Les Genres D'actinomycètes (Hors Mycobactéries)

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université Constantine 1 Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Microbiologie

Nº d’ordre : Nº de série :

Thèse de Doctorat en Sciences

Biochimie et Microbiologie Appliquées

Présentée par :

ZERIZER Habiba

Thème :

Les genres d’actinomycètes (hors mycobactéries) impliqués dans les infections dans la région de Constantine

Soutenue le : 28 / 04 / 2014

Devant le jury :

Président : Mr M.A. Hamidechi Professeur U. Constantine 1

Directeur de thèse : Mr A. Boulahrouf Professeur U. Constantine 1

Examinateurs : Mr M. Houhamdi Professeur U. 08 Mai 1945 Guelma Mr Z. Branes Professeur U. Badji Mokhtar Annaba Mr R. Arhab U. Larbi Benm'hidi Oum El Bouaghi Maître de conférences A

Année Universitaire : 2013-2014

Remerciements

L’achèvement de cette thèse de doctorat n'aurait pu voir le jour sans la collaboration de nombreuses personnes qu'il m'est agréable de remercier. Je tiens dans un premier temps à remercier le Pr. BOULAHROUF Abderrahmane, qui a accepté de diriger ce travail et a veillé à son bon déroulement, en m’apportant des critiques constructives et des conseils pertinents, et ce suite à l’intérêt qu’il a accordé à mes travaux de recherches. Toute ma reconnaissance va, également, au staff du service des maladies infectieuses : Pr. DALICHAOUCHE M., Dr. INOURI S., Dr. BOUSSMAT N., Dr. ALOUI W., Dr. SAKHRI L., Dr. GOUMAIDENE S., Dr. BOUMAARAF W., Dr. SABA W., Dr. BENAISSA S. et Dr. TALEB S. ainsi qu’aux infirmières et infirmiers. Mes vifs remerciements sont adressés au Pr. RAOULT Didier, directeur de l’unité des Rickettsies à la faculté de médecine de Marseille, pour son bon accueil et les analyses qu’il m’a autorisé de réaliser. Mes sincères remerciements s’adressent aux membres du jury: le Pr. HAMIDECHI Mohamed Abdelhafid, qui a bien voulu m’honorer en présidant ce jury, et les Pr. HOUHAMDI Moussa, BRANES Zidane et ARHAB Rabah qui ont bien voulu juger ce travail et enrichir le débat. Je tiens à remercier aussi Mme BOUGHACHICHE Faiza, Melle RACHEDI Kounouz, Melle KHAROUB Karima, Melle BENATIYA Malika, Mr EL HADEF EL OUKI Mohamed et Mr GOUMRI Mohamed Amine pour leur aide à la rédaction. Je témoigne mon amitié à tous mes collègues de l’institut de la nutrition de l’alimentation et des technologies agroalimentaires pour les échanges scientifiques. Avant de terminer, je dois remercier mes parents, à qui je dois toute ma réussite et mon mari pour son encouragement, son soutien et sa patience.

Merci à tous.

Liste des abréviations

C.H.U.: Centre Hospitalo-Universitaire C: crachat D.A.B.: acide 2,4- diaminobutyrique D.A.P.: acide 2,6- diaminopimélique EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid FG: fluide gastrique HIV: Human Immunodeficiens Virus ISP: International Streptomyces Project LCR: liquide céphalorachidien LFRFA: Low-Frequency Restriction Fragment Analysis LP: liquide pleural P: pus PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism TAE: Tris HCl, Acide acétique glacial U: urines

Liste des figures

Titre Page Figure 1. Étapes de développement et structure d’une colonie d’actinomycètes (genre Streptomyces) sur milieu solide (Hopwood et al., 1985)………………………………………………………………………….. 5 Figure 2. Organisation des conidies chez quelques genres d’actinomycètes (Larpent et Sanglier, 1989)…………………………………………………………………………………………………………… 7 Figure 3. Formes et disposition de sporanges chez quelques genres d’actinomycètes (Larpent et Sanglier, 1989)…………………………………………………………………………………………………………… 7 Figure 4. Structure des isomères de l’acide diaminopimélique…………………………………………...... 9 Figure 5. Schéma élucidant les étapes des méthodes RAPD et RFLP ………………………………………. 13 Figure 6. Structure de l’ADNr 16S de Streptomyces coelicolor (Anderson et Wellington, 2001)………….. 14 Figure 7. Photographies par microscope électronique du mycélium aérien de deux espèces du genre Nocardia (Kageyama et al., 2004 )……………………………………………………………………………. 19 Figure 8. Photographies de cas de nocardiose………………………………………………………………… 23 Figure 9. Photographies par microscope électronique du mycélium aérien de quelques espèces d’Actinomadura …………………………………………………………………………………………...... 27 Figure 10. Photographies de cas d’infections par Actinomadura sp. ………………………………………… 29 Figure 11. Morphologie des chaines de spores des Streptomyces sp. (Hütter, 1967) ………………………... 32 Figure 12. Différentes ornementations de la paroi des spores des Streptomyces sp. (Vobis, 1997)…………. 33 Figure 13. Photographies par microscope électronique du mycélium de l’espèce Nocardiopsis valliformis HBUM 20028T (Yang et al., 2008)……………………………………………………………………………. 38 Figure 14. Photographies par microscope électronique des chaines de spores de quelques espèces de Nonomuraea ………………………………………………………………………………………………………………. 44 Figure 15. Photographies par microscope électronique du mycélium de Kribbella yunnanensis YIM 30006T (a et b) et de Kribbella alba YIM 31075T (c et d) (Li et al., 2006)…………………………………………… 46 Figure 16. Photographies par microscope électronique du mycélium de l’espèce Micromonospora yangpuensis FXJ6.011T (Zhang et al., 2012)……………………………………………………………...... 50 Figure 17. Photographies par microscope électronique du mycélium de quelques espèces de Saccharothrix…………………………………………………………………………………………………………….. 53 Figure 18. Schéma des étapes de l’isolement des souches d’actinomycètes aérobies…………………...... 58 Figure 19. Technique de culture sur lame (Holt et al., 1994)………………………………………………… 61 Figure 20. Technique de culture sur lamelle (Holt et al., 1994)……………………………………………… 61 Figure 21. Étapes d’extraction de l’ADN par le kit « MagNA Pure LC »……………………………………. 71 Figure 22. Purification du produit de PCR par ultrafiltration………………………………………………… 73 Figure 23. Étapes du séquençage de l’ADNr 16S……………………………………………………………. 75 Figure 24. Reconstitution de la séquence de l’ADNr 16S…………………………………………………… 76 Figure 25. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon le sexe…………….. 79 Figure 26. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon l’âge…………...... 79 Figure 27. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon les pathologies associés…………………………………………………………………………………………………...... 80 Figure 28. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon les facteurs de risque…………………………………………………………………………………………………………... 81 Figure 29. Taux (en %) de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies………………………………….. 81 Figure 30. Taux (en %) de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies selon la période…………...... 82 Figure 31. Taux (en %) des isolats d’actinomycètes aérobies selon le milieu de culture………………...... 82 Figure 32. Taux (en %) de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies selon la présence d’une antibiothérapie…………………………………………………………………………………………………. 83 Figure 33. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.P.03…………………. 91 Figure 34. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.03 avec les espèces types les plus proches du genre Nonomuraea…………………. 93 Figure 35. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.P.44…………………. 94 Figure 36. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.44 avec les espèces type du genre Kribbella……………………………………………. 96 Figure 37. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.B.44……………….... 98 Figure 38. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 avec les espèces type du genre Micromonospora…………………………………………………………………………………………………………. 100 Figure 39. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.S.118………………... 102

Suite de la liste des figures Titre Page Figure 40. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats C.S.118 et FG.S.118 avec les espèces les plus proches du genre Saccharothrix et des autres genres…………………………………………………………………………………………………... 103 Figure 41. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.P.63………………… 104 Figure 42. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.63 avec les espèces les plus proches du genre Nocardiopsis…………………………. 106 Figure 43. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat P.S.262……………...... 107 Figure 44. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats FG.S.262 et P.S.262 avec les espèces les plus proches du genre Actinomadura…………. 109 Figure 45. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat LP.P.473……………….. 111 Figure 46. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat LP.P.473 avec les espèces type du genre Nocardia………………………………………….. 112 Figure 47. Arbre phylogénique construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation entre les isolats du genre Streptomyces………………………………………………………………………………………….. 123 Figure 48. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats P.P.21a, P.B.21, FG.B.22, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces…………………………………...... 125 Figure 49. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52, C.S.66a et P.S.461avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces……………………………………………………………… 128 Figure 50. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats C.B.46, FG.B.151, C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces………………………………….. 132 Figure 51. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats C.S.348 et FG.S.348 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces…………… 134 Figure 52. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats FG.P.68 et C.S.194 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces……………. 136 Figure 53. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.40 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces……………………….. 138 Figure 54. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat LP.B.373 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces……………………….. 139 Figure 55. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.B.435 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces…………………….. 140 Figure 56. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat U.B.458 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces…………………………. 141 Figure 57. Taux (en %) des isolats d’actinomycètes aérobies selon la sensibilité aux antibiotiques………… 147 Figure 58. Taux (en %) des isolats de Streptomyces selon la sensibilité aux antibiotiques………………….. 148

Liste des tableaux

Titre Page Tableau 1. Types de parois des actinomycètes en fonction des constituants en acides aminées et en sucres (Lechevalier et Lechevalier, 1970)………………………………………………………………… 9 Tableau 2. Profils en phospholipides des actinomycètes (Lechevalier et al., 1977)………………...... 10 Tableau 3. Spécificités des techniques moléculaires appliquées à la taxonomie des Streptomyces (Ludwing et Schleifer, 1994, cité par Anderson et Wellington, 2001)…………………………………… 11 Tableau 4. Nombre de souches d’actinomycètes produisant des métabolites actifs (Berdy, 2005)…….. 15 Tableau 5. Cas d’infections invasives à Streptomyces sp. ………………………………………………. 34-35 Tableau 6. Différents cas d’infections par Nocardiopsis sp. (Rudramurthy et al., 2012)…………...... 39-40 Tableau 7. Habitats et localisation géographique de quelques espèces de Micromonospora…………… 49 Tableau 8. Critères de catégorisation selon les valeurs critiques des diamètres d’inhibition………...... 66 Tableau 9. Composants du Kit de l’extraction de l’ADN « MagNA Pure LC DNA »……………...... 69 Tableau 10. Caractères physiologique de l’isolat FG.P.03 et les espèces les plus reliées phylogéniquement……………………………………………………………………………………...... 92 Tableau 11. Caractères physiologiques de l’isolat FG.P.44 et les espèces les plus reliées phylogéniquements…………………………………………………………………………………...... 94-95 Tableau 12. Matrice de distance de l’isolat FG.P.44 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S…………………………………………………………………...... 96 Tableau 13. Caractères physiologiques des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 et des espèces les plus reliées phylogéniquements……………………………………………………………………….. 99 Tableau 14. Matrice de distance des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S………………………………………………… 100 Tableau 15. Caractères physiologiques des isolats C.S.118 et FG.S.118 et l’espèce Saccharothrix longispora…………………………………………………………………………………………………………….. 102 Tableau 16. Caractères physiologiques de l’isolat FG.P.63 et les espèces les plus reliées phylogéniquements ………………………………………………………………………………………... 105 Tableau 17. Caractères physiologiques des isolats FG.S.262 et P.S.262 et des espèces les plus reliées phylogéniquements………………………………………………………………………………………..... 108 Tableau 18. Caractères physiologiques de l’isolat LP.P.473 et les espèces les plus reliées phylogéniquements………………………………………………………………………………………..... 111 Tableau 19. Matrice de distance de l’isolat LP.P.473 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S……………………………………………………………………………… 112 Tableau 20. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique des isolats du genre Streptomyces ……………………………………………………………………………………………….. 120 Tableau 21. Taille de l’ADNr 16S des isolats d’actinomycètes appartenant au genre Streptomyces, et résultats de l’alignement avec les espèces types les plus proches………………………………………… 121-122 Tableau 22. Matrice de distances des isolats P.P.21a, P.B.21, FG.B.22, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S……………………………………………………………………………………………... 126 Tableau 23. Matrice de distances des isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52, C.S.66a et P.S.461 calculée par la modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S…… 129 Tableau 24. Matrice de distances des isolats C.B.46, FG.B.151, C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 calculée par la modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S………………………………………………………………………………….. 133 Tableau 25. Matrice de distances des isolats C.S.348 et FG.S.348 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S……………………………………………………………… 135 Tableau 26. Matrice de distances des isolats FG.P.68 et C.S.194 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S……………………………………………………………… 137 Tableau 27. Matrice de distances de l’isolat U.B.458 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S……………………………………………………………………...... 141 Tableau 28. Les espèces rapprochées aux isolats appartenant au genre Streptomyces…………………..... 142 Tableau 29. Antibiogramme des isolats d’actinomycètes aérobies……………………………………….. 146 Tableau 30. Activités antibactérienne et antifongique des isolats cliniques d’actinomycètes aérobies…... 149

Table des Matières Liste des abréviations Liste des tableaux Liste des figures INTRODUCTION REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 1. Actinomycètes: taxonomie et activité…………………………………………….. 4 1.1. Historique et classification……………………………………………………….. 4 1.2. Taxonomie………………………………………………………………………... 5 1.2.1. Culture et morphologie…………………………………………………………. 5 1.2.1.1. Mycélium primaire…………………………………………………………… 6 1.2.1.2. Mycélium secondaire………………………………………………………… 6 1.2.1.3. Spores………………………………………………………………………… 6 1.2.2. Chimiotaxonomie………………………………………………………………. 8 1.2.2.1. Acides aminés………………………………………………………………… 8 1.2.2.2. Sucres…………………………………………………………………………. 9 1.2.2.3. Lipides………………………………………………………………………... 10 1.2.3. Physiologie…………………………………………………………………….... 11 1.2.4. Méthodes génotypiques………………………………………………………… 11 1.2.4.1. Hybridation ADN-ADN……………………………………………………… 12 1.2.4.2. Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction………………………….. 12 1.2.4.3. Amplification aléatoire de l’ADN polymorphique (RAPD-PCR)……………. 12 1.2.4.4. Amplification des fragments de restriction de polymorphisme (PCR-RFLP)... 13 1.2.4.5. Comparaison des séquences du gène de l’ARN ribosomique………………... 13 1.3. Activité………………………………………………………………………….... 14 1.3.1. Production d’antibiotiques……………………………………………………… 16 1.3.2. Production d’enzymes………………………………………………………….. 16 2. Les actinomycètes pathogènes……………………………………………………. 17 2.1. Nocardia………………………………………………………………………...... 17 2.1.1. Historique et classification……………………………………………………... 17 2.1.2. Habitat et localisation géographique…………………………………………… 18 2.1.3. Macromorphologie et micromorphologie………………………………………. 19 2.1.4. Chimiotaxonomie, physiologie et activité……………………………………… 20 2.1.5. Pathogénie……………………………………………………………………… 20 2.1.5.1. Espèces impliquées…………………………………………………………… 20 2.1.5.2. Facteurs de pathogénie………………………………………………….……. 21 2.1.5.3. Manifestations cliniques……………………………………………………… 21 2.1.5.4. Facteurs de prédisposition……………………………………………………. 23 2.1.5.5. Incidence géographique………………………………………………………. 24 2.1.5.6. Thérapeutique………………………………………………………………… 24 2.2. Actinomadura…………………………………………………………………...... 26 2.2.1. Historique, classification et habitat…………………………………………….. 26 2.2.2. Macromorphologie et micromorphologie………………………………………. 26 2.2.3. Chimiotaxonomie, physiologie et activité……………………………………… 27 2.2.4. Pathogénie………………………………………………………………………. 28 2.2.4.1. Facteurs de prédisposition……………………………………………………. 28 2.2.4.2. Manifestations cliniques…………………………………………………….... 28 2.2.4.3. Incidence géographique………………………………………………………. 29 2.2.5.4. Thérapeutique………………………………………………………………… 30

2.3. Streptomyces……………………………………………………………………… 30 2.3.1. Historique, classification et habitat…………………………………………….. 30 2.3.2. Macromorphologie……………………………………………………………... 31 2.3.3. Micromorphologie……………………………………………………………… 32 2.3.4. Chimiotaxonomie, physiologie et activité……………………………………… 33 2.3.5. Pathogénie………………………………………………………………………. 34 2.4. Nocardiopsis……………………………………………………………………… 35 2.4.1. Historique et classification….…………………………………………………... 36 2.4.2. Habitat et localisation géographique…………………………………………… 36 2.4.3. Macromorphologie……………………………………………………………... 37 2.4.4. Micromorphologie……………………………………………………………… 37 2.4.5. Chimiotaxonomie et physiologie……………………………………………...... 38 2.4.6. Activité………………………………………………………………………..... 38 2.4.7. Pathogénie………………………………………………………………………. 39 2.5. Autres genres…………………………………………………………………...... 40 2.5.1. Dermatophilus………………………………………………………………….. 40 2.5.2. Gordona………………………………………………………………………… 40 2.5.3. Rhodococcus……………………………………………………………………. 41 2.5.4. Amycolata……………………………………………………………………..... 41 2.5.5. Oerskovia……………………………………………………………………...... 41 2.5.6. Rhotia…………………………………………………………………………… 41 2.5.7. Tsukamurella…………………………………………………………………… 41 2.5.8. Corynebacterium……………………………………………………………….. 41 2.5.9. Cellulomonas…………………………………………………………………… 42 2.5.10. Dietzia…………………………………………………………………………. 42 2.5.11. Actinomycètes thermophiles………………………………………………….. 42 2.5.12. Actinomycètes non cultivables………………………………………………... 42 3. Actinomycètes rares……………………………………………………………….. 43 3.1. Nonomuria………………………………………………………………………... 43 3.1.1. Historique et classification……………………………………………………... 43 3.1.2. Habitat et localisation géographique…………………………………………… 43 3.1.3. Macromorphologie et micromorphologie………………………………………. 44 3.1.4. Chimiotaxonomie, physiologie et activité……………………………………… 44 3.2. Kribbella………………………………………………………………………...... 45 3.2.1. Historique et classification……………………………………………………... 45 3.2.2. Habitat et localisation géographique…………………………………………… 45 3.2.3. Macromorphologie et micromorphologie………………………………………. 46 3.2.4. Chimiotaxonomie et physiologie……………………………………………...... 47 3.2.5. Activité………………………………………………………………………..... 47 3.3. Micromonospora………………………………………………………………….. 48 3.3.1. Historique, classification, habitat et localisation géographique………………... 48 3.3.2. Macromophologie………………………………………………………………. 48 3.3.3. Micromorphologie……………………………………………………………… 49 3.3.4. Chimiotaxonomie et physiologie……………………………………………...... 50 3.3.5. Activité………………………………………………………………………..... 51 3.4. Saccharothrix…………………………………………………………………...... 51 3.4.1. Historique et classification……………………………………………………... 51 3.4.2. Habitat et localisation géographique…………………………………………… 51 3.4.3. Macromophologie et micromorphologie……………………………………….. 52 3.4.4. Chimiotaxonomie et physiologie………………………………………………. 53 3.4.5. Activité………………………………………………………………………..... 54

MATÉRIEL ET MÉTHODES 1. Isolement, purification et conservation…………………………………………... 55 1.1. Prélèvements……………………………………………………………………… 55 1.2. Examen microscopique…………………………………………………………… 55 1.3. Ensemencement et culture………………………………………………………... 56 1.4. Purification et conservation………………………………………………………. 56 2. Caractérisation phénotypique……………………………………………………. 59 2.1. Préparation des inocula…………………………………………………………… 59 2.1.1. Inoculum général……………………………………………………………….. 59 2.1.2. Inoculum lavé…………………………………………………………………... 59 2.1.3. Inoculum en suspension………………………………………………………… 59 2.2. Optimisation des conditions de croissance……………………………………….. 59 2.2.1. Température…………………………………………………………………….. 60 2.2.2. Potentiel d’hydrogène…………………………………………………………... 60 2.3. Caractères culturaux et macromorphologie……………………………………… 60 2.4. Micromorphologie………………………………………………………………... 60 2.4.1. Culture sur lame………………………………………………………………… 60 2.4.2. Culture sur lamelle……………………………………………………………… 61 2.5. Chimiotaxonomie………………………………………………………………… 61 2.5.1. Préparation des cellules………………………………………………………… 62 2.5.2. Hydrolyse acide des cellules……………………………………………………. 62 2.5.3. Chromatographie sur couche mince…………………………………………..... 62 2.6. Physiologie……………………………………………………………………….. 63 2.6.1. Production du pigment mélanoïde……………………………………………… 63 2.6.2. Hydrolyse de la caséine………………………………………………………... 63 2.6.3. Hydrolyse de la gélatine………………………………………………………... 63 2.6.4. Hydrolyse de l’amidon…………………………………………………………. 63 2.6.5. Hydrolyse de la tyrosine, xanthine et hypoxanthine………………………….... 64 2.6.6. Hydrolyse de l’urée…………………………………………………………….. 64 2.6.7. Hydrolyse du Tween 80………………………………………………………… 64 2.6.8. Production de la catalase……………………………………………………….. 64 2.6.9. Production de l’oxydase………………………………………………………... 64 2.6.10. Utilisation du citrate…………………………………………………………... 64 2.6.11. Résistance au chlorure de sodium……………………………………………... 65 2.6.12. Réduction des nitrates…………………………………………………………. 65 2.6.13. Utilisation des substrats carbonés…………………………………………….. 65 2.6.14. Tests biochimiques API 20NE………………………………………………… 65 2.7. Résistance aux antibiotiques.……………………………………………………... 66 2.8. Test d’activité antimicrobienne…………………………………………………... 66 2.8.1. Souches tests……………………………………………………………………. 66 2.8.2. Activité antibactérienne………………………………………………………… 67 2.8.3. Activité antifongique…………………………………………………………… 67 3. Caractérisation phylogénique…………………………………………………….. 69 3.1. Extraction de l’ADN……………………………………………………………… 69 3.1.1. Extraction avec l’eau pure……………………………………………………… 69 3.1.2. Extraction à l’aide du Kit « MagNA Pure LC DNA isolation Kit III »………… 69 3.1.2.1. Lyse des cellules……………………………………………………………… 69 3.1.2.2. Adhésion aux micro-billes et séparation de l’ADN…………………………... 70 3.1.2.3. Lavage avec tampons et récupération billes-ADN…………………………… 70 3.1.2.4. Elution et élimination des billes magnétiques………………………………... 70 3.2. Amplification de l’ADNr 16S…………………………………………………….. 70 3.3. Électrophorèse sur gel d’agarose………………………………………………..... 72

3.4. Purification de l’amplicon………………………………………………………... 72 3.5. Séquençage de l’ADNr 16S………………………………………………………. 73 3.5.1. Amplification en présence des ddNTP…………………………………………. 73 3.5.2. Purification sur résine Sephadex G50…………………………………………... 74 3.5.3. Séquençage des fragments d’ADNr 16S……………………………………….. 74 3.5.4. Assemblage des séquences……………………………………………………... 76 3.5.5. Comparaison des séquences de l’ADNr 16S…………………………………… 76 3.5.6. Analyse phylogénique………………………………………………………….. 77 RÉSULTATS ET DISCUSSION 1. Les actinomycètes aérobies en clinique…………………………………………... 78 1.1. Taille de l’échantillon…………………………………………………………….. 78 1.2. Taux de prévalence……………………………………………………………….. 78 1.3. Facteurs cliniques………………………………………………………………… 78 1.3.1. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonction du sexe…………. 78 1.3.2. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonction de l’âge………… 79 1.3.3. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonctions des maladies associées………………………………………………………………………………. 79 1.3.4. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonctions des facteurs de risques…………………………………………………………………………………. 80 1.4. Facteurs microbiologiques………………………………………………………... 81 1.4.1. Prélèvements…………………………………………………………………..... 81 1.4.2. Période de prélèvements………………………………………………………... 82 1.4.3. Examen directe des prélèvements……………………………………………..... 82 1.4.4. Milieu de culture………………………………………………………………... 82 1.4.5. Antibiothérapie…………………………………………………………………. 83 1.5. Discussion………………………………………………………………………… 83 1.5.1. Incidence des actinomycètes aérobies dans la clinique……………………….... 83 1.5.2. Conditions climatiques, voies et sites de contamination……………………….. 84 1.5.3. Influence du sexe et de l’âge………………………………………………….... 85 1.5.4. Signes cliniques et symptômes…………………………………………………. 86 1.5.5. Maladies associées……………………………………………………………… 86 1.5.6. Facteurs de risque………………………………………………………………. 87 1.5.7. Critères microbiologiques……………………………………………………..... 88 1.6. Conclusion………………………………………………………………………... 90 2. Genres rares d’actinomycètes aérobies………………………………………….. 91 2.1. Isolat appartenant au genre Nonomuraea……………………………………….... 91 2.1.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 91 2.1.2. Phylogénie…………………………………………………………………….... 92 2.1.3. Discussion taxonomique………………………………………………………... 93 2.2. Isolat appartenant au genre Kribbella…………………………………………….. 94 2.2.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 94 2.2.2. Phylogénie……………………………………………………………………… 95 2.2.3. Discussion taxonomique……………………………………………………….. 97 2.3. Isolats appartenant au genre Micromonospora…………………………………… 98 2.3.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 98 2.3.2. Phylogénie……………………………………………………………………… 99 2.3.3. Discussion taxonomique………………………………………………………... 101 2.4. Isolats appartenant au genre Saccharothrix……………………………………..... 101 2.4.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 101 2.4.2. Phylogénie……………………………………………………………………… 102 2.4.3. Discussion taxonomique………………………………………………………. 103 2.5. Isolat appartenant au genre Nocardiopsis………………………………………… 104

2.5.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 104 2.5.2. Phylogénie……………………………………………………………………… 105 2.5.3. Discussion taxonomique……………………………………………………….. 106 2.6. Isolats appartenant au genre Actinomadura……………………………………..... 107 2.6.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 107 2.6.2. Phylogénie……………………………………………………………………… 108 2.6.3. Discussion taxonomique………………………………………………………... 109 2.7. Isolat appartenant au genre Nocardia…………………………………………….. 110 2.7.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie…….. 110 2.7.2. Phylogénie……………………………………………………………………… 111 2.7.3. Discussion taxonomique………………………………………………………... 113 2.8. Discussion clinique……………………………………………………………….. 113 2.8.1. Nocardia, Actinomadura et Nocardiopsis……………………………………… 113 2.8.2. Micromonospora, Kribbella, Nonomuraea et Saccharothrix…………………... 117 2.9. Conclusion………………………………………………………………………... 118 3. Isolats appartenant au genre Streptomyces……………………………………… 119 3.1. Macromorphologie, micromorphologie et chimiotaxonomie…………………….. 119 3.2. Phylogénie et phénotype distinctif……………………………………………….. 121 3.2.1. Alignement des séquences d’ADNr 16S……………………………………….. 121 3.2.2. Affiliation des isolats…………………………………………………………… 123 3.2.2.1. Isolats P.P.21a, P.B.21, FG.B.22, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392……………………………………………………….. 124 3.2.2.2. Isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52, C.S.66a et P.S.461……………………………………………………………………………….... 127 3.2.2.3. Isolats C.B.46, FG.B.151, C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466……………………………………………………….. 130 3.2.2.4. Isolats C.S.348, FG.S.348…………………………………………………….. 134 3.2.2.5. Isolats FG.P.68 et C.S.194…………………………………………………..... 135 3.2.2.6. Isolat FG.P.40………………………………………………………………… 137 3.2.2.7. Isolat LP.B.373……………………………………………………………….. 138 3.2.2.8. Isolat FG.B.435……………………………………………………………….. 139 3.2.2.9. Isolat U.B.458………………………………………………………………… 140 3.2.3. Conclusion de l’affiliation des isolats…………………………………………... 142 3.3. Discussion clinique……………………………………………………………….. 142 3.4. Conclusion………………………………………………………………………... 144 4. Sensibilité aux antibiotiques et activité antimicrobienne……………………….. 145 4.1. Sensibilité aux antibiotiques…………………………………………………….... 145 4.2. Activité antimicrobienne………………………………………………………….. 148 4.3. Discussion………………………………………………………………………… 150 4.4. Conclusion………………………………………………………………………... 154 CONCLUSION GÉNÉRALE RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES RÉSUMÉS

Introduction Les actinomycètes sont des bactéries filamenteuses, prenant généralement la coloration de Gram, et dont l’aspect morphologique a conduit, à l’origine, à les classer parmi les champignons. Ils possèdent, en effet, un mycélium vrai, ramifié et septé, caractéristique des éléments fongiques. Cependant, leur organisation cellulaire est de type procaryotique. En effet, sur la base de la composition chimique de leur paroi cellulaire, en particulier en lipides, et de la structure du peptidoglycane, ces microorganismes sont maintenant reconnus, définitivement, comme de vraies bactéries. Ce groupe rassemble principalement des bactéries à coloration de Gram positive, aspect filamenteux ramifié, avec un taux élevé de guanine et cytosine dans leur ADN génomique (G+C% > 55 %) (Mc Neil et Brown, 1994; Sullivan et Chapman, 2010; Gao et Gupta, 2012). Une attention particulière est attribué à ce groupe bactérien dans les applications biotechnologiques qui est un résultat cohérent de leur grande diversité métabolique: ils sont la source la plus importante des antibiotiques et une source promotrice d’une large gamme d’enzymes, des inhibiteurs d’enzymes, des immuno-modulateurs et de vitamines. Dans la nature, ils jouent un grand rôle dans le recyclage des composés organiques (Kumar et al., 2012; Silva et al., 2013). Dans ces dernières années, les études portées sur ces bactéries sont principalement canalisées vers celles capables de produire de nouvelles substances intéressantes en biotechnologie, ou bien celles qui peuvent provoquer de problèmes de santé. La majorité de ces recherches se sont focalisées sur le genre Streptomyces, comme étant le majeur producteur d’antibiotiques, et le genre Mycobacterium, agent infectieux, responsable du plus grand nombre de décès dues aux maladies infectieuses (Gao et Gupta, 2012; Kumar et al., 2012). Cependant, beaucoup de travaux se sont réorientés vers les genres rares d’actinomycètes aérobies qui sont peu isolés et étudiés. La stratégie employée pour une meilleure compréhension de ce groupe bactérien, vise à exploiter les écosystèmes inhabituels ou exceptionnels. En effet, une grande population d’actinomycètes aérobies est présente dans ces environnements et ses membres peuvent même coloniser l’homme et l’animal (Gao et Gupta, 2012). Certains d’entre eux peuvent passer de l’état de la colonisation à l’état d'une infection sérieuse, se sont donc des pathogènes opportunistes: ils peuvent, ou non, causer une maladie, selon l'équilibre naturel entre le pathogène et l’hôte (Packey et Sartor, 2009). Parmi les actinomycètes aérobies pathogènes, les genres Mycobacterium, Nocardia, Actinomadura, Corynebacterium, Rhodococcus et Tsukamurella revêtent une importance

1 médicale particulière. Les bactéries de ces genres sont ubiquistes, elles ont été isolées du sol, des plantes et de composts, mais également de la peau, de l’oropharynx et du tractus digestif de l’être humain et des animaux. Les Streptomyces sont largement distribuées dans l’environnement et sont classiquement considérés comme des saprophytes, et l’évaluation de leur rôle en pathologie humaine est difficile. Cependant, leur implication dans les pathologies et en augmentation permanente. Les infections à actinomycètes sont devenues plus courantes suite à l’augmentation permanente de sujets immunodéprimés, qui est le principal facteur déterminant, cette augmentation est portée, également, par l’utilisation massive des agents cytotoxiques, les transplantations d’organes et l’accroissement d’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (Muir et Pritchard, 1994; Patel et al., 2004). En conséquence ces dernières années ont été marquées par un intérêt croissant des études tournées vers les infections provoquées par les actinomycètes aérobies. Cependant, la rareté des rapports sur les infections provoquées par les actinomycètes peut être attribuée à la difficulté de l’isolement et de l’identification de ces bactéries dans les laboratoires de diagnostic de routine. En raison de la nature et de la gravité des infections dont elles sont responsables, l’identification rapide et précise des actinomycètes aérobies pathogènes est impérative et est devenue un objectif de plus en plus important pour les laboratoires de microbiologie clinique (Patel et al., 2004). Néanmoins, la caractérisation taxonomique des actinomycètes est une étape extrêmement importante dans n’importe quel programme de recherche. Une affiliation des isolats est toujours sollicitée, pour une approche médicale, biotechnologique ou écologique. La taxonomie des actinomycètes est extrêmement complexe, la classification avec les méthodes traditionnelles, qui sont basée sur les caractères morphologiques et physiologique a conduit à beaucoup de groupes hétérogènes. Récemment trois principales approches sont suggérées pour l’identification des espèces d’actinomycètes: la chimiotaxonomie, la différentiation phénotypique et l’étude moléculaire, la combinaison entre ces trois techniques donne des résultats plus complets (Silva et al., 2013). L’objectif général de cette étude est d’évaluer la fréquence des actinomycètes usuels et rares (à l’exception des mycobactéries) impliqués dans les infections chez l’homme. Sur le plan microbiologique, elle portera essentiellement sur la détection, l’isolement et l’identification des actinomycètes aérobies. Les patients principalement concernés par cette étude seront les malades hospitalisés au Centre-Hospitalo-Universitaire de Constantine, qui feront l’objet d’une enquête épidémiologique, reposant sur le rassemblement

2 de renseignements à l’aide d’un formulaire qui sera systématiquement complétée par le médecin traitant, afin qu’une analyse globale puisse être réalisée. Ainsi, autour de cet objectif général s’articulent les points suivants: -isolement de ces bactéries, sur des milieux de culture spécifiques, à partir de différents prélèvements cliniques; -analyse des facteurs microbiologiques et cliniques qui peuvent contribuer à leur distribution; -caractérisation polyphasique des isolats purifiés; -étude de leur sensibilité aux antibiotiques; -étude de l’activité antimicrobienne.

1. Actinomycètes: taxonomie et activité 1.1. Historique et classification Le plus ancien genre d’actinomycètes aérobie décrit par Cohn (1875), a été appelé Strepthrotrix. Ce nom était assigné à un vrai champignon et donc pour des raisons de priorité dans la classification, ce genre bactérien a été déclaré invalide. En 1877, l’espèce Actinomyces bovis isolée d’un cas d’actinomycose de bœuf a été décrite comme étant une moisissure. Ainsi, les actinomycètes ont débuté leur carrière appelés: moisissures rayonnants. Comme dans le cas de Streptothrix, beaucoup de taxonomistes attirent l’attention sur l’existence du champignon Actinomyce horkelii qui contrarie la validité du non Actinomyces bovis. Néanmoins, le nom Actinomyces a été accepté comme un nom d’un genre bactérien pour deux raisons, premièrement parce que le nom est orthographié différemment, et deuxièmement le nom Actinomyce n’a été utilisé que par son auteur Meyen, en 1827, et universellement considéré comme invalide. En conséquence, le nom générique, Streptomyces est proposé comme combinaison des deux noms qui pour la première fois ont été attribués aux actinomycètes: Streptothrix et Actinomyces. Par la suite, d’autres genres sont décrits par Lehmann et Neumann: Corynebacterium et Mycobacterium en 1896, ces genres sont réunis avec les deux premiers dans la famille des Mycobacteriaceae. Winslow et al. (1917), incluent aussi les genres Nocardia, Leptotrichia et Fusiformis. Buchanan (1917; 1918) propose l’ordre des Actinomycetales, contenant deux familles Actinomycetaceae et Mycobacteriaceae. Entre les années 1950 et 1960, une description massive de nouvelles espèces a introduit une ambigüité dans la classification de ces bactéries. Cette ambigüité a demeuré jusqu’à l’année 1970 avec la mise au point des techniques chimiotaxonomiques qui ont démontré l’hétérogénéité phénotypique des genres d’actinomycètes. Mais les réarrangements taxonomiques majeurs au niveau des genres et des familles n’ont débuté qu’après les années 1980, sur la base des caractéristiques chimiotaxonomiques et moléculaires (Stackebrandt et Schumann, 2006). Dans le volume 4 du « Bergey’s Manual » (1989) les actinomycètes sont regroupés dans un seul ordre des Actinomycetales, qui est répartie en repartis en 8 groupes, dans les quels les genres sont rassemblés selon la morphologie et la chimiotaxonomie (Williams et al., 1989; Holt et al., 1994). Dans le volume 5 du « Bergey’s Manual » (2012) la classification des actinomycètes est basée principalement sur l’analyse de la séquence de l’ADNr 16S, alors, les actinomycètes sont classés dans le phylum des Actinobateria, qui est arrangé en classes, ordres, familles, genres et espèces (Whitman et al., 2012).

1.2. Taxonomie Pour la caractérisation et l’identification des actinomycètes un ensemble de donnés phénotypiques et génotypiques doivent être rassemblées, pour arriver jusqu’au niveau de l’espèce ou de la souche. Cette caractérisation polyphasique repose sur les techniques classiques qui sont l’étude de la culture, de la morphologie, de la physiologie, de la chimiotaxonomie et les méthodes génotypiques. 1.2.1. Culture et morphologie La croissance des colonies des actinomycètes est variable en fonction de la composition des milieux de culture. La forme, la taille et la texture de la colonie sont des critères qui aident à différencier les genres. Les mycéliums, végétatif et aérien, peuvent avoir des pigments intracellulaires différents qui peuvent être observé sur le dos de la colonie (mycélium végétatif) et à la surface de la colonie (mycélium aérien). Ces germes peuvent aussi diffuser des pigments dans le milieu de culture. La couleur des pigments varie selon les espèces (Shirling et Gottlieb, 1966). Les colonies des actinomycètes sont des entités multicellulaires, elles forment des structures très variées morphologiquement et biochimiquement qui ont des fonctions spécifiques et des relations spatiales précises l'une par rapport à l'autre. Ces structures peuvent être utilisées dans leur taxonomie. Les étapes de développement et les différentes structures formants une colonie d’actinomycètes sont élucidés par la figure 1.

Figure 1. Étapes de développement et structures d’une colonie d’actinomycètes (genre Streptomyces) sur milieu solide (Hopwood et al., 1985) 1: spore, 2: tube germinal, 3: mycélium végétatif, 4: colonie jeune, 5: mycélium aérien, 6: sporophore, 7: sporulation, 8 et 9: maturation des spores, 10: colonie mature

1.2.1.1. Mycélium primaire Le mycélium primaire est appelé aussi mycélium végétatif, mycélium de substrat ou mycélium intramatriciel, c'est un ensemble de filaments multinucléaires formés à partir du tube germinal (hyphe) issue d’une spore. Cet hyphe s'allonge par croissance apicale et se ramifie à maintes reprises. Son développement, sur la surface et à l'intérieur du milieu solide, donne naissance à des jeunes colonies, formées par des filaments attachés en matrice complexe (Mighélez et al., 2000). 1.2.1.2. Mycélium secondaire Le mycélium secondaire est appelé aussi mycélium aérien, il se forme lorsque la colonie sera plus âgée. Les hyphes primaires donnent des branches spécialisées qui se développent loin de la surface de la colonie en donnant un mycélium reproductif dans l’air. Contrairement à celui du substrat, le mycélium aérien est plus épais et peu ramifié, il est protégé par sa paroi hydrophobe et peut se développer sur milieu pauvre en sources nutritionnelles, dans la plupart des cas, par la dégradation du mycélium de substrat dont les produits assurent un apport de nutriments pour sa croissance loin de la colonie (Miguélez et al., 2000). 1.2.1.3. Spores Les hyphes aériens des actinomycètes subissent une série de changements développementaux qui donneront naissance aux spores. La paroi cellulaire des hyphes du mycélium aérien est typique à celle des bactéries à coloration de Gram positive. Le volume interne des hyphes est occupé par: les membranes du mésosome (vacuoles), le matériel nucléique, qui est allongé en fibres tout le long de l'hyphe, et le cytoplasme, ce dernier se divise en petites portions qui se distribuent de telle façon que chaque portion occupera le compartiment d'une spore, au même moment, le matériel nucléique apparaît d'être étranglé aux sites où les septations auront lieu, puis il se divise complètement lorsque les septations seront formées. Les septations se forment à des intervalles réguliers pour limiter chaque spore individuelle, leur développement est synchronisé tout le long de l'hyphe. Les parois s'épaississent autour de chaque spore et des ornementations externes peuvent se former (Wildermuth et Hopwood, 1970; Williams et al., 1972; Miguélez et al., 2000). D'un genre à l'autre, les spores des actinomycètes s'organisent en diverses structures et nous observons: -conidies C'est un terme utilisé pour désigner les spores asexuées, qui sont des chlamidiospores ou des sporangiospores non intercalaires. Les conidies des actinomycètes peuvent avoir plusieurs organisations: une seule, en paires, en chaînes courtes ou longues (plus de 20 spores par chaîne) (figure 2), ou bien rassemblées dans des synnémata (Holt et al., 1994).

-sporanges Les sporanges, nombreux ou limités, sont des sacs contenant des spores, ils peuvent être rencontrés sur le mycélium aérien ou à l'intérieur du milieu solide (figure 3) (Holt et al., 1994).

Figure 2. Organisation des conidies chez quelques genres d’actinomycètes (Larpent et Sanglier, 1989) a: une seule, b: paires ou chaines courtes, c: longues chaines

Figure 3. Formes et disposition de sporanges chez quelques genres d’actinomycètes (Larpent et Sanglier, 1989) a: sur le mycélium secondaire, b: sur le mycélium primaire, 1: spores nombreuses, 2: spores en nombres limités

-autres structures Quelques genres d’actinomycètes forment des structures rares comme: -une masse de spores qui sont le résultat d'une division dans plusieurs plans (au lieu de la division perpendiculaire à l'extrémité des hyphes), ces structures sont appelées sporanges multiloculaires; -des structures sphériques sur les hyphes aériens, et on peut trouver de l'eau condensée autour des chaînes de spores, ces structures peuvent contenir des hyphes en matrice amorphe; -des sclérotes qui sont des structures sphériques compactes de mycélium, formées chez quelques espèces de Streptomyces, ils ne contiennent pas de spores mais des cellules enfilées avec des lipides; -des synnémata qui sont un ensemble de conidiophores, dressés et consolidés ensemble, pouvant former des conidies uniquement à leur apex, ou bien à leurs apex et bords latéraux. (Hasegawa et al., 1978; Holt et al., 1994). Les critères morphologiques principalement utilisés pour délimiter les genres d’actinomycètes sont: -la présence, l'abondance et la disposition des hyphes du mycélium de substrat et du mycélium aérien, -la présence des spores, leur nombre, leurs formes, leur mobilité et leur position sur les hyphes, -la formation de structures spéciales comme les sporanges, sclérotes ou synnémata. (Shirling et Gottlieb, 1966; Schofieled et Schaal, 1981; Demain et Solomon, 1985). 1.2.2. Chimiotaxonomie La composition chimique de la paroi cellulaire des actinomycètes est un outil pratique pour leur taxonomie, elle se montre surtout efficace pour délimiter les genres. La composition en acides aminés, en glucides et en lipides constitue la principale caractéristique utilisée en chimiotaxonomie (Stanek et Roberts, 1974; Lechevalier et al., 1977). 1.2.2.1. Acides aminés Le péptidoglycane des actinomycètes aérobies contient, en quantité importante, un acide aminé di-basique: l'acide 2,6- diaminopimélique. Selon la forme isomérique de cet acide aminé, les bactéries d'actinomycètes sont regroupées en deux catégories, celles qui ont la forme LL et celles ayant la forme méso (figure 4). La glycine, la lysine et l’ornithine sont aussi caractéristiques (Becker et al., 1964; Lechevalier et Lechevalier, 1970).

O O O O

HO OH HO OH

NH2 NH2 H2N NH2

Acide LL 2,6 diaminopimélique Acide méso diaminopimélique

Figure 4. Structure des isomères de l’acide diaminopimélique

1.2.2.2. Sucres La composition de la paroi en glucides permet la distinction de 4 spectres: -spectre glucidique A une composition en arabinose et en galactose, -spectre glucidique B une composition en madurose (3-O-méthyle-D- galactose), -spectre glucidique C correspond à l’absence de sucres caractéristiques, -spectre glucidique D une composition en xylose et arabinose. (Lechevalier et Lechevalier, 1970). La combinaison entre la composition en acides aminés et le spectre glucidique permet la distinction de 8 types de paroi (tableau 1).

Tableau 1. Types de parois des actinomycètes en fonction des constituants en acides aminées et en sucres (Lechevalier et Lechevalier, 1970) Type de paroi Constituants majeurs I LL-D.A.P II Méso ou hydroxy-D.A.P., Glycine, Xylose, Arabinose III Méso-D.A.P., Madurose ou aucun sucre IV Méso-D.A.P., Arabinose, Galactose V Lysine, Ornitine VI Lysine VII D.A.B., Glycine VIII Ornitine D.A.P.: acide 2,6- diaminopimélique, D.A.B.: acide 2,4- diaminobutyrique

1.2.2.3. Lipides Les lipides peuvent être divisés en 3 groupes: -acides gras Les acides gras les plus communs chez les actinomycètes appartiennent soit à un groupe de molécules comportant 12 à 20 atomes de carbone (comme chez les genres Streptomyces, Actinomadura et Micromonospora), soit au groupe des acides mycoliques de 22 à 90 atomes de carbone. La présence d'acides mycoliques chez les genres: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Gordona et Tsukamurella, et son absence chez autres genres comme: Streptomyces, Actinomadura, etc, est une caractéristique d’identification; ainsi que le nombre d'atomes de carbone, par exemple pour le genre Nocardia les acides mycoliques sont des molécules de 46 à 60 atomes de carbone. Le spectre des autres acides gras (12 à 20 atomes de carbone) peut varier qualitativement et quantitativement d'une espèce à une autre (Larpent et Sanglier, 1989; Holt et al., 1994; Steingrube et al., 1997). -ménaquinones Les ménaquinones sont classées en fonction du nombre d'unités d'isoprènes et du nombre de doubles liaisons, la composition en ménaquinones est une caractéristique du genre,

à titre d'exemple: le genre Nocardia se caractérisent par du MK-8(H4) alors que le genre

Streptomyces possède principalement du MK-9(H6), le genre Thermoactinomyces est caractérisé par la présence de MK-6 (Larpent et Sanglier, 1989). -lipides polaires Les lipides polaires les plus courants chez les actinomycètes sont les phospholipides, leur analyse aide à la détermination du genre. Lechevalier et al. (1977) ont proposé cinq types différents de la composition en phospholipides chez les actinomycètes (tableau 2). Tableau 2. Profils en phospholipides des actinomycètes (Lechevalier et al., 1977) Type de phospholipides PIM PI PC PG PE PME GluNU APG DPG I + + - V - - - V V II + + - V + - - V + III V + + V V + - V V IV ? + - - V V + - + V ? + - - - + V + PIM: phosphatidyl inositol mannosides, PI: phosphatidyl inositol, PC: phosphatidyl choline, PG: phosphatidyl glycérine, PE: phosphatidyl éthanolamine, PME: phosphatidyl méthyléthanolamine, GluNU: phospholipides contenant glucosamine non connus, APG: acyl phosphatidyl glycérol, DPG: diphosphatidyl glycérol, + : présence, - : absence, V : variable

1.2.3. Physiologie Les principaux caractères physiologiques utilisés en taxonomie des actinomycètes sont: les optima du pH et de la température de croissance; la sensibilité au chlorure de sodium et aux antibiotiques ainsi qu’à certains agents chimiques; l'utilisation de sources carbonées et azotées ainsi que la dégradation de certains polymères tels que l'amidon, la caséine et la gélatine; la production de mélanine (Shirling et Gottlieb, 1966). 1.2.4. Méthodes génotypiques Auprès des méthodes phénotypiques, pour la caractérisation des bactéries, différentes méthodes de biologie moléculaire ont été développées et utilisées. L’application de ces techniques moléculaires pour l’analyse du génome bactérien a une contribution considérable pour élargir les connaissances sur la taxonomie bactérienne. Ces techniques sert non seulement a regroupé les organismes taxonomiquement mais aussi a donné un aperçu sur les relations phylogénétiques des procaryotes au niveau du genre, de l’espèce et sous espèce. Celles qui sont appliquées pour la taxonomie des actinomycètes sont: hybridation ADN-ADN, la digestion par des enzymes de restriction de la totalité de l’ADN chromosomique, amplification aléatoire de l’ADN polymorphique (RAPD), restriction de la longueur du fragment de polymorphisme (RFLP) et analyse des séquences comme ADNr 16S. Ces différentes techniques et leur rôle taxonomique sont donnés dans le tableau 3 (exemple pour le genre Streptomyces).

Tableau 3. Spécificités des techniques moléculaires appliquées à la taxonomie des Streptomyces (Ludwing et Schleifer, 1994, citée par Anderson et Wellington, 2001) Cible Méthode Spécificité ADN chromosomique total -Hybridation ADN-ADN Genre, espèce -Restriction par des endo-nucléases Espèce, souche (RFLP, LFRLA) Amplification aléatoire de fragments d’ADN -Isolement et clonage de fragments non Espèce, souche hybrides par le croisement Gènes codants des protéines ou des fragments du -Isolement et séquençage de gènes ou Espèce, souche gène codant le ARNr 16S ou 23S de fragments -Analyse comparative des séquences Famille, genre, espèce

1.2.4.1. Hybridation ADN-ADN L’hybridation ADN-ADN repose sur le contrôle de la réassociation de monobrins d’ADN de différents organismes. Le degré de cette réassociation est exprimé en pourcentage (%) d’homologie, et l’organisme est considéré appartenir à l’espèce lorsque ce pourcentage est > 70 % et la divergence est > 5 %, à une température ≤ à 5 °C, dans les mêmes conditions de dénaturation. L’utilisation de l’hybridation ADN-ADN comme seule technique pour la taxonomie n’est pas recommandable, entre les même espèces ou un groupes d’espèces, plusieurs facteurs limitent sont utilisation comme: la présence des suppressions et les amplifications génomiques, les phénotypes peuvent être exprimés par plus d’un seul gène, une large portion du génome des actinomycètes est silencieuse (Anderson et Wellington, 2001). 1.2.4.2. Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction (LFRFA) L’analyse des fragments de restriction à basse fréquence (LFRFA) est une technique qui utilise la totalité du chromosome bactérien, le principe repose sur la digestion de l’ADN avec des enzymes de restriction. Les fragments qui en résulte sont analysés par électrophorèse sur gel à champ de pulsation (PFGE) qui donne un profile d’empreintes de bandes affirmant l’hybridation qui sont utilisées pour déterminer l’apparenté entre les organismes. Cette méthode est utilisée pour déterminer les souches très étroitement reliées mais elle ne peut pas résoudre le problème des relations interspécifiques (pour la même souche) et elle peut donner des erreurs s’il y a des amplifications et délétions chromosomiques assez importantes (Anderson et Wellington, 2001). 1.2.4.3. Amplification aléatoire de l’ADN polymorphique (RAPD-PCR) Dans cette technique nous utilisons une amorce courte de séquence définie arbitrairement pour amplifier, par PCR, l’ADN génomique, en utilisant une température basse d’alignement, ainsi le polymorphisme peut être détecté. Le produit de PCR donne une bande caractéristique qui permet de différencier entre les chromosomes des souches sans faire appel à des connaissances préalables sur les séquences chromosomiques. Cette méthode peut être utilisée pour la discrimination entre les souches de la même espèce. La RAPD-PCR est une méthode rapide pour le criblage de souches similaires des actinomycètes mais elle exige une optimisation stricte de l’amorce, la température de l’alignement et le mélange de la réaction (Mehling et al., 1995).

1.2.4.4. Amplification des fragments de restriction de polymorphisme (PCR-RFLP) C’est une méthode développée en parallèle avec la RAPD-PCR (figure 5). Toute modification des séquences d'ADN réorganise fréquemment les sites de restriction. Lors de l'action d'enzymes de restriction, la taille des fragments de restriction est alors modifiée: on observe un polymorphisme. La différence dans cette technique est que les molécules amplifiées de l’ADN sont coupées par les endonucléases avant électrophorèse sur gel d’agarose (Anderson et Wellington, 2001).

Figure 5. Schéma élucidant les étapes des méthodes RAPD et RFLP

1.2.4.5. Comparaison des séquences du gène de l’ARN ribosomique La comparaison des séquences de gènes de l’ARN ribosomique est un outil vigoureux pour la taxonomie et la phylogénie des actinomycètes. Ces gènes sont hautement conservés chez les bactéries. Trois régions dans le gène de l’ARNr 16S présentent assez de variation de séquences donc elles sont utilisées comme sonde spécifique pour le genre (régions α et β) et pour l’espèce (région γ) chez les actinomycètes (figure 6). Il y a trois méthodes pour l’analyse de l’ADNr 16S, soit le séquençage de sa totalité et qui abouti à une classification exacte de la souche, un séquençage partiel d’un fragment par exemple les premiers 500 pb de la séquence, ou bien un séquençage partiel avec deux ou plusieurs amorces, les alignements réalisés sont comparés avec une base de donnée. Les gènes de l’ARNr 23S, ARNr 5S et les séquences de protéines ribosomales ont aussi été utilisés pour étudier la relation entre les espèces (Anderson et Wellington, 2001).

Figure 6. Structure de l’ADNr 16S de Streptomyces coelicolor (Anderson et Wellington, 2001) α, β, γ: régions variables correspondant aux nucléotides 982-998, 1102-1122 et 158-203 respectivement

1.3. Activité Les actinomycètes représentent le groupe de microorganismes le plus important dans la production de métabolites bioactifs, ils sont à l’origine de plus de 45 % de composés bioactifs connus, 34 % dérivent du genre Streptomyces et 11 % des genres d’actinomycètes rares. Le tableau 4 donne le nombre des différentes souches d’actinomycètes produisant les métabolites bioactifs.

Tableau 4. Nombre de souches d’actinomycètes produisant des métabolites bioactifs (Berdy, 2005) Famille/Genre Nombre Famille/Genre Nombre Streptomycetaceae: Thermomonosporaceae: Streptomyces ≈8000 Actinomadura 345 Streptoverticillium 258 Saccharothrix 68 Kitasatosporia 37 Microbispora 54 Chainia 30 Actinosynnema 51 Microellobosporia 11 Nocardiopsis 41 Nocardioides 9 Microtetraspora/Nonomuria 26/21 Thermomonospora 19 Micropolyspora/Faenia 13/3 Thermoactinomyces 14 Thermopolyspora 1 Thermoactinopolyspora 1 Micromonosporaceae: Mycobacteriaceae: (Actinoplanetes) (Actinobacteria) Micromonospora 740 Nocardia (357) Actinoplanes 248 Mycobacterium 57 Dactylosporangium 58 Arthrobacter 25 Ampullariella 9 Brevibacterium 17 Glycomyces 2 Proactinomyces 14 Catenuloplanes 3 Rhodococcus 13 Catellatospora 1 Pseudonocardiaceae: Autres espèces (non classées): Saccharopolyspora 131 Actinosporangium 30 Amycalotopsis/Nocardia 120/357 Microellobosporia 11 Kibdellosporangium 34 Frankia 7 Pseudonocardia 27 Westerdykella 6 Amycolata 12 Kitasatoa 5 Saccharomonospora 2 Synnenomyces 4 Actinopolyspora 1 Sebekia 3 Elaktomyces 3 Excelsospora 3 Waksmania 3 Alkalomyces 1 Catellatospora 1 Erythrosporangium 1 Streptoplanospora 1 Microechinospora 1 Salinospora 1 Streptosporangiaceae: (Maduromycetes) Streptosporangium 79 Streptoalloteichus 48 Spirillospora 11 Planobispora 10 Kutzneria 4 Planomonospora 2

1.3.1. Production d’antibiotiques Les antibiotiques occupent la part la plus importante des métabolites produits par les actinomycètes. Depuis la découverte du premier antibiotique, la streptomycine, à partir d’une espèce du genre Streptomyces, beaucoup d’intérêts ont été donnés à ce genre, durant les années 1950 et 1960. Environ 70 % des antibiotiques ont été isolés de ce genre. Ainsi, durant ces dernières décennies, l’importance a été donnée aux actinomycètes rares, de ce fait ces derniers sont à l’origine de 25 à 30 % des antibiotiques. Cependant, les Streptomyces sp. sont toujours les producteurs de la majorités des antibiotiques utilisés en thérapeutique. Les actinomycètes rares produisent les composés les plus singuliers et les plus divers et le plus souvent non toxiques, possédant un excellent potentiel antibactérien. Parmi les métabolites produits par ces actinomycètes rares, il y a beaucoup de molécules qui sont très importantes en pratique clinique comme les gentamicines, les erythromycines, la vancomycine et la rifamycine. Ainsi d’autres molécules comme le ziracine, le dalbavacine et le spynosine sont utilisées en agriculture. Aussi, nous notons que la vancomycinristocetine est un type complexe de glycopeptide produit, presque en exclusivité, par plusieurs espèces d’actinomycètes rares (Bérdy, 2005). 1.3.2. Production d’enzymes Dans leur environnement naturel, les actinomycètes sont des bactéries saprophytes, ils participent à la dégradation, par la production d’enzymes extra-cellulaires, de la matière organique, donc au recyclage des biopolymères complexes comme la cellulose, la lignine, la lignocellulose, la kératine, la chitine, la pectine et le xylane. De ce fait ces enzymes ont été exploités dans l'industrie, tel que les amylases, les protéases, les ligninases, les cellulases et les lipases (Demain et Solomon, 1985; Sanglier et Trujillo, 1997; Chitte et al., 1999; Pitinate et al., 1999; Mason et al., 2001; Rivas et al., 2003).

2. Les actinomycètes pathogènes Les actinomycètes sont rarement rencontrés en clinique, dans la plupart des cas ils sont considérés comme des pathogènes opportunistes; bien qu’ils peuvent causés des infections potentiellement importantes et sérieuses chez l’homme et l’animal. Les manifestations cliniques, la sévérité de la maladie et le pronostic chez l’hôte infecté sont extrêmements variables et doivent être déterminés par plusieurs facteurs comme la voie de l’infection et l’état du système immunitaire. L’aspect typique de la pathologie est une réaction inflammatoire granulomateuse qui peut progresser en la formation d’abcès (McNeil et Brown, 1994). Les genres d’actinomycètes aérobies les plus souvent rencontrés en clinique et plus largement étudiés est le genre Nocardia, suivi par le genre Actinomadura. D’autres genres sont aussi rencontrés qui sont: Streptomyces, Nocardiopsis, Dermatophilus, Gordona, Rhodococcus, Amycolata, Oerskovia, Rhotia, Tsukamurella, Corynebacterium, Cellulomonas, Dietzia et d’autres genres d’actinomycètes aérobies, thermophiles ou non cultivables (McNeil et Brown, 1994; Yaccin et al., 1997). 2.1. Nocardia 2.1.1. Historique et classification Le premier microorganisme classé dans le genre Nocardia a été isolé par le vétérinaire Edmond Nocard en 1888. Une année après, Trevisan a caractérisé cet organisme et il lui a donné le nom de Nocardia farcinica. Entre 1954-1985, N. farcinica est considérée comme l’espèce type du genre Nocardia, des exemplaires de la souche d’origine sont conservés dans deux différentes banques du « National Type Culture Collection » sous le code ATCC 3318T. Ultérieurement, des études phénotypiques ont montré qu’il y a deux souches nettement différentes, une est caractérisée comme souche de Mycobacterium (NCTC 4524T), et l’autre comme une souche de Nocardia (ATCC 3318T) (Yassin et al., 2000). En 1962, Gordon et Mihm, ont trouvé qu’il n’y a pas une différence phénotypique entre la souche N. farcinica ATCC 3318T et d’autres souches isolées, connues sous le non de N. asteroïdes. Gordon et Mihm ont réuni ces deux espèces ensemble et retenu le nom de N. asteroïdes, qui ainsi est devenue l’espèce type du genre Nocardia; à ce moment, une nouvelle souche type, N. asteroïdes ATCC 19247T, possédant tous les caractères de la souche ATCC 3318T de Nocard, est aussi sélectionnée comme souche type. En 1969, des études effectuées par Tsukamura, puis poursuivies par d’autres chercheurs, ont montré que les collections de microorganismes considérés appartenir à N. asteroïdes contiennent un sous-groupe d'isolats qui sont biochimiquement et immunologiquement semblable à la souche ATCC 3318T, mais pas à la souche ATCC 19247T; par conséquence, le Comité International Judiciaire a

17 continué d’utiliser le nom N. farcinica, bien que la distinction entre les espèces N. farcinica et N. asteroïdes est restée controversé. Avec l'application de méthodes utilisant les testes de sensibilité aux antibiotiques et les études moléculaires, le rang taxonomique de l'espèce N. farcinica est, clairement, séparé de N. asteroïdes. En 1988, Wallace et al. ont établi six groupes de Nocardia sp. reconnus, ils les ont classés selon le profil de sensibilité aux antibiotiques, et ils ont rassemblé les isolats de N. asteroïdes dans un seul groupe. Yassin et al. (2001), par l’analyse de la séquence du gène codant l’ARNr 16S, ont révélé que les isolats de ce groupe sont identiques à une nouvelle espèce décrite sous le non de N. cyriacigeorgica. Donc, l’assignement de ce nom asteroïdes à une espèce ou à un groupe d’espèces (selon le profil de sensibilité aux antibiotiques) exige l'estimation du Comité International Judiciaire (Brown-Elliott et al., 2006). Les espèces du genre Nocardia sont classées dans la famille des Nocardiaceae, dans l’ordre des Corynebacteriales (Brown-Elliott et al., 2006; Whitman et al., 2012). Le genre Nocardia est en extension rapide, plus de 30 espèces ont été décrites dans la dernière décennie; à ce jour, 100 espèces de Nocardia sont officiellement reconnues, (Sullivan et Chapman, 2010; Lai et al., 2011; Liu et al., 2011; Euzéby, 2012). 2.1.2. Habitat et localisation géographique Les Nocardia sp. sont ubiquitaires dans l’environnement, elles sont rencontrées comme saprophytes dans les composés organiques, dans les eaux douces et salées, dans les sols, dans la végétation et dans la matière fécale des animaux. Les espèces de Nocardia peuvent aussi être trouvées dans l’environnement domestique comme la poussière, le sol des jardins, le sable des plages, l’eau de piscines. Elles ne font pas partie de la flore commensale de l’homme (Brown-Elliott et al., 2006; Soraa et al., 2009; Sullivan et Chapman, 2010). Quelques espèces sont plus prévalentes dans des régions géographiques avec un climat spécifique, par exemple Nocardia brasiliensis, est plus communément isolé dans des régions avec un climat tropical ou sous-tropical. Selon Saubolle et Sussland (2003), les Nocardia sp. semblent plus prévalent dans des climats arides et chauds du sud-est des Etats Unis, ils ont émis une hypothèse que les conditions climatiques de ces régions (secs, poussiéreux, et toujours venteux) facilitent l’aérosolisation et la dispersion des souches de Nocardia. La distribution des espèces pathogènes n’est pas très claire, mais quelques espèces sont plus isolées dans certains climats ou régions géographiques particulières (Leger et al., 2009).

2.1.3. Macromorphologie et micromorphologie Les colonies des Nocardia sp. sont légèrement surélevées en dôme, leur surface est souvent plissée, cérébriforme au début de leur croissance elles sont recouvertes d’un court duvet blanchâtre (mycélium aérien), masquant la couleur de la colonie et lui donnant un aspect crayeux après quelques jours de culture. Certaines colonies apparaissent pigmentées, leur couleur variant du jaune beige, voire du blanc ou blanc grisâtre, orange à l'orange-rouge (due à la couleur du mycélium de substrat). Elles sont souvent incrustées dans la gélose. Leur consistance est généralement ferme mais friable, elles ne produit pas de pigments solubles ou mélanoïdes. (Hidri et al., 2000; Yassin et al., 2000; Kageyama et al., 2004; Schlaberg et al., 2008; Lamm et al., 2009). Les Nocardia sp. sont à coloration de Gram positive ou variable, partiellement (ou totalement) acido-alcoolo-résistantes. Le mycélium de substrat de diamètre 0,5-1,2 µm, est bien développé avec des hyphes ramifiés de façon irrégulière (pléomorphes) et pénètre dans la gélose; sur lequel un mycélium aérien se développe, avec l’âge de la colonie. Ces mycéliums se fragmentent souvent en éléments bacillaires ou coccobacilles, de différentes formes et tailles (figure 7) (Yassin et Brenner, 2005; Couraud et al., 2007; Lai et al., 2009). Le genre Nocardia est rapproché à d’autres genres d’actinomycètes, dits nocardioformes, en raison de leurs caractéristiques morphologiques (mycélium primaire et aérien se fragmentant en éléments bacillaires et coccoïdes) (Cargill et al., 2010).

Figure 7. Photographies par microscope électronique du mycélium aérien de deux espèces du genre Nocardia (Kageyama et al., 2004 ) a: N. araoensis IFM 0575T, b: N. pneumoniae IFM0784T

2.1.4. Chimiotaxonomie, physiologie et activité Les Nocardia sp. ont une paroi cellulaire comportant l’isomère méso de l’acide diaminopimélique, l’arabinose et le galactose comme sucres caractéristiques. Elles possèdent les acides tuberculostéarique, comme chez les membres du genre Mycobacterium, cependant, à l’opposé des mycobactéries, elles possèdent les acides mycoliques à courtes chaines (40 à 60 atomes de carbones) (Brown-Elliott et al., 2006). Les Nocardia sp. sont des bactéries aérobies, mais elles peuvent vivre en anaérobiose.

Il y a celles qui exigent pour une bonne croissance la présence de CO2 dans le milieu (Couraud et al., 2007; Lai et al., 2009). L’intervalle de température de leur croissance est entre 20 et 45°C, la majorité ont un optimum autour de 28 °C. Leur pH optimum est autour de 7 mais pour quelques espèces il peut s’étendre de 4,5 à 9. Elles sont résistantes au lysozyme (Hidri et al., 2000; Hamid et al., 2001; Cui et al., 2005). Des espèces du genre Nocardia sont exploitées comme source de substances actives. De nombreux nouveaux antibiotiques antibactériens de types terpénoïdes, macrolides et lactones ainsi que des substances antifongiques sont produites par ces bactéries. Elles sont, aussi, une source de nouvelles enzymes comme l’oxyde nitrique synthase, l’acide carboxylique réductase, la phosphopantetheinyl transferase (Kinoshita et al., 2001; Lamm et al., 2009). 2.1.5. Pathogénie La moitié des espèces connues de Nocardia sont des pathogènes de l’homme et des animaux (Leger et al., 2009; Bawa et al., 2010). Les infections à Nocardia sp. sont observées chez de nombreux animaux, elles sont décrites chez une variété d’espèces de vertébrés et invertébrés, ainsi que chez les mammifères (Leger et al., 2009; Bawa et al., 2010). Le taux de mortalité chez les animaux est plus élevé que chez l’être humain (50 % de mortalité) (Leger et al., 2009 ). Chez l’homme, les espèces de Nocardia peuvent causées des infections appelées « nocardiose », qui peuvent être considérées comme des infections opportunistes, mais qui peuvent être invasives dans les unités de transplantations et oncologiques (Soraa et al., 2009; Lai et al., 2009; Sullivan et Chapman, 2010). 2.1.5.1. Espèces impliquées Au début, N. asteroïdes est considérée comme l’espèce la plus commune associée aux infections chez l’homme. Celle-ci est, par la suite, redéfinie comme un complexe qui comprend N. asteroïdes, N. nova et N. cyriacigeorgica. Plus récemment, N. cyriacigeorgica est considérée comme un pathogène en émergence responsable d’infections humaines dans les pays de l’ouest de l’Europe, de la Grèce, de la Turquie, du Japon, de la Thaïlande, du Canada

20 et des Etats Unis. N. farcinica est plus virulente du complexe de N. asteroïdes, et elle a tendance à être de plus en plus résistante aux antibiotiques. D’autres espèces sont aussi, couramment, décrites être la cause d’infections chez l’homme comme: N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum et N. transvalensis (Sullivan et Chapman, 2010). À ce jour, les espèces pathogènes du genre Nocardia sont de plus en plus nombreuses, au moins 42 espèces de Nocardia, sont reconnues et validées comme: N. abscessus, N. pseudobrasiliensis, N. veterana, N. paucivorans, N. ignorata, N. vinacea, N. beijingensis, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum N. mexicana, N. transvalensis, N. africana, N. arthritidis, etc (Yassin et al., 2000; Hamid et al., 2001; Kageyama et al., 2004; Couraud et al., 2007; Schlaberg et al., 2008; Rodrìguez-Nava et al., 2008). 2.1.5.2. Facteurs de pathogénie Les souches pathogènes de Nocardia sont considérées comme des germes intracellulaires facultatifs dont la pathogénie repose sur des mécanismes multiples et complexes, qui ne sont pas tous connus. Cependant, certains des facteurs contribuant à la pathogénie et la virulence de souches de Nocardia sont décrits par Beaman et Beaman (1994); ils associent: -l’inhibition de la fusion phagolysosomiale responsable de la survie intracellulaire et la croissance de Nocardia; -la présence d’acides mycoliques; -la neutralisation de l’acidification du phagosome; -la résistance aux activités oxydatives de cellules phagocytaires. 2.1.5.3. Manifestations cliniques La nocardiose est une infection granulomateuse et suppurative, localisée ou disséminée, la voie respiratoire est souvent le site initial de l’infection à partir duquel le germe peut être disséminé vers les autres organes. Le germe peut être aussi introduit à travers des lésions traumatiques (Sullivan et Chapman, 2010). La nocardiose affecte principalement les patients immunodéprimés, mais elles peuvent aussi toucher des patients immunocompétents (Conville et al., 2000; 2012). Chez l’homme, plusieurs formes cliniques de la nocardiose sont décrites: -nocardiose pulmonaire Le poumon est l’organe atteint dans 60 à 80 % des cas, après inhalation de spores ou de fragments de filaments en suspension dans l’air, en particulier dans des particules de poussière (Rodrìguez-Nava et al., 2008). La présentation clinique, la plus fréquente, est une pneumonie subaiguë ou chronique, souvent nécrosante (Couraud et al., 2007). Les symptômes sont divers: fièvre, sueurs nocturnes, anorexie, perte de poids, asthénie, anémie, toux

21 productive rarement hémoptysique (Hamid et al., 2001). Certains signes évoquent un syndrome bronchique, avec dyspnée, douleur thoracique d’origine pleurale, voire détresse respiratoire; l’infection pulmonaire est parfois asymptomatique et la nocardiose est révélée à la radiographie pulmonaire (figure 8a) (Hidri et al., 2000). -nocardiose du système nerveux central L’atteinte du système nerveux central apparaît généralement sous la forme d’un seul ou plusieurs abcès qui peuvent siéger en n’importe quel site cervical, avec une tendance à la formation d’extensions satellites (figure 8b), elle est secondaire à une dissémination hématogène à partir d’un foyer primaire pulmonaire. Les symptômes sont variables en fonction de la région du cerveau atteinte: céphalées, nausées et vomissements, raideur de la nuque, photophobie, déficits sensitifs et/ou moteurs, troubles sensoriels, troubles du comportement. L’atteinte cérébrale peut également être asymptomatique (Rodrìguez-Nava et al., 2008; Rakotoarivelo et al., 2011). -nocardiose cutanée, sous-cutanée et lymphocutanée Les nocardioses cutanées et sous-cutanées surviennent généralement après une inoculation traumatique des microorganismes dans la peau, sa croissance reste localisée et l’infection se limite à la formation d’un abcès, qui peut être subdivisé en quatre groupes: abcès et cellulite, lymphangite, mycétome, atteintes cutanées secondaires avec dissémination (Sullivan et Chapman, 2010). Les symptômes ressemblent à l’infection pyogène à Staphylococcus aureus. La dissémination à partir du foyer cutané primaire peut fréquemment avoir lieu par voie lymphatique, entraînant une nocardiose lymphocutanée (Rodríguez-Nava et al., 2008 ). Le mycétome constitue un cas particulier d’infection sous-cutanée, caractérisé par la présence de grains, localisé aux extrémités, le plus souvent aux membres inférieurs, mais aussi aux bras ou aux mains, le mycétome peut se développer sur d’autres parties du corps (dos, épaules et tête) (figure 8c) (Fahal, 2004). -nocardiose extrapulmonaire À côté des atteintes cérébrales et cutanées, presque tous les organes peuvent être atteints, de façon secondaire: la plèvre et la paroi thoracique, l’oeil, le foie, les ganglions lymphatiques et d’autres localisations: le pancréas, le cœur, l’aorte, le squelette, l’articulation, les reins, les surrénales, la rate, l’intestin, le péritoine, la thyroïde, le conduit auditif, les amygdales, le pharynx, la cavité buccale, la trachée (Hidri et al., 2000).

-nocardiose disséminée La nocardiose disséminée est le plus fréquemment d’origine secondaire à une infection pulmonaire primaire par diffusion hématogène. Cette forme disséminée polyviscérale a un pronostic sombre, avec un taux de mortalité allant de 7 à 44 %, et qui peut atteindre 85 % chez les patients sévèrement immunodéprimés (Rodrìguez-Nava et al., 2008).

Figure 8. Photographies de cas de nocardiose a: nocardiose pulmonaire (Schlaberg et al., 2008), b: nocardiose cérébrale (Rakotoarivelo et al., 2011), c: nocardiose cutanée (Epelboin et al., 2013)

2.1.5.4. Facteurs de prédisposition La nocardiose apparaît habituellement comme une infection de l’adulte dans la seconde partie de sa vie puisque 75 % des patients ont plus de 50 ans, et presque aussi souvent chez l’homme que chez la femme. Les facteurs ethniques ne semblent pas exercer une influence (Rodrìguez-Nava et al., 2008; Soraa et al., 2009). Les patients soumis à une immunosuppression, sont particulièrement prédisposés aux infections à Nocardia, viennent ensuite les sujets atteints de néoplasies, notamment celles affectant l’arbre trachéobronchique (cancers otorhinolaryngologiques et pulmonaires), et ceux souffrant de dilatations des bronches (Sullivan et Chapman, 2010; Rakotoarivelo et al., 2011). De nombreux facteurs débilitants sont décrits: tuberculose, silicose, asthme, emphysème, bronchopneumopathies chroniques obstructives, protéinose alvéolaire pulmonaire, sarcoïdose, diabète, malnutritions, lipodystrophie intestinale, colite ulcéreuse, alcoolisme chronique, toxicomanie, grossesse (Couraud et al., 2007; Lowman et Aithma, 2010). Une faible incidence de la nocardiose est remarquée chez les patients infectés par le VIH, cela peut être expliqué par l’utilisation de triméthoprime-sulfaméthoxazole (cotrimoxazole) chez ces patients en prophylaxie primaire de la toxoplasmose, qui est généralement active sur les Nocardia. Cependant, cette fréquence est probablement sous- estimée chez ces patients, en raison de la difficulté du diagnostic de la nocardiose (Rodrìguez- Nava et al., 2008).

2.1.5.5. Incidence géographique L’augmentation apparente de l’incidence de la nocardiose, à travers le monde, peut être expliquée par l’augmentation du nombre de patients en situation d’immunodépression, et de l’amélioration de techniques de diagnostic. Dans les années 1970, aux États-Unis 500 à 1000 cas de nocardiose auraient été diagnostiqués annuellement; mais l’incidence réelle était probablement plus élevée, du fait que les techniques de diagnostic été grossières, il y avait une confusion avec d’autres affections et que d’autres pathologies intercurrentes masquant parfois le diagnostic (Soraa et al., 2009). Une étude plus récente faite par Saubolle et Sussland (2003), sur l’épidémiologie de la nocardiose dans l’état d’Arizona a rapporté un nombre de 455 cas de 1998-2002. En France, entre les années 2000 et 2007, 607 cas de nocardiose sont rapportés (Rodrìguez-Nava et al., 2008). McNab et al. (2006) ont rapporté qu’au centre de contrôle médical britannique de Colombia, 30 à 40 souches de Nocardia sont identifiées par an. Dans une étude, de 1998 à 2010, sur des souches responsables d’infections, préservées dans plusieurs centres médicaux à Taiwan, Lui et al. (2011) ont montré que prés de 100 souches appartiennent à différentes espèces du genre Nocardia. 2.1.5.6. Thérapeutique Le traitement de la nocardiose repose sur une antibiothérapie systémique qui doit être adaptée à la gravité du tableau clinique, aux localisations de la maladie mais aussi à l’espèce (Couraud et al., 2007). Cependant, le profil de sensibilité aux antibiotiques des espèces de Nocardia est variable d’une souche à l’autre (Lai et al., 2011). La durée de cette antibiothérapie est variable selon les auteurs mais toujours prolongée: de 9 à 12 mois pour les abcès cérébraux, de 3 à 12 mois pour les infections pulmonaires et des tissus mous. Enfin, la chirurgie (drainage ou ablation) peut prendre une place non négligeable dans le traitement des abcès cérébraux ou des collections tissulaires (Courau et al., 2007; Sullivan et Chapman, 2010; Rakotoarivelo et al., 2011). -β-lactamines La plupart des souches de Nocardia sont modérément à fortement résistantes à la plupart des β-lactamines. La résistance peut être en partie attribuée à la présence de β- lactamases dans la grande majorité des souches, leur conférant une résistance quasi constante à la pénicilline G, l’ampicilline et l’amoxicilline. À l’exception de N. nova dont seulement 50 % des souches produisent une β-lactamase, ainsi rendant l’espèce sensible en particulier à l’amoxicilline (Hidri et al., 2000; Rodrìguez-Nava et al., 2008). L’association de l’acide clavulanique permet d’augmenter sensiblement la sensibilité à l’amoxicilline des souches de N. farcinica et, dans une moindre mesure, de N. asteroïdes et N.

24 brasiliensis, mais est presque sans effet sur celles de N. otitidiscaviarum (Rodrìguez-Nava et al., 2008). Le cefuroxime, le cefotaxime et la ceftriaxone sont les plus actifs vis-à-vis de N. asteroïdes et le sont très peu vis-à vis de N. farcinica, la ceftriaxone est moins souvent active que le cefotaxime (Rodrìguez-Nava et al., 2008). L’imipénème est la β-lactamine la plus efficace vis-à-vis de N. asteroïdes, N. farcinica et N. nova, néanmoins entre 10 et 20 % des souches apparaissent résistantes. Mais, l’imipénème est inactif vis-à-vis de N. brasiliensis et N. otitidiscaviarum (Rodrìguez-Nava et al., 2008). Les associations de céphalosporines de troisième génération ou imipénème avec amikacine pourraient être la meilleure alternative (Schlaberg et al., 2008; Rakotoarivelo et al., 2011). -aminosides, sulfamides, quinolones et oxazolidinone Les seuls aminosides actifs contre toutes les espèces sont l’amikacine et la nétilmicine (Couraud et al., 2007; Rodrìguez-Nava et al., 2008; Lowman et Aithma, 2010). L’association de triméthoprime-sulfaméthoxazole constitue un des traitements de référence des nocardioses (Couraud et al., 2007). Pour ces sulfamides, il y a une discordance entre les différents rapports de sensibilité des isolats cliniques de Nocardia sp., Brown-Elliott et al. (2012) rapportent qu’il est nécessaire de préserver leurs utilisations comme traitement empirique dans les cas de nocardiose. Les quinolones sont peu actives sur N. asteroïdes (Rodrìguez-Nava et al., 2008), à l’exception de la ciprofloxacine qui peut s’avérer intéressante pour sa diffusion pulmonaire et cérébrale mais est inactive sur N. nova (Couraud et al., 2007). Le linézolide représente le premier antibiotique actif contre toutes les principales espèces de Nocardia d’intérêt clinique, en particulier contre N. brasiliensis, agent commun d’actinomycétome (Lai et al., 2009; Lowman et Aithma, 2010). Il s’avère être particulièrement efficace, seul ou en association, notamment dans le traitement des atteintes du système nerveux central et les atteintes disséminées, mais peut présenter des effets secondaires justifiant l’arrêt du traitement (Rodrìguez-Nava et al., 2008).

2.2. Actinomadura 2.2.1. Historique, classification et habitat Selon Goodfellow (1989) la première apparition du genre Actinomadura a eu lieu en 1894, lorsque Vincent a isolé et décrit l’agent causatif de la maladie du pied à madura, et il lui a proposé le non Streptothrix madurae. Cette proposition n’a pas été retenue et la souche a été classée dans le genre Nocardia puis da ns le genre Streptomyces. Avec l’introduction de l’analyse de la paroi cellulaire par Lechevalier et Lechevalier (1970), il a été réalisé que la souche diffère des membres du genre Streptomyces et le genre Actinomadura est ainsi établit. Ce genre comprend les actinomycètes, qui leur paroi contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique et qui ne présente pas de sucres caractéristiques. L’utilisation de la taxonomie polyphasique et surtout le séquençage de l’ADNr 16S a éclairci la taxonomie de ce genre et elle a été corrigée par Zhang et al. (1998, 2001), Miyadoh et Miyara (2001), Le Roes et Meyers, (2007); Lee et Lee, (2010); Yassin et al., (2010). Le genre Actinomadura appartient à la famille des Thermomonosporaceae, dans l’ordre des Streptosporangiales (Lu et al., 2003; Lee et al., 2006; Ara et al., 2008; Qin et al., 2009 b; Puhl et al., 2009; Whitman et al., 2012). Le genre Actinomadura comprend 75 espèces et deux sous espèces décrites et validées (Euzéby, 2012). Les espèces du genre Actinomadura sont isolées de sols désertiques, cultivables et de montagnes, le sol représente leur premier réservoir (Wink et al., 2003; Cook et al., 2005; Pitche et al., 1999; Yassin et al., 2010; Badji et al., 2011; Bonnet et al., 2011; Lee, 2012). Il a été aussi isolé de la surface d’une pierre (Lee et Lee, 2010), de sédiments (Le Roes et Meyer, 2007; He et al., 2012), de composts (Puhl et al., 2009), de feuilles de plantes (Qin et al., 2009 b), de ruche de miel d’abeilles (Promnuan et al., 2011). 2.2.2. Macromorphologie et micromorphologie La surface des colonies (mycélium aérien) peut être blanche, jaune, blanc jaunâtre, jaune grisâtre, rose pâle, rose jaunâtre, vert bleuâtre ou gris; le dos de la colonie (mycélium de substrat) peut être crème, jaune claire, jaune, jaune orange, jaune brunâtre, jaune grisâtre, gris, brun, pourpre noirâtre, rouge ou brun rougeâtre. Les pigments diffusibles peuvent être aussi présents, ils sont de couleur sombre, bronze ou bleu pâle (Lu et al., 2003; Lee et Geong, 2006; Wang et al., 2007; Ara et al., 2008; Qin et al., 2009 b; Yassin et al., 2010). Les espèces du genre Actinomadura sont aérobies, non acido-alcoolo-résistantes, non mobiles qui produisent un mycélium de substrat bien développé et non fragmenté et un mycélium aérien sur lequel se forme des chaines d’arthrospores courtes (de 2 à 8 spores par chaine seulement) ou longues (de 10 jusqu’à 50 par chaine), et elles peuvent être droites, incurvées (sous forme de boucle ouverte), ou en spires irrégulières (une à deux tours)

(figure 9). Les spores sont de formes rondes ou en bâtonnés, leurs parois sont lisses, épineuses ou verruqueuses. (Lu et al., 2003; Lee et Jeong, 2006; Wang et al., 2007; Ara et al., 2008; Puhl et al., 2009; Qin et al., 2009 b; Tamura et al., 2009; Tseng et al., 2009).

Figure 9. Photographies par microscope électronique du mycélium aérien de quelques espèces d’Actinomadura a: courte chaine de 3 spores de A. catellatispora 80-60T (Lu et al., 2003), b: spire irrégulière avec 8 spores de A. chokoriensis 3-45-a(11)T (Ara et al., 2008), c: chaine droite de 15 spores de A. flavalba YIM 61435T(Qin et al., 2009 b), d: chaine incurvée de 10 spores avec paroi verruqueuse de A. glauciflava 3.24T(Lu et al., 2003)

2.2.3. Chimiotaxonomie, physiologie et activité Les Actinomadura sp. possèdent une paroi cellulaire contenant l’isomères méso de l’acide diaminopimélique et le madurose comme sucre caractéristique, le ribose, le xylose, le galactose, le glucose et le mannose peuvent être aussi présents, donc la paroi est de type III/B (Lu et al., 2003; Wang et al., 2007; Ara et al., 2008; Qin et al., 2009 b; Puhl et al. 2009). L’intervalle de température de croissance des espèces du genre Actinomadura est entre 15 à 45 °C, il y a des espèces qui sont thermotolérantes, elles peuvent croître jusqu’à 60 °C; le pH de croissance est entre 5 et 9; les concentrations de NaCl tolérées sont de 2 à 10 % (Wang et al., 2007; Ara et al., 2008; Qin et al., 2009 b; Puhl et al. 2009; Tseng et al., 2009). Le genre Actinomadura produit des molécules d’antibiotiques appartenant aux familles de polyéther, d’anthracycline et de macrolactame. Les souches isolées du sol saharien algérien sont douées d’une activité importante contre une variété de champignons pathogènes et toxinogènes (Badji et al., 2011).

2.2.4. Pathogénie Les Actinomadura sp. sont les mieux connues comme agents causant des infections appelés « actinomycétomes » (Yassin et al., 2010). Se sont des infections granulomateuses cutanées et sous cutanées, chroniques et destructives, réalisant des pseudo-tumeurs inflammatoires, souvent polyfistulisées déchargeant à l'extérieur des grains cystiques (formé par l’agrégation de l’organisme causatif) à l’intérieur du sinus sous-jacent; la taille des grains est entre 30 µm à 2 cm, de couleur rouge (Sy et al., 2003; Trabelsi et al., 2009; Ait Essi et al., 2011; Bonnet et al., 2011; Cascio et al., 2011). Les infections peuvent se présenter aussi sans émission de grains (Dieng et al., 2005). Ces infections sont déformantes à évolution rapide et parfois mortelles (Pitche et al., 1999; Dieng et al., 2005). Les Actinomadura sp. peuvent aussi être aussi des agents causatifs d’infections non mycétomiques dans des cas de pneumonies et de bronchites (Yassin et al., 2010). Les actinomycétomes peuvent être aussi causés par d’autres genres d’actinomycètes aérobie comme Nocardia et Streptomyces (Le Roes et Meyers, 2007; Cascio et al., 2011). La majorité des infections à Actinomadura sont causées par A. madurae, A. pelletieri, A. sputi et A. meyerae (Bonnet et al., 2011; Cascio et al., 2011). 2.2.4.1. Facteurs de prédisposition Les actinomycétomes touchent essentiellement les sujets d'origine rurale, en particulier les agriculteurs, et surtout dans les régions arides et chaudes. La chaleur, les contraint à des habitudes vestimentaires qui laissent découverte la majeure partie du corps, les exposant à des piqûres d’épines souillées d’agents pathogènes, ceci permet l'inoculation de l'agent pathogène qui vivait en saprophyte dans le sol ou sur les végétaux (Develoux et al., 2003; Sy et al., 2003; Dieng et al., 2005; Trabelsi et al., 2009; Yassin et al., 2010; Cascio et al., 2011). La tranche d’âge la plus frappée est celle comprise entre 20 et 40 ans (Develoux et al., 2003; Sy et al., 2003; Trabelsi et al., 2009). 2.2.4.2. Manifestations cliniques Trois formes cliniques sont individualisées, la forme inflammatoire, la forme kystique sans grains ni fistules et la forme multifocale (Dieng et al., 2005). L’actinomycétome siège, préférentiellement, au niveau du pied (80 à 90 % des cas rapportés) d’où l'appellation de pied de Madura. Les localisations extrapodales, concernent tous les autres segments corporels: genoux, jambes, cuisse, fesses, paroi abdominale, périnée, thorax, membres supérieurs (les mains et avant bras), la nuque, le cou, le tronc, la tête, et peut s’étendre jusqu’aux os (figure 10) (Develoux et al., 2003; Sy et al., 2003; Dieng et al., 2005; Trabelsi et al., 2009; Ait Essi et al., 2011; Cascio et al., 2011; Bonnet et al., 2011). L’infection peut s’étendre du foyer primaire à travers les os et les vaisseaux lymphatiques et sanguins (Develoux et al., 2003; Dieng et al., 2005; Kumar et al., 2005; Cascio et al., 2011).

L’atteinte ganglionnaire est beaucoup plus rare, mais elle doit être recherchée systématiquement car, méconnue, elle risque d’évoluer pour son propre compte dans un second temps (Develoux et al., 2003). L’atteinte intracrânienne est aussi rapportée (Kumar et al., 2005 ). L’infection évolue, généralement, au cours de plusieurs années, les douleurs et les tumeurs apparaissent, en général, après plus de cinq ans d’évolution (Dieng et al., 2005).

Figure 10. Photographies de cas d’infections par Actinomadura sp. a: mycétome de la cheville par A. pelletieri (Develoux et al., 2001), b: lyse osseuse du tarse par A. madura (Trabelsi et al., 2009)

2.2.4.3. Incidence géographique Incidence des actinomycétomes dans le monde varies selon les régions et le climat (Cascio et al., 2011). Un climat semi désertique, sec et aride, correspond à l’écosystème des agents étiologiques (Pitche et al., 1999). Les mycétomes sont fréquents dans les pays tropicaux et subtropicaux, ils se rencontrent souvent dans les régions nord-tropicales, (Pitche et al., 1999; Sy et al., 2003; Dieng et al., 2005; Trabelsi et al., 2009; Ait Essi et al., 2011; Bonnet et al., 2011). La pluviométrie annuelle est le facteur déterminant majeur de la répartition géographique des agents pathogènes des actinomycétomes (Dieng et al., 2005). Les actinomycétomes sont endémiques de part et d’autre du 15ème degré parallèle Nord et s’observent sur une bande de territoire allant du Sénégal et de la Mauritanie à l’Ouest, vers la république de Djibouti, la Somalie à l’Est, en passant par le Mali, le Niger, le Tchad, le nord du Nigeria et du Cameroun, et le Soudan. Les actinomycétomes sont aussi observés en Amérique Latine (Pitche et al., 1999). Ainsi avec l’avancée galopante du désert vers la côte, avec les mouvements de migration et le brassage des peuples, les moyens modernes de transport, l’épidémiologie classique des mycétomes semble être modifiée, il n’y a pas de pays africain épargné par les mycétomes et il faut s’attendre à une augmentation sensible de la prévalence de ces affections au cours des années à venir dans les pays côtiers dits « géographiquement épargnés » (Pitche et al., 1999). Quelques cas autochtones ont été décrits en zones subtropicales et tempérées telles qu’au Maghreb où l’incidence de l’affection est peu élevée comme c’est le cas au Maroc (Trabelsi et al., 2009), en Tunisie, en Libye et en

Algérie (Denguezli et al., 2003; Zait et al., 2008). En Europe, 5 cas, seulement, sont décrit (Bonnet et al., 2011). 2.2.4.4. Thérapeutique Le traitement est actuellement bien codifié, consistant en une prescription orale de sulfaméthoxazole-triméthoprime à la dose de 1600 mg/320 mg par jour pendant 12 mois. Le traitement sera poursuivi plus longtemps en cas de réponse incomplète (Develoux et al., 2003). Dans les cas dus à A. madurae, cette espèce répond assez bien à l’association streptomycine-dapsone; la streptomycine est donnée à la dose de 1 g/j jusqu’à une dose totale de 50 g, la dapsone à 100-200 mg/j. La dapsone peut être remplacée par le cotrimoxazole. Avec cet agent étiologique, l’association cotrimoxazole-amikacine est peu efficace (Develoux et al., 2003). Le cotrimoxazole est le traitement de choix des actinomycétomes donnant de bons résultats avec des taux de guérison de 70 à 80 % pour une durée de traitement de six mois à quatre ans (Ait Essi et al., 2011). Des auteurs mexicains ont rapporté des résultats satisfaisants avec un protocole plus court consistant en des cycles successifs, un cycle associe de l’amikacine (15 mg/kg/j) pendant 3 semaines et du cotrimoxazole (7-35 mg/kg/j) pendant 5 semaines (Dieng et al., 2005; Trabelsi et al., 2009; Cascio et al., 2011).

2.3. Streptomyces 2.3.1. Historique, classification et habitat Le genre Streptomyces, proposé par Waksman et Henrici (1943), est classé sur la base de la morphologie puis du type de la paroi cellulaire (Anderson et Wellington, 2001; Xiao et al., 2009). C’est le plus important genre des actinomycètes aérobies, de 1940 à 1957, plus de 1000 espèces de Streptomyces ont été décrites, avant les années 1970 le nombre total a augmenté jusqu’à 3100, bien que beaucoup d’espèces ont été insuffisamment décrites, à cette époque l’identification au niveau de l’espèce été basée, seulement, sur la pigmentation et un nombre limité de caractères morphologiques. Cependant, après de nouvelles études phénotypiques exhaustives, Williams et al. (1981, 1983), considérant que l’intérêt donnée aux caractères morphologiques n’est pas justifié, ils ont suggéré que toutes les espèces qui ont une relation doivent être classées dans des groupes dans le genre des Streptomyces. D’autres études menées par Goodfellow et al. (1986; 1992) ont, aussi, aidé à limiter le nombre des espèces et à clarifier la classification des Streptomyces sp. Avec l’introduction de l’outil moléculaire, beaucoup d’ambigüités ont été écartées. Streptomyces est le genre type de la famille des Streptomycetaceae dans l’ordre des Streptomycetales. Ce genre contient 1890 espèces et 114 sous espèces. L’espèce type de ce genre est S. albus (Holt et al., 1994; Reddy et al., 2010; Euzéby, 2012; Whitman et al., 2012).

Les Streptomyces sp. se trouvent dans tous les milieux terrestres et aquatiques ainsi que les environnements symbiotiques et endophytiques (Xiao et al., 2009). Elles sont très abondantes dans les sols riches en matière organique en décomposition (Holt et al., 1994). Elles représentent le genre le plus abondant de la population des actinomycètes dans le sol et elles sont responsables de son odeur d’humus caractéristique (Katsifas et al., 1999; Zaitlin et al., 2003). Mais elles sont, aussi, trouvées dans les milieux où les conditions sont extrêmes (Zhao et al., 2009). 2.3.2. Macromorphologie Les colonies des Streptomyces ont la forme lichenoïde. Au début de la croissance, elles ont une surface lisse. Mais tout au long de leur développement, elles forment une trame avec le mycélium aérien qui apparaît floconneux, granuleux, poudreux ou velouté. Les Streptomyces produisent une variété de pigments qui sont responsables de la couleur des mycéliums, aérien et de substrat, cette pigmentation est le plus souvent différente entre ces deux mycéliums; de ce fait, la coloration est rarement homogène au niveau de la colonie. Ainsi selon la couleur du mycélium aérien, les Streptomyces sp. sont classées dans sept séries: rouge (bronze, rose et rose pâle), jaune (jaunâtre à jaune-verdâtre), vert (verdâtre à gris-verdâtre pâle), bleu (bleuâtre à bleu-grisâtre pâle), violet, gris (de gris à brun) ou blanc. Le mycélium de substrat aide, aussi, à différencier les colonies, il peut être de couleur: jaune brunâtre, jaune brunâtre et rouge (orange), jaune brunâtre et bleu ou violet, jaune brunâtre et vert. D’autres pigments colorés, autres que les pigments mélanoïdes, solubles dans le milieu ou précipitent au voisinage de la colonie et dont la couleur peut être sensible ou non au pH, sont: rouge, jaune, vert, bleu ou violet. Au cas de présence de pigments mélanoïdes on observe une couleur brune modifiée par un reflet de ces couleurs (Shirling et Gottlieb, 1966; Holt et al., 1994). 2.3.3. Micromorphologie Les Streptomyces sp. sont non acido-alcoolo-résistantes. Le mycélium végétatif est formé de filaments de 0,5-2,0 µm de diamètre, extrêmement ramifié, souvent non septé, il se fragmente rarement durent la phase végétative, son développement se fait par croissance apicale des hyphes accompagnée de ramification, donc il se produit une matrice tressée d’hyphes. Avec l’âge de la colonie, les sporophores du mycélium aérien sont produits sous forme de filaments multinucléaires sur la surface de la gélose, à l’intérieur des quels nous observons la formation de septations suivi par la séparation de cellules individuelles qui se développent en conidies (chaines de spores). Les spores diffèrent, selon les espèces, de forme (rondes, ovales ou cylindriques) et de taille. Le nombre des spores est de trois à plusieurs par chaine, et prennent différents types morphologiques ce qui est utiliser comme critère de

31 détermination des espèces, les chaines peuvent être de forme droites, flexibles, rectiflexibles ou spirales, monverticillées ou biverticillées, droites ou en spires (figure 11). Peu d’espèces forment des chaines courtes de spores sur le mycélium de substrat. Les spores sont non mobiles, leur surface peut être lisse, épineuse, poilue ou verruqueuse (figure 12). Les sclérotes, les pycnidiales, les sporanges et les synnemata peuvent se former chez quelques espèces (Shirling et Gottlieb, 1966; Holt et al., 1994; Anderson et Wellington, 2001; Reddy et al., 2010).

Figure 11. Morphologie des chaines de spores des Streptomyces sp. (Hütter, 1967) 1: droites, 2: flexible et rectiflexible, 3: spires serrées, 4: spires ouvertes, 5: verticillées, 6: spires verticillées

Figure 12. Différentes ornementations de la paroi des spores des Streptomyces sp. (Vobis, 1997) 1: noueuse, 2: rugueuse, 3: verruqueuse, 4: poilue, 5: épineuse, 6: lisse

2.3.4. Chimiotaxonomie, physiologie et activité Le peptidoglycane de la paroi cellulaire des Streptomyces sp. contient en quantité importante l’isomère LL de l’acide diaminopimélique et la glycine. Les sucres caractéristiques sont absents; le ribose, le glucose, le galactose et des traces de mannose

32 peuvent être présents. Leur paroi cellulaire est donc de type I (Holt et al., 1994; Anderson et Wellington, 2001; Petrosyan et al., 2003; Zhao et al., 2009; Reddy et al., 2010). Les Streptomyces sp. sont aérobies, chimioorganotrophes et elles ont un métabolisme oxydative. Elles utilisent une large gamme de composés organiques comme seule source de carbone et d’énergie. Il y a des espèces qui sont carboxydotrophes (utilisent le monooxyde de carbone). La catalase est positive, et généralement elles réduisent le nitrate en nitrites. Elles dégradent l’adénine, l’esculine, la caséine, la gélatine, l’hypoxantine, l’amidon et la tyrosine. La température optimale se situe entre 25 à 35 °C, quelques espèces sont psychrophiles et d’autres thermophiles qui peuvent tolérer une température de 55 °C (l’optimum est à 50 °C). Le pH optimum est dans l’intervalle de 6,5-8,0, mais il y a des espèces qui sont alcalophiles et se développent à un pH de 11 (Shirling et Gattlieb, 1966; Holt et al., 1994; Kim et al., 1998; Kim et al., 1999; Petrosyan et al., 2003). Ce genre est la source de plus de la moitié des 10000 métabolites actifs rapportés, comme les enzymes, les antibiotiques, les agents pharmacologiquement actifs (immunomodulateurs et les antitumoraux). Ils ont suscité l’intérêt des industriels et des académiciens pendant plus de 50 ans (Petrosyan et al., 2003; Bouizgarne et al., 2009; Reddy et al., 2010). Ce genre est à l’origine d’environ 70 % des molécules antibiotiques utilisées en médecine et 60 % des antifongiques utilisés en agriculture (Sujatha et al., 2005). Les Streptomyces sp. jouent, aussi, un rôle important dans la bioremédiation et la biodégradation de la lignine, des pesticides et des composés aromatiques récalcitrants, (Benimeli et al., 2003; Guo et al., 2008). 2.3.5. Pathogénie Malgré le nombre important des espèces de Streptomyces, seulement S. griseus et S. somaliensis ont été confirmées comme pathogènes. Les cas d’infections rapportés sont principalement des actinomycétomes (nodules fistulisés cutanés et locals). Par contre, des cas rares d’infections non-mycétomiques invasives à Streptomyces sp. sont aussi rencontrés dans la clinique pratique, en majorité chez des patients immunodéprimés par le virus d’HIV, les tumeurs malignes ou après un traitement avec un agent immunodépresseur comme les corticoïdes et la chimiothérapie (Serrano et al., 1998; Kapadia et al., 2007; Rose et al., 2008). Le tableau 5 résume les cas documentés dans la littérature depuis 1951. D’autres espèces de Streptomyces sont phytopathogènes, les exemples les plus cités sont ceux des espèces S. scabeis, S. caviscabies, S. acidiscabies, S. setonii, S. tendae et S. ipomoeae qui provoquent la gale de la pomme de terre qui se manifeste par des lésions superficielles, relevées ou profondément trouées et la virole de la pomme de terre douce provoquée par la thaxtomine (toxine) ( Goyer et al., 1996; Bramwell et al., 1998).

Tableau 5. Cas d’infections invasives à Streptomyces sp. Isolat Cas clinique Référence

Streptomyces sp. Pneumonie, septicémie Kohn et al. (1951)

S. coelicolor Abcès cérébrale Clarke et al. (1964)

Streptomyces sp. Penniculite Cantwell et al. (1966)

S. somaliensis Péritonite Gruet et al. (1970)

S. pelletieri Pneumonie Werder et Sonnabend (1973)

Streptomyces sp. Péricardite chronique Shanley et al. (1979)

Streptomyces sp. Lymphadénite Holtz et al. (1985)

Streptomyces sp. Pneumonie Caron et al. (1992)

S. griseus Pneumonie Gugnani et al. (1993)

Streptomyces sp. Endocardite Mossad et al. (1995)

Streptomyces sp. Pneumonie, arthrite septique du genou Ahmed et al. (1996)

Streptomyces sp. Abcès pulmonaire Dunne et al. (1998)

Streptomyces sp. Septicémie Carey et al. (2001)

S. bikiniensis Septicémie Moss et al. (2003)

S. thermovulgaris Septicémie Ekkelenkamp et al. (2004)

Suite du tableau 5 Isolat Cas clinique Référence

S. maritimus /S. olivaceus, Pneumonie, leucémie Kapadia et al. (2007)

S. albus Pneumonie, lupus érythémateux systémique

Lymphome de Burkitt

Streptomyces sp. Cholangiocarcinome

S. nobilis ou S. parvulus Cancer du sein

S. humidus ou S. pilosus Sarcome d’Ewing

S. indigoferus ou S. herbaricolor

S. cinereoruber

Pneumonie Manteca et al. (2008)

Streptomyces sp. Abcès cérébral Rose et al. (2008)

Streptomyces sp. Actinomycétome Joseph et al. (2011)

S. anulatus Septicémie néonatal Bhuyar et al. (2011)

Streptomyces sp. Sarcoïdose systémique évolutive Riviere et al. (2012)

S. cacaoi ssp. cacaoi Abcès au cuire chevelu Pellegrini et al. (2012)

2.4. Nocardiopsis 2.4.1. Historique et classification La première souche originale du genre Nocadiopsis a été isolée en 1904 par Brocq- Rousseu à partir de grains moisis, décrite sous le nom de Streptothrix dassonvillei et désignée sous le nom d’Actinomadura dassonvillei. Quelques années plus tard, Liegard et Landrieu l’ont isolée, à partir d’un cas de conjonctivite, un microorganisme qu’ils ont considéré identique à Streptothrix dassonvillei et ils l’ont assignée au genre Nocardia. Gordon et Horan ont découvert que quelques caractères microscopiques et physiologiques de Nocardia dassonvillei étaient similaires à Streptomyces griseus. Par conséquent, Lechevalier et Lechevalier ont décrit le genre Actinomadura pour héberger Nocardia madurae, qui est l’espèce type de ce genre, N. pelletieri et N. dassonvillei. Entre temps, beaucoup de nouvelles

35 espèces d’Actinomadura ont été décrites, cependant, il a été raisonnable de reconsidérer la position taxonomique d’Actinomadura dassonvillei, car cette souche présente des différences dans la morphologie avec les autres membres du genre Actinomadura comme le mode de sporulation du mycélium aérien, la nature du mycélium de substrat et surtout l’absence du madurose dans l’hydrolysat de ses cellules. Goodfellow (1971) a établi un dendrogramme par analyse numérique des bactéries Nocardioformes, ce qui a apporté plus d’évidence que A. dassonvillei n’est pas reliée à Nocardia, ni aux souches A. madurae ou A. pelletieri. Toutes les souches appartenant à A. dassonvillei examinées forment un ensemble homogène avec un niveau de similarité à 90 %. Il n’y a pas de relation entre A. dassonvillei et A. madurae ou A. pelletieri. Williams et al. (1974) ont étudié le processus de formation de spores par A. dassonvillei pour déterminer sa relation avec les autres espèces mais ils n’ont pu tirer de conclusions. Mayer et al. (1976) ont montré que les différences entre A. dassonvillei et les autres espèces d’Actinomadura et de Nocardia sont non seulement morphologiques mais aussi biochimiques. Ainsi, les caractères de cette souche ne permettent pas de la classer dans l’un des genres décrit dans la 8ème édition du « Bergy’s Manual of Determinative Bactériologie » donc le nouveau genre Nocardiopsis a été proposé, il regroupe les bactéries qui auparavant été désignées comme Streptothrix dassonvillei, Nocardia dassonvillei et Actinomadura dassonvillei. Le nom Nocardiopsis veut dire « bactéries qui ont l’apparence de Nocardia » (Mayer, 1976). Le genre Nocardiopsis est le plus grand genre dans la famille des Nocardiopsaceae, qui est classée dans l’ordre des Streptosporangiales. Il représente le genre type de cette famille (Hozzein et Goodfellow, 2008; Yassin et al., 2009; Yamamura et al., 2010; Fang et al., 2011; Chang et al., 2012; Qiao et al., 2012; Whitman et al., 2012). Ce taxon contient 44 espèces et 5 sous espèces (Euzéby; 2012), Nocardiopsis dassonvillei ssp. dassonvillei est l’espèce type de ce genre (Meyer, 1976; Grund et Kroppenstedt, 1990; Euzéby; 2012). 2.4.2. Habitat et localisation géographique Le genre Nocardiopsis est fréquemment isolé des milieux où la concentration en sel est élevée ou modérée, et d’environnements alcalins (Hozzein et Goodfellow, 2008; Engelhardt et al., 2010; Chang et al., 2011; Chang et al., 2012). Il a été isolé d’une variété d’habitats: de sédiments de mer (Fang et al., 2011; Engelhardt et al., 2010), de bassins (Chen et al., 2008), de lac alcalin (Yang et al., 2008), d’anémone de mer (Chen et al., 2009), d’éponge de mer (Engelhardt et al., 2010), de sable de dunes (Hozzein et Goodfellow, 2008). Cependant, les espèces de ce genre ont été isolées d’autres environnements, ni salins ni alcalins comme les dépôts de scories, les prélèvements cliniques, l’intérieur des

36 appartements, les composts, la rhizosphère de plantes, les déchets ménagés, les grains fermentés, les ruches et le miel d’abeilles domestiques, l’eau et la matière organique en décomposition (Mayer, 1976; Hozzein et Goodfellow, 2008; Yassin et al., 2009; Yamamura et al., 2010; Yan et al., 2011; Chang et al., 2012; Rudramurthy et al., 2012; Qiao et al., 2012). Le genre Nocardiopsis est écologiquement universel, il a été détecté dans plusieurs pays à travers le monde. Il a été isolé surtout à partir de plusieurs sites en Chine (Chen et al., 2008; Yang et al., 2008; Chen et al., 2009; Fang et al., 2011; Yan et al., 2011), mais aussi au Norvège (Engelhardt et al., 2010), au Japon (Yamamura et al., 2010), en Thailande, en Amérique du nord (Qiao et al., 2012), en Egypte (Hozzein et Goodfellow, 2008) et en Algérie (Zitouni et al., 2006; Meklat et al., 2011). 2.4.3. Macromorphologie Les colonies du genre Nocardiopsis ont une bonne croissance sur les milieux organiques, elles sont non hémolytique sur les géloses au sang. Ces colonies sont circulaires, rugueuses, sèches, grossièrement plissées, minces et plates, de couleur blanche (Mayer, 1976; Chen et al., 2009; Yamamura et al., 2010; Rudramurthy et al., 2012). Le dos de la colonie, qui représente le mycélium de substrat, est de couleur jaune pâle à jaune sombre. L’élévation de la colonie est convexe à irrégulière, les marges sont filamenteuses (Fang et al., 2011). Le mycélium végétatif pénètre dans la gélose et forme une colonie compacte (Yassin et al., 1997). Les espèces de Nocardiopsis ne produisent pas de pigments mélanoïdes, ni diffusibles (Mayer, 1976; Yassin et al., 1997; Chen et al., 2008; Hozzein et Goodfellow, 2008; Chen et al., 2009; Yassin et al., 2009; Fang et al., 2011; Yamamura et al., 2010). 2.4.4. Micromorphologie Les souches du genre Nocardiopsis sont des bactéries nocardioformes, à coloration de Gram positive, non acido-résistant (Mayer, 1976; Grund et Kroppenstedt, 1990). Elles forment un mycélium de substrat bien développé, très ramifié avec des branches irrégulières, arrangées comme des palissades et qui se fragmentent avec l’âge en éléments sous forme de bacilles et coccobacilles non mobiles. Le mycélium aérien forme des chaines d’arthrospores longues, droites ou flexibles (contenant 10 à 20 spores par chaine) irrégulièrement courbées, en forme, plus ou moins, de zigzag avant et au début de la sporulation; puis ce mycélium se subdivise en spores en forme de bacilles allongés et de différentes longueurs, non mobiles, de taille allant de 0,7 à 1,5 µm avec une surface lisse (figure 13) (Mayer, 1976; Yassin et al., 1997; Chen et al., 2008; Hozzein et Goodfellow, 2008; Yang et al., 2008; Chen et al., 2009; Yassin et al., 2009; Yamamura et al., 2010; Fang et al., 2011; Yan et al., 2011). Pour l’espèce N. synnematafomans, les synnemata sont formés à partir du mycélium aérien sous forme de

37 chaines de spores qui sont enveloppées ensemble pour former de longues cordes. Les sporanges et les éléments mobiles ne sont pas observés (Yassin et al., 1997).

Figure 13. Photographies par microscope électronique du mycélium de l’espèce Nocardiopsis valliformis HBUM 20028T (Yang et al., 2008) a: mycélium de substrat ramifié, b: mycélium aérien qui se divise en spores de forme de bacilles, c: mycélium arrangé en forme de palissades

2.4.5. Chimiotaxonomie et physiologie La paroi cellulaire des souches du genre Nocardiopsis contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique et ne présente pas de sucres caractéristiques, ce qui leur confère une paroi de type III/C. Le glucose et le galactose peuvent être présents dans l’hydrolysat des cellules entières (Mayer, 1976; Grund et Kroppenstedt, 1990; Hozzein et Goodfellow, 2008; Chen et al., 2009; Yassin et al., 2009; Yamamura et al., 2010; Fang et al., 2011). Les Nocardiopsis sp. sont des bactéries aérobies, à catalase positif (Mayer, 1976). Ils peuvent croitre dans un large intervalle de température allant de 10 à 60 °C, l’optimum se situe entre 25 et 40 °C (Hozzein et Goodfellow, 2008; Yang et al., 2008; Chen et al., 2008 et 2009; Yamamura et al., 2010; Chang et al., 2011; Fang et al., 2011). La majorité des espèces peuvent être alcalotolérantes ou alcalophiles, le pH optimum de leur croissance est situé dans l’intervalle de 6 à 14 (Chen et al., 2009; Chang et al., 2011). Les espèces de Nocardiopsis sont soit halotolérantes ou halophiles, elles peuvent tolérées une concentration allant jusqu’à 20 % de NaCl; mais la plupart des espèces ont un optimum de croissance qui se situe entre 5 et 10 % (Hozzein et Goodfellow, 2008; Chen et al., 2009; Yamamura et al., 2010; Chang et al., 2011). 2.4.6. Activité Le genre Nocardiopsis est une source d’agents bioactifs. Les souches de Nocardiopsis sp. sont utilisées pour la production de la griseusine D, de l’apoptolidine et la methylpendolmycine (Yamamura et al., 2010). Nocardiopsis dassonvillei (OPC-15T) est utilisée pour la production des antibiotiques de type phenazine. Nocardiopsis sp. (YIM DT266) produit un métabolite cytotoxique et un antibiotique: le Naphthospironone A(1)

(Sarethy et al., 2011). Des souches de Nocardiopsis, isolées de sédiments marins, ont présentées une activité antibactérienne et antifongique, elles sont utilisées pour la production d’un antibiotique: le thiopeptide (Engelhardt et al., 2010); N. mutabilis (DSM 43853T) et N. syringae DSM 43886T sont aussi connues pour la production des antibiotiques (Grund et Kroppenstedt, 1990). N. alba est active contre des isolats de Bacillus et des bactéries à coloration de Gram négative pathogènes de l’homme; elle produit aussi des susbstances actives contre Paenibacillus larvae et Melissococcus plutonius bactéries pathogènes qui provoque la loque américaine et européenne, une maladie qui touche les abeilles domestiques (Qiao et al., 2012). Beaucoup d’enzymes à intérêt industriel sont extraits de cultures du genre Nocardiopsis, comme une cellulase (Yan et al., 2011); une protéase produite par N. prasina HA-4T, une chitinase alcaline produite par N. albus ssp. prasina OPC-131T (Sarethy et al., 2011). 2.4.7. Pathogénie Les infections qui sont dues au genre Nocardiopsis sont rares, seules les deux espèces N. dassonvillei et N. synnemataformans ont été rapportées être impliquées dans les infections humaine. Les formes rencontrées peuvent être des conjonctivites, des infections cutanées, pulmonaires ou disséminées (Beau et al., 1999; Rudramurthy et al., 2012). Le tableau 6 présente les différents cas d’infections causée par Nocardiopsis, d’après Rudramurthy et al., (2012).

Tableau 6. Différents cas d’infections par Nocardiopsis sp. (Rudramurthy et al., 2012) Site(s) Facteurs de risques Manifestation Thérapie Référence

Cutané Lésion avec fourche pendant le Cellulites de bras, tuméfaction et décoloration Acte Philip et jardinage de pomme de terre du dos de la main droite chirurgicale Roberts

Co- (1984) trimoxazole

NC Multiple nodules et sinusite drainante Co- Sindhuphak et trimoxazole al. sur un aspect antérieur de la jambe droite (mycétome) (1985)

Lesion par cure-dents Plusieurs lésions nodulo-ulcérative le long de Minocycline Gonzălez- Lòpez et aspects fléchisseurs de la main gauche et al. (2011) avant bras dans une forme sporotrichoïde

NC NC NC Singh et al. (1991)

Suite du tableau 6 Site(s) Facteurs de risques Manifestation Thérapie Référence

Pulmonaire NC NC NC Bernatchez et

Lebreux (1991)

NC Infection pulmonaire NC Mordarska et al. suppurative (1998)

Occulaire NC NC NC Liegard et Landrieu

(1911)

Disséminé Spondylite rhumatoïde Cholangite Piperacillin, Beau et al. (1999)

et hypertension ciprofloxacin

artérielle

NC Fièvre, détresse respiratoire avec Trimethoprim et Lejbkowicz et al. toux gentamicin (2005) productive

Nasal Diabète sucré Fièvre, masse pulpeuse avec des Clarithromycin et Rudramurthy et al. (2012) douleurs aiguës levofloxacin et érythème sur zone nasale droite

NC: non connu

2.5. Autres genres 2.5.1. Dermatophilus L’espèce Dermatophilus congolensis provoque une dermathophilose, caractérisée par l’apparence d’une dermatite exsudative avec incrustation. Elle affecte les animaux domestiques, principalement les chevaux, les chèvres, les moutons et les chats ainsi que les animaux sauvages comme le singe, l’ours polaire, le cerf, etc. L’homme est infecté généralement après un contact avec les tissus ou les produits des animaux malades, donc les personnes à grand risque sont les fermiers, les vétérinaires, les travailleurs aux abattoirs, les bouchers, les chasseurs, etc (McNeil et Brown, 1994; Ambrose, 1996; Amor et al., 2011). 2.5.2. Gordona Les espèces qui sont rapportées dans les cas de pathologies sont Gordona terrae, G. bronchialis, G. rubra, G. sputi et G. rubropertincta. Chez l’homme la maladie se manifeste

40 soit par des lésions cutanées, soit par une infection pleuro-pulmonaire, soit une endocardite ou une bactériémie. Chez le cochon, l’espèce G. sputi est l’agent causatif d’une lymphadénite granulomateuse (McNeil et Brown, 1994; Blanc et al., 2007; Cargill et al., 2010; Johnson et al., 2011 ). 2.5.3. Rhodococcus Ce genre est largement distribué dans l’environnement, le sol est son principal habitat et source de contamination. L’espèce Rhodococcus equi est la plus connue en pathologie, elle peut causer une infection cutanée primaire, une bactériémie, une infection pulmonaire invasive, une endocarditeo u un sepsis. Ce germe est aussi impliqué dans des infections chez l’animal comme les herbivores en particulier les chevaux. Elle provoque soit une pneumonie, soit une lymphangite ulcérative ou lymphadénite (McNeil et Brown, 1994; Weinstock et Brown, 2002; Cargill et al., 2010). 2.5.4. Amycolata Rarement rencontré en pathologie, l’espèce Amycolata autotrophica a été isolée de cas de péricardite purulente, de méningite, d’une blessure à la jambe et de sepsis. Son rôle dans ces pathologies n’a pas été confirmé, mais des expériences ont montré qu’elle peut causer des abcès péritonéaux, hépatiques ou spléniques. L’éspèce A. orientalis a été aussi isolée du liquide cérébrospinale (McNeil et Brown, 1994). 2.5.5. Oerskovia Ce genre est très rare en clinique, il y a cinq cas qui ont été publiés (jusqu’à l’année 2011) sur les deux espèces Oerskovia turbata et O. Xanthineolytica, elles ont été isolées de prélèvements cliniques dans des cas de péritonite, d’endophtalmie traumatique, de méningite, de bactériémie et endocardite (McNeil et Brown, 1994; Betancourt-Castellanos et al., 2011). 2.5.6. Rhotia Rhotia dentocariosa est un germe commensale dans la cavité dentaire, il à été isolé de cas de carie dentaire, d’infection abdominale, d’abcès de pilonidale, de kyste maxillaire, d’endocardite (McNeil et Brown, 1994; Binder et al., 1997; Ferraz et al., 1998). 2.5.7. Tsukamurella Les trois espèces: Tsukamurella paurometabola, T. inchonensis et T. pulmonis sont impliquées dans plusieurs cas d’infections: une méningite, une bactériémie, une endocardite, une infection pulmonaire, une péritonite, une conjonctivite, une infection de prothèse au genou et une infection cutanée (McNeil et Brown, 1994; Cho et al., 2010; Cargill et al., 2010; Karunakaran et al., 2011).

2.5.8. Corynebacterium Plusieurs espèces sont responsables de diverses infections chez les animaux domestiques ou sauvages, parmi elles: Corynebacterium cystitidis, C. kutscheri, C. pilosum et C. pseudotuberculosis. C. kutscheri est hébergée dans la cavité orale, dans l'œsophage, dans l'intestin et dans les nœuds lymphatiques sous-maxillaires du rat et de la souris. C. renale, C. cystitidis et C. pilosum sont responsables d'infections de l'appareil urinaire des ruminants. C. pseudotuberculosis provoque des infections chez de nombreuses espèces animales notamment chez le cheval, le mouton, la chèvre et les bovins. C. diphtheriae n'a que peu d'intérêt en médecine vétérinaire, mais ne nous pouvons passer sous silence que cette bactérie est responsable d'une maladie infectieuse grave de l'homme, la diphtérie (Riegel, 1998; Euzéby, 2012). 2.5.9. Cellulomonas La détection des espèces du genre Cellulomonas en clinique est extrêmement rare, mais il a été rapporté qu’elles causent de sérieuses infections opportunistes chez l’homme. L’espèce C. denverensis, a été confirmés comme agent étiologique d’une endocardite et d’un cas de cholécystite avec sepsis (Ohtaki et al., 2009; Lai et al., 2009). 2.5.10. Dietzia Dietzia maris est la seule espèce de ce genre responsable bactériémie, d’une infection intra-vasculaire et d’une infection du matériel prosthétique (Cargill et al., 2010). 2.5.11. Actinomycètes thermophiles Les espèces Saccharopolyspora rectivirgula, Saccharomonospora viridis, Thermoactinomyces vulgaris, Thermoactinomyces sacchari et Thermoactinomyces candidus sont connues comme agents étiologique d’une pneumonie d’hypersensibilité ou alvéolite allergique extrinsèque. La maladie la plus connue est le poumon des fermiers, appelée ainsi parce qu’elle affecte surtout les agriculteurs, mais aussi les travailleurs dans des endroits fermés ou moisis et qui sont exposés en permanence à la poussière. Cette maladie peut affecter aussi les animaux comme les chevaux, les chats et les animaux de laboratoire (le lapin, le hamster et le rat) (McNeil et Brown, 1994; Harvey, 1999). 2.5.12. Actinomycètes non cultivables Tropheryma whippelii est un actinomycète non cultivable, identifié directement, à partir des tissus infectés, par le séquençage de son ARNr 16S, cette souche provoque une lypodistrophie intestinale appelée la maladie de Whipple (McNeil et Brown, 1994).

3. Actinomycètes rares Les actinomycètes dis « rares » comprennent les genres d’actinomycètes filamenteux autre que le genre Streptomyces (Marcone et al., 2010). La présence relativement basse des ces genres, contrairement au genre Streptomyces, résulte du fait qu’ils sont difficilement isolés, cultivés, maintenus et manipulés (Berdy, 2005). 3.1. Nonomuria 3.1.1. Historique et classification Le genre Nonomuria a été proposé la première fois en 1988, par Goodfellow, Stackebrandt et Kroppenstedt, mais à cette époque le nom n’a pas été retenu officiellement dans la taxonomie bactérienne. Ce n’est qu’en 1998 que Zhang et al., sur la base de l’analyse du gène codant l’ARNr 16S ont réalisé que Microteraspora pusilla est phylogénétiquement distincte des autres membres du genre Microtetraspora, de ce fait ils l’ont transféré à un nouveau taxon qu’ils ont appelé Nonomuria; après, Chiba et al. (1999) ont indiqué que le non Nonomuria ne suis pas les règles du code international de la nomenclature des bactéries, de ce fait ils l’ont remplacé par le non: Nonomuraea comme orthographe correcte du genre (Gyobu et Miyadoh, 2001; Quintana et al., 2003; Hozzein et Goodfellow , 2007; le Roes et Meyers 2008; Kampfer et al., 2010). Ce genre regroupe des espèces qui ont des caractères communs appartenant au début au genre Actinomadura puis au genre Microtetraspora (Quintana et al., 2003). Le genre Nonomureae appartient à la famille des Streptosporangiaceae, dans l’ordre des Streptosporangiales (Hozzein et Goodfellow, 2007; Whitman et al., 2012; Camas et al., 2013). Il contient 32 espèces et deux sous espèces connues et valides; N. Pusilla représente l’espèce type de ce genre (Le Roes et Meyers 2008; Euzéby, 2012). 3.1.2. Habitat et localisation géographique Les espèces du genre Nonomureae sont largement distribuées dans les sols, elles ont été isolées de plusieurs sites géographiques dans le monde comme: de divers sols au Japon (Gyobu et Miyadoh, 2001); de sol de la Corée du sud (Quintana et al., 2003); de sable des plages et de la boue d’une rhizosphère au Bangladesh (Ara et al., 2007 a et b); de sable de dunes en Égypte. (Hozzein et Goodfellow, 2007); de sédiments de rivières en Afrique du sud (le Roes et Meyers, 2008), de sols arides en Algérie (Badji et al., 2007) et au Nigéria (Camas et al., 2013); aussi elles ont été isolées d’autres écosystèmes comme des feuilles de plantes médicinales et d’éponges de mer en Chine (Qin et al., 2009a; Xi et al., 2012).

3.1.3. Macromorphologie et micromorphologie Le mycélium de substrat (dos de la colonie) est de couleur très variée: blanc ou blanc ocre, beige, jaune, jaune noirci, brun jaunâtre, brun pâle, rose, violet, orange, brun rouge ou rouge. Le mycélium aérien (surface de la colonie) peut être en traces seulement, blanc, beige, blanc crème ou blanc rosâtre, blanc jaunâtre, rose, rose violacé ou bleu grisâtre. Les pigments solubles peuvent se trouvés chez quelques espèces, ils sont: brun jaunâtre, jaune, rouge ou violet (Ara et al., 2007; Hozzein et Goodfellow, 2007). Les espèces du genre Nonomureae forment un mycélium de substrat très ramifiés; les hyphes du mycélium aérien se différencient en chaines de spores de formes spirales, incurvées ou droites, d’un nombre allant de 4 jusqu’à 30 par chaine. Les spores ont une ornementation irrégulière, lisses, plissées ou verruqueuses (figure 14) (Stackbrant et al., 2001; Quintana et al., 2003; Hozzein et Goodfellow, 2007; Camas et al., 2013).

Figure 14. Photographies par microscope électronique des chaines de spores de quelques espèces de Nonomuraea a: forme spirale de N. maheshkhaliensis 16- 5-14T (Ara et al., 2007 a), b: forme incurvée de N. bangladeshensis sp. nov. 5-10-10T (Ara et al., 2007 b) , c: forme droite de N. longicatena K252T(Chiba et al., 1999)

3.1.4. Chimiotaxonomie, physiologie et activité La paroi cellulaire de Nonomureae contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique. Le glucose et le ribose sont présents dans la paroi comme sucres majeurs, le mannose et le madurose sont aussi présents, ce dernier est le sucre caractéristique, donc la paroi de type III/ B (Stackbrant et al., 2001; Quintana et al., 2003; Camas et al., 2013). Les espèces de Nonomuraea sont aérobies, non mobiles, non acido-alcoloo-résistantes. La majorité croient dans un large intervalle de température variant de 10 à 45 °C et quelques 2µm espèces peuvent croitre à 55 °C (Quintana et al., 2003). L’intervalle de pH de croissance est de 5 à 11, l’optimum est à 7. Le maximum de NaCl toléré, pour la plupart des espèces, est 2 2µm à 5 % (Ara et al., 2007; Qin et al., 2009 a; Camas et al., 2013). Les espèces du genre Nonomuraea produisent plusieurs métabolites de natures différentes, à titre d’exemples: la souche Nonomureae sp. ATCC 39727T produit la teicoplanin qui est un antibiotique de nature glycopeptidique (Marcone et al., 2010 a et b); N. roseoviolacea ssp. carminata produit l’antracycline qui est un antibiotique antitumorale (Gyobu et Miyadoh, 2001); N. flexuoza produit une enzyme endo-1,4-β-xylanase (Morin et

44 al., 2011); N. longicatena produit un inhibiteur de la protéine kinase C (Chiba et al., 1999). Nonomuraea sp. NM94 produit des antibactériens et des antifongiques (Badji et al., 2007). 3.2. Kribbella 3.2.1. Historique et classification En 1999, Park et al. par l’analyse de la séquence du gène de l’ARNr 16S, ont trouvé que les deux souches Nocardioides fulvus et Nocardioides sp. ATCC 39419T forment une lignée phylogénetique distincte des autres espèces du genre Nocardioides. En conséquence, ils ont analysé les caractères phénotypiques de ces deux espèces pour déterminer leur position taxonomique, et ils ont proposé qu’elles doivent être classées dans un nouveau genre qu’ils ont appelé Kribbella, ce nom est formé par l’acronyme donné par l’institut de recherche en Corée « Bioscience and Biotechnology, KRIBB» au niveau duquel l’étude taxonomique de ce taxon a été réalisée. En 2003, Sohn et al., pour regrouper les actinomycètes nocardioformes qui contiennent l’isomère LL de l’acide diaminopimélique dans leur paroi cellulaire, ont transféré Hongia koreensis, qui est la souche type du genre Hongia, au genre Kribbella (Everest et Meyers, 2008). Le genre Kribbella est un membre de la famille des Nocardioidaceae, dans l’ordre des Propionibacteriales (Carlsohn et al., 2007; Urzì et al., 2008; Whitman et al., 2012; Xu et al., 2012). Ce genre contient 17 espèces connues et valides: K. flavida et K. sandramycini (Park et al., 1999), K. koreensis (Sohn et al., 2003), K. solani et K. jejuensis (Song et al., 2004), K. antibiotica (Li et al., 2004), K. lupini (Trujillo et al., 2006 a), K. yunnanensis et K. alba (Li et al., 2006), K. karoonensis et K. swartbergensis (Kirby et al., 2006), K. aluminosa (Carlsohn et al., 2007) K. catacumbae et K. sancticallisti (Urzì et al., 2008), K. hippodromi (Everest et Meyers, 2008), K. ginsengisoli (Cui et al., 2010), K. amoyensis (Xu et al., 2012). Kribbella flavida IFO 14399T est la souche type du genre Kribbella (Pukall et al., 2010; Euzéby, 2012). 3.2.2. Habitat et localisation géographique Le genre Kribbella est très rare, ses espèces sont isolées, dans la plupart des cas, à partir du sol: K. flavida, K. sandramycini, K. yunanensis, K. alba et K. amoyensi isolées à partir des échantillons de sol prélevés en Chine (Park et al., 1999; Li et al., 2006; Pukall et al., 2010; Xu et al., 2012), K. koreensis, K. ginsengisoli et K. Jejuensis isolée, respectivement, de sols prélevés d’une mine d’or, d’une culture de pomme de terre et d’un champ de ginseng en Corée du sud (Song et al., 2004; Cui et al., 2010), K. karoonensis et K. swartbergensis isolées, respectivement, des sols de la base d’un arbre et des sédiments d’une rivière en Afrique du sud (Kirby et al., 2006). Les autres espèces ont été isolées d’autres habitats: K. aluminosa à partir de la surface de pierre d’une mine de moyen âge en Allemagne (Carlsohn

45 et al., 2007), K. hippodromi à partir d’un hippodrome en Afrique du sud (Everest et Meyers, 2008), K. solani à partir de pomme de terre en Corée du sud (Song et al., 2004), K. lupini est trouvées associée avec les racines de nodules de plantes méditerranéennes en Espagne (Trujillo et al., 2006a), K. catacumba et K. sancticallisti à partir des catacombes en Italie (Urzì et al., 2008). 3.2.3. Macromorphologie et micromorphologie Le genre Kribbella forme des colonies plissées, aspect cratériforme et d’une surface rugueuse, sableuse, de forme lichéneuse, les bords sont irréguliers, la texture est pâteuse, la couleur varie, selon les espèces, du blanc à crème, voir au jaune pâle (Park et al., 1999; Song et al., 2004; Carlsohn et al., 2007; Urzì et al., 2008; Xu et al., 2012). Ces bactéries sont non mobiles, la coloration de Gram est positive ou variable, non acido-résistantes. Elles forment un mycélium végétatif extrêmement ramifié, les hyphes ont tendance a pénétré dans la gélose, le mycélium aérien est très abondant, qui se fragmente fréquemment en des éléments en forme de bacilles de tailles variables, courts ou étendus (pas de bacilles réguliers), en des coccobacilles et/ou des coccis (figure 15) (Park et al., 1999; Carlsohn et al., 2007; Urzì et al., 2008; Pukall et al., 2010; Xu et al., 2012). Chez quelques espèces, il peut y avoir formation de bourgeons aux extrémités du mycélium aérien (Kirby et al., 2006).

Figure 15. Photographies par microscope électronique du mycélium de Kribbella yunnanensis YIM 30006T (a et b) et de Kribbella alba YIM 31075T (c et d) (Li et al., 2006) a et c: mycélium de substrat ramifié, b et d: mycélium aérien se fragmente en bacilles

3.2.4. Chimiotaxonomie et physiologie Les espèces du genre Kribbella contiennent dans leur peptidoglycane l’isomère LL de l’acide diaminopimélique, qui leur confère une paroi cellulaire de type I (Park et al., 1999; Carlsohn et al., 2007). L’alanine, la glycine et l’acide glutamique sont aussi présents (Song et al., 2004; Trujillo et al., 2006a). Le galactose est trouvé comme sucre majeur dans la paroi des espèces de Kribbella (Song et al., 2004). Néanmoins, la composition de la paroi en sucres

46 est différente selon les espèces, ce qui peut être utilisé comme un marqueur pour l’identification (Trujillo et al., 2006a). À titre d’exemples, K. antibiotica contient le glucose, le ribose et le xylose. Dans le cas de K. sandramycini et K. flavida, nous notons la présence du glucose, du mannose et du galactose. En plus de ces trois derniers sucres, la paroi des espèces K. koreensis, K. jejuensis et K. solani, contient du ribose (Song et al., 2004; Trujillo et al., 2006a). K. amoyensis contient le glucose, le galactose et le ribose en petite quantité (Xu et al., 2012). Les espèces du genre Kribbella sont aérobies, mais les espèces K. solani, K. flavida, K. jejuensis, K. koreensis et K. sandramycini peuvent croitre faiblement dans les conditions d’anaérobiose (Kirby et al., 2006). La température de croissance est optimale entre 8-37 °C, faible à 40 °C et absente à 45 °C sauf pour K. swartbergensis DSM 17345T. Il y a pas de croissance à 4°C (Kirby et al., 2006; Park et al., 1999; Cui et al., 2010; Xu et al., 2012). La plupart des espèces ont un pH optimum neutre ou légèrement alcalin, mais il y a des espèces qui peuvent croitre dans un milieu acide ou basique (intervalle de pH est entre 4,3-10) (Everest et Meyers, 2008; Urzì et al., 2008; Cui et al., 2010). La résistance à NaCl est entre 2 et 7 % (Kirby et al., 2006; Trujillo et al., 2006 a; Everest et Meyers, 2008). 3.2.5. Activité Les espèces du genre Kribbella ont montré une activité contre une variété de souches pathogènes, à titre d’exemples: -K. karoonensis et K. swartbergensis sont actives, d’une part, contre des souches pathogènes, isolées de divers prélèvements cliniques, appartenant aux genres et espèces suivantes: Citrobacter braaki, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium aurum A+, et d’autre part, contre des souches pathogènes de références: Escherichia coli ATCC 25922T, Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294T, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853T et Staphylococcus aureus ATCC 25923T (Kirby et al., 2006), -K. hyppodromi est active contre Mycobacterium aurum A+ (Everest et Meyers, 2008). K. solani et K. Jejuensis présentent une activité contre des isolats cliniques de Bacillus subtilis, de Pseudomonas aeruginosa, de Micrococcus luteus, de Streptomyces scabiei, de Candida albicans, d’Aspergillus niger, de Trichoderma harzianum, de Fusarium acuminatum et de Colletotrichum gloeosporioides (Song et al., 2004).

3.3. Micromonospora 3.3.1. Historique, classification, habitat et localisation géographique Le genre Micromonospora a été décrit la première fois par Ørskov (1923) sur la base de caractéristiques morphologiques comme: l’absence d’un vrai mycélium aérien et la présence de monospores sur le mycélium de substrat (Ara et Kudo, 2006; Jongrungruangchok et al., 2008; Tanasupawat et al., 2010; Wang et al., 2011; Zhang et al., 2012). Micromonospora est le genre type de la famille des Micromonosporaceae, dans l’ordre des Micromonosporales (Ara et Kudo, 2006; Qiu et al., 2008; Kirby et Meyers, 2010; Whitman et al., 2012; Zhang et al., 2012 ). Ce genre comprend 53 espèces et 7 sous espèces, M. chalcea est l’espèces type (Holt et al., 1994; Euzéby, 2012). La première souche du genre Micromonospora a été isolée du sol, ce dernier est la niche écologique principale de ce genre, notamment lorsqu’il est riche en humus. Les espèces du genre Micromonospora sont largement distribuer dans la nature, elles ont été isolées d’une très grande variété d’habitats comme l’eau, les environnements marins, les sédiments, les plantes, etc. (Zenova et Zvyagintsev, 2002; Jongrungruangchok et al., 2008; Qiu et al., 2008; Wang et al., 2011). Le tableau 7 montre des exemples d’écosystèmes et de pays à partir des quels les souches de Micromonospora, connues et valides, ont été isolées ces dernières années. 3.3.2. Macromophologie Le caractère typique des colonies de Micromonospora est leurs petites tailles, elles ne forment pas de mycélium aérien et sporulent longtemps (Qiu et al., 2008). La majorité des espèces ont une couleur qui change durant l’incubation en allant du jaune pâle, orange claire ou orange abricot à orange noirci, noire brunâtre ou noire. Cette couleur acquise à la maturité de la colonie est reflétée par la couleur des spores formées. Quelques espèces présentes des colonies d’autres couleurs comme le marron pourpré et le bleu vert. Les pigments diffusibles ne sont pas produits par toutes les espèces de Micromonospora. Le genre Micromonospora ne produit pas de pigments mélanoïdes. (Takahashi et al., 1985; McNeil et Brown, 1994; Lam et al., 1996; Ara et Kudo, 2006; Huang et al., 2008).

Tableau 7. Habitats et localisation géographique de quelques espèces de Micromonospora Espèce de Micromonospora Habitat, localisation géographique Référence

M. auratinigra TT1-11T Marais, Thaïlande Thawai et al. (2004)

M. endolithica AA-459T Pierre, Antarctique Hirsch et al. (2004)

M. eburnea LK2-10T Sol, Chine Thawai et al. (2005)

M. mirobrigensis WA201T Eau, Espagne Trujillo et al. (2005)

M. coriariae NAR01T Nodules de plante (Coriaria Trujillo et al. (2006b) myrtifolia ), Espagne

M. chokoriensis 2-19(6)T et M. coxensis Sol sableux, Bangladesh Ara et Kudo (2006) 2-30-b(28)T

M. lupini Lupac 14NT et M. Nodules de plante (Lupinus Trujillo et al. (2007) saelicesensis Lupac 09T angustifolius), Espagne

M. narathiwatensis BTG4-1T Sol, Thaïlande Thawai et al. (2007)

M.chaiyaphumensis MC5-1 T Sol, Thailande Jongrungruangchok et al. (2008)

M. rifamycinica AM105T Sédiments de mer, Sud de Chine Huang et al. (2008)

M. pattaloongensis TJ2-2T Sol, Thaïlande Thawai et al. (2008)

M. krabiensis MA-2T Sol, Thaïlande Jongrungruangchok et al. (2008)

M. tulbaghiae TVU1T Feuilles de plante (Tulbaghia Kirby et Meyers (2010)

Violacea), Afrique du Sud

M. Marina JSM1-1T Sable de mer, Thailande Tanasupawat et al. (2010)

M. pisi GUI 15T Nodules de plante (Pisum sativum), Garcia et al. (2010) Espagne

M. rhizosphaerae 211018T Rhizosphère de plante (Excocaria Wang et al. (2011) agallocha), Chine

M. humi P0402T Sol, Thaïlande Songsumanus et al. (2011)

M. haikouensis 232617T Sol, Chine Xie et al. (2012)

M. yangpuensis FXJ6.011T Eponge marin, Sud de Chine Zhang et al. (2012)

M. equina Y22T Sol, Afrique du sud Everest et Meyers (2013)

M. maritima D10-9-5T Sol, Thaïlande Songsumanus et al. (2013)

3.3.3. Micromorphologie Les Micomonospora sp. sont non acido-résistantes. Le mycélium de substrat est septé, son diamètre est à la moyenne de 0,5 µm, il est très abondant et non fragmenté, son développement est monopodiale ou dans quelques cas sympodiale. Sur ce mycélium se forment des monospores, qui est le caractère typique de ce genre, par scission ou à partir d’un sporophore, ce dernier est court ou un peu long et de forme de grappes ramifiés. Dans quelques cas de courtes chaines comportant deux à cinq spores peuvent se présentées, comme c’est le cas de l’espèce M. pisi GUI 15T et M. rifamycinica AM105T. Les spores sont de forme sphériques à ovale de 0.5 jusqu’à 1 µm de diamètre selon les espèces, non mobiles, leur surface est rugueuse, nodulaire à verruqueuse (figure 16). Ce genre ne possède pas de mycélium aérien seulement dans quelques cultures, il apparait irrégulier, comme la forme d’une fleure d’une croissance très limitée, de couleur blanche ou grisâtre. En culture liquide, on peut observer la fragmentation des hyphes et la formation des spores qui se regroupent en amas (Holt et al., 1994; McNeil et Brown, 1994; Lam et al., 1996; Ara et Kudo, 2006; Huang et al., 2008; Jongrungruangchok et al., 2008; Qiu et al., 2008; Garcia et al., 2010; Wang et al., 2011; Zhang et al., 2012).

Figure 16. Photographies par microscope électronique du mycélium de l’espèce Micromonospora yangpuensis FXJ6.011T (Zhang et al., 2012) a: mycélium de substrat septé, b: monospores sphériques, c: sporophores

3.3.4. Chimiotaxonomie et physiologie La paroi du genre Micromonospora contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique et/ou les dérivés 3-hyroxy du diaminopimélique, l’acide glutamique, l’alanine, la glycine, cette paroi est donc de type II. Les sucres caractéristiques de la paroi sont le xylose et l’arabinose mais elle peut contenir aussi le glucose, le mannose, le ribose ou le galactose; donc, ce genre possède un profil glucidique D (Holt et al., 1994; McNeil et Brown, 1994; Ara et Kudo, 2006; Huang et al., 2008; Jongrungruangchok et al., 2008; Tanasupawat et al., 2010).

Les espèces de Micromonospora sont aérobies à microaérophiles, chimioorganotrophes. Elles ne résistent pas aux lysozymes. Selon les espèces, la croissance peut être observée dans un intervalle de température de 10 jusqu’à 45 °C, l’optimum pour la plupart est entre 30 et 35 °C, pour quelques espèces l’optimum peut aller jusqu’à 40 °C. Elles ne peuvent pas croitre à plus de 50 °C. L’intervalle de pH de leur croissance est de 4 à 11. Les maximums de concentrations de NaCl tolérées sont de 2 % jusqu’à 7 %. (Holt et al., 1994; Tanasupawat et al., 2010; Wang et al., 2011; Zhang et al., 2012). 3.3.5. Activité Le premier antibiotique extrait, en 1942, à partir de culture de l’espèce Micromonospora purpurea (qui a été reclassée comme M. echinospora par Kasai et al., 2000) est un aminoglycoside (la gentamicine). Cet évènement a ouvert la vois pour le screening des antibiotiques à partir des espèces de ce genre qui sont devenues, depuis, une source prolifique de métabolites bioactifs. Les Micromonospora sp. sont classées en deuxième position comme source de substances actives, après les Streptomyces. Elles peuvent produire plusieurs types d’antibiotiques, les plus importants sont les aminoglycosides comme la gentamicine, la sisomicine et la fortimicine; les macrolides comme: le mycinamicine la rosamicine; les antibiotiques polysaccharides comme: l’everninomycine; les maquarimicides et les anticancéreux. En outre, Micromonospora sp. sont fortement protéolytiques et produisent beaucoup d’autres enzymes comme la cellulase, la chitinase, la pentosanase, etc. (McNeil et Brown, 1994; Lazzarini et al., 2000; Zenova et Zvyagintsev, 2002; Qiu et al., 2008; Kirby et Meyers, 2010; Zhang et al., 2012).

3.4. Saccharothrix 3.4.1. Historique et classification Le genre Saccharothrix (Saccharo = sucre, trix: cheveux) a été décrit par Labeda et al. en 1984, pour regrouper des souches d’actinomycètes qui ressemblent morphologiquement au genre Nocardiopsis mais elles diffèrent par les caractères chimiques de leur paroi (Labeda et Kroppenstedt, 2000; Lee et al., 2000; Otoguro et al., 2009). Ce genre appartient à la famille des Pseudonocardiaceae, classée dans l’ordre des Pseudonocardiales (Labeda et al., 2001; Labeda et Kroppenstedt, 2006; Whitman et al., 2012). Il contient 20 espèces et 4 sous espèces; l’espèce type est S. australiensis ATCC 31947T (Labeda et Lechevalier, 1989; Euzéby 2012). 3.4.2. Habitat et localisation géographique Le sol, avec ses différentes natures, est l’écosystème à partir duquel la majorité des espèces de Saccharothrix ont été isolées. La première espèce assignée à ce genre, S.

51 australiensis ATCC 31947T, a été isolée du sol d’Australie (Labeda et al., 1984) . S. espanaensis a été isolée de sol d’Espagne (Labeda et Lechevalier, 1989); S. texasensis est isolée d’un sol au texas; S. waywayandensis est isolée de sédiment d’un lac à Waywayanda (Labeda et Lyons, 1989); S. aerocolonigenes NRRL B-3298T est isolée du sol au Japon (Labeda et Lyons, 1989); S. violacea LM 036T et S. albidocapillata DSM 44073T sont isolées d’un sol collecté d’une mine d’or, en Corée du sud (Lee et al., 2000); S. coeruleoviolacea NRRL B-24058T est isolée d’un sol en Russie (Labeda et Kroppenstedt, 2006 ); S. violaceirubra YU 692-1T est isolée d’un sol au Japon (Otoguro et al., 2009); S. variisporea NRRL B-16296T est isolée d’un sol en Inde (Kim et al., 2011). Beaucoup d’espèces sont isolées de sols arides au sud Algérien, deux d’entre elles, S. algeriensis SA 233T et S. hoggarensis SA181T, ont été décrites et publiées comme nouvelles espèces (Zitouni et al., 2004; Bouras et al., 2006; Boubetra et al., 2013). Enfin, elles peuvent être trouvées dans d’autres habitats comme S. xinjiangensis PYX-6T qui a été isolée de l’eau d’un lac en Chine (Labeda et Kroppenstedt, 2006). 3.4.3. Macromophologie et micromorphologie La couleur des colonies de Saccharothrix diffère selon les espèces, mais la plus abondante est la couleur blanche clairsemé, blanc jaunâtre ou jaune orange. Le dos de la colonie, qui représente le mycélium de substrat, est généralement de couleur jaune avec ses variations (jaune claire, jaune orange, jaune grisâtre ou bien jaune brunâtre) jusqu’à l’orange clair ou rouge clair brunâtre; sauf pour l’espèce S. violacea LM 036T et S. violaceirubra YU 692-1T qui sont de couleur violette (d’où leurs noms). Un pigment jaune claire, rouge brunâtre ou jaune brunâtre, diffusible dans le milieu, est souvent présent, mais pas de pigment mélanoïde sauf pour S. variisporea NRRL B-16296T et S. waywayandensis NRRL B-16159T (Labeda 1986; Labeda et Lechevalier, 1989; Labeda et Lyons, 1989; Lee et al., 2000; Zitouni et al., 2004; Otoguro et al., 2009; Kim et al., 2011). Ce genre a la morphologie des nocardioformes, le mycélium de substrat est ramifié, dressé et strié, se fragmente en des éléments ovoïdes (Labeda et Lechevalier, 1989; Labeda et Lyons, 1989). Ce mycélium produit des sporophores, comme chez le genre Streptomyces, les hyphes aériens se divisent irrégulièrement en des longues chaines de spores droites et irrégulièrement courbées, souvent sous forme de zigzag, au stade de la maturation les hyphes se fragmentent irrégulièrement en longues chaines de spores ces derniers sont lisses, non mobiles, allongées, avec différentes tailles (figure 17), (Labeda et Lyons, 1989; Zitouni et al., 2005). Les sporanges, les sclérotes et les synnemata ne sont pas observés sauf pour S. violaceirubra YU 692-1T et S. variisporea NRRL B-16296T où la formation de spores sur des synnemata a été observée (Lee et al., 2000; Otoguro et al., 2009; Kim et al., 2011).

Figure 17. Photographies par microscope électronique du mycélium de quelques espèces de Saccharothrix a: mycélium aérien de S. violacea LM 036T qui se fragmente en éléments bacillaires (Lee et al., 2000), b: chaines de spores lisses irrégulièrement courbées de S. algeriensis SA 233T(Zitouni et al., 2004), c et d: mycélium aérien sous forme de zig zag de S. syringae ATCC 51364 T(Wink, 2002).

3.4.4. Chimiotaxonomie et physiologie Le genre Saccharothrix possède une paroi de type III, marquée par la présence de l’isomère méso de l’acide diaminopimélique et l’absence de glycine. La L-alanine, la D- alanine, l’acide glutamique, l’acide muramique peuvent être, aussi, présents. Cette paroi est caractérisée aussi par un profil glucidique E car l’hydrolysat des cellules entière contient le rhamnose et le galactose comme sucres caractéristiques; des traces de mannose, de glucose et de ribose peuvent être trouvées (Labeda et al., 1984; Labeda et Lechevalier, 1989; Labeda et Lyons, 1989; Lee et al., 2000; Hu et al., 2004; Zitouni et al., 2004a; Zitouni et al., 2004b; Zitouni et al., 2005; Otoguro et al., 2009). Toutes les espèces du genre Saccharothrix sont aérobies strictes, catalase et uréase positives, résistantes aux lysozymes (Labeda et al., 1984). L’intervalle de la température de croissance est de 10 jusqu’à 45 °C, l’optimum est généralement à 30 °C, mais il y a des exceptions comme pour l’espèce S. xinjiangensis PYX-6T qui peut croître à 50 °C (Labeda, 1986; Lee et al., 2000; Hu et al., 2004; Zitouni et al., 2004). L’intervalle de pH est de 4 à 10, l’optimum est au tour de 7 (Kim et al., 2011). L’optimum de la concentration en NaCl, pour la plupart des espèces, est dans l’intervalle de 4-5 %, mais il y a des espèces qui exigent une concentration en sel inférieure à 4 % (Labeda et Lechevalier, 1989; Otoguro et al., 2009).

3.4.5. Activité Depuis l’isolement de la première espèce de ce genre, il a été montré qu’il est une source de substances actives, à titre d’exemple: S. australiensis ATCC 31947T produit un complexe d’antibiotiques de nature aminoglycoside (Labeda et al., 1984, Labeda, 2001); S. cryophilis NRRL B-16238T produit le dopsisamine; S. aerocolonigenes NRRL B-3298T produit le rebeccamycine (Labeda et Lyons, 1989). S. violacea LM 036T et S. albidocapillata DSM 44073T sont actives contre des bactéries pathogènes à coloration de Gram positive et contre des champignons (Lee et al., 2000); S. algeriensis SA 233T produit au moins cinq antibiotiques dithiolopyrrolone qui sont: la thiolutine, le senecioyl-pyrrothine, le tigloyl- pyrrothine, l’isobutyryl-pyrrothine et le butanoyl-pyrrothine (Zitouni et al., 2004; Bouras et al., 2006); S. espanaensis NRRL 15764T produit un antibiotique de nature polysaccharide faiblement basique le LL-C19004; S. mutabilis NRRL B-16077T produit la polynitoxine; S. variisporea NRRL B-16296T et S. mutabilis ssp. capreolus NRRL 2773T produisent le capréomycine (Kim et al., 2011); S. tangerinus MK27-91F2T produit la formamicine (Kinoshita et al., 1999). Les souches de ce genre, isolées des sols sahariens algériens, sont actives contre beaucoup de bactéries et des champignons pathogènes (Zitouni et al., 2004; Bouras et al., 2006). D’autres activités biologiques sont présentes chez ce genre, par exemple l’espèce S. xinjiangensis PYX-6T dégrade des composés poly-aromatiques comme le pyrène, l’anthracène et le phénanthrène, et les utilisent comme seuls sources de carbone et d’énergie (Hu et al., 2004).

1. Isolement, purification et conservation L’isolement et l’identification phénotypique des isolats d’actinomycètes ont été réalisés au niveau du laboratoire de génie microbiologique et applications, Université Constantine 1. 1.1. Prélèvements Les prélèvements ont été effectués, du 01 Février 2005 au 15 Décembre 2007, à partir de malades, admis en hospitalisation pour infections, au niveau du service des maladies infectieuses de l’Hôpital Universitaire de Constantine (C.H.U.), Algérie. Des informations sur chaque patient sont rassemblées par le médecin traitant, en remplissant une fiche de renseignement détaillée (annexe 1), cette fiche a été conçue, dans le cadre d’une étude épidémiologique des infections aux actinomycètes aérobies, par l’équipe du laboratoire de mycologie fondamentale et appliquée aux biotechnologies industrielles de la faculté de pharmacie (Lyon, France) dirigée par le professeur P. Boiron. Les renseignements recueillis sont l’âge, le sexe, le lieu de provenance ; des donnés cliniques comme la thérapie avec immunosuppresseurs et des maladies comme le diabète, le cancer ; les signes de la maladie et le diagnostic probable. La nature du produit pathologique prélevé dépend du cas du malade: -crachats, fluide gastrique et liquide pleural, en cas de localisation pulmonaire de l’infection; -pus d’abcès, s’il s’agit d’une atteinte cutanée, sous-cutanée ou lymphocutanée; -liquide céphalorachidien, s’il y a suspicion d’une maladie disséminée; -d’autres prélèvements sont aussi récoltés comme le liquide d’ascites et les urines. Notant que nous avons analysé, uniquement, les prélèvements prescrits par le médecin traitant. 1.2. Examen microscopique Les échantillons prélevés sont transportés immédiatement, de l’hôpital au laboratoire, dans une glacière à 4 °C. L’examen direct des prélèvements est effectué dés l’arrivé au laboratoire. Après homogénéisation avec le vortex, une goutte du prélèvement est déposée sur une lame stérile, recouverte avec une lamelle et observée au microscope optique avec le grossissement x 100. La coloration de Gram (Gerhardt et al., 1994) et la coloration de Ziehl Neelsen (Gordon et Smith, 1984), ont été réalisées parallèlement à l’examen direct, les méthodes détaillées sont données en annexe 2. 1.3. Ensemencement et culture Le diagramme donné dans la figure 18 montre les étapes de l’isolement. Le crachat, le fluide gastrique, le pus d’abcès et les urines sont, au préalable, enrichis dans du bouillon Carbone-Free (annexe 3) avant d’être ensemencés sur les milieux d’isolement. Le

55 liquide pleural, liquide d’ascites et le liquide céphalorachidien, réputés stériles, sont ensemencés directement (McClung, 1960; McNeil et Brown, 1994). L’ensemencement de tous les prélèvements se fait, d’une part, sur des milieux d’isolement non sélectifs: Bennett-Agar et Sabouraud-Dextrose-Agar (Gordon et Mihm, 1956), additionnés d’antibiotiques (la nystatine 50 µl/ml et l’acide nalidixique 10 µl/ml) (Ara et Kudo, 2006; Ara et al., 2007; Kirby et al., 2006; Yamamura et al., 2010; Camas et al., 2013) et, d’autre part, sur le milieu sélectif, Paraffine-Agar (Ayyar et al., 1992). En cas de forte contamination des échantillons, la concentration de l’acide nalidixique, d’une part, est introduite dans le milieu d’isolement à 20 µg/ml et d’autre part, le cyclohéximide est utilisé comme agent sélectif à une concentration de 50 µg/ml avec la nystatine et l’acide nalidixique (Ara et Kudo, 2006; Ara et al., 2008; Yamamura et al., 2010). Pour chaque prélèvement, deux boites des différents milieux de culture sont ensemencées. La composition des milieux de culture est donnée dans annexe 3. Les boites ensemencées sont scellées avec du parafilm, pour prévenir la déshydratation (McNeil et Brown, 1994), puis elles sont incubées à 28 et à 37 °C en aérobiose. La durée d’incubation est de 3 à 5 jours. Au bout de cinq jours, les cultures négatives sont incubées jusqu’à 4 ou 6 semaines en faisant des lectures chaque semaine (McNeil et Brown, 1994; Hidri et al., 2000; Rodríguez-Nava et al., 2008). Toutes les colonies apparues dans les boites sont examinées, dés la première semaine, avec un microscope optique au grossissement x10, pour détecter le mycélium caractéristique des colonies des actinomycètes aérobies (Zenova et Zvyagintsev, 2002). 1.4. Purification et conservation Les colonies d’actinomycètes isolées sont séparées selon leur morphotype (couleur, aspect et texture) à la maturité (incubation jusqu’à 21 jours), purifiées par un repiquage successif sur le même milieu d’isolement et codifiées comme suit: -l’abréviation de la nature du prélèvement (crachat: C, fluide gastrique: FG, pus d’abcès: P, liquide pleural: LP, liquide céphalorachidien: LCR, urines: U); -l’abréviation du milieu de culture (Bennett’s-Agar: B; Sabouraud-Dextrose-Agar: S; Paraffine-Agar: P). -le numéro du patient; -les lettres a et b, pour désigner les souches isolées du même prélèvement et sur le même milieu. Les colonies d’actinomycètes aérobies pures subissent une coloration de Gram et de Ziehl-Neelsen (annexe 2) puis conservées par trois techniques:

-conservations des spores et des fragments mycéliens dans du glycérol à une concentration de 20 % (V/V) à -20 °C (Hozzein et Goodfellow, 2008); -conservation par culture sur une gélose inclinée du même milieu d’isolement à 4 °C (Xu et al., 2012); -conservation sur le milieu d’isolement en boites de Pétri scellées avec du parafilm à 4 °C (Zitouni et al., 2004; Chen et al., 2008). Pour la première technique la conservation peut durée plusieurs années, pour les deux dernières un repiquage est nécessaire chaque trois mois.

Figure 18. Schéma des étapes de l’isolement des souches d’actinomycètes aérobies

2. Caractérisation phénotypique 2.1. Préparation des inocula Trois types d’inocula sont préparés: -un inoculum général, -un inoculum lavé pour l’utilisation des substrats carbonés, -un inoculum, dit en suspension, pour le test de sensibilité aux antibiotiques et les tests Api 20NE. 2.1.1. Inoculum général

Les isolats d’actinomycètes sont ensemencés sur le milieu ISP2 gélosé (annexe 3), dans des tubes en plan incliné ou des boites de Pétri, puis incubés pendant 21 jours. La surface des colonies est raclée pour récupérer les spores et fragments mycéliens dans de l’eau physiologique stérile (Shirling et Gottlieb, 1966). 2.1.2. Inoculum lavé 5 ml de l'inoculum général sont introduits dans un Erlen Meyer de 250 ml contenant

50 ml du milieu ISP1 (annexe 3) puis incubés au bain-marie agitateur à 200 rpm pendant 72 heures. La culture est centrifugée stérilement pendant 10 mn à 13000 g. Le surnageant est écarté et le culot est lavé deux fois avec de l’eau physiologique stérile (Shirling et Gottlieb, 1966). 2.1.3. Inoculum en suspension Les isolats d’actinomycètes sont cultivés 3 à 7 jours sur milieu Gélose au sang de mouton (annexe 3). Avant sporulation, une suspension dense des cellules est préparée dans des tubes d’Eppendorf, à laquelle sont ajoutées quelques billes en verre stériles (3 à 5 mm de diamètre), la suspension de cellules est émulsionnée par agitation avec le vortex. Centrifugée 10 mn à 13000 g et laissée sédimenter, puis le surnageant est retiré délicatement; le reste est utilisé pour préparer des suspensions dans de l’eau physiologique stérile: quelques gouttes de cette suspension de cellules sont mélangées avec 5 ml d’eau distillée stérile. La turbidité, après agitation avec le vortex, est vérifiée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 610 nm pour standardiser les autres solutions à préparer (Chen et al., 2009; Conville et al., 2012). 2.2. Optimisation des conditions de croissance La détermination de la température optimale et du pH optimum, de la croissance, de chaque isolat est nécessaire pour la suite de notre étude.

2.2.1. Température

Pour chaque isolat, des boites du milieu ISP2 sont ensemencées avec le même inoculum, puis incubées, en même temps, aux températures suivantes: 4, 10, 25, 28, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55 et 60 °C. L’estimation de la croissance, pour les incubations de 4 à 40 °C, est déterminée après 5 ou 7 jours. Pour les températures supérieures à 40 °C, les boites sont incubées pendant 3 autres semaines (Gordon et Mihm, 1957). 2.2.2. Potentiel d’hydrogène

Chaque isolat est ensemencé en touches sur le milieu ISP2, tamponné par des solutions de K2HPO4 ou de KH2PO4 à 100 mM de concentration, à des pH allant de 5 à 11 avec un intervalle de 0,5 unité. Le pH final de ces milieux est ajusté juste avant stérilisation. La croissance est évaluée visuellement après 5 à 7 jours d’incubation. Trois niveaux d'appréciation sont retenus: une croissance faible ou absente (±), une croissance moyenne (+ ou + +), une bonne croissance (+ + +) (Qin et al., 2009). 2.3. Caractères culturaux et macromorphologie Les milieux les plus recommandés pour la caractérisation morphologique exacte des actinomycètes sont ceux de l’ « International Streptomyces Project »: ISP2, ISP3, ISP4 et ISP5 (Shirling et Gottlieb, 1966) et le milieu Bennett’s-Agar (Kirby et al., 2006; Hozzein et Goodfellow, 2008; Zhang et al., 2012; Camas et al., 2013). La composition des milieux est donnée en annexe 3. Ces milieux sont stérilisés et répartis en boîtes de Pétri, puis incubées pendant 24 heures à 28 °C afin de contrôler leur stérilité. Deux boîtes pour chaque milieu sont ensemencées. Après 7, 14 et 21 jours d’incubation, l’importance de la croissance et le développement du mycélium aérien sur chaque milieu sont observés. La pigmentation du mycélium aérien et celui du substrat (le dos de la colonie) et la présence de pigments diffusibles sont notées (Shirling et Gottlieb, 1966). 2.4. Micromorphologie La morphologie des chaines de spores doit être déterminée par l’observation d’une culture complètement mature et avec une bonne sporulation, mais avant dénaturation. Deux techniques sont employées pour observer la morphologie du mycélium aérien et celui de substrat. Les photographies des structures caractéristiques sont prises avec un appareil photographique modèle SONY 7.2 méga pixels, avec un zoom optique de x4 à x6. 2.4.1. Culture sur lame Les isolats sont ensemencés, à raison d'une goutte de l'inoculum général, sur une portion rectangulaire d'agar de 1 cm x 1 cm x 2 mm d'un milieu de culture solide ISP2, ISP3,

ISP4 ou ISP5 . Ce rectangle est déposé sur une lame puis recouvert avec une lamelle. La culture sous forme de sandwich (figure 19) est incubée pendant 14 à 21 jours. L'observation

60 se fait avec un microscope optique (grossissement x 100). Cette technique ne permet que l’observation du mycélium aérien (Holt et al., 1994; Zaitlin et al., 2003). 2.4.2. Culture sur lamelle Cette technique consiste à insérer, délicatement, une lamelle stérile dans un milieu gélosé (ISP2, ISP3, ISP4 ou ISP5) de telle sorte qu'elle forme un angle de 45° avec la surface de celui-ci (figure 20). Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en contact avec le milieu. Après 14 jours d’incubation à la température optimale, la lamelle est retirée soigneusement de la gélose, entraînant avec elle des fragments des mycéliums de substrat et aérien non-dénaturés, elle est ensuite déposée sur une lame puis examinée au microscope optique (grossissement x 100) (Holt et al., 1994).

Figure 19. Technique de culture sur lame (Holt et al., 1994) a: mycélium aérien, b: mycélium de substrat dans l'agar

Figure 20. Technique de culture sur lamelle (Holt et al., 1994)

2.5. Chimiotaxonomie Les différents isomères de l’acide 2,6-diaminopimélique ainsi que les sucres pariétaux sont déterminés par analyse chromatographique de l'hydrolysat acide des cellules entières, la préparation et l'hydrolyse des cellules est réalisée selon la technique de Becker et al. (1964), la chromatographie sur couches minces selon la technique de Staneck et Roberts (1974).

2.5.1. Préparation des cellules

50 ml du milieu ISP2 liquide sont ensemencés à raison de 1 % d’inoculum général, puis incubés pendant 14 jours à la température optimale de croissance, avec agitation (250 rpm). Les cellules sont récupérées par centrifugation à 10000 g pendant 20 mn, puis lavées trois fois avec de l’eau physiologique stérile. Ces dernières sont traitées pendant 24 heures à la potasse éthanolique (0,5 % P/V) à 37 °C, lavées avec de l’éthanol puis récupérées par centrifugation à 10000 g pendant 15 mn et séchées à 30 °C. 2.5.2. Hydrolyse acide des cellules -pour les acides aminés Dans un tube scellé, 20 à 30 mg de mycélium sec sont hydrolysés avec 1 ml d’acide chlorhydrique (6 N) pendant 18 heures à 100 °C. L'hydrolysât est filtré, ensuite évaporé à sec au bain-marie à 100 °C. Le résidu est dissout dans 1 ml d’eau distillée puis soumis à une nouvelle évaporation, ce traitement est répété plusieurs fois jusqu’à obtention d’un pH compris entre 5,5 et 7,0 qui est vérifié par l’utilisation du rouge de phénol comme indicateur de pH. Les débris sont éliminés par centrifugation pendant 15 mn à 18000 g et le surnageant est à nouveau évaporé. Le résidu final, exempt d’acide chlorhydrique, est finalement repris dans 0,3 ml d’eau distillée. -pour les sucres 50 mg de mycélium sec sont hydrolysés avec 1 ml d’acide sulfurique (2 N) dans un tube scellé à 100 °C pendant 2 heures. L'hydrolysat est ajusté à pH 5-5,5 avec une solution saturée de Ba(OH)2 en présence du rouge de méthyle comme indicateur de pH. Le précipité de

BaSO4 obtenu est éliminé par centrifugation à 15000 g pendant 10 mn. Le surnageant est évaporé, le résidu final est repris dans 0,4 ml d’eau distillée. 2.5.3. Chromatographie sur couche mince -pour les acides aminés 2 µl de l'hydrolysat cellulaire sont déposés sur une plaque de cellulose (Merck 1.05552.) ainsi qu’1 µl des solutions témoins: la lysine, la glycine, l’alanine, la glutamate, l’acide aspartique et les isomères LL et méso de l’acide diaminopimélique, seuls ou en mélange, tous ces acides aminés sont préparés en solutions de 0,01 M. Après 3 à 4 heures de migration par le système de solvants méthanol-eau-HCl 6 N-Pyridine (40 : 13 : 2 : 5, V/V), le chromatogramme obtenu est séché à une température ambiante puis révélé par pulvérisation d'une solution acétonique à 0,2 % de ninhydrine et chauffage à 100 °C pendant 5 mn.

-pour les sucres 1 µl de l'hydrolysat cellulaire est déposé sur une plaque de cellulose (Merck 1.05552.) ainsi qu’1 µl des solutions à 1 % (P/V) des sucres témoins: glucose, arabinose, madurose, xylose et galactose à 0,1 % (P/V), seuls ou en mélange. Après 4 heures de migration par le système de solvant n-butanol-eau distillée-pyridine-toluène (10 : 6 : 6 : 1, V/V), le chromatogramme est séché à température ambiante. La révélation des spots se fait par pulvérisation d'une solution aniline-acide phtalique (2 ml d’aniline, 3,30 g d’acide phtalique, 100 ml de n-butanol saturé d’eau) suivi d'un chauffage à 100 °C pendant 4 mn. 2.6. Physiologie Pour chaque isolat, selon le genre identifié, les tests physiologiques discriminants qui aident à la détermination des espèces sont choisis. Les différents tests ont tous été effectués à partir de l’inoculum général sauf pour le test de l’utilisation des substrats carbonés dans le quel on utilise l’inoculum lavé, et le test de sensibilité au antibiotiques et les Api 20NE on ensemence avec l’inoculum en suspension. 2.6.1. Production du pigment mélanoïde La mise en évidence de la production de ce pigment (pigment brun diffusible) est réalisée par culture sur le milieu gélosé ISP7 (annexe 3). Deux boîtes pour chaque isolat sont ensemencées à raison d'une goutte de l'inoculum, une boite de milieu stérile est incubé dans les mêmes conditions sert de témoins négatif. La production est appréciée après 2 et 4 jours d’incubation (Shirling et Gottlieb, 1966). 2.6.2. Hydrolyse de la caséine Les isolats sont ensemencés sur le milieu au lait écrémé (annexe 3), après 7 et 14 jours d’incubation, l’hydrolyse de la caséine est observée par l’apparition des zones claires sous et/ou autour des colonies (Berd, 1973). 2.6.3. Hydrolyse de la gélatine Deux boites du milieu de l’hydrolyse de la gélatine (annexe 3) sont ensemencées. Après 5 jours d’incubation une boite est recouverte avec la solution au chlorure de mercure (annexe 4); l’hydrolyse de la gélatine est observée par l’apparition de zones claires sous et/ou autour des colonies; si le test est négatif le milieu reste blanc avec un précipité opaque. La deuxième boite est testée après 10 jours d’incubation (Gordon et Mihm, 1956). 2.6.4. Hydrolyse de l’amidon Le milieu utilisé pour l’hydrolyse de l’amidon est le même que celui utilisé pour l’hydrolyse de la gélatine avec la substitution de la gélatine par 10 g d’amidon (annexe 3). Deux boites par isolat sont ensemencées. Après 5 jours d’incubation, une boite est recouverte avec 8 à 10 ml d’une solution d’iodine de la coloration de Gram (Lugol) (annexe

4), la deuxième est testée après 10 jours d’incubation. Une zone claire indique la présence d'une hydrolyse alors que l'apparition d'une couleur bleu signifie que l'amidon n'a pas été hydrolysé (Gordon et Mihm, 1956). 2.6.5. Hydrolyse de la tyrosine, xanthine et hypoxanthine L’isolat est ensemencé sur le milieu Nutrient-Agar additionné de ces substrats (annexe 3). Le test est positif lorsqu’il y a apparition de zones claires sous et/ou autour des colonies. L’hydrolyse de la tyrosine et de l’hypoxanthine sont observées au bout de 4 semaines d’incubation, alors que pour la xanthine, la durée d’incubation est de 3 semaines (Berd, 1973; Gordon et al., 1974). 2.6.6. Hydrolyse de l’urée Le test de l’hydrolyse de l’urée est réalisé sur le milieu Urée-Agar (annexe 3). Après incubation, le virage de la couleur indique que le test est positif. L’hydrolyse de l’urée est testée aussi avec la galerie Api 20E (annexe 5). 2.6.7. Hydrolyse du Tween 80 L’hydrolyse du Tween 80 est mise en évidence après ensemencement des isolats sur le milieu de Sierra (1957) (annexe 3). Après 3 à 9 jours d’incubation, l’apparition d’un halo opaque autour de la colonie indique un test positif (Delmotte, 1958). 2.6.8. Production de la catalase Sur une lame en verre, une ou deux gouttes d’une solution à 3 % de peroxyde d’hydrogène est déposée, puis un fragment de la colonie est dissocié dans ces gouttes. La présence de la catalase se traduit, en quelques secondes, par la formation de bulles d'oxygène (Lee et al., 2000). 2.6.9. Production de l’oxydase Un fragment de colonie est dissocié dans une solution de tetramethyl-p- phenylènediamine à 1 % (P/V). La présence de la cytochrome oxydase se traduit par l'apparition d'une coloration rouge virant rapidement au violet très foncé (Lee et al., 2000). 2.6.10. Utilisation du citrate Ce test est réalisé par ensemencement du milieu citrate de Simmons en tubes de gélose inclinée qui est de couleur verte due à la présence de l’indicateur coloré: le bleu de bromotymol. Après 5 jours d’incubation, l’apparition d’une couleur bleu indique l’utilisation du citrate avec production de bases (Wauters et al., 2005).

2.6.11. Tolérance au chlorure de sodium La tolérance au chlorure de sodium est contrôlée sur le milieu Peptone-Extrait de levure (annexe 3), préparé avec les concentrations de 0 à 20 %, avec un intervalle de 1 %. Après 5 à 10 jours d’incubation, la concentration la plus élevée dans la quelle il y a une croissance est notée. Dans la majorité des cas il n’y a pas une limite bien définie entre la présence d’une croissance et son absence; souvent il y a une bonne croissance et formation d’un mycélium aérien (++), après la formation du mycélium aérien diminue et nous observons une bonne croissance du mycélium de substrat (+). En présence, d’une concentration élevée en NaCl, la croissance du mycélium de substrat s’arrête (-) (Kutzner, 1981). 2.6.12. Réduction des nitrates Les isolats sont inoculés dans le milieu liquide Peptone-Extrait de bœuf (annexe 3). Après 5, 10 et 14 jours d’incubation, 1 ml du bouillon de culture est prélevé et introduit dans d’autres tubes stériles. À chaque prélèvement, 3 gouttes de la solution 1 et 2 sont ajoutés (annexe 4). La présence des nitrites est indiquée par l’apparition d’une couleur rouge. S’il y a absence de nitrite au bout de 14 jours, 4 à 5 mg de la poudre de zinc sont ajoutés aux tubes préalablement testés, le zinc réduit le nitrate s’il est présent et donne une couleur rouge, si le test est négatif (pas de couleur rouge), donc la bactérie a réduit le nitrate en nitrites (Gordon et Mihm, 1957). 2.6.13. Utilisation des substrats carbonés La capacité des isolats à utiliser les substrats carbonés est déterminée par la méthode de Shirling et Gottlieb (1966) avec le milieu de base ISP9 (annexe 3), les substrats suivants sont testés: glucose, arabinose, saccharose, xylose, m-inositol, mannitol, fructose, rhamnose, raffinose, ribose, maltose, lactose, sorbitol et glycérol. Le milieu avec le glucose représente le témoin positif; le milieu sans substrat carboné représente le témoin négatif. Ainsi, la croissance est indiquée par: - (-) si elle est inférieure au contrôle négatif; - (F) si elle est un peu supérieure au contrôle négatif et inférieure au contrôle positif; - (+) si elle est comme ou supérieure au contrôle positif. 2.6.14. Tests biochimiques API 20NE Des tests supplémentaires sont réalisés par l’ensemencement des API 20NE (annexe 5), les galeries sont ensemencées par l’inoculum en suspension. L’incubation est de 3 à 5 jours (Qin et al., 2009).

2.7. Sensibilité aux antibiotiques La mise en évidence de la sensibilité des isolats d’actinomycètes aérobies à différents antibiotiques est basée sur la méthode de l’antibiogramme par diffusion en milieu gélosé. Les différents antibiotiques testés appartiennent aux classes des β-lactamines, aminosides macrolides et fuoroquinoles. Une suspension en eau physiologique, à une densité optique de 0,1, est préparée à partir de l’inoculum en suspension; la suspension, ainsi obtenue, est diluée au 1/100e avant d’être ensemencée par inondation ou par écouvillonnage sur le milieu Bennett’s-Agar. Une fois que la surface gélosée est sèche, les disques d’antibiotiques sont déposés sur la gélose. Après une pré-diffusion des antibiotiques pendant 30 mn à température ambiante, les boites de Pétri sont incubées pendant une semaine à la température optimale de chaque isolat (Conville et al., 2012). Les diamètres critiques des zones d’inhibitions (mesurés en millimètre) sont déterminés selon les indications du comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie (Cavallo et al., 2008). Ces diamètres permettent de classer les isolats d’actinomycètes aérobies en trois catégories: sensibles (S), résistantes (R) et intermédiaires (I). Les critères de catégorisions sont déterminés selon des valeurs critiques des concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques testés et les diamètres d’inhibitions correspondants selon le tableau 8. Les concentrations et les diamètres critiques des antibiotiques testés sont donnés en annexe 6. Tableau 8. Critères de catégorisation selon les valeurs critiques des diamètres d’inhibition Catégorie CMI (mg/L) Diamètre (Φ) (mm) S CMI < c Φ > D R CMI > C Φ < d I c < CMI < C d < Φ < D S: sensible, R: résistant, I: intermédiaire, c: concentration critique basse correspondant au diamètre critiques D, C: concentration critique haute correspondant au diamètre critique d

2.8. Test d’activité antimicrobienne 2.8.1. Souches tests Les isolats d'actinomycètes sont testés pour la production des substances inhibitrices vis-à-vis de cinq souches bactériennes (trois à coloration de Gram négative et deux à coloration de Gram positive), et de quatre souches de champignons filamenteux. Les bactéries tests proviennent de la collection américaine et nous ont été fournies par le laboratoire de bactériologie du C.H.U. de Constantine: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 et des isolats cliniques

Bacillus cereus et Salmonella enteritidis. Les champignons-tests sont des souches de collection de l’institut Pasteur: Aspergillus niger CIP 1431.83, Aspergillus fumigatus CIP 1082.74, Trichophyton rubrum CIP 2043.92 et Fusarium oxysporum CIP 625.72. 2.8.2. Activité antibactérienne Pour chaque bactérie-test, un inoculum est réalisé à partir d’une culture de 24 heures, mis en suspension dans de l'eau physiologique stérile de telle manière à obtenir une densité optique entre 0,1 et 0,2 à une longueur d'onde de 620 nm (Cavalla et Eberlin, 1994). L’activité antibactérienne est testée par la technique des cylindres d’agar. Dans cette technique, les isolats d’actinomycètes sont ensemencés en stries serrées sur des boîtes de Pétri contenant le milieu Bennett’s-Agar. Après 12 à 14 jours d’incubation des cylindres d’agar de 6 millimètres de diamètre sont prélevés, déposés sur le milieu Muller-Hinton préalablement ensemencés en surcouche par les bactéries-tests, dont la couche supérieure est faiblement gélosée. L'ensemble est placé dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 2 heures pour permettre aux substances actives de diffuser dans la gélose, ensuite les boîtes sont incubées à 37 °C pendant 24 heures, les diamètres des zones d’inhibitions apparues sont mesurés en mm (Shomura et al., 1979; Saadoun et Al moumani, 1997; Petrosyan et al., 2003). 2.8.3. Activité antifongique Les champignons tests sont ensemencés sur le milieu Sabouraud, et ils sont incubés à une température de 28 °C pendant 5 jours. L’activité antifongique est testée selon le protocole d’antagonisme qui consiste à prélever des cylindres d’agar de 17 mm de diamètre à partir de cultures d’actinomycètes, et de les déposer aux extrémités de la boite de Pétri contenant le milieu de Sabouraud-Agar stérile, dont la couche supérieure est faiblement gélosée. Ensuite, un cylindre de 6 mm de diamètre prélevé à partir de cultures des champignons filamenteux tests est déposé au centre de la boite de Pétri. L’ensemble est placé dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 2 heures, ensuite les boites sont incubées à 28 °C pendant 3 jours. Le test est positif lorsqu’il y a une inhibition de la croissance du mycélium de la moisissure autour des cylindres d’actinomycètes (Hwang et al., 2001; Woo et al., 2002). Notes techniques: -pour éviter la déshydratation rapide du milieu de culture lors de l’incubation à une température plus de 40 °C, les boites sont mises dans des bacs contenant de l’eau distillée stérile au fond. -les milieux pour le test de tyrosine, xanthine et hypoxantine doivent être coulé dans les boites sous une agitation constante de façon à obtenir une répartition uniforme des poudres et ainsi être d'apparence opaque. -le test de l’hydrolyse de l’amidon peut être aussi révélé avec une solution d’alcool à 95 %.

Dans ce cas, les zones claires autour des colonies indiquent un test positif comparativement avec le milieu stérile opaque. -pour les tests API 20NE il y a risque de ne pas avoir un résultat s’il y a la formation d’une couche du mycélium sporulé à la surface du puits, ce qui empêche l’aération. Pour prévenir ce problème, il faut mélanger chaque jour pendant la période d’incubation avec le bout d’une pipette pasteur les cellules qui flottent à la surface des puits. -pour prévenir la déshydratation les API 20NE sont mises dans une boite en plastique fermée.

-pour les tests où on a fait les cultures sur le milieu ISP2 on peut aussi utiliser le milieu Bennett’s-Agar. -l’agitation au bain mari peut être de 100 jusqu’à 250 r.p.m. -une autre méthode pour tester la sensibilité aux antibiotiques, est d’incorporer l’antibiotique voulu dans le milieu de culture pour actinomycètes.

3. Caractérisation phylogénique Au niveau de l’unité des Rickettsies de la faculté de médecine, Université de la Méditerranée (Marseille), la caractérisation phylogénique des isolats purs a été réalisée par des techniques adaptées et optimisées sous la direction de Mr. le professeur D. Raoult. 3.1. Extraction de l’ADN Les isolats d’actinomycètes sont ensemencés sur le milieu Gélose au sang de mouton (annexe 3) et incubées jusqu’au stade de jeunes colonies non sporulées (2 à 5 jours) puis ils sont, éventuellement, repiquées jusqu’à obtention de colonies pures. La pureté est vérifiée par microscopie optique. L’ADN a été extrait par deux techniques: 3.1.1. Extraction avec de l’eau pure Dans un tube d’Eppendorf 2 ou 3 colonies de 5 mm de diamètre sont mélangées avec 300 µl d’eau pure stérile, écrasées pendant 2 mn avec le bout d’une anse de platine puis agitées avec le vortex et, enfin, le mélange est centrifugé, le surnageant contenant l’ADN est récupéré. 3.1.2. Extraction à l’aide du Kit « MagNA Pure LC DNA isolation Kit III » Ce kit est destiné pour les bactéries et les mycètes (PG 0212/Roche), la composition est donnée dans le tableau 9. Il est employé avec un système complètement automatisé (MagNA Pure LC 2.0) pour l’isolement des acides nucléiques avec une purification à haute qualité, en utilisant la technologie de micro-billes en verre avec force magnétique selon les étapes suivantes, élucidées dans la figure 21.

Tableau 9. Composants du Kit de l’extraction de l’ADN « MagNA Pure LC DNA » Composant Fonction Tampon de lavage I Élimine les inhibiteurs de la PCR Tampon de lavage II Élimine les sels et protéines Tampon de lavage III Élimine les sels Tampon de lyse/adhésion Lyse des cellules et adhésion d’ADN Suspension de billes en verre magnétiques Adhésion de l’AND Tampon d’élution Élution de l’ADN pur Reconstitution de la protéase K Dilution de l’éluât (optionnel) Tampon de lyse de bactéries Lyse efficace des bactéries Protéase K Digestion des proteins

3.1.2.1. Lyse des cellules Dans un tube Eppendorff, une colonie de 5 mm de diamètre (ou deux si elles sont de petites tailles) est introduite, à laquelle est ajouté 260 µl du tampon de lyse contenant un sel chaotropique pour détruire la structure tridimensionnelle des macromolécules, 40 µl de protéase K pour digérer les protéines et quelque billes en verre (600 µm de diamètre, acid-

69 washed, Sigma). Cette préparation est agitée, rigoureusement, pendant 2 mn avec le mixeur « Fast Prep-24 » qui est un instrument d’homogénéisation à de très hautes vitesses pour assurer la cassure des parois cellulaires, puis l’homogénéisât est chauffé pendant 10 mn à 70 °C au bain à sec (figure 21a). 3.1.2.2. Adhésion aux micro-billes et séparation de l’ADN L’homogénéisât est mis dans le « Magna Pure LC 2.0 » auquel est ajouté la suspension de micro-billes en verre du kit. L’ADN adhère à la surface des billes, cette adhésion est favorisée, d’une part, par l’agent chaotropique et l’isopropanol et d’autre part, à la haute force ionique du tampon. Les billes, avec l’ADN attaché, sont séparées magnétiquement des débris résiduels de la lyse (figure 21b). 3.1.2.3. Lavage avec tampons et récupération des micro-billes et ADN Les micro-billes en verre avec l’ADN attaché sont lavées plusieurs fois avec les tampons de lavage qui éliminent les substances non adhérentes comme les protéines (nucléases) et les membranes, et réduisent la concentration de sels chaotropiques (figure 21b). Les micro-billes avec l’ADN sont séparées du tampon de lavage, contenant les débris résiduels, par réduction de la force magnétique (figure 21b). 3.1.2.4. Élution et élimination des micro-billes magnétiques L’ADN pur est élué, des micro-billes, par un tampon de faible salinité, il est récupéré à raison d’un volume de 100 µl et conservé à 4 °C jusqu’à caractérisation (figure 21b). 3.2. Amplification de l’ADNr 16S L’ADN extrait est amplifié, selon la méthode de Lascolat et Raoult (1998), par l’utilisation des amorces universelles (Eurogentec, Seraing, Belgium) suivantes:

-fD1 (5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’),

-rP2 (5’ ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT 3’). L’amplification par PCR est réalisée dans un volume total de 50 µl (45 µl du mélange réactionnel et 5 µl de l’ADN). Le mélange réactionnelle contient: les dNTP (A, T, C et G) (5

µl), Mg Cl2 (2 µl), « hot start polymerase » (0,25 µl), tampon (5 µl), amorce fD1 (1 µl), amorce rP2 (1 µl), eau pure (30,25 µl) et l’ADN (5 µl). La PCR est accomplie selon le programme suivant: dénaturation initial 15 mn à 95 °C, suivi par 35 cycles d’une dénaturation 1 mn à 95 °C, un alignement 30 s à 62 °C et une extension 1 mn à 72 °C, une étape d’extension additionnelle 5 mn à 72 °C. À chaque réaction de PCR, un contrôle négatif (mélange réactionnel sans ADN) est soumis aux mêmes conditions. L’amplification est réalisée dans un thermo-cycler type « Perkin-Elmer 9600 ».

Figure 21. Étapes d’extraction de l’ADN par le kit « MagNA Pure LC »

a: lyse des cellules, b: séparation et purification de l’ADN

3.3. Électrophorèse sur gel d’agarose L’amplicon (produit de l’amplification) subi une électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 %. (annexe 7). 6 µl de l’amplicon sont mélangés avec une goutte du bleu bromophénol, ce volume sert à remplir les puits du gel, dans le premier puits un marqueur de poids moléculaires avec une échelle de 100 pb est déposé. Le gel, ainsi préparé, est déposé dans le générateur d’électrophorèse recouvert avec le tampon TAE, l’appareil est réglé à 135 V pendant 15 mn. Le bromure d’éthydium est un marqueur d’acides nucléiques, il aide à la révélation des bandes présentes sur le gel d’agarose avec une lumière ultra violette. Le gel est photographié à laide d’un appareil photographique numérique (photographies des électrogrammes sont données en annexe 8). 3.4. Purification de l’amplicon La purification de l’amplicon se fait par ultrafiltration sur membrane « NucleoFast 96 PCR » (Macherey-Nagel, Germany), permettant de purifier les produits de PCR d’une taille supérieur à 150 pb. 50 µl de l’amplicon sont mélangé avec 50 µl d’eau pure, puis ce volume est transféré dans la plaque « NucleoFast ». La plaque est mise sous une pression entre 400-600 mbar pendant 10 à 15 mn (ou bien on fait une centrifugation à 4500 g), ainsi les impuretés sont filtrés et l’amplicon reste sur la membrane. L’ADN est récupéré par l’addition de 50 µl d’eau pure à la membrane portant l’ADN, l’ensemble est agité pendant 10 mn à 500 r.p.m. (figure 22). L’ADNr 16S amplifié et purifié est congelé jusqu’à utilisation.

Figure 22. Purification du produit de PCR par ultrafiltration

3.5. Séquençage de l’ADNr 16S Les différentes étapes du séquençage sont élucidées dans la figure 23. Le mélange réactionnel contient: l’ADNr 16S, les amorces, les dNTP, la Taq polymérase et les ddNTP fluoresçents. La synthèse s’arrête de façon aléatoire et des fragments d’ADN de différentes tailles sont obtenus. Leurs tailles sont définies par une chromatographie d’exclusion moléculaire par un séquenceur, celui-ci détecte la fluorescence sortant des colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et leurs tailles précises. Le résultat est présenté sous forme d’un chromatogramme. 3.5.1. Amplification en présence des ddNTP (figure 23a) L’ADNr 16S est amplifié par l’utilisation de six amorces d’oligonucléotides qui permettent le séquençage de toute sa longueur (approximativement 1500 pb), ces amorces sont: -536f (5’CAG-CAG-CCG-CGG-TAA-TAC3’), -536r (5’GTA-TTA-CCG-CGG-CTG-CTG3’), -800f (5’ATT-AGA-TAC-CCT-GGT-AG3’), -880r (5’CTA-CCA-GGG-TAT-CTA-AT3’), -1050f (5’TGT-CGT-CAF-CTC-GTG3’), -1050r (5’CAC-GAG-CTG-ACG-ACA3’).

Le kit (Big Dey Terminator, V 1.1, 5x sequencing buffer, P/N 4339843, L/N 0907114), contenant les dNTP, ddNTP et la Taq polymérase, est utilisé. Le mélange réactionnel de la PCR a un volume total de 10 µl, contenant: tampon du kit BDV1 (1,5 µl), le kit Big Dey Terminator (1 µl), amorce (0,5 µl), eau pure (3 µl), ADN (4 µl). Six tubes de PCR pour chaque isolat sont préparés. La PCR est réalisée dans un thermo-cycler type « Perkin-Elmer 9600 », programmé ainsi: -une dénaturation initiale d’1 mn à 96 °C, -suivi par 25 cycles de dénaturation, 10 s à 96 °C par cycle, -alignement 5 s à 50 °C, -une extension 3 mn à 60 °C. Après l’amplification 10 µl d’eau pure sont rajoutés dans chaque mélange, le volume total de l’amplicon est, alors, de 20 µl. 3.5.2. Purification sur résine Sephadex G50 Cette étape à pour but de purifier par gel-filtration les produits de l’amplification. La résine Sephadex G50 utilisée permet de déssaler les échantillons et d’éliminer les nucléotides, en excès, non incorporés et les amorces de PCR. Les mini-colonnes d’une plaque « MultiSceen 96-Well Plates, MAHV N45 50 » sert de support inerte de la résine (figure 23b). La préparation des mini-colonnes est donnée en annexe 7. Les mini-colonnes du gel Sephadex, ainsi préparées, sont mises sur la plaque du séquenceur, en respectant la position des puits, il faut que chaque puits de la plaque du gel corresponde avec celui qui a la même désignation sur la plaque du séquenceur. Les 20 µl de l’amplicon sont déposés délicatement au centre des mini-colonnes du gel Sephadex, ils sont soumis à une centrifugation 6 mn à 2600 trs/mn. Ainsi, l’amplicon passe à travers le gel et il est récupéré dans les cupules de la plaque de microtitrage de 96 puits du séquenceur. Les filtrats contiennent l’amplicon purifié dans de l’eau (un volume d’environ 15 μl) (figure 23b). 3.5.3. Séquençage des fragments d’ADNr 16S La séquence de l’ADNr 16S est déterminée par un séquenceur d’électrophorèse capillaire avec 4 capillaires pour le traitement automatique d’une plaque de microtitrage à 96 puits (Applera_ABI Prism 3130xl, Applied Biosystems). Ce séquenceur sépare les divers fragments amplifiés de l’ADNr 16S selon leurs tailles en les faisant migrer dans un gel poreux sous l’action d’un courant électrique. Comme les amplicons sont des copies incomplètes et consécutives qui ont une différence de taille d'un seul nucléotide, on peut identifier le nucléotide au niveau duquel la copie s’est interrompue (nucléotide terminal) pour chacune des copies incomplètes. De la plus petite à la plus grande séquence, la séquence des nucléotides

74 des fragments de l’ADNr 16S est ainsi reconstituée. Un programme informatique intégré au séquenceur, permet de reconstituer (nucléotide par nucléotide) la séquence originale des fragments analysés sous forme d’un éléctrogramme (figure 23b).

Figure 23. Étapes du séquençage de l’ADNr 16S a: amplification et marquage des fragments, b: purification sur résine et séquençage automatique

3.5.4. Assemblage des séquences Les séquences des fragments obtenus par les six amorces utilisées, sont des séquences qui se recouvrent en partie. À l’aide de ces parties communes entre les séquences lues, nous pouvons reconstituer la séquence de la totalité du fragment de l’ADNr 16S du départ (figure 24). Cette opération d'assemblage est réalisée par le programme informatique « Sequencher, version 4.5 ».

Figure 24. Reconstitution de la séquence de l’ADNr 16S

3.5.5. Comparaison des séquences de l’ADNr 16S Les séquences de l’ADNr 16S des isolats d’actinomycètes sont comparées avec les séquences de l’ADNr 16S des bactéries disponibles sur la base de donnés « GenBank » par l’utilisation du programme de comparaison des multi séquences de nucléotides « BLAST », disponible sur le site http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast, qui est un outil de recherche de régions de ressemblances entre séquences. Cette base de données contient toutes les séquences de souches d’actinomycètes filamenteuses, les pourcentages de similarités des séquences de souches types validées et publiées sont choisis, en se référant à la base de donnés Euzéby (2012) et au « Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology » (Whitman et al., 2012).

3.5.6. Analyse phylogénique L’alignement multiple des séquences est réalisé par l’utilisation du programme Clustal W (Thompson et al., 1994). Les arbres phylogéniques sont construits par la méthode de Neighbour-Joining (Saitou et Nei, 1987). La topologie des arbres est évaluée par l’analyse des « bootstrap » de Felsenstein (1985) avec 1000 répliques. L’évaluation de la divergence évolutionnaire entre les séquences est présentée par une matrice de distance. Toutes ces analyses phylogéniques sont réalisées par le programme MEGA version 5.2.1. (Tamura et al., 2011).

1. Les actinomycètes aérobies en clinique Les objectifs de cette partie étaient, principalement, d’estimer la prévalence des actinomycètes aérobies dans les cas de pathologies répandues au service des maladies infectieuses, de mettre en évidence les facteurs cliniques qui peuvent influencer la présence de ces bactéries et, enfin, de définir les paramètres microbiologiques qui contribuent à leur isolement. 1.1. Taille de l’échantillon Le nombre total de malades étudiés est de 479. Ainsi, 609 prélèvements ont été effectués à partir de ces sujets. Les malades sont tous adultes. 1.2. Taux de prévalence Le nombre de malades porteurs d’actinomycètes est de 31, soit un taux de prévalence de 6,47 % de la population étudiée. Le tableau donné en annexe 9 rassemble les informations sur les cas positifs et décrit leurs signes cliniques. L’analyse de ces cas permet de déduire les facteurs cliniques et microbiologiques qui peuvent aider à distinguer une infection par un actinomycète aérobie. 1.3. Facteurs cliniques Le taux de prévalence des actinomycètes aérobies peut être influencé par des facteurs qui sont en rapport avec les patients étudiés. 1.3.1. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonction du sexe La figure 25 montre le taux de prévalence des actinomycètes aérobies selon le sexe. Ces bactéries sont détectées chez 8,33 % de femmes et 4,18 % d’hommes. Pour distinguer l’influence du sexe sur le taux des cas positifs à actinomycètes aérobies, un test de comparaison de pourcentages observés sur deux échantillons indépendants « Khi deux » (χ2) est réalisé. La valeur de χ2 calculée est égale à 3,35, elle est inférieur à la 2 valeur critique lue sur la table (χ t = 3,84), pour un seuil α = 0,05 et un degré de liberté égal à 1, donc le sexe des patients n’a pas une influence sur la prévalence des actinomycètes aérobies.

120

95.81 100 91.66

60 révalence (%) révalence Présence 40 Absence Taux de p Taux 20 8.33 4.18 0 Femmes Hommes Sexe

Figure 25. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon le sexe

1.3.2. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonction de l’âge La figure 26 visualise le taux de prévalence des actinomycètes aérobies selon les classes d’âges. Il semble que les patients moins de 50 ans sont plus concernés par la présence des actinomycètes aérobies. Le taux le plus élevé est observé dans la classe entre 17 et 28 ans, suivi par la classe entre 39 et 50 ans.

16 13.48 14 12 9.64 10 8 6 5.33 létude de 11 ans11 de létude 3.96 3.45 4 amp 2 1.37 taux de prévalence (%) pour une(%) pour de prévalence taux 0 [17-28[ [28-39[ [39-50[ [50-61[ [61-72[ [72-83[ Age (ans)

Figure 26. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon l’âge

1.3.3. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonctions des maladies associées Les isolats d’actinomycètes aérobies sont issus de patients atteints de tuberculose (12 cas) suivi par des patients avec abcès et fièvre au long court (5 cas pour chaque maladie), de cas de pneumopathie (3 cas) et de septicémie (2 cas) et enfin les autres isolats sont associés à des maladies diverses: pyélonéphrite, pyonéphrose, syndrome d’hypertension intrarachidienne fébrile et cirrhose.

Le taux de prévalence des actinomycètes aérobies, selon chaque pathologie, est montré par la figure 27.

14.81 16 14 12 9.25 9.43 10 8 6.52 4.76 6 4 1.97

Taux deprévalence (%) deprévalence Taux 2 0

Pathologie

Figure 27. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon les pathologies associées

1.3.4. Taux de prévalence des actinomycètes aérobies en fonctions des facteurs de risques La prévalence des actinomycètes aérobies est plus élevée chez les patients les patients soumis à une corticothérapie (10,25 %), les patients sans aucun facteur de risque, ou ceux ayant une pathologie associé, une histoire d’une maladie comme la tuberculose, la cirrhose, l’adénopathie, un acte chirurgicale, ont présenté des taux faibles (6,06 et 6,08 % respectivement) (figure 28).

12 10.25 10 8 6.08 6.06 6 4 2

Taux de prévalence (%) de prévalence Taux 0 Corticothérapie Pathologies Aucun associées Facteur de risque

Figure 28. Taux de prévalence (en %) des cas positifs à actinomycètes aérobies selon les facteurs de risque

1.4. Facteurs microbiologiques Les facteurs microbiologiques qui peuvent avoir un impact sur le nombre de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies sont au nombre de cinq. 1.4.1. Prélèvements Le taux le plus intéressant de prélèvements positifs est obtenu avec le fluide gastrique et le crachat suivis par le pus d’abcès. Les prélèvements de liquide pleural et des urines ont donné le taux le plus faible. Aucun actinomycète n’a été isolé des prélèvements du liquides d’ascite et céphalo-rachidien (figure 29).

19.51 20 18 16 14 10.06 12 8.69 10 8 4.16 Taux (%) Taux 6 2.06 4 0 0 2 0

Prélèvement

Figure 29. Taux (en %) de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies

1.4.2. Période de prélèvements

Le taux de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies, augmente considérablement pendant la période de Mars à Avril (figure 30).

30 25 20 15 10 èvements positifs(%) èvements 5 0 Taux de prél Taux

Période de prélèvement(mois)

Figure 30. Taux (en %) des échantillons positifs à actinomycètes aérobies selon la période

1.4.3. Observations microscopiques Les observations microscopiques (examen direct et coloration de Gram) des prélèvements ont été négatives sauf pour le prélèvement du liquide pleural qui a permis l’isolement de la souche LP.P.473. 1.4.4. Milieu de culture (figure 31) Le plus grand nombre d’isolats d’actinomycètes aérobies a été obtenu sur les milieux non sélectifs: Bennett’s-Agar et Sabouraud-Dextrause-Agar avec des taux très proches (37 et 35 % respectivement). Le milieu à la paraffine a permis l’isolement d’un taux moins élevé.

28% 37% 1 2 3 35%

Figure 31. Taux (en %) des isolats d’actinomycètes aérobies selon le milieu de culture 1: Sabouraud-Dextrause-Agar, 2: Bennett’s-Agar, 3: Paraffine-Agar

1.4.5. Antibiothérapie Le taux le plus élevé des prélèvements positifs à actinomycètes aérobies a été obtenu en présence d’une antibiothérapie (7,91 %) (figure 32). L’influence de l’antibiothérapie sur le taux de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies, peut être distinguée par un test de comparaison de pourcentages observés sur deux échantillons indépendants « Khi deux » (χ2). La valeur de χ2 calculée est égale 0,76, elle est inférieur à la valeur critique lue sur la table, pour un seuil α = 0,05 et un degré de liberté égal à 1, donc la présence de l’antibiothérapie n’a pas d’influence sur le taux de prélèvements positifs.

94,00 100 92.09 90 80 70 60 50 Prélèvements positifs 40 Prélèvements négatifs 30 20 7.91 6,00 Taux de prélèvements(%) Taux 10 0 Présence Absence Antibiothérapie

Figure 32. Taux (en %) de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies selon la présence d’une antibiothérapie

1.5. Discussion 1.5.1. Incidence des actinomycètes aérobies dans la clinique Il y a peu de connaissances sur la distribution des actinomycètes aérobies dans la clinique pratique. Les infections causées par ces germes restent sous-estimées, surtout en Algérie où très peu d’études ont été réalisées. Ces bactéries sont des composants de la flore microbienne de l’environnement, elles sont présentes dans le sol, dans l’air et dans l’eau. Comme elles sont ubiquitaires, leur isolement peut être un indicateur d’une contamination ou bien d’une simple colonisation, mais non pas d’une infection invasive. En outre, les actinomycètes aérobies peuvent exister comme des saprophytes sur la peau et dans les voies respiratoires supérieures (Brown-Elliot et al., 2006). Néanmoins, leur impact sur l’organisme humain ne peut être ignoré, les directives de l'Autorité de la Santé Finlandaise stipulent que la présence des actinomycètes formant des spores dans les environnements des habitations peut présenter un risque sur la santé humaine (Peltola et al., 2001). Ces bactéries sont considérées comme des pathogènes opportunistes, leur isolement des prélèvements cliniques est en augmentation (McNeil et Brown, 1994; Patel et al., 2004). Les critères pour attester une signification clinique d’une culture positive à actinomycètes aérobies incluent les signes, les symptômes et le tableau clinique du patient. Ceux-ci doivent être en corrélation avec ceux d’une infection d’un actinomycète pathogène connue et décrite dans la bibliographie comme les infections à Nocardia sp. et les infections à Actinomadura sp. (Brown-Elliot et al., 2006).

4.6.2. Conditions climatiques, voies et sites de contamination Par sa position géographique, l’Algérie présente un climat semi aride. Elle est exposée, notamment ces dernières années, aux phénomènes de désertification qui provoquent la dégradation des terres (Belaroui et Liazid, 2012). Ce phénomène favorise l’émission de sable et de poussières dans l’atmosphère. Ainsi, le climat de l’est algérien, chaud et sec, favorise l'aérosolisation et la dispersion des poussières et des micro-organismes y compris les actinomycètes aérobies. Pour cela, des patients positifs à actinomycètes aérobies résidant dans les wilayas de l’est algérien ont été détectés (Constantine, Mila, Djijel, Khenchela, Batna et Tebassa). La plupart des isolats proviennent de prélèvements récoltés durent la période du printemps, donc il est fortement probable que les cas positifs à actinomycètes aérobies ont acquis ces germes par inhalation ou par une contamination directe d’une plaie. Saubolle and Sussland (2003) ont rapporté que les infections à Nocardia sp. aux États Unis paraissent être plus prévalentes dans les climats chauds et arides du Sud Est. Par conséquent, ils ont émis l’hypothèse que les conditions atmosphériques de sécheresse, de poussières et souvent de vent peuvent faciliter l’aérosolisation et la dispersion des Nocardia sp. et donc augmenter la probabilité de l’acquisition par inhalation de fragments mycéliens d’actinomycètes (Brown-Elliott et al., 2006). Les sites d’isolements sont, dans la plupart des cas étudiés, pulmonaire ou gastrique. La dimension des spores des actinomycètes varie de 0,3 à 2 µm, grâce à leur petite taille leur pouvoir de pénétration dans le poumon est très élevé. Selon Harvey (1999) ils pénètrent facilement jusqu’au niveau des alvéoles, et leur persistance peut être de longue durée. Rodríguez-Nava et al. (2008) ont suggéré que les actinomycètes aérobies peuvent pénétrer les poumons par inhalation à partir de l’environnement ou après ingestion d’un aliment contaminé. Cependant, deux cas d’isolement sont obtenus du liquide pleural, Gowrinath et al. (2009) expliquent que les complications pleural des nocardioses sont détectés dans 36 % des cas, et la diffusion du germe se fait directement à partir de la paroi thoracique ou des poumons. Par ailleurs, l’isolement de P.P.66 d’un abcès mésentérique et de P.B.225 d’un abcès de psoas, qui sont des sites profonds, laisse supposer la dissémination de ces bactéries. Les cas d’actinomycétomes et de nocardioses dans les tissus profonds sont rapportés fréquemment, et la propagation de l’agent causatif peut être par vois hématogène ou lymphatique (Couraud et al., 2007; Rodríguez-Nava et al., 2008; Conville et al., 2012). 1.5.3. Influence du sexe et de l’âge Dans notre étude, les actinomycètes aérobies statistiquement sont souvent rencontrés chez les hommes que chez les femmes. Ce résultat concorde avec les cas de mycétomes en Algérie, rapportés par et Zait et al. (2008) et sur les nocardioses rapporté par Rodríguez-Nava

84 et al. (2008). Cependant, l’incidence de la nocardiose en France et en Inde parait avoir une prédilection supérieure pour les hommes que pour les femmes (Laurent et al., 1999; Moiton et al., 2006; Shivaprakash et al., 2007). Egalement, Pitche et al.(1999), Develou et al.(2003), Fahal (2003), Hashimi et al.(2008) et Somanath Padhi et al. (2010) ont observé une prédominance masculine dans des études sur les actinomycétomes. La raison de cette prédominance masculine n’est pas connue, Shivaprakash et al. (2007) ont supposé qu’elle est due aux effets des hormones masculines sur la virulence ou la croissance des Nocardia sp. Cette hypothèse ne peut être prise en considération d’autant plus qu’il y a d’autres résultats qui font ressortir une prédominance féminine avec l’infection par Actinomadura madurae au Méxique (Buot et al. 1987; Lopez-Martinez et al., 1992), aussi par A. madura et Nocardia sp. en Tunisie (Denguezli et al. 2008). Nos résultats montrent que les actinomycètes aérobies semblent être plus fréquemment rencontrés chez les adultes moins de 50 ans. Ce résultat est similaire à ceux obtenus par Develou et al. (2003) dans des cas d’actinomycétomes à l’ouest africain, par Fahal (2003) qui a rapporté que la tranche d’âge la plus frappée est celle comprise entre 20 et 40 ans, par Shivaprakash et al. (2007) qui ont donné une moyenne d’âge de 38,4 ans pour les cas de nocardioses étudiés en Inde. Aussi, Pitche et al. (1999) au Togo, Denguezli et al. (2003) en Tunisie, Moiton et al. (2006) au C.H.U. de Bordeaux (France), Hashimi et al. (2008) en Iran, Zait et al. (2008) en Algérie et Somanath Padhi et al. (2010) en Inde ont tous signalé une tranche d’âge comprise entre 20 et 50 ans. En revanche, dans des cas de nocardioses en France, Boiron et al., (1997) et Laurent et al. (1999), ont rapporté que l'âge moyen des patients atteints est de 60 ans et un maximum de cas sont observés à partir de 46 ans (> 80 %), en particulier entre 46 et 60 ans (45 %). Aussi Rodríguez-Nava et al. (2008) ont rapporté que la nocardiose apparaît comme une infection de l’adulte, puisque 75 % de patients ont plus de 50 ans. 1.5.4. Signes cliniques et symptômes Les signes de l’infection les plus communément observés (fièvre, toux et amaigrissement) ne sont pas spécifiques aux infections à actinomycètes. Ils persistent pendant une période allant d’une semaine à plusieurs mois, voire même à plusieurs années. Les symptômes évoquent la suspicion d’une tuberculose. Selon Brown-Elliot et al. (2006) ces symptômes sont prédominants dans les cas de nocardioses. Selon Rodríguez-Nava et al. (2008), la colonisation par les Nocardia sp. semble pouvoir persister plusieurs années après un épisode infectieux apparemment traité avec succès. Une infection non tuberculeuse par mycobactéries peut avoir des symptômes en commun avec les nocardioses.

1.5.5. Maladies associées La majorité des cas positifs à actinomycètes, dans cette étude, sont associés à une maladie. Brown-Elliot et al. (2006) ont rapporté que des malades ayant une nocardiose pulmonaire ont aussi une maladie pulmonaire sous jacente. Ils ont signalé qu’un diagnostic différentiel est nécessaire surtout dans les cas de pathologies comme la tuberculose pulmonaire ou une infection par Rhodococcus equi ou une pneumonie fongique. Shivaprakash et al. (2007) dans une étude rétrospective des cas de nocardioses, de 2004 à 2006, en Inde ont remarqué que la majorité des cas de patients sont aussi tuberculeux. Aussi d’après Rodríguez-Nava et al. (2008) les désordres pulmonaires sous-jacents, en particulier ceux associés à une obstruction bronchique ou un ralentissement de l’élimination bronchociliaire (par exemple: cancer, tuberculose, mucoviscidose, asthme, bronchite, aspergillose allergique), peuvent prédisposer des patients à une colonisation du tractus respiratoire par les Nocardia sp. Selon Lamrani et al. (2002), les actinomycétomes peuvent être confondues avec d’autres maladies et les diagnostics différentiels cliniques se font essentiellement avec la tuberculose, la syphilis et la leishmaniose. Hamid et al. (2001) ont rapporté que les symptômes persistants d’une maladie pulmonaire suite à la non-amélioration à un traitement antituberculeux sont des arguments convaincants pour conclure que le malade soufre d’une actinomycose pulmonaire, mais pas une tuberculose. Par ailleurs, Matulionyte et al. (2004) et Lowman et Aithma (2010) ont rapporté que l’incidence de la tuberculose et la pneumocystose masque les infections causées par les Nocardia sp. et il est nécessaire de les prendre en considération dans un diagnostic différentiel, en particulier chez les patients qui ne répondent pas au traitement empirique pour la tuberculose, ce qui est le cas de la majorité des patients étudiés. 1.5.6. Facteurs de risque Dans la plupart des cas étudiés, l’incidence des actinomycètes aérobies est survenue chez les patients sous corticothérapie (ou dépression du système immunitaire), qui est le facteur de risque le plus connue, le diagnostic peut être en faveur d’une infection à actinomycètes aérobies. Le reste des cas sont obtenue sans aucun facteur de risque, ou en association avec une maladie, il peut s’agir probablement d’une simple colonisation, mais la possibilité de l’infection ne peut être écartée, car la nocardiose peut même toucher le sujet immunocompétent (Couraud et al., 2007). Moiton et al. (2006) ont trouvé que sur 11 cas de nocardiose 8 présentaient au moins un facteur de risque, les 3 autres ne présentaient aucun facteur de risque. Shivaprakash et al.

(2007) ont rapporté que l’infection à Nocardia sp. est rare chez les patients immunocompétents. Les patients les plus affectés sont ceux avec une immunosuppression ou une maladie sous jacente. Patel et al. (2004) ont rapporté que les infections dues aux actinomycètes aérobies sont de plus en plus prévalent avec l’accroissement de l’utilisation d’agents cytotoxiques, des immunosuppresseurs, de transplantations d’organes ainsi de l’avènement du sida. Selon Muir et al., (1997), Moiton et al. (2006), l’immunosuppression est un facteur majeur qui dispose l’être humain à une infection par un actinomycète aérobie. Aussi Shivaprakash et al., (2007) et Rodríguez-Nava et al., (2008) ont rapporté que les facteurs de risques qui peuvent favoriser l’infection par un actinomycète aérobie sont l’utilisation d’une corticothérapie pendant une longue période ou bien une maladie qui affaiblit le système immunitaire comme exemple les patients avec transplants d’organes, ou soumis à la chimiothérapie. Ils ont, aussi, démontré que la colonisation par les Nocardia sp. semble être plus fréquente dans les affections respiratoires préexistantes non traitées par corticoïdes, telles que des troubles obstructifs chroniques, des bronchectasies ou encore une mucoviscidose, une tuberculose ou une aspergillose allergique. Alors que les infections invasives à Nocardia ne se développent, généralement, pas chez ces patients jusqu’à ce qu’ils reçoivent un traitement stéroïdien. Les patients atteints d’une nocardiose ont, souvent, été soumis à un traitement par une forte dose de corticostéroïdes, durant une longue période (Saubolle and Sussland., 2003), Aussi, Brown-Elliot et al. (2006) ont rapporté que les patients avec un traitement induisant une immunosuppression systémique (particulièrement les corticostéroïdes), et les patients qui ont une maladie granulomateuse chronique, un diabète insulinodépendant, atteints de virus de l’immunodéficience sont plus susceptibles d’une infection à Nocardia sp. Dans une étude à Taiwan, de 1998 à 2010, sur les infections causées par les Nocardia sp. Lui et al. (2011) ont remarqué que l’utilisation des stéroïdes et la présence de maladies chroniques du foie sont les facteurs de risque les plus communément soulignées. Par ailleurs, Kapadia et al. (2007) ont rapporté six cas d’infections invasives à Streptomyces sp., toutes chez des patients immunodéprimés. 4.6.7. Critères microbiologiques Les prélèvements, pour la recherche des actinomycètes aérobies, sont très divers, ils varient selon la localisation de l’infection: pulmonaire, cutanée ou autres sites plus profonds. Selon Brown-Elliot et al. (2006), l’isolement d’un actinomycète à partir d’un site du corps humain qui naturellement doit être stérile est, du point de vue clinique, très pertinent. Dans cette étude, le nombre d’actinomycètes, le plus élevé, est obtenu à partir de prélèvements peu profonds (crachats, fluides gastrique et pus d’abcès) ce résultat ne nous permet pas de

87 confirmer un diagnostic en faveur d’une infection à actinomycètes aérobie. En effet, d’après Rodríguez-Nava et al. (2008), l’isolement d’actinomycètes à partir de tels sites superficiels ne peut refléter qu’une simple colonisation. Mais cela ne peut être affirmatif, car de nombreux cas d’infections à actinomycètes ont été confirmés par isolement de ses bactéries à partir de pus d’abcès et de crachats (Philip et Roberts, 1984; Sindhuphak et al., 1985; Lejbkowicz et al., 2005; Manteca et al., 2008; Gonzălez-Lòpez et al., 2011; Pellegrini et al., 2012; Rudramurthy et al., 2012). Les observations microscopiques de nos prélèvements sont en majorité négatives. Ceci a été rapporté également par Hidri et al. (2000) affirmant que l’examen direct des prélèvements est souvent négatif. En effet, du point de vue microbiologique, l’examen direct des prélèvements ou après la coloration de Gram permettent d’observer les fins filaments ramifiés (morphologie typique des actinomycètes) entourés d’un nombre important de cellules inflammatoires. Cette observation sera la première et la plus intéressante constatation qui oriente le diagnostic vers une infection par un actinomycète. Dans l’étude de Shivaprakash et al. (2007), l’examen des prélèvements a permis l’observation de filaments ramifiés et des coccis à coloration de Gram positive dans la totalité des cas, ils ont mentionné que l’examen microscopique des prélèvements après coloration de Gram peut aider à un diagnostic précoce de nocardiose. Cependant, des prélèvements négatifs à l’examen microscopique n’éliminent pas la possibilité d’isolement d’un actinomycète aérobie. D’après Rodríguez-Nava et al. (2008), l’examen microscopique négatif à partir des prélèvements pathologiques n’élimine pas le diagnostic de nocardiose, en raison du nombre parfois faible de bactéries présentes, et il peut être suivi d’une culture positive nécessitant souvent une incubation prolongée. Les milieux riches de Bennett’S-Agar et Sabouraud-Dextrose-Agar sont les milieux les plus souvent utilisés pour l’isolement des actinomycètes aérobies de l’environnement ou des prélèvements cliniques. Ils ont été utilisés, dans notre étude, comme des milieux d’isolement mais additionnés, au préalable, d’inhibiteurs de champignons et de bactéries à coloration de Gram négative pour favoriser la détection du nombre le plus élevé des actinomycètes aérobies à partir des prélèvements cliniques. En effet, McNeil et Brown (1994) préconisent les milieux riches pour l’isolement des actinomycètes aérobies surtout à partir de milieux non stériles, les microorganismes compétitifs (champignons et bactéries à coloration de Gram négative) sont éliminés par l’adition des antibiotiques comme agents sélectifs. Par ailleurs, l’utilisation du milieu sélectif à la paraffine est une technique simple basée sur la capacité des actinomycètes aérobies à utiliser la paraffine comme seule source de carbone et d’énergie. Cependant, ce milieu a l’inconvénient d’exiger une période d’incubation très prolongée (jusqu’à deux mois) au cours de laquelle la compétition des autres

88 microorganismes à croissance rapide est possible ce qui diminue le nombre d’isolats d’actinomycètes. Le traitement des patients par les antibiotiques n’a pas d’impact sur l’isolement des actinomycètes aérobies des prélèvements cliniques. La présence des actinomycètes chez des patients traités au moment du prélèvement avec les antituberculeux ou autres antibiotiques à large spectre ne peut être expliquée que par la résistance de ces bactéries à ces agents antimicrobiens. Nous pouvons supposer que l’antibiothérapie a permis l’élimination des autres microorganismes sensibles en compétions avec les actinomycètes aérobies dans les prélèvements cliniques, ce qui favorise leur isolement. Martin et al. (1999) rapportent que la résistance aux antibiotiques est un phénomène remarquablement observé chez les espèces des actinomycètes aérobies isolées de la clinique. Ces auteurs ont décrit un cas d’une infection cranio-faciale par Streptomyces somaliensis, cette dernière était résistante au traitement antituberculeux effectué. Clavier et al. (2001) ont isolées de prélèvements cliniques, des souches de Streptomyces résistantes aux tetracyclines. Les isolats cliniques de S. griseus, dans des centres de prévention et de contrôle des maladies, sont fréquemment résistants à l’ampicillin (80 %), le sulfamethoxazole (43 %), le cotrimoxazole (29 %), la ciprofloxacin (57 %), la doxycycline (19 %) et la minocycline (10 %) (Moss et al., 2003). Ces mêmes auteurs ont suggéré que le profil de résistance aux antibiotiques doit être vérifié continuellement du fait que les Streptomyces peuvent synthétiser des antibiotiques. Les infections à Streptomyces répondent, généralement, à un traitement avec la pénicilline, les sulfamides, ou les tétracyclines, mais l’amélioration est très longue ce qui recommande une cure prolongée de traitement (plus de 10 mois), pendant cette période la détection de ces germes est possible.

6. Conclusion Cette étude est attribuée à la conception de la prévalence des actinomycètes aérobies dans les cas d’infections répondues au service de maladies infectieuses du centre hospitalo- universitaire (C.H.U.) de Constantine. Á partir de 479 patients analysés, 609 prélèvements de crachats, de fluides gastrique, de pus d’abcès, d’urines, de liquides d’ascites, de liquides pleural et de liquides céphalorachidien, ont été récoltés durent une période de trois ans (entre 2005 et 2007). 49 isolats d’actinomycètes proviennent de ces prélèvements obtenus à partir de 31 malades. Le sexe des patients n’a pas une influence sur la prévalence des actinomycètes aérobies, ces bactéries sont obtenues aussi souvent chez les hommes que chez les femmes. Elles sont plus fréquentes chez les jeunes adultes, avec âge inférieur à 50 ans. Les signes de l’infection sont des symptômes évoquant, le plus souvent, une suspicion d’une tuberculose, ils s’étendent sur une longue période, allant d’une semaine à plusieurs années. Les sites de l’isolement sont, dans la plupart des cas, pulmonaire ou gastrique. Le climat chaud, sec ou aride peut favoriser la contamination. Les actinomycètes aérobies sont souvent détectés chez les patients soumis à une corticothérapie. Mais l’incidence de ces germes chez les patients sans aucun facteur de risque, ou une pathologie associée comme la tuberculose, les abcès, la fièvre au long cours, la pneumopathie et la septicémie, sont remarquables et ils peuvent masquer le vrai diagnostic. La nature du prélèvement influe sur l’isolement des actinomycètes aérobies, les prélèvements naturellement contaminés (crachats, fluides gastrique et pus d’abcès) ont donné le taux le plus élevé. La période du printemps peut favoriser la contamination par ces bactéries. L’examen direct des prélèvements n’est pas une étape déterminante. Les milieux riches additionnés d’agents antifongiques et antibiotiques qui inhibent les bactéries à coloration de Gram négatives sont plus préconisés. L’antibiothérapie au moment des prélèvements n’a pas d’influence sur l’isolement des actinomycètes.

2. Genres rares d’actinomycètes aérobies Douze isolats purifiés sont à coloration de Gram positive et non acido-alcoolo- résistants à l’exception de l’isolat LP.P.473. Ils ne produisent pas de pigments mélanoïdes ni de pigments diffusibles dans le milieu. Ces isolats appartiennent à sept genres rares d’actinomycètes aérobies. 2.1. Isolat appartenant au genre Nonomuraea 2.1.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie La croissance de l’isolat FG.P.03 sur les milieux utilisés est très lente (apparition des colonies après 5 à 6 jours d’incubation), la formation des spores peut aller jusqu’à deux mois de culture. Le développement de la colonie commence par la formation du mycélium de substrat de couleur orange saumon, long et ramifié, coriace et incrusté dans la gélose. À un âge plus avancé, le mycélium aérien se développe, de couleur orange à rouge saumon allant vers le brun au sommet de la colonie. Le mycélium aérien est formé de chaines droites de spores (entre 6 et 8). Les spores sont sous forme de coccobacilles (figure 33). L’analyse chromatographique de l’hydrolysat des cellules entières de l’isolat FG.P.03 montre la présence de l’isomère méso de l’acide diaminopimélique avec le madurose comme sucres caractéristique, il y a aussi présence de glucose et de ribose. Cet isolat possède donc une paroi de type III/ B. Les caractères phénotypiques et chimiotaxonomiques de l’isolat codé FG.P.03, le rapproche du genre Nonomuraea. Le tableau 10 donne les caractères physiologiques de l’isolat FG.P.03 et les espèces les plus reliées phylogéniquement.

Figure 33. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.P.03 a: colonies orange saumon, b: mycélium de substrat ramifié non fragmenté, c: mycélium aérien sporulé

Tableau 10. Caractères physiologiques de l’isolat FG.P.03 et les espèces les plus reliées phylogéniquement

Caractère(1) FG.P.03 N. roseola N. recticatena N. africana N. dietziea DSM 43767T IFO 14525T IFO 14745T IFO 14309T Utilisation de(2): Arabinose - - + + F Inositol F + + + - Mannose - - - + - Raffinose - - - + - Fructose - - - + + Saccharose + + + + - Xylose - - - + - Dégradation de(2): Caséine - - - + ND Amidon - - + + ND Xantine - - - - ND Hypoxantine + + + + ND Tyrosine + + - + ND Production de(2): Citrate lyase + + ND ND + Arginine dihydrolase + + ND ND + β-Galactosidase + + ND ND + Lysine + + ND ND - décarboxylase Ornitine + + ND ND + décarboxylase Tryptophane - - ND ND - désaminasse Uréase + + ND ND + Acétoïne + + ND ND + H2S + + ND ND + (1) Références des caractères des espèces types: Stackbrant et al. (2001), Hozzein et Goodfellow (2007), Kāmpfer et al. (2010)

(2) F: faible, ND: non déterminé, + : positif, - : négatif. Toutes les souches ont une température optimale à 30 °C, elles utilisent le rhamnose et produisent la gélatinase et la nitrate réductase

2.1.2. Phylogénie L’analyse comparative de la séquence de l’ADNr 16S à 1486 pb (le numéro d’accès à

« GenBank » est JQ972872) confirme l’appartenance de l’isolat FG.P.03 au genre Nonomuraea. Cette analyse a donnée le plus haut taux d’identité avec l’espèce N. roseola DSM 43767T (100 %), suivie par N. dietziae IFO 14309T (99.38 %). L’arbre phylogénique (figure 34), construit par la méthode de Neighbour-Joining, montre que l’isolat forme un clade monophylétique avec ces deux espèces, il confirme qu’il est plus relié à N. roseola par une valeur de « bootstrap » élevée (99 %) par rapport à N. dietziae (« bootstrap » égale à 51 %). L’isolat FG.P.03 et ces deux espèces les plus proches phylogéniquement sont reliés aussi aux deux espèces N. recticatena et N. africana avec une valeur de « bootstrap » élevée (99 %).

Figure 34. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.03 avec les espèces types les plus proches du genre Nonomuraea. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,005 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

2.1.3. Discussion taxonomique La majorité des caractères physiologiques de l’isolat FG.P.03 sont similaires à l’espèce N. roseola DSM 43767T. L’isolat possède le même profil enzymatique de l’espèce N. dietziea IFO 14309T mais, contrairement à celle-ci, il utilise l’inositol et le saccharose et n’utilise pas l’arabinose et le fructose. L’isolat diffère de N. recticatena IFO 14525T par la couleur du mycélium (mycélium aérien est blanc, celui de substrat est brun) et aussi par la dégradation de la tyrosine, la non dégradation de l’amidon et la non utilisation de l’arabinose. Il diffère aussi de N. africana IFO 14745T par la couleur du mycélium aérien et de substrat (qui sont de couleur gis bleuâtre et jaune respectivement), par la production de pigments diffusibles ainsi que la non dégradation de la caséine et l’amidon, et la non utilisation de l’arabinose, le mannose, le raffinose, le fructose et le xylose. La caractérisation phénotypique, physiologique, chimiotaxonomique et phylogénique confirme l’appartenance de cet isolat au genre Nonomuraea, et permet de l’assimiler à l’espèce N. roseola.

2.2. Isolat appartenant au genre Kribbella 2.2.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie Les colonies de l’isolat FG.P.44 sont d’un aspect sableux, d’une consistance pâteuse et de forme lichéneuse. Elles sont friables et pénètrent légèrement dans la gélose. Elles commencent leur croissance avec une couleur blanche opaque correspondant au mycélium de

93 substrat, puis, avec la formation du mycélium aérien, une poudre de couleur blanche à bègue claire couvre la surface des colonies. FG.P.44 forme un mycélium de substrat très ramifié, et un mycélium aérien très abondant. Il ressemble aux actinomycètes nocardioformes par la fragmentation du mycélium aérien en des éléments en formes de bacilles et de coccobacilles avec des tailles irrégulières (figure 35). L’analyse de l’hydrolysat des cellules entières de l’isolat a révélé la présence de l’isomère LL de l’acide diaminopimélique, l’alanine, la glycine et l’acide glutamique, le ribose, le glucose, le galactose et le mannose. Cet isolat donc possède une paroi de type I. Les caractères physiologiques de l’isolat FG.P.44 et ceux des espèces types les plus reliées phylogéniquement sont donnés dans le tableau 11.

Figure 35. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.P.44 a: colonies sableuses blanches, b: mycélium de substrat ramifié, c: mycélium aérien fragmenté

Tableau 11. Caractères physiologiques de l’isolat FG.P.44 et les espèces les plus reliées phylogéniquements Caractère(1) FG.P.44 K. flavida KACC K. alba YIM K. lupini LU14T 20248T 31075T Température (°C) 20-37 optimum 30 20-37optimum 30 15-35 optimum 30 12-37 optimum 28 pH optimum 6-9 5-9 5,5-8,5 6-9 Tolérance de NaCl 3 3 < 5 7 (%) Utilisation de(2): Arabinose - - + + Galactose - - + + Inositol + + + ND Mannose + - + + Rhamnose - - + + Ribose - - ND ND Fructose - - + ND Xylose - - + ND Lactose + - + ND Maltose + + + - Glycérol + - + ND

Suite du tableau 11 Dégradation de(2): Caséine + + - + Amidon - - + - Hypoxantine + - ND ND Tyrosine + ND ND - Tween 80 + + ND + Production de(2): Gélatinase + - + + Citrate lyase + + - - Arginine dihydrolase + ND ND + β-Galactosidase + + ND F Uréase + + + - H2S - - - ND Nitrate réductase + + - - Oxydase + + - +

(1) Référence des caractères des espèces types: Park et al. (1999), Kirby et al. (2006), Trujillo et al. (2006 a), Urzì et al. (2008), Cui et al. (2010), Xu et al. (2012). (2) ND: non déterminé, + : positif, - : négatif, F: faible. Toutes les souches utilisent le mannitol, le raffinose et le saccharose, elles produisent la catalase.

2.2.2. Phylogénie L’analyse comparative de la séquence de l’ADNr 16S obtenue d’une longueur de 1465 pb (le numéro d’accès à « GenBank » est JQ972873) montre que l’isolat appartient au genre Kribbella. Les plus hauts taux d’identités sont obtenus avec les espèces K. flavida KACC 20248T et K. alba YIM 31075 T avec le même pourcentage (99,31 %) suivi de K. sandramycini KACC 20249T à 99,04 %. L’arbre phylogénique (figure 36), montre que l’isolat est plus relié avec K. lupini LU14T, K. alba YIM 31075T et K. flavida KACC 20248T mais avec des valeurs faibles de « bootstrap » (25, 33 et 34 % respectivement). La matrice de distance évolutionnaire (tableau 12) montre que l’isolat est plus rapproché de l’espèce K. flavida KACC 20248T qu’avec les autres espèces types avec la distance la moins élevée (0,006).

Figure 36. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.44 avec les espèces type du genre Kribbella. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,002 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

Tableau 12. Matrice de distance de l’isolat FG.P.44 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1 2 0,008 3 0,014 0,017 4 0,011 0,014 0,009 5 0,016 0,017 0,017 0,013 6 0,013 0,013 0,019 0,016 0,015 7 0,011 0,011 0,017 0,014 0,018 0,016 8 0,013 0,016 0,017 0,014 0,020 0,020 0,020 9 0,021 0,023 0,025 0,022 0,026 0,025 0,026 0,016 10 0,010 0,011 0,015 0,012 0,015 0,014 0,013 0,013 0,019 11 0,016 0,016 0,021 0,018 0,022 0,019 0,021 0,013 0,015 0,013 12 0,010 0,012 0,018 0,015 0,015 0,014 0,016 0,018 0,025 0,013 0,019 13 0,016 0,014 0,022 0,019 0,019 0,016 0,019 0,013 0,011 0,013 0,011 0,016 14 0,010 0,013 0,014 0,011 0,017 0,017 0,017 0,003 0,013 0,010 0,010 0,015 0,010 15 0,006 0,007 0,012 0,009 0,015 0,013 0,009 0,013 0,022 0,010 0,013 0,011 0,016 0,010

1: K. flavida KACC 20248T, 2: K. alba YIM 31075T, 3: K. sandramycini KACC 20249T, 4: K. yunnanensis YIM 30006T, 5: K. antibiotica YIM 31530T, 6: K. koreensis LM 161T, 7: K. lupini LU14T, 8: K. solani DSA1T, 9: K. jejuensis HD9T, 10: K. karoonensis Q41T, 11: K. swartbergensis HMC25T, 12: K. sancticallisti BC633T, 13: K. aluminosa HKI 0478T, 14: K. hippodromi S1.4T, 15: FG.P.44

2.2.3. Discussion taxonomique La morphologie et la chimiotaxonomie de l’isolat FG.P.44 concorde avec la description de toutes les espèces du genre Kribbella. Il est à uréase et oxydase positive qui sont deux caractéristiques du genre selon Trujillo et al. (2006 a). Cependant, l’arbre phylogénique avec des valeurs faibles de « bootstrap » et la matrice évolutionnaire qui donne une estimation élevée de la distance avec les espèces types les plus reliées (minimum de distance est à 0,006), indiquent que cet isolat est génétiquement éloigné des espèces validées et publiées de ce genre. En outre, la comparaison des caractères physiologiques révèle plus encore les différences de l’isolat avec les trois espèces les plus reliées phylogéniquement, les caractéristiques des espèces de références sont données par Park et al. (1999), Kirby et al. (2006), Trujillo et al. (2006 a), Urzì et al. (2008), Cui et al. (2010) et Xu et al. (2012). En effet, même si les conditions de croissance en température et pH de l’isolat sont très proches de celles des espèces types, FG.P.44 se distingue par sa capacité de dégradation des substrats carbonés et son profil enzymatique. Il se différencie de K. alba YIM 31075T par la non utilisation de l’arabinose, du galactose, du rhamnose, du fructose, du xylose et de l’amidon et par dégradation de la caséine et la production de nitrate réductase, citrate lyase et d’oxydase. Par rapport à K. lupini LU14T aussi par la non assimilation de l’arabinose, le galactose et de rhamnose, l’utilisation du maltose, la dégradation de la tyrosine et la production du citrate lyase, l’uréase et de la nitrate réductase. FG.P.44 présente des caractères qui le distinguent de K. flavida KACC 20248T, qui sont l’utilisation du mannose, du sorbitol, du lactose, du glycérol et de l’ hypoxantine ainsi que la production de la gélatinase. D’autre part, l’isolat FG.P.44 ne produit pas de pigments mélanoïdes contrairement à l’espèce K. flavida KACC 20248T selon Li et al. (2006). Les résultats des caractères phénotypiques et génotypiques ont révélé que FG.P.44 est différent de toutes les espèces types valides et publiées du genre Kribbella, et soutient la probabilité que cet isolat soit une nouvelle espèce de ce genre.

2.3. Isolats appartenant au genre Micromonospora 2.3.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie Les quatre isolats codés FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 présentent la même couleur et morphologie des colonies, qui sont de petites tailles (1-2 mm de diamètre) et de consistance friables. Au début de leurs croissances, les quatre isolats présentent un mycélium de substrat de couleur orange qui devient de plus en plus foncé et d’un un aspect huileux avec le développement. La couleur noire, des spores du mycélium aérien, caractérise la surface des colonies matures et leur aspect devient plus sec. Le mycélium de substrat est très développé, peu ramifié et non fragmenté, alors que le mycélium aérien est peut abondant et porte des spores unitaires en forme de cocci (figure 37). L’analyse de l’hydrolysat des cellules entières a révélée que les quatre isolats possèdent le même profil en acides aminées et en sucres. Ils contiennent l’isomère méso de l’acide diaminopimélique, l’alanine, la glycine et des traces de l’acide glutamique. Les sucres présents sont le xylose, l’arabinose, le glucose, le mannose et le ribose, donc ces isolats possèdent une paroi de type II/D. Les caractères physiologiques des quatre isolats et ceux des espèces types les plus reliées phylogéniquement sont donnés dans le tableau 13.

Figure 37. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.B.44 a, b, c: aspect des colonies (oranges, huileuses, sèches), d: mycélium de substrat peu ramifié, e et f: sporophores et spores unitaires

Tableau 13. Caractères physiologiques des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 et des espèces les plus reliées phylogéniquements Caractère(1) FG.B.44, C.S.46, M. aurantiaca M. coxensis M. chalcea FG.S.46 et P.P.66 ATCC 27029T 2-30-b(28)T 1464-217LT Température (°C) 20-37 ND 15-37 27-45 Tolérance de NaCl (%) 4 4 3 5 Utilisation de(2): Arabinose + F + F Fructose + + + F Glycérol - - + - Lactose - - + + Mannose + ND + + Inositol - ND - - Rhamnose - - F - Raffinose + F + + Ribose - - + - Saccharose + ND + + Dégradation de(2): Amidon - - ND + Tyrosine + + ND - Production de(2): Gélatinase + + ND + Nitrate réductase + + ND V (1) Référence des caractères des espèces types: Takahashi et al. (1986), Thawai et al. (2005), Ara et Kudo (2007), Tanasupawat et al. (2010), Kirby et Meyers (2010), Whitman et al. (2012) (2) ND: non déterminé, + : positif, - : négatif, F: faible. Toutes les souches utilisent le galactose et le xylose et n’utilisent pas le mannitol.

2.3.2. Phylogénie Les séquences de l’ADNr 16S des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 ont une longueur de 1465, 1201, 1471 et 1383 (les numéros d’accès à « GenBank » sont de JQ972874

à JQ972877 respectivement). L’alignement avec les séquences disponibles sur la base de donnés « GenBank » a montré que les quatre isolats appartiennent au genre Micromonospora. FG.B.44 et FG.S.46 se rapprochent le plus à M. aurantiaca ATCC 27029T (à 99,86 et 99,79 % respectivement) et à M. coxensis 2-30-b(28)T (à 99,17 et 99,05 % respectivement). P.P.66 est plus raprochée à M. aurantiaca ATCC 27029T et à M. chalcea 1464-217LT (à 99,85 et 99,12 % respectivement). C.S.46 est similaire à M. aurantiaca ATCC 27029T (à 100 %). L’arbre phylogénique (figure 38) montre que les quatre isolats appartiennent à la même ligne phylogénique et ils sont reliés avec l’espèce M. aurantiaca ATCC 27029T avec un support de « bootstrap » élevé (93 %). La matrice de distance évolutionnaire (tableau 14) montre qu’il n’y a pas de différences phylogéniques entre ces quatre isolats et aussi qu’ils n’ont pas de différence avec l’espèce M. aurantiaca ATCC 27029T (0,000 de distance).

Figure 38. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 avec les espèces type du genre Micromonospora. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

Tableau 14. Matrice de distance des isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 0,003 3 0,003 0,007 4 0,004 0,006 0,002 5 0,005 0,007 0,005 0,005 6 0,014 0,012 0,010 0,010 0,014 7 0,007 0,008 0,007 0,006 0,004 0,015 8 0,013 0,013 0,009 0,011 0,014 0,003 0,015 9 0,010 0,010 0,014 0,014 0,014 0,008 0,014 0,007 10 0,006 0,009 0,003 0,005 0,004 0,014 0,003 0,012 0,014 11 0,012 0,012 0,008 0,010 0,014 0,002 0,015 0,001 0,007 0,012 12 0,012 0,012 0,008 0,010 0,014 0,002 0,015 0,001 0,007 0,012 0,000 13 0,000 0,003 0,003 0,004 0,005 0,014 0,007 0,013 0,010 0,006 0,012 0,012 14 0,000 0,003 0,003 0,004 0,005 0,014 0,007 0,013 0,010 0,006 0,012 0,012 0,000 15 0,000 0,003 0,003 0,004 0,005 0,014 0,007 0,013 0,010 0,006 0,012 0,012 0,000 0,000 16 0,000 0,003 0,003 0,004 0,005 0,014 0,007 0,013 0,010 0,006 0,012 0,012 0,000 0,000 0,000 1: M. aurantiaca ATCC 27029T, 2: M. chalcea 1464-217LT, 3: M. coxensis 2-30-b(28)T, 4: M. purpureochromogenes Antibioticos S.A. 2CG-315T, 5: M. halophytica DSM 43171T, 6: M. citrea DSM 43903T, 7: M. carbonacea DSM 43168T, 8: M. auratinigra TT1-11T, 9: M. rosaria DSM 803T, 10: M. krabiensis MA-2 16ST, 11: M. endolithica AA459T , 12: M. chaiyaphumensis MC5-1 16ST, 13: P.P.66, 14: FG.B.44, 15: C.S.46, 16: FG.S.46

100

2.3.3. Discussion taxonomique La morphologie et la chimiotaxonomie des quatre isolats ont permis de les intégrer au genre Micromonospora. La caractérisation phylogénique a confirmée cette affiliation, et elle a montré aussi que ces quatre isolats sont phylogéniquement très rapprochés et ils appartiennent à l’espèce M. aurantiaca. Les propriétés physiologiques déterminées des quatre isolats concordent, parfaitement, avec celles de M. aurantiaca, ils tolèrent une concentration de 4 % de NaCl, ils utilisent le glucose, l’arabinose, le galactose, le mannose, le fructose, le raffinose et le xylose, et n’utilisent pas le mannitol, le rhamnose, le ribose, le lactose et le glycérol, ils dégradent la tyrosine et non pas l’amidon et la gélatine et ils réduisent le nitrate. Les caractères culturaux et physiologiques des quatre isolats les distinguent des espèces rapprochées phylogéniquement. M. chalcea, a un mycélium de couleur rouge orange et elle produit un pigment diffusible de couleur jaune claire. Cependant, cette espèce tolère 5 % d’NaCl, utilise le lactose et dégrade l’amidon et pas la tyrosine. M. coxensis a un mycélium de couleur brun ou saumon claire, ne tolère que 3 % d’NaCl, et utilise le glycérol, le lactose et le ribose.

2.4. Isolats appartenant au genre Saccharothrix 2.4.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie Les deux isolats C.S.118 et FG.S.118 présentent des colonies d’aspect coriace, incrustées dans la gélose et très consistantes, leur surface est élevée et rugueuses. Ils débutent leur croissance par une couleur orange abricot qui s’obscurcie durant le développement. C.S.118 et FG.S.118 ont la morphologie des nocardioformes, le mycélium de substrat est très ramifié et se fragmente en des éléments de tailles et de formes irrégulières. Le mycélium aérien porte des chaines de spores en forme de bacilles longs (figure 39). Les cellules des deux isolats contiennent l’isomère méso de l’acide diaminopimélique, l’alanine et l’acide glutamique avec le glucose donc les deux isolats possèdent une paroi de type III/C. Les caractères physiologiques de C.S.118 et FG.S.118 et de l’espèce Saccharothrix longispora sont donnés dans le tableau 15.

101

Figure 39. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.S.118 a: colonies oranges, b : mycélium de substrat fragmenté, c: mycélium aérien avec de longues spores

Tableau 15. Caractères physiologiques des isolats C.S.118 et FG.S.118 et l’espèce Saccharothrix longispora Caractère(1) C.S.118 FG.S.118 S. longispora NRRL B-116116T Utilisation de(2): Arabinose F + + Fructose F + + Glycérol F + + Lactose F + + Maltose F + ND Mannose + + ND Mannitol - - ND Sorbitol - + - (1) Référence des caractères des espèces types: Zitouni et al. (2004), Kim et al. (2011), Whitman et al. (2012) (2) ND: non déterminé, + : positif, - : négatif, F: faible. Toutes les souches peuvent croitre entre 10 et 37 °C, tolèrent 5 % de NaCl, utilisent le rhamnose, le xylose, le saccharose et pas l’inositol et le raffinose, dégradent l’amidon, la caséine, la gélatine, la tyrosine, l’urée, le citrate, mais pas la xanthine et hypoxanthine, et ne réduisent pas les nitrates.

2.4.2. Phylogénie Les séquences de l’ADNr 16S des isolats C.S.118 et FG.S.118 sont d’une longueur, respective, de 1474 et 1482 pb (les numéros d’accès à « GenBank » sont JQ972879 et JQ972880 respectivement). La comparaison de ces séquences avec celles des bactéries disponibles sur « GenBank » a donnée le plus haut taux d’identité avec Saccharothrix longispora NRRL B-116116T (98,35 et 98,42 % respectivement) et avec Actinosynnema mirum DSM 43827T (97,62 et 97,63 % respectivement). L’arbre phylogénique (figure 40) montre que les deux isolats sont étroitement reliés avec une valeur maximal de « bootstrap » (100 %), et sont rassemblés avec les espèces du genre Saccharothrix (« bootsprap » support égal à 68 %), l’espèce la plus proche est S. longispora NRRL B-116116T avec une valeur de « bootstrap » 83 %.

102

Figure 40. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats C.S.118 et FG.S.118 avec les espèces les plus proches du genre Saccharothrix et des autres genres. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,005 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

2.4.3. Discussion taxonomique L’analyse phylogénique confirme l’appartenance de C.S.118 et FG.S.118 au genre Saccharothrix. Les deux isolats sont très proches, et ils sont tous les deux rapprochés à l’espèce S. longispora NRRL B-116116T. Selon Labeda et Kroppenstedt (2000) les membres du genre Saccharothrix sont phylogéniquement alignés avec les autres genres de la famille Pseudonocardiaceae avec une valeur élevée de « bootstrap » (77 %). Les caractéristiques morphologiques et chimiotaxonomiques des deux isolats C.S.118 et FG.S.118 concordent avec leur affiliation, par analyse phylogénique, au genre Saccharothrix. La probabilité d’appartenance à Actinosynnma mirum est écartée, cette espèce a un mycélium aérien blanc à jaune pâle et se caractérise particulièrement par la formation de synnémata (un ensemble d’hyphes compactes qui peuvent porter des conidies à leur apex) avec des zoospores (Hasegawa et al., 1978; Land et al., 2009). Du point de vue chimiotaxonomique, la caractéristique commune entre les genres Saccharothrix et

103

Actinosynnma est la présence de l’isomère méso de l’acide diaminopimélique, mais la composition en sucres pariétaux est distincte, ce dernier possède le galactose et le mannose dans sa paroi (Land et al., 2009). Mis à part la capacité de l’utilisation du sorbitol par FG.S.118, et l’assimilation très faible des substrats carbonés par C.S.118, les autres caractéristiques physiologiques des deux isolats sont similaires, ce qui permet de constater qu’il s’agit de deux souches de la même espèce, ou bien d’une même souche qui s’est probablement adaptée aux conditions de son milieu d’isolement. Ces caractéristiques sont similaires à ceux de l’espèce S. longispora.

2.5. Isolat appartenant au genre Nocardiopsis 2.5.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie L’isolat FG.P.63 présente des colonies plates et un peu surélevée au centre, elles commencent leur croissance par une couleur rose pâle qui devient de plus en plus foncé au cours du développement, puis à la maturité elles se couvrent à la surface par une couleur blanche. Le mycélium de substrat est bien développé, irrégulièrement ramifié, le mycélium aérien forme de longues chaines de spores de forme droite ou en zigzag, dans quelques cas nous observons un regroupement compact des chaines de spores comme des synnémata (figure 41). La paroi de l’isolat FG.P.63 contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique et le glucose, donc il possède une paroi de type III/C. Les caractères physiologiques de l’isolat FG.P.63 et ceux de l’espèce et sous espèces les plus reliées phylogéniquement, sont donnés dans le tableau 16.

Figure 41. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat FG.P.63 a: colonies blanches, b: mycélium de substrat bien développé, c: chaines de spores en zigzag, d: forme de synnémata (photographie prise par microscope électronique à balayage JEOL 35 CS)

104

Tableau 16. Caractères physiologiques de l’isolat FG.P.63 et les espèces les plus reliées phylogéniquements Caractère (1) FG.P.63 N. synnemataformans N. dassonvillei ssp. N. dassonvillei ssp. IMMIB D-1215T dassonvillei DSM albirubida DSM 43111T 40465T Tolérance de: Température (°C) 40(F) 37 42 42 NaCl (%) 12 10 10 10 Utilisation de(2): Arabinose - - ND ND Galactose + + D D Mannose + + - + Rhamnose + + F F Ribose - - + + Fructose + + ND ND Saccharose - - + + Maltose + + - - Lactose - - - + Glycérol + ND + + Paraffine + - - - Tween 80 + ND - - Production de(2): β-Galactosidase + + ND ND Uréase + + - - Nitrate réductase + + - + Catalase + + ND ND (1)Références des caractères des espèces types: Yassin et al. (1997), Evtushenko et al. (2000), Fang et al. (2011) (2) + : positif, - : négatif, D: douteux, F: faible, ND: non déterminé. Toutes les souches utilisent le mannitol et le xylose mais n’utilisent pas l’inositol, et le raffinose. Elles dégradent la caséine, la xantine, l’hypoxantine et la tyrosine et elles produisent la gélatinase.

2.5.2. Phylogénie L’alignement de la séquence de l’ADNr 16S d’une longueur de 1469 pb (le numéro d’accès à « GenBank » est JQ972878) avec celles des bactéries disponibles sur « GenBank » montre que l’isolat FG.P.63 appartient au genre Nocardiopsis. Il se rapproche le plus à l’espèce Nocardiopsis synnemataformans IMMIB D-1215T (99,93 %) suivi par l’espèce Nocardiopsis dassonvillei ssp. albirubida DSM 40465T (99,58 %). Il en ressort de l’arbre phylogénique (figure 42) que l’isolat est relié à l’espèce Nocardiopsis synnemataformans IMMIB D-1215T et à la sous espèce N. dassonvillei ssp. dassonvillei DSM 43111T avec la même valeur de « bootstrap » (99 %). Avec la sous espèce Nocardiopsis dassonvillei ssp. albirubida DSM 40465T la valeur de « bootstrap » est faible, elle est de 38 %.

105

Figure 42. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.63 avec les espèces les plus proches du genre Nocardiopsis. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,002 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

2.5.3. Discussion taxonomique Les caractères morphologiques et chimiotaxonomiques de l’isolat FG.P.63, permettent de le rapprocher au genre Nocardiopsis. Les bactéries d’actinomycètes appartenant à ce genre se caractérisent par des hyphes en forme de zigzag et ils ont une paroi de type III. La comparaison de la séquence de l’ADNr 16S a confirmée l’appartenance de cet isolat à ce genre, le plus haut taux de similarité a été obtenu avec l’espèce N. synnemataformans IMMIB D-1215T, puis avec les deux sous espèces de N. dassonvillei. Du point de vue phylogénique, cette espèce et ces deux sous espèces sont très reliées (Yassin et al., 1997; Evtushenko et al. 2000; Tamura et al., 2008; Fang et al., 2011). Les propriétés physiologiques de FG.P.63 sont identiques à celles de l’espèce type N. synnemataformans IMMIB D-1215T dont les propriétés ont été décrites par Yassin et al. (1997). Toutefois, notre isolat se distingue par l’assimilation de la paraffine (cette souche a été isolée sur un milieu où la paraffine est la seule source de carbone) et par la tolérance de NaCl jusqu’à une concentration de 12 %. Le principal caractère morphologique qui écarte FG.P.63 des deux sous espèces de N. dassonvillei est la formation des synnémata. L’isolat FG.P.63 diffère:

106

-de la sous espèce dassonvillei par l’utilisation du mannose, du maltose et du Tween 80 et par la non assimilation du ribose et du saccharose et par la production de l’uréase et de la nitrate réductase, -de la sous espèce albirubida par l’utilisation du maltose et la non assimilation du ribose, du saccharose et du lactose et par la production de l’uréase. D’après tous les caractères étudiés, l’isolat FG.P.63 est une souche appartenant à l’espèce N. synnemataformans.

2.6. Isolats appartenant au genre Actinomadura 2.6.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie Les deux isolats FG.S.262 et P.S.262 développent un mycélium de substrat de couleur rose pâle, sur lequel apparait le mycélium aérien de la même couleur qui devient blanc avec la sporulation. Le mycélium de substrat est ramifié et non fragmenté, le mycélium aérien est formé par des chaines de spores, droites et légèrement incurvées à leurs extrémités, les spores sont comme des coccobacilles (figure 43). L’hydrolysat des cellules des deux isolats FG.S.262 et P.S.262 contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique, le madurose, le galactose le mannose et le glucose. Les deux isolats possèdent une paroi de type III/B. Les caractères physiologiques des deux isolats et les espèces les plus reliées phylogéniquement sont donnés dans le tableau 17.

Figure 43. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat P.S.262 a: colonies rose couvertes d’une poudre blanche, b: mycélium de substrat ramifié et non fragmenté, c: chaines de spores légèrement incurvées

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Tableau 17. Caractères physiologiques des isolats FG.S.262 et P.S.262 et des espèces les plus reliées phylogéniquements Caractère (1) FG.S.262 et A. bangladeshensis A. meyerae A. chokoriensis P.S.262 3-46-b(3)T A288T 3-45-a(11)T Croissance à 45 °C F F + + Utilisation de(2): Arabinose + F + + Mannose - - + - Mannitol + F ND F Raffinose - - + - Fructose F F + F Saccharose + F + + Glycérol + F ND + Xylose F F + + (1)Références des caractères des espèces types: Cook et al. (2005), Ara et al. (2008) (2) + : positif, - : négatif, F: faible, ND: non déterminé. Toutes les souches n’utilisent pas l’inositol, elles peuvent croitre à un pH entre 5 et 9. Elles tolèrent 4 % d’NaCl.

2.6.2. Phylogénie Les séquences complètes de l’ADNr 16S des isolats FG.S.262 et P.S.262 sont respectivement d’une longueur de 1521 et 1572 pb (les numéros d’accès à « GenBank » sont JQ972881 et JQ972882 respectivement). La comparaison avec les séquences correspondantes sur « GenBank» a montré qu’ils appartiennent au genre Actinomadura, les deux isolats sont les plus rapprochées aux espèces types: A. bangladeshensis 3-46-b(3)T et A. meyerae A288T avec les mêmes taux d’identités (98,90 et 98,30 % respectivement). L’arbre phylogénique (figure 44) montre d’une part la relation entre FG.S.262 et P.S.262 et, d’autre part, avec les espèces du genre Actinomadura. Les deux isolats sont regroupés sur la même ligne phylogénique avec une valeur de « bootstrap » très élevée (99 %), et ils sont le plus reliés à l’espèce A. bangladeshensis 3-46-b(3)T avec 85 % de « bootstrap », puis avec les deux espèces: A. chokoriensis 3-45-a(11)T et A. meyerae A288T avec 53 % et 56 % de « bootstrap » respectivement.

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Figure 44. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats FG.S.262 et P.S.262 avec les espèces les plus proches du genre Actinomadura. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,002 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

2.6.3. Discussion taxonomique La morphologie des colonies des isolats FG.S.262 et P.S.262 n’est pas distinctive. C’est en analysant la composition chimiotaxonomique de la paroi qui nous a permis de les rapprocher du genre Actinomadura. L’analyse phylogénique a confirmée l’appartenance au genre Actinomadura du fait que les deux isolats présentent des pourcentages d’identités élevés (entre 95 et 98 %) avec les espèces de ce genre. Les espèces A. bangladeshensis 3-46-b(3)T, A. chokoriensis 3-45-a(11)T et A. meyerae A288T sont les plus identiques et aussi les plus reliées phylogéniquement. La couleur rose pâle du mycélium de substrat des isolats est la même que celle de A. bangladeshensis 3-46-b(3)T, contrairement à celle de A. chokoriensis 3-45-a(11)T qui est brune dorée. La micromorphologie des isolats FG.S.262 et P.S.262, d’une part, diffère de l’espèce A. meyerae A288T par la présence du mycélium aérien, cette espèce se distingue par l’absence

109 de ce dernier, et d’autre part, par la forme incurvée des chaines de spores par rapport à A. chokoriensis 3-45-a(11)T dont les chaines sont de forme spirale (description des deux espèces est selon Ara et al., 2008). Les deux isolats présentent le même profil physiologique. La comparaison des propriétés physiologiques des deux isolats avec celles des espèces types A. bangladeshensis 3-46-b(3)T, A. chokoriensis 3-45-a(11)T et A. meyerae A288T, donnés par Cook et al. (2005) et Ara et al. (2008), montre qu’il n y a pas de différences remarquables entre ces trois espèces types. Elles ont toutes le même profil à l’exception de la capacité d’assimiler le mannose et le raffinose par A. meyerae A288T. Les caractères chimiotaxonomique et phylogénique permettent de rapprocher les deux isolats FG.S.262 et P.S.262 au genre Actinomadura. Les propriétés phénotypiques et phylogéniques ont révélé que les deux isolats sont très proches, il peut s’agir donc de d’une même souche ou bien de deux souches appartenant à la même espèce. La caractérisation macroscopique et microscopique en association avec l’analyse phylogénique permettent de les rapprochés à l’espèce A. bangladeshensis. 2.7. Isolat appartenant au genre Nocardia 2.7.1. Macromorphologie, micromorphologie, chimiotaxonomie et physiologie Les colonies de l’isolat LP.P.473 débutent leur croissance avec une couleur crevette pâle. Elles se couvrent durant, leur développement, par un fin duvet d’une couleur blanche. Les colonies sont surélevées, de consistance pâteuse et friable. LP.P.473 présente l’aspect des nocardioformes dont le mycélium de substrat est irrégulièrement ramifié dans tous les sens et le mycélium aérien est bien développé. Les deux se fragmentent en forme de bacilles de différentes tailles (figure 45). Ces mycéliums sont résistants à la coloration de Zheil-Neelsen. L’hydrolysat des cellules de l’isolat contient l’isomère méso de l’acide diaminopimélique, le glucose, le ribose, le galactose et l’arabinose, ces deux derniers sont des sucres caractéristiques du spectre A. L’isolat possède donc une paroi de type IV/A. Les caractères physiologiques de LP.P.473 et les espèces les plus rapprochées phylogéniquement sont donnés dans le tableau 18.

Figure 45. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique de l’isolat LP.P.473

110 a: colonies crevettes couvertes d’une poudre blanche, b: mycélium de substrat irrégulièrement ramifié, c: mycélium aérien fragmenté

Tableau 18. Caractères physiologiques de l’isolat LP.P.473 et les espèces les plus reliées phylogéniquements LP.P.473 N. asteroïdes DSM 43757T N. neocaledoniensis SBHR OA6T Caractère(1) Tolérance de 45 °C - - + Intervalle de pH 6-8 ND 4-12 Utilisation de(2): Mannose - - + Mannitol - - + Raffinose + ND + Fructose + ND + Saccharose + + - Lactose - ND - Tyrosine - - + Tween 80 + ND + Production de(2): Catalase + ND + (1)Référence des caractéristiques des espèces types: Hamid et al. (2001), Yassin et al. (2000), Kageyama et al. (2004), Saintpierre-Bonaccio et al. (2004). (2)Les trois souches utilisent le glucose mais n’utilisent pas l’arabinose, le galactose, l’inositol, le rhamnose, le xylose, le sorbitol et le maltose, elles ne dégradent pas la caséine, la xanthine et l’hypoxantine, elles produisent l’uréase et la nitrate réductase mais pas la gélatinase et la citrate lyase.

2.7.2. Phylogénie La séquence de l’ADNr 16S amplifiée est d’une longueur de 1424 pb (le numéro d’accès à « GenBank» est JX066804). L’alignement avec les séquences de l’ADNr 16S des bactéries disponibles sur « GenBank » a donné des pourcentages d’identités entre 97 et 99 % avec les espèces du genre Nocardia. Les taux les plus élevés sont obtenus avec l’espèce N. asteroïdes DSM 43757T (99,50 %) suivi par N. neocaledoniensis SBHR OA6T (98,91 %).

L’arbre phylogénique (figure 46) montre que l’isolat est le plus relié avec les deux espèces N. neocaledoniensis SBHR OA6T et N. asteroïdes DSM 43757T avec un support élevé de « bootstrap » (83 et 71 % respectivement). La matrice évolutionnaire donnée dans le tableau 19 révèle que la distance la plus courte (0,004) est avec l’espèce N. asteroïdes DSM 43757T.

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Figure 46. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat LP.P.473 avec les espèces type du genre Nocardia. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications. L’échelle 0,002 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences.

Tableau 19. Matrice de distance de l’isolat LP.P.473 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 0,013 3 0,016 0,021 4 0,024 0,012 0,019 5 0,012 0,018 0,024 0,026 6 0,011 0,012 0,012 0,018 0,019 7 0,021 0,008 0,029 0,011 0,026 0,020 8 0,022 0,029 0,030 0,034 0,028 0,030 0,037 9 0,016 0,021 0,000 0,019 0,024 0,012 0,029 0,030 10 0,012 0,014 0,017 0,015 0,020 0,015 0,022 0,029 0,017 11 0,023 0,026 0,021 0,019 0,032 0,020 0,024 0,035 0,021 0,024 12 0,024 0,027 0,029 0,027 0,026 0,029 0,036 0,021 0,029 0,022 0,033 13 0,004 0,012 0,018 0,020 0,008 0,013 0,020 0,021 0,018 0,015 0,026 0,021

1: N. asteroïdes DSM 43757T, 2: N. shimofusensis YZ-96T, 3: N. cyriacigeorgica GUH-2T, 4: N. farcinica IFM 10152T, 5: N. neocaledoniensis SBHR OA6T, 6: N. abscessus IMMIB D-1592T, 7: N. higoensis IFM 10084T, 8: N. anaemiae IFM 0323T, 9: N. cyriacigeorgica DSM 44484T, 10: N. thailandica IFM 10145T, 11: N. brasiliensis ATCC 700358T, 12: N. caishijiensis F829T, 13: LP.P.473

112

2.7.3. Discussion taxonomique Les caractères morphologiques de l’isolat LP.P.473 concordent avec ceux des espèces appartenant au genre Nocardia, principalement la fragmentation des mycéliums et la coloration positive de Ziehl-Neelson. L’analyse phylogénique rapproche l’isolat à deux espèces N. neocaledoniensis SBHR OA6T et N. asteroïdes DSM 43757T. En revanche, la matrice de distance évolutionnaire le rapproche plus à N. asteroïdes DSM 43757T. La comparaison des propriétés physiologiques permet de constater la similitude entre LP.P.473 et N. asteroïdes DSM 43757T pour la majorité des caractères. Par ailleurs, il diffère de N. neocaledoniensis SBHR OA6T par l’utilisation du saccharose et la non assimilation du mannose, du mannitol et de la tyrosine. Les critères morphologiques, chimiotaxonomiques et phylogéniques confirment l’appartenance de l’isolat au genre Nocardia. Les résultats de l’alignement, la matrice de distance évolutionnaire et les caractères physiologiques permettent de rapprocher l’isolat LP.P.473 à l’espèce N. asteroïdes.

2.8. Discussion clinique Les isolats identifiés comme appartenant aux genres d’actinomycètes aérobies dits rares (rarement isolés d’environnements naturels, aussi bien que dans les milieux de clinique pratique) peuvent être répartis en deux groupes: -Nocardia, Actinomadura et Nocardiopsis qui sont déjà rencontrés en clinique et impliqués dans des cas de pathologies chez l’homme, -Nonomuraea, Kribbella, Micromonospora et Saccharothrix qui n’ont jamais été isolés de prélèvements cliniques et donc leur rôle en pathologie est mal connu. 2.8.1. Nocardia, Actinomadura et Nocardiopsis L’isolat LP.P.473 est une souche appartenant à l’espèce N. asteroïdes. Le genre Nocardia comprend beaucoup d’espèces qui sont connues être des causes inhabituelles d'un large spectre de maladies cliniques chez l’homme et l’animal (Lui et al., 2011). L’infection qu’elles provoquent est granulomateuse et suppurative, localisée ou disséminée appelée: nocardiose. La voie respiratoire est souvent le site initial de l’infection à partir duquel le germe peut être disséminé vers les autres organes. Le germe peut aussi s’introduire à travers des lésions traumatiques (Sullivan et Chapman, 2010). La nocardiose affecte principalement les patients immunodéprimés, mais elle peut aussi atteindre des patients immunocompétents (Conville et al., 2000; 2012). Plusieurs formes cliniques de nocardioses sont décrites: pulmonaire, du système nerveux central, cutanée, sous-cutanée et lymphocutanée,

113 extrapulmonaire (autre que système nerveux et tissu cutané) ou disséminée (impliquant deux ou plusieurs sites infectieux) (Rodríguez-Nava et al., 2008). Les Nocardia sp., agents des nocardioses, sont ubiquitaires dans l’environnement et sont rencontrés comme des saprophytes dans les eaux douces et salées, le sol, la poussière, la végétation et la matière fécale des animaux en décomposition. Ils ne font pas partie de la flore normale de l’homme (Brown-Elliott et al., 2006; Soraa et al., 2009; Sullivan et Chapman, 2010). Approximativement la moitié des espèces du genre Nocardia sont des pathogènes de l’homme et des animaux (Leger et al., 2009; Bawa et al., 2010). N. asteroïdes est considérée comme l’espèce la plus connue associée aux infections chez l’homme (McNab et al., 2006; Lai et al.,2009; Lowman et Aithma, 2010). Chez la patiente à partir de laquelle l’espèce Nocardia asteroïdes a été isolée, le début des symptômes remonte à un an avant son admission à l’hôpital. En effet, l’installation d’une nocardiose est souvent insidieuse sur plusieurs mois (Kageyama et al., 2004). En outre, la patiente présentait les facteurs majeurs de risque pour une nocardiose. Il est rapporté que la nocardiose atteint, en particulier, les patients immunodéprimés ou porteurs d’une pathologie pulmonaire sous-jacente (Yamamura et al., 2004; Soraa et al., 2009). Dans le cas de cette patiente, une culture positive d’une souche de N. asteroïdes à partir de prélèvement de liquide pleural peut diriger le diagnostic vers une nocardiose pulmonaire, il est rapporté que la nocardiose pulmonaire présente un tableau clinique d’une pneumopathie infectieuse aiguë ou subaiguë accompagnée d’une altération importante de l’état général, et un épanchement pleural est souvent associé dans 15 à 25 % des cas (Couraud et al., 2007), ce qui est, effectivement, le cas de notre patiente. L’espèce N. asteroïdes est impliquée comme pathogène opportuniste dans une gamme de maladies pulmonaires (Lowman et Aithma, 2010). Les prélèvements de la vois respiratoire y compris le crachat, le lavage du fluide bronchioalvéolaire, l’effusion pleural, la biopsie des poumons, sont les sources les plus fréquentes des isolats de Nocardia sp. (Lai et al., 2009; Liu et al., 2011). Cependant, l’isolement des Nocardia sp. à partir du liquide pleural peut être expliqué par une dissémination hématogène ou bien par une diffusion du germe par contigüité qui a conduit à la formation d’une pleurésie (Moiton et al., 2006). Même si la nocardiose reste une maladie rare, l’attention du clinicien devra être attirée devant une pneumopathie fébrile, fréquemment associée à un épanchement pleural, dans un contexte d’altération de l’état général, surtout chez un sujet présentant des facteurs de risques. Les deux isolats FG.S.262 et P.S.262 sont identifiés comme souches appartenant à l’espèce Actinomadura bangladeshensis. Le genre Actinomadura, est fréquemment isolé de la surface du sol, et il est impliqué dans les mycétomes. Ces derniers sont des pseudo-

114 tumeurs inflammatoires, granulomateuses souvent polyfistulisées dues à des champignons (eumycétomes) ou à des bactéries aérobies appartenant aux actinomycètes (actinomycétomes) (Sy et al., 2003; Trabelsi et al., 2009). C’est une maladie infectieuse chronique, déformante et parfois mortelle résultant de l’inoculation de l’agent pathogène à travers une blessure, une infection, une lésion existante ou un traumatisme (Martin et al., 1999; Bonnet et al., 2011). Les localisations préférentielles des mycétomes sont le pied, mais les mycétomes peuvent siéger sur le tronc, les fesses et l’aine; l’atteinte du cuir chevelu ou de la nuque est relativement fréquente; l’atteinte viscérale est plus rare, et souvent secondaire à un envahissement du mycétome à partir d’un foyer cutané (Pitche et al., 1999). Ces infections affectent surtout les sujets exposés à un traumatisme, surtout dans les régions rurales (Develoux et al., 2003), et elles sont plus fréquentes dans les régions sèches et arides ou avec un climat semi désertique correspondant à l’écosystème des agents étiologiques (Pitche et al., 1999). Le diagnostic clinique de mycétomes se base sur l’existence d’une tuméfaction inflammatoire polyfistulisée avec ou sans émission de grains visibles (Dieng et al., 2005; Bonnet et al., 2011). Mais il existe assez peu de diagnostics différentiels du mycétome, d’autres infections comme une osteïte chronique fistulisée à la peau, une tuberculose ganglionnaire ou articulaire, une autre mycose sous-cutanée peuvent évoquer cliniquement ce diagnostic (Develoux et al., 2003). La majorité des infections à Actinomadura sont causées par A. madurae et A. pelletieri, ces deux espèces peuvent causer des infections cutanées, chroniques et destructives et peuvent s’étendre jusqu’aux os. Les deux isolats d’Actinomadura bangladeshensis ont été obtenus de prélèvements du fuide gastrique et d’une ponction de pus d’une patiente diagnostiquée comme atteinte d’une tuberculose ganglionnaire. La souche type de cette espèce a été initialement isolée d’un sol sableux (Ara et al., 2008). À notre connaissance, aucune publication ne fait état de l’isolement de cette espèce à partir de prélèvements cliniques, son rôle pathogène est donc méconnue. En revanche, il a été rapporté, récemment, qu’il y a des espèces d’Actinomadura (comme A. sputi et A. meyerae) qui sont d’origine tellurique et qui ont été trouvées par la suite impliqués dans des cas d’actinomycétomes (Bonnet et al., 2011). Les mycétomes ganglionnaire sont rares (Develoux et al., 2003), par contre un envahissement ganglionnaire à distance, prouvé par l’histologie, est survenu 9 fois sur 133 cas au Niger et 6 fois sur 109 cas au Sénégal (Cascio et al., 2011). L’atteinte ganglionnaire doit être recherchée systématiquement car, méconnue, elle risque d’évoluer dans un second foyer (Develoux et al., 2003). La détection de la même espèce d’Actinomadura dans le fluide gastrique de cette patiente, n’a pas d’explications affirmatives, nous pouvons suggérer qu’il s’agit d’une contamination par inhalation ou ingestion du germe. Mais la possibilité de dissémination du

115 germe à partir d’un foyer primaire par voix lymphatique ne peut être exclue. Un cas de propagation de mycétome causé par A. pellietiri à partir du pied par voie lymphatique a été rapporté, avec une présence asymptomatique dans le tibia et le péroné, puis après il s’est étendu à travers les nœuds lymphatiques inguinal et a affecté la 11ème vertèbre dorsale (Cascio et al., 2011). L’isolement du même microorganisme à partir de plusieurs prélèvements peut avoir une signification clinique (Brown-Elliot et al., 2006). Les complications de mycétome peuvent être rencontrées, elles sont soit locales (comme une gangrène) ou régionale (un envahissement ganglionnaire). Les métastases viscérales par voie lymphatiques ont été rapportées (Lamrani et al., 2002). L’isolat FG.P.63 est une souche appartenant à Nocardiopsis synnemataformans, elle a été isolée d’un patient présentant une fièvre prolongée et le diagnostic n’a pas été déterminé. Les souches de Nocardiopsis, y compris l’espèce N. synnemataformans, sont xérotolérantes, ce qui leur permet de vivre, en de haute densité (105 to 106 UFC/g), dans des milieux où l’activité d’eau est très faible. Et elles peuvent utiliser une très large variété de substances nutritionnelles. Ces caractéristiques leur permettent de coloniser les environnements déficients en nutriments comme des intérieurs ménagers, l’air environnent l’intérieur et les matières de construction de bâtiments (Peltola et al., 2001). Par ailleurs, plusieurs espèces du genre Nocardiopsis (N. alba ssp. alba, N. prasina, N. lucentensis, N. tropica, N. exhalens, N. umidischolae) produisant de métabolites cytotoxiques ont été isolées des espaces ménagers (Peltola et al., 2001; Yassin et al., 2009). Cette tendance à coloniser les environnements intérieurs, combinée à la capacité d’émettre des substances toxiques rendent les membres de ce genre capables d’altérer la santé humaine (Suihko et al., 2009). Cependant, ces espèces sont rencontrées rarement en clinique. Du point de vue pathogénicité, l’espèce N. dassonvillei est la plus citée, elle est impliquée dans des cas de mycétomes, d’infections pulmonaires, d’alvéolites, de conjonctivites et de septicémie (Beau et al., 1999). Le seul cas décrit de l’espèce N. synnemataformans a été, son isolement, à partir de crachat d’un malade avec transplantation rénale (Yassin et al., 1997). 2.8.2. Micromonospora, Kribbella, Nonomuraea et Saccharothrix Les isolats FG.B.44, C.S.46, FG.S.46 et P.P.66 sont identifiés comme appartenant à l’espèce Micromonospora aurantiaca. Les espèces de ce genre sont abondamment distribués dans le sol, l’eau, le sable de mer, les nodules de plantes, etc (Tanasupawat et al., 2010). Ce genre a été, déjà, rencontré en clinique mais son potentiel de pathogénie n’a pas été définie (McNeil et Brown, 1994). Nous pouvons noter comme remarque importante et singulière c’est que ces quatre isolats ont été obtenues de prélèvements récoltés la même semaine à

116 partir de trois patients différents. Cela nous laisse supposer que c’est une contamination à partir du milieu hospitalier. L’isolat FG.P.44 appartient au genre Kribbella. Ce genre est très rare, il y a que 17 espèces qui sont connues jusqu’à ce jour (Euzéby, 2012). Elles sont isolées d’environnement divers, principalement, du sol, elles sont, aussi, isolées de pierre, d’un sol d’hippodrome, de la pomme de terre, de racines de nodules de plantes et des catacombes (Song et al., 2004; Trujillo et al., 2006a; Carlsohn et al., 2007; Everest et Meyers, 2008; Urzì et al., 2008; Pukall et al., 2010). À notre connaissance, il n’y a pas eu, auparavant, des cas d’isolement de souches de ce genre à partir de prélèvements cliniques. Cet isolat est probablement une nouvelle espèce. L’isolat FG.P.03 est identifié à l’espèce Nonomuraea roseola, les espèces du genre Nonomuraea sont isolées de différents sols (Le Roes et Meyers, 2008). La détection de cet isolat dans le fluide gastrique, qui est un environnement hostile et inhabituelle, et son absence dans le crachat du malade, peut être due à l’ingestion de ce microorganisme. Les deux isolats C.S.118 et FG.S.118 représentent, probablement, la même souche qui a été identifiée à l’espèce Saccharothrix longispora. Les différent espèces de ce genre sont isolées de différents sols et de feuilles de plantes (Lee et al., 2000; Zitouni et al., 2004; Otoguro et al., 2009). Jusqu’à ce jour il n’y a pas eu de rapports sur l’occurrence en clinique de souches appartenant à ce genre. Dans notre étude, leur présence dans le crachat et le fluide gastrique peut être expliquée par une simple contamination par inhalation puis le microorganisme s’est propagé dans le tube digestif. Micromonospora, Kribbella, Nonomuraea et Saccharothrix sont des genres rarement rencontrés dans la nature, beaucoup d’études se sont focalisées en leur isolement de milieux naturels en vue de l’exploitation de leur capacité de produire de nouvelles molécules bioactives. Cependant, elles sont méconnues en pathologie. 2.9. Conclusion L’étude taxonomique des isolats cliniques d’actinomycètes aérobies a révélé que douze appartiennent à sept genres et espèces rarement isolés de prélèvements cliniques et des environnements naturels. Nocardia asteroïdes a été isolée du liquide pleural qui est naturellement stérile, chez une patiente avec des signes d’infection prolongée durant une année et qui présentait les facteurs majeurs de risques: maladies sous-jacentes (pneumopathie et tuberculose) et une corticothérapie. Il est fortement probable que le diagnostic soit dirigé vers une nocardiose. Actinomadura bangladeshensis a été isolée de deux prélèvements différents: le fluide gastrique et le pus d’abcès, chez une même malade qui a été diagnostiquée comme atteinte de

117 tuberculose ganglionnaire et abdominale, par conséquence elle a été soumise aux antituberculeux et aux corticoïdes. Quelques espèces du genre Actinomadura sont citées comme agents causatifs d’actinomycètomes, mais cette espèce n’a pas été détectée auparavant. Comme notre patiente présentait des signes cliniques en faveur d’un cas d’actinomycétome et des facteurs en faveur d’une infection opportuniste, le pouvoir pathogène de cette espèce est très probable. Nocardiopsis synnemataformans a été isolée du fluide gastrique d’un patient présentant une fièvre au long cours et sans un diagnostic bien définie. Par son pouvoir de résister à des environnements hostiles, combiné à la capacité d’émettre des substances toxiques, les membres du genre Nocardiopsis peuvent causer des effets néfastes sur la santé humaine. En clinique, un seul cas d’isolement de cette espèce a été signalé chez un patient immunodéprimé suite a une transplantation d’organe, donc le pouvoir pathogène de cette espèce doit être étudié. Nonomuraea roseola, Kribbella sp., Micromonospora aurantiaca et Saccharotrix longispora sont des espèces rarement rencontrées dans l’environnement naturel, il n’y a pas de description de cas d’isolement de ces espèces en clinique. Leur présence à cet environnement peut être une simple contamination, mais comme elles sont méconnues nous ne pouvons écarter, de manière claire et définitive, leur implication en pathologie.

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3. Isolats appartenant au genre Streptomyces L’ensemble des caractères morphologiques, chimiotaxonomiques et phylogéniques ont permis d’affilier trente sept isolats au genre Streptomyces. Ces isolats sont à coloration de Gram positive et non acido-alcoolo-résistants. 1. Macromorphologie, micromorphologie et chimiotaxonomie Les colonies de ces isolats sont, toutes, du même type, elles présentent, au début de leur développement, un aspect sec coriace, avec des surfaces lisses. Au cours du développement elles se couvrent par un mycélium aérien qui est, selon les espèces, d’un aspect granuleux, poudreux, cotonneux ou velouté. Les colonies à la maturité sont dures et incrustées dans la gélose. Elles sont plates, en dôme ou sous forme de chou-fleur. La couleur et la production de pigments diffusibles et mélanoïdes diffèrent selon les espèces. Les hyphes du mycélium de substrat sont ramifiés et non fragmentés. Le mycélium aérien, à la maturité, forme de longues chaines d’arthrospores, d’un nombre qui diffère selon les espèces. Les chaines de spores sont de forme droites, flexibles, rectiflexibles ou spirales. Les spores, non mobiles, sont ovales ou cylindriques avec des bords arrondis. Le tableau 20 rassemble des photographies représentatives de l’aspect macroscopique et microscopique des différents isolats appartenant au genre Streptomyces. L’hydrolysat des cellules des 37 isolats contient l’isomère LL de l’acide diaminopimélique, dans quelques cas il y a, aussi, présence de la glycine. Les sucres caractéristiques ne sont pas présents. Ces isolats possèdent, donc, une paroi de type I/C.

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Tableau 20. Photographies de l’aspect macroscopique et microscopique des isolats du genre Streptomyces

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3.2. Phylogénie et phénotype distinctif 3.2.1. Alignement des séquences de l’ADNr 16S Les résultats de l’alignement des séquences de l’ADNr 16S avec le programme de comparaison des séquences de nucléotides « BLAST » a permis l’affiliation des 37 isolats au genre Streptomyces. Les pourcentages d’identités, avec les espèces types les plus rapprochées, ainsi que les numéros d’accès à « GenBank», sont donnés dans le tableau 21.

Tableau 21. Taille de l’ADNr 16S des isolats d’actinomycètes appartenant au genre Streptomyces, et résultats de l’alignement avec les espèces types les plus proches Isolats ADNr16S (pb)* Espèces types les plus proches (% d’identité) ** P.P.21a 1378 - S. rubrogriseus NBRC 15455T(99,11) - S. lienomycini LMG 20091T(99,05) P.P.21b 1444 - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T(99,44) - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,44) - S. microflavus NRRL B-2156T(99,44) - S. luridiscabiei S63T(99,37) P.B.21 1491 - S. lienomycini LMG 20091T(99,31) - S. rubrogriseus NBRC 15455T(99,30) FG.B.22 1493 - S. rubrogriseus NBRC 15455T(99,16) - S. lienomycini LMG 20091T(99,11) P.P.22 1479 - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,93) - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T(99,86) - S. microflavus NRRL B-2156T(99,86) - S. anulatus NRRL B-2000T(99,86) C.P.31 1487 - S. lienomycini LMG 20091T(99,04) FG.B.31 1373 - S. rubrogriseus NBRC 15455T(99,03) C.P.38 1494 - S. flavogriseus ATCC 33331T (99,86) - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T (99,73) FG.P.40 1494 - S. carpaticus NRRL B-16359T(99,52) - S. cheonanensis VC-A46T(98,64) C.S.42 1417 - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,85) - S. anulatus NRRL B-2000T(99,78) C.P.44 1468 - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,72) - S. anulatus NRRL B-2000T(99,65) C.B.46 1494 - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(98,71) - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(98,57) C.S.51 1336 - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,70) - S. anulatus NRRL B-2000T(99,62) - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T(99,62) - S. microflavus NRRL B-2156T(99,62) C.S.52 1491 - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,93) - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T(99,86) - S. anulatus NRRL B-2000T(99,86) - S. microflavus NRRL B-2156T(99,86) C.P.57 1484 - S. lienomycini LMG 20091T (99,31) - S. rubrogriseus NBRC 15455T (99,30) C.S.66a 1258 - S. flavogriseus ATCC 33331T (99,61) - S. griseoplanus AS 4.1868T (99,61) - S. anulatus NBRC 12755T (99,61) - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T(99,48) C.S.66b 1490 - S. rubrogriseus NBRC 15455T (99,30) - S. lienomycini LMG 20091T (99,24)

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Suite du tableau 21 Isolats ADNr16S (pb)* Espèces types les plus proches (% d’identité) ** FG.B.66 1492 - S. rubrogriseus NBRC 15455T (99,30) - S. lienomycini LMG 20091T (99,17) FG.P.68 1464 - S. sampsonii ATCC 25495T(99,72) - S. exfoliatus NBRC 13475T(99,64) - S. albidoflavus NBRC 13010T(99,64) - S. odorifer DSM 40347T(99,64) FG.B.151 1489 - S. pseudogriseolus NRRL B-3288T(99,19) - S. atrovirens NRRL B-16357T(99,06) C.S.194 1491 - S. albidoflavus NBRC 13010T (99,86) - S. albus J1076T (99,79) - S. sampsonii ATCC 25495T (99,79) P.B.255 1490 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,86) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,75) C.B.239 1492 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(100) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,65) U.B.239 965 - S. djakartensis NBRC 15409T(99,79) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,79) - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,79) - S. geysiriensis NRRL B-12102T(99,79) - S. levis NBRC 15423T(99,79) - S. anandii NBRC 13438T(99,79) - S. rochei NBRC 12908T(99,79) - S. lavendulocolor NRRL B-3367T(99,68) C.S.348 1358 - S. heliomycini NBRC 15899T(98,18) - S. speibonae PK-BlueT(98,06) FG.S.348 1477 - S. heliomycini NBRC 15899T(98,99) - S. speibonae PK-BlueT(98,88) C.B.356 1481 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,65) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,59) FG.B.356 1491 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,72) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,65) - S. geysiriensis NRRL B-12102T(99,65) LP.B.373 1459 - S. cinereoruber ssp. cinereoruber JCM 4205T(99,85) - S. violaceorectus NBRC 13102T(99,45) C.B.392 1298 - S. rubrogriseus NBRC 15455T (99,60) - S. lienomycini LMG 20091T(99,53) FG.S.392 1475 - S. lienomycini LMG 20091T (99,31) - S. rubrogriseus NBRC 15455T (99,30) FG.B.435 1485 - S. coeruleorubidus NBRC 12844T(99,93) - S. iakyrus NBRC 13401T(99,38) U.B.458 1106 - S. lydicus ATCC 25470T(98,52) - S. rimosus ssp. paromomycinus DSM 41429T(98,51) FG.S.461 1472 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,72) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,65) - S. geysiriensis NRRL B-12102T(99,65) P.S.461 1492 - S. griseus ssp. griseus NBRC 13350T(99,86) - S. flavogriseus ATCC 33331T(99,86) - S. luridiscabiei S63T(99,79) C.B.464 1491 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,79) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,72) - S. geysiriensis NRRL B-12102T(99,72) C.S.466 1465 - S. mutabilis NRRL ISP-5169T(99,79) - S. minutiscleroticus NRRL B-12202T(99,72) - S. geysiriensis NRRL B-12102T(99,72) * Les numéros d’accès à « GenBank » sont de KF991620 à KF991656. **Un isolat donné est rapproché des espèces ayant les deux premiers pourcentages d’identités les plus élevés.

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3.2.2. Affiliation des isolats

Afin de définir l’affiliation à l’espèce la plus rapprochée, les isolats sont regroupés dans plusieurs clades, selon leur rapprochement phylogénique (figure 47), qui est défini par des valeurs de « bootstrap » supérieures à 60 % (Labeda et al., 2011). Ainsi les arbres phylogéniques et les matrices de distances évolutionnaires sont établis. L’affiliation des isolats du genre Streptomyces à une espèce donnée repose sur la combinaison des caractères génotypiques et phénotypiques et leur comparaison avec ceux des espèces les plus reliées.

C.P.57 C.S.66b C.B.392 FG.B.66 99 C.P.31 FG.B.31 Clade 1 FG. B.22 P.P.21a P.B.21 FG.S.392 C.S.348 Clade 2 99 FG.S.348 U.B.458 LP.B.373 P.P.21b P.P.22 C.S.52 98 C.S.51 Clade 3 C.P.38 C.S.42 P.S.461 C.P.44 C.S.66a FG.B.435 97 FG.P.68 Clade 4 C.S.194 FG.B.151 U.B.239 C.B.239 62 C.B.356 FG.B.356 61 FG.S.461 Clade 5 C.B.464 C.S.466 C.B.46 P.B.255 FGP40 T Nocardia asteroides DSM 43757 (NR_041856.1)

0.01

Figure 47. Arbre phylogénique construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation entre les isolats du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent les pourcentages supérieurs à 60 % après 1000 réplications; l’échelle 0,01 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences; Nocardia asteroides DSM 43757T est utilisée comme « out group ».

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3.2.2.1. Isolats P.P.21a, P.B.21, FG.B.22, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392

L’arbre phylogénique (figure 48) montre que ces isolats sont regroupés sur la même ligne phylogénique avec une valeur de « bootstrap » élevée (85 %) et ils sont liés aux espèces S. lienomycini LMG 20091T et S. rubrogriseus NBRC 15455T avec une valeur de « bootstrap » de 79 %. La matrice de distances évolutionnaires (tableau 22), permet de distinguer les différences existantes entre ces dix isolats. Les isolats P.P.21a, P.B.21, C.P.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66 et FG.S.392 n’ont pas de différences entre eux (0,000 de distance); ils sont le plus rapprochés aux espèces S. lienomycini LMG 20091T et S. rubrogriseus NBRC 15455T avec une valeur de distance égale à 0,002. Les isolats, FG.B.22, FG.B.31 et C.B.392, aussi, rapprochés aux deux espèces précédentes mais avec une distance de 0,003; L’isolat FG.B.22 est séparé de FG.B.31 et C.B.392 d’une distance égale à 0,003. Ces deux derniers sont séparés d’une distance égale à 0,002, et ils sont rapprochés aux autres isolats avec une distance de 0,001. Les isolats P.P.21a, P.B.21, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392 possèdent des caractères très proches. Leurs mycéliums aériens sont de couleur grise, les mycéliums de substrat sont jaunes, ils produisent un pigment mélanoïde, mais pas de pigments diffusibles. Les chaines de spores sont de forme spirale avec plus de 20 spores par chaine. Ces isolats utilisent l’arabinose, le raffinose, le rhamnose, le xylose, le lactose, le saccharose et l’inositol. Ils peuvent supporter une concentration de 7 % de NaCl. Ces caractéristiques sont très similaires à ceux de l’espèce S. lienomycini décrite par Bouizgarne et al. (2009) et Loqman et al. (2009). L’isolat FG.B.22 diffère des isolats précédents par la couleur du mycélium de substrat qui est rose. Cette macromorphologie correspond à l’espèce S. rubrogriseus (Bouizgarne et al., 2009; Loqman et al., 2009).

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Figure 48. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats P.P.21a, P.B.21, FG.B.22, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

Tableau 22. Matrice de distances des isolats P.P.21a, P.B.21, FG.B.22, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, C.B.392 et FG.S.392 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

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3.2.2.2. Isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52, C.S.66a et P.S.461 L’arbre phylogénique (figure 49) montre que ces isolats sont sur la même ligne avec une valeur de « bootstrap » faible (28 %), ils sont liés aux espèces S. griseoplanus AS 4.1868T, S. griseus ssp. griseus NBRC 13350 T, S. fimicarius ISP 5322T, S. flavogriseus CBS 101.34T et S. anulatus NRRL B-2000T. La matrice de distances évolutionnaires (tableau 23) montre que les isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52 et P.S.461 n’ont aucunes différences entre eux (0,000). Ces huit isolats sont très proches des espèces S. flavogriseus CBS 101.34T, S. griseoplanus AS 4.1868T, S. anulatus NRRL B-2000T et S. fimicarius ISP 5322T sans aucune différence (0,000). L’isolat C.S.66a est séparé des isolats et des espèces précédents avec une distance de 0,004. Les isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52 et P.S.461 présentent un mycélium aérien de couleur grise, celui de substrat est jaune, les chaines de spores sont de forme rectiflexible. Ils produisent un pigment de couleur jaune clair dans le milieu mais pas de pigment mélanoïde et utilisent l’arabinose, le xylose, le mannitol, le fructose et le rhamnose comme seule source de carbone mais n’assimilent pas le saccharose, le raffinose et l’inositol. Tous ces caractères sont similaires à ceux de S. flavogriseus décrits par Shirling et Gottlieb (1969). L’isolat C.S.66a diffère des premiers par la forme spirale de chaines de spores, il ne produit pas de pigments diffusibles et utilise le raffinose, le rhamnose, le saccharose et l’inositol. Ces caractéristiques permettent de le rapprocher à l’espèce S. griseoplanus dont les caractéristiques ont été décrites par Williams et al. (1989). Les caractères qui séparent ces isolats des autres espèces les plus rapprochées phylogéniquement sont les suivants: -S. fimicarius a un mycélium de substrat qui peut se fragmenter, le mycélium aérien est de couleur jaune, le pigment diffusible est rose ou brun rouge; -S. anulatus a mycélium aérien jaune ou blanc. (Whitman et al., 2012).

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Figure 49. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52, C.S.66a et P.S.461avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap »aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

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Tableau 23. Matrice de distances des isolats P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52, C.S.66a et P.S.461 calculée par la modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

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3.2.2.3. Isolats C.B.46, FG.B.151, C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 L’arbre phylogénique (figure 50) montre, d’une part, que les isolats C.B.46 et U.B.239 forment des lignes séparées de toutes les espèces, et d’autre part, que les isolats C.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 sont regroupés, sur la même ligne phylogénique avec les espèces S. mutabilis NRRL ISP-5169T, S. minutiscleroticus NRRL B-12202T, S. levis NBRC 15423T, S. geysiriensis NRRL B-12102T et S. rochei NBRC 12908T. Il en ressort de l’analyse de la matrice des distances évolutionnaires (tableau 24) que: -les isolats C.B.239, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 sont proches des espèces citées ci-dessus et ils ne présentent aucune différence entres eux (0,000 de distance); -P.B.255 est rapproché de ces six isolats (distance 0,001) et s’apparente le plus aux mêmes espèces avec une distance de 0,001; -U.B.239 est, également, rapproché des isolats cités ci-dessus (distances 0,001 et 0,002) et se rapproche le plus de S. mutabilis NRRL ISP-5169T, S. minutiscleroticus NRRL B-12202T, S. levis NBRC 15423T, S. geysiriensis NRRL B-12102T, S. rochei NBRC 12908T, S. anandii NBRC 13438T, S. lavendulocolor NRRL B-3367T, S. djakartensis NBRC 15409T, S. spiralis NRRL B-16922T; -C.B.46 est éloigné, à la fois de toutes ces espèces et des autres isolats, avec, respectivement, des valeurs de distances allant de 0,008 à 0,011. -FG.B.151 est aligné avec trois espèces: S. cellulosae NRRL B-2889T, S. gancidicus NBRC 15412T et S. pseudogriseolus NRRL B-3288T avec une valeur de « bootstrap » de 60 %; il est le plus rapproché de ces espèces sans aucune différence (0,000 de distance). Les isolats P.B.255, C.B.239, U.B.239, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 présentent un mycélium aérien de couleur grise, un mycélium de substrat jaune brun, des chaines de spores rectiflexibles. Ils ne produisent pas de pigments diffusibles et mélanoïdes, utilisent le rhamnose, l’arabinose, le fructose l’inositol, le mannose, le raffinose, le xylose, le saccharose et le citrate, dégradent l’amidon, la gélatine, l’urée et la caséine. Ils tolèrent jusqu’à une concentration de 7 % de NaCl. Ils ne produisent pas d’H2S. Toutes ces caractéristiques sont semblables à ceux de S. mutabilis décrits par Willams et al. (1989) et Whitman et al. (2012). Les caractères discriminants des espèces les plus rapprochées phylogéniquement sont les suivants: -S. minutiscleroticus et S. geysiriensis ont des chaines de spores de forme spirale (Willams et al., 1989; Lanoot et al., 2004).

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-S. rochei produit un pigment diffusible brun grisâtre. Elle n’utilise pas l’arabinose, le saccharose, le raffinose et le xylose (Willams et al., 1983; Kumar et al. 2013). -S. lavendulocolor: le mycélium aérien est rouge, elle produit le pigment mélanoïde, elle n’utilise pas le mannitol (Willams et al., 1989). -S. djakartensis: les chaines de spores de forme spirale, elle produit le pigment mélanoïde (Willams et al., 1989). -S. spiralis: le mycélium aérien est de couleur gris jaunâtre, le mycélium de substrat est crème à jaune, forme de longues chaines de spores de forme spirale. Ne dégrade pas l’urée, elle produit l’H2S, elle n’utilise pas le xylose (Whitman et al., 2012). -S. levis: le mycélium de substrat est rouge brun, elle produit le pigment mélanoïde, elle n’utilise pas le xylose, elle résiste jusqu’à une concentration de 5 % de NaCl, elle produit de l’H2S (Gausse et al., 1983). - S. anandii: les chaines de spores sont de forme spirale, elle produit le pigment mélanoïde et elle n’utilise pas le rhamnose (Whitman et al., 2012). La majorité des caractères phénotypiques de FG.B.151 sont en commun avec les espèces les plus reliées phylogéniquement (caractères de S. cellulosae, S. gancidicus et S. pseudogriseolus selon Holt et al., 1994). Toutes ces espèces (y compris l’isolat FG.B.151) présentent un mycélium aérien de couleur grise, ne produisent pas de pigment mélanoïde. Les chaines de spores sont de forme spirale. Elles tolèrent une température de 45 °C et une concentration de NaCl de 7 %. Elles utilisent le glucose, le rhamnose, le saccharose, l’inositol et le mannitol. Elles dégradent les lipides et la xanthine. Elles ne réduisent pas le nitrate et elles ne produisent pas d’H2S. Le seul critère qui diffère FG.B.151 de S. cellulosae est l’utilisation du raffinose, et de S. gancidicusla, la production d’un pigment diffusible. C.B.46 a un phénotype qui, d’une part, est différent de celui des autres isolats, et d’autre part, des espèces rapprochées phylogéniquement. Son mycélium aérien est de couleur blanc grisâtre, celui de substrat est crème, il (isolat) ne produit pas de pigment diffusibles ou mélanoïdes. Les chaines de spores sont de forme spirale. Il utilise le rhamnose, l’arabinose, le fructose l’inositol, le mannose, le raffinose, le xylose, le saccharose et le citrate. Il dégrade l’amidon, la gélatine, l’urée et la caséine. Il ne produit pas de l’H2S.

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Figure 50. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats C.B.46, FG.B.151, C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

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Tableau 24. Matrice de distances des isolats C.B.46, FG.B.151, C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 calculée par la modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

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3.2.2.4. Isolats C.S.348 et FG.S.348 C.S.348 et FG.S.348 sont étroitement reliés avec une valeur élevée de « bootstrap » (99 %), ils forment une ligne séparée dans l’arbre phylogénique (figure 51). Considérant la matrice de distances évolutionnaires (tableau 25), C.S.348 et FG.S.348 sont le plus proches de l’espèce S. coeruleorubidus avec une distance de 0,007, et ils n’ont pas de différences évolutionnaires entre eux (0,000 de distance); Les caractères phénotypiques de ces isolats montrent qu’ils ont le même phénotype, un mycélium aérien de couleur blanche, un mycélium de substrat de couleur jaune pâle, les chaines de spores sont de forme spirales, ils produisent le pigment mélanoïde mais pas de pigments diffusibles. Ils utilisent l’arabinose, le fructose, le galactose, le mannose, le rhamnose, le xylose, le glycérol, l’inositol, le mannitol, le lactose, le maltose et le saccharose comme seule source de carbone. Ils réduisent le nitrate et produisent l’H2S. Ils dégradent la caséine, l’amidon, la gélatine, l’hypoxanthine, la xanthine, le Tween 80, la tyrosine et l’urée. Cependant ces deux isolats diffèrent de l’espèces S. coeruleorubidus par la couleur du mycélium aérien, celui de cette espèce est bleu (Williams et al., 1989).

Figure 51. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats C.S.348 et FG.S.348 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

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Tableau 25. Matrice de distances des isolats C.S.348 et FG.S.348 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 0,005 3 0,013 0,014 4 0,013 0,014 0,000 5 0,004 0,009 0,016 0,016 6 0,011 0,012 0,013 0,013 0,016 7 0,010 0,016 0,003 0,003 0,012 0,010 8 0,005 0,010 0,008 0,008 0,007 0,017 0,007 9 0,005 0,010 0,008 0,008 0,007 0,017 0,007 0,000 10 0,004 0,009 0,016 0,016 0,000 0,016 0,012 0,007 0,007 11 0,004 0,009 0,016 0,016 0,000 0,016 0,012 0,007 0,007 0,000 12 0,011 0,017 0,013 0,013 0,009 0,010 0,012 0,014 0,014 0,009 0,009 13 0,010 0,016 0,006 0,006 0,012 0,007 0,003 0,009 0,009 0,012 0,012 0,009 14 0,013 0,017 0,013 0,013 0,011 0,016 0,010 0,012 0,012 0,011 0,011 0,007 0,010 15 0,006 0,007 0,011 0,011 0,008 0,013 0,008 0,003 0,003 0,008 0,008 0,018 0,010 0,013 16 0,010 0,016 0,012 0,012 0,008 0,007 0,009 0,016 0,016 0,008 0,008 0,003 0,006 0,008 0,017 17 0,008 0,011 0,010 0,010 0,010 0,010 0,009 0,011 0,011 0,010 0,010 0,008 0,007 0,009 0,012 0,009 18 0,008 0,011 0,010 0,010 0,010 0,010 0,009 0,011 0,011 0,010 0,010 0,008 0,007 0,009 0,012 0,009 0,000 1: S. heliomycini NBRC 15899T, 2: S. griseoloalbus NBRC 13046T, 3: S. olivaceus NBRC 3200T, 4: S. pactum NBRC 13433T, 5: S. variabilis NRRL B-3984T, 6: S. atrovirens NRRL B-16357T, 7: S. fulvissimus NBRC 3717T, 8: S. coelicoflavus NBRC 15399T, 9: S. anthocyanicus NBRC 14892T, 10: S. matensis NBRC 12889T, 11: S. griseorubens NBRC 12780T, 12: S. speibonae PK-BlueT, 13: S. coeruleorubidus ISP 5145T, 14: S. cinereospinus NBRC 15397T, 15: S. ambofaciens NBRC 12836T, 16: S. lusitanus NBRC 13464T, 17: C.S.348, 18: FG.S.348

3.2.2.5. Isolats FG.P.68 et C.S.194 FG.P.68 forme une ligne séparée dans l’arbre phylogénique (figure 52), il est le plus rapproché des espèces: S. violascens ISP 5183T, S. odorifer DSM 40347T, S. sampsonii ATCC 25495T, S. albus J1074T, S. albidoflavus NBRC 13010T, S. daghestanicus NRRL B-5418T, S. exfoliatus NBRC 13475T avec une valeur élevée de « bootstrap » (94 %). Cependant, C.S.194 est sur la même ligne phylogénique avec ces espèces. La matrice de distances évolutionnaires (tableau 26) montre que FG.P.68 est plus proche à S. sampsonii ATCC 25495T, S. albidoflavus NBRC 13010T, S. odorifer DSM 40347T, S. exfoliatus NBRC 13475T et S. violascens ISP5183T avec une distance de 0,003. Par contre, C.S.194 est proche à ces mêmes espèces sans aucune distance évolutionnaire (0,000). FG.P.68 et C.S.194 sont séparés d’une distance de 0,003. FG.P.68 à un mycélium aérien de couleur vert jaunâtre pâle, le mycélium de substrat est jaune pâle, ne produit pas de pigments diffusible ou mélanoïde. Les chaines de spores sont droites ou rectiflexibles avec 50 spores par chaine. Il utilise le glucose, l’arabinose, le xylose, le fructose, le mannitol, mais pas le rhamnose, le raffinose, le saccharose et l’inositol. Ces caractères sont en communs avec S. sampsonii (Shirling et Gottlieb, 1969; Lee et al., 2005). Cependant, FG.P.68 diffère des autres espèces proches par quelques caractères:

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-S. albidoflavus a un mycélium aérien qui est blanc grisâtre, les chaines de spores contiennent 3 à 10 spores, le mycélium de substrat peut se fragmenter (Shirling et Gottlieb, 1969); -S. odorifer a un mycélium aérien de couleur jaune, produit des pigments diffusibles (Lee et al., 2005); -S. exfoliatus a un mycélium aérien de couleur grise, elle produit des pigments mélanoïde et diffusible, elle utilise le rhamnose, le raffinose et le saccharose et pas le mannitol; -S. violascens le mycélium aérien est de couleur violette, et elle produit le pigment mélanoïde, elle utilise l’inositol (Williams et al., 1989). C.S.194 a un mycélium aérien de couleur grise, les chaines de spores sont rectiflexibles, il produit un pigment mélanoïde et un pigment diffusible de couleur jaune brun. Il dégrade le Tween 80 et la xantine. Il réduit les nitrates et produit de l’H2S. Il utilise le rhamnose, le raffinose et le saccharose mais pas le mannitol et l’inositol comme seule source de carbone. Ces caractéristiques sont similaires à celle de S. exfoliatus selon Williams et al. (1989).

Figure 52. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation des isolats FG.P.68 et C.S.194 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

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Tableau 26. Matrice de distances des isolats FG.P.68 et C.S.194 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 0,000 3 0,000 0,000 4 0,000 0,000 0,000 5 0,000 0,000 0,000 0,000 6 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 7 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,007 8 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,015 0,009 9 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,015 0,011 0,001 10 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,015 0,011 0,001 0,000 11 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,015 0,011 0,001 0,000 0,000 12 0,017 0,017 0,017 0,017 0,017 0,019 0,014 0,009 0,009 0,009 0,009 13 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,020 0,015 0,010 0,009 0,009 0,009 0,002 14 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,003 0,006 0,014 0,014 0,014 0,014 0,018 0,019 15 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,005 0,006 0,014 0,014 0,014 0,014 0,016 0,017 0,004 16 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,002 0,005 0,013 0,013 0,013 0,013 0,017 0,018 0,001 0,003

1: S. sampsonii ATCC 25495T, 2: S. albidoflavus NBRC 13010T, 3: S. odorifer DSM 40347T, 4: S. exfoliatus NBRC 13475T, 5: S. violascens ISP5183T, 6: S. daghestanicus NRRL B-5418T, 7: S. koyangensis VK-A60T, 8: S. intermedius NBRC 13049T, 9: S. diastaticus ssp. diastaticus NBRC 3714T, 10: S. gougerotii NBRC 3198T, 11: S. rutgersensis NBRC 12819T, 12: S. misionensis NRRL B-3230T, 13: S. phaeoluteichromatogenes NRRL B- 5799T, 14: S. albus J1074T, 15: FG.P.68, 16: C.S.194

3.2.2.6. Isolat FG.P.40 L’arbre phylogénique (figure 53) regroupe FG.P.40 avec les espèces: Streptomyces carpaticus NRRL B-16359T (avec une valeur de « bootstrap » de 78 %), S. cheonanensis VC-A46T (100 %) puis à S. xiamenensis MCCC 1A01550T (99 %). Les caractères phénotypiques de l’isolat FG.P.40 sont similaires à ceux de S. carpaticus donné par Haritha et al. (2012): un mycélium aérien de couleur grise, des chaines de spores de forme spirale, diffuse un pigment mélanoïde dans le milieu et tolère une concentration de NaCl jusqu’à 3 %, ne produit pas d’H2S, utilise l’arabinose, le mannose, le rhamnose, le fructose et le saccharose, mais pas le raffinose, le xylose et l’inositol, dégrade la gélatine, l’amidon, l’urée et ne réduit pas les nitrates. Elle diffère des autres espèces proches phylogéniquement par les caractères suivant: -S. cheonanensis a un mycélium aérien est de couleur olive, les chaines de spores sont de forme rectiflexible, elle produit un pigment vert olive dans le milieu mais pas de pigment mélanoïde, elle tolère jusqu’à 5 % de NaCl, elle utilise le raffinose, le xylose et l’inositol; -S. xiamenensis a un mycélium aérien de couleur blanche, les chaines de spores sont droites ou rectiflexibles, elle diffuse un pigment de couleur rose dans le milieu, elle ne produit pas de pigment mélanoïde (Haritha et al., 2012).

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Figure 53. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.P.40 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,005 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

3.2.2.7. Isolat LP.B.373 L’arbre phylogénique (figure 54) montre que l’isolat est le plus relié à la sous espèces S. cinereoruber ssp. cinereoruber JCM 4205T avec une valeur de « bootsrap » élevée (87 %) puis à S. violaceorectus NBRC 13102T et S. bikiniensis DSM 40581T avec 60 % de « bootsrap ». L’isolat LP.B.373 présente un mycélium aérien de couleur grise, un mycélium de substrat brun, des chaines de spores droites, produit le pigment mélanoïde et un pigment brun foncé diffusible, utilise le glucose, le xylose, l’arabinose, le galactose comme source de carbone mais pas le rhamnose, le fructose, le raffinose, l’inositol et le mannitol. Ces caractères phénotypiques sont similaires à ceux de S. cinereoruber ssp. cinereoruber décrits par Pridham et Lyons (1965). Cet isolat est différent phénotypiquement des espèces suivantes: -S. violaceorectus a un mycélium de substrat de couleur jaune brun, les chaines de spores sont rectiflexibles, produit un pigment de couleur brun rosâtre (Williams et al., 1989; El-Naggar et al., 2011).

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-S. bikiniensis ne produit pas de pigments diffusibles, elle utilise le rhamnose, le fructose et le mannitol, mais pas le xylose et l’arabinose (Zhu et al., 2007).

Figure 54. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat LP.B.373 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,0005 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

3.2.2.8. Isolat FG.B.435

FG.B.435 est relié aux espèces S. coeruleorubidus NBRC 12844T et S. coerulescens ISP 5146T avec 100 % de « bootstrap » (figure 55). FG.B.435 possède un mycélium aérien de couleur bleu, le mycélium de substrat est jaune brun et les chaines de spores sont de forme spirale. Il produit un pigment mélanoïde mais pas de pigments diffusibles, réduit les nitrates et produit L’H2S. Il utilise l’arabinose, le rhamnose, le raffinose, le xylose, le saccharose, l’inositol, le mannitol comme seule source de carbone. Ces caractéristiques sont en commun avec les deux espèces reliées phylogéniquement (Whitman et al., 2012). Le seul caractère phénotypique qui peut être distinctif est que S. coeruleorubidus a un mycélium de substrat de couleur jaune grisâtre ou jaune brun alors que celui de S. coerulescens est sans couleur distinctive.

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Figure 55. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat FG.B.435 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,001 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

3.2.2.9. Isolat U.B.458 L’arbre phylogénique (figure 56) montre que l’isolat U.B.458 forme une ligne séparée, il est rapproché de S. lydicus ATCC 25470T, S. sioyaensis NRRL B-5408T et S. albospinus JCM 3399T à 89 % de « bootstrap », de S. rimosus ssp. paromomycinus DSM 41429T, S. chrestomyceticus DSM 40545T et de S. albofaciens JCM 4342T avec 30 % de « bootstrap ». Cependant, la matrice de distances évolutionnaires (tableau 27) fait ressortir que l’isolat U.B.458 est le plus rapproché des trois espèces: S. lydicus ATCC 25470T, S. rimosus ssp. paromomycinus DSM 41429T et S. chrestomyceticus DSM 40545T mais avec une distance élevée (0,013).

U.B.458 a un mycélium aérien de couleur jaune brun, il produit un pigment diffusible jaune mais pas de pigment mélanoïde; les chaines de spores sont de forme spirale; il utilise le fructose, le raffinose, le xylose, le saccharose, l’inositol et le mannitol, comme seul source de carbone, mais pas l’arabinose et le rhamnose; il résiste à une concentration de 4 % de NaCl, il ne produit pas d’H2S. Ces caractères phénotypiques différencient l’isolat U.B.458 des trois espèces les plus rapprochées: -S. lydicus a un mycélium aérien de couleur gris brunâtre claire et elle utilise l’arabinose le rhamnose; -S. rimosus ssp. Paromomycinus : le mycélium aérien est de couleur blanche;

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-S. chrestomyceticus a un mycélium aérien de couleur blanche, ne produit pas de pigment diffusible et elle utilise l’arabinose. (Xu et al., 2005 ; Whitman et al., 2012).

Figure 56. Arbre phylogénique non enraciné construit par la méthode de Neighbor-Joining montrant la relation de l’isolat U.B.458 avec les espèces les plus proches du genre Streptomyces. Les valeurs de « bootstrap » aux nœuds représentent le pourcentage après 1000 réplications; l’échelle 0,002 représente le nombre de substitution par position de nucléotide et estime la divergence des séquences

Tableau 27. Matrice de distances de l’isolat U.B.458 calculée par le modèle de Kimura (1980) à partir des séquences de l’ADNr 16S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 0,011 3 0,010 0,001 4 0,010 0,001 0,000 5 0,019 0,018 0,019 0,019 6 0,019 0,018 0,019 0,019 0,000 7 0,010 0,012 0,013 0,013 0,019 0,019 8 0,015 0,024 0,025 0,025 0,021 0,021 0,013 9 0,030 0,027 0,026 0,026 0,023 0,023 0,026 0,033 10 0,022 0,019 0,020 0,020 0,003 0,003 0,022 0,024 0,024 11 0,022 0,021 0,022 0,022 0,003 0,003 0,021 0,023 0,025 0,006 12 0,020 0,019 0,020 0,020 0,001 0,001 0,020 0,021 0,024 0,004 0,004 13 0,013 0,014 0,013 0,013 0,019 0,019 0,023 0,021 0,031 0,020 0,022 0,020 1: S. lydicus ATCC 25470T, 2: S. albofaciens JCM 4342T, 3: S. rimosus ssp. paromomycinus DSM 41429T, 4: S. chrestomyceticus DSM 40545T, 5: S. asiaticus NBRC 100774T, 6: S. rhizosphaericus NBRC 100778T, 7: S. sioyaensis NRRL B-5408T, 8: S. albospinus JCM 3399T, 9: S. albiaxialis NRRL B-24327T, 10: S. griseiniger NRRL B-1865T, 11: S. cangkringensis D13P3T, 12: S. indonesiensis DSM 41759T, 13: U.B.458

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3.2.2.10. Conclusion de l’affiliation des isolats Le tableau 28 présente l’affiliation des isolats appartenant au genre Streptomyces. Tableau 28. Les espèces rapprochées aux isolats appartenant au genre Streptomyces Isolats Espèce d’appartenance P.P.21a, P.B.21, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, FG.S.392 et S. lienomycini C.B.392 FG.B.22 S. rubrogriseus P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52 et P.S.461 S. flavogriseus C.S.66a S. griseoplanus FG.P.40 S. carpaticus C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 S. mutabilis FG.B.435 S. coeruleorubidus FG.B.151 S. pseudogriseolus C.S.194 S. exfoliatus FG.P.68 S. sampsonii LP.B.373 S. cinereoruber ssp. cinereoruber C.B.46, C.S.348, FG.S.348 et U.B.458 Streptomyces sp.

3.3. Discussion clinique Dans cette étude, la plupart des isolats appartiennent au genre Streptomyces (37 isolats sur 49 ce qui correspond à un taux de 75,51 %), ils sont identifiés à différentes espèces de ce genre (tableau 28). deux isolats sont obtenus de prélèvements profonds (le liquide pleural et pus d’abcès du psoas), le reste des isolats provient de sites naturellement non stériles (crachat, fluide gastrique, pus d’abcès et urines). Des isolats appartenant à la même espèce ont été détectés dans différents sites du même patient c’est le cas de : (C.P.31 et FG.B.31) ; (C.S.66b et FG.B.66); (C.B.392 et FG.S.392) ; (C.B.239 et U.B.239) ; (C.B.356 et FG.B.356) ; (C.S.348 et FG.S.348). Aussi, des isolats appartenant à la même espèce ont été isolés de patients hospitalisés durant une période proche, c’est le cas de P.P.21b et P.P.22 (Février 2005), C.P.38 et C.P.44 (Mars 2005) C.S.51 et C.S.52 (Avril et Mai 2005), C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b et FG.B.66 (Mars et Avril, 2005), C.B.239, U.B.239, P.B.255 (Mars et Avril, 2006). Des isolats appartenant à la même espèce proviennent de prélèvements à partir de différents patients, c’est le cas de: P.P.21a, P.B.21, C.P.31, FG.B.31, C.P.57, C.S.66b, FG.B.66, FG.S.392 et C.B.392 (S. lienomycini ); P.P.21b, P.P.22, C.P.38, C.S.42, C.P.44, C.S.51, C.S.52 et P.S.461 (S. flavogriseus) et C.B.239, U.B.239, P.B.255, C.B.356, FG.B.356, FG.S.461, C.B.464 et C.S.466 (S. mutabilis). La même espèce a été isolée de patients hospitalisés dans la même chambre (patients numérotés 31 et 57, 42 et 52). S. flavogriseus et S. mutabilis, deux espèces différentes, ont été isolées du même malade (patient numéroté 461).

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Le genre Streptomyces est l’actinomycète aérobie le plus fréquent dans l’environnement. C’est le genre le plus communautaire dans le sol est constitue plus de 90 % des isolats. Le nombre des espèces de ce genre est en augmentation permanente. Ces espèces sont en majorité des saprophytes, ce qui a fait que leur signification en microbiologie clinique est habituellement minimisée, surtout lorsqu’elles sont isolées de sites non stériles. Elles sont rarement connues comme agents d’infections invasives, leurs isolements signifient plus probablement une simple contamination qu’un vrai pathogène. Dans l’environnement clinique, quelques espèces seulement sont prouvées d’être responsables de cas d’actinomycétomes (Patel et al., 2004; Kapadia et al., 2007). Néanmoins, Andersson et al., (1998), Paananen et al., (2000) et Peltola et al., (2001) ont rapporté que les β-D-glucans et les métabolites cytotoxiques produits par les espèces du genre Streptomyces sont suspectés d’avoir des effets néfastes sur la santé. Kapadia et al. (2007) de 1997 à 2005 ont détectés 47 patients positifs à Streptomyces sp., les espèces impliquées ont été isolées de sites et de prélèvements naturellement stériles de ces patients. 6 (13 %) cas se sont avérés comme étant de vraies infections à Streptomyces, les autres ont été considérés comme des contaminants. Les mêmes auteurs ont suggérés que du fait qu’il n’y a pas qu’une seule espèce de Streptomyces signifie la nature hautement opportuniste de ces infections. La contamination par ces germes se fait probablement par inhalation, vu que le plus grand nombre des isolats sont obtenues de crachat et de fluide gastrique. Elle semble être du milieu hospitalier, du fait que nous avons détecté la même espèce chez différents patients, surtout lorsqu’ils sont hospitalisés durant une période proche, ou dans la même chambre. Selon Goyer et al. (2001) les actinomycètes (y compris le genre Streptomyces) sont présents, avec une fréquence entre 18 et 20 % dans 63 environnements de travail, incluant 36 édifices à bureaux, 12 écoles et 15 hôpitaux. Les espèces S. griseus et S. somaliensis sont les plus largement étudiées en pathologie mais ne sont pas les seules isolées. Berd (1973) a étudié 25 isolats cliniques appartenant au genre Streptomyces, quatre d’entres elles sont identifiés comme appartenant à l’espèce S. somaliensis, deux ont été identifiés à S. fradiae et le reste n’a pas été identifié jusqu’au niveau de l’espèce. Mishra et al. (1980) ont étudié 110 isolats du genre Streptomyces provenant de l’homme et d’animaux. La majorité d’entre eux ont été identifiés comme appartenant à S. griseus (53 %) et S. somaliensis (25 %). Cependant, les autres isolats ont été identifiés aux espèces: S. albus, S. rimosus et S. lavendulae. Ces chercheurs considèrent que toutes ces espèces ont une importance clinique considérable. Les espèces S. violaceoruber, S. coelicolor et S. albus ont été isolées chez l’homme, dans des cas de streptothricose, de caries dentaires, des amygdales, de la peau, de crachat et

142 du sang. S. candidus isolée partir d’un exsudat de pus et d’une fracture de rotule, S. gedaensis isolée de crachat et de pus d’abcès, S. horton de pus et S. willmorei de streptothricoses (McNeil et Brown 1994). Patel et al. (2004) ont identifié des isolats, ayant une signification clinique, du genre Streptomyces aux espèces suivantes: S. somaliensis, S. griseus, S. albus, S. anulatus et S. violaceoruber. À l’exception de S. cinereoruber qui a été, auparavant, signalée dans le milieu clinique, impliquée dans une pneumopathie aigue (Manteca et al., 2008), toutes les autres espèces isolées, dans notre étude, ne sont pas apparentées à celles décrites comme de vrais pathogènes. Cela ne peut écarter la signification clinique de ces espèces vue que dans la majorité des études publiées sur l’implication des Streptomyces sp. dans les maladies, l’identification n’a pas été achevée jusqu’au niveau de l’espèce. De plus, les rapports cliniques continuent de décrire à chaque fois de nouveaux cas impliquant des espèces différentes du genre Streptomyces (revoir le tableau 5).

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3.4. Conclusion Parmi 49 isolats cliniques d’actinomycètes aérobies, 37 appartiennent au genre Streptomyces. Le nombre élevé des isolats du genre Streptomyces est due, certainement, à leur prépondérance dans les habitats naturels. 33 isolats sont rapprochés aux espèces : S. lienomycini, S. rubrogriseus, S. flavogriseus, S. griseoplanus, S. carpaticus, S. mutabilis, S. pseudogriseolus, S. coeruleorubidus, S. exfoliatus, S. sampsonii et S. cinereoruber ssp. cinereoruber. Cependant, quatre sont, probablement, de nouvelles espèces. L’identification jusqu’au niveau de l’espèce de ce genre est une tâche difficile due a leur nombre très élevé et au rapprochement des caractères entre les espèces qui sont phylogéniquement reliées. La majorité de ces espèces sont isolées de sites non stériles: crachat, fluide gastrique, pus d’abcès et urines. Ainsi, leur signifiance en pathologie est minimisée, leur existence dans les prélèvements cliniques peut être expliquée par une simple colonisation. Deux isolats rapprochés à S. cinereoruber ssp. cinereoruber et S. mutabilis sont détectés dans des sites profonds (liquide pleural et abcès du psoas), ce qui laisse déduire leur implication dans la pathologie.

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4. Sensibilité aux antibiotiques et activité antimicrobienne

4.1. Sensibilité aux antibiotiques

Les isolats appartenant aux espèces et genres rares: FG.P.63 (Nocardiopsis synnemataformans), FG.S.46 (Micromonospora aurantiaca) et FG.P.44 (Kribbella sp.). sont résistants à tous les antibiotiques testés (tableau 29). Par contre, les isolats identifiés à l’espèce M. aurantiaca sont sensibles: FG.B.44 à l’imipenème, l’amikacine et la nétilmicine, C.S.46 à l’amikacine et P.P.66 à la gentamicine et la nétilmicine Les deux isolats P.S.262 et FG.S.262 (Actinomadura bangladeshensis) sont sensibles à l’amikacine Les isolats C.S.118 et FG.S.118 appartenant à l’espèce Saccharothrix longispora sont, respectivement, sensibles à l’érythromycine et à la céfotaxime. Nocardia asteroïdes (LP.P.473) est sensible à l’amoxicilline plus acide clavulanique, l’imipenème et l’amikacine. Enfin, FG.P.03 (Nonomuraea roseola) est sensible à l’imipenème. Les isolats appartenant aux Streptomyces sont tous sensibles au moins à un des antibiotiques testés. Les isolats rapprochés à la même espèce et provenant du même patient n’ont pas le même profil de sensibilité. C’est le cas des isolats appartenant à l’espèce Streptomyces lienomycini: P.P.21a est sensible à la céfotaxime, l’imipenème, la gentamicine et la nétilmicine, P.B.21 n’est sensible qu’à l’imipenème et la nétilmicine; C.B.392 est sensible à la céfotaxime, nétilmicine et intermédiaire à la ciprofloxacine, FG.S.392 est sensible à l’amikacine, intermédiaire à la nétilmicine et résistante à la ciprofloxacine. Aussi, le cas des isolats rapprochés à S. mutabilis: C.B.239 est sensible à la céfotaxime et la gentamicine, U.B.239 est résistante à ces deux antibiotiques; C.B.356 est résistante à l’imipénème, l’érytromycine, et sensible à l’amikacine contrairement à FG.B.356 qui est sensible aux deux premiers et résistante au dernier. Selon le communauté de l’antibiogramme de la société française de microbiologie (CASFM), Il est important de signaler que dans la catégorie intermédiaire (I) les souches peuvent présenter un mécanisme de résistance dont l'expression in vitro est faible ou dont l'expression n'est pas suffisante pour justifier un classement dans la catégorie R. Cependant, in vivo, une partie de ces souches apparaît résistante au traitement, la catégorie intermédiaire est aussi une zone qui tient compte des incertitudes techniques et biologiques.

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Tableau 29. Antibiogramme des isolats d’actinomycètes aérobies β-lactamines Aminglycosides Macrolides Fluoroquinolones Céphalosporines Pénicillines Carbapénemes FOX CAZ CTX AM AMC IPM CN AK NET E CIP

Isolats FG.P.03 R R R R R S R I R R R P.P.21a R R S R R S S I S R R P.P.21b R R R R R S R S S R R P.B.21 R R R R R S R I S R R FG.B.22 R R S R R S R S I R R P.P.22 R R S R R I R I I R R C.P.31 R R R R R S R S S R R FG.B.31 R R R R R S R S I R R C.P.38 R R I R R S R S S R S FG.P.40 R R S R R S R S S R R C.S.42 R R R R R R R S S R R C.P.44 R R S R R R R S S R R FG.P.44 R R R R R R R R R R R FG.B.44 R R R R I S R S S R R C.B.46 R R R R R I I S S R R C.S.46 R R I R R R R S I R R FG.S.46 R R R R R R R R I R R C.S.51 R S I R R S R S I R S C.S.52 R R R R R S R S S R R C.P.57 R R R R R S R S S R R FG.P.63 R R R R R R R R R R R C.S.66a R R R R R S R S I R R C.S.66b R R S R R S R S I R R FG.B.66 R R S R R S R S S R R P.P.66 R R R R R I S R S R R FG.P.68 R R S R R I R S I R R C.S.118 R R I R R R R R R S R FG.S.118 R R S R R R R R R R R FG.B.151 R R S R R I R S S R R C.S.194 R R S R R R R S S R R C.B.239 R R S R R R S S S R R U.B.239 R R R R R R R S S R R P.B.225 R R R R R R R S S R R FG.S.262 R R I R R R R S R R R P.S.262 R R R R R R R S R R R C.S.348 R R R R R R R R S R R FG.S.348 R R I R R R R S I R R C.B.356 R R R R R R I S I R R FG.B.356 R R R R R S I R I S R LP.B.373 R R R R R S R S S R R C.B.392 R R S R R S R R S R I FG.S.392 R R R R R S R S I R R FG.B.435 R R R R R S R S S R R U.B.458 R R I R R R R S S R R P.S.461 R R S R R S R S S R R FG.S.461 R R R R R S R S S R R C.B.464 R R R R R R R I S R R C.S.466 R R R R R R R S S R R LP.P.473 R R I R S S R S R R R R: résistant, S: sensible, I: intermédiaire FOX: céfoxitine, CAZ: ceftazidime, CTX: céfotaxime, AM: ampicilline, AMC: amoxicilline plus ac. clavulanique, IPM: imipenème, CN: gentamicine, AK: amikacine, NET: nétilmicine, E: érythromycine, CIP: ciprofloxacine

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Le profil de sensibilité des isolats d’actinomycètes aérobies aux antibiotiques (figure 57) fait ressortir, globalement, que d’une part, 57,15 et 71,43 % sont sensibles, respectivement, à la nétilmicine et l’amikacine, et que d’autre part, tous les isolats résistent à la céfoxitine et l’ampicilline, et entre 55,10 et 97,96 % résistent à la céfotaxime, ceftazidime, l’amoxicilline plus acide clavulanique, la gentamicine, l’érythromycine et la ciprofloxacine.

100 97.96 100 100 95.92 93.88 95.92 87.75 %) 90 80 71.43 70 57.15 60 55.1 48.98 Résistants 50 40.82 40 Sensibles 28.57 26.53 30 Intermédiaires 16.33 18.37 16.32 20 10.2 10.2 6.12 10 2.04 2.04 6.12 4.08 Taux des isoltas d'actinomycètes ( d'actinomycètesisoltas des Taux 00 0 0 0 2.04 6.12 0 0 0 FOX CAZ CTX AM AMC IPM CN AK NET E CIP Antibiotiques

Figure 57. Taux (en %) des isolats d’actinomycètes aérobies selon la sensibilité aux antibiotiques FOX : céfoxitine, CAZ: ceftazidime, CTX: céfotaxime, AM: ampicilline, AMC: amoxicilline plus acide clavulanique, IPM: imipénème, CN: gentamicine, AK: amikacine, NET: nétilmicine, E: érythromycine, CIP: ciprofloxacine

Selon le profil de sensibilité aux antibiotiques (figure 58), de 56,75 à 81,09 % des isolats, appartenant au genre Streptomyces, sont sensibles à l’imipenème, l’amikacine et la nétilmicine. Tous résistent à la céfoxitine, l’ampicilline et l’amoxicilline plus acide clavulanique. De 54,05 à 97,30 % résistent à la céfotaxime, la ceftazidime, la gentamicine, l’érythromycine et la ciprofloxacine.

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100 100 100 97.3 97.3 100 91.9 90 86.49 81.09

( %) 80 70.27 70 56.75 60 54.05 Streptomyces 50 Résistants 35.14 Sensibles 40 32.44 29.73 isolats de 30 Intermédiaires 20

Taux Taux des 10.81 10.81 10.81 8.11 5.4 10 2.7 5.4 8.11 2.7 0 0 0 00 0 0 0 0 2.7 0 FOX CAZ CTX AM AMC IPM CN AK NET E CIP Antibiotiques

Figure 58. Taux (en %) des isolats de Streptomyces selon la sensibilité aux antibiotiques FOX: céfoxitine, CAZ: ceftazidime, CTX: céfotaxime, AM: ampicilline, AMC: amoxicilline plus ac. clavulanique, IPM: imipenème, CN: gentamicine, AK: amikacine, NET: nétilmicine, E: érythromycine, CIP: ciprofloxacine

4.2. Activité antimicrobienne Les résultats des inhibitions des microorganismes-tests par les isolats cliniques d’actinomycètes aérobies sont rassemblés dans le tableau 30. Parmi les 49 isolats d’actinomycètes aérobies, 45 soit 91,83 % sont actifs contre au moins un des microorganismes-tests dont 10 et 35 appartiennent, respectivement, aux genres rares et au genre Streptomyces. 28 (57,14 %) sont, à la fois, antibactériens et antifongiques, 11 (22,45 %) seulement présentent une activité antibactérienne et 6 (12,24 %) sont, seulement, antifongiques et, enfin, 4 (8,16 %) n’ont aucune activité.

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Tableau 30. Activités antibactérienne et antifongique des isolats cliniques d’actinomycètes aérobies

Activité antibactérienne Activité antifongique Activité antibactérienne Activité antifongique

Gram(+) Gram(-) Gram(+) Gram(-)

ATCC 27853 ATCC 27853 ATCC 25923 ATCC ATCC 25923 ATCC 2043.92CIP 2043.92 CIP

CIP 1082.74 CIP 1082.74 CIP CIP 625.72 CIP 625.72 CIP CIP 1431.83 CIP 1431.83 CIP ATCC 25922 ATCC 25922 ATCC aureus aureus

aerugenosa aerugenosa

coli coli

fumigatus fumigatus

enteritidis enteritidis

cereus cereus

Fuzarium oxysporum Escherichia Staphylococcus Bacillus Aspergillus niger Aspergillus Trychophytum rubrum Aspergillus niger Aspergillus Trychophytum rubrum Fuzarium oxysporum Escherichia Salmonella Staphylococcus Bacillus Pseudomonas Isolats Isolats Pseudomonas Salmonella FG.P.03 ------+ - - FG.P.68 - + + - - +++ - +++ ++ P.P.21a ++ - + + ++ + + - +++ C.S.118 ------P.P.21b - - + - - - + - - FG.S.118 - - - - - ++ - - - P.B.21 - ++ ++ ------FG.B.151 - + - - - +++ +++ - - FG.B.22 + ++ ++ - - + + - +++ C.S.194 - - - - - +++ +++ ++ +++ P.P.22 - ++ ++ + - - +++ +++ ++ C.B.239 - + + - - ++ + - - C.P.31 +++ - - + - - + + - U.B.239 ++ + + + - + + - - FG.B.31 + + - - - - + + - P.B.225 - + - - - ++ - - - C.P.38 ++ ++ ++ + - - ++ + + FG.S.262 - ++ ------FG.P.40 - + ++ - - - ++ ++ +++ P.S.262 - + - - - + ++ - - C.S.42 ++ +++ + - - - +++ - + C.S.348 - ++ ++ ------C.P.44 + ++ ++ - - +++ +++ - ++ FG.S.348 + - + ------FG.P.44 - - ++ - - - +++ - - C.B.356 + + ++ ------FG.B.44 - - ++ - + - - - - FG.B.356 ------+ - - C.B.46 + + ++ + - +++ - - - LP.B.373 ++ + - - - - + - - C.S.46 - - - + ++ - - - - C.B.392 - + - - - + + - - FG.S.46 - - - - - +++ +++ ++ +++ FG.S.392 ++ + ++ + - + ++ - - C.S.51 - ++ + - - ++ ++ ++ +++ FG.B.435 - ++ ++ ------C.S.52 - ++ + - - - + - ++ U.B.458 ------C.P.57 - ++ ++ - - + + - - P.S.461 ++ + - + - - - - - FG.P.63 - +++ - - - + - - - FG.S.461 + + ------C.S.66a + + ++ + - +++ ++ + +++ C.B.464 ------C.S.66b - - - - - +++ ++ - ++ C.S.466 - + - - - + + - - FG.B.66 - ++ ++ - - - - ++ - LP.P.473 ------P .P.66 - + ------: pas d’activité, + : zone d’inhibition inférieure à 15 mm, ++ : zone d’inhibition comprise entre 15 et 25 mm, +++: zone d’inhibition supérieur ou égale à 25 mm

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4.3. Discussion Plusieurs définitions sont accordées au terme de multirésistance, le plus communément utilisé pour les bactéries c’est la non sensibilité à des antibiotiques appartenant au minimum à trois classes différentes (Magiorakos et al., 2012). Dans ce contexte, tous les isolats d’actinomycètes aérobies de cette étude sont multirésistants. Trois isolats appartenant aux genres rares d’actinomycètes (Kribbella sp., Nocardiopsis synnemataformans et Micromonospora aurantiaca) résistent à tous les antibiotiques testés. Les autres isolats sont sensibles au moins à un des antibiotiques. La sensibilité de Micromonospora aurantiaca n’a pas été mentionnée dans la bibliographie, il semble que nos travaux sont les premiers à le faire. Parmi les espèces du genre Kribbella décrites jusqu’à ce jour, il n’y a pas une espèce qui résiste à tous les antibiotiques employés (Kirby et al., 2006; Trujillo et al., 2006; Carlsohn et al., 2007; Everest et Meyers, 2008; Urzì et al., 2008; Cui et al., 2010). Les espèces sensibles, les plus rapprochées à nos isolats sont: K. lupini est sensible à l’amoxicilline et la gentamicine (Trujillo et al., 2006), K. flavida est sensible à la céfotaxime et à l’ampicilline (Kirby et al., 2006). Selon Yaccin et al. (1997). l’espèce Nocardiopsis synnemataformans devrait être sensible à l’amoxicilline plus acide clavulanique, l’imipenème, l’érythromycine, la gentamicine, l’amikacine et la ciprofloxacine. L’isolat identifié à l’espèce, Nocardia asteroïdes est sensible à l’amoxicilline plus acide clavulanique, l’imipenème et l’amikacine, ces antibiotiques sont parmi les plus préconisés dans les cas de nocardioses (Couraud et al ., 2007; Rodrìguez-Nava et al., 2008; Lai et al., 2009a; Lowman et Aithma, 2010; Lui et al., 2011; Amin et al., 2012). Également, les deux isolats appartenant au genre Actinomadura bangladeshensis sont sensibles seulement à l’amikacine, cet antibiotique est prescrit dans les cas d’actinomycétomes à Actinomadura madura, mais en association avec le cotrimoxazole (Develoux et al., 2003; Dieng et al., 2005; Trabelsi et al., 2009; Cascio et al., 2011). La plupart des isolats du genre Streptomyces sont résistants à la majorité des β- lactamines et aux macrolides et fuoroquinolones. Il n’y a que 56,75 % qui sont sensibles à l’imipenème et 35,14 % à la céfotaxime. Cette résistance est due au fait que les Streptomyces sont des producteurs de ces classes d’antibiotiques (Kieser et al., 2000; Madigan et Martinko, 2007). Cependant, il est remarquable que plus de 70 % des isolats sont sensibles aux aminoglycosides (amikacine et nétilmicine) qui peuvent être un traitement efficace. Le nombre réduit des rapports signalant des cas d’infections à Streptomyces a limité l’expérience clinique, de ce fait il n’y a pas un traitement optimal standardisé (Kapadia et al., 2007; Joseph et al., 2011). Le choix de l’antibiotique convenable est, généralement, fait après un test de sensibilité. Ainsi et selon Rose et al. (2008), Hamid (2011); Joseph et al., (2011), Riviere et

150 al. (2012), l’amikacine, le linezolide, l’amoxicilline-clavulanate, la clarithromycine, la minocycline, l’imipenème, la pénicilline, les céphalosporines, la ciprofloxacine et les sulfonamides peuvent être utilisés comme traitement. Il est important de signaler que les prélèvements ont été effectués, dans la plupart des cas, au moment de la thérapie appliquée aux patients qui était souvent à base d’antibiotiques. L’antibiorésistance de nos isolats peut être expliquée par ce moment de récoltes des échantillons. Selon Nouvel (2005) l’utilisation d’un antibiotique inhibe les bactéries sensibles à cet antibiotique mais permet la multiplication des autres résistantes. L’analyse des données, figurant dans l’anexe 9 (résultats cliniques) et le tableau 29 (sensibilité aux antibiotiques), fait ressortir que les isolats d’actinomycètes sont résistants aux antibiotiques utilisés en thérapie. Par ailleurs, nous remarquant aussi, la présence des actinomycètes au moment du traitement avec les antituberculeux, cela peu être expliqué par la non activité de ces substances sur les actinomycètes isolés, selon Rieder (2002) et Nouvel (2005) l’isoniazide est un antituberculeux bactéricides, les autres mycobactéries et procaryotes sont résistants. L’isoniaside et l’éthambunol sont des antituberculeux qui bloquent l’incorporation des acides mycoliques à la paroi bactérienne. Donc ces antituberculeux peuvent être actifs seulement sur les actinomycètes possédant de l’acide mycolique dans leur parois, dans notre cas, à l’exception de Nocardia asteroïdes, tous les autres isolats n’ont pas d’acides mycoliques. Selon Rieder (2002) le pyrazinamide est un antituberculeux synthétique actif, exclusivement, sur les souches de Mycobacterium tuberculosis, même les autres espèces de ce genre sont résistantes. La rifampicine est un antituberculeux isolé de Streptomyces mediterranei. Les actinomycètes peuvent donc être producteurs de rifampicine, et résiste donc à l’action de cette substance. Généralement les actinomycètes possèdent les gènes de résistances aux mêmes antibiotiques produits (Marcone et al., 2010). Les bactéries peuvent avoir une résistance spontanée, comme elles peuvent développer une résistance à beaucoup de classes d’antibiotiques, notamment dans les milieux défavorables à leur vie. Cette résistance est obtenue soit par le transfert des éléments de résistance d’une bactéries à l’autre (Forsberg et al., 2012), ou bien par des mutations au niveaux des gènes codants pour des réactions métaboliques. À titre d’exemple, la résistance acquise des mycobactéries aux antituberculeux est toujours liée à des mutations de gènes chromosomiques et n’est pas transférable. Ces mutations surviennent au niveau des gènes qui codent pour les protéines cibles de l’antibiotique (rifampicine-rpoB, isoniazide- KatG/InhA/Ahpc/ndh, éthambutol-embB, aminoside-Rrs, éthionamide et fluoroquinolone- gyrA), ou bien de gènes qui codent pour des enzymes impliquées dans l’activation de l’antibiotique (isoniazide, pyrazinamide-pncA et éthionamide) (Meyssonnier, 2012).

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Ces mutations engendrent beaucoup de changements dans le métabolisme bactérien. Selon Derewacz et al. (2013), chez des mutants résistants aux antibiotiques appartenant au genre Nocardiopsis plus de 311 nouveaux caractéristiques sont observées, qui n’existaient pas chez leurs progéniteurs. Ces mutants montrent des changements dans leur métabolisme primaire comme exemple la modulation de la composition en acide gras, et l’augmentation de la production des éctoïnes osmoprotecteurs en addition de la présence d’un potentiel riche et émergent de métabolites secondaires. Peu de mutations peuvent donner beaucoup de changements complexes, global et significative dans l’expression des gènes et la synthèse des protéines. Par exemple les mutations au niveau du gène rpoB stimule la régulation des protéines impliquées dans le métabolisme centrale (la biosynthèse des acides nucléiques, des lipides, des phospholipides, des acides aminés, les carbohydrates), la détoxification, les signaux de transduction, la synthèse des protéines, le développement de l’enveloppe cellulaire (Neri et al., 2010; Sandalakis et al., 2012). Des études récentes ont décrit la corrélation apparente entre l’acquisition de la résistance aux antibiotiques et la productivité du métabolisme secondaire chez des actinomycètes producteurs d’antibiotiques. L’acquisition de la résistance chez ces souches résulte en une augmentation des niveaux de la production de composés bioactifs. Ces études ont suggéré que la sélection de souches sur le critère de résistance aux antibiotiques peut être une stratégie pour découvrir de nouveaux métabolites secondaires (Derewacz et al., 2013). Les actinomycètes producteurs d’antibiotiques doivent posséder des mécanismes de résistance pour éviter leur propre destruction. Parmi les quels: la modification de la cible, l’inactivation ou la séquestration de l’antibiotique, les mécanismes d’épanchement. Les gènes codants pour ces mécanismes sont régulés au même moment de la production (Marcone et al., 2010). De ce fait, les méthodes les plus réussies pour rechercher de nouvelles substances antibiotiques intéressantes est de viser les souches ayant une résistance aux antibiotiques (Takahashi et al., 1996). La majorité des agents antibiotiques à usage clinique sont issus de composés isolés de bactéries et de champignons, les actinomycètes aérobies est la source la plus dominante. Fréquemment, la majorité de ces substances est obtenue d’actinomycètes isolés de sol. La nouvelle stratégie dans ces dernières années est focalisée sur l’isolement et le screening des autres genres d’actinomycètes à partir d’environnements inexploités. Dans cette étude la majorité des isolats sont actives, les Streptomyces ont présenté le taux le plus élevé, ce genre est connu et reste la source dominante de substances bioactives (Berdy, 2005; Reddy et al., 2010).

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Les genres rares d’actinomycètes (qui sont défini comme les actinomycètes autres que le genre Streptomyces) sont une source promotrice de nouvelles substances antibiotiques (le Roes et Meyers, 2008). L’importance donnée aux genres rares est justifiée par le fait que beaucoup de composés anti infectieux effectifs et commercialisés dérivent de ce groupe (Lazzarini et al., 2000). Les genres rares dans cette étude, notamment ceux qui ont présenté une résistance à tous les antibiotiques testés, peuvent être une source importante de substances bioactives. Micomonospora est le genre d’actinomycètes rare considéré comme le deuxième grand groupe d’actinomycètes isolé du sol, après les Streptomyces. D’importants métabolites connus, de différentes structures chimiques ont été isolés de ce genre, tels que les aminocyclitol: la gentamicine, la sisomicine, la fortimicine; des macrolides: la mycinamicine, la rosamicine et le polysaccharide everninomycine (Lazzarini et al., 2000; Berdy, 2005; Qui et al., 2008; Hirsch et Valdés, 2009). Selon Meklat et al. (2011) le genre Nocardiopsis est une source promotrice de nouvelles substances antimicrobiennes, cet auteur a isolé seize souches de Nocardiopsis du sol saharien Algérien, toutes étaient actives. Sarethy et al. (2011) a décrit un nouveau produit, le Naphthospironone A(1), métabolite cytotoxique, à activité antibiotique produit par une espèce de Nocardiopsis. Engelhardt et al. (2010) ont isolé sept souches de Nocardiopsis de sédiments marin, toutes étaient actives contre des bactéries et des champignons multirésistants, et une nouvelle substance antibiotique a été identifiée. Le genre Nonomuraea était, aussi, exploité dans la production de substances antibiotiques, N. antimicrobica a une activité antilevurienne (Qin et al., 2009). Nonomuraea sp. ATCC 39727 produit un antibiotique de nature glycopeptidique A40926, cette souche possède les gènes de résistance aux mêmes antibiotiques. Nonomuraea sp. NM94, isolée d’un sol saharien en Algérie, est productrice de substance antifongique (Badji et al., 2007). L’espèce Nonomuraea candida, malgré qu’elle soit sensible aux antibiotiques, a présenté une activité contre Mycobacterium aurum (A+) (le Roes et Meyers, 2008). Le genre Saccharothrix a été, aussi, exploité comme une source de nouvelles substances antibactériennes, notamment les souches isolées du sol algérien ces dernières années (Zitouni et al., 2004; Zitouni et al., 2005; Bouras et al., 2006; Boubetra et al., 2013).

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4.4. Conclusion Les actinomycètes isolés de prélèvements cliniques présentent un large spectre de résistance à différents antibiotiques, appartenant aux classes des β-lactamines, des aminoglycosides, des macrolides et des fuoroquinoles. Trois souches sont résistantes à tous les antibiotiques testés. La majorité des isolats ne sont sensibles, au maximum, qu’à trois antibiotiques. La sensibilité est observée avec les aminoglycosides: l’amikacine, la nétilmicine et un seul β-lactamines: l’imipenème. Des isolats appartenant à la même espèce, isolées de différents sites du même patient, possèdent un profil de sensibilité différent. L’environnement clinique, inhabituel pour les actinomycètes, peut influencer leur métabolisme. Dans les cas où l’isolat d’actinomycète aérobie est suspecté d’être l’agent étiologique, le profil de sensibilité aux antibiotiques aide à raccourcir le délai de la thérapie par la prescription du traitement adéquat. Les actinomycètes aérobies isolés de prélèvements cliniques sont une source intéressante de métabolites bioactifs. La résistance est un indicateur encourageant la recherche de molécules intéressantes. Les Streptomyces sp. restent le réservoir le plus important. Les genres rares, peu étudiés, peuvent être exploités pour la recherche de nouvelles substances.

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Conclusion Générale Les infections que provoquent les actinomycètes, résultent généralement de l’inhalation de ces bactéries et/ou de la contamination d’une plaie, elles peuvent être localisées ou disséminées. En raison de la nature et de la gravité des maladies dont elles sont responsables, il a fallu démontrer, en premier lieu, l’implication de ces micro-organismes dans les infections au niveau de la région de Constantine. Ainsi, l’objectif général de cette étude était d’évaluer la fréquence des actinomycètes aérobies usuels et rares (à l’exception des mycobactéries) impliqués dans les infections chez l’homme. À notre connaissance, cette étude est pionnière au niveau de Constantine et de sa région. En conséquence, durant la période de 2005 à 2007, 609 prélèvements cliniques ont été effectués sur 479 malades dont les symptômes de leurs infections évoquaient, principalement, une suspicion d’une tuberculose, une pneumopathie ou des abcès. Ces symptômes persistent sur une longue période, allant d’une semaine à plusieurs années. Ainsi, 49 isolats d’actinomycètes aérobies ont été obtenus à partir de 31 malades. Tous les patients positifs à actinomycètes résident dans l’est algérien, dont le climat, semi aride, favorise l'aérosolisation. Les sites d’isolements sont, dans la plupart des cas, pulmonaires ou gastriques, la dimension des spores des actinomycètes fait que leur pénétration se fait facilement jusqu’au niveau des alvéoles, et ils peuvent, aussi, être ingérés.

Deux isolats proviennent du liquide pleural, ceci peut être expliqué par la diffusion du germe qui se fait, directement, à partir de la paroi thoracique ou des poumons. Deux autres isolats sont obtenus de sites profonds, dont la propagation a eu lieu, probablement, par voie hématogène ou lymphatique.

Le sexe des patients n’a pas une influence sur la prévalence des actinomycètes mais ils semblent être plus fréquents chez les adultes de moins de 50 ans. La prévalence des actinomycètes est le plus marquée chez les patients atteints de tuberculose suivie par les patients avec abcès et pneumopathie, un taux important de cas de fièvre au long court, sans un diagnostique défini, est aussi marqué. En effet, les désordres pulmonaires prédisposent les patients à une colonisation par un actinomycète pathogène. Cependant, ces désordres causés par la tuberculose et les autres maladies pulmonaires peuvent, aussi, masquer les cas d’infections par les actinomycètes. Les signes de l’infection (fièvre, toux et amaigrissement) ne sont pas spécifiques et ils s’étendent sur une longue période, les symptômes qui évoquent la suspicion d’une tuberculose ou d’une infection non tuberculeuse par mycobactéries sont prédominants dans les cas de nocardioses. La colonisation par les actinomycètes pathogènes peut persister plusieurs années.

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L’incidence des actinomycètes aérobies est survenue le plus chez les patients fragilisés sur le plan immunitaire, surtout ceux soumis à une corticothérapie, dans ces cas le diagnostic est, largement, en faveur d’une infection à actinomycètes aérobies. La nature du prélèvement influe sur le nombre d’actinomycètes aérobies, les prélèvements de fluides gastriques, de crachats et de pus d’abcès ont donné le nombre le plus élevé. Le nombre des actinomycètes est faible dans les prélèvements pathologiques et donne généralement un examen microscopique négatif, mais cela n’élimine pas la possibilité de leur isolement. Les milieux riches additionnés, au préalable, d’inhibiteurs de champignons et de bactéries à coloration de Gram négative favorisent la détection des actinomycètes aérobies à partir des prélèvements cliniques. Une augmentation du nombre d’échantillons positifs est remarquable durant le printemps, dont le climat favorise l’aérosolisation. L’antibiothérapie, au moment des prélèvements, n’a pas d’influence sur le taux d’isolement des actinomycètes. Une identification de l’agent pathogène est impérative pour un diagnostic définitif permettant, ainsi, de prescrire un traitement approprié. Elle repose surtout sur les méthodes génotypiques et phénotypiques que nous avons utilisées pour caractériser nos souches. Un volet des résultats obtenus s’est avéré remarquable du fait que huit isolats appartenant à des genres rares n’ont jamais été isolés de prélèvements cliniques et donc leur rôle en pathologie est mal connu, ces genres sont : Nonomuraea, Kribbella, Micromonospora et Saccharothrix. Quatre isolats ont été rapprochés de trois autres genres rares : Nocardia, Actinomadura et Nocardiopsis. Ces genres ont été déjà rencontrés en clinique et considérés comme impliqués dans des cas de pathologies chez l’homme, donc le diagnostic peut être dirigé vers une infection par actinomycètes. La patiente infectée par l’espèce Nocardia asteroïdes, agent causatif le plus connue dans les cas de nocardioses, a présenté des signes prolongés durant une année, des maladies sous-jacentes (pneumopathie et tuberculose) et subissait une corticothérapie. Il est fortement probable que le diagnostic soit dirigé vers une nocardiose; La patiente avec Actinomadura bangladeshensis, espèce non rencontrée auparavant dans les cas d’actinomycétomes, a des signes et des facteurs de risques en faveur d’une infection opportuniste, ce qui laisse soupçonner le pouvoir pathogène de cette espèce; Le patient, d’où l’espèce Nocardiopsis synnemataformans a été isolée, présente une fièvre au long cours sans un diagnostic bien définie. Cette espèce a été signalée auparavant dans un cas clinique. Son pouvoir d’émettre des substances toxiques incite l’étude de son rôle pathogène.

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Trente sept isolats sur quarante neuf appartiennent au genre Streptomyces, ils sont identifiés comme appartenant à 11 espèces différentes, l’espèce Streptomyces cinereoruber est la seule signalée dans le milieu clinique, dans notre cas, son isolement du liquide pleural, d’un patient immunodéprimé et avec une longue période d’infection (8 ans) incite à l’étude de son pouvoir pathogène. Un autre isolat appartenant à S. mutabilis est obtenu d’un site profond (abcès de psoas) son implication dans la pathologie est très probable. Quatre isolats sont probablement de nouvelles espèces. Toutes les autres espèces sont obtenu de prélèvements naturellement contaminés (crachat, fluide gastrique, pus d’abcès et urines) et elles ne sont pas apparentées à celles décrites comme de vrais pathogènes, cela ne peut écarter la signification clinique de ces espèces vue que dans la majorité des études publiées sur l’implication des Streptomyces sp. dans les maladies, l’identification n’a pas été achevée jusqu’au niveau de l’espèce. De plus les espèces de ce genre continues d’être détectées dans les pathologies. Tous les isolats d’actinomycètes aérobies dans cette étude présentent un large spectre de résistance à différents antibiotiques, appartenant aux classes des β-lactamines, des aminoglycosides, des macrolides et des fuoroquinoles. Trois souches sont résistantes à tous les antibiotiques testés. Dans les cas où l’isolat d’actinomycète aérobie est suspecté d’être l’agent étiologique, le profil de sensibilité aux antibiotiques aide à raccourcir le délai de la thérapie par la prescription du traitement adéquat. La patiente avec Nocardia asteroïdes peut être traitée avec l’amoxicilline plus acide clavulanique, l’imipenème et l’amikacine, qui sont les antibiotiques préconisés dans les cas de nocardioses. La patiente avec l’espèce Actinomadura bangladeshensis peut être traitée par l’amikacine, antibiotique prescrit dans les cas d’actinomycétomes, mais en association avec le cotrimoxazole. Le cas où l’isolat de Streptomyces cinereoruber est détecté, l’imipenème, l’amikacine et la nétilmicine peuvent être un traitement efficace. Le cas avec Streptomyces mutabilis la prescription de l’amikacine et la nétilmicine parait être convenable. L’isolement et le screening des actinomycètes à partir du milieu clinique, qui est un environnement inhabituel et inexploité, est une stratégie efficace pour la recherche de nouvelles souches et métabolites intéressants. L’acquisition de la résistance chez les actinomycètes résulte en une augmentation des niveaux de la production de composés bioactifs. La sélection de souches sur ce critère peut être une stratégie pour découvrir de nouveaux métabolites secondaires. La majorité des isolats, dans cette étude, est active. Les Streptomyces sp. ont présenté le taux le plus élevé, ce genre est connu et reste la source dominante de substances bioactives. Les genres rares,

157 notamment ceux qui ont présenté une résistance à tous les antibiotiques testés, peuvent être une source promotrice de nouvelles substances bioactives.

Cette étude a mis en évidence l’implication des actinomycètes aérobies dans les infections, elle ouvre la voie pour plusieurs recherches en perspective: -dans le domaine clinique il serait intéressant d’élargir le spectre de recherche sur tout le territoire algérien, notamment la région du sud, où le climat et le mode de vie favorise la contamination par les actinomycètes aérobies. Ainsi le pouvoir virulent des isolats clinique d’actinomycètes doit être étudié. Les résultats doivent être documentés officiellement et transmis, d’une part, aux cliniciens pour qu’ils prennent en considération les infections par ces germes dans un diagnostic différencié, et d’autre part, aux laboratoires de diagnostic pour mettre en place des techniques, routinières rapides et non onéreuses, de détections des actinomycètes pathogènes dans les prélèvements cliniques et aider à leur identification. -une identification par hybridation des isolats suspectés d’être de nouvelles espèces. -les isolats cliniques d’actinomycètes, notamment les genres rares et les nouvelles espèces, peuvent être exploités dans la production de métabolites intéressants la clinique et la biotechnologie.

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Ahmed A.J., Ali S.T., Weinbaum D. and Goldberg E. 1996. Streptomyces infection in AIDS presenting with pneumonia and monoarthritis. Infec. Dis. Clin. Pract., 5: 207–208. Ait Essi F., Abkari I., Najeb Y., Latifi M., Hokar O. et Amal S. 2011. Le mycétome tumoral du pied. Méd. Chir. Pied. 27: 9–11.

Ambrose N.C. 1996. The pathogenesis of dermatophilosis. Trop. Anim. Health. Prod. 28 (2 Suppl.): 29S–37S. Amin A., Mahmood S.F., Anis M., Adhi F., Ahmad S., Ali F. and Khan E. 2012. Pulmonary nocardiosis: a comparative analysis of Nocardia asteroides and non-asteroides species. Tropical Doctor, 42: 94–96.

Amor A., Enríquez A., Corcuera M.T. and Toro C. 2011. Dermatophilus congolensis: an underestimated human pathogen?. J. Clin. Microbiol. 49 (1): 449–451.

Anderson A.S. and Wellington E.M.H. 2001. The taxonomy of Streptomyces and related genera. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 797–814. Andersson M.A., Mikkola R., Kroppenstedt R., Rainey F.A., Peltola J., Helin J., Sivonen K. and Salkinoja-Salonen M.S. 1998. Mitochondrial toxin produced by Streptomyces griseus strains isolated from an indoor environment is valinomycin. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4767–4773. Ann M. Hirsch and Valdés M. 2009. Micromonospora: An important microbe for biomedicine and potentially for biocontrol and biofuels. Soil Biol. Biochem. 42(4): 536–542.

Ara I. and Kudo T. 2007. Two new species of the genus Micromonospora: Micromonospora chokoriensis sp. nov. and Micromonospora coxensis sp. nov., isolated from sandy soil. J. Gen. Appl. Microbiol. 53: 29–37. Ara I., Kudo T., Matsumoto A., Takahashi Y. and Omura S. 2007. Nonomuraea bangladeshensis sp. nov. and Nonomuraea coxensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 1504–1509. (a)

Ara I., Kudo T., Matsumoto A., Takahashi Y. and Omura S.J. 2007. Nonomuraea maheshkhaliensis sp. nov., a novel actinomycetes isolated from mangrove rhizosphere mud. Gen. Appl. Microbiol. 53: 159–166. (b) Ara I., Matsumoto A., Abdul Bakir M., Kudo T., Omura S. and Takahashi Y. 2008. Actinomadura bangladeshensis sp. nov. and Actinomadura chokoriensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 1653–1659. Ayyar S., Tendolkar U. and Deodhar L. 1992. A comparison of three media for isolation of Nocardia species from clinical specimens. J. Postgrad. Med. 38: 70–72. Badji B. Mostefaoui A., Sabaou N., Lebrihi A., Mathieu F., Seguin E. and Tillequin F. 2007. Isolation and partial characterization of antimicrobial compounds from a new strain Nonomuraea sp. NM94. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34: 403–412. Badji B., Mostefaoui A., Sabaou N., Mathieu F. and Lebrihi A. 2011. Identification of a new strain of Actinomadura isolated from Saharan soil and partial characterization of its antifungal compounds. Afr. J. Biotechnol. 10(63): 13878–13886.

Bawa B., Bai J., Whitehair M., Purvis T. and DeBey B.M. 2010. Bovine abortion associated with Nocardia farcinica. J. Vet. Diagn. Invest. 22: 108–111. Beaman B.L. and Beaman L. 1994. Nocardia species: host-parasite relationships. Clin. Microbiol. Rev. 7: 213–264. Beau F., Bollet C., Coton T., Garnotel E and Drancourt M. 1999. Molecular identification of a Nocardiopsis dassonvillei blood isolate. J. Clin. Microbiol. 37(10): 3366–3368. Becker B., Lechevalier M.P. and Lechevalier H.A. 1964. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates. Appl. Microbiol. 12: 421–423.

Becker B., Lechevalier M.P., Gordon R. and Lechevalier H.A.1964. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of the whole-cell hydrolysates. Appl. Microbiol. 12(5): 421–423. Belaroui K. et Liazid M. 2012. Impact des facteurs climatiques sur la désertification et l’environnement des zones semi-arides (cas de la région de Saida, Algérie). Communication Science et Technologie (10): 45–56.

Benimeli C.S., Amoroso M.J., Chaile A.P. and Castro G.R. 2003. Isolation of four aquatic Streptomycetes strains capable of growth on organochlorine pesticides. Bioresource Technology, 89: 133–138. Berd D. 1973. Laboratory identification of clinically important aerobic actinomycetes. Appl. Microbiol. Appl. Microbiol. 25(4): 665–681.

Bérdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58(1): 1–26.

Betancourt-Castellanos L., Ponz Clemente1 E., Fontanals Aymerich D., Blasco Cabañas C., Marquina Parra D., Grau Pueyo C., García García M. 2011. First case of peritoneal infection due to Oerskovia turbata (Cellulosimicrobium funkei). Nefrologia, 31(2): 223–225. Bhuyar G. R., Agrawal G.N. and Jalgaonkar S.V. 2011. Streptomyces septicaemia in a neonate. N. J. Integ. Res. Med. 2(1): 60–62. Biehle J.R., Cavalieri S.J., Felland T. and Zimmer B.L. 1996. Novel method for rapid identification of Nocardia species by detection of preformed enzymes. J. Clin. Microbiol. 34(1): 103–107.

Binder D., Zbinden R., Widmer U., Opravil M. and Krause M. 1997. Native and prosthetic valve endocarditis caused by Rothia dentocariosa: diagnostic and therapeutic considerations. Infection, 25(1): 22-26.

Blanc V., Dalle M., Markarian A., Debunne M.V., Duplay E., Rodríguez-Nava V. and Boiron P. 2007. Gordonia terrae: a Difficult-To-Diagnose Emerging Pathogen?. J. Clin. Microbiol. 45(3): 1076–1077. Boiron P. 1997. Nocardiose (épidémiologie, physiopathologie, traitement). In: Dabernat H, Petitjean O., Schlemmer B., Stahl J.P., Weinbreck P. Infectiologie de A à Z. Arnette, 413– 416.

Bonnet E., Flecher X., Paratt S., Argenson J.-N., Raoult D. and Fournier P.-E. 2011. Actinomadura meyerae osteitis following wound contamination with hay in a woman in France: a case report. J. Medical Case Reports, 5: 32–35.

Boubetra D., Zitouni A., Bouras N., Mathieu F., Lebrihi A., Schumann P., Spröer C., Klenk H.-P. and Sabaou N. 2013. Saccharothrix hoggarensis sp. nov., an actinomycete isolated from saharan soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63: 549-553.

Bouizgarne B., Lanoot B., Loqman S., Spröer C., Klenk H.-P., Swings J. and Ouhdouch Y. 2009. Streptomyces marokkonensis sp. nov., isolated from rhizosphere soil of Argania spinosa L. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2857–2863. Bouras N., Mathieu F., Sabaou N. and Lebrihi A. 2006. Nutritional requirements for the production of dithiolopyrrolone antibiotics by Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137. Enz. Microbiol. Tech. 39: 1423–1429.

Bramwell P.A., Wiener P., Akkermans A.D.L. and Wellington E.M.H. 1998. Phenotypic, genotypic and pathogenic variation among streptomycetes implicated in common scab disease. Lett. Appl. Microbiol. 27: 255–260. Brown-Elliott B.A., Biehle J., Conville P.S., Cohen S., Saubolle M., Sussland D., Wengenack N., Kriel K., Bridge L., McNulty S., Vasireddy R. and Wallace R.J., Jr. 2012. Sulfonamide resistance in isolates of Nocardia spp. from a U.S. multicenter survey. J. Clin. Microbiol. 50(3): 670–672. Brown-Elliott B.A., Brown J.M., Conville P.S. and Wallace R..J. 2006. Clinical and Laboratory Features of the Nocardia spp. Based on Current Molecular Taxonomy. Clin. Microbiol. Rev. 19(2): 259–282. Buot G., Lavalle P., Mariat F. and Suchill P. 1987. Étude épidémiologique des mycétomes au Mexique. À propos de 502 cas. Bull. Soc. Pathol. Exot. 80: 329–339.

Camas M., Sazak A., Spröer C., Klenk H.-P., Cetin D., Guven K. and Sahin N. 2013. Nonomuraea jabiensis sp. nov., isolated from arid soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63: 212– 218. Cantwell A.R., Craggs Jr.E., Swateck F. and Wilson J.W. 1966. Unusual acid-fast bacteria in panniculitis. Arch. Dermatol. 94:161–167. Carey J., Motyl M. and Perlman D.C. 2001. Catheterrelated bacteremia due to Streptomyces in a patient receiving holistic infusions. Emerg. Infect. Dis. 7:1043–1045.

Cargill J.S., Boyd G.J. and Weightman N.C. 2010. Nocardia cyriacigeorgica: a case of endocarditis with disseminated soft-tissue infection. J. Med. Microbiol. 59: 224–230. Carlsohn M.R., Groth I., Spröer C., Schütze B., Saluz H.-P., Munder T. and Stackebrandt E. 2007 Kribbella aluminosa sp. nov., isolated from a medieval alum slate mine Marc René. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 1943–1947. Caron F., Borsa-Lebas F., Boiron P., Vasseur E., Hennequin C., Nouvellon M., Dauga C., Lemeland J.F. and Humbert G. 1992. Streptomyces sp. as a cause of nodular pneumonia in an HIV infected patient. Med. Microbiol. Lett. 1: 297–303.

Cascio A., Mandraffino G., Cinquegrani M., Delfino D., Mandraffino R., Romeo O., Criseo G. and Saitta A. 2011. Actinomadura pelletieri mycetoma–an atypical case with spine and abdominal wall involvement. J. Med. Microbiol. 60: 673-676.

Cavalla M. and Eberlin T. 1994. Isolement des Streptomycetes du sol. L’opéron XIX, 4: 13- 17. Cavallo J.D., Chardon H., Chidiac C., Courvalin P., Dabernat H., Drugeon H., Dubreuil L., Goldstein F., Guery B., Jarlier V., Lambert T., Leclercq R., Nicolas-Chanoine M.H., Quentin C., Rouveix B., Soussy C.J. et Varon E. 2008. Recommendations du comité de l’antibiogramme de la societé francaise de microbiologie. Disponible sur le site http://www.sfm.asso.fr/

Chang X., Liu W. and Zhang X.-H. 2011. Spinactinospora alkalitolerans gen. nov., sp. nov., an actinomycete isolated from marine sediment. Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 61: 2805–2810.

Chang X., Liu W. and. Zhang X.-H. 2012. Salinactinospora qingdaonensis gen. nov., sp. nov., a halophilic actinomycete isolated from a salt pond. Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 62: 954–959.

Chen Y.-G., Cui X.-L., Kroppenstedt R.M., Stackebrandt E., Wen M.-L., Xu L.-H. and Jiang C.-L. 2008. Nocardiopsis quinghaiensis sp. nov., isolated from saline soil in China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 699–705.

Chen Y.-G., Wang Y.-X., Zhang Y.-Q., Tang S.-K., Liu Z.-X., Xiao H.-D., Xu L.-H., Cui X.- L. and Li W.-J. 2009. Nocardiopsis litoralis sp. nov., a halophilic marine actinomycete isolated from a sea anemone. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2708–2713.

Chiba S., Suzuki M. and Ando K. 1999. Taxonomic re-evaluation of Nocardiopsis sp. K- 252T (= NRRL 15532T): a proposal to transfer this strain to the genus Nonomuraea as Nonornuraea longicatena sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 1623–1630.

Chitte R.R., Nalawade V.K. and Dey S. 1999. Keratinolytic activity from the broth of a feather-degrading thermophilic Streptomyces thermoviolaceus strain SD8. Lett. Appl. Microbiol. 28: 131-136.

Cho A. R., Kim H. R., Lee M.-K., Choi S. H., Yun S.W. 2010. A Case Report of Tsukamurella pulmonis Infection Misidentified as Atypical Mycobacteria. Korean J. Clin. Microbiol. 13 (2): 93–96. Clarke P.R.R., Warnock G.B.R., Blowers R. and Wilkinson M. 1964. Brain abscess due to Streptomnyces griseus. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 27: 553-555. Clavilier L., Hervieu F., Letodé O. 2001. Genes de résistance aux antibiotiques et plantes transgéniques. Edition institut nationanl de recherche agronomique (INRA), Paris. Conville P.S., Brown-Elliott B.A., Wallace R.J., Jr., Witebsky F.G., Koziol D., Hall G.S., Killian S.B., Knapp C.C., Warshauer D., Van T., Wengenack N.L., Deml S. and Woodsh G.L. 2012. Multisite reproducibility of the broth microdilution method for susceptibility testing of Nocardia species. J. Clin. Microbiol. 50(4): 1270–1280. Conville P.S., Fischer S.H., Cartwright C.P.and Witebsky F.G. 2000. Identification of Nocardia species by restriction endonuclease analysis of an amplified portion of the 16S rRNA gene. J. Clin. Microbiol. 38(1): 158–164.

Cook A.E., Le Roes M. and Meyers P.R. 2005. Actinomadura napierensis sp. nov., isolated from soil in South Africa. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 703–706.

Couraud S., Houot R., Coudurier M., Ravel A.C., Coiffier B., Souquet P.J. 2007. Infections pulmonaires à Nocardia. Rev. Mal. Respir. 24: 353–357. Cui Q., Wang L., Huang Y., Liu Z. and M. Goodfellow. 2005. Nocardia jiangxiensis sp. nov. and Nocardia miyunensis sp. nov., isolated from acidic soils. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1921–1925.

Cui Y.-S., Lee J.-S., Lee S.-T. and Im W.-T. 2010. Kribbella ginsengisoli sp. nov., isolated from soil of a ginseng field. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 364–368. Delmotte A. 1958. L’activité lipolytique microbiènne décélée par la méthode de Sierra avec référence spéciale au M. pyogenes var. aureus. Antonie Van Leeuwenhoek 24(1): 309–320.

Demain A.L. and Solomon N.A.1985. Biology of industrial microorganisms. Edition: The Benjamin/ Commings Publishing Company, London, p. 291–357. Denguezli M., Kourda M., Ghariani N., Belajouza C., Mokni B., Chebil F., Riahi B., Jomaa B. et Nouira R. 2003. Les mycétomes en Tunisie (région du centre). Rev. Tun. Infectiol. 130 (5): 515-518. Derewacz D.K., Goodwin C.R., McNees C.R., McLean J. A. and Bachmann B.O. 2013. Antimicrobial drug resistance affects broad changes in metabolomic phenotype in addition to secondary metabolism. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 110 (6): 2336–2341.

Develoux M., Dieng M. T., Kane A. et Ndiaye B. 2003. Prise en charge des mycétomes en Afrique de l’Ouest. Bull. Soc. Pathol. Exot. 96(5): 376–382. Dieng M.T., Niang S.O., Diop B. et Ndiaye B. 2005. Actinomycétomes au Sénégal. Étude de 90 cas. Bull. Soc. Pathol. Exot. 98(1): 14–17. Dunne E.F., Burman W.J. and Wilson M.L.1998. Streptomyces pneumonia in patient with Human immunodeficiency virus infection: case report and review of the literature on invasive Streptomyces infections. Clin. Infec. Dis. 27: 93–96. Ekkelenkamp M.B., De Jong W., Hustinx W. and Thijsen S. 2004. Streptomyces thermovulgaris bacteremia in Crohn’s disease patient. Emerg. Infect. Dis. 10: 1883–1885.

El-Naggar N.E., Sherief A.A. and Shawky Hamza S. 2011. Streptomyces aegyptia NEAE 102, a novel cellulolytic Streptomycete isolated from soil in Egypt. Afr. J. Microbiol. Res. 5(29): 5308–5315.

Engelhardt K., Degnes K.F., Kemmler M., Bredholt H., Fjærvik E., Klinkenberg G., Sletta H., Ellingsen T.E. and Zotchev S.B. 2010. Production of a new thiopeptide antibiotic, TP- 1161, by a marine Nocardiopsis species. Appl. Env. Microbiol. 76(15): 4969–4976. Epelboin L., Woessner J., Roussin C., Benoit-Cattin T., Noca P., Godefroy C., Rodrìguez- Nava V. and Aubry P. 2013. Actinomycetoma of the knee due to Nocardia otitidiscaviarum described in the Comoro Islands. Annales de Dermathologie et de Vénéréologie, 140(4): 287– 290. Euzeby J. 2012. List of prokaryotic names with standing in nomenclature. Disponible sur les sites :

http://www.bacterio.cict.fr/n/nocardia.html http://www.bacterio.cict.fr/m/micromonospora.html http://www.bacterio.cict.fr/c/corynebacterium.html http://www.bacterio.cict.fr/a/actinomycetales.html http://www.bacterio.cict.fr/s/streptomycesc.html http://www.bacterio.cict.fr/ijk/kribbella.html http://www.bacterio.cict.fr/s/saccharothrix.html

Everest G.J. and Meyers P.R. 2013. Micromonospora equina sp. nov., isolated from soil from a racecourse. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63: 879–885.

Everest J. and Meyers P.R. 2008. Kribbella hippodromi sp. nov., isolated from soil from a racecourse in South Africa gareth. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 443–446.

Evtushenko L.I., Taran V.V., Akimov V.N., Kroppenstedt R.M., Tiedje J.M. and Stackebrandt E. 2000. Nocardiopsis tropica sp. nov., Nocardiopsis trehalosi sp. nov., nom. rev. and Nocardiopsis dassonvillei subsp. albirubida subsp. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 73–81. Fahal A.H. 2004. Mycetoma: a thorn in the flesh. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 98: 3–11.

Fang C., Zhang J., Pang H., Li Y., Xin Y. and Zhang Y. 2011. Nocardiopsis flavescens sp. nov., an actinomycetes isolated from marine sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 2640– 2645. Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution, 39: 783–791.

Ferraz V., McCarthy K., Smith D. and Koornhof H.J. 1998. Rothia dentocariosa endocarditis and aortic root abscess. J. Infect. 37(3): 292–295. Forsberg K.J., Reyes A., Wang B., Selleck E.M., Sommer M.O.A., Dantas G. 2012. The shared antibiotic resistome of soil bacteria and human pathogens. Science, 337: 1107–1111.

Gao B. and Gupta R. S. 2012. phylogenetic framework and molecular signatures for the main clades of the phylum Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Reviews, 76(1): 66–112.

Garcia L.C., Martínez-Molina E. and Trujillo M.E. 2010. Micromonospora pisi sp. nov., isolated from root nodules of Pisum sativum. Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 60: 331–337. Gerhardt P., Murray R.G.E., Wood W.A. and Krieg N.R. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. Edition American Society for Microbiology, Washington. Gordon R.E. and Mihm J.M. 1956. A comparative study of some strains received as Nocardiae. J. Bacteriol. 73: 15–26. Gordon R.E. 1967. The taxonomy of soil bacteria. In the ecology of soil bacteria. Edition Gray T.R.G. and Parkinson D., Liverpool University Press, Liverpool, p. 293–321. Gordon R.E., Barnett D.A., Handerhan J.E. and Hor-Nay Pang C. 1974. Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica and the nocardia strain. Int. J. Syst. Bacteriol. 24: 54–63.

Goyer C., Faucher E. and Beaulieu C. 1996. Streptomyces caviscabies sp. nov., from Deep- Pitted Lesions in Potatoes in Qukbec, Canada. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 46(3): 635–639.

Goyer N., Lavoie J., Lazure L. et Marchand G. 2001. Les bioaérosols en milieu de travail: guide d’évaluation, de contrôle et de prévention. Guide technique disponible sur le site: www.irsst.qc.ca Gowrinath K., Rao P.S., Mohapatra A.K. and Prakash P.Y. 2009. Pleural nocardiosis. Indian. J. Chest. Dis. Allied. Sci. 51:169–171. Gruet M., Maydat L. and Ferro R. 1970. Peritonite a Streptomyces somaliensis. Bull. Soc. Med. Afr. Noire Lang. Fr. 15: 609–610.

Grund E. and Kroppenstedt R.M. 1990. Chemotaxonomy and numerical taxonomy of the genus Nocardiopsis -Meyer 1976- Int. J. Syst. Bacteriol. 40(1): 5–11. Gugnani A.C., Unaogu I.C. and Emeruwa C.N. 1993. Pulmonary infection due to Streptomyces griseus. J. Commun. Dis. 25: 38–40.

Guo Y., Zheng W., Rong X. and Huang Y. 2008. A multilocus phylogeny of the Streptomyces griseus 16S rRNA gene clade: use of multilocus sequence analysis for streptomycete systematic. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 149–159.

Gyobu Y. and Miyadoh S. 2001. Proposal to transfer Actinomadura carminata to a new subspecies of the genus Nonomuraea as Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 881–889. Hamid M.E., Maldonado L., Sharaf Eldin G.S., Mohamed M.F., Saeed N.S. and Goodfellow M. 2001. Nocardia africana sp. nov., a new pathogen isolated from patients with pulmonary infections. J. Clin. Microbiol. 39(2): 625–630. Hamid M.E. 2011. Variable antibiotic susceptibility patterns among Streptomyces species causing actinomycetoma in man and animals. Ann. Clin. Microbiol. 10: 24. Antimicrob. doi:1186/1476-0711-10-24

Haritha R., Kumar K.S., Swathi A., Jagan Y.S.Y.V. and Ramana T. 2012.Characterization of marine Streptomyces carpaticus and optimization of conditions for production of extracellular proteases. Microbiol. J. 2(1): 23–35.

Harvey I. 1999. Sélection de tests discriminants pour l'identification rapide des actinomycètes thermophiles impliqués dans l’alvéolite allergique extrinsèque. Mémoire présenté à la faculté des études supérieures de l'université Laval pour l'obtention du grade de maîtrise en sciences.

Hasegawa T., Lechevalier M.P. and Lechevalier H.A. 1978. New genus of the Actinomycetales: Actinosynnema gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 28(2): 304–310. He J., Xu Y., Sahu M.K., X.-P. Tian, G.-X. Nie, Xie Q., Zhang S., Sivakumar K. and Li W.-J. 2012. Actinomadura sediminis sp. nov., a marine actinomycete isolated from mangrove sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 1110–1116. Hidri H., Couble A., Casoli E., Farina C. et Boiron P. 2000. Les Nocardia. Lyon Pharmaceutique, 51(3): 178–183.

Hirsch P., Mevs U., Kroppenstedt R.M., Schumann P. and Stackebrandt E. 2004. Cryptoendolithic actinomycetes from antarctic sandstone rock samples: Micromonospora endolithica sp. nov. and two isolates related to Micromonospora coerulea Jensen 1932. Syst. Appl. Microbiol. 27: 166–174.

Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T. and Williams S.T. 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology, 9th edition, Williams and Wilkins, Baltimore, p. 2340–2343. Holtz H. A., Lavery D. P. and Kapila R. 1985. Actinomycetales infection in the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Int. Med. 102: 203–205. Hopwood D.A., Bibb M. J., Chater K.F., Kieser T., Bruton C.J., Kieser H.M., Lydiate D.J., Johnson J.A., Onderdonk A.B., Cosimi L.A., Yawetz S., Lasker B.A., Bolcen S.J., Brown J.M. and Marty F.M. 2011. Gordonia bronchialis bacteremia and pleural infection: case report and review of the literature. J. Clin. Microbiol. 49(4): 1662–1666. Hütter, R. 1967. Systematik der Streptomyceten. Bibl. Microbiol. Fasc. 6.

Hozzein W.N. and Goodfellow M. 2008. Nocardiopsis arabia sp. nov., a halotolerant actinomycete isolated from a sand-dune soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 2520–2524. Hu Y.-T., Zhou P.-J., Zhou Y.-G., Liu Z.-H. and Liu S.-J. 2004. Saccharothrix xinjiangensis sp. nov., a pyrene-degrading actinomycete isolated from Tianchi Lake, Xinjiang, China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 2091–2094.

Huang H., Lv J., Hu Y., Fang Z., Zhang K. and Bao S. 2008. Micromonospora rifamycinica sp. nov., a novel actinomycete from mangrove sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 17– 20.

Hwang B.K., Lim S.W., Kim B.S., Lee J.W. and Moon S.S. 2001. Isolation and in vivo and in vitro antifingal activity of phenylacetate from Streptomyces humidus. Appl. Env. Microbiol. 67(8): 3739–3745.

Jongrungruangchok S., Tanasupawat S. and Kudo T. 2008. Micromonospora chaiyaphumensis sp. nov., isolated from Thai soils. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 924– 928.

Jongrungruangchok S., Tanasupawat S. and Kudo T. 2008. Micromonospora krabiensis sp. nov., isolated from marine soil in Thailand. J. Gen. Appl. Microbiol. 54: 127–133. Joseph N.M., Harish B. N., Sistla S., Thappa D.M. and Parija S.C. 2011. Streptomyces bacteremia in a patient with actinomycotic mycetoma. J. Infect. Dev. Ctries. 4(4):249–252. Kageyama A., Torikoe K., Iwamoto M., Masuyama J-I., Shibuya Y., Okazaki H., Yazawa K., Minota S., Kroppenstedt R. M. and Mikami Y. 2004. Nocardia arthritidis sp. nov., a new pathogen isolated from a patient with rheumatoid arthritis in Japan. J. Clin. Microbiol. 42(6): 2366–2371.

Kămpfer P., Busse H.-J., Tindall B. J., Nimtz M. and I. Grün-Wollny. 2010. Nonomuraea rosea sp. Nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 1118–1124. Kapadia M., Rolston K. and Han X.Y. 2007. Invasive Streptomyces infections: six cases and literature review. Am. J. Clin. Pathol. 127: 619–624.

Karunakaran R., Halim H.A., Ng K.P., Hanifah Y.A., Chin E., Jaafar F.L., Abubakar S. 2011. Tsukamurella tyrosinosolvens intravascular catheter-related bacteremia in a haematology patient: a case report. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 15(11): 1343–1346.

Katsifas E.A., Giannoutsou E.P. and Karagouni A.D. 1999. Diversity of streptomycetes among specific greek terrestrial ecosystems. Lett. Appl. Microbiol. 29: 48–51.

Kieser T., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F. and Hopwood D.A. 2000. Practical Streptomyces genetics. Edition The John Innes Foundation, Norwich, UK , p. 613.

Kim B., Sahin N., Minnikin D.E., Zakrzewska-Czerwinska J., Mordarski M. and Goodfellow M. 1999. Classification of thermophilic Streptomycetes, including the description of Streptomyces thermoalcalitolerans sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 7–17. Kim B.-Y., Brown R., Labeda D.P. and Goodfellow M. 2011. Reclassification of ‘Dactylosporangium variesporum’ as Saccharothrix variisporea corrig. (ex Tomita et al. 1977) sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 310–314. Kinoshita N., Homma Y., Igarashi M., Ikeno S., Hori M. and Hamada M. 2001. Nocardia vinacea sp. nov. Actinomycetology. 15(1): 1–5. Kinoshita N., Igarashi M., Ikeno S., Hori M., Hamada M. 1999. Saccharothrix tangerinus sp. nov., the producer of the new antibiotic formamicin: taxonomic studies. Actinomycetologica, 13(1): 20–31.

Kirby B.M. and Meyers P.R. 2010. Micromonospora tulbaghiae sp. nov., isolated from the leaves of wild garlic, Tulbaghia violacea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 1328–1333.

Kirby B.M., Le Roes M. and Meyers P.R. 2006. Kribbella karoonensis sp. nov. and Kribbella swartbergensis sp. nov., isolated from soil from the Western Cape, South Africa. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 1097–1101. Kohn P.M., Tager M., Siegel M.L. and Ashe R. 1951. Aerobic actinomyces septicemia: report of a case. N. Engl. J. Med. 245: 640–644.

Kumar G.S.S., Chacko G., Mathews M.S., and Mathews J.M.2005. Intracranial Actinomadura granuloma. Neurology India, 53(3): 368–370.

Kumar V., Gusain O., Thakur R.L. and Bisht G.S. 2013. Isolation, purification and partial characterization of an antibacterial agent produced by halotolerant alkaliphilic Streptomyces sp. EWC 7(2). Proc. Nati. Acad. Sci. India Sect. B. Biol. Sci. 83(2): 199–206. Kumar V., Bharti A., Gupta V.K., Gusain O. and Bisht G.S. 2012. Actinomycetes from solitary wasp mud nest and swallow bird mud nest: isolation and screening for their antibacterial activity. World J. Microbiol. Biotechnol. 28: 871–880. Kutzner H.J. 1981. The family Streptomycetaceae In: Starr M.P., Stolp H., Trüper H.G., Balons A. and Schlegel H.G. (eds.) : The Prokaryotes . A handbook on habitats, isolation and identification of bacteria. Springer Verlag, Berlin, p. 2028–2090.

La Scolat B. and Raoult D. 1998. Molecular identification of Gemella species from three patients with endocarditis. J. Clin. Microbiol. 36(4): 866–871. Labeda D.P. and Kroppenstedt R.M. 2006. Goodfellowia gen. nov., a new genus of the Pseudonocardineae related to Actinoalloteichus, containing Goodfellowia coeruleoviolacea gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 1203–1207. Labeda D.P. and Lyons A.J. 1989. Sacchavothvix texasensis sp. nov. and Saccharothrix waywayandensis sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 39(3): 355–358. Labeda D.P. 2001. Crossiella gen. nov., a new genus related to Streptoalloteichus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1575–1579.

Labeda D.P. and Kroppenstedt R.M. 2000. Phylogenetic analysis of Saccharothrix and related taxa: proposal for Actinosynnemataceae fam. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 331–336. Labeda D.P. and Lechevalier M.P. 1989. Amendment of the genus Sacchavothvix Labeda et al. 1984 and descriptions of Sacchavothvix espanaensis sp. nov. Saccharothrix cryophilis sp. nov. and Sacchavothvix mutabilis comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 39(4): 420–423. Labeda D.P., Hatano K., Kroppenstedt R.M. and Tamura T. 2001. Revival of the genus Lentzea and proposal for Lechevalieria gen. nov. Int. J. Syst. Microbiol. 51: 1045–1050. Labeda D.P., Testa R.T., Lechevalier M.P. and Lechevalier H.A. 1984. Saccharothrix: a New Genus of the Actinomycetales Related to Nocardiopsis. Int. J. Syst. Bacteriol. 34(4): 426–431. Labeda D.P. 1986. Transfer of “Nocardia aerocolonigenes” (Shinobu and Kawato 1960) Pridham 1970 into the Genus Saccharothrix Labeda, Testa, Lechevalier, and Lechevalier 1984 as Saccharothrix aerocolonigenes sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 36(1): 109–110.

Lai C.-C., Tan C.-K., Lin S.H., Liao C.-H., Chou C.-H., Hsu H.-L., Huang Y.-T. and Hsueh P.-R. 2009. Comparative in vitro activities of nemonoxacin, doripenem, tigecycline and 16 other antimicrobials against Nocardia brasiliensis, Nocardia asteroides and unusual Nocardia species. J. Anti. Chemo. 64:73-78. (a) Lai C-C., Liu W-L., Ko W-C., Chen Y-H., Tan H-R., Huang Y-T. and Hsueh P-R. 2011. Multicenter study in Taiwan of the in vitro activities of nemonoxacin, tigecycline, doripenem, and other antimicrobial agents against clinical isolates of various nocardia species. Antim. Agen. Chemoth. 55(5): 2084–2091. Lai P.-C., Chen Y.-S., Lee S.S.-J. 2009. Infective endocarditis and osteomyelitis caused by Cellulomonas: a case report and review of the literature. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 65(2):184–187. (b)

Lam K.S., Hesler G.A., Gustavson D.R., Berry R.L., Tomita K., MacBeth L., Rossf J. , Miller D. and Forenza S. Pyrrolosporin A. 1996. A new antitumor antibiotic from Micromonospora sp. C39217-R109-7 I. Taxonomy of producing organism, fermentation and biological activity. J. Antibiot. 49 (9): 860–864. Lamm A.S., Khare A., Conville P., Lau P.C. K., Bergeron H. and Rosazza J.P.N. 2009. Nocardia iowensis sp. nov., an organism rich in biocatalytically important enzymes and nitric oxide synthase. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2408–2414. Lamrani O., Bentaleb H., Ajbar M.E., Mahfoud M., Berrada M.S., Elbardouni A., Ouadghini M., Hermas M., Wahbi S., Ouazzani N., Elyacoubi M. et Elmanouar M. 2002. Le pied de madura (à propos d’un cas). Rev. Maroc. Chir. Orthop. Traumato. 15: 56–57.

Land M., Lapidus A., Mayilraj S., Chen F., Copeland A., Del Rio T.G., Nolan M., Lucas S., Tice H., Cheng J.-F., Chertkov O., Bruce D., Goodwin L., Pitluck S., Rohde M., Göker M., Pati1 A., Ivanova N., Mavromatis K., Chen A., Palaniappan K., Hauser L., Chang Y.-J., Jeffries C. C., Brettin T., Detter J. C., Han C., Chain P., Tindall B. J., Bristow J., Eisen J. A., Markowitz V., Hugenholtz P., Kyrpides N.C. and Klenk H.-P. 2009. Complete genome sequence of Actinosynnema mirum type strain (101T). Standards in Genomic Science, 1: 46– 53. Lanoot B. 2004. Improved taxonomy of the genus Streptomyces. Thèse de doctorat, Faculty des Sciences, Université de Ghent, Belgique, p.132.

Larpent J.P. and Sanglier J.J. 1989. Biotechnology of antibiotics. Masson edition, School of biotechnology, Strasbourg, France. Laurent F., Mick V. et Boiron P. 1999. Clinique et biologie de la nocardiose. Ann. Biol. Clin. 57(5): 545–554.

Lazzarini A., Cavaletti L., Toppo G. and Marinelli F. 2000. Rare genera of actinomycetes as potential producers of new antibiotics. Antonie van Leeuwenhoek, 78: 399–405.

Le Roes M. and Meyers P.R. 2007. Actinomadura rudentiformis sp. nov., isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 45–50.

Le Roes M., Paul A.E. and Meyers R. 2008. Nonomuraea candida sp. nov., a new species from South African soil. Antonie van Leeuwenhoek, 93: 133–139.

Lechevalier M.P. and Lechevalier H.A. 1970. Chimical composition as criterion in the classification of aerobic actinomycetes. Int. J. Sys. Bacteriol. 20(4): 435–443.

Lechevalier M.P., Bievre C.D. and Lechevalier H.A. 1977. Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipides composition. Biochem. Syst. Ecol. 5: 249–260.

Lee D.W. and Lee S.D. 2010. Actinomadura scrupuli sp. nov., isolated from rock. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 2647–2651.

Lee S.D. 2012. Actinomadura rupiterrae sp. nov., isolated from cliff soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 990–995. Lee S.D., Kim E.S., Roe J.-H., Kim J.-H., Kang S.-O. and Hah Y.C. 2000. Saccharothrix violacea sp. nov., isolated from a gold mine cave, and Saccharothrix albidocapillata comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1315–1323.

Lee S.D. and Jeong H.S. 2006. Actinomadura hallensis sp. nov., a novel actinomycete isolated from Mt. Halla in Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 259–264.

Leger J.A.S.T., Begeman L., Fleetwood M., Frasca J.R.S., Garner M.M., Lair S., Trembley S., Linn M.J. and Terio K.A. 2009. Comparative pathology of nocardiosis in marine mammals. Vet. Pathol. 46: 299–308.

Li W.-J., Wang D., Zhang Y.-Q., Schumann P., Stackebrandt E., Xu L.-H. and Jiang C.-L. 2004. Kribbella antibiotica sp. nov., a novel nocardioform actinomycete strain isolated from soil in Yunnan, China. Syst. Appl. Microbiol. 27: 160–165.

Lia W.-J., Wanga D., Zhanga Y.-Q., Xua L.-H. and Jianga C.-L. 2006. Kribbella yunnanensis sp. nov., Kribbella alba sp. nov., two novel species of genus Kribbella isolated from soils in Yunnan, China. Syst. Appl. Microbiol. 29: 29–35.

Liu W.L., Lai C.C., Ko W.C., Chen Y.H., Tang H.J., Huang Y.L., Huang Y.T. and Hsueh P.R. 2011. Clinical and microbiological characteristics of infections caused by various Nocardia species in Taiwan: a multicenter study from 1998 to 2010. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: 1341–1347. Lopez Martinez R., Mendez Tovar L., Lavalle P., Welsh O., Saul A. and Ruiz E.M. 1992. Epidemiologica del micetoma en Mexico. Estudio de 2105 casos. Gac. Med. Mex. 128: 477- 481.

Loqman S., Bouizgarne B., Ait Barka E., Clément C., von Jan M., Spröer C., Klenk H.-P. and Ouhdouch Y. 2009. Streptomyces thinghirensis sp. nov., isolated from rhizosphere soil of Vitis vinifera. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 3063–3067. Lowman W. and Aithma N. 2010. Antimicrobial susceptibility testing and profiling of Nocardia species and other aerobic actinomycetes from South Africa: comparative evaluation of broth microdilution versus the Etest. J. Clin. Microbiol. 48(12): 4534–4540. Lu Z., Wang L., Zhang Y., Shi Y., Liu Z., Quintana E.T. and Goodfellow M. 2003. Actinomadura catellatispora sp. nov. and Actinomadura glauciflava sp. nov., from a sewage ditch and soil in southern China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 137–142.

Madigan M.T et Martinko J.M. 2007. Biologie des microorganismes. 11ème édition, Pearson Education, France, p. 331–423, 686–718.

Magiorakos A.-P., Srinivasan A., Carey R.B., Carmeli Y., Falagas M.E., Giske C.G., Harbarth S., Hindler J.F., Kahlmeter G., Olsson-Liljequist B., Paterson D.L., Rice L.B., Stelling J., Struelens M.J., Vatopoulos A., Weber J.T. and Monnet D.L. 2012. Multidrug- resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 18: 268–281.

Manteca A., Pelaez A.I., del Mar Garcia-Suarez M., Hidalgo E., del Busto B. and Mendez F.J. 2008. A rare case of lung coinfection by Streptomyces cinereoruber and Haemophilus influenzae in a patient with severe chronic obstructive pulmonary disease: characterization at species level using molecular techniques. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 60(3):307–311.

Marcone G.L., Beltrametti F., Binda E., Carrano L., Foulston L., Hesketh A., Bibb M. and Marinelli F. 2010. Methods for the genetic manipulation of Nonomuraea sp. ATCC 39727. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 37(10): 1097–1103. (a)

Marcone G.L., Beltrametti F., Binda E., Carrano L., Foulston L., Hesketh A., Bibb M. and Marinelli F. 2010. Novel mechanism of glycopeptide resistance in the A40926 producer Nonomuraea sp. ATCC 39727. Antimicrob. Agents Chemother. 54 (6): 2465–2472. (b) Martin G.J., Blazes D.L., Mayers D.L. and Spooner K.M. 1999. Refractory craniofacial actinomycetoma due to Streptomyces somaliensis that required salvage therapy with amikacin and imipenem. Clin. Infec. Dis. 29: 460–461.

Mason M.J., Ishizawa K., Silkstone G., Nicholls P. and Wilson M.T. 2001. Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken identity. Appl. Env. Microbiol. 67(10): 4512–4519.

McClung N.M. 1960. Isolation of Nocardia asteroides form soils. Mycologia, 52: 154–156.

McNab B., Geddes G., Shaw C., Mithani S. and Isaac-Renton J. 2006. Identification of Nocardia species by partial sequencing of the 16S rRNA gene: the sun sets on Nocardia asteroides. Can. J. Med. Lab. Scien. 68: 18–33.

McNeil M.M. and Brown J.M. 1994. The medically important aerobic actinomycetes: epidemiology and microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 7 (3): 357–417.

McNeil M.M., Brown J.M., Jarvis W.R. and Ajello L. 1990. Comparison of species distribution and antimicrobial susceptibility of aerobic actinomycetes from clinical specimens. Rev. Infect. Dis. 12: 778–783.

Mehling A., Wehmeier U.F. and Piepersberg W. 1995. Application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) assays in identifying conserved regions of actinomycete genomes. FEMS Microbiol. Lett. 128: 119–126.

Meklat A., Sabaou N., Zitouni A., Mathieu F. and Lebrihi A. 2011. Isolation, taxonomy, and antagonistic properties of halophilic actinomycetes in saharan soils of Algeria. Appl. Env. Microbiol. 77(18): 6710–6714.

Meyer J., 1976. Nocardiopsis, a new genus of the order Actinomycetales. Int. J. Syst. Bacteriol. 26(4): 487–493. Meyssonnier V. 2012. Epidemiologie de la tuberculose et de la resistance aux antituberculeux. These de doctorat de l’universite pierre et marie curie, France, p.24.

Mighélez E.M., Hardisson C. and Manzanal M.B. 2000. Streptomycetes: A new model to study cell death. J. Cell. Biol. 3: 153–158. Mishra S.K., Gordon R.E. and Barnett D.A. 1980. Identification of Nocardiae and Streptomycetes of medical importance. J. Clin. Microbiol. 11: 728–736.

Moiton M.-P., Robert D., Bébéar C.-M., Neau D., Dugué C., Ragnaud J.-M. 2006. Clinical, microbiological and therapeutic aspects of Nocardia sp. Infections in the Bordeau hospital from 1993 to 2003. Med. Mal. Infect. 36: 264–269.

Morin A., Kaufmann K.W., Fortenberry C., Harp J.M., Mizoue L.S. and Meiler J. 2011. Computational design of an endo-1,4-b-xylanase ligand binding site. Protein Engineering, Design and Selection, 24(6): 503–516. Moss W.J., Sager J.A., Dick J.D. and Ruff A. 2003. Streptomyces bikiniensis bacteremia Emerg. Infec. Dis. 9(2): 273–274. Mossad S.B., Tomford J.W., Stewart R., Ratliff N.B. and Hall G.S. 1995. Case report of Streptomyces endocarditis of a prosthetic aortic valve. J. Clin. Microbiol. 33: 3335–3337. Muir D.B. and Pritchard R.C. 1997. Use of the BioMerieux ID 32C yeast identification system for identification of aerobic actinomycetes of medical importance. J. Clin. Microbiol. 35(12): 3240–3243. Neri A., Mignogna G., Fazio C., Giorgi A., Schinin Ã.M.E. and Stefanelli P. 2010. Neisseria meningitidis rifampicin resistant strains: Analysis of protein differentially expressed. BMC Microbiol. 10(1): 246. doi:10.1186/1471-2180-10-246.

Nouvel L.X.M. 2005. Recherche de marqueurs génétiques de souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques en république centrafricaine. Thèse pour obtenir le grade de docteur vétérinaire. Ecole national de vétérinaire, Toulouse, p.40, 48.

Ohtaki H., Ohkusu K., Sawamura H., Ohta H., Inoue R., Iwasa J., Ito H., Murakami N., Ezaki T., Moriwaki H. and Seishima M. 2009. First case report of acute cholecystitis with sepsis caused by Cellulomonas denverensis. J. Clin. Microbiol. 47(10): 3391–3393.

Otoguro M., Tamura T., Suzuki K.-I. and Hayakawa M. 2009. Saccharothrix violaceirubra sp. nov., isolated from soil and plant litter. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 1504–1507.

Paananen A., Mikkola R., Sareneva T., Matikainen S., Andersson M., Julkunen I., Salkinoja- Salonen M. and Timonen T. 2000. Inhibition of human NK cell function by valinomycin, a toxin from Streptomyces griseus in indoor air. Infect. Immun. 68: 165–169. Packey C.D. and Sartor R.B. 2009. Commensal bacteria, traditional and opportunistic pathogens, dysbiosis and bacterial killing in inflammatory bowel diseases. Curr. Opin. Infect. Dis. 22(3): 292–301.

Park Y.-H., Yoon J.-H., Shin Y.K., Suzuki K.-I., Kudo T., Seino A., Kim H.-J., Lee J.-S. and Lee S.T. 1999. Classification of Nocardioides fulvus IF0 14399 and Nocardioides sp. ATCC 39419 in Kribbella gen. nov., as Kribbella flavida sp. nov. and Kribbella sandrarnycini sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 743–752. Patel J.B., Wallace R.J., Jr., Brown-Elliott B.A., Taylor T., Imperatrice C., Leonard D.G.B., Wilson R.W., Mann L., Jost K.C. and Nachamkin I. 2004. Sequence-based identification of aerobic actinomycetes. J. Clin. Microbiol. 42(6): 2530–2540.

Pellegrini G.J., Jr., Graziano J.C., Ragunathan L., Bhat M.A., Hemashettar B.M. and Brown J.M. 2012. Scalp abscess due to Streptomyces cacaoi subsp. cacaoi, first report in a human infection. J. Clin. Microbiol. 50(4):1484–1486.

Peltola J. S. P., Andersson M. A., Kāmpfer P., Auling G., Kroppenstedt R.M., Busse H.-J., Salkinoja-Salonen M. S. AND Rainey F. A. 2001. Isolation of toxigenic Nocardiopsis strains from indoor environments and description of two new Nocardiopsis species, N. exhalans sp. nov. and N. umidischolae sp. nov. Appl. Environ. Microbiol. 67 (9): 4293–4304.

Petinate S.D.G., Martin R.M., Coelho R.R.R., Meirelles M.N.L., Branquinha M.H. and Vermelho A.B. 1999. Influence of growth medium in proteinase and pigment production by Streptpmyces cyaneus. Mémoire de l’institut Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 91(6): 755–760.

Petrosyan P., Garcia-Varela M., Luz-Madrigal A., Huitron C. and Floress M.E. 2003. Streptomyces mexicanus sp. nov., a xylanolytic microorganism isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 269–273.

Pitche P., Napo-Koura G., Kpodzro K. et Tchangaï-Wallam K. 1999. Les mycétomes au togo: Aspects épidémiologiques et étiologiques des cas histologiquement diagnostiqués. Médecine d'Afrique Noire, 46: 322–325. Pridham T.G. and Lyons A.J. 1965. Further taxonomic studies on straight to flexuous Streptomycetes. J. Bacteriol. 89(2): 331–342.

Promnuan Y., Kudo T., M. Ohkuma and Chantawannakul P. 2011. Actinomadura apis sp. nov., isolated from a honey bee (Apis mellifera) hive, and the reclassification of Actinomadura cremea subsp. rifamycini Gauze et al. 1987 as Actinomadura rifamycini (Gauze et al. 1987) sp. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 2271–2277.

Puhl A.A., Selinger L.B., McAllister T.A. and Inglis G.D. 2009. Actinomadura keratinilytica sp. nov., a keratin degrading actinobacterium isolated from bovine manure compost. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 828–834.

Pukall R., Lapidus A., Del Rio T.G., Copeland A., Tice H., Cheng J.-F., Lucas S., Chen F., Nolan M., LaButti K., Pati A., Ivanova N., Mavromatis K., Mikhailova N., Pitluck S., Bruce D., Goodwin L., Land M., Hauser L., Chang Y.-J., Jeffries C.D., Chen A., Palaniappan K., Chain P., Rohde M., Göker M., Bristow J., Eisen J.A., Markowitz V., Hugenholtz P., Kyrpides N.C., Klenk H.-P. and Brettin T. 2010. Complete genome sequence of Kribbella flavida type strain (IFO 14399T). Standards in Genomic Sciences, 2: 186–193.

Qiao J., Chen L., Li Y., Wang J., Zhang W. and Chenc S. 2012. Whole-genome sequence of Nocardiopsis alba strain ATCC BAA-2165, associated with Honeybees. J. Bacteriol. 194(22): 6358–6359.

Qin S., Zhao G.-Z., Klenk H.-P., Li J., W.-Y. Zhu, Xu L.-H. and Li W.-J. 2009. Nonomuraea antimicrobica sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from a leaf of Maytenus austroyunnanensis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2747–2751. (a)

Qin S., Zhao G.-Z., Li J., Zhu W.-Y., Xu L.-H. and Li W.-J. 2009. Actinomadura flavalba sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2453–2457. (b)

Qiu D., Ruan J. and Huang Y. 2008. Selective isolation and rapid identification of members of the genus Micromonospora. Appl. Env. Microbiol. 74(17): 5593–5597.

Quintana E., Maldonado L. and Goodfellow M. 2003. Nonomuraea terrinata sp. nov., a novel soil actinomycetes. Antonie Van Leeuwenhoek, 84: 1–6. Rakotoarivelo R.A., Raveloson H.F.R., Razafimahefa S.H., Farbos S., Gemain M.-C. and Bonnal F. 2011. Abcès cérébral à Nocardia asteroides révélant un adénocarcinome pulmonaire. Rev. Pneumo. Clin. 67: 329–332.

Reddy T.V.K., Mahmood S., Mohammed Idris M. and Ciesielski S. 2010. Streptomyces osmaniensis sp. nov., isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 1755–1759. Rieder H.L. 2002. Interventions for tuberculosis control and elimination. International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Paris, France, p.17, 26, 35, 37.

Riegel P. 1998. Les corynébactéries, aspects bactériologiques et cliniques. Ann. Biol. Clin. 56(3): 285–296.

Rivas R., Sanchez M., Trujillo M.E., Zurdo-Pineiro J.L., Mateos P.F., Martinez-Molina E. and Valazquez E. 2003. Xylanimonas cellulosilyca gen. nov., sp. nov., a xylanolytic bacterium isolated from a decaded tree (Ulmus nigra). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 99– 103. Riviere E., Ghiringhelli C.B., Lippa N., Roger-Schmeltz J., Neau D., Mercie P. et Longy- Boursier M. 2008. Infection invasive à Streptomyces chez un adulte (22e cas mondial). Congrès SNFMI, Bordeaux. Riviere E., Neau D., Roux X., Lippa N., Roger-Schmeltz J., Mercie P. and M. Longy- Boursier. 2012. Pulmonary Streptomyces infection in patient with sarcoidosis, France, 2012. Emerg. Infec. Dis. 18 (11): 1907–1908. Rodríguez-Nava V., Couble A., Molinard C., Sandoval H., Boiron P. and Laurent F. 2004. Nocardia mexicana sp. nov., a new pathogen isolated from human mycetomas. J. Clin. Microbiol. 42: 4530–4535.

Rodríguez-Nava V., Zoropoguy A., Laurent F., Blaha D. Couble A., Mouniée D. et Boiron P. 2008. La nocardiose, une maladie en expansion Antibiot. 10: 115–127. Rong X. and Huang Y. 2010. Taxonomic evaluation of the Streptomyces griseus clade using multilocus sequence analysis and DNA–DNA hybridization, with proposal to combine 29 species and three subspecies as 11 genomic species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 696– 703. Rose III C.E., Brown J.M. and Fisher J.F. 2008. Brain abscess caused by Streptomyces infection following penetration trauma: case report and results of susceptibility analysis of 92 isolates of Streptomyces species submitted to the CDC from 2000 to 2004. J. Clin. Microbiol. 46(2): 821–823.

Rudramurthy S.M., Sumangala B., Honnavar P., Madhav Y.B., Munegowda K.C., Ravi D. and Chakrabarti A. 2012. Nasal vestibulitis due to Nocardiopsis dassonvillei in a diabetic patient. J. Med. Microbiol. 61: 1168–1173.

Saadoun I. and El-Momani F. 1997. Streptomycetes from jordan soils active against Agrobacterium tumefaciens. Actinomycetes, 8(1, 2): 29–36.

Saint pierre-Bonaccio D., Maldonado L.A., Amir H., Pineau R. and Goodfellow M. 2004. Nocardia neocaledoniensis sp. nov., a novel actinomycete isolated from a New-Caledonian brown hypermagnesian ultramafic soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 599–603. Saitou N. and Nei M. 1987. The Neighbor-Joining method-a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406–425. Sandalakis V., Psaroulaki A., De Bock P.J., Christidou A., Gevaert K., Tsiotis G. and Tselentis Y. 2012. Investigation of rifampicin resistance mechanisms in Brucella abortus using MS-driven comparative proteomics. J. Proteome Res. 11(4):2374–2385.

Sanglier J.J. et Trujillo M. 1997. Substances bioactives produites par les actinomycètes et stratégie de sélection de souche. Bult. Soc. Fr. Microbiol. 12(3): 269–276.

Sarethy I.P., Saxena Y., Kapoor A., Sharma M., Sharma S.K., Gupta V. and Gupta S. 2011. Alkaliphilic bacteria: applications in industrial biotechnology. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38: 769–790. Saubolle M.A. and Sussland D. 2003. Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J. Clin. Microbiol. 41: 4497–4501. Schlaberg R., Huard R.C. and Della-Latta P. 2008. Nocardia cyriacigeorgica, an emerging pathogen in the United States. J. Clin. Microbiol. 46(1): 265–273.

Schofieled G.M. and Schaal K.P. 1981. A numerical taxonomic study of members of the Actinomycetales and related taxa. J. Gen. Microbiol. 121: 237–259.

Serrano J.A., Mejia M.A., Garcia E., Zamora R. and Boiron P. 1998. Streptomyces somaliensis as an etiologic agent of actinomycetoma in Lara State, Venezuela. An epidemiological, clinical, microbiological, molecular and histological study of five cases. J. Mycol. Médicale 8: 97–104. Shanley J.D., Snyder K. and Child J.S. 1979. Chronic pericarditis due to Streptomyces species. Am. J. Clin. Pathol. 72: 107–110.

Shirling E.B. and Gottlieb D. 1969. Cooperative description of type cultures of Streptomyces. IV. Species descriptions from the second, third and fourth studies. Int. J. Syst. Bacteriol. 19(4): 391–512 Shirling E.B. and Gottlieb D. 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. bacteriol. 16(3): 313–340. Shivaprakash M.R., Rao P., Mandal J., Biswal M., Gupta S., Ray P., Chakrabarti A. 2007. Nocardiosis in a tertiary care hospital in North India and review of patients reported from India. Mycopathologia, 163: 267–274.

Shomura T., Yoshida J., Amano S., Kojima M. and Niida T. 1979. Studies on Actinomycetales producing antibiotics only in agar culture. I. Screening, taxonomy and morphology-productivity relationship of Streptomyces halstedii, Strain SF-1993. J. Antibiot. 32: 427–435.

Silva M.S., Sales A.N., Magalhães-Guedes K.T., Dias D.R. and Schwan R.F. 2013. Brazilian cerrado soil actinobacteria ecology. Article in press: Biomed. Res. Int. Article ID 503805, 10 pages, disponible sur le site: http://dx.doi.org/10.1155/2013/503805.

Sohn K., Hong S.G., Bae K.S. and Chun J. 2003. Transfer of Hongia koreensis Lee et al. 2000 to the genus Kribbella Park et al. 1999 as Kribbella koreensis comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1005–1007.

Song J., Kim B.-Y., Hong S.-B., Cho H.-S., Sohn K., Chun J. and Suh J.-W. 2004. Kribbella solani sp. nov. and Kribbella jejuensis sp. nov., isolated from potato tuber and soil in Jeju, Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1345–1348.

Songsumanus A., Tanasupawat S., Igarashi Y. and Kudo T. 2013. Micromonospora maritima sp. nov., isolated from mangrove soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63: 554–559.

Songsumanus A., Tanasupawat S., Thawai C., Suwanborirux K. and Kudo T. 2011. Micromonospora humi sp. nov., isolated from peat swamp forest soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 1176–1181. Soraa N., Arsalane L., Ouhdouch Y. et Louzi L. 2009. Abces cerebral à Nocardia: a propos d’un cas. Rev. Tun. Infectiol. 3(2): 29–33.

Stackbrant E., Wink J., Steiner U. and Kroppenstedt R.M. 2001. Nonomuraea dietzii sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1437–1441.

Stackebrandt E. and Schumann P. 2006. Introduction to the taxonomy of actinobacteria. Prokaryotes, 3: 2 97–321.

Staneck J.L. and Roberts G.D. 1974. Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography. Appl. Microbiol. 28: 226–231.

Steingrube V.A., Wilson R.W., Brown B.A., Jost K.C., Jr., Blacklock Z., Gibson J. L. and Wallace R.J., Jr. 1997. Rapid identification of clinically significant species and taxa of aerobic actinomycetes, including Actinomadura, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, and Tsukamurella Isolates, by DNA amplification and restriction endonuclease analysis. J. Clin. Microbiol. 35 (4): 817–822.

Suihko M.-L., Priha O., Alakomi H.-L.,Thompson P., Malarstig B., Stott R., Richardson M. 2009. Detection and molecular characterization of filamentous bacteria and thermoactinomycetes present in water damaged building materials. Indoor Air, 19: 268–277.

Sujatha P., Bapi-Raju K.V.V.S.N. and Ramana T. 2005. Studies on a new marine Streptomycete BT-408 producing polyketide antibiotic SBR-22 effective against methicillin resistant Staphylococcus aureus. Microbiol. Res. 160: 119–126. Sullivan D.C. and Chapman S.W. 2010. Bacteria that masquerade as fungi: actinomycosis and nocardiosis. Proc. Am. Thorac. Soc. 7: 216–221.

Sy M.H., Diouf A.G., Diakhate I., Dangou J.M., Dieng M.T., Barberet G., Ndiaye A., Dieme C.B., Dansokho A.V. et Seye S.I.L. 2003. Ostéites mycétomiques et mycétomes osseux. e- mémoires de l'Académie Nationale de Chirurgie, 2(2): 11–17.

Takahashi Y., Iwai Y. and Omura S. 1986. Clostomicins, new antibiotics produced by Micromonospora echinospora subsp. armeniaca subsp. Nov. II. Taxonomic study of the producing microorganism. J. Antibiot. 39(10): 1505–1507. Takahashi Y., Matsumoto A., Seino A., Iwai Y. and Omura S. 1996. Rare actinomycetes isolated from desert soils. Actinomycetologia, 10(2): 91–97.

Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M. and Kumar S. 2011. MEGA 5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecul. Biol. Evol. 28: 2731–2739.

Tamura T., Ishida Y., Nozawa Y., Otoguro M. and Suzuki K.-I. 2009. Transfer of Actinomadura spadix Nonomura and Ohara 1971 to Actinoallomurus spadix gen. nov., comb. nov., and description of Actinoallomurus amamiensis sp. nov., Actinoallomurus caesius sp. nov., Actinoallomurus coprocola sp. nov., Actinoallomurus fulvus sp. nov., Actinoallomurus iriomotensis sp. nov., Actinoallomurus luridus sp. nov., Actinoallomurus purpureus sp. nov. and Actinoallomurus yoronensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 1867–1874. Tamura T., Ishida Y., Otoguro M., Hatano K. and Suzuki K.-I. 2008. Reclassification of Streptomyces flavidofuscus as a synonym of Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 2321–2323.

Tanasupawat S., Jongrungruangchok S. and Kudo T. 2010. Micromonospora marina sp. nov., isolated from sea sand. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 648–652.

Thawai C., Tanasupawat S., Itoh T., Suwanborirux K. and Kudo T. 2004. Micromonospora aurantionigra sp. nov., isolated from a peat swamp forest in Thailand. Actinomycetologica, 18: 8–14.

Thawai C., Tanasupawat S., Itoh T., Suwanborirux K., Suzuki K.-I. and Kudo T. 2005. Micromonospora eburnea sp. nov., isolated from a Thai peat swamp forest. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 417–422.

Thawai C., Tanasupawat S., Suwanborirux K., Itoh T. and Kudo T. 2007. Micromonospora narathiwatensis sp. nov., from Thai peat swamp forest soils. J. Gen. Appl. Microbiol. 53: 287–293.

Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. 1994. Clustal W-improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673–4680.

Trabelsi A., Ben Abdelkrim S., Boussofara L., Mestiri S., Denguezli M., Sriha B. et Korbi S. 2009. Mycetome actinomycosique: a propos d'un nouveau cas tunisien. Rev. Tun. Infectiol. 3(1): 26–28.

Trujillo M.E., Kroppenstedt R.M., Fernăndez-Molinero C., Schumann P. and Martínez Molina E. 2007. Micromonospora lupini sp. nov. and Micromonospora saelicesensis sp. nov., isolated from root nodules of Lupinus angustifolius. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 2799– 2804.

Trujillo M.E., Kroppenstedt R.M., Schumann P. and Martínez-Molina E. 2006. Kribbella lupini sp. nov., isolated from the roots of Lupinus angustifolius. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 407–411. (a)

Trujillo M.E., Kroppenstedt R.M., Schumann P., Carro L. and Martínez-Molina E. 2006. Micromonospora coriariae sp. nov., isolated from root nodules of Coriaria myrtifolia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2381–2385. (b)

Trujillo M.E., Fernández-Molinero C., Velázquez E., Kroppenstedt R.M., Schumann P., Mateos P.F. and Martínez-Molina E. 2005. Micromonospora mirobrigensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 877–880.

Tseng M., Yang S.-F., Hoang K.-C., Liao H.-C., Yuan G.-F. and Liao C.-C. 2009. Actinomadura miaoliensis sp. nov., a thermotolerant polyester-degrading actinomycetes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 517–520.

Urzì C., De Leo F. and Schumann P. 2008. Kribbella catacumbae sp. nov. and Kribbella sancticallisti sp. nov., isolated from whitish-grey patinas in the catacombs of St Callistus in Rome, Italy. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 2090–2097.

Vobis G. 1997. Morphology of actinomycetes. In: Atlas of actinomycetes. Edition: Asakura Publishing Co., Asakura, Japan.

Wael N., Hozzein A.E. and Goodfellow M. 2007. Nonomuraea aegyptia sp. nov., a novel actinomycetes isolated from a sand dune. Antonie Van Leeuwenhoek, 92: 165–171.

Waksman S.A. et Heinrici A.T. 1943. The nomenclature and classification of the Actinomycetes. J. Bacteriol. 46: 337–341.

Wang C., Xu X.-X., Qu Z., Wang H.-L., Lin H.-P., Xie Q.-Y., Ruan J.-S. and Hong K. 2011. Micromonospora rhizosphaerae sp. nov., isolated from mangrove rhizosphere soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61: 320–324.

Wang Y.-X., Zhi X.-Y., Chen H.-H., Zhang Y.-Q., Tang S.-K., Jiang C.-L., Xu L.-H. and Wen-Jun L. 2007. Actinomadura alba sp. nov., isolated from soil in Yunnan, China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 1735–1739. Wauters G., Avesani V., Charlier J., Janssens M., Vaneechoutte M. et Delmée M. 2005. The Distribution of Nocardia species in clinical samples and their routine rapid identification in the laboratory. J. Clin. Microbiol. 43(6): 2624–2628.

Weinstock D.M. and Brown A.E. 2002. Rhodococcus equi: an emerging pathogen. Emerg. Infec. 34: 1379–1385. Werder E.A. and Sonnabend W. 1973. Neonatal infection with Streptomyces pelletieri. Am. J. Dis. Child. 125: 439–441. Whitman W.B., Goodfellow M., Kämpfer P., Busse H.-J., Trujillo M.E., Ludwig, W. and Suzuki K.-I., (Eds.). 2012. Bergey’s manual of systematic bacteriology. The Actinobacteria, Part A. Volume 5, 2nd edition, Spinger New York, Dordrecht Heidelberg London.

Wildermuth H. and Hopwood D.A. 1970. Septation during sporulation in Streptomyces coelicolor. J. Gen. Micobiol. 60: 51–59.

Williams S.T., Bradshaw R.M., Costerton J.W. and Forge A. 1972. Fine structure of the spore sheath of some Streptomyces species. J. Gen. Microbiol. 72(2): 249–258. Williams S.T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M.H, Sneath P.H.A. and Sachin M.J. 1983. Numerical classification of Streptomyces and related genera. J. Gen. Microbiol. 129: 1743–1813. Williams S.T., Wellington E.M.H., Goodfellow M., Alderson G., Sachin M. and Sneath P. H.A. 1981. The genus Streptomyces-a taxonomic enigma. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A Suppl. 11: 45–57. Williams S.T., Goodfellow M. and Alderson G. 1989. Genus Streptomyces Waksman and Henrici, 1943, 339AL. In: Bergey’s manual of systematic bacteriology, Williams and Wilkins, Baltimore, Vol. 4, p. 2452–2492.

Wink J., Kroppenstedt R.M., Seibert G. and Stackebrandt E. 2003. Actinomadura namibiensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 721–724. Woo J.H., Kitamura E., Myouga H. and Kamei Y. 2002. An antifungal protein from the marine bacterium Streptomyces sp. Strain AP77 is specific for Pytium porphyrae, a causative agent of red disease in Porphyra spp. Appl. Env. Microbiol. 68(6): 2666–2675.

Xi L., Ruan J. and Huang Y. 2012. Diversity and biosynthetic potential of culturable actinomycetes associated with marine sponges in the China seas. Int. J. Mol. Sci. 13: 5917–5932.

Xiao J., Wang Y., Luo Y., Xie S.-J., Ruan J.-S. and Xu J. 2009. Streptomyces avicenniae sp. nov., a novel actinomycete isolated from a rhizosphere of the mangrove plant Avicennia mariana. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2624–2628.

Xie Q.Y., Qu Z., Lin H.P., Li L. and Hong K. 2012. Micromonospora haikouensis sp. nov., isolated from mangrove soil. Antonie Van Leeuwenhoek, 101: 649–655. Xu P., Li W.-J., Tang S.-K., Gao H.-Y., Xu L.-H. and Jiang C.-L. 2005. Streptomyces daliensis sp. nov. from soil. Antonie van Leeuwenhoek, 89(1): 71–78.

Xu Z., Xu Q., Zheng Z. and Huang Y. 2012. Kribbella amoyensis sp. nov., isolated from rhizosphere soil of a pharmaceutical plant, Typhonium giganteum Engl. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 1081–1085.

Yamamura H., Hayakawa M., Nakagawa Y. and Iimura Y. 2004. Characterization of Nocardia asteroides isolates from different ecological habitats on the basis of repetitive extragenic palindromic-PCR fingerprinting. Appl. Env. Microbiol. 70: 3149–3151.

Yamamura H., Ohkubo S.-Y., Ishida Y., Otoguro M., Tamura T. and Hayakawa M. 2010. Nocardiopsis nikkonensis sp. nov., isolated from a compost sample. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 2967–2971.

Yan X., Yan H., Liu Z., Liu X., Mo H. and Zhang L. 2011. Nocardiopsis yanglingensis sp. nov., a thermophilic strain isolated from a compost of button mushrooms. Antonie Van Leeuwenhoek, 100: 415–419.

Yang R., Zhang L.-P., Guo L.-G., Lu N.S.Z. and Zhang X. 2008. Nocardiopsis valliformis sp. nov., an alkaliphilic actinomycete isolated from alkali lake soil in China. Int. J. Syst. Bacteriol. 58: 1542–1546. Yassin A.F. and Brenner S. 2005. Nocardia elegans sp. nov., a member of the Nocardia vaccinii clade isolated from sputum. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1505–1509.

Yassin A.F., Rainey F.A., Burgevlrdt J., Gierth D., Ungerechts J., Lux I., Seifert P., Bal C. and Schaal K.P. 1997. Description of Nocardiopsis synnematafomans sp. nov., elevation of Nocardiopsis alba subsp. prasina to Nocardiopsis prasina comb. nov., and designation of Nocardiopsis antarctica and Nocardiopsis alborubida as later subjective synonyms of Nocardiopsis dassonvillei. Int. J. Syst. Bacteriol. 47(4): 983–988. Yassin A.F., Rainey F.A., Mendrock U., Brzezinka H. and Schaal K.P. 2000. Nocardia abscessus sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1487–1493.

Yassin A.F., Spröer C., Hupfer H., Siering C. and Klenk H.-P. 2009. Nocardiopsis potens sp. nov., isolated from household waste. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2729–2733.

Yassin A.F., Spröer C., Siering C. and Klenk H.-P. 2010. Actinomadura sputi sp. nov., isolated from the sputum of a patient with pulmonary infection. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 149–153.

Zait H., Madani K., Abed-Benamara M., Achir I. et Hamrioui B. 2008. Les mycétomes en Algérie. À propos de deux nouveaux cas. Revue des cas rapportés de 1995 à 2005. J. Mycol. Méd. 18: 116-122.

Zaitlin B., Watson S.B., Ridal J., Satchwill T. and Parkinson D. 2003. Actinomycetes in lake Ontario: habitats and geosmin and MIB production. Peer-Review J. 95(2): 113–118.

Zenova G.M. and Zvyagintsev D.G. 2002. Actinomycetes of the genus Micromonospora in meadow ecosystems. Microbiol. 71(5): 570–574.

Zhang L., Xi L., Ruan J. and Huang Y. 2012. Micromonospora yangpuensis sp. nov., isolated from a sponge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 272–278.

Zhao X.-Q., Li W.-J., Jiao W.-C., Li Y., Yuan W.-J., Zhang Y.-Q., Klenk H.-P., Suh J.-W. and Bai F.-W.2009. Streptomyces xinghaiensis sp. nov., isolated from marine sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2870–2874.

Zhu H.-H., Guo J., Yao Q., Yang S.-Z., Deng M.-R., Phuong L.T.B., Hanh V.T. and Ryan M.J. 2007. Streptomyces vietnamensis sp. nov., a Streptomycete with violet–blue diffusible pigment isolated from soil in Vietnam.Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 57: 1770–1774. Zitouni A., Boudjella H., Lamari L., Badji B., Mathieu F., Lebrihi A. and Sabaou N. 2005. Nocardiopsis and Saccharothrix genera in saharan soils in Algeria: Isolation, biological activities and partial characterization of antibiotics. Res. Microbiol.156: 984–993. Zitouni A., Boudjella H., Mathieu F., Sabaou N. and Lebrihi A. 2004. Mutactimycin PR, a new anthracycline antibiotic from Saccharothrix sp. SA 103 I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological activities. J. Antibiot. 57 (6): 367–372. Zitouni A., Lamari L., Boudjella H., Badji B., Sabaou N. Gaouar A., Mathieu F., Lebrihi A. and Labeda D.P. 2004. Saccharothrix algeriensis sp. nov., isolated from Saharan soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1377–1381.

Abstract This work is an approach pioneer making evident and analyzing the aerobic actinomycetes linked to the infectious diseases in Constantine region in the perspective to establish routine analyses to the level of the laboratories of microbiology hospitable centers. From 479 hospitalized patients, 609 clinical specimens have been collected during a period of three years (from 2005 to 2007). The isolated sites are, in most cases, pulmonary or gastric. So, 49 isolates of actinomycetes has been gotten from 31 patients, of which two isolates are obtained from pleural liquid and two others from pus of abscess in deep sites. The sex of the patients doesn't have an influence on the actinomycetes prevalence rate, and they are more frequent in adults of less than 50 years. The signs of the infection are not specific and they spread over long period, them evoking to a suspicion of tuberculosis, pneumonia or abscess. These patients are in majority immunocompromised. Microscopic direct examination of the specimens is often negative. The non selective culture media supplemented with antimicrobial agents are more favorable for the isolation. The polyphasic identification of isolates revealed on the one hand, that twelve belong to seven rarely isolated genera and species in clinical and natural environments, these isolates are brought closer to the species: Nonomuraea roseola, Kribbella sp. (probably a new species), Micromonospora aurantiaca, Saccharotrix longispora, Nocardiopsis synnemataformans, Actinomadura bangladeshensis and Nocardia asteroïdes, and on the other hand, thirty seven isolates belongs to the Streptomyces genera, among which thirty three are brought closer to the species: S. lienomycini, S. rubrogriseus, S. flavogriseus, S. fimicarius, S. griseoplanus, S. carpaticus, S. mutabilis, S. coeruleorubidus, S. pseudogriseolus, S. exfoliatus, S. sampsonii and S. cinereoruber ssp. cinereoruber. Four are probably of new species of this genus. The antibiotic susceptibility tests of the isolates complete identification and help recommended the adequate treatment. The Nocardia, Actinomadura and Nocardiopsis species are probably pathogenic agents. However, Nonomuraea, Kribbella, Micromonospora and Saccharothrix are underestimated in clinical practice. Streptomyces cinereoruber ssp. Cinereoruber and S. mutabilis detected in deep sites are suspected to have a pathogenic power, the other isolates of the Streptomyces genus is more probably that are simple colonizers. The all 49 clinical isolates of aerobic actinomycetes present antimicrobial activity.

Key words: aerobic actinomycetes, clinic, taxonomy, pathogenicity

اﻟﻤﻠﺨﺺ ا

ªﺬا اﻟﻌﻤﻞ ﻋﺒﺎرة ﻋﻦ دراﺳﺔ أوﻟﻰ ﺗ ﺪف إﻟﻰ إظ ﺎر و ﺗﺤﻠ ﻞ ﺑﻜﺘ ﺮ ﺎ اﻷﻛﺘ ﻨﻮﻣ ﺴﺎت اﻟ ﻮاﺋ ﺔ اﻟﻤﺮﺗﺒﻄﺔ ﺑﺎﻷﻣﺮاض اﻟﻤﻌﺪ ﺔ ﻓﻲ ﻻﺳﺘﺸﻔﺎﺋﺔﻣﻨﻄﻘﺔ ﻗﺴﻨﻄ ﻨﺔ ،ﻛﻤﺎ ﺗﺴﻌﻰ إﻟﻰ وﺿﻊ طﺮق ﺗﺤﺎﻟ ﻞ روﺗ ﻨ ﺔ ﻋﻠﻰ ﻣﺴﺘﻮى ﻣﺨﺎﺑﺮ اﻷﺣ ﺎء اﻟﺪﻗ ﻘﺔ ﻓﻲ اﻟﻤﺮاﻛﺰ ا .

ﻟﻘﺪ ﺗﻢ ﺟﻤﻊ 609 ﻜﺔﻋ ﻨﺔ إﻛﻠ ﻨ ﺗﻢ اﺳﺘﺨﺮاﺟ ﺎ ﻣﻦ 479 ﻣﺮ ﺾ ﻛﺎﺋﻦ ﺑﺎﻟﻤﺴﺘﺸﻔﻰ ﻋﻠﻰ ﻣﺪى 3 ﺳﻨﻮات (ﻣﻦ ﺳﻨﺔ 2005 إﻟﻰ إ ﺳﻨﺔ ).2007 ).2007

ﻣﻮﻗﻊ اﻟﻌﺰل ﻓﻲ اﻏﻠﺐ اﻟﺤﺎﻻت اﻟﺠ ﺎز اﻟﺘﻨﻔﺴﻲ و اﻟﺠ ﺎز اﻟ ﻀﻤﻲ و ﻣﻨ ﺗﻢ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﻰ 49 ﻋﺰﻟﺔ 31أﻛﺘ ﻨﻮﻣ ﺴﺎت ﻣﻦ 31أ ﻣﺮﺑﺾ اناﺛﻨﺎن ﻣﻨ ﺎ اﺳﺘﺨﺮﺟﺖ ﻣﻦ اﻟﺴﺎﺋﻞ اﻟﺮﺋﻮي و اﺛﻨﺎن آﺧﺮ ﻣﻦ ﺳﺎﺋﻞ اﻧﺘﻔﺎخ ﺟﺮﺛﻮﻣﻲ ﻋﻠﻰ ﻣﺴﺘﻮى ﻣﻮاطﻦ ﺑﺎطﻨ ﺔ . .

أظ ﺮت أناﻟﺪراﺳﺔ ﺮﺎﺟﻨﺲ اﻟﻤﺮ ﺾ ﻟ ﺲ ﻟ ﺗﺄﺛ ﺮ ﻋﻠﻰ ﻋﺪد اﻷﻛﺘ ﻨﻮﻣ ﺴﺎت ﻟﻜﻦ ªﺬه اﻟﺒﻜﺘ ﺗﻈ ﺮ أﻛﺜﺮ ﻋﻨﺪ اﻟﺒﺎﻟﻐ ﻦ ﺑﻌﻤﺮ ا 50أﻗﻞ ﻣﻦ ﺳﻨﺔ . ﻣﻈﺎªﺮ اﻟﻌﺪوى ﻟ ﺴﺖ ﺧﺎﺻﺔ و ﺗﻤﺘﺪ ﻟﻔﺘﺮة طﻮ ﻠﺔ، ،و ªﻲ ﺗﺸﺒ ﺗﻠﻚ اﻟﻤﺸﺎªﺪة ﻋﻨﺪ أﻣﺮاض اﻟﺮﺋﺘ ﻦ أواﻟﺴﻞ أوا .اﻻﻧﺘﻔﺎخ اﻟﺠﺮﺛﻮﻣﻲ ﻓ ﻢ ﺗﻢ ﻣﻼﺣﻈﺔ أن اﻏﻠﺐ اﻟﻤﺮﺿﻰ ﺿﻌﺎف اﻟﻤﻨﺎﻋﺔ . .

ناﻟﻤﻼﺣﻈﺔ اﻟﻤﺠ ﺮ ﺔ اﻟﻤﺒﺎﺷﺮة ﻟﻠﻌ ﻨﺎت ﺳﺎﻟﺒﺔ ﻓﻲ اﻏﻠﺐ اﻷﺣ ﺎ طو اﺳﺘﻌﻤﺎل أوﺳﺎ اﻟﻨﻤﻮ ﻏ ﺮ اﻧﺘﻘﺎﺋ ﺔ ﻣﻀﺎف إﻟ ﺎ ﻣﻀﺎدات ﺣ ﻮ ﺔ ﺳﺎﻋﺪ ﻛﺜ ﺮا ﻓﻲ اﻟﻌﺰل . .

ﻣﻦ ﺟ ﺔ أﺧﺮى ﻓﺈن اﻟﺘﻌﺮف ﻋﻠﻰ اﻟﻌﺰﻻت اظ ﺮ أن 12 ﻟﻰﻣﻨ ﺎ ﺗﻨﺘﻤﻲ إ 7 سأﺟﻨﺎ و ﺳﻼﻻت ﻧﺎدرة ﻓﻲ اﻟﻮﺳﻂ اﻹﻛﻠ ﻨ ﻜﻲ أو أو ا .اﻟﻄﺒ ﻌﻲ ﻟﻰﻗﺮﺑﺖ ªﺬه اﻟﻌﺰﻻت إ اﻟﺴﻼﻻت : (Kribbella sp ﻣﻦ اﻟﻤﺤﺘﻤﻞ أن ﺗﻜﻮن ﺳﻼﻟﺔ ﺟﺪ ﺪة ,) Nonomuraea ,) roseola, Micromonospora aurantiaca, Saccharothrix longispora, Nocardiopsis . synnemataformans, Actinomadura bangladeshensis, Nocardia asteroides.

ىو ﻣﻦ ﺟ ﺔ أﺧﺮ ﻓﺎن 37 ﻟﻰﻋﺰﻟﺔ ﺗﻨﺘﻤﻲ إ ﺟﻨﺲ Streptomyces وﻣﻦ ﺑ ﻨ ﻢ 33 ﻟﻰﻋﺰﻟﺔ ﻗﺮﺑﺖ إ :اﻟﺴﻼﻻت :ا

S. lienomycini, S. rubrogriseus, S. flavogriseus, S. fimicarius, S. griseoplanus, S. carpaticus, S. mutabilis, S. coeruleorubidus, S. pseudogriseolus, S. exfoliatus, S. sampsounii, S. cinereoruber ssp. cinereoruber.

أرﺑﻊ ﻋﺰﻻت ﻣﻦ اﻟﻤﺤﺘﻤﻞ أن ﺗﻜﻮن ﺳﻼﻻت ﺟﺪ ﺪة.

إن ﺣﺴﺎﺳ ﺔ ªﺬه اﻟﻌﺰﻻت ﻟﻠﻤﻀﺎدات اﻟﺤ ﻮ ﺔ ﻜﻤﻞ اﻟﺘﻌﺮ ﻒ ﺑﺎﻟﺴﻼﻻت .و ﺴﺎﻋﺪ ﻋﻠﻰ وﺿﻊ اﻟﺪواء اﻟﻤﻨﺎﺳﺐ ﻟﻠﺤﺎﻟﺔ .و

اﻟﺴﻼﻻت اﻟﻤﻨﺘﻤ ﺔ ﻏﺎﻟﻰ اﻷﺟﻨﺎس : Nocardiopsis، Actinomadura، Nocardia ﻣﻦ اﻟﻤﺤﺘﻤﻞ ﺗﻜﻮن ﻋﻮاﻣﻞ ﻣﻤﺮﺿﺔ، ﻓ ﻤﺎ أن Saccharothrix، Micromonospora، Kribbella، Nonomuraea ﻏ ﺮ ﻣﻌﺮوﻓ ﻦ ﻓﻲ اﻟﻜﻠ ﻨ ﻚ اﻟﺘﻄﺒ ﻘﻲ . .

:اﻟﺴﻼﻻت Streptomyces cinereoruber ssp. cinereoruber و Streptomyces mutabilis اﻟﺘﻲ وﺟﺪت ﻓﻲ ﻣﻨﺎطﻖ ﺑﺎطﻨ ﺔ ﻣﻦ اﻟﻤﺤﺘﻤﻞ أن ﺗﻜﻮن ذات ﻗﺪرة ﻣﻤﺮﺿﺔ . ىاﻟﻌﺰﻻت اﻷﺧﺮ أﻛﺜﺮ أناﺣﺘﻤﺎل ﺗﻜﻮن ﻣﺠﺮد ﻣﺴﺘﻌﻤﺮات . .

و ﻓﻲ اﻷﺧ ﺮ ﺠﺪر اﻹﺷﺎرة أن ﻛﻞ ﻋﺰﻻت اﻷﻛﺘ ﻨﻮﻣ ﺴﺎت اﻟ ﻮاﺋ ﺔ 49( ) ﻟ ﺎ اﻟﻘﺪرة ﻋﻠﻰ إﻧﺘﺎج ﻣﻀﺎدات ﺣ ﻮ ﺔ . .

اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣ ﺔ ،: أﻛﺘ ﻨﻮﻣ ﺴﺎت ªﻮاﺋ ﺔ ﻛﻠ ﻨ ﻚ، اﻟﺘﻌﺮف ﻋﻠﻰ اﻟﺒﻜﺘ ﺮ ﺎ، اﻟﻘﺪرة اﻟﻤﻤﺮﺿﺔ ا

Annexe 1. Fiche de renseignements des malades

Annexe 2. Techniques de colorations 1. Coloration de Gram (Gerhardt et al., 1994) Solutions -solution de crystal violet: crystal violet (10 mg); oxalate d’ammonium (4 mg); éthanol à 20 % (500 ml) -solution d’iodine: iodine (1,25 mg); iodure de potassium (2,50 mg); éthanol à 95 % (156,20 ml) -solution de safranine: safranine (4 g); alcool à 95 % (500 ml) Technique -mettre une goutte d’eau distillée stérile sur une lame; -mette une portion de colonie âgée de 24 heures avec la goutte d’eau, bien écrasé et faire un frottis mince, laisser sécher à l’air ambiant; -fixer avec la chaleur du bec bunsen; -appliquer la solution de cristal violet (1 - 2 mn); -laver avec l’eau distillée; -inonder avec la solution d’iodine (1 mn); -laver avec l’eau distillée; -tremper dans l’éthanol à 95 % jusqu’à la disparition de l’excès de couleur; -colorer avec la solution de safranine (30 s); -laver avec l’eau distillée; -sécher à l’air, observer au microscope optique grossissement x 100. 2. Coloration de Ziehl-Neelsen (Gordon et Smith, 1984) Solutions -solution de fuschine: fuschine basique saturée d’alcool (10 ml) + solution aqueuse de phénol à 5 % (90 ml) -solution d’acide-alcool: 3 ml HCl concentré + 97 ml alcool à 95 % -solution de bleu de méthylène: 30 ml solution de bleu de méthylène saturé d’alcool + 100 ml solution aqueuse de KOH à 0,01 % Technique -préparer le frottis sur lame et la sécher à l’air; -immerger la le frottis dans la solution de fuschine; -chauffer jusqu’à ébullition (5 mn), refroidir puis laver avec l’eau de robinet; -immerger dans le mélange acide alcool, laver la lame; -contre coloration au bleu de méthylène.

Annexe 3. Composition des milieux de culture Milieu Composants Quantités/ Préparation/Stérilisation litre Bennett-Agar Extrait de bœuf 1 g -pH 7,2 Glucose 10 g -stérilisation 20 mn à 121°C Extrait de levure 1 g N-Z Amine 2 g Agar 2 g

Sabouraud- Peptone de viande 5 g -pH 7 Dextrose-Agar Peptone de caséine 5 g Glucose 40 g

Bouillon Carbone- NaNO3 29 g -pH 7,2 Free K2HPO4 0,19 g MgSO4. 7H2O 0,5 g FeC13 10 mg MnC12. 4H2O 8 mg ZnSO4 2 mg

Paraffine-Agar Pastilles de paraffine (solide à 60-62 -liquéfier la paraffine et additionner °C) dans une proportion de 9 : 11 au bouillon Carbone-Free -agiter rigoureusement avant distribution dans les boites de pétri

ISP1 Tryptone 5g -pH 7,0 - 7,2 Extrait de levure 3g -stérilisation 20 mn à 120 °C

ISP 2 Extrait de levure 4 g -pH 7,3 Extrait de malt 10 g -stérilisation 20 mn à 121 °C Glucose 4 g Agar 15 g

ISP 3 Avoine 20 g -ébullition de l’avoine 20 mn; filtrer Solution d’oligo-éléments (annexe 4) 2,5 ml/l et rajouter la solution d’oligo- Agar 18 g élément et l’agar. -pH 7,2 -stérilisation 20 mn à 121 °C

ISP4 Amidon soluble 10 g -pH 7,0 - 7,4 K2HPO4 1 g -stérilisation 20 mn à 121°C MgSO4. 7H2O 1 g NaCl 1 g (NH4)2 SO4 2 g CaCO3 2 g Solution d’oligo-éléments (annexe4) 1 ml Agar 20g

ISP 5 L-asparagine 1 g -pH 7,0 – 7,4 Glycérol 10 g -stérilisation 20 mn à 121°C K2HPO4 1 g Solution d’oligo-éléments (annexe 4) 1 ml/l Agar 20 g

Suite de l’annexe 3 Milieu Composants Quantités/ Préparation/Stérilisation litre

ISP7 Glycérol 15 g -pH 7,2 – 7,4 L-tyrosine 0,5 g -stérilisation 20 mn à 121 °C L-asparagine 1 g K2HPO4 0,5 g NaCl 0,5 g FeSO4. 7H2O 0,01 g Solution d’oligo-éléments (annexe 4) 1 ml/l Agar 20g

ISP9 (NH4)2SO4 2,64 g -pH 6,8 – 7,0 KH2PO4 2,38 g -stérilisation 20 mn à 121°C K2HPO4 5,65 g -préparer 900 ml du milieu, stérilisé MgSO4. 7H2O 1 g puis ajouter 100 de la solution des Agar 15 g substrats carbonés à 10 %, stériliser Solution d’oligo-éléments (annexe 4) 1 ml/l par filtration

Tolérance du Peptone de caséine 10 g -pH 7,0 chlorure de Extrait de levure 5 g -stérilisation 20 mn à 121 °C sodium Agar 20 g Hydrolyse de la Gélatine 4 g -pH 7,0 gélatine Peptone 5 g -la gélatine doit être trempée dans Extrait de bœuf 3 g 40 ml d’eau froide avant de la Agar 15 g mélanger avec le milieu gélosé

Hydrolyse de Amidon 40 g -pH 7,0 l’amidon Peptone 5 g -l’amidon est suspendu dans 40 ml Extrait de bœuf 3 g d’eau froide avant de le mélanger Agar 15 g avec le milieu gélosé

Hydrolyse de Hydrolysat enzymatique de gélatine 1 g -pH 6,8 l’urée Glucose 1 g -stérilisation 15 mn à 121°C NaCl 5 g KH2PO4 2 g Urée 20 g Rouge de phénol 0.012g Agar 15 g

Réduction des Peptone 5 g -pH 7,0 nitrates Extrait de bœuf 3 g KNO3 1 g

Hydrolyse de la caséine Solution 1: Lait écrémé 10 g -stériliser séparément puis mélanger Eau distillée 100 ml les deux solutions Solution 2: Agar 2 g Eau distillée 100 ml

Nutrient-Agar Peptone 5 g -pH 7,0 Extrait de bœuf 3 g Agar 15 g

Suite de l’annexe 3 Milieu Composants Quantités/ Préparation/Stérilisation litre Hydrolyse de Tyrosine 0,5 g -préparer des suspensions dans tyrosine, xanthine Xantine 0,4 g 10 ml d’eau distillée; stériliser 15 et hypoxanthine Hypoxantine 0,5 g min à 115 °C pour la xanthine et hypoxanthine et à 121 °C pour la tyrosine, puis mélanger avec 100 ml du milieu Nutrient-Agar

Gélose au sang de Extrait de viande 10 g -pH 7,3 mouton Peptone 10 g -stérilisation 15 mn à 121°C Chlorure de sodium 5 g Agar 15 g

Muelleur-Hinton Extrait de levure 2 g -pH 7,4 Hydrolysat acide de caséine 17,5 g -stérilisation 15 mn à 115°C Amidon 1,5 g -ajouter de 5 à 10 % de sang Agar 10 g défibriné

Citrate de Citrate de sodium 1 g -pH 7,1 Simmons Sulfate de magnésium 0,2 g Hydrogenophosphate de potassium 1 g Dihydrogénophosphate d’ammonium 1 g Chlorure de sodium 5 g Bleu de bromothymol 0,08g Agar 15 g

Milieu de Sierra Peptone 10 g -pH à 7,4 10 g NaCl 5 g 20 g CaCl2. H2O 0,1g 5 g Tween 80 10 ml 0,1 g Agar 20 g

Annexe 4. Solutions d’oligo-éléments et des tests biochimiques Test Composants Quantités

Hydrolyse de la gélatine HgCl2 15 g HCl concentré 20 ml Eau distillée 100 ml

Réduction des nitrates Acide sulfanilique 8 g Solution 1: Acide acétique (5 N) (acide acétique glacial, eau distillée) 1 : 2,5 Eau distillée 1000 ml Solution 2: Dimethyl-anaphthylamine 6 ml Acide acétique (5 N) 1000 ml

Solution d’oligo-éléments pour le FeSO4. 7 H2O 1 g milieu ISP5 MnCl2. 4 H2O 1 g ZnSO4.7 H2O 1 g Eau distillée 100 ml

Solution d’oligo-éléments pour FeSO4. 7H2O 1 g les milieux ISP4 et ISP7 ZnSO4. 7H2O 1 g MnCl2. 7 H2O 1 g

Solution d’oligo-éléments pour le CuSO4. 5 H2O 0,64 g milieu ISP9 FeSO4. 7H2O 0,11 g ZnSO4. 7H2O 0,15 g

MnCl2. 4 H2O 0,79 g

Solution de l’iodine pour le test Iodine 1 g hydrolyse de l’amidon Iodure de potassium (KI) 2 ml Eau distillée 100 ml

Solution rouge de crésol pour le Rouge de crésol 0,5 g test hydrolyse de l’urée (pH 6) Tampon phosphate (0,005M) 100 ml

Annexe 5. Tests de la galerie Api 20NE

Test Substrat Caractère Révélateur/ Résultat Résultat recherché méthode de - + lecture ONPG ONPG = Ortho-Nitro- β-galactosidase Lecture directe Transparent Jaune Phényl-Galactoside ADH Arginine Arginine Rouge de phénol Jaune Rouge LDC Lysine dihydrolase ODC Ornithine Lysine décarboxylase Ornithine décarboxylase CIT Citrate Utilisation du Bleu de Jaune Bleu citrate bromothymol

H2S Thiosulfate de sodium Production d’H2S Lecture directe transparent Noire URÉ Urée Uréase Rouge de Phénol Jaune Rouge ou rose TDA Tryptophane Tryptophane Chlorure de fer III Jaune Rouge désaminase IND Tryptophane Tryptophanase ou Réactif de Transparent Rouge ou production Kovacs ou jaune rose d’indole VP Pyruvate de sodium Production Réactifs VP 1 et Transparent Rouge ou d’acétoïne VP 2 rose (hydroxy-3- butanone

GEL Gélatine Gélatinase Lecture directe Transparent Noire GLU, MAN, Substrats carbonés Utilisation de Bleu de Bleu Jaune INO, SOR, substrats carbonés bromothymol RHA, SAC, (glucides) MEL, AMY et ARA

- NO2 / N2 Nitrates (NO3) Nitrate réductase Réactifs NIT 1 et Jaune Rouge NIT 2 et poudre de zinc GLU: glucose, MAN: mannitol, INO: inositol, SOR: sorbitol, rhamnose: RHA, SAC: saccharose, MEL: mélibiose, AMY: amygdaline, ARA: arabinose.

Annexe 6. Concentrations et diamètres critiques pour les diverses classes d’antibiotiques selon les recommandations de la société française de microbiologie (2008)

Antibiotique Charge du disque Concentrations critiques Diamètres critiques (mm) (mg/l) S R S R Céphalosporines: Céfoxitine 30 µg < 8 > 32 > 22 < 15 Ceftazidime 30 µg < 4 > 8 > 21 < 19 Céfotaxime 30 µg < 1 > 2 > 26 < 23 Pénicillines: Ampicilline 10 µg < 4 >16 > 19 < 14 Amoxicilline+ac. 20/10 µg < 4/2 >16/2 > 21 < 14 clavulanique Carbapénemes: Imipénème 10 µg < 2 > 8 > 24 < 17 Aminosides: Gentamicine 15 µg < 2 > 4 > 18 < 16 Amikacine 30 µg < 8 > 16 > 17 < 15 Nétilmicine 30 µg < 2 > 4 > 21 < 19 Macrolides: Erythromycine 15 UI < 1 > 4 > 22 < 17 Fuoroquinoles: Ciprofloxacine 5 µg < 0,5 > 1 > 25 < 22

Annexe 7. Préparation des gels

1. Gel d’agarose -préparer le tampon d’électrophorèse: Tris HCl, Acide acétique glacial et EDTA (TAE) à 0,5x; -gel d’agarose 0,5 g; -TEA (0,5x) 100 ml; -quantité suffisante de bromure d’éthydium; -fondre dans un micro-onde. Pour 25 ml de gel on met 6,5 µl bromure d’éthydium; pour 35 ml de gel on met 8 µl de bromure d’éthydium 2. Gel sephadex G 50 Charger la résine sèche Sephadex G-50 superfine dans les puits d’une plaque « MultiSceen 96-Well Plates, MAHV N45 50 » en utilisant le chargeur de colonne de 45 μl comme suit: -déposer la résine Sephadex G-50 dans chaque puits (45 μl) du chargeur de colonne; -retirer l’excès de résine avec la raclette; -placer la plaque « MultiScreen » à l’envers sur le chargeur jusqu’au butoir et retourner l’ensemble; -taper sur le chargeur pour évacuer la résine vers la plaque; -placer la plaque « MultiScreen » à l’envers sur le chargeur jusqu’au butoir et retourner l’ensemble; -taper sur le chargeur pour évacuer la résine vers la plaque; -placer la plaque « MultiScreen » à l’envers sur le chargeur jusqu’au butoir et retourner l’ensemble; -taper sur le chargeur pour évacuer la résine vers la plaque; -ajouter 300 µl d’eau ultra pure dans chaque puits contenant de la résine, fermer la plaque avec son couvercle et laisser incuber 3 heures à température ambiante; Une fois que les mini-colonnes sont gonflées dans la plaque « MultiScreen », elles peuvent être stockées à 4 °C entourées de parafilm pour limiter le dessèchement des colonnes. À l’utilisation, mettre le couvercle de la plaque qui a la même forme avec des puits, centrifuger 6 mn à 2600 trs/mn (Centrifugeuse Sigma 3K15, rotor Nr. 11222) pour éliminer l’eau et compacter les mini-colonnes.

Annexe 8 . Photographies représentatives des électrogrammes de l’ADNr 16S

-Extraction avec l’eau pure (n’a pas permi l’extraction de l’ADN de toutes les isolats)

-Extraction avec le KIT« MagNA Pure LC DNA isolation Kit III »

Annexe 9. Description des cas cliniques de prélèvements positifs à actinomycètes aérobies

Age Réside Débu Forme clinique Diagnostic Signes Facteurs Taux Prélèvem Prélèvem Traitement Isolats et nce t des au moment cliniques et favorisants de ents ents au moment d’actinomy sexe signe des pathologies GB(1 effectués/ positifs des cètes s prélèveme associées 03) date prélèveme nts nts 47/F Cne 9moi Cutano-muqueuse Fièvre au Aphtose Corticothé 5,5 C, FG FG NP/décédé FG.P.03 s long cours bucale, rapie 6 01/02/20 e polyartralg mois 05 ie 53/ Cne 1 Cutanée Abcès de Fièvre, Corticothé NE P P NP/décédé P.P.21a M semai la cheville polyarthrit rapie 22/02/20 P.P.21b ne gauche e 05 P.B.21 rhumatoïde 19/F KH 10 Cutanée Abcès Toux Aucun 9,9 C, FG, P FG Antituberc FG.B.22 mois multiple sèches, 22/02/20 P uleux P.P.22 d’origine adénopathi 05 TBC e cervicale probable droite, multiples abcès à la partie thoracique supérieure d’une grosse collection pariétale douloureus e à la palpitation 18/F Cne 3moi Cérébrale, TBC Fièvre, Corticothé 9 C, FG C Antituberc C.P.31 intestinale neuro- frissons, rapie à 13/03/20 FG uleux FG.B.31 s méningée, sueurs, forte dose 05 Flagyl amibiase anorexie, (1semaine) intestinale asthénie, amaigrisse ment 56 / Cne 2moi Pulmonaire Fièvre au Fièvre Aucun 7,4 C, FG C NP C.P.38 F long cours vespérale, 20/03/20 s sueurs 05 nocturnes, douleurs thoraciques 45/ DJ 1moi Pulmonaire Fièvre au Fièvre non Aucun NE C, FG FG NP FG.P.40 M long cours chiffrée, 20/03/20 s toux sèches 05

35/ B 2 Disséminée/mése TBC Fièvre au Aucun NE C, FG C Antituberc C.S.42 M ntérique ganglionna long court, 01/06/20 uleux mois ire amaigrisse 05 mésentériq ment, ue sueurs nocturnes 28/ KH 7 Disséminée/osseu Spondylodi Fièvre, Aucun 8,5 C, FG C Antituberc C.P.44 M mois se scite asthénie, 23/03/20 FG uleux FG.P.44 d’origine amaigrisse 05 FG.B.44 TBC ment, probable sueurs, tassement D8-D9 19/ Cne 3moi Septicémique/diss TBC Hématurie Aucun 10 C, FG C Antituberc C.B.46 M s éminée rénale macroscopi 29/03/20 FG uleux C.S.46 probable que 05 FG.S.46

Suite de l’annexe 9

Age Résiden Débu Forme clinique Diagnostiqu Signes Antécédents Taux Prélèvemen Prélèvemen Traitement au Isolats et ce t des e cliniques et de ts ts positifs moment des d’actinomycèt sexe signe au moment pathologies GB(10 effectués/da prélèvements es s des associées 3) te prélèvement s 20/F DJ 1 Pulmonaire Fièvre au Fièvre, toux Aucun 20 C, FG C Céfotaxime C.S.51 mois long cours grasses, 11/04/2005 Gentamicine asthénie, anorexie, amaigrisseme nt, arthromyalgie 35/F Cne 1 Disséminée/ Pyélonéphri Fièvre non Aucun 11 C, FG, U C Céfazoline C.S.52 mois urinaire te aigue chiffrée 11/05/2005 Gentamicine 26/F Cne 2 Disséminée/urinai Pyonéphros Fièvre non Aucun 9 C, FG, U C Cefotaxime, C.P.57 re e gauche sur chiffrée, 17/04/2005 Gentamicine, mois lithiase douleurs Flagyl abdominales, érythème noueux au niveau des jambes 52/M Cne 1 Cardiaque Fièvre au Fièvre non Aucun 9,8 C, FG FG NP FG.P.63 mois long cours chiffrée, 20/04/2005 souffle systolique, foyer mitral (3/6) 17/F Cne 1 Disséminée Abcès Fièvre Aucun 7,6 C, FG, P C Céfazoline, C.S.66a mois mésentériqu prolongée, 29/03/2005 P Gentamicine C.S.66b e toux sèches, FG.B.66 amaigrisseme P.P.66 nt, asthénie 24/M M 1 Pulmonaire Pneumopath Fièvre au Aucun 9 C, FG FG NP FG.P.68 ie atypique long court, 24/04/2005 mois toux productives, sueurs nocturnes 24/F Cne 3 Pulmonaire Pneumopath Fièvre, Histoire NE C, FG C Vibramycine, C.S.118 mois ie bilatérale frissons, d’adénopath 08/10/2005 FG Corticothérapi FG.S.118 d’origine sueurs, ie cervicale e allergique dyspnée, douleurs thoraciques, éruption papuleuse généralisée avec œdème diffus 20/F M 1 Disséminée/cérébr Méningo- Fièvre non TBC NE C, FG, FG Antitubercule FG.B.151 mois ale encéphalite chiffrée, pulmonaire LCR ux/ DCD fébrile vomissements chez le père 26/11/2005 d’origine , céphalées, et TBC paralysie péritonéale probable motrice des chez la deux mère membres inférieurs, globe vésical 23/F Cne 6 Pulmonaire/ Septicémie Fièvre non Mari décédé NE C, FG C Ampicilline C.S.194 mois disséminée à porte chiffrée, par TBC 22/01/2006 d’entrée frissons, toux pulmonaire sèches, HTA, cardiopathie

Suite de l’annexe 9

Age Résiden Débu Forme clinique Diagnostique Signes Facteurs Taux Prélèvemen Prélèvemen Traitement au Isolats et ce t des au moment cliniques et favorisan de ts ts positifs moment des d’actinomycèt sexe signe des pathologies ts GB(10 effectués/ prélèvements es s prélèvements associées 3) date 40/F Cne 3 Disséminée/cérébr Adénopathie Fièvre au long Aucun NE C, FG, U, C NP C.B.239 mois ale mésentérique court, LCR U U.B.239 d’origine TBC amaigrissement 08/03/2006 probable, , ptosis TBC cérébrale 70/F M 1 Disséminée Spondylodisci Fièvre, Opérée 7,8 C, FG, P, U P NP P.B.225 mois te dorsale asthénie, deux fois 01/04/2006 et (D10, D11, douleurs d’un demi D12), abcès rachidiennes, kyste paravertébrale HTA hydatiqu droit, discite e, opérée lombaire L4- d’un L5 (abcès du kyste au psoas droit) niveau de l’épaule 42/F Cne 7 Cutanée/ TBC Toux sèches, Aucun 7,6 C, FG, P, FG Antitubercule FG.S.262 mois abdominale ganglionnaire dyspnée A, LP P ux P.S.262 caséo- anorexie, 04/04/2006 Corticothérap folliculaire, frissons, sueurs, ie ascites de pleurésie grande discrète, ascites abondance de grande d’origine TBC abondance 82/F Cne 3 Disséminée/ Septicémie a Fièvre, Aucun NE C, FG C Céfotaxime, C.S.348 mois cérébrale porte d’entré dyspnée, 26/06/2006 FG Gentamicine/ FG.S.348 digestive avec asthénie, DCD localisation amaigrissement neuro- , anorexie méningée 45/F Cne Disséminée Syndrome Fièvre, raideurs Aucun NE C, FG, C NP C.B.356 d’hypertensio méningée, LCR FG FG.B.356 n vomissements, 16/10/2006 intrarachidien photophobie, ne fébrile épilepsie, diabète insulinodépend ant 40/F Cne 8 ans Pulmonaire Pleurésie Fièvre non Traitée NE C, FG, LP LP Antitubercule LP.B.373 persistante chiffrée, toux de TBC 10/11/2006 ux d’origine TBC sèches, depuis 8 Corticothérap probable asthénie, ans ie anorexie, amaigrissement dyspnée, épanchement liquidien de grande abondance, pathologie cardiaque 46/M Cne 1moi Disséminée/ Décompensati Œdème des Cirrhose 5,8 C, FG, A C NP C.B.392 s abdominale on ascitiques membres 03/12/2006 FG FG.S.392 d’une cirrhose inférieurs, post hépatite ascites, B cytolyse hépatique

Suite de l’annexe 9

Age Réside Déb Forme clinique Diagnosti Signes Facteurs Taux Prélèvem Prélèvem Traitement Isolats et nce ut que cliniques et favorisants de ents ents au moment d’actinomy sexe des au pathologies GB(1 effectués/ positifs des cètes sign moment associées 03) date prélèvemen es des ts prélèveme nts 32/F T 1 Disséminée/ Méningo- Fièvre, Aucun NE C, FG FG Antitubercu FG.B.435 moi cérébrale encéphalit céphalées, 03/03/200 leux s e agitation 7 Ampicilline d’origine TBC probable 63/ Cne 1 Pulmonaire Pneumopa Toux Aucun NE C, FG, U U Amoxicilin U.B.458 M thie sèches, 07/03/200 e, moi pneumopath 7 Ciprofloxac ie droite, ine s syndrome d’hypertensi on portale 55/F Cne 3 Cutanée Zona Eruption Aucun 8 C, P, FG, P Aciclovire P.S.461 moi ophtalmiq papuleux LCR FG Céfazoline FG.S.461 s ue vésiculeux 07/03/200 surinfecté avec pus du 7 e territoire frontale gauche 39/F Cne 7 Intestinale TBC Fièvre non Aucun NE C, FG C Antitubercu C.B.464 gastro- chiffrée, 15/04/200 leux moi colique asthénie, 7 amaigrisse s ment, diarrhée chronique, appendicect omie 24/F Cne 6 Pulmonaire, Polysérite Fièvre au Corticothér NE C, FG, A, C Antitubercu C.S.466 abdominale d’origine long court, apie LP leux moi TBC ascite, 02/10/200 Corticothér pleurésie 7 apie s gauche

24/F M 12 Pulmonaire/dissé Pneumopa Fièvre, toux Aucun 9,5 C, FG, LP Antitubercu LP.P.473 moi minée thie avec productrices LP, A, U leux s TBC , douleurs 04/04/200 Corticothér ganglionn thoraciques 7 apie aire dyspnée, épanchemen t pleural, cyanoses des lèvres et des extrémités F: féminin, M: masculin, Cne: Constantine, DJ: Djijel, KH: Khenchela, M: Mila, T: Tébessa, B: Batna, TBC: tuberculose, NP: non prescrit, NE: non effectué, C: crachat, FG: fluide gastrique, P: pus, LP: liquide pleural, LCR : liquide céphalorachidien, A: ascite, U: urines, DCD: décédé, HTA: hypertension artérielle Antituberculeux: Rifampicine + Isoniazide + Pyrazinamide + Ethambutol Code des isolats: abréviation du prélèvement + abréviation du milieu d’isolement + numéro du patient + (a, b: souches isolées du même prélèvement sur le même milieu) Milieux de culture: S: Sabouraud-Dextrose-Agar, B: Bennett’S-Agar, P: Paraffine-Agar

Résumé

Ce travail est une approche pionnière mettant en évidence et analysant les actinomycètes aérobies liés aux maladies infectieuses dans la région de Constantine dans la perspective d’établir des analyses de routine au niveau des laboratoires de microbiologie des centres hospitaliers. À partir de 479 patients hospitalisés, 609 prélèvements cliniques ont été récoltés durant une période de trois ans (entre 2005 et 2007). Les sites d’isolements sont, dans la plupart des cas, pulmonaire ou gastrique. Ainsi, 49 isolats d’actinomycètes ont été obtenus à partir de 31 malades dont deux isolats proviennent de liquide pleural et deux autres de pus d’abcès à partir de sites profonds. Le sexe des patients n’a pas une influence sur la prévalence des actinomycètes, et ils sont plus fréquents chez les adultes de moins de 50 ans. Les signes de l’infection ne sont pas spécifiques et ils s’étendent durent une longue période, ils évoquant à une suspicion d’une tuberculose, d’une pneumopathie ou d’un abcès. Ces malades sont en majorité immunodéprimés. L’examen microscopique direct des prélèvements est souvent négatif. Les milieux de culture non sélectifs additionnés d’agents antimicrobiens sont plus favorables pour l’isolement. L’identification polyphasique des isolats a révélée d’une part, que douze appartiennent à sept genres et espèces rarement isolées de prélèvements cliniques et des environnements naturels, ces isolats sont rapprochés aux espèces: Nonomuraea roseola, Kribbella sp. (probablement une nouvelle espèce), Micromonospora aurantiaca, Saccharotrix longispora, Nocardiopsis synnemataformans, Actinomadura bangladeshensis et Nocardia asteroïdes, et d’autre part, trente sept isolats appartiennent au genre Streptomyces, parmi lesquels trente trois sont rapprochés aux espèces: S. lienomycini, S. rubrogriseus, S. flavogriseus, S. fimicarius, S. griseoplanus, S. carpaticus, S. mutabilis, S. coeruleorubidus, S. pseudogriseolus, S. exfoliatus, S. sampsonii et S. cinereoruber ssp. cinereoruber. Quatre sont probablement de nouvelles espèces de ce genre. L’antibiogramme effectué des isolats complète l’identification et aide a préconisé le traitement adéquat. Les espèces appartenant aux genres Nocardia, Actinomadura et Nocardiopsis sont probablement des agents pathogènes. Cependant, Nonomuraea, Kribbella, Micromonospora et Saccharothrix sont méconnues en clinique pratique. Streptomyces cinereoruber ssp. cinereoruber et S. mutabilis, détectés dans des sites profonds, sont suspectées d’avoir un pouvoir pathogène, les autres isolats du genre Streptomyces sont plus probablement de simples colonisateurs. Les 49 isolats cliniques d’actinomycètes aérobies présentent tous une activité antimicrobienne.

Mots clés: actinomycètes aérobies, clinique, taxonomie, pathogénie

Membres du jury : Président : Mr M.A. Hamidechi Professeur U. Constantine 1 Directeur de thèse : Mr A. Boulahrouf Professeur U. Constantine 1 Examinateurs : Mr M. Houhamdi Professeur U. 08 Mai 1945 Guelma M r Z. Branes Professeur U. Badji Mokhtar Annaba Mr R. Arhab Maître de conférences A U. Larbi Benm'hidi Oum El Bouaghi