (MHC) class II เป็นสืTอกลางให้ T cell (Helper T cell) มาจดจําภาย- หลังจากทีT Helper T cell มาตรวจพบ Epitope ของสิTงแปลกปลอมแล้ว จะปล่อยสารทีTสําคัญบาง ชนิดคือ Cytokines (Whyte, 2007) ออกมาเพืTอกระตุ้นให้กลุ่มของ APC มีการแบงเซลล์อย่ างรวดเร็ว่ และยังกระตุ้นให้ APC มีการตอบสนองได้อยางมีประสิทธิภาพมากยิ่ งขึT Nนและบางส่วนยังมีการ พัฒนาตัวไปเป็น Memory APC เพืTอการตอบสนองและจดจํา Antigen ตัวเดิมในครัNงต่อไป (Dixon and Stet, 2001)

Lymphocytes

Lymphocytes ทีTพบในสัตว์ชัNนสูงสามารถแบงได้เป็น่ 2 กลุ่มใหญ ่ ๆ ได้แก่ B และ T lymphocytes (B และ T cells) ในปลาถึงแม้วายังไม่ มีการพิสูจน์ได้ชัดเจนว่ ามี่ B และ T cells อยูจริง่ แตจากการกระตุ้น่ Lymphocytes ของปลาด้วย Mitogen ซึTงเป็นสารทีTมีคุณสมบัติในการกระตุ้นให้ B และ T cell มีการแบงเซลล์แบบ่ Mitosis ในสัตว์ชัNนสูง กพบว็ า่ Lymphocytes ของปลากมีการ็ ตอบสนองต่อสาร Mitogen ออกเป็นสองกลุ่ม เช่นเดียวกบในสัตว์ชัั Nนสูง จึงมีความเชืTอวา่ Lymphocytes ของปลาน่าจะแบงออกเป็น่ B และ T cells เหมือนในสัตว์ชัNนสูงเช่นเดียวกนั (ประพันธ์ศักดิt, 2547)

B cells

ในการตอบสนองภูมิคุ้มกนแบบจําเพาะเจาะจงนัั Nน B cell จะมีบทบาทสําคัญอยางยิ่ งในT การสร้างสารทีTทําหน้าทีTในการจดจําและทําลายสิTงแปลกปลอมทีTเรียกวา่ Antibody ซึTง B cell 1 ชนิด จะสามารถสร้าง Antibody ตอ่ Antigen หรือ Epitope เพียงชนิดเดียวเทานั่ Nน เมืTอ B cell พบกบั Antigen ทีTจําเพาะเจาะจงเป็นครัNงแรกจะมีทีTรับ Antigen ทีTจําเพาะอยูบนผิว่ B cell นันกT ็คือ Antibody ชนิด IgM ทีTอยูในรูป่ Membrane form ซึTงจะเป็นตัวพา Antigen เข้าสู่เซลล์ และตกแตง่ Antigen เพืTอให้อยูในรูป่ Epitope ทีTพร้อมจะกระตุ้นภูมิคุ้มกนโดยจะมีั MHC class II เป็นตัวพา Epitope เหล่านีNไปไว้ทีTผิวเซลล์ (Ollila and Vihinen, 2005) เมืTอ Helper T cell ทีTมีความจําเพาะตอ่ Epitope ชนิดนีNมาจับและตรวจพบกจะหลั็ งสารสําคัญหลายชนิดออกมาT เช่น Interleukin II เพืTอทํา ให้ B cell มีการแบงเซลล์เพิ่ มจํานวนอยT างรวดเร็ว่ (Proliferation) และมีการจําแนกตัวเอง (Differentiation) เพืTอกาหนดหน้าทีTในการสร้างชนิดของํ Ig ทีTจําเพาะและพัฒนาตัวเองไปเป็น Plasma B cell ทีTสามารถสร้าง Antibody ในรูป Secreted form ออกไปสู่ระบบหมุนเวียนเลือดเพืTอ ตอบสนองต่อ Antigen ชนิดนัNน ๆ ในเลือดหรืออวัยวะอืTนทีTมี Antigen ชนิดนัNนอยู ่ (Kaiser et al., 2004) นอกจากนีNยังพบวา่ B cell บางส่วนมีการพัฒนาตัวเองไปเป็น Memory B cell เพืTอจดจําและ ตอบสนองต่อ Antigen ตัวเดิมในครัNงต่อไป ซึTงเรียกการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกนตั อ่ Antigen ในครัNงแรกนีNวา่ Primary immune response ผลของการตอบสนองจะมีการสร้าง Ig ออกมาในระดับ ทีTไมมากนักและการตอบสนองจะเก่ ิดค่อนข้างช้า แตจะพบว่ ามีการสร้างเซลล์ทีTมีความจําเพืTอ่ รองรับการเข้ามาอีกครัNงของ Antigen ชนิดเดิม

T cells

T cell ในสัตว์ชัNนสูงโดยทัวไปแล้วแบT งออกเป็น่ 3 ชนิดได้แก่ Helper T cell, Cytotoxic T cell และ Suppressor T cell แตชนิดทีTเก่ ีTยวข้องกบการสร้างั Ig คือ Helper T cell เทานั่ Nน โดยจะทํา หน้าทีTจดจํา Epitope ของ Antigen ทีTแสดงโดย MHC class II บนผิวเซลล์ของ B cell หลังจากตรวจ พบ Epitope ทีTจําเพาะแล้ว จะหลังสารจําพวกT Cytokines ออกมาซึTงจะมีผลทําให้ B cell เกิดการ พัฒนาตัว จําแนกหน้าทีTและผลิต Ig ออกมาในทีTสุด Helper T cell จะสามารถจดจําตอ่ Antigen ทีT จําเพาะได้ จะต้องมีทีTรับบนผิวเซลล์ซึTงเป็นสารประกอบพวกโปรตีนทีTเรียกวา่ T cell receptor (TCR) ซึTงจะจดจําอยางจําเพาะเจาะจงก่ บั Antigen ชนิดใดชนิดหนึTงโดยลําพังไมได้่ TCR จะต้อง จดจําโครงสร้างทีTเป็น Complex ซึTงเกิดจาก MHC class II ของ Antigen presenting cell ทัNงหลายกบั

Epitope โดยจะทํางานร่วมกนเป็นกลุั ่มของเซลล์กลุ่มใดกลุ่มหนึTงเทานั่ Nน ผลของการตอบสนอง ดังกล่าวยังทําให้ APC มีการหลังสารจําพวกT Interleukin I ออกมา ซึTงจะมีความสําคัญอยางมากต่ อ่ การพัฒนาและความอยูรอดของทั่ Nง B และ T cells (Klein and Horejsi, 1997)

2.2 การตอบสนองโดยผานเซลล์่ (Cell-mediated immune response)

การตอบสนองประเภทนีNมีความสําคัญอยางมากในกรณีทีTมีการติดเชื่ Nอภายในเซลล์ โดยเฉพาะอยางยิ่ งการติดเชืT NอทีTมีสาเหตุมาจากไวรัส โดยมี Cytotoxic T cell (T killer cell) และจะ อาศัย MHC class I ซึTงสามารถพบได้ในเซลล์ทีTมีนิวเคลียสทุกชนิด เป็นตัวช่วยหรือสืTอกลางในการ จดจํา โดยทัวไปเมืTอเซลล์เกT ิดการติดเชืNอจากไวรัส ภายใน Cytoplasm ของเซลล์ทีTติดเชืNอ (Nakanishi et al., 2002) นัNนจะมีกลไกในการตัดและตกแตงอนุภาคของไวรัสให้อยู่ ในรูปทีTเป็น่ Epitope ทีT เหมาะสมแล้วจะมี MHC class I มาจับอยางจําเพาะเจาะจงเป็นรูป่ Complex แล้วจะนํา Epitope เหล่านัNนไปไว้บนผิวเซลล์ ของตัวเอง เพืTอรอให้ Cytotoxic T cell ทีTมี TCR ทีTจําเพาะมาตรวจสอบ เมืTอได้รับการจดจําด้วย Cytotoxic T cell อยางจําเพาะเจาะจงแล้ว่ Cytotoxic T cell จะหลังสารพิษT ออกมาเพืTอทําลายหรือฆาเซลล์ทีTมี่ Epitope ของสิTงแปลกปลอมหรือไวรัสอยางจําเพาะเจาะจง่ ทําให้ เซลล์ตายและมีผลตอเนืTองให้ไวรัสทีTอาศัยอยู่ ภายในเซลล์ตายและไม่ สามารถแพร่ ่กระจายไปยัง ส่วนตาง่ ๆ ของร่างกายได้ (Klein and Horejsi, 1997)

3. อวัยวะทีTทําหน้าทีTในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนของปลาั (Lymphoid tissue containing organ)

ในกลุ่มปลาโดยทัวไปทัT Nงปลากระดูกแข็ง ปลากระดูกอ่อนและปลาปากกลม จัดเป็นกลุ่ม สิTงมีชีวิตทีTมีกระดูกสันหลังทีTไมมีไขกระดูก่ (Bone marrow) ซึTงทําหน้าทีTในการผลิตเซลล์เม็ดเลือด อยางเช่ ่นในสัตว์ทีTมีกระดูกสันหลังชัNนสูงอืTนๆ โดยกลุ่มของสิTงมีชีวิตเหล่านีNจะมีการพัฒนาระบบ การทํางานเพืTอใช้ในการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกนโดยอาศัยอวัยวะทีTเรียกวั า่ Lymphoid tissue นีNประกอบด้วย Reticular cell framework ทีTช่วยในกระบวนการทีTเรียกวา่ Migratory และ non- migratory cell population โดยเซลล์ทีTอยูใน่ Lymphoid organ นีNจะประกอบไปด้วยกลุ่มเซลล์ ทีTทําหน้าทีTในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนทัั Nงแบบจําเพาะ (Specific) และไมจําเพาะเจาะจง่ (Non-specific) เซลล์ในกลุ่มนีNทีTสําคัญคือ Lymphocytes, monocytes, macrophages, granulocytes และ thrombocytes (Nakanishi, 1996) โดยอวัยวะหลักทีTทําหน้าทีTเป็น Lymphoid organ ในปลา ได้แก่

3.1 ไตส่วนหน้า (Head kidney)

ไตถือเป็นอวัยวะทีTมีความสําคัญอยางมากในกลุ่ ่มของปลากระดูกแข็ง เนืTองจากเป็น อวัยวะทีTมีความสําคัญในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนโดยมีตําแหนั ่งอยูทีTผนังช่ ่องท้อง (Body cavity) ติดกบกระดูกสันหลังั (Vertebra) ประกอบไปด้วย 2 ส่วนคือ ไตส่วนหน้า (Head kidney) และไตส่วนหลัง (Trunk kidney) โดยไตส่วนทีTทําหน้าทีTโดยตรงในระบบภูมิคุ้มกนของปลาั คือ ไต ส่วนหน้าซึTงจะมีรูปร่างลักษณะแตกตางก่ นไปในปลาแตั ่ละชนิด เป็นอวัยวะทีTมีความสําคัญในการ ผลิตเซลล์เม็ดเลือด (Haematopoietic organ) และมีหน้าทีTคล้ายกบไขกระดูกในสัตว์มีกระดูกสัน-ั หลังชัNนสูง (Meseguer et al., 1995) นอกจากนีNยังเป็น Lymphoid organ ทีTคล้ายคลึงกบั Lymph node ในสัตว์ชัNนสูงทีTใช้ในกระบวนการการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนั (Kaattari and Irwin, 1985) และยัง พบวามี่ Parenchyma cell แพร่กระจายอยูใน่ Sinusoids ทีTพัฒนา และมีการเจริญของเซลล์ในกลุ่ม Stroma ทีTเรียกวา่ Reticulo-endothelial stroma ทีTประกอบด้วย Endothelial cell (lining the sinusoids), adventitial cells ทีTปกคลุม Abluminal surface ของ endothelial cells และ reticular cell ซึTงทําหน้าทีTเกีTยวข้องกบกระบวนการั Phagocytosis (Meseguer et al., 1995) กลุ่มเซลล์ stroma มี บทบาทสําคัญในกระบวนการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนแบบไมั จําเพาะเจาะจงและทําหน้าทีTในการ่ กาจัดและการทําลายเศษซากของเซลล์ํ (Press and Evensen, 1999) นอกจากนีNไตส่วนหน้ายัง ประกอบไปด้วย Sinusoidal macrophages และ endothelial cells ทีTช่วยในกระบวนการ Sinusoids participate โดยการจับกบเชืั NอโรคและสิTงแปลกปลอมในกระแสเลือด (Dannevig et al., 1994) และ Renal portal ทีTทําหน้าทีTเป็น Filtration bed สําหรับการเคลืTอนย้าย Blood-borne particle ดังนัNนไต ส่วนหน้าจึงเป็นอวัยวะหลักทีTทําหน้าทีTเป็นแหล่งสําหรับเซลล์ทีTทําหน้าทีTในการผลิต Antibody มา พัฒนาตัวเองและจะมี Melanomacrophage accumulation ซึTงเป็นกลุ่มของเซลล์ Parenchyma ทีT สามารถเกบ็ Antigen ไว้ได้นาน จึงถือได้วาไตส่ ่วนหน้าของปลาจัดเป็นอวัยวะทีTสําคัญในการ ตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกนในสัตว์กลุั ่มนีNด้วย (Press and Evensen, 1999)

3.2 ม้าม (Spleen)

ม้ามจัดเป็นอวัยวะทีTทําหน้าทีTในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนในกลุั ่มปลากระดูกแข็งอยู่ ในบริเวณช่องท้องของปลามีลักษณะคล้ายกบเม็ดถัั วเขียวมีสีแดงหรือนํT Nาตาลเข้ม แบงออกเป็น่ 2 ส่วน คือ Red pulp ซึTงเป็นบริเวณทีTมีเม็ดเลือดแดงเป็นส่วนใหญ ่ ประกอบไปด้วย Reticular cell network supporting blood-filled sinusoids นอกจากนีNยังสามารถพบกลุ่มของเซลล์ Macrophage,

Lymphocytes และ Plasma cell และอีกส่วนหนึTงคือ White pulp เป็นส่วนทีTถูกพัฒนาขึNนแบบไม่ สมบูรณ์ โดยแบงออกเป็นสองส่ ่วนยอย่ คือ Melanomacrophage accumulation และ ellipsoids ซึTง เป็นทีTอยูของกลุ่ ่มเซลล์ Lymphocytes ตาง่ ๆ โดยจะมี B lymphocytes อยูรวมก่ นเป็นกระจุกเรียกวั า่ “Lymphoid follicles”

ทีTผานมามีการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของม้ามในกลุ่ ่มปลากระดูกแข็งหลาย ชนิดพบวามีความแตกต่ างก่ นเล็กน้อยั เช่น ในการศึกษาในปลากลุ่ม Non-salmonid พบวามีการ่ รวมกนในสั ่วนทีTเป็น Melanomacrophages ให้กลายเป็น Melanomacrophage center โดยจะถูกยึด จับด้วยเยืTอบาง ๆ ของ Argyrophilic capsule และล้อมรอบด้วย White pulp โดยเส้นเลือดขนาดเล็ก (Ellis et al., 1989) ในขณะทีTปลาในกลุ่ม Salmon จะมีการสะสมของ Melanomacrophage อยาง่ ชัดเจนแตจะไม่ มี่ Capsule และมีการรวมกนของเซลล์เม็ดเลือดและยังมีการรวมตัวกั นของั Lymphocytes ชนิดตาง่ ๆ อยูด้วย่ (Press and Evensen, 1999)

Melanomacrophage center ของม้ามเป็นศูนย์กลางหลักในการทําลายเซลล์เม็ดเลือดแดง (Erythrocyte) ทีTเสืTอมสภาพหรือหมดอายุลงและเป็นศูนย์กลางของกระบวนการ Metabolic dumps นอกจากนีNยังเป็นส่วนของอวัยวะในการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกนทีTมีตั อเชื่ NอโรคและสิTง แปลกปลอมหรือ Germinal center คล้ายกบในสัตว์ชัั Nนสูง (Agius, 1980) นอกจากนีNในส่วนของ Ellipsoids ยังทําหน้าทีTในกระบวนการ Plasma filtration และ trapping of blood-borne substance และเป็นศูนย์กลางของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนเชั ่นเดียวกนั (Espenes et al., 1995) นอกจากนีN ม้ามยังถือได้วาเป็น่ Peripheral lymphoid organ ทีTใหญทีTสุด่ และสามารถกกเกั บ็ Antigen ทีT ไหลเวียนเข้ามาทางกระแสเลือด ม้ามจึงเป็นอวัยวะสําคัญในการส่งเสริมการสร้าง Antibody และ ปล่อยออกสู่กระแสเลือดต่อไป (ฤทัย, 2539)

4. Cytokines and chemokines

จัดเป็นสารทีTเกีTยวข้องกบระบบภูมิคุ้มกั นทีTถูกควบคุมโดยยีนในกลุั ่ม Cytokines และ Chemokines ซึTงสามารถจําแนกได้ทัNงสิNน 6 ชนิด ได้แก่ CC chemokine 1, Ectodysplasin (Eda), Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B, Interleukin 1 β, Interleukin 8, Interleukin 16 และ Transforming growth factor β 1 ตามลําดับ (เอกพล, 2551) สารเหล่านีNถือได้วามี่ ความสําคัญอยางมากในการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มก่ นแบบั Innate และ Adaptive immunity

เนืTองจากถูกสร้างขึNนและหลังโดยกลุT ่มเซลล์ทีTทําหน้าทีTเกีTยวข้องกบภูมิคุ้มกั นของรั ่างกาย เช่น Helper T cell, fibroblast, endothelial cell, keratinocyte และ macrophage เป็นต้น ซึTงมีชืTอเรียก แตกตางก่ นขึั Nนอยูก่ บเซลล์ทีTทําการผลิตขึั Nน การออกฤทธิtของ Cytokines หรือ Chemokines นีNจะมี ผลตอเซลล์ข้างเคียงหรือเซลล์เดิมทีTผลิตขึ่ Nนมา โดยมีความสําคัญตอการพัฒนาตัว่ ความอยูรอดและ่ การทํางานร่วมกนของกลุั ่มเซลล์เหล่านัNน (Secombes et al., 1999) และยังสามารถกระตุ้นให้เซลล์ เม็ดเลือดขาวเกิดการแบงตัวเพืTอตอบสนองได้อย่ างมีประสิทธิภาพ่ นอกจากนีNยังมีหน้าทีTสําคัญใน การควบคุมการเจริญเติบโต การเคลืTอนทีT การเปลีTยนแปลงรูปร่างของเซลล์เม็ดเลือดขาวและเซลล์ อืTน ๆ ทีTเกีTยวข้อง (Kaiser et al., 2004)

Interleukin (IL) เป็น Cytokine กลุ่มหนึTงทีTมีการผลิตออกมาคอนข้างมาก่ โดยพบจํานวน ทัNงหมด 3 ชนิด คือ Interleukin 1 β (IL-1β), interleukin 8 (IL-8) และ interleukin 16 (IL-16) ซึTงมี หน้าทีTหลักในการควบคุมการทํางานร่วมกนระหวั างเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดต่ าง่ ๆ (Abbas et al., 2000) โดย Interleukin 1 β ทําหน้าทีTเป็น First line of defense ของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนั แบบ Innate immunity และสามารถชักนําให้เกิดกระบวนการอักเสบ (Inflammation) และส่งเสริม ให้มีการหลังสารทีTเกT ีTยวข้องในกระบวนการอักเสบเพิมมากขึT Nน นอกจากนีNยังเกีTยวข้องกบั กระบวนการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนแบบเฉียบพลันั (Acute phase response) อีกด้วย โดยถูกสร้าง จากเซลล์ในกลุ่ม Monocytes เป็นหลัก

Interleukin 8 มีบทบาทสําคัญในการกระตุ้นกลุ่มเซลล์ Neutrophils ให้เกิดการเคลืTอนทีT มายังบริเวณทีTมีการบุกรุกของเชืNอโรคและสิTงแปลกปลอม รวมทัNงส่งเสริมกระบวนการ Chemotaxis, exocytosis และ respiratory burst (Baggiolini and Clark-Lewis, 1992) ซึTงยีน IL-8 นีN ถูกผลิตขึNนโดยเซลล์ในกลุ่มของ Monocytes/macrophages, fibroblast, keratinocytes และ endothelial cells เป็นต้น (Inoue et al., 2003a) ปัจจุบันมีรายงานการศึกษาเกีTยวกบั IL-8 กนอยั าง่ กว้างขวาง ทัNงในสัตว์ชัNนสูงชนิดตาง่ ๆ เช่น มนุษย์ รวมทัNงในกลุ่มของปลาโบราณ ชนิด Lamprey (Lampetra fluviatilis) (Najakshin et al., 1999) ในปลากระดูกออน่ ได้แก่ Silver chimera (Chomaera phantasma) (Inoue et al., 2003a) และ Leopard shark (Triakis scyllia) (Inoue et al., 2003b) และในกลุ่มของปลากระดูกแข็งได้แก่ Japanese flounder (Paralichthys olivaceous) (Lee et al., 2001), Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (Laing et al., 2002; Sangrador-Vegas et al., 2002; Fujiki et al., 2003) Channel catfish (Ictalurus puntatus) (Baoprasertkul et al., 2004; Chen et al., 2005) และ haddock (Melanogrammus aeglefinus) (Corripio-Miyar et al., 2007)

Interleukin 16 (IL-16) มีความสําคัญในการกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิด Monocytes, dendritic cells และ fibroblasts (Mathy et al., 2000) โดยเฉพาะอยางยิ่ งกระตุ้นให้T Helper T cell เกิด การเคลืTอนทีT ซึTงเชืTอวาเป็น่ T helper cell chemoattractant factor ทีTสําคัญ (Gu et al., 2008) ทัNงนีN เนืTองจากสามารถกระตุ้นการทํางานของกลุ่มเซลล์ T-cell, monocytes, macrophages และ dendritic cells ได้ (Center et al., 1996) ข้อมูลการศึกษาเกีTยวกบั IL-16 ในกลุ่มปลากระดูกแข็งนัNนมีน้อยมาก โดยพบรายงานในปลา Pufferfish (Tetraodon nigroviridis) (Wen et al., 2006) และในปลานิล Nile tilapia (Oreochromis niloticus) (เอกพล, 2551) เทานั่ Nน

Transforming growth factor β1 จัดเป็น Cytokine อีกชนิดทีTมีบทบาทสําคัญตอการ่ เจริญเติบโตของเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิด B cell โดย Cytokine ชนิดนีNพบวาถูกสร้างขึ่ Nนจากกลุ่ม เซลล์ Platelets, activated macrophage และ T cell เป็นหลัก และมีรายงานวา่ Cytokines ชนิดนีNยังมี ความสามารถในการยับยัNงการเจริญของ T cell และ B cell ได้อีกด้วย (Ichii et al., 2008) นอกจากนีN ยังสามารถยับยัNงการแบงตัวของ่ B cell (Proliferation) เพืTอลดกระบวนการผลิต Immunoglobulin (Haddad et al., 2008) ซึTง TGF β1 นีNยังสามารถยับยัNงกลุ่มของเซลล์ Macrophage ในการหลังT IL-1 รวมทัNงควบคุมการเจริญของเซลล์เนืNองอกและกระบวนการตายแบบ Apoptosis อีกเช่นกนั (Filyak et al., 2007)

Tumor necrosis factor จัดเป็น Cytokine อีกชนิดหนึTงทีTมีบทบาทสําคัญโดยจะมีส่วนใน การทําให้เซลล์เกิดการแตกสลายโดยเฉพาะอยางยิ่ งT Tumor cell นอกจากนีNยังทําหน้าทีTเป็น ตัวกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนแบบั Acute inflammatory ตอแบคทีเรียแกรมลบและ่ การติดเชืNอโรคชนิดตางๆ่ (Abbas et al., 2000)

แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์

แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นองค์ประกอบในผนังเซลล์ยีสต์ชัNนนอก โดยพบในส่วน ของแมนโนโปรตีน (Mannoprotein) ซึTงทําหน้าทีTในการยึดเกาะองค์ประกอบตาง่ ๆ ของผนังเซลล์ ให้คงอยูด้วยก่ นั ผนังเซลล์ยีสต์ประกอบด้วย เบต้า 1, 3 กลูแคน (β-1, 3 glucan) 50% เบต้า 1, 6 กลูแคน (β-1, 6 glucan) 10% แมนแนน (Mannan) 40% และไคติน (Chitin) 1-3% ซึTงพบวากว่ า่ 50-95% นัNนเป็นคาร์โบไฮเดรต (Lipke and Ovalle, 1998) ซึTงเป็นพวกนํNาตาลแมนโนสเกาะเป็น กTิงกานอยู้ ด้วยพันธะแอลฟา่ (α)โดยโครงสร้างหลักจะจับกนด้วยพันธะั α-1, 6 และจับกนด้วยั

พันธะ α-1, 2 และ α-1, 3 เป็นแขนงยืTนออกไป (Walker, 1998) แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีชืTอ ทางการค้าหลายชืTอด้วยกนั เช่น Mycosob หรือ Bio-Mos ซึTงสกดได้จากผนังเซลล์ยีสต์ั Saccharomyces cerevisiae ด้วยการนําเซลล์ยีสต์มาทําให้เกิดการแตกตัว (Lysed yeast culture) โดย วิธีการปัTนแยก (Sipring et al., 2000) หรือโดยการใช้เอนไซม์ในการสกดั (Parodi, 1979) จากบาง รายงานพบวาใช้่ α-mannosides ในการสกดั (Jones and Ballou, 1969) และในบางครัNงการสกดั กลูแคนจากยีสต์กทําให้ได้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ออกมาพร้อมก็ นด้วยั (Freimund et al., 2003)

จากการศึกษาพบวาแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีคุณสมบัติทีTน่ ่าสนใจต่อสิTงมีชีวิตอยูหลาย่ ประการ ดังการศึกษาในกลุ่มของสัตว์บกจากการอนุบาลลูกหมู (Miguel et al., 2004) และลูกหมูทีT เพิงหยT านม่ (White et al., 2002) พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารส่ ่งผลให้ ลุกหมูมีนํNาหนักเพิมมากขึT Nน และมีความแข็งแรงมากกวาลูกหมูทีTไม่ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิ-่ โกแซคคาไรด์ในอาหาร การศึกษาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารให้กบลูกวัวั (Terre et al., 2007) ไก่ (Vesna et al., 2007) และไก่งวง (Fritts and Waldroup, 2003) กให้ผลการ็ ทดลองทีTคล้ายกนกั บการศึกษาในลูกหมูั

นอกจากนีNแล้วยังพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารเลี่ NยงเชืNอ Bacillus licheniformis ช่วยให้สร้างสารทีTมีคุณสมบัติเป็นยาปฏิชีวนะ (Bacitracin) ได้มากขึNน (Murphy et al., 2007) รวมไปถึงช่วยลดระดับความเป็นพิษของสาร Aflatoxins (Baptista et al., 2004) และมี ความเกีTยวข้องกบการควบคุมการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกั นอีกด้วยั (Bland et al., 2004)

บทบาทของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อสัตว์นํcา

Bogut et al. (2006) ได้ทดลองเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารปลา European sheatfish (Silirus glanis) พบวาทีTระดับ่ 5 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม สามารถเพิมนํT Nาหนักและลด อัตราเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอ (FCR) รวมไปถึงลดอัตราการตายระหวางการเลี่ Nยงได้

Torrecillas and Izquierdo (2006) รายงานวาเมืTอเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม สามารถช่วยเพิมอัตราการเจริญเติบโตของลูกปลาT European seabass (Dicentrarchus labrax) ได้ 10% และมีการสะสมไขมันทีTเซลล์ตับลดลง 5% เมืTอเปรียบเทียบกบั

ปลาชุดทีTไมได้รับอาหารทีTเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์่

Culjak et al. (2006) รายงานวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ ความเข้มข้น 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัมในลูกปลาไน (Cyprinus carpio L.) ส่งผลให้ลดอัตราการ ตายจาก 50% เหลือเพียง 16.7% และลดอัตราเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอจาก 2.06 เหลือ 1.60 อีกทัNงยัง เพิมนํT Nาหนักได้ถึง 24%

Hossu et al. (2006) พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารปลากะรัง่ (Sparus aurata) ทีTระดับ 2 และ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม สามารถช่วยเพิมนํT Nาหนัก และลดอัตรา การตาย รวมไปถึงลดอัตราเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอลงได้

การศึกษาในปลาไน (C. carpio L.) และปลา Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ทีTมี การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับความเข้มข้น 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม สามารถ ช่วยเพิมนํT Nาหนัก และลดอัตราการตายรวมไปถึงลดอัตราเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอลงได้เช่นกนั (Staykov et al., 2005a; 2005b; 2005c)

จากรายงานในปลาข้างเดียว (Solea solea) ทีTได้รับสารแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ ความเข้มข้น 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม พบวามีอัตราการตายลดลง่ 8% มีปริมาณของ Microvilli ทีTผนังลําไส้ส่วนต้นเพิมมากขึT Nนอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) และมีสภาพคอนข้างสมบูรณ์่ ไมฉีกขาด่ (Dimitroglou et al., 2006) ซึTงสอดคล้องกบการศึกษาของั AyÇe Gen et al. (2006) ใน ปลาดุกรัสเซีย (Clarias gariepinus) ซึTงพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร่ สามารถปรับปรุงโครงสร้างของทางเดินอาหารบริเวณผนังลําไส้ ทําให้ Villi มีความแข็งแรงและมี พืNนทีTผิวในการดูดซึมอาหารเพิมมากขึT Nน

Salze et al. (2008) ได้ศึกษาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารให้กบลูกปลาั Cobia (Rachycenrton canadum) พบวาลูกปลาสามารถทนทานต่ ่อการเปลีTยนแปลงความเค็มได้ดี และมีปริมาณ Microvilli มากกวาลูกปลาทีTไม่ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร่

รายงานถึงการศึกษาผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารปลาไน (C. carpio L.) และในปลาเทร้า (O. mykiss) ตอก่ ิจกรรมการทําลายเชืNอแบคทีเรีย (Bactericidal activity)

คาแอนติบอดี่ Nไตเตอร์ (Antibody titres) ความเข้มข้นของไลโซไซม์ (Lysozyme concentration) (Lie, 1985), Alternative pathway of complement activity (Sotirov, 1986) และ Classical pathway of complement activation (Stelzar and Stein, 1971) พบวามีปริมาณสูงขึ่ NนเมืTอเทียบกบชุดการั ทดลองทีTไมได้มีการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร่ ซึTงจากการศึกษาของ Staykov et al. (2007) ในปลา Rainbow trout กให้ผลการทดลองในทํานองเดียวก็ นั

นอกจากนัNนแล้ว จากการศึกษาของ Torrecillas et al. (2007) ยังพบวาก่ ิจกรรมการจับกิน สิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาวบริเวณไตส่วนหน้าของปลากะรังทีTทดสอบกบเชืั Nอ Vibrio alginolyticus มีปริมาณสูงถึง 32.4% และ 26.9% เมืTอเลีNยงด้วยอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์ทีTระดับความเข้มข้น 4 และ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ตามลําดับ เมืTอเปรียบเทียบกบชุดั ควบคุมทีTมีเพียง 23.8% ซึTงสอดคล้องกบระดับความเข้มข้นทีTเหมาะสมตั อระบบภูมิคุ้มก่ นของปลาั European seabass (D. labrax) คือทีTระดับ 2 และ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม

Torrecillas et al. (2007) ให้เหตุผลบทบาทของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตอการ่ เจริญเติบโตวาอาจเก่ ิดจากแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ช่วยให้มีการดูดซึมกรดอะมิโนได้มากขึNนซึTง สอดคล้องกบการศึกษาในไกั ่ (Lji et al., 2001) วาการเพิ่ มปริมาณของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์T ในอาหารทําให้มีการดูดซึม L-tryptophan ได้มากขึNนทัNงบริเวณลําไส้ส่วน Jejunal และ Ileal ซึTง L- tryptophan เป็นกรดอะมิโนทีTเกีTยวข้องกบการหลัั งT Serotonin ออกมาเพืTอทําให้ร่างกายรู้สึกผอน่ คลายหรือหลับไปในทีTสุดทําให้มีการใช้พลังงานในร่างกายลดลง จากรายงานของ Torrecillas et al. (2010) พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทําให้มีการสะสมไขมันทีTตับของปลา่ European sea bass ลดลงเนืTองจากทําให้การทํางานของเอนไซม์ acetyl-CoA carboxylase ทีTทํา หน้าทีTเร่งปฏิกิริยาในการเปลีTยนกลูโคสให้เป็นกรดไขมันนัNนลดลง (Santoso et al., 1995) ทําให้มี กลูโคสเป็นแหล่งพลังงานของกล้ามเนืNอและการนําสารอาหารไปใช้ในร่างกายเพืTอการเจริญเติบโต และการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารช่วยเสริมให้ผนังลําไส้มีความสมบูรณ์จึงมีพืNนทีT ในการดูดซึมอาหารได้มากขึNน (Spring et al., 2000; Shane, 2001) 23

อปกรณ์และวิธีการุ

อปกรณ์ุ

1. ลูกปลานิล (Oreochromis niloticus) ระยะเริTมกินอาหาร (S 5) นํNาหนักประมาณ 0.013 กรัม จากสถานีวิจัยประมงกาแพงแสนํ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ 2. ปลานิล (O. niloticus) นํNาหนักประมาณ 60-70 กรัม จากฟาร์มเอกชน 3. ตู้กระจกปริมาตร 100 ลิตร 4. โหลแกวปริมาตร้ 10 ลิตร 5. เครืTองให้อากาศพร้อมอุปกรณ์ 6. ตาขายมุ้งฟ้า่ 7. อาหารกุงเบอร์ศูนย์้ 8. อาหารปลากินพืชเบอร์ 3 9. แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ชนิดผง มีประสิทธิภาพในการออกฤทธิt 40% 10. นํNามันปลาหมึก 11. อุปกรณ์การชัง-วัดT (เครืTองชังทศนิยมT 2 ตําแหน่ง, ไม้บรรทัด) 12. อุปกรณ์การผสมอาหาร (กระบอกฉีดนํNา, กระบอกตวง, กะละมัง, ถุงมือ) 13. เครืTองผสมสาร (Vortex mixer) 14. อุปกรณ์ในการเขีTยเชืNอแบคทีเรีย (ตะเกียงแอลกอฮอล์, Loop เขีTยเชืNอ, เข็มเขีTยเชืNอ และ แทงแก่ วสามเหลีTยม)้ 15. เครืTองแกวสําหรับการทดลอง้ (หลอดทดลอง, จานแกว,้ บีกเกอร์, ขวดรูปชมพู)่ 16. สารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว 17. อาหารเลีNยงเชืNอ Brain Heart Influsion agar (BHIA) 18. อาหารเลีNยงเชืNอ Brain Heart Influsion broth (BHIB) 19. อาหารเลีNยงเชืNอ Tryptic soy agar (TSA) 20. อาหารเลีNยงเชืNอ Tryptic soy broth (TSB) 21. อุปกรณ์ผาตัด่ 22. เครืTองนึTงภายใต้ความดันสูง (Autoclave) 23. ตู้อบ (Oven)

24. ตู้บมเชื่ Nอ (Incubator) 25. Water Bath Shaker ชนิดควบคุมอุณหภูมิ 26. เครืTองวัดการดูดกลืนคลืTนแสง (Sprectophotometer) 27. เครืTองปัTนเหวีTยง (Centrifuge) 28. สไลด์ 29. ชุดย้อมสีแกรม 30. กล้องจุลทรรศน์ 31. เข็มฉีดยาเบอร์ 24G x 1.5 นิNว 32. กระบอกฉีดยาขนาด 1 ml 33. หลอดพลาสติกใส 15 ml (Cornicol tube) 34. Microtiter plate 96 well 35. Microcentrifuge tube 36. Automatic micropipette ขนาด 2, 10, 20, 200, 1000 ไมโครลิตร 37. Multi channel autopipette 38. Hemacytometer 39. เชืNอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae จากห้องปฏิบัติการสุขภาพสัตว์นํNา 40. Heat-Killed yeast 41. เครืTอง Semi-automated microcell counter

42. อุปกรณ์และสารเคมีสําหรับเกบตัวอย็ างทําสไลด์เนื่ NอเยืTอ - ขวดเกบตัวอย็ าง่ - 10% Formalin

43. สารเคมีทีTใช้ในการเตรียมอาหารแปลงเพศสําหรับลูกปลานิล - 95% Ethanol - Hormone 17 α-methyltestosterone

44. สารเคมีทีTใช้ในการวิเคราะห์คา่ Antibody titer - Formalin-Killed vaccine

45. สารเคมีทีTใช้ในการศึกษากระบวนจับกินสิTงแปลกปลอม (Phagocytic activity) และ - Superoxide anion (O2 ) - Ethylene diamine tetreacetic acid, disodium salt dehydrate; EDTA - RPMI Medium with HEPES + L-Glutamine - Nitrotetrazolium blue chloride (NBT) - Dimethyl sulfoxide (DMSO) - Phosphate Buffered Saline (PBS) - Lymphoprep - 2N KOH - Diff-Quick Staining - 70% Methanol, 100% Methanol

46. อุปกรณ์และสารเคมีสําหรับงานทางด้านชีวโมเลกุล - ตู้ -20 องศาเซลเซียส (Whirlpool) - ตู้ -80 องศาเซลเซียส (Thermo Forma) - ชุดเจลอิเล็คโตรโฟรีซีส (Bio-Rad) - Power supply : Power PAC 3000 (Bio-Rad Laboratories, USA) - White/UV trasilluminator: UVP ImageStore 7500 (Mitsubishi Electric Corporation, Japan) - Gel documentation - Thermal cycle (Polymerase chain reation; PCR) machine model TP600 (Takara Bio Inc.) - เครืTองมือบดเนืNอเยืTอ (Glinder) - ถุงมือปลอดเชืNอ - PCR tube - Microwave oven (Sanyo Electric Co., Ltd.) - Sodium chloride (NaCl) (Merck) - ดีเอ็นเอมาตรฐาน 100 คูเบส่ (Fermentas) - Absolute ethanol (Merck) - Ammonium persulfate (Bio basic Inc.)

- Chloroform (Fisher Scientific) - Phenol (Merck) - Tris (Tris-Borate EDTA) (Fisher Scientific) - Ethidium bromide (Sigma) - Diethyl pyrocarbonate; DEPC (Sigma) - Formamide (BDH) - Formaldehyde (BDH) - 3-[N-morpholino] propane-sulfonic acid; MOPS (BIO BASIC INC.) - Trizol reagent (Molecular Research Center) Isopropanol (Merck) - RevertAidTM Firststrand cDNA synthesis kit (Fermentas) - Loading dye (Fermentas) - Gel star (Lonza) - Agarose gel (Conda)

วิธีการ

การทดลองทีM 1 ศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต อัตรารอด และความต้านทานต่อเชืcอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ของลกปลานิลู

1. การวางแผนการทดลอง

วางแผนการทดลองแบบสุ่มตลอด (Completely Randomized Design) โดยมี 4 ชุดการ ทดลอง (Treatment) ในแตละชุดการทดลองมี่ 3 ซํNา (Replication) ได้แก่

ชุดการทดลองทีT 1 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α– methyltestosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

ชุดการทดลองทีT 2 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมและแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

ชุดการทดลองทีT 3 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมและแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

ชุดการทดลองทีT 4 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมและแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

2. การเตรียมสัตว์ทดลอง

นําลูกปลานิลทีTถุงไขแดงยุบแล้วโดยมีนํ่ NาหนักเฉลีTย 0.013±0.001 กรัม (ระยะ S5) มาใส่ตู้ ทดลองขนาด 100 ลิตร บรรจุนํNาจืดปริมาตร 80 ลิตร ปล่อยปลาในอัตราแตกตางก่ นั 3 ระดับ ใช้ผ้า ตาขายฟ้าคลุมตู้เพืTอป้องก่ นสิั Tงแปลกปลอมตกลงไปในตู้ระหวางการทดลอง่ ให้อากาศอยางเพียงพอ่ ตลอดการทดลอง ดูดตะกอนและเปลีTยนถ่ายนํNาทุกวัน ทําการทดลองแยกเป็น 3 ครัNง โดยแตละครั่ Nง ใช้จํานวนลูกปลาในตู้ทดลองทีT 100, 200 และ 300 ตัว ตามลําดับ

3. อาหารและการให้อาหาร

ผสมฮอร์โมนเพศผู้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตอ่ อาหารกุงเบอร์ศูนย์้ 1 กิโลกรัม ซึTงเป็นระดับทีTมีประสิทธิภาพในการแปลงเพศลูกปลานิลให้เป็น เพศผู้ได้ (ไพบูลย์ และณัฐพงษ์, 2547) โดยวิธีสเปรย์สารละลายฮอร์โมนลงบนอาหาร คลุกเคล้าให้ เข้ากนแล้วนําไปผึTงลมให้อาหารแห้งั จากนัNนจึงผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับความ เข้มข้นทีTตางก่ นั 3 ระดับ ตามระบุข้างต้น

บันทึกนํNาหนักอาหารเริTมต้นของแตละชุดการทดลองเพืTอนําข้อมูลไปประกอบการศึกษา่ ถึงผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารตอการเจริญเติบโต่ เกบอาหารในภาชนะ็

พลาสติกปิดฝาให้สนิทในตู้เย็น ให้อาหารอนุบาลลูกปลาวันละ 5 มืNอ คือ 8.00 น. 10.00 น. 12.00 น. 14.00 น. และ 16.00 น. โดยในสัปดาห์แรกให้ในอัตรา 30% ของนํNาหนักตัว สัปดาห์ทีT 2 ให้ในอัตรา 20% ของนํNาหนักตัว และสัปดาห์ทีT 3 ให้ในอัตรา 15% ของนํNาหนักตัว เป็นระยะเวลาทัNงสิNน 21 วัน

4. การศึกษาผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารต่อการเจริญเติบโตและ อัตรารอด

5. การศึกษาผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารตอความต้านทานโรค่

5.1 เลีNยงเชืNอ Streptococcus agalactiae ในอาหาร Brain Heart Infusion Broth ในหลอด ทดลองปริมาตร 10 มิลลิลิตร เป็นเวลา 24 ชัวโมงT ทีTอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นําเชืNอแบคทีเรียทีT ได้มาปัTนล้างด้วยนํNาเกลือ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว ทีTความเร็ว 2,000 รอบต่อนาที รอบละ 15 นาที ทัNงหมด 3 รอบ ทําการปรับความเข้มข้นของสารละลายแบคทีเรียให้มีปริมาณเซลล์แบคทีเรีย ประมาณ 109 เซลล์ตอมิลลิลิตร่ โดยการวัดคาการดูดกลืนคลืTนแสง่ (OD) เทาก่ บั 0.3 ทีTช่วงความยาว คลืTน 560 นาโนเมตร นําสารละลายแบคทีเรียทีTได้ไปฉีดเข้าปลานิลขนาดประมาณ 30 กรัม ปริมาตร 0.2 มิลลิลิตร บริเวณช่องท้องเพืTอกระตุ้นความรุนแรงของเชืNอในการก่อโรค นําปลาทีTผานการฉีด่ เชืNอแบคทีเรียแล้วลงเลีNยงในตู้ขนาด 100 ลิตร ให้อากาศตามปกติ สังเกตปลาทีTเริTมมีอาการของโรค และนํามาแยกเชืNอจากอวัยวะภายในบริเวณตับ ม้าม ไต และสมอง ด้วยวิธีปลอดเชืNอลงบนอาหาร Brain Heart Infusion Agar บมทีTอุณหภูมิ่ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชัวโมงT จากนัNนทําการแยก เชืNอให้บริสุทธิtและทําการย้อมสีแกรมดูลักษณะ รูปร่างเซลล์ เพืTอยืนยันชนิดของแบคทีเรียทีTได้จาก การแยก

5.2 เขีTยโคโลนีของเชืNอ S. agalactiae ทีTแยกได้จากข้อ 5.1 ลงในอาหาร Brain Heart Infusion Broth ปริมาตร 200 มิลลิลิตร เป็นเวลา 24 ชัวโมงT ทีTอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นําเชืNอ แบคทีเรียทีTได้มาปัTนล้างด้วยนํNาเกลือ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว ทีTความเร็ว 2,000 รอบตอนาที่ รอบละ 15 นาที ทัNงหมด 3 รอบ และทําเป็นสารละลายแบคทีเรีย เพืTอทําการเลือกระดับความเข้มข้น ของเชืNอ S. agalactiae ทีTเหมาะสมสําหรับการทดลองจริง โดยเลือกระดับความเข้มข้นทีTทําให้ลูก

ปลานิลตายประมาณ 50% (LC50) โดยวิธีการแช่มาใช้ในการทดลอง

5.3 ทดสอบความสามารถในการต้านเชืNอโรคของลูกปลานิล เมืTอครบกาหนดํ 21 วันของ การให้อาหารทดลอง นําลูกปลานิลจากแตละชุดการทดลองมาทดสอบความต้านทานเชื่ Nอโรค โดย วิธีการแช่ลูกปลาจํานวน 30 ตัว ในนํNาปริมาตร 3 ลิตร ทีTมีปริมาณความเข้มข้นของเชืNอ S. agalactiae ทีTได้ทําการทดสอบแล้ววาเป็นระดับความเข้มข้นทีTสามารถทําให้ลูกปลานิลวัยเดียวก่ นตายถึงั 50% จากข้อ 5.2 แช่ลูกปลานิลในนํNาทีTมีเชืNอแบคทีเรียเป็นระยะเวลา 6 ชัวโมงT จากนัNนย้ายลูกปลาไปเลีNยง ในโหลแกวทีTมีนํ้ Nาอยูปริมาตร่ 8 ลิตร เป็นระยะเวลา 7 วัน เพืTอเปรียบเทียบอัตราการตายของปลาใน แตละชุดการทดลอง่

6. การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ

วิเคราะห์ความแตกตางระหว่ างชุดการทดลองของข้อมูล่ นํNาหนัก ความยาว อัตรารอด อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอ อัตราการเจริญเติบโตต่อวัน และอัตราการตายเมืTอสัมผัสเชืNอ โดยใช้ วิธีวิเคราะห์ความแปรปรวน (Analysis of Variance) ตามแผนการทดลองแบบสุ่มตลอด (Completely Randomized Design) และเปรียบเทียบความแตกตางของค่ าเฉลีTย่ โดยใช้วิธี Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) (บุญอ้อม, 2550) ทีTระดับความเชืTอมันT 95 เปอร์เซ็นต์ (α=0.05)

การทดลองทีM 2 ศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิค้มกันของุ ปลานิล

การทดลองทีM 2.1 ศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิค้มกันแบบุ จําเพาะเจาะจงของปลานิล

1. การวางแผนการทดลอง

ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช

ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

2. การเตรียมสัตว์ทดลอง

นําปลานิลนํNาหนักเฉลีTยประมาณ 60-70 กรัม มาใส่ตู้ทดลองขนาด 100 ลิตร บรรจุนํNาจืด ปริมาตร 80 ลิตร ตู้ละ 10 ตัว จํานวน 12 ตู้ ใช้ผ้าตาขายฟ้าคลุมตู้เพืTอป้องก่ นสิั Tงแปลกปลอมตกลงไป ในตู้ระหวางการทดลอง่ ให้อากาศอยางเพียงพอตลอดการทดลอง่ ดูดตะกอนและเปลีTยนถ่ายนํNาทุก วัน

3. อาหารและการให้อาหาร

ผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับความเข้มข้นทีTตางก่ นั 3 ระดับ ตามระบุ ข้างต้นกบอาหารปลากั ินพืช จากนัNนเคลือบด้วยนํNามันปลาหมึก เมืTออาหารแห้งดีแล้วจึงเกบใส็ ่ ภาชนะทีTปิดมิดชิด บันทึกนํNาหนักอาหารเริTมต้นของแตละชุดการทดลองเพืTอนําข้อมูลไปประกอบ่ การศึกษาถึงผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารต่อการเจริญเติบโต ให้อาหาร วันละ 2 มืNอ เช้า-เย็น ตลอดการทดลอง

4. การศึกษาคา่ Antibody titer ของปลานิล

หลังจากให้อาหารผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 2 สัปดาห์ จะเริTมทําการเกบ็ คา่ Antibody titer ครัNงแรกก่อนการให้วัคซีน โดยขัNนตอนการเตรียมวัคซีนดังรายละเอียดใน ภาคผนวก เกบค็ า่ Antibody titer ทุกชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 10 ตัว จากนัNนทําการฉีด วัคซีนปริมาตร 0.3 มิลลิลิตร ให้กบปลาทุกตัวของชุดการทดลองทีTั 1, 2, 3 และ 4 ซึTงวิธีการดัดแปลง มาจากการศึกษาของภิรัตน์ และคณะ (2550) จากนัNนจึงทําการเกบค็ า่ Antibody titer ตอไปทุก่ ๆ สัปดาห์พร้อมกบชัั งนํT Nาหนักและวัดความยาว วิธีการตรวจวัดคา่ Antibody titer ดัดแปลงจากนิลุบล และคณะ (2549) โดยวิธีการ Direct agglutination โดยการเจือจาง Serum แบบ Two-fold dilution ในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว โดยเจาะเลือดจากเส้นเลือดบริเวณใต้ แนวกระดูกสันหลัง (Caudal vein) ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใส่ Microcentrifuge tube แล้วนําไปปัTนทีT 2,500 รอบตอนาที่ ทีTอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เพืTอให้เลือดแยกชัNน แล้วจึงดูด Serum ด้านบนมา ใช้ เติมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้วในหลุมทีT 2 ถึง 12 จํานวนหลุมละ 50 ไมโครลิตร จากนัNนนํา Serum ทีTได้มาเติมใน Microtiter plate 96 well โดยใส่ในหลุมทีT 1 และ 2 จํานวนหลุมละ 50 ไมโครลิตร ทําให้ในหลุมทีT 2 มีจํานวนปริมาตรรวม 100 ไมโครลิตร ผสม สารละลายในหลุมทีT 2 โดยใช้ Multi channel autopipette และทําการเจือจางสารละลายในหลุมทีT 2 โดยการดูดสารละลายจํานวนหลุมละ 50 ไมโครลิตร ไปใส่ในหลุมทีT 3 แล้วทําการดูดสารละลายใน หลุมทีT 3 จํานวน 50 ไมโครลิตร ใส่ในหลุมทีT 4 ทําตามวิธีดังกล่าวนีNจนถึงหลุมสุดท้าย จึงดูด สารละลายในหลุมสุดท้ายทิงไปN 50 ไมโครลิตร จากนัNนเติมสารละลาย Antigen ซึTงในการทดลอง คือ Formalin-killed vaccine ทีTมีความเข้มข้น 109 CFU/ml ลงในทุก ๆ หลุม จํานวนหลุมละ 50 ไมโครลิตร ในการทดลองแต่ละครัNงปลา 1 ตัวจะตรวจหาค่า Antibody titer จํานวน 2 ซํNา โดย 1 ซํNา เทาก่ บั 1 แถวดังนัNนปลา 1 ตัว จะต้องใช้จํานวน Serum อยางน้อย่ 200 ไมโครลิตร ปิดด้านบนของ Microtiter Plate ด้วย Parafilm เพืTอป้องกนการปนเปืั N อนและการระเหยออกของสารละลาย บมในตู้่ บมทีTอุณหภูมิ่ 37 องศาเซลเซียส เพืTอปล่อยให้เกิดการจับกนระหวั าง่ Antibody กบั Antigen เป็น เวลา 18 ชัวโมงT แล้วทําการอ่านผลเพืTอนําไปประกอบการวิเคราะห์ข้อมูล เมืTอคา่ Antibody titer ของ การให้วัคซีนครัNงแรกมีคาลดลงจึงฉีดวัคซีนเพืTอกระตุ้นภูมิคุ้มก่ นอีกเป็นครัั NงทีT 2 และทําการเกบค็ า่ Antibody titer ตอไปตามวิธีข้างต้น่

5. การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ

วิเคราะห์ความแตกตางของค่ า่ Antibody titer ระหวางชุดการทดลอง่ โดยใช้วิธีวิเคราะห์ ความแปรปรวน (Analysis of Variance) ตามแผนการทดลองแบบสุ่มตลอด (Completely Randomized Design) และเปรียบเทียบความแตกตางของค่ าเฉลีTย่ Antibody titer ในช่วงเวลา เดียวกนั โดยใช้วิธี Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) (บุญอ้อม, 2550) ทีTระดับความ เชืTอมันT 95 เปอร์เซ็นต์ (α=0.05)

การทดลองทีM 2.2 ศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิค้มกันแบบไมุ่ จําเพาะเจาะจงของปลานิล

1. การวางแผนการทดลอง

ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช

2. การเตรียมสัตว์ทดลอง

3. อาหารและการให้อาหาร

ผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับความเข้มข้นทีTตางก่ นั 3 ระดับ ตามระบุ ข้างต้นกบอาหารปลากั ินพืช จากนัNนเคลือบทับด้วยนํNามันปลาหมึก เมืTออาหารแห้งดีแล้วจึงเกบใส็ ่ ภาชนะทีTมิดชิด ให้อาหารวันละ 2 มืNอ เช้า-เย็น ตลอดการทดลองเป็นเวลา 50 วัน โดยให้อาหาร ทดลองนาน 30 วัน และให้อาหารปกติ 20 วัน

4. การศึกษาระบบภูมิคุ้มกนของปลานิลั

ทําการสุ่มปลาทุก ๆ 10 วัน จนครบ 50 วัน จากแตละชุดการทดลอง่ ชุดละ 10 ตัว เจาะ เลือดจาก Caudal vein ให้ได้ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ด้วยเข็มฉีดยาทีTเคลือบด้วย EDTA เพืTอป้องกนการั แข็งตัวของเลือด แบงเลือดทีTเจาะได้ปริมาตร่ 0.1 มิลลิลิตรใส่ Microcentrifuge tube เพืTอนําเลือดทีT ได้ไปวิเคราะห์คาโลหิตวิทยา่ (Total red blood cells, Hematocrit, Hemoglobin และ Peripheral blood leukocytes) ด้วยเครืTอง Semi-automated microcell counter และใส่เลือดส่วนทีTเหลือลงใน Cornicol tube ซึTงภายในบรรจุอาหารเลีNยงเซลล์เม็ดเลือด (RPMI Medium) (อัตราส่วนเลือดต่อ อาหารเลีNยงเซลล์เม็ดเลือดเทาก่ บั 1:2) ผสมให้เข้ากนอยั างระมัดระวัง่ เพืTอนําเลือดไปศึกษากิจกรรม - การจับกินสิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาว (Phagocytic activity) และ Superoxide anion (O2 ) ตามขัNนตอน ดังนีN

4.1 การวิเคราะห์คาโลหิตวิทยา่ (Total red blood cells, Hematocrit, Hemoglobin และ Peripheral blood leukocytes)

นําเลือดใน Micocentrifuge tube มาตรวจวิเคราะห์คาโลหิตวิทยาโดยใช้เครืTอง่

Semi-automated microcell counter ในการวิเคราะห์

4.2 การแยกเซลล์เม็ดเลือด

ผสมเลือดกบอาหารเลีั Nยงเซลล์เม็ดเลือดทีTอยูใน่ Cornicol tube ให้เข้ากนด้วยวิธีการั เอียงหลอดเบา ๆ ใช้ Tip ปลายตัด ดูดสารละลายเลือดทัNงหมด 3 มิลลิลิตร ใส่ใน Cornicol tube ทีTมี Lymphoprep อยู ่ 3 มิลลิลิตร (อัตราส่วนสารละลายเลือดกบั Lymphoprep เทาก่ บั 1:1) อยาง่ ระมัดระวังอยาให้รวมชั่ Nนกนั นํามาหมุนเหวีTยงทีTความเร็ว 3,000 รอบตอนาที่ เป็นเวลา 20 นาที ทีT อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ดูดชัNนของเซลล์เม็ดเลือดขาวทีTมีลักษณะขุนโดยใช้่ Tip ปลายตัด ให้ได้ ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใส่ใน Cornicol tube ทีTมีสารละลาย PBS อยู ่ 1 มิลลิลิตร (อัตราส่วนเม็ดเลือด ขาวกบสารละลายั PBS เทาก่ บั 1:1) นํามาหมุนเหวีTยงทีTความเร็ว 1,500 รอบตอนาที่ เป็นเวลา 10 นาที ทีTอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ดูดสารละลายใสส่วนบนทิงจากนัN Nนเติมสารละลาย PBS 1 มิลลิลิตร นํามาหมุนเหวีTยงทีTความเร็ว 1,500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ทีTอุณหภูมิ 25 องศา- เซลเซียส ทําเช่นนีN 2 รอบ เพืTอเป็นการทําความสะอาดเซลล์เม็ดเลือดขาว จากนัNนนําเซลล์เม็ดเลือด ขาวทีTได้ไปนับด้วย Hemacytometer เพืTอคํานวณปริมาณเม็ดเลือดขาวเป็นจํานวนเซลล์ตอมิลลิลิตร่ ดังรายละเอียดในภาคผนวก และปรับความเข้มเข้นของเซลล์เม็ดเลือดให้มีความเข้มข้นเทาก่ บั 106 เซลล์ตอมิลลิลิตร่ เพืTอนําไปศึกษากิจกรรมการจับกินสิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาว - (Phagocytic activity) ในข้อ 4.3 และ Superoxide anion (O2 ) ในข้อ 4.4 ตอไป่

4.3 การศึกษากิจกรรมการจับกินสิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาว (Phagocytic activity)

การวิเคราะห์ดัดแปลงจากวิธีการของ Puangkaew et al. (2004) โดยแบงขั่ NนตอนดังนีN

4.3.1 หยดเซลล์เม็ดเลือดขาวทีTปรับความเข้มข้นแล้วปริมาตร 200 ไมโครลิตร ลงบน Cover slip ทิงไว้N 2 ชัวโมงT ทีTอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เพืTอให้เซลล์เม็ดเลือดเกาะติดกบกระจกั ของ Cover slip

4.3.2 เตรียมสารละลายยีสต์ให้มีความเข้มข้นทีT 107 เซลล์ตอมิลลิลิตร่ ด้วยการใช้ สารละลายเซลล์ยีสต์ความเข้มข้นทีT 108 เซลล์ตอมิลลิลิตร่ 70 ไมโครลิตรผสมกบั RPMI Medium

630 ไมโครลิตร (อัตราส่วนสารละลายเซลล์ยีสต์ความเข้มข้นทีT 108 เซลล์ตอมิลลิลิตรก่ บั RPMI Medium เทาก่ บั 1:9) ทิงไว้N 1 ชัวโมงT ทีTอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส

4.3.3 เมืTอครบ 2 ชังโมงแล้วT ล้างเซลล์เม็ดเลือดขาวทีTไมยึดเกาะบนผิวของ่ Cover slip ด้วย RPMI Medium 3 ครัNง จากนัNนเติมสารละลายยีสต์ทีTเตรียมไว้ในข้อ 4.3.2 ลงไปบน Cover slip ทีTมีเซลล์เม็ดเลือดขาวเกาะอยู ่ 200 ไมโครลิตร ทิงไว้N 1 ชัวโมงT ทีTอุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส

4.3.4 เมืTอครบ 1 ชัวโมงแล้วT ล้าง Cover slip ด้วย RPMI Medium 3 ครัNง เพืTอขจัด เซลล์ทีTไมยึดเกาะและยีสต์ส่ ่วนเกินออกไป แล้วย้อม Cover slip ด้วย Diff-Quick Staning ทิงให้แห้งN จากนัNนนําไปตรวจดูการจับกินสิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาวภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดย สุ่มนับเซลล์เม็ดเลือดขาวทัNงทีTกินยีสต์และไมก่ ินยีสต์รวมทัNงหมด 200 เซลล์ ข้อมูลทีTได้นําไป คํานวณหาคา่ Percent phagocytosis และ Phagocytic index โดยมีสูตรคํานวณ ดังนีN

Phagocytosis (%) = จํานวนเซลล์ทีTจับกินยีสต์ x 100 จํานวนเซลล์ทีTนับทัNงหมด Phagocytic index = จํานวนเซลล์ทีTจับกินยีสต์ x จํานวนเซลล์ยีสต์ทีTถูกกินทัNงหมด x 100 จํานวนเซลล์ทีTนับทัNงหมด จํานวนเซลล์ทีTนับทัNงหมด

- 4.4 Superoxide anion (O2 )

การวิเคราะห์ตามวิธีการของ Christybapita et al. (2007) โดยหยดเซลล์เม็ดเลือดขาว ทีTปรับความเข้มข้นแล้วจากข้อ 4.2 ปริมาตร 25 ไมโครลิตร ในหลุมของ Microtiter plate จากนัNนใส่ NBT 25 ไมโครลิตร ตามด้วย RPMI Medium 175 ไมโครลิตร ทิงไว้N 2 ชัวโมงT ทีTอุณหภูมิ 28 องศา เซลเซียส ดูดสารละลายส่วนบนทิงแล้วเติมN 100% Methanol ทิงไว้N 5 นาที แล้วดูดออก ล้างหลุมด้วย 70% Methanol 125 ไมโครลิตร จํานวน 2 ครัNง ดูดออกให้หมด จากนัNนปล่อยให้แห้ง แล้วเติม 2N KOH 125 ไมโครลิตร ตามด้วย DMSO 150 ไมโครลิตร นําไปวัดทีTเครืTองวัดการดูดกลืนคลืTนแสงทีT ความยาวคลืTน 650 นาโนเมตร โดยสารละลายมาตรฐานใช้สารเคมีเช่นเดียวกบตัวอยั างแต่ แตกต่ าง่ ตรงทีTไมมีการเติมเซลล์เม็ดเลือดขาว่ จากนัNนนําคาดูดกลืนคลืTนแสงทีTวัดได้ไปวิเคราะห์ทางสถิติ่ ตอไป่

5. การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ

วิเคราะห์ความแตกตางระหว่ างชุดการทดลองของข้อมูล่ คาโลหิตวิทยา่ กิจกรรมการจับ - กินสิTงแปลกปลอม (Phagocytosis และ Phagocytic index) และ Superoxide anion (O2 ) (Reactive oxygen species (ROS) production) โดยใช้วิธีวิเคราะห์ความแปรปรวน (Analysis of Variance) ตาม แผนการทดลองแบบสุ่มตลอด (Completely Randomized Design) และเปรียบเทียบความแตกตาง่ ของคาเฉลีTย่ โดยใช้วิธี Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) (บุญอ้อม, 2550) ทีTระดับ ความเชืTอมันT 95 เปอร์เซ็นต์ (α=0.05)

การทดลองทีM 3 ศึกษาผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการแสดงออกของยีน Interleukin 1 β, Interleukin 8, Transforming growth factor β 1 และ Tumor necrosis factor α โดยใช้เทคนิค Semi-quantitative RT-PCR

1. การวางแผนการทดลอง

ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช

2. การเตรียมสัตว์ทดลอง

3. อาหารและการให้อาหาร

4. การเกบตัวอย็ างเนื่ NอเยืTอจากอวัยวะตาง่ ๆ และการสกดั Total RNA

เมืTอปลานิลได้รับอาหารทดลองครบ 30 วัน ทําการสุ่มปลาจากทัNง 4 ชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 4 ตัว เพืTอเกบเนื็ NอเยืTอจากไตส่วนหน้าและม้าม อยางละประมาณ่ 100 มิลลิกรัม จากนัNนทําการสกดั Total RNA โดยนําเนืNอเยืTอมาบดด้วย Trizol reagent (Molecular Research Center) ปริมาตร 1 มิลลิลิตร นํามาบมทีTอุณหภูมิห้อง่ 5 นาที จากนัNนเติม Chloroform ปริมาตร 200 ไมโครลิตร บมทีTอุณหภูมิห้อง่ 2-3 นาที และนําไปปัTนเหวีTยงทีTความเร็วรอบ 12,000 xg ทีTอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที จากนัNนแยกส่วนใสซึTงประกอบด้วย RNA ไปยังหลอด microcentrifuge tube ใหม ่ จากนัNนเติม Isopropyl alcohol ปริมาตร 500 ไมโครลิตร เขยาให้เข้าก่ นั ด้วยมือ บมทีTอุณหภูมิห้องเป็นเวลา่ 10 นาที นําไปปัTนเหวีTยงทีTความเร็วรอบ 12,000 xg ทีTอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที จะเห็นตะกอนสีขาวของ RNA อยูบริเวณก่ นหลอด้ ล้างตะกอน RNA ด้วย 75% Ethanol ปริมาตร 1 มิลลิลิตรและเกบทีTอุณหภูมิ-80็ องศาเซลเซียส จนกวาจะ่ นํามาใช้ การวัดคุณภาพของ RNA ทําได้โดยนํามาวัดคาดูดกลืนแสงทีTความยาวคลืTน่ 260 นาโน- เมตร และทํา Electrophoresis โดยใช้ 1% Formaldehyde-agarose gel

4.1 การวัดคุณภาพ Total RNA ด้วย Formaldehyde-agarose gel electrophoresis

เตรียมตัวอยาง่ Total RNA ทีTได้จากอวัยวะตาง่ ๆ โดย ผสม Total RNA ปริมาตร 3.5 ไมโครลิตรจาก Total RNA ความเข้มข้น 10-20 ไมโครกรัมด้วย DEPC-treated water, 50% Formamide ปริมาตร 5 ไมโครลิตร, 2.2 M Formaldehyde ปริมาตร 2 ไมโครลิตร และ10X MOPS ปริมาตร 1.5 ไมโครลิตร นําไปบมทีT่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที จากนัNนนําไปแช่ในนํNาแข็งง ทันทีเป็นเวลา 10 นาที เติม 10X Formaldehyde gel loading buffer (50% Glycerol, 10 mM EDTA, pH 8.0, 0.25% (W/V) Bromophenol blue และ 0.25% (W/V) Xylene cyanol FF) ปริมาตร 3 ไมโครลิตร ลงไปในตัวอยางแต่ ละหลอด่ นําตัวอยางไปแยก่ RNA บน 1% Formaldehyde-agarose gel ซึTงอยูใน่ 1X MOPS (เจือจางด้วย 10X MOPS: 0.2 M MOP, pH 7.0, 20 mM Sodium acetate และ 10 mM EDTA) นําเจลทีTได้ไปย้อมด้วย Ethidium bromide (0.5 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชัวโมงและนํามาสT ่องใต้แสง UV ด้วยเครืTอง Gel documentation โดยสามารถพบแถบของ RNA 2 แถบอยางชัดเจน่ คือ แถบของ 28s rRNA ซึTงมีขนาดประมาณ 4.7 kb และ 18s rRNA ซึTงมีขนาด ประมาณ 1.9 kb และพบรอย Smear ด้านบนของแถบ RNAซึTงมีขนาดมากกวา่ 10 kb แสดงวา่ mRNA ทีTสกดได้มีคุณภาพดีั ซึTงเป็นสภาพทีTเหมาะสมสําหรับการนําไปสังเคราะห์ First strand cDNA ตอไป่

4.2 การสังเคราะห์ First strand cDNA synthesis

นํา Total RNA ทีTเกบใน็ 75 % Ethanol มาทิงไว้ทีTอุณหภูมิห้องเพืTอให้ละลายN จากนัNน นําไปเขยาโดยใช้่ Vortex mixture แล้วนําไปปัTนเหวีTยงทีT 12,000 รอบตอนาที่ จากนัNนดูด 75 % Ethanol ทิงN แล้วตากตะกอนทีTอุณหภูมิห้องอยาให้แห้งมาก่ เติม DEPC treated water ประมาณ 10 ไมโครลิตร ทีละน้อยเพืTอให้ตะกอนละลายจนหมด ใช้ Automatic micropipette ดูด Total RNA มา 2 ไมโครลิตรผสมกบั DEPC treated water 68 ไมโครลิตรแล้วนําไปวัดคาการดูดกลืนแสงทีTความ่ ยาวคลืTน 260-280 นาโนเมตรซึTงใช้ DEPC treated water เป็น Blank เมืTอได้คาความเข้มข้นของ่ Total RNA เป็นหน่วยไมโครกรัม/มิลลิลิตร จากนัNนใช้ Total RNA ทีTสกดได้จากแตั ละตัวอย่ าง่ ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัมมาสังเคราะห์ First strand cDNA โดยใช้ RevertAidTM Firststrand cDNA synthesis kit (Fermentas) เกบไว้ทีTอุณหภูมิ็ -20 องศาเซลเซียส จนกวาจะนําไปใช้เพืTอเป็น่ DNA template ในการทํา RT-PCR ตอไป่

4.3 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

First strand cDNA ทีTได้จะใช้เป็น Template ในกระบวนการ PCR เพืTอหาปริมาตร

ของ Magnesium chloride (MgCl2) และจํานวนรอบ (Cycles) ของปฏิกิริยาทีTเหมาะสมตอการ่ แสดงออกของยีนในไตส่วนหน้าและม้ามของปลาแตละชุดการทดลอง่ เพืTอนําไปใช้ในการทํา Semi-quantitative RT-PCR โดยใช้ Template ของปลาชุดควบคุมในการหาปฏิกิริยาทีTเหมาะสม ซึTง ในการทํา PCR amplification ใช้ Gene-specific primers ของยีน Interleukin 1 β, Interleukin 8, Transforming growth factor β 1, Tumor necrosis factor α และ β actin โดยมีลําดับของนิวคลีโอ- ไทด์ทีTใช้เป็น Gene-specific primers และขนาดของ PCR product ดังนีN

ตารางทีM 1 Gene specific primers เพืTอใช้ในการศึกษา RT-PCR

Gene name Primer Sequences from 5' to 3' PCR product size names Interleukin 1 β IL-1b-F 5'- GTCACTGACAGCCAAAAGAG -3' 339 bp IL-1b-R 5'- GACAGACATGAGAGTGCTGA -3' Interleukin 8 On-IL8 F 5'- CTGTCATGGTCTGCATCTC -3' 256 bp On-IL8 R 5'- GAGGAAGTGGTCTTCTGCT -3' Transforming growth factor β 1 TGF-βF 5'- CATAAGCCAACGGGTTAC -3' 359 bp TGF-βR 5'- CCCCATGTCCACATTATC -3' Tumor necrosis factor α TNF-αF 5'- CTGAGGCGAAGACTGTAGTT -3' 499 bp TNF-αR 5'- CTGCTTCCCATAGACTCTGA -3' β actin BA-F1 5'- GGTCATCACCATTGGCAATG -3' 592 bp BA-R1 5'- ACTGAAGCCATGCCAATGAG -3'

โดยมีปฏิกิริยาและสภาวะของปฏิกิริยาดังนีN

ตารางทีM 2 ส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR เพืTอหาปริมาตรของ Magnesium chloride ทีTเหมาะสม

ปริมาตรของ MgCl2 (ไมโครลิตร) ส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 DNA Template (ไมโครลิตร) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10X Taq buffer (ไมโครลิตร) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 mM dNTP (ไมโครลิตร) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 10 µM Forward primer (ไมโครลิตร) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10 µM Reverse primer (ไมโครลิตร) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 0.5 U/µl Taq DNA Polymerase (ไมโครลิตร) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

25 mM MgCl2 (ไมโครลิตร) 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 Distill water (ไมโครลิตร) 13.7 13.2 12.7 11.7 10.7 ปริมาตรรวม (ไมโครลิตร) 25 25 25 25 25

รอบของปฏิกิริยา

Pre-Denaturation 95oC เป็นเวลา 5 นาที Denaturation 95oC เป็นเวลา 30 วินาที Annealing 55 oC เป็นเวลา 30 วินาที 25 รอบ Extension 72 oC เป็นเวลา 1 นาที Post-Extension 72 oC เป็นเวลา 5 นาที

จากนัNนนํา PCR product ทัNงหมดทีTได้มาตรวจสอบโดยวิธี Electrophoresis บน 1.5% Agarose gel ใน 1X TBE buffer ทีTกาลังไฟฟ้าํ 100 โวลท์ ใช้ 100 bp DNA ladder เป็น DNA marker จากนัNนย้อมเจลด้วย Gel star (Lonza) และนําไปส่องใต้แสง UV ด้วยเครืTอง Gel documentation ใช้โปรแกรม SynGene Genetools version 3.08.01 ในการวิเคราะห์

นําปฏิกิริยาทีTเลือก มาปรับจํานวนรอบในการทําปฏิกิริยาเพืTอหารอบทีTเหมาะสมในการทํา กระบวนการ PCR ของแตละยีนในแต่ ละอวัยวะ่ โดยจํานวนรอบทีTใช้ทดลองคือ 22, 25, 28, 32 และ 35 รอบ ตามลําดับ จากนัNนนํา PCR product ทัNงหมดทีTได้มาตรวจสอบโดยวิธี Electrophoresis บน 1.5% Agarose gel ใน 1X TBE buffer ทีTกาลังไฟฟ้าํ 100 โวลท์ ใช้ 100 bp DNA ladder เป็น DNA marker จากนัNนย้อมเจลด้วย Gel star (Lonza) และนําไปส่องใต้แสง UV ด้วยเครืTอง Gel documentation ใช้โปรแกรม SynGene Genetools version 3.08.01 ในการวิเคราะห์ ได้คาทีT่ เหมาะสมดังแสดงในตารางทีT 3

ตารางทีM 3 ปริมาตรของ MgCl2 และจํานวนรอบในการทํา PCR ทีTเหมาะสม

อวัยวะ ชืTอยีน ปริมาตรของ MgCl2 รอบในการทํา PCR (ไมโครลิตร) ไตส่วนหน้า Interleukin 1 β 1.0 25 Interleukin 8 1.0 25 Transforming growth factor β 1 1.5 25 Tumor necrosis factor α 4.0 32 β actin 2.0 25 ม้าม Interleukin 1 β 4.0 22 Interleukin 8 1.0 25 Transforming growth factor β 1 2.0 25 Tumor necrosis factor α 2.0 25 β actin 1.5 25

4.4 Semi-quantitative RT-PCR

นําคาของปฏิก่ ิริยาทีTเหมาะสมของแตละยีนในไตส่ ่วนหน้าและม้ามทีTได้จากข้อ 4.2 มา ทํากระบวนการ PCR โดยใช้ Template ของปลาจากทุกชุดการทดลองมาเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั ชุดการทดลองละ 4 ซํNา จากนัNนนํา PCR product ทัNงหมดทีTได้มาตรวจสอบโดยวิธี Electrophoresis บน 1.5% Agarose gel ใน 1X TBE buffer ทีTกาลังไฟฟ้าํ 100 โวลท์ ใช้ 100 bp DNA ladder เป็น DNA marker จากนัNนย้อมเจลด้วย Gel star (Lonza) และนําไปส่องใต้แสง UV ด้วยเครืTอง

Gel documentation ใช้โปรแกรม SynGene Genetools version 3.08.01 ในการวิเคราะห์ ทําการ Normalize ระดับการแสดงออกของยีนด้วยจํานวนของ β actin คาทีTได้ออกมาคือ่ relative fluorescence units/rfU (%) (Flach et al., 1998) ดังสมการ

relative fluorescence units (%) = Raw volumn of target gene x 100 Raw volumn of β actin

5. การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ

ข้อมูลของการแสดงออกของยีน Interleukin 1 β, Interleukin 8, Transforming growth factor β 1, Tumor necrosis factor α จะแสดงในรูปของ Means ± standard deviation และความ แตกตางทางสถิติระหว่ างกลุ่ ่มจะวิเคราะห์ความแปรปรวนโดยใช้ One-way analysis of variance (ANOVA) และเปรียบเทียบความแตกตางของค่ าเฉลีTยโดยวิธี่ Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) (บุญอ้อม, 2550) ทีTระดับความเชืTอมันT 95 เปอร์เซ็นต์ (α=0.05)

สถานทีMและระยะเวลาทําการวิจัย

สถานทีMทําการวิจัย

ห้องปฏิบัติการสุขภาพสัตว์นํNา ภาควิชาเพาะเลีNยงสัตว์นํNา คณะประมง มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตบางเขน

ระยะเวลาทําการวิจัย

เริTมทําการทดลอง เดือนตุลาคม 2551 และ สิNนสุดการทดลองในเดือนมกราคม 2553

ผลและวิจารณ์

ผลการทดลอง

การทดลองทีM 1 การศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต อัตรารอด และความต้านทานต่อเชืcอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ของลกปลานิลู

เมืTอครบกาหนดการอนุบาลเป็นระยะเวลาํ 21 วันแล้ว นับจํานวนปลาทีTเหลือในทุก ๆ ซํNา ของทุกชุดการทดลองเพืTอคํานวณอัตรารอด และสุ่มลูกปลาจากแตละซํ่ Nาของทุกชุดการทดลองมา จํานวนซํNาละ 30 ตัว ชังนํT Nาหนักและวัดความยาว ประเมินอัตราการเจริญเติบโตต่อวัน (ADG) ชังนํT NาหนักอาหารทีTเหลือของแตละชุดการทดลองเพืTอนําไปคํานวณหาอัตราการเปลีTยนอาหาร่ เป็นเนืNอ (FCR) จากนัNนสุ่มลูกปลาจากแตละชุดการทดลองมาผ่ าตัดเก่ บอวัยวะภายในบริเวณลําไส้็ ส่วนต้นและตับ ใส่ขวดเกบตัวอย็ างทีTมีสารละลาย่ 10% Formalin ส่งตัวอยางนําไปทําสไลด์เนื่ NอเยืTอ ถาวร เพืTอศึกษาถึงสภาพเนืNอเยืTอของลําไส้ส่วนต้นและตับของแตละชุดการทดลอง่ ทดสอบ ความสามารถในการต้านเชืNอโรคของลูกปลานิล โดยวิธีการแช่ลูกปลาจํานวน 30 ตัว ในนํNาปริมาตร 3 ลิตร ทีTมีปริมาณความเข้มข้นของเชืNอ S. agalactiae ทีT 108 CFU/ml เป็นระยะเวลา 6 ชัวโมงT จากนัNนย้ายลูกปลาไปเลีNยงในโหลแกวทีTมีนํ้ Nาอยูปริมาตร่ 8 ลิตร เป็นระยะเวลา 7 วัน เพืTอ เปรียบเทียบอัตราการตายของปลาในแตละชุดการทดลอง่ ได้ผลดังนีN

1.1 อัตรารอด

หลังจากให้อาหารผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในแตละชุดการทดลองเป็น่ ระยะเวลา 21 วัน พบวาอัตรารอดเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTทุกอัตราการปล่ ่อยไม่มีความ แตกตางก่ นทางสถิติั (P>0.05) ระหวางชุดควบคุมและชุดทดลอง่ ดังแสดงในตารางทีT 4 และ ภาพทีT 1

ตารางทีM 4 อัตรารอดของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้

ชุดการทดลอง อัตรารอดลูกปลานิลแปลงเพศของแตละอัตราปล่ ่อย (เปอร์เซ็นต์) 100 (ตัว/ตู้) 200 (ตัว/ตู้) 300 (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 89.67±9.07 92.33±6.83 92.00±5.48 ชุดการทดลองทีT 2 94.00±10.39 94.00±6.26 92.56±2.45 ชุดการทดลองทีT 3 95.67±3.21 95.00±5.89 96.78±3.98 ชุดการทดลองทีT 4 96.33±6.35 95.33±8.08 98.22±2.80

หมายเหตุ ไมพบความแตกต่ ่างกนทางสถิติั (P>0.05) ของคาเฉลีTยในแนวตั่ Nง ชุดการทดลองทีT 1 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α– methyltestosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัมตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

120.00 a a a a a a a a a a a 100.00 a 80.00 60.00 40.00

อัตรารอด (เปอร์เซ็นต์) อัตรารอด 20.00 0.00 100 200 300 อัตราปล่อย (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 1 อัตรารอดเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน

1.2 นํNาหนัก

หลังจากให้อาหารผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในแตละชุดการทดลองเป็น่ ระยะเวลา 21 วัน พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัว/ตู้ นํNาหนักเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศชุดควบคุมกบั ชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ไม่ แตกตางก่ นทางสถิติั (P>0.05) คือ 0.78±0.16 และ 0.79±0.19 กรัม ตามลําดับ ในขณะทีTชุดการ ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีนํNาหนักเฉลีTยมากกวาชุดควบคุมและชุดทีTได้รับการ่ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมอยางมีนัยสําคัญ่ ทางสถิติ (P<0.05) คือ 0.85±0.20 และ 0.90±0.19 กรัม ตามลําดับ เมืTอพิจารณานํNาหนักเฉลีTยของลูก ปลานิล แปลงเพศทีTอัตราปล่อย 200 และ 300 ตัว/ตู้ พบวานํ่ NาหนักเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศชุด ควบคุม กบชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับั 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ไมแตกต่ างก่ นทางสถิติั (P>0.05) คือ 0.49±0.10 , 0.50±0.11, 0.41±0.11 และ 0.43±0.18 กรัม ตามลําดับ สําหรับชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT ระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีนํNาหนักเฉลีTย มากกวา่

ชุดควบคุมอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 0.52±0.10, 0.53±0.13, 0.46±0.15 และ 0.48±0.13 กรัม ตามลําดับ แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) ระหวางนํ่ NาหนักเฉลีTยของลูกปลานิล แปลงเพศทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ตารางทีT 5 และภาพทีT 2)

ตารางทีM 5 นํNาหนักเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา– ไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้

ชุดการทดลอง นํNาหนักเฉลีTยลูกปลานิลแปลงเพศของแตละอัตราปล่ ่อย (กรัม) 100 (ตัว/ตู้) 200 (ตัว/ตู้) 300 (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 0.78±0.16 a 0.49±0.10a 0.41±0.11a ชุดการทดลองทีT 2 0.79±0.19a 0.50±0.11ab 0.43±0.18ab ชุดการทดลองทีT 3 0.85±0.20b 0.52±0.10b 0.46±0.15b ชุดการทดลองทีT 4 0.90±0.19b 0.53±0.13b 0.48±0.13b

หมายเหตุ คาเฉลีTยก่ ากํ บด้วยอักษรทีTตั างก่ นในแนวตัั Nง มีความแตกตางก่ นอยั างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ชุดการทดลองทีT 1 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α– methyltestosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัมตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

นํNาหนักเฉลีTย (กรัม) 1.20 b b 1.00 a a

0.80 b a ab b ab b b 0.60 a

0.40

0.20

0.00 100 200 300 อัตราปล่อย (ตัว/ตู้)

ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 2 นํNาหนักเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ เป็นระยะเวลา 21 วัน

1.3 ความยาวมาตรฐาน

หลังจากให้อาหารผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในแตละชุดการทดลองเป็น่ ระยะเวลา 21 วัน พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัว/ตู้ ความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศ ชุดควบคุมกบชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับั 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ไมแตกต่ างก่ นทางสถิติั (P>0.05) คือ 2.86±0.24 และ 2.88±0.20 เซนติเมตร ตามลําดับ ในขณะทีTชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีความยาวมาตรฐานเฉลีTยมากกวาชุด่ ควบคุมและชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัมอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 2.96±0.25 และ 3.03±0.22 เซนติเมตร ตามลําดับ เมืTอพิจารณาความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTอัตราปล่อย 200 และ 300 ตัว/ตู้ พบวาความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศชุดควบคุมก่ บชุดการทดลองทีTได้รับการั เสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ไมแตกต่ างก่ นั ทางสถิติ (P>0.05) คือ 2.44±0.19, 2.49±0.23, 2.24±0.40 และ 2.32±0.24 เซนติเมตร ตามลําดับ

สําหรับชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีความยาวมาตรฐานเฉลีTยมากกวาชุด่ ควบคุมอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 2.51±0.19, 2.53±0.20, 2.33±0.27 และ 2.40±0.23 เซนติเมตร ตามลําดับ แตไม่ ่พบความแตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) ระหวางความยาวมาตรฐานเฉลีTย่ ของลูกปลานิลแปลงเพศทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ตารางทีT 6 และภาพทีT 3)

ตารางทีM 6 ความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิ- โกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้

ชุดการทดลอง ความยาวมาตรฐานเฉลีTยลูกปลานิลแปลงเพศ ของแตละอัตราปล่ ่อย (เซนติเมตร) 100 (ตัว/ตู้) 200 (ตัว/ตู้) 300 (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 2.86±0.24a 2.44±0.19a 2.24±0.40a ชุดการทดลองทีT 2 2.88±0.20a 2.49±0.23ab 2.32±0.24ab ชุดการทดลองทีT 3 2.96±0.25b 2.51±0.19b 2.33±0.27b ชุดการทดลองทีT 4 3.03±0.22b 2.53±0.20b 2.40±0.23b

4.00 a a b b 3.00 aab b b a ab b b 2.00 1.00 0.00 ความยาวมาตรฐานเฉลีTย(เซนติเมตร) 100 200 300 อัตราปล่อย (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 3 ความยาวมาตรฐานเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน

1.4 อัตราการเจริญเติบโตต่อวัน (Average daily growth/ADG)

หลังจากให้อาหารผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในแตละชุดการทดลองเป็น่ ระยะเวลา 21 วัน พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัว/ตู้ อัตราการเจริญเติบโตตอวันเฉลีTยของลูกปลานิล่ แปลงเพศชุดควบคุมกบชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับั 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ไมแตกต่ างก่ นทางสถิติั (P>0.05) คือ 0.037±0.007 และ 0.037±0.009 กรัม/วัน ตามลําดับ ในขณะทีTชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีอัตราการเจริญเติบโตต่อวัน เฉลีTยมากกวาชุดควบคุมและชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 0.040±0.010 และ 0.042±0.009 กรัม/วัน ตามลําดับ เมืTอพิจารณาอัตราการเจริญเติบโตตอวันเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTอัตรา่ ปล่อย 200 และ 300 ตัว/ตู้ พบวาอัตราการเจริญเติบโตต่ อวันเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศไม่ มี่ ความแตกตางก่ นทางสถิติั (P>0.05) ระหวางชุดควบคุมและชุดทดลอง่ คือ 0.022±0.001, 0.023±0.003, 0.024±0.002, 0.024±0.002, 0.019±0.002, 0.020±0.002, 0.021±0.004 และ 0.022±0.002 กรัม/วัน ตามลําดับ (ตารางทีT 7 และภาพทีT 4)

ตารางทีM 7 อัตราการเจริญเติบโตตอวันเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม่ แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้

ชุดการทดลอง อัตราการเจริญเติบโตต่อวันเฉลีTยลูกปลานิลแปลงเพศ ของแตละอัตราปล่ ่อย (กรัม/วัน) 100 (ตัว/ตู้) 200 (ตัว/ตู้) 300 (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 0.037±0.007a 0.022±0.001a 0.019±0.002a ชุดการทดลองทีT 2 0.037±0.009a 0.023±0.003a 0.020±0.002a ชุดการทดลองทีT 3 0.040±0.010b 0.024±0.002a 0.021±0.004a ชุดการทดลองทีT 4 0.042±0.009b 0.024±0.002a 0.022±0.002a

หมายเหตุ คาเฉลีTยก่ ากํ บด้วยอักษรทีTตั างก่ นในแนวตัั Nง มีความแตกตางก่ นอยั างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ชุดการทดลองทีT 1 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α– methyltestosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัมตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัมตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α- MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัมตออาหาร่ 1 กิโลกรัมผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

0.060 b b 0.050 a a 0.040 0.030 aa aa aa a a (กรัม/วัน) 0.020 0.010 0.000 อัตราการเจริญเติบโตต ่อวันเฉลีTย 100 200 300 อัตราปล่อย (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 4 อัตราการเจริญเติบโตตอวันเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริมแมน-่ แนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน

1.5 อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอ (Feed conversion rate [FCR])

หลังจากให้อาหารผสมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในแตละชุดการทดลองเป็น่ ระยะเวลา 21 วัน พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัว/ตู้ อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยของลูกปลานิล แปลงเพศไมมีความแตกต่ างก่ นทางสถิติั (P>0.05) ระหวางชุดควบคุมและชุดทดลอง่ คือ 1.42±0.10, 1.39±0.25, 1.28±0.19 และ 1.12±0.09 ตามลําดับ ส่วนชุดการทดลองทีTมีอัตราปล่อย 200 ตัว/ตู้ พบวาอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนื่ NอเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศชุดควบคุมกบชุดทีTได้รับั การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ไมแตกต่ างก่ นั ทางสถิติ (P>0.05) คือ 1.59±0.07 และ 1.47±0.20 ตามลําดับ ในขณะทีTชุดการทดลองทีTได้รับการ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผล ทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยน้อยกวาชุดควบคุมและชุดทีTได้รับ่ การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม อยางมีนัย-่ สําคัญทางสถิติ (P<0.05) คือ 1.32±0.14 และ 1.30±0.09 ตามลําดับ แตทีTชุดการทดลองทีTมีอัตรา่ ปล่อย 300 ตัว/ตู้ พบวาอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนื่ NอเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศชุดควบคุมกบั ชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม และ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ไมมีความแตกต่ างก่ นทางสถิติั (P>0.05) คือ 1.39±0.09, 1.27±0.09 และ 1.18±0.19 ตามลําดับ ในขณะทีTชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTย น้อยกวาชุดควบคุมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 1.06±0.09 และมีอัตราการเปลีTยนอาหาร

เป็นเนืNอเฉลีTยน้อยกวาชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 2 กรัมและ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) (ตารางทีT 8 และ ภาพทีT 5)

ตารางทีM 8 อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้

ชุดการทดลอง อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยลูกปลานิลแปลงเพศ ของแตละอัตราปล่ ่อย 100 (ตัว/ตู้) 200 (ตัว/ตู้) 300 (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 1.42±0.10a 1.59±0.07a 1.39±0.09a ชุดการทดลองทีT 2 1.39±0.25a 1.47±0.20ab 1.27±0.09ab ชุดการทดลองทีT 3 1.28±0.19a 1.32±0.14b 1.18±0.19ab ชุดการทดลองทีT 4 1.12±0.09a 1.30±0.09b 1.06±0.09b

1.80 a a ab 1.60 a a a b b ab ab 1.40 a 1.20 b 1.00 0.80 0.60 0.40

อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอ 0.20 0.00 100 200 300 อัตราปล่อย (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 5 อัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน

1.6 ลักษณะทางพยาธิสภาพของเนืNอเยืTอบริเวณลําไส้ส่วนต้นและตับ

เมืTอครบกาหนดการอนุบาลเป็นระยะเวลาํ 21 วันแล้ว สุ่มลูกปลาจากแตละชุดการ่ ทดลองมาผาตัดเก่ บอวัยวะภายในเพืTอศึกษาถึงสภาพเนื็ NอเยืTอของลําไส้ส่วนต้นและตับของแตละชุด่ การทดลอง พบวาชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีพืNนทีTผิวของ microvilli ในลําไส้ส่วนต้นไมฉีกขาด่ มีสภาพคอนข้าง่ สมบูรณ์ และเพิมขึT Nนอยางเห็นได้ชัด่ (ภาพทีT 6) สําหรับชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอ- ลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม มีพืNนทีTผิวของ microvilli เพิมมากT ขึNนแตยังพบว่ ามีการฉีกขาดอยู่ บ้าง่ (ภาพทีT 7) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมั แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่อ อาหาร 1 กิโลกรัม (ภาพทีT 8) และชุด ควบคุม (ภาพทีT 9) ทีTมีพืNนทีTผิวของ microvilli คอนข้างน้อยและพบการฉีกขาดทีTผนังด้านนอกของ่ microvilli อยูมาก่ สําหรับลักษณะทางพยาธิสภาพเนืNอเยืTอตับของชุดควบคุมและชุดทดลองทีTได้รับ การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร พบวามีการสะสมไขมัน่ (Fat droplet) อยูในเซลล์่ ตับ (Hepatocyte) แตชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 4 กรัม และ 6 กรัม ต่อ อาหาร 1 กิโลกรัม มีการสะสมไขมันในเซลล์ตับมากกวาชุดควบคุมและ่ ชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่อ อาหาร 1 กิโลกรัม (ภาพทีT 10)

ภาพทีM 6 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารกุง้ เบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

ภาพทีM 7 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารกุง้ เบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบการฉีกขาดของ microvilli (Laceration; L)

ภาพทีM 8 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารกุง้ เบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบการฉีกขาดของ microvilli (Laceration; L)

ภาพทีM 9 ลักษณะทางพยาธิสภาพบริเวณลําไส้ส่วนต้นของลูกปลานิลแปลงเพศหลังได้รับอาหารกุง้ เบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ชุดควบคุม) พบการฉีกขาดของ microvilli (Laceration; L)

H H F F T1 T2

F F H H T3 T4

ภาพทีM 10 เซลล์ตับ (Hepatocyte; H) มีการสะสมของไขมัน (Fat droplet; F) อยูในเซลล์่

หมายเหตุ T1 = เซลล์ตับของลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ 17 α–methyl testosterone (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม (ชุดควบคุม) T2 = เซลล์ตับของลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T3 = เซลล์ตับของลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T4 = เซลล์ตับของลูกปลานิลเลีNยงด้วยอาหารกุงเบอร์ศูนย์ผสมฮอร์โมนเพศผู้้ (17 α-MT) ในอัตรา 60 มิลลิกรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

1.7 ผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารต่อความต้านทานเชืNอ S. agalactiae ของลูกปลานิลแปลงเพศ

หลังทดสอบความสามารถในการต้านเชืNอโรคของลูกปลานิล โดยวิธีการแช่ด้วยเชืNอ S. agalactiae ทีT 108 CFU/ml พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัว/ตู้ อัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลง เพศของชุดควบคุม คือ 43.33±20.82 เปอร์เซ็นต์ ในขณะทีTชุดทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอ- ลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ส่งผลให้อัตรา การตายลดลงอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 3.33±5.77, 0.00±0.00 และ 0.00±0.00 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ ส่วนอัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTอัตราปล่อย 200 และ 300 ตัว/ตู้ พบวาลูกปลานิลแปลงเพศชุดควบคุมก่ บชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในั อาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีอัตราการตายเฉลีTยไมแตกต่ างก่ นทางสถิติั (P>0.05) คือ 63.33±11.55, 50.00±17.32, 46.67±5.77 และ 43.33±15.28 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ ในขณะทีTชุด การทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม มีผลทําให้ลูกปลานิลแปลงเพศมีอัตราการตายเฉลีTยน้อยกวาชุดควบคุมและชุดทีT่ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัมอยางมี่ นัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) คือ 16.67±5.77, 3.33±5.77, 16.67±5.77 และ 6.67±5.77 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ (ตารางทีT 9 และภาพทีT 11)

นําลูกปลาทีTตายมาแยกเชืNอแบคทีเรียจากตับ ม้าม และไตส่วนหลัง และนําเชืNอแบคทีเรียทีT ได้มาทดสอบคุณสมบัติทางกายภาพและทางชีวเคมีพบวาเป็นเชื่ Nอ Streptococcus agalactiae

ตารางทีM 9 อัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์เป็นเวลา 21 วัน ทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว/ตู้ หลังแช่ด้วยเชืNอ S. agalactiae ทีT 108 CFU/ml

ชุดการทดลอง อัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศของแตละอัตราปล่ ่อย 100 (ตัว/ตู้) 200 (ตัว/ตู้) 300 (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 43.33±20.82a 63.33±11.55a 46.67±5.77a ชุดการทดลองทีT 2 3.33±5.77b 50.00±17.32a 43.33±15.28a ชุดการทดลองทีT 3 0.00±0.00b 16.67±5.77b 16.67±5.77b ชุดการทดลองทีT 4 0.00±0.00b 3.33±5.77b 6.67±5.77b

100.00 80.00 a a a a 60.00 a 40.00 b b 20.00 b b b อัตราการตาย(เปอร์เซ็นต์) b b 0.00 100 200 300 อัตราปล่อย (ตัว/ตู้) ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 11 อัตราการตายเฉลีTยของลูกปลานิลแปลงเพศทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์เป็นระยะเวลา 21 วัน หลังแช่ด้วยเชืNอ S. agalactiae ทีT 108 CFU/ml

การทดลองทีM 2 การศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิค้มกันของุ ปลานิล

การทดลองทีM 2.1 ระบบภูมิค้มกันแบบจําเพาะเจาะจงของปลานิลในเชิงการสร้างุ Antibody หลังจากได้รับวัคซีน S. agalactiae

ผลการศึกษาคา่ Antibody titer เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นในแตั ละสัปดาห์่ พบวาการเปลีTยนแปลงของค่ า่ Antibody titer เฉลีTยของ ปลานิลในแตละชุดการทดลองหลังจากให้วัคซีนครั่ Nงแรก มีคาสูงขึ่ Nนในสัปดาห์ทีT 1-2 โดยปลานิล จากชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ในสัปดาห์ทีT 1 มีคา่ Antibody titer เฉลีTยสูงสุด คือ 8.00±0.00 รองลงมาคือชุดควบคุม และชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ตามลําดับ คือ 6.40±2.07, 5.50±2.80 และ 3.80±0.63 สัปดาห์ทีT 2 ปลานิล จากชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ยังคงมีคาเฉลีTยสูงสุด่ คือ 8.80±6.20 รองลงมาคือชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดควบคุม และชุดการ

ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ตามลําดับ ซึTงมีคาใกล้เคียงก่ นคือั 4.00±0.00, 3.30±2.58 และ 3.10±1.20 ตามลําดับ เมืTอเข้าสู่สัปดาห์ ทีT 3 คาเฉลีTย่ Antibody titer ของทุกชุดการทดลองเริTมมีคาลดลง่ โดยชุดการทดลองทีTได้รับการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ยังคงมีคาเฉลีTยสูงสุด่ คือ 3.20±1.03 รองลงมาคือชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT ระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม และชุดควบคุม ตามลําดับ คือ 2.40±2.17, 1.40±0.52 และ 1.20±0.42 ตามลําดับ และทําการให้วัคซีนกระตุ้นเป็นครัNงทีTสอง

สัปดาห์ทีT 4 (หนึTงสัปดาห์หลังการฉีดวัคซีนครัNงทีT 2) พบวาการตอบสนองต่ ่อวัคซีนของทุก ชุดการทดลองมีคาสูงขึ่ Nนกวาการได้รับวัคซีนครั่ Nงแรก โดยชุดการทดลองทีTได้รับการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTยสูงทีTสุด่ คือ 166.40±61.83 รองลงมาคือชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT ระดับ 2 กรัม และ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาใกล้เคียงก่ นคือั 14.22±3.53 และ 13.71±3.90 และชุดควบคุม ซึTงมีคาเฉลีTย่ Antibody titer ตํTาสุดคือ 6.67±4.00 สัปดาห์ทีT 5 คาเฉลีTย่ Antibody titer ของชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ลดลงอยางเห็นได้ชัด่ คือ 14.40±3.37 สําหรับชุดควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับการ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม และ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม นัNน ยังคงมีคาเพิ่ มขึT Nน คือ 15.60±9.70, 15.20±7.00 และ 22.40±8.26 ตามลําดับ เมืTอเข้าสู่สัปดาห์ทีT 6 คาเฉลีTย่ Antibody titer ของทุกชุดการทดลองเริTมลดลง โดยคาเฉลีTย่ Antibody titer ของชุดการ ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ลดลงเป็น 7.60±1.26 ซึTงเทาก่ บชุดควบคุมั รองลงมาคือชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนน- โอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม คือ 7.20±1.69 และ 5.60±2.07 สัปดาห์ทีT 7 คาเฉลีTย่ Antibody titer ของทุกชุดการทดลองลดลงเกือบคงทีT โดยทีTชุด ควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม มีคาเท่ ่ากบในสัปดาห์ทีTั 6 คือ 7.60±1.26 และ 5.60±2.07 ตามลําดับ ส่วนชุด การทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม ลดลงเล็กน้อย คือ 4.80±3.49 และ 4.20±1.48 ตามลําดับ (ตารางทีT 10 และ ภาพทีT 12)

ตารางทีM 10 คาเฉลีTย่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลอง่

สัปดาห์ ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 0 2.00±0.00a 2.00±0.00 a 2.00±0.00 a 2.00±0.00 a 1 6.40±2.07 c 8.00±0.00 bc 5.50±2.80 b 3.80±0.63 a 2 3.30±2.58 a 8.80±6.20 b 4.00±0.00 a 3.10±1.20 a 3 1.20±0.42 a 3.20±1.03 c 2.40±2.17 bc 1.40±0.52 ab 4 6.67±4.00 a 14.22±3.53 a 13.71±3.90 a 166.40±61.83 b 5 15.60±9.70 a 15.20±7.00 a 22.40±8.26 b 14.40±3.37 a 6 7.60±1.26 b 5.60±2.07 a 7.20±1.69 b 7.60±1.26 b 7 7.60±1.26 b 5.60±2.07 a 4.80±3.49 a 4.20±1.48 a

หมายเหตุ คาเฉลีTยก่ ากํ บด้วยอักษรทีTตั างก่ นในแนวนอนั มีความแตกตางก่ นอยั างมีนัยสําคัญทาง่ สถิติ (P<0.05) ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

175.00

150.00

ชุดการทดลองทีT 1 125.00 ชุดการทดลองทีT 2

100.00 ชุดการทดลองทีT 3

ชุดการทดลองทีT 4 75.00 Antibodytitervalue

50.00

25.00

0.00 011 22 33 44 55 66 7 8weeks7

ภาพทีM 12 คาเฉลีTย่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลอง่

ผลการตอบสนองของปลานิลทีTได้รับวัคซีน แบงออกเป็น่ การตอบสนองในช่วงการให้ วัคซีนครัNงแรก (primary response) พบวาค่ าเฉลีTย่ Antibody titer ของทุกชุดการทดลองอยูในช่ ่วง 3.80±0.63-8.80±6.20 โดยชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT ระดับ 2 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม มีการตอบสนองต่อวัคซีนครัNงแรกสูงทีTสุด คือ 8.80±6.20 ใน สัปดาห์ทีT 2 หลังการให้วัคซีน และมีคาสูงกว่ าการตอบสนองต่ ่อวัคซีนของชุดการทดลองทีTได้รับ การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม อยางมี่ นัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) คือ 3.80±0.63 ซึTงมีการตอบสนองสูงสุดในสัปดาห์แรกหลังการให้ วัคซีน แตไม่ พบความแตกต่ างทางสติถิ่ (P>0.05) กบชุดควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมั แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ต่อ อาหาร 1 กิโลกรัม ทีTมีคา่ 6.40±2.07 และ 5.50±2.80 ตามลําดับ และมีการตอบสนองสูงสุดในสัปดาห์แรกหลังการให้วัคซีนเช่นเดียวกนั สําหรับการตอบสนองของปลานิลหลังการฉีดวัคซีนกระตุ้นครัNงทีT 2 (secondary response) มีคาเฉลีTย่ Antibody titer ของทุกชุดการทดลองอยูในช่ ่วง 15.20±7.00-166.40±61.83 ซึTงชุดการทดลองทีTได้รับ การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม มีการ ตอบสนองต่อวัคซีนครัNงทีT 2 สูงทีTสุด คือ 166.40±61.83 ในสัปดาห์ทีT 1 หลังการให้วัคซีนครัNงทีT 2 (สัปดาห์ทีT 4) และมีคาสูงกว่ าชุดควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซค-่ คาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัมและ 4 กรัม ต่อ อาหาร 1 กิโลกรัม ทีTมีการตอบสนองในสัปดาห์ทีT 2

หลังจากการให้วัคซีน (สัปดาห์ทีT 5) อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P>0.05) คือ 15.60±9.70, 15.20±7.00 และ 22.40±8.26 ดังแสดงในตารางทีT 11 และภาพทีT 13

ตารางทีM 11 คาเฉลีTยสูงสุดของ่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลองหลังได้รับวัคซีน่ ทัNง 2 ครัNง

ชุดการทดลอง คาเฉลีTยสูงสุดของ่ Antibody titer Primary response Week Secondary response Week ชุดการทดลองทีT 1 6.40±2.07 ab 1 15.60±9.70 a 5 ชุดการทดลองทีT 2 8.80±6.20b 2 15.20±7.00 a 5 ชุดการทดลองทีT 3 5.50±2.80 ab 1 22.40±8.26 a 5 ชุดการทดลองทีT 4 3.80±0.63 a 1 166.40±61.83b 4

หมายเหตุ คาเฉลีTยก่ ากํ บด้วยอักษรทีTตั างก่ นในตัั Nง มีความแตกตางก่ นอยั างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

250.00 b 225.00 200.00 175.00 150.00 125.00 100.00 Antibodytitervalue 75.00 50.00 a a b a 25.00 ab ab a 0.00 primary response secondary response ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 13 คาเฉลีTยสูงสุดของ่ Antibody titer เปรียบเทียบระหวางชุดการทดลองหลังได้รับวัคซีนทั่ Nง 2 ครัNง

เมืTอเลีNยงปลานิลด้วยอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ทีTระดับความเข้มข้นทีTกาหนดํ เมืTอครบ 30 วัน และเลีNยงปลานิลตอเป็นระยะเวลา่ 20 วัน โดยให้อาหารปกติทุกชุดการทดลอง เช่นเดียวกบชุดควบคุมั ทําการสุ่มปลานิลทุก ๆ10 วัน เพืTอศึกษาระดับภูมิคุ้มกนของปลานิลตลอดั การทดลอง ผลการศึกษาระดับภูมิคุ้มกนมีดังนีั N

2.2.1 ปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม (Total red blood cells)

คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดแดงรวมของปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมน-่ แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นระยะเวลา 10 วัน มีคาสูง่ กวาปลานิลในชุดควบคุมและชุดการทดลองอืTน่ ๆ คือ 27.10±16.81 x 108 cells/ml แตไม่ แสดงความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) ระหวางชุดควบคุมและชุดทดลอง่ เมืTอพิจารณาในวันทีT 20 ของการ

ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร พบวาปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริม่ แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัมและ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTย่ ปริมาณเม็ดเลือดแดงรวมเป็น 23.67±6.79 x 108 cells/ml และ 24.33±4.37 x 108 cells/ml ตามลําดับ ซึTงสูงกวาชุดควบคุมทีTมีค่ าเฉลีTยเท่ าก่ บั 21.43±8.43 x 108 cells/ml แตไม่ แสดงความแตกต่ างทาง่ สถิติ (P>0.05) ในขณะทีTคาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดแดงรวมของปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการ่ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาน้อยทีTสุด่ คือ 17.31±5.87 x 108 cells/ml และมีความแตกตางอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) เมืTอเปรียบเทียบ กบระดับอืTนั ๆ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) กบชุดควบคุมั ส่วนคาเฉลีTยปริมาณเม็ด่ เลือดแดงรวมของปลานิลทีT 30 วัน พบวาปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาสูงกว่ าปลานิลในชุดควบคุมและชุด่ การทดลองอืTน ๆ คือ 27.75±4.91 x 108 cells/ml แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) ระหวางชุดควบคุมและชุดทดลองอืTน่ หลังจากหยุดให้อาหารทดลองเป็นระยะเวลา 10 วัน พบวา่ คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดแดงรวมของปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซค-่ คาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคาตํTากว่ าปลานิลในชุดควบคุมและชุดการ่ ทดลองอืTน ๆ คือ 16.05±2.65 x 108 cells/ml โดยพบความแตกตางอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารั ทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ทีTมีคาเป็น่ 21.18±4.37 x 108 cells/ml ซึTงเป็นชุดการทดลองทีTมี คาสูงสุดในช่ ่วงเวลานัNน แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั และชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ทีTมีคาเฉลีTยเป็น่ 19.44±3.62 x 108 cells/ml และ 18.09±5.68 x 108 cells/ml ตามลําดับ แต่ เมืTอพิจารณาในวันทีT 20 ของการหยุดให้อาหารทดลอง พบวาปลานิลทีTเคยได้รับการเสริมแมนแนน-่ โอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกชุดการทดลองมีคาเฉลีTยของปริมาณเม็ดเลือดแดงรวมใกล้เคียงก่ นั และสูงกวาชุดควบคุม่ แตไม่ ่แสดงความแตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) (ตารางทีT 12 และภาพทีT 14)

ตารางทีM 12 คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม่ (Total red blood cells) ของปลานิลทีTได้รับอาหาร เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ ( x 108 cells/ml)

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 20.37±6.99a 17.50±7.51 a 27.10±16.81 a 19.76±4.31 a 20 วัน 21.43±8.43 ab 17.31±5.87 a 23.67±6.79 b 24.33±4.37 b 30 วัน 21.13±7.64 a 23.00±7.93 a 22.40±3.88 a 27.75±4.91 a หยุดให้ 10 วัน 19.44±3.62 ab 21.18±4.37 b 16.05±2.65 a 18.09±5.68 ab หยุดให้ 20 วัน 18.41±2.46 a 19.45±5.27 a 19.83±4.29 a 20.00±2.62 a

Total red blood cells (cells/ml) 5000000000 a 4000000000 ab b a a 3000000000 a a b a a b a a a a ab ab a a 2000000000 a 1000000000 0 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 14 คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม่ (Total red blood cells) ของปลานิลทีTได้รับอาหาร เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ

2.2.2 คา่ Hematocrit

คา่ Hematocrit เฉลีTยของปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ทีTระยะเวลา 10 และ 20 วัน มีคาสูงกว่ า่ ปลานิลในชุดควบคุมและชุดการทดลองอืTน ๆ โดยมีคา่ 19.500±8.546 และ 22.080±6.042 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับแตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั และชุดทดลองอืTน ๆ ส่วนคา่ Hematocrit เฉลีTยของปลานิลทีT 30 วัน พบวาปลานิลชุดการทดลองทีT่ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคาสูง่ กวาปลานิลในชุดควบคุมและชุดการทดลองอืTน่ ๆ คือ 16.950±5.710 เปอร์เซ็นต์ แตไม่ แสดงความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั ๆ หลังจากหยุดให้ อาหารทดลองเป็นระยะเวลา 10 วัน พบวาปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเป็น16.470±4.679่ เปอร์เซ็นต์ ซึTงสูง กวาปลานิลในชุดควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร่ ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ทีTมีคาเป็น่ 15.030±5.666 และ 12.900±6.502 เปอร์เซ็นต์ แต่ ไมแสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) ในขณะทีTแสดงความแตกตางอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) เมืTอ เปรียบเทียบกบปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ั ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคาเป็น11.160±3.472่ เปอร์เซ็นต์ ซึTงน้อยกวา่

ปลานิลในชุดควบคุมและชุดการทดลองอืTน ๆ แต่เมืTอพิจารณาในวันทีT 20 ของการหยุดให้อาหาร ทดลอง พบวาปลานิลทีTเคยได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกชุดการทดลองมี่ คา่ Hematocrit เฉลีTยใกล้เคียงกนและสูงกวั าชุดควบคุม่ โดยปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคาสูงสุด่ คือ 15.270±5.251 เปอร์เซ็นต์ แต่ไมพบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั และชุดทดลองอืTน ๆ (ตารางทีT 13 และภาพทีT 15)

ตารางทีM 13 คา่ Hematocrit เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตาม ระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (เปอร์เซ็นต์)

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 14.633±4.743a 13.133±5.817 a 19.500±8.546 a 17.100±6.380 a 20 วัน 19.200±10.053 a 16.080±7.447 a 22.080±6.042 a 18.120±5.248 a 30 วัน 15.330±8.260 a 15.390±8.610 a 15.650±4.840 a 16.950±5.710 a หยุดให้ 10 วัน 15.030±5.666 ab 16.470±4.679 b 11.160±3.472 a 12.900±6.502 ab หยุดให้ 20 วัน 13.013±5.136 a 13.980±5.896 a 14.400±5.177 a 15.270±5.251 a

35.000 30.000 a a a a a a a a 25.000 a a ab b a a a ab a a a 20.000 a 15.000 10.000

Hematocrit(Percent) 5.000 0.000 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 15 คา่ Hematocrit เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตาม ระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (เปอร์เซ็นต์)

2.2.3 คา่ Hemoglobin

คา่ Hemoglobin เฉลีTยของปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ทีTระยะเวลา 10 วัน มีคาสูงกว่ าปลานิลใน่ ชุดควบคุมและชุดการทดลองอืTน ๆ เพียงเล็กน้อย คือ 6.267±2.998 g/dL แตไม่ แสดงความแตกต่ าง่ ทางสถิติ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั ๆ ส่วนคา่ Hemoglobin เฉลีTย ของปลานิลทีT 20 วัน และ 30 วัน พบวาปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาสูงกว่ าปลานิลในชุดควบคุมและชุด่ การทดลองอืTน ๆ คือ 8.490±2.055 และ 8.610±1.880 g/dL ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทาง่ สถิติ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั ๆ และเมืTอพิจารณาในวันทีT 10 และ 20 ของการหยุดให้อาหารทดลอง พบวาปลานิลทีTเคยได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน่ อาหารมีคา่ Hemoglobin เฉลีTยลดลงเกือบทุกชุดการทดลองและใกล้เคียงกนั และไมแสดงความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั ๆ (ตารางทีT 14 และ ภาพทีT 16)

ตารางทีM 14 คา่ Hemoglobin เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตาม ระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (g/dL)

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 6.267±2.875 6.267±2.998 6.000±1.885 6.257±1.753 20 วัน 7.200±3.575 6.060±2.399 7.560±2.087 8.490±2.055 30 วัน 6.230±2.330 6.360±3.170 6.540±2.420 8.610±1.880 หยุดให้ 10 วัน 6.000±1.241 6.510±1.371 5.100±1.327 6.030±2.211 หยุดให้ 20 วัน 5.138±0.870 5.200±1.324 5.610±0.917 5.730±1.253

หมายเหตุ ไมพบความแตกต่ ่างกนทางสถิติั (P>0.05) ของคาเฉลีTยในแนวนอน่ ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

12.000 a a a a 10.000 a a a a a aa a a a 8.000 a a a a aa 6.000 4.000

Hemoglobin(g/dL) 2.000 0.000 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 16 คา่ Hemoglobin เฉลีTยของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตาม ระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (g/dL)

2.2.4 ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด (Peripheral blood leukocytes)

คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือดของปลานิลชุดควบคุม่ ทีTระยะเวลา 10 วัน มีคาสูงกว่ าปลานิลในชุดการทดลองอืTน่ ๆ คือ 30.13±12.22 x 107 cells/ml แตไม่ แสดงความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) กบทุกชุดทดลองั เมืTอพิจารณาในวันทีT 20 ของการได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร พบวาปลานิลชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแส่ เลือดเป็น 33.76±8.30 x 107 cells/ml ซึTงสูงกวาชุดการทดลองอืTน่ และแสดงความแตกต่างทางสถิติ อยางมีนัยสําคัญ่ (P<0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั และยังคงมีปริมาณสูงทีTสุดเมืTอเข้าสู่วันทีT 30 ของการกินอาหารทดลอง โดยมีคาเป็น่ 39.83±8.58 x 107 cells/ml แตไม่ แสดงความแตกต่ าง่ ทางสถิติ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั หลังจากหยุดให้อาหารทดลอง เป็นระยะเวลา 10 วันและ 20 วัน พบวาค่ าเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือดของปลานิลชุด่ ควบคุมและชุดการทดลองทีTเคยได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกระดับ มี ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือดลดลง และไมแสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอ เปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั (ตารางทีT 15 และภาพทีT 17)

ตารางทีM 15 คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด่ (Peripheral blood leukocytes) ของ ปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีT กาหนดํ ( x 107 cells/ml)

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 30.13±12.22 a 26.74±13.05 a 26.40±10.42 a 28.72±9.22 a 20 วัน 22.42±10.33a 24.55±10.27 ab 30.77±11.29 ab 33.76±8.30 b 30 วัน 31.87±7.64 a 32.01±12.52 a 33.41±10.06 a 39.83±8.58 a หยุดให้ 10 วัน 25.72±5.54 a 28.40±7.08 a 23.51±4.34 a 23.10±9.25 a หยุดให้ 20 วัน 24.60±5.07 a 25.10±8.70 a 24.61±8.02 a 25.09±6.33 a

Peripheral blood leukocytes (cells/ml) a 500000000 a a ab b a a a a 400000000 a ab a a a a a a a 300000000 a a 200000000 100000000 0 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 17 คาเฉลีTยปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด่ (Peripheral blood leukocytes) ของปลานิล ทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ ( x 107 cells/ml)

2.2.5 กิจกรรมการจับกินสิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาว (Phagocytic activity)

คาเฉลีTย่ percent phagocytosis ของปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์ในอาหารทุกชุดการทดลอง ทีTระยะเวลา 10, 20 และ 30 วัน มีคาสูงกว่ าชุดควบคุม่ โดยชุดการ ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTย่ percent phagocytosis สูงทีTสุดคือ 14.74±16.26, 18.54±15.64 และ 37.40±31.65 ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดั ทดลองอืTน หลังจากหยุดให้อาหารทดลองเป็นระยะเวลา 10 วันและ 20 วัน พบวาค่ าเฉลีTย่ percent phagocytosis มีคาน้อยกว่ าช่ ่วงทีTได้รับอาหารทดลอง โดยทีTชุดการทดลองทีTเคยได้รับการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุกชุดการทดลองมีคาสูงกว่ าชุดควบคุม่ โดยชุดการทดลองทีT เคยได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มี คาเฉลีTย่ percent phagocytosis สูงทีTสุดคือ 20.66±13.36 และ 21.50±13.40 ตามลําดับ แตไม่ แสดง่ ความแตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั (ตารางทีT 16 และ ภาพทีT 18)

ตารางทีM 16 คาเฉลีTย่ percent phagocytosis ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 9.62±11.87 13.92±9.11 11.07±15.30 14.74±16.26 20 วัน 14.92±11.97 17.44±9.48 16.39±13.71 18.54±15.64 30 วัน 33.55±28.90 34.90±20.10 36.70±20.60 37.40±31.65 หยุดให้ 10 วัน 17.35±2.98 19.90±7.26 20.21±17.39 20.66±13.36 หยุดให้ 20 วัน 14.90±3.35 18.45±7.26 18.20±14.35 21.50±13.40

80 a 70 a 60 a a 50 40 a a a a a a a a a a a 30 a a a a 20 a Percentphagocytosis 10 0 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 18 คาเฉลีTย่ percent phagocytosis ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ

2.2.6 ดัชนีกิจกรรมการจับกินสิTงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาว (Phagocytic index)

คา่ เฉลีTย phagocytic index ของปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ในอาหารทุกชุดการทดลองทีTระยะเวลา 10, 20 และ 30 วัน มีคาสูงกว่ าชุดควบคุม่ โดยชุดการ ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTย่ phagocytic index สูงทีTสุดคือ 4.83±5.61, 5.31±4.61 และ 33.30±28.49 ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั หลังจากหยุดให้อาหารทดลองเป็นระยะเวลา 10 วันและ 20 วัน พบวาค่ าเฉลีTย่ phagocytic index มี คาน้อยกว่ าช่ ่วงทีTได้รับอาหารทดลอง โดยทีTชุดการทดลองทีTเคยได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ในอาหารทุกชุดการทดลองมีคาสูงกว่ าชุดควบคุม่ โดยชุดการทดลองทีTเคยได้รับการ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTย่ phagocytic index สูงทีTสุดคือ 6.00±4.01 และ 7.46±4.76 ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทาง่ สถิติ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั (ตารางทีT 17 และภาพทีT 19)

ตารางทีM 17 คาเฉลีTย่ phagocytic index ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 1.31±1.72 2.93±2.05 3.30±4.59 4.83±5.61 20 วัน 2.52±2.16 4.25±2.37 4.08±3.49 5.31±4.61 30 วัน 23.10±20.23 27.20±16.08 31.50±18.03 33.30±28.49 หยุดให้ 10 วัน 3.40±0.60 4.37±1.67 5.20±4.52 6.00±4.01 หยุดให้ 20 วัน 2.66±0.64 3.60±1.45 3.87±3.09 7.46±4.76

50.00 a a 40.00 a a 30.00 a a a a a a a a a a a a 20.00 a a a a

Phagocyticindex 10.00 0.00 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 19 คาเฉลีTย่ phagocytic index ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ

- 2.2.7 ปริมาณ Superoxide anion (O2 )

คาเฉลีTย่ Superoxide anion (O.D.) ของปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ในอาหารทุกชุดการทดลอง ทีTระยะเวลา 10, 20 และ 30 วัน มีคาสูงกว่ าชุดควบคุม่ โดยชุด การทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTย่ superoxide anion สูงทีTสุดคือ 0.295±0.325, 0.371±0.313 และ 0.748±0.633 ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดั ทดลองอืTน หลังจากหยุดให้อาหารทดลองเป็นระยะเวลา 10 วันและ 20 วัน พบวาค่ าเฉลีTย่ superoxide anion มีคาลดลง่ โดยทีTชุดการทดลองทีTเคยได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ในอาหารทุกชุดการทดลองมีคาสูงกว่ าชุดควบคุม่ โดยชุดการทดลองทีTเคยได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTย่ superoxide anion สูงทีTสุดคือ 0.413±0.267 และ 0.430±0.268 ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดทดลองอืTนั (ตารางทีT 18 และภาพทีT 20)

ตารางทีM 18 คาเฉลีTย่ superoxide anion ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (O.D.)

ระยะเวลา ชุดการทดลอง ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4 10 วัน 0.192±0.237 0.278±0.182 0.221±0.306 0.295±0.325 20 วัน 0.298±0.239 0.349±0.190 0.328±0.274 0.371±0.313 30 วัน 0.671±0.578 0.698±0.402 0.734±0.412 0.748±0.633 หยุดให้ 10 วัน 0.347±0.060 0.398±0.145 0.404±0.348 0.413±0.267 หยุดให้ 20 วัน 0.298±0.067 0.369±0.145 0.364±0.287 0.430±0.268

a 1.500 a a a 1.000 a a a a a a a a a a a a a 0.500 a a a

Superoxide(O.D.) anion 0.000 หยุดให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 10 วัน 20 วัน 30 วัน 40 วัน 50 วัน ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 20 คาเฉลีTย่ superoxide anion ของปลานิลทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา- ไรด์ตามระดับและระยะเวลาทีTกาหนดํ (O.D.)

จากการศึกษาการแสดงออกของยีน Interleukin 1 β, Interleukin 8, Transforming growth factor β 1 และ Tumor necrosis factor α จากไตส่วนหน้า (Head kidney) และม้าม (Spleen) ของ ปลานิลจากทุกชุดการทดลอง โดยใช้เทคนิค RT-PCR ซึTงใช้ Gene specific primers ได้แก่ IL-1b-F/IL-1b-R, On-IL8 F/On-IL8 R, TGF-βF/TGF-βR และ TNF-αF/TNF-αR เป็น Forward และ Reverse primers ตามลําดับ (ตารางทีT 1) ผลปรากฏวาเก่ ิด Band ของ PCR product จากไตส่วน หน้าและม้าม ขนาด 339 bp เมืTอใช้ Primer คูทีT่ 1 (ภาพทีT 21A และ 21B) และ 256 bp เมืTอใช้ Primer คูทีT่ 2 (ภาพทีT 22A และ 22B) และ 359 bp เมืTอใช้ Primer คูทีT่ 3 (ภาพทีT 23A และ 23B) และ 499 bp เมืTอใช้ Primer คูทีT่ 4 (ภาพทีT 24A และ 24B) ตามลําดับ สําหรับยีน ß-actin จากไตส่วนหน้าและม้าม ซึTงเป็น House keeping gene ทีTใช้เป็น Internal control พบวาเก่ ิด Band ของ PCR product ขนาด 592 bp ดังแสดงในภาพทีT 25A และ 25B ตามลําดับ

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

300 bp (A) 339 bp 200 bp

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 300 bp (B) 339 bp 200 bp

ภาพทีM 21 การแสดงออกของยีน Interleukin 1 β จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิลจาก ทุกชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 4 ซํNา โดยใช้เทคนิค RT-PCR โดย A) และ B) คือ PCR product ขนาด 339 bp ของยีน Interleukin 1 β ของไตส่วนหน้าและม้าม ตามลําดับ (M; Marker) T1 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) T2 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T3 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T4 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

T1 T2 T3 T4

300 bp M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 (A) 256 bp 200 bp

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 300 bp (B) 200 bp 256 bp

ภาพทีM 22 การแสดงออกของยีน Interleukin 8 จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิลจาก ทุกชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 4 ซํNา โดยใช้เทคนิค RT-PCR โดย A) และ B) คือ PCR product ขนาด 256 bp ของยีน Interleukin 8 ของไตส่วนหน้าและม้าม ตามลําดับ (M; Marker) T1 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) T2 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T3 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T4 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 (A) 400 bp 300 bp 359 bp

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 (B) 400 bp 300 bp 359 bp

ภาพทีM 23 การแสดงออกของยีน Transforming growth factor β 1 จากไตส่วนหน้าและม้ามของ ปลานิลจากทุกชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 4 ซํNา โดยใช้เทคนิค RT-PCR โดย A) และ B) คือ PCR product ขนาด 359 bp ของยีน Transforming growth factor β 1 ของ ไตส่วนหน้าและม้าม ตามลําดับ (M; Marker) T1 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) T2 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T3 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T4 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 500 bp (A) 499 bp 4 00 bp T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 500 bp (B) 499 bp 4 00 bp

ภาพทีM 24 การแสดงออกของยีน Tumor necrosis factor α จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิลจาก ทุกชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 4 ซํNา โดยใช้เทคนิค RT-PCR โดย A) และ B) คือ PCR product ขนาด 499 bp ของยีน Tumor necrosis factor α ของไตส่วนหน้าและม้าม ตามลําดับ (M; Marker) T1 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) T2 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T3 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T4 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 600 bp (A) 500 bp 592 bp

T1 T2 T3 T4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 600 bp (B) 500 bp 592 bp

ภาพทีM 25 การแสดงออกของยีน β-actin จากไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิลจาก ทุกชุดการทดลอง ชุดการทดลองละ 4 ซํNา โดยใช้เทคนิค RT-PCR โดย A) และ B) คือ PCR product ขนาด 592 bp ของยีน β-actin ของไตส่วนหน้าและม้าม ตามลําดับ ซึTงใช้เป็น Internal control (M; Marker) T1 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) T2 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T3 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม T4 = ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

จากนัNนนําข้อมูลทีTได้มาวิเคราะห์ระดับการแสดงออกตามวิธีของ (Flach et al., 1998) โดย ใช้โปรแกรม SynGene Genetools version 3.08.01 ในการวิเคราะห์ ทําการ Normalize ระดับการ แสดงออกของยีนด้วยจํานวนของ β actin คาทีTได้ออกมาคือ่ relative fluorescence units/rfU (%) ดังนีN 1.1 Interleukin 1 β

การแสดงออกของยีน Interleukin 1 β ทีTไตส่วนหน้าของปลานิลชุดควบคุมมีการ แสดงออกสูงสุดคือ 25.11±10.56 เปอร์เซ็นต์ เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมั แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาเป็น่ 19.45±7.83, 16.49±9.01 และ 19.77±6.77 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่

(P>0.05) ในขณะทีTการแสดงออกของยีน Interleukin 1 β ทีTม้าม พบวาชุดการทดลองทีTได้รับการ่ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีการแสดงออก สูงสุดคือ 4.40±1.89 เปอร์เซ็นต์ รองลงมาคือชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม และ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาเป็น่ 3.26±4.94 และ 3.21±1.32 เปอร์เซ็นต์ และชุดควบคุมซึTงมีคาการแสดงออกตํTาทีTสุด่ คือ 1.62±0.77 เปอร์เซ็นต์ แตไม่ พบว่ ามีความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) ดังภาพทีT 26

40.00% a 30.00% a a a 20.00% rfU (%) rfU 10.00% a a a a 0.00% ไตส่วนหน้า ม้าม ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 26 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Interleukin 1 β ในปลานิลทีTได้รับอาหาร เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั

หมายเหตุ ไมพบความแตกต่ ่างกนทางสถิติั (P>0.05) ของการแสดงออกของยีน Interleukin 1 β ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

1.2 Interleukin 8

การแสดงออกของยีน Interleukin 8 ทีTไตส่วนหน้าของปลานิลชุดควบคุมมีการ แสดงออกสูงสุดคือ 30.84±6.95 เปอร์เซ็นต์ ซึTงพบวาการแสดงออกนั่ Nนมีความแตกตางอย่ างมี่ นัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-ั แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม และ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาเป็น่ 19.79±8.49 และ 14.20±2.46เปอร์เซ็นต์ แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองั ทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ซึTงมีคา่ เป็น 21.47±14.62 เปอร์เซ็นต์ ในขณะทีTการแสดงออกของยีน Interleukin 8 ทีTม้าม พบวาชุดการ่ ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีการแสดงออกน้อยทีTสุด คือ 23.55±8.91 เปอร์เซ็นต์ และมีความแตกตางทางสถิติ่ (P<0.05) เมืTอ เปรียบเทียบกบชุดควบคุมั ซึTงมีการแสดงออกสูงสุดคือ 37.71±11.88 เปอร์เซ็นต์ แตไม่ พบความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-ั แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาเป็น่ 25.47±5.94 และ 35.74±4.16 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ ดังภาพทีT 27

60.00% 50.00% b c ab 40.00% bc a ab 30.00% ab rfU(%) 20.00% a 10.00% 0.00% ไตส่วนหน้า ม้าม ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 27 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Interleukin 8 ในปลานิลทีTได้รับอาหารเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั

หมายเหตุ คาเฉลีTยทีTมีอักษรก่ ากํ บตั างก่ นมีความแตกตั างอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

1.3 Transforming growth factor β 1

การแสดงออกของยีน Transforming growth factor β 1 ทีTไตส่วนหน้าของปลานิลชุด ควบคุมมีการแสดงออกสูงสุดคือ 9.91±4.09 เปอร์เซ็นต์ เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับั การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ซึTงมี คาเป็น่ 6.60±3.41, 8.65±5.19 และ 3.69±3.73 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทาง่ สถิติ (P>0.05) ในขณะทีTการแสดงออกของยีน Transforming growth factor β 1 ทีTม้าม พบวาชุด่ การทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีการแสดงออกน้อยทีTสุดคือ 4.61±4.24 เปอร์เซ็นต์ แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่

(P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั ซึTงมีการแสดงออกเทาก่ บั 10.89±1.54 เปอร์เซ็นต์ สําหรับ ชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีการแสดงออกมากกวาชุดควบคุม่ แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) คือ 13.69±1.27 เปอร์เซ็นต์ ในขณะทีTชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน อาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีการแสดงออกสูงทีTสุด (P<0.05) คือ 18.45±5.88 เปอร์เซ็นต์ และมีความแตกต่างทางสถิติเมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับั การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (P<0.05) แต่ ไมพบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมน-ั แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม (ภาพทีT 28)

30.00% c 25.00% 20.00% a bc 15.00% a ab a rfU(%) 10.00% a a 5.00% 0.00% ไตส่วนหน้า ม้าม ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 28 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Transforming growth factor β 1 ในปลานิล ทีTได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั

1.4 Tumor necrosis factor α

การแสดงออกของยีน Tumor necrosis factor α ทีTไตส่วนหน้าของปลานิลชุดควบคุมมี การแสดงออกน้อยทีTสุดคือ 0.75±0.27 เปอร์เซ็นต์ เมืTอเปรียบเทียบกบชุดการทดลองทีTได้รับการั เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาเป็น่ 1.36±1.26 และ 1.31±1.93 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ ในขณะทีTชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีการแสดงออกสูงทีTสุด คือ 2.02±0.94 เปอร์เซ็นต์ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) ในขณะทีTการแสดงออกของยีน Tumor necrosis factor α ทีTม้าม พบวาชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์่ ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีการแสดงออกสูงสุดคือ 6.77±3.24 เปอร์เซ็นต์ รองลงมาคือชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ซึTงมีคาเป็น่ 4.07±0.68 และ 3.44±2.37 เปอร์เซ็นต์ ตามลําดับ สําหรับชุดควบคุมพบวามีค่ าการแสดงออกน้อยทีTสุดคือ่ 3.38±0.68 เปอร์เซ็นต์ แตไม่ พบว่ ามีความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) ดังภาพทีT 29

12.50% a 10.00% 7.50% a a a

rfU (%) 5.00% a a a 2.50% a 0.00% ไตส่วนหน้า ม้าม ชุดการทดลองทีT 1 ชุดการทดลองทีT 2 ชุดการทดลองทีT 3 ชุดการทดลองทีT 4

ภาพทีM 29 คาเฉลีTย่ relative fluorescence units ของยีน Tumor necrosis factor α ในปลานิลทีTได้รับ อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นั

หมายเหตุ ไมพบความแตกต่ ่างกนทางสถิติั (P>0.05) ของการแสดงออกของยีน Tumor necrosis factor α ชุดการทดลองทีT 1 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืช (ชุดควบคุม) ชุดการทดลองทีT 2 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 3 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ชุดการทดลองทีT 4 ปลานิลเลีNยงด้วยอาหารปลากินพืชผสมแมนแนนโอลิโกแซกคาไรด์ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม

วิจารณ์ผลการศึกษา

การศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการเจริญเติบโต อัตรารอด และความต้านทานต่อเชืcอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ของลกปลานิลู

จากการศึกษาครัNงนีNพบวาการให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลให้ลูกปลานิลแปลงเพศทีTอัตราปล่อย 100, 200 และ 300 ตัว ตอตู้มีค่ าเฉลีTยของนํ่ Nาหนักและความยาวมาตรฐานสูงกวาชุดควบคุมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) โดยทีTอัตราปล่อย 100 ตัวต่อตู้ ลูกปลาทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีT ระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคาเฉลีTยของนํ่ NาหนักและความยาวมาตรฐานตํTากวาลูกปลาทีT่ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัมและ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมอยางมี่ นัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) ด้วยเช่นกนั ในขณะทีTอัตราปล่อย 200 และ 300 ตัวตอตู้่ พบวาการให้่ อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมนัNนไมมีความแตกต่ าง่ ทางสถิติ (P>0.05) กบชุดควบคุมและชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTั ระดับ 4 กรัมและ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เมืTอพิจารณาถึงอัตราการเจริญเติบโตต่อวันของลูก ปลานิล พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัวต่อตู้ การให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัมและ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีผลให้คาเฉลีTยของอัตราการเจริญเติบโตต่ ่อวันของลูกปลา- นิลมีคาสูงกว่ าลูกปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมและชุดควบคุมอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ในขณะทีTอัตราปล่อย 200 และ 300 ตัว ตอตู้กลับไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) ระหวางชุดควบคุมและชุดทดลอง่ สําหรับอัตรา การเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอของลูกปลานิลจากชุดการทดลองทีTมีอัตราปล่อย 100 ตัวตอตู้่ พบวาการ่ ให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ส่งผลให้ มีคาเฉลีTยตํTากว่ าชุดควบคุม่ ตามลําดับ แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสติถิ่ (P>0.05) อาจเกิดจากมี อัตราการปล่อยทีTเบาบางทําให้ลูกปลามีการเจริญเติบโตได้อยางเต็มทีT่ และมีความแตกตางระหว่ าง่ ขนาดของลูกปลานิลคอนข้างน้อยในแต่ ละชุดการทดลองทีTได้รับแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน่ อาหารระดับทีTแตกตางก่ นั แตในชุดการทดลองทีTมีอัตราการปล่ ่อย 200 ตัวตอตู้่ ลูกปลานิลทีTได้รับ การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัมและ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีค า่ เฉลีTย ของอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอตํTากวาชุดควบคุมและชุดทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) สําหรับชุดการ ทดลองทีTมีอัตราการปล่อย 300 ตัวต่อตู้ พบวาลูกปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคา-่

ไรด์ทีTระดับ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม มีคา่ เฉลีTยของอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอตํTากวาชุด่ ควบคุม อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) และมีความแตกตางก่ นระหวั างขนาดของลูกปลานิลให้่ เห็นได้ในระหวางทําการทดลอง่ จากการศึกษาครัNงนีNแสดงให้เห็นวาการทีTปลาชุดการทดลองทีTมี่ อัตราปล่อยหนาแน่นขึNนต้องใช้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในปริมาณทีTมากขึNนถึงจะแสดงผลตอ่ การเจริญเติบโตและอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอนัNน เกิดจากการทีTอยูก่ นอยั างหนาแน่ ่นอาจ ส่งผลให้เกิดความเครียดทําให้มีอัตราการเจริญเติบโตได้ไมดีเท่ าอัตราปล่ ่อยทีTน้อยกวา่ จึงต้องเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับทีTสูงกวาเพืTอช่ ่วยให้มีความสามารถเสริมในเรืTองของการ เจริญเติบโตของลูกปลานิลได้ และนอกจากประสิทธิภาพของอาหารแล้วอัตราปล่อยในการอนุบาล ลูกปลานิลวัยแปลงเพศ รวมไปถึงปัจจัยอืTนทีTเกีTยวข้อง เช่น อุณหภูมิ ขนาดของลูกปลา หรือวิธีการ ให้อาหาร กมีผลต็ อการเจริญเติบโตของลูกปลานิลด้วยเช่ ่นเดียวกนั (Dambo and Rana, 2008; Aksungur et al., 2007)

จากผลการศึกษาครัNงนีNแสดงให้เห็นวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT่ ระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลต่อการเจริญเติบโต และอัตราการเปลีTยนอาหาร เป็นเนืNอ ซึTงสอดคล้องกบการศึกษาของั Rodriguez-Estrada et al. (2009) ในลูกปลา Rainbow trout ทีTพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม เป็นระยะเวลา 12 สัปดาห์ มีผลทําให้ลูกปลามีอัตราการเจริญเติบโตสูงกวาลูกปลาทีTไม่ ได้รับการเสริม่ จาก การศึกษาในปลา Rainbow trout (Yilmaz et al., 2007) และในปลานิลลูกผสม (Genc et al., 2007a) พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม นัNนสามารถเพิมT ระดับโปรตีนในร่างกายได้จึงทําให้มีนํNาหนักเพิมขึT Nนและมีอัตราการเจริญเติบโตดีกวาสัตว์ทดลองทีT่ ไมได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์่ ในขณะทีTการศึกษาของ Grisdale-Helland et al. (2008) พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 1 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นเวลา 16 สัปดาห์ สามารถเพิมอัตราการเจริญเติบโตของปลาT Salmon ได้ และการเสริมแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ทําให้มีนํNาหนักเพิมขึT Nน มีอัตราการตาย และอัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนืNอลดลงเมืTอสิNนสุดการทดลอง (Staykov et al., 2007) และมี รายงานในปลากะพง (Torrecillas et al., 2007) และกุงกุลาดํา้ (Genc et al., 2007b) ทีTได้รับการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 3 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบวามีการเจริญเติบโตทีTดีขึ่ Nน การทีTแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีบทบาทช่วยเสริมการเจริญเติบโตนัNนอาจเป็นไปได้วา่ การเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีส่วนช่วยให้ผนังลําไส้ส่วนต้นมีความสมบูรณ์มากขึNน ดังผลจาก การศึกษาในครัNงนีNซึTงพบวาลักษณะพยาธิสภาพของลําไส้ส่ ่วนต้นของลูกปลานิลทีTได้รับแมนแนน-

โอลิโกแซคคาร์ในระดับสูงขึNนทําให้มีพืNนทีTในการดูดซึมอาหารเพิมมากขึT Nน สอดคล้องกบรายงานั ของ Spring et al. (2000) และ Shane (2001) ซึTงพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน่ อาหารช่วยเสริมให้ผนังลําไส้มีความสมบูรณ์จึงมีพืNนทีTในการดูดซึมสารอาหาร เช่น กรดอะมิโนได้ มากขึNน (Torrecillas et al., 2007) ดังรายงานการศึกษาในไก่ (Lji et al., 2001) ทีTพบวาการเพิ่ มT ปริมาณของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทําให้มีการดูดซึมกรดอะมิโน L-tryptophan ได้ มากขึNนทัNงบริเวณลําไส้ส่วน Jejunal และ Ileal ซึTง L-tryptophan เป็นกรดอะมิโนทีTเกีTยวข้องกบการั หลังT Serotonin ออกมาเพืTอทําให้ร่างกายรู้สึกผอนคลายหรือหลับไปในทีTสุด่ ทําให้มีการใช้พลังงาน ในร่างกายลดลง และจากรายงานของ Torrecillas et al. (2010) พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ในอาหารทําให้มีการสะสมไขมันทีTตับของปลา European sea bass ลดลงเนืTองจากทําให้ การทํางานของเอนไซม์ acetyl-CoA carboxylase ทีTทําหน้าทีTเร่งปฏิกิริยาในการเปลีTยนกลูโคสให้ เป็นกรดไขมันนัNนลดลง (Santoso et al., 1995) ทําให้มีกลูโคสเป็นแหล่งพลังงานของกล้ามเนืNอและ การนําสารอาหารไปใช้ในร่างกายเพืTอการเจริญเติบโตได้ นอกจากนีNแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ยัง อาจมีส่วนเกีTยวข้องกบการทํางานของระบบประสาทของตั อมใต้สมองเก่ ีTยวกบความอยากอาหารซึTงั อาจส่งผลตอปริมาณความต้องการอาหาร่ (Torrecillas et al., 2010) แตการศึกษาเก่ ีTยวกบเรืTองนีั Nยัง ไมสามารถอธิบายถึงกลไกได้ชัดเจนจึงจําเป็นต้องมีการศึกษาต่ อไป่ ในขณะทีTการศึกษาผลของการ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับแตกตางก่ นในอาหารนัั Nนไมมีผลต่ อการเจริญเติบโตใน่ ปลา Sturgeon (Pryor et al., 2003) และในลูกปลาช่อนทะเล (Salze et al., 2008) ซึTงต้องใช้อาหารมี ชีวิตในการทดลอง คือ อาร์ทีเมีย โดยให้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์แก่อาร์ทีเมียก่อนทีTจะนําไปให้ อาหารลูกปลาอีกครัNง จึงอาจเกิดการสูญเสียแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ออกไปในขัNนตอนนีN การศึกษาของ Dimitroglou et al. (2010) ในปลา Sea bream ทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ทีTระดับ 2 กรัม และ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นระยะเวลา 9 สัปดาห์ กไม็ พบความ่ แตกตางทางสถิติ่ (P>0.05) ของอัตราการเจริญเติบโต การทีTแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ไม่ แสดงผลสอดคล้องกบในสิั TงมีชีวิตบางชนิดนัNน อาจเกิดจากความแตกตางก่ นของระดับทีTเหมาะสมั ในการใช้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในสิTงมีชีวิตตางชนิดก่ นั การออกแบบการทดลองทีTแตกตาง่ กนั หรือลักษณะทางกายภาพของสิTงมีชีวิตทีTตางก่ นั เช่น ความยาวของลําไส้ เป็นต้น จึงทําให้มีผล ตอการตอบสนองต่ ่อแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์แตกตางก่ นออกไปั

จากการศึกษาครัNงนีNพบวาอัตรารอดของลูกปลานิลจากชุดการทดลองทีTได้รับการเสริม่ แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีอัตรารอดสูงกวาชุดควมคุม่ โดยลูกปลานิลทีTได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารมีอัตรารอดสูงกวา่ 92% ขึNนไป แตไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติ่

(P>0.05) อาจเป็นเพราะการทดลองมีระยะเวลาสัNนและมีการควบคุมสภาพแวดล้อมให้ดีตลอดการ ทดลอง ประกอบกบการได้รับสารอาหารในปริมาณทีTเพียงพอทีTเกั ิดจากการเพิมพืT NนทีTในการดูดซึม อาหารของลําไส้ทําให้มีพลังงานเหลือเกบไว้ในรูปของไกลโคเจนทีTตับและกล้ามเนื็ NอซึTงมี ประโยชน์ต่อร่างกาย เมืTอพบกบสภาพแวดล้อมทีTเปลีTยนแปลงจะมีการดึงไกลโคเจนทีTสะสมนีั N ออกมาใช้เป็นพลังงานเพืTอให้ดํารงชีวิตต่อไปได้ (เมฆ, 2525) ในขณะทีTการศึกษาในกุงนํ้ Nาจืด (Sang and Fotedar, 2010) ทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นระยะเวลา 56 วัน พบวามีอัตรารอดสูงกว่ ากุ่ งทีTไม้ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ในอาหาร อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) จึงแสดงให้เห็นวาการทีTสัตว์นํ่ Nาได้รับการ เสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับเดียวกนแตั ในระยะเวลาทีTแตกต่ างก่ นั หรือในสัตว์นํNาตาง่ ชนิดกนกั ส็ ่งผลตอการเจริญเติบโต่ และอัตรารอดแตกตางก่ นออกไปั

ผลการศึกษาความต้านทานต่อเชืNอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ของลูกปลานิล โดย พิจารณาจากอัตราการตายของลูกปลานิลหลังได้รับเชืNอ S. agalactiae ทีTความเข้มข้น 108 CFU/ml พบวาทีTอัตราปล่ ่อย 100 ตัวต่อตู้ ลูกปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีอัตรารอดสูงกวาลูกปลานิลทีTไม่ ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิ-่ โกแซคคาไรด์ในอาหารอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ในขณะทีTอัตราปล่อย 200 และ 300 ตัว ตอตู้่ พบวาลูกปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 4 กรัมและ 6 กรัม ตอ่ อาหาร 1 กิโลกรัม มีอัตรารอดสูงกวาลูกปลานิลทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีT่ ระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม และลูกปลานิลทีTไมได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์่ ในอาหารอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) การทีTต้องใช้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับสูง กบชุดการทดลองทีTมีอัตราปลั ่อยหนาแน่นขึNนเพืTอช่วยเสริมความต้านทานโรคนัNน อาจเกิดจากการ ได้รับปริมาณแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารไมเพียงพอทีTจะช่ ่วยเพิมความต้านทานโรคและT เกิดจากความเครียดเนืTองจากมีอัตราปล่อยทีTหนาแน่น จึงทําให้ต้องเพิมระดับของแมนแนนโอลิโก-T แซคคาไรด์เพืTอให้เกิดความต้านทานต่อเชืNอแบคทีเรีย S. agalactiae ในลูกปลานิลทีTมีอัตราปล่อย เพิมมากขึT Nน การทดลองนีNได้ทําการทดสอบความต้านทานตอเชื่ Nอ S. agalactiae โดยวิธีการแช่ ซึTง เชืNอสามารถเข้าสู่ร่างกายทัNงในระบบทางเดินอาหารได้โดยตรงและระบบหมุนเวียนโลหิตผานทาง่ เหงือก ซึTงแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์อาจควบคุมปริมาณเชืNอในทางเดินอาหารได้โดยการไปจับ กบั Mannose-specific lectins ทีTผนังเซลล์ของแบคทีเรียซึTงเป็นส่วนทีTใช้ในการยึดเกาะกบผนังลําไส้ั (Mirelman and Ofek, 1986) ตามรายงานในแบคทีเรียชนิด Campylobacter jejuni (McSweegan and Walker, 1986) และ Aeromonas hydrophila (Merino et al., 1996) ทําให้เชืNอแบคทีเรียไมสามารถยึด่

เกาะกบผนังลําไส้ได้ั และถูกกาจัดโดยเซลล์ทีTทําหน้าในการกลืนกํ ินสิTงแปลกปลอมในร่างกายหรือ ทางระบบขับถ่าย (Perry and Ofek , 1984; Wright et al., 1989) เช่นจากการศึกษาผลของการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารต่อความต้านทานโรคในระบบทางเดินอาหารโดยวิธี oral inoculation ด้วยเชืNอ Salmonella typhimurium พบวาลูกไก่ ทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซค-่ คาไรด์ในอาหารมีปริมาณเชืNอ S. typhimurium ในลําไส้ส่วนต้นลดลง (Spring et al., 2000) และจาก การศึกษาของ Oyofo et al. (1989a) พบวาแมนโนสซึTงเป็นองค์ประกอบหลักในแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์นัNนสามารถลดการกระจายตัวของเชืNอ S. typhimurium ในลําไส้ของลูกไก่ได้ การศึกษา ถึงผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เกีTยวกบความต้านทานตั อเชื่ NอทีTเข้าสู่ระบบหมุนเวียนโลหิต พบวาแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ไปกระตุ้นกระบวนการทํางานของระบบ่ complement ใน รูปแบบของ lectin pathway โดยอาศัยโปรตีนชนิด Mannan binding lectin (MBL) ใน Serum ของ สิTงมีชีวิต โดย MBL จะจับกบบริเวณโครงสร้างทีTเป็นนํั Nาตาล คือ mannose (Turner, 2003) และเกิด การกระตุ้นจนได้ Mannan-binding lectin association proteinase 1 และจะเปลีTยนเป็น Mannan- binding lectin association proteinase 2 และจะกระตุ้นการทํางานตอ่ ๆ ไปจนได้เอนไซม์ทีTเรียกวา่ C3 convertase และมีการทํางานตอไปในลักษณะเดียวก่ นกั บการกระตุ้นระบบั complement แบบ classical pathway และทําลายเซลล์สิTงแปลกปลอมได้ในทีTสุด (Turner, 1996) สอดคล้องกบั การศึกษาในลูกไก่ (Elmusharaf et al., 2007) ทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 10 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม แล้วนํามาทดสอบความต้านทานตอโปรโตซัวในกลุ่ ่ม Eimeria spp. ทีT เป็นสาเหตุทําให้เกิดโรคบิดในสัตว์ปีก พบวาหลังจากทีTได้รับโปรโตซัวเข้าไปในร่ ่างกาย ลูกไก่ทีT ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารมีการกระจายตัวของไข่โปรโตซัวน้อยกวา่ ลูกไก่ชุดทีTไมได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) และ Torrecillas et al. (2007) พบวาไตส่ ่วนหน้าของปลากะพงทีTได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ 4 ‰ มีปริมาณเชืNอ V. alginolyticus ตํTากวา่ ปลากลุ่มทีTได้รับการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 2 ‰ และปลาทีTไมได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์อย่ าง่ มีนัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) จากการศึกษาข้างต้นสามารถอธิบายให้ทราบถึงการทํางานของแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการต้านทานเชืNอแบคทีเรียได้

การศึกษาครัNงนีNพบวาลักษณะทางพยาธิสภาพของลําไส้ส่ ่วนต้นของลูกปลานิลทีTได้รับ แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัมและ 6 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม เป็นเวลา 21 วัน มีการ พัฒนาพืNนทีTผิวในการดูดซึมอาหารและมี microvilli ทีTยาวและสมบูรณ์กวาลูกปลาทีTได้รับการเสริม่ แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมและชุดทีTไมได้รับการเสริมแมน-่

แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารอยางชัดเจน่ แม้วาลูกปลานิลทีTได้รับแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์่ ทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม จะพบวามีการฉีกขาดของผนังลําไส้อยู่ บ้างแต่ ก่ น้อยกว็ าลูก่ ปลาทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมและชุดทีT ไมได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร่ ในขณะทีTลูกปลานิลทีTได้รับแมนแนนโอ- ลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบการฉีกขาดของผนังลําไส้น้อยมาก จาก รายงานของ Dimitroglou et al. (2008) ได้ทําการศึกษาลักษณะพยาธิสภาพของลําไส้ในปลา Rainbow trout ทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ 2 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็น ระยะเวลา 8 สัปดาห์ พบวามีการพัฒนาของ่ microvilli เพิมมากขึT Nน และยาวกวาปลาทีTไม่ ได้รับการ่ เสริม จึงอาจเป็นไปได้วาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในระดับตํTา่ ๆ กสามารถเสริมให้ผนัง็ ลําไส้มีความสมบูรณ์ได้เช่นเดียวกนั เพียงแต่ต้องใช้ระยะเวลาทีTนานกวา่ เช่นจากรายงานของ Torrecillas et al. (2010) ในปลา sea bass ทีTได้รับแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2, 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม พบวาทีTระยะเวลา่ 60 วัน ปลาทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีจํานวน mucus cell ทีTอยูบริเวณผนังเซลล์ชั่ Nน mucosa ของลําไส้เพิมขึT Nนอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) เมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั และ เมืTอทําการศึกษาอีกครัNงทีTระยะเวลา 14 เดือนพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 2 กรัมและ 4 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม กเพียงพอต็ ่อการช่วยให้ผนังลําไส้มีความสมบูรณ์และมี จํานวน mucus cell เพิมขึT NนเมืTอเปรียบเทียบกบชุดควบคุมั (P<0.05) การทําหน้าทีTของ mucus cell คือ การสร้างและปล่อย mucin ออกมาเคลือบผนังลําไส้เพืTอปกป้องผนังลําไส้จากการเกาะตัวของสิTง แปลกปลอมตาง่ ๆ ด้วย (Torrecillas et al., 2010 Cited Sandberg et al., 2000) โดยปกติแล้วการ ฉีกขาดหรือการผลัดเซลล์บริเวณผนังลําไส้นัNนสามารถพบได้ทัวไปในสัตว์T และจะมีการสร้างเซลล์ ใหมขึ่ Nนมาทดแทน แตการทําลายจากเชื่ NอทีTไมเก่ ิดประโยชน์หรือเชืNอก่อโรคทีTเข้ามาในระบบ ทางเดินอาหารก็เป็นอีกปัจจัยหนึTงของความไมสมบูรณ์ภายในลําไส้่ จากรายงานของ Swanson et al. (2002) พบวาแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์จะเข้าจับก่ บผนังเซลล์ของเชืั NอแบคทีเรียตรงบริเวณทีT เป็น Lectins โดยอาศัยหลักการ Carbohydrate binding protein จึงทําให้โอกาสทีTแบคทีเรียจะจับกบั ผนังลําไส้ลดลง ซึTงโดยปกติแบคทีเรียจะจับกบผนังลําไส้โดยจะจับกั บโมเลกุลของนํั Nาตาลกลุ่มยอย่ ของ glycoconjugate receptor Type 1 (Oyofo et al., 1989b) จากข้อมูลนีNสอดคล้องกบข้อมูลทีTั กล่าวถึงบทบาทของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในการจํากดปริมาณเชืั Nอแบคทีเรียและผลตอความ่ ต้านทานตอเชื่ NอแบคทีเรียในสิTงมีชีวิตดังกล่าวข้างต้น จึงเป็นเหตุผลหนึTงทีTสามารถอธิบายได้ถึงผล ของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์วามีผลต่ ่อการเจริญเติบโตของสิTงมีชีวิตเนืTองจากมีพืNนทีT ในการดูดซึมอาหารได้มากขึNนนันเองT นอกจากนีNแล้วยังมีการศึกษาเกีTยวกบคุณสมบัติของแมน-ั

100

แนนโอลิโกแซคคาไรด์ซึTงไม่สามรถถูกยอยได้ในระบบทางเดินอาหารเพราะมีการยึดเกาะก่ นด้วยั พันธะทีTหลากหลายจึงต้องใช้เอนไซม์จําเพาะในการยอย่ (Jones and Ballou, 1969) และมีประโยชน์ ตอเจ้าบ้านโดยช่ ่วยเสริมในเรืTองการเจริญเติบโตและหรือมีผลดีตอเชื่ NอแบคทีเรียทีTมีประโยชน์ต่อเจ้า บ้าน (Gibson and Roberfroid, 1995) จึงจัดให้เป็นสารในกลุ่มพรีไบโอติก (Merrifield et al., 2010; Genc et al., 2007a; Sang et al., 2009)

สําหรับลักษณะทางพยาธิสภาพของตับทีTได้จากลูกปลานิลทีTในการศึกษาครัNงนีNพบวามีการ่ สะสมของไขมัน (Fat droplet) ในเซลล์ตับ (Hepatocyte) เพิมมากขึT NนเมืTอได้รับการเสริมแมนแนน- โอลิโกแซคคาไรด์เพิมมากขึT Nนเช่นเดียวกนั ทัNงนีNอาจเกิดจากการได้รับอาหารในปริมาณเกินความ ต้องการแล้วเกิดการสะสมในรูปของไขมันทีTตับ แตจากบางรายงานพบว่ าแมนแนนโอลิโกแซคคา-่ ไรด์มีผลทําให้การดูดซึมคลอเรสเตอรอลในหนูขนาด 50-75 กรัมลดลง 20% (Gallaher et al., 2000) และเพิมการหลัT งของนํT Nาดี (Jie and Shu-Sheng, 1997; Gallaher et al., 1999) จึงทําให้มีการสะสม ของไขมันในตับน้อยลง สอดคล้องกบผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTมีั โปรตีน 51.50% พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ่ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ในปลากะพงขนาดประมาณ 30 กรัม มีการสะสมของไขมันในตับน้อยลงเมืTอเปรียบเทียบกบชุดั ควบคุม (Torrecillas et al., 2007) และจากการศึกษาของ Torrecillas et al. (2010) ในปลา sea bass (Dicentrarchus labrax) ขนาดประมาณ 60 กรัม พบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน่ อาหารทีTมีปริมาณโปรตีน 48.71 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นเวลา 60 วัน ทําให้มีการสะสม ไขมันทีTตับลดลงเมืTอมีปริมาณแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารเพิมขึT Nน เนืTองจากทําให้การ ทํางานของเอนไซม์ acetyl-CoA carboxylase ทีTทําหน้าทีTเร่งปฏิกิริยาในการเปลีTยนกลูโคสให้เป็น กรดไขมันนัNนลดลง (Santoso et al., 1995) จากการศึกษาของ Dimitroglou et al. (2010) ทีT 9 สัปดาห์ของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTมีโปรตีน 44% พบวาปลา่ Gilthead sea bream ขนาด 24 กรัม ชุดการทดลองทีTได้รับแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีคา่ Hepatosomatic index ลดลงอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) การ ทีTผลการทดลองครัNงนีNแสดงความแตกตางก่ บการศึกษาข้างต้นเป็นไปได้วั าอาหารทีTนํามาทําการ่ ทดลองมีโปรตีนสูงถึง 40% จึงทําให้ได้รับสารอาหารอยางเต็มทีTประกอบก่ บลูกปลานิลทีTทําการั ทดลองนัNนเป็นปลาขนาดเล็กและมีอายุน้อยจึงจะนําสารอาหารไปใช้เป็นพลังงานในการ เจริญเติบโตเป็นหลัก และมีบางส่วนทีTเหลือและเกิดการสะสมในรูปไขมันบริเวณตับมากกวา่ การศึกษาอืTน ๆ ทีTสัตว์ทดลองอยูในช่ ่วงอายุทีTมากกวา่ และเป็นวัยทีTนอกจากจะนําสารอาหารไปใช้ เป็นพลังงานในเรืTองของการเจริญเติบโตและซ่อมแซมส่วนทีTสึกหรอแล้ว ยังต้องนําพลังงานมาใช้

101

ในเรืTองของระบบสืบพันธุ์อีกด้วย จึงทําให้จําเป็นต้องใช้ปริมาณสารอาหารสูงกวาและเก่ ิดการ สะสมในรูปของไขมันหรือแป้งในตับน้อยกวาปลาขนาดเล็ก่

การศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิค้มกันแบบจําเพาะเจาะจงุ ของปลานิล

ระบบภูมิคุ้มกนแบบจําเพาะเจาะจงในเชิงการสร้างั Antibody หลังจากได้รับวัคซีน S. agalactiae

การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกนแบบจําเพาะในเชิงการสร้างั Antibody นัNนการตรวจวัด คา่ Antibody titer ของการทดลองครัNงนีNพบวาหลังจากให้วัคซีนครั่ Nงแรกปลาชุดควบคุมและชุดการ ทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีการตอบสนองต่อวัคซีนเกิดขึNนเพียงเล็กน้อยและเริTมลดลงในสัปดาห์ถัดไปในขณะทีT ชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 2 กรัม ต่ออาหาร 1 กิโลกรัม ยังคงมีการตอบสนองเพิมขึT Nนเล็กน้อยอยูทีT่ 8.80±6.20 และลดลงเมืTอเข้าสู่สัปดาห์ทีT 3 เมืTอมี การให้วัคซีนครัNงทีT 2 ปลาชุดการทดลองทีTได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT ระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีการตอบสนองอยางรวดเร็วโดยเพียง่ 1 สัปดาห์หลังการให้ วัคซีนครัNงทีT 2 (สัปดาห์ทีT 4 ตัNงแตเริ่ Tมทดลอง) และสูงทีTสุดอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) คือ 166.40±61.83 ก่อนทีTจะลดลงในสัปดาห์ตอมาและมีค่ าใกล้เคียงก่ บการตอบสนองตั ่อวัคซีนครัNงทีT 2 ของชุดการทดลองอืTนทีTเริTมมีการตอบสนองสูงขึNนในสัปดาห์ทีT 5 (2 สัปดาห์หลังจากได้รับวัคซีน ครัNงทีT 2) และการตอบสนองตอวัคซีนของทุกชุดการทดลองจะลดลงเรืTอย่ ๆ ในสัปดาห์ถัดไป แสดง ให้เห็นวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผล ตอการตอบสนองทางภูมิคุ้มก่ นแบบจําเพาะเจาะจงในเชิงการสร้างั Antibody ในช่วง Secondary immune response ซึTงน่าจะเกิดจากแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีผลต่อปริมาณของ B lymphocyte ซึTงสามารถพัฒนาไปเป็น memory B cell ทีTมีบทบาทสําคัญต่อการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกนั ในช่วงนีN โดยเกิดจากแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์สามารถคงสภาพเดิมได้ในระบบทางเดินอาหาร เมืTอถูกดูดซึมเข้าสู่กระแสเลือดจะไปจับกบั mannose receptor ทีTอยูบนผนังเซลล์เม็ดเลือดขาว่ (Rodriguez et al., 2003) โดยอาศัยคุณสมบัติของการจดจําโครงสร้างตาง่ ๆ บนผิวสิTงแปลกปลอม ของเซลล์เม็ดเลือดขาว และเกิดกระบวนการ phagocytosis แล้วตกแตงโครงสร้างโดยเลือกเอา่ เฉพาะส่วนทีTมีคุณสมบัติดีทีTสุดในการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกนทีTเรียกวั า่ Antigenic determinant ไป

102

แสดงไว้ทีTผิวเซลล์ โดยอาศัย Major histocompatibility complex (MHC) class II เป็นสืTอกลางให้ T cell (Helper T cell) มาจดจํา ภายหลังจากทีT Helper T cell มาตรวจพบ Antigenic determinant ของ สิTงแปลกปลอมแล้ว จะปล่อย Cytokines (Whyte, 2007) ออกมาเพืTอกระตุ้นให้กลุ่มของเซลล์เม็ด เลือดขาวมีการแบงเซลล์อย่ างรวดเร็วและยังกระตุ้นให้เซลล์เม็ดเลือดขาวมีการตอบสนองได้อย่ างมี่ ประสิทธิภาพมากยิงขึT Nน ดังนัNนเมืTอปลานิลได้รับวัคซีนของเชืNอ S. agalactiae เข้าไปในร่างกาย จะมี การตอบสนองของเซลล์เม็ดเลือดขาวได้ไวเนืTองจากได้ถูกกระตุ้นให้มีปริมาณเพิมขึT Nนแล้วจาก ขัNนตอนข้างต้น นําไปสู่การตอบสนองตอระบบภูมิคุ้มก่ นแบบจําเพาะเจาะจงเมืTอได้รับวัคซีนั ระบบ ภูมิคุ้มกนจะกระตุ้นั lymphocyte ให้รับรู้และเพิมจํานวนพร้อมกT บสร้างั Antibody ซึTงจะอยูได้ระยะ่ หนึTงแล้วคอย่ ๆ ลดลง ในระหวางนี่ N B lymphocyte บางเซลล์จะพัฒนากลายเป็น memory B cell ทีT จดจําต่อ Antigen ชนิดนัNน ๆ ถ้าได้รับ Antigen ชนิดเดิมอีก กจะมีการตอบสนองได้มากและรวดเร็ว็ กวาในครั่ Nงแรก จากการศึกษาของ Swanson et al. (2002) ในสุนัขพบวาการได้รับแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์มีผลให้มีปริมาณของ IgA และเซลล์เม็ดเลือดขาวใน Serum มากขึNนทําให้มี B lymphocyte มากขึNน แตผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารต่ อการตอบสนอง่ ของวัคซีนในช่วง primary immune response จากการศึกษาครัNงนีNยังแสดงผลไมชัดเจน่ ในขณะทีT การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลตอการ่ ตอบสนองของวัคซีนในช่วง secondary immune response เทานั่ Nน

การศึกษาระดับทีMเหมาะสมของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิค้มกันแบบไมุ่ จําเพาะเจาะจงของปลานิล

ในการศึกษาครัNงนีNพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารมีผลต่ อระดับ่ ภูมิคุ้มกนแบบไมั จําเพาะเจาะจงของปลานิลเพียงเล็กน้อย่ โดยคาปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม่ คา่ Hematocrit คา่ Hemoglobin ในทุกชุดการทดลองทีTระยะเวลา 30 วันของการได้รับการเสริม แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารไมมีความแตกต่ างก่ นทางสถิติั และไมพบความแตกต่ างก่ นั ในทุกชุดการทดลองเมืTอหยุดการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTเวลา 10 และ 20 วัน สําหรับปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด คา่ percent phagocytosis คา่ phagocytic index และคา่ superoxide anion ทีTระยะเวลา 30 วัน พบวาปลานิลทีTได้รับการได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโก-่ แซคคาไรด์ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ส่งผลให้มีคาดังกล่ ่าวมากกวาชุดการทดลองอืTน่ เพียงเล็กน้อย แตยังคงไม่ พบความแตกต่ างทางสถิติเช่ ่นเดียวกนั การทีTแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีส่วนช่วยให้ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด คา่ percent

103 phagocytosis คา่ phagocytic index และคา่ superoxide anion มากกวาชุดการทดลองอืTนนั่ Nน อาจเกิด จากแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTซึมเข้าสู่กระแสเลือดไปมีส่วนร่วมในกระบวนการทํางานของ ระบบ complement ทีTถูกกระตุ้นโดย lectin pathway โดยอาศัยการทํางานของโปรตีนชนิด Mannan binding lectin (MBL) ทีTอยูใน่ Serum ของสิTงมีชีวิต และจะจับกบแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตรงั โครงสร้างทีTเป็นนํNาตาล mannose (Turner, 2003) และเกิดการกระตุ้นจนได้ Mannan-binding lectin association proteinase 1 และจะเปลีTยนเป็น Mannan-binding lectin association proteinase 2 และจะ กระตุ้นการทํางานต่อ ๆ ไปจนได้เอนไซม์ทีTเรียกวา่ C3 convertase และมีการทํางานต่อไปใน ลักษณะเดียวกนกั บการกระตุ้นระบบั complement แบบ classical pathway และทําลายเซลล์สิTง แปลกปลอมได้ในทีTสุด (Turner, 1996) และมีการส่งสัญญาณให้ monocyte หลังสารT Tumor necrosis factorα (TNF-α), Interleukin 1β และ Interleukin 6 (Jack et al., 2001) ซึTง Interleukin มี หน้าทีTหลักในการควบคุมการทํางานร่วมกนระหวั างเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดต่ าง่ ๆ (Abbas et al., 2000) และ TNF-α ทีTมีบทบาทในการส่งเสริมการเดินทางออกจากเส้นเลือดของเม็ดเลือดขาวใน กระบวนการอักเสบ และส่งเสริมกิจกรรมการกลืนกินสิTงแปลกปลอมของ polymorphonuclear cell และส่งเสริมการสร้าง hydrogen peroxide ใน macrophage (Secombes et al., 2001) และการทํางาน ของ mannose receptor ทีTอยูบนผนังเซลล์เม็ดเลือดขาว่ (Rodriguez et al., 2003) ทําให้มีจํานวนของ เซลล์เม็ดเลือดขาวเพิมขึT Nน การทีTแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ไมมีผลต่ ่อระบบภูมิคุ้มกนแบบไมั ่ จําเพาะเจาะจงจากการทดลองครัNงนีNอาจเกิดจากระยะเวลาทีTให้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน อาหารอาจน้อยเกินไป คือ 30 วัน ซึTงในการทดลองของ Torrecillas et al. (2010) กบปลาั sea bass ทีT ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัม และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม และ ศึกษาคา่ phagocytic activity ในวันทีT 30, 45 และ 60 วันของการได้รับอาหารเสริม พบวาค่ า่ phagocytic activity เพิมขึT NนเมืTอมีระยะเวลาของการกินอาหารเสริมมากขึNน การทีTมี phagocytic activity เพิมขึT Nนเกิดจากการทํางานของ mannose receptor ทีTอยูบนผนังเซลล์เม็ดเลือดขาว่ (Rodriguez et al., 2003) จับกบโครงสร้างทีTเป็นนํั Nาตาลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ และเกิด กระบวนการ phagocytosis ตามกลไกทีTอธิบายไว้แล้วข้างต้น

นอกจากเหตุผลของระยะเวลาในการได้รับแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์มีน้อยเกินไปจึงทํา ให้ไมแสดงผลต่ อระบบภูมิคุ้มก่ นแบบไมั จําเพาะเจาะจงแล้วอาจเป็นเพราะระดับของแมนแนนโอ-่ ลิโกแซคคาไรด์ทีTศึกษาอาจน้อยเกินไปสําหรับการศึกษาผลทีTมีตอระบบภูมิคุ้มก่ นภายในั 30 วัน จึง อาจจําเป็นต้องเพิมระดับของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารให้มีปริมาณสูงขึT Nน เช่นในการ ทดลองของ Yoshida et al. (1995) ทีTให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 10 กรัม ตอ่

104

อาหาร 1 กิโลกรัม กบปลาดุกแอฟริกาั (Clarias gariepinus) พบวามีปริมาณของ่ activated neutrophils เพิมขึT NนตัNงแต ่ 2 สัปดาห์แรกของการได้รับอาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์อยาง่ มีนัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) สอดคล้องกบั การศึกษาในลูกไก่ (Elmusharaf et al., 2007) ทีTได้รับ การเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 10 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นเวลา 19 วัน พร้อม กบทดสอบความต้านทานตั ่อโปรโตซัวในกลุ่ม Eimeria spp. ซึTงเป็นสาเหตุทําให้เกิดโรคบิดในสัตว์ ปีกในระหวางทีTได้รับอาหารเสริม่ พบวาในวันทีT่ 5 และวันทีT 12 ของการได้รับอาหารเสริม ลูกไก่ทีT ได้รับการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหาร มีการกระจายตัวของไข่โปรโตซัวน้อยกวา่ ลูกไก่ชุดทีTไมได้รับการเสริมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05)

การศึกษาในครัNงนีNพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารเป็นเวลา่ 30 วัน ในปลานิลวัยรุ่นไมส่ ่งผลทีTชัดเจนตอระบบภูมิคุ้มก่ นั โดยพิจารณาจากปริมาณเม็ดเลือดแดงรวม คา่ Hematocrit คา่ Hemoglobin ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด คา่ percent phagocytosis คา่ phagocytic index และคา่ superoxide anion แตพบว่ าการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ใน่ อาหารเป็นเวลา 21 วัน มีผลต่อความต้านทานต่อเชืNอแบคทีเรีย S. agalactiae ในลูกปลานิล ดังนัNนจึง ควรทําการศึกษากิจกรรมอืTน ๆ ของระบบภูมิคุ้มกนั เช่น Lysozyme activity และ Complement activity เพิมเติมT เพืTอให้ทราบถึงผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อระบบภูมิคุ้มกนได้ชัดเจนั ยิงขึT Nน

การศึกษาผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ต่อการแสดงออกของยีน Interleukin 1 β, Interleukin 8, Transforming growth factor β 1 และ Tumor necrosis factor α โดยใช้เทคนิค Semi-quantitative RT-PCR

ในการศึกษาครัNงนีNพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารไม่ มีผลต่ ่อการ แสดงออกของยีนในกลุ่ม Cytokines คือ Interleukin 1 β, Interleukin 8, Transforming growth factor β 1 และ Tumor necrosis factor α โดยพบวามีการแสดงออกของยีนทั่ Nง 4 ชนิด ในไตส่วน หน้าและม้ามของปลานิลในทุกชุดการทดลองและมีปริมาณการแสดงออกทีTไมสอดคล้องก่ บระดับั ของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTเพิมขึT Nน ยกเว้นการแสดงออกของยีน Transforming growth factor β 1 ในม้ามทีTพบวามีปริมาณการแสดงออกเพิ่ มขึT Nนเล็กน้อยตามระดับของการเสริมแมนแนนโอลิ- โกแซคคาไรด์ทีTเพิมขึT Nน แตไม่ แสดงความแตกต่ างทางสถิติ่ (P>0.05) การศึกษาครัNงนีNพบการแสดง ออกของยีน Transforming growth factorβ 1 แบบเบาบางมากในไตส่วนหน้า การแสดงออกของยีน

105

ในกลุ่ม Cytokines นีNเป็นยีนทีTมีการแสดงออกเมืTอมีสิTงแปลกปลอมเข้าไปในร่างกายหรือเมืTอเกิดการ อักเสบ (เอกพล, 2551) โดยการแสดงออกนัNนจะมีระยะเวลาของการแสดงออกทีTแตกต่างกนตามแตั ่ หน้าทีTและบทบาทของยีนนัNน ๆ (Secombes et al., 2001) โดย Tumor necrosis factor α (TNFα) จะ หลังออกมากT ่อน Cytokines ชนิดอืTน ๆ จากนัNนจะไปกระตุ้นให้เซลล์เม็ดเลือดขาวสร้างและหลังT Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) และ Interleukin-8 (IL-8) ตามออกมา รวมถึงกระตุ้น ให้เซลล์เม็ดเลือดขาวของตัวเองหรือข้างเคียงหลังT TNFα ออกมาเพิมด้วยT จากการศึกษาการแสดง - ออกของ Cytokines ในปลาไนทีTกระตุ้นด้วยปรสิตพบวา่ การแสดงออกของ Cytokines ชนิดอืTน ๆ จะคอย่ ๆ สูงขึNนและสูงทีTสุดช่วงประมาณชัวโมงทีTT 3-4 หลังจากถูกกระตุ้น และลดลงภายใน 24 ชัวโมงT แตจะมีเพียง่ TNFα ทีTมีการแสดงออกขึNน ๆ ลง ๆ (Gonzalez et al., 2007) จึงอาจเป็นไปได้ วา่ TNFα สามารถแสดงออกได้อีกหรือสามารถแสดงออกได้แม้จะไมใช่ ่ในสภาวะทีTถูกกระตุ้น โดย TNFα จะสามารถแสดงออกได้บ้างในปลาทีTไมได้รับการกระตุ้นจากสิ่ Tงแปลกปลอม หรือ สามารถหลังออกมาได้อีกเมืTอได้รับการกระตุ้นจากเซลล์เม็ดเลือดขาวทีTจับกT บั Lipopolysaccharide (LPS) หรือ Phorbol myristate acetate เป็นต้น นอกจากการกระตุ้นด้วย TNFα เพืTอให้มีการหลังT ของ IL-1β แล้วนัNนยังพบวาในสภาวะทีTมีอุณหภูมิตํTา่ มีความเครียด หรือได้รับการกระตุ้นจาก LPS กส็ ่งผลให้มีการแสดงออกของยีน IL-1β ได้เช่นกนั (Zou et al., 2000) ซึTงการแสดงออกของยีนใน กลุ่ม Cytokines จากการทดลองครัNงนีNอาจเกิดขึNนก่อนหรือหลังระยะเวลา 30 วันของการเกบตัวอย็ าง่ จึงทําให้ไมเห็นผลทีTชัดเจนและบทบาทของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTจับก่ บั Mannan-binding lectin แล้วไปกระตุ้นให้มีการหลังT Cytokines (TNFα, IL-1β และ Il-6) ออกมานัNนพบวาไม่ แสดง่ ผลให้เห็นอยางชัดเจนเช่ ่นเดียวกนั อาจเป็นเพราะระดับของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTเสริมใน อาหารนัNนยังไมเพียงพอทีTจะมีผลต่ อการแสดงออกของยีนในกลุ่ ่มนีNภายใน 30 วัน ซึTงการศึกษาของ Terova et al. (2009) ทดลองให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 30 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เป็นระยะเวลา 30 วัน พบวามีการแสดงออกของยีน่ Dicentracin ทีTไตส่วนหน้าเพิมขึT Nน อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) นอกจากเหตุผลทีTวาระดับของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีT่ เสริมในอาหารไมเพียงพอทีTจะมีผลต่ อการแสดงออกของยีนในกลุ่ ่ม Cytokines แล้ว สาเหตุอีก ประการหนึTงคือ ยีนในกลุ่มนีNจะมีการแสดงออกเมืTอได้รับกระตุ้นจากสิTงแปลกปลอม แตการศึกษา่ ครัNงนีNเป็นการศึกษาในปลาทีTมีสุขภาพดีและไมถูกกระตุ้นด้วยสิ่ Tงแปลกปลอม

จากผลการทดลองทัNงหมดของการศึกษาครัNงนีNจึงมีข้อเสนอวาควรใช้อาหารเสริมแมนแนน-่ โอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ในช่วงการอนุบาลลูกปลานิลเพืTอยกระดับ การเจริญเติบโต และความต้านทานต่อเชืNอ S. agalactiae และควรใช้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโก-

106

แซคคาไรด์ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม เพืTอยกระดับการทํางานของระบบภูมิคุ้มกนแบบั จําเพาะเจาะจงของปลานิลวัยรุ่น 107

สรุปและข้อเสนอแนะ

สรุป

1. การให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม ระหวางการอนุบาลและแปลงเพศลูกปลาเป็นเวลา่ 21 วัน ส่งผลให้มีนํNาหนักและความยาว มาตรฐานมากกวาชุดควบคุมในทุกอัตราปล่ ่อย อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) การเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ 4 และ 6 กรัม มีผลตออัตราการเจริญเติบโตต่ ่อวันอยางมี่ นัยสําคัญทางสถิติ (P<0.05) ทีTอัตราปล่อย 100 ตัวตอตู้บรรจุนํ่ Nา 80 ลิตรเทานั่ Nน ส่วนการเสริมแมน- แนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีT 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม กบปลาั 200 ตัวตอตู้่ และทีT 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม กบปลาั 300 ตัวตอตู้ตามลําดับ่ มีผลตออัตราการเปลีTยนอาหารเป็นเนื่ Nอ อยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ในขณะทีTการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทุก ความเข้มข้นไมมีผลต่ ่ออัตรารอดของลูกปลานิลเมืTอสิNนสุดการอนุบาล 21 วันในทุกอัตราปล่อย

2. การศึกษาทางพยาธิสภาพพบวาการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารทีTระดับ่ 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มีผลตอการเพิ่ มพืT NนทีTและความสมบูรณ์ในการพัฒนาของ microvilli ซึTงมีส่วนสําคัญในการดูดซึมอาหารในลําไส้ และการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ ในอาหารทุกระดับมีผลช่วยให้ลูกปลานิลทีTอัตราปล่อย 100 ตัวต่อตู้มีความต้านทานตอเชื่ Nอ Streptococcus agalactiae ได้ดีกวาชุดควบคุมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) ส่วนทีTอัตรา ปล่อย 200 และ 300 ตัวตอตู้พบว่ าเฉพาะทีTระดับ่ 4 และ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัมเท่านัNนทีTมี ความต้านทานตอเชื่ Nอ S. agalactiae ได้ดีกวาชุดควบคุมอย่ างมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05)

3. การให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ทีTระดับ 6 กรัม ตออาหาร่ 1 กิโลกรัม มี ผลตอการตอบสนองทางภูมิคุ้มก่ นในเชิงการสร้างั Antibody ตอบสนองในช่วง secondary immune response ตอการให้วัคซีนเชื่ Nอ S. agalactiae ได้เร็วและสูงทีTสุดอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ่ (P<0.05) แตการให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา่ 30 วัน ไมมีผลต่ อปริมาณเม็ดเลือด่ แดงรวม คา่ Hematocrit คา่ Hemoglobin ปริมาณเม็ดเลือดขาวในกระแสเลือด คา่ percent phagocytosis คา่ phagocytic index และคา่ superoxide anion ของปลานิลวัยรุ่น

108

4. การให้อาหารเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์เป็นระยะเวลา 30 วันไมมีผลต่ อการ่ แสดงออกของยีนในกลุ่ม Cytokines ของปลานิลวัยรุ่น

ข้อเสนอแนะ

1. ควรมีการศึกษาผลของการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในอาหารตอค่ า่ Lysozyme activity และ Complement activity เพิมเติมT เพืTอให้ทราบถึงประสิทธิภาพของแมนแนนโอลิโกแซค- คาไรด์ต่อระบบภูมิคุ้มกนแบบไมั จําเพาะเจาะจงอืTน่ ๆ มากขึNน

2. การใช้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ร่วมกบโปรไบโอติกอาจเป็นอีกแนวทางหนึTงทีTอาจั สามารถเพิมประสิทธิภาพของการใช้แมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์หรือโปรไบโอติกในการT เพาะเลีNยงสัตว์นํNาได้

3. ควรมีการศึกษาเกีTยวกบกลไกการกระตุ้นภูมิคุ้มกั นทีTเกั ิดจากการได้รับแมนแนนโอลิโก- แซคคาไรด์ในอาหารเพิมเติมT เพืTอเป็นแนวทางในการอธิบายความสามารถในการกระตุ้นภูมิคุ้มกนั ของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ในปลาได้ดียิงขึT Nน เนืTองจากปัจจุบันมีการศึกษาเกีTยวกบกลไกั ดังกล่าวน้อยมาก

4. การศึกษาเกีTยวกบผลของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์ตั อการแสดงออกของยีนในกลุ่ ่ม Cytokines ควรศึกษาในกลุ่มสัตว์ทดลองทีTได้รับสิTงแปลกปลอมเข้าสู่ร่างกาย และระยะเวลาทีTมีการ แสดงออกตามแตชนิดของยีน่ เพืTอให้ได้ผลการศึกษาทีTก่อให้เกิดประโยชน์ในการใช้แมนแนนโอลิ- โกแซคคาไรด์ในสิTงมีชีวิตมากยิงขึT Nน

5. ควรมีการศึกษาการเจริญเติบโตและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกนระหวั างการเสริมเซลล์่ ยีสต์ทัNงเซลล์เปรียบเทียบกบการเสริมแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์และเบต้ากลูแคนในอาหารั เพืTอ ทราบถึงประสิทธิภาพของสารและเป็นการลดต้นทุนในการผลิตผลผลิตสัตว์นํNาทีTมีคุณภาพ

6. ควรมีการศึกษาเพิมเติมเพืTอให้ทราบถึงบทบาทของระดับแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์T ในอาหารต่อลักษณะทางพยาธิสภาพของเซลล์ตับ และความสัมพันธ์ของการนําไขมันทีTสะสมใน ตับไปใช้ 109

เอกสารและสิMงอ้างอิง

คีรี กออนันตกุล. 2542. การเพาะเลีcยงปลานิลแปลงเพศ. กองประมงนํNาจืด กรมประมง, กรุงเทพฯ.

ชาญชัย แสนศรีมหาชัย. 2522. การเพาะพันธ์ปลานิล.ุ สถาบันวิจัยประมงนํNาจืดแห่งชาติ กองประมงนํNาจืด กรมประมง, กรุงเทพฯ.

ดริญญา จันทวรรณ, นนทวิทย์ อารีย์ชน และ ประพันธ์ศักดิt ศีรษะภูมิ. 2550. การศึกษาชนิดและ ความไวตอยาปฏิชีวนะของเชื่ Nอ Streptococcus spp. ทีTแยกได้จากปลานิล, น. 204-211. ใน การประชุมวิชาการของมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ครัcงทีM 44 (สาขาประมง). มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพฯ.

นิลุบล กิจอันเจริญ, ชุติมา หาญจวณิช และ นงนุช สุวรรณเพ็ง. 2549. ประสิทธิภาพของการให้ วัคซีนทีTผลิตจากเชืNอ Streptococcus agalactiae ในการป้องกนโรคสเตรปโตคอคโคซิสในั ปลานิล. วารสารวิจัย มข. 11(1): 53-61.

บุญอ้อม โฉมที. 2550. หลักการวางแผนการทดลอง. ภาควิชาสถิติ, คณะวิทยาศาสตร์, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพฯ.

ประพันธ์ศักดิt ศีรษะภูมิ. 2547. การวินิจฉัยและการป้องกันรักษาโรคในสัตว์นํcา. ม.ป.ท.

ไพบูลย์ วรสายัณห์ และ ณัฐพงศ์ เพชรฤทธิt. 2547. การเพาะพันธุ์ปลานิลแปลงเพศโดยใช้ ฮอร์โมนผสมอาหาร. วารสารประมง ปีทีT 57 (2): 163-167.

ภิรัตน์ มันใจอางค์,T นนทวิทย์ อารีย์ชน, ประพันธ์ศักดิt ศีรษะภูมิ และ ส่งศรี มหาสวัสดิt. 2550. การทดลองใช้วัคซีนเพืTอป้องกนโรคทีTเกั ิดจากเชืNอแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ใน ปลานิล (Oreochromis niloticus), น. 174-182. ใน การประชุมวิชาการของมหาวิทยาลัย เกษตรศาสตร์ ครัcงทีM 44 (สาขาประมง). มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพฯ.

110

ฤทัย สกุลแรมรุ่ง. 2539. วิทยาภูมิค้มกันุ . ภาคจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, กรุงเทพฯ

สุปราณี ชินบุตร. 2550. ปลานิลจิตรลดา--สายสัมพันธ์พระราชวงศ์ไทย-ญีMป่ นุ . กรมประมง. กรุงเทพฯ.

อุดม เรืองนพคุณ. 2549. การเพาะพันธ์และการเลีcยงปลานิล.ุ อักษรสยามการพิมพ์, กรุงเทพฯ.

เมฆ บุญพราหมณ์. 2525. อาหารทีTให้พลังงานและการเจริญเติบโต. สารานุกรมไทย สําหรับเยาวชน เล่ม 7. แหล่งทีTมา: http://guru.sanook.com/encyclopedia/อาหารทีTให้ พลังงานและการเจริญเติบโต, 26 เมษายน 2553.

เอกพล วังคะฮาต. 2551. การแสดงออกของยีนในไตส่วนหน้าและม้ามของปลานิล (Oreochromis niloticus) ทีMถูกกระต้นด้วยเชืcอุ Streptococcus agalactiae โดยใช้เทคนิค Expressed Sequence Tags (ESTs). วิทยานิพนธ์ปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์.

Abbas, A. K., A. H. Lichtman and J. S. Pober. 2000. Cellular and Molecular Immunology. 4th ed. W.B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania.

Agius, C. 1980. Phylogenetic development of melano-macrophage centres in fish. J. Zool. (Lond.) 191: 11-31.

Aksungurl, N., M. Aksungurl, B. Akbulutl and I. Kutlul. 2007. Effects of stocking density on growth performance, survival and food conversion ratio of turbot (Psetta maxima) in the net cages on the southeastern coast of the Black Sea. Turk. J. Fish. Aquat. Sci. 7: 147-152.

Arason, G. J. 1996. Lectins as defence molecules in vertebrates and invertebrates. Fish Shellfish Immunol. 6: 277-289.

111

AyÇe Gen M., E. Yilmaz and E. GenÇ. 2006. Yeme Eklenen Mannan- Oligosakkarit’in Karabaliklarin (Clarias gariepinus, Burchell, 1822) Gelisimine, Barsak ve Karaciger Histolojisine Etkileri. J. Fish. Aquat. Sci. 23: 37-41.

Baggiolini, M. and I. Clark-Lewis. 1992. Interleukin-8, a chemotactic and inflammatory cytokine. FEBS Lett. 307: 97-101.

Baoprasertkul, P., E. Peatman, L. Chen, C. He, H. Kucuktas, P. Li and M. Simmons. 2004. Sequence analysis and expression of a CXC chemokine in resistant and susceptible catfish after infection of Edwardsiella ictaluri. Dev. Comp. Immunol. 28: 769-780.

Baptista, A. S., J. Horii, M. A. C. Domingues, D. M. Gloria, J. M. Salgado and M. R. Vizioli. 2004. The capacity of manno-oligosaccharides, thermolused yeast and active yeast to attenuate aflatoxicosis. World J. Microbiol. Biotechnol. 20: 475-481.

Bland, E. J., T. Keshavarz and C. Bucke. 2004. The influence of small oligosaccharides on the immune system. Carbohydr. Res. 339: 1673-1678.

Bogut, I., Z. Milakovic, J. Pavlicevic and D. Petrovic. 2006. Effect of Bio-Mos on performance and health of European catfish, Sillirus glanis, pp. 90. In Lyons, T. P., K. A. Jacques and J. M. Hower, eds. Proceedings of Alltech’s 22nd Annual Symposium April 23-26, 2006, Abstracts of Posters Presented. Lexington, KY, USA.

Bols, N. C., J. L. Brubacher, R. C. Ganassin and L. E. J. Lee. 2001. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Dev. Comp. Immunol. 25: 853-873.

Center, D. M., H. Kornfeld and W. W. Cruikshank. 1996. Interleukin 16 and its function as a CD4 ligand. Immunol. Today 17: 476-481.

112

Chen, L., C. He, P. Baoprasertkul, P. Xu, P. Li, J. Serapion and G. Waldbieser 2005. Analysis of a catfish gene resembling interleukin-8: cDNA cloning, gene structure, and expression after infection with Edwardsiella ictaluri. Dev. Comp. Immunol. 29: 135-142.

Chivers, D. P., B. D. Wisenden, C. J. Hindman, T. A. Michalak, R. C. Kusch, S. G. W. Kaminskyj, K. L. Jack, M. C. O. Ferrari, R. J. Pollock, C. F. Halbgewachs, M. S. Pollock, S. Alemadi, C. T. James, R. K. Savaloja, C. P. Goater, A. Corwin, R. S. Mirza, J. M. Kiesecker, G. E. Brown, J. C. Adrian, Jr., P. H. Krone, A. R. Blaustein and A. Mathis. 2007. Epidermal ‘alarm substance’ cells of fishes maintained by non-alarm functions: possible defence against pathogens, parasites and UVB radiation. Proc. Biol. Sci. 274: 2611-2619.

Christybapita, D., M. Divyagnaneswari, R. D. Michael. 2007. Oral administration of Eclipta alba leaf aqueous extract enhances the non-specific immune responses and disease resistance of Oreochromis mossambicus. Fish Shellfish Immunol. 23: 840-852.

Corripio-Miyar, Y., S. Bird, K. Tsamopoulos and C. J. Secombes. 2007. Cloning and expression analysis of two pro-inflammatory cytokines, IL-1β and IL-8, in haddock (Melanogrammus aeglefinus). Mol. Immunol. 44: 1361-1373.

Culjak, V., I. Bogut, E. Has-Schon, Z. Milakovic and K. Canecki. 2006. Effect of Bio-Mos on performance and health of juvenile carp, pp. 90. In Lyons, T. P., K. A. Jacques and J. M. Hower, eds. Proceedings of Alltech’s 22nd Annual Symposium April 23-26, 2006. Abstracts of Posters Presented. Lexington, KY, USA.

Dambo, W. B. and K. J. Rana. 2008. Effect of stocking density on growth and survival of Oreochromis niloticus (L.) fry in the hatchery. Aquac. Res. 24: 71-80.

113

Dannevig, B. H., A. Lauve, C. M. Press and T. Landsverk. 1994. Receptor-mediated endocytosis and phagocytosis by rainbow trout head kidney sinusoidal cells. Fish Shellfish Immunol. 4: 3-18.

Dimitroglou, A., S. Davies and J. Sweetman. 2008. The effect of dietary mannan oligosaccharides on the intestinal histology of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comp. Biochem. Physiol. 150: s56-s63.

, T. Janssens and S. Davies. 2006. Effect of Bio-Mos on sole, Solea solea, gut integrity (histological perspectives), pp. 94. In Lyons, T. P., K. A. Jacques and J. M. Hower, eds. Proceedings of Alltech’s 22nd Annual Symposium April 23-26, 2006. Abstracts of Posters Presented. Lexington, KY, USA.

, D. L. Merrifield, P. Spring , J. Sweetman, R. Moate and S. J. Davies. 2010. Effects of mannan oligosaccharide (MOS) supplementation on growth performance, feed utilization, intestinal histology and gut microbiota of gilthead sea bream (Sparus aurata). Aquaculture 300: 182-188.

Dixon, B. and R. J. M. Stet. 2001. The relationship between major histocompatibility receptors and innate immunity in teleost fish. Dev. Comp. Immunol. 25: 683-699.

Ellis, A. E. 2001. Innate host defense mechanisms of fish against viruses and bacteria. Dev. Comp. Immunol. 25:827-839.

, R. J. Roberts and P. Tytler. 1989. The Anatomy and Physiology of Teleost. Bailliere Tindall., London.

Elmusharaf, M. A., H. W. Peek, L. Nollet and A. C. Beynen. 2007. The effect of an in-feed mannanoligosaccharide preparation (MOS) on a coccidiosis infection in broilers. Anim. Feed Sci. Technol. 134: 347-354.

114

Espenes, A., C. M. Press, B. H. Dannevig and T. Landsverk. 1995. Immune-complex trapping in the splenic ellipsoids of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell Tissue Res. 282: 41-48.

Filyak, Y., O. Filyak and R. Stoika. 2007. Transforming growth factor β-1 enhances cytotoxic effect of doxorubicin in human lung adenocarcinoma cells of A549 line. Cell Biol. Int. 31: 851-855.

Flach, R., N. Speidel, S. Flohe, J. Borgermann, I. G. Dresen, J. Erhard and F. U. Schade. 1998. Analysis of intragraft cytokine expression during early reperfusion after liver transplantation using semi-quantitative RT-PCR. Cytokine 10: 445-451.

Freimund, S., M. Sauter, O. Kappeli and H. Dutler. 2003. A new non-degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity from Baker’s yeast Saccharomyes cerevisiae. Carbohydr Polym. 54: 159-171.

Fritts, C. A. and P. W. Waldroup. 2003. Evaluation of Bio-Mos mannanoligosaccharide as a replacement for growth promoting antibiotics in diet for turkeys. Poult. Sci. 2: 19-22.

Fujiki, K., J. Gauley, N. C. Bols and B. Dixon. 2003. Genomic cloning of novel isotypes of the rainbow trout interleukin-8. Immunogenetics 55:126-131.

Gallaher, C. M., J. Munion, R. Hesslink, J. Wise and D. D. Gallaher. 1999. Glucomannan and chitosan lower cholesterol by reducing cholesterol absorption. FASEB J. 13:A883

______. 2000. Cholesterol reduction by glucomannan and chitosan is mediated by changes in cholesterol absorption and bile acid and fat excretion. J. Nutr. 130:2753-2739.

115

Genc, M. A., M. Aktas, E. Genc and E. Yilmaz. 2007a. Effects of dietary mannan oligosaccharide on growth, body composition and hepatopancreas histology of Penaeus semisulcatus (de Haan 1844). Aquacult. Nutr. 13: 156–161.

, E. Yilmaz, E. Genc and M. Aktas. 2007b. Effects of dietary mannan oligosaccharides (MOS) on growth, body composition, and intestine and liver histology of the hybrid tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus). Aquaculture 59: 10–16.

Gibson, G. R. and M. B. Roberfroid. 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 125: 1401–1412.

Gonzaleza, S. F., M. O. Huisingc, R. Stakauskase, M. Forlenzac, B. M. L. Verburg-van Kemenadec, K. Buchmanna, M. E. Nielsena and G. F. Wiegertjesc. 2007. Real-time gene expression analysis in carp (Cyprinus carpio L.) skin: Inflammatory responses to injury mimicking infection with ectoparasites. Dev. Comp. Immunol. 31: 244–254.

Grisdale-Helland, B., S. J. Helland and D. M. Gatlin III. 2008. The effects of dietary supplementation with mannanoligosaccharide, fructooligosaccharide or galactooligosaccharide on the growth and feed utilization of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture 283: 163–167.

Gu, X. J., B. Cui, Z. F. Zhao, H. Y. Chen, X. Y. Li, S. Wang, G. Ning and Y. J. Zhao. 2008. Association of the interleukin (IL)-16 gene polymorphisms with Graves' disease. Clin. Immunol. 127: 298-302.

Haddad, G., P. C. Hanington, E. C. Wilson, L. Grayfer and M. Belosevic. 2008. Molecular and functional characterization of goldfish (Carassius auratus L.) transforming growth factor β. Dev. Comp. Immunol. 32: 654-663.

116

Hossu, B., S. Salnur and N. Gultepe. 2006. The effects of yeast derivatives (Bio-Mos) on growth of gilthead sea bream, Sparus aurata, pp. 93. In Lyons, T. P., K. A. Jacques and J. M. Hower, eds. Proceedings of Alltech’s 22nd Annual Symposium April 23-26, 2006, Abstracts of Posters Presented. Lexington, KY, USA.

Ichii, M., K. Oritani, T. Yokota, M. Nishida, I. Takahashi, T. Shirogane, S. Ezoe, N. Saitoh, R. Tanigawa, P. Kincade and Y. Kanakura. 2008. Regulation of human B lymphopoiesis by the transforming growth factor-β superfamily in a newly established coculture system using human mesenchymal stem cells as a supportive microenvironment. Exp. Hematol. 36(5): 587-597

Inoue, Y., M. Endo, C. Haruta, T. Taniuchi, T. Moritomo and T. Nakanishi. 2003a. Molecular cloning and sequencing of the silver chimaera (Chimaera phantasma) interleukin-8 cDNA. Fish Shellfish Immunol. 15: 269-274.

, C. Haruta, K. Usui, T. Moritomo and T. Nakanishi. 2003b. Molecular cloning and sequencing of the banded dogfish (Triakis scyllia) interleukin-8 cDNA. Fish Shellfish Immunol. 14: 275-281.

Jack, D.L., R. C. Read, A. J. Tenner, M. Frosch, M. W. Turner and N. J. Klein. 2001. Mannose- binding lectin regulates the inflammatory response of human professional phagocytes to Neisseria meningitidis serogroup B. J. Infect. Dis. 184: 1152–1162.

Jie, W. and P. Shu-Sheng. 1997. Comparison of hypolipidemic effect of refined Konjac meal with several common dietary fibers and their mechanisms of action. Biomed. Environ. Sci. 10: 27-37.

Jones, G. H. and C. E. Ballou. 1969. Studies on the structure of yeast mannan. J. Biol. Chem. 244: 1043-1051.

117

Jones, S. R. 2001. The occurrence and mechanisms of innate immunity against parasites in fish. Dev. Comp. Immunol. 25: 841-852.

Kaattari, S. L. and M. J. Irwin. 1985. Salmonid spleen and anterior kidney harbor populations of lymphocytes with different B cell repertoires. Dev. Comp. Immunol. 9: 433-444.

Kaiser, P., L. Rothwell, S. Avery and S. Balu. 2004. Evolution of the interleukins. Dev. Comp. Immunol. 28: 375-394.

Klein, J., and V. Horejsi. 1997. Immunology. Blackwell Science Inc.

Laing, K., J. Zou, T. Wang, N. Bols, I. Hirono, T. Aoki and C. Secombes. 2002. Identification and analysis of an interleukin 8-like molecule in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Dev. Comp. Immunol. 26: 433-444.

Lee, E., H. Park, Y. Kim and T. J. Choi. 2001. Cloning and sequence analysis of the interleukin-8 gene from flounder (Paralichthys olivaceous). Gene 274: 237-243.

Lie, O. 1985. Improved agar plate assays of bovine lysozyme and haemolytic complement activity, pp. 1-12. In Markers of Resistance to Infection in Dairy Cattle. Dissertation, Oslo, Norway, National Veterinary Institute. Vol. 5.

Lipke, P. N. and R. Ovalle. 1998. Cell wall architecture in yeast. J. Bacteriol. 180: 3735-3740.

Lji P. A., A. A. Saki and D. R. Tivey. 2001. Intestinal structure and function of broiler chickens on diets supplemented with a mannan oligosaccharide. J. Sci. Food. Agric. 81: 1186-1192.

Magnadottir, B. 2006. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20: 137-151.

118

Magor, B. G. and K. E. Magor. 2001. Evolution of effectors and receptors of innate immunity. Dev. Comp. Immunol. 25: 651-682.

Mathy, N. L., W. Scheuer, M. Lanzendorfer, K. Honold, D. Ambrosius, S. Norley and R. Kurth. 2000. Interleukin-16 stimulates the expression and production of pro-inflammatory cytokines by human monocytes. Immunology 100: 63-69.

Merrifield, D. L., A. Dimitroglou , A. Foey, S. J. Davies, R. T. M. Baker, J. Bøgwald, M. Castex and E, Ringø. 2010. The current status and future focus of probiotic and prebiotic applications for salmonids. Aquaculture 302: 1-18.

McSweegan, E. and R. I. Walker. 1986. Identification and characterization of two Campylobacter jejuni adhesins for cellular and mucous substrates. Infect. Immun. 53:141-148.

Merino, S., X. Rubires, A. Aguilar and J. M. Tomas. 1996. The O:34-antigen lipopolysaccharide as an adhesin in Aeromonas hydrophila. FEMS Microbiol. Lett. 139: 97-101.

Meseguer, J., A. Lopez-Ruiz and A. Garcia-Ayala. 1995. Reticulo-endothelial stroma of the head-kidney from the seawater teleost gilthead seabream (Sparus aurata): an ultrastructural and cytochemical study. Anat. Rec. 241: 303-309.

Miguel, J. C., S. L. Rodriguez-Zas and J. E. Pettigrew. 2004. Efficacy of a mannan oligosaccharide (Bio-Mos) for improving nursery pig performance. J. Swine Health Prod. 12: 296-307.

Miller, N. W. and L. W. Clem. 1984. Temperature-mediated processes in teleost immunity: differential effects of temperature on catfish in vitro antibody responses to thymus-dependent and thymus-independent antigens. J. Immunol. 133: 2356-2359.

119

Mirelman, D. and I. Ofek. 1986. Introduction to microbial lectins and agglutinin. In Mirelman, D., eds. Microbial lectins and agglutins-properties and biological activity. New York: John Wiley & Sons, Inc.

Murphy, T., I. Roy, A. Harrop, K. Doxon and T. Keshavarz. 2007. Effect of oligosaccharide elicitors on bacitracin A production and evidence of transcriptional level control. J. Biotechnol. 131: 397-403.

Najakshin, A., V. Mechetina, B. Alabyev and A. Taranin. 1999. Identification of an IL-8 homolog in lamprey (Lampetra fluviatilis): early evolutionary divergence of chemokines. Eur. J. Immunol. 29: 375-382.

Nakanishi, T. 1996. The Fish Immnue System Organism, Pathogen and Environment. Academic Press., San Diego, California.

, U. Fischer, J. M. Dijkstra, S. Hasegawa, T. Somamoto, N. Okamoto and M. Ototake. 2002. Cytotoxic T cell function in fish. Dev. Comp. Immunol. 26: 131-139.

Ollila, J. and M. Vihinen. 2005. B cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37: 518–523.

Oyofo, B. A., J. R. DeLoach, D. E. Corrier, J. O. Norman, R. L. Ziprin and H. H. Mollenhauer. 1989b. Prevention of Salmonella typhimurium colonization of broilers with D-mannose. Poult. Sci. 68: 1357-1360.

Oyofo, B. A., R. E. Droleskey, J. O. Norman, H. H. Mollenhauer, R. L. Ziprin, D. E. Corrier and J. R. DeLoach. 1989a. Inhibition by mannose of in vitro colonization of chicken small intestine by Salmonella typhimurium. Poult. Sci. 68: 1351–1356.

120

Parodi, A. J. 1979. Biosynthesis of yeast glycoproteins. Processing of the oligosaccharides transferred from dolichol derivatives. J. Biol. Chem. 254: 10051– 10060.

Pasquier, L. D. 2001. The immune system of invertebrates and vertebrates. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 129:1-15.

Perry, A. and I. Ofek. 1984. Inhibition of blood clearance and hepatic tissue binding of Escherichia coli by liver lectin-specific sugars and glycoproteins. Infect. Immun. 52:257-262.

Press, C. M. and O. Evensen. 1999. The morphology of the immune system in teleost fishes. Fish Shellfish Immunol. 9: 309-318.

Pryor, G.S., J. B. Royes, F. A. Chapman and R. D. Miles. 2003. Mannanoligosaccharides in fish nutrition: effects of dietary supplementation on growth and gastrointestinal villi structure in Gulf of Mexico sturgeon. N. Am. J. Aquacult. 65: 106–111.

Puangkaew, J., V. Kiron, T. Somamoto, N. Okamoto, S. Satoh, T. Takeuchi and T. Watanabe. 2004. Non specific immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) in relation to different status of vitamin E and highly unsaturated fatty acids. Fish Shellfish Immunol. 16: 25-39.

Raida, M. K. and K. Buchmann. 2008. Bath vaccination of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) against Yersinia ruckeri: Effects of temperature on protection and gene expression. Vaccine 26: 1050-1062.

Rodriguez, A., M. A. Esteban and J. Meseguer. 2003. A mannose-receptor is possibly involved in the phagocytosis of Saccharomyces cerevisiae by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes. Fish Shellfish Immunol. 14: 375-388.

121

Rodriguez-Estrada, U., S. Satoh, Y. Haga, H. Fushimi and J. Sweetman. 2009. Effects of single and combined supplementation of Enterococcus faecalis, mannan oligosaccharide and polyhydrobutyric acid on growth performance and immune response of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Aquacult. Sci. 57: 609–617.

Salze, G., E. McLean, M. H. Schwarz and S. R. Craig. 2008. Dietary mannan oligosaccharide enhances salinity tolerance and gut development of larval cobia. Aquaculture 274: 148-152.

Sang, H. M. and R. Fotedar. 2010. Effects of mannan oligosaccharide dietary supplementation on performances of the tropical spiny lobsters juvenile (Panulirus ornatus, Fabricius 1798). Fish Shellfish Immunol. 28: 483-489.

, L. T. Ky and R. Fotedar. 2009. Dietary supplementation of mannan oligosaccharide improves the immune responses and survival of marron, Cherax tenuimanus (Smith, 1912) when challenged with different stressors. Fish Shellfish Immunol. 27: 341-348.

Sangrador-Vegas, A., J. B. Lennington and T. J. Smith. 2002. Molecular cloning of an IL-8-like CXC chemokine and tissue factor in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by use of suppression subtractive hybridization. Cytokine 17: 66-70.

Santoso, U., K. Tanaka and S. Ohtani. 1995. Effect of dried composition and Bacillus subtilis culture on growth, body hepatic lipogenic enzyme activity in female broiler chicks. Br. J. Nutr. 74: 523-529.

Secombes, C. J., L. J. Hardie and G. Daniels. 1996. Cytokines in fish. Fish Shellfish Immunol. 6: 291-304.

122

, T. Wang, S. Hong, S. Peddie, M. Crampe, K. J. Laing, C. Cunningham and J. Zou. 2001. Cytokine and innate immunity of fish. Dev. Comp. Immunol. 25: 713-723.

, J. Zou, K. Laing, G. D. Daniels and C. Cunningham. 1999. Cytokine genes in fish. Aquaculture 172: 93-102.

Shane, S. 2001. Mannan oligosaccharides in poultry nutrition: mechanisms and benefits, pp. 65-77. In Jacques K. A. and T. P. Lyons, eds. Proceedings of Alltech’s 17th Annual Symposium. Biotechnology in the feed industry. Nottingham University, Nottingham, UK.

Sipring, P., C. Wenk, K. A. Dawson and M. E. Newman. 2000. The effect of dietary mannan oligosaccharides on cecal parameters and the concentrations of enteric bacteria in cecal of Salmonella challenged broiler chick. J. Poult. Sci. 79: 205-211.

Sotirov, L. K. 1986. Method for determination of the alternative pathway of complement activation in some animals and man, pp. 1-10. In Fourth Scientific Conference of Agriculture. Stara Zagora.

Spring, P., C. Wenk, K. A. Dawson and K. E. Newman. 2000. The effects of dietary mannan oligosaccharides on cecal parameters and the concentrations of enteric bacteria in the ceca of Salmonella-challenged broiler chicks. Poult. Sci. 79: 205-211.

Staykov, Y., S. Denev and P. Spring. 2005a. The effects of mannan oligosaccharide (Bio-Mos) on the growth rate and immune function of rainbow trout (Salmo gairdneri irideus G.) growth in net cages, pp. 427-428. In Howell, B. and R. Flos, eds. Lessons from the past to optimise the future. European Aquaculture Society, Special Publication No.35. June 2005.

123

______. 2005b. The effects of mannan oligosaccharide (Bio-Mos) on the growth rate and immune function of rainbow trout (Salmo gairdneri irideus G.) growth in raceways, pp. 429-430. In Howell, B. and R. Flos, eds. Lessons from the past to optimise the future. European Aquaculture Society, Special Publication No.35. June 2005.

______. 2005c. Influence of dietary mannan oligosaccharides (Bio-Mos) on growth rate and immune function of common carp (Cyprinus carpio L), pp. 431-432. In Howell, B. and R. Flos, eds. Lessons from the past to optimise the future. European Aquaculture Society, Special Publication No.35. June 2005.

, P. Spring, S. Denev and J. Sweetman. 2007. Effects of mannan oligosaccharide on the growth performance and immune status of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 15: 153-161.

Stelzar, A. and G. Stein. 1971. Moglichkikten zur hamolytishchen Aktivitatsmessung von Gesamtkomplement Theoretische Grundlangen und methodische Hinweise. Wissenschaftliche Zeitschrift der Friedrich Schiler Universitat Uena. Mathematisch Naturwissenschaftlische Reihe 20, Jg H6: 933-941.

Swanson, K. S., C. M. Grieshop, E. A. Flickinger, L. L. Bauer, H. P. Healy, K. A. Dawson, N. R. Merchen and G. C. Fahey, Jr. 2002. Supplemental fructooligosaccharides and mannanoligosaccharides influence immune function, ileal and total tract nutrient digestibilities, microbial populations and concentrations of protein catabolites in the large bowel of dogs. Nutrition : 980-989

Terre, M., M. A. Calvo and C. Adelantado. 2007. Effects of mannan oligosaccharides on performance and microorganism fecal counts of calves following an enhanced-growth feeding program. Anim. Feed Sci. Technol. 137: 115-125.

124

Terova, G., A. Forchino, S. Rimoldi, F. Brambilla, M. Antonini and M. Saroglia. 2009. Bio-Mos®: An effective inducer of dicentracin gene expression in European sea bass (Dicentrarchus labrax). Comp. Biochem. Physiol. 153: 372-377.

Torrecillas, S. and M. S. Izquierdo. 2006. The effect of Bio-Mos on European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles: growth performance and feed utilization, pp. 91. In Lyons, T. P., K. A. Jacques and J. M. Hower, eds. Proceedings of Alltech’s 22nd Annual Symposium April 23-26, 2006. Abstracts of Posters Presented. Lexington, KY, USA.

, A. Makol, M. J. caballero, D. Montero and R. Gines. 2010. Improved feed utilization, intestinal mucus production and immune parameters in sea bass (Dicentrarchus labrax) fed mannan oligosaccharides (MOS). Aquaculture Nutrition. Blackwell Publishing Ltd. Cited Sandberg, T., M. Nestor, C. Pahlson, L. Shi and K. D. Caldwell. 2000. Mucin as surface protectant against bacterial adhesion. Abstr. Pap. Am. Chem. Soc. 220: 35.

______, L. Robaina, F. Real, J. Sweetman, L. Tort and M.S. Izquierdo. 2007. Immune stimulation and improved infection resistance in European sea bass (Dicentrarchus labrax) fed mannan oligosaccharides. Fish Shellfish Immunol. 23: 969-981.

Turner, M. W. 1996. Mannose-binding lectin: the pluropotent molecule of the innate immune system. Immunol. Today. 17: 532-540.

125

, 2003. The role of mannose-binding lectin in health and disease. Mol. Immunol. 40: 423-429.

Vesna, T., M. Lazarevic, Z. Sinovec and A. Tokic. 2007. The influence of different feed additives to performances and immune response in broiler chicken. Acta Vet. 57: 217-229.

Wallker, G. M. 1998. Yeast Physiology and Biotechnology. John Willey & Sons Ltd. Chichester, England.

Warr, G. W. 1995. The immunoglobulin gene of fish. Dev. Comp. Immunol. 19: 1-12.

Wen, Y., J. Z. Shao, L. X. Xiang and W. Fang. 2006. Cloning, characterization and expression analysis of two Tetraodon nigroviridis interleukin-16 isoform genes. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 144: 159-166.

White, L. A., M. C. Newman, G. L. Cromwell and M. D. Lindemann. 2002. Brewers dried yeast as a source of mannan oligosaccharides for weanling pigs. J. Anim. Sci. 80: 2619-2628.

Whyte, S. K. 2007. The innate immune response of finfish. Fish Shellfish Immunol. 23: 1127-1151.

Wright, S. D., S. M. Levine, M. C. T. Jong, Z. Chad and L. G. Kabbash. 1989. CR3 (CD11b}CD18) expresses one binding site for Arg-Gly-Asp-containing peptides and a second site for bacterial lipopolysaccharide. J. Exp. Med. 169: 175-183.

126

Yilmaz, E., M. A. Genc and E. Genc, 2007. Effects of dietary mannan oligosaccharides on growth, body composition, and intestine and liver histology of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 59: 182–188.

Yoakim, E. G. and J. M. Grizzle. 2006. Ultrastructure of alarm substance cells in the epidermis of the channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). J. Fish. Biol. 20: 213-221.

Yoshida, T., R. Kruger and V. Inglis. 1995. Augmentation of nonspecific protection in African catfish, Clarias gariepinus (Burchell), by the long-term oral-administration of immunostimulants. J. Fish Dis. 18: 195–198.

Zarkadis, I. K., D. Mastellos and J. D. Lambris. 2001. Phylogenetic aspects of the complement system. Dev. Comp. Immunol. 25: 745-762.

Zou, J., J. Holland, O. Pleguezuelos, C. Cunningham and C. J. Secombes. 2000. Factors influencing the expression of interleukin-1β in culture rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) leukocytes. Dev. Comp. Immunol. 24: 575-582. ภาคผนวก

128

การเตรียมสารในการวิเคราะห์ค่า Antibody titer

วัคซีน (Formalin-killed vaccine)

อปกรณ์และสารเคมีุ

1. เซลล์ของแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ทีTผานการทดสอบแล้วว่ าเป็นเชื่ NอทีTทําให้ เกิดโรค 2. สารละลายฟอร์มาลิน (Formalin solution) 2 ความเข้มข้น คือ - ความเข้มข้น 0.1% (ใช้สําหรับเกบรักษาวัคซีนทีTเตรียมแล้ว)็ - ความเข้มข้น 1.0% (ใช้สําหรับฆาเชื่ Nอแบคทีเรียให้ตาย) 3. เครืTองปัTนเหวีTยง (Centrifuge) 4. Test tube และ Volumetric flasks 5. อาหารเลีNยงเชืNอ (TSA และ TSB) 6. สารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว

วิธีการทดลอง

1. นําเชืNอ (Streptococcus agalactiae) ทีTตรวจยืนยันชนิดแล้วมาเลีNยงในอาหารเลีNยงเชืNอ TSB เป็นเวลา 18-24 ชัวโมงT 2. หลังเชืNอเจริญแล้วจึงนําไปปัTนเหวีTยง 2,500 รอบตอนาที่ เป็นเวลา 15 นาที 3. เทส่วนใสออก แล้วล้างออกด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอ แล้ว 4. นําไปปัTนเหวีTยงอีกครัNง ทีT 2,500 รอบตอนาที่ เป็นเวลา 15 นาที 5. ทําในขัNนตอนทีT 3 และ 4 อีก 2 ครัNง 6. ใส่สารละลายฟอร์มาลินความเข้มข้น 1.0% เพืTอเป็นการฆาเชื่ Nอ 7. นําสารละลายเชืNอทีTถูกฆาแล้วนําไป่ Streak บน TSA เพืTอตรวจยืนยันวาเชื่ Nอตายสมบูรณ์ แล้ว โดยระยะเวลาการตรวจบนอาหารเลีNยงเชืNอใช้เวลา 1 คืน จึงเกบสารละลายเชื็ Nอไว้ทีT 4 องศา- เซลเซียส ก่อน

129

8. ตรวจผลการเจริญบน TSA ถ้าไมพบเชื่ NอเจริญแสดงวาวัคซีนทีTได้เหมาะสมจะนําไปใช้่ ตอ่ หากมีเชืNอเจริญ ต้องนํากลับไปฆาด้วยฟอร์มาลินอีกครั่ Nง 9. กรณีไมมีเชื่ NอขึNน ให้นําวัคซีนทีได้ล้างด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการ่ ฆาเชื่ Nอแล้ว นําไปปัTนทีT 2,500 รอบตอนาที่ เป็นเวลา 15 นาที 2-3 ครัNง จึงนํา Formalin-killed vaccine ทีTได้ไปใช้ หากวัคซีนทีTได้มีความเข้มข้นสูงเกินไปต้องปรับความเข้มข้น ให้มีระดับความเข้มข้น 109 CFU/ml ซึTงเป็นความเข้มข้นทีTจะใช้ในสัตว์ทดลองและสําหรับทํา Antibody titer และถ้า ต้องการเกบวัคซีนไว้นาน็ ๆ ให้เกบโดยการเติม็ 0.1% Formalin ลงไปแตก่ ่อนนํามาใช้ทุกครัNงต้อง ล้างด้วยสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้วก่อน

การเตรียมสารเคมีในการวิเคราะห์กิจกรรมการจับกินสิMงแปลกปลอมของเซลล์เม็ดเลือดขาว (Phagocytic activity)

1. Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 ประกอบด้วย - NaCl 8.0 กรัม - KCl 0.2 กรัม

- Na2H2PO4.2H2O 1.44 กรัม

- KH2PO4 0.24 กรัม

นําส่วนผสมทัNงหมดละลายด้วยนํNากลันT ปรับปริมาตรให้ได้ 800 มิลลิลิตร จากนัNนนําไป ปรับ pH ด้วย HCl หรือ NaOH เพืTอให้ได้คา่ pH=7.4 จากนัNนนําไปฆาเชื่ Nอด้วยเครืTองนึTงภายใต้ ความดันสูง (Autoclave)

2. สารละลายยีสต์ (Heat-killed yeast) Baker’s yeast 0.5 กรัม สารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.9% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว 250 มิลลิลิตร

เติมยีสต์ลงไปในสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.9% ทีTผานการฆ่ าเชื่ Nอ คนให้เข้ากนแล้วั นําไปต้มเป็นเวลานาน 1 ชัวโมงT จากนัNนนําไปปัTนล้างด้วยสารละลาย PBS ทีTความเร็ว 2,000 รอบตอ่ นาที เป็นเวลา 10 นาที จํานวน 3 ครัNง จากนัNนปรับความเข้มข้นของเซลล์ยีสต์ให้ได้เทาก่ บั 108 เซลล์ ตอมิลลิลิตร่

130

- การเตรียมสารเคมีในการวิเคราะห์ Superoxide anion (O2 )

1. Nitrotetrazolium blue chloride (NBT) ละลาย NBT 1 มิลลิกรัมด้วย PBS pH 7.4 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เกบไว้ในทีTทึบแสง็ 2. 2N KOH ละลาย KOH 112.22 กรัม ในนํNากลันทีTผT านการฆ่ าเชื่ Nอแล้วปริมาตร 1 ลิตร 3. 70% Ethanol ผสม 100% Ethanol ปริมาตร 70 มิลลิลิตรกบนํั NากลันทีTผT านการฆ่ าเชื่ Nอแล้วปริมาตร 30 มิลลิลิตร

การคํานวณปริมาณเม็ดเลือด (Total hemocytes count)

ปริมาตรของ Hemacytometer = กว้าง x ยาว x สูง = 1 มม. x 1 มม. x 0.1 มม. = 0.1 มม.3 จํานวนเซลล์เม็ดเลือด/ มม.3 = เซลล์เม็ดเลือดทีTนับได้ จํานวนเซลล์เม็ดเลือด/ มล.3 = เซลล์เม็ดเลือดทีTนับได้ x 104 x คา่ dilution

การเตรียมสารเคมีทีMใช้สําหรับงานทางด้านอณชีวโมเลกู ลุ

1. 1.5% Agarose Gel

ชังT Agarose ใส่บัฟเฟอร์ TBE (1X) ให้ได้ความเข้มข้น 1.5% ต้มจนละลายเป็นเนืNอ เดียวกนั ทิงให้เย็นจนอุณหภูมิประมาณN 60 องศาเซลเซียส จากนัNนนําไปเทลงบน Gel chamber ทีTมี Comb อยูแล้ว่ วางทิงไว้ประมาณN 1 ชัวโมงจนกระทัT งเจลแข็งตัวจึงดึงT Comb ออก

131

2. 10X MOP Buffer

200 mM [N-Morpholino] proprapane sulfonic acid 50 mM Sodium acetate 10 mM EDTA

ปรับ pH ให้ได้เทาก่ บั 6.5-7.0 ด้วย NaOH

3. 5X TBE (Tris-Borate-EDTA) ปริมาตร 1000 มิลลิลิตร

Tris base 54.0 กรัม Boric acid 27.5 กรัม EDTA (pH 8.0) 20.0 กรัม

ปรับปริมาตรให้ได้ 1,000 มิลลิลิตร แล้วจึงนําไปฆาเชื่ Nอด้วยหม้อนึTงความดันไอทีT อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลานาน 20 นาที

4. Marker 100 bp ปริมาตร 60 ไมโครลิตร

100 bp DNA Ladder plus (Fermentas) 10 ไมโครลิตร 6X Loading dye solution 10 ไมโครลิตร Distilled water 40 ไมโครลิตร

5. 10X Loading dye Ficol 400 7.5 กรัม Bromphenol blue 0.125 กรัม เติมนํNากลันทีTผT านการฆ่ าเชื่ Nอแล้ว 50.0 มิลลิลิตร

132

ประวัติการศึกษาและการทํางาน

ชืTอ นางสาวจิณณพัต สํารองพันธุ์ เกิดวันทีT 13 กรกฎาคม 2527 สถานทีTเกิด อําเภอเมือง จังหวัดนครพนม ประวัติการศึกษา วท.บ. (ประมง) มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ตําแหน่งปัจจุบัน - สถานทีTทํางานปัจจุบัน - ผลงานดีเด่นและ/หรือรางวัลทางวิชาการ - ทุนการศึกษาทีTได้รับ -