Tese Final Helton Colares Da Silva
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA HELTON COLARES DA SILVA CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E BIOLÓGICA DAS LECTINAS DE SEMENTES DE Parkia biglobosa (Jacq.) Benth e Vatairea guianensis Aublet. FORTALEZA 2013 HELTON COLARES DA SILVA CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E BIOLÓGICA DAS LECTINAS DE SEMENTES DE Parkia biglobosa (Jacq.) Benth e Vatairea guianensis Aublet. Tese de Doutorado submetida à Coordenação do Curso de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada FORTALEZA 2013 HELTON COLARES DA SILVA CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E BIOLÓGICA DAS LECTINAS DE SEMENTES DE Parkia biglobosa (Jacq.) Benth e Vatairea guianensis Aublet. Tese submetida à coordenação do curso de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica. Aprovada em 21 de junho de 2013. A Minha Família, fonte inesgotável de amor, compreensão e força, Dedico. AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida e por ter me concedido paz, saúde e força para superar os obstáculos e seguir sempre em frente. Ao meu orientador, o Professor Dr. Benildo Sousa Cavada, por ter me aberto as portas do BioMol-Lab, por ter acreditado no meu potencial e no meu trabalho e, principalmente, pela orientação e ensinamentos, fundamentais não só para a conclusão deste trabalho, mas para toda minha vida. Ao Professor Celso S. Nagano pela Co-orientação na realização deste trabalho e pelos valiosos conhecimentos transmitidos durante o convívio no laboratório. Aos Professores Plínio Delatorre e Alana Freitas Pires pelos conselhos e por terem aceitado julgar esse trabalho de tese tão prontamente. A Coordenação de Aperfeçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio finaceiro. A Professora Ana Maria Sampaio Assereuy e a toda equipe do LAFFIN (UECE), em especial a aluna de mestrado Gabriela Fernades, pela valiosa colaboração para a realização e êxito deste trabalho. Aos todos os professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – UFC, pelos valiosos ensinamentos que me proporcionaram ao longo do curso. Ao Professor Bruno Anderson Matias da Rocha e a Professora Beatriz Tupinambá Freitas por terem me iniciado nesse vasto mundo da pesquisa e por todos os ensinamentos, carinho e atenção que sempre teve comigo. A Alfa Umaro Bari pela amizade e pela contribuição direta para o sucesso desse trabalho. Aos meus amigos, companheiros e colegas de trabalho do Biomol, Raquel, Ito, Mayron, Eduardo, Bruno Lopes e Claudener pelo convívio e aprendizado, dentro e fora do laboratório, no decorrer desses anos. Aos demais integrantes do BioMol-Lab, Profa. Kyria, Prof. Edson, Alysson, Sâmia, Arthur, Raphael, Guilherme, Fernando, Maria Júlia, Batista, Cintia, Suzete, Jeferson, Mayara Torquato, Ronniery, Mayara Queiroz, Vanir, Vinícius, Claudia, e todos os demais que compõe o BioMol-Lab que contribuíram durante esta caminhada e a quem aprendi a ter um grande carinho. Aos meus dois grandes amigos desde os tempos de URCA, Pereira Júnior e Camila, pelos que sempre estiveram comigo de insentivando e apoiando durante toda esta caminhada. Aos Irmãos que conquistei aqui em Fortaleza, Rafael Simões e Rômulo Farias, com quem compartilhei muitas angustias e também muitas vitórias ao longo de todos estes anos de trabalho. A todos os amigos que conquistei ao longo da minha vida e que, apesar de estarem longe, sempre estiveram comigo. Palavras jamais irão descrever tudo que eu tenho a agradecer a minha família, minha mãe Meirilucia, meu pai Antônio, às minhas outras duas mães Raimunda e Eloide, minha esposa Ana Márcia e minha filhinha Mariany, que sempre me deram todo o suporte em amor, compreensão, paciência e força durante essa fase e sem os quais eu não conseguiria atingir meus objetivos. Muito Obrigado... “Chamamos de Ética o conjunto de coisas que as pessoas fazem quando todos estão olhando. O conjunto de coisas que as pessoas fazem quando ninguém está olhando chamamos de Caráter” Oscar Wilde LISTA DE SIGLAS ABU : ácido aminobutírico PAL : Lectina de Pterocarpus angolensis ACA : Lectina de Amaranthus caudatus PBL: Lectina de Parkia biglobosa AFAL: Preteina semelhante a lectina de PDB : Protein Data Bank Acacia farnesiana. PEG: Polietilenoglicol BSA : Albumina Sérica Bovina PEL : Lectina de Platypodium elegans CID: Dissociação induzida por colisão pH : Logaritmo negativo da concentração ConA : Lectina de sementes de Canavalia de íons de hidrogênio ensiformes PHA : Lectina de Phaseolus vulgaris ConBr : Lectina de Canavalia brasisliensis PPL-1: Lectina 1 de Parkia platyceplala Da: Dalton PPL2 : Lectina 2 de Parkia platyceplala 2 DDA: Análise Direta de Dados PPL2 : Lectina de Parkia platyceplala 2 EDA: Etileno diacrilato RIPs: Proteína inativadora de ribossomo EDTA : Ácido Etilenodiaminotetraácido RPA: Lectina de Robinia peseudoacacia ESI : Ionização por Electrospray s.c.: Injeção Subcutânea fMLP : N-formil-metionil-leucil-fenilanina SDS-PAGE : Eletroforese em gel de GlcNAc: N-Acetilglicosamina poliacrilamida em presença de Dodecil GNA : Lectina de Galanthus nivalis Sulfato de Sódio HPLC : Cromatografia Líquida de Alto SJA: Lectina de Sophora japônica Desempenho (High Performance Liquid TEMED: N-N-N´-N´-tetrametilenodiamina Chromatography) TxLCI : Lectina do bulbo de tulipa IFN-γ: Interferon gama U.H.: Unidade Hemaglutinante kDa : Kilodalton VGL: Lectina de Vatairea guianensis kV: Kilovolt VML : Lectina de Vatairea macrocarpa m/z : Relação massa/carga MIC : Concentração Mínima Inibitória MS/MS: Espectrometria de massa em sequencial MS : Espectrometria de Massa NCBI - Nacional Center of Biotechnology Information NO : Óxido Nítrico NOS : Enzimas Óxido Nítrico Sintases LISTA DE TABELAS Tabela 01: Membros da subfamília Mimosoideae com dos quais lectinas foram isoladas e caracterizadas ............................................................................................................... 33 Tabela 02: Membros da tribo Dalbergieae com dos quais lectinas foram isoladas e caracterizadas ................................................................................................................. 36 Tabela 03: Atividade hemaglutinante no extrato total das sementes de P. biglobosa ......................................................................................................................................... 65 Tabela 04: Inibição da atividade hemaglutinante no extrato total de sementes de P. biglobosa por carboidratos ............................................................................................ 66 Tabela 05: Tabela de Purificação da Lectina de Sementes de P. biglobosa ............. 68 Tabela 06. Estatística da coleta de dados de difração de raios X ............................... 79 Tabela 07: Tabela de Purificação da Lectina de Sementes de V. guianensis ............ 97 Tabela 08: Sequência de aminoácidos dos peptídeos da lectina de sementes de V. guianensis com suas respectivas massas experimentais e calculadas. ....................... 100 LISTA DE FIGURAS Figura 01. Classificação estrutural das lectinas vegetais. Representação esquemática de merolectinas (Heveína; PDB: 1Q9B), hololectinas (Com-Br; PDB: 3JU9), quimerolectinas (Ricina; PDB: 1RZO) e superlectinas (TxLC-1 ............................... 26 Figura 2. Classificação das Lectinas Vegetais . (A) Lectinas de leguminosas, Canavaila ensiformis (Con-A); (B) Lectina ligante à quitina compostas por domínios heveínicos, Heveína; (C) Lectina de monocotiledôneas ligantes à manose , Galanthus nivalis agglutinina (GNA); (D) RIP´s do tipo II, Ricina; (E) Lectinas relacionadas às Jacalinas, Artocarpus integrifolia (Jacalina); (F) Lectina da família da amarantina, Amaranthus caudatus (ACA). Fonte: PDB .................................................................. 28 Figura 03. Estrutura tridimensional da Lectina PPL-1. (A) Estrutura cristalográfica de PPL1 nativa (PDB: 1ZGR); (B) Estrutura cristalográfica de PPL1 complexada com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-manose (PDB: 1ZGS ................................................. 34 Figura 04. Estrutura tridimensional de lectinas de Dalbergieae . (A) Estrutura cristalográfica de PAL complexada com D-manose (PDB: 2ARE); (B) Estrutura cristalográfica PELa complexada com um trimanosídeo (PDB: 3ZVX ..................... 38 Figura 05. Parkia biglobosa Jacq. (A) Vagem com sementes; (B) Ramos com inflorescências; (C) Visão geral de uma árvore ........................................................... 51 Figura 06. Purificação da Lectina PBL. (A) Perfil de eluição da cromatografia de afinidade em Sephadex-G100. Aproximadamente 10 mL da fração 0-60% solubilizada em Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7.6 com NaCl 150mM foram aplicados em uma coluna de Sephadex-G100 (12,0 X 2,0 cm) previamente equilibrada com a mesma solução. A fração não retida (PI) foi removida com o tampão de equilíbrio, enquanto que, a fração retida (PII) foi eluida com solução de equilíbrio contendo D-glicose 200 mM. Frações de aproximadamente 2,5 mL foram coletadas manualmente e analisadas por espectrofotometria com leitura a 280 nM. (B) SDS-PAGE. Poços: 1- Marcadores moleculares (Beta galactosidade 120 kDa, BSA 85 kDa, Ovoalbumina 50 kDa, Anidrade Carbônica 35 kDa e Beta- lactoalbumina 25 kDa; Lisozima 20 kDa). 2- PBL em condições não redutoras. 3- PBL em condições redutoras .................................... 67 Figura 07: Propriedades físico-químicas