Excavata: Heterolobosea)

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta

Studijní program: Biologie Studijní obor: Zoologie

Bc. Kristýna Uhrová

Diverzita nekultivovatelných a obtížně kultivovatelných zástupců čeledi Psalteriomonadidae (Excavata: Heterolobosea)

Diversity of noncultivation and difficult cultivation representatives of family Psalteriomonadidae (Excavata: Heterolobosea)

Diplomová práce

Školitel: doc. RNDr. Ivan Čepička, Ph.D

Praha, 2017

Prohlášení:

Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze, 15. 08. 2017

Podpis

Poděkování

Na tomto místě bych ráda poděkovala zejména svému školiteli, Ivanu Čepičkovi, za pomoc při sepisování této práce, za odborné rady, poskytnutí materiálu a za trpělivost. Díky Ivane. Dále bych ráda poděkovala Petru Táborskému za cenné rady, Tomáši Pánkovi a velké díky Pavle Hanouskové za pomoc při scanovací elektronové mikroskopii.

A v neposlední řadě děkuji svým blízkým za podporu při mém studiu.

OBSAH

Abstrakt...... 5 Abstract...... 6 1. Úvod a cíle...... 7 2. Literální přehled...... 8 2.1. Environmentální diverzita protist...... 8 2.2. Charakteristika kmene Heterolobosea...... 9 2.3. Charakteristika čeledi Psalteriomonadidae...... 15 2.4. Taxonomie čeledi Psalteriomonadidae...... 19 3. Materiál a metody...... 20 3.1. Kultivace izolátů...... 20 3.1.1. Složení a příprava médií...... 20 3.1.2. Získávání nových izolátů...... 21 3.2. Morfologie...... 21 3.2.1. Barvení protargolem podle Bodiana, modifikováno podle Nie (1950)...... 21 3.2.2. Pozorování pomocí světelného mikroskopu...... 23 3.2.3. Scanovací elektronová mikroskopie...... 23 3.3. Izolace DNA...... 23 3.3.1. Amplifikace genu pro SSU rRNA...... 24 3.4. Elektroforéza...... 25 3.5. Purifikace PCR produktů...... 25 3.6. Klonování...... 25 3.6.1. Příprava ligační směsi...... 26 3.6.2. Příprava bakteriálních kolonií...... 26 3.7. Sekvenace DNA...... 27 3.8. Vyhodnocení sekvencí a fylogenetická analýza...... 28 4. Výsledky...... 29 4.1. Izoláty...... 29 4.2. Fylogenetická analýza...... 35 4.3. Morfoligie...... 40 4.4. Environmentální sekvenování...... 50 5. Diskuze...... 51 5.1. Environmentální sekvenování...... 51 5.2. Fylogeneze a morfologie nových druhů...... 51 5.3. Diverzita čeledi Psalteriomonadidae...... 55 6. Závěr...... 56 7. Literatura...... 57

ABSTRAKT

Kmen Heterolobosea je skupinou améboflagelátů, améb a flagelátů patřící do říše Excavata. V současnosti je popsáno asi 150 druhů zástupců kmene Heterolobosea, z nichž je asi 20 druhů obligátně anaerobních. Většina z nich patří do čeledi Psalteriomonadidae. Cílem této práce bylo poznat diverzitu potenciálních obtížně kultivovatelných a nekultivovatelných anaerobních zástupců kmene Heterolobosea. Získali jsme mnoho nových izolátů zejména ze sladkovodních sedimentů. Izolovali jsme DNA z čerstvých kultur a určili jsme sekvence jejich genu pro SSU rRNA za použití primerů specifických pro skupinu Psalteriomonadidae. Získali jsme 123 nových sekvencí, které reprezentují 6 již popsaných druhů, dále bylo objeveno 16 potenciálně nových druhů. Nicméně mnoho nových druhů zaniklo v raných stádiích kultivování. Naše výsledky naznačují, že existuje velká diverzita nekultivovatelných a obtížně kultivovatelných druhů čeledi Psalteriomonadidae.

Klíčová slova: diverzita, gen pro SSU rRNA, Heterolobosea, kultivace, Psalteriomonadidae

ABSTRACT

Heterolobosea is a group of amoeboflagellates, amoebae, and flagellates belonging to the supergroup Excavata. Approximately 150 species of Heterolobosea have been described, from which less than 20 are obligately anaerobic. Most anaerobic species belong to the family Psalteriomonadidae. The aim of this study was to examine the diversity of potentially uncultivable anaerobic heteroloboseids. We obtained multiple new isolates, mainly from freshwater hypoxic sediments, isolated DNA from fresh cultures and determined their SSU rRNA gene sequences using Psalteriomonadidae-specific primers. In total, we have analyzed sequences of 123 new strains, which represented six already described species of Psalteriomonadidae as well as 16 potentially new ones. However, most of the new species died during the early stages of culture. Our results suggest that a great diversity of uncultivable psalteriomonadids exists in the nature.

Key words: diversity, SSU rRNA, Heterolobosea, cultivation, Psalteriomonadidae

1. ÚVOD A CÍLE PRÁCE

Tato práce byla původně zaměřena na environmentální sekvenování vybraných linií anaerobních protist, zejména zástupců čeledi Psalteriomonadidae (Excavata: Heterolobosea: Tetramitia). Tato čeleď byla vybrána, protože byly publikovány PCR primery, které by měly být specifické pro gen pro SSU rRNA jejich zástupců (Pánek et al. 2012, 2014b). Čeleď Psalteriomonadidae patří do kmene Heterolobosea. Kmen Heterolobosea je nepočetnou skupinou, kde bylo posáno přibližně 150 druhů. Avšak je to významný taxon, protože do něho náleží několik významných patogenů člověka. Nicméně náplň diplomové práce se brzy změnila kvůli obtížím při izolování DNA přímo z prostředí a po zjištění, že zmíněné primery nejsou zcela specifické v případě, že ve vzorku výrazně převažuje DNA jiných organismů, a tudíž byly použity i další metody k odhalení diverzity, a to metody mikroskopovací a kultivační. Kvůli již zmíněným problémům při odhalování environmentální diverzity jsme se nakonec zaměřili na charakterizaci kultur, které jsme nasbírali a na kultury z naší sbírky, která byla velmi rozsáhlá. Jednalo se o sladkovodní i mořské izoláty, ze kterých jsme izolovali a následně sekvenovali DNA, která dosud nebyla analyzována. Získali jsme 123 nových sekvencí a objevili jsme 16 potenciálně nových druhů čeledi Psalteriomonadidae. V další fázi této práce jsme se zaměřili na morfologii těchto nově objevených druhů.

2. Literální přehled

2.1. Environmentální diverzita protist

Protisté jsou skupinou extrémně diverzifikovaných organizmů a jsou dominantní složkou planktonu ve vodním ekosystému (Lie et al. 2014; Massana et al. 2015; Orsi et al. 2011; Šlapeta et al. 2005). Jsou všudypřítomní a početní ve všech typech prostředí. Protista v anoxickém i oxickém prostředí slouží jako hostitelé pro mnoho symbiotických bakterií i archeí (Weber et al. 2014). Protisté hrají důležitou ekologickou roli ve vodních ekosystémech jako primární producenti, konzumenti, predátoři, dekompozitoři a paraziti (Lie et al. 2014). Mořský ekosystém má také vliv na regulaci biochemických cyklů a podnebí (Karsenti et al. 2011). Prvoci mají také významný vliv na ekologické procesy. Mořské planktonní fotosyntetické organizmy jsou zodpovědné za přibližně 50% primární produkce na Zemi a jsou důležité pro koloběh uhlíku (Guidi et al. 2016; Medinger et al. 2010; Sungawa et al. 2015; Weber et al. 2014). Diverzita prvoků je obecně ovlivněna sezónní fluktuací, teplotou, salinitou, pH. V různých měsících a v různé hloubce se vyskytují různí zástupci protist. Také je důležitá dostupnost potravních zdrojů a vliv predace (Armbrust et al. 2015; Orsi et al. 2012; Weisse et al. 2008). Metody, které slouží k odhalení diverzity protist, jsou kultivační, mikroskopovací a molekulární, jsou založené na amplifikaci a sekvenování genu pro RNA malé ribozomální podjednotky (SSU rRNA). Molekulární metody umožnily studovat diverzitu protist nezávisle na kultivačních a pozorovacích metodách. Tyto metody umožnily studovat diverzitu protist v rozmanitých ekosystémech a odhalily dosud nepoznanou diverzitu (např. Amaral-Zettler et al. 2002; Dawson a Pace 2002; Diez et al. 2001; Edgcomb et al. 2002; Lopez-Garcia et al. 2003; Romari a Vaulot 2004; Stoeck et al. 2003). Environmentální sekvenování, pyrosekvenování nebo NGS („next-generation DNA sequencing“) nabízejí příležitost detailně zkoumat planktonní společenstvo a v posledních dvou desetiletí aplikace molekulárních metod vedla k objevům velké rozmanitosti protist v přírodě. Analýza genu pro SSU rRNA vedla k objevení četných fylogenetických linií, byly objeveny nové skupiny organizmů, které ovlivnily naše pochopení evoluce eukaryot (Behnke et al. 2010; Caron et al. 2009; Diéz et al. 2001; Guidi et al. 2016; Kolísko et al. 2010; Lie et al. 2014; Massana et al. 2014; Stoeck et al. 2007). Výzkum biodiverzity mořského planktonu dosáhl rozmachu s expedicí (Tara Oceans), která studovala globální mořský ekosystém. Tato expedice nasbírala mnoho vzorků virů, bakterií, archeí i prvoků, které sloužily pro morfologickou, genetickou a environmentální analýzu (Armbrust et al. 2015; De Vargas et el. 2015; Karsenti et al. 2011; Pesant et al. 2015; Sunagawa et al. 2015). I když probíhají tyto rozsáhlé studie, naše poznání skutečné diverzity protist je stále ještě silně omezeno a informace jsou neucelené (Adl et al. 2007; Countway et al. 2005). Počet katalogizovaných protist je velmi nízký. Nejčastěji se používá SSU rRNA, a to proto, že se nachází ve všech eukaryotech v mnoha kopiích (Pawlowski et al. 2012).

Vědci se více zaměřovali nejprve na oxická prostředí, protože se domnívali, že eukaryota jsou limitována kyslíkem (Dawson a Hagen 2009). Až v několika posledních letech anoxická prostředí začala přitahovat pozornost, protože mohou ukrývat dosud neobjevenou diverzitu protist (např. Bernard et al. 2000; Dawson et al. 2009; Edgcomb et al. 2002; Luo et al. 2005; Orsi et al. 2012; Stock et al. 2009; Takishita et al. 2007; Zuendorf et al. 2006). Environmentální sekvenování volně žijících anaerobů je v současnosti stále málo účinné, to může být také způsobeno tím, že mnoho organismů není detekováno za použití univerzálních eukaryotických primerů (Zuendorf et al. 2006). Pro odhalení diverzity protist jsou ostatní metody, jako kultivační a mikroskopovací, zatím stále lepší než ty molekulární. Poměr nově objevených druhů z environmentálních vzorků je přesto vysoký (Adl et al. 2007). V mnoha případech je také těžké organismy kultivovat (Abida et al. 2013). Pokud jsou organizmy kultivovatelné, tak tyto kultivační metody významě přispívají k detekci nových druhů. Molekulární metody také dovolují detekci nových druhů i při nízké abundanci v prostředí (Countway et al. 2005).

2.2. Charakteristika kmene Heterolobosea

Kmen Heterolobosea Page a Blanton, 1985 je malou skupinou měňavek a bičíkovců patřící do superskupiny Excavata (Adl et al. 2012). Dosud bylo popsáno 35 rodů s přibližně 150 druhy (Pánek et al. 2017). Jedná se o heterotrofní organizmy. Heterolobosea jsou převážně volně žijící, některá jsou endobiotická (některé druhy rodu Paravahlkampfia) a některá jsou fakultativní parazité zvířat (Paravahlkampfia francinae) a lidí (Naegleria spp.) (Visvesvara et al. 2007, 2009). Nejznámějším parazitem člověka je Naegleria fowleri a díky tomu je rod Naegleria nejlépe studovaným rodem. Další zástupce Naegleria gruberi slouží jako modelový organismus v buněčné biologii pro studium morfogeneze bičíkatého aparátu (Fritz-Laylin a Fulton 2016; Visvesvara et al. 2007). Heterolobosea byla nalezena na všech kontinentech ve sladkovodním, mořském a brakickém prostředí. Také mohou žit v prostředí termálních pramenů, v prostředí s vysokým obsahem soli, nebo kyselém prostředí (Harding et al. 2013; Park a Simpson 2016; Pánek et al. 2017). U kmene Heterolobosea můžeme rozlišit tři životní stádia, a to bičíkovce, měňavku a cystu. Mnoho druhů ovšem jedno nebo dvě stádia ztratilo (Harding et al. 2013; Pánek et al. 2017). Například u několika druhů rodu Tetramitus jsou známa všechna tři životní stádia (Obr. 1) (Bunting, 1922; De Jonckheere et al. 2005).

Obr. 1: Životní cyklus rodu Tetramitus. A – cysta; B – améba; C, C´- dělení; D, D´- améba po rozdělení; E, F – fáze transformace; G - bičíkovec; H – Tetramitus před rozdělením; I, I´- Tetramitus po rozdělení; J,K,L a J´,K´,L´- stádia transformace bičíkovce na amébu (Bunting, 1922).

Někteří zástupci kmene Heterolobosea střídají dvě stádia (chybí stádium cysty), mohou se přeměnit z bičíkovce na měňavku a zpět. To je známo například u některých druhů rodů Naegleria, Willaertia, Tetramitus, Heteramoeba, Euplaesiobystra a Psalteriomonas (Pánek et al. 2012). Tato přeměna může být velmi rychlá, jako například u rodu Naegleria, kde transformace z améby na bičíkovce trvá asi hodinu. Při této přeměně se nově vytvoří bazální tělíska, bičík a mikrotubuly cytoskeletu (Fritz-Laylin a Fulton 2016). Jiní zástupci kmene Heterolobosea mají pouze měňavkové stádium, jako například druhy rodů Vahlkampfia, Neovahlkampfia, Sawyeria a Marinamoeba. A pouze bičíkaté stádium mají například zástupci rodů Percolomonas, Stephanopogon nebo Pleurostomum (Nikolaev et al. 2004; Park et al. 2007; Yubuki a Leander 2008). Zvláštními organizmy jsou druhy rodu Stephanopogon, které svým vzhledem připomínají nálevníky a také byly zprvu do nálevníků řazeny. Nálevníky připomínají například tím, že mají několik podélných řad bičíků a zvláštností je, že jsou to predátoři živící se ostatními prvoky (Yubuki a Leander 2008). U některých zástupců kmene Heterolobosea je dokonce známa agregativní mnohobuněčnost, jako například zástupci rodů Acrasis nebo Pocheina (Brown a Silberman 2013).

Obr. 2: Různá morfologie sporokarpu u rodu Acrasis (Brown et al. 2011).

Mnoho měňavek má válcovitý tvar a pohybuje se pomocí eruptivních lobopodií. Měňavky druhu Pharyngomonas se liší od ostatních typických měňavek kmene Heterolobosea tím, že jsou zploštělé a jen zřídka se pohybují pomocí eruptivních lobopodií. Nejčastěji jsou oválného tvaru. Některé jsou i obdélnikovité, ty jsou však vzácné. Některé za sebou táhnou tenké dlouhé pseudopodie a celkově se pohybují velmi pomalu (Harding et al. 2013; Park a Simpson 2016; Plotnikov et al. 2015). Stachyamoeba lipophora je schopná tvořit dva typy měňavek. První je klasická, která tvoří eruptivní lobopodie, a druhá forma je poměrně zploštělá s pseudopodiemi trnitého tvaru, které vychází z přední části buňky (Page 1975). Další podivnou měňavkou je druh Creneis carolina, která netvoří klasickou měňavku, ale améboidního bičíkovce. Z přední části buňky vychází jeden dlouhý bičík. Ze zadního konce aktivně se pohybujících buněk často vychází adhezivní filamenta. Jádro je prodloužené a často nepravidelného tvaru (Pánek et al. 2014a). Někteří zástupci heteroloboseí tvoří odolné cysty k přečkání nepříznivých podmínek (Pánek et al. 2014b). Dobře prostudované cysty jsou u rodu Naegleria, tvar cysty je kulovitý a stěny se kládají se ze dvou vrstev. Většina cyst má jeden nebo dva póry, které pronikají buď jen jednou vrstvou, nebo oběma, a pomocí nichž dochází k excystaci. Některé cysty póry nemají a excystují se tím, že praskne celá stěna. Cysty mají jedno jádro s centrálně umístěným jadérkem (Chávez-Munguía et al. 2009; Visvesvara et al. 2007). Cysty vznikají v různé fázi životního cyklu. Přeměna na cysty je ovlivněna příznivými nebo nepříznivými přírodními podmínkami. Různé podněty mohou vést k encystaci a excystaci a dosud nejsou dobře ptostudovány. Někteří autoři považují počet pórů za důležitý morfologický znak při rozlišování cyst jednotlivých druhů rodu Naegleria (Chávez-Munguía et al. 2009).

E F

Obr. 3: Přehled některých zástupců kmene Heterolobosea. A – Creneis carolina améboidní bičíkovec; B – Creneis carolina bičíkovec; C – Euplaesiobystra sp.; D – Pharyngomonas turkanaensis; E - Allovahlkampfia; F – Stephanopogon minuta (Geisen et al. 2015; Pánek et al. 2014a; Park et al. 2009; Park a Simpson 2016; Yubuki a Leander 2008).

Bičíkovci mají buď dva bičíky (například Heteramoeba, Euplaesiobystra, Pleurostomum a většina zástupců rodu Naegleria), nebo čtyři bičíky (například Pharyngomonas, Percolomonas, Harpagon, Pseudoharpagon a někteří zástupci rodu Tetramitus). Bičíky obvykle vychází z horního předního konce buňky (Pánek et al. 2017). Mezi zástupci kmene Heterolobosea nalezneme i některé výjimky jako například druh Creneis carolina, který má pouze jeden bičík ve stádiu améboidního bičíkovce a více než deset bičíků ve stádiu bičíkovce (Pánek et al. 2014a). Zástupci druhu Pseudoharpagon longus mohou mít čtyři bičíky, pět bičíků nebo více jak pět bičíků (Pánek et al. 2017). Dále je pro bičíkovce heteroloboseí typická ventrální rýha, která slouží k zachytávání potravy (Pánek et al. 2012), nicméně u některých zástupců je redukovaná jako například u bičíkovce Creneis carolina, nebo u bičíkovců rodu Naegleria (Pánek et al. 2014a). Kořist loví buď při plavání, nebo mohou přilnout zadním koncem buňky k povrchu a kořist loví přichycení k podkladu jako například rod Harpagon. Například u rodů Pharyngomonas, Tetramitus nebo Pleurostomum slouží k přijímání potravy cytopharynx a cytostom. (De Jonckheere et al. 2005; Harding et al. 2013; Park et al. 2007).

Obr. 4: Stavba bičíkatého aparátu u druhu Harpagon descissus. G – břišní rýha; dF – dorzální vějíř mikrotubulů; Rh - rhizoplast; R1, R´1 – dorzální mikrotubulární kořen; R1r a R1l – pravá a levá větev (Brugerole a Simpson 2004).

Pro mnoho heteroloboseí je typický rhizoplast, dále pak absence Golgiho aparátu, paralelní basální tělíska a velké množství periferních mikrotubulů (Park et al. 2007). Cytoskelet heteroloboseí se skládá většinou ze čtyř bazálních tělísek, někteří zástupci však mohou mít jen dvě bazální tělíska. Dvě bazální tělíska má například Pleurostomum flabelatum nebo bičíkovci rodu Naegleria (Park et al. 2007; Fritz-Laylin a Fulton 2016). Čtyři bazální tělíska má například bičíkovec Psalteriomonas lanterna, nebo rod Harpagon a Monopylocystis (Broers 1990; Pánek et al. 2012). Bičíkatý aparát hraje důležitou roli při pohybu, příjmání potravy a také při dělení buňky (Yubuki a Leander 2013). Hlavními mikrotubulárními elementy cytoskeletu je mikrotubulární kořen R1 a R2. Mikrotubulární kořen R2 se rozděluje na vnitřní a vnější část (iR2 a oR2) a podporuje levý a pravý okraj břišní rýhy (Yubuki a Leander 2013). Kořen R2 je asociován s bazálním tělískem 1 (Pánek et al. 2017). U Heteroloboseí nalezneme I fibrilu, která je složena z nemikrotubulárního materiálu a přiléhá k přední straně mikrotubulárního kořene R2 (Yubuki a Leander 2013). Mikrotubulární kořen R1 je u heteroloboseí přítomen pouze u rodu Pharyngomonas společně s fibrilou C (Pánek et al. 2017). Dorzální a laterální strana buňky je vyztužena vějířem podélných mikrotubulů (dF) (Brugerolle a Simpson 2004). Unikátní strukturou je rhizoplast, to je příčně pruhovaná fibrila, která přiléhá k levé straně bazálních tělísek 1 a 2 (Brugerole a Simpson 2004). Většina zástupců kmene Heterolobosea má jedno jádro s centrálním jadérkem (např. Park et al. 2009; Park a Simpson 2011; Schuster a Rechtand 1975). U některých zástupců nalezneme jadérka fixovaná ke stěně, a to například u zástupců rodů Selenaion, Heteramoeba a Stachyamoeba a u čeledi Psalteriomonadidae (Pánek et al. 2017). A byly popsány i heterolobosní měňavky s více než jedním jádrem, a to Fumarolamoeba ceborucoi, Gruberella flavescens, Pseudovahlkampfia emersoni (Broers et al. 1990; De Jonckheere et al. 2011). Můžeme rozlišit tři skupiny organel a to klasickou mitochondrii, hydrogenosomy a mitosomy. Klasickou mitochondrii nalezneme u aerobních organizmů. Hydrogenosomy a mitosomy nalezneme u prvoků, kteří žíjí v anaerobních podmínkách (Lithgow a Schneider 2010). Hydrogenosomy mohou být považovány za anaerobní ekvivalent mitochondrie. Produkují ATP a navíc ještě produkují vodík. Hydrogenosomy postrádají DNA (Lithgow a Schneider 2010; Müller et al. 2012). Mitosomy neprodukují ATP a postrádají genom (Lithgow a Schneider 2010). Pro Heterolobosea jsou typické diskovité mitochondriální kristy asociované s drsným endoplasmatickým retikulem a absence Golgiho komplexu ve formě dyktiosomu (Brugerole a Simpson 2004; Pánek et al. 2017). Organely považované za peroxisomy obalené jednou membránou byly pozorovány u druhů Pharyngomonas kirbyi (Park a Simpson 2011) a Selenaion koniopes (*Park et al. 2012). Heterolobosea jsou blízce příbuzná skupinám Euglenozoa, Jakobida a Tsukubamonadida (Hampl et al. 2009; Kamikawa et al. 2014). Systematika kmene Heterolobosea je chaotická, protože chybí spolehlivé morfologické znaky a také je nejasná vnitřní fylogeneze této skupiny. Zatím není dostatek studií a tyto studie jsou založeny na nedostatečném počtu genů. Existují dva různé taxonomické koncepty jejich rozdělení (viz Pánek et al. 2012). První koncept považuje heterolobosea za monofyletická a dělí Heterolobosea na dvě hlavní skupiny Pharyngomonada a Tetramitia. (Park a Simpson 2011; Pánek et al. 2012). To, co většina lidí považuje za Heterolobosea, tak druhý koncept nazývá Percolozoa a jméno Heterolobosea používá jen pro část těchto organismů. Druhý koncept

považuje Heterolobosea za parafyletická (Cavalier-Smith 1993). V následujícím textu bude používán systém podle (Pánek et al. 2012). Kmen Heterolobosea se dělí na dvě hlavní skupiny, a to na Pharyngomonada a Tetramitia. Skupina Tetramitia se dělí na 8 čeledí: Acrasidae (Acrasis, Allovahlkampfia, Solumitrus a Pocheina), Creneidae (Creneis), Gruberellidae (Gruberella, Stachymoeba), Percolomonadidae (Percolomonas), Stephanopogonidae (Stephanopogon), Psalteriomonadidae (viz kapitola 2.2), Tulamoebidae (Pleurostomum, Tulamoeba) a Vahlkampfiidae (Fumarolamoeba, Heteramoeba, Marinamoeba, Naegleria, Neovahlkampfia, Parafumarolamoeba, Paravahlkampfia, Pseudovahlkampfia, Tetramastigamoeba, Tetramitus, Vahlkampfia, Willaertia). Některé rody něbyly při popisu zařazeny do žádné čeledi: Euplaesiobystra, Oramoeba, Pernina, Selenaion, Trimastigamoeba a Vrihiamoeba (Anderson et al. 2011; Brown et al. 2011; De Jonckheere et al. 2005; De Jonckheere et al. 2011; Fritz-Laylin a Fulton 2016; Geisen et al. 2015; Harding et al. 2013; Nikolaev et al. 2004; Niyyati at al. 2009; Pánek et al. 2014a; Page 1975; Park et al. 2007; Park et al. 2009; Park a Simpson 2016; Smirnov a Fenchel 1996; Walochnik et al. 2009; Yubuki a Leander 2008). Dále do kmene Heterolobosea patří dosud nepopsaná linie améb nazvaná BB2, která má nejasné postavení. Na základě fylogenetické analýzy patří tyto améby buď ke skupině Pharyngomonadea nebo by mohly být sesterskou linií ke kmeni Heterolobosea, nicméně statistická podpora je velmi nízká. U této améby byly pozorovány typické znaky pro Heterolobosea. Je známo stádium cysty a améby (Harding et al. 2013; Pánek et al. 2017). Heterolobosea jsou monofyletická (Pánek et al. 2014b). Vnitřní fylogeneze heteroloboseí je v současnosti stále nejasná. Tetramitia byla dále rozdělena na základě analýzy SSU rRNA na sedm dobře podpořených kládů, nicméně příbuzenské vztahy mezi nimi jsou nejasné (Pánek et al. 2017). Čeleď Psalteriomonadidae (viz. kapitola 2.3) je jednou ze třech hlavních anaerobních linií spolu s rody Creneis a Pleurostomum (Park et al. 2007; Pánek et al. 2014a). Rod Pleurostomum Namylowski, 1913 je extrémně halofilní. Je znám pouze bičíkovec, který má dva bičíky. Dále je pro tento rod typická cytostomální struktura a cytostom. Dosud bylo popsáno šest druhů (Park et al. 2007). Rod Creneis s jediným posaným druhem (Creneis carolina) byl objeven teprve nedávno (Pánek et al. 2014a). Jedná se o obligátně anaerobní organismus. Její životní cyklus zahrnuje dvě stáda. První stádium je améboidní bičíkovec (Obr. 3A) s jedním dlouhým bičíkem, který vychází z přední části buňky. Druhé stádium je bičíkovec, který může mít více než deset bičíků (Obr. 3B). Ventrální rýha ani cytostom nejsou přítomny. Struktura bičíkatého aparátu je pro tento druh unikátní a není srovnatelná s žádnou jinou eukaryotickou skupinou (Pánek et al. 2014a).

2.3. Charakteristika čeledi Psalteriomonadidae

Čeleď Psalteriomonadidae Cavalier-Smith 1993 tvoří jednu ze tří anaerobních linií patřící do kmene Heterolobosea. Synonymem této skupiny je název Lyromonadidae (viz Pánek et al. 2012).

Některé druhy střídají jednotlivá stádia během svého životního cyklu (Pánek et al. 2012, 2014b). Bičíkovci mají většinou čtyři bičíky. U bičíkovců je přítomna ventrální rýha, která slouží k zachytávání potravy. Jádro obsahuje jedno nebo několik jadérek. Měňavky se pohybují pomocí eruptivních lobopodií. Granuloplasma je jasně oddělena od hyaloplasmy. U některých měňavek je přítomen uroid a na uroidu mohou být přítomna filamenta (Pánek et al. 2012, 2014b). Prvoci, kteří žijí v anaerobních podmínkách, postrádají klasickou mitochondrii, místo toho mají organely podobné mitochondriím s odlišnou biochemickou funkcí. U rodu Sawyeria a Psalteriomonas je mitochondrie redukována na hydrogenosom (Barberà et al. 2010; De Graaf et al. 2009). Rozšíření čeledi Psalteriomonadidae je celosvětové, zástupce této čeledi můžeme nalézt ve sladkých, mořských i brakických vodách. Většina zástupců je mořská (Pánek et al. 2012). Tato skupina zahrnuje pět rodů, a to Psalteriomonas, Sawyeria, Monopylocystis, Harpagon a Pseudoharpagon. Celkem je posáno 16 druhů. Jejich životní cyklus zahrnuje bičíkovce, améby i cysty. U rodu Harpagon jsou popsány tři druhy (Harpagon descissus, H. schusteri a H. salinus) a je znám pouze bičíkovec. Jsou to sladkovodní i mořští bičíkovci s jedním jádrem a několika jadérky. Všichni zástupci mají čtyři nestejně dlouhé bičíky. Ventrální rýha zasahuje většinou do poloviny délky buňky, nebo může být i kratší. U druhu H. salinus zasahuje ventrální rýha mírně přes polovinu délky buňky. Améby a cysty nebyly pozorované. Tvoří několik různých morfotypů. U druhu H. schusteri jsou známé tři odlišné morfotypy. H. descissus má čtyři odlišné morfotypy. H. descissus a H. schusteri jsou od sebe dost těžko rozlišitelní. Jediným mořským zástupcem je H. salinus, který žije ve slaných mokřadech. (Pánek et al. 2012, 2014b). U rodu Sawyeria s jediným zástupcem (Sawyeria marylandensis) je známá pouze améba. Jedná se o sladkovodního zástupce. Tato améba má jedno jádro, které může obsahovat jedno, nebo dvě jadéreka, která jsou většinou umístěna naproti sobě (O´Kelly et al. 2003). Postrádají klasickou mitochondrii, místo toho mají v cytoplasmě přítomny samostatně uložené hydrogenosómy, které jsou obaleny dvěma membránami a nejsou obalené drsným endoplasmatickým retikulem (Barberà et al. 2010). Cysty u tohoto druhu nejsou známé (Barberà et al. 2010; Pánek et al. 2012). Rod Psalteriomonas zahrnuje tři popsané druhy (Psalteriomonas vulgaris, P. lanterna a P. magna). Jsou známí bičíkovci i améby, cysty nebyly pozorovány. Jedná se o sladkovodní zástupce. Typickým znakem pro tento rod jsou shluky hydrogenosomů. Ventrální rýha u bičíkovců zasahuje do 2/3 délky buňky (Broers et al. 1993; Pánek et al. 2012). U druhu P. vulgaris je znám pouze bičíkovec, který má jedno jádro, které se nachází v přední části buňky. Má čtyři stejně dlouhé bičíky, zhruba 1,5krát delší než délka buňky. Také má metanogenní endosymbionty, a to prokaryota druhu Methanobacterium formicicum, které jsou spojené s hydrogenosomy, které produkují vodík (Broers et al. 1993). P. magna tvoří pouze améby. Pohybující se améba má velikost v průměru okolo 70 µm a je větší než P. lanterna. U některých buněk jsou přítomna dlouhá filamenta na uroidu. Jádro obsahuje jedno nebo dvě jadérka lokalizovaná na opačné straně. Shluky hydrogenosomů se nacházejí blízko jádra. (Pánek et al. 2012). U druhu P. lanterna jsou známí bičíkovci i améby. Bičíkovci mají čtyři jádra, čtyři mastigonty a čtyři potravní rýhy. Celkem mají 16 bičíků. Bičíky jsou 1,5krát delší než délka buňky a jsou přibližně stejně dlouhé. (Broers et

16 al. 1990). U bičíkovce je ve středu buňky přítomna globule. Tato globule je tvořena až 20 shluky hydrogenosomů. S tímto hydrogenosomem jsou asociované metanogenní prokaryota (Broers 1992; De Graaf et al. 2009). Pohybující se améba má velikost v průměru okolo 45 µm. Má jedno jádro, které je umístěno centrálně s jedním nebo dvěmi jadérky. Také mají uroid bez filament (Pánek et al. 2012). Rod Monopylocystis zahrnuje šest popsaných druhů (Monopylocystis visvesvarai, M. minor, M. disparata, M. robusta, M. elegans a M. anaerobica). Jsou známé améby, bičíkovci i cysty. Tento rod je mořský a brakický. Jádro je u améb lokalizováno v přední části granuloplasmy a během pohybu se deformuje. Vznášející se améby netvoří pseudopodie a jsou kulovitého tvaru. Bičíkovci mají čtyři bičíky a ventrální rýha dosahuje téměř až k zadnímu konci buňky (Pánek et al. 2014b). U M. minor jsou známá všechna stádia. Průměrná délka této améby je 17 µm. Obvykle je přítomen uroid s jedním krátkým filamentem. Bičíkovci jsou menší než ostatní druhy Monopylocystis. Cysty jsou kulovité s jedním pórem (Pánek et al. 2014b). U M. disparata jsou známá také všechna stádia. Aktivně se pohybující améba je menší než ostatní druhy, její průměrná délka je jen 16 µm. Mohou mít uroid s dlouhými filamenty. Bičíkovec tohoto druhu je největší mezi druhy Monopylocystis. Zatímco cysty tohoto druhu jsou malé v porovnání s ostatními druhy (Pánek et al. 2014b). U M. visvesvarai jsou známá také včechna stádia. Jádro má dvě jadérka. Mnoho améb tvoří uroidu někdy s filamenty. Bičíkovec má čtyři nestejně dlouhé bičíky. Je podlouhlého tvaru a zadní konec buňky je buď kulatý, nebo špičatý. U tohoto druhu jsou známé cysty, které jsou kulovité s jedním pórem (O´Kelly et al. 2003; Pánek et al. 2012, 2014b). Největším druhem je M. robusta. U tohoto druhu jsou známé améby a cysty. Bičíkovci nejsou známí. Aktivně se pohybující améba má průměrnou délku 32 µm. (Pánek et al. 2014b). Améba M. elegans je unikátní mezi ostatními druhy, protože její jádro nemá stabilní pozici v granuloplasmě a během pohybu se nedeformuje. Jsou známí bičíkovci i cysty (Pánek et al. 2014b). Pouze stádium améby je známo u druhu M. anaerobica. Mohou být přítomna filamenta na uroidu. V cytoplasmě jsou přítomny bakterie (Smirnov a Fenchel 1996). U rodu Pseudoharpagon jsou popsány tři druhy (Pseudoharpagon pertyi, P. longus a P. tertius). Jsou známé améby, bičíkovci i cysty. Mají jedno jádro. Jsou brakičtí a mořští. Ventrální rýha zasahuje do 1/2 - 2/3 délky buňky. (Pánek et al. 2012, 2014b). Pseudoharpagon pertyi má průměrnou délku buňky 14 µm. Má čtyři nestejně dlouhé bičíky. Nejdelší bičík je dlouhý 1,5 krát než délka buňky, zbývající tři jsou stejně dlouhé. Améby a cysty nejsou známé (Pánek et al. 2012). U druhu P. longus jsou známá všechna tři stádia. Améba má průměrnou délku 38 µm. Améby příležitostně tvoří uroid. Bičíkovec je z těchto tří druhů největší a převážně má pět bičíků. Také může mít čtyři nebo více než pět bičíků. Cysty tohoto druhu jsou větší než u druhu Monopylocystis a jejich morfologie je neobvyklá. Jsou kulovité a vytvářejí obvykle dva dlouhé výčnělky, které mohou být segmentované. Umístění výčnělku se liší mezi jednotlivými cystami (Pánek et al. 2014b). P. tertius se nijak zvlášť morfologicky neliší od druhu P. pertyi. Bičíkovec má průměrnou délku 15 µm se čtyřmi bičíky. Je známá také améba, cysty ne (Pánek et al. 2014b). Tato čeleď je blízce příbuzná linii tvořené aerobními rody Vrihiamoeba, Oramoeba a Stachyamoeba, nicméně tato domněnka je podpořena nízkou statistickou podporou (Pánek et al. 2014b). Čeleď Psalteriomonadidae se zozděluje na tři klády. První klád je tvořen

17 jedním rodem Pseudoharpagon, druhý klád je tvořen rody Sawyeria a Psalteriomonas a třetí klád je tvořen rody Harpagon a Monopylocystis (Pánek et al. 2014b).

Obr. 5: Někteří zástupci čeledi Psalteriomonadidae. A- Psalteriomonas lanterna améba; B – Sawyeria marylandensis; C – P. lanterna bičíkovec; D – Harpagon schusteri; E – H. descissus.

2.4. Taxonomie skupiny Psalteriomonadidae

Čeleď: Psalteriomonadidae Cavalier-Smith, 1993 Syn.: Lyromonadidae Cavalier-Smith, 1993

Rod: Psalteriomonas Broers, Stumm, Vogels, Brugerolle, 1990. Psalteriomonas lanterna Broers, Stumm, Vogels, Brugerolle, 1990. Psalteriomonas vulgaris Broers, Meijers, Symens, Stumm, Vogels, 1993. Syn.: Lyromonas vulgaris (Broers, Meijers, Symens, Stumm, Vogels, 1993). Psalteriomona magna Pánek, Silberman, Yubuki, Leander, Čepička, 2012.

Rod: Sawyeria O´Kelly, Silberman, Amaral-Zettler, Nerad, Sogin, 2003. Sawyeria marylandensis O´Kelly, Silberman, Amaral-Zettler, Nerad, Sogin, 2003.

Rod: Monopylocystis O´Kelly, Silberman, Amaral-Zettler, Nerad, Sogin, 2003. Monopylocystis visvesvarai O´Kelly, Silberman, Amaral-Zettler, Nerad, Sogin, 2003. Monopylocystis minor Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014. Monopylocystis disparata Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014. Monopylocystis robusta Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014. Monopylocystis elegans Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014. Monopylocystis anaerobica (Smirnov, Fenchel, 1996). Syn.: Vahlkampfia anaerobica Smirnov, Fenchel, 1996.

Rod: Harpagon Pánek, Silberman, Yubuki, Leander, Čepička, 2012. Harpagon descissus (Perty, 1852). Syn.: Tetramitus descissus Perty, 1852 a Percolomonas descissus (Perty, 1852). Harpagon schusteri Pánek, Silberman, Yubuki, Leander, Čepička, 2012. Harpagon salinus Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014.

Rod: Pseudoharpagon Pánek, Silberman, Yubuki, Leander, Čepička, 2012. Pseudoharpagon pertyi Pánek, Silberman, Yubuki, Leander, Čepička, 2012. Pseudoharpagon longus Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014. Pseudoharpagon tertius Pánek, Ptáčková, Čepička, 2014.

3. MATERIÁL A METODY

3.1. Kultivace izolátů

3.1.1. Složení a příprava médií

Tab č. 1: Sonnebornovo parameciové médium (ATCC #802)

Cereal Grass Media (Scholar Chemistry) 1,25 g Na₂HPO₄ 0,25 g destilovaná voda 500 ml

Prášek Cereal Grass Media byl nasypán do destilované vody a nechal se 5 minut vařit. Po zchladnutí bylo médium přefiltrováno pomocí filtračního papíru, doplněno vodou do 500 ml a přelito do 0,5 l lahve. Poté byl do lahve přidán Na₂HPO₄. Hotové médium bylo autoklávováno.

Mořské 802 médium (ATCC #1525): Nejprve bylo připraveno dvakrát koncetrované ATCC #802 médium (viz výše), do kterého ale nebyl přidán Na₂HPO₄. Poté byla připravena dvakrát koncentrovaná umělá mořská voda, která byla pomocí sterilizačního filtru přefiltrována do vychladlého dvakrát koncentrovaného ATCC #802 média.

Tab č. 2: dvakrát koncentrovaná umělá mořská voda Roztok A

NaCl 24,71 g KCl 0,68 g CaCl₂ · 2H₂O 1,36 g MgCl₂ · 6H₂O 4,66 g destilovaná voda 300 ml

Roztok B

MgSO₄ 7H₂O 6,3 g destilovaná voda 100 ml

Roztok C

NaHCO₃ 0,18 g destilovaná voda 100 ml

Tab č. 3: LB Broth médium

LB Broth (Sigma) 5 g destilovaná voda 500 ml

Nejprve byl v destilované vodě rozpuštěn prášek LB Broth a médium bylo autoklávováno. Takto připravené médium bylo později používáno při klonování jako živné médium pro bakterie (viz 3.6.2). Pro potřeby kultivace heteroloboseí bylo stávající médium naředěno destilovanou vodou na 3% koncentraci a bylo znovu autoklávováno.

Tab č. 4: Směs agaru a LB Broth na Petriho misky

LB Broth 10 g bakteriologický agar (Oxoid) 6 g destilovaná voda 500 ml

V destilované vodě byl nejprve rozpuštěn LB Broth. Poté byl do roztoku přidán bakteriologický agar. Médium bylo autoklávováno a po mírném ochlazení bylo rozlito do Petriho misek, které byly dále používány při klonování (viz kap. 3.7).

3.1.2. Získávání nových izolátů

Nové vzorky byly odebírány v anoxických zejména sladkovodních, ale i mořských sedimentech. Z nově získaného sedimentu byly vždy odebrány 2 ml a inokulovány do média. Pro sladkovodní druhy bylo použito ATCC #802 médium a pokud začla klesat početnost buněk, tak byla kultura také přeočkována do 3% média LB Broth, které obsahuje více živin. Mořské kultury byly naočkovány do mořského média ATCC #1525. Kultury byly pravidělně jednou týdně přeočkovány. Vždy byly přeočkovány 2 ml do 10 ml média. Kultury byly uchovávány při pokojové teplotě.

3.2. Morfologie

3.2.1. Barvení protargolem podle Bodiana, modifikováno podle Nie (1950)

Při barvení protargolem se fixuje za vlhka. V ideálním případě nedojde při celém procesu k vysušení buněk, a tím k jejich deformaci. Tato metoda je však časově náročná a výsledná kvalita preparátů není vždy uspokojující. Proto je dobré barvit izolát vždy na více sklíčkách, aby se zvýšila pravděpodobnost úspěchu.

Příprava Bouin-Hollandovy fixáže:

V destilované vodě bylo nejdříve rozpuštěno 25 g octanu meďnatého. Poté bylo přidáno a rozpuštěno 40 g kyseliny pikrové. Nakonec bylo do roztoku přidáno 100 ml 40%

21 formaldehydu a objem byl doplněn destilovanou vodou do 1 l. 30 ml fixáže bylo přelito do Petriho misky, do které bylo následně přidáno 1,5 ml ledové kyseliny octové.

1. Den

Fixace: Z dobře narostlé kultury bylo nejprve ze dna odebráno 1,5 ml vzorku, který byl poté stočen na stolní centrifuze 8 minut na 500 g. Supernatant byl odlit a pelet byl resuspendován ve zbytku supernatantu. Na krycím sklíčku o velikosti 15 x 15 mm byla vytvořena asi 1 µl kapka. Hned vedle byla vytvořena poloviční kapka z vaječného bílku, díky kterému vzorek lépe přilnul ke krycímu sklíčku. Obě kapky byly špičkou smíchány, opatrně rozetřeny po sklíčku a sklíčko bylo ihned položeno na hladinu připřavené fixáže natřenou stranou dolů. Po chvíli bylo sklíčko otočeno a ponecháno na dně ca 5 – 14 hodin fixovat. Pro snadnou manipulaci byla sklíčka namontována na ca 1 cm polyethylenové tyčinky, na kterých byl vytvořen asi 3 mm zářez, do nichž bylo vloženo sklíčko. Preparáty byly převedeny přes 50% ethanol do 70% ethanolu, aby se vymyla fixáž. 70% ethanol byl několikrát vyměněn. Potom se buď hned pokračovalo v barvení, anebo byly preparáty uschovány v 70% ethanolu.

2. Den

Barvení:

1. Nafixované vzorky konzervované v 70% ethanolu byly převedeny přes 50% ethanol do destilované vody. 2. Sklíčka byla ponechána 5 minut v 0,5% roztoku manganistanu draselného. 3. Poté byla sklíčka vždy 5x po 30 sekundách opláchnuta v destilované vodě. 4. Preparáty byly následně ponechány 5 minut v 5% roztoku kyseliny oxalové. 5. Dále byly vždy 5x po 30 sekundách opláchnuty v destilované vodě. 6. Sklíčka byla opatrně poskládána ve svislé poloze do kádinky, ve které byl roztok 1% protargolu. Na dně kádinky byl spirálovitě stočený a očištěný měděný drát. Protargol (Bayer, I. G. Farbenindustrie Actinengesellschaft) byl na začátku barvení nasypán na hladinu destilované vody a nechal se samovolně rozpustit. Mezi naskládaná sklíčka byly nakonec vloženy tenké měděné drátky a uzavřená kádinka byla vložena na 48 hodin do 37˚C.

3. Den

7. Preparáty byly 2x po 5 sekundách opláchnuty v destilované vodě. 8. Sklíčka byla na 10 minut vložena do čerstvě připraveného redukčního roztoku (roztok 1% hydrochinonu a 5% Na₂SO₃). 9. Sklíčka byla 5x po 30 sekundách opláchnuta v destilované vodě. 10. Poté byla ponořena na 5 minut do 0,5 – 1% roztoku AuCl₃. 11. Sklíčka byla 2x po 5 sekundách opláchnuta v destilované vodě. 12. Poté byla ponořena na 5 minut do 2% roztoku kyseliny oxalové. 13. Sklíčka byla 5x po 30 sekundách opláchnuta v destilované vodě.

14. Poté byla ponořena na 10 minut do 5% roztoku Na₂S₂O₃. 15. Následně byla propírána 20 minut pod tekoucí vodovodní vodou. 16. Poté byla převedena alkoholovou řadou (50%, 70%. 80%, 96%, 100% ethanol) do xylenu. 17. Na závěr byla sklíčka montována do DPX Mountant for histology (Sigma).

3.2.2. Pozorování pomocí světelného mikroskopu

Nativní preparáty byly pozorovány mikroskopem Olympus BX 51 vybaveným Nomarského diferenciálním interferenčním kontrastem. Pozorované objekty byly snímané kamerou Olympus DP70/DP71 a zpracovány v programu Quick PHOTO CAMERA 2.3. Pozorování nativních preparátů probíhalo při nastavení mikroskopu na Nomarského diferenciální interferenční kontrast a nastavení světla na Bright-field. Preparáty barvené protargolem byly pozorovány při nastavení světla Bright-field. Změřeno bylo vždy celkem 30 buněk z vybrané kultury. U améb byla měřena délka a šířka buňky a u bičíkovců byla měřena pouze délka buňky. Pořízené fotografie byly dále upraveny pomocí software CorelDraw X5.

3.2.3. Scanovací elektronová mikroskopie

Do 100 µl dobře narostlé kultury bylo přidáno 100 µl fixační směsi (2%OsO4 a 3% glutaraldehyd, 1:1) a celý objem byl přenesen na krycí skla s vrstvou poly-L-lysinu. Fixace probíhala na ledu 60 minut. Skla s fixovanými buňkami byla následně třikrát promyta destilovanou vodou, vysušena vzestupnou ethanolovou řadou (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% po 5-15 minutách) a převedena do acetonu. Následné vysušení pomocí kritického bodu CO2 v přístroji CPD 030 (Bal-Tec) (5 lázní po 30 min) a pozlacení vzorku v naprašovačce SCD 050 (Bal-Tec) bylo provedeno servisním způsobem v Laboratoři elektronové mikroskopie PřF UK. Snímky byly pořízeny na rastrovacím elektronovém mikroskopu JSM – 6380LV (JEOL).

3.3. Izolace DNA

Před vlastní izolací DNA byly kultury centrifugovány 10 minut při 800 g při pokojové teplotě. Byl odebrán supernatant tak, aby ve zkumavce zbylo 200 µl pro resuspendování peletu. DNA byla izolována kitem ZR Genomic DNA ll Kit ᵀᴹ (Zymo Research) podle protokolu „Cell suspension and proteinase K digested samples“ DNA byla uchovávána v -20 ˚C. Pokud byla DNA izolována přímo ze sedimentu, byl použit kit ZR Soil Microbe DNA MiniPrepᵀᴹ (Zymo Research) dle protokolu výrobce.

3.3.1. Amplifikace genu pro SSU rRNA

Pro amplifikaci genu pro SSU rRNA byly použity primery specifické pro čeleď Psalteriomonadidae (HeterF1 a HeterR1K). Místo primeru HETER1K byla používán i nově navržený primer Heter Bahno R1, který by měl být také specifický pro gen pro SSU rRNA čeledi Psalteriomonadidae. Dále byly použity specifické primery pro rod Paratrimastix ze skupiny Preaxostyla (TRIF3 a MedlinB), metopidní nálevníky (MedlinA a ARMR4) a volně žijící archaméby (59F a 750R). Nastavení cyklů PCR pro amplifikaci genu pro SSU rRNA je znázorněno v Tab 8. Při použití primerů MedlinA a ARMR4 byla nastavena teplota k nasedání primerů 50 ˚C. Při použití primerů 59F a 759R byla nastavena teplota k nasedání primerů 58 ˚C. Amplifikace DNA byla prováděna v termocyklerech MyCyclerᵀᴹ Personal Thermal Cycler (Bio-Rad).

Tab č. 5: Použité primery k amplifikaci SSU rRNA

Primer Designováno Sekvence 5′ - 3′ HeterR1K Pánek, 2011 AAYTCAGGGACGTAATCATT HETERF1 Pánek, 2011 GCTTATTTCRAAGATTAAGCCATGYAAA PELOSSU750R Silberman, unpubl GTATTTGTCGTCACTACCTCG PELOSSU59F Silberman, unpubl GTGTTAAAGATTAAGCCATGCATGC MedlinA Medlin et. al. 1988 AYCTGGTTGAYYTGCCAG MedlinB Medlin et. al. 1988 TGATCCTTCTGCAGGTCCACCTAC ARMR4 Bourland et al. 2017 GWGGTTWTCCACACAGTC TRIF3 nepublikováno GGATAGAGGCCTACCATGGTTTTG HETERbahno tato práce GGGCGGTGTGTACAAAACTCAGT R1

Tab č. 6: Složení reakční směsi s LA polymerázou (Top-Bio)

Chemikálie µl voda do 25 LA pufr 2,5 LA dNTP 0,75 HETER R1K (10 pmol.µl¯¹) 0,625 HETER F1 (10 pmol.µl¯¹) 0,625 DMSO (MERCK) 0,5 LA polymeráza 0,25 DNA 3 - 5

Tab č. 7: Složení reakční směsi pro Taq polymerázu (Fermentas)

Chemikálie µl Combi PPP Master Mix 12,5 HETER R1K (10 pmol.µl¯¹) 1,25 HETER F1 (10 pmol.µl¯¹) 1,25 voda 7 DNA 3

Tab č. 8: Nastavení cyklů PCR pro amplifikaci SSU rRNA pomocí primerů Heter R1k, HeterF1 a nový primer Heterbahno R1.

Počet cyklů Teplota Čas 1 94 ˚C 1 min 94 ˚C 15 s 31 55 ˚C 1 min 72 ˚C 3 min 1 72 ˚C 20 min

3.4. Elektroforéza

Elektroforéza byla provedena na 1% horizontálním agarovém gelu. Amplifikované fragmenty byly zviditelněny ethidiumbromidem. Obraz byl nasnímán digitálním fotoaparátem a zpracován v programu Alpha Digi Doc RT.

3.5. Purifikace PCR produktů

PCR produkt byl přečištěn pomocí kitu QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen) podle protokolu „QIA Quick PCR purification using a microcentrifuge″.

3.6. Klonování

Pokud byly amplifikovány směsné izoláty, bylo nutné vzorek zaklonovat. K tomuto účelu byl použit kit pGEM® T-Easy Vector System (Promega) a kompetentní buňky Escherichia coli JM109 Competent Cells (Promega).

3.6.1. Příprava ligační směsi

Tab č. 9: Ligační směs

Chemikálie µl Ligační pufr 5 µl pGEM plasmidy 1 µl PCR produkt 3 µl T4 ligáza 1 µl

Byla namíchána ligační směs, která se nechá při teplotě 24 ˚C 1 hodinu ligovat, nebo přes noc ve 4˚C.

3.6.2. Příprava bakteriálních kolonií

Následující den jsme opatrně a bez bublin přidali 10 µ ligační směsi do rozmražených kompetentních buněk a opatrně jsme je špičkou promíchali. Směs buněk a plasmidů necháme 20 minut na ledu a poté mikrozkumavky necháme 45 sekund při 42 ˚C. Potom vrátíme buňky ještě na 2 minuty na led. Každou mikrozkumavku doplníme do 1 ml 100% LB médiem a necháme 90 minut růst v třepačce (37 ˚C a 220 rpm). Na každou plotnu (utuhlá směs agaru a LB média) jsme nanesli kapku směsi (viz. Tab 10). Tuto směs jsme rozetřeli bakteriální kličkou po celém povrchu plotny.

Tab č. 10: Směs na potírání Petriho misek

Chemikálie µl Ampicilin (100 µg.ml¯¹) 18,5 µl IPTG (100 mM) 75 µl X-gal (50 mg.ml¯¹) 15 µl

Na takto připravenou plotnu jsme nanesli 50-60 µl narostlých bakterií a dobře jsme je rozetřeli. Zbytek buněk jsme uložili do lednice pro další použití, nebo jsme je vyseli na alternativní plotnu pro případ, že by úspěšnost transformace byla nízká.

Tyto plotny jsme dali do termostatu (37 ˚C) a po 15 minutách jsme je obrátili dnem vzhůru. Nechali jsme je 12 hodin inkubovat.

Následující den bylo vybráno cca 8-12 bílých kolonií z každé plotny, které byly přidány do 10 µl destilované vody. Tyto mikrozkumavky jsme vložili do termocykléru a spustili jsme program LIKV.

Tab č. 11: Program LIKV

Počet cyklů Teplota Čas 1 96 ˚C 5 min 1 50 ˚C 1,5 min 1 96 ˚C 1,5 min 1 45 ˚C 1 min 1 96 ˚C 1 min 1 40 ˚C 1 min

Mezitím si připravíme master mix pro amplifikační PCR.

Tab č. 12: Složení reakční směsi s Taq polymerázou (Fermentas)

Chemikálie µl Combi PPP Master Mix 10 primer T7 0,5 primer SP6 0,5 bakteriální lyzát 10

Tab č. 13: Použité primery primer SP6 GATTTAGGTGACACTATAG Primer T7 TAATACGACTCACTATAGGG

Tab č. 14: Nastavení cyklů PCR pro klonování

Počet cyklů Teplota Čas 1 94 ˚C 4 min 94 ˚C 1 min 31 55 ˚C 1 min 72 ˚C 4 min 1 72 ˚C 15 min

Výsledek PCR byl ověřen na elektroforéze.

3.7. Sekvenace DNA

Sekvence DNA byla provedena v Laboratoři sekvenace DNA PřF UK pomocí sekvenátoru 3100 Avant Genetic analyzer nebo 3130 Genetic analyzer (Applied Biosystems). K sekvenaci byly použity univerzální primery na čeleď Psalteriomonadidae (577F, 577R, HeterR1K, HeterF1) a univerzální primery komplementární k vektoru pGEM (SP6, T7).

Tab č. 15: Použité primery k sekvenaci DNA

Primer Designováno Sekvence 5′ - 3′ 577F Elwood et al. 1985 GCCAGCMGCCGCGGT 577R Elwood et al. 1985 ACCGCGGCKGCTGGC HeterR1K Pánek, 2011 AAYTCAGGGACGTAATCATT HeterF1 Pánek, 2011 GCTTATTTCRAAGATTAAGCCATGYAAA SP6 Wallace et al. 1981 GATTTAGGTGACACTATAG T7 Wallace et al. 1981 TAATACGACTCACTATAGGG

3.8. Vyhodnocení sekvencí a fylogenetická analýza

Byly vytvořeny dva datasety zahrnující sekvence genu pro SSU rRNA. První dataset se skládal ze 123 nově získaných sekvencí čeledi Psalteriomonadidae, 57 sekvencí čeledi Psalteriomonadidae získaných z databáze GenBank a 38 sekvencí jiných linií kmene Heterolobosea. Druhý dataset obsahoval stejné sekvence čeledi Psalteriomonadidae jako první dataset, ale neobsahoval sekvence ostatních linií kmene Heterolobosea. Sekvence byly alignovány metodou MAFFT (Katoh et al. 2002) na serveru MAFFT 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/), s použitím algoritmu G-INS-i. Alignmenty byly ručně upraveny a ořezány v programu BioEdit 7.2.5 (Hall 1999). Finální datasety obsahovaly 1322 (první dataset) a 1601 (druhý dataset) pozic. Fylogenetické stromy byly konstruovány metodou maximum likelihood v programu RAxML 8. (Stamatakis 2006) s použitím evolučního modelu GTRGAMMAI. Ten byl vybrán pomocí kritéria AKAIKE a programu Modeltest 3.7 (Posada a Crandall 1998). Statistická podpora získané topologie byla odhadnuta pomocí boostrap analýzy s 1000 pseudoreplikáty v programu RAxML.

4. Výsledky

4.1. Izoláty

Izoláty jsme získali vlastním sběrem, nebo již byly v naší sbírce a dosud nebyly sekvenovány. V kulturách byli zástupci skupiny Psalteriomonadidae poměrně častí. Sbírka izolátů studovaných v této práci obsahovala přibližně 60 převážně sladkovodních, ale i mořských kultur. Nejvíce zastoupenými byly již popsané druhy Harpagon schusteri, H. descissus, Sawyeria marylandensis a Psalteriomonas lanterna. Většina kultur byla stabilní, ale některé zanikly již během prvních pasáží a některé kultury náhle zanikly, i když byly dlouhodobě stabilní. Často byly kultury smíšené, vyskytovaly se v nich dva i více druhů protist, kromě zástupců čeledi Psalteriomonadidae často zástupci skupiny Euglenozoa nebo Ciliata. Z těchto získaných izolátů jsme izolovali DNA a následně jsme tyto izoláty sekvenovali. Také jsme sekvenovali izoláty, ze kterých již byla izolována DNA, ale dosud nebyl sekvenován gen pro SSU rRNA. Přehled všech úspěšně osekvenovaných izolátů je zaznamenán v Tab. 16. Sama jsem nasbírala vzorky sedimentu, ze kterých byly vytvořeny následující kultury: CID1, CID2, KU09, KUCR1, KUCR1nove, KUCR1stare, NABABE2, RYBNIK1, RYBNIK2, STOD4, STOD5, VYSVES2. Následující kultury jsem dostala od kolegů Ivana Čepičky, Pavly Hanouskové, Johany Rotterové a Petra Táborského: AYEN, FUEN4, NAM1, CVIA, STOVIK, CANC3, HIGRI, KACENA, MAD4, PANT1, PPP1, PPP3, SEMUC, CIZICI, POTCOAVA, STORCH5, KAKADU, SAR, SARICHIUS, IND9, IND2, CANA, KANE3, BLAHO, TERLIVKA, REU5B2, REU2, EBRO2C, TITICACA, A4, KIR1, KIR2, LUKAS2, STAN2, STJONES, EBOGO2A, ZOOMEDAN, BORNEO1, BORNEO2, KUBAMA3, BIGISLAND, KRM7, CENOTES6, BURRU1, STRM1, ZZIET, DWERSA, KAMERUN. Další kultury jsme již měli delší dobu ve sbírce. Dále byla izolována DNA z kultur hlavně v raných stádiích, protože některé organismy v pozdějších stádiích v kultuře zanikly. Pro PCR byly použity primery specifické pro gen pro SSU rRNA čeledi Psalteriomonadidae (Heter R1K, Heter F1).

Tab č. 16: Přeheld úspěšně osekvenovaných izolátů v naší sbírce

Izolát Místo nálezu Souřadnice Místo výskytu A4 n.a. n.a. n.a. ADANA Adana, Adana, TR N 39°59'10" E 35°20'00" sladkovodní sediment AFRO Aydin, Afrodosias, TR N 37°42'32" E 28°43'27" sladkovodní sediment ALTINUM Altinum (blízko Benátek), I N 45°32'12" E 12°23'41" sladkovodní sediment ANASSA Awassa, ETH n.a. n.a. ANASSAPL Awassa, ETH n.a. n.a. ARAGON Pozuel del Campo, Aragón, E N 40°46'29.1" W 001°31'16.5" sladkovodní sediment AYEN Region Aysen, Chile N 45°27′521" E 72°48′899" sladkovodní sediment (SWLB) BEAVER1 Beaver lake, Vancouver, Kanada N 49°18" W 123°08" sladkovodní sediment BEAVER5 Beaver lake, Vancouver, Kanada N 49°18" W 123°08" sladkovodní sediment BELEC Běleč, ČR n.a. sladkovodní jezírko BEROUN4 Česká Republika n.a. sladkovodní sediment BOT1AN Na Slupi, Praha, CZ N 50°04'20.18" E 14°24'24.77" sladkovodní sediment BOTANKA Na Slupi, Praha, CZ N 50°04'20.18" E 14°24'24.77" sladkovodní sediment BUKITLA Bukit Lawang, gunung leuser n.p.,Sumatra N 3.543897 E 98.110288 pralesní potok BUKITLA2 Bukit Lawang, gunung leuser n.p.,Sumatra N 3.543897 E 98.110289 pralesní potok BURMA Adiyaman, Burmapinar, TR N 37°55'57" E 38°36'31" sladkovodní sediment BURREL Suç Burell, Albania N 41.57150 E 20.05219 sladkovodní sediment BURRU1 Jezero Burqu, Jordánsko N 32°36'32.47" E 37°57'42.71" sladkovodní sediment BURRU1 Jezero Burqu, Jordánsko N 32°36'32.47" E 37°57'42.71" sladkovodní sediment CANA Kanada n.a. n.a. CANC3 n.a. n.a. n.a. CASTILLO Cerro Castillo, Chile S 45° 59.648" W 72° 4.359" sladkovodní sediment CERETE Cereté, Kolumbie N 08o53" W 75o47" sladkovodní sediment CID1klon řeka Cidlina, Vysoké Veselí, CZ N 50°20'11.88" E 15°26'09.45" sladkovodní sediment CID1kultura Cidlina, Vysoké Veselí, CZ N 50°20'11.88" E 15°26'09.45" sladkovodní sediment CID2 Cidlina, Vysoké Veselí, CZ N 50°20'11.88" E 15°26'09.45" sladkovodní sediment CIZICI Čižiči, HR N 45.171182" E 14.606369" sladkovodní jezírko CONGO Brazzaville, Congo, CGO n.a. n.a. CVIA n.a. n.a. n.a. DRINGARI Dringari, Kamerun n.a. n.a. EVROS4B delta řeky Evros, GR N 40˚48" E 26˚01" n.a. FLORENCIE Florencie, Itálie N 43°45'54.517" E 11°16'19.622" n.a. GANGA Ganga, New Dellhi, Indie n.a. n.a. GO25 Kréta, Agios Nikolaos, GR n.a. n.a. GO7E Kréta, Agios Nikolaos, GR N 35°07'42,88" E 25°43'44,84" n.a. GO7T Kréta, Agios Nikolaos, GR N 35°07'42,88" E 25°43'44,84" n.a. GOLAKABAS Golakabas, IND n.a. u pumpy GORGOVAT Gorgova, Rumunsko N 45.117670" E 29.189438" sladkovodní sediment GOUVIA Gouvia, Corfu Island, Řecko N 39°38'45" E 19°50'58" sladkovodní potok H1N Halifax, Kanada N 44o37" W 63o34" sladkovodní sediment HAR Hardargervidda, N n.a. proudící řeka HIGRI Wadi Higri, OM n.a. sladkovodní sediment HIGRI Wadi Higri, OM n.a. sladkovodní sediment HOUSKA Houska, CZ n.a. n.a. IND2N Bhangarh, Indie N 27o05" E 76o17" sladkovodní sediment IND7 Bhangarh, Indie N 27o05" E 76o17" sladkovodní potok INONGO Lac Mai-Ndombe, Inongo, DR Congo n.a. n.a. IVANAKV n.a. n.a. n.a. JAVR n.a. n.a. n.a. KACEN2a Kolumbie 3,30,57, S 73.42.56 Z n.a. KAKADU Kakadu NP, AUS -12.664983, 132.489883 sladkovodní sediment KAKADU Kakadu NP, AUS -12.664983, 132.489883 sladkovodní sediment

KAKITA Řeka Kakita, Japonsko N 35.107922" E138.900106" vývěr vod KALIPOKARI Kalipokari, IND n.a. sladkovodní sediment KAMERUN4a Kamerun n.a. n.a. KAMERUN4b Kamerun n.a. n.a. KANE3 Kanada n.a. n.a. KIR1 Cape town, Kirstenbosch botanic garden (RSA) n.a. vlhké bahno u cesty KIR2 Cape town, Kirstenbosch botanic garden (RSA) n.a. vlhké bahno u cesty KORISSIONTUN Corfu, GR N 39,4361" E 19,923" sladkovodní jezírko KRIVOKLAT Křivoklát, CZ n.a. n.a. KRM9 n.a. n.a. n.a. KRP2 Kréta N 35,29669° E 25,48382° moře, přílivové jezírko KU09 Stodůlky, Praha 5, ČR N 50˚ 03’ 02,94” E 14˚18’ 55,40” sladkovodní jezírko KUCR1 Červená Řečice, Dolní rybník, ČR N 49˚ 30’ 37,60” E 15˚10’ 34,24” sladkovodní jezírko KUCR1nove Červená Řečice, Dolní rybník, ČR N 49˚ 30’ 37,60” E 15˚10’ 34,24” sladkovodní jezírko KUCR1stare Červená Řečice, Dolní rybník, ČR N 49˚ 30’ 37,60” E 15˚10’ 34,24” sladkovodní jezírko LAGUNDRI Lagundri, Nias, Indonesia N 0°34'45" E 97°44'03" brakický sediment v laguně LUKAS2 Maroko n.a. n.a. LUOBIAO Luo Biao, Sichuan, Čína N 28°05'43" E 104°58'41" znečištěná oblast M2A n.a n.a. n.a. MAD4C Madeira, P n.a. n.a. MAREK3 Kozlovice, CZ N 49°36'09" E 8°14'47" nepoužívaný septik MONTER Monterosso, Itálie N 44°8.743" E 9°39.312" n.a. MOSSE1 SAR n.a. n.a. MOSSE2 SAR n.a. n.a. NABABE2 Křivoklát n.a. rybník NAG1 Near Nagada village, PNG S5 09.792 E145 48.354 brakický sediment NAG4 Near Nagada village, PNG S5 09.459 E145 47.766 přírodní pramen NAM1 n.a. n.a. pěstováno v SW

NDJOKO Ondu forest, Cuvette-Ouest, CGO N 0.27 E 14.16 bažina PETPOT CZ n.a. n.a. PNG PNG S 03°29.086" E 135°42.249" sladkovodní sediment PNG PNG S 03°29.086" E 135°42.249" sladkovodní sediment POMPEJE1 Pompei, Itálie n.a. sladkovodní sediment REU2 Reunion S 21,081515" E 55,230354" brakický sediment REU2a Reunion S 21,081515" E 55,230354" brakický sediment REU5B2 Reunion S 20,945081" E 55,282598" brakický sediment REU5B2 Reunion S 20,945081" E 55,282598" brakický sediment RUDIME Rudine, HR N 45.188013" E 14.612431" sladkovodní RUM4 Sfantu Gheorghe, RO N 44 o53" E 29 o34" sladkovodní sediment RYBNIK1 Čakovice u Pelhřimova, ČR N 49˚ 27’ 25,90" E 15˚10’ 35,38" sladkovodní jezírko RYBNIK2 Čakovice u Pelhřimova, ČR N 49˚ 27’ 25,90" E 5˚10’ 35,38" sladkovodní jezírko SAR IND n.a. n.a. SCHOONER2 n.a. n.a. n.a. SRA3 Sravanabelagoda, IND n.a. sladkovodní sediment SRPJEZ2 Štrpské pleso, Tatry, Slovensko N 49°07'19.9" E 20°03'20.4" jezero, 1700 m.n.m. STAN2 Kanada, Beaver lake, Stanley n.a. sladkovodní STOD4 Stodůlky, Praha 5, ČR N 50°03'02.94" E 14°18'55.40" sladkovodní jezírko STOD5 Stodůlky, Praha 5, ČR N 50°03'02.94" E 14°18'55.40" sladkovodní jezírko STORCH4 n.a. n.a. n.a. STORCH5 n.a. n.a. n.a. STOVIK Botanická zahrada, Benátská, ČR n.a. n.a. SUSBARB Bako NP, Malaysie N 1°43'00" E 110°28'00" sladkovodní sediment SUSBARB Bako NP, Malaysie N 1°43'00" E 110°28'00" sladkovodní sediment SUSBARB Bako NP, Malaysie N 1°43'00" E 110°28'00" sladkovodní sediment TERLIVKA Terlivka, Khmelnitskaya obl., Ukrajina N 49.35722° E 027.57791° sladkovodní sediment TITICACA isle Taquille, jezero Titicaca n.a. sladkovodní sediment

TRECIME Tre Cime, Itálie N 46°35'36" E 12°15'49" Sladkovodní jezírko UZLINA Uzlina, Rumunsko N 45°6´43" E 29°10´12" n.a. UZO n.a. n.a. n.a. VAKANASI Vakanasi, IND n.a. sladkovodní sediment VIKOS1 Vikos, GR N 39°56'46" E 20°42'01" sladkovodní sediment VITSEDAN Kamenice, ČR N 49o54" E 14o35" sladkovodní sediment VLADA7 Německo N 54°31.541" E 11 °07.277" mořský VLADA7 Německo N 54°31.541" E 11 °07.277" mořský VLADA7SW Německo N 54°31.541" E 11 °07.277" mořský VLADAJOHANA Německo n.a. n.a. VYSVES2 Vysoké Veselí, ČR N 50°20'11.88" E 15°26'09.45" Sladkovodní jezírko WACT07 Ausangate, PE S 13°47" W 71°13" sladkovodní sediment WACT09 Ausangate, PE S 13°47" W 71°13" sladkovodní sediment WACT13 Ausangate, PE S 13°47" W 71°13" sladkovodní sediment ZOO2 n.a. n.a. n.a. ZOOMEDAN Zoo, Medan, Sumatra, Indonesia S 3°28'59.4ʺ E 98°38'32.7ʺ sladkovodní sediment ZZIET LB Etiopie n.a. n.a. n.a. – nedostupná data

4.2. Fylogenetická analýza

Fylogenetická analýza genu pro SSU rRNA založená na prvním datasetu obsahujícím široké zastoupení kmene Heterolobosea potvrdila, že čeleď Psalteriomonadidae je monofyletická a rozděluje se na tři linie, zde nazvané linie Pseudoharpagon, linie Psalteriomonas/Sawyeria a linie Harpagon/Monopylocystis (Obr. 6; základní linie čeledi Psalteriomonadidae jsou zde pro přehlednost zkolabovány). Fylogenetické vztahy mezi těmito liniemi nebyly naší analýzou vyřešeny. Všechny naše izoláty se umístily do čeledi Psalteriomonadidae. Protože gen pro SSU rRNA zástupců skupiny Heterolobosea je značně variabilní a z alignmentu muselo být vypuštěno mnoho pozic, byla provedena analýza druhého datasetu obsahujícího pouze sekvence čeledi Psalteriomonadidae. Protože je výsledný strom příliš veliký pro zobrazení na jednu stránku, byl pro přehlednost rozdělen na tři části podle základních linií čeledi Psalteriomonadidae (Obr. 7 – 9). Celkem bylo získáno 123 nových sekvencí. Na základě fylogenetické analýzy bylo zjištěno, že tyto sekvence reprezentují šest již popsaných druhů čeledi Psalteriomonadidae. U druhu Harpagon schusteri bylo získáno 26 nových izolátů, u druhu H. descissus bylo získáno 33 nových izolátů a ke druhu H. salinus se umístil jeden nový izolát. U rodu Monopylocystis byly získány dva nové izoláty. Ke druhu Sawyeria marylandensis se umístilo 15 nových izolátů. U druhu Psalteriomonas magna bylo získáno pět nových izolátů a do druhu P. lanterna se umístilo 23 nových izolátů. V linii Psalteriomonas/Sawyeria bylo získáno 55 nových sekvencí a v linii Harpagon/Monopylocystis bylo získáno 68 nových sekvencí. V linii Pseudoharpagon nebyla získána žádná nová sekvence. Bylo objeveno 16 potenciálně nových nepopsaných druhů. Několik izolátů (VLADA7SW, CID1KULTUR, H1N) pravděpodobně patří do nových rodů.

Obr. 6: Fylogenetický strom genu pro SSU rRNA skupiny Heterolobosea konstruovaný na základě prvního datasetu. Strom byl sestrojen metodou maximum likelihood s modelem GTRGAMMAI v programu RAxML. Čísla na větvích představují hodnotu bootstrapové podpory větší než 50 %. Čísla za lomítky na větvích uvnitř čeledi Psalteriomonadidae představují hodnotu podpory odhadnuté z analýzy druhého datasetu. Nové sekvence jsou označeny tučně.

Obr. 7: Část fylogenetického stromu genu pro SSU rRNA skupiny Heterolobosea konstruovaného na základě prvního datasetu zobrazující pouze linii Psalteriomonas/Sawyeria Strom byl sestrojen metodou maximum likelihood s modelem GTRGAMMAI v programu RAxML. Čísla na větvích představují hodnotu bootstrapové podpory větší než 50 %. Nové sekvence jsou označeny tučně. Hvězdičkou jsou označeny izoláty mořské a brakické.

Obr. 8: Část fylogenetického stromu genu pro SSU rRNA skupiny Heterolobosea konstruovaného na základě prvního datasetu zobrazující pouze linii Harpagon/Monopylocystis. Strom byl sestrojen metodou maximum likelihood s modelem GTRGAMMAI v programu RAxML. Čísla na větvích představují hodnotu bootstrapové podpory větší než 50 %. Nové sekvence jsou označeny tučně. Hvězdičkou jsou označeny izoláty mořské a brakické.

Obr. 9: Část fylogenetického stromu genu pro SSU rRNA skupiny Heterolobosea konstruovaného na základě prvního datasetu zobrazující pouze linii Pseudoharpagon. Strom byl sestrojen metodou maximum likelihood s modelem GTRGAMMAI v programu RAxML. Čísla na větvích představují hodnotu bootstrapové podpory.

4.3. Morfologie

Cysty nebyly zaznamenány. Někdy bylo možné pozorovat dělící se buňky. Také jsme použili barvení protargolem pro lepší zviditelnění vnitřních struktur. U čeledi Psalteriomonadidae se dobře nabarvilo jádro, bičíky a cytoplazma. Preparáty barvené protargolem byly pozorovány ve světlém poli. Nativní preparáty byly pozorovány s použitím Nomarského diferenciálního interferenčního kontrastu. U jednoho izolátu (RYBNIK) byla použita skenovací elektronová mikroskopie. Vždy bylo změřeno 30 buněk a hodnoty jsou zaznamenané v Tab 17. Naměřené rozměry buněk jsou v tabulce uvedeny jako aritmetický průměr ± směrodatná odchylka (MIN – MAX). U bičíkovců byla měřena pouze délka buňky. U měňavek byla měřena délka i šířka buňky. Snažili jsme se dokumentovat morfologii izolátů, které podle fylogenetické analýzy nejspíš představují nové druhy. Některé takovéto izoláty však vyhynuly předtím, než jsme je stihli prostudovat. Pro srovnání byly také vyfoceny již popsané druhy.

Tab č. 17: rozměry měřených buněk.

Izolát (druh) Délka buňky Šířka buňky Délka/Šířka AYEN (Sawyeria sp. 6) 22.0±5.4 (14.6 – 40.1) µm 10.1±4.2 (5.6 – 26.8) µm 2.3±0.8 (0.9 – 4.4) µm CASTILLO (Psal. gen. sp. 8) 23.3±7.4 (11.6 – 45.9) µm 8.1±2.5 (4.3 – 16.1) µm 3.0±1.0 (1.4 – 5.4) µm CVI A (Psal. gen. sp. 8) 22.9±6.6 (13 – 37.6) µm 8.8±1.7 (4.7 – 11.9) µm 2.6±0.6 (1.3 – 4.2) µm KACEN a (H. schusteri) 16.2±3.1 (11.1 – 23.5) µm n.a. n.a. KAKADU (S. m.) 31.3±4.1 (22.6 – 38.9) µm 9.0±2.0 (5.9 – 13.1) µm 3.6±0.8 (2.3 – 5.8) µm KALIPOKARI (S. m.) 40.8±7.9 (25.3 – 66.6) µm 8.6±1.8 (6.9 – 16.7) µm 2.8±2.4 (0.1 – 6.3) µm KIR 1 (P. lanterna) 41.3±9.3 (26.6 – 58.6) µm 13.4±2.7 (8.7 – 19.6) µm 3.1±0.9 (1.5 – 4.9) µm KRP 2 (Harpagon sp. 12) 19.3±1.4 (15.6 – 21.7) µm n.a. n.a. KUCR 1 (P. lanterna) 28.8±8.7 (12.1 – 45) µm 9.5±1.9 (7.2 – 14.4) µm 3.0±0.9 (1.3 – 5.4) µm LUKAS 2 (H. descissus) 14.3±2.1 (10.1 – 19.2) µm n.a. n.a. MAD 4 (P. lanterna) 36.9±4.1 (23.9 – 46.8) µm 12.8±2.7 (9.7 – 24.7) µm 2.9±0.6 (1.4 – 4.2) µm NA BABE 2 (H. descissus) 16.7±6.8 (10.7 – 47.4) µm n.a. n.a. NAM 1 (M. disparata) 22.2±4.9 (9.1 – 32.8) µm 7.3±1.8 (4.5 – 14.3) µm 3.1±0.8 (1.4 – 5.2) µm POTCOAVA (H. descissus) 18.9±3.6 (13.9 – 33.8) µm n.a. n.a. RYBNIK (S. m.) 30.1±5.7 (21.4 – 43.3) µm 11.6±3.3 (6.8 – 20.4) µm 2.7±0.8 (1.5 – 4.9) µm RYBNIK (bičíkovec) 17.4±2.8 (11.9 – 23.2) µm n.a. n.a. SARICHIUS (H. schusteri) 15.2±2.8 (11.5 – 20.3) µm n.a. n.a. STOD 5 (P. lanterna) 28.2±6.2 (21.4 – 47.5) µm 10.2±2.9 (6.1 – 16.7) µm 2.9±0.9 (1.4 – 6.1) µm STORCH 5 (H. schusteri) 20.0±4.0 (12.3 – 26.9) µm n.a. n.a. STRPJEZ 2 (Sawyeria sp. 4) 31.9±9.5 (16.9 – 60.3) µm 9.4±1.4 (6.3 – 12.2) µm 3.4±0.9 (1.8 - 5.7) µm TERLIVKA (Harpagon sp. 15) 18.0±3.2 (12.1 – 26.6) µm n.a. n.a. TITICACA (S. m.) 25.0±3.5 (16.9 – 31.1) µm 9.1±1.4 (6.7 – 11.7) µm 2.8±0.5 (1.7 – 4.5) µm ZOOMEDAN (Harpagon sp. 16.4±2.6 (12.4 – 22.6) µm n.a. n.a. 16) n.a. – data nejsou dostupná; Psal. – Psalteriomonadidae; H. - Harpagon; S.m. – Sawyeria marylandensis; P. - Psalteriomonas; M. – Monopylocystis.

Sawyeria sp. 4 - (izolát STRPJEZ 2). Obr. 10. Je známá pouze améba, bičíkovci ani cysty nebyli pozorováni. Jádro obsahuje jedno až tři jadérka. Průměrná délka aktivně se pohybující améby je 32 µm. U některých buněk byl přítomen uroid s filamenty. Přechod mezi granuloplasmou a hyaloplasmou je méně zřetelný než u S. marylandensis.

Obr. 10: Sawyeria sp 4 - izolát STRPJEZ 2. N – jádro; Ur – uroid. Měřítko 10 µm.

Sawyeria sp. 5 (izolát KAKADU). Obr. 11. Byla pozorována pouze améba, bičíkovci ani cysty nebyli pozorováni. Jádro je lokalizováno v přední části granuloplasmy s jedním až dvěmi jadérky. Průměrná délka aktivně se pohybující améby je 31 µm. U některých buněk byl přítomen uroid s filamenty. Vypadá to, že jsou přítomny shluky hydrogenosomů, které jsou dobře patrné na obrázku H, I.

Obr. 11: Sawyeria sp. 5 - izolát KAKADU. N – jádro; Ur – uroid. Buňky G, H, I jsou obarveny protargolem. Měřítko - 10 µm.

Sawyeria sp. 6 (izolát AYEN). Obr. 12. Byla pozorována pouze améba, bičíkovci ani cysty nebyli pozorováni. Všechny pozorované buňky měly jádro s jedním velikým jadérkem. Jádro bylo lokalizované v přední části granuloplasmy. U některých buněk byl přítomen uroid s filamenty. Průměrná délka aktivně se pohybující améby byla 22 µm.

Obr. 12: Sawyeria sp. 6 - izolát AYEN. N – jádro; Ur – uroid. Měřítko - 10 µm.

Psalteriomonadidae gen. sp. 8 (izoláty CASTILLO a CVIA). Obr. 13. Jsou známé pouze améby, bičíkovci ani cysty nebyli pozorováni. Améby obou izolátů jsou malé. Průměrná délka aktivně se pohybující améby je 23 µm. Jádro má 1 až 2 jadérka. U obou izolátů se v blízkosti jádra nachází shluky hydrogenosomů. Uroid s filamenty byl pozorován pouze u izolátu CASTILLO. Jádro je lokalizováno v přední části granuloplasmy.

Obr 13. Psalteriomonadidae gen. sp. 8. Buňky A - F je izolát CASTILLO. Buňky E, F jsou obarvené protargolem. Buňky G - I je izolát CVI A. N – jádro; Ag – hydrogenosomy; Ur – uroid. Měřítko - 10 µm.

Sawyeria marylandensis - (izolát RYBNIK). Obr. 14. Tato améba má jedno jádro, které může obsahovat jedno, nebo dvě jadéreka, která jsou většinou umístěna naproti sobě. Postrádají klasickou mitochondrii, místo toho mají v cytoplasmě přítomny samostatně uložené hydrogenosómy, které jsou dobře patrné na obrázku C. U některých buněk je přítomen uroid s filamenty.

Obr. 14: Sawyeria marylandensis - izolát RYBNIK. N – jádro; Ur – uroid. Buňky A, B, C jsou měňavky S. marylandensis. Buňka C je obarvená protargolem. Buňky D - H jsou bičíkovci S. marylandensis. Buňky G, H jsou obarvené protargolem. Měřítko 10 µm.

Izolát RYBNIK – Obr. 15. Na základě fylogenetické anylýzy byl objeven dosud neznámý bičíkovec druhu Sawyeria marylandensis. Průměrná délka bičíkovce je 17 µm. Bičíkovec má čtyři bičíky přibližně stejné délky, které z buňky vybíhají apikálně. Ventrální rýha probíhá podél celé buňky. Bylo pozorováno jedno jádro s dvěmi jadérky. Byl nalezen ve sladkovodním prostředí. Je typický velmi rychlým pohybem.

Obr. 15: bičíkovec Sawyeria marylandensis. Buňky A – D jsou pořízeny pomocí scanovací elektronové mikroskopie. Obrázky A, C, D měřítko 5 µm. Obrázek B měřítko 2 µm.

Harpagon sp. 12 (izolát KRP 2). Obr. 16. Tento bičíkovec byl nalezen v mořském prostředí. Améby ani cysty nebyly pozorované. Průměrná délka tohoto bičíkovce je 19 µm. Buňky mají čtyři bičíky, které jsou přibližně stejně dlouhé a delší než buňka. Ventrální rýha zasahuje do 1/5 - 2/3 délky buňky. Všechny pozorované buňky byly protáhlé.

Obr. 16: Harpagon sp. 12 - izolát KRP 2. Měřítko - 10 µm.

Harpagon sp. 15 (izolát TERLIVKA). Obr. 17. Byl pozorován pouze bičíkovec, který byl nalezen ve sladkovodním prostředí. Měňavky ani cysty nebyly pozorované. Bičíkovec má čtyři bičíky, nestejně dlouhé. Průměrná délka tohoto bičíkovce je 18 µm. Většina pozorovaných buněk měla podlouhlý tvar a byly méně variabilní ve tvaru než H. schusteri a H. descissus. Ventrální rýha nezasahuje ani do poloviny délky buňky.

Obr. 17: Harpagon sp. 15 - izolát TERLIVKA. Buňky E, F jsou obarvené protargolem. Měřítko 10 µm.

Harpagon sp. 16 - (izolát ZOOMEDAN). Obr. 18. Tento potenciálně nový druh byl nalezen ve sladkovodním prostředí. Je to bičíkovec se čtyřmi bičíky. Dva bičíky jsou kratší než buňka a stejně dlouhé. Třetí je zhruba 1,5krát delší než buňka. Čtvrtý bičík je nejdelší a je asi dvakrát delší než délka buňky. Ventrální rýha u většiny buněk zasahovala do poloviny délky buňky. Améby ani cysty nebyly pozorovány. Průměrná délka tohoto bičíkovce je 16 µm. Nijak zvlášť se neliší od již posaných dvou sladkovodních druhů H. descissus a H. schusteri.

Obr. 18: Harpagon sp. 16 - izolát ZOOMEDAN. Buňky E, F jsou obarvené protargolem. Měřítko - 10 µm.

4.4. Environmentální sekvenování

Environmentální sekvenování je založené na získávání sekvencí DNA přímo z přírodních vzorků, bez izolace cílových organismů. Při amplifikaci DNA přímo ze sedimentu byly použity specifické primery na čeleď Psalteriomonadidae, nálevníky skupiny Metopida, rod Paratrimastix (Excavata: Preaxostyla) a volně žijící zástupce skupiny Archamoebae. Tyto skupiny byly vybrány, protože jsou k dispozici specifické primery, které byly v minulosti navrženy na našem pracovišti. Měli jsme dvě sady sedimentů, ze kterých jsme zkoušeli amplifikovat gen pro SSU rRNA těchto čtyř skupin. První sada obsahovala sedm vzorků a z toho úspěšně na Heterolobosea vyšly dva. Na skupinu Preaxostyla nevyšel ani jeden. Na skupinu Archamoebae také nic nevyšlo a na metopidní nálevníky vyšly úspěšně dva vzorky. V ostatních vzorcích vyšly hlavně rozsivky a řasy. Druhá sada sedimentů obsahovala 10 vzorků a z této sady nevyšel ani jeden.

5. Diskuze

5.1. Environmentální sekvenování

Na diverzitu skupiny Heterolobosea existuje poměrně velké množství literatury a stále jsou objevovány nové druhy (např. Anderson et al. 2011; Brown et al. 2010; Čepička et al. 2010; De Jonckheere et al. 2009; Geisen et al. 2015; Pánek et al. 2014a,b; Park a Simpson 2016). My jsme si vybrali čeleď Psalteriomonadidae, hlavně proto, že byly publikovány PCR primery, které by měly být specifické pro gen pro SSU rRNA jejich zástupců (Pánek et al. 2012, 2014b) a také na tuto čeleď není mnoho studií, které by se zabývaly její diverzitou (např. O´Kelly et al. 2003; Pánek et al. 2012; Pánek et al. 2014a; Pánek et al. 2014b). Chtěli jsme se hlavně zabývat environmentálním sekvenováním a studovat nekultivovatelnou diverzitu nejen této čeledi, ale i některých dalších skupin volně žijících anaerobních prvoků. Byly vybrány čtyři skupiny protist, na které máme k dispozici specifické primery a na které jsme se chtěli zaměřit při environmentálním sekvenování. Vybrali jsme si následující skupiny: Heterolobosea (čeleď Psalteriomonadidae), metopidní nálevníci, Preaxostyla (Paratrimastix) a skupina Archamoebae. Nicméně environmentální sekvenování nebylo příliš úspěšné. Většina vzorků vyšla ne elektroforéze negativně, a pokud vyšly pozitivně, tak vyšly hlavně rozsivky a zelené řasy. Také byly upravovány primery, ale ani úprava primerů nebyla úspěšná. Sediment byl odebírán pouze ve sladkovodním anoxickém prostředí. Po nasbírání byl sediment pozorován pod mikroskopem a zástupci čeledi Psalteriomonadidae se v environmentálních vzorcích vyskytovali jen v malém množství, což mohlo mít za následek, že environmentální sekvenování nebylo úspěšné. To, že se amplifikovaly hlavně rozsivky a zelené řasy, může být způsobeno, že se vyskytovaly na lokalitě ve velkém množství a jejich DNA převažovala nad jinými druhy. Pokud byl sediment naočkován do živného média, následně se v kultuře objevili hlavně zástupci čeledi Psalteriomonadidae a také metopidní nálevníci v mnohem větším počtu, než v jakém byli přítomni v environmentálních vzorcích. Kvůli již zmíněným potížím je tato práce nakonec zaměřena na sekvenování DNA z již zavedených stabilních kultur z naší sbírky a na nově získané kultury, které jsem nasbírala já nebo kolegové. Zatím environmentální studie u anaerobů jednoznačně nepřispívají k odhalení druhové diverzity, protože se používají hlavně obecné primery, které nejsou vhodné (viz Pánek et al. 2015).

5.2. Fylogeneze a morfologie nových druhů

Většina autorů dnes používá název Heterolobosea pro skupinu obsahující všechny potomky posledního společného předka rodů Naegleria a Pharyngomonas (tedy zástupců linií Pharyngomonadea a Tetramitia) (např.; Harding et al. 2013; Pánek et al. 2012; Plotnikov et al. 2015). Naproti tomu Cavalier-Smith pro výše uvedené rody používá název Percolozoa (Cavalier-Smith 1993). Osekvenovali jsme více než 70 kultur (Tab. 16), které

51 jsme buď nasbírali, nebo získali od kolegů. Zbývající sekvence byly získány jako vedlejší produkty jiných projektů, ale nikdy nebyly detailně analyzovány. Celkem bylo získáno 123 nových sekvencí. Na základě fylogenetické analýzy založené na genu pro SSU rRNA bylo objeveno 16 potenciálně nových druhů. V linii Harpagon/Monopylocystis bylo objeveno šest potenciálně nových druhů. Zcela jasným novým druhem je izolát KRP2, který není blízce příbuzný ze žádným popsaným druhem rodu Harpagon a tvoří samostatnou dlouhou větev. Izolát KRP2 (Obr. 16) byl nalezen v mořském prostředí. Všechny pozorované buňky měly podlouhlý tvar, některé se zašpičatělým koncem. Ventrální rýha zasahuje do poloviny, nebo mírně přes polovinu délky buňky, stejně jako u H. salinus (Pánek et al. 2014b). Od H. salinus se tento izolát liší velikostí, průměrná délka buňky je výrazně větší než u H. salinus. U izolátu KRP2 je průměrná délka buňky 19 µm, kdežto u druhu H. salinus je průměrná délka buňky 13,7 µm (Pánek et al. 2014b). Izolát KRP2 má čtyři bičíky přibližně stejné délky, podrobněji se bičíkatý aparát nepodařilo prozkoumat, protože v raném stádiu kultivování tento izolát zanikl, přitom mastigont bičíkovců nese mnoho morfologických znaků, které jsou důležité pro taxonomii, nicméně mnoho bičíkovců kmene Heterolobosea ještě není dostatečně prozkoumáno a jejich ultrastruktura je neznámá (Pánek et al. 2012). Jádro se u izolátu KRP2 nedalo prozkoumat, protože kvůli rychlému pohybu těchto bičíkovců se ho nepodařilo při focení zachytit, a nemohli jsme ho srovnat s ostatními druhy rodu Harpagon. Morfologie jádra je při tom důležitý znak. Jádro se u bičíkovců nachází v horní části buňky. Důležitým znakem je počet jadérek. Rod Harpagon může mít jedno až několik jadérek (Pánek et al. 2012). Druh H. salinus se od ostatních dvou druhů rodu Harpagon liší strukturou jádra, jeho jádro se morfologicky podobá druhu Monopylocystis a Pseudoharpagon. Jádro druhu H. salinus má tenkou okrajovou vrstvu nepravidelné tloušťky (Pánek et al. 2014b). Izolát LAGUNDRI tvoří samostatnou dlouhou větev a domníváme se, že se jedná o další nový druh. Tento izolát je příbuzný již popsanému druhu H. salinus, který byl objeven ve slaniscích (Pánek et al. 2014b). K tomuto již popsanému druhu H. salinus se také umístil izolát REU5B2S. Dle fylogenetické analýzy se také jedná o druh H. salinus, který máme stále ve sbírce. Oba izoláty byly nalezeny v brakickém prostředí. Nicméně izolát LAGUNDRI zanikl v raném stádiu kultivování, a proto z tohoto izolátu nejsou dostupná morfologická data. Izoláty UZLINA a TERLIVKA (Obr. 17) jsou si vzájemně příbuzné a nejsou blízce příbuzné ostatním druhům rodu Harpagon. Z izolátu UZLINA nejsou dostupná morfologická data. Domníváme se, že oba izoláty patří do jednoho nového druhu. Izolát TERLIVKA je velmi podobný již popsaným druhům H. descissus (Perty 1852) a H. schusteri, které se dají od sebe špatně odlišit (Pánek et al. 2012) a liší se od nich tím, že buňky byly méně variabilní ve tvaru. H. schusteri má tři možné formy lišící se tvarem a H. descissus má čtyři možné formy (Pánek et al. 2012). Ventrální rýha u tohoto izolátu zasahuje do jedné třetiny – jedné poloviny délky buňky a koresponduje s popisem H. descissus (Perty 1852) a H. schusteri (Pánek et al. 2012). Dle buněk obarvených protargolem to vypadá, že izolát TERLIVKA má tři přibližně stejně dlouhé bičíky a čtvrtý bičík je delší než ty tři ostatní. U ostatních druhů je jeden bičík nejdelší, který může být až dvakrát delší než délka buňky, druhý bičík je kratší a další dva bičíky jsou kratší než druhý bičík a stejně dlouhé (Pánek et al. 2012). Izolát BOTANKA není blízce příbuzný s druhem

H. schusteri a tvoří samostatnou a dlouhou větev a na základě toho usuzujeme, že by se mohlo jednat o nový druh. Z tohoto izolátu nejsou dostupná morfologická data. U izolátu ZOOMEDAN (Obr. 18) si nejsme jistí, zda se jedná opravdu o nový druh, protože sedí vedle druhu H. schusteri a má jen velmi krátkou větev. Izolát ZOOMEDAN je morfologicky dost podobný oběma již popsaným sladkovodním druhům H. descissus (Perty 1852) a H. schusteri (Pánek et al. 2012). Ventrální rýha a stejně tak délka a počet bičíků izolátu ZOOMEDAN korespondují s popisem H. descissus (Perty 1852) a H. schusteri (Pánek et al. 2012). U izolátu ZOOMEDAN byl tvar buněk různorodý, byly pozorovány buňky zakulacené, podlouhlé, se zašpičatělým krátkým koncem i s prodlouženým špičatým koncem. Pokud by se jednalo o již popsaný druh H. schusteri, pak by měla chybět forma s prodlouženým špičatým koncem, která ovšem byla u tohoto izolátu pozorována. Nicméně existují mezi těmito tvary přechody a nejedná se o spolehlivý určující znak. V linii Psalteriomonas/Sawyeria bylo objeveno deset potenciálně nových druhů, převážně améby. U améb je důležitý znak počet jadérek v jádru a také přítomnost nebo nepřítomnost shluků hydrogenosomů (Pánek et al. 2012). Nejzajímavějším objevem byl izolát RYBNIK1 (Obr. 14, 15). V této kultuře se nacházeli pohromadě bičíkovci i améby. Tento izolát byl nalezen ve sladkovodním prostředí. Dle sekvence genu pro SSU rRNA se jednalo o druh Sawyeria marylandensis. Morfologie améb (Obr. 14A, B, C) koresponduje s popisem S. marylandensis (O´Kelly et al. 2003). Na obrázku 14C, na kterém jsou buňky obarvené protargolem, jsou dobře vidět jednotlivě uložené hydrogenosomy, které jsou pro S. marylandensis typické. Dále se v této kultuře společně s amébou S. marylandensis, která se v kultuře vyskytovala jen v malém množství, nacházel také bičíkovec, který dle fylogenetické analýzy vycházel také jako druh S. marylandensis. Tyto bičíkovce jsme z vodního sloupce přeočkovali do dvou samostatných zkumavek, abychom měli ve zkumavce pouze bičíkovce, a ne měňavky. Snažili jsme se takto prokázat, že tento bičíkovec opravdu patří ke druhu S. marylandensis. U obou takto vytvořených izolátů bylo provedeno PCR a sekvenace potvrdila, že tento bičíkovec je S. marylandensis. Do této doby bičíkovec u S. marylandensis nebyl znám. PCR jsme několikrát opakovali a také jsme DNA z tohoto izolátu dvakrát klonovali a vždy vyšla S. marylandensis. Tento izolát také byl obarven protargolem a také byl vyfocen na scanovacím elektronovém mikroskopu. Bičíkovci se ovšem pohybovali velmi rychle, a tudíž se podařilo pořídit na světelném mikroskopu jen několik kvalitních fotografií. Domníváme se, že by se mohlo jednat o bičíkovce, který koresponduje s popisem Psalteriomonas vulgaris (Broers et al. 1993). Bičíkovec P. vulgaris také má čtyři bičíky, které jsou umístěny apikálně, jádro je umístěno v horní části buňky. Ventrální rýha dle popisu Broers et al. (1993) zasahuje do dvou třetin délky buňky, náš bičíkovec má ventrální rýhu po celé délce buňky. Jak u rodu Sawyeria, tak u rodu Psalteriomonas se nacházejí hydrogenosomy. Na základě těchto zjištění by se měly oba rody Sawyeria a Psalteriomonas sloučit do jednoho rodu, a to do rodu Psalteriomonas, protože tento rod byl popsán dříve než rod Sawyeria, je tedy historicky starší a má přednost. Pokud by se rod Sawyeria stal synonymem pro rod Psalteriomonas, tak čtyři nově objevené druhy (STRPJEZ2, KAMERUN4a, KAKADU, AYEN, NAG1, KAMERUN4b), které vyšly k rodu Sawyeria by patřily do rodu Psalteriomonas. Izolát VLADA7SW v linii Psalteriomonas/Sawyeria není blízce příbuzný žádným již popsaným druhům a tvoří samostatnou dlouhou větev a na základě toho usuzujeme, že se

53 jedná o nový druh. Dalším zcela evidentním novým druhem, který není blízce příbuzný žádnému z již popsaných druhů je izolát CID1KULTUR. K tomuto izolátu nejsou dostupná morfologická data, protože v raném stádiu kultivování zanikl. Izolát STRPJEZ2 (Obr. 10) je příbuzný druhu S. marylandensis, ale tvoří dlouhou a samostatnou větev, a proto usuzujeme, že se jedná o nový druh. Tato améba je velmi podobná již popsanému druhu Sawyeria marylandensis (O´Kelly et al. 2003). Jediným rozdílem je přechod mezi granuloplasmou a hyaloplasmou, který je méně zřetelný u buněk tohoto izolátu než u S. marylandensis. Izoláty KAMERUN4a a KAKADU (Obr. 11) jsou si navzájem příbuzné a tvoří dlouhou větev, na základě toho usuzujeme, že se jedná o další nový druh. K izolátu KAMERUN4a nejsou dostupná morfologická data. U izolátu KAKADU to vypadá, že jsou přítomny shluky hydrogenosomů, které jsou dobře vidět na buňkách obarvené protargolem (Obr. 11G, H, I). Tyto shluky hydrogenosomů jsou typické pro rod Psalteriomonas (De Graaf et al. 2009; Broers et al. 1990). Toto zjištění také podporuje teorii, že by rod Sawyeria měl být synonymem pro rod Psalteriomonas. Izoláty NDJOKO a KUCR1STARE se větví od rodu Psalteriomonas a na základě dlouhých větví se domníváme, že se jedná o nové druhy. K těmto izolátům nejsou dostupná morfologická data. Dalšími vzájemně si příbuznými a novými druhy, které jsou na základě fylogenetické analýzy příbuzné ke druhu S. marylandensis, jsou izoláty AYEN (Obr. 12) a NAG1. K izolátu NAG1 nejsou dostupná morfologická data. Tento izolát byl nasbírán v brakickém prostředí. Izolát AYEN je podobný druhu Sawyeria marylandensis (O´Kelly et al. 2003). Všechny pozorované buňky tohoto izolátu měly jádro s jedním jadérkem, a také toto jadérko bylo větší v porovnání s druhem S. marylandensis. S. marylandensis může mít jedno až tři jadérka (Pánek et al. 2012). Dále se liší izolát AYEN tím, že tato améba je výrazně menší. Průměrná délka pohybující se améby je 22 µm. Průměrná délka aktivně se pohybující améby S. marylandensis ve studii Pánek et al. (2012) byla 37,6 µm. Izolát KAMERUN4b stojí zcela samostatně a proto usuzujeme, že se jedná o nový druh. K tomuto izolátu nejsou dostupná morfologická data. Izoláty CVIA a CASTILLO (Obr. 13) vycházely spíše ke druhu S. marylandensis, nicméně u obou izolátů byly objeveny shluky hydrogenosomů. Pokud by se rody Sawyeria a Psalteriomonas sloučily, pak by se jednalo o nové druhy rodu Psalteriomonas. Obě améby jsou velmi malé v porovnání s rody Sawyeria (O´Kelly et al. 2003) a Psalteriomonas (Broers et al. 1990). Průměrná délka aktivně se pohybující améby u izolátu CVIA je 22,9 µm a u izolátu CASTILLO 23 µm. Ve studii Pánek et al. (2012) byla průměrná délka aktivně se pohybující améby druhu P. lanterna 46,4 µm. Bylo zjištěno, že všechny již popsané druhy jsou dobře kultivovatelné s použitím našich metod. Všichni dosud popsaní zástupci čeledi Psalteriomonadidae byli v našich kulturách velmi hojní a jen zřídka se stalo, že by kultury zanikly. Mnoho nově objevených druhů v raném stádiu kultivování zaniklo. Mohlo by to být způsobeno například odlišnými nároky na prostředí nebo potravu. Nelze ani vyloučit možnost, že tyto nově objevené druhy mohou mít symbionty, kterým se nedaří v laboratorních podmínkách, proto se nám je zatím nedaří kultivovat.

5.3. Diverzita čeledi Psalteriomonadidae

Předpokládá se, že přímý předek čeledi Psalteriomonadidae byl mořský a že do sladké vody přestoupil společný předek rodů Psalteriomonas a Sawyeria pouze jednou (Cavalier- Smith a Nikolaev 2008). Na proti tomu ve studii Pánek et al. (2012) se domnívají, že přechod z mořské vody do sladké nebo ze sladké do mořské byl více častý, než se předtím myslelo, a že u čeledi Psalteriomonadidae proběhl nejméně dvakrát. Nicméně kvůli nedostatečnému množství dat se nedá s jistotou určit, zda poslední společný předek čeledi Psalteriomonadidae byl mořský nebo sladkovodní (Pánek et al. 2012). Zástupci čeledi Psalteriomonadidae jsou převážně mořští. Dosud bylo popsáno 10 mořských druhů a šest druhů sladkovodních (viz Pánek et al. 2012, 2014b) a žijí v anoxických podmínkách (Pánek et al. 2012). Všichni zástupci rodu Monopylocystis a Pseudoharpagon jsou mořští nebo brakičtí a rod Monopylocystis je v této čeledi nejpočetnější. Rody Psalteriomonas a Sawyeria jsou výhradně sladkovodní. U rodu Harpagon byl do této doby znám jeden mořský zástupce a dva sladkovodní. Nejčastěji se v našich kulturách objevovaly druhy H. schusteri, H. descissus, S. marylandensis a P. lanterna. U druhu P. lanterna některé izoláty v naší sbírce tvořily jak améby, tak bičíkovce a jiné izoláty tvořily buď jen bičíkovce, nebo jen améby. V naší sbírce byli bičíkovci běžní a stabilní, nicméně někdy se stávalo, že bičíkovci druhu P. lanterna často v kultuře zanikli. Není zcela jasné, proč v některých kulturách zanikli a v jiných byli zcela běžní. Ve studii Broers et al. (1990) provedli pokus, kdy měli v kultuře pouze bičíkovce druhu P. lanterna a snažili se zjistit, za jakých podmínek se transformuje na amébu. Do kultury přidali 1,5 % kyslíku, nicméně pouze malé množství bičíkovců se transformovalo na améby. Ani při změně pH, teploty, koncentraci soli nebo při změně média nebyl pokus úspěšný (Broers et al. 1990). Například u rodu Tetramitus, kde je také známo stádium bičíkovce i améby byl zaznamenán hojný výskyt bičíkovců společně s amébami v kulturách. Nicméně výskyt těchto bičíkovců byl krátkodobý v kulturách, protože se zanedlouho bičíkovci přeměnili na améby. Stádium bičíkovce je u tohoto rodu jen krátkodobé, aby nezahynuli, musí se bičíkovec přeměnit na amébu (Bunting 1922). Není zcela jasné proč se v některých kulturách druhu P. lanterna objevují jen améby a v jiných jen bičíkovci, mohlo by to být například způsobeno různými podněty, které se v laboratorních podmínkách nevyskytují. Bičíkovec druhu P. vulgaris se objevil pouze ve dvou našich kulturách (RYBNIK1 a RYBNIK2) a nebude tedy zcela běžným druhem. V našich dvou kulturách byl tento bičíkovec velmi hojný a stabilní. Výskyt těchto bičíkovců může být limitován například specifickými nároky na prostředí, nebo živiny.

6. Závěr

Naše sbírka izolátů studovaných v této práci obsahovala přibližně 60 převážně sladkovodních, ale i mořských kultur, kzeré jsme osekvenovali a získali jsme 123 nových sekvencí. Na základě fylogenetické analýzy bylo zjištěno, že tyto sekvence reprezentují šest již popsaných druhů čeledi Psalteriomonadidae. V linii Psalteriomonas/Sawyeria bylo získáno 55 nových sekvencí a v linii Harpagon/Monopylocystis bylo získáno 68 nových sekvencí. V linii Pseudoharpagon nebyla získána žádná nová sekvence. Bylo objeveno 16 potenciálně nových nepopsaných druhů. Nové druhy byly objeveny převážně ve sladkovodních, ale i v mořských sedimentech. Mnoho kultur nově objevených druhů zaniklo již v prvních pasážích. Nejzajímavějším objevem byl izolát RYBNIK. V této kultuře byl objeven společně s druhem Sawyeria marylandensis také bičíkovec. Domníváme se, že by se mohlo jednat o bičíkovce, který koresponduje s popisem Psalteriomonas vulgaris. U druhu P. vulgaris dosud nebyla améba známá. Na základě těchto zjištění by se měly rody Sawyeria a Psalteriomonas sloučit a rod Sawyeria by se stal mladším synonymem pro rod Psalteriomonas.

7. Literatura

* značí sekundární citace

* Park JS, Jonckheere JF, Simpson AG. 2012. Characterization of Selenaion koniopes n. gen., n. sp., an amoeba that represents a new major lineage within Heterolobosea, isolated from the Wieliczka salt mine. Journal of Eukaryotic Microbiology 59(6): 601 - 613.

Abida H, Ruchaud S, Rios L, Humeau A, Probert I, De Vargas C, Bach S, Bowler Ch. 2013. Bioprospecting Marine Plankton. Marine Drugs 11: 4594 – 4611.

Adl SM, Leander BS, Simpson AGB, Archibald JM, Anderson OR, Bass D, Bowser SS, Brugerolle G, Farmer MA, Karpov S, Kolisko M, Lane ChE, Lodge DJ, Mann DG, Meisterfeld R, Mendoza L, Moestrup O, Mozley-Standridge SE, Smirnov AV, Spiegel F. 2007. Diversity, Nomenclature, and Taxonomy of Protist. Systematic Biology 56(4): 684 – 689.

Adl SM, Simpson AG, Lane ChE, Lukeš J, Bass D, Bowser SS, Brown M, Burki F, Dunthorn F, Hampl V, Heiss A, Hoppenrath M, Lara E, leGall L, Lynn DH, McManus H, Mitchell EAD, Mozley-Stanridge SE, Parfrey LW, Pawlowski J, Rueckert S, Shadwick L, Schoch C, Smirnov A, Spiegel FW. 2012. The revised classification of eukaryotes. Journal of Eukaryotic Microbiology 59(5): 429 – 493.

Amaral-Zettler LA, Gómez F, Zettler E, Keenan BG, Amils R, Sogin ML. 2002. Eukaryotic diversity in Spains River of Fire. Nature 417: 137.

Anderson OR, Wang W, Faucher SP, Bi K, Shuman HA. 2011. A New Heterolobosean Amoeba Solumitrus palustris n. g., sp. Isolated from Freshwater Marsh Soil. The Journal of Eukaryotic Microbiology 58: 60 – 67.

Armbrust EV, Palumbi SR. 2015. Uncovering hidden worlds of ocean biodiversity. Science 348 (6237): 865 – 867.

Barberá MJ, Ruiz-Trillo I, Tufts JYA, Bery A, Silberman JD, Roger AJ. 2010. Sawyeria marylandensi (Heterolobosea) Has a Hydrogenosome with Novel Metaboli Properties. Eukaryotic Cell 9: 1913 – 1924.

Behnke A, Barger KJ, Bunge J, Stoeck T. 2010. Spatio-temporal variations in Protistan communities along an O₂/H₂S gradient in the anoxic Framvaren Fjord (Norway). FEMS Microbiology Ecology 72: 89 – 102.

Bernard C, Simpson AGB, Patterson DJ. 2000. Some free-living flagellates (protista) from anoxic habitats. Ophelia 52: 113 – 142.

Bourland W, Rotterová J, Čepička I. 2017. Redescription and molecular phylogeny of the type species for two main metopid genera, Metopus es (Müller, 1776) Lauterborn, 1916 and Brachonella contorta (Levander, 1894) Jankowski, 1964 (Metopida, Ciliophora), based on broad geographic sampling. European Journal of Protistology 59: 133 – 154.

Broers CAM, Meijers HHM, Symens JC, Stumm CK, Vogels GD, Brugerolle G. 1993. Symbiotic Association of Psalteriomons vulgaris n. spec. with Methanobacterium formicicum. European Journal of Protistology 29: 98 – 105.

Broers CAM, Stumm CK, Vogels GD, Brugerolle G. 1990. Psalteriomonas lanterna gen. nov., sp. nov., a Free-living Amoeboflagellate Isolated from Freshwater Anaerobic Sediments. European Journal of Protistology 25: 369 – 380.

Broers CAM. 1992. Anaerobic psalteriomonad amoeboflagellates. Doctoral dissertation. Radboud University Nijmegen.

Brown MW, Silberman JD, Spiegel FW. 2010. A Morphologically Simple Species of Acrasis helenhemmesae n. sp. The Journal of Eukaryotic Microbiology 57: 346 – 353.

Brown MW, Silberman JD, Spiegel FW. 2011. A contemporary evaluation of the acrasids (Acrasidae, Heterolobosea, Excavata). The Journal of Eukaryotic Microbiology 48(2): 103- 123.

Brown MW, Silberman JD. 2013. The Non-dictyostelid Sorocarpic Amoebae. Dictyostelids. Springer Berlin Heidelberg: 219-242.

Brugerolle G, Simpsom AGB. 2004. The Flagellar Apparatus of Heteroloboseans. Journal of Eukaryotic Microbiology 51(1): 96 – 107.

Bunting M. 1922. A preliminary note on Tetramitus, a stage in the life cycle of a coprozoic amoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences 8: 294-300.

Caron DA, Countway PD. 2009. Hypotheses on the role of the Protistan rare biosphere in a changing world. Aquatic Microbial Ecology 57: 227 – 238.

Cavalier-Smith T. 1993. Kingdom Protozoa and its 18 phyla. Microbiological Reviews 57: 953 – 994.

Countway PD, Gast RJ, Savai P, Caron DA. 2005. Protistan Diversity Estimates Based on 18S rDNA from Seawater Incubations in the Western North Atlantic. Journal of Eukaryotic Microbiology 52(2): 95 – 106.

Čepička I, Hampl V, Kulda J. 2010. Critical Taxonomic Revision of Parabasalids with Description of one New Genus and three New Species. Protist 161: 400 – 433.

Dawson SC, Pace NR. 2002. Novel kingdom-level eukaryotic diversity in anoxic environments. Proceedings of the National Academy of Sciences 99(12): 8324 – 8329.

Dawson SC, Hagen KD. 2009. Mapping the protistan ‘rare biosphere’. Journal of Biology 8: 105.

De Graaf RM, Duarte I, Van Alen TA, Kuiper JWP, Schotanus K, Rosenberg J, Huynen MA, Hackstein JHP. 2009. The hydrogenosomes of Psalteriomonas lanterna. BioMed Central Evolutionary Biology 9: 287.

De Jonckheere JF, Murase J, Opperdoes FR. 2011. A New Thermophilic Heterolobosean Amoeba, Fumarolamoeba ceborucoi, gen. nov., sp. nov., Isolated Near a Fumarole at a Volcano in Mexico. Acta Protozoologica 50: 43 – 50.

De Jonckheere JF, Brown S, Walochnik J, Aspöck H, Michel R. 2005. Morphological investigation of three Tetramitus spp. which are phylogenetically very closely related: Tetramitus horticolus, Tetramitus russelli n. comb. and Tetramitus pararusselli n. sp. European Journal of Protistology 41:139–150.

De Jonckheere JF, Baumgartner M, Opperdoes FR, Stetter KO. 2009. Marinamoeba thermophila, a new marine heterolobosean amoeba growing at 50 °C. European Journal of Protistology 45: 231 – 236.

De Vargas C, Audic S, Henry N, Decelle J, Mahé F, Logares R, Lara E, Berney C, Le Bescot N, Probert I, Carmichael M, Poulain J, Romac S, Colin S, Aury JM, Bittner L, Chaffron S, Dunthorn M, Engelen S, Flegontova O, Guidi L, Horák A, Jaillon O, Lima- Mendez G, Lukeš J, Malviya S, Morard R, Mulot M, Scalco E, Siano R, Vincent F, Zingone A, Dimier C, Picheral M, Searson S, Kandels-Lewis S, Acinas SG, Bork P, Bowler Ch, Gorsky G, Grimsley N, Hingamp P, Iudicone D, Not F, Ogata H, Pesant S, Raes J, Sieracki ME, Speich S, Stemmann L, Sunagawa S, Weissenbach J, Wincker P, Karsenti E. 2015. Eukaryotic plankton diversity in the sunlit ocean. Science 348.6237: 1261605.

Díez B, Pedrós-Alió C, Massana R. 2001. Study of Genetic Diversity of Eukaryotic Picoplankton in Different Oceanic Regions by Small-Subunit rRNA Gene Cloning and Sequencing. Applied and Environmental Microbiology 67(7): 2932 – 2941.

Edgcomb VP, Kysela DT, Teske A, De Vera Gomez A, Sogin ML. 2002. Benthic eukaryotic diversity in the Guaymas Basin hydrothermal vent environment. PNAS 99: 7658 – 7662.

Elwood HJ, Olsen GJ, Sogin ML. 1985. The small-subunit ribosomal RNA gene sequences from the hypotrichous ciliates Oxytricha nova and Stylonychia pustulata. Molecular Biology and Evolution 2: 399-410.

Fritz-Laylin LK, Fulton Ch. 2016. Naegleria: a classic model for de novo basal body assembly. Cilia 5:10.

Geisen S, Bonkowski M, Zhang J, De Jonckheere JF. 2015. Heterogenity in the genus Allovahlkampfia and the description of the new genus Parafumarolamoeba (Vahlkampfiidae; Heterolobosea). European Journal of Protistology 51: 335 – 349.

Guidi L, Chaffron S, Bittner L, Eveillard D, Larhlimi A, Roux S, Darzi Y, Audic S, Berline L, Brum J, Coelho LP, Espinoza JCI, Malviya S, Sunagawa S, Dimier C, Kandels-Lewis S, Picheral M, Poulain J, Searson S, Stemmann L, Not F, Hingamp P, Speich S, Follows M, Karp-Boss, Boss E, Ogata H, Pesant S, Weissenbach J, Wincker P, Acinas SG, Bork P, De Vargas C, Iudicone D, Sullivan MB, Raes J, Karsenti E, Bowler Ch, Gorsky G. 2016. Plankton networks driving carbon export in the oligotrophic ocean. Nature 532: 465 – 470.

Hampl V, Hug L, Leigh JW, Dacks JB, Lang BF, Simpson AGB, Roger AJ. 2009. Phylogenomic analyses support the monophyly of Excavata and resolve relationship among eukaryotic „supergroups“. PNAS 106(10): 3859 – 3864.

Harding T, Brown MW, Plotnikov A, Selivanova E, Park JS, Gunderson JH, Baumgartner M, Silberman JD, Roger AJ, Simpson AGB. 2013. Amoeba Stages in the deepest Branching Heteroloboseans, Including Pharyngomonas: Evolutionary and Systematic Implications. Protist 164: 272 – 286.

Chávez-Munguía B, Omaňa-Molina M, Castaňón G, Bonilla P, González-Lázaro M, Hernández-Martínez D, Salazar-Villatoro L, Esparza-García A, Martínez-Palomo A, Ortega- Pierres G. 2009. Ultrastructural Study of the Encystation processes in Naegleria sp. Journal of Eukaryotic Microbiology 56(1): 66 – 72.

Kamikawa R, Kolisko M, Nishimura Y, Yabuki A, Brown MW, Ishikawa SA, Ishida K, Roger AJ, Hashimoto T, Inagaki Y. 2014. Gene Content Evolution in DiscobidMitochondria Deduced from the Phylogenetic Position and Complete Mitochondrial Genome of Tsukubamonas globosa. Genome Biology and Evolution 6(2): 306 – 315.

Karsenti E, Acinas SG, Bork P, Bowler Ch, De Vargas C, Raes J, Sullivan M, Arendt D, Benzoni F, Claverie J, Follows M, Gorsky G, Hingamp P, Iudicone D, Jaillon O, Kandels- Lewis S, Krzic U, Not F, Ogata H, Pesant S, Reynaud EG, Sardet Ch, Sieracki ME, Speich S, Velayoudon D, Weissenbach J, Wincker P. 2011. A Holistic Approach to Marine Eco- Systems Biology. PLOS Biology 9(10): e1001177

Kolisko M, Silberman JD, Čepička I, Yubuki N, Takishity K, Yabuki A, Leander BS, Inouye I, Inagaki Y, Roger AJ, Simpson AGB. 2010. A wide diversity of previously undetected free-living relatives of diplomonads isolated from marine/saline habitats. Environmental microbiology 12: 2700 – 2710.

Lie AAY, Liu Z, Hu SK, Jones AC, Kim DY, Countway PD, Amaral-Zettler LA, Cary SC, Sherr EB, Sherr BF, Gast RJ, Caron DA. 2014. Investigating Microbial Eukaryotic Diversity from a Global Census: Insights from a Comparison of Pyrotag and Full-Length Sequences of 18S rRNA Genes. Applied and Environmental Microbiology 80(14): 4363 – 4373.

López-García P, Philippe H, Gail F, Moreira D. 2003. Autochthonous eukaryotic diversity in hydrothermal sediment and experimental microcolonizers at the Mid-Atlantic Ridge. Proceedings of the National Academy of Sciences 100(2): 697 – 702.

Lithgow T, Schneider A. 2010. Evolution of macromolecular import pathways in mitochondria, hydrogenosomes and mitosomes. Philosophical Transactions of the Royal Society B 365: 799 – 817.

Luo Q, Krumholtz LR, Najar FZ, Peacock AD, Roe BA, White DC, Elshahed MS. 2005. Diversity of the Microeukaryotic Community in Sulfide-Rich Zodletone Spring (Oklahoma). Applied and Environmental Microbiology 71: 6175 – 6184.

Massana R, Gobet A, Audic S, Bass D, Bittner L, Boutte Ch, Chambouvet A, Christen R, Claverie JM, Decelle, J, Dolan JR, Dunthorn M, Edvardsen B, Forn I, Forster D, Guillou L, Jaillon O, Kooistra WHCF, Logares R, Mahé F, Not F, Ogata H, Pawlowski J, Pernice MC, Probert I, Romac S, Richards T, Santini S, Shalchian-Tabrizi K, Siano R, Simon N, Stoeck T, Vaulot D, Zingone A, De Vargas C. 2015. Marine Protist diversity in European coastal waters snd sediments as revealed by high-throughput sequencing. Environmental Microbiology 17: 4035 – 4049.

Massana R, Del Campo J, Sieracki ME, Audic S, Logares R. 2014. Exploring the uncultured microeukaryote majority in the oceans: reevaluation of ribogroups within stramenopiles. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology 8: 854 – 866.

Medinger R, Nolte V, Pandey RV, Jost S, Ottenwälder B, Schlötterer Ch, Boenigk J. 2010. Diversity in a hidden world: potential and limitation of nexr-generation sequencing for surveys of molecular diversity of eukaryotic microorganisms. Molecular Ecology 19: 32 – 40.

Medlin L, Elwood HJ, Stickel S, Sogin ML. 1988. The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene 71: 491 – 499.

Müller M, Mentel M, Van Hellemond JJ, Henze K, Woehle Ch, Gould SB, Yu R, Van Der Giezen M, Tielens AGM, Martin WF. 2012. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews 76: 444 – 495.

Nikolaev SI, Mylnikov AP, Berney C, Fahrni J, Pawlowsko J, Aleshin VV, Petrov NB. 2004. Molecular Phylogenetic Analysis Places Percolomonas cosmopolitus within Heterolobosea: Evolutionary Imlpications. Journal of Eukaryotic Microbiology 51(5): 575 – 581.

Niyyati M, Lorenzo-Morales J, Motevalli Haghi A, Valladares B, Rezaeian M. 2009. Isolation of Vahlkampfiids (Willaertia magna) and Thecamoeba from Soil Samples in Iran. Iranian Journal of Parasitology 4(1): 48 – 52.

O´Kelly ChJ, Silberman JD, Amaral-Zettler LA, Nerad TA, Sogin ML. 2003. Monopylocystis visvesvarai n. gen., n. sp. and Sawyeria marylandensis n. gen., n. sp.: Two New Amitochondrial Heteroloboseans Amoebae from Anoxic Environments. Protist 154: 281 – 290.

Orsi W, Edgcomb V, Jeon S, Leslin Ch, Bunge J, Taylor GT, Varela R, Epstein S. 2011. Protistan microbial observatory in the Cariaco Basin, Caribbean. II. Habitat specialization. The ISME Journal 5: 1357 – 1373.

Orsi W, Song YC, Hallam S, Edgcomb V. 2012. Effect of oxygen minimum zone formation on communities of marine Protists. International Society for Microbial Ecology 6: 1586 – 1601.

Pánek T, Brown MW, Dexter-Dyer B, Simpson AGB. 2017. Heterolobosea. Handbook of the Protists.

Pánek T, Silberman JD, Yubuki N, Leander BS, Čepička I. 2012. Diversity, Evolution and Molecular Systematics of the Psalteriomonadidae, the Main Lineage of Anaerobic/Microaerophilic Heteroloboseans (Excavata: Discoba). Protist 163: 807 – 831.

Pánek T, Simpson AGB, Hampl V, Čepička I. 2014a. Creneis carolina gen. et sp. nov. (Heterolobosea), a Novel Marine Anaerobic Protist with Strikingly Derived Morphology and life Cycle. Protist 165: 542 – 567.

Pánek T, Ptáčková E, Čepička I. 2014b. Survey on diversizy of marine/saline anaerobic Heterolobosea (Excavata: Discoba) with description of seven new species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64: 2280 – 2304.

Pánek T, Táborský P, Pachiadaki MG, Hroudová M, Vlček Č, Edgcomb VP, Čepička I. 2015. Combined Culture-Based and Culture-Independent Approaches Provide Insights into Diversity of Jakobids, an Extremely Plesiomorphic Eukaryotic Lineage. Frontiers in Microbiology 6: 1288.

Pánek T. 2011. Evoluce anaerobních Heteroloboseí. Diplomová práce, PřF Univerzity Karlovy.

Page FC. 1975. A new family of amoebae with fine pseudopodia. Zoological Journal of the Linnean Society 56(1): 73-89.

Park JS, Simpson AGB, Lee WJ, Cho BCh. 2007. Ultrastructure and Phylogenetic Placement within Heterolobosea of the Previously Unclassified, Extremely Halophilic Heterotrophic Flagellate Pleurostomum flabellatum (Ruinen 1938). Protist 158: 397 – 413.

Park JS, Simpson AGB, Brown S, Cho BCh. 2009. Ultrastructure and Molecular Phylogeny of two Heterolobosean Amoebae, Euplaesiobystra hypersalinica gen. et sp. nov. and Tulamoeba peronaphora gen. et sp. nov., Isolated from an Extremely Hypersaline Habitat. Protist 160: 265 – 283.

Park JS, Simpson AGB. 2011. Characterization of Pharyngomonas kirbyi (=“Macropharyngomonas halophila“ nomen nudum), a Very Deep-branching, Obligately Halophilic Heterolobosean Flagellate. Protist 162: 691 – 709.

Park JS, Simpson AGB. 2016. Characterization of a Deep-Branching Heterolobosean, Pharyngomonas turkanaensis n. sp., Isolated from a Non-Hypersaline Habitat, and Ultrastructural Comparison of Cysts and Amoebae Among Pharyngomonas Strains. Journal of Eukaryotic Microbiology 62: 100 – 111.

Pawlowski, J, Audic S, Adl S, Bass D, Belbahri L, Berney C, Bowser S, Čepička I, Decelle J, Dunthorn M, Fiore-Donno AM, Gile GH, Holzmann M, Jahn R, Jirků M, Keeling PJ, Kostka M, Kudryavtsev A, Lara E, Lukeš J, Mann DG, Mitchell EAD, Nitsche F, Romeralo M, Saunders GW, Simpson AGB, Smirnov AV, Spouge JL, Stern RF, Stoeck T, Zimmermann J, Schindel D, De Vargas C. 2012. CBOL Protist Working Group: Barcoding Eukaryotic Richness beyond the Animal, Plant, and Fungal Kingdoms. PLOS Biology 10: e1001419.

Pesant S, Not F, Picheral M, Kandels-Lewis S, Le Bescot N, Gorsky G, Iudicone D, Karsenti E, Speich S, Troublé R, Dimier C, Searson S. 2015. Open science resources for the discovery and analysis of Tara Oceans data. Scientific data 2: 150023.

Plotnikov AO, Mylnikov AP, Selivanova EA. 2015. Morphology and life cycle of amoeboflagellate Pharyngomonas sp. (Heterolobosea, Excavata) from hypersaline inland Razval Lake. Biology Bulletin 42: 759 – 769.

Romari K, Vaulot D. 2004. Composition and temporal variability of picoeukaryote communities at a coastal site of the English Channel from 18S rDNA sequences. Limnology and Oceanography 49(3): 784 – 798.

Schuster FL, Rechthand E. 1975. In Vitro Effects of Amphotericin B on Growth and Ultrastructure of the Amoeboflagellates Naegleria gruberi and Naegleria fowleri. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 8: 591 – 605.

Smirnov AV, Fenchel T. 1996. Vahlkampfia anaerobica n. sp. and Vannella peregrinia n. sp. (Rhizopoda) – Anaerobic Amoebae from a Marine Sediment. Archiv Für Protisten Kunde 147: 189 – 198.

Stoeck T, Taylor GT, Epstein SS. 2003. Novel Eukaryotes from the Permanently Anoxic Cariaco Basin (Caribbean Sea). Applied and Environmental Microbiology 69(9): 5656 – 5663.

Stoeck T, Behnke A, Christen R, Amaral-Zettler L, Rodriguez-Mora MJ, Chistoserdov A, Orsi W, Edgcomb VP. 2009. Massively parallel tag sequencing reveals the complexity of anaerobic marine Protistan communities. BMC Biology 7:72.

Stoeck T, Zuendorf A, Breiner HW, Behnke A. 2007. A Molecular Approach to Identify Active Microbes in Environmental Eukaryote Clone Libraries. Microbial Ecology 53: 328 – 339.

Sunagawa S, Coelho LP, Chaffron S, Kultima JR, Labadie K, Salazar G, Djahanschiri B, Zeller G, Mende DR, Alberti A, Cornejo-Castillo FM, Costea PI, Cruaud C, D'Ovidio F, Engelen S, Ferrera I, Gasol JM, Guidi L, Hildebrand F, Kokoszka F, Lepoivre C, Lima- Mendez G, Poulain J, Poulos BT, Royo-Llonch M, Sarmento H, Vieira-Silva S, Dimier C, Pichera M, Searson S, Kandels-Lewis S, Bowler Ch, De Vargas C, Gorsky G, Grimsley N, Hingamp P, Iudicone D, Jaillon O, Not F, Ogata H, Pesant S, Speich S, Stemmann L, Sullivan MB, Weissenbach J, Wincker P, Karsenti E, Raes J, Acinas SG, Bork P. 2015. Structure and Function of the Global Ocean Microbiome. Science 348 (6237): 1261359.

Šlapeta J, Moreira D, García-López P. 2005. The extent of Protist diversity: insights from molecular ecology of freshwater eukaryotes. Proceedings of the Royal Society B 272: 2073 – 2081.

Takishita K, Tsuchiya M, Kawato M, Oguri K, Kitazato H, Maruyama T. 2007. Genetic Diversity of Microbial Eukaryotes in Anoxic Sediment of the Saline Meromictic Lake Namako-ike (Japan): On the Detection of Anaerobic or Anoxic- tolerant Lineages of Eukaryotes. Protist 158: 51 – 64.

Visvesvara GS, Moura H, Schuster FL. 2007. Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, and Sappinia diploidea. Federation of European Microbiological Societies 50: 1 – 26.

Visvesvara GS, Sriram R, Qvarnstrom Y, Bandyopadhyay K, Da Silva AJ, Pieniazek NJ, Cabral GA. 2009. Paravahlkampfia francinae n. sp. Masquerading as an Agent of Primary Amoebic Meningoencephalitis. The Journal of Eukaryotic Microbiology 56(4): 357 – 366.

Wallace RB, Johnson MJ, Suggs SV, Ken-ichi M, Bhatt R, Keiichi I. 1981. A set of synthetic oligodeoxyribonucleotide primers for DNA sequencing in the plasmid vector pBR322. Gene 16: 21-26.

Walochnik J, Mulec J. 2009. Free-living Amoebae in Carbonate Precipitating Microhabitats of Karst Caves and a New Vahlkampfiid Amoeba, Allovahlkampfia spelaea gen. nov., sp. nov. Acta Protozoologica 48: 25 – 33.

Weber F, Anderson R, Foissner W, Mylnikov AP, Jürgens K. 2014. Morphological and molecular approaches reveal highly stratified protist communities along Baltic Sea pelagic redox gradients. Aquatic Microbial Ecology 73: 1 – 16.

Weisse T. 2008. Distribution and diversity of aquatic protists: an evolutionary and ecological perspective. Biodiversity and Conservation 17: 243 – 259.

Yubuki N, Leander BS. 2008. Ultrastructure and molecular phylogeny of Stephanopogon minuta: An enigmatic microeukaryote from marine interstitial environments. European Journal of Protistology 44: 241 – 253.

Yubuki N, Leander BS. 2013. Evolution of microtubule organizing centers across the ree of eukaryotes. The Plant Journal 75: 230 – 244.

Zuendorf A, Bunge J, Behnke A, Barger KJA, Stoeck T. 2006. Diversity estimates of microeukaryotes below the chemocline of the anoxic Mariager Fjord, Denmark. FEMS Microbiology Ecology 58:476 – 491.