Caractérisation Fonctionnelle Des Cellules Souches Cardiaques Humaines Dans Un but Thérapeutique

THÈSE

Pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR des sciences fondamentales et appliquées Laboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges) Secteur de recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie

Présentée par : Oualid Ayad

Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique

Directeur(s) de Thèse : Patrick Bois, Aurélien Chatelier

Soutenue le 12 décembre 2017 devant le jury

Jury :

Président Valérie Coronas Professeur des Universités, Université de Poitiers

Rapporteur Emmanuel Deval Chargé de recherche CNRS, Université de Nice-Sophia Antipolis

Rapporteur Christophe Vandier Professeur des Universités, Université de Tours

Membre Patrick Bois Professeur des Universités, Université de Poitiers

Membre Aurélien Chatelier Maître de conférences, Université de Poitiers

Membre Anne Aries Chercheur, Institut de recherche en hématologie et transplantion, Mulhouse

Pour citer cette thèse : Oualid Ayad. Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique [En ligne]. Thèse Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie. Poitiers : Université de Poitiers, 2017. Disponible sur Internet

THESE

Pou l’otetio du Gade de

DOCTEUR DE L’UNIVER“ITE DE POITIER“

(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

Ecole Doctorale : Biologie-santé

Secteur de Recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie

Présentée par :

Oualid AYAD

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Caractérisation fonctionnelle des cellules souches cardiaques humaines dans un but thérapeutique

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Directeurs de Thèse : Pr. Patrick Bois & Dr. Aurélien Chatelier

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Soutenue le 12 décembre 2017

Deat la Coissio d’Eae

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JURY

C. VANDIER Professeur, Université de Tours Rapporteur E. DEVAL CR CNRS, IPMC, Nice Rapporteur A. ARIES Chercheur, IRHT, Mulhouse Examinateur V. CORONAS Professeur, Université de Poitiers Examinateur A. CHATELIER MCU, Université de Poitiers Examinateur P. BOIS Professeur, Université de Poitiers Examinateur

Sommaire

SOMMAIRE TABLE DES ILLUSTRATIONS ...... 8 ABREVIATIONS ...... 12 INTRODUCTION ...... 16 Chapitre I : Cellules souches et régénération tissulaire ...... 16 1 Historique ...... 16 2 Propriétés des cellules souches ...... 17 2.1 L’auto-renouvellement ...... 17 2.2 Pouvoir de différenciation en plusieurs lignages cellulaires ...... 18 3 Types et potentiels de différenciation des cellules souches humaines : ...... 19 3.1 Les cellules souches embryonnaires (CSEs) : ...... 20 3.1.1 Les cellules souches totipotentes : ...... 20 3.1.2 Les cellules souches pluripotentes : ...... 21 3.2 Les cellules souches adultes: ...... 21 3.2.1 Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) ...... 22 3.2.2 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) ...... 24 3.2.3 Les cellules souches du tissu adipeux ...... 27 3.2.4 Les cellules progénitrices endothéliales ...... 27 3.2.5 Les ellules souhes de l’pithliu itestial : ...... 29 3.2.6 Les ellules souhes de l’pidee ...... 31 3.2.7 Les ellules souhes de l’pithliu puloaie ...... 32 3.2.8 Les cellules souches de la cornée et de la rétine ...... 33 3.2.9 Les cellules souches/progénitrices hépatiques ...... 35 3.2.10 Les cellules souches neurales (CSNs) du système nerveux central ...... 36 3.2.11 Les cellules souches musculaires squelettiques ...... 39 3.2.12 Les cellules souches cardiaques ...... 41 Chapitre II : Cellules souches et progéniteurs cardiaques ...... 43 1 Nature des cellules souches cardiaques ...... 43 2 Types des cellules souches cardiaques...... 45 2.1 Les CSCs c-kit positives (CSC c-kit+) ...... 45 2.2 Les CSCs Sca1 positives (CSC Sca1+) ...... 48 2.3 Les CSCs Isl-1 positives (CSCs Isl-1+)...... 50 2.4 Les CSCs BCRP+ positives side-population (BCRP+ SP) ...... 51

Sommaire 2.5 Les cellules dérivées des cardiosphères (CDCs) ...... 53 2.6 Les CSCs W8B2 positives (CSC W8B2+) ...... 54 3 Modulateurs de la différenciation in vitro des CSCs adultes en cardiomyocytes ...... 56 3.1 La 5-azacytidine ...... 57 3.2 Le TGF-b: ...... 58 3.3 L’aide asoiue : ...... 59 3.4 L’aide tioïue : ...... 60 3.5 La dexaméthasone :...... 61 3.6 L’otoie: ...... 61 Chapitre III : Physiologie des cellules souches /progéniteurs cardiaques ...... 62 1 Le calcium : ...... 62 1.1 Le calcium dans les cellules souches: ...... 62 1.1.1 L’atiit aliue spotae das les ellules souhes: ...... 63 1.1.2 Canaux VGCC et signalisation calciques ...... 64 1.1.3 Les stocks calciques intracellulaires dans les cellules souches: ...... 67 1.2 Le calcium dans les cellules souches/progéniteurs cardiaques: ...... 67 2 Les canaux ioniques : ...... 70 2.1 Les canaux ioniques dans les CSEs: ...... 70 2.2 Les canaux ioniques dans les CSMs: ...... 71 2.3 Les canaux ioniques dans les cellules souches/progéniteurs neurales: ...... 72 2.4 Les canaux ioniques dans les CSCs: ...... 73 3 Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation des cellules souches: ...... 73 3.1 Prolifération ...... 73 3.2 Différenciation : ...... 75 POSITION DU PROBLEME ...... 76 MATERIELS ET METHODES ...... 78 I- Isolement et purification des CSCs W8B2+ à pati d’hatillos huais d’oeillettes doites 78 1 Isolement des CSCs W8B2+ avec la méthode des explants ...... 78 2 Purification des CSCs W8B2+ ...... 79 2.1 Enrichissement en CSCs W8B2+ par le système du tri cellulaire magnétique positif: ...... 79 2.1.1 Principe : ...... 79 2.1.2 Protocole expérimental : ...... 81 2.2 Purification des CSCs W8B2+ par le système de tri cellulaire par cytométrie en flux: ...... 82 2.2.1 Principe: ...... 82 2.2.2 Protocole expérimental: ...... 87

Sommaire II- Immunophénotypage des CSCs W8B2+ ...... 87 III- Conditions de culture et entretien des CSCs W8B2+ ...... 88 IV- Congélation/décongélation des CSCs W8B2+ ...... 89 V- Test de formation de colonies (CFU-Fs)...... 89 1 Principe : ...... 89 2 Protocole expérimental: ...... 89 VI- Test de prolifération par comptage cellulaire ...... 90 1 Principe : ...... 90 2 Protocole expérimental: ...... 90 VII- Test de blessure (wound healing assay) ...... 90 1 Principe : ...... 90 2 Protocole expérimental : ...... 91 VIII- Test de viabilité cellulaire ...... 91 1 Principe : ...... 91 2 Protocole expérimental: ...... 92 IX- Aalse du le ellulaie ae l’iodue de popidiu ...... 92 1 Principe : ...... 92 2 Protocole expérimental : ...... 92 X- Immunocytochimie indirecte ...... 93 1 Principe : ...... 93 2 Protocole expérimental : ...... 93 XI- Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+...... 94 1 Principe : ...... 94 2 Protocole expérimental : ...... 94 XII- Imagerie calcique ...... 95 1 Principe : ...... 95 2 Protocol expérimental : ...... 96 XIII- RT-PCR « Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction » ...... 98 1 Principe : ...... 98 2 Protocole expérimental : ...... 98 2.1 Extraction des ARNs totaux ...... 99 2.1.1 Extraction des ARNs totaux à partir des CSCs W8B2+ adhérentes en culture : ...... 99 2.1.2 Extraction des ARNs totaux à partir des EODHs : ...... 99 2.2 Rétro-transcription ou RT (Reverse Transcription): ...... 100 2.3 Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) ...... 100 XIV- RT-qPCR « Reverse Transcription- quantitative Polymerase Chain Reaction » en SybrGreen 101

Sommaire 1 Principe : ...... 101 2 Protocole expérimental : ...... 101 2.1 qPCR avec la technologie SybrGreen ...... 102 2.2 RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (TaqMan Low Density Custom Array) ...... 102 2.2.1 Principe: ...... 102 2.2.2 Extraction des ARNs totaux ...... 102 2.2.3 Transcription inverse ou RT (Reverse Transcription): ...... 103 2.2.4 qPCR avec la technologie TaqMan ...... 103 XV- Western blot ...... 106 1 Principe: ...... 106 2 Protocole expérimental: ...... 107 XVI- Patch clamp ...... 108 1 Principe : ...... 108 2 Protocole expérimental : ...... 108 XVII- Tests statistiques ...... 109 RESULTATS ...... 110 Chapitre I : Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ ...... 110 I- Isolement et caractérisation phénotypique des CSCs W8B2+ ...... 111 1 Isolement des CSCs W8B2+ ...... 111 2 Capaits d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+ ...... 111 3 Immunophénotype des CSCs W8B2+ ...... 114 II-Caractérisation génique des CSCs W8B2+ ...... 115 1 Pofil d’epessio des aueus adiaues ...... 115 1.1 Pofil d’epessio giue des facteurs de transcription cardiaques ...... 115 1.2 Pofil d’epessio giue des stutues otatiles adiaues ...... 117 1.3 Pofil d’epessio giue des oeies adiaues...... 118 1.4 Pofil d’epessio giue des peptides atiutiues...... 119 2 Pofil d’epessio giue des aau ioiues das les C“Cs WB+ ...... 119 2.1 Pofil d’epessio giue des aau sodiues das les CSCs W8B2+ ...... 120 2.2 Pofil d’epessio giue des aau potassiues das les C“Cs WB+ ...... 121 2.3 Pofil d’epessio giue des aau HCN das les C“Cs WB+ ...... 127 2.4 Pofil d’epessio giue des aau aliues das les C“Cs WB+ ...... 128 2.5 Pofil d’epessio giue des taspoteus ioiues das les C“Cs WB+ ...... 129 3 Pofil d’epessio giue des ateus de l’hoostasie aliue das les C“Cs WB+ ...... 130 III-Caractérisation fonctionnelle des CSCs W8B2+ ...... 131 1 Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+...... 131

Sommaire

1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des marqueurs cardiaques ...... 132 1.1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des facteurs de transcription cardiaques ...... 132 1.1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des structures contractiles cardiaques ...... 134 1.1.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des connexines cardiaques ...... 136 1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux ioniques ...... 137 1.2.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux sodiques ...... 137 1.2.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux potassiques ...... 138 1.2.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux HCN ...... 142 1.2.4 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux calciques ...... 143 1.2.5 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des taspoteus ioiues et/ou des ateus de l’hoostasie aliue ...... 145 2 Etude de l’atiit aliue au ous de la diffeiatio adiaue in vitro des CSCs W8B2+ . 151 2.1 “igatue de l’atiit spotae aliue au ous de la diffeiatio adiaue in vitro des CSCs W8B2+ ...... 151 2.2 Evolution des paramètres calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 153 2.2.1 Evolution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 153 2.2.2 Eolutio de l’aplitude des osillatios aliues au ous de la diffeiatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 155 2.2.3 Evolution de la durée des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 155 2.2.4 Eolutio de l’aie des osillatios aliues au ous de la diffeiatio adiaue in vitro des CSCs W8B2+ ...... 155 2.2.5 Evolution du TTP (time to peak) des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 157 2.2.6 Evolution du TTR (time to recovery) des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 157 2.2.7 Evolution des pentes 1 et 2 des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 158 2.2.8 Eolutio du pouetage du teps d’atiit aliue au ous de la diffeiatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 160

Sommaire 2.3 Identification des acteurs impliqués dans la génération des oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées ...... 161 2.3.1 Effet de l’ihiitio de l’hageu NCX su les osillatios aliues das les C“Cs W8B2+ différenciées pendant 28 jours...... 161 2.3.2 Effet de l’ihiitio de la “ERCA su les osillatios aliues das les C“Cs WB+ différenciées pendant 28 jours ...... 162

2.3.3 Effet de l’ihiitio des aau CaV de type L sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours...... 163 2.3.4 Effet de l’ihiitio des epteus à l’IP su les osillatios aliues das les C“Cs W8B2+ différenciées pendant 28 jours...... 164 2.3.5 Effet de l’ihiitio des epteus à la aodie su les osillatios aliues das les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours ...... 170

Chapitre II : Rôle du canal BKCa das la gulatio de la polifatio et de l’auto-renouvellement des CSCs W8B2+ ...... 172 1 Cade de l’tude ...... 172 2 Résumé des résultats ...... 173

3 Article scientifique: « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS EXPRESSING W8B2»...... 174

+ 4 BKCa et oscillations calciques dans les CSCs W8B2 différenciées ...... 192 Chapitre III : Effets de la sphingosine 1-phosphate sur les propriétés des CSCs W8B2+ ...... 196 1 Contexte bibliographique ...... 196 1.1 S1P et signalisation ...... 196 1.2 S1P et tissu cardiaque ...... 197 1.3 S1P et cellules souches ...... 198 2 Cotete de l’tude ...... 198 3 Résultats ...... 199 3.1 Pofil d’epessio des i epteus à la “P das les C“Cs WB+ ...... 199 3.2 Effet de la S1P sur les capacités prolifératives des CSCs W8B2+ ...... 201 3.3 Ipliatio des “PR das l’effet atipolifatif de la “P ose das les C“Cs WB+ 204 3.4 Effet de la “P su les popits d’auto-renouvellement des CSCs W8B2+ ...... 205 3.5 Effet de la S1P sur les capacités migratoires des CSCs W8B2+ ...... 206 DISCUSSION ...... 207 I-Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ ...... 207 II-Pofil d’epessio giue des anaux ioniques dans les CSCs W8B2+ ...... 208 III-Rôle des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+ ...... 209 IV-Pofil d’epessio giue des ateus aliues das les C“Cs WB+ ...... 211 V-Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 213 1 Profil des marqueurs cardiaques ...... 213

Sommaire 2 Profil des transcrits codant pour les canaux ioniques ...... 215 3 Oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 219 4 La sphingosine 1-phosphate (S1P) joue un rôle important dans les CSCs W8B2+ ...... 223 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...... 227 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 230 RESUME ...... 266 ANNEXES ...... 268

Table des illustrations

TABLE DES ILLUSTRATIONS Liste des figures Figure H-1 : Hiérarchie de la différenciation des cellules souches...... 19 Figure H-2 : La hiérarchie des cellules souches...... 20 Figure H-3 : Les cellules souches hématopoïétiques ...... 23 Figure H-4 : Les cellules souches mésenchymateuses ...... 25 Figure H-5 : Les cellules progénitrices endothéliales ...... 28 Figure H-6 : Les cellules souches intestinales ...... 30 Figure H-7 : Les cellules souches de l'épiderme interfolliculaire ...... 32 Figure H-8 : Les ellules souhes de l’pithliu puloaie ...... 33 Figure H-9 : Les cellules souches du limbe scléro-cornéen ...... 34 Figure H-10 : Les cellules progénitrices hépatiques ...... 36 Figure H-11 : Les cellules souches neuronales ...... 38 Figure H-12 : Les cellules satellites du muscle strié squelettique ...... 40 Figure H-13 : Concept des cellules souches cardiaques ...... 42 Figure H-14 : Hiérarchie de la croissance et de la différenciation des cellules souches cardiaques..... 44 Figure H-15 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant c-kit et de leur pouvoir de différenciation ...... 46 Figure H-16 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant Sca-1 et de leur pouvoir de différenciation ...... 50 Figure H-17 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant BCRP et de leur pouvoir de différenciation ...... 53 Figure H-18 : Illustatio shatiue de l’epessio fotioelle des aau et epteus calciques au cours de la différenciation des CSEs et des CSMs (du tissu adipeux et de la moelle osseuse) ...... 66 Figure H-19 : Voies de signalisations majeures impliquées dans le maintien de la pluripotence ou de la favorisation de la différenciation des cellules souches cardiaques ...... 69 Figure H-20 : Structure chimique de la sphingosine 1-phosphate ………………………………………………….196 Figure MM-1 : “ha du potoole d’isoleet et de puifiation des CSCs W8B2+ à partir des échantillons auriculaires humains ...... 78 Figure MM-2 : Schéma du principe de la technique du tri cellulaire magnétique positif ...... 80 Figure MM-3 : Schéma simplifié du principe de la technique du tri cellulaire par FACS ...... 83 Figure MM-4 : “ha siplifi du piipe du fotioeet d’u tote de flu ...... 84 Figure MM-5 : Schéma simplifié des paramètres clés mesurés par le cytomètre de flux ...... 85 Figure MM-6 : Schéma simplifié du protocole de différenciation cardiaque in vitro utilisé pour différencier les CSCs W8B2+ ...... 95 Figure MM-7 : “ha du Maise d’atio de la GCaMP ...... 95 Figure MM-8 : Eeple d’iage de fluoesee oteue los des osillatios aliues aps traitement avec le logiciel Image J...... 97 Figure MM-9 : Ta d’ue osillation calcique obtenue au 28ème jour de différenciation montrant les différents paramètres calculés avec le logiciel IDL ...... 98 Figure R-1 : Proportions des CSCs W8B2+ durant les différentes étapes de purification ...... 112 Figure R-2 : Morphologie des CSCs W8B2+ isolées et des colonies formées ...... 113 Figure R-3 : Capait d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+ ...... 113

Table des illustrations Figure R-4 : Pourcentage des CSCs W8B2+ positives pour les marqueurs de surface indiqués déterminé par cytométrie en flux...... 114 Figure R-5 : Pofil d’epessio des fateus de tasiptio adiaues das les C“Cs WB+ ...... 116 Figure R-6 : Pofil d’epessio giue des stutues otatiles adiaues das les C“Cs WB+ ...... 117 Figure R-7 : Pofil d’epessio giue des oeies adiaques dans les CSCs W8B2+ ...... 118 Figure R-8 : Pofil d’epessio giue des peptides atiutiues de tpe A et de tpe B das les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 119 Figure R-9 : Pofil d’epessio giue des aau sodiues oltage-dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 120 Figure R-10 : Pofil d’epessio giue des sous-unités alpha des canaux potassiques voltage- dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 122 Figure R-11 : Caatisatio de l’epression des ARNm codant pour KV4.2 et KV4.3 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ...... 122 Figure R-12 : Pofil d’epessio giue des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage- dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 123 Figure R-13 : Caatisatio de l’epessio des ARN odat pou KCa., KCa. et KCa. das les CSCs W8B2+ par RT-PCR ...... 124 Figure R-14 : Pofil d’epessio giue des aau potassiues TWIK et TA“K das les C“Cs WB+ déterminé par RT-qPCR ...... 125 Figure R-15 : Profil d’epessio giue des aau potassiues etifiats etats ae leus sous- unités régulatrices) et le courant sensible au baryum enregistré dans les CSCs W8B2+ ...... 126 Figure R-16 : Pofil d’epessio giue des aau HCN das les C“Cs WB+ déterminé par RT- qPCR ...... 127 Figure R-17 : Pofil d’epessio giue des aau aliues das les C“Cs WB+ déterminé par RT-qPCR ...... 129 Figure R-18 : Pofil d’epessio giue des hageus Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 130 Figure R-19 : Pofil d’epessio giue des ateus iplius das l’hoostasie aliue das les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 131 Figure R-20 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio gique des facteurs de transcription cardiaques ...... 133 Figure R-21 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des structures contractiles cardiaques ...... 135 Figure R-22 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des peptides natriurétiques de type A et de type B déterminé par RT-qPCR ...... 136 Figure R-23 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des connexines déterminé par RT-qPCR ...... 137 Figure R-24 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux sodiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ...... 138 Figure R-25 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ...... 139 Figure R-26 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des sous- unités bêta des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR ...... 140 Figure R-27 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux potassiques TWIK et TASK déterminé par RT-qPCR ...... 141 Figure R-28 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des sous- unités régulatrices et des canaux potassiques rectifiants entrants déterminé par RT-qPCR ...... 142

Table des illustrations

Figure R-29 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux HCN déterminé par RT-qPCR ...... 143 Figure R-30 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux calciques déterminé par RT-qPCR ...... 144 Figure R-31 : Courant dynamique enregistré sur les CSCs W8B2+ différenciées en configuration cellule-entière ...... 145 Figure R-32 : Effet de la différenciatio adiaue des C“Cs WB+ su l’epessio giue des échangeurs Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 déterminé par RT-qPCR ...... 146 Figure R-33 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des ateus iplius das l’hoostasie calcique déterminé par RT-qPCR ...... 147 Figure R-34 : Regroupement hiérarchique des gènes dans les CSCs W8B2+, les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque (Diff) et les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation optogénétique du CHR2 ...... 150 Figure R-35 : Tpes d’atiits aliues spotaes eegistes au ème jour et au 28ème jour de différenciation des CSCs W8B2+ ...... 152 Figure R-36 : Eolutio de la fuee et de l’aplitude de l’atiit aliue spotae au ous des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ...... 154 Figure R-37 : Eolutio de la due et de l’aie de l’atiit aliue spotae au ous des semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ...... 156 Figure R-38 : Eolutio de TTP et de TTR de l’atiit alique spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+...... 158 Figure R-39 : Eolutio de la pete et de la pete de l’atiit aliue spotae au ous des semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ...... 159 Figure R-40 : Eolutio du teps d’atiit epi e pouetage de l’atiit aliue spotae au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ...... 160 Figure R-41 : Effet de SEA- su l’atiit aliue spotae eegiste su les C“Cs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 162 Figure R-42 : Effet de la thapsigagie su l’atiit aliue spotae eegiste su les C“Cs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 163 Figure R-43 : Effet de la ifdipie su l’atiit aliue spotae eegiste su les C“Cs WB+ après 28 jours de différenciation ...... 164 Figure R-44 : Effet de la stospogie C su les l’aplitude, la fuee, l’aie et la due des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 165 Figure R-45 : Effet de la xéstospongine C sur le TTP , le TTR , la pente1 , la pente 2 et le pourcentage du teps d’atiit des osillatios aliues spotaes eegistes sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 166 Figure R-46 : Effet du 2-APB su l’aplitude, la fuee, l’aie et la due des osillatios aliues spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 168 Figure R-47 : Effet du 2-APB sur le TTP , le TTR , la pente1 , la pente 2 et le pourcentage du temps d’atiit des osillatios aliues spotaes eegistes su les C“Cs WB+ après 28 jours de différenciation ...... 169 Figure R-48 : Effet de la aodie su l’aplitude, la fuee, l’aie et la due des osillatios calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 170 Figure R-49 : Effet de la ryanodine sur le TTP , le TTR , la pente 1 , la pente 2 et le pourcentage du teps d’atiit des osillatios aliues spotaes eegistes su les C“Cs WB+ après 28 jours de différenciation ...... 171

Table des illustrations

Figure R-50 : Effet de la paillie su l’atiit aliue spotae eegiste su les C“Cs WB+ après 28 jours de différenciation ...... 192 Figure R-51 : Effet de la paillie su l’aplitude, la fuee, l’aie et la due des osillatios calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation ...... 194 Figure R-52 : Effet de la paxilline sur le TTP , le TTR , la pente 1 , la pente 2 et le pourcentage du teps d’atiit des osillatios aliues spotaes eegistes su les C“Cs WB+ après 28 jours de différenciation ...... 195 Figure R-53 : Caatisatio de l’epession des ARNm codant pour les récepteurs à la sphingosine 1 phosphate de type 1 (S1PR1) et de type 2 (S1PR2) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ...... 199 Figure R-54 : Caatisatio de l’epessio des ARN odat pou les epteus à la sphigosie phosphate de type S1PR3, de type S1PR4 et de type S1PR5 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR ...... 200 Figure R-55 : Pofil d’epessio giue des i epteus à la “P “PR, “PR, “PR “PR et S1PR5) dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR ...... 201 Figure R-56 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence de la S1P ou en situation contrôle ...... 202 Figure R-57 : Test de viabilité cellulaire des CSCs W8B2+ par cytométrie en flux en présence de S1P ou en situation contrôle ...... 202 Figure R-58 : Analyse du cycle cellulaire par cytométrie de flux en présence de la S1P ou en situation contrôle ...... 203 Figure R-59 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ en présence de la S1P, S1P + JTE013 , S1P + W146, S1P + BML241 ou en situation contrôle ...... 204 Figure R-60 : Test de formation de colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la S1P , S1P+JTE013, S1P+W146 ou en situation contrôle ...... 205 Figure R-61 : Test de migration cellulaire après 7 heures en présence de la S1P, S1P+JTE013, S1P+W146 ou en situation contrôle ...... 206 Figure D-1 : Modle hpothtiue d’u potetiel d’atio g pa ue ellule WB+diffeie ...... 218 Figure C-1 : “ha apitulatif des piipau ges dot l’epessio aie aps diffeiatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ ...... 229

Liste des tableaux Tableau H-1 : Principaux marqueurs des cellules souches cardiaques (CSCs) ...... 45 Tableau H-2 : Protocoles de différenciation cardiaques utilisés pour différents types de CSCs ...... 57 Tableau MM-1 : Liste des atiops utiliss pou l’iuophotpage pa totie e flu ...... 88 Tableau MM-2 : Liste des atiops utiliss pou l’iuotohiie idiete ...... 94 Tableau MM-3 : Liste des amorces sens et anti-sens utilisées pour la PCR ...... 101 Tableau MM-4 : Liste des sondes et des 96 gènes analysés par TLDA ...... 104 Tableau MM-5 : Liste des anticorps utilisés pour le Western Blot ...... 107 Tableau R-1 : Etat d’epessio des piipau ges dot l’epessio aie aat et aps différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ ...... 148

Abréviations

ABREVIATIONS A AA : acide ascorbique ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: acide désoxyribonucléique complémentaire ADSCs: adipose-derived stem cells ALP: alkaline phosphatase ANG: Angiopoietin ANKB: ankyrine B ANP: atrial natriuretic factor ARN: acide ribonucléique ATP: adénosine triphosphate ATF2: activating transcription factor 2 AT2: alveolar type 2 B BCRP: breast cancer resistance protein BKCa : Large conductance calcium-activated potassium channel BMSCs: bone marrow stromal cells BNP: brain natriuretic peptide BrdUrd: bromodésoxyuridine C Ca2+: calcium ion CaM: calmoduline CaMK-II: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II CD: Cluster of differentiation CDCs : cellules dérivées des cardiosphères CFU-Fs: colony-forming unit-fibroblasts ChR2: channelrhodopsins 2 Cl- : chloride ion CLASP2: cytoplasmic Linker Associated Protein 2 CPEs: cellules progénitrices endothéliales CPHs: cellules progénitrices hépatiques CPS : prosurfactant protein C CREB: C-AMP response element-binding protein CSBAs : cellules souches broncho-alvéolaires CSCs: cellules souches cardiaques CSECs: ellules souhes de l’pithliu oe CSEs: Cellules souches embryonnaires CSHs: cellules souches hématopoïétiques CSIs: cellules souches intestinales CSKs: cellules souches des kératinocytes CSMs: cellules souches mésenchymateuses CSNs: cellules souches neurales CSEps: ellules souhes de l’pidee CSRs: cellules souches rétiniennes CT: cycle threshold CX: connexine [Ca2+]i: concentration de calcium intracellulaire D DG: dental gyrus DMSO: diméthylsulfoxyde

Abréviations DNMT: DNA Methyltransferases dNTP: deoxynucleotide

E eCSCNs : cellules souches épidermiques issues de la crête neurale EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid EGF: epidermal growth factor EGFP: enhanced green fluorescent protein EGF-R: epidermal growth factor receptor EGM-2: Endothelial Cell Growth Medium 2 EODHs: hatillos huais d’oeillettes doites ER : endoplasmic reticulum F FACS: fluorescence activated cell sorting FGF: Fibroblast growth factors FSC: forward scatter channel G GFP: green fluorescent protein G-CSF: granulocyte colony-stimulating factor GPCs: glial progenitor cells GPI: glycerophosphatidylinositol H hEag1 human Ether à Go-Go 1 HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HCN Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated HLA: human leukocyte antigen HGF : Hepatocyte growth factor I IA : A-type potassium current ICa.L : L-type calcium current ICa.T : T-type calcium current ICl : chloride current ICl.vol : Volume-sensitive chloride channels IDL: interactive data language IGF : insulin-like growth factor Ih : hyperpolarization-activated cation current IKir : cardiac inward rectifier potassium current 2+ IKCa : intermediate-conductance Ca -dependent potassium channels IKDR : delayed rectifier potassium current IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium INa : sodium current InsP3 : inositol trisphosphate IP: iodure de propidium iPSCs : induced pluripotent stem cells IP3 : inositol trisphosphate IP3R: inositol trisphosphate receptor ISL1: ISL LIM Homeobox 1 Ito : cardiac transient outward potassium current J JNK: c-Jun N-terminal kinases

Abréviations K K+: potassium ion KCa: calcium-activated potassium channels Kv: voltage-gated potassium channels K2P: two-pore domain potassium channels L LIN- : lignage négatif L-VOCC: L type Voltage-operated calcium channels M MACS: magnetic-activated cell sorting MAPK: mitogen-activated protein kinases MEF2C: myocyte enhancer factor 2C M-MLV: moloney murine leukemia virus MPC: myocyte progenitor cells MSCA-1: mesenchymal stem cell antigen 1 MYH: myosin heavy chain MYL: myosin light chain M199: medium 199 N Na+: sodium ion Nav: voltage-gated sodium channels NCX: sodium-calcium exchanger Na+/K+ ATPase: sodium-potassium pump NFAT: nuclear factor of activated T-cells NF-KB: nuclear factor-kappa B NPCs: neural progenitor cells N-VOCC: N type Voltage-operated calcium channels O OB: olfactory bulb OV-6: ovalbumine-6 P PBS: phosphate-buffered saline PGF: placental growth factor PKC: protein kinase C PMCA : plasma membrane Ca2+ ATPase PMT : photomultiplicateur P/Q-VOCC : P/Q type Voltage-operated calcium channels pRb : retinoblastoma protein P2X P2Y: purinergic receptors Q QSP : quantité suffisante pour R RA: retinoic acid RAR: retinoic acid receptor RMS: rostro-migratory stream RPL13A: Ribosomal Protein L13a RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction RYR: ryanodine receptor R-VOCC : R type Voltage-operated calcium channels S SCA-1: stem cell antigen 1 SCF: stem cell factor

Abréviations SCs: satellite cells SDF-1: stromal cell-derived factor-1 SERCA: sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SHH: Sonic hedgehog siRNA: Small interfering RNA SK: small conductance calcium-activated potassium channels SOC: store-operated channel SP: side population SSC: side scatter channel SUR : sous-unité régulatrice SVF: su de eau fœtal SVZ : subventricular zone S1P: sphingosine 1-phosphate S1PR: sphingosine 1-phosphate receptor T TA: transit amplifying TAK: tat-associated kinase THY-1: thymus cell antigen 1 TTP: time to peak TTR: time to recovery TRP: transient receptor potential TTX: tetrodotoxin TRPC1: transient receptor potential cation channel subfamily C member 1 TLDA: taqMan low density arrays TNNI: troponin I TNNT: troponin T TNAP: tissue nonspecific alkaline phosphatase TGFβ: transforming growth factor beta T-VOCC: T type Voltage-operated calcium channels U UA: unité arbitraire V VEGF: Vascular endothelial growth facto VPC: vascular progenitor cells VGCC HVA: voltage-dependent calcium channels high-voltage-activated VGCC LVA: voltage-dependent calcium channels low-voltage-activated 2-APB: 2-aminoethoxydiphenyl borate W Wnt 11: wingless-type MMTV integration site family member 11

Introduction

INTRODUCTION

Chapitre I : Cellules souches et régénération tissulaire

1 Historique

La biologie des cellules souches a vu sa renaissance à la fin du siècle passé grâce à John Gurdon (prix Nobel en 2012 avec Shinya Yamanaka), qui est parvenu (dans les années 1960) à eplae ae sus le oau d’ue ellule iatue d’u ovocyte de grenouille avec le oau d'ue ellule atue d’oigie itestiale. Cet oote s’est esuite delopp normalement.

En 1997, Wilmut et son groupe ont appliqué le résultat de John Gurdon pour démontrer que le noyau des cellules somatiques avait un potentiel génétique complet en donnant naissance à la brebis Dolly. Un an après, Thomson et al. (1998) ont développé une méthode d’isoleet et de ultue pou aitei les ellules souhes embryonnaires (CSEs) humaines in vitro. Ces travaux ont ouvert les portes pour de nouvelles perspectives de recherche sur les CSEs (Thomson et al., 1998).

Pou e ui est des ellules souhes adultes, l’histoie oee avec Ernest McCulloch et James Till (dans les années 1960) ui s’itessaiet au effets des adiatios d'une explosion atomique) sur la capacité de la moelle osseuse à produire des cellules sanguines. McCulloch a ose des gueau su la ate d’ue souis aat eçu des ijetios de moelle. Ces deux chercheurs ont pensé que ces nodules étranges provenaient d'une seule cellule, probablement de la moelle osseuse.

En 1966, Friedenstein et ses collègues ont caractérisé les popits d’ue petite population mixte de cellules de la moelle osseuse capable d’adher au plastique in vitro. Cette populatio ite tait ostitue de ellules souhes hatopoïtiues et d’ue aute populatio ellulaie, ioue à l’poue, apale de doe aissae à des ellules « réticulaires » et à des ostéoblastes. Cette population inconnue correspond à e ue l’o appelle maintenant les cellules souches mésenchymateuses (CSMs). Cette équipe a également ot l’ipotae de l’iteatio des C“Ms avec le microenvironnement de la moelle osseuse (ou niche hématopoïétique) mais aussi leur capacité à se différencier en tissu

Introduction d’oigie sodeiue. Das etaies oditios, les CSMs étaient capables de se différencier en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes (Caplan, 1986; Piersma et al., 1985). Dans les années 1990-2000, le pouvoir de différenciation myogénique des CSMs a été démontré (Wakitani et al., 1995), notamment leur différenciation en cardiomyocytes in vivo (Toma et al., 2002; Vacanti et al., 2005). Durant la même période une autre étude a pu mettre en évidence un pouvoir immuno-modulateur des CSMs par surpression de la prolifération des lymphocytes T (Di Nicola et al., 2002). Cette tude a atti patiulieet l’attetio du ilieu sietifiue su l’appliatio thapeutiue des CSMs lors de transplantations allogéniques.

Ces études ont révélé la plasticité et le pouvoir multipotent des cellules souches adultes et ont ouvert les possibilités de thérapies cellulaires.

Avant de faire une description plus exhaustive des différents types de cellules souches, il est important de rappeler les propriétés intrinsèques qui les définissent.

2 Propriétés des cellules souches 2.1 L’auto-renouvellement Les cellules souches sont définies comme étant des cellules indifférenciées dotées de apait d’auto-renouvellement et de diffeiatio e d’autes tpes ellulaies. L’auto- renouvellement est un processus par lequel une cellule souche se divise asymétriquement ou symétriquement pour générer respectivement une ou deux cellules filles qui présentent un potentiel de développement similaire à celui de la cellule mère. Les divisions symétriques supposet ue les ellules filles oseet les aatistiues popes d’ue ellule souhe (Ulloa-Montoya et al., 2005). La apait d’auto-renouvellement est essentielle pour les cellules souches pour accroitre leur nombre durant le développement, être maintenues au sein des tissus adultes et rétablir le stock des cellules souches après blessure. L’auto- renouvellement se différencie de la prolifération même si les deux processus sont liés à la division cellulaire. La prolifération est un terme plus générique qui regroupe tous les types de diisios des ellules souhes et pogities. L’auto-eouelleet ipliue u’au ois une des cellules filles possède le même potentiel de développement que la cellule mère.

Pour la plupart des cellules souches de mammifères, telles que les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) et les cellules souches neurales (CSNs), l'auto-renouvellement est

Introduction une division avec maintien de la multipotence. Pour les cellules souches qui forment un seul type de cellule fille, par exemple les cellules souches spermatogoniales, l'auto-renouvellement est la division avec la maintenance de l'état indifférencié. La plupart des mécanismes impliqués dans l'auto-renouvellement des cellules souches régulent ceux impliqués dans la prolifération de nombreux types cellulaires (Molofsky et al., 2003; Nishino et al., 2008).

Les ellules souhes oseet pedat de ts logues piodes leu apait d’auto- eouelleet. Il est ie tali u’à haue dupliatio du goe, des eeus de letue ou des doages de l’ADN peuet suei. Les ellules souches possèdent des mécanismes de surveillance qui détectent les erreurs de réplication et éliminent les cellules dans lesquelles apparaissent ces erreurs. Il y aurait intervention de la protéine p53 bien connue pour son rôle de facteur anti-tumoral et pro-apoptotique, et de la protéine du rétinoblastome (pRb), elle aussi facteur anti-tumoral. Ce mécanisme préviendrait ainsi la formation de tumeur par utatio d’ue ellule souhe et polifatio de ette ellule ute MORRI“ON et SPRADLING, 2008).

2.2 Pouvoir de différenciation en plusieurs lignages cellulaires La différenciation est définie comme un changement dans le phénotype cellulaire en raison de l’epessio de ges spifiues de la fotio ellulaie suiat le ligage auuel elle appartient (Gargett, C.E. . Coe ous l’aos djà etio, les cellules souches etet das la oie de diffeiatio pa des diisios dites astiues ipliuat u’ue seule des deux cellules filles conserve les caractéristiques propres des cellules souches, alors ue l’aute ellule fille otiue das la oie de la diffeiatio (Ulloa-Montoya et al., 2005).

Il semblerait que l’astie soit lie à ue astie olulaie au sei de la ellule souche en division. Il y aurait une ségrégation asymétrique des protéines, des ARNs, des ogaelles et de l’ADN. Il seleait galeet ue le fuseau essaie à la diisio ellulaire soit lui aussi asymétrique (Morrison and Spradling, 2008). Efi l’eioement iteiedait aussi das l’astie des diisios. La ellule fille oteue etat das la oie de diffeiatio est appele ellule d’aplifiatio tasitoie tasit aplifig pogeito ou cellule TA) (Gargett, 2007). Ces cellules TA, aussi appelées, suivant leur stade, cellules progénitrices puis cellules précurseurs, possèdent des propriétés intermédiaires entre les cellules souches adultes et les cellules différenciées : elles ont un potentiel de division limité,

Introduction ue asee de apait à l’auto-renouvellement et donnent naissance progressivement aux cellules différenciées (Figure H-1).

Figure H-1 : Hiérarchie de la différenciation des cellules souches. Les cellules souches subissent des divisions cellulaires astiues, e ui leu peet de s’auto-renouveler ou de se différencier pour donner naissance à des progéniteurs engagés. Ces derniers prolifèrent et donnent lieu à des « cellules amplificatrices de transit » ou (transit amplifying (TA) cells) plus différenciées, qui prolifèrent rapidement et se différencient finalement pour produire de nombreuses cellules fotioelles diffeies sas apait de polifatio. D’aps Gagett, C.E et al., .

La division asymétrique jouerait aussi un rôle dans la apait u’ot les ellules souhes à se aitei logteps : les utatios de l’ADN seaiet spifiueet eoes das la ellule fille pousuiat la diffeiatio alos ue l’ADN oigial, itact, serait conservé dans la cellule souche fille resposale de l’auto-eouelleet. Ce phoe ’a epedat pas été décrit dans tous les systèmes (Morrison and Spradling, 2008).

3 Types et potentiels de différenciation des cellules souches humaines : Le pouvoir de différenciation des cellules souches est différent selon le type de cellules souches qui peuvent être totipotentes, pluripotentes ou multipotentes (Laurie, 2004; Takahashi et al., 2007; Thomson et al., 1998) (Figure H-2).

Introduction

Figure H-2 : La hiahie des ellules souhes. Le zgote totipotet fo pa la fusio de l’oule et le spermatozoïde se divise pour former la masse cellulaire interne (ICM ou inner cell mass) et le tissu extra-embryonnaire (EE ou extra-embryonic) du blastocyste. Lorsqu'elles sont isolées du blastocyste, les cellules de l'ICM peuvent être maintenues in vitro en culture sous la forme de lignées de cellules souches embryonnaires (CSEs) pluripotentes. Au cours du développement de l'embryon, les cellules souches pluripotentes de l'ICM sont de plus en plus restreintes dans leur potentiel de lignage et génèrent des cellules souches multipotentes tissu-spécifiques. Celles-ci incluent des cellules souches épidermiques (cellules souches du follicule pileux) qui forment la peau et les cheveux, des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse qui donnent naissance à toutes les cellules hématopoïétiques, des cellules souches neurales dans la zone subventriculaire du cerveau, des cellules souches gastro-intestinales situées dans la crypte de l'intestin grêle, des cellules ovales qui donnent naissance au foie (non montrées) et des cellules souches mésenchymateuses qui résident dans la moelle osseuse et peuvent former des cellules osseuses, stromales et des adipocytes (non représentées). D’aps Ekfeldt, C.E et al..

3.1 Les cellules souches embryonnaires (CSEs) : 3.1.1 Les cellules souches totipotentes :

Les cellules souches ont la capacité de se différencier en tous types cellulaires spécialisés. Le nombre de type de cellules spécialisées différents que peut engendrer une cellule souche définit sa potentialité.

Introduction Les ellules souhes totipotetes ot la apait de doe aissae à ’ipote uel tpe ellulaie ostituat l’ogaise huai ompris les tissus extra-embryonnaires comme le placenta (Thomson et al., 1998). L’eistee de es ellules souhes totipotetes est courte, et dure entre la fertilisation et la formation du blastocyste, lorsque le zygote ou œuf fod oee à se diise jusu’à aoi huit ellules idetiues (Figure H-2).

3.1.2 Les cellules souches pluripotentes :

Au uatie jou du deloppeet eoaie, l’aas ellulaie foe le lastoste. Le lastoste est ostitu de deu ouhes ; une couche externe qui se transforme en tissus extra-embryonnaires et la couche interne qui est un ensemble de 30 ellules eio ui foeot pa la suite l’ogaise (Eckfeldt et al., 2005) (Figure H-2).

Ces cellules sont pluripotentes et ont le potentiel de se différencier en 200 types ellulaies à l’essee du ops huai (Laurie, 2004). Ainsi, les cellules souches pluripotentes de la couche interne du blastocyste représente une source pour créer des lignées de CSEs humaines (Laurie, 2004; Thomson et al., 1998). A la différence des cellules souches totipotentes, les ellules souhes pluipotetes e peuet pas te à l’oigie d’u te huai puisu’elles sont incapables de constituer les tissus extra-embryonnaires essentiels au développement embryonnaire. Les cellules souches pluripotentes peuvent donc former les trois feuillets germinaux (endoderme, mésoderme et ectoderme) et se spécialiser ensuite en d’autes tpes de ellules souhes ue sot les ellules souhes ultipotetes (Enmon et al., 2002).

3.2 Les cellules souches adultes: On retrouve les cellules souches adultes multipotentes dans plusieurs tissus et organes comme la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang périphérique, le muscle squelettique, l’pidee, le œu, le foie et le eeau. Ces ellules sot « ogaes-spécifiques », se forment pedat le deloppeet fœtal et peduet das l’ogaise adulte (figure H-2).

Elles sont indifféreies ae ue apait d’auto-renouvellement et une forte prolifération et se différencient en cellules spécialisées avec des fonctions spécifiques (Pittenger et al., 1999). Les cellules souches multipotentes comme par exemple les cellules souches hématopoïétiques, mésenchymateuses et épidermiques, peuvent êtres différenciées in vitro et utilisées en médecine régénérative (Ma, 2010; Macrin et al., 2017). Malgré leur

Introduction pouvoir limité de différenciation, les cellules souches adultes multipotentes peuvent être orientées vers plusieurs types cellulaires et facilement manipulées in vitro contrairement aux CSEs dot l’utilisatio est souet ts liite pou des uestios thiues. Les ellules souches multipotentes adultes se présentent donc comme de bons candidats pour le traitement de multiples pathologies dans le domaine de la médecine régénérative et de la thérapie cellulaire. Cependant, il est nécessaire et indispensable de bien caractériser et comprendre in vitro leus aises d’auto-renouvellement, de prolifération et de différenciation.

Avant de développer plus spécifiquement les cellules progénitrices cardiaques il est important de faire une description plus généraliste (synthétique) des différents types de cellules souches adultes

3.2.1 Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs)

Elles font partie des cellules souches adultes de la moelle osseuse les plus connues et les plus étudiées. Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules multipotentes et donnent naissance aux deux lignées myéloïde et lymphoïde des cellules sanguines. Ces cellules ont été utilisées avec succès dans la thérapie cellulaire (Kuznetsov et al., 2001) et peuvent être aussi trouvées dans le sang périphérique ou dans le sang du cordon ombilical des nouveaux- nés. Les CSHs ot t à l’oigie du dut des ehehes odees su les ellules souhes adultes grâce aux découvertes faites sur leur très forte capacité d’auto-renouvellement et de différenciation en tous les types cellulaires du lignage hématopoïétique (figure H-3).

Introduction

Figure H-3 : Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs). Les CSHs sont dotées d'une capacité d'auto-renouvellement (flèche incurvée) qui maintient leur stock et de potentiel de différenciation multipotent qui permet de produire toutes les cellules du système hématopoïétique mature. À esue ue les C“Hs se diffeiet, elles pedet leu apait d’auto-renouvellement et leur pouvoir multiple de différenciation devient de plus en plus restreint. Les CSHs donnent naissance à des progéniteurs (CLP, CMP, MEP et GMP) qui s’egaget das u poessus de diffeiatio pour donner à la fin des cellules spécialisées (lymphocyte B, lymphpcyte T, cellules NK etc ... CLP (common lymphoid progenitor); CMP (common myeloid progenitor); GMP, (granulocyte monocyte progenitor); MEP (megakaryocyte erythrocyte progenitor); NK (natural killer). D’aps Eckfeldt, C.E et al.2005.

Les CSHs peuvent être isolées par prélèvement direct de la moelle osseuse hématopoïétique mais aussi prélevées dans le sang périphérique après stimulation par des cytokines (Sackstein, 2004). Les CSHs de la moelle osseuse expriment à leur surface des marqueurs qui permettent de les identifier comme le CD34, KDR, CD45, AC133. Elles expriment peu les marqueurs THY- 1, KIT et SCA-1. Les CSHs ont la capacité de se différencier en toutes les lignées cellulaires qui composent le sang. Leur pouvoir de différenciation in vivo en cardiomyocytes a été analysé mais les résultats obtenus in vitro sont controversés ; des études ont montré que les CSHs isolées de la moelle osseuse pouvaient exprimer plusieurs facteurs de transcription cardiaques intégrant les protéines sarcomériques (Eisenberg et al., 2003).

Plusieurs études ont suggéré que des cellules isolées de moelle osseuse et donc enrichies en CSHs pouaiet ge le oade das des odles aiau d’ifatus (Agbulut et al., 2003; Jackson et al., 2001; Kajstura et al., 2005; Orlic et al., 2001a). Cependant,

Introduction des publications ont montré que la même population de cellules adoptait uniquement un phénotype hématopoïétique après transplantation (Balsam et al., 2004; Murry et al., 2004).

D’autes statgies oe la oilisatio de ellules puseus hatopoïtiues pa du Stem Cell Factor et du Granulocyte-Colony Stimulating Factor ou G-CSF pendant le douleet d’u ifatus ot galeet do des sultats otaditoies (Deten et al., 2005; Orlic et al., 2001b).

3.2.2 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs)

Les cellules souches mésenchymateuses appelées également cellules souches stromales ont été également retrouvées dans la moelle osseuse. Coe ous l’aos djà etio les CSMs de la moelle osseuse ont été décrites pour la première fois par Ernest McCulloch et James Till dans les années 1960. D’autes heheus duat les aes -80 (Friedenstein (1970), Owen (1988), Tavassoli et Crosby (1970), qualifiaient ces cellules de « mechanocytes dérivées de la moelle osseuse » ou encore « des fibroblastes stromaux ». Ce ’est u’à pati de 1991 que Caplan nomma ces cellules ; «cellules souches mésenchymateuses ». Les CSMs sot fusifoes et ot la popit d’adhe au plastique in vitro. A l’iese, la plupat des autres types de cellules souches de la moelle osseuse comme les CSHs ’ot pas ette popit d’adhee au plastiue (Friedenstein, 1995). Les CSMs peuet s’auto-renouveler et se différencier en lignage mésodermique (adipocyte, chondrocytes, ostéoblastes et cellules stromales) (figure H-4).

Des études ont montré la capacité des CSMs à se transdifférencier in vitro e d’autes lignages (ectoderme et endoderme) mais cette transdifférenciation est controversée in vivo (figure H-4). Elles interviennent in vivo lors des processus de réparations des tissus edoags oe l’os, le atilage, le usle, le ligaet, le tedo et le stoa (Pittenger et al., 1999; Psaltis et al., 2008). Les CSMs ont pu être isolées à partir de plusieurs tissus comme le sang périphérique (Kuznetsov et al., 1997), le sang du cordon ombilical (Lee et al., 2004), le sang foetal (Noort et al., 2002), la pulpe dentaire (Gronthos et al., 2000), le liquide amniotique I ’t Ake et al., , le poumon (Fan et al., 2005), le foie (Campagnoli et al., 2001), le tissu adipeux (Zuk et al., 2002), l’itesti (Bjerknes and Cheng, 2002) et le follicule pileux (Amoh et al., 2005).

Introduction

Figure H-4 : Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Les MSCs de la moelle osseuse ont la apait de s’auto-renouveler (flèche incurvée) et à se différencier vers la lignée mésodermique en donnant naissance aux cellules stromales, chondrocytes, adipocytes et ostéoblastes, (flèches otiues. D’autes apaits de diffeiatio in vitro vers les lignages ectodermique et edodeiue, ot t douetes das la littatue flhes poitilles. D’aps Uelli, A et al.2008.

U des poles d’idetifiation des CSMs est l’asee de aueus immunophénotypiques universels qui leur sont spécifiques (Rastegar et al., 2010; Williams and Hare, 2011). Cependant, le comité de la société internationale pour la thérapie cellulaire s’itessat au cellules souches mésenchymateuses (the International Society for Cellular Therapy), a bien défini certains critères pour décrire une CSM, qui se résume en leur adhésion au plastique en conditions de culture. De plus une CSM doit exprimer le CD105, CD73 et CD90 et doit être négative pour le CD45, CD34, CD14, CD79, CD19 et HLA-DR et doit se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes in vitro (Dominici et al., 2006). En général, elle

Introduction ’epie pas le CD, le CD, le CD et le CD (Majumdar et al., 2003). D’aute pat, les CSMs sont connues pour être positives pour les peptides de surface SH2, SH3, SH4, le CD35 (trans-membrane protein), le CD73, le CD90 (Thy1), le CD123, le CD117, CD271 et le Stro-3- positive mesenchymal precursor cell (Kuçi et al., 2010). Ces ellules souhes doiet d’aute pat epie des aueus eoaies oe l’Ot, le Naog et le ““EA-4 (Gang et al., 2007).

Naois, d’autes tpes ellulaies, oe les CSHs, expriment également certains des marqueurs déjà cités rendant la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses plus complexe (Kim and Ahn, 2012). Il en résulte que pour bien distinguer les CSMs des CSHs, une sélection basée sur l'absence des marqueurs hématopoïétiques CD34, CD45 et CD14 serait suffisante (Majumdar et al., 2003).

Les CSM peuvent se différencier en plusieurs types cellulaires. La première différenciation a été réalisée par Friedenstein et ses collaborateurs (1970) qui ont pu isoler et différencier les CSMs en tissus osseux in vitro. Différents groupes ont montré par la suite que les CSMs peuvent se différencier en cellules pancréatiques (Lee et al., 2004) , neuronales (Woodbury et al., 2000), en os (Haynesworth et al., 1992), en cartilage (Yoo et al., 1998), en muscle (Wakitani et al., 1995), stroma de la moelle (Majumdar et al., 1998), tendon et ligament (Young et al., 1998), tissu adipeux (Dennis et al., 1999) et en différents tissus connectifs (Studeny et al., 2004). Les CSMs de la moelle osseuse sont également capables de freiner et « réparer » les altérations pulmonaires (Curley et al., 2012), le diabète (Si et al., 2012), les désordres neurologiques (Edalatmanesh et al., 2011), les maladies rénales (Alfarano et al., 2012) et les blessures hépatiques (Zhao et al., 2012). En plus de leur pouvoir de différenciation en différents lignages mésenchymateux, les CSMs peuvent aussi donner aissae sous etaies oditios de ultue à d’autes ellules spialisées comme les cardiomyocytes.

Ces taau ot peis de ette e idee des hageets d’epessio de certains gènes cardiaques comme la chaîne lourde de myosine, la troponine T cardiaque, des facteurs de transcription précoces cardiaques comme NKx2.5 et GATA4 (Reik, 2007). GATA4 est u gulateu ajeu de l’epessio des ges adiaues duat la diffeiatio (Heineke et al., 2007). Pset das le œu adulte il joue u ôle de gulateu transcriptionnel de nombreux gènes cardiaques comme le facteur natriuretic atrial, le peptide

Introduction natriuretic de type B, la chaîne lourde de myosine et la troponine T cardiaque qui sont deux protéines contractiles cruciales dans la fonction musculaire squelettique et cardiaque.

3.2.3 Les cellules souches du tissu adipeux

Des études ont montré que le tissu adipeux contient des cellules souches nommées cellules mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSCs ou Adipose tissue-derived stem cells) (Nakagami et al., 2005). Ce tissu est aodat, faile d’as et epsete ue potentielle source de cellules pour des transplantations autologues. Les ADSCs sont multipotentes et sont localisées au niveau du stroma vasculaire du tissu adipeux sous cutané. Ces cellules ont beaucoup de similitude avec les CSMs de la moelle osseuse. Elles seraient positives pour les marqueurs SCA-1 et CD44 et négatives pour les marqueurs KIT, CD11b, CD31, CD34 ou CD45 (Nakagami et al., 2005). Elles présentent un phénotype proche de celui des fibroblastes et peuvent se différencier in vitro en adipocytes, ostéoblastes et chondroblastes. Les ADSCs secrètent de oeuses tokies HGF, VEGF, PGF, TGFβ, FGF, ANG-1 et ANG) mais aussi des facteurs angiogéniques comme le VEGF et le HGF. Les ADSC partagent beaucoup de gènes avec les CSMs de la moelle osseuse et expriment des marqueurs hématopoéitiques (CD34, CD133 et ABCG2) (Planat-Benard et al., 2004) suggérant une double populatio d’AD“Cs : elles de tpe hatopoïtiue et elles de tpe sehateu.

3.2.4 Les cellules progénitrices endothéliales

Les cellules progénitrices endothéliales (CPEs) sont des cellules circulantes de la moelle osseuse ui sidet au sei de l’edothliu et otiuet à la asulogese et l’hoostasie asulaie (Khakoo and Finkel, 2005) (figure H-5). Elles ont été identifiées pour la première fois en 1997 (Asahara et al., 1997) et ont été isolées à partir du sang périphérique comme étant des cellules exprimant le marqueur CD34. Ces cellules seraient natives de la moelle osseuse.

Introduction

Figure H-5 : Les cellules progénitrices endothéliales (CPEs). Les CPEs peuvent dériver de cellules embryonnaires (hémangioblastes) et de plusieurs tissus adultes (cellules CD14+/ CD34+/CD133+ du sang périphérique, moelle osseuse, paroi vasculaire et myocarde). Les CPEs sont impliquées essetielleet das la eedothelisatio des aisseau lss et das l’agiogese das des zoes ischémiques. D’aps Lei, A., ad Kajstua, J. .

Les hagiolastes psets pedat l’eogese seaiet à l’oigie des ellules précurseurs des endothéliums (Kubo and Alitalo, 2003; Risau and Flamme, 1995) mais pourraient également provenir directement des CSHs (Kubo and Alitalo, 2003). En effet, les CPEs partagent des marqueurs communs avec les CSHs comme le CD133 et CD34 mais elles expriment en plus le marqueur endothélial FLK-1 (Liao et al., 2007). Les CPEs se présenteraient comme une sous population de CSHs aat la apait d’aui u photpe edothlial (Liao et al., 2007). Les CPEs sont très peu nombreuses dans le sang périphérique et dans la moelle, limitant leur utilisation (Nakagami et al., 2005). Ces cellules ont été utilisées en thérapie cellulaire pour différentes pathologies comme certaines maladies cardiovasculaires (Kawamoto and Losordo, 2008) et le diabète (Fadini et al., 2010).

Introduction 3.2.5 Les ellules souhes de l’pithliu itestial :

Les ellules souhes de l’pithliu itestial fot patie des ellules souhes pithliales des tissus à eouelleet apide et eposs au ilieu etieu. L’itesti a u ôle poteteu ajeu pa la foatio d'ue aie ae le ilieu etieu d’où la nécessité de se renouveler en permanence. Ce renouvellement (tous les deux à sept jours) est assuré par la présence de cellules souches qui en se différenciant, donnent différents types cellulaires avec différentes fonctions. Les cellules souches intestinales (CSIs) résident dans les cryptes et expriment à leur surface les marqueurs (MSI-1), CD-24 et KIT (Reya and Clevers, 2005). Elles sont multipotentes et se différencient en quatre types cellulaires : les entérocytes ôle d’asoptio des aliets, les ellules uipaes aliifoes potetio de la sufae de l'épithélium par la sécrétion du mucus), les cellules entéroendocrines (sécrétion des hormones peptidiques) et les cellules de Paneth (sécrétion de lysozymes et rôle immunitaire) (Goodell et al., 2015) (figure H-6).

Les entérocytes, les cellules mucipares caliciformes et les cellules entéroendocrines se diffeiet e igat es l’etit des ptes et e haut des illosits, es ellules suisset l’apoptose et desuaet das la luie itestinale. Les cellules de Paneth se différencient en migrant vers la base de la crypte. Ces cellules ont une durée de vie plus longue ue les autes tpes ellulaies aat d’te phagotes pa les ellules eioates.

Introduction

Figure H-6 : Les cellules souches intestinales (CSIs). Les CSIs sont localisées au niveau de la base des cryptes de Lieberkühn et sont de deux types : les cellules souches CBC (Crypt base columnar) et les cellules souches intestinales quiescentes (qISC). Les cellules souches CBC prolifèrent quotidienneet et assuet la podutio des diffets tpes ellulaies de l’pithliu intestinal. Les cellules souches CBC se divisent et produisent des cellules filles progénitrices de deux types ; les cellules TA (transient amplifying) et les cellules progénitrices sécrétrices. Ces cellules progénitrices se différencient par la suite et donnent naissance aux divers types cellulaires de l’pithliu itestial etotes, ellules aliifoes, ellules etoedoies, ellules de Paneth). Les qISC se divisent rarement sous conditions homéostatiques mais peuvent être induites à produire de nouvelles cellules souches CBC en réponse à des lésions ou à d'autres stimuli. D’aps Goodell, M.A et al (2015).

Introduction 3.2.6 Les ellules souhes de l’pidee

L’pidee est u tissu qui se renouvelle constamment par le phénomène de desuaatio. Cette deie oespod à l’liiatio des ellules de la ouhe oe ui sont replacées rapidement par les kératinocytes. Il existe ainsi une population de cellules souches multipotentes apales d’auto eouelleet et ui epiet des aueus spifiues oe la K, des olules d’adhsio oe des β-intégrines, des E- adhies et des β-caténines. Ces cellules souches portent le nom de cellules souches des kératinocytes (CSKs) (Watt, 2002). Ces CSKs donnent rapidement des cellules intermédiaires qui se détachent de la membrane basale et se différencient (Solanas and Benitah, 2013) (figure H-7). On a ainsi des CSKs au niveau de la couche basale associée à des cellules intermédiaires, des cellules intermédiaires dans la couche épineuse, des cellules différenciées dans la couche granuleuse et des cellules mortes dans la couche cornée.

Les CSKs sot issues d’autes ellules souhes ultipotetes appeles ellules souhes de l’pidee C“Eps). Les CSEps epiet les aueus CD, le K et la α-intégrine (Mimeault and Batra, 2006). Les CSEps sot à l’oigie des cellules progénitrices de la matrice du follicule pileux, des cellules progénitrices des glandes sébacées et des cellules de la papille deiue. A la diffee des C“Ks ui e doet aissae u’au cellules épidermiques, les CSEps se différencient à la fois e ellules de l’pidee et e ellules pogities de la matrice du follicule pileux. En plus des CSKs et des CSEps, la peau contient également des cellules souches pluripotentes épidermiques issues de la crête neurale (eCSCNs). Les eCSCNs ont été découvertes par LI et al. en 2003 chez la souris comme des cellules exprimant la nestine (marqueur des cellules de la crête neurale) et retrouvées en partie au niveau du bulbe du follicule pileux. Les eCSCNs expriment aussi le CD34 et THY-1 et peuvent se différencier en plusieurs lignages cellulaires incluant des neurones, des mélanocytes, des cellules de Schwann et des cellules de Merkel (Mimeault and Batra, 2006) et (Sakaue and Sieber-Blum, 2015). Les eNCSCs semblent être localisées au niveau du bulbe du follicule pileux mais leur localisation change suivant le cycle folliculaire (Li et al., 2003).

Introduction

Figure H-7 : Les cellules souches de l'épiderme interfolliculaire. Les cellules souches de l'épiderme interfolliculaire humain expriment des marqueurs spécifiques (intégrines α6 et β1, LRIG1, MCSP et Kératine 15). On a ainsi des cellules souches au niveau de la couche basale associée à des cellules intermédiaires, des cellules intermédiaires dans la couche épineuse, des cellules différenciées dans la couche granuleuse et des cellules mortes dans la couche cornée. LRIG1 (Leu-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1), MCSP (melanoma-associated chondroitin sulphate proteoglycan). D’aps “olaas, G et Benitah, S.A. (2013).

3.2.7 Les ellules souhes de l’pithliu puloaie

Chez la souis, l’pithlium pulmonaire renferme des cellules souches multipotentes capables de se différencier en cellules ciliées et en cellules mucipares des glandes sous- muqueuses (Kim et al., 2005; Lee et al., 2014; Mimeault and Batra, 2006). Ces cellules sont appelées cellules souches broncho-alvéolaires multipotentes ou CSBAs et sont capables d’auto-renouvellement. Les CSBAs sont au niveau de la jonction broncho-alvéolaire (Engelhardt, 2001) et contribuent au maintien des cellules broncho-alvéolaires du poumon. Ces cellules expriment différents marqueurs comme le marqueur « Scgb1a » des cellules bronchiques exocrines de Clara, le marquer « AT2 ou alveolar type 2» et le marqueur CPS (prosurfactant protein C) (Kim et al., 2005). Les CSBAs sot dotes de apaits d’auto- renouvellement et se différencient en réponse à une lésion pulmonaire en cellules épithéliales

Introduction bronchiques en en cellules épithéliales alvéolaire (Lee et al., 2014; Tropea et al., 2012; Zacharek et al., 2011) (figure H-8).

Figure H-8 : Les ellules souhes de l’pithliu puloaie. Les ellules souches broncho- alvéolaires (CSBAs) se trouvent au niveau de la jonction broncho-alvéolaire et peuvent se différencier en cellules épithéliales bronchiques et en cellules épithéliales alvéolaies. D’aps Lee et al., (2014).

L’EGF epideal goth fato et le “HH “oi hedgehog au ieau de l’pithliu puloaie jouet u ôle ipotat das l’hoostasie tissulaie du pouo e stiulat la prolifération et la différenciation des CSBAs. Ces facteurs contribueraient ainsi à la réparation de l’pithliu puloaie aps ue lsio (Mimeault and Batra, 2006). La majorité des recherches sur les cellules souches pulmonaires ont été effectuées chez la souris, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent l'homéostasie pulmonaire et la gatio sot eoe al opis hez l’Hoe.

3.2.8 Les cellules souches de la cornée et de la rétine

L’pithliu de la sufae des eu oped la oe, le lie, et l’pithliu statifi conjonctival. De par son exposition aux agressions extérieures ce tissu est constamment régénéré. Dans la cornée il existe des cellules souches de l’pithliu oe C“ECs qui

Introduction sont localisées plus particulièrement au niveau du limbe dans des cryptes épithéliales (Li et al., 2007; Pajoohesh-Ganji and Stepp, 2005) (figure H-9).

Figure H-9 : Les cellules souches du limbe scléro-cornéen (CSECs). Les cellules souches du limbe scléro-cornéen (SC) sont situées dans la couche basal du limbe oculaire. Au niveau de cette couche épithéliale, il existe aussi des cellules progénitrices (eTAC et lTAC) en plus des mélanocytes (M) et des ellules de Lageha’s LC. Les ellules pogities poes eTAC donneraient naissance à des cellules progénitrices tardives (lTAC), qui à leur tour donneraient les cellules post-mitotiques suprabasales (PMC), et enfin les cellules superficielles différenciées (TDC). La membrane basale (BM) sépare l'épithélium du stroma sous-jacent. Ce dernier contient des cellules mésenchymateuses (MC), des nerfs (N) et des aisseau saguis BV. D’aps Li, W et al. (2007).

Les CSECs forment des cellules progénitrices transitoires qui à leur tour donnent des cellules différenciées de la cornée (Li et al., 2007; Pajoohesh-Ganji and Stepp, 2005). Ces cellules souches expriment des marqueurs coe le p, l’ABCG, les α- et β-intégrines, l’EGF-R, le K, l’α-énolase, et le CD71.

U aute tpe de ellules souhes eiste aussi au ieau de l’pithliu iliaie potat le nom de cellules souches rétiniennes (CSRs). Les CSRs peuet s’auto-renouveler et expriment des marqueurs comme la télomérase, la nestine et PAX-6 (Das et al., 2005). La

Introduction prolifération et la différenciation des CSRs sont régulées par de nombreux facteurs et voies de signalisation (Das et al., 2005).

3.2.9 Les cellules souches/progénitrices hépatiques

Dans des conditions physiopathologiques, par exemple une infection ou un traumatisme, le foie peut initier un processus de régénération. Le renouvellement hépatique est assuré par les hépatocytes et les cholangiocytes ou cellules des canaux biliaires qui sont des cellules inter-mitotiques pouvant entrer en division après stimulation. Ces deux types cellulaires assurent seulement une régénération à petite échelle lors de lésions mineures.

Des recherches ont révélé la présence de niches pour des cellules souches au sein des canaux de Hering (canaux biliaires dans la région péri-portale). Ces cellules progénitrices hépatiques (CPHs) présentent un phénotype intermédiaire entre les hépatocytes péri-portaux et les cellules des canaux biliaires (Tarnowski and Sieron, 2006). Les CPHs assurent une régénération à grande échelle et se différencient en hépatocytes et en cellules des canaux biliaires (Van Haele and Roskams, 2017) (figure H-10). L’oigie des CPHs serait soit les hépatoblastes (eux-mêmes issus de cellules précurseurs endodermiques) ; soit des cellules précurseurs endodermiques (Walkup and Gerber, 2006). Les CPHs expriment de manière spécifique le OV-6 (ovalbumine-6) (Tarnowski and Sieron, 2006) mais expriment aussi des marqueurs communs avec les hépatocytes immatures et les cellules des canaux biliaires oe le CK, l’α-ftopotie αFP, la -glutamyl-tasfase, l’aluie ALB, le CK, et l’OC. Les CPHs sont aussi positives pour des marqueurs hématopoïétiques comme CD34, THY-1, FLT-3 et KIT. Plusieurs facteurs (HGF, EGF, TGF-α, VEGF, SCF, TGF-β, et “DF-1) et voies de sigalisatios WNT/β-caténine, Notch) sont impliqués dans la régulation de la prolifération et de la différenciation de ces cellules pendant la régénération hépatique. Des études ont suggérés une source extra-hépatique des CPHs que serait la moelle osseuse (Tarnowski and Sieron, 2006).

Introduction

Figure H-10 : Les cellules progénitrices hépatiques (CPHs). Les CPHs quiescentes (K19, K7, NCAM, CD133+) prolifèrent après activation et donnent des CPHs (K19, K7, NCAM, CD133+, EpCAM). Ces dernières peuvent se différencier à la fois en hépatocytes et en cholangiocytes, lors de l'embryogenèse et suite à une lésion hépatique. Après une blessure, la différenciation des CPHs dépend du site de la lésion. Après une perte d'hépatocytes, les CPHs aties s’egaget das u lignage hépatocytaire et donnent naissance à des CPHs (K19-, K7+, NCAM-, CD133-, EpCAM+) suite à l’ihiitio de la oie de sigalisatio Noth. Ces dernières se différencient en hépatocytes matures (K19-, K7-, NCAM-, CD133-, EpCAM-). Après la perte des voies biliaires, les CPHs aties s’egaget dans un lignage cholangiocytaire et donnent des CPHs (K19+, K7+, NCAM+, CD133-, EpCAM+) via l'activation de la voie Notch. Ces CPHs engagées se différencient après en cholangiocytes matures (K19+, K7+, NCAM-, CD133-, EpCAM+). X: inhibition, ++: activation, numb: inhibiteur de la voie Notch. D’aps Va Haele, M., et Roskas, T. .

3.2.10 Les cellules souches neurales (CSNs) du système nerveux central

Depuis très longtemps, le cerveau était considéré comme un organe dépourvu de régénération avec un stock de neurones qui diminue tout au long de la vie. Mais des études sur les rongeurs dans les années 196 ot l u’il eistait u phoe de euogese dans certaines zones du cerveau adulte de mammifères (Altman, 1963, 1969; Altman and Das, 1965). Plus tard entre 1970 et 1980, cette neurogenèse a été confirmée chez des rongeurs

Introduction das l’hippoape et das la zoe sous-ventriculaire près du ventricule latéral (Bayer, 1982; Kaplan and Hinds, 1977).

Il a fallu attendre les années 1990 pour démontrer que la neurogenèse se produisait galeet das le eeau des piates et de l’Hoe (Kuhn et al., 1996; Luskin, 1993; Seki and Arai, 1993). La neurogenèse commence précisément dans deux zones du cerveau qui sont le gus det detal gus ou DG de l’hippoape et la zoe sous-ventriculaire (subventricular zone ou SVZ) (Taupin, 2006). Dans le DG, les nouvelles cellules neuronales sont obtenues au niveau de la zone sous-granulaire (subgranular zone ou SGZ) puis elles migrent das la ouhe des ellules gaulaies d’où elles se pojettet das l’aie CA de la oe d’Ao (Bond et al., 2015) (figure H-11 A).

Das la “V), les ouelles ellules euoales oteues iget jusu’au ule olfatif (olfactory bulb ou OB), à travers la voie de migration rostrale (rostro-migratory stream ou RMS), où elles se différencient en interneurones. Dans le cerveau adulte, la majorité de la neurogenèse se fait dans la SVZ et la SGZ (LI et XIE, 2005; TARNOWSKI et SIERON, 2006). Une euogese plus « diste » a t appote das d’autes zoes du eeau oe le ops sti et le e etiule et l’aie CA, hez les ogeus, aisi ue dans le néocortex chez les primates non humains (Taupin, 2006).

Les CSNs sot dotes de apait d’auto-renouvellement et elles sont considérées comme des cellules souches multipotentes donnant naissance aux neurones, aux astrocytes et aux oligodendrocytes (Taupin, 2006) (figure H-11 B). Les CSNs sont aussi les précurseurs des cellules progénitrices neurales (neural progenitor cells ou NPCs) et gliales (glial progenitor cells ou GPCs). Ces deux types de cellules progénitrices sont des cellules indifférenciées et comparées aux CSNs, elles possèdent une capacité de prolifération limitée et ne peuvent pas s’auto-renouveler (Taupin, 2006).

L’isoleet et la aatisatio in vitro des CSNs ont commencé en 1992 avec les travaux de REYNOLD et WEISS sur la souris. Ces travaux ont montré que les CSNs isolées à partir de la SVZ pouvaient se différencier en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces cellules avaient la particularité de se développer en neurosphères in vitro en présence de l’EGF.

Introduction A

Figure H-11 : Les cellules souches neuronales. (A) Vue sagittale du cerveau adulte de rongeur montrant les deux niches ; la SVZ (subventricular zone) et la SGZ (subgranular zone) des cellules souches neurales (NSCs). La SVZ est située le long du ventricule latéral (LV) dans le cerveau antérieur, tandis que la SGZ est située dans l'hippocampe (Hipp) le long de la couche granulaire du gyrus denté (DG). CC : corps calleux ; OB : bulbe olfactif; RMS : courant de migration rostrale ; St : striatum ; CA1 : aie CA de l’hippoape ; CA : aie CA de l’hippoape. (B) Potentiel de différenciation des NSCs. Les NSCs adultes se trouvent dans un état quiescent ou actif en quittant ou en entrant dans le cycle cellulaire, respectivement. Une fois activées, les NSCs peuvent se diviser de manière asymétrique (donnant une NSC et une cellule progénitrice intermediaire IPC) ou de manière symétrique (donnant deux NSCs ou deux IPCs). Les IPCs peuvent être unipotentes (se différentiant en un seul type cellulaire), ou multipotentes (se différenciant en plusieurs types cellulaires. Il est aussi possile u’ue N“Cs puisse se diffeie dieteet e ellules gliales matures (astrocytes). NG2 : eual/glial atige . D’aps Bod, A.M et al. (2015).

Introduction La nestine marque les cellules souches neuro-épithéliales et les cellules du système nerveux central durant le développement embryonnaire. En plus de la nestine, les cellules souches foat es euosphes epiet aussi d’autes aueus oe LEX/““EA-1, AC133 et NG2 (Tarnowski and Sieron, 2006). D’autes uipes ot pu isole des NSCs à partir du cerveau adulte et de la oelle piie hez de oeuses espes opis l’Hoe (Li and Xie, 2005; Taupin, 2006). La neurogenèse du cerveau adulte est modulée par de nombreux stimuli environnementaux et selon certaines conditions physiopathologiques (Taupin, 2006). Chez le ogeu, l’eeie augeteait la euogese das l’hippoape alos ue l’aaeet das l’âge la diiueait. L’isoleet soial, l’aloolise, le stess et le aue de soeil diminuent la neurogenèse. La neurogenèse adulte survient dans les processus physiologiques oe la oie et d’appetissage ais aussi das des conditions pathologiques, comme les pathologies neurologiques et les traumatismes du cerveau (Taupin, 2006).

3.2.11 Les cellules souches musculaires squelettiques

Le muscle strié squelettique renferme des cellules souches bien caractérisées qui assurent son renouvellement et sa réparation lors des lésions. Les cellules souches myogéniques, nommées cellules satellites (satellite cells ou SCs), se localisent entre deux couches de lame basale et expriment des marqueurs comme N-CAM, CD56, la M-cadhérine, PAX-7, MYO-D et MYF-. L’epessio e es aueus aie selo le stade de différenciation (McCullagh and Perlingeiro, 2015; Zammit et al., 2006) (figure H-12). Les SCs se trouvent dans u tat uieset ais suite à leu atiatio pa u stiulus lessue, tauatise, …) ces cellules prolifèrent, fusionnent et se différencient en myofibres (Christov et al., 2007; Hawke and Garry, 2001). La différenciation des SCs en myofibres s’aopage de hageets toplasiues ipotats oe la dutio de l’htohoatie, augetatio du atio toplase/oau et augetatio du oe d’ogaelles itaellulaies (Hawke and Garry, 2001; Tarnowski and Sieron, 2006).

Introduction

Figure H-12 : Les cellules satellites du muscle strié squelettique. Les cellules souches adultes du muscle strié squelettique ou cellules satellites (SCs) peuvent sortir de leur état quiescent sous certaines conditions. La SC quiescente (Pax7+ s’atie et se diise de manière asymétrique donnant naissance à une cellule SC (flèche incurvée) et une cellule SCs (Pax7+, Myf5+, MyoD-). Cette dernière, à son tour, se divise asymétriquement et se diffrérencie en myoblaste (Pax7+, Myf5+, MyoD+). Le myoblaste se divise asymétriquement et se différencie en myocyte (MyoD+, Myogénine). Enfin, les + + + myocytes fusionnent entre eux pour former des myotubes (Desmine , MyH , α-actinine . D’aps McCullagh, K.J et Perlingeiro, R.C (2015).

L’hpothse d’ue paatio adiaue, aps ifarctus, par des cellules satellites de usle suelettiue a t teste hez l’aial et l’hoe. Les sultats oteus otet que le potentiel de différenciation in vivo des SCs en muscle cardiaque, après injection de SCs das des odles aiau d’ifarctus, a pu améliorer la fonction cardiaque (Al Attar et al., 2003; Blatt et al., 2003; Horackova et al., 2004).

Chez l’Hoe, l’ijetio de “Cs das le oade sele galeet favoriser la fonction cardiaque (Menasché et al., 2001, 2003; Siminiak et al., 2004). Cependant, les SCs ’adoptet pas de photpe ardiaque mais sauvegardent leur phénotype squelettique (Dorfman et al., 1998; Reinecke et al., 2002).

D’aute pat, les otues fos aps ijetio ’talisset pas de oeio ae les cardiomyocytes environnants (Leobon et al., 2003) ou alors très rarement (Rubart et al., 2004) laissat pese ue l’alioatio de la fotio adiaue passeait pa d’autes aises. D’autes ellules ot pu te isoles in vitro à partir du muscle squelettique et différenciées en cardiomyocytes contractiles (Winitsky et al., 2005). Ces cellules sont différentes des SCs et ’epiet pas de aueus de ellules souhes oe “a-1 et c-

Introduction kit. Cette nouvelle population de cellules souche contractile pourrait, selon les auteurs, représenter une alternative intéressante.

3.2.12 Les cellules souches cardiaques

Depuis logteps, le œur des mammifères a été considéré comme un organe post- mitotique dépourvu de tout pouvoir de régénération. Ce dogme a ainsi limité la recherche fondamentale et clinique en cardiologie depuis plusieurs décennies. On pensait alors que suite aux lésions cardiaques, les cardiomyocytes subissaient des hypertrophies cellulaires et ne pouvaient pas être remplacés. Une autre hypothèse propose que pendant la vie embryonnaire, les CSEs adiaues s’egaget das u photpe adiaue et pedet définitivement leurs popits de ellules souhes das le œu adulte (Anversa et al., 2006). Il est vrai que, suite à un infarctus du myocarde, les cardiomyocytes nécrosés sont remplacés par un tissu cicatriciel fibrotique. Cependant, quelques recherches ont pu montrer que les adiootes peuet se diise de aie peu fuete das le œur adulte (Beltrami et al., 2001; Kajstura et al., 1998; Quaini et al., 2002; Reiss et al., 1994). Cette découverte de divisions mitotiques cardiomyocytaires a cassé le dogme selon lequel le nombre de cardiomyocytes était défini à la naissance et a éveillé la curiosité des chercheurs sur le fait que ces nouveaux cardiomyocytes dériveraient de cellules souches cardiaques (figure H-13). En effet, plusieus uipes ot is e idee l’eistee de ellules souhes adiaues (Cardiac Stem Cells ou CSCs) capables de se différencier en myocytes, cellules musculaires lisses et en cellules endothéliales (Beltrami et al., 2003; Linke et al., 2005; Oh et al., 2003; Urbanek et al., 2005). Cette découverte importante a donné de nouvelles perspectives oeat la iologie du œu et les mécanismes de son homéostasie tissulaire et de sa régénération. Grâce à ces travaux, le concept de CSCs est né et le tissu cardiaque est désormais dfii oe u tissu apale d’auto-renouvellement et les myocytes sont régénérés durant toute la vie de l’ogaise (Bergmann et al., 2015; Lázár et al., 2017). De même, il a été montré que les C“Cs e s’egaget pas iesileet e se diffeiat duat la ie embryonnaire mais elles restent après la naissance apales d’auto-renouvellement.

Introduction A

a b

c d

Figure H-13 : Concept des cellules souches cardiaques. (A) La niche cardiaque contient des cellules souches quiescentes qui une fois activées, donnent des cellules progénitrices qui se différencient en cardiomyocytes. Dans des conditions pathologiques, les cellules souches cardiaques activées sont plus nombreuses et forment de nouveaux cardiomyocytes. (B). Cardiomyocytes en division e ouge epiat l’α-atie das des œus de ats fœtau (a), néonatals (b), adultes (c), et hypertrophiés (d). Les encadrés blancs montrent des cardiomyocytes en mitose (indiqués par des flèches). La couleur verte montre les noyaux des cellules (marquage iodide de propidium ou PI) et la couleur bleue montre le marquage des cellules en prolifération Ki67. D’aps Aesa, P et al.(2006).

Introduction Suite à cette nouvelle découverte, plusieurs groupes de chercheurs ont pu isoler des C“Cs à pati de œus adultes e se asat su l’epessio de etais arqueurs de surface déjà utilisés pou isole des ellules souhes à pati d’autes ogaes.

Chapitre II : Cellules souches et progéniteurs cardiaques

1 Nature des cellules souches cardiaques Le photpe des C“Cs ’est pas eoe ie dfii. La oelatue est ipise et plusieurs types de cellules cardiaques adultes ont été caractérisés et proposés comme des cellules souches cardiaques (Iancu et al., 2015). Le nombre des CSCs chez différentes espèces, opis l’Hoe, est estimé à environ 1 CSC pour 8000 à 20000 myocytes (Anversa et al., 2006). Un modèle de classement par hiérarchie de différenciation des CSCs a été proposé (figure H-14). Selon ce modèle, une CSC originelle se divise de manière asymétrique pour donner naissance à une cellule souche fille et une autre cellule fille nommée cellule progénitrice (CPg). Cette CPg à son tour donne une variété de cellules progénitrices plus spialises ; les puseus de otes MPg, ue ellule pogitie d’edothliu EPg et enfin, une cellule progénitrice de muscle lisse (SMPg). Ces cellules donnent ensuite un précurseur ; la MPg ui est à l’oigie d’ue ellule puseu de otes MP, la EPg ue ellule puseu d’edothliu EP et la “MPg ue ellule puseu de usle lisse “MP.

Enfin, les précurseurs deviennent des « cellules amplificatrices transitoires » (transient amplifying cells) et se différencient en myocytes matures des cellules endothéliales ou des cellules du muscle lisse des vaisseaux sanguins. Les CSC dans ce modèle sont des cellules lignage-négatives qui expriment uniquement c-kit, MDR1 ou Sca-1. Les progéniteurs expriment des antigènes de cellules souches et des facteurs de transcription de cellules cardiaques mais ne présentent pas de protéines cytoplasmiques spécifiques.

Introduction

Figure H-14 : Hiérarchie de la croissance et de la différenciation des cellules souches cardiaques (CSCs). Une CSC se divise de manière asymétrique pour donner naissance à une CSC (auto- renouvellment) et une cellule progénitrice fille (CPg) qui peut être c-kit+, Sca-1+ ou MDR1+. La CPg (GATA4+) est multipotente et peut donner des cellules progénitrices plus spécialisées ; les cellules progénitrices du muscle lisse SMPg (GATA4+ ,GATA6+), les cellules progénitrices de myocytes MPg (GATA4+,Nkx2.5+,MEF2C+ et les ellules pogities d’edothliu EPg GATA+, Ets1+). Ces trois types de cellules progénitrices se spécialisent encore en précurseurs SMPr, MPr et EPr et deviennent des cellules amplificatrices transitoires. Enfin, les trois types de précurseurs se diffeiet e ellules usulaies lisses, otes et ellules edothliales. D’aps Aesa, P et al. (2006).

Les précurseurs possèdent des antigènes de cellules souches, des facteurs de transcription et des protéines membranaires et cytoplasmiques typiques des myocytes, des EC et des SMC. Les cellules amplificatrices ont des protéines nucléaires, cytoplasmiques et membranaires des ligages adiaues ais sot gaties pou les atiges de ellules souhes. A l’heue actuelle, plusieurs types ou catégories de cellules souches/progénitrices cardiaques sont tudis. Cette atgoisatio est ase selo l’epessio spifiue de etais pitopes de surface. Cependant, la distinction entre les cellules souches et les cellules plus engagées pogiteus ou ellule aplifiatie tasitoie est souet dliate a l’epessio de

Introduction certains épitopes de surface peut être commune entre ces cellules. Ceci complique leur idetifiatio et leu lassifiatio. Des epiees d’isoleet à partir de tissus humains ont montré que différents types de cellules souches/progénitrices étaient présents das le œu (Guan and Hasenfuss, 2013). Elles expriment différentes protéines qui peuvent permettre de les caractériser comme le facteur de transcription islet-1 (Isl-, l’atige-1 des cellules souches (Sca-1) ou encore le récepteur membranaire au facteur de croissance des cellules souches c-Kit, cellules SP (Side Population) etc (Tableau H-1).

Tableau H-1 : Piipau aueus des ellules souhes adiaues CSCs. Modifi d’aps Iau et al., 2015).

Type de CSCs Positives pour Négatives pour Plus ou moins

c-kit, MDR1, Gata4, TBX5 et CD45, CD34, CD31, KDR Sca-1 c-kit+ NKX2-5 MDR1, CD31, Pdfra, Tcf21, CD45, CD34, Kdr, Isl1, Nkx2-5, c-kit Sca-1+ Gata4, Gata6, Tbx5, Tbx20, Hand1 Hand2 Isl1, Nkx2.5, Flk1, TBX1 CD45, CD31, Sca-1 c-kit Isl1+ Nk., α“A, MDR, Ag, c-kit, CD31, Sca-1, CD45, Gata4 BCRP+ ou SP Vegf, Vcam1, Icam1, Vwf, CD29, Oct3/4, SSEA-3, SSEA-4, Esg1, CD44, capsulin, Meox2, Mef2A, Rex3, SOX2, Utf1, Nkx2.5, Mef2C Hand 1/2, myocardin

2 Types des cellules souches cardiaques

2.1 Les CSCs c-kit positives (CSC c-kit+) C-kit a été identifié dans les années 1980 comme un proto-oncogène dans les cellules de mammifères (Yarden et al., 1987). C-kit ou CD117 est un récepteur (glycoprotéine transmembranaire de 145 kDa) au facteur de croissance SCF (Stem Cell Factor) qui possède une activité tyrosine kinase. Le gène codant pour ce récepteur de 5,1 kpb est situé sur le chromosome 4 humain. La protéine c-Kit est couplée à des voies de signalisations intracellulaires impliquées dans la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire (Nigro et al., 2015).

Les CSCs exprimant c-Kit ont été découvertes en 2003 (Beltrami et al., 2003) comme une ae populatio sidete das le œu. Pa eeple, das le oade du at adulte, les C“Cs

Introduction c-Kit+ sont relativement rares (1 pour 104 myocytes) et de petite taille (un dixième de la taille d’u ote. De e, la fatio des C“Cs -Kit+ isoles à pati de œus huais sais est eteet faile et ette fatio est augete los d’ue hpetophie adiaue (Urbanek et al., 2003) ou après un infarctus (Kubo et al., 2008; Urbanek et al., 2005). D’autes études ont montré que le nombre des CSCs c-kit+ augmente considérablement chez le rat lors de l’hpetophie phsiologiue due à l’effot phsiue (Kolwicz et al., 2009; Waring et al., 2014). Les CSCs c-Kit+ expriment plusieurs facteurs de transcription cardiaques (NKX2.5+/-, GATA4+ et MEF2C+) mais elles sont négatives pour les marqueurs du lignage hématopoïétique (LIN-) comme CD31, CD34, CD45, CD20, CD45-RO et CD8 (Barile et al., 2007). Ces cellules souhes possdet des apaits d’auto-renouvellement et peuvent se différencier in vitro en cardiomyocytes, cellules musculaires lisses et cellules endothéliales (Beltrami et al., 2003) (figure H-15).

Figure H-15 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant c-kit (CSCs c-kit+) et de leur pouvoir de différenciation. Les CSCs c-kit+ se trouvent au niveau des quatre chambres cardiaques (majoritairement dans les oreillettes et faiblement dans les ventricules). Les CSCs c-kit+ (Isl-1-, CD45-, CD31-, GATA4+), se différencient in vivo e adiootes epiat l’ α-atie α- actin+), en cellules musculaire lisses et en cellules endothéliales. In vitro et après traitement à la 5- Azacitydine (5-Aza), les CSCs c-kit+ peuvent être différenciées en cardiomyocytes non battants positives pour la troponine-T cardiaque (cTnT+). RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche ; RV : ventricule doit ; LV : etiule gauhe. D’aps Gua et Hasefuss. .

Introduction Les cellules CSCs c-kit+/Lin- epsetet l’ue des piipales populatios de ellules souhes toues das le œu (Bollini et al., 2011). Ces cellules se localisent préférentiellement dans l’oeillette doite du œu hez l’adulte et hez l’efat (Itzhaki-Alfia et al., 2009; Mishra et al., 2011). Cependant, l’epessio de -kit ’est pas se seuleet au C“Cs a ette protéine est aussi exprimée par les mastocytes (Kubo et al., 2008), les cellules endothéliales (Castaldo et al., 2008), des cellules souches de la moelle osseuse (Chong et al., 2011), les cellules dendritiques et mélanocytes (Fang et al., 2012), les cardiomyocytes postnatals (Li et al., 2008) etc. A cause de cette expression non spécifique, les CSCs c-Kit+ représentent une population hétérogène. E effet, l’aalse tasiptoiue au ous de la diffeiatio cardiaque des cellules c-Kit+ a l l’eistee de plusieus lasses de C“C -kit+; les cellules c-Kit+KDR+ ou VPC (vascular progenitor cells) , les cellules c-Kit+KDR- ou MPC (myocyte progenitor cells) et les c-kit+KDR+CD31+ (se différenciant en cellules endothéliales) (Bearzi et al., 2009; Fang et al., 2012; Tallini et al., 2009). Une autre étude a montré que les CSC c-kit+ expriment des marqueurs mésenchymateux comme le CD105 et le CD29 (Gambini et al., 2011) et peuvent se différencier en adipocytes et en ostéocytes (Itzhaki-Alfia et al., 2009). Il est probable donc que les CSCs c-kit+ isolées in vitro soient contaminées par d'autres types cellulaires (fibroblastes cardiaques, les mastocytes ou les cellules de lignée hématopoïétique). Les données sur l'expression des marqueurs de lignage sont encore plus conflictuelles. Par exemple, des études ont montré que les CSC c-kit+ n'expriment pas tous les marqueurs de lignage cardiaques tels que GATA4, NKX2.5, MEF2C (Bearzi et al., 2007; Boni et al., 2008; D’Aaio et al., . De plus, das les œus des oueau-nés et des jeunes enfants, le pourcentage de cellules c-kit+ variait de 5% à 9% et seulement 1% à 3% des cellules c-kit+ étaient positives pour Nkx2.5+ (Mishra et al., 2011). De toute évidence, de nombreux aspects de ces cellules restent à comprendre.

In vitro, les CSC c-kit+ ont des propriétés typiques de cellules souches et certaines études in vivo ont montré que la transplantation de ces cellules améliore la fonction cardiaque chez des odles aiau d’ifatus du oade (Ellison et al., 2013). Chez l’Hoe, l’ijetio intra-coronarienne de CSCs c-Kit+ peie essai liiue su l’Hoe de phase I a alio la fotio sstoliue du etiule gauhe et a duit la taille de l’ifarctus chez les patients souffrat d’isuffisae adiaue (Bolli et al., 2011; Chugh et al., 2012). Une étude a également montré que la perfusion intra-coronarienne de 20 millions de CSCs c-kit+ dans des

Introduction œus des pos e pooue auu doage al, hpatiue ou oadiaue (Keith et al., 2015). Néanmoins, la rétention de ces cellules dans le myocarde reste faible malgré le nombre élevé injecté.

2.2 Les CSCs Sca1 positives (CSC Sca1+)

L'antigène de cellules souches-1 (Sca-1 ou Ly6A) est une protéine à ancre GPI (glycerophosphatidylinositol) de 18 KDa qui appartient à la famille des gènes Ly6 (lymphocyte activation protein-6). La famille des gènes Ly6 contient au moins 18 gènes liés étroitement sur le hoosoe et ui pataget plus de % d’hoologie de suee ae “a-1 (LeClair et al., 1986; Patterson et al., 2000; van de Rijn et al., 1989). Coe d’autes poties à ae GPI, les protéines Ly6 ont une position membranaire idéale pour réguler ou co-activer des voies de signalisation via des liaisons ligand-epteu ou d’autes iteactions protéine- protéine. Cependant le mécanisme moléculaire exact par lequel ces protéines agissent reste non élucidé. Sca-1 a été initialement identifié comme marqueur de cellules souches hématopoïétiques murines (Chong et al., 2014; Han et al., 1995) mais son expression est également retrouvée das d’autes tpes ellulaies. En effet, plusieurs groupes de chercheurs ont identifié la protéine Sca-1 chez la souris dans plusieurs tissus comme le système squelettique (Short et al., 2001), la glande mammaire (Welm et al., 2002), la prostate (Burger et al., 2005; Xin et al., 2005), le derme (Fernandes et al., 2004; Toma et al., 2001), le muscle squelettique (Gussoni et al., 1999; Lee et al., 2000), le foie (Petersen et al., 2003; Wulf et al., 2003), la moelle osseuse (Gojo et al., 2003) et le œu (Oh et al., 2003; Rosenblatt-Velin et al., 2005). Toutefois, il ’a pas eoe t ot si es populatios “a-1 positives sont vraiment des cellules souches tissu-spécifiques. Plusieurs sous-populations de cellules Sca-1+ ont été aatises das des odles uis e se asat su l’epessio de aueus de sufae lignage-spécifique (Valente et al., 2014). Ces sous-populatios ’epiet pas les aueus endothéliaux (CD31) et hématopoïétiques (CD45) nommées Lignage négatif (ou Lin-) et montrent un profil mésenchymateux (CD34-, CD29+, CD90+, CD105+ et CD44+). Ces cellules Sca-1+ murines, ont été décrites comme pouvant se différencier en cardiomyocytes, cellules musculaires lisses et cellules endothéliales. De plus, les CSCs Sca-1+ murines expriment faiblement les gènes codant pour les facteurs de transcription cardiaques précoces GATA-4 et NKX2.5 et les protéines sarcomériques (Matsuura et al., 2004).

Introduction Il a été montré que l'injection intra-myocardique du facteur de croissance hépatique (HGF) et du facteur de croissance lié à l'insuline (IGF) chez des modèles animaux facilite la migration et la prolifération des cellules Sca-1+ c-kit+, qui semblent se différencier en petits myocytes fonctionnels (Linke et al., 2005; Urbanek et al., 2005).

De plus, après injection intraveineuse des CSCs Sca-1+ das des odles d’ifatus murins, il a été mis en évidence dans le myocarde atteint, la présence de cellules différenciées en cardiomyocytes epiat l’α-actine sarcomérique et la connexine 43 (Oh et al., 2003). Bien que l'expression de Sca-1 soit limitée aux souris, une protéine de type Sca-1 a été dtete pa iosopie ofoale et pa Weste lot das le œu du hie et de l’Hoe (Leri et al., 2005). Comme Sca-1, cette protéine appartient probablement à la famille des gènes Ly6. Des cellules semblables à Sca-1+ (Sca-1+-like ot t isoles à pati du œu humain adulte en utilisant des anticorps Sca-1 anti-souris. Ces cellules Sca-1+-like humaines sont négatives pour le CD45, CD34, CD133 et CD14, et positives pour le CD105, GATA4 et Nkx2.5 (figure H-16). Les CSCs Sca-1+-like huaie fœtales et adultes, sot ultipotetes et peuvent se différencier en cardiomyocytes fonctionnels, en cellules endothéliales et en cellules musculaires lisses (van Vliet et al., 2008, 2010). Cepedat, auu essai liiue ’a été rapporté avec cette population cellulaire.

Introduction

Figure H-16 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant Sca-1 (CSCs Sca-1+) et de leur pouvoir de différenciation. Les CSCs Sca-1+ se trouvent majoritairement au niveau des oreillettes, faiblement dans le ventricule droit et elles sont absentes dans le ventricule gauche). Les CSCs Sca-1+ (CD45-, CD34-, CD133-, CD14-, CD105- , GATA4+, NKX2.5+), se différencient in vivo en cellules musculaire lisses et en cellules endothéliales. In vitro et après traitement à la 5-Azacitydine (5-Aza), les CSCs Sca-1+ peuvent être différenciées en adiootes attats posities pou l’ α-atie α-actin+) et la troponine-I cardiaque (cTnI+). RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche ; RV : ventricule doit ; LV : ventricule t Hasenfuss. (2013). gauhe. D’aps Gua e

2.3 Les CSCs Isl-1 positives (CSCs Isl-1+) ISL1 (ISL LIM Homeobox 1) appartient à la famille de facteurs de transcription à homéodomaine LIM qui lie et régule les promoteurs des gènes de l'insuline, du glucagon et de la somatostatine. Une petite population de cellules souches cardiaques exprimant Isl-1 (CSCs Isl-1+ a t idetifie das le œu postatal hez la souis et hez l’Hoe ae ue localisation majoritaire au niveau des oreillettes (Laugwitz et al., 2005). Les cellules souches cardiaques exprimant Isl-1 semblent générer, en plus des cardiomyocytes matures, une partie du œud sio-auriculaire, des éléments de l'aorte proximale, du tronc pulmonaire, les tiges des deux artères coronaires, les valvules aortiques et pulmonaires, l'endocarde, l’edothliu vasculaire et le muscle lisse (Moretti et al., 2006). Des analyses de coupes cardiaques provenant du œu fœtal huai de 11 à 18 semaines, ont identifié une population mixte de cellules ISL1+, une exprime uniquement Isl-1 et une autre qui expriment Isl- ae d’autes marqueurs spécifiques de lignage comme Nkx2.5 et TBX1. Les CSCs Isl-1+ se situent principalement dans la région connue sous le nom du second champ cardiaque (oreillette

Introduction droite et le tractus d'éjection) (Bu et al., 2009). Juste après la naissance, des CSCs Isl-1+ ont été identifiées chez la souris, le rat et l'Homme. In vitro, ces cellules sont capables de se différencier en cardiomyocytes (Laugwitz et al., 2005). Durant le développement cardiaque, les CSCs Isl1+ jouent un rôle primordial dans la création du ventricule droit, des oreillettes et du tatus d’jetio (Cai et al., 2003). Ces cellules sont multipotentes et capables de se différencier en tous les lignages cardiaques (Bu et al., 2009). Cependant, l'expression d'Isl1 dans les progéniteurs cardiovasculaires endogènes est étroitement corrélée avec l'âge. Les tissus oatau et fœtau adiaues ot des ieau d’epession élevés en progéniteurs Isl1+, ais ae l’âge, l’epessio de Isl est duit à des ieau failes oie ieistats (Simpson et al., 2012). En outre, les marqueurs de surface des cellules Isl1 adultes n'ont pas été bien définies (Serradifalco et al., 2011) car la plupart des travaux identifiant les progéniteurs Isl1 reposent sur des études de traçage des lignages pendant le développement. Malgré le pouvoir de différenciation multiple des CSCs Isl-1+, leu uatit liite das le œu adulte est insuffisante pour pouvoir envisager des thérapies cellulaires après infarctus de myocarde.

2.4 Les CSCs BCRP+ positives side-population (BCRP+ SP)

Les cellules souches cardiaques BCRP+ “P ot t idetifies das le œu de souis (Hierlihy et al., 2002) et das le œu huai (Emmert et al., 2013). Les CSCs BCRP+ SP ou “ide Populatio ot t oes aisi a elles ot la popit d’elue atieet le marqueu d’ADN Hoehst de leu toplase, e ui peet de les sparer des autres cellules par cytométrie de flux. Ces CSCs SP+ sont nommées BCRP+ SP car la protéine BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) est responsable du phénotype SP. La protéine BCRP a été identifiée en tant que membre des transporteurs membranaires à ATP binding cassette (ABC). C'est un peptide de 655 acides aminés avec une capacité à extruder une grande variété de composés chimiques à partir des cellules (Hierlihy et al., 2002). Les CSCs BCRP+ SP+ de souris peuvent se différencier in vitro e oloies de ellules otatiles losu’elles sot ulties avec des cardiomyocytes primaires de rat (Hierlihy et al., 2002). Des études ont montré que des cellules cardiaques SP+ de souris expriment un ensemble de marqueurs qui les distinguent des autres types de cellules souches déjà connus. Ces cellules sont positives pour Sca-1, CD31 et CD38, expriment une télomerase active et des facteurs de transcription cardiaques comme MEF2C, GATA-4 et TEF-1 (Oh et al., 2003, 2004). In vitro, les CSCs SP+ de souris se différencient

Introduction en cardiomyocytes qui expriment Nkx2.5 et des protéines sarcomériques. De plus, après ijetio das u odle d’ifatus hez la souis, es ellules sot etoues das le myocarde et se différencient à la périphérie de la zone infarcie (Oh et al., 2004). Dans la population de CSCs SP+ murines, il existe une sous-population positive pour Sca-1 et négative pour CD31 (Pfister et al., 2005). Cette population Sca-1+CD31- qui exprime déjà des marqueurs de cellules musculaires et des cellules endothéliales présentent le plus grand potentiel de différenciation vers le lignage cardiomyocytaire. Différencier les cellules SP cardiaques des CSCs Sca-1+ reste une approche expérimentale difficile et non clairement définie. L'analyse par FACS a suggéré que les cellules SP sont en fait une sous-population des CSCs Sca-1+ (Oh et al., 2003). Par conséquent, il est probable que seules les cellules SP Sca-1+/CD31- soient responsables du potentiel cardiomyogénique observé (Pfister et al., 2005). Une autre étude a montré que les cellules Sca-1+/CD31- de souris isolées par tri cellulaire magnétique se différencient en lignées endothéliales et cardiomyogéniques (Wang et al., 2006). In vitro, la stimulation des cellules Sca-1+/CD31- avec le VEGF entraine une forte expression des marqueurs endothéliaux. La stimulation par la 5-azacytidine et plusieurs facteurs de croissance induit une différenciation cardiomyocytaire. Comme pour les cellules SP Sca- 1+/CD31- décrites (Pfister et al., 2005), la différenciation des cellules progénitrices Sca-1+/ CD31- est favorisée en co-culture avec des cardiomyocytes de rat. Environ 93% des CSCs SP+ sont Sca-1+/CD45-/c-kit- (Oh et al., 2003) mais les CSCs Sca-1+ ne sont pas toutes des cellules SP+ (Noseda et al., 2015). Les CSCs SP+ sont des cellules quiescentes retrouvées dans les tissus adultes, qui sont aatises pa l’elusio spotae du oloat Hoehst, l’epessio de la estie et leu capacité à former des sphères in vitro (Tomita et al., 2005). Fonctionnellement, les cellules CSCs SP+ cardiaques peuvent se différencier en multiples lignages cellulaires (figure H-17). L'analyse transcriptomique réalisée sur les cellules SP de souris a montré la présence de certains marqueurs endothéliaux (par exemple, VEGF, Vcam1, Icam1, Vwf) mais une absence de CD31 (Martin et al., 2004). Tomita et ses collègues, ont montré l'expression de CD29, CD44 à la surface des cellules SP et l'absence de marqueurs de la lignée hématopoïétique (Tomita et al., 2005).

Introduction

Figure H-17 : Illustration schématique des cellules souches cardiaques exprimant BCRP (BCRP+ ou SP) et de leur pouvoir de différenciation. Les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+) se trouvent dans les oreillettes et les ventricules. Les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+, CD31+) se différencient in vivo en cellules endothéliales alors que les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+, CD31-) se différencient en myocytes exprimant la titine (Titin+). In vitro et aps taiteet à l’otoie otoi, les CSCs BCRP+ (c-kit-, Sca-1-, Nkx2.5+) se différencient en cardiomyocytes non battants positives pour la troponine-T cardiaque (cTnT+). RA : oreillette droite, LA : oreillette gauche ; RV : ventricule doit ; LV : etiule gauhe. D’aps Gua et Hasefuss. .

De plus, ue patie de es ellules epiet des aueus d’autes ellules souhes cardiaques comme c-kit et Flk1 et Sca-1. Le même groupe a aussi montré que ces cellules sont positives pour GATA4 mais négatives pour Nkx2-5 et Mef2C et peuvent se différencier en cardiomyocytes et en lignages neuronaux.

2.5 Les cellules dérivées des cardiosphères (CDCs)

Les adiosphes sot des aggats ellulaies de à μ, ui sot ges à pati d’eplats poeat de biopsies cardiaques et cultivés en suspension (Messina et al., 2004; Smith et al., 2007). Ces cardiosphères seraient constituées de CSCs qui résideraient à l’itieu de la sphère et de cellules différenciées situées à la couche externe (Messina et al., 2004). Une étude a montré que le micro-environnement tridimensionnel apporté par les cardiosphères protège les CSCs du stress oxydatif et maintient leur état de cellule souche (Wang et al., 2010). Lorsque ces cardiosphères sont cultivées in vitro, elles adhèrent au plastique, deviennent hautement prolifératives, clonogéniques et multipotentes (Smith et al., 2007). Les cellules dérivées de cardiosphères (CDCs) représentent une population cellulaire

Introduction hétérogène composée de cellules indifférenciées et engagées, exprimant c-kit, Sca-1, CD105, CD90 et CD29 (Messina et al., 2004). Les CDCs peuvent se différencier en cardiomyocytes battants, en cellules musculaires lisses vasculaires et en cellules endothéliales (Tang et al., 2009).

Des études in vivo sur des modèles animaux infarctus, ont montré ue l’adinistration des CDCs duit la taille de l'ifatus, alioe la fatio d’jetio du etiule gauhe et l'hémodynamique cardiaque (Carr et al., 2011; Chimenti et al., 2010; Johnston et al., 2009; Smith et al., 2007). Chez l’Hoe, u essai liiue de phase , onnu sous le nom de « CADUCEUS », a ot ue l’ijetio ita-coronarienne de CDCs réduit significativement la masse de la cicatrice après infarctus (8,4 g au cours des six premiers mois et 12,9 g après un a, ais auue diffee ’a t osee oeat la fatio d’jetio du etiule gauche (Makkar et al., 2012).

2.6 Les CSCs W8B2 positives (CSC W8B2+)

W8B2 ou MSCA-1 (Mesenchymal Stem Cell Antigen-1) est une phosphatase alcaline non spécifique (TNAP pour tissue nonspecific alkaline phosphatase) (Sobiesiak et al., 2010). Cette enzyme (ALP pour alkaline phosphatase) est présente dans de nombreux tissus humains et possède trois isoformes spécifiques du placenta, des cellules germinales et des intestins et une isoforme tissulaire non spécifique (Devito et al., 2014).

L’epessio du marqueur W8B2 chez la souris a été retrouvée dans plusieurs populations de cellules progénitrices dans les zones neuronales embryonnaires, postnatales et adultes (Langer et al., 2007). Chez l’Hoe, WB est utilis oe aueu spifiue des CSEs Adeui et al., ; O’Coo et al., , des cellules progénitrices du muscle squelettique (Dellavalle et al., 2007) et aussi comme marqueur spécifique des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse à haut potentiel prolifératif (Bühring et al., 2007). L’epessio de W8B2 a également été retrouvée dans les cellules souches sehateuses d’autes tissus adultes huais oe le pioste de la âhoie (Alexander et al., 2013) et la gelée de Wharton (Devito et al., 2014).

Deux équipes ont rapporté pour la première fois la présence de cellules souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 avec une provenance mésenchymateuse (Aguiar et

Introduction al., 2011). Depuis, d’autes heheus ot pu isole et aatise e tpe de ellules souhes cardiaques exprimant le marqueur W8B2 et confirmer leur origine mésenchymateuse (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a). En effet, les cellules souches cardiaques exprimant W8B2 (CSCs W8B2+) sont positives pour les marqueurs mésenchymateux (CD29+ ,CD73+ ,CD90+ ,CD105+ et CD106+), négatives pour les marqueurs hématopoïétiques endothéliaux (CD31- ,CD34- ,CD45- ,CD11b- ,CD19- et CD133-), pour le marqueur des fibroblastes cardiaques DDR2 et les marqueurs de CSCs (Aguiar et al., 2011; Reus et al., 2016; Rossini et al., 2011; Zhang et al., 2015a).

Bien que les CSCs W8B2+ aient une origine mésenchymateuse, l'analyse génomique a montré que ces cellules mésenchymateuses cardiaques diffèrent par leur expression génique des cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse ou encore les CSCs c-kit+ (Rossini et al., 2011; Zhang et al., 2015a).

De plus, les CSCs W8B2+ expriment des facteurs de transcription spécifiques cardiaques comme GATA4 et peuvent être différenciées en cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et en cellules ayant un phénotype cardiaque immature (Zhang et al., 2015a). Ces cellules cardiaques immatures (cardiac-like cells), obtenues après différenciation in vitro des CSCs W8B2+, ne possèdent pas de structures contractiles matures comme celles retrouvées dans un cardiomyocyte mais répondent aux stimulations électriques (Zhang et al., 2015a).

Rossini et ses collègues ont aussi montré que les cellules souches cardiaques mésenchymateuses, comparativement aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, se différenciaient plus facilement vers le phénotype cardiovasculaire que vers les phénotypes adipogénique et ostéogénique.

Les CSCs W8B2+ possèdent des capacités réparatrices cardiaques importantes losu’elles sot ijetes das des odles uis d’ifatus du oade. E effet, l’ijetio ita-oadiue de es ellules à des ats souffat d’ifatus hoiue du oade a ot u’elles taiet apales de ige es la iatie fieuse et de se différencier en cardiomyocytes (Rossini et al., 2011). Ces résultats ont été confirmés par les taau de )hag et ses ollgues ui ot ot ue l’ijetio ita-myocardique des CSCs W8B2+ das des odles d’ifatus de oade hoiue de rats, améliorait la fraction

Introduction d’jetio du etiule gauhe et augetait la asulaisatio de la iatie fieuse aps trois semaines de transplantation (Zhang et al., 2015a).

Parallèlement à leurs capacités réparatrices, les CSCs W8B2+ possèdent un large sécrétome composé de cytokines et de facteurs de croissance intervenant notamment dans l'agiogese, la suie ellulaie, le hiiotatise, la pose iuitaie, l’iflaatio et le remodelage extracellulaire (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

Il a été également montré que le milieu conditionné issu de cellules souches cardiaques sehateuse faoisait l’atiit agiogiue des ellules edothliales huaies (microvasculaires et celles de la veine ombilicale), la survie et la prolifération des cardiomyocytes de rats et des cellules souches mésenchymateuse humaines du tissu adipeux et favorisait la différenciation cardiomyocytaire de la lignée myoblastique H9c2 (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

3 Modulateurs de la différenciation in vitro des CSCs adultes en cardiomyocytes

Plusieurs approches expérimentales ont été appliquées pour induire la différenciation des CSCs en cardiomyocytes in vitro. Plusieurs protocoles de différenciation cardiaque existent comme l'utilisation de milieux de culture spéciaux, la co-culture avec des cardiomyocytes néonataux, la stimulation électrique, la stimulation mécanique, des approches pharmacologiques utilisant par exemple l'ocytocine ou la 5-azacytidin, la stimulation par le FGF- 2 ou encore le TGF-β (Pasha et al., 2008; Rosenblatt-Velin et al., 2005; Tran et al., 2014). Divers groupes ont isolé et différencié des CSCs adultes en utilisant des protocoles de différenciation différents (Chamuleau et al., 2009) (Tableau H-2).

Introduction Tableau H-2 : Protocoles de différenciation cardiaques utilisés pour différents types de CSCs. Modifié d’aps Chauleau et al., .

Type de CSCs Protocole de différenciation Gènes cardiaques exprimés après différenciation -Milieu MEM + 10% SVF+dexamethasone Actine a-sarcomérique, myosine c-kit+ -Co-culture avec cardiomyocytes de rats cardiaque, desmine, connexine 43 néonatals

-5-azacytidine Troponine I, a-sarcomerique Sca-1+ -Oxytocine actine, myosine cardiaque, -5-aza + TGF-b MHC (a et b), desmine, connexine 43 Co-culture avec cellules cardiaque dans Troponine, a-actinine cardiaque BCRP+ ou SP un milieu cardiaque spécifique

Co-culture avec cardiomyocytes Troponine T, a-actinine cardiaque Isl1+ néonatals

-Co-culture avec cardiomyocytes de rats Troponine, a-MHC Cardiosphères néonatals -Champs magnétique à très faible fréquence

3.1 La 5-azacytidine

La 5-azacytidine est l'un des agents de déméthylation d'ADN le plus important et le mieux caractérisé (Jüttermann et al., 1994). Elle s’iopoe das l'ADN et foe u oplee covalent et irréversible avec l'ADN méthyltransférase (DNMT) empêchant l'enzyme de méthyler la position 5 des cytosines qui sont regroupées dans les îlots CpG régulateurs (Cheng et al., 2003). Cette modification épigénétique par la 5-azacytidine conduit au démasquage des ges ui e sot pas epis e aiso de l’hpethlatio de leus pooteus (Keating, 2009). Bie u’il ait t précédemment montré que la 5-Azacytidine induit une différenciation en cardiomyocytes de cellules souches mésenchymateuses in vitro, son effet sur les CSCs reste peu clair. Concernant les CSMs issues du cordon ombilical, cette différenciation passerait par l’atiatio des kiases etaellulaies (Qian et al., 2012).

D’autes taau otrent que suite au traitement avec la 5-azacytidine, les CSMs de la oelle osseuse sot apales d’epie des aueus spifiues adiaues et psetent des battements spontanés et un potentiel d'action mesurable, compatible avec un lignage

Introduction myocytaire (Antonitsis et al., 2007; Naeem et al., 2013; Toma et al., 2002; Xu et al., 2004; Ye et al., 2006).

3.2 Le TGF-b:

Le TGF-β est u fateu de oissae ultifotioel ts ipotat ipliu das la différenciation cardiaque des CSEs (Behfar et al., 2002; Slager et al., 1993). Les membres des facteurs de croissance de la famille TGF-β ot t appots pou gule la ardiogenèse en induisant la formation du premier champ cardiaque et en régulant les processus morphologiques au cours du développement cardiovasculaire (Azhar et al., 2003; Brand and Schneider, 1995).

Chez les mammifères, il existe trois isoformes de TGF-β1-3 (TGF-β, -β et -β (Schiller et al., 2004). Durant le développement, ces trois isoformes sont présentes mais ont un profil d’epessio spatio-temporel différent (Pelton et al., 1991). En effet, les trois isoformes de TGF ont montré des profils d'expression spécifiques à différents stades de développement avec une localisation spécifique de TGF-β das les fies de l'œil etodee, de TGF-β dans le cortex de la glande surrénale (mésoderme) et de TGF-β das l'pithliu ohlaie de l'oreille interne (endoderme).

De plus, l’epessio des tois isofoes au sei d’u e ogae aie en fonction du stade eoaie. Pa eeple, das le œu de souis, le ieau d’epessio de TGF-β est élevé dans les coussinets atrioventriculaires et faible dans les ventricules au jour 11.5 de développement. Au jour de développement 12,5, le niveau d’epessio de TGF-β das le œu est le das les etiules et les oeillettes et faile das les oussiets atio- ventriculaires.

Les protéines de la famille TGF-β seet de sigau idutifs pou la foatio et la différenciation des muscles cardiaques. Le traitement avec du TGF-β eoge alioe la formation du muscle cardiaque dans des CSEs de souris et des lignées cellulaires de carcinome embryonnaire (Singla et al., 2005; Slager et al., 1993; Zeineddine et al., 2006). Dans le myocarde infarci la famille TGF-β seait suatie (Bujak and Frangogiannis, 2007; Deten et al., 2001). L'implantation de CSMs de la moelle osseuse préprogrammée par le TGF-β das le oade ls s’est le effiae, elle pooue ue gation cardiaque accompagnée d’ue idutio de l’epessio de gènes de différenciation myocardiques (Li et al., 2005).

Introduction Réciproquement, la perturbation de la voie de signalisation TGF-β via un mutant dominant négatif du récepteur au TGF-β ephe la diffeiatio des adiootes (Behfar et al., 2002). L’ihiitio de l'activité du TGF-β duit l'at du le ellulaie aisi ue l'epessio de l'inhibiteur des CDK : p21WAF1 et freine l'induction du facteur de transcription cardiaque Nkx2.5. La voie de signalisation TGF-β joue u ôle ipotat das le maintien des capacités dites « souches » des cellules souches adultes mais aussi celles des cellules ES (Kitisin et al., 2007; Pucéat, 2007). Les effets observés par le TGF-β sot ts dpedats du teps et de la dose de traitement et seraient différents selon la source et le type de cellules souches (Pucéat, 2007). Il agit positivement sur la différenciation des myoblastes embryonnaires (Slager et al., 1993) alos u’il a u effet gatif su le poessus de diffeiation myogénique des myoblastes de lignée C2C12 (Gardner et al., 2011; Massagué et al., 1986).

E su, l’esele des tudes ees su la diffeiatio des C“Cs adultes humaines montrent clairement que la stimulation par TGF-β iduit et/ou alioe la différenciation en cardiomyocytes.

3.3 L’aide asoiue :

L'acide L-ascorbique (AA), souvent appelé vitamine C, est essentiel à la vie chez l'homme, chez lequel ses propriétés antioxydantes protègent les cellules contre le stress oxydatif (Padayatty et al., 2004). L’AA pouait te osid oe u ateur important dans la polifatio et la diffeiatio ellulaie. E effet, Il a t ot ue l’AA aait u effet atipolifatif assoi à l’ihiitio des ges essaies das la pogessio du le cellulaire (Belin et al., 2009). De plus, l’AA ihie la diffeiatio des padipotes adultes en adipocytes matures (Rahman et al., 2014). Plusieus tudes etes ot ot ue l’AA est capable de reprogrammer des cellules somatiques murines et humaines en cellules souches adultes (Esteban et al., 2010; Stadtfeld et al., 2012; Wang et al., 2011). Cette reprogrammation est médiée par la déméthylation de l'ADN sur des loci spécifiques (Chen et al., 2013).

L'AA favorise la différenciation cardiaque des CSEs (Chan et al., 2009; Sato et al., 2006) et améliore la différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes murines par stimulation de la voie de signalisation Wnt/β-catenine (Ivanyuk et al., 2015). La différenciation des CSEs vers le lignage myogénique serait engagée via son récepteur

Introduction intracellulaire SVCT2 (Rahman et al., 2017). La diffeiatio pa l’AA ipliue la oie p MAPK / CREB, probablement stimulée par l'AMPc via l'adénylate cyclase. De e fait, l’AA est utilisé dans plusieurs protocoles de différenciation cardiaque des ESC et des cellules souches pluripotentes induites ou iPSCs (Burridge et al., 2011; Kattman et al., 2011; Yang et al., 2008).

3.4 L’aide tioïue :

L'acide rétinoïque (retinoic acid ou RA) est le dérivé actif de la vitamine A. Le RA régule, par stimulation de ses récepteurs nucléaires (RAR ou retinoic acid receptor), des voies de signalisation qui sont essentielles à la croissance des organes pendant le développement embryonnaire (Duester, 2008; Niederreither and Dollé, 2008). La génération locale de RA implique la rétinaldéhyde déshydrogénase 2 (Raldh2) catalyseur de la deuxième étape d'oxydation dans la biosynthèse du RA. En effet, les embryons de souris déficients pour la Raldh2 (Raldh2 -/-) présentent une carence sévère en AR et des défauts de développement cardiaques (Niederreither et al., 1999, 2003). L’ihiitio de la sigalisatio pa le RA iduit également des défauts de développement précoce cardiaques (Gruber et al., 1996; Hochgreb et al., 2003). En excès, l’aide tioïue pooue u lagisseet du opatiet sio- auriculaire au détriment des tissus ventriculaires chez les embryons de poulets (Osmond et al., 1991; Yutzey et al., 1994) et chez le poisson zèbre (Stainier and Fishman, 1992). Toutes ces études indiquent que le RA est nécessaire en tant que morphogène pour un développement cardiovasculaire normal, mais entraîne des défauts myocardiques si il est présent à des concentrations anormales.

Dans les CSEs, le traitement avec le RA accélère la différenciation cardiaque et améliore le développement des cardiomyocytes ventriculaires (Wobus et al., 1997). Par analogie à la vitamine C, l’effet du RA su la diffeiatio des E“C (soit en cellules pacemaker soit en cellules atriales) est dépendant de la dose et du teps d’adiistatio (Gassanov et al., 2008). Des effets de l’AR e oiaiso ae d’autes olules su la diffeiatio des cellules souches progénitrices in vitro, ont été observés mais les mécanismes moléculaires restent complexes. Récemment, il a été montré que le RA en combinaison avec la 5- azacytidine et le DMSO, favorise la différenciation cardiaque des CSMs humaines dérivées du foie fœtal (Deng et al., 2016). D’aute pat, das les CSMs huaies dies du œu, le RA (en combinaison avec la 5-azacytidine et le phényl butyrate) induit une différenciation de ces cellules vers un phénotype cardiaque immature (Zhang et al., 2015a).

Introduction 3.5 La dexaméthasone : La dexaméthasone est un glucocorticoïde synthétique, couramment administré à des nourrissons prématurés, afin de réduire l'incidence et la gravité du syndrome de détresse respiratoire (Liggins and Howie, 1972). Cependant, l'exposition aux glucocorticoïdes synthétiques peut être nocive pour d'autres tissus et organes (Davis et al., 2011; Kelly et al., 2012). Une étude récente indique que le traitement des rats nouveau-nés avec la dexaméthasone pendant une période critique du développement cardiaque, diminue la prolifération et le oe total des adiootes das le œu via des modifications épigénétiques (Gay et al., 2015). Cette étude montre également que la dexaméthasone stimule une différenciation terminale cardiomyocytaire prématurée par la répression épigénétique du gène cycline D2.

Ces résultats ont fourni de nouvelles pistes concernant la régulation de la maturation des cardiomyocytes par les glucocorticoïdes. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués durant la différenciation des cellules souches cardiaques en cardiomyocytes en utilisant la dexaméthasone restent non étudiés. Ainsi, les différentes propriétés de la dexaméthasone évoquées ci-dessus conduisent à son utilisation in vitro dans plusieurs protocoles de différenciation de CSCs en cardiomyocytes (Matsuura et al., 2004; Zhang et al., 2015a).

3.6 L’otoie:

L'ocytocine ou oxytocine, est un neuropeptide composé de neuf acides aminés sécrétés principalement par les noyaux hypothalamiques. L'ocytocine est également produite dans des tissus piphiues oe l’utus, le plaeta, l’aios, le ops jaue opus luteu, le testiule et le œu (Gimpl and Fahrenholz, 2001). Elle a longtemps été reconnue comme étant principalement impliquée dans la régulation des fonctions reproductives, telles que l'induction des contractions utérines, le réflexe d'éjection du lait et l'ovulation (Gimpl and Fahrenholz, 2001). D’autes ôles de l’otoie ot t tudis otaet das la gulatio de différentes fonctions et comportements (comportement sexuel et maternel, la mémoire, la cognition, la tolérance, les fonctions cardiovasculaires etc.) (Bussolati and Cassoni, 2001). L'ocytocine est également considérée comme régulateur positif et négatif de la prolifération cellulaire dans différents tissus (Cassoni et al., 2001). Cette hormone administrée en excès hez le fœtus petue le deloppeet adiaue hez le at (Schriefer et al., 1982). Elle

Introduction régulerait également la différenciation. En effet, le nombre de récepteus à l’otoie augmente à partir du 7ème jour de gestation, le jour où la différenciation cardiaque oee hez l’eo de souis (Mukaddam-Daher et al., 2002). Chez l’adulte, das l'ifatus du oade iduit epietaleet hez les ats, l’appot otiu d’otoie améliore la guérison cardiaque, le travail cardiaque, réduit l'inflammation et stimule l'angiogenèse (Gutkowska et al., 2014).

En résumé, l'ocytocine est décrite comme étant un puissant inducteur de différenciation cardiomyocytaire dans les CSEs et les CSCs adultes de souris (Matsuura et al., 2004; Paquin et al., 2002).

Chapitre III : Physiologie des cellules souches /progéniteurs cardiaques

1 Le calcium : 1.1 Le calcium dans les cellules souches:

Dans toutes les cellules et particulièrement dans les cellules somatiques de mammifères cet ion divalent joue un rôle fondamental dans les processus de prolifération et la différenciation. Cependant le rôle du calcium das les ellules souhes ’a t tudi ue depuis quelques années (Heubach et al., 2004; Kawano et al., 2002). Cette recherche a suscité un intérêt important dans le domaine car les données suggèrent que la signalisation calcique est liée à la prolifération et à la différenciation cellulaire, deux fonctions fondamentales des cellules souches.

Le calcium (Ca2+) est un cation ubiquitaire qui contrôle de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation cellulaire, et l'apoptose. Le mécanisme général de la signalisation calcique est relativement simple et repose sur les variations spatiotemporelles de cet ion (calcium libre). Dans les cellules eucaryotes, la concentration de calcium intracellulaire [Ca2+]i au repos est comprise entre 50 et 100 nM et peut atteindre entre 1 et 10µM suite à une stimulation. Les composants moléculaires du réseau de signalisation Ca2+ peuvent être divisés en plusieurs groupes selon leur fonction : il existe des canaux calciques de la membrane plasmique qui permettent l'entrée de Ca2+ dans la cellule (comme les canaux calciques indépendants et dépendants du voltage), des canaux de libération calcique localisés aux niveaux des stocks intracellulaires (comme les canaux sensibles à l’iositol tiphosphate IP et à la ryanodine), des pompes et des échangeurs Ca2+ (comme la

Introduction pompe PMCA (pour plasma membrane Ca2+ ATPase) et SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase), l’hageu Na+/Ca2+) qui réduisent la concentration du calcium cytosolique et/ou favorisent sa recapture dans les stocks intracellulaires; et enfin de nombreux senseurs cytoplasmiques (comme la calséquestrine, la calmoduline, le phospholamban ou encore la calcineurine A) qui traduisent les signaux calciques en activité cellulaire.

Plusieurs paramètres caractérisent les signaux calciques: leur origine, leur localisation, leur fréquence, leur amplitude et leur cinétique. Ainsi, en fonction de la nature de ces signaux, la ellule pa l’itediaie de poties liat le aliu a laoe ue pose appropriée (Berridge et al., 2000).

1.1.1 L’ativit aliue spotae das les ellules souhes:

Les oscillations calciques spontanées ont été observées à la fois dans les cellules excitables et non-excitables et elles sont importantes pour le développement embryonnaire. Les oscillations calciques contribuent à la régulation de plusieurs processus tels que la fertilisation, la prolifération cellulaire, la sécrétion, la différenciation neuronale, la croissance axonale, la prolifération et la migration neuronale etc. (Clapham, 2007; Montoro and Yuste, 2004).

Bie u’elles soiet des ellules dites « non-excitables », les cellules souches adultes expriment certains canaux ioniques activés par le voltage (Heubach et al., 2004; Zahanich et al., 2005). Une étude réalisée sur les CSEs et les CSMs a montré que ces deux types cellulaires e podaiet pas au stiulatios pa le glutaate, le GABA, l’otoie ou la dépolarisation confirmant leur non-excitabilité (Forostyak et al., 2013).

Cependant, la majorité des cellules souches ont généré des [Ca2+]i transitoires après stiulatio pa l’ATP ; % des CSEs, 90% des CSMs du tissu adipeux et 62% des CSMs de la moelle osseuse (Kawano et al., 2006). La majorité des CSMs ont des récepteurs purinergiques fonctionnels (Faroni et al., 2013; Kotova et al., 2014) de type P2X pour les CSMs du tissu adipeux et de type P2X et P2Y pour les CSMs de la moelle osseuse (Coppi et al., 2007).

Les transitoires [Ca2+] spontanés se produisent principalement au cours des premiers stades de la différenciation des précurseurs neuronaux et régulent la croissance des neurites et l'apparition du phénotype GABAergique (Ciccolini et al., 2003). L'activité [Ca2+] spontanée a été observée dans 31% des précurseurs neuronaux dérivés des CSEs humaines et elle est

Introduction médiée par l'influx Ca2+ via les VGCC HVA (pour High-voltage-activated Voltage-gated calcium channel) (Forostyak et al., 2013). L’ihiitio des tasitoies [Ca2+] spontanés (médiés par les VGCC de type L et des canaux de type TRPC1) entraine une réduction significative de la prolifération dans les neurones post-mitotiques dérivés des CSEs humaines (Weick et al., 2009). L'activité [Ca2+] spontanée et synchronisée enregistrée dans les progéniteurs neuronaux dérivés des CSNs fœtales huaies seait dpedate des jotios gap de tpe connexine 43 et des VGCC (Jäderstad et al., 2010). En effet dans ces cellules neuronales, l'inhibition des jonctions gap annule l'activité Ca2+ spontanée et la prolifération cellulaire (Malmersjö et al., 2013).

Les CSMs de la moelle osseuse possèdent également des oscillations [Ca2+] spontanées et des transitoires calciques (Kawano et al., 2003). Dans les CSMs de la moelle osseuse humaines, les transitoires [Ca2+] spontanés résultent de la libération calcique des stocks du réticulum endoplasmique (ER) médiée par IP3 (Kawano et al., 2003, 2006).

En résumé, les oscillations calciques spontanées se produisent dans plusieurs types cellulaires; dans les CSEs, elles dépendent de l'influx Ca2+ via la membrane plasmique, alors que dans les cellules souches adultes, elles sont déclenchées principalement par la libération du Ca2+ depuis le RE. Les recherches dans ce domaine et plus particulièrement sur les cellules souhes adultes sot peu oeuses. Les douetes das l’aei pouaient aider à la compréhension des mécanismes et du rôle de ces oscillations dans la prolifération et la différenciation.

1.1.2 Canaux VGCC et signalisation calciques

Les canaux Ca2+ voltage-dépendant (Voltage-Gated Ca2+ Channels ou VGCC) représentent la principale voie d'entrée de Ca2+ dans les cellules excitables. Les VGCC ont été lasss e deu goupes piipau: les aau à haut seuil d’atiatio High Voltage- Activated channels ou HVA) qui comprennent les canaux de type L, N-, P / Q et R et les canaux à bas seuil d’atiatio Lo Voltage-Activated channels ou LVA) ou canaux de type T (Catterall and Swanson, 2015; Wang et al., 1999b). L'expression du VGCC de type L et T a été identifiée dans de nombreux types de cellule souches.

En particulier, ils ont été détectés au niveau protéique dans les CSMs du tissu adipeux (Bai et al., 2007; Jang et al., 2010) et dans les CSMs de la moelle osseuse (Heubach et al., 2004;

Introduction Kawano et al., 2002; Zahanich et al., 2005). Certains travaux montrent que la modulation des canaux de type T qui se produit pendant la progression dans le cycle cellulaire pourrait contribuer à la maintenance de la capacité d'auto-renouvellement des CSEs de souris (Rodríguez-Gómez et al., 2012). L'activation des VGCC LVA serait à l’oigie des osillatios calciques dans les progéniteurs neuronales dérivés des CSEs suggérant leur intervention dans le processus de prolifération cellulaire (Malmersjö et al., 2013). Les stocks calciques impliqués dans ces oscillations induites dans les CSEs et les CSMs avant différenciation font intervenir principalement les stocks calciques sensibles aux IP3 couplés aux vecteurs calciques membranaires P2x,y et VGCC. Les VGCC favorisent la différenciation des CSEs ainsi que les CSMs adultes de différentes origines (Forostyak et al., 2016) (figure H-18). En effet, au cours de la différenciation neuronales des CSEs, ces dernières commencent à exprimer les canaux calciques (L-VOCC, N-VOCC, P/Q-VOCC et R-VOCC). Les CSMs (du tissu adipeux et de la moelle osseuse) quand elles sont différenciées en plusieurs lignages (neuronal, adipogénique et ostéogénique) expriment les canaux calciques L-VOCC et T-VOCC (pour les CSMs du tissu adipeux) et les canaux calciques P/Q-VOCC (pour les CSMs de la moelle osseuse). En particulier, il a été démontré que la différenciation neuronale des CSEs dépend de la coopération entre les canaux calciques VGCC de type L et les canaux de libération calcique intracellulaire de type RyR2 (Yu et al., 2008) (figure H-18).

Le signal calcique spontané ou induit observé pendant la différenciation jouerait un rôle fodaetal das l’epessio de etais ges otaet ceux impliqués dans le cycle e du aliu. L’appaitio des epteus à la aodie et de diffets aau aliues tpes N, P/Q, R, T, L ete autes seait otepoaie à l’olutio des popits du sigal calcique.

Introduction

Figure H-18 : Illustatio shatiue de l’epessio fotioelle des aau et epteus calciques au cours de la différenciation des ESCs (A), des AMSCs (B) et des BMSCs (C). Les uESCs expriment les canaux (T-VOCC), les récepteurs (P2X2,4,5,7 et P2Y1,2,6) et les récepteurs (InsP3 R1-3). Au cours de la différenciation, les pESCs commencent à exprimer les canaux calciques (L-VOCC, N- VOCC, P/Q-VOCC et R-VOCC), les récepteurs (P2X2,3,4,5,7 et P2Y1), les récepteurs (RyR1,2,3), la SERCA et une augmentation du [Ca2+]i aopage de l’appaitio d’osillatios aliues. Les uAM“Cs expriment les récepteurs P2X, les récepteurs AVP-V1, les récepteurs OT,les récepteurs InsP3R et présentent des oscillations calciques. Au cours de la différenciation, les pAMSCs commencent à exprimer les récepteurs P2Y, les canaux calciques (L-VOCC,T-VOCC), la SERCA et les récepteurs 2+ (RyR) avec une augmentation [Ca ]i. Les uBMSCs expriment les récepteurs (P2X, P2Y1,2), les canaux calciques (L-VOCC) ,les récepteurs AVP-V1a,les récepteurs InsP3R , la SERCA et présentent des oscillations calciques. Au cours de la différenciation, les pBMSCs commencent à exprimer les récepteurs OT, les récepteurs (P2X7, P2Y1), les canaux calciques (P/Q-VOCC), les récepteurs RyR avec une augmentation [Ca2+]i. D’aps Foostak et al., (2016). u: undifferentiated ; p :pre- differentiated ;ESCs : embryonic stem cells ; AMSCs : adipose-derived mesenchymal stem cells ; BMSCs : bone-marrow derived mesnchymal stem cells ; P2 :récepteur purinergique ;OT :récepteur à l’otoie,AVP :récepteur à la vasopressine ;VOCC :canal calcique voltage 2+ dépendant ;RyR :récepteur à la ryanodine ;InsP3R :epteu à l’IP ; [Ca ]i :concentration calcique intracellulaire ; SERCA : Ca2+-ATPase du réticulum sarco-endoplasmique.

Introduction 1.1.3 Les stocks calciques intracellulaires dans les cellules souches:

Le réticulum endoplasmique (ER) est le principal organe de stockage de Ca2+. Parallèlement, deux mécanismes majeurs de libération de Ca2+ réticulaire existent via les récepteurs à la ryanodine (RyR) et les récepteurs au 1,4,5-triphosphate d'inositol (InsP3). Le remplissage des stocks calciques « vidés » est assu pa l’eistee d’ue pope Ca2+-ATPase (SERCA).

La cascade de signalisation métabotropique PLC/InsP3 a été démontrée comme la voie principale induisant la libération de Ca2+ de l'ER dans différents types de cellules souches. Des tudes ot ot ue seuls les epteus à l’IsP, et o les RR, sot fotioels das les ESC de souris (Yanagida et al., 2004); dans les CSMs humaines du tissu adipeux (Kotova et al., 2014; Tran et al., 2014) et dans les CSMs humaines de la moelle osseuse (Kawano et al., 2002). La oie de liatio aliue PLC/IsP este fotioelle uelle ue soit l’oigie ou le stade de différenciation, ce qui laisse à penser que cette voie est conservée dans toutes les cellules souches. Par exemple, les CSES et les MSC différenciés en cardiomyocytes, en adipotes ou e euoes, possdet toutes des epteus fotioels à l’IsP (Kawano et al., 2006; Resende et al., 2010; Sedan et al., 2008; Tran et al., 2015). Cependant, les récepteurs à la ryanodine sont peu caractérisés dans les cellules souches, même si ils apparaissent lors de la différenciation. Par exemple, les cellules neuronales et cardiaques dérivées des CSEs ou des CSMs, expriment des RyR fonctionnels (Forostyak et al., 2013; Resende et al., 2010). Des tudes ot ot u’il y a un lien fonctionnel entre les RyR type2 et les VGCC de type L et que cela est important dans la différenciation neuronale (Yu et al., 2008).

1.2 Le calcium dans les cellules souches/progéniteurs cardiaques:

Le aliu joue u ôle ipotat das le œu e atiat les poessus de oissae (Berridge et al., 2000; Frey et al., 2000) et en modulant le comportement mécanique des cardiomyocytes (Bers, 2002; Houser and Molkentin, 2008).

A l’heue atuelle, les tudes su l’atiit et la sigalisatio aliue das les C“Cs sot rares. Ferreira-Martins et ses collègues ont montré pour la première fois que les CSC c-kit+ humaines possèdent des oscillations calciques spontanées et que ces dernières jouent un rôle essentiel dans la régulation de la prolifération cellulaire (Ferreira-Martins et al., 2009). Ces

Introduction oscillations intrinsèques se produisent indépendamment du couplage avec des cardiomyocytes ou de la présence de Ca2+ extracellulaire. Ces résultats ont été confirmés dans les œus de souis tasgiues das lesuelles l’EGFP (pour enhanced green fluorescent protein) était sous le contrôle du promoteur c-kit. Ces oscillations calciques ont été régulées par la libération calcique depuis l'ER par l'activation des IP3R et la réabsorption du Ca2+ par la SERCA. Les IP3R et les SERCA ont été fortement exprimés dans ces cellules alors que les RyR n'ont pas été détectés.

D’aute pat, les C“Cs -kit+ exprimaient des canaux SOC (Store-Operated Channel ou canaux calciques activés consécutivement à la déplétion des stocks de Ca2+ du réticulum endoplasmique) et la pompe Ca2+ de la membrane plasmique. Bien que ces canaux et pompes soient fonctionnels, ils n'ont aucun effet direct sur les oscillations de Ca2+. Néanmoins, la fréquence des oscillations calciques peut être significativement augmentée par l'ATP et l'histamine via les epteus puigiues et les epteus à l’histaie de tpe .

D’aute pat, il appaait ue es oscillations calciques sont couplées avec l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire et l'incorporation de BrdUrd. L'induction des oscillations calciques dans les CSCs c-kit+ aat leu ijetio itaoadiue das des œus ifais de souris, amélioeait la geffe et l’epasio de es ellules (Ferreira-Martins et al., 2009). Lors de la différenciation des CSCs en cardiomyocytes, la famille des facteurs de croissance FGF et TGFβ joue u ôle ajeu dans lequel intervient le signal calcique (Tonelli et al., 2012) (figure H-19).

L'activation des récepteurs TGF-ß stiule l’atiatio de la tat-associated kinase (TAK), une protéine qui appartient à la voie MAPK. Le TAK agit sur les facteurs de transcription ATF2 et CREB via la voie MAPK sensible au Ca2+ (Park et al., 2009). L'ATF2 peut également se lier aux Smads pour favoriser l'expression des facteurs de transcription responsables du développement du phénotype cardiaque.

Wnt11 participe également au processus de différenciation cardiaque, en agissant sur des voies de signalisation dépendantes du Ca2+ médiées par la Protéine kinase Ca2+/calmoduline-dépendante (CaMK-II), la proteine kinase C (PKC) et les c-Jun N-terminal kinases (JNK) (Biteau et al., 2008).

Introduction

Figure H-19 : Voies de signalisations majeures impliquées dans le maintien de la pluripotence ou de la favorisation de la différenciation des cellules souches cardiaques (CSCs). Le calcium (entouré e ouge iteiet e aal de la oie Wt/β-catenin canonique (médiée par Wnt 1,3,8) mais également en amant de Wnt 11 (voie Wnt non canonique dépandante du calcium). La CamK II, intervient par la suite pour maintenir la multipentence ou la pluripotence des cellules souche. Dans la différenciation des CSCs en cardiomyocytes, la faille des fateus FGF, BMP et TGFβ sot les principaux régulateurs. L'activité de TAK (une protéine appartenant à la voie MAPK), est stimulée pa l'atiatio des epteus au TGFβ. La TAK agit su les fateus de tasiptio oe ATF via la voie MAPK sensible au Ca2+. L'ATF2 peut également se lier aux Smads pour promouvoir l'expression des facteurs de transcription responsables du développement du phénotype cardiaque. La voie ERK est activée par les FGF via la protéine Ras pour favoriser essentiellement la prolifération cellulaire. . D’aps Toelli et al.,

Les propriétés des cellules souches cardiaques (différenciation, auto-renouvellement, polifatio, igatio sot ideet oditioes pa d’autes poessus olulaies que ceux décrits plus haut. En effet, au stade de progéniteur et au cours de la différenciation de cellules souches cardiaques, il apparait un nombre significatif de protéines membranaires qui incluent les canaux ioniques.

Introduction 2 Les canaux ioniques :

Comme nous l’aos aod suiteet das le hapite pdat, les signaux bioélectriques générés par les canaux ioniques jouent un rôle crucial dans la genèse de l’eitatio letiue et das la odutio des stiulatios das les ellules eitales. Das les cellules non-excitables, les canaux ioniques interviennent dans différents processus ellulaies oe la polifatio, la igatio et l’apoptose (Berridge et al., 1998, 2000; Orrenius et al., 2003). E effet, il a t ot u’ue stiulatio électrique conditionnante (de 1 Hz pendant 7 à 14 jours) sur des progéniteurs cardiaques humains, faoise l’epessio de protéines membranaires et structurales (ex : Troponine I, SERCA2 Cx43, alpha-actine) ; favorisant leur potentiel phénotypique cardiovasculaire (Llucià-Valldeperas et al., 2014).

Plusieurs études ont montré que les cellules souches expriment différents canaux ioniques. Ces derniers sont exprimés de manière hétérogène et dépendent du type de cellule souche. Le rôle de ces canaux dans les cellules souches reste peu étudié mais les données dispoiles otet u’ils sot fodaetau das la gulatio de la polifatio, la différenciation et la migration.

De nombreux courants ioniques ont été caractérisés dans les cellules souches; ils comprennent des courant potassiques rectifiants retardés voltage-dépendant ou IKDR (codé

+ 2+ par différents gènes KV), des courants K activés par le Ca intracellulaire ou KCa (BKCa, KCa de grande conductance, IKCa; KCa de conductance intermédiaire et SK4, KCa à petite conductance

+ + comme le SK1,2,3), le courant transitoire sortant K (Ito) , le courant K rectifiant entrant (IKir), le ouat ati pa l’hpepolaisatio Ih aau HCN et modulé par les nucléotides cycliques intracellulaires et non sélectif aux cations, différents courants chlorures (ICl), le courant sodium dépendant du voltage (INa), les courant calciques de types T et L (ICaT ,ICa.L) et les courants TRP (transient receptor potential ) perméables aux cations (Li and Deng, 2011).

Tous ces courants étaient présents de manière hétérogène dans les cellules ES, les CSMs de différentes origines (moelle osseuse, tissu adipeux et sang du cordon ombilical humain), les cellules progénitrices neurales ou les cellules progénitrices cardiaques.

2.1 Les canaux ioniques dans les CSEs:

Il a été rapporté que les CSEs qui co-expriment les courants IKDR et BKCa sont retrouvés dans 52% des cellules CSEs de souris et 100% des cellules CSEs humaines (Wang et al., 2005).

Introduction

Les IKDR des cellules CSEs de souris sont codés par les gènes KV1.1, KV1.2, KV1.3 et KV1.6 dans des cellules CSEs alors que les IKDR des cellules ES humaines sont codés par les gènes KV7.2 et

Kv9.3. De plus, un courant Ih (codé par le gène HCN3) est présent dans 23% des cellules CSEs de souris mais absent dans les cellules CSEs humaines. De même, les courants K rectifiant entrant (IK1) responsables de la stabilisation du potentiel de membrane de repos n'étaient pas présents dans les CSEs de souris (Wang et al., 2005).

2.2 Les canaux ioniques dans les CSMs:

La plupart des CSMs humaines de la moelle osseuse possèdent des courant KCa et IKDR

(Heubach et al., 2004; Li et al., 2005). Le courant KCa dans les CSMs de la moelle osseuse est codé par le gène MaxiK (KCa1.1 ou Slo), comme le montrent plusieurs études (Heubach et al., 2004; Kawano et al., 2003). De plus, des courants sodiques tetrodotoxine (TTX) sensibles

(codés par NaV1.7), des courants Ito (codés par KV1.4 et KV4.2) et des courants ICa.L (codés par

CaV1.2) sont présents dans une petite population (29%, 8% et 15% respectivement) de CSMs humaines (Li et al., 2005).

Des courants IKCa (codé par KCa3.1), des courants Cl- sensibles au volume (codé par Clcn3) et des courants IKir (codé par Kir2.1), sont présents dans les CSMs de la moelle osseuse de souris (Tao et al., 2007). Le pofil d’epessio des aau ioiues das les CSMs de souris est différent de celui des cellules ES de souris, ce qui suggère que l'expression du canal ionique peut dépendre de l'origine de la cellule souche. Il a été constaté que dans les CSMs de rat, plusieurs courants ont été caractérisés; des courants INa TTX sensibles (16% des cellules) ; Ito

(10% des cellules) ; ICa.L (8% des cellules), IKDR (91% des cellules) et des BKCa coexprimés avec des courants IKCa (33% des cellules) (Li et al., 2006). Dans les CSMs de la moelle osseuse de lapin, il existe des courants IKDR (codés par KV1.2 et KV2.1) présents dans 78% des cellules, des courants BKCa et IKCa coexprimés avec IKDR dans 29% des cellules, tandis que IKir (codé par Kir1.1) est présent dans 28% des cellules (Deng et al., 2006). Les résultats obtenus sur les CSMs de la oelle osseuse de at, de lapi ou de l’Hoe ettet e idee des pofils et des photpes d’epessio de aau ioiques différents, suggérant une expression dépendante de l'espèce.

D’autes tudes ot ot la présence de plusieurs courants dans les CSMs de la veine du cordon ombilical humain. Ces cellules possèdent des courant ; BKCa (codé par KCa1.1) dans

Introduction

92% des cellules, Ito (codé par KV1.4 et KV4.2) dans 50%, INa TTX sensibles (codé par hNE-Na) dans 30% des cellules et des courants IKir (codé par TWIK et Kir2.1) dans 5% des cellules.

Cependant, aucun courant IKDR typique n'a été enregistré, bien que les gènes KV1.1 et KV10.1 soient détectés dans ces cellules (Park et al., 2007). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, des courants INa et Ito ont pu être enregistrés dans une petite population de cellules (8% et

19%). Les courants IKDR (73% des cellules), BKCa (codé par KCa1.1), IKCa (codé par KCa3.1) et

SKCa (codé par KCa2.3) sont présents dans ces cellules (Bai et al., 2007). Ces études suggèrent que le profil d'expression des canaux ioniques dans les CSMs peut être tissu-spécifique.

2.3 Les canaux ioniques dans les cellules souches/progéniteurs neurales:

Une étude publiée en 1997, a montré que les cellules progénitrices oligodendrocytaires et les oligodendrocytes différenciés provenant de rats néonatals, possèdent des courants IKDR

(codés par KV1.2, KV1.5 et KV1.6) et des courants potassiques IA (codés par KV1.4) (Attali et al., 1997). Des études récentes ont montré également que les courants IKir (codé par Kir4.1 et

Kir5.1) et le IKDR (codé par KV3.1) sont présents dans les progéniteurs neuronaux de souris issus de sphères (Yasuda and Adams, 2010; Yasuda et al., 2008).

De multiples canaux ioniques sont exprimés de manière hétérogène dans des cellules souches neurales embryonnaires de rat. Ces cellules ont des courants potassqiues IA et IKDR dans plus de 80% des cellules, des courants INa (TTX sensibles et TTX non sensibles) dans 22

% des cellules et et des courants ICa,L dans 19% des cellules souches neurales (Cai et al., 2004).

Des courants IKDR (codé par KV2.1) et IA (codé par KV4.3) ont été aussi retrouvés chez les progéniteurs neuronaux embryonnaires de rat (Smith et al., 2008). Il a été signalé que les cellules progénitrices du cerveau antérieur de rat néonatal co-expriment des courants INa

TTX sensibles, des courants IKDR et des courants IA (Stewart et al., 1999) alors que, seuls les courants IKDR sont présents dans les cellules progénitrices de rat adulte (Liebau et al., 2006).

Concernant les cellules souches neurales embryonnaires humaines, des études ont montré la présence de courants IA (codé par KV4.2) et de courants IKDR dans les CSEs neurales huaies dies du tissu eeu de fœtus aot (Schaarschmidt et al., 2009). Quatre types de courants ioniques (IA, IKDR, IKir et INa TTX sensibles) ont été également décrits dans les ellules souhes euales huaies du ote de fœtus aot (Lim et al., 2008).

Introduction 2.4 Les canaux ioniques dans les CSCs:

Peu d’ifoatios su l'epessio des aau ioiues das les ellules souches/progénitrices cardiaques humaines sont disponibles. Une étude sur les cellules progénitrices c-kit cardiaques de souris adultes a montré que ces cellules expriment des courants IKDR (codé par KV1.1, KV1.2 et KV1.6), des courants ICl (codé par Clcn3) et des courants IKir (codé par Kir1.1, Kir2.1 et Kir2 .2) (Han et al., 2010).

En 2014, Zhang et ses collègues ont caractérisé des courants ioniques dans les cellules progénitrices cardiaques humaines c-kit+. Plusieurs courants ioniques étaient présents dans ces cellules ; des courants BKCa codés par KCa.1.1 (dans 86% des cellules), des courants IKir codés par Kir2.1 ( dans 84% des cellules), des courants Ito codés par KV4.2 et KV4.3 (dans 47% des cellules) et des courants Na+ TTX sensibles codés par SCN3A et SCN8A (dans 61% des cellules) (Zhang et al., 2014a). Ces résultats ont révélé pour la première fois que quatre types de courants ioniques (BKCa, Ito, IKir et INa TTX sensibles) sont présents de manière hétérogène dans les cellules cardiaques humaines c-kit+.

Une autre étude publiée en 2016 par Che et ses collègues, a identifié la présence de canaux TRPV (transient receptor potential vanilloid) de type 2 et de type 4 sur les CSC c-kit+ (Che et al., 2016).

3 Rôles des canaux ioniques dans la régulation de la prolifération et/ou la différenciation des cellules souches:

3.1 Prolifération

Les canaux ioniques jouent un rôle important dans le contrôle de la prolifération cellulaire (MacFarlane and Sontheimer, 2000; Pardo, 2004). Dans les CSMs de la moelle osseuse de rat, il a été montré que durant la transition G1/S du cycle cellulaire, le courant

IKDR diminue tandis que le courant IKCa augmente dans les MSC dérivés de la moelle osseuse de rat (Deng et al., 2007).

De plus, l’etitio des aau IKDR ou les aau IKCa avec des siRNA ciblant KV1.2 et

KV2.1 (pour IKDR) ou KCa3.1 (pour IKCa) inhibe la prolifération cellulaire et provoque l’auulatio des ellules e phase G / G du le, e ui sugge ue es deux canaux sont nécessaires à la régulation de la prolifération cellulaire de ces cellules (Deng et al., 2007;

Introduction Wang et al., 2008). Le blocage du canal responsable du courant IKDR réduit considérablement la prolifération des cellules CSEs murines et humaines (Wang et al., 2005), et celle des CSMs humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007) mais pas la prolifération des CSC c-kit+ murines (Han et al., 2010). Cependant, l'inhibition de IKDR favorise la prolifération de cellules progénitrices neurales adultes de rat (Liebau et al., 2006; Yasuda and Adams, 2010; Yasuda et al., 2008) et celle des progéniteurs neuronaux humains (Schaarschmidt et al., 2009).

De même, le blocage de IKCa réduit également la prolifération cellulaire dans les CSMs murines de la moelle osseuse avec une accumulation des cellules dans la phase G0 / G1 du cycle (Tao et al., 2008). Cependant, dans les CSMs humaines du tissu adipeu l'ihiitio d’IKCa n'a pas d'effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007).

L'effet régulateur de BKCa sur la prolifération a été reporté dans plusieurs types cellulaires. L'inhibition de BKCa réduit la prolifération cellulaire des pré-adipocytes humains (Hu et al., 2009) et celle des cellules ES murins (Wang et al., 2005) mais pas celle des CSMs humaines du tissu adipeux (Bai et al., 2007). Cependant, l'inhibition de BKCa réduit la polifatio ellulaie et pooue l’at du le e phase G/G das les CSMs humaines de la moelle osseuse (Zhang et al., 2014b). De la e aie, l’ihiitio de BKCa réduit la prolifération en accumulant les cellules en phase G0/G1 dans les CSCs c-kit+ humaines (Zhang et al., 2015b). Le canal Cl- sensible au volume a été impliqué dans la prolifération cellulaire et l'apoptose de plusieurs types cellulaires (Blackiston et al., 2009; Lang et al., 2006; Liu et al., 2010). L’ihiitio de ICl.ol duit otaleet la polifatio ellulaie des CSMs murines (par accumulation des cellules en phase G0/G1) en inhibant la cycline D et la cycline E (Tao et al., 2008). De même, le blocage du canal ICl.vol diminue également la prolifération cellulaire des CSC c-kit+ murines (Han et al., 2010). L’hpepolaisatio de la eae est ipliue das l’ihiitio de la polifatio ellulaie (Hu et al., 2009; Kuhlmann et al., 2005).

Dans les cellules progénitrices neuronales adultes, la dépolarisation membranaire par l’ihiitio de IKi ou par l'augmentation de la concentration de K+ extracellulaire favorise la prolifération cellulaire (Yasuda et al., 2008). Cepedat l’ihiition du canal Kir2.1 dans les CSCs c-kit+ huaies ’affete pas la polifatio ellulaie (Zhang et al., 2015b). Concernant le rôle du courant Ito dans la prolifération, des études ont montré que l'activation du courant

IA (KV4.2) est une condition requise pour la prolifération dans les cellules progénitrices neuronales embryonnaires humaines (Schaarschmidt et al., 2009) et ue l’ihiitio du aal

Introduction

KV4.2 réduit la prolifération cellulaire dans les préadipocytes humains (Hu et al., 2009). Une tude ete a ot ue l’ihiitio des aau TRPV et TRPV das les C“Cs -kit+ humaines réduit la prolifération cellulaie pa l’auulatio des ellules e phase G/G du cycle cellulaire.

+ + Le rôle précis des canaux Na TTX sensibles et les canaux Na TTX résistants (NaV1.5), connus pour jouer un rôle fondamental dans la génération du potentiel d'action dans les ellules eitales, ’est pas totaleet luid das les ellules o-excitables y compris les cellules souches (Cai et al., 2004; Li et al., 2005). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, le blocage de l'INa n'affecte pas la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007). De e, l’ihiitio des canaux Na+ TTX sensibles dans les CSCs c-kit+ ’a pas d’ipat su leu polifatio (Zhang et al., 2015b).

3.2 Différenciation :

Coe ou pdeet, l’atiit aliue tosoliue est uiale pou la croissance et la progression dans le cycle cellulaire des cellules souches et des progéniteurs (Ferreira-Martins et al., 2009; Resende et al., 2010).

L’ihiitio des aau Ca2+ de type L réduit la différenciation des cellules progénitrices neurales dérivées du cortex cérébral de souris D’Asezo et al., . De plus, l'entrée Ca2+ médiée par TRPC1 favorise la différenciation des CSEs neurales de rat (Fiorio Pla et al., 2005). L’ihiitio de TRPC ais pas TRPC ae des siRNA diiue la diffeiatio des ellules progénitrices neurales de rat (Shin et al., 2010). Ces résultats suggèrent que la régulation du Ca2+ cytosolique par les canaux Ca2+ de type L, TRPC1 ou TRPC5 joue un rôle important dans la transition entre la prolifération et la différenciation neuronale. Dans les CSMs humaines de la

oelle osseuse l’ihiitio des aau BKCa ou hEag1 réduit la différenciation adipogénique et ostéogénique de ces cellules (Zhang et al., 2014b).

En résumé, su les ellules souhes adiaues oe su d’aute tpe de ellules souches les propriétés du signal calcique (fréquence amplitude, répartition spatio-temporelle, microdomaines) conditionneraient les propriétés cellulaires des cellules souches (différenciation, auto-renouvellement, prolifération migration). Ce signal conditionnerait l’epessio de oeuses poties e patiulie les aau ioiues.

Position du problème

POSITION DU PROBLEME

Le œu huai a t osid pedat logteps oe u ogae post-mitotique sans aucune régénération et dans lequel les cardiomyocytes présents à la naissance persisteraient tout au long de la vie sans divisions cellulaires. La seule réponse majeure aux doages adiaues seait l’hpetophie des adiootes eoe viables (Chien and Olson, 2002; MacLellan and Schneider, 2000; Soonpaa and Field, 1998). Ce dogme selon lequel le myocarde est vu comme un tissu statique commençait à être contesté avec les découvertes chez l’aial ettat e idee des diisios itotiues das les adiootes (McDonnell and Oberpriller, 1984; Rumyantsev and Borisov, 1987). D’autes does ot ot l’eistee de otes etiulaies e diisio hez l’Hoe das des oditios normales et pathologiques (Beltrami et al., 2001; Kajstura et al., 1998; Quaini et al., 2002). Cette ouelle isio du œu oe tat u ogae daiue ipliueait la psee d’ue populatio de ellules pogities ou de ellules souhes adiaues à pati desquelles les nouveaux myocytes peuvent être formés.

En effet, plusieurs équipes ont is e idee l’eistee de ellules souhes adiaues C“Cs ultipotetes das le œu huai sai et pathologiue, apales de se différencier en myocytes, cellules musculaires lisses et en cellules endothéliales (Messina et al., 2004; Urbanek et al., 2005). Cette découverte de CSCs a ouvert un nouveau domaine de recherche sur les méaises de l’hoostasie et de la gatio adiaue et a peis d’eisage des thapies ellulaies à ase de C“Cs. Depuis, différents types de cellules ayant des propriétés souches ont été isolées à partir des tissus cardiaques humains et proposées comme modèles de CSCs (Barile et al., 2007; Guan and Hasenfuss, 2013). Ces CSCs portent plusieus oelatues, ui oespodet à des aueus u’elles epiet, oe pa exemple les CSCs Isl-1+, les CSCs Sca-1+ ou les CSCs c-kit+.

Récemment, ue ouelle populatio de C“Cs d’oigie sehateuse a t douete das le œu huai (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a). Ces cellules expriment des facteurs de transcription spécifiques cardiaques et peuvent être différenciées en plusieurs types cellulaires notamment en « cardiomyocytes ». Cependant, cette différenciation est incomplète et aboutit à des cardiomyocytes très immatures.

Position du problème

Les CSCs W8B2+ possèdent des capacités réparatrices cardiaques importantes losu’elles sot ijetes das des odles uis d’ifatus du oade (Reus et al., 2016; Rossini et al., 2011). Cette capacité réparatrice cardiaque serait liée au large sécrétome que possède ces cellules qui est composé de cytokines et de facteurs de croissance intervenant notamment dans l'angiogenèse, la survie cellulaire, le chimiotactisme, la réponse iuitaie, l’iflaatio et le eodelage etaellulaie (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

Naois, auue aatisatio fotioelle à l’helle ellulaie (électrophysiologie, signalisation calcique au cours la différenciation… ’a t appote.

Ainsi, les objectifs de ces travaux consistent à :

 Mettre au point un modèle de CSCs humaines exprimant le marqueur W8B2+ à partir d’hatillos auiulaies huais oteus e ollaoatio ae le CHU de Poities.

 Caractériser la signature électrophysiologique (canaux ioniques et signalisation aliue à l’tat souhe et aps diffenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+.

 Améliorer la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ in vitro par optogénétique.  Suivre les changements calciques au cours de cette différenciation via l’utilisatio de la sonde calcique GCaMP.

En parallèle de ces objectifs, nous avons étudié sur ce modèle cellulaire deux types de cibles, un canal calcium dépendant et un médiateur lipidique, soient:

 l’ipotae des aau ioiues plus piset le aal BKCa) dans la régulation des propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+.

 les effets et le ode d’atio de la sphigosie -phosphate (un important régulateur physiologique et physiopathologique cardiaque) sur les propriétés des CSCs W8B2+ (prolifération, auto-renouvellement et migration).

Matériels et méthodes

MATERIELS ET METHODES

I- Isolement et purification des CSCs W8B2+ à pati d’hatillos huais d’oeillettes droites L’isoleet et la puifiatio des C“Cs WB+ est un processus relativement long (5 à 6 semaines pour avoir des CSCs W8B2+ pues ui osiste e l’utilisatio de diffetes méthodes et techniques (Figure MM-1).

Passage 0

Passage 2 Passage 1

Figure MM-1 : “ha du potoole d’isoleet et de puifiatio des C“Cs WB+ à partir des échantillons auriculaires humains. Les échantillons fraîchement récoltés sont coupés en petits fragments de 1-2 mm3 et cultivés selon la méthode des explants. Au bout de 3-4 semaines, les cellules adhérentes ayant proliféré sont triées avec le système du tri magnétique positif pour avoir une population enrichie en CSCs W8B2+. Après la confluence, les cellules sont marquées avec l’atiops ati-W8B2-PE et triées par FACS.

1 Isolement des CSCs W8B2+ avec la méthode des explants Les CSCs W8B2+ ot t isoles à pati d’hatillos huais d’oeillettes doites (EODHs) en collaboration avec le CHU de Poitiers. Ces échantillons sont des déchets opératoires issus de la mise en place de circulation extracorporelle lors de chirurgies cardiaques telles que le pontage coronarien ou le remplacement valvulaire aortique. Toutes les procédures ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki. Une fois prélevés, les EODHs sont stockés

Matériels et méthodes

dans une solution de Tyrode (NaCl 140 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,8 mM, CaCl2 1,8 mM, HEPES 10 mM, D-Glc 10 mM, pH 7.4) à 4°C et acheminés rapidement au laboratoire. Les échantillons huais d’oeillettes doites faiheet olts sot is fois ae du PB“ oi opositio e aee pou elee le aiu de sag. Le tissu adipeu adiaue s’il est présent) est complétement retiré par dissection. Ces échantillons sont ensuite coupés manuellement avec des ciseaux stériles en petits fragments de 1–2 mm3 et rincés avec du PBS X jusu’à e ue le suageat deiee totaleet taspaet. Ces fagets sot esuite digérés enzymatiquement avec la collagénase A (1 mg/mL, Sigma-Aldrich) pendant 20 minutes dans un bain marie à 37°C sous agitation. Après digestion enzymatique, les fragments sont ensemencés (comme passage 0) dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre préalablement recouvertes de fibronectine (10 μg/mL, Sigma-Aldih aat d’te ultis das le « milieu des explants » opos de ilieu IMDM Loza supplet de % de “VF, ,M de β- mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich), 2mM de L-glutamine (Sigma-Aldrich), 100 U/mL de pénicilline (Sigma-Aldrich), 100 µg/mL de streptomycine (Sigma-Aldrich) et 0,25 µg/mL d’aphotiie B “iga-Aldrich)) dans un incubateur à 37°C et 5% CO2 pendant 3 à 4 semaines en changeant le milieu 1 à 2 fois par semaine. Au bout de quelques jours, les cellules commencent à sortir des explants, adhèrent au plastic et prolifèrent.

2 Purification des CSCs W8B2+ 2.1 Enrichissement en CSCs W8B2+ par le système du tri cellulaire magnétique positif: 2.1.1 Principe : Il ne faut que 3 étapes simples pour obtenir une population enrichie en CSCs W8B2+ (Figure MM-2). Dans la 1ère étape, les cellules en suspension sont magnétiquement marquées (marquage magnétique direct) avec des microbilles (MACS MicroBeads) de 50 nm de diamètre ouples au atiops diigs ote les atiges de sufae WB huais. Il s’agit d’ue sletio dite positie a seul u tpe ellulaie spifiue e l’ouee les C“Cs WB+) est magnétiquement marqué.

Dans la 2ème étape, la suspension cellulaire est appliquée à une colonne placée dans un séparateur. Durant cette étape de séparation, les CSCs W8B2+ marquées magnétiquement (fraction positive) sont retenues dans la colonne grâce au champ magnétique apporté par un aimant alors que les cellules non-marquées traversent la colonne (fraction négative). Dans la 3ème étape, une courte étape de lavage est réalisée et la colonne est retirée du champ

Matériels et méthodes magnétique du séparateur. Enfin, les CSCs W8B2+ magnétiquement marquées sont récupérées par simple élution.

Figure MM-2 : Schéma du principe de la technique du tri cellulaire magnétique positif (MACS pour magnetic-activated cell sorting). Les chiffres 1,2 et 3 illustrent les 3 étapes du tri magnétique. S et N signifient les pôles sud et nord du séparateur. Source : Miltenyi Biotec.

Matériels et méthodes

2.1.2 Protocole expérimental : -Préparation des cellules : Losue les ellules issues des eplats ot polif jusu’à ofluee soit eio à semaines après ensemencement des explants), le milieu de culture est retiré et le tapis cellulaire est rincé avec du PBS 1X (Lonza). Les cellules et les explants sont récoltés par digestio ezatiue à l’Aua® “iga-Aldrich), pendant 2 à 4 min à 37°C. La totalité des cellules est récupérée via un tamis cellulaire de nylon de porosité 40µm (Corning) puis centrifugées à 300 g pendant 7 min. -Marquage magnétique ae l’atiops ati-W8B2 (appelé aussi anti-MSCA-1): Le culot cellulaire est ensuite suspendu dans le tampon du tri magnétique (PBS+ BSA 0,5%+ EDTA M, Miltei iote oteat l’atiops ati-W8B2 humain couplé à des microbilles magnétiques (dilué au 1/5ème, Miltenyi biotec) et du FCR Blocking Reagent® (dilué au 1/5ème, Miltenyi biotec). Les cellules sont ensuite incubées 15 min à froid (entre 4 et 8°C). -Séparation magnétique : Après un lavage dans du tampon dit « tri magnétique », les cellules sont centrifugées (10 min à 300g), resuspendues puis passées à travers une colonne de séparation cellulaire MACS® (Miltenyi biotec) positionnée sur un aimant. Un filtre cellulaire de nylon de porosité 40µm est préalablement placé sur la colonne de séparation cellulaire MACS® pour bien séparer les cellules. -Elution des cellules W8B2 positives: Les cellules W8B2 positives ou W8B2+, retenues dans la colonne, sont lavées par du tampon « tri magnétique » et récoltées par simple élution en séparant la colonne de l’aiat. Aps centrifugation (10 min à 300 g), les cellules W8B2+ sont ensemencées (comme passage 1) avec le « milieu de croissance » (contenant 25% du milieu EGM-2 (Lonza) et 75% du milieu M199 Loza, supplet ae % de “VF, , M d’aides aminés non essentiels, 100 U/mL de pénicilline, 100µg/mL de streptomycine (Sigma-Aldrich)) et cultivées soit dans des plaques 6

2 3 2 puits ou dans des flasques 25 cm (à raison de 10 cellules/cm ) à 37°C et 5% de CO2. Le milieu de croissance est changé deux fois par semaine et à confluence les cellules W8B2+ sont préparées pour le tri cellulaire par cytométrie en flux.

Matériels et méthodes

2.2 Purification des CSCs W8B2+ par le système de tri cellulaire par cytométrie en flux: 2.2.1 Principe: La cytométrie en flux est une technologie basée su l’utilisatio de lases peettat ue analyse multi-paramétrique des cellules à un très haut débit (plusieurs milliers de cellules/seconde).

De nos jours, les termes «cytométrie de flux» et «FACS» sont souvent utilisés pour décrire la e tehiue. Le FAC“ est ue tehiue de totie e flu dote d’u odule supplémentaire permettant de séparer physiquement les cellules.

Dans ce travail, cette technique a permis de réaliser les expériences suivantes:

-Le tri cellulaire par FACS (Fluorescence-atiated ell sotig à fi d’otei ue populatio pure de CSCs W8B2+.

- L’iuo-photpage pou tudie le pofil d’epessio des aueus de surface sur ces cellules.

-L’aalse du le ellulaie pa iopoatio d’iodue de popidiu pou tudie la répartition des différentes phases du cycle cellulaire.

-L’tude de la viailit ellulaie pou tudie l’etuelle totoiit de etaines molécules (ex : paxilline et S1P) sur les CSCs W8B2+.

La figure MM-3 illuste l’istallatio epietale et les podues gales pou ue expérience type de tri cellulaire par FACS. Une population mixte de cellules est triée en deux fractions ; une négative et une positive qui contient les cellules exprimant le marqueur d’itt.

E utilisat des atiops spifiues ojugus à des sodes fluoesetes, l’aalse pa FAC“ peet de ollete des does et aussi de tie les ellules d’itt.

L’utilisateu dfiit les paates selo lesuels les ellules doiet te ties. E fotio des paramètres choisis, le cytomètre impose une charge électrique sur chaque cellule de manière à ce que les cellules soient triées par charge (par électro-aimants). Elles sont ensuite réparties dans des récipients séparés à la sortie de la chambre d'écoulement.

Matériels et méthodes

Figure MM-3 : Schéma simplifié du principe de la technique du tri cellulaire par FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting). Source : Bosterbio.

La cytométrie en flux est réalisée à l’aide d’u tote ui est ostitu de gads modules : fluidique, optique et électronique (figure MM-4).

-Le système fluidique comprend une cellule d'écoulement, où la suspension cellulaire est injectée. La cellule d'écoulement nécessite un fluide de gaine pour transporter et aligner les cellules afin qu'elles passent en une seule file à travers un canal étroit et dans le faisceau lumineux. Cette focalisation hydrodynamique permet l'analyse d'une cellule à la fois par interrogation laser.

Matériels et méthodes

-Le système optique comprend une source de lumière (habituellement un laser), des détecteurs de lumière et différents filtres.

Figure MM-4 : “ha siplifi du piipe du fotioeet d’u tote de flu. “ource : Bosterbio.

Les détecteurs de lumière:

Un détecteur situé en face du faisceau lumineux mesure les signaux lumineux de diffusion diete, ’est-à-die d’ue luie fate pa ue ellule et ui otiue so dplaeet dans la même direction ue elle de so hei d’oigie galeet jusu'à ° de décalage par rapport à l'axe du faisceau laser). Ce signal est collecté par un PMT appelé le canal de diffusion direct (FSC : pour Forward Scatter Channel) figure MM-5 A.

Ce système est couramment utilisé pour déterminer la taille des cellules figure MM-5 A.

Les cellules les plus grandes produiront plus de lumière à diffusion directe que les plus petites. Le signal de diffusion direct sera plus fort.

Matériels et méthodes

Figure MM-5 : Schéma simplifié des paramètres clés mesurés par le cytomètre de flux comprenant la diffusion de lumière directe (FSC), la diffusion de lumière latérale (SSC) et les signaux d'émission de fluorescence. Source : Bosterbio.

Des détecteurs situés sur le côté mesurent les signaux lumineux de diffusion latérale et sont appelés SSC (pour Side Scatter Channel) figure MM-5 B. Les détecteurs de fluorescence mesurent l'intensité du signal de fluorescence émis par les cellules marquées positivement figure MM-5 C.

Le signal lumineux de diffusion latérale (SSC) est une lumière qui est réfractée par une cellule et qui se déplace dans une direction différente de celle de son chemin d'origine (mesurée à un angle de 90 ° par rapport à la ligne d'excitation) figure MM-5 B.

Il fournit généralement des informations sur la granularité et la complexité des cellules. Les cellules à faible granularité et complexité produiront moins de lumière à diffusion latérale, tandis que les cellules hautement granulaires avec un degré élevé de complexité interne (comme les neutrophiles) entraîneront un signal de diffusion latéral plus élevé. Ainsi, en utilisant la détection de lumière à diffusion directe et à diffusion latérale, les populations cellulaires peuvent souvent être distinguées en fonction de leur taille et de leur granularité.

Matériels et méthodes

En plus du FSC et du SSC, les cellules peuvent également être séparées en fonction de l’epessio d’ue potie spifiue. Das e as, u fluoophoe est haituelleet utilisé pour marquer la protéine d'intérêt. Les fluorophores utilisés pour la détection des protéines cibles émettent de la lumière après excitation par un laser de longueur d'onde compatible figure MM-5 C.

À mesure que la cellule fluorescente traverse le point d'interrogation et interagit avec le faisceau laser, elle crée une impulsion d'émission de photons dans le temps (un pic). Ceux-ci sont détectés par les PMT et convertis par le système électronique en une impulsion de tension, généralement appelée «événement». La hauteur et la surface totale des impulsions sont mesurées par le cytomètre de flux, et la zone d'impulsion de tension sera corrélée directement à l'intensité de fluorescence pour cet événement individuel.

Il est important de noter que les signaux de fluorescence peuvent également se produire à partir de substances naturellement fluorescentes dans la cellule telles que les nucléotides de pyridine (NAD (P) H) et les flavines oxydées (FAD). Cette auto-fluorescence est généralement plus intense dans les cellules plus grandes et granulaires. Le niveau d'auto-fluorescence peut être déterminé et exclu à l'aide de cellules non marquées. Il est aussi ipotat d’utilise u anticorps contrôle isotypique (un témoin négatif qui révèle la quantité de bruit de fond qui peut être le résultat de fixations non spécifiques de l'anticorps) approprié qui permet d’idetifie ae etitude l'esele des does posities.

Les filtres :

Dans le cytomètre de flux, tous ces différents signaux lumineux sont divisés en longueurs d'onde définies et canalisées par un ensemble de filtres et de miroirs de sorte que chaque capteur détecte la fluorescence uniquement à une longueur d'onde spécifique. Ces capteurs sont appelés tubes photomultiplicateurs (PMTs pour photomultiplying tubes). Chaque PMT détectera également tout autre fluorophore émettant à une longueur d'onde similaire au fluorophore qu'il détecte.

Matériels et méthodes

2.2.2 Protocole expérimental:

Après enrichissement par tri magnétique positif et multiplication cellulaire in vitro, les cellules W8B2+ sot ppaes pou te ties pa le sste de totie e flu afi d’otei ue population pure de CSCs W8B2+. Pou ela, les ellules sot tout d’aod ies au PB“ X, puis oltes pa digestio ezatiue à l’Aua® “iga-Aldrich). Les cellules sont ensuite centrifugées (8 min à 300 g). Après élimination du surnageant, le culot est repris dans du tampon (PBS+ BSA 0,5% + EDTA 2mM) et réparti dans 3 tubes de Polystyrène® (greiner bio- one) selon les quantités suivantes : 100000 cellules non marquées, 100000 cellules marquées ae l’atiops isotpiue o eleat, et le este des ellules ae l’atiops ati-W8B2. Chaque tube est centrifugé (10 min à 300g) à 8°C et les culots sont resuspendus dans du tapo ae l’atiops isotypique non relevant au 1/11ème couplé à la phycoérythrine Miltei Biote pou le otôle isotpe ou l’atiops ati-W8B2 (MSCA-1) au 1/11ème couplé à la phycoérythrine (Miltenyi Biotec) pour marquer les CSCs W8B2+, pendant 10 min, à l’osuit, entre 2 et 8°C. Après le marquage, les cellules sont lavées avec du tampon puis centrifugées (10 min à 300g) à 8°C. Les cellules sont ensuite resuspendues dans du tampon et triées avec le cytomètre de flux (BD FACS Aria III) en utilisant les cellules non marquées ainsi ue les ellules iues ae l’atiops isotpiue pou pode au glages de l’appaeil et régler le bruit de fond de la fluorescence émise par la phycoérythrine. Les CSCs W8B2+ sont ainsi récupérées séparément dans un tube de Polypropylène (Sarstedt) préalablement recouvert de milieu de croissance. Enfin, les cellules W8B2+ pures récupérées sont centrifugées (10 min à 300g) puis resuspendues dans du milieu de croissance à une densité de 50% (passage 2). Suite au tri, les données sont analysées par utilisation du cytomètre de flux BD FasVese afi d’estie la puet de la populatio de C“Cs WB+ récupérées.

II- Immunophénotypage des CSCs W8B2+ Les marqueurs de surface cellulaire des CSCs W8B2+ triées ont été analysés par cytométrie en flux. Les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans du tampon (PBS+ BSA 0,5% + EDTA 2mM) contenant les anticorps humains listés dans le tableau MM-1.

Tableau MM-1: Liste des atiops utiliss pou l’iuophotpage pa totie e flu.

Matériels et méthodes

Anticorps Espèce Dilution Fournisseur IgG1 CD117-APC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a CD45-VioBlue souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 CD133/1-VioBright FITC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 CD105-PE souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a CD34-PerCP-Vio700 souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 CD90-PE-Vio770 souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1 (S) CD106-FITC Rec Human 1/11e Miltenyi Biotec IgGκ CD-PE-Vio770 souris 1/11e Miltenyi Biotec Mouse IgG1 CD73-APC souris 1/11e Miltenyi Biotec

Anticorps isotypique Espèce Dilution Fournisseur IgG1-APC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a-VioBlue souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1-VioBright FITC souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG1-PE souris 1/11e Miltenyi Biotec IgG2a-PerCP-Vio700 souris 1/11e Miltenyi Biotec REA Control (S)-FITC / 1/11e Miltenyi Biotec IgG1-PE-Vio770 souris 1/11e Miltenyi Biotec

Les cellules ont été incubées à 4 °C dans l'obscurité pendant 10 min, puis lavées avec du PBS, et remises en suspension pour analyse par cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules positives a été analysé avec le cytomètre Aria Flow FACS en se basant sur plus de 2x104 événements. Pour chaque anticorps testé, un anticorps isotypique est utilisé (tableau MM-1). Coe il s’agit d’u auage ultiple ellules aues ae plusieus atiops ojugus à des fluorochromes différents), une analyse de compensation de fluorescence par cytométrie en flux a été réalisée grâce aux deux kits suivants: anti-mouse Igk MACS Comp Bead Kit (Miltenyi Biotec) et anti-REA MACS Comp Bead Kit (Miltenyi Biotec).

III- Conditions de culture et entretien des CSCs W8B2+ Une fois triées, les CSCs W8B2+ sont centrifugées et ensuite ensemencées au ½ dans des flasques de culture à bouchon ventilé de 25 ou 75 cm2 (en fonction du nombre de cellules récupérées après tri par FACS) dans du milieu de croissance dans un incubateur à 37°C et 5%

CO2. Les repiquages cellulaires se font quand les CSCs W8B2+ sont à 80 % de confluence et l’eseeeet ellulaie se fait au ¼ aiu das des flasues de ultue à ouho etil. Aps aspiatio de l’aie ilieu de ultue, les ellules sont lavées au PBS puis iues i ae l’Aua® “iga-Aldrich) à 37°C pour les détacher de leur support.

Matériels et méthodes

Après ajout du milieu DMEM (voir composition en annexe) supplémenté avec 10% de SVF, la suspension cellulaire est centrifugée (300 g pendant 5 min). Une fois le surnageant aspiré, le culot cellulaire est repris dans du milieu de croissance et homogénéisé par pipetage/refoulement et enfin ensemencé dans des flasques. Les changements de milieu se font 2 à 3 fois par semaine en fonction de la couleur du milieu de culture. Le nombre de passages maximal pour les expériences est de 9, mais les CSCs W8B2+ continuent à proliférer de manière normale même après 9 passages en culture.

IV- Congélation/décongélation des CSCs W8B2+ Les CSCs W8B2+ peuvent être congelées à faibles passages à une concentration de 1 million de cellules/ml. Pour cela, les cellules sont passées et le culot est repris dans du milieu de croissance contenant 10% de DMSO. La suspension cellulaire (1 ml) est rapidement transférée dans des cryotubes qui sont ensuite placés à -80°C dans une boite de congélation progressive. heues aps, les otues sot tasfs pou te oses das l’azote liuide. Pou la doglatio, les otues sot sotis de l’azote liuide et plas dans le bain marie à 37°C 30 sec. Le contenu du cryotube est repris avec du milieu de croissance et centrifugé (300 g pendant 5 min). Après aspiration du surnageant, le culot cellulaire est repris dans un volume adéquat de milieu de croissance dans des flasques de culture qui seront placées dans un iuateu. Le ledeai, le ilieu est hag afi d’liie toute tae de DM“O.

V- Test de formation de colonies (CFU-Fs).

1 Principe : Le test de formation de colonies (CFU-Fs dote la apait d’auto-renouvellement des cellules souches en les ensemençant à très faible densité pendant plusieurs jours.

2 Protocole expérimental: Pour réaliser le test de formation de colonie CFU-Fs (colony-forming unit-fibroblasts), les CSCs W8B2+ ont été ensemencées à une densité de 5 cellules/cm² dans une plaque 6 puits (soit 50 cellules/puit), dans du milieu de croissance. Le milieu de croissance est renouvelé tous les 3-4 jours. Après 10 jours de culture, les cellules ont été rincées au PBS, fixées pendant 10 min avec du paraformaldehyde 4% et enfin colorées avec du Crystal violet à 0,5% pendant 30 min (Sigma-Aldih. Le tapis ellulaie est esuite i à l’eau ouate, et sh à l’ai lie, à température ambiante.

Matériels et méthodes

L’effiait de foatio de oloie a t estie e alulat le appot du oe de colonies sur le nombre de cellules ensemencées et est exprimée en pourcentage.

VI- Test de prolifération par comptage cellulaire

1 Principe :

En comptant le nombre de cellules à différents jours après culture, ce test nous permet de uatifie et de opae l’olutio du oe ellules à haue diisio ellulaie pa rapport à la condition contrôle.

2 Protocole expérimental: Les cellules sont ensemencées à une densité de 133 cellules / cm2 dans des boites de Pétri de 35 mm de diamètre et synchronisées avec le milieu de croissance sans SVF pendant 12 h. Le lendemain le milieu est remplacé par du milieu de croissance (contenant 10 % de SVF) et les drogues paillie ou “P sot ajoutes. Aps h jou d’iuatio ae les dogues, les ellules sot ies au PB“, upes pa digestio ezatiue à l’Aua et epises dans le milieu DMEM supplémenté avec 10% de SVF et comptées pour chaque jour de culture (de j 1 à j 9) et pour chaque condition (condition contrôle et condition avec le traitement) en utilisant la chambre cellulaire de Malassez et le bleu de Trypan pour éliminer les cellules mortes. Ce comptage est répété durant toute la période de taiteet allat jusu’à jous. Pour chaque condition, trois comptages différents sont réalisés. Les drogues et le milieu de croissance sont renouvelés tous les 2 jours.

VII- Test de blessure (wound healing assay)

1 Principe : Ce test est as su la alisatio d’ue giffue au oe d'u ojet pointu (avec une pointe de pipette) sur une monocouche de cellules confluentes. Les cellules entourant la zone de lésion (cicatrice ou « wound ») vont se déplacer de façon à recoloniser et couvrir (« healing ») cet espace. La capacité et la vitesse des cellules à recoloniser la zone de blessure peuvent être étudiées en présence de différents traitements pour évaluer leurs effets sur le processus migratoire des cellules.

Matériels et méthodes

2 Protocole expérimental : La igatio ellulaie a t tudie e utilisat le test de lessue pou egade l’effet des drogues (paxilline et S1P) sur les capacités migratoires des CSC W8B2+. Pour cela, les CSC W8B2+ sont ensemencées à une densité de 2x104 cellules/cm2 dans des plaques 6 puits avec le milieu de croissance contenant 10 % de SVF. Après 6h, le milieu est remplacé par du milieu de croissance contenant 0 % de SVF et les cellules sont incubées pendant 16h. Ensuite, une blessure est réalisée au centre du puits de la plaue à l’aide d’une pointe de cône plastique stile de μL. Les fagets de ellules dtahes sot liis pa içages dou au PBS. Les cellules sont incubées à 37 °C avec le milieu contenant 0% de SVF avec la drogue correspondante (paxilline ou S1P) pendant 7 h. Les cellules sont ensuite fixées et les noyaux sont marqués avec le colorant DAPI. Des images cellulaires en transmission ont été prises juste après la plaie (temps 0h) et après 7h de traitement avec la drogue. Les images ont été ges à l’aide d’u iosope ofoale à disque rotatif (Revolution, Andor) équipé d'un système motorisé XY (Marzhauser) et d'un logiciel IQ3 (Revolution, Andor) de haute précision permettant de mémoriser les positions de chaque échantillon. Le nombre de cellules qui ont ig das la zoe de lessue est uatifi à l’aide du logiiel IageJ NIH, U“A e comparant les images prises au temps 0h à celles prises au temps 7h.

VIII- Test de viabilité cellulaire

1 Principe : Le test de viailit epose su l’utilisatio de oloats fluoesets ui peettet de dtete et de discriminer les cellules mortes. Ces colorants réagissent avec les groupements des amines primaires des protéines de surface et intracellulaires. Contrairement aux cellules viables, les cellules mortes présentent une membrane cellulaire désintégrée permettant à ces colorants fluorescents de marquer les protéines intra-cellulaires. Il en résulte une fluorescence 50 fois plus lumineuse. La discrimination entre les cellules mortes et les cellules vivantes sera estimée en cytomètrie de flux.

Matériels et méthodes

2 Protocole expérimental: Aat de upe les ellules adhetes pa taiteet à l’Aua, l’aie ilieu de culture est récupéré car ce dernier peut renfermer des cellules mortes. Après centrifugation i à g, le ulot ellulaie est epis das µl de PB“ et µl du oloat Vioilit™ Fiale De Miltei Biote et iu pedat iutes à l’osuit et à tepatue ambiante. Après un rinçage avec le tampon (PBS+ BSA 0,5% + EDTA 2mM), les cellules sont centrifugées (10 min à 300g) et ensuite analysées par cytométrie de flux à l'aide du cytomètre de flux FACS VERSE. Pour déterminer le pourcentage de cellules mortes, un contrôle positif est utilisé (cellules chauffées pendant 10 minutes à 95°C).

IX- Aalse du le ellulaie ave l’iodue de popidiu

1 Principe : L’iodue de popidiu IP est u aget itealat ui peut te utilis e iologie olulaie comme marqueur des acides nucléiques (ADN et ARN). L’IP est ue olule fluoesete ui e s’itgat à l’ADN aps taiteet à l’ARNase pou dgade les ARNs peet de aue les oau des ellules. E utilisat la totie e flu, le auage à l’IP peet d’tudie le le ellulaie.

2 Protocole expérimental : En pratique, les cellules sont ensemencées à une densité de 5 x 102 cellules / cm2 dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre et synchronisées avec le milieu de croissance sans SVF pendant 12 h. Le lendemain le milieu est remplacé par du milieu de croissance (contenant 10 % de SVF) et les drogues (paxilline ou S1P) sont ajoutées. Pour chaque jour de culture (j 6 à j 8 pour les cellules traitées avec la S1P et j 5 à j 6 pour les cellules traitées avec la paxilline) et pour chaque condition, le pourcentage des différentes phases du cycle cellulaire (G1, S et G2) est déterminé. Pour cela, les cellules sont lavées avec du PBS, récupérées par digestion ezatiue à l’Aua et etifuges i à g. Ue fois le suageat aspi, le culot cellulaire est lavé avec du PBS et centrifugée (5 min à 300 g). Après centrifugation, les ellules sot fies ae de l’thaol % pedat i à °C e epeat le ulot ae µl de PB“ et e ajoutat µl d’thaol % foid goutte à goutte tout en agitant). Après fixation, les cellules sont centrifugées (5 min à 500g) et ensuite reprises dans la solution de marquage (constituée de : iodure de propidium à 5 µg/ml (Sigma-Aldrich) + 0,1% de triton

Matériels et méthodes

(Sigma-Aldrich) + RNase A (Sigma-Aldrich) à 50 µg/ml + QSP PBS) et incubées 1h30 à tepatue aiate à l’ai de la luie. Aps iuatio, les ellules sot filtes ae des tubes de cytométrie à filtre (BD Falcon) et passées dans le cytomètre de flux (FACS VERSE, BD pou l’aalse. Les données acquises par le cytomètre sont ensuite traitées à l'aide du logiciel FLOWJO (Flowjo LLC) afin de déterminer le pourcentage des phases du cycle cellulaire.

X- Immunocytochimie indirecte

1 Principe : La technique d'immunocytochimie permet de localiser des antigènes dans des cellules ou organites grâce à l'utilisation d'anticorps spécifiques dirigés contre l'antigène d'intérêt à détecter. Cette réaction est visualisée par des marqueurs qui sont des molécules fluoesetes. O pale d’iuodtection indirecte quand on utilise un anticorps secondaire (fabriqué chez l'espèce B) couplé au marqueur dirigé contre l'anticorps primaire (fabriqué chez l'espèce A).

2 Protocole expérimental : Les CSCs W8B2+ sont ensemencées à raison de 2x104 cellules/cm² dans des plaques de 24 puits, sur lamelles de verre recouvertes de gélatine à 0,1% et de fibronectine 10µg/mL. Le jour suiat l’eseeeet, les C“Cs WB+ (non différenciées), ou après 28 jours de différenciation sont rincées dans du PBS puis fixées dans du PFA 4% pendant 10 min. Les cellules sont à nouveau rincées 3 fois pendant 5 min dans du PBS. Les sites de fixation non spécifiques sont saturés et les membranes cellulaires perméabilisées par du PBS 1X - BSA 0,5% - Triton 0,1% pendant 1h. Après 3 rinçages au PBS, les cellules sont incubées pendant une nuit à 4°C sous agitation lente avec les anticorps primaires (tableau MM-2) dilués dans du PBS – BSA 0,5%. Après 3 rinçages au PBS de 15 min sous agitation, les cellules sont incubées pendant 2h avec les anticorps secondaires (tableau MM-2) dilués dans du PBS – BSA 0,5% et les noyaux sont marqués dans la même solution avec le TOPRO® 1/1000e (LifeTechnologies). Enfin, les lamelles sont montées sur lame dans du Mowiol® (Sigma-Aldrich) et observées par iosopie ofoale à l’aide d’u iosope ies FV Olpus IX, Toko, Japo. L’auisitio et l’aalse des iages sot alises à l’aide du logiiel Fluoie Olpus.

Matériels et méthodes

Tableau MM-2 : Liste des atiops utiliss pou l’iuotohiie idiete.

Anticorps primaire Espèce Dilution Fournisseur Monoclonal anti-GATA4 souris 1/250e Santa Cruz Biotech Monoclonal anti-MEF2C souris 1/100e abcam Polyclonal anti-NKX2.5 chèvre 1/250e R&D Systems Monoclonal anti-Cnx43 souris 1/500e BD Transduction Labolatories Polyclonal anti-TNNT2 lapin 1/400e Abcam Monoclonal anti-α-actinine souris 1/200e Abcam Monoclonal anti-β-MHC souris 1/500e Abcam

Anticorps secondaire Espèce Dilution Fournisseur Alexa Fluor 488 anti-lapin poulet 1/250e Invitrogen Alexa Fluor 555 anti-souris chèvre 1/250e Invitrogen Alexa Fluor 555 anti-chèvre singe 1/250e Invitrogen

XI- Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

1 Principe : Ce test de diffeiatio epose su l’utilisatio d’agets hiiues oe iduteus de la différenciation cardiaque sur des cellules cultivées en monocouche pendant 4 semaines.

2 Protocole expérimental : Pour induire une différenciation cardiaque in vitro, les CSCs W8B2+ ont été différenciées selon le protocole schématisé dans la figure MM-6. Ce potoole de diffeiatio due jous et epose essetielleet su l’utilisatio d’agets chimiques (5-azatidie, deathasoe, phlutate et l’aide tioïue pour induire une différenciation cardiaque. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2x104 cellules/cm² dans des puits recouverts de fibronectine 10µg/mL (Sigma-Aldrich) et gélatine 0,1% (Sigma-Aldrich), dans le ilieu de oissae. Aps ue uit d’iuatio, les ellules sot taites ae µM de - azacytidine (Sigma-Aldrich) dans le milieu de croissance pendant 24h. Les cellules sont ensuite cultivées dans le milieu de différenciation (constitué du milieu IMDM Loza supplet ae M de deathasoe, µM de phlutate et µM d’aide rétinoïque). Le milieu de différenciation est renouvelé tous les 2 jours.

Matériels et méthodes

Figure MM-6 : Schéma simplifié du protocole de différenciation cardiaque in vitro utilisé pour différencier les CSCs W8B2+.

XII- Imagerie calcique

1 Principe : Pou osee l’olutio de l’atiit aliue spotae au ous de la diffeiatio des CSCs W8B2+ in vitro, la GCaMP a été utilisée comme sonde calcique. La GCaMP est constituée d’ue GFP, d’ue alodulie CaM ui est ue potie liat le aliu et u peptide synthétique appelé M13. E l’asee de aliu, la GFP fluoese à u tau faile. E présence du calcium, le domaie CaM s’eoule autou du peptide M poouat u hageet ofoatioel aopag d’ue fote fluoesee de la GFP figure MM-7).

Figure MM-7 : “ha du Maise d’atio de la GCaMP. E l’asee de aliu, la GFP permutée est faiblement fluorescente (GCaMP inactive, à gauche). En liant le calcium, le domaine CaM s’eoule autou du peptide M et pooue u hageet ofoatioel de la potie qui restaure la fluorescence de la GFP (GCaMP active, à droite). cpEGFP : enhanced green fluorescent protein (EGFP) modifiée par permutation circulaire (cp) , CaM : calmoduline et M13 : un peptide synthétique (identique au domaine de liaison à la CaM de la kinase de la chaîne légère de la myosine).

Matériels et méthodes

A l’aide de la iosopie ofocale, la GCaMP est excitée à 488 nm à une fréquence donnée et l’issio de fluoesee est ollete. Cette fluoesee eflte do l’atiit aliue enregistrée.

2 Protocole expérimental : En pratique, les CSCs W8B2+ sont ensemencées à une densité de 2x104 cellules/cm² dans des boites de Pétri de 35 mm fond verre sur un manteau de fibronectine (10µg/mL) et de gélatine (0,1%) dans le milieu de croissance. Le lendemain, les cellules sont infectées avec la sonde calcique GCaMP (AAV2/1 CAG-Gcamp6s, Canadian Neurophotonics Platform) pendant 12h, à 4.109 particules virales/mL, dans le milieu de croissance. Après avoir été infectées avec la GCaMP, les cellules sont cultivées selon le protocole de différenciation déjà décrit. Au cours de la différenciation (de j à j , l’atiit aliue spotae ui se taduit pa des variations de la fluoesee ise pa la GCaMP eite à est eegiste à l’aide d’u iosope ofoal à disue otatif Olympus IX81-ZDC, Andor) uip d’u sste d’iuatio otôl e tepatue °C et e CO2 (5%). Les enregistrements calciques sot aliss au gossisseet pedat i à ue fuee d’ue iage/seode. Coeat l’tude phaaologiue, u sste de pefusion (fabriqué au laboratoire) peet l’itodutio des agets phaaologiues et ei pedat l’eegisteet. La durée des enregistrements est comprise entre 20 et 30 min à une fuee d’ue image/seconde. Les enregistrements calciques bruts sont ensuite aalss à l’aide d’ue « macro » appliquée sous Image J qui permet de quantifier les variations de fluorescence globales dans chaque cellule étudiée (figure MM-8). Concernant les graphes epsetat l’atiit aliue sous foe d’osillatios, les sultats de aiatio de fluoesee sot oaliss e appliuat la foule ΔF/F. Ae ΔF ui epsete la aiatio de l’itesit de fluoesee IF à l’istat t pa appot à ue valeur basale de fluorescence (F0) obenue en moyennant les 10 valeurs de fluorescence les plus basses.

�� à � − �� é ΔF/F = �� é

Matériels et méthodes

Figure MM-8 : Eeple d’iage de fluoesee oteue los des osillatios aliues aps traitement avec le logiciel Image J. La zone rouge délimitée en jaune correspond à la fluorescence gloale au sei d’ue seule ellule. Cette iage est issue de C“Cs WB+ aps jous de différenciation cardiaque in vitro. Bae d’helle = µ.

L’aalse des paates des osillatios aliues fuee, amplitude, durée, aire, TTP, TTR, pouetage du teps d’atiit, pete et pete , a t oteue à l’aide d’u pogae delopp au laoatoie à pati du logiiel IDL. L’aplitude U.A oespod au rapport F/F0, la fréquence (pic/min) correspod au oe d’osillatios aliues oteues en 10 min, la durée (s) mesurée à mi-hauteu de la oue, l’aie sous la oue U.A.s, le TTP (s) ou « time to peak » correspond au temps nécessaire pour passer de la fluorescence de base F0 au maximum de la fluorescence F, le TTR (s) ou « time to recovery » correspond au temps nécessaire pour passer de la fluorescence maximale F à la fluorescence de base F0, la pente 1 (s) et la pente 2 (s). Figure MM-9

Matériels et méthodes

Figure MM-9 : Ta d’ue osillatio aliue oteue au ème jour de différenciation montrant les différents paramètres calculés avec le logiciel IDL.

XIII- RT-PCR « Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction »

1 Principe : La RT-PCR est une technique qui permet l’aplifiatio de aie epoetielle d’u faget d’ADN opletaie ADNC d’itt oteu pa to-transcription ou RT. Elle s’effetue pa ue suessio de les theiues opeat hau ue phase de datuatio suiie d’ue phase d’hidatio des aoes puis ue tape d’logatio. La sthse du i opletaie se fait pa ajout de dNTP sous l’atio de la Ta polase.

2 Protocole expérimental : La RT-PCR se fait en 3 grandes étapes ; extraction des ARNs totaux, rétro-transcription (RT) et amplification en chaîne par polymérase (PCR).

Matériels et méthodes

2.1 Extraction des ARNs totaux 2.1.1 Extraction des ARNs totaux à partir des CSCs W8B2+ adhérentes en culture :

Aat de pode à la tasiptio iese RT, ue tape d’etatio des ARNs totaux avec la tehiue d’etatio « Phénol/chloroforme/isothiocyanate de guanidine selon la méthode de Chomczynski et Sacchi ». Pour cela, les CSCs W8B2+ adhérentes en culture sont ies ae du PB“ et le atif RNABle Euoio oteat l’isothioaate de guanidine et le phénol est ajouté. Après 30 secondes, les cellules sont lysées mécaniquement avec un grattoir à cellules (Costar®). Le lysat cellulaire est ensuite transféré dans un microtube exempt de ribonucléases de 1,5 ml et le chloroforme est ajouté. Après homogénéisation par vortex, une étape de centrifugation à 14000 rpm pendant 15 min à 4° est nécessaire pour séparer l’esele du lsat e tois phases ue phase aueuse, ue itephase et ue phase organique). Un volume de la phase aqueuse est récupéré et incubé toute la nuit à 4°C avec un olue idetiue d’isopopaol pou pipite les ARNs. Le ledeai, la solutio est centrifugée pendant 15 min à 14 p à °C et l’isopopaol est eti. Le ulot oteat les ARNs est la ae de l’thaol 70% pour éliminer les sels et de nouveau centrifugé pendant 15 min à 14 p à °C. Aps aoi eti l’thaol, le ulot d’ARNs est sh à °C à l’aide d’u ai à se. Efi, les ARNs totau sot suspedus das de l’eau dsioise exempte de ribonucléases et chauffés 5 min à 65°C. La concentration en ARN de chaque échantillon est mesurée en ng/ml par spectrophotométrie en utilisant le NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc, USA).

2.1.2 Extraction des ARNs totaux à partir des EODHs :

Les EODHs fraichement récoltés sont rincés 3 fois avec du PBS, dégraissés et ensuite coupés manuellement avec des ciseaux stériles en petits fragments de 1–2 mm3. Ces fragments sont transférés dans des tubes de 4,5 ml à fond rond (Greiner Bio-One) contenant du réactif RNABle Euoio. Les fagets sot esuite os Polto PTE, Fishe “ietifi jusu’à otetio d’u oat hooge.

Le reste du protocole expérimental est le même que pour les cellules adhérentes en culture à l’eeptio de l’tape de pipitatio des ARNs totau ui se fait à tepatue aiate pendant 15 min.

Matériels et méthodes

2.2 Rétro-transcription ou RT (Reverse Transcription): Les ARNs totaux précédemment extraits sont rétrotranscrits en ADN complémentaire (ADNc) en utilisant les heaes ulotidiues alatoies ui se fiet alatoieet su l’ARN afi d’aoe la sthse du i d’ADN et l’eze la tasiptase iese M-MLV) qui atalse la atio de sthse de l’ADN e utilisat l’ARN oe atie. Après dissolution des ARNs totau, μL de pi sot ajouts au μL d’ARNs totau µg). Le prémix (ou mélange réactionnel) est constitué de : 5 µl de tampon 5X (composé de 100 mM Tris–HCl pH 8.3, 150 mM KCl, 6.25 mM MgCl2, Invitrogen), 2,5 µl de DTT (20 mM, Invitrogen), 1 µl de dNTPs (2 mM, Iitoge et , µl de Rado Pie PdN . μg , Iitoge et µl d’eau. Aps iuatio des ARNs à °C pedat i, µl de d’ihiiteu de RNAse U, RNaseOUT-Invitrogen) et 2 µl de transcriptase inverse M-MLV (400 U, Invitrogen) sont ajoutés pou aoi u olue fial de μL. L'ADNc est synthétisé à 37°C pendant 1 heure puis 25 µL d'eau stérile sont ajoutés. Les enzymes restantes ont été désactivées par la chaleur (100°C, 2 min). Les ADNc peuvent être conservés à -20°C.

2.3 Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) Aps la podue de RT, , µl d’ADN ≈ g sot ajouts aux 22,5 µl de mélange réactionnel de PCR. Ce mélange est composé de 2,5 µl de tampon 10X (composé de : 250 mM de Tris-HCl pH8.4, 62,5 mM KCl, Invitrogen), 1 µl de MgCl2 (2,5 mM, Invitrogen), 0,25 µl de dNTPs (277, µM, Iitoge, µl d’aoes ses et ati-sens (12 pM, Invitrogen), 0,25 µl de Taq polymérase (1, U, Iitoge et , µl d’eau. De l’huile ioise µl est ajoutée dans haue tue pou ite l’apoatio à haute tepatue.

La réaction de PCR est effectuée avec un thermocycleur (dénaturation à 95 ° C pendant 5 minutes, suivie de 38 cycles à 57°C pendant 30 s, 72°C pendant 30 s et 95°C Pendant 30 s. Après le dernier cycle, les échantillons sont incubés à 57°C pendant 2 min et à 72°C pendant 10 minutes pour assurer une extension complète du produit. Toutes les amorces sont décrites dans le tableau MM-3. La GAPDH est utilisée comme gène de ménage. Les produits amplifiés sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% (contenant 0,01% de bromure d'éthidium) dans du tampon Tris-Acétate-EDTA et visualisés en utilisant un Transilluminateur UV.

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Matériels et méthodes

Tableau MM-3 : Liste des amorces sens et anti-sens utilisées pour la PCR. Gène Amorce sens Amorce anti-sens GAPDH AAGGTCATCCCTGAGCTGAA TGACAAAGTGGTCGTTGAGG MEF2C AAGAAGGAGATTTGTTTGGAGG CTTTGTAAATGTCACCTGTCTG GATA4 CCCAATCTCGATATGTTTGAC CGTTCATCTTGTGGTAGAGG TNNT2 CTGCTGTTCTGAGGGAGAGC CACCAAGTTGGGATGAACG ACTC1 CCTTCATTGGTATGGAATCTG AATCTTCATGGTGCTTAGGAG β-MHC GAGCTACGGGTTCCCCTCT GGAAGCTCTGCTACCCCTTTT NKX2.5 AAAGAAAGGGTGTGAACTGC CGCACAGTAATGGTAAGGGA KCa1.1 CCTGCAGCGAAGTATCATCA ACTCGAAGTGAAGCTGCCAT Connexin43 GGGCGTTAAGGATCGGGTTAAGG GTTGGTGAGGAGCAGCCATTGAA KCa3.1 GCCTCAGAGCAAAAGTCCCA AGGTAGAGCGCCCACGAG KCa2.1 GAAGTTCCTCCAAGCTATCCA TCTTTCCGTTCCCTGGTCT

KV4.2 ACATGCAGAGCAAACGGAA GGACTGTGACTTGAAGGACGA

KV4.3 GCCTCCGAACTAGGCTTTCT CCCTGCGTTTATCAGCTCTC Kir2.1 ACTTCCACTCCATGTCCC CTTTACTCTTCCCGTTCC S1PR1 var 1 GACTCGAGCTGCGGTTTCC TCCTTGTCCGCGCTGATATT S1PR1 var 2 GAGCGAGGCTGCGGTT CCGCGCTGATATTCAGCTTT S1PR2 CGGCCTAGCCAGTTCTGAAA AATGGCGCAACAGAGGATGA S1PR3 GGCCGCTGGAAAAGTTTAGTC GTTGAAAAAGGGCTCCTCCGT S1PR4 TTGCAGTCTTGCGTGTGGAT GACCATGGGAAGCCCATTTG S1PR5 var 1 GGAGCAGCGGGAACCTATCT CCCCAAGGCTGTGAACTGA S1PR5 var 2 AGGGCGCAGACCTTGG GCCCCGACAGTAGGATGTTG TRPM4 TTGGCATACTGGGAGACGCA GGCCCAAGATCGTCATCGT TRPM7 TCACAGAACTTCCATTCCTGTTCA CTGTGACAGGCTCCCCTCTT

XIV- RT-qPCR « Reverse Transcription- quantitative Polymerase Chain Reaction » en SybrGreen

1 Principe : Cette tehologie est ase su la dtetio et la uatifiatio d’u epote fluoeset le « Sybr Green » dot l’issio est dieteet popotioelle à la uatit d’aplios gs pendant la réaction de PCR. Le « Sybr Green » est un intercalant de l’ADN.

2 Protocole expérimental : La RT-qPCR comme la RT-PCR, s’effetue e gades tapes : extraction des ARNs totaux, reverse transcription (RT) et amplification par PCR quantitative (qPCR ou real-time PCR). -Les potooles d’etatio d’ARNs totau et de RT sont les mêmes que pour la RT-PCR.

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Matériels et méthodes

2.1 qPCR avec la technologie SybrGreen Après la procédure de RT, la qPCR (avec la technologie SybrGreen) est réalisée sur plaque de 96 puits, avec les amorces sens et anti-sens de chaque gène étudié (tableau MM-3). Le volume final du mélange réactionnel est de 15 µl par puits, oteat µl de Mi et µl d’ADN g fial/puits. Le Mi otiet , µl de ouple d’aoes ses et ati-sens) à 900 nM, 7,5 µl de réactif Power SYBR® Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) et 1, µl d’eau. Le Power SYBR® Green PCR Master Mix contient la Taq Gold® DNA Polymerase (enzyme de la réaction), les dNTPs et les sels nécessaires pour la réaction. Chaque échantillon a été polis e tiple afi d’estie au ieu le le seuil le theshold d’appaitio de la fluoesee. L’eau est hoisie oe otôle gatif. La atio d’aplifiatio oee pa ue datuatio iitiale de l’ADN pedat i à °C, peettat l’atiatio de l’ADN polase, et est suiie de les suessifs oposs d’ue tape de datuatio pedat se à °C, puis d’ue tape d’hidatio des aoes et d’logatio pedat 1 min à 60°C. La quantification de produits amplifiés à chaque cycle se fait par détection de fluoesee gâe à l’appaeil Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems USA).

2.2 RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (TaqMan Low Density Custom Array) 2.2.1 Principe:

La technologie TLDA (ou TaqMan Low Density Array) est une qPCR à haut rendement car elle permet de déterminer rapidement le profil d'expression d'un grand nombre de gènes et sur plusieus hatillos tout e utilisat ue faile uatit d’ADN. Cotaieet à la PCR en plaque 96 puits, la TLDA est réalisée sur cartes micro-fluidiques composées de 384 puits. Le piipe de la TLDA epose su l’utilisatio de sodes fluoesetes « sondes TaqMan ». Comme pour la qPCR en « SybrGreen », le signal fluorescent résultant permet une mesure quantitative de l'accumulation exponentielle du produit au cours des différents cycles de PCR.

2.2.2 Extraction des ARNs totaux

L’etatio des ARNs totau à pati des C“Cs WB+ et des CSCs W8B2+ différenciées est alise ae u Kit d’etatio d’ARN Nuleo“pi® Mahee-Nagel). Les cellules sont collectées après trypsinisation et centrifugation (8 min à 300 g) et lysées avec le tampon RA1 et le β-mercaptoethanol. Le lysat est ensuite filtré avec des colonnes (NucleoSpin® Filter) et

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Matériels et méthodes

etifugs i à g. Aps filtatio, l’thaol % est ajout au lsat et e deie est déposé sur des colonnes (NucleoSpin® RNA Column). Le lysat est ensuite centrifugé (30 s à 11000 g). Après ajout du MDB (Membrane Desalting Buffer), le lysat est centrifugé (1 min à g pou liie les sels. L’ADN est esuite dig ae ue solutio dite de « digestion » (DNase reaction mixture) pendant 15 min à température ambiante. Les ARNs sont ensuite rincés avec les tampons RAW2 et RA3 (1er rinçage avec le tampon RAW2 et le 2ème et 3ème içage ae le tapo RA. Efi, les ARNs sot lus das µl d’eau RNase-free water) et centrifugés (1 min à 11000 g). La concentration en ARN de chaque échantillon est mesurée en ng/ml par spectrophotométrie en utilisant le NanoDrop Spectrophotometer ND- 1000 (NanoDrop Technologies Inc, USA). Les ARNs sont gardés à -8°C jusu’à la pohaie étape.

2.2.3 Transcription inverse ou RT (Reverse Transcription): Les ARNs totaux précédemment extraits sont rétrotranscrits en ADN complémentaires (ADNc) en utilisant un Kit de transcription inverse (Super Script IV VILO, Invitrogen). Pour cela, 16 µl d’ARNs totau oteat µg d’ARNs totau oplts ae de l’eau sot ajouts aux 4 µl de superscript IV VILO Master mix du kit (contenant tout ce qui est nécessaire pour la réaction de RT). Après centrifugation rapide, le mélange est incubé 10 min à 25°C puis 20 min à 50°C et enfin 5 min à 85°C. Après une rapide centrifugation, les ADNc obtenus sont conservés à -20 °C.

2.2.4 qPCR avec la technologie TaqMan

Cette expérimentation a été réalisée en collaboration avec le Docteur Nathalie Gaborit de l'institut du thorax, équipe INSERM UMR 1087 / CNRS UMR 6291 à Nantes. Le mélange réactionnel TaqMan® master mix (incluant tous les agents nécessaires pour la réaction de PCR) est ajouté aux 384 puits de la carte (TaqMan® Array Micro Fluidic Card, AB) préchargés ave des sodes d’hdolse fluoescentes TaqMan® et des amorces spécifiques du gène à amplifier. La réaction de PCR est effectuée sur TLDA avec le système de détection de suees ABI Pis HT Applied Biosstes. L’aplifiatio se fait e uaate cycles comprenant trois étapes : une étape de dénaturation de 30 secondes à 97°C et une tape d’hidatio et d’logatio d’ue iute à .°C. Les does sot eueillies à l’aide du logiiel Applied Biosstes “D“ . et aalses ae la thode de uatifiatio relative du cycle seuil (Ct) (Livak & Schmittgen, 2001).

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Matériels et méthodes

Les 96 gènes humains sélectionnés pour leur expression génique (tableau MM-4) codent pour des canaux potassiques, calciques, sodiques et HCN. Mais également pour des protéines ipliues das la sigalisatio et l’hoostasie aliue, des oeies, des fateus de transcription et des protéines structurales cardiaques, des NP (peptide natriurétique) et enfin 4 gènes références pour la normalisation. Nous avons sélectionné le gène RPL13A (Ribosomal Protein L13a) pour la normalisation des données, en tant que gène le plus uniformément distribué. L'expression relative de chaque gène par rapport à RPL13A a été calculée pour haue hatillo ΔCt idiue des does oalises. Le pofil d’epessio de haue gène dans les CSCs W8B2+ est représenté avec la formule : 2-ΔCt vs RPL13A (x104). La variation d'expression de chaque gène dans les CSCs W8B2+ différenciées versus les CSCs W8B2+ non différenciées est représentée par le facteur –ΔΔCt.

Tableau MM-4: Liste des sondes et des 96 gènes analysés par TLDA

Référence de la sonde Nom du gène Nom de la protéine Hs01093761_m1 ABCC8 SUR1 Hs00245832_m1 ABCC9 SUR2 Hs00958036_m1 ATP1A3 Na/K-ATPase a3 Hs00426868_g1 ATP1B1 Na/K-ATPase b1 Hs00544877_m1 ATP2A2 SERCA2 Hs00193090_m1 ATP2A3 SERCA3 Hs00608066_m1 ATP2B4 Ca ATPase4 Hs00167681_m1 CACNA1C Cav1.2 Hs00167753_m1 CACNA1D Cav1.3 Hs00367969_m1 CACNA1G Cav3.1 Hs01103527_m1 CACNA1H Cav3.2 Hs00984856_m1 CACNA2D1 Cava2d1 Hs01021049_m1 CACNA2D2 Cava2d2 Hs01100744_m1 CACNB2 Cavb2 Hs00300085_s1 CALM1 CALM1 Hs00968732_g1 CALM3 CALM3 Hs00154286_m1 CASQ2 CASQ2 Hs00748445_s1 GJA1 Cx43 Hs00270952_m1 GJA5 Cx40 Hs00271416_s1 GJA7 Cx45 Hs00987388_s1 GJD3 Cx30.2 Hs01085412_m1 HCN1 HCN1 Hs00606903_m1 HCN2 HCN2 Hs00380018_m1 HCN3 HCN3

104

Matériels et méthodes

Hs00975492_m1 HCN4 HCN4 Hs00181881_m1 ITPR1 ITPR1 Hs00609908_m1 ITPR3 ITPR3 Hs00270656_s1 KCNA2 Kv1.2 Hs00937357_s1 KCNA4 Kv1.4 Hs00969279_s1 KCNA5 Kv1.5 Hs00361015_m1 KCNA7 Kv1.7 Hs00186308_m1 KCNAB2 Kvb2 Hs01085073_m1 KCNAB3 Kvb3 Hs00270657_m1 KCNB1 Kv2.1 Hs00428198_m1 KCNC4 Kv3.4 Hs01054873_m1 KCND2 Kv4.2 Hs00542597_m1 KCND3 Kv4.3 Hs00264799_s1 KCNE1 MinK Hs01085745_s1 KCNE1L KCNE5 Hs00270822_s1 KCNE2 MIRP1 Hs01921543_s1 KCNE3 MIRP2 Hs01851577_s1 KCNE4 MIRP3 Hs04234270_g1 KCNH2 hERG Hs01552688_g1 KCNIP2 KChIP2 Hs00265026_s1 KCNJ11 Kir6.2 Hs01876357_s1 KCNJ2 Kir2.1 Hs04334861_s1 KCNJ3 Kir3.1 Hs00705379_s1 KCNJ4 Kir2.3 Hs00168476_m1 KCNJ5 Kir3.4 Hs00958961_m1 KCNJ8 Kir6.1 Hs00158428_m1 KCNK1 TWIK1 Hs00605529_m1 KCNK3 TASK1 Hs00186652_m1 KCNK5 TASK2 Hs00923522_m1 KCNQ1 KvLQT1 Hs00383230_g1 NPPA ANP Hs01057466_g1 NPPB BNP Hs01848144_s1 PLN PLN Hs00174223_m1 PPP3CA CAM-PRP Hs00181461_m1 RYR2 RYR2 Hs01045137_m1 SCN10A Nav1.8 Hs03987893_m1 SCN1B Navb1 Hs00394952_m1 SCN2B Navb2 Hs00366913_m1 SCN3A Nav1.3 Hs01024483_m1 SCN3B Navb3 Hs01109480_m1 SCN4A Nav1.4 Hs03681025_m1 SCN4B Navb4 Hs00165693_m1 SCN5A Nav1.5 Hs00161546_m1 SCN7A Nav2.1

105

Matériels et méthodes

Hs00161567_m1 SCN9A Nav1.7 Hs01062258_m1 SLC8A1 NCX1 Hs00153998_m1 ANK2 ANKB Hs99999903_m1 ACTB ACTB Hs04194366_g1 RPL13A RPL13A Hs00231122_m1 GATA3 GATA3 Hs00171403_m1 GATA4 GATA4 Hs00388359_m1 GATA5 GATA5 Hs00232018_m1 GATA6 GATA6 Hs00232622_m1 HEY2 HEY2 Hs01124217_g1 IRX3 IRX3 Hs00212560_m1 IRX4 IRX4 Hs04334749_m1 IRX5 IRX5 Hs00361155_m1 TBX5 TBX5 Hs00195612_m1 TBX3 TBX3 Hs00911929_m1 TBX2 TBX2 Hs00231763_m1 NKX2.5 NKX2-5 Hs00165957_m1 TroponineI, cardiac TNNI3 Hs00943911_m1 TroponineT,cardiac TNNT2 Hs01101425_m1 MYH6 MYH6 Hs01110632_m1 MYH7 MYH7 Hs00188163_m1 RRAD RAD Hs00380556_m1 CLASP2 CLASP2 Hs00380518_m1 GPD1L GPD1L Hs00187842_m1 B2M B2M Hs01085598_g1 MYL7 MLV2A Hs00166405_m1 MYL2 MLC2V Hs99999901_s1 18S 18S

XV- Western blot

1 Principe: Le Weste lot est ue tehiue d’aalse pou ette e idee l’epessio des poties d’itt se touat das u lage potiue. Les poties totales etaites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes selon leur poids moléculaire, puis transférées sur une membrane (électrotransfert ou blot). La protéine d'intérêt est ensuite dtete pa iuodtetio idiete pa u atiops piaie spifiue. L’atiops secondaire est couplé à un groupement enzymatique permettant une révélation par chimie- luminescence.

106

Matériels et méthodes

2 Protocole expérimental: Pour déterminer l'expression protéique de KCa1.1, NCX1 ,NCX3 et S1PR3, les cellules W8B2+ ou le tissu atrial humain ont été lysées dans le tampon de radioimmunoprécipitation (radioimmunoprecipitation assay buffer) contenant en mM: Tris-HCl 50 pH: 8, NaCl 150, EDTA 5, 0,05% d'Igepal, 1% d'acide désoxycholique, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS) et supplémenté avec des inhibiteurs des protéases et des phosphatases (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich - PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail, Roche).

Les lysats cellulaires solubles ont été dénaturés 5 min à 37 ° C dans du tampon de Laemmli 2 x contenant (en mM): Tris-HCl 125 pH 6,8, SDS 4%, glycerol 20%, bleu de bromophénol 0,004%, β-mercaptoéthanol à 10%). Les échantillons protéiques (entre 20 et 80 μg), obtenus à partir de cellules W8B2+ ou du tissu atrial humain, ont été séparés par SDS-PAGE en utilisant des gels de polyacrylamide à 8% et transférés dans des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées 90 min dans une solution de blocage « TBS-Tween » contenant (en mM): Tris 20 pH: 7,6, NaCl 150 et Tween-20 0,2% supplémenté avec 5% de lait écrémé à température ambiante. Les membranes sont ensuite incubées pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires (tableau MM-5) dilués dans du TBST contenant 5% de lait écrémé. Les membranes sont ensuite lavées avec du TBS-Tween trois fois pendant 10 min, puis incubées pendant 90 minutes à température ambiante avec les anticorps secondaires correspondants couplés à la peroxydase HRP (Horse-Radish Peroxydase) dilués dans le TBST contenant 5% de lait écrémé. Les membranes sont révélées par chémoluminescence avec le substrat (ECL) (GE Healthcare, Velizy-Villaoula, Fae. Les sultats oteus sot aalss e utilisat l’iageu GeneGnome (SynGene Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, France).

Tableau MM-5 : Liste des anticorps utilisés pour le Western Blot.

Anticorps primaire Espèce Dilution Fournisseur Polyclonal anti-KCa1.1 Lapin 1/500e Alomone Labs Polyclonal anti-NCX1 Lapin 1/200e Alomone Labs Polyclonal anti-NCX3 Lapin 1/200e Alomone Labs Polyclonal anti-S1PR3 Lapin 1/100e Abcam Polyclonal anti-Vimentine Lapin 1/500e Santa Cruz

Anticorps secondaire Espèce Dilution Fournisseur Anti-lapin Chèvre 1/5000e Interchim

107

Matériels et méthodes

XVI- Patch clamp

1 Principe : Le patch-clamp (« patch » pour fragment de membrane et « clamp » pour maintien) est une tehiue d’tude des aau ioiues. Elle est ase su l’utilisatio d’ue fie pipette de ee eplie d’ue solutio odutie et oete à u aplifiateur) qui une fois en contact avec la membrane cellulaire (qui contient des canaux ioniques peet d’eegiste des courants ioniques. L’aplifiateu peet d’ipose des potentiels et de recueillir des courants (voltage‐lap ou d’ipose des ouats et de eueilli des aiatios de potetiel (current-clamp).

Selon la configuration choisie, ette tehiue peet d’eegiste des ouats aosopiues sultat de l’atiit de plusieus etaies ou illies de aau, ou des ouats uitaies poous pa l’ouetue d’u ou de uelues aau idiiduels < à canaux). Pour enregistrer les courants portés sur les CSCs W8B2+, nous avons utilisé le voltage- clamp en configuration cellule entière (whole cell).

2 Protocole expérimental : Les courants ioniques ont été enregistrés sur les CSCs W8B2+ (ensemencées à une densité de 2.103 cellules/cm2 dans des boites de culture de 35mm de diamètre) par la technique du patch lap e ofiguatio ellule etie. Le path lap est alis à l’aide d’u aplifiateu Axopatch 200A avec une tête CV 202AU (Molecular Devices, CA, USA). Les courants sont esus e pose à l’appliatio d’ue tesio ode oltage lap ge pa l’aplifiateu otol pa u odiateu pesoel uip d'u oetisseu aalogiue- numérique (Digidata 1322A, Molecular Devices) et à l'aide du logiciel pClamp version 10 (Molecular Devices).

Au ous de l’epietatio, les ellules sot pefuses ae ue solutio etaellulaie contenant (en mM) : 136 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 0,3 NaH2PO4, 10 Glucose, 10 HEPES, pH 7,3). Les courants ioniques membranaires sont enregistrés via des électrodes de verre de sistae opise ete et MΩ e oosiliate GC-T fabriquées sur une étireuse verticale à double chauffage. La solution intrapipette contient (en mM) : 20 KCl, 110 K-asp, 1

MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES, 2,5 EGTA, 0,1 GTP, 5 Na2-phosphocréatinine, 5 Mg-ATP, pH 7,2 (PCa = 6,3). Le calcium est absent pour la solution PCa<9. Les ouats sot eegists e l’asee

108

Matériels et méthodes de traitement pharmacologique ou en présence de drogues. Après avoir obtenu une résistae d’aoleet eaaie de l’ode du giga-Ohm par pression négative, la eae ellulaie a t opue pa suio afi d’otei la ofiguatio ellule-entière. Divers protocoles de stimulation ont été imposés et sont précisés sur les figures représentatives des traces de courant enregistrées.

XVII- Tests statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Les tests utilisés pour les différentes expériences sont spécifiés dans les légendes des figures.

109

Résultats

RESULTATS

La partie « Résultats » s’atiule autou de tois hapites visant à mieux caractériser la population des cellules souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+) à l’tat souhe ais aussi au ous de sa diffeiatio adiaue in vitro.

Dans un premier temps, nous nous sommes focalisés sur la caractérisation phénotypique, génique et fonctionnelle des CSCs W8B2+ soit :

- La caractérisation immuno-phénotypique après isolement et purification - La caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs clés de la signalisation calcique - L’olutio de ette epessio giue au ous de leu diffeiatio adiaue in vitro - L’tude de l’atiit alique au cours de la différenciation cardiaque in vitro

Das u seod teps, ous aos tudi l’ipotae des aau ioiues plus précisément le canal BKCa) dans la régulation des propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+.

Et efi ous aos aals les effets et le ode d’atio de la sphigosie -phosphate ou S1P (un important régulateur physiologique et physiopathologique cardiaque) sur les propriétés des CSCs W8B2+ (prolifération, auto-renouvellement et migration).

Chapitre I : Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ Différents types de cellules souches ont pu être isolés à partir du tissu cardiaque humain (Guan and Hasenfuss, 2013). Cette diesit est due à l’epessio spifiue de etais marqueurs qui peuvent être des récepteurs membranaires, des facteurs de transcription ou encore des antigènes de surface. En fonction des travaux et données récemment publiés dans le domaine des progéniteurs cardiaques humains (Zhang et al., 2015a) ote tude s’est oiete su la aatisatio d’u tpe de ellules souhes adiaues epiat le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+). Plusieurs propriétés ont été vérifiées :

- Leus popits d’auto-renouvellement et de prolifération - Leur immuno-phénotype

110

Résultats

- Leu pofil d’epessio pou etais aueus adiaues - Leu pofil d’epessio giue pou etais aau ioiues

I- Isolement et caractérisation phénotypique des CSCs W8B2+

1 Isolement des CSCs W8B2+ Les CSCs W8B2+ sot isoles à pati d’hatillos d’oeillettes doites huaies oteus los d’opatios hiugiales e : pontages coronariens). Dans cette étude les patients choisis présentent tous un rythme sinusal oal. L’âge oe est de , ± 9 ans (5 femmes et 17 hommes).

Ue populatio ellulaie totale est d’aod isole pa la tehiue de « culture des explants » à partir des tissus atriaux humains. Cette population a été ensuite purifiée par les techniques du tri magnétique et du tri par FACS. La 1ère étape de purification par tri cellulaire magnétique positif montre que les CSCs W8B2+ représentent environ 3% des cellules totales (figure R-1 A).

Après expansion cellulaire en culture, la proportion des CSCs W8B2+ isolées par tri magnétique est enrichie mais reste faible et représente 9,7% des cellules totales (figure R-1 B). La e tape de puifiatio pa ti ellulaie pa FAC“ uat à elle, peet d’otei ue population pure (> 98% de pureté) de CSCs W8B2+ (figure R-1 C).

Ces résultats réalisés sur 22 patients démontrent la présence de CSCs W8B2+ dans l’oeillette huaie et la essit, de pa leu aet, d’utilise des tehiues de ti ellulaie pour obtenir une population pure.

2 Capaits d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+ Les CSCs W8B2+ pures isolées adhèrent facilement au plastique et possèdent un phénotype allongé et fusiforme identique à celui des cellules mésenchymateuses humaines (figure R-2 A). Pour démontrer le caractère souche de ces cellules, il a été nécessaire de montrer leur capacité de multiplication clonogénique par un test de formation de colonies CFU-Fs (colony-forming unit-fiolasts. A ts faile desit d’eseeeet cellules/cm²), les CSCs W8B2+ prolifèrent et forment de multiples colonies rendues visibles par la coloration au Crystal violet (figure R-2 B a,b).

111

Résultats

A Cellules totales Cellules W8B2+ 3± 1,4%

97± 1,4%

B C

Figure R-1 : Proportions en pourcentage des CSCs W8B2+ durant les différentes étapes de purification. (A) Pourcentage des CSCs W8B2+ et des cellules W8B2- (calculé après tri magnétique) après mise en culture des biopsies auriculaires cardiaques humaines selon la méthode des explants. n = 22 (âge moyen = 67,9 ± 9 ans, 5 femmes et 17 hommes). (B) Pourcentage des CSCs W8B2+ (déterminé par cytométrie en flux) après tri magnétique et expansion cellulaire en culture. n = 21 (âge moyen = 69,5 ± 9,9 ans, 4 femmes et 17 hommes). (C) Pourcentage des CSCs W8B2+ (préalablement triées par tri magnétique) obtenues et purifiées par tri cellulaire par cytométrie en flux. n = 15 (âge moyen = 70,8 ± 10,4 ans, 3 femmes et 12 hommes). CSCs W8B2+ : cellules souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 ; W8B2- : ellules ’epiat pas le aueu WB; W8B2-PE = fluoesee ise pa l’aticorps anti-W8B2 couplé à la phycoérythrine ; FSC-A = forward scatter, représentant la taille de la cellule. Les pourcentages représentent la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

112

Résultats

Concernant leur capacité proliférative, le test de prolifération montre que le nombre des CSCs W8B2+ passe en moyenne de 1889 cellules (au jour 1) à plus de 139000 (au jour 9) (figure R-3 A, n = 3). De plus, le atio d’augetatio ellulaie e h est d’eio , (figure R-3 B).

Ces résultats démontrent que les CSCs W8B2+ sont clonogéniques et hautement prolifératives.

A B a b

Figure R-2 : Morphologie des CSCs W8B2+ isolées et des colonies formées. (A) observation en microscopie photonique des CSCs W8B2+ (passage 1) isolées par tri cellulaire par cytométrie en flu. Bae d’helle = µ. (B) Test de formation des colonies CFU-F (Colony-Forming Unit- Fibroblastsissues). (B.a) Observation macroscopique des colonies des CSCs W8B2+ après 10 jours de ultue. Bae d’helle = . B. Agadisseet d’ue oloie de C“Cs WB+. Barre d’helle = .

A B

2.010 5 2.5

2.0 1.510 5

1.5 1.010 5 1.0

5.010 4

cellulaire en 24h en cellulaire

Nombre cellulaire Nombre 0.5

Ratio de l'augmentation de Ratio 0 0.0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 Temps en culture (jour) Temps en culture (jour)

Figure R-3 : Capait d’auto-renouvellement et de prolifération des CSCs W8B2+. (A) Test de prolifération des CSCs W8B2+ ulties pedat jous otat l’olutio du oe ellulaie. (n = 3). (B) atio d’augetatio ellulaie e h. = . J: jou. Chaue rond noir sur la courbe représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne) au jour de culture correspondant. n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

113

Résultats

3 Immunophénotype des CSCs W8B2+ Pour tudie la atue et l’iuophotpe des C“Cs WB+ isoles, l’epessio e surface de marqueurs de différents lignages (mésenchymateux, hématopoïétique et cellules souches cardiaques) a été étudiée par cytométrie en flux. Les résultats obtenus révèlent que ces cellules expriment des marqueurs de surface typiquement mésenchymateux (W8B2 : 98,6%, CD29 : 99,8%, CD73 :99,8% et CD105 :96,2%) (figure R-4 ; 3 patients). Concernant l’epessio des aueus des ellules hatopoïtiues, les C“Cs WB+ présentent une très faible expression de CD34 (4,8%) et une expression quasi nulle pour les marqueurs CD45 et CD133 (0,1% et 0% respectivement) (figure R-4). Les CSCs W8B2+ présentent aussi une très faile epessio .% de l’un des marqueurs de cellules souches cardiaques CD177 (appelé aussi c-kit).

Ces sultats dotet ts laieet l’oigie sehateuse des C“Cs WB+.

100

% des cellules positives des cellules %

CD29

CD73

CD90

CD34

CD45

W8B2

CD105

CD106

CD133

CD117 Marqueurs Marqueurs Marqueur de progéniteurs Mésenchymateux Hématopoïétiques Cardiaques

Figure R-4 : Pourcentage des CSCs W8B2+ positives pour les marqueurs de surface indiqués déterminé par cytométrie en flux. (n = 3). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). CD : Cluster of differentiation. n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

114

Résultats

II-Caractérisation génique des CSCs W8B2+

1 Pofil d’epessio des aueus adiaues 1.1 Pofil d’epessio giue des fateus de tasiptio adiaues Les facteurs de transcription cardiaques contrôlent le programme génétique cardiaque et jouent un rôle important dans la cardiogenèse et la différenciation cardiaque. Pour dteie le pofil d’epessio giue de etais fateus de tasiptio adiaues, ous aos uatifi leu ieau d’epessio pa RT-qPCR à haut rendement ou TLDA.

Les facteurs de transcription étudiés sont :

- La famille des facteurs de transcription GATA (protéines à doigts de zinc se fixant sur la suee d’ADN « GATA ») : GATA3, GATA4, GATA5 et GATA6 - La famille des facteurs de transcription HESR (proteins à motif bHLH (basic helix-loop- helix)) : HEY2 - La famille des facteurs de transcription à homéodomaine « Iroquois homeobox » : IRX3, IRX4 et IRX5. - La famille des facteurs de transcription T-box : TBX2, TBX3 et TBX5. - La famille des facteurs de transcription à homéodomaine NKX : NKX2.5

Les résultats montrent (figure R-5A) que les CSCs W8B2+ expriment fortement les facteurs de transcription GATA4 et TBX3 mais aussi les facteurs de transcription GATA3, GATA6, IRX3, TBX2 et TBX5. Une faible expression des facteurs de transcription HEY2 et IRX5 est détecté dans les CSCs W8B2+. Les résultats montrent aussi que les facteurs de transcription GATA5, IRX4 et NKX2.5 sont absents dans les CSCs W8B2+.

L’esele de es oseatios idiue ue certains facteurs de transcription cardiaques précoces sont exprimés (ex : GATA4). Il ressort également une très forte expression de TBX3 connu comme étant impliqué dans les processus de développement cardiaque.

Afi d’alue le pofil d’epessio potéique de certains facteurs de transcription cardiaques, nous avons vérifié leur présence par immunocytochimie.

Les résultats illustrés figure R-5B, ofiet la psee de la potie GATA et l’asee de la protéine NKX2.5 dans les CSCs W8B2+. Il est à noter u’u aute fateu de tasiptio

115

Résultats

adiaue o MEFC Mote Ehae Fato C e psete pas d’epessio protéique dans les CSCs W8B2+.

A 2500

2000

)

4 1500

1000

600

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

Ct 400



2 200

HEY2 IRX3 IRX4 IRX5 TBX2 TBX3 TBX5 GATA3GATA4GATA5GATA6 NKX2-5

Figure R-5 : Pofil d’epessio des fateus de tasiptio adiaues das les C“Cs WB+. (A) Pofil d’epessio giue des fateus de tasiptio adiaues das les C“Cs WB+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. (B) Pofil d’epessio potiue de GATA, MEFC et NKX 2.5 (en rouge) dans les CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les noyaux sont epsets e leu ae le auage TOPRO. Bae d’helle = µ.

116

Résultats

1.2 Pofil d’epessio giue des structures contractiles cardiaques Une des particularités phénotypiques cardiaques matures est la présence de structures contractiles comme la troponine et/ou la myosine. Afin de contrôler si les CSCs W8B2+ se trouvent bien dans un état souche non diffei ous aos ifi l’epessio giue de certaines protéines structurales et contractiles dont ; l’akie B ANKB, la topoie cardiaque inhibitrice de type 3 (TNNI3), la troponine-T cardiaque de type 2 (TNNT2), la chaîne lourde de la myosine de type 6 (MYH6), les chaînes lourde et légère de la myosine de type 7 (MYH7 & MYL7) et la chaîne légère de la myosine de type 2 (MYL2).

Les résultats obtenus (figure R-6) par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA, montrent que les CSCs W8B2+ ’epiet pas les ges odat pou ANKB, TNNI, TNNT, MYH, MYH, MYL7 et MYL2. Néanmoins, comme certaines cellules souches (Drabek et al., 2012) les CSC W8B2+ expriment des gènes structuraux non spécifiquement cardiaques comme par exemple CLASP2 (Cytoplasmic Linker Associated Protein 2) qui code pour une protéine structurale impliquée dans la stabilisation des microtubules.

400

)

4 300

200

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

 100

MYH6 MYH7 MYL7 MYL2 ANKB TNNI3 TNNT2 RRAD GPD1L CLASP2

Figure R-6 : Pofil d’epessio giue des stutues otatiles adiaues das les C“Cs WB+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epession des gènes est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+

117

Résultats

1.3 Pofil d’epessio giue des oeies adiaues. Les connexines cardiaques sont des protéines de communication fondamentales ipliues das le dootopise adiaue ais aussi de la shoisatio de l’atiit myocytaire.

Les résultats obtenus par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA indiquent clairement la psee d’epessio das les C“Cs WB+ de toutes des connexines cardiaques (connexine 43, 40, 45 et 30.2) avec une prédominance de la connexine 43 (figure R-7 A). En outre, la protéine type connexine 43 a été détectée par immunocytochimie dans les CSCs W8B2+ (figure R-7 B). A

6000

)

4000

2000

vs RPL13A (x10 RPL13A vs



2 0

Cx43 Cx40 Cx45 Cx30.2 B

Figure R-7 : (A) Pofil d’epessio giue des oeies cdans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset e -ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. (B) Pofil d’epessio potiue de la oeie e ouge) dans les CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les noyaux sont représentés en leu ae le auage TOPRO. Bae d’helle = µ.

118

Résultats

1.4 Pofil d’epessio giue des peptides atiutiues Les peptides natriurétiques (NP) sont des hormones qui jouent un rôle dans l’hoostasie adioasulaie e gulat la atiuse, la diuse et aussi la asodilatio. Ils sont considérés comme des marqueurs de différenciation cardiaques.

Les sultats oteus TLDA fot essoti ue asee d’epessio du tasit codant pour les NP de type A (ANP) et une faible expression du neuropeptide de type B (BNP) (figure R-8). Ce sultat ofie le peu d’egageet des ellules dans le processus de différenciation myocytaire.

)

4 40

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

 10

ANP BNP

Figure R-8 : Pofil d’epessio giue des peptides atiutiues de tpe A et de tpe B das les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est représenté en 2- ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

2 Pofil d’epessio giue des aau ioiues das les CSCs WB+ Les canaux ioniques sont exprimés dans différents types cellulaires et sont importants das le aitie de l’hoostasie phsiologiue. Cepedat, l’epessio et le ôle des canaux ioniques dans les cellules souches cardiaques restent très peu étudiés. Nous nous sommes donc focalisés sur la caractérisation de ces canaux dans les CSCs W8B2+ en étudiant leus pofils d’epessio giues par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA.

Les résultats obtenus sont présentés par classes : canaux sodiques, canaux potassiques, canaux calciques et canaux HCN

119

Résultats

2.1 Pofil d’epession génique des canaux sodiques dans les CSCs W8B2+

Les canaux sodiques jouent un rôle fondamental dans la génération et la propagation du potetiel d’atio des ellules dites « excitables » comme par exemple les neurones et les muscles. Un canal sodique de type NaV dpedat du potetiel est ostitu d’u oplee multimérique incluant au moins une sous-unité alpha et une ou plusieurs petites sous-unités ta β, β, β et β. Les sous-unités alpha seules sont nécessaires et suffisantes pour former un canal fonctionnel. Le rôle des sous-unités bêta est de moduler, entre autres, l’atiit du aal et so aage à la eae.

La famille des NaV est composée de 10 isoformes qui présentent une distribution tissulaire différente. Par exemple, on retrouve dans le système nerveux périphérique les isoformes NaV1.3, NaV1.7, NaV1.8 et NaV.. Das le œu l’isofoe NaV1.5 est prédominante (Moreau et al., 2017).

Dans les CSCs W8B2+ les résultats obtenus (figure R-9) montrent que les sous-unités alpha des isoformes NaV1.8 NaV1.3, NaV1.4, NaV1.5, NaV1.7 et NaV2.1 sont absentes. Seule une faible expression du NaV1.3 est détectée. Concernant les sous-unités bêta régulatrices, les

+ CSCs W8B2 ’expriment uniquement que la sous-uit β NaVb1).

400

)

300

200

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

 - 100

Navb1 Navb2 Navb3 Navb4 Nav1.3 Nav1.4 Nav1.5 Nav1.7 Nav1.8 Nav2.1 Figure R-9 : Pofil d’epessio giue des aau sodiues oltage-dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset e -ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

120

Résultats

2.2 Pofil d’epessio giue des aau potassiues das les CSCs WB+ Les canaux potassiques participent à de nombreuses fonctions biologiques et sont notamment responsables du maintien du potentiel membranaire, de la transmission de l'influx nerveux et de la rythmogenèse.

Les canaux potassiques sont très variés et peuvent être regroupés en 4 grandes familles :

-Les canaux potassiques dépendant du potentiel (Kv), 6 segments transmembranaires (STM) et d’ue oule P foat le filtre de sélectivité du canal :

Cette famille regroupe la sous-famille : des KV1.x appelée « shaker », des KV2.x appelée

«shab », des KV3.x appelée «shaw », des KV4.x appelée «shal », des KV7.x appelée «KQT » et la sous-famille des KV10.x KV11.x et KV12.x appelée « eag » (Luneau et al., 1991; Perney and Kaczmarek, 1991; Stühmer et al., 1989).

Les résultats obtenus par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA montrent que les CSCs

+ W8B2 expriment fortement le KV3.4 et faiblement le KV4.2, des canaux potassiques cardiaques impliqués dans le courant transitoire sortant repolarisant Ito (Han et al., 2002;

Nerbonne, 2016) (figure R-10). Concernant les canaux KV1.2, KV1.4, KV1.5, KV1.7, KV2.1, KV4.3,

KV7.1 (KVLQT1) et KV. hERG, auue epessio sigifiatie ’est dtete.

De plus, les résultats des RT-PCR (figure R-11) confirment et montrent que les CSCs

+ W8B2 ’epiet pas le tasit KV4.3 et modérément le KV4.2.

+ E effet, l’isofoe KV4.2 (220 pb) est exprimée à la fois dans les CSCs W8B2 et dans le tissu atrial humain utilisé comme contrôle positif.

Quat à l’isofoe KV4.3, nous obtenons une bande de 310 pb seulement dans le tissu atrial humain (contrôle positif).

121

Résultats

)

4 30

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

 10

Kv1.2 Kv1.4 Kv1.5 Kv1.7 Kv2.1 Kv3.4 Kv4.2 Kv4.3 hERG KvLQT1 Figure R-10 : Pofil d’epessio giue des sous-unités alpha des canaux potassiques voltage- dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

Figure R-11 : Caatisatio de l’epessio des ARN odat pou K. (à gauche) et Kv4.3 (à droite) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. Les ADNc issus du tissu atrial cardiaque humain sont utiliss oe otôle positif et l’eau oe otôle gatif.

122

Résultats

Sous-unités régulatrices des canaux potassiques :

Il existe aussi des sous-uits ta auiliaies ou gulaties ui peuet s’assoie et

gule l’atiit des aau potassiues. C’est le as des sous-unités auxiliaires (KVb2, KVb3,

MiK ui s’assoiet ae les sous-unités alpha des KV fonctionnels et les sous-unités régulatrices (MiRP1, MiRP2, MiRP3, KCNE et KChIP ui s’assoiet ae les KV et modulent leurs activités (Gulbis et al., 1999; Kukreja, 2017).

Les résultats obtenus (figure R-12) sur les CSCs W8B2+ motet u’il a ue epessio importante de KVb2, KVb3, KCNE5, MiRP2 et MiRP3 et une expression très faible de MinK, MiRP1 et KChIP2.

)

4 40

vs RPL13A (x10 RPL13A vs



2 10

Kvb2 Kvb3 MinK KCNE5 MIRP1 MIRP2 MIRP3 KChIP2 Figure R-12 : Pofil d’epessio giue des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage- dépendant dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

- La famille des canaux potassiques activés par le calcium (KCa) à 6 STM et 1 segment P :

Cette famille regroupe la sous-famille des KCa à large conductance (BKCa ou KCa1.1), la sous-famille des KCa à conductance intermédiaire (IKCa ou KCa3.1) et la sous-famille des KCa à petite conductance (SKCa avec les sous-types KCa2.1, KCa2.2 et KCa2.3). Ces canaux sont sensibles aux variations de calcium intracellulaires (Miller, 2000; Yuan et al., 2010). Ils repolarisent ou hpepolaiset la eae los d’augetatios asales ou osillatoies de l’atiit aliue itaellulaie.

123

Résultats

Les résultats obtenus par RT-PCR montrent que les CSCs W8B2+ expriment le transcrit de type BKCa (bande de 333 pb) (figure R-13 A) et le transcrit IKCa (bande de 304 pb) (figure R- 13 B) comparées au contrôle positif (tissu atrial humain). Aucune expression significative du transcrit KCa2.1 codant pour SKCa ’est osee comparé au tissu atrial humain (bande de 498 pb).

A B

Figure R-13: Caatisatio de l’epessio des ARN odat pou KCNMA1 ou KCa1.1 (A) et KCa3.1 et KCa2.1 (B) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. GAPDH est utilisé comme gène de référence. Les ADNc issus du tissu atrial cardiaque humain sont utilisés comme contrôle positif et l’eau oe contrôle négatif.

- La famille des canaux potassiques de fonds à 4 STM et 2 segments P :

Cette famille regroupe les sous-familles TWIK, TREK, TASK, TALK, THIK et TRESK. Ces canaux influencent le potentiel de la membrane de repos et, par conséquent, peuvent contrôler l'excitabilité des cellules. Ils sont également régulés par les dérivés de l'oxygène moléculaire, le GABA, la noradrénaline et la sérotonine (Enyedi and Czirják, 2010; Lotshaw, 2007).

Les résultats obtenus ici montrent que seul le canal TWIK1 est exprimé. Les transcrits codant pour TASK1 et TASK2 dans les CSCs W8B2+ (figure R-14) sont non détectables.

124

Résultats

Il est à ote ii ue le aal potassiue TWIK est ts pset das l’atiu et joue u ôle non négligeable dans la régulation du rythme et la morphologie du tissu atrial (Christensen et al., 2016).

)

vs RPL13A (x10 RPL13A vs



TWIK1 TASK1 TASK2

Figure R-14 : Pofil d’epessio giue des aau potassiues TWIK et TA“K das les C“Cs WB+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset e -ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

- Les canaux potassiques à rectification entrante (Kir) à 2 STM et 1 segment P :

Cette famille regroupe la sous-famille des Kir ou IK (Kir2.x), des Kir couplés à une protéine Go ou KG (Kir3.x) et des Kir ATP-sensibles ou KATP (Kir6.x). Les KATP sont régulés par les deux sous-unités régulatrices SUR1 et SUR2. Ces canaux sont fondamentaux car ils contrôlent le potetiel de eae et/ou de epos, oditioet l’eitailit et assuet d’autes rôles physiologiques (Hibino et al., 2010).

La figure R-15A montre que les transcrits codant pour IK1 (Kir2.1) et pour le KATP Kir6.1 sont exprimés significativement dans les CSCs W8B2+. Une légère expression du récepteur aux sulfonylurés SUR2 est observable. Les résultats de la RT-PCR figure R-15B confirment la présence du transcrit codant pour Kir2.1.

En revanche, on note une absence de l’epessio des tasits odat pou le KATP

(Kir6.2), les KG (Kir3.1 et Kir3.4), le IK (Kir2.3) ainsi que de la sous-unité régulatrice SUR1 (figure R-15A).

125

Résultats

A B

)

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

Ct 10



SUR1 SUR2 Kir6.2 Kir2.1 Kir3.1 Kir2.3 Kir3.4 Kir6.1

C D 1000

I (pA) 500

-100 -50 50 100 150 V (mV) 500 µM BaCl2 100 pA -500

250 ms -1000

Figure R-15 : (A) Pofil d’epessio giue des sous-unités régulatrices et des canaux potassiques rectifiants entrants dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des gènes est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. (B) Caatisatio de l’epessio des ARN odant pour le Kir2.1 dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. Les ADN issus du tissu atial adiaue huai sot utiliss oe otôle positif et l’eau oe contrôle négatif. (C) Traces des courants enregistrées en condition contrôle en patch-clamp, en configuration cellule entière au ous d’ue ape de , s de -110 mV à -70 mV. (D) Traces de courants enregistrées en patch-lap e ofiguatio ellule etie au ous d’ue ape de s de -100 mV à +100 mV en présence ou en absence de 500 µM de Baryum extracellulaire.

126

Résultats

Les résultats du patch-clamp en configuration cellules entière, montrent la présence d’u ouat sortant portant des oscillations sous forme de « bruit » et une réctification entrante pour le potentiel négatif (Figure R-15C). La rectification entrante est bloquée par l’ajout de µM de au (Figure R-15D). Les signatures des courant obtenues correspondent aux canaux de type BKCa (en dépolarisation) et Kir (en hyperpolarisation). Il est ipotat de ote l’asee de ouants dits dynamiques sodiques ou calciques.

2.3 Pofil d’epessio giue des aau HCN das les CSCs WB+ Les canaux contrôlés par les nucléotides cycliques et activés par l'hyperpolarisation ou HCN (Hyperpolarisation-activated Cyclic Nucleotides-gated cation channels) sont des canaux cationiques non sélectifs activés par hyperpolarisation intégrant un site de fixation pour les nucléotides cycliques. Les canaux HCN sont entre autres présents dans le cerveau (courant Ih) et le œu ouat If). Les canaux HCN sot à l’oigie du ouat paeake et la gese et la gulatio de l’autothiit odale adiaue (Biel et al., 2002).

Quatre sous-types de canaux HCN sont connus ; HCN1, HCN2, HCN3 et HCN4. Ces iodofoes sot plutôt epis das les tissus dous d’atiit thiues. Les HCN est ubiquitaire, le HCN1 est neuronal et la HCN4 est très exprimé dans les tissus nodaux et conducteurs cardiaques (Stieber et al., 2003).

Les résultats obtenus montrent que les CSCs W8B2+ expriment exclusivement les transcrits codant pour les canaux HCN2 et HCN3 avec une expression plus forte du transcrit HCN2 (figure R-16). 250

)

4 200

150

100

vs RPL13A (x10 RPL13A vs



- 50

0 HCN1 HCN2 HCN3 HCN4 Figure R-16 : Pofil d’epessio giue des aau HCN das les C“Cs WB+ déterminé par RT- PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset e -ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

127

Résultats

2.4 Pofil d’epessio giue des aau aliues das les CSCs WB+ Les canaux calciques sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires allant du couplage excitation-otatio usulaie à la liatio d’hooes ou de neurotransmetteurs.

On décrit deux types de canaux calciques ; les canaux calciques récepteurs dépendants dot l’ouetue est oteue pa l'atio des diateus hiiues et/ou les canaux calciques potentiel-dépendants qui s'ouvrent grâce aux variations de voltage.

Les canaux calciques potentiel-dépendants (CaV sot ostitus d’ue sous-unité canalaire alpha (qui apporte la diversité fonctionnelle) associée aux sous-unités régulatrices bêta et alpha 2-delta.

Les CaV sont eux-mêmes classés en plusieurs types (Catterall, 2011) ;

-Les CaV de type L (CaV 1.x) : exprimés dans les muscles (lisse, squelettique et cardiaque), les neurones, les cellules endocrines et la rétine.

-Les CaV de type P/Q (CaV 2.1) : epis das les euoes et les ellules β paatiues.

-Les CaV de type N (CaV 2.2) : exprimés dans les neurones.

-Les CaV de type R (CaV 2.3) : exprimés dans les neurones et les cellules endocrines.

-Les CaV de type T (CaV 3.x) : exprimés dans les muscles (lisse et cardiaque), les neurones et les cellules endocrines.

Dans notre étude, nous avons ciblé les CaV adiaues à as et haut seuil d’atiatio

(CaV 1.2, CaV 1.3, CaV 3.1 et CaV 3.2) et à leurs sous-uits gulaties α , α et β.

Les résultats figure R-17 montrent que les CSCs W8B2+ ’epiet auu tasit codant pour les CaV cardiaques et les sous-uits gulaties α et β. La sous-unité gulatie α uat à elle, psete ue epessio ts fote du tasit. Ces sultats sugget u’auue peailit fotioelle aliue dpedate du oltage ’est présente dans les progéniteurs cardiaques.

128

Résultats

1500

)

1000

500

vs RPL13A (x10 RPL13A vs



Cav1.2 Cav1.3 Cav3.1 Cav3.2 Cavb2 Cava2d1 Cava2d2 Figure R-17 : Pofil d’epessio giue des canaux calciques dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset e -ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

2.5 Pofil d’epessio giue des taspoteus ioiues das les CSCs WB+ Le transport ionique actif à travers la membrane plasmique via les échangeurs et les popes essite de l’egie pa le gadiet letohiiue et/ou l’ATP pou assue les changements de configurations profonds de ces acteurs. Il est essentiel pour le maintien de l'homéostasie ionique, particulièrement calcique.

Dans les cellules excitables comme les cardiomyocytes, les échangeurs et les pompes jouet u ôle essetiel das les poessus d’eitatio et de otatio. Dans les cellules non excitables, ils assurent notamment les processus sécrétoires.

Nous nous soes do itesss au pofil d’epessio giue des C“Cs WB+ oeat l’epessio de la pope sodiu-potassium (Na+/K+ ATPase), de la pompe à calcium (Ca2+-ATPase) du réticulum sarcoplasmique et endoplasmique (SERCA), la pompe à calcium (Ca2+-ATPase de la eae plasiue PMCA et l’hageu Na+/Ca2+ (NCX1).

129

Résultats

Les résultats illustrés en figure R-18, montrent une forte expression des transcrits codant pour la SERCA2, la SERCA3 et la Ca-ATPase4 (PMCA) et une expression significative, mais moins intense du NCX1. Concernant la pompe Na+/K+ ATPase, les CSCs W8B2+ ne montrent aucune expression du transcrit codant pour Na+/K+ ATPase a3 mais elles expriment fortement la sous- unité bêta 1 Na+/K+ ATPase b1.

4000

3000

)

4 2000

1000

100

vs RPL13A (x10 RPL13A vs



2 50

NCX1 SERCA2 SERCA3 Ca ATPase4 Na/K-ATPase Na/K-ATPasea3 b1

Figure R-18 : Pofil d’epessio giue des hageus Na+/K+, “ERCA, PMCA et NCX das les CSCs W8B2+ déterminé par RT-PCR. = . Le Pofil d’epessio des ges est epset e - ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

3 Pofil d’epessio giue des ateus de l’hoostasie aliue das les CSCs WB+ Le calcium est un second messager important au sein des cellules, car il intervient dans différentes voies de signalisation et divers processus biologiques. De ce fait, les concentrations calciques entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire sont hautement régulées. Les variations de concentration calcique permettent de contrôler différents phénomènes cellulaires comme la prolifération, la différenciation, la sécrétion ou encore la contraction (Marty, 1989). Das le usle adiaue, l’hoostasie aliue itaellulaie est die notamment via les epteus aliues atis pa l’iositol tiphosphate ITPR, les récepteurs calciques activés par la ryanodine (RYR), les CaV de type T, les CaV de type L et

130

Résultats l’hageu NCX. Ieseet, le aliu est etud du toplase via la SERCA, la pompe PMCA et l’hageu NCX. Dans cette régulation calcique sont intégrées également certaines calciproteines intracellulaires comme la calmoduline (CALM), la calséquestrine (CASQ), le phospholamban (PLN) ou encore la calcineurine A (CAM-PRP). Les résultats obtenus (figure R-19) sur les CSCs W8B2+ montrent une expression très forte du transcrit codant pour la CALM3 et forte des transcrits codant pour CALM1, CAM-PRP, ITPR1 et ITPR3. Cependant, il y a une faible expression du PLN et aucune expression des transcrits codant pour CASQ2 et RYR2.

30000000

) 20000000

10000000

1000 800

vs RPL13A (x10 RPL13A vs

Ct 600



2 400 200 0

PLN RYR2 ITPR1 ITPR3 CALM1 CALM3 CASQ2 CAM-PRP Figure R-19 : Pofil d’epessio giue des ateus iplius das l’hoostasie aliue das les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le Profil d’epessio des ges est epset e 2-ΔCt par rapport au gène de référence RPL13A (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

III-Caractérisation fonctionnelle des CSCs W8B2+

1 Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ La capacité des cellules souches cardiaques humaines à se différencier in vitro en plusieurs lignages cellulaires a été démontrée (Guan and Hasenfuss, 2013). Dans notre étude fonctionnelle, nous nous sommes concentrés sur la différenciation de notre modèle de CSCs

131

Résultats

W8B2+ e ligage adiootaie. L’tude des aises iplius das ette diffeiatio e adiootes est fodaetale a elle peet d’oiete et d’iagie des solutios thapeutiues de deie gatie. Le ut ultie est d’obtenir des ellules pogities ui ue fois geffes, seaiet apales de pae le œu pa eplaeet ou efoeet des adiootes das les as d’isuffisae adiaue grave.

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches cardiaques après différenciation in vitro décrits à ce jour, présentent des caractéristiques fonctionnelles et structurelles plutôt immatures par rapport aux cardiomyocytes adultes natifs. Ainsi, un défi futur sera de développer des stratégies pour atteindre un degré plus élevé de maturation des cardiomyocytes in vitro.

Dans cette partie, nous avons suivi le processus de différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ e aalsat l’epessio giue des aueus adiaues ouaet utiliss dans la littérature (structures contractiles, facteurs de transcription cardiaque, connexines et… ais aussi le pofil giue des aau ioiues et des ateus de l’hoostasie calcique aau sodiues, potassiues, aliues, popes, hageus et….

1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des marqueurs cardiaques 1.1.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des facteurs de transcription cardiaques

Les facteurs de transcriptions cardiaques sont primordiaux pour le développement et la morphogenèse cardiaque et sont utilisés pour caractériser les différents types de cellules souches cadiaues. Il est do ipotat d’aalse l’olutio de es fateus aps différenciation.

Les résultats montrent que les transcrits codant pour GATA5 et GATA6 sont fortement augmentés (+ 55,3 fois pour GATA5 et + 14 ,4 fois pour GATA6) (figure R-20A). L’epessio de GATA3 et TBX5 est légèrement induite (+ 2,6 fois pour GATA3 et + 2,9 fois pour TBX5) et auue aiatio de l’epessio giue des fateus de tasiptio GATA, HEY, IRX, IRX, TBX et NKX. ’est osee. Coeat les deu fateurs de transcription IRX3 et TBX3, une légère répression de leurs transcrits est observée (- 3,8 fois pour IRX3 et -2,5 fois

132

Résultats pou TBX. Au ieau potiue, les sultats de l’iuotohiie otet ue les C“Cs W8B2+ diffeies epiet le fateu de tasiptio GATA à l’iese de MEFC et NKX2.5 (figure R-20B).

A 8 7 6 5 4 3 2

VS Non Diff Non VS 1 0 -1

Variation d'expressionVariation (log2) -2 -3

IRX3 IRX4 IRX5

TBX2 TBX3 TBX5

HEY2

GATA3 GATA4 GATA5 GATA6 B NKX2-5

Figure R-20 : (A) Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des facteurs de transcription cardiaques déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées. (B) Pofil d’epession protéique de GATA4, MEF2C et NKX 2.5 (rouge) après 28 jours de différenciation des CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les oau sot epsets e leu ae le auage TOPRO. Bae d’helle = µ.

133

Résultats

1.1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des structures contractiles cardiaques

La mise en place des structures contractiles cardiaques après les protocoles de différenciation cardiaque in vitro est souvent observée pour confirmer la présence ou non d’u photpe adiaue aps diffeiatio des ellules souhes adiaues.

Nous nous sommes donc intéressés aux marqueurs de différenciation cardiaque oe la topoie, la osie, l’akie ou eoe les peptides natriurétiques.

Les résultats obtenus par RT-qPCR à haut rendement ou TLDA (figure R-21A), montrent ue l’epessio des tasits odat pou l’ANKB et MYL est foteet iduite au ous de la différenciation cardiaque (induction de + 137 fois pour ANKB et + 13 fois pour MYL7). A moindre intensité il en est de même pour les transcrits TNNT2 et e GPD1L (induction de + 3,3 fois pour la TNNT2 et + 2,9 fois pour GPD1L).

Auue odifiatio de l’epessio de CLA“P et de MYL ’est isile ; en effet, entre + 2 fois et – 2 fois par rapport aux CSCs W8B2+ o diffeies. E eahe, l’epessio des transcrits codant pour la TNNI3, MYH6, MYH7 et RRAD est réprimé au cours de la différenciation (répression de – 5,2 fois pour la TNNI3, - 4,7 fois pour MYH6, - 3.1 fois pour MYH7 et - 3,2 fois pour RRAD).

Les iuoauages idiuet aussi u’il ’ a pas de stutues otatiles matures (absence de striations typiques des adioote oe l’idiue le marquage de TNNT2, a-actinine et b-MHC (figure R-21B).

134

Résultats

A 8 7 6 5 4 3 2 1 VS Non Diff Non VS 0 -1 -2

Variation d'expressionVariation (log2) -3 -4

MYL7 MYL2

MYH6 MYH7

ANKB RRAD

TNNI3

TNNT2

GPD1L

CLASP2

Figure R-21 : (A) Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des structures contractiles cardiaques déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epession des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées. (B) Pofil d’epessio potiue de TNNT, a-actinine et b-MHC après 28 jours de différenciation des CSCs W8B2+ déterminé par immunocytochimie. (n = 3). Les noyaux sont représentés en bleu avec le marquage TOPRO. Bae d’helle = µ.

135

Résultats

En ce qui concerne les peptides natriurétiques, les résultats montrent une très forte indutio + fois de BNP alos ue l’epessio de ANP este iaiale (figure R-22).

15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5

VS Non Diff 4 3 2 1 0 Variation d'expression (log2) d'expression Variation -1 -2

ANP BNP Figure R-22 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des peptides natriurétiques de type A et de type B déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

1.1.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des connexines cardiaques Coe ous l’aos etio plus aat les cardiomyocytes sont connectés les uns aux autres par des jonctions communicantes au niveau des disques intercalaires. Ces jonctions sont assurées par les quatre connexines cardiaques Cx43, Cx40, Cx45 et Cx30.2.

Les connexines cardiaques ont un rôle très important dans la médiation électrique et l’hage de taolites entre les cardiomyocytes pour coordonner les contractions des quatre chambres cardiaques (Jansen et al., 2010). L’ojetif est de ifie l’olutio de l’epessio de es oeies duat le poessus de diffeiatio des C“Cs WB+.

136

Résultats

Les résultats (figure R-23) montret auue aiatio d’epessio des tasits odat pou les Cx43, Cx40, Cx45 et Cx30.2 au cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+.

VS Diff Non -1

Variation d'expression (log2) d'expression Variation -2

Cx43 Cx40 Cx45

Cx30.2

Figure R-23 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des connexines déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

1.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des canaux ioniques 1.2.1 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des canaux sodiques

Das le œu, o etoue ajoitaieet l’isofoe NaV1.5 responsable de la phase asedate du potetiel d’atio adiaue, ais galeet les isoformes Nav1.1, Nav1.2,

NaV1.3, NaV1.4, NaV1.6 et NaV2.1 (Gaborit et al., 2007; Mishra et al., 2015; Zimmer et al., 2014).

Il tait do ipotat d’alue l’epessio des aau sodiues et de dteie les isoformes impliqués lors de la différenciation des CSCs W8B2+. Les résultats montrent (figure

R-24) ue fote idutio de l’epression des transcrits codant pour NaV1.4 (+ 14,3 fois),

NaV1.5 (+ 14,5 fois), NaV1.7 (+ 8,9 fois) et NaV2.1 (+ 474,4 fois) ainsi que pour les sous-unités

NaVb2 (+ 12 fois) et NaVb3 (+ 24,7 fois).

137

Résultats

Cepedat, l’epessio du tasit NaV1.3 diminue fortement (- 13 fois) au cours de la diffeiatio. Auue aiatio d’epessio ’est isile pou le NaV1.8 et les sous-unités

NaVb1 et NaVb4.

10 9 8 7 6 5 4 3 2

VS Diff Non 1 0 -1

Variation d'expression (log2) d'expression Variation -2 -3 -4 -5

Navb1 Navb2 Navb3 Navb4

Nav1.3 Nav1.4 Nav1.5 Nav1.7 Nav1.8 Nav2.1

Figure R-24 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux sodiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -1, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

1.2.2 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des canaux potassiques

Les canaux de potassium représentent la classe la plus complexe de canaux ioniques du point de vue fonctionel et stutuel. Das le œu, les aau potassiues sot essaies pou la phase de epolaisatio du potetiel d’atio et la estauatio du potetiel du epos eaaie. Le pofil des aiatios d’epessio giue des aau potassiques durant la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ est illustré dans les figures de R-25 à R-28.

138

Résultats

Les résultats indiquent ue das l’esele, il a ue idutio sigifiatie de l’epessio des tasits odat pou les aau potassiues dpedats du potetiel KV), les canaux potassiques à rectification entrante (Kir), les canaux potassiques de fonds TASK et les sous-unités régulatrices.

Plus précisément il y a une augmentation très importante de KV1.2 (+ 36,2 fois), KV1.4

(+ 19,1 fois), KV1.5 (+ 10,1 fois), KV2.1 (+ 28,8 fois), KV4.2 (+ 9,3 fois) et KV4.3 (+ 23,4 fois) (figure R25). Naois, auue aiatio d’epessio au ous de la diffeiatio des tasits codant pour KV4.3, KV11.1 (hERG) et KV7.1 (KVLQT ’est oseale.

9 8 7 6 5 4 3 2 1

VS Non Diff Non VS 0 -1 -2

Variation d'expressionVariation (log2) -3 -4

Kv1.2 Kv1.4 Kv1.5 Kv1.7 Kv2.1 Kv3.4 Kv4.2 Kv4.3

hERG

KvLQT1

Figure R-25 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epession des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

139

Résultats

L’epessio des sous-unités régulatrices des Kv change au cours de la différenciation avec une induction forte du transcrit codant pour MIRP3 (+ 19,1 fois) et une induction relativement faible des transcrits codant pour KVb2 (+ 2,7 fois), MinK (+ 3 fois), MIRP1 (+ 3,7 fois) (figure R-26). Les transcrits codant pour KVb3, KCNE5, MIRP2 et KChIP2 ne varient pas au cours de la différenciation cardiaque.

6 5 4 3 2

VS Non Diff Non VS 1 0

Variation d'expressionVariation (log2) -1 -2

MinK

Kvb2 Kvb3

MIRP1 MIRP2 MIRP3

KCNE5

KChIP2

Figure R-26 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des sous-unités bêta des canaux potassiques voltage-dépendant déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

140

Résultats

Une forte induction du transcrit codant pour TASK1 (+ 4067 fois) est observée au cours de la diffeiatio alos ue l’epessio des tasits odat pou TA“K et TWIK ’est pas modifiée (figure R-27).

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2

VS Non Diff VS Non 1 0 -1 -2

Variation d'expression (log2) d'expression Variation -3 -4 -5

TWIK1

TASK1 TASK2

Figure R-27 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux potassiques TWIK et TASK déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

Concernant les canaux potassiques à rectification entrante (Kir), nous observons une induction des transcrits codant pour Kir6.2 (+ 18,7 fois), Kir3.1 (+ 14,4 fois) et Kir2.3 (+ 10,1 fois) et une répression du Kir2.1 (- 4,4 fois) au cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ (figure R-28). Pour les transcrits codant pour Kir3.4, Kir6.1 et les sous-unités gulaties “UR et “UR, ous ’oseos auue odifiatio.

141

Résultats

7 6 5 4 3 2 1

VS Non Diff Non VS 0 -1 -2

Variation d'expressionVariation (log2) -3 -4

SUR1 SUR2

Kir6.2 Kir2.1 Kir3.1 Kir2.3 Kir3.4 Kir6.1

Figure R-28 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des sous-unités régulatrices et des canaux potassiques rectifiants entrants déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

1.2.3 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des canaux HCN

Comme nous l’aos pis das le hapite pdet les aau HCN à l’oigie du ouat de paeake sot esposales das les ellules odales de la gese de l’atiit rythmique cardiaque.

Afin de vérifier si notre protocole de différenciation pouvait orienter les cellules vers un photpe odal les ieau d’epessio des aau HCN ot t estis (figure R-29).

142

Résultats

8 7 6 5 4 3 2 VS Non Diff 1 0

Variation d'expression (log2) d'expression Variation -1 -2

HCN1 HCN2 HCN3 HCN4

Figure R-29 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux HCN déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des gènes ne varie pas (ceci correspond à des variations de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

Les résultats montrent une forte induction des canaux HCN1 (+ 22,9 fois) et HCN4 (+ 25,8 fois) qui apparait moins intense pour des canaux HCN2 (+ 3,5 fois) et HCN3 (+ 4,1 fois) au cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+.

1.2.4 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des canaux calciques

Das le œu, les CaV de tpe L sot u des ateus esposales du potetiel d’atio cardiaque et ils sont responsables du phénomène de la libération du calcium induite par le calcium (Calcium-Induced Calcium Release) qui permet la contraction du muscle cardiaque.

Les CaV de type T quant à eux, sont importants dans les événements de dépolarisation et patiipet à l'atiit thiue du œud sio-auriculaire (SA).

Les sultats de l’aalse de l’epessio des transcrits codant pour les CaV après différenciation des CSCs W8B2+, montrent une forte induction des transcrits codant pour les canaux CaV de type L : CaV1.2 (+ 897,6 fois) et CaV1.3 (+ 74,5 fois) et les CaV de type T : CaV3.2 (+ 149 fois) (figure R-30).

143

Résultats

Concernant les sous-unités régulatrices, nous remarquons une variation de l’epessio de CaVb2 (+ 7,5 fois), une très légère induction de CaV3.1 (+ 2.5 fois) et aucun hageet d’epessio pou CaVad.

12 11 10 9 8 7 6 5 4

VS Non Diff Non VS 3 2 1 0 Variation d'expressionVariation (log2) -1 -2

Cavb2

Cav1.2 Cav1.3 Cav3.1 Cav3.2

Cava2d1 Cava2d2 Figure R-30 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des canaux calciques déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -1, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

Un courant entrant a pu être mis en évidence lors des expérimentations de patch-clamp en configuration cellule entière, sur la population W8B2+ après 28 jours de différenciation cardiaque in vitro (Figure R-31).

Ce courant est daiue ae ue phase d’atiatio relativement rapide (10 à 20 ms) suivie d’ue phase d’iatiatio lente (figure R-31a). Ce ouat etat s’atie pou u potetiel proche de -50mV est atteint son pic à - V. Le potetiel d’iesio du ouat est proche de +80 (figure R-31b). Ce courant rapide est bloqué par 5 mM nickel NiCl2 (figure R-31c). Il faut etioe ii ue e ouat etat poaleet aliue ’a t eegist ue deu fois su ellules diffeies tudies idiuat poaleet l’eistee das ote odle ellulaie, d’ue sous populatio et/ou u stade du le ellulaie différent. Il est difficile de conclure sur un type précis de courant calcique compte tenu des seuils d’atiatio, de la sesiilit au ikel et de la itiue. Il est epedat poale u’il s’agisse d’u ouat de tpe L de tpe euoal i ae un de type L cardiaque ou lisse.

144

Résultats

Figure R-31 : Courant dynamique enregistré sur les CSCs W8B2+ différenciées en configuration cellule-entière. (a) Traces du courant enregistré. (b) Courbe courant-potentiel du courant enregistré. (c) courant dynamique enregistré pour différents temps de rampes de potentiel en condition contrôle (à gauche) et en présence du chlorure de nickel (à droite).

1.2.5 Effet de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ su l’epessio génique des taspoteus ioiues et/ou des ateus de l’hoostasie calcique Les résultats de la figure R-32, ote ue fote augetatio de l’epessio des tasits codant pour la pompe sodium-potassium Na+/K+ ATPase a3 (+ 14,4 fois), la sous-unité Na+/K+ ATPase b1 (+ 4,9 fois), de la pompe à calcium (Ca2+-ATPase) du réticulum sarcoplasmique et edoplasiue “ERCA + , fois et “ERCA + ,. L’hageu Na+/Ca2+ ou NCX1 a été aplifi de , fois. Auue aiatio d’epessio pou la pope à aliu (Ca2+-ATPase4) de la eae plasiue ’est oseale.

145

Résultats

VS Non Diff Non VS 1

Variation d'expressionVariation (log2) -1

-2 NCX1

SERCA2 SERCA3

Ca ATPase4

Na/K-ATPase a3

Na/K-ATPase b1 Figure R-32 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des échangeurs Na+/K+, SERCA, PMCA et NCX1 déterminé par RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

La figure R-33 ote les aiatios d’epessio des epteus IP (ITPR), à la ryanodine (RYR) et celle des calciprotéines comme la calmoduline (CALM) et la calséquestrine CA“Q, d’u gulateu des “ERCA le phopholaa PLN et des poties phosphatases comme la CAM-PRP. Les résultats obtenus montrent que les transcrits codant pour la calmoduline CALM3 sont hautement réprimés (- 40,5 fois) au cours de la différenciation. Nous observons une légère induction des transcrits codant pour le PLN (+ 2,9 fois) et le ITPR1 (+ 3,4 fois et auue aiatio de l’epessio des transcrits codant pour CALM1, CASQ2, CAM-PRP, RYR2 et TTPR3.

146

Résultats

3 2 1 0 -1 -2 -3 -4

VS Non Diff Non VS -5 -6 Variation d'expressionVariation (log2) -7 -8

-9 PLN

RYR2

ITPR1 ITPR3

CALM1 CALM3

CASQ2

CAM-PRP

Figure R-33 : Effet de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+ su l’epessio giue des ateus iplius das l’hoostasie aliue dtei pa RT-qPCR. (n = 4). Le graphe illustre les variations d'expression de gènes (en log 2) des cellules différenciées versus les cellules non différenciées. Entre 1 et -, l’epessio des ges e aie pas ei oespod à des aiatios de + 2 fois et - 2 fois par rapport aux cellules non différenciées). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées.

L’esele des ges dot le ieau d’epession varie entre l’tat souhe et l’tat diffei des CSCs W8B2+ est résumé dans le tableau R-1.

147

Résultats

Tableau R-1 : Etat d’epessio des piipau ges dot l’epessio vaie avat et aps différenciation cardiaque des CSCs W8B2+.

Gène Expression dans les CSCs Expression après différenciation des CSCs W8B2+ W8B2+ GATA4 Forte Invariable TBX3 Forte Invariable GATA5 Absente Induite GATA6 Présente Induite ANKB Absente Induite MYL7 Absente Induite Connexine 43 Forte Invariable

NaVb1 Forte Invariable

NaVb2 Absente Induite

NaVb3 Absente Induite

NaV1.3 Présente Réprimée

NaV1.4 Absente Induite

NaV1.5 Absente Induite

NaV1.7 Absente Induite

NaV2.1 Absente Induite

KV3.4 Forte Invariable

KV4.2 Forte Induite

KV1.2 Absente Induite

KV1.4 Absente Induite

KV1.5 Absente Induite

KV1.7 Absente Induite

KV2.1 Absente Induite

KV4.3 Absente Induite MIRP1 Présence Induite MIRP3 Forte Induite Kir2.1 Forte Légèrement réprimée Kir6.1 Forte Invariable Kir6.2 Très faible Induite Kir3.1 Absente Induite Kir2.3 Absente Induite TWIK1 Forte Invariable TASK1 Absente Induite HCN2 Forte Induite HCN1 Absente Induite HCN3 Très faible Induite HCN4 Absente Induite

CaV2d1 Forte Invariable

CaVa2d2 Absente Induite

CaVb2 Absente Induite

148

Résultats

CaV1.2 Absente Induite

CaV1.3 Absente Induite

CaV3.2 Absente Induite Pompe Na+/K+ b1 Forte Induite Pompe Na+/K+ a3 Absente Induite SERCA2 Forte Invariable SERCA3 Forte Induite Pompe calcique Forte Invariable NXC1 Forte Induite CALM1 Forte Invariable CALM3 Forte Réprimée Calcineurine Forte Invariable (CAM-PRP) ITPR1 Forte Induite ITPR3 Forte Invariable BNP Forte Induite KCa1.1 Présente Non étudiée KCa3.1 présente Non étudiée

Das le ut d’alioe la diffeiatio e adiootes des C“Cs WB+, nous avons opté pour une approche optogénétique par expression du canal rhodopsine 2 (CHR2) dépolarisant capable de transporter du sodium et des protons activé par flash lumineux dans le bleu.

Cette dépolarisation pourrait être un puissant déclencheur de la différenciation cardiaque tel u’il a djà t ot das d’aute tpe de ellules souhes (Stroh et al., 2011).

Nos résultats préliminaires ont montré que cette stimulation par optogénétique au cours de la différenciation des CSCs W8B2+, ’alioe pa la diffeiatio adiaue ie au contraire comme le montre la figure R-34. En effet, le profil génique des CSCs W8B2+ différenciées avec stimulation optogénétique est très similaire à celui des CSCs W8B2+ non différencié.

149

Résultats

Figure R-34 : Regroupement (clustering) hiérarchique des gènes (données normalisées en - ΔCt das les C“Cs WB+ (Non Diff), les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque (Diff), les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation optogénétique du CHR2 (Diff CHR2). Diff GFP représente les CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque et stimulation optogénétique de la GFP, utilisée comme contrôle.

150

Résultats

2 Etude de l’ativit aliue au ous de la diffeiatio adiaue in vitro des CSCs W8B2+ La bibliographie actuelle montre que très peu de travaux sont publiés sur le décryptage de la sigatue de l’atiit et la sigalisatio aliue das les ellules souhes adiaues. Seule une étude réalisée sur les CSCs c-kit+ a montré que ces progéniteurs cardiaques pouvaient présenter des oscillations calciques spontanées qui semblaient jouer un rôle essentiel dans la régulation de la croissance cellulaire (Ferreira-Martins et al., 2009).

Cepedat, auue aatisatio de l’atiit aliue au ous de la diffeiatio des C“Cs ’a t appote. Note ojetif est do de suie l’atiit aliue des C“Cs WB+ au cours de leur différenciation cardiaque in vitro et d’appote des léments de réponse qui pouaiet ous aide à ieu opede l’ipliatio du aliu das le poessus de différenciation.

2.1 Sigatue de l’ativit spotae aliue au ous de la diffeiatio adiaue in vitro des CSCs W8B2+ Pour étudier et suivre l’olutio de l’atiit aliue spotae au ous de la différenciation in vitro des CSCs W8B2+, nous avons utilisé la sonde calcique GCaMP6s comme senseur des changements de concentrations calciques intracellulaires. Via cette sonde, nous pouvons suie l’olutio de l’atiit aliue tout au log du potoole de diffeiatio cardiaque in vitro (4 semaines) des CSCs W8B2+.

L’eegisteet de l’atiit aliue a t alis pa iosopie ofoale à °C. Les variations de fluorescence de cette dernière reflètent les variations de calcium intracellulaires. Les enregistrements calciques bruts obtenus par microscopie confocale sont ensuite analysés à l’aide d’ue ao appliue sous Iage J ui peet de uatifie les aiatios de fluorescence globales dans chaque cellule étudiée. Ces variations de fluorescence peuvent être présentées sous forme de courbes en fonction du temps.

Les sultats oteus otet ue l’atiit aliue eegiste su les C“Cs WB+ en début de différenciation (2ème jour de différenciation) et à la fin du protocole de différenciation (28ème jou se psete sous foe d’osillatios aliues (figure R-35).

151

Résultats

A 1.2

1.0

0.8

0.6

F/F0 (U.A) F/F0

 0.4

0.2

0.0 200 400 600 Temps (s)

B 1.2

1.0

0.8

0.6

F/F0 (U.A) F/F0

 0.4

0.2

0.0 200 400 600 Temps (s)

Figure R-35 : Tpes d’atiits aliues spotaes eegistes au ème jour (A) et au 28ème jour + 2+ (B) de différenciation des CSCs W8B2 . Les graphes illustrent les variations de la [Ca ]i représentées pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : 2+ fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire. [Ca ]i : concentration en calcium intracellulaire.

152

Résultats

Les oscillations obtenues au 2ème jour de différenciation cardiaque sont irrégulières, plus fréquentes, et présentent une amplitude nettement plus faible que les oscillations obtenues au 28ème jour de différenciation.

2.2 Evolution des paramètres calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ Afi d’tudie etais paates de l’atiit aliue eegiste au ous de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+, dans chaque cellule, les variations de globales fluorescence obtenues sous Image J ont été analysées grâce à une application développée au laboratoire sous le langage IDL (Interactive Data Language). Cette application permet de mesurer différents paramètres cinétiques des oscillations calciques obtenues comme ; l’aplitude, la fuee, la due, l’aie sous la oue, le TTP tie to peak, le TTR tie to eoe ou eoe le pouetage du teps d’atiit oi atiels et thodes.

L’olutio de es paates est epsete pa seaie pedat uate seaies de différenciation :

1ère semaine de différenciation : regroupant toutes les oscillations calciques obtenues entre le 2ème et le 7ème jour post-différenciation.

2ème semaine de différenciation : regroupant toutes les oscillations calciques obtenues entre le 8ème et le 14ème jour pos-différenciation.

3ème semaine de différenciation : regroupant toutes les oscillations calciques obtenues entre le 15ème et le 21ème jour post-différenciation.

4ème semaine de différenciation : regroupant toutes les oscillations calciques obtenues entre le 22ème et le 28ème jour de différenciation.

2.2.1 Evolution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ Les résultats représentés dans la figure R-36A, montrent que la fréquence des oscillations calcique diminue progressivement au cours des 4 semaines de différenciation.

153

Résultats

A 1.0

0.8

** 0.6

*** 0.4 ***

Fréquence (pic/min) Fréquence 0.2 n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0.0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine) B

1.5 * ns ns 1.0

0.5

Amplitude (U.A) Amplitude n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0.0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine)

Figure R-36 : Evolution de la fréquence (A) et de l’aplitude (B) de l’atiité calcique spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. se . L’aalse statistiue est effetue pa u test Aoa Nopaaeti epeated Measues One-Way ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

154

Résultats

En effet, cette fréquence baisse significativement et diminue de 0,75 pic/min en semaine 1 à 0,31 pic/min en semaine 4 de différenciation (soit une diminution de 58,7 %). Cette diminution de la fréquence est également significative en comparant la semaine 1 avec la semaine 2 (une baisse de 20%) et la semaine 1 avec la semaine 3 (une baisse de 50,6%).

2.2.2 Evolutio de l’aplitude des osillatios aliues au ous de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

L’aplitude aiale de fluoesee appote des idiatios su la uatit de calcium libéré. Les résultats représentés dans la figure R-36B, otet ue l’aplitude des oscillations calciques augmente progressivement à chaque semaine de différenciation jusu’à atteindre une significativité statistique à la semaine 4. Cette amplitude passe de 0,7 U.A en semaine 1 à 1,2 U.A en semaine 4. Ceci représente une augmentation significative de l’aplitude de 1,4%.

2.2.3 Evolution de la durée des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ La figure R-37A montre que la durée des oscillations calciques augmente progressivement au cours des quatre semaines de différenciation. Cette durée est de 36,8 s en semaine 1 contre 88,7 s en semaine 4 soit une augmentation significative de 141%.

Cette augmentation est aussi significative entre la semaine 1 (36,8 s) et la semaine 3 (74,2 s) soit 101,6% d’augetatio.

2.2.4 Evolutio de l’aie des osillatios aliues au ous de la diffeiation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ L’aie sous la oue appote des idiatios su l’ipotae des osillatios aliues puisu’elle ped e opte à la fois l’aplitude du phoe et sa due. La figure R-37B ote ue l’aie sous la oue augmente progressivement au cours des quatre semaines de diffeiatio. L’aie augete sigifiatieet de , U.A.s e seaie à , U.A.s e semaine 4 (soit une augmentation de 210,9%).

155

Résultats

A 100 *** ** 80

60 ns

Durée (s) Durée 40

20 n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine)

** 60 ns

40 ns

Aire (U.A) Aire

20 n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine)

Figure R-37 : Evolution de la durée (A) et de l’aie (B) de l’atiit aliue spotae au ous des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. **p<., ***p<. s. se . L’aalse statistique est effectuée par un test Anova (Nonparametric repeated Measures One-Way ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

156

Résultats

2.2.5 Evolution du TTP (time to peak) des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ Le TTP est le temps mis pour atteindre le pic ou le maximum de fluorescence « F ». Le TTP apporte des indications sur le temps des libérations calciques intracellulaire.

La figure R-38A montre que le TTP augmente progressivement au cours des quatre semaines de différenciation cardiaque et il passe de 9,8 s en semaine 1 à 26 s en semaine 4 (soit une augmentation significative de 165,3%). Cette augmentation est également significative entre la semaine 1 et la semaine 3 post-différenciation (augmentation significative de 120,1%).

2.2.6 Evolution du TTR (time to recovery) des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ Le TTR est le temps mis pour atteindre la fluorescence de base « F0 ». Le TTR apporte des indications sur le temps des recaptures et extrusions calciques intracellulaires.

La figure R.38B montre que le TTR augmente progressivement entre la semaine 1, la semaine 2 et la semaine 4 post-différenciation. Entre la semaine 2 et la semaine 3 post- différenciation, le TTR reste stable.

Le TTR passe de 27 s en semaine 1 à 62,7 s en semaine 4 (soit une augmentation significative de 132,2%). Cette augmentation est également significative entre la semaine 1 et la semaine 3 (augmentation significative de 52,9%) et la semaine 1 et la semaine 2 post- différenciation (augmentation significative de 50,3%).

157

Résultats

A 40

30 *** **

TTP(s) ns

10 n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine)

B 80

*** 60 * * 40

TTR(s)

20 n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine)

Figure R-38 : Evolution de TTP (A) et de TTR (B) de l’atiit aliue spotae au ous des semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. sem 1. L’aalse statistiue est effetue pa u test Aoa Nopaaeti epeated Measues Oe-Way ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

2.2.7 Evolution des pentes 1 et 2 des oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ Les pentes 1 et 2 apportent respectivement des indications sur les vitesses de libération et de recapture calciques. La figure R-39 montre que la pente 1 (figure R-39A) et la pente 2 (figure R-39B) des oscillations calciques varient faiblement au cours des quatre semaines de

158

Résultats différenciation cardiaque in vitro. La pente 1 varie de manière non significative et diminue de 0.07 U.A/s en semaine 1 à 0,04 U.A/s en semaine 4 (figure R-39A).

La pente 2 augmente de -0.02 U.A/s en semaine 1 à -0.01 U.A/s en semaine 4 avec une variation statistiquement non significative (figure R-39B).

A 0.15

0.10 ns

Pente 1 Pente ns 0.05

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0.00 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine) B

Temps de différenciation (semaine) sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 0.00

n = 65 n = 42 n = 36 n = 65 -0.01

ns -0.02 ns

Pente 2 Pente ns -0.03

Figure R-39 : Evolution de la pente 1 (A) et de la pente 2 (B) de l’atiit aliue spotae au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. s s. se . L’aalse statistiue est effectuée par un test Anova (Nonparametric repeated Measures One-Way ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

159

Résultats

2.2.8 Evolutio du pouetage du teps d’ativit alcique au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ Le pouetage du teps d’atiit aliue est u paate ts ipotat a il ped en considération la fréquence et la durée des oscillations calciques.

La figure R-40 ote laieet ue le pouetage du teps d’atiit au ous des quatre semaines de différenciation cardiaque in vitro. Ce pourcentage varie faiblement et sans aucune significativité statistique (37,9% en semaine 1, 47,7% en semaine 2, 39,7% en semaine 3 et 42,4% en semaine 4).

60 ns ns ns 40

% temps d'activité temps % n = 65 n = 42 n = 36 n = 65

0 sem 1 sem 2 sem 3 sem 4 Temps de différenciation (semaine)

Figure R-40 : Eolutio du teps d’atiit epi e pouetage de l’atiit aliue spontanée au cours des 4 semaines de différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. (N = 3). Sem : semaine, U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre total des cellules analysées. s s. se . L’aalse statistique est effectuée par un test Anova (Nonparametric repeated Measures One-Way ANOVA) suivi par un test de Newman-Keuls.

160

Résultats

2.3 Identification des acteurs impliqués dans la génération des oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées Pou alue le ôle des diffets ateus ajeus de l’hoostasie aliue das la génération des oscillations calciques observées dans les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation cardiaque in vitro, ous aos tudi l’effet de l’ihiitio spifiue de hau de es ateus à l’aide d’agets phaaologiues.

Soit :

 L’hageu Na+/Ca2+ ou NCX: ihi pa l’aget phaaologiue “EA  La pompe à calcium du réticulum sarco-endoplasmique (SERCA) : inhibée par la thapsigargine

 Les epteus à l’IP : inhibés par la xéstospongine C et le 2-APB (2- Aminoethoxydiphenyl borate)

 Les canaux calciques dépendants du voltage de type L : inhibés par la nifédipine  Les récepteurs à la ryanodine : inhibés par la ryanodine à forte concentration

Nous nous également testé :

 L’effet de la sphigosie -phosphate, un second messager lipidique connu pour moduler les stocks calciques intracellulaires

 L’effet de l’ihiitio du aal BKCa ; u aal potassiue dot l’atiatio est dpedate de l’hoostasie aliues itaellulaie.

Les effets observés lors de cette étude pharmacologique sur les oscillations calciques sont analysés grâce à Image J et les paramètres calciques décrits précédemment sont analysés grâce à une application développée au laboratoire sous le langage IDL (Interactive Data Language).

2.3.1 Effet de l’ihiitio de l’hageu NCX su les osillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours Le “EA ihiiteu sletif de l’hageu Na+/Ca2+ ou NCX, utilisé à 10 µM abolit totalement les oscillations calciques observées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation (figure R-41).

161

Résultats

SEA-0400 0.8

0.6

0.4

0.2

F/F0 (U.A) F/F0



0.0 300 600 900 1200 Temps (s) -0.2

Figure R-41 : Effet de SEA- ihiiteu de l’hageu NCX su l’atiit aliue spotae enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les 2+ variations de la [Ca ]i epsetes pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire.

L’ajout du “EA à teps = s, oïide ae l’ouee d’ue ème oscillation calcique suivie d’u etou à l’tat asal sas auue osillatios ouelles.

2.3.2 Effet de l’ihiitio de la SERCA su les osillatios aliues das les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours Pou estie le deg d’ipliatio de la pope à calcium (Ca2+-ATPase) du réticulum sarcoplasmique et endoplasmique (SERCA) dans la génération des oscillations calciques obtenues sur les W8B2+ CSCs après 28 jours de différenciation cardiaque in vitro, nous avons testé son inhibiteur, la thapsigargine (figure R-42).

L’appliatio de µM de thapsigargine (ajout au temps t = 750 s), est suivie de l’appaitio d’ue ème oscillation calcique interrompue par une nouvelle augmentation calcique qui diminue progressivement.

162

Résultats

3.5 Thapsigargine

3.0

2.5

2.0

1.5

F/F0 (U.A) F/F0

 1.0

0.5

0.0 300 600 900 1200 1500 Temps (s)

Figure R-42 : Effet de la thapsigagie ihiiteu de la “ERCA su l’atiit aliue spotae enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les 2+ variations de la [Ca ]i epsetes pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire.

2.3.3 Effet de l’ihiitio des aau CaV de type L sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours L’ajout das le ilieu de µM de ifdipie oue oe loueu des aau aliues de type L) à t = 600s augmente transitoirement la concentration du calcium cytoplasmique (figure R-43).

Cette augmentation est suivie d'ue aisse pogessie jusu’à l'appaitio d'u plateau.

163

Résultats

1.5

Nifédipine

1.0

0.5

F/F0 (U.A) F/F0



0.0 300 600 900 1200 Temps (s)

Figure R-43 : Effet de la nifédipine (inhibiteur des CaV de tpe L su l’atiit aliue spotae enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les 2+ variations de la [Ca ]i epsetes pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire.

2.3.4 Effet de l’ihiitio des epteus à l’IP sur les oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours

L’ajout de µM de stospogie C ihiiteu spifiue des IP à t = s (figure R-44A), iduit ue diiutio sigifiatie ,% de l’aplitude pa appot au otrôle (figure R-44Ba), une augmentation significative (63,3%) de la durée des oscillations calciques (figure R-44Bd) et aucun changement concernant la fréquence (figure R-44Bb) et l’aie (figure R-44Bc).

164

Résultats

A Xéstospongine C 1.0

0.5

F/F0 (U.A) F/F0



0.0 300 600 900 1200 1500 1800 Temps (s) B a b 1.0 0.6 ns 0.8

0.4 0.6 **

0.4 0.2 n = 10 n = 20 n = 4 n = 8 Amplitude (U.A) Amplitude 0.2

Fréquence (pic/min) Fréquence

0.0 0.0 Contrôle Xéstospongine C Contrôle Xéstospongine C

c 40 d 150 ns * 30 100 20

Durée (s) Durée Aire (U.A.s) Aire 50 10 n = 11 n = 20 n = 11n = 24

0 0 Contrôle Xéstospongine C Contrôle Xéstospongine C

Figure R-44 : (A) Effet de la stospogie C ihiiteu des epteus à l’IP su l’atiit aliue spontanée enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent 2+ les variations de la [Ca ]i epsetes pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire. (B) Effet de la stospogie C su l’aplitude (a), la fréquence (b), l’aie (c) et la durée (d) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : oe d’eets (oscillations) enregistrés. *p<0.05, **p<0.01 vs. Cotôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test t Nopaaeti t test.

165

Résultats

De plus, la figure R-45 montre que le traitement à la xéstospongine C provoque une augmentation significative (105,7%) du TTR (figure R-45B) et aucun changement pour le TTP (figure R-45A), de la pente 1 (figure R-45C), la pente 2 (figure R-45 D) et le pourcentage du teps d’atiit (figure R-45E).

A B 25 150

20 * ns 100 15

TTP (s) TTP TTR (s) TTR 50 n = 11 n = 27 5 n = 11 n = 26 0 0 Contrôle Xéstospongine C Contrôle Xéstospongine C

C 0.15 D 0.000

ns -0.005 n = 11 n = 27 0.10 -0.010

-0.015 0.05

Pente 1 U.A/s 1 Pente

Pente 2 U.A/s 2 Pente -0.020 ns n = 11 n = 27

0.00 -0.025 Contrôle Xéstospongine C Contrôle Xéstospongine C

E 80 ns 60

20 n = 3 n = 8

% temps d'activité temps %

0 Contrôle Xéstospongine C

Figure R-45 : Effet de la stospogie C ihiiteu des epteus à l’IP su le TTP (A), le TTR (B), la pente1 (C), la pente 2 (D) et le pouetage du teps d’atiit (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). U.A : unité arbitraire, ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : oe d’eets osillatios eegists. *p<. s. Cotôle. L’aalyse statistique est effectuée par un test t (Nonparametric t test). 166

Résultats

Nous avons ensuite testé le 2-APB connu comme étant est un autre inhibiteur des epteus à l’IP ais ae ois de spifiit ue la stospogie C.

En effet, selon la concentration utilisée, le 2-APB agit sur des cibles différentes. Le 2-

APB est u atagoiste des epteus à l’IP IC50 = μM et u odulateu des aau “OCs (store-operated calcium channels) (Diver et al., 2001; Ma et al., 2002; Prakriya and Lewis, 2001). Le 2-APB stimule les libérations calciques à partir des SOCs pour de faibles concentrations (< µM et les ihie à fotes oetatios jusu’à µM.

Les sultats otet ue l’ajout de et µM de 2-APB ’ipate isileet pas les oscillations calciques observées dans les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation cardiaque in vitro (figure R-46 A).

Cepedat, l’aalse des paates itiues des osillatios calciques après traitement au 2-APB, ote des effets su etais paates oe l’aplitude, l’aie, la due, le TTP et le TTR.

Le 2-APB à µM, augete l’aplitude de ,% pa appot au otôle et à l’iese, la diminue de 26% quand il est utilisé à 50 µM (figure R-46 Ba). Le 2-APB utilis à µM ’a pas d’effet sigifiatif su la fuee (figure R-46 Bb), l’aie (figure R-46 Bc), la durée (figure R- 46 Bd), le TTP (figure R-47 A), le TTR (figure R-47 B), la pente 1 (figure R-47 C), la pente 2 (figure R-47 D) et le pourcetage du teps d’atiit (figure R-47 E).

Le 2-APB à µM, ’a pas d’effet su la fuee (figure R-46 Bb) mais diminue de 61,5% l’aie (figure R-46 Bc) et diminue de 45,1% la durée (figure R-46 Bd). De plus, le 2-APB à 50 µM ’a pas d’effet su le TTP (figure R-47 A), la pente 1 (figure R-47 C) et la pente 2 (figure R- 47 D) mais diminue de 56,3% le TTR (figure R-45 B) et de 48,4% le pourcentage du temps d’atiit (figure R-47 E).

L’esele de es sultats sugget ue patiipatio sigifiatie de la voie IP3 sesile ui seait ipliue plus spifiueet das l’itesit du sigal aliue sas altérer sa fréquence.

167

Résultats

2APB 5 µM 2APB 50 µM A 1.5

1.0

F/F0 (U.A) F/F0

 0.5

0.0 300 600 900 1200 1500 1800 Temps (s) B a b 1.5 0.5 * ns 0.4 1.0 ns ** 0.3

0.2 0.5

Amplitude (U.A) Amplitude 0.1

n = 15n = 11 n = 4 (pic/min) Fréquence n = 6n = 2n = 4

0.0 0.0

Contrôle Contrôle 2APB 5 µM 2APB 5 µM 2APB 50 µM 2APB 50 µM c d 150 ns 200 ns

150 100

100 *

50 (s) Durée

Aire (U.A.s) Aire * 50 n = 16n = 12 n = 4 n = 16 n = 4 n = 12 0 0

Contrôle Contrôle 2APB 5 µM 2APB 5 µM 2APB 50 µM 2APB 50 µM

Figure R-46 : (A) Effet du 2-APB et µM su l’atiit aliue spotae eegiste su les C“Cs + 2+ W8B2 après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les variations de la [Ca ]i représentées pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP).U.A : unité arbitraire. (B) Effet du 2-APB (5 et 50 µM) sur l’aplitude (a), la fréquence (b), l’aie (c) et la durée (d) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre d’eets osillatios eegists. *p<., **p<. s. Cotôle. L’aalse statistiue est effectuée par un test one way ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

168

Résultats

A B 80 150 ns ns 60 100

40 ns

TTP (s) TTP TTR (s) TTR 50 * 20

n = 16n = 4 n = 12 n = 16 n = 4 n = 10 0 0

Contrôle Contrôle 2APB 5 µM 2APB 5 µM 2APB 50 µM 2APB 50 µM

C 0.15 D 0.0 ns n = 16 n = 4 -0.0 n = 12 0.10

-0.0 ns ns 0.05 Pente 1 U.A/s 1 Pente U.A/s 2 Pente -0.0 ns n = 16 n = 4 n = 12 0.00

Contrôle Contrôle 2APB 5 µM 2APB 5 µM 2APB 50 µM 2APB 50 µM E 80

60 ns 40 *

20 % temps d'activité temps % n = 5 n = 2 n = 4 0

Contrôle 2APB 5 µM 2APB 50 µM

Figure R-47 : Effet du 2-APB (5 et 50 µM) sur le TTP (A), le TTR (B), la pente1 (C), la pente 2 (D) et le pouetage du teps d’atiit (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : oe d’eets osillatios eegists. *p<. s. Cotôle. L’aalse statistique est effectuée par un test one way ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

169

Résultats

2.3.5 Effet de l’ihiitio des epteus à la aodie su les osillatios aliues dans les CSCs W8B2+ différenciées pendant 28 jours L’ajout de µM de aodie ihiiteu des RR à fote oetatio à t = s (figure R- 48A), ’iduit auu hageet su l’aplitude (figure R-48 Ba), la fréquence (figure R-48 Bb), l’aie (figure R-48 Bc), la durée des oscillations calciques (figure R-48 Bd).

2.5 A Ryanodine 2.0

1.5

1.0

F/F0 (U.A) F/F0

 0.5

0.0 300 600 900 1200 Temps (s)

B a b 2.0 0.5 ns ns 0.4 1.5

0.3 1.0 0.2

0.5 n = 5 n = 2 n = 2

Amplitude (U.A) Amplitude n = 5 0.1

Fréquence (pic/min) Fréquence

0.0 0.0 Contrôle Ryanodine Contrôle Ryanodine

c d 150 150 ns

100 ns 100

Durée (s) Durée

Aire (U.A.s) Aire 50 50 n = 5 n = 5 n = 5 n = 5

0 0 Contrôle Ryanodine Contrôle Ryanodine

Figure R-48 : (A) Effet de la aodie µM su l’atiit aliue spotae eegiste su les C“Cs + 2+ W8B2 après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les variations de la [Ca ]i représentées pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP). U.A : unité arbitraire. (B) Effet de la aodie µM su l’aplitude (a), la fréquence (b), l’aie (c) et la durée (d) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : oe d’eets (oscillations) enregistrés. ns s. Cotôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test t Nopaaeti t test.

170

Résultats

De plus ette ihiitio ’affete pas le TTP (figure R-49A), le TTR (figure R-49B), la pente 1 (figure R-49C), la pente 2 (figure R-49D) et le pouetage du teps d’atiit (figure R-49E). Ce sultat oooe l’asee d’epessio du epteu aodie (figure R-19 et figure R- 32) sur les W8B2 en début et en fin de différenciation.

A B 80 100

80 60 ns ns 60 40 40

TTP (s) TTP

TTR (s) TTR 20 n = 5 n = 5 20 n = 5 n = 5 0 0 Contrôle Ryanodine Contrôle Ryanodine C D 0.025 0.000

0.020 n = 5 n = 5 ns -0.005 0.015 -0.010 0.010

Pente 1 U.A/s 1 Pente Pente 2 U.A/s 2 Pente -0.015 0.005 ns n = 5 n = 5

0.000 -0.020 Contrôle Ryanodine Contrôle Ryanodine E

80 ns

20 n = 2 n = 2

% temps d'activité temps %

0 Contrôle Ryanodine

Figure R-49 : Effet de la ryanodine (50 µM) sur le TTP (A), le TTR (B), la pente 1 (C), la pente 2 (D) et le pourcentage du teps d’atiit (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre d’eets osillatios eegists. s s. Cotôle. L’aalse statistique est effectuée par un test t (Nonparametric t test).

171

Résultats

Chapitre II : Rôle du canal BKCa dans la régulation de la prolifération et de l’auto-renouvellement des CSCs W8B2+

Les résultats présentés dans ce chapitre sont présentés sous format article scientifique. Ce dernier est soumis dans le journal « The FEBS Journal » et il est actuellement en révision.

L’atile sietifiue s’ititule « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS EXPRESSING W8B2».

1 Cade de l’tude Le œu huai adulte aite plusieus populatios de ellules souhes adiaues ui expriment des marqueurs spécifiques. Récemment, une nouvelle population positive pour le marqueur W8B2 a été identifiée. Ces cellules souches cardiaques exprimant W8B2 (CSCs W8B2+) ont une origine mésenchymateuse et présentent un fort potentiel thérapeutique (Zhang et al., 2015a). Cependant, le profil électrophysiologique de ces cellules n'a pas encore été caractérisé. Nous nous sommes donc focalisés sur la caractérisation des canaux fonctionnels exprimés par les CSCs W8B2+ et leurs éventuels rôles dans la régulation de leurs propriétés (auto-renouvellement, prolifération et migration cellulaire) qui sont importantes pour le maintien de leur nombre et de leur mobilité pour la réparation tissulaire tout au long de la vie. Grâce à la technique du patch-clamp, nous avons montré pour la première fois la signature

letophsiologiue d’u ouat BKCa dans ces cellules.

Les canaux potassiques à large conductance activés par le calcium, ou BKCa, sont des aau ui s’ouet suite aux changements du potentiel électrique membranaire et/ou suite à l’augetatio du calcium intracellulaire. Ces canaux se trouvent dans de nombreux tissus et participent à divers processus cellulaires (Toro et al., 2014). Les canaux BKCa sont impliqués dans la modulation de l'excitabilité vasomotrice et nerveuse en régulant le potentiel de membrane et la signalisation calcique (Nelson and Quayle, 1995). En outre, cette large conductance potassique contribue au maintien du potentiel de membrane dans les petits vaisseaux myogéniques (Waldron and Cole, 1999). Il est intéressant de noter que ce canal joue un rôle clé dans de nombreux processus biologiques tels que le métabolisme cellulaire, la prolifération, la migration et l'expression des gènes. En plus de ses rôles physiologiques, le canal BKCa est impliqué dans plusieurs

172

Résultats pathologies comme l'obésité ou le cancer (Toro et al., 2014). Cepedat, l’epessio fonctionnelle et le rôle des canaux BKCa dans les cellules souches cardiaques humaines, restent peu étudiés.

+ Après avoir identifié le canal fonctionnel BKCa dans notre modèle de CSCs W8B2 , nous avons donc voulu étudier son rôle physiologique dans la régulation des processus fondamentaux de ces cellules souches comme l'auto-renouvellement, la prolifération et la migration.

2 Résumé des résultats Coe ous l’aos djà dit pdeet hapite I résultat (p 114) Les CSCs W8B2+ isolées par tri magnétique suivi du tri par FACS, ont une morphologie étalée et fusifoe oe elle des fiolastes et possdet des apaits d’auto-renouvellement (démontrées par le test de formation de colonies « CFU-Fs »). De plus, ces cellules polifaiet apideet ae u teps de ddouleet d’eio h. L'aalse pa cytométrie de flux a révélé que les CSCs W8B2+ expriment fortement les marqueurs de surface associés aux cellules souches mésenchymateuses (W8B2, CD29, CD73 et CD105) et sont négatives pour les marqueurs hématopoïétiques (CD34, CD45 et CD133). Au niveau génique, les CSCs W8B2+ ont montré une forte expression des facteurs de transcription cardiaque spécifiques précoces comme GATA4 et MEF2C mais pas Nkx2.5. De plus, ces cellules expriment les transcrits codant pour la connexine 43 (isoforme cardiaque) mais pas les transcrits codant pour les structures contractiles cardiaques (ACTC1, TNNT2, b-MHC). Les enregistrements de courants obtenus par la technique de patch clamp (en configuatio ellule etie, ot l la psee d’u ouat potassiue de tpe BKCa bloqué par la paxilline. L'identité moléculaire du canal BKCa a été confirmée au niveau transcriptionnel par RT-PCR et au niveau protéique par Western Blot dans les CSCs W8B2+.

+ Pour évaluer le rôle du canal BKCa dans la prolifération cellulaire des CSCs W8B2 , la paxilline a t utilise pou loueu spifiueet e aal. La paillie utilise à μM et μM a progressivement inhibé la prolifération à partir du 4èe jou e ultue. D’aute pat, l'aalse du le ellulaie pa totie de flu, a ot ue la paillie μM et patiulieet à 10 µM) a significativement augmenté la fraction de la population cellulaire en phase G1 et considérablement diminu la fatio de la populatio ellulaie e phase “/G. L’ihiitio + du canal BKCa a affecté l'auto-renouvellement des CSCs W8B2 . En effet, la paxilline (utilisée à

173

Résultats

, et μM a osidaleet duit le oe de oloies CFU-Fs après dix jours de culture. Concernant la migration cellulaire évaluée par le test de blessure (wound healing), les résultats ont montré que le blocage du canal BKCa par la paxilline ne réprime pas les capacités migratoires des cellules.

L’esele de es sultats dote que le canal BKCa est probablement un régulateur clé de la prolifération et de l'auto-renouvellement des CSCs W8B2+ et fournit une base pour une meilleure compréhension de la physiologie de ces cellules. De nouvelles recherches, basées sur la relation ente le potetiel de eae et l’atiit aliue via les canaux BKCa, semblent primordiales pour ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

3 Article scientifique: « FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS EXPRESSING W8B2».

174

Résultats

FUNCTIONAL BKCa CHANNEL IN HUMAN RESIDENT CARDIAC STEM CELLS EXPRESSING W8B2 Ayad O , Magaud C, Sebille S, Bescond J, Cognard C, Faivre JF, Bois P* and A Chatelier*

Equipe Transferts Ioniques et Rythmicité Cardiaque, Laboratoire Signalisation et Transports Ioniques Membranaires, ERL CNRS 7368, EA 7349, Université de Poitiers *These authors have contributed equally to this work

ABSTRACT Recently, a new population of resident cardiac stem cells positive for W8B2 marker has been identified. These cardiac stem cells (CSCs) are considered an ideal cellular source to repair myocardial damage after infarction. However, the electrophysiological profile of these cells has not been characterized yet. We first establish the conditions of isolation and expansion of W8B2+ CSCs from human heart biopsies using magnetic sorting system followed by flow cytometry cell sorting. These cells display a spindle-shaped morphology, are highly proliferative and possess self-renewal capacity demonstrated by their ability to form colonies. Besides, W8B2+ CSCs are positive for mesenchymal markers but negative for hematopoietic and endothelial ones. RT-qPCR and immunostaining experiments show that W8B2+ CSCs express some early cardiac-specific transcription factors but lack the expression of cardiac- specific structural genes. Using patch-clamp in whole cell configuration, we show for the first time the electrophysiological signature of BKCa current in these cells. Accordingly, RT-PCR and western blotting analysis confirm the presence of BKCa at both mRNA and protein levels in W8B2+ CSCs. Interestingly, BKCa channel inhibition by paxilline decreases cell proliferation in a concentration-dependent manner and cell cycling progression by accumulating the cells at G0/G1 phase. The inhibition of BKCa also decreased self-renewal capacity but did not affect W8B2+ CSCs migration. Taken together, our results are consistent with an important role of BKCa channels on cell cycle progression and self-renewal in human cardiac stem cells. Key words: W8B2+ CSCs, BKCa channel, cell proliferation, cell cycle; migration; patch-clamp; self-renewal. INTRODUCTION The adult human heart harbors several populations of cardiac stem/progenitor cells that express specific markers. Recently a new population was identified which is positive for W8B2 marker (also called mesenchymal stem cell antigen-1) and shows high expression of mesenchymal but not hematopoietic nor endothelial markers. W8B2 positive cardiac stem cells (W8B2+ CSCs) exhibit a strong therapeutic potential when transplanted into a chronic myocardial infarction rat model [1]. Self-renewal, proliferation and migration are important properties that allow the perpetuation of progenitor cells and their mobility for repairing processes during life. However, the mechanisms that control these properties still have to be characterized in W8B2+ CSC.

175

Résultats

High-conductance calcium-activated potassium channels (BKCa) are found in many tissues and participate in variety of cellular processes [2]. These channels are gated open by both binding of intracellular calcium and membrane depolarization. BKCa channels are involved in the modulation of vasomotor and nerve excitability by regulating membrane potential and calcium signaling [3]. Moreover, this large potassium conductance contributes to the maintenance of the membrane potential in small myogenic vessels [3-5]. Interestingly, increasing evidence indicates that the channel plays a key role in numerous biological processes such as cell metabolism, proliferation, migration, and gene expression. It strongly impacts physiological cell functions, for example in human primary skeletal myoblast [6] or in pathologies like obesity or brain, prostate, and mammary cancers [2]. However, whether these high-conductance calcium-activated potassium channels are functionally expressed in human cardiac progenitor cells remains poorly understood. Although human cardiac W8B2+ progenitor cells have been well characterized, the physiological role of BKCa channel in these cells type has never been reported. In the present study, we identify BKCa channel current expressed in human cardiac W8B2+ progenitor cells isolated from human atrial appendage. We also investigate the role of BKCa on proliferation, migration and self-renewal processes in these progenitor cells. MATERIALS AND METHODS Isolation of W8B2+ CSCs Human right atrial specimens were obtained from 10 adult patients (mean age 72.7 ± 3.2 years, 9 males and 1 female). The right human atrium samples are operational waste resulting from the implementation of extracorporeal cardiac surgery, such as coronary artery bypass surgery, and are obtained in cooperation with the University hospital of Poitiers. All procedures were carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. Freshly harvested specimens were rinsed with PBS and manually minced into 1–2 mm3 fragments and subjected to enzymatic digestion with collagenase A (1 mg/mL, Sigma-Aldrich) for 20 minutes at 37°C. The tissue fragments were plated onto fibronectin-oated dishes μg/L, Rohe Diagnostics) and cultured in explant medium containing IMDM medium (Lonza) supplemented with 20% fetal bovine serum (Biowest), 0. M β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 2 mM L- glutaie, μg/L steptoi “iga-Aldih, μg/L peiilli “iga-Aldrich) and . μg/L aphoteii B “iga-Aldrich), at 37 °C and 5% CO2. Magnetic-activated cell sorting

After 2–3 weeks, monolayers of adherent cells outgrowth from the adherent tissue fragments were collected using enzymatic digestion with Accumax® (Sigma-Aldrich) and partially enriched for W8B2 marker by magnetic Cell Sorting System (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) using W8B2 antibody. The cells were incubated for 15 minutes at 4-8°C in PBS-BSA 0.5% -2 mM EDTA buffer containing FCR Blocking Reagent® (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), mouse anti-MSCA-1 monoclonal antibody coupled to magnetic micro-beads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). After being washed, the cells ee passed though a μ poosit lo ell siee Coig plaed ito a MAC“ ell separation column (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) positioned on a magnet.

176

Résultats

Inside the column, the retained cells were washed with PBS-BSA buffer 0.5% - 2 mM EDTA and then harvested in this same buffer by separating the column from the magnet. The positive fraction (W8B2+ cells) were seeded in growth medium containing 25% EGM-2 (Lonza) and 75% M Loza, suppleeted ith % fetal oie seu Bioest, μg/L steptoi (Sigma-Aldih ad . μg/L aphoteii B “iga-Aldrich), 0.1 mM nonessential amino acids, 100 U/mL penicillin, cultured at 37°C 5% CO2.

Flow cytometry cell sorting After magnetic cell sorting, confluent cells were labeled with W8B2 PE-conjugated antibody and sorted using a FACS Aria Flow cytometer and sorter. Cells were first rinsed with PBS and then harvested by Accumax® (Sigma-Aldrich) enzymatic digestion. The cells were taken up in PBS buffer - BSA 0.5% - 2 mM EDTA and labeled with the isotypic antibody coupled to phycoerythrin (1:11, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) or MSCA-1 (W8B2) antibody coupled to phycoerythrin (1:11, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) for 10 min, in the dark, at 2-8 ° C. After labelling, the cells were washed with PBS buffer - 0.5% BSA - 2 mM EDTA and sorted by a flow cytometer (FACS Aria III, BD). After cell sorting, the collected W8B2+ cells were seeded into flasks with growth medium.

Cell surface marker analysis The cell surface markers of sorted human W8B2+ CSCs were analyzed with flow cytometry. The cells were rinsed twice with pre-cooled PBS and re-suspended in cold PBS containing specific human antibodies from Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany: Mouse IgG1 CD117-APC (1:11), Mouse IgG2a CD45-VioBlue (1:11), Mouse IgG1 CD133/1-VioBright FITC (1:11), Mouse IgG1 CD105-PE(1:11), Mouse IgG2a CD34-PerCP-Vio700 (1:11), Mouse IgG1 CD90-PE-Vio770(1:11), Rec Human IgG1 (S) CD106-FITC :, Mouse IgGκ CD-PE-Vio770 (1:11), Mouse IgG1 CD73-APC (1:11). For each antibody, isotype control antibodies were used: Mouse IgG2a-VioBlue (1:11), REA Control (S)-FITC (1:11), Mouse IgG1-VioBright FITC (1:11), Mouse IgG1-PE (1:11), Mouse IgG2a-PerCP-Vio700 (1:11), Mouse IgG1-PE-Vio770 (1:11), Mouse IgG1-APC (1:11). For flow cytometry florescence compensation, MACS Comp Bead Kit, anti-mouse Igk (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and MACS Comp Bead Kit, anti- REA (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) were used. The cells were incubated at 4 °C in the dark for 10 min, then washed with PBS, and re- suspended for flow cytometry analysis. The percentage of positive cells was analyzed with FACS Aria Flow cytometer based on over 20000 events.

Colony formation assay (colony-forming unit fibroblasts) W8B2+ CSCs were seeded at a density of 5 cells/cm² in a 6-well plate, in growth medium. The growth medium was renewed every 3-4 days. After 10 days of culture, the cells were rinsed with PBS, fixed for 10 min with 4% PFA and finally stained with 0.5% Crystal violet for 30 min (Sigma-Aldrich). The colonies were photographed under a phase contrast microscope and the colonies were counted.

Proliferation assay

177

Résultats

Cells were plated at a density of 133 cells/cm2 in 35mm dishes with growth medium for 9 days. Cells were then synchronized to G0/G1 phase with a culture medium containing 1% FBS for 12 h. Every day, cell number is counted for each condition (control vs paxilline treated) using Malassez cell chamber.

Cell cycle analysis with propidium iodide incorporation Cells were plated and cultured in 35 mm cell culture dishes at a density of 5×102 cells/cm2. Cells were then synchronized to G0/G1 phase with a culture medium containing 1% FBS for 12 h. Briefly, the cells were cultured in normal culture medium with ion channel blocker paxilline for 9 days. The cells were lifted using 0.125% trypsin, washed with PBS, and fixed with 70% ethanol for 30 minutes, cells were incubated with the staining solution (0.1% triton, 50µg/mL of RNase A (Sigma-Aldrich) and 5 µg/mL of propidium iodide (Sigma-Aldrich) in PBS in the dark for 90 minutes. Data were acquired using FACS VERSE cytometer (BD) and the percentage of cell cycle phases was determined using and FLOWJO software (Flowjo LLC). Immunostaining W8B2+ cells were seeded on gelatin-fibronectin coated glass slide. Cells were then fixed, permeabilized and incubated overnight with primary antibodies directed against connexin-43 (1:500, mouse monoclonal antibody, BD Transduction Laboratories, San Jose, CA), GATA4 (1:250, mouse monoclonal antibody, Santa Cruz Biotech,Texas,U.S.A.) and Nkx2.5 (1:250, goat polyclonal antibody, R & D Systems Minneapolis,U.S.A). Cells were washed three times with PBS and incubated for 2 h with the secondary antibody against connexin-43 (1:250, goat anti- mouse alexa 555, Invitrogen,California , U.S.A), GATA-4 (1:250, goat anti-mouse alexa 555, Invitrogen,California , U.S.A) and NKX2.5 (1:250, donkey anti-goat, alexa 555, Invitrogen,California , U.S.A). TOPRO (1:1000, Invitrogen,California , U.S.A) was used for nuclei labelling. Finally, the slides were slide-mounted in Mowiol® (Sigma-Aldrich) and visualized using confocal microscopy. Patch clamp Cells were seeded at a density of 2.103 cells/cm2 in 35mm diameter culture dish 24 h prior to the patch clamp experiments. The ionic currents were recorded on human W8B2+ CSCs in the whole-cell configuration using an Axopatch 200A amplifier with a CV 202AU headstage (Molecular Devices, CA, USA). Voltage clamp were generated by a personal computer equipped with an analog-digital converter (Digidata 1322a, Molecular Devices) using pClamp software v10 (Molecular Devices). During recordings, cells were superfused with an extracellular solution containing (in mM) : 136 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 0.3 NaH2PO4, 10 glucose , 10 HEPES, pH 7.3. Membrane ion currents were recorded via glass electrodes of borosilicate GC150-T manufactured on a vertical twin heating puller. Pipette resistance was etee ad MΩ he filled ith the itapipette solutio hih otaied in mM): 20 KCl, 110 K-asp, 1 MgCl2, 10 HEPES, 2 CaCl2, 2.5 EGTA, 0.1 GTP, 5 Na2-phosphocreatine, 5 Mg- ATP, pH 7.2 (PCa = 6.3). The currents were recorded in control (with 0.1% DMSO as vehicle) or i paillie μM oditios. Aalses ee pefoed usig Clapfit softae. Cell

178

Résultats capacitance was measured by integrating the area under the capacitive transient elicited by 5 mV depolarizing steps from holding potential of 0 mV. Reverse transcription and polymerase chain reaction Total RNA from W8B2+ cells was isolated using Rnable reagent (Eurobio) followed by chloroform extraction and isopropanol precipitation. RNA integrity was evaluated by ethydium bromide staining on a 1% agarose gel. Total RNA was quantified by assessing optical density at 260 and 280 nm (NanoDrop ND-100 Labtech France). cDNA was synthesized using the PdN ado heae pie Iitoge. μL of total RNA µg as added to μL of reaction mixture (100 mM Tris–HCl pH 8.3, 150 mM KCl, 6.25 mM MgCl2, 20 mM DTT, 2 M dNTPs Iitoge ad . μg Rado Pie PdN Iitoge. RNA ee deatued at 65 °C during 2 min and then added to 40 U RNAse inhibitor (RNaseOUT-Invitrogen) and 400 U M-MLV Reese Tasiptase Iitoge to μL fial olue. DNA as sthesized at °C fo h ad the added ith μL steile ate. Reaiig ezes ee heat- deactivated (100 °C, 2 min). After the RT poedue, μL of DNA ≈g as added to μL of PCR eatio itue M Tis–HCl pH 8.4, 55 mM KCl, 2.2 mM MgCl2, 277.8 µM dNTPs, 12 pmol forward and reverse primers and 1.25 U of Taq Polymerase (Invitrogen). The PCR reaction was performed with a thermocycler (denaturation at 95 °C for 5 min, followed by 38 cycles at 57 °C for 30 s, 72 °C for 30 s, and 95 °C for 30 s. After the last cycle, samples were incubated at 57 °C for 2 min and at 72 °C for 10 min to ensure complete product extension. All primers are described in table 1. GAPDH cDNA was used as housekeeping. cDNA extracted from cardiac atrial tissue was used as a positive control and the negative control consisted of the PCR reaction without the addition of the template. Amplified products were separated by electrophoresis on 2% agarose gels (containing 0.01% ethidium bromide) in Tris- Acetate-EDTA buffer and visualised using a UV Transilluminator. Quantitative RT-qPCR After reverse transcription the quantitative PCR reaction was carried out on a 96 well- plate, with the sense and antisense primers allowing the amplification of GAPDH (used as reference gee, GATA, MEFC, ACTC, TNNT, ad β-MHC (all primers are described in table 1). Each well contained a 25 mM primer pair (sense and anti-sense), cDNA at 100 ng/well final , as well as Power SYBR® Green PCR reagent Master Mix (Thermo Fisher Scientific) containing AmpliTaq Gold® DNA Polymerase. Each sample was polymerized in triplicate to best estimate the threshold cycle of fluorescence appearance and water was used as a negative control. The amplification reaction begins with initial denaturation of the cDNA for 10 min at 95 °C, allowing the activation of the DNA polymerase, and is followed by 40 successive cycles consisting of a denaturation step for 15 sec at 95 °C followed by a step of hybridization of the primers and elongation for 1 min at 60 ° C. The results were obtained and analyzed by the 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems USA).

Western blotting analysis To determine KCa1.1 protein expression, cultured W8B2+ cells were washed with cold phosphate-buffered saline (PBS) and lysed by scraping the cells into a

179

Résultats radioimmunoprecipitation assay buffer (in mM: Tris-HCl 50 pH:8, NaCl 150, EDTA 5, 0.05% Igepal, 1% deoxycholic acid, 1% Triton X-100, 0.1% SDS) containing protease and phosphatase inhibitors (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich - PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail, Roche). Soluble cell lysates were denatured 5 min at 37°C in 2× Laemmli sample buffer (in mM): Tris- HCl pH ., “D“ %, gleol %, oopheol lue .%, β-mercaptoethanol 10%). Potei saples ad μg, otaied fo ultued WB+ cells, were separated by SDS- PAGE using 8% polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. Membranes were blocked 90 min in TBS-Tween blocking solution (in mM: Tris 20 pH : 7.6, NaCl 150 and Tween-20 0.2%) with 5% non-fat milk at room temperature. Blots were then incubated overnight at 4°C with primary antibodies diluted in TBST-5% nonfat dry milk. We used polyclonal anti-rabbit KCa1.1 (1:500, Alomone Labs, Jerusalem, Israel). Vimentine was probed by rabbit polyclonal anti-vimentine (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, U.S.A). Membranes were washed with TBS-Tween three times for 10 min and then incubated for 90 min at room temperature with specific anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:5000, Interchim, Montluçon, France). Membranes were revealed with enhanced chemiluminescence (ECL) chemiluminescent substrate (GE Healthcare, Velizy- Villacoublay, France). The results were analyzed by using the GeneGnome Imager (SynGene Ozyme, Montigny - le - Bretonneux, France).

Cell mobility determination Cell migration was determined using a wound healing method to investigate the potential effect of BKCa channels on cell mobility in human W8B2+ CSCs. The wound healing assay was conducted when the cells grew to total confluence in 6-well plates in 0% FBS culture medium. A stadad oud as eated sathig the ell oolae ith a steile μL plasti pipette tip. After removing cell fragments by washing cell monolayer gently with PBS, the cells were incubated at 37°C with the medium containing 0% FBS and 10 µM paxilline for 7 h. The cells were then fixed and nuclei were labelled with DAPI. Transmission images were taken just after the wound (time 0h) and after 7h of paxilline treatment. The images were generated with a spinning disk confocal station (Revolution, Andor) equipped with a high precision motorized XY stage (Marzhauser) and IQ3 software (Revolution, Andor) that allowed to memorize positions of each sample. The number of migrated cells on the images were counted (based on the nuclei labelling) to assess cell mobility under different conditions of treatments.

Statistical analysis Results were expressed as mean ± SEM. All statistical analysis were performed using GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). The tests used for the different assays are provided in the figure legends.

RESULTS

W8B2+ CSCs are clonogenic and proliferative Purified W8B2+ CSCs displayed spindle-shape and fibroblastic morphology during early passages of culture (Fig. 1A). To demonstrate their stem character and their self-renewal

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Résultats capacity, their ability to elicit clonogenic multiplication was checked using a colony-forming unit fibroblasts (CFU-Fs) test carried out by seeding pure W8B2+ CSCs at low density. After 10 days of growth, the cells were able to form several colonies confirming self-renewal ability (Fig. 1B). Cells were rapidly proliferating and about 1.4 105 cells were obtained after 9 days of culture from 2.103 cells at day 1 (Fig. 1C left). The cell increase fold in 24 hours was about 1.76 ± 0.2 (Fig. 1C right).

Immunophenotype of W8B2+ CSCs Flow cytometry analysis revealed that W8B2+ CSCs highly express surface markers associated with mesenchymal stem cells (W8B2, CD29, CD73 and CD105) (Fig. 1D). Regarding CD90 and CD106, two others mesenchymal markers, W8B2+ CSCs showed very little expression. W8B2+ cells were negative for hematopoietic lineage markers (CD34and CD133), CD45, excluding the possible contribution of bone marrow cells and mast cells, and CD117, a marker of another type of cardiac stem/progenitor cells. (Fig. 1D). At gene level, W8B2+ cells showed strong expression of early specific cardiac transcription factors GATA4 and MEF2C but not Nkx2.5. They did express connexin 43 transcript but lacked expression of cardiac-specific structural genes ACTC1, TNNT2, b-MHC (Fig. 1E). At the protein level, immunostaining show that W8B2+ cells did express GATA4 and connexin-43 but no specific labelling of Nkx2.5 was detected (Fig. 1F).

BKCa current can be recorded and identified in W8B2+ CSCs Ionic current recordings were performed on W8B2+ CSCs using patch-clamp in the whole cell configuration. Representative traces, shown in Fig. 2, exhibit voltage–dependent currents ith ois osillatios duig stog depolaizatios etee + ad + V Fig. Aa. Accordingly, the I/V curve obtained by voltage-ramps ranging from -110 to +110 mV, shows a strong outward going rectification with a significant increase in noise at high depolarization voltages (Fig. 2B). This current signature, which is characteristic for BKCa current, was present in 8 out of 9 human W8B2 progenitor cells. When cells were superfused with 10 µM paxilline (a BKCa selective blocker the outad uet as deeased ad ois uet osillatios were abolished (Fig. 2Ab, 2B and 2C), as expected for BKca inhibition. Similar inhibitory effect was obtained with 5 mM TEA (not shown, n = 3).

W8B2+ CSCs express BKCa channel at both transcriptional and protein levels To investigate the molecular identity of the functional ionic channel in W8B2+ CSCs, gene expression was examined by RT-PCR using the human gene-specific primers targeting genes for BKCa channel (Table 1). Fig. 3A shows the images of RT-PCR products corresponding to gene expression of ion channels. A remarkable expression of KCNMA1 gene (coding for BKCa) was detected. Atrial tissue was used as positive control and GAPDH as reference. At the protein level, western blot analysis demonstrated an abundant expression of the ionic channel responsible for BKCa current using the specific antibody anti-KCa1.1 (Fig.3B). Atrial tissue was used as positive control and vimentin as reference.

Inhibition of BKCa channel by paxilline decreases cell proliferation and cell cycling progression in a concentration-dependent manner

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Résultats

To evaluate the role of BKCa channel in cell proliferation, paxilline was used as a specific blocker of this channel at different concentrations (1, 3 and 10 µM). Whereas paxilline 1 µM had no effect, the cell proliferation was progressively inhibited by the application of paxilline at 3 µM and 10 µM until day 9 of culture (Fig. 4A). The inhibitory effect of paxilline 10 µM was stronger than that of 3 µM, an effect which reached statistical significance from day 4. The paxilline blocking effect of BKCa on cell cycling progression was evaluated by flow cytometry analysis in human W8B2+ CSCs. Fig 4B illustrates an example of the mean percentage values of lig phases i otol ‰ DM“O as ehile o i ells teated ith paillie ad µM) at day 5, showing a shift from cells in S and G2 phases into G1 phase. Taken together, these experiments show that 10 µM paxilline significantly increased the fraction of G1 population from 56.9 % to 72.4 % (p<0.01) and from 59.8 % to 71.4 % (p<0.01; Fig 4C) at day 5 and 6, respectively. In contrary, fraction of S+G2 population was significantly decreased from 39.8% to 22.8% (p<0.001) at day 5 and from 37.6 % to 24.4 % (p<0.05) at day 6 after treatment with 10 µM of paxilline (Fig 4C). At 3 µM, the effect of paxilline was lower in amplitude but reached statistical significance versus control only for the S+G2 population. These results suggest that BKCa participates in G1/S cell cycling progression in human W8B2+ CSCs.

Inhibition of BKCa channel by paxilline decreases self-renewal in human W8B2+ CSCs To investigate further the role of BKCa channel, paxilline was used at different concentrations (1, 3 and 10 µM) to block the activity of BKCa channel on self-renewal of W8B2+ CSCs. Paxilline at 1, 3 and 10 µM significantly reduced the number of colony-forming unit W8B2+ CSCs after ten days of culture (Fig. 5). This decrease reached about 15 % (p<0.05), 34 % (p<0.001) and 50% (p<0.001) with 1 ,3 and 10 µM of paxilline, respectively. This result suggests that BKCa channel is important in the stem cells self-renewal process by which stem cells divide to perpetuate their pool throughout life and maintain their undifferentiated state.

Inhibition of BKCa channel by paxilline did not affect cell migration To examine whether BKCa channel can regulate cell migration in human W8B2+ CSCs, wound healing assay was conducted in cells treated with different concentrations of paxilline. Figure A shos the oud healig iages i otol ‰ DM“O as ehile ad paillie oditios (1, 3 and 10 µM). For each condition, images were taken just after the wound (time 0h) and after 7 h of migration. To estimate the cell migration, nuclei of cells were fixed and colored with DAPI (green) after 7 hours as illustrated (fig. 6A, right). Fig. 6B illustrates the ratio of migrated cells into the acellular area after 7 h in the different treatments. Blockade of BKCa channels with paxilline did not impact cell migration compared to the control (ns) suggesting that BKCa channel may not be involved in cell migration regulation of W8B2+ CSCs.

DISCUSSION In the present study, human W8B2+ cardiac progenitor cells isolated from right atrial specimens highly expressed surface markers associated with mesenchymal stem cells (W8B2, CD29, CD73, and CD105) but not hematopoietic markers. Moreover, human W8B2+ CSCs exhibited an important clonogenic efficiency. These human cardiac stem cell properties assessed in our experimental conditions are consistent with those reported previously [1].

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Résultats

In stem cells, the presence of BKCa current has been reported in some cell types like human embryonic stem cells [7], human mesenchymal stem cells from different origins [8-10], cancer stem cells [11] and human cardiac progenitor cells [12]. In the present study, electrophysiological properties of W8B2+ CSCs, paxilline sensitivity, RT-PCR and Western immunoblot analysis, all converge on the idea that BKCa current exists in these cells and that the ionic channel responsible for this current is encoded by KCa1.1 gene. In non-excitable cells, high-conductance calcium-activated potassium channel has been reported to be involved in the regulation on cell proliferation. For example, blocking BKCa by the selective channel blocker inhibits cell proliferation in human endothelial cells [13-14], in mouse ES cells [7] and in human preadipocytes [15]. In human cardiac fibroblast, BKCa inhibition by paxilline results in a cell proliferation reduction [16]. Other studies report that inhibition of BKCa has little effect on cell proliferation in human bronchial smooth muscle cells [17], or MCF-7 cells [18]. Recently it was reported that blocking of KCa1.1 in normal myoblasts induced an increase in proliferation [6], suggesting that regulation of cell proliferation by BKCa channels may be cell-type dependent. In the present study, we report that inhibition of BKCa by paxilline significantly reduces human W8B2+ CSCs proliferation as well as the proportion of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. This result is in agreement with that obtained on human cardiac c-kit+ progenitor cells [19]. Interestingly, it has been reported that membrane potential hyperpolarized during the cell cycle and that potassium conductance increased during progress from G1 to S phase in rat mesenchymal stem cells from bone marrow [19]. Accordingly, the effects that we have obtained by inhibiting BKCa could be due to changes in the membrane potential during the cellular cycle. The present study also shows that blocking BKCa channels with paxilline decreased the number of colony-forming unit fibroblasts (CFU-Fs) suggesting that BKCa channel could be involved in the process of self-renewal and differentiation of W8B2+ CSCs. Self-renewal consists in cell division with maintenance of the undifferentiated state. This requires cell cycle control and often maintenance of multipotency or pluripotency, depending on the stem cell type [21]. We show that mesenchymal stem cells are clonogenic when plated at low densities. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate.

Ca2+-activated potassium channels, including BKCa, are involved in the regulation of differentiation of several cell types. Similarly to what was reported on cell proliferation (see above), BKCa modulation can enhance or inhibit the differentiation process depending on the cell type. It has been shown for example that inhibition of potassium channels influences the differentiation of endothelial progenitor cells (EPCs) from human peripheral blood [22]. These cells strongly express BKCa channel, which inhibition disrupts their differentiation into mature endothelial cells. On another hand, inhibition of BKCa with paxilline negatively regulates the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) suggesting the essential role of BKCa in maintaining bone marrow physiological function [23]. Further study is required to find out how BKCa channel may contribute to cellular differentiation in human W8B2+ CSCs.

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Résultats

In addition to differentiation and proliferation, previous studies have demonstrated that the Ca2+-activated potassium channel is closely involved in cell migration but its implication is again cell-type specific. For example, KCa1.1 channels were shown to be required for migration in gloma cells, but not in microglia cells [24-25]. Interestingly, blockade of BKCa by paxilline inhibited cell migration in human cardiac c-kit+ progenitor cells [19]. In the present study, inhibition of BKCa did not affect W8B2+ CSCs migration suggesting that the regulation of mobility differs between the two types of human cardiac progenitor cells. This discrepancy could be due to the various calcium signaling parameters such as amplitude and frequencies of calcium oscillations, which regulate directly and/or indirectly BKCa channel (preliminary data not shown). An estimation of calcium subcellular domains within cells is required to investigate further this hypothesis, for example using green fluorescence protein (GFP)-linked calcium calmoduline (CaM) probes [25]. In conclusion, we demonstrate that BKCa channel is likely a key regulator of proliferation and self-renewal of human cardiac stem cells and provides a basis for a better understanding of the physiology of these cells. Further investigations are required to open new avenues for cellular therapeutic strategies since W8B2+ cells have been described as having powerful regenerative and functional effects when injected into the hearts of rats after attack [1].

Figure Legends Figure 1. Growth and phenotype characteristics of W8B2+ CSCs. (A) Cell morphology at passage 2 of isolated W8B2+ cells. (B) colony-forming unit fibroblasts (CFU-Fs) assay after 10 days post-plating. (C) Proliferation assay of W8B2+ cells cultured for 9 days. (n=3). D: day. (D) Percentage of positive cells for the indicated surface markers in W8B2+ CSCs determined by flow cytometry. (n=3). (E) Gene expression of cardiac markers in W8B2+ CSCs determined by RT-qPCR (n=3). Ct: cycle threshold. Bar graph represents the 1/Ct ratio for each gene. A value of /Ct hih is ≤ . Ct= oespods to a egligible gene expression. (F) Immunostaining of cardiac markers in W8B2+ CSCs. Left: GATA4; Center: Nkx2.5; Right: connexin 43. Nuclei are marked in blue with TOPRO staining. (n=3). Scale bare = 50 µm. Figure 2. Inhibition of membrane current by BKCa ion channel blocker in W8B2+ CSCs. (A) Voltage dependent current recorded in whole cell configuration during 2 s pulses at potentials from -110 to +90 mV (10 mV increment) with a holding potential of -80 mV in the absence (Aa) and in the presence (Ab) of 10 µM paxilline (arrow indicates 0 current level). (B) I/V curves obtained during a ramp protocol stimulation from -110 to 110 mV (duration 2 sec) in the absence and in the presence of 10 µM paxilline. In A and B, note the presence of large noisy oscillations (typical signature of BKCa channels) on the current traces obtained for high positive potentials in control condition. (C) Current density estimated at +110 mV in control and in the presence of paxilline (10 µM) (P<0.001, n= 5). Figure 3. Molecular scanning of functional channel in W8B2+ CSCs. (A) Characterization of the expression of KCNMA1 mRNA in cultured W8B2+ cells by RT-PCR. Expression of KCNMA1 mRNA was analyzed in cultured W8B2+ Cells using RT-PCR primers specific. Amplification products were resolved on 2% agarose gels alongside a X174 RF DNA/HaeIII fragments

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Résultats ladder marker. GAPDH cDNA was used as housekeeping. cDNA extracted from cardiac atrial tissue was used as a positive control and the negative control consisted of the PCR reaction without the addition of the template. Fragment of the expected molecular size indicated the expression of KCNMA1 in cultured W8B2+ Cells. The top and the down arrows indicate amplicons with 310 and 271-281 bp, respectively. (B) Characterization of the expression of KCa1.1 protein in cultured W8B2+ cells. Western blotting analysis were performed from cell lsates otaiig o μg of total poteis. As sho, WB+ cells displayed a band with a molecular mass of 100 kDa approximately, as expected for KCa1.1 protein channel. Figure 4. Effect of BKCa inhibition by paxilline on cell proliferation and cell cycling in W8B2+ CSCs. (A) Cell proliferation assay expressed as percentage of cell number obtained with vehicle (control) or paxilline at different concentrations. (n=3,*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. control, Two-Way ANOVA with Bonferroni post-test). (B) Examples of flow cytometry graphs with percentage of cycling phases in cells treated with vehicle (control, left) or paxilline (3 (middle) and 10 µM (right)) at day 5 post treatment. (C) Distribution of cell cycle phases in cells treated with vehicle (control) or paxilline at 3 and 10 µM after 5 and 6 days post-plating. (n=3,*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. control, Two-Way ANOVA with Bonferroni post-test). Figure 5. Effect of BKCa inhibition by paxilline on self-renewal of W8B2+ CSCs. (A) Images of colony-forming unit W8B2+ CSCs in control or paxilline conditions after 10 days post-plating. (B) Number of CFU-Fs in cells treated with vehicle (control) or paxilline at different concentrations for 10 days post-plating. (n=3,*p<0.05, ***p<0.001 vs. control, Nonparametric One-Way ANOVA). Figure 6. Effect of BKCa inhibition by paxilline on cell migration in W8B2+ CSCs. Cell images with a cellular wound at time 0 (left) and after 7 hours (right) in cells treated with vehicle (control) or paxilline at different concentrations. Green dots represent nuclei of cells fixed and colored with DAPI after 7 hours. (B) % of migrated cells in W8B2+ CSCs treated with vehicle (control) or paxilline at different concentrations. (n=3, Nonparametric One-Way ANOVA). Scale bare = 100 µm. ACKNOWLEDGMENT This work has benefited from the facilities and expertise of ImageUP (University of Poitiers) and was supported by AFM. References

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Résultats

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Résultats

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Table 1: Human gene-specific primers for RT-PCR and RT-qPCR

Gene name foad ’  ’ eese ’  ’ GAPDH AAGGTCATCCCTGAGCTGAA TGACAAAGTGGTCGTTGAGG MEF2C AAGAAGGAGATTTGTTTGGAGG CTTTGTAAATGTCACCTGTCTG GATA4 CCCAATCTCGATATGTTTGAC CGTTCATCTTGTGGTAGAGG TNNT2 CTGCTGTTCTGAGGGAGAGC CACCAAGTTGGGATGAACG ACTC1 CCTTCATTGGTATGGAATCTG AATCTTCATGGTGCTTAGGAG β-MHC GAGCTACGGGTTCCCCTCT GGAAGCTCTGCTACCCCTTTT NKX2.5 AAAGAAAGGGTGTGAACTGC CGCACAGTAATGGTAAGGGA KCNMA1 CCTGCAGCGAAGTATCATCA ACTCGAAGTGAAGCTGCCAT Connexin43 GGGCGTTAAGGATCGGGTTAAGG GTTGGTGAGGAGCAGCCATTGAA

187

Résultats

Figure 1

188

Résultats

Figure 2

Figure 3

189

Résultats

Figure 4

190

Résultats

Figure 5

Figure 6

191

Résultats

4 BKCa et oscillations calciques dans les CSCs W8B2+ différenciées En plus de so ôle das la polifatio et l’auto-renouvellement des CSCs W8B2+, le canal BKCa semble joue u ôle su l’atiit aliue au ous de la différenciation (figure R- 50).

A 1.0 Paxilline 1 µM

0.5

F/F0 (U.A) F/F0



0.0 300 600 900 1200 Temps (s)

B 2.0

1.5 Paxilline 10 µM

1.0

F/F0 (U.A) F/F0

 0.5

0.0 300 600 900 1200 Temps (s)

Figure R-50 : Effet de la paxilline à 1 µM (A) et à 10 µM (B) su l’atiit aliue spotae enregistrée sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. Les graphes illustrent les 2+ variations de la [Ca ]i epsetes pa le appot ΔF/F. ΔF =F-F0 (F : fluorescence émise par la GCaMP à un temps donné, F0 : fluorescence de base émise par la GCaMP).U.A : unité arbitraire.

192

Résultats

La perfusion de 1 µM de paxilline (inhibiteur spécifique du canal BKCa) à t = 700 s (figure R-50A), ’iduit auu hageet su l’aplitude (figure R-51A), la fréquence (figure R-51B), l’aie (figure R-51C) , la durée des oscillations calciques (figure R-51D), le TTP (figure R-52A), le TTR (figure R-52B), la pente 1 (figure R-52C) , la pente 2 (figure R-52D) et le pouetage du teps d’atiit (figure R-52E).

Cependant, à 10 µM (figure R-50B) la paillie diiue sigifiatieet l’aplitude (diminution de 83,3%, figure R-51A), la fréquence (diminution de 83,3%, figure R-51B, l’aie (diminution de 81,3%, figure R-51C) et la durée (diminution de 67,7%, figure R-51D) des oscillations calciques par rapport au contrôle.

De plus, la figure R-52 montre que le traitement la paxilline à 10 µM, provoque une diminution significative (64.1%) du TTR (figure R-52B), de la pente 1 (81,4%) (figure R-52C), et du pouetage du teps d’atiit % (figure R-52E) mais ne modifie pas le TTP (figure R- 50A) et la pente 2 (figure R-52D).

193

Résultats

A B 1.5 0.5 ns ns 0.4 1.0 0.3 ns

0.2 0.5

Amplitude (U.A) Amplitude * 0.1 **

Fréquence (pic/min) Fréquence n = 12 n = 10 n = 6 n = 4 n = 3 n = 4 0.0 0.0

Contrôle Pax 1 µM Contrôle Pax 1 µM Pax 10 µM Pax 10 µM C D 80 100 ns ns 80 60

60 40 ** 40

Durée (s) Durée

Aire (U.A.s) Aire 20 ** 20 n = 12 n = 6 n = 10 n = 12 n = 9 n = 6 0 0

Contrôle Pax 1 µM Contrôle Pax 1 µM Pax 10 µM Pax 10 µM

Figure R-51 : Effet de la paillie et µM su l’aplitude (A), la fréquence (B), l’aie (C) et la durée (D) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : oe d’eets osillatios eegists. *p<., **p<. s. Cotôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test oe a ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

194

Résultats

A B 50 80 ns ns 40 60

30 ns 40 ** 20

TTP (s) TTP

TTR (s) TTR 20 10 n = 12 n = 5 n = 10 n = 12 n = 9 n = 6 0 0

Contrôle Pax 1 µM Contrôle Pax 1 µM Pax 10 µM Pax 10 µM C D 0.05 0.000 n = 12 n = 10 n = 6 0.04 -0.005

0.03 -0.010 ns 0.02 ns ns

Pente 2 U.A/s 2 Pente Pente 1 U.A/s 1 Pente -0.015 0.01 * n = 11 n = 6 n = 7 0.00 -0.020

Contrôle Pax 1 µM Contrôle Pax 1 µM Pax 10 µM Pax 10 µM

E 80 ns

60 ns 40

20 *

% temps d'activité temps % n = 4 n = 3 n = 4 0

Contrôle Pax 1 µM Pax 10 µM Figure R-52 : Effet de la paxilline (à 1 et 10 µM) sur le TTP (A), le TTR (B), la pente 1 (C), la pente 2 (D) et le pouetage du teps d’atiit (E) des oscillations calciques spontanées enregistrées sur les CSCs W8B2+ après 28 jours de différenciation. U.A : unité arbitraire. (N = 2). ns : non significatif, N : nombre de patients à partir desquels les CSCs W8B2+ ont été différenciées et n : nombre d’eets osillatios eegists. *p<., **p<. s. Cotôle. L’aalse statistiue est effectuée par un test one way ANOVA suivi par un post test de Bonferroni.

195

Résultats

Chapitre III : Effets de la sphingosine 1-phosphate sur les propriétés des CSCs W8B2+

1 Contexte bibliographique 1.1 S1P et signalisation La sphingosine 1-phosphate (S1P) est un lysophospholipide (figure H-20) circulant qui induit plusieurs réponses cellulaires comme la prolifération, la migration, la contraction et la mobilisation du calcium intracellulaire (Payne et al., 2002; Spiegel and Milstien, 2003). Dans le plasa, la oetatio e “P peut atteide jusu’à µM. Cette stio poiet majoritairement des plaquettes, des mastocytes et des érythrocytes. Dans la lymphe, la podutio de la “P est piipaleet assue pa l’edothliu eio M.

Figure H-20 : Structure chimique de la sphingosine 1-phosphate. D’aps Rose, H et al. .

La S1P exerce la majorité de ses effets biologiques via l’atiatio de ses epteus nommés S1PR1-5. Ces epteus ou epteus EDG pou edothelial diffeetiatio gee, appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G ou GPCRs. Ils ont une forte affinité pour la S1P (Kd = 2- M et sot epis de faço diffetielle d’u tpe cellulaire à l’aute. La sigalisatio die pa es i epteus est oplee a es deies œuet e segie ou e atagoise e s’assoiat ae des poties G distites. L’effet iologiue ose est la sultate de l’esele des chaînes de transduction activées. Bien que la signalisation médiée par la S1P via ses cinq récepteurs est bien caractérisée, le rôle de la S1P en tant que second messager intracellulaire a été évoqué (Olivera et al., 2003; Payne et al., 2002).

Les S1PR1, S1PR2 et S1PR3 sont exprimés de manière ubiquitaire et assurent de oeuses fotios oe l’agiogese, la euogese, la igatio, la gulatio du rythme cardiaque, la survie des cardiomyocytes etc. Quant aux S1PR4 et S1PR5, leurs expressions sont restreintes à certains types cellulaires. Le S1PR4 est exprimé dans les cellules immunitaires, les cellules musculaires lisses bronchiques alors que le S1PR5 se trouve exprimé dans les cellules immunitaires et les cellules neuronales.

196

Résultats

1.2 S1P et tissu cardiaque Pai les i epteus à la “P, le œu e epie tois ; le S1PR1, le S1PR2 et le S1PR3. De par leur expression et localisation ces récepteurs sont impliqués dans différentes fonctions cardiaques. En effet, dans les cardiomyocytes, on retrouve les récepteurs S1PR1, S1PR2 et S1PR3 avec une prédominance du S1PR1 (Means et al., 2008; Zhang et al., 2007). L’atiatio de es epteus das les adiootes est assoie au the et contractilité cardiaque (Budde et al., 2002; Sanna et al., 2004), à l’idutio d’hpetophie (Robert et al., 2001), à la potetio de l’ishie (Jin et al., 2004; Zhang et al., 2007) et à la mobilisation du calcium intracellulaire (Egom et al., 2016). Les cellules musculaires lisses, quant à elles, expriment les S1PR1, S1PR2 et S1PR3 avec une prédominance des récepteurs S1PR2 et S1PR3 (Alewijnse et al., 2004; Kluk and Hla, 2001). L’atiation de ces récepteurs dans le muscle lisse est associée à la vasoconstriction (Ryu et al., 2002) et la migration (Alewijnse et al., 2004).

Dans les cellules endothéliales vasculaires, on retrouve majoritairement le S1PR1 et des niveaux faibles d’epessio de S1PR2 et de “PR. L’atiatio de es pteus est assoie à l’agiogese (Allende et al., 2003), à la migration (Wang et al., 1999a), l’adhee (Windh et al., 1999) et l’itgit de l’edothliu (Brindley et al., 2002; Garcia et al., 2001). Les fibroblastes cardiaques expriment majoritairement le S1PR3 et à des niveaux faibles des récepteurs S1PR1 et S1PR2 (Landeen et al., 2008). La signalisation par ces récepteurs régule la prolifération des fibroblastes cardiaques (Benamer et al., 2011; Gellings Lowe et al., 2009).

En plus des rôles physiologiques cardiaques, il a été montré que les quantités de S1P circulante augmentent chez les patiets atteits d’isuffisae adiaue (Polzin et al., 2017), d’ifatus du oade aigu (Klyachkin et al., 2015) et de fibrose cardiaque (Takuwa et al., 2013). La “P est aussi ipliue das d’autes pathologies de tpe iflaatoies, immunitaires, métaboliques ou encore cancéreuses (Maceyka et al., 2012).

197

Résultats

1.3 S1P et cellules souches Chez la souris, il a été montré que les cellules souches mésenchymateuse (CSMs) de la moelle osseuse secrétaient la S1P et que cette dernière stimulait la prolifération des cellules satellites du muscle squelettique (Sassoli et al., 2014).

D’autes tudes idiuet ue la “P pouait stiule la polifatio et la igatio des cellules satellites(Calise et al., 2012; Donati et al., 2007) et des cellules souches mésenchymateuse de la moelle osseuse (Lu et al., 2015; Price et al., 2015). La S1P participe également à la régulation de la différenciation des CSMs murines de la moelle osseuse. En effet, la S1P améliorait la différenciation des CSMs murines en adipocytes, en ostéoblastes et en cellules endothéliales vasculaires (Lu et al., 2015; Price et al., 2015).

Chez l’Hoe, la “P joue u ôle ipotat das la gulatio de la polifération, de la différenciation et la migration. Certaines études montrent que la S1P intervient dans la survie cellulaire des CSEs humaines (Inniss and Moore, 2006) et module la migration des CSMs humaines de la moelle osseuse (Kong et al., 2014). De plus, la S1P oriente la différenciation des CSMs du tissu adipeux vers un phénotype musculaire lisse (Nincheri et al., 2009) et favorise la différenciation des CSMs humains du cordon ombilical vers un phénotype cardiaque (Zhao et al., 2011).

2 Cotete de l’tude La “P gule l’atiit adio-vasculaire (via ses récepteurs) par la médiation de voies de signalisation intervenant dans la régulation du tonus vasculaire et dans l’itgit de la aie edothliale. Il alioe la sistae des adiootes à l’ishie-reperfusion. Cependant, le rôle de ce lysophospholipide dans la régulation des propriétés des cellules souhes adiaue ’a pas t tudi.

Nous nous sommes donc focalisés dans notre étude sur les points suivants :

 Caatisatio de l’epessio des i epteus à la “P das les C“Cs WB+  Effet de la S1P utilisé à 1µM (concentration plasmatique normale) sur les propriétés d’auto-renouvellement, de prolifération et de migration des CSCs W8B2+.

 Implication des récepteurs à la S1P (exprimés dans CSCs W8B2+) dans la régulation des propriétés fondamentales de ces cellules (auto-renouvellement, prolifération et migration).

198

Résultats

3 Résultats 3.1 Pofil d’epessio des i epteus à la SP das les CSCs WB+ La S1P assure la majorité de ses fonctions en agissant sur ces cinq récepteurs qui sont exprimés de manière différente selon le tissu et le type cellulaire. Pour identifier les récepteurs à la S1P (S1PR) exprimés dans les CSCs W8B2+, nous avons vérifié la présence ou non des transcrits codant pour les 5 récepteurs par la technique de RT-PCR.

Les résultats obtenus montrent que les CSCs W8B2+ expriment les transcrits codant pour les récepteurs S1PR1 (variant 1) et S1PR2 (figure R-53). Le tissu atrial humain utilisé comme contrôle positif, présente aussi une expression des transcrits codant pour S1PR1 (variant 1 et 2) et S1PR2.

Figure R-53 : Caatisatio de l’epessio des ARN odat pou les epteus à la sphigosie 1 phosphate de type 1 (S1PR1) et de type 2 (S1PR2) dans les CSCs W8B2+ par RT-PCR. GAPDH est utilisé comme gène de référence. Les ADNc issus du tissu atrial cardiaque humain sont utilisés oe otôle positif et l’eau oe otôle gatif.

La figure R-54 A, montre que les CSCs W8B2+ expriment faiblement les transcrits codant pour le S1PR3 comparées aux cellules issues de glioblastome humain (1) utilisées comme contrôle positif. Concernant le S1PR4, les transcrits codant pour ce récepteur sont totalement absents dans les CSC W8B2+ et le tissu atrial humain comparés aux cellules issues de glioblastome humain (2).

199

Résultats

Figure R-54 : Caatisatio de l’epessio des ARN odat pou les epteus à la sphigosie 1 phosphate de type S1PR3 et de type S1PR4 (A) et de type S1PR5 (B) dans les CSCs W8B2+ par RT- PCR. GAPDH est utilisé comme gène de référence. Les ADNc issus des cellules de glioblastome huai et sot utiliss oe otôle positif et l’eau oe otôle gatif.

Le S1PR5 quant à lui, présente une faible expression des transcrits codant pour le variant 1 du S1PR5 et aucune expression des transcrits codant pour le variant 2 du S1PR5 dans les CSCs W8B2+ (figure R-54 B). Le tissu atrial humain ne présente aucune expression des

200

Résultats transcrits codant pour les variants 1 et 2 du S1PR5 comparé aux cellules issues de glioblastome humain (1) utilisées comme contrôle positif.

Parallèlement, les résultats de RT-qPCR (figure R-55) montrent une expression des transcrits codant pour les récepteurs S1PR1 et S1PR2 (avec une plus forte expression du S1PR2), une très faible expression des transcrits codant pour les S1PR3 et S1PR5 et aucune expression du récepteur S1PR4.

150

)

100

vs GAPDH (x10 GAPDH vs 50



0 S1PR1 S1PR2 S1PR3 S1PR4 S1PR5

Figure R-55 : Profil d’epessio giue des i epteus à la “P “PR, “PR, “PR “PR et S1PR5) dans les CSCs W8B2+ déterminé par RT-qPCR. (n = 2). Le Profil d’epessio des ges est représenté en 2-ΔCt par rapport au gène de référence GAPDH (x 104). Ct : Cycle Threshold ou cycle seuil. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

3.2 Effet de la S1P sur les capacités prolifératives des CSCs W8B2+ Afi d’alue le ôle de la “P das le poessus de polifatio ellulaie, les C“Cs W8B2+ ont été cultivées pendant plusieurs jours en présence de la S1P utilisée à une oetatio de μM. La figure R-56 montre que la S1P diminue significativement la prolifération cellulaire par rapport au contrôle. Cette diminution débute à partir du 3ème jour ae ue aisse de % et pedue jusu’au ème jour (avec une baisse de 31,4%). Le aiu d’ihiitio se poduit au ème jour de culture avec une baisse de 48,6% par rapport au contrôle.

201

Résultats

100 Contrôle S1P (1 µM) * 80 ** ** *** *** *** *** 60

% du nombre cellulaire nombre du %

par rapport au contrôle au rapport par 20

0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 Temps en culture (jour) Figure R-56 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence de la S1P (1µM) ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) pendant 9 jours. (n = 5). Le taux de prolifération cellulaire est exprimé en pourcentage par rapport au nombre cellulaire obtenu dans le contrôle. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. *p<., **p<., ***p<. s. otôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test Anova double entrée suivi par un test de Bonferroni.

Cette diminution de la prolifération suite au traiteet ae la “P ’est pas due à une mortalité cellulaire comme le montre la figure R-57.

100 Contrôle positif Contrôle S1P (1 µM)

% de mortalité cellulaire mortalité de %

0 J5 J6 J7 J8 J9 Temps en culture (jour)

Figure R-57 : Test de viabilité cellulaire des CSCs W8B2+ par cytométrie en flux en présence de S1P (1 µM) ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) cultivées pendant 9 jours. (n = 1). Le taux de mortalité cellulaire est exprimé en pourcentage par rapport au contrôle positif (CSCs W8B2+ chauffées à 95°C pendant 10 minutes).

202

Résultats

En effet, le pourcentage des cellules mortes suite au traitement à la S1P est compris entre 0,2 et 1,5 % par rapport au contrôle positif. Dans les cellules non traitées (contrôle), le pourcentage des cellules mortes est également faible et reste compris entre 0.2 et 1,6%.

Afi de ifie si l’effet atipolifatif de la “P est li à u loage das la pogessio du cycle cellulaire, nous avons évalué la répartition des différentes phases du cycle cellulaire. La figure R-58 A, illustre un exemple des valeurs (exprimées en pourcentage) des différentes phases du le ellulaie e otôle et aps jous de taiteet à la “P μM.

B 60 ns Contrôle S1P (1 µM)

40 ns ns

cycle cellulaire cycle

% des phases du phases des % 20 ns ns ns

0 G1 S G2 G1 S G2 G1 S G2 J6 J7 J8 Temps en culture (jour) Figure R-58 : Analyse du cycle cellulaire par cytométrie de flux en présence de la S1P (1 µM) ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule). (A) Graphs de cytométrie en flux montrant la distribution des phases du cycle cellulaire (G1, S et G2) dans les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM) ou en situation contrôle au 6ème jour post-traitement. (n = 3). (B) Pourcentages des phases du cycle cellulaire (G1, S et G2) dans les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM) ou en situation contrôle à j 6, j 7 et j 8 post-traitement. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. s s. otôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test Aoa doule entrée suivi par un test de Bonferroni.

203

Résultats

Les sultats oteus idiuet ue la “P ’alte pas la patitio des diffetes phases du le ellulaie G, “ et G. E effet, auue diffee sigifiatie ’est osee à j 6, j 7 et j 8 post-traitement à la S1P comparativement au contrôle.

3.3 Ipliatio des SPR das l’effet atipolifatif de la SP osev das les CSCs W8B2+ Das le ut d’idetifie les tpes de epteus à la “P “PR iplius das l’effet antiprolifératif observé suite au traitement avec la S1P, nous avons inhibé grâce à des antagonistes très spécifiques les S1PR exprimés dans les CSCs W8B2+. Les agents pharmacologiques W146, JTE013 et BML241 ont été choisis pour inhiber respectivement et spécifiquement les récepteurs S1PR1, S1PR2 et S1PR3. La figure R-59 confirme une fois de plus l’effet atipolifatif de la “P utilise à µM et ei à pati du ème de culture (avec une ihiitio de ,%. De plus, la psee d’atagoistes des deux récepteurs de types S1PR1 et “PR W et JTE, foteet epis das les C“Cs WB, e odifie pas l’effet atipolifatif de la “P. L’ihiitio du “PR faileet epi das les C“Cs WB+) par l’atagoiste BML, aitiet aussi l’effet atipolifératif de la S1P. Contrôle ns ns ns ns S1P 100 S1P+JTE013 S1P+W146 S1P+BML241 ** * 80 ** ** *** * *** *** *** 60 ** *** ***

% du nombre cellulaire nombre du % par rapport au contrôle au rapport par 20

0 J1 J4 J6 J8 Temps en culture (jour) Figure R-59 : Test de prolifération cellulaire des CSCs W8B2+ par comptage cellulaire en présence de la S1P (1µM), S1P (1µM) + JTE013 (1µM), S1P (1µM) + W146 (1µM), S1P (1µM) + BML241 (10µM) ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) pendant 8 jours. (n = 3 sauf pour S1P + BML241). Le taux de prolifération cellulaire est exprimé en pourcentage par rapport au nombre cellulaire obtenu dans le contrôle. Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. *p<., **p<., ***p<. s. otôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test Anova double entrée suivi par un test de Bonferroni.

204

Résultats

3.4 Effet de la SP su les popits d’auto-renouvellement des CSCs W8B2+ Das l’optiue d’tudie l’effet de la “P µM su les apaits d’auto- renouvellement des CSCs W8B2+, nous avons réalisé le test de formation de colonies CFU-Fs en condition contrôle ou en présence de la S1P utilisée seule ou en présence des antagonistes des récepteurs S1PR1 et S1PR2 (figure R-60).

20 Contrôle S1P S1P+JTE013 15 S1P+W146

10 * 5 ** **

Nombre de colonies

Figure R-60 : Test de formation de colonies CFU-Fs (colony-forming unit fibroblastes) dans les CSCs W8B2+. (A) Images des colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule) après 10 jours de culture. (B) Nombre des colonies CFU-Fs formées par les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle après 10 jours de culture. (n = 3). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+. *p<0.05, **p<0.01 s. otôle. L’aalse statistiue est effetue pa u test Aoa siple ete o-paramétrique suivi par un test de Dunnett.

La figure R-60 A et B, montre que la S1P réduit très fortement le nombre de colonies CFU-Fs comparé au contrôle (une diminution de 81,2%). L’effet de diiutio du oe de colonies de la S1P est aussi observé en présence des antagonistes du S1PR1 (W146) et du S1PR2 (JTE013). Cette diiutio est de ,% e psee de l’atagoiste W et de ,% e psee de l’atagoiste JTE.

205

Résultats

3.5 Effet de la S1P sur les capacités migratoires des CSCs W8B2+ Pou eaie l’etuel ôle de la “P su la igatio ellulaie des C“C W8B2+, nous aos alu leu apait igatoie à l’aide du test de « wound healing » ou test de blessure. Ce test a été réalisé en présence de la S1P seul ou en présence des antagonistes des récepteurs S1PR1 et S1PR2. Les résultats préliminaires représentés dans la figure R-61 A et B, montrent que la S1P réduit la migration cellulaire de 27,9% après 7h par rapport au contrôle. Cependant, e psee des atagoistes du “PR W et du “PR JTE, l’effet ati-migratoire de la S1P semble être levé.

Contrôle S1P+JTE013 S1P S1P+W146

migrantes 20

Nombre de cellules de Nombre

Figure R-61 : Test de migration cellulaire en « wound healing ». (A) Images cellulaires du test de blessure à temps 0 heure (à gauche) et après 7 heures de migration (à droite) dans les CSCs W8B2+ en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle (méthanol utilisé comme véhicule). (B) Nombre des cellules ayant migré après 7 heures en présence de la S1P (1µM), S1P + JTE013, S1P + W146 ou en situation contrôle. (n = 2). Chaque barre représente la valeur moyenne ± S.E.M (erreur standard de la moyenne). n : représente le nombre de patients à partir desquels sont issues les CSCs W8B2+.

206

Discussion

DISCUSSION

I-Isolement et caractérisation des CSCs W8B2+ Dans la première partie des résultats, nous avons mis en place un modèle de cellules souches cardiaques exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+ à pati d’hatillos auriculaires humains en collaboration avec le CHU de Poitiers. Ces CSCs W8B2+ isolées dans un premier temps par tri cellulaire magnétique ne représentaient que 3% de la population cellulaire totale. Ce faible pourcentage est proche de celui obtenu par BEARZI et al., 2007 pour la population des CSCs c-kit+ huaies. Afi d’alioe le edeet ous aos is ue étape de tri cellulaire par cytométrie de flux, plus fiable et efficace, et qui nous a permis d’otei ue populatio pue de C“Cs WB+ (plus de 98% de pureté).

Les CSCs W8B2+ isolées sont apales d’auto-renouvellement et hautement prolifératives. Elles expriment des marqueurs typiques des cellules souches sehateuses WB, CD, CD et CD oe l’ot djà ot )hag et ses collègues (Zhang et al., 2015a). Cependant, les CSCs W8B2+ isolées dans nos conditions expérimentales, présentent une faible expression des marqueurs mésenchymateux CD90 et CD106. Néanmoins, une faible expression du CD90 est fréquemment observée sur les CSCs huaies d’oigie sehateuse Rossii et al., 1 ; Reus et al., 2016). De plus, Yang et ses ollgues, ot ot u’au sei e des C“Ms huaies, l’epessio de CD variait selon la nature tissulaire (0,73% dans les CSMs du tissu adipeux, 7,44% dans les CSMs du cordon ombilical, 32,04% dans les CSMs de la moelle osseuse et 65,01% dans les CSMs du placenta) (Yang et al., 2013b). Cette diffee d’epessio du CD et CD, peut aussi te due au diffetes soues d’atiops utiliss pou la totie. Les C“Cs WB+ présentent une très faible expression des marqueurs de cellules hématopoïétiques (CD34, CD45, CD133) et du marqueur de CSCs CD117 (ou c-kit, ofiat aisi l’oigie sehateuse de notre population.

Les CSCs W8B2+ non différenciées expriment certains transcrits codant pour des facteurs de transcription spécifiques du lignage cardiaque comme GATA4 et TBX3. GATA4 et TBX3 ont un rôle clé dans le développement et la fonction cardiaque (Ang et al., 2016; Yang et al., 2013a). TBX3 est essentiel dans la régulation génique et phénotypique des cellules nodales

207

Discussion

(Hoogaars et al., 2007). Les travaux de Bakker et al. ont mont ue l’idutio de TBX3 favorisait la reprogrammation des cardiomyocytes matures de souris en cellules possédant un phénotype nodale (Bakker et al., 2012). Coe das d’autes odles de ellules souches cardiaques, les CSCs W8B2+ ’epiet pas tous les fateus de tasiptio adiaues tels que GATA5, IRX4 ou encore NKX2.5. Par exemple, dans les CSCs c-kit+ humaines, seulement 0,4% des cellules sont positives pour GATA4 et NKX2.5 (Bearzi et al., 2007). Dans les CSCs Isl- 1+ fœtales huaies, deu populatios ae u pouoi de diffeiatio diffet ot t identifiées; une population exprimant uniquement Isl-1 et une autre qui expriment Isl-1 avec Nkx2.5 et TBX1 (Bu et al., 2009). Il est do poale ue l’epession des facteurs de transcription cardiaques soit dépendante du type des CSCs étudié.

La nature non différencié des CSCs W8B2+ isolées dans nos conditions expérimentales est efoe pa l’asee d’epessio giue des stutues otatiles adiaues (comme par exemple ANKB, TNNI3, TNNT2).

Le œu epie uate isofoes de la oeie C, C, C et C. ae ue distiutio patiulie selo la gio du œu Desplatez, . L’epessio des quatre isoformes de la connexine cardiaque (avec une prédominance de la connexine 43) est détectée dans les CSCs W8B2+. Leu psee sugge u’elles pouaiet joue u ôle das le contact intracellulaire observé dans les niches intra tissulaires des cellules souches cardiaques.

Le profil d’epessio giue des peptides atiutiues NP ote ue les C“Cs WB+ epiet le NP de tpe B. Ce deie ui est u idiateu d’isuffisae adiaue, a t récemment montré comme modulateur important de la prolifération des CSCs Sca-1+ murines (Rignault-Clerc et al., 2017).

II-Pofil d’epessio giue des aau ioiues das les CSCs WB+ L’aalse des tasits odat pou les aau ioiues ote ue les C“Cs WB+ psetet u photpe de ellules o eitales ui se taduit pa l’asee des tasits

odat pou les aau sodiues otaet l’isofoe adiaue NaV1.5) et les canaux calciques (notamment les isoformes cardiaques CaV 1.2, CaV 1.3, CaV 3.1 et CaV 3.2). Dans la littérature, seule une petite population de CSMs humaines de la moelle osseuse présentait des canaux sodiques tetrodotoxine (TTX) sensibles (codés par NaV1.7 dans 29% des cellules)

208

Discussion

et des canaux de type ICa.L (codés par CaV1.2 dans 15% des cellules) (Li et al., 2005). Naois, ue aute tude alise su le e tpe ellulaie idiue l’asee des transcrits codant pour le canal sodique NaV. ole ae l’asee des ouat sodiues (Heubach et al., 2004). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, seulement des courants INa ont pu être enregistrés dans une petite population de cellules (8%) (Bai et al., 2007) alors que dans les CSMs de la veine du cordon ombilical humain, 30% des cellules présentaient des courants INa TTX sensibles (codé par hNE-Na) (Park et al., 2007). Dans les CSC c-kit+ humaines, des courants Na+ TTX sensibles codés par SCN3A et SCN8A ont été observés dans 61% des cellules (Zhang et al., 2014a). Ces études suggèrent que le profil d'expression des canaux ioniques dans les CSMs peut être tissu-spécifique.

Contrairement aux canaux sodiques, les CSCs W8B2+ montre une expression génique de certains canaux potassiques codant pour les canaux K dépendant du voltage KV3.4 et KV4.2

(Ito), les canaux K activés par le calcium intracellulaire BKCa et SK4, les canaux K à rectification entrante Kir2.1 et Kir6.1 et les canaux K TWIK1. Ces résultats sont en accord avec ceux décrits dans la littérature notamment dans les CSMs humaines de la moelle osseuse où des courants

KCa (codé par KCa1.1) ont été observés (Heubach et al., 2004).

D’autes tudes alises das les CSMs de la veine du cordon ombilical humain (Park et al., ot ot l’epessio de plusieus ouats potassiues BKCa (codé par KCa1.1) dans 92% des cellules, Ito (codé par KV1.4 et KV4.2) dans 50% des cellules, et des courants IKir (codé par TWIK et Kir2.1) dans 5% des cellules. En outre, aucun courant IKdr typique n'a été enregistré, bien que les transcrits KV1.1 et KV10.1 soient détectés dans ces cellules. Dans les

CSMs humaines du tissu adipeux, des courants IKdr et BKCa ont pu être enregistrés (73% des cellules) ainsi que des courants Ito (19% des cellules) (Bai et al., 2007). Dans les cellules progénitrices cardiaques humaines c-kit+, plusieurs courants potassiques ont été également caractérisés (des courants BKCa codés par KCa.1.1 (dans 86% des cellules), des courants IKir codés par Kir2.1 (dans 84% des cellules), des courants Ito codés par Kv4.2 et Kv4.3 (dans 47% des cellules) (Zhang et al., 2014).

III-Rôle des canaux ioniques dans les CSCs W8B2+ L’esele de es tudes otet ue epessio diffetielle des aau ioiues dans les cellules souches qui serait liée à leur origine tissulaire et/ou à des fonctions

209

Discussion spécifiques. Le rôle de ces canaux dans les cellules souches adultes reste peu étudié mais les does dispoiles otet u’ils sot toiteet iplius das la gulatio de la prolifération et la migration cellulaire.

Le blocage du courant IKdr réduit considérablement la prolifération des CSMs huaies du tissu adipeu alos ue l'ihiitio d’IKCa 'a pas d'effet Bai et al., . De plus, l’ihiitio des ouats BKCa et KV4.2 (Ito) réduit la prolifération cellulaire des pré- adipocytes humains (Hu et al., 2009). Une autre étude a montré que l’ihiitio de BKCa réduit la prolifération cellulaire des CSMs huaies de la oelle osseuse e poouat l’at du + cycle en phase G0/G1 (Zhang et al., 2014b). Dans les CSCs c-kit huaies, l’ihiitio de BKCa réduit la prolifération (en accumulant les cellules en phase G0/G1) et réduit également la igatio ellulaie. Cepedat, l’ihiitio du aal Ki. ’affete pas la polifatio cellulaire mais stimule la migration cellulaire (Zhang et al., 2015b).

Dans notre modèle de CSCs W8B2+, nous avons observé deux courants majoritaires, le courant

BKCa (codé par KCa1.1) et le courant IK1 od poaleet pa Ki.. L’appliatio de l’apaie loueu du aal SK1, 2, 3) ne provoque aucun effet suggérant que les canaux SK1, 2 et 3 ne sont pas des canaux fonctionnels dans les CSCs W8B2+ (résultats non présentés).

Quant au canal BKCa il joue un rôle important dans notre modèle cellulaire car son inhibition affecte les propriétés fondamentales (prolifération et auto-renouvellement) des CSCs W8B2+ (Résultats, chapitre II « article scientifique »).

+ + Le rôle précis des canaux Na TTX sensibles et des canaux Na TTX résistants (NaV1.5), ’est pas totaleet luid das les ellules souhes adultes. Das les CSMs humaines du tissu adipeux, le blocage de l'INa n'affecte pas la prolifération cellulaire (Bai et al., 2007). De e, l’ihiitio des canaux Na+ TTX sensibles dans les CSCs c-kit+ ’a pas d’ipat su leu prolifération (Zhang et al., 2015b).

Nos résultats ont également montré que les CSCs W8B2+ expriment les transcrits codant pour les canaux potassiques TWIK1 de la famille des canaux K à deux pores (K2P) qui sont entre autres des canaux sensibles au pH (Chatelain et al., 2012). Les données de la littérature ne cessent de démontrer que les acteurs de cette famille possèdent divers rôles physiologiques et pathologiques (Feliciangeli et al., 2015). Un étude récente montre que le

210

Discussion

aal TWIK est foteet epi das les oeillettes et u’il est dieteet ipliu das la régulation de la fréquence cardiaque et de la taille des oreillettes (Christensen et al., 2016).

Malg la psee des tasits odat pou HCN, ous ’aos pas ose de courant If dans les CSCs W8B2+. Heubach et ses collègues ont obtenus les mêmes résultats dans les CSMs humaines de la moelle osseuse, qui expiet uiueet l’ARN de l’isofoe HCN sas ge de ouat ati e hpepolaisatio Heuah et al., . Auue tude à l’heue atuelle ’a ot l’eistee de ouats If dans les CSCs humaines adultes.

Concernant les canaux calciques, nous ’aos eegist auu ouat aliue das notre modèle de CSCs W8B2+. Ce constat est peu surprenant car les résultats obtenus en RT- qPCR ne montrent aucune expression des transcrits codant pour les CaV de type L (Cav1.2,

Cav1.3) et les CaV de type T (CaV3.1 et CaV3.2). Cependant, plusieurs équipes ont reporté l’epessio des tasits odats pou les CaV de tpe L et T et la psee de ouat CaV de type L dans les CSMs humaines de la moelle osseuse (Kawano et al., 2002 ; Heubach et al., 2004 ; Zahanich et al., 2005). Il est important de mentionner dans ces travaux une htogit etaie das l’epessio fotioelle des aau aliues. E effet, % des CSMs de la moelle osseuse expriment les transcrits codant pour les canaux Ca2+ de type L et seulement une petite population (13%) de ces cellules présentent des courant fonctionnels

(Zahanich et al., 2005). Dans les CSMs humaines du tissu adipeux, les ARNm des CaV de type L et T ont été détectés sans aucune fonctionnalité (Bai et al., 2007). De même, dans les CSCs c- kit+ huaies, auu ouat aliue ’a t ose (Zhang et al., 2014a).

IV-Pofil d’epessio giue des ateurs calciques dans les CSCs W8B2+ Bien que les CSCs W8B2+ ’epiet pas de tasits odat pou les aau calciques, nos résultats montrent une présence de plusieurs transporteurs ioniques (la pompe Na+/K+, la pompe calcique SERCA, la pompe à calcium PMCA et l’hageu Na+/Ca2+) et des ateus de l’hoostasie aliue la CALM/ et les epteus à l’IP ITPR/.

Ce pofil d’epessio est selale à e ui a t djà dit su les CSMs humaines et ui seait à l’oigie de phoes d’osillations calciques spontanées (Ye, 2010). En effet, les CSMs humaines possèdent des oscillations calciques spontanées qui sont régulées ajoitaieet pa les IPR, la “ERCA, l’hageu Na+/Ca2+ et la pompe PMCA (Kawano et

211

Discussion al., 2002, 2003, 2006; Orciani et al., 2010). Ces oscillations induiraient des fluctuations du potentiel membranaire via le canal potassique IKCa (Kawano et al., 2003) et seraient associées à la translocation nucléaire de NFAT; un facteur de transcription connu comme régulateur d’epessio giue Kaao et al., .

Ces oscillations calciques sont aussi présentes dans les CSCs c-kit+ humaines (Ferreira- Martins et al., 2009; Maxwell et al., 2016) et sont régulées par les IP3R et la SERCA sans impliquer la pompe Ca2+ membranaire (Ferreira-Martins et al., 2009). D’aute pat, il appaait que ces oscillations calciques jouent un rôle essentiel dans la régulation de la prolifération cellulaire. L'induction des oscillations calciques dans les CSCs c-kit+ avant leur injection dans des œus ifais de souis, alioeait la geffe et l’epasio de es ellules souhes. (Ferreira-Martins et al., 2009).

Il est à noter que notre modèle de CSCs W8B2+, nous retrouvons aussi ces oscillations aliues sultats o ots ais ous ’aos pas eoe aatis les ateus calciques impliqués dans leur genèse.

Paallleet à l’epessio des odulateus iplius das l’hoostasie aliue nous avons pu mettre en évidence, sur notre modèle de CSCs W8B2+, l’epessio des transcrits codants pour la calmoduline et la calcineurine qui sont deux principaux médiateurs des effets moléculaires du calcium. La calmoduline, qui est un acteur fondamental de tadutio ellulaie li à l’atiit aliue, gule plusieus poessus ellulaies dot la régulation du cycle cellulaire et la cytokinèse (Tsang et al., 2006). E atiat d’autes potie (comme la CaMKII ou Ca2+/calmodulin-dependant protein kinase II), la calmoduline promeut la survie des CSCs de souris et leur engagement dans le lignage cardiaque (Quijada et al., 2015). La calcineurine intervient également dans diverses fonctions notamment le développement du muscle cardiaque et squelettique via le facteur de transcription NFAT (Schulz and Yutzey, 2004; Seok et al., 2014; Wu et al., 2009) et le cycle cellulaire (Afroze et al., 2003).

Il est donc très probable que la calmoduline et la calcineurine jouent un rôle fondamental dans la régulation de prolifération des CSCs W8B2+ en relation directe ou indirecte avec la signature calcique.

212

Discussion

En conclusion, de cette partie nous avons pu isoler et purifier à partir de biopsie de œu huai des ellules d’oigie sehateuse qui possèdent toutes les caractéristiques des cellules souhes. L’aalse gloale de l’epessio giue idiue laieet u’elles e sot pas « strictement excitables » par analogie aux cardiomyocytes (absence de canaux dépolarisants de type sodique et calcique) mais auraient une activité intracellulaire liée probablement aux IP3 et à certaines conductances potassiques calcium- dépendante de type BKCa. Ces cellules possèdent un potentiel de différenciation certain orienté prioritairement vers un génotype et un phénotype myocytaire.

V-Différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+

1 Profil d’epessio des marqueurs cardiaques Les cellules souches adultes ont la propriété de se différencier in vivo et générer des cellules différenciées du tissu dans lequel elles se trouvent (Ghosh et al., 2011; Guilak et al., 2010). L’ojetif ii est d’tudie le pouvoir de différenciation cardiaque de notre modèle de CSCs W8B2+. Ce choix de différenciation est particulièrement intéressant car il permet de proposer des thérapies cellulaires de type autologue qui permettraient de remplacer des tissus nécrosés par de nouveaux cardiomyocytes lors de pathologies cardiaques comme l’ifatus pa eeple.

Pou iduie ette diffeiatio adiaue et das le ut d’ue tude opaatie nous avons utilisé des inducteurs chimiques de différenciation en se basant sur les travaux de Zhang (Zhang et al., 2015a).

Nos résultats de RT-qPCR montrent u’aps jous de diffeiatio in vitro, les CSCs W8B2+ présentent un profil génique très différent de celui avant différenciation. Néanmoins, les cellules différenciées ne présentent pas le phénotype strict des adiootes. Cei se taduit à l’helle potiue pa l’asee de stiatios tpiues des structures contractiles (la troponine T cardiaque, l’α-actinine, la chaîne lourde la myosine adiaue et à l’helle tasiptoiue pa l’asee d’idutio des tasits odant notamment pour les chaînes lourdes de la myosine cardiaques. En revanche, certains tasits odat pou des aueus de diffeiatio adiaue oe l’akie B, la chaîne légère de la myosine, le facteur natriurétique de type B sont surexprimés au cours de du processus de différenciation.

213

Discussion

L’akie B ANKB a t ote oe ue potie gulatie de l’autoatise du œud sio-auriculaire humain (Hund and Mohler, 2008; Le Scouarnec et al., 2008) probablement via la régulation du canal calcique CaV1.3 (Cunha et al., 2011). Parmi les chaînes légères de la osie, l’isofoe auiulaie MYL7 est surexprimé au cours de la diffeiatio adiaue oe l’ot ot )hag et ses ollgues (Zhang et al., 2015a). Ces résultats ne sont aucunement surprenant car les cardiomyocytes différenciés à partir des cellules souches in vitro ont été largement montrés comme ayant un phénotype cardiaque immature sur les plans morphologiques et électrophysiologiques (Shi et al., 2016; Yang et al., 2014; Zhang et al., 2015a).

Il est probable que les protéines contractiles aient une localisation nucléaire immature dans les « cardiomyocytes » issus des CSCs W8B2+. En effet, plusieurs études ont montré l’epessio de structures contractiles (comme la tropomyosine et la troponine) dans le noyau des CSMs de rat à un stade précoce de différenciation (Asumda and Chase, 2012). D’autes marqueurs cardiaques comme les facteurs de transcription GATA5 et GATA6 se trouvent également surexprimés au cours de la différenciation cardiaque des CSCs W8B2+. Ces deux facteurs jouent un rôle fondamental dans la morphogenèse cardiaque (Charron and Nemer, 1999; Peterkin et al., 2005) particulièrement vers le développeet d’u photpe odal , comme par exemple, sur les CSEs de souris (Hashem and Claycomb, 2013; Wiese et al., 2011). GATA6 est également surexprimé au cours de la différenciation vers un phénotype cardiomyocytaire des cellules humaines du cordon ombilical exprimant c-kit (Iachininoto et al., 2015) mais aussi lors la reprogrammation des CSMs humaines en précurseurs cardiovasculaires (Vecellio et al., 2012). GATA6 serait également essentiel dans le processus de différenciation en cellules musculaires lisses vasculaires (Lepore et al., 2005; Losa et al., 2017).

Dans ce contexte, il est a noter u’auue idutio de GATA ’a t osee à l’helle tasiptoiue das ote odle, oe peuet le ofie deu autes études (Reus et al., 2016; Zhang et al., 2015a).

Nos sultats souliget galeet ue aplifiatio de l’epessio du fateu natriurétique de type B (BNP) au cours de la différenciation des CSCs W8B2+. Cette induction a été également retrouvée lors de la différenciation en cardiomyocytes des CSMs de rat et des CSEs de singe (Abdelalim et al., 2006; Fukuda, 2002; He et al., 2011). Ce facteur natriurétique

214

Discussion est apale d’iduie la diffeiatio adiootaie des C“Cs de souis (Bielmann et al., 2015) mais également d’améliorer la fonction cardiaque lors de transplantation de CSMs dans u odle ui d’isuffisae adiaue (Zhang et al., 2013). Récemment, Al-Maqtari et ses collègues ont montré que les transcrits codant pour le BNP sont surexprimés lors de l’idutio des C“Cs -kit+ humaines par certains facteurs de transcription cardiaques (Al- Maqtari et al., 2017).

Cependant, nous ’aos pas ose de hageets d’epessio de tasits odat pou le fateu atiutiue de tpe A ANP d’autat plus ue e deie e psete pas d’epessio das les C“Cs WB+ aat diffeiatio. Il est à ote u’il a pu te is en évidence, notamment par notre équipe, que l’ANP joue u ôle ipotat los de la différenciation des fibroblastes de rat en myofibroblastes (Cameron et al., 2000; Moubarak et al., 2015). L’epessio et le ôle de es deu tpes de fateus atiutiues pouaiet dépendre du type cellulaire.

L’esele de es sultats ofiet le photpe iatue des adiootes oteus après différenciation in vitro des CSCs W8B2+.

L’utilisatio de l’optogtiue à l’aide du ChR oe oe peettat l’alioatio de ette diffeiatio s’est l ieffiae a le « clustering hiérarchique » des gènes se rapproche plus des CSCs W8B2+ non différenciées que celui des CSCs W8B2+ après différenciation cardiaque. Nous pensons que ce constat viendrait de la dégradation par la lumière bleue (utilisée en pulse de 50 ms à une fréquence de 1Hz pour stimuler le ChR2 tout au long du protocole de différenciation) des agents de différenciation utilisés dans notre protocole comme par exemple la vitamine A (acide rétinoïque).

2 Profil d’epessio des transcrits codant pour les canaux ioniques Les résultats des RT-PCR ous ot peis d’idetifie plusieus tasits odats pou des aau ioiues sodiues, potassiues, aliues, HCN dot d’epessio appaait au cours de la différenciation cardiaque in vitro de notre modèle de CSCs W8B2+.

En effet, plusieurs transcrits codants pour les canaux sodiques apparaissent au cours de la diffeiatio otaet, l’egee de l’epessio de l’isofoe adiaue

NaV1.5 ; un canal sodique responsable de la phase de dépolarisation (phase 0) du potentiel d’atio adiaue. E plus de l’isofoe adiaue, les tasits odats pou les isofoes

215

Discussion

neuronaux (NaV1.7) et du muscle squelettique (NaV1.4) émergent au cours de la diffeiatio. Cette oseatio est ouple à l’appaitio des tasits codants pour les sous-unités β régulatrices (NaV β et NaV β. Ces sultats sot ts selales à eu dits au cours de la différenciation cardiomyocytaire des iPSC humaines (Moreau et al., 2017). Une autre isoforme (NaV. epi das le œu huai Gaoit et al., appaait également durant la différenciation. Une étude réalisée sur les CSCs c-kit+ de souris a montré l’epessio potiue de aau sodiues de e atue ais o fotioels asee de courant sodique) (Lagostena et al., 2005).

Après différenciation « cardiaque » des CSCs W8B2+, nous avons également observé l’appaitio des tasits KV1.4 et KV4.3 et la surexpression du transcrits KV4.2 codant pour les canaux potassiques cardiaques impliqués dans le courant transitoire sortant repolarisant

Ito duat la phase du potetiel d’atio adiaue. Il est ipotat de pise ue des transcrits codant pour des canaux potassiques neuronaux apparaissent au cours de la différenciation cardiaque. Ceux-ci incluent le KV1.2 et le KV2.1 ; des canaux responsables du courant IKDR essaie à la epolaisatio du potetiel d’atio euoal.

Les transcrits codant pour les canaux KV1.5 et KV1.7 responsables des courants sortants repolarisants ultra-rapides IKur apparaissent au cours de la différenciation. Cependant les transcrits codant pour les canaux hERG (responsables du courant IKr) et KVLQT1 (responsables du courant IKs) essentiels pou la epolaisatio phase du potetiel d’atio adiaque sont absents. Parallèlement, nous avons observé la surexpression des sous-unités β régulatrices des canaux potassiques après différenciation cardiaque.

Nous retrouvons également une induction très forte des transcrits codant pour TWIK1

(canal potassique à deux domaines P ou K2P). Ce canal serait impliqué dans les processus fréquentiels et sécrétoires de certaines cellules neurales (Buckler, 2015; Ryoo and Park, 2016) et semble jouer un rôle important dans la régulation du tonus musculaire vasculaire lisse (Olschewski et al., 2006; Tang et al., 2009).

Nos sultats otet galeet l’appaitio des tasits odat pou le aal calcique CaV1.2 responsable du courant ICaL essentiel pour la phase du plateau (phase 3) du potetiel d’atio adiaue. De e ue les tasits odats pou le aal CaV1.3 ; un canal responsable du courant ICaL neuronal et qui serait également impliqué dans la

216

Discussion gatio de l’atiit paeaker cardiaque chez la souris (Mangoni et al., 2003; Zhang et al., 2005). D’autes tasits, odat pou le aal aliue CaV3.2 dont le courant (ICaT) est responsable d’ue patie de la phase lete de dpolaisatio du potetiel d’atio siusale apparaissent au cours de la différenciation cardiaque. L’appaitio de l’epessio de es canaux calciques (de type L et T) est corrélée avec celle des sous-unités régulatrices importantes pour la modulation de leur activité.

Grajales et ses collègues ont montré que durant la différenciation myogénique des

MSC murines, les transcrits codant pour les canaux calciques CaV1.2 étaient induits alors que les transcrits codant pour les canaux CaV3.2 ne présentaient aucune variation (Grajales et al., 2015). Il faut mentionner que ces conductances calciques joueraient un rôle important dans les popits ellulaies des ellules souhes. E effet, l’ihiitio des aau aliues de type L par la nifédipine, diminuait la prolifération et la différenciation cardiaque des CSCs de souris (Hotchkiss et al., 2014).

La différenciation cardiaque in vitro de notre modèle de CSCs W8B2+ est aussi accompagnée de l’appaitio des tasits odats pou HCN isofoe euoale et HCN (isoforme cardiaque) et d’une surexpression de HCN2 et HCN3. Ces canaux HCN, notamment le HCN4 sot à l’oigie des ouats If esposales de l’atiit thiue adiaue des cellules nodales. Plusieurs études réalisées sur les CSMs huaies et hez d’autes espes, ont montré clairement que la différenciation en cellules pacemaker fonctionnelles était corrélée avec la surexpression génique des isoformes HCN1 ou HCN4 (Bruzauskaite et al., 2016; Lu et al., 2013; Zhou et al., 2013).

Concernant les canaux potassiques rectifiant entrants non dépendants du temps, nous aos ose l’appaitio des tasits Ki. odat pou le aal esponsable du courant potassique IK1, etifiat etat. Ce ouat est fodaetal puisu’il oditioe le potentiel dit de « repos » à ue aleu pohe du potetiel d’uilie au potassiu. D’autes tasits odat pou des aau potassiues etifiat etats sesiles à l’atlholie Ki. et sesiles à l’ATP Ki. appaaisset galeet au ous de la différenciation des CSCs W8B2. Les canaux Kir3.x ont une localisation nodale et atriale et sont impliqués dans la régulation du rythme cardiaque via les récepteurs muscariniques de type M2 (Corey et al., 1998; Krapivinsky et al., 1995). Quant aux canaux Kir6.x couplés aux récepteurs aux sulfonylurés (SUR2A ; qui est maintenu), ils sont fortement impliqués dans la régulation de la

217

Discussion stio d'isulie et das etaies oditios ishiues dpltio d’ATP itaellulaie du contrôle du tonus musculaire vasculaire lisse et cardiaque (Miki et al., 2002; Ng et al., 2010; Seino, 1999). Das ote odle, es aau e peuet te atifs u’e asee d’ATP itaellulaie, soit das des oditios d’ishie dastiues ui pouaiet te potentiellement un déclencheur de la différenciation.

Il a t ot ue l’hpepolaisatio des C“Cs fœtales huaies tait suffisate pou induire la différenciation cardiaque mature (générant des cardiomyocytes qui battent spontanément) soulignant un nouveau mécanisme de différenciation cardiomyogénique des CSCs (van Vliet et al., 2010) ayant pour socle une plateforme de vecteurs ioniques.

Das l’esele l’aalse des tanscrits codant pour les canaux ioniques après différenciation des CSCs W8B2+, peut toige d’ue oietatio ves u photpe de cellules excitables de type pacemaker. Le maintien des gènes TBX3 (voir chapitre I résultats), de l’idutio de HCN, ICaT, Ki va das le ses d’ue diffeiatio de tpe paeake,

aois l’idutio du Nav.5, de Ki. IK1 est e faveu d’ue diffeiatio de tpe atrial.

Même si un courant calcique a été enregistré sur quelques CSCs W8B2+ différenciées (non ot, les autes ouats iplius das le potetiel d’atio adiaue ’ot pas t enregistrés (mise à part BKCa et IK1), confirmant ainsi le phénotype cardiomyocytaire immature obtenu après différenciation in vitro. Nous pouvons néanmoins construire ue sigatue d’u potetiel d’atio hpothtiue d’ue ellule diffeie. Figure D-1

Figure D-1 : odle hpothtiue d’u potetiel d’atio g pa ue ellule WB+différenciée

218

Discussion

3 Oscillations calciques au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+ E plus de l’appaitio de l’epessio des transcrits codant pour les canaux calciques de tpe L et T, os sultats ot ot u hageet das l’epessio des ateus de l’hoostasie aliue iplius das le ouplage excitation-contraction au cours de la différenciation des CSCs W8B2+. E effet, ous aos ose ue appaitio de l’epessio des transcrits codant pour la pompe Na+/K+, une surexpression des transcrits codant pour la “ERCA, l’hageu NCX et les epteus à l’IP et ue fote sous-expression de la CALM3. En paallle, l’iageie aliue via l’utilisatio de la sode aliue GCaMP a l des hageets sigifiatifs das la fuee, l’aplitude, l’aie, le TTP, le TTR et les petes des oscillatios aliues osees au ous de ette diffeiatio adiaue. De plus, l’tude pharmacologique réalisée sur les CSCs après différenciation a permis de déterminer le rôle ajeu de l’hageu NCX das la gatio de es osillatios. Les sultats de l’ihiitio de etais ateus aliues sugget ue es osillatios sot ges d’ue pat pa les canaux calciques CaV de tpe L et les epteus à l’IP esposales de l’augetatio aliue itaellulaie et d’aute pat pa la “ERCA pour la recapture calcique responsable de la baisse de la concentration calcique intracellulaire. Ces oscillations apparaissent insensibles à la ryanodine, un constat logique car les transcrits qui la codent sont absents dans les CSCs non différenciées et après différenciation cardiaque.

Dans les cellules souches les oscillations calciques ont été enregistrées et analysées principalement dans les CSMs humaines (Orciani et al., 2010 ; Kawano et al., 2006 ; Kawano et al., 2003) . Elles ont été néanmoins obsees et aatises das d’autes tpes cellulaires comme les fibroblastes cardiaques humains (Chen et al., 2010), les cellules endothéliales aortiques et cérébrovasculaires humaines (Hu et al., 2002; Scharbrodt et al., 2009) et les lymphocytes (Lewis, 2003). Toutefois, leurs rôles dans ces différents types cellulaires restent à élucider.

Il est ipotat aussi de sigale le aue uel de does su l’olutio et le ôle de ces oscillations lors de processus de différenciation notamment cardiaque.

Au cours de la différenciation cardiaque in vitro des CSCs W8B2+, nous avons observé ue diiutio de la fuee et ue augetatio de l’aplitude des osillatios aliues ce qui pourrait suggérer un rôle de ces oscillations dans le processus de différenciation. Une étude sur la différenciation ostéogénique des CSMs humaines a rapporté également une

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Discussion diminution de la fréquence des oscillations calciques au cours de la différenciation mais aucun hageet oeat l’aplitude (Sun et al., 2007). Dans ce travail, la différenciation ostéogénique des CSMs conjuguée à la réduction de la fréquence des oscillations (induites par stiulatio letiue augetait l’effiait de la diffeiatio, e ui sugge u ôle important de la fréquence dans ce poessus. D’aute pat, il a t ot ue des osillatios calciques apparaissent dans les cellules souches hépatiques de rat et les MSC humaines quand celles-ci sont mises en culture avec des cardiomyocytes de rats néonataux (Muller-Borer et al., 2012, 2007). Ces oscillations dans ces cellules souches sont synchrones avec celles des adiootes et poouet l’auisitio d’u photpe adiaue pa l’idutio transcriptomique de gènes cardiaques. Dolmetsch et ses collègues indiquent que la fréquence des osillatios aliues gulait diffeet l’epessio giue et seul NF-kB répondait aux oscillations de faibles fréquences (Dolmetsch et al., 1998).

Nos résultats montrent une sous-expression significative des transcrits codants pour la calmoduline 3 supposant son asee d’implication durant le processus de différenciation cardiaque.

Cepedat, auu hageet d’epessio des tasits odats pou la alieuie ’a été observé. La calmoduline (CaM) et la calcineurine font partie des principaux médiateurs des effets moléculaires du calcium en activant plusieurs cibles moléculaires comme NF-AT, NF-KB, CaMKII. La odulatio de l’epessio spifiue de fateus de tasiptio (Smedler and Uhlén, 2014) serait en relation avec les paramètres cinétiques, d’aplitude et de fuee de l’hologe aliue itisue.

Le facteur de transcription NFAT activé par la calcineurine jouerait le rôle de décodeur des oscillations calciques (Dolmetsch et al., 1998). Par exemple, dans les cellules endothéliales humaies de la eie du odo, la fuee, l’aplitude et la due des osillatios aliues gulaiet l’atiit du fateu de tasiptio NF-KB (Song et al., 2012). Ce facteur de transcription est activé seuleet si l’aplitude des osillatios atteit ue aleu seuil. “o activité est plus intense au fur et à mesure que la fréquence et/ou la durée des oscillations augmentent. Plusieurs études ont également souligné que la fréquence et la durée des oscillatios gulaiet l’atiit de NFAT das plusieus odles ellulaies (Onohara et al., 2006; Tomida et al., 2003; Uhlén et al., 2006). Des travaux récents indiquent (via un contrôle des oscillations calciques par optogénétique) que le facteur de transcription NFAT est aussi

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Discussion sesile au aiatios de l’aie des osillatios aliues (Hannanta-Anan and Chow, 2016). L’esele des données disponibles montre que NFAT est activé par les oscillations calciques aat ue fuee de à Hz et d’ue due de , à s (Smedler and Uhlén, 2014).

Le facteur de transcription NF-KB (activé par la calcineurine) connu comme étant sesile à la fuee, la due et l’aie des osillatios aliues das plusieus tpes cellulaires (Hu et al., 1999; Jin et al., 2006; Scharbrodt et al., 2009; Zhu et al., 2008, 2011).

NF-KB seait ati pa les osillatios aliues aat ue fuee de à Hz et d’ue durée de 36 à 52 s (Smedler and Uhlén, 2014).

L’atiatio de la aliu alodulie kiase de tpe II CaMKII est aussi sensible aux oscillations calciques (De Koninck and Schulman, 1998; Dupont et al., 2003). Elle est activée par les oscillations calciques ayant une fréquence de 100 à 4000 mHz et une durée de 200 ms (Smedler and Uhlén, 2014).

La protéase calpaïne a été également considérée comme un décodeur calcique (Tompa et al., 2001) et activée par les oscillations calciques ayant une fréquence de 1 à 50 Hz et une durée de 20 ms (Smedler and Uhlén, 2014).

Durant la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes, la voie MAPK (Mitogen-activated protein kinases) joue un rôle central (Grajales et al., 2010; Park et al., 2009; Tonelli et al., 2012). Elle serait également sensible aux oscillations calciques (Lockyer et al., 2001; Tognon et al., 1998; Walker et al., 2004). L’atiatio de ette oie via la phosphorylation de ERK) est régulée par des oscillations calciques ayant une fréquence de 1,7 à 17 mHz et une durée approximative de 50 s (Kupzig et al., 2005). Ces résultats ont été confirmés dans une étude de modélisation théorique montrant une corrélation négative entre la diiutio de la fuee osillatoie et l’atiatio de la oie MAPK (Yi et al., 2011).

Il est très probable que les changements dans les paramètres des oscillations calciques fuee, aplitude, due, aie … oseves aps diffeiatio de ote odle de CSCs W8B2+ soiet lis à l’auisitio du photpe adiaue iatue osev.

De plus, les changements des paramètres des oscillations calciques pourraient bien agir sur des ateus olulaies pou odule l’epessio de ges adiaues. Copte teu des données bibliographiques, la voie MAPK serait un décodeur potentiel des changements de

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Discussion fréquence et de durée des oscillations observées dans notre modèle de CSCs W8B2+ différenciées. Dans ces dernières, la fréquence est de 5 mHz et la durée est de 92 s, des valeurs proches de celles auxquelles la MAPK est sensible (Smedler and Uhlén, 2014). De plus, nous observons une diminution de la fréquence au cours de la différenciation cardiaque, des sultats selales à l’tude de odlisatio thoiue (Yi et al., 2011) selon laquelle la diiutio de la fuee osillatoie et lie à l’ativatio de la voie MAPK.

Selon Smedler et Uhlén, la MAPK est également sensible aux oscillations dans les cardiomyocytes d’autat plus ue ette oie est ipliue das la diffeiatio adiaue.

Il est très probable que les facteurs de transcription NFAT et NF-KB (régulés par la calcineurine) ne seraient pas des décodeurs des oscillations observées dans les W8B2+ différenciées car l’epessio des tasits odat pou la alieuie e haget pas au ous de la différenciation. De même, la CaMKII ne serait pas directement impliquée car les transcrits codant pour la calmoduline se trouvent sous-exprimés au cours de la différenciation. De plus, la alpaïe, la CaMKII ’est pas sesile au valeus de fuee et de due oseves su les CSCs W8B2+ différenciées.

Il est ipotat de ote u’e plus de so ôle essetiel das la polifatio et l’auto- +, renouvellement des CSCs W8B2 le canal potassique activé par le calcium BKCa semble jouer u ôle das la diffeiatio. L’ihiitio du aal BKCa diminuait drastiquement les paates des osillatios aliues fuee, aplitude, due… osees su les C“Cs W8B2+ diffeies. D’aute pat, les osillatios aliues spotaes iduiset des fluctuations du potentiel membranaire via le canal potassique IKCa (Kawano et al., 2003) et est associées à la translocation nucléaire de NFAT (Kawano et al., 2006). Une autre étude a ot ue le potetiel eaaie gulait les osillatios aliues otôles pa l’IP

(Kukuljan et al., 1994) suggérant une implication du canal BKCa dans la régulation ce ces oscillations.

222

Discussion

4 La sphingosine 1-phosphate (S1P) joue un rôle important dans les CSCs W8B2+ La signalisation par les récepteurs à la S1P (S1PR) joue un rôle important dans la gulatio des popits fodaetales polifatio, diffeiatio… des ellules cardiaques (Means and Brown, 2009). Cepedat auue tude à l’heue atuelle su les C“Cs et notamment sur les CSCs W8B2+ n’a appot des effets de la “P. Nos sultats ot ot sur ce modèle de cellules souches cardiaques, l’epessio tasiptoiue des epteus S1PR1, S1PR2 et S1PR3 (avec une prédominance du S1PR2). Ce pofil d’epessio est semblable à celui des MSC humaines de la moelle osseuse (Kong et al., 2014; Quint et al., 2013). Das le œu huai, Ahed et ses ollgues ot idetifi l’epessio des “PR, S1PR2 et S1PR3 au niveau transcriptomique et S1PR1 et S1PR3 au niveau protéique, un profil quasi identique, das les œus de ats (Ahmed et al., 2017).

Dans notre étude, l’ajout de la “P à µM, ue oetatio plasatiue physiologique) diminue significativement la prolifération des CSCs W8B2+. Cependant l’aalse du le ellulaie aps et jous de taiteet à la “P e ote pas de différence dans les phases du cycle comparé au contrôle contrairement à la paxilline et l’iiotoie. De plus, l’ihiitio phaaologiue spifiue des epteus “PR, “PR et S1PR3 (candidats moléculaires potetiels e ous a pas peis d’idetifie le ou les epteus iplius das l’effet atipolifatif di pa la “P.

Il est important de signaler que la majorité des données de la littérature rapporte un effet pro-prolifératif de la S1P et ceci dans plusieurs modèles cellulaire tels que les fibroblastes cardiaques (via le S1PR3) (Benamer et al., 2011), les cellules satellites (via le S1PR2 et le S1PR3) (Calise et al., 2012; Donati et al., 2013), les cellules endothéliales (via le S1PR1 et le S1PR3) (Kimura et al., 2000) et les CSMs humaines du chorion (Innamorati et al., 2017).

Cependant, la S1P peut avoir un effet antiprolifératif notamment dans les lymphocytes T humaines (Jin et al., 2003), les myofibroblastes hépatiques humains (Davaille et al., 2000), les hépatocytes (Ikeda et al., 2003) et dans les cellules thyroïdiennes de rats (Björklund et al., 2005). Das les lphotes T, le aise ’a pas t tudi ais l’effet atipolifatif dans les hépatocytes de rats serait médié par le S1PR2 (via la voie Rho) (Ikeda et al., 2003). Les auteurs ont supposé que la S1P est un régulateur négatif de la régénération hépatique. Das les ofiolastes hpatiues huais, l’effet atipolifatif de la “P stiulait la oie de l’AMP suite à ue augetatio du taux des protaglandine E2 (Davaille et al., 2000). Dans

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Discussion les cellules thyroïdiennes de rats, la S1P augmente la concentration de calcium intracellulaire (via la phoshoplipase C et l’IP et de l’AMP. D’aute pat, la “P pooue ue augetatio transitoirement des transcrits codant pour son propre récepteur S1PR2 (Björklund et al., . De plus, Ji et ses ollgues ot ot ue l’atiatio des lphotes T par des stimuli chimiques ipatait osidaleet l’epessio des “PR Ji et al., 2003).

L’esele de es does otet laieet ue l’effet atipolifatif de la SP est di pa le SPR faisat itevei le aliu. Le hageet de l’epessio des SPR pa la S1P elle-même ajoute u aute iveau d’auto-régulation par la S1P.

Il a été montré récemment que la S1P pouvait être secrétée par les CSMs de souris (Sassoli et al., 2014) et humaines dérivées des iPS (Du et al., 2017), ajoutat aisi d’autes niveaux de complexité de régulation para et autocrine. En effet, cette S1P secrétée par les CSMs uies tait apale d’iduie la polifatio des cellules souches satellites et des cellules myoblastiques C2C12 (Sassoli et al., 2014). Quant aux MSC humaines dérivées des iPS, les auteurs observent pour la première fois que la sécrétion de la S1P passait par un processus exosomique via la membrane plasmique des hépatocytes (Du et al., 2017). Ces exosomes taiet apales d’iduie la polifatio des hpatotes poaleet e iduisat la synthèse et la libération de la S1P intracellulaire.

La S1P agit principalement via ses cinq récepteurs mais une voie intracellulaire déclenchée indépendamment des récepteurs est de plus en plus décrite (Dupont et al., 2003; Payne et al., 2002). Par exemple, Xiu et ses collègues ont montré que la S1P intracellulaire iduit l’epessio du ollage pa les ofiolastes los de la fiose hpatiue, indépendamment de l’atiatio de ses récepteurs (Xiu et al., 2015).

Ces données viennent encore une fois ajouter un autre niveau de régulation indépendant de la signalisation médiée par les récepteurs à la S1P.

Nos sultats ot galeet ot ue la “P diiue dastiueet l’auto- eouelleet, u aise de diisio ae pseatio de l’tat souhe et ui peut te odul pa l’eioeet (He et al., 2009). L’ihiitio des “PR1 et S1PR2 dans notre modèle de CSCs W8B2+, a ot ue ette pessio de l’auto-eouelleet ’est pas médiée par les récepteurs S1PR1 et S1PR2.

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Discussion

Il a été montré que la S1P joue un rôle très important dans la régulation des cellules souches neurales (CSNs) de souris (Codega et al., 2014). Ces CSNs se trouvent dans deux états ; un état quiescent (qCNSs) et un état activé (aCNSs). Quand elles sont activées, les CNSs deviennent hautement prolifératives. Ces chercheurs ont montré que la S1P agit en diminuant l’atiatio des CN“s sas alte le oe des aCN“s alos ue les postagladies D diiuaiet à la fois l’atiatio des CN“s et le oe des aCNSs (Codega et al., 2014). Ces travaux soulignent un rôle important de la S1P dans la physiologie des cellules souches.

Une autre étude décrite sur les MSC humaines du chorion a montré que la S1P diiuait l’auto-renouvellement seulement si elle est combinée avec des agents qui augetet la oetatio itaellulaie de l’AMP (Innamorati et al., 2017).

Ces does de la littatue sugget ue la SP gule gativeet l’auto- renouvellement des cellules souches en maintenant leur état quiescent ou en induisant leur engagement vers un processus de différenciation.

Enfin, nos résultats préliminaires ont montré un effet plutôt anti-migratoire de la S1P dans les CSCs W8B2+.

La migration joue un rôle essentiel dans la régulation des propriétés des cellules souches. En effet, la majorité des cellules souches est retenue dans une niche mais peuvent la quitter en réponse à des stimuli spécifiques, un processus appelé « mobilisation ». Les cellules souches sont également capables de regagner la niche par un processus opposé nommé domiciliation ou « homing ». Il s’ae ue la “P est u stiulus ts ipotat qui régule la mobilisation de différents types cellulaire comme les CSMs, les progéniteurs endothéliaux, les CSHs etc. (Ratajczak et al., 2014).

Le rôle de la S1P dans la mobilisation des CSHSs a été bien étudié et les études ont soulig l’ipotae du gadiet “P ete le sag, la lphe et le tissu das la gulatio de la mobilisation de ces cellules (Golan et al., 2013; Liu et al., 2011).

L’esele des does de la littatue su l’effet de la “P su la igatio ellulaie in vitro montre des effets pro et anti-igatoies. L’effet po-migratoire a été signalé par exemple dans les cellules endothéliales humaines (probablement via S1PR1 et S1PR3) (Kimura et al., 2000), les cellules satellites de souris (Calise et al., 2012), les CSMs humaines de la moelle osseuse (via S1PR1 et S1PR3)(Kong et al., 2014) et les fibroblastes cardiaques de souris (via le

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Discussion

S1PR3) Beae et al., . Quat à l’effet ati-migratoire, la S1P inhibait la migration des CSMs humaines du chorion (via l’augetatio de l’AMP Iaoati et al., , les cellules musculaires lisses bronchiques humaines (via S1PR2)(Kawata et al., 2005), les myoblastes C2C12 (via S1PR2) (Becciolini et al., 2006) et les puseus d’oligodedotes de rat (via S1PR5) (Novgorodov et al., 2007).

E su, l’esele de os sultats ote ue epessio des tasits odat pour S1PR1, S1PR2 et S1PR3 avec une prédominance du S1PR2 dans notre modèle de CSCs W8B2+. De plus dans ce modèle cellulaire, la S1P régule négativement la prolifération et/ou l’auto-renouvellent et la migration. Les données de la littérature suggèrent que la S1P augmenterait la quiescence (cellules en phase G0, sorties du le ellulaie ou l’egageet des CSCs W8B2+ dans une voie de différenciation.

Quant au mécanisme, les données de la littérature nous orientent vers un effet de la S1P médié par le S1PR2 faisant intervenir le Ca2+ et l’AMP. Cei peut eette e uestion la spifiit de so ihiitio SPR pa l’aget JTE. E effet, l’ihiitio du SPR pa le JTE s’est vle ieffiae (Salomone and Waeber, 2011) et sutout su l’augetatio du calcium intracellulaire (Long et al., 2010).

Sio, d’autes aises e : autorégulation par la S1P de ses propres récepteurs, sécrétion de la S1P par les CSCs W8B2+, signalisation intracellulaire etc.) peuvent être à l’origine des effets observés de la S1P dans notre modèle.

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Conclusion générale et perspectives

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Nous aos pu isole et puifie à pati de iopsies de œu huai des ellules d’oigie sehateuse epiat le aueu WB2, ayant des caractéristiques de cellules souches. Ces clones apparaissent homogènes de par leur génotype et leur phénotype.

L’aalse gloale de l’epessio giue e patiulie des aau ioiues, idiue que les CSCs W8B2+ possèdent un phénotype non-eitale oe ’est le as pou les autes types de cellules souches. Ces cellules expriment quelques courants potassiques, notamment le canal BKCa ui s’ae essetiel pou gule leus popits fodaetales oe la polifatio et l’auto-renouvellement. De plus, ces cellules présentent une signature calcique ou atiit aliue itaellulaie poaleet lie à l’hologe aliue de tpe IP et au conductances potassiques calcium-dépendantes de type BKCa. L’aalse tasiptoiue monte ue es ellules peuet s’oiete es u photpe adiaue de tpe odal et/ou auriculaire immature quand elles sont différenciées in vitro (figure C-1).

Cette diffeiatio s’aopage d’ipotats hageets de l’atiit aliue et peut s’appaete à l’appaitio d’ue hologe aliue eaaie gulatie de l’hologe calcique interne. Nos expérimentations montrent que la différenciation in vitro, par analogie à la différenciation des cellules souches pluripotentes induites, ne peut en aucun cas conduire à l’otetio de adiootes tpiues. Nous otos galeet ue la diffeiatio in vitro ne semble pas la meilleure orientation pour la réalisation de greffe cellulaire cardiaque. Les approches génomiques et fonctionnelles des progéniteurs cardiaques semblent les plus pertinentes pour en intégrant la notion de niches cardiaques et les processus autocrine/paracrine liés à leur environnement multicellulaire. La cible principale apparait oe tat l’hologe aliue itee piitive intégrant tous les facteurs de régulation. Comme par exemple les processus inflammatoires, hormonaux, ischémiques, mécaniques, de otates… suseptiles d’eille es pogiteus pou ue paatio tissulaie opate.

Dans ce cadre et comme exemple, les CSCs W8B2+ sont particulièrement sensibles à la sphingosine 1-phosphate (S1P), un lipide plasmatique extrêmement important qui agit sur ces ellules e diiuat leus apaits de polifatio, d’auto-renouvellement et de migration.

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Conclusion générale et perspectives

Dans son esele e taail appote d’ipotates ifoatios su la phsiologie des ellules souhes adiaues, otaet su l’ipliatio des aau ioiues et l’atiit dynamique calcique intrinsèque dans la régulation de leurs propriétés.

Néanmoins, cette étude doit être complétée par :

 Ue tude plus appofodie de l’atiit aliue spotae des ellules souhes WB pa ue aatisatio phaaologiue, afi d’idetifie les ateus iplius das la gatio de leu l’hologe ou osillateu alique.

 L’aalse à l’helle potiue des aau ioiues et ateus aliues dot l’epessio hage au ous de la diffeiatio oe pa eeple les aau de la K2P et TRP, ASIC, les récepteurs purinergiques ou SOCs ...

 Une optimisation du protocole de différenciation cardiaque de type chimique en ajustant notre mode de stimulation par optogénétique ou par des protocoles de différenciation plus performants (par exemple en 3 dimensions ou en mimant le microenvironnement cardiaque).

 Une étude plus poussée pour décrypter au niveau moléculaire les cibles impliquées dans les modifications des paramètres des oscillations calciques au cours de la différenciation.

 Un examen plus approfondi du ode d’atio de la “P ui peut te u odulateu négatif de la régénération cardiaque en impactant les propriétés fondamentales des C“Cs. Plusieus poits doiet te solus pou dteie le aise d’atio de ce lipide (expression protéique des récepteurs, étude de la quiescence, inhibition plus ciblée des réepteus et…

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Conclusion générale et perspectives

A B

Figure C-1 : Scha apitulatif des piipau ges dot l’epessio aie aps diffeiatio cardiaque in vitro des CSCs W8B2+. Avant différenciation cardiaque, les CSCs W8B2+ (A) expriment les transcrits codant pour les facteurs de transcription GATA4 et TBX3, les connexines cardiaques (Cx43, Cx40, Cx45, Cx30.2) et la calmoduline 3. Ces cellules expriment également les transcrits codant pour les canaux potassiques (KV3.4, KV4.2, BKCa, TWIK1, Kir 2.1 et Kir 6.1) et les canau HCN. A l’tat non différencié, les CSCs W8B2+ psetet des osillatios aliues apides, des epteus à l’IP, la “ERCA et l’hageu NCX. Aps diffeiatio adiaue B, il a ue appaitio de l’epessio des tasits odat pou les canaux calciques (CaV1.2 CaV1.3 et CaV3.2), les canaux sodiques (NaV1.4 NaV1.5 NaV1.7 et NaV2.1), les canaux HCN (HCN1, HCN3 et HCN4), les canaux potassiques (KV1.2, KV1.4, KV1.5, KV1.7, KV2.1, KV4.3, TASK1, Kir 2.3, Kir 3.1 et Kir 6.2) et la pompe Na+/K+). Dans les CSCs W8B2+ différenciées, les oscillations calciques présentent une fréquence plus faible et ue aplitude plus ipotate. Paallleet à ela, il a ue suepessio de l’hageu NCX, de la “ERCA et des epteus à l’IP. Il est à ote galeet u’aps diffeiatio les facteurs de transcription GATA5 et GATA6 sont surexprimés.

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Références bibliographiques

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Résumé

RESUME Résumé

L’ojetif de ette thse tait de deloppe et de aatise u odle de ellules souhes cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire.

Aps aoi sletio et aatis ue populatio de ellules souhes d’oigie sehateuse, isole à pati d’auiules huaies, epiat le aueu WB C“Cs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d’iuo-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1) la caractérisation giue des aau ioiues et des ateus de la sigalisatio aliue et l’tude de leu diffeiatio i ito e paallle à l’atiit aliue itaellulaire.

Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker.

Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, KV, NCX, s’epiet duat la diffeiatio. L’eegisteet de l’atiit aliue ia ue sode optogénétique) montre la psee d’osillatios aliues ui oluet e fuee et e itesit pedat la différenciation. Les stocks-IP sesiles et l’hageu NCX joueaiet u ôle fodaetal.

Nous aos esuite tudi l’ipotae du aal BKCa et des récepteurs sphingosine 1- phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+.

L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-eouelleet ais ’affete pas la igatio. Quat à la “P elle feie la polifatio et l’auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3.

Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque.

Mots-clés : thérapie cellulaire, cellules souches cardiaques humaines, cellules mésenchymateuses, différenciation, canaux ioniques, signalisation calcique, canal BKCa, sphingosine 1-phosphate, optogénétique.

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Résumé

Abstract

The aim of this thesis was to develop and characterize a model of human heart stem cells in a context of cell therapy.

A population of mesenchymal stem cells, expressing the W8B2 marker (CSCs W8B2+), was first isolated from human auricles and characterized using high-throughput RT-qPCR techniques, immuno-labeling, western-blot and calcium fluorescence imaging. These experiments were focused on 1) the gene expression of ion channels and calcium signaling proteins; and 2) the study of CSCs W8B2+ in vitro differentiation and associated intracellular calcium activity changes.

The results show that CSCs W8B2+ tend to differentiate into pacemaker cells. Some nodal specific genes such as Tbx3, HCN, ICaT, L, KV, NCX, are expressed during differentiation. The recording of calcium activity (via an optogenetic probe) shows the presence of calcium oscillations that change in frequency and intensity during differentiation. IP3 sensitive calcium stocks and the NCX exchanger would play a fundamental role in these variations.

Then we studied the importance of the BKCa channel and the sphingosine 1-phosphate (S1P) receptors in the regulation of the fundamental properties of the W8B2+ CSCs. Inhibition of

BKCa reduces cell proliferation by accumulating cells in the G0 / G1 phase, suppresses cell self- renewal but does not affect migration properties. Concerning S1P, it decreases proliferation and self-renewal without stimulate S1P1,2,3 receptors.

This work highlights fundamental potential molecular targets in a context of cardiac cell therapy

Keywords : cell therapy, human cardiac stem cells, mesenchymal cells, differentiation, ion channels, calcium signaling, BKCa channel, sphingosine 1-phosphate, optogenetic.

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