Universidade Federal Do Rio De Janeiro

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE BIOLOGIA

EVOLUÇÃO DA SUBSOCIALIDADE EM CASSIDINAE GYLLENHAAL, 1813 (COLEOPTERA:

CHRYSOMELIDAE) COM BASE EM UMA FILOGENIA MOLECULAR

MICHELE LEOCÁDIO GASPAR

RIO DE JANEIRO 2019 ii

EVOLUÇÃO DA SUBSOCIALIDADE EM CASSIDINAE GYLLENHAAL, 1813 (COLEOPTERA:

CHRYSOMELIDAE) COM BASE EM UMA FILOGENIA MOLECULAR

MICHELE LEOCÁDIO GASPAR Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva, Instituto de Biologia, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutora em Biodiversidade e Biologia Evolutiva

Orientador: Prof. Dr. José Ricardo. M. Mermudes Coorientadores: Prof. Carlos G. Schrago e Dr. Donald Windsor Banca examinadora: ______(Presidente) Prof. Dr. José Ricardo. M Mermudes ______Prof. Dr. Allan dos Santos ______Profª Drª Margarete Macedo ______Profª Drª Marcela Monné ______Profª Drª Beatriz Mello ______Profª Drª Daniela Takiya ______Prof. Dr. Ricardo Monteiro

Rio de Janeiro

Julho de 2019 iii

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Entomologia,

Departamento de Zoologia,

Instituto de Biologia - UFRJ.

Orientador:

Prof. Dr. José Ricardo. M Mermudes – Instituto de Biologia, UFRJ.

Coorientadores: Prof. Dr. Carlos Guerra Schrago – Instituto de Biologia, UFRJ. Dr. Donald M. Windsor – Smithsonian Tropical Research Institute, Panamá. iv

LEOCÁDIO, Michele Evolução da subsocialidade em Cassidinae Gyllenhaal, 1813 (Coleoptera: Chrysomelidae) com base em uma filogenia molecular / Michele Leocádio Gaspar. Rio de Janeiro: UFRJ, IB, 2019. xv, 129 f. il.; 29,7 cm. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo M. Mermudes Dissertação (Mestrado). UFRJ/IB/Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva, 2019. Referências bibliográficas: f. 22-28; 73-78; 110-113; 1. Cassidinae. 2. Subsocialidade. I. Mermudes, José Ricardo Miras II. Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Biologia/ Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva. III. Teses. v

NOTA Segundo os critérios do Código Internacional de Nomenclatura Zoológica (artigos 8° e 9°) essa dissertação não constitui publicação e, portanto, quaisquer nomes novos propostos ou atos que afetem a nomenclatura não têm validade. vi

AGRADECIMENTOS

Assim que iniciei esse doutorado, tive certeza que a lista de agradecimentos seria longa. Propus-me a fazer algo em que sabia que toda ajuda seria necessária e felizmente eu a tive. Aos meus orientadores, cada qual com um papel fundamental na elaboração e construção dessa tese. José Ricardo Mermudes, por estar me orientando desde a graduação e ter me dado a liberdade de tecer todos meus projetos ao longo desse tempo. Carlos Guerra, por ter topado coorientar esse projeto desde o começo, oferecer espaço em seu laboratório e estar à disposição quando necessário. Donald Windsor, Don, chegou quase na metade do caminho mas nem por isso a contribuição foi menor. Obrigada por décadas de coleta e conhecimento de campo que ajudaram a embasar este trabalho! Aos meus pais e meu irmão, que me permitem fazer ciência nesse país – mesmo que eles nem façam muita ideia disso. Obrigada por bancar uma filha que, aos olhos da sociedade, “não trabalha, só estuda”. Vamos em frente! Ao Gabriel, por me fazer achar que eu sou a pessoa mais inteligente do mundo e ter interesse em ouvir absolutamente tudo sobre o mundo dos insetos (e todos os outros animais, na verdade). Os últimos três anos foram menos difíceis por sua causa, fico muito feliz de estar com uma pessoa tão incrível! Ao Smithsonian Tropical Research Institute por ter me concedido financiamento para pesquisa e estadia no Panamá, que foi absolutamente fundamental nessa tese. À Mabelle Chong, por ter me acompanhado em quase todo trabalho de bancada no Panamá e ter me apresentados as arepas e patacones. Aos curadores de coleções entomológicas espalhadas pelo Brasil e que me receberam de forma muito atenciosa: Profª. Sônia Casari (MZUSP), Profª. Marcela Monné (MNRJ), Profª. Cibele Ribeiro-Costa (UFPR), Dr. Orlando Tobias (MPEG) e Dr. Márcio Félix (FIOCRUZ), que me recebeu aos 45 do segundo tempo para que eu pudesse fotografar espécimes. Ao Laboratório de Entomologia e todos os seus integrantes, por me forneceram o espaço e equipamentos necessários durante esse tempo. Além de um pouco (bastante) de convívio social. Em especial André Roza (Pastor), companheiro de bancada e outras ciladas coleopterológicas. Rafael, o melhor amigo que o laboratório me deu, obrigada por me ajudar em todos os aspectos! À Mariana Rossi, pela paciência de me ensinar todo o procedimento de bancada quando eu ainda era uma jovem doutoranda. Ao Marco Pellegrini e a Fernanda Petrongari pela identificação botânica. vii

Aos amigos da Biologia UFRJ: Aos que a distância separou (mas só a distância!): Nelson, meu parceiro de vida e campos em todos os biomas possíveis, ornitologia e entomologia sempre andando juntas! Ian, obrigada por sempre me ajudar no que eu preciso e pelas cervejas e viagens nas suas vindas ao Brasil, você é muito querido (e você sabe). Behind, você é uma pessoa linda e iluminada, agradeço muito te ter comigo. Aos ainda moradores desta cidade caótica: Natália, miga, aqui vai mais um agradecimento (o último!)… Obrigada por me acompanhar em todas as minhas fases acadêmicas, muita força pra nós de agora em diante. Tod, dividimos um apartamento durante um curto período desse doutorado e arrisco dizer que foi a melhor fase desses quatro anos, obrigada por estar sempre presente. Liu Kang, por sempre me ouvir chorar as pitangas em relação ao mundo acadêmico e me aconselhar. Stephanie migan, obrigada por todos os rolês possíveis (acho que a gente fez de tudo em 4 anos). Outros biólogos (praticantes ou não) que estiveram por aí nesses quatro anos: Yow, Luísa, Batavo, Paula... Ao meu pequeno e lindo núcleo de amigos niteroienses, em especial a Paula, que resolveu embarcar nessa loucura de pós-graduação também – mesmo não precisando. Te admiro, amiga! Vamos defender!!! Aos colegas cassidinólogos, somos poucos mas somos ótimos. Em especial a Marianna Simões que me ajudou de forma crucial (e vai continuar até esse artigo sair). Lukas Sekerka, obrigada por auxiliar nas identificações e fornecer enormes e proveitosas discussões. viii

RESUMO

Evolução da subsocialidade em Cassidinae Gyllenhaal, 1813 (Coleoptera:

Chrysomelidae) com base em uma filogenia molecular

Michele Leocádio Gaspar

Orientador: José Ricardo M. Mermudes

Coorientadores: Carlos G. Schrago e Donald Windsor

Resumo da Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva do Instituto de

Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de

Doutora em Biodiversidade e Biologia Evolutiva.

A subsocialidade (= cuidado parental) é um comportamento difundido, mas raro em insetos. Dentro da subfamília Cassidinae há duas tribos que apresentam cuidado parental: Mesomphaliini e

Eugenysini. Investigamos a evolução da subsocialidade em Cassidinae a partir de uma reconstrução filogenética empregando dados moleculares (28S, CAD e COI) com enfoque na tribo

Mesomphaliini. Nossos resultados recuperaram Mesomphaliini monofilético se incluída a tribo

Eugenysini, por essa razão restabelecemos a sinonímia de Mesomphaliini a Eugenysini. Além disso, fornecemos hipóteses para discutir as tribos mais proximamente relacionadas a Cassidinae, ao utilizar uma amostragem abrangente e geralmente negligenciada. A partir da reconstrução do estado de caráter ancestral recuperamos duas origens independentes e nenhuma perda da subsocialidade em Cassidinae. Também foi realizada a reconstrução de estado ancestral de escolha das plantas hospedeiras e largura do élitro, visto essas características podem estar ligadas ao comportamento subsocial. Escolha de plantas hospedeiras, por si só, provavelmente não foi o fator que desencadeou o cuidado parental em Cassidinae. A largura do élitro pode ter contribuído para a origem da subsocialidade e, posteriormente, ter sido positivamente selecionada.

Palavras-chave: Sistemática, insetos subsociais, Neotropical, reconstrução de estado ancestral,

Eugensyini ix

ABSTRACT

The evolution of subsociality in Cassidinae Gyllenhaal, 1813 (Coleoptera:

Chrysomelidae) with a molecular phylogenetics approach

Michele Leocádio Gaspar

Advisor: José Ricardo M. Mermudes

Co-advisors: Carlos G. Schrago e Donald Windsor

Abstract of the PhD Thesis submitted to the Graduate Program in Biodiversity and Evolutionary Biology of the Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, as part of the requisites for the completion of the PhD in

Biodiversity and Evolutionary Biology.

Subsociality (= parental care) is a widespread, but rare behaviour among insects. Within Cassidinae there are two tribes which present parental care: Mesomphaliini and Eugenysini. We investigate the evolution of subsociality in Cassidinae with a molecular phylogenetic approach focused on

Mesomphaliini, employing three gene regions (28S, CAD and COI). Our results recovered a monophyletic Mesomphaliini when Eugenysini is included, for that reason we reestablish the synonym of Mesomphaliini with Eugenysini. Besides that, we provide hypotheses regarding the closest related tribes to Mesomphaliini by employing a comprehensive and usually neglected set of tribes as outgroups. Based on the ancestral state reconstruction analysis, we recovered two origins and no losses of the subsociality in Cassidinae evolution. Host plants choice and elytra width were also reconstructed for their ancestral states, since they might be related to parental care. Host plants choice alone was probably not the trigger factor for the emergence of subsociality in Cassidinae.

Elytra width may have contributed to the origin of subsociality and, later, being positively selected.

Keywords: Systematics, subsocial insects, Neotropics, ancestral character reconstruction, Eugenysini x

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL……………………………………………………………………….…….….1

A SUBFAMÍLIA CASSIDINAE GYLLENHAL, 1813…………………………….……………..………1

AS TRIBOS MESOMPHALIIINI HOPE, 1840 E EUGENYSINI HINCKS, 1952………………………...10

O CUIDADO PARENTAL E A SUBSOCIALIDADE…………………………………………………….13

ORIGEM E EVOLUÇÃO DO COMPORTAMENTO SOCIAL EM INSETOS……………………………….14

A SUBSOCIALIDADE EM CASSIDINAE……………………………………………………………..16

O PRESENTE ESTUDO…………………………………………………………………………….21

REFERÊNCIAS…………………………………………………………………………………….22

Capítulo 1: Reconstrução filogenética de Mesomphaliini Hope, 1840 (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae) com base em dados moleculares……..…………………………...29

1.1. INTRODUÇÃO………………………………………………………………………………...29

1.2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………...31

1.3. MATERIAL E MÉTODOS……………………………………………………………………32

1.3.1. AMOSTRAGEM TAXONÔMICA…………………………………………………………...32

1.3.2. OBTENÇÃO DOS DADOS MOLECULARES………………………………………………...35

1.3.3. ANÁLISE DOS DADOS MOLECULARES…………………………………………………...39

1.4. RESULTADOS………………………………………………………………….……..……….43

1.4.1. ANÁLISES FILOGENÉTICAS DOS DADOS CONCATENADOS……………………….……...43

1.4.2. ANÁLISES FILOGENÉTICAS POR MARCADORES………………………………………...47

1.5. DISCUSSÃO…………………………………………………………………………………..56

1.5.1. CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA…………………………………………………………56

1.5.2. POSICIONAMENTO DE MESOMPHALIINI……………………………………………….57

1.5.3. MONOFILETISMO DE MESOMPHALIINI………………………………………………….62

1.5.4. RELAÇÕES INTERNAS EM MESOMPHALIINI……………………………………………..62

1.5.5. SINAL FILOGENÉTICO DOS MARCADORES MOLECULARES……………………………..69

1.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS……………………………………………………………………..72

1.7. REFERÊNCIAS…………………………………………………………………………….….73

Capítulo 2: Origem e Evolução da Subsocialidade em Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae)…………………………………………………………………………………….79

2.1. INTRODUÇÃO……………………………………………………………….………………..79

2.2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………...83

2.3. MATERIAL E MÉTODOS……………………………………………………………………84 xi

2.3.1. RECONSTRUÇÃO DO ESTADO DE CARÁTER ANCESTRAL………………………………..84

2.4. RESULTADOS……………………………………………………………………..…………..86

2.4.1. RECONSTRUÇÃO DO ESTADO DE CARÁTER ANCESTRAL………………………………...86

2.4.2 NOVO REGISTRO DE SUBSOCIALIDADE EM MESOMPHALIINI……………….……..…….92

2.5. DISCUSSÃO…………………………………………………………………………………..94

2.5.1. ORIGEM DA SUBSOCIALIDADE EM CASSIDINAE………………………………………...94

2.5.2. EVOLUÇÃO DO CUIDADO PARENTAL…………………………………..….…………….98

2.5.3. SURGIMENTO E ACÚMULO DE DEFESAS EM CASSIDINAE……………..……………….101

2.5.4. PLANTAS HOSPEDEIRAS……………………………………………………………….104

2.5.5. MORFOLOGIA DO ÉLITRO……………………………………………………………...105

2.5.6. PREDADORES E PARASITÓIDES………………………………………………………..107

2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS………………..…………………………………………………..109

2.7. REFERÊNCIAS……………………………………………………………………………….110 xii

ÍNDICE DE FIGURAS INTRODUÇÃO GERAL

Figuras 1A-Q. Diversidade morfológica de Cassidinae. (A) Chalepus aurantiacicollis Pic, 1931; (B) Sceloenopla balyi (Grimshaw, 1897); (C) Octotoma puncticollis Staines, 1994; (D) Cephaloleia deyrollei Baly, 1858; (E) Delocrania sp.; (F) Paranota minima (Wagener, 1881); (G) Syngambria bisinuata (Boheman, 1855); (H) Bradycassis romani Spaeth, 1952; (I) Omocerus casta (Boheman, 1862); (J) Physonota alutacea Boheman, 1854; (K) Polychalma multicava (Latreille, 1811); (L) Goniochenia buckleyi (Baly, 1872); (M) Eugenysa coscaroni Viana, 1968; (N) Stolas conspersa (Germar, 1824); (O) Acromis sparsa (Boheman, 1864); (P) Mesomphalia gibbosa (Fabricius, 1781); (Q) Zatrephina lineata Spaeth, 1909...... 2

Figura 2. Árvore sumário mostrando as relações filogenéticas entre subfamílias de Chrysomelidae e grupos externos, baseada em dados moleculares. Cassidinae, recuperado monofilético, mostrado pela seta vermelha. Modificado de Gómez-Zurita et al. (2008)...... 3

Figura 3. Hipótese filogenética de Cassidinae baseada em 17 caracteres morfológicos e dois biológicos, sendo a primeira a embasar a sinonímia de Cassidinae s. str. e Hispinae s. str. Tribos marcadas em vermelho pertenciam a Cassidinae s. str. e tribos marcadas em azul são Hispinae s. str. Gêneros de Spilophorini foram descritos em ambos os grupos. Modificado de Borowiec (1995)...... 5

Figura 4. Hipótese filogenética de Cassidinae baseada em 210 caracteres morfológicos para 98 espécies, a mais abrangente até então. Cassidinae foi recuperado monofilético. Modificado de Chaboo (2007)...... 7

Figuras 5A-B. Larvas de Cassidinae exibindo comportamento de cicloalexia, que consiste em uma posição circular com os abdomens voltados para a face externa, carregando os escudos fecais. (A) Nuzonia ishtmica (Champion, 1894); (B) Herissa pantherina (Blanchard, 1837)...... 8

Figuras 6A-B. Larvas de Cassidinae com escudo fecal. (A) Larvas de primeiro ínstar de Stolas aenea (Olivier, 1790); (B) Larva de último ínstar de Stolas nudicollis (Boheman, 1850)...... 8

Figuras 7A-D. Morfologia dos tarsômeros de Mesomphaliini e Eugenysini. O tarsômero expandido em Eugenysini foi utilizado como caráter para torná-lo um grupo a parte Mesomphaliini. (A) Stolas antiqua (Sahlberg, 1823) (Mesomphaliini); (B) Echoma clypeata (Panzer, 1798) (Mesomphaliini); (C) Agenysa parellina (Boheman, 1850) (Eugenysini); (D) Eugenysa sp. (Eugenysini)...... 11

(D) Paraselenis puncticollis (Spaeth, 1907); (E) Paraselenis sp.; (F) Paraselenis scapulosa (Boheman, 1854); (H) Omaspides augusta Boheman, 1856...... 17

CAPÍTULO 1

Figura 1. Árvore consenso recuperada pela inferência Bayesiana com base nos dados concatenados (28S, COI e CAD). Valores de suporte das diferentes avaliações são mostrados por cor em cada um dos ramos. Valores de suporte calculados na análise de Máxima Verossimilhança (Ultrafast Bootstrap e SH-aLRT) são mostrados apenas para os nós congruentes entre ambas as análises (ver Figura 2 para nós conflitantes). O clado 1 representa o grupo com espécies subsociais de Mesomphaliini. As tribos amostradas estão realçadas por cores distintas. Mesomphaliini e Eugenysini foram recuperados polifiléticos...... 43

Figura 2. Topologias espelhadas das árvores de máxima verossimilhança (esquerda) e inferência Bayesiana (direita). Nós conflitantes e seus respectivos valores de suporte são mostrados em vermelho. Gêneros com espécies subsociais estão marcados em azul...... 44

Figura 3. Gêneros recuperados como grupos naturais dentro da nossa amostragem. Espécies-tipo, quando presentes, estão marcados por um asterisco ao final do nome. Espécies ilustradas (de cima para baixo): Hilarocassis bordoni Borowiec, 2002, Acromis sparsa (Boheman, 1854), Paraselenis dichroa (Germar, 1824), Chelymorpha marginata (Linnaeus, 1758), Zatrephina sexlunata (Klug, 1829), Botanochara subnervosa (Boheman, 1850) e Echoma clypeata (Panzer, 1798)...... 45

Figura 4. Árvore consenso recuperada pela inferência Bayesiana com base nos dados dos fragmentos de 28S...... 47

Figura 5. Árvore com melhor valor de log de verossimilhança recuperada pela análise de máxima verossimilhança com base nos dados dos fragmentos de 28S...... 48

Figura 6. Árvores consenso de inferência Bayesiana (acima) e de melhor valor de log verossimilhança da análise de máxima verossimilhança (abaixo) recuperadas pelos fragmentos de CAD2...... 50

Figura 7. Árvores consenso de inferência Bayesiana (acima) e de melhor valor de log verossimilhança da análise de máxima verossimilhança (abaixo) recuperadas pelos fragmentos de CAD3...... 51

Figura 8. Árvore consenso recuperada pela inferência Bayesiana com base nos dados dos fragmentos de COI...... 53

Figura 9. Árvore com melhor valor de log de verossimilhança recuperada pela análise de máxima verossimilhança com base nos dados dos fragmentos de COI...... 54 xiv

Figura 10. Hipótese filogenética do gênero Stoiba Spaeth, 1909 (abreviado como S.) baseada em dados morfológicos. Gênero Elytrogona Chevrolat, 1836 abreviado como E. Retirado de Shin & Chaboo (2012)...... 63

Figura 11. Hipótese filogenética do gênero Acromis Chevrolat, 1836 baseada em dados morfológicos e com a mesma topologia recuperada por dados moleculares (este estudo). Retirado de Chaboo (2001)...... 64

CAPÍTULO 2

Figura 1. Modelo ilustrando as medidas feitas para a análise de reconstrução do estado ancestral da largura do élitro. LD = largura do disco; LE = largura da expansão...... 84

Figura 2. Reconstrução do estado de caráter ancestral do cuidado parental sob o critério de máxima parcimônia. Ramos e terminais estão coloridos de acordo com o seu estado. O cuidado parental teve duas origens independentes em Mesomphaliini. Espécies ilustradas (de cima para baixo): Acromis sparsa (Boheman, 1854); Omaspides bistriata Boheman, 1862; Paraselenis puncticollis (Spaeth, 1907) e Eugenysa coscaroni Viana, 1968...... 86

Figura 3. Reconstrução do estado de caráter ancestral da preferência de planta hospedeira sob o critério de máxima verossimilhança. Os gráficos de pizza nos nós representam a verossimilhança de cada um dos estados. Apenas estados com mais de 10% de verossimilhança estão coloridos nos gráficos, o restante aparece em preto...... 88

Figura 4. Reconstrução do estado de caráter ancestral da proporção entre expansão e disco elitral sob o critério de máxima verossimilhança. Os gráficos de pizza nos nós representam a verossimilhança de cada um dos estados. Apenas estados com mais de 10% de verossimilhança estão coloridos nos gráficos, o restante aparece em preto. O gradiente de cores e respectivas ilustrações representam as proporções, do amarelo (expansão mais estreita) ao vermelho (expansão mais larga)...... 90

Figuras 5A-E. (A) Fêmea adulta de Paraselenis (Spaethiechoma) normalis (Germar, 1824) guardando seus ovos; (B) Macho adulto de P. normalis; (C-D) Folhas e flor da planta hospedeira Distimake dissectus var. edentatus (Meisn.) Petrongari & Sim.-Bianch (Convolvulaceae); (E) Vespas parasitóides da família Eulophidae (círculos vermelhos)...... 92

Figura 6. Recorte da hipótese filogenética de Chaboo (2007), com espécies ditas subsociais em negrito. Apesar de Miocalaspis gentilis (Erichson, 1847) ter sido destacada pelos autores, não há registro de cuidado parental no gênero. Echoma quadritvittata (sic) provavelmente se refere a Echoma quadristillata (Boheman, 1862). Clado destacado em cinza está retratado como na fonte original e mostra a origem da subsocialidade. Modificado de Chaboo et al. (2014)...... 95 xv

Figura 7. Suposta origem do comportamento gregário em larvas de acordo com Vencl & Srygley (2013) e Chaboo et al. (2014) e origens da subsocialidade recuperadas neste trabalho...... 102 xvi

ÍNDICE DE TABELAS INTRODUÇÃO GERAL

Tabela 1. Características divergentes entre os gêneros subsociais de Mesomphaliini e Eugenysini. Informações retiradas de Windsor & Choe (1994), Chaboo (2002) e Chaboo et al. (2014)...... 18

CAPÍTULO 1

Tabela 1. Nomes, localidade e número dos vouchers das espécies utilizadas neste trabalho...... 31

Tabela 2. Primers utilizados para amplificar os marcadores utilizados neste estudo...... 36

Tabela 3. Condições dos protocolos da reação em cadeira de polimerase (PCR) utilizada para amplificar cada fragmento...... 37

Tabela 4. Modelos selecionados pelo PartitionFinder para cada partição...... 39

Tabela 5. Resumo das relações recuperadas entre Mesomphaliini, Eugenysini e tribos proximamente relacionadas em hipóteses filogenéticas precedentes e o presente estudo. O trabalho de Borowiec (1995) utiliza tribos como terminais...... 57

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Lista atualizada das espécies com cuidado parental registrado em Cassidinae...... 78

Tabela 2. Lista de caracteres multiestado utilizados nas análises de reconstrução do estado de caráter ancestral….………………………………………………………………………………….84 1

INTRODUÇÃO GERAL

A SUBFAMÍLIA CASSIDINAE GYLLENHAL, 1813

A subfamília Cassidinae compreende mais de 6.300 espécies descritas, sendo a segunda subfamília mais diversa em Chrysomelidae (Coleoptera), atrás apenas de Galerucinae

(BOROWIEC & SWIETOJANSKA, 2014). As espécies de Cassidinae estão atualmente classificadas em 35 tribos restritas ao Novo ou Velho Mundo, com exceção da tribo Cassidini, que inclui táxons de ambas as regiões (SEKERKA, 2017).

Os adultos de Cassidinae medem de 2 a 40 mm e a forma do corpo varia de alongado a arredondado. A coloração também é muito variada, podendo ser uniforme ou com máculas amarelas, vermelhas, marrom ou pretas, além de metálico azul, verde ou roxo. A forma do

élitro é extremamente variável, sendo geralmente convexo, mas plano em alguns grupos; podendo possuir espinhos ou tubérculos; a pontuação varia de completamente irregular a disposta em fileiras (geralmente 11); margens com expansão de tamanho variável. As antenas possuem de três a 11 antenômeros e geralmente são filiformes (BOROWIEC & SWIETOJANSKA,

2014) (Fig. 1).

As larvas geralmente possuem corpo achatado dorso-ventralmente e oval ou alongado, podendo ainda ser fortemente convexo; abdômen geralmente estreitado na direção posterior. A cabeça é hipognata, frequentemente oculta pelo corpo, assim como as pernas. Laterais do corpo possuem projeções chamadas escolos, com no máximo 16 pares. Final do corpo com um par de processos supra-anal, estes geralmente ausentes nas larvas minadoras. Antenas com dois (larvas exofíticas) ou três antenômeros (larvas minadoras) (SWIETOJANSKA, 2009).

Cassidinae já foi recuperado como grupo irmão de diferentes subfamílias de

Chrysomelidae, dependendo do tipo de dado utilizado (morfológico, molecular ou ambos) e até do tipo de análise empregada. Com dados morfológicos (larvas e/ou adultos), Cassidinae foi recuperado como grupo irmão de Criocerinae ou Eumolpinae (REID, 1995; 2000). Com o 2

BOCÁK et al., 2013) (Fig. 2).

Cassidinae é composto pelos dois grupos artificiais Cassidinae s. str. + Hispinae s. str., que eram tradicionalmente tratados como subfamílias distintas, até serem sinonimizadas na década de 90 (BOROWIEC, 1995). Os caracteres comumente utilizados para separar os grupos estavam relacionados a modificações no élitro e pronoto (expandidos lateralmente ou não) e no hábito das larvas (exofíticas ou minadoras) (STAINES, 2002). No entanto, existem vários gêneros e tribos considerados transicionais, ou seja, com características que os conectam aos dois grupos (STAINES, 2002). O fato de Cassidinae s. str. e Hispinae s. str. terem sido tratados como subfamílias diferentes, mesmo que próximas, resultou em um histórico taxonômico independente e com diversas inconsistências, tal como a descrição de espécies do mesmo gênero em uma ou outra subfamília (BOROWIEC & SWIETOJANSKA, 2014). Alguns autores, baseados em diferentes caracteres morfológicos, fizeram tentativas de reuni-los em um único grupo (SHUCKARD, 1839; CHAPUIS, 1875; CHEN, 1940), mas não foram amplamente aceitos pelos autores subsequentes.

Finalmente, BOROWIEC (1995) apresentou a primeira hipótese filogenética abordando os dois grupos. Apesar das claras limitações, tais como o uso de tribos como terminais filogenéticos (dez tribos de Cassidinae e duas de Hispinae) e de apenas 19 caracteres (17 morfológicos e dois ecológicos), o autor recuperou uma com Hispinae s. tr. monofilético divergindo de parte de Cassidinae s. str. (Fig. 3). O autor concluiu sinonimizando as duas subfamílias sob o nome Hispinae, porém sem discutir a prioridade nominal. Como Cassidinae e Hispinae haviam sido publicados no mesmo trabalho, o correto é que se siga o nome dado pelo primeiro revisor do grupo, de acordo com o artigo 24.2 do ICZN (Código Internacional de Nomenclatura Zoológica) (ICZN 1999). BOUCHARD et al. (2011) discutiram a prioridade nominal e concluíram que SHUCKARD (1839) foi o primeiro revisor e este nomeou o grupo de

"Cassidariae". Portanto, Cassidinae é o nome correto para o clado Hispinae s. str. +

Cassidinae s. str.. 5

O monofiletismo de Cassidinae é bem suportado por hipóteses filogenéticas moleculares recentes (ex.: GOMÉZ-ZURITA et al., 2008; BOCÁK et al., 2013). No entanto, há poucos caracteres morfológicos diagnósticos para o grupo. CHAPUIS (1874, 1875) criou o grupo “Cryptostomes” para alocar Cassidinae s. str. e Hispinae s. str. com base nas peças bucais hipognatas, enquanto que nos outros crisomelídeos estas seriam prognatas. Esse caráter foi utilizado por autores subsequentes como uma das principais sinapomorfias de Cassidinae 6

(CROWSON, 1955; CHEN, 1964; CHABOO, 2007). No entanto, alguns gêneros da tribo

Imatidiini (Cassidinae) possuem peças bucais claramente prognatas ou de posicionamento intermediário entre a prognatia e hipognatia (SEKERKA, 2014).

Outro caráter sugerido como diagnóstico foram as inserções antenais aproximadas

(CHEN, 1940). No entanto, essa característica também ocorre em outras linhagens de

Chrysomelidae, como a subfamília Galerucinae, e não está presente em certas espécies de

Arescini e Cryptonychini (Cassidinae) (SEKERKA, 2017). O único caráter que parece ser realmente diagnóstico para Cassidinae é o tarsômero IV fusionado ao V e, portanto, indistinto

(CHABOO, 2007). Nos outros grupos de Chrysomeloidea o tarsômero IV se encontra reduzido, mas ainda distinto, sendo os tarsos chamados pseudotetrâmeros (RILEY et al., 2002). Mesmo com a aparente falta de caracteres diagnósticos, o monofiletismo de Cassidinae foi recuperado também em hipóteses filogenéticas baseadas em dados morfológicos (REID, 1995, 2000;

CHABOO, 2007) (Fig. 4).

Assim como os outros Chrysomelidae, as espécies de Cassidinae são fitófagas e atualmente são conhecidas as plantas hospedeiras de cerca de 200 gêneros (JOLIVET &

HAWKESWOOD, 1995; BOROWIEC, 1999). De um modo geral, as espécies de Hispinae s. str. estão associadas a monocotiledôneas, especialmente das ordens Arecales e Zingiberales, enquanto que a preferência de Cassidinae s. str. é por dicotiledôneas, principalmente das famílias Asteraceae e Convolvulaceae (CROWSON, 1981). Geralmente, grupos com larvas minadoras são oligófagos amplos ou polífagos, ou seja, podem se alimentar de plantas de famílias diferentes (proximamente relacionadas ou não), enquanto que grupos com larvas exofíticas são oligófagos restritos ou monófagos, se alimentam de espécies de um mesmo gênero ou gêneros próximos, sempre da mesma família (BOROWIEC & SWIETOJANSKA, 2014).

Insetos fitófagos certamente sofrem uma forte seleção imposta por inimigos naturais, especialmente nas espécies cujos imaturos são exofíticos, em que a taxa de mortalidade pode 7 atingir 90% (CORNELL et al., 1998; HUNTER, 2000). Consequentemente, as espécies de hábito

RUXTON et al., 2004; CHABOO, 2011). No caso das larvas exofíticas de Cassidinae, muitas espécies apresentam comportamento gregário, especialmente nos primeiros ínstares (CHABOO,

2007). Acompanhado do gregarismo, pode haver um comportamento chamado cicloalexia, que consiste nas larvas formarem um círculo com as cabeças voltadas para dentro e, quando perturbadas, flexionam rapidamente seus abdomens (JOLIVET et al., 1990) (Fig. 5). Muitas larvas também carregam no final do abdômen estruturas compostas por fezes e/ou exúvias, chamadas de escudo fecal (Fig. 6).

Figuras 6A-B. Larvas de Cassidinae com escudo fecal. (A) Larvas de primeiro ínstar de Stolas aenea (Olivier, 1790); (B) Larva de último ínstar de Stolas nudicollis (Boheman, 1850). 9

O escudo fecal atua como forma de defesa mecânica e química, podendo conter compostos secundários das plantas hospedeiras (VENCL et al., 2005). Alguns crisomelídeos, no entanto, deram um passo além do comportamento gregário, ao desenvolveram cuidado parental (WINDSOR et al., 2013; CHABOO et al., 2014). As únicas duas subfamílias de

Chrysomelidae que apresentam esse comportamento são Chrysomelinae e Cassidinae

(CHABOO, 2007). Na subfamília Cassidinae, o cuidado parental está registrado em duas tribos:

Eugenysini Hincks, 1952 e Mesomphaliini Hope, 1940.

AS TRIBOS MESOMPHALIIINI HOPE, 1840 E EUGENYSINI HINCKS, 1952

A tribo Mesomphaliini é a quarta mais diversa de Cassidinae, compreendendo 545 espécies alocadas em 25 gêneros (BOROWIEC & SWIETOJANSKA, 2014). A tribo Eugenysini, por sua vez, é pouco diversa, possuindo 34 espécies distribuídas em três gêneros (BOROWIEC

& SWIETOJANSKA, 2019). A primeira encontra-se amplamente distribuída por toda a América do Sul, Central e sul da América do Norte, enquanto que a segunda é encontrada do norte da

Argentina até a Costa Rica, com grande parte das suas espécies restritas ao bioma Amazônico

(VIANA, 1968). Mesomphaliini possui como planta hospedeira espécies das famílias

Asteraceae ou Convolvulaceae (BUZZI, 1994). As espécies de Eugenysini são hospedeiras das plantas trepadeiras do gênero Mikania Wild, 1803 (Asteraceae) (CHABOO et al., 2014).

As tribos Mesomphaliini e Eugenysini possuem um histórico taxonômico entrelaçado, ainda sem consenso até os dias atuais. HOPE (1840) designou Mesomphalidae para alocar 11 gêneros, porém não forneceu uma diagnose para o grupo. Posteriormente, CHAPUIS (1875) caracterizou Mésomphaliites (=Mesomphalidae) baseado nos seguintes caracteres: (1) cabeça parcialmente visível dorsalmente, (2) prosterno expandido anteriormente (colar prosternal) e

(3) garras tarsais apendiculadas.

SPAETH (1942) propôs o grupo Calaspideitae para abrigar três gêneros previamente classificados em Mesomphaliini: Calaspidea Hope, 1840, Agenysa Spaeth, 1905 e 10

Miocalaspis Weise, 1899. HINCKS (1952) propôs que o nome correto para Calaspideitae seria

Eugenysini, visto que, Calaspidea, o gênero-tipo, havia sido sinonimizado a Eugenysa

Chevrolat, 1836 (GUÉRIN, 1844). Apenas recentemente a autoria de Eugenysini foi creditada a

HINCKS (1952), porque Calaspideitae (=Eugenysini) foi proposto após 1930 sem descrição ou bibliografia referente, o que torna o nome indisponível (Art. 13.1 ICZN) (BOUCHARD et al.,

2011). O trabalho de HINCKS (1952) é baseado em um manuscrito não publicado de Franz

Spaeth que foi parcialmente destruído por um bombardeio em Viena, na Segunda Guerra

Mundial. O trabalho inclui uma chave de classificação para as tribos de Cassidinae e um catálogo com todos os gêneros descritos. De acordo com a chave, Eugenysini se diferencia de

Mesomphaliini (=Stolaini) pelos tarsômeros fortemente expandidos, encobrindo a base ou a totalidade das garras tarsais (Fig. 7). VIANA (1968) produziu uma ampla revisão taxonômica de Eugenysini e reiterou que a principal característica que separa Eugenysini de

Mesomphaliini são os tarsômeros expandidos lateralmente, especialmente o último, sem discutir quais seriam outras características distintas.

BOROWIEC (1995) propôs uma hipótese filogenética para as tribos de Cassidinae definidas por HINCKS (1952). Borowiec argumentou que Eugenysini havia sido criado com base em um simples caráter apomórfico, os tarsômeros expandidos, e que algumas espécies do gênero Stolas Billberg, 1820 (Mesomphaliini) também possuem tal característica. Em sua opinião, Eugenysini representaria apenas um estágio extremo da modificação dos tarsômeros dentro de Mesomphaliini. Por fim, sinonimizou Eugenysini a Mesomphaliini antes que tal hipótese fosse testada pela sua análise filogenética. No entanto, posteriormente, o próprio autor em seu catálogo para os Cassidinae do mundo não levou em consideração a sinonímia

(BOROWIEC, 1999). A classificação taxonômica atual considera individualmente as duas tribos

(BOUCHARD et al., 2011). 11

HSIAO & WINDSOR (1999) foram os primeiros a testar as relações intertribais em

Cassidinae com dados moleculares (12S mtDNA). Mesomphaliini (=Stolaini) foi recuperado como polifilético, enquanto que Eugenynisi teve apenas uma espécie amostrada e esta foi recuperada dentro de parte de Mesomphaliini. CHABOO (2007) apresentou a hipótese filogenética para Cassidinae com a maior amostragem até o momento, baseada na morfologia de adultos e larvas. Mesomphaliini (=Stolaini) foi recuperado em ao menos quatro clados dentro de uma politomia junto a outras tribos de Cassidinae, impossibilitando a discussão de relacionamento entre os clados de Mesomphaliini. Quatro espécies de Eugenysini foram amostradas, estas foram recuperadas como um grupo monofilético derivando de um dos clados de Mesomphaliini, portanto pode-se afirmar que este último grupo não foi recuperado monofilético, mesmo com a politomia. O monofiletismo de Eugenysini foi suportado por dois caracteres: (i) a expansão apical do tarsômero V – previamente proposto por HINCKS (1952) – 12 e (ii) duto ejaculatório muito longo e enrolado. BOROWIEC & OPALINSKA (2007) descreveram a espermateca de 43 espécies de Eugenysini e Mesomphaliini (=Stolaini) e não encontraram uma diferença clara entre as duas tribos, com ambas possuindo conjuntos de caracteres que se sobrepõem.

Dentre as características que os adultos de Mesomphaliini e Eugenysini compartilham, estão: metepisterno incompletamente fusionado ao metepímero, margem expandida do élitro e pronoto geralmente extensas, corpo geralmente grande (mais de dois centímetros em alguns casos) e metálico, cabeça não completamente coberta pelo pronoto, peças bucais cobertas pelo colar prosternal e garras tarsais com dente basal (apendiculadas) (BOROWIEC, 1995). Apenas uma larva de Eugenysini é conhecida, a partir de uma descrição bastante superficial

(CHABOO, 2002). Nela são descritos 14 pares de escolos laterais, enquanto que o padrão em

Mesomphaliini é de 16 pares de escolos (SWIETOJANSKA, 2009). No entanto, nas espécies subsociais de Mesomphaliini foi observada uma redução no número de escolos (8-10)

(DONCEEL, 1885; BUZZI, 1980).

O CUIDADO PARENTAL E A SUBSOCIALIDADE

O cuidado parental e o comportamento subsocial são termos que, além das suas próprias discussões terminológicas, se sobrepõem em algum grau (CLUTTON-BROCK, 1991;

DEW et al., 2016). O cuidado parental é definido como qualquer comportamento dos pais que aumente a chance de sobrevivência da sua prole, nele estão incluídos comportamentos que vão desde o suprimento de nutrientes aos gametas até a guarda da prole (SMISETH et al.,

2012). O cuidado parental pode ser categorizado temporalmente em dois grupos: pré-natal

(breve) e pós-natal (prolongado) (BRANDMAYR, 1992). No cuidado parental breve, não há contato com a prole (ex.: escolha do local de oviposição, construção de abrigo para os ovos, etc.), enquanto que no cuidado prolongado ocorre contato com a prole (ex.: guarda da prole, suprimento de alimento a mesma, etc.) (BRANDMAYR, 1992). Apesar dessa visão mais ampla 13 ser adotada em livros especializados no assunto (CLUTTON-BROCK, 1991; ROYLE et al.,

2012), uma visão mais restrita de cuidado parental é a comumente utilizada em artigos

(GILBERT & MANICA, 2015). Esta visão mais restrita se refere apenas a guarda da prole – ovos e estágios consecutivos (CRUMP, 1995; TALLAMY, 1984). Por exemplo, quase todas as espécies de besouros realizam a oviposição em substratos adequados ou cobrem os ovos com algum dispositivo de proteção, dessa forma aumentam a chance de sobrevivência da prole, mas apenas os que guardam a prole são tratados como tendo cuidado parental (BRANDMAYR,

1992). A sobreposição com o comportamento social ocorre no cuidado parental prolongado.

O comportamento social é composto por ao menos um de três aspectos: (1) cooperação no cuidado da prole, (2) castas reprodutivas e (3) sobreposição de gerações

(WILSON, 1971). O comportamento subsocial é o nível mais simples de interação social, pois preenche apenas um dos requisitos: sobreposição de gerações – os pais (adultos) e a prole

(imaturos) (MICHENER, 1969). Sendo assim, tal como o cuidado parental prolongado, a subsocialidade é definida pelo conjunto formado por um dos pais (ou ambos) e a prole.

WILSON (1971) definiu a subsocialidade como o cuidado dos adultos em relação às larvas ou ninfas, sem mencionar o cuidado aos ovos. YIP & RAYOR (2014) aprimoraram a definição de

Wilson: a subsocialidade é definida pela presença dos pais (ou apenas um deles) junto à prole no espaço temporal em que esta começa a se alimentar até o momento em que se dispersa. Já

HINTON (1944) e COSTA (2018) afirmam que o comportamento subsocial também inclui aquele em que os pais cuidam dos ovos.

ORIGEM E EVOLUÇÃO DO COMPORTAMENTO SOCIAL EM INSETOS

WILSON (1975) identificou quatro gatilhos que poderiam ser favoráveis ao surgimento do cuidado parental: ambientes estáveis, ambientes fisicamente estressantes, fonte de alimento escassa ou específica e predação. No entanto, a maior parte dos insetos enfrenta ao menos um desses obstáculos e o cuidado parental está presente em apenas cerca de 1% das espécies 14

(COSTA, 2006).

TALLAMY & WOOD (1986), por sua vez, argumentaram que é o recurso alimentar que determina os padrões espaciais e temporais de alimentação e reprodução, consequentemente sendo responsável em como a competição e predação afetam a prole. Por exemplo, insetos fitófagos que se alimentam dos tecidos externos das plantas (exofíticos) tendem a estar mais suscetíveis a ataques de predadores e parasitóides em relação aos insetos que se alimentam de tecidos internos (endofíticos). Muitos insetos exofíticos desenvolveram o cuidado parental de ovos e imaturos (CORNELL & HAWKINS, 1995). Ainda assim, não se sabe porque inúmeras espécies de insetos exploram os mesmos recursos nos mesmos habitats e apenas uma pequena parcela desenvolveu o cuidado parental (COSTA, 2006).

Além da origem do comportamento social, muito se discute sobre como se deu a evolução até o seu estágio mais avançado: a eussocialidade. Os insetos eussociais são os que cumprem os três requisitos do comportamento social e estão amplamente representados nas ordens Isoptera e Hymenoptera. Saltos evolutivos de comportamento solitário até eussocial são improváveis, acredita-se que estágios intermediários sejam necessários para a evolução da eussocialidade (MICHENER, 1985; HUNT, 2007). A partir disso, existem duas teorias sobre como os insetos eussociais evoluíram: pela rota parasocial (MICHENER, 1958) ou pela rota subsocial (WHEELER, 1928). A rota parasocial sugere que comportamentos sociais mais complexos evoluíram a partir de indivíduos não aparentados da mesma geração cooperando entre si. A rota subsocial, por sua vez, sugere que o ponto de partida tenha sido o cuidado parental prolongado, ou seja, em vez de se dispersar após a maturação, a prole auxiliaria a fêmea a cuidar de novas proles. O caminho evolutivo para a eussocialidade, tanto em insetos como em outros táxons, foi majoritariamente pela rota subsocial (BOURKE, 2011).

Apesar de formigas, cupins e abelhas Apidae serem organismos modelo para o entendimento da organização eussocial (MICHENER, 1969), esses grupos fornecem pouca 15 informação acerca das origens evolutivas da eussocialidade, visto que táxons solitários proximamente relacionados foram extintos há muito tempo (DANFORTH, 2002). Abelhas da família Halictidae e da tribo Allodapini, por sua vez, são tidas como grupos modelo para o estudo da evolução da socialidade por apresentarem espécies solitárias e em diferentes níveis de organização social (DANFORTH, 2002; SCHWARZ et al., 2007).

Aranhas, apesar de não demonstrarem comportamento eussocial, apresentam quasissocialidade, que corresponde a um comportamento social mais complexo que a subsocialidade, em que membros de uma colônia cooperam na manutenção da teia, captura de presas e cuidado com a prole (AGNARSSON et al., 2006). Aranhas quasissociais provavelmente evoluíram a partir de ancestrais subsociais pelo prolongamento gradual da atividade entre irmãos e da supressão da fase de dispersão (AGNARSSON et al., 2006; RUCH et al., 2015).

Sendo assim, estágios intermediários de comportamento social desempenham um papel muito importante no estudo da evolução da socialidade em insetos.

O comportamento subsocial é difundido mas incomum em insetos (WYATT & FOSTER,

1989). Este mesmo padrão se mantém em Coleoptera, das mais de 200 famílias reconhecidas, em apenas 12 delas está registrado o cuidado parental (Brentidae, Carabidae, Chrysomelidae,

Curculionidae, Erotylidae, Lampyridae, Passalidae, Rhagophthalmidae, Scarabaeidae,

Silphidae, Staphylinidae e Tenebrionidae) (COSTA, 2006). Na família Chrysomelidae Latreille,

1802, esse comportamento está restrito às subfamílias Cassidinae Gyllenhal, 1813 e

Chrysomelinae Gyllenhal, 1802.

A SUBSOCIALIDADE EM CASSIDINAE

Todos os Cassidinae com comportamento subsocial estão restritos a região

Neotropical, enquanto que as espécies de Chrysomelinae que exibem o mesmo comportamento ocorrem, além da região Neotropical, nas regiões Holoártica e Australiana

(CHABOO, 2011). As espécies subsociais das duas subfamílias não estão proximamente 16 relacionadas, mas possuem características em comum, como estágios imaturos vivendo e se alimentando de forma exposta nas folhas (FRIEIRO-COSTA & VASCONCELLOS-NETO, 2003), estando assim mais vulneráveis a predadores (Cornell & Hawkins, 1995). Em Cassidinae, assim como em Chrysomelinae, as fêmeas são responsáveis pelo cuidado com a prole

(CHABOO et al., 2014) (Fig. 8).

O comportamento subsocial está registrado em apenas duas das 35 tribos de

Cassidinae: Eugenysini e Mesomphaliini (CHABOO et al., 2014). Em ambas as tribos, as fêmeas depositam os ovos nas respectivas plantas hospedeiras e guardam a prole até a emergência dos jovens adultos (CHABOO, 2007). As fêmeas utilizam seus élitros largamente expandidos para encobrir e defender a prole de possíveis predadores (CHABOO et al., 2014).

Em Mesomphaliini, o comportamento subsocial está registrado em três dos 25 gêneros

(número de espécies subsociais/número total de espécies): Acromis Chevrolat, 1836 (3/3),

Paraselenis Spaeth, 1913 (6/29) e Omaspides Chevrolat, 1836 (11/40) (CHABOO et al., 2014), enquanto que em Eugenysini está registrado em dois dos três gêneros: Agenysa (1/9) e

Eugenysa (3/18) (MACEDO et al., 2015). Trabalhos publicados e extensas observações de campo mostram que o cuidado parental está presente em todas as espécies de Acromis,

Paraselenis e Omaspides em que o comportamento reprodutivo é conhecido (WINDSOR &

CHOE, 1994; CHABOO et al., 2014).

WINDSOR E CHOE (1994) propuseram duas origens independentes da subsocialidade em Cassidinae, uma em Mesomphaliini e outra em Eugenysini. Os autores embasaram essa proposta nas diferenças no arranjo da oviposição, nas plantas hospedeiras e na morfologia das larvas (Tab. 1). 17

Figuras 8A-H. Comportamento subsocial em Mesomphaliini, fêmeas adultas guardando a prole em diferentes estágios: ovos (A-C), larvas (D-E), pupas (F-G) e adultos recém-emergidos (H). (A, G) Omaspides confusa Borowiec, 2010; (B) Omaspides sp.; (C) Omaspides trichroa (Boheman, 1854); (D) Paraselenis puncticollis (Spaeth, 1907); (E) Paraselenis sp.; (F) Paraselenis scapulosa (Boheman, 1854); (H) Omaspides augusta Boheman, 1856. 18

Tabela 1. Características divergentes entre os gêneros subsociais de Mesomphaliini e Eugenysini. Informações retiradas de Windsor & Choe (1994), Chaboo (2002) e Chaboo et al. (2014).

Mesomphaliini (Acromis, Eugenysini (Agenysa e Paraselenis, Omaspides) Eugenysa) Em cacho, anexados a veia central Em fileiras, formando círculos ao Arranjo da da face abaxial da folha, com ou redor do caule, sem pedúnculo oviposição sem pedúnculo Planta hospedeira Convolvulaceae Mikania (Asteraceae) Cerdas curtas (?), processo supra- Cerdas longas (?), processo Morfologia da larva anal e escudo exúvio-fecal pouco supra-anal e escudo exúvio-fecal desenvolvidos bem desenvolvidos

CHABOO (2007) realizou uma reconstrução filogenética para Cassidinae com base em

209 caracteres morfológicos de adultos e estágios imaturos. No entanto, inúmeros táxons foram erroneamente identificados ou incluídos duas vezes na matriz (em tribos diferentes), além de espécies que foram listadas mas os caracteres não foram codificados (SWIETOJANSKA,

2009; SEKERKA, 2017). A partir do resultado de CHABOO (2007), CHABOO et al. (2014) propuseram duas hipóteses para a origem da subsocialidade em Cassidinae: (1) uma origem, com uma reversão em Echoma Chevrolat, 1836 (Mesomphaliini) ou (2) duas origens independentes, uma em Paraselenis e outra no grupo composto por Acromis, Omaspides e

Eugenysini. No entanto, os autores consideraram a segunda hipótese equívoca devido à politomia recuperada na árvore. Dados indicam uma constrição filogenética na subsocialidade em Cassidinae, em que os grupos subsociais estão agrupados e proximamente relacionados dentro do ramo mais derivado de Cassidinae (CHABOO et al., 2014).

VENCL & SRYGLEY (2013) propuseram um modelo de acúmulo de defesas obtidas por

Cassidinae após a transição do hábito de vida endofítico (larvas minadoras) para um hábito de vida exofítico, em que as larvas tornam-se expostas a uma enorme diversidade de inimigos naturais. A evolução da subsocialidade em Cassidinae possivelmente ocorreu como uma adaptação convergente a vida exposta em folhas de trepadeiras tropicais de rápido crescimento e infestada de inimigos naturais (WINDSOR & CHOE, 1994). No modelo de 19

VENCL & SRYGLEY (2013), o cuidado parental teria sido a defesa mais recente a ter evoluído.

Ainda assim, não há um grande suporte para o que se sabe hoje sobre as origens da subsocialidade em Cassidinae. O único trabalho que teve essa discussão como foco (CHABOO et al., 2014) utilizou o resultado de outro trabalho que continha uma amostragem que não era focada nessa discussão (CHABOO, 2007), além de sabidamente apresentar inúmeros problemas na construção de sua análise (SWIETOJANSKA, 2009; SEKERKA, 2017) e ter como resultado uma árvore com pouca resolução. Mesmo as propostas feitas acerca da subsocialidade em

Cassidinae, são questionadas pelos próprios autores (CHABOO et al., 2014). Sendo assim, faz- se necessário uma amostragem adequada, que contenha tanto os grupos subsociais, como grupos solitários possivelmente aparentados. Por último, a utilização de dados moleculares em

Cassidinae, apesar de uma ferramenta ainda recente no grupo, têm fornecido resultados mais resolvidos em relação aos dados provindos de caracteres morfológicos de adultos (SIMÕES et al., 2018). 20

O PRESENTE ESTUDO

Este trabalho encontra-se dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo são tratadas as relações filogenéticas de Mesomphaliini, em especial os três gêneros subsociais. Para isso, são utilizados dados moleculares de quatro fragmentos de DNA (um mitocondrial e três nucleares). Este é apenas o terceiro trabalho a utilizar dados moleculares para uma hipótese filogenética em Cassidinae s. str., sendo a maior amostragem até então – 90 táxons terminais.

Discutimos o monofiletismo de Mesomphaliini e restabelecemos a sinonímia com a tribo

Eugenysini, a partir de evidências reveladas pelos nossos resultados que corroboram hipóteses previamente levantadas na literatura. Também são discutidas as possíveis tribos filogeneticamente próximas a Mesomphaliini, visto a enorme falta de consenso quanto às relações intertribais em Cassidinae.

No segundo capítulo são apresentadas análises de reconstrução do estado de caráter ancestral tendo como base uma das árvores obtidas no primeiro capítulo. Primeiramente foi feita uma análise de reconstrução do cuidado parental e, posteriormente, a fim de discutir uma possível relação com o cuidado parental, também realizamos reconstruções dos estados de caráter ancestral da escolha de planta hospedeira e da morfologia do élitro. Além disso, há um novo registro de cuidado parental em Mesomphaliini. 21

REFERÊNCIAS

Agnarsson, I., Avilés, L., Coddington, J. A. & Maddison, W. P. (2006). Sociality in theridiid spiders: repeated origins of an evolutionary dead end. Evolution 60(11): 2342-2351.

Bocak, L., Barton, C., Crampton‐ Platt, A., Chesters, D., Ahrens, D., & Vogler, A. P. (2014). Building the Coleoptera tree‐‐ of life for >8000 species: composition of public DNA data and fit with Linnean classification. Systematic Entomology, 39(1): 97-110.

Borowiec, L. (1995). Tribal classification of the cassidoid Hispinae (Coleoptera: Chrysomelidae). In: J. Pakaluk, S.A. Slipiński, Biology, Phylogeny, and Classification of Coleoptera: Papers Celebrating the 80th Birthday of Roy A. Crowson, Warszawa, 541-558.

Borowiec, L. (1999). A world catalogue of the Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae). Biologica Silesiae, Wroclaw, 476pp.

Borowiec, L. & Opalińska, S. (2007). The structure of the spermathecae of selected genera of Stolaini and Eugenysini (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae) and its taxonomic significance. Annales Zoologici 57(3): 463-479.

Borowiec, L. & Świętojańska, J. (2014). In: Leschen, R.A.B. & Beutel, R.G. (Eds.), Handbuch der Zoologie / Handbook of Zoology, Arthropoda, Insecta, Coleoptera. Vol. III. Curculionoidea. Walter De Gruyter, Berlin, xii + 675 pp.

Borowiec, L. & Świętojańska, J. (2019). World catalog of Cassidinae. Wrocław, Poland. http://www.cassidae.uni.wroc.pl/katalog%20internetowy/index.htm (Acessado em 15 de junho de 2019).

Bouchard, P., Bousquet, Y., Davies, A. E., Alonso-Zarazaga, M. A., Lawrence, J. F., Lyal, C. H. C., Newton, A. F., Reid, C. A. M., Schmitt, M., Ślipiński, S. A., Smith, A. B. T. (2011) Family-group names in Coleoptera (Insecta). ZooKeys 88: 1–972.

Bourke, A. F. (2011). Principles of social evolution. Oxford University Press, Oxford.

Brandmayr, P. (1992). Short review of the presocial evolution in Coleoptera. Ethology Ecology & Evolution 4: 7-16

Buzzi, Z. J. (1980). Estágios imaturos de Acromis nebulosa (Boheman, 1854) (Coleoptera, 22

Chrysomelidae, Cassidinae). Dusenia, 12: 63-67.

Buzzi, Z. J., (1994). Host plants of Neotropical Cassidinae. In: P.H. Jolivet, M.L. Cox., E. Petitpierre, Novel aspects of the biology of Chrysomelidae. Kluver Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, pp. 205-212.

Chaboo, C. S. (2002). First report of immatures, genitalia and maternal care in Eugenysa columbiana (Boheman) (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Eugenysini). The Coleopterists' Bulletin 56(1): 50-68.

Chaboo, C. S. (2007). Biology and Phylogeny of the Cassidinae Gyllenhal Sensu Lato (Tortoise and Leaf-Mining Beetles) (Coleoptera: Chrysomelidae). Bulletin of the American Museum of Natural History 305: 1–250.

Chaboo, C. S. (2011). Defensive behaviors in leaf beetles: From the unusual to the weird. In: Vivanco, J. M., Weir, T. (eds.). Chemical biology of the tropics. Berlin: Springer Verlag; p. 59–69.

Chaboo, C. S., Frieiro-Costa, F. A., Gómez-Zurita, J., Westerduijn, R. (2014). Origins and diversification of subsociality in leaf beetles (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Chrysomelinae). Journal of Natural History 48(37-38): 2325-2367.

Chapuis, M. F. (1874). Tome dixième. Famille des Phytophages in: Lacordaire, T. & Chapuis, F. (eds). Histoire Naturelle des Insectes. Genera des Coléopteres ou exposé méthodique et critique de tous les genres proposés jusqu ici dans cet ordre d'Insectes. Libraire Encyclopédique de Roret, Paris, iv + 415pp.

Chapuis, M. F. (1875). Tome onzième. Famille des Phytophages in: Lacordaire, T. & Chapuis, F. (eds). Histoire Naturelle des Insectes. Genera des Coléopteres ou exposé méthodique et critique de tous les genres proposés jusqu ici dans cet ordre d'Insectes. Libraire Encyclopédique de Roret, Paris, 420 pp.

Chen, S. H. (1940). Attempt at a new classification of the leaf beetles. Sinensia 11(5-6), 451- 481.

Chen, S. H. (1964). Evolution and classification of the chrysomelid beetles. Acta Entomologica Sinica 13: 469–483.

Clutton-Brock, T. H. (1991). The evolution of parental care. Princeton University Press, Princeton.

Cornell, H. V. & Hawkins, B. A. (1995). Survival patterns and mortality sources of 23

herbivorous insects: some demographic trends. The American Naturalist 145(4): 563- 593.

Cornell, H. V., Hawkins, B. A. & Hochberg, M. E. (1998). Towards an empirically-based theory of herbivore demography. Ecological Entomology 23(3): 340-349.

Costa, J. T. (2006). The Other Insect Societies. Cambridge, Massachusetts: Harvard University Press.

Costa, J. T. (2018). The other insect societies: overview and new directions. Current opinion in insect science 28: 40-49.

Crowson, R. A. (1955). The natural classification of the families of Coleoptera. Nathaniel Lloyd & Co., London, 187 pp.

Crowson, R. A. (1981). The biology of the Coleoptera. London: Academic Press, 802 pp.

Crump, M. L. (1995). Parental care. Amphibian biology (2): 518-567.

Danforth, B. N. (2002). Evolution of sociality in a primitively eusocial lineage of bees. Proceedings of the National Academy of Sciences 99(1): 286-290.

Dew, R. M., Tierney, S. M. & Schwarz, M. P. (2016). Social evolution and casteless societies: needs for new terminology and a new evolutionary focus. Insectes sociaux 63(1): 5-14.

Donceel, H. D. (1885). Premiers etats de quelques cassidides exotiques. Annales de la Société Entomologique de Belgique 29: 158-162.

Evans, L. E., Schmidt, J. O. (1991). Insect defenses: adaptive mechanisms of prey and predators. State University of New York Press, Albany

Farrell, B. D. & Sequeira, A. S. (2004). Evolutionary rates in the adaptive radiation of beetles on plants. Evolution 58: 1984–2001.

Frieiro-Costa, F. A. & Vasconcellos-Neto, J. (2003). Biological and ecological studies on the tortoise beetle Omaspides tricolorata Boheman 1854 (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). In Special topics in leaf beetle biology: Proceedings of the 5 th International Symposium on the Chrysomelidae (pp. 213-225).

Gilbert, J. D. & Manica, A. (2015). The evolution of parental care in insects: a test of current hypotheses. Evolution 69(5): 1255-1270.

Gómez-Zurita, J., Hunt, T., & Vogler, A. P. (2008). Multilocus ribosomal RNA phylogeny of 24

the leaf beetles (Chrysomelidae). Cladistics 24(1): 34–50.

Guérin, F. E. (1844). Iconographie du regne animal de G. Cuvier, vol. 7, insectes, 576 pp., 104 pls. J. B. Baillière. Paris.

Gyllenhal, L. (1813). Insecta Suecica. Classis I. Coleoptera sive Eleuthera, Tomus I, pars. III, Scaris, 730.

Hincks, W. D. (1952). The genera of the Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae). Transactions of the Royal Entomological Society of London 103(10): 327-358.

Hinton, H. E. (1944). Some general remarks on sub-social beetles, with notes on the biology of the staphylinid, Platystethus arenarius (Fourcroy). Proceedings of the Royal Entomological Society of London (A) 19: 115–128.

Hope, F. W. (1840). The Coleopterist’s Manual. Part 3. J. C. Bridgewater. London. 191 pp.

Hsiao, T. H. & Windsor, D. M. (1999). Historical and biological relationships among Hispinae inferred from 12S mtDNA sequence data. In: Cox ML, ed. Advances in Chrysomelidae Biology 1. Leiden, The Netherlands: Backhuys, 39–50.

Hunt, J. H. (2007). The evolution of social wasps. Oxford University Press, New York.

Hunter, A. F. (2000). Gregariousness and repellent defences in the survival of phytophagous insects. Oikos 91(2): 213-224.

ICZN. (1999). International Code of Zoological Nomenclature. Quarta edição. London: The international Trust for Zoological Nomenclature.

Jolivet, P., Vasconcellos-Neto, J. & Weinstein, P. (1990). Cycloalexy: a new concept in the larval defense of insects. Insecta Mundi 4: 133-142.

Jolivet, P., & Hawkeswood, T. (1995). Host-plants of Chrysomelidae of the world. Leiden: Backhuys, 671pp.

Macedo, M. V., Flinte, V., Abejanella, A. & Chaboo, C. S. (2015). Three new reports of subsocial tortoise beetles from South America (Chrysomelidae: Cassidinae). Annals of the Entomological Society of America 108(6): 1088-1092. 25

Michener, C. D. (1958). The evolution of social behavior in bees. In Proceedings of the 10th International Congress of Entomology (Vol. 2, pp. 441-447).

Michener, C. D. (1969). Comparative social behavior of bees. Annual review of entomology 14(1): 299-342.

Michener, C. D. (1985). From solitary to eusocial: need there be a series of intervening species? In: Holldobler, B. & Lindauer, M. (eds) Experimental behavioral ecology and sociobiology. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, pp. 293–305.

Reid, C. A. M. (1995). A cladistic analysis of subfamilial relationships in the Chrysomelidae sensu lato (Chrysomeloidea). Biology, phylogeny and classification of Coleoptera: papers celebrating the 80th birthday of Roy A. Crowson 2: 559-631.

Reid, C. A. M. (2000). Spilopyrinae Chapuis: a new subfamily in the Chrysomelidae and its systematic placement (Coleoptera). Invertebrate Systematics 14(6): 837–862.

Riley, E.G., Clark, S.M., Flowers, R.W., Gilbert, A.J., (2002) .124. Chrysomelidae Latreille 1802. In: R.H. Arnett, M.C. Thomas, P.E. Skelley, J.H. Frank, American Beetles, Volume 2, Polyphaga: Scarabaeoidea through Curculionoidea. CRC Press, Boca Raton-London-New York-Washington, 617-691.

Royle, N. J., Smiseth, P. T., Kölliker, M. (2012). The Evolution of Parental Care. Oxford: Oxford University Press.

Ruch, J., Riehl, T., May-Collado, L. J. & Agnarsson, I. (2015). Multiple origins of subsociality in crab spiders (Thomisidae). Molecular phylogenetics and evolution 82: 330-340.

Ruxton, G. D., Sherratt, T. N., Speed, M. P., Speed, M. P. & Speed, M. (2004). Avoiding attack: the evolutionary ecology of crypsis, warning signals and mimicry. Oxford University Press, Oxford.

Schwarz, M. P., Richards, M. H. & Danforth, B. N. (2007). Changing paradigms in insect social evolution: insights from halictine and allodapine bees. Annual Review of Entomology 52: 127-150.

Sekerka, L. (2014). Review of Imatidiini genera (Coleoptera : Chrysomelidae : Cassidinae). Acta Musei Nationalis Pragae 54(1): 257–314.

Sekerka, L. (2017). Taxonomy and Ecology of Neotropical Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae). Tese de Doutorado. University of South Bohemia, České Budějovice, 26

República Tcheca, 278 pp.

Simões, M. V., Baca, S. M., Toussaint, E. F., Windsor, D. M. & Short, A. E. (2018). Solving a thorny situation: DNA and morphology illuminate the evolution of the leaf beetle tribe Dorynotini (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). Zoological Journal of the Linnean Society 185(4): 1123-1136.

Smiseth, P. T., Kölliker, M. & Royle, N. J. (2012). What is Parental care?. The Evolution of Parental Care (ed. by N. J. Royle, P. T. Smiseth and M. Kölliker), pp. 1–17. Oxford University Press, Oxford, U.K.

Shuckard, W. E. (1839). Elements of British entomology, containing a general introduction to the science, a systematic description of all the genera, and a list of all the species of British insects, with a history of their transformation, habits, economy, and distribution, with outline fi gures of the families and their larvae and pupae, an explanation of the technical terms, and full directions for collecting. Part I. Hippolyte Bailliere, London, 240 pp. [before 3 Jun 1839 (Jour. Proc. Ent. Soc. Lond. 1839: xxv)

Spaeth, F. (1942). Cassidinae (Col. Chrysom.). Pp. 11–43. In: TITSCHAK E. (ed.) Beitrage zur Fauna Perus: nach der Ausbeute der Hamburger Sudperu- Expedition 1936, anderer Sammlungen, wie auch auf Grund von Literaturangaben. Band 2. Gustav Fischer, Jena, 344 pp. + 1 pl.

Staines, C. L. (2002). The new world tribes and genera of hispines (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). Proceedings of the Entomological Society of Washington 104(3): 721-784.

Świętojańska, J. (2009). The immatures of tortoise beetles with bibliographic catalogue of all taxa (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). Polish Taxonomical Monographs 16: 1– 157.

Tallamy, D. W. (1984). Insect parental care. Bioscience 34(1): 20-24.

Tallamy, D. W. & Wood, T. K. (1986). Convergence patterns in subsocial insects. Annual Review of Entomology 31: 369–390.

Vencl, F. V., Nogueira-de-Sá, F., Allen, B. J., Windsor, D. M. & Futuyma, D. J. (2005). Dietary specialization influences the efficacy of larval tortoise beetle shield defenses. Oecologia 145(3): 404-414.

Vencl, F. V. & Srygley, R. B. (2013). Enemy targeting, trade-offs, and the evolutionary assembly of a tortoise beetle defense arsenal. Evolutionary ecology 27(2): 237-252.

Viana, M. (1968). Revision sistematica de las ‘‘Eugenysini’’ Spaeth con nuevas especies y catalogo bibliografico de la tribus (Coleopt., Chrysomelidae, Cassidinae). Revista del 27

museo argentino de ciencias naturales ‘‘Bernardino Rivadavia’’ 3: 1–106.

Wheeler, W. M. (1928). The social insects. Their origin and evolution. London: Kegan Paul, Trench, Trubner and Co., Ltd; 378 p.

Wilson, E. O. (1971). The Insect Societies. Harvard University Press, Cambridge.

Wilson, E. O. (1975). Sociobiology: the New Synthesis. Cambridge, Massachusetts: Belknap Press.

Windsor, D. M. & Choe, J. C. (1994). Origins of parental care in Chrysomelid beetles. In: Jolivet, P., Cox, M. L. & Petitpierre, E. eds. Novel Aspects of the Biology of Chrysomelidae. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 111–117.

Windsor, D. M., Dury, G. J., Frieiro-Costa, F. A., Lanckowsky, S., Pasteels, J. M. (2013). Subsocial Neotropical Doryphorini (Chrysomelidae, Chrysomelinae): new observations on behavior, host plants and systematics. In: Jolivet P, Santiago-Blay J, Schmitt M (Eds) Research on Chrysomelidae 4. ZooKeys 332: 71–93.

Wyatt, T. D. & Foster, W. A. (1989). Leaving home: predation and the dispersal of larvae from the maternal burrow of Bledius spectabilis, a subsocial intertidal beetle. Animal behaviour 38: 778-785. Yip, E. C. & Rayor, L. S. (2014). Maternal care and subsocial behaviour in spiders. Biological Reviews 89(2): 427-449. 28

Capítulo 1: Reconstrução filogenética de Mesomphaliini Hope, 1840

(Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae) com base em dados moleculares

1.1. INTRODUÇÃO

Mesomphaliini é uma tribo endêmica do Novo Mundo, mas é majoritariamente encontrada na região Neotropical (BOROWIEC, 1995; BOROWIEC & ŚWIĘTOJAŃSKA, 2019). É a quarta tribo mais diversa de Cassidinae, possuindo 545 espécies alocadas em 25 gêneros

(BOROWIEC & ŚWIĘTOJAŃSKA, 2014). Mesomphaliini é caracterizado por possuir cabeça parcialmente visível em vista dorsal, prosterno expandido anteriormente (colar prosternal) e garras tarsais apendiculadas (CHAPUIS, 1875; Borowiec, 1995). A tribo Eugenysini Hincks,

1952 foi proposta a partir de três gêneros que estavam previamente alocados em

Mesomphaliini (SPAETH, 1942; HINCKS, 1952). Os tarsômeros foram amplamente utilizados como estrutura distinta entre as tribos, estando os tarsômeros apicais lateralmente expandidos em Eugenysini (HINCKS, 1952; VIANA, 1967; CHABOO, 2007). Mais recentemente também foi proposto um caráter relacionado ao ducto ejaculatório (CHABOO, 2007). As duas tribos chegaram a ser sinonimizadas tendo como base que algumas espécies de Mesomphaliini também possuem tarsômeros expandidos (BOROWIEC, 1995). No entanto, esta sinonímia não foi acolhida pela literatura subsequente (BOROWIEC, 1999; BOUCHARD et al., 2011;

BOROWIEC & ŚWIĘTOJAŃSKA, 2019).

Mesomphaliini foi amostrado em duas hipóteses filogenéticas para Cassidinae, uma molecular (HSIAO & WINDSOR, 1999) e outra morfológica (CHABOO, 2007), e em ambas abordagens não foi recuperado como um clado monofilético. Não há consenso quanto a tribo irmã de Mesomphaliini e já foram recuperadas como proximamente relacionadas

Ischyrosonychini, Goniocheniini e Cassidini (HSIAO & WINDSOR, 1999; SHIN, 2015; LÓPEZ-

PÉREZ et al., 2017). Eugenysini sempre foi recuperado como proximamente relacionado a

Mesomphaliini, por vezes como parte do grupo (HSIAO & WINDSOR, 1999; CHABOO, 2007; 29

SHIN, 2015). Além disso, há poucas propostas filogenéticas para os gêneros de Mesomphaliini

(CHABOO, 2000, 2001; SHIN & CHABOO, 2012; SHIN, 2013).

Diante do exposto, propomos a mais abrangente hipótese filogenética da tribo

Mesomphaliini a fim de testar seu monofiletismo e buscar elucidar sua relação com as tribos próximas, bem como as relações intergenéricas. 30

1.2. OBJETIVOS

I. Elucidar a relação filogenética entre Mesomphaliini e Eugenysini

II. Testar o monofiletismo de Mesomphaliini

III. Esclarecer as relações entre os gêneros com espécies subsociais 31

1.3. MATERIAL E MÉTODOS

1.3.1. AMOSTRAGEM TAXONÔMICA

Foi amostrado o maior número possível de espécies das tribos Mesomphaliini e

Eugenysini, totalizando 65 e seis, respectivamente. A amostragem de Mesomphaliini cobriu

14 dos 25 gêneros e em Eugenysini foram amostrados dois dos três gêneros conhecidos. Com

relação aos gêneros com espécies subsociais, foram amostradas todas as três espécies de

Acromis, sete espécies cada de Paraselenis e Omaspides e quatro espécies de Eugenysa.

Também foram incluídas duas espécies de Agenysa, porém nestas não há informação sobre a

presença (ou ausência) de cuidado parental. Devido a falta de resolução na relação entre as

tribos de Cassidinae, selecionamos algumas tribos para grupo externo baseados em outros

estudos filogenéticos já realizados (BOROWIEC, 1995; HSIAO & WINDSOR, 1999; CHABOO,

2007; LÓPEZ-PÉREZ et al., 2017; SIMÕES et al., 2018; WINDSOR & MCKENNA pers. comm.).

Foram amostradas 19 espécies distribuídas nas tribos Cassidini Gyllenhal, 1813, Dorynotini

Monros & Viana, 1949, Goniocheniini Spaeth, 1942, Ischyrosonychini Chapuis, 1875 e

Omocerini Hincks, 1952. As espécies amostradas foram coletadas por nós (Michele Leocádio,

ML; Donald Windsor, DW; e Marianna Simões, MS). em diversas localidades do Novo

Mundo, especialmente nas Américas do Sul e Central (Tab. 1). O material encontra-se

depositado na Coleção Entomológica Prof. José Alfredo Pinheiro Dutra (DZRJ) na

Universidade Federal do Rio de Janeiro (ML), no laboratório do Dr. Donald Windsor, no

Smithsonian Tropical Research Institute, Panamá (DW) e na Divisão de Entomologia da

Universidade do Kansas, Lawrence, EUA (MS).

Tabela 1. Nomes, localidade e número dos vouchers das espécies utilizadas neste trabalho. Espécies-tipo de cada gênero, quando presentes, estão assinaladas com um asterisco. Número de Espécies Localidade 28S CAD 2 CAD 3 COI voucher CASSIDINI Charidotella circumnotata Rio Quijos, Reventador, EquadorDW5442 X X 32

(Boheman, 1862) Deloyala cruciata* (Linnaeus, Guiana Francesa DW7861 X X X X 1758) Gratiana conformis (Boheman, El Fuerte, Florida, Bolívia DW7607 X X X 1854) Microctenochira quadrata Guiana Francesa DW7863 X X X X (Degeer, 1775) DORYNOTINI Dorynota bidens* (Fabricius, Rio de Janeiro, Brasil MVPS16B X X 1781) Dorynota distincta (Baly, 1872) Panamá MVPS11B X X Dorynota truncata (Fabricius, Guiana Francesa DW7828 X X X 1781) Paranota minima (Wagener, Andrés Ibáñez, Santa Cruz, DW7606 X X X X 1881) Bolívia EUGENYSINI Agenysa boliviana Spaeth, 1915 Santa Cruz, Bolívia DW8339 X X Agenysa connectens (Baly, 1869) Cana, Darién, Panamá DW5679 X X Eugenysa columbiana (Boheman, Chiriqui, Panamá DW7704 X 1850) Eugenysa coscaroni Viana, 1968 Cana, Darién, Panamá DW7152 X X X X Eugenysa subopaca (Spaeth, Yasuni, Orellana, Equador DW8090 X X X 1919) Eugenysa unicolor (Borowiec & Yasuni, Orellana, Equador DW8087 X X X Dabrowska, 1997) ISCHYROSONYCHINI Orexita varians (Guérin, 1844) Buena Vista, Ichilo, Bolivia DW7766 X X Physonota attenuata Boheman, Veracruz, México MVPS53B X X 1854 Physonota gigantea Boheman, Guanacaste, Costa Rica MVPS52B X X 1854 GONIOCHENIINI Goniochenia buckleyi (Baly, Puyo, Pastaza, Equador DW0463 X X X X 1872) Goniochenia quadraticollis* Itatiaia, Rio de Janeiro, Brasil ML0023 X X X X (Boheman, 1850) Herissa pantherina* (Blanchard, Ñuflo de Chavez, Bolívia DW7662 X X 1837) Polychalma multicava* Cana, Darién, Panamá DW1119 X X X (Latreille, 1811) MESOMPHALIINI Acromis sparsa (Boheman, 1854) Colón, Panamá DW7813 X X X Acromis spinifex* (Linnaeus, Buena Vista, Ichilo, Bolivia DW7800 X X X 1763) Acromis venosa Erichson, 1847 Rio Hollin, Napo, Equador DW7817 X X X Botanochara impressa* (Panzer, Campo Grande, Mato Grosso do ML0027 X X 1798) Sul, Brasil Botanochara ordinata (Boheman, Cerro Campana, Panamá DW1094 X X X X 1850) Botanochara subnervosa Ñuflo de Chavez, Bolívia DW7760 X X X X (Boheman, 1850) Botanochara sp. Santa Cruz, Bolívia DW8027 X X X X Chelymorpha alternans Santa Fe, Darién, Panamá DW8294 X X X 33

Boheman, 1854 Chelymorpha constellata (Klug, Brazil DW7830 X X X X 1829) Chelymorpha gressoria Chiriqui Grande, Bocas del Toro, DW8223 X X X Boheman, 1862 Panamá Chelymorpha marginata Andrés Ibáñez, Santa Cruz, DW7632 X X (Linnaeus, 1758) Bolívia Chelymorpha praetextata Andrés Ibáñez, Santa Cruz, DW7633 X X X X Boheman, 1854 Bolívia Chelymorpha sericea Boheman, Changuinola, Bocas del Toro, DW8224 X X X X 1862 Panamá Jardin Botanico, Santa Cruz, Chelymorpha sp. DW7751 X X X Bolívia Cyrtonota cyanea (Linnaeus, Itatiaia, Rio de Janeiro, Brazil ML0020 X X X 1758) Cascada San Rafael, Orellana, Cyrtonota deliciosa (Baly, 1872) DW7160 X X X X Equador Cyrtonota marginata (Kirsch, Napo, Equador DW8093 X X X 1883) Cyrtonota serinus (Erichson, Equador DW1484 X X 1847) Cyrtonota tristigma (Boheman, México DW7789 X X X X 1850) Echoma anaglyptoides Borowiec, Cerro Galera, Panamá DW8337 X X X X 1998 Echoma bonfilsii (Boheman, Unión del Toachi, Equador DW6835 X X X 1854) Potrerillos del Guendá, Santa Echoma clypeata* (Panzer, 1798) DW7673 X X X Cruz, Bolívia Echoma quadristillata Chiriqui Grande, Bocas del Toro, DW0359 X X X (Boheman, 1862) Panamá Hilarocassis bordoni Borowiec, Panamá DW0900 X X 2002 Hilarocassis venusta (Boheman, Potrerillos del Guendá, Santa DW7940 X X 1854) Cruz, Bolívia Jardín Botânico, Santa Cruz, Hilarocassis sp DW8010 X X X Bolívia Mesomphalia gibbosa* Rio de Janeiro, Brasil X (Fabricius, 1781) Mesomphalia turrita (Illiger, Itatiaia, Rio de Janeiro, Brasil ML0024 X X X X 1801) Ogdoecosta biannularis Morelos, México DW0512 X X (Boheman, 1854) Ogdoecosta catenulata Colón, Panamá DW0680 X X (Boheman, 1854) Omaspides bistriata Boheman, El Copé, Coclé, Panamá DW0868 X X X 1862 Omaspides brunneosignata Passa Quatro, Minas Gerais, MVPS39B X X (Boheman, 1854) Brazil Omaspides confusa Borowiec, Napo, Ecuador DW7499 X X 2010 Omaspides sp. Cana, Darién, Panamá DW1033 X X Omaspides pallidipennis Teresópolis, Rio de Janeiro, DW4534 X X (Boheman, 1854) Brasil 34

Omaspides trichroa (Boheman, Ñuflo de Chavez, Bolívia DW7663 X X X 1854) Omaspides trifasciata (Fabricius, French Guiana DW7824 X X X 1787) Paraselenis brunnidorsis Potrerillos del Guendá, Santa DW7594 X X X (Spaeth, 1902) Cruz, Bolívia Paraselenis decipiens (Boheman, Passa Quatro, Minas Gerais, ML0035 X 1854) Brasil Paraselenis dichroa (Germar, Passa Quatro, Minas Gerais, MVPS36B X X 1824) Brasil Paraselenis flava (Linnaeus, Alta Vista, Ñuflo de Chavez, DW8008 X X X 1758) Bolívia Paraselenis normalis (Germar, Cachoeiras de Macacu, Rio de ML0005 X 1824) Janeiro, Brasil Paraselenis puncticollis (Spaeth, Santa Cruz, Bolívia DW8334 X X 1907) Paraselenis sp. Cana, Darién, Panama DW8343 X X X X Stoiba sp Cuba DW8220 X X Stolas brachiata (Fabricius, Jardin Botanico, Santa Cruz, DW8250 X X X X 1798) Bolívia Stolas brevicuspis (Spaeth, 1922) Itatiaia, Rio de Janeiro, Brasil ML0025 X X X X Stolas conspersa (Germar, 1824) Rio de Janeiro, Brasil MVPS44A X X X Stolas costaricensis (Boheman, La Fortuna, Panamá DW8168 X X X X 1862) Stolas discoides* (Linnaeus, Guiana Francesa DW7835 X X X X 1758) Stolas ephippium (Lichtenstein, Chiriquí Grande, Bocas del Toro, DW0492 X X X 1795) Panamá Stolas excelsa (Spaeth, 1917) Cana, Darién, Panama DW7212 X X X Teresópolis, Rio de Janeiro, Stolas implexa (Boheman, 1850) DW4564 X X X X Brasil Stolas indigacea (Boheman, Samaipata, Florida, Bolívia DW7649 X X X X 1850) Stolas inexculta (Boheman, 1862)Rio Quijos, Reventador, EquadorDW5238 X X X X Stolas lacordairei (Boheman, Bolivia DW8144 X X X X 1850) Stolas lebasii (Boheman, 1850) Las Minas, Herrera, Panamá DW7554 X X X X Stolas mannerheimi (Boheman, Ñuflo de Chavez, Bolívia DW7668 X X X X 1850) Stolas sexsignata (Boheman, Campinas, São Paulo, Brasil DW0758 X X X X 1850) Chiriquí Grande, Bocas del Toro, Stolas sp nr isthmica DW6516 X X X X Panamá Terpsis quadrivittata* Cerro Campana, Panamá DW0466 X X X (Champion, 1893) Xenicomorpha scapularis* Santa Cruz, Bolivia DW8345 X X (Boheman, 1854) Zatrephina lineata (Fabricius, Guiana Francesa DW7841 X X X 1787) Zatrephina sexlunata* (Klug, Ñuflo de Chavez, Bolívia DW7764 X X X X 1829) OMOCERINI Canistra irrorata (Guérin, 1844) Mato Grosso, Brasil MVPS65B X X 35

Cascada San Rafael, Orellana, Canistra osculatii Guérin, 1855 DW7164 X X Equador Omocerus gibberus (Boheman, Reventador, Napo, Equador DW0388 X X 1850) Polychalca salebrosa (Boheman, Jardin Botanico, Santa Cruz, DW7593 X X X 1850) Equador

1.3.2. OBTENÇÃO DOS DADOS MOLECULARES

A obtenção dos dados moleculares foi realizada em dois laboratórios: no Laboratório

de Biologia Evolutiva Teórica e Aplicada (LBETA) do Instituto de Biologia da Universidade

Federal do Rio de Janeiro e no Naos Marine Molecular Laboratories do Smithsonian Tropical

Research Institute (STRI). Em ambos os locais, os espécimes utilizados no estudo estavam

preservados em álcool 90% a -20º C.

Extração de DNA

O DNA genômico foi extraído a partir de kits de extração Qiagen DNeasy Blood and

Tissue (Valencia, California) utilizando protocolos fornecidos pelo fabricante. No LBETA

foram utilizadas uma ou duas metapernas com musculatura associada a coxa para maceração

com tempo de incubação de 24 h. No STRI foram utilizados espécimes inteiros em suspensão

com período de incubação de 48 h. Neste último caso, após os procedimentos de extração, os

espécimes retornaram às condições prévias de preservação em via líquida.

Amplificação dos marcadores

Devido à carência de estudos moleculares em Cassidinae, a escolha de marcadores

genéticos foi baseada em trabalhos de Coleoptera e Insecta (Tab. 2), bem como consulta a

outros pesquisadores desenvolvendo trabalhos com dados moleculares em Cassidinae. A partir

disso, foram selecionados três marcadores genéticos para amplificação. O gene mitocondrial

citocromo oxidase I (COI) foi escolhido devido à sua extensa utilização em trabalhos

filogenéticos de insetos. Utilizamos diversos primers para a amplificação de fragmentos deste

gene e após as devidas edições obtemos fragmentos de 471 pb. Com objetivo de amostrar 36

regiões independentes do genoma (não ligadas), além do marcador mitocondrial também

foram amplificados fragmentos de genes nucleares. O DNA nuclear é herdado

biparentalmente, enquanto que o DNA mitocondrial é herdado, geralmente, de forma

uniparental. Essa diferença na transmissão, associada a algumas mudanças importantes nos

padrões de evolução, faz com que as genealogias de DNA nuclear e organelas específicas

reflitam diferentes aspectos da sua história (SUNNUCKS, 2000). Optamos pela escolha de um

fragmento de 28S rDNA que cobre as regiões D1-D3 (997 pb) devido à ampla utilização em

estudos de Coleoptera (WILD & MADDISON, 2008) e pela indicação de sucesso em Cassidinae

em trabalho agora já publicado (SIMÕES et al., 2018). Além deste fragmento de 28S, também

foi utilizado um de menor comprimento (504 pb) que encontrava-se disponível no banco de

dados do Dr. Donald Windsor (STRI). Trata-se de um fragmento da região D2 que se

sobrepõe completamente ao anterior, permitindo o alinhamento entre ambos os fragmentos.

Por fim, também pelo uso com sucesso em Coleoptera e mais especificamente em

Chrysomelinae (DURY et al., in prep.), foram selecionados dois fragmentos de diferentes

regiões do carbamoil-fosfato sintetase (CAD), com tamanhos 558 pb e 616 pb. No caso dos

fragmentos de CAD, foi realizado um nested PCR, que consiste em amplificar fragmentos

maiores de CAD (~1.600 pb) e usar o produto deste PCR para amplificar os fragmentos alvo

(WILD & MADDISON, 2008).

Tabela 2. Primers utilizados para amplificar os marcadores utilizados neste estudo.

Gene Origem Primer Direção Sequência (5' - 3') Referência LCO-1490 Forward GGTCAACAAATCATA AAGATATTGG Folmer et al. 1994 C1-J-1718 Forward GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC Simon et al. 1994 COI Mitocondrial HCO-2198 Reverse TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA Folmer et al. 1994

C1-N-2191 Reverse CCCGGTAAAATTAAAATATAA ACTTC Simon et al. 1994 NLF184-21 Forward ACCCGCTGAAYTTAAGCATAT Van der Auwera et 28S D1-D3 Nuclear al. (1994) LS1041R Reverse TACGGACRTCCATCAGGGTTTCCCCTGACTTC Maddison (2012) D2UP4 Forward GAGTTAAGAGTACGTGAAACC Kjer et al. (2001) 37

28S D2 Nuclear D2DNB Reverse CCTTGGTCCGTGTTTCAACAC Kjer et al. (2001)

CD667F Forward GGATGGAAGGAAGTDGARTAYGARGT Wild & Maddison CAD 2 Nuclear (2008) CD851R Reverse GGATCGAAGCCATTHACATTYTCRTCHACCAT Wild & Maddison (2008) CD821F Forward AGCACGAAAATHGGNAGYTCNATGAARAG Wild & Maddison CAD 3 Nuclear (2008) CD1030R Reverse CWSRGCAYACCARTCRAACTCWACWGAGCT Dury G, Windsor DM (in prep)

A preparação para as reações em cadeia de polimerase (PCR) consistiu em uma reação

contendo 6.5 μL de MyTaqTM Red Mix (Bioline), 4.35 μL de água destilada, 0.4 μL de

dimetilsulfóxido (DMSO) a 5%, 0.25 μL de cada um dos primers e 1.0 μL de DNA,

totalizando uma reação de 12.5 μL. O protocolo do PCR na termocicladora foi diferenciado

para cada marcador e está detalhado na tabela 3.

Tabela 3. Condições dos protocolos da reação em cadeira de polimerase (PCR) utilizada para amplificar cada fragmento.

Início Gene Desnaturação Anelamento Extensão Extensão final Desnaturação 94ºC - 60s 94ºC - 30s 50ºC - 120s 72ºC - 90s 72ºC - 120s COI 1 x 35 x 1 x 94ºC - 120s 94ºC - 35s 55º C - 60s 72ºC - 120s 72ºC - 300s Amplicons do CAD 1 x 45 x 1 x 94ºC - 120s 95ºC - 30s 53ºC - 60s 95ºC - 30s 72ºC - 300s CAD 2 & 28S D2 1 x 45 x 1 x 94ºC - 120s 95ºC - 30s 52ºC - 60s 95ºC - 30s 72ºC - 300s CAD 3 1 x 45x 1 x 95ºC - 15s 49ºC - 30S 72º C - 15s 95ºC - 60s 10 x 72ºC - 600s 28S D1-D3 1x 95ºC - 15s 54º C - 15S 72º C - 15s 1x 25x

O resultado do PCR foi verificado através de eletroforese de gel de agarose 1% e

TM posteriormente visualizado em luz UV com auxílio de corante presente no MyTaq Red Mix.

A adequação de tamanho de fragmento foi verificada por meio de comparação com amostra

padrão de peso molecular (DNA ladder). 38

Purificação e sequenciamentos dos marcadores

No LBETA, as amostras amplificadas com sucesso foram enviadas para purificação e sequenciamento na Macrogen (Seul, Coréia do Sul). No STRI, por sua vez, como todo o conteúdo da reação de PCR era utilizado no procedimento de eletroforese, as amostras amplificadas com sucesso foram recortadas do gel de agarose. As bandas recortadas foram purificadas com Gelase (Epicentre Biotechonologies) para digestão da agarose. Os produtos de PCR purificados foram, então, tratados com o kit de sequenciamento de ciclos BigDye

Terminator 3.1 (Applied Biosystems). As reações de sequenciamento foram limpas via

BigDye Xterminator kit (Applied Biosystems) e posteriormente submetidas ao sequenciador

ABI 3130xl.

1.3.3. ANÁLISE DOS DADOS MOLECULARES

Edição e alinhamento das sequências

Os eletroferogramas das fitas complementares (forward e reverse) resultantes foram alinhados no Sequencher 5.1 (Gene Codes Corporation). As sequências foram editadas e conferidas por erros manualmente. A fita consenso gerada no Sequencher foi analisada no

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para conferir se houve contaminação, ou seja, se a sequência pertence ao gene e táxon alvos. Essa ferramenta compara a sequência inserida com a base de dados do GenBank e calcula a significância estatística entre as sequências mais semelhantes.

O alinhamento múltiplo de sequências de genes codificantes de proteína (COI e CAD) foi realizado pelo programa ClustalW (THOMPSOM et al., 1994) implementado no programa

MEGA7 (KUMAR et al., 2016) utilizando os parâmetros padrão (15 para abertura e 6,66 para extensão de gap). Os fragmentos de 28S rRNA foram alinhados na versão online do MAFFT

(KATOH et al., 2017), utilizando o algoritmo Q-INS-i, que considera a estrutura secundária do

DNA (KATOH & TOH, 2008). O alinhamento resultante foi traduzido para proteína a fim de 39 verificar a ausência de códons de parada nas sequências.

Particionamento dos dados e seleção de modelos evolutivos

Os fragmentos de 28S foram analisados como uma partição única, enquanto que os fragmentos de genes codificantes de proteína foram particionados manualmente. Neste caso separamos duas partições por fragmento: uma partição representada pelas posições 1 e 2 dos códons e outra partição com as posições 3 dos códons. Nos genes codificantes de proteínas, a taxa de substituição de sítios nas posições 3 podem ser largamente influenciadas pelas taxas de mutação, enquanto que as posições 1 e 2 dos códons geralmente estão sujeitas a níveis mais altos de seleção purificadora (HO & LANFEAR, 2010). Por isso, recomenda-se o particionamento para a busca dos melhores modelos de substituição (SHAPIRO et al., 2005).

Os dados de cada fragmento foram concatenados no programa SequenceMatrix (VAIDYA et al., 2011). Em seguida, os dados concatenados foram usados para estimar o melhor esquema de modelos evolutivos no programa PartitionFinder2 (LANFEAR et al., 2016). Para estas análises, utilizamos o parâmetro de comprimento de ramos “linked”, que permite diferentes taxas de evolução para cada subconjunto de dados, mas não altera o comprimento de ramos de um em relação ao outro. Para a busca dos melhores modelos foi utilizado o algoritmo

“greedy”, que permite uma busca ampla e rápida, sob o critério de informação de Akaike corrigido (AICc) (HURVICH & TSAI, 1993). Quanto ao conjunto de opções para a busca dos modelos, selecionamos a opção “mrbayes” para buscas referentes à inferência Bayesiana, tendo em vista que essa opção considera apenas os modelos disponíveis no programa

MrBayes. Para as buscas referentes à máxima verossimilhança selecionamos a opção “all”, já que o programa escolhido para este tipo de análise trabalha com busca de todos os modelos disponíveis no PartitionFinder. A Tabela 4 mostra os modelos selecionados para cada partição e análise. 40

Tabela 4. Modelos selecionados pelo PartitionFinder para cada partição. Partição Número de sítios Modelos selecionados Modelos selecionados para análise de BI para análise de MV 28S 999 SYM + I + G TVM+I+G COI posições 1+2 316 GTR + I + G GTR + I + G COI posições 3 158 HKY + I + G TRN+I+G CAD 2 posições 1+2 372 GTR + I + G GTR + I + G CAD 2 posições 3 186 GTR + I + G TVM+I+G CAD 3 posições 1+2 410 GTR + I + G GTR + I + G CAD 3 posições 3 205 GTR + I + G TVM+I+G

Reconstruções Filogenéticas

Empregamos dois tipos de análises probabilísticas para as reconstruções filogenéticas: inferência Bayesiana (IB) e máxima verossimilhança (MV). As análises de IB foram conduzidas pelo programa MrBayes 3.2.6 (RONQUIST et al., 2012) no servidor Cipres Science

Gateway (MILLER et al., 2010). Conduzimos duas corridas independentes com 40 milhões de gerações e oito cadeias (sete quentes e uma fria), com árvores sendo amostradas a cada mil gerações. Foi aplicado um burn-in de 25%. Ao fim da análise, foram calculadas as probabilidades posteriores (PP) e uma árvore consenso foi gerada. A convergência das corridas foi estimada a partir das médias de desvio padrão (average standard deviation split of frequencies). Além dos dados concatenados, os marcadores também foram analisados separadamente com os mesmos parâmetros, porém com menor número de gerações.

As análises de máxima verossimilhança foram conduzidas no programa IQ-TREE 1.6

(NGUYEN et al., 2015). O suporte dos ramos foi avaliado a partir de 1000 réplicas de ultrafast bootstrap (UFBoot) (HOANG et al., 2017) e 1000 réplicas do teste aproximado da razão de verossimilhança Shimodaira-Hasegawa (SH-aLRT) (ANISIMOVA et al., 2011). Conduzimos dez corridas independentes, como recomendado pelo manual do programa (MINH et al.,

2017), e a corrida com melhor valor de log da verossimilhança foi selecionada entre as dez. A 41 análise dos dados concatenados e dos marcadores separados foram feitas sob os mesmos parâmetros.

As árvores consenso geradas em ambas as análises foram visualizadas e enraizadas na tribo Dorynotini com auxílio do programa FigTree 1.4.2

(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). A tribo Dorynotini foi escolhida pois dentre as tribos amostradas como grupo externo, esta é a que provavelmente encontra-se filogeneticamente mais distante de Mesomphaliini (SHIN, 2015; LÓPEZ-PÉREZ et al., 2017;

SIMÕES et al., 2018). Como indicação de alto suporte de ramos para determinado nó, foram considerados PP ≥ 0.95, SH-aLRT ≥ 80 e UFBoot ≥ 95. 42

1.4. RESULTADOS

1.4.1. ANÁLISES FILOGENÉTICAS DOS DADOS CONCATENADOS

A matriz de dados concatenados foi composta de 90 táxons e 2641 pares de base alinhados. A tribo Mesomphaliini foi recuperada polifilética, pois ambos os gêneros de

Eugenysini amostrados na análise foram recuperados como parte de Mesomphaliini (Fig. 1).

Eugenysini também foi recuperado polifilético, com três linhagens independentes recuperadas. Mesomphaliini + Eugenysini foi recuperado monofilético com alto suporte (PP =

1, SH-aLRT = 99, UFBoot = 99) (ver tópico 1.5.1). A topologia recuperada nas análises de inferência Bayesiana e máxima verossimilhança foi muito similar, com apenas pequenas incongruências nos gêneros Omaspides e Chelymorpha Chevrolat, 1836 (Fig. 2). Como grupo irmão de Mesomphaliini foram recuperadas com baixo suporte as tribos Goniocheniini +

Ischyrosonychini (em parte) (PP = 0.56, SH-aLRT = 0, UFBoot = 49) e com alto suporte

Goniocheniini + Ischyrosonychini (PP = 0.95, SH-aLRT = 84, UFBoot = 94).

O primeiro clado subsocial a divergir é o composto por Acromis, Paraselenis e

Omaspides (clado 1). O clado 1 foi recuperado com alto suporte (PP = 0.99, SH-aLRT = 93,

UFBoot = 98). Dentro deste clado, Acromis divergiu primeiro, enquanto que Paraselenis e

Omaspides divergiram posteriormente e foram recuperados como grupos irmãos com alto suporte (PP = 0.99, SH-aLRT = 83, UFBoot = 94). Acromis (PP = 1, SH-aLRT = 100, UFBoot

= 100) e Omaspides (PP = 0.97, SH-aLRT = 98, UFBoot = 99) foram recuperados com alto suporte, enquanto que Paraselenis está fortemente suportado apenas nas avaliações de ramos da máxima verossimilhança (PP = 0.94, SH-aLRT = 99, UFBoot = 98). O gênero

Hilarocassis, que não apresenta cuidado parental, foi recuperado como grupo irmão do clado

1 (subsocial) com alto suporte (PP = 1, SH-aLRT = 97, UFBoot = 99). O grupo formado por

Hilarocassis, Acromis, Omaspides e Paraselenis foi recuperado como irmão do restante de

Mesomphaliini. Mais adiante na árvore, outro grupo subsocial, o gênero Eugenysa foi 43

recuperado com suporte máximo nas três avaliações de suporte de ramo.

Além dos gêneros subsociais supracitados, seis gêneros de Mesomphaliini que não apresentam cuidado parental também foram recuperados: Chelymorpha (PP = 1, SH-aLRT =

100, UFBoot = 100), Botanochara Dejean, 1836 (PP = 1, SH-aLRT = 100, UFBoot = 100),

Echoma Chevrolat, 1836 (PP = 1, SH-aLRT = 100, UFBoot = 100), Hilarocassis Spaeth, 1913

(PP = 1, SH-aLRT = 93, UFBoot = 99), Mesomphalia Hope, 1839 (PP = 1, SH-aLRT = 99,

UFBoot = 100), Zatrephina Spaeth, 1909 (PP = 0.6, SH-aLRT = 4, UFBoot = 65) (Fig. 3). 45

Apenas Agenysa Spaeth, 1905, Cyrtonota Chevrolat, 1836, Ogdoecosta Spaeth, 1909 e

Stolas Billberg, 1820 não foram recuperados.

1.4.2. ANÁLISES FILOGENÉTICAS POR MARCADORES

28S rRNA

A topologia geral fornecida pelos fragmentos de 28S foi bastante similar à concatenada (Figs. 4 e 5). Relações mais exclusivas, como as intra– e intergenéricas foram, em muitos clados, recuperadas em politomia ou com baixíssimo suporte. Mesomphaliini +

Eugenysini não foi recuperado como um grupo monofilético pois Zatrephina sexlunata (Klug,

1829) (Mesomphaliini) foi recuperada como espécie irmã de Omocerini, no grupo externo.

Excetuando-se Z. sexlunata, Mesomphaliini foi recuperado com baixo suporte (PP = 0.54,

UFBoot = 77), com exceção do SH-aLRT (= 81). Ischyrosonychini + Goniocheniini +

Omocerini + Z. sexlunata foram recuperados como grupo irmão de Mesomphaliini com baixo suporte (PP = 0.58, SH-aLRT = 67, UFBoot = 86).

O clado 1 não foi recuperado com a mesma topologia da análise concatenada, pois

Omaspides e Paraselenis não foram recuperados monofiléticos. Além disso, Hilarocassis foi recuperado como grupo irmão de Acromis, em vez de irmão do clado 1. Apenas Hilarocassis

(PP = 1.0, SH-aLRT = 91, UFBoot = 96) e Acromis (PP = 1.0, SH-aLRT = 93, UFBoot = 98) foram recuperados monofiléticos em ambas as análises (IB e MV). 47

Figura 4. Árvore consenso recuperada pela inferência Bayesiana com base nos dados dos fragmentos de 28S. 48

Figura 5. Árvore com melhor valor de log de verossimilhança recuperada pela análise de máxima verossimilhança com base nos dados dos fragmentos de 28S.

CAD 2 e CAD 3

Os fragmentos de CAD forneceram as árvores com topologias melhor resolvidas e bem suportadas, sendo as mais similares às árvores concatenadas (Figs. 6 e 7). Apenas alguns clados foram recuperadas em politomia ou com baixo suporte. No entanto, foram os marcadores com a menor amostragem disponível. Mesomphaliini + Eugenysini foi 49 recuperado como monofilético com suporte variável por CAD 2 (PP = 0.92, SH-aLRT = 83,

UFBoot = 91) e CAD 3 (PP = 0.93, SH-aLRT = 83, UFBoot = 95). CAD 2 recuperou

Goniocheniini como grupo irmão de Mesomphaliini com alto suporte (PP = 1.0, SH-aLRT =

98, UFBoot = 100) e CAD 3 recuperou Goniocheniini + Ischyrosonychini com alto suporte

(PP = 1.0, SH-aLRT = 98, UFBoot = 99), no entanto não foi possível amostrar fragmentos de

CAD 2 para Ischyrosonychini.

Foram recuperados monofiléticos por CAD 2: Paraselenis (PP = 1.0, SH-aLRT = 96,

UFBoot = 99), Chelymorpha (PP = 0.99, SH-aLRT = 83, UFBoot = 97), Zatrephina (PP =

0.91, SH-aLRT = 79, UFBoot = 93), Botanochara (PP = 1.0, SH-aLRT = 96, UFBoot = 100),

Eugenysa (PP = 1.0, SH-aLRT = 99, UFBoot = 100), Echoma (PP = 0.99, SH-aLRT = 99,

UFBoot = 100).

Foram recuperados monofiléticos por CAD 3: Acromis (PP = 1.0, SH-aLRT = 100,

UFBoot = 100), Omaspides (PP = 1.0, SH-aLRT = 94, UFBoot = 100), Paraselenis (PP = 1.0,

SH-aLRT = 99, UFBoot = 100), Chelymorpha (PP = 1.0, SH-aLRT = 94, UFBoot = 98),

Mesomphalia (PP = 1.0, SH-aLRT = 99, UFBoot = 100), Botanochara (PP = 1.0, SH-aLRT =

92, UFBoot = 99) e Eugenysa (PP = 1.0, SH-aLRT = 100, UFBoot = 100).

O clado 1, recuperado nas análises concatenadas, foi recuperado na análise de MV dos fragmentos de CAD 3 com baixo suporte (SH-aLRT = 57, UFBoot = 66). Na inferência

Bayesiana, o clado 1 foi recuperado em uma politomia junto com o restante de

Mesomphaliini. Já para os fragmentos de CAD 2, não foi possível amostrar os gêneros

Acromis e Omaspides. 50

Figura 6. Árvores consenso de inferência Bayesiana (acima) e de melhor valor de log verossimilhança da análise de máxima verossimilhança (abaixo) recuperadas pelos fragmentos de CAD2. 51

Figura 7. Árvores consenso de inferência Bayesiana (acima) e de melhor valor de log verossimilhança da análise de máxima verossimilhança (abaixo) recuperadas pelos fragmentos de CAD3. 52

COI

Dentre os marcadores utilizados neste trabalho, o COI forneceu a topologia menos resolvida (Figs. 8 e 9). No caso da inferência Bayesiana, a árvore foi recuperada em politomia quase que por inteiro, sendo impossível discutir qualquer relação entre as tribos. Apenas algumas relações intragenéricas foram recuperadas com alto suporte. Na inferência

Bayesiana, apenas as tribos Omocerini e Dorynotini foram recuperadas como monofiléticas, esta última com alto suporte. Foram recuperados monofiléticos os gêneros Acromis (PP = 1.0,

SH-aLRT = 99, UFBoot = 100), Omaspides (PP = 1.0, SH-aLRT = 96, UFBoot = 74),

Paraselenis (PP = 1.0, SH-aLRT = 97, UFBoot = 99), Zatrephina (PP = 1.0, SH-aLRT = 95,

UFBoot = 97), Chelymorpha (PP = 0.92, SH-aLRT = 92, UFBoot = 98), Botanochara (PP =

1.0, SH-aLRT = 99, UFBoot = 100) e Echoma (PP = 1.0, SH-aLRT = 99, UFBoot = 100). 53

Figura 8. Árvore consenso recuperada pela inferência Bayesiana com base nos dados dos fragmentos de COI. 54

Figura 9. Árvore com melhor valor de log de verossimilhança recuperada pela análise de máxima verossimilhança com base nos dados dos fragmentos de COI. 55

1.5. DISCUSSÃO

1.5.1. CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA

Nossas análises recuperaram Mesomphaliini parafilético e Eugenysini polifilético.

Esse resultado contradiz a classificação como duas tribos distintas, atualmente adotada

(BOUCHARD et al., 2011). O clado contendo Eugenysini e Mesomphaliini, por sua vez, foi recuperado como monofilético com alto suporte em ambas as abordagens de reconstrução filogenética com os dados concatenados.

As duas tribos possuem um histórico taxonômico entrelaçado, especialmente pela aparente fragilidade do caráter que é tradicionalmente utilizado para justificar Eugenysini como um grupo à parte. O caráter tarsômeros expandidos, apesar de ser encontrado em todas as espécies de Eugenysini, pode não ser sinapomórfico por se apresentar em mais de um estado. Segundo VIANA (1968), que elaborou uma extensa revisão taxonômica de Eugenysini,

Eugenysa possui os tarsômeros II-IV fortemente expandidos lateralmente, cobrindo totalmente as garras, enquanto que em Agenysa e Miocalaspis apenas o tarsômero IV é lateralmente expandido e encobre parcialmente as garras. BOROWIEC (1995) ao sinonimizar

Eugenysini e Mesomphaliini argumentou que algumas espécies do gênero Stolas

(Mesomphaliini) também possuíam tarsômeros expandidos, sem detalhar quais seriam essas espécies. Além disso, outra diferença em Eugenysini são as antenas, que são bastante robustas e telescopadas (junção entre os antenômeros muito aproximadas) em Eugenysa e Miocalaspis, enquanto que em Agenysa são mais delgadas e com a separação entre os antenômeros mais espaçadas, mais similar às antenas de Mesomphaliini (VIANA, 1968).

Apenas uma reconstrução filogenética de grupos mais inclusivos em Cassidinae amostrou mais que uma espécie de Eugenysini (CHABOO, 2007). Este trabalho, que visava testar o monofiletismo de Cassidinae, recuperou Eugenysini monofilético derivando de parte de Mesomphaliini com base em dois caracteres: (i) a expansão apical do tarsômero V e (ii) 56 duto ejaculatório muito longo e enrolado. Foram amostradas as espécies Agenysa caedemadens (Lichtenstein, 1795), Miocalaspis gentilis (Erichson, 1847), Eugenysa columbiana (Boheman, 1859) e E. coscaroni Viana, 1968. Estas duas últimas também amostradas em nosso trabalho.

Em Cassidinae, análises filogenéticas baseadas na morfologia dos adultos são duvidosas, já que a maioria dos táxons é suportada por uma combinação de caracteres que é, em parte, homoplástica (SEKERKA, 2016). Essa afirmação vem sendo corroborada em análises filogenéticas recentes de Cassidinae, que mostraram que caracteres morfológicos classicamente considerados sinapomórficos haviam, na verdade, evoluído independentemente algumas vezes (ex.: LÓPEZ-PÉREZ et al., 2017; SIMÕES et al., 2018). No caso de Eugenysini, é possível que os tarsômeros expandidos não representem apenas um estado de caráter

(tarsômeros expandidos x tarsômeros não expandidos) e, sim, um caráter multiestado com estados intermediários. A forma mais extrema, encontrada em Eugenysa, parece representar uma sinapomorfia para o gênero, porém o caráter visto de forma mais ampla, como sempre foi abordado na literatura, aparece por três vezes em nossa árvore (nas três linhagens independentes recuperadas de Eugenysini). Levando em consideração que nossos resultados são contraditórios à classificação taxonômica corrente e também que o caráter utilizado para distinguir ambas as tribos pode não representar uma sinapomorfia, nós propomos novamente a sinonimização da tribo Mesomphaliini a Eugenysini, corroborando BOROWIEC (1995).

1.5.2. POSICIONAMENTO DE MESOMPHALIINI

Nas últimas décadas, alguns trabalhos tentaram elucidar as relações filogenéticas entre as tribos de Cassidinae (Tab. 5). Ainda assim, há pouco consenso nessa questão. BOROWIEC

(1995) propôs a primeira hipótese filogenética para Cassidinae e utilizou 12 tribos como táxons terminais. Sua hipótese foi baseada em 19 caracteres, sendo 17 morfológicos e dois biológicos (hábito da larva e planta hospedeira). Eugenysini foi sinonimizado a 57

Mesomphaliini no mesmo trabalho, porém antes da hipótese filogenética ser testada. Sendo

assim, o táxon de Mesomphaliini que é mostrado em sua árvore também inclui Eugenysini.

Mesomphaliini foi recuperado como grupo irmão de Dorynotini + Cassidini +

Ischyrosonychini. Além disso, o autor também sinonimizou Goniocheniini e Omocerini, sob o

nome Omocerini. Tanto esta sinonímia quanto a de Eugenysini nunca foram adotadas, nem

pelo próprio autor (BOROWIEC, 1999). Omocerini aparece como grupo irmão do clado

contendo Mesomphaliini, Dorynotini, Cassidini e Ischyrosonychini (Borowiec, 1995).

Trabalho Dados Tribos amostradas Posição de Posição de Mesomphaliini Eugenysini Filogenia de - Morfologia Mesomphaliini Irmã de Dorynotini Cassidinae (adultos) (=Eugenysini), Cassidini, + Cassidini + (Borowiec, 1995) - Comportamento Dorynotini, Ischyrosonychini - Ischyrosonychini, Goniocheniini, Omocerini Filogenia de - Molecular (12S) Mesomphaliini, Parafilético, Recuperado Cassidinae Eugenysini, Dorynotini, proximamente dentro de (Hsiao & Cassidini, relacionado a Mesomphaliini Windsor, 1999) Ischyrosonychini, Ischyrosonychini, (uma espécie Goniocheniini, Omocerini Goniocheniini e amostrada) Cassidini (parte) Filogenia de - Morfologia Mesomphaliini, Não-monofilético, Divergindo de Cassidinae (adultos e Eugenysini, Dorynotini, Cassidinae s. str. Mesomphaliini (Chaboo, 2007) imaturos) Cassidini, recuperado em uma (parte) - Comportamento Ischyrosonychini, politomia Omocerini Filogenia de - Morfologia Mesomphaliini, Irmã de Omocerini Irmã de Cassidini Omocerini (adultos e Eugenysini, Cassidini, + (Fernandes, 2011) imaturos) Ischyrosonychini, Ischyrosonychini Omocerini, Goniocheniini + Goniocheniini + Mesomphaliini + Omocerini Filogenia de - Morfologia Mesomphaliini, Irmã de Recuperado Ischyrosonychini (adultos) Eugenysini, Dorynotini, Goniocheniini dentro de (Shin, 2015) Cassidini, Mesomphaliini Ischyrosonychini, (uma espécie Omocerini amostrada) 58

Cassidini - Morfologia Mesomphaliini, Irmã de phylogeny (adultos) Dorynotini, Cassidini, Ischyrosonychini + - (López-Pérez et Ischyrosonychini Cassidini al., 2017) Dorynotini - Morfologia Mesomphaliini, Irmã de phylogeny (adultos) Dorynotini, Cassidini, Ischyrosonychini - (Simões et al,. - Molecular Ischyrosonychini 2018) (COI, CAD, 28S) Presente trabalho - Molecular Mesomphaliini, Irmã de Recuperado (COI, CAD, 28S) Eugenysini, Dorynotini, Goniocheniini + dentro de Ischyrosonychini, Ischyrosonychini Mesomphaliini Goniocheniini, Omocerini (parte)

HSIAO & WINDSOR (1999) foram os primeiros a utilizar dados moleculares para testar

hipóteses filogenéticas em Cassidinae. Para isso, foram amostradas 48 espécies de 17 tribos.

Com base em uma reconstrução filogenética feita a partir de fragmentos de 12S mtDNA,

Mesomphaliini foi recuperado polifilético com três tribos incluídas dentro do clado: Cassidini

(uma espécie), Ishchyrosonychini (duas espécies) e Goniocheniini (uma espécie). Além disso,

a única espécie amostrada de Eugenysini também foi recuperada como parte de

Mesomphaliini. A espécie de Cassidini, Chersinellina heteropunctata (Boheman, 1954)

(gênero monotípico), deveria ser transferida para Mesomphaliini (Donald Windsor, com.

pess.). A espécie de Goniocheniini, Polychalma multicava (Latreille, 1811), também foi

amostrada por nós e recuperada junto às outras espécies de sua tribo, fora do clado de

Mesomphaliini. As espécies de Ischyrosonychini não são as mesmas amostradas por nós e

Ischyrosonychini foi recuperado fora de Mesomphaliini em nossa reconstrução.

CHABOO (2007) apresentou a hipótese filogenética para Cassidinae mais abrangente

até então, que amostrou 98 espécies de 30 das 35 tribos de Cassidinae. Com base em 210

caracteres (morfológicos de imaturos e adultos e biológicos), a maior parte de Cassidinae s.

str. foi recuperada em uma politomia, impossibilitando uma discussão mais aprofundada sobre

a relação entre as tribos. Mesomphaliini foi recuperado em quatro clados dentro dessa

politomia. Eugenysini foi recuperado como derivando do maior clado de Mesomphaliini. 59

Windsor & McKenna (com. pess.) estão preparando uma filogenia molecular de Cassidinae com a maior amostragem até então (~200 spp.). Nos resultados preliminares, Mesomphaliini foi recuperado parafilético, tendo como grupo irmão Ischyrosonychini, Goniocheniini e

Cassidini (parte).

Outros trabalhos que tiveram como foco a reconstrução filogenética de tribos também merecem atenção. FERNANDES (2011) testou o monofiletismo de Omocerini com uma filogenia morfológica baseada em 230 caracteres (imaturos e adultos). Neste trabalho foram amostradas três espécies de Mesomphaliini que foram recuperadas como grupo irmão de

Omocerini. Goniocheniini foi recuperado como irmão de Mesomphaliini + Omocerini.

Apenas uma espécie de Eugenysini foi amostrada e esta foi recuperada mais próxima a base da árvore, como grupo irmão de quase todas as tribos restantes. SHIN (2015) testou o monofiletismo de Ischyrosonychini com base em 155 caracteres morfológicos de adultos.

Foram amostradas três espécies de Mesomphaliini e uma de Eugenysini. As quatro foram recuperados num clado único irmão de Goniocheniini, que foi recuperado parafilético. LÓPEZ-

PÉREZ et al. (2017) realizaram uma análise filogenética para testar o monofiletismo de

Cassidini, baseada em 96 caracteres morfológicos (95 de adultos e um de imaturos). Foram amostradas duas espécies de Stolas para representar Mesomphaliini e elas foram recuperadas irmãs de um clado composto por Ischyrosonychini, Cassidini e Aspidimorphini.

Goniocheniini, Omocerini e Eugenysini não foram amostrados. Finalmente, SIMÕES et al.

(2018) prepararam uma reconstrução filogenética baseada em dados moleculares e morfológicos da tribo Dorynotini. Foram amostradas quatro espécies de Mesomphaliini que foram recuperadas como grupo irmão de Ischyrosonychini. Goniocheniini, Eugenysini e

Omocerini não foram amostrados.

Em nosso trabalho, recuperamos Goniocheniini + Ischyrosonychini (parte) como grupo irmão de Mesomphaliini com baixo suporte, porém Goniocheniini + Ischyrosonychini 60

+ Mesomphaliini foi recuperado com alto suporte. Vale ressaltar que SHIN (2015) desmembrou Ischyrosonychini em mais uma tribo, Asterizini. Como o trabalho não foi publicado até então, optamos por adotar a classificação vigente. Amostramos três espécies de

Ischyrosonychini: Physonota attenuata Boheman, 1854, P. gigantea Boheman, 1854 e

Orexita varians (Guérin, 1844). As duas espécies de Physonota Boheman, 1854 foram recuperadas mais distantes de Mesomphaliini e de acordo com a classificação proposta por

SHIN (2015), este gênero pertenceria a Asterizini. Orexita, por sua vez, que foi recuperada como irmã de Goniocheniini foi recentemente transferida de Cassidini para Ischyrosonychini

(SEKERKA, 2016). SWIETOJANSKA et al. (2018) baseados na morfologia de imaturos também distinguiram os mesmos dois grupos propostos por SHIN (2015). De acordo com o conjunto de caracteres diagnósticos propostos por SHIN (2015), Orexita também pertenceria a Asterizini.

De acordo com nosso resultado e de outros trabalhos, há uma relação bem suportada entre Mesomphaliini, Goniocheniini e Ischyrosonychini mas não há consenso sobre qual das duas tribos seria mais proximamente relacionada a Mesomphaliini. No entanto, a maioria dos trabalhos citados não amostrou as três tribos concomitantemente, dificultando uma comparação adequada entre os estudos. A tribo Goniocheniini é especialmente negligenciada, tendo sido amostrada, além do nosso trabalho, em apenas três oportunidades (HSIAO &

WINDSOR, 1999; FERNANDES, 2011; SHIN, 2015), e em todos os casos recuperadas proximamente relacionadas a Mesomphaliini. Nosso trabalho deu um passo importante na elucidação das relações intertribais em Cassidinae, mesmo tendo como foco a investigação do monofiletismo de uma tribo. Amostramos a maior parte das tribos de Cassidinae s. str. do

Novo Mundo, inclusive tribos que são comumente negligenciadas (Goniocheniini, Omocerini e Eugenysini). Além disso, utilizamos dados moleculares, que ainda são pouco empregados no grupo, porém tem se mostrado uma ferramenta eficiente para reconstruir a história filogenética de Cassidinae. Ainda assim, são necessários estudos adicionais empregando uma 61 maior amostragem de espécies de cada uma das tribos a fim de se chegar em um consenso quanto a essa questão.

1.5.3. MONOFILETISMO DE MESOMPHALIINI

Este trabalho é o primeiro focado em testar o monofiletismo de Mesomphaliini.

Reconstruções filogenéticas anteriores incluíram poucas espécies de Mesomphaliini e objetivaram testar o monofiletismo de Cassidinae ou relações às outras tribos (Tab. 5). Nós recuperamos Mesomphaliini polifilético, pois Eugenysini foi recuperado como parte da tribo, corroborando BOROWIEC (1995). A partir disso, restabelecemos a sinonímia das duas tribos.

A primeira proposta filogenética para Cassidinae utilizou tribos como táxons terminais, impossibilitando assim testar o monofiletismo dessas tribos (BOROWIEC, 1995).

Posteriormente, foram utilizados dados moleculares de 12S mtDNA para reconstruir filogeneticamente Cassidinae (HSIAO & WINDSOR, 1999). Neste trabalho, Mesomphaliini foi recuperado polifilético, com espécies de Ischyrosonychini, Goniocheniini e Cassidini recuperadas dentro do clado de Mesomphaliini. CHABOO (2007), baseada em dados morfológicos, recuperou Cassidinae s. str. em uma politomia e quatro clados com espécies de

Mesomphaliini dentro dessa politomia. Outros trabalhos com foco em outras tribos amostraram de uma a quatro espécies de Mesomphaliini e em todos os casos foi recuperado monofilético. Nosso trabalho representa a maior amostragem de espécies de Mesomphaliini e

Eugenysini, além de ser um dos primeiros a utilizar dados moleculares em Cassidinae. Ambas as tribos não foram recuperadas como clados monofiléticos, no entanto foram recuperadas como um clado único com alto suporte em ambas as análises com dados concatenados.

1.5.4. RELAÇÕES INTERNAS EM MESOMPHALIINI

Testar o monofiletismo dos gêneros de Mesomphaliini não era um dos objetivos iniciais deste trabalho, dada a grande diversidade da tribo. Ainda assim, apresentamos em nossa reconstrução filogenética a maior amostragem de Mesomphaliini até então. São 65 62 espécies amostradas, cobrindo 14 dos 25 gêneros. Os gêneros não amostrados são, em boa parte, pouco diversos ou monotípicos. Sendo assim, apesar de não ser possível tomar decisões taxonômicas acerca dos gêneros e espécies, tendo em vista a ausência de algumas espécies-tipo e baixa amostragem em relação à totalidade de espécies, serão fornecidos comentários acerca deste assunto. O monofiletismo da maioria dos gêneros de Mesomphaliini nunca foi testado e mesmo considerando inadequada a amostragem de nosso trabalho para discussões intragenéricas, é a maior amostragem disponível até então para todos os gêneros de

Mesomphaliini.

Em nossa reconstrução filogenética, foram recuperados os seguintes gêneros:

Hilarocassis, Acromis, Omaspides, Paraselenis, Chelymorpha, Zatrephina, Botanochara,

Eugenysa e Echoma. Todos os gêneros foram recuperados com alto suporte, com exceção de

Paraselenis (baixo suporte da probabilidade posterior) e Zatrephina (baixo suporte nos três testes).

Há hipóteses filogenéticas apenas para gêneros pouco diversos: Acromis (CHABOO,

2001), Convexocoleus Shin, 2013 (SHIN, 2013), Elytrogona Chevrolat, 1836 (CHABOO, 2000) e Stoiba Spaeth, 1909 (SHIN & CHABOO, 2012). Todos os estudos foram baseados em dados morfológicos e recuperaram os respectivos gêneros como monofiléticos. Nós amostramos apenas uma espécie de Stoiba, que foi recuperada num clado com Ogdoecosta e Terpsis quadrivittata (Champion, 1893) (monotípico). Esses dois gêneros, no entanto, não foram amostrados no trabalho de SHIN & CHABOO (2012). Na reconstrução feita por eles, Stoiba foi recuperada como grupo irmão de um clado contendo Chelymorpha, Phytodectoidea, Stolas

(uma espécie de cada, não identificadas) e Elytrogona (quatro espécies) (Fig. 10). Em análises não publicadas feitas por nós, Phytodectoidea e Elytrogona foram recuperadas no clado de

Stoiba. O clado contendo esses três gêneros, mais Odgoecosta e Terpsis é composto por espécies que ocorrem do extremo norte da América do Sul até o México, além de incluir os 63 gêneros de Mesomphaliini que não possuem capacidade de voo (Elytrogona e Stoiba).

Nossos resultados recuperaram a mesma topologia que a de CHABOO (2001) para

Acromis, com A. sparsa (Boheman, 1854) divergindo primeiro e A. venosa Erichson, 1847 irmã de A. spinifex (Linnaeus, 1763). CHABOO (2001) recuperou Echoma quadristillata

(Boheman, 1862) como irmã de Acromis e duas espécies de Omaspides como irmãs desse clado (Fig. 11). O clado contendo Echoma e Acromis foi suportado por dois caracteres: ângulo humeral do élitro projetado anteriormente em machos e ângulo humeral do élitro projetado anteriormente em fêmeas. De fato, as espécies de Omaspides não possuem o ângulo humeral tão projetado como em Echoma e Acromis, mas a autora apenas estabeleceu os estados como projetados ou não projetados. Posteriormente, CHABOO (2007) recuperou Echoma como grupo irmão do clado contendo Paraselenis, Acromis e Eugenysini, na sua reconstrução 64 filogenética de Cassidinae. Esse clado foi suportado por dois caracteres: élitro com ângulo

ântero-lateral (previamente nomeado como humeral) projetado anteriormente e largura da margem expandida do élitro igual ou maior que a do disco.

Em nossa reconstrução, um dos

CHABOO (2001, 2007) não condizem com a reconstrução baseada em dados moleculares. Na nossa reconstrução do estado ancestral de caráter (Capítulo 2) podemos observar que o élitro de Echoma, de fato, se assemelha bastante ao das espécies subsociais. No entanto, de acordo com nossa reconstrução filogenética, a largura do élitro não configuraria uma sinapomorfia que une Echoma, Acromis e Paraselenis, tendo esta evoluído possivelmente mais de uma vez em Mesomphaliini. São necessários estudos morfológicos mais aprofundados, para testar se há alguma diferença na forma do élitro que suporte cada um desses grupos ou se de fato este é um caráter homoplástico. Por fim, um caráter, que diferentemente do élitro, se mantém estável em Mesomphaliini é a escolha da planta hospedeira (Capítulo 2). Enquanto que Acromis e

Paraselenis estão no grupo mais basal, que se alimenta de Convolvulaceae, Echoma encontra- se no grupo que se alimenta de Asteraceae, comportamento que surgiu posteriormente na evolução da tribo.

Quatro gêneros não foram recuperados como monofiléticos: Ogdoecosta, Cyrtonota,

Stolas e Agenysa. Ogdoecosta é um pequeno gênero (12 spp.) que foi revisado recentemente 65

(LÓPEZ-PÉREZ et al., 2016), mas não há propostas filogenéticas sobre ele. Amostramos apenas duas espécies, que não foram recuperadas juntas. Porém, dentro de um clado com uma politomia e baixo suporte de ramos.

Stolas, por sua vez, é o maior gênero de Mesomphaliini, contendo atualmente quase

200 espécies (BOROWIEC & SWIETOJANSKA, 2019). O gênero nunca foi revisado, porém existe um manuscrito não publicado com uma chave para todas as espécies e uma divisão do gênero em grupos de espécies (BOROWIEC & POMORSKA, 2009). Tal manuscrito foi feito por

Franz Spaeth, um dos maiores especialistas em Cassidinae, e estaria preservado no Museu de

História Natural de Manchester (Inglaterra). Neste manuscrito, Spaeth dividiu Stolas em dez grupos (A a J) de espécies baseadas em sua morfologia. Destes dez grupos, amostramos espécies de sete deles. Em nossa reconstrução, apesar de Stolas ter aparecido em diversos pontos da árvore, houve uma clara divisão entre as espécies que se alimentam de

Convolvulaceae e as que se alimentam de Asteraceae. Neste primeiro grupo (Convolvulaceae) foram recuperadas S. extricata, S. discoides, S. ephippium (grupo I), S. brachiata e S. sp nr. isthmica (grupo J) – este último formando um grupo monofilético. Dentre as espécies que se alimentam de Asteraceae, S. inexculta foi a primeira a divergir (grupo B), posteriormente S. mannerheimi (grupo C) foi recuperada como irmã de Agenysa connectens. S. sexsignata

(grupo A) foi recuperada com irmã de Echoma. Por último, S. lacordairei (grupo J) foi recuperada como irmã de S. excelsa (grupo E), S. brevicuspis, S. conspersa, S. implexa e S. indigacea (grupo A). BOROWIEC & POMORSKA (2009) examinaram a espermateca de 72 espécies de Stolas e tentaram associar sua morfologia aos grupos propostos por Spaeth. A partir disso, propuseram que os grupos A e B, G e H deveriam ser fundidos. Além disso, os grupos D, F, I e J seriam polifiléticos, enquanto que os grupos restantes seriam monofiléticos.

O grupo E não foi mencionado. Apesar de terem usado uma nomenclatura derivada de análises filogenéticas, os autores não realizaram tais procedimentos. Em nossas análises, 66 espécies do grupo I foram proximamente recuperadas, apesar de parafiléticas. Das três espécies do grupo J amostradas por nós, duas foram recuperadas monofiléticas (S. brachiata e

S. sp. nr. isthmica) e uma como irmã de espécies do grupo A e E. Espécies do grupo H foram recuperadas monofiléticas. Quatro das cinco espécies do grupo A foram recuperadas monofiléticas. Apesar do polifiletismo de Stolas já ter sido sugerido anteriormente, é a primeira vez que isso é recuperado em uma análise filogenética. CHABOO (2007) amostrou três espécies de Stolas que foram recuperadas em uma politomia junto a Botanochara impressa. Os grupos de espécies propostos por Spaeth são parcialmente condizentes com nossos resultados, podendo vir a representar novos gêneros no futuro, visto a clara necessidade de desmembrar Stolas em grupos menores devido ao seu polifiletismo. Um fator interessante no caso do gênero é a relação da posição filogenética com as plantas hospedeiras, que pode até ser utilizado em caráter preditivo. Espécies que se alimentam de uma família ou outra podem ser esperadas ser encontradas em uma certa posição na árvore, enquanto que espécies sem informação sobre a planta hospedeira podem ter essa lacuna especulada de acordo com sua posição na árvore. Por exemplo, S. lacordairei, apesar de ter sido colocado no grupo J por Spaeth a partir de informações ligadas à sua morfologia, foi recuperada juntamente às espécies que se alimentam da mesma planta hospedeira (Asteraceae). Sendo assim, podemos considerar esse caráter biológico tão ou mais relevante que a morfologia.

Cyrtonota é o terceiro gênero mais diverso em Mesomphaliini, possuindo atualmente

59 espécies. Já foi considerado um subgênero de Stolas (HINCKS, 1952; SEENO & WILCOX,

1982), pois difere deste apenas pelo número de antenômeros basais com poucas cerdas

(quatro em Stolas e cinco em Cyrtonota). Não há propostas filogenéticas para o gênero, apenas chaves para o grupo lateralis (BOROWIEC & SASSI, 1999) e para as espécies sem élitro metálico (BOROWIEC, 2009). De forma similar à Stolas, Cyrtonota foi recuperado em dois grupos distintos de acordo com sua planta hospedeira, porém no caso de Cyrtonota cada um 67 dos grupos foi recuperado monofilético. No grupo de espécies que se alimentam de

Convolvulaceae (C. tristigma, C. cyanea e C. serinus) há apenas espécies com élitro metálico, enquanto que nas espécies que se alimentam de Asteraceae, uma possui élitro metálico (C. deliciosa) e a outra não (C. marginata). Sendo assim, a coloração do élitro não parece ser um caráter com utilidade taxonômica. Além disso, assim como Stolas, Cyrtonota necessita de revisão urgente e possivelmente terá de ser desmembrada em ao menos mais um gênero.

O gênero Agenysa possui atualmente nove espécies (SEKERKA, 2016) e foi revisado por VIANA (1968), que além disso propôs uma chave para o gênero utilizando primariamente coloração para distinguir os táxons. No entanto, quase todas as espécies de Agenysa exibem uma grande variedade de coloração, por isso uma nova chave, baseada em outros caracteres, foi proposta (SEKERKA, 2016). Em nosso trabalho amostramos duas espécies de Agenysa, que foram recuperadas separadamente em posições distintas na árvore. Como já discutido (ver tópico 1.5.1), Agenysa possui antenas diferentes das de Eugenysa, mais similares às de outros gêneros de Mesomphaliini, como Stolas. Agenysa boliviana foi recuperada irmã de Stolas ephippium, enquanto que A. connectens foi recuperada irmã de S. mannerheimi. A. connectens possui morfologia bastante similar ao grupo C, proposto por Spaeth, no qual S. mannerheimi está incluída. São espécies de tamanho grande, corpo sub-triangular, élitro metálico com reticulações e antenômeros basais parcialmente amarelos. No entanto, A. boliviana não se assemelha morfologicamente a S. ephippium e aos caracteres do grupo I proposto por Spaeth. Levando em consideração nossos resultados e a falta de um real caráter diagnóstico para o gênero é bastante provável que após uma revisão mais cuidadosa de

Agenysa, as espécies sejam sinonimizadas a um ou mais gêneros de Mesomphaliini.

Todos as análises filogenéticas citadas neste tópico utilizaram caracteres morfológicos em suas reconstruções. Nosso estudo é o primeiro a empregar dados moleculares para investigar relações filogenéticas em Mesomphaliini. É possível identificar algumas 68 semelhanças entre estudos baseados em morfologia e o nosso (molecular), embora o primeiro método forneça árvores claramente menos resolvidas. SEKERKA (2016) argumenta que análises filogenéticas baseadas na morfologia dos adultos de Cassidinae são meramente especulativas, portanto é necessário combiná-las com morfologia de imaturos e dados moleculares. Nosso trabalho suporta essa visão ao não recuperar gêneros diagnosticados por caracteres ou conjuntos de caracteres morfológicos.

1.5.5. SINAL FILOGENÉTICO DOS MARCADORES MOLECULARES

Dentre os quatro fragmentos analisados, os dois fragmentos de CAD foram os que forneceram melhores resultados para a nossa amostragem, resolvendo tanto relações mais inclusivas, quanto mais exclusivas. Os fragmentos de CAD se mostraram mais variáveis que os de 28S e menos variáveis que os de COI. Em uma avaliação de utilidade de genes codificantes de proteína em Coleoptera, CAD obteve o melhor desempenho (WILD &

MADDISON, 2008). Nesta mesma avaliação, CAD desempenhou melhor papel para relações mais recentes em vez de mais antigas.

Fragmentos de RNA ribossomal, como o 28S rRNA, evoluem mais lentamente que os codificantes de proteína, como CAD, e são particularmente importantes em análises filogenéticas de espécies distantemente relacionadas (MORITZ et al., 1987). Sendo assim, os fragmentos de 28S produziram resultados dentro do esperado, com clados mais inclusivos resolvidos e falta de resolução ou baixo suporte nas relações intergenéricas e intragenéricas.

O DNA mitocondrial é conhecido por evoluir mais rapidamente que o genoma nuclear

(HWANG & KIM, 1999). De fato, em nosso trabalho os fragmentos mitocondriais de COI tiveram as maiores distâncias genéticas, comparadas aos três fragmentos nucleares. Os fragmentos de COI vem sendo aplicados a uma grande variedade de problemas filogenéticos em insetos, de espécies proximamente relacionadas e populações até mesmo entre ordens

(PATWARDHAN et al., 2014). No entanto, o COI se mostrou o menos eficiente dentre os 69 marcadores utilizados por nós, tendo apenas auxiliado na resolução de alguns grupos com espécies proximamente relacionadas, mas com pouca ou nenhuma resolução entre os gêneros e tribos. Tem se observado que quando genes mitocondriais são usados em combinação a genes nucleares, estes últimos fornecem maior poder de resolução (especialmente em nível taxonômico mais profundo), níveis mais baixos de homoplasia e maior suporte (BAKER et al.,

2001; BRADY, 2002; LIN et al., 2004). Com poucos sítios (posição 3 do códon) evoluindo a altas taxas, estes tenderão a saturar mais rapidamente, levando a níveis mais altos de homoplasia em conjuntos de dados mitocondriais (LIN & DANFORTH, 2004)

Como o uso de dados moleculares ainda é precoce em Cassidinae, é importante que sejam avaliadas as utilidades de cada marcador para o grupo a fim de embasar estudos futuros. No estudo pioneiro utilizando dados moleculares em Cassidinae, foi utilizado apenas um marcador mitocondrial (12S) que gerou uma árvore para a subfamília com suportes baixíssimos (HSIAO & WINDSOR, 1999). Apenas quase vinte anos depois outra filogenia molecular, dessa vez para a tribo Dorynotini, é feita para o grupo (SIMÕES et al., 2018). A escolha de marcadores foi bastante similar à nossa: COI (fragmento maior mas de região correspondente), CAD (um fragmento de outra região) e 28S (mesmo fragmento) e foi recuperada uma árvore com ótima resolução e suporte. Isso provavelmente deve-se a uma amostragem menor e com menos lacunas que a nossa: foram amostradas 31 espécies de quatro tribos.

Para estudos filogenéticos de relações mais antigas (tribos e subfamília) os fragmentos de marcadores nucleares se mostraram mais eficientes, especialmente os fragmentos de CAD.

Os fragmentos de COI parecem ser mais interessantes em estudos com espécies proximamente relacionadas ou populacionais (delimitação de espécies). Em estudo da delimitação de espécies do gênero Delocrania (Cassidinae: Delocraniini), fragmentos de COI forneceram alta resolução e suporte (Leocádio & Windsor, em prep.). Sendo assim, 70 recomendamos o uso de fragmentos adicionais em Cassidinae a fim de avaliar a sua utilidade 71

1.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Cassidinae é um dos grupos mais bem estudados em Chrysomelidae e apesar de seu monofiletismo ser bem corroborado, as suas relações internas não possuem consenso ou são desconhecidas. Nesse sentido, damos um passo importante para uma melhor compreensão nas relações evolutivas do grupo ao apresentar a primeira hipótese filogenética para a tribo

Mesomphaliini. Nessa hipótese recuperamos Mesomphaliini como um grupo parafilético, pois a tribo Eugenysini também foi recuperada como parte do clado. No entanto, como clado único foram recuperados com alto suporte. A partir disso, propusemos a sinonímia das tribos sob o nome Mesomphaliini. Apesar desse resultado não ser uma surpresa, levando em consideração o histórico taxonômico dos dois grupos, essa sinonímia nunca havia sido proposta com base em uma hipótese filogenética. Além da tribo, vários de seus gêneros foram recuperados como grupos naturais com alto suporte. Contudo, alguns gêneros dentre os mais diversos da tribo não foram recuperados e necessitam de revisão urgente. Outra frente inovadora de nosso trabalho foi a utilização de dados moleculares, que até o momento é raríssimo para o grupo.

Tal ferramenta possui um futuro promissor no grupo como alternativa ou concatenada aos dados morfológicos, que não costumam fornecer muita resolução à hipóteses filogenéticas mais abrangentes em Cassidinae. 72

1.7. REFERÊNCIAS

Anisimova, M., Gil, M., Dufayard, J. F., Dessimoz, C. & Gascuel, O. (2011). Survey of branch support methods demonstrates accuracy, power, and robustness of fast likelihood- based approximation schemes. Systematic Biology 60(5): 685-699.

Baker, R. H., Wilkinson, G. S. & DeSalle, R. (2001). Phylogenetic utility of different types of molecular data used to infer evolutionary relationships among stalk-eyed flies (Diopsidae). Systematic Biology 50(1): 87-105.

Borowiec, L. (1999). A world catalogue of the Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae). Biologica Silesiae, Wroclaw, 476pp.

Borowiec, L. (2009). A new species of Cyrtonota CHEVROLAT from Colombia (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Mesomphaliini). Genus 20(1): 111-116.

Borowiec, L. & Pomorska, J. (2009). The structure of the spermathecae of the genus Stolas (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Mesomphaliini) and its taxonomic significance. Annales Zoologici 59(2): 201-222.

Borowiec, L. & Sassi, D. (1999). Four new species of Cyrtonota Chevrolat (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). Genus 10: 89-101.

Borowiec, L. & Świętojańska, J. (2019). World catalog of Cassidinae. Wrocław, Poland. http://www.cassidae.uni.wroc.pl/katalog%20internetowy/index.htm (Acessado em 15 de junho de 2019).

Brady, S. G. (2002). Phylogenetics of army ants (Hymenoptera: Formicidae) based on morphological and molecular data. Tese de Doutorado, University of California, Davis, EUA.

Chaboo, C. S. (2000). Revision and phylogeny of the Caribbean genus Elytrogona Chevrolat (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Stolaini). The Coleopterists' Bulletin 54: 379- 394.

Chaboo, C. S. (2001). Revision and Phylogenetic Analysis of Acromis Chevrolat (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Stolaini). The Coleopterists' Bulletin 55: 75-102.

Fernandes, F. R. (2011). Filogenia da tribo Omocerini Hincks, 1952 (Coleoptera, Chrysomelidae, Cassidinae). Tese de Doutorado, Universidade de São Paulo, Brasil.

Folmer, O., Hoeh, W. R., Black, M. B. & Vrijenhoek, R. C. (1994). Conserved primers for PCR amplification of mitochondrial DNA from different invertebrate phyla. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294-299.

Hincks, W. D. (1952). The genera of the Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae). Transactions of the Royal Entomological Society of London 103(10): 327-358.

Ho, S. Y. & Lanfear, R. (2010). Improved characterisation of among-lineage rate variation in cetacean mitogenomes using codon-partitioned relaxed clocks. Mitochondrial DNA 21(3-4): 138-146.

Hoang, D. T., Chernomor, O., Von Haeseler, A., Minh, B. Q. & Vinh, L. S. (2017). UFBoot2: improving the ultrafast bootstrap approximation. Molecular biology and evolution 35(2): 518-522.

Hsiao, T. H. & Windsor, D. M. (1999). Historical and biological relationships among Hispinae inferred from 12S mtDNA sequence data. In: Cox ML, ed. Advances in Chrysomelidae 74

Biology 1. Leiden, The Netherlands: Backhuys, 39–50.

Hurvich, C. M. & Tsai, C. L. (1993). A corrected Akaike information criterion for vector autoregressive model selection. Journal of time series analysis 4(3): 271-279.

Hwang, U. W. & Kim, W. (1999). General properties and phylogenetic utilities of nuclear ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics. The Korean journal of parasitology 37(4): 215.

Katoh, K., Rozewicki, J. & Yamada, K. D. (2017). MAFFT online service: multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization. Briefings in bioinformatics: bbx180.

Katoh, K. & Toh, H. (2008). Recent developments in the MAFFT multiple sequence alignment program. Briefings in bioinformatics 9(4): 286-298.

Kjer, K. M., Blahnik, R. J. & Holzenthal, R. W. (2001). Phylogeny of Trichoptera (caddisflies): characterization of signal and noise within multiple datasets. Systematic Biology 50(6): 781-816.

Kumar, S., Stecher, G. & Tamura, K. (2016). MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution 33(7): 1870- 1874.

Lanfear, R., Frandsen, P. B., Wright, A. M., Senfeld, T. & Calcott, B. (2016). PartitionFinder 2: New Methods for Selecting Partitioned Models of Evolution for Molecular and Morphological Phylogenetic Analyses. Molecular Biology and Evolution: msw260.

Lin, C. P. & Danforth, B. N. (2004). How do insect nuclear and mitochondrial gene substitution patterns differ? Insights from Bayesian analyses of combined datasets. Molecular phylogenetics and evolution 30(3): 686-702.

Lin, C. P., Danforth, B. N. & Wood TK. (2004). Molecular phylogenetics and evolution of maternal care in membracine treehoppers. Systematic Biology 53: 400-421.

López-Pérez, S., Zaragoza-Caballero, S. & Chaboo, C. S. (2016). Revision of Ogdoecosta Spaeth 1909 with description of Ogdoecosta paraflavomaculata López-Pérez, sp. nov. (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Mesomphaliini). Zootaxa 4179(3): 410-440. 75

López-Pérez, S., Zaragoza-Caballero, S., Ochoterena, H. & Morrone, J. J. (2017). A phylogenetic study of the worldwide tribe Cassidini Gyllenhal, 1813 (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae) based on morphological data. Systematic Entomology 1813: 1–15.

Maddison, W. P. (2012). Five new species of lapsiine jumping spiders from Ecuador (Araneae: Salticidae). Zootaxa 3424: 51-65.

Miller, M. A., Pfeiffer, W. & Schwartz, T. (2010). Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees. 2010 Gateway Computing Environments Workshop, GCE 2010.

Minh, B. Q., Trifinopolous, J., Schrempf, D. & Schmidt, H. A. (2017). IQ-TREE version 1.6.0: Tutorials and Manual Phylogenomic software by maximum likelihood. www.iqtree.org/doc/iqtree-doc.pdf

Moritz, C. T. E. D., Dowling, T. E. & Brown, W. M. (1987). Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics. Annual Review of Ecology and systematics 18(1): 269-292.

Nguyen, L. T., Schmidt, H. A., Von Haeseler, A. & Minh, B. Q. (2015). IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Molecular Biology and Evolution 32: 268–274.

Patwardhan, A., Ray, S. & Roy, A. (2014). Molecular markers in phylogenetic studies-a review. Journal of Phylogenetics & Evolutionary Biology 2: 131.

Ronquist, F., Teslenko, M., Van Der Mark, P., Ayres, D. L., Darling, A., Höhna, S., Larget, B., Liu, L., Suchard, M. A. & Huelsenbeck, J. P. (2012). MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Systematic biology 61(3): 539-542.

Seeno, T. N. & Wilcox, J. A. (1982). Leaf beetle genera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomography 1: 1-221.

Sekerka, L. (2016). Taxonomic and nomenclatural changes in Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae). Acta Entomologica Musei Nationalis Prague 56: 275–344.

Simões, M. V., Baca, S. M., Toussaint, E. F., Windsor, D. M. & Short, A. E. (2018). Solving a thorny situation: 76

DNA and morphology illuminate the evolution of the leaf beetle tribe Dorynotini (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). Zoological Journal of the Linnean Society 185(4): 1123-1136

Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H. & Flook, P. (1994). Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America 87: 651–701.

Shapiro, B., Rambaut, A. & Drummond, A. J. (2005). Choosing appropriate substitution models for the phylogenetic analysis of protein-coding sequences. Molecular biology and evolution 23(1): 7-9.

Shin, C. (2013). A new genus of mesomphaliine tortoise beetle (Coleoptera: Chrysomelidae), with description of a new flightless species from Haiti. The Coleopterists Bulletin 67: 521-531.

Shin, C. (2015). Systematics and morphology of Ischyrosonychini, with an investigation of color change in the Geiger tortoise beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Tese de Doutorado, University of Kansas, EUA.

Shin, C. & Chaboo, C. S. (2012). A revision and phylogenetic analysis of Stoiba Spaeth 1909 (Coleoptera, Chrysomelidae). ZooKeys 224: 1-36.

Sunnucks, P. (2000). Efficient genetic markers for population biology. Trends in ecology & evolution 15(5): 199-203.

Świętojańska, J., Sekerka, L., Borowiec, L., Kwiatek, A. & Windsor, D. (2018). Description and comparison of immature stages of four Ischyrosonychini Chapuis, 1875 (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae) species. Annales zoologici 68(2): 317-344.

Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994). CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-4680.

Vaidya, G., Lohman, D. J. & Meier, R. (2011). SequenceMatrix: concatenation software for the fast assembly of multi-gene datasets with character set and codon information. Cladistics 27(2): 171-180. 77

Van der Auwera, G., Chapelle, S. & De Wächter, R. (1994). Structure of the large ribosomal subunit RNA of Phytophthora megasperma, and phylogeny of the oomycetes. FEBS Letters 338: 133–136.

Viana, M. (1968). Revision sistematica de las ‘‘Eugenysini’’ Spaeth con nuevas especies y catalogo bibliografico de la tribus (Coleopt., Chrysomelidae, Cassidinae). Revista del museo argentino de ciencias naturales ‘‘Bernardino Rivadavia’’ 3: 1–106.

Wild, A. L. & Maddison, D. R. (2008). Evaluating nuclear protein-coding genes for phylogenetic utility in beetles. Molecular Phylogenetics and Evolution 48: 877–891. 78

Capítulo 2: Origem e Evolução da Subsocialidade em Cassidinae

(Coleoptera: Chrysomelidae)

2.1. INTRODUÇÃO

O cuidado maternal (ou biparental) é a forma de socialidade mais difundida entre

artrópodes sociais (ROYLE et al., 2012; COSTA, 2018). O cuidado parental pode ser

categorizado em pré-natal (ex.: nidificação, provisão de alimentos, guarda dos ovos) e pós-

natal (guarda da prole, provisão de alimento e defesa) (BRANDMAYR, 1992). O cuidado

parental estendido (pós-natal) também pode ser denominado de comportamento subsocial

(Wilson, 1971), em que pais (um ou ambos) e prole se mantém juntos até o que o segundo

disperse para acasalar posteriormente (YIP & RAYOR, 2014).

Chrysomelidae Latreille, 1802 é uma das apenas 12 famílias de Coleoptera em que o

comportamento subsocial é conhecido, e nela está restrito às subfamílias Cassidinae

Gyllenhal, 1813 e Chrysomelinae Gyllenhal, 1802 (WINDSOR et al., 2013; CHABOO et al.,

2014). Em Cassidinae, este comportamento está registrado em cinco gêneros da tribo

Mesomphaliini: Acromis Chevrolat, 1836, Paraselenis Spaeth, 1913, Omaspides Chevrolat,

1836, Agenysa Spaeth, 1905 (CHABOO et al., 2014) (Tab. 1). O comportamento é similar entre

os gêneros, a fêmea coloca seus ovos nas respectivas plantas hospedeiras e cuida da sua prole

até que os adultos emergem, o que pode durar de algumas semanas até três meses (CHABOO et

al., 2014).

Tabela 1. Lista atualizada das espécies com cuidado parental registrado em Cassidinae. Espécie Distribuição Planta Hospedeira Primeiro Registro

Agenysa peruviana Spaeth, Argentina, Brasil, Bolívia, Peru Mikania spp. (Asteraceae) Chaboo et al. (2014) 1915

Eugenysa columbiana Colômbia, Costa Rica, Panamá Mikania sp. (Asteraceae) Chaboo (2002) (Boheman, 1850) Mikania guaco Bonpl. Windsor et al. Panamá Eugenysa coscaroni Viana, (Asteraceae) (1992) 79

1968

Eugenysa martae Borowiec, Colômbia Desconhecida Macedo et al. (2015) 1987 Bolívia, Brasil, Colômbia, Costa Merremia umbellata (L.) Acromis sparsa (Boheman, Rica, México, Nicarágua, Hallier f. Windsor (1987) 1854) Panamá, Peru, Venezuela (Convolvulaceae) Argentina, Bolívia, Brasil, Acromis spinifex (Linnaeus, Colômbia, Equador, Guiana Ipomoea batatas (L.) 1763) Francesa, Guiana, Paraguai, Fiebrig (1910) Lam. (Convolvulaceae) Peru, Suriname, Trinidade & Tobago, Venezuela Bolívia, Brasil, Colômbia, Convolvulus sp. Acromis venosa Erichson, Chaboo et al. (2014) Equador, Guiana, Peru (Convolvulaceae) 1847 Ipomoea sp. Omaspides (O.) abbreviata Equador, Peru Chaboo et al. (2014) (Convolvulaceae) Baly, 1872 Ipomoea philomega Bolívia, Colômbia, Equador, Omaspides (O.) augusta (Vell.) House Chaboo et al. (2014) Peru Boheman, 1856 (Convolvulaceae) Colômbia, Costa Rica, Panamá, Ipomoea philomega Omaspides (O.) bistriata Rodriguez (1994) Venezuela (Convolvulaceae) Boheman, 1862 Brasil, Guiana Francesa, Guiana, Omaspides (O.) clathrata Desconhecida Macedo et al. (2015) Suriname (Linnaeus, 1758) Ipomoea philomega Omaspides (O.) Costa Rica, Panamá Rodriguez (1994) (Convolvulaceae) convexicollis Spaeth, 1909

Omaspides (O.) Ipomoea batatas Brasil Monte (1932) nigrolineata (Boheman, (Convolvulaceae) 1854) Ipomoea alba (L.), I. Omaspides (O.) Brasil saopaulista O'Donell Ohaus (1900) pallidipennis (Boheman, (Convolvulaceae) 1854) Bolívia, Brasil, Guiana Ipomoea sp. Omaspides (O.) trichroa Flinte et al. (2015) Francesa, Peru (Convolvulaceae) (Boheman, 1854) Frieiro-Costa & Ipomoea alba Omaspides (O.) tricolorata Brasil Vasconcellos-Neto (Convolvulaceae) (Boheman, 1854) (2003)

Omaspides (O.) trifasciata Guiana Francesa, Suriname ??? Presente estudo (Fabricius, 1787) Ipomoea syringifolia Brasil Chaboo et al. (2014) Omaspides (P.) Meisn. (Convolvulaceae) 80 brunneosignata (Boheman, 1854) Vasconcellos-Neto Omaspides (P.) sobrina Argentina, Brasil Desconhecido & Jolivet (1988) (Boheman, 1854) Ipomoea philomega Paraselenis (S.) aulica Brasil Macedo et al. (2015) (Convolvulaceae) (Boheman, 1854) Convolvulus sp., Ipomoea Paraselenis (S.) decipiens Brasil sp., I. regnellii Meisn. Chaboo et al. (2014) (Boheman, 1854) (Convolvulaceae) Ipomoea alba, I. batatas, Paraselenis (S.) dichroa I. grandifolia (Dammer) (Germar, 1824) O'Donell, I. purpurea (L.) Argentina, Brasil, Paraguai Roth, I. regnellii, Monte (1932) Merremia macrocalyx (Ruiz & Pav.) O'Donell (Convolvulaceae) Ipomoea batatas, I. Argentina, Bolívia, Brasil, Paraselenis (S.) flava purpurea Weyenberg (1874) Paraguai (Linnaeus, 1758) (Convolvulaceae) Distimake dissectus var. Paraselenis (S.) normalis edentatus (Meisn.) Brasil Presente estudo (Germar, 1824) Petrongari & Sim.-Bianch (Convolvulaceae) Brasil, Guiana Francesa, Ipomoea batatas Paraselenis (S.) solieri Monte (1932) Suriname (Convolvulaceae) (Boheman, 1854) Brasil, Colômbia, Costa Rica, Ipomoea tiliacea (Willd.) Windsor et al. Paraselenis (S.) tersa Panamá, Peru Choisy (Convolvulaceae) (1992) (Boheman, 1854)

WINDSOR & CHOE (1994) hipotetizaram que haveria duas origens independentes do

cuidado parental em Cassidinae baseados em diferentes famílias de plantas hospedeiras e na

forma em que ovos são dispostos pelas fêmeas. CHABOO et al. (2014), com base em uma

reconstrução filogenética da subfamília, propuseram duas hipóteses para a origem do

comportamento subsocial em Cassidinae: (i) uma, com uma perda em Echoma Chevrolat,

1836 ou (ii) duas, uma vez em Paraselenis e uma segunda vez no grupo composto por

Acromis, Paraselenis e gêneros de Eugenysini. A evolução da subsocialidade em Cassidinae

possivelmente ocorreu como uma resposta a vida exposta em folhas de trepadeiras tropicais

de rápido crescimento e infestada de inimigos naturais, em contraponto com seus ancestrais 81 endofíticos (larvas minadoras) (WINDSOR & CHOE, 1994; VENCL & SRIGLEY, 2013).

Em favor dessa hipótese, TALLAMY & WOOD (1986) argumentaram que a fonte de alimento utilizada pelos insetos determina seus padrões espaciais e temporais de alimentação e reprodução, dessa forma, influenciando como inimigos naturais afetam sua prole. Por exemplo, insetos fitófagos exófagos tendem a estar mais expostos a predadores e parasitas, em relação aos endófagos, e muitos desenvolveram a guarda dos ovos e prole (CORNELL &

HAWKINS, 1995). KLUG & BONSALL (2010) mostraram que o cuidado parental pode evoluir sob uma gama de combinações de fatores ecológicos e de história de vida das espécies.

Modelos teóricos suportam que, embora agentes ecológicos de seleção combinados a histórias de vidas preexistentes sejam importantes, eles também revelam que agentes ecológicos por si só, geralmente não sendo suficientes para o surgimento do cuidado parental (KLUG &

BONSALL, 2010; KLUG et al., 2012).

Assim, para testar uma possível correlação de agentes ecológicos e morfologia com o cuidado parental, realizamos reconstruções ancestrais adicionais, relacionadas a fatores que já foram previamente ligados ao cuidado parental. O primeiro deles, a planta hospedeira

(WINDSOR & CHOE, 1994), e o segundo, a morfologia do élitro. As fêmeas subsociais de

Cassidinae utilizam o élitro com margens amplamente expandidas para esconder e defender a prole (CHABOO et al., 2014; VENCL et al., 2011; GOMES, 2018). 82

2.2. OBJETIVOS

Objetivos gerais

i. Elucidar a origem do comportamento subsocial em Cassidinae

ii. Discutir que fatores podem estar relacionados a esse comportamento

Objetivos específicos

i. Reconstruir o estado de caráter ancestral do comportamento subsocial

ii. Reconstruir o estado de caráter ancestral para a preferência de plantas hospedeiras e

largura do élitro

iii. Reportar um novo registro de cuidado parental em Mesomphaliini 83

2.3. MATERIAL E MÉTODOS

A amostragem taxonômica, bem como os procedimentos para as reconstruções filogenéticas estão descritas no Capítulo 1 (seção 1.3). Para as análises de reconstrução do estado de caráter ancestral, foi utilizada a árvore de máxima verossimilhança por esta apresentar-se completamente resolvida.

2.3.1. RECONSTRUÇÃO DO ESTADO DE CARÁTER ANCESTRAL

Subsocialidade

Para esta análise foi selecionada a árvore com maior log de verossimilhança gerada pela análise de máxima verossimilhança. A evolução da subsocialidade foi avaliada sob a reconstrução do estado de caráter ancestral no programa Mesquite 3.04 (MADDISON &

MADDISON, 2015). Foi construída uma matriz incluindo os mesmos táxons amostrados na análise filogenética e o caráter “cuidado parental”. Todas as espécies subsociais dos gêneros

Acromis, Paraselenis e Omaspides foram codificadas como “presente” para o cuidado parental. Por conta da dificuldade de observação das espécies do gênero Eugenysa, pouco sabe-se sobre elas, contudo acredita-se que todas sejam subsociais, por isso as espécies de

Eugenysa que não tiveram seu comportamento reprodutivo observado foram codificadas como dados faltantes em vez de “ausente”. As espécies E. coscaroni e E. columbiana possuem cuidado parental registrado em literatura e E. unicolor foi observada em atividade de cuidado parental por um de nossos colaboradores (Lukas Sekerka, com. pess.). As espécies do gênero Agenysa (A. boliviana e A. connectens) também foram tratadas como dados faltantes, devido ao registro de cuidado parental em uma de suas espécies. O estado de caráter ancestral foi reconstruído sob a abordagem de parcimônia na árvore escolhida, pois trata-se de um caráter binário que não se encontra amplamente distribuído na filogenia.

Plantas hospedeiras e élitros

Além deste caráter, também foram avaliados outros dois que podem estar relacionados 84 com a subsocialidade: plantas hospedeiras e largura do élitro (Tab. 2). As plantas hospedeiras foram codificadas em nível de família. As informações de planta hospedeira foram retiradas do catálogo de Cassidinae do mundo (BOROWIEC & SWIETOJANSKA, 2019) e também de comunicações pessoais de Donald Windsor e Lukas Sekerka. Quanto a largura do élitro, foi utilizada a razão da largura da expansão do élitro (LE) sobre a largura do disco elitral (LD)

(Fig. 1). As mensurações foram tomadas na maior largura do élitro a partir de fotografias dos espécimes utilizados no estudo. A partir dessa razão (LE/LD), foram selecionados quatro intervalos representando quatro tipos de élitro – da menor até a maior expansão elitral – e estes foram codificados para as espécies. Os intervalos são 0,13–0,19; 0,20–0,36; 0,37–0,45;

0,46–0,54. As reconstruções de planta hospedeira e largura do élitro foram também foram realizadas no programa Mesquite 3.04, no entanto foi utilizada a abordagem de máxima verossimilhança (modelo Mk1). A escolha deste tipo de análise ocorreu por tratarem-se de caracteres multiestado e distribuídos de forma mais dispersa na árvore, se comparados à subsocialidade. A abordagem de máxima verossimilhança fornece porcentagens para cada nó da árvore, que dizem a respeito a verossimilhança da presença de cada estado de caráter naquele dito ancestral.

Tabela 2. Lista de caracteres multiestado utilizados nas análises de reconstrução do estado de caráter ancestral.

Planta Hospedeira Razão LE/LD Acromis sparsa Convolvulaceae 0,53 Acromis spinifex Convolvulaceae 0,51 Acromis venosa Convolvulaceae 0,51 Agenysa boliviana Asteraceae 0,47 Agenysa connectens Asteraceae 0,52 Botanochara impressa Convolvulaceae 0,32 Botanochara ordinata Convolvulaceae 0,25 Botanochara sp Convolvulaceae 0,29 Botanochara subnervosa Convolvulaceae 0,32 Canistra irrorata Boraginaceae 0,3 Canistra osculatii Boraginaceae 0,32 85

Charidotella circumnotata Convolvulaceae 0,38 Chelymorpha alternans Convolvulaceae 0,19 Chelymorpha constellata Convolvulaceae 0,44 Chelymorpha gressoria Convolvulaceae 0,15 Chelymorpha marginata Convolvulaceae 0,14 Chelymorpha praetextata Convolvulaceae 0,18 Chelymorpha sericea Convolvulaceae 0,18 Chelymorpha sp Convolvulaceae 0,15 Cyrtonota deliciosa Asteraceae 0,43 Cyrtonota marginata Asteraceae 0,45 Cyrtonota serinus Convolvulaceae 0,35 Cyrtonota cyanea Convolvulaceae 0,29 Cyrtonota tristigma Desconhecido 0,17 Deloyala cruciata Convolvulaceae 0,43 Dorynota bidens Bignoniaceae 0,41 Dorynota distincta Bignoniaceae 0,46 Dorynota truncata Bignoniaceae 0,47 Echoma anaglyptoides Asteraceae 0,49 Echoma bonfilsi Asteraceae 0,48 Echoma clypeata Asteraceae 0,44 Echoma quadristillata Asteraceae 0,43 Eugenysa columbiana Asteraceae 0,51 Eugenysa coscaroni Asteraceae 0,42 Eugenysa subopaca Asteraceae 0,49 Eugenysa unicolor Asteraceae 0,45 Goniochenia buckleyi Boraginaceae 0,41 Goniochenia quadraticollis Boraginaceae 0,31 Gratiana conformis Solanaceae 0,22 Herissa pantherina Malvaceae 0,19 Hilarocassis bordoni Convolvulaceae 0,13 Hilarocassis sp. Convolvulaceae 0,19 Hilarocassis venusta Convolvulaceae 0,19 Mesomphalia gibbosa Asteraceae 0,43 Mesomphalia turrita Desconhecido 0,38 Microctenochira quadrata Convolvulaceae 0,4 Ogdoecosta biannularis Convolvulaceae 0,24 Ogdoecosta catenulata Convolvulaceae 0,27 86

Omaspides bistriata Convolvulaceae 0,54 Omaspides confusa Convolvulaceae 0,53 Omaspides brunneosignata Convolvulaceae 0,47 Omaspides sp Convolvulaceae 0,52 Omaspides pallidipennis Convolvulaceae 0,49 Omaspides trichroa Convolvulaceae 0,41 Omaspides trifasciata Convolvulaceae 0,45 Omocerus gibberus Lamiaceae 0,2 Orexita varians Boraginaceae 0,25 Paranota minima Bignoniaceae 0,23 Paraselenis brunnidorsis Convolvulaceae 0,49 Paraselenis decipiens Convolvulaceae 0,49 Paraselenis dichroa Convolvulaceae 0,45 Paraselenis flava Convolvulaceae 0,42 Paraselenis normalis Convolvulaceae 0,48 Paraselenis puncticollis Convolvulaceae 0,49 Xenicomorpha scapularis Convolvulaceae 0,3 Paraselenis sp Convolvulaceae 0,44 Physonota attenuata Boraginaceae 0,33 Physonota gigantea Boraginaceae 0,16 Polychalca salebrosa Boraginaceae 0,13 Polychalma multicava Boraginaceae 0,2 Stoiba sp Desconhecido 0 Stolas brachiata Convolvulaceae 0,32 Stolas brevicuspis Desconhecido 0,39 Stolas conspersa Asteraceae 0,39 Stolas costaricensis Asteraceae 0,41 Stolas discoides Convolvulaceae 0,34 Stolas ephippium Convolvulaceae 0,36 Stolas excelsa Asteraceae 0,47 Stolas extricata Convolvulaceae 0,33 Stolas implexa Asteraceae 0,21 Stolas indigacea Asteraceae 0,27 Stolas inexculta Asteraceae 0,42 Stolas lacordairei Asteraceae 0,15 Stolas lebasii Asteraceae 0,31 Stolas mannerheimi Asteraceae 0,42 87

Stolas aff. isthmica Convolvulaceae 0,29 Stolas sexsignata Desconhecido 0,32 Terpsis quadrivittata Convolvulaceae 0,29 Zatrephina ineata Convolvulaceae 0,19 Zatrephina sexlunata Convolvulaceae 0,19

Figura 1: Modelo ilustrando as medidas feitas para a análise de reconstrução do estado ancestral da largura do élitro. LD = largura do disco; LE = largura da expansão. 88

2.4. RESULTADOS

2.4.1. RECONSTRUÇÃO DO ESTADO DE CARÁTER ANCESTRAL

Subsocialidade

De acordo com a reconstrução, a subsocialidade teve duas origens em Cassidinae. A primeira origem ocorreu no clado 1 e a segunda, posteriormente, no clado 2 (Fig. 2). O clado

1 é composto pelos gêneros Acromis, Paraselenis e Omaspides e assumidamente todas suas espécies são subsociais. O clado 2 é composto pelo gênero Eugenysa e das quatro espécies amostradas, apenas uma não possui informações sobre o comportamento reprodutivo. O gênero Agenysa possui apenas uma espécie com subsocialidade registrada (A. peruviana) e esta não foi amostrada por nós. As duas espécies amostradas (A. boliviana e A. connectens) foram recuperadas em regiões distintas da árvore e fora dos clados subsociais. Além de não suportar o monofiletismo do gênero, o posicionamento de Agenysa levanta a questão de origens adicionais da subsocialidade em Cassidinae. Nenhuma reversão foi registrada para este caráter. 89

Plantas hospedeiras

O grupo interno possui como plantas hospedeiras apenas espécies das famílias

Asteraceae ou Convolvulaceae (Fig. 3). De acordo com a reconstrução, é possível observar dois grupos bem definidos para cada preferência alimentar. As primeiras linhagens a divergirem em Mesomphaliini se alimentam de Convolvulaceae e posteriormente houve uma transição de hábito alimentar para Asteraceae, com uma regressão no clado contendo

Botanochara e parte de Cyrtonota. Ainda no clado que se alimenta de Convolvulaceae, houve uma mudança para Asteraceae (Agenysa boliviana). O ancestral de Mesomphaliini possui

99% de chances ter se alimentado da família Convolvulaceae. O ancestral do grupo que se alimenta majoritariamente de Asteraceae possui 92% de chances de ter se alimentado de

Asteraceae e 8% de Convolvulaceae.Quanto ao grupo externo, as tribos mais próximas de

Mesomphaliini (Omocerini, Ischyrosonychini e Goniocheniini) alimentam-se majoritariamente da família Boraginaceae. Outros registros de Convolvulaceae encontram-se na tribo Cassidini – que não foi recuperada monofilética. Esta, por sua vez, foi recuperada mais distante em relação à Mesomphaliini e seu ancestral comum mais recente possui 72% de chance de ter se alimentado de Convolvulaceae. Ainda assim, de acordo com a reconstrução do estado de caráter ancestral, tratam-se de duas origens independentes, uma em Cassidini e outra em Mesomphaliini. A preferência por Boraginaceae, por sua vez, parece ter se originado no ancestral comum mais recente de Omocerini + Ischyrosonychini + Goniocheniini +

Mesomphaliini, com 97% de chance de ter se alimentado de Boraginaceae. Trata-se de uma origem que foi transmitida às tribos Omocerini, Ischyrosonychini e Goniocheniini, mudando a preferência alimentar apenas mais tarde, em Mesomphaliini, para Convolvulaceae. 91

Largura do élitro

A fim de testar a relação da largura do élitro com o cuidado parental, foram codificados quatro tipos de élitros (1, 2, 3 e 4) de acordo com a relação da largura da expansão (LE) com a largura do disco (LD) elitral. O élitro do tipo 1 representa a menor razão

LE/LD, ou seja, em que a largura da expansão é proporcionalmente pequena em relação a largura do disco e o tipo 4 com a maior largura de expansão proporcional a largura do disco.

O ancestral comum mais recente de Mesomphaliini possui 64% de chance de possuir o

élitro do tipo 2, seguidos dos tipo 1 (14%), 4 (13%) e 3 (9%) (Fig. 4). O élitro do tipo 4 aparece em Mesomphaliini no clado 1, em que seu ancestral possui 71% de chance de possuir o élitro do mesmo tipo, seguidos pelos tipos 3 (13%), 2 (9%) e 1 (7%). O grupo irmão do clado 1 (Hilarocassis), por sua vez, é formado apenas por espécies com menor largura da expansão proporcional ao disco (tipo 1), tendo seu ancestral comum mais recente 35% de chance de possuir o élitro do tipo 4 e 33% do tipo 2, seguidos pelos tipos 1 (21%) e 3 (12%).

No clado que se alimenta de Asteraceae vemos um aumento na predominância dos

élitros dos tipos 3 e 4, seu ancestral comum mais recente tendo 74% de chance de ser do tipo

3 e 22% de chance do tipo 2. Nele, há o clado subsocial de Eugenysa, em que seu ancestral possui 58% de chance de ser do tipo 3 e 29% do tipo 4, seguidos dos tipo 2 (8%) e 1 (5%).

Outro clado que chama a atenção é Echoma, por ser o único gênero não subsocial a possuir somente élitros dos tipos 3 ou 4, com o ancestral comum mais recente tendo 86% de chance de ser do tipo 3 e 12% de ser do tipo 4. 93

2.4.2 NOVO REGISTRO DE SUBSOCIALIDADE EM MESOMPHALIINI

Observamos um novo registro de cuidado parental em Cassidinae durante trabalho de campo realizado ao longo dos anos 2013 a 2015 em Cachoeiras de Macacu, Rio de Janeiro

(22° 24' 58,8" S 42° 44' 20,3" W), um fragmento de Mata Atlântica em recuperação.

Observamos a espécie Paraselenis (Spaethiechoma) normalis (Germar, 1824) guardando sua prole (Fig. 5). Como previamente registrado para outras espécies subsociais de Cassidinae, a fêmea era responsável pela guarda. Machos foram observados na mesma planta que as fêmeas em guarda, mas nunca próximos a elas (Fig. 5B). A planta hospedeira foi identificada como

Distimake dissectus var. edentatus (Meisn.) Petrongari & Sim.-Bianch (Convolvulaceae) e é o primeiro registro para a espécie, condizente com os registros prévios para seus congenéricos

(Figs 5C-D). Nós também observamos uma vespa da família Eulophidae pousada no élitro da fêmea em guarda (Fig. 5E), que possivelmente estava tentando parasitar os ovos de

Paraselenis (Spaethiechoma) normalis. Eulophidae é um grupo conhecido por ser parasitóide de ovos de besouros, inclusive Cassidinae (CUIGNET et al., 2007). 95

2.5. DISCUSSÃO

2.5.1. ORIGEM DA SUBSOCIALIDADE EM CASSIDINAE

Nossos resultados mostram que o comportamento subsocial teve duas origens em

Cassidinae: no clado composto por Acromis, Paraselenis e Omaspides (clado 1) e em

Eugenysa (clado 2). Há de se levar em consideração a possibilidade de mais uma origem deste comportamento em Mesomphaliini. A espécie Agenysa peruviana é a única de seu gênero com cuidado maternal registrado (CHABOO et al., 2014). No entanto, questionamos a validade deste registro, pois os autores sequer descreveram em que condições os espécimes foram encontrados (guardando ovos, larvas ou pupas; tamanho da prole, etc.) e a única foto fornecida pelos autores não mostra comportamento de cuidado parental, enquanto que os registros novos para outras espécies no mesmo trabalho estão devidamente descritos e ilustrados. Após anos de trabalhos de campo em diversos países da América do Sul e Central nunca foi observado comportamento de cuidado parental em Agenysa (Donald Windsor &

Lukas Sekerka com. pess.). Em nosso trabalho, foram amostradas duas espécies de Agenysa em que o comportamento reprodutivo não é conhecido. Estas espécies, por sua vez, foram recuperadas em pontos distintos da árvore e nenhuma delas foi recuperada dentro de um dos clados subsociais. Por enquanto, consideramos válido o registro de cuidado parental de A. peruviana, portanto deve ser considerada a possibilidade de mais uma origem independente da subsocialidade em Cassidinae. Contudo, há de ser investigado mais profundamente se há, de fato, cuidado parental em Agenysa.

WINDSOR & CHOE (1994) propuseram dois possíveis cenários evolutivos da subsocialidade em Cassidinae, a partir de dados relacionados a morfologia e o comportamento das espécies. O primeiro cenário hipotetiza uma única origem em que alguns descendentes colonizaram Asteraceae enquanto que outros mantiveram Convolvulaceae como planta hospedeira. O segundo cenário sustenta duas origens independentes para cada hábito 97 alimentar (Asteraceae e Convolvulaceae). Os autores consideraram a segunda hipótese mais verossímil pois está em maior concordância com a morfologia e história natural das espécies.

Em nossa reconstrução evolutiva das plantas hospedeiras, corroboramos a segunda hipótese. A primeira origem da subsocialidade ocorreu no clado 1, que se alimenta de Convolvulaceae, e posteriormente no clado 2, que possui Asteraceae como planta hospedeira.

CHABOO et al. (2014) foram os primeiros a discutir a origem da subsocialidade em

Cassidinae tendo como base uma hipótese filogenética. Os autores utilizaram uma reconstrução filogenética que havia sido feita previamente para testar o monofiletismo de

Cassidinae (CHABOO, 2007), por conta disso não há uma amostragem adequada das espécies subsociais, tampouco dos gêneros relacionados. Para fins de comparação, foram amostradas em nosso trabalho 71 espécies de Mesomphaliini, sendo 21 subsociais versus 24 e sete espécies, respectivamente. CHABOO et al. (2014) propuseram dois cenários alternativos para a origem da subsocialidade em Cassidinae: (i) uma origem, com uma perda em Echoma ou (ii) duas origens independentes, uma em Omaspides e outra em Acromis + Paraselenis +

Eugenysini (Fig. 6). A primeira hipótese, por si só, já se apresenta filogeneticamente incorreta, pois como o clado foi recuperado em uma politomia, não é possível afirmar que houve apenas uma reversão já que o posicionamento de Hilarocassis exclamationis e Ogdoecosta biannularis não é conhecido.

Nossos resultados não corroboram nenhuma das hipóteses. Em relação a primeira hipótese, recuperamos duas origens e, além disso, Echoma não foi recuperado junto aos grupos subsociais e seu ancestral não apresentava esse comportamento, de acordo com a nossa reconstrução do estado ancestral. A segunda hipótese propõe duas origens, assim como a nossa, mas em grupos totalmente distintos. É extremamente improvável que haja uma origem única para Acromis, Paraselenis e Eugenysa. Nossas análises recuperaram origens independentes para os clados 1 e 2 com alto suporte. 98

Origem da subsocialidade em Chrysomelidae

Chrysomelinae, juntamente a Cassidinae, são as duas únicas subfamílias de

Chrysomelidae que apresentam comportamento subsocial. No aspecto comportamental, o cuidado parental se apresenta de forma semelhante nas duas subfamílias. O cuidado é provido sempre pela mãe, que realiza a postura na planta hospedeira e guarda ovos e as larvas

(WINDSOR et al., 2013; CHABOO et al., 2014). A diferença ocorre na extensão da guarda, que em Chrysomelinae se estende até o último ínstar, visto que as larvas empupam abaixo do solo, enquanto que em Cassidinae a guarda ocorre até o momento em que os jovens adultos emergem (WINDSOR et al., 2013; CHABOO et al., 2014).

As diferenças mais marcantes entre as duas subfamílias estão na quantidade de origens da subsocialidade e da distribuição geográfica das espécies subsociais, fatores que provavelmente estão intimamente relacionados. A partir do nosso trabalho, concluímos que o cuidado parental se originou duas vezes em Cassidinae, em apenas uma tribo

(Mesomphaliini). Além disso, todas as espécies subsociais de Cassidinae possuem distribuição Neotropical, apesar de a subfamília ser cosmopolita. As espécies subsociais de 99

Chrysomelinae estão alocadas em três subtribos de Chrysomelini (Doryphorina, Gonioctenina e Phyllocharitina), ora classificadas como tribos, com distribuição Neotropical, Holoártica e

Australiana, respectivamente (REID et al., 2009; WINDSOR et al., 2013). Além disso, possuem como plantas hospedeiras: Apocynaceae, Betulaceae, Salicaceae, Solanaceae ou Proteaceae

(CHABOO et al., 2014)

WINDSOR et al. (2013) propuseram uma hipótese filogenética para gêneros neotropicais de Doryphorina (=Doryphorini) que se alimentam de Solanaceae (Platyphora e

Proseicela), sendo algumas das espécies desses gêneros subsociais. O gênero Neotropical

Doryphora, que também apresenta subsocialidade, não foi incluído. A árvore foi construída com base em dados moleculares de um fragmento de COI e os autores limitaram-se a apontar a subsocialidade (ou ausência dela) nos táxons terminais, de modo que não foi feita uma análise de reconstrução do estado ancestral. Ainda assim, de acordo com os resultados fornecidos é possível concluir que no grupo amostrado houve ao menos uma origem e uma reversão desse comportamento.

CHABOO et al. (2014) propuseram uma reconstrução filogenética para Chrysomelinae com base em dados moleculares (COI e rrnL) e amostraram um representante de cada gênero subsocial, com exceção de Pterodunga (Phyllocharitina). Assim como WINDSOR et al. (2013), os autores limitaram-se a apontar os táxons subsociais na árvore resultante. Mesmo com a ausência de uma reconstrução do estado de caráter ancestral, os autores mostraram quatro origens independentes de cuidado parental em Chrysomelinae – uma em cada um dos gêneros subsociais amostrados.

Origem da subsocialidade em outros grupos de insetos

LIN et al. (2004) reconstruíram a filogenia de Membracinae (Hemiptera:

Membracidae) com base em dados combinados de três marcadores mitocondriais (COI, COII e 12S) e um nuclear (Wg) a fim de estudar a evolução do cuidado maternal no grupo. O 100 comportamento se mostrou amplamente difundido na subfamília, tendo sido recuperadas três origens independentes e uma perda. JORDAL et al. (2011) reconstruíram filogeneticamente grupos brocadores de madeira da família Curculionidae (Coleoptera) a partir de dados moleculares e morfológicos. A reconstrução do estado de caráter ancestral indicou cinco origens independentes (seis em uma estimativa conservadora) da subsocialidade em

Curculionidae, com uma origem adicional no grupo externo (Brentidae). A subfamília

Cossoninae por si só foi responsável por quatro origens da subsocialidade, sendo que em grande parte das espécies amostradas deste grupo não há informação sobre a biologia, sendo assim os autores estimaram que se assumido o cuidado parental para boa parte (ou todas) das espécies de Cossoninae, o número de origens independentes cairia para duas ou três. TSAI et al. (2015) propuseram uma hipótese filogenética para Acanthosomatidae (Hemiptera) utilizando dados de cinco marcadores genéticos e recuperaram três origens independentes do cuidado maternal nesse grupo, sem nenhuma perda.

Todos esses trabalhos apresentam pontos em comuns com a nossa reconstrução (i) o múltiplas origens e (ii) uma ou nenhuma perda. Em Cassidinae, o cuidado parental se originou independentemente duas vezes em apenas uma tribo, ou seja, em um grupo de distribuição cosmopolita com mais de 6 mil espécies conhecidas, esse comportamento surgiu em uma tribo de distribuição Neotropical com mais de 500 espécies. Outra característica marcante refere-se a ausência de reversões ao estado de comportamento solitário, demonstrando que a subsocialidade é um comportamento fortemente fixado nas linhagens em que se origina e raramente é perdido. Sendo assim, pode-se concluir que ao ser adquirido tal comportamento complexo, ele dificilmente será perdido.

2.5.2. EVOLUÇÃO DO CUIDADO PARENTAL

Existem diversos trabalhos que discorrem acerca das origens da eussocialidade

(THORNE, 1997; HUGHES et al., 2008; WILSON & HÖLLDOBLER, 2005; NOWAK et al., 2010) e 101 a grande maioria corrobora a rota subsocial, no entanto a origem da subsocialidade não é discutida com a mesma intensidade.

WILSON (1975) propôs quatro hipóteses sobre que fatores ecológicos podem determinar a evolução do cuidado parental. Ele estimou que o cuidado parental deveria evoluir predominantemente sob (i) habitats estruturados e estáveis, (ii) ambientes fisicamente estressantes, (iii) alta pressão de predação ou (iv) fonte de alimento escassa ou especializada.

TALLAMY & WOOD (1986) propuseram que as condições de WILSON (1975) são determinadas pela fonte de alimento. A qualidade nutricional, persistência e dispersão do alimento influenciam a taxa e local em que insetos se alimentam e, portanto, até que ponto eles estão expostos a predadores, parasitas e competição (PRICE, 1984). Além disso, TALLAMY &

BROWN (1998) argumentaram que a hipótese de WILSON (1975) carece de poder preditivo porque existem inúmeros exemplos de insetos, muitas vezes relacionados a espécies subsociais, que vivem sob essas condições e não desenvolveram cuidado parental. Por exemplo, apesar de existirem ao menos 7.859 espécies de besouros rola-bosta (Scarabaeidae) que utilizam fezes como recurso para reprodução, apenas 41 (0.5%) dessas espécies apresentam cuidado parental (HALFFTER & EDMUNDS, 1982). Em Cassidinae também é possível observar espécies solitárias e subsociais convivendo e se alimentando em uma mesma planta e, teoricamente, sofrendo as mesmas pressões seletivas (CHABOO et al., 2014).

KLUG & BONSALL (2010) demonstraram que o cuidado parental pode evoluir a partir de um estado ancestral sem cuidado sob uma variedade de combinações de fatores ecológicos e histórias de vida. Em um ambiente variável, a seleção do cuidado parental depende da interação entre variabilidade do ambiente, características da história de vida afetadas por essa variabilidade e os custos específicos do cuidado (BONSALL & KLUG, 2011). Agentes ecológicos, por si só, normalmente não são suficientes para a emergência do cuidado parental

(KLUG & BONSALL, 2010). 102

Na mesma corrente de uma maior influência da história de vida, a Hipótese da

Semelparidade pressupõe que linhagens com espécies semélparas (com um único evento reprodutivo) estariam mais sujeitas à evolução do cuidado parental (especialmente do maternal), já que o investimento em uma única prole é considerável e as fêmeas têm muito a ganhar e pouco a perder ao permanecer e guardar sua prole em vez de dispersar (TALLAMY &

BROWN, 1998). No entanto, apenas 24.5% das espécies que apresentam cuidado maternal são semélparas (TRUMBO, 2013). Em Cassidinae, os ciclos anuais parecem possuir uma forte influência da latitude, com espécies de latitudes temperadas se reproduzindo uma vez ao ano e espécies tropicais de duas a três vezes ao ano (CHABOO, 2007). Espécies subsociais são bivoltinas, ou seja, se reproduzem duas vezes no período de um ano (WINDSOR, 1987; GOMES et al., 2012). Sendo assim, o número de eventos reprodutivos não parece ser um fator determinante para o surgimento do cuidado parental. A Hipótese da Semelparidade também não fala em favor da rota subsocial, já que ela tem como pré-requisito a sobrevivência da mãe e a geração de uma nova prole, em que a prole antiga auxilia na guarda (LINKSVAYER, 2010).

GILBERT & MANICA (2015) estudaram a evolução do cuidado parental em insetos com uma abordagem filogenética e concluíram que existem todas as permutações possíveis acerca da ausência de cuidado e dos diferentes tipos de cuidado parental (paternal, maternal e biparental), no entanto, as transições são esmagadoramente maiores entre ausência de cuidado e cuidado maternal, especialmente em Holometabola. As espécies de Chrysomelidae seguem esse padrão ao fazer a transição de espécies solitárias para espécies com cuidado maternal.

Algumas características de história de vida facilitam a evolução do cuidado parental ou os custos do cuidado parental que evoluiu sob condições ecológicas particulares levaram a uma certa história de vida? Apesar da vasta literatura disponível, ainda faltam estudos sistemáticos que resolvam causa e efeito entre história de vida e ecologia e que testem fatores que contribuem para a evolução do cuidado parental (WONG et al., 2013). 103

2.5.3. SURGIMENTO E ACÚMULO DE DEFESAS EM CASSIDINAE

Inimigos naturais certamente impuseram uma forte seleção em insetos folívoros, especialmente nas espécies cujos imaturos se alimentam na superfície das folhas, em que as taxas de mortalidade podem alcançar os 90% (CORNELL et al., 1998). Algumas destas espécies evoluíram a guarda de ovos e larvas (SMISETH et al., 2012).

VENCL & SRYGLEY (2013) propuseram um modelo evolutivo de acúmulo de defesas que teriam surgido frente a inimigos naturais específicos, sendo o cuidado parental o mais recente e aprimorado. Todas essas defesas teriam surgido após a mudança de um hábito endofítico (larvas minadoras) para o hábito exofítico, fazendo com que as larvas se tornassem expostas a uma diversidade de predadores e, consequentemente, a novas forças seletivas. De acordo com a história evolutiva de Cassidinae, os comportamentos de defesa teriam surgido na seguinte ordem temporal: escudos fecais, gregarismo e cuidado parental (CHABOO, 2007;

VENCL & SRYGLEY, 2013). Ainda há uma enorme lacuna em estudos biológicos em

Cassidinae (GOMES, 2018), fazendo com que a presença dessas características, especialmente do escudo e do gregarismo, seja especulativa em parte das espécies e, consequentemente, de generalizações para cada tribo. As fêmeas adultas de Cassidini, tribo não monofilética, são conhecidas por colocar ovos solitários, porém há registros de espécies que depositam ootecas e posteriormente suas larvas apresentam comportamento gregário (LÓPEZ-PÉREZ et al., 2017;

GOMES, 2018). As larvas de Ischyrosonychini são gregárias, porém algumas espécies perderam o escudo fecal que estava presente nos seus ancestrais, enquanto que em outras o escudo é formado apenas por exúvias dos ínstares anteriores (SWIETOJANSKA et al., 2018).

Baseados em VENCL & SRYGLEY (2013) e CHABOO et al. (2014), apontamos a suposta origem do comportamento gregário de larvas em nossa árvore (Fig. 7). A transição de larvas sem escudo para larvas com escudo teria ocorrido em tribos mais relacionadas à Hispinae s. str., estas teriam sido as primeiras a adquirir hábito exofítico. Como nossa amostragem diz 104 respeito apenas à Mesomphaliini e tribos aproximadas, tais tribos mais basais não foram amostradas, de forma que escudos exúvio-fecais já estavam presentes nas larvas do ancestral em comum mais recente de toda nossa amostragem. O gregarismo surgiu a partir da linhagem de Ischyrosonychini e o cuidado parental, como já discutido, surgiu por duas vezes em

Mesomphaliini. O preenchimento dessas lacunas biológicas auxiliará no fornecimento de hipóteses mais robustas sobre a evolução de defesas em Cassidinae.

A fim de testar a influência de fatores ecológicos e de história de vida, além da reconstrução do caráter de cuidado parental, também reconstruímos o estado ancestral da fonte de alimento (família da planta hospedeira) e uma característica morfológica utilizada na guarda da prole: o élitro (CHABOO et al., 2014). 105

Figura 7. Suposta origem do comportamento gregário em larvas de acordo com Vencl & Srygley (2013) e Chaboo et al. (2014) e origens da subsocialidade recuperadas neste trabalho. 106

2.5.4. PLANTAS HOSPEDEIRAS

Todas as espécies do grupo interno (Mesomphaliini) alimentam-se apenas das famílias

Asteraceae ou Convolvulaceae, sendo monófagas ou oligófagos, ou seja, alimentam-se de uma única espécie ou espécies proximamente relacionadas. A partir da reconstrução do estado ancestral da preferência alimentar, foi possível observar dois clados distintos em

Mesomphaliini representando cada uma das duas famílias de planta hospedeira. O cuidado parental originou-se uma vez em cada um dos grupos. Importante apontar que tanto as espécies de Convolvulaceae e Asteraceae utilizadas como alimento por Mesomphaliini são lianas (trepadeiras ou reptantes), com exceção de Anacassis, que não foi amostrada mas alimenta-se de arbustos do gênero Baccharis (Asteraceae). Os gêneros não subsociais relacionados aos gêneros subsociais alimentam-se de espécies com hábitos similares. Por exemplo, os gêneros Acromis, Paraselenis e Omaspides alimentam-se de espécies dos gêneros

Convolvulus, Ipomoea, Camonea ou Distimake e seu gênero irmão, Hilarocassis, alimenta-se de espécies de Jacquemontia, sendo todos os gêneros de espécies trepadeiras, com hábitos similares. O mesmo ocorre em Eugenysa, em que todas as espécies do clado de Asteraceae alimentam-se de Mikania.

Apesar do ancestral de Mesomphaliini provavelmente ter se alimentado de

Convolvulaceae, as tribos mais relacionadas se alimentam de Boraginaceae ou famílias aparentadas. Apenas na tribo Cassidini existem espécies que alimentam-se de

Convolvulaceae. Cassidini é a tribo mais diversa da subfamília e também a única com distribuição cosmopolita, talvez por essa razão apresente a maior diversidade de plantas hospedeiras (CHABOO, 2007). Como foi amostrada apenas como grupo externo em nosso trabalho, não foi possível ter a dimensão da diversidade dessa tribo. Uma reconstrução do estado ancestral da preferência alimentar de Cassidini certamente auxiliaria a desvendar padrões na subfamília, visto que Cassidini, apesar de se alimentar especialmente de 107

Convolvulaceae, também se alimenta de famílias relacionadas as outras tribos (Asteraceae,

Boraginaceae, Bignoniaceae, etc.).

A escolha de planta hospedeira, por si só, não parece ser o fator ecológico que impulsionou a origem da subsocialidade em Mesomphaliini, visto que não há uma diferenciação marcante de planta hospedeira entre as espécies subsociais e as não subsociais.

Além disso, Cassidini possui espécies que também alimentam-se de Convolvulaceae ou

Asteraceae e estas não desenvolveram cuidado parental. Em um local no Brasil, ao menos três espécies solitárias de Cassidinae (Stolas lineaticollis e duas espécies indeterminadas) compartilham a mesma planta hospedeira com outros Cassidinae subsociais e, portanto, presume-se que sofram as mesmas pressões de seleção (CHABOO et al., 2014).

Os Chrysomelinae do Novo Mundo alimentam-se de aproximadamente nove famílias de planta hospedeira, no entanto as espécies subsociais estão restritas a apenas duas delas:

Apocynaceae e Solanaceae (WINDSOR et al., 2013). Como também há espécies solitárias proximamente relacionadas com o mesmo hábito alimentar, assim como Cassidinae, assume- se que esse não seja o único fator responsável pela origem do cuidado parental em

Chrysomelinae (WINDSOR et al., 2013).

2.5.5. MORFOLOGIA DO ÉLITRO

As fêmeas subsociais de Cassidinae defendem fisicamente sua prole, utilizando o

élitro com margens expandidas para esconder e proteger a ninhada (VENCL et al., 2011;

CHABOO et al., 2014). Já foram observadas fêmeas que utilizam o élitro e pronoto como uma

“guilhotina” para defender sua prole, tanto de possíveis predadores como de fêmeas

“invasoras” (GOMES, 2018).

Uma das características marcantes de Cassidinae s. str. é o élitro com margens expandidas, no entanto foi observado por nós que as espécies subsociais aparentavam possuir as margens ainda mais largas. Para isso, testamos se proporção da largura da margem do disco 108 poderia estar relacionada ao comportamento subsocial.

Os grupos com cuidado parental, no geral, apresentam margens do élitro proporcionalmente mais largas em relação ao disco (Fig. 7). No entanto, esse mesmo padrão também foi recuperado pelo gênero Echoma, que não apresenta comportamento subsocial.

Essa semelhança morfológica entre Echoma e os gêneros subsociais já havia sido recuperada em análises filogenéticas morfológicas a partir de caracteres relacionados a largura da margem expandida e ao ângulo ântero-lateral (humeral) do élitro (CHABOO, 2001; CHABOO,

2007). Tal topologia, no entanto, não foi recuperada por nós, o que indica que a largura por si só não é um caráter sinapomórfico. Certamente é um caráter que precisa de refinamento para continuar sendo investigado no futuro, com a utilização de mais medidas ou mesmo com uma abordagem da forma, na morfometria geométrica. O gênero Echoma é o único conhecido em

Cassidinae a se alimentar de inflorescências (WINDSOR et al., 1995), fazendo com que sofra pressões seletivas diferentes do resto das espécies, que se alimentam de folhas. Ao se alimentar de inflorescências, podem se apresentar menos expostos em relação às espécies folívoras. Além disso, o ciclo de vida de 21 dias dos imaturos é um dos menores já registrados em Cassidinae e pode estar relacionado à exploração de recursos efêmeros (inflorescência)

(WINDSOR et al., 1995), ao mesmo tempo que encurta o período de desenvolvimento dos estágios mais indefesos, o que também pode funcionar como uma estratégia de defesa.

Os élitros expandidos provavelmente são fundamentais durante a guarda dos ovos, o estágio em que a prole se encontra mais vulnerável. A fêmea utiliza o élitro como um escudo contra predadores. Experimentos de campo com Acromis sparsa mostraram que a remoção da mãe resultava em mortalidade total dos ovos em 24h, causada especialmente por predação de formigas (WINDSOR & CHOE, 1994; VENCL & SRYGLEY, 2013).

Posteriormente, nos estágios larvais, as fêmeas não são mais capazes de cobrir a prole em sua totalidade com seu corpo. Nesse caso, as fêmeas se posicionam centralmente acima 109 das larvas e ainda as defendem ativamente. Nesses estágios, a guarda da prole não é o mecanismo de defesa mais eficaz e, sim, mecanismos adquiridos pelas próprias larvas, como o escudo fecal e o comportamento gregário (VENCL et al., 2011; VENCL & SRYGLEY, 2013).

No estágio de pupa, assim como nos ovos, a guarda da fêmea é uma defesa fundamental contra formigas (VENCL & SRYGLEY, 2013). Sendo assim, o cuidado maternal tem sua maior importância nos estágios inativos dos imaturos e mais experimentos são necessários para verificar em que extensão o élitro mais expandido contribui para essa proteção.

A proporção da largura expansão/disco elitral, como foi codificado por nós, se mostrou um caráter bastante variável na árvore. No entanto, os grupos subsociais, assim como o gênero Echoma, possuem consistentemente expansões largas em proporção ao disco. No caso dos grupos subsociais, há de se testar se a expansão possui papel significativo no sucesso reprodutivo da sua prole. Como a largura do élitro é um caráter bastante variável em

Mesomphaliini, e provavelmente em Cassidinae como um todo, é possível que esta característica tenha facilitado o surgimento da subsocialidade e posteriormente sido positivamente selecionada pela eficiência na proteção aos ovos.

2.5.6. PREDADORES E PARASITÓIDES

Exposição a inimigos naturais (predadores ou parasitóides) pode favorecer a seleção do cuidado parental caso os pais sofram substancialmente menos a essa exposição em relação a sua prole (WONG et al., 2013). O cuidado maternal se mostrou extremamente eficiente na proteção de ovos e pupas contra predadores, especialmente formigas (VENCL & SRYGLEY,

2013). No entanto, a guarda não se mostrou efetiva em relação às moscas parasitóides

Eulophidae, que inclusive parasitam significantemente mais as massas de ovos guardadas pela fêmea em relação aos ovos em que a fêmea foi removida (VENCL & SRYGLEY, 2013). Com frequência é possível observar essas vespas pousadas nos élitros das fêmeas em guarda. Como já foi observado em Acromis sparsa, ovos com guarda são mais atacados por parasitóides, é 110 possível que a fêmea adulta funcione como um chamariz para as vespas, enquanto que a massa de ovos por si só não seja tão facilmente reconhecida. O cuidado maternal também se mostrou ineficaz contra parasitóides em percevejos Pentatomidae e Acanthosomatidae

(EBERHARD, 1975; KUDO, 1996) e besouros Chrysomelinae (KUDO & ISHIBASHI, 1996).

Como os parasitóides não possuem nenhum efeito sob o adulto, poderia se esperar o favorecimento da seleção do cuidado maternal nesse caso. Parasitóides, por sua vez, se mostraram como de menor importância em relação a outros inimigos naturais, mantendo uma taxa de mortalidade da prole mais ou menos estável (VENCL & SRYGLEY, 2013).

Diferentemente de formigas, que possuem a capacidade de eliminar uma prole inteira, e o fazem quando permitidas. Devido a uma certa especificidade de hospedeiro e de um ciclo de vida em que o hospedeiro é absolutamente necessário (CUIGNET et al., 2007), é mais interessante às vespas Eulophidae que mantenham uma taxa de parasitismo estável. 111

2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Por ser um dos poucos grupos que apresentam subsocialidade dentro de Coleoptera,

Cassidinae fornece um ótimo modelo de estudo evolutivo desse comportamento. A partir de nossa hipótese filogenética, que compreendeu todos os grupos subsociais de Cassidane, oferecemos a primeira proposta bem suportada acerca das origens da subsocialidade no grupo.

Filogenias com boa resolução e suporte são fundamentais para esse tipo de estudo. Revelamos duas origens da subsocialidade, ambas na tribo Mesomphaliini e cada uma com uma história evolutiva em uma planta hospedeira de famílias diferentes. As causas do surgimento da subsocialidade em Cassidinae certamente não estão ligadas a apenas um fator, mas sim a alguns. A escolha de planta hospedeira pode ter sido um dos gatilhos, mas não é o fator determinante. A forma do élitro, por sua vez, pode ser uma resposta a esse comportamento e não necessariamente uma característica preexistente que permitiu sua origem. Agora com uma filogenia bem suportada, estudos mais direcionados poderão ser realizados no sentido de desvendar o que pode estar por trás da origem deste comportamento tão interessante e complexo. 112

2.7. REFERÊNCIAS

Bonsall, M. B. & Klug, H. (2011). The evolution of parental care in stochastic environments. Journal of evolutionary biology 24(3): 645-655. Borowiec, L. & Świętojańska, J. (2019). World catalog of Cassidinae. Wrocław, Poland. http://www.cassidae.uni.wroc.pl/katalog%20internetowy/index.htm (Acessado em 15 de junho de 2019). Brandmayr, P. (1992). Short review of the presocial evolution in Coleoptera. Ethology Ecology & Evolution 4: 7-16.

Chaboo, C. S. (2001). Revision and Phylogenetic Analysis of Acromis Chevrolat (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae: Stolaini). The Coleopterists' Bulletin 55(1): 75-103.

Cornell, H. V., Hawkins, B. A. & Hochberg, M. E. (1998). Towards an empirically-based theory of herbivore demography. Ecological Entomology 23(3): 340-349.

Costa, J. T. (2018). The other insect societies: overview and new directions. Current opinion in insect science 28: 40-49.

Cuignet, M., Hance, T. & Windsor, D. M. (2007). Phylogenetic relationships of egg parasitoids (Hymenoptera: Eulophidae) and correlated life history characteristics of their Neotropical Cassidinae hosts (Coleoptera, Chrysomelidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 42(3): 573-584.

Eberhard, W. G. (1975). The ecology and behavior of a subsocial pentatomid bug and two scelionid wasps: strategy and counterstrategy in a host and its parasites. Smithsonian Contributions to Zoology 205: 1-39. 113

Fiebrig, K. (1910) Cassiden und Cryptocephaliden Paraguays. Ihre Entwicklungsstadien und

Schutzvorrichtungen. Zoologische Jahrbücher 12 (2): 161–264.

Flinte, V., Hentz, E., Morgado, B. M., Monte, A. C. M, Khattar, G., Monteiro, R. F. & Macedo, M. V. (2015). Biology and phenology of three leaf beetle species (Chrysomelidae) in a montane forest in southeast Brazil. ZooKeys (547): 119-132.

Gilbert, J. D. & Manica, A. (2015). The evolution of parental care in insects: a test of current hypotheses. Evolution 69(5): 1255-1270.

Gomes, P. A. (2018). História natural de Cassidinae Gyllenhaal, 1813 sensu stricto (Coleoptera: Chrysomelidae) na Floresta Nacional de Passa Quatro – MG. Tese de Doutorado, Universidade Federal de Lavras, Brasil.

Gomes, P. A., Prezoto, F. & Frieiro-Costa, F. A. (2012). Biology of Omaspides pallidipennis Boheman, 1854 (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). Psyche: A Journal of Entomology 2012: 1-8.

Halffter, G. & Edmunds, W. D. (1982). The Nesting Behavior of Dung Beetles (Scarabaeinae): An Ecological and Evolutionary Approach. Vol. 10. Xalapa, Veracruz, Mexico: Instituto de Ecologia. Hughes, W. O., Oldroyd, B. P., Beekman, M. & Ratnieks, F. L. (2008). Ancestral monogamy shows kin selection is key to the evolution of eusociality. Science 320(5880): 1213-1216.

Jordal, B. H., Sequeira, A. S. & Cognato, A. I. (2011). The age and phylogeny of wood boring weevils and the origin of subsociality. Molecular phylogenetics and evolution 59(3): 708-724.

Klug, H. & Bonsall, M. B. (2010). Life history and the evolution of parental care. Evolution 64(3): 823-835.

Kudo, S. I. (1996). Ineffective maternal care of a subsocial bug against a nymphal parasitoid: a possible consequence of specialization to predators. Ethology 102(2): 227-235.

Kudo, S. I. & Ishibashi, E. (1996). Maternal defence of a leaf beetle is not effective against parasitoids but is against pedestrian predators. Ethology 102(4): 560-567.

Lin, C. P., Danforth, B. N. & Wood, T. K. (2004). Molecular phylogenetics and evolution of maternal care in membracine treehoppers. Systematic Biology 53(3): 400-421.

Linksvayer, T. A. (2010). Subsociality and the evolution of eusociality. In Encyclopedia of 114

animal behavior (Vol. 3, pp. 358-362). Academic Press Oxford, UK.

Maddison, W. P. & Maddison, D. R. (2015). Mesquite: a modular system for evolutionary analysis. Version 3.04. – [http://mesquiteproject.org].

Monte, O. (1932). Alguns Cassidideos, pragas da batata doce. Boletim de Agricultura Zootechnica e veterinaria, Belo Horizonte 5(4): 43-46.

Nowak, M. A., Tarnita, C. E. & Wilson, E. O. (2010). The evolution of eusociality. Nature 466(7310): 1057-1062.

Ohaus, F. (1900). Bericht über eine entomologische Reise nach Centralbrasilien. Stettiner Entomologische Zeitung 61(7-12): 193-274.

Price, P. W. (1984). Insect Ecology. Wiley, New York.

Reid, C. A. M., Beatson, M. & Hasenpusch, J. (2009). The morphology and biology of Pterodunga mirabile Daccordi, an unusual subsocial Chrysomeline (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Natural History 43(7-8): 373-398.

Rodriguez, V. (1994). Sexual behavior in Omaspides convexicollis Spaeth and O. bistriata Boheman (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae), with notes on maternal care of eggs and young. The Coleopterists' Bulletin 48(2): 140-144.

Royle, N. J., Smiseth, P. T., Kölliker, M. (2012). The Evolution of Parental Care. Oxford: Oxford University Press.

Tallamy, D. W. & Brown, W. P. (1999). Semelparity and the evolution of maternal care in insects. Animal Behaviour 57(3): 727-730. 115

Tallamy, D. W. & Wood, T. K. (1986). Convergence patterns in subsocial insects. Annual review of entomology 31(1): 369-390.

Thorne, B. L. (1997). Evolution of eusociality in termites. Annual Review of Ecology and Systematics 28(1): 27-54.

Trumbo, S. T. (2013). Maternal care, iteroparity and the evolution of social behavior: a critique of the semelparity hypothesis. Evolutionary Biology 40(4): 613-626.

Tsai, J. F., Kudo, S. I. & Yoshizawa, K. (2015). Maternal care in Acanthosomatinae (Insecta: Heteroptera: Acanthosomatidae)—correlated evolution with morphological change. BMC evolutionary biology 15(1): 258.

Vencl, F. V. & Srygley, R. B. (2013). Enemy targeting, trade-offs, and the evolutionary assembly of a tortoise beetle defense arsenal. Evolutionary ecology 27(2): 237-252.

Vencl, F. V., Trillo, P. A. & Geeta, R. (2011). Functional interactions among tortoise beetle larval defenses reveal trait suites and escalation. Behavioral ecology and sociobiology 65(2): 227-239.

Wilson, E. O. (1971). The Insect Societies. Harvard University Press, Cambridge.

Wilson, E. O. (1975). Sociobiology: the New Synthesis. Cambridge, Massachusetts: Belknap Press.

Wilson, E. O., & Hölldobler, B. (2005). Eusociality: origin and consequences. Proceedings of the National Academy of Sciences 102(38): 13367-13371.

Windsor, D. M. (1987). Natural history of a subsocial tortoise beetle, Acromis sparsa Boheman (Chrysomelidae, Cassidinae) in Panama. Psyche: A Journal of Entomology 94(1-2): 127-150.

Windsor, D. M., Macêdo, M. V. & Siqueira-Campos, A. T. (1995). Flower feeding by species of Echoma Chevrolat (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae) on Mikania (Asteraceae) 116

in Panama and Brazil. The Coleopterists' Bulletin 49(2): 101-108.

Windsor, D. M., Riley, E. G., Stockwell, H. P. (1992). An introduction to the biology and systematics of Panamanian tortoise beetles (Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae). In: Quintero, D., Aiello, A., editors. Insects of panama and mesoamerica: selected studies. Oxford: Oxford University Press; p. 372–391.

Wong, J. W., Meunier, J. & Koelliker, M. (2013). The evolution of parental care in insects: the roles of ecology, life history and the social environment. Ecological Entomology 38(2): 123-137.

Yip, E. C. & Rayor, L. S. (2014). Maternal care and subsocial behaviour in spiders. Biological Reviews 89(2): 427-449.