Evaluación Del Efecto De Algunos Elicitores Sobre La Producción De Metabolitos Secundarios En Suspensiones Celulares De Piper Sp
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Evaluación del efecto de algunos elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de Piper sp. Laura Katherine Rodríguez Sánchez Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2019 Evaluación del efecto de algunos elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de Piper sp. Laura Katherine Rodríguez Sánchez Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias - Biotecnología Director: Ph.D. Oscar Javier Patiño Ladino Codirector: Ph.D. Xavier Marquínez Casas Línea de Investigación: Biotecnología vegetal Grupo de Investigación: Química de Productos Naturales Vegetales Bioactivos Laboratorio de Biotecnología Vegetal Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias Medellín, Colombia 2019 ... y entonces, un día, llegó una criatura cuyo material genético no era muy diferente de las estructuras moleculares reproductoras de cualquier otra clase de organismos del planeta, que dicha criatura llamó Tierra. Pero era capaz de reflexionar sobre el misterio de su origen, de estudiar el extraño y tortuoso sendero por el cual había surgido desde la materia estelar. Era el material del Cosmos contemplándose a sí mismo. Consideró la enigmática y problemática cuestión de su futuro... Y ansió regresar a las estrellas Carl Sagan Resumen y Abstract VII Agradecimientos A la vida y a la infinidad del universo por este sublime planeta en el que tengo la oportunidad de vivir, de soñar, de crear y de amar. A la exuberante riqueza vegetal de la Tierra y en especial de este privilegiado país en el que tengo la fortuna de vivir, por inquietarme, inspirarme y motivarme a entenderla. A mis padres, hermano y abuela, por su apoyo cada día de mi vida y en particular, durante el desarrollo de esta Maestría. Por su amor infinito, sus enseñanzas sobre diversos temas que comprenden la vida y su apoyo financiero. A mi director de Tesis, el profesor Oscar Patiño, por sus enseñanzas, dedicación, paciencia, constancia y su confianza depositada en mi para el desarrollo de este y otros proyectos. Por su amor a la ciencia y tenacidad dispuesta en cada nuevo reto investigativo. A mi codirector de Tesis, el profesor Xavier Marquínez, por su apoyo, dedicación y guía durante esta investigación. Por su constancia y admirable inquietud por entender la vida y desarrollo de las plantas. A Juliet Prieto, por su apoyo, paciencia y fortaleza brindada a nivel profesional y personal no solo durante el desarrollo de este proyecto sino también de otros diversos retos a lo largo de mi vida. Por su especial cariño y dinamismo científico. Al profesor Luis Enrique Cuca, líder del Grupo de investigación en Química de Productos Naturales Vegetales Bioactivos (QuiProNaB) de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá, por brindarme la oportunidad de hacer parte del grupo de investigación. Por sus enseñanzas, paciencia y confianza. Así mismo, a todos los integrantes del Laboratorio por acogerme como una familia y por su ayuda en diferentes etapas de esta investigación. Contenido VIII A la profesora Eddy Herrera de la Pontificia Universidad Javeriana por su asesoría en los análisis multivariados de los datos obtenidos mediante GC-MS relacionados con la evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de metabolitos en suspensiones celulares de P. cumanense. A Jorge Pérez por acompañarme todo este tiempo, por su ayuda en cada paso de esta investigación y por hacer parte de mi transformación como persona a lo largo de estos años. Por su ímpetu por entender la vida, su espíritu aventurero y explorador. A Jorge Parra por los patrones de los compuestos y así como yo, por querer entender a través de sus investigaciones un poco más de la química de P. cumanense A Mary Santamaría por su especial colaboración en el proceso de extracción y análisis cromatográfico de las muestras. Por su confianza y amistad. A Sebastián Sánchez por su grandiosa ayuda en parte de los análisis estadísticos. Por su incondicional apoyo, por hacer tan agradables mis días y por su excepcional amor. A la Sede Medellín de la Universidad Nacional de Colombia por aportar en mi formación a nivel de posgrado, a los profesores y administrativos que contribuyeron de distintas maneras en el desarrollo de este trabajo. A los proveedores del material de laboratorio y reactivos químicos y, particularmente a Luis Puentes por haber sido siempre tan diligente en la entrega del material necesario para el desarrollo de los experimentos. A la Universidad Nacional de Colombia por mi formación tanto profesional como personal y por convertirse en los últimos años en mi hogar. Por la financiación a través de la Convocatoria del Programa Nacional de Proyectos para el Fortalecimiento de la Investigación, la Creación y la innovación en Posgrados 2013-2015, Modalidad 1, código 28213. Contenido IX A la Pontificia Universidad Javeriana por el préstamo de equipos y algunas instalaciones. En especial al Laboratorio de Bioensayos y al Laboratorio de Biomoléculas, a los profesores Juliet Prieto, Ricardo Vera y Geison Costa. A Colciencias por mi financiación a través del Programa Nacional de Jóvenes investigadores convocatoria 645 de 2014. A Colciencias por la financiación a través del Programa Nacional en Ciencias Básicas, convocatoria 745 de 2016, Modalidad 1 con contrato No. 380-2016 y código 110171250886. Contenido XI Resumen Una de las principales limitantes en la investigación de los metabolitos secundarios aislados de plantas es la baja concentración producida en los organismos lo que dificulta la realización de investigaciones que generen aplicaciones a nivel industrial. El cultivo de células en suspensión proporciona una alternativa renovable, sostenible y respetuosa con el ambiente para incrementar la producción de estos compuestos bajo condiciones controladas. Una especie de interés de la que se han aislado en baja concentración sustancias con promisoria actividad antifúngica y antiparasitaria es Piper cumanense (Piperaceae), haciéndose importante emplear estrategias para obtener mayores cantidades de sus sustancias bioactivas. Dado el interés del grupo en los constituyentes químicos provenientes de P. cumanense, en la presente investigación se exploraron estrategias biotecnológicas para su producción en condiciones controladas mediante el establecimiento de algunas condiciones favorables de cultivos in vitro (inducción de callos y suspensiones celulares) y la evaluación del efecto de elicitores sobre la producción de algunos metabolitos secundarios. Este trabajo comprendió el establecimiento de condiciones para la formación de callos a través del uso de reguladores de crecimiento vegetal en diferentes explantes (lámina y pecíolo) de plántulas germinadas in vitro. Posteriormente, se determinaron condiciones para el crecimiento de células en suspensión al utilizar callos friables, evaluando su acondicionamiento al medio líquido y el crecimiento de diferentes inóculos iniciales. Finalmente, se estableció el efecto de jasmonato de metilo (MeJA) y ácido salicílico (SA) como elicitores sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de P. cumanense. En el establecimiento de condiciones para callogénesis se encontró que para la germinación in vitro de las semillas y posterior obtención de plántulas, es favorable para la esterilización hacer lavados previos con detergente y mayores tiempos de exposición con hipoclorito (10 min). El porcentaje de germinación se vio incrementado al usar AG3 (0.02 mg/L) en medios MS y al reducir el tiempo de siembra después de su recolección en campo. Los ensayos realizados con diferentes explantes (pecíolos y láminas) y diferentes combinaciones de auxina y citoquinina, permitieron determinar que el uso de pecíolo y una combinación de 2,4-D (1 mg/ L) y BAP (0,5 mg/L) produjeron los mejores callos friables. Los resultados de los estudios de actividad metabólica, cambios de acidez, producción de biomasa y cambio de Contenido XII color de las suspensiones celulares demostraron que hacer un recambio de medio 15 días después de establecidas las suspensiones permite mantener las células en un mejor estado fisiológico. Se estableció la curva de crecimiento de suspensiones con un inóculo de 90 g/L, obteniendo una tasa de crecimiento de 0,1097 ± 0,001477 día -1, un tiempo de duplicación de 6,319 días y una producción de biomasa favorable para los análisis cromatográficos. Finalmente, se determinó el efecto los elicitores MeJA y SA (10 y 100 µM) en la producción de metabolitos en extractos de células y medios de suspensiones celulares elicitadas encontrando una producción diferencial debida al efecto de estos inductores, apreciándose mayores cambios en el perfil al emplear SA. La expresión diferencial de los metabolitos secundarios fue más evidente en los medios de cultivo, destacándose los tratamientos con SA 100 µM, donde se logró una producción alta de los compuestos 5-hidroximetilfurfural (6,3%), fenol (6,5%) y (Z)-9-octadecenamida (8,8%), identificados tentativamente por GC-MS, y que fueron determinados como las variables de mayor peso en el análisis ACP. Con los elicitores empleados no se logró la producción de los metabolitos secundarios aislados previamente de P. cumanense. Las condiciones de cultivo in vitro establecidas pueden servir de base para la aplicación de diferentes estrategias para el aumento de la producción de metabolitos en P. cumanense y para el desarrollo de