Amplificazione Delle Regioni ITS1 E ITS2 Per L’Identificazione Di Muffe Di Interesse Clinico

Blanca M. Fernandez Rodriguez

Lavoro di diploma Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno

Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico

Lavoro svolto presso Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona

2007 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 1

Indice

1. Riassunto, Abstract 3

2. Introduzione 4

3. I funghi 5

4. La classificazione 6

5. Gli aspetti clinici 7

6. Le regioni ITS1 e ITS2 8

7. Materiali e metodi 10

7.1. Campioni 10 7.2. Coltura 10 7.3. Estrazione 10 7.4. PCR 11 7.5. Seminested PCR 12 7.6. Controlli 12 7.7. Elettroforesi 13 7.8. Purificazione dei prodotti PCR 13 7.9. Reazione di sequenza 13 7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza 13 7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica 14 7.12. Analisi delle sequenze 14 7.13. Costruzione dell’albero filogenetico 14

8. Risultati 15

8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA 15 8.2. Coltivazione su piastra 17 8.3. Estrazione e amplificazione 17 8.4. Sequenze 18 8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante analisi 18 delle sequenze 8.6. Albero filogenetico 19

9. Discussione 27

10. Bibliografia 28 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 2

11. Allegati 30

11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti, 31 Zigomiceti, e basidiomiceti 11.2. Lista dei campioni 34 11.3. Lista delle sequenze di riferimento 37 11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro 39 11.5. Albero filogenetico 42 11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras, 44 delle specie usate in questo lavoro Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 3

1. Riassunto Abstract

Il numero delle micosi é in continuo aumento Invasive fungal diseases are increasing in soprattutto nei pazienti ospedalizzati ed immunocompromised and hospitalized immunocompremessi. Una rapida ed accurata patients. Early detection and accurate diagnosi permette d’iniziare una terapia identification of the fungi permits a rapid and antimicotica adeguata. Le tecniche optimal initiation of antifungal therapy. diagnostiche comunemente usate in The diagnosis of mould is generally based on laboratorio per l’identificazione dei miceti biochemical, serological and phenotype sono tecniche biochimiche , sierologiche e identification. However these methods take fenotipiche. Purtroppo queste tecniche time and do not always lead to a precise prevedono tempi d’esecuzione lunghi e non identification of the microorganism. For this sempre forniscono risultati accurati reason, the Cantonal Institute of Microbiology nell’identificazione della specie. decided to test a molecular biological Per questo motivo l’Istituto Cantonale di technique, the polymerase chain reaction Microbiologia ha deciso di testare come (PCR), as identification procedure. In fact tecnica d’analisi per l’identificazione delle PCR technology promises more rapid and muffe patogene l’utilizzo della polymerase specific identification. chain reaction (PCR). Una tecnica che si In this work we have evaluated the feasibility presenta con un’alta sensibilità e specificità. of the sequence analysis of the internal In questo lavoro abbiamo sfruttato la PCR per transcribed spacer regions (ITS) of the ottenere le sequenze di una regione altamente ribosomal DNA for the identification of variabile presente nel DNA ribosomale, e pathological moulds. regioni ITS1 e ITS2, mediante l’utilizzo di The ITS sequences were obtained by primers universali (ITS1, ITS4).Le sequenze amplification of the ITS region (ITS1-5,8S- ottenute, appartenenti a 56 ceppi di 36 specie ITS2) with universal fungal primers (ITS1, diverse, sono state confrontate con le ITS4). The sequence analyses of 56 strains for sequenze presenti nella GenBank a total of 36 different species were compared (NCBI).L’identificazione genotipica che to reference data available at the GenBank questa ha fornito é stata confrontata con database, and the genotypic identification was l’identificazione morfologica. compared with phenotype identification. Le due tecniche d’analisi mostrano For 98,2% of the strains, both methods gave un’identificazione identica a livello di genere concordant results at the genus level. Of per il 98,2% e a livello di specie per il 44,6% . these, 44,6% were assigned to the identical L’identificazione fenotipica é risultata più species. Phenotypic criteria were more specifica a livello di specie per il 21,4%. specific in 21,4% and genotypic criteria were Mentre l’identificazione genotipica é risultata more discriminative for 7,14%. 12,5% of the più discriminante solamente per il 7,14%. Il strains showed discrepant results. We can 12,5% dei ceppi analizzati ha mostrato dei therefore conclude that identification of risultati discrepanti fra le due tecniche medically important moulds at the level of d’identificazione. In conclusione si può dire species by ITS sequencing is not a viable che l’analisi delle diverse specie di funghi alternative to conventional identification mediante l’utilizzo delle sequenze ITS non methods. può essere un valido sostitutivo dell’identificazione morfologica . Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 4

2. Introduzione

Il numero delle infezioni fungine é in continuo aumento soprattutto nei pazienti immunocompromess [1]. L’identificazione precisa delle diverse specie nella diagnostica delle micosi gioca dunque un ruolo molto importante per l’orientamento del trattamento medico. Prendiamo per esempio il genere Scedosporium dove il Scedosporium apiospermun é sensibile ad una determinata gamma di antimicotici mentre ill Scedosporium prolificans si mostra resistente alla maggior parte di essi [2]. Oppure consideriamo il genere degli Aspergillus che comprendente più di 180 specie diverse, ma la principale causa di problemi broncopolmonari, delle cheratiti, delle sinusiti, sopratutto nei pazienti immunocompromessi, sono unicamente l’Aspergillus fumigatus, l’A. flavus e A. terreus [3, 4]. L’identificazione delle diverse specie fungine può essere effettuata con l’analisi diretta al microscopio ottico del campione, mediante la coltura su piastra e la differenziazione morfologica delle diverse strutture, con test sierologici per la ricerca di antigeni o anticorpi e test biochimici. Oggi queste tecniche non sono più soddisfacenti soprattutto a livello diagnostico poiché sono tecniche laboriose, poco standardizzabili e con tempi di esecuzione molto lunghi in particolar modo per quanto riguarda la coltura su piastra i qui tempi variano da specie a specie, ma richiedono un minimo di 48h d’incubazione [2]. In oltre nella maggior parte dei casi queste tecniche non forniscono risultati accurati poiché presentano una bassa specificità nell’identificazione della specie [2].

L’utilizzo di tecniche di biologiamolecolare Figura 1. Tempi di crescita su piastra per permette invece un’identificazione rapida e specifica lieviti, muffe e funghi dimorfi [20] con una sensibilità maggiore. Molte pubblicazioni propongono infatti varie tecniche fra le quali troviamo la PCR, la Real-time PCR, la PCR-Elisa, la RFLP (Restriction Fragment Polymorfism) ecc. [5, 6, 7, 8, 21].

In questo lavoro si é deciso di testate come tecnica d’analisi per l’identificazione delle diverse specie di muffe l’amplificazione mediante la PCR della regione altamente variabile ITS1 e ITS2 presente nel DNA ribosomiale. Studi precedenti propongono l’utilizzo dei geni ribosomali poiché si presentano in più copie all’interno del genoma e mostrano regioni conservate, come per esempio i geni 18S, 28S e 5.8S comuni a tutti i funghi, e delle regioni altamente variabili fra le differenti specie, come le regioni ITS. Queste regioni variabili sono quindi sfruttabili per la classificazione filogenetica e dunque anche per un’identificazione a livello di specie necessaria per la diagnostica.[1, 3, 9, 10, 11]. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 5

3. I Funghi

Gli organismi che costituiscono il regno dei funghi sono organismi eucarioti, non fotosintetici, aerobi o anaerobi, pluricellulari o unicellulari. Possono presentarsi come lieviti, muffe o funghi dimorfi, essere saprofiti, parassiti oppure vivere in simbiosi con l’organismo ospite. Sono provvisti di una parete cellulare rigida, che può essere pluristratificata, composta da cellulosa, emicellulosa o chitina e presentano un citoplasma spesso multinucleato. I lieviti sono organismi unicellulari ovali di 3-5 µm di diametro; si riproducono principalmente per gemmazione e possono formare delle pseudoife. Le muffe sono funghi pluricellulari caratterizzati da un elemento di crescita tubulare ramificato detto ifa. L’ifa può essere suddivisa da setti parietali o no: ifa settata o cenocitica. Dal suo sviluppo per estensione apicale e laterale viene a formarsi il micelio (o tallo). Il micelio viene detto vegetativo se aderisce e penetra nel terreno di coltura o nel tessuto ospite, riproduttivo o aereo se le sue ife si proiettano sulla superficie del terreno e portano le cellule riproduttive o spore. I fungi dimorfi sono definiti come miceti in grado di presentarsi sotto forma di lieviti o muffe al variare delle condizioni ambientali [4, 12].

I funghi si riproducono in maniera asessuata o in maniera sessuata attraverso la produzione di spore. I due tipi di riproduzione possono alternasi durante il ciclo vitale. A dipendenza dello stadio in qui si trova l’organismo, se nella forma telomorfa (riproduzione sessuata) o nella forma anamorfa (riproduzione asessuata) possono prende una diversa nomenclatura. La specie Aspergillus nidulans, per esempio, nella sua forma telomorfa prende il nome di Emericella nidulans (vedi allegato 11.4). Se alla forma anamorfa é stata attribuita la stessa forma telomorfa allora si parla si sinamorfismo [13]. Per molte specie e sconosciuta la forma telomorfa, perché l’organismo non é in grado di riprodursi sessualmente oppure perché non é stata ancora identificata. Questi fungi vengono classificati in un gruppo tassonomico artificiale: i Deuteromiceti o funghi imperfetti. Oggigiorno però, mediante l’impiego di analisi molecolari la maggior parte dei Deuteromiceti é assegnata alla divisione degli Ascomiceti ed una piccola parte ai Basidiomiceti [5]. La produzione assesuata avviene per scissione, gemmazione o formazione di spore. Queste a loro volta possono essere prodotte per frammentazione e distacco di una parte della ifa oppure per sporulazione. Le spore possono essere di tipo diverso, fra le più frequenti troviamo le tallospore, formate per trasformazione di elementi preesistenti del tallo, oppure le conidiospore, prodotte da ife specializzate. La riproduzione sessuata prevede invece la plasmogamia e la cariogamia. Nei zigomiceti due ife riproduttive si uniscono formando una zigospora all’interno della quale si formerà lo zigote che in seguito a meiosi verrà liberato ed inizierà la fase asessuata. Nei ascomiceti gli organi riproduttivi si uniscono formando l’asco contenente le ascospore. Nei Basidiomiceti il corpo fruttifero produce numerosi basidi ciascuno dei quali svilluppa 4 spore [14]. (vedi tavole 11.1) Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 6

4. La classificazione

La classificazione odierna prevede quattro divisioni del regno dei funghi: Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota [13]. Le diverse specie sono state raggruppate in base alle caratteristiche morfologiche del tallo e delle strutture riproduttive. Dal 1970, per ovviare alle differenti classificazioni presenti in letteratura dovute soprattutto alle nomenclature diverse attribuite alla stessa specie, si é cercato d’introdurre fra i criteri che definiscono una specie l’analisi del DNA. Il regno dei funghi é comunque in continua evoluzione con ca. 20 nuove specie all’anno [5, 9, 15].

Tabella 1. Divisione del regno dei funghi con alcune classi ed ordini di intersesse medico [13]

Ascomicota Basidiomycota Zygomicota Chytridiomycota

Archiascomycetes Hymenomycetes Zygomycetes Pneumocystidiales Agaricales Entomophthorales Stereales Mortierellales Hemiascomycetes Tremellales Mucorales Saccharomycetales Urediniomycetes Euascomycetes Sporidiales Chaetothyriales Clavicipitales Ustilaginomycetes Dothideales Microstomatales Eurotiales Tilletiales Hypocreales Ustilaginales Leotiales Microascales Onygenales Ophiostomatales Pezizales Phyllachorales Pleosporales Sordariales

Gli Ascomiceti rappresentano il più grande gruppo tassonomico del regno dei funghi. Raggruppano il 50% di tutte le specie fungine e aprossimativamente l’80% dei funghi patogeni. Sono caratterizzati da una riproduzione asessuata mediante la formazione di conidiospore e da una riproduzione sessuata mediante la formazione di aschi contenenti le ascospore. I Basisiomiceti comprendono circa 23'000 specie sopratutto funghi a cappello mangerecci. Sono caratterizzati dalla formazione di copri fruttiferi contenenti numerosi basidi ciascuno dei quali sviluppa 4 spore durante la riproduzione sessuata. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 7

Fra i Zigomiceti, caratterizzati dalla formazione di zigospore, troviamo 1% di tutte le specie del regno dei funghi, molti dei quali responsabili di infezioni cutanee e gastrointestinali nell’uomo. In fine i Chitridiomiceti rappresentano i funghi meno sviluppati, caratterizzati sopratutto da una struttura unicellulare e da una riproduzione asessuata mediante la formazione di zoospore [ 4, 9]. (vedi tavole 11.1)

5. Gli aspetti clinici

Su più di 10'000 specie descritte all’incirca 100 sono coinvolte in micosi umane o animali. Le micosi possono essere superficiali se colpiscono solo i peli e gli strati più esterni dell’epidermide senza provocare dunque una risposta immunitaria [13]. Vengono comunemente denominate con il nome di tigna o piedra [4]. Le micosi cutanee coinvolgono invece l’epidermide, i capelli, le unghie e le mucose esterne come per esempio quelle dei genitali [13]. Queste micosi sono causate sopratutto dai generi Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton [4]. Le micosi sottocutanee interessano cute, sottocute, muscoli e ossa. La malattia si sviluppa lentamente e può impiegare anche degli anni dopo la penetrazione per raggiungere il tessuto sotto cutaneo [4]. Ci sono in fine le micosi profonde o sistemiche che colpiscono gli organi interni ed i visceri. Sono causate sopratutto da funghi dimorfi penetrati all’interno dell’organismo per inalazione delle spore, in seguito ad operazioni chirurgiche, tramite l’utilizzo di cateteri, ecc.. L’infezione nasce con una lesione polmonare che può diventare cronica ed entrare nel sistema sanguineo fino a raggiungere altri organi [4, 13,].

Tabella 2. Alcuni miceti d’importanza medica [4] Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 8

Troviamo poi le infezioni causate da fungi opportunisti come per esempio l’aspergillosi causate soprattutto dall’ Aspergillus fumigatus, un fungo presente ovunque in natura che penetra all’interno dell’organismo mediante l’inalazione delle spore causando problemi allergici e broncopolmonari. Un’altro esempio di infezioni da funghi opportunisti sono le candidosi, causate dalla Candida albicans comunemente presente nella flora normale delle nostre mucose che prende il sopravvento quando questa viene alterata. Queste micosi colpiscono sopratutto i neonati, i pazienti immunocompromessi in seguito a neoplasie, leucemie, chemioterapie, AIDS oppure pazienti in cure intensive, gli ustionati ed inseguito all’utilizzo prolungato di antibiotici [3,10,13].

6. Le regioni ITS1 e ITS2

I ribosomi degli organismi eucariotici sono formati da due subunità strutturali, 60S e 40S, costituite da frammenti di rRNA e proteine che prendono il nome dalla misura della loro velocità di sedimentazione, in seguito a centrifugazione, definita in unità di Svedberg (S). La subunità 60S presenta i frammenti di rRNA 28S, chiamato anche LSU (large subunit), 5,8S e 5S e circa 50 proteine. La subunità 40S presenta un unico frammento di RNA 18S, chiamato anche SSU (small subunit) e circa 33 proteine. Al momento della traduzione del mRNA queste subunità si uniranno per formare i ribosomi 80S [16].

Tabella 3. Struttura dei ribosomi procarioti ed eucarioti [16]

Subunità rRNA Proteine

PROCARIOTI 70 S 50S 23S + 5S ~ 31

30S 16S ~ 21

EUCARIOTI 80 S 60S 28S + 5,8S + 5S ~ 50

40S 18S ~ 33

I geni che codificano per i diversi frammenti di rRNA sono geni ripetuti, costituenti dell’organizzatore nucleolare, NOR (Nucleolus organizer region). All’interno del cromosoma sono raggruppati in unità strutturali separate da sequenze spaziatrici non codificanti, NTS (nontranscribed spacer) o IGS (intergenic spacer). Ogni unità strutturale é costituita da un spaziatore trascritto esterno, ETS (external transcribed spacer), situato all’estremità 3’ del gene 18S, due spaziatori trascritti interni, ITS (internal transcribed spacer), situati rispettivamente: l’ITS1 fra il gene 18S ed il gene 5,8S, l’ITS2 tra il gene 5,8S e l’estremità 3’ del gene 28S ed in fine il gene 5S separato dal gene 28S da una sequenza spaziatrice non codificante. I geni 18S, 5,8S e 28S verranno trascritti dalla DNA polimerasi I in un pre-rRNA 45S che in seguito a maturazione tramite eliminazione delle sequenze spaziatrici ETS ed ITS formerà i rispettivi frammenti di rRNA. Il gene 5S verrà transcritto dalla DNA polimerasi III nel suo corrispettivo rRNA.[6, 9, 17] Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 9

Figura 2. Struttura dei geni ribosomali degli organismi eucarioti Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 10

7. Materiali e metodi

7.1. Campioni

I diversi ceppi di fungi usati per questo lavoro provengono da una raccolta interna all’ICM effettuata dal 1995 al 2005. La raccolta comprende ceppi ottenuti da campioni clinici, ceppi provenienti da corsi di aggiornamento effettuati presso la BioMérieux e ceppi provenienti da controlli di qualità della NEQAS (National External Quality assesment Service, Regno Unito), tutti identificati morfologicamente all’interno dell’istituto. I campioni sono conservati a temperatura ambiente in acqua sterile.

7.2. Coltura

I ceppi sono stati coltivati su piastre di Petri, contenenti 25 ml di agar Sabouraud Cloramfenicolo (SAB CHL-D, bioMérieux, Svizzera), ed incubati a 37°C.

7.3. Estrazione

Per l’estrazione del DNA sono state testate due metodiche differenti previste per il mini kit DNeasy Plant (Metodica 1) e per il kit QIAamp DNA extraction della QIAGEN (QIAGEN, Svizzera) (Metodica 2). Le due metodiche presentano una versione modificata dei processi di lisi previsti per i protocolli originali.

Metodica 1

Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura e depositarla in una provetta Eppendorf. Aggiungere ca. 1,5 ml di azoto liquido ed attendere per ca. 30 s fino a completa evaporazione dell’azoto. Mediante l’utilizzo di un pestello, schiacciare il micelio congelato fino a ridurlo in una polvere fine. Aggiungere 400 µl di tampone AP1 e 4µl di RNase A (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) e vortexare vigorosamente. Incubare il tutto per 10 min a 65°C miscelando 2 o tre volte durante l’incubazione. Aggiungere 130 µl di tampone AP2 ed incubare per altri 5 min al freddo, immergendo le provette Eppendorf in un contenitore con ghiaccio. Centrifugare il lisato per 5 min a 20'000 x g e trasferire il sovranatante in una QIAshedder Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera). Centrifugare per 2 min a 20'000 x g e aggiungere 795 µl di tampone AP3/E. Pipettare 650 µl della soluzione in una DNeasy Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Ripetere il passaggio precedente con la rimanente quantità di soluzione. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11

Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW e centrifugare per 1 min a 6'000 x g . Ripetere l’operazione e centrifugare 2 min a 20'000 x g. Eluire il DNA con 200 µl di tampone AE.

Metodica 2

Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura ed incubarla per 10 min a 98°C in 200 µl di soluzione di lisi contenente 5 µl di NaOH 1M, 20 µl SDS al 5%, e 175µl H2O. Neutralizzare la soluzione con 200 µl di HCl 25 mM. Aggiungere 400 µl di tampone di lisi AL (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) ed incubare per altri 10 min a 98°C [7]. Aggiungere 400 µl di etanolo al 100% e centrifugare per 5 sec a 20'000 x g. Caricare 600 µl del supernatante su una colonnina DNA Mini spin (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500µl di soluzione di lavaggio AW1. Centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Riposizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW2 . Centrifugare per 3 min a 20'000 x g. Effettuare un’ulteriore centrifugazione per 1 min a 20'000 x g per asciugare completamente la membrana della colonnina. Eluire il DNA con 200 µl di tampone di eluizione AE.

7.4. PCR

La PCR prevede l’amplificazione della regione ITS che comprende i geni spaziatori non codificanti ITS1 e ITS2 ed il gene 5,8S, mediante l’utilizzo del forward primer ITS1 ed il revers primer ITS4 (Microsynth, CH) [3].

ITS1: 5’- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3’ 19 bp ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 20 bp

Il mix di reazione per un campione contiene 28,65 µl H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera), 5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP, dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera), 1µl ITS1, 1µl ITS4 10 µM (Microsynth, Svizzera), 0,1 µl UNG (1U/µl)(Uracil DNA Glicosilasi, Roche, Svizzera) e 10 µl di DNA estratto.

La reazione d’amplificazione é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e prevede un ciclo di prePCR di 5 min a 37°C, per l’attivazione dell’UNG e 15 min a 95°C seguito da 40 cicli suddivisi in: 30 sec a 95 °C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C per l’estensione del frammento. Si conclude con un’estensione finale 72°C per 1 min. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 12

7.5. Seminested PCR

Per i campioni per i quali la PCR ha fornito scarse quantità di amplificato é stata eseguita una reazione di seminested PCR mediante l’utilizzo del forward primer ITS86 ed il reverse primer ITS4 [18].

ITS86: 5’- GTG AAT CAT CGA ATC TTT GAA C -3’ 22 bp ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 20 bp

Il mix di reazione per un campione contiene 37, 75 µl H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP, dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera), 1µl ITS86, 1µl ITS4 10µM (Microsynth, Svizzera) e 1 µl di DNA amplificato. I diversi passaggi della reazione d’amplificazione corrispondono a quelli visti per la PCR (vedi paragrafo precedente).

7.6. Controlli

Per il controllo delle reazioni d’amplificazione sono stati usati 3 controlli positivi. Il BRF 15 Trichophyton rubrum, isolato da un campione clinico di pelle. Il BRF 24 Candida glabrata, isolato da un espettorato e il BRF 32 Cladosporium sp. isolato da un campione clinico proveniente da un’infezione batterica. La grandezza del loro prodotto di amplificazione con i primer ITS1 e ITS4 corrisponde rispettivamente a : Candida glabrata 820 bp, Cladosporium sp. 549 bp, Trichophyton rubrum 692 bp [6, 7].

123 4 5 6 7 8 9 10 Figura 3. Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei controlli positivi. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 135, 4) 46, 5) 27, 6) 79a, 7) 79b, 8) BFR 32 Cladosporium sp. 549 bp, 9) BFR 15 Trichophyton rubrum 692 bp, 10) BFR 24 Candida glabrata 820 bp Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 13

7.7. Elettroforesi

I prodotti ottenuti dopo amplificazione sono stati fatti migrare mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% in tampone TBE 1x a 10Volt/cm2 per circa 30 min. Per ogni campione sono stati depositati 10µl dell’amplificato. Dopo elettroforesi il gel é stato immerso per circa 10 min in una soluzione di bromuro di etidio (0,5-1.0 µg/ml), lavato in acqua e depositato in un transilluminatore UV per la messa in evidenza dei frammenti di DNA.

7.8. Purificazione dei prodotti PCR

I campioni amplificati sono stati purificati mediante l’utilizzo di colonnine Montage PCR (Milliore, Svizzera) sulle quali sono stati depositati 40 µl di amplificato. Dopo centrifugazione per 5 min a 1'020 x g, il DNA é stato eluato con 20 µl di tampone di eluizione AE (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) e con sucessiva centrifugazione di 2 min a 1'020 x g.

7.9. Reazione di sequenza

Per ogni amplificato purificato sono state effettuate due reazione di sequenza usando separatamente il primer ITS1 o il primer ITS86, per i campioni amplificati con la seminested PCR, e il primer ITS4.

Il mix di reazione di sequenza contiene 2 µl di BigDye Reaction Mix, 3µl di tampone 5x Buffer BigDye (ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Applied Biosystems, USA), 4µl di H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 3µl di un primer 1µM(ITS1, ITS86 o ITS4) (Microsynth, Svizzera) per mix di reazione e 3 µl di DNA purificato.

La reazione di sequenza é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e prevede 25 cicli suddivisi in: 10 sec a 96 °C per la denaturazione del DNA, 5 sec a 50°C per l’ibridazione del primer e 4 min a 60°C per l’estensione del frammento.

7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza

I prodotti ottenuti dalla reazione di sequenza sono stati purificati mediante l’utilizzo di mini colonne di Sephadex G50 (Sephadex G50 fine, Amersham Bioscences) ottenute mediante centrifugazione di 900µl della soluzione di Sephadex per 3 min a 770 x g. Sulle colonnine sono stati caricati e centrifugati, per 3 min a 770 x g, i 15µl del prodotto della reazione di sequenza. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 14

7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica

I prodotti purificati della reazione di sequenza sono stati sequenziati mediante l’utilizzo del sequenziatore automatico ABI Prism 310 (Applied Biosystems, USA). Sul sequenziatore sono stati caricati 5 µl di prodotto della reazione di sequenza e 15 µl di H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera).

7.12. Analisi delle sequenze

Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente mediante la lettura dell’ettroferogramma e mediante l’allineamento dei frammenti ottenuti con il forwar primer ed il revese primer. L’allineamento delle sequenze é stato effettuato con il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution Genetics Analysis).

Le sequenze consenso sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank usando il BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for Biotecnology Information, USA) per l’identificazione del frammento. L’identificazione é stata fatta in base alla maggior percentuale di omologia della sequenza analizzata rispetto alle sequenze presenti nella banca dati. Le sequenze presenti nella GenBank con maggior omologia sono state prese come sequenze di riferimento e sono state introdotte nel programma d’analisi MEGA 3.0. Queste sequenze sono state in seguito utilizzate come riferimento per il taglio del frammento nella regione esatta ITS1 ed ITS2.

7.13. Costruzione dell’albero filogenetico

Le sequenze ottenute e le sequenze di riferimento prese dalla GenBank (NBCI) sono state allineate mediante l’uso del programma MEGA 3.0. La costruzione dell’albero, che rappresenta le relazioni esistenti tra le sequenze, é stata fatta in base al numero di differenze di nucleotidi utilizzando il metodo matematico UPGMA (Unweighted pair group method using aricmetic averages). Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 15

8. Risultati

8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA

L’ottenimento del DNA da amplificare inizia con la lisi cellulare, ma la struttura della parete cellulare dei funghi composta da chitina, glucani, lipidi e peptidi presenti in forma variabile da specie a specie, influisce con le diverse metodiche di estrazione che siano enzimatiche, chimiche o fisiche. Trovare un metodo che sia adatto per tutte le diverse especie risulta dunque molto difficile [5]. Per questo lavoro sono state testate due metodiche che si basano su due processi di lisi diversi. La Metodica 1 prevede una lisi cellulare mediante reazione meccanica, chimica e termica, mentre la Metodica 2 si basa su reazioni chimiche e termiche. L’efficienza dell’estrazione del DNA delle due metodiche è stata verificata mediante l’utilizzo della PCR con i primers ITS1 e ITS4 effettuata su 8 campioni appartenenti a 8 specie diverse aventi lo stesso volume di eluizione pari a 200 µl di tampone AE (QIAamp DNA Mini Kit, DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera). Si è ottenuta un’amplificazione di 7/8 campioni con la Metodica 1 e di 8/8 campioni con la Metodica 2.

Tabella 4. Campioni usati per il confronto delle 2 metodiche di estrazione

Estrazione DNA Specie Ceppo No. Micoteca Metodica 1 Metodica 2 Identificazione fenotipica

Aspergillus candidus M6558/03 90 + + Aspergillus flavus Neqas 6657/M19635 94 + + Aspergillus fumigatus - 56 + + Aspergillus nidulans R10937/03 91 + + Aspergillus japonicus M9618/CQ015888 62 + + Aspergillus ochraceus M45878/02 82 + + Aspergillus versicolor Neqas 6406/M35301 83 + + Malbranche sp. M42299 N.P. - +

L’analisi dei diversi amplificati migrati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% ed evidenziati con bromuro di etidio non mostra differenze significative delle diverse bande di migrazione. I tempi di esecuzione per ambedue le metodiche si aggirano attorno ai 30 min ca.. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 16

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 4.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 1 (versione modificata DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 91, 5) 82, 6) 94, 7) 83, 8) 62, 9) M42299, 10) 90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 5 Figura 6.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 2 (versione modificata QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 90, 5) M42299, 6) 94, 7) 62, 8) 83, 9) 82, 10) 91

Per lo svolgimento del lavoro si è così scelto l’utilizzo della Metodica 2, non solo per il maggior numero di risultati positivi ma anche perché si presenta manualmente più facile da eseguire. Infatti, questa metodica presenta un minor numero di passaggi riducendo dunque i rischi di contaminazione e soprattutto non prevede l’utilizzo dell’azoto liquido; sostanza non facilmente maneggiabile. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 17

8.2. Coltivazione su piastra

Sono stati coltivati su piastra agar Sabouraud Cloramfenicolo a 37°C, 86 ceppi appartenenti a 49 specie diverse (vedi allegato 11.2) selezionati dalla micoteca in modo casuale. Si è riscontrata una crescita per 77/86 campioni .

Tabella 5. Campioni non cresciuti

Specie Ceppo No. Micoteca Identificazione fenotipica

Absidia corymbifera Neqas 5891/M9621 64 Acremonium sp. Neqas 6210/M7440 75 Alternaria alterneta Neqas 6325/M19931 78 Alterneria alternata CQ12.96 35 Aspergillus terreus CQ99/M14318 54 Aureobasidium sp. - 57 Cunninghamella berthalletiae CQ99/M28018 53 Geotrichum candidum ID ZH/95 1 Mucor sp. 48

8.3. Estrazione e amplificazione

Sono state eseguite 143 estrazioni, utilizzando la Metodica 2, per i 77 ceppi con un’amplificazione positiva della regione ITS1-5,8S-ITS2 per 66/77 campioni. Per i campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, è stata eseguita una seconda amplificazione di PCR seminested poiché la prima amplificazione a fornito scarse quantità di amplificato.

Tabella 5 Estrazioni DNA non riuscite

Specie Identificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca

Caldosporium cladosporioides M29240 71 Cladosporium sp. M753/97 41 Cladosporium sphaerospermum Neqas 7355/M5569 140 Cunninghamella bertholletiae Neqas 6659/M19638 96 Fusarium oxysporum R36234 119 Fusarium solani M35303/02 79 Hormographiella aspergillata R8459 139 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 18

Tabella 5. (Continuazione)

Specie Identificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca

Malbranchea sp. Tbc22067 113 Microsporum persicolor corso 2004 BioMérieux 135 Monascus ruber CQ99 2 Trichoderma sp. M948 27

8.4. Sequenze

Sono state ottenute 56/66 sequenze della regione ITS1-5.8S-ITS2 di 56 ceppi differenti appartenenti a 36 specie diverse (vedi allegato 11.2.) mediante l’amplificazione con i primer ITS1 e ITS4. Le sequenze corrette (vedi.) presentano una lunghezza variabile fra 286-810 bp e un omologia compresa fra il 90-100 % con le sequenze di riferimento prelevate dalla GenBank (NCBI). Come sequenze di riferimento sono state prese dalla GenBank (NCBI) 80 sequenze che presentavano la maggior percentuale di omologia per le rispettive sequenze analizzate. Queste sequenze provengono dall’analisi di ceppi certificati e ceppi ottenuti da altri istituti di ricerca. (vedi allegato 11.3)

Le sequenze dei campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, ottenute con la seminested PCR sono state escluse dal lavoro poiché non coprivano l’intero gene.

8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante l’analisi delle sequenze

Fra i campioni per i quali si é ottenuta la sequenza del frammento ITS1-5.8S-ITS2, l’identificazione morfologica forniva un’identificazione a livello di specie per 44/56 ceppi. I restanti 12 ceppi erano identificati a livello di specie. L’identificazione mediante l’analisi delle sequenze ha fornito invece un’identificazione a livello di specie per 36/56 ceppi, di genere 19/56 e di ordine 1/56.

Tabella 6. Confronto fra identificazione morfologica e genotipica

Identificazione morfologica Analisi della sequenza

Specie 78,6% (44/56) 64,3% (36/56) Genere 21,4% (12/56) 33,9% (19/56) Ordine - 1,8% (1/56) Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 19

Messe a confronto, le due tecniche presentano un’identificazione identica per 32/56 campioni di qui 25 campioni identificati a livello di specie e 7 a livello di genere con un’omologia con le sequenze di riferimento che varia dal 90-100%. Si può notare come per tre ceppi differenti di Aspergillus flavus la sequenza risulta identica alla sequenza della specie Aspergillus oryzae. Il campione No. 98 Absidia corymbifera presenta un’omologia al 100% con l’Absidia corymbifera ATCC 46774. La sequenza di riferimento però, copre solamente la regione 5.8S-ITS2. L’identificazione fenotipica a livello di specie risulta più discriminante per 12/56 campioni, mentre a livello di genere per 1/56 campioni. Al contrario l’identificazione a livello di specie effettuata mediante l’analisi delle sequenze risulta più discriminante per 4/56 campioni le qui percentuali di omologia variano fra il 92-100%. Infine per 7/56 campioni otteniamo delle identificazioni contrastanti. Di questi, 6 campioni sono comunque classificati correttamente a livello di genere. Dunque possiamo dire che l’identificazione mediante l’analisi delle sequenze fornisce un’identificazione identica a l’identificazione fenotipica a livello di genere per 55/56 campioni.

Tabella 7. Confronto fra identificazione fenotipica ed identificazione mediante l’analisi delle sequenze a livello di genere e specie

No. campioni Percentuale

Identificazione fenotipica a livello di genere identica 55/56 98,2% all’identificazione mediante sequenza

Identificazione fenotipica a livello di specie identica 25/56 44,6% all’identificazione mediante sequenza

Identificazione fenotipica a livello di specie più 12/56 21,4% discriminante

Identificazione mediante sequenza a livello di specie 4/56 7,14% più discriminante

Risultati discrepanti fra fenotipo e sequenza a livello 7/56 12,5% di specie

8.6. Albero filogenetico

L’albero filogenetico é stato creato mediante il programma MEGA 3.0 introducendo 80 sequenze di riferimento provenienti dalla GenBank (NCBI) e le 56 sequenze ottenute appartenenti a 36 specie diverse. L’albero mostra un buon raggruppamento degli ordini e delle famiglie salvo per il campione 55 Paecilomices lilacinus, appartenente all’ordine delle Eurotiales, e il campione 99 Geotricum candidum, appartenente appartenente all’ordine dei Saccharomycetales, i quali si trovano raggruppati all’interno dell’ordine delle Hypocreales. (vedi allegato 11.5) Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 20

Tabella 8. Tabelle risultati

A. Identificazione fenotipica a livello di specie identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

98 Neqas 6758/M34707 Absidia corymbifera Absidia corymbifera 100% di omologia con Absidia corymbifera ATCC 46774 AF117937 90 M6558/03 Aspergillus candidus Aspergillus candidus 100% di omologia con Aspergillus candidus ATCC 1002 AY373842 18 DSM 816/95 Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847 102 - Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847 5 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 10 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 15 CQ99 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 23 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 56 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 62 M9618/CQ015888 Aspergillus japonicus Aspergillus japonicus 100% di omologia con Aspergillus japonicus CBS 61178 AY585562 100% di omologia con Aspergillus aculeatus CBS 17266 AY585558 32 R5340 esp 96 Aspergillus niger Aspergillus niger 100% di omologia con Aspergillus niger ATCC 16888 AY373852 37 CQ97/M89 Aspergillus terreus Aspergillus terreus 100% di omologia con Aspergillus terreus ATCC 1012 AY373871 83 Neqas 6406/M35301 Aspergillus versicolor Aspergillus versicolor 100% di omologia con Aspergillus versicolor 2014 AM158229 99% di omologia con Aspergillus versicolor ATCC 9577 AY373880 138 Corso BioMérieux Epidermophyton floccosum Epidermophyton floccosum 100% di omologia con Epidermophyton floccosum ATCC 26072 AY213646 99 Neqas 6759/M34711 Geotrichum candidum Galactomyces geotrichum 99% di omologia con Galactomyces geotrichum YF01C DQ668351 76 M19220/02 Microsporum canis Microsporum canis 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657 100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329 111 M21559 Microsporum canis Microsporum canis 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657 100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329 11 VA2397/97 Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 AJ970141 117 M35037 Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 99% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 161.69 AJ000621 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 21

A. (continuazione)

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

136 Corso BioMérieux Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 AJ970141 137 Corso BioMérieux Microsporum praecox Microsporum praecox 100% di omologia con Microsporum praecox CBS 468.74 AJ970148 55 CQ00/17436 Paecilomyces lilacinus Paecilomyces lilacinus 100% di omologia con Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 AY213665 61 Neqas 5775/M38017 Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii 99% di omologia con Paecilomyces variotii NRRL 1115 AF033395 Paecilomyces variotii 97% di omologia con Paecilomyces variotii ATCC 22319 AY373941 149 Neqas 7640/M36113 Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii 99% di omologia con Paecylomices variotii NRRL 1115 AF033395 97% di omologia con Paecylomices variotii ATCC 22319 AY373941 N.P.1 VA460449 Schizophyllum comune Schizophyllum commune 100% di omologia con Schizophyllum commune HNO34 AF280758

1 N.P., campione non presente nella micoteca Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 22

B. Identificazione fenotipica a livello di genere identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

51 - Acremonium sp. Acremonium sp. 100% di omologia con Acremonium sp. KMU 4529 AB158290 100% di omologia con Acremonium strictum UW 836 AY138844 116 M25474 Acremonium sp. Hypocreales sp. 97% di omologia con Hypocreales sp. LM92 EF060464 68 Neqas 6019/M22420 Exophiala sp. Exophiala sp. 90% di omologia con Exophiala sp. CBS 115831 AY857539 90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589 24 - Fusarium sp. Fusarium sp. 100% di omologia con Fusarium oxysporum Ppf15 EF495237 100% di omologia con Fusarium sp. 448 AY729069 100% di omologia con Fusarium subglutinans CNFM 960512 AY898246 72 M4938 Penicillium sp. Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903 100% di omologia con Penicillium commune wb153 AF455544 100% di omologia con Penicillium sp. PC6 EF105368 93 R13266/03 Penicillium sp. Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium citrinum WM 05.3 DQ249207 100% di omologia con Penicillium westlingii NRRL 800 AF033423 105 R5798 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Hypocrea jecorina ATCC 24449 DQ000625 100% di omologia con Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 X93966 100% di omologia con Trichoderma longibrachiatum ATCC52326 Z48935 147 M39284/05 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Hypocrea koningii GJS 95-175 AF456923 100% di omologia con Hypocrea rufa GJS 96-47 AJ230685 100% di omologia con Trichoderma koningiopsis Dis326h DQ379015 100% di omologia con Trichoderma ovalisporum Dis 203c DQ315458 100% di omologia con Trichoderma sp. YM2 AB297794 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 23

C. Identificazione fenotipica a livello di specie più discriminante dell’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

50 CQ98/9792 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782 100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857 94 Neqas 6657/M19635 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782 100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857 N.P. CQR5708 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782 100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857 91 R10937/03 Aspergillus nidulans Aspergillus sp. 100% di omologia con Emericella nidulans NRRL 2395 AY373888 100% di omologia con Emericella dentata IFM 42021 AB249000 100% di omologia con Emericella quadrilineata UWFP 613 AY213644 100% di omologia con Emericella cleistominuta IFM 48170 AB248989 100% di omologia con Emericella rugulosa IFM 54242 AB249002 82 M45878/02 Aspergillus ochraceus Aspergillus sp. 99% di omologia con Aspergillus ochraceus ATCC 18412 AY373854 99% di omologia con Aspergillus westerdijkiae NRRL 35197 DQ250530 25 M1023/95 Aspergillus versicolor Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus versicolor NHRC-FE078 AJ937755 100% di omologia con Emericella nidulans 2172 AM158232 90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589 86 M4859/03 Fusarium oxysporum Fusarium sp. 99% di omologia con Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico AY904065 99% di omologia con Fusarium bulbicola NRRL 13618 U61676 99% di omologia con Gibberella sacchari wb 395 AF455450 99% di omologia con Fusarium lactis NRRL 25200 U61681 99% di omologia con Gibberella moniliformis FV 4773 AY428795 34 CQ12.96 Fusarium solanii Fusarium sp. 100% di omologia con Fusarium oxysporum FO-05 AY928412 100% di omologia con Fusarium solani WB 853 AY569560 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 24

C. ( Continuazione)

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

133 Corso BioMérieux Microsporum audouinii Microsporum sp. 99% di omologia con Microsporum audouinii CBS 344.50 AJ252333 100% di omologia con Microsporum rivalieri CBS 409.51 AJ000625 100% di omologia con Microsporum langeronii CBS 408.51 AJ252334 134 Corso BioMérieux Microsporum canis Microsporum sp. 99% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657 99% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329 99% di omologia con Microsporum ferrugineum CBS 426.63 AJ252338 143 Neqas 7432/M14243 Penicillium Chrysogenum Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903 100% di omologia con Penicillium commune wb153 AF455544 100% di omologia con Penicillium sp. PC6 EF105368 81 CQ5/02/M19992 Rhizopus oryzae Rhizopus sp. 100% di omologia con Rhizopus oryzae CBS 395.95 AY213684 100% di omologia con Rhizopus japonicus AHU6525 AB097347 100% di omologia con Rhizopus microsporus AHU6527 AB097348 100% di omologia con Amylomyces rouxii SDM34 AB181338 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 25

D. Identificazione a livello di specie mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 più discriminante dell’identificazione fenotipica

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

110 M21439 Chaetomium sp. Chaetomium funicola 92% di omologia con Chaetomium funicola CBS 141.50 AJ279450 20 M1292/97 Chrysosporium sp. Chrysosporium keratinophilum 100% di omologia con Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 AJ131681 46 M19793/98 Penicillium sp. Penicillium nalgiovense 100% di omologia con Penicillium nalgiovense IBT 12108 AJ004895 N. P. M42299 Malbranchea sp. Auxarthron conjugatum 97% di omologia con Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ608967 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 26

E. Risultati discrepanti fra identificazione fenotipica e identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 a livello di specie

No. No. Micoteca Specie Specie Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank ICM Ceppo Identificazione fenotipica Identificazione ITS GenBank (NCBI) (NCBI)

13 M430/95 Aspergillus candidus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 69 Neqas 6020/M22415 Aspergillus nidulans Emericella corrugata 100% di omologia con Emericella corrugata IFM 54743 AB264794 21 M41912/01 Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus reticulisporus 100% di omologia con Aphanoascus reticulisporus AJ390381 Chrysosporium articulatum 100% di omologia con Chrysosporium articulatum UAMH 4320 AJ007841 95 Neqas 6658/M19637 Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus fulvescens 100% di omologia con Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 AF038357 40 M742/97 Curvularia lunata Curvularia trifolii 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AF455446 38 M1609/96 Exophiala spinifera Exophiala jeanselmei 100% di omologia con Exophiala jeanselmei CBS 463.80 AY163552 Exophiala oligosperma 100% di omologia con Exophiala oligosperma IP 2118.92 DQ836797 100 Neqas6760/M34712 Paecilomyces lilacinus Curvularia trifolii 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AF455446 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 27

9. Discussione

L’identificazione della specie nella diagnostica delle micosi gioca un ruolo fondamentale per lo svolgimento del trattamento medico. Un’identificazione basata sulla morfologia delle ife o delle spore non é purtroppo sempre facile da eseguire poiché specie molto vicine filogeneticamente possono presentare tratti fenotipici uguali o difficilmente differenziabili. Oltre alle difficoltà di identificazione morfologica dobbiamo prendere in considerazione i tempi che la crescita su piastra prevede: tempi troppo lunghi per un tipo di diagnostica che vuole risultati precisi in tempi sempre più brevi. In questo lavoro si é voluto così testare una tecnica alternativa, che fosse più specifica rispetto alla morfologia nella determinazione della specie, e che in un futuro potesse essere applicata ad una determinazione direttamente dal campione. Si é deciso quindi, di effettuare l’identificazione dei diversi funghi mediante analisi delle sequenze dei geni ITS1-5.8S-ITS2. Le sequenze di 56 ceppi appartenenti a 36 specie diverse ottenute tramite amplificazione del DNA ribosomale, mediante l’impiego di primers specifici per i funghi, sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank (NCBI) ed i risultati ottenuti sono stati messi a confronto con l’identificazione fornita dalla morfologia. I risultati ottenuti mostrano un’alta specificità di questa tecnica nell’identificazione esatta a livello di genere con un’identificazione corrispondente all’identificazione morfologica di 55/56 (98,2%) ceppi. A livello di specie purtroppo si é riscontrato che l’identificazione morfologia riesce ad essere più discriminante con un’identificazione di specie di 44/56 ceppi (78,6%) rispetto all’identificazione mediante l’analisi delle sequenze che posiziona a livello di specie 36/56 (64,3%) ceppi fra i quali solamente 25 con un’identificazione identica all’identificazione fenotipica. Da notare che per 4 campioni dove la morfologia forniva solo la classificazione a livello di genere l’identificazione mediante la sequenza é risultata più discriminante. Si può dunque concludere che l’identificazione dei diversi funghi mediante l’analisi dei geni ITS1- 5,8S-ITS2 non può sostituire un’identificazione morfologica bensì essere un appoggio in caso di difficoltà nell’identificazione fenotipica. Altre prospettive di analisi potrebbero contemplare invece l’utilizzo dell’amplificazione della regione ITS accompagnata dall’amplificazione di un’altro gene ribosomiale come potrebbe essere il 28S o il 18S. Oppure ancora si potrebbe cercare di classificare le diverse specie mediante l’utilizzo di geni codificanti per alcune proteine come l’actina, la chitina sintetasi, l’acetil coenzima sintetasi e sopratutto l’α-tubulina e la β-tubulina, due geni che si presentano altamente variabili fra le diverse specie [9,19]. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 28

10. Bibliografia

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22. H. Einsele, H. Hebart, G. Roller, J. Löffler, I. Rothenhöfer, C. A. Müller, R. A. Bowden, J. Van Burik, D. Engelhard, L. Kanz, U. Schumacher; Detection and Identification of Fungal Pathogens in Blood by Using Molecular Probes; Journal of Clinical Microbiology, 35, 1353- 1360, 1997

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11. Allegati Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 31

11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti, Zigomiceti e Basidiomiceti

Tavola 1. Ascomiceti

J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology Reviews, July, 454-500, 1999. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 32

Tavola 2. Zigomiceti

Tavola 3. Basidiomiceti

11.2. Lista dei campioni

Sequenza Specie Ceppo No. Micoteca ITS1-5.8S-ITS2 No. Sequenza Lunghezza frammento bp

Absidia corymbifera Neqas1 5891/M9621 64 - Absidia corymbifera R12109/01 66 - Absidia corymbifera Neqas 6758/M34707 98 810 Acremonium sp. CQ97/M89 39 - Acremonium sp. M18768/98 45 - Acremonium sp. - 51 492 Acremonium sp. Neqas 6210/M7440 75 - Acremonium sp. M25474 116 488 Alternaria alterneta Neqas 6325/M19931 78 - Alterneria alternata CQ12.96 35 - Aphanoascus fulvescens M732/ZH96 31 - Arthrinium phaeospermium M29513/05 146 - Aspergillus candidus M430/95 13 512 Aspergillus candidus M6558/03 90 508 Aspergillus clavatus DSM 816/95 18 515 Aspergillus clavatus - 102 515 Aspergillus clavatus Neqas 7021/M19740 109 - Aspergillus flavus CQR5708 N.P.2 / CQR5708 510 Aspergillus flavus CQ98/9792 50 510 Aspergillus flavus Neqas 6657/M19635 94 510 Aspergillus fumigatus - 5 512 Aspergillus fumigatus - 10 512 Aspergillus fumigatus CQ99 15 512 Aspergillus fumigatus - 23 512 Aspergillus fumigatus - 56 512 Aspergillus glaucus CQ00/M19448 58 - Aspergillus japonicus M9618/CQ015888 62 490 Aspergillus nidulans Neqas 6020/M22415 69 481 Aspergillus nidulans R10937/03 91 481 Aspergillus niger R5340 esp 96 32 514 Aspergillus ochraceus M45878/02 82 504 Aspergillus terreus CQ97/M89 37 523 Aspergillus terreus CQ99/M14318 54 - Aspergillus versicolor M1023/95 25 482 Aspergillus versicolor Neqas 6406/M35301 83 471 Aureobasidium sp. - 57 - Bipolaris sp. M26530 115 - Caldosporium cladosporioides M29240 71 - Chaetamium sp. M21439 110 488

Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 35

Sequenza Specie Ceppo No. Micoteca ITS1-5.8S-ITS2 No. Sequenza Lunghezza frammento bp

Chrysosporium keratinophilum M41912/01 21 515 Chrysosporium keratinophilum Neqas 6658/M19637 95 516 Chrysosporium sp. M1292/97 20 520 Cladosporium sp. M753/97 41 - Cladosporium sphaerospermum Neqas 7355/M5569 140 - Cunninghamella berthalletiae CQ99/M28018 53 - Cunninghamella bertholletiae Neqas 6659/M19638 96 - Curvularia lunata M742/97 40 515 Epidermophyton floccosum corso 2004 BioMérieux 138 695 Exophiala sp. Neqas 6019/M22420 68 540 Exophiala spinifera M1609/96 38 541 Fusarium oxysporum M4859/03 86 461 Fusarium oxysporum R36234 119 - Fusarium solani M35303/02 79 - Fusarium solanii CQ12.96 34 489 Fusarium sp. - 24 459 Geotrichum candidum ID ZH/95 1 - Geotrichum candidum Neqas 6759/M34711 99 286 Hormographiella aspergillata R8459 139 - Malbranche sp. M42299 N.P. / M42299 492 Malbranchea sp. Tbc22067 113 - Microsporum audouinii corso 2004 BioMérieux 133 649 Microsporum canis M19220/02 76 652 Microsporum canis M21559 111 652 Microsporum canis corso 2004 BioMérieux 134 652 Microsporum gypseum VA2397/97 11 581 Microsporum gypseum M35037 117 534 Microsporum gypseum corso 2004 BioMérieux 136 581 Microsporum persicolor corso 2004 BioMérieux 135 - Microsporum praecox corso 2004 BioMérieux 137 555 Monascus ruber CQ99 2 - Mucor sp. - 48 - Ochroconis sp. M31577/01 70 - Paecilomyces lilacinus CQ00/17436 55 511 Paecilomyces lilacinus Neqas6760/M34712 100 515 Paecilomyces variotii Neqas 5775/M38017 61 528 Paecylomices veriotii Neqas 7640/M36113 149 528 Penicillium Chrysogenum Neqas 7432/M14243 143 500 Penicillium sp. M19793/98 46 500 Penicillium sp. M4938 72 500 Penicillium sp. R13266/03 93 468 Rhizopus oryzae CQ5/02/M19992 81 562 Schizophyllum comune VA460449 N.P. / VA460449 549 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 36

Sequenza Specie Ceppo No. Micoteca ITS1-5.8S-ITS2 No. Sequenza Lunghezza frammento bp

Trichoderma sp. M948 27 - Trichoderma sp. R5798 105 552 Trichoderma sp. M39284/05 147 519 Trichophyton tonsurans CQ95/M106 3 -

1. National External Quality assesment service, UK 2. Non presente nella micoteca Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 37

11.3. Lista delle sequenze di riferimento

Specie Ceppo GenBank (NCBI) Lunghezza sequenza bp No. Referenza ITS1-5.8S-ITS2

Absidia corymbifera ATCC1 46774 AF117937 420 sequenza parziale 5.8S-ITS2 Acremonium sp. KMU 4529 AB158290 492 Acremonium strictum UW 836 AY138844 492 Amylomyces rouxii SDM34 AB181338 562 Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 AF038357 516 Aphanoascus reticulisporus - AJ390381 515 Arthroderma gypseum CBS2 258.61 AJ970141 581 Arthroderma gypseum CBS 161.69 AJ000621 534 Aspergillus aculeatus CBS 17266 AY585558 490 Aspergillus candidus ATCC 1002 AY373842 508 Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847 515 Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782 510 Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 512 Aspergillus japonicus CBS 61178 AY585562 490 Aspergillus niger ATCC 16888 AY373852 514 Aspergillus ochraceus ATCC 18412 AY373854 502 Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857 510 aspergillus terreus ATCC 1012 AY373871 523 Aspergillus versicolor NHRC-FE078 AJ937755 482 Aspergillus versicolor ATCC 9577 AY373880 482 Aspergillus versicolor 2014 AM158229 471 Aspergillus westerdijkiae NRRL3 35197 DQ250530 501 Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ608967 494 Chaetomium funicola CBS 141.50 AJ279450 494 Chrysosporium articulatum UAMH 4320 AJ007841 515 Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 AJ131681 520 Curvularia trifolii wb 403 AF455446 515 Emericella cleistominuta IFM 48170 AB248989 481 Emericella corrugata IFM 54743 AB264794 481 Emericella dentata IFM 42021 AB249000 481 Emericella nidulans NRRL 2395 AY373888 481 Emericella nidulans 2172 AM158232 402 Emericella quadrilineata UWFP4 613 AY213644 481 Emericella rugulosa IFM 54242 AB249002 481 Epidermophyton floccosum ATCC 26072 AY213646 695 Exophiala jeanselmei CBS 463.80 AY163552 541 Exophiala oligosperma IP5 2118.92 DQ836797 541 Exophiala sp. CBS 115831 AY857539 520 Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589 519 Fusarium bulbicola NRRL 13618 U61676 461 Fusarium lactis NRRL 25200 U61681 461 Fusarium oxysporum Ppf15 EF495237 459 Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico AY904065 461 Fusarium oxysporum FO-05 AY928412 494 Fusarium solani WB 853 AY569560 494 Fusarium sp. 448 AY729069 459 Fusarium subglutinans CNFM 960512 AY898246 459 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 38

Specie Ceppo GenBank (NCBI) Lunghezza sequenza bp No. Referenza ITS1-5.8S-ITS2

Galactomyces geotrichum YF01C DQ668351 286 Gibberella moniliformis FV 4773 AY428795 461 Gibberella sacchari wb 395 AF455450 461 Hypocrea jecorina ATCC 24449 DQ000625 552 Hypocrea koningii GJS 95-175 AF456923 519 Hypocrea rufa GJS 96-47 AJ230685 519 Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 X93966 552 Hypocreales sp. LM92 EF060464 487 Microsporum audouinii CBS 344.50 AJ252333 649 Microsporum canis ATCC 23828 AY213657 652 Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329 652 Microsporum ferrugineum CBS 426.63 AJ252338 652 Microsporum langeronii CBS 408.51 AJ252334 649 Microsporum praecox CBS 468.74 AJ970148 555 Microsporum rivalieri CBS 409.51 AJ000625 649 Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 AY213665 511 Paecilomyces variotii NRRL 1115 AF033395 529 Paecilomyces variotii ATCC 22319 AY373941 514 Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903 500 Penicillium citrinum WM 05.3 DQ249207 468 Penicillium commune wb153 AF455544 500 Penicillium nalgiovense IBT 12108 AJ004895 500 Penicillium sp. PC6 EF105368 500 Penicillium sp. ZN 105 DQ810189 468 Penicillium westlingii NRRL 800 AF033423 468 Rhizopus japonicus AHU6525 AB097347 562 Rhizopus microsporus AHU6527 AB097348 562 Rhizopus oryzae CBS 395.95 AY213684 562 Schizophyllum commune HNO34 AF280758 549 Trichoderma koningiopsis Dis326h DQ379015 519 Trichoderma longibrachiatum ATCC 52326 Z48935 552 Trichoderma ovalisporum Dis 203c DQ315458 519 Trichoderma sp. YM2 AB297794 519

1. American Type Culture Collection, USA 2. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands 3. Northen Regional Research Laboratory, USA 4. University of Washington Fungal Project, USA 5. Pasteur Institute Collection Fungi, France Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 39

11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro

Anamorfismo Telomormismo

Monascus ruber Absidia corymbifera Acremonium sp. Acremonium strictum Alternaria alternata Amylomyces rouxii (Mucor rouxii) Arthrinium phaeospermum Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Emericella cleistominuta Aspergillus corrugatus Emericella corrugata Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus (Aspergillus aculeatus) Aspergillus nidulans Emericella nidulans Emericella quadrilineata Emericella dentata Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzae Aspergillus rugulosus Emericella rugulosa Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Aureobasidium sp. Discophaerina sp. Bipolaris sp. Cochliobolus sp. Caldosporium cladosporioides Chaetomium funicola Chaetomium sp. Chrysosporium articulatum Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus keratinophilus Chrysosporium sp. Aphanoascus fulvescens Chrysosporium sp. Aphanoascus sp. Chysosporium sp. Aphanoascus reticulisporus Cladosporium sp. Cladosporium sphaerospermum Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 40

Anamorfismo Telomormismo

Cunninghamella bertholletiae Curvularia lunata Cochliobolus lunatus Curvularia trifolii Cochliobolus sp. Epidermophyton floccosum Exophiala jeanselmei Exophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera Exophiala xenobiotica Fusarium bulbicola Gibberella sacchari (Fusarium sacchari) Fusarium lactis (Fusarium Moniliforme) Fusarium oxysporum Fusarium solani Nectria haematococca Fusarium sp. Gibberella sp. Nectria sp. Fusarium subglutinans Fusarium verticillioides Gibberella moniliformis Geotrichum candidum Galactomyces geotrichum Hormographiella aspergillata Coprinopsis cinerea Malbranchea sp. Auxarthron sp. Malbranchea sp. Auxarthron conjugatum Microsporum audouinii (Microsporum rivalieri) Microsporum canis Arthroderma otae (Microsporum distortum) Microsporum ferrugineum Microsporum gypseum Arthroderma gypseum Microsporum langeronii Microsporum persicolor Arthroderma persicolor Microsporum praecox Mucor sp. Ochroconis sp. Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium commune Penicillium nalgiovense Penicillium sp. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 41

Anamorfismo Telomormismo

Penicillium westlingii Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus) Schizophyllum commune Trichoderma citrinoviride Hypocrea schweinitzii Trichoderma koningii Hypocrea koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Hypocrea sp. Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Hypocrea jecorina Trichoderma sp. Hypocrea sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Hypocrea rufa

Referenze

1. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss. ETH 16410, 2006

2. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat Rovira i Virgili, 2000

3. NCBI, Taxonomy Browser. http://ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 42

11.5. Albero Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 43

11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras, delle specie usate in questo lavoro

Ascomicota Euascomycetes Eurotiales Trichomaceae

Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Aspergillus corrugatus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzae Aspergillus rugulosus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium commune Penicillium nalgiovense Penicillium sp. Penicillium westlingii Epidermophyton floccosum

Ascomicota Euascomycetes Onygenales Onygenaceae

Chrysosporium articulatum Chrysosporium keratinophilum Chrysosporium sp. Chrysosporium sp. Chysosporium sp. Malbranchea sp. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 44

Ascomicota Euascomycetes Onygenales Arthrodermataceae

Microsporum audouinii Microsporum canis Microsporum ferrugineum Microsporum gypseum Microsporum langeronii Microsporum persicolor Microsporum praecox Epidermophyton floccosum

Ascomicota Euascomycetes Sordariales Chaetomiaceae

Chaetomium funicola Chaetomium sp.

Ascomicota Euascomycetes Hypocreales Hypocreaceae

Acremonium sp. Acremonium strictum Trichoderma citrinoviride Trichoderma koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Trichoderma sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Fusarium bulbicola Fusarium lactis Fusarium oxysporum Fusarium solani Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 45

Fusarium sp. Fusarium subglutinans Fusarium verticillioides

Ascomicota Euascomycetes Chaetothyriales Herpotrichiellaceae

Exophiala jeanselmei Exophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera

Ascomicota Euascomycetes Pleosporales Pleosporaceae

Curvularia lunata Curvularia trifolii

Basidiomycota Hymenemycetes Stereales Schizophyllaceae

Schizophyllum commune

Zygomicota Mucorales Mucoraceae

Absidia corymbifera Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae Amylomyces rouxii Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae Schizophyllum commune Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 46

Ringraziamenti

Ringrazio coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore dell’Intituto Cantonale di Microbiologia, il Dr. Orlando Petrini, per avermi concesso la possibilità di svolgere il mio lavoro di diploma presso il loro laboratorio di sierologia. Ringrazio la Dr.ssa Gladys martinetti per la fiducia che mi ha concesso in questi mesi e soprattutto per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma; un lavoro che mi ha coinvolto pienamente. Ringrazio la Dr ssa Antonella Demarta Aeschbacher e la Dr.ssa. Simona Casati per avermi seguito durante l’elaborazione dei dati Non in minor modo rigrazio i tecnici in analisi biomediche Anna Paola Caminada, Marilena Chiaravalloti, Karin Gervasoni-Bolgiani, Tecla Fondrini per il loro importante supporto tecnico Ed in fine ringrazio il direttore della Scuola Medico Tecnica Andrea Boffini, le docenti Daniela Marcacci, Sonja Marci e Susan Gilbert.