عنوان: مطالعه تنوع ژنتیکي جمعیت ماهي آزاد )Salmo Trutta Caspius Kessler, 1877( در پنج رودخانه حوضه جنوبي دریای خزر ایران

دانشگاه آزاد اسالمي

واحد علوم و تحقیقات

دانشکده کشاورزی و منابع طبیعي، گروه شیالت

رساله دکتری رشته شیالت )Ph.D(

عنوان: مطالعه تنوع ژنتیکي جمعیت ماهي آزاد )Salmo trutta caspius Kessler, 1877( در پنج رودخانه حوضه جنوبي دریای خزر ایران

استادان راهنما: دکتر سهراب رضواني گیل کالئي دکتر ابوالقاسم کمالي

استاد مشاور: دکتر مهدی سلطاني

نگارش: سلطنت نجار لشگری

تابستان 2931

ن دا ش گاه آزاد اسالمی

معاونت ژپوهش و فناوری

هب انم خدا

منشور اخالق ژپوهش مح هم هم ن با یاری از خداوند سبحان و اعتقاد هب اینکه عالم ضر خداست و واره انرظ رب اعمال انسان و هب منظور اپسداشت مقام بلند دانش و ژپوهش و نظر هب ا یت جای گاه دا ش گاه رد

بش نش علم ن هی اعتالی رفهنگ و تمدن ری، ما دا جویان و اعضاء هیات ی واحداهی دا ش گاه آزاد اسالمی متهدد می دردمم اوول ز ر را رد اجاام ععایتهدای ژپو ی د نظر ارار داده و تخ نک از آن طی نیم:

حق حق حق 1- اصل یقت جویی: تالش رد راستای پی جویی یقت و وافداری هب آن و دوری از ره گوهن پندان سازی یقت.

ه 2- اصل رعایت حقوق: التزام هب رعایت کامل حقوق ژپو شگران و ژپوهیدگان )انسان، حیوان و نبات( و سا ر صاحبان حق.

ن ه 3- اصل مالکیت مادی و معنوی: تهدد هب رعایت کامل حقوق مادی و معنوی دا ش گاه و کلیه م کاران ژپوهش.

ل پیش ح 4- اصل مناعع ملی: تهدد هب رعایت مصا ح ملی و رد نظر داشتن برد و توسعه کشور رد کلیه رما ل ژپوهش.

علم تج 5- اصل رعایت انصاف و امانت: تهدد هب اجتناب از ره گوهن جانب داری غیر ی و حفاظت از اموال، هیزات و منابع رد اختیار.

تحق 6- اصل رازداری: تهدد هب صیانت از ارصار و اطالعات محرماهن ارفاد، سازمان اه و کشور و کلیه ارفاد و نداداهی رمتبط با یق.

تح 7- اصل احترام: تهدد هب رعایت رحمم اه و رحمت اه رد اجاام قیقات و رعایت جانب نقد و خودداری از ره گوهن رحمت شکنی.

ی ی تح ه علم نش 8- اصل رتو ج: تهدد هب رواج دانش و اشاهع نتا ج قیقات و انتقال آن هب م کاران ی و دا جویان هب غیر از مواردی هک منع اقنونی دارد.

نس علم 9- اصل ربائت: التزام هب ربائت جویی از ره گوهن رف تار غیر رحهف ای و اعالم موضع بت هب کسانی هک حوزه علم و ژپوهش را هب شائبه اهی غیر ی می آالیند.

دانشگاه آزاد اسالمي واحد علوم و تحقیقات

تعهد نامه اصالت رساله

اینجانب سلطنت نجار لشگری دانش آموخته مقطع دکتری تخصصی در رشته شیالت که در تاریخ 13/6/3131 از رساله Salmo trutta caspius Kessler, 1877 " خود تحت عنوان مطالعه تنوع ژنتیکي جمعیت ماهي آزاد ) ( در پنج رودخانه " حوضه جنوبي دریای خزر ایران با کسب نمره ...... و درجه ...... دفاع نموده ام بدینوسیله متعهد می شوم: 3( این رساله حاصل تحقیق و پژوهش انجام شده توسط اینجانب بوده و در مواردی که از دستاوردهای علمی و پژوهشی دیگران )اعم از پایان نامه، کتاب، مقاله و ...( استفاده نموده ام، مطابق ضوابط و رویه موجود، نام منبع مورد استفاده و سایر مشخصات آن را در فهرست مربوطه ذکر و درج کرده ام. 1( این رساله قبالً برای دریافت هیچ مدرک تحصیلی )هم سطح، پائین تر یا باالتر( در سایر دانشگاه ها و مؤسسات آموزش عالی ارائه نشده است. 1( چنانچه بعد از فراغت از تحصیل، قصد استفاده و هر گونه بهره برداری اعم از چاپ کتاب، ثبت اختراع و ... از این رساله داشته باشم، از حوزه معاونت پژوهشی واحد مجوزهای مربوطه را اخذ نمایم. 4( چنانچه در هر مقطع زمانی خالف موارد فوق ثابت شود، عواقب ناشی از آن را می پذیرم و واحد دانشگاهی مجاز است با اینجانب مطابق ضوابط و مقررات رفتار نموده و در صورت ابطال مدرک تحصیلی ام هیچ گونه ادعایی نخواهم داشت.

نام و نام خانوادگی: سلطنت نجار لشگری تاریخ و امضاء:

دانشگاه آزاد اسالمي

واحد علوم و تحقیقات

دانشکده کشاورزی و منابع طبیعي، گروه شیالت

رساله دکتری رشته شیالت )Ph.D(

عنوان: مطالعه تنوع ژنتیکي جمعیت ماهي آزاد )Salmo trutta caspius Kessler, 1877( در پنج رودخانه حوضه جنوبي دریای خزر ایران

استادان راهنما: دکتر سهراب رضواني گیل کالئي دکتر ابوالقاسم کمالي

استاد مشاور: دکتر مهدی سلطاني

نگارش: سلطنت نجار لشگری

تابستان 2931

سپاسگزاری سپاس و ستایش خدای را سزاست که آدمیان را اندیشیدن و تفکر آموخت تا به طریق معرفت، اسرار هستی را یک به یک پرده بردارد و هر پرسش را به پاسخی ختم نمود و ذهن پویای بشر را مشتاق این پاسخها قرار داد. اکنون که به یاری خداوند مهربان نگارش این پایان نامه به اتمام رسید، وظیفه خود می دانم که از زحمات تمام کسانی که در اجرای آن مرا راهنمایی و یاری نمودند، تشکر و قدردانی نمایم. در ابتدا از آقای دکتر سهراب رضوانی گیل کالئی، استاد راهنمای اول این پژوهش که کار با ایشان برایم افتخاری بزرگ بود کمال قدردانی و تشکر را دارم. همچنین از استادان گرانقدر آقایان دکتر ابوالقاسم کمالی و دکتر مهدی سلطانی که در طی اجرای این پژوهش به عنوان استاد راهنمای دوم و مشاور از راهنماییهایشان بهره برده ام سپاسگزاری می کنم. از آقای دکتر پورغالم، رئیس محترم پژوهشکده اکولوژی دریای خزر که امکان انجام مراحل آزمایشگاهی این تحقیق را در آن پژوهشکده برایم فراهم نمودند، از آقای مهندس اللوئی، رئیس محترم بخش بیوتکنولوژی پژوهشکده که با راهنماییهای ارزنده شان در طی اجرای مراحل آزمایشگاهی و تجزیه و تحلیل داده های ژنتیکی این تحقیق نهایت همکاری را با اینجانب داشته اند و از همکاریهای بی- دریغ کارشناسان محترم آزمایشگاه ژنتیک آن بخش، آقایان تقوی و مهندس پورغالم در طی اجرای مراحل آزمایشگاهی این پژوهش، از آقای دکتر فضلی، رئیس محترم بخش ارزیابی ذخایر پژوهشکده که در تجزیه و تحلیل داده های زیستی این تحقیق با اینجانب همکاری داشته اند و کارشناسان محترم آن بخش، آقایان مهندس طالشیان که در کار تعیین سن و آموزش آن و مهندس دریانبرد که در تعیین موقعیت ایستگاه های نمونه برداری و تهیه عکس از فلسهای تعیین سن شده از هیچ گونه مساعدتی دریغ ننمودند، صمیمانه قدردانی می نمایم. از آقای مهندس رضوانی، رئیس محترم مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر کالردشت که امکان انجام نمونه برداری در مراحل مختلف تکثیر ماهی آزاد دریای خزر در آن مرکز را برای اینجانب فراهم نمودند و کارشناسان محترم این مرکز، آقایان زرودی، بیگلریان، میار و جعفرنژاد، نهایت سپاس و تقدیر را دارم. از آقای دکتر صیاد بورانی رئیس محترم مرکز تحقیقات ماهیان سردآبی کشور و آقایان مهندس بهرامیان و مهندس راست روان، کارشناسان محترم این مرکز که در طی مراحل مختلف نمونه برداری مرا یاری رساندند سپاسگزاری می کنم. از آقایان رفیع زاده، میرزایی، مقدم و رضایی در بازارهای ماهی فروشان هشتپر، رامسر، تنکابن و نوشهر که در طی مراحل مختلف نمونه برداری از هیچ مساعدتی دریغ ننمودند قدردانی می کنم. در نهایت از پدر و مادر عزیزم که در طول این سالها همواره مشوق و پشتیبانم بوده اند و خواهر و برادرانم که مایه دلگرمی و امیدم بودند کمال سپاس و امتنان را دارم و امیدوارم

که نتایج این تحقیق توانسته باشد ذره ای از زحمات این بزرگواران را پاسخگو باشد.

سلطنت نجار لشگری

تقدیم به: او که مرا حیات بخشید و شوق دانستن را در وجودم نهاد و همواره توجه و محبت او را نسبت به خود باور داشته ام.

تقدیم به: نگاه های مهربان و همیشه مضطرب قامتهای استوار و همیشه مقاوم زندگیم آنانکه گرانمایه جانم، استواری گامم، معنای تمام عمرم و سودای خیالم در گرو ارمغان تنها یک نگاهشان است آنانکه لحظه ای نیاسودند تا بیاسایم و امروزم ثمره ی دیروز آنهاست و کالم را توانایی و یارای بازگویی مقام واالیشان نیست ))پدر و مادر عزیزم((

این تحقیق با حمایت مالي مؤسسه تحقیقات علوم شیالتي کشور و حمایتهای اجرایي پژوهشکده اکولوژی دریای خزر- ساری، مرکز تحقیقات ماهیان سردآبي کشور- تنکابن و مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر- کالردشت انجام شده است.

ز فهرست مطالب عنوان شماره صفحه چکیده فصل اول: کلیات تحقیق 3-3- مقدمه ...... 1 3-1- بیان مسأله ...... 6 3-1- اهمیت و ضرورت تحقیق ...... 6 3-4- اهداف تحقیق ...... 7 3-5- فرضیه های تحقیق ...... 7 3-6- دریای خزر ...... 8 3-6-3- تقسیمات زیر حوضه ای ...... 31 3-6-3-3- زیر حوضه طالش- انزلی ...... 31 3-6-3-3-3- آستاراچای...... 31 3-6-3-3-1- کرگانرود ...... 31 3-6-3-1- زیر حوضه چالوس ...... 31 3-6-3-1-3- چالوس ...... 34 3-6-3-1-1- چشمه کیله...... 34 3-6-3-1-1- سرداب رود ...... 35 3-6-1- ماهیان دریای خزر ...... 35 3-6-1-3- آزاد ماهیان ...... 37 3-6-1-3-3- خصوصیات خانواده آزاد ماهیان ...... 37 3-6-1-3-1- خصوصیات جنس Salmo ...... 38 3-6-1-1- ماهی آزاد دریای خزر ...... 38 3-6-1-1-3- رده بندی ...... 33 3-6-1-1-1- خصوصیات ظاهری ...... 33 3-6-1-1-1- پراکنش جغرافیایی ...... 11 3-6-1-1-4- زیستگاه ...... 11 3-6-1-1-5- تغذیه ...... 13

ح 3-6-1-1-6- تولید مثل ...... 13 3-6-1-1-7- مهاجرت ...... 11 3-6-1-1-8- ارزش اقتصادی ...... 11 3-6-1-1-3- صید ...... 11 3-6-1-1-31- عوامل مؤثر بر کاهش ذخایر ...... 14 3-6-1-1-33- راهکارهای حفاظتی و بازسازی ذخایر ...... 15 3-7- تعاریف واژه ها و اصطالحات ...... 16 3-7-3- جمعیت ...... 16 3-7-3-3- ساختار جمعیت ...... 16 3-7-1- ذخیره ...... 16 3-7-1- ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیت ...... 16 3-7-1-3- آللهای واقعی و مؤثر ...... 17 3-7-1-1- تنوع ژنی یا هتروزایگوسیتی ...... 17 3-7-1-1-3- منابع تنوع ژنتیکی ...... 18 3-7-1-1-1- روشهای حفظ تنوع ژنتیکی ...... 18 3-7-1-1- تمایز ژنتیکی ...... 13 3-7-1-4- شاخص شانون ...... 11 3-7-1-5- جریان ژنی ...... 11 3-7-1-6- رانش ژنتیکی ...... 13 3-7-1-7- تعادل هاردی- واینبرگ ...... 13 3-7-1-8- فاصله و شباهت ژنتیکی ...... 13 3-7-4- چند شکلی ژنتیکی...... 11 3-7-5- نشانگرهای ژنتیکی ...... 11 3-7-5-3- نشانگرهای مورفولوژیکی ...... 11 3-7-5-1- نشانگرهای سیتوژنتیکی ...... 14 3-7-5-1- نشانگرهای مولکولی ...... 14 3-7-5-1-3- نشانگرهای بیوشیمیایی ...... 14 3-7-5-1-1- نشانگرهای DNA...... 15

ط 3-7-5-1-1-3- چند شکلی طول قطعات حاصل از هضم آنزیم های محدودگر ...... 16 3-7-5-1-1-1- تکثیر تصادفی DNA چند شکل ...... 17 3-7-5-1-1-1- چند شکلی طولی قطعات تکثیر شده ...... 17 17 ...... SCAR -4-1-1-5-7-3 18 ...... RLGS -5-1-1-5-7-3 18 ...... DAF -6-1-1-5-7-3 18 ...... ALP -7-1-1-5-7-3 18 ...... DGGE -8-1-1-5-7-3 3-7-5-1-1-3- چند شکلی تطبیقی رشته های منفرد ...... 13 3-7-5-1-1-31- چند شکلی های تک نوکلئوتیدی ...... 13 3-7-5-1-1-33- ماهواره ها ...... 41 3-7-5-1-1-31- نشانگرهای DNA میتوکندریایی ...... 56 3-7-5-1-1-31- توالی یابی DNA ...... 53 3-7-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز ...... 61 3-7-6-3- مواد اولیه در واکنش PCR ...... 64 3-7-6-1- ارزیابی محصول PCR ...... 67 3-7-7- الکتروفورز ...... 68 3-7-7-3- الکتروفورز ژل آگارز...... 68 3-7-7-3-3- محلولهای الزم جهت الکتروفورز ژل آگارز ...... 63 3-7-7-1- الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید ...... 71 3-7-8- فیلوژنی ...... 71 3-7-8-3- استفاده از آرایه شناسی مولکولی در مطالعات فیلوژنی و جمعیتی ...... 71 3-7-8-1- درخت فیلوژنیک ...... 73 فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق 1-3- بررسی منابع در داخل کشور ...... 75 1-1- بررسی منابع در خارج از کشور ...... 81 فصل سوم: روش اجرای تحقیق 1-3- جمع آوری نمونه ها و داده ها ...... 83

ي 1-1- استخراج DNA ژنومی ...... 33 1-1- ارزیابی کمیت DNA های استخراج شده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری ...... 34 1-4- ارزیابی کیفیت DNA های استخراج شده با استفاده از روش الکتروفورز ژل آگارز %3 ...... 35 1-5- طراحی و آماده سازی آغازگرها ...... 37 1-6- بهینه سازی واکنش زنجیره ای پلیمراز و پروفایل حرارتی آن ...... 33 1-7- انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز و تکثیر قطعه ژن هدف ...... 33 1-8- ارزیابی کیفی محصوالت PCR روشهای ریز ماهواره و توالی یابی ...... 313 1-3- الکتروفورز عمودی محصوالت PCR روش ریز ماهواره...... 311 1-31- رنگ آمیزی ژل پلی اکریل آمید 6% با استفاده از روش نیترات نقره ...... 314 1-33- سنجش وزن مولکولی محصوالت PCR روش ریز ماهواره و امتیازدهی باندها ...... 316 1-31- توالی یابی محصوالت PCR ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA ...... 316 1-31- پردازش داده ها ...... 317 فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها 4-3- ارزیابی کیفیت DNA های استخراج شده ...... 331 4-1- ارزیابی کمیت DNA های استخراج شده ...... 331 4-1- ارزیابی کیفیت محصوالت واکنش زنجیره ای پلیمراز ...... 331 4-4- نتایج مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از روش ریز ماهواره ...... 333 4-4-3- الکتروفورز عمودی محصوالت PCR جایگاه های ریز ماهواره...... 333 4-4-1- تعداد آللهای اختصاصی و فراوانی آنها ...... 331 4-4-1- تعداد آلل واقعی )NA( و مؤثر )NE( ...... 334 4-4-4- میزان تنوع ژنتیکی ...... 335 4-4-5- شاخص شانون ...... 336 4-4-6- تعادل هاردی- واینبرگ ...... 336 4-4-7- تمایز ژنتیکی و جریان ژنی ...... 337 4-4-8- فاصله و شباهت ژنتیکی ...... 338 4-4-3- تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها و بین و درون افراد ...... 338 4-4-31- نمودار سنجش ژنتیکی جفت جمعیتها ...... 333 4-4-33- آنالیز تجزیه به مؤلفه های اصلی ...... 333

ك 4-5- نتایج مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از روش توالی یابی...... 311 4-5-3- فراوانی هاپلوتایپها ...... 311 4-5-1- میانگین تعداد آلل مشاهده شده و هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار ...... 311 4-5-1- تعادل هاردی- واینبرگ ...... 313 4-5-4- تمایز ژنتیکی و جریان ژنی ...... 313 4-5-5- فاصله و شباهت ژنتیکی ...... 313 4-5-6- تنوع ژنتیکی ...... 313 4-5-7- تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها در رودخانه های مورد مطالعه ...... 311 4-5-8- نسبت نوکلئوتیدها ...... 311 4-5-3- تخمین الگوی جانشینی نوکلئوتیدی ...... 311 4-5-31- تخمین درجه خویشاوندی ...... 311 4-5-33- شرح درخت فیلوژنی رسم شده به روشهای Maximum Parsimony و Neighbor Joining با استفاده از آنالیز خود راه انداز ...... 321 4-5-31- شرح درخت فیلوژنی رسم شده با استفاده از اطالعات موجود در بانک ژن ...... 314 فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات 5-3- روش ریز ماهواره ...... 318 5-1- روش توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA ...... 317 5-1- نتیجه گیری کلی ...... 343 5-4- پیشنهادات اجرایی ...... 343 5-5- پیشنهادات پژوهشی ...... 341 منابع و مآخذ ...... 341 فهرست منابع فارسی ...... 344 فهرست منابع انگلیسی ...... 353 چکیده انگلیسی

ل فهرست جدولها عنوان شماره صفحه جدول 3-3- قیمت هر کیلوگرم گوشت ماهی آزاد دریای خزر در بازار ماهی فروشان تنکابن طی سالهای 3131 و 3133 ...... 11 جدول 1-3- تعداد و پراکنش نمونه های جمع آوری شده ماهی آزاد دریای خزر ...... 33 جدول 1-1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در روش ریز ماهواره ...... 38 جدول 1-1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در روش توالی یابی ...... 38 جدول 1-4- برنامه های داده شده به دستگاه ترمال سایکلر برای بهینه سازی PCR ...... 33 جدول 1-5- نوع و مقدار مواد استفاده شده در واکنش زنجیره ای پلیمراز ...... 311 جدول 1-6- برنامه PCR مورد استفاده در روشهای ریز ماهواره و توالی یابی ...... 313 جدول 4-3- محدوده باندی، دمای اتصال و تعداد آللهای مشاهده شده در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر...... 331 جدول 4-1- آللهای اختصاصی، محدوده باندی و فراوانی آللی در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر ...... 331 جدول 4-1- تعداد آللهای واقعی و مؤثر در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر ..... 335 جدول 4-4- مقادیرهتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر ...... 336 جدول 4-5- مقادیر شاخص شانون در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر ...... 336 جدول 4-6- تعادل هاردی- واینبرگ در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر ...... 337 جدول 4-7- تمایز ژنتیکی و جریان ژنی در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر .... 337 جدول 4-8- میانگین تعداد آلل مشاهده شده و هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار ...... 311 جدول 4-3- ماتریس فاصله و شباهت ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر ...... 313 جدول 4-31- میزان تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر ...... 313 جدول 4-33- نسبت نوکلئوتیدهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 311 جدول 4-31- الگوی جانشینی نوکلئوتیدی ماهی آزاد دریای خزر ...... 311 جدول 4-31- درجه خویشاوندی ماهی آزاد دریای خزر ...... 311 جدول 4-34- مشخصات گونه های منتخب بانک ژن ...... 314

م فهرست شکلها عنوان شماره صفحه شکل 3-3- دریای خزر ...... 31 شکل 3-1- هیدرولوژی زیر حوضه طالش- انزلی ...... 33 شکل 3-1- توپوگرافی زیر حوضه طالش- انزلی ...... 33 شکل 3-4- کیفیت آب زیر حوضه طالش- انزلی ...... 33 شکل 3-5- هیدرلوژی زیر حوضه چالوس ...... 31 شکل 3-6- توپوگرافی زیر حوضه چالوس ...... 31 شکل 3-7- کیفیت آب زیر حوضه چالوس ...... 31 شکل 3-8- پراکنش جغرافیایی آزاد ماهیان در جهان ...... 38 شکل 3-3- ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ایران ...... 33 شکل 3-31- پراکنش جغرافیایی ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ایران ...... 11 شکل 3-33- چرخه زندگی آزاد ماهیان ...... 11 شکل 3-31- میزان صید ماهی آزاد دریای خزر طی سالهای بهره برداری 3173-3133 ...... 14 شکل 3-31- آناتومی ریز ماهواره ها ...... 41 شکل 3-34- مکان و اندازه ریز ماهواره ها در ژنوم ...... 41 شکل 3-35- تنوع ریز ماهواره ای ...... 55 شکل 3-36- نقشه ژنی mtDNA با جایگاه و موقعیت تمامی ژنها ...... 58 شکل 1-3- صید با استفاده از سد شیل )کلهام( ...... 83 شکل 1-1- صید با با استفاده از تور سالیک ...... 83 شکل 1-1- صید با استفاده از تور پره ...... 31 شکل 1-4- نمونه برداری از باله ماهی آزاد دریای خزر ...... 31 ° شکل 1-5- فیکس نمودن باله در الکل اتانول 36 ...... 31 شکل 1-6- آزمایشگاه ژنتیک پژوهشکده اکولوژی دریای خزر ...... 31 شکل 1-7- موقعیت ایستگاه های نمونه برداری ماهی آزاد دریای خزر ...... 31 شکل 1-8- اضافه نمودن مواد هضم کننده به بافتهای خرد و له شده ...... 31 شکل 1-3- دستگاه شیکر لوله ...... 31 شکل 1-31- دستگاه شیکر پلیت ...... 31

ن شکل 1-33- دستگاه سانتریفیوژ ...... 31 شکل 1-31- کالفهای سفید رنگ DNA ...... 31 شکل DNA -31-1 محلول در آب مقطر استریل ...... 31 شکل 1-34- دستگاه اسپکتروفتومتر ...... 35 شکل 1-35- ترازوی دیجیتال ...... 37 شکل 1-36- تزریق به داخل چاهکهای مستطیلی شکل ژل ...... 37 شکل 1-37- حرکت DNA تزریق شده به طرف قطب مثبت ...... 37 شکل 1-38- دستگاه مستندساز ژل ...... 37 شکل 1-33- دستگاه ترمال سایکلر ...... 313 شکل 1-11- مسدود ساختن درزهای شیشه ها ...... 314 شکل 1-13- چاهکهای ایجاد شده در ژل پلی اکریل آمید ...... 314 شکل 1-11- نشانگر DNA Ladder 50 bp ...... 314 شکل 1-11- ژل پلی اکریل آمید غوطه ور در محلول ثبوت اولیه ...... 316 شکل 1-14- ژل پلی اکریل آمید غوطه ور در محلول ظهور ...... 316 شکل 1-15- روش Sanger Coulson ...... 317 شکل 1-16- دستگاه DNA Sequence Analyzer ...... 317 DNA شکل 4-3- ارزیابی های استخراج شده به روش استات آمونیوم ...... 331 شکل 4-1- ارزیابی محصوالت PCR روش ریز ماهواره ...... 333 شکل 4-1- ارزیابی محصوالت PCR روش توالی یابی ...... 333 شکل 4-4- الگوی باندی آغازگر Otsg 83 ...... 333 شکل 4-5- الگوی باندی آغازگر Otsg 100 ...... 333 شکل 4-6- الگوی باندی آغازگر Otsg 107 ...... 331 شکل 4-7- الگوی باندی آغازگر Otsg 249 ...... 331 شکل 4-8- الگوی باندی آغازگر Ssa 171 ...... 331 شکل 4-3- تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 338 شکل 4-31- تنوع ژنتیکی درون و بین افراد و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 338 شکل 4-33- تنوع ژنتیکی بین افراد، درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 338 شکل 4-31- سنجش ژنتیکی جفت جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 333

س شکل 4-31- درجه تفکیک ژنتیکی جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 333 شکل 4-34- تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر ...... 311 شکل 4-35- درخت Maximum Parsimony رسم شده با استفاده از آنالیز خود راه انداز و اطالعات موجود در بانک ژن ...... 315 شکل 4-36- درخت Neighbor Joining رسم شده با استفاده از آنالیز خود راه انداز و اطالعات موجود در بانک ژن ...... 316

ع چکیده جهت مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر ایران، 381 عدد مولد در فصول پاییز و زمستان سال 3131 از رودخانه های چالوس، سردآبرود، چشمه کیله، کرگانرود و آستارا جمع آوری شدند. سپس حدود 5-1 گرم از بافت نرم و تازه انتهای باله ماهی جدا و در الکل ° اتانول 36 تثبیت شد. DNA ژنومی به روش استات آمونیوم استخراج و کمیت و کیفیت DNA های استخراج شده با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و الکتروفورز افقی ژل آگارز 3% تعیین شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از 36 جفت آغازگر ریز ماهواره و یک جفت آغازگر توالی یابی )D- Loop( انجام شد و ارزیابی کیفیت محصوالت تکثیر شده PCR روش ریز ماهواره با استفاده از الکتروفورز افقی ژل آگارز 1% انجام و برای مشاهده آللها و تعیین اندازه آنها از الکتروفورز عمودی ژل پلی اکریل آمید 6% و روش رنگ آمیزی نیترات نقره استفاده شد. ثبت تصاویر ژل توسط دستگاه مستندساز ژل انجام و باندهای حاصل با استفاده از نرم افزار Photo- Capt امتیازدهی شدند و تجزیه و تحلیل آماری دادهها با استفاده از نرم افزارهای Gene Alex و Pop Gene انجام پذیرفت. همچنین محصوالت PCR روش توالی یابی پس از ارزیابی کیفی با ژل آگارز 5/3%، خالص سازی و برای توالی یابی به شرکت Bioneer کره جنوبی ارسال شدند. توالی یابی به روش خاتمه یابی زنجیره و تجزیه و تحلیل آماری داده ها با استفاده از نرم افزارهای Arlequin ،Mega ،Bio- Edit و DNA SP انجام شد. در روش ریز ماهواره، 5 جفت از آغازگرها تولید باندهای پلیمورفیک نمودند و میانگین تعداد آللهای واقعی و مؤثر در رودخانه چشمه کیله 81/3±61/5 و 46/3±87/1 و در رودخانه کرگانرود 75/3±61/7 و 11/3±48/5 و میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار در رودخانه چشمه کیله 35/1±44/1 و 36/1±51/1 و در رودخانه کرگانرود 33/1±51/1 و 31/1±71/1 محاسبه شد. نتایج آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که اختالف تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها و بین و درون افراد دو رودخانه معنی دار است )P<0.01(. در روش توالی یابی 15 هاپلوتایپ مختلف شناسایی شد و بیشترین تعداد جایگاه پلی مورفیک )153( و هاپلوتایپ )34( در رودخانه چالوس مشاهده شد. بیشترین میانگین تعداد آلل مشاهده شده )48/1±14/1( در رودخانه سردآبرود، بیشترین میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده )11/1±11/3( در رودخانه چالوس و بیشترین میانگین تنوع نوکلئوتیدی )17/1±31/1( در رودخانه سردآبرود مشاهده شد و میانگین تنوع هاپلوتایپی در هر سه رودخانه )3( به دست آمد. به طور کلی نتایج نشان داد که جمعیت یکسانی از این ماهی در رودخانه های مورد مطالعه وجود ندارد و رودخانه کرگانرود در روش ریز ماهواره و رودخانه چالوس در روش توالی یابی دارای باالترین میزان تنوع ژنتیکی بودند. کلیدواژه ها: ماهی آزاد دریای خزر، تنوع ژنتیکی، ریز ماهواره، توالی یابی

فصل اول کلیات تحقیق

2-2- مقدمه شناسایی گونهها، زیر گونهها و جمعیتهای آبزیان از اهمیت زیادی برخوردار است چرا که عالوه بر مدیریت صحیح و بهره برداری مناسب موجب اجرای برنامههای اصولی جهت حفاظت از گونهها یا جمعیتهای پر ارزش، بازسازی ذخایر و همچنین ایجاد تنوع در تکثیر و پرورش این موجودات خواهد شد. در ابتدا ارزیابی ساختار ذخایر، تشخیص گونهها، جمعیتها و نژادها با استفاده از صفات مورفومتریک و مریستیک مثل طول بدن، تعداد فلس روی خط جانبی و تگهای مصنوعی صورت میگرفت. اما با توجه به حساسیت باالی صفات مورفومتریک و مریستیک به تغییرات محیطی و اثرات منفی دستکاری در نشانه گذاری بر سالمت و بقای ماهیان و از طرفی محدود بودن تفسیر دادههای نشانه گذاری به زمان جمع آوری آنها )Adams and Hutchings, 2003(، پیشرفت علم استفاده از نشانگرهای مولکولی مثل Microsatellite، RFLP ،AFLP ،RAPD و آلوزایم را که متأثر از فاکتورهای محیطی نمیباشند جهت شناسایی ساختار ژنتیکی ذخایر امکان پذیر ساخته است )Ryman, 1991(. توسعه روشهای مولکولی به تقویت مطالعات سیستماتیک ماهیان کمک فراوانی کرده است. روشهای جدید برای سیستماتیک ماهیان صفات مناسب جدیدی را برای آنالیز روابط ما بین گونه ها پیشنهاد کرد. روشهای مولکولی بسیاری از تقسیم بندی های مورفولوژیک را تأیید می کنند و در برخی موارد گروه بندی نادرست آنها را نیز آشکار می سازند. در کل هماهنگی بین روشهای مولکولی و مورفولوژیک باال است. اگر چه روشهای مورفولوژیک در شناسایی جنس3 عملکرد خوبی دارند ولی در شناسایی گونه و روابط ما بین آنها با مشکل روبه رو هستند. در گذشته تعین دقیق زمان گونه زایی به دلیل نبود امکانات ژنتیکی فقط به صورت استقرا انجام می شد و فقط فنوتیپها را مطالعه می کردند. از این رو مشخص نبود که تا چه حد اختالفات مورفولوژیک می توانند مکانیسم جدایی ژنتیکی را نشان دهند. تنوع ژنتیکی یک گونه را نمی توان به طور مستقیم از داده های فنوتیپی به دست آورد زیرا تأثیر عوامل محیطی مانع تفسیر صحیح و دقیق آنها می شود. بنابراین به روشهای علمی که بر پایه طرحهای آزمایشگاهی باشند نیاز است. ژنتیک مولکولی و بیوشیمی شکاف و نقایص ژنتیک کمی را پر کرده و درک ما را از علل تغییرات کمی در سطح ژن باال برده است. علم ژنتیک مولکولی در آبزیان می- کوشد با پرده برداری از سیما و ساختار ژنها نقش دقیق آنها را در آبزیان شناسایی و چگونگی تغییراتشان را

3- Genera

1 در سطح مولکولی بررسی نماید. شناسایی طبیعت کنترل صفات نه تنها دستاوردهای علمی عمده ای را در تشخیص و علل ایجاد جمعیتهای مختلف آبزیان به همراه داشته بلکه برنامه های اصالحی در آبزی پروری را به یک بازده مناسب هدایت خواهد نمود که این امر از طریق نشانگرها امکانپذیر است. ما با استفاده از نشانگرهای ژنتیکی مستقیماً روی تنوع ژنتیکی نگرش داشته و با شناسایی تنوع در سطح DNA قادر خواهیم بود تفاوت صحیح ژنتیکی دو فرد را بررسی نماییم. روش مناسب، ترکیب اطالعات حاصل از نشانگرهای ژنتیکی با روشهای آماری می باشد که سبب افزایش دقت، کاهش فاصله نسل و در نهایت افزایش پاسخ به انتخاب می گردد. از آنجایی که این مطالعات بر روی DNA صورت می گیرد، به دلیل دقت و سهولت تعیین نشانگرهای DNA و امکان به کارگیری آنها در تمام مراحل زندگی، فراوانی آنها و عدم تأثیر شرایط محیطی بر آنها، کاربرد و میزان موفقیتشان بسیار زیاد است. بیشترین کاربرد نشانگرهای مولکولی، آنالیز فیلوژنی سطوح پایین گونه ها و خصوصاً آنالیز تمایز جغرافیایی ما بین جمعیتها و درون گونه ها است که در گذشته میسر نبود. جمعیتها دارای مجموعه گوناگونی از ژنها می باشند که عوامل مختلفی همچون فاصله نسل ها، صید بی رویه، شرایط نامناسب آب و هوایی و از بین رفتن زیستگاه ها موجب کاهش اندازه مؤثر آنها می گردد و این امر می تواند منجر به کاهش تنوع ژنتیکی ذخایر شود. وجود تنوع در ذخیره ژنی هر جمعیت، ضامن بقای آن در روند انتخاب طبیعی است. در جمعیتهای کوچک به دلیل محدود بودن ذخیره ژنی امکان رانش ژنتیکی وجود دارد که شانس بقای آن جمعیت را تحت تأثیر قرار می دهد. این امر خطر انقراض گونه ها را افزایش می دهد. تنوع ژنتیکی عامل تداوم حیات جانداران از جمله آبزیان در برابر تغییر شرایط گوناگون محیطی می باشد همچنین موجب ارتقاء ویژگیهای مهم و اقتصادی آنان از جمله رشد، لقاح و مقاومت در برابر عوامل بیماریزا است. یکی از مشکالت امروز ذخایر آبزیان در دنیا، کاهش تنوع ژنتیکی است که بر اثر فعالیتهای متعدد بشر اعم از ایجاد آلودگی ها، صید بی- رویه، تخریب زیستگاه ها، مسدود کردن مسیر مهاجرت و کاهش تکثیر طبیعی ایجاد شده است ) Zhao et al., 2005(. از مصوبات کنوانسیون نظارت بر تجارت گونه های در حال انقراض3 این است که کشورهای مشترک در یک اکوسیستم آبی باید هر یک از گونه های خود را بر اساس نتایج گشت دریایی، ارزیابی ذخایر کنند. لذا احتمال می رود که در آینده تعیین سهمیه صید و مدیریت آن بر مبنای جمعیتهای شناسایی شده از هر گونه، صورت پذیرد )Rezvani Gilkolaei, 2002(. اغلب گونه ها بیش از یک ذخیره دارند و مدیریت شیالتی با برداشت پایا از ذخایر و یا ترکیب آنها )جهت تجدید جمعیتها(، می تواند به حفظ تنوع ژنتیکی ذخایر کمک زیادی نماید. در نتیجه، شناسایی ذخایر از اصول مدیریت شیالتی است ) Waldman et al., 1999(. به این منظور گسترش برنامه های مدیریتی و انجام فعالیتهای بازسازی ذخایر آبزیان هنگامی

1- Convention on International Trade Endangered Species of Fona and Flora= CITES

4 مفید است که ابتدا تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی آنها مطالعه و بررسی شود )Lin et al., 2002(. بررسی ساختار جمعیتی و تشخیص زیر گونه ها در آبزیان، توسط روشهای مختلفی انجام می گیرد که از آن جمله می توان به مطالعه تاریخچه زندگی، ریخت شناسی، نسبت ایزوتوپ ها در اتولیت ) ,.Solomon et al 2006(، نشانه گذاری )Campbell and Beveridge, 1996( و در نهایت شناسایی مولکولی و ژنتیکی اشاره کرد. در حال حاضر نشانگرهای DNA با اعتمادترین ابزار جهت مطالعه تنوع ژنتیکی گونه ها می باشند )صفری، 3185(. اما مواد ژنتیکی در معرض تغییرات و جهشهای دائمی قرار دارند زیرا عوامل گوناگون فیزیکی و شیمیایی موجود در محیط درون و برون سلولی موجب جابجایی ترکیب نوکلئوتیدهای DNA در هنگام همانندسازی می گردند. بنابراین در گونه های جانوری یا گیاهی، جمعیتها و نژادهای متفاوتی ایجاد می گردند که شناسایی آنها از روی صفات ظاهری امکان پذیر نیست. این تغییرات طبیعی که سبب گوناگونی در افراد یک جمعیت می شوند، چند شکلی ژنتیکی3 نام دارند. دانستن میزان چند شکلی ژنتیکی در جمعیتهای محدود )مانند جمعیتهای پرورشی( حائز اهمیت است زیرا در جمعیتهای مذکور امکان تجمع یک دسته صفات بیشتر بوده و این امر می تواند شانس بقاء را در شرایط نامساعد محیطی مثل بیماریها و ... تحت الشعاع قرار دهد )قریب خانی، 3188(. امروزه با استفاده از تفاوت توالی های DNA، موجودات زنده را طبقه بندی نموده و به بررسی میزان تنوع در جمعیتهای آنها می پردازند. به طور معمول در توالی ژنوم یا بخشی از یک ژن، در گونه های مختلف یا حتی در افراد یک گونه، تفاوتهایی به چشم می خورد که هر چند این تفاوتها بسیار اندک می باشند ولی می توانند به عنوان مالکی جهت بررسی فاصله ژنتیکی و زمان انشقاق دو گونه به شمار روند. همچنین می توان از آنها به منظور مدل سازی و بازسازی تاریخچه تکاملی، رابطه جدی- فرزندی و در نهایت ترسیم درخت فیلوژنی احتمالی استفاده کرد. این تفاوتها به روش مستقیم یعنی تعیین دقیق توالی قطعه مورد نظر و یا غیر مستقیم یعنی توسط نشانگرها تعیین می گردند )نقوی و همکاران، 3186(. امروزه استفاده از تکنیکهای مولکولی در مطالعات زیستی از قبیل اصالح نژاد آبزیان، تشخیص بیماریها حتی قبل از بروز عالئم ظاهری آن، شناخت جمعیتها و نژادهای مختلف، تهیه بانک ژنی، انتقال صفات و… کاربرد بسیار زیادی پیدا کرده است )صفری، 3185(. علیرغم اهمیت اقتصادی و استراتژیک ماهی آزاد دریای خزر1 تا کنون هیچ گونه مطالعه جامعی بر روی ژنتیک جمعیت آنها در رودخانه های مهم محل مهاجرتشان در حوضه جنوبی دریای خزر ایران انجام نشده است و از آنجا که جزء گونه های منحصر به فرد و به شدت در معرض خطر انقراض می باشد مطالعات هر چه بیشتر بر روی جنبه های مختلف زیست شناسی آن به منظور برنامه ریزی های آتی برای ارزیابی ذخایر، بازسازی ذخایر، نحوه

1- Polymorphism 2- Salmo trutta caspius

5 بهره برداری و استفاده یا پرورش آن ضروری به نظر می رسد و می تواند نقش مؤثری در شناخت جمعیتها، حفاظت و مدیریت این گونه داشته باشد. 2-1- بیان مسأله دریای خزر بزرگترین دریاچه شور کره زمین با قدمت و تاریخچه طوالنی و زیستگاه های مختلف بوده که یک اکوسیستم آبی کم نظیر را ایجاد کرده است )رسولی، 3184(. از لحاظ تنوع زیستی 584 گونه جانوری و بیش از 511 گونه گیاهی در آن زندگی می کنند که تعدادی از گونه های جانوری و گیاهی از دریاهای سیاه و آزوف به آن راه یافته اند. در مجموع 15 گونه ماهی با اهمیت اقتصادی و تجاری در آن به بهره برداری می رسد )Ivanov, 2000( که یکی از مهمترین آنها ماهی آزاد دریای خزر می باشد که از نظر کیفیت گوشت، ارزش اقتصادی )Kazancheev, 1981( و همچنین حفظ ذخیره ژنتیکی )عبدلی و نادری، 3187( از اهمیت و ارزش زیادی برخوردار می باشد اما امروزه عوامل مختلفی از جمله رشد جمعیت، پیشرفت ابزار و ادوات صید، صید بی رویه و غیر مجاز و ... باعث تهدید جمعیت و در مواردی کاهش موفقیت در بازسازی ذخایر این گونه ارزشمند از طریق تکثیر مصنوعی شده است. Coad )1980( این ماهی را طبق معیارهای IUCN در لیست سرخ و در طبقه در معرض خطر انقراض قرار داد )عبدلی و نیک سیرت، 3186(. تنوع ژنتیکی برای بقای طوالنی مدت یک گونه ضروری است )Bataillon et al., 1996( و مدیریت تنوع ژنتیکی در موجودات، نیازمند ارزیابی ساختار ژنتیکی و تفکیک ذخایر گونه مورد نظر است ) ,.Pujolar et al 2009(. یکی از دالیل عمده شناخته شده در کاهش ذخایر آبزیان در بسیاری از اکوسیستم های جهان، یکسان تلقی نمودن جمعیتها و ذخایر تشکیل دهنده یک گونه در پهنه گسترش آبی آن گونه می باشد و شایدعلت اصلی آن عدم شناخت و درک ژنتیک جمعیت آبزیان توسط اکثر مدیران شیالتی است )Ovenden, 1990(. از این رو با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی آزاد دریای خزر در ایران و نبود اطالعات کافی درباره وضعیت ژنتیکی جمعیتهای موجود، در این مطالعه سعی شده است با بهره گیری از روشهای ریز ماهواره و توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA، تنوع ژنتیکی جمعیت ماهی آزاد در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر ایران بررسی گردد. 2-9- اهمیت و ضرورت تحقیق ماهی آزاد دریای خزر گونه ای گوشتخوار بوده که نقش حیاتی در برقراری اکوسیستم دریای خزر دارد و به دلیل تقاضای شدید بازار، صید بی رویه، افزایش آلودگی ها، تخریب زیستگاه ها و محلهای تخمریزی طبیعی، احداث سد و پل و در نتیجه مسدود کردن مسیر مهاجرت، کاهش تخمریزی طبیعی و ... که در دهه های گذشته اتفاق افتاده جمعیت آن به شدت کاهش پیدا کرده به نحوی که امروزه با میانگین رهاسازی 431 هزار عدد بچه ماهی در 31 سال اخیر توسط سازمان شیالت ایران جمعیت آن ترمیم و تا حدودی بازسازی

6 شده است. صرفنظر از ایراداتی که در تولید و نحوه رهاسازی بچه ماهیان وجود دارد این سؤال مطرح می- شود که آیا ماهی آزاد دریای خزر در محدوده پراکنش خود یک جمعیت واحد است یا به جمعیتهای مختلفی تعلق دارد؟ آیا ذخایر آن دسته از ماهیان آزادی که به سایر رودخانه ها مهاجرت می کنند و از مولدین آنها در بازسازی ذخایر استفاده نمی شود و صید آنها کم و بیش در دریا صورت می گیرد را از دست نخواهیم داد؟ در سالهای اخیر که استفاده از شیوه های گوناگون مطالعات ژنتیکی به روشی استاندارد و مطمئن در مطالعات پویایی جمعیتهای آبزیان مبدل شده است، مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیت ماهی آزاد دریای خزر به عنوان یکی از بازارپسندترین ماهیان حوضه جنوبی دریای خزر در مهمترین رودخانه های محل مهاجرتشان )چالوس، سردآبرود، چشمه کیله، کرگانرود و آستارا( می تواند به شناسایی بیشتر ذخایر این ماهی، احیاء و افزایش ذخایر آن کمک شایانی نماید. همچنین این مطالعه می تواند در مدیریت برداشت پایدار، حفظ تنوع زیستی و تکثیر و پرورش ماهی مذکور نقش بسزایی داشته باشد و در گامی فراتر، به عنوان الگو و مرجعی جهت مدیریت ذخایر دیگر ماهیان اقتصادی دریای خزر نیز مورد استفاده قرار گیرد. از سوی دیگر این مطالعه یکی از راههای علت یابی عدم موفقیت برنامه های بازسازی ذخایر سازمان شیالت ایران با اثبات وجود بیش از یک جمعیت می باشد که در صورت اثبات آن برنامه بازسازی ذخایر این ماهی از مرحله صید مولدین تا تکثیر و رهاسازی بچه ماهی دچار دگرگونی خواهد شد. 2-4- اهداف تحقیق این پژوهش در نظر دارد با استفاده از روش های نوین مولکولی به ویژه بهره گیری از تکنیک های ریز ماهواره و PCR- Sequencing ژن منطقه کنترل )D- Loop( مولکول mtDNA اهداف زیر را دنبال نماید: 3- شناسایی و تفکیک جمعیتهای مختلف ماهی آزاد در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر )چالوس، سردآبرود، چشمه کیله، کرگانرود و آستارا( 1- تعیین تنوع و اختالف ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد در رودخانه های مورد مطالعه 1- محاسبه فاصله و شباهت ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد در رودخانه های مورد مطالعه 4- تعیین رابطه فیلوژنی بین جمعیتهای ماهی آزاد در رودخانه های مورد مطالعه 5- تعیین توالی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه و ثبت آنها در Gene Bank 7- اصالح برنامه های بازسازی ذخایر و بهره برداری ماهی آزاد با استفاده از یافته های این تحقیق 2-5- فرضیه های تحقیق 3- روش ریز ماهواره از کارایی الزم برای مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر برخوردار است.

7 1- توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA از کارایی الزم برای مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر برخوردار است. 1- ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه دارای تنوع ژنتیکی می باشد. 2-6- دریای خزر دریای خزر )شکل 3-3( با مساحت بالغ بر178411 کیلومتر مربع، حجم آب 78311 کیلومتر مکعب و ° ° ° ° مشخصات جغرافیایی آن ′11 16 تا ′7 47 شمالی و ′51 45 تا ′41 46 شرقی بزرگترین دریاچه لب شور3 جهان است که در دورترین قسمت جنوب شرقی اروپا و مرز مشترک با قاره آسیا واقع شده و حدود %41 آبهای دریاچه های جهان را به خود اختصاص داده است ) Aladin and Plotnikov, 2004; Kostyanoy and Kosarev, 2005(. عرض این دریا 415 کیلومتر و طول خط ساحلی آن حدود 6441 کیلومتر است که بیش از 5111 کیلومتر آن مربوط به کشورهای همسایه شمالی ایران بوده و فقط حدود 3111 کیلومتر آن در ایران واقع شده است و با حذف پیکره های آبی نظیر خلیج گرگان، طول خط ساحلی دریای خزر در ایران به بالغ بر 741 کیلومتر می رسد )دفتر طرح و توسعه شیالت، 3181(. گودی آن در قسمت شمالی 31-31 متر، در بخش میانی تا 771 متر و در ژرفترین نقطه بخش جنوبی تا 3115 متر نیز می رسد. سطح آب آن 5/18 متر از میانگین سطح دریاهای آزاد پایین تر بوده و میزان شوری آن تقریباً یک سوم آب دریاهای آزاد و اقیانوسها است )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. خزر شمالی، میانی و جنوبی به ترتیب 1/5، 3/11 و 6/65 درصد از حجم آب این دریا را به خود اختصاص داده اند ) Zenkevitch, 1963 and Ghasemov, 1987(. منابع تأمین کننده آب دریای خزر، رودخانه ها و آبهای سطحی، بارش، آبهای زیر زمینی و چشمه ها می باشند و حدود 37-35 درصد آب آن از طریق رودهایی که از خاک روسیه سرچشمه می گیرند تأمین می گردد و تنها 1-1 درصد آب این دریا توسط رودخانه های ایران تأمین می شود )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. رودخانه ولگا بیشترین حجم آب شیرین ورودی به دریای خزر را تأمین می کند که حدود 1/76 درصد از کل منابع آبی ورودی به این دریا می باشد. حوضه جنوبی دریای خزر دارای 63 رودخانه در استان گیالن و 81 رودخانه در استانهای مازندران و گلستان می باشد و بیشتر این رودخانه ها باریک و کم عمق بوده و طول آنها از چند کیلومتر تجاوز نمی کند )Zenkevitch, 1963(. یکی از مهمترین ویژگیهای دریای خزر تنوع گونهای و شرایط فیزیکی- شیمیایی آن است ) Kosarev and °c °c Yablonskaya, 1994(. دمای آب خزر جنوبی در زمستان از 31 در عمق 41 متری تا 6 در عمق611 °c °c متری و در تابستان از 17 در سطح تا 6 در عمق 611 متری تغییر میکند. در بهار حرارت آب در طبقات °c °c سطحی به 18-14 می رسد و گاهی اوقات در سواحل شرقی از 11 نیز باالتر میرود ) Aladin and

1- Brackish water

8 Plotnikov, 2004(. شوری، در قسمتهای مختلف آن متفاوت است به طوری که از آب کامالً شیرین در ورودی رودهای بزرگ مانند دهانه ولگا تا 1/31-6/31 قسمت در هزار3 در بخش جنوبی متغیر است )Kosarev and Yablonskaya, 1994( و با افزایش عمق رابطه مستقیم دارد. شرایط متغیر شوری باعث افزایش تنوع جانوری شده به طوری که گونههای آب شیرین، لب شور، مقاوم به شوری1 و فراشور قادر به بقا در آن هستند و به دلیل تشابه ترکیب یونی با آب دریاها، بسیاری از گونه های خالص دریایی1 نیز میتوانند در این دریا زیست کنند )Aladin and Plotnikov, 2004(. تنوع زیستی دریای خزر در تمامی شاخه های جانوری، در مقایسه با دیگر دریاها پایین اما میزان بومی زیستی4 در آن به شدت باال است )Dumont, 1995(. سرازیر شدن مقادیر زیاد مواد مغذی از طریق رودخانه های حوضه آبریز خزر جنوبی و باال بودن درجه حرارت در این منطقه، شرایط اکولوژیکی مناسبی را برای تداوم تولیدات اولیه فراهم کرده است و نرخ تولیدات اولیه در نواحی غربی خزر جنوبی به مراتب بیشتر از نواحی شرقی آن می باشد )Zenkevitch, 1963(. یکی از مشاغل اصلی ساحل نشینان دریای خزر، صید و صیادی بوده و عالوه بر صیادان، گروهی از مردم از طریق ساخت و فروش ادوات صیادی و یا از طریق تجارت آبزیان، معیشت خود را در ارتباط با دریای خزر و ذخایر آن می بینند )دریانبرد، 3187(. تنوع گونه ای و فون ماهیان دریای خزر بسیار محدودتر از دریاهای آزاد بوده و بیشتر گونه های آن کوچک جثه و به شدت آسیب پذیر می باشند )آکادمی علوم قزاقستان، 3334 و تقوی، 3177(. بدین ترتیب بهره برداری و استحصال از ذخایر این دریا، نیازمند مدیریت صحیح شیالتی است که ضامن حفظ ذخایر و بهره برداری پایدار باشد و این مهم بدون مطالعه خصوصیات بیولوژیکی، نیازهای اکولوژیکی و ارزیابی ذخایر حاصل نمی شود.

1- Parts per thousand 2- Euryhaline 3- Marine 4- Endemism

شکل 2-2- دریای خزر )http://upload.wikimedia.org( 2-6-2- تقسیمات زیر حوضه ای حوضه آبریز دریای خزر واقع در شمال ایران با وسعتی برابر 15/371311 کیلومتر مربع و مساحتی در حدود ° ° ° ° 31% مساحت کل کشور، بین مدار 15 تا ′45 13 عرض شمالی و نصف النهار ′5 44 تا 53 طول شرقی قرار گرفته است. این حوضه به 3 زیر حوضه تقسیم می شود که سفیدرود بزرگترین آنها می باشد. زیر- حوضه های دیگر این حوضه به ترتیب وسعت عبارتند از: ارس، اترک، گرگانرود، چالوس، نکا- تجن، طالش- انزلی، تاالر- بابلرود و هراز )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. 2-6-2-2- زیر حوضه طالش- انزلي زیر حوضه طالش- انزلی در شرق دریای خزر واقع شده و از نظر وسعت هفتمین زیر حوضه از حوضه آبریز دریای خزر می باشد. حدود جغرافیایی آن از شمال به دریای خزر و خاک جمهوری آذربایجان، از جنوب به زیر حوضه سفید رود، از شرق به دریای خزر و از غرب به زیر حوضه های ارس و سفید رود ° ° ° ° محدود می گردد و بین ′11 48 تا ′41 43 طول شرقی و ′55 16 تا ′11 18 عرض شمالی قرار دارد )شکل 3-1(. مساحت این زیر حوضه 5/6331 کیلومتر مربع می باشد که از این مقدار 5/3138 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی کمتر از صفر، 5/1351 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی صفر تا 811 متر، 3513/5 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی 811 تا 3611 متر، 5/837 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی 3611 تا 1411 متر و 5/117 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی 1411 تا 1111 متر و 5 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی باالی 1111 متر واقع شده است. از رودخانه های مهم آن می توان به سیاه رود )74 کیلومتر(، ماسوله )73 کیلومتر(، شاندرمن )71 کیلومتر(، شفارود )55 کیلومتر(، سیاه مزگی )53 کیلومتر(، لومیر )51 کیلومتر(، پسیخان )46 کیلومتر(، پیشرودبار )18 کیلومتر(، کرگانرود )18 کیلومتر( و آستاراچای )14 کیلومتر( اشاره

31 نمود )شکل 3-1(. از نظر کیفیت آب، رودخانه های این زیر حوضه در ارتفاعات از مناطق بی کربناته کلسیک، بی کربناته در سازندهای سیلیکاته و بی کربناته سولفاته به صورت پراکنده و ناپیوسته و در نواحی پست از مناطق بی کربناته، کلروره و سولفاته بی کربناته عبور می کنند )شکل 3-4( )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(.

شکل 2-1- هیدرولوژی زیر حوضه طالش- انزلی شکل 2-9- توپوگرافی زیر حوضه طالش- انزلی

شکل 2-4- کیفیت آب زیر حوضه طالش- انزلی

33 1 2-6-2-2-2- آستاراچای از رودخانه های مستقل زیر حوضه طالش- انزلی که در شمال مرکز شهرستان آستارا و در مرز ایران و جمهوری آذربایجان جریان دارد. از کوههای تویوخ با ارتفاع 3617 متر واقع در 17 کیلومتری غرب، آسبیناس با ارتفاع 1115 متر واقع در 33 کیلومتری غرب و خان بالغی با ارتفاع 1313 متر واقع در 13 کیلومتری جنوب غربی شهر آستارا سرچشمه می گیرد و پس از مشروب ساختن آبادیهای مسیرش به دریای خزر می ریزد. منبع تغذیه رودخانه نزوالت جوی بوده و در جهت غرب به شرق جریان دارد. طول رودخانه 14 کیلومتر، شیب متوسط بستر آن در کوهستان 5% و در جلگه 6/1 دصد است و در منطقه بی کربناته در سازندهای سیلیکاته جریان دارد )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. 2 2-6-2-2-1- کرگانرود از رودخانه های مستقل زیر حوضه طالش- انزلی که در غرب شهر هشتپر جریان دارد، دو رودخانه سوره چای و سله یوردی در آبادی آق اولر واقع در 11 کیلومتری شهر هشتپر به هم پیوسته و این رودخانه را تشکیل می دهند و پس از مشروب ساختن آبادیهای مسیرش به دریای خزر می ریزد. نام دیگر این رودخانه 6 5 4 1 سوقوشان می باشد و در مسیر خود رودخانه های کلور ، وزنه سر ، رزه و دش برو را نیز دریافت میکند. کند. منبع تغذیه رودخانه نزوالت جوی بوده و در جهت غرب به شرق جریان دارد. طول رودخانه 18 کیلومتر، شیب متوسط بستر آن در کوهستان 1% و در جلگه 3% است و در مناطق بی کربناته در سازندهای سیلیکاته، بی کربناته کلسیک، بی کربناته و سولفاته بی کربناته جریان دارد )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. 2-6-2-1- زیر حوضه چالوس زیر حوضه چالوس در جنوب دریای خزر واقع شده و از نظر وسعت پنجمین زیر حوضه از آبریز دریای خزر می باشد. حدود جغرافیایی آن از شمال به دریای خزر، از جنوب به حوضه آبریز ایران مرکزی، از ° ° شرق به زیر حوضه هراز و از غرب به زیر حوضه سفیدرود محدود می گردد و بین ′41 43 تا 11′ 51 ° ° طول شرقی و ′5 16 تا ′11 17 عرض شمالی قرار دارد )شکل 3-5(.مساحت این زیر حوضه 31417 کیلومتر مربع می باشد که از این مقدار 764 کیلومتر در سطوح ارتفاعی کمتر از صفر، 1335 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی صفر تا 811 متر، 1165 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی 811 تا 3611 متر، 5/1117 کیلومتر

1- Astara Chay 2- Kargan Rud 3- Kolur 4- Vazneh Sar 5- Razeh 6- Dash Beru

32 مربع در سطوح ارتفاعی 3611 تا 1411 متر، 3548 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی 1411 تا 1111 متر، 411 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی 1111 تا 4111 متر و 5/57 کیلومتر مربع در سطوح ارتفاعی باالی 4111 متر واقع شده است. از رودخانه های مهم آن می توان به پلرود )81 کیلومتر(، چالوس )71 کیلومتر(، لنگرود رود )53 کیلومتر(، شلمان رود )48 کیلومتر(، واز رود )48 کیلومتر(، آلش رود )48 کیلومتر(، چاک رود )47 کیلومتر(، کجور )45 کیلومتر(، چالک رود )44 کیلومتر( و آزاد رود )41 کیلومتر( اشاره نمود )شکل 3-6(.از نظر کیفیت آب رودخانه های این زیر حوضه در ارتفاعات از مناطق بی کربناته کلسیک، بی کربناته سولفاته به صورت پراکنده و ناپیوسته و بی کربناته سولفاته در سازندهای سیلیکاته و در نواحی پست از مناطق بی کربناته و سولفاته بی کربناته عبور می کنند )شکل 3-7( )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(.

شکل 2-5- هیدرلوژی زیر حوضه چالوس شکل 2-6- توپوگرافی زیر حوضه چالوس

شکل 2-7- کیفیت آب زیر حوضه چالوس

31 2-6-2-1-2- چالوس2 از رودخانه های مستقل زیر حوضه چالوس که در جنوب مرکز شهرستان چالوس جریان دارد، شاخه های این رودخانه از کوه حصار چال با ارتفاع 1886 متر واقع در 55 کیلومتری جنوب شرقی شهر تنکابن و کوه گوکول با ارتفاع 1431 متر واقع در 55 کیلومتری جنوب شهر چالوس سرچشمه می گیرد، در شمال آبادی انارک به هم پیوسته و رودخانه چالوس را تشکیل می دهند. این رودخانه پس از مشروب ساختن آبادیهای مسیرش از شهر چالوس عبور کرده و در بستر دلتایی خود به دریای خزر می ریزد. این رودخانه در مسیر خود رودخانه های ایلکا1، دونا رود1، اولی4، خشک رود، آسیاب رود، برا رود5 و حیسک6 را دریافت میکند. منبع تغذیه ی رودخانه، نزوالت جوی بوده و در جهت جنوب غرب به شمال شرق جریان دارد. طول رودخانه 71 کیلومتر، شیب متوسط بستر آن در کوهستان 5% و در جلگه 3% است و در مناطق بی کربناته در سازندهای سیلیکاته، بی کربناته کلسیک، بی کربناته سولفاته به صورت پراکنده و ناپیوسته، بی کربناته و سولفاته بی کربناته جریان دارد )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. 7 2-6-2-1-1- چشمه کیله از رودخانه های مستقل زیر حوضه چالوس که در جنوب غربی مرکز شهرستان تنکابن جریان دارد، دو رودخانه دوهزار و سه هزار در آبادی پرده سر واقع در حدود 35 کیلومتری جنوب شهر تنکابن به هم پیوسته و این رودخانه را تشکیل می دهند. این رودخانه پس از مشروب ساختن آبادیهای مسیرش از شهر تنکابن عبور کرده و به دریای خزر می ریزد. این رودخانه در مسیر خود رودخانه ی ولمرود را نیز دریافت 8 می کند و رودخانه های گر کو کیله ، آسیاب رود و ولی آباد از انشعابات آن می باشند. منبع تغذیه رودخانه نزوالت جوی بوده و در جهت جنوب به شمال جریان دارد. طول رودخانه 33 کیلومتر و شیب متوسط بستر آن 3% است و در مناطق بی کربناته کلسیک، بی کربناته و بی کربناته سولفاته جریان دارد )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(.

1- Chalus 2- Ilka 3- Duna Rud 4- Owli 5- Bara Rud 6- Hisak 7- Cheshmeh Kileh 8- Gar Ku Kileh

34 1 2-6-2-1-9- سرداب رود از رودخانه های مستقل زیر حوضه چالوس که در جنوب غرب مرکز شهرستان چالوس جریان دارد، از کوه والر با ارتفاع 1111 متر واقع در 11 کیلومتری جنوب غربی شهر چالوس سرچشمه می گیرد و پس از مشروب ساختن آبادیهای مسیرش به دریای خزر می ریزد. این رودخانه در ابتدای مسیر با نام رودخانه سرداب رود و در انتهای مسیر با نام رودخانه ذوات1 جریان دارد و در مسیر خود رودخانه ملک جوب را دریافت می کند. منبع تغذیه رودخانه نزوالت جوی بوده و در جهت جنوب غرب به شمال شرق جریان دارد. طول رودخانه 13 کیلومتر، شیب متوسط بستر آن در دشت کوهستانی کالردشت 1%، در کوهستان %4 و در جلگه 3% است و در مناطق بی کربناته سولفاته به صورت پراکنده و ناپیوسته، بی کربناته و سولفاته بی کربناته جریان دارد )سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 3181(. 2-6-1- ماهیان دریای خزر دریای خزر به دلیل دارا بودن گونه های با ارزش ماهیان خاویاری و استخوانی از اهمیت خاص اکولوژیکی و اقتصادی در دنیا برخوردار می باشد. فون ماهیان دریای خزر در مقایسه با آبهای آزاد از تنوع کمتری برخوردار بوده )آکادمی علوم قزاقستان، 3334( و بیشتر منابع آن کوچک جثه و به شدت آسیب پذیر می- باشند )تقوی، 3177(. به جز کفال ماهیان و کیلکا ماهیان که تمام دوران زندگی خود را در دریا سپری می- کنند، بیشتر ماهیان استخوانی در زمان تولید مثل به رودخانه های منتهی به دریای خزر مهاجرت کرده و الروهای این ماهیان بعد از نمو اولیه مجدداً به دریا مهاجرت می کنند )وثوقی و مستجیر، 3185(. ماهیان دریای خزر با توجه به جنبه های اکولوژیکی به چهار گروه تقسیم می شوند )Zenkevitch, 1963(: 3- ماهیان دریایی مانند کفال ماهیان و کیلکا ماهیان 1- ماهیان رود کوچ مانند آزاد ماهیان 1- ماهیان نیمه مهاجر مانند ماهی سفید 4- ماهیان رودخانه ای مانند اردک ماهی Berg )1965(، 354 گونه و زیر گونه و Kazancheev )1981(، نزدیک به 311 گونه و زیر گونه ماهی را برای دریای خزر معرفی کردند. در سال 3331 فون ماهیان دریای خزر به غیر از حوضه آبریز آن 311 گونه و زیر گونه گزارش شد )رضوی صیاد، 3178(. طبق آخرین مطالعات انجام شده فون ماهیان دریای خزر 316 گونه می باشد )CEP, 1998(. در حال حاضر با در نظر گرفتن ماهیان غیر بومی 51 جنس و 73 گونه که متعلق به 38 خانواده و 31 راسته می باشند در دریای خزر شناسایی شده است که در این بین کپور

1- Sardab Rud 2- Zavat

35 ماهیان و گاو ماهیان به لحاظ تعداد جنس و گونه متنوع ترین خانواده ها می باشند. ماهیان شناسایی شده اغلب ساکن آب شیرین )رودخانه ها و تاالب ها( می باشند و حدود 11% از آنها را ماهیان مهاجر از دریا به رودخانه تشکیل می دهند. ماهیان غیر بومی در سالهای اخیر در خزر افزایش یافته و حدود 37% از گونه های این منطقه را به خود اختصاص داده اند )عبدلی و نادری، 3187(. تمامی ماهیان استخوانی موجود در دریای خزر بومی این دریا نبوده و در سالهای گذشته تعدادی از ماهیان از قبیل آمور، فیتوفاگ، کپور سرگنده و کفال به این دریا معرفی و پیوند زده شده اند )شریعتی، 3173(. در واقع سه خانواده کفال ماهیان، پهن ماهیان و گامبوزیا یا کپور ماهیان دندان دار زنده زا به وسیله انسان به دریای خزر معرفی گردیدند )Zenkevitch, 1963(. 44% از گونه های ماهیان دریای خزر قابلیت بهره برداری اقتصادی دارند و 14% از آنها انحصاری این دریا بوده و در سایر نقاط دنیا وجود ندارند بنابراین به لحاظ حفاظتی دارای ارزش ویژه- ای بوده ضمن اینکه از خصوصیات ویژه این اکوسیتم منحصر به فرد هستند و می بایست نسبت به حفاظت از آنها تمهیدات خاصی صورت گیرد. 8 خانواده از ماهیان دریای خزر دارای این گونه ها هستند که خانواده 3 گاو ماهیان با 41% دارای بیشترین تعداد گونه انحصاری می باشند )عبدلی و نادری، 3187(. طی سالهای متمادی، ترکیب گونه ای ماهیان استخوانی دریای خزر دچار تغییرات زیادی شده است که مهمترین عامل آن دخالت و تأثیر فعالیتهای انسانی می باشد. احداث سد در رودخانه های منتهی به دریای خزر، صید بی رویه و استحصال از ذخایر، آلودگی رودخانه ها، برداشت بیش از حد شن و ماسه از مصب رودخانه ها و تخریب مناطق چراگاهی، برداشت بیش از حد آب رودخانه ها در فصل زراعت و کاهش سطح آب دریای خزر از مهمترین عواملی می باشند که ترکیب گونه ای ماهیان استخوانی را در چند دهه گذشته از نظر کمی و کیفی شدیداً تحت تأثیر قرار داده است. به دنبال کاهش شدید صید ماهیان استخوانی، اقدامات اولیه برای بازسازی مصنوعی ذخایر این ماهیان نظیر آزاد، سفید، کلمه، سیم و سوف توسط سازمان شیالت ایران آغاز گردید. هر چند که در چند سال اخیر صید ماهیان استخوانی به دلیل بازسازی مصنوعی ذخایر آنها افزایش نسبی یافته است ولی غالبیت صید با 1 گونه ماهی سفید، کفال طالیی و کپور می باشد و ذخایر سایر ماهیان استخوانی نظیر سیم، سس، آزاد، ماش، کلمه و ... به شدت کاهش یافته و برخی از گونه ها نیز در معرض خطر انقراض نسل می باشند )دریانبرد و همکاران، 3187(. بر اساس طبقه بندی مؤسسه جهانی حفاظت از طبیعت1، 6% از گونه های خزر شدیداً در معرض خطر انقراض و 13% نیازمند حفاظت بوده و تنها %16 وضعیت خوبی دارند )عبدلی و نادری، 3187(.

1- Endemic 2- IUCN

36 2-6-1-2- آزاد ماهیان2 2-6-1-2-2- خصوصیات خانواده آزاد ماهیان آزاد ماهیان از جمله ماهیان استخوانی هستند که در اثر تکامل شعاع بالگان به وجود آمده اند )کریم پور و حسین پور، 3167(. همچنین از مهمترین گونه های پرورشی ماهیان در سراسر دنیا می باشند و پرورش آنها قرنهاست که در جوامع مختلف در حال انجام است )Lee and Donaldson, 2001(. ماهیانی که به این تیره تعلق دارند ماهیانی در اندازه های بزرگ و متوسط هستند. فرم بدن دراز و از فلسهای متراکمی پوشیده شده 2 است. روی سر فلس ندارند، دارای خط جانبی هستند، استخوان پیش فکی در آنها بی حرکت است. دهان معموالً مخروطی است و به ندرت در بعضی از فرمها زیرین یا باالیی می باشد. نمو دندانها مختلف است، گاهی فاقد دندانند و گاهی پرده های آبششی متصل نیستند و از Isthmusa جدا هستند. شعاع آبششی بین 31-31 عدد است. میله های آبششی در جنسهای مختلف متفاوت است. همگی باله چربی دارند. باله پشتی معموالً در وسط پشت قرار دارد، باله دمی معموالً دارای فرورفتگی است و کمتر بریده شده است. شکم بدون کیل و دارای انحنا می باشد. دارای کیسه شنا هستند که بزرگ است و تخمریزی آنها در آب شیرین صورت می گیرد )بریمانی، 3156 و وثوقی و مستجیر، 3185(. ماهیان ماده این خانواده فاقد مجرای تخم بر می باشند و تخم پس از رسیدگی در حفره شکمی افتاده و سپس از مجرای تناسلی به خارج هدایت می- شود. از این رو می توان با کشیدن دست در زیر شکم ماهی مولد رسیده، تخمها را به آسانی از بدن آن خارج نمود. در خانواده آزاد ماهیان، ماهیان مهاجر باال رو1 که برای تخمریزی از دریا وارد آب شیرین می- شوند وجود دارند. به عالوه ماهیان مهاجر رود رو4 نیز در بین آنها یافت می شوند که در آبهای رودخانه ها و دریاچه ها زندگی می کنند و فقط در همان محل زندگی خود که آب شیرین است، مهاجرتهایی به قسمتهای باالتر انجام می دهند. ماهیان این خانواده در آبهای سرد با اکسیژن فراوان زندگی می کنند و در پاییز و زمستان تخمریزی می نمایند. در میان آنها، نژادهای مختلف بر حسب شرایط محلی ایجاد شده اند که از نظر شکل بدن و نحوه زندگی با هم متفاوت هستند و به همین جهت شناسایی آنها به دلیل تنوع زیادشان مشکل می نماید. ماهیان این خانواده از نظر اقتصادی بسیار با ارزش و دارای گوشتی لذیذ میباشند )وثوقی و مستجیر، 3185(. آزاد ماهیان به گونه های ماهیان شمالی تعلق دارند )شکل 3-8( و وجود بعضی از آنها در دریاهای سیاه، مازندران و آرال به دلیل ارتباطی است که این دریاها در گذشته با دریاهای شمالی داشته اند )بریمانی، 3156(. خانواده آزاد ماهیان دارای 6 جنس به نامهای Hucho ،Salmo،

1- Salmonidae 2- Inter maxillare 3- Anadromous 4- Potamodromous

37 Salvelinus ،Salmothymus ،Oncorhynchus و Stenodus می باشند )وثوقی و مستجیر، 3185( و Salmo ،Onchorhynchus ،Stenodus ،Coregonus و Salvelinus از جنس های موجود در ایران هستند )ستاری و همکاران، 3181(. از گونه های موجود در ایران می توان به موارد ذیل اشاره نمود )ستاری و همکاران، 3181(: - Coregonus lavaretus (Linnaeus, 1758) - Coregonus lavaretus (Linnaeus, 1758) - Stenodus leucichthys (Guldenestaedt, 1772) - Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) - Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum, 1792) - Oncorhynchus keta (Walbaum, 1792) - Oncorhynchus kisutch (Walbaum, 1792) - Salvelinus fontinalis (Mitchill, 1814) و زیر گونه های موجود در ایران نیز عبارتند از )ستاری و همکاران، 3181(: - Salmo trutta caspius (Kessler, 1877) - Salmo trutta fario (Linnaeus, 1758)

شکل 2-8- پراکنش جغرافیایی آزاد ماهیان در جهان 2-6-1-2-1- خصوصیات جنس Salmo در جنس سالمو دهان بزرگ است. اتصال آرواره زیرین به جمجمه در عقب خط قائمه کناره عقبی چشمها 3 است. آرواره باالیی تا خط قائمه کناره عقبی چشم می رسد و یا از آن می گذرد. استخوان وومر دراز و باریک است. فلسها درشت نیستند و تعداد آنها در طول خط جانبی از 311 تا 111 عدد است. باله های مخرجی و پشتی معموالً کوتاهند و بیش از 31-31 شعاع باله ندارند. در تخمریزی فرم جمجمه، آرواره ها، دندانها و ... به شدت تغییر می کند و این تغییرات فرم در ماهی نر بیش از ماده است )بریمانی، 3156(. 2-6-1-1- ماهي آزاد دریای خزر ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ایران )شکل 3-3( با نام علمی Salmo trutta caspius در واقع نوعی قزل آالی قهوه ای است که به خاطر جثه بزرگ و محیط زیست دریایی آن، به ماهی آزاد دریای خزر

1- Vomer

38 معروف گردیده )عمادی، 3164( و به راسته Salmoniformes، خانواده Salmonidae و جنس Salmo تعلق دارد )Berg, 1984(.

شکل 2-3- ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ایران 2-6-1-1-2- رده بندی Phylum: Chordata Class: Osteichthyes Order: Salmoniformes Family: Salmonidae Rafinesque, 1815 Genus: Salmo Linnaeus, 1758 Species: Salmo trutta Linnaeus, 1758 Synonyms: Salmo caspius Kessler, 1877; Salmo trutta caspius Kavraiskii, 1897; Salmo trutta labrax Berg, 1916; Salmo fario caspius Derzhavin, 1934; Salmo caspius Derzhavin, 1939 Common names: Russian: kaspiiskiy losos; Kazakh: kaspiy albarty; Turkmenian: Kaspi azatmahysy (kumja); Azerbaijani: gyzyl balyg, azatmai, aragez, albat; Iranian: Azat-mai; English: Caspian trout 2-6-1-1-1- خصوصیات ظاهری بدن کشیده و از طرفین کمی فشرده است و به رنگهای مختلف دیده می شود، به طوری که در پهلوها روشن تا بنفش تیره و قسمت پشتی به رنگ زیتونی تیره است. سطح بدن دارای لکه های تیره ای به حالت ضربدر یا صلیب مانند است. باله های پشتی و مخرجی نیز دارای لکه های رنگی می باشند. پوزه کشیده و فکین نیز مجهز به دندان است. طول سر در ماهی بالغ، 3/11-5/37 درصد از طول بدن را تشکیل می دهد. بدن پوشیده از فلس است. تعداد فلس های بین باله چربی و خط جانبی بین 33-33 عدد است و بر روی خط جانبی 311 ،11-11/13-15، 333 فلس دیده می شود. دارای دو باله پشتی است که اولین باله پشتی 3 دارای 4-1 عدد شعاع سخت و 31-8 عدد شعاع نرم )D: III–IV / 8-10( و دومین باله پشتی یا باله چربی بدون شعاع سخت و نرم است. باله مخرجی دارای 1-1 عدد شعاع سخت و 3-7 عدد شعاع نرم ) A: II-III 9-7 /( و باله شکمی دارای یک عدد شعاع سخت و 8-7 عدد شعاع نرم )V: I / 7-8( می باشد. در اولین

1- Adipose fin

39 کمان آبششی دارای 11-36 عدد خار آبششی است اما رقم معمول آن 11-38 عدد است )Berg, 1984(. در نمونه های بالغ، طول باله سینه ای تقریباً دو برابر طول باله شکمی است. باله های پشتی و مخرجی نیز دارای نقاط رنگی می باشند )Farid Pak, 1968b(. این ماهی در دریای خزر دارای سه زیر گونه است و زیر گونه ای که بیشتر در سواحل ایران مشاهده می گردد بسیار کوچکتر از ماهی آزاد کورا بوده وزن متوسط آن 1811 گرم، حداکثر طول آن 331 سانتیمتر و حداکثر وزن آن نیز 31111 گرم می باشد )بریمانی، 3156(. دامنه طولی و وزنی ماهیان آزاد ماده در سواحل ایران بر اساس گزارش 1968b( Farid Pak( به ترتیب 315-51 سانتیمتر )میانگین 6/77 سانتیمتر، n= 346( و 31771-3111 گرم )میانگین 4867 گرم( می باشد )عمادی، 3164(. 2-6-1-1-9- پراکنش جغرافیایي 1968b( Farid Pak(، عنوان نمود که ماهی آزاد دریای سفید حدود 35-31 هزار سال قبل به دریای خزر راه یافته و از آنجا به دو طریق مختلف به دریاهای سیاه و آرال نفوذ کرده است )عمادی، 3164(. ماهی آزاد در ایران در قسمتهای جنوبی، غربی و شمالی دریای خزر پراکنش دارد )شکل 3-31(. این ماهی دریازی رودکوچ بوده و در ایران برای تخمریزی به رودخانه های استان های گیالن، مازندران از جمله آستارا، کرگانرود، شفارود، ناورود، سفیدرود، صفارود، تنکابن، سردآبرود، چالوس، بابل رود و ... وارد می شود )عباسی و همکاران، 3178؛ Kiabi et al., 1999; Armantrout, 1980(.

www.caspianenvironment.org شکل 2-21- پراکنش جغرافیایی ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ایران ) ( 2-6-1-1-4- زیستگاه ماهی آزاد بیشتر عمر خود را در دریا سپری می کند. پس از ورود به دریا، 5-1 سال در دریا تغذیه و رشد کرده و پس از رسیدن به سن بلوغ به رودخانه مادری مهاجرت می کند )کریم پور و حسین پور، 3167(.

21 2-6-1-1-5- تغذیه آزاد ماهیان شکارچی و دارای رژیم گوشتخواری می باشند و جانوران ریز آبزی مانند ماهی را شکار میکنند و میبلعند )www.fishbase.org(. تغذیه بچه ماهیان آزاد در طبیعت ابتدا از زئوپالنکتون ها، الرو حشراتی چون: Chironomidae ،Gammaridae ،Ephemeroptera ،Plecoptera، پاروپایان، کرمها و سپس از بچه- ماهیان ریز انجام می گیرد و پس از ورود به دریا از انواع ماهیان نظیر کیلکا ماهیان، گل آذین ماهیان، شگ- ماهیان جوان، سایر بچه ماهیان و کفزیان تغذیه می کنند )Kazancheev, 1981(. 2-6-1-1-6- تولید مثل ماهیان آزاد در سن 4-1 سالگی و حداکثر 5 سالگی بالغ می شوند )Kazancheev, 1981(. 45% ماهیان آزاد مهاجر به رودخانه ها را ماهیان نر و 55-51 درصد آنها را ماهیان ماده تشکیل می دهند. بدین ترتیب نسبت تقریباً متعادلی از ماهیان نر و ماده جهت تکثیر به رودخانه ها کوچ می نمایند )کریم پور و حسین پور، 3167(. مکان مناسب رودخانه برای تکثیر طببیعی این ماهی باید دارای مشخصاتی نظیر آب زالل، خنک، سرشار از اکسیژن و بستر سنگریزه ای و شنی )منطقه اپی لیتورال رودخانه( باشد. در چنین مکانی، ماهی نر با استفاده از باله سینه ای و دمی خود به حفر گودال می پردازد و ماهی ماده تخمکهای خود را در آن ریخته و سپس ماهی نر اسپرم ریزی نموده و روی تخمها را با ماسه می پوشاند )Kazancheev, 1981(. به 3 تخمهای زیر شن و ماسه اصطالحاً رد گفته می شود )عبدلی و نادری، 3187(. مولدین ماهی آزاد حوضه °c جنوبی دریای خزر ایران در آب با دمای 31-4 و اشباع از نظر اکسیژنی بسته به شرایط رودخانه تکثیر می- °c کنند )ستاری و همکاران، 3181(. دمای باالی 35 باعث مرگ و میر تخمها می شود. ماهیان بالغ تا دمای °c °c °c 13 زنده مانده و دمای مطلوب برای آنها بین 14-38 و دمای ترجیحی 6/37-4/31 می باشد 2 )www.Caspianenvironment.org(. آزاد ماهیان تخمریزی کرده را کلت می نامند )بهرامیان، 3174(. بر خالف سایر آزاد ماهیان واقعی، زیر گونه ای که وارد رودخانه های ایران می شود پس از تخمریزی نمیمیرد بلکه مجدداً به دریا مراجعت می نماید. هماوری ماهی آزاد در رودخانه های ایران بین 31511-1311 عدد تخم می باشد. تخمهای این ماهی درشت بوده، قطر متوسط آنها 3/5 میلیمتر و حداقل و حداکثر قطر تخم گزارش شده نیز 4/1 و 3/6 میلیمتر می باشد. مدت زمان انکوباسیون تخمها بسته به شرایط دمای آب -55 11 شبانه روز طول می کشد )Kazancheev,.) 1981 الروها اوایل بهار از تخم خارج شده و از میان 1 سنگریزه ها بیرون می آیند )Alevin( و بعد از 4-1 هفته آماده تغذیه می شوند که در این حالت به آنها پار گفته می شود. پارها به مدت 1-1 سال در آب شیرین می مانند، تغذیه می کنند سپس تغییر رنگ داده و

1- Redd 2- Kelt 3- Parr

23 شفاف می شوند و از نظر فیزیولوژیکی آمادگی ورود به آب شور را پیدا می کنند که در این حالت به آنها 3 اسمولت گفته می شود. اسمولت ها در ماههای خرداد، تیر و مرداد به طرف دریا مهاجرت می کنند و فواصل زیادی را در دریا پیموده، تغذیه نموده و پس از گذراندن 1-1 سال در دریا به طرف رودخانه 2 مهاجرت نموده و هنگام رسیدن به رودخانه تغذیه نمی کنند که در این حالت به آنها سالمون گفته می شود )بهرامیان، 3174(. چرخه زندگی آزاد ماهیان به صورت زیر می باشد )شکل Laird and ( )33-3 :)Needlham, 1988 Egg  Alevin  Fry  Parr  Smolt  Adult  Spawner

شکل 2-22- چرخه زندگی آزاد ماهیان )www.seascapemodeling.org( 2-6-1-1-7- مهاجرت ماهی آزاد دریای خزر از جمله ماهیان مهاجر رود رو و بومی دریای خزر می باشد )بریمانی، 3156(. این ماهی دارای دو فرم بهاره و پاییزه می باشد. مهاجرت پاییزه این ماهی از 35 شهریور تا 5 آبان ماه انجام گرفته و برای تخمریزی به رودخانه های کورا، ترک، سامور و رودخانه های کوچک سواحل جنوبی دریای خزر از جمله: آستارا، کرگانرود، شفارود، ناورود و به ویژه تنکابن مهاجرت می نماید ولی در رودخانه های ولگا و اورال به ندرت دیده می شود. مهاجرت بهاره نیز در ماههای اسفند و فروردین انجام می گیرد و ماهیان خود را به قسمتهای باالدست رسانیده و چندین ماه را در آنجا به سر می برد. حدود 71% ماهیهای آزاد که جهت تخمریزی به رودخانه های ایران کوچ می کنند دارای مهاجرت پاییزه )تخمدان رسیده( و %11 دارای مهاجرت بهاره )نارس( می باشند. مهاجرین پاییزه از اهمیت بیشتری برای زادآوری و تأمین ذخایر برخوردارند، به طوری که امروزه مولدین مورد استفاده در مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر کالردشت از این دسته اند و مهاجرین بهاره به دلیل عدم سازش پذیری با محیط مصنوعی )شرایط کارگاهی( فاقد این امتیاز می باشند )کریم پور و حسین پور، 3167(. مهاجرت بچه ماهیان اسمولت آزاد

1- Smolt 2- Salmon

22 حوضه جنوبی دریای خزر ایران از سواحل ایران به داغستان اتفاق می افتد .)www.Caspianenvironment.org( 2-6-1-1-8- ارزش اقتصادی ماهی آزاد دریای خزر از نظر کیفیت گوشت، ارزش اقتصادی )Kazancheev, 1981( و همچنین حفظ ذخیره ژنتیکی )عبدلی و نادری، 3187( از اهمیت و ارزش زیادی برخوردار می باشد و کامالً با فرهنگ و ذائقه مردم استانهای شمالی کشور سازگاری پیدا کرده به طوری که گرانترین ماهی از نظر ارزش واحد در شمال کشور محسوب می گردد )بهرامیان، 3174(. جدول 3-3 قیمت فروش هر کیلوگرم گوشت ماهی آزاد دریای خزر در سالهای 3131 و 3133 را به تفکیک جنس در بازار ماهی فروشان شهرستان تنکابن نشان میدهد. بیشترین قیمت فروش جنس های نر و ماده این ماهی مربوط به سال 3133 می باشد و در اوایل و اواخر فصل صید به دلیل عرضه کم در بازار دارای باالترین قیمت فروش می باشد. جدول 2-2- قیمت هر کیلوگرم گوشت ماهی آزاد دریای خزر در بازار ماهی فروشان تنکابن طی سالهای 3131 و 3133 سال صید جنس ماهي بیشترین قیمت )ریال( کمترین قیمت )ریال( 2931 ماده 3111111 551111 نر 3511111 751111 2932 ماده 3661111 711111 نر 3331111 311111

2-6-1-1-3- صید بر اساس گزارش های کمیته علمی آمار صید سازمان شیالت ایران در سال صیادی 31-3133 میزان صید ماهی آزاد دریای خزر در استانهای مازندران و گیالن به ترتیب 1/1 و 1/1 تن بوده است. شکل 3-31 میزان صید ماهی آزاد دریای خزر طی سالهای بهره برداری 81-3173 تا 31-3133 را نشان می دهد که بیشترین میزان صید انجام شده مربوط به سال بهره برداری 81-3181 به میزان 5/34 تن بوده است.

شکل 2-21- میزان صید ماهی آزاد دریای خزر طی سالهای بهره برداری 3173-3133 )گزارش های کمیته علمی آمار صید سازمان شیالت ایران( 2-6-1-1-21- عوامل مؤثر بر کاهش ذخایر در گذشته رودخانه های بسیاری در ایران میزبان کوچندگان ماهی آزاد برای تکثیر بوده اند که رودخانه های چالوس، سردآبرود، کاظم رود، چشمه کیله، شیرود، صفارود، ناورود، شفارود، کرگانرود و آستارا از آن جمله بوده اند )بهرامیان، 3181(. اما در سالهای اخیر رشد جمعیت و پیشرفت ابزار و ادوات صید )بهرامیان، 3176(، صید بی رویه و غیر مجاز )وثوقی و مستجیر، 3185، شکیبی دریاکناری، 3173، جمالزاده، 3181، عبدلی و نیک سیرت، 3186 و www.fishbase.org(، آلودگی دریاها و منابع آبی، از بین رفتن زیستگاه ها و مناطق طبیعی تخمریزی )وثوقی و مستجیر، 3185، جمالزاده، 3181 و عبدلی و نیک سیرت، 3186(، کاهش نزوالت آسمانی )بهرامیان، 3181(، برداشت شن و ماسه و ایجاد تغییرات در مسیر و بستر رودخانه )شکیبی دریاکناری، 3173 و www.fishbase.org(، موانع موجود بر سر راه مهاجرت از دریا به رودخانه ها در هنگام تخمریزی نظیر پل ها و سدها و در نتیجه مسدود شدن مسیر مهاجرت )وثوقی و مستجیر، 3185، جمالزاده، 3181، عبدلی و نیک سیرت، 3186 و www.fishbase.org(، ورود فاضالبهای خانگی، کشاورزی و صنعتی به آب رودخانه ها )شکیبی دریاکناری، 3173 و جمالزاده، 3181(، سیالبی شدن رودخانه های منتهی به حوضه جنوبی دریای خزر در فصل تکثیر، پرندگان مهاجر ماهیخوار )بهرامیان، 3176(، عدم نظارت الزم بر حفاظت دریا و رودخانه و رهاسازی بچه ماهیان )جمالزاده، 3181(، ضعف اجرایی سازمانهای ذیربط و عدم هماهنگی های الزم در این زمینه )بهرامیان، 3176(، محدودیت نرخ تکثیر مصنوعی )www.fishbase.org(، تالش در دستکاری ژنتیکی و دورگه گیری و احتماالً نقص در تکامل مکانیزم های فیزیولوژیک مربوط به فرآیند اسمولت شدن طی تکثیر مصنوعی به علت غیاب عوامل اکولوژیک مؤثر در

24 محیطهای مصنوعی )عبدلی و نیک سیرت، 3186( باعث تهدید جمعیت و در مواردی کاهش موفقیت در بازسازی ذخایر این گونه ارزشمند از طریق تکثیر مصنوعی شده است. Coad )1980(، این ماهی را طبق معیارهای IUCN در لیست قرمز و در طبقه در معرض خطر انقراض3 قرار داد )عبدلی و نیک سیرت، 3186(. در حال حاضر حدود 5-4 رودخانه در طول کرانه جنوبی دریای خزر ایران از جمله )سردآبرود، چالوس، چشمه کیله، شفارود و کرگانرود( محل اصلی مهاجرت این ماهی می باشند و اگر در حفظ و مراقبت از شرایط زیستی این رودخانه ها کوشش و برنامه ریزی به عمل نیاید، چه بسا در آینده ممکن است این رودخانه ها نیز شانس میزبانی کوچندگان ماهی آزاد را نداشته باشند )بهرامیان، 3181(. کاهش میزان صید مولدین ماهی آزاد توسط مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر کالردشت در سالهای اخیر باعث بروز مشکالت جدی در امر تکثیر مصنوعی و بازسازی ذخایر این ماهیان با ارزش شده است )رهبر و همکاران، 3188( و این مسأله به نوبه خود سبب کاسته شدن میزان رهاسازی بچه ماهیان تولید شده در رودخانه های مورد نظر می شود. از طرف دیگر این کاهش صید سبب شده که در فصل تکثیر از توان تکثیر تعداد معدودی از مولدین استفاده شود که خطر کاهش تنوع ژنی این ماهیان را در آینده به دنبال دارد 2 به طوری که هم اکنون این گونه در فهرست ماهیان به شدت در معرض خطر انقراض قرار دارد ) Kiabi et .)al., 1999 2-6-1-1-22- راهکارهای حفاظتي و بازسازی ذخایر شرکت سهامی شیالت ایران به منظور حفظ و افزایش ذخایر ماهی آزاد دریای خزر، با مشارکت روسها مبادرت به احداث مرکز بازسازی ذخایر آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر کالردشت نمود و از سال 3161 رسماً کار خود را آغاز نمود. رودخانه چشمه کیله به عنوان زیستگاه و بانک اصلی ذخایر ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر در امر بازسازی ذخایر این گونه بسیار با اهمیت است زیرا مولدین مورد نیاز مرکز کالردشت عمدتاً از این رودخانه تأمین می گردند. این مرکز در حال حاضر نیز با تولید ساالنه صدها هزار بچه ماهی و رها سازی آنها در اوایل بهار و پاییز در مصب، زیر پل و باالدست رودخانه های چشمه کیله و سردآبرود نقش مهمی در این راستا ایفا می کند )بهرامیان، 3174(. به طوری که میزان تولید و رهاسازی بچه ماهی آزاد دریای خزر از سال 3173 تا 3188 به ترتیب 451، 161، 144، 115، 151، 116، 3/633، 464، 411 و 481 هزار قطعه و میزان صید ماهی آزاد از سال 3184 تا 3183 به ترتیب 8/1، 6/1، 1/1، 1/5، 6/1 و 3/6 تن بوده است )قربانزاده و نظری، 3183(. از دیگر راهکارهای مؤثر در حفظ و بازسازی ذخایر این گونه می توان به کنترل صید و صیادی و بهبود زیستگاه، فرهنگ سازی و افزایش آگاهی جوامع محلی و بهره برداران )بهرامیان، 3174(، بررسی و مطالعه جامع و کامل بر روی اکوسیستم های محل زیست این ماهی و پیدا

1- Endangered 2- ritically Endeangered

25 کردن نیازهای اکولوژیکی و بهینه سازی آنها، ایجاد هماهنگی الزم و حس مسئولیت پذیری بیشتر سازمانهای ذیربط از قبیل شیالت، محیط زیست، سپاه و ... به منظور پشتیبانی هر چه بهتر از نسل این ماهی و مدیریت زمان و مکان رهاسازی بچه ماهیان اشاره نمود )بهرامیان، 3176(. 2-7- تعاریف واژه ها و اصطالحات 2-7-2- جمعیت یک جمعیت، گروهی از افراد درون آمیزش است که از نظر تولید مثلی از گروه های دیگر همان گونه، جدا هستند اما به علت نبود جداسازی کامل میان جمعیتها )یعنی وجود جریان ژنی بین جمعیتها( به عنوان گونه قلمداد نمی گردند. اعضای دو جمعیت از یک گونه اگر فرصتی پیدا نمایند قادرند فرزندان بارور تولید کنند .)Templeton, 2004( 2-7-2-2- ساختار جمعیت ساختار جمعیتی یک گونه می تواند یک جمعیت تولید مثلی منفرد یا جمعیتهای متعدد مجزا که تنها گاهی با هم تبادالت گامتی دارند ولی در اصل به وسیله فاصله جغرافیایی از هم جدا هستند یا جمعیتهایی که در کنار هم زندگی می کنند ولی از نظر تولید مثلی مجزا هستند و یا ترکیبی از تمام حاالت باال باشد ) ,Whitmore 3 1990(. بر خالف این حاالت، در جمعیتهای پانمیکتیک دیده می شود. یک جمعیت پانمیکتیک جمعیتی است که در آن تمام افراد جمعیت، پتانسیل جفت گیری با یکدیگر را دارند. این فرضیه که در آن هیچ گونه محدودیت جفت گیری نه از لحاظ ژنتیکی و نه از لحاظ رفتاری وجود ندارد، امکان به وجود آمدن موجود دارای صفات جدید را امکان پذیر می نماید )Tilman et al., 1996(. 2-7-1- ذخیره یک واحد ذخیره به گروهی از ماهیان که در یک محیط ویژه یا به شیوه ای خاص پراکنده شده اند، اطالق می گردد )Ciftci and Okumus, 2002(. 2-7-9- ارزیابي تنوع ژنتیکي جمعیت وجود گوناگونی های ژنتیکی در افراد یک جمعیت را تنوع ژنتیکی آن جمعیت می نامند. مطالعه تنوع ژنتیکی فرآیندی است که در آن تفاوت بین افراد، جمعیتها و یا گروهها با استفاده از روشهای آماری خاص و بر اساس داده های حاصل از ارزیابی صفات مختلف بررسی می شود )Rousset, 2004(.

1- Panmictic or Panmixia

26 1 2-7-9-2- آللهای واقعي و مؤثر راههای مختلفی برای بررسی تنوع ژنتیکی وجود دارند که ساده ترین آنها اندازه گیری فراوانی آللها یا ژنوتیپها می باشد. آللهای واقعی در حقیقت تعداد آللهای مشاهده شده در هر جایگاه ژنی است. این معیار به شدت تحت تأثیر اندازه نمونه بوده به همین جهت این امکان وجود دارد که در آزمایشهای گوناگون با تعداد نمونه های متفاوت تعداد آللهای واقعی مختلفی برای یک جایگاه معین به دست آید. معیار دیگری که منعکس کننده تعداد آللها است، تعداد آللهای مؤثر می باشد. این معیار بیانگر تعداد آللهایی است که هتروزایگوسیتی یکسان ایجاد می کنند. در شرایطی که همه آللها دارای فراوانی یکسان بوده و تحت تأثیر آللهای نادر قرار نگیرند )P≤ 0.01( تعداد آللهای مؤثر در یک جمعیت برابر تعداد آللهای واقعی خواهد بود. تعداد آللهای مؤثر به فرمول زیر محاسبه می شود )Peakall and Smouse, 2005(:

NE= 1 / 1 - HE Pi: فراوانی هر یک از آللها، ∑: جمع فراوانیهای به دست آمده 2 2-7-9-1- تنوع ژني یا هتروزایگوسیتي هتروزایگوسیتی شاخصی برای ارزیابی تنوع ژنتیکی است و اهمیت زیادی در مطالعه جمعیتها دارد زیرا تأمین کننده طیف وسیعی از ژنوتیپ به عنوان پاسخی به سازش پذیری در شرایط متغیر محیطی است. فراوانی هتروزایگوتها از این جهت اهمیت دارند که هر هتروزایگوت ناقل آللهای متفاوتی است و این نشان دهنده وجود تنوع می باشد به همین دلیل معمول ترین معیار تنوع ژنتیکی در یک جمعیت میزان هتروزایگوسیتی می باشد، این معیار اغلب برای یک مکان ژنی و یا میانگین تعدادی مکان ژنی گزارش می شود )Peakall and Smouse, 2005(. - محاسبه هتروزایگوسیتی مشاهده شده )HO(: HO = NO – of – Hets / N HO: هتروزایگوسیتی مشاهده شده، N: تعداد نمونه - محاسبه هتروزایگوسیتی قابل انتظار )HE(: 2 HE = 1 - ∑Pi HE: هتروزایگوسیتی قابل انتظار، P: فراوانی آللی در هر جایگاه در صورتی که در یک جمعیت، به اندازه کافی تنوع ژنتیکی وجود نداشته باشد، قدرت انتخاب برای اصالح نژاد کاهش می یابد. تنوع ژنتیکی، هم تنوع درون نژادی و هم تنوع بین نژادی را شامل میشود. اصالح نژاد کنندگان از تنوع ژنتیکی برای رسیدن به حیوانات اهلی منطبق بر احتیاجاتشان، بهرهگیری مینمایند. تنوع درون نژادی همواره با ورود تنوع جدید ناشی از جهش مواجه است ولی تنوع ژنتیکی بین نژادی را

1- Real and Effective allele 2- Gene or Heterozygosity Variation

27 نمیتوان به راحتی بازسازی نمود. ساختار ژنتیکی هر نژاد یا سویه، حاصل تقابل جهش، رانش ژنتیکی، تکامل و سازگاری مجزایی است که طی قرون متمادی حاصل گردیده است. در کشورهای پیشرفته، تا کنون از نظر از دست رفتن تنوع ژنتیکی بیشترین توجه به نژادهای نادر معطوف بوده است ولی در مدیریت جهانی منابع ژنتیکی حیوانی، نژادهای در معرض خطر و سایر نژادها تفاوتی اساسی ندارند و تفاوت، میان نژادهای کم کاربرد یا بدون کاربرد و نژادهای دارای کاربرد رایج یا دارای کاربرد احتمالی در آیندهای نزدیک میباشد. در هر یک از موارد مذکور، عملیات الزم عبارت از حفظ به شکل دام زنده، اسپرم یا جنین منجمد یا شامل طراحی برنامههای اصالح نژادی میباشد. تصمیمگیری در مورد اینکه کدام نژادها باید حفظ شوند، بایستی بر اساس مالکهای مورد نظر و با در نظر گرفتن کاربرد فعلی و منظور نمودن حفظ حداکثر تنوع ژنتیکی در مخزن ژنی هر گونه صورت گیرد. با حفظ نمونههایی از تمامی نژادهای یک گونه که دارای بیشترین تفاوت ژنتیکی میباشند، میتوان حداکثر تنوع ژنتیکی را حفظ نمود. این نمونهها نژادهایی را شامل میگردند که دارای آللها یا ترکیبات آللی منحصر به فرد میباشند. شرح کامل تفاوت ژنتیکی بین هر دو نژاد امکان پذیر نیست ولی معیارهای فاصله ژنتیکی بهترین شرح در دسترس برای بیان تفاوت ژنتیکی آنها میباشند. معیارهای فاصله ژنتیکی متعددی پیشنهاد شدهاند ولی همه آنها به دادههای مربوط به فراوانی آللی نیازمندند )Templeton, 2004(. عواملی همچون فاصله نسلها در ماهیان، ذخیره و پرورش ماهیان، صید بیرویه، شرایط نامناسب آب و هوایی و از بین رفتن زیستگاهها منجر به کاهش اندازه مؤثر جمعیت و در نتیجه کاهش تنوع ژنتیکی ذخایر میگردند و خطر انقراض را افزایش میدهند )Rousset, 2004(. 2-7-9-1-2- منابع تنوع ژنتیکي چهار عامل در ایجاد تنوع ژنتیکی جمعیتها نقش اساسی دارند که عبارتند از جهش، جریان ژنی، انتخاب طبیعی و رانش ژنتیکی. جهش عامل نوترکیبی است اما به خودی خود تنوعی ایجاد نمی کند مگر آنکه 3 آللهای مستقر در در جایگاه های ژنی مختلف، متفاوت باشند در غیر این صورت چیزی برای نوترکیب شدن وجود نخواهد داشت. به همین دلیل اگر تمام افراد گونه برای یک آلل هموزایگوت باشند، جریان ژنی نیز تنوعی ایجاد نخواهد کرد. لذا در چنین جوامعی جهش منبع اصلی تنوع خواهد بود ) ,.Neville et al .)2000 2-7-9-1-1- روشهای حفظ تنوع ژنتیکي تنوع ژنتیکی به وسیله انقراض جمعیتها و فقدان تنوع در درون جمعیتهای محدود از بین میرود. نسبت مورد انتظار تنوع ژنتیکی )هتروزایگوسیتی یا HT( که در داخل یک جمعیت پس از t نسل باقی میماند را میتوان از فرمول ذیل به دست آورد:

1- Locus

28 t HT = HO [1 - 1 / (2NE / N)] که در آن: HO: هتروزایگوسیتی اولیه، N: اندازه جمعیت، NE: اندازه مؤثر جمعیت، t: تعداد نسل که در نتیجه حفظ هتروزایگوسیتی از طریق زیر حداکثر میگردد: 3- حداکثر نمودن هتروزایگوسیتی اولیه: حداکثر نمودن هتروزایگوسیتی اولیه از طریق تشکیل جمعیتها با تعداد باال به دست آید. تا حد امکان بایستی جمعیتهایی که دارای سطوح باالیی از تنوع هستند انتخاب شوند. 1- حداقل نمودن تعداد نسل: تعداد نسل را میتوان از طریق افزایش فاصله نسل یا از طریق استفاده از انجماد اسپرم حداقل نمود. فناوری هایی از قبیل انجماد اسپرم و جنین، فرصتهایی را برای به حداقل رساندن کاهش ژنتیکی فراهم میکند. 1- حداکثر نمودن اندازه جمعیت 4- حداکثر نمودن نسبت NE / N )اندازه مؤثر جمعیت به اندازه جمعیت( )Targon et al., 2000( اندازه مؤثر جمعیت نه تنها به اندازه سرشماری شده بلکه به تنوع اندازه خانواده، نابرابری نسبت جنسی و 3 نوسانات تعداد در طی نسلها بستگی دارد و یکسان سازی اندازه خانواده باعث افزایش اندازه مؤثر جمعیت خواهد شد )جوانروح علی آباد، 3183(. 2-7-9-9- تمایز ژنتیکي برای توصیف تمایز ژنتیکی در یک زیر جمعیت و مقایسه آن نسبت به اختالف ژنتیکی کل از فاکتورهای FST )روش برآورد مرسوم تمایز ژنتیکی( و RST )روش برآورد تمایز ژنتیکی مخصوص ریز ماهواره( استفاده می شود و هر یک به طور مستقیم و یا از طریق ارتباط با تعداد مهاجرت مؤثر برآورد کننده تمایز هستند )Rousset, 2004(. - محاسبه FST بر حسب فراوانی: FST= HT – HE / HT HT: هتروزایگوسیتی کل، HE: هتروزایگوسیتی قابل انتظار 2 - محاسبه FST بر اساس آنالیز واریانس مولکولی )روشی برای مطالعه تنوع ژنتیکی در گونه ها میباشد(: FST = VAP + VAR / (VWP + VAP + VAR) VAP: اختالف بین جمعیتها، V: AR اختالف بین مناطق، VWP: اختالف داخل جمعیتها - محاسبه RST بر اساس آنالیز واریانس مولکولی: RST = VAP / (VAP + Vwp)

1- Equalization of family size 2- Analysis of Molecular Variance= AMOVA

29 3 2-7-9-4- شاخص شانون از آنجا که حد نهایی هتروزایگوسیتی برای هر تعدادی از آلل برابر یک می باشد، معیار هتروزایگوسیتی حساسیت زیادی به افزایش تنوع ندارد و این محدودیت، تفکیک بین جمعیتها را با استفاده از جایگاه های بسیار متغیر همچون ریز ماهواره ها دشوار می سازد. بنابراین تنوع را می توان به صورت زیر و تحت عنوان شاخص اطالعات شانون نیز تعیین نمود: I= - ∑ Pi Ln Pi Pi: فراوانی i امین آلل در یک جایگاه معین بر خالف هتروزایگوسیتی که برای هر تعداد آلل حد نهایی یک را دارد، مقدار I برابر (Ln(n می باشد و با وجود اینکه تفسیر بیولوژیکی این معیار مشخص نیست اما ممکن است برای اندازه گیری تنوع جایگاه های بسیار متغیر مفید باشد )Shannon and Weaver, 1949(. 2-7-9-5- جریان ژني1 بسیاری از گونه ها جمعیتهای محلی می سازند به طوری که افراد آن تمایل به تولید مثل در داخل گروه را دارند. هر کدام از این جمعیتهای محلی قادر به گسترش ذخیره ژنی خود به صورت مجزا از دیگر جمعیتها می باشند. با این حال افراد یک جمعیت با افراد تازه وارد که گاهی از جمعیت مجاور وارد می شوند احتمال تولید مثل دارند. این عمل قادر به معرفی ژنهای جدید و یا تغییر تکرار موجود در میان افراد مقیم می باشد. به این فرآیند جریان ژنی می گویند )Slatkin, 1995(. تخمین جریان ژنی بر اساس آنالیز ساختار ژنتیکی جمعیتها با استفاده از FST به دست می آید. جریان ژنی تخمین زده شده توسط این روش نشان می دهد که ساختار ژنتیکی جمعیت با مدل جزیره ای متناسب است که تعادلی بین مهاجرت و جریان ژنی آن برقرار باشد. در N ،NM اندازه جمعیت و M مهاجرت کنندگان در هر نسل را نشان می دهد و تناسب بین FST و NM به صورت زیر است )Ciampi, 1999(: NM= [(1 / FST) - 1] / 4 NM: جریان ژنی، FST: درجه تمایز ژنتیکی جمعیت Wright )1951(، ثابت کرد که اگر NM باالتر از یک باشد یعنی وقتی که یک یا بیشتر از یک مهاجر در هر نسل وجود داشته باشد، مهاجرت می تواند بر خالف رانده شدن ژنتیکی عمل نماید.

1- Shannon Index 2- Gene Flow

11 2-7-9-6- رانش ژنتیکي2 به تغییرات تصادفی فراوانی ژنها در جوامع کوچک، رانش ژنتیکی اطالق می شود. رانش ژنتیکی می تواند منجر به افزایش هموزایگوتها و در نتیجه کم شدن فراوانی هتروزایگوتها، کاهش قابلیت باروری و تنوع گردد )Morgan, 1961(. 2-7-9-7- تعادل هاردی- واینبرگ1 فرضیه چگونگی توزیع ژنها و ژنوتیپهای مختلف در یک جمعیت به طور مستقل توسط دو دانشمند انگلیسی و آلمانی با نامهای Hardy و Weinberg )1908( ارائه گردیده است بدین ترتیب که اگر در یک جامعه ی بزرگ، بین افراد آن جمعیت، آمیزش های تصادفی وجود داشته باشد و عوامل برهم زننده تعادل ژنتیکی مثل انتخاب طبیعی، جهش، جریان ژنی، رانش ژنتیکی و مهاجرت وجود نداشته باشد، فراوانی ژنها و ژنوتیپها، از نسلی به نسل دیگر ثابت می ماند. اولین مرحله تجزیه وتحلیل در هر جمعیت، آزمون تعادل هاردی-واینبرگ است، وقتی یک جمعیت از تعادل هاردی-واینبرگ تبعیت می کند، ضریب عدم تعادل1 برابر صفر است، که این همان آزمون برای تعادل هاردی- واینبرگ یا آزمون فرض می باشد. جمعیتها در محیط طبیعیشان با تمام شرایطی که الزمه رسیدن به تعادل هاردی- واینبرگ است، مواجه نمی شوند بنابراین فراوانی آللی آنها از یک نسل به نسل دیگر تغییر خواهد کرد. میزانی که جمعیت از تعادل هاردی- 2 4 واینبرگ فاصله دارد، نشان دهنده شدت تأثیر گذاری عوامل خارجی است و از طریق آزمون مربع کای یا χ تعیین می شود )Crow, 1964(. فرمول آزمون مربع کای به صورت زیر می باشد: 2 2 χ = ∑ (O - E) / E O: تعداد ژنوتیپ مشاهده شده در افراد، E: تعداد ژنوتیپ قابل انتظار 5 2-7-9-8- فاصله و شباهت ژنتیکي زمانی که داده های ژنتیکی از چند جمعیت به دست می آید اولین سؤالی که مطرح می شود این است که شباهت ژنتیکی جمعیتها چقدر است؟ عموماً عقیده بر این است که ارتباط جمعیتها مربوط به زمانی است که آنها از یک جد مشترک اشتقاق یابند که این نیازمند مدل ژنتیکی مشخص می باشد تا فرآیندهایی از قبیل جهش و تفرق را در جمعیتهای جدا شده تعیین کند. فاصله ژنتیکی طرحی برای بیان تفاوت میان جمعیتها است )جوانروح علی آباد، 3183(. اگر دو جمعیت در برخی جایگاهها توزیع فراوانی آللی یکسانی داشته باشند، فاصله ژنتیکی بین آنها در آن جایگاهها صفر خواهد بود و اگر در هیچ یک از مکانهای ژنی، آلل

1- Genetic drift 2- Hardy-Weinberg Equilibrium 3- DA 4- Chi-squared 5- Genetic Distance and Genetic Identit

13 مشترک نداشته باشند فاصله ژنتیکی حداکثر مقدار ممکن یعنی مساوی یک میباشد. هنگامی که دادههای مربوط به فراوانی آللی برای جایگاههای متعددی وجود داشته باشد، برآورد فاصله این جایگاهها به طور متوسط به دست میآید. معیارهای فاصله ژنتیکی در سطح گستردهای در مطالعات ژنتیک تکاملی برای شرح ساختار ژنتیکی جمعیتهای یک گونه یا برای تعیین روابط تکاملی در بین گونهها مورد استفاده قرار گرفتهاند. اگر دو جمعیت به دالیل بوم شناختی یا جغرافیایی از هم جدا شده باشند، این امر منجر به تجمع آللهای متفاوت حاصل از جهش و فرآیند تصادفی رانش ژنتیکی )به واسطه اندازه محدود جمعیت( خواهد گردید. انتخاب طبیعی و مصنوعی نیز تفاوتهایی را بین جمعیتها موجب خواهند شد ولی معموالً این تفاوت از نوع جایگاههای در دسترس برای تجزیه و تحلیل فاصله ژنتیکی نمیباشد. با این وجود در صورت فقدان شواهد تقویتی دیگر، تجزیه و تحلیل فاصله ژنتیکی امکان رده بندی نژادها و جمعیتها را مطابق با سطح تمایز فیلوژنیکی آنها فراهم مینماید. برآورد فواصل ژنتیکی جفتی میان تمامی نژادهای یک گونه و فیلوژنی حاصل از این فواصل، ما را در تصمیمگیری منطقی در مورد انتخاب نژادها به منظور حفظ یا استفاده و نیز برای مطالعات تکاملی جهت تعیین ارزش ژنتیکی مقایسه ای از نظر صفات تولیدی کمک خواهند نمود. این فواصل بهترین ارائه کننده روابط میان نژادها میباشد. ولی از آنجایی که معیارهای فاصله ای نمیتوانند آثار انتخاب مصنوعی را بر روی صفات اقتصادی یا ریخت شناختی و نیز آثار انتخاب طییعی را بر روی شایستگی منظور نمایند، بایستی آنها را تنها به عنوان راهنمای ابتدایی برای ساختار طبیعی و تفاوت نژادی مورد استفاده قرار داد. در تصمیمگیری نهایی برای انتخاب نژادها باید هر نوع اطالعات در دسترس راجع به صفات دارای ارزش اقتصادی، ویژگیهای سازگاری خاص، حضور ژنها یا فنوتیپ های منحصر به فرد، اهمیت محلی یا منطقهای یک نژاد در سیستمهای تولیدی و قابلیت دسترسی به منابع و زیر ساختها در منطقه استقرار نژاد در نظر گرفته شود )Templeton, 2004(. برای محاسبه فاصله و شباهت ژنتیکی از فرمول زیر استفاده می شود: Nei ID= JXY / √(JXJY) NE: تعداد آلل مؤثر، JY ،JX ،JXY: بر اساس فراوانی هر آلل در جمعیت X و Y 2-7-4- چند شکلي ژنتیکي2 منظور از چند شکلی ژنتیکی وجود چندین فنوتیپ کامالً متفاوت و منفصل در درون یک جمعیت است. چند شکلی )پلی مورفیسم( ژنتیکی ممکن است در سه سطح کروموزوم، ژن و طول قطعه های محدود )قطعه های حاصل از اثر آنزیم محدود کننده( وجود داشته باشد )گله داری و فروغمند، 3185(.

1- Polymorphism

12 1 2-7-5- نشانگرهای ژنتیکي هر فنوتیپ یا صفت )قابل توارث( موجود زنده که با صفت معادل خود در موجود زنده دیگر تفاوت داشته باشد یک نشانگر محسوب می شود )Liu and Cordes, 2004(. هر آنچه که در میان افراد، الینها، جمعیتها، گونهها، نژادها و یا سویههای مختلف به لحاظ ژنتیکی تفاوت داشته و سبب تمایز آنها از یکدیگر گردد به عنوان نشانگر ژنتیکی شناخته میشود. نشانگرهای ژنتیکی جایگاههای خاص روی یک کروموزم دارند که به عنوان نشانههای اختصاصی برای تجزیه و تحلیلهای ژنومی به خدمت گرفته میشوند. در واقع تفاوت موجود بین ردیف DNA کروموزوم در افراد یک جامعه و یا نژاد که از افراد به نتاج آنها منتقل میگردد میتواند به عنوان نشانه یا نشانگر ژنتیکی به کار گرفته شود )جوانروح علی آباد، 3183(. این نشانگرها در بررسی تنوع ژنتیکی و چند شکلی های بین گونه ای و نیز داخل جمعیتهای یک گونه کاربرد وسیعی دارند و تفاوتهای کوچک در سطح DNA )مثالً حذف، اضافه و تغییر یک یا چند باز که در اثر عوامل مختلف به وجود آمده اند( را منعکس کرده و به همین دلیل چند شکلی باالیی را ایجاد می کنند و جهت بررسی تنوع و گوناگونی جمعیتها کاربرد گسترده ای دارند )Schlotterer, 2004(. 2-7-5-2- نشانگرهای مورفولوژیکي1 نشانگرهای مورفولوژیکی از اولین و ساده ترین نشانگرهای مورد استفاده بودند که اساس آنها وجود تفاوتهای ظاهری در افراد مختلف می باشد )Frankham, 1994( و به عالئمی گفته می شود که به طور مستقیم در فنوتیپ جانور و گیاه قابل تشخیص و توارث پذیر هستند مثل فلسها، اتولیتها، پارازیتها و ترکیب عنصری قسمتهای مختلف بدن )مردانی، 3171(. در این نشانگرها تفاوت بین موجودات با اندازه گیری شاخص های مورفومتریک و مریستیک بررسی می شد. چند نمونه از صفات مورفولوژیک قابل اندازهگیری در ماهیان عبارتند از: طول کل، طول چنگالی، طول پوزه، ارتفاع سر، قطر افقی چشم و .... اگر چه نشانگرهای مورفولوژیکی به طور سنتی در علوم زیستی مورد استفاده قرار گرفتهاند ولی دارای محدودیتهای اساسی همچون تعداد کم این نشانگرها، دقت کم، تأثیرپذیری شدید از محیط و مرحله رشد و سن و وجود غالبیت در بروز میباشند. اساس و تفسیر ژنتیکی بسیاری از این نشانگرها نا مشخص بوده و شناسایی افراد نا خالص از خالص ممکن نیست. اغلب دارای توارث غالب و مغلوبی بوده و فراوانی و تنوع کمی دارند. گاهی برای مشاهده نتایج باید منتظر ظهور آنها در نسلهای بعد بود که در مورد برخی موجودات کار بیهوده- ای است )صفری، 3185(. اما این نشانگرها به دلیل ساده و کم هزینه بودن و عدم نیاز به امکانات پیچیده و گران قیمت برای اندازه گیری ها مورد استفاده محققین بسیاری می باشند )Morgan, 1961(.

1- Genetic markers 2- Morphological Markers

11 2-7-5-1- نشانگرهای سیتوژنتیکي وجود اختالف در شکل، اندازه و تعداد کروموزمها میتواند بیانگر وجود اختالف ژنتیکی باشد. بنابراین این نشانگرها نمایانگر تنوع در ساختمان کروموزومها میباشند. تلوسانتریکها، ایزوکروموزمها، جابجایی و الگوهای بایندینگ از این گروه هستند. مطالعات سیتوژنتیکی به منظور مقایسه اختالفات موجود بین افراد یک گروه و آشکار شدن مسیر تکاملی تغییرات در کروموزمهای تشکیل دهنده ژنوم، تفکیک گونهها و بعضاً جمعیتهای مختلف از نظر تعداد و نوع کروموزومها انجام میگیرند )جوانروح علی آباد، 3183؛ ,Hallerman .)2003 2-7-5-9- نشانگرهای مولکولي هر گونه تفاوت در ترتیب نوکلئوتیدی DNA که از والدین به نتاج قابل انتقال باشد به عنوان نشانگرهای مولکولی به کار گرفته میشوند و به دو دسته نشانگرهای مبتنی بر پروتئین و نشانگرهای مبتنی بر DNA تقسیم میشوند )Yue et al., 2007(. هر ردیف متفاوت DNA و کروموزوم منشأ تفاوت صفات در افراد می شود. برخی از ردیفهای DNA هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل می کنند و نه در ردیف اسید آمینه پروتئین ها تأثیری بر جای می گذارند این دسته از تفاوتها را می توان با روشهای مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی نمود و به عنوان نشانگر مولکولی مورد استفاده قرار داد ) ,.Tilman et al .)1996 2-7-5-9-2- نشانگرهای بیوشیمیایي نشانگرهای بیوشیمیایی، شامل پروتئین های ذخیره ای و شکلهای مختلف آنزیم ها )ایزوزایم ها، آلوزایم ها و ...( هستند )Frankham, 1994(. برخی از تفاوتها در ترتیب نوکلئوتیدی DNA بین دو موجود ممکن است که به صورت پروتئینهایی با اندازه های مختلف بروز کند که از طریق بیوشیمیایی قابل آنالیز و مطالعه است. مطالعات ابتدایی برای شناسایی جمعیتهای ماهی با استفاده از نشانگرهای غیر آنزیمی مثل هموگلوبین و ترافسفرین بود که به سرعت به سمت پروتئینهای آنزیمی تمایل پیدا کرد )Smith et al., 1980(. با پیدایش الکتروفورز پروتئین ها بسیاری از معماهای زیستی قابل حل شد. نشانگرهای پروتئینی تغییرات را در سطح ردیف و عمل ژن به صورت نشانگر هم بارز نشان می دهند و به دو نوع آنزیمی و غیر آنزیمی تقسیم می شوند. میزان تنوع ژنتیکی غیر آنزیمی کمتر از آنزیمی است، باندهای غیر اختصاصی زیادی روی ژل ظاهر می شود که شمارش را مشکل می کند و باندها بر حسب نوع بافت متغیرند. در حالی که در آنزیم ها، تعداد آللها و باندها قابل شمارش تر و واضح تر و دقت آن باالتر است )Ferguson et al., 1995(. فرمهای مولکولی متفاوت یک آنزیم در یک فرد را ایزوزایم مینامند. ساختمان اولیه ایزوزایم ها از این جهت متفاوتند که به وسیله ژنهای متفاوت کد گذاری میشوند و دارای فعالیت آنزیمی )کاتالیزوری(

14 یکنواخت و مشخص است. آلوزایمها به زیر گروهی از ایزوزایمها اطالق میشوند که از آللهای مختلف یک جایگاه معین ایجاد میشوند. هنگامی که دو آلل از یک جایگاه به وجود میآیند، شکلهای مختلف الکتروفورتیکی هنوز نقشهای معینی را ایفا میکنند. پروتئینهای حاصل از این آللها تحت عنوان آلوازیم شناخته میشوند )Carvalho, 1998(. نقاط ضعف این روش تجزیه سریع آنزیم ها و هزینه باالی تهیه آنهاست که کارایی آنها را محدود می کند. این نوع نشانگرها تحت تأثیر شرایط، پس از ترجمه متغیر بوده که یک نکته منفی برای آنها می باشد. واکنش افراد یک جمعیت نسبت به عوامل محیطی متفاوت است، ممکن است میزان و نوع پروتئینی که برای هدفی مانند واکنش به عوامل استرس زا تولید شود در بین افراد متفاوت باشد که اثبات این تفاوتها با این روش میسر نیست. عالوه بر آن تمایز پروتئین ها بر اساس حرکت آنها و بار الکتریکی در ستون الکتروفورز است. 71% اسیدهای آمینه فاقد بار الکتریکی هستند و تنها می توان 11 % تنوع ژنتیکی را با این روش مورد مطالعه قرار داد، به عالوه تفسیر باندها نیز گاهی اوقات بسیار دشوار است. از عیوب دیگر نشانگرهای پروتئینی میتوان به نیاز به مقدار زیادی نمونه تازه یا تازه فریزشده )کشتن موجود زنده(، پلیمورفیسم پایین، محدودیت روشهای رنگ آمیزی و مشکل بودن آنالیز دادهها به خصوص در پلیپلوئیدها اشاره کرد )Ferguson et al., 1995(. 2-7-5-9-1- نشانگرهای DNA تفاوتهای موجود در سطح DNA که هیچ گونه تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل میکنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه رشتههای پلیپلوئیدی تأثیر بر جا میگذارند تحت عنوان نشانگرهای DNA قلمداد می شوند. نشانگرهای DNA تفاوت موجودات را در سطح ژنوم نشان می دهند. به عبارتی این نشانگرها، ژنوتیپ موجودات زنده را توصیف کرده به نحوی که توالی های کد کننده3 و غیر کد کننده1 را نیز مشخص می نمایند. از آنجایی که تفاوت عملکرد این نشانگرها فقط از طریق تجزیه و تحلیل مستقیم DNA امکان پذیر است به همین دلیل به آنها نشانگرهای DNA گفته می شود )جوانروح علی آباد، 3183(. کشف واکنش زنجیره ای پلیمراز1 نقش اساسی در مطالعه و پژوهش ژنوم جانداران داشته و در توسعه و کاربرد نشانگرهای گوناگون DNA نیز نقش بسزایی ایفا کرده است )Schlotterer, 2004(. بر همین اساس این نشانگرها به دو دسته مبتنی بر PCR و غیر مبتنی بر PCR تقسیم می شوند. از طریق PCR می توان یک قطعه خاص ژنوم را به چندین میلیون نسخه رساند. انواع مختلفی از این نشانگرها، با تفاوتهای بسیاری از لحاظ تکنیک، روش تولید، نحوه کاربرد، امتیاز بندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع گردیدند و تحولی عظیم در اطالعات تنوع ژنتیکی ایجاد کرده اند )قره یاضی، 3175( و به عنوان ابزارهای

1- Exone 2- Intron 3- PCR

15 ضروری در ایجاد اهدافی چون نگهداری بیولوژیک مطالعات تکاملی و نیز پروژههای نقشه برداری ژنی در آمده اند )دانشور آملی، 3181(. هر کدام از این نشانگرها دارای نقاط ضعف و قدرت خاص هستند و اخیراً استفاده از این نشانگرها تفاوتهای ژنتیکی را بیشتر مشهود ساخته که این تفاوتها تحت تأثیر محیط و اثراتی همچون پلیوترپی و اپیستازی و دوره ی رشد حیوانی نبوده و امکان آگاهی دقیق و کافی از تنوع ژنتیکی در سطح DNA را فراهم میسازند )قره یاضی، 3175(. از 14 سال گذشته توجه به نشانگرهای DNA افزایش پیدا کرده و در ابتدا DNA میتوکندریایی و سپس تکنیکهای مولکولی پیشرفت کرده و به سمت DNA هستهای سوق پیدا کرده است )Ferguson et al., 1995(. مزایای نشانگرهای DNA 3- عدم تأثیر پذیری آنها از شرایط محیطی 1- فراوانی فوق العاده این نشانگرها 1- فراهم نمودن امکان مطالعه در خارج از فصل رشد و تولید مثل 4- دقت و قابلیت مطلوب تفسیر نتایج 5- همبارز بودن بیشتر نشانگرهای DNA 6- امکان استفاده از آنها برای گونه های در معرض انقراض 7- سهولت تشخیص افراد خالص و ناخالص 8- سهولت امتیازدهی و تجزیه و تحلیل داده ها 3- امکان استفاده از نرم افزارهای رایانه ای برای تجزیه و تحلیل داده های حاصل 31- امکان به کارگیری آنها در تمام مراحل زندگی جاندار )حتی در دوران جنینی( 33- دقت و صحت باالی نتایج 31- نمایان سازی تفاوت توالیهای غیر کد کننده عالوه بر نمایان سازی اختالف موجود در توالیهای کد کننده 31- قدرت تمایز باالی این نشانگرها 34- این نشانگرها هنوز تکامل خود را به پایان نرسانده اند و جا برای پیشرفت دارند )قره یاضی، 3175(. 1

2-7-5-9-1-2- چند شکلي طول قطعات حاصل از هضم آنزیم های محدودگر Boestin و همکاران )1980(، روش RFLP را برای مطالعه مستقیم DNA به عنوان نشانگرهای ژنتیکی جدید معرفی نمودند. اساس مولکولی RFLP ها وجود یا عدم وجود نقاط قابل تشخیص آنزیم های محدود کننده به علت وقوع جهشهای نقطه ای، حذف، اضافه یا معکوس شدن قطعه ای از کروموزوم و یا سایر

1- Restriction Fragment Length Polymorphism = RFLP

16 تغییرات ژنی- کروموزومی می باشد که این تغییرات سبب ایجاد پلی مورفیسم می گردند )دانشور آملی، .)3181 2 DNA 2-7-5-9-1-1- تکثیر تصادفي چند شکل دو گروه مستقل )Williams et al., 1990; Welsh and McClelland, 1990( روش جدیدی را برای ارزیابی پلی مورفیسم بر اساس واکنش زنجیره ای پلیمراز ارائه کردند. این تکنیک، انگشت نگاری قابل تشخیص ژنوم بدون استفاده از سیستم های رادیواکتیو و توالی یاب DNA می باشد ) ,Phillips and Vasil 2001(. در صورت نداشتن اطالعات قبلی از ساختار ژنتیکی درون و بین جمعیتهای آبزیان، این نشانگر یکی از کارآمدترین نشانگرهای مورد استفاده است )Fischer et al., 2000(. 2 2-7-5-9-1-9- چند شکلي طولي قطعات تکثیر شده Zabaeu و همکاران )1993(، روش جدیدی تحت عنوان تکثیر قطعات برش یافته انتخابی ابداع نمودند که حاصل آن AFLP بود. این روش تقریباً ترکیبی از RFLP و RAPD بوده و شامل 4 مرحله متوالی زیر است: 3- استخراج DNA و برش آنزیمی مناسب 1 1- اتصال سازگارسازهای اختصاصی و دو رشته ای به انتهای قطعات DNA حاصل از هضم آنزیم که مولکولی مرکب دارای توالی شناخته شده )سازگارساز( و ناشناخته )توالی هدف( ایجاد می شود. 1- انجام PCR، در این مرحله ابتدا یک تکثیر اولیه صورت می گیرد و سپس با استفاده از آغازگرهایی که مکمل با ردیف سازگارساز دو رشته ای و جایگاه تشخیصی آنزیم برشی طراحی شده اند، DNA الگو تکثیر می گردد. 4- فرآورده های PCR را روی ژل پلی آکریل آمید می برند ) قره یاضی، 3175(. 4 SCAR -4-1-9-5-7-2 Parden و Michelmore )1993(، روش جدیدی به نام اسکار را که بر اساس توالی سنجی قطعات به دست آمده از RAPD می باشد پیشنهاد نمودند. در این روش قطعات به دست آمده از روش RAPD را ابتدا کلون کرده و سپس تعیین توالی می کنند. از اطالعات حاصل از باند RAPD )انتهای نشانگر رپیدلینک با صفات یا ژن مورد نظر( برای طراحی آغازگرها با طول زیاد که معموالً اختصاصی بودن واکنش را به همراه خواهد داشت استفاده می کنند و به این ترتیب تکرارپذیری این نشانگرها در مقایسه با RAPD خیلی باال خواهد بود )Rezvani Gilkolaei, 1997(.

1- Random Amplified polymorphic DNA= RAPD 2- Amplified Fragment Length Polymorphism= AFLP 3- Adaptor, Llinker or indexer 4- Sequence Characterizes Amplification Region

17 1 RLGS -5-1-9-5-7-2 Hatada و همکاران )1991(، روشی را برای شناسایی و انگشت نگاری موجودات عالی ابداع کردند و آن را RLGS نامیدند. اساس این روش که بر مبنای جایگاه برش اختصاصی آنزیم های محدودگر است می تواند به عنوان تشابه و عالمتی برای تشخیص و تمایز افراد به کار برده شود. در این روش رشته های DNA توسط آنزیم هضم و محلهای برش داده شده به طور مستقیم با فسفر رادیواکتیو نشاندار می شوند و پس از الکتروفورز قطعات هضم شده، DNA ها از هم جدا شده و باندها به وسیله فلورسانس قابل مشاهده می- گردند. الگوهای متفاوت به دست آمده در این روش می توانند به عنوان یک نشانگر مورد استفاده قرار گیرند. 2 DAF -6-1-9-5-7-2 Caetano- Anolles و همکاران )1991(، تکنیک جدیدی را پیشنهاد نمودند که از نظر اصول مشابه با روش RAPD می باشد با این تفاوت که آغازگر آن بسیار کوچک بوده و از حدود 8-5 نوکلئوتید تشکیل شده است و به جای سه مرحله PCR، دو مرحله دارد. محصوالت PCR توسط ژل پلی اکریل آمید جدا گردیده و با رنگ آمیزی نیترات نقره قابل رویت می گردند. این نشانگرها برای تعیین خصوصیات الین های تقریباً ایروژن، تجزیه و تحلیل های جمعیتی و نیز تعیین شجره افراد مورد استفاده قرار می گیرند )دانشور آملی، .)3181 9ALP -7-1-9-5-7-2 وجود اختالف در اندازه قطعات حاصل از PCR را که در آن آغازگر اختصاصی از توالی ژنوم به کار رفته است ALP می گویند. این اختالف بیانگر وقوع پدیده حذف و اضافه شدن این نشانگر است )مردانی، 3171(. از مزایای این نشانگر می توان به تکرارپذیری باال و از معایب آن می توان به نیاز آن به توالی سنجی اشاره نمود )Philips and Vasil, 2001(. 4DGGE -8-1-9-5-7-2 Myers و همکاران )1987(، روشی را ابداع نمودند که یکی از روشهای مناسب برای آشکارسازی جهشها می باشد. این روش بر روی فرآورده های زنجیره ای پلیمراز صورت می گیرد. در صورتی که قطعات رشته ای DNA در یک نوکلئوتید با هم متفاوت باشند الگوی واسرشته شده متفاوتی را نشان می دهند. در این روش دو نمونه DNA در دو ستون جداگانه از یک ژل پلی اکریل آمید که دارای نسبتی از غلظت ماده

1- Restriction Landmark Genomic Scanning 2- DNA Amplification Fingerprinting 3- Amplified length Polymorphism 4- Denaturing Gradiant Gel Electrophoresis

18 واسرشته کننده )فرمالدئید( هستند آمده و گرادیانی از افزایش مواد دناتوره کننده مورد الکتروفورز قرار می- گیرند. وقتی مولکولها به سطح بحرانی دناتوره می رسند دو رشته شروع به جدا شدن می کنند، در این حالت کاهش معنی داری در حرکت قطعات ایجاد می شود و این نقطه به عنوان نقطه ی ذوب عمل می کند و باعث تأخیر در حرکت مولکول DNA جهش یافته نسبت به فرم وحشی می شود )مردانی، 3171(. در روش DGGE به مواد رادیواکتیو و شیمیایی نیازی نیست ولی ابزار پیشرفته ای می خواهد. درصد تعیین جهش در این روش خیلی نزدیک به 311% است. نوع مشابهی از این روش، TGGE می باشد که در آن از حرارت به جای غلظت مواد شیمیایی در ژل استفاده می شود. بهترین طول قطعات برای DGGE بین -511 351 جفت باز می باشد و برای واسرشته شدن کامل قطعات حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز یک ناحیه حاوی باالترین دمای ذوب مصنوعی به نام GG- Clamp استفاده می شود )Etschied, 1998(. 1

2-7-5-9-1-3- چند شکلي تطبیقي رشته های منفرد این روش در سال 3383 ابداع شد. در الکتروفورز SSCP ابتدا از یک ماده ی واسرشته ساز مانند اوره استفاده می شود تا DNA دو رشته ای به DNA تک رشته ای تبدیل گردد. به هنگام حرکت DNA تک رشته ای بر روی ژل، اثرات متقابل درون مولکولی روی می دهد به عبارت دیگر، بین بخش هایی از این DNA پیوند ایجاد می شود و ساختمان ثانویه ای تشکیل می شود. بنابراین، حرکت مولکول های DNA در این حالت به جای آنکه تابع اندازه مولکول باشد به ساختمان ثانویه DNA تک رشته ای بستگی دارد. اگر در این توالی جهشی روی داده باشد، نوع پیوندهایی که تشکیل می گردند متفاوت بوده و باند مربوطه بر روی ژل نیز متفاوت خواهد بود. عواملی مانند دمای ژل )نباید زیاد باال باشد(، درصد ژل آکریل آمید )5-6 درصد مناسب است( و اندازه قطعه DNA مورد بررسی )معموالً بین 151-311 جفت باز و ایده آل 355 جفت باز( در موفقیت SSCP نقش دارند )Rezvani Gilkolaei, 1997(. 2 2-7-5-9-1-21- چند شکلي های تك نوکلئوتیدی این نشانگرها مبتنی بر تفاوتهای مربوط به تک جفت بازها می باشند. یک SNP وضعیتی است که در آن، دو باز جانشین هم با فراوانی محسوسی رخ می دهند. SNP را می توان به روشهای متعددی تشخیص داد اما 1 یک فن آوری نسبتاً جدید در این رابطه، استفاده از ریزه های DNA می باشد. ریزه ها، قطعات DNA و شامل هزاران ژن هستند که بر روی یک ماده زمینه ای کوچک مرتب شده اند. این ریزه ها، با 4cDNA

1- Single Strand Conformational Polymorphism= SSCP 2- Single Nucleotide Polymorphism= SNP 3- DNA chips 4- Complementary DNA

19 )DNA تک رشته ای که از روی RNA نسخه برداری شده است( نشاندار شده حاصل از یک بافت برگزیده کاوش می گردند )Rezvani Gilkolaei, 1997(. 2-7-5-9-1-22- ماهواره ها2 قسمت عمده ژنوم موجودات را ردیفهایی تشکیل می دهند که هیچ گونه پروتئین خاصی را رمز نمی کنند و عمل و نقش آنها هنوز به درستی مشخص نشده است. از جمله این ردیفهای غیر عملکردی، ردیفهایی هستند که از چند باز تشکیل شده و به طور مکرر به دنبال هم تکرار می شوند و به توالیهای تکراری معروفند. این ردیفها بر اساس اندازه خود به سه دسته زیر تقسیم بندی می شوند: 3- ستالیت ها: DNA ماهوارهای زمانی مطرح گردید که معلوم شد در سانتریفیوژ کلرید سزیم، بخش کوچکی از DNA کل باند ماهوارهای تشکیل میدهد که جدا از باند ژنومی اصلی قرار میگیرد و این بخش کوچک دارای توالیهای سادهای است که کمتر از 511 جفت باز دارد که هزاران یا میلیونها بار تکرار شده و در نواحی هتروکروماتین نزدیک سانترومرها یافت می شوند. 1- مینی ستالیت ها1: نوع دیگری از DNA ماهوارهای با واحدهای تکراری بسیار کوتاهتر است که در طول توالی یابی ژن انسولین انسانی کشف گردید و شامل واحدهای تکراری 64-35 جفت باز بوده و در نواحی یوکروماتین یافت می شوند )O’Reilly and Wright, 1995(. 1- میکروستالیت ها: واژه ریز ماهواره توسط Jeffreys و همکاران )1998( مطرح گردید. ریز ماهواره ها یا توالیهای کوتاه تکراری1، نوع بی نظیری از تکرارهای پشت سر هم توالیهای ژنومی هستند که به فراوانی در طول ژنوم پراکنده شده اند و میزان باالیی از پلی مورفیسم آللی را نشان می دهند )Chistiakov et al., 2006( و تحت عناوین 4STR یا 5SSR شناخته می شوند. دو گروه اخیر به نام 6 VNTR نیز مطرح می باشند )O’Reilly and Wright, 1995(. ریز ماهواره ها با تکرارهای کوتاه 3-6 جفت باز در امتداد DNA پراکنده اند. آنها مجموعاً بین 311-11 جفت باز دارند ) Beckmann and Weber, 1992(. گفته میشود که در گونه های ماهی ریز ماهواره ها تقریباً هر kbp 31، یک بار رخ میدهند و این در حالی است که ماهوارکها هر kbp 3511 یک بار به وقوع میپیوندند و این امر باعث میشود که در مطالعات مربوط به نقشه یابی ژنومی، ریز ماهوارهها بسیار کارآمدتر باشند. به نظر میرسد که هر ژنی حداقل یک ریز ماهواره داشته باشد که در یک اینترون7 یا در نواحی 1َ یا 5َ کنار ردیف کد کننده قرار گرفتهاند.

1- Satellites 2- Minisatellite 3- SSRs 4- Simple Tandem Repeat 5- Simple Sequence Repeat 6- Variable Number Tandem Repeat 7- Intron

41 توزیع ریز ماهوارهها در سرتاسر ژنومهای یوکاریوتی کم و بیش یکنواخت است ولیکن در نواحی کد کننده و احتماالً در تلومرها کمتر یافت میشوند )Tautz et al., 1986(. ریز ماهواره ها بر اساس آرایش قرار گیری واحدهای تکراریشان در ژنوم به سه دسته تقسیم می شوند )O’Connell and Wright, 1997(:

الف- تکرار کامل: از یک واحد تکراری تشکیل شده است که به طور متوالی تکرار می شوند )به عنوان مثال .)CAT CATCATCATCATCATCATCAT… ب- تکرار مرکب: هسته مرکزی آن از دو واحد تکراری تشکیل شده است )در ابتدا CAT و سپس GGC(. CATCATCATCATGGCGGCGGCGGCGGC پ- تکرار ناکامل: تکرارهای مرکبی هستند که توالی آنها به وسیله واحدهای غیر تکرار شونده قطع میشود )برای مثال AAA در توالی زیر(. CATCATCATAAAGCGGCGGCAAGGCGGCGGC فراوانی ریز ماهوارهها متفاوت و بستگی به اندازه ژنوم دارد. توزیع ریز ماهواره ها نه تنها در گونه های مختلف متفاوت است بلکه در درون یک ژنوم و در بین کروموزومهای مختلف نیز متفاوت است. با نقشه - های ژنتیکی و فیزیکی مشخص شد که ریز ماهواره ها از لحاظ توزیع و سازماندهی در ژنوم ها در یک ناحیه جمع نشده و به طور یکنواخت در نواحی مختلف کروموزوم توزیع شدهاند. اما با روش هیبریداسیون فلورسنت و هیبریداسیون در ژل، مشخص شد که این توالیها در برخی از قسمتهای کروموزوم تجمع دارند )Rico et al., 1997(. عمده ترین ریز ماهواره ها عبارتند از )O’Connell and Wright, 1997(: - Mononucleotide (A)11 - Dinucleotide (GT)6 GTGTGTGTGTGT - Trinucleotide (CTG)4 CTGCTGCTGCTG - Tetranucleotide (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC به طور کلی توالیهای مونو نوکلئوتیدی )poly A/T( فراوانی بیشتری نسبت به )poly C/G( دارند. آنها در نواحی اینترون و درون ژنی فراوانی بیشتری دارند. اما این نوع ریز ماهواره به دلیل بیثباتیش در واکنش PCR نشانگر مناسبی نیست. بیشتر ریز ماهواره ها )67-11 درصد( به صورت دی نوکلئوتیدی موجودند. در ژنوم مهره داران تکرار دی نوکلئوتیدی AC)n) و AT)n) به ترتیب متداولترین انواع ریز ماهواره ها به شمار می روند )Toth et al., 2000(. تکرارهای تری نوکلئوتیدی در همه ی نواحی ژنوم با فراوانی قابل توجهی مشخص شدهاند و معمولترین آنها تکرارهای ATT و CAG میباشند این توالیها بیشتر در اگزون حضور دارند و در نواحی دیگر کمتر دیده میشوند )بنابازی، 3183(. تری نوکلئوتیدها احتماالً بیشتر از دی و تترانوکلئوتیدها در منطقه ی اگزون ژن یافت می شوند چون آنها منطقه رمز را منقطع نمی کنند. تری- نوکلئوتیدها هم در جانوران و هم در گیاهان کاهش معنی داری در توالی رمز پروتئین دارند، از این رو کمتر برای مطالعات ژنتیکی استفاده می شوند )O’Connell and Wright, 1997(. اگر چه تکرارهای دی-

43 نوکلئوتیدی در مطالعات ریز ماهواره ای رایجترند اما تکرارهای تترانوکلئوتیدی از قبیل GATA و GACA نیز کم کم در مطالعات جمعیتی ماهیان و دیگر موجودات رایج شده اند اما میزان آنها به فراوانی دی - نوکلئوتیدها نیست. 67-11 درصد ریز ماهواره ها دی نوکلئوتیدی هستند. توالیهای غیر تکرای در موتیفهای ناکامل در طی جهش ثابت هستند به همین خاطر تنوع را کاهش می دهند. با وجود این با توجه به کاهش Stutter در تترانوکلئوتیدها، مطالعات آنها رو به افزایش است )Chistiakov et al., 2006( همچنین تکرارهای تترانوکلئوتیدی در اگزونها وجود ندارند )بنابازی، 3183(. میکروستالیتها در ژنوم سالمون هر 31 کیلو باز و ژنوم قزل آالی قهوهای هر 11 کیلو باز وجود دارند و طول توالی ریز ماهواره ها در ژنوم موجودات خونسرد بیشتر از ژنوم سایر موجودات است )Rico and Hewitt, 1996(. شکل 3-31 آناتومی ریز ماهوارهها و شکل 3-34 مکان و اندازه آنها در ژنوم را نشان میدهند )Rico et al., 1997(. از ریز ماهواره برای کشف اشتباهات موجود در ثبت والدین برای نتاج در مراکز اصالح نژاد )بنابازی، 3183( و همچنین کارهای فیلوژئوگرافی استفاده می شود. در این مطالعات، تغییرات در ترکیب آللی ریز ماهواره جمعیتها به مسافتهای تکاملی تبدیل می شود )Dannewitz et al., 2005( و علت اصلی کاربرد این نشانگرها، قدرت آنها در حل مشکالت بیولوژیکی، تجزیه و تحلیل های جمعیتی و همچنین مطالعات اکولوژیکی میباشد )صفری، 3185(.

شکل 2-29- آناتومی ریز ماهواره ها )Rico et al., 1997(

شکل 2-24- مکان و اندازه ریز ماهواره ها در ژنوم )Rico et al., 1997(

42 پراکنش ژنومي ریز ماهواره ها: ریز ماهواره ها در ژنوم تمام یوکاریوت ها، پروکاریوت ها و حتی باکتریها وجود دارند )Gur- Arie et al., 2000(. وجود ریز ماهواره ها در ژنوم پروکاریوت ها از دهه 3371 شناخته شد )Hamada .)Bruford et al., 1996 و همکاران )1982(، ثابت کردند که این توالیها به تعداد زیاد و در گستره وسیعی از موجودات از مخمرها تا مهره داران وجود دارند. Tautz و Renz )1984(، توالیهای ریز- ماهواره ای جانوران مختلف را با DNA ژنومی آنها هیبرید کرده و انواع مختلفی از توالیهای ساده را گزارش نمودند. ریز ماهواره ها می توانند در هر جای ژنوم، هم در مناطق کد کننده پروتئین و هم در مناطق غیر کد- کننده پروتئین در DNA وجود داشته باشند )Toth et al., 2000(. اما میزان پراکنش آنها در DNA های کد- کننده مهره داران ناچیز بوده و حدود 35-3 درصد می باشد )Van Haeringen, 1996-1997(. تکامل ریز ماهواره ها: ویژگی کلیدی ریز ماهواره ها به عنوان مارکرهای مولکولی بی ثباتی باالی آنها به علت میزان باالی جهش و در نتیجه تنوع زیاد آن در گونه ها و جمعیتها است. میزان جهش ریز ماهواره ها در هر جایگاه و در طی یک نسل برآورد شده است )Ellegren, 2000(. آنالیز ریز ماهواره AC)n) در پنج رده مهره داران )پستانداران، خزندگان، دوزیستان، پرندگان و ماهیها( نشان داد که ریز ماهواره ها تحت تأثیر جهش می باشند و این جهش با افزایش طول توالی ریز ماهواره بیشتر اتفاق می افتد ) ,Neff and Gross .)2001 عملکرد ریز ماهواره ها الف- ساختار DNA: ریز ماهواره ها در به وجود آوردن بیشتر ساختارهای غیر متداول DNA که دارای الگوهای ساده و یا پیچیده هستند نقش دارند )Chistiakov et al., 2006( و بر اساس ترتیب توالی، شکل و ساختارشان به 4 گروه تقسیم بندی میشوند )Hansen, 2004(: 3- ریز ماهواره های کامل3: در این گروه یک واحد کامل ریز ماهواره پشت سر هم و بدون هیچ تداخلی دیده میشود )مانند GTGTGTGTGTGT(. 1- ریز ماهواره های ناقص1: در این گروه در درون واحدهای ریز ماهواره ای یک یا دو نوکلئوتید غیر ریز- ماهواره ای مشاهده میشود که در ساختمان آنها ایجاد تداخل میکنند )مانند GTGTGTCGTGTGT(. 1- ریز ماهواره های گسیخته1: در این گروه تعداد کمی جفت باز که بیش از دو نوکلئوتید هستند و با ساختمان تکراری توالی جور نیستند باعث گسیختگی ریز ماهواره ای میشوند )مانند .)GTGTGTCCCGTGTGT

1- Perfect microsatellite 2- Imperfect microsatellite 3- Interrupted microsatellite

41 4- ریز ماهواره های مرکب یا ترکیبی3: در این گروه نیز دو ساختار یا بیش از آن پشت سر هم و یا یکی در درون دیگری قرار گرفته است )مانند GTGTGT GCGCGCGC(. ب- نوترکیبی DNA: ریز ماهواره ها نقاط مستعدی برای نوترکیبی می باشند )Jeffreys et al., 1998(. موتیف های دی نوکلئوتید به دلیل داشتن میل ترکیبی زیاد به آنزیم های نوترکیب جایگاه های مناسبی برای وقایع نوترکیبی هستند. مشخص شده که برخی از توالیهای ریز ماهواره ای مانند GA ،CT ،CA ،GT و ... با تأثیرگذاری مستقیم بر روی ساختار DNA نوترکیبی را تحت تأثیر قرار می دهند )Biet et al., 1999(. Li et al., 2002 DNA DNA پ- رونویسی : ریز ماهواره ها در رونویسی مؤثر هستند ) (. ت- بیان ژن: تحقیقات مختلف نشان داده اند که ریز ماهواره های مستقر در محلهای ابتدایی می توانند بر بیان ژن مؤثر باشند. آنها به عنوان نقاط مستعد جهش، منبع اصلی تغییرات کمی ژنتیک و سازگاری های تکاملی هستند. در بسیاری از موارد مشخص گردیده است که تعداد تکرارهای ریز ماهواره می تواند تأثیر مهمی بر سطح بیان ژن داشته باشد )Chistiakov et al., 2006(. از سوی دیگر ناپایداری ریز ماهواره ها قادر است اختالفاتی را در بیان ژن ایجاد کند. ریز ماهواره های ژنومی به دلیل آنکه فراوانی و جهش پذیری باالیی دارند، چنانچه تغییری در نحوه آرایش اندازه آنها ایجاد شود می توانند منبع تغییرات مهمی در ویژگیهای اختصاصی جمعیتهای طبیعی گردند )Streelman and Kocher, 2002; Kashi et al., 1997(. این تأثیر می تواند بر بقا جمعیت و سازش پذیری آن نسبت به شرایط متغیر محیطی بسیار پر اهمیت باشد .)Blankenship et al., 2002( چند شکلي ریز ماهواره ها: تنوع تعداد واحدهای تکرار شونده در ریز ماهواره، چند شکلی بسیار باالی آنها را سبب میگردد که این تنوع خود ناشی از نرخ باالی جهش این نشانگرها و از خصوصیات مهم آنها میباشد. میزان جهش در این جایگاهها 3-31 تا 31-31 جهش در هر نسل است و با بلند شدن رشته ریز- ماهواره ای میزان جهش به مراتب افزایش مییابد. وجود چنین ناپایداری های قابل توارث در جایگاههای ریز ماهواره آنها را تبدیل به ابزاری سودمند برای مطالعات ژنتیکی و تکاملی کرده است. عواملی همچون تعداد و نوع تکرار ردیف کناری و نوترکیبی بر میزان جهش ریز ماهوارهای مؤثر میباشند. با توجه به میزان جهش باال دو نوع مکانیسم برای این جهشها پیشنهاد شده است )Ellegren, 2000(: 3- لغزش 1رشته ی مکمل در طی فرآیند تکثیر: بر اساس این نظریه در خالل نسخه برداری، نسخه جدید DNA سنتز شده میتواند به شکل غیر عادی قرار گیرد ولی به دلیل ساختار تکرار شده DNA ریز ماهوارهها اکثر بازهای دو رشتهای جدید هنوز به صورت جفت شده باقی مانده و تنها یک ساختار حلقهای کوچک به صورت جفت نشده باقی می ماند و در صورتی که سنتز DNA ادامه پیدا کند تعداد تکرارها در رشته جدید

1- Compound microsatellite 2- Slippage

44 تغییر خواهد کرد. از این رو لغزش نسخه برداری منجر به ایجاد یک سری از آللها با اندازه متفاوت )تعداد تکرارهای متفاوت( در افراد جمعیت میشود )عرفانی مقدم، 3181(. 1- کراسینگ اور نابرابر3: کراسینگ اور بین کروموزومهای همولوگ که به طور ناقص با هم جفت میشوند در مرحله میوز انجام میشود. کراسینگ اور نامتعادل موجب حذف شدگی در یک مولکول، اضافه شدن در مولکولی دیگر و متعاقب آن باعث انبساط و انقباض آرایه ها میگردد )Goldsteine et al., 1998(. جهش: مشاهدات نشان داده اند که ریز ماهواره ها بر آنزیم های کنترل میزان جهش و چرخه های سلولی مؤثر می باشند )Chang et al., 2001(. به منظور برآورد میزان تنوع در جمعیت و فاصله ژنتیکی از داده های ریز ماهواره و برای توصیف تنوع ژنتیکی در جایگاههای ریز ماهوارهای از دو مدل اساسی جهش آللی 2 نامحدود و جهش مرحلهای1 استفاده میشود. Crow )1964(، جهت درک تحقیقات در سطح مولکولی جمعیتها مدل IAM را پیشنهاد نمود و پیش بینی کرد که جهش تنها به حالت آللی جدید می انجامد و همیشه آللهایی در جمعیت به وجود میآیند که قبالً وجود نداشته اند و این حاالت میتوانند در هر تعداد واحد تکرار شونده )مانند GT( رخ دهند بر عکس در مدل SMM که توسط Kimura و Ota )1973(، به عنوان یک تئوری در مبحث ژنتیک جمعیت معرفی گردید پیش بینی شد که جهش به صورت اضافه شدن یا حذف یک واحد تکرار شونده )مانند GT( رخ میدهد. این بدان معنی است که برخی از جهشها آللهایی را تولید خواهند کرد که از قبل وجود داشتهاند. اهمیت استفاده از مدلی که بهتر با دادههای ریز ماهواره ای هم خوانی داشته باشد در این است که این کار موجب خواهد شد که برآوردهای دقیقتری از اندازه جمعیت و وقایع ساختاری آن به دست آورد. البته مدلهای دیگری مانند مدل دو مرحلهای و مدل K آللی نیز وجود دارد و هرآلل یک احتمال ثابت تغییرپذیری به طرف هر یک K-3 حالت آلل دیگر است ) ,.Rico et al 1997(. مطالعات اولیه بر روی مدلهای جهش حاکی از آن است که SMM میزان تنوع مشاهده شده در جایگاههای ریز ماهواره ای را دقیقتر پیش بینی مینماید و بررسی انواع ترتیبهای ریز ماهواره ای نشان میدهد که تغییر پذیری جایگاههای سه یا چهار نوکلئوتیدی در مقایسه با جایگاههای دو نوکلئوتیدی و ماهوارکها شباهت بیشتری با SMM دارند )Hansen, 2004(. افزایش تعداد واحدهای ریز ماهواره، کاهش طول تکرار )دی نوکلئوتیدی نسبت به تترا نوکلئوتیدی( و کاهش تعداد CG نواحی مجاور واحدها، باعث افزایش میزان جهش میگردند. همچنین بررسی ها نشان داده میزان جهش در نرها نسبت به ماده ها بیشتر است )نوروزی، 3186(.

1- Unequal crossing- over 2- Infinite Allele Model= IAM 3- Step Mutation Model= SMM

45 جداسازی ریز ماهواره ها: استفاده از ریز ماهوارهها نیازمند استخراج، جداسازی و تعیین توالی ناحیه مجاور آنها میباشد. برای این منظور روشهای مختلفی ابداع شده که شامل روش سنتی، مبتنی بر RAPD، روش بسط آغازگر، دو رگهگیری انتخابی و مبتنی بر AFLP میباشد که در ذیل به شرح روش بسط آغازگر که بر خالف دیگر روشها از تکنیک PCR استفاده نمیشود پرداخته میشود: 3- روش بسط نشانگر: در این روش ابتدا برای ساخت کتابخانه ژنومی، DNA را هضم نموده و برای تعیین اندازه آنها قطعات حاصل از هضم را بر روی ژل آگارز برده و پس از انتخاب و جداسازی قطعات مناسب 611-111 جفت باز، قطعه مورد نظر را وارد یک حامل فاژی کرده تا تک رشته تشکیل شود. سپس این ناقل 3 به میکروارگانیزم ها انتقال یافته و یک کتابخانه ژنومی نسبی تشکیل می شود و این کتابخانه با استفاده از 1 2 کاوشگری که واحد تکرار شونده CCT)n) یا CA)n) دارد غربال میگردد و ردیف یابی همسانه هایی که با کاوشگر مذکور جفت شوند صورت گرفته و در آخر طراحی آغازگرهایی متناظر با ردیفهای منحصر به فرد واقع در هر دو طرف آنها انجام میگیرد )Rico et al., 1997(. مزایای ریز ماهواره ها 4 3- دارای توارث همبارز میباشند و از توارث ساده مندلی تبعیت میکنند یعنی به راحتی میتوان افراد هتروزایگوت را از هموزایگوت تفکیک نمود. 1- در ژنوم موجودات به فراوانی یافت میشوند و پراکندگی آنها در سطح ژنوم موجودات عالی نیز یکنواخت میباشد. 1- چند شکلی باالیی دارند و در تشخیص میان افراد، در صورت استفاده از ترکیبی از جایگاهها، در مطالعه جریان ژنی و تعیین هویت بسیار توانمند می باشند. 4- مقدار بسیار کمی DNA نیاز دارند و به وسیله PCR قابل تکثیر هستند. 5- امتیازدهی آنها آسان و دقیق است. 6- معموالً قابلیت استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره یک گونه در گونههای بسیار نزدیک دیگر وجود دارد .)O’Reilly and Wright, 1995(

1- Partial Genomic Library 2- Screen 3- Clones 4- Co- dominant

46 معایب و مشکالت ریز ماهواره ها 3- تعیین توالی: یکی از مشکالت ریز ماهواره ها که در واقع مشکل عملی و ابتدایی آنهاست شناسایی و تعیین توالی بازی برای طراحی و ساخت نشانگر مورد نیاز است که انجام آن مستلزم صرف وقت و هزینه زیادی است. 3 1- اشتباهات آلل خوانی : این اشتباهات در اثر لغزش DNA پلیمراز رخ میدهد که منجر به تولید باندهای پهن و متعددی میگردد که همچون سایه در اطراف باند اصلی قرار گرفته که این باندها را باندهای نارسا می نامند و گفته می شود که در اثر حوادث لغزش در طول PCR به وجود می آیند. این باندها معموالً وضوح کمتری نسبت به باندهای اصلی دارند و میتوان از آنها صرفنظر کرد اما اگر با فرآورده های مربوط به یک فرد هتروزایگوت همپوشانی داشته باشند، آنگاه تشخیص این دو باند مشکل میشود. می توان چند روش را برای رفع این مشکل به کار برد: الف- انتخاب جایگاههایی با واحدهای تکرار چهار نوکلئیدی مناسب است زیرا با توجه به فاصله بیشتر بین آللها در این جایگاهها تعیین آلل ساده تر و نارسایی کمتر است. ب- استفاده از جایگاههای دو نوکلئوتیدی به همراه کاهش اندازه فرآورده ها )حدود 311 جفت باز( است، زیرا اندازه کوچک آللها به لحاظ فیزیکی سبب میگردد تا صحت تعیین آللها افزایش یافته و نارسایی کمتر شود هر چند که میزان تغییر پذیری قابل تشخیص نیز کاهش مییابد. پ- می توان برای افزایش دقت از چندین نشانگر اندازه برای ژلها استفاده کرد. ت- می توان از برنامههایی مانند ژنوتایپر که جهت تشخیص باندهای نارسا طراحی شدهاند استفاده کرد .)O’Reilly and Wright, 1995( 2 1- ایجاد آللهای صفر : آللهای صفر آللهایی هستند که ضعیف تکثیر شوند و یا پس از تکثیر و تفکیک قابل 1 رویت نیستند. وجود جهش در توالیهای مجاور ریز ماهواره ها از اتصال آغازگر جلوگیری کرده و در نتیجه هیچ فرآوردهای در PCR تولید نمیشود. البته وقایعی مانند درج و حذف بین ترتیب مورد تکثیر و محل آغازگر، کیفیت پایین DNA استخراجی و جهش در درون ترتیب مورد تکثیر )که موجب تغییرات زیادی در اندازه فرآورده می گردد( نیز میتوانند باعث ایجاد آللهای صفر شوند. وجود آللهای خنثی موجب برآورد نادرست هتروزایگوسیتی در داخل یک جمعیت میگردد. نوع و منشأ آللهای صفر، اولین بار در سال 3331 و در جایگاههای ریزماهوارهای دو نوکلئوتیدی انسان گزارش گردید. این آللها به طور معنی داری میتوانند در الگوهای تنوع مشاهده شده در جایگاه های ریز ماهواره ای شرکت نمایند. وقوع آللهای صفر را میتوان

1- Scoring errors 2- Null alleles 3- Flanking

47 از روی افزایش هموزایگوتها نسبت به آنچه که در شرایط هاردی- واینبرگ مورد انتظار است، تشخیص داد. وقوع این آللها با فراوانی باال ممکن است به صورت افزایش تعداد موارد عمل ننمودن PCR بروز نماید. باید توجه داشت که ممکن است آلل صفر قابل تعیین بوده ولی ضعیف باشد. در یک فرد هتروزایگوت در اثر فرآیند PCR ممکن است آلل صفر دیده نشود، زیرا فرآورده آلل غیر صفر فرآیند PCR را به زیان آلل صفر پیش خواهد برد. در فردی که برای آلل صفر هموزایگوت است، ممکن است فرآورده هر چند ضعیف دیده شود زیرا در طی واکنش هیچ فرآورده دیگری برای رقابت با فرآورده صفر وجود ندارد. این پدیده 3 آللهای صفر نسبی نامیده میشود و در موجوداتی که ریز ماهواره هایی بزرگ دارند، به پدیده ای معمول 2 تبدیل شده است زیرا بزرگتر بودن سبب میشود ریز ماهواره به ریزش آللهای بزرگ حساس شود. این ریزش که اغلب به کیفیت نامناسب DNA الگو مربوط میشود به سادگی منجر به افزایش نسبت درست- نمایی عمل ننمودن PCR برای فرآورده های بزرگتر میگردد. استفاده از بافتهای قدیمی یا ذخیره شده به عنوان منبع PCR و دستورالعمل های استخراج سریع DNA، بررسی ریز ماهواره ها را به کمک PCR تسهیل نموده است. ولی خرد شدن و آلودگی پروتئینی، تکثیر آللهای بزرگ را در مقایسه با آللهای کوچک کند کرده و یا متوقف میسازد. در یک مطالعه معلوم شد که کمبود معنی دار هتروزایگوت ها تنها در جمعیتهایی مشاهده میشود که DNA به جای خون از بافت عضله استخراج شده است. استخراج DNA از خون به لحاظ فنی سادهتر و سریعتر میباشد. در مطالعاتی که بر روی نمونههای قدیمی انجام میشود و یا در مطالعاتی که کیفیت DNA استخراجی آنها نامناسب است، تنها بایستی جایگاههای کامالً مشخص و کوچکتر )351bp>( مورد بررسی قرار گیرند تا اریبی مربوط به نسبت درست نمایی اندازه فرآورده PCR کاهش یابد )Hansen, 2004(. 4- تشابه یساختمان )هموپالسمی( اندازه: چند شکلی و تغییرات مشاهده شده در ریز ماهوارهها، ناشی از تغییرات طول قطعات تکثیر شده است. دو آلل در صورتی از همه لحاظ یکسان هستند که بدون جهش از آلل اجدادی یکسان ایجاد شده باشند. دو آلل ممکن است اندازه یکسان و یا حتی توالی یکسان داشته ولی از یک جد مشترک نباشند که هموپالسی اندازه نامیده میشوند. آنها ممکن است از یک آلل ولی با یک تاریخ متفاوت ایجاد شده باشند. بیتوجهی به هموپالسی اندازه منجر به برآورد رو به پایین زمان انشعاب واقعی بین جمعیتها خواهد شد. این پدیده ممکن است از طریق مقایسه توالی دو آلل هم اندازه مشخص شود )Hansen, 2004(. - 5- انتخاب مدل جهش مناسب: انتخاب مدلهای جهش مناسب برای توجیه تنوع در جایگاه های ریز ماهوارهای آسان نیست. در حال حاضر با توجه به عدم قطعیتی که در مورد نقش نسبی مدلهای جهش وجود

1- Partial null alleles 2- Large allele dropout

48 دارد، توصیه میشود محققینی که از تغییرپذیری ریز ماهواره ای )بدون آزمون و به ویژه در گونههایی که تعداد زیادی آلل بروز میدهند( استفاده مینمایند، روشی محافظه کارانه در پیش گیرند و از آمارههای F مرسوم بهره گیرند )Hansen, 2004(. 6- اندازه نمونه مورد نیاز: یکی از موارد مهم برای متخصصین ژنتیک و مدیران، تعیین حداقل اندازه نمونه مورد نیاز برای ارزیابی تغییرپذیری ریز ماهوارهای و ارائه تفسیرهای قابل فهم از دادهها میباشد. اگر تعداد آللها در جایگاههای ریز ماهوارهای بسیار زیاد باشد )هر چه جایگاهها چند شکل تر باشند(، با تعداد نمونه کم نیز میتوان تغییرپذیری ژنتیکی را بررسی نمود. در اکثر مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته، اندازه نمونه کافی نبوده است. هنگامی که نسبت تعداد آلل را به اندازه نمونه در نظر میگیریم، این امر بیشتر خود را نشان میدهد و اکثریت فراوانی های آللی گزارش شده بر اساس این نسبت به احتمال زیاد کمتر از %5 میباشند. عالوه بر این اکثر جمعیتها با کمتر از 51% حاالت آللی احتمالی شرح داده میشوند. بنابراین 3 اکثریت مطالعاتی که تا این تاریخ صورت گرفته است در رابطه با آللهای اختصاصی )آللهایی که تنها در 2 یک موقعیت رخ دادهاند( هیچ فرضی را در نظر نگرفتهاند. تکنیکهای عددی برای نمونه سازی ، مانند شبیه- 4 1 سازی مونت کارلو و روش زنجیره مارکف ، در تجزیه و تحلیل تعداد نمونه کم کمک مینمایند. اما برای بهبود حجم داده های گزارش شده و ارائه برآوردهای صحیح تری از تمایز جمعیتها، الزم است تعداد نمونهها افزایش داده شود. این برآوردهای دقیق تر در اثر کاهش دامنه اطمینان مربوط به این برآوردها، حاصل می آیند. اندازه نمونه واقعی مورد نیاز به میزان زیادی به گونه مورد نظر و نوع جایگاه مورد بررسی بستگی دارد. برای مثال، در مطالعاتی که تعداد زیادی آلل گزارش میشود حتماً اندازه نمونه بزرگتری الزم است )O’Reilly and Wright, 1995(. یک راهکار احتمالی برای کم کردن مشکل اندازه نسبتاً کم نمونه )در نتیجه زیاد بودن دامنه اطمینان دادهها( این است که آللها در کالسهای اندازه ای معین گروه بندی شوند. این کار موجب کاهش اطالعات و کاهش دامنه اندازه خاص شده و تعداد گروههای آللی انتخاب شده به میزان زیادی معقول می گردند. این راه ممکن است تنها راه غلبه بر سطوح باالی تغییرپذیری مشاهده شده در برخی جایگاهها )با بیش از 51 آلل( باشد. تنها آللهایی که فراوانی پایینی دارند، نیاز به گروه بندی دارند و معموالً این آللها در دو انتهای دامنه اندازه آلل رخ میدهند. در صورتی که مدل جهش SMM را در نظر داشته باشیم، دستهبندی آللها بر مبنای مشابهت اندازه شان نیز مطلوب به نظر میرسد. تعیین اندازه نمونهای که با آن بتوان در یک جایگاه اکثریت آللها را به تعداد 5 بار یا بیشتر ارائه نمود، انتظار نابجایی است. این کار به نمونههای خیلی بزرگ نیاز دارد و در برخی موارد این تعداد از تعداد افراد موجود در جمعیت بیشتر

1- Private alleles 2- Numerical re- sampling 3- Monte Carlo simulation 4- Markov chain approach

49 است. در چنین مواردی تنها راه حل ممکن، پذیرش تکنیکهای عددی نمونهسازی، مانند خود راه اندازی است که برآوردهایی از میزان اعتماد به دادهها را از طریق دامنه های اطمینان فراهم میآورند. با وجود آنکه تعیین اندازه مناسب برای ریز ماهواره ها غیر ممکن است، برای جایگاه هایی که بین 31-5 آلل نشان میدهند باید 51 فرد را منظور نمود، البته نمونههای بزرگتر مطلوبتر خواهند بود. یکی دیگر از مسائل مربوط به اندازه نمونه، تعداد جایگاههای مورد نیاز برای بررسی تغییرپذیری ریز ماهواره ای است. این تعداد به میزان زیادی به پرسشهای بیولوژیک طرح شده و تغییرپذیری جایگاههای مورد استفاده بستگی دارد. اگر هدف از مطالعه بررسی تمایز جمعیتی باشد، ممکن است برای نشان دادن سطح معنی داری از ساختار بین جمعیتها، یک یا دو جایگاه کافی باشد. با این وجود، تکنیکهای نمونه سازی که واریانس و دامنه اطمینان مربوط به دادههای خاصی را محاسبه میکنند بر روی جایگاهها انجام میگیرند. بنابراین برآوردهای حاصل از تعداد کمی جایگاه مشکوک خواهند بود. گفته شده است که برای به دست آوردن دامنه های اطمینان معنی دار و برآوردهای واریانس برای آمارههای F، حداقل باید 5 جایگاه به کار برده شود )عرفانی مقدم، 3181(. مشکل دیگر در رابطه با تعداد کم جایگاه این است که به هنگام تشکیل درخت فواصل ژنتیکی، گرههایی که از طریق خودراهاندازی برای جایگاهها تولید میشوند به طور ساختگی بزرگ میباشند. از آنجایی که تعداد تحریفات احتمالی به طور قابل مالحظهای از موارد نمونه سازی )اغلب 3111( کمتر است در نتیجه به برآورد واریانس ساختگی و کوچک میانجامد و امکان ایجاد مقادیر ساختگی و بزرگ افزایش مییابد. بنابراین نمونه سازی به میزان زیاد به همراه کم بودن تعداد جایگاه ممکن است به تفسیر نادرستی از توانمندی گره های تعیین شده بیانجامد. از آنجایی که ممکن است عواملی مانند آللهای صفر، مشکالت فنی و مشکالت مربوط به آلل خوانی در برخی جایگاهها وجود داشته و باعث اریب برآوردهای مربوط به تعادل یا عدم تعادل هاردی- واینبرگ گردند، برای بررسی تغییرپذیری درون جمعیتی باید چندین جایگاه را آزمایش نمود. اگر تفاسیر غلط مربوط به دادههای جمعیتی مورد پذیرش قرار نگرفته باشند، مقایسه های تجزیه و تحلیل های تک جایگاهی و چند جایگاهی ضروری خواهند بود. توصیه میشود که برای بررسی پرسشهای ژنتیک جمعیت، بیش از 5 جایگاه به کار برده شود )O’Reilly and Wright, 1995(. حفاظت شدگي ریز ماهواره ها 3- تولد و مرگ ریز ماهواره ها: در اولین مطالعات توسط Mesier و همکاران )1996(، حفاظت شدگی یک جایگاه ریز ماهواره ای تترانوکلئوتیدی درون یک ژن بین همه انواع گونههای میمون و گونه ی انسان نشان داده شده و از روی تغییرات توالیهای جایگاه آنها )در اثر جهش( مدلی برای پیدایش یا تولد و تکامل ریز ماهواره ها ارائه گردید. در همین راستا Taylor و همکاران )1999(، از بررسی توالیهای جایگاه ریز ماهواره در گونههای مختلف نتیجه گرفتند که در مرحلهای خاص از انتهای چرخه تکاملی ریز ماهواره ها، انقطاع در

51 توالیهای تکراری در یک مرحله و حذف شدن بخشهای بزرگتر تکراری در مرحله بعد اتفاق میافتد و این

مرحله را مرگ ریز ماهواره ها نام نهادند )عرفانی مقدم، 3181(. - 1996 Hewitt Rico 1- ریز ماهواره های بسیار حفاظت شده: و ) (، حفاظت شدگی جایگاه های ریز ماهوارهای را به مدت 471 میلیون سال میان گونههای ماهی و ثابت نمودند که میان فاصله سیستماتیک و دو فاکتور حفاظت شدگی محل پرایمرها و هتروزایگوسیتی و پلیمورفیسم ایجاد شده، نسبت آشکاری وجود دارد )عرفانی مقدم، 3181(. کاربردهای ریز ماهواره ها 1 2 3 3- تعیین هویت ، آزمون انساب و آنالیز خویشاوندی : مطالعات مربوط به تعیین هویت در مسائل حقوقی و قضایی، جنایی، دیرین شناسی و ... بسیار مورد استفاده قرار میگیرند. در ایاالت متحده، برای تعیین هویت جنایتکاران از روی مواد بیولوژیکی باقیمانده در صحنه جنایت از 31 جایگاه ریزماهوارهای استفاده میشود 4 که به صورت کیتهای تجاری درآمدهاند. این 31 جایگاه تنها در قالب دو واکنش PCR چندگانه قابل تکثیر میباشند و با نشاندار کردن فلورسنتی آغازگرها و به کمک سیستم ردیف یابی خودکار تشخیص داده 5 میشوند. مطالعات مربوط به بررسی روابط خویشاوندی، آزمون انساب و تعیین اصالت در انسان و حیواناتی همچون اسب که اصیل بودنشان از اهمیت ویژهای برخوردار است، بسیار مورد توجه میباشند. چنین مطالعاتی برای مدیریت جمعیتهای اهلی و درک الگوهای آمیزشی در حیات وحش مفید میباشند. در حالت ایده آل، در قالب یک مطالعه جمعیتی میتوان روابط خویشاوندی بین افراد را از طریق روش نسبت 6 درست نمایی ارزیابی نمود. ریز ماهواره ها به سبب ماهیت بسیار متغیرشان برای چنین مطالعاتی بسیار مناسب هستند )Thaller .)O’Reilly and Wright, 1995 )2003(، با استفاده از ریز ماهواره ها، روشی را برای انتساب نمونههای گمنام به دو جمعیت متفاوت ابداع نمودند. به عبارت دیگر این کار را نیز میتوان یک نوع آزمون انتساب دانست که در آن به جای انتساب یک فرد یا یک نمونه به والدینی مشخص، فرد یا نمونه مذکور به جمعیتی مشخص منتسب میگردد.

1- مطالعات ساختار جمعیت و حفاظت: تصمیمات مدیریتی عاقالنه تصمیماتی هستند که بر مبنای درک صحیحی از ساختار ذخایر زیستی مورد نظر اتخاذ گردند ولی قلمروهای فرضی این ذخایر زیستی به ویژه در محیطهایی همچون اقیانوسها کاری پیچیده و دشوار است. نشانگرهای ژنتیکی را میتوان برای تعریف ساختار این ذخایر به کار برد. سهولت جداسازی، تشخیص و به ویژه تغییرپذیری زیاد ریز ماهواره ها

1- Identification 2- Parentage test or parentage control 3- Kinship analysis 4- Multiplex PCR 5- Paternity 6- Likelihood ratio

53 موجب شده است که ریزماهواره ها علیرغم مدت زمان کوتاهی که از کشف آنها میگذرد، به ابزاری توانمند جهت تجزیه و تحلیل ژنتیکی جمعیتهای طبیعی تبدیل شوند. در بازسازی ذخایر یک منطقه یا بررسی ساختار جمعیتی آنها، معموالً نوع ژنتیکی ماهیان آن منطقه را به دست می آورند تا در زمان در خطر افتادن آن گونه بتوانند آن را نجات دهند )صفری، 3185(. کاربرد فیلوژئوگرافی این نشانگر در جایی که ساختار جمعیت در مقیاس بزرگ جغرافیایی بررسی می شود به طور قابل مالحظه ای عالی است. ریز ماهواره حتی قادراست در مناطق کوچک هم قابل اعتماد باشد برای مثال در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی جمعیتها )Dixon et al., 2008(. در مطالعه ای که روی میگوی ببری جهت بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای وحشی و پرورشی انجام شد کاهش تنوع ژنتیکی و کاهش اندازه مؤثر جمعیت در هر دو جمعیت دیده شد که این رفتار را تنها در اثر نبود مدیریت ژنتیکی قوی حدس زدند. همچنین جهت شناسایی گونه های در معرض 3 خطر و نادر مانند فالندر چشم راست مورد بررسی قرار گرفت )Sekino et al., 2008( و بررسی مهاجرت ماهیان با بررسی ژنتیکی دو جمعیت پرورشی و یک جمعیت طبیعی از باس دریایی و تالقی این دو گونه با هم به منظور شبیه سازی آمیزش اینها در محیط طبیعی، میزان فرار این ماهیان و اثر هر کدام از هچری ها روی ژنتیک جمعیت طبیعی که در اثر شکسته شدن قفسها وارد دریا می شوند قابل اندازه گیری شد .)Miggiano et al., 2005( 1- شناسایی DNA گونه و والدین و روابط والدینی: برای هر ریز ماهواره ، یک فرزند، یک آلل را از پدر و یک آلل را از مادر به ارث می برد. نشانگرهای ریز ماهواره به راحتی می توانند نحوه ارث پذیری یک آلل را از والدین به فرزندان نشان دهند. همچنین ریز ماهواره ها به دلیل همبارز بودنشان می توانند یک روش مفید برای شناسایی هیبرید بین دو گونه باشند که در این راستا می توان به مطالعاتی از قبیل ماهیان هیبرید )Foop- Bayat and Woznicki, 2008(، اثبات تغیر جنسیت )Foop- Bayat et al., 2007(، بررسی روابط والدینی و سهم والدین در تولید مثل گروهی )Munkres et al., 2007(، تعداد مؤثر مولدین یک جمعیت و بررسی موفقیت لقاح )McLean et al., 2008(، تشخیص سیستمهای تولید مثلی گروهی ) ,.Awata et al Herlin et al., 2008 2005 (، تشخیص فرزند و والدین ) ( اشاره نمود. 4- همه گیری و آسیب شناسی مولکولی: از آنجا که ریز ماهواره ها توالی فاقد رمز هستند، نمی توانند م ستقیماً لوسای مسئول فنوتیپ بیماری را شناسایی کنند. با این حال این نشانگر پیوستگی و ارتباط با بیماری را نشان می دهد و با استفاده از آن می توان عدم تعادل لینکاژی با دیگر اختالفات ژنتیکی عملکردی که مسبب فنوتیپ بیماری هستند را نشان داد. نقشه برداری و شناسایی بیشتر ژنهای مسئول مقاومت به بیماری انگلها و پاتوژنها و شناسایی ژنهای کنترل کننده مقاومت دارویی در ارگانیسم های بیماری زا با

1- Verasper variegates

52 غربال ریز ماهواره قابل انجام است که در این راستا می توان به تشخیص بیماری هایی مانند بیماری 3 باکتریایی آب سرد در قزل آال )Johnson et al., 2008(، بیماری ویروسی IHN در قزل آال ) Barroso et al., 2008(، عفونت ایریدوویروسی لمفوسیستیس در فالندر ژاپنی )Fuji et al., 2006(، انگل Gyrodactylus salaries در ماهی آزاد اقیانوس اطلس )Gilbey et al., 2006(، سندرم ویروسی لکه سفید در میگو )Dong et al., 2008( و شناسایی فاکتورهای تنظیم کننده ژن اینترفرون )Sun et al., 2006( اشاره نمود. 2 5- نقشه یابی ژنومی : احتماالً بین 311-51 هزار ژن در هر گونه از پستانداران و پرندگان وجود دارد و اولین گام عمده در مسیر کشف ژنها، خلق نقشههای ژنتیکی است. دو شکل از یک نقشه ژنتیکی وجود دارد: 1 الف- نقشه پیوستگی : که شامل فهرستهایی از ژنها )گروههای( پیوسته است که به ترتیب خطی و بر طبق کسر نوترکیبی شان مرتب شدهاند. 4 ب- نقشه فیزیکی : که موقعیت هر ژن را روی کروموزوم نشان میدهد. به دلیل فراوانی، سطح باالی پلی مورفیسم و مقدار کوچک ریز ماهواره ها، از آنها برای ساخت نقشه های ژنتیکی مفید استفاده می کنند. چارچوب اولیه برای آنالیزهای مولکولی صفات کمی، استفاده از این نقشه ها برای تلفیق با دیگر نقشه های ژنتیکی است. نقشه های لینکاژی ارتباط بین گروه های لینکاژی و بازوهای کروموزومی را فراهم می کنند )جایگاه ژن را روی کروموزوم مشخص می کنند(. نقشه های ژنتیکی در گونه های ماهی آزاد اقیانوس اطلس )Siemon, 2005(، باس دریایی )Chistiakov ) et al., 2006و تیالپیا )Cnaani et al., 2004( شناسایی و گزارش شده است. 6- نقشه لوسای صفات کمی: بیشتر صفاتی که از نظر تجاری مهم هستند، فیلوژنیک هستند. این صفات توسط بیش از یک جایگاه کنترل می شوند که به اختصار 5QTL نام دارند. عموماً صفات کمی، چند فاکتوری هستند و تحت تأثیر چندین ژن و شرایط محیط بروز می کنند. امروزه استراتژی های متکی بر ریز ماهواره، تکنیک مفیدی برای شناسایی QTLs شده است خصوصاً برای صفاتی که در ارتباط با مسائل بیماری، اقتصادی و تکاملی هستند. بیشتر مطالعات QTL در سه گونه ماهی از خانواده آزاد ماهیان )آزاد اقیانوس اطلس، قزل آال و چار قطبی( صورت گرفته است که برای بررسی تحمل دمایی ) ,.Somorjai et al 2003(، طول بدن و زمان تخمریزی )O’Malley et al., 2003(، نرخ تکامل جنینی ) ,.Robison et al

1- Bacterial Cold Water Disease= BCWD 2- Genomic mapping 3- Linkage map 4- Physical map 5- Quantitative Trait Loci

51 2001(، نرخ تکامل جنینی ژنهای عملکردی مانند میوستاتین ) ,.Chistiakov et al., 2006; Xue et al Cnaani et al., 2004 2006 ( و شناسایی لوسای واکنش به استرس در تیالپیا ) ( به کار گرفته شده است. 3MAS 7- انتخاب به کمک نشانگر : نشانگری که در نزدیکی ژن عملکردی یافت شود به عنوان نشانه ای برای شناسایی آن ژن به کار می رود. انتخاب نشانگر بر اساس نزدیکی آن به ژن مورد نظر برای افزایش سرعت و کارایی انتخاب صفت مورد نظر انجام می شود. ریز ماهواره ها به دلیل پراکندگی در کل ژنوم و فراوانی نسبتاً باال، در مراحل ابتدایی MAS در انتخاب اولیه والدین برای تالقی بعدی و تشخیص صفات ژنتیکی فرزندان مفید هستند. برای این کار از ریز ماهواره های متصل به QTL هدف استفاده می شود. به عنوان مثال شناسایی عامل مقاومت به بیماری لمفوسیستیس فالندر ژاپنی )Fuji et al., 2008( را می توان به

عنوان یکی از مطالعات مرتبط انجام شده نام برد. 2 8- تیره سلولی : تاریخچه تشکیل تیره سلولی در ماهیان به سال 3361 بر می گردد که برای جداسازی و بررسی ویروسهای مهم از نظر اقتصادی در بیماریهای ماهیان به کار گرفته شد.مسأله مهم به وجود آمده در کار با تیره سلولی، ناخالصی تالقی است. ریز ماهواره ها به خاطر ویژگی های منحصر به فردشان از قبیل بیان همبارزی، نرخ پایین جهش، چند شکلی باال، سادگی در نمره دهی و تشخیص ساده آنها حتی زمانی که همپوشانی دارند در این رابطه مفید واقع می شوند. با آنالیز 31 لوسای ریز ماهواره، 31 الین سلولی منحصر Perry et al., 2001 به فرد در قزل آال شناسایی شد ) (. 3- مطالعات فیلوژنی: نشانگرهای ریز ماهواره گر چه قادرند تنوع ژنتیکی باالیی را شناسایی و آشکار سازند، در مطالعات فیلوژنی نیز می توانند کاربرد داشته باشند که باید سعی نمود از لوسای متعددی استفاده کرد )Nauta .)Zhivotovsky et al., 1995 و Weissing )1996(، با بررسی تئوری جهشها در ریز ماهواره و مقایسه آن با آلوزایم و توالی یابی با استفاده از شبیه سازی کامپیوتری نشان دادند که داده های حاصل از ریز ماهواره ها در جمعیتهای کوچک قابل استناد است. Wilson و Balding )1998(، در مطالعات خود به این نتیجه رسیدند که یک لوسای ریز ماهواره به تنهایی برای بررسی فرآیندهای تکامل کافی نیست. Streelman و همکاران )1998(، با استفاده از لوسای ریز ماهواره و لوسای ژن یک اسید آمینه توانستند درخت فیلوژنی ماهی سیچالید را رسم کنند. Petren و همکاران )1999(، نشان دادند که ریز ماهواره ها برای بازسازی فیلوژنی گونه های نزدیک و تفسیر تاریخچه تکاملی و جغرافیایی بسیار مفید هستند. در بررسی فیلوژنی که روی خوکهای وحشی و پرورشی با لوسای ریز ماهواره انجام گرفت، نتایج با رده بندی Fang et al., 2005 تاکسونومیک همخوانی داشت و روابط جدیدتری نیز کشف شد ) (.

1- Marker- Assisted Selection 2- Cell line

54 31- تشخیص آللهای ریز ماهوارهای: این نشانگرها نیز همانند سایر نشانگرهای مبتنی بر PCR، از این طریق تکثیر شدن و فرآورده های حاصل پس از الکتروفورز تشخیص داده میشوند. تکثیر ناحیه مورد نظر با استفاده از یک جفت آغازگر که مکمل قسمتی از ردیفهای پهلویی ناحیه تکرار شونده میباشد، صورت میگیرد. این ردیفها کامالً اختصاصی میباشند و در ژنوم کامل تنها یک بار رخ میدهند. بنابراین حتی اگر در ریز ماهواره ای خاص، واحد تکرار شونده در چندین محل متفاوت در ژنوم روی دهد، PCR تنها محلی را که دارای ردیفهای پهلویی متناظر با آغازگرهای مربوطه میباشد را تکثیر خواهد نمود. طول فرآورده PCR مطابق با تعداد واحد تکرارشونده در آن محل متفاوت است. الکتروفورز باید به گونهای باشد که امکان تمیز باندهایی که تنها به اندازه یک باز متفاوتند را به وجود آورد. انحصاری بودن آغازگرها موجب میشود که در فرد هتروزایگوت دو باند و در فرد هموزایگوت یک باند به دست آید. شکل 3-35 طرحی از این حالت را نشان میدهد )صفری، 3185(.

2 1 9 4 5 6 7 8 ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ شکل 2-25- تنوع ریز ماهواره ای )در این تصویر 5 آلل دیده می شود و ستون 8، ژنوتیپ یک فرد هموزایگوت و سایر ستونها ژنوتیپهای هتروزایگوت را نشان میدهند.( پس از الکتروفورز سه راه برای نمایان سازی آللها وجود دارد: 3- نشاندار کردن با آغازگرهای رادیواکتیو یا استفاده از نوکلئوتیدهای نشاندار: هر دو راهکار موجب میشوند که فرآورده PCR نشاندار شود. بنابراین این فرآورده ها را میتوان بر روی فیلمهای حساس به اشعه X نمایان ساخت. این روش علیرغم دقت زیاد، به دلیل بهرهگیری از مواد رادیواکتیو و خطرات ناشی از آن به تجهیزات ویژه نیاز داشته و تنها در آزمایشگاههای مجهز قابل انجام است. 3 1- نشاندار کردن فلورسنتی آغازگرها و سپس استفاده از سیستم ردیف یابی خودکار : بدین ترتیب توالی قطعه تکثیر شده مشخص و تعیین اندازه دقیق آلل امکانپذیر میگردد. این روش دقیقترین روش موجود میباشد ولی تجهیزات مورد نیاز آن بسیار گران بوده و در هر آزمایشگاهی وجود ندارد. 2 1- استفاده از رنگ آمیزی های ویژه مانند رنگ آمیزی نیترات نقره : که بسیار حساس بوده و مقادیر بسیار جزئی DNA را نیز نمایان میسازد. سادگی و سهولت کار، کارآمدی برابر با سایر روشها، ارزان بودن، امکان

1- Automated sequencing system 2- Silver staining

55 استفاده از آن در هر نوع شرایط آزمایشگاهی و حساسیت بسیار باال از برتریهای این روش میباشند )صفری، 3185( که به سبب همین برتریها در این مطالعه نیز از این روش استفاده گردید. 1 2-7-5-9-1-21- نشانگرهای DNA میتوکندریایي سالها پیش با بررسی میتوکندری از طریق میکروسکوپ الکترونی، وجود DNA اختصاصی و مستقل از DNA موجود در هسته )mtDNA( به اثبات رسید و امروزه با کشف توالیهای موجود در میتوکندری امکان بررسی ژنهای کنترل کننده ی موجود در این اندامک به عنوان یکی از دیدگاههای جدید و مهم مطالعات ژنتیکی در آمده است. نام میتوکندری از دو کلمه یونانی Mito به معنی رشد و Chondrial به معنی دانه گرفته شده است. این اندامک در سیتوپالسم همه سلولهای یوکاریوتی وجود دارد و حاوی آنزیم های کنترل کننده زنجیره تنفسی می باشد )Magoulas and Zouros, 1993(. در سلولهای جانوران یوکاریوت، مقدار کمی از DNA، خارج از هسته و درون میتوکندریها یافت می شود و هر یک از میتوکندریها حاوی حدود 31 کپی یکسان از ژنوم میتوکندریایی می باشند. ژنوم میتوکندریایی به طور قابل مقایسه ای کوچک )36-33 هزار نوکلئوتید(، دو رشته ای و حلقوی است و DNA غیر عملکردی1 بسیار کمی دارد ) ,.Avise et al 1987(. احتمال دارد توالی نوکلئوتیدی mtDNA دو نمونه انتخاب شده از یک گونه، متفاوت باشند. تفاوت ممکن است در نوع یا تعداد نوکلئوتیدها در یک مکان از ژنوم باشد که آن را جهشهای نقطه ای1 می نامند و یا ممکن است به وسیله جانشینی یک نوکلئوتید به وسیله یک معادل ساختاری آن رخ دهد ) ,.Brown et al 1982( که آن را جهشهای طولی4 می نامند و در توالی غیر کد کننده5 مرسوم تر است ) Hauswirth and Clyton, 1985(. اگر جهش در ژنوم میتوکندری سلولهای زایا ایجاد شود، احتمال اینکه در تقسیمات بعدی این سلولها و همه میتوکندریهای فرد جدید که از آن سلول منشأ می گیرند شامل mtDNA جهش یافته باشند، بسیار باال می رود )DNA .)Ovenden, 1990 میتوکندریایی جانوران به میزان زیادی دارای وراثت مادری است )Giles et al., 1980(. بیشتر نمونه ها دارای ژنوم میتوکندریایی متفاوتی می باشند همانطور که بیشتر انسانها نام خانوادگی متفاوتی دارند. پس در یک نسل یا چندین نسل، ممکن است افراد یا جانوران، ژنوم میتوکندریایی یکسانی داشته باشند. داشتن نام خانوادگی یکسان به طور عادی، نشان دهنده قرابت نزدیک است پس جانوران دارای mtDNA یکسان نیز از نظر ژنتیکی مشابهند. مخلوط دودمان میتوکندریایی که به نسل بعد منتقل می شود به دلیل توارث مادری mtDNA، به موفقیت نسبی تولید مثل هر فرد ماده وابسته است. افراد دارای mtDNA جدید )که به وسیله مهاجرت یا جهش ایجاد شوند( می توانند با تولید

1- mtDNA 2- Non- functional 3- Point mutations 4- Length mutations 5- Non- coding

56 مثل بعدی این ژنوم را به نسل بعدی منتقل کنند و سبب دوام این ژنوم جدید شوند. اگر سدی در برابر مهاجرت در جمعیت انسانی رخ دهد یا ازدواج درونی در یک جمعیت صورت گیرد، از بین رفتن یا کسب نام خانوادگی در هر گروه مجزا در نسلهای متعدد سبب می شود ترکیب نام خانوادگی هر گروه متفاوت شود. تفاوت mtDNA بین جمعیتهای جانوران مجزا نیز به همین شیوه رخ می دهد )Ovenden, 1990(. هر چند که ژنوم میتوکندری جانوری اغلب منشأ مادری دارد ولی منشأ پدری ژنوم میتوکندری در آنچوی اروپایی3 گزارش شده است )Magoulas and Zouros, 1993(. وراثت مادری، عدم نوترکیبی و سرعت باالی جایگزینی نوکلئوتیدها، mtDNA را به یک نشانگر عالی در مطالعات سیستماتیک، فیلوژنی و جمعیت تبدیل کرده است. سرعت تغییرات نوکلئوتیدی در نواحی مختلف ژنوم میتوکندری متفاوت است. هر ژن و به عالوه مناطق درون یک ژن به خاطر اختالف در سطح عملکردی خود با یک نرخ منحصر به فرد تکامل می یابند. ژنهای rRNA برای تعیین روابط گروههای جدا از هم مناسب می باشند. در حالی که مناطقی با سرعت تکاملی باالتر برای تشخیص سطوح پایین تر سیستماتیک به کار می روند. ساختار mtDNA در ماهیان نسبت به دیگر مهره داران محافظت بیشتری شده است و به عنوان یک واحد منفرد به ارث می رسد؛ بنابراین مانند یک ژن منفرد با آن رفتار می شود که ممکن است یکی از معایب mtDNA در مطالعات جمعیتی باشد زیرا تاریخچه تکامل یک ژن منفرد می تواند با تاریخچه کل ژنوم متفاوت باشد ) Kocher and Stepein, 1997(. اندازه mtDNA در اکثر ماهیان حدود 511±36511 جفت باز می باشد. با وجود اینکه DNA میتوکندریایی ماهیان هموپالسمیک است در برخی از ماهیان خاویاری نوع هتروپالسمیک آن نیز شناسایی شده است )Pourkazemi, 1996(. در گونه های جانوری ژنوم میتوکندری دارای 17 ژن می- باشد که عبارتند از 31 ژن رمز دهنده پروتئین، 11 ژن rRNA و یک ناحیه به عنوان آغاز همانندسازی یا -D Loop )شکل 3-36(. ژن سیتوکروم b یکی از پروتئینهای رمز شده میتوکندریایی است که درچرخه تنفسی سلولی اهمیت زیادی دارد و یکی از بهترین نقاط ژنوم میتوکندری برای مطالعات ماهیان می باشد. از برخی از قابلیتهای این ژن خصوصاً زیر مجموعه های کوتاه این ژن در حل مسائل فیلوژنی استفاده شده است .)Kocher and Stepein, 1997(

1- Engraulis encrasicolus

شکل 2-26- نقشه ژنی mtDNA با جایگاه و موقعیت تمامی ژنها )Hallerman, 2003( مزایای استفاده از mtDNA :mtDNA به دالیل متعدد یک سیستم عمومی ژنتیکی برای تحلیل ها بوده است. ژنوم میتوکندری در ساختار و عملکرد در مقایسه با ژنوم هسته، ساده است و بر خالف آن در هنگام میوز، از دو سر نوترکیبی نمی یابد و همه افراد، mtDNA مشابه والد ماده خود را حمل می کنند. این ترکیبات به استثنای وقایع جهش، یک نوع منفرد از مولکول هستند که به وسیله تولید مثل موفق به ارث می رسند و می توانند برای ارزیابی وابستگی بین جمعیتها به کار روند. ژنوم میتوکندری میان کنش شناخته شده با محیط ندارد و به نظر میرسد تنوعات ژنتیکی بین افراد حقیقتاً بازتابی از وجود جدایی تولید مثلی باشد )Ovenden and Brasher, 2000(. اندازه گیری تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها مزیت بزرگ تحلیل های mtDNA به دلیل توارث مادری و ظاهراً نرخ سریع تکامل آنها می باشد )Brown et al., 1979(. ژنوم میتوکندری می تواند برای نشان دادن حرکت یک طرفه جریان ژنی در یک گونه که مدارک غیر ژنتیکی از این نوع حرکت در آن وجود ندارد مفید باشد. مثالی از این مورد توسط Avise و Saunders )1984(، بر 3 روی خورشید ماهی جنس Lepomis ارائه شده است. محدودیتهای استفاده از mtDNA :mtDNA اساساً یک جایگاه1 ژنتیکی منفرد شامل چندین هزار نوکلئوتید است که فقط می تواند کسری از تصویر تغییرات ژنتیکی را در یک گروه از جانوران نشان دهد. تحلیل های mtDNA هیچ اطالعاتی در مورد نوع تغییر ژنتیکی که جمعیتها را کنترل می کنند نمی دهد. همچنین این تحلیل ها دلیل قاطع برای وجود جدایی تولید مثلی درون یا بین جمعیتها فراهم نمی کنند ) Ovenden and .)Brasher, 2000

1- Sun fish 2- locus

58 کاربرد mtDNA در ارزیابي ذخایر: هدف از مطالعه mtDNA در مدیریت ذخایر نشان دادن تفاوت در mtDNA نمونه های جمع آوری شده در دامنه گونه است که برای تخمین اندازه و تعداد قسمتی یا تمام جمعیتهای مجزا از نظر تولید مثلی که گونه را تشکیل می دهند به کار می رود )Ovenden, 1990(. 1 2-7-5-9-1-29- توالي یابي DNA توالی یابی به تعیین ردیف قرارگیری نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA یا RNA و یا تعیین ردیف قرارگیری اسیدهای آمینه در یک زنجیره پلی پپتیدی گفته می شود. تعیین چینش تمام DNA روشی کامل تر، پیشرفته تر و قوی تر نسبت به روشهای فوق می باشد. از طرفی DNA هسته ای قابلیت ترمیم خود را دارد به طوری که بسیاری از جهشها و مشکالت ساختاری که در کروموزوم های جنسی وجود دارند به نسل بعدی منتقل نمی شوند و ترمیم می گردند، اما در سلولها اندامک هایی به نام میتوکندری وجود دارند که ترمیم و همانند سازی را با دقت کمتری نسبت به ژنوم هسته ای انجام می دهند )گله داری و فروغمند، 3185(. توالی یابی به چند روش انجام می شود که در ذیل به اختصار اشاره می گردد: Gilbert Maxam 1 1 3- توالی یابی شیمیایی )روش ماکسام گیلبرت (: روش شکست شیمیایی توسط و )1977(، ابداع شد )Pherson et al., 2000(. در این روش قطعه مشخصی از DNA به عنوان ماده اولیه مورد نیاز است و الزم نیست که این قطعه در ناقل پالسمید کلون شود. بنابراین این روش برای هر قطعه DNA کاربرد دارد. انتهای ´5 هر دو رشته DNA با فسفر رادیواکتیو )P32( نشاندار می شوند. رشته ها ذوب شده و جدا می گردند تا جمعیتی از رشته های نشاندار شده برای واکنشهای تعیین توالی تولید شوند. گام بعدی تغییر شیمیایی بازهای DNA است. DNA به چهار قسمت تقسیم شده و به هر قسمت ماده شیمیایی خاصی افزوده می شود که یک یا دو باز ازت دار را تغییر می دهد. آزمایش به گونه ای برگزیده می شود که به طور میانگین در هر مولکول DNA فقط یک تغییر شیمیایی انجام می شود. سپس بازهای تغییر یافته از قندی که به آن متصل هستند جدا شده و با افزودن ماده شیمیایی پیپریدین، زنجیره فسفو دی استراز در محلی که باز ازت دار تغییر یافته است شکافته می شود. این فرآیندها تولید قطعات نشاندار شده ای خواهند کرد که انتهای آنها بازهای متفاوتی وجود دارند و هر یک از آنها فقط در یک نوکلئوتید با دیگران متفاوت است که اصطالحاً قطعه های همجوار4 نام دارند )امین الری، 3178(. 1- توالی یابی به روش خاتمه یابی زنجیره5 )سانجرکولسان3(: روش خاتمه دی داکسی1 توسط Sanger و Coulson )1977(، ابداع شد و متداولترین روش مورد استفاده می باشد )Pherson et al., 2000(. هر چند

1- DNA Sequencing 2- Maxam Gilbert 3- Chemical cleavage 4- Nested 5- Chain termination

59 نتایج نهایی این روش با روش شیمیایی یکسان است اما در روش متفاوت است. در این روش، نسخه ای از DNA که توالی آن مورد نظر است به وسیله قطعه کلنو آنزیم DNA پلیمراز ساخته می شود. در این واکنش، الگو یک DNA تک رشته ای است و یک آغازگر نیز باید تهیه شود تا به انتهای ´1 متصل گردد و آنزیم DNA پلیمراز سنتز خود را از آن ناحیه آغاز کند. تولید قطعات همجوار از راه وارد کردن dNTP های تغییر یافته به محلول واکنش صورت می گیرد. dNTP های تغییر یافته بدون گروه هیدروکسیل، در محل ´1 دی اکسی ریبوز بوده و برای طوالنی شدن زنجیره DNA الزم هستند. این بازهای تغییر یافته دی دی اکسی نوکلئوزید تری فسفات )ddNTP(1 هستند. در هر یک از چهار محلول واکنش، یکی از چهار ddNTP ها )A, G, C, T( ریخته می شود. همه محلولها دارای چهار dNTP معمولی نیز هستند. غلظت دی دی اکسی به گونه ای برگزیده می شود که شمار ورود آن به DNA در حال رشد محدود باشد. بنابراین هر واکنش، قطعه هایی تولید می کند که رشد آنها در محل یک نوکلئوتید متوقف شده است و چهار واکنش یک سری قطعه های همجوار را تولید می کنند. زنجیره DNA با به کار گیری dNTP رادیواکتیو در محیط واکنش نشاندار می شود. برای این کار معموالً dNTP نشاندار شده با گوگرد رادیواکتیو )α- S35- dNTP( استفاده می شود زیرا در مقایسه با dNTP نشاندار شده با P32 امکان خواندن شمار بیشتری از توالی را روی یک ژل فراهم می کند. تولید قطعه ها برای تعیین توالی با روش دی دی اکسی معموالً پیچیده تر از روش شیمیایی است و اغلب در آن به کلون کردن دوباره4 در ناقل متفاوتی نیاز است. در یک روش، DNA را در فاژ M13 کلون می کنند که هنگام آلوده کردن باکتری میزبان، DNA تک رشته ای تولید می کند. این DNA ماده اولیه مناسب برای تعیین توالی است. )امین الری، 3178(. تعیین توالی DNA با این روش در واقع بر اساس وارد شدن ' 1 و ' 1 دی داکسی نوکلئوتیدها به عنوان خاتمه دهنده های زنجیره های DNA تازه ساخته شده می- باشد. در واقع واکنش تعیین توالی DNA بر اساس ساخت یک رشته جدید DNA توسط یک DNA پلیمراز استوار می باشد که در محل اتصال یک آغازگر به مولکول DNA الگو تک رشته ای انجام می گیرد. به طور کلی در مورد محصوالت PCR الگوی مورد استفاده دو رشته ای خواهد بود لذا برای استفاده در واکنش تعیین توالی، حرارت داده می شوند تا دو رشته DNA از هم باز شوند و سریعاً از طریق قرار دادن در یخ خشک یا نیتروژن مایع سرد می شوند به طوری که از اتصال مجدد رشته های جدا شده جلوگیری شود. در این نوع تعیین توالی که به صورت چهار واکنش مجزا )یک واکنش به ازای هر نوکلئوتید( انجام میگیرد، دی داکسی نوکلئوتیدهای تری فسفاته نیز وجود دارند. وارد شدن یک ddNTP به جای dNTP

1- Sanger Coulson 2- ddNTP 3- Dideoxynucleoside triphosphate 4- Subcloning

61 ' مربوطه باعث خاتمه سنتز زنجیره می شود زیرا عدم وجود گروه OH –3 در ddNTP ها مانع از تشکیل پیوند فسفو دی استر بعدی خواهد شد )Pherson et al., 2000(. 1- تعیین ترادف DNA های طویل: آزمایش تعیین توالی به روشهای سانجر کولسان و ماکسام گیلبرت، فقط در حدود 411 نوکلئوتید از زنجیره الگو را در بر می گیرد ولی اکثر ژنها خیلی طویل تر از این هستند. برای رفع این محدودیت، تعیین توالی DNA می تواند با تعداد زیادی قطعات مختلف که همه از یک مولکول DNA بزرگ و منفرد مشتق شده اند انجام گیرد. قطعات مذکور باید دارای نقاط همپوشان باشند. محل همپوشان با استفاده از نرم افزارهای تخصصی تعیین می گردد )گله داری و فروغمند، 3185(. 3 4- قدم زنی آغازگری : DNA تک رشته ای که بیش از 511 نوکلئوتید دارد طبعاً به صورت مطلوب نمی- تواند بر روی ژل پلی اکریل آمید تفکیک شود. این مشکالت محدودیتهایی برای تعیین توالی ایجاد می کند و تغییرات طول توالیها در این روش محدود می باشد. روشی که جدیداً به وجود آمده است شامل سنتز یک آغازگر الیگو نوکلئوتیدی است که این آغازگرها می توانند یک جایگاه مشخص را در توالی نامشخص در انتهای رشته شناسایی کرده و با آن جفت شوند. این توالیها معموالً در انتهای پایانی رشته ها قرار دارند. در این روش توالیها با قدم زنی مشخص می شوند، در هر مرحله یک آغازگر جدید سنتز می شود که منطقه توالی شناخته شده را گسترش می دهد. البته می توان قطعات قرار گرفته در پایین دست جایگاه اتصال آغازگر را به کمک آنزیم ها حذف کرد و مرتباً این کار را ادامه داد تا یک سلسله فرآیند حذف به وجود آید. با تعیین توالی هر دو رشته مکمل DNA و تأیید اینکه هر دو توالی تعیین شده به طور کامل مکمل هستند امکان آشکارسازی و حذف توالیهای مصنوعی تولید شده در واکنش یا در طول الکتروفورز به وجود خواهد آمد. وقتی این موضوع بررسی شد توالی DNA می تواند با دقت باالیی ساخته شود )گله داری و فروغمند، .)3185 5- تعیین توالی مستقیم به کمک واکنشهای زنجیره ای پلیمراز: واکنشهای زنجیره ای پلیمراز به طور متداول برای تعیین توالی DNA مورد استفاده قرار می گیرند. این روش توالی یابی DNA بسیار سریع تر و مطمئن- تر بوده و برای DNA ژنومی و قطعات تکثیر یافته به طور یکسان مورد استفاده می باشد. تعیین توالی DNA با استفاده از PCR شامل دو مرحله است: الف- تولید الگوهای توالی یاب )تک یا دو رشته( توسط PCR ب- توالی یابی محصوالت PCR به وسیله DNA پلیمرازهای حساس به حرارت و یا توسط تک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت

1- Primer walking

63 بنابراین روش توالی یابی DNA به وسیله PCR، ضرورت شبیه سازی DNA را در ناقل فاژ دارای DNA تک رشته ای مثل M13 مرتفع می سازد. اگر چه محصول DNA دو رشته ای به دست آمده از PCR می- تواند جهت توالی یابی استفاده شود اما مشکالتی را به وجود خواهد آورد که از به هم پیوستن مجدد توالیهای جدا شده ناشی می شود. این عمل توسط جلوگیری از هیبرید شدن آغازگر با توالی مکمل بر روی الگو انجام می گیرد، در نتیجه فرآیند گسترش رشته ای را متوقف می کند. برای کاهش مشکالت می توان از روش استاندارد برای تعیین توالی DNA دو رشته ای استفاده نمود و یا الگوهای DNA تک رشته ای را با 3 استفاده از PCR نامتقارن تولید کرد )گله داری و فروغمند، 3185(. 6- آنالیز اتوماتیک تعیین توالی DNA: در توالی یابی ماشینی با استفاده از چهار ماده فلورسنتی، یک واکنش با هر چهار ddNTP در یک شیار یا چاهک ژل انجام می شود. محصوالت واکنش با هم مخلوط گردیده و در ژل به حرکت در می آیند. با تابیدن اشعه، برچسب های موجود بر قطعات با طولهای مختلف، یک عالمت یا سیگنال خاص از خود نشان می دهند. وقتی امواج آرگون توسط دستگاه به برچسب های فلورسنت تابیده شوند پرتوهایی در طول موج های مختلف ساطع می گردد. این امواج توسط یک جستجوگر شناسایی و با استفاده از نرم افزار خاصی به صورت سیگنال ثبت و پردازش می شود و هر سیگنال معرف یک باند است )گله داری و فروغمند، 3185(. 2-7-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز1 ژنتیک مولکولی این امکان را فراهم کرده است که به برخی از بنیادیترین فرآیندهای حیات پی برده شود. پژوهشهای انجام شده بر روی DNA منجر به ابداع فن آوری جدیدی در زیست شناسی مولکولی گشته است که خود شالوده های یک انقالب علمی جدید را پی ریزی نموده است. یکی از مهمترین اجزای تمام این تکنولوژیها واکنش زنجیرهای پلیمراز میباشد. ظهور این بخش از تکنولوژی DNA شتاب فراوانی به مطالعات مربوط به ساختار ژنومی موجودات مختلف بخشیده است. این روش اولین بار توسط Kary Mullis )1983( در کانادا ابداع شد )شاه حسینی، 3181(. این تکنیک 31111 بار دقیق تر از تکنیک ساترن بالت و 311111 بار حساس تر از تکنیک های سیتوژنتیک متداول می باشد )Rooney et al., 1992(. تکنیک PCR به ژن مورد نظر این امکان را می دهد که به صورت تصاعد هندسی در مقیاس بیلیون تکثیر شود سپس می توان با روشهایی از قبیل الکتروفورز آن ژن را از میان هزاران هزار ژن دیگر شناسایی و با تکنیک های استاندارد تعیین توالی DNA، ردیف اسیدهای نوکلئیک و بازهای آن را مشخص نمود. اساس PCR بر پایه همانند سازی DNA می باشد، در این روش DNA سلول مورد نظر را استخراج و آن را به

1- Asymetric PCR 2- Polymerase Chain Reaction= PCR

62 همراه Taq DNA پلیمراز، آغازگرهای مخصوص، داکسی نوکلئوتیدهاdNTPs( 3(، بافر PCR و کلرید منیزیم در لوله های واکنش دهنده ریخته و برای تکثیر در دستگاه تولید کننده چرخه حرارتی1 قرار می دهند )Newton and Graham, 1994(. واکنش زنجیرهای پلیمراز عبارت است از چرخههای مکرر حرارتی که در خالل آن، توالی خاصی از DNA که در بین دو آغازگر الیگو نوکلئوتید )11-36 نوکلئوتیدی( محصور شده، تکثیر میشود. توالی این آغازگرها با یکدیگر متفاوت بوده و هر یک از آنها مکمل یکی از رشتههای DNA الگو میباشد. در واکنش PCR هر چرخه حرارتی شامل مراحل زیر است: °c 3- واسرشته سازی1: در این مرحله از درجه حرارت 35-34 جهت باز شدن مارپیچ های DNA استفاده میشود تا سنتز انجام شود )پور نقشبند،3181(. 1- جفت شدن آغازگرها با توالیهای مکمل خودشان در رشته الگو4: چنانچه رشتههای منفرد DNA به آرامی سرد شوند مجدداً به هم متصل میشوند. محققینی مثل جولیس مارمو و پائول دوتی )3361( نشان دادند که وقتی رشتههای منفرد و مکمل DNA به مدت چند ساعت در شرایط پایینتر از دمای واسرشته سازی قرار °c گیرند )تقریباً 61( مجدداً به هم میچسبند. آنها ابراز داشتند که چنین جفت شدن هایی به صورت کامالً اختصاصی انجام میشود و فقط رشتههایی که از نظر ردیف بازی کامالً مکمل یکدیگر باشند به هم متصل خواهند شد )پورنقشبند،3181(. در این مرحله درجه حرارت اتصال آغازگرها با توجه به طول قطعه آغازگر و تعداد بازهای مکمل محاسبه می شود و در صورت امکان هر دو آغازگر باید دمای ذوب یکسانی داشته باشند )Newton and Graham, 1994(. بسیاری از محققینی که در آزمایشگاه کار می کنند دمای اتصال °c آغازگرها را برای نقطه شروع در PCR، 5-1 پایین تر از دمای محاسبه شده در نظر می گیرند اما دمای قطعی را باید با روش آزمون و خطا به دست آورد )Stryer, 1991(. 1- توسعه5: ایجاد رشتههای جدید در جهت ′1 → ′5 وابسته به میزان فعالیت آنزیم تک DNA پلیمراز است. این آنزیم اولین بار از باکتری ترموس اکواتیکوس6 متعلق به چشمه آب گرم در یلواستون استخراج شد و باعث ساده و خودکار شدن واکنشهای PCR گردید. از آنجا که این آنزیم میتواند درجه حرارتهای باال را که برای واسرشته کردن رشتهها مورد نیاز است تحمل نماید دیگر نیازی به اضافه کردن قطعه کلنور °c در هر سیکل نمیباشد. این آنزیم در دمای 71 بیشترین فعالیت را نشان میدهد و عواملی مثل کاتیونهای +2 دو ظرفیتی )از قبیل Mg( در فعالیت این آنزیم بسیار مؤثرند )پور نقشبند،3181(. حاصل یک چرخه از این واکنش ساخته شدن دو مولکول DNA از یک رشته DNA الگو می باشد و با تکرار چندین باره این چرخه

1- Deoxynucleotides 2- Thermal cycler 3- Denaturation 4- Annealing 5- Extension 6- Thermos aquaticus

61 تعداد بسیار زیادی از قطعه DNA الگو ساخته خواهد شد )Stryer, 1991(. هر چرخه تا دو دقیقه به طول می انجامد که در چرخه آخر این زمان به بیش از 31 دقیقه می رسد تا اینکه اطمینان حاصل شود همه مولکولهای ساخته شده کامل می باشند. بدین ترتیب تکثیر و همانندسازی و به عبارت دیگر آخرین تعداد کپی های رشته هدف به دست می آیند. اگر در هر چرخه 311% بازده وجود داشته باشد بعد از 11 چرخه میزان تکثیر برابر است با 111 مقدار اولیه، ولی با توجه به درجه حرارت زمان تکثیر، میزان موالریته رشته الگو، طراحی و میزان کیفیت آنزیم، معموالً بعد از 11-15 چرخه میزان تکثیر 316 برابر مقدار اولیه DNA است که با بازده کامل در تناقض می باشد )Harris, 1998(. برای محاسبه مقدار DNA تکثیر یافته پس از پایان چرخههای حرارتی از فرمول زیر نیز استفاده میشود: n N= 2 -2n N: تعداد کل رشتههای تکثیر یافته پس از n سیکل، n: تعداد سیکل انتهای قطعات تکثیر یافته که در واقع همان فرآوردههای PCR هستند، بر اساس پایانههای ′5 دو آغازگر و طول آنها بر اساس فاصله بین دو آغازگر مشخص میشوند )پور نقشبند،3181(. فرآوردههای PCR را میتوان به سه دسته تقسیم کرد: الف- قطعاتی که از دو طرف نامحدود هستند: اینها در واقع همان رشتههای الگوی اولیه هستند. ب- قطعاتی که از یک طرف محدود و از طرف دیگر نامحدود هستند: اینها قطعاتی هستند که از روی رشتههای الگوی اولیه ساخته شدهاند و چون در یک انتها به توالی آغازگر ختم میشوند، از یک طرف محدود نامیده میشوند. پ- قطعاتی که از دو طرف محدود هستند: اینها قطعاتی هستند که از روی فرآوردههای نوع دوم تکثیر میشوند و در واقع محصول اصلی PCR هستند. این قطعات در دورههای بعدی PCR به صورت نمایی تکثیر میشوند در حالی که محصوالت نوع اول و دوم به صورت خطی تکثیر میشوند بنابراین فرم غالب محصول PCR همان محصوالت نوع سوم است )شاه حسینی، 3181(. 2-7-6-2- مواد اولیه در واکنش PCR DNA -3 الگو: طبق پروتکل موجود، DNA استخراج شده با استفاده از روش استات آمونیوم از بافت مورد نظر به عنوان الگو جهت انجام واکنش PCR استفاده می گردد. به طور معمول 1-3 میکرولیتر )3-5 نانوگرم( از DNA استخراج شده در حجم نهایی 15 میکرولیتر استفاده می شود )Pherson et al., 2000(. 3 1- بافر DNA : PCR پلیمرازهای مقاوم به حرارت معموالً همراه با یک بافر 10X هستند. این بافر شامل ترکیبات زیر می باشد:

1- PCR Buffer

64 100 mM Tris-HCl (pH= 8, Temperature= 25˚c) 100 mM KCl 0.5 mM EDTA 0.1 mM DTT 15 mM MgCl2 0.5% Tween- 20 0.5% Nonidet P- 40 50% Glycerol محلول بافر قبل از اضافه شدن شوینده های3 غیر یونی Nonidet P- 40 و Tween- 20 باید اتوکالو شود. در برخی از روشهای تهیه بافر، افزودن آلبومین سرم گاوی1 را به میزان µg/ml 511 توصیه می کنند، این بافر برای پایدار کردن آنزیم Taq DNA پلیمراز است. Tris- HCl یک بافر یونی دوقطبی است که pH آن با دما تغییر می کند. در واقع Taq DNA پلیمراز در مقادیر pH پایین تر که در دمای باالی PCR ایجاد می شوند صحت عمل بیشتری خواهد داشت. Kcl نیز می تواند به اتصال آغازگر به الگو کمک کند، اگر چه در غلظتهای باال این عمل ممکن است بیش از حد مطلوب شده و باعث پایداری اتصال غیر اختصاصی آغازگر به الگو و ایجاد محصوالت ناخواسته گردد. 1- کلرید منیزیم1: منیزیم یکی از اساسی ترین اجزای PCR می باشد زیرا غلظت آن می تواند بر دقت و بازده واکنش تأثیر بگذارد. فعالیت آنزیم Taq DNA پلیمراز به وجود یون منیزیم وابسته است و بیشترین فعالیت خود را در محدوده غلظت 1/3-1/3 منیزیم آزاد نشان می دهد. غلظت منیزیم همچنین بر صحت DNA پلیمرازها اثر می گذارد. در غلظت باالی منیزیم نسبت به غلظت پایین آن خطای Taq DNA پلیمراز افزایش می یابد و باعث افزایش محصوالت غیر اختصاصی می شود، در صورتی که در غلظتهای بسیار پایین بازده واکنش کم خواهد شد. غلظت منیزیم آزاد تحت تأثیر غلظت dNTP ها، پیرو فسفات آزاد )PPi( و 2+ EDTA می باشد. اتصال مولی dNTP ها و Mg به صورت یک به یک است. 4- دی اکسی نوکلئوتید تری فسفات ها4: نوکلئوتیدها همان واحدهای سازنده DNA می باشند که از مواد مهم مورد نیاز در واکنش PCR هستند. آنزیم های Taq DNA پلیمراز ساخت زنجیره پلی نوکلئوتیدی را از این مونومرها یا واحدها کاتالیز می نمایند. این نوکلئوتیدها معموالً به طور جداگانه یا مخلوط به صورت تجاری در دسترس می باشند. برای موفقیت PCR باید غلظت هر چهار dATP, dCTP, dGTP, ( dNTP dTTP( برابر باشند، در غیر این صورت اشتباه در جایگزینی رخ می دهد و ممکن است باعث تفاوت چینش فرآورده PCR با چینش الگو شود. در اکثر موارد، غلظت dNTP باید در حدود 111-51 میکروموالر باشد، اگر غلظت باالتر رود دقت واکنش کم می شود زیرا Taq DNA پلیمراز در این حالت بازهای اشتباه را بیش

1- Detergent 2- BSA 3 - MgCl2 4- dNTPs

65 از حالت معمول وارد زنجیره می کند، در حالی که اگر غلظت پایین تر باشد ممکن است بر بازده PCR تأثیر داشته باشد. 5- آنزیم Taq DNA پلیمراز: نوعی DNA پلیمراز وابسته به DNA مقاوم به حرارت است که اولین بار توسط Brock و Freeze )1969( و از باکتری گرمادوست Thermophilus aquaticus به دست آمد. این آنزیم یک پلی پپتید 34 کیلو دالتونی است که دارای فعالیت 'DNA 5'→1 پلیمرازی است و برای فعالیت خود نیاز به یون منیزیم دارد. سرعت ساخت DNA توسط آن 61-51 نوکلئوتید در ثانیه است که این °c سرعت معادل سرعت Kb/min 1 در دمای 71 می باشد. این آنزیم نیمه عمری حدود 41 دقیقه در دمای °c 35 دارد که معادل 51 چرخه تحت شرایط عادی PCR می باشد. دمای بهینه فعالیت این آنزیم در حدود °c °c 75-71 می باشد. با استفاده از این آنزیم می توان از دماهای باال حتی 71 در مرحله اتصال آغازگرها استفاده کرد که این مزیت باعث دقت بیشتر در شناسایی توالی هدف توسط آغازگرها می گردد و توالی هدف به طور اختصاصی تکثیر می شود )Pherson et al., 2000(. 6- آغازگرها: آغازگرها برای پیشبرد فرآیند PCR و به منظور افزایش تعداد نسخه های ناحیه خاصی از ژنوم طراحی می شوند و بیش از هر عامل دیگری در موفقیت یا شکست یک واکنش تکثیری مؤثر هستند. آغازگرها عبارتند از دو زنجیره تک رشتهای کوتاه الیگو نوکلئوتیدی3 که طولی در حدود 18-38 نوکلئوتید دارند. الیگو نوکلئوتیدها مولکولهای DNA دو رشتهای کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای توالی DNA هدف میباشد. از آنجا که DNA دو رشتهای است دو نوع آغازگر در PCR مورد نیاز است که دو عمل را انجام میدهند: اول محل ژنی را که باید تکثیر شود را مشخص مینمایند و دوم اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین میکنند. زمانی که این دو شناساگر به دو ناحیه مختلف DNA و به سمت هم قرار میگیرند DNA پلیمراز تنها قطعات بین این دو ناحیه را همانندسازی میکند و به این ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین میشود. به عبارت دیگر یک زنجیره به عنوان آغازگر و زنجیره دیگر به عنوان پایان گر قطعه ژن مورد نظر محسوب میشود. اغلب آغازگرها با درجات متغیری از موفقیت کار مینمایند و گاهی به طور کامل چیزی را غیر از DNA مورد نظر سنتز میکنند. دالیل این کار تا اندازهای پیچیده است اما با تغییر دادن توالی آغازگرها از نظر تعداد کمی باز، مشکل حل خواهد شد. غلظتهای باالی آغازگر احتماالً باعث افزایش نقاط آغازین اشتباه1، تجمع محصوالت غیر اختصاصی و احتماالً افزایش تولید یک الگوی مستقل مصنوعی یعنی همان پرایمر- دایمر1 میشوند. محصوالت غیر اختصاصی و پرایمر- دایمرهای مصنوعی خودشان پیش مادههایی برای PCR بوده و با محصول مطلوب و مورد نظر بر سر آنزیم، dNTP و آغازگر

1- Oligonuleotide 2- Mispriming 3- Primer- Dimer

66 در رقابت هستند در نتیجه مقدار کمی محصول مطلوب به دست میآید. تولید پرایمر- دایمر معموالً هنگامی رخ میدهد که یک آغازگر به عنوان رشته الگو عمل کرده و دیگری بسط یابد که به نظر میرسد به توالی، غلظت آغازگر و آنزیم بستگی داشته باشد. پرایمر- دایمر معموالً زمانی دیده میشود که تعداد چرخههای واکنش زیاد باشند، درجه حرارت پایین باشد و آغازگرها به گونهای طراحی شوند که انتهای ′1 آنها به طور جزئی مکمل یکدیگر باشند )یزدی صمدی،3181(. درجه اتصال ایدهآل آغازگر باید به قدر کافی پایین باشد تا قادر به دورگه سازی )پهلوگیری( بین آغازگر و الگو باشد اما باید به قدر کافی هم باال باشد تا از تشکیل اتصاالت اشتباهی جلوگیری شود. این درجه حرارت میتواند به وسیله تعیین درجه حرارت ذوب یا 3Tm از هیبرید آغازگر- الگو تخمین زده شود. Tm، درجه حرارتی است که در آن بازهای مکمل از هم جدا میشوند. معموالً دمایی معادل 4-1 درجه کمتر یا بیشتر از Tm کافی است تا مجال دورگه سازی صحیح بین آغازگر و الگو حاصل شود. دمای ذوب به طور تجربی میتواند تعیین شود اما معموالً از طریق فرمول زیر محاسبه میشود: Tm= [(A+T) × 2°c + (G+C) × 4°c] که در آن [G+C] تعداد نوکلئوتیدهای G و C و [A+T] تعداد نوکلئوتیدهای A و T در توالی آغازگر °c میباشد. با توجه به کاربرد و نوع استفاده، Tm ها معموالً بین 81-55 مطلوب میباشند )پور نقشبند، 3181(. مدت زمان الزم برای بسط، به طول و غلظت توالی هدف و دما بستگی دارد. بسط آغازگر به طور °c معمول در 71 انجام میشود. در طراحی یا انتخاب آغازگر باید نکات متعددی مانند: طول آغازگر، اختصاصی و مکمل بودن آغازگر، دمای ذوب، ترکیب نوکلئوتیدی )میزان درصد C-G(، ′5-′1 انتهایی و ... را در نظر داشت. طول آغازگر مهم بوده زیرا طول مناسب از احتمال اتصال آغازگر با مناطق غیر هدف می- کاهد. طویل بودن آغازگر )آغازگرهایی با بیش از 11 باز( امکان اتصال آنها به خود و به یکدیگر را تشدید می کند و زمان اتصال را نیز افزایش می دهد )یزدی صمدی، 3181(. برای طراحی و آنالیز آغازگرها، نرم- افزارهای متعددی وجود دارد که از میان آنها می توان به DNA man ،DNA sis و Oligo tech اشاره نمود. 2-7-6-1- ارزیابي محصول PCR الکتروفورز ژل آگارز، متداولترین و سریعترین روش برای بررسی محصوالت PCR می باشد و روشی استاندارد به منظور شناسایی، تفکیک و تخلیص قطعات DNA و تکنیکی ساده و سریع می باشد که قادر است قطعات DNA ای را که نمی توانند توسط روشهای دیگر همچون سانتریفیوژ شیب چگالی از هم جدا شوند را از هم تفکیک کند. عالوه بر این، مکان DNA درون ژل مستقیماً از طریق رنگ آمیزی با غلظتهای پایین رنگ فلورسانت اتیدیوم بروماید تعیین می شود. ژل آگارز به صورت افقی در میدان الکتریکی ثابت

1- Melting temperature

67 قرار می گیرد. به کمک این ژل با غلظتهای مختلف می توان قطعات DNA از 111 جفت باز تا تقریباً 11 کیلو باز را از هم جدا کرد )Sambrook and Russell, 1990(. آشکارسازی محصول PCR بر اساس بررسی غلظت خاصی از آگارز بوده به طوری که غلظت باالتر آگارز منافذ ریزتری را به وجود آورده و قدرت تفکیک اندازه DNA ای را که با آن بررسی می شود را افزایش می دهد. 2-7-7- الکتروفورز اساس کار الکتروفورز قرار گرفتن ذرات باردار در مسیر جریان الکتریکی می باشد. واژه Electro به معنای انرژی الکتریسیته و phoresis از فعل یونانی phoros به معنای انتقال از طریق می باشد. ترکیبات باردار با وارد شدن در محلولهای آبی به یونهای مثبت و منفی یونیزه می شوند و در صورتی که مولکولها دارای بار خالص باشند می توانند به طرف قطبین حرکت نمایند. ماکرومولکولهای زیستی مانند پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک باردار هستند در نتیجه مانند یک الکترولیت یونیزه می شوند و حرکت آنها در چنین سیستمی به میزان بار خالص آنها بستگی دارد که خود تابعی از pH محیط است. اگر توزیع بارها در مولکول متقارن باشد در طول یک گرادیان میدان و سرعتی که تابع بار الکتریکی، اندازه، شکل و وزن ماده است حرکت می- کنند. مولکولهای با بار و اندازه مختلف در میدان الکتریکی، سرعتهای متفاوتی پیدا کرده و به مناطقی متفاوت تفکیک می شوند، این مناطق از هم فاصله گرفته و در یک زمان معین در طول میدان، منظم میشوند که این در واقع اساس جداسازی مواد آلی به طریق الکتروفورز است. پارامترهایی که حرکت ماکرومولکولها را در ژل تحت تأثیر قرار می دهند شامل: غلظت ژل، ترکیب بافری الکتروفورز، ساختار ماکرومولکول و ولتاژ دستگاه می باشند. از آنجایی که تفکیک و جداسازی نمونه ها در یک محلول از طریق الکتروفورز مشکل می باشد سعی شده است از بسترهای مختلف مانند سلولز، ژل اکریل آمید، نشاسته، آگارز و غیره بدین منظور استفاده گردد که هر یک کاربرد اختصاصی خود را دارند )شاه حسینی،3181(. 2-7-7-2- الکتروفورز ژل آگارز2 آگارز یک پلی ساکارید بوده که از واحدهای تکرار شونده آرابینوز دی ساکارید تشکیل شده است. هنگامی که پودر آگارز در اثر حرارت در بافر خود توسط باندهای هیدروژنی به حالت ژل در می آید در واقع مولکولهای پلیمراز از حالت حلقوی نامنظم به شکل مولکولهای مارپیچی دوتایی در می آیند. بسته به اندازه متفاوت ماکرومولکول از غلظتهای متفاوت آگارز استفاده می شود که معموالً بین 1-1 درصد است. غلظت استاندارد 8/1-7/1 درصد قادر به تفکیک باندهایی به طول Kb 511-35 می باشد. این سیستم قادر به ارزیابی قطعاتی به طول bp 511 و بیشتر از Mb 31 بوده و استحکام، پردوام و غیر سمی بودن از محاسن آن می باشند )Hildebrandt and Igarashi, 1999(.

1- Agarose gel electrophoresis

68 2-7-7-2-2- محلولهای الزم جهت الکتروفورز ژل آگارز 3- بافر TBE: این بافر در غلظتهای 5 برابر )5X( و یا 31 برابر )10X( تهیه می شود. در هنگام الکتروفورز افقی از بافر TBE 1X استفاده می شود. برای تهیه این بافر، TBE 10X به نسبت 3/1 رقیق می شود )یک حجم از بافر با 3 حجم آب مقطر مخلوط می شود(. 1- رنگهای ردیاب: با افزودن این رنگها به بافر سنگین کننده میزان حرکت قطعه DNA در ژل الکتروفورز مشخص می شود. از رنگهای معمول که قابلیت حرکتی زیادی در طول ژل الکتروفورز دارند بروموفنل بلو و زایلن سیانول می باشند که در غلظتهای متفاوت ژل قابلیت تفکیک خاصی دارند ) Hildebrandt and .)Igarashi, 1999 1% Agarose: Xylene cyanol ~ 5kb, bromphenol blue ~ 0.5kb 5% Acrylamid: Xylene cyanol ~ 260bp, bromphenol blue ~ 60bp 1- لودینگ بافر3: این بافر به دلیل داشتن گلیسرول، چگالی نمونه را افزایش داده تا DNA سریعتر به ته چاهک برود. به دلیل اینکه محلول بهینه آن دارای دو رنگ بروموفنل بلو و زایلن سیانول است، میزان حرکت نمونه ها به سمت آن را قابل پیش بینی می کند. این بافر معموالً به صورت محلولی با غلظت 6 برابر )6X( ساخته می شود و دارای Tris- HCl 31 میلی موالر )pH= 7.6(، 11/1 درصد بروموفنل بلو، 1/11 درصد زایلن سیانول ، 61% گلیسرول و EDTA 61 میلی موالر می باشد. EDTA موجود در محلول به یونهای فلزی دو ظرفیتی1 متصل و نوکلئازهای وابسته به فلزات را مهار می کند ) ,Sambrook and Russell .)1990 4- محلول اتیدیوم بروماید: مناسبترین روش مشاهده DNA در ژل آگارز، رنگ آمیزی آن با رنگ فلورسانت اتیدیوم بروماید است. این رنگ حاوی گروههای سطحی1 است که بین جفت بازهای DNA قرار گرفته و باعث می شود تا فلورسانت شدید شده ای را نسبت به رنگ آزاد در محلول، در زیر نور ماوراء بنفش نشان دهد. اتیدیوم بروماید یک ماده فلوروکروم دارای بار مثبت است و در میدان الکتریکی به سمت الکترود منفی حرکت کرده و در تماس با DNA به آن متصل شده که بر اثر دریافت نور ماورأ بنفش تهییج و نور فلورسانت نارنجی ساطع می نماید در نتیجه باندهای ایجاد شده قابل رویت می شوند. اتیدیوم بروماید معموالً به صورت محلول ذخیره ای mg/ml 31 در آب تهیه شده و در دمای اتاق و ظروف تیره نگهداری می گردد. این رنگ معموالً به ژل و بافر الکتروفورز در غلظت µg/ml 5/1 اضافه می شود ) Sambrook and Russell, 1990(. در پژوهش حاضر برای جلوگیری از آلودگی تانک و وسایل الکتروفورز بعد از اتمام

1- Loading buffer 2- Divalent 3- Planar

69 الکتروفورز، ژل آگارز رنگ آمیزی می گردد و بدین منظور ژل به مدت 35 دقیقه در آب حاوی اتیدیوم بروماید )μg/ml 0.5( در حرارت اتاق قرار می گیرد. 2-7-7-1- الکتروفورز ژل پلي اکریل آمید2 سیستم ژل پلی اکریل آمید1 برای آنالیز قطعات کوچکتر زنجیره DNA دو رشته ای و تک رشته ای مورد استفاده قرار می گیرد. اکریل آمید یک مونومر سنتتیک بوده که شدیداً نوروتوکسیک1 می باشد و بسته به هدف از غلظتهای متفاوت این ژل استفاده می شود که معموالً بین 11-5/1 درصد می باشد. غلظت W/V 5/1 درصد قادر به تفکیک باندهایی به طول 1111-3111 جفت باز و غلظت W/V 11 درصد قادر به تفکیک باندهایی به طول 311-6 جفت باز می باشد. پلیمریزاسیون ژل با افزودن TEMED و آمونیوم پرسولفات در طول یک ساعت تکمیل شده و میزان پلیمره شدن ژل به فاکتورهای متعددی از قبیل درجه حرارت محیط، مقادیر آغازگر و کاتالیزورها بستگی دارد. این سیستم قادر به تفکیک مولکولهایی به طول یک جفت باز بوده و مقادیر DNA )31 میکروگرم( تزریق شده در چاهک ها ناچیز می باشد. نمونه های حاصله عاری از آلودگی بوده و در اکثر اهداف مولکولی به کار می روند، الزم به ذکر است که آماده سازی ژل پلی اکریل آمید وقت گیر و همراه با زحمت بسیار می باشد )Hildebrandt and Igarashi, 1999(. 2-7-8- فیلوژني4 گسترش فیلوژنیک در نیمه دوم قرن 13 در نتیجه پیشرفت سریع تکنیکهای مولکولی و کاهش چشمگیر هزینه ها، استاندارد جدیدی را در زمینه طبقه بندی گونه ها ایجاد کرده است )Hou, 2007( و علمی است که با در نظر داشتن شباهتها و تفاوتهای بین گونه ها به توضیح روابط تکاملی موجودات می پردازد. یعنی اگر دو گونه خیلی شبیه هم باشند می توان این فرض را در نظر داشت که آنها در یک جد مشترک با هم اشتراک دارند. در بررسی های فیلوژنیک می توان از انواع مختلف صفات استفاده نمود اما در دهه های اخیر استفاده از توالی یابی ژنهای میتوکندریایی بیشتر رایج است. ولی زمانی که از داده های این توالیها در درک روابط فیلوژنی استفاده می گردد بایستی دانست که ممکن است میزان جهش ثابت باشد در نتیجه این توالیها ممکن است در معرض تغییرات ناشی از انتخاب قرار گیرند )Page and Holmes, 1998(. 2-7-8-2- استفاده از آرایه شناسي مولکولي5 در مطالعات فیلوژني و جمعیتي آرایه شناسی مولکولی بر پایه شناسایی ساختارهای مولکولی بنا نهاده شده است. بررسی تفاوتهای موجود در توالی زیر واحدهای درشت مولکولی می تواند در تعیین خویشاوندی های تکامل یاری رسان باشد.

1- Polyacryl amid gel electrophoresis 2- Page 3- Neurotoxic 4- Phylogeny 5- Molecular taxonomy

71 روشهایی که به آرایه شناس امکان می دهد تا توالی نوکلئوتیدهای اسیدهای نوکلئیک و اسیدهای آمینه پروتئین ها را مقایسه کند به ابزارهای تاکسونومیکی مهمی تبدیل شده اند. چنین مقایسه هایی اطالعات با ارزشی در خصوص میزان خویشاوندی دو ارگانیسم در اختیار کارشناسان علم رده بندی قرار می دهند و هر چه ترتیب توالی زیر واحدها3 شبیه تر باشند خویشاوندی نزدیکتری برقرار است )Hou .)Hou et al., 2007 بر این عقیده است که تاکسونومی بر پایه صفات ریختی اشتباه است و داده های ژنتیکی باید جایگزین داده های ریختی شوند. از جمله ژنهای مورد استفاده در این گونه مطالعات می توان به ژنهای COI و 16S میتوکندریایی و ژنهای 18S و 28S هسته ای اشاره کرد. اخیراً بسیاری از زیست شناسان برای کمک به توصیف بسیاری از تبارزایی ها و روابط بین گونه ها، ساختارهای RNA ریبوزومی را مورد مطالعه قرار می- دهند و تقسیم بندی موجودات زنده بر اساس مقایسه ریبوزومی در سه قلمرو توسط Karelwos بنیان نهاده شد. همه موجودات زنده شناخته شده حاوی ریبوزوم هستند که در سنتز پروتئین ها شرکت می کنند. توالیهای نوکلئوتیدی RNA ریبوزومی در تکامل به خوبی محفوظ مانده اند. RNA یوکاریوت ها از پروکاریوت ها بزرگتر بوده و شامل 18S در جزء کوچک ریبوزوم و 5S در جزء بزرگتر می باشند. RNA ریبوزومی که در هستک ساخته می شود تغییرات کندتری را نسبت به دیگر DNA ها نشان می دهد بنابراین تفاوتهای موجود در توالیهای RNA می تواند برای ردیابی برخی از انشعابات در درخت حیاتی مورد بهره برداری قرار گیرند )علی بیک، 3183(. این ژن که از روی rDNA کپی برداری می شود به علت وجود چند کپی از توالیهای تکرار شونده در rDNA مبنای تفاوتهای گسترده میان گونه ها، جمعیتها و افراد است و به عنوان شاخصی با کارایی باال در مطالعه ساختار ژنتیکی جمعیتها به کار می رود ) ,.Santi- Rampazzo et al .)2008 2-7-8-1- درخت فیلوژنیك درختان فیلوژنیک مسیرهای تکاملی را نشان می دهند و می توان از آنها برای درک روابط تکاملی استفاده نمود. به عبارت دیگر هر چه موجودات مورد بررسی مشابهت بیشتری در مولکولهای توارثی داشته باشند، خویشاوندی نزدیکتری دارند )بنابازی، 3183(. در بیشتر موجودات از داده های مربوط به توالی DNA برای تعیین روابط تکاملی استفاده می شود. از آنجایی که چنین داده هایی در مقایسه با داده های ریخت شناسی کمتر تحت تأثیر نتایج انتخاب قرار می گیرند، بهتر می توانند روابط فیلوژنی واقعی را نمایان سازند ) Zhang and Hewitt, 2003(. درخت فیلوژنیک، نموداری شامل گره ها و شاخه های متصل به این گره ها می باشد. از اتصال دو شاخه یک گره1 حاصل می شود. گره ها حاکی از وجود واحدهای تاکسونومیک1 است.

1- Subunit 2- Node 3- Clade

73 واحدهای تاکسونومیک به گره هایی که می توانند یک گونه یا جمعیت یا یک فرد و حتی یک ژن باشند منتهی می گردند )Page and Holmes, 1998(. گره های خارجی یا پایانی، گروه ها را نشان می دهند و گره های داخلی، گروه های خویشاوند را به هم پیوند می دهند )بنابازی، 3183(. شاخه ها3 تعیین کننده ارتباط واحدهای تاکسونومیک و به بیان دیگر نژادها و جدشان است. معموالً برای نشان دادن میزان انشقاق گروهها، طول شاخه هایی که آنها را به هم متصل می کنند مورد قیاس قرار می گیرد ) ,Page and Holmes 1998(. الگوی شاخه بندی یک درخت فیلوژنیک، موضع شناسی )توپولوژی( آن درخت نامیده می شود. بر اساس یک نوع تقسیم بندی، دو نوع درخت فیلوژنتیک وجود دارد. درختان بی ریشه1 که تنها فواصل بین واحدها را بدون تعیین اینکه کدامیک جد دیگری است، ارائه میدهند. در حالی که درختان ریشه دار1 تصویری از ترتیب موقتی گونه ها را بر روی یک درخت ارائه میدهند. برای تشکیل درخت فیلوژنیک روشهای متعددی وجود دارند که از انواع آنها می توان به روشهای مبتنی بر ماتریس فاصله که شامل موارد ذیل می باشند اشاره نمود )بنابازی، 3183(: الف- 4UPGMA: روش جفت گروهی غیر وزنی از طریق میانگین حسابی برای تمام تبارها یک نرخ تکاملی ثابت در طول زمان فرض می شود بنابراین طول شاخه ها نصف فاصله ژنتیکی بین دو گروه می- باشد. در این روش دو واحدی که فاصله میان آنها در ماتریس کمترین است یک خوشه را تشکیل می دهند. سپس فاصله سایر واحدها از این خوشه به صورت میانگین فاصله بین آنها و هر یک از اعضای این خوشه به دست می آید و واحدی که کمترین فاصله را از خوشه حاصله دارد همراه با خوشه قبلی خوشه بندی میگردد. این روند تا خوشه بندی تمام واحدها ادامه دارد. در این روش برای به دست آوردن فاصله دو گروه بر روی درخت حاصله میتوان طول شاخه هایی که آنها را به هم متصل ساخته اند با هم جمع نمود )Tamura et al., 2007(. هنگامی که تعداد گروهها زیاد باشد، تعداد بسیار زیادی موضع شناسی درختی وجود دارد، بنابراین تعیین تأیید آماری قسمتهای مختلف درخت الزم است و معمولترین روش تعیین سطح اطمینان آماری برای یک گره خاص در درخت فیلوژنتیک، محاسبه مقادیر خود راه انداز5 میباشد. در این روش برای رسیدن به سطوح آماری معنی دار، مجدداً از روی داده های اصلی به طور تصادفی نمونه برداری میشود. برای ایجاد یک نمونه خود راه انداز از روی یک نمونه اصلی n عضوی ابتدا n عدد تصادفی بین صفر تا یک ایجاد و سپس هر کدام در n ضرب میگردد و حاصلضرب به نزدیکترین عدد صحیح گرد میشود. این اعداد صحیح جدید شماره نمونه هایی از نمونه های اصلی است که در نمونه خود راه انداز

1- Branch 2- Unrooted 3- Rooted 4- Unweighted Pair- Group Method using an Arithmetic Avereage 5- Bootstrapping

72 حضور خواهند داشت. با هر نمونه خود راه انداز نیز یک درخت فیلوژنتیک رسم میگردد و موضع شناسی آن بررسی میشود. این فرآیند چندین بار )معموالً 3111 بار( تکرار میشود. در درخت نهایی، گروههایی که بیشترین درصد دفعات حضور در نمونه های خود راه انداز را دارند، حضور داشته و درصد مربوطه بر روی گره مورد نظر نشان داده میشود )بنابازی، 3183(. 3 ب- Neighbor Joining : روش نزدیکترین همسایه توسط Nei )1987(، ارائه گردید. اساس این روش حداقل نمودن طول کل درخت است. همجوارها جفتهایی هستند که وقتی به هم می پیوندند درختی با کوتاهترین طول را تشکیل می دهند و برای رسیدن به درختی با کوتاهترین طول، تشخیص همجوارها مرحله به مرحله پیش میرود. فاصله بین هر جفت واحد تاکسونومی بر روی درخت ایجاد شده، برابر مجموع طول شاخه هایی است که آن دو را به هم متصل می گرداند. از آنجایی که این روش بر خالف روش UPGMA میزان تکامل متفاوت در تبارهای مختلف را منظور مینماید، برگزیده ترین روش برای اکثر داده های مولکولی میباشد )Tamura et al., 2007(. پ- 1Maximum Parsimony: روش حداکثر ایجاز معمولترین روش برای بازسازی روابط اجدادی است. معیارهای اصلی مورد نظر در این روش میزان تغییرات تکاملی است که باید برای تفسیر داده های مشاهده شده با درخت ترسیم شده مد نظر قرار گیرند. این روش از جمله روشهای تخمین درخت بر مبنای صفات است که در ماتریس صفات فیلوژنتیکی گسسته مورد استفاده قرار می گیرد تا یک یا بیش از یک درخت فیلوژنتیکی بهینه را برای گروهی از تاکسون ها )که اغلب گروهی از گونه ها یا جمعیتهای مجزا شده تولید مثلی یک گونه واحد هستند( را ترسیم کند. حداکثر ایجاز می تواند برای انواع متنوعی از داده ها مورد استفاده قرار گیرد )Tamura et al., 2007(.

1- NJ 2- MP

فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

1-2- بررسي منابع در داخل کشور اللوئی و همکاران )3181(، با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از ژن سیتوکروم b میتوکندری به بررسی جمعیت 61 نمونه ماهی Barbus capito در آبهای حوضه جنوبی دریای خزر )دریای خزر و رودخانه های استانهای مازندران و گیالن( پرداختند و پدیده پلی مورفیسم را مشاهده ننمودند و اعالم نمودند جمعیت قابل جداسازی تشخیص داده نشد و تمام افراد از ژنوتیپ هموژن برخوردار بودند. خارا )3181(، وجود تنوع مورفومتریک، مریستیک و ژنتیک مولکولی درون گونه ای 311 عدد ماهی سیم3 در تاالب انزلی، سواحل جنوبی دریای خزر، دریاچه سد ارس و جمهوری آذربایجان را با استفاده از 37 آنزیم برشگر مورد بررسی قرار داد که 4 آنزیم برشگر در بین نمونه های آذربایجان و ارس پلی مورفیسم را نشان دادند و 6 هاپلوتایپ مختلف مشخص گردید. حداقل و حداکثر اختالف نوکلئوتیدی بین هاپلوتایپها به ترتیب 835/1 و 14/1 به دست آمد و بیشترین اختالف نوکلئوتیدی )357/1( بین نمونه های آذربایجان و انزلی و کمترین آن )111/1( بین نمونه های انزلی و دریای خزر مشاهده شد. میانگین تنوع هاپلوتایپی نیز 115/1±151/1 به دست آمد و حداکثر تنوع هاپلوتایپی )144/1±811/1( در نمونه های آذربایجان و حداقل آن در نمونه های انزلی و دریا مشاهده شد. تست ناهمگنی جغرافیایی با توجه به فراوانی و ترکیب هاپلوتایپها به وسیله Roff and Bentzen, 1989( Monte- Carlo( با 3111 بار تکرار نشان داد که اختالف 2 معنی داری در توزیع هاپلوتایپها در بین جمعیتهای چهارگانه وجود دارد )χ = 63.09; P= 0.000(. بر این اساس اعالم نمود که جمعیت آذربایجان از جمعیتهای ارس، انزلی و دریای خزر جدا می باشد و از نظر پراکنش هاپلوتایپها اختالف معنی داری بین نمونه هایی که در ایران وجود داشت مشاهده نشد )P≥0.05(. نویدی مقدم فومنی )3184(، در بررسی تنوع ژنتیکی 11 نمونه بچه ماهی آزاد دریای خزر جمعیت منطقه تنکابن با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره1 به وجود تنوع ژنتیکی در آنها پی برد و هتروزایگوسیتی را در هر جایگاه بین 756/1-416/1 به دست آورد. رضوانی گیل کالئی و همکاران )3185(، از روش PCR- RFLP و ژن سیتوکروم b برای شناسایی و جداسازی 5 گونه از کپور ماهیان دریای خزر شامل ماهی سفید، سس ماهی بزرگ سر، سیم، ماش و کلمه استفاده کردند و هاپلوتایپهای اختصاصی برای هر یک از 5 گونه را شناسایی و معرفی نمودند.

1- Abramis brama orientalis 2- Microsatellite markers

75 اللوئی و همکاران )3185(، در بررسی مولکولی جمعیت ماهی کیلکای معمولی3 در حوضه جنوبی دریای خزر با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA، از 311 عدد محصول PCR حدود 3135 جفت باز به دست آوردند و 3 هاپلوتایپ مختلف شناسایی نمودند. آنها تفاوت معنی داری بین هاپلوتیپها مشاهده نکردند )P<0.01( و به ساختار ژنتیکی متفاوت این ماهی بین دو منطقه نمونه برداری پی بردند. چشمه ای )3185(، با استفاده از 5 جفت آغازگر ریز ماهواره به بررسی ساختار ژنتیک جمعیت اردک ماهی1 تاالب انزلی پرداخت و نشان داد که با توجه به عدم ارتباط تاالب انزلی با سایر منابع آبی، یک جمعیت از این گونه در تاالب انزلی وجود دارد. رفیعی )3185(، در بررسی تنوع ژنتیکی 51 نمونه بچه ماهی آزاد دریای خزر از جمعیت غرب استان مازندران )تنکابن( با استفاده از روش PCR- RFLP، به وجود پلی مورفیسم در آنها پی برد و دامنه هتروزایگوسیتی را بین 3/1-8/1 و دامنه تعداد آلل را بین 6-1 عدد در هر جایگاه به دست آورد. سیادتیان و همکاران )3186(، با استفاده از توالی یابی مستقیم محصول PCR بخشی از ناحیه D- Loop میتوکندریایی به بررسی فیلوژنیک کفال ماهیان گونه های Liza aurata و Liza saliens دریای خزر پرداختند و عنوان نمودند که با توجه به وجود اختالفات مورفولوژیک بین این دو گونه نتایج مولکولی نیز تأیید کننده این اختالف است به طوری که هر کدام از این گونه ها در شاخه هایی جداگانه و با اختالفاتی نسبت به یکدیگر قرار گرفتند. شیبانی و همکاران )3186(، با استفاده از توالی یابی مستقیم محصول PCR بخشی از ناحیه D- Loop میتوکندریایی به بررسی فیلوژنیک کفال ماهیان گونه های Liza abu و Liza subviridis شمال خلیج فارس پرداختند و با رسم درخت فیلوژنی، این دو گونه در دو شاخه مجزا از یکدیگر قرار گرفتند. آنها همچنین ثابت کردند که مطالعات مورفولوژیک و ژنتیک مولکولی با هم همسویی دارند. جرفی )3186(، با استفاده از روش PCR- RAPD به مطالعه ژنتیکی ماهی صبور در استان خوزستان پرداخت و بیشترین میزان فاصله ژنتیکی )333/1( را بین جمعیتهای صبور اروندرود و دریا و کمترین آن را )184/1( بین جمعیتهای اروندرود و بهمنشیر مشاهده نمود و به مجزا بودن گروه های ماهیان صبور مورد بررسی و وجود همبستگی باال بین داده های هر منطقه جغرافیایی اشاره نمود. Keyvanshokooh و همکاران )2007(، با استفاده از 6 جایگاه ریز ماهواره ای تنوع جمعیتی کلمه تاالب انزلی و خلیج گرگان را مورد بررسی قرار دادند و به وجود اختالف ژنتیکی در جمعیتهای مورد مطالعه پی بردند.

1- Clupeonella cultiventris 2- Esox lucius

76 رضوانی گیل کالئی و همکاران )3187(، با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از ژن ND2 میتوکندری به بررسی مولکولی جمعیت ذخایر ماهی حلوا سفید3 خلیج فارس و دریای عمان )تعداد 361 نمونه شامل 18 نمونه از کویت، 314 نمونه از استان خوزستان، 41 نمونه از چابهار و 18 نمونه از بوشهر( در آبهای ایران و کویت پرداختند. از 36 آنزیم بررسی شده، 4 آنزیم دارای الگوهای پلی مورفیسم بودند و پلی مورفیسم در 31 نمونه از 361 نمونه دیده شد. از بین هاپلوتایپهای به دست آمده، 6 هاپلوتایپ نادر بودند و هر کدام تنها یک بار تکرار شدند اما سایر هاپلوتایپهای پلی مورفیسم که 4 نوع بودند بیش از یک بار تکرار شدند و آنالیز آماری انجام شده با استفاده از نرم افزار Reap تفاوت معنی داری را بین مناطق مورد بررسی نشان نداد )P≥0.05(. آنها اعالم داشتند که ژن ND2 میتوکندری قادر به تفکیک جمعیتهای احتمالی حلوا سفید در آبهای ایرانی خلیج فارس، دریای عمان و آبهای کویت نبوده و نمونه های بررسی شده وجود یک جمعیت را نشان دادند. اللوئی و همکاران )3187(، در بررسی ژنتیک جمعیت 161 نمونه ماهی کپور معمولی1 حوضه جنوبی دریای خزر )نواحی غربی، میانی و شرقی حوضه جنوبی دریای خزر، تاالب انزلی، رودخانه تجن، گرگانرود و خلیج گرگان( با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از ژنهای ناحیه ی ND- 5/6 و ND- 3/4 مولکول mtDNA پرداختند و در مجموع 34 و 31 هاپلوتایپ متفاوت به ترتیب برای ژنهای ND- 3/4 و ND- 5/6 مشاهده کردند. میانگین تنوع هاپلوتایپها برای ژنهای ND- 3/4 و ND- 5/6 به ترتیب 53/1 و 48/1، میانگین تنوع نوکلئوتیدی به ترتیب 16/1 و 11/1 و میانگین اختالف نوکلئوتیدی به ترتیب 15/1 و 11/1 درصد محاسبه شد. تجزیه و تحلیل داده های حاصل از ارزیابی دو ژن نشان داد که نمونه های سواحل استان گیالن با تاالب انزلی، سواحل استان گیالن با سواحل استان گلستان و رودخانه تجن با گرگانرود از لحاظ فراوانی هاپلوتایپ دارای اختالف معنی دار بوده است )P≤0.05(. آنها با توجه به معنیدار بودن تفاوت ژنتیکی بین نمونه ها اعالم کردند که جمعیت یکسانی از کپور معمولی در مناطق مورد بررسی وجود نداشته و به طور کلی سه گروه ژنتیکی از این گونه شناسایی شدند. قطب رزمجو )3186(، در بررسی ساختار ژنتیک جمعیت 35 نمونه گاو ماهی خزری1 در مرکز و شرق سواحل جنوبی دریای خزر )چالوس و بندر ترکمن( با استفاده از روش ریز ماهواره، در 5 جفت از 31 جفت آغازگر مورد بررسی پلی مورفیسم را مشاهده نمود و متوسط هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار به ترتیب 738/1 و 841/1 به دست آمد و اعداد حاصل از RST و FST اختالف معنی داری را میان دو منطقه مورد بررسی نشان داد )P<0.05(. او انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ را در بین تمامی نمونه ها

1- Pampus argenteus 2- Cyprinus carpio 3- Neogobius caspius

77 مشاهده نمود و با توجه به نتایج به دست آمده اعالم کرد که در سواحل جنوبی دریای خزر حداقل دو جمعیت مجزا از گاو ماهی خزری وجود دارد. قطب رزمجو و همکاران )3187(، در بررسی ساختار ژنتیک جمعیت گاو ماهی خزری در حوضه جنوبی دریای خزر )بندر انزلی، چالوس و بندر ترکمن( با استفاده از روش PCR- RFLP، اعالم کردند که در سه منطقه مورد مطالعه اختالف ژنتیکی وجود نداشته و تمام ذخایر موجود در مناطق مختلف نمونه برداری از یک جمعیت واحد هستند. رضوانی گیل کالئی و همکاران )3188(، در بررسی ساختار ژنتیکی 384 عدد ماهی سوکال3 در آبهای خلیج فارس و دریای عمان با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره، بر اساس آزمون AMOVA حداکثر مقدار FST )161/1( با کمترین میزان جریان ژنی )7/1( را بین نمونه های بندر دیر و پزم به دست آوردند و میزان RST بین مناطق واقع در یک ناحیه نمونه برداری غیر معنی دار ولی بین مناطق واقع در نواحی مختلف معنی- دار بود )P<0.01(. بر اساس درخت فیلوژنی رسم شده، مناطق مختلف به دو خوشه تقسیم شدند، خوشه اول شامل مناطق بوشهر و دیر بود و خوشه دوم به دو گروه )گروه اول شامل نمونه های مناطق پزم و بریس و گروه دوم شامل نمونه های مناطق بندر لنگه و بندر عباس( تقسیم شد. نتایج نشان داد که ماهی سوکال احتماالً دارای سه جمعیت مجزا )بوشهر، هرمزگان و چابهار( در خلیج فارس و دریای عمان است. چکمه دوز )3188(، در مطالعه ساختار ژنتیک جمعیت ماهی سفید نژاد بهاره و پاییزه با استفاده از روشهای تعیین توالی DNA و ریز ماهواره به وجود تفاوت ژنتیکی بین این دو نژاد پی برد. رحمانی و همکاران )3188(، در مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیتهای ماهی شاه کولی1 در رودخانه های هراز، شیرود و گزافرود با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از ژن 18S rRNA، تفاوت نوکلئوتیدی پایینی را بین جمعیتهای مورد مطالعه به دست آوردند و بیشترین و کمترین تنوع ژنتیکی و هاپلوتایپی درون جمعیتها به ترتیب در رودخانه های هراز و گزافرود مشاهده شد. قریب خانی )3188(، در مطالعه ساختار ژنتیک جمعیت و فیلوژنی 358 عدد سوف حاجی طرخان1 در تاالب های انزلی و امیر کالیه الهیجان و 117 عدد سوف سفید4 در سد ارس و حوضه جنوب غربی دریای خزر با استفاده از 35 جفت آغازگر ریز ماهواره اعالم نمود که حداقل دو جمعیت متمایز از ماهی سوف حاجی طرخان در سه منطقه مورد بررسی و حداقل سه جمعیت متمایز از سوف سفید در چهار منطقه مورد بررسی وجود دارد و تنوع ژنتیکی ماهی سوف حاجی طرخان در مقایسه با ماهی سوف سفید بیشتر بوده و

1- Rachycentron canadum 2- Chalcalburnus chalcoides 3- Perca fluviatilis 4- Sander lucioperca

78 روش توالی یابی ژن سیتوکروم b در تعیین روابط فیلوژنیک این دو گونه و روش ریز ماهواره برای تفکیک جمعیتهای سوف ماهیان از کارایی مناسبی برخوردار می باشند. پورغالم و همکاران )3188(، در بررسی ژنتیک جمعیت 311 نمونه گاو ماهی سرگنده ی3 حوضه جنوبی دریای خزر )18 نمونه از منطقه گلستان، 51 نمونه از منطقه مازندران و 51 نمونه از منطقه گیالن( با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره ای در هر 6 جفت آغازگر ریز ماهواره بررسی شده پلی مورفیسم را مشاهده نمودند. میانگین تعداد آللهای مشاهده شده و مؤثر به ترتیب 44/33 و 18/7 و حداکثر هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار به ترتیب 364/1 و 311/1 محاسبه گردید و بیشتر جایگاه های مورد بررسی خارج از تعادل هاردی- واینبرگ بودند )P<0.05(. حداکثر FST )16/1( و کمترین میزان جریان ژنی )3/4( بین نمونه های گلستان و گیالن و حداقل FST )11/1( و بیشترین میزان جریان ژنی )41/1( بین نمونه های مازندران و گیالن مشاهده گردید. بیشترین فاصله ژنتیکی )73/1( و کمترین شباهت ژنتیکی )43/1( بین نمونه های گیالن و گلستان مشاهده شد و نتایج حاصل از محاسبه FST نشان داد که سه گروه ژنتیکی متفاوت از این گونه در حوضه جنوبی دریای خزر وجود دارد. رضایی و همکاران )3183(، در بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت 15 عدد ماهی سفید1 در سواحل استان گلستان )رودخانه های گرگانرود و قره سو( با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره در همه جایگاه های ژنی پلی مورف را مشاهده نمودند. دامنه تعداد آلل در مناطق مورد مطالعه 31-4 و دامنه هتروزایگوسیتی مشاهده شده 11/3-11/1 به دست آمد. مقدار FST بین جمعیتها 134/1 بود )P<0.05(. آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که میزان تنوع درون جمعیتی بسیار باال )33%( و تنوع بین جمعیتی )3%( پایین است. انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ باالیی در هر دو جمعیت دیده شد و نتایج نشان داد که این گونه هنوز از تنوع ژنتیکی نسبتاً مناسبی برخوردار است و دندروگرام UPGMA ترسیم شده بر اساس مقدار فاصله ژنتیکی نشان داد که بیش از یک جمعیت ماهی سفید در سواحل استان گلستان وجود دارد. درافشان و همکاران )3183(، کاربرد نشانگر ریز ماهواره را در بررسی صحت آمیخته گری بین دو گونه اقتصادی آزاد ماهیان ایران )جنس ماده قزل آالی رنگین کمان1 و جنس نر ماهی آزاد دریای خزر( مورد مطالعه قرار دادند و بیان نمودند که نتاج تولیدی آمیخته حقیقی بوده و توارث کاملی از باندهای اختصاصی والدین را دارا هستند. ضمن اینکه نشان دادند که ریز ماهواره ها می توانند به عنوان شاخصی جهت بررسی صحت آمیخته گری این دو گونه مورد استفاده قرار گیرند.

1- Neogobius gorlap 2- Rutilus frisii kutum 3- Oncorhynchus mykiss

79 محمدیان و همکاران )3183(، در مطالعه تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت 51 نمونه ماهی سیاه کولی3 در سواحل شرقی و غربی دریای خزر )رودخانه های حویق و گرگانرود( با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره به این نتیجه رسیدند که دو جمعیت متفاوت از ماهی سیاه کولی در سواحل شرقی و غربی دریای خزر وجود دارد و بیان کردند که روش ریز ماهواره توانایی باالیی برای نشان دادن میزان تنوع ژنتیکی در ماهی سیاه کولی دارد. قلیچ پور و همکاران )3183(، در مقایسه ساختار ژنتیکی دو جمعیت کپور معمولی در مناطق قره سو و انزلی با استفاده از 8 نشانگر ریز ماهواره اعالم کردند که جمعیتهای مورد بررسی از غنای آللی و تنوع ژنتیکی قابل قبولی برخوردارند. همچنین وجود هتروزایگوسیتی باال در منطقه قره سو را ناشی از جریان ژنی باال در این منطقه دانسته که تأثیرات منفی تکثیر مصنوعی بر تنوع ژنتیکی را خنثی می کند. عبدالحی و همکاران )3183(، ساختار ژنتیک جمعیت 134 عدد ماهی سفید حوضه جنوبی دریای خزر )رودخانه های سفیدرود، شیرود، تجن و لمیر( را با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از مولکول mtDNA و 11 عدد ماهی سفید از هر رودخانه را با استفاده از روش ریز ماهواره مورد بررسی قرار دادند. ارزیابی مقادیر حاصل از فراوانی آللی، هتروزایگوسیتی و تعادل هاردی- واینبرگ نشان داد که بیش از یک جمعیت از ماهی سفید در دریای خزر وجود دارد و نشانگر ریز ماهواره ابزار بسیار توانمندی برای بررسی تنوع درون و بین جمعیتی و روابط تکاملی میان جمعیتها و به طور کلی مطالعات ژنتیک جمعیت می باشد. رضوانی گیل کالئی و همکاران )3131(، در مقایسه تنوع ژنتیکی جمعیت 335 نمونه گاو ماهی خزری در غرب و شرق سواحل جنوبی دریای خزر )مناطق بندر انزلی و بندر ترکمن( با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره در 3 آغازگر پلی مورفیسم و دو آغازگر مونومورفیسم را مشاهده نمودند و در یک آغازگر باندی مشاهده نکردند. متوسط چند شکلی مشاهده شده و مورد انتظار را به ترتیب 743/1 و 618/1 محاسبه نمودند و انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در تمام نمونه ها مشاهده شد. با توجه به اعداد به دست آمده از FST و RST بیان کردند که میان دو منطقه مورد بررسی اختالف معنی داری وجود دارد )P≤0.01(. نتایج نشان داد که در سواحل جنوبی دریای خزر حداقل دو جمعیت مجزا از گاو ماهی خزری وجود دارد. نعمت زاده و همکاران )3131(، 6 گونه از کفال ماهیان ایران را با استفاده از روش PCR- Sequencing مورد مطالعه قرار دادند که با استفاده از روش Maximum parsimony گونه L. aurata با L. subviridis در یک شاخه اما در روش Neighbor joining گونه L. aurata با L. saliens در یک شاخه قرار گرفتند. قدسی و همکاران )3131(، با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره تنوع ژنتیکی Liza aurata را در سواحل استان گلستان مورد بررسی قرار دادند. از طریق RST ،FST و آنالیز واریانس مولکولی تمایز بارز ژنتیکی در

1- Vimba vimba persa

81 میان مناطق مشاهده نشد اما میزان نسبتاً باالیی از جریان ژنی بین جمعیتها مشخص گردید. همچنین عالئمی از تنگنای ژنتیکی در جمعیتها گزارش شد. خالدی )3131(، ساختار ژنتیکی 358 عدد ماهی راشگو معمولی3 در خلیج فارس و دریای عمان را با استفاده از 3 نشانگر RAPD و توالی یابی ژن 28S rRNA مورد بررسی قرار داد. در روش RAPD بیشترین و کمترین پلی مورفیسم به ترتیب در بوشهر )61/31( و سیستان و بلوچستان )13/61(، بیشترین و کمترین میزان تنوع ژنتیکی به ترتیب در بوشهر و هرمزگان )11/1( و سیستان و بلوچستان )37/1(، بیشترین اختالف ژنتیکی بین خوزستان- سیستان و بلوچستان و هرمزگان- سیستان و بلوچستان )14/1( و بیشترین و کمترین میزان جریان ژنی به ترتیب میان جفت نواحی خوزستان و سیستان و بلوچستان )33/1( و جفت نواحی خوزستان- بوشهر )13/1( محاسبه گردید و اختالف ژنتیکی میان مناطق، میان نواحی و درون نواحی در دو منطقه خلیج فارس و دریای عمان معنی دار نبود )P>0.01(. بر اساس دندروگرام رسم شده، نمونه های مناطق مختلف به دو کالستر تقسیم شدند. کالستر اول شامل سیستان و بلوچستان و کالستر دوم با دو شاخه شامل هرمزگان، خوزستان و بوشهر بود. در روش توالی یابی، 6 هاپلوتایپ شناسایی شد و میانگین تنوع هاپلوتایپی و نوکلئوتیدی به ترتیب 51/1 و 13/1 به دست آمد. باالترین و پایین ترین تنوع هاپلوتایپی به ترتیب بین جفت نواحی خوزستان- هرمزگان )84/1( و بوشهر- سیستان و بلوچستان )33/1( و بیشترین و کمترین اختالف ژنتیکی به ترتیب بین جفت جمعیتهای بوشهر- هرمزگان )13/1( و جفت جمعیتهای بوشهر- سیستان و بلوچستان )11/1( ثبت گردید که نشان دهنده جدایی جمعیت بوشهر از سایر جمعیتها بود. بیشترین جریان ژنی )11/1( بین جفت جمعیتهای خوزستان و هرمزگان محاسبه گردید. فراوانی هاپلوتایپی میان جفت جمعیتهای هرمزگان- بوشهر و بوشهر- خوزستان معنی دار بود )P<0.05( که مؤید فرضیه جدایی این جمعیت از جمعیتهای همجوار بود. مقادیر حاصل از بررسی تنوع ژنتیکی در دو منطقه خلیج فارس و دریای عمان معنی دار نبودند )P>0.05( و بیانگر این بود که علیرغم جدایی جمعیتی برای گونه هدف در بوشهر، ساختار ژنتیکی آن در خلیج فارس و دریای عمان خیلی با یکدیگر متفاوت نیست. همچنین درخت تبارزایی به روشهای NJ ،MP و UPGMA جدایی مشخصی را برای نمونه های نواحی مورد مطالعه فراهم نکردند. قانع )3131(، در بررسی تنوع ژنتیکی کفال پوزه باریک در سواحل جنوبی دریای خزر با استفاده از ژن 16S rRNA جمعیت متفاوتی از این گونه در مناطق مورد بررسی مشاهده نکرد و دلیل آن را نامناسب بودن این ژن برای بررسی جمعیت ماهیان کفال پوزه باریک دانسته و اینکه این ژن در درون گونه ها دارای میزان

1- Eleutheronema tetradactylum

83 جهش پایین و نقاط حفاظتی است در نتیجه نمی تواند بیان کننده جمعیتها باشد و بیشتر برای تفکیک گونه ها از هم مناسب می باشد. Yousefian )2011(، در بررسی تنوع ژنتیکی ماهیان آزاد جوان و در معرض خطر انقراض دریای خزر با استفاده از آغازگرهای ریز ماهواره دامنه آلل مشاهده شده در هر جایگاه در والدین و فرزندان را به ترتیب 31-8 و 33-7 و دامنه آلل مؤثر در آنها را به ترتیب 8/8-6/4 و 1/3-1/5 به دست آورد و بر اساس نتایج آنالیز واریانس مولکولی هیچ اختالف ژنتیکی بین جمعیتهای مولدین نر و فرزندانشان مشاهده نکرد اما اعالم کرد که اختالف ژنتیکی بین جمعیتهای مولدین ماده و نر و مولدین ماده و فرزندانشان معنی دار است .)P<0.05( Jamshidi و Kalbassi )2011(، در بررسی ارتباط بین شکلهای مهاجر بهاره و پاییزه 61 عدد ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از 36 آغازگر RAPD، 37-5 عدد آلل به ازای هر جایگاه با متوسط 315/31 به دست آوردند و میزان شباهت و فاصله ژنتیکی بین دو جمعیت را به ترتیب 386/1 و 134/1 محاسبه نمودند. Sourinejad و همکاران )2011(، در بررسی انتساب نسب فرزندان 8 عدد مولد ماده و نر ماهی آزاد دریای خزر موجود در مرکز شهید باهنر کالردشت از جمعیت رودخانه تنکابن با استفاده از 1 جفت آغازگر ریز ماهواره، متوسط تعداد آلل در والدین و فرزندان را به ترتیب 7 و 66/6، متوسط هتروزایگوسیتی مشاهده شده در والدین و فرزندان را به ترتیب 333/1±811/1 و 133/1±711/1 و متوسط هتروزایگوسیتی مورد انتظار را به ترتیب 314/1±811/1 و 113/1±684/1 محاسبه نمودند. Hashemzadeh Segherloo و همکاران )2012(، در بررسی وضعیت فیلوژنتیکی ماهی قزل آالی خال قرمز در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر و دو دریاچه در حوضه دریاچه های داخلی ایران با استفاده از روش توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA، 7 عدد هاپلوتایپ مختلف شناسایی نمودند و با رسم درخت تبارزایی به روش Maximum Likelihood جدایی مشخصی را در نمونه های مناطق مورد مطالعه مشاهده نکردند. سعیدی )3133(، در مطالعه تنوع ژنتیکی Liza aurata در استانهای گیالن، مازندران و گلستان با استفاده از روش mtDNA، 43 عدد هاپلوتایپ و 155 جایگاه متغیر به دست آورد. بیشترین و کمترین مقدار FST را به ترتیب بین استانهای گیالن و مازندران )733/1( و بین استانهای مازندران و گلستان )171/1( مشاهده و مطرح نمود که تمایز ژنتیکی نسبتاً باالیی در جمعیت کفال طالیی وجود داشته که منجر به ایجاد دو جمعیت متفاوت از این گونه در سواحل جنوبی دریای خزر شده است. او همچنین تنوع هاپلوتایپی مشاهده شده در هر سه استان را عدد یک اعالم کرد و بیشترین تنوع نوکلئوتیدی به دست آمده به میزان )183/1( را در نمونه

82 های مربوط به استان گلستان مشاهده نمود و باال بودن تنوع هاپلوتایپی و نوکلئوتیدی را بیانگر تنوع جمعیتی نسبتاً باال در داخل و بین جمعیتهای مورد مطالعه دانست. 1-1- بررسي منابع در خارج از کشور Williams و Powell )2000(، در بررسی تنوع ژنتیکی قزل آالی رنگین کمان Silver Creek و کارگاه تکثیر Hayspur با استفاده از روش PCR- RFLP و بهره گیری از ژن ناحیه ND2 میتوکندری تعداد 5 هاپلوتایپ در نمونه های Silver Creek مشاهده نمودند و اظهار داشتند هاپلوتایپهایی که در ماهیان قزل آالی رنگین کمان پرورشی معمول هستند و در نمونه های Silver Creek نیز وجود دارند ممکن است باقیمانده نمونه های اولیه تکثیر یافته باشند. Banks و همکاران )2000(، با استفاده از آنالیز دادههای ریز ماهواره وجود 5 زیر جمعیت مجزا را در ماهیان آزاد چینوک3 در ناحیه مرکزی کالیفرنیا نشان دادند. Adams و Hutchings )2003(، با استفاده از تکنیکهای صید، نشانه گذاری، رهاسازی و صید مجدد و ریز ماهواره به بررسی ساختار جمعیتی قزل آالی جویباری1 دریاچه های حوضه آبریز خلیج هند پرداختند و سطح باالیی از هتروزایگوسیتی )6/1-17/1( را مشاهده نمودند و بیان کردند که علیرغم عدم وجود موانع فیزیکی برای مهاجرت بین دریاچهها، هر دریاچه جمعیت تولید مثلی مجزایی دارد. حتی دادههای نشانه- گذاری هم داللت بر مهاجرت جزئی و عدم مهاجرت بین دریاچهها داشت. همچنین مشاهده کردند که سطح هتروزایگوسیتی جمعیتهای این گونه در این منطقه نسبت به سایر مناطق باالتر است. Kohlmann و همکاران )2003(، تنوع و ساختار ژنتیکی ماهی کپور معمولی را در نواحی از اروپا، آسیای مرکزی و آسیای شرقی/ جنوب شرقی با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره، آلوزایم ها و mtDNA مورد مطالعه قرار دادند و به ترتیب 11، 33 و 13 جمعیت را شناسایی نمودند که در این بررسی میزان تغییرپذیری ریز ماهواره ها نسبت به آلوزایم ها بسیار بیشتر بود. DNA 2004 Alarcon و همکاران ) (، با استفاده از مقایسه آلوزایم، میکروستالیت و میتوکندریایی به مقایسه ژنتیکی جمعیتهای اروپایی وحشی و پرورشی سیم دریایی سر طالیی1 در اقیانوس اطلس شمالی و مدیترانه پرداختند. به نظر آنها ریز ماهواره سطح پلی مورفیسم باالتری در مقایسه با آلوزایم نشان می دهد. تغییر- پذیری پایین mtDNA نشان داد که هیچ تمایز اساسی در جمعیتها وجود ندارد. تنوع آللی و تغییرپذیری باالیی در نمونه ها دیده شد که متأثر از اندازه نمونه ها )n= 171( بود. نمونه های وحشی در مقایسه با نمونه های پرورشی تعداد آلل باالتری نشان دادند )P< 0.05( و دامنه آن 35-31 بود. هتروزایگوسیتی قابل انتظار

1- Oncorhynchus tshawytscha 2- Salvelinus fontinalis 3- Sparus aurata

81 در 3 جایگاه از 35 جایگاه در نمونه های وحشی بیشتر بود که از نظر آماری معنی دار )P>0.05( نبوده و میانگین آن برای ریز ماهواره 845/1 و آلوزایم 318/1 به دست آمد که احتماالً ناشی از میزان باالی جهش یا به خاطر فشار بهگزینی پایین تر ریز ماهواره ها نسبت به آلوزایم و یا به خاطر تغییر پذیری جزئی در آلوزایمها است. اختالف نشان داده شده به وسیله mtDNA بسیار پایین بود. همچنین یافته های آنها نشان داد که نژادهای اهلی نسبت به وحشی از تنوع ژنتیکی کمتری برخوردارند. Skaala و همکاران )2004(، با بهره گیری از 31 نشانگر ریز ماهواره به بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای ماهی آزاد وحشی و اهلی اطلس در نروژ پرداختند و با دقت باالیی توانستند نمونه های وحشی را از نمونه های پرورشی تشخیص دهند. نتایج این مطالعه نشان داد که در تمامی نژادهای پرورشی اختالف آللی کل به طور قابل مالحظه ای پایین تر از جمعیتهای وحشی بود که می تواند ناشی از اثر مؤسس یا رانش ژنتیکی در افزایش تولید نسل در برنامه های تولید مثلی باشد. مقدار FST نیز تمایز ژنتیکی معنی داری را در تمام جایگاهها نشان داد اما فاصله ژنتیکی و تمایز جنسی با یکدیگر در تمامی موارد هماهنگ نبودند. به طور کلی FST در نژادهای پرورشی 8-1 بار باالتر از نژادهای وحشی بود که ممکن است به خاطر اثر مؤسس باشد که افراد بنا کننده از نژادهای مختلف بودند و همچنین در نتیجه درجه باالی جدایی بین ذخایر ایجاد شده باشد. Faria و همکاران )2004(، خصوصـیات ژنتیکـی ماهیان Alosa alosa و Alosa fallax در نواحی مدیترانه و دریای سیاه را با استفاده از نشانگر ریز ماهواره مورد مطالعه قرار دادند. این مطالعه نشان داد که تعداد آللها در هر جایگاه برای A. alosa 3-1 و برای A. fallax 7-1 عدد بود. ضمن اینکه تنوع هتروزایگوسیتی برای این دو گونه به ترتیب 316/1-167/1 و 717/1-141/1 بود. Beacham و همکاران )2004(، با استفاده از 34 جایگاه ریز ماهواره ساختار جمعیت دو نوع دریاچه ای و رودخانه ای سوکی سالمون3 را در 47 جمعیت رودخانه های شمال بریتیش کلمبیا بررسی کردند. به طور واضح بین جمعیتهای رودخانه ای و دریاچه ای اختالف ژنتیکی مشاهده شد و میزان تنوع ژنتیکی ماهی آزاد رودخانه ای بیشتر از نوع دریاچه ای بود. میانگین آللهای مشاهده شده در هر جایگاه و هتروزایگوسیتی قابل انتظار در رودخانه به ترتیب 7/31 و 71/1 و در دریاچه به ترتیب 5/31 و 65/1 بود. به نظر آنها هتروزایگوسیتی باالتر رودخانه نسبت به دریاچه به خاطر اختالف ژنتیکی در کلونی ماهیانی است که به رودخانه بازگشت کرده و با محیط جدید سازگار شدند. افزایش میزان تمایز دیده شده در جایگاههای ریز ماهواره نسبت به آلوزایم به خاطر تغییر در میزان جهش بین این دو مارکر بود. در بررسی تعادل هاردی- واینبرگ فقط در یک جایگاه عدم تعادل دیده شد. بیشترین شباهت ژنتیکی مشاهده شده بین جمعیتهای

1- Oncorhynchynchus nerka

84 دریاچه ای در مقایسه با دیگر جمعیتهای رودخانه است و تمایز ژنتیکی بین جمعیتهای ماهی آزاد رودخانه- ای با جمعیت دریاچه ای به روشنی تفاوت زیادی داشت و اختالفات مشاهده شده در جایگاههای ریز- ماهواره بیشتر از آلوزایم بود. Aguilar و همکاران )2005(، با استفاده از تکنیک مولکولی ریز ماهواره منشأ ژنتیکی جمعیت اردک ماهی )Esox lucius( معرفی شده به شمال دریاچه دیویس کالیفرنیا و تغییرات ژنتیکی آن را از زمان رهاسازی بررسی کردند. در این بررسی از 31 جایگاه تترا نوکلئوتیدی ریز ماهواره در 33 جمعیت استفاده کردند و میانگین تعداد آلل و هتروزایگوسیتی در جایگاهها به ترتیب 6/7 و 68/1 به دست آمد. به نظر آنها اندازه مؤثر جمعیت و تنگناهای ژنتیکی بر تمایز ژنتیکی در داخل یک جمعیت و تغییر در فراوانی آللی مؤثر است و انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در 7 جایگاه جمعیت سبز، 4 جایگاه جمعیت قرمز و 1 جایگاه جمعیت طالیی معنی دار گزارش شد. Brigitte و همکاران )2005(، با استفاده از 6 جایگاه ریز ماهواره ای به آنالیز 31 جمعیت اردک ماهی3 از شمال اروپا و شمال آمریکا پرداختند و تنوع ژنتیکی بسیار پایین جمعیت اردک ماهی شمال اروپا را در نتیجه کاهش جمعیت مؤثر در مقیاس زمانی چند هزار ساله که در رابطه با حوادث عصر یخبندان و بعد آن میباشد نسبت دادند. Jug و همکاران )2005(، با استفاده از 5 نشانگر ریز ماهواره توزیع جمعیتهای غیر بومی قزل آال در اسلوونی و سایر ورودی ها را با جمعیتهای بومی قزل آال در دریاچه آدریاتیک1 و دریاچه دانوب1 مورد ارزیابی قرار دادند و توانستند نژادهای غیر بومی انتشار یافته و ورود آنها به جمعیتهای بومی را تشخیص دهند و اعالم کردند که جمعیتهای بومی در معرض خطر قرار دارند. آنها 71 آلل در این 5 جایگاه گزارش نمودند و دامنه آللی 1/8-1/3، دامنه هتروزایگوسیتی مشاهده شده 65/1-31/1 و دامنه هتروزایگوسیتی قابل انتظار -1/71 16/1 محاسبه گردید. آنها همچنین اعالم کردند که نه تنها گونه قزل آالی مرمری در سواحل اسلوونی بلکه ماهی قزل آالی قهوه ای دانوبی هم در معرض خطر انقراض قرار دارد. آنها نشانگرهای ریز ماهواره را ابزار بسیار مناسبی برای ارزیابی ژنتیکی جمعیت و حفاظت از گونه های در معرض خطر انقراض معرفی نمودند. Lundrigan و همکاران )2005(، با استفاده از 6 نشانگر ریز ماهواره اختالف ژنتیکی را در داخل و بین جمعیتهای وحشی و پرورشی چار قطبی4 در شمال آمریکا مورد بررسی قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که نژادهای پرورشی و وحشی چار قطبی از یکدیگر متمایزند و نژاد پرورشی تنوع ژنتیکی کمتری نشان میدهد. در این مطالعه دامنه آللی در نژاد وحشی تا 33 آلل و در نژادهای پرورشی به میزان کمتر و بین -13

1- Esox Lucius 2- Salmo marmoratus 3- Salmo trutta 4- Salvelinus alpinus

85 13 آلل مشاهده شد. همچنین میزان هتروزایگوسیتی مشاهده شده برای نمونه های وحشی بیشتر از پرورشی بود و میانگین تعداد آللی و هتروزایگوسیتی مشاهده شده در جمعیتهای وحشی به ترتیب 5/36 و 731/1 و در جمعیتهای پرورشی به ترتیب 11/8 و 651/1 به دست آمد. Charrier و همکاران )2006(، با استفاده از 6 نشانگر ریز ماهواره ساختار ژنتیکی جمعیت ماهی پوالک3 را در سواحل اروپا، شامل سواحل فرانسه در اقیانوس اطلس و شمال نروژ مورد بررسی قرار دادند. تنوع آللی 31-67/33 و هتروزایگوسیتی مشاهده شده 743/1-678/1 به دست آمد. عدم انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در تمامی جمعیتها یا جایگاهها آشکار شد که علت آن استفاده از پرایمرهای بین گونه ای و وجود آللهای نول عنوان شد. آنها همچنین بیان کردند که میان مقادیر FST و فاصله های جغرافیایی ارتباط مثبتی وجود دارد. Lucentini و همکاران )2006(، با بهره گیری از 7 جایگاه ریز ماهواره پلی مورفیسم را در 31 جمعیت اردک ماهی شمال ایتالیا و شرق اروپا بررسی نمودند. نتایج بررسیهای جمعیت اردک ماهی شمال ایتالیا نشان داد که تفاوتهای فردی بین جمعیتها وجود داشته که بر اثر فشارهای وارد شده توسط انسان با روشهای ذخیره سازی به وجود می آید که باید در برنامه های مدیریتی و حفاظتی آینده در نظر گرفته شود. 51 آلل در 6 جایگاه پلی مورفیک مشاهده شد و میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده بین جمعیتها 1/18-1/76 بود. در بررسی 31 جمعیت فوق سه جمعیت خارج از تعادل هاردی- واینبرگ قرار داشتند که علت آن را وجود جهشهای محلی در پرایمرها که موجب نارسایی در تولیدات تکثیر شده و طبقه بندی نادرست هتروزایگوتها همانند هموزایگوتها می شود اعالم کردند. Yoon و همکاران )2007(، در مطالعه آنالیز میتوکندریایی و ریز ماهواره ای جمعیتهای ) Oncorhynchus keta walbaum( تنوع ژنتیکی باالتری را در روش ریز ماهواره نسبت به روش DNA میتوکندریایی مشاهده و اعالم نمودند بهتر است در مطالعه ساختار جمعیتی از هر دو نشانگر استفاده گردد. Papasotirpoulos و همکاران )2007(، با استفاده از آنالیز توالی یابی ناحیه mtDNA به بررسی روابط خویشاوندی خانواده کفال ماهیان پرداختند و از 5 گونه شامل Liza ،Liza aurata ،Liza saliens Chelon labrosus ،ramanda و Mugil cephalus و از هر جنس به تعداد 5 نمونه از دریاچه Messolongi در یونان نمونه برداری انجام شد. سه ناحیه از 16S rRNA ،12S rRNA( mtDNA و COI( تکثیر و توالی یابی شدند. آنالیز توالی یابی نشان داد که بیشترین تفاوت ژنتیکی بین M. cephalus با دیگر جنسهای مورد مطالعه بود در حالی که Chelon labrosus و Liza aurata نزدیکترین جنسها به هم بودند.

1- Pollachius pollachius

86 Taylor و همکاران )2007(، با استفاده از نشانگر ریز ماهواره به بررسی وضعیت بومی بودن و تمایز تکاملی

قزل آالی رنگین کمان در منطقه شرق کانادا پرداختند. قزل آالی این منطقه طبق اندازه گیری های دقیق حفاظت ذخایر مربوط به دوران قبل از یخبندان و جمعیتهای غیر بومی معرفی شده مربوط به اوایل قرن بیستم بود. آنالیزها نشان داد که گونه بومی از تنوع کمی برخوردار بوده و غالبیت تنوع مربوط به گونه های

معرفی شده است. Welch و همکاران )2010(، با استفاده از توالی یابی ژن COI به بررسی ساختار جمعیتی ماهی .E Tetradactylum و P. macrochir در آبهای استرالیا پرداختند. در این بررسی تنوع هاپلوتایپی راشگو معمولی )75/1( و P. macrochir )87/1( و تنوع نوکلئوتیدی نیز به ترتیب )111/1( و )117/1( محاسبه گردید. Vera و همکاران )2011(، ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود را با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره و توالی یابی mtDNA مورد مطالعه قرار دادند. در روش ریز ماهواره همه جایگاه ها باندهای پلی مورفیک تولید نمودند و بیشترین تعداد آلل مشاهده شده )11( و هتروزایگوسیتی مورد انتظار )311/1( در جایگاه Strutta 58 محاسبه شد و میزان اختالف ژنتیکی P<0.001( 1/151( به دست آمد. نتایج آزمون آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که تنوع ژنتیکی درون جمعیتها 33/33 درصد )P<0.001(، بین جمعیتها 11/7 درصد )P=0.066( و بین جمعیتهای داخل گروه 63/3 درصد )P<0.001( می باشد. در روش توالی یابی تنوع هاپلوتایپی و نوکلئوتیدی به ترتیب 1433/1±6861/1 و 11133/1±11317/1، اختالف ژنتیکی P<0.001( 1/1361( و میانگین فاصله ژنتیکی 11333/1±11173/1 محاسبه گردید.

فصل سوم روش اجرای تحقیق

9-2- جمع آوری نمونه ها و داده ها در این مطالعه پس از انجام مطالعات اولیه، تعیین ایستگاه ها، صید 183 عدد مولد ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از سد شیل )کلهام( و تورهای سالیک، پره و دام )شکلهای 1-3، 1-1 و 1-1( از رودخانه های چالوس )11 نمونه(، سردآبرود )31 نمونه(، چشمه کیله )378 نمونه(، کرگانرود )47 نمونه( و آستارا )33 نمونه( در فصول پاییز و زمستان سال 3131 و ثبت داده های بیومتری، 5-1 گرم از بافت نرم و تازه انتهای باله توسط قیچی جدا )شکل 1-4( و پس از شستشو با آب مقطر و خشک نمودن با دستمال کاغذی در ° تیوبهای 5 میلی لیتری حاوی الکل اتانول 36 تثبیت )شکل Barber et al., 2000( )5-1( و برای انجام آزمایشها و مطالعات ژنتیکی به آزمایشگاه ژنتیک )شکل 1-6( پژوهشکده اکولوژی دریای خزر واقع در °c شهرستان ساری منتقل شدند و برای نگهداری طوالنی مدت در فریزر 11- قرار گرفتند. شکل 7-1 موقعیت ایستگاه های نمونه برداری ماهی آزاد در حوضه جنوبی دریای خزر تعیین شده با استفاده از GPS و جدول 1-3 تعداد و پراکنش نمونه های جمع آوری شده ماهی آزاد دریای خزر در ایستگاه های مختلف را نشان می دهند.

شکل 9-2- صید با استفاده از سد شیل )کلهام( شکل 9-1- صید با استفاده از تور سالیک

شکل 9-9- صید با استفاده از تور پره شکل 9-4- نمونه برداری از باله ماهی آزاد دریای خزر

° شکل 9-5- فیکس نمودن باله در الکل اتانول 36 شکل 9-6- آزمایشگاه ژنتیک پژوهشکده اکولوژی دریای خزر

شکل 9-7- موقعیت ایستگاه های نمونه برداری ماهی آزاد دریای خزر )چالوس، سردآبرود، چشمه کیله، شفارود و کرگانرود(

91 جدول 9-2- تعداد و پراکنش نمونه های جمع آوری شده ماهی آزاد دریای خزر استان )ناحیه( نام رودخانه )ایستگاه( تعداد نمونه موقعیت جغرافیایي طول جغرافیایي عرض جغرافیایي ° ° 3- چالوس 11 ׳11 53 ׳11 16

׳ ° ׳ ° مازندران 1- سردآبرود 31 11 53 43 16

׳ ° ׳ ° 1- چشمه کیله 378 51 51 45 16

° ° 4- کرگانرود 47 ׳54 48 ׳41 17

گیالن ׳ ° ׳ ° 5- آستارا 33 17 48 14 18

9-1- استخراج DNA ژنومي روشهای متعددی برای استخراج DNA کل وجود دارد که در این مطالعه از روش استات آمونیوم )McQuown et al., 2000( استفاده شد. مواد مورد استفاده: بافر Nacl 100 mµ, Tris- Hcl 10 mµ, EDTA 1 mµ pH: 8( STE( تهیه شده از شرکت سیناژن3، الکل اتانول 71% ساخت شرکت Merck، پروتئیناز u/ml( K 900( تهیه شده از شرکت سیناژن، محلول سدیم دودسیل سولفات1 31% تهیه شده از شرکت سیناژن، استات آمونیوم تهیه شده از شرکت سیناژن، سرسمپلر، دستکش یک بار مصرف، آب مقطر استریل، دستمال کاغذی، نمونه باله های جمع آوری شده از رودخانه های مختلف تجهیزات مورد استفاده: بن ماری )مدل BSL 22 ساخت شرکت مهندسی اختریان ایران(، شیکر پلیت )ساخت شرکت Instrumen(، شیکر لوله )مدل Vortex RS 502(، سانتریفیوژ )مدل Mikro 22R ساخت °c °c شرکت Hettich آلمان(، یخچال 4 )مدل 111KA00077 ساخت شرکت LG(، فریزر 11- )مدل GSD3601 FU ساخت شرکت Bosch آلمان(، نمونه بردار1 با توانایی 31-5/1 میکرولیتر )مدل Transferpette ساخت آلمان(، 11-1 میکرولیتر )مدل Eppendorf ساخت آلمان(، 311-31 )مدل Transferpette ساخت آلمان( و 3111-311 میکرولیتر )مدل Eppendorf ساخت آلمان(، قیچی، پنس، تیوب، رک

1- Cinnagene 2- SDS 3- Sampler

93 مراحل استخراج 3- 311-51 میلی گرم از بافت نرم باله با استفاده از قیچی جدا شد و پس از آنکه به وسیله کاغذ صافی کامالً خشک گردید به تیوب 5/3 میلی لیتری شماره گذاری شده استریل منتقل گردید. 1- بافت باله با استفاده از قیچی به صورت قطعات کوچک خرد گردید و 511 میکرولیتر بافر STE، 51 میکرولیتر 3SDS 10% و 1 میکرولیتر Proteinase K 900 u/ml برای هضم بافت مورد نظر به ویژه پروتئینها به داخل تیوبها تزریق گردید )شکل 8-1(. 1- محتویات هر یک از تیوبها به مدت یک دقیقه توسط دستگاه شیکر لوله مخلوط شدند و بعد از انتقال به داخل پلیت، به مدت 61 دقیقه بر روی دستگاه شیکر پلیت قرار گرفتند )شکلهای 1-3 و 31-1(. °c 4- فعالیت اپتیمم پروتئیناز K قلیایی در دمای 61 ـ55 می باشد بدین منظور تیوبها به مدت 61 دقیقه در °c بن ماری با دمای 55 قرار گرفتند تا بافت به طور کامل هضم شده و به صورت امولسیون غلیظ درآید. 5- میزان 361 میکرولیتر استات آمونیوم 5/7 درصد به محتویات داخل تیوبها اضافه و به مدت یک دقیقه توسط دستگاه شیکر لوله مخلوط شدند. سپس تیوبها به مدت 61 دقیقه بر روی دستگاه شیکر پلیت قرار گرفتند. 6- محتویات داخل تیوبها توسط دستگاه سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در دور rpm 31111 سانتریفیوژ شدند )شکل 33-1(. 7- 511 میکرولیتر از فاز باالیی تیوبها به آرامی توسط نمونه بردار جدا و به تیوبهای شماره گذاری شده جدید منتقل گردید. سپس 511 میکرولیتر ایزوپروپانول به محتویات داخل تیوبها اضافه شد و تیوبها به آرامی سر و ته شدند تا کالف سفید رنگ DNA ظاهر گردد )شکل 31-1(. 8- جهت رسوب دادن DNA در هر تیوب، از سانتریفیوژ با دور rpm 31111 به مدت 35 دقیقه استفاده شد. 3- فاز باالیی به آرامی در داخل ظرفی تخلیه شد و تیوبها به صورت وارونه بر روی کاغذ صافی یا دستمال کاغذی قرار گرفتند. سپس 311 میکرولیتر الکل اتانول 71% به رسوب DNA کف هر یک از تیوبها اضافه شد و به مدت 1 دقیقه در دور rpm 31111 سانتریفیوژ گردید. 31- فاز باالیی تخلیه گردید و برای تبخیر الکل از سطح رسوب DNA، تیوبها به مدت 61-11 دقیقه به صورت وارونه بر روی کاغذ صافی یا دستمال کاغذی در دمای محیط آزمایشگاه قرار گرفتند )از انکوباتور °c با دمای 17 نیز میتوان استفاده کرد(. پس از خشک شدن DNA، مقدار 311 میکرولیتر آب مقطر استریل و 1 میکرولیتر RNase به DNA موجود در کف هر یک از تیوبها اضافه شد و به مدت 11 دقیقه در بن ماری

1 - C12H15O4SNa

92 °c با دمای 17 قرار داده شدند تا رسوب DNA در آب مقطر استریل حل و قطعات RNA ناخواسته هضم گردند )شکل 31-1(. °c 33- در انتها تیوبها به مدت 14 ساعت به داخل یخچال با دمای 4 منتقل شدند تا DNA به طور کامل حل °c شود. سپس نمونه DNA های استخراج شده جهت نگهداری طوالنی مدت به فریزر با دمای 11- منتقل شدند.

شکل 9-8- اضافه نمودن مواد هضم کننده به بافتهای خرد و له شده شکل 9-3- دستگاه شیکر لوله

شکل 9-21- دستگاه شیکر پلیت شکل 9-22- دستگاه سانتریفیوژ

DNA DNA شکل 9-21- کالفهای سفید رنگ شکل 9-29- محلول در آب مقطر استریل

91 9-9- ارزیابي کمیت DNA های استخراج شده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری مواد مورد استفاده: DNA استخراج شده، آب مقطر استریل تجهیزات مورد استفاده: دستگاه اسپکتروفتومتر3 )مدل 22331 ساخت شرکت Eppendorf آلمان(، کووت، شیکر لوله )مدل Vortex RS 502 ساخت شرکت مهندسی اختریان( روش ارزیابي: برای تعیین کمیت دقیق DNA نمونه ها از دستگاه اسپکتروفتومتر )شکل 1-34( در طول موج های 161 و 181 نانومتر استفاده شد زیرا بیشترین جذب DNA در طول موج 181-161 نانومتر می باشد. برای این منظور 11 میکرولیتر از DNA ژنومی به وسیله آب مقطر استریل به حجم 111 میکرولیتر رسانده شد. باید توجه داشت محلول شاهد1 که برای کالیبره کردن دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده می شود، بایستی حتماً با محلولی که جهت رقیق سازی DNA استفاده می گردد یکسان باشد. پس از کالیبره کردن دستگاه و شیکر کردن نمونه ها در دور پایین، دو میکرولیتر از DNA ژنومی روی سل پایین ریخته و میزان جذب نوری1 نمونه DNA رقیق شده در طول موج های 161 و 181 نانومتر اندازه گیری و ثبت شد )در طول موج 161 نانومتر، DNA و در طول موج 181 نانومتر، پروتئینها بیشترین جذب را دارند(. برای ادامه کار دوباره سل باال و پایین را با آب مقطر پاک کرده و این کار برای اجتناب از خطا 5-1 بار تکرار گردید. میانگین اعداد به دست آمده به عنوان غلظت DNA استخراج شده محاسبه و نسبت جذب در 161 به 181 نانومتر )A260/A280( محاسبه گردید. نسبت مذکور فاکتور رقت نامیده می شود، در صورتی که نسبت جذب A1/A2= 3/8 باشد، جذب عمدتاً توسط اسید نوکلئیک صورت گرفته و کیفیت DNA مناسب می RNA DNA A1/A2> باشد و اگر 8/3 باشد، نشان دهنده آلودگی با است و اگر نسبت جذب 3/8 >A1/A2 باشد نشان دهنده آلودگی با پروتئین و یا دیگر ناخالصی ها است. از آنجایی که برای انجام آزمایشهایی از قبیل PCR نیاز به غلظت دقیق DNA می باشد برای به دست آوردن آن از رابطه زیر استفاده شد: [DNA]ng/ml= 50 × D × A260 D= نسبت رقیق سازی 61 =111/11 A= میزان جذب نوری در طول موج 161 نانومتر

1- Spectrophotometer 2- Blank 3- Optical density

شکل 9-24- دستگاه اسپکتروفتومتر 9-4- ارزیابي کیفیت DNA های استخراج شده با استفاده از روش الکتروفورز ژل آگارز %2 مواد مورد استفاده: بافر 3TBE 1X تهیه شده از شرکت سیناژن، آگارز، بافر سنگین کننده1، اتیدیوم بروماید 3% تهیه شده از شرکت سیناژن، آب مقطر استریل، سرسمپلر1، چسب نواری تجهیزات مورد استفاده: نمونه بردار با توانایی 31-5/1 میکرولیتر )مدل Transferpette ساخت آلمان(، سینی ژل و شانه های آن، ترازوی دیجیتال با دقت 13/1 گرم )مدل GM 312 ساخت شرکت Sartorius(، الکتروفورز افقی و منبع تأمین کننده جریان الکتریسیته )مدل EPS 7601 ساخت شرکت مهندسی پزشکی پایا پژوهش(، دستگاه مستندساز ژل4 یا UV ترانس ایلیومیناتور )مدل Doc- 008XD ساخت شرکت UVI tec انگلیس و مدل Doc- Print- 1000/26MX، ساخت شرکت Vilber Lourmat فرانسه( همراه با برنامه های نرم افزاری UVI- DocMw Ver. 99.04 و Photo- Capt Ver. 15.0 روش ارزیابي 3- تانک الکتروفورز ژل پس از تمیز و خشک شدن در سطح افقی میز کار قرار داده شد. 1- سینی مخصوص ژل در محلی مسطح قرار داده شد و شانه ژل )35 تایی( به طوری که تا یک میلی متر با کف سینی ژل فاصه داشته باشد بر روی دو لبه انتهایی سینی قرار گرفت و بین دو لبه سینی با استفاده از چسب نواری بسته شد. 1- برای تهیه ژل آگارز 3%، مقدار31/1 گرم آگارز با استفاده از ترازوی دیجیتال )شکل 1-35( توزین و در ارلن ریخته شد و 33 میلی لیتر بافر TBE 1X به آن اضافه گردید که یک میلی لیتر آن برای تبخیر در نظر گرفته شد )حجم محلول TBE 1X به حجم پلیتی که ژل در آن ریخته می شود بستگی دارد.(.

1- Tris Boric acid EDTA 2- Loading buffer 3- Treff 4- Gell Documentation

95 4- سوسپانسیون حاصله روی شعله حرارت داده شد تا آگارز در آن حل و شفاف شود. سپس ارلن با محتویات درون آن به مدت چند دقیقه در دمای محیط آزمایشگاه قرار گرفت تا با آن هم دما شود. 5- آگارز مذاب در سینی ژل ریخته شد تا منعقد گردد. 6- پس از بستن ژل، حائلهای دو طرف سینی باز و ژل به آرامی داخل تانک الکتروفورز قرار داده شد و پس از مدتی شانه ی ژل به آرامی از ژل خارج گردید. 7- مقدار 7-6 میکرولیتر از DNA ژنومی همراه با 1 میکرولیتر بافر سنگین کننده کامالً مخلوط و با استفاده از نمونه بردار با دقت به داخل هر یک از چاهکهای مستطیلی شکل ژل تزریق گردید )شکل 36-1(. 8- تانک الکتروفورز به منبع جریان برق متصل و دستگاه مولد برق بر روی 31 ولت و 45 میلی آمپر تنظیم گردید )DNA به دلیل دارا بودن گروه های فسفات در ساختمان خود دارای بار منفی است بنابراین در دستگاه الکتروفورز به سمت قطب مثبت حرکت می کند و متناسب با وزن مولکولی در قسمتهای مختلف ژل قرار می گیرد( )شکل 37-1(. 3- پس از اتمام الکتروفورز و رسیدن بافر سنگین کننده به انتهای ژل، ژل مورد نظر برای مدت 5 دقیقه در ظرف محتوی محلول اتیدیوم بروماید و بعد از آن به مدت یک دقیقه در داخل ظرف محتوی رنگ بر )آب مقطر( قرار داده شد تا قسمتهایی از ژل که به طور غیر اختصاصی رنگ گرفته اند رنگ زدایی شوند. الزم به ذکر است که محلول اتیدیوم بروماید جزء مواد بسیار سمی می باشد و از طریق پوست، چشم و دستگاه تنفسی به راحتی قابل نفوذ بوده و اثر جهش زایی و سرطان زایی باالیی دارد لذا هنگام کار با این ماده می- بایست از دستکش، عینک محافظ و ماسک استفاده شود. 31- در انتها ژل مورد نظر توسط کاردک بر روی دستگاه مستندساز ژل با طول موج 131-154 نانومتر قرار داده شد )شکل 1-38( و قطعات DNA به صورت باندهایی بر روی ژل مشاهده شدند. سپس تصویر ژل فریز و ذخیره گردید. بدین ترتیب کیفیت DNA از لحاظ خلوص، آلودگی پروتئینی، آلودگی به RNA، شکستگی DNA و تا حدودی کمیت DNA مورد ارزیابی قرار گرفت )قطعات سنگین و با وزن باالی DNA نشان از صحت استخراج دارند در حالی که DNA های خرد شده، به صورت اسمیر3 روی ژل مشاهده می شوند.( )Tsoi et al., 2005(.

1- Smear

شکل 9-25- ترازوی دیجیتال شکل 9-26- تزریق به داخل چاهکهای مستطیلی شکل ژل

شکل 9-27- حرکت DNA تزریق شده به طرف قطب مثبت شکل 9-28- دستگاه مستندساز ژل 9-5- طراحي و آماده سازی آغازگرها پس از بررسی مطالعات انجام شده بر روی تنوع ژنتیکی گونه های مختلف آزاد ماهیان با استفاده از روشهای ریز ماهواره و توالی یابی و جستجو در پایگاه مرکز ملی داده های بیوتکنولوژی3 و مشاهده الگوی باند دهی آنها، تعداد 36 جفت آغازگر ریز ماهواره با مشخصات جدول 1-1 و یک جفت آغازگر توالی یابی )Atabeyoglu, 2007( با مشخصات جدول 1-1 انتخاب و نسبت به سفارش و خرید آنها اقدام گردید. آغازگرهای مورد استفاده در این روشها بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده، توسط آب مقطر استریل از حالت لیوفیلیزه به حالت محلول درآورده شدند. رقیق سازی آنها به نسبت 11 میکرولیتر آغازگر و 71 میکرولیتر آب مقطر استریل به صورت جداگانه در میکروتیوبهای 5/1 میلی لیتری انجام شد و جهت استفاده °c در واکنش زنجیره ای پلیمراز در فریزر با دمای 11- قرار داده شدند. از آنجایی که داشتن توالی DNA مربوط به یک منطقه خاص از ژنوم یک گونه این اجازه را میدهد تا همین منطقه خاص از ژنوم مربوط به گونههای بسیار نزدیک یا جمعیتهای مشابه از یک گونه با همان یک جفت پرایمر تکثیر گردد لذا برای تمامی رودخانه های مورد مطالعه در روشهای ریز ماهواره و توالی یابی از همین آغازگرها استفاده شد.

1- National Center for Biotechnology Information= NCBI

97 جدول 9-1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در روش ریز ماهواره

(

°c

آللي )

)

منبع

موتیف

جایگاه

توالي

تکرار

محدوده

)

بانك در ژن

کد دستیابي

دمای اتصال

Otsg3 F: 5′-GGACAGGAGCGTCTGCTAAATGACTG-3′ (GAAT)8- 52 146- AF393184 Ohno, 1970 R: 5′-GGATGGATTGATGAATGGGTGGG-3′ AGATTAATA 246 -GATA)11- GATTAATAG AGA– ( GATA)26 Otsg13 F: 5′-GGTTCCTCTCACATAGAA-3′ (GATA) 52 292- AF393185 Ohno, 1970 R: 5′-GCCTAGTTAAATAAAGGTAAA-3′ ( TAGA)20 436 (TGGATAGA) 4-(TGGA)2 (TAGA)10 Otsg68 F: 5′-TATGAACTGCAGCTTGTTATGTTAGT-3′ (GATA)30 52 184- AF393187 Ohno, 1970 R: 5′-CATGTCGGCTGCTCAATGTA-3′ (TAGA)1 296 Otsg83 F: 5′-GGACAGGAGCGTCTGCTAAATGACTG-3′ 59 R: 5′-GGATGGATTGATGAATGGGTGGG-3′ Otsg100 F: 5′-TGAACATGAGCTGTGTGAG-3′ 62 Nelson and R: 5′-ACGGACGTGCCAGTGAG-3′ Beacham, 1999 Otsg103 F: 5′-AGGCTCTGGGCTCGTG-3′ 62 Beacham R: 5′-TGATATGGTGTGATAGCTGG-3′ and Dempson, 1998 Otsg107 F: 5′-ACAGACCAGACCTCAACA-3′ R: 5′-ATAGAGACCTGAATCGGTA-3′ Otsg108 F: 5′-TCTGTTTATCTTTCTATTA-3′ 62 Nelson and R: 5′-AAGGAGAGACAGAGGG-3′ Beacham, 1999 Otsg249 F: 5′-TCTCAGAGGGTAAAATCTCAGTAAG-3′ (TAGA)19 52 192- AF393192 Ohno, 1970 R: 5′-GTACAACCCCTCTCACCTACCC-3′ 310 Otsg409 F: 5′-GATGCCATTTGTGTCACCATCATT-3′ (GA)9 52 116- AF393196 Ohno, 1970 R: 5′-CATTCTCCTGCCTCACAGAGTTTA-3′ (TAGA)6- 282 GGTA- ( GATA)16 Otsg432 F: 5′-TGAAAAGTAGGGGAAACACATACG-3′ (GATA)3 52 122- AF393199 Ohno, 1970 R: 5′-TAAAGCCCATTGAATTGAATAGAA-3′ -GGAT- 202 ( GATA)8 Otsg474 F: 5′-TTAGCTTTGGACATTTTATCACAC-3′ (GATA)6 52 155- AF393200 Ohno, 1970 R: 5′-CCAGAGCAGGGACCAGAAC-3′ 191 Strutta12 F: 5′-AATCTCAAATCGATCAGAAG-3′ (GT)43 55 124- U60220 Poteaux R: 5′-AGCTATTTCAGACATCACC-3′ 206 et al., 1999 Strutta58 F: 5′-AACAATGACTTTCTCTGAC-3′ (GT)40 55 101- U60223 Poteaux R: 5′-AAGGACTTGAAGGACGAC-3′ 177 et al., 1999 Ssa171 F: 5′-TTATTATCCAAAGGGGTCAAAA-3′ GTGA(+GTP) 58 143- U43693 O’Reilly R: 5′-GAGGTCGCTGGGGTTTACTAT-3′ 217 et al., 1996 OmyFgt1 F: 5′-AGATTTACCCAGCCAGGTAG-3′ GT 59 187- BX9272291 TUF R: 5′-CATAGTCTGAACAGGGACAG-3′ 263

جدول 9-9- مشخصات آغازگر مورد استفاده در روش توالی یابی )Atabeyoglu, 2007( توالي آغازگر جایگاه D-Loop F1 F: 5'− TGGCATTTGGTTCCTACTTCAGG −3' 12S1-H R: 5'− TGCGGAGACTTGCATGTGTAAGT −3'

98 9-6- بهینه سازی واکنش زنجیره ای پلیمراز2 و پروفایل حرارتي آن برای بهینه سازی واکنش زنجره ای پلیمراز ابتدا PCR استاندارد انجام شد )جدول 1-4( و سپس با توجه به محصوالت PCR اقدام به تغییر شرایط گردید )Sambrook and Russel, 2006(. در مرحله اول با دادن دامنه حرارتی 65-55 درجه سانتیگراد بهترین دمای اتصال هر کدام از آغازگرهای ریز ماهواره و با دادن دامنه حرارتی 55-45 درجه سانتیگراد بهترین دمای اتصال آغازگر توالی یابی به رشته الگو به دست آمد و در مرحله بعد جهت تظاهر خوب باندها و حذف شکستگی )اسمیر(، غلظت DNA ،MgCl2 ژنومی، °c آغازگرها و dNTPs بهینه سازی گردید. پس از اتمام کار، نمونه ها به داخل یخچال با دمای 4 منتقل شدند تا برای انجام آزمایشهای بعدی که شامل انتقال بر روی ژلهای آگارز 1 و 5/3 درصد برای سنجش کیفیت محصول PCR روشهای ریز ماهواره و توالی یابی است در دسترس باشند. جدول 9-4- برنامه های داده شده به دستگاه ترمال سایکلر برای بهینه سازی PCR دما )درجه سانتیگراد( دما )درجه سانتیگراد( مراحل زمان )ثانیه( تعداد چرخه در روش ریز ماهواره در روش توالي یابي

واسرشته سازی اولیه 34 34 381 3

واسرشته سازی 34 34 11 الحاق )55-65( )45-55( 11 11-15 بسط 71 71 11 بسط نهایي 71 71 111 3

9-7- انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز و تکثیر قطعه ژن هدف جهت تکثیر قطعه ژن هدف از واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده شد )Lavery et al., 2004(. مواد مورد استفاده: آنزیم تک DNA پلیمراز1 تهیه شده از شرکت سیناژن، MgCl2 با غلظت 51 میلی موالر تهیه شده از شرکت سیناژن، بافر (PCR (10X تهیه شده از شرکت سیناژن، dNTPs )حاوی 31 میلی موالر از هر یک از نوکلئوتیدهای خالص )dTTP ،dATP ،dCTP و dGTP با pH= 7/5( تهیه شده از شرکت سیناژن، آغازگرهای ریز ماهواره و توالی یابی تهیه شده از شرکتهای تکاپوزیست و فرآیند دانش، سرسمپلر، آب مقطر استریل، DNA ژنومی استخراج شده، تیوبهای 1/1 و 5/1 میلی لیتری استریل، رک، دستمال کاغذی، دستکش یک بار مصرف

1- Polymerase Chain Reaction= PCR 2- Taq DNA Polymerase

99 تجهیزات مورد استفاده: نمونه بردارها با توانایی 31-5/1 میکرولیتر )مدل Transferpette ساخت آلمان(، 11-1 میکرولیتر )مدل Eppendorf ساخت آلمان(، 311-31 میکرولیتر )مدل Transferpette ساخت آلمان( و 3111-311 میکرولیتر )مدل Eppendorf ساخت آلمان(، ترمال سایکلر )مدل Auto- Qselver شرکت )Quanta biotech روش کار 3- برای هر نمونه DNA یک میکروتیوب 1/1 میلی لیتری استریل انتخاب و شماره نمونه روی آن ثبت گردید، سپس ترکیبات جدول 1-5 با مقادیر مشخص شده به تفکیک روشهای ریز ماهواره و توالی یابی بر روی یخ به میکروتیوبها افزوده شد. جدول 9-5- نوع و مقدار مواد استفاده شده در واکنش زنجیره ای پلیمراز مقدار برای واکنش 51 میکرولیتری مقدار برای واکنش 15 میکرولیتری غلظت مواد ماده DNA 5-10 ng 1/4 1/8 Taq DNA Polymerase 1 u 1/15 1/5 dNTPs 0.1 mM 1/15 1/5 MgCl 1.5 mM 2 1/75 3/5 PCR Buffer 1 X 1/5 5 Forward Primer 1.2 nM 3 1 Reverse Primer 1.2 nM 3 1 5/17 75/38 * آب مقطر * مواد فوق به وسیله ی آب مقطر دو بار تقطیر3 به حجم نهایی رسانده شد. 1- محتویات میکروتیوبها توسط نمونه بردار به خوبی مخلوط و به مدت 31 ثانیه سانتریفیوژ شدند. 1- سپس میکروتیوبها در داخل دستگاه ترمال سایکلر قرار گرفتند )شکل 1-33( و برنامه دستگاه پس از به دست آمدن غلظت بهینه مواد و بهترین دمای اتصال1 به نحوی تنظیم گردید تا حداقل باند اضافی را دارا بوده و باند اصلی دارای وضوح کامل باشد )جدول 6-1(.

1- DDW 2- Annealing temperature

311 جدول 9-6- برنامه PCR مورد استفاده در روشهای ریز ماهواره و توالی یابی مراحل دما )درجه سانتیگراد( دما )درجه سانتیگراد( زمان )ثانیه( زمان )ثانیه( تعداد چرخه در روش ریز ماهواره در روش توالي یابي در روش ریز ماهواره در روش توالي یابي واسرشته سازی اولیه 34 35 381 ثانیه 381 ثانیه 3 واسرشته سازی 34 34 11 ثانیه 11 ثانیه 11 الحاق 61-51 48 45 ثانیه 45 ثانیه 11 بسط 71 71 11 ثانیه 45 ثانیه 11 بسط نهایي 71 71 381 ثانیه 381 ثانیه 3

4- برای اطمینان از درستی انجام PCR و نداشتن آلودگی، یک میکروتیوب به عنوان کنترل منفی در دستگاه قرار داده شد که محتویات آن شامل مخلوط مواد الزم برای PCR به غیر از DNA الگو بود. البته الزم به ذکر است هرگاه در شرایط استاندارد PCR نتیجهای مشاهده نشود مقدار MgCl2 و تعداد چرخه ها تغییر مییابد .)Sambrook and Russel, 2006( °c 5- پس از اتمام کار، محصوالت PCR هر دو روش به فریزر 11- منتقل شدند.

شکل 9-23- دستگاه ترمال سایکلر 9-8- ارزیابي کیفي محصوالت PCR روشهای ریز ماهواره و توالي یابي جهت کنترل کیفیت محصوالت PCR روشهای ریز ماهواره و توالی یابی به ترتیب از الکتروفورز افقی ژل آگارز 1 و 5/3 درصد استفاده گردید )Sambrook and Russell, 2006( و برای این منظور 7-6 میکرولیتر از محصول PCR با 1 میکرولیتر بافر سنگین کننده کامالً مخلوط و با استفاده از نمونه بردار با دقت به داخل هر یک از چاهکهای مستطیلی شکل ژل تزریق گردید و در چاهک پایانی نیز از نشانگر DNA Ladder 50 bp به عنوان شاخص برای تعیین اندازه قطعات حاصل استفاده شد. تانک الکتروفورز به منبع جریان برق متصل و دستگاه مولد برق بر روی 31 ولت و 45 میلی آمپر تنظیم گردید. پس از اتمام الکتروفورز و رسیدن بافر سنگین کننده به انتهای ژل، ژل مورد نظر به مدت 5 دقیقه در ظرف محتوی محلول اتیدیوم بروماید و

313 بعد از آن به مدت یک دقیقه در داخل ظرف محتوی آب مقطر قرار داده شد تا قسمتهایی از ژل که به طور غیراختصاصی رنگ گرفته اند رنگ زدایی شوند. در انتها ژل مورد نظر توسط کاردک بر روی دستگاه مستندساز ژل با طول موج 131-154 نانومتر قرار داده شد و قطعات DNA به صورت باندهایی بر روی ژل مشاهده شدند سپس تصویر ژل فریز و با فرمت Tiff ثبت و ذخیره گردید. بدین ترتیب کیفیت DNA از لحاظ خلوص، آلودگی پروتئینی و شکستگی و تا حدودی کمیت DNA مورد ارزیابی قرار گرفت. حال می- توان از مطلوب بودن واکنش PCR و عدم تشکیل باندهای غیر اختصاصی مطمئن شد در غیر این صورت واکنش باید مجدداً بهینه و تکرار گردد. در روش توالی یابی در صورت نیاز همچنین می توان از روشهای تخلیص محصوالت PCR استفاده کرد که در مطالعه حاضر نمونه های ارسالی به خارج از کشور بعد از خالص سازی توالی یابی شدند. 9-3- الکتروفورز عمودی محصوالت PCR روش ریز ماهواره از آنجایی که حساسیت ژل پلی اکریل آمید 111-111 برابر ژل آگارز است پس از ارزیابی کیفی محصوالت PCR روش ریز ماهواره با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 1% اندازه قطعات حاصل از طریق مقایسه با نشانگر DNA Ladder 50 bp بر روی ژل پلیآکریلآمید 6% و روش رنگ آمیزی نیترات نقره به دست آمد .)Sambrook and Russel, 2006( مواد مورد نیاز: آب مقطر استریل، اسید نیتریک تهیه شده از شرکت سیناژن، نیترات نقره تهیه شده از شرکت سیناژن، سود، کربنات سدیم )NaBH4(، فرمالدئید ساخت شرکت Merck، ورق پالستیکی، DNAژنومی تکثیر شده، اکریل آمید 11% تهیه شده از شرکت سیناژن ، TBE 10X ،TBE 1X، آمونیوم پرسولفات3 31% تهیه شده از شرکت سیناژن، تترا متیل اتیلن دی آمید1 ساخت شرکت Merck، بافر سنگین کننده، نشانگر DNA Ladder 50 bp ساخت شرکت MBI Fermentase، سرسمپلر، دستکش یک بار مصرف تجهیزات مورد نیاز: بشر، سمپلر با توانایی 31-5/1 )مدل Transferpette ساخت آلمان(، شانه ژل، همزن مغناطیسی )مدل HS 4000 ساخت شرکت Delta(، ترازوی دیجیتال )مدل GM 312 ساخت شرکت Sartorius(، الکتروفورز عمودی )مدل VSTS 1002 ساخت شرکت مهندسی اختریان(، دستگاه مستندساز ژل )مدل Doc- Print- 1000/26MX ساخت شرکت Vilber Lourmat فرانسه(

1- Ammonium Per Sulfate = APS 2- TEMED

312 روش کار 3- شیشه های الکتروفورز عمودی شسته و تمیز گردید. برای ایجاد فضا در بین صفحات شیشه ای از Spacer استفاده و با استفاده از گیره محکم شد. جهت بستن درزهای پایین و طرفین شیشه ها نیز از آگار داغ استفاده شد )شکل 11-1(. 1- سپس 313 میلی لیتر آب مقطر، 18 میلی لیتر اکریل آمید 11%، 31 میلی لیتر TBE 10X، 3344 میکرولیتر آمونیوم پر سولفات، 348 میکرولیتر تترا متیل اتیلن دی آمید در یک بشر ترکیب و بعد از هم زدن در فضای بین دو شیشه که از طرفین و قسمت پایین مسدود بود ریخته شد و شانه ژل بالفاصله در محل خود قرار گرفت به طوری که حبابی در چاهکها ایجاد نشود )شکل 13-1(. 1- مدت زمان الزم برای پلیمریزه شدن ژل پلی اکریل آمید حدود 11 دقیقه می باشد. بعد از این مدت شانه به آرامی از قسمت باالیی ژل خارج گردید و چاهکها با استفاده از بافر TBE 1X )بافر الکترود( شستشو داده شد تا باقیمانده اکریل آمید از فضای بین چاهکها خارج شود. 4- در این مرحله مقدار دو میکرولیتر بافر سنگین کننده به میکروتیوبهای واجد DNA تکثیر شده اضافه و به مدت چند ثانیه سمپلر گردید. سپس مقدار 5 میکرولیتر از محتویات هر میکروتیوب به ترتیب در چاهکهای ایجاد شده بر روی ژل پلی اکریل آمید 6% غیر دناتوره ریخته شد. 5- در چاهک پایانی ژل از نشانگر DNA Ladder 50 bp به عنوان شاخص برای تعیین اندازه آللی استفاده شد )شکل 1-11(. از آنجایی که وجود یا عدم وجود جهش در محلهای ویژه جایگاه های ریز ماهواره ای، سبب ایجاد قطعات DNA با وزن مولکولی متفاوت از محصول PCR می شود و تفاوت بین باندهای DNA و اختالف در وزن مولکولی نیز منجر به تولید ژنوتیپهای مختلف می گردد در این تحقیق از نشانگر مذکور جهت تخمین وزن مولکولی باندهای PCR و شناسایی ژنوتیپها استفاده شد. این نشانگرها چیزی نیستند جز ژنوم باکتریهای خاص که توسط آنزیم های مختلف به قطعات متعدد با وزن مولکولی مشخص برش داده شده اند. 6- ژل در ستون عمودی بین دو مخزن بافر TBE 1X دستگاه الکتروفورز عمودی قرار گرفت به طوری که تنها راه ارتباط بین این دو بافر از طریق ژل بود و دستگاه خنک کننده که مخزن آن با آب مقطر و یخ پر شده بود فعال شد. سپس با روشن نمودن دستگاه و تنظیم مولد برق آن بر روی مد 51 میلی آمپر و ولتاژ 181 ولت، قطب مثبت به مخزن باال و قطب منفی به مخزن پایین وصل شد که این امر باعث برقراری جریان از سمت مخزن باال به سمت مخزن پایین و حرکت نمونه های لود شده در چاهکها در این مسیر شد. الکتروفوز نمونهها در مدت حدود 4-1 ساعت انجام پذیرفت و قطعات DNA تکثیر شده بر اساس وزن مولکولی خود در طول ژل از هم تفکیک گردیدند )Pourkazemi, 1996(.

311 7- سپس ژل الکتروفورز شده با استفاده از آب مقطر از فضای بین دو شیشه به داخل سینی رنگ آمیزی منتقل و جهت نمایان شدن باندهای DNA با استفاده از روش نیترات نقره )Bassam et al., 1991( رنگ آمیزی گردید و برای اطمینان از تکرارپذیری نوارها آزمایش 4-1 بار در شرایط یکسان تکرار گردید.

شکل 9-11- مسدود ساختن درزهای شیشه ها شکل 9-12- چاهکهای ایجاد شده در ژل پلی اکریل آمید

شکل 9-11- نشانگر http://www.thermoscientificbio.com( DNA Ladder 50 bp( 9-21- رنگ آمیزی ژل پلي اکریل آمید 6% با استفاده از روش نیترات نقره جهت رنگ آمیزی ژل پلی اکریل آمید سه نوع محلول به صورت زیر تهیه و مورد استفاده قرار گرفت: 3- محلول ثبوت اولیه )A(: الکل اتانول )5%( + اسید نیتریک )3%( + نیترات نقره3 )3/1 درصد( + آب مقطر استریل

1 - AgNO3

314 الکل اتانول: 51 میلی لیتر اسید نیتریک: 31 میلی لیتر نیترات نقره: یک گرم آب مقطر استریل: 341 میلی لیتر 1- محلول ظهور )B(*: سود3 )1/3 درصد(، کربنات سدیم1 )65/1 درصد( + فرمالدئید )4/1 درصد( + آب مقطر استریل سود: 31 گرم کربنات سدیم: 5/6 گرم فرمالدئید: 4 میلی لیتر آب مقطر استریل: 336 میلی لیتر * الزم به ذکر است که جهت تهیه محلول شماره 1 ابتدا هیدروکسید سدیم در آب مقطر استریل حل و سپس مواد دیگر بر روی آنها ریخته شد. 1- محلول ثبوت نهایی )C(: الکل اتانل )5%( + اسید نیتریک )3%( + آب مقطر استریل الکل اتانول: 51 میلی لیتر اسید نیتریک: 31 میلی لیتر آب مقطر استریل: 341 میلی لیتر روش رنگ آمیزی 3- پس از اتمام الکتروفورز عمودی ژل دو بار و در هر بار به مدت 1 دقیقه در داخل سینی محتوی محلول ثبوت اولیه )A( بر روی شیکر قرار گرفت )شکل 1-11( و پس از آن به مدت 31 ثانیه با استفاده از آب مقطر استریل شستشو داده شد. 1- در این مرحله ژل رنگ آمیزی شده تا مرحله ظهور باندها در داخل سینی محتوی محلول ظهور )B( بر روی شیکر قرار گرفت )شکل 1-14( و در پایان این مدت دو بار و هر بار به مدت یک دقیقه با استفاده از آب مقطر استریل شستشو داده شد. 1- سپس ژل برای مدت 1-1 دقیقه یا تا زمانی که باندها به صورت نوارهای تیره رنگی دیده شوند در محلول ثبوت نهایی )C( قرار گرفت تا رنگ ژل ثابت شود و بعد از آن ژل رنگ آمیزی شده با استفاده از ورق پالستیکی مخصوص بسته بندی و پرس گردید.

1- NaOH 2 - NaBH4

315 4- تصویر ژل مورد نظر توسط دستگاه مستند ساز ژل )مدل Doc- Print- 1000/26MX ساخت شرکت Vilber Lourmat فرانسه( ثبت و ذخیره گردید.

شکل 9-19- ژل پلی اکریل آمید غوطه ور در محلول ثبوت اولیه شکل 9-14- ژل پلی اکریل آمید غوطه ور در محلول ظهور 9-22- سنجش وزن مولکولي محصوالت PCR روش ریز ماهواره و امتیازدهي باندها پس از ثبت و ذخیره شدن تصاویر ژل پلی اکریل آمید توسط دستگاه مستندساز ژل، وزن مولکولی باندهای محصول PCR، محاسبه تعداد و اندازه آللها و تعیین انواع آنها و نیز تعیین ژنوتیپها با استفاده از نرم افزار Photo- Capt Ver. 15.0 انجام پذیرفت و در هر ژنوتیپ وجود یک باند به منزله هموزایگوستی و مشاهده دو باند، به منزله هتروزایگوسیتی منظور گردید. mtDNA D- Loop PCR 9-21- توالي یابي محصوالت ژن ناحیه مولکول پس از انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز و ارزیابی محصوالت PCR روش توالی یابی با استفاده از ژل آگارز 5/3 درصد، DNA های خالص مربوط به هر نمونه )با کیفیت باال که فقط دارای باند اختصاصی باشد( با باندهای قوی و بدون آلودگی با حجم 41 میکرولیتر و غلظت 11 نانومول به درون میکروتیوبهای 5/3 میلی لیتری جداگانه که شماره نمونه ها بر روی در و بدنه آنها نوشته شده بود منتقل گردیدند و در آنها با استفاده از پارافیلم بسته شد. یکی از آغازگرها )D- Loop( نیز با حجم 31 میکرولیتر و غلظت 31 پیکومول به ازای هر خوانش به میکروتیوب 5/3 میلی لیتری دیگری منتقل، در آن با پارافیلم بسته و به همراه جدول مشخصات نمونه ها )نام آغازگر، روش تخلیص DNA، حجم DNA، غلظت DNA، اندازه آغازگر، نوع واکنش و نام نمونه( برای توالی یابی نمونه های DNA ماهی آزاد دریای خزر توسط شرکت تکاپوزیست به شرکت Bioneer کشور کره جنوبی ارسال شدند. توالی یابی با استفاده از روش خاتمه یابی زنجیره )سانجرکولسان( )Pherson et al., 2000( و توسط دستگاه DNA Sequence Analyzer انجام گردید )شکلهای 1-15 و 1-16(. داده های به دست آمده از توالی یابی قطعه 751-511 جفت باز ژن D- Loop با استفاده از بسته های نرم افزاری مطالعات ژنتیکی آنالیز شدند.

316

شکل 9-15- روش Helmut, 2003( Sanger Coulson( شکل 9-16- دستگاه http://research.amnh.org( DNA Sequence Analyzer( 9-29- پردازش داده ها Excel در روش ریز ماهواره برای ورود داده ها و ردیف کردن باندها از نرم افزار ، جهت امتیازدهی باندهای DNA، محاسبه تعداد باندها، تعداد جایگاههای پلی مورف و درصد آنها، الگوی باندی تشکیل شده برای گونه مورد مطالعه، تعداد آلل واقعی و آلل مؤثر3 برای هر جایگاه، تعداد آللهای اختصاصی، فراوانی آللی، هتروزایگوسیتی مشاهده شده1 و هتروزایگوسیتی مورد انتظار1 و شاخص شانون )I( از نرم افزار Pop Gene4 Yeh et al., 1999( Ver. 1.31( و برای محاسبه مقادیر FST )تمایز ژنتیکی زیر جمعیتهای درون جمعیت کل بر طبق مدل آللی بی نهایت5( و RST )تمایز زیر جمعیتها بر اساس مدل جهش پله ای6( جمعیتهای مورد مطالعه بر اساس آنالیز واریانس مولکولی7، ماتریس شباهت ژنتیکی8 و فاصله ژنتیکی3 بر اساس ) ,Nei 2 1978 ,1972(، جریان ژنی )NM( و تعادل هاردی- واینبرگ بر اساس آزمون χ از نرم افزار GeneAlex Peakall and Smouse, 2005( Ver. 6.41( استفاده شد. در روش توالی یابی، جهت تصحیح توالیهای زیستی از برنامه Thompson et al., 1997( Clustal- X( نرم افزار Hall, 1999( Bio- Edit Ver. 7.1.3.0(، جهت محاسبه هاپلوتایپها و جایگاههای پلی مورفیسم، تنوع هاپلوتایپی )h( و تنوع نوکلئوتیدی )π( درون نواحی بر اساس معیار Nei, 1987، گوناگونی و فراوانی هاپلوتایپی میان جمعیتها، فاصله ژنتیکی، جریان ژنی )NM( و واگرایی بین رودخانه ها، نوترکیبی، تعیین درجه خویشاوندی بر اساس آزمون Tajima, 1993( Tajima’s D- Test( و تبدیل داده ها به فرمت Mega

1- Effective allell 2- Observed heterozygosity 3- Expected heterozygosity 4- Population Genetic Analysis 5- IAM 6- SMM 7- Analysis of Molecular Variance= AMOVA 8- Genetic similarity 9- Genetic identity

317 از نرم افزار Excoffier et al., 2005( Arlequin Ver. 3.5.1.2(، برای انجام محاسبات اندازه گیری تنوع توالیهای DNA درون و بین جمعیتها از نرم افزار Rozas et al., 2003( DNA SP3 Ver. 5.10.01(، جهت محاسبه فاصله ژنتیکی بین نمونه ها با استفاده از آنالیز Kimura, 1973( Kimura 2-parameter(، برای محاسبه میانگین اختالف جفت نوکلئوتیدی داخل و بین نمونه های رودخانه های مورد مطالعه ) Tamura et al., 2007( و برای رسم درخت فیلوژنی به روشهای Maximum Parsimony و Neighbor Joining 2 )Yeh et al., 1999( از نرم افزار Tamura et al., 2007( Mega Ver. 4.0( استفاده شد.

1- DNA Sequence polymorphism 2- Molecular Evolutionary Genetics Analysis

318

فصل چهارم تجزیه و تحلیل داده ها

319

4-2- ارزیابي کیفیت DNA های استخراج شده کیفیت DNA استخراجی از نظر وضوح باندها، شدت بانددهی، شکستگی و یا عدم شکستگی DNA، وجود آلودگیهای پروتئینی و یا RNA توسط الکتروفورز افقی ژل آگارز 2% و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید بررسی شد و مشاهده شفافیت، قوت و شدت باندهای تولید شده نشان داد که DNA های استخراج شده از کیفیت و کمیت مناسبی برای استفاده در آزمایشهای PCR برخوردار بوده و فاقد آلودگی پروتئینی، آلودگی به RNA و شکستگی می باشند. کیفیت باندهایی که توسط دستگاه مستندساز ژل با برنامه نرم افزاری UVI- DocMw Ver. 99.04 مشاهده شدند در شکل 4-3 نشان داده شده است.

DNA شکل 4-2- ارزیابی های استخراج شده به روش استات آمونیوم 4-1- ارزیابي کمیت DNA های استخراج شده میزان جذب نوری DNA های استخراج شده به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج های 161 و 181 نانومتر محاسبه گردید و این نسبت در کل نمونه های DNA بین 1-8/3 به دست آمد یعنی جذب عمدتاً توسط اسید نوکلئیک صورت گرفته و DNA ها از کیفیت مناسبی برخوردار می باشند. همچنین غلظت DNA استخراجی در کل نمونه ها بر اساس فرمول محاسبه شده بین ng/ml 311-51 بود که پس از رقیق سازی و همسان سازی غلظت DNA، در غلظت ng/ml 51 مورد استفاده قرار گرفت. 4-9- ارزیابي کیفیت محصوالت واکنش زنجیره ای پلیمراز کیفیت محصوالت PCR روشهای ریز ماهواره و توالی یابی به ترتیب بر روی ژلهای آگارز 1 و 5/3 درصد مورد ارزیابی قرار گرفتند )شکلهای 4-1 و 1-4(.

331

شکل 4-1- ارزیابی محصوالت PCR روش ریز ماهواره شکل 4-9- ارزیابی محصوالت PCR روش توالی یابی 4-4- نتایج مطالعه تنوع ژنتیکي ماهي آزاد دریای خزر با استفاده از روش ریز ماهواره 4-4-2- الکتروفورز عمودی محصوالت PCR جایگاه های ریز ماهواره پس از انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز 36 جفت آغازگر ریز ماهواره مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر در دو رودخانه چشمه کیله )11 نمونه( و کرگانرود )11 نمونه( و ارزیابی محصوالت PCR آنها با استفاده از الکتروفورز عمودی ژل پلی اکریل آمید 6%، 5 جفت از آغازگرها )Otsg ،Otsg 83 Otsg 249 ،Otsg 107 ،100 و Ssa 171( باندهای پلی مورفیک DNA تولید نمودند )شکلهای 4-4 تا -4 8(، 7 جفت از آغازگرها )Strutta 58 ،Otsg 474 ،Otsg 108 ،Otsg 68 ،Otsg 13 ،Otsg 3 و Omyf( باندهای DNA تولید نمودند اما به دلیل مونومورف بودن در بررسی جمعیت استفاده نشدند و 4 جفت از آغازگرها )Otsg 432 ،Otsg 409 ،Otsg 103 و Strutta 12( نیز در شرایط مختلف PCR هیچ باندی ایجاد نکردند. در 5 جایگاه پلی مورفیک، بیشترین تعداد آلل مشاهده شده )33( در جایگاه Otsg 83 با محدوده باندی 118-318 و کمترین تعداد آن )1( در جایگاه Otsg 100 با محدوده باندی 314-336 مشاهده شد. همچنین بهترین درجه حرارت برای پهلوگیری آغازگرها بین 61-51 درجه سانتیگراد بود )جدول 3-4(.

شکل 4-4- الگوی باندی آغازگر Otsg 83 )ستونهای 16-3( و مارکر مولکولی )ستون 17(

شکل 4-5- الگوی باندی آغازگر Otsg 100 )ستونهای 16-3( و مارکر مولکولی )ستون 17(

333

شکل 4-6- الگوی باندی آغازگر Otsg 107 )ستونهای 16-3( و مارکر مولکولی )ستون 17(

شکل 4-7- الگوی باندی آغازگر Otsg 249 )ستونهای 16-3( و مارکر مولکولی )ستون 17(

شکل 4-8- الگوی باندی آغازگر Ssa 171 )ستونهای 16-3( و مارکر مولکولی )ستون 17( جدول 4-2- محدوده باندی، دمای اتصال و تعداد آللهای مشاهده شده در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر °c ردیف نام جایگاه محدوده باندی )bp( دمای اتصال ) ( تعداد آلل مشاهده شده 33 61 318-118 Otsg 83 2 1 51 336-314 Otsg 100 1 33 55 336-131 Otsg 107 9 31 61 371-116 Otsg 249 4 6 61 114-144 Ssa 171 5

4-4-1- تعداد آللهای اختصاصي و فراواني آنها بر اساس داده های فراوانی آللی بیشترین تعداد آلل اختصاصی )11( در رودخانه کرگانرود مشاهده شد. همچنین میانگین فراوانی آللها در رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود به ترتیب 11/1 و 33/1 درصد محاسبه و بیشترین فراوانی آللی )38/1 درصد( در جایگاه Otsg 107 و کمترین آن )11/1 درصد( در جایگاه Ssa 171 رودخانه چشمه کیله مشاهده شد )جدول 1-4(.

332 جدول 4-1- آللهای اختصاصی، محدوده باندی و فراوانی آللی در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر رودخانه جایگاه آللهای اختصاصي فراواني آللي 1/14 366 1/13 376 1/16 384 1/35 331 1/35 114 Otsg 83 1/17 318 چشمه کیله 131 1/16 1/33 111 1/14 118 1/81 314 Otsg 100 1/38 336 Otsg 107 1/14 116 Otsg 249 1/11 144 Ssa 171 1/33 318 1/18 336 1/18 311 1/35 314 Otsg 83 1/16 318 1/16 311 کرگانرود 316 1/35 1/16 344 1/35 351 Otsg 100 1/13 336 1/14 118 Otsg 107 1/14 136 1/14 111

331 1/33 116 1/37 144 1/11 147 1/31 156 1/13 181 1/13 131 1/17 331 Otsg 249

1/16 136 1/11 114 Ssa 171

1/16 116

4-4-9- تعداد آلل واقعي )NA( و مؤثر )NE( میانگین تعداد آللهای واقعی و مؤثر در رودخانه چشمه کیله به ترتیب 81/3±61/5 و 46/3±87/1 و در رودخانه کرگانرود به ترتیب 75/3±61/7 و 11/3±48/5 محاسبه شد. میانگین آللهای واقعی و مؤثر در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه به ترتیب 14/3±61/6 و 37/1±67/4 محاسبه و بیشترین میانگین آنها به ترتیب 51/1±51/31 و 18/1±67/7 در جایگاه Otsg 249 و کمترین میانگین آنها به ترتیب 11/1±11/1 و 34/1±14/3 در جایگاه Otsg 100 مشاهده شد. دامنه آلل واقعی در جایگاه های پلی مورفیک رودخانه های مورد مطالعه بین 33-1 و بیشترین تعداد آن در جایگاه Otsg 249 رودخانه کرگانرود و کمترین تعداد آن در جایگاه های Otsg 100 رودخانه چشمه کیله و Otsg 107 رودخانه کرگانرود مشاهده شد. دامنه آلل مؤثر در جایگاه های پلی مورفیک رودخانه های مورد مطالعه بین 75/7-14/3 و بیشترین تعداد آن در جایگاه Otsg 249 رودخانه کرگانرود و کمترین تعداد آن در جایگاه Otsg 107 رودخانه چشمه کیله مشاهده شد. همچنین در رودخانه های مورد مطالعه و در تمام جایگاه ها تعداد آلل مورد انتظار از تعداد آلل واقعی کمتر بود )جدول 1-4(.

334 جدول 4-9- تعداد آللهای واقعی و مؤثر در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر رودخانه متغیر Ssa 171 Otsg 249 Otsg 107 Otsg 100 Otsg 83 کل ± 5/61 2/89 4 31 1 1 31 NA چشمه کیله ± 9/87 2/46 3/36 7/53 3/14 3/48 7/13 NE ± 7/61 2/75 5 33 31 1 31 NA کرگانرود ± 5/48 2/91 1/53 7/75 7/35 3/11 7/68 NE ± ± ± ± ± ± 6/61 2/14 4/51 1/51 21/51 1/51 6/11 4/11 1/11 1/11 21/11 1/11 NA کل ± ± ± ± ± ± 4/67 1/37 1/78 1/82 7/67 1/18 4/13 9/15 2/94 1/24 7/43 1/11 NE

4-4-4- میزان تنوع ژنتیکي میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده )HO( و مورد انتظار )HE( در رودخانه چشمه کیله به ترتیب 35/1±44/1 و 36/1±51/1 و در رودخانه کرگانرود به ترتیب 33/1±51/1 و 31/1±71/1 محاسبه شد. میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار در جایگاه های پلی مورفیک رودخانه های مورد مطالعه به ترتیب 13/1±47/1 و 31/1±63/1 محاسبه و بیشترین میانگین آنها به ترتیب 31/1±71/1 و 1/87±1/11 در جایگاه های Otsg 83 و Otsg 249 و کمترین میانگین آنها به ترتیب 11/1±38/1 و 18/1±15/1 در جایگاه Otsg 100 مشاهده شد. دامنه هتروزایگوسیتی مشاهده شده در جایگاه های پلی مورفیک رودخانه های مورد مطالعه بین 85/1-14/1 و بیشترین و کمترین میزان آن در جایگاه های Otsg 83 و Otsg 107 رودخانه چشمه کیله مشاهده شد. دامنه هتروزایگوسیتی مورد انتظار در جایگاه های پلی مورفیک رودخانه های مورد مطالعه بین 87/1-14/1 و بیشترین میزان آن در جایگاه Otsg 249 رودخانه کرگانرود و کمترین میزان آن در جایگاه Otsg 107 رودخانه چشمه کیله مشاهده شد. همچنین محاسبه ضریب افت هتروزایگوسیتی نشان داد که در رودخانه های مورد مطالعه و در تمام جایگاه ها به استثنای جایگاه Otsg 107 رودخانه ی چشمه کیله و جایگاه Otsg 100 رودخانه کرگانرود، هتروزایگوسیتی مورد انتظار از هتروزایگوسیتی مشاهده شده بیشتر بود )جدول 4-4(.

335 جدول 4-4- مقادیر هتروزاایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر رودخانه متغیر Ssa 171 Otsg 249 Otsg 107 Otsg 100 Otsg 83 کل ± HO 1/44 1/25 1/43 1/71 1/14 1/38 1/85 چشمه کیله HE ± 1/51 1/26 1/43 1/87 1/14 1/11 1/86 ± HO 1/51 1/22 1/11 1/51 1/81 1/38 1/63 کرگانرود HE ± 1/71 1/29 1/71 1/87 1/86 1/37 1/87 ± ± ± ± ± HO 1/47 1/13 1/97 1/14 1/62 1/13 1/14 1/28 1/11 1/79 1/21 کل HE ± ± ± ± ± 1/62 1/21 1/62 1/21 1/87 1/11 1/14 1/15 1/18 1/87 1/11

4-4-5- شاخص شانون میانگین شاخص شانون )I( در رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود به ترتیب 41/1±34/3 و 3/61±1/16 محاسبه شد. میانگین شاخص شانون در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه 17/1±13/3 محاسبه و بیشترین میانگین آن )11/1±36/1( در جایگاه Otsg 249 و کمترین میانگین آن )31/1±43/1( در جایگاه Otsg 100 مشاهده شد. بیشترین مقدار شاخص شانون )33/1( در جایگاه Otsg 249 رودخانه کرگانرود و کمترین مقدار آن )13/1( در جایگاه Otsg 107 رودخانه چشمه کیله مشاهده شد که بیانگر تنوع باالتر رودخانه کرگانرود و جایگاه Otsg 249 نسبت به سایر جایگاه ها می باشد )جدول 5-4(. جدول 4-5- مقادیر شاخص شانون در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر Ssa 171 Otsg 249 Otsg 107 Otsg 100 Otsg 83 جایگاه کل رودخانه چشمه کیله 1/31 1/51 1/13 1/31 1/84 2/24±1/41 کرگانرود 1/34 1/13 1/33 1/33 3/43 2/69±1/96 کل 1/24±1/12 1/42±1/21 2/21±2/12 1/26±1/19 2/21±1/18 2/93±1/17

4-4-6- تعادل هاردی- واینبرگ نتایج آزمون مربع کای نشان داد به جز جایگاه های Otsg 107 ،Otsg 83 و Otsg 249 رودخانه چشمه کیله و جایگاه Otsg 100 رودخانه کرگانرود که در تعادل هاردی- واینبرگ قرار داشتند در سایر جایگاه های رودخانه های مورد مطالعه انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ مشاهده شد )P<0.001( )جدول 6-4(.

336 جدول 4-6- تعادل هاردی- واینبرگ در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر رودخانه متغیر Ssa 171 Otsg 249 Otsg 107 Otsg 100 Otsg 83 درجه آزادی 45 3 3 45 6 آزمون مربع کای 43/114 4/371 1/131 54/885 17/678 چشمه کیله احتمال 1/641 1/116 1/311 1/348 1/113 معني دار بودن ns ns * ns *** درجه آزادی 45 3 45 55 31 آزمون مربع کای 74/581 1/183 71/577 33/663 51/185 کرگانرود احتمال 1/114 1/536 1/116 1/113 1/113 معني دار بودن ** ns ** *** *** )ns: اختالف معنی دار نیست، *: P< 0.001 :*** ،P< 0.01 :** ،P< 0.05( 4-4-7- تمایز ژنتیکي و جریان ژني بر اساس آزمون AMOVA میزان FST )شاخص تمایز ژنتیکی( بین رودخانه های مورد مطالعه 11/1 با NM

NM FST P< 0.01 RST )شاخص جریان ژنی( 51/1 و میزان نیز 11/1 با جریان ژنی 51/1 بود ) (. میانگین و در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه به ترتیب )1/14±1/31( و )13/1±11/4( محاسبه شد و بیشترین مقدار FST )54/1( و کمترین میزان جریان ژنی )11/1( در جایگاه Otsg 100 و کمترین مقدار FST )13/1( و بیشترین میزان جریان ژنی )15/36( در جایگاه Otsg 249 مشاهده شد )جدول 7-4(. جدول 4-7- تمایز ژنتیکی و جریان ژنی در جایگاه های پلی مورفیک ماهی آزاد دریای خزر

جایگاه NM FST 1/16 1/17 Otsg 83 1/11 1/54 Otsg 100 1/43 1/18 Otsg 107 36/15 1/13 Otsg 249 3/31 1/38 Ssa 171 ± ± کل 1/21 1/14 9/12 4/19

337 4-4-8- فاصله و شباهت ژنتیکي میزان فاصله و شباهت ژنتیکی ماهیان آزاد دریای خزر در رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود به ترتیب 35/1 و 11/1 محاسبه شد. 4-4-3- تنوع ژنتیکي بین و درون جمعیتها و بین و درون افراد بر اساس نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی در رودخانه های مورد مطالعه میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیتها )58%( و بین جمعیتها )41%( )شکل 4-3(، بر اساس نتایج FST حاصل از آنالیز واریانس مولکولی میزان تنوع ژنتیکی درون افراد )43%(، بین جمعیتها )11%( و بین افراد )33%( )شکل 4-31( و بر اساس نتایج RST حاصل از آنالیز واریانس مولکولی میزان تنوع ژنتیکی بین افراد )61%(، بین جمعیتها )11%( و درون جمعیتها )7%( محاسبه شد )شکل 4-33(. به طور کلی نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که اختالف تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها و بین و درون افراد در رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود معنی دار بود )P<0.01(.

شکل 4-3- تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر

شکل 4-21- تنوع ژنتیکی درون و بین افراد و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر

شکل 4-22- تنوع ژنتیکی بین افراد، درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر

338 4-4-21- نمودار سنجش ژنتیکي جفت جمعیتها نمودار سنجش ژنتیکی جفت جمعیتها توانست جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر مهاجر به رودخانه های چشمه کیله در استان مازندران و کرگانرود در استان گیالن را به طور کامل از یکدیگر تفکیک نماید ) شکل .)31-4

شکل 4-21- سنجش ژنتیکی جفت جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر 4-4-22- آنالیز تجزیه به مؤلفه های اصلي2 آنالیز تجزیه به مؤلفه های اصلی توانست ماهیان آزاد دریای خزر مهاجر به رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود را به طور کامل از یکدیگر تفکیک نماید )شکل 31-4(.

شکل 4-29- درجه تفکیک ژنتیکی جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر

1- Principal Component Analysis= PCA

339

4-5- نتایج مطالعه تنوع ژنتیکي ماهي آزاد دریای خزر با استفاده از روش توالي یابي 4-5-2- فراواني هاپلوتایپها توالیهای mtDNA ناحیه D- Loop ماهی آزاد دریای خزر پس از ردیف و ویرایش شدن شامل 654 جفت باز بود. از میان توالیها در مجموع 15 هاپلوتایپ مختلف مشاهده شد. رودخانه های چالوس، سردآبرود و آستارا به ترتیب دارای 153، 111 و 141 عدد جایگاه پلی مورفیک بودند. از مجموع هاپلوتایپهای مشاهده شده 34 هاپلوتایپ در رودخانه چالوس، 33 هاپلوتایپ در رودخانه سردآبرود و 31 هاپلوتایپ در رودخانه آستارا مشاهده شد. هاپلوتایپهای هر رودخانه اختصاصی بوده و در رودخانه های دیگر دیده نشدند. 1 عدد توالی DNA مربوط به هاپلوتایپهای 6 رودخانه چالوس، 1 رودخانه سردآبرود و 1 رودخانه آستارا جهت بررسی همخوانی یا اختالف با سایر توالیهای ثبت شده در بانک جهانی ژن3، در این پایگاه ثبت شدند و به ترتیب با کدهای KC991027 ،KC991028 و KF015727 مورد پذیرش قرار گرفتند. همچنین نسبت فراوانی هر هاپلوتایپ در رودخانه های چالوس، سردآبرود و آستارا به ترتیب 17/1، 13/1 و 31/1 درصد بود و رودخانه های مورد مطالعه از نظر فراوانی هاپلوتایپی دارای اختالف معنی دار بودند )P<0.05(. 4-5-1- میانگین تعداد آلل مشاهده شده و هتروزایگوسیتي مشاهده شده و مورد انتظار بیشترین تعداد ژن کپی شده )34( در رودخانه چالوس و کمترین تعداد آن )31( در رودخانه آستارا، بیشترین میانگین تعداد آلل مشاهده شده )48/1±14/1( در رودخانه سردآبرود و کمترین میانگین آن )1/31±1/11( در رودخانه آستارا، بیشترین میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده )11/1±11/3( در رودخانه چالوس و کمترین میانگین آن )15/1±11/3( در رودخانه آستارا و بیشترین میانگین هتروزاگوسیتی مورد انتظار )34/1±17/1( در رودخانه سردآبرود و کمترین میانگین آن )34/1±13/1( در رودخانه چالوس محاسبه شد )جدول 8-4(. جدول 4-8- میانگین تعداد آلل مشاهده شده و هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار رودخانه تعداد ژن کپي شده تعداد آلل مشاهده شده هتروزایگوسیتي مشاهده شده هتروزایگوسیتي مورد انتظار ± ± ± چالوس 34 1/15 1/31 1/11 3/11 1/34 1/13 ± ± ± سردآبرود 33 1/48 1/14 1/14 3/11 1/34 1/17 ± ± ± آستارا 31 1/11 1/31 1/15 3/11 1/34 1/11

1- Gene Bank

321 4-5-9- تعادل هاردی- واینبرگ نتایج آزمون مربع کای نشان داد که میزان انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در رودخانه چالوس )1/14(، در رودخانه سردآبرود )11/1( و در رودخانه آستارا )11/1( بود و نمونه های ماهی آزاد دریای خزر در هر سه رودخانه خارج از تعادل هاردی- واینبرگ قرار داشتند )P<0.05(. 4-5-4- تمایز ژنتیکي و جریان ژني مقدار FST )شاخص تمایز ژنتیکی( بین رودخانه های چالوس و سردآبرود )11/1(، بین رودخانه های چالوس و آستارا )16/1( و بین رودخانه های سردآبرود و آستارا )13/1( بود و میزان NM )شاخص جریان ژنی( نیز در رودخانه های مورد مطالعه )78/1( به دست آمد. 4-5-5- فاصله و شباهت ژنتیکي بیشترین فاصله ژنتیکی )15/1( و کمترین شباهت ژنتیکی )35/1( بین رودخانه های چالوس و آستارا و کمترین فاصله ژنتیکی )11/1( و بیشترین شباهت ژنتیکی )38/1( بین رودخانه های سردآبرود و آستارا مشاهده شد )جدول 3-4(. جدول 4-3- ماتریس فاصله و شباهت ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر

رودخانه چالوس سردآبرود آستارا چالوس 1/11 1/36 1/35 سردآبرود 1/14 1/11 1/38 آستارا 1/15 1/11 1/11 )اعداد پایین قطر فاصله ژنتیکی و اعداد باالی قطر شباهت ژنتیکی( 4-5-6- تنوع ژنتیکي بیشترین میانگین تنوع نوکلئوتیدی )π( )17/1±31/1( در رودخانه سردآبرود و کمترین میانگین آن )16/1±31/1( در رودخانه آستارا محاسبه شد و میانگین تنوع هاپلوتایپی)h( نیز در هر سه رودخانه )3( به دست آمد )جدول 31-4(. جدول 4-21- میزان تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر

شاخص تنوع مولکولي رودخانه تعداد نمونه تعداد هاپلوتایپ تنوع نوکلئوتیدی تنوع هاپلوتایپي ± چالوس 34 34 1/16 1/31 3 ± سردآبرود 33 33 1/17 1/31 3 آستارا 31 31 1/31±1/16 3

323 4-5-7- تنوع ژنتیکي بین و درون جمعیتها در رودخانه های مورد مطالعه بر اساس نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیتها )83%( و بین جمعیتها )33%( محاسبه شد )شکل 4- (34 و اختالف تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های چالوس، سردآبرود و آستارا معنی دار بود )P<0.01(.

شکل 4-34- تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر 4-5-8- نسبت نوکلئوتیدها بیشترین نسبت نوکلئوتید مشاهده شده در رودخانه های چالوس، سردآبرود و آستارا مربوط به نوکلئوتید آدنین به میزان 81/11، 41/11 و 81/11 درصد و کمترین نسبت آن مربوط به نوکلئوتید گوانین به میزان 44/31، 61/31 و 33/31 درصد بود )جدول 33-4(. جدول 4-22- نسبت نوکلئوتیدهای ماهی آزاد دریای خزر )بر حسب درصد(

نوکلئوتید سیتوزین تیمین آدنین گوانین رودخانه چالوس 16/11 17/51 11/81 31/44 سردآبرود 16/11 17/75 11/41 31/61 آستارا 16/11 17/31 11/81 31/33

4-5-3- تخمین الگوی جانشیني نوکلئوتیدی میانگین Transition و Transversion در رودخانه های مورد مطالعه به ترتیب 37/31±67/81 و 71/36±11/351 محاسبه شد. بیشترین تعداد Transition )31( در رودخانه های چالوس و سردآبرود و کمترین تعداد آن )73( در رودخانه آستارا و بیشترین تعداد Transversion )371( در رودخانه چالوس و کمترین تعداد آن )317( در رودخانه آستارا مشاهده شد )جدول 31-4(.

322 جدول 4-21- الگوی جانشینی نوکلئوتیدی ماهی آزاد دریای خزر رودخانه چالوس سردآبرود آستارا میانگین خطای معیار الگوی جانشیني نوکلئوتیدی Transitions تعداد 31 31 73 81/67 31/37 Transversions تعداد 371 343 317 351/11 36/71

4-5-21- تخمین درجه خویشاوندی میانگین درجه خویشاوندی ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه )15/1-( محاسبه و بیشترین درجه خویشاوندی )14/1( در رودخانه سردآبرود و کمترین آن )53/1-( در رودخانه آستارا مشاهده شد )جدول 31-4(. جدول 4-29- درجه خویشاوندی ماهی آزاد دریای خزر رودخانه چالوس سردآبرود آستارا میانگین خطای معیار

آزمون تاجیما 1/13 1/14 -1/53 -1/15 1/41

4-5-22- شرح درخت فیلوژني رسم شده به روشهای Maximum Parsimony و Neighbor Joining با استفاده از آنالیز خود راه انداز در روش Maximum Parsimony درخت فیلوژنی حاصل به دو شاخه A و B و شاخه A به 1 زیر شاخه A2 ،A1 و A3 تقسیم شد و بیشتر نمونه های ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه در زیر شاخه A1 قرار گرفتند و شاخه B نیز به 4 زیر شاخه B3 ،B2 ،B1 و B4 تقسیم شد و 1 نمونه از رودخانه سردآبرود در زیر شاخه های B1 و B2 و 1 نمونه از رودخانه چالوس در زیر شاخه های B3 و B4 جدا از نمونه های مستقر در شاخه A قرار گرفتند که نشان دهنده وجود فاصله ژنتیکی بین این نمونه ها می باشد )شکل 4-35(. در روش Neighbor Joining نیز درخت فیلوژنی حاصل به دو شاخه A و B و شاخه A به دو زیر شاخه A1 و A2 تقسیم شد و بیشتر نمونه های ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه در زیر شاخه A1 قرار گرفتند و شاخه B نیز به 1 زیر شاخه B2 ،B1 و B3 تقسیم شد و تنها 1 نمونه از رودخانه چالوس در این شاخه و جدا از سایر نمونه ها قرار گرفتند که نشان دهنده وجود فاصله ژنتیکی بین آنها می باشد )شکل 4-36(. تفاوت این دو درخت در شاخه B می باشد به طوری که در روش Maximum Parsimony، 1 نمونه از رودخانه سردآبرود و 1 نمونه از رودخانه چالوس در شاخه B اما در روش Neighbor Joining، تنها 1 نمونه از رودخانه چالوس در شاخه B قرار گرفتند. در کل با مقایسه این دو درخت می توان نتیجه گیری کرد که توالی نوکلئوتیدی ماهیان آزاد دریای خزر رودخانه های مورد مطالعه

321 بسیار به هم نزدیک بوده و درخت رسم شده به روش Neighbor Joining با استفاده از آنالیز خود راه انداز با توجه به عدد 33 شاخه A1 از صحت و اطمینان بیشتری برخوردار می باشد. 4-5-21- شرح درخت فیلوژني رسم شده با استفاده از اطالعات موجود در بانك ژن در این مطالعه برای مقایسه جایگاه فیلوژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر با اطالعات موجود در بانک ژن از داده های 4 گونه با مشخصات جدول 4-34 در کنار داده های گونه حاضر برای رسم درخت فیلوژنی استفاده شد که در درختهای رسم شده به روشهای Maximum Parsimony و Neighbor Joining در شاخه A و زیر شاخه A1 قرار گرفتند که نشان دهنده شباهت ژنتیکی آنها با نمونه های مستقر در شاخه A و فاصله ژنتیکی آنها با نمونه های مستقر در شاخه B هر دو روش می باشد. جدول 4-24- مشخصات گونه های منتخب بانک ژن

منبع کد دستیابي در بانك ژن نام گونه Salmo trutta caspius HM237337 Vera et al., 2011 Salmo trutta caspius HM237338 Vera et al., 2011 Salmo trutta caspius HM237339 Vera et al., 2011 Salmo trutta caspius HM237340 Vera et al., 2011

324

شکل 4-25- درخت Maximum Parsimony رسم شده با استفاده از آنالیز خود راه انداز و اطالعات موجود در بانک ژن

325

شکل 4-26- درخت Neighbor Joining رسم شده با استفاده از آنالیز خود راه انداز و اطالعات موجود در بانک ژن

326

فصل پنجم نتیجه گیری و پیشنهادات

327

5-2- روش ریز ماهواره در سالهای اخیر روند آسیب پذیری آبزیان دریای خزر به علت برداشت بی رویه، ورود آلودگیهای گوناگون و ...، لزوم اجرای مطالعات بنیادی و کاربردی جهت اطالع از جمعیت یا جمعیتهای احتمالی، طرح برنامه های حمایتی و حفاظتی مثل تکثیر و پرورش، مدیریت ذخایر و ارائه الگوی پایدار صید و برداشت را ضروری نموده و اهمیت این موضوع فقط به منظور بهره برداری از منابع شیالتی نیست بلکه جهت حصول اطمینان از تنوع زیستی و حفظ عملکرد اکولوژیک اکوسیستم های دریایی نیز می باشد ) Rezvani Gilkolaei, 1997(. ماهی آزاد دریای خزر یکی از ماهیان با ارزش این دریا و دنیا محسوب شده و جمعیت آن در دریای خزر به مناطق خاصی از جمله ایران محدود گشته است. کشور قزاقستان در سال 3331 به علت عدم صید 35 ساله، این ماهی را در ردیف لیست قرمز و در معرض خطر انقراض قرار داد. بنابراین بررسی گوناگونی و تنوع ژنتیکی ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر به عنوان یک گونه به شدت در معرض خطر انقراض )Kiabi et al., 1999( ضروری می باشد. نخستین گام جهت حفاظت از ساختار ژنتیکی و تنوع زیستی جمعیتهای در حال بهره برداری آبزیان، تدوین استراتژی مدیریت برداشت پایدار است. در صورتی که این استراتژی بر پایه روشهای دقیق و قوی مثل داده های مولکولی باشد، می تواند عالوه بر حفظ تنوع زیستی، میزان برداشت و بهره برداری را به حد معقول و حداکثر برساند ) ,.Thai et al 2006(. یافتن مدارکی مبتنی بر وجود ذخایر متعدد با یک روش کافی نبوده و باید از روشهای مختلفی استفاده شود و وجود تفاوت بین روشها به طور عمده ناشی از فقدان همزمانی بین خصوصیات قابل آنالیز در اختالف توارث در بین ذخایر است )Utter et al., 1991(. از آنجایی که تفکیک جمعیتها و شناسایی ذخایر ژنتیکی بر اساس داده های ریخت شناسی از ضریب اطمینان کمتری نسبت به داده های مولکولی برخوردار می باشد و از طرفی چون تفاوتهای مورفولوژی و فیزیولوژی ناشی از ذخایر ژنومی هر ارگانیسم می باشد، به همین دلیل بررسی تنوع ژنتیکی در بین جمعیتها و نیز بین افراد داخل جمعیت با توجه به تغییرات شرایط محیطی ضروری است )Sivasunder and Biemann, 2005(. یکی از راههای بررسی تحوالت ساختاری و درون گونه ای آبزیان، استفاده از ژنتیک جمعیت است. زیرا آنالیز ساختار جمعیتی، تنوع زیستی، ارتباطات گونه ای و سیستماتیک آنها درک روشنی از ساختار جوامع زیستی می دهند )Rezvani Gilkolaei et al., 2007(. تنوع ژنتیکی یکی از سه سطح تنوع زیستی پیشنهاد شده توسط

328 اتحادیه بین المللی حفاظت از گونه ها و طبیعت برای برنامه های حفاظت از ذخایر است ) Lucentini et al., 2009(. ریز ماهواره ها شاخص حساسی در اندازه گیری هموزایگوسیتی در جفتگیری های همخون هستند. بنابراین برای تشخیص تمایز کم بین جمعیتها مناسب می باشند )Alarcon et al., 2004(. استفاده از ریز ماهواره ها در گونه هایی که با هم خویشاوندی بسیار نزدیک یا کمی نزدیک دارند متداول و معموالً موفقیت آمیز است اما با افزایش فاصله فیلوژنتیکی میزان موفقیت این روش کاهش می یابد و علت آن قرار گرفتن بازهای جانشین در مناطق پهلوگیری ریز ماهواره ها است که محل اتصال با آغازگرها می باشد. Yoon و همکاران )2007(، در مطالعه میتوکندریایی و ریز ماهواره ای جمعیتهای )Oncorhynchus keta( اعالم نمودند بهتر است در مطالعه ساختار جمعیتی از هر دو نشانگر استفاده گردد که در این مطالعه نیز با بهره گیری از هر دو روش به مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر پرداخته شده است. حالت پلی مورفیسم در ژنوم هسته موجودات به عنوان شاخص ژنتیکی ارزشمند برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیتی به منظور حفاظت از ذخایر ژنی گونه ها محسوب می شود )Thai et al., 2006(. در مطالعات ژنتیکی که با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره صورت می گیرد سعی بر استفاده از جایگاه های ژنی پلی مورف می باشد. در این مطالعه نیز از 36 جفت آغازگر ریز ماهواره مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود، 5 جفت باندهای پلی مورفیک تولید نمودند )جدول 4-5(. در این راستا می توان به مطالعات Dionne و همکاران )2008( و Griffiths و همکاران )2010( که از 31 و 31 جفت نشانگر ریز ماهواره پلی مورف برای بررسی تنوع ژنتیکی ماهی آزاد اقیانوس اطلس3 بهره برده اند اشاره نمود. راههای مختلفی برای بررسی تنوع ژنتیکی جوامع زیستی وجود دارد اما اندازه گیری فراوانی آللی یا ژنوتیپها از ساده ترین آنها بوده و جهت بیان و آشکارسازی روابط تکاملی جمعیتهای نزدیک به هم، ابزار مناسبی است )Takezaki and Nei, 1996(. در این مطالعه بیشترین تعداد آلل اختصاصی در رودخانه کرگانرود و جایگاه Otsg 83 و بیشترین میانگین فراوانی آللی در رودخانه چشمه کیله و جایگاه Otsg 107 مشاهده شد )جدول 4-6(. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، بیشترین تعداد آلل اختصاصی )31( را در جایگاه Otsg 100 و محدوده باندی 161-331 و کمترین تعداد آن )8( را در جایگاه Otsg 474 و محدوده باندی 371-341 و بیشترین فراوانی آللی )133/1( را در مولدین نر و کمترین آن )133/1( را در مولدین ماده و بچه ماهیان مشاهده نمودند. وجود مواد سمی در آب نیز می تواند موجب افزایش میزان مرگ و میر جمعیتها، کاهش تنوع و

1- Salmo salar

329 فراوانی ژنتیکی و از بین رفتن آللهای کمیاب شود )Theodorakis et al., 2001(. باال بودن ارتباطات ژنتیکی )Herwerden et al., 2006( و تبادالت ژنتیکی )Hoolihan et al., 2006( سبب کاهش تعداد آللهای اختصاصی می شود. در مقابل باالتر بودن آلل اختصاصی و تراز باالی پلی مورفیسم می تواند ناشی از پویایی ژنتیکی باشد )Hassanien et al., 2004(. بنابراین تعداد بیشتر آللهای اختصاصی در رودخانه کرگانرود بیانگر این است که جمعیت رودخانه مذکور به سرعت توسعه یافته )پویایی ژنتیکی داشته اند( و آللهای جدید در میان جهشهای جدید برخاسته اند. در بررسی های تنوع ژنتیکی، غنای آللی نسبت به هتروزایگوسیتی دارای ارزش باالتری است زیرا باال بودن غنای آللی نشان دهنده باال بودن اندازه مؤثر جمعیت است و استفاده از آن برای ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیتهایی که برای برنامه های بهگزینی یا حفاظت انتخاب شده اند، مناسب تر است ) ,Diz and Persa 2009(. تعداد آلل واقعی )NA( و مؤثر )NE( معیاری جهت تعیین میزان چند شکلی جایگاهها می باشند. آللهای واقعی یعنی تعداد آللهای مشاهده شده در هر جایگاه ژنی و آللهای مؤثر بیانگر تعداد آللهایی است که هتروزایگوسیتی یکسان ایجاد می کنند )Ferguson et al., 1995(. در این مطالعه بیشترین تعداد و میانگین آللهای واقعی و مؤثر در رودخانه کرگانرود مشاهده شد که بیانگر باال بودن اندازه مؤثر جمعیت آن نسبت به رودخانه چشمه کیله است )جدول 4-7(. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، بیشترین تعداد آلل واقعی )33( را در جایگاه های Otsg 483 و Otsg 100 مولدین نر و بچه ماهیان و کمترین تعداد آن )6( را در جایگاه Otsg 108 مولدین نر و بیشترین تعداد آلل مؤثر )371/3( را در جایگاه Strutta 58 بچه ماهیان و کمترین تعداد آن )641/4( را در جایگاه Otsg 108 مولدین نر مشاهده نمودند. Yousefian )2011(، در بررسی تنوع ژنتیکی ماهیان آزاد جوان و در معرض خطر انقراض دریای خزر با استفاده از آغازگرهای ریز ماهواره دامنه آلل مشاهده شده در هر جایگاه در فرزندان را 33-7 به دست آورد. آللهای مشاهده شده در هر جایگاه ژنی به شدت تحت تأثیر اندازه نمونه بوده و اندازه کوچک نمونه، مانع از ردیابی تمایز جمعیتی ماهیان شده و جهت نتیجه گیری باید تحقیقات بیشتری همراه با افزایش تعداد نمونه و آغازگرهای جدید انجام شود. همچنین استفاده از آغازگرهای اختصاصی هر گونه نیز در ردیابی تمایز جمعیتی، بسیار مؤثر است )Ferguson et al., 1995(. در نظریه دیگری عنوان شده که اندازه کم نمونه، تعداد آللهای شناسایی شده در هر جایگاه را کاهش می دهد اما بر آللهای معمولی و فراوانی آنها مؤثر نیست )Xu, 2002(. پایین بودن تعداد آلل مشاهده شده در برخی از جایگاه ها، شاید متأثر از محدودیت مهاجرتها )جریان ژنی( و آمیزش های خویشاوندی باشد )Welch et al., 2010(. متوسط تعداد آللها در هر جایگاه ژنی، در ماهیان آب شور )6/11(، در ماهیان آب شیرین )5/7( و در ماهیان رودکوچ )1/33( گزارش شده است ) Dewoody and

311 Avise, 2000( و میانگین تعداد آلل مشاهده شده در این مطالعه )14/3±61/6( کمتر از مقدار اعالم شده برای ماهیان رود کوچ است و پایین بودن آن را می توان به عوامل مختلفی چون تفاوت درجه حرارت، شوری، مواد مغذی و جریانات دریایی بین زیستگاه های مختلف دریای خزر، کاهش شدید جمعیت به ویژه به حداقل رسیدن مولدینی که برای تخمریزی به رودخانه ها مهاجرت می کنند، آمیزش های خویشاوندی و ... نسبت داد که موجب محدود شدن جریان ژنی و کاهش تنوع آللی شده است. Was و Wenne )2002(، نیز متوسط تعداد آلل در هر جایگاه ماهی Salmo trutta را 36 آلل اعالم نمودند که از مقدار یاد شده در نظریه )Dewoody and Avise, 2000( برای ماهیان آب شور کمتر محاسبه شد. رفیعی )3185(، در بررسی تنوع ژنتیکی 51 نمونه بچه ماهی آزاد دریای خزر از جمعیت غرب استان مازندران با استفاده از روش PCR- RFLP، دامنه تعداد آلل در داخل جمعیت را بین 6-1 عدد به دست آورد. Jamshidi و Kalbassi )2011(، در بررسی ارتباط بین شکلهای مهاجر بهاره و پاییزه 61 عدد ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از 36 آغازگر RAPD، 37-5 عدد آلل به ازای هر جایگاه با متوسط 31/31 به دست آوردند که از مقدار یاد شده در نظریه )Dewoody and Avise, 2000( کمتر محاسبه شد. Sourinejad و همکاران )2011(، در بررسی انتساب نسب فرزندان 8 عدد مولد ماده و نر ماهی آزاد دریای خزر موجود در مرکز شهید باهنر کالردشت از جمعیت رودخانه تنکابن با استفاده از 1 جفت آغازگر ریز ماهواره، متوسط تعداد آلل در فرزندان را 66/6 و کمتر از مقدار یاد شده در نظریه )Dewoody and Avise, 2000( به دست آوردند. جمعیتها در حقیقت مجموعه متنوعی از ژنها هستند که عواملی همچون فاصله نسلها، صید بی رویه، شرایط نامناسب آب و هوایی و از بین رفتن زیستگاه ها منجر به کاهش اندازه مؤثر جمعیتها و در نتیجه کاهش تنوع ژنتیکی ذخایر شده و خطر انقراض را افزایش می دهد )Zolgharnine et al., 2010(. به علت بزرگ بودن اندازه مؤثر جمعیت ماهیان دریایی و جریان ژنی محدود در آبهای شیرین، ماهیان دریایی در مقایسه با ماهیان آب شیرین، تنوع ژنتیکی باالتر و تمایز ژنتیکی پایین تری را نشان می دهند ) ,.Brighitte et al 2005(. تنوع ژنتیکی در گونه هایی که در محیطهای ناپایدار و تنش زا زیست می کنند، از گونه های مشابه در محیطهای پایدار بیشتر است اما در دوره های کوتاه تکاملی )چند نسل(، چنانچه گونه ای به مدت طوالنی در معرض آلودگی قرار گیرد، در محدوده سنی خاصی تحت تأثیر فشار صید باشد، زیستگاه طبیعی آن از بین برود و یا مکان تخمریزی آن محدود شود، تنوع ژنتیکی آن کاهش خواهد یافت و یا اینکه صید بی رویه ماهیان بالغ و عدم جایگزینی آنها در طی نسلهای مختلف سبب گشته است که تنها تعداد معدودی قادر به ازدیاد نسل باشند در نتیجه ماهیان زاده شده، از مولدین اندکی تولید می گردند که این امر سبب کاهش تنوع ژنتیکی می گردد. پایین بودن تنوع عالوه بر عوامل محیطی و خارجی می تواند متأثر از رفتار ذاتی یعنی محدود بودن قلمرو پراکنش گونه مورد مطالعه باشد )Welch et al., 2010(. فقدان تنوع، قدرت

313 انتخاب موجود برای رفع نیازهای غیر قابل پیش بینی آتی را محدود می سازد )Templeton, 2004(. هتروزایگوسیتی می تواند اختالفات ژنتیکی بسیاری از جایگاه ها را در یک جمعیت نشان دهد در نتیجه به عنوان شاخص مناسبی برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در یک جمعیت در نظر گرفته می شود و اهمیت زیادی دارد زیرا تأمین کننده طیف وسیعی از ژنوتیپها به عنوان پاسخ به سازش پذیری در شرایط متغیر محیطی است. هتروزایگوسیتی بررسی فراوانی آللها یا ژنوتیپها می باشد و از این جهت دارای اهمیت است که هر هتروزایگوت ناقل آللهای متفاوتی است که نشان دهنده تنوع می باشد بنابراین معمول ترین معیار تنوع ژنی در یک جمعیت تعیین میزان هتروزایگوسیتی است )Fei et al., 2007(. در این مطالعه بیشترین میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار در رودخانه کرگانرود مشاهده شد )جدول Adams .)8-4 و Hutchings )2003(، در بررسی ساختار جمعیتی قزل آالی جویباری دریاچههای حوضه ی آبریز خلیج هند با استفاده از تکنیک ریز ماهواره، دامنه هتروزایگوسیتی را در هر جایگاه بین )17/1-6/1( به دست آوردند. نویدی مقدم فومنی )3184(، در بررسی تنوع ژنتیکی 11 نمونه بچه ماهی آزاد دریای خزر جمعیت منطقه تنکابن با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره، دامنه هتروزایگوسیتی را در هر جایگاه بین 76/1-43/1 به دست آورد. رفیعی )3185(، در بررسی تنوع ژنتیکی 51 نمونه بچه ماهی آزاد دریای خزر از جمعیت غرب استان مازندران با استفاده از روش PCR- RFLP، دامنه هتروزایگوسیتی را در هر جایگاه بین 3/1-8/1 به دست آورد. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، دامنه هتروزایگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار را بین 11/3-11/1 و 83/1-78/1 به دست آوردند و بیشترین و کمترین مقدار هتروزایگوسیتی مشاهده شده را به ترتیب در جایگاه های Omyf و Otsg 474 و بیشترین و کمترین مقدار هتروزایگوسیتی مورد انتظار را به ترتیب در جایگاه های Strutta 58 و Otsg 108 مشاهده نمودند و اعالم نمودند که به استثناء جایگاه های Strutta 12 و Strutta 58 در کلیه جایگاه ها میزان هتروزاگوسیتی مشاهده شده از هتروزایگوسیتی مورد انتظار کمتر می- باشد. Vera و همکاران )2011(، در مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره بیشترین مقدار هتروزایگوسیتی مورد انتظار )31/1( را در جایگاه Strutta 58 مشاهده نمودند. میزان تنوع ژنتیکی در ماهیان دریایی 1/73، در ماهیان آب شیرین 46/1 و در ماهیان رود کوچ 68/1 گزارش شده است )Dewoody and Avise, 2000( و میانگین تنوع ژنتیکی مشاهده شده در این مطالعه )13/1±47/1( کمتر از مقدار اعالم شده برای ماهیان رودکوچ است و پایین بودن آن را می توان به عوامل مختلفی چون صید بی رویه، از بین رفتن مکانهای طبیعی تخمریزی، تکثیر مصنوعی و ... نسبت داد. محاسبه ضریب افت هتروزایگوسیتی در مطالعه حاضر

312 نشان داد که در تمام جایگاه ها به استثنای جایگاه Otsg 107 رودخانه چشمه کیله و جایگاه Otsg 100 رودخانه کرگانرود، هتروزایگوسیتی مورد انتظار از هتروزایگوسیتی مشاهده شده بیشتر بود و کاهش هتروزایگوسیتی مشاهده شده نسبت به هتروزایگوسیتی مورد انتظار نشان دهنده کاهش در تغییر پذیری ژنتیکی نمونه ها است و علت این کاهش، تنگناهای ژنتیکی می باشند که احتماالً بر اثر شرایط زیست محیطی، تخریب زیستگاه های طبیعی و آمیزش های خویشاوندی به وجود می آیند و در نتیجه با گذشت زمان موجب کاهش آلل و کاهش هتروزایگوسیتی در ذخایر می شوند )Norris et al., 1999(. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده در مولدین ماده، نر و بچه ماهیان را به ترتیب 75/1، 63/1 و 15/1 محاسبه نمودند که در مولدین نر و بچه ماهیان کمتر از مقدار یاد شده در نظریه ) Dewoody and Avise, 2000( برای ماهیان رود کوچ می باشد. Sourinejad و همکاران )2011(، در بررسی انتساب نسب فرزندان 8 عدد مولد ماده و نر ماهی آزاد دریای خزر موجود در مرکز شهید باهنر کالردشت از جمعیت رودخانه تنکابن با استفاده از 1 جفت آغازگر ریز ماهواره، متوسط هتروزایگوسیتی مشاهده شده در والدین و فرزندان را به ترتیب 33/1±81/1 و 13/1±71/1 محاسبه نمودند که بیشتر از مقدار یاد شده در نظریه )Dewoody and Avise, 2000( برای ماهیان رود کوچ می باشد. چون حد نهایی هتروزایگوسیتی یک است و تفاوت میان مقادیر در چنین رنجی در نشانگرهای بسیار چند- شکلی مثل ریز ماهواره ها که در اکثر موارد هتروزایگوسیتی حدود 8/1 یا باالتر دارند به میزانی نمی باشد که اطالعات دقیقی را بیان کند بنابراین برای بزرگنمایی این مقادیر از شاخص اطالعات شانون )I( که معیار مناسبی برای ارزیابی چند شکلی و میزان تغییر پذیری جایگاه های مورد مطالعه در سطح جمعیت می باشد استفاده می شود )Shannon and Weaver, 1949(. در این مطالعه بیشترین میانگین شاخص شانون در رودخانه کرگانرود و جایگاه Otsg 249 مشاهده شد )جدول 4-3( که بیانگر تنوع باالتر رودخانه کرگانرود و جایگاه Otsg 249 نسبت به سایر جایگاه ها می باشد. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، بیشترین مقدار شاخص شانون )16/1( را در جایگاه Strutta 58 بچه ماهیان و کمترین مقدار آن )71/3( را در جایگاه Strutta 12 مولدین نر مشاهده نمودند و متوسط شاخص شانون در مولدین ماده، نر و بچه ماهیان را به ترتیب 13/1، 33/3 و 15/1 به دست آوردند. یکی از بهترین روشها برای مطالعه ساختار ژنتیک جمعیت، بررسی تمایز بین نمونه ها است ) ,.Viard et al 1997( و سازگاری و بقای گونه ها، هنگامی حفظ می شود که تغییرپذیری ژنتیکی موجود در آنها از دست نرود )Meffe and Carrol, 1997(. برای تعیین میزان اختالف ژنتیکی کل موجود در یک زیر جمعیت و

311 مقایسه آن با اختالف ژنتیکی کل در بین مناطق هر ناحیه از فاکتورهای FST و RST استفاده میشود. FST روش برآورد مرسوم تمایز ژنتیکی در مطالعات ژنتیکی و RST برآورد کننده تمایز ژنتکی در روش ریز- ماهواره می باشد. FST بیشتر شامل اندازه گیری تمایز در زیر جمعیتها است و بیشترین کاربرد را در آزمون واگرایی ژنتیکی کل در بین زیر جمعیتها دارد و مقدار آن همیشه مثبت بوده و بین عدد صفر )هیچ زیر جمعیتی وجود ندارد( و یک )وجود زیر جمعیت و جدایی کامل جمعیتها( متغیر است. هر دو فاکتور FST و RST به طور مستقیم یا غیر مستقیم با میزان جریان ژنی یا تعداد مهاجرت مؤثر )NM( میان جمعیتها ارتباط دارند. هر چه میزان جریان ژنی بین دو منطقه بیشتر باشد بیانگر آن است که مهاجرت بین مناطق بیشتر بوده و اختالف ژنتیکی کمتر است. نقش اختالف ژنتیکی و جریان ژنی وابسته به آن در شکل گیری الگوی اختالف ژنتیکی، از نظر تئوری و تجربی به خوبی به اثبات رسیده است )Rousset, 2004(. وجود اختالف ژنتیکی درون و بین جمعیتهای گونه های مختلف، تحت تأثیر عوامل مختلفی چون تاریخچه مشترک، جدایی جغرافیایی، جریان ژنی حال و گذشته و همینطور فرآیندهای مختص جمعیت مانند رانش ژنتیکی و انتخاب انطباقی قرار دارد )Dorak, 2005; Li et al., 2007(. در این مطالعه میزان FST و RST )شاخصهای تمایز ژنتیکی( و NM )شاخص جریان ژنی( بین رودخانه های مورد مطالعه معنی دار بود )P<0.01(. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، بیشترین مقدار FST )11/1( و کمترین مقدار NM )17/3( را بین مولدین نر و ماده و کمترین مقدار FST )115/1( و بیشترین مقدار NM )36/53( را بین مولدین ماده و بچه ماهیان گزارش نمودند. FST بین 15/1-11/1 بیانگر تمایز ژنتیکی پایین، بین 35/1-15/1، تمایز ژنتیکی متوسط، بین 15/1-35/1، تمایز ژنتیکی زیاد و باالی 15/1 حاکی از تمایز ژنتیکی خیلی زیاد و نشان دهنده جدایی کامل جمعیتها از یکدیگر می باشد )Dorak, 2005( اما به طور معمول مقدار FST زیر 15/1 به دست می آید، در چنین حالتی ممکن است محققین ساختار بین زیر جمعیتها را ضعیف تصور کنند در حالی که عدد به دست آمده نمایانگر همه جمعیت حقیقی نیست. نکته دیگر اینکه میزان FST در اکثر مواقع به یک نمی رسد، زیرا اثر پلی مورفیسم )ناشی از جهش( به طور مؤثری میزان FST را کاهش می دهد )Balloux et al., 2002(. با توجه به نظریه Dorak )2005(، میزان FST در این مطالعه )11/1( بزرگتر از 15/1 و بیانگر تمایز ژنتیکی خیلی زیاد جمعیتهای مورد مطالعه و جدایی کامل آنها از یکدیگر و موفقیت آمیز بودن روش ریز ماهواره در بررسی واگرایی ژنتیکی می باشد. Vera و همکاران )2011(، در مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره میزان

314 اختالف ژنتیکی را 15/1 به دست آوردند که بر اساس نظریه Dorak )2005(، بیانگر تمایز ژنتیکی پایین میباشد. جریان ژنی یکی از مهمترین معیارها در تکوین ساختار جمعیتی گونه های مورد مطالعه است به طوری که میزان آن بیانگر واحد تکاملی مستقل جمعیتهای محلی یک منطقه می باشد. اگر جریان ژنی بین جمعیتها زیاد باشد بیانگر تکامل گروهی آنها بوده و در صورتی که کم باشد نشانگر این است که هر یک از جمعیتها تقریباً به طور مستقل از یکدیگر تکامل یافته اند )Slatkin, 1993(. بر اساس گزارش Li و همکاران )2007(، هرگاه Nm> 1 باشد، جریان ژنی و هرگاه Nm< 1 باشد، رانش ژنتیکی اصلی ترین عامل در ایجاد تمایز ژنتیکی است. بنابراین از آنجا که میزان جریان ژنی در مطالعه حاضر )51/1( کوچکتر از یک به دست آمد، عامل اصلی ایجاد تمایز ژنتیکی جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه رانش ژنتیکی بوده است و از سوی دیگر بیانگر این است که جمعیتهای مورد مطالعه به طور مستقل از یکدیگر تکامل یافته اند و تفاوتهای باالی ژنتیکی بین جمعیتها زمانی رخ می دهد که میزان جریان ژنی کمتر از یک باشد و در صورتی که بزرگتر از یک باشد بیانگر این است که جریان ژنی به حدی زیاد است که موجب جلوگیری از تفاوتهای ناشی از انتخاب طبیعی شده است )Tremblay and Ackerman, 2001(. قانون هاردی- واینبرگ رابطه پیش بینی های ژنوتیپی اختالف را بر حسب فراوانی های آللی خزانه ژن والدینی بیان می کند. وجود جمعیت بزرگ با آمیزش اتفاقی، عدم انتخاب، عدم مهاجرت، فقدان فشار جهش و میوز معمولی در برقراری حالت تعادل مؤثر می باشند )Hallerman, 2003(. در این مطالعه دو جایگاه در رودخانه چشمه کیله و 4 جایگاه در رودخانه کرگانرود خارج از تعادل هاردی- واینبرگ بودند )P<0.001( )جدول Beacham .)31-4 و همکاران )2004(، در بررسی ریز ماهواره ای 3Sokeye salmon انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ را در بعضی جایگاه ها برای بعضی جمعیتها مشاهده نمودند )P<0.05(. یوسفیان و همکاران )3183(، در مطالعه ارتقاء نرخ رشد مولدین نر، ماده و بچه ماهیان آزاد دریای خزر از طریق بهگزینی، بیان داشتند که در برخی از جایگاه های مولدین نر و ماده و بچه ماهیان انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ را مشاهده نمودند. انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ به دالیل مختلفی چون افزایش هموزایگوسیتی، حضور آللهای نول که پهلوگیری در آنها صورت نمی پذیرد، رانش ژنتیکی، وجود آمیزش های خویشاوندی در بین گونه ها، پهلوگیری تعداد محدودی از آللها، انتخاب، اختالط جمعیتها، جفتگیری های غیر تصادفی، غیر کافی بودن نمونه ها و خطای نمونه برداری اتفاق می افتد ) ;Callen et al., 1993 McQuown et al., 2003; Skaala et al., 2004; Liu et al., 2005; Zhao et al., 2005; Dahle et al., Chauhan et al., 2007; Li et al., 2007 ;2006( و مشاهده انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در این

1- Oncorhynchus nerka

315 مطالعه می تواند به علت حضور آللهای نول، وجود آمیزش های خویشاوندی، جفتگیری های غیر تصادفی و مخلوط شدن باشد. Kitanishi و همکاران )2008(، انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ مشاهده شده در مطالعه ساختار جمعیتی Onchorhynchus masou را به خطای نمونه برداری نسبت دادند. ماتریس شباهت و فاصله ژنتیکی برای توصیف تمایز ژنتیکی ساختارهای جمعیتی مورد استفاده قرار می- گیرد. Shaklee و همکاران )1982( و Thorpe و همکاران )1994(، نشان دادند که میزان متوسط فاصله ژنتیکی Nei, 1978 برای جمعیتهای هم گونه )15/1( )دامنه 17/1-111/1(، برای گونه های هم جنس )1/1( )دامنه 63/1-11/1( و برای جنسهای هم خانواده )دامنه 13/3-58/1( می باشد. بنابراین با توجه به میزان فاصله ژنتیکی به دست آمده در مطالعه حاضر )35/1( ماهیان آزاد دریای خزر رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود در محدوده جنسهای هم خانواده قرار می گیرند که خود دلیلی بر انشقاق ژنتیکی جمعیتهای مورد مطالعه می باشد. Jamshidi و Kalbassi )2011(، در بررسی ارتباط بین شکلهای مهاجر بهاره و پاییزه 61 عدد ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از 36 آغازگر RAPD، میزان شباهت و فاصله ژنتیکی را به ترتیب 38/1 و 13/1 به دست آوردند. سدهای محیطی، فرآیندهای تاریخی و پیشینه زندگی همانند روش جفتگیری از عواملی هستند که هر کدام تا حدودی ساختار ژنتیکی جمعیتها را شکل می دهند )Tiedemann et al., 2000( و آنالیز واریانس مولکولی به عنوان یک آنالیز آماری، آزمون مناسبی برای مشخص کردن ساختار جمعیت و میزان تمایز ژنتیکی بین جمعیتها است )Grassi et al., 2004(. نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی در مطالعه حاضر نشان داد که بیشترین میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیت هر رودخانه وجود دارد و تنوع ژنتیکی درون جمعیتها، پارامتری مهم و اساسی در تکامل و حفاظت بیولوژیکی آنهاست و سطوح باالی تنوع ژنتیکی، توانایی جمعیتها را در پاسخ به انتخاب طبیعی و سالمت افراد آن جمعیت افزایش می دهد ) ,Kalinowski Vera .)2005 و همکاران )2011(، با مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از 31 جفت آغازگر ریز ماهواره و بررسی نتایج آزمون آنالیز واریانس مولکولی اعالم کردند که میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیتها 33/33 درصد )P<0.001(، بین جمعیتها 11/7 درصد )P=0.066( و بین جمعیتهای داخل گروه 63/3 درصد )P<0.001( می باشد. نمودار سنجش ژنتیکی جفت جمعیتها روش مناسبی برای اندازه گیری اختالف میان جمعیتها به کمک نمودار و بر اساس آزمونهای سنجش بوده و نمایشی از درجه تفکیک ژنتیکی جمعیتها را میسر میسازد )Paetkau et al., 2004( و در مطالعه حاضر توانست جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر مهاجر به رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود را به طور کامل از یکدیگر تفکیک نماید. همچنین در آنالیز تجزیه به مؤلفه

316 های اصلی، محورها یا مؤلفه ها به طور متوالی از ماتریس شباهتها استخراج می گردند که به طور تیپیک از همبستگی ها یا کوواریانس بین متغیرها نتیجه می شوند )Quicke, 1993( و داده های استاندارد و دارای بیشترین واریانس، در اولین محور عاملی3 و بیشترین مقدار باقیمانده واریانس که توسط محور اول در نظر گرفته نشده در دومین محور عاملی1 با زاویه قائمه نسبت به اولین محور عاملی قرار گرفته است ) ,Fry 1993( و این آنالیز در مطالعه حاضر توانست جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر مهاجر به رودخانه های چشمه کیله و کرگانرود را به طور کامل از یکدیگر تفکیک نماید. 5-1- روش توالي یابي ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA با کشف توالیهای موجود در میتوکندری امکان بررسی ژنهای کنترل کننده موجود در این اندامک به عنوان یکی از دیدگاههای جدید و مهم مطالعات ژنتیکی در آمده است )Magoulas and Zouros, 1993( و تعیین توالی ژنوم امکان بررسی الگوهای تنوع ژنتیکی در گونه های مختلف را فراهم کرده و با پیشرفت و تکامل دستگاه های تعیین توالی و نرم افزارهای تخصصی مطالعات ژنتیکی متداول تر، راحت تر و به دور از هر گونه اشتباه است )Hedrick, 1999(. ماهیان دریایی تنوع ژنتیکی بیشتری نسبت به ماهیان آب شیرین نشان می دهند که دلیل آن را به بزرگ بودن اندازه مؤثر جمعیت، جریان ژنی باال در محیطهای دریایی و بالعکس جریان ژنی محدود در ماهیان آب شیرین نسبت می دهند )Rossi et al., 2004(. در این مطالعه بیشترین تعداد جایگاه پلی مورفیک )153( و بیشترین تعداد هاپلوتایپ )34( در رودخانه چالوس و بیشترین درصد فراوانی هاپلوتایپ )31/1( در رودخانه آستارا مشاهده شد و فراوانی هاپلوتایپی میان رودخانه های مورد مطالعه معنی دار بود )P<0.05( که بیانگر فرضیه جدایی جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه است. Bardakci و همکاران )2006(، در بررسی تنوع ژنتیکی قزل آالی قهوه ای ترکیه1 با استفاده از روش PCR- RFLP روی ژنوم میتوکندری، 17 عدد هاپلوتایپ مختلف شناسایی نمودند. Hashemzadeh Segherloo و همکاران )2012(، در بررسی وضعیت فیلوژنتیکی ماهی قزل آالی خال قرمز در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر و دو دریاچه در حوضه دریاچه های داخلی ایران با استفاده از روش توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA، 7 عدد هاپلوتایپ مختلف شناسایی نمودند. در این مطالعه بیشترین میانگین هتروزایگوسیتی مشاهده شده در رودخانه چالوس، بیشترین میانگین تعداد آلل مشاهده شده و بیشترین میانگین هتروزاگوسیتی مورد انتظار در رودخانه سردآبرود مشاهده شد )جدول 4-31( و میانگین تعداد آلل و هتروزایگوسیتی مشاهده شده در رودخانه های مورد مطالعه کمتر از مقدار

1 - PC1 2 - PC2 3 - Salmo trutta L.

317 اعالم شده توسط )Dewoody and Avise, 2000(، برای ماهیان رود کوچ )1/33( و )68/1( است که پایین بودن آن را می توان به عوامل مختلفی چون تفاوت درجه حرارت، شوری، مواد مغذی و جریانات دریایی بین زیستگاه های مختلف دریای خزر، آمیزش های خویشاوندی و ... نسبت داد. Vera و همکاران )2011(، با مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از روش توالی یابی مولکول mtDNA دامنه تعداد آلل مشاهده شده را بین 4/6-3/3 به دست آوردند که کمتر از مقدار اعالم شده توسط )Dewoody and Avise, 2000(، برای ماهیان رود کوچ است. در این مطالعه نمونه های ماهی آزاد دریای خزر رودخانه های چالوس، سردآبرود و آستارا خارج از تعادل هاردی- واینبرگ قرار داشتند )P<0.05( که می تواند به علت حضور آللهای نول، وجود آمیزش های خویشاوندی، مخلوط شدن و غیر کافی بودن نمونه ها باشد. در این مطالعه بیشترین مقدار FST )16/1( بین رودخانه های چالوس و آستارا مشاهده شد و با توجه به نظریه Dorak )2005(، میزان تمایز ژنتیکی بین رودخانه های چالوس و آستارا )16/1( متوسط و بین رودخانه های چالوس و سردآبرود )11/1( و سردآبرود و آستارا )13/1( پایین بود. Vera و همکاران )2011(، با مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از روش توالی یابی مولکول mtDNA مقدار FST را 11/1 به دست آوردند که بر اساس نظریه Dorak )2005(، بیانگر تمایز ژنتیکی زیاد می باشد. میزان جریان جریان ژنی در رودخانه های مورد مطالعه )78/1( بزرگتر از یک به دست آمد و بر اساس گزارش Li و همکاران )2007(، در این مطالعه جریان ژنی اصلی ترین عامل در ایجاد تمایز ژنتیکی و بیانگر تکامل گروهی جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه است. میزان اختالف های نوکلئوتیدی در هر توالی به صورت فاصله ژنتیکی تخمین زده می شود. بنابراین بسته به میزان تفاوت نوکلئوتیدها در هر توالی، اختالف های درون گونه ای و بین گونه ای مشخص می شود. این عامل به طور مستقیم یا از طریق ارتباط با مهاجرت مؤثر، برآورد کننده تمایز ژنتیکی است. بیشترین فاصله ژنتیکی و کمترین شباهت ژنتیکی بین رودخانه های چالوس و آستارا و کمترین فاصله ژنتیکی و بیشترین شباهت ژنتیکی بین رودخانه های سردآبرود و آستارا مشاهده شد و بین رودخانه های مورد مطالعه از نظر میانگین فاصله ژنتیکی اختالف معنی دار وجود داشت )P<0.001( )جدولهای 4-34 و 4-35(. با توجه به نظریه Shaklee و همکاران )1982( و Thorpe و همکاران )1994( و بر اساس نتایج میانگین فاصله ژنتیکی، ماهیان آزاد رودخانه های سردآبرود و آستارا گونه های هم جنس و رودخانه های )سردآبرود و چالوس( و

318 )چالوس و آستارا( جمعیتهای هم گونه می باشند. Vera و همکاران )2011(، در مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از روش توالی یابی mtDNA، میزان فاصله ژنتیکی ماهیان آزاد رودخانه های مورد مطالعه را P< 0.001( 1/11( محاسبه نمودند که بر اساس نظریه Shaklee و همکاران )1982( و Thorpe و همکاران )1994(، در محدوده گونه های هم جنس )63/1-11/1( قرار می گیرند. هاپلوتایپها، شاخص خوبی برای تعیین میزان تفاوت ژنتیکی جمعیتها از یکدیگر بوده و تراز تنوع ژنتیکی یا هاپلوتایپی می تواند از صفر )همه افراد جمعیت دارای هاپلوتایپ یکسان( تا یک )همه افراد جمعیت دارای هاپلوتایپهای متفاوت( متغیر باشد )Aboim et al., 2005(. اغلب گزارشهای مربوط به آنالیز mtDNA ماهیان تنوع هاپلوتایپی کمی را نشان می دهد و تعداد هاپلوتایپهایی هم که وجود دارد در واقع مشتقات جهش یافته می باشند )Billington and Hebert, 1991(. در موجودات خونسرد به دلیل متابولیسم پایین سرعت تکاملی و تغییر نوکلئوتیدی mtDNA کم است )Beaumant, 1994( و از سوی دیگر تنوع mtDNA تنها بر اساس جهش می باشد و نوترکیبی در آن دخالتی نداشته و اندازه کوچک جمعیت و فشار صید از عوامل کاهش دهنده تنوع ژنتیکی در ماهیان می باشند )Krieger et al., 2000(. در این مطالعه بیشترین میانگین تنوع نوکلئوتیدی )π( در رودخانه سردآبرود و کمترین میانگین آن در رودخانه آستارا مشاهده شد و میانگین تنوع هاپلوتایپی )h( نیز در هر سه رودخانه یک به دست آمد )جدول 4-36( که بیانگر متفاوت بودن هاپلوتایپ همه افراد جمعیت و تنوع ژنتیکی می باشد. Bardaki و همکاران )2006(، در بررسی تنوع ژنتیکی قزل آالی قهوه ای ترکیه با استفاده از روش PCR- RFLP روی ژنوم میتوکندری، میانگین تنوع نوکلئوتیدی و هاپلوتایپیی را به ترتیب 1114/1 و 3137/1 محاسبه نمودند. Vera و همکاران )2011(، در مطالعه ساختار ژنتیکی مولدین ماهی آزاد دریای خزر ایران جمع آوری شده از رودخانه های کرگانرود )8 عدد(، ناورود )8 عدد( و تنکابن )66 عدد( و 48 عدد بچه ماهی حاصل از جمعیت رودخانه سردآبرود با استفاده از روش توالی یابی mtDNA، میانگین تنوع نوکلئوتیدی و هاپلوتایپی را به ترتیب 113/1 و 151/1±686/1 محاسبه نمودند. نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی در مطالعه حاضر نشان داد که بیشترین میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیت هر رودخانه وجود دارد و اختالف تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه معنی دار است )P<0.01( که بیانگر باال بودن توانایی باالی جمعیتهای مورد مطالعه در پاسخ به انتخاب طبیعی و سالمت افراد آن جمعیت می باشد )Kalinowski, 2005(.

319 جانشینی نوکلئوتیدی که در بین بازهای یک توالی رخ می دهد از نوع Transition و Transversion است. Transition زمانی رخ می دهد که یک باز پورین )A و G( به باز پورین دیگر و یا یک باز پیریمیدین )C و T( به باز پیریمیدین دیگر تبدیل شود و Transversion زمانی رخ می دهد که یک باز پورین به باز پیریمیدین و یا بالعکس تبدیل شود و این دو فاکتور به عنوان شاخصهای تنوع مولکولی مطرح می باشند )Tamura et al., 2004( و در این مطالعه بیشترین تعداد Transition و Transversion در رودخانه چالوس مشاهده شد که بیانگر باال بودن میزان تنوع مولکولی این رودخانه نسبت به سایر رودخانه های مورد مطالعه می باشد )جدول 4-33(. مهمترین مسأله در رده بندی، تعیین درجه خویشاوندی است و از آن در تعیین میزان خویشاوندی افراد، نمونه ها، تاکسون ها و یا شباهت بین سطوح مختلفی از اکوسیستم ها و ... استفاده می شود. میزان ارتباطی که گونه های یک خانواده با یکدیگر دارند، ناشی از شباهت و اختالف در توالی ژنوم آنهاست. تغییراتی که در الگوی توالی ژنوم گونه ها از قبیل جهش رخ می دهد باعث می شود تکامل دو گونه با نرخ متفاوتی از یکدیگر جریان یابد. میزان کم تغییرات ژنوم )در دو گونه ی خواهری یا گونه هایی با خویشاوندی نزدیک( در اثر جانشینی بازها صورت می گیرد. آزمون تاجیما بر اساس میانگین تفاوت نوکلئوتیدها تعیین می نماید که جهشها تحت انتخاب بی طرف و خنثی بوده اند یا خیر و بر اساس این آزمون، اگر P<0.05 باشد، فرضیه صفر )برابری نرخ تکامل بین شجره ها( رد می شود و در صورتی که P>0.05 باشد نشان دهنده برابری نرخ تکامل بین شجره ها می باشد )Tajima, 1993( و در این مطالعه بیشترین درجه خویشاوندی در رودخانه سردآبرود و کمترین آن در رودخانه آستارا مشاهده شد و میانگین درجه خویشاوندی ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه کوچکتر از 15/1 به دست آمد یعنی نرخ تکامل بین شجره هایشان برابر نمی- باشد )P<0.05( )جدول 37-4(. نبودن اطالعات فیلوژنیک در صفات مهم تجاری برای ماهیان مانع از پیشرفتهای آبزی پروری در زمینه ژنتیک نژادها و افزایش جمعیت می شود و باید توجه بیشتری به جمعیتهای هچری در برنامه های تولید مثلی و اسناد شجره نامه در ذخیره سازی مولدین داشت )Lundrigan, 2005(. درختهایی که بر اساس صفات گونه ها و شباهتهای بین آنها ساخته می شوند شامل Maximum Parsimony و Maximum Likelihood و درختهایی که بر اساس فاصله تکاملی بین گونه ها ساخته می شوند شامل Neighbour Joining و UPGMA می باشند. در آنالیز خود راه انداز نیز جایی که شاخه جدید ایجاد می شود عددی از 311-1 تعلق می گیرد که این عدد میزان اطمینان و صحت شاخه ایجاد شده را نشان می دهد و عددهای متفاوتی که در زیر شاخه ها مشاهده می شوند نشان دهنده تفاوتهای نوکلئوتیدی نمونه ها با یکدیگر است )Tamura et al., 2007(. در این مطالعه جهت رسم درخت فیلوژنی از روشهای Maximum Parsimony و

341 Neighbour Joining استفاده شد. مقایسه این دو درخت نشان داد که توالی نوکلئوتیدی بیشتر ماهیان آزاد دریای خزر رودخانه های مورد مطالعه و 4 گونه منتخب بانک ژن بسیار به هم نزدیک بوده که بیانگر شباهت ژنتیکی آنها با یکدیگر و برابری نرخ تکامل بین شجره هایشان می باشد و درخت رسم شده به روش Neighbor Joining از صحت و اطمینان بیشتری برخوردار است. Hashemzadeh Segherloo و همکاران )2012(، در بررسی وضعیت فیلوژنتیکی ماهی قزل آالی خال قرمز در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر و دو دریاچه در حوضه دریاچه های داخلی ایران با استفاده از روش توالی یابی ژن ناحیه -D Loop مولکول mtDNA و رسم درخت تبارزایی به روش Maximum Likelihood جدایی مشخصی را در نمونه های مناطق مورد مطالعه مشاهده نکردند. 5-9- نتیجه گیری کلي نتایج حاصل از مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد در پنج رودخانه حوضه جنوبی دریای خزر نشان داد که جمعیت یکسانی از این ماهی در رودخانه های مورد مطالعه وجود نداشته و در روش ریز ماهواره دو گروه ژنتیکی متفاوت )چشمه کیله و کرگانرود( و در روش توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA سه گروه ژنتیکی متفاوت )چالوس، سردآبرود و آستارا( از این گونه در رودخانه های مورد مطالعه تشخیص داده شد و رودخانه های کرگانرود در روش ریز ماهواره و چالوس در روش توالی یابی دارای باالترین میزان تنوع ژنتیکی بودند. بنابراین علیرغم فشار صید و کاهش شدید ذخایر، این ماهی توانسته تنوع ژنتیکی خود را به میزان قابل توجهی حفظ نماید و به نظر می رسد تکثیر مصنوعی و رهاسازی بچه ماهیان در طبیعت هنوز اثر درخور توجهی روی سطوح تنوع ژنتیکی این گونه نداشته است ولی با این وجود، با توجه به اینکه بازسازی ذخایر این ماهی توسط سازمان شیالت ایران در مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر کالردشت در حال انجام بوده و در آینده نیز ادامه خواهد یافت، ارائه تدابیر و انجام اقدامات الزم برای حفظ و تقویت تنوع ژنتیکی این گونه و اجتناب از مشکالت حاصل از درون آمیزی و برون آمیزی ضروری به نظر می رسد. همچنین نتایج نشان داد که روش ریز ماهواره عالوه بر مقرون به صرفه بودن توانایی باالتری برای نشان دادن میزان تنوع ژنتیکی ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر نسبت به روش توالی یابی ژن ناحیه D- Loop مولکول mtDNA داشته است. 5-4- پیشنهادات اجرایي 3- ضرورت حفظ و بازسازی ذخایر جمعیتهای ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مورد مطالعه به دلیل مستقل بودن آنها 1- تکثیر ماهی آزاد دریای خزر در رودخانه های مهم دیگر حوضه جنوبی دریای خزر و رهاسازی بچه ماهیان حاصل از تکثیر هر رودخانه به داخل همان رودخانه به منظور حفظ ذخیره ژنتیکی و بازسازی ذخایر

343 1- ایجاد مناطق حفاظت شده و بازسازی مکانهای تخمریزی طبیعی این گونه 4- ایجاد بانک زنده از جمعیتهای مختلف ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ایران جهت حفظ این گونه مهم و ارزشمند زیست محیطی و شیالتی 5- بهبود کیفیت حفظ و بازسازی ذخایر ماهی آزاد دریای خزر با استفاده از یافته های این مطالعه 6- حمایت مالی و اجرایی مؤسسات و سازمانهای مرتبط برای ادامه مطالعات ژنتیکی این گونه در آینده 5-5- پیشنهادات پژوهشي 3- استفاده همزمان روشهای ریز ماهواره و توالی یابی در مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد در سایر رودخانه های محل مهاجرت این ماهی در حوضه جنوبی دریای خزر جهت بهبود برنامه های مدیریتی و بهره برداری از ذخایر این گونه 1- لزوم به کار گیری تعداد بیشتر آغازگرهای ریز ماهواره به دلیل توانایی باالی این روش در نشان دادن تنوع ژنتیکی جهت تفکیک جمعیتهای احتمالی ماهی آزاد دریای خزر در مطالعات آینده 1- استفاده از ژنهای دیگر نظیر ND5/6 ،ND5 ،ND1 و ... برای مطالعه تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر به روش توالی یابی 4- استفاده از تعداد نمونه های بیشتر در مطالعات آینده

342

منابع و مآخذ

341 فهرست منابع فارسي 3- آکادمی علوم قزاقستان. 3334. تنوع زیستی منابع زنده دریای خزر. 358 ص. 1- امین الری، م. 3178. پیش درآمدی بر مهندسی ژنتیک. انتشارات دانشگاه شیراز، 131 ص. 1- بریمانی، ا. 3156. ماهی شناسی و شیالت. انتشارت دانشگاه تهران، جلد اول، شماره 3118، 116 ص. 4- بنابازی، م. ح. 3183. بررسی تنوع ژنتیکی در درون و بین پنج جمعیت گوسفند ایرانی با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره. پایان نامه کارشناسی ارشد علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران، 311ص. 5- بهرامیان، ب. 3174. گزارش عملکرد و تولید مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید دکتر باهنر کالردشت 75-3174. 33 ص، صفحه 3. 6- بهرامیان، ب. 3176. بررسی و تعیین طول و وزن مناسب بچه ماهی آزاد دریای خزر تکثیر و پرورش یافته در مرکز دکتر باهنر کالردشت جهت رهاسازی. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، گروه بیولوژی ماهیان، دانشکده علوم و فنون دریایی، دانشگاه تهران شمال، 313 ص، صفحات 31-7 و 38. 7- بهرامیان، ب. 3181. نقش اداره کل تکثیر و بازسازی ذخایر و اهمیت فزاینده مرکز تکثیر و پرورش آزاد ماهیان شهید باهنر کالردشت در حفظ و افزایش ماهی آزاد حوضه جنوبی دریای خزر ) Salmo trutta caspius(. گزارش نهایی، انتشارات مؤسسه تحقیقات شیالت ایران، پژوهشکده اکولوژی دریای خزر. 8- پورغالم، ح.، زمینی، ع. ع.، اللوئی، ف.، خارا، ح. و نادری، م. 3188. بررسی ژنتیک جمعیت گاو ماهی سرگنده )Neogobius gorlap( حوضه جنوبی دریای خزر با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره ای. مجله علمی شیالت ایران، سال هجدهم، شماره 4، زمستان 3188، صفحات 15-11. 3- پورنقشبند، ز. 3181. آشنایی با PCR. انتشارات صنم، 361 ص. 31- پهلوان یلی، م. 3177. بوم شناسی، تعیین میزان هم آوری در یک دوره تکثیر و تکثیر مصنوعی ماهی آزاد دریای خزر. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران. 33- تقوی، ا. 3177. روشهای مناسب حفاظت از منابع آبزیان. مجموعه مقاالت ماهیگیری مسئوالنه، شرکت سهامی شیالت ایران، صفحات 43-55. 31- جرفی، الف. 3186. مطالعه ژنتیکی ماهی صبور در منطقه خوزستان با استفاده از روش RAPD- PCR. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 316 ص، ص 1. 31- جمالزاده، ح. ر. 3181. بررسی فاکتورهای خونی آزاد ماهی دریای خزر. پایان نامه کارشناسی ارشد بیولوژی دریا، دانشکده علوم و فنون دریایی، دانشگاه آزاد اسالمی واحد تهران شمال، 335 ص، ص 13. 34- جمالزاده، ح. ر. 3181. زیست شناسی و اکولوژی آزاد ماهی دریای خزر. سمینار کارشناسی ارشد بیولوژی دریا، دانشکده علوم و فنون دریایی، دانشگاه آزاد اسالمی واحد تهران شمال، 65 ص.

344 35- جوانروح علی آباد، ع. 3183. بررسی تنوع ژنتیکی شش توده بز بومی ایران با استفاده از نشانگرهای RAPD. پایان نامه کارشناسی ارشد علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران، 74 ص. 36- چشمه ای، م. ر. 3185. بررسی تنوع ژنتیکی اردک ماهی منطقه گیالن با استفاده از نشانگر ریز ماهواره. پایان نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه گیالن. 37- چکمه دوز قاسمی، ف. 3188. بررسی امکان تمایز ژنتیکی و مقایسه ساختار ژنتیک جمعیت ماهی سفید )Rutilus frisii kutum( نژاد بهاره و پاییزه با استفاده از روش تعیین توالی DNA ( DNA Sequencing( و Microsatellite. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد الهیجان، 318 ص. 38- حسن ساجدی، ر. 3178. بررسی تنوع ژنتیکی در ماهی های مولد قزل آالی رنگین کمان با استفاده از تکنیک PCR- RFLP روی ژنوم میتوکندری. پایان نامه کارشناسی ارشد بیوشیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت مدرس، 83 ص. 33- خارا، ح. 3181. بررسی وجود تنوع مورفومتریک، مریستیک و ژنتیک مولکولی درون گونه ای ماهی سیم )Abramis brama orientalis( در تاالب انزلی، سواحل جنوبی دریای خزر، دریاچه سد ارس و جمهوری آذربایجان. رساله دکتری شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 111 ص. 11- خالدی، ه. 3131. مطالعه ساختار ژنتیکی جمعیتهای ماهی راشگو معمولی ) Eleutheronema tetradactylum( در خلیج فارس و دریای عمان با استفاده از تعیین توالی )Sequencing( ژن 28S rRNA و PCR- RAPD. رساله دکتری زیست شناسی دریا، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، 343 ص. 13- دانشور آملی، ع. ر. 3181. بررسی پلی مورفیسم تعدادی از مارکرهای میکروستالیتی در جمعیت گوسفند بلوچی. پایان نامه کارشناسی ارشد علوم دامی، گرایش ژنتیک و دام، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران، 311 ص. 11- درافشان، س.، کلباسی، م. ر.، پورکاظمی، م. و مجازی امیری، ب. 3183. کاربرد نشانگر ریز ماهواره در بررسی صحت آمیخته گری بین دو گونه اقتصادی آزاد ماهیان ایران. مجله زیست شناسی ایران، جلد بیست و سوم، شماره یک، 3183، صفحات 85-31. 11- دریانبرد، غ. ر. 3187. مطالعه خصوصیات تولید مثلی ماهی کفال طالیی )Liza aurata( در سواحل جنوبی دریای خزر )استان مازندران(. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، دانشکده شیالت و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، 34 ص.

345 14- دریانبرد، غ. ر.، عبدالملکی، ش.، بندانی، غ. و کر، د. 3187. ارزیابی ذخایر ماهیان استخوانی در سواحل جنوبی دریای خزر )86-3184(. گزارش نهایی، مؤسسه تحقیقات شیالت ایران، پژوهشکده اکولوژی دریای خزر، 381 ص. 15- دفتر طرح و توسعه شیالت. 3181. شناسایی دریای خزر. شرکت سهامی شیالت ایران، 146 ص. 16- رحمانی، ح.، کاظمی، ب.، پورکاظمی، م.، بنده پور، م.، نادری جلودار، م.، نگار، س. و عطائی، ف. 3188. تنوع ژنتیکی جمعیتهای ماهی شاه کولی )Chalcalburnus chalcoides( در رودخانه های هراز، شیرود و گزافرود با استفاده از ژن 18S rRNA به روش PCR- RFLP. مجله علوم محیطی، سال ششم، شماره سوم، بهار 3188، صفحات 53-41. 17- رسولی، ب. 3184. نقش عوامل محیطی و شرایط کیفی آب رودخانه شیرود در رسیدگی جنسی ماهی سفید. سمینار کارشناسی ارشد شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد الهیجان، 11 ص، صفحات8-13 . 18- رضایی، م.، شعبانی، ع.، شعبانپور، ب. و کشیری، ح. 3183. بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت ماهی سفید )Rutilus frisii kutum( در سواحل استان گلستان با استفاده از نشانگر ریز ماهواره. مجله علمی شیالت ایران، سال بیستم، شماره 1، پاییز 3183، صفحات 353-355. 13- رضوانی گیل کالئی، س.، اللوئی، ف.، عقیلی، ر. و ابراهیم زاده موسوی، ح. ع. 3185. معرفی نشانگرهای ژنتیکی برای شناسایی و جداسازی پنج گونه از خانواده کپور ماهیان دریای خزر به روش -PCR RFLPs. مجله علمی شیالت ایران، سال پانزدهم، شماره 1، صفحات 43-58. 11- رضوانی گیل کالئی، س.، گلستانی، ن.، فاطمی، م. ر.، اللوئی، ف. و غفله مرمضی، ج. 3187. بررسی مولکولی جمعیت ذخایر ماهی حلوا سفید )Pampus argenteus( خلیج فارس و دریای عمان در آبهای ایران و کویت. مجله علمی شیالت ایران، سال هفدهم، شماره 4، زمستان 3187، صفحات 45-55. 13- رضوانی گیل کالئی، س.، ساالری علی آبادی، م. ع.، سواری، ا.، ذوالقرنین، ح. و نبوی، س. م. ب. 3188. بررسی ساختار ژنتیکی ماهی سوکال )Rachycentron canadum( با استفاده از نشانگرهای ریز- ماهواره. مجله علمی شیالت ایران، سال هجدهم، شماره 1، پاییز 3188، صفحات 67-77. 11- رضوانی گیل کالئی، س.، قطب رزمجو، ا.، اللوئی، ف.، تقوی، م. ج. و نوروزی، م. 3131. مقایسه تنوع ژنتیکی جمعیت گاو ماهی خزری )Neogobius caspius Eichwald, 1831( در غرب و شرق سواحل جنوبی دریای خزر با استفاده از روش ریز ماهواره. مجله علمی شیالت ایران، سال بیستم، شماره 3، بهار 3131، صفحات 65-71. 11- رضوی صیاد، ب. 3178. مقدمه ای بر اکولوژی دریای خز. مؤسسه تحقیقات و آموزش شیالت ایران، 31 ص.

346 14- رفیعی، الف. 3185. بررسی تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر )Salmo trutta caspius(. پایان نامه کارشناسی ارشد بیولوژی دریا، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیالن، 58 ص. 15- رهبر، م.، نظامی بلوچی، ش. ع.، خارا ، ح. و رضوانی، م. 3188. تعیین رابطه سن مولدین ماده با عوامل مؤثر در تکثیر مصنوعی در ماهی آزاد دریای خزر )Salmo trutta caspious, Kessler 1877(. مجله علمی شیالت ایران، سال سوم، شماره چهارم، زمستان 3188. 16- رهبر، م.، نظامی بلوچی، ش. ع.، خارا، ح.، رضوانی، م.، شمس پور، س.، کامکار، م. و موحد، ر.، 3188. تعیین رابطه سن مولدین نر با عوامل کارایی تکثیر مصنوعی در ماهی آزاد دریای خزر ) Salmo trutta caspius, Kessler 1877(. مجله علوم زیستی دانشگاه آزاد اسالمی واحد الهیجان، سال سوم، شماره اول، بهار 3188. 17- سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح. 3181. فرهنگ جغرافیایی رودهای کشور )حوضه آبریز دریای خزر(. جلد دوم، انتشارات سازمان جغرافیایی نیروهای مسلح، 141 ص. 18- ستاری، م.، شاهسونی، د. و شفیعی، ش. 3181. ماهی شناسی )1(، سیستماتیک. انتشارات حق شناس، 511 ص، صفحات 144-151. 13- سیادتیان، ف.، قریشی، ع.، امینی، ف.، فاطمی، م. ر.، صالحی تبار، ر. و هوشمند، م. 3186. بررسی فیلوژنتیک کفال ماهیان گونه های Liza aurata و Liza salience در حوضه جنوبی دریای خزر با استفاده از روش توالی بخشی از mtDNA. پنجمین همایش ملی بیوتکنولوژی جمهوری اسالمی ایران، 5-1 آذر 3186، تهران. 41- سعیدی، ز. 3133. مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیت ماهی کفال طالیی )Liza aurata( در سواحل جنوبی دریای خزر با استفاده از روش توالی یابی mtDNA. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 311 ص. 43- شاه حسینی، م. ح. و سید رضای تهرانی، س. م. 3181. واکنش زنجیره ای پلیمراز. انتشارات پارسیران، 384 ص. 41- شریعتی، ا. 3173. ترجمه ماهیان دریای خزر و حوضه آبریز آن، کازانچف، اِ. ان. )مؤلف(. شرکت سهامی شیالت ایران، 373 ص. 41- شکیبی دریا کناری، ع. 3173. بررسی بیوتکنیک تکثیر ماهی آزاد دریای خزر. سمینار کارشناسی ارشد شیالت، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی، دانشگاه تربیت مدرس، 85 ص. 44- شیبانی، ز.، قریشی، ع.، امینی، ف.، فاطمی، م. ر.، صالحی تبار، ر. و هوشمند، م. 3186. بررسی روابط فیلوژنتیک کفال ماهیان شمال خلیج فارس )گونه های Liza abu و Liza subviridis با استفاده از بررسی

347 توالی نوکلئوتیدی منطقه ای از mtDNA. پنجمین همایش ملی بیوتکنولوژی جمهوری اسالمی ایران، 1-5 آذر 3186، تهران. 45- صفری، ر. 3185. بررسی ساختار ژنتیکی ماهی شیپ )Acipenser nudiventris( در سواحل جنوبی دریای خزر و رودخانه اورال با استفاده از روش Microsatellite. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، دانشکده شیالت و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، 311 ص. 46- عباسی، ک.، ولی پور، ع. ر.، طالبی حقیقی، د.، سرپناه، ع. ن. و نظامی بلوچی، ش. ع.، 3178. اطلس ماهیان ایران، آبهای داخلی گیالن. مرکز تحقیقات شیالت گیالن، بندر انزلی، 331 ص. 47- عبدالحی، ح. ع.، رضوانی گیل کالئی، س.، اللوئی، ف.، تقوی، م. ج.، حسن زاده صابر، م. و نیرانی، م. 3183. ساختار ژنتیک جمعیت ماهی سفید )Rutilus frisii kutum( حوضه جنوبی دریای خزر با استفاده از روش مولکولی. گزارش نهایی پروژه تحقیقاتی، مؤسسه تحقیقات شیالت ایران، 64 ص، صفحات 3-1. 48- عبدلی، الف. و نادری، م. 3187. تنوع زیستی ماهیان حوضه جنوبی دریای خزر. انتشارت علمی آبزیان، 118 ص. 43- عبدلی، الف. و نیک سیرت، ح. 3186. مروری بر فرآیند اسمولت شدن با تأکید بر آزاد ماهی دریای خزر. ماهنامه آبزیان، سال هشتم، دی 3186، صفحات 36-14. 51- عبدلی، الف. و نیک سیرت، ح. 3186. مروری بر زیست شناسی تولیدمثل گونه در حال انقراض، آزاد ماهی خزر از گذشته تا به حال. ماهنامه آبزیان، سال هشتم، اسفند 3186، صفحات 11-16. 53- عرفانی مقدم، و. 3181. حفاظت شدگی و توانایی ایجاد پلی مورفیسم میکروستالیتهای EST در تعدادی از گونههای مرتعی خانواده Leguminosae ایران. پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان، 314 ص. 51- علی بیک، ه. 3183. تکامل موجودات زنده. انتشارات فیروزه، 384 ص. 51- عمادی، ح.، 3164. ماهی آزاد دریای خزر بزرگترین نوع قزل آالی قهوه ای در جهان. ماهنامه آبزیان، شماره 4، صفحات 1-6. 54- قانع، ر. 3131. بررسی تنوع ژنتیکی کفال پوزه باریک )Liza saliens( در سواحل جنوبی دریای خزر با استفاده از روش توالی یابی mtDNA. پایان نامه کارشناسی ارشد شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 31 ص. 55- قدسی، ز.، شعبانی، ع. و شعبانپور، ب. 3131. بررسی تنوع زنتیکی ماهی کفال طالیی )Liza aurata( در سواحل استان گلستان با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره. مجله تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال سوم، شماره ششم، بهار 3131، صفحات 15-46.

348 56- قربانزاده، ر. و نظری، س. 3183. میزان تولید و رهاسازی بچه ماهیان آزاد دریای خزر. سالنامه آماری سازمان شیالت ایران 3188-3173، معاونت برنامه ریزی و توسعه مدیریت، دفتر برنامه و بودجه، 61 ص، صفحات 18-13. 57- قره یاضی، ب. 3175. کاربرد نشانگرهای DNA در اصالح نباتات. مجموعه مقاالت کلیدی چهارمین کنگره زراعت و اصالح نباتات ایران. 58- قریب خانی، م. 3188. بررسی ساختار ژنتیک جمعیت و فیلوژنی سوف حاجی طرخان ) Perca fluviatilis( در تاالب های انزلی و امیر کالیه الهیجان و سوف سفید )Sander lucioperca( در سد ارس و حوضه جنوب غربی دریای خزر. رساله دکتری شیالت، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 375 ص، صفحه 318. 53- قطب رزمجو، ا. 3186. بررسی مورفولوژی و ژنتیکی جمعیت گاو ماهی خزری ) Neogobius caspius( در حوضه جنوبی خزر به روش PCR- RFLP. پایان نامه کارشناسی ارشد بیولوژی دریا، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 71 ص. 61- قطب رزمجو، الف.، رضوانی گیل کالئی، س.، قوام مصطفوی، پ.، فاطمی، م. ر. و پورکاظمی، م. 3187. بررسی ساختار ژنتیکی جمعیت گاو ماهی خزری )Neogobius caspius( در حوضه جنوبی خزر به روش PCR- RFLP. مجله علمی شیالت ایران، سال دوم ، شماره سوم، پاییز 3187. 63- قلیچ پور، م.، شعبانی، ع. و شعبانپور، ب. 3183. مقایسه ساختار ژنتیکی دو جمعیت کپور معمولی )Cyprinus carpio( در مناطق قره سو و انزلی با استفاده از هشت نشانگر ریز ماهواره. مجله تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال دوم، شماره پنجم، زمستان 3183، صفحات 13-48. 61- کریم پور، م. و حسین پور، ن. 3167. ماهی آزاد دریای مازندران. مؤسسه تحقیقات شیالت ایران، 314 ص. 61- گله داری، ح. و فروغمند، ع. 3185. مهندسی ژنتیک جامع. انتشارات گلهای بهشت، 433 ص. 64- اللوئی، ف.، رضوانی گیل کالئی، س. و پورکاظمی، م. 3181. بررسی مولکولی جمعیت ماهی Barbus capito در آبهای حوضه جنوبی دریای خزر به روش PCR- RFLP. مجله علمی شیالت ایران، سال دوازدهم، شماره 3، بهار3181، صفحات 337-311. 65- اللوئی، ف.، رضوانی گیل کالئی، س.، نیرانی، م. و تقوی، م. ج.، 3185. بررسی مولکولی جمعیت ماهی کیلکای معمولی )Clupeonella cultiventris( در حوضه جنوبی دریای خزر به روش PCR- RFLP. مجله علمی شیالت ایران، سال پانزدهم، شماره 1، تابستان 3185، صفحات 333-318.

349 66- اللوئی، ف.، رضوانی گیل کالئی، س.، فاطمی، ر. و تقوی، ج. 3187. بررسی ژنتیک جمعیت ماهی کپور معمولی )Cyprinus carpio( حوضه جنوبی دریای خزر با استفاده از PCR- RFLP( mtDNA(. مجله علمی شیالت ایران، سال هفدهم، شماره 1، تابستان 3187، صفحات83-313 . 67- محمدیان، س.، رضوانی گیل کالئی، س.، کاظمیان، م.، کمالی، الف.، تقوی، م. ج.، روح الهی، ش.، اللوئی، ف. و نیرانی، م. 3183. مطالعه تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت ماهی سیاه کولی ) Vimba vimba persa( در سواحل شرقی و غربی دریای خزر )رودخانه های حویق و گرگانرود( با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره. مجله تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال دوم، شماره پنجم، زمستان 3183، صفحات 13-18. 68- مردانی، د. 3171. بیوشیمی ژنتیک از ژن تا پروتئین. نشر خدمات آموزشی و فرهنگی مبتکران. 63- نعمت زاده، م.، رضوانی گیل کالئی، س.، خالصی، م. ک. و اللوئی، ف. 3131. بررسی تنوع ژنتیکی 6 گونه از کفال ماهیان آبهای ایران به روش PCR- Sequencing با استفاده از ژنوم mtDNA. کتاب اولین کنفرانس ملی آبزی پروری ایران، ص 358. 71- نقوی، م.، قره یاضی، ب. و حسینی سالکده، ق. 3186. نشانگرهای مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران، چاپ دوم، 114 ص، صفحات 311-345. 73- نوروزی، م. 3186. بررسی ساختار ژنتیکی جمعیتهای ماهی ازون برون )Acipenser stellatus( دریای خزر با استفاده از روش مولکولی میکروستالیت. رساله دکتری بیولوژی دریا، دانشگاه آزاد اسالمی واحد علوم و تحقیقات تهران، 371 ص. 71- نویدی مقدم فومنی، ر. 3184. بررسی تنوع ژنتیکی ماهی آزاد دریای خزر جمعیت منطقه تنکابن با استفاده از نشانگرهای ریز ماهواره )Microsatellite markers(. پایان نامه کارشناسی ارشد بیولوژی دریا، دانشکده علوم پایه دانشگاه گیالن، 331 ص. 71- وثوقی، غ. ح. و مستجیر، ب. 3185. ماهیان آب شیرین. مؤسسه انتشارات و چاپ دانشگاه تهران، 137 ص، صفحات 313-343. 74- یزدی صمدی، ب. و ولیزاده، م. 3181. ژنتیک از دیدگاه مولکولی. انتشارات دانشگاه تهران، 441 ص. 75- یوسفیان، م.، رضوانی، م.، اللوئی، ف.، نیرانی، م.، فیروزکندیان، ش.، پاشازانوسی، ع.، میار، م.، نهاوندی، ر.، تقوی، م. ج.، آذری، ع. و فرزانفر، ع. 3183. ارتقاء نرخ رشد ماهی آزاد از طریق بهگزینی. گزارش نهایی، مؤسسه تحقیقات شیالت ایران، پژوهشکده اکولوژی دریای خزر، 31 ص.

351 فهرست منابع انگلیسي 1- Aboim, M. A., Menezez, G. M., Schlitt, T. and Rogers, A. D. 2005. Genetic structures and history of populations of the deep- Sea fish Helicolenus dactylopterusinferred from mtDNA sequence analysis. Molecular Ecology, Vol. 14: pp. 1343-1354. 2- Adams, B. K. and Hutchings, A. 2003. Micro geographic population structure of Brook charr: a comparison of microsatellite and mark-recapture data. Journal of Fish Biology, Vol. 62: pp. 517-533. 3- Aguilar, A., Banks, j. D., Levine, K. F. and Wayne, R. K., 2005. Population genetics of northern pike (Esox lucius) introduced into Lake Davis, California. Can. J. Fish. Sci. Aquaculture, Vol. 62: pp. 1589-1599. 4- Aladin, N. B. and Plotnikov, I. S. 2004. The Caspian Sea, Lake Basin Management Initiative. The Caspian Bulletin, Vol. 4: pp. 112–126. 5- Alarcon, J. A., Magoulas, A., and Alvarez, M. C. 2004. Genetic comparison of wild and cultivated European population of the Gillhead sea bream. Aquaculture, Vol. 230: pp. 65-80. 6- Armantrout, N. B. 1980. The freshwater fishes of Iran. Ph.D. Thesis Oregon State University, Corvallis, Oregon, U.S.A, 427 P. 7- Atabeyoglu, K. 2007. Determination of genetic differences between mtDNA D- Loop F1 and 12S1-H region of native Salmons (Salmo trutta sp.) caught in the Rivers of Aras, Karasu and Coruh in our district using PCR- RFLP and microsatellite methods. Ms Thesis, Department of Fisheries, Institution of Natural and Applied Sciences, Ataturk University, 62 P. 8- Avise, J. C. and Saunders, N. C. 1984. Hybridization and introgression among species of sunfish (Lepomis): analusis by mitochondrial DNA and allozyme markers. Genetics, Vol. 108: pp. 237-255. 9- Avise, I. C., Arnold, J., Ball, R. M., Birmingham, E., Lamb, T., Neigel, J. E., Reeb, C. A. and Saunders, N. C. 1987. Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA Bridge between population genetics and systematic. Annual Review of Ecology and Systematic, Vol. 18: pp. 489-522. 10- Awata, S., Munehara, H. and Kohda, M. 2005. Social system and reproduction of helpers in a cooperatively breeding cichlid fish (Julidochromis ornatus) in Lake Tanganyika: field observations and parentage analyses. Behav. Ecol. Sociobiol. Vol. 58: pp. 506-516. 11- Balloux, F., Brunner, H. and Lugon- Moulin, N. 2002. The estimate of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology, Vol. 11: pp. 321-323. 12- Banks, M. A., Rashbrook, V. K., Calavetta, M. J., Dean, C. A. and Hedgecock, D. 2000. Analysis of microsatellite DNA resolves genetic structure and diversity of Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) in Californian’s central valet. pp. 915-927. 13- Barber, P. H. and Erdman, M. V. 2000. Molecular systematic of the Gonodactylidae (stomapoda) using mitochondrial cytochrome oxidase C (submit) DNA sequencing data. Journal of Crustacean Biology, Vol. 20 (2): pp. 20-36. 14- Bardakci, F., Degerli, N., Ozdemir, O. and Basibuyuk, H. H. 2006. Phylogeography of the Turkish brown trout Salmo trutta L.: mitochondrial DNA PCR-RFLP variation. Journal of Fish Biology, Vol. 68 (Supplement A): pp. 36–55. 15- Barroso, R. M., Wheeler, P. A., LaPtra, S. E., Drea, R. E. and Thorgaard. 2008. QTL for IHNV resistance and growth identified in a rainbow (Oncorhynchus mykiss) × Yellowstone cutthroat (Oncorhynchus clarki bouvieri) trout cross. Aquaculture, Vol. 277: Issues 3-4, pp. 156-163.

353 16- Bassam, B. J., Caetano- Anolles, G. and Gresshoff, G. M. 1991. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Annual Biochemistry, Vol. 84: pp. 680-683. 17- Bataillon T. M., David J. L. and Schoen D. J. 1996. Neutral genetic markers and conservation: simulated germplasm collections. Genetics, Vol. 144: pp. 409-417. 18- Beacham, T. D. and Dempson, J. B. 1998. Population structure of Atlantic salamon from the Conne River, Newfoundland as determined from microsatellite DNA. Journal of Fish Biology, Vol. 52: pp. 665-676. 19- Beacham, T. D., Mcintosh, B. and Macconnachie, C. 2004. Microsatellite identification of individual sockeye salmon in Barkley Sound, British Colombia. Journal of Fish Biology, Vol. 61: pp. 1021-1032. 20- Beaumant, A. R. 1994. Genetic and evolution of aquatic organisms. Chapman and Hall. London, 539 P. 21- Beckmann, J. S. and Weber, J. L. 1992. Survey of human and rat microsatellites. Genomics, Vol. 12: pp. 627-631. 22- Berg, L. S. 1965. Freshwater fishes of the USSR and adjacent countries. Vol. 3. Academy of Sciences of the USSR, Zoological Institut, 510 P. (Translated). 23- Berg, L. S. 1984. Freshwater fishes of the USSR. and Neighbouring countries. Vol. 1. Academy of Science of USSR, Moscow- Leningrad (In Russian). 24- Biet, E., Sun, J. and Dutreix, M. 1999. Conserved sequence preference in DNA binding among recombinant proteins: abnormal effect of ssDNA secondary structure. Nucleic Acids Res. Vol. 27: pp. 596-600. 25- Billington, N. and Hebert, P. D. N., 1991. Mitochondrial DNA diversity in fishes and its implication for introductions. Can. J. Fish. Aquat. Sci. Vol. 48 (Supplement A): pp. 80-94. 26- Blankenship, S. M., May, B. and Hedgecock, D. 2002. Evolution of a perfect simple sequence repeat locus in the context of its flanking sequence. Mol. Biol. Evol. Vol. 19: pp. 1943-1951. 27- Bostein, D., White, R. L., Skolnick, M. and Davis, R. W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lrngth polymorphisms. Am. J. Hum. Genet, Vol. 32: pp. 314-331. 28- Brighitte, J., Hansen, M. and Loeschcker, V., 2005. Microsatellite DNA analysis of northern pike (Esox lucius) populations: insights into the genetic structure and demographic history of a genetically depauperatee specious. Biology Journal of Linnaean Society, Vol. 84: pp. 1-11. 29- Brock, T. D. and Freeze, H. 1969. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile. Journal of Bacteriology, Vol. 98 (1): pp. 289 –297. 30- Brown, W. M., George, M. and Wilson, A.C. 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United State of America, Vol. 76: pp. 1967-1971. 31- Brown, W. M., Prager, E. M., Wang, A. and Wilson, A. C. 1982. Mitochondrial DNA sequences of primers: tempo and mode of evolution. Journal of Molecular Evolution, Vol. 18: pp. 225-239. 32- Bruford, M. W., Cheesman, D. J., Coote, T., Green, H. A. A., Haines, S. A. and Oryan, C. 1996. Microsatellites and their application to conservation genetics. In: Smith, T. B., Wayne, R. K. (Eds.), Molecular Genetics Approaches in Conservation, Oxford University Press, Oxford, pp. 278-297. 33- Caetano- Anolles, G., Bassam, B. Y. and Grasshoff, P. M. 1991. High resolution DNA amplification Fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers biotechnology. Vol. 9: pp. 553-557.

352 34- Callen, D. F., Thompson, A. D., Shen, Y., Philips, H. A., Richards, R. I., Mulley, J. C. and Sutherland, G. R. 1993. Incisence and origin of null alleles in the (AC)n microsatellite markers. American Journal of Human Genetics, Vol. 52: pp. 922-927. 35- Campbell, R. A. and Beveridge, I. 1996. Revision of the family pterobothriidae Pintner, 1931, (Cestoda: Trypanorhyncha). Invertebrate Taxonomy, Vol. 10: pp. 617-662. 36- Carvalho, G. R. 1998. Advanced in the molecular analysis of fish population structure. Intl. J. Zool. Vol. 65: pp. 21-23. 37- CEP, 1998. National reports of the Caspian Sea countries (Azarbaijan, Iran, Kazakhistan, Russian federation, Turkmanistan), Caspian Environmental Programme. 38- Chang, D. K., Metzgar, D., Wills, C. and Boland, C. R. 2001. Microsatellites in the eukaryotic DNA mismatch repair genus as modulators of evolutionary mutation rate. Genome Res. Vol. 11: pp. 1145-1146. 39- Charrier, G., Durand, J., Quiniou, L. and Laroche, J. 2006. An investigation of the population genetic structure of Pollack (Pollachius pollachius) based on microsatellite markers. Vol. 1: pp. 1705-1709. 40- Chauhan,T., Lal, K. K., Mohinra, V., Singh, R., Punia, P., Gopalakrishnan Prakash, C. S. and Lakra, W. S. 2007. Evaluating genetic differentiation in wild populations of Indian major carp, cirrhinus mirgala evidence from allozyme and microsatellite. Aquaculture, Vol. 269: pp. 135-149. 41- Chistiakov, D. A., Hellemans, B. and Volckaert, F. A. M. 2006. Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications: A review with special reference to fish genetics. Aquaculture, Vol. 255: pp. 1–29. 42- Ciampi, A. Y. 1999. Desenvolvimento e utilizacao de marcadores microsatélites, AFLP e sequenciamento de cpDNA, no estudo da estrutura genetica e parentesco em populacoes de Copaíba (Copaifera langsdorffii) em matas de galeria no cerrado. Tese (Doutorado), Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociencias, Botucatu, 109 P. 43- Ciftci, Y. and Okumus, I. 2002. Fish Population Genetics and Applications of Molecular Markers to Fisheries and Aquaculture: I- Basic Principles of Fish Ppoulation Genetics. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Science, Vol. 2: pp. 145-155. 44- Cnaani, A., Zilberman, N., Tinman, S., Hulata, G. and Ron, M., 2004. Genome-scan analysis for quantitative trait loci in an F (2) tilapia hybrid. Mol. Genet. Genomics, Vol. 272: pp. 162–172. 45- Coad, B. W. 1980. Environmental change and its impact on the freshwater fishes of Iran. Biological Conservation, Vol. 19 (1): pp. 51-80. 46- Crow, J. F. 1964. Hardy- Weinberg and language impediments. Genetics, Vol. 152: pp. 821-825. 47- Dahle, G., Jorstad, K. E., Rusas, H. E. and Ottera, H. 2006. Genetic characteristics of brood stock collected from four Norwegian coastal cod (Gadus morhua) populations. ICES Journal of Marine Science, Vol. 63: pp. 209-215. 48- Dannewitz, J., Maes, G. E., Johansson, L.,Wickstrom, H., Volckaert, F. A. M. and Jarvi, T. 2005. Panmixia in the European eel: a matter of time. Proc. Royal Soc. Lond. B., Vol. 272: pp. 1129–1137. 49- Dewoody, J. A. and Avise, J. C. 2000. Microsatellite variation in marine, freshwater and anadromous fishes compared with other animals. Journal of Fish Biology, Vol. 56: pp. 461- 473.

351 50- Dionne, M., Caron, F., Julian, J. D. and Louis, B. 2008. Landscape genetics and hierarchical genetic structure in Atlantic salmon: the interaction of gene flow and local adaptation. Molecular Ecology, Vol. 17: pp. 2382–2396. 51- Dixon, T. J., Coman, G. J., Arnold, S. J., Sellars, M. J., Lyons, R. E., Dierens, L., Preston, N. P. and Li, Y. 2008. Shifts in genetic diversity during domestication of Black Tiger shrimp, Penaeus monodon, monitored using two multiplexed microsatellite systems. Aquaculture, No. 1-4, Vol. 283: pp. 1-6. 52- Diz, P. A. and Persa, P. 2009. The genetic diversity pattern of Mytilus alloprovincialis in Galician Rias (NW Iberian estuaries). Aquaculture, Vol. 287: pp. 278-285. 53- Dong, S., Kong, J., Meng, X., Zhang, Q., Zhang, T. and Wang, R. 2008. Microsatellite DNA markers associated with resistance to WSSV in Penaeus (Fennero penaeus) chinensis. Aquaculture, Vol. 282: pp. 138-141. 54- Dorak, T. 2005. Basic population genetics. WWW. Dorak. Info/ genetics/popgen. Html. 55- Dumont, H. J., 1995. The Caspian Lake: history, biota, structure, and function. Limnology and Oceanography, Vol. 43: pp. 44–52. 56- Ellegren, H. 2000. Microsatellite mutation in the germline: implications for evolutionary inference. Trends Genet, Vol. 16: pp. 551-558. 57- Etscheid, M. and Riesner, D. 1998. Modification for the important of TGGE and SSCP. Molecular tools for screening biodiversity, pp. 150-152. 58- Excoffier, L., Laval, G. and Schneider, S. 2005. Arlequin Ver. 3.5: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolution Bioinformatics, Vol. 1: pp. 47-50. 59- Fang, M., Hu, X., Jiang, T., Braunschweig, M., Hu, L., Du, Z., Feng, J., Zhang, Q., Wu, C. and Li, N. 2005. The phylogeny of Chinese indigenous pig breeds inferred from microsatellite markers. Anim. Genet, Vol. 36: pp. 7–13. 60- Faria, R., Wallner, B., Weis, S. and Alexandrino, P. 2004. Isolation and characterization of eight dinucleotide microsatellite loci from two closely related clupeid species (Alosa alosa and Alosa Fallax). Molecular Ecology Notes, Vol. 4: pp. 586-588. 61- Farid Pak, F. 1968b. Fertility of the salmon (Salmo trutta caspius Kessl.) from the Iranian coast of the Caspian. Problems of Ichthyology, Vol. 8 (2): pp. 215-222. 62- Fei, C., Wei, Y. and Fu- Ling, Y. 2007. Isolation of DNA microsatellites and preliminary genomic analysis of Mud crab (Cirrohina moliterolla). Zoological research, Vol. 28 (2): pp. 119-125. 63- Ferguson, A., Taggart, J. B., Prodohl, P. A., McMeel, O., Thompson, C., Stone, C., Mcginnity, P. and Hynes, R. A. 1995. The application of molecular marker to the study and conservation of fish populations, with special reference to Salmo. Journal of Fish Biology, Vol. 47 (Supplement A): pp. 103-126. 64- Fischer, M., Husi, R., Prati, D., Peintinger, M., Kleunen, M. V. and Schmid, B. 2000. RAPD variation among and within small and large populations of the rare clonal plant Ranunculus reptans (Ranunculaceae). American Journal Botany, Vol. 87: pp. 1128-1137. 65- Fitzsimons, N. N., Moritz, C. and Moore, S. S. 1995. Conservation and dynamics of microsatellite Loci over 300 million years of marine turtle evolution. Mol. Biol. Evol. Vol. 12: pp. 432-440. 66- Fopp- Bayat, D., Kolman, R. and Woznicki, P. 2007. Induction of meiotic gynogenesis in starlet (Acipenser ruthenus) using UV-irradiated bester sperm. Aquaculture, Vol. 264: pp. 54- 58. 67- Fopp- Bayat, D. and Woznicki, P. 2008. Test of Mendelian segregation among 10 microsatellite loci in the fourth generation of bester (Huso huso L. × Acipenser ruthenus L.). Aquaculture Reasearch, Vol. 277: pp. 1-6.

354 68- Frankham, R. 1994. Conservation of genetic diversity for animal improvement. 5th World Congres on Genetics Applied to Livestock Production. University of Guelph. Guelph Ontario, Canada, Vol. 21: pp. 385-392. 69- Fry, J. C. 1993. Biological data analysis, apractical approach. Oxford University Press. New York. 70- Fuji, K., Kobayashi, K., Hasegawa, O., Coimbra, M. R. M., Sakamoto, T. and Okamoto, N. 2006. Identification of a single major genetic locus controlling the resistance to lymphocystis disease in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture, Vol. 254: pp. 203-210. 71- Fuji, K., Hasegawa, O., Honda, K., Kumasaka, K., Sakamoto, T. and Okamoto, N. 2008. Marker-assisted breeding of a lymphocystis disease-resistant Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture, Vol. 272: pp. 291-295. 72- Ghasemov, A. W. 1987. The Caspian Sea. Leningrad. Vol. 4: pp. 177-180. 73- Gilbey, J., Verspoor, E., Atle Mo, T., Sterud, E., Olstad, K., Hytterod, S., Jones, C. and Noble, L. 2006. Identification of genetic markers associated with Gyrodactylus 118alaries resistance in Atlantic salmon Salmo salar. Dis Aquat Organ, Vol. 71, Issue 2, pp. 119-29. 74- Giles, R. E., Blanc, H. M. and Wallace, D. C. 1980. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United State of America, Vol. 77: pp. 6715-6719. 75- Goldsteine, D. B. and Schlotterer, C. 1998. Microsatellite: Evolution and Application. Oxford university press, 320 P. 76- Grassi, F., Imazio, S., Gomarasca, S., Citterio, S., Aina, R., Sgorbati, S., Skala, F., Patrignani, G. and Labra, M. 2004. Populationstructure and genetic variation within Valeriana wallrothii Kreyer in relation to different ecological locations. Plant Science, Vol. 166: pp. 1437-1441. 77- Griffiths, A. M., Machado- Schiaffino, G., Dillane, E., Coughlan, J., Horreo, J. L., Bowkett, A. E., Minting, P., Toms, S., Roche, W., Gargan, P., McGinnity, Ph., Cross, T., Bright, D., Garcia- Vazques, E. and Stevens, J. R. 2010. Genetic stock identification of Atlantic salmon (Salmo salar) populations in the southern part of the European range. BMC Genetics, Vol. 11: 31 P. 78- Gur- Are, R., Cohen, C., Eitan, L., Shelef, E., Hallerman, E. and Kashi, Y. 2000. Abundance, non- random genomic distribution, nucleotide composition, and polymorphism of simple sequence repeats in E. coli. Genome Res. Vol. 10: pp. 61-70. 79- Hall, T. A. 1999. BIOEDIT: A user- friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, Vol. 41: pp. 95- 98. 80- Hallerman, E. M. 2003. Population genetics: principles and applications for fisheries scientists. Bethesda, Maryland, American Fisheries Society, pp. 239–259. 81- Hamada, H., Petrino, M. and Kakunaga, T. 1982. A novel repeated element with Z- DNA- forming potential is widely found in evolutionary diverse eukaryotic genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 79: pp. 6465-6469. 82- Hansen, M. 2004. Application of Molecular Markers in Population and Conservation Genetics, With Special Emphasis on Fishes. MSc thesis, Submitted to the l Faculty of Natural Sciences, University of Aarhus, 100 P. 83- Hardy, G. H. 1908. Mendelian proportions in a mixed population. Science, Vol. 28: pp. 49–50. 84- Harris, E. 1998. A Low-Cost Approach to PCR. Oxford: Oxford University Press.

355 85- Hashemzadeh Segherloo, I., Farahmand, H., Abdoli, A., Bernatchez, L., Primmer, C. R., Swatdipong, A., Karami, M. and Khalili, B. 2012. Phylogenetic status of brown trout Salmo trutta populations in five rivers from the southern Caspian Sea and two inland lake basins, Iran: a morphogenetic approach. Journal of Fish Biology, Vol. 81: pp. 1479-1500. 86- Hassanien, H. A., Einady, M., Obeida, A. and Itriby, H. 2004. Genetic diversity of Nile tilapia populations revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Aquaculture Research, Vol. 35: pp. 597-593. 87- Hatada, I., Hayashizoki, Y., Hirotsune, S., Komatsabara, Hand Mukai, T. 1991. A genomic scanning method for higher organisms using restriction site as landmarks. Pro. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 88: pp. 9523-9527. 88- Hauswirth, W. W. and Clayton, D. A., 1985. Length heterogeneity of a conserved sequence in human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research displacement- loop, Vol. 13: pp. 8093-8104. 89- Hedrick. P. W. 1999. Highly variable loci and their interpretation in evolution and conservation. Evolution, Vol. 53: pp. 313-318. 90- Helmut, K. 2003. Genome projects: Uncovering the Blueprints of Biology. The Science Creative Quarterly. 91- Herlin, M., Delghandi, M., Wesmajervi, M., Taghhart, J. B., McAndrew, B. J. and Penman, D. J. 2008. Analysis of the parental contribution to a group of fry from a single day of spawning from a commercial Atlantic cod (Gadus morhua) breeding tank. Aquaculture, Vol. 274: pp. 218-224. 92- Herwerden, L. V., McLlwain, J., Al- Quf, H., Al- Amry, W. and Reyes, A. 2006. Development and application of microsatellite markers for Scombermorus commerson (Perciformes of Teleostei) to a population genetic study Arabian Peninsula stocks. Fisheries Research, Vol. 79: pp. 258-266. 93- Hildbrandt, F. and Igarashi, P. 1999. Techniques in molecular medicine. Springer Lab Manual. 94- Hoolihan, J. P., Anandh, P. J., Herwerden, L. V. 2006. Mitochondrial analysis of narrow- barred Spanish mackerel (Scomberomorus commerson) suggests a single genetic stock in the ROPME sea area. ICES Journal of Marine Science, Vol. 63: pp. 1066-1074. 95- Hou, Z. 2002. Systematics of Chinese freshwater Amphipoda. Ph. D dissertation, University of Chinese Academy of Sciences. Beijing, 195 P. 96- Hou, Z., Fu, J. and Li, S. 2007. A molecular phylogeny of the genus Gammarus based on mitochondrial and nuclear gene sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, Vol. 45 (2): pp. 596-611. 97- http://upload.wikimedia.org 98- http://research.amnh.org 99- Ivanov, V. P. 2000. Biological Resources of the Caspian Sea. Astrakhan Kasp NIRKH. Pp. 96. 100- Jamshidi. Sh. and Kalbasi, M. R. 2011. Conspecific relation between two seasonal migratory forms of endangered Caspian trout, Salmo trutta caspius Kessler, 1877, revealed by RAPD markers. Iranian Journal of Fisheries Science, Vol. 10 (3): pp. 437-446. 101- Jeffreys, A. J., Neil, D. L. and Neumann, R. 1998. Repeat instability at human minisatellites arising from meiotic recombination. EMBO J. Vol. 17: pp. 4147-4157. 102- Johnson, N. A., Vallejo, R. L., Silverstein, J. T., Welch, T. J., Wiens, G. D., Hallerman, E. M. and Palti, Y. 2008. Suggestive Association of Major Histocompatibility IB Genetic Markers with Resistance to Bacterial Cold Water Disease in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Mar. Biotechnol. Vol. 10: pp. 429–437.

356 103- Jug, T., Berrebi, P. and Snoj, A. 2005. Distribution of non-native trout in Slovenia and their introgression with native trout population as observed through microsatellite DNA analysis. Biological Conservation, Vol. 123: pp. 381-388. 104- Kalinowski, S. T. 2005. Polymorphic loci require large sample size or estimate genetic distance. Heredity, Vol. 94: pp. 33-36. 105- Kashi, Y., King, D. C. and Soller, M. 1997. Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation. Trends Genet, Vol. 13: pp. 74-78. 106- Kazancheev, E. N. 1981. Ryby Kaspiiskogo Morya [Fishes of the Caspian Sea]. Legkaya I Pischchevaya Promyshlennost, Moskva. 167 P. 107- Keyvanshokooh, S., Ghasemi, A., Shahriari-Moghadam, M., Nazari, R. M. and Rahimpour, M., 2007. Genetic analysis of Rutilus rutilus caspicus (Jakowlew, 1870) populations in Iran by microsatellite markers. Aquaculture Research, Vol. 38: pp. 953-956. 108- Kiabi, B. H., Abdoli, A. and Naderi, M., 1999. Status of fish fauna in south Caspian basin of Iran. Zoology in the Middle East, Vol. 16: pp. 57-65. 109- Kimura, M. and Ota, T., 1973. Mutation and evolution at the molecular level. Genetics, Vol. 73 (Supplement A): pp. 19-35. 110- Kitanishi, S., Yamamoto, T. and Higashi, S. 2008. Microsatellite variation reveals fine- scale genetic structure of Masou salmon, Oncorhynchus masou within the Atsuta River. Ecology of Freshwater Fish, Vol. 32: pp. 1-7. 111- Kocher, T. D. and Stepien, C. A. 1997. Molecular Systematics of Fishes. Academic Press. 112- Kohlmann, K., Gross, R., Murakaeva, A. and Kersten, P. 2003. Genetic variability and structure of common carp (Cyprinus carpio) populations throughout the distribution range inferred from allozyme, microsatellite and mitochondrial DNA markers. Aquatic Living Resources, Vol. 16: pp. 421-431. 113- Kosarev, A. N. and Yablonskaya, E. A. 1994. The Caspian Sea. SPB Academic Publishing. Netherlands, 259 P. 114- Kostianoy, A. and Kosarev. A. 2005. The Caspian Sea Environment, (Handbook of Environmental Chemistry). Volume 5, Part P, Springer-Verlag, Germany, ISBN-10: 3540282815, pp. 1-3. 115- Krieger, J., Fuerts, P. A. and Cavender, T. 2000. Phylogenetic relationship North American sturgeons (Order: Acipenseriformes) based on mitochondrial DNA sequences. Mol. Phylogenet. Evol. Vol. 16: pp. 64-72. 116- Laird, L. M. and Needham, T. 1988. Salmon and trout farming. Ellis Horwood Limited, pp. 87-116. 117- Lavery, S., Chan, T. K., Tam, Y. K. and Chu, K. H. 2004. Phylogenetic relationship and evolutionary of the Shrimp genus Penaeus. L. Drived from mitochondrial DNA. Molecular Phylogenetic Evolution, Vol. 31: pp. 396-499. 118- Lee, C. S. and Donaldson, E. M. 2001. General discussion on "Reproductive biotechnology in finfish aquaculture". Aquaculture, Vol. 197: pp. 303-320. 119- Li, Y. C., Korol, A. B., Fahima, T., Beiles, A., Nevo, E. 2002. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Mol. Ecol. Vol. 11: pp. 2453-2465. 120- Li, D., Kang, D., Yin, Q., Sun, Z. and Liang, L. 2007. Microsatellite DNA marker analysis of genetic diversity in wild common carp (Cyprinus carpio L.) populations. Genetics and Genomics, Vol. 34: pp. 984-993. 121- Lin, Y. S., Poh, Y. P., Lin, S. M. and Tzeng, C. S. 2002. Molecular techniques to identify freshwater eels. Zoological Studies, Vol. 41 (4): pp. 421-430.

357 122- Liu, Y., Chen, S., Li, J. and Li, B. 2005. Assessing the genetic structure of three Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) stocks by microsatellite markers. Aquaculture, Vol. Supplement A 243: pp. 103-111. 123- Liu, Z. J. and Cordes, J. F. 2004. DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture, Vol. 238: pp. 1-37. 124- Lucentini, L., Palomba, A., Lancioni, H., Gigliarelli, L., Natali, M. and Panara, F. 2006. Microsatellite Polymorphism in Italian population of northern pike (Esox Lucius L.). Fisheries Research, Vol. 80: pp. 251-262. 125- Lucentini, L., Palomba, A., Gigliarelli, L., Sgaravizzi, G., Lancioni, H., Lanfaloni, L., Natali, M. and Panara, F. 2009. Temporal changes and effective population size of an Italian isolated and supportive- breeding managed northern pike (Esox Lucius) population. Fisheries Research, Vol. 96: pp. 139-147. 126- Lundrigan, T. A., Reist, J. D. and Ferguson, M. M. 2005. Microsatellite genetic variation within and among Arctic char (Salvelinus alpines) from aquaculture and natural populations in North America. Aquaculture, Vol. 244: pp. 63-75. 127- Magoulas, M., and Zouros, E. 1993. Restriction-site heteroplasmy in anchovy (Engraulis encrasicolus) indicates indcidental biparental inheritance of mitochondrial DNA. Molecular Biology and Evolution, Vol. 10: pp. 319-325. 128- Maxam, A. and Gilbert, W. 1977. A new method of sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Vol. 74: pp. 560-564. 129- McLean, J. E., Seamons, T. R., Daur, M. B., Bentzen, P. and Quinn, T. P. 2008. Variation in reproductive success and effective number of breeders in a hatchery population of steelhead trout (Oncorhynchus mykiss): examination by microsatellite-based parentage analysis. Conserv Genet, Vol. 9: pp. 295-304. 130- McQuown, E. C., Sloss, B. L., Sheehan, R. J., Rodzen, J., Tranah, G. and May, B. 2000. Microsatellite and analysis of genetic variation in sturgeon: new sturgeon primer sequences for scaphirhynchus and Acipenser. Tran's actions of the American fisheries society, Vol. 139: pp. 1380-1388. 131- McQuown, E., Krueger, C. C., Kincaid, H. L., Gall, G. A. E. and May, B. 2003. Genetic comparison of lake sturgeon population: differentiation based on allelic frequencies at seven microsatellite Loci. Great Lakes Research, Vol. 29: pp. 3-13. 132- Meffe, G. K. and Carroll, C. R. 1997. Genetics: Conservation of diversity within species. In Principles of conservation biology, eds. G. K. Meffe, C. R. Carroll, pp. 161-201. Sunderland, Ma: Sinauer Associates, INC: Publisher. 133- Messier, W., Li, D. and Stewart, C. 1996. The birth of microsatellite. Nature, Vol. 381: 483 P. 134- Miggiano, E., De Innocentiis, S. and Ungaro, A. 2005. AFLP and microsatellites as genetic tags to identify cultured gilthead seabream escapes: data from a simulated floating cage breaking event. Aquaculture International, Vol. 13: pp. 137–146. 135- Morgan, T. H. 1961. Random segregation versus coupling in Mendelian inheritance. Science, Vol. 34: pp. 384. 136- Munkres, K. P., Bay, L. K., Jerry, D. R., McCormick, M. I. and Herwerden, L.V. 2007. Development and characterization of microsatellite markers for parentage analyses of the coral reef damselfish (Pomacentrus amboinensis: Pomacentridae). Conserv Genet, Vol. 8: pp. 987-990. 137- Myers, R. M., Lumelsky, N., Lerman, L. S. and Maniatis, T. 1987. Detection of single base substitution in total genomic DNA. Nature, Vol. 313 (6002): pp. 495-498.

358 138- Nauta, M. J. and Weissing, F. J. 1996. Constraints on allele size at microsatellite loci: implications for genetic differentiation. Genetics, Vol. 143: pp. 1021-1032. 139- Neff, B. D. and Gross, M. R. 2001. Microsatellite evolution in vertebrates: inference from AC dinucleotide repeats. Evolution, Vol. 55: 1717-1733. 140- Nei, M. 1972. Genetic distance between populations. American Naturalist, Vol. 106: pp. 283-292. 141- Nei, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and Genetic distance from a small number of individuals. Genetics, Vol. 89: pp. 583-590. 142- Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia Univ. Press, New York. 143- Nelson, R. J., and Beacham, T. D. 1999. Isolation and cross species amplification of microsatellite loci useful for study of Pacific salmon. Animal Genetics, Vol. 30: pp. 228-229. 144- Neville, P. J., Thomas, N., and Campbell, I. G. 2000. Loss of heterozygosity at 7q22 and mutation analysis of the CDP gene in human epithelial ovarian tumors. International Journal of Cancer, Vol. 91: pp. 345-349. 145- Newton, C. R. and Graham, A. 1994. PCR. Bios Scientific Publishers Limited. 146- Norris, A. T., Bradley, D. G. and Cunningham, E. D. 1999. Microsatellite genetic variation between and within farmed and wild Atlantic salmon (Salmo salar) populations. Aquaculture, Vol. 180: pp. 247–264. 147- O’Connell, M. and Wright, J. M. 1997. Microsatellite DNA in fishes. Reviews in Fish Biology and Fisheries, Vol. 7: pp. 331-363. 148- Ohno, S. 1970. Evolution by Gene Duplication. Allen and Unwin, London. 149- O’Malley, K. G., Sakamoto, T., Danzmann, R. G. and Ferguson, M. M. 2003. Quantitative trait loci for spawning date and body weight in rainbow trout: Testing for conserved effects across ancestrally duplicated chromosomes. J. Hered. Vol. 94: pp. 273–284. 150- O’Reilly, P. and Wright, J. M. 1995. The evolving technology of DNA fingerprinting and its application to fisheries and aquaculture. Journal of Fish Biology, Vol. 47 (Supplement A): pp. 29-55. 151- O’Reilly, P. T., Hamilton, L. C., McConnell, S. K. and Wright, J. M. 1996. Rapid analysis of genetic variation in Atlantic salmon (Salmo salar) by PCR multiplexing of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Science, Vol. 53, pp. 2292–2298. 152- Ovenden, J. R. 1990. Mitochondrial DNA and marine stock assessment: A review. Australian Journal of Marine and Freshwater Research, Vol. 41: pp. 835-853. 153- Ovenden, J. R. and Brasher, D. J. 2000. Stock identity of the red (Jasus edwardsii) and green (J. verrauxi) rock lobsters inferred from mitochondrial DNA Analysis. In: B. F. Phillips, and Kittaka (Eds), spiny lobster fisheries and culture. Fishing News book, Oxford. 154- Paetkau, D., Slade, R., Burden, M. and Estoup, A. 2004. Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate: a simulation-based exploration of accuracy and power. Mol. Ecol. Vol. 13: pp. 55–65. 155- Page, R. D. and Holmes, E. C. 1998. Molecular evaluation: a phylogenetic approach. Blackwell Science, Oxford, Vol. 459: pp. 13-21. 156- Parden, I. and Michelmore, R. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to dowing mildow resistance genes in lettuce. Theorical and Applied Centeric, Vol. 85: pp. 985-993. 157- Papasotiropoulos, V., Klossa-Kilia, E., Kilias, G., Alahiotis, S. and Kilias, G. 2007. Molecular phylogeny of grey mullets (Teleostei: Mugilidae) in Greece: evidence from sequence analysis of mtDNA segments. Biochem Genet, Vol. 45: pp. 623–636.

359 158- Peakall, M. and Smouse, A. 2005. GeneAlex 6. 41: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. The Australian national university, Canberra, Australia. 159- Perry, G. M. L., McDonald, G. j., Fergusen, M. M., Ganassin, R. C. and Bols, N. C. 2001. Characterization of rainbow trout cell lines using microsatellite DNA profiling. Cytotrchnology, Vol. 37: pp. 143-151. 160- Petren, K., Grant, B. R. and Grant, P. R. 1999. A phylogeny of Darwin’s finches based on microsatellite DNA length variation. Proc. Roy. Soc. Lond. B., Vol. 266: pp. 321-329. 161- Pherson, M. M., Moller, S. and Moller, S. G. 2000. PCR (Basic: from background to bench). Bios Scientific Publishers Ltd. 162- Phillips, R. L. and Vasil, I. K. 2001. DNA-Based Markers in plants. 2nd Edition, Kluwer Academic Publishers. 163- Poteaux, C., Bonhomme, F. and Berrebi, P. 1999. Microsatellite polymorphism and genetic impact of restocking in Mediterranean brown trout (Salmo trutta L.). Heredity, Vol. 82: pp. 645-653. 164- Pourkazemi, M. 1996. Molecular and biochemical genetic analysis of sturgeon stocks from the south Caspian Sea. Ph.D Thesis, School of Biochemical Sciences, University of Wales, Swansea, 260 P. 165- Pujolar J. M., Deleo G. A., Ciccotti E. and Zane L. 2009. Genetic composition of Atlantic and Mediterranean recruits of European eel Anguilla anguilla based on EST-linked microsatellite loci. Journal of Fish Biology, 74: 2034-2046. 166- Quicke, D. L. J. 1993. Principal and technique of contemporary taxonomy. Blackie Academic Professional Chapman and Hall. London. 167- Rezvani Gilkolaei, S. 1997. Molecular population genetic studies of sturgeon species in the south Caspian Sea. Ph.D Thesis, School of Biological Sciences, University of Wales, Swan Sea, U. K, 196 P. 168- Rezvani Gilkolaei, S. 2002. DNA PCR amplification for species diagnosis of Caviar from Caspian Sea sturgeon. Journal Agriculture Science and Technology, Vol. 4: pp. 51-61. 169- Rezvani Gilkolaei, S., Imanifar, A., Aghili, R. and Laloei, F. 2007. PCR- RFLP analysis of mitochondrial DNA for identification of Rutilus rutilus population on the southern coast of the Caspian Sea. Iranian Journal of Marine Biology Association. U.K. Vol. 86: pp. 1463- 1467. 170- Rico, C., Rico, I. and Hewitt, G. 1996. 470 million years of conservation of microsatellite loci among fish species. Proc. R. Soc. Lond., B Biol. Sci. Vol. 263: pp. 549– 553. 171- Rico, C., Ibrahim, K. M., Rico, I. and Hewitt, G. M. 1997. Stock composition in North Atlantic population of whiting using microsatellite markers. Journal of Fish Biology, Vol. 51: pp. 462-475. 172- Robison, B. D., Wheeler, P. A., Sundin, K., Sikka, P. and Thorgaard, G. H. 2001. Composite interval mapping reveals a major locus influencing embryonic development rate in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). J. Hered. Vol. 92: pp. 16–22. 173- Roff, D. A. and Bentzen, P. 1989. The statistical analysis of mitochondrial DNA polyrnorphisms: Chi-square and the problem ofsmall samples. Mol. BioI. Evol. Vol. 6: pp. 539-545. 174- Rooney, D. E. and Czepulkowski, B. H (eds). 1992. Human Cytogenetics. Volume I and II – A Practical Approach (New York: Oxford University Press).

361 175- Rossi, A. R., Ungaro, A., De Innocentiis, S., Crosetti, D. and Sola, L. 2004. Phylogenetic analysis of Mediterranean Mugilids by allozymes and 16S rRNA genes investigation: Are the Mediterranean species of Liza monophyletic? Biochem Genet, Vol. 42: pp. 301-313. 176- Rousset, F. 2004. Genetic structure and selection in subdivided populations Princeton. Princeton University Press. 177- Ryman, N. 1991. Conservation genetics considerations in fishery management. Journal of Fish Biology, Vol. 39 (Supplement A): pp. 211-224. 178- Sambrook, J. and Russell, D. 1990. Molecular cloning. Laboratory Manual CSHL Press, 2344 P. 179- Sambrook, J. and Russell, D. W. 2006. The conserved protocols from Molecclar cloning. Cold Spring Harbor laboratory press, pp. 705-762. 180- Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Vol. 74: pp. 5463-5467. 181- Santi- Rampazzo, A. P., Nishiyama, P. B., Ferreira, P. E. B. and Martins- Santos, I. 2008. Intrapopulational polymorphism of nucleous organizer regions in Serrapinnus notomelas (Characidae, Cheirodontinae) from the Parana River. Journal of Fish Biology, Vol. 72: pp. 1236-1243. 182- Schlotterer, C. 2004. The evolution of molecular markers- just a matter of fashion? National Revision Genetic, Vol. 5: pp. 63-69. 183- Sekino, M., Saitoh, K. and Aritaki, M. 2008. Microsatellite markers for a rare species of right-eye flunder Verasper 121ariegates (Pleuronectiformes, Pleuronectidae). Conserv Genet, Vol. 9: pp. 761-765. 184- Shaklee, J. B., Tamaru, C. S. and Waples, R. S. 1982. Speciation and evolution of marine fishes studied by electrophoretic analysis of proteins. Pacific Science, Vol. 36: pp. 141-157. 185- Shannon, C. E. and Weaver, W. 1949. The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana. 186- Siemon, H. S., Ng Carlo, G., Artieri, I., Bosdet, E., Readman, Ch., Roy, G., Danzmann, W., Davidson, M., Ferguson, M., Christopher, D., Fjell, B., Hoyheim, S., Jones, J. M., Pieter, J., de Jong, B., Koop, F., Martin, I., Krzywinski, K., Lubieniecki, M., Marra, A., Leslie, A., Mitchell, C., Mathewson, K., Osoegawa, S., Parisotto, E., Ruth, B., Phillips, M., Risef, L., Kristian, R., Von Schalburg, J., Schein, E., Heesun, S., Asim, S., Jim, T., Natasja, W., George, Y. and Baoli, Z. 2005. A physical map of the genome of Atlantic salmon, Salmo salar. Genomics, Vol. 86: pp. 396 – 404. 187- Sivasunder, A. and Biemann, C. H. 2005. Genetic evidence of postglacial population expansion in Puget sound rock fish (Sebastes emphaeus). Marine Biotechnology, Vol. 7: pp. 223-230. 188- Skaala, Q., Hoyheim, B., Glovera, K. and Dahlea, G. 2004. Microsatellite analysis in domesticated and Wild Atlantic salmon (Salmo salar L.): allelic diversity and identification of individuals. Aquaculture, Vol. 240: pp. 131-143. 189- Slatkin, M. 1993. Isolation by distance in equilibrium and non- equilibrium population. Evolution, Vol. 47: pp. 264-279. 190- Slatkin, M. 1995. A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics, Vol. 139(1): pp. 457–462. 191- Smith, P. J., McKoy, J. L. and Machin, P.J. 1980. Genetic variation in the rock lobsters Jasus edwardsii and Jasus novaehollandiae. New Zeeland Journal of Marine and Freshwater Research, Vol. 14 (1): pp. 55-63.

363 192- Solomon, C. T., Weber, P. K., Cech, J. J., Ingram, B. L., Conrad, M. E., Machavaram, M. V., Pogodina, A. R. and Franklin, R. L. 2006. Experimental determination of the sources of otolith carbon and associated isotopic fractionation. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, Vol. 63: pp. 79-89. 193- Somorjai, I. M. L., Danzmann, R. G. and Ferguson, M. M. 2003. Distribution of temperature tolerance quantitative trait loci in Arctic charr (Salvelinus alpinus) and inferred homologies in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Genetics, Vol. 165: pp. 1443–1456. 194- Sourinejad, I., Kalbassi, M. R., Pino- Querido, A., Vera, M., Bouza, C. and Martinez, P. 2011. Parentage assignment of progeny in mixed milt fertilization of Caspian brown trout Salmo trutta caspius using microsatellite DNA markers: Implications for conservation. African Journal of Biotechnology, Vol. 10 (26): pp. 5084-5090. 195- Streelman, J. T., Zardoya, R., Meyer, A. and Karl, S. A. 1998. Multilocus phylogeny of cichlid fishes (Pisces: Perciformes): Evolutionary comparison of microsatellite and single- copy nuclear loci. Molecular Biology and Evolution, Vol. 15: pp. 798-808. 196- Streelman, J. T. and Kocher, T. D. 2002. Microsatellite variation associated with prolactin expression and growth of salt- challenged tilapia. Physiol. Genomics, Vol. 9: pp. 1- 4. 197- Stryer, L. 1991. Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag, GmbH, Heidelberg. 198- Sun, B., Chang, M., Chen, D. and Nie, P. 2006. Gene structure and transcription of IRF- 2 in the mandarin fish Siniperca chuatsi with the finding of alternative transcripts and microsatellite in the coding region. Immunogenetics, Vol. 58: pp. 774-484. 199- Tajima, F. 1993. Simple methods for testing molecular clock hypothesis. Genetics, Vol. 135: pp. 599-607. 200- Takezaki, N. and Nei, M. 1996. Genetic distances and reconstraction of phylogenetic trees from microsatellite DNA. Genetics, Vol. 144: pp. 389-399. 201- Tamura, K., Nei, M. and Kumar, S. 2004. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 101: pp. 11030- 11035. 202- Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. 2007. Mega 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, Vol. 24: pp. 1596-1599. 203- Targon, M. L. P., Machado, M. A., Colettafilho, H. D. and Cristofani, M. 2000. Genetic polymorphism of sweet organ varieties by Random amplified polymorphic DNA. in Proceeding of the first International Symposium on Citrus Biotechnology, pp. 51-54. 204- Tautz, D. and Renz, M. 1984. Simple sequence are ubiquitous repetitive components of eukaryote genomes. Nucleic acids Res. Vol. 17: pp. 4127-4138. 205- Tautz, D., Trick, M. and Dover, G. 1986. Cryptic simplicity in DNA is a major Source of genetic variation. Nature, Vol. 322: pp. 652-653. 206- Taylor, J. S., Durkin, M. H. and Breden, F. 1999. The death of a microsatellite: a phylogenetic perspective on microsatellite interruptions. Mol. Bio. Evol. Vol. 14: pp. 220-229. 207- Taylor, E. B., Tamkee, P., Sterling, G. and Hughson, W. 2007. Microsatellite DNA analysis of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from western Alberta, Canada: native status and evolutionary distinctiveness of ‘‘Athabasca’’ rainbow trout. Conserv Genet, Vol. 8: pp. 1- 15. 208- Templeton, N. S. 2004. Gene and cell theraphy: therapeutic mechanisms and strategies. Marcel Dekker, New York.

362 209- Thai, B. T., Pham, T. A. and Austin, G. M. 2006. Genetic diversity of common carp in Vietnam using direct sequencing and SSCP analysis of the mitochondrial DNA control region. Aquaculture, Vol. 258: pp. 228-240. 210- Thaller, G., Kuhn, C., Winter, A., Ewald, G., Bellmann, O., Wegner, J., Zuhlke, H. and Fries, R. 2003. DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle. Animal genetics, Vol. 34: pp. 354-357. 211- Theodorakis, C. W., Bickham, J. W. and Lamb, T. 2001. Integration of genotoxicity and population genetic analysis in kangaroo rats (Dipodomys merriami) exposed to radionuclide contamination at the Nevada test site, USA. Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 20: pp. 317-326. 212- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D. G. 1997. The Clustal- X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. Vol. 25: pp. 4876-4882. 213- Thorpe, J. P. and Sol- Cave, A. M. 1994. The use of allozyme electrophoresisin vertebrate systematics. Zoologica Scripta, Vol. 23: pp. 8-18. 214- Tiedemann, R., Hardy, O., Vekemans, X. and Milinkovitch, M. C. 2000. Higher impact of female than male migration on population structure in large mammals. Molecular Ecology, Vol. 9: pp. 1159-1163. 215- Tilman, D., Wedin, D. and Knopps, J. 1996. Productivity and sustainability influenced by biodiversity in grassland ecosystems. Nature, Vol. 379: pp. 718-720. 216- Toth, G., Gaspari, Z. and Jurka, J. 2000. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res. 10: pp. 967-981. 217- Tremblay, R. L. and Ackerman, J. D. 2001. Gene flow and effective population size in Leopanthes (Orchidaceas): a case for genetic drift. Biological Journal of the Linnean Society, Vol. 72: pp. 47-62. 218- Tsoi. K. H., Wang, Z. Y. and Chu, K. H. 2005. Genetic divergence between two morphological similar varieties of the kurma shrimp Penaeus japonicas. Marine Biology, Vol. 147: pp. 367-379. 219- Utter, F. M. 1991. Biochemical genetics and fishery management: an historical perspective. Journal of Fish Biology, Vol. 39 (Supplement A): pp. 1-20. 220- Van Haeringen, W. A., Den Bieman, M., Van Zutphen, L. F. and Van Lith, H. A. 1996- 1997. Polymorphic microsatellite DNA markers in the rabbit (Oryctolagus cuniculus). J. Exp. Anim. Sci. Vol. 38(2): pp. 49-57. 221- Vera, M., Sourinejad, I., Bouza, C., Vilas, R., Pino- Querido, A., Kalbassi, M. R. and Martinez, O. 2011. Phylogeography, genetic structure, and conservation of the endangered Caspian brown trout, Salmo trutta caspius (Kessler, 1877), from Iran. Hydrobiologia, Vol. 2: pp. 51–67. 222- Viard, F., Justy, F. and Jarne, P. 1997. Population dynamics inferred from temporal variation at microsatellite loci in the selfing snail Bulinus trancatus. Genetics, Vol. 14: pp. 6973-6982. 223- Waldman, I. D., Robinson, B. F. and Rowe, D. C. 1999. A logistic regression based extension of the TDT for continuous and categorical traits. Annals of Human Genetics, Vol. 63: pp. 329-340. 224- Was, A. and Wenne, R. 2002. Genetic differentiation in hatchery and wild sea trout (Salmo trutta) in the Southern Baltic at microsatellite loci. Aquaculture, Vol. 204: pp. 493– 506. 225- Weinberg, W. 1908. Uber den Nachweis der Vererbung beim Menschen. Jahresh. Ver. Vaterl. Naturkd. Wurttemb, Vol. 64: pp. 369–382.

361 226- Welch, D. J., Balagh, A., Newman, S. J., Lester, R. J., Moore, B., Herwerden, L., Horne, J., et al. 2010. Defining the stock structure of northern Australia, S threadfin salmon species. FRDC project, NO. 2007/032. 227- Welsh, J. and McClenlland, M., 1990. Fingerprinting genomic using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, Vol. 12: pp. 7212-7213. 228- Williams, J. G. K., Kubelic, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. and Tingey, S. V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. Vol. 18: pp. 6531-6535. 229- Wiilliams, R. N. and Powell, M. S. 2000. Genetic analysis of rainbow trout from Silver Creek preserve of the nature conservancy. Aquaculture Research Institute. Fish Genetic Lab, University of Idanho, Moscow, pp. 345-532. 230- Wilson, I. J., and Balding, D. J. 1998. Genealogical inference from microsatellite data. Genetics, Vol. 150: pp. 499–510. 231- Whitmore, H. 1990. Electrophoresis and isoelectric focusing technique in fisheries management, PCR. Press, INC. 150 P. 232- Wright, S. 1951. The genetical structure of populations. Genetics, Vol. 16: pp. 97-159. 233- www.Caspianenvironment.org 234- www.fishbase.org 235- www.seascapemodeling.org 236- www.thermoscientificbio.com 237- Xu, Sh. 2002. Estimating polygenic effects using markers of the entire genome. Genetics, Vol. 163: pp. 789-801. 238- Xue, L., Qian, K., Qian, H., Li, L. and Li, M. 2006. Molecular cloning and characterization of the myostatin gene in croceine croaker, Pseudosciaena crocea. Mol. Biol. Rep. Vol. 33: pp. 129–136. 239- Yeh, F. C., Yang, R. C. and Boyle, T. 1999. PopGene. Version. 1.31, Microsoft, Window- based Freeware for Population Genetic Analysis. Available: www. Uallberta.ca/ fyeh/University of Alberta and the Centre for International Forestry Research, Canada. 240- Yoon, M., Sato S., Azoma, N., Seeb, J. E., Brykov, V., Seeb, L. W., Varnavskaya, N., Wilmot, R. L., Jin, D. H., Urava, S., Urano, A. and Abe, S. 2007. Congruence of Population Genetic Profiles Obtained from Mitochondrial and Microsatellite DNA Analysis in the Pacific Rim Chum Salmon Populations. North Pacific Anadramous Fish Commission, Technical Report, Vol. 7: pp. 121-123. 241- Yousefian, M. 2011. Evaluation of Genetic Variation Among Endangered Sea Brown Trout Young Fish for restocking to Caspian Sea. Advances in Environmental Biology, Vol. 5 (9): pp. 2769-2775, ISSN 1995-0756. 242- Yue, G. H., David, L. and Orban, L. 2007. Mutation rate and pattern of microsatellites in common carp (Cyprinus carpio L.). Genetica, Vol. 129: pp. 329-331. 243- Zabeau, M. and Vos, P. 1993. Selective restriction fragment amplification, a general method for DNA fingerprinting. Europian Patent Application, Vol. 2: pp. 550-570. 244- Zenkevitch, L. 1963. Biology of the Seas of the U.S.S.R. George Allen and Unwin, London. 956 P. 245- Zhang, D. X. and Hewitt, G. M. 2003. Selective restriction fragment amplification, a general method for DNA fingerprinting. Europian Patent Application, Vol. 2: pp. 250-570. 246- Zhao, N. A., Shao, Z., Ai, W., Zhu, B., Brosse, S. and Chang, J. 2005. Microsatellite assessment of Chinese sturgeon (Acipencer sinensis Gray) genetic variability. Journal of Applied Ichthyology, Vol. 21: pp. 7-13.

364 247- Zhivotovsky, L. A. and Feldman, M. W. 1995. Microsatellite variability and genetic distances. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 92: pp. 11549–11552. 248- Zolgharnine, H., Kamyab, M., Keyvanshokooh, S., Ghasemi, A. and Nabavi, S. M. B. 2010. Genetic diversity of Avicennia marina (Forsk.) vierh. Populations in the Persian GULF by microsatellite markers. Journal of Fisheries and Aquatic Research, Vol. 5: pp. 223-229.

365 Abstract For study the genetic diversity of Caspian brown trout population in five rivers in the southern part of Caspian Sea in Iran 182 number generators in the fall and winter of 1390 were collected in Chalus, Sardab Rud, Cheshmeh Kileh, Kargan Rud and Astara rivers. Then about 3-5 g of soft and fresh tissue from the bottom fin fish removed and were fixed in ethanol 96°. Genomic DNA was extracted by using ammonium acetate, then quantity and quality of the extracted DNA were determined by using spectrophotometry and horizontal electrophoresis in 1% agarose gel. The polymerase chain reaction was performed by using 16 SSR primers and sequencing primers (D-Loop) and the quality of PCR products amplified by SSR method were performed by using horizontal electrophoresis in 2% agarose gel. Alleles and their sizes were determined by using vertical electrophoresis in 6% polyacrylamide gel and silver nitrate staining method. Gel images were recorded by gel documentarian, the bands were scored by using Photo- Capt software and statistical analysis was performed by using Gene Alex and Pop Gene software. Also the PCR sequencing products after quality assessment by using horizontal electrophoresis in 1.5% agarose gel were purified and sent to South Korea Bioneer Corporation for sequencing. Sequencing was performed by chain termination method and the statistical analysis was performed by using Bio- Edit, Mega, Arlequin and DNA SP software. The SSR method, 5 pairs of primers produced polymorphic bands and the average real and effective number of alleles were calculated 5.60±1.83 and 3.87±1.46 in the Cheshmeh Kileh river and 7.60±1.75 and 5.48±1.32 in the Karganrud river and the mean observed and expected heterozygosity were calculated 0.44 ±0.15 and 0.52 ±0.16 in the Cheshmeh Kileh river and 0.50 ±0.11 and 0.70±0.13 in the Karganrud river. Analysis of Molecular Variance results showed that significant differences in genetic diversity between and within populations and between and within individuals in the studied rivers (P<0.01). The sequencing method identified 35 different haplotype, the highest number of polymorphic position (251) and haplotype (14) were observed in the Chalus river. The highest mean observed number of alleles (2.24±0.48) was calculated in the Sardabrud river, the highest mean observed heterozygosity (1.00±0.03) was calculated in the Chalus river and the highest mean nucleotide diversity (0.13±0.07) was observed in the Sardabrud river and mean haplotype diversity was obtained (1) in three studied rivers. The overall results show that there are no same population of this fish in the studied rivers and Karganrud and Chalus rivers in the SSR and sequencing methods had the highest levels of genetic diversity. Keywords: Salmo trutta caspius, genetic diversity, microsatellite, sequencing

366

ISLAMIC AZAD UNIVERSITY

SCIENCE AND RESEARCH BRANCH Faculity of Agriculture and Natural Resources-Department of Fisheries

Ph.D Thesis Fisheries

Subject: Genetic diversity study of Caspian brown trout (Salmo trutta caspius Kessler, 1877) population in five rivers in the southern part of Caspian Sea, Iran

Thesis Advisors: S. Rezvani Gilkolaei Ph.D. A. Kamali Ph.D.

Consulting Advisor: M. Soltani Ph.D.

By: Saltanat Najjar Lashgari

Summer 2013

367