The Healthy Human Retina
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Zurich Open Repository and Archive University of Zurich Main Library Strickhofstrasse 39 CH-8057 Zurich www.zora.uzh.ch Year: 2011 Identification and treatment of splice defects in ciliary genes RPGRand BBS1 causing Retinitis pigmentosa Schmid, Fabian Abstract: Retinitis pigmentosa (RP) ist eine genetisch und klinisch heterogene Krankheit, die zur De- generation von Photorezeptoren führt und vollständige Blindheit verursachen kann. Zirka eine von 3000 bis 4000 Personen erkrankt an RP und weltweit sind mind. 1.5 Millionen Menschen betroffen. RP kann auch Teil einer syndromalen Krankheit, wie zum Beispiel dem Bardet-Biedl Syndrom (BBS) sein. Wir haben Mutationen in den Genen RPGR und BBS1 gefunden, welche für das Funktionieren des Verbinden- den Ziliums (connecting cilium) im Photorezeptor wichtig sind. Die Mutationen führen zu Defekten im Spleissen der pre-mRNA. Mutationen in BBS1 sind normalerweise mit BBS assoziiert, wohingegen die meisten RPGR Mutationen nicht syndromale RP verursachen. Unsere Patienten zeigen aber Symptome, die dem zu erwartenden Krankheitsbild widersprechen. In der Familie des einen Patienten mit Spleissde- fekten in RPGR, sind heterozygote Trägerinnen der Mutation ebenfalls betroffen. Im anderen Fall leidet der Patient zusätzlich zu RP an einer milden Höhrschwäche. Die zwei Patienten mit der Splice Donor Mutation in BBS1 zeigen RP, aber keine weiteren Symptome von BBS. Unsere Beobachtungen deuten an, dass Spleissdefekte das Krankheitsbild und den Krankheitsverlauf modifizieren können. Die zwei RPGR Mutationen verändern die exprimierte Menge von neu entdeckten, alternativen RPGR Transkrip- tisoformen. Wir haben gefunden, dass deren Menge in gesunden Menschen gewebespezifisch reguliert ist. Dies impliziert, dass eine Misregulation dieser Isoformen Schäden in den entsprechenden Geweben verursachen oder den Schweregrad der Krankheit erhöhen könnte. Im Gegensatz dazu, führt die BBS1 Mutation zu RP, höchstwahrscheinlich durch eine Reduktion der Menge an funktionellem BBS1 Protein. Die reduzierte Menge an BBS1 scheint auf die anderen Gewebe aber keinen Einfluss zu haben. In unserer Gruppe wurde ein gentherapeutischer Ansatz entwickelt, um die pathogenen Effekte von Spleissendefek- ten zu mildern. Der Ansatz basiert auf der Expression einer modifizierten Form des U1 small nuclear Ribonukleoproteins (U1). U1 ist ein Spleissfaktor der direkt am Pozess des Transkriptspleissens beteiligt ist. Höchstwahrscheinlich stört die Mutation in BBS1 die Interaktion von U1 mit dem Transkript, was dadurch den Spleissdefekt verursacht. Um die Interaktion von U1 mit dem Transkript und damit die Erkennung des von der Mutation betroffenen Exons zu verbessern, wurde U1 an die Mutation angepasst. Die Behandlung von Patientenzellen mit dem angepassten U1 verhindert das Überspringen von Exon 5 und erhöht die Menge an korrekt gespleisstem BBS1 Transkript. Diese Resultate, werden möglicherweise dazu beitragen, eine Behandlungsmethode für solche Mutationen in betroffenen Patienten zu etablieren. Summary Retinitis pigmentosa (RP) is a genetically and clinically heterogeneous disease leading to the degeneration of photoreceptors and can cause complete blindness. The prevalence of the disease is about 1 in 3000 to 4000 people with more than 1.5 million affected worldwide. RP can be a part of several syndromic disorders, as for example the Bardet-Biedl syndrome (BBS). We have identified mutations in the genes RPGR and BBS1 which are important for the functioning of the photoreceptor’s connecting cilium. The mutations lead to defects in pre-mRNA splicing. Mutations in BBS1 are generally associated with BBS, whereas most of the mutations in RPGR cause non-syndromic RP. However, our patients show different phenotypes. In the family of one of the two male RP patients who show RPGR splice defects, heterozygous female carriers are affected. The other patient suffers from mild hearing impairments in addition to RP. Furthermore, the two patients with a splice site mutation in BBS1 show RP without any further signs of BBS. Our findings implicate that defects in mRNA splicing might modify progression and expression of the disease. The two mutations found in RPGR change the amount of novel, alternative transcript isoforms. We have found that the novel RPGR isoforms were expressed in a tissue-dependent manner in healthy individuals which suggests that misregulation of these variants could affect other tis- sues or increase disease severity. In contrast, the splice site mutation in BBS1 causes RP, most probably by reducing the amount of functional protein, whereas other tissues remain unaffected. To correct spliced defects a gene therapeutic approach using a modified form of the U1 small nuclear ribonucleoprotein has been developed in our group. U1 is a splicing factor directly involved in the general splicing process. The mutation in BBS1 causes the splice defect most probably by interfering with U1 binding to the transcript. To increase its binding affinity to the transcript and thereby improve recognition of the affected exon, U1 was adapted to the mutation. Treatment of patient-derived fibroblasts with the adapted form ofU1 increased the amount of correctly spliced BBS1 transcripts and completely abolished skipping of exon 5. These results could help to establish a gene therapeutic treatment to correct splice defects in patients. Posted at the Zurich Open Repository and Archive, University of Zurich ZORA URL: https://doi.org/10.5167/uzh-51232 Dissertation Published Version Originally published at: Schmid, Fabian. Identification and treatment of splice defects in ciliary genes RPGR and BBS1 causing Retinitis pigmentosa. 2011, University of Zurich, Faculty of Science. 2 Identification and Treatment of Splice Defects in Ciliary Genes RPGR and BBS1 Causing Retinitis Pigmentosa Dissertation zur Erlangung der naturwissenschaftlichen Doktorwürde (Dr. sc. nat.) vorgelegt der Mathematisch-naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Zürich von Fabian Schmid von Schübelbach (SZ) Promotionskomitee Prof. Dr. Wolfgang Berger (Vorsitz) Dr. John Neidhardt (Leitung der Dissertation) Prof. Dr. Stephan Neuhauss Prof. Dr. Christian Grimm Zürich, 2011 Declaration I declare that the present thesis was composed by myself and the whole experimental work was performed by my own. This dissertation has not been submitted anywhere else in order to get any other degree or professional qualification. Fabian Schmid, 2011 Table of Contents Zusammenfassung 1 Summary 3 1. General Introduction 4 1.1. General structure and function of the eye 4 1.1.1. Structure and function of the retina 4 1.1.2. Rod and Cone photoreceptors 5 1.1.3. The phototransduction cascade 8 1.1.4. The photoreceptor connecting cilium 11 1.2. Inherited disease affecting photoreceptors 14 1.2.1. Retinitis pigmentosa 14 1.2.2. The retinitis pigmentosa GTPase regulator 16 1.2.3. Bardet-Biedl syndrome 18 1.3. Splicing of pre-mRNA transcripts 19 1.3.1. Alternative splicing 21 1.3.2. Splicing and disease 23 1.3.3. Therapeutic approaches to treat splice defects 25 1.4. References General Introduction 28 2. Aims of the thesis 38 3. Results 39 3.1. Mutation- and tissue-specific alterations of RPGR transcripts 39 3.1.1. Abstract 40 3.1.2. Introduction 41 3.1.3. Materials and Methods 43 3.1.4. Results 46 3.1.5. Discussion 50 3.1.6. Acknowledgements 54 3.1.7. References 55 3.1.8. Figures and Tables 60 3.1.9. Own contribution 67 3.2. U1 snRNA-mediated gene therapeutic correction of splice defects 68 caused by an exceptionally mild BBS mutation 3.2.1. Abstract 69 3.2.2. Introduction 70 3.2.3. Materials and Methods 72 3.2.4. Results 77 3.2.5. Discussion 82 3.2.6. Acknowledgements 85 3.2.7. References 86 3.2.8. Figures and Tables 91 3.2.9. Own contribution 99 3.3. Search for downstream target genes of BBS1 100 3.3.1. Abstract 101 3.3.2. Introduction 102 3.3.3. Methods and Results 104 3.3.4. Discussion 107 3.3.5. Acknowledgements 109 3.3.6. References 110 3.3.7. Figures and Tables 112 3.3.8. Supplementary Material 117 3.3.9. Own contribution 136 4. General Discussion 137 4.1. Ciliopathies 137 4.1.1. Ciliary genes BBS1 and RPGR 138 4.1.2. Genotype-phenotype correlations in BBS1- and RPGR- associated 140 ciliopathies 4.1.3. Splicing as a modifier in RPGR- associated ciliopathies 141 4.2. Therapy of splice defects by adaptation of the U1 snRNA 144 4.2.1. Functional assays 144 4.2.2. Side effects and improvements of the U1-based approach 145 4.3. Concluding remarks 147 4.4. References General Discussion 148 5. Acknowledgements 153 6. Curriculum vitae 154 Zusammenfassung Zusammenfassung Retinitis pigmentosa (RP) ist eine genetisch und klinisch heterogene Krankheit, die zur Degeneration von Photorezeptoren führt und vollständige Blindheit verursachen kann. Zirka eine von 3000 bis 4000 Personen erkrankt an RP und weltweit sind mind. 1.5 Millionen Menschen betroffen. RP kann auch Teil einer syndromalen Krankheit, wie zum Beispiel dem Bardet-Biedl Syndrom (BBS) sein. Wir haben Mutationen in den Genen RPGR und BBS1 gefunden, welche für das Funktionieren des Verbindenden Ziliums (connecting cilium) im Photorezeptor wichtig sind. Die Mutationen führen zu Defekten im Spleissen der pre-mRNA. Mutationen in BBS1 sind normalerweise mit BBS assoziiert, wohingegen die meisten RPGR Mutationen nicht syndromale RP verursachen. Unsere Patienten zeigen aber Symptome, die dem zu erwartenden Krankheitsbild widersprechen. In der Familie des einen Patienten mit Spleissdefekten in RPGR, sind heterozygote Trägerinnen der Mutation ebenfalls betroffen.