Stilbenoides

Université Bordeaux Segalen

Année 2012 Thèse no 2006

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences, Technologie, Santé

Option : Interface Chimie-Biologie

Présentée et soutenue publiquement

Le 20 décembre 2012 Par Jonathan BISSON Né le 26 Mars 1985 à Bruges (France, 33)

DÉVELOPPEMENTS MÉTHODOLOGIQUES EN CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE APPLICATION AUX STILBÉNOÏDES

Membres du jury

Mme. Françoise Guéritte, Directrice de recherche INSERM-CNRS, ICSN, Gif-sur-Yvette Présidente

M. Alain Berthod, Professeur à l’Université de Lyon Rapporteur

M. Marcel Hibert, Professeur à l’Université de Strasbourg Rapporteur

M. Philippe Jeandet, Professeur à l’Université de Reims Examinateur

M. Patrice André, Responsable, GIE LVMH Recherche Personnel extérieur

M. Jean-Michel Mérillon, Professeur à l’Université de Bordeaux Examinateur

M. Pierre Waﬀo-Téguo, Maître de conférences à l’Université de Bordeaux Directeur de thèse Résumé

Les stilbénoïdes, sont des composés phénoliques majoritairement issus du règne vé- gétal. La Vigne par l’intermédiaire du vin et du raisin est la principale source alimen- taire de stilbènes. La mise en évidence de leur rôle dans les mécanismes de défense des plantes et leurs activités biologiques, y compris sur l’Homme, en font un sujet d’étude en plein essor. L’un des objectifs de cette thèse a été de développer un ensemble destra- tégies à la fois analytiques et préparatives utilisant la Chromatographie de Partage Cen- trifuge (CPC) pour l’étude et l’obtention de ces molécules. Dans un premier temps, nous avons développé une approche de couplage entre cette technique et un spectromètre à Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) par l’intermédiaire d’un système d’Extraction sur Phase Solide automatisé (EPS). Dans un second temps, nous avons mis au point un ensemble de méthodes et d’approches séparatives permettant d’obtenir ces com- posés. Nous avons, grâce au développement d’une méthodologie de dosage de solvants par spectrométrie RMN, étudié une gamme dérivée d’une gamme très utilisée en CPC, l’ARIZONA. Nous avons montré que ces systèmes dérivés, peuvent être utilisés au travers de stratégies d’élution telles que des pas et des gradients afin d’optimiser les sépa- rations. L’une des finalités de notre travail est d’offrir des méthodes permettant d’obtenir ces composés dans des quantités et des qualités suffisantes pour pouvoir constituer une chimiothèque interne au laboratoire pouvant prétendre à s’intégrer dans la Chi- miothèque Nationale. Une dernière partie fait état du développement d’outils informatiques, dont la création d’une base de donnée Libre pour les chercheurs en Substances Naturelles.

Mots-clés : Stilbénoïdes, Vitis vinifera, CPC, RMN, EPS, Couplages, Gradients

b Abstract

Stilbenoids are phenolic compounds mostly found in the vegetable kingdom. Vine through wine and grape is the main source of stilbenes in the human diet. The involvement of these compounds in plants resistance mechanisms and their diverse biological activi- ties, including on the human health are continuously highlighted. Making this topic a fast-growing one. One of the objectives of this thesis has been to develop a whole set of analytical and preparative strategies using Centrifugal Partition Chromatography (CPC) in order to study and obtain these molecules. Over a first phase, we developed a hyphenated approach between this technique and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) through an automated Solid Phase Extraction (SPE) system. Then, we developed a set of separative methods and approaches with the aim of obtaining these compounds. Then, we carried out the development of a solvent quantifications methodology using NMR spectrometry. This allowed us to study a spin-off scale of a widely-used solvent systems collection called ARIZONA. We showed that these systems are good candidates for different elution strategies using steps and gradients with the aim to optimize separa- tions. One of our purpose was to provide methods for effective and efficient purification of these compounds. This would allow, together with a lab-scale compounds library, their integration into the Chimiothèque Nationale, a nationwide chemical library. Last part accounts for computer tools development, including the creation of a Free database system for Natural Substances researcher.

Keywords : Stilbenoids, Vitis vinifera, CPC, NMR, SPE, Hyphenation, Gradients

c Remerciements

Cette thèse n’aurait pu avoir lieu sans un nombre incalculable de personnes. Àcom- mencer par le directeur du GESVAB, le Professeur Jean-Michel Mérillon, et mon directeur de thèse le Docteur Pierre Waffo-Téguo. Je tiens à les remercier pour l’encadrement, la très forte confiance qu’ils m’ont accordé, même quand il fallait mettre les mains dans les machines, les discussions, les échanges d’expériences. Merci Pierre pour ta disponibilité, que ce soit pour discuter de la thèse, de science ou d’autres choses et pour la confiance et les libertés que tu m’as laissées.

Je tiens à remercier le Docteur Françoise Guéritte, pour avoir accepté de présider le jury, mais aussi pour son accueil chaleureux et les nombreuses discussions lors de mon stage de Master 2. J’ai été initié à la Phytochimie, domaine à l’époque tout nouveau pour moi, au sein de son équipe. Et plus particulièrement avec l’encadrement du Docteur Vincent Dumontet et d’Anne-Laure Simonin, mais je n’oublie pas tous les autres qui ont participé aussi, Marc, Barbara, Jean-François, Marie-Thérèse, Nicolas, Guillaume, Aurélie, Mélanie, Mialy… Ainsi que Pierre-Marie et Mehdi, dont j’ai beaucoup apprécié et apprécie encore d’être si proche.

Merci à Alain Berthod, rapporteur de ce travail et spécialiste de la Chromatographie de Partage Centrifuge, dont les travaux ont inspiré une partie de ces recherches. Je remercie aussi Marcel Hibert, lui aussi rapporteur de ce travail, ses remarques très perti- nentes, ses travaux et ses réalisations ont été pour moi une grande source d’inspiration.

Merci à Philippe Jeandet et Patrice André pour avoir accepté de participer à ce jury, et avoir apporté leurs visions de leurs domaines respectifs, à savoir la science de la vigne et du vin et l’ethnobotanique à visée industrielle.

Ces travaux n’auraient pas pu voir le jour sans la participation des autres membres du GESVAB. Avec un remerciement tout particulier allant à Gérard Fondeville, Antonio Palos-Pinto, Marie-Laure Iglesias, Éric Pédrot, Martine Naud et Antonio Gomez-Garcia

d pour leur soutien technique et moral. Au Docteur Alain Badoc, pour les nombreuses discussions et invitations à des activités en lien avec la botanique. Aux chercheurs per- manents ou non, les Docteurs Stéphanie Cluzet, Alain Decendit, Jean-Claude Delaunay, Stéphanie Krisa, Céline Rivière, Céline Valadeau (aussi pour son grand soutien et les discussions sur l’ethno pendant les pauses !), Jean-Pierre Monti, Tristan Richard, Gré- gory Da Costa. Tous les membres passés et présents de la cellule, Pascal Poupard, Élo- die Renouf, Caroline Henry-Vitrac, Xavier Vitrac, Nadège Télef. À tous les doctorants, Carole Lambert, Merian Nassra, Yorgos Papastamoulis, Kamel Arraki, Jean-Baptiste Guyon, Stéphanie Dudonné. Les stagiaires et visiteurs Marie-Pierre Gaultier, Sylvia Lucas, Koovendren Ruthnum, Hilaire Kouakou, Yapo, Hamza Temsamani, Alexander Acevedo, Éva Gatineau, Holmi Khayati, Blandine Madji Hounoum, Frédérique Andrieu, Ainura Chodoeva.

Et des remerciements tout particuliers aux Docteurs Alison Pawlus et Jonah Shaver pour toute leur aide ici et ailleurs et qui mériterait un chapitre entier.

Un grand merci à tous les autres de l’ISVV, que ce soit au niveau de la recherche ou de l’administration : Alexandre Pons, Philippe Darriet, Axel Marchal, Davide Slaghe- nauﬁ, Soizic Lacampagne, Gérard Darné (pour nos longues discussions), Bernard Do- nèche, Christian Kappel, Raj, Serge Delrot, Bernard Donèche, Christine Marty, Olivier, Ghislaine Hilbert, David et Fatma Lecourieux, Christel Renaud, Gilles De Revel, Denis Dubourdieu, Pierre-Louis Teissedre, Cécile Thibon, Mickael Jourdes, Yann Maguirre, Blanche Masclef, Olivier, Judith. Les personnels de la bibliothèque : Christine Badoc- Moreno, Renaud Benech, Hervé Cazassus, Elen Kenamgueven… Et tout ceux que j’ai malheureusement oublié de citer.

Un remerciements aux remarquables stagiaires : Marion Brunel, Caroline Böcker, Marie Fortin, Keshika Mahadeo et Ramla Sahli.

Des remerciements à l’équipe de pharmacognosie Catherine Chèze et Tshilundu Mu- lamba, j’ai vraiment apprécié pouvoir travailler avec vous et m’initier à l’enseignement.

Aux membres de l’AFERP et de l’association Lapervenchelif pour m’avoir accordé la bourse m’ayant permis de faire une conférence à New-York pour l’ICNPR 2012.

À toi Anthony, qui nous a quitté brutalement. Pour tous nos échanges lors denos pauses, soirées, discussions de couloir, dégustations… Ta motivation et ta vision des choses et de la science en particulier restera une source d’inspiration pour moi.

e À mes parents, ma soeur, mon frère, mes grands parents et toute ma famille qui m’a accompagné, inspiré, formé, aiguisé ma curiosité et eu conﬁance en mes choix… À la famille de Margaux.

À tous mes amis, du ﬁn fond du Médoc et d’au delà, Yohan, Anne et Didier (et l’équipe du Hellfest), Dan, Bertrand, Laurent, Marc, 2T, Nuts, Svet, Ned, JoPi, MyOliv et tous les autres.

Aux membres des diverses associations qui m’ont accompagné en lien ou non avec cette thèse : 2D2B, Aquidoc, AFSEP Club Jeunes, SFE, LaBx, CCBX… Et en particulier les TROLLiens et encore plus particulièrement à Christophe et Céline, pour leur soutien et plus.

À Mukti, Jaz, Apo, Salvador et RR® pour l’accompagnement (et le café).

Et encore une fois tous ceux et celles que j’ai oubliés !

Mais surtout à Margaux, pour avoir supporté un doctorant pendant ses 3 années de thèse, je sais que ça n’a pas été facile tous les jours. Une thèse c’est long, surtout vers la ﬁn… Table des matières

Table des ﬁgures I

Liste des tableaux IV

Abréviations V

Glossaire X

I Introduction générale 1

II Notions générales 8

1 Stilbénoïdes 10 1.1 Description générale ...... 10 1.2 Biosynthèse ...... 14 1.2.1 Monomères ...... 14 1.2.2 Oligomères ...... 19 1.2.3 Dérivés ...... 28 1.3 Nomenclature ...... 31 1.4 Activités biologiques des stilbénoïdes ...... 32 1.4.1 Rôle des stilbénoïdes dans les plantes ...... 36 1.4.2 Activité anti-fongique des stilbénoïdes ...... 37 1.4.3 Activités des stilbénoïdes chez les mammifères ...... 39

2 Techniques 42 2.1 Notions générales de chromatographies ...... 42 2.1.1 Diﬀérents types de chromatographies utilisées dans l’étude des Substances Naturelles ...... 44 2.1.2 Quelques termes utilisés en chromatographie ...... 46 2.2 CPC ...... 48 2.2.1 Introduction ...... 48 2.2.2 Comparaison avec d’autres techniques ...... 49 2.2.3 Fonctionnement ...... 51 2.3 Spectromètre de masse ...... 52 2.4 Spectrométrie RMN ...... 56

III Matériel et méthodes 61

3 Équipements et procédures 63 3.1 CPC 200 mL ...... 63 3.2 CPC 1 L ...... 64 3.3 CLHP ...... 64 3.4 Spectrométrie de masse ...... 65 3.5 Mesure des coeﬃcients de partage ...... 65 3.6 Dosage des systèmes de solvants ...... 65 3.7 Couplage CPC-Masse ...... 66 3.8 Traitement des données et réalisation des ﬁgures ...... 66 3.8.1 CLHP, CPC et Spectrométrie de Masse ...... 66 3.8.2 Spectrométrie RMN ...... 66 3.8.3 Figures ...... 67

4 Plantes étudiées 68 4.1 Vitis vinifera ...... 68 4.1.1 Racines ...... 68 4.1.2 Sarments ...... 69 4.2 Gnetum africanum ...... 70 4.3 Fallopia multiﬂora ...... 71

IV Développement de couplages pour la Chromatographie de Partage Centrifuge et les techniques analytiques 72

5 Introduction 74

6 Couplage Hybride-Direct : CPC-SM 77 6.1 Couplage entre chromatographies liquide-liquide et spectrométrie de masse 77 6.2 Des pionniers à l’utilisation en routine ...... 77 6.3 Séparer deux ﬂux ...... 79 6.4 Réalisation ...... 83 6.4.1 Choix du solvant auxiliaire ...... 84 6.4.2 Optimisation des conditions de masse ...... 84 6.5 Résultats ...... 84 6.6 Conclusion ...... 85

7 CPC-EPS-RMN : Un couplage Hybride Indirect 86 7.1 Introduction ...... 86 7.1.1 CPC-RMN ...... 89 7.1.2 Choix d’une phase solide ...... 90 7.1.3 Couplages CPC-EPS existants ...... 94 7.1.4 Présentation du Prospekt2 ...... 95 7.2 Réalisation ...... 98 7.2.1 Adaptation du système mécanique ...... 98 7.2.2 Rétro-ingénierie ...... 99 7.2.3 Création de Prosper ...... 103 7.3 Applications ...... 104 7.3.1 Mise au point ...... 104 7.3.2 Application à la mise au point de méthodes de séparation ...... 106 7.3.3 Application au mode ascendant ...... 109 7.4 Conclusion et perspectives ...... 112

V Développements de systèmes de solvants pour la Chro- matographie de Partage Centrifuge 114

8 Introduction 115

9 Méthodologie de développement de systèmes 117 9.1 Dosage de solvants par spectrométrie RMN ...... 117 9.2 Systèmes dérivés des ARIZONAs ...... 122 9.2.1 Systèmes ARIZONA-Acétonitrile ...... 124

10Élution par gradients-inverses (back-gradients) et pas-inverses (back- step) 135

11Approche par gradients 141 11.1 Choix des bornes du gradient ...... 141 11.2 Méthode ...... 142 11.3 Résultats ...... 143 11.4 Application à d’autres séparations ...... 146

12Conclusion et perspectives 149

VI Développements annexes 151

13Développement d’outils pour la lecture et le traitement de données chromatographiques 153 13.1 Heisenberg : Une bibliothèque basée sur la rétro-ingénierie du format U2 . 153 13.2 CIERamp ...... 156

14Développement d’une base de données pour Phytochimiste 158 14.1 Données ...... 159 14.2 Présentation de l’interface ...... 161 14.3 Conclusion et perspectives ...... 163

VII Conclusion et perspectives 166

Bibliographie 171

Annexes i

Publications ii 14.4 Parues ...... ii 14.5 Acceptées ...... ii 14.6 En préparation ...... ii

Présentations orales et posters iv 14.7 Présentations orales ...... iv 14.8 Posters ...... iv

Autres publications vi

Activités d’enseignement vii Encadrement de stages viii 14.9 Master 2 ...... viii 14.10Master1 ...... viii

Spectrométrie de masse - Fonctionnement d’une ESI-IT Bruker Esquire ix

Paramètres de masse utilisés xi

Fractionnement de E11 par CPC 1L xii

Erratum Vitisine B xv

Protocole du Prospekt2 obtenu par rétro-ingénierie xvii

Solvants résiduels dans les produits à usage pharmaceutique xxi Table des ﬁgures

1 Puriﬁcation de Substances Naturelles ...... 6

1.1 Structure générale des stilbènes ...... 12 1.2 Les premiers stilbènes extraits de végétaux ...... 12 1.3 Étude des citations concernant les stilbènes ...... 12 1.4 Familles de plantes dans lesquelles des stilbènes ont été mis en évidence . 13 1.5 Site actif de la stilbène synthase ...... 16 1.6 Biosynthèse du resvératrol ...... 17 1.7 Monomères de stilbénoïdes issus de la vigne ...... 18 1.8 Mécanismes conduisant à la formation de radicaux sur le resvératrol . . . 20 1.9 Dimères de stilbénoïdes issus de différents Vitis dérivant de la (+)-E-ε- Viniférine ...... 21 1.10 Autre dimères de stilbénoïdes issus de différents Vitis ...... 22 1.11 Propositions de biogenèse de dimères de stilbénoïdes ...... 23 1.12 Trimères issus de différents Vitis ...... 24 1.13 Tétramères issus de différents Vitis ...... 25 1.14 Tétramères issus de différents Vitis ...... 26 1.15 Stilbénoïdes glycosylés ...... 29 1.16 Stilbénoïdes méthoxylés ...... 30 1.17 Stilbénoïdes prénylés ...... 30 1.18 Problème de nomenclature sur les molécules issues de la vigne ...... 33 1.19 Structure du Carexane H, aux effets allélopathiques ...... 37 1.20 Un composé anti-fongique et anti-bactérien produit par une bactérie . . . 38 1.21 Diéthylstilbestrol et tamoxifène ...... 40 1.22 La combrétastatine A-4 et ses dérivés ...... 41

2.1 Principe de l’élution ...... 43 2.2 Classiﬁcation des techniques chromatographiques ...... 44 2.3 Présentation et principe de fonctionnement d’une CPC ...... 52

I 2.4 Représentation du fonctionnement d’un spectromètre de masse ESI-IT Brüker Esquire ...... 55 2.5 Expériences communes de RMN ...... 60

5.1 Diﬀérents types de couplages ...... 76

6.1 Principe du couplage CCC-Thermospray ...... 78 6.2 Problème des vitesses de ﬂux ...... 80 6.3 Séparation passive des ﬂux ...... 81 6.4 Principe du séparateur actif - Schéma ...... 82 6.5 Principe du séparateur actif - Réalisation ...... 82 6.6 Principe du séparateur actif - Conception ...... 83

7.1 Représentation des différents couplages en CLHP-RMN ...... 91 7.2 Représentation schématique du Prospekt2 ...... 97 7.3 Adaptation du système hydraulique du Prospekt2 ...... 98 7.4 Adaptation du système hydraulique du Prospekt2 - Chargement/Injection 99 7.5 Prospekt2 - Analyse des trames ...... 102 7.6 Simulateur de Prospekt2 ...... 103 7.7 Architecture de Prosper ...... 104 7.8 Fenêtre principale de Prosper ...... 105 7.9 Fenêtre de choix des cartouches de Prosper ...... 106 7.10 Rétention de 1 mg d’un extrait de /Gnetum africanum/ sur colonne HLB pour /Prospekt2/ ...... 109 7.11 Séparation d’extraits de trois parties de Fallopia multiflora par CPC avec le système ARIZONA-C ...... 110 7.12 Spectre proton CPC-EPS-RMN du THG issu de la tige ...... 111 7.13 Spectres COSY et HSQC par CPC-EPS-RMN du THG issu de la racine . . . 111 7.14 Effet de l’échantillonage sur EPS sur le chromatogramme UV ...... 112 7.15 Montage en dérivation pour permettre l’utilisation de la CPC-EPS en mode ascendant ...... 113

9.1 Exemple de spectre RMN d’un mélange de solvants ...... 121 9.2 Représentation graphique de la composition volumique des systèmes ARIZONA ...... 125 9.3 Comparaison acétonitrile/méthanol dans les phases supérieures des sys- tèmes étudiés ...... 128

II 9.4 Comparaison acétonitrile/méthanol dans les phases inférieures des sys- tèmes étudiés ...... 129 9.5 Composition en acétate d’éthyle des phases des systèmes étudiés . . . . . 130 9.6 Composition en eau des phases des systèmes étudiés ...... 131 9.7 Composition en heptane des phases supérieures des systèmes étudiés . . . 132

10.1 Chromatogrammes de l’extrait de racine de vigne ...... 136 10.2 Simulation du contenu de la colonne pour une élution correspondante à la moitié de la phase mobile ...... 136 10.3 Comparaison du système ARIZONA-L avec et sans backstep ARIZONA-M 138 10.4 Comparaison des chromatogrammes UV et Masse avec et sans back-step . 139 10.5 Comparaison de la fraction Vitisine A avec et sans back-step ...... 139 10.6 Composés séparés de la fraction F2 par le système ARIZONA-L ...... 140

11.1 Chromatogramme de la CPC gradient ARIZONA modifié ...... 143 11.2 Chromatogramme des composés fortement enrichis de la CPC gradient ARIZONA modifié ...... 144 11.3 Chromatogramme des autres fractions de la CPC gradient ARIZONA mo- difié ...... 144 11.4 Spectres RMN de trois des produits fortement enrichis ...... 145 11.5 Chromatogrammes des fractions issues d’un gradient CPC sur KD3 . . . . 147 11.6 Chromatogrammes des fractions issues d’un gradient CPC sur GaM2 . . . 148

14.1 Structure générale de la base de données ...... 159 14.2 Exemple simplifié d’une comparaison entre différentes expériences . . . . 160 14.3 Représentation des liens entre données dans PhytoBase ...... 160 14.4 Page d’accueil de PhytoBase ...... 162 14.5 Exemple simplifié de schéma de fractionnement ...... 162 14.6 Exemple de structure générée à la volée par le code SMILES ...... 163 14.7 Exemple de saisie assistée ...... 163

14.8 Chromatogramme de l’extrait E11 ...... xii 14.9 Fractionnement de l’extrait E11 par CPC 1L avec le système ARIZONA-K . xiii 14.10Fractionnementde l’extrait E11 par CPC 1L avec le système ARIZONA-K : Fractions ...... xiv

14.11Centres asymétriques de la vitisine B ...... xv

III 14.12Spectre COSY des deux phenols a et d ...... xvi

Liste des tableaux

1.1 Classiﬁcation de Xiao ...... 31 1.2 Classiﬁcation de Shen ...... 31 1.3 Quelques activités biologiques des stilbénoïdes d’origine naturelle ...... 34 1.3 Quelques activités biologiques des stilbénoïdes d’origine naturelle ...... 35

2.1 Grade et origine des solvants et acides utilisés ...... 62

3.1 Gradient CLHP utilisé ...... 65 3.2 Masses utilisées pour les bandes de CIERamp ...... 67

6.1 Comparaison des diﬀérents types de séparation de ﬂux ...... 81 6.2 Réglages du séparateur actif ...... 83

7.1 Quelques phases existantes pour le Prospekt 2 ...... 92 7.2 Surface spécifique de quelques phases utilisées en EPS ...... 94 7.3 Structure des requêtes du Prospekt2 ...... 100 7.4 Structure des réponses du Prospekt2 ...... 100 7.5 ...... 101 7.6 Requêtes d’action communes aux deux modules ...... 102 7.7 Phases Spark testées ...... 107 7.8 Rétention de 1 mg d’un extrait de /Gnetum africanum/ sur colonne HLB pour /Prospekt2/ 108 7.9 Tableau récapitulatif des CPC avec système ARIZONA-C sur différentes parties de Fal- lopia multiflora ...... 110

8.1 Convention utilisée pour l’abréviation des noms de solvants...... 116

9.1 Composition du système Acétate d’Éthyle/H2O 50 : 50 à 25 ℃ ...... 118 9.2 Analyse des données de la ﬁgure 9.1 ...... 122 9.3 Composition volumique des systèmes ARIZONA ...... 124 9.4 Résultats des mesures par RMN de quelques dérivés de la gamme ARIZONA ...... 126

IV 9.5 Résultats des mesures par RMN de quelques dérivés de la gamme ARIZONA (en volumes) 127

10.1 Tableau des coeﬃcients de partage des composés étudiés ...... 137

11.1 Coeﬃcients de partage des composés majoritaires de l’extrait de vigne E11 ...... 142

13.1 Format des ﬁchiers U2 ...... 154 13.2 Format des blocs de données dans les ﬁchiers U2 ...... 154 13.3 Format des longueurs d’ondes ...... 155

14.1 Paramètres du spectromètre de masse ...... xi

14.2 Constantes de couplages des protons portés par les centres asymétriques de la vitisine B xvi

14.3 Requêtes d’action du module ACE ...... xvii 14.4 Requêtes d’action du module HPD ...... xviii 14.5 Requêtes d’état communes aux deux modules ...... xviii 14.6 Requêtes d’état du module ACE ...... xix 14.7 Requêtes d’état du module HPD ...... xix 14.8 Registres d’erreurs des modules ...... xx

14.9 Solvants de classe 1 décrits dans le document Q3C(R5) de l’ICH ...... xxii 14.10Solvants de classe 2 décrits dans le document Q3C(R5) de l’ICH ...... xxii 14.11Solvants de classe 3 décrits dans le document Q3C(R5) de l’ICH ...... xxiii

Acronymes

4CL 4-coumarate CoA ligase 5DOA 5,4’-Dihydroxystilbene-3-O-α-arabinopyranoside 5OMRG 5-O-methyl-(E)-resveratrol 3-O-β-D-glucopyranoside

ACP Acyl Carrier Proteins - Protéines transporteuses d’acyls Ani Acétonitrile APCI Atmospheric-pressure chemical ionization - Ionisation chimique à pression at- mosphérique

BBS Bibenzyl synthase

C4H Cinnamate-4-hydroxylase CCC Chromatographie à Contre-Courant CCM Chromatographie sur Couche Mince cD Couplage Direct

CE50 Concentration Eﬃcace 50 % - Concentration nécessaire pour obtenir 50 % de l’ac- tivité maximale cHD Couplage Hybride-Direct cHI Couplage Hybride-Indirect CHS Chalcone synthase cI Couplage Indirect CLHP Chromatographie Liquide Haute-Pression (ou Performance) CLHP-EPS-RMN Chromatographie Liquide Haute-Pression couplée à la Résonnance Magnétique Nucléaire par l’intermédiaire d’une Extraction Phase Solide

VII CLHP-RMN Chromatographie Liquide Haute-Pression couplée à la Résonnance Ma- gnétique Nucléaire CLHP-SM Chromatographie Liquide Haute-Pression couplée à la Spectrométrie de Masse CN Chimiothèque Nationale COSY COrrelation SpectroscopY CPC Chromatographie de Partage Centrifuge CPC-EPS Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à une Extraction Phase So- lide CPC-EPS-RMN Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à la Résonnance Ma- gnétique Nucléaire par l’intermédiaire d’une Extraction Phase Solide CPC-RMN Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à la Résonnance Magné- tique Nucléaire CPC-SM Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à la Spectrométrie de Masse CPG Chromatographies en Phase Gazeuse CPL Chromatographies sur Phase Liquide CPS Chromatographies sur Phase Solide

DART Direct Analysis in Real Time - Analyse directe en temps réel

E Acétate d’Éthyle ECU Entité Chimique Unique EI Electronic ionizasion - Ionisation électronique ENs Extrait Naturel standardisé EPS Extraction sur Phase Solide ERGGP (E)-resveratrol 3-(6-galloyl)-O-β-D-glucopyranoside ESI Electro-Spray Ionisation - Ionisation par elecro-spray Et Éthanol

FAB Fast Atom Bombardment - Bombardement par atomes rapides FDA Food and Drug Administration - Agence américaine de l’alimentation et de la santé

VIII FTICR Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance - Analyseur à résonance cyclotronique d’ions

GESVAB Groupe d’Étude des Substances Végétales à Activité Biologique

GI50 Growth Inhibition 50 % - Concentration nécessaire pour une inhibition de 50 % de la croissance

HAT Hydrogen Atom Transfer Hep Heptane HIF Hypoxia Inducible Factors - Facteurs d’hypoxie inductibles HMBC Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy HRP Peroxydase du Raifort - Horseradish Peroxidase HSQC Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy

IC50 Inhibition Concentration 50 % - Concentration nécessaire pour une inhibition de 50 % de l’activité ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Re- gistration of Pharmaceuticals for Human Use IT Ion Trap - Trappe à ions IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

Ki Concentration d’un inhibiteur enzymatique pour laquelle la moitié des sites de l’enzyme sont occupés.

M Méthanol MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Désorption et ionisation par laser assistée par une matrice MT Médecines Traditionnelles

NIST National Institute of Standards and Technology NOESY Nuclear Overhauser eﬀect spectroscopy

PAL Phenylalanine Ammonia Lyase PEEK Poly(etheretherketone) PKS Polycétides Synthases (Polyketides Synthase)

IX PMT Pinosylvine O-methyltransferase

RMN Résonnance Magnétique Nucléaire ROESY Rotating frame nuclear Overhauser eﬀect spectroscopy ROMT Resveratrol O-methyltransferase RPA Relation Pureté-Activité

SLLC Séparation Liquide-Liquide Centrifuge SM Spectrométrie de Masse SN Substances Naturelles SPLET Sequential Proton Loss Electron Transfer STCS Stilbène carboxylate synthase STS Stilbène synthase

Ter Methyl Tert-Butyl Ether THG 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbène-2-O-β-glucopyranoside TIT Trans-4-isopentenyl-3,5,2’,4’-tetrahydroxystilbene TOF Time Of Flight - Analyseur par temps de vol

VEGF Vascular Endothelial Growth Factors - Facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire

Wat Eau

X Glossaire

Capacité de charge Quantité de matière pouvant être soumise à une séparation en une seule étape. Capacité en pics Nombre d’entités chimiques diﬀérentes pouvant être séparées en une étape. Chimie combinatoire Méthode de production d’entités chimiques, souvent en grand nombre, à partir d’unités de base simples mais nombreuses et de réactions chimiques permettant de les coupler entre elles. Cette méthode est aussi utilisée pour optimiser des entités chimiques en les modiﬁant chimiquement.

Granulométrie Distribution statistique des tailles de particules dans une poudre. On parle souvent de la valeur moyenne de cette distribution sous l’appellation granu- lométrie.

Ratio de phase Rapport du volume de phase stationnaire sur le volume total. Ou, dans le cas d’une étude en tube du système, volume de la phase supérieure sur le total.

Sélectivité Capacité d’une technique chromatographique à séparer de manière satis- faisante deux entités chimiques.

Première partie

Introduction générale

1 « And what is a weed ? A plant whose virtues have not yet been discovered […] » Ralph Waldo Emerson (1803-1882) 1

L’Homme, comme tout organisme vivant, est capable d’extraire de son milieu envi- ronnant les éléments permettant d’assurer sa survie et la pérennité de son espèce. Les plantes jouent dans cette relation avec l’Homme un rôle prépondérant. Elles sont un de ses intermédiaires entre le monde minéral et le monde vivant, elles apportent nour- riture, protection et soin à ceux qui savent les apprivoiser, tout en représentant des dangers parfois immenses pour les autres.

L’interaction Plantes-Animaux est une notion complexe 2, faisant intervenir par exemple : l’écologie 3, les proximités et expériences au cours de l’histoire… Dans le cas de l’étude des interactions Hommes-Plantes s’ajoutent les inﬂuences de la société et de ses institutions au travers des représentations, des interdits ou des pratiques culturelles, religieuses et hiérarchiques…

Le soin est un domaine d’exploitation des ressources naturelles dans lequel les plantes sont très représentées. Dans certains pays, en particulier d’Asie et d’Afrique, les Médecines Traditionnelles (MT), dont la majorité des traitements sont d’origine végé- tale, représentent 80 % de l’oﬀre de soin (WHO 2008). Il est diﬃcile de dater l’apparition des Substances Naturelles (SN), qu’elles soient originaires de plantes, micro-organismes ou animaux, dans la thérapeutique ; les plus anciennes formes d’écriture découvertes faisaient déjà état de leur utilisation (Borchardt 2002). Au regard des recherches en éthologie et en zoo-pharmacognosie, on pourrait être à même de penser que ces usages précèdent la naissance du premier Homo Sapiens (Huffman 2001).

Dans le cas des MT, les plantes sont utilisées directement ou au travers de diverses préparations dont les macérâts, les infusions… Dans les pays occidentaux, où la pharmacie industrielle a pris le pas sur les anciennes pratiques de soin 4, les plantes sont principalement utilisées au travers de leurs composants élémentaires. Ces composants, appellés molécules par les chimistes, sont soit puriﬁées à partir des extraits, soit mo- diﬁées (on parle alors d’hémisynthèse), soit synthétisées en s’inspirant des molécules

1. Conférence Fortune of the republic 1838, Antislavery Writings, 137-154, 1995, Yale University Press 2. Complexe dans le sens de son étymologie latine « complexus » : enchaîné, lié 3. Ensemble des relations entre les êtres vivants et leur milieu, vivant ou non. 4. On peut citer l’herboristerie dont le diplôme n’est plus délivré en France depuis 1941.

2 naturelles. Ainsi les SN sont à l’origine de plus de la moitié des médicaments actuels (Newman et Cragg 2012). Bien que la part des SN soit restée importante, la pharmacie industrielle a connu une phase durant laquelle ces substances ont perdu leur intérêt (McChesney, Venkataraman et Henri 2007), en particulier lors de la fièvre de la Chimie combinatoire des années 1990. La même Chimie combinatoire qui, mal- gré les sommes colossales investies, n’aurait donné lieu qu’à la sortie d’une molécule anticancéreuse, le Sorafenib. Il est cependant difficile de pouvoir estimer l’utilisation de cette technique dans le domaine privé, que ce soit pour la création de nouvelles entités chimiques ou l’optimisation d’existantes, dont des SN. L’hypothèse quant au faible taux d’activité des bibliothèques issues de la Chimie combinatoire, serait dû au manque de diversité structurale, la faible ou inexistante stéréosélectivité des réactions et la faible rigidité des structures obtenues (Feher et Schmidt 2003). Le défi majeur de cette approche pour les prochaines années sera donc, entre autres, de résoudre ces différents problèmes. Les centaines de milliers de molécules par an issues de la Chimie combinatoire ne sont qu’une poussière dans l’espace chimique qui, si l’on se restreint à des masses inférieures à 500 Da, contiendrait tout de même plus de 1060 molécules (Kirkpatrick et Ellis 2004). Bien qu’étant une manière intéressante, mais encore balbutiante, d’explorer cet espace chimique, il existe d’autres méthodes permettant d’aller visiter des contrées inaccessibles par cette approche. La phytochimie, se concentrant sur les SN produites par les plantes en est une.

Mais pourquoi les plantes restent elles une source importante de SN actives ? Les plantes sont souvent considérées comme des usines chimiques. Les composés produits par les organismes vivants sont très souvent séparés en deux catégories, les métabolites primaires (communs aux espèces vivantes et indispensables) et les secondaires (spéci- ﬁques à quelques organismes, non vitaux).

L’Hypothèse du Screening (R.D. Firn et C.G. Jones 2009) remet en question ces déﬁnitions tout en proposant une nouvelle vision des processus évolutifs à l’œuvre dans les organismes vivants. Cette dichotomie dans les métabolites, attribuée àKös- sel en 1891, ne correspond ni à la réalité des composés identiﬁés ni à une quelconque base théorique. La catégorie secondaire correspondant plutôt à une sorte de catégorie fourre-tout. On se retrouve dans des cas où certains produits n’appartiennent à aucune ou aux deux catégories, prouvant de ce fait que ces catégories ne peuvent être descriptives pour l’ensemble des composés existants. En prenant l’exemple de la ca- tégorie des lipides, on peut, de par leur importance métabolique, les placer dans les

3 métabolites primaires. Mais dans ce cas, que dire des lipides produits uniquement par certains organismes et qui ne leur sont pas essentiels à court terme ? C’est d’ailleurs sur ce dernier point qu’apparaît une réflexion importante, quelle est la limite de la dé- finition d’un métabolite « essentiel » ? Est-ce un métabolite assurant la pérennité en éprouvette ou dans un milieu contrôlé ou dans son milieu naturel ? Richard D.Firnet Clive G. Jones ont, au travers de leur hypothèse, tenté de créer des catégories de voies métaboliques correspondant à différents types de pressions de sélection pour évacuer ces questions auxquelles il est difficile de répondre : – « Le métabolisme spéculatif 1 », contient les voies conduisant à des composés à forte activité biomoléculaire (R. D. Firn et C. G. Jones 2000) ou ayant des proprié- tés physico-chimiques très spécifiques. Ce sont les voies qui sont le plus à même de subir les pressions de sélection fortes et rapides et souvent courtes (comme les attaques par les pathogènes). Le fait pour une molécule de présenter uneforte activité biomoléculaire est une propriété rare au regard du nombre de composés existants. – « Le métabolisme de soutien 2 », regroupe les voies produisant des molécules aux propriétés physico-chimiques héritées de leurs précurseurs ou qui leur sont intrin- sèques. Les molécules issues de ces voies sont interchangeables dans la mesure où des composés de structures variées peuvent avoir des propriétés très proches. Cette hypothèse prend en compte le fait que la diversité vue dans certaines familles de composés comme les lipides, caroténoïdes et flavonoïdes pourrait être expliquée par des propriétés physico-chimiques suffisamment proches, ne néces- sitant alors pas d’adaptation ni de spécialisation des enzymes de la voie. De plus, cette hypothèse peut aussi expliquer le rôle d’une telle diversité dans ladéfense des organismes contre les pathogènes ; la diversité structurale des parois, mem- branes et autres structures à vocation séparatrice, pourrait être un avantage pour se prémunir des attaques. – « Le métabolisme fondamental intégré 3 », correspond aux voies métaboliques les plus conservées par l’évolution, qui sont aussi celles qui alimentent les voies précédentes. Les enzymes participant à ce métabolisme sont généralement très spécifiques de leurs substrats. En effet, les composés produits étant nécessaires à la fois à la constitution de l’organisme et aux autres voies métaboliques, la pression de sélection à rendu ces voies très efficaces et spécifiques. Ce qui expliquerait 1. Speculative metabolism 2. Supporting metabolism 3. Basic integrated metabolism

4 aussi la faible variabilité structurale des composés issues de ces voies au sein des organismes vivants. Ces catégories se chevauchent en certains endroits et lorsqu’une nouvelle voie est crée ou adaptée, le crible de ces diﬀérents catégories s’appliqueraient alors et la modè- leraient. On remarque cela au niveau des composés issus du métabolisme de soutien qui, pour certains, peuvent avoir des activités biomoléculaires fortes qui ne sont pas partagées avec d’autres molécules présentant les mêmes propriétés physico-chimiques. Cette hypothèse est basée sur l’idée que ce ne sont pas seulement les voies métabo- liques qui ont subi un processus de sélection, mais aussi le fait même de l’existence et la conservation simultanée et pérenne de diﬀérents types de métabolismes au sein de tous les organismes (R.D. Firn 2004). Permettant alors, à ceux ci, de réaliser une sorte de sélection permanente.

L’homme a appris à exploiter les produits de ce criblage pour produire des SN pures ou sous forme d’extraits aﬁn de se soigner ou de répondre à des besoins technologiques précis. Mais la source principale de SN reste de très loin l’alimentation. Au-delà de l’in- térêt métabolique indiscutable de l’alimentation, les liens entre nature de l’alimentation et santé sont très étudiés, que ce soit l’inﬂuence des polyphénols, des Oméga-3 (Rizos 2012), et des innombrables autres. L’interaction entre l’homme et son alimentation est un sujet complexe faisant intervenir comme dans le cas général des SN, des notions d’usages et de pratiques, de disponibilités des ressources, d’éducation et de croyances.

Un laboratoire comme le Groupe d’Étude des Substances Végétales à Activité Biolo- gique (GESVAB), spécialisé dans les polyphénols et leurs activités biologiques, et plus particulièrement les stilbènes et leurs activités neuroprotectrices, se doit, au vu de la complexité et de la diversité des organismes producteurs et des molécules de cette famille, de disposer d’outils pour faciliter leur étude. Ceci implique d’avoir des outils adaptés, allant de l’extraction des substances actives à partir des organismes, leur purification, leur identification et enfin leur étude biologique plus poussée. Un schéma représentant un type de stratégie d’étude des SN est présenté sur la figure 1.

Dans le cadre d’un tel laboratoire étudiant les SN, il est d’une importance primor- diale d’avoir des bibliothèques de composés et d’extraits permettant, lors de la mise au point de nouveaux tests biologiques en interne ou au travers d’une collaboration ex- térieure, de sélectionner des molécules ou organismes candidats pour une étude plus

5 Bio-guidage Vériﬁcation RSA, RPA Criblage Sélection d'activité RPA d'activité Pharmacologie

ENs Organisme Métabolome Puriﬁcation SN Contrôle de pureté ECU Organisme Échelle préparative n Échelle analytique

CR Complexité lim = 0 Complexité résiduelle n 8

Figure 1 – Représentation du travail nécessaire à l’obtention d’une Substance Naturelle à visée théra- peutique à partir de l’extrait d’un organisme. Le nombre d’étapes n, est relié à la Complexité Résiduelle, notion elle même dépendante de l’origine de la SN et de sa méthode d’obtention. C’est en étudiant la Relation Pureté-Activité (RPA) que cette complexité peut être estimée et ainsi, au travers de l’étape de contrôle de pureté, définir le produit obtenu, comme une Entité Chimique Unique (ECU), ou un Extrait Naturel standardisé (ENs). C’est sur ces derniers que seront réalisées les études pharmacologiques, de Relations Structures-Activité (RSA), mettant en lien l’influence de l’organisation intrinsèque de l’entité chimique avec son activité biologique. Schéma adapté de (G.F. Pauli, Chen et al. 2012). poussée. Ce sont aussi ces bibliothèques qui permettent le travail de déduplication, stra- tégie visant à se concentrer uniquement sur les molécules nouvelles 1. Pour valoriser à la fois les essais biologiques, les extraits et les SN obtenues, la Chimiothèque Natio- nale (CN) apporte une série de solutions adaptées à la mise en place d’échanges et de collaborations (Hibert 2009). L’un des objectifs de cette thèse a été de permettre la création d’outils séparatifs et analytiques, principalement autour de la Chromato- graphie de Partage Centrifuge (CPC), permettant la constitution d’une bibliothèque de stilbénoïdes en quantité suffisantes pour les usages internes et la participation à la CN, cette dernière étant très peu pourvue en cette famille de molécules. La CPC, et plus gé- néralement les techniques chromatographiques liquide-liquide, en faisant abstraction d’une phase solide, permettent de décupler les couples phase mobile/phase stationnaire possibles apportant ainsi une Sélectivité importante, tout en procurant à la fois une Ca- pacité de charge incomparable avec les techniques sur phase solide à volume égal. Ces deux derniers points compensant dans bien des cas la moindre Capacité en pics de ces techniques. De plus, l’adaptation des méthodes de laboratoire à des échelles supérieures pour la production en grande quantité des entités chimiques est aisée et très efficace. Ce sont ces particularités qui font de cette technique un outil idéal pour la constitution d’une chimiothèque, des études phytochimiques et l’obtention de composés en grande quantité.

1. Nouvelles à l’échelle du laboratoire.

6 La première partie de cette thèse est consacrée à une présentation de notions gé- nérales sur les stilbénoïdes, les diﬀérentes techniques utilisées pour les obtenir et les caractériser pour ﬁnir par une présentation des activités biologiques de ces composés et en particulier les activités neuroprotectrices. Ces dernières sont un des volets de la thématique du GESVAB : « Polyphénols et neuroprotection ».

Par la suite seront présentées les diﬀérentes plantes étudiées, contenant toutes des stilbénoïdes, ainsi que les méthodes mises on œuvre pour les étudier.

La plus grande partie de cette thèse est consacrée à des travaux sur le développe- ment de méthodes pour la CPC. En particulier l’étude de systèmes de solvants et d’outils facilitant leur création et leur sélection et la mise en place et le développement de couplages entre la CPC et diverses techniques analytiques telles que la Spectrométrie de Masse (SM) et la spectrométrie Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN).

Une dernière partie est consacrée à diﬀérents autres outils créés au cours des travaux décrits. Et en particulier à la création d’une base de données pour le phytochimiste et d’outils pour traiter les données acquises par diﬀérents appareils.

7 Deuxième partie

Notions générales

8 Table des matières

Stilbénoïdes

1.1 Description générale

Les stilbènes sont des composés dont la structure de base est le 1,2-diphenyléthylène, voir Figure 1.1. Leur nom proviendrait de l’aspect des cristaux de stilbène (Derby 1851) ressemblants à de la stilbite, une roche dont le nom lui même est dérivé du grec stilbos (στιλβος), signiﬁant « brillant, éclatant » 1, en raison de son aspect éclatant et nacré (René Just Haüy 1796). Ce sont les stilbénoïdes, et plus particulièrement les dérivés hydroxylés de stilbène et leurs oligomères qui ont été étudiés au cours de cette thèse.

C’est en 1909, dans une variété d’Hydrangea hortensia (Hydrangeaceae) du Japon, que pour la première fois des stilbénoïdes ont été mis en évidence (Asahina 1909). La structure de ces composés (Figure 1.2) n’a cependant été finalisée que vingt ans plus tard (Asahina et Asano 1929). Le Resvératrol, représentant le plus célèbre des stilbénoïdes, a lui été découvert en 1939, toujours au Japon, dans le vératre blanc Veratrum grandi- florum (Melanthiaceae) (Takaoka 1939). Il a ensuite été retrouvé en 1963 dans Fallopia multiflora (Polygonaceae), anciennement Polygonum cuspidatum. Plus d’un millier de stilbénoïdes et leurs oligomères ont été identifiés depuis, et plusieurs revues d’articles et livres tentent d’en faire un catalogue, (Gorham 1995 ; N. Li et al. 2001 ; Xiao et al. 2008 ; Shen, Wang et H.-X. Lou 2009 ; Pawlus et al. 2012 ; Rivière, Pawlus et Mérillon 2012), en reprenant les structures, organismes et références bibliographiques de chacun de ces composés ou d’un genre particulier, et parfois avec les activités biologiques 1. qui a donné le nom au stilb, unité de métrologie de mesure de luminance

10 associées. D’autres documents sont quand à eux plus orientés vers les activités biologiques et/ou physiques des stilbènes et stilbénoïdes (Likhtenshtein 2009 ; Jeandet et al. 2010 ; Gindro et al. 2012).

Les stilbénoïdes d’origine naturelle n’ont pas vraiment éveillé d’intérêt particulier auprès des chercheurs avant 1992. Un article dans The Lancet (Renaud et de Lorgeril 1992) reprend des résultats d’un rapport du projet MONICA (WHO MONICA Project 1989) de l’OMS, et fait le lien entre la mortalité plus faible de certaines populations montrée dans ce rapport, et la consommation de vin dans les populations concernées. En 1993 et 1997, deux autres publications, (Frankel 1993 ; Jang et Cai 1997) lancent la machine en associant l’activité supposée du vin, proposée par Renaud et De Lorgeril dans The Lancet, à la présence de stilbénoïdes et particulièrement du Resvératrol. À partir de cette date, un engouement très important pour ces composés a secoué àla fois les domaines de recherche dans les SN, les biologistes mais aussi les fabriquants de compléments alimentaires…

En ce qui concerne le domaine de la recherche, la figure 1.3 montre le nombre de citations par années concernant les mots « resvératrol » ou « stilbenoids » et « stilbene ». On remarquera que le mot « stilbene » est encore plus représenté dans ces courbes. Ceci est dû au fait que les stilbènes synthétiques étaient déjà connus comme des com- posés présentant des propriétés très intéressantes, particulièrement en optique, comme milieu amplificateur dans les lasers, en chimie des textiles comme azurant optique dans les lessives, en pharmaceutique et bien d’autres… Concernant l’occurrence des stilbé- noïdes dans les organismes vivants, la liste des familles concernées est elle aussi en augmentation. La figure 1.4 fait état de celles connues à ce jour. On constate que la quasi intégralité des familles appartiennent au règne des plantes, même si on retrouve tout de même quelques exemples d’organismes, non intégrés dans la précédente figure, dans le règne animal (Kikuchi, Takahashi et Oshima 2004) et dans le règne bactérien, (Nishanth Kumar et al. 2012) qui produisent des stilbénoïdes. Dans le cas de la larve du Bombyx, les stilbènes isolés sont des dérivés glycosylés de stilbènes déjà isolés des feuilles de Morus alba (Takasugi et al. 1979), une plante qui par ailleurs constitue la majorité de son alimentation.

Ce n’est qu’entre 1986 et 1990 que la voie de biosynthèse du resvératrol a été mise en évidence (J. Schröder et G. Schröder 1990). Les deux prochaines parties traiteront respectivement des biosynthèses des monomères et des oligomères de stilbénoïdes.

11 Figure 1.1 – Structure générale des stilbènes sous leurs formes cis à gauche et trans à droite.

COOH

O OH OH

Hydrangénol Acide hydrangéaique

Figure 1.2 – Hydrangénol et acide hydrangéaique, les deux premiers stilbènes extraits de plantes.

16,000 Stilbene 14,000 Resveratrol ou stilbenoids

12,000

10,000 s n o i t 8,000 a t i C 6,000

4,000

2,000

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 ,8 ,8 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,0 ,0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 Années

Figure 1.3 – Données extraites de Scopus avec les requêtes “resveratrol OR stilbenoids” et “stilbene” par année. Les ﬂèches rouges indiquent respectivement la découverte du premier stilbène d’origine végétale et l’article de Renaud et De Lorgeril.

12 13

Figure 1.4 – Familles de plantes dans lesquelles des stilbènes ont été mis en évidence . 1.2 Biosynthèse

1.2.1 Monomères

Les Polycétides Synthases (Polyketides Synthase) (PKS) sont une grande classe d’enzymes capables de condenser un acyl-CoA initial avec d’autres acyl-CoA. Elles sont divisées en trois groupes (Flores-Sanchez et Verpoorte 2009): – Type I : complexe enzymatique de une à plusieurs protéines multifonctionnelles. Présentes particulièrement dans les bactéries et les champignons. – Type II : complexe enzymatique de protéines monofonctionnelles. Présentes dans des actinomycetes du sol et des organismes marins. – Type III : protéine multifonctionnelle, sans domaine Acyl Carrier Proteins - Pro- téines transporteuses d’acyls (ACP), présentes dans les bactéries, les plantes et les champignons. Les PKS de type III, très présentes chez les végétaux sont responsables de la bio- genèse de chalcones, 2-pyrones, stilbènes, bibenzyls, stilbènes carboxylates, ériodic- tyols, acridones, benzophénones, phlorisovalérophénones, isobutyrophénones, acides coumaroyl triacétiques, benzalacétones, C-méthylchalcones, résorcinols, chromones, hydroxynapthalènes, curcuminoïdes… (Flores-Sanchez et Verpoorte 2009). Les stil- bènes, qui nous intéressent particulièrement ici, sont produits par trois classes principales : les Stilbène synthase (STS), Bibenzyl synthase (BBS) et Stilbène carboxylate synthase (STCS), enzymes qui produisent respectivement les stilbènes, les bibenzyls (di- hydrostilbènes) et les stilbènes carboxylates. Certains auteurs utilisent encore d’autres catégories, plus spéciﬁques, comme les pinosylvine synthases, resveratrol synthases (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009)…

Les STS, enzymes des plantes productrices de stilbènes, produisent ceux-ci à partir de trois unités de malonyl-CoA, dites unités d’extension, et d’un ester CoA de dérivés d’acide cinnamique dit unité de démarrage. La nature de ce dérivé, variant selon la plante, est principalement du p-coumaroyl-CoA chez les angiospermes, et du cinnamoyl-CoA chez les gymnospermes (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009). Mais, chez certaines orchidées, des stilbénoïdes de type bibenzyl sont synthétisés par des STS à partir d’unités de démarrage telles que le dihydro-m-coumaroyl-CoA ou le dihydro-p-coumaroyl-CoA, avec tout de même une nette préférence pour le premier ; ces enzymes ont par la suite été classées dans les BBS. De même, l’étude in vitro de la

14 STS de Pinus strobus, montre que, bien qu’elle soit vouée dans cette plante à transformer le cinnamoyl-CoA en pinosylvine, elle peut, en présence de caffeoyl-CoA, produire du piceatannol (Raiber, G. Schroder et J. Schroder 1995), que l’on retrouve dans les genres Picea et Vitis par exemple. C’est d’ailleurs l’une des pistes envisagées pour la voie de biosynthèse de ce composé. Même si au vu de la position des radicaux sur le resvératrol, on peut aussi supposer une formation à posteriori (Hammerbacher et al. 2011). Au-delà de ces études sur substrats naturels, il a été montré que les STS étaient capables d’utiliser du methyl-malonyl-CoA comme unité d’extension ainsi qu’une grande variété d’unités de démarrage telles que les acétyl-CoA, cinnamoyl-CoA, cafféoyl-CoA, butyryl-CoA, isovaléryl-CoA, hexanoyl-CoA, benzoyl-CoA ou phénylacétyl-CoA, montrant ainsi la faible spécificité des enzymes de cette famille (Zuurbier et al. 1998 ; Samappito et al. 2003), même si cette dernière particularité est variable selon l’origine de la STS. Certaines parties de la séquence protéique des STS ont été bien étu- diées (G. Schröder et J. Schröder 1992) et on a l’avantage de disposer de la structure co-cristallisée avec du resvératrol par diffraction des rayons X à 2.90 Å, d’une enzyme provenant de Arachis hypogaea (Shomura et al. 2005). Tout ceci permet d’étudier plus en détail le fonctionnement de cette famille d’enzymes ; on peut ainsi constater surla figure 1.5 que certains des acides aminés très conservés ont des intérêts structuraux ou catalytiques importants au niveau du site actif. Et des mutations dirigées sur ces acides aminés ont montré que ceux-ci étaient responsables de la sélectivité vis-à-vis de l’unité de démarrage, permettant ainsi de transformer des STS produisant principalement du resvératrol en STS produisant de la pinosylvine. À noter que dans le cas de la STS d’Arachis hypogaea, ces mutations entraînent une diminution drastique de l’activité de l’enzyme, qui ne se retrouve pas dans les autres espèces étudiées. Une autre voie de production de motifs stilbéniques qui ne sera pas décrite plus en détail ici, est présente dans la biogenèse des lignines (Albinsson et al. 1999) et dans leur dégradation lors de la fabrication de papier.

La première transformation assurée par les STS, première ligne dans le cadre de la figure 1.6, est commune avec les Chalcone synthase (CHS), ces dernières assurant par la suite une condensation de Claisen en lieu et place de la condensation aldolique et de la décarboxylation réalisées par les STS. Les STS, présentes de manière sporadique dans différentes espèces de plantes, semblent dériver de manière différente de la CHS (Tropf et al. 1994 ; Austin et al. 2004) selon les espèces ; mais elles présentent toutes de très fortes homologies avec cette dernière, de l’ordre de 70 à 90 %(Tropf et al. 1994).

15 Figure 1.5 – À gauche, une vue d’ensemble d’une des unités de la STS dimérique de Arachis hypogaea avec en vert le resvératrol, en surfaces les acides aminés proches de celui-ci, et la cystéine dont son atome de soufre est en jaune. À droite, on observe la cystéine 164 et deux acides aminés conférant sa sélectivité à la STS, la glutamine 162 et l’histidine 161.

Les plantes, même les plus anciennes phylogénétiquement, ayant la capacité de clo- ner leurs gènes ; cette capacité leur procure, au ﬁl de l’évolution, des séries d’enzymes aux activités distinctes ou aux conditions d’expression diﬀérentes que l’on appelle iso- zymes. On constate cela par exemple chez des bryophytes, dont certains gènes codant à l’origine pour une CHS et dupliqués au cours de l’évolution, codent, après mutation, pour une enzyme à activité STS. Ceci n’implique pour autant pas que ces plantes produisent des stilbènes ; comme cela a été constaté chez Physcomitrella patens, Marchantia paleacea ou Psilotum nudum, références dans (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009). À l’opposé, l’étude du génome de Vitis vinifera, produisant de nombreux stilbènes, a démontré l’existence probable d’une cinquantaine de gènes codant pour des STS dont plus d’une trentaine de fonctionnels (Parage et al. 2012), là où on n’en retrouve qu’un seul dans Sorghum bicolor (Paterson et al. 2009) produisant elle aussi des stilbènes (Bröhan, Jerkovic et Collin 2011).

En utilisant la classiﬁcation de Firn et Jones, présentée en introduction, ce type de métabolisme correspondrait à un métabolisme de soutien, ce qui serait par ailleurs en accord avec la diversité observée à la fois dans les structures, avec plus d’un millier de stilbénoïdes découverts, mais aussi au sein des organismes. Le point étonnant dans cette capacité à produire les stilbènes est l’absence d’ancêtres communs comme on l’observe souvent dans les voies métaboliques. Le lecteur trouvera dans la ﬁgure 1.7 quelques exemples de monomères servant d’unités de base à la construction de molécules déri- vées ou d’oligomères dont la formation sera décrite par la suite.

16 PAL C4H 4CL + CoASH

Phénylalanine Acide cinnamique Acide p-coumarique 4-coumaroyl-CoA

- CoASH - CoASH - CoASH - CO - CO Tétraketide - CO2 2 2

- CoASH - CoASH - CO2 Stilbene synthase Tétraketide Chalcone synthase 17

Figure 1.6 – Schéma de biosynthèse du resvératrol et d’une chalcone. On constate que le fonctionnement de la Stilbène synthase est identique à celui de la Chalcone synthase jusqu’à la transformation du tetraketide. OR1 OH

HO HO

R2O R1O OH O R1 R3

OR4 OR2

R1 R2 R3 R4 R1 R2 R1 (Z)- ou (E)-Resvératrol H H H H (E)-Picéatannol H H 2,4,6-Trihydroxyphénanthrène-2-O-glucoside Glc (E)-Ptérostilbène CH3 CH3 H H (E)-Rhapontigénine H CH3 (Z)- ou (E)-Picéide Glc H H H (Z)- ou (E)-Astringine Glc H (Z)- ou (E)-Resvératroloside H H H Glc (E)-Resvératrol-2-C-glucoside H H Glc H 18 (Z)- ou (E)-Mulbérroside E Glc H H Glc (Z)- ou (E)-Resvératrol-3,5-O-β-diglucoside Glc Glc H H (Z)-Resvératrol-3,5,4'-O-β-triglucoside Glc Glc H Glc

Figure 1.7 – Structures des monomères de stilbénoïdes mis en évidence dans la vigne, compilés dans (Pawlus et al. 2012). 1.2.2 Oligomères

Même si le Resvératrol présente des activités importantes, les oligostilbénoïdes pré- sentent des activités plus spéciﬁques et souvent plus importantes, ce qui rend leur production intéressante. Malgré un grand nombre de tentatives de synthèses eﬀectuées (S.A. Snyder et al. 2010 ; Scott A. Snyder, Gollner et Chiriac 2011), deux problèmes principaux sont apparus : un manque de stéréosélectivité des réactions, et un grand nombre de réactions annexes. Le meilleur moyen d’obtenir certains de ces composés reste encore de les extraire de plantes ou de cultures végétales et éventuellement de réaliser l’hémi-synthèse (Takaya, Yan, Terashima, He et al. 2002) à partir de ces com- posés extraits. La vigne, dont la biomasse est importante et disponible, en raison des tailles, arrachages, renouvellement, production de vin, est une source intéressante de ce point de vue là.

Il existe deux hypothèses principales traitant de la biosynthèse des oligomères. La première approche est d’ordre purement chimique, alors que la deuxième impliquerait des intermédiaires chiraux, éventuellement des enzymes. Au vu des différentes structures de dimères existantes, il semblerait que ces deux possibilités soient présentes. Dans tous les cas, c’est la capacité de ce type de composés, comme la plupart des po- lyphénols, à former et piéger des radicaux qui permet d’obtenir une telle diversité par couplage radicalaire. En effet, ce sont des mécanismes de type Sequential Proton Loss Electron Transfer (SPLET) et Hydrogen Atom Transfer (HAT) décrits sur la figure 1.8 qui, par transfert de radicaux et de protons conduiraient à une telle réactivité (Shang et al. 2009 ; Stojanović et Brede 2002). Les figures 1.9 et 1.10 reprennent les différents dimères isolés dans le genre Vitis (Pawlus et al. 2012), le lecteur trouvera une liste plus exhaustive des oligostilbénoïdes extraits de plantes ainsi que leurs motifs de polyméri- sation dans (Shen, Wang et H.-X. Lou 2009). La figure 1.11 contient des propositions de biogenèse, à notre connaissance jamais décrites, pour certains des composés pré- sentés. Les figures 1.12, 1.13 et 1.14 représentent quand à elles les différents trimères et tétramères isolés dans les Vitis.

19 SPLET

HAT

SPLET

HAT

Figure 1.8 – Représentation des mécanismes SPLET et HAT conduisant à la formation de radicaux sur le resvératrol. La ﬁgure du haut est issue de résultats de (Shang et al. 2009). En bas, les mêmes mécanismes pour la formation des radicaux sur le noyau résorcinole inspiré de (X.-C. Li et Ferreira 2003).

20 (+)-(E)-ε-Viniférine

(+)-(E)-ε-Viniférine-diol Viniférifurane Amurensine A Betulifol A Ampelopsine F Isoampelopsine F 21

Ampelopsine D Gnétine A Vitisinol D (+)-Ampelopsine A Vitisinol E

Viniferether A Viniferether B

Figure 1.9 – Structures de dimères de stilbénoïdes de diﬀérents Vitis dont la biogenèse peut être liée à la (+)-(E)-ε-Viniférine en haut à gauche, compilés dans (Pawlus et al. 2012). a)

Parthenocissine A adrangularine A δ-Viniférine Pallidol Scirpusine A 22

Vitisinol G Vitisinol C Vitisinol E b)

Malibatol A (+)-Vitisinol E Vitisinol A

Figure 1.10 – a) Dimères pouvant être issus de deux unités resvératrol ou dans le cas de la Scirpusine A d’un picéatannol et d’un resvératrol. b) Dimères dont la biogenèse implique des réarrangements et/ou pertes de carbone. Compilés dans (Pawlus et al. 2012). Gnétine A

Pallidol

Parthenocissine A adrangularine A

ε-Viniférine

Betulifol A

Figure 1.11 – Propositions de biogenèse de dimères de stilbénoïdes. Une proposition avait été faite pour le Pallidol dans (X.-C. Li et Ferreira 2003).

23 1S,2R,3S,4R (Z)- ou (E)-Ampélopsine E 1S,2S,3R,4S (Z)- ou (E)-Amurensine B Ampélopsine C déhydro 1-2,3R,4R (E)-Amurensine C déhydro 1-2,3R,4S (E)-Amurensine D 1S,2R,3R,4S (Z)-Gnétine H

Amurensine G Vitisinol F

(E)-trans-Miyabenol C (E)-cis-Miyabenol C (Z)-trans-Miyabenol C

(+)-Viniférol D Vitisine E Figure 1.12 – Trimères issus de diﬀérents Vitis.

24 1 2

Ampelopsine H Amurensine I

1R Amurensine J 1S,2S Hopeaphenol 1S Flexuosol A 1R,2R Isohopeaphenol

Amurensine L 25 Miyabenol A Amurensine K Heyneanol A

Davidol A (hypothétique) Vaticanol C (hypothétique) Vitisine D Amurensine M Figure 1.13 – Tétramères issus de diﬀérents Vitis, compilés dans (Pawlus et al. 2012). (Z)- ou (E)-Vitisine A (Z)- ou (E)-Vitisine B (E)-Vitisine C (-)-Vitisifurane B 26

(+)-Viniférol B (+)-Viniférol E (+)-Viniférol A (-)-Viniférol C (+)-Vitisifurane A

Figure 1.14 – Tétramères issus de diﬀérents Vitis, compilés dans (Pawlus et al. 2012). Les péroxydases, enzymes très présentes chez tous les végétaux, font partie des enzymes capables de catalyser la formation de certains dimères, et peut-être au-delà, à partir de monomères. Il a été montré (Calderón, Zapata, Pedreño et al. 1992 ; Calderón, Zapata et Ros Barceló 1994 ; Morales et A.R. Barceló 1997 ; A. R. Barceló et al. 2003) que certaines peroxydases issues de la Vigne sont capables de former la δ-Viniférine et d’autres dimères. Malgré de nombreuses tentatives utilisant la Peroxydase du Raifort - Horseradish Peroxidase (HRP) ou d’autres peroxydases, même issues de la Vigne, aucune expérience n’a pu montrer que ce sont ces enzymes qui sont impliquées dans la formation de la (+)-(E)-ε-Viniférine (A. R. Barceló et al. 2003). Mais la présence d’un intermédiaire chiral est cependant fortement supposée, vu que les plantes semblent capables de produires spéciﬁquement de la (+)-(E)-ε-Viniférine, comme la Vigne ou de la (-)-(E)-ε-Viniférine comme certaines Cyperaceae. Une laccase de Botrytis cinerea a été considérée comme capable de catalyser la réaction du resvé- ratrol vers la (+)-(E)-ε-Viniférine (Pezet 1998), mais des études ultérieures ont réfuté cette hypothèseBreuil ( et al. 1998 ; Cichewicz, Kouzi et Hamann 2000).

1.2.2.1 Stéréochimie

En faisant réagir différents acides sur de la (+)-(E)-ε-Viniférine de configuration connue, Takaya et al (Takaya, Yan, Terashima, He et al. 2002 ; Takaya, Yan, Terashima, Junko Ito et al. 2002) ont réussi à produire 4 composés, la (+)-Ampelopsine A, la (+)-Ampelopsine B, (-)-Ampelopsine D et la (+)-Ampelopsine F. C’est en se ba- sant sur des mécanismes réactionnels simples, proches de ceux présentés précédem- ment, qu’ils ont pu déduire la configuration absolue de ces composés. La configuration absolue de la (+)-(E)-ε-Viniférine à laquelle ils se réfèrent provient d’une expérience sur la (-)-(E)-ε-Viniférine de Carex pumila (Kurihara et al. 1990). Cette dernière a été soumise à une série de réactions pour obtenir un composé de type Gnetine F dont la configuration était connue (Lins et al. 1986). Ce qui a permis, grâce à une comparaison du spectre de dichroïsme circulaire de la Gnetine F et de ce composé, de déter- miner sa configuration absolue et donc indirectement celle de la (-)-(E)-ε-Viniférine. Le dichroïsme circulaire reste un outil assez utilisé pour déterminer les configurations absolues de stilbénoïdes (T. Ito et al. 2009 ; Ge et al. 2010), même si certaines ont pu être aussi obtenues grâce à des dérivés bromés et méthylés en diffraction des rayons X (Coggon, King et Walwork 1966). On peut aussi déduire les configurations des com- posés des hypothèses biogénétiques, ce qui peut par ailleurs constituer un bon moyen

27 de confirmer celles-ci. Il existe une étude assez poussée sur les configurations des stil- bénoïdes issus de Vitis vinifera infectée par Plasmopara viticola (Mattivi et al. 2011), même si il est difficile dans ce genre de cas de faire la distinction entre les composés produits par la plante et les métabolites de l’agent infectieux.

1.2.3 Dérivés

1.2.3.1 Isomérie

Les stilbénoïdes ont la capacité de subir une isomérisation de leur double liaison lorsqu’ils sont exposés à une irradiation ultraviolette. Le sens de cette isomérisation cis->trans ou trans->cis est dicté par les diﬀérentes fonctionnalisations, l’énergie de l’irradiation, le type de milieu, la température… Le lecteur trouvera un chapitre dédié à ces transformations et aux diﬀérents mécanismes impliqués dans (Likhtenshtein 2009). Certaines expériences d’expression de STS dans Arabidopsis thaliana semblent cependant indiquer que cette plante produit une enzyme capable d’isomériser les stil- bénoïdes (Yu et al. 2006), mais il est aussi possible que ce soit le substrat 4-coumaroyl qui soit en position cis. Sauf mention contraire, quand il est fait référence au resvéra- trol dans ce document, c’est de trans-resvératrol dont il s’agit.

1.2.3.2 Glycosylation

La glycosylation est une des transformations des stilbénoïdes les plus observées in vivo, voir la figure 1.15 pour quelques exemples. Les formes glycosylées se trouvent le plus souvent dans les fruits et représentent la forme majoritaire des stilbènes dans les jus de raisin (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009). Il semblerait que la glycosylation puisse être réalisée par plusieurs enzymes, spécifiques ou non (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009) aux stilbénoïdes dont trois ont pu être mises en évidences dans des cultures in vitro de cellules de Vitis vinifera (Krasnow et Murphy 2004). Les quelques plantes ne produisant pas de stilbénoïdes, modifiées génétiquement pour exprimer des STS, montrent une formation de composés majoritairement glycosylés ; alors que dans les plantes en produisant naturellement, on constate souvent un mélange des deux (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009). Il existe deux hypothèses principales quand

28 à la formation de ces molécules glycosylées. La première serait un mécanisme de protection contre la toxicité de ces composés, en particulier dans les plantes modiﬁées, l’autre serait un intérêt dans le transport, la protection et le stockage de ces composés au niveau intra-cellulaire (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009).

trans-Resvératrol 2-C glucoside Astringine Picéide Resvératroloside

ε-Viniférine diglucoside Pallidol 3,3'' diglucoside

Figure 1.15 – Exemple de stilbénoïdes glycosylés.

1.2.3.3 Methoxylation

Les dérivés méthoxylés de stilbénoïdes présentent (voir ﬁgure 1.16) un intérêt phar- macologique et cultural important, en particulier deux molécules, la combretastatine A4 (Kingston 2009) et le ptérostilbène (Roupe et al. 2006). Il existe deux type d’enzymes très diﬀérentes au niveau de leurs gènes, avec moins de 30% d’identité sur leurs séquences, capables de catalyser la méthylation des groupements hydroxy :

– Les Pinosylvine O-methyltransferase (PMT), qui sont capables soit de monomé- thyler un substrat comme les stilbénoïdes. La methylation ne se fait que sur un seul des hydroxyls du noyau résorcinol. – Les Resveratrol O-methyltransferase (ROMT), qui semblent plus spéciﬁques aux stilbénoïdes, forment quand à elles des diméthyls sur le noyau resorcinol.

29 La revue (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009) fait état de publications montrant que l’évolution de ces deux familles semblent s’être faite de manière sporadique, comme dans le cas des STS.

Ptérostilbène Rhapontigénine Figure 1.16 – Exemple de stilbénoïdes methoxylés.

1.2.3.4 Prénylation

Des dérivés prénylés de resvératrol (ﬁgure 1.17), présentant des activités sur les ré- cepteurs cannabinoïdes (Brents et al. 2012), ont été mis en évidence dans Arachis hypogaea, mais les prenyltransférases pouvant produire ces composés n’ont pas encore été mises en évidence (Sobolev, Potter et Horn 2006) cité dans (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009). Certaines publications font état d’une prénylation non enzymatique de stilbénoïdes à partir d’isoprényl di-phosphate (D’Abrosca et al. 2005).

Figure 1.17 – Deux stilbènes prénylés actifs sur des récepteurs cannabinoïdes et plus résistants à la glucuronidation que le Resvératrol.

30 1.3 Nomenclature

La première façon de ranger les stilbènes dans des catégories est de les diviser en deux groupes : monomères et oligomères, et éventuellement en un groupe par degré de polymérisation. Mais il existe plusieurs types de monomères conduisant à une diversité élevée d’oligomères. Dans une publication de 1993, Sotheeswaran et al (Sotheeswaran et Pasupathy 1993) proposent deux groupes pour les oligomères : A, au moins un hé- térocycle (comme le trans-2-aryl-2,3-dihydrobenzofurane), groupe B aucun. Mais cette classiﬁcation se limite à classer des dérivés de Resvératrol et ne rend toujours pas vraiment compte de la diversité des constituants. Une autre classiﬁcation a été proposée en 2008 (Xiao et al. 2008), elle ne concerne que les monomères :

Tableau 1.1 – Classiﬁcation proposé par Xiao des monomères stilbénoïdes en fonction de leurs structures.

ABCDE Fonctions oxygé- Prénylés Aryl Substititions par Hybrides nées Géranylés benzofuranes des carbones autres sur les cycles même cyclisés Hors catégories A methylènedioxy et C glycosides

Concernant les oligomères, Li et al., en 2001 (N. Li et al. 2001), ont déﬁni cinq groupes, selon les unités constituantes. Cette classiﬁcation a ensuite été étendue à 6 groupes par Shen et al. en 2009 (Shen, Wang et H.-X. Lou 2009), voir le tableau 1.2.

Tableau 1.2 – Classiﬁcation proposé par Shen des oligomères de stilbénoïdes en fonction de leurs unités constituantes. Les groupes V et VI n’avaient pas été numérotés dans leur publication et ont été ajoutés ici.

IIIIIIIVVVI Resvératrol Isorhapontigénine Picéatannol Oxyresvératrol IV+I Autres

31 C’est à notre connaissance les seules tentatives de nomenclature et de classiﬁcation des stilbénoïdes à ce jour.

Shen et al. ont ensuite créé des groupes par connectivité en fonction du nombre de liaisons C-C ou C-O-C. Ils ont ainsi pu dégager les motifs structuraux uniques correspondants : – une liaison : 10 motifs structuraux – deux liaisons, conduisant à la formation d’un cycle : 10 motifs structuraux – trois liaisons, conduisant à la formation de deux cycles : 7 motifs structuraux – quatre liaisons, rare : 2 motifs structuraux Dans la plupart des publications, les composés sont classés par degré de polyméri- sation et par substituants, sans vraiment prendre en compte les structures planes des composés. De plus, certaines substances de familles chimiques diﬀérentes portent le même nom, comme par exemple les vitisines A et vitisines B qui désignent à la fois des stilbénoïdes et des pyranoanthocyanes (voir Figure 1.18).

1.4 Activités biologiques des stilbénoïdes

Les stilbénoïdes et leurs dérivés synthétiques ou hémi-synthétiques présentent une grande variété d’activités biologiques parfois très importantes. Le tableau 1.3 recense quelques-unes de ces activités, dont certaines seront détaillées davantage dans les sec- tions suivantes. Les activités des stilbénoïdes en neuro-protection seront traitées dans un chapitre particulier.

32 Figure 1.18 – Représentation des diﬀérentes molécules nommées vitisines A et vitisines B. À gauche les stlibénoïdes, à droite les pyranoanthocyanes.

33 Tableau 1.3 – Quelques activités biologiques de stilbénoïdes d’origine naturelle, informations tirées des citations dans(Shen, Wang et H.-X. Lou 2009).

Nom Organisme Activité Valeur

Combretastatin A-4 Combretum caﬀrum Cytotoxique, < perfusion IC50 = 3.20 nM Combretaceae sanguine NCI 60 Phoyunbene B Pholidota yunnanensis Anti-inﬂammatoire IC50 = 7.5 μM Orchidaceae Inhibition NO Halophilol A Iris halophila Cytotoxique IC50 = 17.28 et 22.47 μM Iridaceae KB/HMEC 5DOA Rumex bucephalophorus Anti-diabétique > acarbose Polygonaceae Inhibition α-glucosidase ERGGP Calligonum leucocladum Anti-bactérien (activité synergique) 34 Polygonaceae Restaure sensibilité -1 TIT Artocarpus integer Anti-paludique CE50 = 1.7 μg.mL Moraceae Plasmodium falciparum

Pawhuskine A Dalea purpurea Anti-douleur Ki = 0.29 ± 0.11 μM Leguminosae Récepteurs opioïde

Chlorophorine Chlorophora excelsa Dermatologique IC50 = 1.3 μM Moraceae Inhibiteur tyrosinase Schweinfurthins A Macaranga schweinfurthii Cytotoxique IC50 = 0.36 μM Euphorbiaceae NCI 60 Schweinfurthine E Macaranga alnifolia Cytotoxique IC50 = 0.26 μM Euphorbiaceae A2780 (ovaire) Suite page suivante Tableau 1.3 – Quelques activités biologiques de stilbénoïdes d’origine naturelle, informations tirées des citations dans(Shen, Wang et H.-X. Lou 2009).

Nom Organisme Activité Valeur -1 Machaeriol B Machaerium multiﬂorum Anti-paludique IC50 = 0.12 μg.mL Leguminosae Plasmodium falciparum

Hopeanol Hopea exalata Cytotoxique IC50 = 0.52-19.36 μM Dipterocarpaceae KB, AGS, HeLa… Hepeahainol A Hopea hainanens Anti-parkinson IC50 = 1.6 μM Dipterocarpaceae Acetylcholinesterase -1 Hopeanolin Hopea exalata Anti-fongique IC50 = 0.10-22.5 μg.mL Dipterocarpaceae divers -1 Nepalensinol B Kobresia nepalensis Cytotoxique IC50 = 0.02 μg.mL

35 Cyperaceae Topoisomerase II Carasinol C Caragana sinica Reconstruction osseuse stimulation 26.5% à 1 μg.mL-1 Fabaceae Prolifération d’ostéo- blastes Vitisine B Vitis vinifera Anti-AGEs Inhibition de 60 % à 1 μM Vitaceae Inhibition des AGE Gnetuhainine Gnetum hainanense Anti-histaminique IC50 = 0.1 μM Gnetaceae Recepteur à l’histamine Rhaponticine Rheum franzenbachii Anti-diabétique 125 mg.kg-1, réduction signiﬁcative du glucose sanguin et de la tolérance au glucose Polygonaceae 1.4.1 Rôle des stilbénoïdes dans les plantes

1.4.1.1 Allélopathie

L’allélopathie regroupe l’ensemble des processus impliquant des entités chimiques produites par un autre organisme vivant et capable d’influencer la croissance et le dé- veloppement d’une plante ou d’un système biologique. De nombreux ouvrages ex- pliquent plus en détail les tenants et aboutissants de ce terme et de ce qu’il englobe, dont l’ouvrage (Narwal 2004). D’autres se consacrent aux méthodes permettant de mettre en évidence et d’étudier les entités chimiques mises en jeu dans ces processus (Sampietro, Catalan et Vattuone 2009). Ce terme, défini en 1937 par Hans Molisch (Narwal 2004), est à l’origine d’un domaine de recherche fertile. Dans un contexte écologique, économique, sanitaire et sociétal dans lequel les pratiques culturales de l’agriculture dite « conventionnelle » 1 sont remises en question, la recherche de solutions permettant de limiter les intrants phytosanitaires ainsi que la conservation etla régénération de la fertilité et de la durabilité des sols et des pratiques qui y sont liées sont des enjeux cruciaux. Les interactions allélopathiques peuvent être qualifiées de positives ou de négatives, selon qu’elles se fassent en faveur ou non de l’organisme avec lequel la plante est en lien. Ce qui fait des organismes producteurs de ces entités chimiques, ou de ces entités extraites, de bons candidats pour répondre aux besoins exprimés précédemment. Dans certaines plantes, il a été montré que les stilbénoïdes peuvent justement servir de support à ces interactions.

Les premiers eﬀets allélopathiques négatifs des stilbénoïdes ont semble-t’il été mis en évidence en 1983 par Ronald Taylor et David Shaw (Taylor et Shaw 1983). Leur étude portait sur la synergie tannins-stilbènes, et la capacité de ce mélange à limiter la germination de diﬀérentes espèces. Les stilbènes seuls ont seulement la capacité d’augmenter le temps nécessaire à la germination, alors que couplés aux tannins, ils sont à la fois capables de limiter la germination mais aussi de réduire la croissance du radicelle de manière drastique. De plus la grande concentration de ces deux familles de polyphé- nols à la fois dans la plante et dans le sol conforte l’hypothèse que ces composés ont une activité sur les plantes environnantes. Les auteurs font l’hypothèse que cela pourrait contribuer à la distribution éparse des forêts de Picea engelmannii en Amérique du Nord. 1. Qui n’est pas si conventionnelle au regard de l’histoire de l’agriculture chez lesHumains.

36 L’étude de composés extraits de Carex distachya (Fiorentino et al. 2008), montre des effets allélopathiques positifs et négatifs selon les espèces et les composés considé- rés. Le carexane H, voir figure 1.19 est par exemple capable de stimuler la croissance de Petrorhagia velutina de 50 % ; alors que d’autres stilbénoïdes et flavonoïdes étudiés inhibent la croissance des trois plantes étudiées dans cette étude.

Une étude plus récente sur Polygonum cuspidatum (Fan, Hostettmann et H. Lou 2010), une plante qualiﬁée d’envahissante, montre que ce sont trois stilbénoïdes qui ont l’eﬀet allélopathique négatif le plus important sur les 13 composés testés, à savoir le Resvératrol, le Resvératroloside et le Picéide. Selon les auteurs, ces composés pourraient être responsables du caractère envahissant de cette espèce.

La revue de Chong (Chong, Poutaraud et Hugueney 2009) cite quelques autres références sur des eﬀets allélopathiques des stilbénoïdes dont un eﬀet répulsif vis-à-vis du liévre d’Amérique, des nématicides, insecticides et répulsifs…

Figure 1.19 – Structure du Carexane H, aux eﬀets allélopathiques (Fiorentino et al. 2008). Cette structure est un dérivé de stilbène par réouverture d’un cycle (D’Abrosca et al. 2005).

1.4.2 Activité anti-fongique des stilbénoïdes

Le Docteur Carole Lambert, dans sa thèse (Lambert 2011), recense l’impact sur les cultures, les symptômes, les diﬀérences de sensibilité et les moyens de défense de la vigne vis-à-vis de pathogènes responsables de ce que l’on nomme les maladies du bois. Ses recherches ont montré, en accord avec les études précédentes (Jeandet et al. 2010 ; Chong, Poutaraud et Hugueney 2009), que les stilbénoïdes ont une capacité importante à inhiber la croissance de certains de ces pathogènes, dont certains pour lesquels la sensibilité aux stilbénoïdes n’avait jamais été démontrée.

37 Les concentrations actives in vitro sur ces pathogènes étant proches de celles consta- tées in vivo, il est probable que ces composés jouent un rôle important dans les mé- canismes de défense. Cette étude émet l’hypothèse que la vigne tente de se défendre contre les pathogènes agressifs par une induction importante de la production de stil- bénoïdes.

Même si in vitro certaines de ces souches agressives se montrent peu sensibles à ces composés, il semble que les plantes les plus résistantes restent celles dont l’induction est la plus forte et la plus précoce. Par ailleurs, les stilbénoïdes constitutifs 1 ne semblent pas être des marqueurs de résistance puisque les niveaux varient fortement en fonction des périodes de l’année, des conditions climatique, des pratiques culturales et que ces paramètres ne semblent pas corrélés aux taux d’infections.

Cependant, même les plantes les plus résistantes ne sont pas capables de se protéger contre certains des pathogènes étudiés. Ces résultats semblent conﬁrmés par des études ultérieures (Boso et al. 2012).

L’activité anti-fongique des stilbénoïdes ne semble pas limitée au règne végétal puisque une bactérie associée à un nématode entomopathogène a montré une production de stilbénoïdes, le Resvératrol et un dérivé di-hydroxy-isoprényl de stilbène, à activités anti-bactériennes et anti-fongiques in vitro, voir figure 1.20. Ces activités étant, dans certains des cas étudiés, efficaces à concentration équivalente aux compo- sés de références tels que l’Amphotéricine B, la bavistine ou la céfotaxime (Nishanth Kumar et al. 2012). De même, des plantes modifiées pour produire la STS ont montré pour la plupart une meilleure résistance aux pathogènes (Jeandet et al. 2010).

Figure 1.20 – Un composé anti-fongique et anti-bactérien produit par une bactérie (Nishanth Kumar et al. 2012).

1. qui sont présents dans la plante non infectée

38 1.4.3 Activités des stilbénoïdes chez les mammifères

1.4.3.1 Anti-tumorale

Il existe un dérivé de stilbène tristement célèbre : le diéthylstilbestrol 1 (voir la structure dans la figure 1.21). Ce composé, découvert à la fin des années 1930 (Dodds et al. 1939) a été utilisé chez l’Humain principalement pour ses propriétés prétendument anti-abortives chez la femme enceinte, pour réduire la croissance des jeunes filles trop grandes (Venn et al. 2004) ou des prétextes plus farfelus comme avoir des bébés plus grands et plus forts ; il a provoqué de graves problèmes chez les enfants et particulière- ment chez les filles. 95 % des enfants, garçon ou fille, exposés prénatalement présentent au moins un des signes cliniques. Malgré un refus de la Food and Drug Administra- tion - Agence américaine de l’alimentation et de la santé (FDA) d’autoriser le produit initialement, invoquant un principe de précaution, les pressions des politiques et des industriels ont fini par faire céder l’agence. Utilisé parallèlement, et surtout aux États- Unis, comme produit vétérinaire permettant de changer les ratios viande/gras oude jouer sur le système hormonal afin de contrôler le comportement, faciliter les accou- chements… ; ce composé s’est retrouvé dans la viande des animaux traités, mais aussi dans les personnes manipulant les implants utilisés pour administrer ce produit, provoquant entre autre chez les hommes une gynécomastie. La FDA a, malgré de nombreux signalements, longtemps réfuté les accusations de dérèglement hormonaux graves cau- sés par ce composé (Langston 2008) et les études montrant non seulement son ineffica- cité pour ses indications thérapeutiques mais aussi les effets secondaires dramatiques. En France, malgré les avertissements, il a fallu attendre 1977, 6 ans plus tard que les États-Unis 2, pour une suppression des indications thérapeutiques chez les femmes, depuis lors il reste toujours utilisé comme traitement pour le cancer de la prostate mais avec de strictes contre-indications.

Un autre dérivé de stilbène est utilisé comme anti-tumoral, le tamoxifène 1.21. On constatera que sur ce composé et le précédent, les doubles liaisons sont toujours fonc- tionnalisées, contrairement aux composés discutés dans cette thèse. Mais il pourrait être important de tester les stilbénoïdes vis-à-vis de leurs activités œstrogéniques et potentiellement non souhaitées avant une étude plus poussée. 1. distribué en France sous le nom de distilbène. 2. À noter qu’aux États-Unis, la FDA donne l’autorisation de mise sur le marché, mais ne peut pas retirer un produit, seul le fabriquant le peut.

39 Figure 1.21 – À gauche le diéthilstilbestrol, à droite le tamoxifène.

Une série d’anti-cancéreux stilbénoïdiques ont été mis en évidence récemment (voir figure 1.22). La combrétastatine A-4 issue de Combretum caffrum (Combretaceae) (Nihei et al. 1999) ayant présenté de fortes activités cytotoxiques et sur la perfusion sanguine in vitro mais une faible solubilité, a été modifiée. L’un de ces dérivés, la com- brétastatine A-4 phosphate, et plus particulièrement son sel disodique, le Zybrestat est actuellement en essai clinique phase III pour le cancer anaplasique de la thyroïde et en phase II pour le cancer du poumon non a petites cellules et le cancer de l’ovaire résistant au platine (OXiGENE - ZYBRESTAT in Oncology 2012). Un autre derivé, plus complexe (Hori, Saito et Kubota 2002) est actuellement développé sous le nom Ombrabulin. Ce composé seul est en étude clinique phase III pour les sarcomes des tissus mous, en phase II en combinaison avec des taxanes et du platine pour les cancers du poumon non à petites cellules et en phase I en combinaison avec d’autres traitement pour le traitement des tumeurs solides (Ombrabulin AVE8062 | Vascular Disrupting Agent |Tubulin- Binding Agent 2012). La plupart des tumeurs, passé une certaine taille, se retrouvent en hypoxie. Elles émettent alors comme les autres tissus dans la même situation desfac- teurs Hypoxia Inducible Factors - Facteurs d’hypoxie inductibles (HIF) appellés HIF-1α et HIF-2β. Ces facteurs vont à leur tour induire la production des Vascular Endothelial Growth Factors - Facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Grâce à ces facteurs, des néovaisseaux viennent irriguer la tumeur qui est désormais alimentée en nutriments par le système sanguin. Judah Folkmann, chirurgien, a publié en 1971 un article sur l’hypothèse de l’implication de l’angiogénèse dans la croissance tumorale (GARBAY et BRION 2012). Après les habituelles critiques et le scepticisme, cette hypothèse s’est concrétisée par la création de nouveaux axes de recherche visant l’an- giogénèse tumorale. Il existe deux approches thérapeutiques principales, la première

40 est d’empêcher la création des néovaisseaux, la deuxième, celle sur laquelle agissent les combrétastatines, est la limitation voir même l’arrêt du flux sanguin irriguant la tumeur. En effet, les premiers essais sur l’AC7700, qui sera renommée Ombrabulin, ont montré que ce composé était capable d’arrêter définitivement l’afflux sanguin des tumeurs. En contrepartie, certains organes se voient cependant moins irrigués pendant des durées plus ou moins longues, contrairement aux tumeurs dans lesquelles cela semble défini- tif (Hori, Saito et Kubota 2002).

De nombreux autres stilbénoïdes ont présenté des activités cytotoxiques in vivo et in vitro, une partie de ceux-ci ont été traités dans les ouvrages cités précédemment (Shen, Wang et H.-X. Lou 2009 ; Likhtenshtein 2009 ; Shen, Wang et H.-X. Lou 2009).

Figure 1.22 – À gauche la combrétastatine A-4, au milieu son dérivé phosphaté, son sel disodique est appellé Zybrestat, à droite l’Ombrabulin actuellement en étude clinique phase III.

1.4.3.2 Autres activités

La recherche sur les stilbénoïdes à activités biologiques met en valeur de nombreuses molécules avec un potentiel intéressant ou très intéressant (comme les Combrétasta- tines). Cependant, la plupart des études se limitent à tester le Resvératrol qui a été la molécule phare pendant une dizaine d’années. C’est ici que l’intérêt d’une chimio- thèque de ces molécules devient importante, à la fois pour permettre un criblage sur d’autres activités que celles étudiées sur place ou en collaboration par l’équipe ayant puriﬁé la molécule, mais aussi, si les quantités sont suﬃsantes, de permettre un travail de chimie médicinale sur ces molécules. Le tableau 1.3 reprend quelques activités majeures référencées dans la revue de Shen (Shen, Wang et H.-X. Lou 2009). Le lecteur trouvera par ailleurs d’autres pistes sur les utilisations de 4 stilbénoïdes en recherche pharmaceutique dans une revue de 2006 (Roupe et al. 2006).

41 Chapitre 2

Techniques

2.1 Notions générales de chromatographies

Bien que la première utilisation du mot chromatographie soit datée de 1906 (Tswett 1906), cette technique semble apparue quelques années plus tôt chez ce même bota- niste russe, qui, en faisant passer un extrait de plante sur du carbonate de calcium, s’est aperçu que des composés de couleurs diﬀérentes n’allaient pas à la même vitesse, permettant alors de les séparer les uns des autres. Le lecteur pourra trouver de plus amples informations sur l’histoire de la chromatographie dans les deux ouvrages se référant respectivement à l’histoire de 1900 à 2000 et de 2000 à nos jours (Chromatography - A century of discovery 1900-2000. 2002 ; Wixom et Gehrke 2010).

La chromatographie regroupe l’ensemble des techniques consistant à séparer les mo- lécules ou ensemble de molécules composant un mélange, en exploitant leurs affinités différentes pour deux milieux non miscibles. Ces deux milieux, généralement appelés phase mobile et phase stationnaire sont en mouvement relatif l’un par rapport à l’autre, on parle d’élution. Le fonctionnement de la chromatographie peut être as- similé à un nombre de cellules fini reliées entre elles. Dans chaque cellule a lieu un échange du composé à séparer entre les deux phases jusqu’à ce qu’un équilibre s’éta- blisse.

La ﬁgure 2.1 représente le contenu d’un ensemble de cellules lors d’un cycle d’élu- tion, avant équilibrage, avec en haut la phase mobile et en bas la phase stationnaire.

42 La courbe bleue représente la concentration du composé considéré dans la phase supé- rieure, la rouge celle dans la phase inférieure. La courbe pointillée représente le transfert de masse entre la phase supérieure et l’inférieure, c’est à dire qu’elle représente la diﬀérence entre l’état non-équilibré et l’état équilibré. On observe que lorsque la phase supérieure avance par rapport à la phase inférieure, la matière se transfère en avant du pic dans le sens phase supérieure vers inférieure, et l’on a l’eﬀet inverse à l’arrière du pic.

Le principe de l’élution en chromatographie est de provoquer un déséquilibre constant entre les deux phases en les faisant avancer l’une par rapport à l’autre et ainsi séparer les composés selon leurs affinités vis-à-vis de chacune des phases. Même si en pratique beaucoup d’autres paramètres influent sur cette séparation, dans la plupart des cas où l’on utilisera cette approche, on ne considérera que le coefficient de partage et le rapport entre le volume de phase stationnaire et le volume de phase mobile comme facteurs pouvant influer sur la séparation de différents composés.

Phase supérieure

*100

Phase inférieure

Figure 2.1 – Transfert de matière entre deux phases juste après l’avancée de la phase supérieure. La courbe en pointillé vert, agrandie 100 fois, représente ce transfert de matière entre la concentration du composé dans la phase supérieure en bleu et dans la phase inférieure en rouge. Réalisé à partir des résultats de SimCpc.

Il existe plusieurs grandes familles de chromatographies, adaptées à des usages, des natures de composés et des visées diﬀérentes, ce qui les distingue les unes des autres ce sont les natures de chaque phase et la technologie utilisée pour les séparer et/ou les faire avancer l’une relativement à l’autre.

43 Depuis cette expérience pionnière, la chromatographie est devenu un outil indispensable, sans cesse améliorée et adaptée, afin de séparer différentes espèces chimiques entre elles de manière toujours plus versatile, rapide, efficace, économique ou fiable selon les besoins de l’utilisateur.

Les techniques chromatographiques peuvent être classées selon diﬀérents critères résumés dans la ﬁgure 2.2.

Phénomène physique Nature de la phase mobile - Adsorption - Partage - Liquide - Échange d'ions - Gaz - Exclusion stérique - Fluide supercritique - Aﬃnité

Visée Nature de la phase stationnaire

- Analytique - Liquide - Préparative - Solide - Gel

Figure 2.2 – Schéma représentant les diﬀérents critères permettant de classiﬁer les techniques chromatographiques.

L’objectif de cette partie est de présenter succintement les diﬀérents types de chromatographies utilisées dans ce travail, d’expliciter les termes et paramètres utilisés et de donner au lecteur des références pour aller plus loin dans la compréhension des sujets traités.

2.1.1 Diﬀérents types de chromatographies utilisées dans l’étude des Substances Naturelles

Voici quelques techniques chromatographiques ayant une importance dans l’analyse et la production des SN de nos jours :

44 – Les Chromatographies sur Phase Solide (CPS), techniques dont la phase stationnaire est une phase solide : – Planaire : – La Chromatographie sur Couche Mince (CCM), utilisant des plaques recou- vertes d’une phase solide sur laquelle la phase mobile va se déplacer par ca- pillarité, gravité ou poussée par une pompe dans un milieu contraint. Elle est le plus souvent à visée analytique, mais peut être aussi être utilisée à l’échelle préparative. – En colonne : – Les colonnes ouvertes, utilisant des phases solides de Granulométrie souvent grossière. Utilisation à visée préparative. – La Chromatographie Liquide Haute-Pression (ou Performance) (CLHP), utilisant elle aussi une phase solide, mais de Granulométrie beaucoup plus petite. Utilisation à visée analytique ou préparative. – La chromatographie supercritique, utilisant comme son nom l’indique des ﬂuides supercritiques en tant que phase mobile. À visée préparative. – Les Chromatographies sur Phase Liquide (CPL), techniques dont la phase stationnaire est une phase liquide, même si leur part dans l’étude des SN semble bais- ser, elles sont toujours bien présentes dans les séparations complexes (G.F. Pauli, Chen et al. 2012): – La Chromatographie à Contre-Courant (CCC) : une technique dite hydrodyna- mique, dans laquelle les deux phases sont soumises à des cycles de mélange/- séparation. La conception actuelle de ces machines consiste en un tube enroulé sur un ou plusieurs rotors et mis en rotation selon un mouvement planétaire. Ce type de mouvement permet de se passer de joints rotatifs, et donc de rendre les machines plus robustes, même si l’utilisation d’un tube et la réalisation du mouvement entraînent de fortes limitations concernant les systèmes de solvants utilisables et les conditions expérimentales. – La CPC : une technique dite hydrostatique. Dans celle-ci, la phase stationnaire est maintenue en position à l’aide d’un champ centrifuge dans une colonne gra- vée. La phase mobile percole alors à travers cette dernière. Bien que ces machines nécessitent des joints rotatifs, réputés être fragiles, les matériaux actuels montrent une bonne robustesse d’après notre expérience. L’avantage de cette technique par rapport à la CCC est la plus grande diversité de systèmes biphasiques pouvant être utilisée. Mais elle semble moins répandue dans l’étude des

45 SN , en particulier dans les pays Asiatiques et aux États-Unis. – Les Chromatographies en Phase Gazeuse (CPG), techniques dont la phase mobile et l’échantillon sont sous forme gazeuse. Elles existent à l’échelle préparative, mais leur utilisation principale reste à visée analytique. – Les techniques électrophorétiques, telles que l’électrophorèse capillaire, utilisées pour séparer des espèces ioniques grâce à un champ électrique. – … Dans ce travail, ce sont la CPC et la CLHP qui ont été principalement utilisées. Ces deux techniques ayant été déjà explicitée dans de nombreux travaux antérieurs, le lecteur pourra se référer à ceux-ci pour une explication plus détaillée. Pour la CPC, il pourra se référer aux ouvrages (Alain P. Foucault 1994 ; Menet et Thiebaut 1999 ; Berthod 2002), ainsi qu’aux thèses des Docteurs Alix Toribio (Toribio 2007) et Alexandre Maciuk (MACIUK 2005). L’ouvrage d’un des pères de la CLHP, Lloyd R. Snyder, constitue quant à lui une bonne lecture pour approfondir cette technique (L. Snyder, Kirkland et Dolan 2009). En ce qui concerne la théorie de la chromatographie, l’ouvrage (Cazes et Scott 2002) constitue une bonne introduction.

2.1.2 Quelques termes utilisés en chromatographie

2.1.2.1 Constante de partage, Rapport de partage, Constante de distribution

Appellés de manière imprécise et dépréciée coeﬃcient de partage (Nič et al. 1993), et souvent confondus, ces noms et notions ont été normalisés par l’International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Rice, Irving et Leonard 1993).

Le transfert de masse d’un composé A d’une phase 1 à une phase 2 est régi par la diﬀérence de potentiel chimique du composé entre ces deux phases. Le potentiel chimique du composé A dans une condition i peut être déﬁni, dans un cas idéal par :

µA,i = µA,i + RT ln(γA,i · χA,i) (2.1)

Où µA,i est le potentiel chimique de A dans la condition i à l’état standard, γA,i est son coeﬃcient d’activité et χA,i sa fraction molaire.

Le produit γA,i · χA,i est aussi noté αA,i, activité de A dans la condition i.

46 À l’équilibre entre les phases 1 et 2, on a µA,1 = µA,2 soit :

αA,1 µA,1 − µA,2 = −RT ln (2.2) αA,2

On peut alors déﬁnir la constante de partage ou constante de distribution comme étant le rapport des activités :

α o A,1 (KD)A = (2.3) αA,2

Dans le cas idéal pour lequel les γA,i sont égaux à 1, on déﬁnit le rapport de partage :

χA,1 (KD)A = (2.4) χA,2

Dans le cas d’une forte dilution, on a χA,1 << χtotal, on peut donc considérer le rapport de partage comme étant approximativement égal au rapport des concentrations :

[A]1 (KD)A ≈ (2.5) [A]2

Tout ceci n’est valable que pour une seule espèce chimique considérée. Dans le cas de composés pouvant s’ioniser ou se polymériser de manière non covalente, les potentiels chimiques ne sont plus les mêmes, on utilise alors la notion de rapport de distribution, déﬁni comme le rapport de concentration du soluté dans chacune des phases, quelle que soit sa forme.

2.1.2.2 Autres déﬁnitions

mr Rendement global de séparation Donné par la formule = , où mr est la masse mi de composés récupérée après manipulation et mi la masse injectée. Ce facteur est in- ﬂuencé par les adsorptions irréversibles en chromatographie sur phase solide et aux pertes tout au long de la manipulation de l’échantillon et des fractions.

47 Sélectivité Capacité d’un système chromatographique à séparer deux composés. On k02 déﬁnit la sélectivité par le rapport = où k02 et k01 sont les facteurs de rétention de k01 deux composés 2 et 1, avec 2 plus retenu que 1.

Volume de rétention Donné par la formule Vr = Vm + kc ∗ Vs, dans le cas idéal d’une injection inﬁniment ﬁne. Il correspond au volume de phase mobile nécessaire pour pouvoir éluer le composé.

0 tR−t0 Facteur de rétention Donné par la formule k = , où tR est le temps de ré- t0 tention et t0 le temps de rétention nulle, correspondant au temps de rétention d’un composé non retenu.

Nombre de plateaux théoriques Nombre théorique représentant le nombre d’es- paces virtuels dans lesquels ont lieu les séparations pour un composé donné. Plus ce nombre est important, plus la séparation sera résolutive. Il existe diﬀérentes méthodes pour calculer ce nombre, on retiendra ici la formule utilisée par la pharmacopée euro- t péenne, N = 5.54( r )2. Où t est le temps de rétention et W la largeur du pic chroma- W r tographique à mi-hauteur dans la même unité que tr. On peut aussi utiliser le volume de rétention comme unité de mesure.

Rétention de phase Utilisé en chromatographie liquide-liquide. Rapport entre le Vs volume de phase stationnaire Vs et le volume total Vt. R = . En pratique, on a accès Vt Vt−Vm au volume de phase mobile Vm, la formule devient alors R = . La publication Vt (Sutherland 2007) montre l’eﬀet de la rétention de phase sur la séparation.

Chromatogramme C’est la représentation graphique du signal de sortie du détec- teur en fonction du temps ou des facteurs de rétentions ou coeﬃcients de partage (J.B. Friesen et G.F. Pauli 2007b).

2.2 CPC

2.2.1 Introduction

L’histoire des chromatographies liquide-liquide commence en 1941, avec les travaux de Post et Craig. À l’origine de ce que l’on appelle la distribution à contre-courant

48 se trouve la première expérience de Craig, consistant à séparer des acides aminés N- acétylés par une série de séparations en ampoule à décanter. Les composés se séparant en fonction de leur coeﬃcient de partage dans un système biphasique. Il a ensuite dé- cidé d’essayer de mettre la phase stationnaire sur une phase solide et de faire percoler la phase mobile à travers. Puis, il construit une machine constituée de 20 ampoules à décanter (cellules) et capable de transférer la phase mobile (supérieure en l’occurence) dans les ampoules successivement. Il a ensuite étendu cette technique à 200 cellules, puis 1000. C’est cette approche, consistant à maintenir la phase stationnaire enposi- tion et à faire percoler la phase mobile au travers, qui est à l’origine de tous les déve- loppements en chromatographie liquide-liquide, en particulier la CCC et la CPC.

La CPC, qui est la technique chromatographique pour laquelle des méthodes ont été développées au cours de cette thèse, a été développée en 1982 au Japon (Murayama et al. 1982). C’est elle qui sera décrite un peu plus en détail par la suite. Tous les systèmes de solvants biphasiques utilisables en CCC ou en distribution à contre-courant le sont aussi en CPC, permettant ainsi à la richesse bibliographique disponible sur l’utilisation de ces techniques d’être aussi exploitable par l’utilisateur de la CPC. Il faut cependant noter que l’inverse n’est pas forcément possible, en raison d’une capacité de rétention de phase stationnaire diﬀérente sur ces machines.

Le lecteur pourra se référer à diverses revues pour une histoire plus précise et dé- taillée de ces techniques (Marchal, Legrand et A. Foucault 2003)(McAlpine, J. B Friesen et G. F Pauli 2012), de ses développeurs, acteurs et journaux de prédilection (Berthod, Ruiz-Ángel et Carda-Broch 2009) et des utilisations qui peuvent en être faites (G.F. Pauli, Pro et J.B. Friesen 2008)(McAlpine, J. B Friesen et G. F Pauli 2012). Plusieurs ouvrages ont été spécialement consacrés à ces techniques ou à la CPC en particulier (Alain P. Foucault 1994 ; Berthod 2002) et quelques chapitres dans (Cazes 2005 ; Poole, Cooke et Wilson 2000).

2.2.2 Comparaison avec d’autres techniques

Bien que récente dans l’histoire de la chromatographie, l’eﬃcacité et la versatilité de cette technique n’ont de cesse d’être démontrées, en particulier dans l’étude etlapro- duction des SN. Ses deux avantages techniques principaux sont une grande Capacité

49 de charge et une grande Sélectivité grâce à un Ratio de phase stationnaire utile important, un volume relatif de phase mobile réduit et une très grande diversité de systèmes de solvants et de stratégies d’élution. Trois études comparatives entre les techniques CPL et CPS ont des résultats assez signiﬁcatifs.

La première concernant l’utilisation de ces techniques à l’échelle du laboratoire, a comparé les techniques « conventionnelles » et la CPC dans la puriﬁcation de la caja- ﬂavanone à partir de Derris ferruginea (Fabaceae) (Morel et al. 2012). Les auteurs ont montré une réduction du temps d’expérimentation d’un facteur 40, un rendement aug- menté d’un facteur 10 et une consommation de solvants réduite d’un facteur 35 pour une pureté équivalente.

La deuxième étude est consacrée aux résultats de travaux à l’échelle industrielle (échelle du kilogramme) visant à la production d’un insecticide d’origine bactérienne à partir de Saccharopolyspora spinosa (Pseudonocardiaceae) (DeAmicis et al. 2011). Les auteurs ont montré, qu’à pureté et rendement équivalents, le temps nécessaire pour puriﬁer un kilogramme était réduit par un facteur 2,5, que la consommation de solvant était elle diminuée d’un facteur 3,5 et que la quantité de solvant de la fraction contenant le produit d’intérêt était elle réduite 14 fois, facilitant ainsi les étapes d’élimination de solvants ultérieures.

Une autre étude s’est intéressée à la puriﬁcation à l’échelle de plusieurs grammes de xantholides extraits de Xanthium macrocarpum (Asteraceae) (Pinel et al. 2007). Ces auteurs ont montré que la CPC permettait en une seule étape de récupérer 10 fois plus d’un des composés, avec une meilleure pureté, de 6 à 14 fois sur les trois produits étu- diés, et dans des fractions beaucoup mieux résolues avec une réduction du volume de solvants utilisés d’un facteur 2, ainsi que 40 grammes de Silice par gramme d’extrait n’étant plus nécessaires, limitant ainsi les déchets et coûts de retraitement liés à ceux-ci.

2.2.2.1 Inconvénients

L’un des inconvénients de cette technique advient lorsque l’échantillon injecté ades propriétés déstabilisantes pour l’équilibre des deux phases. Cela peut être dû à une viscosité trop importante, une concentration trop forte pour laquelle l’échantillon ou l’un de ses composants se comporte comme un solvant ou des composés surfactants.

50 L’autre inconvénient est que l’utilisateur doit être particulièrement vigilant à trois éléments : – L’échantillon doit être filtré et ne doit pas contenir de particules solides, contrairement à la CCC. – Sur les appareils à joints rotatifs en céramique, ils ne doivent être mis en rotation que lorsque du solvant circule, ce dernier assurant en effet la lubrification entre le graphite et la céramique constituant le joint. – La pression doit être inférieure aux limites données par le fabriquant afin d’éviter une sortie des joints.

2.2.3 Fonctionnement

On peut représenter cette machine comme un enchaînement de minuscules ampoules à décanter, appellées cellules, reliées entre elles et gravées sur des disques en acier. Ces disques sont connectés et empilés pour former ce que l’on appelle la colonne. Plutôt que d’utiliser la gravité comme force de séparation, un champ centrifuge est créé dans l’axe de chaque cellule et permet alors d’obtenir une séparation des phases beaucoup plus rapidement. C’est en faisant percoler la phase mobile au travers de la phase stationnaire qu’est effectuée la séparation. La figure 2.3 illustre ces différents points.

L’utilisation de ce champ centrifuge permet d’utiliser cet appareil dans deux modes diﬀérents dans lesquels la phase stationnaire est soit la phase la plus dense (mode As- cendant), soit la plus légère (mode Descendant). De par la diversité des systèmes de solvants existants, il est possible d’obtenir des séparations eﬃcaces, rapides et avec une très grande sélectivité, malgré le nombre de plateaux théoriques plus faibles qu’en CLHP.

De plus, le fait de ne pas avoir de phase solide permet d’éviter aux composés de se ﬁxer de manière irréversible à la colonne, augmentant ainsi de manière drastique les rendements. L’autre avantage de cette absence de phase solide est la capacité de charge des colonnes, c’est-à-dire la quantité de matière injectable, beaucoup plus importante à volume égal que dans les chromatographies sur phase solide. Le dernier avantage de cette absence de support solide est de ne plus avoir de déchets solides à retraiter ni de poudres ﬁnes à manipuler évitant ainsi les risques liés à celles-ci (Greenberg, Waksman et Curtis 2007).

51 Les premiers appareils de CPC étaient composés de 3 à 12 cartouches de 18 mL, contenant 400 canaux chacune, chargées dans une centrifugeuse. Actuellement les appareils commerciaux fonctionnent de manière autonome, et ont un volume total de 25 mL à plusieurs dizaines de litres, permettant ainsi de travailler d’une échelle « analytique », pour séparer quelques milligrammes, à une échelle industrielle adaptée pour la séparation de plusieurs centaines de grammes au kilogramme par injection (Margraff et al. 2005).

Figure 2.3 – À gauche, une implémentation de la CPC par la société Kromaton, au milieu en haut, un disque comportant les cellules gravées, en bas, représentation de la phase mobile en rouge percolant au travers de la phase stationnaire en bleu. À droite, trois composés se séparent selon leurs coeﬃcients de partage, le composé 1 a une aﬃnité très forte pour la phase mobile, le 2 pour la phase stationnaire et le 3 se partage entre les deux.

2.3 Spectromètre de masse

Il est important pour un phytochimiste de pouvoir détecter et distinguer les com- posés d’un mélange. L’une des solutions consiste à mesurer la masse des molécules présentes. Il existe pour cela de nombreux appareils appellés spectromètres de masse utilisant des approches diﬀérentes. Mais tous fonctionnent selon le même principe. Les

52 composants de l’échantillon sont ionisés, focalisés et séparés selon leur masse puis dé- tectés.

L’ionisation est réalisée de façon différente selon la nature de l’échantillon et la nature des composés. On peut ainsi analyser directement des solides avec des techniques telles que le Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Désorption et ionisation par laser assistée par une matrice (MALDI) ou le Direct Analysis in Real Time - Ana- lyse directe en temps réel (DART), ce dernier permettant même d’analyser directement un échantillon solide (gélule, comprimé, fibre, partie de plante) sans préparation préa- lable, promettant à cette technique un avenir certain. Mais pour l’instant, en chimiedes SN, la spectrométrie de masse est surtout utilisée en tant que détecteur à la sortie d’un système chromatographique avec le plus souvent des sources Electro-Spray Ionisation - Ionisation par elecro-spray (ESI) ou Atmospheric-pressure chemical ionization - Io- nisation chimique à pression atmosphérique (APCI), ou utilisée avec un composé pu- rifié afin d’obtenir soit sa composition soit une signature avec des techniques comme l’Electronic ionizasion - Ionisation électronique (EI) 1 et la Fast Atom Bombardment - Bombardement par atomes rapides (FAB).

Concernant la séparation des composés selon leur masse, il existe de nombreuses techniques adaptées à diﬀérentes utilisations telles que les Ion Trap - Trappe à ions (IT), les Time Of Flight - Analyseur par temps de vol (TOF), les quadrupôles, la Fourier Trans- form Ion Cyclotron Resonance - Analyseur à résonance cyclotronique d’ions (FTICR) ou les Orbitraps. Leur utilisation va dépendre du type d’informations souhaitées par l’utilisateur, certains appareils n’ont pas une précision suﬃsante pour connaître la formule brute d’un composé, mais permettent en contre-partie d’étudier plus en détail la structure du composé.

Le spectromètre de masse utilisé pour les travaux de cette thèse est un spectromètre à source electro-spray et à trappe ionique (ESI-IT), dont une représentation est donnée dans la figure 2.4. L’avantage de cet appareil est de pouvoir le coupler facilement à un flux liquide contenant les espèces à analyser grâce à la source ESI, adaptée aux stilbénoïdes, et de pouvoir réaliser des études de fragmentation des composés grâce à la trappe quadripolaire. Un système inclus dans la trappe permet en effet, en injectant de l’hélium, de casser les ions présents et ainsi d’analyser ces fragments. On peut répéter

1. Aussi utilisée dans les couplages de la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse

53 cela sur des ions issus d’une première fragmentation, on parle alors de MSn avec n le nombre de fragmentations successives. L’autre intérêt de ce type d’appareil est de pouvoir former des ions négatifs et positifs, et de pouvoir alterner entre ces deux modes rapidement (200 ms) au cours d’une analyse.

54 Source du ﬂux (CLHP,…) Nebulization gas Débit Pression

Skimmer Partition Lentille de focalisation Drying gas Lens 1 Lens 2 Température, débit Trappe

End plate Octopole Dynode Capillary Octopole

55 Spray shield Multiplicateur

Vcap Vcapexit Voct1 Voct2 d'électrons Vcap-Voﬀset Vskimmer V lens1 VtrapdriveRF VRF Vlens2

Voctn = VoctnDC + VoctRF Pression atmosphérique Pression 4 mbar Pression 1.10-5 mbar

Figure 2.4 – Représentation du fonctionnement d’un spectromètre de masse ESI-IT Brüker Esquire. Le lecteur pourra se référer à la présentation du fonctionnement de la masse utilisée lors de cette thèse dans l’annexe 14.10 page ix ainsi qu’aux ouvrages et documents suivants pour obtenir une description plus détaillée de cette technique (Poole, Cooke et Wilson 2000 ; Laprévote 2001 ; Flamini et Traldi 2010). Il trouvera en particulier, sur l’ensemble des techniques de spectrométrie de masse et leurs applications, plus d’informations dans l’ouvrage de Watson (Watson et Sparkman 2007).

2.4 Spectrométrie RMN

La RMN est un phénomène ayant lieu quand un noyau atomique, de spin 1 non nul, est placé dans un champ magnétique, champ terrestre y compris, et soumis à une radiation électromagnétique. En eﬀet, un noyau de spin non nul dans un champ magnétique est doté d’un moment magnétique propre pouvant interagir avec ces radiations.

L’étude de l’interaction de ce moment avec la radiation, au moyen de séquences d’impulsions spéciﬁques, permet d’obtenir des informations sur l’environnement chimique de ce noyau, ce qui inclus son voisinage d’un point de vue liaison chimique, mais aussi son voisinage spatial.

On peut ainsi, comme dans l’exemple de la ﬁgure 2.5, avoir une indication de la nature des groupements chimiques ainsi qu’une indication sur la façon dont ces groupements sont liés.

Le spectre proton, donne des informations sur chaque groupement à l’aide de 3 pa- ramètres : – le déplacement chimique, (δ sur la figure) qui correspond à l’influence de l’environnement du groupement sur sa fréquence de résonnance – l’aire du signal correspondant à ce groupement (A sur la figure), qui est proportionnelle au nombre de noyaux – le motif de couplage et sa ou ses constantes de couplage (J sur la figure). Un proton situé à 3 liaisons covalentes d’un autre proton aura un motif en doublet et la constante de couplage dépendra entre autres de l’orientation spatiale de l’un par rapport à l’autre. Dans le cas de l’éthanol présenté dans la figure, les protons

1. Propriété quantique d’une particule.

56 du groupement CH3 forment un triplet (les aires de chaque pic suivant le motif 1 : 2 : 1) en raison de leur proximité avec le groupement CH2. Ce même groupement CH2 de par sa proximité avec le CH3 formera lui un quadruplet (avec les aires des composants suivant le motif 1 : 3 : 3 : 1). Ce phénomène est dû à l’interaction entre les spins de chacun des groupements. On appelle cela l’interaction Spin-Spin, elle devient de plus en plus faible avec le nombre de liaisons séparant les groupements considérés. Les séquences permettant d’obtenir les spectres carbone contiennent en général ce que l’on appelle un motif de découplage, permettant de simplifier le spectre obtenu en supprimant les couplages Spin-Spin. On obtient alors qu’un seul pic par carbone, facilitant la lecture et la différenciation entre des signaux souvent proches. Le carbone 12, isotope majeur du carbone a un spin nul, on ne peut donc pas obtenir de spectre à partir de lui. Cependant, le carbone 13, dont l’abondance naturelle moyenne est de 1 % dans le carbone sur terre le permet. Mais cette faible abondance réduit d’autant la sensibilité dans les expériences faisant intervenir le carbone directement. C’est d’ailleurs l’autre intérêt du découplage ; puisqu’il permet d’augmenter l’intensité du signal du carbone considéré. Par ailleurs, d’un point de vue plus théorique, la spectrométrie RMN est ba- sée sur l’étude des différences énergétiques entre les états stables et les états excités, or cette différence d’énergie est liée à une autre propriété des noyaux nommée rapport gyromagnétique 1. Or, le carbone a un rapport gyromagnétique d’environ le quart de celui du proton, ce qui combiné à l’abondance naturelle de l’isotope carbone 13 réduit la sensibilité d’un facteur 400.

Il existe aussi des séquences multi-dimensionnelles, permettant de projeter des ca- ractéristiques sur les autres dimensions. Ainsi, un spectre COrrelation SpectroscopY (COSY) permet de visualiser les noyaux (en l’occurrence ici les protons) interagissant entre eux par couplage Spin-Spin. Les séquences hétéronucléaires permettent d’observer les interactions entre deux noyaux de nature diﬀérente. Dans le cas d’une séquence Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy (HSQC), on observe les couplages sur une liaison (on parle de J1) alors qu’avec la Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy (HMBC), on les observe à plusieurs liaisons de distance (de J2 jusqu’a J4 dans certains des cas). L’autre intérêt de ces séquences est de s’aﬀranchir d’une détection sur les noyaux carbone en transférant l’information qu’ils portent vers les protons, augmentant ainsi la sensibilité.

1. Représentant le rapport entre le moment magnétique et le moment cinétique d’une particule.

57 Il existe des centaines de séquences d’impulsions permettant d’obtenir plus d’informations, en particulier des séquences permettant de déterminer quels noyaux sont proches spatialement comme les Nuclear Overhauser eﬀect spectroscopy (NOESY), Ro- tating frame nuclear Overhauser eﬀect spectroscopy (ROESY) qui peuvent être utiles pour obtenir des informations sur la structure tri-dimensionnelle.

Comme indiqué précedemment, le signal en spectrométrie RMN est dépendant d’un écart d’énergie. Cet écart peut être déﬁni par la formule :

∆E = 2πhγB (2.6)

Où h est la constante de Planck, γ le rapport gyromagnétique du noyau considéré et B le champ vu par ce noyau. Ainsi la seule façon d’augmenter cette diﬀérence d’énergie est d’augmenter le champ magnétique. Ceci implique pour des champs puissants tels que ceux utilisés en routine dans les laboratoires, de l’ordre de 10 Teslas 1, correspondants à une fréquence de résonnance des protons de 400 MHz. Pour atteindre de tels champs (actuellement les appareils commerciaux dépassent les 20 T), il faut pour l’instant des aimants supraconducteurs, nécessitant des systèmes de refroidissement complexes et coûteux. Malgré cela, l’avantage des appareils à hauts champs est leur résolution et leur sensibilité accrue.

La spectrométrie RMN est un outil important dans le travail du phytochimiste, il permet au delà de la détermination structurale des molécules, d’obtenir d’autres types d’informations, telles que pouvoir déterminer la composition relative ou absolue d’une mo- lécule dans un mélange (Heikkinen et al. 2003 ; Koskela, Kilpeläinen et Heikkinen 2005 ; Giraudeau et al. 2007 ; G.F. Pauli, Jaki et Lankin 2007 ; Napolitano et al. 2012), réaliser un travail de déduplication, visant à identiﬁer rapidement les molé- cules connues aﬁn de mettre rapidement en évidence les molécules bio-actives (F.C. Schroeder et al. 2007 ; F. C. Schroeder et al. 2008 ; Qiu et al. 2012). L’apparition d’outils permettant de coupler un système chromatographique à la spectrométrie RMN re- pousse encore la portée de cette technique.

Le lecteur pourra se référer aux ouvrages suivants pour plus d’informations sur cette technique. Concernant les aspects théoriques, le Docteur Jean-Marc Nuzillard propose un livre en français. Bien qu’en cours d’écriture, il est déjà accessible, qui plus

1. Entre 100000 et 300000 fois le champ magnétique terrestre selon la lattitude.

58 est librement (http://eos.univ-reims.fr/LSD/JmnSoft/livre.pdf). Il existe beaucoup d’ouvrages sur la RMN, mais la qualité est très inégale. Parmi les ouvrages d’intérêt, on peut citer deux ouvrages (Keeler 2010) et (Levitt 2008), le second étant beaucoup plus dé- taillé sur l’aspect mathématique et physique. Concernant la détermination structurale, l’ouvrage du professeur Marcel Jaspars (Crews, Rodriguez et Jaspars 2009), ne traitant pas que de la RMN, est une référence, à utiliser conjointement à un ouvrage recensant des tables de déplacements chimiques tel que (Pretsch, Bühlmann et Badertscher 2009).

59 COSY Spectre proton Spectre carbone A=1 A=3 HSQC H H H C C OH A=2 1 2 J

H H J HMBC

δCH2 δOH δCH3 δC2 δC1

Spectre COSY Spectre HSQC Spectre HMBC

δCH2 δCH3 δCH2 δCH3 δCH2 δCH3 60

δCH3 δC1 δC1

δCH2 δC2 δC2

Figure 2.5 – Expériences communes de RMN Troisième partie

Matériel et méthodes

61 Tableau 2.1 – Grade et origine des solvants et acides utilisés

Solvant Utilisation Grade Fournisseur Heptane CPC Synthèse Scharlau (Barcelone, Espagne) Acétate d’éthyle CPC HPLC Scharlau (Barcelone, Espagne) Méthanol CPC HPLC Carlo Erba (Rodano, Italie) Eau CPC ultra-pure Production interne, appareil Elga (Bucks, Royaume-Uni) Eau Extraction di-distillée Production interne, appareil Elga (Bucks, Royaume-Uni) Methyl tert-butyl ether Extraction Extra pur Scharlau (Barcelone, Espagne) Acétone Extraction Industriel Xilab (Bruges, France) Éther de pétrôle Extraction Synthèse Scharlau (Barcelone, Espagne) Acétonitrile CLHP-SM LC-MS Scharlau (Barcelone, Espagne) Eau CLHP-SM ultra-pure Production interne, appareil Elga (Bucks, Royaume-Uni) Éthanol CPC-SM HPLC VWR (Fontenay-sous-Bois, France) Acide formique CLHP-SM, CPC-SM MS Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis) Acétone-d6 RMN 99.9 % < 0.01% H2O Eurisotop (Gif-sur-Yvette, France) 62 Chapitre 3

Équipements et procédures

3.1 CPC 200 mL

La CPC 200 mL utilisée est une FCPC200® de la société Kromaton Technolo- gies (Sainte-Gemmes-sur-Loire, France) faisant désormais partie du groupe Rousselet- Robatel. La pompe utilisée est une Gilson 321-H1 haute-pression deux voies permettant de réaliser des gradients. Les échantillons sont introduits grâce à une vanne d’injection Rheodyne 3725(i)038 équipée d’une boucle de 20 mL. La collecte est eﬀectuée à l’aide d’un collecteur Gilson FC204 ou en bouteilles Schott (St. Gallen, Suisse) de 50mL ou 250 mL. Les expériences ont été réalisées à une température régulée dans la pièce à 23℃. Dans le cas d’expériences enchaînées ou de longues séparations, l’appareil a été refroidi à l’aide d’une circulation d’eau du circuit général non régulée en température.

600 mL de phase stationnaire sont pompés à 10 mL/min dans le mode (ascendant ou descendant) correspondant à l’expérience aﬁn de s’assurer de l’homogénéité du solvant dans la colonne et rincer d’éventuels composés restés à la suite d’expériences précé- dentes. Dans certaines expériences, la colonne est mise en rotation à 300 rpm au bout de 300 mL. La phase d’équilibrage est réalisée à 1000 ou 1300 rpm selon les expériences avec un débit dépendant du système de solvant et de l’expérience réalisée. Les changements éventuels de solvants ont été réalisés en changeant la bouteille de solvant et en purgeant manuellement la voie. Les échantillons sont injectés dans un mélange de chacune des phases dans un volume le plus petit possible mais néanmoins peu visqueux

63 et filtrés sur filtre en téflon 0,45 μm. Le mode sandwich indiqué pour certaines expé- riences signifie que l’injection est réalisée pendant l’équilibrage de la colonne.

Le lavage est eﬀectué par le reste de phases non utilisées puis par 600 mL d’un mé- lange eau/acétone, eau/méthanol ou eau/éthanol à un débit de 10 mL/min sans rotation.

Dans le cas des expériences sur le back-step, le débit utilisé lors de la séparation est de 4 mL/min.

3.2 CPC 1 L

La CPC 1 L utilisée est une chaîne FCPC1000® de la société Kromaton Technologies (Sainte-Gemmes-sur-Loire, France). Les équipements annexes à la colonne, tels que la pompe et le détecteur UV sont fournis avec l’appareil. La collecte a été eﬀectuée en bouteilles Schott (St. Gallen, Suisse) de 250 mL pour les expérimentations présentées dans cette thèse. La boucle d’un volume de 50 mL est remplie avec un volume toujours inférieur à 45 mL.

3 L de phase stationnaire sont pompés à 50 mL/min dans le mode correspondant à l’expérience avant chaque série de séparations. Toutes les injections ont été réalisées en mode sandwich. La colonne a toujours été mise en rotation à 1000 rpm.

Le volume de solvant pour le lavage de la colonne est de 3 L.

Le reste des paramètres est identique à ce qui a été décrit pour la CPC 200 mL.

3.3 CLHP

La chaîne est une Agilent 1200 d’Agilent Technologies (Santa Clara, CA, États-Unis). Elle est composée d’un injecteur automatique, d’un dégazeur, d’une pompe binaire, d’un sélecteur/thermostat de colonne et d’un détecteur UV-Visible à barrette de diodes.

La colonne utilisée est une Prontosil C18 250 mm x 4.0 mm avec des particules de 5 μm, de la société Bischoﬀ (Leonberg, Allemagne).

Le gradient utilisé, sauf indication contraire est celui donné dans le tableau 3.1. Les solvants, eau et acétonitrile sont tout deux acidiﬁés par 0,1% d’acide formique.

64 Tableau 3.1 – Gradient CLHP utilisé, transitions linéaires.

Temps (minutes) 0 5 25 35 45 55 55,5 65 % d’acétonitrile 17 17 30 38 100 100 17 17

3.4 Spectrométrie de masse

Le spectromètre de masse utilisé est un Bruker Esquire 3000+ de Bruker-Daltonics (Billerica, MA, États-Unis). Seule la source ESI a été utilisée. Le ﬂux issu de la chaîne CLHP est divisé par un split passif assurant un ratio d’environ 1 : 100 pour un mélange 50 : 50 acétonitrile/eau.

Les diﬀérents paramètres utilisés en fonction des expérience sont donnés dans le tableau 14.1 page xi en annexe.

3.5 Mesure des coeﬃcients de partage

Afin de déterminer le coefficient de partage d’un composé dans un système donné, la méthode utilisée est la méthode de l’ampoule à décanter adaptée à des petits volumes (Berthod et Carda-Broch 2004). Le système de solvant est préparé et 1 mL de chaque phase est placé sur 1 mg du composé ou d’un mélange de composés. Après agitation, 0.5 mL de chaque phase est prélevé, séché, redissout dans un mélange méthanol/eau 50 : 50 (v/v) et injecté en CLHP. Le coefficient de partage est obtenu en faisant le rapport des aires entre la phase inférieure et la phase supérieure à 280 nm du composé considéré.

3.6 Dosage des systèmes de solvants

La balance utilisée pour les dosages de solvants est une Voyager Pro VP64CN de la société Ohaus (Nänikon, Suisse). La répétabilité de cet appareil est donnée par le fabriquant à 0,1 mg et sa gamme de linéarité à ± 0,2 mg.

65 3.7 Couplage CPC-Masse

Le couplage CPC-Masse, décrit dans la partie 6 est réalisé en utilisant comme solvant de ﬂux secondaire de l’éthanol auquel 0,1 % d’acide formique est ajouté, avec un débit de 1 mL/min. Le split actif est un MRA100-000 de Rheodyne fourni par Kromaton technologies (Sait-Gemmes-sur-Loire, France). Le réglage utilisé dépend de la quantité injectée et des composés présents dans l’extrait, pour une injection de 200 mg et un dé- bit de 4 mL/min c’est le mode 6 qui est utilisé. Le split actif est utilisé en lieu et place de la colonne sur la chaîne Chromatographie Liquide Haute-Pression couplée à la Spec- trométrie de Masse (CLHP-SM), et de l’éthanol additionné d’acide formique (0,1 % v/v) est pompé par cette chaîne dans le split.

3.8 Traitement des données et réalisation des ﬁgures

3.8.1 CLHP, CPC et Spectrométrie de Masse

Les données CLHP, CPC 200 mL et masse ont été traitées soit avec le logiciel DataA- nalysis 3.2 de Bruker, soit avec deux outils développés en interne décrits en annexe.

Les chromatogrammes obtenus avec la CPC 1L sont issus du logiciel ECOMAC fourni par la société ECOM (Praha 2, République Tchèque) fabriquant de la pompe, du détecteur UV et du système de distribution des solvants et des fractions.

Les bandes de Chromatogrammes d’Ions Extraits sont réalisées avec le logiciel CIE- Ramp, décrit et présenté dans cette thèse. Les masses présentées correspondent aux éléments présentés dans le tableau 3.2.

Les images résultantes ont été découpés, épaissies et montées avec Inkscape (http://www.inkscape.org) pour les images vectorielles et les bandes issues de CIERamp et The Gimp (http://www.gimp.org) pour les autres.

3.8.2 Spectrométrie RMN

Les données de spectrométrie RMN ont été acquises avec TopSpin 2.0 et traitées avec ACD/NMR Processor (édition académique) version 12.01 (http://www.acdlabs.com/re- sources/freeware/nmr_proc/).

66 Tableau 3.2 – Masses utilisées pour les bandes de CIERamp.

Masse mode + Élément 229-230 trihydroxystilbène (Resveratrol…) 245-246 tétrahydroxystilbène (Picéatannol…) 455-456 Dimère de trihydroxystilbène ((+)-(E)-ε-Viniférine,Pallidol…) 681-682 Trimères de trihydroxystilbène (Miyabenol C…) 907-908 Tétramères de trihydroxystilbène (Vitisine B…) 429-429.2 Tetrahydroxyacetophenone glycoside + Na 369-369.2 Tetrahydroxystilbene glucoside (THG) + Na 487-487.2 Inconnu + Na 581-581.2 Inconnu + Na

3.8.3 Figures

Les ﬁgures ont été crées avec Inkscape (http://www.inkscape.org) pour les images vectorielles et The Gimp (http://www.gimp.org) pour les autres. Sauf mention contraire toutes les images sont des travaux personnels.

67 Chapitre 4

Plantes étudiées

4.1 Vitis vinifera

4.1.1 Racines

Les racines étudiées sont issues du Château Dubraud, Premières Côtes de Blaye. Elles sont issues d’un croisement de Vitis riparia et Vitis berlandieri, appellé SO4 (Sé- lection Opperheim numéro 4) et agées de 32 ans. Ce croisement a été obtenu en 1896 par Sigmund Teleki et Heinrich Fuhr (Les porte-greﬀes : le SO4 ou Sélection Oppenheim 4 2012).

500 grammes de racines séchées dans une étuve à 40℃ pendant une semaine ont été broyées et conservées à -20℃ dans des récipients étanches à l’air et à la lumière. Cette poudre a ensuite été extraite deux fois par un mélange acétone/eau 60 : 40 sous agitation à température ambiante durant 4 heures. Après filtration, le mélange de solvants a été évaporé à 35℃ dans un évaporateur rotatif afin d’éliminer un maximum d’acétone. Le résidu d’évaporation de 800 mL a ensuité été partagé 3 fois avec de l’éther de pétrole (800 mL) et 6 fois avec du methyl tert-butyl ether (800 mL). La fraction methyl tert-butyl ether a ensuite été concentrée sous vide à 35℃, redissoute dans une quantité réduite de méthanol et diluée dans un grand volume d’eau pour être lyophylisé ; conduisant à 22.5 g (rendement 4.5 % m/m). L’extrait a ensuite été enrichi sur Amberlite XAD-7 (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, États-Unis) après lavage à l’eau et élution à l’acétone, permettant ainsi d’éliminer les sucres et les composés non retenus. C’est cet extrait semi-purifié qui a été utilisé pour les expériences ultérieures sous le nom RVSO4-XAD.

68 4.1.2 Sarments

Les sarments utilisés sont de la variété Merlot et ont été récoltés en janvier 2010 sur le Domaine de Merlet (Léognan, France). 9 kg ont été utilisés pour réaliser l’extraction. Ils ont été mis à sécher dans une étuve à 40 ℃ pendant une semaine puis ont été broyés grossièrement à l’aide d’un broyeur Bosch AXT 22D avant d’être broyés plus ﬁnement dans un broyeur Retsch SM-100 de l’unité TCEM de l’INRA Villenave d’Ornon, avec une grille à trous carrés de 6 mm aﬁn d’obtenir des morceaux d’environ 3 mm³. Ce broyat a ensuite été remis à l’étuve durant une semaine puis conservé dans des récipients étanches à l’air et à la lumière à -20℃.

Ce broyat a ensuite été extrait en plusieurs fois, 2,5 kg par extraction par un mé- lange acétone/eau (60 : 40 v/v) dans un percolateur. L’extraction s’est effectuée sur le broyat humidifié préalablement avec le mélange de solvants et placé en sachet dans le percolateur. Puis deux 2 cycles macération-percolation identiques sont effectués : ma- cération dans 5 l du mélange durant 12 heures puis percolation lente pendant 12 h.

Par la suite cet extrait est réduit à l’évaporateur rotatif aﬁn d’éliminer un maximum d’acétone. Cet acétone est récupéré et dosé (par pesée) pour les autres étapes d’extraction ou les étapes suivantes.

L’extrait concentré obtenu est déposé sur 1 kg de résine XAD-7HP en colonne verre préalablement lavée à l’acide chlorhydrique 1N et à la soude 1N puis rincée. L’extrait est lavé à l’eau jusqu’à ce que l’éluat soit transparent (environ 10 à 15 litres d’eau sont nécessaires). Puis la colonne est éluée par l’acétone récupéré lors de l’extraction addi- tionné d’acétone frais pour atteindre un rapport 90 : 10 acétone/eau. En règle générale l’acétone issu de l’évaporation de l’extrait titre entre 60 et 80%. Cette fraction éluée à l’acétone est ensuite évaporée à sec, en récupérant l’acétone distillé et reprise dans un volume minimal de méthanol puis additionnée d’un grand volume d’eau. Ce mélange est ensuite mis à congeler puis lyophylisé pour obtenir l’extrait enrichi.

En procédant ainsi, cette méthode permet de recycler plus de 60 % de l’acétone uti- lisé. Qui plus est la résine XAD-7HP a pu être réutilisée pour chacun des 5cyclesde prépuriﬁcation eﬀectués. Ainsi, cette méthode est beaucoup plus propre, pratique et économique en comparaison avec les méthodes utilisées précédemment faisant intervenir de l’acétate d’éthyle, du MTBE et de l’éther de pétrole et des partages en ampoule à décanter.

69 L’extrait enrichi a ensuite été déposé sur une colonne en verre pour chromatographie et lavé à l’acétate d’éthyle, pour donner la fraction E11. L’acétate d’éthyle évaporé à partir de cette fraction a été réutilisé jusqu’à épuiser la poudre. Le contenu de lacolonne une fois séché est une poudre rougeâtre, assez soluble dans l’eau ne présentant aucun pic déﬁni en CLHP.

4.1.2.1 Fractions E11-KD

60 grammes de l’extrait E11 ont été fractionnés par CPC 1 L en utilisant le système ARIZONA-K en mode descendant. Chaque injection en mode sandwich de 10 g a pu être séparée en 80 minutes 1 en augmentant progressivement le débit d’élution de 20 mL/min à 50 mL/min au cours de la séparation, puis 80 mL/min pour l’extrusion. Un chromatogramme d’une des injections se trouve dans la figure 14.9 page xiii en annexe, les lignes pointillées indiquant le début des fractions avec leur nom. Les chromatogrammes UV des différentes fractions sont présentés dans la figure 14.10 page xiv en annexe.

4.2 Gnetum africanum

Les racines de la plante, récoltées par le Dr Gilbert Deccaux en juillet 2007 à Yaoundé au Cameroun, identiﬁées par M Victor Nana et déposées dans l’herbier national du Cameroun sous le numéro 21165/SFRK.

Le broyage et l’extraction ont été réalisés par le Dr Pierre Waﬀo-Téguo et Gérard Fondeville selon le protocole décrit ci-après.

300 g de racines séchées ont été broyées à l’aide du broyeur Retsch SM-100 de l’équipe de Pharmacognosie de Bordeaux Ségalen. Ce broyat a ensuite été lavé avec 2 fois 1,5 L de toluène par macération de 24 h suivie d’une lixiviation. Le marc résultant est extrait par deux fois avec 2 L d’un mélange acétone/eau (60 : 40 v/v) par macération de 24 h suivie d’une lixiviation. L’acétone est évaporé pour donner une phase aqueuse réduite à 900 mL. Cette phase est partagée dans une ampoule à décanter avec 6fois1L

1. temps total entre chaque injection

70 de méthyl tert-butyl ether. Ce lavage organique est regroupé, évaporé, redissout dans du méthanol et additionné d’eau. Après évaporation à l’évaporateur rotatif du métha- nol, une gomme insoluble dans l’eau apparaît (22,86 g), la fraction soluble représentant 2,75 g. C’est cet extrait qui a été utilisé par la suite et nommé GaM2.

4.3 Fallopia multiﬂora

La plante a été cultivée au Jardin Botanique de Talence (33, France), par le Docteur Alain Badoc. Les diﬀérentes parties, racines, tiges et feuilles ont été récoltées en Juillet 2011, séchées à l’étuve à 40 ℃ puis broyées et extraites au méthanol par le Docteur Pierre Waﬀo-Téguo. Ces extraits ont ensuite été déposé séparément sur XAD-7 HP, lavé à l’eau puis élué au méthanol. Ce sont ces derniers éluats qui constituent les extraits utilisés au cours de cette thèse.

71 Quatrième partie

Développement de couplages pour la Chromatographie de Partage Centrifuge et les techniques analytiques

72 « […] tout comme les étoiles semblent se retirer devant l’habituelle clarté du jour, alors qu’en fait nous savons tous que c’est la lumière qui vient les couvrir comme un voile − et qu’elles attendent d’être révélées lorsque la clarté qui les obscurcit se sera dissipée. » Thomas de Quincey - 1822

73 Chapitre 5

Introduction

Les couplages des techniques préparatives et analytiques avec des détecteurs sont des outils courants dans les laboratoires. Pouvoir identifier les composés séparés né- cessite d’interagir avec eux. Pour cela, il existe un très grand nombre de détecteurs utilisant des principes physiques différents tels que l’absorption et la diffusion de lumière, la fluorescence, la spectrométrie RMN, la SM, la conductimétrie… Mais ces détecteurs nécessitent des conditions particulières quand à la nature du flux qui leur est fourni, en particulier au niveau du débit, de la concentration ou de la nature du solvant. C’est ici qu’intervient le principe du couplage et des hybridations, ensemble des techniques permettant de relier ces éléments entre eux en assurant la conversion du flux sinéces- saire. Ces approche hybridées sont d’une importante toute particulière dans l’étude des substances naturelles en particulier dans le domaine de la CLHP (Bringmann et Lang 2003 ; Wolfender, Queiroz et Hostettmann 2006 ; Sprogøe et al. 2008). L’approche développée dans cette partie est le couplage de la CPC avec la SM et la spectrométrie RMN.

La répétabilité de la CPC fait que pour des échantillons connus et des méthodes éprouvées, surtout dans le cadre d’une production d’ECU, le suivi de l’élution peut ne plus s’avérer nécessaire, en dehors du contrôle qualité. Par contre, étudier et analyser les composés élués à l’aide de détecteurs lors d’une expérience de CPC est important lors du développement de méthodes ou le travail sur de nouveaux extraits ou fractions. D’une manière générale, tout détecteur adapté aux CPS le sera aussi pour les CPL, il faut seulement s’assurer que le ﬂux fourni à ces détecteurs est conforme à leurs spéci- ﬁcations.

74 Il existe deux approches principales pour coupler un détecteur en sortie de CPC. La première, que l’on nommera Couplage Direct (cD) consiste à connecter un détecteur compatible en sortie de l’appareil. A l’opposé, le Couplage Indirect (cI), se fait en deux étapes. La première étant l’élimination du solvant des fractions, la plupart du temps par évaporation ou lyophylisation. On peut alors pour la deuxième étape, l’analyse de l’échantillon, utiliser tout l’arsenal analytique existant. Dans la plupart des cD, les équipes de chercheurs utilisent des détecteurs UV-Visible (DAD ou à longueur d’onde fixée) et DEDL . Cependant, pour certaines applications, il peut être nécessaire de détecter les composés à l’aide d’autres techniques. Le DEDL, par exemple, n’est pas capable de détecter des composés plus volatils que le solvant d’élution. De la même manière, les détecteurs UV-Visible ne sont pas utilisables pour les composés ne possédant pas de chromophores. C’est ici qu’apparaît l’intérêt du couplage d’autres détecteurs en sortie de l’appareil. Il existe des dizaines de détecteurs différents, mais la plupart n’ont pas la capacité de distinguer les différents composants d’un mélange et sont pour certains adaptés uniquement à des molécules présentant des caractéristiques particulières. La SM, la spectrométrie RMN et même la CLHP couplée à d’autres détecteurs sont idéales pour contourner ces limitations mais nécessitent cependant de faire appel à des systèmes d’adaptation, on ne parle donc plus de cD. Les cI sont une solution pour s’affranchir de tous ces problèmes. Ils consistent en la réalisation des fractions au préalable et leur traitement pour en éliminer le solvant. Mais cela implique une connaissance à priori du contenu de l’échantillon ou l’analyse d’un échantillonage ou de l’intégralité des tubes de collecte, une étape de rassemblement et le traitement de chaque fraction, ce qui peut constituer des contraintes majeures, en particulier dans le cas de composés fragiles. Pour s’affranchir de toutes ces limitations, l’utilisation de stratégies d’hybridation est indispensable. On peut les diviser en deux catégories principales, les Couplage Hybride- Direct (cHD) et les Couplage Hybride-Indirect (cHI). Dans les deux cas on utilise un flux (appelé ici flux analytique) qui est dirigé vers la technique analytique. Quand dans ce flux est intégrée une petite quantité de l’éluat de la CPC, on parle de cHD. Alors que lorsque un élément intermédiaire est utilisé afin de stocker une partie de ce flux pour l’intégrer ultérieurement dans le flux analytique, on parle de cHI. L’objectif de cette étude a été de réaliser un système de Chromatographie de Par- tage Centrifuge couplée à la Spectrométrie de Masse (CPC-SM), une technique impliquant un couplage cHD déjà réalisée précédemment (Michel 2011), sur nos appareils

75 Direct Hybride Indirect Direct ● UV ● SDS-PAGE ● ● DEDL SM avec Séparateur actif ● Essais biologiques ● ● CCM SM Thermospray Limitation: ● ● CLHP Infrarouge Tolérance aux solvants ● RMN (solvants 2H) ● RMN Concentration faible ● pH-métrie ● SM ● Emission-atomique ● … ● Conductimétrie ● … Hybride Indirect Limitation: Contre-pression ● EPS-RMN Limitation: Tolérance aux solvants ● CLHP Stabilité et abondance Pas d'isolation des flux Limitation: des composés Peut être destructif Compatibilité des phases Temps et manipulations

Figure 5.1 – Représentation des diﬀérents types de couplages existants avec les chromatographies liquide-liquide. et d’adapter les diﬀérents paramètres à ceux-ci. L’autre objectif a consisté à coupler la CPC à la spectrométrie RMN au travers d’un cHI au travers d’un système automatisé d’Extraction sur Phase Solide (EPS).

76 Chapitre 6

Couplage Hybride-Direct : CPC-SM

La spectrométrie de masse est une technique bien plus sensible et informative que l’UV, ainsi en l’utilisant pour étudier le flux de sortie d’une CPC, le chercheur peut identifier plus facilement les différents composés. Mais cette technique est aussi tribu- taire de stratégies d’ionisation particulières requérant des concentrations et des débits généralement plus faibles que celles présentes en sortie de cette technique chromatographique. Il est donc nécessaire de développer des systèmes d’adaptation. Après une brève partie introductive sur les différents moyens à disposition du chercheur, la réali- sation d’un tel couplage entre une CPC 200 mL et un spectromètre de masse à source ESI sera présenté.

6.1 Couplage entre chromatographies liquide- liquide et spectrométrie de masse

6.2 Des pionniers à l’utilisation en routine

La première réalisation d’un couplage de chromatographie liquide-liquide avec la spectrométrie de masse date de 1988 (Lee, Voyksner et al. 1988), voir ﬁgure 6.1. Elle

77 exploitait la capacité des sources Thermospray, désormais tombées en désuétude, de pouvoir travailler avec des flux concentrés et à haut débit. Cette approche nécessitait souvent un système de régulation de pression au niveau de l’appareil chromatographique afin de compenser les fortes contre-pression crées par ce couplage, pouvant détruire la colonne. Qui plus est, elle n’était pas conçue pour faciliter la collecte des composés, l’intégralité du flux partant dans le spectromètre de masse.

Pompe à vide

Échappement Piège à azote liquide

Source Solution pour aide à Thermospray l'ionisation

Pompe Solvant CCC T coaxial pour mélange CCC Pompe Vaporisateur Thermospray (boucle chauffée) Pompe Pompe pour compenser les contre-pressions

Figure 6.1 – Fonctionnement d’un couplage CCC-Thermospray. Schéma adapté de(Lee et Voyksner 1989)

Par la suite, de nombreux autres types de spectromètre de masse ont été couplés à ce type de chromatographie, Frit Electron Ionization, Fast Atom Bombardment, Ionisation chimique, Ionisation électronique (H. Oka et al. 1991), ESI (Kong et al. 1998)… Dans sa thèse, le Docteur Thomas Michel, fait un historique et une revue de quelques-unes de ces utilisations en ESI et APCI (Michel 2011).

78 6.3 Séparer deux ﬂux

Pour les cHD, il faut diviser le flux d’entrée en deux parties, une destinée à l’analyse, l’autre destinée à la collecte et éventuellement à d’autres détecteurs. Les grandeurs physiques à suivre sont : le rapport de séparation r, les débits Qp pour le flux principal et Qpa pour le flux analytique, mais aussi la contre-pression provoquée par cette séparation sur le flux d’entrée. Le ratio de séparation est donné par la formule suivante :

Q r = p (6.1) Qp − Qpa

La méthode la plus simple est d’utiliser un Séparateur Passif (Split). Le principe de ce type d’appareils est simple, mais leur usage, qu’il soit calculé ou empirique, est complexe puisque le rapport de séparation dépend des viscosités, contre-pressions sur chaque ﬂux de sortie et débits d’entrée. Qui plus est, ces systèmes provoquent eux- mêmes des contre-pressions sur le ﬂux d’entrée qui, en plus d’être dépendantes du ratio, peuvent être élevées, ce qui est une contre-indication formelle pour la CPC.

L’autre problème d’une séparation passive provient de la vitesse linéaire du flux analytique qui peut être extrêmement faible et ainsi conduire à des décalages en temps importants entre les deux flux de sortie (voir Figure 6.2). Cette vitesse est inversement proportionnelle au rapport de séparation comme on peut le voir dans l’équation 6.3. On peut, pour compenser cette faible vitesse, réduire le diamètre du tube de flux analytique, conduisant alors à une augmentation des contre-pressions. L’autre solution consiste à utiliser un split assisté, nécessitant une pompe auxiliaire, et dont les réglages de rapport de séparation ne sont pas aisés. En effet, le rapport de séparation, quelle que soit l’approche utilisée avec les Séparateurs Passifs est dépendant du rapport des contre- pressions de sortie entre le flux principal et le flux analytique.

Pour jouer sur ces contre-pressions, on peut faire varier les diamètres de sortie de chaque flux, ou alors appliquer une contre-pression à l’aide de résistances hydrauliques fixes et/ou variables. Cette dernière méthode ayant l’avantage d’un rapport de sépara- tion moins sensible aux contre-pressions en aval du séparateur tant que celles-ci sont très inférieures aux résistances hydrauliques. L’inconvénient étant alors que ces pressions se répercutent sur le flux principal (voir Tableau 6.1).

79 Il est à noter qu’il existe des séparateurs à rapport variable qui agissent en faisant varier l’une des deux résistances, ainsi que des séparateurs asservis électromécani- quement, permettant de maintenir un débit constant quel que soient les conditions de contre-pression ou de viscosité. On retrouve ces derniers sur certaines chaînes nano, capillaires et micro CLHP aﬁn d’obtenir de faibles débits de manière précise à partir de pompes standards. Plus le séparateur est petit, moins la variation de viscosité aura d’importance ce qui fait que dans les appareils actuels, de volume réduit, ce paramètre n’est plus très inﬂuent.

P r i n c i p a l QPA A n D a l y t i q u e Figure 6.2 – En réduisant le diamètre au niveau du ﬂux analytique ou en augmentant le débit analytique, on réduit le délai entre les deux ﬂux de sortie.

Q 4Q V = pa = p S (r + 1)πD2 avec D : Diamètre du tube entre le split et la technique analytique (6.2)

80 Qp Qp-Qpa

Flux principal Qpa Flux analytique Qp Qp-Qpa

Flux principal Qp-Qpa Q Qp pa Qa Qa+Qpa Flux principal Flux analytique

Qpa

Flux analytique

Figure 6.3 – Séparation passive d’un ﬂux. En haut à gauche, séparation la plus simple. En bas à gauche, séparation compensée. À droite, séparation assistée par un ﬂux auxiliaire.

81 Tableau 6.1 – Comparaison des diﬀérents types de séparation de ﬂux. (n/a : non applicable)

Contre-pression Contre-pression Dépendence de r à la viscosité Vitesse linéaire flux principal flux analytique et contre-pressions flux analytique Simple Variable n/a Très dépendant Lente Compensé Forte n/a Seulement des contre-pressions Lente Assisté Variable/Forte Variable Très dépendant Rapide Actif Négligeable Importante Pas du tout dépendant Rapide On peut, pour éviter ces problèmes, utiliser un Séparateur Actif (Active Splitter) qui est l’équivalent d’une vanne 6 voies automatisée intégrant une boucle (voir Figure 6.4). L’avantage d’utiliser un appareil de ce type est sa capacité à avoir un rapport variable et constant. Dans l’appareil utilisé lors des travaux de cette thèse, ce n’est pas une boucle qui assure le stockage mais un sillon gravé dans un disque ou plus exactement plusieurs sillons de volumes différents (voir Figure 6.5), que l’appareil sélectionne conjointement à la vitesse à laquelle il commute entre les deux flux (voir Figure 6.6). C’est grâce à ces deux paramètres, temps et volume, que l’appareil est capable de gérer des ratios différents (voir tableau 6.2).

Flux 12 principal 12 3 6 0,2 - 2,0 Hz 3 6 4 5 4 5 Flux analytique

22 - 300 nL Mode chargement Mode injection Figure 6.4 – Schéma simpliﬁé du fonctionnement du séparateur actif.

60°

100 nL 300 nL ø 17 mm

22 nL

Figure 6.5 – À gauche : photographie du disque du séparateur actif, à droite : en rouge le sillon utilisé pour transférer la matière, en bleu le sillon assurant une continuité du ﬂux analytique durant le transfert.

Les fréquences de commutation enregistrées en audio et analysées avec le logiciel Audacity (http://audacity.sourceforge.net/), correspondraient à des aliquotes de 23.5 μL,

82 Figure 6.6 – Vue en coupe du principe de fonctionnement du séparateur actif

Tableau 6.2 – Les nombres correspondent au réglage à indiquer à l’appareil pour obtenir le ratio souhaité. Les lettres en exposant a,b et c correspondent respectivement aux sillons de 22, 100 et 300 μL choisispar l’appareil dans ce mode.

Débit analytique Ratio 100 :1 500 :1 1000 :1 4000 :1 10000 :1 20000 :1 100000 :1 1 1b 4a 12a 2 2c 5b 13a 22a 4 3c 6b 14b 23a 34a 6 7b 15b 24a 35a 45a 8 8c 16b 25a 36a 46a 10 9c 17b 26a 37a 47a 15 10c 18c 27b 38a 48a 20 11c 19c 28b 39a 49a 30 20c 29b 40b 50a 55a 40 21c 30b 41b 51a 56a 60 31c 42b 52b 57a 80 32c 43b 53b 58a 100 33c 44b 54b 59a

100 μL et 333.3 μL, le séparateur actif doit donc prendre en compte le temps de posi- tionnement du disque pour assurer les rapports de split, ou alors les rapports de splits ne sont pas exactement ceux indiqués par le fabricant.

6.4 Réalisation

L’un des critères pour la réalisation de ce couplage a été d’intervenir le moins possible sur la chaîne CLHP-SM. Pour cela, le split actif est connecté en lieu et place de la colonne, permettant ainsi de proﬁter du détecteur à barrettes de diodes et dusplit passif allant vers la masse. Deux points ont nécessité des optimisations aﬁn d’obtenir un comportement et des signaux satisfaisants.

83 6.4.1 Choix du solvant auxiliaire

Le choix du solvant auxiliaire s’est fait selon l’idée que celui-ci doit se mélanger à un maximum de phases diﬀérentes, et ce aﬁn d’homogénéiser au maximum le signal (en UV particulièrement). Pour cette raison, c’est de l’éthanol qui a été utilisé, présentant l’avantage d’être compatible avec tout l’appareillage. Les premiers essais ont montré une très faible sensibilité de la technique, par la suite, un ajout de 0,1 % d’acide formique a permis de résoudre ce problème.

6.4.2 Optimisation des conditions de masse

L’autre critère est l’optimisation des paramètres de la source du spectromètre de masse. En effet, dans le cas de la CLHP-SM, l’éluat est constitué d’un mélange variable d’eau et d’acétonitrile. Ici, l’éthanol présente une viscosité et une densité plus importante que l’eau, il a donc été nécessaire d’augmenter à la fois la pression de nébulisation et le débit de gaz de séchage. La température de 320° n’ayant que peu d’influence au vu des différents essais d’optimisation effectués. Le reste des paramètres de la masse ne sont plus influencés par le solvant, la différence visible dans les paramètres en annexe 14.1 page xi au niveau de ces paramètres est dû au fait que les expériences en CPC-SM avaient pour but de rechercher les molécules d’un peu plus haut poids moléculaire et d’être en particulier très sensible pour les trimères de Resvératrol, alors que l’objectif des paramètres en CLHP était d’avoir une étendue spectrale la plus large possible pour caractériser les échantillons.

6.5 Résultats

Les résultats de diﬀérentes expériences en CPC-SM sont présentées dans la partie suivante.

84 6.6 Conclusion

Nous avons pu, à l’aide d’un léger développement au niveau du choix du solvant auxiliaire et de l’optimisation des conditions de masse obtenir un nouvel outil analytique. Cet outil, exploité pour diﬀérentes études au sein du laboratoire, dont certaines sont décrites dans la prochaine partie, s’est montré particulièrement intéressant lors du développement de méthode. Il est à noter que cet outil présente un autre intérêt qui n’a pas été exploité dans les cas présentés dans cette thèse, celui de pouvoir réaliser une fragmentation au cours de la séparation. Les composés mettant plusieurs minutes à s’éluer, l’utilisateur peut ainsi exploiter des cycles d’acquisition très longs et des cycles de fragmentation beaucoup plus poussés, permettant alors d’obtenir des données pour des études structurales.

85 Chapitre 7

CPC-EPS-RMN : Un couplage Hybride Indirect

7.1 Introduction

La RMN est une technique de choix pour étudier les molécules organiques 1. Dans la plupart des cas, elle est utilisée au travers de cI. Mais l’évolution à la fois des aimants, des sondes et des séquences permet désormais d’utiliser cette technique dans des situations de faibles concentrations, de solvants d’échantillon majoritairement non deutérés et de vitesses d’acquisitions élevées.

Ainsi, ces évolutions ont conduit à la création de deux approches d’hybridations entre les chromatographies et la RMN au travers de cHD et de cHI. On ne peut que constater l’importance grandissante de la Chromatographie Liquide Haute-Pression couplée à la Résonnance Magnétique Nucléaire (CLHP-RMN), un cHD, et la Chroma- tographie Liquide Haute-Pression couplée à la Résonnance Magnétique Nucléaire par l’intermédiaire d’une Extraction Phase Solide (CLHP-EPS-RMN), un cHI, mais aussi l’apparition d’approches alternatives prometteuses telles que la CPG (Kühnle et al. 2010), la chromatographie supercritique et l’electrophorèse capillaire couplées à la spectrométrie RMN (Albert 2002).

1. On peut aussi étudier des molécules non-organiques, mais cela dépasse le cadre de ce qui est pré- senté ici.

86 Pour identiﬁer les composants d’un mélange simple, il est possible d’utiliser un simple spectre RMN proton, permettant alors d’identiﬁer des produits connus à l’aide d’une base de données. Mais pour des raisons de faible abondance et d’analogies entre les composés provoquant des superpositions de signaux, l’apport d’une séparation dans une autre dimension peut être indispensable. Coupler un système chromatographique à la spectrométrie RMN permet alors d’avoir accès à une dimension supplémentaire. On peut alors dans certains cas se contenter d’une simple acquisition proton de l’élution (Spring et al. 1995), mais aussi faire des cartes 2D. La technique la plus utilisée dans ce cadre là est la CLHP (Albert 2002), même si il est possible de l’utiliser aussi avec des colonnes basse-pression (Shapira et al. 2004)

On a, pour un tel couplage, trois approches principales : – Avec les cHD, dans lesquels la sortie de la CLHP est couplée directement à une sonde à cellule de flux. Il existe deux méthodes majeures, une utilisant uniquement des solvants deutérés, avec le surcoût que cela implique. L’autre approche, utilisant la capacité de certaines séquences RMN de supprimer des signaux spécifiques (Albert 2002). En effet, la gamme dynamique des convertisseurs analogique- numérique des spectromètres RMN n’est pas suffisante pour observer à la fois les composés en faible concentration et les solvants non-deutérés en très forte concentration. En supprimant la majorité du signal des solvants, on peut alors se permettre d’utiliser des mélanges de solvants hydrogénés et deutérés, approche plus intéressante économiquement. Ces séquences ont néanmoins l’inconvénient de cacher ou de déformer certains signaux se trouvant à proximité des zones trai- tées. L’autre inconvénient de cette approche, c’est que l’acquisition de spectres 2D peut s’avérer plus longue que la durée de transit du composé dans la cellule. En effet, dans le cas d’une CLHP analytique, chaque composé est élué en un pic d’une largeur de 30 secondes à 1 minute pour des séquences d’acquisition de l’ordre de plusieurs minutes à plusieurs heures en fonction de l’abondance du composé étudié. L’arrivée de sondes plus réduites, offrant donc une sensibilité accrue, de cryo-sondes réduisant le bruit de fond et de séquences ultra-rapides rendent l’acquisition de ce type de spectres possibles en cours d’élution, en utilisant des séquences comme la COSY ultra-rapide (Frydman, Scherf et Lupulescu 2002 ; Queiroz Júnior et al. 2012). Un autre problème présent avec ces couplages directs est l’importance parfois marquée des contaminations croisées, souvent ap- pellé effet mémoire. Le temps restreint entre deux composés et les concentrations

87 importantes rendant difficile un rinçage efficient de la sonde et de l’ensemble des volumes de connexions. – L’utilisation du mode interrompu (stop-flow), consistant à arrêter les pompes d’élution lorsque le composé se trouve dans la sonde, permettant d’effectuer alors toutes les expériences souhaitées, mais aussi un rinçage de la sonde entre chaque composé. Cette méthode à un revers cependant, même si la diffusion des compo- sés est généralement faible dans la colonne, surtout pour de grosses molécules, la diffusion des solvants est elle beaucoup plus rapide, conduisant, dans le cas d’élu- tions avec de forts gradients, à des perturbations pouvant être importantes lors de la reprise de l’élution (Bedani, Kok et Janssen 2006). L’autre inconvénient de ces deux premières techniques se révèle lorsque l’utilisateur souhaite comparer les spectres obtenus avec ceux d’une base de donnée. En effet, dans le cas d’une élution gradient, la susceptibilité magnétique du solvant, l’homogénéité de champ et les intéractions dipolaires avec les composés changent, conduisant alors à des changements dans les déplacements chimiques parfois considérables conjointement à une perte de résolution et de sensibilité. Par ailleurs, la longueur des impulsions 90° est aussi différente d’environ 5 % (Albert 2002), ce qui pour une acquisition d’un spectre proton n’est pas problématique, mais le devient rapidement avec les séquences multi-dimensionnelles. Une issue à ce problème consiste à ajouter, en sortie de la colonne, un mélange de solvant permettant d’homogénéiser la composition au cours de l’élution. Par exemple, avec les proportions inverse des solvant d’élution, on a constamment un mélange 1 :1 en sortie du dispositif. L’inconvénient majeur étant la réduction importante de la sensibilité en raison de la dilution. Même sans cette solution, cette technique semble être la plus utilisée en CLHP-RMN dans l’étude des substances naturelles. – Les cHI, résolvant ces problèmes se divisent en deux catégories majeures. La pre- mière est l’utilisation de boucles de stockage. Les composés, au fur et à mesure de leur élution sont stockés dans des boucles dont le contenu est injecté dans la sonde RMN ultérieurement. La finesse du diamètre interne des boucles limite les phé- nomènes de diffusion, et la dé-corrélation de la séparation et de l’analyse évite la diffusion dans la colonne et permet des temps d’acquisition longs, mais celà ne résout en rien le problème de la composition du solvant d’échantillon. Pour ré- pondre à cette limitation on peut utiliser des mini-cartouches d’EPS sur lesquelles les composés élués sont stockés. Puis, après séchage et élution avec un solvant deu- téré, injectées dans la sonde. On se retrouve donc avec un système dé-corrélé, avec

88 une composition en solvants fixe et deutérés, évitant l’étape de suppression de signaux. Mais aussi la possibilité d’accumuler plusieurs fois sur la même cartouche, augmentant par la même la concentration dans la sonde. L’inconvénient majeur de cette technique étant qu’il faut trouver des phases solides compatibles àlafois avec les composés et avec la phase mobile de la CLHP. Cette technique donne cependant d’excellents résultats en particulier pour des mélanges complexes (Seger et al. 2005 ; van der Hooft, Mihaleva et al. 2011 ; van der Hooft, de Vos et al. 2012). En raison des inconvénients financiers à faire une séparation en CPC avec des solvants deutérés, et des inconvénients des techniques cHD et du stockage en boucle, c’est la solution utilisant des cartouches d’EPS qui a été retenue pour effectuer le couplage Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à la Résonnance Magnétique Nucléaire (CPC-RMN).

Le lecteur trouvera des références et des explications plus complètes dans les deux revues suivantes (Jaroszewski 2005a ; Jaroszewski 2005b) et dans l’ouvrage (Albert 2002).

7.1.1 CPC-RMN

Ce n’est pas la première fois que la CPC est couplée à la RMN, en 1997, un cD, utilisant des solvants deutérés en mode interrompu a permis de suivre l’élution de compo- sés (Spraul et al. 1997). Mais il est évident qu’en raison du coût important des solvants deutérés, cette technique ne peut être utilisée en routine. L’idée ici a donc été deréduire l’utilisation des solvants deutérés, et l’inﬂuence des solvants non-deutérés sur le signal en utilisant comme intermédiaire entre la CPC et la RMN, des cartouches d’EPS au travers d’un système de piégeage automatisé. Ces cartouches induisent des contraintes importantes, en particulier sur leur capacité à retenir et relarguer les composés d’intérêt. L’autre contrainte importante a été l’inadéquation des solutions logicielles disponibles et la documentation inexistante sur les protocoles utilisés pour communiquer avec les appareils d’automatisation du piégeage parallèlement à un refus du fabriquant de l’appareil et celui du logiciel de collaborer ou de donner les informations nécessaires. Le travail sur cette partie a donc consisté à la fois à sélectionner une phase adaptée, mais aussi à eﬀectuer une rétro-ingénierie du protocole utilisé par l’appareil à disposition, permettant alors de le piloter librement.

89 7.1.2 Choix d’une phase solide

Il existe une grande variété de phases (voir Tableau 7.1) adaptées à différents types de composés à isoler et à différentes matrices. Ici le but n’est pas d’avoir une cartouche sélective pour un composé en particulier, mais au contraire une phase la plus univer- selle possible et ayant une capacité de charge importante. En effet, on n’utilise les cartouches que dans un but de stockage, pas dans un but séparatif, ce qui reste néanmoins une possibilité de ce type de technique. Même si beaucoup des phases disponibles (en gras dans le Tableau 7.1) sont capables de retenir nos composés d’intérêt, elles diffèrent sur deux paramètres importants : – La capacité de rétention, il ne faut pas que le solvant dans lequel arrivent les com- posés élue la cartouche ou les empêche de se fixer, en particulier dans le cas où on charge plusieurs fois la cartouche (accumulation) – La capacité de charge, il faut que la cartouche soit capable de stocker une quantité suffisante de composé pour faciliter l’analyse ultérieure. De plus, le laboratoire disposant d’un Prospekt 2 (version pour Bruker, Spark, Hol- lande), appareil permettant de gérer automatiquement le stockage sur de multiples cartouches, ce ne sont que les phases disponibles pour cet appareil qui ont été retenues pour cette étude.

90 Effet des solvants sur le champ +++

Temps pour acquisition --- Couplages directs Sensibilité --- Contaminations croisées ++ Dilution post-colonne Coût ++

Solvants deutérés Coût +++ Séparation - 100% Mode interrompu Sensibilité --- Séquences courtes Coût ++ 1H et Ultra-fast Solvants deutérés < 100% Signaux parasites +++

Déformation Suppression Perte d'information de solvants Temps d'acquisition ++

Couplages hybrides-indirects

Effet des solvants sur le champ +++ Boucles Coût (solvants 2H) ++ à +++

Nécessité de phases compatibles Extraction en Phase Solide

Figure 7.1 – Représentation des diﬀérents couplages en CLHP-RMN.

91 Tableau 7.1 – Tableau récapitulatif de diﬀérentes phases disponibles pour le Prospekt 2. Les phases en gras sont celles qui sont adaptées aux hydroxy- stilbènes.

Marque Nom Type Particularités Spark Resin SH PS-DVB 20-50 μm, très poreux, phénols et composés polaires C18 HD C18 Haute Densité, End-Capped 7 μm, fort taux de greffage C18-SE C18 End-Capped sur silice 7 μm C8 EC-SE C8 End-Capped sur silice 10 μm C2-SE C2 sur silice 7 μm CN-SE CN sur silice 7 μm, cyano propyle Resin GP DVB 5-15 μm, générique MM anion DVB avec échangeur d’anions 10 μm, pour les acides organiques MM cation DVB avec échangeur de cations 10 μm, pour les composés basiques MM weak anion amino-DVB avec échangeur d’anions 10 μm, greffage apolaire, charge dépendante du pH 92 MM weak cation amino-DVB avec échangeur de cations 10 μm, greffage apolaire, charge dépendante du pH Waters HLB N,PVP-DVB 30 μm, grande capacité de charge, rétention forte WAX N,PVP-DVB et échangeur d’anions 30 μm, Pipérazine, échange faible WCX N,PVP-DVB et échangeur de cations 30 μm, Carboxyl, échange faible MAX N,PVP-DVB et échangeur d’anions 30 μm, Amine quaternaire, échange fort MCX N,PVB-DVB et échangeur de cations 30 μm, Acide sulfonique, échange fort Agilent Plexa PS-DVB Hydrophile 45 μm ENV PS-DVB C18 C18, tri-fonctionnalisée 40 et 120 μm C8 C8 40 et 120 μm SAX Trimethyl-aminopropyle sur silice échange fort Certify C8 et échangeur de cations Extraction aqueuse, apolaire et échangeur de cations (PCP) Certify II C8 et échangeur d’anions Composés apolaires et échangeur d’anions (THC-COOH) Plexa PCX PS-DVB avec échangeur de cations En dehors de l’existence de références bibliographiques concernant l’adéquation entre composés et phase solide, l’utilisateur peut se référer aux caractéristiques chimiques de ceux-ci. Pour cela, il faut prendre en compte 6 types d’interactions principales, classées par énergie de liaison, de la plus forte à la plus faible : – l’interaction ionique, dans laquelle deux ions s’attirent par un effet electrosta- tique. Elle n’existe pas seule. Il y a toujours une part variable d’interaction covalente entre les deux espèces, on parle alors de liaisons covalentes polaires. – l’interaction covalente, dans laquelle deux atomes partagent une paire d’élec- trons, peu exploitée en EPS. – l’interaction diélectrique, apparaît entre un ion ou composé chargé et un com- posé ayant un moment dipolaire. La molécule polaire s’oriente alors en fonction de la charge. – les liaisons hydrogène, dont les 100 ans de la découverte ont été fêtés cette année (Goymer 2012), résultant d’une liaison partielle entre un donneur et un accepteur de protons par l’intermédiaire d’un proton. – les interactions de type dipolaire, entre molécules dont le dipôle est permanent (molécules dites polaires), on parle alors d’interactions de Keesom, ou entre une molécule au dipôle permanent et une autre dans laquelle le dipôle est induit, on parle dans ce cas de d’interaction de Debye. – l’interaction de dispersion ou de London, liées à l’émergence temporaire d’un dipôle dans une molécule en raison d’un nuage électronique transitoirement dis- symétrique, ce dipôle est capable d’induire un dipôle dans une molécule voisine. Favorisant ainsi une interaction Coulombienne entre les deux. C’est une intérac- tion faible et présente plus particulièrement entre des molécules polarisables mais non polaires. La constitution de la phase solide influe sur sa résistance à des pH extrêmes, dans le cas de la silice, on considère généralement que le pH doit se situer entre 2 et 8, même si cela peut varier en fonction du greffage. Pour les polymères, on peut atteindre des gammes de pH plus étendues, très souvent entre 1 et 14. Cependant, pour les stil- bénoïdes, les interactions ioniques sont difficiles à exploiter. En effet, les pKa de ces composés sont assez élevés (8,8 ; 9.8 ; 11.4) et le risque de dégrader les composés est important dans ces conditions (López-Nicolás et García-Carmona 2008).

La surface spéciﬁque 1 est une propriété physique des solides correspondant à la surface accessible rapportée à la masse, son unité SI est m2/kg, mais dans le cas des 1. Speciﬁc Surface Area ou SSA

93 EPS, on utilise plus souvent le m2/g. C’est une des valeurs importantes permettant de déﬁnir la capacité d’un matériau à servir de support en EPS (Fontanals et al. 2005).

Tableau 7.2 – Surface spéciﬁque de quelques phases utilisées en EPS.

Matériau Surface spéciﬁque (m2/g) Waters - Oasis HLB 823 Spark - Resin SH ˜ 1000 Agilent - Plexa 550

La taille des particules à tendance à être inversement proportionnelle à la capacité de charge et au volume mort. Ainsi, il est plus intéressant de travailler avec de petites particules, avec comme critère limitant la contre-pression plus importante créée par des particules plus fines et un coût plus élevé. La taille des pores est elle aussi importante, plus les pores seront petits, plus les grosses molécules auront une surface accessible ré- duite, c’est un critère à prendre en considération en fonction de la tailles des molécules que l’on souhaite fixer et/ou éliminer. C’est d’ailleurs ce phénomène qui est utilisé dans des techniques de chromatographie à flux turbulent (Ayrton et al. 1997).

Dans le cas présent, les diﬀérentes phases de chez Spark testées n’ayant pas apporté de rétention suﬃsante, le choix s’est porté sur des cartouches Waters HLB, procurant une bonne capacité de charge, jusqu’à 1 mg par cartouche et de bonnes rétentions. La Agilent Plexa, donnée comme équivalente à la HLB par le fabriquant n’a pas été testée.

7.1.3 Couplages CPC-EPS existants

Les couplages entre CPL et EPS ne sont pas nouveaux, des couplages entre CCC et des EPS ont été réalisés (Guo, Liang et Wu 2010 ; Lu, Hu et Pan 2010 ; Hu et al. 2011), mais l’objectif était dans ces cas là d’utiliser l’EPS comme moyen de désaliniser l’échantillon ou de l’utiliser pour une nouvelle séparation 1, qui plus est, la technique telle qu’elle a été utilisée ici n’avait pour but que de stocker un seul composé. D’autres

1. On parle alors de séparation bi-dimensionnelle ou 2D voir même multi-dimensionnelle (Yang et al. 1998).

94 auteurs ont envisagé d’arrêter la colonne le temps de changer de cartouche EPS, mais ici encore, la visée était purement préparative (Liang et al. 2011). En utilisant le système de cette étude, l’utilisateur peut stocker jusqu’à 192 composés sur des cartouches aﬁn de les analyser de manière découplée, mais la taille des cartouches ne permet pas une utilisation à visée préparative, même si cela est tout à fait envisageable techniquement.

7.1.4 Présentation du Prospekt2

Le Prospekt2 (Spark, Hollande) est un système prévu à l’origine pour stocker, sur une collection de 192 cartouches EPS réparties sur deux racks, les composés élués à la sortie d’un système CLHP et disposant d’un système de conditionnement, élution, séchage, régénération des cartouches intégré. Il permet aussi, en série sur les derniers modèles, de réinjecter automatiquement le contenu des cartouches en CLHP, permettant ainsi de faire une séparation multi-dimensionnelle.

Les cartouches utilisées font 10 mm de diamètre avec un diamètre interne de 1 ou 2 mm, permettant contenir jusqu’à 25 mg de phase solide. Les 8 mm ou 9 mm restants étant nécessaires à la résistance de la cartouche aux fortes pressions, jusqu’à 300 bars supportées par l’appareil.

Il est en fait composé de deux modules, un nommé ACE pour Automated Cartridge Exchange et l’autre HPD pour High Pressure Delivery, voir ﬁgure 7.2.

– L’ACE est responsable de 4 vannes ACE-V1 à ACE-V4 sur le schéma, du bras mo- torisé ACE-B et de la pince situé en bout de ce bras, du support de plaques moto- risé ACE-P et de deux pinces ACE-PG et ACE-PD permettant de fermer le circuit hydraulique avec une cartouche. La présence des deux pinces permet de charger une nouvelle cartouche pendant que la première est utilisée et ainsi gagner sur le temps mort entre deux opérations. Le système est équipé d’une lecteur RFID permettant d’identiﬁer la nature et le numéro de série des racks ACE-R1 etACE-R2, fournissant les informations nécessaires à l’identiﬁcation et le suivi des opérations sur chaque cartouche. – Le HPD est responsable de deux seringues motorisées HPD-S1 et HPD-S2, toutes deux connectées à une vanne 6 voies, HPD-V1 et HPD-V2, permettant ainsi d’aspirer et refouler de multiples solvants. Elles sont aussi équipées de capteurs de pression individuels.

95 Les deux appareils disponibles au laboratoire sont des versions adaptées pour la so- ciété Bruker, un est relié à une chaîne CLHP-SM, l’autre à une chaîne CLHP-EPS-RMN. Or, sur le premier une vanne est disponible et permet d’utiliser cet appareil seul pour réaliser le couplage Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à une Extraction Phase Solide (CPC-EPS). Chaque élément peut être contrôlé individuellement par une liaison série ou des programmes internes. On peut donc en théorie l’utiliser pour toutes sortes d’applications. Néanmoins, ne pouvant obtenir la documentation de la part du fabriquant, il a été nécessaire de pratiquer de la rétro-ingénierie sur le protocole aﬁn de pouvoir l’utiliser pour cette application.

96 HPD-V1 HPD-V2 12 12 1 d1 3 6 3 6 4 5 4 5 2 d2 HPD-V1 HPD-V2 12 2 1 3 3 6 3 6

4 5 4 5 Pompe

W d3 W HPD-S1 HPD-S2 W 1 2 8

97 Azote 3 7 HPD-S1 HPD-S2 4 5 6 ACE-V1 ACE-V2 ACE-V3 ACE-V4 ACE-V3 W 1 67 2 1 2 8 12 8 5 3 6 3 7 3 6 1 4 2 3 4 5 4 5 6 4 5 HPLC ACE-PG ACE-P 2 1 12 ACE-B 3 6 3 6 4 5 4 5 ACE-PG ACE-PD ACE-V2 ACE-V4 ACE-R1 ACE-R2 W ACE-PD

Figure 7.2 – Représentation schématique du Prospekt2. 7.2 Réalisation

7.2.1 Adaptation du système mécanique

Pour pouvoir coupler de manière indirecte la CPC au Prospekt2, il faut un système d’interface qui puisse stocker une partie du ﬂux de la CPC pour l’envoyer ensuite dans le Prospekt2. La solution retenue est d’utiliser une boucle et une pompe secondaire. Les premiers essais ont été réalisés en utilisant une des seringues asservies, mais il s’est avéré que l’utilisation de la pompe réduit le nombre de commutations de vannes et évite les mouvements de seringue, limitant l’usure de ces composants. La vanne disponible sur l’appareil étant une vanne 8 voies, elle permet, en bouchant l’une de ses sorties et en utilisant une jonction en T, de l’utiliser à la manière d’une vanne d’injection comme on en trouve en CLHP. Il est aussi possible de relier deux des sorties ensembles pour éviter l’utilisation d’un T, mais cette solution n’a pas été retenue aﬁn de laisser l’opportunité de contrôler la sortie de la boucle en position chargement pour d’autres applications.

1 d1 2 d2 HPD-V1 HPD-V2 12 2 1 3 3 6 3 6 4 5 4 5

W d3 W HPD-S1 HPD-S2 W 1 2 8 Azote 3 7 Pompe 4 5 6 ACE-V3 W Sortie CPC

ACE-PG 67 12 12 8 5 3 6 3 6 1 4 2 3 4 5 4 5 ACE-V1 ACE-V2 ACE-V4 Détecteur/Collecte W ACE-PD

Figure 7.3 – Adaptation du système hydraulique du Prospekt2.

98 W 1 2 8 Azote 3 7 Pompe 4 5 6 ACE-V3 W Sortie CPC

ACE-PG 67 12 12 8 5 3 6 3 6 1 4 2 3 4 5 4 5 ACE-V1 ACE-V2 ACE-V4 Détecteur/Collecte W ACE-PD

W 1 2 8 Azote 3 7 Pompe 4 5 6 ACE-V3 W Sortie CPC

ACE-PG 67 12 12 8 5 3 6 3 6 1 4 2 3 4 5 4 5 ACE-V1 ACE-V2 ACE-V4 Détecteur/Collecte W ACE-PD

Figure 7.4 – Chargement et injection de la boucle.

7.2.2 Rétro-ingénierie

L’analyse et la compréhension du protocole s’est déroulée en 4 étapes : – Enregistrement des échanges depuis l’ordinateur pilotant l’appareil avec le logiciel Serial Port Monitor de la société Eltima (http://www.eltima.com). – Analyse des enregistrements pour repérer le format des trames. – Association entre trames et actions démandées et réalisées. – Injection manuelle de trames et analyse des codes de retour pour valider les associations. – Réalisation d’un simulateur permettant de vériﬁer que le protocole trouvé estco- hérent avec les attentes du programme du fabriquant

7.2.2.1 Analyse des enregistrements.

L’analyse des enregistrements a montré que le protocole est synchrone (une requête- une réponse) et que les requêtes sont conçues de la manière suivante (0x indique une valeur en hexadécimal) :

99 Tableau 7.3 – Structure des requêtes du Prospekt2.

En-tête Code module Code sous-module Argument Fin 0x2 3xxx yyyy zzzzzz 0x3

Il existe deux types de requêtes, les requêtes d’action, indiquant à l’appareil quoi faire, et les requêtes d’état permettant d’obtenir une valeur ou un paramètre. À lasuite d’une de ces requêtes, l’appareil retourne soit un code court, dans le cas des requêtes d’action, soit une séquence de réponse construite de la même manière que les requêtes, avec le même code module, le code sous-module correspondant à l’argument de la re- quête et l’argument contenant la valeur de réponse.

Tableau 7.4 – Structure des réponses du Prospekt2.

Code Fonction 0x15, 0x24, 0x18 Erreur 0x6 Ok requête Retour d’une information

7.2.2.2 Association entre trames et actions demandées et réalisées

Les modules mis en évidence en recoupant les informations entre le logiciel, la documentation commerciale de l’appareil et les requêtes sont les suivants :

Les modules 3501 (HPD) et 3001 (ACE) sont les seuls modules appellés dans les re- quêtes analysées, à l’exception de la requête de demande de version qui est adressée directement à chaque module. Ce qui laisse penser que ces deux modules sont les contrô- leurs principaux et que ce sont eux qui distribuent les demandes aux autres modules.

La ﬁgure 7.5 montre un exemple de transactions, la première demandant de remettre la vanne ACE-V2 en position 0, et la seconde permettant d’obtenir l’état de l’appareil, que l’on appellera requête 152 par la suite. Si la réponse à cette requete est inférieure à 1000, cela signiﬁe que l’appareil est en train de réaliser l’action demandée, on peut

100 Tableau 7.5

Code module Description 3501 HPD - Contrôleur principal 3502 HPD - Contrôleur de la seringue HPD-S1 3503 HPD - Contrôleur de la seringue HPD-S2 3504 HPD - Contrôleur vannes HPD-V1 et V2 3001 ACE - Contrôleur principal 3002 ACE - Contrôleur du bras et de la pince ACE-B 3003 ACE - Contrôleur de la pince ACE-PG 3004 ACE - Contrôleur de la pince ACE-PD 3005 ACE - Contrôleur de vannes auxiliaires ACE-V1,V2 et V3 3006 ACE - Contrôleur RFID pour les racks 3007 ACE - Contrôleur du système de gestion en température (non présent) 3008 ACE - Contrôleur du système de distribution de racks 3009 ACE - Contrôleur de vanne principale ACE-V4 aussi suivre l’état de plusieurs actions demandées en parallèle, mais cette partie n’a pas encore été étudiée.

L’analyse a montré l’existence de 2 requêtes communes aux deux appareils recensées en annexe dans le tableau 7.6 page 102, servant à les réinitialiser, 20 actions pour l’ACE, voir tableau 14.3 page xvii et 12 pour le HPD, voir tableau 14.4 page xviii.

Il y a 6 registres présents dans les deux modules qui ont pour rôle de suivre l’état du module et d’obtenir des informations sur lui, voir tableau 14.5 page xviii. Pour l’ACE, il existe 22 registres accessibles par des requêtes d’état, voir tableau 14.6 page xix et pour le HPD, 16 registres voir tableau 14.7 page xix.

Lorsque le registre 152 d’un module contient un nombre supérieur à 1000, cela si- gniﬁe qu’une erreur est survenue, diﬀérents codes d’erreur disponibles dans le registre 155 ont pu être mis en évidence dans les modules, voir tableau 14.8 page xx.

Il existe d’autres commandes que celles données ici, en particulier les modes auto- matiques permettant le séchage et l’équilibrage automatisé des cartouches, mais ilest possible de les simuler avec toutes les commandes décrites ici.

7.2.2.3 Injection manuelle de trames

L’injection manuelle de trames peut être réalisée à partir de n’importe quel logiciel de type terminal permettant d’envoyer des séquences brutes. Sur le Prospekt2

101 Request: 4/10/2012 4:25:34 PM.38664 (+0.0251 seconds) 02 33 30 30 31 35 31 30 36 30 30 30 30 30 30 03 .30015106000000. Answer: 4/10/2012 4:25:34 PM.41164 (+0.0251 seconds) 06 . Request: 4/10/2012 4:25:34 PM.43064 (+0.0188 seconds) 02 33 30 30 31 31 30 30 31 30 30 30 31 35 32 03 .30011001000152. Answer: 4/10/2012 4:25:34 PM.46264 (+0.0314 seconds) 02 33 30 30 31 30 31 35 32 20 20 30 32 31 34 03 .30010152 0214. Figure 7.5 – Prospekt2 - Analyse des trames, exemple des deux types de requêtes, état et action et leurs réponses.

Tableau 7.6 – Requêtes d’action communes aux deux modules.

Code action Argument Fonction Requête 152 Réponse 0156 000001 Mode panique / Sortie d’erreur Oui 0x6 5100 000000 Réinitialiser Oui 0x6 disponible, la liaison série est assurée avec un boitier DE-304 de la société Moxa (http://www.moxa.com) procurant 4 ports série par l’intermédiaire d’une connexion ethernet. L’avantage de ce périphérique est d’être pilotable depuis un système Micro- soft Windows mais aussi un GNU/Linux. On peut utiliser le logiciel PComm lite fourni par la même société pour envoyer les trames. C’est la solution qui a été utilisée au début du développement. Mais par la suite un petit outil en Python (http://www.python.org) permettant de visualiser plus facilement les réponses de l’appareil a été développé. Cette étape a montré que l’appareil fonctionne eﬀectivement de manière synchrone, et que la grande quantité de requêtes d’état envoyées par le logiciel lui servent juste à indiquer quand l’action est terminée. Cette étape a aussi permis de mettre en évidence les séquences d’initialisation des diﬀérents modules.

7.2.2.4 Réalisation d’un simulateur

Le simulateur est un outil capable de prendre la place du Prospekt2. Il est pour cela nécessaire qu’il gère diﬀérentes fonctions : – Comprendre les requêtes d’action et d’état – Simuler le fonctionnement de chacune des parties, par exemple conserver le volume aspiré dans les seringues, les positions des vannes, les cartouches chargées… – Répondre de manière cohérente au logiciel utilisé pour le piloter Le simulateur, voir son fonctionnement ﬁgure 7.6, a montré que l’ensemble des re- quêtes mises en évidence correspondent bien à ce qu’attend le logiciel de pilotage. Ilne

102 lui manque que les programmes internes, mais comme il a été expliqué précédemment, cela ne gène en rien l’utilisation de l’appareil.

Simulator

Module principal

Simulateur HPD

Simulator

Simulateur ACE

Box Logiciel Bruker prospektBox

Figure 7.6 – Simulateur de Prospekt2.

7.2.3 Création de Prosper

Suite à ce travail de rétro-ingénierie, il a été possible de développer un logiciel permettant de piloter cette machine depuis n’importe quel ordinateur, en particulier depuis un système GNU/Linux tel que celui qui a servi au travail après l’étape de récolte des données par Serial Port Monitor. Le langage choisi est le Python avec une interface Qt4 (http://qt.digia.com). Ce choix technique a été régi par différents avantages procu- rés par cette solution : – Code source de l’application disponible – Portabilité de l’application sur différentes plateformes (GNU/Linux, Apple Mac OS, Microsoft Windows…) – Système modulaire Or, l’avantage de Python et de Qt, en plus d’être disponibles sous licences libres, est la programmation par classes permettant de séparer les différents modules et leur excellente portabilité. La nouvelle version de Qt (version 5) à venir procurera d’avantage

103 de systèmes supportés, en particulier les tablettes tactiles dont celles d’Apple, confor- tant le choix de ce système d’interface pour répondre à la portabilité.

L’architecture interne du programme 7.7 a été pensée de manière à pouvoir ajouter et modiﬁer aisément des modules. On voit d’ailleurs sur ce schéma la pumpBox, qui est le module en charge du contrôle de la pompe Knauer secondaire. À noter qu’il n’a pas été nécessaire d’eﬀectuer de rétro-ingénierie pour piloter cette pompe, le fabriquant ayant donné toutes les informations nécessaires dans le manuel d’utilisation.

Prosper

Module principal

Actions Qt (GUI) Qt (Signals) Logger

Worker

Box Pompe pumpBox

Queue Communicator

Box Prospekt prospektBox

Figure 7.7 – Architecture interne de Prosper.

7.3 Applications

7.3.1 Mise au point

Après la mise au point du système hydraulique et de Prosper, il a fallu tester le sys- tème de cartouches et les diﬀérentes phases disponibles. Pour cela, le détecteur UV de

104 Figure 7.8 – Fenêtre principale de Prosper. la chaîne CLHP-SM a été monté en aval du Prospekt2 afin à la fois de vérifier si les composés se fixent bien sur les cartouches, mais aussi déterminer la capacité de charge de chacune.

Afin de s’assurer d’une fenêtre de fixation la plus large possible, l’échantillon était un extrait brut de sarments de vigne dilué à 1 mg/mL dans un mélange Eau/Métha- nol/Acétate d’éthyle (50 : 35 : 15 v/v/v) permettant de mimer approximativement la phase inférieure du système ARIZONA-L (voir tableau 9.5). Cet extrait étant très riche en stilbénoïdes absorbants très bien en UV, il est idéal pour observer la fixation et l’élu- tion des stilbénoïdes sur les cartouches. C’est un mélange Eau/Acide formique 0.1% (v/v) qui a été utilisé comme solvant pour la pompe secondaire, permettant de pousser l’échantillon injecté dans la boucle vers la cartouche. L’injection de l’extrait se fait par 100 µL d’extrait injecté dans une boucle de 100 μL dans un flux secondaire de 1 mL/min tous les 900 μL, soit 54 secondes.

Les différentes phases testées, voir tableau 7.7 n’ayant pas apporté une fixation suffisante, une recherche plus approfondie sur les phases disponibles a montré que l’Oasis HLB, par sa bonne capacité de fixation de composés sur une large gamme de polari- tés pouvait être une solution. Et effectivement, sur les échantillons fournis par la so- ciété Waters (http://www.waters.com), la fixation s’est avérée exceptionnelle, jusqu’à 1 mg d’extrait brut par cartouche, allant bien au delà des autres cartouches qui pour

105 Figure 7.9 – Fenêtre de choix des cartouches de Prosper. la meilleure, Resin-SH, n’a ﬁxé que 200 μg, qui plus est avec une importante perte à chaque injection de 100 μg.

Suite à un problème avec l’acquisition, les résultats de ces tests n’ont pu être en- registrés, mais un test de rétention global avec 1 mg d’un extrait de Gnetum africanum, contenant principalement des stilbénoïdes méthylés est présenté dans le tableau 7.8 et les chromatogrammes correspondants sont présentés dans la figure 7.10, les différents pics ont été intégrés avec DataAnalysis 3.1 de la société Bruker Daltonics (http://www.bdal.de). On remarquera que les produits plutôt polaires sont bien retenus, alors que ceux en fin de chromatogramme, les composés les plus méthylés, sont moins bien retenus.

7.3.2 Application à la mise au point de méthodes de séparation

Cette technique a été par la suite mise en pratique sur plusieurs extraits. Troisex- traits de Fallopia multiﬂora (FM-R,FM-T,FM-F) travaillés avec Marion Brunel, stagiaire en Master 2, et dont l’obtention a été décrite précédemment, l’extrait brut réalisé en début de thèse de Vitis vinifera var. Merlot, une fraction de cet extrait et un extrait de Gnetum Africanum.

Les diﬀérents extraits ont été étudiés par un couplage CPC-UV-SM-EPS-RMN, combinant les deux approches de couplages décrites dans cette thèse. Ce couplage permet

106 Tableau 7.7 – Phases Spark testées.

Type Granulométrie CN 8 μm C2 8 μm C8 8 μm C8 EC-SE 8 μm C18 8 μm C18 HD 7 μm Resin GP 10-12 μm Resin SH 25-35 μm d’obtenir à la fois les données spectrales UV, les données de masse et le stockage sur cartouche permet lui d’obtenir les spectres RMN.

Concernant les extraits de Fallopia multiﬂora, trois séparations utilisant le même sys- tème de solvants, ARIZONA-C, ont été réalisées dans le but de puriﬁer en une étape le 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbène-2-O-β-glucopyranoside (THG) et d’autres composés d’in- térêt. Les résultats sont présentés dans le tableau 7.9.

On peut voir sur la ﬁgure 7.11 la diﬀérence entre chaque partie de plantes, en particulier sur la feuille ne contenant quasiment pas de THG. Par ailleurs, la masse de 429 indiquée correspond à l’adduit sodium [M + Na]+ du THG. L’ion à 581 présent dans la racine est l’adduit sodium d’un composé de masse [M + H]+ 559 qui ne représente en fait qu’un composé minoritaire dans la fraction correspondante. À ce jour, ce composé n’a pas pu être isolé. L’ion à 369 présent dans l’expérience sur les feuilles est l’adduit sodium du 2,3,4,6-tetrahydroxyacetophenone 3-O-β-D-glucoside (THG) isolé par ailleurs (Brunel 2012). L’autre ion présent dans les feuilles, à 487 est l’adduit sodium d’un com- posé pour le moment inconnu car très minoritaire, 4 pics visibles en CLHP contribuent à ce signal.

Le spectre proton du THG piégé sur les cartouches lors de l’expérience sur les tiges est donné sur la ﬁgure 7.12, il a été réalisé avec une séquence proton simple (pulse 90°) en un seul scan. À noter qu’il est tout à fait possible de faire l’acquisition de spectres 2D tels que des COSY et des HSQC, voir ﬁgure 7.13. Ces deux spectres 2D ont été réalisés sur les cartouches correspondant au THG dans la racine, la COSY telle qu’elle est pré- sentée a été acquise en moins de 5 minutes, il est possible de l’obtenir en 2 minutes 30

107 Tableau 7.8 – Rétention de 1mg d’un extrait de Gnetum africanum sur colonne HLB pour Prospekt2.

Composé RT [min] Aire brut Aire après HLB % Récupération 1 12.7 156.86 93.278 59.5 2 15.1 1766.97 1314.284 74.4 3 17 311.62 226.391 72.6 4 23.4 2095.59 1718.351 82 5 25 839.7 687.395 81.9 6 25.4 931.76 776.102 83.3 7 26.9 2073.01 1927.275 93 8 27.3 177.35 150.846 85.1 9 27.9 124.81 93.428 74.9 10 28.4 254.05 122.15 48.1 11 31.2 322.95 224.059 69.4 12 33.6 936.59 439.125 46.9 13 34.2 161.42 82.409 51.1 14 34.6 256.45 104.003 40.6 15 35.1 199.02 98.007 49.2 16 38.1 5804.24 3356.215 57.8 17 38.5 2251.32 1326.352 58.9 18 38.8 1430.75 762.491 53.3 19 39 993.55 163.975 16.5 20 39.2 601.86 138.29 23 21 39.4 434.53 82.962 19.1 22 39.5 216.21 43.667 20.2 23 39.7 1126.34 254.199 22.6 24 39.8 922.88 261.902 28.4 25 40 647.45 155.281 24 26 40.1 405.87 41.911 10.3 27 40.5 204.99 41.816 20.4 28 44.3 201.33 38.012 18.9

avec une qualité suﬃsante pour faire la détermination structurale de cette molécule. À noter que sur le spectre HSQC, il n’a pas été possible de voir, sur l’acquisition faite, les signaux du sucre. Il est possible qu’une mauvaise calibration des impulsions carbone et des temps de relaxation soit en cause.

La ﬁgure 7.14 montre l’eﬀet de l’échantillonage d’un pic CPC sur le spectre UV ac- quis après le Prospekt 2. Chaque saut représente un cycle d’injection (passage en mode injection de la boucle).

108 Intens. [mAU] Après HLB 16

500

400

300 17

200 7 4 18 2 100

5 2324 6 12 19 25 3 11 20 1 8 910 131415 21222627 0 Intens. [mAU] Avant HLB 16

800

600

17 400

18 7 23 200 4 24 2 19 25 12 56 20 212226 1 3 8 910 11 131415 27 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Time [min]

Figure 7.10 – Rétention de 1mg d’un extrait de Gnetum africanum sur colonne HLB pour Prospekt2.

7.3.3 Application au mode ascendant

Quelques essais non présentés ici ont été effectués en mode ascendant. Leproblème dans ce mode est la force élutive des solvants qui est trop importante pour piéger les composés sur la cartouche. Parmi les diverses approches envisagées, une a été réalisée et a consisté à réaliser un système de dérivation présenté dans la figure 7.15. Celui-ci fonctionne sur le principe d’une dérivation d’une petite partie du flux de la pompe vers la boucle, et d’une grande partie du flux dans laquelle se déverse la sortie de la boucle, cette technique présente cependant l’inconvénient de requérir un temps de stockage sur cartouche bien plus long. Le temps nécessaire pour vider le contenu de la boucle

109 Tableau 7.9 – Tableau récapitulatif des CPC avec système ARIZONA-C sur diﬀérentes parties de Fallopia multiﬂora. Adapté de (Brunel 2012)

Organe de la plante Racine Tige Feuille Masse injectée (mg) 200 200 200 Rendement après lyophilisation (% m/m) 73.7 76.4 80.9 Masse de la fraction contenant le THG (mg) 50.5 7.5 traces

Intens. [mAU] CIE 581-581.2 + CIE 429-429.2 + 1250

1000

750

500

250 Racine Fallopia C 200mg

Intens.0 [mAU] CIE 429-429.2 + CIE 487-487.2 + 1250 CIE 369-369.2 +

1000

750

500

250 Feuille Fallopia C 200mg

Intens.0 [mAU] CIE 429-429.2 +

1250

1000

750

500

250 Tige Fallopia C 200mg

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Time [min]

Figure 7.11 – Séparation d’extraits de trois parties de Fallopia multiﬂora par CPC avec le système ARIZONA-C. Les bandes colorées représentent les chromatogrammes d’ion extraits sur la zone de masse indiquée réalisées avec CIERamp.

110 0.0070

0.0065

0.0060

0.0055

0.0050

0.0045

0.0040

0.0035

0.0030 NormalizedIntensity

0.0025

0.0020

0.0015

0.0010

0.0005

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Chemical Shift (ppm)

Figure 7.12 – Spectre proton CPC-EPS-RMN du THG issu de la tige dans l’acétonitrile deutéré.

3.0 90

3.5 95

4.0 100

4.5 105

5.0 110

5.5 115

6.0 ChemicalF1 (ppm) Shift F1 ChemicalF1 (ppm) Shift 120

6.5 125

7.0

130

7.5

135

8.0

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 F2 Chemical Shift (ppm) F2 Chemical Shift (ppm)

Figure 7.13 – Spectres COSY et HSQC par CPC-EPS-RMN du THG issu de la racine.

étant inversement proportionnel au ratio de séparation dans les deux branches. Même si la rétention est moins bonne, il a été possible d’observer une ﬁxation de composés sur la cartouche. L’ajout d’un système de mélange dynamique pourrait permettre de réduire ce temps. On peut aussi imaginer un système de stockage par boucles combiné à cette approche, permettant de réaliser les opérations de dilution et de stockage surla cartouche de manière décorrélée.

111 Intens. [mAU]

150

125

100

0 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Time [min]

Figure 7.14 – Eﬀet de l’échantillonage sur EPS sur le chromatogramme UV.

7.4 Conclusion et perspectives

Dans cette partie, nous avons montré le développement d’une nouvelle approche pour coupler la CPC à la RMN au travers d’un système EPS. Nous avons du pour réaliser cela, découvrir le protocole utilisé par l’appareil servant à gérer automatiquement le stockage sur cartouches d’EPS.

Cette technique, on l’a vu, va cependant nécessiter quelques améliorations, enpar- ticulier en ce qui concerne la capacité de ﬁxation des composés sur les cartouches. Au

112 W 1 2 8 Azote 3 7 Pompe 4 5 6 ACE-V3 W Sortie CPC

ACE-PG 12 12 D 3 6 3 6 4 5 4 5 ACE-V1 ACE-V2 ACE-V4 Détecteur/Collecte W ACE-PD

Figure 7.15 – Montage en dérivation pour permettre l’utilisation de la CPC-EPS en mode ascendant. vu de la longueur des pics chromatographiques en CPC, on peut envisager l’utilisation de plusieurs phases diﬀérentes, ce qui est possible avec cet appareil de manière assez facile en utilisant la vanne ACE-V2. Qui plus est, la compatibilité des phases solides avec les solvants CPC est un point à prendre en compte. Même si une approche a été proposée, celle-ci présente toute de même des inconvénients majeurs au niveau de la durée et du risque de contamination croisée. Un autre point à prendre en compte et qui n’a pas été détaillé ici est l’utilisation de solvants deutérés, qui bien que drastique- ment réduite par rapport à d’autres techniques, pourrait l’être encore plus en utilisant des cartouches avec un volume réduit, en réduisant les volumes morts et volumes de connexion de l’appareil et en utilisant une sonde plus petite.

L’avantage de cette conception est aussi de pouvoir coupler cette technique à d’autres. C’est ce type de couplage combinant SM, UV et RMN qui a été mis à pro- ﬁt dans la partie suivante.

113 Cinquième partie

Développements de systèmes de solvants pour la Chromatographie de Partage Centrifuge

114 Chapitre 8

Introduction

La CPC, de par sa conception est capable d’accepter tout système biphasique à partir du moment où les viscosités ne sont pas trop élevées, que le temps de séparation des deux phases après mélange ne soit pas trop long et que les densités de chaque phase soient suﬃsamment diﬀérentes pour assurer leur séparation.

L’idée derrière le travail présenté dans cette partie est de proposer des outils permettant à la fois de mettre au point et de choisir des systèmes de solvants, maisaussi des méthodes d’élution adaptées. Cet ensemble permettant alors d’élargir la gamme de séparation et/ou la sélectivité vis-à-vis de composés d’intérêt.

L’un de ces développements a été la mise au point d’une stratégie de dosage des systèmes de solvants par RMN. Les approches techniques pour élargir la gamme de séparation ont, quant à elles, consisté à exploiter trois types d’élutions diﬀérents, une nouvelle approche, le « back-step » et deux approches déjà existantes, l’élution par paliers et par gradients.

Dans cette partie, la convention d’abréviation des solvants utilisée sera celle utili- sée par le Dr. Friesen et le Dr. Pauli (J.B. Friesen et G.F. Pauli 2007a) et proposée à une discussion sur la normalisation de la terminologie en chromatographies liquide-liquide centrifuges lors du congrès CCC 2012 (Berthod Alain et al., à paraître). Les noms et abréviations proposés dans ce dernier article sont présentées dans le tableau 8.1. L’in- térêt de ces abréviations, au-delà d’une normalisation, est leur possibilité de prononcer les systèmes de solvants, comme HepEMWat et HepEMAniWat, pour la composition des systèmes ARIZONA discutés dans cette partie.

115 Tableau 8.1 – Convention utilisée pour l’abréviation des noms de solvants.

Ac : Acétone iP : Isopropanol Ani : Acétonitrile M : Méthanol Bu : Butanol Mib : Methyl isobutyl cétone Cl : Chloroforme P : Propanol Dim : Dichlorométhane Pet : Éther de pétrole E : Acétate d’éthyle T : Toluène Et : Éthanol Ter : Methyl tert-butyl ether H : Hexane Wat : Eau Hep : Heptane

116 Chapitre 9

Méthodologie de développement de systèmes

9.1 Dosage de solvants par spectrométrie RMN

Doser un système de solvants apporte plusieurs avantages. Le premier est d’ordre économique. En eﬀet, la plupart des systèmes sont donnés par leur composition globale. Ce qui oblige l’utilisateur à produire les deux phases à la fois, et ce, dans les proportions dictées par l’équilibre du système.

Par exemple, un mélange simple Acétate d’Éthyle (E)/Eau (Wat), donné en proportions volumiques 50 : 50 produira à 25 ℃ un système biphasique dont la composition est donnée dans le tableau 9.1 et dont le Ratio de phase est compris entre 0.9 (calcul) et 0.88-0.82 expérimentalement (Margraff 1994 ; Berthod, Hassoun et Ruiz-Angel 2005). Mais, sur d’autres systèmes cet écart peut être plus grand. Sur le sys- tème ARIZONA-Q, décrit ultérieurement, certains auteurs donnent un Ratio de phase de 0.68 (Berthod, Hassoun et Ruiz-Angel 2005).

Or, lors d’une expérience en CPC, on n’a pas forcément besoin de tout le volume de phases produites. L’une des solutions consiste à réutiliser l’excédent pour rincer la colonne après utilisation.

117 Une autre solution est de doser la composition de chaque phase, aﬁn de produire chacune d’elles dans la quantité nécessaire ou d’avoir la composition du système biphasique correspondant aux quantités voulues.

L’autre avantage de connaître cette composition, est de pouvoir créer de nouveaux systèmes, de corréler le comportement de certains composés à cette composition et de créer des systèmes intermédiaires.

Tableau 9.1 – Composition du système Acétate d’Éthyle/H2O 50 : 50 à 25 ℃, selon les données de (Góral et al. 2009 ; WebBook de Chimie NIST 2012 ; González et al. 2007), les ratios v/v correspondent aux volumes initiaux.

50 : 50 (v/v) E/Wat T = 25 ℃ E/Wat (M/M) E/Wat (v/v) Phase supérieure 85.8 :14.2 97.1 :2.9 Phase inférieure 1.6 :98.4 8.1 :91.9

Dans le cas de systèmes binaires, en utilisant une pesée on peut obtenir de manière approximative la proportion de chaque solvant en considérant que le volume du mé- lange est égal au volume des parties seules. Or, il existe un phénomène nommé le volume molaire d’excès qui fait qu’un mélange de 1 L d’eau (55.5 moles à 25 ℃) et 2 L d’éthanol (34.3 moles à 25 ℃) ne donne pas 3 L du mélange mais environ 2,9 L car le volume molaire d’excès de ce mélange à cette température est d’environ -1,2 mL par mole de mélange. Cette contraction volumique est principalement due à une réorgani- sation des molécules de solvants, et dans ce cas précis à la formation de liaisons hydro- gène. Mais ce phénomène peut aussi provoquer une augmentation du volume, comme dans le mélange éthanol/heptane (HADJ-ARAB 2010). Ainsi, si l’on souhaite obtenir la composition exacte de n’importe quel mélange de solvants, il est nécessaire de doser individuellement chacun de ses composants.

Il existe plusieurs stratégies pour connaître la composition de systèmes de solvants, les deux approches les plus utilisées semblent désormais être la CPG (Berthod, Hassoun et Ruiz-Angel 2005 ; Wu et al. 2012) et la RMN (Arce, Rodríguez et Soto 2004 ; Boudesocqe 2010 ; Mirkhani et al. 2011). Durant la phase préliminaire du projet, la CPG a été envisagée, mais les expériences réalisées n’ont pas apporté une précision suﬃsante en raison de colonnes peu adaptées et de détecteurs à disposition

118 n’étant pas sensibles à l’eau, l’un des composants des systèmes étudiés. Le problème principal des colonnes utilisées étant le gonflement progressif de la phase stationnaire, introduisant de grandes variations dans les aires mesurées, ainsi que des temps de ré- génération lents. Afin de mesurer la proportion d’eau présente dans le mélange, il a été nécessaire de faire appel à une autre technique, le système de titration de Karl-Fischer. Mais l’ensemble CPG/Karl-Fischer, de par les limitations énoncées et le fait de devoir combiner deux techniques différentes et non recouvrantes sur les résultats n’a pas été retenu pour la suite de l’étude.

La RMN, a quand à elle pu répondre entièrement aux critères de répétabilité et de précision souhaités, mais surtout, elle permet de doser relativement 1 chacun des composants du mélange simultanément.

La méthodologie développée tente de réduire au maximum l’influence de paramètres extérieurs, et en particulier celle de la température. Bien que les systèmes de solvants dans le domaine de la CPC soient toujours donnés en volumes, la température est rare- ment donnée avec, ce qui peut constituer certaines difficultés pour obtenir des valeurs cohérentes. La manipulation de petits volumes de solvants de manière précise et répé- table est particulièrement difficile. Pour s’affranchir de ce problème, ce travail a été réalisé en prenant les systèmes décrits dans la littérature, en convertissant ces don- nées en masses, et en travaillant par la suite sur les rapports molaires et les masses seulement. Les mélanges de solvants ont ainsi tous été réalisés à l’aide d’une balance de précision.

Mais la température influe aussi sur la formation du système biphasique, en particulier dans ce cas précis sur la distribution des composants dans chacune des phases. N’ayant pas pu, pour des raisons d’ordre pratique, réaliser une régulation précise en température, on considère que toutes les phases d’équilibrage ont été réalisées à 23℃ ± 2℃. Les variations de température au sein de la conception d’une même série de sys- tèmes étaient très faibles, < 0.5℃. Mais les différentes séries ayant été réalisées dans des périodes relativement séparées, les variations de température ont pu être plus importantes. L’erreur maximale de ± 2℃ présentée devrait assurer une marge d’erreur suffisante, la mesure et la régulation de température de la pièce étant précise à ± 1℃.

Une fois les systèmes de solvant préparés, mélangés et équilibrés, 20 μL de chaque phase est mélangé à 180 μL d’acétone deutéré et ce mélange est placé dans un micro- tube de 3 mm (Bruker, Allemagne). L’acquisition des spectres RMN est faite avec un seul 1. Il est aussi possible de faire un dosage absolu, mais cela n’a pas été utilisé ici.

119 scan, un temps d’acquisition de 10 s, permettant la relaxation complète du signal, une fenêtre suffisamment large pour éviter les effets de filtres 1 et un gain automatique pour éviter tout problème de distorsion 2. Le dosage étant fait de manière relative, ce sont les seuls paramètres importants à prendre en compte. Il est possible d’utiliser d’autres solvants deutérés que l’acétone, à partir du moment où il n’est pas présent dans les sys- tèmes à doser. On peut aussi utiliser des tubes à double paroi, évitant de faire le mélange et permettant d’économiser le solvant deutéré. Il est aussi possible de ne pas utiliser de solvant deutéré du tout, mais on s’expose alors à des problèmes de calibration du champ magnétique (shim) et de ré-émission de l’échantillon pouvant être gênants.

L’autre avantage de la RMN par rapport aux détecteurs utilisés en CPG est l’absence de toute courbe de calibration. En eﬀet, les massifs correspondants à chaque groupements sont proportionnels au nombre de protons du groupement considéré et leur quantité, selon la formule :

A = k · χh · N (9.1)

A : Aire du massif considéré, N : nombre de molécules, χh : nombre de protons du groupement, k : facteur expérimental ﬁxe avec un appareil donné et une méthode donnée.

Ainsi, on peut obtenir les rapports molaires de chacun des composants du système en utilisant la formule :

Aj Aj k·χh,j χh,j χj = = (9.2) Pn Ai Pn Ai i k·χh,i i χh,i

χj : ratio molaire du solvant j dans le mélange, χh,j : nombre de protons du groupement d’aire Aj considéré.

1. Effets de filtre qui ne sont plus vraiment un problème désormais avec les filtres numériques. 2. Il est aussi possible de régler toujours le gain sur une même valeur faible, permettant ainsi d’avoir des valeurs absolues plus proches d’une acquisition à une autre.

120 1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4 NormalizedIntensity 121 0.3

0.2

0.1

0 100.00 25.53 21.378.51 150.0033.08 441.76 265.05150.01

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm)

Figure 9.1 – Spectre RMN d’un mélange Hep/E/M/Wat. Ainsi, à partir du spectre RMN présenté sur la ﬁgure 9.1, on obtient les résultats donnés dans le tableau 9.2. Ces valeurs sont proches de la composition de la phase su- périeure du système ARIZONA-M (voir tableau 9.4) et sont cohérentes avec les valeurs publiées dans (Berthod, Hassoun et Ruiz-Angel 2005) utilisant l’approche CPG/Karl- Fischer. L’échantillon était en fait un système préparé par mesure de volumes et non par pesées.

Tableau 9.2 – Analyse des données de la ﬁgure 9.1

Composition du système Hep E M Wat Proportions molaires 38.97 44.10 7.51 9.42 Proportions volumique à 25℃ 54.37 41.12 2.90 1.61

L’intérêt de connaître la composition des phases est aussi très important au regard de développements récents dans les modèles et logiciels de modélisation moléculaire, et en particulier ceux utilisant le modèle COSMO-RS, permettant de prédire avec une assez bonne précision les coeﬃcients de partage de composés dans un système donné (Hopmann, Arlt et Minceva 2011 ; Hopmann, Frey et Minceva 2012).

9.2 Systèmes dérivés des ARIZONAs

Il existe un très grand nombre de systèmes de solvants biphasiques possibles (US Department of Commerce 2012). Mais l’utilisateur de CPC est limité à des systèmes de solvants compatibles avec son appareillage, son environnement de travail, ses ressources et la nature des composés à séparer. Au niveau de l’appareillage, l’utilisateur est pour l’instant limité à des gammes restreintes de températures, de viscosités et de diﬀérences de densités, mais aussi de compatibilité chimique si il utilise des tubes de connexions en Poly(etheretherketone) (PEEK), ces derniers se dégradant rapidement avec les solvants chlorés. Au niveau de l’environnement de travail et des ressources, il faut que les solvants soient disponibles, économiquement rentables et peu toxiques. Certains solvants peuvent être bannis, restreints ou soumis à justiﬁcation d’usage au

122 sein d’industries, en particulier dans l’industrie pharmaceutique, voir la liste de l’ICH en annexe page 14.10 page xxi. En dernier lieu, il faut que les composés à séparer ne réagissent pas avec les solvants utilisés. Malgré tout ces points, il reste à l’utilisateur une gamme très étendue de systèmes possibles. Pour pouvoir choisir entre eux, il existe diﬀérentes approches dont certaines sont détaillées dans les ouvrages et thèses cités dans l’introduction de cette partie.

Ce travail est basé sur un développement de la gamme ARIZONA ; qui est une collection de systèmes, dont les prémices ont été publiés en 1991 (F. Oka, H. Oka et Y. Ito 1991). Ces systèmes sont une combinaison des deux systèmes binaires heptane/- méthanol, appelé Z dans cette série et acétate d’éthyle/eau appelé A, voir le tableau 9.3 et la figure 9.2. À partir du moment où un produit se trouve dans la phase métha- nol du système Z et dans la phase E du système A, son rapport de partage sera, dans un des systèmes de la gamme, adapté à une séparation en CPC. Il peut être intéressant de modifier ces systèmes afin d’améliorer soit leur sélectivité, soit leur capacité à dis- soudre un échantillon donné. En effet, en milieu de gamme, dans le cas d’un échantillon se dissolvant bien dans l’acétate d’éthyle et le méthanol mais peu dans l’eau et l’heptane, il se peut que l’échantillon soit peu soluble. Plusieurs approches ont été proposées pour augmenter la sélectivité comme remplacer le méthanol par de l’acétonitrile (Le Crouerour 2000) ou l’acétate d’éthyle par du methyl tert-butyl ether. De même pour le pouvoir de dissolution, le remplacement du système acétate d’éthyle/eau constituant la gamme par un mélange methyl tert-butyl ether/dimethoxyethane/eau (A.P. Foucault et Chevolot 1998). Cette dernière adaptation présentant l’inconvénient d’utiliser un éther, le dimethoxyethane, pouvant former plus de peroxydes que le methyl tert-butyl ether, assez stable dans ce genre d’utilisations.

L’objectif de ce travail a été de commencer l’étude de quelques systèmes ARIZONA dérivés dans lesquels le méthanol est remplacé en partie ou totalement par de l’acéto- nitrile. Une étude similaire est parue au cours de cette thèse, remplaçant le méthanol par de l’éthanol (Wu et al. 2012). Le but a été de développer une méthode d’analyse des systèmes dérivés, permettant à la fois une meilleure compréhension des mécanismes en jeu, mais aussi une éventuelle aide au choix des systèmes de solvants par l’utilisateur.

123 Tableau 9.3 – Composition volumique des systèmes ARIZONA.

Système (Hep+E)/Total Hep+M E+Wat Hep E M Wat A 0 0 1 0 50 0 50 B 0.05 1 19 2.5 47.5 2.5 47.5 C 0.1 1 9 5 45 5 45 D 0.14 1 6 7.1 42.9 7.1 42.9 F 0.17 1 5 8.3 41.7 8.3 41.7 G 0.2 1 4 10 40 10 40 H 0.25 1 3 12.5 37.5 12.5 37.5 J 0.29 2 5 14.3 35.7 14.3 35.7 K 0.33 1 2 16.7 33.3 16.7 33.3 L 0.4 2 3 20 30 20 30 M 0.45 5 6 22.7 27.3 22.7 27.3 N 0.5 1 1 25 25 25 25 P 0.55 6 5 27.3 22.7 27.3 22.7 Q 0.6 3 2 30 20 30 20 R 0.67 2 1 33.3 16.7 33.3 16.7 S 0.71 5 2 35.7 14.3 35.7 14.3 T 0.75 3 1 37.5 12.5 37.5 12.5 U 0.8 4 1 40 10 40 10 V 0.83 5 1 41.7 8.3 41.7 8.3 W 0.86 6 1 42.9 7.1 42.9 7.1 X 0.9 9 1 45 5 45 5 Y 0.95 19 1 47.5 2.5 47.5 2.5 Z 1 1 0 50 0 50 0

9.2.1 Systèmes ARIZONA-Acétonitrile

Partant de là, est venue l’idée, en s’inspirant de travaux du docteur Céline Le Croué- rour (Le Crouerour 2000), de modiﬁer les systèmes ARIZONA en remplaçant le mé- thanol par de l’acétonitrile. Le choix a été fait de réaliser le remplacement en respectant la fraction molaire. On remplace ainsi une mole de méthanol par une mole d’acéto- nitrile. L’idée derrière cela est que le méthanol, étant un solvant protique, peut interagir avec l’eau et tous les composés pouvant former des liaisons hydrogène. Alors que l’acétonitrile, solvant aprotique interagit principalement avec son moment dipolaire.

D’ailleurs, malgré les apparences, l’acétonitrile n’est soluble dans l’eau que dans des conditions particulières. À -20℃ il se sépare de celle-ci, de même qu’en présence

124 Heptane AcOEt Méthanol Eau ABCDFGHJKLMNPQ R S T U VW X Y Z 100

% 60

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Ratio Heptane+Méthanol / Total

Figure 9.2 – Représentation graphique de la composition volumique des systèmes ARIZONA. d’une concentration forte de composés dissouts. C’est peut être ce phénomène qui est à l’origine des systèmes triphasiques observés à partir du système ARIZONA-M ou lorsque les systèmes riches en acétonitrile dérivés d’ARIZONA-L sont chargés avec un échantillon.

Cette étude a été réalisée sur 6 systèmes, de ARIZONA-G à ARIZONA-L. Lessys- tèmes ont été nommés de la façon suivante, la première lettre indique le nom du système d’origine, MA pour indiquer que l’on remplace le méthanol par de l’acétonitrile et un nombre indique la fraction de méthanol remplacée. Le tableau 9.4 recense les résultats en fraction molaire obtenus par dosage en RMN. Les colonnes indiquées O représentent les compositions originales (molaires) du système, les colonnes U correspondent à la composition de la phase supérieure et L à celle de l’inférieure. Le tableau 9.5 représente les mêmes valeurs, mais converties en ratio de volumes initiaux.

125 Tableau 9.4 – Résultats des mesures par RMN de quelques dérivés de la gamme ARIZONA.

% Moles HepO EO MO W atO AniO HepU EU MU W atU AniU HepL EL ML W atL AniL G 2.3 13.8 8.4 75.5 0 12.52 68.98 5.2 13.3 0 0 1.93 8.74 89.33 0 GMA0.25 2.3 13.8 6.3 75.5 2.1 11.31 64.2 3.97 14.38 6.14 0 1.84 6.66 90.44 1.07 GMA0.50 2.3 13.8 4.2 75.5 4.2 10.62 60.91 2.67 14.09 11.71 0 1.66 4.42 91.83 2.09 GMA0.75 2.3 13.8 2.1 75.5 6.3 9.88 57.17 1.27 14.8 16.88 0 1.36 2.24 93.55 2.85 GMA1.00 2.3 13.8 0 75.5 8.4 9.08 53.43 0 14.68 22.81 0 1.26 0 95.09 3.65 H 3 13.4 10.8 72.9 0 16.14 65.46 6.48 11.92 0 0 2.17 11.45 86.38 0 HMA0.25 3 13.4 8.1 72.9 2.7 14.71 60.85 5.03 12.35 7.07 0 1.96 8.58 87.94 1.52 HMA0.50 3 13.4 5.4 72.9 5.4 13.36 55.34 3.34 14.02 13.95 0 1.76 5.72 89.71 2.81 HMA0.75 3 13.4 2.7 72.9 8.1 12.27 52.24 1.63 13.5 20.37 0 1.57 2.96 91.57 3.91 HMA1.00 3 13.4 0 72.9 10.8 11.08 48.33 0 13.41 27.18 0 1.27 0 94.29 4.43 J 3.5 13 12.6 70.9 0 18.84 61.53 7.15 12.48 0 0 2.43 13.3 84.27 0 JMA0.25 3.5 13 9.4 70.9 3.1 16.94 56.48 5.6 13.22 7.76 0 2.23 10.01 85.81 1.96 JMA0.50 3.5 13 6.3 70.9 6.3 15.09 51.87 3.83 14.12 15.09 0 1.94 6.79 87.94 3.34 126 JMA0.75 3.5 13 3.1 70.9 9.4 13.47 47.69 1.87 14.4 22.57 0 1.52 3.38 90.54 4.55 JMA1.00 3.5 13 0 70.9 12.6 11.79 43.37 0 15.09 29.75 0 1.24 0 93.56 5.2 K 4.2 12.5 15.1 68.2 0 23.2 57.82 7.97 11 0 0 2.88 16.26 80.86 0 KMA0.25 4.2 12.5 11.3 68.2 3.8 20.53 52.52 6.33 12 8.62 0 2.67 12.4 82.46 2.46 KMA0.50 4.2 12.5 7.6 68.2 7.6 17.79 47.96 4.61 11.88 17.75 0 2.23 8.31 85.12 4.34 KMA0.75 4.2 12.5 3.8 68.2 11.3 15.16 42.56 2.28 13.69 26.31 0 1.7 4.13 88.54 5.63 KMA1.00 4.2 12.5 0 68.2 15.1 13.2 38.77 0 13.64 34.39 0 1.24 0 92.54 6.22 K1 4.8 12 17.5 65.7 0 27.75 54.48 8.26 9.51 0 0 3.63 20.12 76.25 0 K1MA0.25 4.8 12 13.1 65.7 4.4 24.27 48.81 6.68 11.85 8.39 0 3.23 14.51 79.07 3.19 K1MA0.50 4.8 12 8.7 65.7 8.7 20.46 43.43 4.79 12.46 18.85 0 2.66 9.67 82.15 5.52 K1MA0.75 4.8 12 4.4 65.7 13.1 16.91 38.39 2.4 14.39 27.91 0 1.92 4.93 86.31 6.83 K1MA1.00 4.8 12 0 65.7 17.5 14.22 34.57 0 14.1 37.1 0 1.22 0 91.58 7.21 L 5.2 11.8 18.9 64.1 0 31.69 51.99 8.89 7.43 0 0 3.79 20.67 75.54 0 LMA0.25 5.2 11.8 14.2 64.1 4.7 27.61 46.49 6.64 10.3 8.95 0 3.8 15.41 77.23 3.55 LMA0.50 5.2 11.8 9.5 64.1 9.5 22.81 41.45 5.09 11.76 18.89 0 3.07 10.48 80.36 6.09 LMA0.75 5.2 11.8 4.7 64.1 14.2 18.14 36.85 2.85 13.69 28.46 0 2.05 5.14 85.26 7.56 LMA1.00 5.2 11.8 0 64.1 18.9 14.53 31.67 0 14.34 39.46 0 1.25 0 91.08 7.67 M 6.2 11.1 22.3 60.4 0 39.26 45.46 7.92 7.36 0 0 4.75 24.46 70.78 0 Tableau 9.5 – Résultats des mesures par RMN de quelques dérivés de la gamme ARIZONA converties en pourcentage volumique à 25℃.

% Volumes HepO EO MO W atO AniO HepU EU MU W atU AniU HL EL ML W atL AniL G 9.96 39.92 10.05 40.06 0 20.3 74.73 2.33 2.64 0 0 8.8 16.49 74.71 0 GMA0.25 9.89 39.63 7.48 39.77 3.23 19.09 72.38 1.85 2.97 3.7 0 8.46 12.66 76.25 2.63 GMA0.50 9.81 39.34 4.95 39.48 6.41 18.32 70.21 1.27 2.98 7.22 0 7.74 8.52 78.52 5.21 GMA0.75 9.74 39.06 2.46 39.2 9.54 17.56 67.87 0.62 3.22 10.72 0 6.48 4.42 81.82 7.27 GMA1.00 9.67 38.78 0 38.92 12.63 16.59 65.22 0 3.29 14.9 0 6.1 0 84.44 9.46 H 12.57 37.5 12.5 37.43 0 25.57 69.28 2.84 2.31 0 0 9.54 20.82 69.64 0 HMA0.25 12.45 37.16 9.29 37.09 4.01 24.2 66.87 2.29 2.49 4.16 0 8.73 15.81 71.84 3.62 HMA0.50 12.34 36.83 6.14 36.75 7.94 23.05 63.79 1.59 2.96 8.6 0 7.97 10.71 74.51 6.81 HMA0.75 12.23 36.5 3.04 36.42 11.81 21.69 61.71 0.8 2.93 12.88 0 7.24 5.65 77.46 9.65 HMA1.00 12.12 36.18 0 36.1 15.6 20.24 59 0 3 17.75 0 6.07 0 82.61 11.32 J 14.37 35.66 14.3 35.67 0 29.69 64.79 3.11 2.41 0 0 10.39 23.52 66.09 0 JMA0.25 14.24 35.33 10.57 35.35 4.51 27.95 62.25 2.55 2.67 4.58 0 9.63 17.88 67.96 4.53 JMA0.50 14.07 34.93 7 34.94 9.06 26.05 59.82 1.83 2.99 9.31 0 8.56 12.39 71.17 7.88 127 JMA0.75 13.95 34.62 3.41 34.63 13.39 24.19 57.22 0.93 3.17 14.49 0 6.92 6.37 75.63 11.09 JMA1.00 13.79 34.22 0 34.24 17.75 22.14 54.41 0 3.47 19.97 0 5.85 0 81.01 13.13 K 16.74 33.3 16.64 33.32 0 35.48 59.09 3.37 2.06 0 0 11.78 27.52 60.69 0 KMA0.25 16.54 32.89 12.3 32.92 5.35 33.15 56.67 2.83 2.38 4.98 0 11.01 21.16 62.4 5.43 KMA0.50 16.33 32.46 8.16 32.49 10.56 30.2 54.39 2.16 2.47 10.77 0 9.45 14.56 66.15 9.84 KMA0.75 16.15 32.12 4.04 32.15 15.54 27.41 51.41 1.14 3.03 17.01 0 7.5 7.54 71.67 13.29 KMA1.00 15.96 31.75 0 31.77 20.52 24.87 48.81 0 3.15 23.17 0 5.76 0 78.8 15.45 K1 18.67 31.19 18.82 31.32 0 41.05 53.85 3.38 1.72 0 0 13.99 32.09 53.92 0 K1MA0.25 18.42 30.76 13.89 30.89 6.04 38.41 51.62 2.92 2.3 4.75 0 12.69 23.59 57 6.71 K1MA0.50 18.19 30.39 9.11 30.52 11.79 34.64 49.13 2.24 2.59 11.41 0 10.78 16.21 61.05 11.97 K1MA0.75 17.93 29.95 4.54 30.08 17.49 30.77 46.67 1.21 3.21 18.15 0 8.19 8.7 67.53 15.59 K1MA1.00 17.7 29.56 0 29.68 23.06 27.19 44.16 0 3.3 25.36 0 5.58 0 76.79 17.63 L 19.88 30.13 19.97 30.03 0 45.41 49.77 3.52 1.3 0 0 14.47 32.64 52.89 0 LMA0.25 19.59 29.7 14.79 29.59 6.33 42.5 47.81 2.82 1.94 4.92 0 14.48 24.29 53.99 7.24 LMA0.50 19.29 29.24 9.74 29.14 12.6 37.95 46.08 2.34 2.4 11.24 0 12.08 17.07 58.02 12.83 LMA0.75 19.04 28.86 4.76 28.76 18.58 32.74 44.44 1.42 3.03 18.36 0 8.59 8.91 65.54 16.95 LMA1.00 18.78 28.47 0 28.36 24.4 28.18 41.04 0 3.41 27.36 0 5.67 0 75.73 18.6 M 22.81 27.28 22.67 27.23 0 53.98 41.76 3.01 1.24 0 0 17.05 36.33 46.62 0 0.4

A_U M_U 0.3 U , M χ , 0.2 U , A χ

5 2 5 . 5 2 2 0 . 5 5 . 1 0 A 5 L 0 0.1 2 2 K . A 5 5 . . K A 5 M . M 2 0 0 . 1 0 . J M M 0 A 5 A 0 K A 5 L 5 0 H . 5 K 7 A 5 . A 5 M . 7 A . M 0 5 M 0 M . 5 J 5 7 1 0 G 0 A 7 M . L 0 M 7 H . A 7 K A . . K 0 A A G M 0 M A 0 M 0 J 0 M . 0 H A 0 0 M 0 A . . A 0 M . 1 1 L . G . 1 M 1 K 1 K A 1 M JM 1 A H A A A G A M M M M 1 M G H JM K K L 128 0

Figure 9.3 – Comparaison acétonitrile/méthanol dans les phases supérieures des systèmes étudiés. M

A_L M_L 1 L K 0.2

5 5 2 2 . . 0 K 0 A A M M L 5 1 2 . K L 0 _ J A M M χ 5 5 K . , 5 2 . 0 L 129 . 0

_ H A 5 0 A A 2 M . A

χ 5 M L 0 . JM 1 A 0 K 5 A 0.1 2 M G . H 5 M 0 . K 5 0 5 A . A 7 5 M 0 . 7 A M 0 . G 5 J 5 0 . M 7 A 0 . A H M A 5 5 0 M 7 7 1 M 5 . . A K L G 7 0 0 M . A A K 0 A M JM H M 0 . G 0 0 0 0 . . 0 . 1 . . 1 1 1 A 1 1 A A A A A M M M M 1 M G H JM K K L 0

Figure 9.4 – Comparaison acétonitrile/méthanol dans les phases inférieures des systèmes étudiés. 0.8

5 2 . G 0 5 5 2 A . . M 0 5 H 0 G A 7 A . 5 M M 5 2 0 . J . G A 0 H 0 5 0 5 . 7 2 M A . A . 1 K 5 G M 0 M 5 0 2 A J . . 0.6 A 0 A 1 M H 0 5 0 . 5 K 5 M A 7 M . G 1 . A 2 H M K 0 L . A J 0 M 5 A 5 . 0 M A 1 0 M 7 0 A . . K H M K A 5 5 J 1 0 M . E_L M 7 L A A 0 . 0 1 5 M M . 0 A E_U JM 1 K 7 K A 0 M . A . L M L 0 - M 1 1 A

U K A , K 0 M . E M 130 L 1 χ 0.4 1 K A M L

0.2

5 2 5 5 5 . 5 5 5 5 . 7 2 5 5 2 5 2 5 0 . 0 . 5 2 5 . 5 7 5 . 5 0 . . 7 . . 7 0 . . 0 2 5 . 7 0 A 0 0 . 0 . . 0 . . . 7 0 0 . . A 1 0 . 0 0 0 1 0 0 1 . . 0 0 A A 0 A 0 0 A 1 M M A A 1 A A A A A A A 0 1 A A 1 M A A A M A 1 1 M M A M M M M M A A M K 1 M L L M M M M M K K M M K K 1 L M G H H J J JM M K K L M G G G G H H H J JM K K K L 0

Figure 9.5 – Composition en acétate d’ethyle des phases des systèmes étudiés. 1

0.8

0.6 L

- W_L U , W_U 131 W χ 0.4

5 5 5 7 7 0 5 5 5 . 0 5 2 5 . . 5 5 5 . . . . 7 0 5 0 5 7 0 2 5 0 7 0 0 1 2 . . 5 7 . . . . . 1 . . 0 0 . 0 2 . . 2 5 A A 0 1 . 1 . . 0 1 0 0 A 5 5 0 1 A A A 0 A 0 0 2 . A A 0 A 0 0 A A A M M . A M M A A A A 0 A 0.2 M M M A A A 1 1 0 M G M M M JM M M M M A M G G G M H JM J 1 K K A L G H H JM M M K K 1 L H K M H J K K K M L K 1 L K L M

Figure 9.6 – Composition en eau des phases des systèmes étudiés. 0.5

0.4 M

5 L 2 . 5 0 2 A . 1 0.3 0 M K L A 5 . M 5 5 0 . U 2 1 , A . K 0 p 0 e K A M 5 5 A L 132 H 5 M 7 7 . . . χ 5 M 1 0 0 0 2 K K 5 . 5 A A A 0 7 0 2 . . . J 5 M M M 0 A . . 5 0 1 L 0.2 0 5 K 1 . 5 0 0 1 M 7 A . A 5 A 7 J K 0 A . A H . 1 2 M 0 M M . A 0 0 0 5 5 . M K A M J A . 1 0 . H A L 7 M 1 1 K 0 . M A 0 M H M A J A A 0 . K G M A 1 H M M M J G A M H G M G 0.1 G

Figure 9.7 – Composition en heptane des phases supérieures des systèmes étudiés. Un travail est en cours afin d’utiliser ces données pour créer un modèle. La plupart des valeurs ont pu être modélisées par des équations relativement simples en utilisant le logiciel Eureqa (http://www.nutonian.com) auquel sont fournies les compositions des systèmes et des systèmes dont ils sont dérivés. Ce logiciel permet, à partir d’un jeu de données de rechercher des équations pouvant relier un paramètre aux autres. Les premiers essais de modélisation du comportement avaient été réalisés avec des réseaux de neurones, mais l’aspect « boîte noire » du réseau a fait que l’approche par équations a été préférée. Bien que le logiciel donne des équations dont la réponse corresponds statistiquement à ce que l’on cherche, il reste à vérifier et à comprendre le rôle des différents paramètres.

HepL = 0

2 EL = (0.002407 + MO ∗ E0L)/(0.1979 + 1.428 ∗ MO), R²=0,9852, erreur maximale 0,4 %

ML = M0L ∗ (1 − ratio), R²=0,9996, erreur maximale de 0,5 %

WL = W 0L + (0.5888 ∗ ratio ∗ M0L − 2.251 ∗ MO ∗ AO)/W 0L, R²=0,9976, erreur maximale de 0,9 %

AL = AO ∗ (0.4138 + 2.301 ∗ MO), R²=0,9985, erreur maximale de 0,2 %

HU = H0U ∗ (1 − 2.891 ∗ AO) − 0.001693, R²=0,9992, erreur maximale 0,4 %

2 EU = E0U − 0.1933 ∗ ratio ∗ MO − 3.801 ∗ AO ∗ E0U , R²=0,9986, erreur maximale 0,9 %

MU = MO ∗ (0.7584 + 0.7704 ∗ AO − H0U ), R²=0,9969, erreur maximale 0,5 %

WU , Pas d’équation simple trouvée, problème dans le dosage ? Erreur supérieure à 1 %

AU = 3.913 ∗ AO ∗ E0U , R²=0,9987, erreur maximale 0,9 %

Avec, ratio : rapport de remplacement du méthanol par l’acétonitrile, X0L : composition en solvant X de la phase inférieure du système ARIZONA dans le système sans acétonitrile, XO : composition en solvant X du système considéré.

133 Ces équations peuvent ne pas refléter les phénomènes sous-jacents, et ne les re- flètent d’ailleurs certainement pas, mais elles pourraient permettre de trouver les compositions de tous les systèmes intermédiaires, et ainsi éviter à l’utilisateur d’affiner ses séparations en corrélant la proportion d’acétonitrile des systèmes qu’il a téstés au comportement des coefficients de partage de ses composés. Il sera nécessaire pour valider ces équations d’obtenir plus de points pour chaque valeur, ce modèle n’ayant été réa- lisé que sur les résultats d’une seule répétition.

134 Chapitre 10

Élution par gradients-inverses (back-gradients) et pas-inverses (back-step)

Les pas et les gradients sont les transitions typiques en CPC entre une phase et une autre, mais toujours dans le sens d’une élution plus forte (Renault et al. 1997 ; Marston et Hostettmann 2006 ; Ignatova et al. 2011). L’approche utilisée dans cette étude a consisté à utiliser des gradients ou des pas dans le sens inverse de la force élutive. C’est pour cette raison qu’ils portent le nom « back-step » et « back-gradients ». L’expérience la plus représentative a été une CPC avec un système ARIZONA-K durant laquelle un back-step avec de l’eau a été eﬀectué. Après un volume d’élution correspondant à Vmobile/2, la phase mobile a été commutée vers de l’eau, préalablement équilibrée avec la phase inférieure du système K, durant un même volume d’élution de

Vmobile/2. Après cela, un retour à la phase mobile du système initial a été eﬀectuée.

Le but de ce travail était d’obtenir de la manière la plus efficace des composés purifiés à partir d’un extrait brut de racine de vigne (voir chromatogramme figure 10.1), avec comme objectif de réduire au maximum le nombre d’étapes nécessaires.

La ﬁgure 10.2 est une représentation de la composition des diﬀérentes cellules d’une colonne virtuelle après une élution correspondante à un demi volume de phase mobile

135 Intens. [mAU] x105

1.5

1.0

0.5

0.0 5 10 15 20 25 30 35 40 Time [min] EIC 229-230 + EIC 455-456 + EIC 681-682 + EIC 907-908 + Figure 10.1 – Chromatogrammes de l’extrait de racine de vigne, données UV et chromatogrammes d’ion extraits en bandes obtenus avec CIERamp. en utilisant les coeﬃcients de partage obtenus avec le système ARIZONA-K (voir tableau 10.1). La zone en jaune, ajoutée manuellement est là pour représenter la zone des composés peu retenus et qui doivent être élués lors du back-step.

0.4 Phase mobile

0.3

0.2

0.1

0.0 Phase stationnaire −0.1

−0.2

−0.3

−0.4

−0.5 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Figure 10.2 – Simulation du contenu de la colonne pour une élution correspondante à la moitié de la phase mobile.

On remarquera un écart dans les coeﬃcients de partage selon la technique utilisée dans le tableau 10.1, les diﬀérentes hypothèses vis-à-vis de cet écart sont : – perte de phase stationnaire dans le cas du système ARIZONA-L, particulièrement touché par ce phénomène – co-élution avec d’autres composés

136 Tableau 10.1 – Tableau des coeﬃcients de partage des composés étudiés dans les systèmes ARIZONA indiqués. Les nombres entre parenthèse sont les coeﬃcients recalculés depuis le chromatogramme.

(+)-(E)-ε-Viniférine (1) Picéatannol (2) Mélange de trimères (3) Vitisine B (4) K (descendant) 3,33 (2,70) 1,15 (1,18) 1.28 (1,47) 2,94 (2,78) L (ascendant) 2,27 (1,52) 3,70 (2,86) 6,67 (4,55) 5,26 (4,00)

Il ne semble pas possible que ce soit le volume d’injection qui perturbe cette mesure, en effet, le volume d’injection augmente le coefficient de partage apparent, effet opposé à celui qui est aperçu ici.

Dans le cas de l’injection de plus de 500 mg dans le système ARIZONA-L, une perte totale de la phase stationnaire est observée, ce système n’est donc pas indiqué pour des séparations importantes. Ceci est très certainement dû à une déstabilisation de l’équi- libre des phases par une formation d’une émulsion stable, une géliﬁcation (observée dans certains tubes) ou une réduction de l’écart de densité des phases. Un essai en mode dit « sandwich », consistant à injecter l’échantillon avant la phase mobile n’a montré aucune amélioration, de même que des changements de volume injecté et de rapport des phases de l’échantillon.

Dans le cas d’une injection plus réduite (300 mg), on constate une co-élution importante des composés (1) et (2) ainsi que des composés (3) et (4). L’ensemble de tous ces éléments fait que le système ARIZONA-L n’est pas adapté à une première séparation de l’extrait. La rétention de phase stationnaire est dans ce cas de 60%.

Le système ARIZONA-K quand à lui n’a pas montré ces défauts de stabilité, malgré le fait qu’il ne soit pas capable de séparer les composés individuellement. On obtient en eﬀet les composés 2 et 3 ensemble, de même que les composés (1) et (4). Les valeurs de rétention de phase stationnaire sont restées proches de 63 % pour des injections jusqu’à 1 g, l’intérêt de ce système se situe donc au niveau de sa capacité de charge.

Un essai de back-step sur le système ARIZONA-L en mode ascendant en utilisant la phase supérieure du système ARIZONA-M a montré un effet, mais trop limité pour être utilisé en l’état, voir figure 10.3. Les autres essais effectués par exemple en utilisant un gradient ARIZONA-L en mode ascendant vers ARIZONA-K (phase mobile) n’ont montré aucun intérêt sur la séparation.

137 70 80 90 Time [min] 40 50 60 Time [min]

Figure 10.3 – Comparaison du système ARIZONA-L avec et sans backstep ARIZONA-M. En rouge, chromatogramme d’ion extrait de 1, en vert de 2. La courbe bleue est le chromatogramme UV 200-600 nm.

Afin d’obtenir ces composés individuellement, on peut utiliser les deux systèmes à la suite. En commençant avec le système ARIZONA-K adapté aux échantillons concentrés puis le système ARIZONA-L permettant de séparer les blocs obtenus. C’est ce qui aété réalisé en utilisant le système ARIZONA-K en mode descendant avec un back-step eau, sur 1 g d’extrait, permettant d’obtenir quatre fractions : – Fa, 470 mg – Fb, 14 mg, la fraction contenant la Vitisine A. – Fc, 42 mg, contenant les composés 2 et 3. – Fd, de masse inconnue, contenant les composés 1 et 4. L’intérêt du backstep est montré sur la figure 10.4 et la figure 10.5, on observe en effet que le back-step a permis d’obtenir une fraction contenant la Vitisine A plus pure. Par ailleurs, on constate un affinement de la fraction contenant les composés 1 et 4.

Par la suite, cette fraction Fd a été soumise à une séparation par le système ARIZONA-L en mode ascendant. C’est pour cette raison que la masse de cette fraction n’a pas été déterminée, elle a été évaporée puis redissoute pour être injectée dans la foulée. Cette dernière séparation a permis d’obtenir trois composés (voir leschro- matogrammes ﬁgure 10.6), le resvératrol (20 mg), la (+)-(E)-ε-viniférine (1, 39 mg) et la vitisine B (4, 255 mg). Tous ces composés ont été obtenus avec une pureté supérieure à 90 %, déterminée par CLHP et par RMN.

On peut émettre l’hypothèse que la meilleure séparation obtenue, provient del’élu- tion courte réalisée avant le back-step, permettant de pré-séparer les composés de faible coeﬃcients de partage des composés d’intérêt, et ainsi de limiter les phénomènes de co- élution et une trop forte viscosité risquant de déstabiliser l’équilibre des phases. Mais d’autres expériences sont nécessaires aﬁn de corroborer ou de réfuter celle-ci.

138 Intens. UV Chromatogram, 200-600 nm Intens. UV Chromatogram, 200-600 nm [mAU] [mAU] x105 x105 2.0 F3 F1 F2 1.5 1.5 1.0 1.0

0.5 0.5

0.0 0.0 Intens. BPC 905.5 -All MS Intens. BPC 905.5 -All MS x106 x106 6

4 3

2 2 1

0 0 Intens. BPC 679.5 -All MS Intens. BPC 679.5 -All MS x105 x105 6 2.0

1.5 4 1.0

2 0.5

0 0.0 Intens. BPC 453.8 -All MS Intens. BPC 453.8 -All MS x105 x105

3 3

2 2

1 1

0 0 0 20 40 60 80 100 120 Time [min] 0 20 40 60 80 100 120 Time [min]

Figure 10.4 – Comparaison des chromatogrammes UV et Masse avec et sans back-step.

Intens. [mAU] x104 Sans back-step

0 Intens. [mAU] x105 Avec back-step

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00 5 10 15 20 25 30 35 40 Time [min]

Figure 10.5 – Comparaison de la fraction vitisine A avec et sans back-step.

La technique de couplage CPC-SM utilisée dans cette étude et décrite ultérieuremnt 6 a apporté une façon rapide et efficace de suivre les expériences effectuées, et ainsi de guider les expérimentations ultérieures. Le fait de pouvoir utiliser la capacité de cette masse à fragmenter les ions en cours d’expérimentation peut aussi aider à la collecte des fractions, en particulier de composés de même masse, mais de structure différente.

Ce travail a montré qu’il était possible de faire certains changements drastiques de phase mobile sans pour autant perturber l’équilibre des phases, tout en apportant une

139 Intens. Resvératrol F2 Back-Step [mAU] 2000

1000

0 Intens. ε-Viniférine F2 Back-Step [mAU] 1000 500 0 Intens. Vitisine B F2 Back-Step [mAU]

1000

0 0 10 20 30 40 50 Time [min]

Figure 10.6 – Composés séparés de la fraction F2 par le système ARIZONA-L. capacité de charge équivalente à celle du système initial. Ceci peut être utile dans le cas de séparations difficiles ou d’échantillons peu solubles. Il pourra être intéressant de ca- ractériser plus précisément le comportement et la composition de la phase stationnaire vis-à-vis d’une élution à l’eau ou à d’autres phases mobiles afin de pouvoir affiner encore cette approche. De plus, l’amélioration du simulateur utilisé pour cette étude,ou de simulateurs existants tels que CpcSim (http://eos.univ-reims.fr/LSD/JmnSoft/Cpc- Sim/index.html), pourrait permettre une mise au point plus facile de gradients oude pas, inverses ou non. De plus l’apparition de modèles, présentés précédemment, permettant de prévoir les coefficients de partage est prometteur pour la compréhension et l’exploitation de ces modes d’élution.

Ce travail a donné lieu à une publication dans Journal of Chromatography A (Bisson et al. 2011). Cette publication fait référence à la Vitisine C, un erratum est encoursde préparation pour le journal. Il est disponible en français en annexe 14.2 page xvi. L’étude de la conﬁguration relative en RMN de la molécule ayant montré qu’il s’agissait en fait de la Vitisine B.

140 Chapitre 11

Approche par gradients

En utilisant les données obtenues précédemment, un gradient entre un système ARI- ZONA à acétonitrile et un système sans a été effectué. L’objectif de ce travail a été de développer une méthodologie standard, permettant à la fois d’obtenir des fractions très bien résolues, c’est à dire se chevauchant le moins possible, mais aussi d’obtenir les composés majoritaires connus, seuls, afin de les intégrer dans la chimiothèque. Ce projet s’inscrit dans un autre plus vaste, visant à proposer une palette d’outils pour l’utilisateur de CPC, lui permettant de résoudre des séparations difficiles.

11.1 Choix des bornes du gradient

Le suivi de cette expérimentation étant réalisé en CPC-MS-RMN, le choix a été fait de travailler en mode descendant. L’avantage d’utiliser ce mode est aussi de pouvoir lyophyliser rapidement les fractions après une évaporation à l’évaporateur rotatif uniquement pour éliminer les solvants organiques de l’eau.

Partant de là, il est nécessaire de trouver un système qui, au départ du gradient, main- tient la majorité des composés dans la phase stationnaire. Or, il s’avère qu’en rempla- çant le méthanol par de l’acétonitrile dans le système ARIZONA-K, le même système que celui utilisé dans la partie sur les Back-Steps, les composés se retrouvent majoritairement dans la phase supérieure. On a donc les deux bornes du gradient, la première

141 retenant les composés, la deuxième les séparant, mais de manière insuffisante au regard de l’objectif fixé. Il n’a pas été tenté ici de fixer une borne finale plus élutive que le système ARIZONA-K standard, mais cela devrait être possible.

Les coefficients de partage des composés dans les différents systèmes sont résumés dans le tableau 11.1. Plus le coefficient de partage indiqué dans ce tableau est élevé, plus le composé est retenu. La convention pour nommer les systèmes de solvants est la même que dans la partie précédente.

Tableau 11.1 – Coeﬃcients de partage des composés majoritaires de l’extrait de vigne E11 dans les sys- tèmes dérivés de l’ARIZONA-K. Coeﬃcients calculés à partir du ratio phase mobile sur phase stationnaire.

Composé Picéide Resvératrol (+)-(E)-ε-Viniférine Miyabénol C (trimère) K 0,9 3,2 3,0 1,5 KMA0.25 1,3 4,2 4,8 2,9 KMA0.50 1,9 5,4 7,4 4,5 KMA1.00 9,2 19,2 43,5 36,9

11.2 Méthode

Les phases inférieures des systèmes KMA1.00 et K et la phase supérieure du système KMA1.00 ont été préparées séparément en utilisant les résultats des dosages présen- tés dans la partie précédente. 1 gramme de l’extrait de sarment de vignes purifé sur XAD-7HP a été dissout dans 10 mL d’un mélange des phases du système KMA1.00. Le Ratio de phase ﬁnal était bien de 50 %.

Cet extrait a ensuite été injecté dans la colonne équilibrée contenant le système KMA1.00 à une rotation de 1100 rpm. Le débit d’élution était de 10 mL/min.

Au bout de 40 minutes (400 mL), après remplacement de la bouteille de phase stationnaire par la phase inférieure du système K et purge manuelle des tuyaux, un gradient a été eﬀectué vers cette phase sur 200 minutes (2 L). Puis la bouteille de phase stationnaire est remise en place sur la voie disponible et une extrusion à 20 mL/min est lancée aﬁn de vider la colonne de son contenu.

142 11.3 Résultats

La crainte majeure vis-à-vis de cette expérimentation a été celle d’une perte dela stabilité du système conduisant à une perte de phase stationnaire. Cependant, les essais en tube ont montré une faible variation de phase en présentant la phase K inférieure à la phase KMA1.00 supérieure. Lors de la réalisation du gradient, la pression a peu chuté et il n’a pas été observé de perte de phase stationnaire, signe d’une bonne rétention. Le volume mort déterminé après équilibrage était de 60 mL.

Les résultats sont très encourageants pour cette technique, la séparation (voir figure 11.1) étant en effet très efficace puisque permettant d’obtenir à la fois des fractions contenant 3 composés fortement enrichis (voir figure 11.2), mais surtout des fractions bien définies et non recouvrantes (voir figure 11.3). La figure 11.4 montre les spectres protons du Picéatannol, du Resvératrol et de la (+)-(E)-ε-Viniférine obtenus par le couplage de cette expérience avec le système de Chromatographie de Partage Centrifuge couplée à la Résonnance Magnétique Nucléaire par l’intermédiaire d’une Extraction Phase Solide (CPC-EPS-RMN).

Intens. UV Chromatogram, 306 nm [mAU]

200

150

100

0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

250

200

150

100

0 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Time [min] CIE 929-930 + CIE 703-704 + CIE 455-456 + Figure 11.1 – Chromatogramme de la CPC gradient ARIZONA modiﬁé.

143 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

20 Pallidol 0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

400

200 Picéatannol 0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

1500 1000 500 Resvératrol 0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

1000

500 ε-Viniférine 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time [min]

Figure 11.2 – Chromatogramme des composés fortement enrichis de la CPC gradient ARIZONA modiﬁé.

Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU] 60

0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU] 300

200

100

0 Intens. UV Chromatogram, 280 nm [mAU]

300

200

100

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Time [min]

Figure 11.3 – Chromatogramme des autres fractions de la CPC gradient ARIZONA modiﬁé.

À titre de comparaison, la même expérience avec le système ARIZONA-K seul, ne sépare pas le Resvératrol et la (+)-(E)-ε-Viniférine, même avec une injection moins importante, comme celle eﬀectuée dans la partie sur les Back-Steps.

À titre de comparaison, cette méthode demande beaucoup plus de solvants par

144 0.0060 0.045 0.19

0.18 0.0055 0.040 0.17

0.0050 0.16

0.15 0.035 0.0045

0.14

0.0040 0.13 0.030

0.12 0.0035 0.11 0.025

0.0030 0.10

0.09 0.0025 0.020 NormalizedIntensity NormalizedIntensity NormalizedIntensity 0.08

0.0020 0.07 0.015 0.06 0.0015 0.05

0.010 0.0010 0.04

0.03 0.0005 0.02 0.005

0 0.01

0 0

7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 6.30 6.25 6.20 6.15 7.40 7.35 7.30 7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 6.30 6.25 6.20 6.15 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 Chemical Shift (ppm) Chemical Shift (ppm) Chemical Shift (ppm)

Figure 11.4 – Spectres RMN de trois des produits fortement enrichis, Picéatannol, Resvératrol et (+)-(E)-ε-Viniférine. gramme de composé purifié que la méthode en deux étapes présentée dans la partie sur le Back-Step figure 10.4. Mais elle présente l’avantage de n’être réalisée qu’en une seule étape, d’obtenir une bonne séparation et de ne pas présenter de problèmes de dissolution de l’échantillon. En effet, lorsque la fraction contenant le Resvératrol et la (+)-(E)-ε-Viniférine issue d’une séparation par le système ARIZONA-K (voir la pré- paration de l’extrait E11 dans le matériel et méthode) a été injectée dans le système ARIZONA-L, seuls 2,5 g ont pu être injectés dans un volume de 50 mL sur la CPC 1 L. Là où une injection plus concentrée ne pose aucun problème avec la même fraction issue de racines de vigne, qui elle est beaucoup moins riche en resvératrol.

Plusieurs approches permettant de réduire la forte consommation de solvants peuvent être envisagées, en particulier, jouer sur les différents solvants utilisés et sur la forme du gradient, comme cela se fait en CLHP afin de faire éluer les composés plus vite tout en conservant une bonne séparation de ceux-ci. On peut aussi effectuer un gain non négligeable en réalisant les injections en mode « sandwich », c’est à dire en n’équilibrant pas la colonne avant d’injecter l’échantillon.

Ce gradient à l’heure actuelle n’est donc pas applicable tel quel à grande échelle, mais il montre les possibilités de développement et de réalisation de tels systèmes, et c’était là le but de cette expérimentation. Il a permis, sans optimisation particulière de réaliser une séparation diﬃcile.

Cette stratégie peut permettre de réaliser des gains de temps et de solvants, etce à partir du moment où le gradient conduit à une occupation maximale du chromatogramme, et non comme dans le cas présenté ici à des zones mortes sans composés élués.

145 11.4 Application à d’autres séparations

Cette approche a par la suite été appliquée à 2 autres séparations : – Une fraction KD3, de l’extrait E11 de sarments de vigne – Un extrait de racines de Gnetum africanum, GaM2 Seuls les chromatogrammes obtenus lors de ces expériences seront présentés dans cette partie, et ce aﬁn de montrer la versatilité de cette approche, tout du moinsdans le domaine des stilbénoïdes et des ﬂavonoïdes, seules molécules sur lesquelles cette approche a été appliquée pour l’instant.

La séparation de KD3 a été effectuée avec un gradient entre le système LMA1.00 et le système LMA0.50 en mode descendant à 6 mL/min et 1100 rpm. Les systèmes LMA1.00 et LMA0.50 ont été fabriqués entièrement, puis chacune des phases séparées. Le sys- tème LMA1.00 était légèrement triphasique (petite phase supérieure) et l’était beaucoup plus après ajout de 1 g d’échantillon dans les 13 mL utilisés pour l’injection. La phase du milieu a été utilisée comme phase stationnaire, et la phase inférieure comme phase mobile. La pression après équilibrage et injection était de 34 bar pour un volume de phase mobile de 60 mL, et a évolué jusqu’à 21 bars après application du gradient vers la phase inférieure de LMA0.50 pendant 120 minutes à partir de 40 minutes. Il n’a pas été constaté de perte de phase stationnaire importante, à part dans les premiers tubes collectés. L’injection a été réalisée avec le système triphasique. Les chromatogrammes CLHP des différentes fractions sont présentés dans la figure 11.5.

La séparation de GaM2 a été effectuée avec un gradient entre les systèmes GMA1.00 et GMA0.25 en mode descendant à 10 mL/min et 1100 rpm. Les phases ont été prépa- rées individuellement. 400 mg de GaM2 ont été dissouts dans un mélange de 5 mL de chaque phase de GMA1.00. La pression après équilibrage était de 38 bars et n’a que très peu diminué (34 bars à la fin de l’expérience). Le volume de phase stationnaire après équilibrage et injection était de 65 mL. Le gradient vers la phase inférieure de GMA0.25 a été réalisée après 30 minutes (300 mL) sur une durée de 30 minutes. Puis une extrusion a été réalisée. Les chromatogrammes CLHP des différentes fractions issues de cette séparation sont regroupés dans la figure 11.6.

On voit bien qu’au travers de ces deux séparations, non seulement les systèmes sont suﬃsamment stables lors d’un changement de phases, mais qu’en plus, ces systèmes apportent une sélectivité intéressante sur une vaste gamme de polarité à en juger par les

146 Intens. E11-KD3-GCPC-2 [mAU] 200

0 [mAU] E11-KD3-GCPC-3 40 20 0 [mAU] E11-KD3-GCPC-4

200

0 [mAU] E11-KD3-GCPC-5

0 [mAU] E11-KD3-GCPC-6 200 100 0 [mAU] E11-KD3-GCPC-7

100

0 [mAU] E11-KD3-GCPC-8

100

0 [mAU] E11-KD3-GCPC-9 100

0 [mAU] E11-KD3-GCPC-10

[mAU] E11-KD3-GCPC-11 100 50 0 [mAU] E11-KD3-GCPC-12 20 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time [min]

Figure 11.5 – Chromatogrammes des fractions issues d’un gradient CPC sur KD3. chromatogrammes CLHP. En particulier, sur la fraction KD3, aucun système ARIZONA n’a pu procurer une telle qualité de séparation.

147 Intens. g100g25 1 [mAU] 60

0 Intens. g100g25 2 [mAU]

200

100

0 Intens. g100g25 3 [mAU]

200

100

0 Intens. g100g25 4 [mAU] 200

100

0 Intens. g100g25 5 [mAU]

200

100

0 Intens. g100g25 6 [mAU]

400

200

0 Intens. g100g25 7 [mAU] 1000 750 500 250 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Time [min]

Figure 11.6 – Chromatogrammes des fractions issues d’un gradient CPC sur GaM2.

148 Chapitre 12

Conclusion et perspectives

Les systèmes de solvants, avec le développement de machines ayant de meilleures performances 1, sont les piliers de l’amélioration des techniques de chromatographie liquide-liquide. Dans le domaine des systèmes de solvants, la compréhension, les mé- thodes de sélection et l’utilisation de solvants moins toxiques et/ou plus compatibles avec certaines applications sont les points à développer. Au travers de l’étude de sys- tèmes ARIZONA modiﬁés, notre but était de contribuer à cette recherche, et nous avons pour cela développé une méthodologie de dosage de ces solvants par RMN. Cette approche permet à l’utilisateur et au chercheur de disposer d’informations pour guider ses choix et sa compréhension théorique. Après leur caractérisation, nous avons déve- loppé des stratégies séparatives utilisant ces systèmes.

L’apport des gradients et des couplages de systèmes biphasiques en CPC peut être très important selon nous. En effet cela permet, en une seule expérience, de balayer une grande gamme de polarité avec une très forte sélectivité tout en profitant de l’excellente capacité de charge de cette technique. Les résultats présentés ici, montrent que lessys- tèmes ARIZONA dans lesquels le méthanol est remplacé par de l’acétonitrile peuvent servir à construire des gradients, entre eux, et avec les systèmes ARIZONA non modi- fiés. Mais nous avons aussi montré qu’il est possible d’utiliser des phases mobiles dont les compositions sont assez éloignées les unes des autres, comme dans le cas du Back- Step.

1. avec en premier lieu la rétention de phase accrue et la résistance aux pressions élevées

149 À l’avenir, il pourra être important, selon nous, de déterminer l’étendue des possi- bilités de couplages entre des systèmes diﬀérents. En eﬀet, même si il a été montré que les phases de certains systèmes semblent s’accommoder avec les phases d’autres, les limites n’ont pas, dans les cas présentés ici, été trouvées. De même, il est primordial de déterminer ce qu’il se passe réellement entre les deux phases présentées l’une à l’autre. Permettant alors de proposer un modèle facilitant leur conception et et ainsi mettreau point des approches séparatives optimisées les exploitant. Il pourra aussi être néces- saire de déterminer quels modes de transitions (pas, gradient linéaire, exponentiel…) lors des gradients sont les plus adaptés.

150 Sixième partie

Développements annexes

151 « Every time we introduce a new tool, we see a new cosmos. » - Freeman Dyson, dans un e-mail au sujet d’un ouvrage de David Gelernter.

152 Chapitre 13

Développement d’outils pour la lecture et le traitement de données chromatographiques

Afin de traiter les données obtenues en CLHP-SM, il était nécessaire de passer par les logiciels fournis par le fabriquant. Ces mêmes logiciels ne permettant pas le traitement par lot 1. En ce qui concerne les données masse, un logiciel fourni par Bruker Daltonics permettait de convertir les fichiers au format interne Yep en fichiers MzXML pouvant être traités par toute sorte d’applications. Mais pour les données UV, il n’existait pas de moyen de faire le même genre d’opérations. Un travail de rétro-ingénierie a donc été effectué sur le format U2 de Agilent, dans lequels les données sont enregistrées pour faciliter cela. Cette partie décrit aussi le développement d’une application, CIERamp, utilisée pour construire les barres de chromatogrammes utilisée sur certaines figures de cette thèse à partir des fichiers MzXML.

13.1 Heisenberg : Une bibliothèque basée sur la rétro- ingénierie du format U2

La bibliothèque Heisenberg, permettant à diverses applications d’accéder aux don- nées sous le format U2 d’Agilent Technologies a été développée au cours de cette thèse, 1. C’est à dire le fait de traiter plusieurs ﬁchiers ensembles.

153 afin de pouvoir travailler en dehors des outils Agilent et Bruker, ne permettant pas le traitement par lot. Elle permet à un programme l’utilisant, en quelques lignes de code, d’accéder aux chromatogrammes à une longueur d’onde donnée, aux spectres à un temps donné, ou a des sommes de ceux-ci. Le détail de la rétro-ingénierie ne sera pas développé dans cette partie, seuls les résultats seront présentés. Le principe de cette rétro-ingénierie a consisté à modifier le fichier à l’aide d’un éditeur hexadécimal et étudier l’impact sur les chromatogrammes et spectres obtenus. Toutes les données présentes dans ce format n’ont pas été extraites, seules celles servant à calculer les spectres et chromatogrammes ont été étudiées. Les types de données sont indiquées en types C sur une architecture 32/64 bits Intel avec GCC, le type signé ou non étant d’une importance capitale pour la bonne lecture du fichier. Le format du fichier U2 est constitué de la manière suivante :

Tableau 13.1 – Format des ﬁchiers U2.

Position Élément Taille mémoire 0x24 Taille des spectres unsigned short int 0x2D Longueur d’onde de départ unsigned short int 0x35 Longueur d’onde de ﬁn unsigned short int 0x154 Nombre de blocs int 0x4700 Début du bloc de données (spectre) n/a

Tableau 13.2 – Format des blocs de données dans les ﬁchiers U2.

Position relative au début du bloc Élément Taille mémoire 0x0 Temps d’acquisition du spectre unsigned int 0x6 Point d’origine signed int … (signed short int) * Taille des spectres Oﬀset par rapport au point précédent signed short int

Les spectres sont encodés de manière diﬀérentielle, la raison en est que le spectre d’un ensemble de particules est par nature continu, les variations entre deux longueurs

154 d’onde concomitantes sont donc faibles, et peuvent être enregistrées avec un type de donnée de taille plus réduite. En pratique, cela réduit la taille d’un bloc presque de moitié sur le disque. Les spectres sont recalculés selon la formule suivante :

w w X 2w Sb = Ob − db (13.1) n=0

w Où Sb est le point du spectre pour le bloc b à l’index de longueur d’onde w, Ob est le n point d’origine du bloc b, db est l’oﬀset du point du bloc b à la position n dans le ﬁchier.

L’index de longueur d’onde est calculé selon la formule :

(λ − λ ) w = S(1 − min ) (13.2) (λmax − λmin)

Où S est la taille du spectre, λ la longueur d’onde recherchée, λmin la longueur d’onde minimale et λmax la longueur d’onde maximale.

En pratique, les longueurs d’onde sont encodées dans un format un peu particulier qu’il a été un peu diﬃcile de déterminer :

λ = (1 << (wl >> 12)) ∗ (2+ ((wl&0xF F F ) >> 8)/8+ (13.3) ((wl&0xF F ) >> 4)/128+ ((wl&0xF ))/2048)

Les << et >> correspondent aux décalages binaires, et les & au ET binaire.

Les longueurs d’onde sont stockées sur 16 bits dans le ﬁchier, la formule précédente sert en fait à couper le nombre en 4 parties :

Tableau 13.3 – Format des longueurs d’ondes.

Bits 15-12 Bits 11-8 Bits 7-4 Bits 3-0 a b c d

155 Ce qui fait que chacune des valeurs a, b, c et d est comprise entre 0 et 15.

Ainsi la formule précédente devient :

b c d λ = 2a · (2 + + + ) (13.4) 8 128 2048

Cette représentation permet de prendre les valeurs comprises entre 3 nm et 131040 nm et suit une tendance exponentielle. Ce n’est pas une représentation standard de nombres dans un format informatique. Mais au vu des activités d’Agilent technologies, ce format doit certainement servir à encoder des données de détecteurs variés. Elle présente néanmoins un inconvénient de non continuité de la fonction ainsi qu’une résolution variant selon la valeur.

Cette bibliothèque a par exemple permis de développer un programme prenant l’ensemble des analyses eﬀectuées lors de cette thèse et générant un chromatogramme à 280 et 306 nm disposé dans un dossier. Ce qui permet d’avoir une vision très rapide de chaque analyse considérée. Elle permet aussi de générer des images ressemblant à des CCM, mais avec la résolution de la CLHP, pour faire une comparaison rapide entre diﬀérents échantillons déjà analysés.

13.2 CIERamp

CIERamp est un petit outil utilisant la bibliothèque Ramp développée par le Seattle Proteome Center sous licence libre (http://tools.proteomecenter.org/wiki/index.php?title=Software:RAMP). Ramp permet la lecture non-séquentielle de fichiers MzXML. Ainsi il est très simple de s’interfacer avec pour pouvoir extraire les don- nées d’intérêt. En particulier dans le cas de CIERamp, réaliser des chromatogrammes d’ion extraits et produire un fichier PNG à l’aide de la libPNG (http://www.libpng.org/- pub/png/). La spécificité de ce logiciel est de produire une représentation sous forme de barres représentant sur l’axe horizontal le temps et avec l’intensité lumineuse correspondant à l’intensité du signal. La carte de couleur utilisée est celle de la radiation du corps-noir, carte la plus adaptée pour visualiser des données avec de nombreuses frontières contrairement aux cartes Arc-en-ciel (Borland et Taylor II 2007), utilisées bien souvent dans les logiciels de chromatographie.

156 Cet outil permet donc, comme ce qui est fait avec un des programmes exploitant Heisenberg de visualiser des données de masse à la façon des CCM et ainsi comparer facilement diﬀérents échantillons. Il est aussi possible de générer une carte 2D avec en abscisse le temps, en ordonnée la masse et l’intensité de la couleur étant l’intensité de l’ion correspondant. Ces cartes permettant en un seul coup d’oeil d’avoir une idéede la complexité d’un échantillon voir même de sa composition.

157 Chapitre 14

Développement d’une base de données pour Phytochimiste

L’idée du développement d’une base de donnée pour phytochimiste est venue lors de mon stage de Master 2, et plus particulièrement avec la question « Comment ranger les fractions, expériences et résultats mais en conserver une vue d’ensemble ? ». L’approche utilisant uniquement le cahier de laboratoire, ou des ﬁches concernant chacun de ces éléments ne semblait pas forcément pratique, surtout dans l’hypothèse d’une base de données concernant l’ensemble de la carrière d’un chercheur ou d’une équipe, et même au delà.

À partir de là, est apparue l’idée d’une base de donnée dans laquelle toutes les informations sont reliées entre elles, permettant à partir de n’importe quel point d’entrée d’accéder à toutes les informations qui sont en relation avec celui-ci. Elle doit permettre au chercheur d’eﬀectuer un suivi de ses activités et de ses travaux, une mise en lien des sujets et entités traités et un moyen de rechercher facilement des éléments dans toutes ces informations.

Cette base de donnée, évolution d’un projet personnel, est distribuée sous une licence Libre GNU GPL V3.0 (Free Software Foundation 2007), permettant ainsi à chacun de contribuer, étudier, adapter et partager cet outil tout en restant assuré que les futurs contributeurs auront eux aussi ces droits fondamentaux. Cela n’implique aucunement que les données inclues dans la base soient distribuées sous une licence du même type.

158 Cette partie fait état du développement actuel du projet, qui loin d’être terminé, permet déjà d’avoir un aperçu de ce qu’il sera possible de réaliser avec cet outil.

Il existe des outils pouvant répondre en partie à ces besoins, mais peu sont libres. Un des outils semblant intéressant et répondre à beaucoup des points développés ici est commercial et n’est accessible que sous contrat et décrit dans une thèse conﬁden- tielle (Blondeau 2011). Une étude bibliographique et théorique des usages possibles de telles bases de données a été publiée par le docteur Sylvain Blondeau et présente succintement cet outil (Blondeau et al. 2010). Le lecteur trouvera aussi dans cette der- nière référence une liste de bases de données en ligne permettant d’avoir accès à des informations compilées. Néanmoins aucunes de celles-ci ne propose au chercheur de réaliser sa propre base. À noter qu’il existe un outil développé à l’ICOA, et sous licence libre permettant au chercheur de gérer sa base de données de molécules et d’essais biologiques, Screening Assistant 2 (http://sa2.sourceforge.net/).

14.1 Données

La figure 14.1 reprend les différents types de données exploitables grâce à cette base et la figure 14.2 montre un exemple d’étude pouvant être réalisée avec cet outil. Ayant ce type d’outil à sa disposition, le chercheur peut alors obtenir le chemin optimal pour l’obtention d’une ECU ou pratiquer la soustraction de composés dans un extrait (Chen et al. 2008).

Activités biologiques

ENs Métabolome Puriﬁcation SN Contrôle de pureté ECU Organisme Échelle préparative Échelle analytique

Parties Méthodes Familles Extraits Données analytiques Conditions culturales Fractions Lieu de récolte

Figure 14.1 – Structure générale de la base de données, chacune de ces données peut être mise en lien avec les autres, permettant ainsi au chercheur de mettre en évidence des liens entre ses diﬀérentes acti- vités de recherche.

159 Organisme A Méthode A Méthode B Partie 1

Organisme A Méthode C ECU Partie 2

Organisme B Méthode A Méthode B

Figure 14.2 – Sur cette ﬁgure, on peut constater que diﬀérentes voies permettent d’obtenir une ECU, et que la méthode C permet de l’obtenir en une seule étape. Cela peut permettre au chercheur d’utiliser cette même méthode sur l’Organisme B.

D’une manière plus détaillée, l’ensemble des types de données actuellement implé- mentés et les liens existants est présentée dans la ﬁgure 14.3.

Plante Genre Famille Phytobase

Parties de Extrait Expériences Fraction Composé plantes

Activité Analyse Dosage

Unités

Protocole Données n

Figure 14.3 – Représentation des liens entre données dans PhytoBase.

Le lecteur remarquera que beaucoup de ﬂèches sont à double sens sur la ﬁgure 14.3, ceci est du au fait que les relations entre les données sont bi-directionnelles dans une

160 majorité de cas, et la gestion de ces relations est totallement transparente pour l’utilisateur. Elle permet en se plaçant sur n’importe quel élément, de savoir immédiatement quelles sont les données en relation sans avoir à implémenter chacun des types de recherche possibles. C’est d’ailleurs une des fonctionnalités qui permet à la structure de la base de donnée d’évoluer plus facilement.

Ce schéma, bien que tentant de prendre en compte la majorité des cas ayant pu être discutés avec des utilisateurs potentiels, devrait changer dans les prochaines versions aﬁn d’augmenter la souplesse d’utilisation. En particulier pour ajouter des outils permettant de travailler avec des approches d’ethnobotanique, d’ethnopharmacologie ou industrielles. Par ailleurs, suite à une demande des utilisateurs potentiels, la base devrait évoluer vers un système plus universel, et particulièrement pour permettre un travail avec des organismes non végétaux.

14.2 Présentation de l’interface

PhytoBase est un outil développé en Python et pouvant être exécuté sur le poste client ou sur un serveur. L’accès à PhytoBase se fait depuis un navigateur internet tel que Firefox (https://www.mozilla.org/ﬁrefox), il ne nécessite pas de modules complé- mentaires tels que Java ou Flash comme d’autres outils. Ce qui est un atout majeur au regard, entre autres choses, des failles de sécurités importantes révélées dans ces logiciels ces dernières années, voir la référence (Cyber spies exploiting Java, Flash ﬂaws 2012) par exemple. L’avantage d’une interface web est de permettre à tout appareil connecté à Internet, à un réseau local ou pouvant exécuter l’application localement d’utiliser cet outil.

La figure 14.4 montre la page d’accueil, personnalisable par l’administrateur, affichée à l’utilisateur après avoir rentré son identifiant et son mot de passe.

La ﬁgure 14.5 montre le type de schémas produits automatiquement par PhytoBase et montrant les ramiﬁcations d’expériences, de fractions,… Il est à noter que chacun des éléments est cliquable et permet d’atteindre la description de l’élément concerné. Ainsi sur ce schéma, si l’utilisateur clique sur CPC2, il arrive sur la page concernant cette ex- périence et peut alors voir les paramètres d’expérience, les autres fractions obtenues…

161 Figure 14.4 – Page d’accueil de PhytoBase.

Extract RVSO4

CPC2

Fraction-2B Fraction test

Vitisin B

Figure 14.5 – Exemple simpliﬁé de schéma de fractionnement.

Actuellement, les structures, telles que celle présentée dans la ﬁgure 14.6 sont géné- rées automatiquement à partir du code SMILES, une représentation moléculaire issue de la théorie des graphes (Weininger 1988).

Tous les types de données disposent au minimum d’un champ pour leur code, leur description (avec éditeur de texte et de mise en forme intégré) et un commentaire. Chaque type dispose en plus de champs qui lui sont spéciﬁques, tels que les coordon- nées GPS ou les références de planches d’herbier pour les plantes ou les liens vers d’autres types de données.

D’un point de vue de l’ajout et l’édition de données, tout est conçu pour faciliter la saisie des données. Ainsi, quand l’utilisateur crée une nouvelle expérience de fractionnement, il peut ajouter directement toutes les fractions qui en découlent ou accéder avec une complétion automatique à des éléments déjà existants. L’aspect de cette fonc- tionnalité est présenté dans la ﬁgure 14.7.

162 OH HO HO

OH O HO

O OH

Figure 14.6 – Exemple de structure générée à la volée par le code SMILES.

Figure 14.7 – Exemple de saisie assistée, les nouveaux éléments apparaissent en bleu, les boîtes en haut représentent les éléments à placer dans le champ, la croix permettant de les supprimer, en dessous se trouve la zone de saisie, avec le texte tapé par l’utilisateur, les éléments commençant par ce qu’a tapé l’utilisateur, et la ligne bleue permettant d’ajouter un nouvel élément avec le nom correspondant àce qu’a tapé l’utilisateur.

14.3 Conclusion et perspectives

Concernant le modèle de données, quelques modifications devront être effectuées, permettant entre autres à l’utilisateur de joindre des fichiers de données. L’idée estde permettre à l’utilisateur d’intégrer les chromatogrammes, spectres RMN et Masse, et autres données afin de les visualiser et les comparer directement depuis l’interface. Il existe déjà des solutions à intégrer aux applications web, permettant d’afficher ce type de données. Le lecteur peut se faire une idée de ce qu’il est possible de faire avec les technologies actuelles en visitant le page des démonstrations de ChemDoodle, une solution de la société iChemLabs (http://web.chemdoodle.com/demos/simulate-nmr-and-ms).

Aﬁn de permettre un import et un export facile des données, un format ﬁdèleàla représentation interne en XML doit être développé, ainsi qu’une possibilité d’importer

163 et exporter les données en CSV et éventuellement d’autres formats pour intégrer les données déjà existantes de l’utilisateur ou interagir avec d’autres logiciels.

Actuellement, la solution est développée en Python en utilisant le cadriciel Turbo- Gears (http://turbogears.org/), malgré la facilité de développement avec cet outil, il peut être plus prudent d’envisager des solutions moins dépendantes de modules externes, présentant un risque important de cassage de compatibilité. En eﬀet actuellement, la solution dépend d’un certain nombre d’interfaces en particulier PyGraphViz (http://- networkx.lanl.gov/pygraphviz/) pour la génération des diagrammes et Pybel (O’Boyle, Morley et Hutchison 2008) pour la gestion des structures moléculaires (recherche de sous-structures, aﬃchage…), et TurboGears dépend de plusieurs dizaines d’autres modules. La question se pose donc de redévelopper la solution avec un langage tel que le C++, permettant de s’interfacer directement avec GraphViz (http://www.graphviz.org/) et OpenBabel (http://www.openbabel.org). Qui plus est, cela procurerait un avantage indéniable au niveau des performances, même si l’implémentation actuelle est tout à fait capable de gérer plus d’1000000 d’entrées sans impact notable sur l’interaction utilisateur 1. Ce changement de langage s’accompagnera d’un changement d’interface, l’idée étant actuellement d’utiliser un cadriciel tel que Witty (http://www.webtool- kit.eu/wt) capable d’apporter de plus grandes capacités d’interaction avec l’utilisateur, sur des plateformes plus variées (tablettes,…) ainsi qu’une sécurité accrue. Ce changement sera l’occasion de changer le nom du logiciel, déjà utilisé pour d’autres bases dont celle de l’association Tela-Botanica.

Une forte demande des utilisateurs lors d’une enquête initiale a été la possibilité d’avoir une base de donnée collective et ouverte dans laquelle chacun pourrait dépo- ser les données qu’il souhaite partager. Ce point là nécessiterait cependant une ré- ﬂexion plus poussée sur les limites, cadres légaux, et infrastructures nécessaires à cela. Néanmoins, actuellement, l’outil peut être converti assez rapidement en une plateforme d’échange entre utilisateurs, de par l’existence de politiques de gestion utilisateur (droits et groupes) déjà en partie implémentés. Cette partie nécessitera aussi d’ajouter un système permettant de suivre la source de l’information, permettant à l’utilisateur de se faire une idée de sa ﬁabilité.

Cette base de donnée, bien que balbutiante est, de par sa conception modulaire et surtout sa licence libre une plateforme présentant un fort potentiel d’évolution. Mais 1. Testé à l’aide d’une injection de données virtuelles et aléatoires dans la base puis des essais d’accès depuis l’interface utilisateur.

164 pour que celui-ci puisse s’exprimer, il va être nécessaire de travailler avec d’autres dé- veloppeurs après une première phase d’essais par les utilisateurs. Pour cette phase d’essais, une dizaine de personnes s’est actuellement proposée, ce qui constitue un nombre suffisant pour valider le modèle de données et l’interface utilisateur. Un soin tout particulier devra être apporté au support et à la conversion des données au fil des versions ainsi qu’à la sécurité des données afin de ne pas détourner les utilisateurs de cette solution. L’autre point critique sera la possibilité pour l’utilisateur d’importer et exporter facilement ses données, afin de faire entrer facilement les sommes parfois considérables de données dont disposent certains chercheurs ou instituts, mais aussi coupler cette solution avec d’autres logiciels, tels que la modélisation moléculaire, les plateformes haut-débit, les systèmes d’impression et de lecture/impression de code-barres pour la gestion des chimiothèques…

165 Septième partie

Conclusion et perspectives

166 Nos travaux présentés dans ce manuscrit sont issus d’une question simple « Com- ment utiliser la Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) dans le but de constituer une chimiothèque de stilbénoïdes ? ». Partant de là, plusieurs interrogations ont émergé, la première concernait les méthodes à utiliser pour traiter les extraits bruts de plante. Et ce, afin de pouvoir fournir des fractions bien distinctes les unes des autres et dans des quantités suffisantes pour les étapes de purification et d’analyse ultérieures.

La CPC, de par ses qualités, a rapidement éliminé les autres candidats. Néanmoins, cette technique demande, pour l’instant, un développement de méthode un peuplus complexe que celui d’autres techniques telles que la CLHP ou les colonnes basse- pression. En particulier, l’optimisation des systèmes de solvants, responsables de la séparation en CPC, est un des points clés dans ce développement. Pour cette raison, il nous a semblé nécessaire de développer un outil permettant de faciliter le choix de ces systèmes et par là même de contribuer aux savoirs sur l’utilisation et la compré- hension des systèmes de solvants. Cet outil s’est concrétisé au travers du développe- ment d’une méthodologie de préparation et de dosage de ces systèmes par spectromé- trie RMN. Nous avons ainsi pu, avec celle-ci, étudier plus en détail des systèmes de solvants s’étant montrés particulièrement intéressants lors d’essais préliminaires. Ces systèmes sont des dérivés de la gamme ARIZONA, très utilisée en CPC, dans lesquels le méthanol est remplacé par de l’acétonitrile.

Un autre aspect du développement de méthodes en CPC est celui de l’élution. Même si celle-ci est capitale pour n’importe quelle approche chromatographique ; elle l’est plus particulièrement en CPC, méthode victime d’une faible résolution mais d’une excellente sélectivité. L’usage de gradients et de pas de différents types permet ainsi de contourner ce problème de résolution en adaptant la fenêtre de sélectivité au cours de la séparation. Or, il s’est avéré que les systèmes dérivés que nous avons étudiés sont aptes à composer de tels gradients. Ces derniers ont procuré, sur les différents extraits et fractions présentés dans cette thèse ainsi que sur d’autres réalisés lors de collaborations, des séparations très satisfaisantes. La première interrogation a donc, au travers de ces développement, trouvé un semblant de réponse. Il reste désormais à étudier plus en détail ces systèmes et la conception de gradients les utilisant, et ce afin de proposer aux utilisateurs une solution clé en main pour le développement de méthodes en CPC.

Dans le laboratoire, la CLHP-SM et la CLHP-RMN sont des techniques souvent uti- lisées en complément de séparations par CPC, ou directement sur des extraits. Une

167 autre question a alors émergé : « Pourquoi ne pas coupler directement la CPC aux spectrométries de masse et RMN ? ». Le développement de couplages avec la spec- trométrie de masse avait été décrit précédemment, nous n’avons donc eu qu’à adapter notre matériel à cette approche. Par contre, même si des techniques de couplages avec la spectrométrie RMN avaient elles aussi été décrites, aucune n’était vraiment adaptée d’un point de vue économique ni d’un point de vue pratique à l’objectif que nous nous étions ﬁxé. Pour réaliser le couplage CLHP avec le spectromètre RMN, nous utilisons un système automatisé d’Extraction sur Phase Solide. L’utilisation de cet appareil pour le couplage CPC-RMN s’est donc avérée être la solution la plus intégrée et la plus pratique pour les utilisateurs. Le développement de cette méthode a néanmoins nécessité un travail de rétro-ingénierie pour pouvoir piloter le système automatisé de la manière souhaitée. Ce travail assure par ailleurs des possibilités d’évolution du système bien plus confortables. Nous avons montré que cette technique, malgré des limitations liées à la nature de la phase solide utilisée et la nature des solvants issus de la CPC, présente des capacités et un potentiel d’évolution importants.

Nous avons présenté dans une dernière partie trois nouveaux outils informatiques. Les deux premiers ont pour but de faciliter l’analyse et la présentation des données issues des détecteurs UV-Visible et SM de notre chaîne CLHP. Ils permettent ainsi d’analyser les résultats issus de séparations en CLHP, mais aussi, grâce au couplage déve- loppé, les résultats de séparations par CPC. Le dernier outil, issu d’un projet personnel, est une base de donnée Libre, encore en développement, destinée aux chercheurs en Substances Naturelles. Elle doit permettre à ceux-ci d’avoir une vue d’ensemble de leurs diﬀérents travaux, et de pouvoir exploiter l’ensemble de leurs données autrement.

La finalité de tous ces développement est leur intégration dans une démarche Phy- tochimique intégrée, allant de la plante à la molécule. Le but initial était d’obtenir un ensemble de molécules d’une famille présentant des activités biologiques importantes, afin de les intégrer à la fois dans la chimiothèque interne au laboratoire mais aussi dans la Chimiothèque Nationale. Cette dernière, au moment de la rédaction de cette thèse, n’étant pas très fournie en stilbénoïdes dont la structure est proche de ceux présents dans les plantes étudiées. En effet, sur les 47327 composés contenus dans la base de la Chimiothèque Nationale le 11 juin 2012, 650 présentent un motif stilbène. Parmi celles- ci, la majorité sont des dérivés, probablement synthétiques ou hémisynthétiques, de monomères. Nous espérons que les différents outils développés, et dont l’efficacité a pu

168 être mise à l’épreuve sur dans des situations réelles, pourront contribuer à l’étude des Substances Naturelles.

Au cours de cette thèse, j’ai pu approcher la CPC, nouvelle technique pour moi, et me perfectionner sur d’autres outils tels que la spectrométrie RMN, la CLHP et la SM. J’ai pu librement utiliser, me familiariser et lutter avec ces outils, pour développer diverses approches, pas toujours fructueuses, tout cela dans le but de résoudre les diffé- rentes problématiques issues de mon projet, mais aussi de ceux des autres. En effet, au delà des travaux décrits dans ce manuscrit, mon expérience naissante dans le domaine de la chromatographie et des techniques analytiques a suscité l’intérêt d’autres chercheurs et jeunes chercheurs recherchant des solutions pour leurs séparations et leurs analyses. Ainsi, j’ai pu, en confrontant mes pratiques et approches aux besoins expri- més par d’autres, construire de manière, je l’espère apporter ma pierre à leur édifice. Au cours de l’encadrement de quatre stagiaires de Master 1 et une de Master 2, j’ai pu confronter ma compréhension des outils utilisés quotidiennement, parfois d’une ma- nière proche du réflexe, avec ma capacité de transmission de tels savoirs, savoirs qui je l’espère leur seront profitables. Ces expériences, extrêmement enrichissantes, ont sans cesse provoqué de nouvelles questions, remises en question et la nécessité d’adapter mes méthodes d’échange des connaissances. Et j’estime avoir eu la chance de travailler avec elles, leur motivation, leur curiosité et leurs ambitions étant une source d’enrichis- sement permanente. J’ai aussi eu, au cours de cette thèse, l’occasion d’avoir différentes expériences d’enseignement. Dans le cadre du monitorat, sur des séances de travaux pratiques en Pharmacognosie, mais aussi pour un cours que j’ai construit, transmis et partagé avec des étudiants. Toutes ces expériences m’ont permis de confronter la pratique expérimentale en laboratoire avec toutes celles et ceux qui gravitent autour, et je remercie pour cela toutes les personnes ayant participé de près ou de loin à ce voyage initiatique dans l’univers de la recherche qu’a été cette thèse.

169

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189

Annexes

i Publications

14.4 Parues

– Jonathan Bisson, Pascal Poupard, Alison D. Pawlus, Alexandre Pons, Philippe Darriet, Jean-Michel Mérillon, Pierre Waffo-Téguo. Development of hybrid elution systems for efficient purification of stilbenoids using centrifugal partition chromatography coupled to mass spectrometry. J. Chrom. A., 1218 (36), 6079-6084, 2011. (http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2011.03.020)

14.5 Acceptées

– Alison D. Pawlus, Ramla Sahli, Jonathan Bisson, Céline Rivière, Jean-Claude De- launay, Tristan Richard, Eric Gomès, Louis Bordenave, Pierre Waffo-Téguo, Jean- Michel Mérillon. Stilbenoid profiles of canes from Vitis and Muscadinia species. Journal cible : J. Agric. Food Chem. (Manuscript ID : jf-2012-03843z) – Carole Lambert, Jonathan Bisson, Pierre Waffo-Téguo, Yorgos Papastamoulis, Tristan Richard, Marie-France Corio-Costet, Jean-Michel Mérillon, Stéphanie Clu- zet. On the role of phenolics in grapevine wood decay – Focus on the Botryos- phaeriaceae family. J. Agric. Food Chem. (Manuscript ID : jf-2012-03290g)

14.6 En préparation

– Jonathan Bisson, Marion Brunel, Alain Badoc, Antonio Palos-Pinto, Jean-Michel Mérillon, Pierre Waﬀo-Téguo. Hyphenating countercurrent chromatography with

ii NMR and mass spectrometry. How to enhance the range of the liquid phases. Journal cible : Anal. Chem. – Alison D. Pawlus, Emma Cantos-Villar, Tristan Richard, Jonathan Bisson, Pascal Poupard, Yorgos Papastamoulis, Pierre Waffo-Téguo, Jean-Michel Mé- rillon. Chemical dereplication of wine stilbenoids using high performance liquid chromatography-nuclear magnetic resonance. Journal cible : J. Chrom. A – Merian Nassra, Yorgos Papastamoulis, Gilbert Deccaux Kapche, Jonathan Bis- son, Caroline André, Jan-Pieter Konsman, Jean-Marie Schmitter, Jean-Michel Mérillon, Stéphanie Krisa, Pierre Waffo-Téguo. Effects of plant stilbenoids on lipopolysaccharide-induced nitric oxide, reactive oxygen species and tumor ne- crosis factor-α production in microglia. Journal cible : Planta Medica – Davide Slaghenaufi, Stéphanie Marchand-Marion, Jonathan Bisson, Pierre Waffo-Téguo, Tristan Richard, Jean-Pierre Monti, Jean Michel-Mérillon, Gilles de Revel. Isolation and characterization of galloyl glucoside precursors in French oak wood. Journal cible : J. Agric. Food Chem.

iii Présentations orales et posters

14.7 Présentations orales

– Jonathan Bisson, Marion Brunel, Alain Badoc, Antonio Palos-Pinto, Jean-Michel Mérillon, Pierre Waffo-Téguo. Hyphenating Countercurrent Chromatography with NMR and Mass Spectrometry. How to enhance the range of the liquid phases. INCNPR 2012, New York, USA, 31 Juillet 2012 – Jonathan Bisson, Pierre Waffo-Téguo, Couplages de la Chromatographie de Par- tage Centrifuge avec des techniques analytiques dans la recherche de stilbénoïdes à activités biologiques. Société de Pharmacie de Bordeaux, Bordeaux, France, 5 Avril 2012 – Jonathan Bisson, Tristan Richard, Alison D. Pawlus, Pierre Waffo-Téguo, Jean- Michel Mérillon. Phytochimie de la vigne et du vin : Apport des techniques cou- plées, CPC-MS et CLHP-RMN. Rencontres du Club Jeune, AFSEP, Paris, France, 14 Octobre 2010 – Jonathan Bisson, Pascal Poupard, Jean-Michel Mérillon, Pierre Waffo-Téguo. Phytochimie des stilbénoïdes de la vigne et du vin : Développement de méthodes innovantes pour l’obtention de nouveaux composés. Rencontres annuelles de l’ISVV, Bordeaux, France, 1-2 Juillet 2010

14.8 Posters

– Jonathan Bisson, Jean-Michel Mérillon, Pierre Waﬀo-Téguo. Développement d’un nouveau mode d’élution «back-step» CPC en utilisant le couplage avec la masse pour la puriﬁcation de stilbénoïdes de la vigne. SEP 2011, Toulouse, France, 23-25 Mars 2011

iv – Jonathan Bisson, Pascal Poupard, Alexandre Pons, Jean-Michel Mérillon, Pierre Waffo-Téguo. Development of a gradient elution system for efficient purification of Stilbenoids using centrifugal partition chromatography coupled to mass spectrometry. CCC2010, Lyon, France, 28-30 Juillet 2010

v Autres publications

– Jonathan Bisson, Pierre Waﬀo-Téguo, Jean-Michel Mérillon. Les techniques analytiques dans l’étude de la vigne et du vin : le cas des stilbénoïdes. CJ’ Mag, AFSEP, 2, 18-23, 2010

vi Activités d’enseignement

– Travaux pratiques de pharmacognosie “Voies d’accès aux substances médicamen- teuses - Substances actives d’origine naturelle”, étudiants de 2ème et 3ème année de pharmacie. 64 heures. – Cours sur “Métabolites d’intérêt industriel”, orienté sur les relations hommes- organismes vivants dans la découverte, le développement et l’utilisation des substances naturelles. DEUST Production et contrôles des produits de santé 1ère an- née, 6 heures

vii Encadrement de stages

14.9 Master 2

– Marion Brunel, Master 2 Phytochimie, Université de Corse, Développement de techniques pour la puriﬁcation et l’analyse de composés naturels - Applications aux stilbénoïdes, 2012

14.10 Master 1

– Keshika Mahadeo, Master 1 Biotechnologie des plantes, INRA-Université Bor- deaux 1-Université Bordeaux Ségalen, Purification de stilbénoïdes à partir de sources végétales, 2011 – Ramla Sahli, Master 1 Biotechnologie des plantes, INRA-Université Bordeaux 1-Université Bordeaux Ségalen, Purification de stilbénoïdes à partir de sources végétales, 2011 – Caroline Böcker, Master 1 Sciences des Aliments et Nutrition Humaine, Université Bordeaux Ségalen-Université Bordeaux 1, Purification de stilbènes glucosylés de Vitis vinifera, 2010 – Marie Fortin, Master 1 Sciences des Aliments et Nutrition Humaine, Université Bordeaux Ségalen-Université Bordeaux 1, Purification de stilbènes glucosylés de Vitis vinifera, 2010

viii Spectrométrie de masse - Fonctionnement d’une ESI-IT Bruker Esquire

La figure 2.4 reprend les différents éléments constituant le spectromètre de masse utilisé lors de cette thèse. Les éléments en rouge sont les paramètres pouvant êtremo- difiés par l’utilisateur pour optimiser la détection et la sélection des ions d’intérêt.

La première étape dans une source ESI est de créer une cône de mini goutelettes à partir du ﬂux, il faut pour celà jouer sur la position de l’aiguille et la pression du gaz de nébulisation (Nebulizer gas) en fonction du solvant utilisé et de son débit.

Par la suite, l’action conjointe d’un champ électrique appellé tension de capillaire et du gaz de séchage (Drying gas), dont on peut régler la température et le débit, permet d’éliminer la majorité du solvant et de former les ions.

Ceux-ci sont alors transportés au travers du capillaire (Capillary) par la diﬀérence de pression entre ses deux extrémités.

Les ions sont attirés au travers d’une plaque appellée Skimmer, permettant d’élimi- ner le solvant résiduel, puis, envoyés vers un système de focalisation des ions constitué de deux octopoles séparés par une plaque de partage. Cette dernière assurant la sé- paration entre le vide de premier niveau (ordre du millibar) et celui de second niveau (5 · 10−6 mbar).

Deux lentilles assurent la ﬁn de la focalisation des ions. Les ions arrivent dans la trappe dans laquelle un puit de potentiel électrostatique quadripolaire est présent pour

ix les piéger et sont ralentis par de l’hélium aﬁn de ne pas le quitter. Ils se rassemblent au centre de la trappe puis sont éjectés par un gradient de tension sur les deux électrodes de la trappe pour arriver à percuter la dynode qui en retour émettra des électrons détectés par le multiplicateur d’électrons.

Le spectre de masse est ainsi obtenu en traçant la caractéristique tension appliquée sur la trappe en fonction du signal du multiplicateur d’électrons. Une calibration de l’appareil permet d’obtenir la correspondance tension appliquée sur la trappe par rapport à la masse de l’ion éjecté.

Pour assurer de bonnes performances, deux étapes supplémentaires peuvent être nécessaires, contrôler le temps d’accumulation des ions dans la trappe et empêcher les ions de rentrer en dehors de cette étape d’accumulation. Ce dernier paramètre est géré par l’appareil par défaut, mais l’utilisateur peut jouer sur certains paramètres pour aﬃner cette étape.

Dans le cas de la fragmentation, l’application d’un signal radio-fréquence particulier permet d’éjecter tous les ions sauf celui que l’on souhaite fragmenter avant d’envoyer plus d’hélium dans la trappe pour le fracturer. S’en suit une phase d’analyse, ou une autre phase de fragmentation dans le cas des analyses MSn.

Afin de mettre au point une méthode sur ce type d’appareil, l’utilisateur doit intervenir sur les paramètres régissant chacune de ces étapes. Les logiciels fournis permettent une pré-configuration rapide en fonction de la gamme de masse que l’utilisateur souhaite observer, mais c’est à lui d’affiner tous ces paramètres par la suite pour obtenir une sensibilité meilleure 1.

1. Sur l’appareil disponible au laboratoire, cette phase d’optimisation permet dans certains cas d’augmenter la sensibilité d’un facteur 102 à 103.

x Paramètres de masse utilisés

Tableau 14.1 – Paramètres du spectromètre de masse

Condition CLHP (positif) CLHP (négatif) CPC (positif) CPC (négatif) Nebulizer, pression (psi) 15 15 35 35 Drying gas, ﬂux (l/min) 5 5 9 9 Drying gas, température (℃) 320 320 320 320 Capillaire (V) -3900 +4300 -5000 4300 Skimmer (V) 40 -29.5 35.2 -29.5 Cap Exit (V) 138.9 -176.4 250 -176.4 Oct 1 DC (V) 12 -8.77 12 -8.77 Oct 2 DC (V) 1.85 -2.74 2.28 -2.74 Oct RF (V) 125.5 200 250 200 Lens 1 (V) -4.5 5.4 -6.2 5.4 Lens 2 (V) -46.9 55.7 -61.6 55.7 Trap Drive (V) 63.7 75.0 73.7 75 Block voltage Lens 2 (V) -46.9 46.9 -60 60 Scan Delay (ms) 25 25 25 25 Accu Time (ms) 100 100 100 100 ICC Target 90000 90000 50000 90000 Scan 130-1100 130-1100 50-1000 50-1000 Averages 5 5 5 ou 10 5 ou 10 Rolling average 2 2 5 ou 10 5 ou 10

xi Fractionnement de E11 par CPC 1L

Intens. E11 [mAU]

250

200

150

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Time [min] CIE 229-230 + CIE 245-246 + CIE 455-456 + CIE 681-682 + CIE 907-908 + Figure 14.8 – Chromatogramme UV à 280 nm de l’extrait E11 et Chromatogrammes d’Ions Extraits réalisés grâce à CIERamp.

xii Absolute level 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 200 400 600 800 0 Figure Absorbance 280 Absorbance 306 Absorbance 5 49–Fatonmn eletatE1prCC1 vcl ytm ARIZONA-K. système le avec 1L CPC par E11 l’extrait de Fractionnement – 14.9 10 15 20 KD1 25 KD2 KD3 30 35 Time [min] xiii KD4 40 KD5 45 KD6 50 KD7 55 KD8 60 65 70 75 80 Intens. E11-KD1 [mAU] 20

0 Intens. E11-KD2 [mAU] x106 4 2 0 Intens. E11-KD3 150

100

0 Intens. E11-KD4 [mAU]

1000

0 Intens. E11-KD5 [mAU]

1000

0 Intens. E11-KD6 [mAU]

400

200

0 Intens. E11-KD7 [mAU] 1500 1000 500 0 Intens. E11-KD8 [mAU] 20

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time [min]

Figure 14.10 – Fractionnement de l’extrait E11 par CPC 1L avec le système ARIZONA-K : Fractions.

xiv Erratum Vitisine B

Dans la publication (Bisson et al. 2011), il est fait référence à la Vitisine C. Après vériﬁcation du spectre RMN, il s’avère que ce composé est en fait la Vitisine B, en accord avec les données spectrales de (J. Ito et Niwa 1996). Les constantes de couplage des protons portés par les carbones asymétriques, voir ﬁgure 14.11 sont données dans le tableau 14.2.

7a 8a

8b 7d 8d 7b

Figure 14.11 – Centres asymétriques de la vitisine B.

Par ailleurs, la mesure en polarimétrie donne une valeur de [α]D de -83,33 ℃, dans le méthanol, pour une concentration de 0,02 g/100 mL à 20 ℃. Valeur cohérente avec les -90° pour une concentration de 2,3 g/100 mL donnés dans la même publication. À titre d’information, la Vitisine C à un [α]D de +239.9 pour une concentration de 0.5 g/100 mL.

Lors de la détermination de structure, une incohérence est apparue par rapport à l’attribution des protons 6d-2d,5d-3d et 2a-6a,3a-5a. Il semblerait que l’attribution soit plutôt, à partir de ce qui est observé en COSY, voir ﬁgure 14.12 :

xv Tableau 14.2 – Constantes de couplages des protons portés par les centres asymétriques de la vitisine B. Entre parenthèses valeurs données dans (J. Ito et Niwa 1996) pour cette même molécule.

Proton Déplacement chimique (ppm) Multiplet Constante de couplage (Hz) 7a 5,4 (5,36) d 6,6 (6,2) 8a 4,38 (4,33) d 6,6 (6,2) 7b 5,47 (5,42) d 5,1 (5,1) 8b 4,3 (4,25) d 5,1 (5,1) 7d 5,38 (5,33) d 4,4 (4,8) 8d 4,4 (4,36) d 4,4 (4,8)

Protons Déplacement chimique (ppm) Multiplet Constante de couplage (Hz) 2a-6a 7.18 (7.13) d 8.4 3a-5a 6.81 (6.76) d 8.4 6d-2d 7.23 (7.18) d 8.4 5d-3d 6.87 (6.52) d 8.4

6.65

6.70

6.75

3a 5a 7.18, 6.81, 0.12, 0 (11, 12)(15, 14) 6.80

2a 6a 7.22, 6.87, 0.03, 0 (60, 61)(63, 64)(64, 64) 6.85

6.90

6.95

7.00

6d 7.05

5d ChemicalF1 (ppm) Shift 2d 7.10 3d 6.81, 7.18, 0.04, 0 (12, 11)(14, 15) 7.15

7.20

6.87, 7.22, 0.05, 0 (60, 61)(61, 60)(63, 64)(64, 63) 7.25

7.30

7.35

7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 F2 Chemical Shift (ppm)

Figure 14.12 – Spectre COSY des deux phénols a et d.

xvi Protocole du Prospekt2 obtenu par rétro-ingénierie

Tableau 14.3 – Requêtes d’action du module ACE.

Code action Argument Fonction Requête 152 Réponse 0160 000000 Pré-initialisation ? Non 0x6 2120 000021 Décharger ACE-P Oui 0x6 2137 000001 Charger ACE-P Oui 0x6 2112 00000x Changer position de la vanne ACE-V1 Oui 0x6 5106 00000x Changer position de la vanne ACE-V2 Oui 0x6 2102 00000x Changer position de la vanne ACE-V3 Oui 0x6 2190 00000x Changer position de la vanne ACE-V4 Oui 0x6 2127 00000x Changer position de ACE-B (1=gauche,2=droite) Oui 0x6 2110 000001 Initialiser ACE-PG Oui 0x6 2110 000000 Remettre en position repos ACE-PG Oui 0x6 2111 000001 Ouvrir ACE-PG Oui 0x6 2111 000000 Fermer ACE-PG Oui 0x6 2100 000001 Initialiser ACE-PD Oui 0x6 2100 000000 Remettre en position repos ACE-PD Oui 0x6 2101 000001 Ouvrir ACE-PD Oui 0x6 2101 000000 Fermer ACE-PD Oui 0x6 2050 000001 Remettre les cartouches à leurs positions Oui 0x6 2122 0xyyyb Mettre la cartouche y du rack x dans la pince bOui0x6 2123 0xyyyb Mettre la cartouche de la pince b à la position y du rack xOui0x6 016x 00yyyy Changer l’état des sorties Non 0x6

xvii Tableau 14.4 – Requêtes d’action du module HPD.

Code action Argument Fonction Requête 152 Réponse 2000 00000x Changer la position de la vanne HPD-V1 Oui 0x6 2020 00000x Changer la position de la vanne HPD-V2 Oui 0x6 2001 0xxxxx Vitesse d’aspiration HPD-S1 Non 0x6 2005 0xxxxx Vitesse de refoulement HPD-S1 Non 0x6 2021 0xxxxx Vitesse d’aspiration HPD-S2 Non 0x6 2025 0xxxxx Vitesse de refoulement HPD-S2 Non 0x6 2002 00xxxx Aspiration d’un volume x dans HPD-S1 Oui 0x6 2006 00xxxx Refoulement d’un volume x dans HPD-S1 Oui 0x6 2022 00xxxx Aspiration d’un volume x dans HPD-S2 Oui 0x6 2026 00xxxx Refoulement d’un volume x dans HPD-S2 Oui 0x6 2011 000xxx Limite de pression dans HPD-S1 Non 0x6 2031 000xxx Limite de pression dans HDP-S2 Non 0x6

Tableau 14.5 – Requêtes d’état communes aux deux modules.

Code d’action Argument Fonction 1001 000152 Indicateur d’état 1001 000154 Demande version 1001 000155 Indicateur d’erreur 1 1001 000156 Indicateur d’erreur 2 1001 000158 Signature appareil 1 1001 000159 Signature appareil 2

xviii Tableau 14.6 – Requêtes d’état du module ACE.

Code d’action Argument Fonction 1001 002112 Position de la vanne ACE-V1 1001 005106 Position de la vanne ACE-V2 1001 002102 Position de la vanne ACE-V3 1001 002190 Position de la vanne ACE-V4 1001 002110 État de ACE-PG 1001 002100 État de ACE-PD 1001 000160 État des sorties 1001 000169 État des entrées 1001 002130 RFID : code ACE-R1 1001 002133 RFID : code ACE-R2 1001 002132 RFID : type ACE-R1 1001 002135 RFID : type ACE-R2 1001 002172 RFID : état des cartouches ACE-R1 1001 002173 RFID : état des cartouches ACE-R2 1001 002200 Cartouche dans ACE-PG 1001 002201 Cartouche dans ACE-PD 1001 000614 Nombre de rotations ACE-V1 1001 000601 Nombre de rotations ACE-V2 1001 000612 Nombre de rotations ACE-V3 1001 000635 Nombre de rotations ACE-V4 1001 000615 Nombre de déplacements de ACE-B 1001 002182 Inconnu (réponse 0x15)

Tableau 14.7 – Requêtes d’état du module HPD.

Code d’action Argument Fonction 1001 002000 Position de la vanne HPD-V1 1001 002020 Position de la vanne HPD-V2 1001 002010 Pression dans HPD-S1 1001 002030 Pression dans HPD-S2 1000 002009 Volume de HPD-S1 1000 002029 Volume de HPD-S2 1000 002001 Vitesse d’aspiration HPD-S1 1000 002005 Vitesse de refoulement HPD-S1 1000 002021 Vitesse d’aspiration HPD-S2 1000 002025 Vitesse de refoulement HPD-S2 1000 002011 Limite de pression dans HPD-S1 1000 002031 Limite de pression dans HPD-S2 1001 002016 Volume courant dans HPD-S1 1001 002036 Volume courant dans HPD-S2 1001 000607 Nombre de rotations de HPD-V1 1001 000609 Nombre de rotations de HPD-V2

xix Tableau 14.8 – Registres d’erreurs des modules.

Module Registre Erreur HPD 300 Erreur dans le contrôleur principal HPD 3x0 Erreur dans le contrôleur de seringue (1=HPD-S1,2=HPD-S2) HPD 3x1 Surpression dans la seringue (1=HPD-S1,2=HPD-S2) HPD 3x2,3x3 La seringue ne peut aspirer (1=HPD-S1,2=HPD-S2) HPD 3x8,3x9 Le contrôleur de la seringue ne fonctionne pas (1=HPD-S1,2=HPD-S2) ACE 400 Erreur dans le contrôleur principal ACE 401 Cartouche invalide ACE 402 Module non initialisé ACE 410 Erreur dans la vanne ACE-V1 ou ACE-PD ACE 411 Cartouche inattendue dans ACE-PD ACE 420 Erreur dans la vanne ACE-V3 ou ACE-PG ACE 421 Cartouche inattendue dans ACE-PG ACE 440 Erreur vanne ACE-V2 ou ACE-V4 ACE 450 Erreur du transpondeur RFID ACE 47x Position inconnue ACE 473 Pas de bac de récupération de solvant en place ACE 474,487 Pas de tiroir ou mauvaise position de celui-ci ACE 475,476 Erreur de mouvement de ACE-B (5=gauche, 6=droite) ACE 479,481,483 Une cartouche était attendue dans ACE-B ACE 480,482,484,485 La cartouche n’était pas attendue dans ACE-B ACE 488,489 Erreur dans le contrôleur du transporteur ACE 500 Impossible de lancer la tâche demandée ACE 501 Les versions des microgiciels de correspondent pas ACE 520,528,529 Erreur du contrôleur principal de vanne

xx Solvants résiduels dans les produits à usage pharmaceutique

La liste des solvants présentée ici est issue du guide développé par l’International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharma- ceuticals for Human Use (ICH) dans sa dernière révision de 2011 (Guideline 2005). Cet organisme à pour objectif d’harmoniser les réglementations dans les industries pharmaceutique d’Europe, du Japon et des États-Unis. Les solvants décrits ici sont divisés en trois classes : – Classe 1 : Solvants à éviter, Cancérigènes connus, cancérigènes suspectés et risques environnementaux. – Classe 2 : Solvants à limiter, Cancérigènes non génotoxiques sur l’animal ou pouvant causer des symptômes irréversibles tels que la tératogénicité ou la neurotoxicité. Tout solvant suspecté d’effets significatifs mais réversibles. – Classe 3 : Solvants avec un faible potentiel toxique, Faible toxicité pour l’Homme, pas de limitation d’exposition nécessaire. L’exposition journalière admissible doit être de 50 mg ou plus. Toute concentration inférieure à 5000 ppm ne nécessite pas de justification.

xxi Tableau 14.9 – Solvants de Classe 1 décrits dans le document Q3C(R5) de l’ICH.

Solvant Limite de concentration (ppm) Risque associé Benzène 2 Cancérigène Tétrachlorure de carbone 4 Toxicité et risque environnemental 1,2-Dichloroéthane 5 Toxicité 1,1-Dichloroéthane 8 Toxicité 1,1,1-Trichloroéthane 1500 Risque environnemental

Tableau 14.10 – Solvants de Classe 2 décrits dans le document Q3C(R5) de l’ICH. EJA : Exposition jour- nalière admissible.

Solvant EJA (mg/jour) Limite de concentration (ppm) Acétonitrile 4.1 410 Chlorobenzene 3.6 360 Chloroforme 0.6 60 Cumène 0.7 70 Cyclohexane 38.8 3880 1,2-Dichloroéthène 18.7 1870 Dichlorométhane 6.0 600 1,2-Dimethoxyéthane 1.0 100 N,N-Diméthylacétamide 10.9 1090 N,N-Diméthylformamide 8.8 880 1,4-Dioxane 3.8 380 2-Ethoxyéthanol 1.6 160 Éthylèneglycol 6.2 620 Formamide 2.2 220 Hexane 2.9 290 Méthanol 30.0 3000 2-Méthoxyéthanol 0.5 50 Méthylbutyl kétone 0.5 50 Méthylcyclohexane 11.8 1180 N-Methylpyrrolidone 5.3 530 Nitrométhane 0.5 50 Pyridine 2.0 200 Sulfolane 1.6 160 Tetrahydrofurane 7.2 720 Tétraline 1.0 100 Toluène 8.9 890 1,1,2-Trichloroéthène 0.8 80 Xylène 21.7 2170

xxii Tableau 14.11 – Solvants de Classe 3 décrits dans le document Q3C(R5) de l’ICH.

Acide acétique Heptane Acétone Acétate d’isobutyle Anisole Acétate d’isopropyle 1-Butanol Acétate de méthyle 2-Butanol 3-Méthyl-1-butanol Acétate de butyle Méthyléthyl cétone tert-Butylméthyl éther Méthylisobutyl cétone Diméthyl sulfoxide 2-Méthyl-1-propanol Éthanol Pentane Acétate d’éthyle 1-Pentanol Éther éthylique 1-Propanol Formate d’éthyle 2-Propanol Acide formique Acétate de propyle

xxiii