Estudo Histológico E Molecular Dos Efeitos Da Exposição Ao Material Particulado Inalável Fino Da Cidade De São Paulo Nos Testículos De Camundongos
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CATARINA GOMES CANI Estudo histológico e molecular dos efeitos da exposição ao material particulado inalável fino da cidade de São Paulo nos testículos de camundongos Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências Programa de Endocrinologia Orientadora: Profa. Dra. Elaine Maria Frade Costa Versão corrigida São Paulo 2017 iii Dedicatória À minha família. Aos que se interessam pelos impactos dos poluentes na saúde e no meio ambiente. iv Agradecimentos Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. À Drª Elaine Costa, pela orientação. À Disciplina de Endocrinologia da Faculdade de Medicina da USP, à colega de pós-graduação Isabela Pacetti pela ajuda com as extrações e, especialmente, à Drª Éricka Trarbach por todo apoio nas análises de expressão e revisões de texto. À Disciplina de Patologia da Faculdade de Medicina da USP. Ao Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental. A todos os pós-graduandos e alunos de iniciação científica que participaram dos cuidados aos animais, das exposições e das coletas. À colega de pós-graduação Marlise Di Domenico pela ajuda com os dados compartilhados, com os blocos, com as lâminas, com as colorações, com as discussões sobre os temas. Especialmente, à Drª Mariana Veras por toda ajuda. Ao Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, onde foram realizados os preparos das lâminas. Ao Laboratório de Genômica Funcional do Centro de Investigação Translacional em Oncologia do Instituto do Câncer de São Paulo Octavio Frias de Oliveira (ICESP), onde foram realizadas as leituras das análises de expressão gênica. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro. v Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011. Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus. vi SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ix LISTA DE TABELAS xii LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS xiv RESUMO xx ABSTRACT xxi 1. INTRODUÇÃO ____________________________________________ 1 2. POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA __________________________________ 4 2.1 Histórico ________________________________________________ 5 2.2 Definição ________________________________________________ 6 2.3 Poluentes primários e secundários ___________________________ 7 2.4 Padrões de qualidade do ar _________________________________ 8 2.4.1 Ozônio __________________________________________________ 8 2.4.2 Dióxido de nitrogênio ______________________________________ 8 2.4.3 Dióxido de enxofre ________________________________________ 9 2.4.4 Monóxido de carbono ______________________________________ 9 2.4.5 Compostos orgânicos voláteis _______________________________ 9 2.4.6 Material particulado _______________________________________ 9 2.5 Poluição atmosférica no Brasil e no estado de São Paulo _________ 12 3. SISTEMA REPRODUTOR DE CAMUNDONGOS MACHOS: FUNÇÕES DOS TESTÍCULOS__________________________________________ 15 3.1 Desenvolvimento gonadal durante o período pré-natal e após o nascimento ______________________________________________ 17 3.2 Espermatogênese _________________________________________ 20 3.2.1 Fases da espermatogênese _________________________________ 20 3.2.1.1 Mitose __________________________________________________ 21 3.2.1.2 Meiose __________________________________________________ 21 3.2.1.3 Espermiogênese ___________________________________________ 22 3.2.1.4 Espermiação _____________________________________________ 23 vii 3.2.2 Barreira hemato-testicular __________________________________ 24 3.3 Esteroidogênese __________________________________________ 26 3.4 Regulação da espermatogênese e da esteroidogênese ___________ 28 4 MATERIAL PARTICULADO INALÁVEL FINO (MP2,5) E IMPLICAÇÕES NA SAÚDE __________________________________________________ 33 4.1 Prováveis mecanismos envolvidos na toxicidade do MP2,5 ________ 36 4.2 Poluição atmosférica e reprodução ___________________________ 39 5. JUSTIFICATIVA ____________________________________________ 45 6. OBJETIVOS _______________________________________________ 48 6.1 Objetivo geral ____________________________________________ 49 6.2 Objetivos específicos ______________________________________ 49 7. MÉTODOS _______________________________________________ 50 7.1 Ética ____________________________________________________ 51 7.2 Animais _________________________________________________ 51 7.3 Protocolo de exposição ao MP2,5 _____________________________ 52 7.4 Exposição ao MP2,5 ____________________________________________________________ 53 7.5 Caracterização da composição do MP2,5 _______________________ 57 7.6 Parâmetros analisados _____________________________________ 57 7.6.1 Peso corporal_____________________________________________ 57 7.6.2 Peso do testículo __________________________________________ 58 7.6.3 Peso do epidídimo _________________________________________ 58 7.6.4 Índice gonadossomático ____________________________________ 58 7.6.5 Volume do testículo _______________________________________ 58 7.6.6 Parâmetros morfométricos _________________________________ 59 7.6.6.1 Volumes das estruturas do testículo ___________________________ 61 7.6.6.2 Área de superfície dos túbulos seminíferos ______________________ 62 7.6.6.3 Área seccional dos túbulos seminíferos _________________________ 63 7.6.6.4 Diâmetro dos túbulos seminíferos _____________________________ 63 7.6.7 Análise histológica do testículo ______________________________ 63 7.6.8 Expressão gênica __________________________________________ 65 viii 7.6.8.1 Extração do RNA __________________________________________ 65 7.6.8.2 Purificação do RNA ________________________________________ 66 7.6.8.3 Microarranjos ____________________________________________ 67 7.6.8.4 Análise dos chips __________________________________________ 74 7.7 Estatística _______________________________________________ 75 8. RESULTADOS _____________________________________________ 77 8.1 Composição do MP2,5 ______________________________________ 78 8.2 Composição dos grupos experimentais ________________________ 79 8.3 Peso corporal ____________________________________________ 80 8.4 Peso do testículo __________________________________________ 80 8.5 Peso do epidídimo ________________________________________ 80 8.6 Índice gonadossomático ____________________________________ 81 8.7 Volume do testículo _______________________________________ 81 8.8 Parâmetros morfométricos do testículo _______________________ 81 8.9 Análise histológica do testículo ______________________________ 84 8.10 Expressão gênica __________________________________________ 89 9. DISCUSSÃO ______________________________________________ 108 10. CONCLUSÕES _____________________________________________ 120 REFERÊNCIAS_____________________________________________ 122 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Categorização, pelo tamanho aerodinâmico, das partículas que compõem o material particulado 12 Figura 2 – Ilustração das estruturas de um testículo de camundongo 16 Figura 3 – Estruturas do epitélio seminífero 19 Figura 4 – Estágios do ciclo do epitélio seminífero no camundongo 23 Figura 5 – Estimativas de deposição de partículas inaladas ao longo do trato respiratório 34 Figura 6 – Protocolo de exposição dos grupos ao MP2,5 53 Figura 7 – Vista aérea da localização do CPA 54 Figura 8 – Unidade móvel que abriga o CPA 54 Figura 9 – Área interna do CPA mostrando as câmaras de exposição e o sistema de tubulações por onde o ar ambiente entra 55 Figura 10 – Área interna do CPA mostrando as câmaras de exposição ao ar filtrado e ao ar não filtrado 56 Figura 11 – Animais sendo expostos ao MP2,5 56 Figura 12 – Animal após eutanásia, durante procedimentos para coleta dos órgãos 60 Figura 13 – Tela do programa ImageJ mostrando sistema-teste 61 Figura 14 – Representação esquemática dos procedimentos realizados no experimento de microarranjo de cDNA utilizando a plataforma da Affymetrix 73 x Figura 15 – Distribuição em gráfico BoxPlot das intensidades das sondas em escala logarítmica (eixo Y) por amostra (eixo X) 74 Figura 16 – Testículos de animais do Grupo Controle 85 Figura 17 – Túbulo seminífero de um animal do grupo pré-natal e pós- desmame (GPNPD) mostrando perda de associação de células germinativas 86 Figura 18 – Túbulo seminífero de um testículo do grupo pré-natal (GPN) apresentando exfoliação de células germinativas 86 Figura 19 – Túbulo seminífero de um testículo do grupo pré-natal e pós- desmame (GPNPD) diversas alterações 87 Figura 20 – Túbulos seminíferos de testículos do grupo pré-natal (GPN) mostrando atrofia tubular 87 Figura 21 – Túbulos seminíferos de testículos do grupo pós-desmame (GPD) mostrando diversas alterações 88 Figura 22 – Gráfico volcano para a comparação entre os grupo controle (GC) e grupo pré-natal e pós-desmame (GPNPD) 90 Figura 23 – Gráfico volcano para a comparação entre os grupos controle (GC) e grupo pré-natal (GPN) 91 Figura 24 – Gráfico volcano para a comparação