MASARYKOVA UNIVERZITA

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Mezidruhová variabilita imunity slunéček a jejich odpověď na stresové podmínky

Diplomová práce

Bc. VOJTĚCH FLORIÁN

Vedoucí práce: Mgr. Pavel Dobeš, Ph.D.

Ústav experimentální biologie obor Speciální biologie

Brno 2020

Bibliografický záznam

Autor: Bc. VOJTECH FLORIAN Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Mezidruhová variabilita imunity slunéček a jejich odpověď na stresové podmínky

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Speciální biologie Vedoucí práce: Mgr. Pavel Dobeš, Ph.D.

Rok: 2020 Počet stran: 80 + 7 (příloha)

Klíčová slova: slunéčko; slunéčkovití; Coccinellidae; imunita; vrozená imunita; slunéčko východní; Harmonia axyridis; invazivní druh; antimikrobiální aktivita; hemocyty; prezimovaní Bibliographic record

Author: Be. VOJTECH FLORIAN Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: The interspecific variability of ladybird immunity and its response to stress conditions

Degree Programme: Experimental Biology

Field of Study: Special Biology Supervisor: Mgr. Pavel Dobeš, Ph.D.

Year: 2020 Number of Pages: 80 + 7 (appendix)

Keywords: ladybird; ladybug; Coccinellidae; innate immunity; Harmonia axyridis; invasive species; antimicrobial activity; haemocytes; overwintering Abstrakt

V rámci této práce byly srovnávány fyziologické a imunitní para­ metry více než dvaceti druhů slunéček vyskytujících se převážně na ev­ ropských lokalitách. Fyziologie a imunita většiny zahrnutých druhů ne­ byla dosud zkoumána, a proto bylo cílem práce jejich porovnání s cha­ rakteristikami probádanějších druhů, jako je Coccinella septempunctata nebo na evropském kontinentu invazní druh Harmonia axyrídis. Bylo zjištěno, že antimikrobiální aktivita je vysoká u druhů ze tří sesterských rodů Harmonia, Hippodamia a Ceratomegilla. Druhy z těchto rodů měly také menší koncentraci proteinů vhemolymfě, proto zřejmě jako pri­ mární ochranu proti patogenům využívají především látky nebílkovinné povahy. Vyšší antimikrobiální aktivita proti gramnegativním bakteriím ve srovnání s některými dalšími druhy byla zjištěna také u druhu Exocho- mus quadripustulatus, který patří do tribu Chilocorini, jenž je blízce pří­ buzný s tribem Coccinellini sdružujícím většinu testovaných slunéček. Jiné rozdíly v zastoupení hlavních živin nebo síle imunitního systému ne­ byly mezi jednotlivými fylogenetickými skupinami zjištěny, stejně jako nebyl prokázán vliv rozdílného typu příjmu potravy. V rámci práce byl dále studován vliv prezimovaní na modelový druh slunéčka Harmonia axyrídis. Prezimovaní je v této práci bráno jako soubor stresových faktorů, které působí na slunéčka v zimním období, a proto mohou mít vliv na jejich hospodaření s živinami a imunitní re­ akce. Bylo zjištěno, že podmínky prezimovaní, jako je teplota, mají vliv na hladinu základních živin v hemolymfě slunéček, při čemž byl také pro­ kázán rozdíl mezi prezimovaním v laboratorních a přirozených podmín­ kách. Na rozdíl od slunéček přezimujících v laboratorně simulované zimě, u kterých během prezimovaní poklesla koncentrace proteinů v he­ molymfě, byl u jedinců přezimujících v přírodě pozorován nárůst kon­ centrace proteinů a lipidů v hemolymfě po zimě. Antimikrobiální aktivita slunéček se v průběhu prezimovaní většinou neměnila. Byl pozorován pouze mírný pokles v antimikrobiální aktivitě proti Escherichia coli u slunéček, která byla vystavena laboratorně simulované teplé zimě. Na­ opak u slunéček přezimujících v přírodě byl zjištěn mírný nárůst v anti­ mikrobiální aktivitě proti E. coli. Bylo zjištěno, že slunéčka H. axyrídis mají před prezimovaním lepší předpoklady buněčné imunity než po pre­ zimovaní a v průběhu zimy dochází ke snížení celkové koncentrace he- mocytů v hemolymfě. Abstract

The physiological and immune parameters of more than twenty species of ladybugs occurring mainly in European localities were com• pared in this work. The physiology and immunity of most of the tested species have not yet been studied, and therefore the aim of the study was to compare them with the characteristics of more studied species, such as Coccinella septempunctata or Harmonia axyhdis, which is an invasive species on the European continent. It was found that tested species from the three related genera Harmonia, Hippodamia and Ceratomegilla have strong antimicrobial activity. The haemolymph of species from these genera contains lower concentration of proteins, so it can be assumed, that they use non-protein molecules as a primary protection against pathogens. It was found that higher antimicrobial activity against Esche• richia coli is also characteristic for pine ladybird, Exochomus quadri- pustulatus, belonging to the tribe Chilocorini, which is closely related to tribe Coccinellini containing most of the tested species. Other differ• ences in the proportion of major nutrients or the strength of the immune system were not found among the studied phylogenetic groups, nor was proved the effect of different types of food intake. The work also studied the effect of overwintering on the model species of ladybird Harmonia axyhdis. In this work, overwintering is con• sidered as a set of stress factors that affect ladybirds in the winter and can therefore affect their nutrient management and immune responses. Overwintering conditions, such as temperature, have been found to af• fect the level of essential nutrients in ladybird haemolymph. Differences between overwintering in laboratory and in natural conditions has also been demonstrated. In contrast to ladybird overwintering in laboratory- simulated winter, in which the protein concentration in the haemolymph decreased during overwintering an increase of protein and lipid concen• tration in the haemolymph was observed after winter in individuals overwintering under natural conditions. The antimicrobial activity of la• dybirds did not change during the winter. Only a slight decrease in anti• microbial activity against E. coli was observed in ladybirds exposed to warm winter simulated in laboratory conditions. In contrast, a slight increase in antimicrobial activity against E. coli was found in ladybirds overwintering under natural conditions. It has been found that harlequin ladybird, H. axyhdis, have better preconditions for cellular immunity before overwintering than after overwintering and the total haemocyte concentration in the haemolymph decreases during the winter. MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE

Akademický rok: 2018/2019

Ústav: Ústav experimentální biologie

Student: Be. Vojtěch Florián

Program: Experimentální biologie

Obor: Speciální biologie

Směr: Experimentální biologie živočichů a imunologie

Ředitel Ústavu experimentální biologie PřF MU Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu MU určuje diplomovou práci s názvem:

Název práce: Mezidruhová variabilita imunity slunéček a jejich odpověď na stresové podmínky

Název práce anglicky: The interspecific variability of ladybird immunity and its response to stress conditions

Oficiální zadání: Cílem experimentální diplomové práce Bc. Vojtěcha Floriána je porovnat imunitní reakce zástupců slunéčkovitých (Co- leoptera: Coccinellidae). V rámci práce bude srovnávána imunita několika druhů slunéček, zejména invazního slunéčka východního, Harmonia axyridis, s přirozených evropských druhů. Optimalizace metodiky proběhre v p-vním roce magis­ terského studia, kdy bude úkolem studenta vytvořit souhrn metod vhodných k popisu imunitního (např. antimikrobi- ální aktivita) a fyziologického (stanovení základních živin) stavu testovaných jedinců. Vybrané metody student následně použije k porovnání invazních a nativních druhů a určení vlivu stresu, který vzniká především v době prezimovaní, na organismus slunéček. Součástí diplomové práce bude rešeršní úvod do problematiky, který se bude zakládat na recentní odborné literatuře, a vhodné grafické zpracování výsledků.

Literatura: Knapp M, Dobeš P, Řeřicha M, Hyrsl P: Puncture vs. reflex bleeding: Haemoíymph composition reveals sig­ nificant differences among ladybird species (Coleoptera: Coccinellidae), but not between sampling methods. Eur Journal of Entomol, 115, 2018.

Řeřicha M, Dobes P, Hyrsl P, Knapp M: Ontogeny of protein concentration, haemocyte concentration and antimicro­ bial activity against Escherichia coli in haemoiymph of the invasive harlequin ladybird Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae). Phys Entomol, 43 (1), 2018.

Vogelweith F, Foitzik S, Meunier J: Age, sex, mating status, but not social isolation interact to shape basal immunity in a group-living insect. J Insect Physiol, 103, 2017.

Průběžný přehled vědeckých prací udržovat prostřednictvím elektronických databází dostupných pro PřF MU.

Jazyk závěrečné práce: čeština

Strana 1 z 2 Vedoucí jHáep M^r. Pavel Dobei, Ph D.

KiHiíultanL dor. RNDr Parcl Hyril, PhD, M^r. Martin Kunc

Diium cidifli prace: 20. ifl, 2018

V Brne drn- 20. 1€. 2C11B

ScuhUtini se zadáním (podpis.

BL. Va\lĚtí\ Flúnán Wfir. flauel DobeS, PhJ3. pro' RNDr. Jan Šmardo. CSc itudíPt vedoucí pfAcí i-diltl Usluvu «pirimniUln biologie

Sírjlrid 2 i 2 Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně pod vedením vedoucího práce s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

V Brně 30. července 2020 Bc. VOJTĚCH FLORIÁN Poděkování

Na tomto místě bych chtěl poděkovat svému vedoucímu Mgr. Pavlu Do­ bešovi, Ph.D. a konzultantům doc. RNDr. Pavlu Hyršlovi, Ph.D. a Mgr. Mar­ tinu Kuncovi, Ph.D. za odborné vedení diplomové práce a celému labora­ tornímu týmu za rady, tipy a připomínky. Dále bych rád poděkoval Ing. Michalu Knappovi, Ph.D a Ing. Michalu Řeřichoví z výzkumné skupiny Ekologie hmyzu na Fakultě životního prostředí České zemědělské uni­ verzity v Praze, kteří zajistili identifikaci odchytových lokalit, odchyt, de­ terminaci slunéček a jejich chov během následných laboratorních expe­ rimentů. OBSAH

Obsah

1 Úvod 13 1.1 Čeleď slunéčkovití 13 1.1.1 Základní popis 13 1.1.2 Fylogeneze a taxonomie slunéčkovitých 17 1.2 Imunita slunéčkovitých 20 1.2.1 Buněčná imunita 20 1.2.2 Humorální imunita 22 1.3 Mikrosporidie 25 1.4 Prezimovaní 26

2 Cíl práce 32

3 Metodika 33 3.1 Odchyt slunéček a odběr hemolymfy 33 3.2 Chov Harmonia axyridis a simulace přezimovacích podmínek 34 3.3 Koncentrace hemocytů a mikrosporidií v hemolymfě 35 3.4 Celková koncentrace proteinů v hemolymfě 36 3.5 Celková koncentrace lipidů v hemolymfě 36 3.6 Antimikrobiální aktivita proti Micrococcus luteus 37 3.7 Antimikrobiální aktivita proti Escherichia coli 37 3.8 Statistické zhodnocení 38

4 Výsledky 39 4.1 Koncentrace hemocytů v hemolymfě 39 4.2 Počet mikrosporidií v hemolymfě 40 4.3 Celková koncentrace proteinů 42 4.4 Celková koncentrace lipidů 43 4.5 Antimikrobiální aktivita proti Escherichia coli 44 4.6 Antimikrobiální aktivita proti Micrococcus luteus 45

11 OBSAH

4.7 Vliv prezimovaní na koncentraci hemocytů 47 4.8 Vliv prezimovaní na koncentraci proteinů 48 4.9 Vliv prezimovaní na koncentraci lipidů 50 4.10 Vliv prezimovaní na antimikrobiální aktivitu proti Escherichia coli 52 4.11 Vliv prezimovaní na antimikrobiální aktivitu proti Micrococcus luteus 54

5 Diskuse 56 5.1 Mezidruhové srovnání 56 5.2 Vliv stresorů během prezimovaní na fyziologii a imunitu slunéček 62

6 Závěr 66

Použité zdroje 68

Přílohy 81

12 ÚVOD

1 Úvod

1.1 Čeleď slunéčkovití

1.1.1 Základní popis

Čeleď slunéčkovití (Coccinellidae) patří do řádu brouků (Coleop- tera). Tito menší až středně velcí brouci žijí téměř po celém světě s vý­ jimkou arktických oblastí a Antarktidy. Rozlišujeme přibližně 360 rodů a 6000 druhů (Escalona et al, 2017). Předchůdci slunéčkovitých prokazatelně žili již na začátku druho- hor v juře asi před 150 miliony lety (McKenna etal, 2015). Podle nových poznatků by ale mohli žít již dříve, konkrétně na přelomu permu a triasu (Touissant et al, 2017). Mají proměnou dokonalou a řadíme je mezi Holometabola. Larva prochází u většiny druhů v čeledi čtyřmi instary. V posledním instaru se larva přilepí k podkladu a znehybní. Toto stádium nazýváme prepupa. Ta se svlékne a vznikne kukla (pupa). Poměrná doba jednotlivých stádií před stádiem dospělce je následující: vajíčko 15 - 20 % času, larva 55 - 65 % a kukla 20 - 25 % (Dixon, 2000). Dobře krmená larva stráví v kaž­ dém z prvních třech instarů přibližně pětinu larválního vývoje a v po­ sledním čtvrtém instaru zůstává nejdéle, cca 40 % larválního vývoje (Ho- dek et al, 2012). Doba života dospělých slunéček závisí na přístupu k po­ travě, teplotě a druhové příslušnosti. Bylo pozorováno, že s vyšší teplo­ tou klesá doba života slunéček (Hodek et al, 2012). Většina druhů má pouze jednu generaci (takový druh se pak ozna­ čuje jako univoltilní) a žijí jeden rok, a to včetně měsíců, kdy slunéčka hibernují (Hodeketa/., 2012). Ale bylo zjištěno, že u některých může pro­ bíhat i druhá hibernace, např. u Calvia quatuordecimguttata. Záleží také na podnebí, ve kterém populace slunéček žijí. Např. středoevropské po­ pulace Ceratomegilla undecimnotata jsou obligátně univoltilní, ale na za­ stíněných lokalitách v Řecku mohly mít populace během roku dvě až tři generace (Katsoyannos etal, 2005). Hippodamia variegata měla na stej­ ných řeckých lokalitách během roku šest až sedm generací. Druhy Coccinella quinquepunctata, Coccinella septempunctata a Coccinella mag- nifica jsou fakultativně polyvoltilní, což může být jedna z příčin úspěšné invaze C. septempunctata na severoamerickém kontinentu (Ceryngier et al, 2004).

13 ÚVOD

V rámci celé čeledi je nejlépe prostudovaný tribus Coccinellini, o kterém se mluví jako o tzv. „pravých slunéčkách" - zde rozlišujeme asi 1000 druhů v 90 rodech (Escalona et al, 2017). Brouky tohoto tribu po­ važujeme za typické zástupce slunéčkovitých a jsou lehce rozpoznatelní. Dospělci mají převážně oválný až podlouhlý tvar, jejich krovky mohou mít rozdílné barvy od černé, žluté, oranžové až po jasně červenou, a zpra­ vidla na nich mají různý počet skvrn. Původním způsobem příjmu potravy čeledi slunéčkovitých je pre- dátorský styl života. Podle Giorgi et al, 2009 byli předchůdci slunéčkovi­ tých kokcidofágní, tzn. živili se se červci, a v průběhu evoluce se objevily minimálně tři přechody na afidofágii, tj. konzumaci mšic, a minimálně je­ den přechod na fýtofágní styl výživy. V rámci jedné taxonomické jed­ notky většinou převládá jednotný styl příjmu potravy, ale existují i vý­ jimky. Jednou z nich je tribus Coccinellini, kde převládá afidofágie. Ně­ které druhy se ale specializují na nedospělé formy zástupců brouků, např. Calvia quindecimguttata (Kanervo, 1940) a Coccinella hieroglyphica (Hippa etal, 1984) konzumují larvy mandelinek; nebo druhy z rodu Ne- ocalvia živící se slunéčky z rodu Psyllobora, kteří jsou mykofágní. Také se v tribu Coccinellini vyskytují druhy, které zvolily čistě nepredátorský styl života, např. fýtofágní Bulaea lichatschovi a mykofágní Tytthaspis sedeci- mpunctata, který také konzumuje pyl rostlin. Další druhy slunéček z ostatních podčeledí a tribů mohou preferovat konzumaci ploštic, mer, druhů z řádu třásnokřídlí, fytofágních roztočů, housenek motýlů nebo spor hub. V rámci celé čeledi tedy najdeme rozdílné styly stravování. Také je potřeba upozornit, že zmíněné styly konzumování neznamenají, že se slunéčka nemohou živit jinou stravou. Např. afidofágní druhy sluné­ ček sice pro správný vývoj a reprodukci potřebují konzumovat mšice, ale při nedostatku této potravy se pro přežití mohou živit i jinou potravu, od larev jiných hmyzích zástupců až po nektar rostlin a šťávu z plodů. Slunéčka interagují v ekosystému mezi sebou a s ostatními orga­ nismy. Spousta druhů slunéček a jiných hmyzích zástupců se živí stejnou potravou, takže si navzájem konkurují a musí o potravu soupeřit. Hovo­ říme o tzv. vnitrocechovém kořistnictví. Jeho výhodami jsou eliminace potencionálního predátora, eliminace soupeře a konzumace na živiny bohaté stravy. V rámci ontogenetického vývoje slunéčka se vnitrocecho- vého kořistnictví nejvíce účastní starší larvální instary a dospělci sluné­ ček. Také starší larvální stádia ve srovnání s mladšími mezi sebou inter­ agují silněji (Yasuda et al, 2004). Procento vnitrocechového kořistnictví je vyšší mezi predujícími druhy slunéček kvůli jejich větší žravosti,

14 ÚVOD podobným stravovacím strategiím a přítomnosti velkého množství po­ travy na jednom habitatu. Obvykle větší jedinec útočí na menšího a nej­ více ohroženými stádii jsou vajíčka, kukly a svlékající se jedinci (Hodek eta/., 2012). Účinnost predace se mezi jednotlivými druhy slunéček liší. Yasuda et al, 2001 pozorovali, že druh Harmonia axyrídis zaútočil na Coccinella septempunctata z více než padesáti procent, kdežto slunéčka z druhu C. septempunctata zaútočila na H. axyrídis z méně než dvaceti procent. Také procento úspěšných úniků H. axyrídis po útoku bylo mnohem větší. Snyder et al, 2004 pozorovali úspěšnost vnitrocechového kořistnictví dvou exotických druhů, H. axyrídis a C. septempunctata, které se začaly v Severní Americe používat jako biologická kontrola proti mšicím, ve srovnání s dvěma nativními druhy, Hippodamia convergens a Coccinella transversoguttata. Nativní druhy se staly mnohem častěji obětmi útokům exotických druhů, a to především druhem H. axyrídis, je­ hož útok žádný z nativních druhů nepřežil. Pro H. axyrídis byl mnohem větší hrozbou kanibalismus. A právě tento druh, H. axyrídis, je považován za vrcholového predátora slunéček (Majerus et al, 2006; Pervez et Om- kar, 2006). Jeho invazivní úspěšnost je možné vysvětlit velkým objemem těla, silnými hřbetními ostny larev, chemickou ochranou, rychlým larvál- ním vývojem, velkou stravovací plasticitou a velkou agresivitou. Vnitro- cechové kořistnictví nemusí probíhat pouze mezi druhy slunéček. Se slunéčky podobně interagují i další druhy hmyzu a členovců (např. Lu- cas et al, 1998; Gardiner et Landis, 2007). Jako obranné mechanismy slouží všem stádiím slunéček toxické látky, které buď syntetizují de novo, nebo je získávají z potravy. S těmito látkami se buď predátor setká pasivně nebo mohou být aktivně vypuš­ těny skrze tzv. reflexní krvácení (Happ et Eisner, 1961; Kendall, 1971). Jako varovný signál pro predátory dospělcům slouží také jejich výrazné aposematické zbarvení, kterým dávají najevo svoji toxicitu (Moore etal, 1990). Reflexní krvácení je obranný mechanismus dospělců a larev slunéček. Z tibio-femorálních kloubů dospělců nebo z pórů na povrchu dorsální strany těla larev dokážou vypustit kapičky hemolymfy, které ob­ sahují důležité alkaloidy a methoxypyrazíny. U slunéček bylo nalezeno více než 50 druhů alkaloidů (Laurent et al, 2005). Tyto látky mají hlavní vliv na toxicitu slunéček. Jednotlivé druhy slunéček mají vhemolymfě odlišné druhy alkaloidů, které jsou různě toxické. To potvrdila např. stu­ die Marples et al, 1989, ve které byla testována mortalita modřinek [Cya- nistes caeruleus] po zkonzumování homogenátů C. septempunctata

15 ÚVOD a A bipunctata. Coccinellin nacházející se vhemolymfě C. septem- punctata byl vyhodnocen jako toxičtější než alkaloid adalin nacházející se v hemolymfě A. bipunctata. Jelikož jsou slunéčka vystavena vnitroce- chovému kořistnictví, po konzumaci např. vajíček jiných druhů se jim do těla dostávají cizí alkaloidy, které musí následně zpracovávat. Bylo zjiš­ těno, že polyfágní druhy ve srovnání se specialisty tyto alkaloidy cizích druhů lépe zpracovávají (Yasuda et Ohnuma, 1999). Methoxypyrazíny jsou oproti alkaloidům těkavé, takže se po uvolnění odpaří a predátoři je detekují svými čichovými receptory. Jejich zápach spolu s aposematic- kým zbarvením slouží jako signál, že jsou slunéčka nepoživatelná (Moore etal, 1990). I přes jejich toxicitu a „nejedlosť jsou slunéčka napadána různými predátory. Z obratlovců jsou to především ptáci. Mizer, 1970 analyzoval žaludky více než 234 druhů ptáků na Ukrajině. Slunéčka našel ve stravě 20 % ptáků. Zcela největším ptačím predátorem slunéček byla vyhodno­ cena jiřička obecná [Delichon urbicum), následovaná vrabcem polním [Passer montanus). Z bezobratlých predátorů napadají slunéčka pavouci a soupeři ve vnitrocechovním kořistnictví jako jsou např. druhy z čeledí síťokřídlích, dvoukřídlích, polokřídlích a brouků (Hodek et al, 2012). Poté klínatky (Gomphidae; Conrad, 2005), roupci (Asilidae; Ghahari et al, 2007) a sršni (Vespidae; Gambino, 1992). Velkými nepřáteli slunéček jsou mravenci, kteří se starají o kolonie mšic kvůli zisku na živiny bohaté medovice a chrání tak mšice před jejich konzumenty (Majerus et al, 2007). Slunéčka jsou ve všech svých stádiích napadána skoro 160 různými druhy parazitoidů, kteří patří mezi blanokřídlé a dvoukřídlé (Hodek et al, 2012). Z blanokřídlých je nejlépe prostudovaný Dinocampus coccinellae, druh lumčíka napadající kukly nebo dospělá slunéčka (Koyama et Majerus, 2008; Riddick et al, 2009; Berkvens et al, 2010). Z parazitů slunéček jsou to poté některé hlístice (Ceryngier et Ho­ dek, 1996; Riddick et al, 2009), houby a roztoči (Kenis et al, 2008). Mezi patogeny pak patří mikrosporidie, houby (Ceryngier, 2000), entomopa- togenní hlístice (Shapiro-Ilan et Cottrell, 2005), eugregariny (Riddick et al, 2009) a bakterie z rodů Rickettsia, Wolbachia, Spiroplasma, Flavobac- teria a y-proteobakterie, které zabíjejí samce (Majerus, 2006). Od roku 1887, kdy bylo úspěšně použito australské slunéčko Rodo- lia cardinalis k likvidaci kolonií červců perlovce zhoubného [leerya pur- chasí), který likvidoval průmysl s citrusovými plody (DeBach, 1964), se začaly hojně využívat druhy slunéček jako biologická kontrola proti

16 ÚVOD přemnožení různých škůdců, především mšic a červců. Jako vhodná bio­ logická zbraň slouží slunéčka díky jejich velké žravosti a vysoké repro­ dukci. Kvůli komplexním interakcím vtrofickém řetězci ale bylo a je těžké určit dopad použití slunéčka jako biologické kontroly v cizích ze­ mích, kde se normálně nevyskytuje. Mnoho druhů slunéček se po intro­ dukci přirozeně začlení do ekosystému bez větších dopadů na něj, ale ně­ které mohou svou postupně zvyšující se abundancí ovlivňovat přirozené druhy slunéček. Prvním případem takového invazivního druhu slunéčka byl druh C. septempunctata, který byl v roce 1956 introdukován v USA. Horn, 1991 pozoroval, že tento druh stal dominantní v oblastech, kde byl do té doby dominantní nativní druh Hippodamia convergens (dle Hodek et al, 2012). Více problémovějším invazivním druhem se později stal druh H. axyrídis, který mnohem rychleji kolonizoval nové oblasti, ve kte­ rých se stával jasně dominantním. Je také prvním druhem čeledi slunéč- kovitých, který se dostal na seznam Globální databáze invazivních druhů (Global Invasive Species Database).

1.1.2 Fylogeneze a taxonomie slunéčkovitých

Monofylie čeledi slunéčkovitých byla několikrát potvrzena (např. Robertson et al, 2008; Giorgi et al, 2009). Původní rozdělení čeledi slunéčkovitých (Coccinellidae) bylo do šesti (dle Sasaji, 1968) nebo do sedmi podčeledí (dle Kovář, 1996): Chilocorinae, Coccidulinae, Coccinellinae, Epilachninae, Scymninae, Sticholotidinae a někdy Orta- liinae (Obr. 1). Další analýzy vycházející z molekulárních a morfologic­ kých dattoto rozdělení ale vyvrátily. Monofylie se potvrdila pouze u pod- čeledi Coccinellinae (např. Giorgi etal, 2009; Magro etal, 2010). Fyloge­ neze podčeledi Epilachninae zůstává nevyřešená. Podle Giorgi et al, 2009 je monofyletická, ale dle Magro et al, 2010 parafyletická. Nejno- vější testování fylogeneze problém neobjasnilo (Songeta/., 2020). Na zá­ kladě testování sekvence nukleotidů v této studii vyšlo, že je podčeleď monofyletická, ale dle analýzy aminokyselin parafyletická. Ostatní pod­ čeledi byly několikrát potvrzeny jako para- či p o ly fy 1 etické. Rozdělení podčeledi Coccinellinae (dnes také pouze Coccinellini) také prodělalo v současné době velké změny. Původní rozdělení na Coccinellini, Discotomini, Halyziini, Singhikaliini a Tytthaspidini bylo vyvráceno a místo toho byla rozdělena na tři klady (Escalona et al, 2017). První klad zahrnuje rod Adalia vyskytující se po celém světě a americké rody Olla, Cycloneda a Eriopis. Klady 2 a 3 zahrnují primárně

17 ÚVOD druhy ze Starého světa, tj. z Evropy, Asie a Afriky Klad 2 obsahuje rody Coccinella, Coleomegilla, rody z bývalého Tytthaspidini a další. A v kladu 3 se nachází největší množství rodů, včetně sesterských rodů Harmonia a Hippodamia. Zajímavým výsledkem byla sesterská příbuznost mezi rody krmící se polokřídlými, Anatis a Megalocaría, a rody z bývalého Ha- lyziini [Halyzia, IUeis a Psyllobora], jejichž strava se skládá z plísní.

Sticholotidinae Sticholotidinae

Coccidulinae

Chilocorinae Chilocorinae

Scymninae Scymninae

Coccidulinae i—

Epilachninae j— Epilachninae

Coccinellinae —I Coccinellinae Obr. 1: Původní rozdělení čeledi slunéčkovitých (Coccinellidae) na podčeledi dle Sasaji, 1968 (nalevo) a Kovář, 1996 (napravo). Pře­ vzato z Giorgi et al, 2009.

V této práci bylo srovnáváno 25 druhů slunéček, z nichž 22 patří do tribu Coccinellini a jedná se převážně o afidofágní druhy. Výjimkou jsou dva druhy z bývalého tribu Halyziini, slunéčko šestnáctiskvrnné [Halyzia sedecimguttata] a slunéčko dvaadvacetitečné [Psyllobora vigin- tiduopunctata], které se živí primárně plísněmi; a dva druhy z bývalého tribu Tytthaspidini, slunéčko šestnáctitečné [Tytthaspis sedecim- punctata) a slunéčko čtrnáctislunné [Coccinula quatuordecimpustulata), u kterých je strava smíšená. Tyto druhy se krmí na mšicích, plísních, pylu, roztočích a dalších druzích bezobratlých (Ricci, 1986). Mimo tribus Coccinellini jsou v této práci testovány dva druhy ze sesterského tribu Chilocorini, jejichž strava je kokcidofágní, a jeden druh z podčeledi Epi­ lachninae, vlnáč netečný [Cynegetis impunctata], který je herbivorní. K určení vzájemné příbuznosti druhů byla jako hlavní zdroj využita práce Escalona et al, 2017 (Obr. 2). Do fylogeneze tribu Coccinellini se nepodařilo zařadit rod Sospita. Rod Ceratomegilla v nedávných letech

18 ÚVOD prodělal změny v názvosloví. Původně byly jeho současné druhy členěny do rodu Semiadalia a později do rodu Hippodamia. Na základě fylogene­ tického testování genů je opravdu úzce příbuzný s rodem Hippodamia (Magro et al, 2010).

Propylea quatuordecimpunctata Ca/via decemguttata Ca/via quatuordecimguttata

Halyzia sedecimguttata J t i—IHalyziiniPsylhbora vigintiduopunctata Anatis oceilata

Myzia obhngoguttata

Myrha octodecimguttata

Harmonia quadripunctata

Harmonia axyridis

Hippodamia convergens

Hippodamia varíegata

Tytthaspis sedecimpunctata I Tytttiaspidii Coccinula quatuordecimpustulata

Coccinellini Goccinella septempunctata

Coccinella magnifíca

Coccinelia quinquepunctata

Adalia bipunctata

Adaiia decempunctata

Chiiocorus bipustulatus

Chilocorini Exochomus quadrípustuiatus

Obr. 2: Fylogenetické zařazení testovaných slunéček podle Escalona etal, 2017. Z testovaných druhů chybí v obrázku dva druhy z rodu Ceratomegilla a jeden druh z rodu Sospita, u kte­ rých není fylogenetické zařazení zatím zcela potvrzeno. Podče- leď Epilachninae byla kvůli nejasnému fylogenetickému posta­ vení vyřazena.

19 ÚVOD

1.2 Imunita slunéčkovitých

Slunéčka jsou jako většina organismů vystavena nebezpečí infekce různými patogeny a parazity (viz 1.1.). Aby snížil riziko infekce, vyvinul si hmyz fyzické bariéry, které mají za úkol bránit vstupu patogenů do těla. Hlavní bariérou je chitinózní hydrofobní kutikula, která vytváří exoskelet hmyzu a také ohraničuje střevo a tracheální systém (Siva-Jothy et al, 2005; Hillyer, 2016). Patogeny tak musí do těla vstoupit buď orálně, skrze poranění nebo pomocí enzymatické degradace kutikuly. Ti, kteří tak vstoupí do střeva, hemocoelu nebo vnitřních orgánů, spustí imunitní reakce, které mají za úkol eliminovat infekci. Reakce jsou spuš­ těny na základě vazby molekulárních vzorů patogenů, tzv. pathogen-as­ sociated molecular patterns či microbe-associated molecular patterns, na hostitelovy receptory tyto vzory rozpoznávající, tzv. pattern reco­ gnition receptors. Základní rozdělení aktivovaných imunitních reakcí je na buněčné a humorální. Ty navzájem spolupracují, ovlivňují se a často i překrývají.

1.2.1 Buněčná imunita

Buněčnou imunitu zajišťují primárně buňky zvané hemocyty. Prv­ ním jejich rozdělením je na volně se pohybující a fixní buňky. Procentu­ ální zastoupení těchto dvou typů buněk se ale může na základně podnětu měnit a z volně pohybujících se buněk se mohou stát fixní a naopak. Druhé rozdělení je na základně morfologie a funkce (Gupta, 2002). Jed­ notlivé subpopulace hemocytů jsou u různých druhů hmyzu morfolo­ gicky odlišné, ale musí plnit stejné funkce, a to fagocytující, hemostatické, nutritivní, pigmentové funkce a buňky, které slouží jako progenitory (Turner, 1994). Nejstarším a nejúčinnějším mechanismem buněčné imunity je fago- cytóza. Fagocytující buňky rozpoznávají cizorodý materiál (nejčastěji mikroorganismy), pohlcují jej do fagolysozomů a zpracovávají jej. Usmr­ cení mikrobů probíhá působením oxidu dusnatého a reaktivních kyslíko­ vých metabolitů, nebo jsou jejich složky degradovány lysozymem a hyd- rolytickými enzymy (Turner, 1994). Kromě fagocytózy existují i další obranné mechanismy. Jedním z nich je nodulace, která je využívána při proniknutí většího množství patogenů, kteří nemohou být fagocytováni. Hemocyty na základě chemo- taktických faktorů začnou ve vrstvách obklopovat cizí materiál a vytvoří

20 ÚVOD

útvar zvaný nodule. Patogeny jsou v nodulích usmrcovány proteolytic- kými enzymy, nedostatkem kyslíku a baktericidními složkami fenoloxi- dázové kaskády. Při proniknutí ještě větších cizorodých materiálů, jako jsou různí paraziti, dochází k enkapsulaci. Hemocyty adherují na jejich povrch a opouzdří je. Na enkapsulované organismy poté působí lytické enzymy a různé toxické molekuly, které se je snaží usmrtit a degradovat. Složky buněčné imunity se také účastní obranných reakcí orga­ nismu při poranění. Organismus musí co nejrychleji předejít ztrátě těl­ ních tekutin. Na místo poranění migrují granulocyty a společně s melani- nem z fenoloxidázové kaskády vzniká koagulační zátka k jeho uzavření (Gupta, 2002). Koagulace je stejně jako u obratlovců komplex enzyma­ ticky řízených dějů vedoucích k vytvoření nerozpustné koagulační zátky. U slunéčkovitých byly subpopulace hemocytů popsány pouze u druhu H. axyrídis (Firlej et al, 2012). Celkově byly hemocyty tohoto druhu rozděleny do pěti typů: plazmatocyty, granulami hemocyty I. typu, granulami hemocyty II. typu, oenocytoidy a sférické buňky (spherulo- cyty). Bylo zjištěno, že hlavními fagocytujícími buňkami jsou granulami hemocyty I. typu. Fagocytickou funkci vykazovaly i plazmatocyty, ale až o více hodin později po propuknutí infekce bakteriemi. Jako primární funkce plazmatocytů byla určena nodulace ve spolupráci s granulárními hemocyty II. typu. Jelikož byly ve studii testovány pouze imunitní reakce, fagocytóza, nodulace a enkapsulace, nebyla zjištěna funkce oenocytoidů a sférických buněk. Oenocytoidy se účastní melanizace a fenoloxidázové kaskády u motýlů (Lavině et Strand, 2002) a komárů (Hillyer et Christen- sen, 2002). U zlatohlávka skvostného [Protaetia speciosissima] se účast­ nily fagocytózy (Giulianini et al, 2003). U slunéčkovitých nebyla zatím jejich imunitní funkce prokázána. Funkce sférických buněk není u hmyzu plně objasněná (Lavině et Strand, 2002; Ribeiro etBrehélin, 2006). Prav­ děpodobně se účastní transportu kutikulárních složek (Sass etal, 1994). Koncentrace hemocytů v hemolymfě se liší mezi druhy slunéček (Knapp et al, 2018). V hemolymfě H. axyrídis bylo nalezeno trojnásobné množství hemocytů než u druhu C. undecimnotata a dvojnásobné než u druhu C. septempunctata. Koncentrace hemocytů se také razantně mění během ontogenetického vývoje (Řeřicha et al, 2018). V larválních stádiích bylo nalezeno v 1 |il hemolymfy přibližně pět tisíc hemocytů. Od vylíhnutí dospělce se koncentrace hemocytů začne prudce zvyšovat, dokud se od osmého dne neustálí na šestinásobném množství hemocytů než v larválních stádiích (přibližně třicet tisíc hemocytů na 1 |il hemo­ lymfy).

21 ÚVOD

Důležitými orgány podílejícími se na imunitní ochraně jsou také tukové těleso a střední střevo. Tukové těleso má kromě důležité funkce zásobárny energie a místa syntézy prekurzorů vitelogeninu funkci také v produkci a sekreci antimikrobiálních peptidů s lytickou aktivitou a dal­ ších složek humorální imunity (Aggarwal et Silverman, 2008; Hillyer, 2010). Střední střevo mimo primární funkce v trávení a absorpci stravy také dokáže produkovat oxid dusnatý a další lytické faktory, které zabí­ její patogeny (Luckhart et al, 1998, Buchon et al, 2009, Hillyer, 2010).

1.2.2 Humorální imunita

Humorální imunitu zajišťuje velké množství látek a molekul. U hmyzu a některých dalších členovců se vyskytuje tzv. fenoloxidázová kaskáda. Jde o kaskádu reakcí, kdy se po navázání elicitoru na receptory v hemolymfě spouští kaskáda serinových proteáz, které proteolytickým štěpením aktivují profenoloxidázu a mění ji na aktivní enzym fenoloxi- dázu. Její hlavní funkcí je tvorba melaninu, který má několik funkcí. Po uložení v kutikule vytváří typické zbarvení živočicha a chrání ho před škodlivými účinky UV záření. Účastní se také hojení poranění a izolace patogenů (Hillyer, 2016). Napomáhá při odstraňování reaktivních meta- bolitů vznikajících při imunitních reakcích a důležitou funkci má i při vý­ voji organismu, jelikož se účastní sklerotizace nové kutikuly. Další skupinou humorální imunity jsou aglutininy (lektiny), což jsou proteiny vázající uhlovodíky. Lektiny dokáží aglutinovat bakterie, prvoky, erytrocyty obratlovců a různé parazity díky přítomnosti sacha­ ridů na jejich povrchu (Gupta, 2001). U hmyzu jsou lektiny syntetizovány vhemocytech a v tukovém tělese. Mohou sloužit jako receptory, opso- niny, aktivují agregaci a proliferaci hemocytů nebo pomáhají v regene­ raci poranění. Velkou složkou humorální imunity jsou lyziny, které mají lytickou funkci. Řadí se sem lysozym a další látky s antimikrobiální funkcí. Lyso- zymy slunéček jsou enzymy s relativní molekulovou hmotností mezi 13,2 - 16,9 kDa. Mají muramidázovou aktivitu, tzn. zajišťují hydrolýzu (3- 1,4-glykosidických vazeb mezi navázanými zbytky kyseliny N-acetylmu- ramidové a N-acetyl-D-glukosaminu u peptidoglykanů bakteriální bu­ něčné stěny (Wiesner et al, 2010). Kvůli odlišné stavbě buněčné stěny tak působí primárně proti grampozitivním bakteriím. U slunéček byly nalezeny dva typy lysozymů, c-typ (chicken) lysozymu a i-typ (inver­ tebrate) lysozymu (Vilcinskas et al, 2013a). V transkriptomu slunéčka

22 ÚVOD

H. axyridis bylo nalezeno 10 genů kódující lysozymy, čtyři kódují c-typy lysozymu a šest i-typy lysozymu. Pouze exprese jednoho c-typu lyso- zymu byla indukována po imunizaci bakteriemi. Jedná se tedy o konsti­ tutivní složku humorální aktivity. Čtyři popsané c-typy lysozymu byly nazvány c-lysl, c-lys2, c-lys3 a c-lys4 (Vilcinskas et al, 2013a). Beckert et al, 2015 zjistili, že pouze c-lys3 a c-lys4 jsou katalyticky aktivní, pro­ tože u zbývajících dvou typů c-typů lysozymu chybí zbytky kyseliny aspartové potřebné k muramidázové aktivitě. Také zjistili, že nepůsobí plošně proti všem grampozitivním bakteriím. Lyžují grampozitivní bak­ terie Micrococcus luteus, Bacillus subtilis and B. megateríum, ale ne gram­ pozitivní Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis a druhy rodu Listeria. Aktivita také nebyla pozorována proti gramnegativním bakteriím jako Escheríchia coli nebo Pseudomonas aeruginosa. U i-typu lysozymu jich bylo pouze pět z šesti pozitivně identifikováno. Byly po­ jmenovány i-lysl, i-lys2, i-lys3, i-lys4 a i-lys5 (Vilcinskas et al, 2013a). Při zkoumání jejich struktury a funkce bylo zjištěno, že žádný z nich nemá muramidázovou aktivitu (Beckert et al, 2016). U i-typů lysozymu slunéček nebylo tedy zatím potvrzeno, zda mají nějakou imunitní funkci. Lytickou funkci dále zastávají antimikrobiální peptidy (AMP). Hmyzí AMP jsou kationické molekuly s méně než 100 aminokyselino­ vými zbytky, obvykle 12-50 (Bulet et Stócklin, 2005). Zastoupení AMP a jejich množství se mezi druhy liší. Např. defenziny můžeme najít u všech živočichů, ale coleoptericiny jsou výhradně přítomné u brouků a glove- riny najdeme jen u motýlů (Vilcinskas, 2013). Kromě antimikrobiální funkce mohou mít také imunomodulační aktivitu (Easton et al, 2009), slouží ke kontrole endosymbiontů (Login etal, 2011), účastní se regene­ race poranění, nebo indukují apoptózu. Identifikace genů pro AMP byla u slunéček nejprve provedena u druhu H. axyridis (Vilcinskas et al, 2013a). V transkriptomu bylo celkově nalezeno více než 50 AMP genů patřících do různých tříd, což je zatím největší počet nalezený u mnoho­ buněčných organismů. Mimo výše zmíněných deset genů kódujích lyso­ zymy, bylo nalezeno deset genů kódujících attaciny, patnáct genů kódu­ jících coleoptericiny, čtyři geny kódující coleoptericinům podobné AMP, devatenáct genů kódujících defenziny a čtyři geny kódující thaumatiny. Attaciny a coleoptericiny působí hlavně proti gramnegativním bak­ teriím, defensiny působí proti bakteriím s oběma typy buněčných stěn a thaumatiny působí antifungálně. Koncentrace AMP se v těle slunéčka několikanásobně zvýší po infekci (Vilcinskas etal, 2013a). Funkčně byly dále testovány dva nejvíce exprimované coleoptericiny, Coll a Col6, proti

23 ÚVOD gramnegativním bakteriím [E. colí), grampožitivním bakteriím (M. lu- teus] a entomopatogenní houbě Metarhizium anisopliae. Oba coleopteri- ciny silně inhibovaly růst gramnegativní bakterie a vykazovaly pouze nízkou inhibici růstu grampozitivní bakterie. U testované entomopato­ genní houby oba silně inhibovaly její klíčení. Podobnou studii provedl Gegner et al, 2018, v níž byl testován vliv vypnutí syntézy Coll na imu­ nitní odpověď H. axyrídis. Mortalita slunéček s vypnutou expresí Coll se po injekci gramnegativní bakterie Pseudomonas entomophila zvýšila po deseti dnech z 50 % na 80 %. Bylo tedy zjištěno, že Coll je důležitou součástí imunitní ochrany slunéčka a že má pravděpodobně hlavní funkci při ochraně proti gramnegativním bakteriím. Exprese genů pro AMP byla zjištěna také u dalších dvou druhů slunéček, C. septempunctata a A bipunctata (Vogel etal, 2017). Ve srov­ nání s H. axyrídis mají tyto dva druhy mnohem méně genů pro AMP. U C. septempunctata bylo nalezeno 18 genů pro AMP včetně sedmi pro lysozymy a u A bipunctata 19 genů pro AMP včetně 11 genů pro lyso- zymy. Také exprese jejich AMP po imunizaci stejnými druhy patogenů, jaké byly použity ve studii Vilcinskas et al, 2013a, byla několikanásobně menší. Nejvíce exprimované coleoptericiny byly u H. axyrídis zvýšeny více než tisícinásobně, u C. septempunctata čtyřicetipětinásobně a u A bi­ punctata pouze pětinásobně. Podobně defenziny, jež jsou u H. axyrídis zvýšeny více než tisícinásobně, byly u C. septempunctata zvýšeny třistanásobně a u A bipunctata nebyla jejich exprese vůbec pozorována. Složkou humorální imunity jsou také alkaloidy, které se nachá­ zejí vhemolymfě slunéček. Spolu s hořkými a dráždivými metoxypyra- zíny slouží k odehnání predátorů a oba typy látek jsou vylučovány z těla při obraně živočicha během tzv. reflexního krvácení (viz 1.1.1.). U sluné­ ček bylo nalezeno více než padesát různých alkaloidů patřících struk­ turně mezi acyklické aminy, piperidiny, pyrrolidiny, perhydroazaphena- leny, dimerické alkaloidy, azamakrolidy a homotropany (King et Mein- wald, 1996). Jsou syntetizovány v tukovém tělese (Laurent et al, 2002). Bylo zjištěno, že v hemolymfě slunéček můžeme najít více druhů alka­ loidů, ale vždy je jeden hlavní (King et Meinwald, 1996). Liší se také toxi­ cita jednotlivých alkaloidů. Antibakteriální účinky byly testovány dle li­ teratury pouze u harmoninu, který se nachází v hemolymfě slunéčka vý­ chodního [H. axyridis].V hemolymfě českých druhů, jako je slunéčko sed­ mitečné [C. septempunctata] či slunéčko dvojtečné (A bipunctata], nebyl tento alkaloid nalezen (Róhrich et al, 2012). Uměle syntetizovaný har- monin vykazoval antimikrobiální aktivitu proti velké škále bakteriálních

24 ÚVOD a houbových patogenů (Róhrich et al, 2012). Zabíjel i např. methicilin- rezistentního zlatého stafylokoka či původce tuberkulózy Mycobacte- rium tuberculosis. Účinek vykazoval dokonce proti původci malárie Plasmodium falciparum. Je možné, že v menší míře budou mít antimikro- biální účinky i ostatní typy alkaloidů slunéček. U nejlépe prostudovaného druhu H. axyridis se hovoří o dvojúrov- ňové imunitě (Vilcinskas et al, 2013a; Schmidtberg et al, 2013), jelikož jejich alkaloid harmonin s širokou antimikrobiální aktivitou slouží jako konstitutivní ochrana proti patogenům. Po infekci se syntéza harmoninu sníží a naopak se indukuje exprese AMP. U druhu C. septempunctata ne­ byla tato základní antimikrobiální aktivita pozorována (Gross et al, 2010; Schmidtberg et al, 2013). Antimikrobiální aktivita tohoto druhu byla indukována až bakteriální infekcí. Absence základní antimikrobiální aktivity byla také naznačena u druhu A bipunctatave studiích Vilcinskas, 2013 a Vogel et al, 2017. Naopak její přítomnost je očekávána u druhu Cer. undecimnotata na základě výsledků uvedených v publikaci Knapp et al, 2018.

1.3 Mikrosporidie

Mikrosporidie jsou obligátní vnitrobuněční parazité příbuzní hou­ bám, kteří napadají většinu živočichů. Problémy způsobují např. v chovu včel a bourců morušových, u kterých způsobují velké úhyny (Pasteur, 1870; Fries, 1993), ale i u imunodeficientních savců včetně lidí (Didier et al, 1994; Weber et al, 2000). Mikrosporidie se uvnitř hostitele rozmno­ žují v jeho buňkách a mohou způsobit i změnu jejich chování (Szumowski et Troemel, 2015). U bezobratlých hostitelů je pod jejich vlivem pozoro­ vána především aktivace imunitních reakcí, ubikvitinace, základních me­ tabolických drah a ovlivnění hormonální signalizace (Ma etal, 2013; Han et Weiss, 2017). Tyto organismy byly také nalezeny v tělech slunéček, u kterých se ale nejedná o parazity, ale spíše o komenzály. U slunéček bylo identifiko­ váno několik druhů mikrosporidií převážně z rodu Nosema (Saito et Bjornson, 2008, Vilcinskas etal, 2013b). Výskyt mikrosporidií byl potvr­ zen u všech životních stádií slunéček (Vilcinskas etal, 2013b). Toleranci či rezistenci k mikrosporidiím slunéčkům zajišťují pravděpodobně anti­ mikrobiální peptidy a další humorální imunitní mechanismy (Vilcinskas et al, 2013b). Mírně negativní vliv mikrosporidií byl zjištěn u larev

25 ÚVOD slunéček, u kterých prodlužoval vývoj (Saito et Bjornson, 2008). Abun- dance mikrosporidií v tělech slunéček se liší mezi druhy, ale i mezi je­ dinci téhož druhu. Např. u H. convergens, jež je běžným americkým slunéčkem, je možné najít populace infikované i neinfikované (Saito et Bjornson, 2006; Saito et Bjornson, 2008). U invazivního slunéčka H. axy- ridis byla přítomnost mikrosporidií potvrzena u všech testovaných na­ tivních i introdukovaných invazivních populací (Vilcinskas etal, 2013b). Mikrosporidie byly v tělech slunéček nalezeny v hemolymfě, svalových tkáních, ovariích a v pojivech okolo střev a gonád (Vilcinskas etal, 2015). Díky predáci mezi slunéčky dochází k horizontálnímu přenosu mi­ krosporidií po konzumaci vajíček jiných druhů (Saito et Bjornson, 2006; Saito et Bjornson, 2008). Po konzumaci vajíček H. axyrídis druhy C. sep- tempunctata a A bipunctata většina predujících slunéček umřela (Vilcin­ skas et al, 2013b). Podle autorů za to může velká koncentrace mikrospo­ ridií, se kterými si imunitní systém nehostitelských druhů neporadí. Tento názor ale vyvrací Sloggett, 2013 a Solter et al, 2013, kteří připisují zvýšenou mortalitu přítomnosti alkaloidu harmoninu ve vajíčcích. Dodnes je tedy role mikrosporidií v životě slunéček z větší části ne­ jasná. Nevíme, zdali si některé druhy vyvinuly mechanismy, které jim umožňují přežít přítomnost mikrosporidií v organismu bez negativní újmy, a jestli opravdu pomáhají hostitelům v likvidaci dalších patogenů. Bylo by zajímavé prokázat, jestli větší koncentrace mikrosporidií v tělech slunéček zajišťuje hostitelům dominanci ve vnitrocechovém kořistnictví a v celkové imunitní ochraně.

1.4 Prezimovaní

Kritickým obdobím života je pro mnoho druhů hmyzu v polárním, mírném a subtropickém pásu zima. Jedinci jsou během této doby vysta­ veni velkému množství stresových faktorů, např. chladným teplotám, de­ hydrataci, omezenému přístupu k potravě nebo odlišnému tlaku pato­ genů. Musí tedy změně podmínek a jejich následkům přizpůsobit svoji fyziologii a imunitu. V přírodě mluvíme o tzv. aklimatizaci a v laborator­ ních podmínkách pak o aklimaci. Největším abiotickým stresorem je pro hmyz obvykle nízká teplota. Organismy mohou snížit vliv tohoto stresoru syntézou kryoprotektivních látek, jako je např. glycerol, trehalóza nebo sorbitol, které omezují tvorbu ledových krystalů uvnitř buněk, a synté­ zou nemrznoucích proteinů, které k sobě poutají krystaly ledu a tím

26 ÚVOD inhibují jejich růst, který by byl pro organismus fatální. Musí také dojít ke zvýšení rezistence k dehydrataci, jelikož jsou jedinci během prezimo­ vaní vystaveni vyššímu odpařování vody a zároveň mají omezený její pří­ jem (Sinclair et al, 2013). Během zimy se hmyz i nadále střetává s patogeny. V nízkých teplo­ tách jsou aktivní např. entomopatogenní houby z rodu Beauveria a Me- tarhizium (Fernandes et al, 2008), nebo bakterie Yersinia entercolitica, která má v chladných podmínkách dokonce vyšší virulenci (Bresolin et al, 2006). Tyto okolnosti tak mohou u hmyzu v nízkých teplotách zapří­ činit zvýšení zátěže imunitního systému, která se projeví na jeho aktivitě. Přezimující hmyz si musí před zimou nahromadit dostatečné ener­ getické zásoby, které mu musí vystačit do začátku jara, jelikož během zimy nemá možnost je získat. Energetické zásoby se uchovávají v orga­ nismu především ve formě lipidů jako triglyceridy; a cukrů. Cukry jsou skladovány nejčastěji jako glykogen, ale mohou to být i menší molekuly jako např. disacharid trehalóza (Sinclair, 2015). Mnoho druhů hmyzu také využívá zásobní proteiny, ale ty obvykle nejsou během prezimovaní primárním zdrojem energie. Nastřádané energetické zásoby musí jedinci během zimy správně rozdělit - k vytvoření kryoprotektivních látek, k opravě poškození (vnitřního i vnějšího), k zachování imunity a k vlastní pohybové aktivitě. I po ukončení zimy musí mít hmyz dostatek energie k další aktivitě, jako je růst, reprodukce, k opravě poranění způ­ sobené zimou a k vyššímu metabolickému výdeji, který souvisí s větším pohybem a vyššími teplotami. Výhodu na konci zimy mají druhy, které přežívají jako tzv. aktivní stádia, jež si mohou další energetické zásoby nasbírat konzumací znovu dostupné potravy, oproti těm, kteří přezimují ve formě kukel a musí mít po zimě dostatek energie k pokračování růstu do stádia dospělce. Jelikož tedy musí s energetickými zásobami šetřit, může u hmyzu docházet ke snížení imunitní aktivity (Ferguson et Sinclair, 2017; Fer- guson et al, 2018). Ta může být snížena vlivem nízkých teplot, ale také jako adaptace na zimní období v kombinaci s nižším patogenním tlakem. To potvrzuje například studie Nakamura et al, 2011, ve které bylo pozo­ rováno snížení fagocytózy a enkapsulace ve 4 °C u přezimující kukly mar- tináče pajasanového [Samia cynthia pryerí). Urbaňski et al, 2017 pozoroval během zimy snížení celkového počtu hemocytů, ale naopak zvýšení fagocytujích buněk u hrobaříka malého [Nicrophorus vespilloides). Nicméně snížení některých imunitních funkcí nemusí zna­ menat menší obranyschopnost jedince. Aklimatizace/aklimace na nízké

27 ÚVOD teploty může modifikovat (nejen) imunitní systém např. syntézou jiných izoforem imunitních enzymů a dalších molekul, které jsou aktivní v chladu (Angilletta, 2009). Ferguson etal, 2016 testovali v nízkých teplotách aktivitu a imunitu cvrčků Gryllus veletis, u nichž proběhla aklimace na chladné teploty, a těch, u kterých aklimace neproběhla. U neaklimovaných jedinců byl po­ zorován nižší práh teploty, při které se přestali vlivem chladu hýbat a ná­ sledně se jim také rychleji po zvýšení teploty obnovila normální pohy­ bová aktivita. Potenciální aktivita fenoloxidázy, lysozymu a proteinů se se snižováním teploty snižovala stejně u obou testovaných skupin. U re­ alizované imunitní aktivity měřené jako melanizace a účinek proti Sta- phylococcus aureus bylo v nižších teplotách nečekaně pozorováno větší snížení u jedinců, u kterých proběhla dřívější aklimace. Podle autorů cvrčci pravděpodobně věnují více energie ke zvýšení tolerance na chlad, např. syntézou kryoprotektantů. I z dalších obdobných studií je zřejmé, že při nízkých teplotách do­ chází ke změnám ve fyziologii a imunitě jedince. Tyto změny jsou ale dru­ hově specifické (Ferguson et Sinclair, 2017). Nízké teploty mohou imu­ nitní reakce potlačit i posílit, a to i nezávisle na patogenech. Aby hmyz přežil zimu, musí si správně fyziologické procesy a imunitu modifikovat (Ferguson et al, 2018). Při nesprávné úpravě buď bude zranitelnější k nákaze nebo si vyčerpá energetické zásoby. Důležitým parametrem pro přežití je správná aklimatizace na teplotu. Ve vyšších teplotách bu­ dou mít vyšší metabolický výdej a větší spotřebu energie, ale při nízkých teplotách zase hrozí tvorba poškození (tzv. chill injuries), na jejichž opravu spotřebovávají energetické zásoby a mohou pro ně skončit fa­ tálně. Je potřebné si uvědomit, že během zimy teplota fluktuuje a hmyz se např. může při krátké teplé frontě nevhodně deaklimatizovat a snížit si toleranci vůči chladu. Nebude poté znovu připraven na chladnější tep­ loty. Během zimy také záleží na mikrohabitatech, ve kterých hmyz zimu přečkává. Pod trvalou sněhovou pokrývkou jsou vyšší teploty než nad sněhem, takže dochází k větší spotřebě energie. Nedochází zde ale k vý­ kyvům teplot, které jsou často pro hmyz kritické. Slunéčka jsou druhy netolerantní vůči mrazu. Hromadí si kryopro- tektivní látky, jako je např. myoinositol u H. axyrídis, které jim pomáhají krátkodobě přežít teploty pod bodem mrazu (Watanabe, 2002). Bod podchlazení a letální teplota se liší mezi druhy v závislosti na výběru pře- zimujících habitatů a klimatickém pásu. Pro většinu slunéček z mírného pásu se tyto hodnoty pohybují mezi -10 až -20 °C (Hodek et al, 2012).

28 ÚVOD

Bylo zjištěno, že s postupem zimy a s úbytkem energetických zásob se stávají méně tolerantní vůči nízkým teplotám (Koch et al, 2004, Berk- vens et al, 2010). Vhodné teplotní podmínky na prezimovaní byly testo­ vány např. u druhu H. axyrídis (Berkvens etal, 2010). Ten v mírném pásu v Evropě nepřežije dlouhodobé vystavení teploty pod -5 °C. Nejvhodnější teploty pro jeho prezimovaní se pohybují v rozmezí mezi 0-5 °C. Při vyšších teplotách se znovu zvyšuje mortalita slunéček tohoto druhu z důvodu vyššího metabolického výdeje, který vede k vyhladovění. Slunéčka přezimují většinou jako dospělci (Hodek et al, 2012). U všech druhů byl pozorován možný vstup do diapauzy. Do ní vstupují na základně podnětů z prostředí (délky světelné části dne, teploty, do­ stupnosti potravy či potřebného zisku energetických zásob) ještě před propuknutím nepříznivých podmínek. Celý proces vstupu do diapauzy je u slunéček řízen především hormonálně a zahrnuje kromě snížení meta­ bolismu na minimum i modifikaci fyziologie (zpomalení růstu a vývoje ovariol), morfologie (zvětšení tukového tělesa) a chování (vyhledávání vhodných mikrohabitatů k prezimovaní) (Raak-van den Berg et al, 2013). Postupem času na základě ubývání světelné části dne a kumulaci po­ škození se oslabují stimuly, které diapauzu udržují, jako jsou např. dia- pauzní hormon a geny více exprimované v diapauze (Denlinger, 2002). V rámci několika dnů až týdnů tak dochází k postupnému ukončování di­ apauzy, což většinou probíhá okolo prosince a ledna. Jelikož ale v této době nadále přetrvávají nepříznivé podmínky, jako jsou nízké teploty, slunéčka zůstávají dormantní a přetrvávají vtzv. post-diapauzní quiescenci. Tu je od diapauzy těžké odlišit, jelikož jedinci mají nadále sní­ ženou metabolickou aktivitu. Jediný rozdíl spočívá v tom, že v quiescenci je hmyz citlivý na vnější podněty. Pokud se zvýší teplota, mohou oka­ mžitě reagovat a znovu obnovit svůj příjem potravy a reprodukci (Raak- van den Berg et al, 2013; Knapp et Řeřicha, 2020). Čas začátku prezimovaní a hibernace slunéček také závisí na druhu a klimatickém podnebí (Hodek et al, 2012). Např. na severní polokouli H. axyrídis prezimuje mezi říjnem a koncem března, některé druhy ale vstupují do diapauzy už na konci léta. Diapauza H. axyrídis je relativně krátká a slabá, v půlce prosince z ní slunéčka vstoupí do quiescence (Raak-van den Berg et al, 2013). U C. septempunctata byly v České re­ publice nalezeny slunéčka, která vstoupila do diapauzy v půlce srpna, ale také jedinci, kteří byli v půlce října stále aktivní na listech (Hodek, 1962). Oproti dormantním samičkám u těch aktivních v říjnu stále ještě

29 ÚVOD probíhala vitelogeneze. Začátek diapauzy u A. bipunctata byl v mírném pásu stanoven při fotoperiodě mezi 13 hodin světla/11 hodin tmy a 14 hodin světla/10 hodin tmy a teplotě 2 3 °C (Obrycki et al., 1983). Ter- minace jejich diapauzy probíhá na základě fotoperiodických podnětů ke konci prosince. Konec hibernace (diapauzy či quiescence) se i na jedné lokalitě liší mezi druhy. V České republice Hodek (1960) a v Polsku Bie- lawski (1961) pozorovali, že na konci zimy jsou aktivní prvně druhy Coccinella quinquepunctata, A. bipunctata a Tytthaspis sedecimpunctata. Až o měsíc později pak C. septempunctata a Hipp. varíegata a jako po­ slední byla pozorována Cer. undecimnotata (Hodek et al, 2002). Slunéčka z tribu Coccinellini a dalších afidofágních druhů často mi­ grují do přezimujících mikrohabitatů lišících se od míst, kde shánějí po­ travu během aktivní části sezóny. V těchto přezimujících mikrohabita- tech pak vytvářejí agregace o různých velikostech. Největší agregace byly nalezeny u druhu T. sedecimpunctata, u něhož obsahovaly přes deset tisíc jedinců (Majerus et Kearns, 1989). Migrace a velké agregace během zimy jsou typické také pro druhy H. convergens, Cer. undecimnotata a H. axyri- dis (Hodek et al, 2012), jejichž agregace obsahují stovky až tisíce jedinců. Agregace druhu C. septempunctata jsou už pouze v řádech desítek je­ dinců. Většinou se jedná o agregace pouze jednoho druhu, ale zřídka byly pozorovány i mezidruhové agregace (Hodek et al, 2012). Také se liší mikrohabitaty, ve kterých jednotlivé druhy slunéček přezimují. H. axyridis vyhledává vnitřní nebo chráněné prostory, jako jsou převážně domy a další umělé objekty, poté také trhliny ve skalách, jeskyně a někdy dokonce prezimuje v listové podestýlce (Sakurai et al, 1993). Jelikož tvoří velké přezimují agregace, v lidských obydlích mohou způsobit obyvatelům alergické reakce (Kidd et Nalepa, 1995). Bylo zjiš­ těno, že v chladnějším mírném pásu a subarktickém pásu nepřežije H. axyridis zimu mimo lidská sídla (Labrie atal, 2008). Další druhy, jako je A. bipunctata nebo Coleomegilla maculata, mohou také lidská obydlí pro prezimovaní využívat, ale byly nalezeny v místech, jako jsou okenní rámy nebo na půdě, které pro ně slouží pouze jako závětrné oblasti. A. bi­ punctata často neopouští své přirozené habitaty, což jsou sady, parky a lesy, a prezimuje v dírách ve stromech, kůře a umělých objektech (Ho­ dek et al, 2012). C. septempunctata vždy přetrvává zimu na zemi, pod ka­ meny, v listové podestýlce, v dírách v půdě či u bází stonků rostlin. Ně­ která slunéčka preferují suchá místa [Coccinula quatuordecipustulata, Hipp. varíegata), jiná habitaty v blízkosti vlhkých oblastí (některé druhy z rodu Hippodamia] a další přímo vlhká místa (např. fytofágní

30 ÚVOD

Subcocinella vigintiquatuorpunctata a mykofágní Psyllobora vigintiduo- punctata).

31 CÍL PRÁCE

2 Cíl práce

Přestože se čeleď s lun éčko vitých těší poměrně velkému zájmu ze strany vědecké komunity, imunita slunéček není do dnešní doby dobře prozkoumána. Většina studií je úzce zaměřena na nejběžnější slunéčka jako jsou Coccinella septempunctata aAdalia bipunctata. Na za­ čátku současného století se do popředí výzkumu, a to nejenom v imuno­ logii, dostal druh Harmonia axyridis, který odbornou i laickou veřejnost překvapil svojí invazní sílou. Tato diplomová práce se proto zaměřuje na srovnání imunity většího souboru druhů slunéček, z nichž ještě mnohé nebyly dosud zkoumány. Mezi testované druhy byly vybrány pře­ devším nejčastější druhy vyskytující se v evropských zemích. Cílem práce bylo porovnat základní fyziologické a imunitní parametry jednot­ livých druhů slunéček odchycených v přírodě. V rámci srovnání jednotlivých druhů byla testována hypotéza vlivu mikrosporidií vyskytujících se v hemolymfě na obranyschopnost sluné­ ček a také to, zda v Evropě silně invazivní druh Harmonia axyridis bude mít prokazatelně sinější imunitní systém než nativní slunéčka nebo jiné fyziologické předpoklady invazivity. Cílem práce bylo také prozkoumat souvislost měřených parametrů s fylogenetickou příbuzností slunéček. Na základě předchozích studií lze předpokládat, že slunéčko H. axyridis má nejsilnější imunitu z čeledi slunéčkovití. Hypotézou práce bylo, že další druhy slunéček mu blízce příbuzných budou mít ve srovnání s fylogenetický vzdálenějšími druhy mnohem silnější imunitní systém. Kromě základního popisu fyziologie a imunity slunéček bylo cílem práce také zjištění dopadů, které mají na slunéčka stresové podmínky bě­ hem prezimovaní. Pro tento účel byl zvolen jako modelový druh H. axy­ ridis, který byl vybrán kvůli jednoduchému chovu, velké reprodukci a dobré dostupnosti v přírodě. Tento druh je velmi zkoumaný, jelikož má velký ekologický dopad na ekosystém kvůli své invazivní síle. Hypotézou je, že slunéčka budou mít největší energetické zásoby před zimou a nej- větší vliv na jejich spotřebu a aktivitu imunitního systému budou mít ex­ trémnější teploty a vyšší patogenní tlak.

32 METODIKA

3 Metodika

3.1 Odchyt slunéček a odběr hemolymfy

Dospělá slunéčka byla sbírána v letech 2017 - 2019 v přírodě na ně­ kolika stanovištích po České republice. Experimenty probíhaly ve spolu­ práci s výzkumnou skupinou Ekologie hmyzu vedenou Dr. Michalem Knappem (Fakulta životního prostředí, Česká zemědělská univerzita v Praze), která zajistila identifikaci odchytových lokalit, odchyt a deter­ minaci slunéček a jejich chov během následných laboratorních experi­ mentů. Jmenovitě patří velké poděkování za poskytnutí materiálu k ana­ lýzám již zmíněnému Ing. Michalu Knappovi, Ph.D a Ing. Michalu Řeři­ choví z ČZU v Praze. Co se týče odchytu slunéček, je jedinou výjimkou druh Hippodamia convergens, který je nativním druhem na americkém kontinentu a v Evropě se nevyskytuje. Za zaslání tohoto druhu děkujeme prof. Johnu Obryckyovi z Oddělení entomologie na University of Ken- tucky, který slunéčka nasbíral v okolí univerzity. K odchytu slunéček byly použily exhaustory a šmýkadla. V labora­ toři byla slunéčkům poskytnuta potrava ve formě vajíček Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) a voda ad libitum ve formě nasáklé vaty. Po identifikaci druhu a minimálně třech dnech pobytu v laboratoři při teplotě 23 °C ± 1 °C jim byla odebrána hemolymfa. Primárním způso­ bem odběru bylo využití reflexního krvácení. Slunéčka byla otočena na záda a přichycena na lepící podložku, aby se zamezilo jejich pohybu. Následně se jim dotykem entomologického špendlíku v místě tibio-femo- rálních kloubů na nohách vyvolalo reflexní krvácení, tj. z daného místa vypustili kapku hemolymfy. Ta byla nabrána do kalibrovaných skleně­ ných kapilár (Hirschmann, Německo). Pokud nebylo možné odebrat he- molymfu reflexním krvácením, byla provedena punkce vpichem entomo­ logického špendlíku do metasterna slunéčka. Hemolymfa byla okamžitě po odběru lOOx naředěna modifikovaným antikoagulačním pufrem (62 mM NaCl, 100 mM glukóza, 30 mM citronan sodný a 26 mM kyselina ci­ trónová; Firlej et al, 2012). Vzorky byly odebírány a dále zpracovávány samostatně pro každého jedince zvlášť. Pouze některé vzorky byly směsí ze dvou jedinců, a to zejména u druhů A decempunctata, Coccinula qua- tuordecimpustulata a Ch. bipustulatus, jelikož se jedná o menší druhy a množství hemolymfy z nich odebrané by nebylo dostačující pro další

33 METODIKA analýzy. Vzorky hemolymfy byly po změření koncentrace hemocytů a mi- krosporidií uskladněny v -20 °C pro další analýzy.

3.2 Chov Harmonia axyridis a simulace přezimovacích podmínek

K zjištění vlivu prezimovaní na fyziologické a imunologické parame­ try byly chovány dvě odlišné skupiny slunéček. První skupina brouků byla chována k otestování vlivu různě silných zim. Tato skupina obsahuje pouze laboratorně chovaná slunéčka H. axyridis. Rodiče těchto slunéček byli odchyceni v přírodě a poté v párech umístěni do 9mm Petriho disek obsahujících několikrát přehnutý filtrační papír, který poskytuje vhodný substrát pro kladení vajíček. Misky byly umístěny do klimatické komory (AVIKO-PRAHA), kde byla nastavena fotoperioda 16 hod. světla/8 hod. tmy, 70% vlhkost a teplota 26 °C. Nově vylíhnuté generaci larev byla do­ dána potrava ad libitum ve formě vajíček Ephestia kuehniella (Lepi- doptera: Pyralidae), voda v nasáklé vatě a byla udržována ve stejných podmínkách jako rodičovské páry až do začátku října, kdy jim byly nasi­ mulovány podmínky zimní diapauzy. Slunéčka byla vystavena třem teplotním režimům, které simulovaly teplou zimu, průměrnou zimu a studenou zimu. Tyto teplotní režimy byly počítačově nastaveny a každou hodinu se teplota v komoře měnila. Prů­ měrná a minimální teplota pro každý režim byla: pro teplou zimu 2,8 °C / -2 °C, pro průměrnou zimu 0,7 °C / -4,1 °C a pro studenou zimu -1,6 °C / -8,1 °C. Tyto teplotní režimy napodobovaly reálné teploty, kterým jsou slunéčka H. axyridis vystavena ve venkovním přístřešcích ve střední Ev­ ropě. Hemolymfa byla odebírána během prezimovaní třikrát, na začátku zimy (druhý týden října), uprostřed zimy (druhý týden ledna) a na konci prezimovaní (druhý týden března). Hemolymfa byla odebírána pouze z živých jedinců a každý odebraný jedinec byl z dalšího pokračování ex­ perimentu vyřazen. Způsob odběru hemolymfy byl stejný, jakým byla odebírána hemolymfa u slunéček odchycených v přírodě (viz 3.1.). Druhá skupina slunéček sloužila k otestování vlivu prezimovaní v kombinaci s reakcí imunity na přítomnost patogenu. Použita byla slunéčka odchycená v přírodě během října. Populace slunéček využívané v tomto experimentu pocházejí ze třech geograficky odlišných lokací: Ko- nětopy (GPS: 50.2764039N, 14.6538239E), Malá Amerika (GPS: 49.9545178N, 14.1760375E) a Hostím (GPS: 49.9603000N,

34 METODIKA

14.1295000E). Slunéčka byla po cca padesáti jedincích umístěna do litro­ vých skleněných nádob. Populace z Konětop byly přemístěny do čtyř mi- krohabitatů s odlišnou teplotou a vlhkostí. Slunéčka z Malé Ameriky a Hostimi byla vystavena podmínkám přirozeným v těchto lokacích. Před zimou (v říjnu) a po konci prezimovaní (polovina března) byly dvě skupiny přemístěny do laboratoře, kde byla slunéčka individuálně umístěna do Petriho misek a na 24 hodin přesunuta do klimatické ko­ mory s nastavenou fotoperiodou 16 hodin světla/8 hodin tmy, 70 % vlh­ kostí a teplotou 23 °C. Polovina každé skupiny byla imunizována bakterií Escherichia coli (CCM 3954) po dvanácti hodinách v klimatické komoře a poté na stejný čas vrácena zpět. Imunizace byla provedena pomocí en- tomopologického špendlíku se špičkou o průměru 0,3 mm, který byl na­ močen do bakteriální suspenze a píchnut do posledního hrudního článku slunéčka. Použitá kultura E. coli byla připravena v živném médiu (desti­ lovaná voda, 33 mg anaerobního bujónu Wilkins-Chalgren, 5 mg sójo­ vého proteinového izolátu, 0,5 mg cysteinu a 1 |il polysorbátu) inkubo- vaném 16 hodin v 23 °C při trvalém osvětlení a síle třepání 400 rpm. He- molymfa byla odebrána pouze z živých jedinců inkubovaných 24 hodin v klimatické komoře a každý odebraný jedinec byl z dalšího pokračování experimentu vyřazen.

3.3 Koncentrace hemocytů a mikrosporidií v hemolymfě

Ve spolupráci s laboratoří na ČZU byla u všech vzorků hemolymfy okamžitě po jejím odběru změřena koncentraci hemocytů. K jejímu ur­ čení byla využita Bůrkerovu komůrku, ve které byly hemocyty spočteny v deseti velkých čtvercích (0,04 mm2). K měření byl použit mikroskop CX31 (Olympus, Japonsko) a zvětšení 400x. Koncentrace hemocytů byla přepočítána na jeden mikrolitr čisté hemolymfy. V hemolymfě vzorků sloužících k mezidruhovému porovnání bylo zjištěno také přibližné množství mikrosporidií. Toto hodnocení bylo také provedeno mikroskopicky v čerstvě odebrané hemolymfě. Množství mi­ krosporidií bylo určeno v arbitrárních jednotkách, které bylo definováno jako počet mikrosporidií na ploše pěti malých čtverců (0,0025 mm2) Bůr- kerovy komůrky bez proostření. Za poskytnutí dat z mikroskopických analýz děkuji Ing. Michalu Řeřichoví z ČZU v Praze.

35 METODIKA

3.4 Celková koncentrace proteinů v hemolymfě

Celková koncentrace proteinů byla měřena modifikovanou meto­ dou podle Lowryho (Lowry atal, 1951) za použití komerčního kitu (Bio- Rad DC Protein Assay, Sigma-Aldrich, USA). Metoda využívá reakce meď­ natých iontů s peptidovými vazbami a Folinovým reagentem v alkalic­ kém prostředí. Výsledkem jsou modré redukované molekuly reagentu. Koncentrace redukovaného reagentu byla vypočtena ze spektrometric- kého stanovení absorbance při 700 nm na destičkovém spektrometru Sunrise (Tecan, Švýcarsko). Tato koncentrace odpovídá množství pro­ teinů ve vzorku. Pro měření bylo konkrétně použito 5 |il lOOx ředěné he­ molymfy, která byla smíchána na destičce se 25 |il reagentu A a 200 |il reagentu B. Směs byla následně inkubována 10 minut ve tmě. Intenzita modrého zbarvení byla změřena na spektrofotometru při 700 nm. Hod­ noty absorbance vzorků byly porovnávány s hodnotami z kalibračních vzorků, které byly připraveny z bovinního sérového albuminu (Sigma- Aldrich, USA). Z hodnot absorbance byla vytvořena kalibrační řada s li­ neární spojnicí. Koncentrace proteinů je přepočítána na 1 ml hemolymfy.

3.5 Celková koncentrace lipidů v hemolymfě

Pro celkovou koncentraci lipidů v hemolymfě byl využit vanilinový test (Zöllner et Kirsh, 1962). Principem metody je, že lipidické sloučeniny v silně kyselém prostředí odštěpují mastné kyseliny, jejichž dvojné vazby reagují s vanilinem za vzniku barevné sloučeniny. Metoda byla optimalizována pro změření lipidů v naředěné hemo­ lymfě slunéček. Jako standard byla použita kyselina olejová, jejíchž kalib­ rační roztoky byly naředěny hexanem na známou koncentraci. Do kalib­ račních vzorků a vzorků hemolymfy o objemu 5 |il bylo přidáno 100 |il kyseliny sírové. Vzorky byly 10 minut zahřívány při 100 °C v termobloku (Four E's Scientific, USA). Poté byly zchlazeny ve vodní lázni a do stude­ ných vzorků bylo přidáno po 1 ml vanilinové reagencie (13 mM vanilin, 66,8% kyselina fosforečná). Po 30 minutách byla změřena absorbance při 546 nm na destičkovém spektrometru Sunrise (Tecan, Švýcarsko). Koncentrace lipidů je vyjádřena na 1 ml hemolymfy.

36 METODIKA

3.6 Antimikrobiální aktivita proti Micrococcus luteus

Pro měření antimikrobiální aktivity proti grampozitivním bakteriím byla použita metoda radiální difúze v gelu obsahujícím živé bakterie Micrococcus luteus (CCM 169) podle Kunc et al, 2019. Jedna kolonie při­ pravených bakterií se nechala přes noc kultivovat při pokojové teplotě v 5 ml LB média. Druhý den bylo přidáno 100 LLI LB média s narostlými bakteriemi s ODóoo= 1,5 do 45 ml agaru (4% agar v LB, MOBIO, USA) ro­ zehřátého na cca 55 °C. Zamíchaná směs byla nalita do Petriho misek s průměrem 14 cm a ponechána zatuhnout. Poté bylo do agaru vyraženo dvanáct rovnoměrně rozložených jamek. Do těchto jamek bylo napipeto- váno 5 Lil vzorku hemolymfy nebo kalibrace. Kalibrační řada byla vytvo­ řena z čistého lysozymu (Sigma-Aldrich, USA), který má proti bakterii M. luteus vysoký degradační účinek (např. Ogasawara-Fujita et Saka- guchi, 1976; Ganz et al, 2003). Misky byly následně kultivovány do dal­ šího dne při 30 °C. Kolem jamek obsahujících hemolymfu se vytvořily ra­ diální zóny, ve kterých došlo k zamezení růstu bakterií. Velikostně zóny odpovídají účinkům antimikrobiálních látek v hemolymfě obsažených. Pro kvantifikaci výsledků byly změřeny průměry vytvořených zón, je­ jichž velikost má v závislosti na aktivitě lysozymu logaritmický průběh (Hultmark et al, 1982). Výsledky jsou vyjádřeny jako mg lysozymu na ml hemolymfy.

3.7 Antimikrobiální aktivita proti Escherichia coli

K luminometrickému měření antimikrobiální aktivity hemolymfy proti gramnegativní bakterii byla využita bioluminiscenční bakterie Escherichia coli K12, která obsahuje plazmid luxABCDamp, díky němuž v ní dochází k expresi bakteriální luciferázy a jejích substrátů (Vojtek et al, 2014). Zásobní kultura bakterií E. coli K12 o známé koncentraci byla naředěna fosfátovým pufrem (pH 7) tak, aby 60 ul suspenze obsahovalo 50 tisíc bakteriálních buněk. Ke 20 LLI vzorku bylo na destičku napipeto- váno 60 LLI bakterií. Poté byla destička ihned vložena do luminometru Chameleón V™ (Hidex, Finsko), kde byl v „counts per second" (CPS) mě­ řen luminiscenční signál bakterií. Reakce hemolymfy s luminiscenčními bakteriemi byla měřena 30 minut zároveň s kontrolami, které obsaho­ valy místo hemolymfy pouze antikoagulační nebo fosfátový pufr. Inte­ grály měření vzorků hemolymfy byly poté srovnány s integrály kontrol

37 METODIKA s fosfátovým pufrem. Výsledné hodnoty jsou vyjádřeny jako procentu­ ální úmrtnost bakterií.

3.8 Statistické zhodnocení

Všechny statistické analýzy byly provedeny v softwaru Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., USA). U parametrů, ve kterých se u některých druhů slunéček vyskytovaly nulové hodnoty, tj. daný parametr nebyl u daného druhu detekovatelný, byla před statistickým testováním pro­ vedena transformace dat přičtením 0,01 ke všem hodnotám v datovém souboru. Soubory dat byly nejprve otestovány Shapiro-Wilkovým testem na normalitu. Pro mezidruhové porovnání u všech testovaných parame­ trů byl následovně proveden neparametrický Dunn test, jelikož nebyly splněny podmínky pro normální rozložení dat. Soubory vzorků slunéček vystavených různým přezimovacím podmínkám, byly mezi sebou navzá­ jem otestovány neparametrickým Kruskal-Wallis testem s následným Dunn testem při nenormálním rozdělení dat, nebo pomocí jednocestné ANOVA s následným Tukey testem pro data s normální distribucí. Pro analýzu souborů vzorků slunéček přezimujících v přírodě, na kterých byl zkoumán i vliv imunizace, byl použit nepárový t-test pro data s normální distribucí či Mann-Whitney test pro data, jež nesplňovala kritéria pro pa­ rametrický test. Jako signifikantní byly považovány vždy rozdíly na hla­ dině p < 0,05. Veškeré výsledky jsou uváděny jako průměr a směrodatné odchylky. Množství testovaných jedinců je uvedeno v legendách obrázků v sekci Výsledky (kapitola 4).

38 POUŽITÉ ZDROJE

Použité zdroje

Aggarwal K., Silverman N. 2008. Positive and negative regulation of the Drosophila immune response. BMB Reports. 41: 267-277. Andersen S. O., Hojrup P., Roepstorff P. 1995. Insect cuticular proteins. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 125(2): 153-176. Angilletta M. J. Jr. 2009. Thermal adaptation: a theoretical and empiri• cal synthesis. Oxford University Press, New York, USA. Arrese E. L., Soulages J. L. 2010. Insect fat body: Energy, metabolism, and regulation. Annual Review of Entomology. 55: 207-225. Beckert A., Wiesner J., Baumann A., Pöppel A. K., Vogel H., Vilcinskas A. 2015. Two c-type lysozymes boost the innate immune system of the in• vasive ladybird Harmonia axyridis. Developmental and Comparative Immunology. 49: 303-312. Beckert A., Wiesner J., Schmidtberg H., Lehmann R., Baumann A., Vogel H., Vilcinskas A. 2016. Expression and characterization of a recombinant i-type lysozyme from the harlequin ladybird beetle Harmonia axyridis. Insect Molecular Biology. 25(3): 202-215. Berkvens N., Bale J. S., Berkvens D., Tirry L., De Clercq P. 2010. Cold to• lerance of the harlequin ladybird Harmonia axyridis in Europe. Journal of Insect Physiology. 56: 438-444. Berkvens N., Moens J., Berkvens D., Samih M. A., Tirry L., De Clerc P. 2010. Dinocampus coccinellae as a parasitoid of the invasive ladybird Harmonia axyridis in Europe. Biological Control: Theory and Applications in Pest Management. 53: 92-99. Bielawski R. 1961. Die in einem Krautpflanzenverein und in einer Kie• ferschonung in Warszawa/Bielany auftretenden Coccinellidae (Coleop- tera). Fragmenta Faunistica. 8: 485-525. Bresolin G., Morgan J. A, Ilgen D., Scherer S., Fuchs T. M. 2006. Low tem• perature-induced insecticidal activity of Yersinia enterocolitica. Molecu• lar Microbiology. 59: 503-512. Buchon N., Broderick N. A., Poidevin M., Pradervand S., Lemaitre B. 2009. Drosophila intestinal response to bacterial infection: activation of host defense and stem cell proliferation. Cell Host & Microbe. 5: 200-211.

68 POUŽITÉ ZDROJE

Bulet P., Stócklin R. 2005. Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation. Protein and Peptide Letters 12: 3-11. Burmester T. 1999. Evolution and function of the insect hexamerins. European Journal of Entomology. 96: 213-225. Ceryngier P., 2000. Overwintering of Coccinella septempunctata (Cole- optera: Coccinellidae) at different altitudes in the Karkonosze Mts, SW Poland. European Journal of Entomology. 97: 323-328. Ceryngier P., Havelka J., Hodek I. 2004. Mating and activity of gonads in pre-dormant and dormant ladybirds (Coleoptera: Coccinellidae). Inver­ tebrate Reproduction and Development. 45: 127-135. Ceryngier P., Hodek I., 1996. Enemies of the Coccinellidae. In: Hodek I., Honk A. (Eds.): Ecology of Coccinellidae. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 319-350. Conrad A. 2005. Adalia bipunctata als Beute von Gomphusflavipes (Cole­ optera: Coccinellidae; Odonata: Gomphidae). Libellula. 24: 237-239. DeBach P. (ed.). 1964. Biological Control of Insect Pest and Weeds. Cha­ pman and Hall, London, U.K. Denlinger D. L. 2002. Regulation of diapause. Annual Review of Ento­ mology. 47:93-122. Didier E. S., Varner P. W., Didier P. J., Aldras A. M., Millichamp N. J., Mur- phey-Corb M., Bohm R., Shadduck J. A. 1994. Experimental microsporidi- osis in immunocompetent and immunodeficient mice and monkeys. Fo­ lia Parasitologica. 41: 1-11. Dixon A. F. G. 2000. Insect predator-prey dynamics: Ladybird beetles and biological control. Cambridge University Press, Cambridge, U.K. Dushay M. S. 2009. Insect hemolymph clotting. Cellular and Molecular Life Sciences. 66: 2643-2650. Easton D. M., Nijnik A., Mayer M. L., Hancock R. E. 2009. Potential of immunomodulatory host defense peptides as novel anti-infectives. Trends in Biotechnology. 27: 582-590. Escalona H. E., Z wick A., Li H.-S., Li J., WangX., Pang H., Hartley D., Jermiin L. S., Nedvěd O., Misof B., Niehuis O., Šlipiňski A., Tomaszewska W. 2017. Molecular phylogeny reveals food plasticity in the evolution of true lady­ bird beetles (Coleoptera: Coccinellidae: Coccinellini). BMC Evolutionary Biology. 17(151).

69 POUŽITÉ ZDROJE

Ferguson L. V., Heinrich D. E., Sinclair B. 2016. Paradoxical acclimation responses in the thermal performance of insect immunity. Oecologia. 181: 77-85. Ferguson L. V., Sinclair B. 2017. Insect immunity varies idiosyncrati- cally during overwintering. Journal of Experimental Zoology. 327A: 322- 234. Ferguson L. V., Korter R., Sinclair B. 2018. Eco-immunology in the cold: the role of immunity in shaping the overwintering survival of ecto- therms. Journal of Experimental Biology. 221. Fernandes E. K., Rangel D. E., Moraes A. M., Bittencourt V. R., Roberts D. W. 2008. Cold activity of Beauveha and Metarhizium, and thermotole- rance of Beauveha. Journal of Invertebrate Pathology. 98: 69-78. Firlej A., Girard, P.-A., Brehelin, M., Coderre, D., Boivin, G. 2012. Immune response of Harmonia axyhdis (Coleoptera: Coccinellidae) supports the enemy release hypothesis in North America. Annals of the Entomological Society of America. 105(2): 328-338. Fries I. 1993. Nosema apis—a parasite in the honey bee colony. Bee World. 74: 5-19. Gambino P. 1992. Yellowjacket [Vespula pensylvanica] predation at Ha• waii Volcanoes and Haleakala National Parks: identity of prey items. Pro• ceedings of the Hawaiian Entomological Society. 31:157-164. Ganz T., Gabayan V, Liao H.-L, Liu L., Oren A., Graf T. Cole A. M. 2003. Increased inflammation in lysozyme M-deficient mice in response to Micrococcus luteus and its peptidoglycan. Blood. 101(6): 2388-2392. Gegner T., Schmidtberg H., Vogel H., Vilcinskas A. 2018. Population-spe• cific expression of antimicrobial peptides conferring pathogen resistance in the invasive ladybird Harmonia axyhdis. Scientific Reports. 8: 3600 Ghahari H., Lehr P. A., Lavigne R.J., Hayat R., Ostovan H. 2007. New re• cords of robber flies (Diptera, Asilidae) for the Iranian fauna with their prey records. Far Eastern Entomologist. 179: 1-9. Giglio A., Battistella S., Talarico F. F., Brandmayr T. Z., Giulianini P. G. 2008. Circulating hemocytes from larvae and adults of Carabus (Chaetocarabus) lefebvrei Dejean 1826 (Coleoptera, Carabidae): Cell ty• pes and their role in phagocytosis after in vivo artificial non-self-chall• enge. Micron. 39: 552-558.

70 POUŽITÉ ZDROJE

Gilbert L. I., Chino H. 1974. Transport of lipids in insects. Journal of Li• pid Research. 15(5): 439-456. Giorgi J. A., Vandenberg N.J., McHugh J. V., Forrester J. A., Slipinski S. A., Miller K. B., Shapiro L. R., Whiting M. F. 2009. The evolution of food pre• ferences in Coccinellidae. Biological Control: Theory and Applications in Pest Management. 51: 215-31. Giulianini P. G., Bertolo F., Battistella S., Amirante GA. 2003. in• frastructure of the hemocytes of Cetonischema aeruginosa larvae (Cole- optera, Scarabaeidae): involvement of both granulocytes and oenocyto- ids in in vivo phagocytosis. Tissue & Cell. 35: 243-251. Gol^biowski M., Malihski E., Bogusb M. I., Kumirska J., Stepnowski P. 2008. The cuticular fatty acids of Calliphora vicina, Dendrolimus pini and Galleria mellonella larvae and their role in resistance to fungal infection. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38(6): 619-627. Gross J., Eben A., Müller I., Wensing A. 2010. A well protected intruder: The effective antimicrobial defense of the invasive ladybird Harmonia axyridis. Journal of Chemical Ecology. 36: 1180-1188. Gupta A. P. 2001. Immunology of invertebrates: Humoral. Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd. New Jersey, USA. Gupta A. P. 2002. Immunology of invertebrates: Cellular. Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd. New Jersey, USA. Hahn D. A., Denlinger D. L. 2007. Meeting the energetic demands of in• sect diapause: nutrient storage and utilization. Journal of Insect Physio• logy. 53: 760-773. Hahn D. A., Denlinger D. L. 2011. Energetics of Insect Diapause. Annual Review of Entomology. 56: 103-121. Haine E. R., Pollitt L. C, Moret Y., Siva-Jothy M. T., RolffJ. 2008. Temporal patterns in immune responses to a range of microbial insults [Tenebrio molitor). Journal of Insect Physiology. 54: 1090-1097. Han B., Weiss L. M. 2017. Microsporidia: Obligate Intracellular Patho• gens within the Fungal Kingdom. Microbiology Spectrum. 5(2). Handke B., Poernbacher I., Goetze S., Ahrens C. H., Omasits U., Marty F., Simigdala N., Meyer I., Wollscheid B., Brunner E., Hafen E., Lehner C. F. 2013. The Hemolymph proteome of fed and starved Drosophila larvae. PLoSONE.8: e67208.

71 POUŽITÉ ZDROJE

Happ G. M., Eisner T. 1961. Hemorrhage in a coccinellid beetle and its repellent effect on ants. Science. 134: 329-331. Haunerland N. H. 1996. Insect storage proteins: Gene families and re­ ceptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 26(8-9): 755-765. Hillyer J. F., Christensen B. M. 2002. Characterization of hemocytes from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Histochemistry and Cell Biology. 117: 431-440. Hillyer J. F. 2010. Mosquito immunity. Advances in Experimental Medi­ cine and Biology. 708: 218-238. Hillyer J. F. 2016. Insect immunology and hematopoiesis. Developmen­ tal & Comparative Immunology. 58: 102-118. Hippa H., Koponen S., Roine R. 1984. Larval growth of Coccinella hiero- glyphica (Col., Coccinellidae) fed on aphids and preimaginal stages of Ga- lerucella sagittariae (Col., Chrysomelidae). Reports from the Kevo Sub­ arctic Research Station. 19: 67-70. Hodek I. 1960. Hibernation - bionomics in Coccinellidae. Časopis Čes­ koslovenské společnosti entomologické. 57: 1-20. Hodek I. 1962. Experimental influencing of the imaginal diapause in Coccinella septempunctata L. (Col., Coccinellidae), 2nd part. Časopis Čes­ koslovenské společnosti entomologické. 59: 297-313. Hodek I., van Emden H. F, Honěk A. 2012. Ecology and Behaviour of the Ladybird Beetles (Coccinellidae). Willey-Blackwell, U.K. Horn D. J. 1991. Potential impact of Coccinella septempunctata on en­ dangered Lycaenidae (Lepidoptera) in NW Ohio, U.S.A. In: Polgar L., Chambers R. J., Dixon A. F. G., Hodek I: Behavior and Impact of Aphi- dophaga. SPB Academic Publishers, The Hague. 159-162. Hultmark, D., Engstrom, A., Bennich, H., Kapur, R., Boman, H. G. 1982. Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae. European Journal of Bio­ chemistry. 127: 207-217. Jeffers L. A., Roe R. M. 2008. The movement of proteins across the insect and tick digestive system. Journal of Insect Physiology. 54(2): 319-332. Kanervo V. 1940. Beobachtungen und Versuche zur Ermittlung der Na- hrung einiger Coccinelliden. Annales Entomologicae Fennicae. 6: 89-110. Katsoyannos P., Kontodimas D. C, Stathas G. 2005. Summer diapause and winter quiescence of Hippodamia (Semiadalia) undecimnotata

72 POUŽITÉ ZDROJE

(Coleoptera: Coccinellidae) in central Greece. European Journal of Ento­ mology. 102: 453-457. Kendall D. A. 1971. A note on reflex bleeding in the larvae of the beetle Exochomus quadripustulatus (L.) (Col.: Coccinellidae). The Entomologist. 104: 233-235. Kenis M., Roy H. E., Zindel R., Majerus M. E. N. 2008. Current and poten­ tial management strategies against Harmonia axyridis. BioControl. 53: 235-252. Kidd K. A., Nalepa C. A. 1995. Distribution of Harmonia axyridis (Pallas) (Coleoptera: Coccinellidae) in North Carolina and Virginia. Proceedings of the Entomological Society of Washington. 97: 729-731. King A. M., MacRae T. H. 2015. Insect heat shock proteins during stress and diapause. Annual Review of Entomology. 60: 59-75. King G. A., Meinwald J. 1996. Review of the defensive chemistry of coccinellids. Chemical Reviews. 96:1105-1122. Knapp M., Dobeš P., Řeřicha M., Hyršl P. 2018. Puncture vs. reflex blee­ ding: Haemolymph composition reveals significant differences among la­ dybird species (Coleoptera: Coccinellidae), but not between sampling methods. European Journal of Entomology. 115: 1-6. Knapp M., Řeřicha M. 2020. Effects of the winter temperature regime on survival, body mass loss and post-winter starvation resistance in la­ boratory-reared and field-collected ladybirds. Scientific Reports. 10: 4970. Koch R. L., Carrillo M. A., Venette R. C, Cannon C. A., Hutchison W. D. 2004. Cold Hardiness of the Multicolored Asian Lady Beetle (Coleoptera: Coccinellidae). Environmental Entomology. 33(4): 815-822. Kovář 1.1996. Morphology and anatomy. In: Hodek I, Honěk A: Ecology of Coccinellidae. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1-18. Koyama S., Majerus M. E. N. 2008. Interactions between the parasitoid wasp Dinocampus coccinellae and two species of coccinellid from Japan and Britain. BioControl. 53: 253-264. Kunc M., Dobeš P., Hurychová J., Vojtek L., Poiani S. B., Danihlík J., Havlík J., Titěra D., Hyršl P. 2019. The Year of the Honey Bee (Apis mellifera L.) with Respect to Its Physiology and Immunity: A Search for Biochemical Markers of Longevity. Insects. 10(8): 244.

73 POUŽITÉ ZDROJE

Labrie G., Coderre D., Lucas E. 2008. Overwintering Strategy of Multi• colored Asian Lady Beetle (Coleoptera: Coccinellidae): Cold-Free Space As a Factor of Invasive Success. Annals of the Entomological Society of America. 101(5): 860-866. Laurent P., Braekman J. C, Daloze S. 2005. Insect chemical defense. To• pics in Current Chemistry. 240: 167-229. Laurent P., Braekman J.-C, Daloze D., Pasteels J. M. 2002. In vitro produ• ction of adaline and coccinelline, two defensive alkaloids from ladybird beetles (Coleoptera: Coccinellidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32: 1017-1023. Laurent P., Lebrun B., Brakeman J.-C, Daloze D., Passteels J. M. 2001. Bi- osynthetic studies on adaline and adalinine, two alkaloids from ladybird beetles (Coleoptera: Coccinellidae). Tetrahedron. 57(16): 3403-3412. Lavine M.D., Strand M.R. 2002. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32: 1295-1309. Login F. H., Balmand S., Vallier A., Vincent-Monegat C, Vigneron A., We- iss-Gayet M., Rochat D., Heddi A. 2011. Antimicrobial peptides keep in• sect endosymbionts under control. Science. 334: 362-365. Lombaert E., Guillemaud T., Cornuet J.-M., Malausa T., Facon B., Estoup A. 2010. Bridgehead effect in the worldwide invasion of the biocontrol harlequin ladybird.PLoS ONE. 5(3): e9743. Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. 1951. Protein me• asurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemis• try. 193(1): 265-275. Lucas E., Coderre D., Brodeur J. 1998. Intraguild predation among three aphid predators: Characterization and influence of extraguild prey den• sity. Ecology. 79: 1084-1092. Lucas E., Coderre D., Brodeur J. 1998. Intraguild predation among aphid predators: characterization and influence of extraguild prey density. Ecology. 79: 1084-1092. Luckhart S., Vodovotz Y., Cui L., Rosenberg R. 1998. The mosquito Anopheles stephensi limits malaria parasite development with inducible synthesis of nitric oxide. Proceedings of the National Academy of Scien• ces of the United States of America. 95: 5700-5705. Ma Z., Li C, Pan G., Li Z., Han B., Xu J., Lan X., Chen J., Yang D., Chen Q., Sang Q., Ji X., Li T., Long M., Zhou Z. 2013. Genome-wide transcriptional

74 POUŽITÉ ZDROJE response of silkworm (Bombyx mori] to Infection by the microsporidian Nosema bombycis. PLoS One. 8: e84137. Magro A., Lecompte E., Magne F., Hemptinne J.-L., Crouau-Roy B. 2010. Phylogeny of ladybirds (Coleoptera: Coccinellidae): are the subfamilies monophyletic. Molecular Phylogenetics and Evolution. 54: 833-848. Majerus M. E. N., Kearns P. 1989. Ladybirds. HarperCollins Publishers. Richmond, London, UK. Majerus M. E. N., Slogett J. J., Godeau J. F., Hemptinne J. L. 2007. Intera• ctions between ants and aphidophagous and coccidophagous ladybirds. Population Ecology. 49: 15-27. Majerus, M. E. N., 2006. The impact of male-killing bacteria on the evo• lution of aphidophagous coccinellids. European Journal of Entomology. 103: 1-7. Manachini B., Arizza V., Parrinello D., Parrinello N. 2011. Hemocytes of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae) and their response to Saccharomyces cerevisiae and Bacillus thuhngiensis. Journal of Invertebrate Pathology. 106(3): 360-365. Marples N. M., Brakefield P. M., Cowie R. J. 1989. Differences between the 7-spot and 2-spot ladybird beetles (Coccinellidae) in their toxic effects on a bird predator. Ecological Entomology. 14: 79-84. Marshall K. E., Sinclair B. J. 2012. Threshold temperatures mediate the impact of reduced snow cover on overwintering freeze-tolerant caterpi• llars. Naturwissenschaften. 99: 33-41. McKenna D. D., Wild A. L., Kanda K, Bellamy C. L., Beutel R. G., Caterino M. S., Farnum C. W., Hawks D. C, Ivie M. A., Jameson M. L., Leschen R. A. B., Marvaldi A. E., McGugh J. V., Newton A. F., Robertson J. A., Thayer M. K, Whiting M. F., Lawrence J. F., Slipinski A., Maddison D. R., Farrell B. 2015. The beetle tree of life reveals that Coleoptera survived end of Per• mian mass extinction to diversify during the cretaceous terrestrial revo• lution. Systematic Entomology. 40(4): 835-80. Mizer A. V. 1970. On eating of beetles from Coccinellidae family by birds. Vestnik Zoologii. 6: 21-24. Moore B. P., Brown W. V., Rothschild M. 1990. Methylalkylpyrazines in aposematic insects, their hostplants and mimics. Chemoecology. 1: 43- 51. Nagel N. C, Masic A., Schurigt U., Boland W. 2015. Efficient synthesis of (R)-harmonine - the toxic principle of the multicolored Asian lady beetle [Harmonia axyridis). Organic & Biomolecular Chemistry. 13: 5139.

75 POUŽITÉ ZDROJE

Nakamura A., Miyado K., Takezawa Y., Ohnami N., Sato M., Ono C, Ha- rada Y., Yoshida K., Kawano N., Kanai S., Miyado M., Umezawa A. 2011. Innate immune system still works at diapause, a physiological state of dormancy in insects. Biochemical and Biophysical Research Communica• tions. 410: 351-357. Ogasawara-Fujita N., Sakaguchi K. 1976. Classification of micrococci on the basis of deoxyribonucleic acid homology. The Journal of General Microbiology. 94(1): 97-106. Overgaard J., MacMillan H. A. 2017. The Integrative Physiology of In• sect Chill Tolerance. Annual Review of Physiology. 79: 187-208. Pandey J. P., Tiwari R.K. 2012. An Overview of Insect Hemocyte Science and its Future Application in Applied and Biomedical Fields. American Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2: 82-105. Pasteur L. 1870. Etudes sur la maladie des vers a soie. Paris, Gauthier- Villars, successeur de Mallet-Bachelier. 1870: 148-168. Pervez A., Omkar O. 2006. Ecology and biological control application of multicoloured Asian ladybird, Harmonia axyhdis: A review. Biocontrol Science and Technology. 16(1/2): 111-128. Phukan M., Hazarika L. K., Barooah M., Puzari K. C, Kalifa S. 2008. Inte• raction of Dicladispa armigera (Coleoptera: Chrysomelidae) haemocytes with Beauveha bassiana. International Journal of Tropical Insect Science. 28(02): 88-97. Raak-van den Berg C. L., De Jong P. W., Hemerik L., Van Lenteren J. C. 2013. Diapause and post-diapause quiescence demonstrated in overwintering Harmonia axyhdis (Coleoptera: Coccinellidae) in northwestern Europe. European Journal of Entomology. 110(4): 585- 591. Ribeiro C, Brehelin M. 2006. Insect haemocytes: what type of cell is that? Journal of Insect Physiology. 52: 417-429. Ricci C. 1986. Food strategy of Tytthaspis sedecimpunctata in different habitats. In: Hodek I: Ecology of Aphidophaga. Academia, Prague. 311- 316. Riddick E. W., Cottrell T. E., Kidd K. A. 2009. Natural enemies of the Coccinellidae: Parasites, pathogens, and parasitoids. Biological Control. 51: 306-312.

76 POUŽITÉ ZDROJE

Robertson J. A., Whiting M. F., McHugh J. V. 2008. Searching for natural lineages within the Cerylonid series (Coleoptera: Cucujoidea). Molecular Phylogenetics and Evolution. 46:193-205. Róhrich C. R., Ngwa C. J., WiesnerJ., Schmidtberg H., Degenkolb T., Koll- ewe C, Fischer R., Prádel G., Vilcinskas A. 2012. Harmonine, a defence compound from the harlequin ladybid, inhibits mycobacterial growth and demonstrates multi-stage antimalarial activity. Biology Letters. 8: 308-311. Roy H. E., Wajnberg E. 2008. From biological control to invasion: the ladybird Harmonia axyridis as a model species. Biological Control. 53: 1- 4. Řeřicha M., Dobeš P., Hyršl P., Knapp M. 2018. Ontogeny of protein con­ centration, haemocyte concentration and antimicrobial aktivity against Escherichia coli in haemolymph of the invasive harlequin ladybird Har­ monia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae). Physiological Entomology. 43: 51-59. Saito T., Bjornson S. 2006. Horizontal transmission of a microspo- ridium from the convergent lady beetle, Hippodamia convergens Gu'erin- M'eneville (Coleopteran: Coccinelidae), to three coccinellid species of Nova Scotia. Biological Control. 39: 427-433. Saito T., Bjornson S. 2008. Effects of a microsporidium from the con­ vergent lady beetle, Hippodama convergens Gu'erin-M'eneville (Coleop­ tera: Coccinellidae), on three non-target coccinellids. Journal of Inver­ tebrate Pathology. 99: 294-301. Sakurai H., Kumada Y., Takeda S. 1993. Seasonal prevalence and hiber- nating-diapause behavior in the lady beetle, Harmonia axyridis. Research Bulletin of the Faculty of Agriculture, Gifu University. 58: 51-55. Sasaji H. 1968. Phylogeny of the family Coccinellidae (Coleoptera). Eti- zenia. 35: 1-37. Sass M., Kiss A., Locke M. 1994. Integument and hemocyte peptides. Journal of Insect Physiology. 40: 407-421. Shapiro-Ilan D. I., Cottrell D. I. 2005. Susceptibility of lady beetles (Coleoptera: Coccinellidae) to entomopathogenic nematodes. Journal of Invertebrate Pathology. 89: 150-156. Schmidtberg H., Róhrich C, Vogel H., Vilcinskas A. 2013. A switch from constitutive chemical defence to inducible innate immune responses in the invasive ladybird Harmonia axyridis. Biology Letters. 9: 20130006.

77 POUŽITÉ ZDROJE

Siddiqui M. I., Al-Khalifa M. S. 2013. Review of haemocyte count, re­ sponse to chemicals, phagocytosis, encapsulation and metamorphosis in insects. Italian Journal of Zoology. 81(1): 2-15. Sinclair B. J., Marshall K. E. 2018. The many roles of fats in overwinte­ ring insects. Journal of Experimental Biology. 221: jebl61836. Sinclair B., 2015. Linking energetics and overwintering in temperate in­ sects. Journal of Thermal Biology. 54: 5-11. Sinclair B., Ferguson L., Salehipour-shirazi G., MacMillan H. A. 2013. Cross-tolerance and Cross-talk in the Cold: Relating Low Temperatures to Desiccation and Immune Stress in Insects. Integrative and Compara­ tive Biology. 53(4): 545-556. Siva-Jothy M. T., Moret Y., Rolff J. 2005. Insect Immunity: An Evolutio­ nary Ecology Perspective. Advances in Insect Physiology. 32: 1-48. Sloggett J. J. 2013. Science. 341:1342. Snyder W. E., Clevenger G. M., Eigenbrode S. D. 2004. Intraguild pre- dation and successful invasion by introduced ladybird beetles. Oecologia. 140: 559-565. Solter L. F., Kyei-Poku G. K., Johny S. 2013. Science. 341: 1342. Song N., Li X., Yin X., Li X., Xi Y. 2020. The mitochondrial genomes of la­ dybird beetles and implications for evolution and phylogeny. Internatio­ nal Journal of Biological Macromolecules. 147: 1193-1203. Szumowski S. C., Troemel E. R. 2015. Microsporidia-Host Interactions. Current Opinion in Microbiology. 26: 10-16. Toussaint E. F., Seidel M., Arriaga-Varela E., Hájek J., Král D., Sekerka L., Short A. E. Z., Fikáček M. 2017. The peril of dating beetles. Systematic Entomology. 42(1): 1-10. Turner R. J. 1994. Immunology: A Comparative Approach. John Wiley & Sons, Ltd. New Jersey, USA. Urbánek A., Szadziewski R., Stepnowski P., Boros-Majewska J., Gabriel I., Dawgul M., Kamysz W., Sosnowska D., Gol^biowski M. 2012. Composi­ tion and antimicrobial activity of fatty acids detected in the hygroscopic secretion collected from the secretory setae of larvae of the biting midge Forcipomyia nigra (Diptera: Ceratopogonidae). Journal of Insect Physio­ logy. 58(9): 1265-1276.

78 POUŽITÉ ZDROJE

Urbaňski A., Czarniewska E., Baraniak E., Rosiňski G. 2017. Impact of cold on the immune system of burying beetle, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Insect Science. 24: 443-454. Vilcinskas, A. 2013. Evolutionary plasticity of insect immunity. Journal of Insect Physiology. 59:12-129. Vilcinskas A., Mukherjee K., Vogel H. 2013a. Expansion of the antimicro­ bial peptide repertoire in the invasive ladybird Harmonia axyridis. Pro­ ceedings. Biological Sciences. 280: 20122113. Vilcinskas A., Stoecker K., Schmidtberg H., Róhrich C. R., Vogel H. 2013b. Invasive harlequin ladybird carries biological weapons against native competitors. Science. 340(6134): 862-863. Vilcinskas A., Schmidtberg H., Estoup A., Tayeh A., Facon B., Vogel H. 2015. Evolutionary ecology of microsporidia associated with the in­ vasive ladybird Harmonia axyridis. Insect Science. 22: 313-324. Vogel H., Schmidtberg H., Vilcinskas A. 2017. Comparative transcripto- mics of three ladybird species supports a role of immunity in invasion biology. Developmental and Comparative Immunology. 67: 452-456. Watanabe M. 2002. Cold tolerance and myo-inositol accumulation in overwintering adults of a lady beetle, Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae). European Journal of Entomology. 99: 5-9. Weber R., Deplazes P., Schwartz D. 2000. Diagnosis and clinical aspects of human microsporidiosis. Contributions to Microbiology. 6: 166-192. Wiesner J., Vilcinskas A. 2010. Antimicrobial peptides: The ancient arm of the human immune systém. Virulence. 1(5): 440-464. Wilson-Rich N., Dres S. T., Starks P. T. 2008. The ontogeny of immunity: Development of innate immune strength in the honey bee [Apis melli- fera). Journal of Insect Physiology. 54:1392-1399. Xiao H., Fu X., Liu Y., Wu K. 2016. Synchronous vitellogenin expression and sexual maturation during migration are negatively correlated with juvenile hormone levels in Mythimna separata. Scientific Reports. 6: 33309. Yasuda H., Ohnuma N. 1999. Effect of cannibalism and predation on the larval performance of two ladybird beetles. Entomologia Experimentalis etApplicata. 93: 63-67.

79 POUŽITÉ ZDROJE

Yasuda H., Kikuchi T., Kindlmann P., Sato S. 2001 Relationships between attack and escape rates, cannibalism, and predation in larvae of two pre• datory ladybirds. Journal of Insect Behavior. 14: 373-384. Yasuda H., Evans E. W., Kajita Y., Urakawa K., Takizawa T. 2004. Asym• metric larval interactions between introduced and indigenous ladybirds in North America. Oecologia. 141: 722-731. Yi H.-Y., Chowdhury M., Huang Y.-D., Yu X.-Q. 2014. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechno• logy. 98(13): 5807-5822. Zöllner N., Kirsch K. 1962. Colorimetric Method for Determination of Total Lipids. Journal of Experimental Medicine. 135: 545-550.

80