第 28 回海洋工学シンポジウム 令和 2 年 3 月 9-10 日 The 28th Ocean Engineering Symposium, March 9-10, 2020 日本海洋工学会・日本船舶海洋工学会 JFOES & JASNAOE

OES28-0027

ミトコンドリア由来 12S-rRNA 遺伝子を用いた 有殻腹足類の博物館標本の DNA バーコーディング

中島 理子 和歌山工業高等専門学校 中路 渚 東京大学大学院理学系研究科 デュ ファン テュ ベトナム国立生態生物資源研究所 佐々木 猛智 東京大学総合研究博物館 スティアマルガ 和歌山工業高等専門学校；東京大学総合研究博物館 デフィン*

Assessment of the mitochondrial gene 12S-rRNA for DNA Barcoding of shelled gastropods museum samples

Satoko National Institute of Technology, Wakayama College NAKASHIMA Nagisa NAKAJI Graduate School of Science, The University of Tokyo Do Van Tu Institute of Ecology and Biological Resources, Vietnam Takenori SASAKI The University Museum of The University of Tokyo Davin H. E. National Institute of Technology, Wakayama College; The SETIAMARGA* University Museum of The University of Tokyo *E-mail: [email protected]

Abstract DNA barcoding is an effective tool for taxonomic identification of samples collected from the field. Conventionally, a fragment of the mitochondrial gene COI sequence has been used as the marker. However, when we consider primers effectivity and the resolutions of higher phylogeny, barcoding with only a single gene marker has several pitfalls. Therefore, we need multiple gene markers when conducting barcoding. In a previous study, we performed DNA barcoding of the shelled gastropods collected from the intertidal area of the coast of Nada in Wakayama Prefecture, and examined the usefulness of the nuclear gene Histone H3. In this study, we performed DNA barcoding of various shelled gastropods preserved at the University of Tokyo Museum, The University of Tokyo, for the purpose of confirming the usefulness of the mitochondrial gene 12S-rRNA for gastropod DNA barcoding. As a result, we found that the 12S-rRNA gene is useful for gastropod species identification. We also found that the sequence data for some samples were not registered on GenBank. For the next step, we will increase the number of samples, and compare the result of 12S-rRNA with other genetic markers.

1 背景 る膨大な参考データベースの存在が必須不可欠である。しか し，分類群によっては，そのような信頼できるデータベース DNA バーコーディングは，フィールドで採取されたサンプ ルを比較的高い精度で素早く同定・分類するのに大変有効的 が存在していないのが現状である。例えば，Troudet ら（2017） は， （ ）データベ な方法とされている[1]。更に，近年の DNA 配列決定技術の Global Biodiversity Information Facility GBIF ースにおける分類上の代表的なバイアスを報告した 。彼 ら 目まぐるしい発展により，生物が生命活動を行う際に体外の [5] は，鳥や哺乳類など人気のある脊椎動物のデータが数多く登 棲息環境に出してしまう DNA のメタバーコーディング 録されているのに対して，腹足類を含む多くの無脊椎動物が （environmental DNA＝eDNA）と用いて組み合わせれば，効 あまり登録されていないことを報告した。また，Machida（2009） 率的な生物多様性モニタリングができるとされている [2-4]。 や （ ） が，現在において， に登録され DNA バーコーディングや環境 DNA には，対象となる分類 [6] Page 2016 [7] Genbank た データも含めて正確にキュレーションされた信頼で 群に含まれる様々な生き物・種に有用な DNA マーカーと， DNA きるデータがないため，バーコーディングを行う際に「同定 生き物をできるだけ網羅する DNA 配列情報が登録されてい

本研究で私たちは，様々な腹足類の分子系統解析にマーカ ーとして良く用いられるミトコンドリアゲノム由来遺伝子で ある 12s-rRNA 遺伝子を，腹足類の DNA バーコーディングに 有用性を検討した。そのため，東京大学総合研究博物館に収 蔵されている有殻腹足類を対象に，先行研究で開発されたプ ライマー[15-17]を用いてバーコーディングを行った。その結 果，12s-rRNA 遺伝子が有殻腹足類の DNA バーコーディング に有用であることが示された。

2 材料及び方法

2.1 サンプル採取 サンプルは全て，東京大学総合研究博物館に収蔵されてい る有殻腹足類の 95%エタノール液浸標本を用いた。これらの サンプルは，日本やベトナムなど様々なところから採取され たものである。採取されたサンプルの形態形質による同定は 主に奥谷（2017）による形態学的同定を行った[18]。サンプ ルは全 12種 36 個体で，内1 種については1 種1 個体（Hemifusus Figure 1. Pictures of some museum specimens analyzed in this carinifer），内 11 種については 1 種 2-4 個体を用いた（Fig.１）。 study: a; Chlorostoma argyrostomum; b; Omphalius nigerrimus; c: Reishia clavigera; d: Turbo stenogyrus 2.2 DNA の配列情報の獲得 不可能」な「暗黒分類群」が同定結果として出てしまうこと 各サンプルの足部分（約 ）を切りだし， フェ を示した。 0.25 mg CTAB- 他方マーカー遺伝子については，同属別種をも区別できる ノール-クロロホルム法にて全ゲノム DNA を抽出した。アニ ーリング温度を ℃として を行い， に表記した ほどの塩基置換を持っていることが重要である[1]。近年，後 52 PCR Table 1 生動物のバーコーディングに使える，種レベルで動物を区別 プライマーを用いて標的遺伝子である 12S-rRNA を増幅した。 増幅に成功した 産物はサンガーシーケンス法にて，塩基 するための置換率を持っている COI遺伝子断片を増幅するた PCR 配列を決定した（外注； ）。 めの強力な幾つかのプライマーが開発された（例：[8-9]）。こ FASMAC Ltd. れらプライマーセットは，海棲腹足類のバーコーディングに も有用であることも示された（例：[10-13]）。 しかしながら， 2.3 塩基配列による種同定（DNA バーコーディング） 一つの遺伝子マーカーのみでバーコーディングを行うことに 得られた配列が既知のものと相同性があるかを確認するた 危険性が潜んでいることを私たちは以前の研究で訴えた め，BLASTn 検索を行った。配列類似性，e-value，および使 [12-13]。先行研究で私たちは，Colgan ら（1998）[14] が開発 用した個体の塩基配列が分類学上どのレベルで（種・属・科） した核ゲノム由来遺伝子である Histone-H3（H3）遺伝子を， 形態学的識別結果と一致したかを確認した。 海棲腹足類の DNA バーコーディングのマーカーとしても有 用かどうかを評価した。その結果，H3 遺伝子が対象分類群の 2.4 シーケンス操作，データセット構築，および系統解析 種レベルでの同定に有用であることが判った。その他の結果 としては，二つの遺伝子を使用することで，一つの遺伝子の 確認された配列は，MAFFT v7 [19]を使用してアライメント みでバーコーディングを行う時に起き得る問題（プライマー された。その後，すべての配列は Gblocks 0.91b（Online ver.） の効き目が限られていることや，科以上の高次分類への同定 [20]にて編集され，Mesquite v.3.40 [21]上で可視化された。系 ができないことなど）を解消することができることを明らか 統解析は，最尤法と近隣接合法による 2 種類の解析法を用い にした。即ち，二つ以上の複数の遺伝子がマーカーをバーコ た。最尤法ではプログラムに RAxML-GUI v.1.5 [22]を使用し， ーディングに用いることで，生物多様性の信頼性がより高く， GTR-GAMMA 置換モデル下で bootstrap 検定を 1000 回行った。 近隣接合法による解析では を用い， より完全なデータを収集することが可能だと示唆された。 MEGA7 [23] Maximum Composite Likelihood モデル下で bootstrap 検定を 1000 回行っ た系統樹を推論した。外群には 種の多板綱である Table 1. List the 12S-rRNA gene primers used in this study. 2 Sypharo- chiton sinclairi （ NC024173.1 ） 及び Cryptochiton stelleri （NC026850.1）を用いた。

3 結果及び考察

3.1 DNA 配列決定結果 私たちは，解析に用いた全 36 個体の全てについて，

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Table 2. List of analyzed OTU in this study, along with the BLASTn search results for DNA Barcoding. for DNA results search BLASTn the with along study, this in OTU analyzed of 2. List Table

3

joining joining (NJ) - likelihood likelihood (ML) and Neighbor - . Trees . Trees were inferred using Maximum sequences rRNA - COI COI and 12S combined

. . trees Phylogenetic of our samples based on 2

Figure methods.

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12Sma(F)/12Smb(R) については約 400bp、12S-I(F)/12S(-)(R) 12s-rRNA 遺伝子は腹足類の環境 DNA マーカーとして用いら については 600bp 前後の塩基配列情報を得ることに成功した。 れる可能性が高いことも示唆されている。 配列編集やアライメント作業を行った後，系統解析に実際に 用いる塩基配列の長さは 346bp である。現段階の結果のみを 4 謝辞 元に議論すれば，本研究で検討された 12s-rRNA のプライマ ーは有殻腹足類のバーコーディングに有用であると言えるが， 本研究に必要なサンプルの一部は，沖縄県海洋深層水研究 今後，より多くの種のこれらのプライマーの有効性について 所の照屋清之介氏及び寺本沙也加氏からご提供を頂いた。ま のさらなる検討実験を行う必要がある。 た、実験や解析について、和歌山工業高等専門学校生物応用 化学科スティアマルガ研究室卒業生の上山隼平氏，友渕直人 3.2 BLAST 検索による DNA バーコーディング結果 氏，Nazifa Naziha bt. Razali 氏, 芝玲奈氏にご助言・ご協力い 得られた配列の種同定は，GenBank の nr データベースに対 ただいた。 する BLASTn 検索により行われた。当たった生物情報が形態 本研究は JSPS 科研費 JP19K12424（代表：スティアマルガ）, 形質による同定と一致すれば，種レベルのバーコーディング JP19K21646（代表：佐々木）及び，一般 財団法人中辻創智 が出来たとした（4 種 13 個体：Murex trapa, Reishia clavigera, 社研究費助成 FY2018（代表：スティアマルガ）の助成を受 Omphalius nigerrimus, Chlorostoma argyrosto- mum）。 この場合， けたものである。 配列類似性が 〜 で が 〜 で 93.67% 98.93% e-value 0.00 1.00e-136 である。一方で 4 種 9 個体（Tonna chinensis, Ellobium aurismidae, 参考文献 Hemifusus carinifer, Turbo stenogyrus）については，配列類似性 が 90.48%〜95.81%で e-value が 0.00〜4.00e-136 で同属のもの 1) Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L. and deWaard J.R., に当たった。その他のものである Marmarofusus nicobaricus, Biological identifications through DNA barcodes. Ovula ovum, Tomlinia frausseni, Linatella caudata については亜 Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, Vol. 270, Issue 1512, 2003, pp. 313–321. 科以上の高次分類群に当たった。これは，GenBank に同属同 2) Thomsen P.F. and Willerslev E., Environmental DNA – An 種の参考配列情報が登録されていないからと考えられるが， emerging tool in conservation for monitoring past and present 形態形質による同定が合っていない可能性も本研究の結果だ biodiversity. Biological Conservation, Vol. 183, 2015, pp. 4– けでは否定出来ない。従って今後の研究課題としては，別の 18. 遺伝子のバーコーディング結果との照合と同時に，形態形質 3) Deiner K., Bik H.M., Mächler E., and other 9 authors, による同定の再検討を行う必要が不可欠である。これらの検 Environmental DNA metabarcoding: Transforming how we 索結果は全て，Table 2 に示した。 survey animal and plant communities. Molecular Ecology, Vol. 26, Issue 21, 2017, pp. 5872-5895. 4) Cristescu M.E. and Hebert P.D.N., Uses and Misuses of 3.3 系統解析結果 Environmental DNA in Biodiversity Science and 本研究で行われた系統解析は，12s-rRNA 遺伝子の単一遺伝 Conservation. Annual Review of Ecology, Evolution, and 子でのみ行われたのにも関わらず，殆どの分岐点の支持率（ブ Systematics, Vol. 49, 2018, pp. 209-230. ットストラップ値）が高いため，解像度の良い系統樹になっ 5) Troudet J., Grandcolas P., Blin A., Vignes-Lebbe R. and ていると言える。これは，両方の推定方法で得られた系統樹 Legendre F., Taxonomic bias in biodiversity data and societal に言える。単一遺伝子のデータだけでは解けないとされてい preferences. Scientific Reports, Vol. 7, 2017, Article Number: 9132. る高次分類についても，佐々木（2010）や Cunha and Giribet 6) Machida R.J., Hashiguchi Y., Nishida M. and Nishida S., （2019）が提案した分類体系には類似している [24-25]。しか Zooplankton diversity analysis through single-gene しながら，彼らの分類体系に合致しない，もしくは系統的位 sequencing of a community sample. BMC Genomics, Vol. 10, 置が安定しなくて支持率が低い分類群もある。これは，Nakaji 2009, Article Number: 438. ら（ 2018）や Setiamarga ら（ 2019）などにも言われたように， 7) Page R.D.M., DNA barcoding and taxonomy: dark taxa and 単一遺伝子マーカーのみで系統推定を行ったことに起因して dark texts. Philosophical Transactions of the Royal Society of いる。この問題を解消するためには今後，複数遺伝子マーカ London B: Biological Sciences, Vol. 371, Issue 1702, 2016, ーを用いる解析が必要であると考えられる。 Article Number: 20150334. 8) Folmer O., Black M., Hoah W., Lutz R. and Vrijenhoek R., 一方で，単一の遺伝子系統は通常，属レベルよりも上の高 DNA primers for amplication of mitochondrial cytochrome c 次分類の系統推定には解像度が不十分とされている。しかし oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. 本研究の目的は DNA バーコーディングに用いるマーカーと Molecular Marine Biology and Biotechnology, Vol. 3, 1994, しての検討であるため，低次分類レベル（属レベル以下）で pp. 294–299. の種の識別と同定である。本研究の結果からは，12s-rRNA 遺 9) Kano Y., Vetigastropod phylogeny and a new concept of 伝子が種同定に有用であるため DNA バーコーディングに相 Seguenzioidea: independent evolution of copulatory organs in 応しいマーカーであると判断することが結論出できる。その the deep-sea habitats. Zoologica Scripta, Vol. 37, 2008, pp. 1– 20. 根拠として挙げられるのが，サンプルが複数個体ある種が， 10) Borges L.M.S., Hollatz C., Lobo J., Cunha A.M., Vilela A.P., 種ごとの単系統分類群を形成していることである。また，今 Calado G., Coelho R., Costa A.C., Ferreira M.S.G., Costa 後の研究で確認する必要はあるものの，本研究の結果から，

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