Evaluación del efecto de algunos elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de Piper sp.

Laura Katherine Rodríguez Sánchez

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2019

Evaluación del efecto de algunos elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de Piper sp.

Laura Katherine Rodríguez Sánchez

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias - Biotecnología

Director: Ph.D. Oscar Javier Patiño Ladino Codirector: Ph.D. Xavier Marquínez Casas

Línea de Investigación: Biotecnología vegetal Grupo de Investigación: Química de Productos Naturales Vegetales Bioactivos Laboratorio de Biotecnología Vegetal

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2019

... y entonces, un día, llegó una criatura cuyo material genético no era muy diferente de las estructuras moleculares reproductoras de cualquier otra clase de organismos del planeta, que dicha criatura llamó Tierra. Pero era capaz de reflexionar sobre el misterio de su origen, de estudiar el extraño y tortuoso sendero por el cual había surgido desde la materia estelar. Era el material del Cosmos contemplándose a sí mismo. Consideró la enigmática y problemática cuestión de su futuro... Y ansió regresar a las estrellas

Carl Sagan

Resumen y Abstract VII

Agradecimientos

A la vida y a la infinidad del universo por este sublime planeta en el que tengo la oportunidad de vivir, de soñar, de crear y de amar. A la exuberante riqueza vegetal de la Tierra y en especial de este privilegiado país en el que tengo la fortuna de vivir, por inquietarme, inspirarme y motivarme a entenderla.

A mis padres, hermano y abuela, por su apoyo cada día de mi vida y en particular, durante el desarrollo de esta Maestría. Por su amor infinito, sus enseñanzas sobre diversos temas que comprenden la vida y su apoyo financiero.

A mi director de Tesis, el profesor Oscar Patiño, por sus enseñanzas, dedicación, paciencia, constancia y su confianza depositada en mi para el desarrollo de este y otros proyectos. Por su amor a la ciencia y tenacidad dispuesta en cada nuevo reto investigativo.

A mi codirector de Tesis, el profesor Xavier Marquínez, por su apoyo, dedicación y guía durante esta investigación. Por su constancia y admirable inquietud por entender la vida y desarrollo de las plantas.

A Juliet Prieto, por su apoyo, paciencia y fortaleza brindada a nivel profesional y personal no solo durante el desarrollo de este proyecto sino también de otros diversos retos a lo largo de mi vida. Por su especial cariño y dinamismo científico.

Al profesor Luis Enrique Cuca, líder del Grupo de investigación en Química de Productos Naturales Vegetales Bioactivos (QuiProNaB) de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá, por brindarme la oportunidad de hacer parte del grupo de investigación. Por sus enseñanzas, paciencia y confianza. Así mismo, a todos los integrantes del Laboratorio por acogerme como una familia y por su ayuda en diferentes etapas de esta investigación.

Contenido VIII

A la profesora Eddy Herrera de la Pontificia Universidad Javeriana por su asesoría en los análisis multivariados de los datos obtenidos mediante GC-MS relacionados con la evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos en suspensiones celulares de P. cumanense.

A Jorge Pérez por acompañarme todo este tiempo, por su ayuda en cada paso de esta investigación y por hacer parte de mi transformación como persona a lo largo de estos años. Por su ímpetu por entender la vida, su espíritu aventurero y explorador.

A Jorge Parra por los patrones de los compuestos y así como yo, por querer entender a través de sus investigaciones un poco más de la química de P. cumanense

A Mary Santamaría por su especial colaboración en el proceso de extracción y análisis cromatográfico de las muestras. Por su confianza y amistad.

A Sebastián Sánchez por su grandiosa ayuda en parte de los análisis estadísticos. Por su incondicional apoyo, por hacer tan agradables mis días y por su excepcional amor.

A la Sede Medellín de la Universidad Nacional de Colombia por aportar en mi formación a nivel de posgrado, a los profesores y administrativos que contribuyeron de distintas maneras en el desarrollo de este trabajo.

A los proveedores del material de laboratorio y reactivos químicos y, particularmente a Luis Puentes por haber sido siempre tan diligente en la entrega del material necesario para el desarrollo de los experimentos.

A la Universidad Nacional de Colombia por mi formación tanto profesional como personal y por convertirse en los últimos años en mi hogar. Por la financiación a través de la Convocatoria del Programa Nacional de Proyectos para el Fortalecimiento de la Investigación, la Creación y la innovación en Posgrados 2013-2015, Modalidad 1, código 28213.

Contenido IX

A la Pontificia Universidad Javeriana por el préstamo de equipos y algunas instalaciones. En especial al Laboratorio de Bioensayos y al Laboratorio de Biomoléculas, a los profesores Juliet Prieto, Ricardo Vera y Geison Costa.

A Colciencias por mi financiación a través del Programa Nacional de Jóvenes investigadores convocatoria 645 de 2014.

A Colciencias por la financiación a través del Programa Nacional en Ciencias Básicas, convocatoria 745 de 2016, Modalidad 1 con contrato No. 380-2016 y código 110171250886.

Contenido XI

Resumen

Una de las principales limitantes en la investigación de los metabolitos secundarios aislados de plantas es la baja concentración producida en los organismos lo que dificulta la realización de investigaciones que generen aplicaciones a nivel industrial. El cultivo de células en suspensión proporciona una alternativa renovable, sostenible y respetuosa con el ambiente para incrementar la producción de estos compuestos bajo condiciones controladas. Una especie de interés de la que se han aislado en baja concentración sustancias con promisoria actividad antifúngica y antiparasitaria es Piper cumanense (Piperaceae), haciéndose importante emplear estrategias para obtener mayores cantidades de sus sustancias bioactivas. Dado el interés del grupo en los constituyentes químicos provenientes de P. cumanense, en la presente investigación se exploraron estrategias biotecnológicas para su producción en condiciones controladas mediante el establecimiento de algunas condiciones favorables de cultivos in vitro (inducción de callos y suspensiones celulares) y la evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de algunos metabolitos secundarios. Este trabajo comprendió el establecimiento de condiciones para la formación de callos a través del uso de reguladores de crecimiento vegetal en diferentes explantes (lámina y pecíolo) de plántulas germinadas in vitro. Posteriormente, se determinaron condiciones para el crecimiento de células en suspensión al utilizar callos friables, evaluando su acondicionamiento al medio líquido y el crecimiento de diferentes inóculos iniciales. Finalmente, se estableció el efecto de jasmonato de metilo (MeJA) y ácido salicílico (SA) como elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de P. cumanense. En el establecimiento de condiciones para callogénesis se encontró que para la germinación in vitro de las semillas y posterior obtención de plántulas, es favorable para la esterilización hacer lavados previos con detergente y mayores tiempos de exposición con hipoclorito (10 min). El porcentaje de germinación se vio incrementado al usar AG3 (0.02 mg/L) en medios MS y al reducir el tiempo de siembra después de su recolección en campo. Los ensayos realizados con diferentes explantes (pecíolos y láminas) y diferentes combinaciones de auxina y citoquinina, permitieron determinar que el uso de pecíolo y una combinación de 2,4-D (1 mg/ L) y BAP (0,5 mg/L) produjeron los mejores callos friables. Los resultados de los estudios de actividad metabólica, cambios de acidez, producción de biomasa y cambio de Contenido XII color de las suspensiones celulares demostraron que hacer un recambio de medio 15 días después de establecidas las suspensiones permite mantener las células en un mejor estado fisiológico. Se estableció la curva de crecimiento de suspensiones con un inóculo de 90 g/L, obteniendo una tasa de crecimiento de 0,1097 ± 0,001477 día -1, un tiempo de duplicación de 6,319 días y una producción de biomasa favorable para los análisis cromatográficos. Finalmente, se determinó el efecto los elicitores MeJA y SA (10 y 100 µM) en la producción de metabolitos en extractos de células y medios de suspensiones celulares elicitadas encontrando una producción diferencial debida al efecto de estos inductores, apreciándose mayores cambios en el perfil al emplear SA. La expresión diferencial de los metabolitos secundarios fue más evidente en los medios de cultivo, destacándose los tratamientos con SA 100 µM, donde se logró una producción alta de los compuestos 5-hidroximetilfurfural (6,3%), fenol (6,5%) y (Z)-9-octadecenamida (8,8%), identificados tentativamente por GC-MS, y que fueron determinados como las variables de mayor peso en el análisis ACP. Con los elicitores empleados no se logró la producción de los metabolitos secundarios aislados previamente de P. cumanense. Las condiciones de cultivo in vitro establecidas pueden servir de base para la aplicación de diferentes estrategias para el aumento de la producción de metabolitos en P. cumanense y para el desarrollo de estudios biosintéticos.

Palabras clave: Piper, germinación in vitro, callogénesis, suspensiones celulares, elicitación, jasmonato de metilo, ácido salicílico. Contenido XIII

Evaluation of the effect of some elicitors on the production of secondary metabolites in cell suspensions of Piper sp.

Abstract

One of the main limitations in research of secondary metabolites from plants is the low concentration produced in organisms, which makes difficult to carry out applications at industrial level. The suspension cell culture provides a renewable, sustainable and environmentally friendly alternative to increase the production of these compounds under controlled conditions. Piper cumanense (Piperaceae) is a species of interest from which have been isolated substances with promising antifungal and antiparasitic activity. However, these compounds have been obtained in low concentration, being important to search strategies to obtain greater amounts of bioactive substances. Given the interest of the research group in the chemical constituents from P. cumanense, this research explores biotechnological strategies for their production under controlled conditions by establishing some favorable culture conditions in vitro (induction of callus and cell suspensions) and the evaluation of the effect of elicitors on the production of some secondary metabolites. This work includes the establishment of conditions for callus formation using plant growth regulators in different explants (lamina and petiole) of germinated seedlings in vitro. Subsequently, the conditions for the growth of cells in suspension are determined by using friable callus, evaluating their conditioning to the liquid medium and the growth of different initial inoculums. Finally, it was evaluated the effect of methyl jasmonate (MeJA) and salicylic acid (SA) as elicitors on the production of secondary metabolites in cell suspensions of P. cumanense. In the establishment of conditions for callogenesis it was found that for in vitro germination of the seeds and subsequent obtaining of seedlings, it is favorable for sterilization to do previous washings with detergent and longer exposure times with hypochlorite (10 min). The germination percentage was increased by using AG3 (0.02 mg / L) in MS media and reducing planting time after harvesting in the field. The tests carried out with different explants (petioles and sheets) and different combinations of auxin and cytokinin, allowed to determine that the use of petiole and a combination of 2,4-D (1 mg/L) and BAP (0.5 mg/L) produced the best friable corns. The results of the studies of metabolic activity, acidity changes, biomass production and color change of the cell suspensions Contenido XIV showed that making a change of media 15 days after the establishment of the suspensions allowed to keep the cells in a better physiological state. The suspension growth curve was established with an inoculum of 90 g/L, obtaining a growth rate of 0.1097 ± 0.001477 day - 1, a doubling time of 6.319 days and a favorable biomass production for the analyzes chromatographic Finally, the effect of elicitors MeJA and SA (10 and 100 µM) on the production of metabolites in extracts of cell and media from elicited cell suspension was determined, finding a differential production due to the effect of these inducers, appreciating greater changes in the profile at employ SA. The differential expression of secondary metabolites was more evident in the culture media, highlighting the treatments with 100 µM SA, where a high production was achieved of 5-hydroxymethylfurfural (6.3%), phenol (6.5%) and (Z) -9-octadecenamide (8.8%)., tentatively identified by GC-MS, and which were determined as the variables of greatest weight in the PCA analysis. With the elicitors used, the production of the secondary metabolites previously isolated from P. cumanense was not achieved. The established in vitro culture conditions can serve as a basis for the application of different strategies for increasing the production of metabolites in P. cumanense and for the development of biosynthetic studies.

Keywords: Piper, in vitro germination, callogenesis, plant cell suspensions, elicitation, methyl jasmonate, salicylic acid.

Contenido XV

Contenido

Pág.

1. Estado actual del tema ...... 7 1.1 Importancia y limitaciones en el estudio de los metabolitos secundarios ...... 7 1.2 Estrategias biotecnológicas para la producción de los metabolitos secundarios11 1.3 Generalidades del género Piper (Piperaceae) ...... 14 1.4 Generalidades de la especie Piper cumanense ...... 21

2. Objetivos ...... 25 2.1 Objetivo general ...... 25 2.2 Objetivos específicos ...... 25

3. Metodología ...... 27 3.1 Establecimiento de condiciones para callogénesis ...... 27 3.1.1 Recolección de material vegetal ...... 27 3.1.2 Evaluación de protocolos para la esterilización superficial de las semillas ..... 27 3.1.3 Germinación in vitro ...... 28 3.1.4 Inducción de callos friables ...... 29 3.2 Establecimiento de suspensiones celulares ...... 30 3.2.1 Evaluación del acondicionamiento de las suspensiones celulares ...... 30 3.2.2 Evaluación del tamaño de inóculo en el crecimiento de células en suspensión ...... 33 3.3 Evaluación de la producción de metabolitos en suspensiones celulares elicitadas ...... 34 3.3.1 Elicitación de suspensiones celulares ...... 34 3.3.2 Estudio de la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares empleando UHPLC-DAD y GC-MS ...... 35

4. Resultados y discusión ...... 39 4.1 Establecimiento de condiciones para callogénesis ...... 39 4.1.1 Evaluación de protocolos para la esterilización superficial de las semillas ..... 39 4.1.2 Germinación in vitro ...... 41 4.1.3 Inducción de callos friables ...... 42 4.2 Establecimiento de suspensiones celulares ...... 53 4.2.1 Acondicionamiento de las suspensiones celulares ...... 53 4.2.2 Evaluación del tamaño de inóculo sobre el crecimiento de células en suspensión ...... 56 4.3 Efecto de la elicitación de suspensiones celulares en la producción de metabolitos secundarios ...... 59 Contenido XVI

4.3.1 Cromatografía líquida (UHPLC-DAD) ...... 59 4.3.2 Cromatografía de gases (GC-MS) ...... 69

5. Conclusiones y recomendaciones ...... 87 5.1 Conclusiones ...... 87 5.2 Recomendaciones ...... 89

Contenido XVII

Lista de figuras

Figura 1-1. Caracteres morfológicos de la familia Piperaceae...... 15 Figura 1-2. Distribución mundial del género Piper...... 16 Figura 1-3. Metabolitos secundarios aislados de Piper...... 19 Figura 1-4. Morfología de P. cumanense...... 22 Figura 3-1. Diseño de la evaluación del acondicionamiento en suspensiones celulares. 31 Figura 3-2. Metodología utilizada para la elicitación de suspensiones celulares con MeJA y SA...... 34 Figura 4-1. Porcentaje de contaminación tras la siembra in vitro de semillas esterilizadas superficialmente con tres protocolos...... 40 Figura 4-2. Porcentajes de germinación de semillas de P. cumanense bajo la influencia de diferentes tiempos de siembra después de su recolección y medios de cultivo (MS con y sin adición de AG3)...... 41 Figura 4-3. Análisis de componentes principales mostrando el efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfológica en pecíolo y láminas...... 52 Figura 4-4. Respuestas morfológicas obtenidas en lámina luego de exponerla ante diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D...... 46 Figura 4-5. Respuestas morfológicas obtenidas en pecíolo luego de exponerla ante diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D...... 51 Figura 4-6. Viabilidad, crecimiento y cambios de acidez durante el acondicionamiento de suspensiones celulares de P. cumanense...... 54 Figura 4-7. Suspensión con el mismo medio inicial y suspensión con recambio luego de 30 días de cultivo...... 56 Figura 4-8. Curvas de crecimiento de suspensiones con concentraciones celulares de 50 g/L y 90 g/L...... 57 Figura 4-9. Perfiles cromatográficos por UHPLC-DAD de células de suspensiones control y elicitadas con SA y MeJA a las concentraciones de 10 µM y 100 µM...... 61 Figura 4-10. Desviación estándar de los picos seleccionados en las muestras control y elicitadas de células...... 63 Figura 4-11. Perfiles cromatográficos por UHPLC-DAD de medios en suspensión elicitadas con SA y MeJA. a las concentraciones de 10 µM y 100 µM...... 64 Figura 4-12. Desviación estándar de los picos seleccionados en las muestras control y elicitadas de medios...... 67 Figura 4-13. ACP de las áreas relativas de los metabolitos identificados tentativamente en extractos de células y medio de suspensiones control y elicitadas...... 79 Figura 4-14. Diagramas de Venn con la distribución de los metabolitos en extractos de células y medio de cultivo...... 80 Contenido XVIII

Figura 4-15. ACP de extractos de células de suspensiones control y elicitadas...... 82 Figura 4-16. ACP de extractos de medio de suspensiones control y elicitadas...... 83 Figura 4-17. Mapa de calor de extractos de células y medio de suspensiones control y elicitadas...... 85

Contenido XIX

Lista de tablas

Tabla 4-1. Efecto de diferentes combinaciones de BAP y 2,4-D en la organogénesis y callogénesis al emplear láminas de P. cumanense como explantes...... 43 Tabla 4-2. Efecto de diferentes combinaciones de BAP y 2,4-D en la organogénesis y callogénesis al emplear pecíolos de P. cumanense como explantes ...... 47 Tabla 4-3. Parámetros cinéticos de crecimiento en suspensiones celulares de distintas especies vegetales ...... 58 Tabla 4-4. Tiempos de retención y máximos de absorción de picos seleccionados en los perfiles de células y de patrones de P. cumanense analizados por UHLPC...... 62 Tabla 4-5. Tiempos de retención y máximos de absorción de picos seleccionados en los perfiles de medios y de patrones de P. cumanense analizados por UHLPC...... 66 Tabla 4-6. Metabolitos de extractos de células provenientes de suspensiones control y elicitadas, analizados e identificados tentativamente mediante GC-MS...... 70 Tabla 4-7. Metabolitos de extractos de medios provenientes de suspensiones control y elicitadas, analizados e identificados tentativamente mediante GC-MS...... 74

Contenido XX

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviatura Término ~ Alrededor de °C Grados Celsius β Beta µg Microgramo µL Microlitro µM Micromolar

µmáx Velocidad específica máxima de crecimiento µm Micometro 2,4-D Ácido 2,4- diclorofenoxiacético AG3 Ácido giberélico ACP Análisis de componentes principales AIA Ácido indol-3-acético AIB Ácido indol-3-butírico AMV Análisis multivariado ANA Ácido naftalenacético ANOVA Análisis de varianza BA 6-benciladenina CI50 Concentración inhibitoria 50 CL50 Concentración letal 50 CMI Concentración mínima inhibitoria DICAMBA Ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico ESM Error estándar de la media Prueba de la inhibición de la biomineralización con FBIT ferriprotoporfirina (FP) IX FcB2 Plasmodium falciparum resistente a cloroquina FP Ferriprotoporfirina g Gramo

GABAARs Receptores tipo A del ácido γ-Aminobutírico Contenido XXI

Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de GC-MS masas Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a HPLC-MS/MS espectrometría de masas In Logaritmo natural IS Índice de similitud L Litro LC50 Concentración letal 50 m Metros MeJA Jasmonato de metilo MeOH Metanol mg Miligramo min Minutos mL Mililitro MS Murashige & Skoog No. Número P1 Protocolo 1 de desinfección P2 Protocolo 2 de desinfección P3 Protocolo 3 de desinfección PDVF Polímero de difloruro de polivinildina rpm Revoluciones por minuto SA Ácido salicílico sp. Especie spp. Especies t Tiempo TDZ Tidiazuron TR Tiempo de retención UHPLC Cromatografía líquida de ultra-alta resolución Cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a UHPLC-DAD detector de arreglo de diodos x Biomasa Promedio

Introducción

Los productos naturales se han utilizado por miles de años para el beneficio de la humanidad ya sea como alimentos o como fuente de materias primas para diversos fines. Por ejemplo, a nivel medicinal son usados en el tratamiento y prevención de enfermedades, a nivel agronómico para el control de diversos tipos de plagas, en la industria alimentaria como colorantes y saborizantes, y en la industria cosmética como fragancias, colorantes y antioxidantes. Dada la amplia aplicabilidad de los productos naturales y que aún existen muchas especies por explorar en la naturaleza, las investigaciones en este campo son cada vez más numerosas (Che & Zhang, 2019; Kessler & Kalske, 2018).

Los responsables de la actividad biológica de los productos naturales son los metabolitos primarios y secundarios, moléculas derivadas del conjunto de reacciones bioquímicas que ocurren en las células y que cumplen funciones vitales y adaptativas en los organismos. Particularmente, los metabolitos secundarios representan una amplia variedad de compuestos químicos que cumplen funciones ecológicas específicas, como lo son: protección frente a patógenos, atracción de polinizadores y dispersores de semillas y, producción de aleloquímicos que generan un efecto de inhibición o estimulación del crecimiento en los organismos receptores. Estos compuestos se suelen producir como respuesta a un estímulo que cause un estrés, bien sea, de tipo biótico o abiótico. La producción de estos metabolitos depende de las características genéticas propias de cada especie y del tipo de estrés al que sea sometida, ocasionando como un mecanismo de respuesta la expresión algunos genes que codifican para la producción de las enzimas involucradas en la síntesis de metabolitos secundarios (Delgoda & Murray, 2017; Kessler & Kalske, 2018; Kooke & Keurentjes, 2012).

Dentro de los productos naturales, las plantas son las más estudiadas debido a que forman parte de todos los ecosistemas y a que se han adaptado a diversos climas y condiciones del suelo, lo que les ha conferido la capacidad de producir millares de metabolitos secundarios con diversas aplicaciones. Sin embargo, a pesar de que muchas sustancias Introducción 2 han sido aisladas e identificadas en distintos grupos de plantas, aún existen muchas a las cuales no se les ha realizado ningún tipo de estudio fitoquímico, razón por la cual varias de ellas pueden ser fuente de nuevos compuestos con potencial aplicación a nivel, farmacéutico, agroquímico y alimenticio, entre otros. Algunos ejemplos de metabolitos secundarios utilizados en la industria son, la ajmalicina, un alcaloide carbonílico aislado de la especie Catharanthus roseus (Apocynaceae) que es el principio activo de varios medicamentos antihipertensivos; los edulcorantes denominados esteviósidos, que son diterpenos glicosidados presentes en Stevia rebaudiana (Asteraceae); y limonoides como la azadiractina presentes en extractos de Azadirachta indica (Meliaceae) usados a nivel agrícola como insecticida y antialimentario (Delgoda & Murray, 2017; Naeem, Aftab, & Khan, 2017; Sharma, Walia, & Kumar, 2016; Zanuncio et al., 2016).

Las investigaciones enfocadas en el estudio de metabolitos secundarios suelen presentar algunas limitaciones, entre las que se encuentran: obtención de metabolitos en bajas cantidades, procesos extractivos y de purificación en muchos casos costosos, y composición química de plantas en ocasiones muy variable y dependiente de factores genéticos, ontogenéticos y/o externos de cada especie. Dichos aspectos han dificultado el desarrollo de estudios científicos más específicos que permitan identificar sustancias con valor productivo para una aplicación particular, quedándose la mayoría de las investigaciones en etapas preliminares (Saurabh Bhatia & Bera, 2015; Yun et al., 2012a).

Algunas de las estrategias para solventar estas limitaciones son: domesticación de especies silvestres y tecnificación de los cultivos, diseño y desarrollo de métodos sintéticos, y el uso de estrategias biotecnológicas. Las herramientas biotecnológicas ofrecen una gran variedad de ventajas, entre las que se encuentran: posibilidad de tener rendimientos de producción de los metabolitos de interés superiores a los obtenidos a partir de plantas silvestres, producción permanente bajo condiciones controladas en cultivos libres de patógenos e independientes de condiciones climáticas, edafológicas y/o geopolíticas y, puede ser en algunos casos técnicas más rápidas, sencillas, eficientes y de menor costo frente a otras estrategias (síntesis química o extracción a partir de cultivos tecnificados) (Saurabh Bhatia & Bera, 2015; Gandhi, Mahajan, & Bedi, 2014; Niranjana, Lee, & Paek, 2014).

Entre las herramientas biotecnológicas se destacan las suspensiones celulares, las cuales Introducción 3 se caracterizan por ser cultivos in vitro de células en medio líquido bajo agitación continua en la que se emplean células denominadas callo, donde dichos callos, de preferencia friables, son inducidos en laboratorio mediante la aplicación de reguladores de crecimiento que desencadenan selectivamente procesos morfogenéticos, fisiológicos y bioquímicos en los tejidos vegetales. En este tipo de cultivos se han utilizado varias estrategias para estimular la producción de metabolitos secundarios, tales como: adición de precursores, biotransformación, transformación genética y elicitación, siendo esta última la más utilizada y efectiva para inducir a gran escala la biosíntesis de compuestos de interés (Saurabh Bhatia & Bera, 2015; Niranjana et al., 2014; Ochoa-Villareal et al., 2016).

La elicitación hace referencia a la inducción de la biosíntesis de metabolitos mediante elicitores, los cuales son factores bióticos como microorganismos, extractos de hongos, oligosacáridos, compuestos químicos como jasmonato de metilo, ácido salicílico, ciclodextrinas, y/o abióticos como cambios de fotoperíodo, radiación y temperatura, entre otros. Estos elicitores estimulan receptores presentes en las células de las plantas y de esta manera, activan respuestas de defensa que pueden generar un aumento en la producción de ciertas enzimas implicadas en la obtención de determinados metabolitos secundarios (Narayani & Srivastava, 2017; Yue et al., 2016). Por ejemplo, cultivos celulares de Lithospermum erythrorhizon optimizados con elicitores como jasmonato de metilo, etileno, reguladores de crecimiento, entre otros, han mostrado una productividad de shikonina, pigmento muy utilizado a nivel industrial, de incluso 800 veces mayor respecto a plantas cultivadas. Suspensiones de Ammi majus elicitadas con extracto de la bacteria Enterobacter sakazaki han presentado un rendimiento 90 veces mayor respecto a suspensiones sin tratamiento en la producción de umbelliferona. Cultivos celulares de Gymnema sylvestre elicitados con extractos de los hongos endófitos Polyancora globosa y Xylaria sp. aumentaron 10 veces la producción de ácido gimnémico, compuesto con propiedades hepatoprotectivas y antiinflamatorias y útil para la reducción de lípidos. Suspensiones de Salvia miltiorrhiza elicitadas con ácido salicílico presentaron un aumento de hasta 10 veces en la producción de compuestos fenólicos, estableciéndose que dichos cultivos podrían usarse para la obtención a gran escala de ácido salvianólico B y ácido cafeico (Netala, Kotakadi, Gaddam, Ghosh, & Tartte, 2016; Staniszewska, Królicka, Maliński, Łojkowska, & Szafranek, 2003; Yazaki, 2017).

Introducción 4

El grupo de Investigación "Química de Productos Naturales Vegetales Bioactivos" (QuiProNaB) perteneciente al departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá, ha enfocado sus investigaciones para realizar aportes al conocimiento químico y propiedades biológicas de los metabolitos secundarios presentes en especies de las familias Myristicaceae, Rutaceae, Lauraceae y Piperaceae, principalmente. A pesar de los importantes aportes realizados por el grupo en el campo de la fitoquímica colombiana, las bajas cantidades de metabolitos aislados por métodos fitoquímicos clásicos ha dificultado llevar a cabo estudios más avanzados de investigación aplicada que permitan encontrar soluciones plausibles a problemas medicinales, agrícolas o industriales.

Es por esto, que en conjunto con el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia- Sede Bogotá, el cual se ha caracterizado por ser uno de los grupos pioneros en el cultivo de tejidos vegetales in vitro en Colombia, se están desarrollando estrategias desde la biotecnología vegetal que permitan obtener mayores cantidades del producto de interés a partir de los cultivos in vitro de células vegetales. Una de las especies prometedoras que ha estudiado nuestro equipo de investigación corresponde a Piper cumanense, de la cual se han aislado principalmente terpenos y derivados de ácido benzoico, en donde algunos de ellos presentaron promisoria actividad antifúngica in vitro sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, molusquicida contra caracoles adultos del género Biomphalaria, y extractos etanólicos de hojas e inflorescencias presentaron actividad antimalárica contra Plasmodium falciparum (FcB2) (Garavito et al., 2006; J. E. Parra, Delgado, & Cuca, 2011; J. E. Parra, Patiño, Prieto, Delgado, & Cuca, 2013; Rapado et al., 2014).

A pesar del gran potencial de aplicabilidad de los metabolitos secundarios presentes en P. cumanense, problemas relacionados con la baja cantidad de los metabolitos aislados, han limitado la realización de ensayos de actividad más específicos que permitan validar el uso de dichas sustancias. Por lo tanto, se hace evidente la necesidad de desarrollar estrategias que permitan obtener mayores cantidades de los compuestos deseados.

Teniendo en cuenta lo anterior, esta investigación tiene como objetivo contribuir a las investigaciones en la familia Piperaceae mediante el establecimiento de algunas condiciones para el cultivo in vitro (inducción de callos y suspensiones celulares) y la Introducción 5 evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en la especie Piper cumanense.

1. Estado actual del tema

1.1 Importancia y limitaciones en el estudio de los metabolitos secundarios

Todos los organismos vivos llevan a cabo procesos de transformación e interconversión de moléculas necesarias para la vida a través de rutas metabólicas específicas mediadas por una red integrada de enzimas. Aquellas moléculas involucradas en procesos esenciales para vivir se conocen como metabolitos primarios e incluyen, por ejemplo, carbohidratos, proteínas, ácidos grasos y ácidos nucleicos. Estos metabolitos hacen parte del metabolismo primario y participan en diferentes procesos biológicos, los cuales son necesarios para el funcionamiento celular. Por otro lado, algunos grupos de organismos, como las plantas, producen sustancias conocidas como metabolitos secundarios. Estos metabolitos, derivados del metabolismo primario, cumplen principalmente funciones ecológicas involucradas en procesos adaptativos y selectivos, no son esenciales para el desarrollo de los organismos y tienen distribución taxonómica restringida, es decir, estos compuestos se producen de manera diferencial en familias, géneros y especies (Anulika, Ignatius, Raymond, Osasere, & Hilda, 2016; Delgoda & Murray, 2017; Kessler & Kalske, 2018).

A nivel ecológico, los metabolitos secundarios tienen un papel fundamental en las plantas pues, actúan como un sistema de defensa contra herbívoros y patógenos al desencadenar repelencia o toxicidad en otros organismos. Además, desempeñan un rol muy importante en la reproducción de las angiospermas (plantas con flor) al favorecer la atracción de polinizadores mediante compuestos volátiles que otorgan aromas característicos a las flores y, permiten una comunicación química con insectos o mamíferos polinizadores. Estos compuestos también actúan como aleloquímicos, es decir, como moléculas que al ser liberadas por las plantas hacia el medio ambiente afectan el crecimiento y/o desarrollo de otras plantas a su alrededor, compitiendo así, por recursos de interés para su Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 8 supervivencia. De esta manera, la producción de metabolitos secundarios en las plantas es fundamental para afrontar los desafíos a los que se ven expuestas en un contexto ecológico brindando protección, aumentando las posibilidades de reproducción y perpetuación de la especie y, otorgando ventajas adaptativas en la competencia por recursos como luz, espacio o nutrientes frente a otras plantas (Agrawal & Weber, 2015; Anulika et al., 2016; Blum, 2019; Delgoda & Murray, 2017; Grajales-Conesa, Meléndez- Ramírez, & Cruz-López, 2011; Nobler et al., 2018).

La biosíntesis de estos compuestos depende de las características genéticas de la especie y, de la activación de los genes involucrados en su producción, la cual es ocasionada generalmente, como respuesta a un estímulo que genera algún tipo de estrés, bien sea biótico, como lo es el daño físico en tejidos vegetales producido por patógenos, o abiótico, como lo son cambios drásticos en temperatura, pH o luz. Estos estímulos son percibidos a nivel celular por receptores que se encuentran en la membrana plasmática y en el citosol, los cuales desencadenan la activación de mensajeros que amplifican la señal y estimulan la expresión génica que conlleva a la acumulación de metabolitos secundarios. Estos compuestos pueden producirse y acumularse en diferentes órganos de las plantas dependiendo de sus interacciones con el medio (por ejemplo, en flores para atracción de insectos o en hojas para defensa contra herbívoros) y, en momentos determinados que pueden depender del ritmo circadiano de la especie o de su fenología (Kessler & Kalske, 2018; Kooke & Keurentjes, 2012; Matsuura et al., 2017; Ramirez-Estrada et al., 2016).

La diversidad de metabolitos secundarios producidos por las plantas es enorme sumando hoy en día alrededor de 200.000 moléculas aisladas e identificadas; sin embargo, se estima que el número puede ser mucho mayor, esto debido a que solo entre el 15 al 20% de las aproximadamente 390.000 especies vegetales se le han realizado estudios fitoquímicos, desconociendo aún una gran variedad de metabolitos. La importancia de investigar estos constituyentes químicos de las plantas radica en la aplicabilidad que tienen estas moléculas en diversas industrias, como la farmacéutica, cosmética, agroquímica y alimentaria y, en la gran cantidad de especies aún no estudiadas que pueden ser fuente potencial de nuevos compuestos (Anulika et al., 2016; Kessler & Kalske, 2018; Royal Botanical Garden & Kew, 2017).

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 9

Algunos ejemplos de metabolitos secundarios utilizados en las industrias mencionadas son: En la industria farmacéutica, la vinblastina, un alcaloide que ha sido aislado de Cathanrantus roseus (Apocynaceae) y que es usado para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer como la enfermedad de Hodgkin, tumores testiculares y cáncer de mama, entre otros; y, la codeína y la morfina, alcaloides extraídos de Papaver somniferum (Papaveraceae) empleados como analgésicos. En la industria cosmética, la curcumina, un compuesto fenólico obtenido de Curcuma longa (Zingiberaceae), se utiliza para la prevención y tratamiento de la psoriasis, acné y quemaduras de piel; y, la glicirricina, una saponina aislada de Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), se usa en el tratamiento de quemaduras ocasionadas por el sol e irritaciones de piel debido a sus propiedades antiinflamatorias. En la industria agroquímica, la azadiractina, un terpeno obtenido de Azaradichta indica (Meliaceae), es utilizado como un pesticida de origen natural para el control de plagas; y, el aceite esencial del eucalipto, Eucalyptus spp. (Myrtaceae), cuyos constituyentes mayoritarios son los terpenos 1,8-cineol y α-pineno, se emplea como repelente e insecticida. En la industria alimentaria, los esteviósidos de Stevia rebaudiana (Asteraceae) son usados como edulcorantes y, extractos de Trigonella foenum-graecum (Fabaceae), ricos en diosgenina (saponina), son empleados como nutracéuticos por sus propiedades antioxidantes, antidiabéticas y anticancerígenas (Aburjai & Natsheh, 2003; Barrales-Cureño et al., 2019; Batish, Pal, Kumar, & Kaur, 2008; Kessler & Kalske, 2018; Miresmailli & Isman, 2014; Siddiqui, Hareramdas, Abbas, Parween, & Nasir, 2018).

Como se aprecia, la aplicabilidad de los metabolitos secundarios de plantas es muy diversa; sin embargo, aunque estas moléculas son usadas en productos que se encuentran en el mercado; su obtención y el uso de nuevos compuestos aislados de fuentes vegetales enfrenta varias limitaciones: La producción de estos metabolitos suele presentarse en bajas cantidades, su biosíntesis puede generarse únicamente en algunos órganos (hojas, flores o raíces), en determinados estados fenológicos (vegetativo o reproductivo), depender del ciclo circadiano de la especie, de su genética, de su ubicación geográfica o de los factores de estrés a los que sean sometidas. La extracción y purificación de estos metabolitos en muchos casos es costosa, puede implicar bastante tiempo y generar residuos tóxicos. Además, debido a la complejidad de algunas estructuras, como el taxol, la síntesis o semisíntesis de estos compuestos puede ser dificultosa, así como producir desechos tóxicos. Estos aspectos muchas veces limitan el desarrollo de investigaciones más detalladas enfocadas a explorar la potencialidad de metabolitos de interés y dificultan Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 10 su escalado para producción a nivel industrial (Gandhi et al., 2014; Matsuura et al., 2017; Yun et al., 2012b).

Existen varias estrategias que se han desarrollado para solucionar estas limitaciones, entre las que se encuentran: El cultivo de plantas en parcelas o en invernaderos, este sistema tiene la ventaja de que su implementación es más económica respecto a las otras estrategias que se mencionarán más adelante; sin embargo, la extracción de los compuestos de interés suele tener bajos rendimientos y a veces su purificación puede ser complicada; por lo tanto, se requiere cultivar una gran cantidad de plantas, lo que implica contar con grandes extensiones de terreno que conlleven a obtener la cantidad de compuesto deseado. Además, la producción de los metabolitos secundarios depende de las condiciones climáticas, de la genética de las plantas, de su estado fenológico, de su susceptibilidad a patógenos y de su capacidad para crecer en monocultivos, para lo cual, se requiere el uso de determinados fertilizantes y pesticidas que favorezcan su crecimiento (Matsuura et al., 2017; Wróbel, Dreger, Wielgus, & Slomski, 2017).

La síntesis o semi-síntesis es otra estrategia utilizada para producir los metabolitos secundarios de interés, tiene la ventaja de que la producción de las moléculas no depende de un sistema vivo sino de la capacidad de obtener estos compuestos en el laboratorio; sin embargo, debido a la complejidad de algunas moléculas los pasos de síntesis o semi- síntesis pueden ser complejos y largos y no siempre se logran obtener los compuestos deseados, se suele generar una gran cantidad de desechos tóxicos y se requiere de personal altamente calificado, lo que eleva su costo (Gary et al., 2018; Wilson & Roberts, 2012).

La biotecnología vegetal, es otra de las estrategias empleadas para atender las limitaciones de la producción de metabolitos secundarios, en este caso, tejidos diferenciados de plantas o células indiferenciadas denominadas callos son cultivados a nivel in vitro en biorreactores donde se induce mediante varias técnicas (elicitación, optimización de medios, adición de precursores, entre otros) la producción de metabolitos de interés. Esta estrategia tiene varias ventajas, entre ellas, que el cultivo de tejidos y células no es dependiente de condiciones climáticas, edafológicas o geográficas; los rendimientos en la producción de los compuestos son más homogéneos pues el cultivo se realiza en condiciones controladas y, los tiempos de obtención de los metabolitos son Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 11 mucho más cortos que en plantas de campo (semanas frente a meses). Sin embargo, enfrenta algunas limitaciones, tales como, variabilidad en la producción de los compuestos en diferentes líneas celulares, dificultad en la obtención o en el aumento de la producción de compuestos de interés en algunas especies y, su implementación puede tener un costo elevado (Saurabh Bhatia & Bera, 2015; Matsuura et al., 2017).

1.2 Estrategias biotecnológicas para la producción de los metabolitos secundarios

La biotecnología vegetal constituye un conjunto de técnicas de diferentes disciplinas (biología, química, ingeniería, entre otras) que buscan a través de la manipulación de plantas, tejidos o células vegetales el desarrollo de conocimiento, bienes y servicios para la humanidad. Dentro de sus aplicaciones, se encuentra la producción de metabolitos secundarios bajo condiciones controladas a través del cultivo in vitro de órganos o células. Estos cultivos se caracterizan por ser axénicos (libres de la presencia de cualquier otro organismo vivo) y desarrollarse en un medio artificial bajo condiciones físicas y químicas establecidas. Además, ofrece una gran variedad de ventajas, algunas mencionadas en la sección anterior, tales como, obtención de metabolitos secundarios bajo condiciones controladas y reproducibles, posibilidad de tener rendimientos de producción de estos metabolitos superiores a los conseguidos por plantas silvestres o cultivadas en invernadero, producción sostenible y de calidad de sustancias con alto valor agregado y, procesos de extracción más rápidos y sencillos, permitiendo así, disminuir los costos de producción comparados con otras estrategias como síntesis química o extracción a partir de cultivos tecnificados (Gandhi et al., 2014; Matsuura et al., 2017; Yun et al., 2012b).

Una de las estrategias que brinda la biotecnología vegetal es el cultivo de órganos, tales como brotes o raíces, los cuales son mantenidos mediante el uso de reguladores de crecimiento. El cultivo de estos órganos o tejidos diferenciados tiene la ventaja de favorecer la producción de algunos metabolitos secundarios cuya biosíntesis es tejido-específica viéndose favorecida la expresión de rutas metabólicas que conllevan a la obtención de los metabolitos de interés. Esta estrategia ha sido implementada en algunas en industrias para la producción de compuestos, tal es el caso de la empresa suiza de cosméticos Mibelle AG Biochemistry que emplea cultivo de raíces de albahaca (Ocimum basilicum) para Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 12 obtener extractos que son empleados en productos que favorecen el crecimiento del cabello (Georgiev, Slavov, Vasileva, & Pavlov, 2018; Matsuura et al., 2017).

El cultivo de células es otra de las estrategias más empleadas para producción de compuestos bioactivos, la cual involucra el mantenimiento de células indiferenciadas a partir de tejidos, denominadas callo, en un medio de cultivo líquido bajo agitación constante y en condiciones físicas y químicas controladas. La obtención de este callo involucra la desdiferenciación de un tejido vegetal (explante), proceso que dependerá de la especie, del tipo de explante, las condiciones físicas (intensidad lumínica, fotoperíodo, temperatura), la adición de reguladores de crecimiento y el tipo de medio de cultivo empleado. Esta es una de las estrategias más utilizadas y estudiadas debido a que el crecimiento de las células es rápido, lo que permite tener una buena cantidad de biomasa en pocos días (1 o 2 semanas), se puede producir cualquier metabolito presente en la planta de la que proviene ya que las células potencialmente tienen esta capacidad y, su escalamiento no es complicado (Gómez-Torres, Moreno-Gómez, Velásquez-Lozano, Aguirre-Mancilla, & Aguado-Santacruz, 2014; Matsuura et al., 2017; Miguel & Marum, 2011; Rodríguez Beraud, Latsague Vidal, Chacón Fuentes, & Astorga Brevis, 2014; Taiz & Zeiger, 2006). En la actualidad, varias empresas utilizan esta tecnología, por ejemplo, Active Concepts LLC de Estados Unidos tiene suspensiones celulares de Perilla frutescens (Lamiaceae) para obtener extractos usados en productos anti-edad e Innvova BM de Bulgaria ha establecido suspensiones de Calendula officinalis (Asteraceae) cuyos extractos son usados en productos antiarrugas y para la regeneración de la piel (Georgiev et al., 2018).

En suspensiones celulares se suele seguir una secuencia metodológica para optimizar la producción sostenible de los metabolitos secundarios de interés, la cual comprende las siguientes etapas: 1. Selección adecuada de la especie vegetal y del tipo de explante a utilizar para lo cual generalmente se tiene en cuenta la especie y la sección de la planta en donde es mayor el contenido de metabolito. 2. Establecimiento de las condiciones de callogénesis para inducir la formación de callos fiables 3. Selección y establecimiento del tipo de cultivo in vitro a emplear para lo cual se tienen en cuenta criterios como la velocidad de crecimiento, fase en que tienden a producirse los metabolitos, estabilidad de las células, niveles de producto en suspensiones finas y en pequeños agregados y, la forma de liberación de los productos (intracelular y extracelular). 4. Optimización del cultivo in vitro Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 13 de las células vegetales mediante un diseño factorial en donde se evalúan varias estrategias para incrementar la producción de metabolitos secundarios. 5. Escalado y optimización de las condiciones en biorreactores. En este sentido, es importante tener en cuenta algunas estrategias que son comúnmente utilizadas de forma individual o de forma combinada para aumentar la producción de metabolitos secundarios, entre las que se encuentran: Selección de especies vegetales apropiada, selección de líneas celulares más promisorias, optimización de las condiciones del medio de cultivo, adición de precursores del metabolismo secundario, uso de elicitores bióticos o abióticos y uso de técnicas de ingeniería genética y metabolómica (Arias, Aguirre, Angarita, & Restrepo, 2009; Pérez- Alonso & Jiménez, 2011).

Dentro de las estrategias utilizadas para aumentar la producción de metabolitos secundarios la elicitación es la más empleada y explorada. Este término hace referencia a la inducción de la biosíntesis de metabolitos mediante el uso de compuestos o condiciones ambientales que desencadenan las rutas de producción de metabolitos secundarios (Ruíz, 2014; Wang, J et al., 2017). Los elicitores pueden ser de tipo biológico, tales como enzimas, fragmentos de paredes celulares o polisacáridos; de tipo químico como sales inorgánicas y metales pesados o factores físicos como radiación ultravioleta, temperaturas extremas, altas presiones o heridas mecánicas (Ruíz, 2014). La mayoría de elicitores desencadenan en las plantas rutas de señalización que dependen del tipo de estímulo y actúan desencadenando la expresión de genes de defensa que propician la producción de metabolitos secundarios (Choi, W et al., 2016, Kimura, S et al., 2012, Volkov, A & Brown, C, 2006).

Uno de los elicitores más empleados es el jasmonato de metilo, el cual ha sido evaluado en Catharanthus roseus (Apocynaceae), una especie de gran interés debido a que produce alcaloides indol-terpénicos (TIAs) como la serpentina y la ajmalicina, importantes agentes hipertensivos y, la vinblastina y la vincristina, compuestos anticancerígenos naturales de gran uso. Debido al aumento en la demanda de algunos de los metabolitos producidos por esta especie se han realizado diversas investigaciones para incrementar su rendimiento mediante el uso de herramientas biotecnológicas (Guo, Liu, & Xing, 2011). Zhou et al. (2015) evaluaron en esta especie la producción de metabolitos en cultivos de células meristemáticas de cambium encontrando que MeJA a una concentración de 150 µM en combinación con 10 mM de β-ciclodextrina generaron una alta producción de vindolina, Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 14 catharantina y ajmalicina, en concentraciones 799, 654 y 426% respectivamente mayores al comparar con el cultivo de CMCs en frascos Erlenmeyer sin elicitores.

El ácido salicílico es otro de los elicitores más utilizados, éste se encuentra de manera natural en las plantas y cumple el papel de molécula señalizadora para activar mecanismos de defensa de la planta contra patógenos. Este elicitor ha logrado aumentar la producción de taxol (alcaloide) 5.1 veces, respecto al control, en callos de Taxus baccata; además, su uso ha incrementado la obtención de antocianinas hasta dos veces más, respecto al control, en cultivos de Vitis vinifera; y, ginkgólidos a y b (sesquiterpenos) se han logrado aumentar 6.1 veces, respecto al control, en suspensiones de Gingkgo biloba (Kang et al., 2006; Oraei, Panahirad, Zaare-nahandi, & Gohari, 2019; Ramirez-Estrada et al., 2016; Sarmadi, Karimi, Palazón, Ghassempour, & Mirjalili, 2018).

1.3 Generalidades del género Piper (Piperaceae)

Piper es el género con mayor riqueza de la familia Piperaceae con alrededor de 2000 especies, es uno de los linajes más diversos de las angiospermas basales y uno de los que tiene mayor número de representantes en bosques húmedos tropicales donde pueden encontrarse como arbustos, trepadoras o hierbas. Las especies de este género son bastante uniformes morfológicamente, presentando hojas simples y alternas con tallos articulados y nudos engrosados, inflorescencias pequeñas tipo espiga y frutos carnosos con una sola semilla (Figura 4-11). Estas especies son comúnmente conocidas como cordoncillo, nudillo o anisillo, entre otros, y, una de las más representativas por su importancia económica es la pimienta negra o P. nigrum (Bernal, Galeano, Rodríguez, Sarmiento, & M., 2017; Lee Dyer & Palmer, 2004; Jaramillo & Callejas, 2004; G. Singh, 2010).

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Figura 1-1. Caracteres morfológicos de la familia Piperaceae. Piper aduncum A. Hojas simples y alternas. Piper sp. B. Inflorescencias tipo espiga. Piper cumanense. C. Inflorescencia madura. Piper nigrum D. Fruto carnoso. (D. Tomado de https://www.ica.gov.co/Noticias/Agricola/2013-(1)/El-cultivo-de-la-pimienta-se-abre-paso- en-el-Valle.aspx ).

Este género tiene una distribución pantropical, especialmente en trópicos americanos (~1300 sp.) y asiáticos (~600 sp.), aunque unas pocas especies pueden encontrarse en islas del pacífico y en África. Habitan principalmente zonas entre los 0 a 2500 m de altitud, aunque algunas especies pueden encontrarse sobre los 3000 m. Los centros de diversidad del género están al sureste de Asia, al sur de México, en los Andes, el Chocó, la Amazonía y en el bosque atlántico de Brasil (Figura 1-2) (Jaramillo et al., 2008; Jaramillo & Manos, 2001; Martínez, Carvalho, Santiago, & Jaramillo, 2015; Quijano-Abril, Callejas-Posada, & Miranda-Esquivel, 2006). En Colombia existe una gran diversidad de Piper, con alrededor de 415 especies, de las cuales cerca del 40% son endémicas. Estas especies se distribuyen principalmente en bosques húmedos de tierras bajas del Chocó y en el frente noroeste de la Cordillera Occidental (departamento de Antioquia) (Bernal, Gradstein, & Celis, 2015; Martínez et al., 2015; Quijano-Abril et al., 2006).

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Figura 1-2. Distribución mundial del género Piper. En color verde oliva se señalan las zonas en las que se distribuye el género. Tomado de POWO, 2019.

Varias especies de Piper son de gran importancia económica, medicinal y ecológica. Una de las especies de mayor importancia económica a nivel mundial es P. nigrum, de cuyos frutos se obtiene la pimienta negra, una especia que ha sido muy utilizada durante siglos como saborizante y conservante. A nivel medicinal, las raíces y frutos de P. longum son utilizados para tratar la bronquitis crónica, la gripa, la tos y como antídoto contra mordeduras de serpientes. A partir de raíces de Piper methysticum (kava) indígenas de islas del Pacífico han elaborado por cientos de años un preparado utilizado como bebida ceremonial por sus efectos relajantes. A nivel ecológico, las especies de Piper mantienen una red compleja de interacciones con insectos herbívoros, parasitoides y mamíferos teniendo un rol fundamental en los ecosistemas; por ejemplo, P. kelleyi alberga la mayor diversidad y densidad de especies de mariposas Eois junto con sus parasitoides, avispas y taquínidos, siendo el hospedero de al menos 17 especies de herbívoros y 9-30 especies de parasitoides (Chahal, Ohlyan, Kandale, Walia, & Puri, 2011; Mgbeahuruike, Yrjönen, Vuorela, & Holm, 2017; Parmar et al., 1997; Y. Singh, 1992; Tepe, Rodríguez-Castañeda, Glassmire, & Dyer, 2014).

A nivel fitoquímico Piper se caracteriza por presentar una gran diversidad de metabolitos secundarios distribuidos en hojas, tallos, raíces e inflorescencias. Dentro de los metabolitos más abundantes se encuentran los alcaloides y amidas, propenilfenoles, lignanos, neolignanos, terpenos, esteroides, kavapironas y chalconas, varios de ellos con actividad Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 17 anticancerígena, antiparasitaria y antibacterial comprobada (Lee Dyer & Palmer, 2004; Mgbeahuruike et al., 2017; Parmar et al., 1997).

Las amidas son los compuestos más representativos de Piper y se conocen comúnmente como piperamidas, este tipo de moléculas están formadas por un ácido como el ácido cinámico que forma una amida al unirse con un nitrógeno que está en un anillo de cinco o seis carbonos. Dentro de estas, la piperina 1 es uno de los metabolitos más conocidos y uno de los responsables de la pungencia en la pimienta negra (obtenida de frutos de P. nigrum), además de tener potencial actividad anticáncer y antibacterial contra bacterias como Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. Otra amida como la chavicina 2 ha reportado tener efectos farmacológicos positivos en la mejora de la memoria al actuar como un potencial neuroprotector (figura 1-3) (Gorgani, Mohammadi, Najafpour, & Nikzad, 2017; Iqbal, Iqbal, Mahmood, Farhat, & Ahmed, 2016; Mgbeahuruike et al., 2017; Talib, 2017).

Los propenilfenoles, son metabolitos conformados por un fenol (o su metil éter) y una cadena de tres carbonos, muchos de ellos son volátiles y pueden encontrarse en aceites esenciales obtenidos de diferentes partes de la planta. Por ejemplo, el aceite esencial de hojas de P. hispidinervium es rico en safrol 3 (90-94%), un metabolito muy importante en la industria química ya que es usado como plantilla para obtener los derivados heliotropina 4, usado como agente fijador para fragancias, y el butóxido de piperonilo 5, un compuesto sinérgico de plaguicidas (figura 1-3) (Braga, Cremasco, & Valle, 2005; Cremasco & Braga, 2010; Lee Dyer & Palmer, 2004).

Los lignanos son una clase de compuestos formados por la dimerización de fenilpropanoides y de los cuales se ha reportados diversas bioactividades. Por ejemplo, de P. cubeba se ha aislado la cubebina 6, un metabolito que reporta actividad anticancerígena contra células de cáncer causando baja citotoxidad y mutagenicidad, además de tener actividad antiparasítica contra Trypanosoma cruzi¸ un protozoo causante de la enfermedad de Chagas. La hinokinina 7, que ha sido aislado de especies como P. nigrum y P. cubeba, tiene una actividad antimicobacterial moderada contra Mycobacterium tuberculosis (con una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 62.5 µg/mL-1), principal agente causante de tuberculosis (figura 1-3) (R. Da Silva et al., 2005; Lima, Barros, & de Laurentiz, 2018; Marcotullio, Pelosi, & Curini, 2014; M. L. A. Silva et al., 2009). Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 18

Las kavapironas como la metisticina 8 y la kavaína 9, son compuestos que se han encontrado únicamente en Piper, la mayoría han sido aislados de P. methysticum y son considerados los componentes activos a los que se asocia propiedades terapéuticas para el tratamiento de la ansiedad, la tensión, la agitación y/o el insomnio. Se piensa que este tipo de compuestos actúa sobre el sistema nervioso central generando hipnosedación y relajación del músculo esquelético al aumentar la actividad de los receptores tipo A del

ácido γ-Aminobutírico (GABAARs) que son los principales mediadores de los procesos de inhibición de la sinapsis nerviosa (figura 1-3) (Chua et al., 2016; Lee Dyer & Palmer, 2004; Nakamura, Darnieder, Deeb, & Moss, 2015).

Los derivados de ácido benzoico y los cromenos, metabolitos formados por la dimerización de un benceno con un anillo heterocíclico pirano, son compuestos minoritarios en Piper pero que reportan interesantes actividades biológicas. Por ejemplo, de P. pesaresanum se ha aislado el ácido 4-metoxi-3,5-di (3'-metil-2'- butenil) benzoico 10, un metabolito con actividad inhibitoria de la acetilcolinesterasa, una enzima encargada de la regulación de la acetilcolina durante la sinapsis nerviosa y con potencial uso para el control de insectos plaga. De P. diospyrifolium se purificó el ácido 4-metoxi-3-[(E)-3-metil- 1,3-butadien-1-il]-5- (3-metil-2-buten-1-il)-benzoico 11, compuesto que presentó moderada actividad contra M. tuberculosis (con CMI de 125 mg/mL). Por otro lado, cromenos como el ácido gaudichaudianico 12, uno de los metabolitos mayoritarios en hojas de P. chimonantifolium, presenta actividad antifúngica contra los hongos Cladosporium cladosporioides y C. sphaerospermum y, el ácido 2,2-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2H-1-cromeno-6-carboxílico 13 aislado de P. dennisii reporta actividad antiparasitaria contra Leishmania amazonensis, parásito causante de la leishmaniasis en la amazonía (IC50 de 199.9 ± 0.7 µM) (figura 1-3) (Cabanillas et al., 2012; Lago, Ito, Fernandes, Young, & Kato, 2012; Nitola, Muñoz, Patiño, & Prieto, 2016; Scodro et al., 2015).

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Figura 1-3. Metabolitos secundarios aislados de Piper. Amidas: 1. Piperina 2. Chavicina. Propenilfenoles: 3. Safrol 4. Heliotropina 5. Butóxido de piperonilo Lignanos: 6. Cubebina 7. Hinokinina. Kavapironas: 8. Metisticina 9. Kavaína. Derivados de ácido benzoico: 10. Ácido 4-metoxi-3,5-di(3'-metil-2'- butenil) benzoico 11. Ácido 4-metoxi-3-[(E)- 3-metil- 1,3-butadien-1-il]-5-(3-metil-2-buten-1-il)-benzoico. Cromenos: 12. Ácido gaudichaudianico 13. Ácido 2,2-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2H-1-cromeno-6-carboxílico.

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Dado el potencial que presentan algunos metabolitos secundarios aislados de especies del género Piper, se han desarrollado estrategias biotecnológicas como alternativa para incrementar la producción de compuestos de interés. Sin embargo, las investigaciones en este campo son escasas y se encuentran en etapas preliminares en las que se ha logrado el establecimiento de suspensiones celulares, pero aún no se han desarrollado estrategias de elicitación. Por ejemplo, Delgado-Paredes, Kato, & Rojas-Idrogo (2013) establecieron suspensiones celulares de P. aduncum, P. cernuum, P. crassinervium y P. regnelli encontrando un máximo crecimiento entre 24-36 días de cultivo y una mayor concentración de metabolitos en medios y células de suspensiones en fase estacionaria, dentro de los metabolitos encontrados se destacan el safrol y la grandisina (P. aduncum), feniletilaminas dopamina y tiramina (P. cernuum) y alcamidas (P. crassinervum). Por su parte, Balbuena et al. (2009) establecieron suspensiones de P. solmsianum encontrando una dinámica de crecimiento con una fase lag larga (20 días) y una estacionaria que inició en el día 36 de cultivo, fase en la que se presentó una mayor producción de metabolitos secundarios en el medio. Los resultados de estas investigaciones muestran el potencial que presentan las especies de Piper para desarrollar una producción a gran escala de compuestos de interés mediante cultivos in vitro de células en suspensión. Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 21

En especies de Piper también se han desarrollado otras estrategias biotecnológicas, enfocadas en la multiplicación in vitro de plantas de interés económico o medicinal. Las investigaciones en esta área son mayores y se concentran principalmente en la micropropagación y aclimatación de P. nigrum, planta de la que se obtiene la pimienta negra, una de las especias más utilizadas a nivel mundial por su uso en culinaria, perfumería y por sus propiedades medicinales. La micropropagación en P. nigrum ha permitido multiplicar de manera efectiva y rápida material vegetal genéticamente homogéneo con el fin de suplir la demanda mundial de esta especia. En este sentido, se han obtenido brotes a partir de la desdiferenciación de láminas foliares sembradas en medios de cultivo MS (Murashige y Skoog) con adición de la citoquinina 6-benciladenina (BA) y la giberelina, ácido giberélico (AG3), brotes que han sido aclimatados exitosamente y han producido una cantidad de piperina incluso superior a la de plantas in vitro. Además, se han utilizado otro tipo de explantes como tallos y meristemos, cuyo cultivo en medios MS con adición de BA también ha permitido producir brotes que han sido aclimatados. Por otro lado, en especies de interés medicinal como P. longum, planta usada en el tratamiento de enfermedades respiratorias, se ha logrado micropropagar plantas a través del cultivo de láminas sembradas en medios MS y expuestas con la citoquinina tidiazuron (TDZ), esta alternativa de propagación rápida se ha estudiado debido a que sus poblaciones naturales han descendido a causa de su recolección indiscriminada (Ahmad, Abbasi, Rahman, & Fazal, 2013; Hussain, Naz, Hummer, & Shinwari, 2011; Prajapati, Patel, Jha, & Makwana, 2019).

1.4 Generalidades de la especie Piper cumanense

Piper cumanense Kunth (1816) es un arbusto poco ramificado que puede alcanzar hasta 4 m de altura, tiene un tallo principal delgado, liso y verde, tallos secundarios verdes con pecas rojizas, hojas simples y alternas, inflorescencias de color blanco cuando están totalmente desarrolladas e infrutescencias de color negro cuando maduran (Figura 1-4). Sus poblaciones son nativas de Suramérica y se encuentran distribuidas a una altitud entre los 500 y 1700 m en Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela (POWO, 2019). En Colombia, se encuentra localizada en los departamentos de Santander, Boyacá, Cundinamarca, Tolima, Huila, Valle del Cauca y Chocó (ICN, 2017).

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Figura 1-4. Morfología de P. cumanense. A. Hábito arbustivo. B. Tallo verde con pecas rojizas. C. Hojas simples y alternas. D. Inflorescencias.

En el grupo de investigación “Química de Productos Naturales Vegetales Bioactivos” (QuiProNaB) del departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá se han desarrollado trabajos de investigación en P. cumanense. Los estudios realizados han permitido aislar y caracterizar compuestos presentes en esta especie y evaluar su actividad en el control de hongos fitopatógenos. Además, se han realizado, mediante semisíntesis química, modificaciones a las moléculas con mayor bioactividad en el control de estos hongos estableciendo aproximaciones de estructura-actividad y determinando el efecto de los grupos funcionales en la actividad de estas moléculas. También, se han hecho estudios computacionales a partir de los cuales se han desarrollado modelos farmacofóricos con los cuales se han determinado las características estructurales responsables de la actividad de estas moléculas. Asimismo, se han estado evaluando estrategias biotecnológicas con el fin de obtener mayores cantidades de los metabolitos de interés debido a los bajos rendimientos de extracción de estos compuestos.

Los estudios a nivel fitoquímico han permitido aislar, a partir de extractos etanólicos de hojas e inflorescencias, metabolitos como el campesterol, estigmasterol, β–sitosterol y, el óxido de cariofileno, así como dos compuestos nuevos: el ácido cumanénsico, un cromeno, y el ácido cuménico, un derivado de ácido benzoico. Estos dos últimos metabolitos (el cromeno y el derivado de ácido benzoico) presentaron actividad antifúngica contra los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, destacándose su efecto contra este último hongo, pues a concentraciones mínimas de 1 µg inhibieron su Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 23 crecimiento, lo que es comparable con el control positivo (benomil < 1 µg). Estos compuestos son muy promisorios para el control de F. oxysporum f. sp. dianthi, hongo causante del marchitamiento vascular en cultivos de clavel y que genera grandes pérdidas económicas a nivel mundial (J. E. Parra et al., 2011, 2013). Además, a partir de cromenos y derivados de ácido benzoico aislados de P. cumanense se han obtenido 42 moléculas mediante semisíntesis, las cuales presentaron actividad fungistática contra el hongo fitopatógeno F. oxysporum f.sp.passiflorae, hongo que afecta a plantas pertenecientes al género Passiflora como la maracuyá (Passiflora edulis) y la curuba (Passiflora mollisima). A partir de las moléculas naturales aisladas y semisintetizadas de P. cumanense se han desarrollado estudios computacionales que han permitido postular estructuras con mejor actividad antifúngica contra F. oxysporum f.sp.passiflorae (J. Parra & Cuca, 2019)

En otros grupos de investigación también se ha evaluado el potencial de compuestos y extractos de P. cumanense. Por ejemplo, Rapado et al. (2014) aislaron a partir de extractos etanólicos de hojas, la 2',4',6'- trihidroxidihidrochalcona (chalcona), metabolito que ha mostrado tener actividad molusquicida contra caracoles adultos del género Biomphalaria con una CL50 de 5.35 µg/mL. Este estudio ha contribuido en la búsqueda de sustancias bioactivas para el control de estos moluscos que son vectores transmisores de la esquistosomiasis, una importante enfermedad parasitaria que afecta principalmente a habitantes de países en desarrollo.

Además, Garavito et al. (2006) evaluaron la actividad antimalárica de extractos etanólicos de infrutescencias y hojas de P. cumanense encontrando a ambos extractos activos en ensayos in vitro (CI50 ˂ 1 µg/mL) contra la cepa de Plasmodium falciparum resistente a cloroquina (FcB2). Estos extractos resultaron activos en el test FBIT (prueba de la inhibición de la biomineralización con ferriprotoporfirina (FP) IX), indicando que su mecanismo de acción en P. falciparum podría estar relacionado con la inhibición de la biomineralización de FP a hemozoína.

A pesar del gran potencial de los metabolitos secundarios aislados de P. cumanense, el rendimiento de extracción es bajo, lo que ha permitido realizar algunos ensayos preliminares de bioactividad, pero su uso a gran escala se ve limitado. Por ende, el grupo de investigación QuiProNaB está implementando estrategias biotecnológicas que permitan obtener mayores cantidades de compuestos cuyas bioactividades han mostrado ser Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 24 promisorias en la solución de problemáticas a nivel agrícola o medicinal. La estrategia que se está evaluando es el cultivo in vitro de células en suspensión, una de las estrategias más empleadas para incrementar por medio de la elicitación, la producción de metabolitos de interés. Además de los avances que se han logrado obtener con el presente trabajo de investigación, también se han evaluado diferentes condiciones nutricionales y ambientales para evitar la actividad oxidativa durante la formación de callos friables obtenidos a partir de plantas cultivadas in vitro de P. cumanense (González & Patiño, 2016). Asimismo, está en curso la investigación de otra de tesis de maestría en la que se está evaluando en suspensiones celulares el uso de esporas del hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum como inductor en la producción de metabolitos secundarios de interés y, una tesis doctoral en la que se busca evaluar en cultivos de células en suspensión el uso de hongos endófitos aislados de P. cumanense para promover la producción de derivados de ácido benzoico.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 25

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Contribuir a las investigaciones en la familia Piperaceae mediante el establecimiento de algunas condiciones favorables de cultivos in vitro (inducción de callos y suspensiones celulares) y la evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de algunos metabolitos secundarios en la especie Piper cumanense.

2.2 Objetivos específicos

▪ Establecer condiciones favorables para la formación de callos friables a partir de plántulas cultivadas in vitro de P. cumanense y la utilización de tratamientos con diferentes reguladores de crecimiento vegetal. ▪ Determinar condiciones favorables para el crecimiento de células en suspensión al utilizar callos friables de P. cumanense. ▪ Establecer el efecto de por lo menos dos elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en las suspensiones celulares de P. cumanense mediante análisis cromatográficos.

3. Metodología

3.1 Establecimiento de condiciones para callogénesis

3.1.1 Recolección de material vegetal

Se recolectaron plantas silvestres con infrutescencias y semillas maduras de Piper sp. en la vereda Berlín, municipio Quipile del departamento de Cundinamarca, Colombia. La especie recolectada fue determinada como Piper cumanense, un voucher reposa en el Herbario Nacional Colombiano ubicado en el Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia con el número de colección COL-518185.

3.1.2 Evaluación de protocolos para la esterilización superficial de las semillas

Se separaron manualmente semillas de las infrutescencias maduras recolectadas en campo y se seleccionaron de acuerdo con el siguiente ensayo: Las semillas se dispusieron en un vaso de precipitados con 200 mL de agua durante 5 minutos y luego de este tiempo se seleccionaron las semillas que reposaron en el fondo del vaso, ya que de ellas se esperaba un buen desarrollo de embrión (Baskin & Baskin, 2014). Las semillas viables se separaron en tres grupos de aprox. 200 unidades y cada grupo se desinfectó superficialmente y por separado aplicando los siguientes protocolos:

▪ Protocolo 1: Se sumergieron las semillas en alcohol etílico al 70% por 3 minutos y luego fueron expuestas en una solución de hipoclorito de sodio al 5.25% por 5 minutos. Finalmente, se realizaron tres lavados en agua destilada esterilizada (Bazán-Calderón, Ventura-flores, Kato, Rojas-idrogo, & Guillermo, 2011)

▪ Protocolo 2: Las semillas se lavaron con agua destilada esterilizada y detergente neutro, luego se lavaron tres veces con agua destilada esterilizada y se sumergieron en Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 28 alcohol etílico al 70% durante 1 minuto. Posteriormente, las semillas fueron sumergidas en solución de hipoclorito de sodio al 5.25% con tres gotas de Tween® 20 durante 10 minutos y finalmente se les realizaron lavados con agua destilada esterilizada (Modificado de Delgado-Paredes et al , 2017).

▪ Protocolo 3: Las semillas se sumergieron en alcohol etílico al 70% durante 1 minuto y luego fueron sumergidas en solución de hipoclorito de sodio al 5.25% con 3 gotas de Tween® 20 durante 10 minutos. Finalmente, a las semillas se les realizaron tres lavados con agua destilada esterilizada (Delgado-Paredes et al, 2017).

Después de realizar la esterilización se sembraron 30 semillas distribuidas en diez frascos de vidrio transparente (diámetro 5.5 cm y una altura 7.0 cm). Cada frasco contenía 20 mL de medio de cultivo con los componentes típicos (macroelementos y microelementos) sugeridos en el medio denominado MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado con los siguientes componentes a una concentración final de 1 mg/L de tiamina, 100 mg/L de inositol, 30 g/L de sacarosa y 7.5 g/L de agar. El pH del medio fue ajustado a 5.8 con soluciones de HCl 0.1 M y NaOH 0.1 M y luego fue autoclavado a 120 °C durante 15 minutos. Cada uno de los tratamientos fue realizado por triplicado.

Con el fin de establecer la efectividad de esterilización de cada protocolo se realizaron observaciones cada dos días y luego de 10 días se determinó el porcentaje de contaminación utilizando la ecuación 1 (Ec. 3.1):

푁표.푓푟푎푠푐표푠 푐표푛푡푎푚푖푛푎푑표푠 % 푐표푛푡푎푚푖푛푎푐푖ó푛 = 푥 100 Ec. 3.1 푁표. 푡표푡푎푙 푑푒 푓푟푎푠푐표푠

Se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn para determinar diferencias entre los protocolos. Las pruebas estadísticas fueron llevadas a cabo con un nivel de significancia de 0.05.

3.1.3 Germinación in vitro

La germinación in vitro se evaluó teniendo en cuenta la influencia del tiempo de siembra de las semillas luego de su recolección en campo y la adición de ácido giberélico (AG3) al medio de cultivo (García et al, 2015). Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 29

Para determinar el efecto del tiempo de siembra se dispusieron en medio MS semillas de una semana y cuatro semanas luego de su recolección en campo. La acción del AG3 se evaluó en semillas de cuatro semanas de recolectadas, las cuales se sembraron en medio MS con adición de 0.02 mg/L de AG3. En cada tratamiento se sembraron por triplicado 54 semillas distribuidas en nueve frascos de vidrio transparente (diámetro 5.5 cm y una altura 7.0 cm) para un total de seis semillas por frasco. Este material fue dispuesto en zona de incubación con luz constante procedente de bombillas fluorescentes de intensidad lumínica de 4500 lux. Finalmente se determinó el porcentaje de germinación de las semillas (emergencia de la radícula) hasta 21 días después de la siembra (Ec. 3.2).

푁표.푠푒푚푖푙푙푎푠 푔푒푟푚푖푛푎푑푎푠 % 푔푒푟푚푖푛푎푐푖ó푛 = 푥 100 Ec. 3.2 푁표.푠푒푚푖푙푙푎푠 푠푒푚푏푟푎푑푎푠

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) a una vía con el fin de establecer si se presentaron diferencias significativas (p<0.05) entre los tratamientos evaluados.

3.1.4 Inducción de callos friables

Se determinó el efecto del tipo de explante junto con la combinación de diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento sobre la formación de callos friables. Para esto, a partir de plantas germinadas in vitro de aproximadamente 45 días de edad se separaron como explantes pecíolos de 10 mm de longitud y láminas de 10 mm2 de área, que fueron dispuestos en medio de cultivo MS con adición de 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D) y 6-benciladenina (BA). Estos reguladores de crecimiento se adicionaron a los medios siguiendo un diseño factorial (4 x 4) con cuatro concentraciones (0, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 mg/L), evaluando un total de 24 tratamientos por explante (Delgado-Paredes et al., 2013; Silva et al., 2012; Hussain et al., 2011; Mathews & Rao, 1984).

Para cada combinación se sembraron por triplicado en frascos de vidrio (diámetro 5.5 cm, altura 7.0 cm) cuatro explantes que fueron dispuestos en el caso de los pecíolos de manera horizontal y en el caso de las láminas con la superficie abaxial en contacto con el medio. Los medios de cultivo de los distintos tratamientos se colocaron en zona de incubación a 22 ± 2 ºC y luz constante emanada de bombillos fluorescentes de intensidad lumínica de Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 30

4500 lux. Luego de cuatro semanas se determinó el porcentaje de explantes que se formaron de callo (Ec. 3.3), su friabilidad y coloración.

푁표.푒푥푝푙푎푛푡푒푠 푞푢푒 푝푟표푑푢푐푒푛 푐푎푙푙표 % 푐푎푙푙표푔é푛푒푠푖푠 = 푥 100 Ec. 3.3 푁표.푡표푡푎푙 푑푒 푒푥푝푙푎푛푡푒푠 푠푒푚푏푟푎푑표푠

Se realizó un análisis de componentes principales con el fin de determinar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfológica en pecíolos y láminas.

3.2 Establecimiento de suspensiones celulares

La transferencia de los callos friables a medio líquido implicó un cambio de matriz (semisólida a líquida), lo cual afecto el crecimiento celular. Por lo tanto, esta transferencia fue monitoreada con el fin de establecer un tiempo favorable de acondicionamiento del callo al nuevo ambiente. Para establecer este tiempo en P. cumanense se determinó la viabilidad, pH y biomasa de las células periódicamente luego de la transferencia del callo.

Después del acondicionamiento de las suspensiones, se evaluó el efecto de diferentes tamaños de inóculos iniciales sobre el crecimiento celular y se establecieron algunos parámetros cinéticos. De esta manera, se determinó el inóculo más adecuado para el crecimiento de las suspensiones que luego fueron expuestas a diferentes elicitores.

3.2.1 Evaluación del acondicionamiento de las suspensiones celulares

Las suspensiones celulares se iniciaron mediante transferencia de 2 g de callo friable medido en balanza analítica a matraces de Erlenmeyer de 100 mL (lote inicial). Estos frascos contenían 20 mL del medio de cultivo MS suplementado con los siguientes componentes a una concentración final de 1 mg/L de tiamina, 100 mg/L de inositol, 30 g/L de sacarosa y la mejor concentración hormonal de 2,4-D y BAP que indujo la formación de callos friables y de color blanco, evaluada en la sección anterior (3.1.4).

En el día 15 el lote inicial se dividió en dos sublotes, a uno de ellos se le renovó el medio de cultivo (sublote 1) y el otro continuó con el mismo medio inicial (sublote 2). La renovación del medio consistió en retirar 10 mL de medio y luego adicionar 10 mL de medio nuevo.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 31

Las suspensiones se dispusieron en agitación continua a 110 rpm, bajo luz constante y a una temperatura de 25 ± 2 °C (Balbuena et al., 2009; Szabados, Mroginski, & Roca, 1991).

El efecto del tiempo de acondicionamiento y la renovación del medio sobre el estado de las suspensiones se monitoreó cada cuarto o quinto día durante 30 días midiendo la actividad metabólica, pH y biomasa celular (figura 3-1). Este experimento se realizó por triplicado con dos réplicas biológicas.

Figura 3-1. Diseño de la evaluación del acondicionamiento en suspensiones celulares.

● Determinación de la actividad metabólica

La actividad metabólica se determinó mediante el ensayo del MTT (Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol). En el ensayo se tomó una muestra de 1 mL de la suspensión celular, a la cual se le retiró el medio luego de centrifugar 3 min a 1900 g. Al residuo celular se le realizaron lavados con solución de buffer fosfato 50 mM a pH 7.5 (2 X 1mL) y luego las células se resuspendieron en 1 mL de este buffer. A continuación, se adicionaron 100 µL de MTT a una concentración de 5 mg/mL y la suspensión resultante se incubó en oscuridad durante 4h a 25 °C en agitación continua. Posteriormente, para solubilizar las sales de formazán obtenidas se adicionó 1.5 mL de una solución de metanol al 50% en medio acuoso con 1% de SDS (dodecilsulfato sódico). La solución resultante se incubó durante 30 minutos a 60 °C y luego de este tiempo se centrifugó a 1900 g durante Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 32

5 minutos y se recuperó el sobrenadante. El proceso de solubilización de las sales de formazán, incubación y centrifugación se repitió dos veces más, y luego se reunieron los sobrenadantes en un mismo tubo. Finalmente, se midió la absorbancia a 570 nm en el espectrofotómetro de serie visible 1200 marca Unico y se usó como blanco la solución de metanol al 50% en medio acuoso con 1% de SDS (Castro-Concha, Escobedo, & Miranda- Ham, 2006). Esta medición se realizó para las muestras tomadas cada cuarto o quinto día de las suspensiones a las que se les renovó el medio de cultivo el día 15 y a las que continuaron los 30 días con el mismo medio inicial, experimento que se realizó por triplicado con dos réplicas biológicas. Se realizó una prueba de ANOVA (análisis de varianza) dos vías y comparaciones múltiples de Sidak con un nivel de significancia de 0.05.

● Determinación de pH Se retiró 1 mL, cada cuarto o quinto día, de las suspensiones celulares a las que se les renovó el medio de cultivo el día 15 y las que continuaron los 30 días con el mismo medio inicial. Estas muestras se dispusieron en tubos Falcon de 15 mL y se determinó el pH con el potenciómetro marca Schott de la serie Lab850, tras sumergir el electrodo en la solución. Esta determinación se realizó por triplicado para cada una de las dos réplicas biológicas del experimento. Se realizó una prueba de ANOVA (análisis de varianza) dos vías y comparaciones múltiples de Sidak con un nivel de significancia de 0.05.

● Determinación de la biomasa

Se tomó una muestra de 1 mL, cada cuarto o quinto día, de cada una de las suspensiones celulares, a las que se les renovó el medio de cultivo el día 15 y a las que continuaron los 30 días con el mismo medio inicial. Estas muestras se centrifugaron a 1900 g, se les retiró el sobrenadante con ayuda de una micropipeta y a las células obtenidas se les realizaron lavados con agua destilada (2 X 1mL). Las muestras se liofilizaron en el equipo Labconco FreeZone®, 2.5 L (Labconco®, MO, USA) para finalmente realizar la determinación de peso seco. Esta determinación se realizó por triplicado para cada una de las dos réplicas biológicas del experimento. Se realizó una prueba de ANOVA (análisis de varianza) dos vías y comparaciones múltiples de Sidak con un nivel de significancia de 0.05. Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 33

3.2.2 Evaluación del tamaño de inóculo en el crecimiento de células en suspensión

Se reunieron suspensiones celulares acondicionadas, bajo el mejor criterio determinado en la sección 3.2.1, en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL y la mezcla resultante fue homogenizada. A partir de esta suspensión se tomaron alícuotas de 10 mL y se sembraron en frascos de Erlenmeyer de 100 mL que contenían previamente 10 mL de medio MS con la concentración hormonal de 2,4-D y BAP que indujo la formación de callos friables y blancos, para tener un volumen final de 20 mL. En estos matraces de 100 mL se sembraron alícuotas con inóculos de diferente tamaño para tener una concentración inicial (en los 20 mL) de 50 g/L y 90 g/L de células en medio líquido. Estas suspensiones, operadas en sistema por lote, se colocaron en agitación continua a 110 rpm, bajo luz constante y a una temperatura de 25 ± 2 °C.

Para cada uno de los tratamientos se tomaron alícuotas de 1 mL cada 4 o 5 días durante 24 días, se filtraron con un kit Buchner de filtración por succión al vacío usando filtros Whatman No. 1, se liofilizaron y se les determinó su peso seco. Para cada uno de los tratamientos se realizaron dos réplicas y se calcularon los siguientes parámetros cinéticos (Ec. 3.4 y 3.5) (Geipel, Socher, Haas, Bley, & Steingroewer, 2013):

-Tasa específica máxima de crecimiento (µm):

푥 ( ) 푥0 µ푚 = 퐼푛 Ec. 3.4 (푡−푡0)

donde, x y x0 representan la biomasa final e inicial, respectivamente. t y t0, el tiempo final e inicial del crecimiento en fase exponencial.

-Tiempo de duplicación (td):

퐼푛 2 푡푑 = Ec. 3.5 µ Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 34

3.3 Evaluación de la producción de metabolitos en suspensiones celulares elicitadas

3.3.1 Elicitación de suspensiones celulares

Se tomaron aproximadamente 90 suspensiones celulares acondicionadas en matraces de Erlenmeyer de 100 mL, se reunieron en un frasco Erlenmeyer de 2 L y se homogenizaron por agitación. La suspensión resultante se dejó en reposo para que se precipitarán las células y luego se retiró aproximadamente 1 L de medio de cultivo, para de esta forma concentrar la suspensión. Esta suspensión resultante se transfirió a un frasco de Erlenmeyer de 750 mL, se sometió a agitación continua y de ella se tomaron alícuotas de 10 mL que fueron transferidas a matraces de Erlenmeyer de 100 mL que contenían previamente 10 mL de medio de cultivo. De esta forma se establecieron suspensiones con 20 mL de medio y una concentración de 90 g de peso fresco / L (figura 3-2).

Figura 3-2. Metodología utilizada para la elicitación de suspensiones celulares con MeJA y SA.

Estas suspensiones, operadas en sistema por lote, se dispusieron en agitación continua a 110 rpm, bajo luz constante y a una temperatura de 25 ± 2 °C. Luego de 15 días, se Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 35 adicionaron dos concentraciones (10 y 100 µM) de los elicitores MeJA y SA, los cuales fueron previamente disueltos en 1 mL una solución de etanol al 0,25% y filtrados en membrana de 0,22 µm. Se evaluó el efecto del MeJA y del SA en tres tiempos (3, 12 y 24 h) después de su adición. En cada muestreo también se tomaron muestras del blanco (suspensiones a las que no se les adicionaron elicitores).

En cada tiempo se separaron las células del medio de cultivo por filtración y las células se almacenaron a -80 °C en microtubos de 2 mL y el medio de cultivo a -20 °C en tubos Falcon de 50 mL para posteriores análisis.

El experimento siguió un diseño factorial aleatorio de 3 x 4 con tres tiempos de muestreo (3, 12 y 24 h) y dos tipos de elicitores en dos concentraciones (MeJA y SA a 10 y 100 µM), por triplicado.

3.3.2 Estudio de la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares empleando UHPLC-DAD y GC-MS

● Extracción de metabolitos A continuación, se describen los procedimientos utilizados para la extracción de los metabolitos de las células y medios separados de las suspensiones celulares control y elicitadas con MeJA y SA a concentraciones de 10 y 100 µM.

- Células Las células separadas se maceraron con nitrógeno líquido hasta la obtención de un polvo fino que posteriormente fue sometido a proceso de liofilización para la eliminación de residuos de agua. Del material seco obtenido se tomaron cantidades de 150 mg que se dispusieron en tubos Falcon de 15 mL, y a los que se les adicionó acetato de etilo (2 mL). Las mezclas resultantes se sometieron a ultrasonido por un periodo de 10 minutos y luego se dejaron en agitación orbital a 110 rpm durante 12 horas a una temperatura de 25 ± 2 °C. Posteriormente, se centrifugaron a 8500 rpm durante 8 minutos, el sobrenadante fue retirado y el solvente fue retirado mediante destilación a presión reducida (rotaevaporador). Los extractos obtenidos fueron solubilizados en 500 µL de metanol con ayuda de ultrasonido y las soluciones resultantes fueron filtradas sobre filtros de membrana de polímero de difloruro de polivinilideno (PDVF) de 0.22 µm y finalmente se almacenaron en Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 36 viales de cromatografía. Este proceso de extracción se realizó tres veces cada 12 horas sobre las muestras de células obtenidas de suspensiones control (sin adición de elicitores) y elicitadas con MeJA y SA.

-Medio líquido A los medios de cultivo (20 mL) dispuesto en tubos Falcon se les adicionaron 20 mL de acetato de etilo y luego fueron sometidos a agitación en vórtex por un periodo de dos minutos. Las mezclas resultantes se dejaron en reposo y las fases orgánicas fueron retiradas, secadas con sulfato de sodio anhidro y filtradas sobre papel de filtro Whatman No. 1. Posteriormente, el disolvente fue retirado por destilación a presión reducida y los residuos obtenidos fueron solubilizados en 500 µL de metanol con ayuda de ultrasonido. Finalmente, las soluciones obtenidas para cada muestra fueron filtradas en filtros PDVF de 0.22 µm y almacenadas en viales de vidrio para los posteriores análisis. Este proceso de extracción se realizó tres veces a los medios obtenidos de suspensiones control (sin adición de elicitores) y elicitadas con MeJA y SA.

● Análisis de perfiles metabólicos

El efecto de los elicitores MeJA y SA sobre la producción de metabolitos en células y medios filtrados de suspensiones celulares de P. cumanense se determinó mediante el uso de las técnicas cromatográficas UHPLC-DAD y GC-MS. Los análisis con cada una de las técnicas se trataron como se describe a continuación.

-Analisis por UHPLC-DAD

Los perfiles metabólicos para las muestras provenientes de células y medios de suspensiones control (sin adición de elicitores) y elicitadas con MeJA y SA se obtuvieron mediante cromatografía líquida de ultra-alta resolución (UHPLC) en el equipo UPLC Ultimate 3000 de Thermo Fisher Scientific acoplado a un detector de arreglo de diodos (UHPLC-DAD). Los análisis se llevaron a cabo a una temperatura de 30 ºC. Las separaciones de los extractos se efectuaron en una columna C18 Kinetex (50 x 2.1 mm d.i; 2.6 µm). Para la separación se empleó como fase móvil metanol (MeOH): agua (0.1% ácido fórmico) con una elución en gradiente de 60 a 100% de MeOH en 30 minutos y 100% de MeOH en 10 minutos. El volumen de inyección fue de 2 µL con un flujo constante de Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 37

0,2 mL/min. Los cromatogramas se registraron a 254 nm y los espectros UV se obtuvieron en un rango entre 200 y 380 nm. A partir de los cromatogramas obtenidos se tomaron datos del número de picos, área y tiempo de retención.

Los perfiles metabólicos obtenidos mediante UHPLC-DAD de los extractos de células y medios de suspensiones tratadas con los elicitores MeJA y SA se compararon entre sí por el número de picos, tiempos de retención, áreas y espectros UV. Para determinar si las áreas de los picos de los tratamientos con elicitores presentaron diferencias respecto al control se estandarizaron los valores promedio de las áreas respecto a la desviación de todo el conjunto de datos. La estandarización consistió en restar el valor promedio del área de cada pico seleccionado en los tratamientos respecto al valor promedio del área del pico en el control y dividir este valor por la desviación de todo el conjunto de datos:

Área pico n tratamiento - Área pico n control Ec. 3.6 σ Asimismo, los datos de los picos caracterizados en cada una de las muestras se compararon con los datos de los picos correspondientes a compuestos aislados e identificados previamente por el grupo de investigación sobre el extracto de inflorescencias e infrutescencias de individuos silvestres de P. cumanense (J. E. Parra et al., 2011, 2013)

- Análisis GC-MS

Los perfiles cromatográficos para las muestras de células y medios de suspensiones control (sin adición de elicitores) y elicitadas con MeJA y SA se obtuvieron por inyección directa sin derivatización en un cromatógrafo Shimadzu GC 2010 Plus acoplado a un detector selectivo de masas Shimadzu GCMS-TQ 8040, equipado con un puerto de inyección Split/splitless (250°C, relación de Split 1:5), un inyector automático Shimadzu AOC-20i y un autosmuestreador Shimadzu AOC-20s. Se empleó una columna capilar HP- 5MS con fase estacionaria de 5%-fenil-poli(metilsiloxano), de 60 m x 0,25 mm, D.I x 0,25

µm, df. El gas de arrastre fue helio, con una presión de entrada en la cabeza de la columna de 117,6 kPa, velocidad lineal de 25,7 cms-1 y flujo constante de 1 mLmin-1. La temperatura del horno se programó desde 50 °C (5 min) - 20 °C/min hasta 150 °C (3 min) y por último a 4 °C/min hasta 310 °C (5 min). Los espectros de masas fueron obtenidos por impacto con electrones (EI) con energía de 70 eV. Las temperaturas de la cámara de ionización y Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 38 línea de transferencia se mantuvieron a 290 °C y 310 °C respectivamente. Los espectros de masas y corrientes iónicas reconstruidas (TIC) fueron obtenidos en un cuadrupolo, por medio de barrido automático de frecuencia (full scan), en el rango de masas de m/z 45- 600.

Los picos obtenidos mediante GC-MS de los extractos de células y medio control y elicitados fueron determinados al comparar su espectro de masas con la librería del National Institute of Standards and Technology 14 (NIST, USA). Se seleccionaron aquellos compuestos que presentaron un índice de similitud IS ≥ 90% y se excluyeron algunos picos tales como, silanos y siloxanos relacionados con el sangrado de la columna.

● Análisis estadístico Con el fin de determinar los metabolitos inducidos debido a la presencia de los elicitores (presentes en tratamientos y ausentes en controles) y los metabolitos en los que se vio afectada su producción por los tratamientos con MeJA y SA (cambios relacionados con área relativa) se realizaron diagramas de Venn y los análisis estadísticos multivariados (AMV): Análisis de componentes principales (ACP), Biplot y mapa de calor. En el caso del mapa de calor, los agrupamientos de los compuestos y de las muestras se determinaron mediante distancias euclidianas. Los diagramas de Venn se construyeron en el programa InteractiVenn (Heberle, Meirelles, Silva, Telles, & Minghim, 2015) y los AMV en RStudio version 1.2.1335 usando los paquetes prcomp, factoextra y pheatmap.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 39

4. Resultados y discusión

4.1 Establecimiento de condiciones para callogénesis

Con el fin de determinar condiciones favorables para la formación de callos friables se evaluó el efecto de distintos reguladores de crecimiento sobre explantes obtenidos de plantas germinadas in vitro. Para esto, fue necesario evaluar protocolos para la esterilización de las semillas recolectadas en campo, seleccionar medio para su germinación in vitro y evaluar diferentes concentraciones de 2,4-D (auxina) y BAP (citoquinina) sobre distintos explantes. Los resultados obtenidos de estas etapas se discuten en esta sección.

4.1.1 Evaluación de protocolos para la esterilización superficial de las semillas La esterilización de la superficie de las semillas que fueron recolectadas en campo es una etapa indispensable para evitar al máximo la contaminación de los medios de cultivo y evitar el crecimiento de microorganismos que puedan afectar el desarrollo de las plantas durante su germinación in vitro. Por lo tanto, se evaluó la efectividad de esterilización de tres protocolos sobre la testa de semillas de P. cumanense, con los resultados obtenidos se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para determinar si existen diferencias entre grupos y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn para establecer los protocolos entre los que se presentan diferencias significativas (p<0.05). De esta manera, se encontró que con el protocolo 2 (P2) se obtiene una menor contaminación y que éste difiere significativamente del protocolo 3 (P3). Por su parte, el protocolo 1 (P1) tuvo la mayor varianza respecto a los demás exhibiendo un porcentaje de contaminación tan alto como el valor mínimo de P3 y tan bajo como el valor máximo de P2 (figura 4-1).

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 40

Figura 4-1. Porcentaje de contaminación tras la siembra in vitro de semillas esterilizadas superficialmente con tres protocolos. P1, P2 y P3 hacen referencia a los tres protocolos de esterilización evaluados. *

El * representa los protocolos en los que se presentaron diferencias significativas de acuerdo con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (p<0.05).

Teniendo en cuenta los resultados de los porcentajes de contaminación y, los tiempos de exposición de las semillas con cada uno de los componentes utilizados en los distintos protocolos (etanol al 70%, hipoclorito de sodio 5.25%, Tween® 20 y detergente) se pudo inferir que un lavado con detergente neutro (P2) es crucial para aumentar la efectividad en la esterilización y que un incremento en el tiempo de exposición de las semillas con etanol 70% (P1) se relaciona aparentemente con una menor contaminación. El lavado con detergente realizado en el P2 pudo favorecer la remoción de residuos orgánicos, microorganismos y/o sales presentes en la testa de las semillas con lo que se logró potenciar la acción de los demás agentes desinfectantes. Por otro lado, un mayor tiempo de exposición con etanol en el P1 podría haber generado una mayor penetración de esta solución en las membranas celulares de microorganismos donde actúa desnaturalizando las proteínas (Rutala & Weber, 2008).

Los agentes desinfectantes y tiempos de exposición empleados en el P2 mostraron ser los más efectivos para esterilizar la testa de las semillas y evitar la contaminación in vitro además de presentar la menor varianza de los tres protocolos. Por lo tanto, el P2 fue seleccionado para esterilizar superficialmente las semillas de P. cumanense que luego fueron empleadas para la evaluar la germinación in vitro.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 41

4.1.2 Germinación in vitro

En la Figura 4-2 se presentan los resultados del estudio de germinación de las semillas de P. cumanense en el que se evaluó la influencia del tiempo de siembra de las semillas después de la recolección y diversos medios de cultivo. Los tratamientos evaluados permitieron determinar que existe una rápida disminución de la viabilidad de las semillas relacionada con el tiempo de siembra luego de su recolección directa en campo, pues, se pasó de aproximadamente 70% de germinación en la primera semana a un 11% cuando son sembradas en la cuarta semana. No obstante, se puede recuperar parcialmente la germinabilidad en la semana 4 mediante la adición de AG3.

Figura 4-2. Porcentajes de germinación de semillas de P. cumanense bajo la influencia de diferentes tiempos de siembra después de su recolección y medios de cultivo (MS con y sin adición de AG3).

Las letras indican los tratamientos con los que hubo diferencias significativas (p<0.05).

Estos resultados muestran que la germinación in vitro de las semillas de P. cumanense se ve afectada por el tiempo de siembra después de su recolección. Esto concuerda con las investigaciones realizadas por Delgado-Paredes et al. (2012) y Delgado-Paredes et al. (2017) en las cuales encontraron que las semillas de especies de Piper disminuyen su viabilidad con el tiempo, tal es el caso de P. tuberculatum cuya germinación disminuye un 75% al sembrar sus semillas luego de tres meses y, de P. cernuum que pasa de un 26% de germinación cuando sus semillas se siembran a la semana de recolección a un 0% luego de tres meses de recolección. Delgado-Paredes et al. (2012) también encontraron casos más extremos como el de P. solmsianum, cuyas semillas pasaron de tener una Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 42 germinación del 98.1% a la semana siembra a una 0% en tres meses. Estos resultados indican que las semillas de Piper tienden a ser recalcitrantes, es decir, que su viabilidad se ve afectada por las condiciones ambientales después de su recolección, lo que desfavorece su conservación por tiempos prolongados.

Debido a estas características que presentan las semillas de Piper se decidió exponer las semillas de P. cumanense recolectadas después de cuatro semanas, en medios MS con adición de la giberelina AG3. El AG3 es una giberelina sintética y biológicamente activa que está involucrada en diversos procesos de desarrollo de las plantas, entre los que se encuentra el rompimiento de la dormancia de las semillas, ya que favorece la síntesis de α-amilasa y proteasas encargadas de hidrolizar el almidón y proteínas de reserva; de esta manera, la adición exógena de AG3 favorece estos procesos de traslocación de nutrientes promoviendo el desarrollo del embrión y con esto la germinación, tal como se observó en este estudio (Pallardy, 2008; Yamaguchi et al., 2010; Bhatia, 2015; Sgamma & Jackson, 2015).

4.1.3 Inducción de callos friables

La generación de callos friables fue evaluada en dos tipos de explantes (láminas y pecíolos) sobre los que se determinó el efecto de la adición de cuatro concentraciones (0, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 mg/L) de los reguladores de crecimiento BA y 2,4-D. Con el fin de establecer el efecto de estos regulares de crecimiento sobre la respuesta morfológica en láminas y pecíolos se realizó también un análisis de componentes principales (ACP) para determinar las relaciones entre las distintas variables.

-Efecto de reguladores en lámina En la Tabla 4-1 se presenta el efecto de diferentes combinaciones de BAP y 2,4-D en la organogénesis y callogénesis al emplear láminas obtenidas de plantas in vitro de P. cumanense como explantes.

Tabla 4-1. Efecto de diferentes combinaciones de BAP y 2,4-D en la organogénesis y callogénesis al emplear láminas de P. cumanense como explantes. Consistencia del callo: C: Callo compacto. F: Callo friable. Color del callo: B: Callo color blanco. M: Callo color marrón. V: Callo color verde. NA: No aplica

Callogénesis Caulogénesis Rizogénesis

Láminas con Consistencia Color del Láminas con formación Láminas con formación BAP (mg/L) 2,4-D (mg/L) formación de callo (%) del callo callo de brotes (%) de raíces (%)

0 0 0 NA NA 0,0 0,0

0 0,25 0,0 NA NA 16,7 66,7

0 0,5 0,0 NA NA 0,0 100,0

0 1 0,0 NA NA 0,0 75,0

0 1,5 100,0 C M 0,0 0,0

0,25 0 0,0 NA NA 8,3 0,0

0,25 0,25 0,0 NA NA 0,0 66,7

0,25 0,5 0,0 NA NA 0,0 75,0

0,25 1 0,0 NA NA 0,0 91,7

0,25 1,5 0,0 NA NA 0,0 50,0

0,5 0 0,0 NA NA 0,0 0,0

0,5 0,25 50,0 C M 0,0 0,0

0,5 0,5 0,0 NA NA 41,7 0,0 Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 44

0,5 1 0,0 C M 0,0 0,0

0,5 1,5 100,0 C M 0,0 0,0

1 0 0,0 NA NA 0,0 0,0

1 0,25 0,0 NA NA 50,0 0,0

1 0,5 0,0 NA NA 25,0 0,0

1 1 0,0 NA NA 0,0 16,7

1 1,5 0,0 NA NA 0,0 16,7

1,5 0 8,3 C M 0,0 0,0

1,5 0,25 0,0 NA NA 25,0 0,0

1,5 0,5 0,0 NA NA 0,0 16,7

1,5 1 0,0 NA NA 0,0 8,3

1,5 1,5 100,0 C B 0,0 0,0

Las láminas tuvieron respuestas de rizogénesis al ser expuestas a altas concentraciones de 2,4-D y bajas o nulas de BAP (Figura 4-3). La exposición de láminas a medios con alta concentración de AIA, ANA y bajos de 2,4-D también han permitido la formación de raíces en P. solmsianum. En callos y brotes expuestos a altas concentraciones de auxinas como 2,4-D (0.5 – 2 mg/L) y AIB (1 – 3 mg/L) se ha favorecido la generación de raíces entre un 40 – 100% en P. nigrum. Esta diferenciación de raíces es muy importante cuando se quiere realizar una micropropagación rápida y en masa de material vegetal de interés pues determinará en gran medida la posterior aclimatación de las plantas (Balbuena et al., 2009; Hussain et al., 2011; Khan, Banu, Islam, & Das, 2017).

Por otro lado, la caulogénesis, contrario a la rizogénesis, se presentó en medios con altas concentraciones de BAP y bajas concentraciones de 2,4-D (Figura 4-3). En otras especies de Piper se han encontrado respuestas similares; por ejemplo, láminas expuestas de P. longum a altas concentraciones de BAP combinado con picloram (auxina) han permitido la formación de brotes (Soniya & Das, 2002). En láminas de P. nigrum altas concentraciones de esta citoquinina combinado con baja concentración de NAA y 2,4-D (auxinas) promovieron la caulogénesis, pero ésta se vio más favorecida en medios con altas concentraciones de BAP en ausencia de auxinas, lo que denota la importancia de esta citoquinina en este proceso organogénico (Ahmad, Haider, Fazal, Ali, & Siddique, 2014) y, P. solmsianum se han generado una alta cantidad de brotes al exponer láminas en medios con alta concentración de BAP combinado con una baja o alta concentración de auxinas (IAA, y 2,4-D) (Balbuena et al., 2009).

La formación de callo tuvo lugar en medios con alta concentración de 2,4-D independientemente de la adición de citoquinina, sin embargo, estos callos siempre fueron compactos y de color marrón (Figura 4-3). Esta respuesta también se ha encontrado en P. colubrinum donde láminas dispuestas en medios con BAP (0.5 – 2.0 g/L) y 2,4-D o ANA (0.5 – 1 mg/L) producen callos compactos y de color blanco (Kelkar, Deboo, & Krishnamurthy, 1996) y, en P. nigrum, donde láminas expuestas a concentraciones medias a altas de AIB en ausencia de citoquinina favorecieron la formación de callos; sin embargo, estos, como en el caso de P. cumanense, fueron compactos y marrones (Hussain et al., 2011).

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 46

Figura 4-3. Respuestas morfológicas obtenidas en lámina luego de exponerla ante diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D.

- Efecto de reguladores en pecíolo En la Tabla 4-2 se presenta el efecto de diferentes combinaciones de BAP y 2,4-D en la organogénesis y callogénesis al emplear pecíolos obtenidos de plantas in vitro de P. cumanense como explantes.

Tabla 4-2. Efecto de diferentes combinaciones de BAP y 2,4-D en la organogénesis y callogénesis al emplear pecíolos de P. cumanense como explantes. Consistencia del callo: C: Callo compacto. F: Callo friable. Color del callo: B: Callo color blanco. M: Callo color marrón. V: Callo color verde. NA: No aplica.

Callogénesis Caulogénesis

Pecíolos con formación de Pecíolos con formación de Consistencia del callo Color del callo BAP (mg/L) 2,4-D (mg/L) callo (%) brotes (%)

0 0 0,0 NA NA 0,0

0 0,25 100,0 C M 0,0

0 0,5 100,0 F M 0,0

0 1 100,0 F M 0,0

0 1,5 91,7 F M 0,0

0,25 0 0,0 NA NA 8,3

0,25 0,25 83,3 F M 0,0

0,25 0,5 100,0 F B 0,0

0,25 1 100,0 C M 0,0

0,25 1,5 75,0 C B 0,0

0,5 0 0,0 NA NA 0,0

0,5 0,25 41,7 C M 0,0

0,5 0,5 100,0 C M 0,0 Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 48

0,5 1 100,0 F B 0,0

0,5 1,5 91,7 C M 0,0

1 0 0,0 NA NA 0,0

1 0,25 100,0 C M 0,0

1 0,5 100,0 C B 0,0

1 1 100,0 C B 0,0

1 1,5 100,0 F B 0,0

1,5 0 0,0 NA NA 0,0

1,5 0,25 100,0 C V 0,0

1,5 0,5 100,0 C B 0,0

1,5 1 100,0 C V 0,0

1,5 1,5 100,0 F B 0,0

Los pecíolos tuvieron respuestas de caulogénesis en tratamientos con BAP en baja concentración (0.25 mg/L) y nulos de 2,4-D (Figura 4-4). Con este explante la caulogénesis fue baja, únicamente 8.3% de los explantes y, al aumentar la concentración de BAP no se encontró ninguna respuesta, lo que señala que posiblemente este tipo de citoquinina, aunque permite formación de brotes no favorece en gran medida la caulogénesis en pecíolos de P. cumanense. No obstante, en otras especies de Piper como P. nigrum se ha encontrado que concentraciones medias a altas (0.5 – 2 mg/L) de BAP promueven una alta formación de brotes (80-100%) al usar callos (Hussain et al., 2011); en P. longum, BAP 0,5 mg/L favorece en gran medida la generación de yemas de brotes (22.00±1.87) en comparación con concentraciones superiores o inferiores (10.50±0,61 – 16.50±1.39) al usar segmentos peciolares (Rani & Kumar, 2012) y; en P. barberi, el uso conjunto de las citoquininas BAP y kinetina (2.22 µM y 0.46 µM, respectivamente) han permitido una alta proliferación de brotes (6.9±0.58 tallos adventicios) al emplear segmentos nodales (Anand & Srinivasa, 2000).

Estos resultados señalan la importancia de las citoquininas, y en particular del BAP, en procesos de caulogénesis, los cuales son dependientes de la concentración, de la especie y del tipo de explante utilizado. La producción de brotes a nivel in vitro es de gran importancia para la micropropagación en masa de especies de interés, tales como P. nigrum (pimienta negra) de importancia económica por sus frutos, P. longum, especie de importancia medicinal para el control de enfermedades respiratorias y P. barberi, una especie endémica de Kerala (India) de importancia medicinal y que se encuentra en peligro crítico (Khan et al., 2017)(Anand & Chaluvadi, 2000).

En contraste a la producción de brotes, se encontró que la ausencia de BAP y la presencia de 2,4-D, en concentraciones variables (0.5 – 1.5 mg/L) permitió la formación de callos friables, pero de coloración marrón y, solo en un caso callo con estas características se formó en medios con BAP y 2,4-D, ambos en concentraciones bajas (0.25 mg/L) (Figura 4-4). Por otro lado, callos friables y blancos se obtuvieron en tratamientos que involucraban principalmente la presencia de ambos reguladores y donde la concentración de auxina fue 1.5 a 2 veces mayor respecto a la citoquinina adicionada y, solo en un tratamiento por la combinación de una concentración alta de ambos reguladores (1.5 mg/L). En cambio, cuando estaban presentes tanto el BAP como el 2,4-D pero la auxina tenía una concentración 3 veces o más superior a la de la citoquinina adicionada se formaron callos Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 50 compactos y en su mayoría marrón y, cuando la auxina se encontraba en una cantidad menor respecto de la máxima concentración de citoquinina evaluada (1,5 mg/L) se formaron callos compactos y de coloración verde (Figura 4-4).

La formación de callos en otras especies de Piper también se ha visto favorecida por la combinación de citoquinina (BAP) y auxina (2,4-D); por ejemplo, segmentos peciolares de P. solmsianum formaron callos en medios con relaciones citoquinina-auxina 1:1 y 1:10; sin embargo, callos friables con una alta tasa de crecimiento favorables para establecimiento de suspensiones se obtuvieron en medios con bajas concentraciones de 2,4-D (0.2 mg/L) y altas de BAP (2 mg/L), contrario a lo encontrado en P. cumanense, donde concentraciones mayores de 2,4-D respecto al BAP adicionado (en relaciones 1:2) generaron callos friables (Balbuena et al., 2009). Por otro lado, segmentos nodales de P. aduncum, P. cernuum y P. crassinervium formaron callos friables en medios con combinaciones de ANA y BAP en los que la auxina estuvo en concentraciones superiores (relaciones ANA-BAP 2:1 o 5:1) (Delgado-Paredes, Kato, & Rojas-Idrogo, 2013).

Lo anterior muestra que para obtener callos a partir de pecíolos de P. cumanense se requiere, principalmente, medios que contengan tanto BAP como 2,4-D y, que su concentración determinará las características físicas de éstos. Así, callos compactos se formaron al adicionar mayor o menor concentración de 2,4-D respecto de BAP, callos que se caracterizan por presentar células más interconectadas entre sí que simulan una organización más de tipo tisular que no es recomendable para el establecimiento de suspensiones, pues su disgregación será dificultosa viéndose posiblemente limitado su crecimiento, lo que generará condiciones de estrés no deseado en este tipo de cultivo.

Además, callos friables con características físicas (friable y blanco) recomendables para ser utilizados en cultivos de células en suspensión se obtuvieron de tratamientos con BAP y 2,4-D, pero con una concentración particular de auxina (1,5 a 2 veces mayor respecto de la citoquinina) y, callos friables pero marrones se lograron al adicionar únicamente 2,4-D (Figura 4-4), lo que señala que posiblemente la ausencia de citoquinina pudo generar un desbalance hormonal que conllevó a un estrés celular no deseado y expresado en esta coloración.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 51

Figura 4-4. Respuestas morfológicas obtenidas en pecíolo luego de exponerla ante diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D.

- Análisis de componentes principales A través de un análisis de componentes principales (ACP) se determinó el efecto de los reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfológica en pecíolos y láminas (Figura 4-5).

El ACP permitió discriminar seis agrupaciones correspondientes al efecto que tuvieron las diferentes combinaciones de reguladores sobre los explantes (Figura 4-5). Cuando se utilizó lámina, la caulogénesis estuvo relacionada, en general, con una concentración variable de BAP (0 – 1.5 mg/L) y una concentración media a baja (0.5 – 0.25 mg/L) de 2,4- D, la rizógenesis se generó a una concentración variable tanto de BAP como de 2,4-D y la callogénesis se presentó, principalmente, al tener concentraciones medias a altas (0.5 – 1.5 mg/L) de BAP y altas de 2,4-D (1.5 mg/L). Cuando el explante fue pecíolo la caulogénesis se presentó en solo un tratamiento caracterizado por concentración baja de BAP (0,25 mg/L) y nula de 2,4-D, la formación de callo estuvo relacionado con concentraciones variables de BAP (0 – 1.5 mg/L) y altas (1.5 mg/L) de 2,4-D. En los Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 52 tratamientos sin 2,4-D y con concentraciones variables de BAP (0.5 -1 mg/L) el explante no tuvo ninguna respuesta.

Figura 4-5. Análisis de componentes principales mostrando el efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfológica en pecíolo y láminas.

Los resultados obtenidos con el ACP soportan el análisis realizado previamente para cada uno de los explantes en los que se detalla el efecto que tuvieron las combinaciones de citoquininas y auxinas sobre las respuestas de organogénesis y callogénesis al emplear láminas y pecíolos. Los callos formados tuvieron diferentes características morfológicas dependiendo del tipo de explante y la combinación de BAP y 2,4-D. Como la obtención de callo friable y de color beige/blanco es ideal para el establecimiento de suspensiones celulares se descartó el uso de lámina como explante pues, bajo las condiciones evaluadas no se generaron callos con estas características (Figura 4-3). En el caso de los pecíolos, de los cuatro tratamientos que indujeron callos friables y blancos se eligió aquel que conllevara a la mayor biomasa observable de este tipo de callo, el cual correspondió a BAP 0,5 mg/L y 2,4-D 1 mg/L, combinación hormonal elegida para formar la cantidad de callo necesario para el establecimiento de las suspensiones celulares.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 53

4.2 Establecimiento de suspensiones celulares

Para el establecimiento de las suspensiones celulares se evaluó el efecto de la renovación de medio sobre el acondicionamiento del callo al medio líquido y el efecto del tamaño de inóculo inicial sobre el crecimiento celular. De esta manera, se determinó un acondicionamiento favorable para las suspensiones y un tamaño de inóculo inicial adecuado para el crecimiento y desarrollo de los posteriores ensayos de elicitación.

4.2.1 Acondicionamiento de las suspensiones celulares

Las suspensiones celulares fueron iniciadas mediante la transferencia de callo friable a medio líquido. A fin de establecer condiciones favorables de acondicionamiento de estas células -de callo- en suspensión, se evaluó el efecto de un recambio de medio de cultivo a los 15 días frente a suspensiones que continuaron con el mismo medio inicial -sin recambio- a lo largo del tiempo de medición.

El estado del callo una vez transferido al medio líquido fue determinado mediante el ensayo de actividad metabólica con MTT, medición de acidez mediante pH y crecimiento celular en términos de peso seco. A través de la prueba con MTT se observó que una vez transferido el callo hubo una tendencia hacia el aumento de la absorbancia con un valor máximo el día 15 (Figura 4-6. A.). Este aumento está relacionado con un incremento de la viabilidad, ya que una mayor intensidad en la coloración violeta es un indicativo de una mayor actividad metabólica, principalmente debida a deshidrogenasas mitocondriales que generan reducción del MTT, de color amarillo, a formazán, de color violeta (Castro-Concha et al., 2006). Lo anterior, se relaciona con el crecimiento tipo exponencial observado durante los primeros 10 días, lo que evidencia un buen ambiente para el crecimiento celular (Figura 4-6. B.). Además, se presentó una reducción en el pH y una posterior estabilización de este entre valores de 3.7 - 3.9 durante los primeros 15 días (Figura 4-6. C.), lo cual pudo deberse a una regulación celular para favorecer su crecimiento en este nuevo ambiente y a la asimilación de los nutrientes disponibles (Castro-Concha et al., 2006).

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 54

Figura 4-6. Viabilidad, crecimiento y cambios de acidez durante el acondicionamiento de suspensiones celulares de P. cumanense. A. Absorbancia tras incubación de células con MTT. B. Biomasa en términos de peso seco. C. Variación del pH en las suspensiones.

En suspensiones de sorgo, Sorghum bicolor, uva, Vitis vinifera y Parkia biglobosa se ha encontrado un comportamiento similar de la viabilidad y crecimiento al hallado en las suspensiones de P. cumanense, aumento de viabilidad conforme incrementa la biomasa y disminución de ambos luego de alcanzar una fase estacionaria. Esto último, se atribuye a cambios en el metabolismo celular debidos a factores que limitan el crecimiento tales como, macroelementos y fuente de carbono, que desencadenan una desaceleración en la multiplicación celular (Abbas, El-Shabrawi, Soliman, & Selim, 2018; Ramulifho et al., 2019; Sahraroo et al., 2018). Dentro de estos factores, uno de los que más afecta el crecimiento es la concentración de azúcares, ya que ésta provee de energía necesaria para el desarrollo de procesos metabólicos y más aún en suspensiones de plantas porque las células tienden a ser mixotrofas o heterótrofas. Por ejemplo, en suspensiones de Thevetia peruviana, Cnidoscolus chayamansa y Satureja khuzistanica se ha encontrado que el crecimiento celular está limitado por la concentración de sacarosa disponible en el medio de cultivo, de tal manera que cuando se consume la totalidad del azúcar las células entran en fase estacionaria y posteriormente a fase de declive (Arias, Zapata, Rojano, & Arias, Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 55

2016; Pérez-González, Nieto-Trujillo, Gutiérrez-Rebolledo, & García-Martínez, 2019; Sahraroo et al., 2018).

Además, en las unidades experimentales evaluadas en P. cumanense (con y sin recambio de medio a los 15 días) se observaron algunas tendencias que se aprecian en la Figura 4-6 aunque, no se presentaron diferencias significativas de acuerdo con las pruebas de ANOVA realizadas para la viabilidad, crecimiento y cambios de acidez durante el acondicionamiento de las suspensiones. Las tendencias observadas fueron: La adición de medio (suspensiones con recambio) el día 15 generó una disminución tanto de la viabilidad como de la biomasa en el día 22. Este descenso pudo deberse a un aumento en el pH de las suspensiones el día 22 (Figura 4-5. C), el cual fue posiblemente ocasionado al agregar medio nuevo, pues este una vez es esterilizado mediante autoclave tiene un pH de 4.5 que, al adicionarse a las suspensiones, que venían creciendo a un pH de 3.7 – 3.9, pudo generar un desbalance en procesos metabólicos y con esto afectar la viabilidad y el crecimiento celular. Sin embargo, luego de este descenso se aprecia una tendencia hacia el incremento de la viabilidad, lo que se puede relacionar con una regulación de pH hacia valores más bajos y favorables para el crecimiento de las suspensiones. Por su parte, las suspensiones a las que no se les realizó recambio de medio tuvieron una tendencia a la disminución de la viabilidad celular después del día 15, la cual estuvo asociada con una tendencia hacia una mayor alcalinidad y, a su vez con una aceleración negativa del crecimiento (Figura 4-6).

Se encontró que el recambio de medio realizado el día 15 determina una ligera disminución de la biomasa en los días 15 a 30 asociado a una leve disminución de la viabilidad celular el día 30 en comparación con las suspensiones a las que no se les realizó recambio de medio. Sin embargo, el día 30 los cultivos sin recambio mostraron células oscuras que evidencian procesos de oxidación asociados a estrés, respecto a tratamientos con recambio de medio, por tal motivo, se decidió realizar esta renovación de medio para acondicionar las suspensiones que fueron empleadas para los siguientes ensayos (Figura 4-7). Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 56

Figura 4-7. Suspensión con el mismo medio inicial (izquierda) y suspensión con recambio (derecha) luego de 30 días de cultivo.

4.2.2 Evaluación del tamaño de inóculo sobre el crecimiento de células en suspensión

Se estableció la curva de crecimiento de suspensiones celulares de P. cumanense con concentraciones iniciales de 50 g/L y 90 g/L. Además, se evaluaron algunos parámetros cinéticos con el fin de determinar el inóculo más adecuado para el establecimiento de las suspensiones que luego serían sometidas a los ensayos de elicitación.

En la Figura 4-8 se presentan estas curvas de crecimiento con los inóculos iniciales evaluados (50 g/L y 90 g/L). Se observa que las suspensiones, independientemente de la concentración celular inicial inoculada, presentan un crecimiento exponencial con un máximo aumento en biomasa el día 10, seguido de una disminución del crecimiento hasta alcanzar la fase estacionaria. También se aprecia que las suspensiones con una concentración inicial de 50 g/L tuvieron una disminución en el crecimiento después del día 5 de cultivo. Esta reducción del crecimiento y la menor velocidad que tuvieron las suspensiones de 90 g/L puede estar relacionada con el consumo de la fuente de carbono, en este caso la sacarosa, o algún macroelemento (potasio o nitrógeno, principalmente) que pudieran actuar como sustrato limitante en el medio de cultivo (Ali et al., 2016; Fazal, Haider, & Nisar, 2015; Niranjana et al., 2014; V. Singh, Vinod, & Dixit, 2013).

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 57

Figura 4-8. Curvas de crecimiento de suspensiones con concentraciones celulares de 50 g/L y 90 g/L.

En Piper hay pocas investigaciones sobre el establecimiento y evaluación del crecimiento de suspensiones celulares. Sin embargo, en estos estudios se ha reportado que las células en suspensión tienen una fase exponencial más prolongada que la encontrada en P. cumanense y un máximo de crecimiento entre los días 21 y 36 después de su cultivo. Por ejemplo, en P. crassinervium y en P. solmsianum se logró la mayor biomasa al día 34 y 36, respectivamente. En cambio, en P. cernuum se reporta un máximo a los 21 días de iniciado el muestreo. Las diferencias presentadas en las cinéticas de crecimiento puede deberse no solo a la especie sino también, a las condiciones físicas (temperatura, fotoperiodo, intensidad lumínica), al sistema de cultivo, al tipo y capacidad del biorreactor empleado (Balbuena et al., 2009; Danelutte, Costantin, Delgado, Braz-Filho, & Kato, 2005; G. Delgado-Paredes et al., 2013).

En P. cumanense, también se determinaron algunos parámetros cinéticos como la tasa específica máxima de crecimiento (µmax) y el tiempo de duplicación (td). Las suspensiones con una concentración celular inicial de 50 g/L tuvieron una mayor velocidad de crecimiento

-1 (µmax) en comparación con las de 90 g/L, con µmax de 0,1726 ± 0,02732 día y 0,1097 ± 0,001477 día -1, respectivamente. Así mismo, el tiempo de duplicación fue mayor en suspensiones de 50 g/L, con un td de 4,016, respecto con las de 90 g/L, con un td de 6,319. Estas diferencias pueden deberse a un consumo más rápido de azúcares o macroelementos en densidades celulares mayores, lo que se pudo ver reflejado en una Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 58

menor µmax y mayor td en inóculos de 90 g/L respecto a los de 50 g/L (Niranjana et al., 2014; Yue et al., 2016).

En los estudios realizados en especies de Piper relacionados al crecimiento en suspensiones celulares no se han reportado valores de µmax ni de td; sin embargo, de acuerdo con los resultados de las investigaciones en suspensiones de P. crassinervium, P. solmsianum y P. cernuum,, en los que se alcanzó un crecimiento máximo después de

20 días de cultivo, se puede esperar que la µmax es menor y la td; mayor que las observadas para P. cumanense (Balbuena et al., 2009; Danelutte et al., 2005; G. Delgado-Paredes et al., 2013)

En suspensiones de especies pertenecientes a diferentes familias y en sistemas de cultivo semejantes al empleado en este trabajo se reportan valores de µmax y td similares a los encontrados para P. cumanense (Tabla 4-3). Estos parámetros sirven de base para realizar un escalado del proceso a biorreactores de mayor capacidad, en cuyo caso sería importante medir otras variables que influyen tanto en el crecimiento como en la eventual producción de metabolitos secundarios de interés, tales como consumo de azúcares y nutrientes, velocidad de agitación, suministro de oxígeno, entre otros (Niranjana et al., 2014; Yue et al., 2016).

Tabla 4-3. Parámetros cinéticos de crecimiento en suspensiones celulares de distintas especies vegetales. µm representa la tasa específica de crecimiento y td el tiempo de duplicación.

-1 Especie µm (Día ) td (días) Sistema Referencia

Prosopis laevigata 0,104 6,6 Matraces (Trejo-Espino, 150 mL Rodríguez-Monroy, Vernon-Carter, & Cruz- Sosa, 2011) Piper cumanense 0,11 y 0,17 6,3 y 4,0 Matraces Este trabajo de 100 mL Solanum tuberosum 0,12 5,8 Matraces (Nova-López, Muñoz- de 100 mL Pérez, Granger-Serrano, Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 59

Arias-Zabala, & Arango- Isaza, 2017)

Taxus cuspidata 0,15 4,62 Matraces (Naill & Roberts, 2005) 125 mL

Debido a que se ha encontrado que en la fase estacionaria las células producen una mayor cantidad de metabolitos respecto a la fase exponencial, en la que su maquinaria metabólica está dirigida principalmente al aumento de biomasa (Ramirez-Estrada, K et al. 2016), se eligió esta fase (entre días 10 y 20) para realizar los tratamientos de elicitación. Además, se eligió establecer suspensiones celulares con inóculos iniciales de 90 g/L para las elicitaciones debido a que el uso de una mayor biomasa permitiría la obtención de extractos más concentrados que iban a poder analizarse mejor con las técnicas cromatográficas (UHPLC-UV y GC-MS), más aún si se tiene en cuenta que el análisis de la presencia de metabolitos en extractos obtenidos a partir de biomasas muy bajas puede dificultarse y verse limitado por el límite de detección de los equipos.

4.3 Efecto de la elicitación de suspensiones celulares en la producción de metabolitos secundarios

4.3.1 Cromatografía líquida (UHPLC-DAD)

Los extractos de células y medio de cultivo de suspensiones celulares (control y elicitadas) se analizaron en el equipo de UHPLC-DAD, siendo los cromatogramas resultantes de cada matriz (células o medio) comparados entre si teniendo en cuenta la presencia/ausencia y el área relativa de los picos seleccionados. Adicionalmente, los cromatogramas fueron analizados para determinar la presencia de algunos constituyentes químicos previamente aislados e identificados de plantas silvestres de P. cumanense.

En la Figura 4-9 se ilustran los perfiles cromatográficos obtenidos para células elicitadas con MeJA y SA, a diferentes concentraciones de cada elicitor y tiempos de exposición. Los perfiles cromatográficos permitieron evidenciar que en todas las muestras analizadas hubo producción de metabolitos de diferente polaridad, algunos compuestos aparecen durante Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 60 los primeros 15 min y la mayor cantidad de metabolitos se registra entre los minutos 25 y 33. Las muestras tanto de controles como de tratamientos presentaron similares perfiles cromatográficos, por lo que las señales más representativas fueron seleccionadas y enumeradas en la Figura 4-9. De los picos seleccionados se resumen sus tiempos de retención y máximos de absorbancia en la tabla 4-5. Adicionalmente, en la tabla se incluyen los tiempos de retención y los máximos de absorbancia para los compuestos previamente aislados e identificados en P. cumanense, los cuales no fueron observado en los diferentes perfiles cromatográficos de los controles y tratamientos, lo que indica que las células en suspensión no están produciendo este tipo de compuestos bajo las condiciones de cultivo in vitro evaluadas.

Los perfiles de las células elicitadas con SA a las dos concentraciones evaluadas fueron los que más tendieron a aumentar el área de las señales: El tratamiento de las suspensiones con SA 10 µM por un tiempo de 24h incrementó el área del pico 6 (2.6 veces) respecto al control, mientras que a las 6h y 12h se observó aumentos de las intensidades de los picos 7 (7.6 y 11 veces, respectivamente) y 9 (2.5 y 2.7, respectivamente). En las muestras tratadas con SA 100µM se observó un aumento a las 6 h del área de los picos 6 (2.7 veces) y 7 (8.7 veces), mientras que a las 24 h solo aumento la intensidad del pico 7 (8.6 veces), respecto al control.

Por su parte, los tratamientos con MeJA también incrementaron el área de algunos picos en los perfiles cromatográficos. La elicitación con MeJA 10 µM en un tiempo de exposición de 12h aumento el área del pico 2, 2.9 veces respecto al control. Los tratamientos con MeJA 100 µM a las 6h ocasionaron aumentos de área del pico 13, en este caso, 3 veces más respecto al control y, a las 24h se observó el aumentó de área (13.7 veces) del pico 7, incluso más que lo logrado por los tratamientos con SA.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 61

Figura 4-9. Perfiles cromatográficos por UHPLC-DAD de células de suspensiones control y elicitadas con SA y MeJA a las concentraciones de A. 10 µM y, B. 100 µM durante un tiempo de exposición de 6h, 12h y 24h.

A.

B.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 62

Tabla 4-4. Tiempos de retención y máximos de absorción de picos seleccionados en los perfiles de células y de patrones de P. cumanense analizados por UHLPC. TR: Tiempo de retención. ESM: Error estándar de la media.

Pico No. / Compuesto TR (min) ± SEM Máximos de absorción (nm) Pico 1 0.62 ± 0.00 200.0*; 258.8 Pico 2 1.32 ± 0.02 200.9; 273.8 Pico 3 2.39 ± 0.04 205.0; 239.7; 313.6 Pico 4 13.55 ± 0.03 279.5

Pico 5 14.38 ± 0.03 233.3*; 277.8 Pico 6 25.82 ± 0.02 200.0*; 226.2; 276.6 Pico 7 26.43 ± 0.02 216.0, 252.9* Pico 8 28.04 ± 0.02 245.0 Pico 9 28.56 ± 0.02 238.3 Pico 10 28.75 ± 0.02 251.8 Pico 11 29.35 ± 0.02 237.5

Picosmuestras células Pico 12 31.69 ± 0.02 242.4 Pico 13 31.82 ± 0.01 242.1*; 321.1 Pico 14 31.97 ± 0.01 285.8 Pico 15 32.39 ± 0.02 242.1 Pico 16 32.58 ± 0.02 241.9

Ácido oxocuménico 15.85 ± 0.61 204.0; 236.0*; 327.0 Ácido gaudichaudianico 20.50 ± 0.60 247.0*; 284.0; 367.0 Ácido cuménico 23.11 ± 0.35 203.0; 242.0*; 270.0

Patrones Óxido de cariofileno 24.86 ± 0.38 201.0*; 288.0 *Corresponde al máximo de absorción en el espectro.

Para determinar si las áreas de los picos de los tratamientos con elicitores presentaron diferencias respecto al control se estandarizaron los valores promedio de las áreas respecto a la desviación de todo el conjunto de datos. A partir de esta información, se determinaron los picos que tuvieron una diferencia mayor, al menos, a una desviación estándar (σ), es decir, cuyos valores promedio de área difirieron respecto al control (Figura 4-10). De esta manera, se estableció que los picos 2, 3, 6, 9, 10 y 16 tuvieron valores de σ entre 1 y 2 y, los picos 7 y 13 valores de σ mayores a 2 indicando que estos dos picos (7 y 13) fueron los que más cambiaron respecto al control en algunos tratamientos.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 63

Figura 4-10. Desviación estándar de los picos seleccionados en las muestras control y elicitadas de células.

En la Figura 4-11 se presentan los perfiles cromatográficos obtenidos de medios provenientes de suspensiones control y elicitadas con MeJA y SA, a diferentes concentraciones de cada elicitor y tiempos de exposición. Los perfiles cromatográficos muestran que en todas las muestras analizadas hubo un pico de alta polaridad en el minuto 0.62 que representó alrededor del 85% del área relativa total y, la mayor cantidad de metabolitos se registró entre los minutos 24 y 34. Así como en el caso de células, las muestras tanto de controles como de tratamientos presentaron similares perfiles cromatográficos, por lo que las señales más representativas fueron seleccionadas y enumeradas en la Figura 4-11. Los picos elegidos junto con sus tiempos de retención y máximos de absorbancia se presentan en la tabla 4-5. Asimismo, en esta tabla se indican los máximos de absorbancia de los compuestos previamente aislados e identificados en P. cumanense, los cuales no se observaron en los controles ni en los tratamientos, lo que señala que las células no los está produciendo ni expulsando al medio de cultivo en las condiciones evaluadas.

Los perfiles de las células elicitadas con SA disminuyeron o aumentaron el área de algunas señales: El tratamiento con SA 100 µM aumentó el área del pico 2 mientras que al tratar las suspensiones con SA 10 µM se presentó una reducción del pico 8 (0.4 veces), respecto Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 64 al control. De manera interesante, este elicitor ocasionó la producción del pico 2 en muestras tratadas con SA 100µM 6h, 12h y 24h, pico que no se encontró en el control.

Por su parte, los tratamientos con MeJA redujeron las áreas relativas de algunas señales seleccionadas: El tratamiento con MeJA 100 µM 6h generó una reducción del pico 8 (0.4 veces), respecto al control. Las muestras tratadas con MeJA 10µM ocasionó una disminución de los picos 1 y 8, los cuales presentaron un área 0.9 y 0.5 veces menor que el control, respectivamente. Por otro lado, la exposición de las suspensiones con MeJA 10µM y un tiempo de 12h generó los mayores aumentos de las áreas de las señales. Se presentaron incrementos 2.5, 3.1 y 2.0 veces más el área de los picos 5, 6 y 7, respectivamente, en referencia al control.

Figura 4-11. Perfiles cromatográficos por UHPLC-DAD de medios de suspensiones control y elicitadas con SA y MeJA a las concentraciones de A. y B. 10 µM y, C. y D. 100 µM durante un tiempo de exposición de 6h, 12h y 24h. En B y D se muestran los cromatogramas desde el tiempo de retención: 4 min. En medios, el pico 2 se observa únicamente en tratamientos con elicitores a concentración de 100 µM.

A.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 65

B.

C.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 66

D.

Tabla 4-5. Tiempos de retención y máximos de absorción de picos seleccionados en los perfiles de medios y de patrones de P. cumanense analizados por UHLPC. TR: Tiempo de retención. ESM: Error estándar de la media.

Pico No. / Compuesto TR (min) ± SEM Máximos de absorción (nm)

Pico 1 0.62 ± 0.00 208.3*; 262.3 Pico 2 0.94 ± 0.00 202.4a; 205.5*; 235.4; 303.3

medio Pico 3 25.62 ± 0.01 200.0*; 250.0 Pico 4 25.26 ± 0.01 252.5 Pico 5 25.92 ± 0.01 200.0*; 224.5; 281.8 Pico 6 28.66 ± 0.01 240.8 Pico 7 32.49 ± 0.01 242.2

Picosmuestras Pico 8 33.23 ± 0.00 200.0*; 212.5; 272

Ácido oxocuménico 15.85 ± 0.61 204.0; 236.0*; 327.0 Ácido gaudichaudianico 20.50 ± 0.60 247.0*; 284.0; 367.0 Ácido cuménico 23.11 ± 0.35 203.0; 242.0*; 270.0

Patrones Óxido de cariofileno 24.86 ± 0.38 201.0*; 288.0 *Corresponde al máximo de absorción en el espectro. Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 67

Con el fin de determinar si las áreas de los picos de los tratamientos con elicitores presentaron diferencias respecto al control se estandarizaron los valores promedio de las áreas respecto a la desviación de todo el conjunto de datos. De esta manera, se determinó que aquellas señales que tuvieron una diferencia mayor a una desviación estándar (σ) se consideraron diferentes respecto al control (Figura 4-12), encontrando que los picos 1, 2, 5, 6, 7 y 8 cumplieron con esta característica.

Figura 4-12. Desviación estándar de los picos seleccionados en las muestras control y elicitadas de medios.

Así como en el caso de células, se compararon los perfiles de medios con los tiempos de retención y máximos de absorción de los compuestos identificados previamente en P. cumanense pero no se encontraron señales que correspondieran a estos compuestos en controles ni en medios de suspensiones elicitadas. Esto podría deberse a que los elicitores empleados y los tiempos a los que fueron expuestas las suspensiones no hubiesen inducido la producción de estos metabolitos en cantidades detectables por el equipo. También, puede que la producción de los metabolitos secundarios de P. cumanense esté asociada a células diferenciadas de tejidos específicos, tales como hojas o inflorescencias, de donde se han aislado los compuestos en plantas silvestres. Esto se plantea, debido a que en otras investigaciones se ha encontrado que la diferenciación celular es muy importante para la activación de rutas que conlleven a la biosíntesis de compuestos de interés; por ejemplo, Langhansová & Maršík (2005) encontraron que el cultivo de raíces de Panax ginseng permite una producción de una mayor variedad de ginsenósidos Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 68

(saponinas) respecto al cultivo de callos o células en suspensión. Esta producción dependiente del tejido se relaciona con el estado de diferenciación de los tejidos, en los cuales puede haber una expresión diferencial de los genes involucrados en la biosíntesis de los compuestos de interés (Giri & Zaheer, 2016; Wei et al., 2016).

La ausencia de los patrones en suspensiones de P. cumanense también podría deberse a que su producción dependa de la presencia de endófitos, término que hace referencia a microorganismos como bacterias u hongos íntimamente asociados a órganos de las plantas y que tienen una relación de comensalismo o mutualismo con su hospedero. Lo anterior, debido a que se ha encontrado que los endófitos pueden inducir la biosíntesis de metabolitos secundarios en las plantas, proporcionar intermediarios que son metabolizados por células vegetales para ensamblar estos metabolitos o incluso producir estos compuestos, cuya biosíntesis a veces inequívocamente se atribuye a las plantas y no a sus endófitos. Por ejemplo, se ha encontrado que el taxol también es producido por los hongos endófitos Pestalotiopsis microspora y Stemphylium sedicola SBU-16 que han sido aislados de especies vegetales de los géneros Taxus y Taxodium y, que la azadiractina A y B es producida por el hongo endófito Eupenicillium parvum aislado de Azadirachta indica (árbol de neem) (Kusari, Verma, Lamshoeft, & Spiteller, 2012; Ludwig- Müller, 2015; Nicoletti & Fiorentino, 2015; Subban et al., 2019).

Además, los perfiles de UHPLC-DAD también mostraron que las áreas de los picos seleccionados de medios tuvieron mayores cambios respecto a las áreas de los picos de células. Esto indica que ante las condiciones de estrés a las que fueron expuestas las suspensiones, las células tienden a producir una mayor cantidad de algunos metabolitos que son preferentemente expulsados hacia el medio de cultivo más que a ser retenidos intracelularmente. Esta expulsión de los metabolitos hacia el medio es deseable en este tipo de estrategias, ya que favorece la extracción de los metabolitos de interés y, además, las células pueden continuar en crecimiento sin necesidad de hacer muestreos destructivos. En algunas especies ha sido posible que las células expulsen los compuestos de interés al medio, tal es el caso de suspensiones de Vitis vinifera, las cuales han secretado resveratrol (polifenol) al medio (Cai, Kastell, Knorr, & Smetanska, 2012; Zamboni et al., 2009). Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 69

4.3.2 Cromatografía de gases (GC-MS)

Al analizar los cromatogramas de GC-MS de las todas las muestras de células y medios (control y elicitadas) y, teniendo en cuenta los criterios de selección de picos (IS ≥ 90), se logró identificar de manera tentativa un total de 121 compuestos que se presentan distribuidos en las Tabla 4-6 yTabla 4-7. En estas tablas se muestra la distribución de los compuestos, junto con sus áreas relativas, en los extractos de medio y células provenientes de suspensiones control y elicitadas.

En los extractos de células se lograron identificar tentativamente un total de 74 metabolitos mientras que en medios hubo un mayor número de compuestos, identificándose tentativamente 87. Los metabolitos de estas matrices (células y medios) corresponden en su mayoría a metabolitos primarios, principalmente, a hidrocarburos y ésteres. Además, se detectaron algunos metabolitos secundarios como terpenos, amidas y fenol, cuyas áreas relativas fueron mayores en extractos de medios de suspensiones elicitadas.

Tabla 4-6. Metabolitos de extractos de células provenientes de suspensiones control y elicitadas, analizados e identificados tentativamente mediante GC-MS.

% Área Relativa

N°

Nombre

Tipo Tipo

0h 6h

6 h 6 h 6 h 6

12h 24h

12 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h

MeJA MeJA MeJA

compuesto

Control Control Control Control

SA10µM SA10µM SA10µM

SA100µM SA100µM SA100µM

100µM 6 h

100µM12 h 100µM24 h

MeJA10µM MeJA10µM MeJA10µM

1 (Z, Z)-Ácido 9,12-octadecadienoico Ácido graso ...... 0,243 ......

2 2,4-decadienal Aldehído ...... 0,140 ...

3 Hexacosanal Aldehído ...... 0,240 ...... 0,210 ......

4 Octacosanal Aldehído ...... 0,163 ......

5 17-metiloctadecanoato de metilo Éster ...... 0,133 ......

6 Octadecanoato de etilo Éster ...... 0,123 ......

7 3-etil-3-metilheptano Hidrocarburo ...... 0,175 ......

8 Decano Hidrocarburo ...... 0,275 ... 0,260 ...... 0,117 ......

9 2,3,7-trimetil-decano Hidrocarburo ...... 0,185 ... 0,700 ......

10 3,7-dimetil-decane Hidrocarburo ...... 0,123 0,333 ... 0,750 0,273 0,617 0,400 0,760 0,577 ...... 0,465

11 4-etil-decane Hidrocarburo ...... 0,933 0,113 ...... 0,123 ... 0,123 ... 0,137 ......

12 2-metil-dodecano Hidrocarburo ...... 0,465 ......

13 4,6-dimetil-dodecano Hidrocarburo ... 0,115 ... 0,242 0,168 0,318 ... 0,349 0,580 0,495 0,612 0,720 0,596 ...... 0,365

14 6-metil-dodecano Hidrocarburo ...... 0,183 0,163 ......

15 Heptacosano Hidrocarburo 0,145 ......

16 8-metil-heptadecano Hidrocarburo ...... 0,933 ...... Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 71

17 4-metil-hexadecano Hidrocarburo 0,145 0,110 ... 0,145 0,567 ...... 0,117 0,833 0,130

18 3,3-dimetil-hexano Hidrocarburo ...... 0,160 0,110 ... 0,253 0,320 0,320 0,480 0,290 0,423 ...... 0,330

19 4-etil-2,2-dimetil-hexano Hidrocarburo ...... 0,867 ......

20 2-metil-nonacosano Hidrocarburo ...... 0,310 ......

21 2,6-dimetil-nonane Hidrocarburo ...... 0,175 ... 0,220 ... 0,117 ......

22 5-(2-metilpropil)-nonano Hidrocarburo ...... 0,580 ... 0,620 ...... 0,247 ... 0,157 ......

23 2,4,6-trimetil-octano Hidrocarburo ...... 0,263 ...... 0,490 0,215 0,317 ......

24 5-etil-2-metil-octano Hidrocarburo ...... 0,900 ...... 0,123 ......

25 6-etil-2-metil-octano Hidrocarburo ...... 0,175 0,800 0,143 ... 0,230 ... 0,133 0,100 0,340 ...... 0,170

26 2,6,10,14-tetrametil-pentadecano Hidrocarburo ...... 0,163 ...

27 4-metil-tetradecano Hidrocarburo 0,140 0,285 0,140 0,365 0,298 0,263 ... 0,297 0,500 0,387 0,473 0,485 0,470 0,110 0,633 0,230

28 5-metil-tetradecano Hidrocarburo ...... 0,167 ... 0,235 0,120 0,225 0,240 0,400 0,113 ...... 0,185

29 Tetratetracontane Hidrocarburo ...... 0,187 ......

30 Tridecano Hidrocarburo ...... 0,160 0,967 0,112 ... 0,227 0,110 0,227 ... 0,165 0,230 ...... 0,240

31 2,5-dimetil-tridecano Hidrocarburo ...... 0,180 ... 0,113 ... 0,243 0,423 0,240 ...... 0,195

32 Undecano Hidrocarburo ...... 0,867 ......

33 2,6-dimetil-undecano Hidrocarburo 0,250 ...... 0,240 0,140 0,257 ... 0,180 0,267 0,347 0,497 0,560 0,483 ...... 0,275

34 Campest-4-en-3-ona Terpeno ... 1,340 ... 1,150 ...... 1,160 ...... 0,910 ...... 0,710

35 Glicerina Alcohol 0,880 0,625 0,915 0,763 1,550 1,383 1,450 0,438 1,150 0,998 0,560 0,560 0,652 1,378 1,313 0,493

36 Eicosanal Aldehído ... 1,600 0,600 0,810 0,160 0,163 ... 0,533 ...... 0,235 0,287 1,220 1,200 0,185

37 Henicosanal Aldehído 0,695 0,825 0,698 0,630 0,490 0,423 0,320 0,310 0,417 0,390 ...... 0,877 0,638 0,380

38 Hexadecanal Aldehído 0,730 ...... Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 72

39 Octadecanal Aldehído ...... 0,245 ...... 0,167 ......

40 Pentadecanal Aldehído ...... 0,330 0,310 0,360 ... 0,120 0,167 0,257 0,230 0,218 ... 0,267 0,250

41 (Z)-9-octadecenamida Amida ...... 0,147 ......

42 13-metil-tetradecanoato de etilo Éster ...... 0,330 ... 0,850 ......

43 2-propenil éster de ácido fórmico Éster ...... 0,160 ......

44 Hexadecanoato de etilo Éster 0,330 0,515 0,450 0,550 0,617 0,747 ... 0,620 0,980 1,480 0,633 0,810 0,833 0,733 0,660 0,890

45 Hexadecanoato de metilo Éster 0,935 1,150 1,100 0,580 ... 0,243 0,860 ...... 0,285 ... 0,633 0,290 ...

46 Éster etílico del ácido linoleico Éster 0,600 0,500 0,525 0,555 0,983 0,793 1,170 0,843 1,360 1,853 0,667 0,910 1,140 0,697 0,870 0,585

47 2-hidroxi-octadeca-9,12,15- Éster ...... 0,233 ... 0,663 ...... 0,260 ...... trienoato de metilo

48 Isobutirato de metilo Éster ...... 0,310 ......

49 2,4-dimetildodecano Hidrocarburo ...... 0,513 0,570 ... 0,490 0,517 0,227 2,833 1,600 1,470 ...... 1,220

50 2,6,10-trimetiltridecano Hidrocarburo 1,043 0,970 0,940 1,210 1,633 1,000 0,170 0,783 1,373 1,500 1,163 1,200 1,267 0,730 0,940 1,100

51 2-metilhexacosano Hidrocarburo 0,580 0,145 0,145 0,645 0,193 0,300 0,180 ... 0,267 0,200 0,217 ... 0,170 0,163 0,240 ...

52 2-metiloctacosano Hidrocarburo 0,230 ......

53 2-metiltetracosano Hidrocarburo ... 0,140 ...... 0,490 0,277 ... 0,253 0,873 0,460 0,473 0,610 0,457 0,377 0,333 0,800

54 Dodecano Hidrocarburo ...... 1,680 1,667 1,693 ... 1,457 1,773 1,590 2,193 2,620 2,620 ...... 1,270

55 2,6,10-trimetil-dodecano Hidrocarburo ...... 0,117 ...... 0,145

56 2,6,11-trimetil-dodecano Hidrocarburo 0,145 0,295 0,170 0,390 0,588 0,523 ... 0,440 0,988 0,275 0,922 1,428 1,446 0,900 ... 0,375

57 4-metil-dodecano Hidrocarburo ...... 0,632 0,892 0,673 ... 0,994 0,950 1,210 1,183 0,923 0,825 ...... 0,857

58 Dotriacontano Hidrocarburo ...... 0,438 0,159 ...... 0,180 ... 0,195

59 Eicosano Hidrocarburo 1,028 0,829 0,870 0,846 0,925 0,749 0,555 0,514 0,895 0,722 0,790 0,669 0,729 0,929 0,882 0,751 Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 73

60 2,4-dimetil-eicosano Hidrocarburo 0,225 0,375 0,370 0,375 0,397 0,267 ... 0,300 0,520 0,153 0,287 ... 0,290 0,300 0,370 0,175

61 Heneicosano Hidrocarburo 0,554 0,650 0,565 0,576 0,357 0,533 0,690 0,397 0,564 0,672 0,556 0,462 0,540 0,495 0,522 0,665

62 Heptadecano Hidrocarburo 0,756 0,835 0,697 0,857 0,873 0,855 0,490 0,593 1,634 0,829 0,852 0,822 0,860 0,875 0,816 0,930

63 2,6,10,15-tetrametil-heptadecano Hidrocarburo 0,000 ...... 0,127 ...

64 Hexadecano Hidrocarburo 0,838 0,712 0,937 0,320 0,728 0,652 0,328 0,497 0,472 0,845 0,756 0,664 0,749 0,522 0,757 0,668

65 2,6,10,14-tetrametil-hexadecano Hidrocarburo 0,225 0,270 0,360 0,175 ...... 0,193 ...... 0,300 0,330 ...

66 Nonadecano Hidrocarburo 0,890 0,455 0,640 ...... 0,730 ... 0,647 1,230 0,293 0,933 0,180 0,767 0,667 0,793 0,615

67 5-butil-nonano Hidrocarburo 0,000 ...... 0,175 ...... 1,153 0,100 0,967 ...... 0,165

68 Octadecano Hidrocarburo 0,000 0,180 0,168 0,110 0,127 0,210 0,270 ...... 0,150 ... 0,127 0,268 ...

69 Pentadecano Hidrocarburo 0,455 0,180 ... 0,475 0,417 0,313 ... 0,367 0,523 0,417 0,447 0,460 0,460 0,267 0,257 0,355

70 2,6,10-trimetil-pentadecano Hidrocarburo 0,305 ... 0,455 0,585 0,170 0,220 ... 0,140 0,120 0,253 0,397 0,260 0,433 0,410 0,367 0,385

71 Tetradecano Hidrocarburo 0,000 1,360 0,553 1,555 0,337 0,830 ... 0,678 1,553 1,143 0,877 1,112 0,940 1,240 0,763 1,400

72 Tetrapentacontano Hidrocarburo 0,000 ...... 0,130 ...... 0,110 ...... 0,127 ... 0,130

73 2,4-dimetil-undecano Hidrocarburo 0,000 ...... 0,490 0,222 0,340 ... 0,120 0,140 0,355 0,472 0,548 0,373 ...... 0,680

74 Escualeno Terpeno 0,000 ...... 0,120 0,145 ......

Tabla 4-7. Metabolitos de extractos de medios provenientes de suspensiones control y elicitadas, analizados e identificados tentativamente mediante GC-MS.

% Área Relativa

Nº Nombre

6h 6h 6h 6h

12h 24h 12h 24h

SA 10µM SA

SA 100µM SA 100µM SA 100µM SA

Control 0h Control 6h Control

Tipo Compuesto Tipo

MeJA 10µM 10µM MeJA 10µM MeJA 10µM MeJA

Control 12h Control 24h Control MeJA 100µM 100µM MeJA 1 Ácido hexanoico Ácido carboxílico ... 0,900 ...... 0,100 0,133 ...... 0,113 ......

2 Ácido octanoico Ácido carboxílico ...... 0,633 ......

(Z, Z, Z)-Ácido 9,12,15- 3 Ácido graso ...... 0,600 ... 0,333 0,295 ... 0,267 0,117 ... octadecatrienoico

4 ácido n-hexadecanoico Ácido graso ... 0,383 ......

5 1,5-hexanodiol Alcohol ...... 0,300 ......

6 2,3-butanodiol Alcohol ... 0,133 ...... 0,833 ... 0,180 0,195 ... 0,933 ... 0,667

7 [R-(R*,R*)]-2,3-butanodiol Alcohol ... 0,313 0,175 ... 0,173 0,140 0,240 0,510 ...... 0,583 0,173

8 1-heptacosanol Alcohol graso ...... 1,860 0,627 ...... 3,267 2,693 0,257

9 1-hexadecanol Alcohol graso ...... 0,183 ......

10 1-Docosanol Alcohol graso ...... 0,313 ...... 2,530 ......

11 Octacosanol Alcohol graso ...... 1,767 ......

12 Bencenoacetaldehído Aldehído ... 0,263 ...... 0,187 ...

13 Tridecanal Aldehído ...... 0,137 ...... 0,620 ......

14 Octadecanamide Amida ...... 0,633 ... 0,210 ...... 0,243 ...

15 Tetradecanamida Amida ...... 0,470 ...... 0,250 0,373 ... Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 75

16 1,2-Ciclopentandiona Dicetona cíclica ... 0,333 ...... 0,120 0,650 0,200 0,227 0,153

17 Ciclopent-4-en-1,3-diona Dicetona cíclica ... 0,767 ......

18 1-acetato-1,2-Propanodiol Éster ... 0,110 ...... 0,137 ...

2,2,4-trimetil-1,3-pentanodiol 19 Éster ...... 0,365 ...... 0,253 diisobutirato

20 Acetato de butilo Éster ... 0,123 ... 0,315 ......

21 Ácido carbónico, eicosil vinil éster Éster ...... 0,173 0,167 ...

22 9,12-hexadecadienoato de etilo Éster ...... 0,333

ácido bis (2-etilhexil) éster- 23 Éster ...... 0,833 ... hexanodioico

24 Acetato de isopropilo Éster ... 0,140 ... 0,355 ......

25 Palmitato de isopropilo Éster ...... 0,177 ... 0,510 0,167 ... 0,733

26 acetato de n-propilo Éster ... 0,163 ... 0,425 ......

3-hidroxi-2,2,4-trimetilpentil éster del 27 Éster ... 0,567 0,465 0,900 0,313 0,297 0,177 0,480 ... 0,933 0,253 0,447 ácido isobutanoico

28 Gamma-Sitosterol Esterol ...... 7,800 ...... 2,547 ...

29 1-etoxi-butano Éter ... 0,433 ... 1,350 ......

30 2-(2-butoxietoxi)-etanol Éter ...... 0,300 ...... 0,467

31 2-[2-(2-butoxietoxi)etoxi]-etanol Éter ...... 0,153 ......

32 1-etoxi-2-metil-propano Éter ... 0,880 ... 1,890 ......

33 Trietilenglicol monododecil éter Éter ...... 0,567 ...... 0,320 0,567 ...

34 Fenol Fenol ...... 6,520 3,953 4,100 0,180 Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 76

35 2(5H)-Furanona Heterociclo ... 0,833 ...... 0,767 0,300

2,4-dihidroxi-2,5-dimetil-3 (2H) - 36 Heterociclo ... 0,360 ...... 0,487 0,173 furan-3-on

37 5-metil-2-furancarboxaldehído Heterociclo ...... 0,800 ...

38 2-furanmetanol Heterociclo ... 0,890 ...... 0,160 ... 0,437 0,633 0,933

2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-4H-piran- 39 Heterociclo ... 2,000 ...... 2,633 ... 4-ona

40 5-hidroximetilfurfural Heterociclo ... 9,317 ...... 3,540 1,977 6,333 1,460

Heterociclo - 41 Furfural ... 0,520 ...... 0,370 0,220 0,447 0,633 plants

42 11-metiltricosano Hidrocarburo ...... 0,120 ...

43 4-metil-1-Undeceno Hidrocarburo ... 0,170 ......

44 2,5-dimetil-hexano Hidrocarburo ... 0,123 ... 0,315 ......

45 Nonacosano Hidrocarburo ...... 0,260 ......

46 Globulol Terpeno ...... 0,350 ......

3-metil-6- (1-metiletil) -ciclohexen-1- 47 Terpeno ... 0,237 ... 0,210 ...... 0,433 ... ona

48 Glicerina Alcohol 0,680 1,172 0,400 0,175 0,150 0,377 0,367 0,755 2,980 2,163 0,170 0,657

49 Eicosanal Aldehído 0,545 0,173 0,363 ... 0,120 0,485 0,247 0,750 0,620 0,200 0,120 0,343

50 Henicosanal Aldehído ... 0,967 0,210 0,333 0,933 0,410 0,337 ...... 1,637 0,390 0,110

51 Hexadecanal Aldehído ...... 0,193 0,173 ......

52 Octadecanal Aldehído ... 0,237 ...... 0,247 ... 0,263 ...... 0,347 ... 0,300

53 Pentadecanal Aldehído ... 0,273 0,145 0,175 0,167 ...... 0,390 0,320 ... 0,127 0,600 Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 77

54 (Z)-9-octadecenamida Amida ... 0,283 0,530 ... 0,637 2,933 4,993 ... 8,800 1,727 0,883 1,793

55 13-metil-tetradecanoato de etilo Éster ...... 0,133 ...... 0,510 ......

56 2-propenil éster de ácido fórmico Éster ... 0,190 ...... 0,350 ...... 0,327

57 Hexadecanoato de etilo Éster ... 0,270 ...... 0,400 0,230 0,633 0,510 ... 0,147 0,623 ...

58 Hexadecanoato de metilo Éster ...... 0,267 0,380 ...

59 Éster etílico del ácido linoleico Éster 0,560 0,613 ... 0,330 0,317 1,500 1,167 1,700 0,980 0,877 1,333 0,367

2-hidroxi-octadeca-9,12,15-trienoato 60 Éster ...... 0,267 0,343 ...... 0,167 ...... de metilo

61 Isobutirato de metilo Éster ... 0,887 ... 2,295 ......

62 2,4-dimetildodecano Hidrocarburo ...... 0,220 ......

63 2,6,10-trimetiltridecano Hidrocarburo 0,380 0,453 0,630 0,735 0,567 0,347 0,157 0,200 0,510 0,357 0,100 0,667

64 2-metilhexacosano Hidrocarburo 0,650 ...... 0,210 ... 0,180 ...... 0,540 0,173 ... 0,500

65 2-metiloctacosano Hidrocarburo ...... 0,265 ...... 0,470 0,110 ......

66 2-metiltetracosano Hidrocarburo 0,500 0,163 ......

67 Dodecano Hidrocarburo ...... 0,167 ...... 0,187 0,120 0,300

68 2,6,10-trimetil-dodecano Hidrocarburo ...... 0,900 ......

69 2,6,11-trimetil-dodecano Hidrocarburo 0,740 0,492 0,675 0,675 0,133 0,190 0,163 0,253 0,530 0,113 0,147 0,567

70 4-metil-dodecano Hidrocarburo ... 0,833 0,190 ...... 0,967 ...... 0,277 ......

71 Dotriacontano Hidrocarburo 0,880 0,617 ... 0,355 ...... 0,440 ...... 0,467

72 Eicosano Hidrocarburo 1,459 1,965 0,841 1,174 0,210 0,425 0,540 0,555 1,850 0,260 0,717 0,342

73 2,4-dimetil-eicosano Hidrocarburo ... 0,167 ...... Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 78

74 Heneicosano Hidrocarburo 0,712 0,235 0,170 0,416 0,367 0,267 0,263 ... 0,330 0,363 0,297 0,300

75 Heptadecano Hidrocarburo ... 1,595 0,933 1,250 0,134 1,450 0,522 ... 1,153 0,998 0,368 0,317

76 2,6,10,15-tetrametil-heptadecano Hidrocarburo ...... 0,395 0,295 ......

77 Hexadecano Hidrocarburo 1,200 0,923 0,616 0,935 0,191 0,725 0,367 0,617 0,665 0,553 0,485 0,292

78 2,6,10,14-tetrametil-hexadecano Hidrocarburo ...... 0,440 ......

79 Nonadecano Hidrocarburo ... 0,688 0,770 0,810 ... 0,400 0,238 0,130 ... 0,457 ... 0,185

80 5-butil-nonano Hidrocarburo ...... 0,143 0,117 ...... 0,120 0,333

81 Octadecano Hidrocarburo ...... 0,400

82 Pentadecano Hidrocarburo ... 0,480 0,190 0,155 ......

83 2,6,10-trimetil-pentadecano Hidrocarburo ... 0,163 ......

84 Tetradecano Hidrocarburo ... 0,237 0,940 0,550 ... 0,667 0,180 0,320 1,240 ...... 0,130

85 Tetrapentacontano Hidrocarburo ...... 0,450 ...... 7,187

86 2,4-dimetil-undecano Hidrocarburo ... 0,117 ...... 0,800 0,533 ......

87 Escualeno Terpeno ... 2,897 ......

Teniendo en cuenta la información obtenida por GC-MS esta información, se realizó un análisis de componentes principales (ACP), a través del cual las variables medidas fueron transformadas y reducidas en nuevas dimensiones o componentes principales con el fin de favorecer su interpretación, explicando en sus primeras dos dimensiones el 54% de la varianza.

En la Figura 4-12 se observa un agrupamiento de los tratamientos de células (anaranjado) indicando la similitud de estas muestras y una baja varianza entre ellas. Por otro lado, las muestras de medio de cultivo (aguamarina) presenta una mayor varianza, lo que puede deberse a la composición de metabolitos y/o de su cantidad detectada. Lo anterior, indica que estas matrices (células y medio) difieren entre sí, de tal manera que se comportan como muestras con características divergentes.

Figura 4-13. ACP de las áreas relativas de los metabolitos identificados tentativamente en extractos de células y medio de suspensiones control y elicitadas.

Sin embargo, algunas muestras de ambas matrices logran solaparse, particularmente los controles, lo que sugiere que éstas posiblemente pueden estar relacionadas con compuestos producidos de manera constitutiva, mientras que las muestras dentro de las agrupaciones pueden relacionarse con compuestos producidos por el efecto de los tratamientos con elicitores. Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 80

Con el fin de determinar la distribución de metabolitos en los extractos de células y medio se construyeron los diagramas de Venn que se presentan en la figura 4-13. En esta se ilustra la distribución de todos los metabolitos presentes en células y medio, apreciando una mayor diversidad de compuestos en el medio (87) respecto a células (74). Además, se observa que entre los dos tipos de matrices se comparten una gran cantidad de metabolitos (40), que corresponden al 46% de los compuestos presentes en células y al 54% de los compuestos en medios. Lo anterior, permite evidenciar que las células están liberando al medio una gran variedad de metabolitos.

Figura 4-14. Diagramas de Venn con la distribución de los metabolitos en extractos de células y medio de cultivo. A. Totalidad de metabolitos en células y medio. B. Metabolitos exclusivos de medio. C. Metabolitos exclusivos de células. D. Metabolitos compartidos por células y medio.

Los diagramas 4-13.B a 4-13.D permiten observar la distribución de los metabolitos exclusivos de medio y de células, así como de los compuestos comunes. En la figura 4- 13.B se presentan los metabolitos exclusivos de medio de cultivo, donde se observa que la adición de los elicitores MeJA y SA indujo la producción de varios compuestos que están ausentes en los controles. Estos metabolitos pueden presentarse únicamente en tratamientos con MeJA (4), con SA (6) o por la acción de ambos elicitores (10). Asimismo, Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 81 se observó que 12 compuestos son propios de controles y 15 están tanto en controles como en medio de suspensiones expuestas a MeJA y/o SA. La distribución de estos metabolitos sugiere que los elicitores están induciendo la síntesis de compuestos que están siendo expulsados al medio. Por otro lado, la presencia de algunas moléculas únicamente en controles indica que los elicitores pueden estar inhibiendo la producción de algunos compuestos, ocasionando su degradación o su transformación hacia nuevos metabolitos.

En la figura 4-13.C se encuentran los metabolitos exclusivos de células, que sugieren que los elicitores indujeron la producción de compuestos que no están presentes en los controles. Sin embargo, en este caso la cantidad de metabolitos inducidos por ambos elicitores fue menor (5 frente a 10 detectados en medio). Adicionalmente, 13 se produjeron tanto en células elicitadas como en controles y solo un compuesto fue exclusivo de controles. Por último, en la figura 4-13. D se ilustra la distribución de los 40 metabolitos compartidos por células y medio. El 77,5% de estos metabolitos, que corresponden a 31 compuestos, se encuentran tanto en controles como en suspensiones elicitadas, el 15% (6 compuestos) están presenten en controles y en algún elicitor, y solo el 7,5% (3 compuestos) se encuentra tanto en tratamientos con MeJA como con SA. También se observa en este diagrama que ningún compuesto fue exclusivo de controles, MeJA o SA. Esto indica que los metabolitos en común están asociados a compuestos constitutivos, pues en su mayoría están siendo compartidos por las muestras control y al menos un elicitor.

Teniendo en cuenta la información obtenida a partir del ACP (figura 4-10) y los diagramas de Venn (figura 4-13) se realizaron análisis ACP independientes para los extractos de células y medio a fin de establecer aquellos compuestos más relevantes dentro de cada uno de estos conjuntos de muestras. En el caso de células se hizo un ACP tipo Biplot que recoge el 64.4% de la información en dos componentes principales (Figura 4-14). En este gráfico se muestran las diez variables (compuestos) más importantes para estos componentes a manera de vectores, cuya contribución en cada componente se ve reflejada por su longitud y dirección. En el primer componente, caracterizado por recopilar la mayoría de la varianza (52.3%), las variables que más peso tuvieron fueron para los compuestos dodecano y 2,4-dimetildodecano, lo que indica que estos compuestos fueron los que en mayor medida determinaron los agrupamientos de las muestras de células y Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 82 son relevantes en el perfil metabólico de este tipo de muestras. En el caso del segundo componente principal, las variables que más peso tuvieron fueron campest-4-en-3-ona, tetradecano y eicosanal, los cuales permiten una separación secundaria de los agrupamientos generados por el primer componente principal.

Figura 4-15. ACP de extractos de células de suspensiones control y elicitadas. Las iniciales de los rótulos de las muestras hacen referencia, en su orden de aparición, a: C: Extracto de células. C, M o S: Muestras control o tratadas con jasmonato de metilo o ácido salicílico, respectivamente. 1 o 2: Concentración de 10 o 100 µM, respectivamente. 6, 12 o 24h: Tiempo de exposición.

En este ACP se observa que las muestras elicitadas tienden a presentar un área relativa porcentual de dodecano y 2,4-dimetildodecano mayor a las de los controles, destacándose las muestras expuestas a SA 100µM. Además, se presentó un solapamiento entre las agrupaciones de controles y SA, ocasionado por muestras tratadas con SA 10 µM durante 6 y 12h, lo que señala que este elicitor a concentraciones bajas y tiempos de exposición menores a 24h no genera cambios respecto a los controles. Por otro lado, el solapamiento Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 83 entre muestras tratadas con MeJA y SA puede indicar un efecto similar de estos elicitores a determinadas concentraciones y tiempos de exposición

El Biplot de medio fue construido con dos componentes principales que reúnen el 60% de la información. Los compuestos 5-hidroximetilfurfural, (Z)-9-octadecenamida y fenol fueron las variables que más peso tuvieron en este ACP, los dos primeros fueron los de mayor contribución para el primer y segundo componente principal, mientras que el fenol tuvo un peso importante solo para el primer componente (Figura 4-15).

Figura 4-16. ACP de extractos de medio de suspensiones control y elicitadas. Las iniciales de los rótulos de las muestras hacen referencia, en su orden de aparición, a: M: Extracto de medio. C, M o S: Muestras control o tratadas con jasmonato de metilo o ácido salicílico, respectivamente. 1 o 2: Concentración de 10 o 100 µM, respectivamente.6, 12 o 24h: Tiempo de exposición.

Los tratamientos con SA se caracterizaron por presentar una mayor área relativa porcentual de 5-hidroximetilfurfural, (Z)-9-octadecenamida y fenol, sobresaliendo nuevamente las muestras tratadas con SA 100 µM. En contraposición, los controles y los tratamientos con MeJA, en general, tuvieron valores menores de área para estos metabolitos. Se presentaron datos atípicos que conllevaron al solapamiento de las agrupaciones de controles y SA, como el control de 6 h, el cual presenta un perfil más Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 84 característico de suspensiones elicitadas con SA. Por otro lado, se observa superposición de algunas zonas de controles y tratamientos con MeJA, planteando que este elicitor a determinadas concentraciones y tiempos de exposición, por ejemplo, 100 µM y 6 h, no genera cambios importantes en el perfil respecto a controles.

Teniendo en cuenta la información obtenida con los Biplot de células y medio y con el fin de analizar la producción de los metabolitos respecto al área relativa porcentual en los diferentes extractos, se realizó un mapa de calor. Para construir este diagrama, los 121 compuestos identificados de manera tentativa se clasificaron en 14 grupos de sustancias, de acuerdo con el grupo funcional principal (identificados con colores). En el mapa de calor se observan dos grandes agrupaciones definidas por el tipo de muestra (células o medio) (figura 4-16). En el grupo de células se aprecia un clúster establecido principalmente por células que han sido sometidas a tratamientos de elicitación. Se observa también, otro clúster compartido por muestras de células y medio que está constituido principalmente por controles o por tratamientos con elicitores cuyos perfiles están más asociados a controles. Finalmente, se encuentra una tercera agrupación poco definida en la que se ubican las muestras de medio provenientes de suspensiones expuestas a elicitores y, que presentaron las mayores áreas relativas de algunos compuestos.

En este diagrama también se observa que los metabolitos detectados en el equipo de GC- MS constituyen principalmente metabolitos primarios como hidrocarburos y ésteres, aunque también se pudieron detectar metabolitos secundarios del tipo terpeno, fenol y amida. Los hidrocarburos fueron característicos en todas las muestras y, formaron bloques que definieron las agrupaciones en células y medio; por ejemplo, en el listado de compuestos de la derecha, del dodecano al 2,6,10-trimetil-pentadecano, los metabolitos definen el perfil de la agrupación de muestras de células elicitadas. El dodecano fue uno de los metabolitos de mayor peso en el Biplot de células (figura 4-14) y en este mapa de calor se observa una mayor área relativa de este compuesto en células elicitadas con SA.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 85

Figura 4-17. Mapa de calor de extractos de células y medio de suspensiones control y elicitadas.

Tratamiento Tratamientos Muestra 8 Control 5−hidroximetilfurfural (Z)−9−octadecenamida Fenol MeJA Gamma−Sitosterol Tetrapentacontano Dodecano SA 1−heptacosanol 4−metil−dodecano 6 Hexadecanoato de etilo 2,4−dimetildodecano 2,6,11−trimetil−dodecano 2,3−dihidro−3,5−dihidroxi−6−4H−piran−4−ona Muestra Escualeno Nonadecano Heneicosano Células Hexadecano 4 Eicosanal Henicosanal Hexadecanoato de metilo Medio 1−Docosanol Campest−4−en−3−ona Isobutirato de metilo 1−etoxi−2−metil−propano 2−metilhexacosano Dotriacontano 2 Grupo 2−metiltetracosano 3,7−dimetil−decane 2,4−dimetil−undecano Ácido carboxílico 3,3−dimetil−hexano 2,6−dimetil−undecano 4,6−dimetil−dodecano 4−metil−tetradecano Ácido graso Pentadecano 0 2,4−dimetil−eicosano 2,6,10−trimetil−pentadecano Ácido graso/Ácido palmítico 1−etoxi−butano 3−hidroxi−2,2,4−trimetilpentil éster del ácido isobutanoico 5−butil−nonano Octacosanol Alcohol 5−(2−metilpropil)−nonano [R−(R*,R*)]−2,3−butanodiol 2−furanmetanol Alcohol graso 2,4−dihidroxi−2,5−dimetil−3 (2H) −furan−3−on 1,2−Ciclopentandiona Furfural 2,6,10,14−tetrametil−hexadecano Aldehído 2−hidroxi−octadeca−9,12,15−trienoato de metilo Hexadecanal 2,4,6−trimetil−octano 2,5−dimetil−tridecano Amida 2−metiloctacosano Palmitato de isopropilo Octadecano Dicetona cíclica 2−metil−dodecano Tridecano 6−etil−2−metil−octano 5−metil−tetradecano Éster 2−propenil éster de ácido fórmico 2,6,10,15−tetrametil−heptadecano 2,3−butanodiol Esterol (Z, Z, Z)−Ácido9,12,15−octadecatrienoico 2,2,4−trimetil−1,3−pentanodiol diisobutirato 3−metil−6− (1−metiletil) −ciclohexen−1−ona Nonacosano Éter Globulol 1,5−hexanodiol acetato den−propilo Acetato deisopropilo Fenol Acetato de butilo 2,5−dimetil−hexano Decano Heterociclo 2,6−dimetil−nonane Bencenoacetaldehído ácido n−hexadecanoico Hexacosanal Heterociclo − plants Octadecanamide 4−metil−hexadecano 6−metil−dodecano Hidrocarburo 2−metil−nonacosano (Z, Z)−Ácido 9,12−octadecadienoico 4−etil−decane Ácido carbónico, eicosil vinil éster Terpeno 2,6,10−trimetil−dodecano Ácido hexanoico 3−etil−3−metilheptano 1−hexadecanol 2−[2−(2−butoxietoxi)etoxi]−etanol 2,4−decadienal 2,6,10,14−tetrametil−pentadecano 4−metil−1−Undeceno Heptacosano Octacosanal Undecano 5−etil−2−metil−octano 4−etil−2,2−dimetil−hexano Octadecanoato de etilo 11−metiltricosano 5−metil−2−furancarboxaldehído ácido bis (2−etilhexil) éster−hexanodioico 1−acetato−1,2−Propanodiol 2(5H)−Furanona 17−metiloctadecanoato de metilo 8−metil−heptadecano Ciclopent−4−en−1,3−diona Ácido octanoico 2−(2−butoxietoxi)−etanol 9,12−hexadecadienoato de etilo 2,3,7−trimetil−decano Tetratetracontane Tridecanal Octadecanal Tetradecanamida Trietilenglicol monododecil éter 13−metil−tetradecanoato de etilo Pentadecanal Glicerina Éster etílico del ácido linoleico Eicosano

Tetradecano

Grupo

M.S2.6h

M.C.6h

M.S1.6h

M.S2.12h

M.S2.24h

M.M1.24h

M.M1.6h

M.M1.12h

M.C.24h

M.C.0h

M.C.12h

M.M2.6h

C.M2.24h

C.C.6h

C.C.0h

C.C.12h

C.S1.6h

C.S1.12h

C.C.24h

C.S2.12h

C.S2.6h

C.S2.24h

C.M1.12h

C.M1.24h

C.M2.6h

C.M2.12h C.M1.6h C.S1.24h 2,6,10−trimetiltridecano Heptadecano

Por otro lado, las muestras de medio de suspensiones elicitadas fueron las que tuvieron una mayor intensidad en algunos metabolitos, principalmente secundarios, lo que señala que ante estas condiciones de estrés las células expulsaron al medio grandes cantidades Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 86 de estos compuestos expresando rutas metabólicas secundarias como respuesta a los elicitores. El 5-hidroximetilfurfural y el fenol se detectaron en medios de suspensiones elicitadas con SA mientras que la (Z)-octadecenamida en tratamientos tanto de MeJA como de SA. La producción de esta amida es interesante pues en especies de Piper se ha reportado la biosíntesis de este compuesto (Hieu, Thang, Hoi, & Ogunwande, 2014; Mohammed, Omran, & Hussein, 2016) y, aunque en P. cumanense no se ha reportado que este metabolito secundario se produzca en condiciones silvestres, a través de estudio se encontró que los elicitores MeJA y SA pueden inducir su producción. El estudio del efecto de estos elicitores en varias concentraciones y tiempos de exposición podría aportar al entendimiento de los factores desencadenantes de la producción de estos metabolitos y con esto, implementar estrategias más dirigidas hacia su obtención.

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

Para la germinación in vitro de las semillas recolectadas en campo se estableció como protocolo de desinfección superficial lavado previo con detergente y un tiempo de exposición de 10 minutos a hipoclorito de sodio 5.25% con Tween® 20 Además, se determinó que el tiempo de siembra de las semillas luego de su recolección en campo influye sobre su germinación, obteniéndose un mayor porcentaje de germinabilidad cuando éstas se siembran luego de una semana de recolección. Sin embargo, una exposición de las semillas con AG3 permite recuperar la germinabilidad de las semillas pasadas cuatro semanas de la colecta.

La obtención de callos con características útiles para el establecimiento de suspensiones celulares (friables y de coloración blanca/beige) se logró empleando pecíolo como explante y medio de cultivo MS con 1 mg/L de la auxina 2,4-D y 0.5 mg/L de la citoquinina BAP.

Para el establecimiento de las suspensiones celulares de P. cumanense a partir de callo friable se encontró que la fase estacionaria se alcanza en 10 días al emplear un inóculo de 90 g/L con el que se obtuvo una tasa de crecimiento, un tiempo de duplicación y una producción de biomasa favorables para realizar los estudios de producción de metabolitos secundarios, siendo necesario hacer un acondicionamiento preliminar de las células por un período de 30 días, con recambio de medio de cultivo a los 15 días para mantener las células en un estado fisiológico adecuado.

Los análisis cromatográficos realizados mediante UHPLC-DAD y GC-MS permitieron determinar que hubo una producción diferencial de metabolitos secundarios debida a la adición de los elicitores MeJA y SA, encontrándose que con los tratamientos con SA (10 y 100 µM) se obtuvieron los mayores cambios. Además, se encontró que en los extractos de Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 88 medio de cultivo fue más evidente la producción diferencial de metabolitos, lo que señala que el estrés generado por los elicitores llevó preferentemente a una expulsión de metabolitos más que a su retención a nivel intracelular.

El análisis estadístico multivariado de los perfiles de GC-MS permite concluir que:a) de los metabolitos detectados en células y medios de cultivo, cerca de la mitad están siendo compartidos en las dos matrices, y éstos se presentan tanto en controles como en tratamientos con MeJA y SA, lo que sugiere que son compuestos constitutivos; b) los compuestos que son exclusivos de extractos de células o medios corresponden principalmente a metabolitos inducidos por los elicitores; c) en las muestras se detectó una gran variedad de metabolitos primarios, principalmente hidrocarburos y ácidos grasos y algunos secundarios del tipo terpeno, fenol y amida, siendo para células las variables más importantes los compuestos dodecano, 2,4-dimetildodecano, campest-4-en-3-ona, tetradecano y eicosanal y, para medio, los compuestos 5-hidroximetilfurfural, (Z)-9- octadecenamida y fenol.

Se destacó una alta producción de (Z)-9-octadecenamida (8,8%) en medios provenientes de suspensiones elicitadas siendo interesante la obtención de este compuesto, pues es un metabolito producido por plantas del género Piper pero que no ha sido reportado en plantas silvestres de P. cumanense lo que indica que, a través de la elicitación se logró la expresión de rutas metabólicas secundarias que conllevaron a su biosíntesis.

Bajo las condiciones de elicitación evaluadas en este trabajo no se logró la producción de ninguno de los metabolitos secundarios aislados de especies silvestre de P. cumanense.

Este trabajo representa la primera investigación enfocada al cultivo in vitro de Piper cumanense, mediante el establecimiento de condiciones favorables para la germinación, callogénesis y desarrollo de suspensiones celulares. Así mismo, este estudio constituye el primer reporte de la evaluación del efecto de elicitores (jasmonato de metilo y ácido salicílico) sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares, operadas en lote, del género Piper. Las condiciones de cultivo in vitro establecidas en cada una de las etapas de este trabajo pueden servir de base para la aplicación de diferentes estrategias para el aumento de la producción de metabolitos en cultivos in vitro y para el desarrollo de estudios biosintéticos. Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 89

5.2 Recomendaciones

La evaluación de factores como el consumo de la fuente de carbono, de macroelementos y la producción de metabolitos durante el crecimiento de las células en suspensión, permitiría una mejor caracterización del crecimiento de las células en medio líquido. De esta manera, se podrían evaluar otros parámetros cinéticos como rendimiento de sustrato en biomasa, rendimiento de sustrato en la producción de metabolitos secundarios y productividad, lo que permitiría desarrollar mejores estrategias para favorecer el crecimiento de las células en suspensión y se podrían determinar factores limitantes para el crecimiento celular, parámetros necesarios en el caso de realizar un escalamiento del proceso a biorreactores de mayor capacidad.

Debido a que la fuente de carbono es un sustrato limitante de gran relevancia en cultivos de suspensiones celulares que puede actuar como limitante no solo para el incremento de biomasa sino también para la producción de metabolitos secundarios, se recomienda evaluar concentraciones de azúcares (glucosa y/o sacarosa) en suspensiones con inóculos celulares de diferente tamaño para desarrollar estrategias de optimización que pudieran favorecer tanto el crecimiento como la síntesis de metabolitos secundarios. El ácido salicílico indujo la respuesta más variada de metabolitos en las suspensiones celulares además de una mayor área relativa en su producción. La evaluación de varias concentraciones de este elicitor y su interacción en tiempos más prolongados podría favorecer la producción de metabolitos de interés y dar una idea del mecanismo de respuesta celular empleado por las suspensiones debido el estrés al que son sometidas.

El uso de otros elicitores tanto bióticos como abióticos, individualmente o en combinación, podría desencadenar la producción de metabolitos secundarios de interés tales como, derivados de ácido benzoico, los cuales han mostrado importante bioactividad contra hongos fitopatógenos de interés agronómico.

El análisis de los extractos mediante UHPLC-DAD limita el desarrollo de un análisis más específico de los metabolitos secundarios producidos debido a que si los patrones empleados resultan estar ausentes en los extractos, los picos generados no pueden ser determinados. El empleo de un equipo de HPLC acoplado a espectrometría de masas Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 90

(HPLC-MS/MS) permitiría una mayor detección de señales, posibilidad de determinación de los compuestos y con esto, el desarrollo de un análisis más detallado.

La detección de una mayor variedad de metabolitos secundarios en el equipo de GC-MS podría lograrse al desarrollar reacciones de derivatización que permitan mejorar la volatilidad y estabilidad térmica de compuestos que presenten grupos funcionales polares.

La producción de (Z)-octadecenamida en suspensiones elicitadas de P. cumanense podría profundizarse al realizar estudios enfocados a investigar el efecto de MeJA y SA sobre las rutas metabólicas relacionadas a su producción y sobre la activación de genes que conlleven a un mejor entendimiento de su biosíntesis.

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 91

A. Anexo: Contribución de los metabolitos y componentes de los ACP en el análisis del efecto de elicitación por GC-MS

Se presentan datos como el porcentaje de varianza explicado por los 10 primeros componentes y el porcentaje de contribución de las 10 variables más importantes para los primeros dos componentes de cada ACP presente en la sección 4.3.2.

• ACP de extractos de células y medio de suspensiones control y elicitadas (Figura 4-13) -Porcentaje de varianza explicada por los componentes

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 92

-Porcentaje de contribución de las variables del componente 1

-Porcentaje de contribución de las variables del componente 2

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 93

• ACP de extractos de células de suspensiones control y elicitadas (Figura 4-15) -Porcentaje de varianza explicada por los componentes

-Porcentaje de contribución de las variables del componente 1

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 94

-Porcentaje de contribución de las variables del componente 2

• ACP de extractos de medio de suspensiones control y elicitadas (Figura 4-16) -Porcentaje de varianza explicada por los componentes

Evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en P. cumanense 95

-Porcentaje de contribución de las variables del componente 1

-Porcentaje de contribución de las variables del componente 2

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