UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

HELTON COLARES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E BIOLÓGICA DAS LECTINAS DE SEMENTES DE Parkia biglobosa (Jacq.) Benth e Vatairea guianensis Aublet.

FORTALEZA 2013

HELTON COLARES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E BIOLÓGICA DAS LECTINAS DE SEMENTES DE Parkia biglobosa (Jacq.) Benth e Vatairea guianensis Aublet.

Tese de Doutorado submetida à Coordenação do Curso de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada

FORTALEZA 2013

HELTON COLARES DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E BIOLÓGICA DAS LECTINAS DE SEMENTES DE Parkia biglobosa (Jacq.) Benth e Vatairea guianensis Aublet.

Tese submetida à coordenação do curso de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Bioquímica.

Aprovada em 21 de junho de 2013.

A Minha Família, fonte inesgotável de amor, compreensão e força,

Dedico.

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida e por ter me concedido paz, saúde e força para superar os obstáculos e seguir sempre em frente.

Ao meu orientador, o Professor Dr. Benildo Sousa Cavada, por ter me aberto as portas do BioMol-Lab, por ter acreditado no meu potencial e no meu trabalho e, principalmente, pela orientação e ensinamentos, fundamentais não só para a conclusão deste trabalho, mas para toda minha vida.

Ao Professor Celso S. Nagano pela Co-orientação na realização deste trabalho e pelos valiosos conhecimentos transmitidos durante o convívio no laboratório.

Aos Professores Plínio Delatorre e Alana Freitas Pires pelos conselhos e por terem aceitado julgar esse trabalho de tese tão prontamente.

A Coordenação de Aperfeçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio finaceiro.

A Professora Ana Maria Sampaio Assereuy e a toda equipe do LAFFIN (UECE), em especial a aluna de mestrado Gabriela Fernades, pela valiosa colaboração para a realização e êxito deste trabalho.

Aos todos os professores do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – UFC, pelos valiosos ensinamentos que me proporcionaram ao longo do curso.

Ao Professor Bruno Anderson Matias da Rocha e a Professora Beatriz Tupinambá Freitas por terem me iniciado nesse vasto mundo da pesquisa e por todos os ensinamentos, carinho e atenção que sempre teve comigo.

A Alfa Umaro Bari pela amizade e pela contribuição direta para o sucesso desse trabalho.

Aos meus amigos, companheiros e colegas de trabalho do Biomol, Raquel, Ito, Mayron, Eduardo, Bruno Lopes e Claudener pelo convívio e aprendizado, dentro e fora do laboratório, no decorrer desses anos.

Aos demais integrantes do BioMol-Lab, Profa. Kyria, Prof. Edson, Alysson, Sâmia, Arthur, Raphael, Guilherme, Fernando, Maria Júlia, Batista, Cintia, Suzete, Jeferson, Mayara Torquato, Ronniery, Mayara Queiroz, Vanir, Vinícius, Claudia, e todos os demais que

compõe o BioMol-Lab que contribuíram durante esta caminhada e a quem aprendi a ter um grande carinho.

Aos meus dois grandes amigos desde os tempos de URCA, Pereira Júnior e Camila, pelos que sempre estiveram comigo de insentivando e apoiando durante toda esta caminhada.

Aos Irmãos que conquistei aqui em Fortaleza, Rafael Simões e Rômulo Farias, com quem compartilhei muitas angustias e também muitas vitórias ao longo de todos estes anos de trabalho.

A todos os amigos que conquistei ao longo da minha vida e que, apesar de estarem longe, sempre estiveram comigo.

Palavras jamais irão descrever tudo que eu tenho a agradecer a minha família, minha mãe Meirilucia, meu pai Antônio, às minhas outras duas mães Raimunda e Eloide, minha esposa Ana Márcia e minha filhinha Mariany, que sempre me deram todo o suporte em amor, compreensão, paciência e força durante essa fase e sem os quais eu não conseguiria atingir meus objetivos.

Muito Obrigado...

“Chamamos de Ética o conjunto de coisas que as pessoas fazem quando todos estão olhando. O conjunto de coisas que as pessoas fazem quando ninguém está olhando chamamos de Caráter”

Oscar Wilde

LISTA DE SIGLAS

ABU : ácido aminobutírico PAL : Lectina de Pterocarpus angolensis ACA : Lectina de Amaranthus caudatus PBL: Lectina de Parkia biglobosa AFAL: Preteina semelhante a lectina de PDB : Protein Data Bank Acacia farnesiana. PEG: Polietilenoglicol BSA : Albumina Sérica Bovina PEL : Lectina de Platypodium elegans CID: Dissociação induzida por colisão pH : Logaritmo negativo da concentração ConA : Lectina de sementes de Canavalia de íons de hidrogênio ensiformes PHA : Lectina de Phaseolus vulgaris ConBr : Lectina de Canavalia brasisliensis PPL-1: Lectina 1 de Parkia platyceplala Da: Dalton PPL2 : Lectina 2 de Parkia platyceplala 2 DDA: Análise Direta de Dados PPL2 : Lectina de Parkia platyceplala 2 EDA: Etileno diacrilato RIPs: Proteína inativadora de ribossomo EDTA : Ácido Etilenodiaminotetraácido RPA: Lectina de Robinia peseudoacacia ESI : Ionização por Electrospray s.c.: Injeção Subcutânea fMLP : N-formil-metionil-leucil-fenilanina SDS-PAGE : Eletroforese em gel de GlcNAc: N-Acetilglicosamina poliacrilamida em presença de Dodecil GNA : Lectina de Galanthus nivalis Sulfato de Sódio HPLC : Cromatografia Líquida de Alto SJA: Lectina de Sophora japônica Desempenho (High Performance Liquid TEMED: N-N-N´-N´-tetrametilenodiamina Chromatography) TxLCI : Lectina do bulbo de tulipa IFN-γ: Interferon gama U.H.: Unidade Hemaglutinante kDa : Kilodalton VGL: Lectina de Vatairea guianensis kV: Kilovolt VML : Lectina de Vatairea macrocarpa m/z : Relação massa/carga MIC : Concentração Mínima Inibitória MS/MS: Espectrometria de massa em sequencial MS : Espectrometria de Massa NCBI - Nacional Center of Biotechnology Information NO : Óxido Nítrico NOS : Enzimas Óxido Nítrico Sintases

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Membros da subfamília Mimosoideae com dos quais lectinas foram isoladas e caracterizadas ...... 33

Tabela 02: Membros da tribo Dalbergieae com dos quais lectinas foram isoladas e caracterizadas ...... 36

Tabela 03: Atividade hemaglutinante no extrato total das sementes de P. biglobosa ...... 65

Tabela 04: Inibição da atividade hemaglutinante no extrato total de sementes de P. biglobosa por carboidratos ...... 66

Tabela 05: Tabela de Purificação da Lectina de Sementes de P. biglobosa ...... 68

Tabela 06. Estatística da coleta de dados de difração de raios X ...... 79

Tabela 07: Tabela de Purificação da Lectina de Sementes de V. guianensis ...... 97

Tabela 08: Sequência de aminoácidos dos peptídeos da lectina de sementes de V. guianensis com suas respectivas massas experimentais e calculadas...... 100

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Classificação estrutural das lectinas vegetais. Representação esquemática de merolectinas (Heveína; PDB: 1Q9B), hololectinas (Com-Br; PDB: 3JU9), quimerolectinas (Ricina; PDB: 1RZO) e superlectinas (TxLC-1 ...... 26

Figura 2. Classificação das Lectinas Vegetais . (A) Lectinas de leguminosas, Canavaila ensiformis (Con-A); (B) Lectina ligante à quitina compostas por domínios heveínicos, Heveína; (C) Lectina de monocotiledôneas ligantes à manose , Galanthus nivalis agglutinina (GNA); (D) RIP´s do tipo II, Ricina; (E) Lectinas relacionadas às Jacalinas, Artocarpus integrifolia (Jacalina); (F) Lectina da família da amarantina, Amaranthus caudatus (ACA). Fonte: PDB ...... 28

Figura 03. Estrutura tridimensional da Lectina PPL-1. (A) Estrutura cristalográfica de PPL1 nativa (PDB: 1ZGR); (B) Estrutura cristalográfica de PPL1 complexada com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-manose (PDB: 1ZGS ...... 34

Figura 04. Estrutura tridimensional de lectinas de Dalbergieae . (A) Estrutura cristalográfica de PAL complexada com D-manose (PDB: 2ARE); (B) Estrutura cristalográfica PELa complexada com um trimanosídeo (PDB: 3ZVX ...... 38

Figura 05. Parkia biglobosa Jacq. (A) Vagem com sementes; (B) Ramos com inflorescências; (C) Visão geral de uma árvore ...... 51

Figura 06. Purificação da Lectina PBL. (A) Perfil de eluição da cromatografia de afinidade em Sephadex-G100. Aproximadamente 10 mL da fração 0-60% solubilizada em Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7.6 com NaCl 150mM foram aplicados em uma coluna de Sephadex-G100 (12,0 X 2,0 cm) previamente equilibrada com a mesma solução. A fração não retida (PI) foi removida com o tampão de equilíbrio, enquanto que, a fração retida (PII) foi eluida com solução de equilíbrio contendo D-glicose 200 mM. Frações de aproximadamente 2,5 mL foram coletadas manualmente e analisadas por espectrofotometria com leitura a 280 nM. (B) SDS-PAGE. Poços: 1- Marcadores moleculares (Beta galactosidade 120 kDa, BSA 85 kDa, Ovoalbumina 50 kDa, Anidrade Carbônica 35 kDa e Beta- lactoalbumina 25 kDa; Lisozima 20 kDa). 2- PBL em condições não redutoras. 3- PBL em condições redutoras ...... 67

Figura 07: Propriedades físico-químicas de PBL. (A) Estabilidade térmica. (B) Estabilidade a variações de pH. (C) Efeito do EDTA e da adição de cátions sobre a atividade hemaglutinante ...... 70

Figura 08. Análise por Espectrometria de Massa com Ionização por Eletrospray. Espectro de massa deconvoluido mostrando a massa molecular média de PBL ...... 72

Figura 09. Estimativa da massa molecular nativa. A massa molecular nativa de PBL foi estimada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sílica Gel (TSK- GEL). Os padrões de massa molecular utilizados foram: (a) β-amilase 200 kDa, (b) Conalbumina 75 kDa, (c) Ovoalbumina 43 kDa, (d)Anidrase carbônica 29 kDa. PBL apresentou uma massa molecular estimada de aproximadamente 108 kDa ...... 72

Figura 10. Sequência de aminoácidos da PBL. A sequência de aminoácidos de PBL foi montada pela sobreposição das sequências de aminoácido de peptídeos, oriundos de digestões proteolíticas com Tripsina (T-), Quimiotripsina (C), Endoproteinase Asp-N (D-), Endoproteinase Glu-C (G), Termolisina (Th-) e Pepsina (P), determinadas por espectrometria de massa sequencial (MS/MS ...... 73

Figura 11. Peptídeos de isoformas de PBL. Espectros de MS/MS produzidos por CID de duas isoformas do Peptídeo T18. (A) Íon duplamente carregado com m/z 783.31 cuja serie de ions y mostra uma sequência interpretada como DTSGLDSATFGGVNPK e (B) Íon duplamente carregado com m/z 783.31 cuja serie de ions y mostra uma sequência interpretada como DTSGLDSGTFGGVNPK ...... 74

Figura 12. Alinhamento da sequência de aminoácidos de PPL-1 e PBL usando o programa ESPript 2.1 (Gouet et al., 2003) ...... 76

Figura 13. Cristais de PBL. (A) Pequenos cristais obtidos com a condição N° 45 do Screen II. (B) Cristal obtido após otimização desta condição ...... 78

Figura 14. Estrutura tridimensional porcial de PBL. A) Visão Geral do monômero de PBL . (B) Visão Geral do dímero de PBL ...... 80

Figura 15. Efeito antinociceptivo PBL administrada por via endovenosa no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético. PBL (0,01; 0,1 e 1,0 mg/Kg) administrada 30 min antes do ácido acético 0.6% (v/v; 0,1ml/10g peso corporal). Controles: ácido acético sem pré- tratamento com a PBL e indometacina (5 mg/kg; i.p.).

Dados representados como média ± E.P.M. (n=6-8). *p<0,05 em relação ao controle; #p<0.05 em relação a outras doses de PBL ...... 81

Figura 16. Efeito de PBL sobre a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos. PBL (1 mg/Kg, i.v.) foi administrada 30 min antes da (A) Carragenana (1 mg, i.p) ou do (B) fMLP (50 ng, i.p.). O controle negativo recebeu salina (i.p.) e o positivo recebeu apenas Carragenana ou fMLP (i.p.). Dados expressos como número de leucócitos/ mL de fluido peritoneal. ANOVA e teste de Bonferroni. # p<0,05 em relação à salina; * p<0,05 em relação à Carragenana ou fMLP ...... 83

Figura 17. Vatairea guianensis Jacq. (A) sementes; (B) Ramo com inflorescências; (C) Visão geral de uma árvore. Fonte: Silva (2011) ...... 87

Figura 18. Purificação da VGL. (A) Perfil de eluição da cromatografia de afinidade em goma de guar. Aproximadamente 10 mL da fração 0-60% solubilizada em NaCl 150mM foram aplicados em uma coluna de goma de guar (10,0 X 2,0 cm) previamente equilibrada com a mesma solução. A fração não retida (PI) foi removida com a solução de equilíbrio, enquanto que, a fração retida (PII) foi eluida com solução de equilíbrio contendo D-galactose 100 mM a um fluxo constante de aproximadamente 1 mL/mim. Frações de aproximadamente 2,5 mL foram coletadas manualmente e analisadas por espectrofotometria com leitura a 280 nm. (B) SDS-PAGE. Poços: 1- Marcadores moleculares (Fosforilase b 97 kDa, BSA 66 kDa, Ovoalbumina 45 kDa, Anidrade Carbônica 29 kDa e α- lactoalbumina 14,4 kDa). 2- VGL em condições não redutoras. 3- VGL em condições redutoras ...... 98

Figura 19. Análise por Espectrometria de Massa com Ionização por Eletrospray. Espectro de massa deconvoluido mostrando a massa molecular média das cadeias de VGL ...... 99

Figura 20. Sequência de aminoácidos da VGL. A sequência de aminoácidos de VGL foi montada pela sobreposição das sequências de aminoácido de peptídeos, oriundos de digestões proteolíticas com Tripsina (T-) e Quimiotripsina (C), determinadas por espectrometria de massa sequencial (MS/MS) ...... 101

Figura 21. Sequencia de aminoácidos do peptídeo T13. Espectro de MS/MS produzidos por CID do íon triplamente carregado com m/z 897,06 cuja serie de ions b foi utilizada para a determinação da sequência de aminoácidos...... 102

Figura 22: Alinhamento múltiplo entre as sequencias de aminoácidos das lectinas de V. guianensis (VGL), V. macrocarpa (VML), lectina de C. kentukea (CLALU), S . japonica (SJA) e R. pseudoacacia (RPA). Os números após as siglas representam os códigos de depósitos nos banco de dados...... 103

Figura 23 – Estrutura do heptassacarídeo comum em proteínas vegetais. Fonte: CHOI & LAURSEN, 2000...... 104

Figura 24. Estimativa da massa molecular nativa. A massa molecular nativa de PBL foi estimada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sílica Gel (TSK- GEL). Os padrões de massa molecular utilizados foram: (a) β-amilase 200 kDa, (b) lectina de sementes de Canavalia brasiliensis 100 kDa, (c) BSA 66 kDa e (d) inibidor de tripsina 21 kDa. VGL apresentou uma massa molecular estimada de aproximadamente 120 kDa...... 106

Figura 25: Efeito vasorrelaxante induzido por VGL. (A) Efeito relaxante da lectina VGL em aortas endotelizadas contraídas por fenilefrina. (B) Efeito de VGL sobre o tônus basal de aortas endotelizadas. (C) Reversão do efeito relaxante em aortas endotelizadas contraídas por fenilefrina pelo L-NAME. (D) Reversão do efeito relaxante pela incubação prévia de VGL com D-galactose. Resultados expressos como Média ± E.P.M. * p<0.05 em relação ao controle (100% de contração). #p<0,05 em relação à VGL...... 107

RESUMO

Lectinas são proteínas que contém pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversivelmente a mono ou oligossacarídeos específicos. Por serem capazes de “decifrar os glicocódigos” codificados na estrutura dos glicoconjugados, as lectinas são moléculas que possuem um grande potencial biotecnológico e despertam um grande interesse científico. As Lectinas de Leguminosas representam o grupo mais bem estudado, contudo a maioria dos estudos de lectinas de leguminosas tem envolvido membros da subfamília Papilionoideae, enquanto que investigações de lectinas de outras duas subfamílias, Caesalpinoideae e Mimosoideae, são escassas. Mesmo dentro da subfamília Papilionoideae, a grande maioria dos estudos com lectinas se concentram em membros da tribo Phaseoleae, prinicpalmente das subtribos Diocleinae e Vicieae, enquanto que as outras tribos desta subfamília ainda são pouco exploradas. Neste contexto, o presente trabalho descreve a caracterização estrutural e biológica das de duas novas lectinas purificadas de sementes de Parkia biglobosa (Subfamília Mimosoideae, tribo Parkiae) e Vatairea guianensis Aublet (Subfamília Papilionoideae, tribo Dalbergieae). Sementes de P. biglobosa possuem uma lectina (PBL) específica para manose/glicose que foi eficientemente purificada por cromatografia de afinidade em gel de Sephadex G-100. PBL é composta por uma cadeia polipeptídica única, não glicosilada e composta por três domínios relacionados a jacalina organizados em sequência. A lectina exibe atividade antiinflamatória que está associada à inibição da migração de leucócitos e uma atividade antiniciceptiva que pode estar associada à inibição da dor inflamatória. PBL foi cristalizada e os dados produzidos nos experimentos de difração do cristal por raios X possibilitarão a futura resolução da estrutura tridimensional desta proteína. Com relação a lectina específica para N-acetil- D-galactosamina/D-galactose presente nas sementes de V. guianensis (VGL) foi evidenciado que esta exibe similaridade de estrutura primária com outras lectinas isoladas de espécies de plantas taxonomicamente relacionadas, tais como lectinas isoladas da tribo Sophoreae e a lectina VML, com a qual VGL compartilha o mesmo processamento pós- traducional. Além disso, ficou evidente que VGL exibe um efeito vasorrelaxante in vitro em aortas de ratos, sendo que este efeito é dependente da presença de endotélio, envolve a participação do óxido nítrico e é mediado pelo sítio de ligação a carboidratos da lectina.

Palavras Chave: Lectina , Parkia biglobosa , Vatairea guianensis , Espetrometria de Massas, Atividades Biológicas.

ABSTRACT

Lectins are defined as structurally heterogeneous proteins of non-immune origin, possessing at least one non-catalytic domain by which they reversibly bind to specific mono- or oligosaccharides. By deciphering the codes present in the glycan structure, lectins are attracting increasing interest in biotechnology. The most studied group of carbohydrate-binding proteins consists of lectins purified from species of the Leguminosae family. Among the studies of the lectins from Leguminosae. many are focused on members of the Papilionoideae subfamily, while investigations of lectins of the other two subfamilies, Caesalpinioideae and Mimosoideae, are scarce. Even within the subfamily Papilionoideae, the vast majority of studies focus on lectins from Phaseoleae and Vicieae tribes, while the other tribes of this subfamily are still poorly explored. In this context, this work describes the structural and biological characterization of two new lectins purified from seeds of Parkia biglobosa (Mimosoideae subfamily, tribe Parkiae) and Vatairea guianensis Aublet (subfamily Papilionoideae, tribe Dalbergieae). P. biglobosa seeds (subfamily Mimosoidae) possess mannose/glucose-specific lectin (PBL) that was purified by affinity chromatography on a Sephadex G-100 column. PBL is composed by a single nonglycosylated polypeptide chain of three tandemly arranged jacalin-related domains and showed important antinociceptive activity associated to the inhibition of inflammatory process. PBL was crystallized and the data produced in the X-ray diffraction experiments will enable the future resolution three-dimensional structure of this protein. With respect to the N- acetyl-D-galactosamine/D-galactose specific lectin present in the V. guianensis seeds (VGL) was demonstrated that this protein presents high similarity in primary structure to other lectins from evolutionarily related plants, such as VML and lectins belonging to the Sophoreae tribe. VGL exhibits vasorelaxant activity in contracted rat aortas, an effect that is strictly dependent on the endothelium and involves NO and the lectin domain.

Key words: Lectin , Parkia biglobosa , Vatairea guianensis , Mass Spectrometry, Biological activities.

SUMÁRIO

1. CAPITULO 01: FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...... 20 1.1. Considerações Gerais ...... 21 1.2. Lectinas Vegetais...... 23 1.2.1. Breve Histórico e Definição ...... 23 1.2.2. Classificação Estrutural das Lectinas Vegetais ...... 25 1.2.3. Distribuição das Lectinas nos Vegetais ...... 27 1.2.4. Lectinas de Leguminosas ...... 30 1.2.5. Lectinas da Subfamília Mimosoideae ...... 33 1.2.6. Lectinas da Tribo Dalbergieae...... 35 1.3. Atividades Biológicas de Lectinas Vegetais ...... 38 1.3.1. Atividade Vasorrelaxante de lectinas Vegetais...... 39 1.3.1.1. Aspectos Gerais da Contratilidade ...... 39 1.3.1.2. Lectinas Vegetais com Efeito Vasorrelaxante ...... 40 1.3.2. Atividade Antiinflamatória de lectinas Vegetais...... 41 1.3.2.1. Aspectos Gerais do Processo Inflamatório ...... 41 1.3.2.2. Lectinas Vegetais com Efeito Anti-inflamatória ...... 43 1.3.3. Atividade Antinociceptiva de lectinas Vegetais...... 44 1.3.3.1. Aspectos Gerais da Nocicepção ...... 44 1.3.3.2. Lectinas Vegetais com Efeito Antinociceptivo ...... 46 2. CAPITULO 02: PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE PARKIA BIGLOBOSA COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVA E ANTIINFLAMATÓRIA ...... 49 2.1. INTRODUÇÃO ...... 50 2.2. OBJETIVOS ...... 52 2.2.1. Objetivo Geral ...... 52 2.2.2. Objetivos Específicos ...... 52 2.3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 53 2.3.1. Purificação da Lectina de Sementes de Parkia biglobosa ...... 53 2.3.1.1. Extração Protéica ...... 53

2.3.1.2. Fracionamento Proteico do Extrato Total ...... 53 2.3.1.3. Cromatografia de Afinidade em Gel de Sephadex-G100 ...... 53 2.3.1.4. Dosagem de Proteínas Solúveis...... 54 2.3.1.5. Detecção de Atividade Hemaglutinante ...... 54 2.3.1.6. Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica ...... 54 2.3.1.7. Especificidade por Carboidratos...... 55 2.3.1.8. Eletrofores em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS ...... 55 2.3.2. Caracterização Físico-qumímica de PBL...... 56 2.3.2.1. Efeito da Temperatura Sobre a Atividade Hemaglutinante ...... 56 2.3.2.2. Efeito do pH Sobre a Atividade Hemaglutinante ...... 56 2.3.2.3. Efeito do EDTA Sobre a Atividade Hemaglutinante ...... 57 2.3.2.4. Análise da Presença de Carboidratos Estruturais ...... 57 2.3.2.5. Determinação da Massa Molecular por Espectrometria de Massas ...... 57 2.3.2.6. Estimativa da Massa Molecular Nativa ...... 58 2.3.3. Determinação da Estrutura Primária de PBL ...... 58 2.3.3.1. Digestão Proteolítica in gel e Obtenção de Peptídeos...... 58 2.3.3.2. Sequenciamento dos Peptídeos por Espectrometria de Massa Sequencial (MS/MS) ...... 59 2.3.3.3. Análise da Estrutura Primária ...... 60 2.3.4. Cristalografia de Raios X ...... 61 2.3.4.1. Cristalização de PBL ...... 61 2.3.3.2. Difração e Coleta de Dados ...... 62 2.3.5. Avaliação das Atividades Antinociceptiva e Atiinflamatória de PBL ...... 62 2.3.5.1. Animais ...... 62 2.3.5.2. Avaliação do efeito de PBL no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético...... 63 2.3.5.3. Avaliação do efeito de PBL no teste de Peritonite...... 63 2.3.5.4. Análise Estatística ...... 64 2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 65 2.4.1. Purificação da Lectina de Sementes de Parkia biglobosa ...... 65

2.4.2. Caracterização Físico-química de PBL ...... 68 2.4.3. Determinação da Estrutura Primária de PBL ...... 73 2.4.4. Cristalografia de Raios X ...... 77 2.3.5. Avaliação das Atividades Antinociceptiva e Anti-inflamatória de PBL ...... 78 2.5. CONCLUSÃO ...... 84 3. CAPITULO 03: DETERMINAÇÃO DA ESTUTURA PRIMÁRIA DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE VATAIREA GUIANENSIS QUE EXIBE EFEITO VASORRELAXANTE...... 85 3.1. INTRODUÇÃO ...... 86 3.2. OBJETIVOS ...... 88 3.2.1. Objetivo Geral ...... 88 3.2.2. Objetivos Específicos ...... 88 3.3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 89 3.3.1. Purificação da Lectina de Sementes de Vatairea guianensis ...... 89 3.3.1.1. Dosagem de Proteínas Solúveis...... 89 3.3.1.2. Detecção de Atividade Hemaglutinante ...... 90 3.3.1.3. Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica ...... 90 3.3.1.4. Eletrofores em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS ...... 90 3.3.2. Determinação da Massa Molecular por Espectrometria de Massa ...... 91 3.3.3. . Estimativa da Massa Molecular Nativa ...... 92 3.3.4. Determinação da Estrutura Primária de VGL ...... 92 3.3.4.1. Digestão Proteolítica in gel e Obtenção de Peptídeos...... 92 3.3.4.2. Sequenciamento dos Peptídeos por Espectrometria de Massa Sequencial (MS/MS) ...... 93 3.3.4.3. Análise da Estrutura Primária ...... 93 3.3.5. Avaliação da Atividades Vasorrelaxante de VGL ...... 94 3.3.5.1. Animais ...... 94 3.3.5.2. Drogas e Reagentes...... 94 3.3.5.2. Testes de Contratilidade em aortas isoladas de ratos...... 94 3.3.5.3. Análise Estatística ...... 96 3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 97

3.4.1. Purificação e Sequenciamento de VGL ...... 97 3.4.2. Avaliação da Atividades Vasorrelaxante de VGL ...... 106 3.5. CONCLUSÃO ...... 109 REFERÊNCIAS ...... 110 ANEXOS: Artigos científicos publicados a partir deste trabalho ...... 110

20

Capitulo 01: Fundamentação Teórica

21

1. Capitulo 01: Fundamentação Teórica

1.1.Considerações gerais.

Nas ultimas décadas grandes esforços têm sido feitos para entender a estrutura e função da glicosilação da superfície celular. Antes vistos como meras moléculas hidrofílicas, cujas únicas funções seriam o fornecimento de energia e a constituição de paredes celulares, os carboidratos agora são reconhecidos como uma intricada rede codificadora, capaz de armazenar uma quantidade quase que infinita de informação biológica (SAXON; BERTOZZI, 2001). Um estímulo para esse aumento na perspectiva dessas pesquisas é o recente desenvolvimento das ferramentas necessárias para a realização de estudos complexos envolvendo carboidratos biologicamente relevantes. Diferente das cadeias polipeptídicas e polímeros de ácidos nucléicos, as cadeias de carboidratos não são tipicamente lineares e não são sintetizadas a partir de uma molécula molde. Esses fatores geram uma maior diversidade estrutural e, consequentemente, uma maior capacidade em armazenar informação, de modo que, cada um dos monossacarídeos constituintes de um determinado oligossacarídeo presente em uma célula representa potencialmente uma palavra no “glicocódigo” que pode ser lida pelas proteínas capazes de interagir com estes carboidratos (GABIUS et al., 2002). Glicobiologia é a ciência que estuda as estruturas, propriedades e funções dos carboidratos presentes em diversidade nos seres vivos. Estes estudos não se restringem apenas aos carboidratos, mas também a todas as outras classes de biomoléculas (proteínas, lipídios, nucleotídeos) que interagem com eles. O objetivo do glicobiologia estrutural é, naturalmente, determinar a estrutura tridimensional e estabelecer modelos para as interações envolvendo essas moléculas (TAYLOR; DRICKAMER, 2003). As lectinas, por serem moléculas capazes de “decifrar os glicocódigos” codificados na estrutura dos glicoconjugados que compõem as membranas celulares, desempenham um papel fundamental em muitos processos biológicos, tais como comunicação celular, resposta imunológica, fertilização, desenvolvimento de infecções parasitárias e metástase de tumores (GABIUS; GABIUS, 1997). Apesar das lectinas terem sido descobertas há mais de 100 anos, estas proteínas permaneceram por muitas décadas como meras curiosidades científicas. Foi somente a partir dos anos 60 que a comunidade científica despertou um real interesse por estas moléculas (SHARON; LIS, 2004). Atualmente, entretanto, é bem conhecido que as 22 lectinas vegetais exibem atividades biológicas que permitem a sua aplicação em diversas áreas científicas, que vão da medicina (BIES et al., 2004; Gemeiner et al., 2009; ZWIERZINA et al., 2011) à agricultura (VANDENBORRE et al., 2011). Baseado nestas atividades, as lectinas vegetais, hoje, está atraindo um grande interesse científico, sendo que, muitas destas proteínas são consideradas como ferramentas biotecnologias em potencial (LAN; NG, 2011). Embora todas as lectinas apresentem a propriedade comum de se ligar, reversivelmente, a carboidratos, elas apresentam características próprias, principalmente no que diz respeito a aplicações biológicas. Assim, ainda que as lectinas apresentem um alto grau de similaridade estrutural entre si, mostram-se diferentes quanto às várias propriedades biológicas que podem desempenhar. Isto faz com que, via de regra, cada lectina possua um potencial de aplicação biológico impar, o que justifica que cada uma delas mereça ser estudada separadamente. Fica evidente, então, que a descoberta, o isolamento e a caracterização físico-química, estrutural e biológica de novas lectinas se revestem de grande importância, em vista que novas lectinas com diferentes aplicações podem ser encontradas. Os estudos estruturais de lectinas servem como ferramentas para a compreensão do reconhecimento celular entre carboidratos da membrana celular e proteínas e qual a sua importância em diversos processos fisiológicos. Dentre as várias técnicas utilizadas para a elucidação estrutural de proteínas, a espectrometria de massa e a cristalografia de raios X se destacam pela sua eficiência. A Espectrometria de Massas (do inglês Mass Spectrometry - MS) é uma técnica muito utilizada em química de proteínas para identificar, caracterizar modificações pós- traducionais, sequenciar proteínas e peptídeos com importância biológica, caracterizar a interação em proteínas e outras moléculas (HOFFMANN; STROOBANT, 2007; DUIJN et al., 2009; SCARFF et al., 2009; RUOTOLO et al., 2005). Por sua vez, a cristalografia de raios X é considerada a principal técnica de resolução da estrutura tridimensional de proteínas, sendo capaz de elucidar a estrutura de moléculas com alto peso molecular e de resolver estruturas oligoméricas (BLUNDELL; JONHSON, 1976; DRENTH, 1994).

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1.2.Lectinas Vegetais

1.2.1. Breve histórico e Definição

No final do século XIX, várias evidências indicavam a existência na natureza de proteínas com a capacidade de aglutinar eritrócitos. Essas proteínas foram denominadas inicialmente de hemaglutininas, ou fitoaglutininas por terem sido originalmente encontradas em plantas (SHARON; LIS, 2004). A primeira descrição de lectinas decorre do ano de 1888, quando Peter Hermann Stillmark, em busca do princípio tóxico da planta Ricinus communis (Euphorbiaceae), estudou essa planta em sua tese, publicada em 1888 na Universidade de Dorpart/Tartu (Estônia, então uma das províncias Bálticas do Império Russo). Stillmark descobriu que extratos de sementes de Ricinus communis eram capazes de aglutinar células sanguíneas de diferentes animais. Ele denominou a substância responsável por essa atividade de Ricina (SHARON; LIS, 2004). Posteriormente, na mesma universidade, H. Hellin relatou efeitos semelhantes ao da ricina com uma proteína de sementes de jeriquiti ( Abrus precatorius ) denominada Abrina (SHARON; LIS, 2004). Ricina e Abrina foram amplamente utilizadas como modelos de antígenos em estudos imunológicos. Isto permitiu a Paul Ehrlich, do Instituto Real de Terapia Experimental (Frankfurt), estabelecer no final da década de 1890, vários dos princípios fundamentais da imunologia, dentre estes, a especificidade da relação antígeno/anticorpo, o fenômeno da memória imunológica e a transferência da imunidade humoral de mãe para filho (SHARON & LIS, 2004). Logo depois, substâncias tóxicas similares a Ricina e Abrina foram identificadas em sementes de Croton tiglium (Crotina) e em casca de Robinia pseudoacacia (Robina). Em 1898, Elfstrand introduziu pela primeira vez o termo “hemaglutinina” como um nome comum paraa todas as proteínas vegetais capazes de aglutinar células. Este termo foi inspirado na similaridade entre a visível atividade macroscópica das proteínas vegetais e a das aglutininas do soro humano e animal, primeiramente descrito por Landois em 1875 (VAN DAMME et al., 1998). A idéia de que a toxicidade é uma propriedade intrínseca das lectinas foi abandonada no início do século XX, depois que Landsteiner e Raubitscheck em 1907 relataram pela primeira vez a presença de uma lectina não tóxica nas leguminosas 24

Phaseolus vulgaris (feijão), Pisum sativum (ervilha), Lens culinaris (lentilha) e Vicia sativa . Após o trabalho, muitas outras hemaglutininas vegetais não tóxicas foram descobertas. Tornou-se, a partir de então, evidente que lectinas estão difundidas no reino vegetal e que a toxicidade atribuída às mesmas, é exceção, e não regra (VAN DAMME et al., 1998). O marco seguinte na história das lectinas vegetais foi a descoberta realizada por Renkonen, em 1948, e Boyd & Reguera, em 1949, de que algumas hemaglutininas exibem uma clara preferência por eritrócitos de um grupo particular de tipo sanguíneo dentro do sistema ABO. Observou-se que algumas proteínas vegetais obtidas de sementes de plantas podiam reconhecer um grupo específico e aglutiná-lo, onde hemácias do sistema ABO respondiam ao contato com essas hemaglutininas de maneira distinta, umas aglutinando e outras não (VAN DAMME et al., 1998). A abilidade das aglutininas de plantas em distinguir eritrócitos de diferentes tipos sanguíneos levou Boyd e Shapleigh a propor em 1954 o termo “lectina” (do latim legere, que significa selecionar ou escolher) para nomear essas proteínas (SHARON; LIS, 2004). Outro grande marco na história das lectinas ocorreu em 1960, quando Petter C. Nowell, demonstrou que a lectina de Phaseolus vulgaris possui atividade mitogênica sobre linfócitos. Essa descoberta teve um impacto revolucionário sobre a imunologia, pois até aquele momento acreditava-se que os linfócitos eram células incapazes de se dividirem ou de se diferenciarem em outros tipos celulares (SHARON; LIS, 2004). Em 1919, James Samner isolou a partir das sementes de Canavalia ensiformes , utilizando a técnica de cristalização, uma proteína que ele próprio nomeou de concanavalina A (Con A) e obteve dessa forma a primeira lectina pura. Contudo, somente em 1936, Sumner e Howell demonstraram que a concanavalina A aglutinava células tais como eritrócitos e também precipitava glicogênio de soluções. Eles demonstraram também que a hemaglutinação era inibida pela sacarose da cana-de- açúcar, demonstrando pela primeira vez a especificidade das lectinas por açúcares (SHARON; LIS, 2004). Mas só em 1952 é que foi demonstrado que as propriedades hemaglutinantes de lectinas eram baseadas em uma atividade específica de ligação a carboidratos (WATKINS; MORGAN, 1952). Ao serem reconhecidas como proteínas ligantes de carboidratos, as lectinas puderam ser distinguidas de outras proteínas com base em um critério funcional bem definido. Goldstein et al. (1980) conceituou lectinas como sendo proteínas ou 25 glicoproteínas de origem não-imune ligantes a carboidratos que são capazes de aglutinar células e/ou precipitar polissacarídeos ou glicoconjugados. Atualmente, a definição mais aceita e, provavelmente, a mais utilizada foi proposta por Peumans e Van Damme (1995). Segundo estes autores lectinas são proteínas de origem não-imune contendo pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversivelmente a mono ou oligossacarídeos específicos.

1.2.2. Classificação Estrutural das Lectinas Vegetais

Dos primeiros relatos até os dias atuais, o estudo de lectinas tem avançado muito, sendo que, várias centenas dessas proteínas têm sido identificadas, isoladas e caracterizadas dos mais diversos organismos tais como microorganismos, plantas e animais. Apesar da ampla distribuição na natureza, durante a evolução, as lectinas conservaram uma característica em comum que as distinguem de todas as outras proteínas por um critério funcional bem definido, que consiste na sua habilidade para reconhecer e ligar-se de forma reversível a carboidratos específicos sem alterar estruturalmente os mesmos. Elas são classicamente consideradas um grupo heterogêneo de proteínas com propriedades bioquímicas e atividades biológicas acentuadamente diferentes (PEUMANS; VAN DAMME, 1995). Considerando suas características estruturais, Van Damme et al. (1998) subdividiram as lectinas vegetais de acordo com a estrutura em quatro classes principais: merolectinas, hololectinas, quimerolectinas e superlectinas (Figura 01).

As merolectinas são proteínas que possuem exclusivamente de único domínio de ligação a carboidrato. Devido a seu caráter monovalente, as merolectinas são incapazes de precipitar glicoconjugados ou aglutinar células. Um exemplo clássico dessa classe de lectinas é a heveína, uma lectina que se liga a quitina e é extraída do látex da Hevea brasiliensis (VAN PARIJS et al., 1991). As hololectinas são proteínas que possuem mais de um domínio de ligação a carboidrato, sendo estes domínios específicos para um mesmo carboidrato ou para carboidratos estruturalmente semelhantes. Elas compreendem a maioria das lectinas de plantas e representam a classe de lectinas mais bem estudada. São exemplos típicos de hololectinas aquelas encontradas em sementes de plantas pertencentes a subtribo Diocleinae (CAVADA et al., 2001). 26

As quimerolectinas possuem um ou mais sítios de ligação a carboidratos ligados e, em adição, possuem um outro domínio com uma atividade não relacionada. Esse domínio pode ter uma atividade enzimática bem-definida ou qualquer outra atividade biológica que atue independentemente do sítio de ligação a carboidrato. São exemplos de quimerolectinas as proteínas inativadoras de ribossomos tipo II (RIPs tipo II) (PEUMANS et al., 2001) e a PPL2, uma lectina quitina-ligante isolada de sementes de Parkia platycephala que possui um segundo sítio, no caso um sítio catalítico endoquitinásico (CAVADA et al., 2006). As superlectinas são proteínas que, de forma semelhante às hololectinas, possuem mais de um domínio de ligação a carboidratos por molécula, porém esses domínios podem reconhecer carboidratos estruturalmente diferentes. A lectina de tulipa é um exemplo desse grupo, possuindo um domínio N-terminal manose-ligante arranjado a um domínio GalNac-ligante não-relacionado (VAN DAMME et al., 1996).

Figura 01. Classificação estrutural das lectinas vegetais. Representação esquemática de merolectinas (Heveína; PDB: 1Q9B), hololectinas (Con-Br; PDB: 3JU9), quimerolectinas (Ricina; PDB: 1RZO) e superlectinas (TxLC-1).

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1.2.3. Distribuição das Lectinas nos Vegetais

Nos vegetais as lectinas têm sido encontradas desde organismos mais simples musgos (MOLINA; VINCENTE, 1995) até os mais complexos como gimnospermas (SANTI-GADELHA et al., 2006) e angiospermas (WONG e NG, 2005; KAUR et al., 2005; CAVADA et al., 1998; MORAES et al., 1996). De todos esses grupos, as angiospermas têm sido as mais investigadas, sendo que algumas centenas de lectinas já foram isoladas e caracterizadas de plantas pertencentes a diferentes famílias deste taxon. Em algumas famílias as lectinas se concentram em maior quantidade em um determinado órgão, como nas sementes maduras de leguminosas, provavelmente nos tecidos cotiledonares (PUZTAI, 1991). Contudo, as lectinas também podem ser encontradas em outras partes das plantas como folhas (RATANAPO et al., 2001), frutos (SAMPIETRO et al., 2001), raízes de algumas Convolvulaceae (PEUMANS et al., 1997) e tubérculos (SUSEELAN et al., 2002). Muitas funções têm sido propostas para as lectinas nos vegetais, tais como proteção contra patógenos e insetos, transporte e armazenamento de carboidratos, reconhecimento celular (dentro da célula, entre células ou entre organismos), proteínas de reserva ou reguladores de crescimento (PUSZTAI, 1991). Van Damme e colaboradores (1998) classificaram as lectinas de plantas em sete grupos, ou famílias, de acordo com as semelhanças estruturais e evolutivas. Esses grupos são nomeados de: lectinas de leguminosas, lectinas ligantes a quitina contendo domínios heveínicos, lectinas de monocotiledôneas que se ligam a manose, proteínas inativadoras de ribossomo tipo II (RIPs tipo II), lectinas de floema de Cucurbitaceae, lectinas relacionadas a Jacalina e lectinas de Amaranthaceae (Figura 02).

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Figura 02. Classificação das Lectinas Vegetais. (A) Lectinas de leguminosas, Canavaila ensiformis (Con-A); (B) Lectina ligante à quitina compostas por domínios heveínicos, Heveína; (C) Lectina de monocotiledôneas ligantes à manose , Galanthus nivalis agglutinina (GNA); (D) RIP´s do tipo II, Ricina; (E) Lectinas relacionadas às Jacalinas, Artocarpus integrifolia (Jacalina); (F) Lectina da família da amarantina, Amaranthus caudatus (ACA). Fonte: PDB.

As lectinas de leguminosas correspondem à família de lectinas mais estudada até o presente, com dezenas de representantes já purificados e caracterizados. As proteínas desse grupo caracterizam-se por possuírem uma alta similaridade estrutural, porém, com especificidades finas por carboidratos e atividades biológicas distintas. Se enquadram nesse grupo a Concanavalina-A (Con-A), extraída de sementes de Canavalia ensiformes , e as lectinas extraídas de outras plantas da subtribo Diocleinae (CAVADA et al., 2001). 29

As lectinas que se ligam a quitina são capazes de se ligar a resíduos de N- acetilglicosamina (principal unidade monomérica constituinte da quitina) e têm como característica principal o fato de possuir um domínio heveínico em suas moléculas (VAN DAMME et al., 1998). O termo “domínio heveínico” refere-se a uma pequena proteína (uma merolectina) de 43 resíduos de aminoácidos, extraída do látex da Hevea brasiliensis , a popular seringueira (WALJUNO et al., 1975). Lectinas pertencentes a esse grupo têm sido encontradas em várias famílias de plantas não relacionadas taxonomicamente tais como Gramineae, Leguminosae, Solanaceae, Urticaceae, Papaveraceae e Amaranthaceae. São também exemplos de lectinas que se ligam a quitina as quitinases classe I (COLLINGE et al., 1993). O termo “lectinas de monocotiledôneas que se ligam a manose” refere-se a uma família de lectinas estreitamente relacionadas que possuem especificidade para manose, encontradas exclusivamente em plantas monocotiledôneas, como nas famílias Amaryllidaceae, Alliaceae, Araceae, Liliaceae, Orchidaceae e Bromeliaceae. Estudos comparativos indicam que essas proteínas compartilham um alto grau de similaridade de sequência primária, porém com uma completa heterogeneidade de estrutura molecular (VAN DAMME et al., 1998). As proteínas inativadoras de ribossomos tipo II (RIPs tipo II) são lectinas do tipo quimerolectina formadas por duas cadeias polipeptídicas sintetizadas a partir de uma única molécula precursora a qual é pós-transducionalmente processada através da excisão de uma ligação entre as cadeias. A primeira dessas cadeias (cadeia A) é formada por um polipeptídeo constituído de um domínio adenosina glicosidase e a outra cadeia (cadeia B) constituída por um domínio de ligação a carboidratos, sendo que as cadeias permanecem unidas por pontes dissulfeto. Ao penetrar nas células, esta ligação dissulfeto é quebrada e a cadeia A adquire uma forte atividade N-glicosidase tornado-se capaz de inativar cataliticamente ribossomos eucarióticos e procarióticos (VAN DAMME et al., 1998). A Ricina ( Ricinus communis ) e Abrina ( Abrus precatorius ) são exemplos clássicos de RIP’s tipo 2 com potentes atividades biológicas (PEUMANS et al., 2001). As lectinas do floema de Curcubitaceae são proteínas diméricas composta de duas subunidades idênticas de 24 kDa que se ligam a resíduos de N-acetilglicosamina. Todas as lectinas conhecidas dos floemas de Curcubitaceae mostram um grau de similaridade sequencial, mas não apresentam qualquer similaridade sequencial com outras lectinas de plantas ou proteínas (VAN DAMME et al., 1998). 30

A expressão “lectinas relacionadas à Jacalina” é usada para nomear um grupo de lectinas que são evolucionaria e estruturalmente relacionadas a Jacalina, uma lectina com especificidade para D-galactose extraída de sementes de jaca ( Artocarpus integrifólia ). Esse tipo de lectina é encontrada principalmente em espécies de Moreaceae e Convolvulaceae (VAN DAMME et al., 1998). A amarantina, uma lectina extraída de Amaranthus caudatos , não se assemelha a nenhuma outra lectina de plantas, tanto com relação a seqüência de aminoácidos quanto com relação a estrutura tridimensional. Baseado nessas informações, a amarantina é considerada um protótipo da família de lectinas das Amaranthaceae. Várias outras lectinas extraídas de plantas do gênero Amaranthus , como por exemplo Amarantus leucocarpus , contêm lectinas que são muito similares à amarantina, sendo todas elas lectinas ligantes específicas por N-acetilgalactosamina (VAN DAMME et al., 1998).Apesar de parecer clara, esta classificação das lectinas vegetais tende a deixar de ser baseada em aspectos evolutivos e passa a levar em conta somente os aspectos estruturais. Isso se dá pelo fato de que, à medida que novas lectinas vão sendo descobertas e caracterizadas, deixa de existir um limite taxonômico bem definido entre as famílias de lectinas vegetais. Um exemplo claro deste fato é a lectina específica para glicose e manose extraída de sementes da leguminosa Parkia platycephala , cuja estrutura é composta por três domínios repetidos relacionados a jacalina (MANN et al., 2001; GALEGO DEL SOL et al., 2005).

1.2.4. Lectinas de Leguminosas

O termo lectina de leguminosa refere-se a uma família particular de lectinas de plantas estreitamente relacionadas, encontradas exclusivamente em vegetais pertencentes à família Leguminosae (VAN DAMME et al., 1998). As lectinas de Leguminosae correspondem ao grupo de lectinas mais bem estudado até o momento, sendo que dezenas de lectinas isoladas de membros desse táxon já foram caracterizadas quanto a suas propriedades químicas, físicas, estruturais, bem como quanto a suas propriedades biológicas. Muito do conhecimento adquirido até o presente momento sobre as lectinas de um modo em geral, provêm de estudos realizados com membros dessa família de lectinas (SHARON; LIS, 1990). As lectinas de leguminosas possuem capacidade de interagir com açúcares simples e complexos (DAM; BREWER, 2002). Essa interação depende, 31 exclusivamente, de um sítio de ligação primário a carboidratos presente na superfície molecular das mesmas. Esse sítio interage diretamente com um único açúcar simples, daí sua denominação. Diversos grupos de lectinas foram descritos quanto à especificidade por monossacarídeos. Dentro das lectinas de leguminosas, os principais grupos de especificidades encontrados, de acordo com Rudiger (1997), são: manose, glicose e seus α-glicosídeos; galactose e N-acetilgalactosamina; Nacetilglucosamina; α – L-fucose; e oligossacarídeos complexos. Sabe-se que as lectinas de Leguminosas são sintetizadas no retículo endoplasmático na forma de pré-pro-lectinas. Essa proteína imatura possui na sua extremidade N-terminal um peptídeo sinal, com 20 a 30 resíduos de aminoácidos, que é removido posteriormente durante o transporte da pré-pro-lectina para o lúmen do reticulo endoplamático, originando uma pró-lectina. A pró-lectina passa então por uma série de modificações pós-traducionais, como glicosilação e clivagens proteolíticas, dando origem a lectina madura (SHARON; LIS, 1990). As lectinas de leguminosas possuem uma estrutura monomérica conservada, apresentando extensiva similaridade seqüencial, ao mesmo tempo em que exibem uma notável variedade de associações quaternárias com importantes implicações nas atividades biológicas desempenhadas por essas proteínas (SRINIVAS et al., 2001). As pequenas variações seqüenciais e de arranjo quaternário parecem significar diferenças importantes em testes de atividades biológicas com lectinas de leguminosas in vitro e in vivo (CAVADA et al., 2001; BARRAL-NETTO et al., 1992; BARBOSA et al., 2001; ASSREUY et al., 2009; FIGUEIREDO et al., 2009; HOLANDA et al., 2009). Lectinas de leguminosas, normalmente, apresentam-se como dímeros ou tetrâmeros, compostos por monômeros iguais ou diferentes com massa molecular em torno de 25 a 30 kDa. Cada uma destas subunidades apresenta um único sítio de ligação a carboidratos com a mesma especificidade. Freqüentemente, estas subunidades são compostas por uma única cadeia polipeptídica e sua união é estabelecida por forças não covalentes como ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e eletrostáticas formando dímeros canônicos e estabilizando o tetrâmero pela união destes dímeros. Entretanto, existem algumas lectinas que possuem subunidades formadas por 2 cadeias polipeptídicas como as lectinas da tribo Vicieae, gêneros Pisum, Vicia , Lathyrus, e Lens, que possuem cadeias polipeptídicas leves denominadas de α (5 a 7 kDa) e cadeias pesadas denominadas β (15 a 19 kDa). Estas lectinas são dímeros formados por duas 32 subunidades iguais e cada subunidade é constituída de uma cadeia α e uma cadeia β mantidas por ligações não-covalentes (SHARON; LIS, 1989). As estruturas dos monômeros de diferentes lectinas de leguminosas são extremamente similares e podem ser descritas como um β-sanduíche rígido consistindo de seis fitas-beta (atrás) e outro curvado de sete fitas-beta (frente), além de uma terceira pequena folha beta, consistindo de cinco fitas ligadas por duas maiores (BANERJEE et al., 1996; HAMELRYCK et al., 1998). O sítio de ligação a carboidratos está localizado no lado côncavo do β-sanduíche, próximo ao sítio de ligação a metais. O sítio de reconhecimento a carboidratos consiste de diversos “ loops” com diferentes graus de variabilidade (SHARMA & SUROLIA, 1997). As conformações destes loops são determinadas pela presença de íons de metais de transição, como o cálcio e o manganês, na estrutura (LORIS et al., 1998; BOUCKAERT et al., 2000). A ausência desses metais resulta em uma instabilidade local e na perda da capacidade de ligar-se a carboidratos (LORIS et al., 2004). Além de um sítio de ligação a carboidratos, altamente conservado, juntamente com um sítio de ligação a metais, que é responsável pela estabilização do “loop” que compõe o sítio de ligação a carboidratos, estudos recentes mostraram a capacidade dessas proteínas interagirem com compostos hidrofóbicos. Algumas lectinas de leguminosas podem interagir com outras espécies de moléculas, que não carboidratos, tais como adenina (HAMELRYCK et al., 1999) e ácido aminobutírico (ABU) (DELATORRE et al., 2007). A ligação das lectinas a essas moléculas se dá através de uma região estrutural hidrofóbica, altamente conservada em muitas lectinas de leguminosas e que, devido a esse alto grau de conservação, pode estar envolvida em algum papel biológico importante (DELATORRE et al., 2007). Algumas lectinas de leguminosas, como as lectinas extraídas de espécies da subtribo Diocleinae , exibem uma oligomerização dependente de pH, onde a proporção entre proteínas no estado dimérico e no estado tetramérico pode ser alterada de acordo com pH do meio (CALVETE et al., 1999; NAGANO et al., 2008). A alteração desse equilíbrio dímero/tetrâmero dependente de pH pode influenciar diretamente nas atividades biológicas dessas lectinas, pelo fato dessas proteínas serem capazes de se ligar aos receptores glicoconjugados da superfície das membranas com uma maior afinidade quando na forma tetramérica (DELATORRE et al., 2006).

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1.2.5. Lectinas da Subfamília Mimosoideae

A família Leguminosae constitui um dos grupos vegetais que apresenta ampla distribuição geográfica. Dentro desta família são estimados cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies, classificados em três subfamílias (Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae) e 36 tribos, dentro da ordem Fabales (LEWIS et al., 2005). As Lectinas de Leguminosas representam o grupo mais bem estudado dentre as lectinas de plantas, contudo a maioria dos estudos referentes a estas proteínas envolvem lectinas extraídas de membros da subfamília Papilionoideae, enquanto que estudos envolvendo lectinas de membros das outras subfamílias, Mimosoideae e Caesalpinoideae, ainda são escassos (MANN et al., 2001; SILVA et al., 2011). A subfamília Mimosoideae é composta por cerca de 78 gêneros e 3270 espécies, tradicionalmente distribuídos em cinco tribos: Acacieae, Ingeae, Parkiae e Mimozygantheae (ELIAS, 1981). Dentro da subfamília Mimosoideae, estudos envolvendo o isolamento e caracterização bioquímica de lectinas tem sido realizados apenas com nove espécies pertencentes a dois gêneros (TABELA 01).

Tabela 01: Membros da subfamília Mimosoideae com dos quais lectinas foram isoladas e caracterizadas. Espécie Referência

Acacia constricta GUZMAN -PARTIDA et al., 2004

Acacia farnesiana SANTI -GADELHA et al., 2008

Parkia biglandulosa KAUR et al., 2005

Parkia discolor CAVADA et al., 2000

Parkia javanica UTARABHAND ; AKKAYANONT

Parkia pendula BELTRÃO et al., 2003

Parkia platycephala CAVADA et al., 1997, 2006

Parkia roxburghii KAUR et al., 2005

Parkia speciosa SUVACHITTANONT ; PEUTPAIBOON, 1992

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Conforme mostrado na tabela acima, o gênero Parkia é o que apresenta o maior número de lectinas isoladas. As lectinas extraídas de sementes de plantas deste gênero compartilham algumas características em comum, dentre as quais se pode citar o fato de que todas apresentam especificidade por manose/glucose e açucares derivados e apresentaram um perfil eletroforético composto por uma banda única de aproximadamente 45-50 kDa. Algumas atividades biológicas têm sido relatadas para as lectinas deste gênero. A lectina de P. speciosa apresenta atividade mitogênica sobre linfócitos humanos, (SUVACHITTANONT; JARANCHAVANAPET, 2000), a lectina de P. pendula é capaz de reconhecer células tumorais (BELTRÃO et al., 2003) e possui atividade anti-viral (FAVACHO et al., 2007). Dentre as lectinas de Mimosoideae, a lectina específica para glicose/manose de sementes de Parkia platycephhala (PPL-1) é a que se encontra melhorar caracterizada com relação a sua estrutura. A determinação da estrutura primária revelou que esta lectina é composta por uma cadeia simples, não glicosilada, composta por três domínios relacionados a jacalina repetidos (Mann et al., 2001). Posteriormente, Gallego Del Sol e colaboradores (2005) elucidaram as estruturas cristalográficas de PPL-1 nativa (Figura 03A) e em complexo com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-manose (Figura 03B). A análise da estrutura tridimensional desta proteína revelou um novo arranjo circular composto por domínios em β-prism (Gallego del Sol et al., 2005).

Figura 03. Estrutura tridimensional da Lectina PPL-1. (A) Estrutura cristalográfica de PPL1 nativa (PDB: 1ZGR); (B) Estrutura cristalográfica de PPL1 complexada com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D- manose (PDB: 1ZGS).

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Em adição a PPL-1, as sementes de P. platycephala apresentam uma segunda lectina a qual foi denominada de PPL-2. A PPL2 é uma quimerolectina homóloga a endoquitinases da família 18 das glicosil hidrolases que exibe atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho, capacidade de ligar-se reversivelmente a GlcNAc e atividade catalítica contra quitina (CAVADA et al. 2006). Com relação às lectinas do gênero Acacia, a lectina isolada de Acacia constricta , apresenta três isolectinas (VL2-VL4). Análises por imunoensaios mostraram que os peptídeos obtidos da digestão dessas lectinas apresentavam grande similaridade com seqüências de diferentes lectinas do gênero Phaseolus (GUZMAN-PARTIDA et al., 2004). Já a lectina de sementes de A. farnesiana (AFAL) foi purificada a partir da fração albumina do extrato protéico solúvel e estudos constataram que ela apresenta uma estreita relação sequencial com lectinas do gênero Phaseolus, uma possível afinidade por quitina caracterizada apenas por cromatografia de afinidade, uma oligomerização tempo dependente com base em equilíbrios dinâmicos do tipo monômero-dímero-tetrâmero, além de atividades importantes contra o nematóide Meloidogyne incognita reduzindo em aproximadamente 90 % a eclosão de ovos e bactérias Gram negativa Xanthomonas axopodis pv. Passiflorae e Gram positiva Clavibacter michiganensis michiganensis . (SANTI-GADELHA et al., 2008, 2012).

1.2.6. Lectinas de Dalbergiae

Conforme mencionado anteriormente, a maioria dos estudos de lectinas de leguminosas tem envolvido membros da subfamília Papilionoideae, enquanto que investigações de lectinas de outras duas subfamílias, Caesalpinoideae e Mimosoideae, são escassas. Mesmo dentro da subfamília Papilionoideae, a grande maioria dos estudos com lectinas se concentram em membros da tribo Phaseoleae, prinicpalmente das subtribos Diocleinae e Vicieae, enquanto que as outras tribos desta subfamília ainda são pouco exploradas. A subtribo Dalbergieae, pertencente à subfamilia Papilionoideae, família Leguminosae, compreende 48 gêneros e cerca de 1200 espécies, distribuídos pelos trópicos, especialmente na América tropical. Dentro desta tribo, estudos de maior relevância envolvendo o isolamento e caracterização bioquímica de lectinas tem sido realizados apenas com dez espécies pertencentes a dois gêneros (Tabela 02).

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Tabela 02: Membros da tribo Dalbergieae com dos quais lectinas foram isoladas e caracterizadas. Espécie Especificidade Referência

Andira surinamensis Man NOBRE, 2012

Centrolobium tomentosum Man/Glc ALMEIDA, 2012

Lonchocarpus carpassa Gal/GalNAc/Glc JOUBERT et al ., 1986

Lonchocarpus sericeus GlcNAc ALENCAR et al., 1999

Platymiscium floribundum Man/ GlcNAc PEREIRA JÚNIOR et al., 2012

Platypodium elegans Man/Glc BENEVIDES et al., 2012

Pterocarpus angolensis Man/Glc LORIS et al., 2003

Pterocarpus rotundifolius Man/Glc MARONDEDZE et al., 2004

Vatairea guianensis Gal/GalNAc ISIDRIO, 2002

Vatairea macrocarpa Gal/GalNAc CAVADA et al. , 1998

Várias atividades biológicas têm sido descritas para as lectinas de Dalbergiaea e, dentre estas, a lectina ligante a galactose/N-Acetil-galactosamina extraída de Vatairea macrocarpa (VML) é a melhor caracterizada. Seus efeitos biológicos descritos incluem indução da infiltração de leucócitos em edema de pata (ALENCAR et al., 2004), migração de neutróficos in vivo por mecanismo indireto (ALENCAR et al., 2003), liberação de mediadores quimiotáticos por macrófagos (ALENCAR et al., 2007), aumento da resistência vascular renal, taxa de filtração glomerular e fluxo urinário (MARTINS et al., 2005), estímulo respiratório em Rhizobium sp . (MARTINEZ et al., 2004), e especificidade de ligação à resíduos de antígeno do tipo Tn (DAM et al., 2007). Algumas atividades biológicas também foram evidenciadas em uma lectina extraída de sementes de Lonchocarpus sericeus , como potente atividade antiinflamatória em modelo de edema de pata (ALENCAR et al., 1999), efeito antiinflamatório e antibacteriano em um modelo de peritonite infecciosa (ALENCAR et al., 2005), diminuição da migração leucocitária e hipernocicepção mecânica pela inibição da produção de citocinas e quimiocinas (NAPIMOGA et al., 2007). 37

Com relação a estudos estruturais, até o presente momento, apenas as lectinas de V. macrocarpa, P. angolensis, P. rotundifolius e P. elegans possuem a sua sequência de aminoácidos conhecida e, dentre estas, apenas as lectinas de P. angolensis e P. elegans tiveram as estruturas tridimensionais determinadas. A lectina de Pterocarpus angolensis (PAL), glicose/manose específica, foi cristalizada em complexo com três diferentes açúcares: glicose, sacarose e turanose (Glc(α1–3)Fru). A estrutura tridimensional de PAL mostra que ela está arranjada sob a forma de um dímero canônico, o que também é observado para as outras lectinas de leguminosas glicose-manose específicas tais como, ConA e outras representantes do gênero Dioclea e também para lectinas da tribo Vicieae (Figura 04A) (LORIS et al., 2003). A lectina contém um loop clássico de ligação à manose, mas seu loop de ligação a metal assemelha-se à de lectinas com especificiade não-relacionada, como Ulex europaeus e Maackia amurensis . Como consequência, as interações com manose no sítio de ligação primário são conservadas, mas detalhes da extensão desse sítio de ligação a carboidratos diferem daqueles vistos em complexos carboidratos equivalentes de Concanavalina A. Essas observações explicam as diferenças em seus respectivos perfis de especificidade fina para oligomanoses (LORIS et al., 2004). Ainda em busca de esclarecimentos sobre a estrutura de PAL, Garcia-Pino e colaboradores (2006) analisaram os efeitos da desmetalização na estabilidade conformacional, estrutura e propriedades de ligação a açúcar dessa lectina através de técnicas calorimétricas, espectroscópicas e cristalográficas. A remoção dos metais levou a uma forma mais flexível da proteína com estabilidade conformacional significativamente menor. As estruturas cristalinas sem metal mostraram rearranjos estruturais significativos, embora algumas características estruturais que permitem a ligação de açúcar sejam mantidas. Estes resultados juntos com dados termodinâmicos e espectroscópicos contribuem para o melhor entendimento das interações lectina-carboidrato. A lectina recombinante de P. elegans (PELa) possui uma organização dimérica canônica típica de lectinas de leguminosas. Uma análise da especificidade por Glycan array evidenciou uma preferência bastante não-usual para N-glicanos do tipo complexos com ramificações assimétricas. Duas estruturas cristalinas de PELa, uma em complexo com um trimanose ramificado (Figura 04B) e outra com um heptassacarídeo complexo simétrico ligado a Asn (Figura 8) foram resolvidas a resoluções de 2,1 e 1,65 Å, respectivamente. A lectina mostrou adotar uma organização dimérica canônica típica de lectinas de leguminosas. O trimanose faz uma ponte entre os sítios de ligação a 38 carboidrato de dímeros vizinhos, resultando na formação de cadeias infinitas no cristal. O heptassacarídeo liga-se com o braço 1-6 no sítio primário de ligação e com contatos extensivos adicionais em ambos os braços. O GlcNAc do braço 1-3 está ligado em uma conformação restrita que pode justificar a alta afinidade que é observada em chips para oligossacarídeos com braço 1-3 curto que não apresentam esse monossacarídeos (BENEVIDES et al., 2012).

Figura 04. Estrutura tridimensional de lectinas de Dalbergieae . (A) Estrutura cristalográfica de PAL complexada com D-manose (PDB: 2ARE); (B) Estrutura cristalográfica PELa complexada com um trimanosídeo (PDB: 3ZVX).

1.3.Atividades Biológicas de Lectinas Vegetais

Ao longo dos anos, vários estudos tem demonstrado que as lectinas, sejam de origem vegetal ou de outras fontes, exibem uma gama de atividades biológicas desencadeadas pela interação dessas proteínas com a porção glicídica dos glicoconjugados da superfície celular. Dentre estas se pode citar a proliferação de linfócitos com produção de interferon γ (BARRAL-NETTO et al., 1992), produção de oxido nítrico (ANDRADE et al., 1999) e indução de apoptose (BARBOSA et al., 2001), reconhecimento específico e atividade antiproliferativa sobre células cancerígenas (SAKER et al, 1994; WU et al., 2004; LIU et al., 2008), atividade anti (ASSREUY et 39 al.,1997; ALENCAR et al., 1999; SANTTI-GADELHA et al., 2006; MOTA et al., 2007) ou pró-inflamatória (ALENCAR et al., 2003, 2004, 2007; FIGUEIREDO et al., 2009), atividade vasorrelaxante (GADELHA et al., 2005; ASSREUY et al., 2009), atividade antinociceptica (HOLANDA et al., 2009; PIRES et al., 2013), atividade cicatrizante (NASCIMENTO-NETO, 2012), agentes em drug delivery (BIES et al., 2004), atividade inseticida (ZHU et al., 1996; MACEDO et al., 2007), atividade antifúngica (CIOPRAGA et al., 1999; SOUZA et al., 2011), atividade antiviral (FAVACHO et al., 2007) e antibacteriana (COSTA et al., 2010; SANTI-GADELHA et al., 2012). Por ser maior interesse para este trabalho, trataremos com maiores detalhes as atividades vasorrelaxante, antinociceptiva e antiinflamatória demonstradas pelas lectinas vegetais quando testadas em modelos experimentais utilizando animais.

1.3.1. Atividade Vasorrelaxante de lectinas Vegetais.

1.3.1.1 Aspectos Gerais da Contratilidade

O mecanismo contrátil do músculo liso vascular é de grande importância para o conhecimento dos papéis funcionais, fisiológicos e fisiopatológicos do mesmo. O músculo liso vascular, geralmente, opera em um estado de tensão devido a pressão que o sangue exerce sobre a parede dos vasos. Este estado é conhecido como tônus, a partir do qual ele pode contrair ou relaxar, induzindo assim o aumento ou redução da pressão no interiro dos vasos (MONCADA et al., 1991; FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1996). O estado contrátil do músculo liso é regulado pela concentração de cálcio livre no citosol. Uma variedade de estímulos que induzem a contração do músculo liso, como despolarização da membrana, α-adrenárgicos, e agonistas muscarínicos ativam um aumento no nível de Ca 2+ (ALESSI et al., 1992; KARAKI et al., 1997). Várias substâncias (fatores) que são produzidas pelas células endoteliais difundem-se ou são liberadas, tanto para o sangue como para as outras camadas do vaso. Dessa forma, elas podem controlar funções das células musculares lisas e das células circulantes que participam das funções regulatórias. Dentre os fatores produzidos, destacam-se o óxido nítrico (NO), a prostaciclina, o tromboxano, as endotelinas, a angiotensina II, o fator hiperpolarizante do endotélio, a bradicinina, a serotonina, a 40 histamina e os radicais livres de oxigênio, dentre outros (VANE, et al., 1990; LUSHER; BARTON, 1997; VAPAATALO; MERVAALA, 2001). Uma dessas funções regulatórias consiste no controle do tônus da musculatura lisa vascular pela produção de mediadores que podem produzir vasodilatação ou vasoconstrição. Os principais fatores relaxantes derivados do endotélio são o NO, o fator hiperpolarizante derivado do endotélio e a prostaciclina (CARVALHO et al., 2001). Dentre os fatores relaxantes, o NO é o mais potente e é produzido no endotélio a partir da ação da enzima NO sintase sobre o substrato L-arginina, com formação de NO e L-citrulina. O NO difunde-se para o interior das células musculares lisas, onde interage com o átomo de ferro do grupo heme da molécula de guanilato ciclase, levando à ativação dessa enzima; essa enzima ativada, por sua vez, atua sobre o trifosfato de guanosina (GTP), transformando-o no composto ativado monofosfato cíclico de guanosina (GMPc). O aumento da concentração de GMPc nas células musculares leva à diminuição da [Ca +2 ]i e ao conseqüente relaxamento do vaso. Sob condições basais, o NO é continuamente liberado pelas células endoteliais saudáveis (SILVA, 2006).

1.3.1.2 Lectinas Vegetais com Efeito Vasorrelaxante

Na superfície das células, inclusive nas células endoteliais, existem glicoproteínas e podem funcionar como receptores para lectinas. Este fato se torna relevante, uma vez que tem sido mostrado que varias lectinas de plantas induziram o relaxamento dose-dependente de aortas contraídas in vitro (Kleha et al., 1991; Lima et al., 2004; Gadelha et al., 2005, ASSREUY et al., 2009, 2011 ; NÓBREGA et al., 2012; NASCIMENTO et al., 2012; BEZERRA et al., 2013 ). Os primeiros estudos demonstrando o efeito vasorrelaxante causado por lectinas vegetais foram realizados com as lectinas do germe do trigo (WGA) e a Concanavalina A (ConA) produzem relaxamento dependente de endotélio em aorta de coelhos (KLEHA et al., 1991). Posteriormente, foi demonstrado que o tratamento de coelhos com ricina (lectina extraída da planta Ricinus communis , conhecida vulgarmente como mamona) potencializa as contrações induzidas por serotonina e histamina em artérias coronárias (ZHANG et al., 1994). A atividade vasorrelaxante não é exclusiva de lectina vegetais. Lectinas purificadas de outras fontes, tais como, as algas vermelhas Bryothamnion triquetrum e 41

B. seafortii lectinas também mostraram o efeito relaxante de aortas intactas, (Lima et al., 2004). Nos últimos anos, alguns estudos utilizando o modelo de contratilidade de aorta isolada de ratos in vitro foram realizados com lectinas específicas para de glicose e manose purificadas de vegetais da subtribo Diocleinae. Este relaxamento mostrou ser estritamente dependente de endotélios intactos, foi inibido pela incubação prévia da lectina com seus açucares específicos, ressaltam a importância do sito de reconhecimento a carboidratos de lectinas e ocorreu via que envolve a enzima óxido nítrico sintase, responsável pela síntese de óxido nítrico (GADELHA et al., 2005, ASSREUY et al., 2009; NÓBREGA et al., 2012; NASCIMENTO et al., 2012; BEZERRA et al., 2013 ).

1.3.2 Atividade antiinflamatória de lectinas Vegetais

1.3.2.1 Aspectos Gerais do Processo Inflamatório

O processo infamatório é uma sequência complexa de eventos que ocorre em tecidos vascularizados, em resposta a agressão por agentes lesivos. Esta reação tem como principal objetivo livrar o organismo do agente causador da injúria e também desencadear processos que tendem a reparação do tecido lesado (McGEER; McGEER, 2000). Uma característica importante deste processo é que, independente da natureza do estímulo, a resposta inflamatória segue um padrão característico, podendo ser observadas modificações discretas no padrão de resposta, inerente ao agente etiológico, ao tecido ou órgão lesado e ao estado patológico do hospedeiro (RANG et al., 2001). A inflamação possui como sinais clínicos característicos: calor, tumor, rubor, dor e perda de função (ABBAS et al., 2010), sendo dividida em uma fase aguda e uma fase crônica. A primeira das fases da reação inflamatória – fase aguda – depende do estímulo ser ou não persistente, esta reação pode tornar-se crônica, podendo, muitas vezes, ser prejudicial ao organismo. Frequentemente, após a fase aguda, ocorre a resolução do processo, em razão da eliminação dos agentes causadores. Vários tipos de células estão envolvidos no processo inflamatório e estas podem ser classificadas em três tipos:

• Células endoteliais; 42

• Células próprias do tecido (mastócitos, fibroblastos e macrófagos residentes); • Células migratórias (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos sanguíneos, plasmócitos e macrófagos livres).

A resposta inflamatória aguda envolve fenômenos vasculares (vasodilatação e aumento da permeabilidade celular) e celulares (infiltração celular) decorrentes da liberação local de mediadores químicos formados e liberados concomitantemente ou sequencialmente no local da lesão. Estes mediadores podem ser divididos em nas seguintes categorias: Aminas vasoativas, metabólitos do ácido araquidônico, fator ativador plaquetário, citocinas, quimiocinas, óxido nítrico, radicais livres derivados de oxigênio e neuropeptídeos (FERENCÍK & STVRTINOVÁ, 1996; ABBAS et al., 2010). A vasodilatação é um fenômeno que corresponde a alterações no calibre vascular, que conduz a um aumento do fluxo sangüíneo, decorrente da ação de mediadores principalmente em arteríolas. O aumento da permeabilidade vascular se deve a ação de mediadores inflamatórios sobre as células endoteliais venulares, induzindo a contração das mesmas. Isto permite a passagem de proteínas plasmáticas para o interstício, as quais não seriam filtradas em condições fisiológicas. O aumento da permeabilidade vascular somado ao aumento da pressão de filtração, por conseqüência da vasodilatação, leva à formação do edema inflamatório (ABBAS et al., 2010). A migração de leucócitos da microcirculação e seu acúmulo no foco da agressão é uma das etapas fundamentais para a defesa do organismo. Os leucócitos ingerem os agentes agressores, destroem as bactérias e outros micróbios e degradam o tecido necrótico e os antígenos estranhos. Porém, os leucócitos podem prolongar a inflamação e induzir lesão tecidual mediante a liberação de enzimas, de mediadores químicos e de radicais livres do oxigênio (ABBAS et al., 2010). A mobilização adequada dos leucócitos, da microcirculação para o foco inflamatório (tecido intersticial), é também uma etapa fundamental para a defesa do organismo e é denominada de extravasamento. Pode ser dividida nas seguintes etapas: (1) intraluminais: marginação, rolamento e adesão; (2) transmigração através do endotélio (também denominada de diapedese); e (3) migração nos tecidos intersticiais na direção do estímulo quimiotático (ABBAS et al., 2010).

43

1.3.2.2 Lectinas Vegetais com atividade anti-inflamatória

Lectinas de leguminosas in vitro estimulam a proliferação de linfócitos e produção de interferon-γ (BARRAL-NETO et al., 1992), a liberação de histamina a partir de mastócitos peritoneais de ratos (GOMES et al, 1994), a ativação de macrófagos peritoneais de camundongos que liberam H2O2 (RODRIGUEZ et al, 1992), a apoptose (BARBOSA et al, 2001) e a produção de óxido nítrico por células peritoneais murinas (ANDRADE et al., 1999). Estudos in vivo demonstram ainda que lectinas, quando administradas por via subcutânea, ativam a migração de leucócitos e formação do edema de pata (BENTO et al., 1993; SILVA, et al., 2011), sendo estes processos decorrentes da liberação de vários mediadores inflamatórios (ANDRADE et al., 1999).

Embora inicialmente as pesquisas se direcionassem predominantemente aos efeitos pró-inflamatórios das lectinas (ALENCAR et al., 2003, 2004, 2007; ASSREUY et al., 2009; FIGUEIREDO et al., 2009) vem sendo demonstrando que, dependendo da via de administração utilizada, algumas lectinas podem induzir respostas estimulatórias ou inibitórias do processo inflamatório, estas últimas ocorrendo quando a injeção da lectina se dá por via intravenosa. O efeito de lectinas na inflamação frequentemente está relacionado ao domínio de ligação à carboidratos (domínio lectínico), a maioria inibindo a migração celular para os sítios inflamados, provavelmente via inibição da adesão ente leucócito e endotélio (ASSREUY et al., 1997; 1999; ALENCAR et al., 1999; SANTTI- GADELHA et al., 2006; MOTA et al., 2007; NAPIMOGA et al., 2007; NUNES et al., 2009; ROCHA et al., 2011).

As lectinas da subtribo Diocleinae, cujo açúcar ligante é glicose-manose, tem mostrado atividade pró-inflamatória por via subcutânea, mas anti-inflamatória por via intravenosa. No tocante ao efeito anti-inflamatório, as lectinas de Dioclea guianensis, D. violacea, D. virgata, Cratylia floribunda inibem edema de pata e migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de ratos (ASSREUY et al., 1997; ALENCAR et al., 1999). Além disso, a D. guianensis e D. violacea previnem alterações inflamatórias oriundas da cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida em camundongos (ASSREUY et al., 1999). Nunes et al., 2009 demonstrou que a lectina de Canavalia grandiflora apresenta atividade anti-inflamatória evidenciado pela redução dos níveis de mieloperoxidase no macerado de patas inflamadas, do rolamento e adesão de leucócitos e do nível de citocinas, além de inibir hipernocicepção mecânica. Recentemente, Rocha et al., 2011 demonstrou que a lectina de Cymbosema roseum apresenta ações pró ou 44 anti-inflamatória dependendo da via de administração, reforçando esse perfil de ação na subtribo Diocleinae.

A lectina de sementes Lonchocarpus sericeus , específica para N-acetil-D- glicosamina, apresenta efeito na peritonite infecciosa, mesmo não sendo bactericida, é capaz de reduzir o número de bactérias viáveis no sítio infeccioso, além de reduzir migração celular (ALENCAR et al., 2005), inibe edema de pata (ALENCAR et al., 1999). É ainda capaz de inibir a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal em inflamação de origem imune e não-imune, também reduz rolamento e adesão de neutrófilos no endotélio e a atenuar a hipernocicepção mecânica, sendo estes efeitos associados a redução nos níveis de de citocinas próinflamatórias (TNF-α e IL1-β) e quimiocinas (CCL3 e CXCL1) (NAPIMOGA et al., 2007).

1.3.3 Atividade antinociceptiva de lectinas Vegetais

1.3.3.1 Aspectos Gerais da Nocicepção

A dor é considerada o sintoma principal em diferentes doenças, sendo um importante fator que limita a qualidade de vida das pessoas (KIPEL, 2004). Ela é uma característica cardinal dos mecanismos protetores fisiológicos normais e uma das suas funções é preservar o organismo, evitando o dano tecidual (BESSON; DICKENSON, 1997)

Dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor como sendo “uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a um dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tais danos”. É complexa experiência que envolve não apenas a transdução de estímulo ambiental nocivo, mas também cognitiva e emocional processada pelo encéfalo (MILLAN, 1999). Por outro lado, a nocicepção é definida como sendo o mecanismo pelos quais os estímulos periféricos nocivos são transmitidos ao Sistema Nervoso Central sem, no entanto, apresentar componentes afetivos (FURST, 199). De acordo com esses conceitos, dor e nocicepção não são definições sinônimas.

Em termos de duração, um episódio de dor pode ser transitório, agudo ou crônico. No tipo transitório, a ativação dos nociceptores é feita na ausência de qualquer dano tecidual. Na dor aguda, ocorrem, geralmente, lesão e ativação dos nociceptores no 45 sítio lesionado. Já a dor crônica é causada, geralmente por uma lesão ou patologia, sendo que essa também pode ser perpetuada por outros fatores não causadores iniciais da dor. A dor aguda associada a uma lesão tecidual recente pode perdurar menos de um mês, mas, às vezes, pode durar seis meses, transformando-se em dor crônica (LOESER; MELZACK, 1999).

De acordo com o tipo e/ou mediadores envolvidos, a dor pode ser classificada como nociceptiva, neurogênica, neuropáticas e psicogênica, estando associadas à estimulação excessiva de nociceptores, ao dano tecidual neural, à disfunção de um nervo e a fatores psicológicos, respectivamente (FURST, 1999). Somando-se a isso, algumas desordens ocorrem comumente em pacientes que experimentam a dor, como a hiperalgesia (sensibilidade exacerbada à um estímulo nóxico), alodínia (dor em resposta a um estímulo mecânico ou térmico, normalmente não doloroso), e a hiperestesia (sensibilidade anormal a um estímulo sensorial) (BESSON, 1999).

Em relação à sensibilidade dolorosa, esta possui dois estágios distintos: o primeiro denomina-se nocicepção, que se refere à transdução do estímulo doloroso ao SNC por receptores especializados (nociceptores) (FURST, 1999). O segundo estágio refere-se ao processamento elaborado dessa informação nociceptiva, conduzindo à percepção consciente (dor) de uma sensação aversiva (BALDO,1999).

A dor pode também ser classificada de acordo com a origem em dor inflamatória e dor neuropática. A dor inflamatória está presente em muitas doenças de duração transitória ou em processos crônicos, podendo resultar em limitações à rotina do individuo (DUBNER e RUDA 1992). A ocorrência da dor inflamatória está associada ao processo de sensibilização periférica, em que, após uma lesão tecidual ou inflamação, há a liberação de substâncias endógenas, responsáveis pela ativação direta ou pela sensibilização dos nociceptores (CUNHA et al., 2005). Essa sensibilização leva aos fenômenos de alodinia, hiperalgesia e dor espontânea, frequentemente associados a condições inflamatórias (SCHAIBLE; RICHTER, 2004).

Nos processos inflamatórios, as células lesadas e as células inflamatórias liberam mediadores químicos, denominados algiogênicos (ROCHA et al., 2007), incluindo prótons H+ e K+, bradicinina, histamina, ATP (adenosina tri-fosfato), óxido nítrico (NO), serotonina (5-HT), substância P (KIDD, 2001), interleucinas (IL) e fator de necrose tumoral (TNF) (ROCHA et al., 2007; MENESCAL - OLIVEIRA, 2008). Em sequência, ocorre a indução da via do ácido araquidônico e produção dos mediadores 46 finais da dor inflamatória: as prostaglandinas. Uma vez liberados, esses mediadores químicos contribuirão para uma modificação fenotípica na fibra aferente primária, através da ativação de cascatas de segundos mensageiros, enzimas e proteínas, o que reduzirá o limiar de resposta dessa fibra, aumentará a freqüência de potenciais de ação e a atividade espontânea dos nociceptores. Esse contexto resulta em maior excitabilidade neuronal, facilitação da transmissão nociceptiva e manutenção da dor (BASBAUM, 1999; SCHAIBLE; RICHTER, 2004).

A modulação do sinal doloroso pode ser feita a nível periférico, a nível segmentar ou medular (controle do portão), e a nível central no tronco cerebral. Tal como em qualquer área do sistema nervoso, a transmissão e a modulação nociceptiva ocorrem através da liberação de neurotransmissores (BALDO, 1999).

1.3.3.2 Lectinas Vegetais com atividade antinociceptiva

Conforme citado anteriormente, vários trabalhos têm demonstrado o potencial das lectinas vegetais em atuar sobre diversos eventos imunológicos, atividade esta que pode se dar através de diversas vias. Contudo, com relação ao papel dessas proteínas no mecanismo de nocicepção, poucos estudos têm sido realizados. Dentre estes, a atividade antinociceptiva tem sido para algumas lectinas de algas, tais como: Amansia multifida (NEVES et al., 2007), Amansia multifida (BITENCOURT et al., 2008), Pterocladiella capillacea (MELO SILVA et al., 2010) e Caulerpa cupressoides ( VANDERLEI et al., 2010). Com relação às lectinas vegetais, alguns estudos realizados recentemente também vêm demonstrando esse tipo de atividade para algumas lectinas de leguminosas pertencentes à subtribo Diocleinae (FIGUEIREDO et al., 2009; NUNES et al., 2009; HOLANDA et al., 2009; DELATORRE et al., 2011; PIRES et al., 2013).

Figueiredo e colaboradores (2009) demonstraram que a lectina de sementes de C. boliviana (CboL) apresenta uma marcante atividade antinociceptiva em vários modelos de dor central e periférica, atividade esta que foi revertida pela pré-incubação da lectina com o seu açucar específico (glicose). CboL administrada por via intravenosa inibiu consideravelmente as contrações abdominais induzidas por ácido acético e a duas fases do teste da formalina. Em adição, CboL também induziu um aumento significativo no latência nos testes da placa quente e de imersão de cauda. No teste da placa quente o efeito da lectina de sementes de C. boliviana foi revertido por naloxona, indicando o 47 envolvimento do sistema opióide. Esse resultados mostram que CboL possui efeito antinociceptivo de origem tanto central quanto periférico, envolvendo a participação do sistema opióide, sendo este efeito mediado pelo sítio de ligação a carboidratos da lectina.

Outra lectina de Diocleinae para a qual a atividade antinociceptiva tem sido reportada é a lectina de sementes de C. grandiflora (ConGF). Esta proteína foi testada em um modelo de hipernocicepção induzida pela injeção intraperitoneal de carragenana ou formalina e, de acordo com os resultados obtidos, foi constatado que o efeito antinociceptivo causado pela lectina está correlacionado com um bloqueio efetivo do influxo de neutrófilos, demonstrados que ConGF é capaz de inibir hipernocicepção inflamatória (NUNES et al., 2009).

Holanda e colaborados (2009) também demonstraram que outras lectinas extraídas de membros da subtribo Diocleinae também apresentaram atividade antinociceptiva utilizando no modelo de contrações abdominais induzidas por acido acético. As lectinas utilizadas nesse trabalho foram extraídas de sementes de Canavalia marítima (ConM), Canavalia grandiflora (ConGF), Dioclea guianensis (DguiL), Dioclea violacea (DvL) e Cratylia floribunda (CFL) . Através destes experimentos foi observado que todas as lectinas testadas causaram uma redução significativa das contrações abdominais, contudo em intensidades variadas. É um fato bem documentado que as lectinas dessa subtribo, apesar de apresentarem uma grade similaridade estrutural, possuem pequenas variações seqüenciais e de arranjo quaternário responsáveis por diferenças marcantes com relação a atividades biológicas dessas proteínas (CAVADA et al., 2001).

A lectina isolada das sementes da leguminosa Canavalia brasiliensis (ConBr), uma das lectinas da subtribo Diocleinae mais bem caracterizadas até o momento, também foi testada quanto a atividade atinociceptiva. Por via endovenosa, a ConBr inibiu o número de contorções induzidas por ácido acético e a nocicepção induzida pela formalina, tanto na primeira fase como na segunda. Por via oral, a ConBr teve atividade antinociceptiva no teste das contorções abdominais e em ambas as fases do teste da formalina. Além desta ação nas vias periféricas da dor, a ConBr (v.o) possui efeito central pois aumentou o tempo de latência dos camundongos colocados sobre a placa quente. Todos estes efeitos foram revertidos pela associação da lectina (e.v. ou v.o.) ao seu açúcar ligante α-metil-manosídio, mostrando participação do seu domínio lectínico. 48

A antinocicepção central induzida pela ConBr no teste da placa quente é dependente do sistema opióde. A ConBr possui atividade antinociceptiva por via oral via interação de vários sistemas, tanto a nível central como periférico, destacando-se a ativação dos receptores opióides do tipo κ e δ e o sistema adrenérgico. A ConBr, apesar de mostrar ação nociceptiva a nível central, não deprimiu o sistema nervoso central no teste de rota Rod (PIRES, 2005; PIRES et al., 2013).

Contudo, a atividade antinociceptiva não é uma atividade exclusiva das lectinas de plantas da subtribo Diocleinae. Foi demonstrado que a lectina de Lonchocarpus sericeus , por via endovenosa, inibe a hipernocicepção mecânica em ratos induzida pela injeção intraplantar de OVA e carragenina, mas não a induzida por PGE2 ou formalina em camundongos (NAPIMOGA et al., 2007).

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Capitulo 02: Purificação e Caracterização Estrutural de uma Lectina de Sementes de Parkia biglobosa com propriedades Antinociceptiva e Antiinflamatória.

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2. CAPITULO 02: Purificação e Caracterização Estrutural de uma Lectina de Sementes de Parkia biglobosa com propriedades Antinociceptiva e Antiinflamatória.

2.1 INTRODUÇÃO

Conforme mostrado no capitulo 01, o gênero Parkia é o principal táxon da subfamília Mimosoideae que apresenta estudos envolvendo lectinas. Contudo, apenas a lectina de sementes de P. platycephala possui a sua estrutura primária e tridimensional resolvidas e estudos de caracterização biológica das proteínas este gênero ainda são escassos.

O gênero Parkia (família Leguminosae, subfamília Mimosoideae, tribo Parkiae) é considerado como o grupo mais primitivo dentro de plantas leguminosas. Este gênero compreende cerca de 30 espécies arbóreas encontradas nas Américas Central e do Sul, oeste da África e Ásia (HOPKINS, 1984). Uma característica importante deste gênero é que várias de suas espécies são economicamente importantes e, dentre elas, podemos destacar a espécie Parkia biglobosa , uma árvore, característica das savanas africanas, que atinge em média 20 metros de altura (Figura 05). Esta espécie é altamente valorizada pelo fato de suas sementes serem utilizadas como alimento pelas populações locais (TEKLEHAIMANOT, 2004).

P. biglobosa possui uma lectina em suas sementes que foi primeiramente identificada pelo grupo de pesquisa do Professor Henry Debray, no Laboratoire de Chimie Biologique et Unité Mixte de Recherche (Université des Sciences et Technologies de Lille, França) e foi parcialmente purificada por cromatografia de afinidade em gel de Sepharose-manose (dados não publicados)

O presente capitulo mostra de forma detalhada um novo precedimento para a purificação da lectina de sementes de P. biglobosa utilizando a combinação de precipitação por sulfato de amõnio e cromatografia de afinidade em Sephadex-G100. Em adição, nós também mostramos a caracterização físico-química, a estrutura prímaria completa, e cristalização e dados preliminares de difração por raios X e a avaliação das atividades antinociceptica e antiinflamatória desta lectina. 51

Figura 05. Parkia biglobosa Jacq. (A) Vagem com sementes; (B) Ramos com inflorescências; (C) Visão geral de uma árvore.

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2.2 OBJETIVOS

2.2.1 Objetivo Geral Purificar, caracterizar e avaliar as atividades antinociceptica e antiinflamatória da lectina de sementes de P. biglobosa.

2.2.2 Objetivos Específicos • Identificar a presença e determinar a especificidade por carboidratos da lectina; • Purificar a lectina por métodos tradicionais de química de proteínas; • Caracterizar a lectina purificada com relação as suas propriedades físico- químicas; • Determinar a massa molecular da lectina por espectrometria de massas; • Determinar a estrutura primária da lectina utilizando espectrometria de massas sequencial; • Cristalizar e resolver a estrutura tridimensional da lectina por cristalografia de raios X; • Avaliar a atividade antinociceptica e antiinflamatória da lectina purificada.

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2.3 MATERIAIS E MÉTODOS

2.3.1 Purificação lectina de sementes de Parkia biglobosa (PBL)

2.3.1.1 Extração Protéica

Sementes maduras de P. biglobosa , coletadas em Bolama, Guinea Bissau, foram submetidas à trituração, até a obtenção de um pó fino, denominado farinha, apropriada para o processo de extração protéica. As proteínas solúveis da farinha foram extraídas com solução de Acetato de Sódio 100 mM pH 4,0 contendo NaCl 150 mM, na proporção de 1:15 p/v, sob agitação constante, durante 4 horas. A suspensão obtida foi centrifugada a 90000 x g, temperatura 4°C, por 20 minutos e o sobrenadante obtido, denominado extrato total.

2.3.1.2 Fracionamento Protéico do Extrato Total

O extrato total foi então submetido a fracionamento proteico através da adição lenta e sob agitação constante de sulfato de amônio sólido a uma concentração, correspondente à fração 0-60% de saturação. Após 12 horas de contato em repouso, as suspensões foram centrifugadas a 9.000 g por 20 minutos a 4°C, obtendo-se, no precipitado, a fração de interesse. O precipitado foi então ressuspendido em Tris-HCl 50 mM com NaCl 150 mM, em seguida dialisado exaustivamente contra a mesma solução e novamente centrifugado a 9.000 g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante, denominado fração 0-60% (F 0-60%) foi utilizado nos experimentos de cromatografia.

2.3.1.3 Cromatografia de afinidade em gel de Sephadex-G100

A lectina de sementes de P. biglobosa foi purificada através de uma única etapa de cromatografia de afinidade em gel de Sephadex-G100 (12 x 2 cm). Para isso, F 0- 60% foi aplicado ao gel previamente equilibrado com Tris-HCl 50 mM com NaCl 150 mM, permanecendo em contato over night. Após a remoção do material não interagiu com gel (PI) utilizando a solução de equilíbrio, o material retido (PII) foi então eluído com a solução de equilíbrio contendo D-glicose 200 mM. A cromatografia foi realizada a fluxo contínuo de aproximadamente de 1 mL/min e os eluatos cromatográficos 54 coletados em frações de aproximadamente 2,5 mL. O PII, que corresponde a lectina purificada (PBL), foi dialisado exaustivamente contra água, liofilizado e armazenado.

2.3.1.4 Dosagem de Proteínas Solúveis

A concentração de proteínas totais solúveis no extrato e nas diferentes frações foi verificada pelo método descrito por Bradford (1976). A cada 100uL de amostra, diluída ou não, 2,5mL do reagente de Bradford foram adicionados. A mistura foi então deixada em repouso por cerca de 10 minutos e em seguida teve sua absorbância determinada a 595nm em um espectrofotômetro de luz visível (VIS LBK Novaspec II, Pharmacia). A concentração de proteínas solúveis nas amostras analisadas foi determinada à partir de uma curva padrão obtida com o uso de soluções de concentrações conhecidas de albumina sérica bovina (BSA). Para os experimentos cromatográficos, o conteúdo protéico foi avaliado utilizando-se a absorbância a 280 nm dos eluatos cromatográficos.

2.3.1.5 Detecção da Atividade Hemaglutinante

Os testes para detecção de atividade hemaglutinante nos extratos e nas diferentes frações protéicas foram realizados em tubos, a partir de uma adaptação ao protocolo descrito por Moreira e Perrone (1967) como descrito a seguir: As amostras, em duplas seriadas, foram diluídas em tubos (1:2, 1:4, 1:8...) em Tris-HCl 100 mM com NaCl 150 mM. A 100 uL de cada diluição adicionou-se 100uL de uma suspensão de hemácias de coelho ou dos tipos sanguíneos A, B e O, normais ou tratadas com enzimas proteolíticas (papaína ou tripsina) a 2% em NaCl 150 mM. O ensaio foi incubado a 37°C por 30 minutos e, após esse período, deixado em repouso à temperatura ambiente por mais 30 minutos. A presença ou não de hemaglutinação foi então detectada macroscopicamente a olho nu. Os títulos de hemaglutinação foram medidos em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H.) como sendo o inverso da maior diluição ainda capaz de apresentar hemaglutinação visível.

2.3.1.6 Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica 55

Após a obtenção do título de hemaglutinação a da concentração de proteínas solúveis, a atividade específica para cada uma das frações foi calculada, com o objetivo de se monitorar avanços na concentração/purificação da lectina em estudo. O cálculo foi feito pela divisão do título de hemaglutinação (UH/mL) pela dosagem de proteínas solúveis (mgP/mL), cujo quociente foi expresso em UH/mgP (unidades de hemaglutinação por miligrama de proteína). Esses resultados poderão ser comparados, levando à escolha da melhor condição / fração purificadora ou concentradora da atividade hemaglutinante.

2.3.1.7 Especificidade por Carboidratos

A especificidade por carboidratos da lectina de sementes de P. biglobosa foi determinada através de ensaios de inibição da atividade hemaglutinante por açúcares simples, os quais foram realizados segundo protocolo adaptado a partir daquele descrito por Ramos et al., (1996). Para tal propósito, 50 µL de soluções estoques, a uma concentração de 0,1 mol/L de cada carboidrato, foram diluídos serialmente em Tris-HCl 100 mM com NaCl 150 mM. Em seguida, foi adicionada a cada tubo 50 µL de uma solução de lectina em uma concentração capaz de provocar uma aglutinação de 4 U.H. O ensaio foi então incubado a 37°C por 30 minutos, e, após isso, mantido em repouso à temperatura ambiente por mais trinta minutos. Após este período, foram acrescidos 100 µL de uma suspensão a 2% de eritrócitos de coelho tripsinisados a todos os tubos do ensaio. A mistura foi novamente incubada a 37°C, durante 30 minutos, e depois, deixada em repouso à temperatura ambiente por mais 30 minutos. A inibição da atividade hemaglutinante pelos açúcares foi então determinada. Para aqueles carboidratos que se mostraram capazes de inibir a atividade hemaglutinante foi determinada a concentração mínima inibitória (MIC), a qual corresponde a maior diluição, ou a menor concentração, do açúcar em que permaneceu a ausência de atividade hemaglutinante.

2.3.1.8 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS

O acompanhamento do processo de purificação e a estimativa da massa molecular aparente das subunidades da lectina purificada foram feitos através de 56 eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE), realizada segundo uma adaptação ao método descrito por Laemmli (1970). O gel superior ou gel de empilhamento foi preparado usando acrilamida/bisacrilamida 3,5 % em tampão Tris/HCl 500 mM, pH 6,8, SDS 1 %, persulfato de amônio (100mg/ml) e TEMED concentrado. O gel de separação da amostra foi preparado em tampão Tris/HCl 1,5 mol/L, pH 8,8 contendo SDS 1 %, TEMED (concentrado) e persulfato de amônio (100mg/ml). A amostra liofilizada foi solubilizada a uma concentração de 4 mg/mL em tampão de amostra contendo Tris/HCl 62,5 mM pH 6,8, 10 % de glicerol, 0,02 % de azul de bromofenol e 1 % de SDS). A eletroforese SDS-PAGE foi realizada em um sistema Mini-Protean II mini-gel (Bio-Rad; Milão, Itália) com a voltagem variando até 200V, potência até 5W e amperagem constante de 35mA. O tampão de corrida utilizado conteve Tris 0,025M, Glicina 0,192M e SDS 0,1% pH 8,8. Proteínas de massa molecular conhecidas foram utilizadas como padrão (Beta galactosidade 120 kDa, BSA 85 kDa, Ovoalbumina 50 kDa, Anidrade Carbônica 35 kDa e Beta- lactoalbumina 25 kDa; Lisozima 20 kDa). Após a corrida eletroforética, o gel de separação foi fixado em uma solução contendo 25% isopropanol e 10% ácido acético, por no mínimo 1 hora. O gel fixado foi então corado em Coomassie R-250 a 0,05%, dissolvido em metanol, ácido acético e água a uma proporção 1:3,5:8 (v/v/v). A retirada do excesso do corante (descoramento) foi feita em água destilada aquecida.

2.3.2 Caracterização Físico-qumímica de PBL

2.3.2.1 Efeito da Temperatura Sobre a Atividade Hemaglutinante

Alíquotas da lectina de sementes de P. biglobosa solubilizadas em NaCl 150 mM (0,5 mg/ml), foram preparadas em tubos de microcentrífuga de 2 mL. Em seguida, cada amostra foi submetida a diferentes temperaturas variando de 10 ºC a 100 ºC por 60 minutos. Após este período, a atividade hemaglutinante foi testada em todas as amostras.

2.3.2.2 Efeito do pH Sobre a Atividade Hemaglutinante 57

O feito do pH sobre a atividade hemaglutinante da lectina foi avaliado através de testes de atividade hemaglutinante. Para isto, a lectina de sementes de P. biglobosa solubilizada em NaCl 150 mM (0,5 mg/ml) foi dialisada por 24 horas contra diferentes soluções tampão com pHs variando de 4,0 a 10,0 contendo NaCl NaCl 150 mM. Os seguintes tampões foram utilizados: Citrato de sódio 100 mM pH 4,0 e 6,0, acetato de sódio 100 mM pH 5,0, fosfato de sódio 100 mM pH 7,0, Tris-HCl 100 mM pH 8,0, glicina-NaOH 100 mM pH 9,0 e 10,0.

2.3.2.3 Efeito do EDTA Sobre a Atividade Hemaglutinante

O requerimento de cátions divalentes para a atividade da lectina foi investigado. Para tal propósito, a lectina de sementes de P. biglobosa solubilizada em NaCl 0,15 mol/L (0,5 mg/ml) foi inicialmente dialisada contra uma solução de EDTA 100 mM contendo NaCl 150 mM por 24 horas, seguida pela diálise exaustiva contra NaCl 150 mM para retirada de excesso de EDTA. Após isto, a atividade hemaglutinante foi testada adicionando-se soluções de NaCl 0,15 mol/L contendo CaCl 2 e/ou MnCl 2 10 mM.

2.3.2.4 Análise da presença de carboidratos estruturais

A lectina de sementes de P. biglobosa solubilizada em NaCl 150 mM (1,0 mg/mL) foi submetida ao método de Dubois et al. (1956) para a determinação do conteúdo de carboidratos, utilizando-se lactose como padrão. Para confirmar a presença de carboidratos covalentemente ligados estrutura da proteína, a lectina foi submetida a SDS-PAGE, as bandas proteicas foram coradas utilizando o método do ácido periódico- reagente de Schiff (PAS) (ZACHARIUS et al., 1969).

2.3.2.5 Determinação da Massa Molecular por Espectrometria de Massas

A massa molecular da lectina purificada foi determinada através da técnica de Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray (ESI-MS) utilizando um instrumento híbrido (Synapt HDMS, Waters Corp., Milford, USA) operando no modo positivo, com uma resolução de 10.000 e uma exatidão de massas de 3 ppm. Para tal, a proteína foi solubilizada em uma solução contendo 50% de acetonitrila e 0,1% de ácido 58 fórmico, a uma concentração final de aproximadamente 1,0 pMol de proteína. A amostra foi aplicada a um fluxo de 1,0 µL/minuto e as voltagens do capilar e do cone foram ajustadas para 3,0 kV e 40 V, respectivamente. A coleta de dados foi realizada com o auxílio do software Mass Lynx 4.0 e os espectros multicarregados foram deconvoluidos usando técnicas de maximização da entropia (FERRIGE et al., 1992).

2.3.2.6 Estimativa da Massa Molecular Nativa

A massa molecular da lectina de sementes de P. biglobosa foi estimada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sílica Gel (TSK-GEL 3000SW 0,8 x 30 cm) acoplada a um Sistema de Cromatografia Líquida de Alta Performance (AKTA Purifier). Com este intuito, a lectina foi solubilizada em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,6 contendo NaCl 500 mM e aplicada na coluna previamente equilibrada coma mesma solução. A cromatografia se procedeu a um fluxo 0,5 ml/minuto e foi monitorada a 280 nm. Proteínas de massa molecular conhecidas foram utilizadas como padrão: β-amilase 200 kDa, Conalbumina 75 kDa, Ovoalbumina 43 kDa, Anidrase carbônica 29 kDa.

2.3.3 Determinação da Estrutura Primária de PBL

A estrutura primária da lectina purificada foi determinada através da sobreposição das sequências de peptídeos, oriundos de digestões proteolíticas, determinadas por espectrometria de massas sequencial (MS/MS).

2.3.3.1 Digestão proteolítica in gel e obtenção de peptídeos

Para os experimentos visando à obtenção de peptídeos através de digestões proteolíticas, PBL foi submetida a dois tipos de eletroforese. Nos experimentos envolvendo as enzimas tripsina (Promega), quimiotripsina (Sigma-Aldrich), termolisina (Sigma-Aldrich) e Pepsina (Sigma-Aldrich), PBL foi submetida à SDS-PAGE como previamente descrito no item 2.3.1.8. No entanto, quando as enzimas endoproteinase Asp-N (Roche) ou endoproteinase Glu-C (Roche) foram utilizadas, a solução de bisacrilamida foi substituída por uma mistura contendo bisacrilamida e EDA (Etileno Diacrilato) a uma concentração final de 0,22 % e 4,5 x 10 -3 %, respectivamente. Protocolo adaptado de Bornemann e colaboradores (2010). 59

O procedimento de digestão proteolítica da lectina para sequenciamento foi realizado seguindo o protocolo descrito por Shevchenko e colaboradores (2006). Após a eletroforese, a banda referente à cadeia alfa da proteína foi recortada do gel, descorada por sucessivas lavagens utilizando uma solução de 50% de acetonitrila contendo 25 mM de bicarbonato de amônio, desidratada em 100% de acetonitrila e seca em Speedvac (LabConco). Com relação aos géis contendo EDA, estes foram submetidos a dois passos adicionais. Primeiro, os spots foram tratados com NH 4OH 5 M por 2 horas a temperatura ambiente. Depois, a solução de NH 4OH 5 M foi removida e os spots foram lavados três vezes com a solução de 50% de acetonitrila contendo 25 mM de bicarbonato de amônio. Por fim, os spots foram desidratados e secados como descrito acima. Após a secagem o gel contendo a lectina foi reidratado em uma solução contendo uma das seguintes soluções contendo enzimas proteolíticas: 50 mM de bicarbonato de amônio com tripsina, quimiotripsina, endoproteinase Asp-N ou endoproteinase Glu-C; Tris-HCl 100 mM (pH 7,6) com 500 mM de NaCl e 50 mM de

CaCl 2 contendo termolisina; HCl 10 mM contendo Pepsina. A razão enzima:substrato utilizada nos experimentos com tripsina e quimiotripsina foi de 1:50 (m/m), nos experimentos com Asp-N e Glu-C foi de 1:100 (m/m) e nos experimentos com termolisina e pepsina 1:25 (m/m). Todos os ensaios de digestão foram incubados a 37°C, over night. Os peptídeos oriundos das digestões proteolíticas foram então extraídos do gel utilizando uma solução de 5% de ácido fórmico em 50%, concentrados em Speedvac e ressuspensos com 25μL com ácido fórmico 0,1%.

2.3.3.2 Sequenciamento dos peptídeos por espectrometria de massas sequencial (MS/MS) Os peptídeos obtidos das digestões proteolíticas foram injetados em um sistema de Cromatografia Liquida de Ultra-performance (nanoAcquity, Waters Corp. Milford, USA) diretamente conectado a uma fonte de nano electrospray de um espectrômetro de massa (Synapt HDMS, Waters Corp., Milford, USA). Os peptídeos foram previamente separados por cromatografia fase reversa em coluna C18 (75 μm x 100 mm), eluída com um gradiente partindo de 10% a 85% de acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico, antes da analise por MS/MS. 60

O espectrômetro de massa foi operado em modo positivo, com a temperatura da fonte de 90 ºC e a voltagem do capilar de 3.0 kV. Os experimentos foram realizados utilizando a função DDA ( Data Dependent Acquisition – Aquisição Dependente de Dados) onde os íons precursores com carga entre +2 e +4 serão selecionados para análise de MS/MS sendo fragmentados através de CID ( Collision Induced Dissociation – Dissociação induzida por colisão). O instrumento foi previamente calibrado com fragmentos do íon duplamente carregado do [glu1]-fibrinopeptideo B (m/z 785.84) gerados por CID enquanto que a correção de massas realizadas durante os experimenteos foi realizada com este ion intacto. Os dados serão coletados, processados e analisados utilizando o programa MassLynx v 4.1 (Waters Corp) e ProteinLynx v 2.4 (Waters Corp). Os peptídeos com sequência de aminoácidos comuns a outras proteínas serão identificados por buscas em banco de dados utilizando as ferramentas de pesquisa por padrão de fragmentação dos peptídeos ProteinLynx 2.4 (Waters Corp) e MASCOT (Matrix Science). Os peptídeos que não forem identificados por estes meios terão suas sequências determinadas através da interpretação manual dos espectros de fragmentação (sequenciamento de novo ).

2.3.3.3 Analise da Estrutura Primária

Uma vez obtida a sequência primária de PBL, esta foi submetida à análise onde utilizados programas de alinhamento para análise de similaridade e homologia entre as sequências de aminoácidos obtidas e todo o banco não redundante de proteínas depositadas no Nacional Center of Biotechnology Information (NCBI). Inicialmente, a sequência primária de PBL foi submetida ao programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1997) e as proteínas com maior scorre foram selecionados para os alinhamentos de sequências utilizando o ESPript 2,2 (GOUET et ai., 2003). A informação de ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular média teórica da sequência de aminoácidos da lectina foram calculada usando a ferramenta PeptideMass (http://web.expasy.org/peptide_mass/) (GASTEIGER et ai., 2005). A presença de sítios de N-glicosilação foi avaliada usando o NetNGlyc ferramenta (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) (GUPTA et al., 2004).

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2.3.4 Cristalografia de Raios X

2.3.4.1 Cristalização da PBL

A lectina de sementes de P. biglobosa foi cristalizada, na forma nativa e complexada com o ligante α-metil-D-manopiranosideo, utilizado o método da difusão de vapor em gota suspensa. As melhores condições de cristalização foram testadas utilizando o método da matriz esparsa (JANCARIK & KIM, 1991), com o objetivo de encontrar uma ou mais condições favoráveis ao crescimento de cristais da proteína.

Para tal propósito, PBL, previamente purificada e liofilizada, foi suspendida em água Milli-Q na concentração final de 10 mg/mL. A suspensão da proteína foi então centrifugada à 9.000 g por 10 min e o sobrenadante foi utilizado para os passos futuros. Para experimentos com o ligante, a proteína em solução foi encubada com α-metil-D- manopiranosideo na concentração final de 5 mM por uma hora antes dos experimentos de cristalização. A lectina foi então submetida ao “screen” de cristalização, utilizando o método da matriz esparsa inicialmente descrito por Jancarik & Kim (1991). Os kits utilizados foram o “crystal screen 1” e “crystal screen 2” (Hampton) onde as variáveis iniciais foram pH, sal e precipitantes.

O método utilizado para a cristalização foi o de difusão de vapor e gota suspensa utilizando placas de cristalização de 96 poços. As placas foram montadas utilizando um robô de cristalização Mosquito ® Crystal (TTP LabTech). Foram colocados em cada poço da placa de cristalização 100 μL da solução do kit (condição de cristalização) e a gota foi composta por 150 nL da solução de proteína e 150 nL da condição de cristalização. O poço foi então vedado e deixado em repouso à temperatura de 18ºC.

Após a obtenção de cristais foi feita a otimização das condições iniciais de cristalização, variando a concentração de precipitante e o pH da solução, repetindo o método da difusão de vapor. Essa otimização visou melhorar a condição de formação dos cristais, produzindo assim, cristais com características necessárias para que ele possa ser difratado quando submetido à difração de raios X. O método utilizado na otimizações foi novamente o de difusão de vapor em gota suspensa, contudo, utilizando desta vez placas de cristalização Linbro® de 24 poços. Foram colocados em cada poço da placa de cristalização 300 µL da solução do kit (condição de cristalização) e a gota foi composta por 2 µL da solução de proteína e 2 µL da condição de cristalização. O 62 poço foi então coberto lamínula siliconizadas utilizando graxa de silicone para vedação, as placas forma deixadas em repouso a temperatura de 18ºC.

2.3.4.2 Difração e coleta de dados

Os dados de difração de raios X foram coletados a temperatura de 100K. Para evitar formação de gelo os cristais foram mergulhados em uma solução crioprotetora composta de 80% da solução de cristalização e 20% de glicerol. O cristal laçado com o loop foi alinhado utilizando-se o goniômetro e então submetido à coleta de dados. A estação experimental MX2 do Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (Campinas-SP) foi utilizada para a coleta. A linha pode realizar coletas em diferentes comprimentos de onda (0,8 – 2,5 Å), contudo o comprimento de onda usado foi de 1,4 Å. O detector utilizado foi MarMosaic 225 (CCD com área de 225x225 mm2) e foram coletadas 180 imagens com oscilação de 1°, totalizando 180°.

Os dados foram processados, indexados e integrados utilizando-se o programa MOSFLM (LESLIE, 1992) e as intensidades reduzidas utilizando o programa SCALA (EVANS, 1997). Todos os programas utilizados fazem parte do pacote CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994). No processamento são observadas as intensidades de cada ponto de difração e os índices de Miller, que são números inteiros utilizados para identificar os pontos de difração no espaço recíproco.

2.3.5 Avaliação das Atividades Antinociceptiva e Anti-inflamatória de PBL

2.3.5.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss albinos, machos, pesando entre 25 e 35 g, provindos do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os animais foram mantidos na sala de quarentena do Instituto Superior de Ciências Biomédicas (ISCB) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) nos dias antecedentes ao experimento, recebendo água e ração ad libitum, sob condições adequadas de luz e temperatura. Esses animais permaneceram no laboratório durante um período de adaptação de, pelo menos, uma hora antes dos testes e foram manipulados de acordo com os padrões éticos estabelecidos pelo Comitê de Ética da UECE (N o 10130208-8/40). 63

2.3.5.2 Avaliação do efeito de PBL no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

A metodologia utilizada seguiu o modelo proposto por Vander-Wende e Margolin (1956) para ratos e modificada por Koster e colaboradores (1959) para camundongos. Os animais receberam ácido acético (0,6%; v/v) por via intraperitoneal obedecendo a relação 0,1mL/10g de peso corporal A contagem do número de contorções abdominais foi realizada durante 30 minutos, iniciando-se após 10 minutos da sua indução.

Para avaliar o efeito antinocicepitivo da PBL, os camundongos foram tratados com esta lectina nas doses de 0,01; 0,1 e 1,0 mg/Kg por via endovenosa (plexo intraorbital) 30 minutos e 1 hora antes da injeção de ácido acético, respectivamente. Os grupos controles receberam o mesmo volume de salina ou indometacina (5 mg/kg).

2.3.5.3 Avaliação do efeito de PBL no modelo de Peritonite.

Este modelo foi utilizado para avaliar a potencialidade de PBL em inibir a migração de leucócitos induzida por agentes quimiotáticos indiretos (carragenana) e diretos (fMLP) (RIBEIRO et al., 1997).

Para tal propósito, PBL (1,0 mg/kg) foi administrada por via endovenosa 30 min antes da injeção de carragenana (1 mg) ou fMLP (50 ng) administrados por via intraperitoneal. Após 4h da indução da peritonite, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e a cavidade peritoneal foi aberta, através de uma incisão longitudinal, e lavada, injetando-se 3 mL de salina, contendo 5 UI/mL de heparina. Após massagem do peritônio, o exsudato foi coletado, em condições estéreis, para a contagem total e diferencial de leucócitos (expressos em no de células/ mL de fluido peritoneal) por microscopia óptica (SOUZA e FERREIRA, 1985). A contagem total foi feita em câmara de Neubauer a partir de 20 μL de fluido peritoneal diluídos em 380 μL de reagente de Turk. A contagem diferencial foi realizada através de esfregaços em lâminas, coradas pelo método da hematoxilina-eosina.

Os controles positivos receberam somente os agentes flogísticos (i.p.) e os controles negativos, somente salina. 64

2.3.5.4 Análise estatística

Todos os resultados foram expressos como média dos valores ± S.E.M. para n experimentos. A avaliação estatística foi combinada pela análise de variância (ANOVA) para múltiplas comparações, seguida pelo teste de Bonferroni. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

65

2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.5 Purificação da Lectina de Sementes de Parkia biglobosa

Os extratos protéicos preparados com a farinha de sementes de Parkia biglobosa apresentaram níveis relativamente altos de atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho nativos ou tratados com enzimas proteolíticas, mas não contra eritrócitos humanos dos grupos sanguíneos A, B e O (Tabela 03), sendo que o maior título de hemaglutinação foi observado contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina. Vários estudos envolvendo lectinas mostram que muitas vezes estas proteínas têm sua atividade hemaglutinante potencializada pelo tratamento dos eritrócitos com enzimas proteolíticas (NAGANO et al., 2002; PINTO et al., 2008), isto ocorre pelo fato destas enzimas atuarem clivando certas proteínas da superfície da membrana celular dos eritrócitos expondo ainda mais os carboidratos que compõem o glicocálice. Isso permite que as lectinas tenham um maior acesso a estes, aumentando assim os títulos de hemaglutinação.

Tabela 03: Atividade hemaglutinante no extrato total das sementes de P. biglobosa . Tratamento Enzimático Tipo de Eritrócito Tripsina Papaína Nativos Coelho 1024 1024 256 Humano tipo A 0 0 0 Humano tipo B 0 0 0 Humano tipo O 0 0 0 *Valores expressos em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H.).

A atividade hemaglutinante presente nos extratos de sementes de P. biglobosa foi totalmente inibida por D-manose, D-glicose e derivados, tais como, α-metil-D- manopiranosideo e N-acetil-D-glicosamina. Contudo não foi inibida pelos demais carboidratos utilizados nos ensaios de inibição (Tabela 04), demonstrando que a atividade hemaglutinante presente no extrato é realmente causada pela presença de uma lectina. Além disso, nesse estudo de inibição também foi observado que a lectina possui uma afinidade para α-metil-D-manopiranosideo (1,56 mM) quatro vezes maior do que para D-manose (6,25 mM) e uma afinidade por N-acetil-D-glicosamina (12,5 mM) duas 66 vezes maior do que para e D-glicose (25 mM). Estes resultados indicam que a presença um substituinte mais hidrofóbico no C-1 do α-metil-D-manopiranosideo e no C-2 da N- acetil-D-glicosamina podem favorecer o estabelecimento de interações adicionais com regiões hidrofóbicas do sítio de ligação a carboidratos da lectina, aumentando assim a afinidade por estes carboidratos em relação a D-manose e D-glicose, respectivamente. Este perfil de especificidade de ligação a carboidratos é característico de outras lectinas isoladas de espécies pertencentes ao gênero Parkia (UTARABHAND & AKKAYANONT, 1995; CAVADA et al., 1997, 2000; KAUR et al., 2005) e de outras espécie de leguminosas (RAMOS et al ., 1996; MO et al., 1999).

Tabela 04: Inibição da atividade hemaglutinante no extrato total de sementes de P. biglobosa por carboidratos

Carboidrato MIC* (mM) D-Glicose 25

D-Galactose NI

D-Frutose NI

D-Fucose NI

D-Manose 6,25

D-Xilose NI

D-Arabinose NI

N-Acetil- D-glicosamina 12,5

α-metil- D-galactopiranosídeo NI

α-metil- D-manopiranosídeo 1,56 Lactose NI Lactulose NI

* Concentração Mínima Inibitória em mM; **O carboidrato não inibiu a uma concentração de 50 mM.

A lectina de sementes de P. biglobosa foi purificada por precipitação pela adição de sulfato de amônio seguida por uma cromatografia de afinidade em uma matriz de Sephadex-G100. Para isto, o extrato total foi inicialmente precipitado pela adição de sulfato de amônio sólido para a obtenção da fração 0-60% de saturação (F 0-60 %) a qual apresentou uma forte atividade hemaglutinante. Esta fração foi então utilizada para 67 a cromatografia de afinidade em uma matriz de Sephadex- G100, na qual, após a remoção das proteínas que não interagiram com a matriz (PI), a lectina purificada (PII) foi eluida com 200 mM de D-glicose (Figura 06A), sendo denominada de PBL.

Figura 06. Purificação da Lectina PBL. (A) Perfil de eluição da cromatografia de afinidade em Sephadex-G100. Aproximadamente 10 mL da fração 0-60% solubilizada em Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7.6 com NaCl 150mM foram aplicados em uma coluna de Sephadex-G100 (12,0 X 2,0 cm) previamente equilibrada com a mesma solução. A fração não retida (PI) foi removida com o tampão de equilíbrio, enquanto que, a fração retida (PII) foi eluida com solução de equilíbrio contendo D-glicose 200 mM. Frações de aproximadamente 2,5 mL foram coletadas manualmente e analisadas por espectrofotometria com leitura a 280 nM. (B) SDS- PAGE. Poços: 1- Marcadores moleculares (Beta galactosidade 120 kDa, BSA 85 kDa, Ovoalbumina 50 kDa, Anidrade Carbônica 35 kDa e Beta- lactoalbumina 25 kDa; Lisozima 20 kDa). 2- PBL em condições não redutoras. 3- PBL em condições redutoras.

O conteúdo de proteínas solúveis totais e a atividade hemaglutinante específica no extrato total foram 7,2 mg/mL e 246,2 U.H./mg, respectivamente. Para a PBL purificada estes valores foram 0,24 mg/mL e 4266,7 U.H./mg, respectivamente. Esse 68

procedimento de purificação resultou na lectina purificada com um grau de pureza de 13,7 vezes em relação ao extrato total (Tabela 05).

Tabela 05: Tabela de Purificação da Lectina de Sementes de P. biglobosa.

a) Proteínas b) c) Fração U.H Ativ. Específica d) Purificação (mg/ml) Total (U.H/mg) Extrato Total 8,32 2048 246,2 1 Fração 30-60% 7,2 2048 284,4 1,6 PII Sephadex-G100 0,24 1024 4266,7 17,3

a) Concentração de proteínas determinada pelo método de Bradford (1976); b) Atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina, expressa em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H.); c) Atividade Hemaglutinante Específica calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante e a concentração de proteínas; d) Purificação, calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante específica do extrato total e aquela de cada passo de purificação subsequente.

O processo de purificação de PBL foi monitorado por SDS-PAGE (Figura 06B). Pode-se observar que a lectina purificada é caracterizada por um perfil composto por uma banda única de massa molecular aparente de 50 kDa, tanto na presença quanto na ausência do agente redutor. Outras lectinas isoladas de membros do gênero Parkia, tais como, P. platycephala (CAVADA et al., 1997), P. discolor (CAVADA et al., 2000) e P. speciosa (SUVACHITTANONT & PEUTPAIBOON, 1992), apresentam um perfil eletroforético semelhante ao de PBL. Em contraste com PBL e demais lectina de Parkia, a lectina purificada de sementes de P. javanica apresenta um perfil composto por uma banda dupla de 45.7 e 47.9 kDa (UTARABHAND & AKKAYANONT, 1995).

2.5.1 Caracterização Físico-química da PBL

PBL demonstrou ser uma proteína e manteve a sua atividade hemaglutinante de em uma ampla faixa de pH. Os títulos de hemaglutinação alcançaram seus valores mais altos no pH 6,0, indicando que esta é a faixa de pH ótimo para a atividade dessa 69 proteína. A atividade hemaglutinante foi reduzida quando realizada em valores de pH tanto mais baixos quanto mais altos do que 6,0 (Figura 07 A). PBL também demonstrou ser uma proteína razoavelmente termoestável e manteve sua atividade hemaglutinante inalterada após incubação a 50 ºC por 1 hora. Contudo, a lectina teve sua atividade hemaglutinante drasticamente reduzida após a incubação a 60 ºC, sendo está atividade perdida quando exposta a temperaturas iguais ou superiores a 70 ºC (Figura 07 B). Uma das características principais das lectinas de leguminosas é o fato de que estas possuem sítios de ligação a cátions divalentes, principalmente cálcio e manganês, em suas estruturas. Esses íons atuam estabilizando a estrutura do sitio de ligação a carboidratos e sua ausência resulta em uma instabilidade local e na perda da capacidade de ligar-se a carboidratos (LORIS et al., 2004). A atividade hemaglutinante da lectina de sementes de P. biglobosa não foi afetada após diálise exaustiva da proteína nativa contra solução de EDTA 100 mM. A adição de Ca 2+ e/ou Mn 2+ à lectina dialisada também não afetou sua atividade hemaglutinante (Figura 07 C). Estes resultados sugerem que PBL, diferentemente da maioria das lectinas de leguminosas (LORIS et al., 1998; CAVADA et al., 2001), não necessita de íons metálicos para sua atividade ou estes íons, se presentes na estrutura da proteína, estão fortemente ligados a molécula e não são quelados pelo EDTA. A resolução da estrutura tridimensional mostrou que a ausência de íons metálicos é uma característica compartilhada pela lectina específica da glicose/manose de sementes de P. platycephala (PPL-1) e por outras lectinas relacionada a jacalina, tais como, Artocarpus integrifolia (PRATAP et al., 2002), Heliantus tuberosus (BOURNE et al., 1999) and Calystegia sepium (BOURNE et al., 2004). 70

Figura 07: Propriedades físico-químicas de PBL. (A) Estabilidade a variações de pH, (B) Estabilidade térmica e (C) Efeito do EDTA e da adição de cátions sobre a atividade hemaglutinante.

Corroborando com os resultados obtidos por SDS-PAGE, a análise por Espectrometria de Massa com Ionização por Eletrospray (ESI-MS) indicou que PBL possui uma massa molecular molecular média de 47562 ± 4 Da (Figura 08). Nenhum íon de com massa molécula inferior foi detectado indicando que PBL é composta por uma cadeia polipeptídica única. Similarmente, PPL-1 através da mesma técnica apresentou uma massa de 47 946 ± 6 Da (MANN et al., 2001).

71

Figura 08. Análise por Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray. Espectro de massa deconvoluido mostrando a massa molecular média de PBL.

As lectinas de leguminosas, normalmente, apresentam-se como dímeros ou tetrâmeros, compostos por monômeros iguais ou diferentes e com massa molecular em torno de 25 a 30 kDa (SHARON & LIS, 1989). PBL, por cromatografia de exclusão molecular em coluna de TSK Gel em condições não desnaturantes, apresentou um pico simétrico correspondendo a uma massa molecular estimada de 98 kDa (Figura 09). Esse resultado, comparado com aqueles observados por SDS-PAGE e por espectrometria de massas, sugere que, em solução, a PBL assume uma estrutura dimérica, composta por subunidades idênticas. Similarmente, Mann e colaboradores (2001) observaram através da técnica de ultracentrifugação analítica que PPL-1 também se comporta como um dímero.

72

Figura 09. Estimativa da massa molecular nativa. A massa molecular nativa de PBL foi estimada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sílica Gel (TSK-GEL). Os padrões de massa molecular utilizados foram: (a) β-amilase 200 kDa, (b) Conalbumina 75 kDa, (c) Ovoalbumina 43 kDa, (d)Anidrase carbônica 29 kDa. PBL apresentou uma massa molecular estimada de aproximadamente 108 kDa.

A análise da presença de carboidratos na estrutura de PBL realizada pelo método de Dubois et al. (1956) mostrou que PBL não possui carboidratos em sua estrutura. Corroborando com este resultado, PBL também não foi corada pelo método do PAS. Juntos, estes resultados mostram que PBL não é uma glicoproteína, característica compartilhada com PPL-1 (MANN et al., 2001). Em contrates, outras lectinas do gênero Parkia mostraram ser glicoproteínas (UTARABHAND & AKKAYANONT, 1995; KAUR et al., 2005).

73

2.5.2 Determinação da Estrutura Primária de PBL

A estrutura primária da lectina de sementes de P. biglobosa foi determinada através da sobreposição das sequências de peptídeos, oriundos de digestões proteolíticas, determinadas por espectrometria de massas sequencial (MS/MS). Nestes experimentos, 64 peptídeos foram sequenciados resultando em um total de 443 resíduos de aminoácidos (Figura 10).

Figura 10. Sequência de aminoácidos da PBL. A sequência de aminoácidos de PBL foi montada pela sobreposição das sequências de aminoácido de peptídeos, oriundos de digestões proteolíticas com Tripsina (T-), Quimiotripsina (C), Endoproteinase Asp-N (D-), Endoproteinase Glu-C (G), Termolisina (Th-) e Pepsina (P), determinadas por espectrometria de massa sequencial (MS/MS).

Durante a análise, foi encontrada heterogeneidade de sequência nas seguintes posições: D/S83, D/A163, G/R211, D/S346, A/G347 e D/S376. Esses achados mostram 74 que as preparações de PBL são compostas por uma mistura de isoformas dessa proteína. A figura 11, mostra duas isoformas do peptídeo T18, no qual os y produzidos por CID formam usados para a determinação das sequências de aminoácidos e onde pode-se observar claramente a substituição A/G347.

Figura 11. Peptídeos de isoformas de PBL. Espectros de MS/MS produzidos por CID de duas isoformas do Peptídeo T18. (A) Íon duplamente carregado com m/z 783.31 cuja serie de ions y mostra uma sequência interpretada como e DTSGLDSATFGGVNPK. (B) Íon duplamente carregado com m/z 776.81 cuja serie de ions y mostra uma sequência interpretada como DTSGLDSGTFGGVNPK.

Considerando Asp83, Asp163, Gly211, Asp346, Ala347 e Asp376 na sequência de PBL a massa molecular média calculada é de 47.236 Da, a qual é apenas 326 Da menor do que massa molecular média determinada experimentalmente por ESI-MS (47.562 ± 4 Da) e o PI teórico calculado para a sequência foi 5,67. 75

A comparação da sequência de aminoácidos de PBL com outras sequências depositadas no banco não redundante de proteínas do NCBI mostrou que PBL apresenta similaridade de sequência lectinas relacionadas à jacalina ligantes a manose. Dentre estas, podemos citar as lectinas de Artocarpus integrifolia (código de acesso TrEMBL: Q7M1T4), Heliantus tuberosus (código de acesso TrEMBL: Q8S3V3), Castanea crenata (código de acesso SwissProt: P82859) e, principalmente, a lectina de sementes de P. platycephala (PPL-1) (código de acesso SwissProt: P83304), com a qual PBL compartilha 94% de similaridade. As lectinas relacionadas à jacalina ligantes a manose correspondem a um grupo de proteínas amplamente distribuído entre os organismos, sendo encontradas em grupos taxonomicamente distantes incluindo algas e plantas de diversos táxons, tais como, Pteridófitas (MORI et al., 2005), Espermatófitas (NAKAMURA et al., 2002; HARAGUCHI et al., 2006) e Angiospermas (BOURNE et al.,1999; MANN et al., 2001; PRATAP et al., 2002). Esta característica sugere que estas lectinas representam um grupo primitivo de proteínas e que foram bastante conservadas ao longo do processo evolutivo. Além disso, as lectinas relacionadas à jacalina ligantes a manose também apresentam similaridade de sequência com proteínas induzíveis por hormônios vegetais, como jasmonato e ácido salicílico (ABEBE et al., 2005; XIANG et al., 2011; MA et al., 2010), e com produtos gênicos induzidos por estresse salino (ZHANG, et al., 2000), o que sugere um ancestral comum para este grupo de lectinas e proteínas induzíveis de defesa de plantas. O alinhamento realizado com as sequências de PBL e PPL-1 utilizando o programa ESPript 2.1 (GOUET et al., 2003) revelou que, similarmente a PPL-1(MANN et al., 2001), a cadeia polipeptídica de PBL é composta por três domínios relacionados a jacalina organizados em repetição (Figure 12). PPL1 apresenta uma sequência de três resíduos de aminoácidos em seu N- terminal (Ser-Leu-Lys) que não foram encontrados em PBL. Contudo, considerando que PBL possua os mesmo três resíduos de aminoácidos no seu N-terminal, a massa calculada aumenta para de 47.236 Da para 47.565 Da, a qual é notavelmente próxima à massa determinada experimentalmente por ESI-MS (47.562 ± 4 Da). Isto sugere que PBL, provavelmente, possui os mesmos três resíduos de aminoácidos presentes no N- terminal de PPL-1 e os peptídeos, produzidos pelas digestões proteolíticas, que continham esta sequência podem ter sido perdidos durante a análise por espectrometria de massa devido ao seu pequeno tamanho ou a dificuldades no processo de ionização. 76

Outra hipose que pode explicar a diferença entre as massas experimental e teórica de PBL é a possibilidade dessas lectina, assim como PPL-1, possir uma modificação postraducional em seu N-terminal causada pela presença de um aminoácido modificado (MANN et al., 2001). A presença de um aminoácido deste tipo poderia ser responsável por essa diferença de massas. A busca pela presença de sítios de N-glicosilação foi avaliada usando o NetNGlyc ferramenta (GUPTA et al., 2004) mostrou que PBL apresenta dois sítios de N-glicosilação, nas posições 103 e 250, os quais também estão presentes em PPL- 1(Figura 12). Contudo, PBL não foi reativa ao método do fenol ácido sulfúrico e ou ensaio do PAS. Estes resultados sugerem que PBL, apesar de possuir sírios para N- glicosilação em sua sequência de aminoácidos, não é uma glicoproteína.

Figura 12. Alinhamento da sequência de aminoácidos de PPL-1 e PBL usando o programa ESPript 2.1 (GOUET et al., 2003). 77

A cadeia de aminoácidos de PBL possui um único resíduo de cisteína. Embora tenha sido evidenciado através de cromatografia de exclusão molecular que PBL em solução se comporta como um dímero, o perfil eletroforético da lectina purificada na ausência e na presença do agente redutor β-mercaptoetanol e o espetro de massa da proteína intacta mostram claramente que este resíduo de cisteína não está envolvido na formação de pontes dissulfeto entre os monômeros de PBL. A elucidação da estrura tridimensional da lectina PPL-1 em complexada com X- Man mostrou que esta lectina possui três sítios de ligação a manose por monômero, um para cada um dos três domínios relacionados à jacalina presentes na sequência. Em cada sítio, a ligação a manose ocorre de forma diferente que é restringido pela flexibilidade dos loops e pelo posicionamento dos resíduos envolvidos na ligação ao carboidrato (GALEGO Del SOL et al., 2005). Os aminoácidos envolvidos em cada um dos sítios de ligação a carboidratos em PPL-1 são: Gly16, Gly136, Tyr137, Tyr138 and Asp140 (Sítio-1); Gly164, Asp165, Gln 206, Tyr283, Tyr284 and Asp286, (Sítio-2); Gly311, Asp312, Asp432 and Asp435 (Sítio-3). O alinhamento entre as sequências mostrou que todos os resíduos de aminoácidos presentes nos diferentes sítios de ligação a carboidratos de PPL-1 são conservados em PBL.

2.5.3 Cristalografia de Raios X

PBL, na sua forma nativa ou complexada pela incubação previamente com α- metil-D-manopiranosideo, foi submetida a experimentos de cristalização utilizando kits de cristalização “crystal screen 1” e “crystal screen 2” da Hampton research, onde após uma semana foram obtidos cristais em duas condições iniciais: condição 42 do crystal screen 2 (Bicina 100 mM, pH 9,0 com NaCl 100 mM e PEG ME 550 20%), condição 45 do crystal screen 2 (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5 com cloreto de níquel hexaidratado10 mM e PEG ME 2000 20%). Apesar de cristais terem crescido nos experimentos iniciais (Figura 13 A), devido ao seu pequeno tamanho, não foram suscetíveis aos experimentos de difração de raios X. Para solucionar este problema, várias etapas de otimizações foram realizadas utilizando como base as condições de cristalização iniciais nas quais foram observadas o crescimento de cristais, contudo, variando pH e concentração de precipitante. Nestes 78 experimentos foram obtidos alguns cristais com tamanho apropriado para a realização de experimentos de difração de raios X. Esses cristais foram levados ao Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS) em Campinas/São Paulo, e difratados na linha de luz MX2, utilizada para experimentos de difração de raios X para macromoléculas. Foram observados padrões de difração característicos de cristais de proteínas, confirmando que os cristais eram realmente compostos de proteínas. Dentre os conjuntos de dados coletados, o conjunto obtido a partir de um cristal da lectina, complexada com α-metil-D-manopiranosideo, crescido em uma condição de cristalização composta por 100 mM de Tris-HCl pH 7,5 contendo 10 mM de Cloreto de níquel e PEG ME 550 20% apresentou uma melhor qualidade para a futura elucidação da estrutura tridimensional da PBL (Figura 13 B). A partir de agora trataremos dos resultados obtidos a partir da difração deste cristal.

Figura 13. Cristais de PBL. (A) Pequenos cristais obtidos com a condição N° 45 do Screen II. (B) Cristal obtido após otimização desta condição.

O cristal de PBL foi difratado colocando a placa de imagem a uma distância de 158,3 mm e geraram um conjunto de dados com resolução máxima de 2,4 Å. O conjunto de 180 imagens foi indexado, integrado e escalonado a 2,4 Å. O cristal apresentou grupo espacial ortorrômbico C2221 com parâmetros de cela a=76,80 Å, b=86,67 Å, c=130,01 Å; α=90° β=90° γ=90°. O coeficiente de Matthews 2,25 Å3Da- 79

1(MATTHEWS, 1968) foi calculado baseado no peso molecular da proteína 47.565 Da e implica que o cristal continha 45,39% de solvente, indicando a presença de um monômero por unidade assimétrica. Os dados foram escalados com um total de 73144 (10672) reflexões, sendo 16259 (2370) reflexões únicas, revelando 96,1 % (96.1 %) de completeza, Rmerge a 12,1 (31,8) e (I/σ) em 2,3 (2,3), sendo os valores em parêntesis referentes a camada de maior resolução (2,53 – 2,4). Todas as estatísticas da coleta de dados estão descritas na (Tabela 06).

Tabela 06. Estatística da coleta de dados de difração de raios X Parâmetros Valores

Grupo espacial C2221 Parâmetros da cela unitária Å A 76,80 B 86,67 C 130,01 Número de reflexões totais 73144 (10672) b Número de reflexões únicas 16259 (2370) b Número de moléculas por unidade assimétrica 1 Limite de resolução Å 43,34 – 2,4 (2,53 – 2,4) b Rmerge (%) a 12,1 (31,8)b Completeza (%) 96,1 (96,1) b Multiplicidade 4,4 (4,5) b I/(σ) 2,3 (2,3) b I (hkl) 〈− I(hkl )i〉 ∑hkl ∑ i a R = merge 〈I (hkl )i〉 ∑hkl ∑ i b Valores em parênteses representam a resolução da ultima camada

Utilizado estes dados foi possível estabelecer um modelo parcial para a estrutura tridimensional da lectina de sementes de P. biglidosa (Figura 14). Contudo, este modelo ainda precisa passar pelo processo de refinamento de posição, onde serão feitas mudança do posicionamento das cadeias laterais orientando-as para dentro das densidades eletrônicas de forma precisa.

80

Figura 14. Estrutura tridimensional porcial de PBL. A) Visão Geral do monômero de PBL; (B) Visão Geral do dímero de PBL.

2.5.4 Avaliação das Atividades Antinociceptiva e Anti-inflamatória de PBL

Avaliação da atividade antinociceptiva da lectina de sementes de P. biglobosa foi testada utilizando o teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos. Neste experimento observou-se que PBL diminuiu o número de contorções abdominais induzidas por este estímulo de maneira dose-dependente. PBL administrada por via endovenosa (0,01; 0,1 e 1,0 mg/Kg), 30 min antes do ácido acético, diminuiu o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético em todas as doses testadas. O número de contorções abdominais foi reduzido para 31.6 ± 3.2 (0,01mg/Kg), 21.28 ± 3.5 (0,1mg/Kg) e 20 ± 2.9 (1,0mg/Kg) em relação ao grupo controle (48.13 ± 4.1). A dose de 1,0 mg/Kg inibiu as contorções abdominais em 58% e foi significantemente diferente da dose de 0,01 mg/Kg (34%) mas não da dose de 0,1 mg/Kg (51%) (Figura 15). 81

Figura 15. Efeito antinociceptivo PBL administrada por via endovenosa no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético. PBL (0,01; 0,1 e 1,0 mg/Kg) administrada 30 min antes do ácido acético 0.6% (v/v; 0,1ml/10g peso corporal). Controles: ácido acético sem pré- tratamento com a PBL e indometacina (5 mg/kg; i.p.). Dados representados como média ± E.P.M. (n=6-8). *p<0,05 em relação ao controle; #p<0.05 em relação a outras doses de PBL.

O teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético tem sido muito utilizado para avaliação da resposta antinociceptiva (LABUZ et al., 2007). A irritação intraperitoneal induzida por ácido acético desencadeia a liberação de uma variedade de mediadores inflamatórios, tais como, bradicinina, prostaglandinas, substâncias P e citocininas, que ativam nociceptores quimio-sensitivos e levam a dor inflamatória (RIBEIRO et al., 2000). O efeito inibitório exercido por PBL sobre o número de contrações induzidas por ácido acético é sugestivo de um efeito analgésico periférico, provavelmente associado à inibição do processo inflamatório. Outras lectinas de plantas apresentam efeito semelhante utilizado este modelo (HOLANDA et al., 2009; PIRES et al., 2013). Com a finalidade de avaliar o efeito de PBL sobre o desenvolvimento do processo inflamatório agudo, nós utilizamos o modelo de peritonite Este modelo foi utilizado para avaliar a potencialidade de da lectina em inibir a migração de leucócitos 82 induzida por agentes quimiotáticos indiretos (carragenana) e diretos (fMLP) (RIBEIRO et al., 1997). Em modelos animais, como o modelo de peritonite, por exemplo, a carragenana estimula as células residentes a liberar mediadores quimiotáticos inflamatórios, aumentando a migração de leucócitos, especialmente neutrófilos (DI ROSA, 1971). Em contrate, fMLP atua diretamente como um agente quimioatrativo sobre leucócitos (RIBEIRO et al., 1997). Os resultados obtidos nos experimentos de peritonite demonstram que PBL apresenta um potente efeito antiinflamatório contra o estímulo quimiotático indireto causado pela carragenana. A migração de leucócitos elicitada pela carragenana (2925 ± 235 células/mL) foi drasticamente reduzida (841.7 ± 118.3 células/mL) pela administração endovenosa prévia de PBL a uma concentração de 1 mg/kg, chegando a valores similares aos observados o grupo controle negativos (930 ± 52 células/mL) que receberam somente salina (Figura 16 A). O efeito inibitório de PBL sobre a migração de leucócitos resultou principalmente da inibição sobre a migração de neutrófilos (PBL: 112 ± 29.8 vs . carragenana: 1883.7 ± 277 células/mL), enquanto que, o número de leucócitos mononucleados, mastócitos e eosinófilos não foram alterados. Com relação aos experimentos onde foi utilizado fMLP como agente quimioatravivo, PBL praticamente não causou nenhum efeito sobre a migração celular (1660 ± 187 células/mL) (Figura 16 B). Estes resultados indicam que PBL atua sobre células residentes, inibindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias e/ou estimulando a liberação de citocinas antiinflamatórias.

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Figura 16. Efeito de PBL sobre a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos. PBL (1 mg/Kg, i.v.) foi administrada 30 min antes da (A) Carragenana (1 mg, i.p) ou do (B) fMLP (50 ng, i.p.). O controle negativo recebeu salina (i.p.) e o positivo recebeu apenas Carragenana ou fMLP (i.p.). Dados expressos como número de leucócitos/ mL de fluido peritoneal. ANOVA e teste de Bonferroni. # p<0,05 em relação à salina; * p<0,05 em relação à Carragenana ou fMLP.

A atividade antiinflamatória de lectinas específicas para glicose/manose tem sido bem descrita para as lectinas extraídas de membros da subtribo Diocleinae (ALENCAR et al., 1999; ASSREUY et al., 1997). Com relação à lectinas relacionadas a jacalina, a lectina de especifica para manose de sementes de A. integrifolia (Articarpina) apresenta efeito imunomodulatório induzindo a produção de citocinas, tais como Interleucina-12, e ativando a resposta imune tipo-1 (SOUZA et al., 2012). Contudo, este estudo representa o primeiro relato que mostra uma lectina relacionada a jacalina capaz de modular negativamente os eventos celulares da inflamação e dor inflamatória.

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2.6 CONCLUSÃO

Os resultados mostrados neste capítulo demonstram claramente que uma lectina especifica para manose e glicose presente nas sementes de P. biglobosa foi eficientemente purificada e caracterizada. PBL é composta por uma cadeia polipeptídica única, não glicosilada e composta por três domínios relacionados a jacalina organizados em sequência. A lectina exibe uma interessante atividade antiinflamatória que está associada à inibição da migração de leucócitos e uma atividade antiniciceptiva que pode estar associada à inibição da dor inflamatória. Estes resultados reforçam a importância da interação proteínas-carboidratos em eventos fisiológicos. PBL foi cristalizada e os dados produzidos nos experimentos de difração do cristal por raios X possibilitarão a futura resolução da estrutura tridimensional desta proteína, a qual permitirá o estabelecimento de uma relação mais precisa entre a estrutura e a função desta proteína.

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Capitulo 03: Determinação da Estutura Primária de uma Lectina de Sementes de Vatairea guianensis que Exibe Efeito Vasorrelaxante.

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3 CAPITULO 03: Determinação da Estutura Primária de uma Lectina de Sementes de Vatairea guianensis que Exibe Efeito Vasorrelaxante.

3.1 INTRODUÇÃO

Conforme mencionado nos capítulos anteriores, a maioria dos estudos de lectinas vegetais são realizados com leguminosas, principalmente membros da subfamília Papilionoideae. Mesmo dentro da subfamília Papilionoidea, a grande maioria dos estudos com lectinas se concentram em membros da tribo Phaseoleae, principalmente das subtribos Diocleinae e Vicieae, enquanto que as outras tribos desta subfamília, como por exemplo a tribo Dalbergiaea, ainda são pouco exploradas com relação a lectinas. Dentro da Tribo Dalbergieae podemos destacar o gênero Vatairea , o qual inclui apenas 7 espécies de leguminosas arbóreas, as quais encontram–se distribuídas desde o sul do México até o sudeste do Brasil (BARROSO et al., 1991; LIMA, 1982). Dentre estas está a espécie Vatairea guianensis Aublet (Figura 17), popularmente conhecida na Amazônia como faveira, fava de empigem, faveira de empigem, fava bolacha, fava mutum, faveiro e Angelim do igapó. V. guianensis é uma árvore mediana, raramente de grande porte, possuindo de 8 a 25 metros de altura, nativa da Amazônia e comum em áreas de florestas sazonalmente inundáveis, como as matas de igapó e várzea da Amazônia, encontrada raramente em terra firme, ocorrendo em toda região banhada pelo Rio Amazonas e seus afluentes. Sua frutificação ocorre geralmente no período de junho (SILVA, 2011). Informações etnofarmacológicas na literatura relatam que o suco do fruto é empregado na medicina tradicional amazônica na cura da empigem e no tratamento de certas dermatoses no Brasil, Venezuela, Colômbia e Guiana Francesa. No médio e baixo Amazonas a população utiliza as sementes de V. guianensis contra diversos tipos de micoses superficiais, sob a forma de tintura alcoólica ou por aplicação direta na pele de suas sementes maceradas. A literatura relata também que as cascas do caule e das raízes são utilizadas pela população contra fungos (SILVA, 2011). Em estudos de triagem fitoquímica realizados com as sementes V. guianensis, foi detectada a presença de classes bioativas no extrato etanólico do tipo: tanino, antocianinas e antocianidinas, flavonóides, xantonas, esteróides, triterpenóides, saponinas e quinonas, bem como a ausência de alcalóides (FERREIRA et al., 2004). 87

Figura 17. Vatairea guianensis Jacq. (A) sementes; (B) Ramo com inflorescências; (C) Visão geral de uma árvore. Fonte: SILVA (2011).

As sementes de V. guianensis possuem uma lectina específica para D-galactose e açúcares derivados que foi purificada e parcialmente caracterizada por Isidro (2002), sendo nomeada VGL. A lectina é uma glicoproteína e possui a habilidade de reconhecer glicoconjugados de superfície sobre células de diferentes linhagens de câncer do cólon humano. O presente capitulo nós detalhamos a determinação da estrutura prímaria completa da lectina de sementes de V. guianensis e sua efeito vasorrelaxante sobre aortas isoladas de ratos.

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3.2 OBJETIVOS

3.2.1 Objetivo Geral Determinar a sequência de aminoácidos da lectina de sementes de V. guianensis e avaliar seu efeito sobre a resposta contrátil de aortas isoladas de ratos.

3.2.2 Objetivos Específicos • Purificar a lectina VGL por cromatografia de afinidade; • Determinar a massa molecular da lectina por espectrometria de massas; • Determinar a estrutura primária da lectina utilizando espectrometria de massas; • Avaliar o efeito da lectina sobre a resposta contrátil de aortas isoladas de ratos.

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3.3 MATERIAIS e MÉTODOS

3.3.1 Purificação lectina de sementes de Vatairea guianensis (VGL).

A lectina de sementes de V. guianensis foi purificada por cromatografia de afinidade em gel de goma de guar, utilizando o protocolo descrito por Isidro (2002). Para tal, as sementes maduras de V. guianensis , coletadas em Manaus-AM, foram submetidas à trituração, até a obtenção de um pó fino, denominado farinha, apropriada para o processo de extração protéica. As proteínas solúveis da farinha foram extraídas com solução de Glicina- HCl 100 mM pH 7,6 contendo NaCl 150 mM, na proporção de 1:10 p/v, sob agitação constante, durante 4 horas. A suspensão obtida foi centrifugada a 90000 x g, temperatura 4°C, por 20 minutos e o sobrenadante obtido, denominado extrato total. O extrato total foi então submetido a fracionamento proteico através da adição lenta e sob agitação constante de sulfato de amônio sólido a uma concentração, correspondente à fração 0-60% de saturação. Após 12 horas de contato em repouso, as suspensões foram centrifugadas a 9.000 g por 20 minutos a 4°C, obtendo-se, no precipitado, a fração de interesse. O precipitado foi então ressuspendido em NaCl 150 mM, em seguida dialisado exaustivamente contra a mesma solução e novamente centrifugado a 9.000 g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante (F 0/60) foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de goma de guar previamente equilibrada com NaCl 150 mM. Após a remoção do material não interagiu com gel (PI) utilizando a solução de equiíbrio, o material retido (PII) foi então eluído com NaCl 150 mM contendo 0,1 mol/L de D-galactose. A cromatografia foi realizada a fluxo contínuo de aproximadamente de 1 mL/min e os eluatos cromatográficos coletados em frações de aproximadamente 3 mL. O PII, que corresponde a lectina purificada (VGL), foi dialisado exaustivamente contra água, liofilizado e armazenado em frascos hermeticamente fechados.

3.3.1.1 Dosagem de Proteínas Solúveis

A concentração de proteínas totais solúveis no extrato e nas diferentes frações foi verificada pelo método descrito por Bradford (1976). A cada 100uL de amostra, diluída ou não, 2,5mL do reagente de Bradford foram adicionados. A mistura foi então deixada em repouso por cerca de 10 minutos e em seguida teve sua absorbância determinada a 595nm em um espectrofotômetro de luz visível (VIS LBK Novaspec II, 90

Pharmacia). A concentração de proteínas solúveis nas amostras analisadas foi determinada à partir de uma curva padrão obtida com o uso de soluções de concentrações conhecidas de albumina sérica bovina (BSA). Para os experimentos cromatográficos, o conteúdo protéico foi avaliado utilizando-se a absorbância a 280 nm dos eluatos cromatográficos.

3.3.1.2 Detecção da Atividade Hemaglutinante

Os testes para detecção de atividade hemaglutinante nos extratos e nas diferentes frações protéicas foram realizados em tubos, a partir de uma adaptação ao protocolo descrito por Moreira e Perrone (1967) como descrito a seguir: As amostras, em duplas seriadas, foram diluídas em tubos (1:2, 1:4, 1:8...) em Tris-HCl 100 mM pH 7,6 contendo NaCl 150 mM. A 100 uL de cada diluição adicionou-se 100uL de uma suspensão de hemácias de coelho ou dos tipos sanguíneos A, B e O, normais ou tratadas com enzimas proteolíticas (papaína ou tripsina) a 2% em NaCl 150 Mm. O ensaio foi incubado a 37°C por 30 minutos e, após esse período, deixado em repouso à temperatura ambiente por mais 30 minutos. A presença ou não de hemaglutinação foi então detectada macroscopicamente a olho nu. Os títulos de hemaglutinação foram medidos em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H.) como sendo o inverso da maior diluição ainda capaz de apresentar hemaglutinação visível.

3.3.1.3 Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica

Após a obtenção do título de hemaglutinação a da concentração de proteínas solúveis, a atividade específica para cada uma das frações foi calculada, com o objetivo de se monitorar avanços na concentração/purificação da lectina em estudo. O cálculo foi feito pela divisão do título de hemaglutinação (UH/mL) pela dosagem de proteínas solúveis (mgP/mL), cujo quociente foi expresso em UH/mgP (unidades de hemaglutinação por miligrama de proteína). Esses resultados poderão ser comparados, levando à escolha da melhor condição / fração purificadora ou concentradora da atividade hemaglutinante.

3.3.1.4 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS 91

O acompanhamento do processo de purificação e a estimativa da massa molecular aparente das subunidades da lectina purificada foram feitos através de eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE), realizada segundo uma adaptação ao método descrito por Laemmli (1970). O gel superior ou gel de empilhamento foi preparado usando acrilamida/bisacrilamida 3,5 % em tampão Tris/HCl 500 mM, pH 6,8, SDS 1 %, persulfato de amônio (100mg/ml) e TEMED concentrado. O gel de separação da amostra foi preparado em tampão Tris/HCl 1,5 M, pH 8,8 contendo SDS 1 %, TEMED (concentrado) e persulfato de amônio (100mg/ml). A amostra liofilizada foi solubilizada a uma concentração de 4 mg/mL em tampão de amostra contendo Tris/HCl 62,5 mM pH 6,8, 10 % de glicerol, 0,02 % de azul de bromofenol e 1 % de SDS). A eletroforese SDS-PAGE foi realizada em um sistema Mini-Protean II mini-gel (Bio-Rad; Milão, Itália) com a voltagem variando até 200V, potência até 5W e amperagem constante de 35mA. O tampão de corrida utilizado conteve Tris 25 mM, Glicina 192 mM e SDS 0,1% pH 8,8. Proteínas de massa molecular conhecidas foram utilizadas como padrão. Após a corrida eletroforética, o gel de separação foi fixado em uma solução contendo 25% isopropanol e 10% ácido acético, por no mínimo 1 hora. O gel fixado foi então corado em Coomassie R-250 a 0,05%, dissolvido em metanol, ácido acético e água a uma proporção 1:3,5:8 (v/v/v). A retirada do excesso do corante (descoramento) foi feita em água destilada aquecida.

3.3.2 Determinação da Massa Molecular por Espectrometria de Massas

A massa molecular da lectina purificada foi determinada através da técnica de Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray (ESI) utilizando um instrumento híbrido (Synapt HDMS, Waters Corp., Milford, USA) operando no modo positivo, com uma resolução de 10.000 e uma exatidão de massas de 3 ppm. Para tal, a proteína foi solubilizada em uma solução contendo 50% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico, a uma concentração final de aproximadamente 10 pMol de proteína. A amostra foi aplicada a um fluxo de 10 µL/minuto e as voltagens do capilar e do cone foram ajustadas para 3,0 kV e 40 V, respectivamente. A coleta de dados foi realizada com o 92 auxílio do software Mass Lynx 4.0 e os espectros multicarregados foram deconvoluidos usando técnicas de maximização da entropia (FERRIGE et al., 1992).

3.3.3 Estimativa da Massa Molecular Nativa

A massa molecular da lectina de sementes de B. bauhinioides foi estimada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sílica Gel (TSK-GEL 3000SW 0,8 x 30 cm) acoplada a um Sistema de Cromatografia Líquida de Alta Performance (AKTA Purifier). Com este intuito, a lectina foi solubilizada em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,6 contendo NaCl 500 mM e aplicada na coluna previamente equilibrada coma mesma solução. A cromatografia se procedeu a um fluxo 0,5 ml/minuto e foi monitorada a 280 nm. Proteínas de massa molecular conhecidas foram utilizadas como padrão: β-amilase (200 kDa), lectina de sementes de Canavalia brasiliensis (Con-Br) nativa (100 kDa), BSA (66 kDa), Cadeia α da lectina Con-Br (25 kDa).

3.3.4 Determinação da Estrutura Primária de VGL

A estrutura primária da lectina purificada foi determinada através da sobreposição das sequencias dos peptídeos (oriundos das digestões proteolíticas) determinados por Espectrometria de Massas no modo seqüencial (MS/MS).

3.3.4.1 Digestão proteolítica in gel e obtenção de peptídeos

O procedimento de digestão proteolítica da lectina para sequenciamento foi realizado seguindo o protocolo descrito por Shevchenko e colaboradores (2006). Para isso, VGL foi submetida à SDS-PAGE como previamente descrito no item 3.3.1.4. Após a eletroforese, a banda referente à cadeia alfa da proteína foi recortada do gel, descorada por sucessivas lavagens utilizando uma solução de 50% de acetonitrila contendo 25 mM de bicarbonato de amônio, desidratada em 100% de acetonitrila e seca em Speedvac (LabConco). Em seguida o gel contendo a lectina foi reidratado em uma solução contendo uma das seguintes enzimas proteolíticas: Tripsina (Promega), Quimiotripsina (Sigma-Aldrich) solubilizadas em bicarbonato de amônio 50 mM. O ensaio foi incubado a 37°C over night. Os peptídeos oriundos das digestões proteolíticas foram então extraídos do gel utilizando uma solução de 5% de ácido fórmico em 50%, concentrados em Speedvac e ressuspensos com 25μL com ácido fórmico 0,1%. 93

3.3.4.2 Sequenciamento dos peptídeos por espectrometria de massas sequencial (MS/MS)

Os peptídeos obtidos das digestões proteolíticas foram injetados em um um sistema de Cromatografia Liquida de Ultra-performance (nanoAcquity, Waters Corp. Milford, USA) diretamente conectado a uma fonte de nano electrospray de um espectrômetro de massa (Synapt HDMS, Waters Corp., Milford, USA). Os peptídeos foram previamente separados por cromatografia fase reversa em coluna C18 (75 μm x 100 mm), eluída com um gradiente partindo de 10% a 85% de acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico, antes da analise por MS/MS.

O espectrômetro de massa foi operado em modo positivo, com a temperatura da fonte de 90 ºC e a voltagem do capilar de 3.0 kV. Os experimentos foram realizados utilizando a função DDA ( Data Dependent Acquisition – Aquisição Dependente de Dados) onde os íons precursores com carga entre +2 e +4 serão selecionados para análise de MS/MS sendo fragmentados através de CID ( Collision Induced Dissociation – Dissociação induzida por colisão). O instrumento foi previamente calibrado com fragmentos do íon duplamente carregado do [glu1]-fibrinopeptideo B (m/z 785.84) gerados por CID enquanto que a correção de massas realizadas durante os experimenteos foi realizada com este ion intacto. Os dados serão coletados, processados e analisados utilizando o programa MassLynx v 4.1 (Waters Corp) e ProteinLynx v 2.4 (Waters Corp). Os peptídeos com sequência de aminoácidos comuns a outras proteínas serão identificados por buscas em banco de dados utilizando as ferramentas de pesquisa por padrão de fragmentação dos peptídeos ProteinLynx 2.4 (Waters Corp) e MASCOT (Matrix Science). Os peptídeos que não forem identificados por estes meios terão suas sequências determinadas através da interpretação manual dos espectros de fragmentação (sequenciamento de novo ).

3.3.4.3 Analise da Estrutura Primária

Uma vez obtida a sequência primária de VGL, esta foi submetida à análise na qual foram utilizados programas de alinhamento para análise de similaridade e homologia entre as sequências de aminoácidos obtidas e todo o banco não redundante de proteínas depositadas no Nacional Center of Biotechnology Information (NCBI). 94

Inicialmente, a sequência primária de VGL foi submetida ao programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1997) e as proteínas com maior scorre foram selecionados para os alinhamentos de sequências utilizando o ESPript 2,2 (GOUET et ai., 2003). A informação de ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular média teórica da sequência de aminoácidos da lectina foram calculada usando a ferramenta PeptideMass (http://web.expasy.org/peptide_mass/) (Gasteiger et ai., 2005).

3.3.5 Avaliação do Efeito Vasorrelaxante de VGL

3.3.5.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g) procedentes do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (UFC) e mantidos na Sala de Quarentena do Laboratório de Fisio-Farmacologia da Inflamação (LAFFIN) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) onde foram realizdos todos os exerimentos. Estes animais receberam ração e água ad libitum, sob condições adequadas de luz e temperatura e manipulados de acordo com os padrões estabelecidos pelo comitê de ética da Universidade Estadual do Ceará (UECE - Nº 10130208-8/40).

3.3.5.2 Drogas e reagentes

D-galactose, L-nitro-arginina-metil-ester (L-NAME), fenilefrina, acetillcolina e tetraetilamônio foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO). Todas as drogas utilizadas foram de pureza analítica e diluídas em salina estéril com exceção da indometacina, em que foi utilizado o dimetilsulfóxido (DMSO - 10%) como solvente.

3.3.5.3 Teste de contratilidade em aortas isoladas de ratos

Após o sacrifício dos animais por concussão cerebral, a aorta torácica foi rapidamente removida, separada de tecidos adiposos e aderentes e então colocada em solução fisiológica de Tyrode (NaCl 136, KCl 5, CaCl2, MgCl 0.98, NaH2PO4 0.36, NaHCO3 11.9 e glicose 5.0 mM, pH de 7.4). O tecido muscular foi seccionado em anéis de aproximadamente 3-5 mm de comprimento e montados em câmara para órgãos 95 isolados com capacidade para 10 mL contendo Tyrode, a 37 °C, pH 7.4, aerada com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2). Uma das extremidades da preparação foi presa a uma base fixa e a outra a um transdutor de força, que transforma força muscular mecânica em sinal elétrico, através de um amplificador ligado ao sistema computadorizado (Powerlab, AD Instruments). O software Chart® (versão 4.1) foi utilizado para análise de dados.

Em todos os protocolos experimentais, o tecido foi estabilizado durante um intervalo de 40 min à 60 min, sob tensão de 2 g (MATEO; ARTIÑANO, 2001). Os tecidos foram contraídos por KCL [60 mM], antes e ao término dos protocolos experimentais, para testar a condição contrátil da preparação.

Nos experimentos em que foi necessário a remoção do endotélio, esta foi realizada por fricção da superfície íntima dos anéis de aorta (ZHENG; KWAN; DANIEL,1994). Para avaliação da preservação do endotélio utilizou-se acetilcolina [1 µM], agonista muscarínico que induz a formação de NO em tecido com endotélio pré- contraído com fenilefrina [0,1 µM]. A ausência de relaxamento foi interpretada como ausência de endotélio (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980) e relaxamento igual ou superior a 75% como preservação de endotélio.

Para avaliação do efeito relaxante da VGL, foi adicionado ao tecido [0,1 μM] de fenilefrina, um agonista α-adrenérgico. Após a obtenção de um platô estável da contração de fenilefrina, a lectina VGL foi adicionada ao tecido, em concentrações crescentes e cumulativas [1-100 μg/mL] Foram utilizadas aortas endotelizadas e sem endotélio. O grupo controle recebeu o volume equivalente da solução de Tyrode.

Para a avaliação do efeito de VGL sobre o tônus basal a lectina foi adicionada em concentrações crescentes e cumulativas [1-100 μg/mL] à preparação em intervalos de 10 min (Figura 4).

Com o intuito de Investigar da participação do sítio de ligação a carboidratos no efeito relaxante da VGL [100 μg/mL] foi previamente incubada com 100 mM de D- Galactose à 37°C durante 1 h antes de serem adicionadas ao tecido. O grupo controle recebeu o volume equivalente da solução de D-galactose.

Foi também realizada a avaliação da participação do óxido nítrico (NO) sobre no efeito relaxante da VGL. Para isso, os tecidos foram incubados por 30 min com L- NAME [100 µM], inibidor da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS). Em seguida o 96 tecido recebeu fenilefrina [0,1 µM] e após a obtenção de um platô estável as lectinas [1- 100 µg/mL] foram adicionadas sobre o tecido contraído.

3.3.5.4 Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e as diferenças estatísticas entre os grupos foram obtidas através da análise de variância (ANOVA) ou pelo teste t de “student”. Valores de p<0,05 foram considerados significantes. Os valores de IC50 foram calculados pela interpolação de semi- logarítmica.

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3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.4.1 Purificação e Sequenciamento de VGL

A lectina de sementes de V. guianensis foi purificada utilizando o protocolo descrito por Isidrio (2002), através da precipitação protéica do extrato total pela adição de sulfato de amônio, seguida por uma cromatografia de afinidade em uma matriz de goma de guar. Na etapa cromatografica foram obttidas duas frações distintas, aprimeira correspondente às proteínas que não interagiram com a matriz (PI), removida utilizando a mesma solução de equilíbrio, e, uma segunda fração (PII) que foi eluida com 100 mM de D-galactose e correspondeu a lectina purificada (Figura 18A). Esse procedimento de purificação mostrou ser muito eficiente e resultou na lectina purificada com um grau de pureza de 20,5 vezes em relação ao extrato total (Tabela 07).

Tabela 07: Tabela de Purificação da Lectina de Sementes de V. guianensis.

a) Proteínas b) c) Fração U.H Ativ. Específica d) Purificação (mg/ml) Total (U.H/mg)

Extrato Total 8,8 2048 232,7 1 Fração 0 -60% 10,5 4096 390,1 1,68 PII Goma de guar 0,86 4096 4762,8 20,5

e) Concentração de proteínas determinada pelo método de Bradford (1976); f) Atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina, expressa em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H.); g) Atividade Hemaglutinante Específica calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante e a concentração de proteínas; h) Purificação, calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante específica do extrato total e aquela de cada passo de purificação subsequente.

O processo de purificação de VGL foi monitorado por SDS-PAGE. Pode-se observar que a lectina purificada é caracterizada por um perfil eletroforético composto por uma banda dupla com uma massa molecular aparente de 30-32 kDa e por outras duas bandas com com massas moleculares aparente mais baixas de aproximadamente 18 e 15 kDa, tanto na presença quanto na ausência do agente redutor β-mercaptoetanol 98

(Figura 18B). O perfíl eletroforético apresentado por VGL é similar a aquele demonstrado para a lectina de sementes de V. macrocarpa VML, o qual é carcterizado por uma banda dupla de massa molecular aparente de 34 e 32 kDa, e por dois componentes menores com 22 e 13 kDa, nomedados de cadeias alfa, beta e gama, respectivamente, resultantes do processamento pós- traducioanl da cadeia alfa (CAVADA et al., 1998).

Figura 18. Purificação da VGL. (A) Perfil de eluição da cromatografia de afinidade em goma de guar. Aproximadamente 10 mL da fração 0-60% solubilizada em NaCl 150mM foram aplicados em uma coluna de goma de guar (10,0 X 2,0 cm) previamente equilibrada com a mesma solução. A fração não retida (PI) foi removida com a solução de equilíbrio, enquanto que, a fração retida (PII) foi eluida com solução de equilíbrio contendo D-galactose 100 mM a um fluxo constante de aproximadamente 1 mL/mim. Frações de aproximadamente 2,5 mL foram coletadas manualmente e analisadas por espectrofotometria com leitura a 280 nm. (B) SDS-PAGE. Poços: 1- Marcadores moleculares (Fosforilase b 97 kDa, BSA 66 kDa, Ovoalbumina 45 kDa, Anidrade Carbônica 29 kDa e α- lactoalbumina 14,4 kDa). 2- VGL em condições não redutoras. 3- VGL em condições redutoras.

99

Corroborando com os resultados obtidos por SDS-PAGE, a análise por Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray (ESI-MS) indicou que VGL é constituida por uma mistura de cadeias com massas moleculares médias de 28.437 ± 2, 14.952 ± 2 e 12.332 ± 2 Da (Figura 19).

Figura 19. Análise por Espectrometria de Massa com Ionização por Eletrospray. Espectro de massa deconvoluido mostrando a massa molecular média das cadeias de VGL.

A estrutura primária completa da cadeia alfa de VGL foi determinada através da sobreposição das sequencias de aminoácidos dos peptídeos, oriundos das digestões com as enzimas proteolíticas tripsina e quimiotripsina, determinados por Espectrometria de Massas no modo sequencial (MS/MS). Utilizando este procedimento foram sequenciados 27 peptídeos, resultando em uma sequência composta por 239 resíduos de aminoácidos (Tabela 08; Figura 20). O PI teórico calculado com base na sequência de aminoácidos da VGL foi 4,71. A sequência de aminoácidos de VGL reportada neste 100

trabalho foi depositada no banco de dados UniProt Knowledgebase, registrada com o número de acesso P86893.

Tabela 08: Sequência de aminoácidos dos peptídeos da lectina de sementes de V. guianensis com suas respectivas massas experimentais e calculadas.

Massa Massa Teorica Peptídeo Sequência Experimental (Da) (Da) T1 1129.4844 1129.5656 SEVVSFSFTK T2 2069.1824 2069.1157 FNPNPKDIILQGDALVTSK T3 1408.5244 1408.6582 VEDGEPVDHSLGR T4 1870.7644 1870.9214 ALYVAPLHLWDDSTDR T5 2016.9644 2016.9644 VASFATSFSFVVEAPDESK T6 1915.7644 1915.9676 TADGIAFFLAPPDTQPQK T7 1381.5844 1381.6626 NGGFLGLFNDSNK T7’ 2552.9443 2553.0825 NGGFLGLFNDSNK + Glicano N -ligado T8 2370.0366 2370.1128 SIQTVAVEFDTFSNTWDPSAR T9 1437.7566 1437.7576 HIGLNVNSLESQK T10 2301.1042 2301.1064 WGWEDGKVANVYISYQASTK T11 2528.2844 2528.3010 TLTASLTYPSNATSYIVSANVDLK T12 1080.5044 1080.5564 VGFSATSGLSR T13 2688.1865 2688.1575 DHVETHDVLNWSETSTMQATSDDA Q01 2461.3564 2461.3904 NPNPKDIILQGDALVTSKGKLQL Q02 2226.0366 2226.1276 QLTKVEDGEPVDHSLGRALY Q03 1927.7266 1927.9115 VAPIHIWDDSTDRVASF Q04 1647.7644 1647.7992 VVEAPDESKTADGIAF Q05 1468.6244 1468.7310 LAPPDTQPQKNGGF Q06 1913.8844 1913.9006 NDSNKSIQTVAVEFDTF Q07 2127.0964 2127.0708 DPSARHIGINVNSIESQKY Q08 1649.7444 1649.8202 VKWGWEDGKVANVY Q09 1110.5044 1110.5920 ISYQASTKTL Q10 2546,0143 2546,0504 TASLTYPSNATSY + Glicano N -lngado Q11 1387.6843 1387.7612 KSALPEWVRVGF Q12 2199.1643 2199.2051 IVSANVDLKSALPEWVRVGF Q13 1607.7244 1607.7328 SRDHVETHDVLDW

101

Figura 20. Sequência de aminoácidos da VGL. A sequência de aminoácidos de VGL foi montada pela sobreposição das sequências de aminoácido de peptídeos, oriundos de digestões proteolíticas com Tripsina (T-) e Quimiotripsina (C), determinadas por espectrometria de massa sequencial (MS/MS).

A figura 21 mostra o espectro de MS/MS do peptídeo C-terminal de VGL (T13), no qual os íons b produzidos por CID formam usados para a determinação da sequência de aminoácidos do peptídeo. Para obter esta sequência completa deste pectídeo, o íon precursor triplamente protonado com m/z 897,06 foi selecionado no quadrupolo do espectrômetro de massa e então fragmentado usando diferentes rampas de energia de colisão (27-38 V e 31-42 V) no interior do analisador do tipo TRAP do instrumento. Tem sido mostrado que altas energias de colisão promovem a formação de uma maior quantidade de íons b , enquanto que uma baixa energia de colisão favorece a formação de íons y (SEIDLER et al., 2010).

102

Figura 21. Sequencia de aminoácidos do peptídeo T13. Espectro de MS/MS produzidos por CID do íon triplamente carregado com m/z 897,06 cuja serie de ions b foi utilizada para a determinação da sequência de aminoácidos.

A comparação da sequência de aminoácidos de VGL com outras sequências depositadas no banco não redundante de proteínas do NCBI mostrou que esta proteína apresenta similaridade de sequência com outras lectinas específica para N-acetil-D- galactosamina/D-galactose isoladas de espécies de plantas taxonomicamente relacionadas a tribo Daldergiae. VGL mostrou um elevado grau de similaridade de sequência (95%) com a lectina de sementes de V. macrocarpa (código de acesso SwissProt: P81371), diferindo desta em somente onze resíduos de aminoácidos (VML/VGL): 38(K/E), 41(K/E), 53(A/V), 103(D/N), 148(M/Q), 157(D/N), 168(E/Q), 228(F/Q), 232(L/M), 235(P/T) and 229(S/A) (Figura 22).

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Figura 22: Alinhamento múltiplo entre as sequencias de aminoácidos das lectinas de V. guianensis (VGL), V. macrocarpa (VML), lectina de C. kentukea (CLALU), S . japonica (SJA) e R. pseudoacacia (RPA). Os números após as siglas representam os códigos de depósitos nos banco de dados.

VGL também apresenta similaridade de sequência com lectinas N-acetil-D- galactosamina/D-galactose purificadas de plantas pertencentes a tribo Sophoreae, tais como, a lectina de Cladrastis kentukea (68%) (código de acesso TrEMBL: Q39527) e a lectina da casca de Sophora japonica (66%) (código de acesso SwissProt: P93538) (Figura 21). Estes resultados corroboram com a ideia de que ambas as tribos, Dalbergiae e Sophoreae, possuem um estreita relação evolucionária (OLIVEIRA et al., 2002). Em adição, VGL também é similar à lectina da casca de Robinia pseudoacacia (62%) (código de acesso PDB: 1FNZ). Rabijns e colaboradores (2001) resolveram a estrutura tridimensional desta lectina complexada com N-acetil-D-galactosamina e identificaram os resíduos de aminoácidos envolvidos no sítios de interação com carboidratos (Asp87, Gly105, Apn131, Ile216 e Asp217) e com metais (Asp127, Phe129, Asn13 and Asp135). O alinhamento entre as sequências de aminoácidos utilizando o programa ESPript 2.1 (GOUET et al., 2003) mostrou que todos os resíduos 104 de aminoácidos presentes tanto no sítio de ligação a carboidratos quanto a metais da lectina de R. pseudoacacia são conservados em VGL. Além da grande similaridade de estrutura primária e da semelhança entre os perfis eletroforéticos, VGL também compartilha outras características estruturais com a lectina de sementes de V. macrocarpa . A cadeia alfa da VML é N-glicosilada em dois resíduos de asparagina nas posições 111 e 183 com um glicano mais abundante que possui uma estrutura composta por Manα1-6[(Manα1-3)(Xylβ1-2)]Manβ1-4- GlcNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc (Figura 23). Este glicano é um típico N-glicano de proteínas vegetais (CHOI e LAURSEN, 2000) que também é encontrado em outras lectinas de plantas, tais como R. pseudoacacia (WANTYGHEM et al., 1992), Erythrina corallodendron (SHAANAN et al., 1991) and E. variegata (YAMAGUCHI et al., 1993). Isídro (2002) demonstrou através da análise por cromatografia gasosa de derivados heptafluorobutitatos de O-matil-glicosideos (ZANETTA et al., 1999) que VGL possui glicanos com uma composição idêntica ao glicano encontrado em VML. Em nossos experimentos de analise por espectrometria de massa dos peptídeos gerados pelas digestões proteolíticas, as posições dos sítios de N-glicosilação em VGL foram confirmados pela presença de dois ions duplamente carregados com m/z 1277.47 e 1274.01, os quais correspondem aos íons T07’ ( 103 NGGFLGLFNDSNK 114 ) e Q10 (175 TASLTYPSNATSY 187 ), respectivamente, quando adicionados a massa calculada de uma glicano N-ligado (1171,42 Da) (Tabela 08). Portanto, VGL possui de glicanos semelhantes aos presentes em na estrutura de VML, o que sugere que ambas as lectinas sofrem o mesmo processamento pós- traducional.

Figura 23 – Estrutura do heptassacarídeo comum em proteínas vegetais. Fonte: CHOI & LAURSEN, 2000. 105

Baseado em resultados obtidos pela análise por espectrometria de massa, Calvete e Colaboradores (1998) sugeriram um mecanismo de processamento pós- traducional proteolítico para a lectina VML. De acordo com os autores, VML cotem uma mistura de cadeias alfa duplamente nas posições 111 e 183 (28.525 Da) e com uma única glicosilação na posição 183 (27.354 Da). Durante o processamento a cadeia alfa, duplamente glicosilada, sofre deglicosilação do resíduo de Asn-111 e este evento é correlacionado com a clivagem proteolítica da ligação peptídica entre os resíduos Asn114 e Lys115, produzindo assim uma cadeia gama não glicosilada (resíduos 1-114, 12.304 Da) e uma cadeia beta glicosilada (resíduos 115-240, 14.957 Da). Posteriormente, algumas moléculas de cadeia beta podem ser são deglicosiladas e modificadas no seu N-terminal. A nossa analise por ESI-MS indica que VGL também é composta por uma mistura de cadeias com massas moleculares médias de 28.437 ± 2, 14.952 ± 2 e 12.332 ± 2 Da. A massa molecular média calculada para a estrutura primária da cadeia alfa da VGL determinada neste trabalho é de 26,096 Da, se adicionarmos a esta a massa de dois glicanos N-ligados (1.171,42 Da) esta massa se eleva para 28.438,7 Da, a qual é notavelmente próxima a massa da cadeia mais pesada (28.437 ± 2 Da) observada experimentalmente por ESI-MS e corresponde a cadeia alfa duplamente glicosilada nas posições 111 e 183. Já os componentes mais leves, de 12.332 ± 2 e 14,952 ± 2 Da, correspondem exatamente a massa calculada para os resíduos 1-114 e 115-239 com a adição de um glicano N-ligado, correspondendo a cadeia gama deglicosilada e cadeia beta glicosilada na posição 183, respectivamente. Portanto, os dados obtidos tanto pela análise da proteína intacta por ESI-MS, quanto o sequenciamento de aminoácidos por MS/MS estão em prefeito acordo e demonstram que VGL passa pelo mesmo processamento pós- traducional que VML. A análise por cromatografia de exclusão molecular mostrou que VGL, sob condições não desnaturantes, apresentou um pico único e simétrico correspondendo a uma massa molecular estimada de aproximadamente 120 kDa (Figura 24). Este resultado, comparado com aqueles observados por SDS-PAGE e por ESI-MS, sugere que, em solução, a VGL assume uma estrutura tetramérica, composta por uma mistura de monômeros constituídos pelas diferentes cadeias contendo uma ou duas glicosilações. Similarmente, Calvete et al., (1998) observaram através da técnica de ultracentrifugação analítica que VML também se comporta como um tetramero em solução. Em adição, as isolectinas presentes nas folhas e casca de S. japônica (HANKINS et al., 1987, 1988) e a lectina de sementes de L. auriculata (OLIVEIRA et 106 al., 2002) também exibem uma estrutura tetramérica quando em solução. Em contraste, as lectinas específicas para D-galactose isoladas de espécies do gênero Erytrina apresentam-se como dímeros (SHAANAN et al., 1991; YAMAGUCHI et al., 1993; PEREZ, 1995).

Figura 24. Estimativa da massa molecular nativa. A massa molecular nativa de PBL foi estimada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sílica Gel (TSK-GEL). Os padrões de massa molecular utilizados foram: (a) β-amilase 200 kDa, (b) lectina de sementes de Canavalia brasiliensis 100 kDa, (c) BSA 66 kDa e (d) inibidor de tripsina 21 kDa. VGL apresentou uma massa molecular estimada de aproximadamente 120 kDa.

3.4.2 Avaliação do Efeito Vasorrelaxante de VGL

A fenilefrina (0,1 µM) induziu contrações tônicas estáveis em aortas de rato, com amplitudes médias de 1,705 ± 0,239 g na presença de endotélio e de 1,543 ± 0,093 g na ausência de endotélio. Em aortas endotelizadas, a adição cumulativa de VGL causou relaxamento significativo de forma dose dependente. Este efeito foi iniciado na dose de 1 μg/mL e foi máximo na dose de 100 μg/mL, provocando uma inibição de 61.98 ± 6.99% relativas a 100% das contrações induzidas por fenilefrina. Contudo, em aortas com endotélio não preservado, VGL não produziu resposta relaxante (Figura 107

25A). . O efeito relaxante sobre aortas de ratos tem sido anteriormente demonstrado para lectina específicas para glicose/manose extraídas de vegetais da subtribo Diocleinae. (GADELHA et al., 2005; ASSREUY et al., 2009, 2011; NÓBREGA et al., 2012; BEZERRA et al., 2013) e da alga Bryothaminium triquetrum (LIMA, et al., 2004). Contudo, este estudo representa o primeiro relato de lectina purificada de um membro da tribo Dalbergieae com atividade vasorrelaxante.

Figura 25: Efeito vasorrelaxante induzido por VGL. (A) Efeito relaxante da lectina VGL em aortas endotelizadas contraídas por fenilefrina. (B) Efeito de VGL sobre o tônus basal de aortas endotelizadas. (C) Reversão do efeito relaxante em aortas endotelizadas contraídas por fenilefrina pelo L-NAME. (D) Reversão do efeito relaxante pela incubação prévia de VGL com D-galactose. Resultados expressos como Média ± E.P.M. * p<0.05 em relação ao controle (100% de contração). #p<0,05 em relação à VGL.

108

Com base na ausência do efeito relaxante da lectina VGL sobre aortas sem endotélio contraídas por fenilefrina, avaliou-se seus efeitos sobre o tônus basal apenas de tecidos endotelizados. Após a estabilização do tecido vascular, a adição cumulativa (1 – 100µg/mL) de VGL não alterou o tônus basal (0% de contração) dos anéis de aorta em nenhuma concentração testada (Figura 25B), o que sugere que a fisiologia do músculo não foi afetada. O efeito vasorrelaxante proporcionado por VGL foi bloqueado na presença de L- NAME. Os valores de IC50 (Concentração que provoca metade do relaxamento máximo) aumentaram de 45.44±2.57 µg/mL na ausência de L-NAME para 111.69±2.46 µg/mL na presença deste inibidor da síntese de NO (Figura 25C). Similarmente, as lectinas de Diocleinae também exercem atividade vasorrelaxante de forma estritamente dependente da presença de endotélio que envolve a participação de NO. De fato, no músculo liso vascular, o NO é o principal mediador do relaxamento dependente de endotélio (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Seria possível postular que a VGL esteja inibindo a atividade da enzima NOS endotelial e consequente formação de NO. Dessa forma, a lectina estaria impedindo a difusão do NO para o interior das células musculares lisas, levando à ativação da guanilato ciclase, conversão de GTP em GMPc, diminuição da concentração de Ca +2 e por fim, o relaxamento do vaso. De forma similar, a incubação prévia da lectina com D-galactose inibiu parcialmente o efeito relaxante em 42.88 ± 5.73 %, enquanto que, a D-galactose sozinha não exibiu efeito significante sobre as induzidas por fenilefrina Figura 25D). Estes resultados mostram que a atividade vasorrelaxante de VGL ocorre mediante a interação do sítio de ligação a carboidratos da lectina com os carboidratos presentes nas células do endotélio. É importante ressaltar que as lectinas não apresentam toxicidade sobre os tecidos avaliados, uma vez que, em todos os experimentos, a lectinas VGL não alterou a responsividade do tecido, visto que, após lavagem da preparação com Tyrode, a adição de KCl produziu resposta contrátil. Assim, VGL possui potencial para futuramente ser usada como uma ferramenta em estudos de doenças nas quais vasos são mantidos em seu estado contraído, como por exemplo, a hipertensão.

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3.5 CONCLUSÃO

Os resultados expostos neste capitulo mostram que o protocolo descrito por

Isídrio (2002) para a purificação da lectina de sementes de V. guianensis é eficiente e reprodutível. VGL exibe similaridade de estrutura primária com outras lectinas específicas para N-acetil-D-galactosamina/D-galactose isoladas de espécies de plantas taxonomicamente relacionadas, tais como lectinas isoladas da tribo Sophoreae e a lectina VML, com a qual VGL compartilha o mesmo processamento pós- traducional.

Além disso, ficou evidente que VGL exibe um efeito vasorrelaxante in vitro em aortas de ratos, sendo que este efeito é dependente da presença de endotélio, envolve a participação do óxido nítrico e é mediado pelo sítio de ligação a carboidratos da lectina.

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Anexos:

Artigos científicos publicados a partir deste trabalho

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