Untersuchungen zur Proteom-basierten Aufklärung einer durch Adenovirus 5 E4orf6 Protein vermittelten Interferenz mit der Hepadnavirus Replikation

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie

vorgelegt von Master of Science Julija Miller aus Schwäbisch Hall

an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

Freiburg im Breisgau Juni 2020

Angefertigt an der Medizinischen Fakultät des Universitätsklinikums Freiburg

Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung für Innere Medizin II des Universitätsklinikums Freiburg unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Michael Nassal angefertigt.

Dekan der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. Dierk Reiff

Vorsitzender des Promotionsausschusses Prof. Dr. Andreas Hiltbrunner

Referent: Prof. Dr. Michael Nassal

Koreferent: Prof. Dr. Hartmut Hengel

Drittprüfer: Prof. Dr. Gerald Radziwill

Datum der mündlichen Prüfung: 02.09.2020

Teile dieser Dissertation wurden bereits auf folgenden nationalen und internationalen Konferenzen präsentiert:

The Global Viral Hepatitis Summit 15th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease Berlin, Deutschland 26.06.2015 – 28.06.2015 Studies on the mechanism of hepatitis B virus cccDNA inhibition by adenovirus early proteins

Int. Meeting on the Molecular Biology of HBV Viruses 2015 Bad Nauheim, Deutschland 04.10.2015 – 08.10.2015 Towards elucidating adenovirus 5 early protein E4orf6-mediated interference with hepadnaviral RC-DNA to cccDNA conversion

Int. Meeting on the Molecular Biology of HBV Viruses 2016 Seoul, Südkorea 21.09.2016 – 24.09.2016 Conversion of hepadnaviral rcDNA to cccDNA and the cellular DNA Damage Response (DDR)

Int. Meeting on the Molecular Biology of HBV Viruses 2017 Washington DC, USA 03.09.2017 – 07.09.2017 Towards CRISPR/Cas-mediated elucidation of host factors involved in hepadnaviral rc- to cccDNA formation

Int. Meeting on the Molecular Biology of HBV Viruses 2018 Taormina, Italien 03.10.2018 – 07.09.2018 Proteome based approach to identify the adenovirus early protein E4orf6 dependent interference with Hepatitis B Virus cccDNA formation

Mitarbeit an folgender Publikation: Schmelas C., Miller J., Zimmermann P., Nassal M., Grimm D. „Dimethyl sulfoxide (DMSO) enhances AAV transduction and expression rates“ (Manuskript in Vorbereitung)

Danksagung

Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen bedanken, die mich bei der Anfertigung dieser Arbeit unterstützt haben.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Michael Nassal für die Überlassung des spannenden Projektes, die engagierte Betreuung sowie die ausdauernde Diskussionsbereitschaft.

Ich bedanke mich herzlich bei Dr. Sabrina Schreiner und Prof. Dr. Hartmut Hengel für die Bereitschaft mich im Rahmen des TRR179 in meinem Thesis Advisory Committee zu unterstützen.

Auch danke ich Dr. Sabrina Schreiner für die Möglichkeit in ihrer Forschungsgruppe am Helmholtz Zentrum in München die Adenovirus-Infektionen durchzuführen. Ein herzliches Dankeschön an Samuel Hofmann, der mir während dieser Zeit unterstützend zur Seite stand.

Herrn Prof. Dr. Andreas Pichlmair und Christian Urban danke ich für die Durchführung der MS-Proteomanalyse meiner Zell-Klone.

Auch möchte ich mich bei Carolin Schmelas und Prof. Dr. Dirk Grimm für die Zeit am BioQuant in Heidelberg und die Einführung in die Herstellung der rAAVs bedanken.

Ein herzliches Dankeschön gilt allen Mitgliedern und Ehemaligen der Arbeitsgruppe Nassal sowie dem gesamten B-Labortrakt für ein wunderbares Arbeitsklima. Danke Céline, Katharina, Julia, Andrea, Johanna, Jürgen, Peter und Matthias für Eure Hilfsbereitschaft und die Diskussionen aller Art. Danke Nina für die Unterstützung am FACS und Deine Geduld am Sorter. Besonders danke ich Ida für die unterstützende Zeit in der Zellkultur, insbesondere in der letzten Phase diese Arbeit sowie den ermutigenden Zuspruch. Danke Sabine für den täglichen Gute-Laune-Brezel-Kaffee-Kuchen-Start in den Laboralltag.

Mein größter Dank richtet sich an alle, die mich außerhalb des Labors motiviert und für einen erholsamen Ausgleich gesorgt haben. Ohne Euch wäre die Fertigstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Danke Michaela, ich werde Deinen 33323-Kaffee-Anruf sehr vermissen. Danke Kathrin für Deine Unterstützung während aller Höhen und Tiefen der vergangenen Jahre.

Von ganzem Herzen danke ich meiner wunderbaren Familie dafür, dass ich mich immer auf Euch verlassen kann.

Für meine Eltern

Inhalt I. Zusammenfassung…………………...…………………………………………………………………………...10 II. Summary………………………………...…………………………………………………………………………….12 III. Abkürzungen…………………………….…………………………………………………………………………...14 1. Einleitung ...... 16 1.1. Das Hepatitis B Virus ...... 16 1.2. Morphologie und Genomstruktur ...... 18 1.3. Der Infektionszyklus des HBV ...... 20 1.4. Die Konversion der rcDNA zur cccDNA...... 22 1.5. Die kovalent geschlossene zirkuläre DNA (cccDNA) ...... 24 1.6. Das Enten-Hepatitis B Virus (DHBV) als Modellsystem für HBV ...... 26 1.7. Die zelluläre DNA-Schadensantwort (DDR) ...... 28 1.7.1. Mechanismus der Homologen Rekombination (HR) ...... 29 1.7.2. Mechanismus des Non-Homologous End Joining (NHEJ) ...... 30 1.7.3. Mechanismus der Einzelstrang-Bruch (SSB)-Reparatur ...... 31 1.8. Interaktion von Viren mit der zellulären DDR ...... 31 1.8.1. Das Adenovirus als gut untersuchtes Modell einer Virus-DDR-Interaktion ...... 32 1.8.2. Interaktion von HBV mit zellulären DDR-Faktoren ...... 34 2. Zielsetzung ...... 36 3. Ergebnisse ...... 39 3.1. Generierung stabiler hAdV5 E4wt- und BCmut-exprimierender HepG2 Zellen ...... 39 3.1.1. HepG2 Zelllinien mit stabiler Transgen-Expression unter Verwendung episomaler Vektoren ...... 40 3.1.1.1. Vergleich viraler und nicht-viraler episomaler Vektoren mittels Reporter- Expression in HepG2 ...... 41 3.1.1.2. Antibiotikaselektion erfolgreich transfizierter HepG2 Zellen ...... 43 3.1.1.3. Einzelklon-screening selektionierter HepG2 Zellen auf Transgen-Expression ...... 45 3.1.1.4. HepG2 Zellen mit stabiler hAdV5 E4wt/BCmut Expression ...... 47 3.1.2. CRISPR/Cas9 vermittelte Integration von E4wt und BCmut in den AAVS1-Lokus naiver HepG2 Zellen ...... 53 3.2. Phänotypische Charakterisierung der E4orf6 exprimierenden HepG2 Zelllinien ...... 64 3.2.1. Funktionelle Untersuchung des E4orf6 Proteins in den stabilen HepG2 Zelllinien ...... 64 3.2.1.1. Nachweis einer E4wt-Cul5 Interaktion durch Ko-Immunpräzipitation ...... 65 3.2.1.2. Nachweis der Degradation von Mre11 und p53 spezifisch in E4wt exprimierenden HepG2 Zelllinien ...... 70 3.2.2. Einfluss von E4orf6 auf die DHBV-Replikation in stabilen HepG2 Zelllinien ...... 75 3.3. Massenspektrometrischer Proteomvergleich der stabil hAdV5 E4orf6- vs. E4orf6_BCmut exprimierenden HepG2 Zelllinien ...... 85 3.4. Etablierung einer DHBV-Cas9-Reporterzelllinie ...... 93 3.4.1. Generierung Cas9 exprimierender DHBV-Reporterzellen mit einem cccDNA abhängigen HAeAg Readout ...... 93

3.4.2. SpCas9-Protein Nachweis in den stabilen DHA2/3-Reporterzelllinien ...... 98 3.4.3. Fluoreszenzbasierter SpCas9 Aktivitätsassay ...... 100 3.4.4. DHBV-Replikationskinetik in der SpCas9 exprimierenden Reporterzelllinie DHA_Cas9 #3-S...... 104 3.5. Funktionale Stilllegung von Wirtsfaktoren mit potenzieller DHBV-Replikationsrelevanz . 106 3.5.1. Einschleusen chemisch synthetisierter RNA-Oligonukleotide in HepG2- und HepG2-basierte Zellen – CRISPRMAX-Transfektion vs. Nucleofektion ...... 107 3.5.2. Virale Vektoren für die KD/KO Validierung von Wirtsfaktoren mit potenzieller DHBV-Relevanz ...... 112 3.5.2.1. Rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) ...... 112 3.5.2.2. Verwendung von Lentivirus Vektoren für einen stabilen KD-Effekt ...... 132 3.5.2.2.1. Wirtsfaktor KD-Effizienzen nach lentiviraler shRNA Vektor Transduktion ...... 135 3.5.2.2.2. Einfluss von Wirtsfaktor-KD auf die Kapsid-interne DHBV Replikation ...... 137 3.5.2.2.3. Einfluss von Wirtsfaktor-KD auf die nukleäre Virus-DNA ...... 141 4. Diskussion ...... 149 4.1. Herstellung stabil E4wt- und BCmut-exprimierende HepG2 Zellen mittels des episomalen pMEP4 Vektors sowie durch gerichtete Integration in den AAVS1 Lokus ...... 150 4.1.1. Episomale Vektoren: EBV-basiert vs. nicht-viral ...... 150 4.1.2. Etablierung E4wt- bzw. BCmut HepG2-Zelllinien mittels EBV-basierter Vektoren ...... 152 4.1.3. CRISPR/Cas9 gerichtete Transgenintegration in den AAVS1 Lokus ...... 154 4.2. In der pMEP4 HepG2 Zelllinie #B11 exprimiertes E4wt hat vergleichbare Eigenschaften wie authentisches hAdV5 E4orf6 Protein ...... 155 4.3. Die DHBV-Replikation in der HepG2-Zelllinie pMEP4_E4wt #B11 ist signifikant reduziert ...... 158 4.4. Der MS-Proteomvergleich zwischen den Zelllinien E4wt #B11 und BCmut #F4 gibt Aufschluss über eine Vielzahl unterschiedlich abundanter zellulärer Proteine ...... 159 4.5. Bekannte physiologische Rollen ausgewählter Wirtsproteine mit E4wt-abhängig verminderter Abundanz ...... 161 4.5.1. ANP32A (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A) ...... 161 4.5.2. ANP32E (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member E) ...... 162 4.5.3. DDX41 (Probable ATP-dependent RNA helicase) ...... 162 4.5.4. HIC2 (Hypermethylated in Cancer 2) ...... 163 4.5.5. HSP27 (Heat shock protein 27/ heat shock protein beta-1 (HSPB1)) ...... 163 4.5.6. NAMPT (Nikotinamid Phosphoribosyl-Transferase)...... 164 4.5.7. RPA (Replication Protein A) und seine Untereinheiten RPA1, RPA2 und RPA3 164 4.5.8. SerpinA3 (alternativer Name: alpha-1-Antichymotrypsin/ α-1ACT) ...... 165 4.5.9. TAGLN2 (Transgelin-2) ...... 166 4.6. Die Reporterzelllinie DHBV-HA_Cas9 ermöglicht eine cccDNA-abhängige Validierung von Wirtsfaktoren auf Relevanz für die hepadnavirale Replikation ...... 166 4.7. Virale Vektoren ermöglichen den stabilen KD von Wirtsfaktoren und deren Validierung bezüglich DHBV-Relevanz ...... 169 4.7.1. Einbringen von shRNA-Expressionskassetten mittels rAAV ...... 169

4.7.1.1. Unerwartete Entkopplung von Fluoreszenz-Reporter- und Resistenzmarker- Expression...... 170 4.7.1.2. Blasticidin interferiert mit der DHBV-Replikation in DHA2/3 Zellen ...... 172 4.7.2. shRNA-kodierende LV ermöglichen die funktionale Validierung von neuen Wirtsfaktoren auf ihre DHBV-Relevanz...... 173 4.7.3. Potenzielle anti-DHBV Wirkmechanismen der Wirtsfaktoren ANPA32A, TAGLN2, HSP27 und RPA1 ...... 176 4.8. Schlussfolgerungen und Ausblick ...... 179 5. Material ...... 184 5.1. Chemikalien und sonstige Reagenzien ...... 184 5.2. Verbrauchsmaterialien ...... 184 5.3. Bakterienstämme und Nährmedien ...... 185 5.4. Zelllinien ...... 185 5.5. Radiochemikalien ...... 186 5.6. Puffer und Lösungen ...... 186 5.7. Plasmide ...... 186 5.8. Primer ...... 188 5.9. RNA ...... 189 5.10. Enzyme ...... 189 5.11. Virale Partikel ...... 189 5.11.1. rAAV ...... 189 5.11.2. Lentivirus Vektoren ...... 190 5.12. Antikörper ...... 190 5.12.1. Primäre Antikörper ...... 190 5.12.2. Sekundäre Antikörper ...... 191 5.13. Kommerzielle Kits ...... 191 5.14. Geräte ...... 191 5.15. Software ...... 191 6. Methoden ...... 193 6.1. Zellkulturtechniken ...... 193 6.1.1. Kultivierung von Zellen ...... 193 6.1.2. Kryokonservierung von Zellen ...... 193 6.1.3. Bestimmung der Lebendzellzahl ...... 193 6.1.4. Generierung stabiler Zelllinien ...... 194 6.1.4.1. Herstellung einer stabilen Zelllinie durch Verwendung episomaler Vektoren ...... 194 6.1.4.2. Generierung stabiler Zellen mittels CRISPR/Cas9 ...... 194 6.2. Molekularbiologische Standardmethoden ...... 195 6.2.1. Klonierung eines Transgens in die episomalen Vektoren pMEP4 und pCEP4 .... 195 6.2.1.1. Klonierung von mCherry ...... 195 6.2.1.2. Klonierung von E4orf6 wt/ BCmut ...... 195 6.2.2. Sequenzierung ...... 196 6.2.3. Isolierung genomischer DNA ...... 196 6.2.4. Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ...... 196

6.2.5. Quantitative PCR (qPCR) ...... 196 6.2.6. Transfektion und Nucleofection ...... 197 6.2.7. Transduktion von HepG2 Zellen mit viralen Partikeln (rAAV / Lentiviren) ...... 197 6.2.8. Southern Blot (SB) und DNA-Hybridisierung ...... 198 6.3. Immun-Biochemische Methoden ...... 199 6.3.1. Immunoblot (IB) ...... 199 6.3.2. Durchflusszytometrie (FACS) ...... 199 6.3.3. HA-ELISA ...... 200 6.3.4. HBsAg ELISA ...... 200 6.3.5. Immunofluoreszenzfärbung (IF) ...... 200 6.3.6. Immunopräzipitation (IP) ...... 201 6.4. Methoden zum Nachweis von Proteinen ...... 202 6.4.1. Induktion der E4orf6 Proteinexpression ...... 202 6.4.2. Zelllyse und Proteinernte ...... 202 6.4.2.1. Herstellung von Gesamtzellextrakten ...... 202 6.4.2.2. Herstellung von Kernextrakten aus Zelllinien ...... 203 6.4.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ...... 203 6.4.4. Native Gelelektrophorese (NAGE) zum Nachweis hepadnaviraler Kapside ...... 204 6.5. Experimentelle Methoden ...... 205 6.5.1. Human Adenovirus 5 (hAdV5) Infektion ...... 205 6.5.2. Herstellung von rAAVs in HEK293T Zellen ...... 205 6.5.3. T7 Endonuklease-Assay (Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) ...... 206 6.5.4. Aufarbeitung und Analyse hepadnaviraler DNA ...... 206 6.5.4.1. Isolierung viraler DNA aus dem Zellkern ...... 206 6.5.4.2. Isolierung viraler DNA-Replikationsintermediate aus dem Zytoplasma ...... 207 6.5.4.3. Analyse enkapsidierter viraler DNA aus dem Zytoplasma ...... 208 7. Anhang ...... 209 7.1. Nachweis von Mre11 und p53 in hAdV5 infizierten AAVS1_E4wt #4 und _BCmut #5 Zellen ...... 209 7.2. E4orf6wt abhängige Reduktion von replikativen Intermediaten in pMEP4 Zellen nach DHBV-Transfektion ...... 210 7.3. Vulkanplots des MS-Proteomvergleichs der stabilen E4wt- und BCmut exprimierenden HepG2 Zelllinien ...... 211 7.4. Lentivirus Vektoren von Sigma: Mission Lenti-shRNAs ...... 213 8. Literaturverzeichnis ...... 216

Zusammenfassung

I. Zusammenfassung

Hepatitis B Virus (HBV), das prototypische Hepadnavirus, kann chronische Infektionen der Leber verursachen. Verantwortlich hierfür sind im Zellkern persistierende Virusgenome in Form von kovalent geschlossenen zirkulären (covalently closed circular) cccDNA- Molekülen. Sie dienen als Matrize zur Synthese aller viralen RNAs und so in der Folge zur Produktion von Nachkommenviren. Derzeitige Therapieansätze erzielen keine Eliminierung des cccDNA Pools, sodass oft eine lebenslange Medikation erforderlich ist.

Das Genom infektiöser HB Virionen ist eine relaxiert-zirkuläre (relaxed circular) rcDNA, die im Zellkern in cccDNA umgewandelt wird. Der Mechanismus ist wenig verstanden, doch spielen Faktoren der zellulären DNA-Reparaturantwort (DNA damage response, DDR) eine wesentliche Rolle. Viele Viren nutzen oder inhibieren die DDR für die eigene Replikation. Ein gut verstandenes Beispiel sind Adenoviren wie das humane Adenovirus 5 (hAdV5), dessen frühe (early) Genprodukte E4orf6 (E4wt) und E1B55k kooperativ die proteasomale Degradation von DDR-Komponenten induzieren und so einer DDR-vermittelten Replikationsinterferenz entgegenwirken. In Vorexperimenten mit humanen Hepatomzellen (HepG2) interferierte die Koexpression der beiden hAdV5 Proteine stark mit Replikation und cccDNA-Bildung des Enten-HBV (duck HBV/DHBV), das vielfach mehr cccDNA akkumuliert als HBV und daher als cccDNA Modellsystem dient. Unerwarteterweise löste bereits E4wt allein diese Interferenz aus, während die für hAdV5 beschriebenen anti-DDR-Effekte zusätzlich E1B55k benötigen. Dabei assoziiert E4wt mit den Zellproteinen Cullin 5 (Cul5), Ring-Box Protein 1 (RBX1) sowie Elongin (Elo) B und C zu einer E3-Ubiquitinligase, deren Spezifität durch E1B55k bestimmt wird. Hieraus resultierte die Hypothese, dass E4wt alleine mindestens einen noch unbekannten Zellfaktor inaktiviert, der für die hepadnavirale Replikation wesentlich ist. Zur Identifizierung entsprechender Kandidaten diente ein massenspektrometrischer (MS) Proteomvergleich (AG Prof. Dr. A. Pichlmair, TU München) zwischen neu etablierten HepG2 Zelllinien, die induzierbar E4wt Protein oder eine E3-Ubiquitinligase-defiziente Variante (BCmut) exprimieren; die Herstellung klonaler Zelllinien gelang durch CRISPR/Cas9- vermittelte Integration entsprechender Expressionskassetten in den chromosomalen AAVS1- Lokus, alternativ mittels des episomalen Vektors pMEP4. Die höhere Expression in den pMEP4-Zellen erlaubte die Bestätigung der Funktionalität des E4wt Proteins anhand der Fähigkeit, die Infektion mit einem E4orf6-defizienten hAdV5 zu komplementieren; zudem induzierte das Zell-kodierte E4wt unter Bildung einer Cul5 E3-Ubiquitinligase in

10 Zusammenfassung

Anwesenheit von E1B55k die Degradation bekannter Zielproteine wie Mre11 und p53. Dies ging einher mit der E4wt plus E1B55k vermittelten verstärkten Neddylierung von Cul5. Konform mit den Vorexperimenten waren DHBV-Expression und cccDNA-Niveau in der pMEP4-E4wt Zelllinie deutlich verringert.

Der MS-Proteomvergleich zwischen pMEP4-E4wt vs. BCmut Zelllinie identifizierte >100 Proteine mit signifikant veränderter Abundanz, wovon die Mehrzahl keinen direkten Bezug zur DDR besaß; eine Ausnahme bildete der RPA (replication protein A) Komplex, dessen Untereinheiten RPA1, RPA2 und RPA3 alle E4wt-abhängig signifikant reduziert waren. RPA stabilisiert als Haupt-Einzelstrang-DNA Bindeprotein eukaryonter Zellen einzelsträngige DNA-Intermediate, wie sie auch während der DNA-Reparatur auftreten. Die Hepadnavirus- Relevanz dieser und weiterer Kandidaten-Faktoren sollte durch knockdown (KD) mittels RNA Interferenz (RNAi) und/oder knockout (KO) mittels CRISPR/Cas9 Genom-Editierung evaluiert werden. Hierzu wurden die TetOFF Reporterzelllinien DHA2/3 und DHA_Cas9 (mit AAVS1-integrierter SpCas9 Expressionskassette) konstruiert, die nach Induktion der DHBV- Replikation cccDNA-abhängig HA-markiertes eAg (HAeAg) sekretieren; hierdurch kann nicht-invasiv die 1-2 Wochen dauernde Kinetik der cccDNA-Bildung verfolgt werden, komplementiert durch direkten Nachweis von rcDNA und cccDNA im Southern Blot.

Für das möglichst effiziente Einschleusen entsprechender Effektor-RNAs wurden shRNA- bzw. gRNA-kodierende Vektoren auf Basis rekombinanter Adeno-Assoziierter Viren (rAAV) und lentivirale Vektoren (LV) verglichen. Die rAAV-vermittelte shRNA-Expression führte zu einem nur wenige Tage anhaltenden KD, was diese Vektoren eher für die CRISPR/Cas9 Genom-Editierung interessant macht. Die integrierenden LV ergaben dagegen einen langanhaltenden shRNA KD. Für 4 der 11 ausgewählten Kandidaten aus der MS-Proteomliste (ANP32A, HSP27, RPA1 und TAGLN2) konnten so in den entsprechenden KD-Zelllinien eine verlangsamte HAeAg Sekretion und veränderte cccDNA-Kinetik als erste Evidenzen für eine Rolle bei der DHBV-Replikation und/oder cccDNA-Bildung erhalten werden.

Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit eine Reihe neuer Testsysteme und Werkzeuge zur Identifizierung von Wirtsfaktoren etabliert, die im hepadnaviralen Replikationszyklus eine Rolle spielen könnten. Für vier solche Faktoren ist dies bereits wahrscheinlich gemacht, die neuen Reporterzellsysteme sollten tiefergehende, auch mechanistische Studien mit weiteren Kandidatenfaktoren deutlich erleichtern. Daraus sollten neue Erkenntnisse zur hepadnaviralen Virus-Wirt-Interaktion hervorgehen, die zum besseren Verständnis von cccDNA-Bildung und -Persistenz wie auch zu neuen Therapieansätzen beitragen.

11 Summary

II. Summary

Hepatitis B virus (HBV), the prototypic hepadnavirus, can establish chronic infections of the liver as a result of viral genomes that persist in the cell nucleus as covalently closed circular (ccc) DNA molecules. They serve as template for all viral transcripts and thus in consequence for new virions. Until now therapeutic approaches can rarely eliminate the cccDNA, often requiring lifelong medication.

The hepadnaviral genome in infectious virions is a relaxed circular (rc)DNA that is converted to cccDNA in the host cell nucleus. The mechanism is poorly understood but accumulating evidence suggests an essential role for factors of the cellular DNA damage response (DDR). Most viruses either exploit or avoid the DDR for their own replication. Adenoviruses such as human adenovirus 5 (hAdV5) are amongst the best-known examples. The hAdV5 early gene products E4orf6 (E4wt) and E1B55k cooperate to induce the proteasomal degradation of several DDR components, counteracting a DDR-mediated replication interference. In preliminary studies with human hepatoma cells (HepG2) coexpression of the two hAdV5 early proteins strongly interfered with replication and cccDNA formation of duck hepatitis B virus (DHBV) which accumulates much higher cccDNA copy numbers per cell compared to HBV and thus serves as a preferred model system. Unexpectedly, DHBV interference was already seen with E4wt alone whereas the known anti-DDR effects of hAdV5 require E1B55k as well. There, E4wt associates with cellular proteins Cullin 5 (Cul5), RING-box protein 1 (RBX1) and Elongins B and C (EloB, EloC) into a functional E3-ubiquitin ligase whose target specificity is determined by E1B55k. We therefore hypothesized that E4wt alone guides at least one unknown hepadnavirus-relevant host factor into proteasomal degradation.

To identify appropriate candidates a mass-spectrometric (MS) proteome comparison was performed (lab of Prof. Dr. A. Pichlmair, TU Munich) between newly established HepG2 cell lines which inducibly express either E4wt protein or an E3-ubiquitin ligase-deficient variant (BCmut). Generation of the stable HepG2 cell lines was accomplished by either CRISPR/Cas9-mediated site-specific integration of appropriate expression cassettes into the chromosomal AAVS1 locus, or by way of the stable episomal vector pMEP4. Higher level expression in the pMEP4 cell lines allowed to confirm functionality of the E4wt protein via its ability to complement infection by an E4orf6-deficient hAdV5. In addition, the pMEP4- encoded E4wt protein formed a functional Cul5 E3-ubiquitin ligase which in the presence of E1B55k induced degradation of the known target proteins Mre11 and the tumor suppressor p53, accompanied by an E4orf6 plus E1B55k dependent Neddylation of Cul5. In line with the

12 Summary preliminary results DHBV replication and cccDNA levels were markedly reduced in the pMEP4-E4wt cell lines.

The proteome comparison between the pMEP4-E4wt and pMEP4-BCmut cell lines revealed over 100 proteins that were significantly up- or downregulated in the E4wt expressing cells. For most of them a direct connection to DDR was not obvious. An exception was the replication protein A (RPA), a complex whose subunits RPA1, RPA2 and RPA3 were all significantly reduced in E4wt expressing cells. As the main single-stranded DNA binding protein in eukaryotic cells RPA stabilizes single-stranded DNA intermediates, especially during DNA repair processes. The potential relevance of these and the other candidate factor for hepadnaviral replication was to be tested by knockdown (KD) via RNA interference and/or knockout (KO) via CRSIPR/Cas-meditated genome editing. To this end, the TetOFF reporter cell lines DHA2/3 and DHA_Cas9 (containing an integrated SpCas9 expression cassette in the AAVS1 locus) were constructed. Upon induction of DHBV replication the cells secrete an HA-tagged eAg (HAeAg) in a cccDNA dependent manner. Complemented by direct rcDNA and cccDNA detection via Southern blotting, this enables the non-invasive monitoring of the slow (1- to 2 weeks) kinetics of cccDNA formation and the impact of host-factor KD or KO events on the process.

For efficient generation of appropriate effector RNAs in the reporter cell lines, shRNA and gRNA encoding recombinant adenovirus-associated virus (rAAV) vectors and lentiviral vectors (LV) were compared. rAAV-mediated shRNA expression resulted in an only transient KD for a few days, whereby these vectors appear more suited for CRISPR/Cas genome editing. The integrating LVs, in contrast, induced a long-term shRNA KD. In this way, for 4 of the 11 preselected candidates from the proteome-derived short-list, i.e. ANP32A, HSP27, RPA1 und TAGLN2, a role in hepadnaviral replication could be made likely by decelerated and/or diminished HAeAg secretion and altered cccDNA formation kinetics.

Altogether this thesis established a set of new test systems and tools for the identification of new host factors with relevance for the hepadnaviral replication cycle. Evidence for four such factors has already been obtained, while the new reporter cell lines should greatly facilitate more detailed, including mechanistic studies, of additional factors. This should shed new light on the hepadnavirus-host interaction and contribute to a better understanding of cccDNA formation and maintenance as well as to new therapeutic approaches.

13 Abkürzungen

III. Abkürzungen

32P Phosphor-32; radioaktives Isotop des Phosphors AAVS1 Adeno-associated virus integration site 1 Abb. Abbildung APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure ATP Adenosin-5-triphosphat BCmut BC-Box Mutante des E4orf6-Proteins bp Basenpaare Cas CRISPR-assoziiert cccDNA kovalent geschlossene zirkuläre- (covalently closed circular) -DNA CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats DAPI 4´, 6´-Diamidin-2-phenylindol Dihydrochlorid DDR DNA-Schadensreparatur (DNA-Damage Repair) DHBV Duck Hepatitis B virus (Hepatitis B Virus der Ente) dlDNA lineare Doppelstrang-DNA (doublestranded linear DNA) DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Desoxynukleosidtriphosphat Dox Doxicyclin DSB Doppelstrangbruch EBV Ebstein-Barr-Virus E. coli Escherichia coli E4orf6 frühe Region 4 offenes Leseraster 6 des Adenovirus ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidiumbromid FACS Durchlusszytometrie (fluorescence-activated cell sorting) FITC Fluorescein-isothiocyanat FKS Fötales Kälberserum FL Fluoreszenz FSC Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter) gDNA genomische DNA gRNA guide RNA HA Hämagglutinin Epitop des Influenza-Virus hAdV5 Humanes Adenovirus Typ 5 HBV Hepatitis B Virus HR Homologe Rekombination IB Immunoblot IF Immunfluoreszenz IP Immunopräzipitation LV Lentivirus Vektor kDa Kilodalton KD knockdown KO knockout MOI Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection) MS Massenspektrometrie

14 Abkürzungen

NAGE Native Gelelektrophorese NHEJ Nichthomologe-Endverknüpfung (Nonhomologous End-Joining) nt Nukleotid(e) NV Nukleaseverdau OD optische Dichte ORF Offener Leserahmen (Open Reading Frame) Ori Replikationsursprung (origin of replication) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) pgRNA prägenomische RNA PO (Meerrettich)-Peroxidase PVDF Polyvinylendifluorid qPCR quantitative PCR rAAV rekombinantes Adeno-Assoziiertes-Virus rcDNA entspannte zirkuläre DNA (relaxed circular DNA) RIPA Radio-Immunpräzipitations-Assay RNAi RNA interferenz rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute) RT Raumtemperatur s. siehe SA Splice-Akzeptor SD Splice-Donor SD Standardabweichung (standard deviation) SDS Sodiumdodecylsulfate (Natrium-Dodecylsulfat) SEM Standardfehler (standard error of the mean) sgRNA single guide RNA shRNA short hairpin RNA siRNA small interfering RNA ssDNA Einzelstrang DNA (single-strand DNA) Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA TBE Tris Borat-EDTA TEMED N, N, N´´, N´´-Tetramethylethylendiamin Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TTBS Tris gepufferte Salzlösung mit Tween 20 vge Virale Genom-Äquivalente (viral genome equivalents) vgl. vergleiche vs. versus wt Wildtyp

15 Einleitung

1. Einleitung

1.1. Das Hepatitis B Virus

1964 entdeckten Baruch S. Blumberg und Kollegen in einigen Seren von Ureinwohnern Australiens ein neues Antigen („Australia antigen“), das mit Bluttransfusionen und, wie später gezeigt, mit einer Form der Hepatitis (Leberentzündung) korrelierte (Blumberg et al., 1965). 1970 konnte David Dane im Serum von Australia antigen-positiven Patienten elektronenmikroskopisch virale Partikel nachweisen (Dane-Partikel, Abb. 1A) (Dane et al. 1970), die das infektiöse Agens, Hepatitis B Virus (HBV), darstellen und Australia antigen auf ihrer Oberfläche tragen; dieses wurde daher später als Hepatitis B Oberflächenantigen (Hepatitis B surface antigen/HBsAg) benannt (Li et al. 2020). Das Hepatitis verursachende HBV gehört zur Familie der Hepadnaviridae, welche umhüllte, hepatotrope (leberspezifische) DNA-Viren beinhaltet, die durch reverse Transkription eines RNA-Intermediats replizieren. Entsprechend seiner Spezies-Spezifität ist das humane HBV in die Säuger-spezifische Gattung Orthohepadnavirus eingeordnet. Avihepadnaviridae wie das Enten-HBV (duck HBV/DHBV) infizieren Vögel, Metahepadnaviridae infizieren Fische und Herpetohepadnaviridae infizieren Amphibien und Reptilien. 2017 wurde basierend auf Sequenzanalysen eine Hepadna-ähnliche Virus-Familie in Fischen beschrieben, die keine Hülle aufweist (nackednaviridae; abgeleitet aus dem schwäbischen Idiom für „nackt"). Diese und weitere neuentdeckte HBV-verwandte Viren ermöglichen neue Erkenntnisse zur Phylogenie und Evolution der Hepadnaviren (Dill et al., 2016) (Jo et al., 2017) (Lauber et al., 2017) (Gogarten et al., 2019) (Rasche et al., 2019).

Für das humane HBV wurden basierend auf Sequenzanalysen bislang 9 Genotypen (A bis I) und mehrere Subtypen identifiziert, die eine unterschiedliche geographische Verteilung aufweisen. In Europa sind die Genotypen A und D stark vertreten. Die Genotypen B und C sind prävalent in Asien, Ozeanien und Australien, A und E hingegen in Subsahara-Afrika. In den meisten Ländern Lateinamerika ist F der dominierende Genotyp, während in Nordamerika die Genotypen A, B, C und D vorherrschen (Velkov et al., 2018).

HBV kann akute und chronische Leberentzündungen hervorrufen (virale Hepatitis). Der häufigste Übertragungsweg ist die vertikale Mutter-Kind Transmission während der Geburt (perinatal) oder des Stillens. Horizontal wird das Virus parenteral über Kontakt mit kontaminiertem Blut und anderen Körperflüssigkeiten (z.B. über Sexualkontakt) übertragen. Dieser Weg ist äußerst effizient; so sind bereits <20 virale Partikel für eine Infektion

16 Einleitung ausreichend (Candotti et al., 2019). Während Infektionen im Kleinkind-Alter zu ≥90% chronisch werden, nehmen Infektionen im Erwachsenenalter bei ≥90% der Betroffenen einen akuten, selbstlimitierender Verlauf, bei dem das Virus vom Immunsystem kontrolliert wird (Borgia et al., 2012) (WHO-Stand: Juli 2019). Problematisch ist allerdings die Persistenz viraler Genome in Form von zirkulären, kovalent geschlossenen (covalently closed circular/ccc)-DNA Molekülen (s. Abschnitt 1.5), die weder durch die körpereigene Immunabwehr noch mit bisherigen Therapieansätzen vollständig eliminiert werden können (Zoulim, 2006). Die cccDNA stellt daher ein andauerndes Risiko für eine Reaktivierung der Hepatitis B dar, besonders bei Immunsuppression.

Trotz der Verfügbarkeit eines effektiven Impfstoffes zur Prophylaxe der HBV-Infektion sind nach Angaben der WHO etwa 257 Millionen Menschen chronisch HBV-infiziert (WHO- Stand Juli 2019). Die HBV-Prävalenz ist in der westlichen Pazifik- und afrikanischen Region am höchsten, wo je über 6% der erwachsenen Bevölkerung infiziert sind. Europaweit sind ca. 1,6% der Gesamtbevölkerung chronische HBV-Träger (WHO, Juli 2019).

Auf längere Sicht kann sich die chronische HBV-Infektion in Leberzirrhose und primärem Leberzellkarzinom (hepatocellular carcinoma, HCC) manifestieren. Pro Jahr treten laut Schätzung der WHO weltweit nahezu 900.000 Todesfälle infolge von HBV-Infektionen auf (WHO-Stand: Juli 2019). Zur Behandlung werden bislang zwei Monotherapieansätze eingesetzt. Interferon-α, meist als durch Pegylierung stabilisiertes Peg-IFN, unterstützt die körpereigene Immunabwehr und hat zudem antivirale Wirkung (Craxi & Cooksley, 2003), aber auch starke Nebenwirkungen. Die besser verträglichen Nukleotid- oder Nukleosidanaloga (NAs) (Tenofovir, Entecavir) hemmen die virale reverse Transkription (Scaglione & Lok, 2012) (Levrero et al., 2018). Beide Behandlungsmethoden können die HBV Replikation unterdrücken und auch den Krankheitsfortschritt verlangsamen, erzielen aber selten eine Heilung, da die persistierende cccDNA nicht eliminiert wird. Die NA- Therapie muss daher oft lebenslang erfolgen, wodurch die Gefahr von HBV-Resistenzbildung und Langzeit-Nebenwirkungen steigt (Zoulim, 2006). Des Weiteren laufen Studien zur Optimierung möglicher Kombinationstherapien von Peg-IFN und NAs, die eine effizientere HBV-Behandlung versprechen (Stelma et al., 2017) (van Campenhout et al., 2019). Bislang fehlen hierzu aber belastbare Daten.

17 Einleitung

1.2. Morphologie und Genomstruktur

Infektiöse Hepatitis B Virionen (Abb. 1A) haben einen Durchmesser von ca. 42 nm und bestehen aus einem ikosahedralen Nukleokapsid, das von einer Lipidhülle umschlossen ist. Im Inneren der Partikel befindet sich das partiell doppelsträngige (double-stranded (ds)DNA- Genom. Es ist zirkulär, jedoch nicht kovalent geschlossen und wird daher als relaxierte zirkuläre DNA (relaxed circular (rc)DNA) bezeichnet. Das Kapsid wird aus 120, seltener 90 Dimeren des Core-Proteins (HBc) geformt (Böttcher et al. 1997) (Wynne et al. 1999). Die Lipidhülle ist von Wirtszellmembranen abgeleitet, in welche die viralen Oberflächenproteine (HBs) S (small, klein), M (middle, mittel) und L (large, groß) in einem ungefähren Verhältnis von 4:1:1 eingebettet sind (Seitz et al., 2007). L und S Protein sind für die Virus- Morphogenese und -Infektiosität essentiell.

Das virale Genom (Abb. 1B) hat eine Größe von 3,2 kb. Der längere DNA-Strang ist komplementär zur prägenomischen RNA (pgRNA) und wird folglich als minus (-)-Strang bezeichnet. Sein 5´-Ende ist kovalent mit der viralen Polymerase (P-Protein) verknüpft (Gerlich & Robinson, 1980), was aus dem speziellen protein-priming Mechanismus der reversen Transkription resultiert. Der unvollständige plus (+)-Strang hat am 3´-Ende variable Längen und trägt am 5´-Ende ein RNA-Oligomer von ca. 18 Nukleotiden (nt) Länge, das vom 5´-Ende der pgRNA stammt und daher eine Cap-Struktur besitzt; es fungiert als primer der (+)-DNA Synthese. Zu den weiteren für die Transkription, Replikation und Genomverpackung essentiellen cis-Elementen gehören direkte Sequenz-Wiederholungen (direct repeats, DR1 und DR2) und das RNA Verpackungssignal ε.

Das Virusgenom kodiert die 4 offenen Leseraster (open reading frame, ORF) P, PräC/C, PräS/S, und X, die teilweise miteinander überlappen. Die Transkription erfolgt durch die zelluläre RNA-Polymerase II von 4 internen Promotoren, die durch zwei Transkriptions- verstärker (Enhancer, Enh1 und Enh2) reguliert werden, wobei alle Transkripte sich ein gemeinsames Polyadenylierungssignal (poly-A) teilen. Aus den 4 ORFs ergeben sich 7 individuelle Proteine. Die subgenomischen 2,4 kb und 2,1 kb Transkripte dienen als mRNAs für das große (L; PräS1/PräS2/S), mittlere (M; PräS2/S) und kleine (S) Hüllprotein (Hepatitis B surface antigen/HBsAg). Das X Protein (HBx) wird von einer 0,7 kb mRNA translatiert; ihm werden wichtige regulatorische Rollen zugesprochen, insbesondere für epigenetische Modifikationen der cccDNA (Lucifora et al., 2011) (Decorsiere et al., 2016). Die Synthese von Core-Protein (C) und Polymerase (P) erfolgt ausgehend von der 3,5 kb langen, terminal redundanten prägenomischen RNA (pgRNA), die auch als Matrize für die reverse

18 Einleitung

Transkription dient. Nahe ihrem 5´-Ende kann die pgRNA eine Haarnadelstruktur (ε) ausbilden, die als Signal zur Verpackung der pgRNA in das Nukleokapsid wirkt und zudem die Initiation der reversen Transkription der pgRNA zur rcDNA durch die Terminale-Protein (TP)-Domäne des P Proteins vermittelt. Im P Protein folgen auf TP, durch eine spacer-Region getrennt, die reverse Transkriptase (RT) und eine RNase H (RH) Domäne (Beck & Nassal, 2007). Das Core-Protein wird zum Aufbau des Nukleokapsids benötigt. Zusätzlich kann von einer 5´-terminal längeren precore-RNA das precore-Protein gebildet werden, das nach Prozessierung als nicht-partikuläres HBeAg sekretiert wird (Ou et al., 1986), das eine wichtige Rolle in der HBV-Diagnostik spielt. Für den viralen Replikationszyklus ist HBeAg nicht essentiell, es weist aber immunregulatorische Funktionen auf. So wurde beschrieben, dass HBeAg das angeborene Immunsystem inhibieren und eine Immunevasion durch die Induktion von T-Zell Toleranz vermitteln kann (Chen et al., 2004).

Abb. 1 Morphologie und Genomorganisation des humanen Hepatitis B Virus (A) Schematischer Aufbau eines infektiösen Dane Partikels. Das ikosaedrische Nukleokapsid besteht aus 90 oder 120 HBc-Dimeren und wird von einer aus der Wirtszelle stammenden Lipidhülle umschlossen. Darin verankert sind die drei Oberflächenproteine (HBs) S, M und L. Im Inneren des Virions befindet sich die Polymerase-gebundene rcDNA; dabei ist die TP-Domäne des P-Proteins über eine Tyrosyl-5´- Phosphodiesterbindung kovalent mit dem 5´ Terminus des (-)-DNA Stranges verknüpft. (B) HBV- Genomorganisation. Im Inneren sind die 4 überlappenden offenen Leseraster (ORFs) als Pfeile dargestellt. Die äußeren, dünnen Linien zeigen die entsprechenden Transkripte mit dem Polyadenylierungssignal (poly-A). Das längste Transkript repräsentiert die pgRNA mit der ε-Haarnadelstruktur, die als Verpackungssignal und zur Initiation der reversen Transkription dient. Die dickeren Linien stellen den vollständigen (-)-DNA-Strang (blau) sowie den unvollständigen (+)-Strang (grau) mit dem 5´-terminalen RNA-Primer (Zickzack-Linie) dar. Weiterhin aufgezeigt sind die direkten Wiederholungssequenzen 1 und 2 (direct repeats, DR) und die Enhancer, EnhI und EnhII. Die vier Blockpfeile symbolisieren die internen Promotoren. Die Abb. wurde nach (Nassal, 2015) modifiziert.

19 Einleitung

1.3. Der Infektionszyklus des HBV

Der initiale Kontakt zwischen HB Virion und Hepatozyte erfolgt an Heparansulfat Proteoglykanen (HSPG) auf der Zelloberfläche, vermittelt durch die antigene Schleife (antigenic loop, AGL) des SHBs (Sureau & Salisse, 2013). Der Viruseintritt wird über die hochaffine Bindung der myristoylierten PräS1-Region des LHBs an den Eintrittrezeptors Na+/Taurocholat Kotransporter (sodium-taurocholate co-transporting polypeptide, NTCP) induziert. NTCP befindet sich überwiegend auf der basolateralen (zum Blut zeigenden) Oberfläche humaner Hepatozyten (Yan et al., 2012) (Ni et al., 2014). Zudem sind an der rezeptorvermittelten Aufnahme viraler Partikel wahrscheinlich weitere Wirts-Faktoren beteiligt, z.B. Glypican 5 (Verrier et al., 2016). Eine Übersicht des HBV-Infektionszyklus ist in Abb. 2 dargestellt. Im Laufe der Internalisierung über Endozytose wird das Nukleokapsid ins Zytoplasma freigesetzt. Vermittelt durch mikrotubulären Transport gelangt das Kapsid mithilfe von Kernlokalisierungssequenzen (nuclear localisation sequence, NLS) des HBc und Importinen an die Kernpore. Dort kommt es zur Dissoziation der Kapsidschale und damit zur Freisetzung der rcDNA (Rabe et al., 2006) (Schmitz et al., 2010) (Gallucci & Kann, 2017).

Im Kern wird die rcDNA über mehrere Schritte in cccDNA konvertiert (s. Abschnitt 1.4). Diese DNA-Moleküle persistieren episomal als Minichromosom im Kern und dienen der zellulären Polymerase II als Matrize zur Transkription aller viralen RNAs. Die Translation der viralen Antigene erfolgt im Zytoplasma, wobei die Hüllproteine HBs am endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und in die Lipidschicht integriert werden (Huovila et al. 1992). Von dort werden sie entweder als subvirale, leere Partikel (SVP) aus der Zelle sekretiert oder zur Umhüllung von sogenannten reifen Kapsiden verwendet, was der Bildung neuer infektiöser Virionen entspricht. Als "reif" werden Kapside bezeichnet, in deren Innerem die initial verpackte pgRNA durch die P Protein-vermittelte reverse Transkription in rcDNA vollständig abgelaufen ist (Summers & Mason, 1982). Zunächst wird die pgRNA in den (-)- DNA-Strang umgeschrieben, wobei die pgRNA Matrize bis auf das 5´-terminale RNA- Oligomer abgebaut wird; das Produkt ist daher im Wesentlichen eine einzelsträngige (single stranded) ssDNA. Das von der pgRNA verbliebene RNA Oligomer dient dann als primer für die Synthese des komplementären (+)-DNA-Strangs, wodurch letztlich neue rcDNA entsteht. Diese wir insbesondere in der frühen Phase der Infektion verstärkt in den Zellkern rück- transportiert (recycling), was die Bildung eines Pools an cccDNA-Molekülen zur Folge hat (Summers et al., 1990). Neben rcDNA entstehen zu etwa 10% auch doppelsträngig-lineare (double stranded-linear) dlDNAs. Im Zellkern werden sie über den DNA-

20 Einleitung

Reparaturmechanismus der Nicht-homologen End-Verknüpfung (Nonhomologous End Joining, NHEJ) (s. Abschnitt 1.7.2) in meist fehlerhafte, nicht-funktionale cccDNAs umgewandelt oder in das Genom der infizierten Zelle integriert (Staprans et al., 1991) (Tu & Urban, 2018) (Caballero et al., 2018). Sind ausreichend viele Hüllproteine vorhanden, werden die reifen Kapside umhüllt und über den zellulären Sekretionsweg über das Multivesikuläre Kompartiment (multivesicular body, MVB) aus der Zelle sezerniert (Lambert et al., 2007) (Watanabe et al., 2007).

Mit Ausnahme weniger human-HBV-spezifischer Komponenten, wie dem Rezeptor NTCP oder dem Transaktivator HBx, trifft der in Abb. 2 gezeigte Infektionszyklus für alle derzeit bekannten Hepadnaviren zu. Auch nach transienter Transfektion von humanen Hepatomzelllinien wie HepG2 oder Huh7 mit HBV-Expressionsvektoren wird in den Zellen der vollständige Replikationszyklus induziert. Hierbei dient zunächst der eingebrachte Plasmidvektor als Matrize zur Synthese der viralen RNAs und der davon translatierten Virusproteine. In der Folge kann dann durch intrazelluläres Recycling neuentstandener, reifer Kapside in den Zellkern die persistente cccDNA-Form gebildet werden. In mit HBV transfizierten humanen Hepatomzellen ist dieser Prozess allerdings sehr ineffizient, während DHBV rcDNA in denselben Zellen bis zu 25-fach mehr cccDNA liefert (Köck et al. 2010).

Abb. 2 Schematische Darstellung des HBV-Infektionszyklus Die einzelnen Schritte sind mit (a) bis (m) benannt. (a) NTCP-Rezeptor vermittelter Eintritt von HBV in eine Hepatozyte. (b) Freisetzung des Nukleokapsids in das Zytoplasma. (c) HBc-abhängiger Transport in den 21 Einleitung

Nukleus und Freisetzung der P-gebundenen rcDNA. (d) Konversion der rcDNA in cccDNA. (e, f und g) Transkription, Kern-Export sowie Translation viraler RNAs. (h) HBx wirkt als Transaktivator und verhindert eine transkriptionelle Stilllegung der cccDNA. (i) ε-abhängige Verpackung von pgRNA und P Protein in neu entstehende Nukleokapside. Dieser Vorgang wird von zellulären Chaperonen unterstützt. (j) ε-abhängige reverse Transkription. Zunächst wird der (-)-DNA-Strang gebildet und dabei die pgRNA abgebaut. Die resultierende einzelsträngige (ss)DNA dient als Matrize für den (+)-DNA-Strang und die rcDNA-Bildung. (k) Umhüllung der reifen Kapside. (l) Sekretion infektiöser Virionen aus der Zelle, vermittelt durch Multivesikuläre Kompartimente (multivesicular bodies, MVB). (m) Sekretion von HBeAg und Subviralen Partikeln (SVP). Ein vollständiger Replikationszyklus kann Infektions-unabhängig durch transiente Transfektion eines HBV-Expressionsplasmids induziert werden. HSPG: Heparansulfat Proteoglykane vermitteln die Adhäsion von Virus und Zellmembran. L, M und S bezeichnen das große, mittlere und kleine Hüllprotein (HBs). Die Abb. wurde nach (Nassal, 2015) modifiziert.

1.4. Die Konversion der rcDNA zur cccDNA

Anders als das humane Genom wird die cccDNA nicht durch semikonservative Replikation amplifiziert, sondern durch Umwandlung der aus der P-Protein vermittelten reversen Transkription der pgRNA hervorgegangenen rcDNA im Zellkern (Abb. 3) (Tuttleman et al., 1986) (Summers et al., 1990). Aus den charakteristischen strukturellen Unterschieden zwischen rc- und cccDNA lassen sich mehrere Einzelschritte vorhersagen, die für diese Konversion notwendig sind. Dazu gehört die Entfernung der Polymerase und der terminalen Redundanz (r) am 5´-Ende des (-)-Strangs sowie die Abspaltung des RNA-primers am 5´- Ende des (+) -DNA-Strangs. Nach Vervollständigung des (+)-Strangs muss für die cccDNA- Bildung eine Ligation beider DNA-Stränge erfolgen (Abb. 3). In den letzten Jahren wurden mehrere zelluläre Proteine identifiziert, denen eine mögliche Rolle bei der Entstehung der cccDNA zukommt (Schreiner & Nassal, 2017) (Gomez-Moreno & Garaigorta, 2017). Als einer der ersten Faktoren wurde 2014 die humane Tyrosyl-DNA-phoshodiesterase-2 (Tdp2) als Wirtsenzym beschrieben, welches das über eine Phosphotyrosyl-Bindung kovalent mit dem 5´-Terminus der (-)-Strang DNA verknüpfte P Protein abspalten kann (Königer et al., 2014). Tdp2 ist ein zelluläres Reparaturenzym, das kovalente Topoisomerase (TOP)-DNA Komplexe spaltet; diese entstehen mitunter bei der eigentlich reversiblen DNA-Strangbruch- Aktivität von Topoisomerasen zur Regulation des "supercoiling" in DNA. Unrepariert würden diese Komplexe mit Replikation und Transkription interferieren. In humanen Hepatomzellen führte die stabile Unterdrückung der Tdp2-Expression durch RNA-Interferenz (RNAi) nach Transfektion mit DHBV zu einer signifikanten Verlangsamung der rcDNA zu cccDNA Konversion, allerdings nicht zur kompletten Inhibition (Königer et al., 2014). Dagegen wurde ein solcher Effekt für humanes HBV im HepG2-NTCP-Infektionssystem nicht beobachtet (Cui et al., 2015). Eine wahrscheinliche Erklärung liegt in der ausgeprägten Redundanz der zellulären DNA-Reparaturmaschinerie, sodass die Deproteinisierungsreaktion

22 Einleitung der rcDNA möglicherweise auch Tdp2-unabhängig über Endonuklease-vermittelte Reaktionen stattfinden kann (Königer et al., 2014) (Cui et al., 2015). Die Abspaltung der Polymerase führt zur Entstehung eines Proteinfreien-(PF)-rcDNA-Intermediats, das fast ausschließlich einen vervollständigten (+)-Strang enthält und primär im Nukleus der Hepatomzelle vorliegt (Gao & Hu, 2007) (Guo et al., 2007). Das Cap-modifizierte RNA Oligomer am 5´-Ende des (+)-DNA-Strangs sowie die 9-10 nt-lange, einzelsträngige terminale Redundanz-(r)-Struktur am 5´-Ende des (-)-Strangs (Abb. 3) können durch die flap- Struktur-spezifische Endonuklease 1 (FEN 1) entfernt werden, eventuell zusammen mit dem P Protein (Kitamura et al., 2018). FEN1 spaltet in der Zelle spezifisch 5´-flap-Strukturen, die aus einzelsträngigen DNA-Oligomeren bestehen (Henneke et al., 2003). Sie entstehen beispielsweise nach Verdrängung der Okazaki-Fragmente während der Replikation. Darüber hinaus könnten weitere Endonukleasen (z.B. XPG) oder Exonukleasen (z.B. Exo1, XRCC1) an der Degradation des RNA-primers sowie der Abspaltung der r-Struktur beteiligt sein (Seeger & Mason, 2015) (Kitamura et al., 2018). Da Topoisomerase (TOP1- und TOP2) - Inhibitoren die cccDNA Bildung reduzieren, spielen auch diese Enzyme höchstwahrscheinlich eine Rolle in der cccDNA Biogenese. Sie regulieren die Topologie doppelsträngiger DNA, indem sie superhelicale Strukturen auflösen. TOP1 und TOP2 könnten auf diese Weise an unterschiedlichen Schritten der cccDNA Synthese beteiligt sein (Sheraz et al., 2019). Für das Auffüllen des (+)-Strangs wurde mittels RNAi-Experimenten der zellulären Polymerase κ (POLK) eine Rolle zugesprochen, wobei daran auch weitere wirtseigene Polymerasen wie Polymerase λ (POLL) und η (POLH) beteiligt sein könnten (Qi et al., 2016). Interessanterweise wird dieser Schritt bei der cccDNA Amplifikation durch intrazelluläres Recycling laut einer anderen Studie vorwiegend von Polymerase α (POLA) katalysiert (Tang et al., 2019). Die finale Ligation der beiden DNA-Stränge zur cccDNA kann von den endogenen DNA-Ligasen (LIG) 1 und 3 vermittelt werden (Long et al., 2017). Im Nukleus infizierter Zellen konnte ein rcDNA-Intermediat, bestehend aus einem kovalent geschlossenen (-)-Strang, aber offenem (+)-Strang beobachtet werden. Demnach würde die Ligation des (-)-Strangs vor der vollständigen Prozessierung des (+)-Strangs stattfinden (Luo et al., 2017).

Auch dlDNA-Moleküle können in eine cccDNA-Form überführt werden, wobei typische Komponenten des NEHJ DNA-Reparaturweges (s. Abschnitt 1.7.2) wie Ku80 und DNA Ligase IV daran beteiligt sind (Guo et al. 2012) (Long et al., 2017). Der NEHJ-Mechanismus führt meist zu fehlerhaften cccDNA-Molekülen mit Insertionen oder Deletionen, die keine vollständige Replikation des viralen Genoms unterstützen. 23 Einleitung

Trotz der zahlreichen Wirtsfaktoren, die bei der Konversion von rcDNA in cccDNA beteiligt sind oder sein könnten, gibt es noch viele Wissenslücken. Die zeitliche Reihenfolge der genannten Modifikationen ist unklar, ebenso repräsentieren die beschriebenen Faktoren wahrscheinlich nur einen kleinen Ausschnitt der an der hepadnaviralen cccDNA-Bildung beteiligten Wirtskomponenten. Diese gehören bislang alle zur zellulären DNA- Schadensantwort (DNA damage response, DDR; s. Abschnitt 1.7), die wegen der elementaren Bedeutung der chromosomalen DNA-Integrität über viele funktionell redundante Reparatur- Mechanismen verfügt (Schreiner & Nassal, 2017) (Gomez-Moreno & Garaigorta, 2017) (Mohd-Ismail et al., 2019). Es ist daher wahrscheinlich, dass diverse weitere DNA- Reparaturfaktoren an der Etablierung der hepadnaviralen cccDNA beteiligt sind.

Abb. 3 Konversion der rc- zur cccDNA Die Transformation von rcDNA in die persistente cccDNA Formerfolgt in mehreren Schritten (Blockpfeile). Die Abspaltung des über eine Tyrosyl-Phosphodiesterbindung verknüpften P Proteins durch Tdp2 und/oder nukleolytische Mechanismen führt zu einer Protein-freien (PF)-rcDNA (Guo et al. 2007) (Königer et al., 2014) (Cui et al., 2015). Die Entfernung des Cap-RNA-Oligomers (primer) (rot) sowie der terminalen Redundanz r könnte durch die Endonuklease Fen1 vermittelt werden (Kitamura et al., 2018), das Auffüllen des unvollständigen 3´-Ende des (+)-Strangs durch zellulären Polymerasen wie POLK, POLL, POLH und POLA (Qi et al., 2016) (Tang et al., 2019). Die finale Ligation der DNA-Stränge erfolgt wahrscheinlich durch die zellulären Ligasen 1 und 3 (Q. Long et al., 2017). Die charakteristische Struktur der rcDNA sowie die Intermediate während der rc- zu cccDNA Transformation weisen Merkmale beschädigter DNA auf, die eine Induktion der zellulären DNA-Schadensantwort (DNA-damage response, DDR) zur Folge haben sollten. Dies deutet auf eine essentielle Beteiligung von Komponenten der DDR an der rc- zu cccDNA Konversion hin. Die Abb. wurde nach (Nassal, 2015) modifiziert.

1.5. Die kovalent geschlossene zirkuläre DNA (cccDNA)

Nach Konversion der rc- zur cccDNA persistiert das HBV-Genom im Nukleus infizierter Hepatozyten und dient als Matrize zur Synthese aller viralen Transkripte und damit auch neuer Viren. Das cccDNA-Molekül wird, ähnlich der zellulären DNA, mit den Histonen H3, H2A, H2B und H4 in eine Chromosom-ähnliche Struktur (Nukleochromosom) verpackt

24 Einleitung

(Bock et al., 1994) (Bock et al., 2001). In humanen Zellen besteht ein Nukleosom aus einem Histon-Oktamer aus je zwei H2A, H2B, H3 und H4-Histonmolekülen, das mit H1 und H5 an der DNA fixiert wird (Luger et al., 1997). Je nach Häufung der Nukleosomen ist die cccDNA mehr oder weniger transkriptionell aktiv (Newbold et al., 1995). Durch epigenetische Modifikationen wie Acetylierung oder Methylierung der Histone wird die virale Expression reguliert (Hong et al., 2017). So beeinflusst die Acetylierung von H3 und H4 die HBV- Replikation positiv, wohingegen eine Hypoacetylierung die cccDNA-abhängige Transkription inhibiert (Pollicino et al., 2006) (Belloni et al., 2012). Des Weiteren lassen sich mit der cccDNA assoziierte virale Komponenten wie HBx und Core-Protein nachweisen. Core beeinflusst die nukleosomale Struktur des HBV-Genoms und könnte die virale Transkription regulieren, beispielsweise durch Rekrutierung von CBP (CREB-binding protein), einer Histonacetyltransferase (HAT) (Guo et al., 2011). HBx ist für die Initiation der cccDNA- Transkription essentiell, vermutlich ebenfalls durch die Rekrutierung von HATs (PCAF/GCN5, CPB) sowie Histon-Deacetylasen (HDAC) (Belloni et al., 2009) (Lucifora et al., 2011) (Riviere et al., 2015). Die Homöostase des viralen Minichromosoms wird durch eine Vielzahl zellulärer Faktoren reguliert. Einige unterstützen die Aktivierung der viralen Transkription und tragen damit indirekt zur Etablierung eines cccDNA-Herds bei (u. a. HAT, HDAC, TBP (TATA-bindung-protein), HNF1, 3, 4 (hepatocyte nuclear factor 1, 3 und 4, AP-1 (activation protein 1), NF1 (nuclear factor), CREB (cAMP response element binding protein), C/EBP (CCAAT-enhancer-bind-protein) (Mohd-Ismail et al., 2019). Andere Wirtsfaktoren wirken hingegen negativ auf die Etablierung der HBV-Infektion. Ein gut untersuchtes Beispiel ist der structural maintenance of chromosomes (Smc5/6) -Komplex, der zur Aufrechterhaltung der zellulären Chromosomstruktur benötigt wird, aber die transkriptionelle Stilllegung von episomalen templates inklusive cccDNA induziert. Das HBx wirkt dem entgegen, indem es über die Bindung von DDB1 (damage DNA binding protein 1) die Rekrutierung von Smc5/6 an einen Cullin 4 (Cul4) basierten E3-Ubiquitin-Ligase Komplex vermittelt und so die proteasomale Degradation einleitet (Decorsiere et al., 2016). Auch APOBEC3A und 3B (apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like 3A und 3B) wirken als HBV-inhibierende Restriktionsfaktoren. Beide Cytidin-Deaminasen führen über Deaminierung zur cccDNA-Hypereditierung und könnten so zu ihrer Degradation beitragen; ein Anteil der cccDNA-Moleküle ist aber Editierungs-resistent. Dieser Mechanismus kann ebenfalls durch HBx kompensiert werden (Lucifora et al., 2014) (Gao et al., 2017).

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Über die Lebensdauer individueller cccDNA Moleküle und ihr Schicksal bei Zellteilung ist wenig bekannt. Da kein aktiver Mechanismus zur Weitergabe des persistierenden HBV- Genoms während der Mitose bekannt ist, sollten die cccDNA-Moleküle zufällig auf die Tochterzellen verteilt werden. Entscheidend wäre dann, ob dies nur zu einer Verdünnung der cccDNA-Kopien pro Zelle führt, oder ob, z.B. mangels Kernimport-Funktion, alle oder ein Teil der weitergegebenen cccDNA-Moleküle außerhalb des neugebildeten Zellkerns verbleiben, wo sie nicht mehr produktiv zur Virusreplikation beitragen können (Nassal, 2018). Tatsächlich führt Zellproliferation zur cccDNA Verdünnung (Allweiss & Dandri, 2017), in sich nicht-teilenden humanen Hepatozyten verbleibt das virale Minichromosom dagegen stabil über die gesamte Lebensdauer der Zelle bestehen. Ob sich eine ausreichend hohe Zellproliferation ohne entsprechende Nebenwirkungen therapeutisch nutzen lässt, ist aber unklar. Zudem wurde geschätzt, dass eine geringe cccDNA-Anzahl von etwa 1,5 Kopien pro Zelle zur Aufrechterhaltung einer chronischen Infektion ausreicht (Laras et al., 2006). Diese Beobachtungen verdeutlichen die Herausforderung einer Eliminierung der cccDNA, entweder durch direkten Abbau oder Destabilisierung, was mit bisherigen Therapieansätzen nicht erzielt werden kann (Allweiss & Dandri, 2017). Hierfür müsste vor allem geklärt werden, ob die lange Lebensdauer des cccDNA-Pools auf die Langlebigkeit einzelner cccDNA-Moleküle oder auf Neusynthese zurückgeht, entweder intrazellulär oder über Re- Infektion.

1.6. Das Enten-Hepatitis B Virus (DHBV) als Modellsystem für HBV

Aufgrund der Einschränkungen beim Arbeiten mit HBV, inklusive des engen, auf Menschen und Menschenaffen begrenzten Wirtsbereichs, wurde ein Großteil des heutigen Wissens über die hepadnavirale Replikation mittels Tiermodellen gewonnen, insbesondere durch das DHBV (Mason et al., 1980). Im Gegensatz zu HBV bietet DHBV die gesamte Bandbreite von in vitro bis zu in vivo Modellen (aviäre Hepatozyten, Pekingente als Tiermodel) zur Untersuchung des vollständigen hepadnaviralen Infektionszyklus (Schultz et al., 2004) (Mason 2015). Im Entenmodell gelang der erste Nachweis, dass die cccDNA durch reverse Transkription aus der pgRNA entsteht (Summers & Mason, 1982). Weitere fundamentale Entdeckungen sind die Initiation der reversen Transkription durch Protein-priming (Wang & Seeger, 1992), wirtsspezifische Determinanten der Infektion (Ishikawa & Ganem, 1995) (Urban & Gripon, 2002) (Dallmeier et al., 2008) sowie potenzielle Rezeptoren (Breiner et al., 1998) (Urban et al., 1998). Auch die Etablierung eines persistierenden cccDNA-Pools durch nukleären Rücktransport neu synthetisierter rcDNA-Moleküle wurde mit DHBV gezeigt.

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Durch diesen intrazellulären Recycling-Mechanismus entstehen bis zu 50 Kopien cccDNA pro Zellkern (Tuttleman et al. 1986). Die Hemmung der Hüllproteinsynthese unterbindet den viralen Export aus der Zelle und begünstigt den Transport von reifen Nukleokapsiden in den Nukleus. So lässt sich die Anzahl an cccDNA-Molekülen pro Zelle auf mehrere 100 steigern (Summers et al., 1990) (Guo et al. 2007). Dieser Effekt zeigt sich nicht nur in aviären (LMH), sondern auch in humanen Hepatozyten (HepG2) (Köck et al. 2010). Die enorme Anreicherung an cccDNA-Molekülen im DHBV-System macht das Entenvirus auch zu einem besonders attraktiven Model für die Untersuchung der rc- zu cccDNA Konversion. Die wesentlich höheren Mengen an DHBV cccDNA, auch in humanen Hepatomzellen (Köck et al. 2010), ermöglichen den spezifischen Nachweis dieser DNA-Form per Southern Blot (SB). Im HBV-System ist der SB-Nachweis der cccDNA aufgrund der geringen Kopienanzahl schwierig; auch die Deletion von Hüllproteinen führt nicht wie bei DHBV zur Anreicherung von cccDNA, sondern zu einer Akkumulation von rcDNA-Molekülen im Zellkern (Köck et al. 2010) (Lentz & Loeb, 2011). Quantitative PCR (qPCR) Techniken wären grundsätzlich viel sensitiver als der SB, leiden aber an mangelnder Spezifität bei der Unterscheidung der cccDNA von den anderen Formen der Virus-DNA. Ohne zusätzliche Absicherung per SB sind daher viele nur auf konventioneller "cccDNA-spezifischer PCR" basierende Angaben zu cccDNA Mengen nicht verlässlich (Nassal, 2015) (Li et al. 2017). In den letzten Jahren gibt es daher internationale Bemühungen zur Etablierung wirklich cccDNA-spezifischer qPCR (Lucifora et al., 2017) (Huang et al., 2018) (Qu et al., 2018) (Caviglia et al., 2018) (Jiang et al., 2019).

Ebenfalls basierend auf dem DHBV-System gelangen die ersten Nachweise über die Beteiligung von DNA-Reparaturfaktoren am cccDNA-Metabolismus, wie etwa der Entfernung der viralen Polymerase durch Tdp2 (Königer et al., 2014), Ligation der rcDNA- Enden zu authentischer cccDNA durch LIG1 und LIG3 (Long et al., 2017) und der (meist unproduktiven) Zirkularisierung von dlDNA-Molekülen mittels Ku80 und LIG4 (Guo et al. 2012). Auch in dieser Arbeit wird das DHBV Modell in HepG2 Zellen zur Untersuchung der cccDNA Biogenese verwendet. Zu beachten ist allerdings, dass DHBV und HBV trotz fundamentaler Gemeinsamkeiten in Struktur, Genomorganisation und Replikationszyklus molekularvirologische Unterschiede aufweisen, die eine direkte Übertragung vom einen auf das andere Virussystem beeinträchtigen können (Ortega-Prieto et al., 2019).

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1.7. Die zelluläre DNA-Schadensantwort (DDR)

Das zelluläre Genom ist einer Vielzahl von Einflüssen ausgesetzt, die das Erbgut schädigen können, zum einen durch endogene Prozesse (Replikation, Transkription) zum anderen durch exogene Faktoren (Chemikalien, UV- und radioaktive Strahlung). Es wird angenommen, dass pro Tag und Zelle etwa 10.000 endogen verursachte DNA-Schäden auftreten (Lindahl & Barnes, 2000). Die Integrität und Stabilität des Chromosoms werden durch die DNA-DDR überwacht. Dies ist ein komplexes Signalnetzwerk, bestehend aus über 200 Proteinen, die entsprechend ihrer spezifischen Funktion in Sensor-, Transduktor-, Mediator- und Effektor- Proteine kategorisiert werden (Andres-Leon et al., 2016). Zellen verfügen über fünf grundsätzliche Reparaturmechanismen. Kleine und lokale Läsionen, wie fehlende oder modifizierte DNA-Basen werden durch Base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER) oder mismatch repair (MMR) korrigiert (Wallace, 2014) (Marteijn et al., 2014) (Li, 2014). Einzelstrang- (single strand breaks, SSB) sowie Doppelstrangbrüche (double- strand breaks, DSB) werden entweder über Homologe Rekombination (HR) oder NHEJ repariert, auf die im Folgenden näher eingegangen wird (s. Abschnitt 1.7.1, 1.7.2 und 1.7.3). Gelegentlich kann ein DSB fälschlicherweise als Telomer erkannt und durch die sogenannte de novo telomer addition (DNTA) repariert werden. Dabei werden in der Regel terminale Deletionen erzeugt (Ribeyre & Shore, 2013). Wird ein DNA-Strangbruch von homologen Wiederholungen flankiert, kann eine Reparatur über Einzelstrang-Verknüpfung (single strand annealing, SSA) erfolgen, wobei die Sequenz zwischen den Homologien verloren geht (Bhargava et al., 2016). Im Normalfall bestimmt, abhängig von der Art des DNA- Strangbruchs, eine der drei PI3K-verwandten (phosphatidylinositol 3-like-kinase) Kinasen ATM (ataxia telangiectasia mutated), ATR (ATM and rad3-related) oder DNA-PK (DNA- dependent protein kinase) den weiteren Reparaturweg. Dabei spielt ATR eine hauptsächliche Rolle bei SSBs, während ATM und DNA-PK bevorzugt durch DSB aktiviert werden (Lee & Paull, 2005) (Cimprich & Cortez, 2008) (Davis et al., 2014). Diese Serin-/Threonin- Transduktor-Kinasen leiten das Schadenssignal an Mediatoren und Effektorproteine weiter, um eine entsprechende DNA-Schadensantwort zu induzieren. Je nach Ausmaß des Schadens resultiert dies in Fortsetzung der DNA-Replikation, Zell-Zyklus-Kontrolle (cell-cycle checkpoint control) durch Aktivierung der Kinasen Chk1 oder Chk2, DNA-Reparatur oder Zelltod (via p53). Die Erkennung „beschädigter“ DNA-Bereiche durch DDR-Sensorproteine wie MRN und Ku70 (s. Abschnitt 1.7.1 und 1.7.2) induziert zudem über die STING/cGAS- Signalkaskade eine Typ-I Interferon (IFN)-Antwort. Somit spielt die zellulären DDR auch eine Rolle bei der angeborenen Immunantwort (Mukherjee et al., 2019). 28 Einleitung

1.7.1. Mechanismus der Homologen Rekombination (HR) Bei der HR nach DSB dient das Schwesterchromatid als Reparaturvorlage. Dies gewährleistet eine fehlerfreie Beseitigung der DNA-Läsion, setzt allerdings eine vorherige Replikation der Chromosomen voraus und ist demnach beschränkt auf die Synthese (S)- und G2-Phase des Zellzyklus (Hustedt & Durocher, 2016). Zunächst wird der DSB von dem trimeren MRN- Komplex aus der Endonuklease Mre11, der ATPase Rad50 und dem gerüstformenden Protein Nbs1 erkannt, der die Rekrutierung und Aktivierung von ATM vermittelt (Petrini & Stracker, 2003) (Falck et al., 2005). Anschließend phosphoryliert die Kinase eine Vielzahl von Mediator- und Effektormolekülen, darunter Chk2 und die Histon-Variante H2AX. Dies führt zur Anreicherung des resultierenden γH2AX an der Stelle des DSB und ermöglicht die Bindung von MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1), das als Gerüst für die Akkumulation großer Proteinkomplexe dient (Lou et al., 2006). So werden die Ubiquitinligasen RNF8 und RNF168 an die Reparaturstelle rekrutiert, die wiederum die Bindung von 53BP1 und BRCA1 erleichtern (Stewart et al., 2009). Während der HR werden durch die Endonukleaseaktivitäten von Mre11 und CtIP an den DNA-Enden ssDNA-Bereiche mit freien 3´-Termini generiert (Symington & Gautier, 2011) (Abb. 4). Sie werden durch die Anlagerung von Replication Protein-A (RPA)-Einheiten (RPA1, 2 und 3) vor weiterer Prozessierung durch diverse Nukleasen geschützt (Präsynapse). Gleichzeitig verhindert das Anlagern von RPA die Bildung von Sekundärstrukturen und gewährleistet damit einen reibungslosen Ablauf der DSB-Reparatur. Alle folgenden Schritte sind in der Beschriftung zur Abb. 4 genauer erläutert. Zusammenfassend erfolgt zunächst die Positionierung der homologen Sequenz des Schwesterchromatids an die entsprechende Reparaturstelle (Synapse), dessen anschließende Stranginvasion die Formung einer transienten Dislokalisatinos-Schleife (displacement-, D-loop) zur Folge hat. Diese Struktur (Postsynapse) wird anschließend entweder durch einen syntheseabhängigen Strang-Verknüpfungs- Mechanismus (synthesis-dependent strand annealing, SDSA) oder nach Ausbildung einer sogenannten doppelten Holiday Junction (dHJ)-Struktur (double-strand-break-repair, DSBR) vollendet. Die Strangsynthese erfolgt von DNA-Polymerasen (POLG und POLH) unter Verwendung der entsprechenden, homologen Chromatin-Matrize (Hollingworth & Grand, 2015) (Andriuskevicius et al., 2018).

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Abb. 4 Übersicht des HR-Mechanismus Ein DNA-Doppelstrangbruch (DSB) wird vom Sensor-Komplex MRN erkannt. Dies aktiviert die Transduktor- Kinase ATM, welche die Histonvariante H2AX zu γH2AX phosphoryliert (roter Punkt). Diese Signalkette ermöglicht die Akkumulation von MDC1 mit Anreicherung weiterer Effektormoleküle wie 53BP1, BRC1 sowie den Ubiquitinligasen RNF8 und RNF168. Für die HR-Reparatur des DSB erzeugt zunächst die Endonuklease Mre11 als Teil des MRN-Komplexes mit Hilfe von CtIP einzelsträngige DNA-Bereiche (ssDNA) mit freien 3´- Enden. Die Anlagerung von RPA-Einheiten schützt die ssDNA vor weiteren Nukleasen (Präsynapse). Rad51, eine Rekombinase, Rad52 und BRCA2 verdrängen RPA, um die Strang-Invasion der Reparaturmatrize des Schwesterchromatids mit Hilfe von Rad54 zu ermöglichen (Synapse). Die Strangverdrängung auf dem intakten Schwesterchromatid durch den zu reparierenden Einzelstrang erzeugt eine D (displacement)-Loop Struktur, die letztlich durch SDSA (synthesis-dependent strand annealing) oder DSBR (double-strand break repair) aufgelöst wird (Postsynapse). Während des SDSA wird der zu reparierende Einzelstrang durch DNA-Polymerasen verlängert und anschließend disloziert, um unter Beteiligung der Helikase RTEL an den zweiten zu reparierenden Einzelstrang zu binden. Im Laufe des DSBR-Mechanismus wird der eingedrungene Einzelstrang wie auch das zweite ssDNA-Ende zunächst durch DNA-Polymerasen verlängert. Der aufgefüllte, invadierende Strang bindet anschließend das freie Strangende auf dem zu reparierenden DNA-Strang, was zur Ausbildung einer doppelten Holiday-Junction (dHJ)-Struktur führt. Mit Hilfe von Endonukleasen wie Mus81/Eme1 und SLX1/SLX4 sowie der Resolvase GEN1 wird die dHJ-Struktur aufgelöst. Gepunktete Linien repräsentieren neu synthetisierte DNA, rote Linien das intakte Schwesterchromatid, blaue Linien die zu reparierende DNA. Die Abb. wurde nach (Hollingworth & Grand, 2015) und (Andriuskevicius et al., 2018) modifiziert.

1.7.2. Mechanismus des Non-Homologous End Joining (NHEJ) Im Gegensatz zur HR erfolgt die Wiederherstellung eines DSB durch NHEJ ohne Korrekturvorlage und ist somit fehlerbehaftet. Dies ist der dominierende Reparatur- mechanismus während des größten Teils des Zellzyklus, wo keine Matrize für HR vorliegt. Zunächst wird die Bruchstelle von dem Heterodimer Ku70/Ku80 im Falle des klassischen (classic, c)-NHEJ, oder von Poly-(ADP-Ribose) -Polymerase 1 (PARP1) während des alternativen (alt)-NHEJ detektiert. Diese induzieren die Aktivierung der DNA-PK und im Folgenden den MRN-Komplex (Uematsu et al., 2007) (Davis et al. 2014). Zur DSB- Reparatur werden anschließend die Endonuklease Artemis, die Polynukleotidkinase/ Phosphatase (PNKP) sowie die DNA-Polymerasen γ und λ rekrutiert. Sie vermitteln den

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Einbau fehlender Nukleotide, wobei oft Insertionen oder Deletionen (Indels) von variabler Länge an der Bruchstelle entstehen (Blanca et al., 2004) (Hollingworth & Grand, 2015). Im finalen Schritt vermitteln LIG4 zusammen mit XRCC4 (c-NHEJ), oder LIG1 und 3 (alt- NHEJ) die Verknüpfung der DNA-Enden. Aufgrund der beteiligten Faktoren ist die Zirkularisierung von HBV dlDNA (s. Abschnitt 1.5) dem c-NHEJ Weg zuzuordnen. Gelegentlich kann es durch NHEJ auch zu großen Chromosomumlagerungen kommen, wenn DNA-Enden von verschiedenen Brüchen oder Ligationen fälschlicherweise verbunden werden (Ghezraoui et al., 2014).

1.7.3. Mechanismus der Einzelstrang-Bruch (SSB)-Reparatur Fehlerhafte Replikationsabschnitte, aber auch die Resektion von DSB können zu ssDNA- Abschnitten führen, die zunächst zur Stabilisierung von RPA-Proteinen gebunden werden. Zusammen mit ATRIP vermittelt die Anhäufung von RPA die Rekrutierung von ATR. Nach Erkennung eines SSB durch Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1) wird die Transduktor Kinase mit Hilfe von TOPBP1 aktiviert, was zu einer Verlangsamung des Zellzyklus durch Phosphorylierung von Chk1 führt und die SSB-Reparatur ermöglicht. PARP1 vermittelt dann die Rekrutierung von XRCC1, das als Gerüst zur Akkumulation weiterer Faktoren wie Polynukleotidkinase/Phosphatase (PNKP), Aprataxin und Polymerase β dient. Zusammen mit der AP-Endonuklease 1 (AP-E1) modifiziert PNKP die ssDNA- Bruchstelle am 3´-Ende, wohingegen ssDNA-Abschnitte mit einem 5´-Terminus Substrate für die DNA-Polymerase β sind. Fehlende Nukleotide werden im Folgenden von den DNA- Polymerasen β, δ und ε eingebaut, wobei weitere Proteine wie XRCC1, PARP1, FEN-1 und PCNA (proliferating cell nuclear antigen) an der Lückenfüllung beteiligt sind. Im finalen Schritt wird die Strangligation von der LIG 1 oder 3 vermittelt (K W Caldecott et al., 1996) (Keith W Caldecott, 2008) (Hollingworth & Grand, 2015).

1.8. Interaktion von Viren mit der zellulären DDR

Viren mit einer nuklären Phase, aber auch einige RNA Viren interagieren im Verlauf ihrer Replikation mit der zellulären DNA-Schadensantwort (Gomez-Moreno & Garaigorta, 2017). Diese Wechselwirkungen können einzelne DDR-Wege aktivieren sowie spezifische Proteine an die Stelle der viralen Replikation rekrutieren, um die zelluläre Schadensantwort für die eigene Vermehrung auszunutzen. Andererseits verhindern manche Viren durch eine gezielte Inhibierung von DDR-Mechanismen eine DDR-vermittelte Repression des viralen Infektionszyklus (Hollingworth & Grand, 2015). Virale Stimulatoren einer DNA-

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Schadensantwort sind zum einen ungewöhnliche Genomstrukturen sowie replikative Intermediate. Beispiele sind das lineare ssDNA-Genom von Parvoviren, lineare dsDNA Moleküle von Adeno- und Herpesviren, zirkuläre dsDNA-Genome von Polyoma- und humanen Papillomaviren (HPV) ebenso wie RNA-Genome von Retroviren, die zu dlDNA- Molekülen revers transkribiert werden (Weitzman & Weitzman, 2014) (Luftig, 2014). Replikative Intermediate des HBV weisen ebenfalls charakteristische Eigenschaften auf, die eine zelluläre DNA-Schadensantwort stimulieren können (Schreiner & Nassal, 2017) (s. Abschnitt 1.8.2). Auch virale Proteine können durch direkte oder indirekte Interaktion mit DDR-Faktoren die DNA-Schadensantwort manipulieren. Die Helikase E1 des HPV beispielsweise aktiviert die ATM-Chk2-Signalkaskade, was zur Stimulierung des DSB- Reparaturweges führt und die virale Replikation begünstigt (Reinson et al., 2013). Das LT-Ag (Large T antigen) des Polyomavirus SV40 (Simian Virus 40) induziert ebenfalls die DDR und interferiert mit der Aktivierung von p53, um die Apoptose der Wirtszelle zu vermeiden. Auch bindet das LT-Ag an Nbs1 im MRN-Komplex und vermittelt dessen proteasomalen Abbau, um eine per DSB-Reparatur vermittelte Konkatemerisierung des SV40-Genoms zu unterdrücken (Boichuk et al., 2010). Im Falle des Ebstein Barr Virus (EBV) werden zur Aufrechterhaltung des viralen Episoms die DSB-Sensor-Proteine Mre11 und Nbs1 aktiv an den viralen Replikationsursprung (OriP) rekrutiert (Dheekollu et al., 2007). Eines der bestuntersuchten Beispiele einer Virus-DDR-Interferenz ist das humane Adenovirus 5 (hAdV5), das in dieser Arbeit zur Manipulation der DNA-Schadensantwort verwendet wird. Die zugrunde liegenden Mechanismen werden in dem folgenden Abschnitt 1.8.1 erläutert.

1.8.1. Das Adenovirus als gut untersuchtes Modell einer Virus-DDR-Interaktion

Adenoviren (hAdV) haben ein dsDNA Genom, das als lineares Molekül zusammen mit viralen Core-Proteinen im Inneren eines nichtumhüllten Viruspartikels liegt. Es weist an beiden Enden invertierte Sequenzwiederholungen (inverted terminal repeats, ITR) auf, an deren 5´-Terminus jeweils ein terminales Protein (TP) kovalent gebunden ist. Es ist für die Initiation der viralen DNA-Replikation essentiell (Protein-priming) (Davison et al., 2003). Der produktive Infektionszyklus wird in eine frühe und eine späte Phase unterteilt. In der frühen Phase erfolgt die Synthese bestimmter regulatorischer Genprodukte (E1, E2A, E2B, E3, E4, IVa2 und pIX). Sie sorgen für optimale Bedingungen für die anschießende virale DNA-Synthese sowie die Produktion viraler Strukturproteine (L1 bis L5) in der späten Phase (Tauber & Dobner, 2001) (Nemerow & Flint, 2019). Untersuchungen des hAdV-Typ 5 (hAdV5) als DNA-Virus Prototyp haben grundlegende Erkenntnisse in zelluläre Prozesse, 32 Einleitung einschließlich der DDR ermöglicht (Pancholi et al., 2017). So resultierte insbesondere die Infektion mit E4-deletierten hAdV5-Mutanten in der Fusion der viralen DNAs zu langen Konkatemeren, die nicht mehr verpackt werden können (Weiden & Ginsberg, 1994). Dabei werden die freien Enden des viralen Genoms vom DSB-Erkennungskomplex MRN fälschlich als DNA-Schaden erkannt, wodurch die DNA-Reparatur induziert wird. Um die Konkatemerisierung zu verhindern, vermitteln frühe Genprodukte des hAdV5 E4 ORF die Mislokalisation des MRN in perinukleäre Aggresomen sowie die Ubiquitin-abhängige proteasomale Degradation von Mre11. Aggresomen sind zelluläre Kompartimente, in denen misgefaltete Proteine proteasomal degradiert werden (Johnston et al., 1998). Die Mislokalisation des MRN-Komplexes wird von E4orf3 vermittelt (Araujo et al., 2005) (Evans & Hearing, 2005), die proteasomale Degradation durch ein Zusammenspiel der frühen Genprodukte von E4orf6 und E1B55k. Die Interaktion beider Proteine führt zur Assemblierung eines Multiproteinkomplexes aus den zellulären Proteinen Cullin 5 (Cul5), RING-box 1 (Rbx1), Elongin B und Elongin C, der E3 Ubiquitin-Ligase Aktivität besitzt (Abb. 5) (Cathomen & Weitzman, 2000) (Harada et al., 2002) (Stracker et al., 2002). Dieser Komplex polyubiquitiniert zelluläre Substrate und markiert sie so zur proteasomalen Degradation. E4orf6 weist mindestens zwei konservierte B/C-Box-Motive auf, die ähnlich zu Sequenzen anderer Elongin C-interagierender Proteine sind (Blanchette et al., 2004) (Luo et al., 2007). Damit vermittelt E4orf6 den Zusammenbau des Ubiquitin-Ligase-Komplexes, während E1B55k die zellulären Proteinsubstrate rekrutiert. Mutationen in den B/C-Motiven verhindern eine Assemblierung der Ubiquitin-Ligase und folglich den Abbau von Zielsubstraten (Blanchette et al., 2004). Bislang konnten p53, Mre11, LIG4 und Bloom Helikase (BLM) als DDR-Substrate identifiziert werden (Querido et al., 2001) (Stracker et al., 2002) (Orazio et al., 2011) (Schreiner et al., 2012). Der Abbau von Mre11, LIG4 und BLM wirkt der Konkatemerisierung entgegen, während die Degradation von p53 die E1A- induzierte p53-Stabilisierung und damit eine verfrühte Apoptose kompensiert. Zu bemerken ist, dass DDR-Substrate zwischen verschiedenen hAdV-Serotypen variieren. So kann das E4orf6 von hAdV12, nicht aber dasjenige von hAdV5, alleine die Degradation von TOPBP1 (DNA topoisomerase 2-binding protein 1) vermitteln (Blackford et al., 2010) (Forrester et al., 2011). Des Weiteren induziert hAdV5 eine DDR-Interferenz über die direkte Bindung von E4orf6 an DNA-PK, was die Funktion der Kinase hemmt (Hart et al., 2005a). Andererseits verstärkt das hAdV5 E4orf6 Protein die DDR durch Inhibition der Proteinphosphatase 2A (PP2A), was eine anhaltende H2AX-Phosphorylierung und PARP-Aktivierung zur Folge hat (Hart et al., 2007). Des Weiteren wurde eine Rekrutierung von RPA2, einer Untereinheit des

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RPA-Komplexes, sowie von ATR, ATRIP, Rad9, TOPBP1 und Rad17 in virale Replikationszentren (viral replication centers, VRC) beobachtet (Blackford et al., 2008) (Weitzman & Ornelles, 2005) (Turnell and Grand 2012), wobei der zu Grunde liegende Mechanismus nicht geklärt ist.

Das breite Wissen über die hAdV5-DDR Interaktion ermöglicht die Anwendung adenoviraler Proteine als Hilfsmittel zur Untersuchung und gezielten Inhibierung der DDR. So werden die beiden frühen Genprodukte E4orf6 und E1B55k zur Verstärkung der HR-vermittelten CRISPR/Cas9- (cluster regularly interspaced short palindromic/ CRISPR-assoziiertes Protein 9) (s. Ergebnisse 3.1.2 und 3.4.1) Genomeditierung genutzt, indem der kompetitive NHEJ- Reparaturmechanismus inhibiert wird (Chu et al., 2015). In dieser Arbeit findet das frühe Genprodukt E4orf6 zur Inhibierung der DDR in der Hepatomzelllinie HepG2 Anwendung, um die Rolle von DDR-Faktoren bei der hepadnaviralen rc-zu cccDNA Konversion zu untersuchen.

Abb. 5 E4orf6 abhängige Komplexbildung einer E3 Ubiquitin-Ligase Das hAdV5 E4orf6 Protein bindet über seine B/C-Box (BC)-Domänen die zellulären Proteine Elongin (Elo) B und C, die wiederum an Cullin 5 (Cul5) und Rbx1 komplexiert vorliegen. Dieser Multiproteinkomplex besitzt E3 Ubiquitin-Ligase Aktivität. Als Substrat-spezifischer Kofaktor bindet das adenovirale E1B55k Protein an zelluläre DDR-Faktoren wie Mre11, BLM, LIG4 und p53 zu binden und rekrutiert sie via Interaktion mit E4orf6 an die E3-Ligase. Die während einer hAdV5-Infektion zu beobachtende kovalente Bindung des kleinen Proteins Nedd8 an Cul5 (Neddylierung) aktiviert die E3-Ligase. Im Folgenden wird das an die E2-Ubiquitin-Ligase (E2) gekoppelte Ubiquitin auf einen Lysinrest des Zielsubstrates übertragen. Diese Ubiquitinierung markiert das Protein zur proteasomalen Degradation. Die Abb. wurde nach (Blanchette et al., 2004) modifiziert.

1.8.2. Interaktion von HBV mit zellulären DDR-Faktoren HBV weist aufgrund seiner Genomgröße von 3,2 kb eine minimale Kodierkapazität auf, was mit einer hohen Abhängigkeit von zellulären Prozessen einhergeht. Vermutlich triggert die atypische DNA-Struktur des HBV rcDNA-Genoms DDR-Mechanismen und nutzt DDR- Proteine für einen produktiven Infektionszyklus (Schreiner & Nassal, 2017) (Mohd-Ismail et al., 2019). In den letzten Jahren konnte Evidenz für die Beteiligung mehrerer DNA- Reparaturfaktoren an der rc- zu cccDNA Konversion gewonnen werden. Wie im Abschnitt 1.4 erläutert, zählen hierzu Tdp2, FEN1, die DNA-Polymerasen POLK, POLL und POLA 34 Einleitung sowie LIG1 und LIG3. Im Verlauf der reversen Transkription der pgRNA entstehen dlDNA- Moleküle, deren freie Enden als DSB interpretiert werden und eine DDR-Antwort auslösen könnten. Die Erkennung durch Ku80, ein Sensorprotein des NHEJ, verursacht eine Zirkularisierung der dlDNA in fehlerhafte cccDNA-Moleküle (Guo et al. 2012). Alternativ kann dlDNA in das Chromosom integriert werden, was zur Entstehung von HCC beiträgt (Chen et al. 2019). Dieser Prozess kann durch die Stimulation von DDR-Mechanismen wie oxidative DNA-Schäden oder die Inhibition von PARP, einer Komponente der ssDNA- Reparatur, begünstigt werden (Dandri et al., 2002). Eine wichtige HBV-DDR- Interaktionskomponente ist vermutlich das HBx Protein. Es interagiert u.a. mit p53 und verursacht dessen Sequestrierung und damit Inaktivierung im Zytoplasma. Da der Tumorsuppressor als Transkriptionsfaktor an der Expression zahlreicher DDR-Faktoren beteiligt ist, könnte HBx so eine Vielzahl p53-abhängiger Aktivitäten wie Zellzykluskontrolle, Apoptose und DNA-Reparatur (Jia et al., 1999) (Arbuthnot et al., 2000) (van de Klundert et al., 2012) (Li et al., 2017) inhibieren. Die Bindung von HBx an DDB1, eine funktionelle Komponente der Reparatur von UV-induzierten DNA-Läsionen durch NER, induziert den proteasomalen Abbau des Smc5/6-Komplexes. Hierbei fungiert DDB1 als Adapter-Protein in der Bildung einer Cul4 basierten E3 Ubiquitin-Ligase. Die Ubiquitinierung von Zielproteinen benötigt weitere, sogenannte DDB1-Cul4-assoziierte Faktoren (DCAFs) wie das zelluläre DDB2. HBx bindet als viraler DCAF-Faktor an die E3- Ligase und vermittelt so die Spezifität für Smc5/6 (Decorsiere et al., 2016) (Murphy et al., 2016). Da dieser Komplex bei der Aufrechterhaltung von Chromosomstrukturen eine Rolle spielt, könnten Apoptose, chromosomale Segregation sowie die Progression der S-Phase indirekt durch HBx beeinflusst werden (Hassler et al., 2018). In Abwesenheit von HBx trägt der Smc5/6-Komplex zur transkriptionellen Stilllegung der cccDNA bei. Die Smc5/6-HBx Interaktion findet sehr wahrscheinlich in PML-NBs (promyelocytic leukemia protein-nuclear bodies) statt (Niu et al., 2017). PML-NBs sind nukleäre Strukturen, die als Plattformen für zahlreichen regulatorischen Zellfunktionen wie DDR, Apoptose, Genomstabilität und Zellteilung dienen (Chang et al., 2018). Welche Rolle PML-NBs bei der Interaktion von HBV mit der DDR spielen, ist aber bislang nicht ausreichend geklärt (Yoon & Yu, 2001) (Chung & Tsai, 2009) (Chung and Wu 2013) (Niu et al., 2017) (Sengupta et al., 2017).

35 Zielsetzung

2. Zielsetzung Die Synthese der hepadnaviralen cccDNA im Zellkern aus der Polymerase-gebundenen rcDNA von infektiösen Virionen ist ein essentieller Schritt für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Virusinfektion. Die Konversion beinhaltet mehrere DNA- Prozessierungsschritte, die das Virus nicht mittels eigener Proteine katalysieren kann. Als Teil der DDR enthält die Wirtszelle prinzipiell alle nötigen Komponenten für die rc- zu cccDNA Umwandlung. In unserer Arbeitsgruppe konnte als ein erstes DNA-Reparaturenzym Tyrosyl- DNA-Phosphodiesterase 2 (Tdp2) identifiziert werden, welches die rcDNA-gebundene Virus- Polymerase durch Spaltung der 5´-Phosphotyrosyl-Bindung freisetzen kann (Königer et al., 2014). In stabil Tdp2-depletierten Zellen war die rc-zu cccDNA Umwandlung stark verlangsamt, aber nicht komplett inhibiert, was auf die Existenz alternativer Mechanismen deutete. In Zellen können Protein-DNA Addukte auch durch spezifische Endonukleasen, u.a. Mre11, gespalten werden. Als Teil des DNA-Schadenerkennungskomplexes MRN könnte dieses Reparaturenzym daher eine Rolle bei der cccDNA Bildung spielen. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurden adenovirale Proteine verwendet. Das hAdV5 inhibiert die zelluläre DNA-Reparatur auf mehreren Ebenen. Die frühen (early) hAdV5 Proteine E4orf6 und E1B55k inaktivieren den MRN Komplex durch Degradation von Mre11, E4orf3 führt zu dessen Mislokalisation (Stracker et al., 2002). Durch die Koexpression dieser adenoviralen Proteine mit einem DHBV kodierenden Vektor (pCD16+env-) wurde der Einfluss auf hepadnavirale cccDNA Synthese in der Hepatomzelllinie HepG2 untersucht (Abb. 6A und B). Diese Experimente zeigten, dass E4orf6 die Replikation von DHBV so stark reduzieren kann, dass keine cccDNA im SB zu detektieren ist. Der bekannte Abbauweg von Mre11 durch E4orf6 verläuft über die Ausbildung eines E3 Ubiquitin-Ligase Komplexes und erfordert E1B55k als viralen Kofaktor (Blanchette et al., 2004) (Schwartz et al., 2008) (Schreiner et al. 2012) (C. Y. Cheng et al., 2013), was hier bestätigt wurde (Abb. 6C). Interessanterweise wurde aber auch ohne E1B55k und ohne Mre11-Abbau eine Inhibition der cccDNA Bildung durch E4orf6 beobachtet (Abb. 6A-C) (C. Königer Dissertation, Universität Freiburg, 2014). Eine E4orf6-vermittelte, aber E1B55k unabhängige Proteindegradation ist für hAdV5 bisher nicht beschrieben, daher sind auch keine potenziellen Zielproteine bekannt. Dies führte uns zu der Hypothese, dass hAdV5 E4orf6 alleine einen oder mehrere bislang unbekannte zelluläre Faktoren inaktiviert, die an der cccDNA-Bildung beteiligt sind, vermutlich über proteasomale Degradation. Hierzu sollte im ersten Teil dieser Arbeit (s. Abschnitt 3) zunächst eine humane Hepatomzelllinie generiert werden, die stabil entweder das wildtypische hAdV5 E4orf6 Protein (E4wt) exprimiert oder eine Proteinmutante, die nicht mehr zur Bildung einer E3 36 Zielsetzung

Ubiquitin-Ligase in der Lage ist (BCmut) (Blanchette et al., 2004). Nach Bestätigung einer E4orf6-abhängigen DHBV-Replikationsinterferenz (s. Abschnitt 3.2) sollte ein Proteomvergleich zwischen beiden Zelllinien mittels Massenspektroskopie (MS) erfolgen (bei Prof. Dr. A. Pichlmair, München, im Rahmen des Transregio-SFBs TRR179), um E4orf6- abhängig regulierte Wirtsfaktoren mit potenzieller cccDNA Relevanz zu finden (s. Abschnitt 3.3). Zum Nachweis einer möglichen Beteiligung am DHBV Replikationszyklus sollten im zweiten Teil dieser Arbeit Methoden zur Modulation der Expression der entsprechenden Kandidatenproteine etabliert werden, zum einen mittels RNA-Interferenz (RNAi), zum anderen mittels Gen-knockout (KO) mit Hilfe des "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" (CRISPR)/"CRISPR-associated protein" (Cas)-Editierungssystems. Hierzu sollte u.a. eine DHBV-Reporterzelllinie generiert werden, die stabil die Endonuklease Cas9 aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) exprimiert (s. Abschnitt 3.4). Durch Einbringen Gen-spezifischer small hairpin (sh) RNAs (knockdown, KD) oder single-guide (sg) RNAs (KO) sollte dann verfolgt werden, ob eine partielle oder vollständige Suppression des jeweiligen Wirtsfaktors einen Einfluss auf Menge und/oder Qualität einzelner Virusprodukte und insbesondere der cccDNA hat (s. Abschnitt 3.5).

Abb. 6. Einfluss der frühen hAdV5 Proteine auf die DHBV Replikation (A) und (B) HepG2 Zellen wurden mit gleichen Mengen pCD16+env- DHBV-Vektor und dem benannten pcDNA3-Expressionsplasmid kotransfiziert („mock“ = pcDNA3.1_leer) und nach 4 Tagen geerntet. Nach NP-40 Lyse wurde die DNA aus den Zellkernen (A) oder zytoplasmatischen Virus-Kapsiden (B) per Southern Blot (SB) mit einer DHBV-spezifischen, 32P markierten Sonde analysiert. Die Signale wurden auf einem Röntgenfilm detektiert. rcDNA, relaxiert-zirkuläre DNA; dlDNA, doppelsträngig-lineare DNA; cccDNA, kovalent geschlossene zirkuläre DNA. (C) Einfluss der frühen hAdV5 Proteine auf die zelluläre Mre11 Expression. 37 Zielsetzung

HepG2 Zellen wurden im Verhältnis 10:1 mit dem jeweils benannten hAdV5 Protein-Vektor und einem GFP- Expressionsplasmids kotransfiziert. Nach 4 Tagen wurden die grün fluoreszierenden Zellen mit einem Zellsortierer (MoFlo High speed cell sorter, BeckmanCoulter) isoliert. SDS-Gesamtlysate dieser Zellen wurden per SDS-PAGE aufgetrennt und nach Transfer auf eine PVDF-Membran gleichzeitig mit einem -Mre11- (Novus Biologicals NB 100-142; 1:5.000) und einem -β-Aktin (Sigma #AC-15; 1:20.000) Antikörper inkubiert. Die Detektion erfolgte mittels Peroxidase (PO)-gekoppeltem Sekundärantikörper und chemilumineszenten Substrat auf Röntgenfilm.

38 Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1. Generierung stabiler hAdV5 E4wt- und BCmut-exprimierender HepG2 Zellen

Basierend auf den Vorexperimenten (Abb. 6) war das primäre Ziel, mittels einer MS- basierten Proteomanalyse potenzielle E4orf6 Zielproteine zu identifizieren. Hierzu sollte das Proteom von E4wt exprimierenden Zellen mit dem von BCmut Zellen verglichen werden. Da die BCmut-Proteinvariante des E4orf6 Mutationen in den Elongin B/Elongin C- Interaktionsdomänen (BC-Box) trägt, kann dieses Protein keine E3 Ubiquitin-Ligase formen und folglich keine Proteinveränderungen durch proteasomalen Abbau induzieren (Blanchette et al., 2004). Es dient daher als Kontrollvariante zu allen E4wt-Ansätzen. Für das e4wt Gen wurde ein splice-KO-Konstrukt verwendet, das die Produktion der Proteinvariante E4orf6/7 unterbindet. In einer hAdV5-Infektion entsteht diese Variante durch alternatives Spleißen und wirkt, anders als E4orf6, als viraler Transaktivator (Neill & Nevins, 1991) (Querido et al., 2000). Die splice-KO Variante des E4wt wurde von Dr. Sabrina Schreiner (TU München) zur Verfügung gestellt.

Ein wichtiger Aspekt für den Proteomvergleich war es, dass die verwendeten Zellen die Replikation von HBV und DHBV unterstützen, weshalb wir uns für die humane Hepatomzelllinie HepG2 entschieden (Köck et al. 2010). Eine weitere entscheidende Voraussetzung ist eine stabile Proteinexpression in möglichst allen zu untersuchenden Zellen. Dies ist mittels transienter Transfektion der ohnehin schlecht transfizierbaren HepG2 Zellen nicht möglich, sondern erfordert die Etablierung einer entsprechenden stabilen Zelllinie. In der Literatur ist bislang nur eine einzige Zelllinie (kolorektale Tumorzelllinie, RKO) publiziert, in der eine stabile Expression von funktionalem E4wt gezeigt wurde (Hart et al., 2005a). Ansonsten sind neben der Infektion mit hAdV bzw. hAdV-Varianten ausschließlich transiente E4orf6-Expressionssysteme beschrieben, was die Annahme einer möglichen E4wt- Zelltoxizität bei der Langzeitexpression stützt (Collis et al., 2003) (Blanchette et al., 2004) (Hart et al., 2007) (Luo et al., 2007) (Guo et al., 2019). Neben diesem Aspekt ist eine Klonalität der Zellen innerhalb der zu untersuchenden Zelllinie für die Proteomanalyse wünschenswert, da E4orf6-unabhängige Einflüsse, beispielsweise durch zufällige Transgen- Integration in unterschiedliche chromosomale loci das Protein-Expressionsmuster der Zielzelle verändern können. Um solche unerwünschten Veränderungen zu vermeiden, wurden zur Herstellung von HepG2 Zellen mit stabiler E4wt- bzw. BCmut-Expression zwei

39 Ergebnisse unterschiedliche Systeme verwendet. In einem nicht-integrativen Ansatz sollte die Transgenexpression ausgehend von einem extrachromosomalen Vektor erfolgen (s. Abschnitt 3.1.1); alternativ sollte mithilfe der CRISPR/Cas-Technologie eine gerichtete Transgenintegration in einen definierten Gen-locus erreicht werden (s. Abschnitt 3.1.2). Die Problematik einer potenziellen Zelltoxizität durch Überexpression des E4wt-Proteins sollte durch induzierbare Promotoren (Metallothionein (MT) Promoter, s. Abschnitt 3.1.1; TetON- Regulationssystem, s. Abschnitt 3.1.2) gelöst werden.

3.1.1. HepG2 Zelllinien mit stabiler Transgen-Expression unter Verwendung episomaler Vektoren In episomalen Vektoren liegt das zu exprimierende Transgen im Kontext eines extrachromosomal replizierenden Plasmids vor. Dies hat den Vorteil, dass die wirtseigene genomische DNA unverändert bleibt und so das Risiko von Insertionsmutationen minimiert wird (Ehrhardt et al., 2008) (Xu et al., 2019). Episomale Vektoren zeichnen sich durch Elemente aus, die eine zellabhängige Replikation sowie eine Chromosom-assoziierte Verteilung der Vektor-Replikate in je eine Tochterzelle vermitteln. Innerhalb der episomalen Vektoren wird zwischen viralen und nichtviralen-/alternativen Vektoren unterschieden. In dieser Arbeit wurden zunächst beide Vektorsysteme mittels fluoreszierender Reportergenprodukte auf ihre Eignung für die Etablierung E4orf6 exprimierender HepG2 Hepatomzellen getestet. Bei den verwendeten Virus-basierten Vektoren wird die Replikation durch regulatorische Elemente aus dem EBV, nämlich dem OriP (origin of replication) und EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1), vermittelt. EBNA1 assoziiert mit Replikationsproteinen aus der Zelle und leitet so die Replikation des zirkulären Plasmids am OriP ein. Synchron mit dem Zellzyklus erfolgt die Replikation im Normalfall einmal pro Zellzyklus. Die korrekte Verteilung beider Replikate in je eine Tochterzelle wird durch die EBNA1-vermittelte Adhäsion der Plasmidstränge an die zellulären Chromosomen gewährleistet (Reisman & Sugden, 1986) (Bashaw & Yates, 2001). In dieser Arbeit wurden die Vektoren pCEP4 und pMEP4 verwendet. Die Expression des Transgens vom pCEP4 Vektor erfolgt konstitutiv durch einen Cytomegalovirus Immediate-Early (CMV-IE) Enhancer/Promoter, die Transkription vom pMEP4 Vektor wird durch einen Metallothionein- Promoter (MT) vermittelt, dessen Aktivität (in Grenzen) durch zweiwertige Metallionen (Me2+) regulierbar ist. Hier wurde zur Induktion der Proteinexpression Zn2+ in Form von

Zinksulfat (ZnSO4) verwendet. Die alternativen-/nicht viralen episomalen Vektoren enthalten regulatorische Elemente des humanen Chromosoms für eine stabile Aufrechterhaltung des

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Transgens (Piechaczek et al., 1999) (Lipps, 2013). In der Zelle findet die DNA Replikation an definierten Replikationszentren statt (organized replication center, ORC), die über sogenannte scaffold/matrix attached regions (S/MAR) mit der nukleären Matrix verbunden sind (Rivera-Mulia et al., 2011). Diese S/MAR Sequenzen enthalten Abschnitte mit mehr als 70% AT-reichen Sequenzen, weisen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren sowie Topoisomerasen II auf und sollen die langfristige ektopische Genexpression ermöglichen (Jenke et al., 2002). Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs (FISH) Analysen zeigten, dass S/MAR- basierte Vektoren während der Mitose mit den Wirtschromosomen ko-segregieren. Gleich den EBV-basierten Vektoren ist die Replikation der alternativen Episomen an den Zellzyklus gekoppelt und findet durchschnittlich einmal in der frühen S- Phase statt (Schaarschmidt et al., 2004) (Stehle et al., 2007). Ein Problem ist die unerwünschte Transkriptionsstilllegung des Transgens durch Methylierung an den CpG Inseln. Regulatorische cis-agierende DNA-Elemente wie das ubiquitous chromatin opening element (UCOE) können die Expression des Transgens vor solchen epigenetischen Ereignissen schützen. UCOEs sind methylierungsfreie CpG-Inseln, die sich innerhalb von Promotoren ubiquitär vorkommender Haushaltsgene befinden. Speziell in Kombination mit dem S/MAR Element sollen UCOEs eine stabile Transgen-Expression ermöglichen (Nematpour et al., 2017). Hier wurden die Plasmide pEPI und pEPI_UCOE verwendet (Hagedorn et al., 2013b). Das Transgen wird in beiden Systemen konstitutiv exprimiert, in pEPI_UCOE durch den CMV-IE-Promoter, in pEPI durch einen chimären CMV-Enhancer/chicken β-actin-Promoter.

3.1.1.1. Vergleich viraler und nicht-viraler episomaler Vektoren mittels Reporter- Expression in HepG2 Zunächst wurde unter Verwendung fluoreszierender Reportergenprodukte evaluiert, welches episomale Vektorsystem sich für die Etablierung stabiler HepG2 Zelllinien am besten eignet. Hierzu wurde ein Gen für das rot fluoreszierende mCherry Protein in die viralen Vektoren pCEP4 und pMEP4 kloniert. Die beiden nichtviralen Plasmide pEPI und pEPI_UCOE enthalten bereits ein enhanced GFP (egfp) kodierendes Transgen und wurden von Frau Dr. Hagedorn (Universität Witten/Herdecke) zur Verfügung gestellt. Alle vier Vektoren wurden mittels Mirus TransIT LT1 Reagenz in HepG2 Zellen transfiziert, dann wurde die Proteinexpression im Fluoreszenz (FL)-Mikroskop beobachtet und die Proteinmengen nach 5 Tagen im Immunoblot (IB) mittels spezifischer Antikörper untersucht (Abb. 7A und B).

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Abb. 7 Reportergenexpression in HepG2 Zellen nach Transfektion mit episomalen Vektoren Etwa 1x106 HepG2 Zellen wurden mit je 1 µg des angegebenen mCherry-Vektors (pMEP4, pCEP4) oder eGFP- Vektors (pEPI, pEPI_UCOE) transfiziert und 5 Tage kultiviert; die pMEP4-Ansätze wurden ab Tag 1 nach Transfektion wie angegeben mit Zn2+ supplementiert. (A) Fluoreszenzmikroskopischer (FL) Nachweis der Zn2+- abhängigen mCherry-Expression. Gezeigt ist jeweils die Hellfeld (HF)-Aufnahme (Vergrößerung 5-fach, Belichtungszeit 20 ms) und die zugehörige FL-Aufnahme mit mCherry-geeigneten Filtern (Anregung 610 nm; Emission: 555 nm, Belichtungszeit 2.000 ms). Die weißen Pfeile zeigen mCherry positive-Zellen im nicht induzierten Ansatz. (B) Nachweis der Reporter-Expression per Immunoblot (IB). SDS-Gesamtlysate der Zellen wurden per SDS-PAGE (15% Polyacrylamid) aufgetrennt. Nach Transfer auf eine PVDF-Membran erfolgte der Nachweis mit -GFP (Chromotek #3H9; 1:2.500), -RFP (Chromotek #5F8; 1:2.500) und -β-Aktin (Sigma #AC-15; 1:10.000) Antikörper, gefolgt von PO-gekoppeltem Sekundärantikörper und chemilumineszentem Substrat. Molmassen eGFP: 27 kDa; mCherry: 26 kDa; β-Aktin: 42 kDa.

In allen Transfektionsansätzen konnte das Reportergen fluoreszenzmikroskopisch (Abb. 7A) und im IB (Abb. 7B) detektiert werden, wobei die Proteinexpression vom pMEP4 Vektor wie erwartet durch Zugabe von Zn2+ deutlich gesteigert wurde (Abb. 7A). Auch ohne Zn2+- Zugabe ließen sich aber fluoreszenzmikroskopisch vereinzelte mCherry-positive Zellen detektieren (weiße Pfeile in Abb. 7A). Dies spricht für eine induktionsunabhängige Basal- Aktivität des MT-Promotors in HepG2 Zellen. Bekannt ist, dass der Promoter auch Me2+ unabhängig aktiviert werden kann, z.B. durch Hormone und oxidativen Stress (Kallunki et al., 2019). Zumindest war aber das basale Expressionslevel von mCherry in diesem Fall nicht im IB detektierbar, sehr wahrscheinlich aufgrund der unterschiedlichen Sensitivität beider Nachweismethoden. Mit Zn2+ entsprach die mCherry Bandenstärke im IB bei 66 nM Zn2+ ungefähr derjenigen vom konstitutiven pCEP Vektor, bei 200 nM Zn2+ lag sie darüber. Für die nicht-viralen Vektoren war eine etwas stärkere eGFP Expression vom pEPI_UCOE

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Vektor im Vergleich zum pEPI Vektor zu beobachten. Allerdings waren weiterführende quantitative Schlussfolgerungen wegen möglicher Unterschiede in der Transfektionseffizienz noch nicht möglich.

3.1.1.2. Antibiotikaselektion erfolgreich transfizierter HepG2 Zellen Wie aufgrund der begrenzten Transfektionseffizienz der HepG2 Zellen erwartet, exprimierte jeweils nur ein Teil der frisch transfizierten Zellen das eGFP- bzw. mCherry-Reporterprotein; der bei der visuellen Inspektion der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen mitunter sehr hoch erscheinende Anteil positiver Zellen (z.B. in (Abb. 7A rechts) lag in FACS-Analysen tatsächlich nur bei 20-30% der Gesamtpopulation. Zur Eliminierung nicht transfizierter Zellen wurde daher eine Selektion mit entsprechenden Antibiotika angeschlossen. Wegen der episomalen Natur der Vektoren sollte dies zu einer einheitlichen Population Vektor-tragender Zellen führen, da anders als bei integrativen Vektoren jegliche Heterogenität bezüglich des Integrationsortes vermieden wird. Die Selektion der pEPI Ansätze erfolgte mit 400 µg/ml Geneticin (G418), die der pMEP4 und pCEP4 Ansätze mittels 200 µg/ml Hygromycin, jeweils für mindestens 3 Wochen bis zur erneuten Bildung eines konfluenten Zellrasens. Die gewählten Antibiotikum-Konzentrationen hatten naive HepG2 Zellen nach etwa einer Woche zum Absterben gebracht. Die Ergebnisse wurde fluoreszenzmikroskopisch festgehalten und für eGFP auch mittels Fluorescence-assisted cell sorting (FACS) quantitativ bestimmt (Abb. 8B); für mCherry stand zu diesem Zeitpunkt leider kein geeigneter Laser zur Verfügung.

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Abb. 8. Selektion Reportergen-exprimierender Zellen Die angegebenen Transfektionsansätze wurden ab Tag 5 nach Transfektion für mindestens 3 Wochen in 400 µg/ml G418 (pEPI und pEPI_UCOE) bzw. 200 µg/ml Hygromycin (pMEP4 und pCEP4) kultiviert. (A) FL- Mikroskopie. Gezeigt ist jeweils die HF-Aufnahme (Belichtungszeit: 20 ms; Vergrößerungsfaktor in Klammern) und die zugehörige FL-Aufnahme (mCherry: 555 nm, Belichtung 2.000 ms; GFP: 470 nm, Belichtung 1.000 ms). Die Induktion der mCherry Expression von pMEP4 wurde durch Zugabe von 200 nM Zn2+ für ≥24 h induziert. (B) Dotplot-Auswertung der eGFP-FACS Messung. Es wurden 20.000 Einzellzellen analysiert. X- Achse: Intensität der GFP-FL. Y-Achse: Signal des Seitwärtsstreulichts (Side-Scatter, SSC). Der jeweilige Anteil eGFP-positiver Zellen in Prozent der Gesamtpopulation ist innerhalb der Plots angegeben.

Erstaunlicherweise zeigte die FL-Mikroskopie trotz Selektion in allen Ansätzen Mischpopulationen aus FL-positiven und -negativen Zellen, wobei eine visuelle Abschätzung des tatsächlichen Anteils schwierig ist. Die quantitative Auswertung der pEPI und pEPI_UCOE Ansätze mittels FACS ergab Anteile von 13% bzw. sogar nur 2,4% eGFP- positiver Zellen, wie bei einem Verlust des Vektors in einem Großteil der Zellen. Andererseits wurde der Selektionsmarker weiterhin exprimiert, da die nicht transfizierten Zellen unter den gewählten Bedingungen komplett abstarben. Eine Erklärung für diesen anscheinenden Widerspruch wäre, dass durch genetische (Mutationen) oder epigenetische Prozesse (z.B. Methylierung) bei erhaltenem Vektor in der Mehrheit der Zellen selektiv die eGFP Expression supprimiert wurde; eine andere Möglichkeit wäre, dass die Selektionsmarker-Kassette vom Vektor unabhängig wurde, z.B. durch chromosomale Integration eines entsprechenden Vektor-Fragments. Schließlich wurde auch beschrieben, dass die vom pEPI-Episom produzierte eGFP-Menge in der Mehrheit der Zellen unter der

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FACS-Detektionsgrenze liegen kann (Hagedorn et al., 2011), sodass hier die tatsächlich positive Zellpopulation möglicherweise unterschätzt wird.

Der pCEP4-Ansatz zeigte deutlichere Hinweise auf die erwünschte Anreicherung mCherry- positiver Zellen durch die Selektion. Hier war anfänglich die Protein-Expression laut IB schwächer als im mit 200 nM Zn2+-induzierten pMEP4-Ansatz (Abb. 7B), nach der Selektion schien der Anteil FL-positiver Zellen sogar höher als in den pMEP4-transfizierten Zellen (Abb. 8A). Auch erreichten die Zellen im pCEP4 Selektionsansatz schneller als die anderen Ansätze ein konfluentes Zellwachstum, obwohl die Hygromycin-Resistenzmarker-Kassette in pCEP4 und pMEP4 identisch ist, was ebenfalls für stochastische Ereignisse während der Selektion spricht (Leight and Sugden 2001a) (Leight and Sugden 2001b).

Jedenfalls wurde anhand der FL-Reporter Experimente deutlich, dass sich in allen Ansätzen trotz Selektion eine Mischpopulation von Zellen etablierte, in der ein Großteil keine detektierbare Expression des Transgens aufwies. Für den geplanten Proteomvergleich zwischen stabil E4wt vs. BCmut exprimierenden Zellen wären derartige Zellmischungen nicht geeignet. Zur Lösung dieses Homogenitätsproblems sollten daher (im nächsten Schritt) Einzelzellklone mit den gewünschten Eigenschaften isoliert werden.

3.1.1.3. Einzelklon-screening selektionierter HepG2 Zellen auf Transgen- Expression Im Falle von fluoreszierenden Transgenen können die gewünschten Einzelzellklone direkt mittels FACS isoliert werden. Da für die spätere Etablierung von E4orf6-wt und E4orf6- BCmut exprimierenden HepG2 Zellen ein solches screening nicht möglich ist, wurden zwei alternative Methoden zur Herstellung von eGFP- und mCherry-positiven Einzelzellklonen getestet. Zum einen wurde die heterogene Zellpopulation so stark verdünnt, dass theoretisch nur eine Zelle pro well einer 96-well Platte ausgesät wurde. Nach Erreichen der Konfluenz erfolgte kontinuierlich die Weiterpassage und Expansion in das nächstgrößere Zellkultur- well-Format. Im zweiten Ansatz wurden 1.000 Zellen auf eine 10 cm Zellkulturschale ausgesät, sodass sich die Zellen vereinzelt auf dem Gefäßboden absetzen. Replizierende Zellen produzieren sichtbare Kolonien, die mit einer 200 µl Pipettenspitze in ein well einer 96-well Platte überführt (je well eine Kolonie) und nach Erreichen der Konfluenz entsprechend weiterpassagiert wurden. Die Vorgehensweise der Einzelklon-Generierung ist in Abb. 9A schematisch dargestellt. Als Hauptproblem der erstgenannten Methode erwies sich die lange Zeitdauer bis zur Ausbildung eines konfluenten Zellrasens aus der Einzelzelle. Im Vergleich dazu war die Etablierung von Zellklonen in der 10 cm Zellkulturschale schneller

45 Ergebnisse und effizienter, möglicherweise weil die Möglichkeit einer Zell-Zell-Kommunikation über das Medium weiterhin gegeben ist. Daher wurde der zweite Ansatz auch für alle folgenden Einzelklon-Generierungen angewandt. Die Expression der Reporterproteine wurde im FL- Mikroskop beobachtet, für den Proteinnachweis mittels IB wurden die Zellen bis zum 24-well Format kultiviert (Abb. 9B, C).

Abb. 9. Einzelklon-Generierung der selektionierten Zellansätze am Beispiel der pEPI_eGFP und pCEP4 Mischpopulation (A) Schematische Darstellung zweier Methoden zur Herstellung von Einzellklonen. i) Durchschnittlich eine Zelle pro well einer 96-well Platte wird ausplattiert und nach Erreichen der Konfluenz auf das nächstgrößere Kultivierungsgefäß passagiert. ii) 1.000 Zellen werden auf eine 10 cm Kulturschale ausplattiert. Die nach Zellteilung entstandenen Kolonien werden in eine 96-well Platte transferiert und nach Erreichen der Konfluenz in das nächstgrößere Kultivierungsgefäß expandiert. Nach Vorversuchen wurde hier im wesentlichen Methode ii) angewandt. (B) IB-screening auf eGFP bzw. mCherry-Expression in selektionierten Einzelklonen. Die SDS- Lysate der Zellen aus einem halben, konfluent bewachsenen well einer 24-well Platte wurden per SDS-PAGE (15% Polyacrylamid) aufgetrennt und wie in Abb. 7 beschrieben per IB untersucht. Als Kontrolle diente jeweils der unselektionierte Transfektionsansatz (Tfx. Kontr.), HG2: HepG2 Zellen (C) FL-Mikroskopie beispielhafter Einzelklone. Gezeigt ist jeweils die HF- und die entsprechende FL-Aufnahme (jeweils 10-fache Vergrößerung). Die Detektionsbedingungen entsprechen der Beschreibung in Abb. 8A.

Anhand des IB-screenings wird deutlich, dass der pCEP4 Vektor wesentlich mehr Reporter- positive Zellklone ergab als der pEPI Vektor. Während von 26 beispielhaft gezeigten pEPI 46 Ergebnisse

Klonen nur drei nachweislich eGFP exprimierten (etwa 11,5% der gesamten Mischpopulation), zeigte der pCEP4 Ansatz eine gut nachweisbare mCherry Expression in jedem dritten Klon (33,3% der gesamten Mischpopulation). Dies hatte sich bereits nach der Selektion in der Mischpopulation angedeutet und ist konsistent mit den FACS Daten der pEPI Zellpopulation (vgl. Abb. 8B und 4B). Angesichts der Ähnlichkeit zwischen mCherry und eGFP ist eine unterschiedliche Cytotoxiziät der beiden Proteine unwahrscheinlich. Die FL- Mikroskopie der selektionierten Einzelklone pEP1 #C3 und pCEP4 #F7 zeigte zudem, dass jeweils nahezu alle Zellen eine FL aufwiesen, deren Intensität relativ homogen erschien (Abb. 9).

Aus den Daten mit den fluoreszierenden Reportern kristallisierte sich der virale Vektor pCEP4 als besonders effizient heraus. Für die Generierung von HepG2 Zellen, die stabil entweder das E4wt oder die BCmut Variante produzieren, wurde daher zum einen dieser Vektor eingesetzt. Da andererseits das E4wt Protein mit dem DNA-Reparatursystem der Zelle interferiert (Stracker et al., 2002) (Schreiner et al., 2012), sollten alternativ mögliche Toxizitätseffekte aufgrund der konstitutiven Expression des Transgens von pCEP4 durch die Verwendung des induzierbaren pMEP4 Vektors umgangen werden.

3.1.1.4. HepG2 Zellen mit stabiler hAdV5 E4wt/BCmut Expression Analog zur Etablierung mCherry-exprimierender Zellen wurden HepG2 Zellen mit den E4wt und BCmut kodierenden pCEP4 und pMEP4 Vektoren transfiziert und an Tag 5 nach Transfektion die Transgen-Expression per IB validiert. Nach einer dreiwöchigen Selektion mit 200 µg/ml Hygromycin wurde ein Einzelklon-screening per IB durchgeführt (Abb. 10A und B). Zum E4orf6-Nachweis diente ein monoklonaler Maus-Antikörper (RSA3) in Form von Hybridomzell-Überstand, der von Dr. Sabrina Schreiner (Helmholtz Zentrum München) zur Verfügung gestellt wurde.

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Abb. 10 Einzelklon-screening von stabil mit E4wt oder BCmut kodierenden episomalen Vektoren pCEP4 und pMEP4 transfizierten HepG2 Zellen Etwa 1x106 HepG2 Zellen wurden mit je 1 µg des entsprechenden Vektors transfiziert, nach 5 Tagen per IB auf transiente Expression der E4orf6 Proteine getestet und anschließend für 3 Wochen mit 200 µg/ml Hygromycin selektioniert. Die pMEP4 Ansätze wurden vor der IB Analyse für ≥24 h mit 100 µM Zn2+ induziert. SDS- Gesamtlysate der Zellen wurden per SDS-PAGE getrennt (12,5% Polyacrylamid) und nach Transfer auf PVDF- Membran mit -E4orf6 (RSA3 Hybridomüberstand; 1:10) und -ß-Aktin- (#AC-15, 1:10.000) Antikörper gefolgt von PO-gekoppeltem Sekundärantikörper und Chemilumineszenz-Substrat sichtbar gemacht. (A) pCEP4-Ansätze. (B) pMEP4-Ansätze. Molmassen E4orf6: 34 kDa; β-Aktin: 42 kDa.

Unter Verwendung beider viraler Vektoren konnte an Tag 5 nach Transfektion sowohl für E4wt als auch für die BCmut Variante eine spezifische Bande im erwarteten Bereich von 34 kDa im IB detektiert werden. Für den pMEP4 Vektor war wie erwünscht eine Zn2+-abhängig verstärkte Expression zu sehen, wobei aber ähnlich wie für mCherry auch ohne Zn2+-Zusatz wt und mutiertes E4orf6 Protein nachweisbar exprimiert wurden. Allerdings waren im Falle von mCherry nur fluoreszenzmikroskopisch vereinzelt leuchtende Zellen zu sehen gewesen, während ein entsprechendes Proteinsignal im IB ausblieb (vgl. Abb. 7 und Abb. 10). Dies könnte auf Unterschiede im Expressionslevel, z.B. durch unterschiedliche Transfektionsraten, und/oder in der Sensitivität des jeweiligen Antikörpernachweises zurückgehen. Unabhängig davon zeigten die Daten, dass im transienten Format alle Ansätze zur Expression der erwarteten E4orf6 Proteine führten.

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Das IB-screening von 20 selektionierten Einzelzellklonen des pCEP4_BCmut Ansatzes zeigte für 15 Klone ein entsprechendes Proteinsignal; beispielhaft sind die Daten für 10 dieser Zellklone in Abb. 10A gezeigt. Im Vergleich zu dieser 75%-igen Erfolgsrate konnte für E4wt im pCEP4-Kontext aus 30 untersuchten Einzelklonen kein einziger Zellklon mit stabiler Expression des wt hAdV5 Proteins generiert werden; die Daten für 9 repräsentative Zellklone sind in Abb. 10B gezeigt. Dies lässt einen negativen Selektionsdruck durch konstitutive Expression des E4wt Proteins vermuten, möglicherweise aufgrund dessen Interferenz mit der zellulären Reparatur-maschinerie (Stracker et al. 2002) (Schreiner et al. 2012). Unterstützt wird diese Annahme dadurch, dass mit dem induzierbaren pMEP4-Systems Einzelklone mit IB-nachweisbarer Proteinexpression sowohl für BCmut wie auch für E4wt etabliert werden konnten, allerdings mit unterschiedlicher Frequenz. Von 30 getesteten Einzelklonen aus dem pMEP4_BCmut Ansatz ergaben 25 Klone (~83%) eine spezifische Proteinbande im IB; von 36 Klonen aus dem pMEP4_E4wt Ansatz waren nur 12 (33,3%) in diesem Assay positiv. Einige repräsentative Ergebnisse sind in Abb. 10 gezeigt. Auch in diesen Versuchen war eine von der Zn2+ Supplementierung unabhängige Basalexpression beider hAdV5 Proteine nachweisbar. Dieses Expressionsniveau scheint auch für das E4wt Protein nicht direkt zelltoxisch zu sein, die geringere Frequenz positiver Zellklone könnte aber auf begrenzt nachteilige Effekte hinweisen.

Die weitere Charakterisierung der Zelllinien erfolgte für das E4wt Protein hauptsächlich mit dem Einzelklon pMEP4_E4wt #B11, für die BCmut Variante mit dem pMEP4_BCmut Klon #F4 (Abb. 10). Diese werden im Folgenden mit E4wt #B11 und BCmut #F4 abgekürzt. Zunächst wurde das Ausmaß der Proteininduktion unter verschiedenen Zn2+ Konzentrationen für beide Zelllinien im IB quantitativ validiert. Die Analyse der Homogenität der Proteinexpression auf Einzelzell-Ebene erfolgte mittels Immunfluoreszenz (IF). Um mögliche Effekte der überexprimierten E4orf6-Varianten auf das Zellwachstum festzustellen, wurden Wachstumskurven der jeweiligen Zellklone erstellt. Um eine Selektion inaktiver E4orf6 Mutanten während der Zellklonierung auszuschließen, wurde das Vorliegen der korrekten Sequenz der entsprechenden e4orf6 Gene nach PCR-Amplifikation bestätigt. Die Ergebnisse sind in Abb. 11A-E zusammengefasst.

49 Ergebnisse

Abb. 11 Validierung der E4orf6 Expression in den Einzelklonen E4wt #B11 und BCmut #F4 (A) IB-Analyse der Zn2+-Abhängigkeit der E4orf6 Protein-Expression. Die Zellen wurden in Duplikaten für 3 Tage in Anwesenheit der angegebenen Zn2+ Konzentrationen kultiviert. Nach SDS-Lyse der Zellen erfolgte die IB-Analyse wie in Abb. 10 beschrieben. (B) Quantitative Auswertung der 34 kDa E4wt und BCmut Signale des in (A) gezeigten IB. Zunächst wurde die Bandenintensität aller Signale in MultiGauge ermittelt. Der Wert für die 34 kDa E4orf6-Bande wurde mit dem des β-Aktin Signals in derselben Spur ins Verhältnis gesetzt und der für die uninduzierte (0 µM) Probe errechnete Quotient auf 1,0 gesetzt. (C) Wachstumskurven der angegebenen Zelllinien. An Tag 0 wurden 3x105 Zellen ausplattiert und die Lebendzellzahl an den genannten Tagen (d, day) durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. (D) IF-Mikroskopie. Die Zellen wurden für 15 min mit 4% PFA fixiert und mit 0,2% TritonX100 für 30 min permeabilisiert. Die E4orf6-Proteinfärbung erfolgte mit RSA3 (1:10) und einem Cy3-markierten Sekundärantikörper (Dianova 115-166-072, 1:500). Die Zellen wurden in Mowiol eingebettet. Kerne sind mit DAPI gegengefärbt. Für die Cy3 Detektion zum E4orf6 Nachweis (rot) wurde ein

50 Ergebnisse

555 nm Filter eingesetzt, für DAPI ein 365 nm Filter. Belichtungszeit: je 500 ms, 40-fache Vergrößerung. (E) PCR-Nachweis der E4orf6 Expressionskassetten in den Einzelklonen E4wt #B11 und BCmut #F4. Je 100 ng genomischer DNA wurden als Matrize für eine KAPA-Polymerase PCR mit den Primern pMEP4_MT(+) und pCEP4_MEP4_rev(-) eingesetzt, welche im leeren Vektor einen Teil des MT-Promotors und die stromab gelegenen multiplen Klonierungsstellen im Abstand von ca. 400 bp flankieren. Als Positivkontrolle dienten 0,1 pg und 0,01 pg des pMEP4_E4wt Transfektionsplasmids, als Negativkontrollen der leere pMEP4-Vektor und

H2O. Die per Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennten Produkte wurden mit Ethidiumbromid (EtBr)-FL sichtbar gemacht. Die E4orf6-spezifischen 1.200 bp PCR Produkte wurden aus dem Gel ausgeschnitten und die Anwesenheit der korrekten Sequenzen durch Sequenzierung bestätigt.

Sowohl die BCmut #F4 wie auch die E4wt #B11 Zellen zeigten im IB eine Zn2+-abhängig gesteigerte E4orf6 Expression (Abb. 11A). Die Quantifizierung der IB-Signale (jeweils normiert auf das β-Aktin-Signal in derselben Spur) zeigte für beide Zelllinien bei 50 µM Zn2+ eine mindestens 2,5-fach verstärkte Adenovirus-Protein Expression im Vergleich zu den nicht induzierten Zellen. Mit 100 µM Zn2+ wurde die Expression in der E4wt Zelllinie #B11 auf etwa das 4-fache gesteigert, für die BCmut #F4 Zelllinie war nur noch ein geringer Anstieg zu beobachten (Abb. 11B); auch blieb die maximale Bandenintensität des mutierten E4orf6 Proteins aus den #F4 Zellen hinter der des E4wt Proteins aus den #B11 zurück. Konzeptuell sollten stabile Zelllinien auf Basis episomaler Vektoren eine geringere Klon-zu-Klon Variabilität aufweisen als auf zufälliger Integration basierende Zelllinien. Eine mögliche Erklärung für die geringere Intensität der BCmut Signale wäre eine geringere Kopienanzahl des BCmut Vektors in der Zellpopulation, z.B. durch eine unvollständige Zellvereinzelung bei Beginn der Selektion oder durch Verlust der BCmut Expression während der Propagation unter Selektionsdruck (ähnlich dem hohen Anteil resistenter, aber Reporter-negativer Zellen in den anfänglichen Versuchen; s. oben); demnach würde ein geringerer Anteil der Zellen das adenovirale Protein exprimieren als im Fall der E4wt Zellen. Um dies zu testen, wurde die Expression beider Proteine mittels IF auf Einzelzellniveau untersucht (Abb. 11D). Hierbei wiesen zumindest nach Zn2+-Induktion nahezu alle Zellen jeder Linie eine nachweisbare E4orf6 Expression auf, jedoch erschien die FL-Intensität pro Zelle in den E4wt Zellen durchschnittlich stärker; in keinem Fall war die Proliferationsfähigkeit der Zellen im Vergleich zu naiven HepG2 Zellen messbar beeinflusst (Abb. 11C). Erklärungsmöglichkeiten für die geringere Expression des BCmut Proteins pro Zelle wären u.a. eine verminderte Stabilität des mutierten E4orf6 Proteins, z.B. durch den Verlust der Interaktionsfähigkeit mit Elongin B und C, aber auch Nukleinsäure-basierte Mechanismen, wie eine epigenetisch verminderte Transkription in den BCmut #F4 Zellen oder eine höhere Kopienzahl des pMEP4-E4wt Vektors in der #B11 Zelllinie. So zeigen mehrere in vivo-Studien, dass EBV- basierte Vektoren in 5-30 Kopien pro Zelle vorliegen können; Die Kopienanzahl der Plasmide

51 Ergebnisse bleibt dann über eine Langzeitkultivierung erhalten (Sclimenti et al., 2003) (Gallaher et al., 2009).

Für eine Abschätzung der Vektoranzahl pro Zelle wurde eine Vektor-spezifische PCR mit genomischen DNA- (gDNA-) Präparationen aus den BCmut Linien #D4 und #F4 sowie den E4wt Linien #B11 und #D2 durchgeführt, die auf gleiche Gesamt-DNA-Konzentration eingestellt waren. Die verwendeten Primer flankieren die multiple Klonierungsstelle im pMEP4 Vektor. Bei Anwesenheit des kompletten E4orf6 ORFs sollten Amplifikate von ca. 1,2 kb Länge entstehen, ohne Insertion wäre die Länge ca. 400 bp. Als Referenzen dienten definierte Mengen (0,1 pg und 0,01 pg pro PCR-Reaktion) der gereinigten pMEP4_E4orf6 Plasmid DNA, sowie gDNA aus mit leerem pMEP4-Vektor transfizierten Zellen. Zudem wurde eine Negativkontrolle ohne template-DNA ("Wasserkontrolle“, H2O) mitgeführt. Wie in Abb. 11E gezeigt, ergaben alle vier Zelllinien-DNAs Amplifikate, deren Größe mit der der zugehörigen E4orf6-Vektor-DNAs übereinstimmte. Die Spezifität der PCR zeigte sich durch das komplette Fehlen eines Signals in der Wasserprobe und eine definierte, kleinere Bande mit leerem pMEP4-Vektor als template. Die Sequenzierung der 1,2 kb PCR-Produkte bestätigte das Vorliegen intakter E4orf6 wt bzw. BCmut Sequenzen. Somit enthielten alle vier Zelllinien-DNA die erwarteten hAdV5 ORFs. Für das E4orf6 wt Protein wurde damit auch ausgeschlossen, dass während der Einzelklon-Isolierung aufgetretene inaktivierende Mutationen das Überleben der Zellen begünstigten.

Ein Vergleich der Bandenintensitäten in Abb. 11E zeigte für die beiden BCmut Klone #D4 und #F4 sowie den E4wt #D2 Klon vergleichbare Signalstärken, die ungefähr derjenigen der 0,01 pg Vektorkontrolle entsprechen. Hingegen erschien die Intensität des E4wt #B11 Amplifikates höher als der 0,1 pg Vektorkontrolle. Da in allen PCR Ansätzen gleiche Mengen gDNA eingesetzt wurden, bekräftigt dies die Annahme, dass in der #B11 Zelllinie der episomale Vektor in höherer Kopienzahl pro Zelle vorliegt als in den anderen getesteten Einzelklonen. Eine genauere Aussage ließe sich mittels quantitativer PCR (qPCR) treffen. Da in dieser Arbeit primär die Proteinfunktion des endogen überexprimierten E4wt bzw. der BCmut Variante im Fokus steht, wurde dieser Aspekt aber noch nicht weiterverfolgt.

Zusammenfassend zeigen die in diesem Teilkapitel dargestellten Ergebnisse, dass mit dem viralen Vektorsystem pMEP4 erfolgreich stabile HepG2 Zellen generiert werden konnten, die eine eindeutig nachweisbare Expression des hAdV5 E4orf6 Proteins in wildtypischer und E3- Ligase-defizienter Form erlauben. Die Expression der adenoviralen Proteine ließ sich durch Zn2+ Induktion des Me2+-regulierbaren MT-Promoter steigern, allerdings wurden auch ohne

52 Ergebnisse

Zn2+ per IB nachweisbare Mengen beider Proteine produziert. Unter Verwendung des konstitutiven CMV-Promoters im pCEP4 Vektorsystem gelang ausschließlich die Etablierung von Zellklonen für das mutierte E4orf6 Protein, was auf zellschädigende Effekte des wildtypischen E4orf6 Proteins hinweisen könnte. Daher war nicht auszuschließen, dass auch die basale Expression des E4wt Proteins im pMEP4 System zu einem Selektionsdruck gegen E4orf6 Aktivität führen könnte. Dies sollte sich durch Verwendung eines stringenter regulierten Expressionssystems vermeiden lassen.

3.1.2. CRISPR/Cas9 vermittelte Integration von E4wt und BCmut in den AAVS1- Lokus naiver HepG2 Zellen Um unerwünschte Nebeneffekte der Basalexpression von E4orf6 zu umgehen, wurden parallel HepG2 Zellen generiert, in denen die Expression des Transgens durch das TetON System reguliert wird. Wie das umgekehrt regulierte TetOFF-System gilt auch dieses Transaktivator-Operator-System als effiziente Methode zur präzisen Steuerung der Transgen- Expression (Kallunki et al., 2019), wobei der TetON-spezifische reverse Tet-trans-Aktivator (rtTA) nur in Anwesenheit von Tet bzw. Dox an die Tet-Operator-Elemente bindet. Die Herstellung der TetON regulierten E4wt bzw. BCmut Zelllinien erfolgte durch eine CRISPR/Cas9-vermittelte, gerichtete Integration der E4orf6 Kassetten in einen definierten Genlokus naiver HepG2 Zellen. Zur Minimierung chromosomaler Aberrationen wurden hierfür frisch von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) erworbene HepG2 Zellen (DSMZ Nr. ACC-180) eingesetzt.

Klassische Methoden zur Generierung stabiler Zelllinien benutzen virale oder Transposon- basierte Vektoren, die zur chromosomalen Integration des gewünschten Transgens führen (Izsvak et al., 2009) (Shearer & Saunders, 2015) (Kim et al., 2016). Die Integration verläuft üblicherweise zufällig und kann so die Synthese und Regulation wirtseigener Gene beeinflussen. Des Weiteren besteht die Gefahr unerwünschter Positionseffekte, wie z.B. epigenetischer Modifikationen, welche die Transkription durch Heterochromatinbildung stilllegen (Pikaart et al., 1998) (Yang et al., 2010). Diese Risiken werden durch eine gerichtete Integration transgener Elemente in einen definierten Genlokus umgangen. In dieser Arbeit wurde mittels CRISPR/Cas9 Editierung eine gezielte Integration von Expressionskassetten für E4wt bzw. BCmut Protein in den Adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1)-Lokus von HepG2 Zellen angestrebt. Dieser Genbereich auf dem Chromosom 19 (Chr. 19) humaner Zellen kodiert die Phosphatase 1 regulatorische Untereinheit 12C (PPP1R12C) und stellt die primäre Integrationsstelle des AAV während

53 Ergebnisse einer persistenten Infektion dar. Hierbei hatte sich gezeigt, dass der Verlust eines funktionellen ppp1r12c Gens keine negativen Auswirkungen auf die Vitalität der Zelle hat. Zudem weist der Genlokus eine offene Chromatinstruktur auf und ist damit zugänglich für trans-wirkende Faktoren, die unter anderem Rekombination, Transkription, Replikation sowie Chromosomsegregation ermöglichen (Lamartina et al., 2000) (Ogata et al., 2003). Diese Eigenschaften machen den AAVS1-Bereich zu einem „safe harbour“ Lokus, in dem nach Integration in vielen Fällen eine robuste Langzeitexpression des Transgens aufrechterhalten wird (Smith et al., 2008) (Oceguera-Yanez et al., 2016).

Eine präzise Modifikation von DNA-Sequenzen in der Zielzelle kann mittels HR erfolgen, was unter üblichen Bedingungen ein seltenes Ereignis ist. Die Effizienz lässt sich durch Einführung eines gezielten DNA-Strangbruchs an der beabsichtigten Integrationsstelle stark erhöhen, wofür sich die CRISPR/Cas9-Systeme anbieten (Hsu et al., 2014) (de Pater et al., 2018). Hierbei handelt es sich um vom adaptiven Immunsystem verschiedener Bakterien abgeleitete sequenzspezifische Nukleasen, deren Spezifität durch eine gRNA bestimmt wird. Die häufig verwendeten Cas9 Proteine besitzen zwei Nuklease-Domänen, die jeweils einen DNA-Strang hydrolysieren und zwei RNAs für ihre Aktivität benötigen (Terns & Terns, 2011) (Jinek et al., 2012). Die CRISPR RNA (crRNA) vermittelt über eine 20 Nukleotide lange, zur Zielsequenz komplementäre Region die Sequenzspezifität, die trans-activating crDNA (tracrRNA) bindet sowohl an das Cas9 Protein wie über Hybridisierung an die crRNA und aktiviert so die Nuklease am Zielort, sofern dort ein passendes protospacer adjacent motif (PAM) vorhanden ist. Beide RNAs können zu einer sgRNA fusioniert werden. Nach Einführung des gezielten Doppelstrangbruches kann bei Anwesenheit eines geeigneten homologen templates die HR-vermittelte Reparatur erfolgen. Typischerweise ist in einer solchen template-DNA die zu integrierende Sequenz beidseitig von mehrere hundert bp umfassenden Regionen flankiert, die homolog zu den chromosomalen Sequenzen rechts und links der Strangbruchstelle sind.

In dieser Arbeit wurde der auf dem vielverwendeten Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) basierende "AAVS1 Safe Harbor Site Targeting Kit" der Firma System Biosciences (SBI) eingesetzt, bei dem Cas9 Protein plus sgRNA einerseits und die HR-flankierte Integrationskassette andererseits jeweils auf einem Plasmid kodiert vorliegen. Die sgRNA erkennt die Zielsequenz GGGGCCACTAGGGACAG/GAT, die auf dem humanen Chr. 19 von der Sequenz TGG gefolgt wird, die dem SpCas9 PAM NGG entspricht. Der Schnitt

54 Ergebnisse erfolgt 3 Nukleotide (nt) stromauf. Die HR-Sequenzen (HL/HR) auf dem Donorvektor (DV) sind jeweils etwa 800 bp lang (Abb. 12).

Für die Herstellung des gewünschten TetON E4orf6 Integrationsvektors wurde der originale SBI DV zur Integration einer konstitutiven aEF1-Promotor-kontrollierten SpCas9 Kassette (SBI pAAVS1-Cas9dono-SA-puro, auch genutzt für stabil SpCas9 exprimierende Zellen, s. Abschnitt 3.4) in mehreren Schritten modifiziert (großteils durchgeführt von M. Nassal). Zunächst wurden im Plasmid backbone pMB1 origin of replication (ori) und Amp- Resistenzgen gegen RSF ori und Kanamycin-Resistenzgen ausgetauscht; hierdurch waren sauberere Plasmidpräparationen möglich, da in den langsam wachsenden Bakterienkulturen keine Plasmid-losen Zellen hochwuchsen. Im nächsten Schritt wurde der aEF1-Promoter durch eine synthetische Sequenz für den Tetracycline-response-Element 3G (TRE3G)- Promoter ausgetauscht, die seinerzeit aktuellste Version des TRE-Promoters; hierauf wurde über eine "selbstspaltende" P2A-Protease-Sequenz (Tang et al., 2016) (Li et al., 2019) ein synthetisches Gen für einen reversen tet-Trans-Aktivator (rtTAV16; (Kinoshita et al., 2012)) an das Vektor-kodierte Puromycin-Resistenz (PuroR)-Leseraster fusioniert und schließlich die SpCas9 kodierende Sequenz durch die ORFs für E4wt bzw. die BCmut Variante ersetzt (pRSF-AAVS1donor_rtTA-TRE3G-Ad5E4orf6 bzw. -BCmut); eine lineare Version der zugehörigen Plasmidkarte inklusive weiterer regulatorischer Elemente ist in Abb. 12B gezeigt. Für Kontrollzwecke wurde analog statt der E4orf6 Sequenzen ein eGFP ORF integriert (pRSF-AAVS1donor_rtTA-TRE3G-eGFP). Der eigentliche P2A-Mechanismus ist keine Spaltung, sondern die Nicht-Ausbildung einer Gly-Pro-Bindung durch "ribosome- skipping" während der Translation (Donnelly et al., 2001).

Bei korrekter Integration des Transgens in den AAVS1-Lokus würden die nachfolgenden Schritte erwartet: a) Über die 5´-proximale splice-Akzeptor (SA) Stelle entsteht ausgehend vom endogenen PPP1R12C-Promotor eine neue mRNA, in der nach splicing mit einer stromauf gelegenen endogenen splice-Donor (SD) Stelle die T2A-PuroR-P2A-rtTAV16 Kassette in-frame mit Exon1 des PPP1R12C platziert wird. b) Bei der Translation werden daraus mittels der 2A Sequenzen separat Puromycin-Resistenz (zur Selektion transfizierter Zellen) und rtTAV16 Protein (zur induzierbaren Expression TRE- kontrollierter Gene) generiert. Da es sich um ein TetON System handelt, erfolgt die Induktion des TRE3G-Promotors erst bei Zugabe von Tetrazyklin (Tet) bzw. seinem Derivat Doxycyclin (Dox). 55 Ergebnisse

Abb. 12 Schematische Darstellung des humanen AAVS1-Lokus und der E4orf6 wt/ BCmut kodierenden Integrationskassette (A) Darstellung des humanen Chromosom 19 (Chr. 19). Die Position der AAVS1 Integrationsstelle im ersten Intron des ppp1r1c Gens ist durch den weißen Pfeil markiert. Die Erkennungssequenz der AAVS1-sgRNA ist grau eingerahmt. Sie vermittelt den spCas9 induzierten Doppelstrangbruch exakt 3 bp vor dem PAM (modifiziert aus (Oceguera-Yanez et al., 2016). (B) AAVS1-E4wt/BCmut Integrationskassette. Die AAVS1- homologen Bereiche (ca. 800 bp) des Donorvektors (DV) sind als Homologie-links und -rechts bezeichnet (AAVS1-HL, -HR). Die Transkription des E4orf6-Transgens erfolgt mittels rtTA vom Dox-abhängigen TRE3G- Promoter. Die mRNA für PuroR und rtTA wird vom chromosomalen ppp1r1-Promotors aus durch splicing zwischen einem endogenen splice-Donor (SD) und dem splice-Akzeptor (SA) auf der Integrationskassette gebildet, die T2A und P2A Elemente ermöglichen die Synthese unabhängiger PuroR und rtTA Proteine. pA: Polyadenylierungssignal des bovinen Wachstumshormons (bGH) bzw. von SV40, V16: Aktivierungsdomäne aus dem Herpes Simplex Virus am rtTA. Kanamyzinresistenz (KanaR) und pRSF ori sind Teile des Klonierungsvektors außerhalb der Integrationskassette. Die unbeschrifteten Blockpfeile repräsentieren Isolatoren zur stabileren Expression integrierter Gene (Geyer, 1997). Der analoge Reporter-DV pRSF-AAVS1donor_rtTA- TRE3G-eGFP /nicht gezeigt) kodiert statt E4orf6 eGFP.

Für die Herstellung induzierbarer AAVS1_E4wt bzw. AAVS1_BCmut HepG2 Zellen wurden die entsprechenden Donorplasmide mit dem SBI Vektor pEF1-hspCas9-H1-AAVS1-gRNA kotransfiziert, der ein Myc-tag und nuclear localization signal (NLS) modifiziertes SpCas9 unter Kontrolle des aEF1-Promotors und zusätzlich die AAVS1-spezifische sgRNA unter Kontrolle des humanen H1 RNA-Polymerase 3 Promotors kodiert. Zur besseren Verfolgbarkeit des Integrationsansatzes wurde auch eine Kotransfektion mit dem analogen eGFP-DV durchgeführt; hier sollte nach erfolgreicher AAVS1-Integration Tet- bzw. Dox- abhängig eGFP exprimiert werden. Für erste Tests wurden die Transfektionsansätze ab Tag 3 nach Transfektion in Gegenwart von 1,5 mg/ml Dox kultiviert und an Tag 5 mittels FL-

56 Ergebnisse

Mikroskopie (eGFP) bzw. IB (E4orf6, BCmut) auf Dox-abhängige Proteinexpression geprüft (Abb. 13).

Abb. 13 Transgenexpression in HepG2 Zellen nach Kotransfektion mit eGFP- bzw. E4orf6 Donorvektor und Cas9-AAVS1sgRNA Expressions-Plasmid Etwa 1x106 HepG2 Zellen wurden mit je 1 µg des entsprechenden DV zusammen mit dem Vektor pEF1- hspCas9-H1-AAVS1-gRNA kotransfiziert. Nach zweitägiger Induktion mittels 1,5 µg/ml Dox im Medium erfolgte an Tag 5 nach Transfektion der Expressions-Nachweis für die Donor-kodierten Transgene. (A) FL- Mikroskopie der mit dem eGFP-DV transfizierten HepG2 Zellen. Gezeigt ist eine repräsentative HF-Aufnahme für induzierte Zellen (Vergrößerung 5-fach; Belichtungszeit: 20 ms) sowie FL-Aufnahmen für nicht-Dox- behandelte vs. Dox-behandelte Zellen (470 nm Filter; Belichtungszeit: 2.000 ms). (B) IB auf Dox-abhängige E4wt bzw. BCmut Expression. Die Durchführung erfolgte wie in Abb. 10 beschrieben.

In der FL Aufnahme zeigten sich wie erwünscht erst nach Dox-Supplementation eGFP- positive Zellen, allerdings im Vergleich zur Gesamtzellmenge in sehr geringer Frequenz (Abb. 13A). Wegen der schlechten Transfizierbarkeit von HepG2 Zellen war dies nicht unerwartet; unter mehreren getesteten Transfektionsreagenzien lieferte aber das routinemäßig benutzte Mirus TransIT-LT Reagenz mit Transfektionseffizienzen von (vereinzelt) bis zu 30% stets die besten Ergebnisse. Auch im IB auf E4orf6 waren nur nach Dox-Zugabe Banden an der erwarteten 34 kDa Position zu detektieren (Abb. 13B), die in den uninduzierten Ansätzen wie auch in naiven HepG2 Zellen fehlten. Die sehr geringe Bandenstärke ist angesichts der geringen Anzahl GFP-positiver Zellen in den Parallelansätzen sehr wahrscheinlich auf die ineffiziente Transfektion zurückzuführen. Zur Eliminierung nicht transfizierter Zellen wurden daher durch Selektion mit 2 µg/ml Puromycin wie in Abb. 9A, ii) beschrieben Einzelklone herangezogen und diese dann auf Transgen-Expression getestet (Abb. 14). Ein repräsentativer Klon aus dem eGFP-Reporteransatz (rTA-GFP #1) zeigte in der FL nach Dox-Zugabe tatsächlich eine drastisch erhöhte Frequenz GFP-positiver Zellen. Auch die Zellklone E4wt #1-4 und BCmut #2-5 produzierten in Anwesenheit von Dox jeweils

57 Ergebnisse deutlich detektierbare spezifische Banden; für die Klone E4wt #3 und #4 sowie BCmut #4 und #5 ist in Abb. 14 explizit die Dox-Induzierbarkeit dargestellt.

Abb. 14 Transgenexpression in selektionierten HepG2 Einzelklonen Die Herstellung der Einzelklone erfolgte nach dem in Abb. 9A, ii) dargestellten Schema. Die Proteinsynthese wurde durch 1,5 µg/ml Dox im Medium für mindestens 24 h induziert. Die Detektion von eGFP in der FL- Mikroskopie erfolgte wie in Abb. 9, der Nachweis von E4orf6 und β-Aktin per IB wie in Abb. 10 beschrieben.

In einem nächsten Schritt wurden E4orf6-IB-positive Einzelklone auf korrekte Integration des Transgens in den AAVS1-Lokus untersucht. Hierzu wurde die gDNA der Zellen isoliert und mithilfe spezifischer Primer die Übergänge des rechten und linken Homologiearms in die Integrationskassette mittels PCR geprüft und die Richtigkeit der entsprechenden Sequenzen bestätigt. Hierzu dienten 6 Primer, deren Namen und Spezifitäten in Abb. 15 schematisch dargestellt sind.

Abb. 15 Schematische Darstellung des AAVS1-Lokus nach Integration der E4orf6 Donorkassetten und Positionen der PCR-Primer zum Integrations-Nachweis Die obere Grafik zeigt die Zielregion auf Chr. 19 vor Integration, die untere Grafik dieselbe Region nach korrekter Integration der Donorkassetten. Primer sind durch Pfeile dargestellt, jeweils mit ihrer Bezeichnung, Orientierung und relativen Position. Senkrechte gestrichelte Linien symbolisieren die Grenzen der auf den DV enthaltenen chromosomalen AAVS1-Regionen. Die Primer HL+ (Homologie links, Vorwärts-Primer) und HR- (Homologie rechts, Rückwärts-Primer) binden außerhalb des Donorbereichs an den AAVS1-Lokus, alle anderen Primer innerhalb. Neu entstandene Übergänge zwischen chromosomaler DNA und Donor-DNA sind wie durch PCR-Produkte eines Donor-externen (z.B. HL+) mit einem Donor-internen Primer (z. B. PuroR1-) zu erkennen; Donor-interne Primer-Paare zeigen nur die Anwesenheit der Donor-Kassette aber nicht ihren spezifischen Integrationsort an. Die jeweils erwarteten Amplifikat-Längen sind ebenfalls angegeben. Das Primer-Paar HL+ und HL- amplifiziert auf einem wt AAVS1-Allel eine ca. 1.200 bp umfassende Region inklusive der

58 Ergebnisse

CRISPR/Cas9 Schnittstelle. Mittels Sequenzierung kann hierdurch auf nicht-HR-Editier-Ereignisse, z. B. Indel- Bildung durch NHEJ, getestet werden.

Für die Untersuchung des genomischen Hintergrunds der selektionierten AAVS1-HepG2 Einzellklone wurden jeweils 100 ng chromosomaler DNA pro PCR als Matrize eingesetzt. Eine erste PCR-Serie mit KAPA-HiFi DNA-Polymerase ergab diverse unspezifische Amplifikate (Ergebnisse nicht gezeigt). Durch die Optimierung der PCR als Touchdown (TD)-PCR wurden Spezifität und Sensitivität deutlich gesteigert. In der TD-PCR wird ein Zyklusprogramm verwendet, bei dem die anfängliche annealing-Temperatur über der theoretischen Schmelztemperatur der verwendeten Primer liegt. Hierdurch wird das Primer- annealing besser auf vollständig komplementäre Matrizen-Sequenzen begrenzt und die Amplifikation unspezifischer Sequenzen minimiert. Im weiteren Zyklusverlauf wird die annealing-Temperatur stufenweise auf die berechnete Temperatur verringert und die weiteren Zyklen bei dieser Temperatur durchgeführt (Korbie & Mattick, 2008). Bei der zum screening der Einzellklone verwendeten TD-PCR wurde nach je 4 Zyklen die annealing-temperatur um 1 °C verringert. Die jeweiligen Amplifikate sind in Abb. 16A-D gezeigt. Als

Spezifitätskontrolle diente eine H2O-Probe sowie gDNA aus naiven HepG2. Die Agarosegel- Bilder sind repräsentativ so gewählt, dass die wichtigsten Einzellklone abgebildet sind. Weiße, dünne Pfeile markieren (wenn angeben) das jeweils spezifische PCR-Produkt, die Blockpfeile zeigen DNA-Fragmente, deren Sequenz als korrekt bestätigt wurde. Die mit einem „*“ markierten E4wt- und BCmut-Klone wurden in dieser Arbeit für alle weiteren Experimente verwendet.

59 Ergebnisse

Abb. 16 Agarosegel-Elektrophorese der TD-PCR Amplifikate aus selektionierten Einzelklonen zur Validierung einer korrekten AAVS1-Integration Die TD-PCR erfolgte mit je 100 ng gDNA pro TD-PCR unter den folgenden Primer annealing Bedingungen: Je 4 Zyklen bei 69 °C, 68 °C, und 67 °C gefolgt von 11 Zyklen bei 66 °C. PCR Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und mittels EtBr.-Färbung sichtbar gemacht. Die weißen, dünnen Pfeile (wenn angegeben) markieren Produkte mit der jeweils erwarteten Größe, die Blockpfeile kennzeichnen Amplifikate, deren Sequenz als korrekt bestätigt wurde. Die mit einem „*“ markierten E4wt- und BCmut-Klone wurden für alle Folgeexperimente in dieser Arbeit verwendet. (A) 600 bp Amplifikat der Integrationskassette mit den Primern HR+ und PuroR-. (B) 1.300 bp Amplifikat der Übergangsregion Integrat-Chromosom am HL-Arm mit den Primern HL+ und PuroR-. (C) 1.030 bp Amplifikat der Übergangsregion Integrat-Chromosom am HR- Arm mit den Primern LoxP+ und HR-. (D) 1.200 bp Amplifikat der AAVS1-CRISPR/Cas9 Schnittstelle des wt AAVS1-Allels mit den Primern HL+ und HL-

Zunächst wurde generell auf die Anwesenheit der Integrationskassetten in den selektionierten Einzelklonen getestet. Die Primer HR+ und PuroR- binden beide innerhalb der Integrationskassette und daher unabhängig von einem spezifischen Integrationsort. Abb. 16A zeigt für alle getesteten Zellklone, wie auch für die selektionierte Mischpopulationen (-pool), eine Bande der erwarteten Größe von ca. 600 bp. Demnach enthalten alle Zellpopulationen zumindest den PuroR-kodierenden Bereich der Integrationskassette, was aufgrund der

60 Ergebnisse

Resistenz der Zellen zu erwarten war. Da bei einer CRISPR/Cas9-vermittelten Integration via HR eine, keine oder maximal zwei Kopien der Integrationskassette vorliegen können, wäre bei gleicher eingesetzter template-DNA-Menge (je 100 ng pro PCR) eine einheitlichere Bandenintensität zu erwarten. Allerdings können Variationen der DNA-Qualität sowie der PCR-Effizienz innerhalb einer Probe nicht ausgeschlossen werden. Wegen der primären Bedeutung der qualitativen Aspekte wurde aber auf eine genauere Abklärung verzichtet.

Das Primerpaar HL+ und PuroR- überspannt den linken Übergangsbereich zwischen AAVS1- Lokus und PuroR in der Integrationskassette, sodass ein 1.300 bp langes PCR Produkt entsteht (Integration HL-Arm). Das in Abb. 16B dargestellte Ergebnis der TD-PCR zeigt für die BCmut-Klone #4 und # 5 sowie für die E4wt-Klone #1, #3, #4 und #24 eine dominante Bande der entsprechenden Größe. Nach Gel-Aufreinigung dieser Fragmente wurde die korrekte Sequenz für die Einzelklone BCmut #4 und #5 sowie für E4wt #3 und #4 bestätigt.

Das Primerpaar LoxP+ und HR- amplifiziert die rechte Integrationsregion. LoxP+ bindet innerhalb des Integrats, HR- auf dem chromosomalen AAVS1 Bereich, wodurch ein 1.030 bp langes PCR-Produkt synthetisiert wird (Integration HR-Arm). Das TD-PCR-Ergebnis in Abb. 16C zeigte für alle selektionierten Zellklone ein spezifisches PCR-Produkt etwas oberhalb der 1 kb Markerbande, das in naiven HepG2 Zellen sowie in der Wasserkontrolle fehlte. Die Sequenzanalyse der zugehörigen PCR-Produkte der E4wt Klone #3 und #4 sowie der BCmut Klone #4 und #5 ergab jeweils die für eine korrekte Integration im rechten Homologiebereich erwartete Sequenz.

Unter Verwendung der Primer HL+ und HL- wurde geprüft, ob die selektionierten Einzelklone auch ein wt AAVS1-Allel aufweisen. Die Primer flankieren die Integrationsstelle inklusive der erwarteten CRISPR/Cas9 Schnittstelle. Die Abb. 16D zeigt ein repräsentatives Ergebnis der zugehörigen TD-PCR. In diesem PCR-setting diente die gDNA aus naiven HepG2 Zellen (mit unmodifiziertem AAVS1-Lokus) als Positivkontrolle. Alle getesteten Zellklone ergaben analog den naiven Zellen ein spezifisches PCR-Produkt der erwarteten Größe von ca. 1.200 bp. Demnach enthielten auch die Zellklone E4wt #3 und #4 sowie BCmut #4 und #5 mit korrekter Integration in den AAVS1-Lokus (vgl. Abb. 16B, C) ein AAVS1 Allel ohne Integrat. Sie sind folglich bezüglich der hAdV5 e4orf6 Gene heterozygot. Ohne Reparaturmatrize wird der von CRISPR/Cas9 induzierte DSB mittels fehlerbehaftetem NHEJ repariert. Dabei entstehen oft Insertionen oder Deletionen (Indels) variabler Länge (Hsu et al., 2014). Nach Aufreinigung der PCR-Produkte wurde durch Sequenzanalyse die Entstehung von Indels an der CRISPR/Cas9 Schnittstelle überprüft. Hierbei konnte in keinem

61 Ergebnisse der Klone ein im Vergleich zu naiven HepG2 Zellen editiertes Fragment gefunden werden. Dies lässt auf eine ineffiziente CRISPR/Cas9 Reaktion schließen, was die Entstehung von relativ wenigen korrekten Zellklonen erklären würde; auch hierfür ist wahrscheinlich die geringe initiale Transfektionseffizienz verantwortlich.

Die in diesem Teilkapitel dargestellten Ergebnisse zeigen zusammenfassend, dass HepG2 Einzelklone mit einer AAVS1-spezifischen Integration der Expressionskassetten für hAdV5 E4orf6 (AAVS1_E4wt #3, #4) und seiner BCmut Variante (AAVS1_BCmut #4, #5) erfolgreich etabliert werden konnten. Mittels TD-PCR konnte eine korrekte, heterozygote Transgen-Integration in den AAVS1-Lokus bestätigt werden, während das zweite AAVS1- Allel in allen untersuchten unmodifiziert vorlag. Die Expression der adenoviralen Proteine war wie gewünscht strikt Dox-abhängig, was gegenüber dem episomalen pMEP4 Vektorsystem den Vorteil bietet, dass die Zellen bis zum eigentlichen Experiment, hier dem avisierten Proteomvergleich, praktisch ohne E4orf6 Expression und deren mögliche toxische Effekte propagiert werden können. Die folgenden Versuche zielten daher darauf ab, weitere für die Proteomanalyse wichtige Parameter der aus dem episomalen (pMEP4) vs. dem integrativen Ansatz (AAVS1) hervorgegangenen Zelllinien zu vergleichen, insbesondere die Mengen an adenoviralem Protein und den Anteil der tatsächlich produktiven Zellen. Hierfür wurden die AAVS1 Zellklone E4wt #4 und BCmut #5 sowie die pMEP4 Klone E4wt #B11 und BCmut #5 eingesetzt, alle mit bestätigt korrekter Transgensequenz.

Bereits in den initialen IBs (Abb. 14) waren die E4orf6-Signale relativ zur jeweiligen β- Aktin-Ladekontrolle in den Zelllinien des AAVS1-Integrations-Ansatzes nach Dox-Induktion schwächer erschienen als in den pMEP4 Zellen nach Zn2+-Induktion (Abb. 11). Zur Prüfung dieser Vermutung wurden nun entsprechende Proben aus allen Zelllinien parallel auf einer einzigen PVDF-Membran auf E4orf6 und β-Aktin getestet und für jede Spur das jeweilige E4orf6 zu β-Aktin Signalverhältnis durch Densitometrie bestimmt (Abb. 17A). Laut Auswertung des beispielhaften IB in (Abb. 17A) enthielten Zn2+-induzierte pMEP4 E4wt #B11 Zellen ≥20-fach so viel E4wt Protein wie Dox-induzierte AAVS1 E4wt #4 Zellen, und ≥10-mal so viel E4wt Protein wie AAVS1 E4wt #5 Zellen. Im Vergleich der BCmut Zellen war die Abundanz des adenoviralen Proteins in der pMEP4-Zellline #B4 ≥6-fach höher als in den AAVS1-Zelllinien #4 und #5.

Zwei von mehreren für die Stärke der Proteinexpression wichtigen Faktoren sind die Anzahl der Transkriptions-Matrizen pro Zelle und die Anzahl produktiver Zellen pro Kultur. Gemäß der oben gezeigten PCR Charakterisierung enthielten die AAVS1-Integrat-Zelllinien ein

62 Ergebnisse

Integrat-haltiges und ein unmodifiziertes Allel, bei angenommener Euploidie daher eine E4orf6 Transkriptionsmatrize pro Zelle. Die Kopienzahl der episomalen pMEP4-Vektoren pro Zelle wurde nicht genauer untersucht, jedoch kann laut Literatur die Kopienanzahl EBV- basierter Plasmide bis zu 30 betragen (Lufino et al., 2008). Ebenso wichtig für die geplanten Proteom-Vergleiche war aber, dass jeweils möglichst alle Zellen einer Kultur das adenovirale Protein exprimieren. Hierzu wurden die beiden AAVS1-Zelllinien mit Dox und die beiden pMEP4-Zelllinien mit 100 µM Zn2+ für 24 h induziert und nach Permeabilisierung mittels indirekter IF mit dem monoklonalen α-E4orf6 Antikörper RSA3 wie in Abb. 11D auf Anwesenheit der adenoviralen Proteine getestet (Abb. 17B).

Abb. 17 Gegenüberstellung der Proteinexpression von selektionierten E4wt und BCmut exprimierenden pMEP4 vs. AAVS1 HepG2 Zellklonen (A) IB der Proteinexpression der genannten E4orf6 AAVS1- und pMEP4-Zelllinien. AAVS1 Zellen wurden mit 1,5 µg/ml Dox stimuliert, pMEP4 Zellen mit 100 µM Zn2+, jeweils für 24 h. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine wie in Abb. 10 beschrieben mittels IB analysiert. Angegeben ist zudem das Verhältnis des E4orf6 Signals zu dem entsprechenden β-Aktin-Signals (E4orf6/β-Aktin). Die Signale wurden in MultiGauge gemessen. (B) IF-Mikroskopie der angegebenen Zelllinien. Die Induktion der Transgen-Expression erfolgte wie in (A), die Färbung der Proteine wie in Abb. 11D beschrieben.

In der IF wurden erhebliche Unterschiede in der jeweiligen Frequenz produktiver Zellen deutlich; insbesondere zeigte die Überlagerung mit der DAPI-Färbung in den AAVS1-Linien trotz Einzelklon-Selektion viele Antigen-negative Zellen gegenüber wenigen, z.T. sehr stark positiven Zellen. Dagegen waren in der pMEP4 E4wt #B11 Zelllinie praktisch alle Zellen doppelt gefärbt, bei insgesamt homogenerer Signalintensität (Abb. 17B). Dieser Gesichtspunkt ließ die pMEP4 Zellen für den Proteom-Vergleich geeigneter erscheinen als 63 Ergebnisse die bezüglich der E4orf6 Expression wesentlich heterogeneren AAVS1 Zellen. Um zu testen, ob die in der IF negativ erscheinenden AAVS1 Zellen die E4orf6 Proteine eventuell auf einem Niveau unterhalb der Detektionsgrenze des IF-Assays exprimieren, sollten die IF- Signale per Einzelzelle mittels FACS quantifiziert werden; trotz Optimierungsversuchen verhinderten aber unspezifische Signale in den naiven Kontrollzellen eine sinnvolle Auswertung. Eine Möglichkeit zur Anreicherung stark E4orf6-positiver Zellen wäre eine erneute Einzelklonselektion (Subklonierung) der AAVS1-Zelllinien gewesen. Wegen des erheblichen Aufwandes erhielt aber die funktionelle Charakterisierung der in den Zelllinien gebildeten hAdV5 Proteine eine höhere Priorität.

3.2. Phänotypische Charakterisierung der E4orf6 exprimierenden HepG2 Zelllinien

Stabil hAdV5 E4orf6 Protein exprimierende humane Hepatomzellen sind nicht publiziert, die in Abschnitt 3.1 dargestellten Ergebnisse belegten aber, dass sowohl mit dem episomalen pMEP4-Vektor wie durch AAVS1-spezifische Integration HepG2 Zellklone mit IB- nachweisbarer E4orf6 Protein Produktion etabliert werden können. Andererseits waren mit dem pMEP4-analogen, aber durch einen konstitutiven CMV-IE-Promotor kontrollierten pCEP4-Vektor stabile Zellklone ausschließlich für das mutierte BCmut E4orf6 Protein erhalten worden. Somit war eine gewisse Zytotoxizität der wt-E4orf6 Expression nicht auszuschließen. Umgekehrt beinhaltete dies die Möglichkeit einer funktionellen Beeinträchtigung des adenoviralen Proteins in den selektionierten Zellklonen, auch wenn die DNA-Sequenzierungen der Transkriptions-Matrizen keine Hinweise auf Mutationen in den E4orf6 Protein-Sequenzen ergeben hatten. Im Folgenden wurden daher funktionell wichtige Eigenschaften des E4orf6 Proteins im Vergleich zur BCmut Variante geprüft.

3.2.1. Funktionelle Untersuchung des E4orf6 Proteins in den stabilen HepG2 Zelllinien Die meisten bekannten biologischen Effekte der adenoviralen E4orf6 Proteine beruhen auf ihrer Fähigkeit, mit zellulären Faktoren funktionelle "Cullin-RING-based" E3 Ubiquitin- Ligasen (CRL) zu bilden (s. Einleitung 1.8.1), die spezifische Zielproteine poly-ubiquitylieren und so dem proteasomalen Abbau zuführen (Zhang & Sun, 2020). Neben Cullin 2 (Cul2) bei einigen hAdV Serotypen dient meist Cul5 als Plattform, das mit der eigentlichen Ubiquitin- Ligase Untereinheit Rbx1 (RING-Box Protein 1; auch Regulator of Cullins 1/ROC1) sowie Elongin B und C als Adaptor assoziiert; hinzu kommt üblicherweise ein zellulärer Substrat-

64 Ergebnisse

Rezeptor. In der hAdV-Infektion übernimmt dessen Rolle das E4orf6 Protein, wobei in den bekannten Mechanismen das E1B55k Protein die Interaktion mit zellulären Substraten wie p53 und Mre11 vermittelt (Querido et al., 2001) (Cheng et al., 2013). Wie in der Einleitung unter 1.8.1 in Abb. 5 schematisch zusammengefasst, beruht die Bindung von E4orf6 an Elongin B und C im E3-Ligase Komplex auf B/C-Box Sequenzen. Die vier in die BCmut Variante eingeführten B/C-Box Mutationen (L47G/C51V und L122S/C126M) führen zum kompletten Verlust der Elongin B/C Interaktionen und verhindern so auch der Bildung einer funktionellen Ubiquitin-E3-Ligase (Blanchette et al., 2004) (Schwartz et al., 2008) (Schreiner et al. 2012). Damit konnte die BCmut Variante als generelle Kontrolle für die Spezifität Wildtyp-E4orf6-vermittelter Effekte wie auch zur Unterscheidung Ubiquitin/Proteasom- System (UPS) abhängiger von potenziell UPS-unabhängigen Mechanismen dienen.

Einer der überzeugendsten Belege für authentische biologische Aktivität des E4wt Proteins in den stabilen HepG2 Zelllinien wäre seine Fähigkeit, ein E4orf6-depletiertes hAdV5 zu komplementieren. Ein solches hAdV5-Derivat (AdVΔE4orf6) wie auch weitere Varianten stehen in der kollaborierenden Arbeitsgruppe von PD Dr. Sabrina Schreiner in München (Ko- Projektleiterin im TP16 des SFB TRR179) zur Verfügung. Daher wurden die nachfolgend beschriebenen hAdV5-Infektionsexperimente im Rahmen eines externen Laboraufenthaltes dort durchgeführt. Spezifisch wurde mittels Ko-Immunopräzipitation (Ko-IP) geprüft, ob das in den pMEP4- bzw. AAVS1 Zellen exprimierte E4orf6 Protein physisch mit der E3- Ubiquitin-Ligase Komponente Cul5 assoziiert (s. Abschnitt 3.2.1.1), dann mittels IB validiert, ob eine potenziell gebildete E3-Ubiquitin-Ligase aktiv die Degradation der bekannten hAdV5 targets Mre11 und p53 induziert (s. Abschnitt 3.2.1.2). Als Positivkontrolle diente die Infektion mit einem wt hAdV5 (AdVwt), als Negativkontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet (Mock).

3.2.1.1. Nachweis einer E4wt-Cul5 Interaktion durch Ko-Immunpräzipitation Die Zelllinien pMEP4_E4wt #B11, pMEP4_BCmut #F4 sowie die AAVS1 Zelllinie E4wt #4 (s. Abschnitt 3) wurden entweder mit hAdV5-wt oder der E4orf6-losen Variante hAdV5- ΔE4orf6 mit einer multiplicity of infection (MOI) von 20 inokuliert, dann für 5 Tage kultiviert; die AAVS1-Zelllinie BCmut #5 konnte wegen einer bakteriellen Kontamination zum Zeitpunkt der Ko-IP leider nicht analysiert werden (eine Wiederholung des Versuchs war wegen der zeitlichen Begrenzung des externen Aufenthaltes nicht möglich). Anschließend wurde das E4orf6 Protein in den Gesamtzelllysaten mit einem spezifischen Antikörper (#1807, AG Schreiner) präzipitiert, der sowohl das wt wie auch die BCmut Variante erkennt.

65 Ergebnisse

Im nächsten Schritt wurde mittels IB auf die Anwesenheit von Cul5 in den Immunpräzipitaten geprüft. Als Präzipitationskontrolle wurden die entsprechenden Proteine im Gesamtzelllysat (Input) und zusätzlich β-Aktin detektiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 18 zusammengefasst.

Abb. 18 Ko-IP von E4orf6 und Cul5 in den stabil E4wt exprimierenden HepG2 Zelllinien IB nach α-E4orf6 IP hAdV5 infizierter pMEP4 Zelllinien E4wt #B11 und BCmut #F4 (A), bzw. AAVS1_E4wt #4 Zellen (B). Die Infektion erfolgte mit AdVwt oder AdVΔE4orf6 mit einer MOI von 20. Nach 5 Tagen wurden die Zellen in RIPA-Puffer geerntet. Die 1.000 µg Gesamtprotein entsprechende Menge Zelllysat wurde für 1 h bei 4°C mit einem an Protein-A-Sepharose beads immobilisierten α-E4orf6 Antikörper aus Kaninchen (#1807) inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Proteine durch SDS-Ladepuffer eluiert, per SDS- PAGE (12,5% Polyacrylamid) getrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert. Für den IB-Nachweis wurden eingesetzt: α-Cul5 (Bethyl Laboratories #A302-173A, 1:1.000); α-E4orf6 (RSA3, Hybridomüberstand 1:10), α-β-Aktin (Sigma #AC-15, 1:10.000); die Detektion erfolgte mittels PO-konjugierten Sekundärantikörpern und chemilumineszentem Substrat. Für die Input-Analyse wurden folgende Gesamtproteinmengen auf das Gel geladen: Zur Detektion von E4orf6: 25 µg, -Cul5: 50 µg, -β-Aktin 15 µg. Die mit „*“ markierten Banden entsprechen der Laufhöhe eines Nedd8 modifizierten Cul5 Proteins.

Qualitativ zeigten alle Zelllysate wie erwartet E4orf6-spezifische 34 kDa Banden, die in den Mock-Ansätzen und den AdVΔE4orf6 Infektionen ausschließlich von den Zellen stammen; in den AdVwt Infektionen kommt hierzu das vom Virus exprimierte wt E4orf6 Protein. Eine entsprechende Zunahme der Bandenstärke war in den E4wt exprimierenden pMEP4 und AAVS1-E4wt Zellen gut zu sehen, in der pMEP4_BCmut Zelllinie allerdings nicht. Alle Zelllysate enthielten auch gut nachweisbare Mengen an Cul5, interessanterweise in Form zweier Banden mit etwas unterschiedlicher Mobilität. Die langsamere Variante (in Abb. 18 mit * gekennzeichnet) dominierte in den mit AdVwt infizierten Ansätzen und in den Wildtyp E4orf6 exprimierenden pMEP4_E4wt Zellen, die mit AdVΔE4orf6 inokuliert worden waren; in den Mock-Ansätzen sowie in AdVΔE4orf6 inokulierten pMEP4_BCmut Zellen war die 66 Ergebnisse schneller laufende Bande stärker. Wie unten gezeigt, korreliert der Laufunterschied mit unterschiedlich starker Modifikation durch Nedd8 (neural-precursor-cell-expressed developmentally down-regulated 8), einem ca. 9 kDa großen Ubiquitin-ähnlichen Protein.

Der IB aus der IP zeigte trotz etwas schwankender Ausbeuten die Anwesenheit von E4orf6 Protein in allen Ansätzen. Cul5-spezifische Banden (bei ca. 100 kDa) waren aber selektiv nur in den pMEP4-E4wt Zellen und den mit wtAdV infizierten pMEP4-BCmut Zellen zu detektieren (Abb. 18A). Die Anwesenheit von Cul5 im Immunpräzipitat korrelierte also mit der Anwesenheit von wt E4orf6 Protein (aus den Zellen, oder von wtAdV). Wie aufgrund der B/C-Box-Mutationen erwartet, konnte die BCmut Variante keine Assoziation an Cul5 vermitteln. Das Laufverhalten der jeweils immunpräzipitierten Cul5 Banden entsprach demjenigen im Gesamtlysat (Input), d.h. mit dominanter schnellerer Bande in den Mock- infizierten pMEP4-E4wt Zellen (die keine weiteren hAdV-Proteine enthalten) und mit dominanter langsamerer Bande in allen AdVwt infizierten Zellen und selektiv den AdVΔE4orf6 infizierten pMEP4_E4wt Zellen.

Auch der Vergleich der Cul5 Mobilitäten in den Gesamtlysaten (Input) aus E4wt und BCmut exprimierenden Zellen erlaubt den Schluss, dass das verstärkte Auftreten der langsameren Cul5 Bande sowohl von wt E4orf6 wie von weiteren hAdV5 Genprodukten abhängt. So trat der Mobilitäts-shift in den pMEP4-E4wt Zellen sowohl mit AdV5wt wie hAdV5ΔE4orf6 auf, in den pMEP4-BCmut Zellen nur mit hAdV5wt.

Anders als in der pMEP4_E4wt #B11 Zelllinie konnte in AAVS1_E4wt #4 Zellen kein E4orf6 gebundenes Cul5 nachgewiesen werden. Obwohl in allen Lysat-Inputs E4orf6 im IB zu sehen war, ließ sich nach IP nur im Mock-Ansatz ein (schwaches) E4orf6 Signal detektieren (Abb. 18B), obwohl der Lysat-Input des hAdV5wt Infektionsansatzes wesentlich mehr E4orf6 enthielt. Aufgrund der fehlenden IP-Signale in dieser Positivkontrolle blieb unklar, ob das wt E4orf6 Protein in den AAVS1 Zellen keine funktionelle E3-Ubiquitin Ligase formen kann oder ob aufgrund der geringen E4wt-Menge im Immunpräzipität das Cul5-Signal unterhalb der IB-Detektionsgrenze liegt (vgl. Abb. 18A und B). Leider konnte durch die zeitliche Begrenzung des Laboraufenthaltes in München dieser Versuch nicht wiederholt werden.

Für die Aktivierung von CRLs ist die Konjugation der Culline mit Nedd8 ("Neddylierung") essentiell (Boh et al., 2011). Die resultierenden Konformationsänderungen im CRL-Komplex ermöglichen dann die Ubiquitinylierung der Substrate (Pan et al., 2004). Um zu bestätigen, dass der Laufunterschied der beiden Cul5-spezifischen Banden in den IBs (Abb. 18) 67 Ergebnisse tatsächlich auf posttranslationaler Neddylierung beruht, wurden im nächsten Experiment E4wt #B11 oder BCmut #F4 Zellen mit dem Neddylierungsinhibitor MLN4924 behandelt (Zhang & Sun, 2020).

Nedd8 wird durch eine Ubiquitinylierungs-ähnliche Enzymkaskade kovalent an konservierte Lysinreste der Culline gebunden (K724 in Cul5). Zunächst werden von einem etwas längeren Nedd8-Vorläufer die 5 C-terminalen Aminosäuren (AS) abgespalten. Die Carboxylgruppe des nun C-terminalen Gly76 wird dann ATP-abhängig aktiviert und durch das Nedd8 activating E1 enzyme (NAE, ein Heterodimer aus einer katalytischen Untereinheit, UBE1C, kodiert von UBA3 und einer regulatorischen Untereinheit, kodiert von NAE1), ein Nedd8 conjugating E2 enzyme (UBE2F oder UBE2M), und schließlich eine Substrat-spezifische Nedd8 E3 Ligase (z.B. Rbx1/2) auf das Substrat übertragen (Chung & Dellaire, 2015). Das kleine Molekül MLN4924 inhibiert E1 und blockiert damit die Neddylierungskaskade (Czuczman et al., 2016). In vielen Tumorzellen ist die Neddylierung hyperaktiv, was zum Abbau von Tumorsuppressoren führt; MLN4924 ist daher auch in der klinischen Erprobung als Krebsmedikament (Zhou et al., 2019).

Für den Cul5-Neddylierungsnachweis wurden pMEP4-E4orf6 Zellen mittels Zn2+ induziert, dann für 3 Tage mit 5 µM MLN4924 kultiviert. Anschließend erfolgte die IP des Cul5 aus den Zelllysaten und die Detektion des gebundenen Cul5 Proteins sowie eventuell gebundenem Nedd8 mittels spezifischer Antikörper im IB (Abb. 19). Im Gesamtzelllysat der nicht MLN4924 behandelten Zellen waren wie zuvor zwei nahe beieinander liegende α-Cul5 reaktive Banden zu sehen (Abb. 19); in den Inhibitor-behandelten Zellen war dagegen nur die schnellere der beiden Banden zu sehen. Umgekehrt detektierte der α-Nedd8 Antikörper nur in den unbehandelten Proben eine Bande, die mit der langsameren der beiden Cul5-Banden komigrierte. Die α-Cul5 IP (Abb. 19 links) bestätigte diese Interpretation. Der α-Nedd8 Antikörper detektierte nur in den unbehandelten Zellproben eine Bande auf Höhe der langsameren Cul5 Spezies, der α-Cul5 Antikörper zeigte in diesen Proben die bekannten Doppelbanden; in den MLN4924 Proben war ausschließlich die schnellere Spezies nachzuweisen. Somit belegen diese Versuche, dass es sich bei der langsameren α-Cul5 reaktiven Bande um neddyliertes Cul5 handelt.

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Abb. 19 Cul5 IP in MLN4924 behandelten pMEP4-Zelllinien Zunächst wurde die E4wt bzw. BCmut Expression durch 100 µM Zn2+ für mind. 24 h induziert. Anschließend wurden die Zellen mit 5 µM MLN4924 für 3 Tage inkubiert oder unbehandelt gelassen. Nach Ablauf der Inkubation wurden 1.000 µg RIPA-Proteinlysat zu Sepharose-A beads gegeben, die zuvor mit einem α-Cul5 spezifischen Antikörper beschichtet wurden. Nach 1 h Inkubation wurde das präzipitierte Cul5 durch SDS- Ladepuffer von den beads eluiert. Die Proteinauftrennung der IP-Ansätze, wie auch der Gesamtzelllysate erfolge in einem 7,5% SDS-Gel. Nach Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran wurden diese durch Inkubation mit einem α-Cul5 (Bethyl Laboratories #A302-173A, 1:1.000), α-Nedd8 (Cell Signaling #2745, 1:1.000) oder α- β-Aktin (Sigma #AC-15, 1:10.000) spezifischen Antikörper und anschließender Behandlung der Membran mit einem entsprechenden speziesspezifischen, PO-gekoppelten Sekundärantikörper mittels eines chemilumineszenten Substrats auf dem Röntgenfilm sichtbar gemacht. Molmasse Cul5: 95 kDa, Nedd8: 9 kDa, β-Aktin: 42 kDa

Zusammen zeigten die IP-Experimente, dass sowohl in der pMEP4-E4wt #B11wie auch in der BCmut #F4 Zelllinie beide Cul5-Formen vorliegen, wobei das unmodifizierte Protein dominierte (Abb. 19); erwartungsgemäß war nur das E4wt Protein zur Ko-IP von Cul5 in der Lage. Interessanterweise führte die Infektion mit wt hAdV in beiden Zelllinien zu einer drastischen Verschiebung zugunsten von neddyliertem Cul5, dass auch jeweils mit α-E4orf6 Antikörper kopräzipitiert werden konnte (Abb. 18A). Dagegen produzierte AdVΔE4orf6 ausschließlich in den E4wt Zellen einen vergleichbaren Phänotyp. Dieser hängt demnach sowohl von wt E4orf6 wie auch von mindestens einem anderen hAdV Genprodukt ab. Eine Schlussfolgerung daraus ist, dass auch in dieser Hinsicht das in der pMEP4-E4wt #B11 Zelllinie vorhandene E4orf6 Protein ein E4orf6-defizientes hAdV5 komplementieren kann. Die weitergehende Frage war, mit welchem(n) weiteren hAdV5 Genprodukt(en) E4orf6 kooperiert, um die verstärkte Cul5-Neddylierung auszulösen. Aufgrund der bekannten Interaktionen zwischen E4orf6 und E1B55k bei der E3 Ligase Bildung und der Definition ihrer Substratspezifität (s. Einleitung 1.8.1) war letzteres Protein ein plausibler Kandidat. Daher wurde getestet, ob E1B55k in pMEP4-E4wt #B11 Zellen alleine eine erhöhte Cul5 Neddylierung induziert. Hierzu wurden pMEP4_E4wt #B11 und pMEP4-BCmut #F4 Zellen mit einem E1B55k exprimierenden Vektor (pCD3.1_E1B55k) sowie -als Transfektionskontrolle- mit einem GFP (pTR-UF5, (Zolotukhin et al., 1996)) kodierenden Plasmid kotransfiziert. Erfolgreich transfizierte, grün fluoreszierende Zellen wurden im

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Zellsorter präparativ von nicht transfizierten Zellen getrennt, dann im IB auf ihr jeweiliges Cul5-Expressionsmuster analysiert; als Referenz dienten dieselben Zellen nach Transfektion mit pCD3.1-Leervektor plus GFP-Vektor (Abb. 20).

Abb. 20 E1B55k Abhängigkeit der Cul5 Neddylierung in E4orf6 exprimierenden pMEP4 Zelllinien Die E4orf6 Expression wurde in den pMEP4-Zelllinien E4wt #B11 und BCmut #F4 mit 100 µM Zn2+ für ≥24 h induziert. Anschließend erfolgte die Kotransfektion der Zellen mit gleichen Mengen pCDNA3.1_E1B55k und dem GFP-Vektor pTR-UF5; als Negativkontrollen dienten analoge Kotransfektionen mit dem Leervektor pCDNA3.1 (Spuren +GFP). Je Ansatz konnten 3x104 GFP-positive Zellen mittels FACS isoliert werden. Die Proteine aus diesen Zellen wurden per SDS-PAGE (10% Polyacrylamid) getrennt und im IB mit Antikörpern gegen Cul5 (#A302-173A, 1:1.000), E1B55k (#6B-10, 1:50) oder GFP (Chromotek #3H9, 1:2.500) wie in Abb. 19 nachgewiesen. Molmasse Cul5: 95 kDa, E1B55k: 55 kDa, GFP: 27 kDa

In beiden Referenzansätzen zeigten sich erneut beide Cul5-Banden, wobei auch hier die nicht neddylierte Form dominant war (Abb. 20, Spuren "+GFP"). Die zusätzliche Gegenwart von E1B55k Protein hatte in den BCmut #F4 Zellen keinen deutlichen Effekt; dagegen war mit E1B55k in den E4wt #B11 Zellen praktisch nur noch die neddylierte Cul5 Bande zu sehen.

Folglich überführt die gleichzeitige Präsenz von E1B55k und E4wt -aber nicht seiner B/C- Mutante- den Großteil von Cul5 in die neddylierte, E3 Ligase-aktive Form wie sie laut Literatur im CRL5-E4orf6-E1B55k Komplex vorliegt, mit dessen Hilfe hAdVs den Abbau zellulärer Faktoren induzieren. Die best untersuchten targets sind p53 und die Mre11 Nuklease als Teil des DNA-Schäden erkennenden MRN Komplexes (s. Einleitung 1.8.1). Die Degradation dieser E4orf6/E1B55k Substrate wurde im Folgenden im hAdV5- Infektionskontext untersucht.

3.2.1.2. Nachweis der Degradation von Mre11 und p53 spezifisch in E4wt exprimierenden HepG2 Zelllinien Die bisherigen Daten (s. Abschnitt 3.2.1.1) hatten eine physische Assoziation des in den pMEP4-E4wt Zellen exprimierten E4orf6 Proteins mit zellulärem Cul5 belegt, bei gleichzeitiger Anwesenheit von hAdV5 E1B55k ganz überwiegend in neddylierter Form. Zur funktionellen Validierung wurde nun der etablierte E4orf6/E1B55k-abhängige Abbau der 70 Ergebnisse targets Mre11 und p53 untersucht, ebenfalls im Rahmen des externen Laboraufenthaltes in der AG Schreiner. Hierzu wurden die Zelllinien pMEP4-E4wt #B11 und pMEP4-BCmut #F4 jeweils wie in Abschnitt 3.2.1.1 beschrieben mit hAdV5ΔE4orf6 oder hAdV5wt mit einer MOI=20 inokuliert und nach 5 Tagen im IB auf Mre11 und p53 getestet (Abb. 21). Zum Nachweis einer erfolgreichen hAdV5 Infektion wurden die frühen Genpodukte E2A und E1B55k detektiert. E2A ist ein ssDNA bindendes Phosphoprotein. Durch Proteolyse entstehen zusätzlich zum 75 kDa Volllängen-Protein auch distinkte kürzere Formen (Asselbergs et al., 1983); E1B55k kann durch Konjugation mit SUMO (small ubiquitin- related modifier) posttranskriptionell modifiziert werden (Burck et al., 2016) (Muncheberg et al., 2018). Die Infektion mit AdV5wt diente als Positivkontrolle für die Depletion von Mre11 und p53.

Analoge Infektionsversuche wurden separat von Nathalie Skvorc (zum damaligen Zeitpunkt Doktorandin in der AG Schreiner) mit den Dox-induzierbaren Zelllinien AAVS1_E4wt #4 und AAVS1_BCmut #5 durchgeführt, die aber vorab keine Hinweise auf Assoziation des wt E4orf6 Proteins mit Cul5 ergeben hatten (Abb. 18B). Auch in den funktionellen Tests ließ sich keine Aktivität des von den Zellen produzierten E4orf6 Proteins nachweisen (s. Anhang Abb. 66). Für beides könnte eine zu geringe Expression des adenoviralen Proteins verantwortlich sein (Abb. 17), was aber nicht weiter untersucht wurde. Eine generelle Blockade des Abbauweges in den Zellen ist allerdings unwahrscheinlich, da die Infektion mit AdVwt effizient die Degradation von p53 und Mre11 induzierte (s. Anhang Abb. 66).

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Abb. 21 Degradation von Mre11 und p53 nach hAdV5 Infektion der pMEP4_E4wt und _BCmut Zelllinien 24 Stunden nach Induktion der E4orf6 Expression mit 100 µM Zn2+ wurden die Zellen mit AdV5wt oder AdV5ΔE4orf6 infiziert (MOI=20); nicht infizierte Zellen (Mock) dienten als Kontrolle. Nach 5 Tagen erfolgte die IB Analyse des Gesamtzelllysats; je nach nachzuweisendem Protein wurden die folgenden Mengen Gesamtprotein aufgetragen: E4orf6: 25 µg; E1B55k: 15 µg; p53: 30 µg; Mre11: 50 µg; E2A: 10 µg; β-Aktin: 15 µg. Nach Auftrennung per SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamid) wurde der IB mit Primärantikörpern gegen Mre11 (Novus Biologicals NB 100-142, 1:200); p53 (Santa Cruz #DO-1, 1:1.000), E4orf6 (RSA3, 1:10), E2A (#6B-10, 1:10), E1B55k (#2A6, 1:10), β-Aktin (#AC-15, 1:5.000), wie in Abb. 20 beschrieben, durchgeführt.

Die Inokulation beider pMEP4 Zelllinien mit hAdV5wt und hAdV5ΔE4orf6 produzierte gut detektierbare Banden für die E2A und E1B55k Proteine, wie bei vergleichbar effizienter Infektion erwartet. Die E4orf6 Bandenstärken waren in den Mock-inokulierten und hAdV5wt infizierten Zellen ähnlich stark, in den hAdV5ΔE4orf6 inokulierten Zellen etwas schwächer. Die Ursache hierfür wurde nicht näher untersucht, da die IBs eindeutige Ergebnisse hinsichtlich der jeweiligen Level an p53 und Mre11 in den Zellen lieferten. In den E4wt #B11 Zellen mit gut detektierbarer Expression beider target-Proteine (Mock-Spuren in Abb. 21) führte sowohl die Infektion mit hAdV5wt wie auch mit hAdV5ΔE4orf6 zu deren praktisch vollständigem Verschwinden. In den BCmut #F4 Zellen dagegen bewirkte die Infektion mit dem E4orf6-defizienten hAdV5 allenfalls eine geringfügige Verringerung der Mre11 Bandenstärke, das p53 Signal erschien sogar deutlich verstärkt. Dass die Abbauwege in der Zelllinie prinzipiell aktivierbar sind, zeigte die Infektion mit hAdV5wt, die zu einer starken Abnahme der Signale beider target-Proteine führte; allerdings ließen sich, anders als in E4wt

72 Ergebnisse

#B11 Zellen, immer noch geringe Mengen beider Proteine detektieren (Abb. 21). Eine plausible Erklärung wäre, dass die B/C-Box Mutationen im mutierten E4orf6 Protein nur mit der Bindung an Elongin B/C, nicht aber an E1B55k interferieren. Daher könnte in der BCmut Zelllinie das Zell-kodierte BCmut Protein mit dem vom hAdV5wt Virus beigesteuerten E4orf6-wt Protein um E1B55k kompetieren und so die Bildung aktiver CRL5 E3-Ligase Komplexe reduzieren. Auch die starke Anreicherung von p53 in den mit dem E4orf6- defizienten hAdV5 infizierten pMEP4_BCmut Zellen ist in Einklang mit der fehlenden Möglichkeit zur Ausbildung aktiver CRL5-E4orf6-E1B55k Komplexe. Eine der vielen Funktionen des hAdV5 E1A Proteins ist die temporäre Stabilisierung von p53, die hAdV5wt später durch die E4orf6-E1B55k vermittelte p53 Degradation antagonisiert (Teodoro & Branton, 1997) (Turnell et al., 2000). In mit hAdV5ΔE4orf6 infizierten pMEP4_BCmut Zellen kann dieser kompensatorische Prozess nicht ablaufen, so dass p53 akkumuliert. Für eine Untersuchung auf Zellniveau wurde in den pMEP4 Infektionsansätzen p53 auch in der IF beobachtet (Abb. 22).

73 Ergebnisse

Abb. 22 IF-Analyse von p53 in hAdV5 infizierten pMEP4_E4wt #B11 vs. _BCmut #F4 Zellen Die Infektion erfolgte wie in Abb. 21 beschreiben. Die Durchführung der IF erfolgte gemäß den Angaben in Abb. 11D. Für die indirekte IF wurde der primäre α-E4orf6 Antikörper (RSA3, 1:10) durch einen Cy3- konjugierten (rot) Sekundärantikörper nachgewiesen (Dianova, 1:500), der α-p53 Antikörper (Santa Cruz #Fl393, 1:1.000) durch FITC (Fluorescein-isothiocyanat)-konjugierten (grün) Sekundärantikörper (Dianova, 1:100). Zellkerne wurden mit DAPI sichtbar gemacht (blau). Konfokale Aufnahme, 100x Vergrößerung. Nicht infizierte BCmut #F4 Zellen (nicht abgebildet) unterschieden sich praktisch nicht von den als mock Kontrolle dienenden E4wt #B11 Zellen.

Die IF Daten bestätigten unabhängig die IB Daten (Abb. 21) und auch die o.g. Hypothesen. Mock-infizierte pMEP4-E4wt Zellen (und genauso die entsprechenden BCmut Zellen, nicht gezeigt) zeigten eine diffus verteilte, gut nachweisbare p53 Färbung. In den E4wt #B11 Zellen war dieses Signal nach Infektion mit hAdV5ΔE4orf6 genauso stark reduziert wie nach Infektion mit hAdV5wt, im Einklang mit weitgehender Degradation des p53. Auch in den BCmut #F4 Zellen war nach Infektion mit hAdV5wt das p53 Signal stark vermindert; dagegen waren nach Infektion mit dem E4orf6-defizienten hAdV5 eine sehr deutliche, und nun vor allem im Kern lokalisierte p53 Färbung sichtbar. Dies ist analog zu indirekten IF- Daten, die für E1B55k Protein beschrieben wurden (Hart et al., 2005a). Alleine exprimiert war das Protein großteils zytoplasmatisch lokalisiert, die Anwesenheit von funktionellem E4orf6 Protein induzierte dagegen eine nukleäre Translokation (Hart et al., 2005a). Der hier beobachtete vergleichbare Effekt auf die p53 Lokalisation in Gegenwart der E4orf6 BCmut Variante steht damit und mit den o.g. Hypothesen in Einklang. Wenn die B/C-Mutationen die Interaktion von E4orf6 mit E1B55k nicht unterbinden, sollte das Protein auch durch BCmut 74 Ergebnisse

E4orf6 in den Kern transloziert werden, hier indirekt sichtbar gemacht durch die Translokation des etablierten E4orf6-E1B55k target-Proteins p53. In E4wt-haltigen Zellen ist -wie bei der Infektion mit hAdV5wt- diese Translokation nicht via p53 zu verfolgen, da dieses dem CRL5-E4orf6-E1B55k vermittelten Abbau unterliegt.

Zusammenfassend konnten in diesem Kapitel für das von der pMEP4_E4wt #B11 Zelllinie exprimierte E4orf6 Protein vergleichbare Eigenschaften nachgewiesen werden wie sie für das authentische, bei der hAdV5wt Infektion entstehende Protein etabliert sind. So assoziierte das Zell-kodierte E4wt mit Cul5 zu einer E3-Ubiquitin Ligase, die E1B55k-abhängig neddyliert wird und die Degradation von Mre11 und p53 induziert. In der BCmut Variante führten die Mutationen in den B/C-Boxen zum Verlust dieser Aktivitäten, in Einklang mit dem Verlust der Interaktionsfähigkeit mit Elongin B/Elongin C; eine Assoziation mit E1B55k scheint dagegen nach wie vor möglich.

Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, ob und inwieweit sich die eingangs in einem transienten Ko-Transfektionssystem gezeigten negativen Auswirkungen der E4orf6 Expression auf DHBV Replikation und cccDNA-Bildung in der stabil E4orf6-wt exprimierenden pMEP4-E4wt #B11 Zelllinie nachvollziehen lassen. Als Kontrolle diente wie oben die pMEP4_BCmut Zelllinie #F4.

3.2.2. Einfluss von E4orf6 auf die DHBV-Replikation in stabilen HepG2 Zelllinien Vorexperimente in unserer Arbeitsgruppe hatten gezeigt, dass die Überexpression des wt hAdV5 E4orf6 Proteins ohne Beteiligung weiterer adenoviraler Proteine DHBV Replikation und cccDNA Bildung supprimiert (Abb. 6). In transienten Kotransfektionsversuchen von E4orf6 und DHBV wurde dabei eine signifikante Reduktion der prägenomischen und subviralen RNAs im Northernblot beobachtet (C. Königer, Dissertation Uni Freiburg, 2014). Übereinstimmend damit waren die Mengen an Gesamt-Core-Protein, Kapsiden und Nukleokapsid-verpackter DNA deutlich verringert. In den folgenden Experimenten wurde untersucht, ob auch das in den stabilen pMEP4- und AAVS1-HepG2 Zelllinien exprimierte wt E4orf6 Protein die DHBV Replikation reduziert. Die entsprechenden BCmut-Zelllinien dienten wieder als Negativkontrolle.

Als Erstes wurde dazu der DHBV Expressionsvektor pCD16+env- in die pMEP4-Zelllinien transfiziert, der unter CMV-IE Enhancer/Promoter-Kontrolle ein envelope-defizientes DHBV16 Genom kodiert. Der Defekt in der Hüllprotein-Expression verhindert die Sekretion umhüllter Nukleokapside als Virionen und verstärkt den Re-Import der rcDNA in den neuen Nukleokapsiden in den Zellkern; dies kann die cccDNA Kopienzahl pro Zelle 25-50-fach 75 Ergebnisse steigern (Köck et al. 2010). Vier Tage nach Transfektion wurde die Synthese von Kapsiden im Zytoplasma mittels Nativer Gelelektrophorese (NAGE) und anschließendem IB nachgewiesen. Parallel wurde die Nukleokapsid-verpackte DNA durch molekulare Hybridisierung analysiert (Abb. 23A). Eine entsprechende Zn2+-Induktion der E4orf6- Expression wurde mittels IB validiert (Abb. 23B).

Abb. 23 E4wt abhängige Reduktion von DHBV-Kapsiden und Nukleokapsid-DNA in stabilen pMEP4_HepG2 Zellen Stabile pMEP4-E4wt #B11 und -BCmut HepG2 Zellen #F4 wurden 24 h vor der Transfektion mit 100 µM Zn2+ stimuliert oder unbehandelt gelassen. Die Transfektion erfolgte mit 2,5 µg/6-well pCD16+env- für 4 Tage (jeweils weiterhin mit oder ohne Zn2+). (A) Die Zellen wurden in NP40-Lysepuffer geerntet und die Kerne vom Zytoplasma durch Zentrifugation voneinander getrennt. Je 1/10 der zytoplasmatischen Fraktion wurden nach Micrococcus Nuclease (MN)-Verdau auf einem 1,2% 1x TAE Agarosegel aufgetrennt und entweder auf eine PVDF- (Kapsid-NAGE) oder eine Nylon-Membran (Nukleokapsid-DNA) transferiert. Zur Detektion von Kapsiden im IB wurde die Membran mit α-DHBc (Abnova #2B94F8, 1:5.000) und anschließend mit einem speziesspezifischen, PO-gekoppelten Sekundärantikörper sowie einem chemilumineszenten Substrat inkubiert. Die Detektion erfolgte auf einem Röntgenfilm. Zur Detektion der Nukleokapsid-DNA wurde die Nylonmembran nach dem Transfer zum Aufschluss der Kapside für 15 sec in 0,2 M NaOH/ 1,5 M NaCl geschwenkt, anschließend für 15 sec mit 0,2 M Tris-HCl pH 7,5/ 1,5 M NaCl neutralisiert und die DNA mit 2x 150 mJoule UV-Licht auf der Membran fixiert. Der DNA-Nachweis erfolgte mittels einer DHBV-spezifischen, 32P markierten Sonde. Die Signale wurden auf einem Röntgenfilm detektiert und mittels MultiGauge Software ausgewertet. Die Zahlen unterhalb der Spuren geben die relative Signalstärke ± Standardabweichung (SD, Standard Deviation) (n=6) im Vergleich zu derjenigen der pMEP4-BCmut Probe ohne Zn2+-Stimulation an. Der uninduzierte BCmut #F4 Transfektionsansatz wurde auf 100% gesetzt. Die Signifikanz wurde mittelst paired, two-tailed t-Test berechnet (Graphpad Prism). *= 0,01≤ p< 0,05; **= 0,001≤ p < 0,01 (B) IB-Nachweis einer 76 Ergebnisse

Zn2+-abhängigen Induktion der E4orf6-Expression der in (A) transfizierten pMEP4-Zellansätze. Der E4orf6 Nachweis erfolgte wie in Abb. 10 beschrieben.

In dem repräsentativen NAGE/-IB (Abb. 23A) ließen sich in allen pCD16+env-- Transfektionsansätzen intakte DHBV Kapside detektieren; dabei nahm die Signalstärke sowohl in den E4wt wie auch den BCmut exprimierenden Zellen bei Zn2+-Zugabe reproduzierbar zu; ein vergleichbarer Effekt war auch im humanen HBV System zu sehen. Offenbar stimuliert Zn2+ die hepadnavirale Transkription und/oder Translation, der zugrunde liegende Mechanismus wurde noch nicht geklärt. Andererseits waren unabhängig von der Zn2+ Induktion der DHBV Replikation die Signale für Kapside wie Kapsid-DNA in den E4wt Zellen jeweils reproduzierbar schwächer als in den BCmut Zellen. Gemäß quantitativer Auswertung der Bandenstärken aus 6 unabhängigen Experimenten war in uninduzierten E4wt Zellen das Kapsidsignal auf etwa 50% des zugehörigen BCmut #F4 Kontrollansatzes (der als 100%-Referenz diente) reduziert, die Verringerung in den induzierten E4wt #B11 Zellen war vergleichbar (65% vs. 135% in der BCmut + Zn2+-Kontrolle). Eine Erklärungsmöglichkeit wäre, dass E4wt, nicht aber BCmut, die DHBV-Expression unterdrückt; Zn2+ verstärkt zwar die E4orf6-Expression (Abb. 23B), gleichzeitig aber auch die DHBV-Expression, so dass eine stärkere Suppression durch mehr E4wt durch ein Mehr an DHBV Kapsidprotein kompensiert wird. Da die Kapsid-DNA Signale sich genauso verhielten wie die Kapsidprotein-Signale ist ein negativer Einfluss von E4wt auf pgRNA-Enkapsidierung und/oder reverse Transkription unwahrscheinlich; der limitierende Faktor in den pMEP4_E4wt Zellen ist demnach die verfügbare Menge an Kapsidprotein, entweder durch verminderte Transkription/Translation oder durch schnelleren Abbau. Auch Zellklon-spezifische Effekte konnten so nicht ausgeschlossen werden.

Für die Kapsid-Stabilität könnte die Art der verpackten Nukleinsäure eine Rolle spielen; diese wird im Kapsid-DNA Assay nicht näher bestimmt. Für eine detailliertere Analyse wurde daher aus allen Ansätzen die virale DNA aus zytoplasmatischen Kapsiden als solche isoliert und im klassischen SB analysiert (Abb. 24).

77 Ergebnisse

Abb. 24 DHBV Replikationsintermediate in den E4orf6 exprimierenden pMEP4-Zelllinien Stabile pMEP4 Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit 100 µM Zn2+ stimuliert oder unbehandelt gelassen. Die Transfektion erfolgte mit 2,5 µg/6-well pCD16+env- für 4 Tage. Die Zellen wurden in NP40-Lysepuffer geerntet und die Kerne vom Zytoplasma durch Zentrifugation voneinander getrennt. Nach Präparation der zytoplasmatischen DNA wurden je 5 µg in einem 1,2% 1x TAE Agarosegel aufgetrennt, anschließend auf eine Nylonmembran transferiert. Der Nachweis DHBV-spezifischer DNA erfolgte wie in Abb. 23A beschrieben. Angegeben ist die Signalauswertung 4 unabhängiger Experimente in MultiGauge, wobei alle DNA Banden gemessen wurden. Der uninduzierte BCmut #F4 Transfektionsansatz wurde auf 100% gesetzt. Die Signifikanz wurde mittelst paired, two-tailed t-Test berechnet (Graphpad Prism). **= 0,0077, ***=0,0005, SD: Standardabweichung

In allen Proben zeigte sich ein vergleichbares Muster der bekannten viralen Replikationsintermediate (rcDNA, dlDNA, ssDNA); deren Intensitätsverteilung spiegelte dasjenige der Kapsid- und Nukleokapsid-DNA Signale (Abb. 23A) wider. Die Gegenwart von Zn2+ verstärkte die DNA-Banden jeweils 2-3-fach, wobei die Bandenintensitäten in den pMEP4_E4wt Zellen etwa 3-fach geringer waren als in den pMEP4_BCmut Zellen. Diese Unterschiede waren jeweils signifikant (Abb. 24 und Legende). Demnach stand auch das Ergebnis dieses Assays in Einklang mit einem inhibitorischen Einfluss des E4wt Proteins auf die DHBV Replikation. Für eine Einschätzung möglicher Zellklon-spezifischer Effekte wurden analoge Versuche im pMEP4_E4wt Geschwisterklon #D2 durchgeführt, was zu vergleichbaren Ergebnissen führte (s. Anhang Abb. 67) und eine Interferenz des E4wt Protein mit der Virus-Replikation verdeutlicht.

Zur weiteren Absicherung wurde die Transfizierbarkeit der pMEP4_E4wt #B11 und pMEP4_BCmut #D4 Zellen mittels Reporter-Plasmiden untersucht. Hierfür wurden beide pMEP4-Zelllinien entweder mit einem mCherry- (pCEP4_mCherry) oder einem Luciferase- Expressionsvektor (pCMV_Gaussia-Dura_Luc) transfiziert, dann an Tag 3 nach Transfektion die Reportersignale mittels FACS (mCherry) bzw. Lumineszenz (Luciferase) ausgelesen (Abb. 25). Keiner der Assays deckte deutliche Unterschiede zwischen den Zelllinien auf. Der 78 Ergebnisse

Anteil mCherry-positiver Zellen nach Transfektion mit 2.5 µg Plasmid pro 6-well lag bei 2,3% der pMEP4-E4wt Zellen und ca. 3.0% der pMEP4-BCmut Zellen; bei doppelter DNA- Menge stieg der Anteil auf jeweils ca. 5% (Abb. 25A). Die durchschnittliche Luciferase- Aktivität im Überstand betrug für naive HepG2 Zellen ca. 1.4x105 relative Lichteinheiten (relative light units/RLU), für pMEP4_E4wt und pMEP4_BCmut lagen die Werte mit 1.0x105 RLU und 1.2x105 RLU etwas niedriger (Abb. 25B). Die Unterschiede waren aber in keinem Fall signifikant. Es ist daher unwahrscheinlich, dass die beobachteten Unterschiede in der DHBV Replikation auf unterschiedliche Transfektionseffizienzen zurückgehen.

Abb. 25 Transfektionseffizienz in den stabil E4orf6 exprimierenden pMEP4-Zelllinien pMEP4_E4wt #B11 und _BCmut #F4 Zellen wurden mit je 2,5 µg/6-well oder 5 µg/6-well eines mCherry- (pCEP4_mCherry) oder Luciferase-kodierenden Reporterplasmids (pCMV_Gaussia-Dura_Luc) transfiziert und jeweils an Tag 3 nach Transfektion analysiert. (A) MCherry als Reporter. Der Anteil mCherry positiver Zellen wurde im FACS anhand 20.000 Einzelzellen analysiert. (B) Gaussia Luciferase als Reporter. Die Luciferase- Aktivität im Überstand der Zellansätze wurde nach Zugabe von Coelenterazin als Substrat in einem TECAN- SPARK Lumineszenz-Reader bei 450 nm in relative Lichteinheiten (relative light units, RLU) gemessen. Die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler (standard error of the mean, SEM) aus n=3. Die Unterschiede waren in keinem Fall signifikant (Prims-Software).

In den initialen transienten Kotransfektionsexperimenten von DHBV- und E4orf6- Expressionsvektoren war die verminderte Virus-Replikation im Zytoplasma auch mit einer Verringerung der rcDNA und einem Verlust der cccDNA im Kern einhergegangen (Abb. 6A). Nachfolgend wurde untersucht, ob das von der pMEP4_E4wt #B11 Zelllinie kodierte E4orf6 Protein vergleichbare Effekte induziert. Hierzu wurde nach pCD16+env- Transfektion der pMEP4-E4orf6 Zellen die virale Kern-DNA im SB analysiert (Abb. 27). Zusätzlich wurde ein modifizierter pCD16+env--Vektor eingesetzt, der einen Hämagglutinin (HA)-tag in der precore Region des DHBV Genoms trägt (pCD16+env-_preC-HA2-5´#2; K. Dörnbrack, C. Costa und M. Nassal, unveröffentlicht). Durch Prozessierung des von einer geeigneten precore-mRNA translatierten Genproduktes entsteht neben dem ohnehin von der pgRNA translatierten core-Antigen (cAg) sekretiertes HA-markiertes e-Antigen (HAeAg), wie

79 Ergebnisse schematisch in Abb. 26 dargestellt. Die HA-Markierung des eAg ermöglicht mittels eines α- HA Antikörpers im ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) eine eindeutige Unterscheidung von cAg, das auf einem schlecht charakterisierten Weg ebenfalls in den Zellüberstand abgegeben wird. Wichtig ist, dass in den pCD16-Vektoren der CMV-IE Promoter ausschließlich pgRNA produziert, nicht aber die 5´-terminal längere precore-RNA. Deren Synthese erfordert als template cccDNA, in der sowohl pgRNA wie precore RNA vom Virus-eigenen Core-Promoter transkribiert werden (Schreiner & Nassal, 2017). So kann das HAeAg im Kulturmedium als nicht-invasiver Surrogatmarker für die cccDNA Entstehung verwendet werden.

Abb. 26 Schematische Darstellung der Verwendung eines HA-ELISA zur Detektion von HAeAg als Surrogatmarker für die cccDNA Entstehung Der pCD16+env-_preC-HA2-5´#2 Vektor trägt einen Hämagglutinin (HA)-tag in der precore-Region des DHBV Genoms. Durch die CMV-IE abhängige Transkription des Transfektionsvektors entsteht pgRNA, aber keine precore-mRNA. Erst nach reverser Transkription der pgRNA und cccDNA Bildung erfolgt die Synthese der precore-mRNA (und auch pgRNA) vom Virus-eigenen Core-Promoter. Aus der precore-mRNA entsteht durch Prozessierung core-Antigen (cAg) und HA-markiertes e-Antigen (HAeAg). Dieses wird aus den Zellen sekretiert und kann in einem HA-spezifischen ELISA detektiert werden (s. Text unten).

Für die SB Analyse der viralen DNA im Kern wurden mit Zn2+ induzierte und nicht induzierte pMEP4_E4wt #B11 und pMEP4_BCmut #F4 Zellen jeweils mit pCD16+env- Plasmid transfiziert; untransfizierte Zellen dienten als Spezifitätskontrolle. Nach 5 Tagen wurden die Zellen geerntet und in NP40-Lysepuffer lysiert; aus den abgetrennten Kernen wurde DNA präpariert, mit Dpn I behandelt, um die transfizierte Plasmid-DNA (aufgrund ihrer bakteriellen Methylierung sensitiv gegen Dpn I Verdau) zu schneiden, und schließlich mit Plasmid-safe DNase (PSD) inkubiert, welche alle DNA-Formen außer cccDNA und rcDNA mit weitgehend aufgefüllten (+)-DNA-Strängen degradieren sollte (Köck et al. 2010)

80 Ergebnisse

(Königer et al., 2014). Wie in Abb. 23 dargestellt, waren Kapsid- und Kapsid-DNA-Signale der transfizierten Proben einander ähnlich. In der SB-Analyse zeigten die transfizierten pMEP4_BCmut Proben starke Signale auf Höhe der rcDNA, die Zn2+-abhängig etwas schwächer erschienen (Abb. 27). Zusätzlich waren eindeutige Banden auf Höhe von cccDNA zu sehen. In der Zn2+-behandelten Probe trat zusätzlich eine schwache Bande auf Höhe von dlDNA auf; falls es sich tatsächlich um dlDNA handelte, müsste diese die PSD-Behandlung überstanden haben oder erst danach entstanden sein, z.B. durch Denaturierung der kurzen kohäsiven Enden der rcDNA während der Aufarbeitung. In den E4wt exprimierenden Zellen waren wie bereits die zytoplasmatischen Kapsid- und Kapsid-DNA Signale (Abb. 23A) auch die nukleären Virus-DNA Signale deutlich schwächer als in den BCmut Zellen. Wie in der transienten Ko-Transfektion (Abb. 6A) war in den nicht mit Zn2+-induzierten E4wt Zellen kein Signal auf Höhe der cccDNA zu detektieren (Abb. 27). Allerding hätte bei ähnlichem rcDNA zu cccDNA Verhältnis wie in den BCmut Zellen potenziell vorhandene cccDNA vermutlich unterhalb des Detektions-Limits gelegen. Überraschenderweise war aber in der Zn2+ induzierten Probe bei noch schwächerem rcDNA Signal eine Bande auf cccDNA-Höhe klar nachweisbar.

Da davon auszugehen ist, dass die in den Kern transportierte rcDNA der Vorläufer der cccDNA ist, würde demnach Zn2+ die rcDNA zu cccDNA Konversion in den pMEP4_E4wt #B11 Zellen fördern; angesichts der ähnlichen cccDNA Bandenstärke in beiden pMEP4_BCmut #F4 Ansätzen bei schwächerer rcDNA Bande in der Zn2+ behandelten Probe gälte das tendenziell auch dort. Ein wahrscheinlich mitverantwortlicher Faktor ist die Zn2+ vermittelte Verstärkung der DHBV Replikation (Abb. 24). Weitere, andersartige Mechanismen sind aber nicht ausgeschlossen, insbesondere angesichts der komplexen Situation durch die simultane Induktion von E4orf6 Protein und DHBV Replikation. Z.B. könnte das Zn2+ unabhängig von E4orf6 auf zelluläre Faktoren oder Prozesse einwirken, die die cccDNA Bildung beeinflussen (Induktion von ccc begünstigenden-, Repression von restringierenden-Faktoren). Nicht zuletzt könnte die nukleäre "rcDNA-Bande" mehrere DNA- Spezies enthalten, von denen nur eine als produktiver Vorläufer der cccDNA dient; ein Kandidat könnte eine kürzlich beschriebene rcDNA-Form mit kovalent geschlossenem (-)- Strang Zirkel sein (Luo et al., 2020).

81 Ergebnisse

Abb. 27 SB Nachweis von cccDNA in mit DHBV transfizierten pMEP4 Zellen Stabile pMEP4 Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit 100 µM Zn2+ stimuliert oder unbehandelt gelassen. Zur Detektion der kernlokalisierten, viralen DNA erfolgte die Zelltransfektion mit 2,5 µg/6-well pCD16+env-. Nach 5 Tagen wurde die nukleäre DNA aus den Zellen präpariert, mit Dpn1 und Plasmid-safe DNase (PSD) Verdaut und in einem 1,2% 0,5x TBE Agarosegel aufgetrennt. Nach Transfer auf eine Nylon-Membran erfolgte die Detektion der DHBV spezifischen Signale wie in Abb. 23A beschrieben.

Um weitere Informationen bezüglich der cccDNA Bildung zu erhalten, wurden als nächstes die pMEP4 Zellen mit dem HA-tag modifizierten pCD16+env- Vektor transfiziert, dann die Zellüberstände von Tag 5 nach Transfektion im ELISA auf sekretiertes HAeAg getestet. Hierzu wurden Mikrotiter-Platten zunächst mit einem polyklonalen Kaninchen-Antiserum beschichtet, das multiple cAg- wie eAg-spezifische Epitope erkennt und somit auch HAeAg bindet. Nach Inkubation mit den Zellüberstanden wurde gebundenes HAeAg mittels eines PO-gekoppelten monoklonalen α-HA Antikörpers und Tetramethylbenzidin (TMB) als Farbsubstrat anhand der Absorption bei 450 nm in einem TECAN SPARK Instrument spezifisch detektiert (Abb. 28). Reines PBS diente als Negativkontrolle. Zur Standardisierung wurden Mikrotiterplatten von Thermo-Fisher Scientific aus dem gleichen batch verwendet und die Inkubationszeiten sowie -Temperaturen strikt eingehalten. Das Abstoppen der TMB-

Umsetzung mit Schwefelsäure (H2SO4, 5 N) erfolgte bei jedem Experiment nach 30 min.

Alle Messwerte der Transfektionsansätze wiesen signifikant höhere Werte im Vergleich zu PBS auf. Deutlich über Hintergrund liegende Messwerte ergaben die Überstände der transfizierten BCmut Zellen; nach Zn2+ Induktion waren die Messwerte etwas höher. Die Signale in den E4wt exprimierenden Zellen waren mindestens dreifach niedriger als in den gleich behandelten BCmut Zellen; für die Ansätze mit Zn2+ war dieser Unterschied trotz Streuung der Einzelwerte signifikant (Abb. 28). Tendenziell zeigte sich auch in den E4wt #B11 Zellen eine leichte Erhöhung der Absorptionswerte im Vergleich mit vs. ohne Zn2+ Behandlung; dieser Unterschied war aber nicht signifikant.

Die HAeAg Werte in den E4wt Zellen waren sehr niedrig, lagen aber signifikant über dem Hintergrund. Daher führten SB einerseits und HAeAg-ELISA als Surrogat-cccDNA Assay andererseits zu dem übereinstimmenden Ergebnis einer deutlich geringerer cccDNA Menge 82 Ergebnisse in den E4wt exprimierenden Zellen (vgl. Abb. 27 und Abb. 28). Dass der HAeAg ELISA in den E4wt Proben auch für die nicht Zn2+ behandelten Ansätze ein cccDNA-positives, im SB aber cccDNA-negatives Resultat ergab, könnte an den unterschiedlichen Sensitivitäten und Dynamiken beider Assay liegen. Die Daten wären somit mit einem inhibitorischen Effekt des adenoviralen Proteins auf die cccDNA Bildung in Einklang, schließen aber andere Optionen nicht aus; nicht zuletzt könnten auch indirekte Effekte wie ein Einfluss von Zn2+ auf Prozessierung, Sekretionseffizienz oder Stabilität des HAeAg einer strikten Korrelation beider Assays im Weg stehen.

Abb. 28 HAeAg-ELISA der DHBV transfizierten pMEP4 Zellen Stabile pMEP4 Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit 100 µM Zn2+ stimuliert oder unbehandelt gelassen, anschließend mit 2,5 µg/6-well pCD16+env-_preC-HA2-5´#2 transfiziert. Nach 5 Tagen wurde der Zellüberstand auf eine mit α-DHBcAg (Biogenes #Ba09- 2. Gelege, 1:1.000) beschichtete ELISA Platte gegeben. Gebundenes HAeAg wurde mit einem HA spezifischen, PO-gekoppelten Antikörper (Roche cat #12013819001, 1:1000) detektiert. Die Substratumsetzung des Tetramethylbenzidin (TMB) wurde bei einer Absorption von 450 nm im TECAN SPARK ELISA-Lesegerät gemessen. Die Signifikanz wurde mittels paired two-tail t-Test validiert (Graphpad Prism). Die Fehlerbalken repräsentieren SEM aus n=3 für –Zn2+-Ansätze und n=5 für +Zn2+-Ansätze. * =0,0387. Die mean ± SEM Werte sind wie folgt: -Zn2+ E4wt #B11: 0,13 ± 0,06; +Zn2+ E4wt #B11: 0,42 ± 0,06; -Zn2+ BCmut #F4: 0,95 ± 0,33; +Zn2+ BCmut #F4:1,38 ± 0,34; PBS: 0,08 ± 0,04. Alle Messwerte der Transfektionsansätze sind * signifikant über PBS.

Insgesamt unterstützen die DHBV-Transfektionsexperimente in den pMEP4-E4orf6 Zelllinien die zuvor in der transienten DHBV/E4orf6 Ko-Transfektion beobachtete spezifische Interferenz des wt E4orf6 Proteins mit der DHBV-Replikation (Abb. 6A); ein vollständiger Verlust des cccDNA Signals war in den pMEP4-E4wt Zellen allerdings nur ohne Zn2+ Induktion zu sehen. Daher wurden analoge DHBV Transfektionsversuche auch in den AAVS1-Zelllinien mit Dox-induzierbarer E4orf6-Proteinexpression durchgeführt, ergaben aber keine Hinweise auf eine spezifische Interferenz des Zell-kodierten E4wt Proteins mit DHBV Replikation oder cccDNA Bildung (Abb. 29). Wenn überhaupt waren die Signale für Kapside und Kapsid-DNA wie auch für die replikativen DNA-Intermediate in den AAVS1-E4wt #4 Zellen etwas stärker als in den AAVS1_BCmut #5 Zellen (Abb. 29A und B). Auch enthielten die Kern-DNAs aller transfizierten Proben sowohl rcDNA wie cccDNA 83 Ergebnisse

(Abb. 29C). Die insgesamt etwas stärkeren Signale in der E4wt #4 Probe ohne Dox könnten technisch begründet sein; auf jeden Fall war das Verhältnis von cccDNA-Signal zu rcDNA Signal überall ähnlich, was gegen eine spezifische Interferenz mit der rc- zu cccDNA Konversion spricht. Auch im HAeAg ELISA nach Dox-Induktion waren die Proben aus beiden Zelllinien positiv, aber nicht signifikant verschieden (Abb. 29D).

Abb. 29 Nachweis der DHBV-Replikation in den stabilen AAVS1-E4orf6 Zelllinien Die AAVS1-Zelllinien E4wt #4 und BCmut #5 wurden 24 h vor der Transfektion mit 1,5 µg/ml Dox stimuliert oder unbehandelt gelassen. Die Transfektion erfolgte mit 2,5 µg/6-well pCD16+env- (A-C) oder mit pCD16+env- _preC-HA2-5´#2 (D). Nach 5 Tagen wurden die Zellen geerntet. (A) Kapside und Nukleokapsid-DNA. Die Detektion DHBV-spezifischer Signal erfolgte durch IB bzw. molekulare Hybridisierung wie in Abb. 23A beschrieben. (B) Replikative Intermediate im Zytoplasma. Der Nachweis erfolgte durch SB wie in Abb. 24 beschrieben. (C) Kernlokalisierte virale DNA. Der Nachweis erfolgte gemäß den Angaben in Abb. 27. (B) HAeAg-ELISA. Der Nachweis erfolgte wie in Abb. 28 beschrieben. Die Signifikanz wurde mit einem paired two-tail t-Test (Graphpad Prism) validiert. Fehlerbalken repräsentieren SEM aus n=4, ns: nicht signifikant. Die Messwerte der Transfektionsansätze lagen signifikant über der PBS-Kontrolle.

Somit waren weder zwischen den beiden Zelllinien noch durch An- oder Abschalten der E4orf6 Protein Expression deutlich unterschiedliche Auswirkungen auf DHBV-Replikation und/oder cccDNA-Bildung nachzuweisen; dies änderte sich auch nicht in der Analyse eines weiteren AAVS1-E4wt Zellklons (#8; nicht gezeigt). Letztlich ist dieses Ergebnis aber nicht unerwartet, da bereits in den früheren funktionellen Tests in den AAVS1-Zelllinien keine

84 Ergebnisse

Interaktion des Zell-kodierten E4orf6 Proteins mit den anderen Cul5 E3-Ligase Komponenten nachzuweisen war (Abb. 18B). Wie dort ist wahrscheinlich die zu geringe Expression des E4orf6 Proteins ein wesentlicher Faktor für die fehlende Nachweisbarkeit eines funktionellen Effektes; andere Faktoren sind aber nicht ausgeschlossen. Für den nachfolgend beschriebenen massenspektrometrischen Proteom-Vergleich wurden daher hauptsächlich die pMEP4_E4wt bzw. _BCmut Zelllinien eingesetzt.

3.3. Massenspektrometrischer Proteomvergleich der stabil hAdV5 E4orf6- vs. E4orf6_BCmut exprimierenden HepG2 Zelllinien

Auf der bekannten Fähigkeit des wt hAdV5 E4orf6 Proteins zur Bildung einer Cul5-E3- Ubiquitinligase basiert die Hypothese, dass die E4wt-abhängige Beeinträchtigung der DHBV Replikation und cccDNA Bildung eine Folge proteasomalen Abbaus eines oder mehrerer zellulärer Faktoren ist. Da anders als in den bisher für hAdV5 bekannten Mechanismen eine Beteiligung von hAdV5 E1B55k Protein nicht erforderlich ist, könnte es sich dabei um noch unbekannte targets handeln. Daher wurden zuvor generierten stabilen pMEP4_ und AAVS1- Zelllinien für eine Proteomanalyse herangezogen, um die Proteinexpressionsmuster der E4wt exprimierenden Zelllinien mit denen der zugehörigen BCmut exprimierenden Zelllinien zu vergleichen. Die einzig bislang nachzuweisende Aktivität der BCmut-Variante war die erhaltene Fähigkeit zur Interaktion mit E1B55k Protein (s. Abb. 21 und 17), das aber per se nicht in den Zelllinien vorhanden ist. Ein direktes CRL5-E4orf6 target sollte daher in den E4wt gegenüber den BCmut Zellen abgereichert sein; indirekt könnte der Abbau eines solchen Zielproteins aber auch die Stabilität anderer Proteine in der Zelle erhöhen (wenn es sich z.B. um ein degradatives Enzyme handelte), sodass ein solches Protein in den E4wt Zellen angereichert würde.

Zur Identifizierung und Quantifizierung der Proteine wurde die MS verwendet, ein Verfahren zur Bestimmung der Masse ionisierter Moleküle (Schwanhausser et al., 2011). Die Zelllinien wurden im 6-well Format zunächst für einen (d1) oder 5 Tage (d5) zur Transgen-Expression stimuliert oder unbehandelt gelassen; die Zellen wurden geerntet und die Zell-Pellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren, dann an die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Andreas Pichlmair an der Technischen Universität München (TUM) versandt. Dort wurde die eigentliche MS-Proteomanalyse von Christian Urban (zum damaligen Zeitpunkt Doktorand) durchgeführt. Die Gesamtzelllysate wurden mit Trypsin verdaut, sodass aus Proteinketten Peptide mit C-terminalen Arg- oder Lys-Resten entstehen. Diese wurden mittels Flüssigkeits- Chromatographie (liquid chromatography) getrennt und per MS die Massen der einzelnen 85 Ergebnisse

Peptide und ihre Sequenzen abgeleitet (Hahne & Küster, 2015). Bioinformatisch können die mittels MS detektierten Peptide mit Hilfe von Proteindatenbanken den jeweiligen intakten Proteinen zugeordnet werden. Gleichzeitig erlauben die Messmethoden einen quantitativen Vergleich der Mengen eines bestimmten Proteins zwischen mehreren Proben (Aebersold & Mann, 2003) (Coombs, 2011). Die Qualität der Datenbanksuche wird über die Festlegung der False Disvovery Rate (FDR) bestimmt. Es wird dabei ein Signifikanz-Schwellenwert festgelegt, ab wann eine Peptid-Zuordnung als „echter Treffer“ erachtet wird bzw. wie viele falsche Treffer in den Ergebnissen akzeptiert werden. Üblich ist ein FDR von 0,05, was 5% falsch positiven Treffern entspricht (Nesvizhskii et al., 2007). Jeder Zellansatz (aus je ca. 1x106 Zellen) wurde in vierfacher Ausführung gemessen. Mit Maßgabe einer FDR=0,05 wurden in allen Datensätzen etwa 6.500 Proteine detektiert. Damit wurden ca. 50% des so detektierbaren Proteoms abgedeckt (persönliche Mitteilung von Prof. Pichlmair).

Zunächst wurden zur Validierung der Proben alle Ansätze auf die Anwesenheit des E4wt Proteins bzw. seiner BCmut Variante untersucht. Für beide Proteine konnten jeweils 11 Peptide detektiert werden, wovon jeweils eines spezifisch für wt vs. BCmut Variante ist. Wie erwartet wurde das E4wt-spezifische Peptid ausschließlich in den pMEP4_E4wt #B11 und AAVS1_E4wt #4 Zellen detektiert, das BCmut Peptid ausschließlich in den pMEP4_BCmut #F4 sowie AAVS1_BCmut #5 Zellen (Abb. 30). Somit konnten Verwechslungen ausgeschlossen werden.

Abb. 30 MS-validierte Aminosäuresequenzen tryptischer Peptide aus E4wt vs. BCmut Variante Die Zellansätze wurden für einen (d1) oder 5 (d5) Tage zur Transgenexpression stimuliert (1,5 µg/ml Dox für AAVS1 Zelllinien, 100 µM Zn2+ für pMEP4 Zelllinien) oder unbehandelt gelassen (d0). Das Proteingemisch wurde mit Trypsin verdaut, per Flüssigchromatographie (liquid chromotography, LC) aufgetrennt und die Masse der Peptide per MS bestimmt. Aus den Massenspektren kann die Aminosäure-Zusammensetzung der Peptide abgeleitet werden. Von den 11 eindeutig detektierbaren E4orf6-Peptiden unterscheidet sich eines spezifisch zwischen E4wt und BCmut Variante. Die anderen Peptide sind in beiden E4orf6 Proteinen identisch.

86 Ergebnisse

Die quantitative Auswertung der E4orf6 Protein-Expression in den jeweiligen Ansätzen ist in Abb. 31 graphisch dargestellt. Dabei zeigen sich erhebliche Unterschiede zwischen den pMEP4- und den AAVS1-Zelllinien. Wie schon in den IB Analysen (Abb. 11) wiesen beide pMEP4-Zelllinien eine basale Transgenexpression auf, die durch Zn2+ Zugabe gesteigert wurde. Der Graphik ist von Tag 0 zu Tag 1 eine bis zu 60-fache Induktion (5 log2-Stufen) zu entnehmen, die dann bis Tag 5 nicht weiter anstieg. Des Weiteren wird deutlich, dass die E4wt #B11 Zelllinie im Vergleich zu allen anderen Zellen das höchste E4orf6 Expressionsniveau aufweist.

Für die AAVS1-E4wt #4 Zelllinie belegen die Daten die erwartet strikte Regulation durch das TetON System. Übereinstimmend mit den IB–Ergebnissen in Abb. 14 konnte ohne Dox auch mittels MS kein E4wt Protein detektiert werden. Die Kultivierung der Zellen mit 1,5 µg/ml Dox führte zeitabhängig zu einer Anreicherung der E4orf6 Proteine. An Tag 1 nach Induktion war zumindest eine von vier Proben positiv für E4wt Protein, an Tag 5 waren alle 4 Proben positiv, mit bis zu 10-fach mehr E4wt als in der einen positiven Probe von Tag 1. In der AAVS1_BCmut #5 Zelllinie zeigte nur ein Ansatz von Tag 1 nach Dox-Zugabe eine nachweisbare Expression des mutierten E4orf6 Proteins. Dies könnte auf das ohnehin sehr geringe Expressionsniveau zurückgehen (vgl. Abb. 17, IB), oder zusätzlich auf eine nicht ausreichende Induktion und/oder eine partielle Stilllegung der Integrationskassette durch epigenetische Modifikationen (Kaufman et al., 2008).

Ein direkter Vergleich der beiden E4wt Zelllinien bestätigte eine deutlich höhere Expression des E4wt Proteins in den pMEP4- vs. den AAVS1 Zellen. So enthielten die Zn2+- induzierten pMEP4_E4w #B11 Zellen an Tag 5 noch über 20 Mal mehr E4orf6 Protein als die induzierten AAVS1_E4wt #4 Zellen (s. Abb. 31).

Die gerichtete CRISPR/Cas9 Integration des Transgens in den AAVS1 Lokus hat den Verlust des ppp1r12c Genproduktes zur Folge. Gemäß der PCR-Analyse der genomischen DNAs (s. Abb. 16) enthielten die AAVS1-Zelllinien mindestens eine korrekt inserierte Transgen- Kassette und mindestens einen unmodifizierten AAVS1 Lokus. Euploidie der HepG2- Zellklone vorausgesetzt könnte dies in einer Halbierung der PPP1R12C Abundanz im Vergleich zu den pMEP4 Zellen resultieren; die Daten zeigten aber keine signifikanten Unterschiede bezüglich der PPP1R12C Peptidintensitäten auf (Ergebnisse nicht gezeigt). Hierbei ist zu bedenken, dass kompensatorische Mechanismen zu einer weniger als zweifachen Reduktion in den AAVS1 Zellen führen könnten; zudem waren in der Komplett-

87 Ergebnisse

Proteom-Analyse nur wenige der um nur eine log2-Stufe unterschiedlichen Werte statistisch signifikant (s. Abb. 32).

Abb. 31 Peptidintensität des E4wt Proteins bzw. der BCmut Variante in den selektionierten HepG2 Einzelklonen Die Zellansätze wurden zur MS-Analyse wie in Abb. 30 beschrieben behandelt. Graphisch dargestellt sind in grau alle Peptidintensitäten (log2) der jeweiligen Probe, in schwarz die die spezifischen Intensitäten des E4wt Proteins bzw. der BCmut–Variante. Es wurden 4 Messungen in jeder Kondition durchgeführt. Die BCmut Ansätze sind in kursiv beschriftet.

Im Folgenden wird nur auf die Ergebnisse der pMEP4-Zelllinien eingegangen, da in den AAVS1-Zelllinien weder die wt Funktion des E4orf6 Proteins noch eine E4wt-abhängige Beeinträchtigung der DHBV-Replikation nachgewiesen werden konnte (die Daten der AAVS1 Zellansätze sind im Anhang 7.3 abgebildet). Die folgenden Abb. 32 und Abb. 33 fassen die Ergebnisse des Proteomvergleichs zwischen den pMEP4-Zelllinien E4wt #B11 und BCmut #F4 zusammen.

88 Ergebnisse

Abb. 32 Vulkanplot des Proteomvergleichs von E4wt- vs. BCmut exprimierenden pMEP4-Zelllinien Exemplarischer Vulkanplot der induzierten pMEP4-Zellansätze an Tag 5 nach Zn2+-Zugabe. Graphisch dargestellt sind auf der y-Achse die label-free quantitation (LFQ-) Werte (markierungsfreie massenspektrometrische Quantifizierung) der Proben aus der MS-Analyse in Abb. 30 und das Signifikanz- Niveau (p-Wert) auf der x-Achse. Jeder Punkt repräsentiert ein detektiertes Protein. Schwarze Punkte in der Mitte des plots stehen für Proteine, deren Abundanz sich nicht signifikant zwischen beiden Zelllinien unterscheidet. Orange dargestellt sind Proteine mit signifikant veränderter Abundanz in den E4wt #B11- vs. den BCmut #F4 Zellen. Die umkreisten und hervorgehobenen Proteine wurden als potentiell DHBV-relevante Proteine für weitere Analysen ausgewählt. FDR (fals discovery range): 3%

Die Abb. 32 zeigt exemplarisch einen Vulkanplot der MS-Messung aus der 5 Tage stimulierten Proben (die weiteren Auswertungen sind im Anhang 7.3 dargestellt). Es wurden die Proteine der pMEP4_E4wt #B11- und pMEP4_BCmut #F4–Zellen miteinander verglichen. Aufgetragen sind auf der x-Achse die "markierungsfrei gemessenen quantitativen Werte" (lable free quantitative values/LFQ) und auf der y-Achse die zugehörigen Signifikanz-Niveaus (p-Wert). Der LFQ Wert ist eine relative Größe, die sich nur aus dem Vergleich zweier Proben ergibt (Tate et al., 2013). Die x-Achse markiert demnach, wie stark ein bestimmtes Protein in einer ersten Zelllinie relativ zu einer Vergleichszelllinie verstärkt oder herabreguliert vorliegt. Die y-Achse gibt Aufschluss darüber, wie signifikant dieser Unterschied ist. Der FDR wurde hier auf 0,03 gesetzt, sodass 3% falsch positive events toleriert werden. Alle Proteine, die in der Mitte des Plots mit schwarzen Punkten dargestellt sind, haben kein signifikant verändertes Expressionsniveau und sind demnach in beiden Zelllinien vergleichbar stark vertreten. Von Interesse sind die grau markierten Punkte links und rechts oberhalb der Hyperbel-Hilfslinien, die Proteine repräsentieren, die in den pMEP4- E4wt Zellen eine signifikant höhere (rechts) oder geringere Abundanz (links) haben als in den 89 Ergebnisse pMEP4_BCmut Kontrollzellen. Sie stellen daher Kandidaten für eine E4wt-abhängige Regulation dar.

Insgesamt zeigt die Gegenüberstellung der Proteinprofile beider Zelllinien bis zu ca. 100 unterschiedlich exprimierte Faktoren. Allerdings waren darunter keine zellulären Proteine mit einer offensichtlichen E4wt-abhängigen Rolle für die DHBV-Replikation bzw. rc- zu cccDNA Konversion, wie z.B DNA-Reparatur-Faktoren. Die Ausnahme ist das Replication Protein A (RPA) (Abb. 32). RPA bindet an einzelsträngige DNA Bereiche (single stranded- ssDNA) und verhindert unter anderem die Bildung von Sekundärstrukturen (Nguyen et al., 2017). Daher spielt RPA auch eine wesentliche Rolle bei der DNA Reparatur mittels HR (Abb. 4), indem es die Einzelstränge während der Stranginvasion stabilisiert und mit anderen Rekombinationsfaktoren interagiert (Deng et al., 2014) (Liu & Huang, 2016). Aufgrund dieser Eigenschaften könnte RPA auch an der rc- zu cccDNA Konversion beteiligt sein. Funktionelles RPA bildet einen heterotrimeren Komplex aus den Untereinheiten RPA1 (70 kDa), RPA2 (32 kDa) und RPA3 (14 kDa). Interessanterweise wurde in den E4wt Zellen an d5 nach Induktion für alle drei Untereinheiten eine Reduktion gemessen. Zwar sind die LFQ- (log2)-Werte mit -0,7 für RPA1, -1,0 für RPA2 und -0,8 für RPA3, im Vergleich mit anderer herabregulierten Proteinen eher gering, jedoch ist insbesondere für RPA1 die Reduktion der Abundanz hoch signifikant (p >106) (Abb. 32).

Zusätzlich zu RPA1,2 und 3 wurden alle Proteine mit einem signifikanten Expressionsunterschied an mindestens einem Zeitwert nach Induktion anhand ihrer publizierten Funktionen auf eine mögliche Rolle in der E4wt abhängigen DHBV-Interferenz eingeschätzt. Hauptkriterium war ein Literaturbezug zwischen dem jeweiligen Faktor und Hepadnaviren, anderen Viren und/oder DNA-Reparatur. Potenzielle Qualitätsunterschiede zwischen den ausgewählten Literaturstellen wurden nicht berücksichtigt. Diese Kandidaten sind im Vulkanplot umkreist und konkret benannt (Abb. 32). Teilweise variierte für einige der ausgewählten Zell-Faktoren das jeweilige Ausmaß an Herab- oder Hochregulation zwischen den Zeitwerten d0, d1 und d5. Das war nicht unerwartet, zum einen wegen der Basal- Expression von E4orf6 Protein in den nicht Zn2+-stimulierten E4wt #B11 Zellen, in denen sich bereits eine Inhibition der DHBV-Replikation beobachten ließ (s. Abschnitt 3.2.2). Zum anderen fehlten Möglichkeiten, die Kinetiken von Neusynthese und Abbau der potenziellen Zielproteine verlässlich vorherzusagen. Daher wurden Proteine, die bereits an d0 in den pMEP4-E4wt Zellen eine deutliche Verminderung oder Erhöhung gegenüber den BCmut Kontrollzellen aufweisen, nicht ausgeschlossen. Abb. 33 fasst die jeweils 12 ausgewählten

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Proteine tabellarisch zusammen. Dabei sind Name, biologische Funktion und LFQ-Wert der Proteine in den Zellproben d0, d1 und d5 aufgelistet. Zusätzlich sind potenzielle Funktionen dieser Faktoren in der DHBV-Replikation benannt. In der Diskussion werden unter 4.5 die bekannten physiologischen Rollen aller ausgewählten Kandidatenfaktoren näher erläutert.

Wesentlicher nächster Schritt wäre nun die Validierung der einzelnen Kandidaten hinsichtlich einer funktionellen Rolle in der hepadnaviralen Replikation und rc- zu cccDNA Konversion. Hierzu wurde ein KD- oder KO-screen in DHBV-Reporterzellen angestrebt (s. Abschnitt 3.4 und 3.5). Zu betonen ist, dass die Festlegung auf die gelisteten Proteine nicht ausschließt, dass auch die hier nicht ausgewählten Proteine eine mögliche Rolle für die DHBV-Replikation spielen könnten. Die genannten Auswahlkriterien dienten lediglich zur Einschränkung der MS-Proteom Liste.

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Abb. 33 Zusammenfassung der ausgewählten Proteine mit potenzieller Relevanz für DHBV-Replikation und/oder cccDNA-Bildung Alle Proteine mit signifikant unterschiedlichem Expressionsniveau zwischen den pMEP4-Zelllinien E4wt #B11 und BCmut #F4 wurden anhand ihrer Literatur-beschriebenen Funktionen auf eine mögliche Rolle in der DHBV-Replikation beurteilt. Angegeben ist der LFQ-Wert aus den Messungen d0, d1 und d5, Name sowie die biologische Funktion des Proteins. Wenn keine weitere Quelle angegeben ist, beziehen sich die Angaben auf www.uniprot.org. Die letzte Spalte benennt mögliche Ziele im DHBV-Replikationszyklus. 92 Ergebnisse

3.4. Etablierung einer DHBV-Cas9-Reporterzelllinie

Zur Validierung der aus dem Proteom-Vergleich hervorgegangenen Zellfaktor-Kandidaten bez. einer hAdV5 E4orf6-abhängigen Regulation sollten diese gezielt stillgelegt (KD) bzw. (soweit nicht essentiell) ausgeschaltet werden (KO), dann der Einfluss der Depletion auf die hepadnavirale Replikation und rc- zu cccDNA Konversion untersucht werden. Für den KO- Ansatz sollte dazu eine Expressionskassette für das Streptococcus pyogenes (Sp) Cas9 Protein in die TetOFF HepG2 DHBV-Reporter Zelllinie DHA2/3 integriert werden (K. Dörnbrack, C. Costa, M. Nassal, unveröffentlicht). Analog den E4orf6 AAVS1 Zelllinien sollte dies mit Hilfe CRISPR/Cas9-vermittelter HR erfolgen.

3.4.1. Generierung Cas9 exprimierender DHBV-Reporterzellen mit einem cccDNA abhängigen HAeAg Readout Zur Herstellung einer Cas9 exprimierenden DHBV-Reporterzelllinie wurden TetOFF HepG2 Zellen verwendet, die stabil einen Tetrazyklin-trans-Aktivator (tTA2; G418-selektionierbar) exprimieren (Sun & Nassal, 2006) und zusätzlich eine integrierte DHBV-Expressionskassette unter einem Tetrazyklin-regulierten tet-response-element (TRE) Promoter (Hygromycin- selektionierbar) enthalten. Die DHBV-Kassette entspricht derjenigen im pCD16+env-_preC- HA2-5´#2 Vektor für transiente Transfektionen (Abb. 26), d.h. das Genom ist defizient bezüglich der Hüllprotein-Synthese (DHBVenv-) und die PräC/C-Region kodiert ein HA- markiertes precore-Protein, das als HAeAg sekretiert und mittels α-HA-Antikörpern von Core-Protein im Kulturüberstand unterschieden werden kann. Der TRE-Promoter des Integrates generiert ausschließlich die zur Replikations-Initiation erforderliche pgRNA; precore-RNA entsteht erst, nachdem cccDNA gebildet wurde. Somit kann der Nachweis von HAeAg als Surrogatmarker für cccDNA dienen (Schreiner & Nassal, 2017). Diese DHBVenv--HA2/3 Zellen werden im Folgenden als DHA2/3 abgekürzt. Anders als bei dem in Abschnitt 3.1.2 beschriebenen TetON-Mechanismus wird im TetOFF System die Genexpression durch Dox unterdrückt. Eine Kultivierung der Zellen in Dox-freiem Wachstumsmedium induziert die Synthese von pgRNA und damit den DHBV- Replikationszyklus.

Die Anreicherung des sekretierten HAeAg im Zellüberstand kann über die Zeit mittels ELISA verfolgt werden, was eine indirekte Beobachtung der cccDNA Bildungs-Kinetik erlaubt (Schreiner & Nassal, 2017). Im Folgenden wurde zunächst ein möglicher Einfluss der HA- Sequenz in der precore-Region auf die DHBV-Replikation untersucht. Hierzu wurden

93 Ergebnisse

DHA2/3 Zellen für mehrere Tage in Dox-freiem Medium kultiviert und die Entstehung von Kapsiden, Nukleokapsid-DNA (Ergebnisse nicht gezeigt) und nukleärer DNA mit einer DHBV-Zelllinie verglichen, die natives eAg exprimiert (DHBVenv--150 #1-1) (Abb. 34A). Die Messung einer cccDNA abhängigen Anreicherung des HAeAg im Zellüberstand erfolgte mittels eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers im ELISA (Abb. 34B).

Abb. 34 Vergleich der DHBV-Replikationskinetik in DHA2/3 vs. DHBVenv-150#1-1 Zellen Die Zellen wurden für die angegebenen Tage in Dox freiem Wachstumsmedium kultiviert. (A) Die Detektion von DHBV-Kapsiden im Zytoplasma erfolgte wie in Abb. 23A beschrieben. Zum Nachweis kernlokalisierter rc- und cccDNA wurde die nukleäre DNA aus den Zellen präpariert und jede Probe mit 150 pg pcD16+env- versetzt. Dies dient als interne DNA-Aufreinigungskontrolle. Die Detektion der DHBV-spezifischen DNA erfolgte wie in Abb. 27 beschrieben. (B) HA-ELISA. Die HAeAg Messung wurde wie Abb. 28 beschrieben durchgeführt.

Die Gegenüberstellung der DHBV-Replikation in DHA2/3 vs. DHBVenv--150 #1-1 Zellen zeigte in beiden Zelllinien eine ähnliche Kinetik nach Dox-Wegnahme (Abb. 34). Nach 7-10 Tagen in Dox-freiem Medium waren erstmals Kapside im IB zu detektieren, ab Tag 10 waren in der Kern-DNA rc- und cccDNA im SB nachweisbar. Die spezifischen Signale werden zeitabhängig sichtbar stärker. Ab Tag 11 war auch im HA-ELISA ein starker Anstieg zu verzeichnen, wobei für alle Zeitwerte über drei Tage akkumuliertes Medium diente. Die leichte Verzögerung gegenüber dem Erscheinen des cccDNA-Signals geht vermutlich auf den zusätzlichen Zeitbedarf für precore-RNA Transkription, precore-Protein Translation und Prozessierung zurück. Zusammengefasst gaben die Daten keine Hinweise auf eine Einschränkung der DHBV-Replikation durch die zusätzliche HA-Sequenz; somit sollte die

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DHA2/3 Zelllinie als Modellsystem für DHBV-Replikation und rc- zu cccDNA Konversion geeignet sein. Sie wurde daher im Folgenden für die Herstellung einer SpCas9 exprimierenden Reporterzelllinie verwendet.

CRISPR/Cas9 vermittelte Integration von cas9 in DHBVenv--HA2/3 Zellen Analog zur Herstellung der stabilen AAVS1-E4orf6 HepG2 Zelllinien (s. Abschnitt 3.1.2) sollte für die stabile Cas9-DHBV-Reporterzelllinie eine Integrationskassette für SpCas9 durch CRISPR/Cas9-vermittelte HR spezifisch in den AAVS1 Lokus auf Chr. 19 integriert werden. Hierzu wird der cas9-DV beidseitig von ca. 800 bp langen AAVS1 Homologie-Regionen flankiert (Abb. 28). Die Expression von Cas9 erfolgt von dem konstitutiv aktiven EF-1a (human elongation factor-1 alpha) Promoter, der eine starke Langzeitaktivität in vivo verspricht (Kim et al., 1990). Er ist an einen trunkierten 5´ LTR des humanen T-Zell Leukämie Virus (HTLV) gekoppelt, um die Stabilität der RNA zu erhöhen (Takebe et al., 1988) (Sakaguchi et al., 2014). Die SpCas9 Sequenz trägt 5´-terminal einen Myc-tag sowie an jedem Terminus ein NLS, um den Transport in den Zellkern zu gewährleisten.

Abb. 35. SpCas9 Donorvektor zur CRISPR/Cas9-vermittelten Integration in den AAVS1-Lokus von DHA2/3 Zellen Der DV trägt an beiden Enden AAVS1-homologe Bereiche von ca. 800 bp, HL und HR. Die Transkription des SpCas9 Transgens erfolgt konstitutiv über den EF-1a Promoter. Die 5´ LTR (long terminal repeat) Sequenz erhöht die RNA Stabilität (Takebe et al., 1988) (Sakaguchi et al., 2014). Weitere Angaben des DV können aus der Legende zu Abb. 12 entnommen werden. Die kodierte Cas9 Sequenz basiert auf cas9 aus S. pyogenes mit zusätzlichem Myc-tag und NLS aus SV40 und Nukleoplasmin (Nukl.).

Die Integrationskassette wurde mit einem Vektor kotransfiziert, der SpCas9 sowie eine AAVS1-spezifische sgRNA kodiert (s. Abschnitt 3.1.2); der so induzierte DSB im AAVS1- Lokus steigert die Effizienz einer ortsspezifischen Integration mittels HR (Hsu et al., 2014) (de Pater et al., 2018). Ab Tag 4 nach Kotransfektion der DHA2/3 Zellen wurde für vier Wochen mit 1,5 µg/ml Puromycin zur Eliminierung nicht transfizierter Zellen selektioniert. Herangezogene Einzelklone wurden zunächst auf korrekte Integration des Transgens in den AAVS1-Lokus untersucht. Hierzu wurde die chromosomale DNA isoliert und die Übergangsbereiche zwischen den Homologie-Armen des Vektors und der chromosomalen

95 Ergebnisse

AAVS1-Sequenz mit spezifischen Primerpaaren in einer TD-PCR amplifiziert; Primer und Reaktionsbedingungen waren identisch zu denen des Integrationsnachweises in den AAVS1_E4wt Zellen (s. Abschnitt 3.1.2); eine schematische Darstellung der erwarteten

Amplifikationsprodukte kann aus Abb. 15 entnommen werden. Naive HepG2 Zellen und H2O dienten als Negativkontrollen. Als Positivkontrolle wurden AAVS1_BCmut Zellen (#4, #5) verwendet, in denen eine korrekte Integration an beiden AAVS1 Schnittstellen bereits gezeigt war (Abb. 16). Die selektionierten SpCas9 exprimierenden DHA2/3 Zellklone werden im Folgenden als DHA_Cas9 bezeichnet. Die TD-PCR-Ergebnisse für die wichtigsten Klone sind in Abb. 36 zusammengefasst.

Abb. 36 Agarosegelelektrophorese der TD-PCR Amplifikate in den selektionierten DHA_Cas9 Zellklonen Je TD-PCR wurden 100 ng chromosomale DNA eingesetzt. Die PCR-Bedingungen entsprachen denen in Abb. 16. Weiße, dünne Pfeile (wenn angegeben) markieren das erwartete PCR-Produkt, der Blockpfeil zeigt das DNA-Fragment, dessen Sequenz als korrekt bestätigt wurde. (A) 600 bp Amplifikat der Integrationskassette mit den Primern HR+ und PuroR1-. (B) 1.300 bp Amplifikat der Integrationsregion am HL-Arm mit den Primern HL+ und PuroR1-. (C) 1.030 bp Amplifikat der Integrationsregion am HR-Arm mit den Primern LoxP+ und HR-. (D) 1.200 bp Amplifikat der flankierenden Sequenzen an der AAVS1-CRISPR/Cas9 Schnittstelle des wt AAVS1-Allels mit den Primern HL+ und HL-.

Das Primerpaar HR+ und PuroR- (Abb. 36A) testet auf das grundsätzliche Vorhandensein der Integrationskassette. Beide Primer binden innerhalb der Kassette und sollten ein 600 bp Amplifikat ergeben. Ein entsprechendes Produkt war für alle selektionierten Einzelklone, nicht aber die Negativkontrollen zu detektieren. Demnach enthalten alle getesteten Klone die Expressionskassette, wie aufgrund ihrer Puromycinresistenz zu erwarten war. Die schwachen

96 Ergebnisse zusätzlichen Banden traten auch in naiven HepG2 Zellen auf, sodass es sich hierbei um unspezifische Produkte handelt.

Die Primer LoxP+ und HR- amplifizieren den Übergangsbereich zwischen DV-kodiertem AAVS1-HR Arm (Bindungsstelle für Primer LoxP+) und Chr. 19 (Bindungsstelle für Primer HR-), wobei ein 1030 bp langes Amplifikat entstehen sollte. Für die Zellklone DHA_Cas9 #3 und #44 ließen sich spezifische PCR-Produkt (weiße Pfeile) auf gleicher Höhe wie in den Positivkontrollen BCmut #4 und #5 (Abb. 36C) detektieren; ihr Fehlen in den Negativkontrollen bestätigt die Spezifität der Amplifikation. Das PCR-Produkt des DHA_Cas9 #3 Zellklons (weißer Blockpfeil) wurde mittels eines PCR-Aufreinigungskits von der Polymerase und Primern gereinigt. Die anschließende Sequenzanalyse bestätigte eine korrekte Integration des rechten Homologiebereichs.

Zum Nachweis einer korrekten Integration des linken Homologiearmes wurden die Primer HL+ und PuroR1- eingesetzt (Abb. 36B). HL+ bindet auf Chr. 19 und PuroR1- innerhalb der Integrationskassette des DV; das erwartete Amplifikat hätte eine Länge von ca. 1.300 bp. Ein entsprechendes Produkt ließ sich in der Positivkontrolle BCmut #5 nachweisen, aber in keiner der Proben der selektionierten DHA_Cas9 Klone. Die sichtbaren kleineren Banden traten alle auch in naiven HepG2 Zellen auf und waren daher unspezifisch (s. weißer Pfeil in Abb. 36B). Auf eine weitere Klärung wurde zugunsten einer funktionellen SpCas9-Nuklease Expression (s. Abschnitt 3.4.2 und 3.4.3) verzichtet.

Schließlich wurde mit den Primern HL+ und HL-, die beide auf dem chromosomalen AAVS1-Bereich binden (Abb. 36D), die Ziel-Region für den intendierten AAVS1- spezifischen DSB amplifiziert. Hierbei dienten naive HepG2 Zellen als Positivkontrolle zur Amplifikation eines wt AAVS1-Allels. Ein entsprechendes Amplifikat von ca. 1.200 bp Länge trat auch in den Zellklonen DHA_Cas9 #3 und #44 auf, für die eine AAVS1- Integration über den rechten Homologiearm eindeutig nachgewiesen war. Folglich sind beide Zellklone bezüglich des spcas9 Gens heterozygot.

Wie bereits in Abschnitt 3.1.2 erläutert, wurden auch diese PCR-Fragmente nach Aufreinigung auf SpCas9/sgRNA induzierte Indel-Mutationen untersucht. Die Sequenzanalyse zeigte aber für beide Klone eine zu den naiven HepG2 Zellen identische Sequenz. Somit ergaben sich wie bei den AAVS1_E4orf6 Zelllinien keine Hinweise auf eine CRISPR/Cas9-vermittelte Editierung des AAVS1-Lokus über NHEJ. Dies stützt die Vermutung, dass bereits die methodisch erwünschte Einführung von AAVS1-spezifischen

97 Ergebnisse

DSBs sehr ineffizient verlief, wobei die Hauptursache hierfür in der sehr geringen Transfektionseffizienz der HepG2-basierten DHA2/3 Zellen liegen dürfte.

3.4.2. SpCas9-Protein Nachweis in den stabilen DHA2/3-Reporterzelllinien Die oben beschriebenen PCR-Analysen hatten keinen eindeutigen Nachweis einer korrekten Integration des linken Homologiearmes des SpCas9-DV in den AAVS1-Lokus geliefert; andererseits sprach die offensichtliche Expression der Puromycin-Resistenz für eine korrekte Integration, da hierfür ein passend stromauf gelegener chromosomaler Promotor und ein mit dem DV-kodierten SA (Abb. 35) kompatibler SD erforderlich sind. Statt auf die Verbesserung der PCR-Analytik wurde der Fokus daher auf die weitergehende Frage der Expression von funktionellem SpCas9 Protein gelegt. Hierzu diente zunächst ein IB mit einem spezifischen α-Myc-Antikörper und auf zellulärem Niveau die IF mit einem spezifischen α-Cas9-Antikörper. Die Ergebnisse sind in Abb. 37A und B gezeigt.

Abb. 37 Validierung der SpCas9 Expression in den selektionierten DHA_Cas9 Zellklonen (A) IB zur Detektion der SpCas9 Proteinexpression in den DHA_Cas9 Einzellklonen #1, #3, #4 und #44. Als Negativkontrolle dienten Cas9-naive DHA2/3 Zellen, als Positivkontrolle DHA2/3 Zellen an d4 nach Kotransfektion des DV mit dem Cas9/sgRNA Expressionsvektor. Einzelklone wurden nach Selektion für 4 Wochen mit 1,5 µg/ml wie in Abschnitt 3.1.2 und Abb. 9 beschrieben herangezogen. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine über ein 7,5% SDS-Gel aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit -Myc- (Cell Signaling #9B11, 1:1.000) oder -β-Aktin- (Sigma #AC-15, 1:10.000) Antikörper inkubiert. Zur Detektion

98 Ergebnisse dienten PO-gekoppelte Sekundärantikörper und ein chemilumineszentes Substrat. Molmasse β-Aktin: 42 kDa, myc-Cas9: 160 kDa. (B) IF von DHA_Cas9 #3 und #44. Naive DHA2/3 Zellen dienten als Negativkontrolle. Die Zellen wurden wie in Abb. 11D beschrieben behandelt. Die Cas9-Färbung erfolgte mit einem α-Cas9 Antikörper (Biolegend #7A9, 1:1.000) und einem Cy3 gekoppelten (rot, Filter: 555 nm) Sekundärantikörper (Dianova, 1:500). Die Kernfärbung erfolgte mit DAPI (blau, Filter 365nm). Belichtungszeit je 500 ms., 40x Vergrößerung. Die weißen Kästchen repräsentieren den ganz rechts vergrößert dargestellten Bildausschnitt.

Der Myc-tag spezifische IB zeigte für die Zellklone #3 und #44 jeweils eine Bande auf der erwarteten Höhe von ca. 160 kDa, die auch in den transient SBI-Cas9/sgRNA transfizierten Zellen, nicht aber Cas9-naiven DHA2/3 Zellen zu sehen war. Die stärkere Bandenintensität in den transient transfizierten Zellen beruht vermutlich auf einem Gendosis-Effekt, da pro Zelle mehrere Kopien des Cas9-Expressionsvektors wie auch des DV (welcher ebenfalls Cas9 exprimiert) vorliegen können, in den stabilen Zellen aber nur ein oder zwei korrekte Integrate. Der DHA_Cas9 Zellklon #1 zeigt keine, der Zellklon #4 nur eine sehr schwache Bande auf der erwarteten Höhe.

Die Varianz in der SpCas9 Expression zwischen den einzelnen Zellklonen könnte auf fehlerhafte Integration und/oder genetische oder epigenetische Veränderungen vor oder während der Selektionsphase zurückgehen, welche die Expression von Volllängen-SpCas9 Protein vermindern oder verhindern. Dies wurde aber nicht näher untersucht.

Die SpCas9-spezifische IF der im IB deutlich SpCas9-positiven Zellklone DHA_Cas9 #3 und #44 zeigte auch zwischen einzelnen Zellen desselben Klons heterogene Signalintensitäten. Neben Zellen mit starker IF waren einige Zellen so schwach gefärbt, dass die SpCas9-FL in der DAPI/Cas9 Überlagerung nicht mehr eindeutig zu sehen war; es blieb daher unklar, ob alle Zellen SpCas9 exprimieren. Die vergrößerten, weiß umrandeten Bildausschnitte in Abb. 37B zeigen für die DHA_Cas9 #3 Zelllinie in nahezu allen Zellen SpCas9-spezifische rote FL, während in der DHA_Cas9 #44 Zelllinie ein erheblicher Anteil der Zellen negativ blieb, in Einklang mit dem schwächeren SpCas9-Signal im IB (vgl. Abb. 37A und B). Für beide Zelllinien veranschaulicht die Vergrößerungsansicht eine Anreicherung des SpCas9 Proteins im Nukleus.

Zusammen belegen diese Daten die erfolgreiche Etablierung von mindestens zwei stabilen SpCas9-exprimierenden Zellklonen auf Basis der DHA2/3 DHBV-Reporterzelllinie. Anmerkenswert ist auch hier, dass ähnlich wie bei den AAVS1-E4orf6 Zelllinien (s. Abschnitt 3.1.2) nur ein geringer Anteil der initial gepickten Zellklone erfolgreich expandiert werden konnte, was auf ein ineffizientes CRISPR/Cas9-Editing in unserem HepG2-

99 Ergebnisse

Transfektionssystem hindeutet. Umso wichtiger war daher der funktionelle Nachweis, dass das Zelllinien-kodierte SpCas9 Protein die erwünschte enzymatische Aktivität besitzt.

3.4.3. Fluoreszenzbasierter SpCas9 Aktivitätsassay Die Bildung eines funktionalen Cas9/sgRNA Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf der von der sgRNA definierten DNA-Zielsequenz induziert einen DSB, der von zellulären Reparaturmechanismen mittels HR oder NHEJ repariert wird (Hsu et al., 2014). Während HR hauptsächlich in der S-Phase des Zellzyklus erfolgt, da ein Geschwisterchromatid als Matrize zur fehlerfreien Reparatur benötigt wird, ist NHEJ der vorherrschende, aber fehlerbehaftete Reparaturmechanismus in allen weiteren Stadien des Zellzyklus (s. Einleitung 1.7) (Hustedt & Durocher, 2016). Die Religation des DSB mittels NHEJ führt oft zu kurzen Insertionen und Deletionen (Indels). Diese Mutationen werden häufig durch die sogenannte Enzym- Fehlpaarungs-Spaltung Methode (enzyme mismatch cleavage method) nachgewiesen (Vouillot et al., 2015) (Hsu et al., 2014). Der Assay umfasst typischerweise mindestens vier Schritte und ist damit recht zeitintensiv (s. 3.5.1.). Als schnellere Alternative für den Aktivitätsnachweis des Zell-kodierten SpCas9 in den DHA_Cas9 Zelllinien wurde hier ein fluoreszenzbasierter SpCas9 Aktivitätsassay etabliert. Hierzu wurde ein Reporterkonstrukt synthetisiert, bei dem die Expression eines funktionalen eGFP von der Bildung eines aktiven Cas9-RNP-Komplexes abhängt. Der entsprechende Vektor (pCMVmCherryP2AGFPrepAAVS1sg, mCherry-GFP) ist in Abb. 38 schematisch dargestellt.

Abb. 38 mCherry-GFP Reportervektor für einen fluoreszenzbasierten SpCas9 Aktivitätsassay Darstellung des mCherry-GFP Reportervektors pCMVmCherryP2AGFPrepAAVS1sg. Die CMV-Promoter- regulierte Expressionskassette kodiert in einem Leseraster mCherry, P2A-Peptid und das per se inaktive eGFP- Segment β1-10; durch P2A entstehen zwei separate Proteinketten. Die folgende sgRNA-Zielsequenz (hier AAVS1-PAM) bringt das fehlende eGFP-Segment β11 aus dem Raster. Vom Vektor-kodierten H1 Promoter erfolgt die Synthese einer AAVS1 spezifischen sgRNA. In Anwesenheit von aktivem SpCas9 wird in der sgRNA-Zielsequenz ein DSB induziert. Durch NHEJ entstehende Indels bringen in 1/3 der Ereignisse das GFP- β11 Segment in ein durchgehendes Leseraster mit GFP β1-10. Dies führt zur Entstehung eines funktionalen eGFP. Zellen ohne SpCas9 oder entsprechende AAVS1-sgRNA exprimieren nur mCherry.

100 Ergebnisse

Wichtigster Bestandteil des Reporterkonstrukts ist eine CMV-Promotor-kontrollierte Expressionskassette für ein mCherry-Protein, das durch ein P2A Peptid mit einem zweigeteilten (split) GFP verknüpft ist. Das größere GFP-Segment umfasst die ersten 10 (β1- 10) der insgesamt 11 β-Stränge der Fass-artigen GFP Struktur und kann für sich keinen Fluorophor ausbilden. Die kodierende Sequenz für den fehlenden β11-Strang wird durch die Insertion einer AAVS1-PAM Zielsequenz aus dem Leseraster gebracht, sodass kein funktionales GFP entsteht. Das Plasmid kodiert weiterhin für eine H1 Promoter-abhängige SpCas9-spezifische sgRNA mit Spezifität für den AAVS1 Lokus. In SpCas9 exprimierenden Zellen kann so die AAVS1-PAM Zielsequenz auf dem Vektor geschnitten und der entstandene DSB mittels NHEJ repariert werden. Die dabei entstehenden Indel-Mutationen bringen die GFPβ11 Einheit mit einer Wahrscheinlichkeit von 1/3 aller Ereignisse in das korrekte Leseraster, was zur Entstehung von funktionalem GFP führt. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass unterschiedliche Aminosäure-Sequenzen als Verbindung zwischen β10 und β11 ohne massive Störung der GFP 3D-Struktur toleriert werden (Walker et al., 2011). Zellen ohne SpCas9 Nuklease und/oder ohne passende sgRNA zeigen nur die mCherry-spezifische rote FL, was als Transfektionskontrolle dienen kann. Die Entstehung der grünen GFP FL zeigt dagegen die gleichzeitige Anwesenheit von aktivem SpCas9 und einer zur Zielsequenz passenden sgRNA an.

Das mCherry-GFP Reporterkonstrukt wurde zunächst mittels transienter Kotransfektion in naiven HepG2 Zellen getestet, wobei der SpCas9-kodierende AAVS1-DV (s. Abschnitt 3.4.1, Abb. 35) als Quelle für SpCas9 Protein diente. An Tag 4 nach Transfektion erfolgte die Analyse auf mCherry- und eGFP-positive Zellen im FL-Mikroskop (Abb. 39A) und eine Bestimmung der jeweiligen Anteile rot bzw. grün fluoreszierenden Zellen mittels FACS (Abb. 39B).

101 Ergebnisse

Abb. 39 Fluoreszenzbasierter SpCas9 Aktivitätsassay in transient kotransfizierten HepG2 Zellen Jeweils ca. 1x106 naive HepG2 Zellen wurden mit 2 µg mCherry-GFP Reportervektor alleine transfiziert oder mit Reportervektor plus der gleichen Menge AAVS1-SpCas9 Vektor. Vier Tage nach Transfektion wurden mCherry- und GFP-FL validiert. (A) FL-Mikroskopie. Gezeigt sind jeweils die HF-Aufnahmen (Belichtungszeit 20 ms) und die zugehörigen FL-Aufnahmen für mCherry (555 nm Filter; Belichtungszeit 2.000 ms) und für eGFP (Filter 470 nm; 1.000 ms). 10x Vergrößerung. Die weißen Kästchen kennzeichnen die ganz rechts vergrößert gezeigten Ausschnitte. (B) FACS Analyse der Transfektionsansätze. Es wurden 20.000 Einzelzellen auf mCherry- (x-Achse) und GFP (y-Achse) FL untersucht. Der Anteil fluoreszierender Zellen an der Gesamtpopulation ist in % angegeben. Doppelt-positive Zellen (oberer rechter Quadrant) zeigen ortsspezifische Editierung des Reporter-Vektors unter Indel-Bildung an.

Aus den FL-Aufnahmen wird deutlich, dass GFP-positive Zellen nur nach Kotransfektion von Reportervektor und AAVS1-SpCas9 Expressionsvektor zu detektieren sind. In der 470 nm Filteraufnahme sind grüne Zellen zu sehen, die aufgrund gleichzeitiger mCherry Expression vereinzelt orange/gelb erscheinen. Dies ist insbesondere in der Vergrößerungsansicht des weiß eingerahmten Bildbereichs zu sehen. Zellen, die nur mit dem Reportervektor transfiziert wurden, leuchten lediglich rot und erscheinen auch nach Anregung mit dem 470 nm Filter schwach rötlich (Abb. 39A). Die FACS Validierung ergab für beide Transfektionsansätzen eine mCherry-positive Zellpopulation von etwa 30%. Dies repräsentiert die generelle Transfektionseffizienz. Die Kotransfektion mit dem AAVS1-SpCas9 Expressionsvektors führte zu einem GFP-positiven Populationsanteil von 2,5% aller roten Zellen. Somit ermöglicht der fluoreszenzbasierte SpCas9 Aktivitätsassay einen schnellen und einfachen Nachweis der Bildung eines aktiven, target-spezifischen RNP-Komplexes. Durch Austausch

102 Ergebnisse der sgRNA- und sgRNA-Zielsequenz-Kassetten sollte das System auch generell anwendbar sein.

Im Folgenden wurden die selektionierten DHA_Cas9 Einzellklone #3 und #44 mit dem mCherry-GFP Reportervektor transfiziert, um die Aktivität des zellkodierten SpCas9 zu bestätigen. Auch hier wurden mCherry- und GFP-Signale im fluoreszenzmikroskopisch festgehalten (Abb. 40).

Abb. 40 Fluoreszenzbasierter SpCas9 Aktivitätsassay in selektionierten DHA_Cas9 Einzelklonen DHA_Cas9 #3 und #44 Zellen wurden mit 2 µg/6-well des mCherry-GFP-Reporterplasmids (pCMVmCherryP2AGFPrepAAVS1sg) transfiziert. Nach vier Tagen wurde die mCherry und GFP Expression im FL-Mikroskop festgehalten. Die Durchführung erfolgte gemäß den Angaben in Abb. 39.

Die FL-Aufnahmen zeigen in beiden DHA_Cas9 Zellklonen ein etwa gleich starkes mCherry Signal, in Einklang mit einer vergleichbaren Transfektionseffizienz. Ebenso ist in beiden Zellklonen die Entstehung GFP-positiver Zellen zu sehen, was eine funktionale Aktivität des zellkodierten SpCas9 belegt. Zudem enthielt der Ansatz von Zellklon #3 mehr GFP-positive Zellen als derjenige von Zellklon #44. Dies spricht für ein effizienteres SpCas9/sgRNA Editieren in den DHA_Cas9 #3 Zellen, in Einklang mit den IB und IF Daten aus Abschnitt 3.4.2. Allerdings wiesen auch in Zelllinie #3 nicht alle mCherry positiven Zellen ein GFP Signal auf. Zwar führt erwartungsgemäß nur ein Drittel der NHEJ-Ereignisse zu einer produktiven Leserasterverschiebung; andererseits gelangen bei der Transfektion wahrscheinlich mehrere Reportervektor-Moleküle in jede transfizierte Zelle, sodass pro Zelle mehrmals die Chance auf die Entstehung eines durchgängigen GFP-Leserasters besteht. Daher war nicht auszuschließen, dass die mCherry-positiven, aber GFP-negativen DHA_Cas9 #3 Zellen trotz vermeintlicher Einzelzell-Klonierung auf genetische Heterogenität bez. der Expression von aktivem SpCas9 zurückgingen. Daher wurde der fluoreszenzbasierte SpCas9 Aktivitätsassay im nächsten Schritt genutzt, um GFP-positive Zellen mittels FACS zu sortieren und so eine Anreicherung von Zellen mit funktionalem SpCas9 zu erreichen (Abb.

103 Ergebnisse

41). Die daraus hervorgegangene Zelllinie wurde als DHA_Cas9 #3-S(ORT) bezeichnet. Die Anreicherung der SpCas9 exprimierenden Zellen wurde im IB und mittels IF bestätigt (Abb. 41).

Abb. 41 Anreicherung SpCas9 exprimierender Zellen nach Transfektion von DHA_Cas9 #3 Zellen mit dem mCherry-GFP Reportervektor Etwa 1x106 Zellen der Linie DHA_Cas9 #3 wurden mit 2 µg des mCherry-GFP-Reporterplasmids (pCMVmCherryP2AGFPrepAAVS1sg) transfiziert. Nach vier Tagen wurden GFP-positive Zellen per FACS präparativ sortiert und anschließend expandiert. Der SpCas9-Nachweis im IB und die IF wurden wie in Abb. 37A und B beschrieben durchgeführt. Vergrößerung: 20x. Molmasse SpCas9: 160 kDa; Lamin B: 70 kDa (α- Lamin B: MilliporeSigma cat #Na12-100UG, 1:2.500).

Die IB-Gegenüberstellung der DHA_Cas9 Zellen vor und nach Sortierung zeigt eine etwa 2,2-fache Anreicherung des SpCas9 Signals relativ zur Lamin B-Kontrolle. Auch in der IF erschien in der sortierten DHA_Cas9 #3-S Zelllinie der Anteil SpCas9-positiver Zellen größer als in der Mutterzelllinie DHA_Cas9 #3. Somit konnte der fluoreszenzbasierte SpCas9 Aktivitätsassay auch erfolgreich für eine präparative Anreicherung SpCas9-positiver Zellen eingesetzt werden.

3.4.4. DHBV-Replikationskinetik in der SpCas9 exprimierenden Reporterzelllinie DHA_Cas9 #3-S Für eine Einschätzung potenzieller Nebenwirkungen des nicht völlig geklärten Insertionsortes der SpCas9 Kassette im Genom der DHA_Cas9 Zellen und der konstitutiven Expression aktiver spCas9 Nuklease wurden die DHA_Cas9 #3-S Zellen zunächst mehrfach passagiert, wobei keine nachteiligen Effekte auf das Zellwachstum zu beobachten waren. Anschließend wurde untersucht, ob die DHBV-Replikationskinetik beeinflusst ist. Hierzu wurde durch mehrtägige Kultivierung in Dox-freiem Medium die Transkription der DHBV- Expressionskassette induziert und von Tag 4 bis Tag 23 nach Induktion analog Abschnitt

104 Ergebnisse

3.4.1 die Akkumulation zytoplasmatischer Kapside und viraler DNA im Zellkern mittels NAGE/IB bzw. SB (Abb. 42A) sowie die cccDNA-abhängige Sekretion von HAeAg im ELISA verfolgt (Abb. 42B). Insgesamt zeigte sich für die DHA_Cas9 #3-S Zellen in allen Assays eine ähnliche Kinetik wie in der Mutterlinie DHA2/3 (Abb. 34); die leichte Zeitverzögerung von ca. 3 Tagen wäre auch durch technische Unterschiede bezüglich genauer Start-Zellzahl, blotting-Effizienz und/oder spezifischer Aktivität der jeweils eingesetzten 32P- Sonden zu erklären.

Abb. 42. DHBV-Replikationskinetik in der SpCas9-exprimierenden DHA_Cas9 #3-S Reporterzelllinie Die Zellen wurden für die angegebenen Tage in Dox-freiem Medium kultiviert. (A) NAGE/IB auf zytoplasmatische Kapside und SB nukleärer DHBV-DNA. (B) HA-ELISA aus Zellkulturüberstand. Alle Assays wurden durchgeführt wie in Abb. 34 beschrieben.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse in diesem Kapitel die erfolgreiche Generierung einer induzierbaren DHBV-Reporterzelllinie mit konstitutiver Expression von sgRNA- abhängig aktiver SpCas9 Endonuklease (Abb. 41). Analog der Mutterzelllinie DHA2/3 ermöglicht die neu etablierte DHA_Cas9 #3-S Zelllinie die Verfolgung der DHBV cccDNA- Kinetik anhand der cccDNA-abhängigen Synthese und Sekretion von HAeAg im ELISA, aber auch durch direkten cccDNA-Nachweis im SB (Abb. 42).

Hiermit standen nun grundsätzlich zwei Reporterzelllinien zur Verfügung, um die Bedeutung individueller Wirtsfaktoren für DHBV-Replikation und rc- zu cccDNA Konversion mittels RNA-Interferenz (RNAi) KD und CRISPR/Cas KO zu untersuchen. Da beide Techniken RNA-abhängig sind (si/shRNA, (s)gRNA), wurden im nächsten Schritt verschiedene 105 Ergebnisse

Methoden zum effizienten Einbringen der erforderlichen Komponenten in die Reporter- Zelllinien verglichen.

3.5. Funktionale Stilllegung von Wirtsfaktoren mit potenzieller DHBV- Replikationsrelevanz

Der Nachweis einer funktionellen Rolle ausgewählter Wirtsfaktoren für DHBV-Replikation und/oder rc- zu cccDNA-Konversion sollte durch deren funktionelle KD oder kompletten KO auf Genebene erfolgen. Ist ein betreffender Faktor relevant und kann nicht durch andere, funktionell redundante Faktoren ersetzt werden, sollte dies zur Verringerung oder zum Verlust viruseigener Genprodukte bzw. Nukleinsäureformen führen. Grundsätzlich verspricht die KO-Technologie klarere Ergebnisse, da bei all-allelischem KO der entsprechende Faktor überhaupt nicht mehr zur Verfügung steht. Falls aber der Faktor auch für die Zelle essentiell ist, kann die entsprechende KO-Zelle nicht überleben. Laut genomweiter KO-screens sind möglicherweise etwa 10% der humanen Gene essentiell (Wang et al., 2015) (Wang et al., 2017) (Cacheiro et al., 2020), wobei zwischen einzelnen Zelllinien große Unterschiede zu bestehen scheinen. Demgegenüber bleibt bei der RNAi die genomische Information üblicherweise erhalten, als Interferenz-target dient statt des Gens eine RNA, z.B. die mRNA für einen Protein-Faktor. Wie die gRNA bei CRISPR/Cas vermittelt auch bei RNAi eine kurze RNA die Sequenzspezifität. Letztlich ist dies die siRNA (small interfering RNA), die den Multikomponenten RISC-Komplex (RNA induced silencing complex) zur komplementären Sequenz auf der Ziel-RNA leitet und so bei ausreichend hoher Komplementarität deren Spaltung mittels der Nuklease-Aktivität eines Komplex-assoziierten Argonaut Proteins wie Ago2 induziert. Bei geringerer Komplementarität (z.B. bei microRNAs) kann auch ohne Spaltung die Translatierbarkeit einer mRNA gehemmt werden. siRNAs können chemisch synthetisiert und so für RNAi eingesetzt werden, entstehen natürlicherweise aber aus zumindest partiell doppelsträngigen (meist Haarnadel-artigen) Vorläufer-RNAs. Diese werden in der Zelle durch RNAse III-artige Nukleasen wie DICER in kurze Duplex-RNAs zerlegt, von denen ein Strang als Leitstrang (guide strand) mit dem RISC assoziiert, während der Gegenstrang (passenger strand) entlassen wird. Synthetische siRNA hat den Vorteil einfacher Anwendbarkeit, da die Zelle über alle weiteren RISC Komponenten bereits verfügt. Wesentlicher Nachteil ist die begrenzte intrazelluläre Lebensdauer solcher siRNAs; da sie nicht nachgeliefert werden, ist auch der resultierende silencing Effekt nur transient. Eine Option wären mehrfache sequenzielle Transfektionen

106 Ergebnisse derselben siRNA, nach Erfahrungen im Labor wird das aber von HepG2 Zellen nicht gut toleriert (C. Königer, Dissertation Uni Freiburg, 2014).

Eine Alternative sind sh (small hairpin) RNAs, die typischerweise von RNA Polymerase 3 Promotoren (U6, H1) transkribiert werden und durch ihre sense-loop-antisense (oder umgekehrt) Architektur Haarnadelstrukturen ausbilden, die von den Nukleasen Drosha und DICER in funktionelle siRNAs prozessiert werden. Entsprechende U6- oder H1-Promotor- shRNA Kassetten können transient oder stabil in Zellen eingebracht werden und führen so zu länger andauernder RNA-Interferenz. Angesichts der sehr langsamen Kinetik (1-3 Wochen) von DHBV-Replikation und rc- zu cccDNA Konversion in den stabilen TetOFF DHA2/3 und DHA_Cas9 #3-S Zelllinien ist dies ein wesentlicher Gesichtspunkt für die Nachweisbarkeit eines RNAi oder KO-Effektes auf das Virus. Ein zweiter wichtiger Aspekt ist eine effiziente Stilllegung der Wirtsfaktor-Expression in der überwiegenden Mehrzahl der Zellen der untersuchten Population. Selbst ein 100%-iger KO eines für das Virus (aber nicht die Zelle) essentiellen Wirtsfaktors wäre nicht sicher zu identifizieren, wenn er nur einen Bruchteil der Zellen betrifft. Würde der betreffende Faktor z.B. in 20% der Zellen komplett fehlen, könnte das Virus in den restlichen 80% der Zellen ungestört replizieren; in der Summe würden virale Antigen- und Genomproduktion nur um 20% vermindert. Eine prinzipielle Option wäre die Selektion derjenigen Zellen mit erfolgreichem KD oder KO. Wegen der erheblichen Anzahl an Wirtsfaktor-Kandidaten und des Aufwandes bei der Etablierung stabiler Zelllinien (vgl. die E4orf6- und die SpCas9-Zelllinien) erschien es angebrachter, Wege zu finden, die von vornherein mit hoher Effizienz zur Präsenz der Effektor-RNAs (und eventuell notwendiger weiterer Faktoren) in den DHBV-Reporterzelllinien führen. Hierzu wurden mehrere unterschiedliche Methoden getestet, die in den folgenden Kapiteln näher erläutert werden.

3.5.1. Einschleusen chemisch synthetisierter RNA-Oligonukleotide in HepG2- und HepG2-basierte Zellen – CRISPRMAX-Transfektion vs. Nucleofektion Eine relativ neue und prinzipiell einfache Methode für CRISPR/Cas-basiertes Genom- Editieren ist das direkte Einschleusen von Cas9-gRNA-RNPs mit speziellen Transfektionsreagenzien, z.B. Lipofectamine-CRISPRMAX Cas9 (Thermo Fisher Scientific). Hierzu wird rekombinantes Cas9 Protein, z.B. TrueCut Cas9 Protein v2 (Thermo Fisher Scientific), in vitro mit der gewünschten gRNA gemischt, die entweder als partieller Duplex aus target-spezifischer crRNA plus konstanter tracrRNA oder als fusionierte, einkettige sgRNA vorliegt.

107 Ergebnisse

In einem Pilotexperiment wurden mit anti-eGFP crRNA/tracrRNA (IDT) beladene Cas9 RNPs assembliert und mittels CRISPRMAX Reagenz gemäß Herstellerangaben in eine HepG2-Zelllinie transfiziert, die analog zu den E4orf6 Zellen eine Expressionskassette für eGFP im AAVS1-Lokus trägt (HepG2-AAVS1_eGFP; Abb. 13). Weder ein Monitoring der Zellen über mehrere Tage im FL-Mikroskop noch eine FACS-Analyse gaben aber Hinweise auf die erwartete Zunahme des Anteils eGFP-negativer Zellen. Der analoge Einsatz einer laut Hersteller hocheffizienten gRNA gegen Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase 1 (HPRT1; bei Thermo Fisher Scientific als positive Kontroll-crRNA im Programm) führte ebenfalls nicht zu klar per Sequenzierung nachweisbaren Editierungs-Ereignissen.

Zur Einschätzung einer geringen Transfektionseffizienz als möglicher Ursache wurde in den nächsten CRISPRMAX Ansätzen die tracrRNA durch ein FL-Markiertes Derivat (Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA-ATTO550; IDT) ersetzt. Korrektes Assembly vorausgesetzt, sollte die FL bei 550 nm (Phycoerythrin/PE Kanal) die Lokalisation des RNP-Komplexes anzeigen. Tatsächlich wurden per FACS bis zu 60% Atto550-positive Zellen gezählt. Auch hier ließ sich aber weder phänotypisch (Verlust von eGFP-FL) noch genotypisch (Indel-Bildung an der HPRT1-Zielstelle) ein substantielles editing nachweisen. Die Ursachen hierfür wurden nicht geklärt; es ist jedoch zu bedenken, dass eine Einordnung Atto550-positiver Zellen per FACS nur auf der Anwesenheit des Fluorophors basiert. Dies belegt noch nicht, dass dieser noch Teil der tracrRNA, des crRNA/tracrRNA-Hybrids, und/oder des kompletten Cas9-RNPs ist und dass er an seinem Wirkort, der chromosomalen DNA, lokalisiert ist. Da wie in Abschnitt 3.5 begründet eine möglichst hohe Editier-Effizienz angestrebt war, wurde die CRSIPRMAX Transfektionsmethodik zugunsten der Evaluierung anderer Methoden nicht weiterverfolgt.

Eine für viele, auch schlecht transfizierbare Zellen effiziente Alternative zur Einschleusung von DNA und RNA ist die Nucleofection, eine Kombination aus Elektroporation und Transfektion; die Anwendbarkeit auf sich nicht teilende Zellen belegt zudem, dass die transferierten Nukleinsäuren direkt in den Zellkern gelangen können, was für die CRISPR/Cas Methodik ohnehin erwünscht ist. Anbieter für Gerät (Nucleofector) und mehrere Zelltyp-spezifische Reagenzien ist nach Übernahme des ursprünglichen Entwicklers Amaxa das Unternehmen Lonza. Mangels eines eigenen Nucleofectors konnte dankenswerterweise ein Nucleofector 4 in der AG von Prof. Dr. Hartmut Hengel am Institut für Virologie der Universität Freiburg für die Versuche benutzt werden.

Für eine Testanwendung wurde das o.g. annealing-Produkt aus HPRT1-spezifischer crRNA und ATTO-550-tracrRNA (hier als gRNA bezeichnet) gemäß Hersteller-Protokoll für

108 Ergebnisse adhärente Zelllinien (inkl. HepG2) in naive HepG2- und in die DHA_Cas9 #3-S Reporterzellen nucleofiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen per FACS bez. 550 nm FL analysiert (Abb. 43).

Abb. 43 FACS Analyse gRNA-ATTO-550 nucleofizierter DHA_Cas9 #3-S Zellen 1x106 Zellen wurden mit 340 pmol einer gRNA aus ATTO-550-markierter tracrRNA und HPRT1-spezifischer crRNA in 100 µl Nucleofection-Puffer nukleofiziert (+Nfx) (Programm Nr. 2-Zellprogramm). Als Kontrollen dienten unbehandelte Zellen (naiv) sowie Zellen, die mit RNA inkubiert, aber nicht im Nucleofector behandelt waren (ohne Nfx.). Es wurden je 20.000 Einzelzellen analysiert. In den Dotplots (links) ist die FL-Intensität im PE Kanal (x-Achse) gegen das Seitwärtsstreulicht (SSC; y-Achse) aufgetragen. Im Histogramm (rechts) zeigt die x-Achse die FL-Intensität bei 550 nm, die y-Achse den zugehörigen Zellanteil in Prozent des auf 100% gesetzten Maximalwertes (Max.). Die Nucleofection naiver HepG2 Zellen (nicht gezeigt) führte zu vergleichbaren Ergebnissen.

Nach Nucleofection wurden bei beiden Zelllinien 100% der Zellen als im PE-Kanal positiv bewertet, wie in Abb. 44 exemplarisch für die DHA_Cas9 #3-S Zellen gezeigt (die Daten für HepG2 Zellen waren vergleichbar). Allerdings führte bereits die Inkubation der Zellen mit der fluoreszenzmarkierten RNA per se ("ohne Nfx.") zu einer als PE-positiv gewerteten Zellpopulation von etwa 25%, jedoch mit geringerer mittlerer FL-Intensität (Histogramm in Abb. 43). Demzufolge wird ein Teil der gRNA entweder bereits ohne elektrischen Impuls von den Zellen aufgenommen oder die RNA-Moleküle haften an der Zellmembran und verursachen so ein falsch-positives FL-Signal. Wiederholtes Waschen mit PBS reduzierte die Signale nicht (Ergebnisse nicht gezeigt), weshalb der tatsächlich in die Zellen bzw. deren Nukleus aufgenommene Anteil unklar blieb. Eine eventuell mögliche Minimierung des unspezifischen FL-Hintergrundes mittels RNase-Verdau wurde aus Zeitgründen und wegen der Entscheidung zugunsten viraler Transfer-Vektoren (s. Abschnitt 3.5.2) nicht weiterverfolgt.

Da andererseits nach Nucleofection sowohl der Anteil PE-positiver Zellen wie ihre FL- Intensität wesentlich höher lagen, wurde auch auf potenzielle HPRT1-Editierung getestet. Hierzu wurde die chromosomale HPRT1-Zielregion zunächst mittels PCR amplifiziert (s.

109 Ergebnisse

Abschnitt 3.4.3), dann die Produkte einem EMC Assay mit T7-Endonuklease 1 (T7E1) unterzogen. Wenn durch NHEJ-Reparaturereignisse nach CRISPR/Cas9 Spaltung Indels eingeführt wurden, bestehen die PCR-Produkte aus einem pool ähnlicher, aber nicht identischer Sequenzen. Durch Denaturierung und anschließendes in vitro annealing können auch Heteroduplexe aus den lokal veränderten Einzelsträngen entstehen. Die T7E1 erkennt und schneidet innerhalb der DNA-Fehlpaarungen, sofern diese mindestens zwei direkt benachbarte Nukleotide beinhalten (Vouillot et al., 2015). Aus den bekannten Positionen der PCR-Primer und der Cas9-Zielstelle ergibt sich die Größe der zu erwartenden Spaltprodukte; diese können per Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht werden. Die hier eingesetzten PCR-Primer zur Amplifikation der HPRT1-Editierungsstellen (huHPRT1_forw und huHPRT1_rev, gemäß IDT) sollten ein 1083 bp langes Produkt ergeben, das bei Editierung der Zielstelle durch T7E1 in Fragmente von 256 bp und 872 bp gespalten werden sollte.

Genomische DNA aus HPRT1-gRNA nucleofizierten DHA_Cas9 #3-S und HepG2 Zellen wie auch aus unbehandelten DHA_Cas9 #3-S Zellen ergab jeweils ein Amplifikat der erwarteten Größe (Abb. 45A). Der T7E1 Verdau potenzieller Heteroduplexe führte aber ausschließlich mit DNA aus den gRNA-nucleofizierten Cas9 Zellen zu zusätzlichen Banden mit einer zu den erwarteten Spaltprodukten kompatiblen Mobilität in der Agarosegelelektrophorese (Abb. 45B). Dies ist das erwartete Ergebnis für eine vorhergehende ortsspezifische Editierung, die nur in Kombination von Cas9 Protein und gRNA ablaufen kann. Die Menge dieser Produkte war allerdings sehr gering. Alternativ wurde daher eine Sequenzanalyse der PCR-Amplifikate durchgeführt. Wie aus dem Vergleich der Chromatogramme der nicht behandelten vs. der HPRT1-gRNA nucleofizierten DHA_Cas9 #3-S Zellen ersichtlich (Abb. 45C), kommt es im Amplifikat aus den letzteren Zellen abrupt ab einer bestimmten Position zum Auftreten gemischter Peaks, und zwar 3 nt stromauf des AGG PAM Motivs der Zielstelle, exakt dort wo der DSB und nachfolgend potenzielle Editier-Ereignisse erwartet werden (Abb. 45B, gezeigt ist der Gegenstrang 5´3´). Eine genaue Betrachtung des Chromatogramms zeigt neben der dominanten wt-Sequenz eine etwa ein Drittel so intensive weitere Sequenz, bei der genau 1 T (Abb. 45B, Blockpfeil) an der erwarteten Schnittstelle fehlt. Somit scheint diese Einzel-Nukleotid-Deletion das Haupt- Editier-Ereignis gewesen zu sein. Weniger abundante Indels würden sich aus der pool- Sequenzierung nur schwer oder gar nicht ableiten lassen. Diese Daten legen nahe, dass das Editing effizienter war als aus dem T7E1 EMC-Assay zu vermuten; aufgrund der Unfähigkeit

110 Ergebnisse des Enzyms, Fehlpaarungen von nur 1 nt Länge zu schneiden, wäre das aus der Sequenzierung abgeleitete Hauptereignis im EMC-Assay nicht erfasst.

Abb. 45 Validierung einer CRISPR/Cas9 HPRT-Editierung nach gRNA-Nucleofection Die angegebenen Zellen wurden wie in Abb. 43 beschrieben mit einer HPRT-spezifischen gRNA nucleofiziert oder unbehandelt gelassen, dann auf HPRT1-Editierung getestet. (A) PCR-Amplifikation der chromosomalen HPRT1-Zielregion. Das anhand der Primer-Sequenzen erwartete Produkt umfasst 1.083 bp. Die PCR-Reaktion in Spur dH2O wurde ohne template-DNA durchgeführt. (B) EMC Assay mit T7 Endonuklease 1 (T7E1). Editierte Zielsequenzen in der template-DNA ergeben lokal veränderte Amplifikate. Zur Heteroduplex-Bildung wurde der Amplifikat-pool denaturiert, dann re-hybridisiert; hierbei entsteht eine Verteilung von Homo- und Hetero-Duplexen. T7E1 erkennt und schneidet DNA-Fehlpaarungen von ≥2 nt. Potenzielle Spaltprodukte wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die erwarteten Produkte haben Längen von 872 bp und 256 bp; dazu kompatible DNA-Fragmente traten ausschließlich in den gRNA-nucleofizierten DHA_Cas9 #3-S Zellen auf. (C) Sequenzanalyse der Amplifikate aus DHA_Cas9 #3-S Zellen vor (oben) und nach Nucleofection mit HPRT1- gRNA. Eingerahmt ist die SpCas9 PAM-Sequenz AGG. Der schwarze Pfeil zeigt die erwartete SpCas9- Schnittstelle (DSB), die schwarzen Blockpfeile markieren die editierte Region; die Deletion des T-Restes 3 nt stromauf der PAM-Sequenz in ca. einem Drittel der Moleküle führt ab da zur Überlagerung der wt mit einer um 1 nt verkürzten Sequenz.

Zusammenfassend waren die Daten zur CRISPRMAX-vermittelten direkten Transfektion von Cas9/gRNA RNPs in HepG2 Zellen wenig erfolgversprechend. Dagegen erschien die Nucleofection der gRNA-Komponenten gemäß der FACS-Analytik mit FL-markierter tracrRNA hocheffizient; trotz nahezu 100%-iger FL-Markierung enthielten aber die stabil

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Cas9 exprimierenden DHA_Cas9 #3-S Zellen nach 2 Tagen gemäß Sequenzanalyse immer noch zu zwei Dritteln uneditierte genomische DNA. Für eine sinnvolle Anwendung zur Identifizierung DHBV-relevanter Wirtsfaktoren wäre daher die Generierung von Einzelklonen mit nachgewiesenem all-allelischem KO notwendig gewesen. Die Nutzung der Nucleofection zum Einschleusen von siRNA erschien für die spezielle Fragestellung wegen des zeitlich begrenzten silencing ohnehin nicht zielführend.

Daher wurden im nächsten Abschnitt virale Vektoren auf Basis von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) und von Lentiviren, spezifisch von humanem Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1), zum Einschleusen von Expressionskassetten für shRNAs und gRNAs (und bei Bedarf für Cas9 Protein) in die humanen Hepatomzellen evaluiert.

3.5.2. Virale Vektoren für die KD/KO Validierung von Wirtsfaktoren mit potenzieller DHBV-Relevanz

3.5.2.1. Rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) Adeno-assoziierte Viren (AAV) gelten als nicht pathogen. Sie gehören zur Familie der Parvoviridae und werden aufgrund der strikten Abhängigkeit ihres Lebenszyklus von der Koinfektion durch ein Helfervirus (z.B. hAdV oder Herpesviren) in das Genus Dependoparvovirus eingeordnet. Virale Partikel bestehen aus einem ikosahedralen Proteinkapsid, dass ein 4,7 kb langes einzelsträngiges DNA-Genom umhüllt. Dieses kann sowohl positive (sense)- wie negative (anti-sense)- Orientierung aufweisen (Wang et al., 2019). Genomstruktur und Genprodukte sind in Abb. 46A schematisch dargestellt. Typische Primaten-AAVs wie AAV2 kodieren vier Replikations-Proteine (Rep78/Rep68, Rep52/Rep40), ein Assembly-aktivierendes Protein (AAP), das für die Formung des Kapsids benötigt wird, sowie drei Strukturproteine (VP1, VP2 und VP3), die Bausteine des Kapsids. Sie vermitteln Zelladhäsion und Internalisierung der viralen Partikel. Das Genom wird beidseitig von ITRs begrenzt. Diese bilden an beiden Termini jeweils eine T-artige Struktur aus und dienen als Replikationsursprung und auch als Verpackungssignal (Aponte-Ubillus et al., 2018). Aufgrund der Sequenzähnlichkeit zwischen ITRs und AAVS1-Lokus auf dem menschlichen Chr. 19 erfolgt mitunter eine Integration des viralen Genoms, was zur Ausprägung einer latenten Infektion führt. Dieses Ereignis wird durch die Aktivität der Rep- Proteine begünstigt (Samulski et al., 1991) (Linden et al., 1996). Da AAVs ohne Helfervirus- Koinfektion nicht replizieren, stellen sie ein relativ sicheres Vehikel zum Einbringen von Transgenen in eine Zielzelle dar; dieser Vorgang wird als Transduktion bezeichnet. In rekombinanten (r)AAVs sind wegen des Größen-Limits von ca. 4,5 kb meist alle AAV- 112 Ergebnisse

Protein-kodierenden Sequenzen durch das/die gewünschte(n) Transgen(e) ersetzt, nur die für Replikation und Genomverpackung essentiellen ITRs verbleiben (Abb. 46B).

Abb. 46. Genomaufbau und Vektor-Biologie des Adeno-Assoziierten Virus (AAV) (A) Genomaufbau eines wt AAV. Die rep- und cap-Gene werden von ITRs flankiert. Rep kodiert vier regulatorische Proteine für Replikation und Genomverpackung. Ihre Expression wird durch die Promotoren p5 (Rep78, Rep68) und p19 (Rep52, Rep40) kontrolliert. Cap kodiert ausgehend vom Promoter p40 drei Kapsidproteine (VP1, VP2, VP3) sowie das assembly-activating protein (AAP). (B) Herstellungsschema für einen rAAV Vektor. In der Vektor-DNA sind nur die ITRs erhalten, die rep- und cap-Gene sind durch ein Transgen ersetzt. Die Herstellung kompletter Vektorpartikel erfordert eine Produzentenzelle (z.B. HEK293), die hAdV E1A und E1B als Teil der notwendigen Helferproteine exprimiert (s. Text). In diese Zelle werden drei Vektoren eingebracht: (i) Der Transgen kodierende Vektor; (ii) ein Verpackungskonstrukt, das Rep, Cap und AAP kodiert; und (iii) ein Helfer-Konstrukt zur Expression der restlichen Helferproteine hAdV E2a und E4orf6 sowie der hAdV VA-RNA. Rep vermittelt die Replikation des Transgen-Konstruktes, ausgehend von Cap werden Kapside synthetisiert. AAP unterstützt das Assembly sowie die Reifung der Kapside. Rep52 und Rep40 vermitteln die Verpackung der ssDNA. P: Promoter, pA: Polyadenylierungssignal. Modifiziert aus (Aponte- Ubillus et al., 2018).

Durch die Deletion der rep und cap Gene ist eine Integration des eingebrachten Transgens äußerst unwahrscheinlich (Kaeppel et al., 2013). Dennoch kann rAAV eine Langzeit- Transgenexpression vermitteln, vorwiegend durch die Persistenz im Zellkern als zirkuläres monomeres,- dimeres- oder konkatemeres-Episom (Nakai et al., 2001) (Penaud-Budloo et al., 2008).

Bislang sind 13 AAV Serotypen bekannt (AAV1-AAV13). Ihre unterschiedlichen Kapsidsequenzen determinieren den Zell- bzw. Gewebstropismus. Der Serotyp AAV9 ist hepatotrop und daher zur Transduktion von Hepatozyten am besten geeignet (Chen et al., 2015) (Singh et al., 2018). In Kollaboration mit der AG von Prof. Dr. Dirk Grimm am BioQuant in Heidelberg, einer führenden Forschergruppe auf dem Gebiet der rAAV-Wirtszell Interaktionen, wurde hier für die Transduktion von HepG2 Zellen ein modifiziertes AAV9 Kapsid (9A2) zum Verpacken der jeweiligen Transgene verwendet. Im Rahmen eines Laboraustausches mit der AG Grimm wurden rAAVs produziert, die neben einer H1-

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Promoter kontrollierten shRNA- (oder sgRNA-) Kassette zur Verfolgbarkeit der Transduktion auch mCherry kodieren; in den zugehörigen Plasmiden der pSSVmCherry_H1αXY Reihe steht XY als generischer Platzhalter für das spezifische Zielgen der jeweiligen shRNA oder sgRNA.

Die gängigste Methode zur Herstellung von rAAVs ist die Dreifach-Transfektion von menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK293), die bereits konstitutiv die hAdV5 Gene E1A und E1B exprimieren (Abb. 46B). Hier wurden HEK293T Zellen verwendet, die zusätzlich das LT-Ag des SV40 tragen. Es ermöglicht die DNA-Replikation von episomalen Plasmiden mit einem SV40 ori, was jedoch für die Herstellung von rAAVs keine Rolle spielt. In die HEK293T Zellen wurde der Transgenvektor zusammen mit einem Expressionsplasmid für die AAV Gene rep und cap sowie einem Helferplasmid transfiziert, das die noch fehlenden hAdV Genprodukte E2A, E4 und VA-RNA bereitstellt (Abb. 46B) (Wang et al., 2019). Die entstandenen viralen Partikel werden nicht aus der Zelle sekretiert und müssen daher durch mechanischen Zellaufschluss aus dem Zytoplasma gewonnen werden. Im Anschluss können die Transgen-DNA-haltigen Partikel mittels Iodixanol-Dichtegradienten- Zentrifugation anhand ihrer höheren Schwimmdichte von ebenfalls entstehenden leeren Partikeln getrennt werden. Typischerweise enthalten die Peakfraktionen, ausgehend von mehreren 15 cm Schalen transfizierter Zellen, zwischen 1013 und 1014 virale Genomäquivalente (vge) pro ml. So gewonnene rAAV Vektorpräparationen können ohne Umpuffern direkt zur Transduktion verwendet werden, da das isomolare Iodixanol inert und für humane Zellen nicht toxisch ist (Zolotukhin et al., 1999).

Für eine initiale Abschätzung der rAAV Transduktionseffizienz für HepG2 Zellen wurden diese mit einer MOI von 7,5x104 bis 3x105 (ein typischer Bereich für die Transduktion von Hepatomzellen; persönliche Mitteilung AG Grimm) mit pSSVmCherry_H1αXY abgeleiteten rAAV-Partikeln inkubiert, die unter CMV-Promoter-Kontrolle mCherry und unter H1- Promotor-Kontrolle eine hier irrelevante, gegen GFP gerichtete sgRNA kodieren (rAAV_SSV-mCherry_H1-sgαGFP). Nach 3 Tagen wurde die mCherry-FL der Zellen mittels FACS quantifiziert. Demnach waren auch bei der höchsten MOI nur etwa 40% der Zellen mCherry-positiv (Daten nicht gezeigt).

Unerwarteterweise resultierte aus parallellaufenden rAAV-Versuchen mit anderer Zielsetzung eine Methode zur außerordentlichen Steigerung der Transduktionseffizienz. Die HBV- Infizierbarkeit von NTCP-exprimierenden HepG2 Zellen in Zellkultur ist nur mittels der Additive DMSO und Polyethylenglykol (PEG) während der Inokulation gut nachzuweisen

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(Yan et al., 2012) (Ni et al., 2014). Im vorliegenden Fall wurde ein replikations-defizientes HBV Genom in Form eines rAAV-Vektors in eine stabil das fehlende HBV-Genprodukt exprimierende Zelllinie transduziert. Zur Prüfung der Infektiosität der daraus entstandenen rHBV-Partikel wurden die aus dem Kulturüberstand konzentrierten Partikel wie für wt-HBV üblich mit DMSO plus PEG zu HepG2-NTCP Zellen gegeben. Die Analyse auf HBV-eigene Genprodukte als Infektionsmarker zeigte eine für HBV unerwartet schnelle und starke Expression; diese konnte letztlich auf im Konzentrat anwesende rAAV-HBV Partikel zurückgeführt werden (P. Zimmermann, J. Miller und M. Nassal, unveröffentlicht). Augenscheinlich begünstigten die für die in vitro HBV-Infektion förderlichen Additive auch die rAAV-Transduktion. Weitere Vorversuche ergaben, dass der größte Anteil der Steigerung auf das DMSO, nicht das PEG, zurückging.

Für eine systematischere Charakterisierung wurde bei reduzierten MOIs der Einfluss von DMSO nochmals per FACS quantifiziert. Bei einer MOI von 2,5x104 bewirkte die alleinige Supplementation mit 2% DMSO eine Steigerung des Anteils mCherry-positiver Zellen von 10% auf >70%, bei einer MOI von 5x104 stieg der Anteil von ca. 17% auf über 80% (Abb. 47A); DMSO in dieser Konzentration hatte keine toxischen Effekte auf die HepG2 Zellen, wie durch fehlende Anfärbung mit dem DNA-Farbstoff 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) bestätigt wurde (nicht gezeigt). Die massive Transduktionsverstärkung durch DMSO wurde inzwischen von Carolin Schmelas in der AG Grimm für diverse AAV-Kapsidtypen und Zelllinien bestätigt (Manuskript in Vorbereitung).

Abb. 47 FACS-Validierung der Transduktionseffizienz von rAAV-9A2 für verschiedene HepG2 Zelllinien (A) HepG2 Zellen wurden mit den angegebenen MOIs mit oder ohne 2% DMSO mit Iodixanol-gereinigtem rAAV-9A2 (pSSVmCherryH1αGFPopt #1) transduziert. An Tag 5 wurden per FACS die mCherry-Signale in je 20.000 Einzelzellen gemessen. Die x-Achse zeigt die mCherry Signalintenisität, die y-Achse das SSC-A Signal. Der mCherry-positive Zellanteil ist je in % angegeben. (B) DMSO-vermittelte Erhöhung der rAAV-9A2

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Transduktionseffizienz auch in HepG2 abgeleiteten Zelllinien. Die angegebenen Zelllinien wurden analog zu (A) mit einer MOI von 5x104 rAAV in An- oder Abwesenheit von 2% DMSO transduziert, dann der Anteil mCherry-positiver Zellen per FACS bestimmt. In allen Fällen stieg deren Anteil mit DMSO bedeutsam an. Die Fehlerbalken repräsentieren den SEM aus n=3.

Für die hier avisierten Anwendungen der rAAVs für KD und/oder KO DHBV-relevanter Zellfaktoren wurden die Versuche auf die HepG2-basierten DHBV Zelllinien DHBVenv- 150 #1-1, DHA2/3 und DHA_Cas9 #3-S (s. Abschnitt 3.4) ausgedehnt. Ohne DMSO zeigten die DHBV-modifizierten Zellen bei einer MOI von 5x104 vge/Zelle etwas höhere Transduktionseffizienzen (40-50%) als die parentalen HepG2 Zellen (ca. 30%); ob dies mit veränderten Expressionsmustern zellulärer Proteine korreliert (Wang et al., 2019), wurde nicht untersucht. Mit 2% DMSO stiegen die Werte in allen Zelllinien auf 70-80% mCherry- positiver Zellen an (Abb. 47B).

Die Methodik schien daher für die avisierten KD- und KO-Experimente vielversprechend. Allerdings konnte die Iodixanol-Dichtegradienten-Zentrifugation zur rAAV-Reinigung mangels geeigneter Geräteausstattung im eigenen Labor nicht durchgeführt werden. Zudem ist die Methodik zeitintensiv und eignet sich eher für die Großproduktion einiger weniger rAAVs. Für ein schnelles KD/KO-screening von mehreren Proteinkandidaten mit potenzieller DHBV-Relevanz wurde daher die Anwendbarkeit von Roh-Lysaten (Crude Lysates, CL) der rAAV produzierenden Zellen untersucht. Hierzu wurden die transfizierten HEK293T Zellen (Abb. 46B) durch mehrmalige Einfrier-/Auftauzyklen und anschließende Ultraschall- behandlung im Wasserbad aufgebrochen. Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation vom Virus-haltigen Zytoplasma getrennt. Ein erfolgreicher Zellaufschluss sollte durch Nachweis der AAV-Kapsidproteine mittels SDS-PAGE validiert werden (Abb. 48A). Proben von Iodixanol-gereinigten Partikeln dienten als Referenz für die Position der VP1, VP2 und VP3- Proteine mit den Molekulargewichten von 87 kDa, 72 kDa und 62 kDa, wobei VP3 als das abundanteste Kapsidprotein (Wang et al., 2019) die stärkste Bande ergab (Abb. 48A). Eine Bande vergleichbarer Mobilität trat auch im CL auf, eine verlässliche Zuordnung zu VP3 war aber aufgrund der vielen Banden in CL und Gesamtzelllysat so nicht möglich.

Da für einen sensitiveren Nachweis der VP Proteine per IB keine für die Kapsidvariante 9A2 spezifischen Antikörper zur Verfügung standen, wurde alternativ eine Abschätzung der rAAV-Titer im CL über die Quantifizierung der verpackten rAAV viralen Genom- Äquivalente (viral genome equivalents, vge) mittels qPCR versucht. Ein technisches Problem ist die Anwesenheit der transfizierten Plasmide, die zu falsch positiven Amplifikaten führen würde; bei der Dichtegradienten-Zentrifugation wird die freie Plasmid-DNA großteils von 116 Ergebnisse den intakten Viruspartikeln abgetrennt (vgl. auch Abb. 48B). Hier wurde zur Kontrolle die template-DNA auch nach vorhergehendem Nuklease-Verdau (wobei die in rAAV-Partikel verpackte DNA geschützt ist) in die PCR eingesetzt, zudem die mit einem CMV-Promoter- spezifischen Primer-Paar (bindet Plasmid und rAAV-Genom) erhaltene nominale Kopienzahl mit derjenigen eines Ampicillin-Resistenzgen-spezifischen Primer-Paars (BlaR) verglichen, das ausschließlich das transfizierte rAAV-Plasmid amplifiziert. Als Referenz diente ein Präparat Iodixanol-gereinigter Reporter-rAAVs mit bekanntem Titer von 1,3x1010 vge/µl. Für diese Probe ergab die jetzige Messung mit dem CMV-Primer-Paar einen Titer von knapp 1x1010 vge/µl, diejenige mit dem BlaR Primer-Paar lag knapp über 1x108 vge/µl (Abb. 48B). Demnach enthielt die Probe >50-fach mehr rAAV als Transgen-Plasmid, d.h. die Iodixanol- Prozedur hatte die Plasmid-Kontamination bis auf etwa 2% der rAAV-Genom-Menge reduziert. Der vorherige Nuklease-Verdau (NV) des rAAV-Präparates verringerte beide Werte nur geringfügig (+NV Proben). Für das nicht Nuklease-behandelte CL ergab das CMV- Primer-Paar einen Titer von ca. 1x107 vge/µl, der Wert für das BlaR-Primer-Paar lag etwa zweifach darunter. Nach NV sank dieser Wert auf etwa 1x106 vge/µl, der Wert mit dem CMV-Primer-Paar blieb in etwa gleich (Abb. 48B). Demnach enthielt das unbehandelte CL größenordnungsmäßig vergleichbare Mengen an verpackten rAAV-Genomen und Transgen- Vektor-Plasmid, wobei der rAAV-Titer mit ca. 107 vge/µl etwa 103-fach unter der des Iodixanol-gereinigten rAAV-Präparates lag. Bei einem CL-Volumen von etwa 1 ml pro 8x10 cm Schalen transfizierter HEK293T Zellen würde dies bei MOIs von 104 -105 für die Transduktion von ca. 106 bzw. 105 Zellen ausreichen, was typischen Zellzahlen in einem well einer 6-well bzw. einer 48-well Platte und damit einem praktikablen Bereich entspricht. Voraussetzung ist allerdings, dass die zahlreichen anderen Komponenten im CL nicht mit der Transduktion interferieren.

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Abb. 48. Herstellung rAAV enthaltender Roh-Lysate (CL) (A) SDS-PAGE der CL im Vergleich mit einem Iodixanol-gereinigten rAAV Präparat. Für die CL-Gewinnung wurden 8x106 HEK293T Zellen je 10 cm Schale ausplattiert, am folgenden Tag mit je 5 µg Cap/Rep-, hAdV- Helfer- sowie pSSVmCherry_H1αXY Transgen-Konstrukt transfiziert und nach 3 Tagen geerntet. Nach 5 Einfrier-/Auftauzyklen in einem Methanol-/Trockeneis Gemisch und Ultraschall-Behandlung wurde durch Zentrifugation bei 13.000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge 5424 R) für 10 min das CL erhalten (1 ml /6x 10 cm Schale). Zur Kontrolle des Zellaufschlusses wurden Aliquots des CL sowie unfraktioniertes Gesamtzelllysat per SDS-PAGE (10% Polyacrylamid) aufgetrennt. Während das Gesamtzelllysat alle Zellproteine enthält, sollten sich im CL nur lösliche Proteine inklusive rAAVs befinden. Als Marker für die Position der rAAV Kapsidproteine VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) und VP3 (62 kDa) dienten 1x1010, 2,5x1010 und 5x1010 vge Iodixanol-gereinigter rAAV Partikel. Proteinnachweis mittels Coomassie-Blau Färbung. (B) qPCR zur rAAV- Titerbestimmung in CL. CL und rAAV-Referenz wurden direkt oder nach Nuklease-Verdau (NV) zum Aufschluss viraler Partikel für 30 min bei RT mit 2 M NaOH behandelt, dann mit 1 M HCl neutralisiert. Nach

1:1.000-Verdünnung in H2O wurden je 5 µl als qPCR-Matrize eingesetzt. Das CMV-Primer-Paar (CMVprom 2+/CMVrevNEW) amplifiziert rAAV und pSSV Transgen-Plasmid, das BlaR-Prime-Paar (Bla 739-759+/bla- 3´endpr) nur das Plasmid. Als Standard diente das zur rAAV Herstellung verwendete pSSV- Transfektionsplasmid in den Konzentrationen 1x103-1x108 (nicht gezeigt). Alle PCR Reaktionen wurden mit SYBR Green in einem Roche Lightcycler 480II in Duplikaten durchgeführt. Die Angabe vge/µl bezieht sich auf das originale CL bzw. die gereinigte Original-rAAV Suspension in Iodixanol.

Für eine erste Validierung der Anwendbarkeit in KD-Experimenten wurden CL mit rAAVs hergestellt, die unter U6-Promotor-Kontrolle eine shRNA gegen das HBV-Oberflächen- Antigen (HBsAg) exprimieren (CL-shHBsAg). Die hohe silencing-Aktivität dieser shRNA war zuvor in unserer AG gezeigt worden (Sun et al., 2010). Ihre Funktionalität in dem zur rAAV-Produktion verwendeten Vektorkontext (pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-sh10SL#1) wurde mittels transienter Kotransfektion mit einem HBV-Vektor bestätigt (Ergebnisse nicht gezeigt). Für die Transduktion des CL-shHBsAg wurde die TetOFF Zelllinie HepG2.117 verwendet, die analog zu den DHA2/3 DHBV Zellen neben tTA2 ein HBV-Integrat trägt, in dem ein Tet- (bzw. Dox-) responsiver TRE-Promoter die pgRNA-Transkription kontrolliert (Sun & Nassal, 2006). Die Transkription der surface-Protein mRNAs, und folglich die Synthese der Oberflächenproteine, erfolgt dagegen Tet-unabhängig von den HBV-eigenen Promotoren. Somit kann ein potenzieller KD der HBsAg-Produktion nach Transduktion mit

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CL-shHBsAg auch ohne Induktion relativ schnell mittels sAg-ELISA validiert werden. Zur Verfolgbarkeit der Transduktion exprimieren die shRNA-Vektoren zusätzlich unter CMV- Promoter-Kontrolle eine Fusions-mRNA, von der mCherry und, über ein P2A-Peptid, ein Blasticidin-Resistenz (BsdR; Blasticidin-S-Deaminase) Gen exprimiert werden, was die Selektion transduzierter Zellen erlaubt; in Vorversuchen erwies sich für die HepG2.117 Zellen eine Blasticidin-Konzentration von 6 µg/ml Medium als geeignet, den Großteil nicht resistenter Zellen innerhalb von 6-8 Tagen zum Absterben zu bringen.

Zunächst wurde an je 1,5x105 HepG2.117 Zellen, die mit 75 µl und 100 µl CL inkubiert wurden (100 µl entsprechen bei einem CL-Titer von 1x107 vge/µl etwa einer MOI von 7x104) mittels des mCherry-Reporters und Durchflusszytometrie der Transduktions-verstärkende Einfluss von 2% DMSO überprüft und die Dauer der mCherry-Expression unter Blasticidin- Selektion verfolgt (Abb. 49). Bei 75 µl CL erhöhte DMSO den Anteil mCherry-positiver Zellen an Tag 4 nach Transduktion von etwa 40% auf über 60%, bei 100 µl stieg der Anteil von 60% auf etwa 80%; die relativ geringe Steigerung beruht großteils auf den bereits ohne DMSO hohen Werten. Auffällig war der 3-5-fach geringere Anteil mCherry-positiver Zellen an Tag 16 in allen Ansätzen, wobei dieser mit knapp 30% in der 100 µl CL +DMSO Probe immer noch am höchsten lag.

Abb. 49 mCherry Expression von G117 Zellen nach Transduktion mit CL-shHBsAg 1,5x105 G117 Zellen wurden mit 75 µl oder 100 µl CL-shHBsAg mit oder ohne 2% DMSO für die angegebenen Tage (d) inkubiert. An Tag 1 nach Transduktion wurde mit der Selektion auf Blasticidin-Resistenz begonnen (6 µg/ml Blasticidin). Graphisch dargestellt ist die per FACS gemessene mCherry-positive Zellpopulation in %. Es wurden jeweils 20.000 Einzelzellen analysiert.

Trotz der beschriebenen Existenz langlebiger episomaler rAAV Genomformen (Nakai et al., 2001) (Penaud-Budloo et al., 2008) hätte dieser Rückgang auf einen zunehmenden Verlust der Replikations-defekten rAAV-Genome durch die Proliferation der Zellen erklärt werden können. Andererseits war zu diesem späten Zeitpunkt zu erwarten, dass Zellen ohne BsdR- Expression die Selektion nicht überlebt hätten. Somit sprachen die Ergebnisse für eine Trennung der eigentlich über das P2A-Peptid gekoppelten Marker mCherry und BsdR. Als

119 Ergebnisse eine Erklärungsmöglichkeiten wurde getestet, ob das schon während der rAAV-Produktion in den transfizierten HEK293T Zellen entstandene mCherry Protein im CL-Inokulum an die Zielzellen binden kann, so dass diese im FACS zusätzlich zu den tatsächlich rAAV- transduzierten Zellen als (falsch) positiv gewertet werden; damit würde die aus der mCherry FL abgeleitete Transduktionseffizienz überschätzt. Tatsächlich zeigte die FACS-Analyse von HepG2 Zellen, die mit 3 µg gereinigtem mCherry Protein pro 3x105 Zellen inkubiert und dann mehrfach mit PBS gewaschen worden waren, eine fluoreszierende Zellpopulation von 7%; eine zehnfach höhere mCherry-Menge führte sogar zu einem positiven Zellanteil von 94% (Ergebnisse nicht gezeigt). Auch eine massive Überbewertung der Transduktionseffizienz zu einem frühen Zeitpunkt würde aber nicht erklären, warum an Tag 16 die Mehrzahl der Zellen mutmaßlich noch BsdR, aber nicht mehr mCherry exprimiert. Andererseits ist nur BsdR für das Überleben unter Selektionsdruck erforderlich; der Verlust der mCherry Expression könnte daher auf diverse genetische wie auch epigenetische Ursachen zurückgehen. Zugunsten der Absicherung einer silencing Aktivität der von demselben rAAV kodierten α-HBs shRNA wurde dies aber nicht weiter untersucht.

Für die silencing Versuche wurden die mit 100 µl rAAV-shHBsAg CL inokulierten HepG2.117 Zellen für 16 Tage in Anwesenheit von 6 µg/ml Blasticidin mit bzw. ohne 2% DMSO kultiviert und die in den Zellkulturüberständen an Tag 4, 6, 8, 14 und 16 enthaltenen HBsAg Mengen mittels ELISA bestimmt (Abb. 50). Die Überstände nicht transduzierter HepG2.117 Zellen, ebenfalls mit oder ohne DMSO kultiviert, dienten als Referenz. Für jeden Zeitwert wurde der ELISA-Wert der ohne DMSO gehaltenen Zellen auf 100% gesetzt.

In Anwesenheit von DMSO lagen die HBsAg-Werte im Medium der nicht transduzierten ("naiven") Zellen zwischen 80% und 120% der zugehörigen Proben ohne DMSO. Diese Schwankungen waren jedoch geringer als die Reduktion der HBsAg-Werte in den rAAV- shHBsAg transduzierten Zellen. Nach einem leichten Abfall auf 70-80% der Vergleichswerte an Tag 4 lagen die Werte an Tag 6 und 8 nur noch bei 40% und 35% (ohne DMSO) bzw. 30% und 35% (mit DMSO). An Tag 14 und 16 wurden aber in beiden Fällen wieder 70-80% der HBsAg-Werte der nicht transduzierten Zellen erreicht. Somit führte die Behandlung mit dem im CL enthaltenen rAAV-shHBsAg zu einer deutlichen, aber transienten Unterdrückung der HBsAg Expression, die ihr Maximum um Tag 6-8 nach Transduktion hatte. Eine temporäres silencing durch über die Zeit nachlassende shRNA Expression wäre in Einklang mit dem in Abb. 49 gesehenen abnehmenden Anteil mCherry-exprimierender Zellen, passt aber ebenfalls nicht zum gleichzeitigen Erhalt von Blasticidin-Resistenz und den anderen auf demselben

120 Ergebnisse rAAV-kodierten Genprodukten. Somit ließe sich spekulieren, dass nicht nur die CMV- Promoter-mCherry Kassette, sondern auch die U6-Promotor-shRNA Kassette auf Dauer genetisch oder epigenetisch inaktiviert wird. Alternativ wäre denkbar, dass der BsdR-Anteil unabhängig vom Rest-rAAV überdauert, z.B. durch Integration ins Chromosom.

Abb. 50 Silencing von HBsAg in G117 Zellen nach Transduktion mit CL-shHBsAg Nach Transduktion von 1,5x105 G117 Zellen mit in 100 µl CL-shHBsAg enthaltenem rAAV wurde der Zellüberstand an den angegebenen Tagen auf eine mit α-HBsAg (F-9H9, 1:1000) Antikörper beschichtete ELISA-Platte gegeben und für 2 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden 25 µl einer Lösung (Konjugat 1 aus dem HBsAg Enzygnost-Kit von Siemens) zu den Ansätzen pipettiert, der biotinylierte α-HBs Antikörper enthält und die Platte für 1 h bei RT inkubiert. Nach Behandlung der Ansätze mit einem PO-gekoppelten Strepatavidin- Antikörper für 30 min bei RT erfolgte der HBsAg Nachweis durch die Zugabe eines chromogenen Substrates (TMB). Die Signale wurden in einem TECAN-SPARK Instrument bei einer Absorption von 450 nm ausgelesen.

Zusammenfassend zeigten die Experimente, dass die Transduktion mit rAAV-enthaltenden CL prinzipiell zum effizienten Einschleusen einer shRNA-Expressionskassette in funktioneller Form genutzt werden kann; hierbei wurden Transduktionsraten von ≥60% mit einer KD-Effizienz von ebenfalls ≥60% erreicht (vgl. Abb. 49 und Abb. 50). Gerade bei geringeren MOIs führte die Supplementation mit DMSO zu einem bemerkenswerten Anstieg der Transduktionseffizienz. Weitere Versuche ergaben, dass hierfür maßgeblich die Anwesenheit von DMSO in der frühen Phase des rAAV-Zelleintritts ist. Daher wurde in den weiteren Experimenten das DMSO-haltige Medium 24 h nach Transduktion durch normales Wachstumsmedium ersetzt, um weitere DMSO-abhängige Zellveränderungen zu vermeiden (Verheijen et al., 2019).

Andererseits gaben die Versuche mit dem rAAV-CL keine Hinweise auf eine wirkliche Langzeitexpression eines Transgens, womit im Fall rAAV-kodierter shRNAs ein stabiler KD des Ziel-Proteins ermöglicht würde. Dies könnte gerade für potenziell DHBV-relevante Wirtsfaktoren in den DHBV-Reporterzelllinien wichtig sein, um trotz der langsamen DHBV-

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Induktionskinetik einen robusten Phänotyp zu erreichen. Um diese Frage anzugehen, wurden rAAV mit einer gegen humanes Tdp2 gerichteten shRNA hergestellt (Vektor: pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-αTDPsh526 #2; rAAV: CL-shTdp2). Tdp2 ist bereits als DHBV-relevanter Wirtsfaktor bekannt, dessen silencing die Kinetik der rc- zu cccDNA- Konversion signifikant verlangsamt (Königer et al., 2014); von einem transfizierten Plasmidvektor exprimiert hatte die spezifische Tdp2-shRNA sh526 in Huh7 Zellen eine rund 80%-ige Reduktion des Tdp2 Signals im IB bewirkt (Diplomarbeit M. Marsmann 2011, Universität Freiburg). Als Negativ-Kontrolle für die jetzigen Versuche diente ein dem genannten CL-shTdp2 analoges rAAV, in dem die U6-Promotor-Kassette statt einer shRNA- Sequenz nur eine Linker-Sequenz mit zwei BsaI Schnittstellen trägt (Vektor: pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-2Bsa; rAAV: CL-2Bsa).

Die Bestimmung der jeweiligen rAAV-Titer im CL durch qPCR mit dem oben beschriebenen CMV-Primer-Paar ergab für CL-shTdp2 mit ca. 5x107 vge/µl (Abb. 51A) einen ähnlichen Wert wie für CL-shHBsAg (Abb. 48B), während für das nicht shRNA-kodierende CL-2Bsa ein fast 20-fach höherer Wert von ca. 1x109 vge/µl gemessen wurde. Wegen der oben beschriebenen Ungenauigkeit durch noch vorhandene Transfektions-Plasmide könnten diese Werte fehlerbehaftet sein; es wurde aber bereits beschrieben, dass shRNA-kodierende Transgene einen negativen Einfluss auf die rAAV Ausbeute haben können (Xie et al., 2017). Für die CL-shTdp2 Transduktion wurde die DHBV-Reporterzelllinie DHA_Cas9 #3-S mit jeweils gleichen Volumina CL-shTdp2 oder CL-2Bsa inokuliert. Nach 24 h wurde die DHBV-Replikation durch Dox-Entzug induziert und gleichzeitig mit der Blasticidin- Selektion begonnen. Die FACS-Analyse auf mCherry-exprimierende Zellen zeigte an Tag 4 für die CL-shTdp2 Transduktion etwa 40%, für die CL-2Bsa Transduktion dagegen über 90% positive Zellen (Abb. 51B). Dieser Unterschied ist wahrscheinlich auf den höheren rAAV- Titer im CL-2Bsa zurückführen. Wie schon bei den CL-shHBsAg Ansätzen sank in beiden Proben mit der Zeit der Anteil mCherry-positiver Zellen; so wiesen an Tag 12 nur noch rund 10% der Zellen im CL-shTdp2 Ansatz und 40% im CL-2Bsa Ansatz eine messbare mCherry Expression auf (Abb. 51B). Andererseits sprach auch hier die augenscheinliche Proliferation der Zellen in Gegenwart von Blasticidin für eine fortdauernde BsdR-Expression auch in den mCherry-negativen Zellen. Für die avisierten KD-Experimente war daher entscheidend, ob die Pol3-Promoter-getriebene shRNA-Expression eher dem mCherry- oder dem BsdR-Muster folgt (Abb. 52).

122 Ergebnisse

Abb. 51. CL-shTdp2 und -2Bsa Titerbestimmung und Transduktionseffizienz in DHA_Cas9 #3-S Zellen 1,5x105 DHA_Cas9 #3-S Zellen wurden mit 50 µl des entsprechenden CL inkubiert. 24 h nach Transduktion begann die BsdR-Selektion mit 6 µg/ml Blasticidin. (A) Titerbestimmung der CL. Die Durchführung erfolgte wie in Abb. 48B beschrieben mit dem CMV-Promotor spezifischen Primer-Paar. rAAV: Iodixanol-gereinigtes Reporter-rAAV mit bekanntem Titer von 1,3x1010 vge/µl (vgl. Abb. 48A). (B) Graphische Auswertung der FACS Messungen der Transduktionsansätze an den angegebenen Tagen (d). Je Ansatz wurden 20.000 Einzelzellen auf mCherry-Expression analysiert; der Anteil als positiv gewerteter Zellen ist in Prozent der Gesamtzellpopulation angegeben. Die Fehlerbalken repräsentieren SEM mit n=2.

Hierzu wurde das jeweilige intrazelluläre Tdp2 Expressionsniveau an den Tagen 4, 6, 8 und 10 nach Transduktion in einem Tdp2-spezifischen IB untersucht. Die CL-2Bsa Ansätze sowie naive Zellen dienten als Negativkontrollen (Abb. 52). Der polyklonale α-Tdp2 Antikörper ließ eine Doppelbande bei ca. 55 kDa und eine weniger ausgeprägte Bande bei ca. 37 kDa erkennen; diese bereits früher im Labor gesehene Bande beruht wahrscheinlich auf einem internen Translationsstart an Met54 (C. Königer, M. Konert und M. Nassal, unveröffentlicht), der kürzlich auf eine Internal Ribosome Entry Site (IRES)-Aktivität in der upstream Sequenz zurückgeführt wurde (Chou et al., 2019); laut einer anderen Studie könnte auch alternatives splicing für die kürzere Form verantwortlich sein (Huang et al., 2018). Abgesehen davon haben beide größeren Produkte anscheinend ein aberrantes Laufverhalten, da das nominale Molgewicht von Volllängen-Tdp2 nur 41 kDa beträgt. Der Laufunterschied zwischen beiden Formen könnte auf unterschiedliche posttranslationale Modifikationen zurückgehen; je nach Gelsystem trennten sich beide Banden auch nicht immer klar voneinander.

Hier wurde für die Bestimmung der relativen Tdp2-Abundanz jeweils die Intensität der schnelleren Bande bei 55 kDa densitometrisch bestimmt und für die Vergleichbarkeit zwischen den Spuren auf die Intensität des β-Aktin-Signals in derselben Spur normiert. Für die individuellen Zeitpunkte wurde dann jeweils das Signalverhältnis Tdp2:β-Aktin in den

123 Ergebnisse naiven Zellen auf 100% gesetzt und die entsprechenden Signalverhältnisse in den rAAV- behandelten Zellen darauf bezogen (%-Zahlen unterhalb der Gel-Spuren in Abb. 52).

Abb. 52. Partielles silencing von Tdp2 in DHA_Cas9 #3-S Zellen nach Transduktion mit CL-shTdp2 Je 1,5x105 DHA_Cas9 #3-S Zellen wurden mit 50 µl des entsprechenden CL inkubiert. 24 h nach Transduktion begann die Selektion mit 6 µg/ml Blasticidin. Für die IB-Detektion von Tdp2 und β-Aktin wurden die Zellen an den angegebenen-Tagen nach Transduktion in SDS- Lysepuffer geerntet und die Proteinlysate nach SDS-PAGE- Auftrennung (15% Polyacrylamid) mit Antikörpern gegen Tdp2 (Biogenes #6152, 1:10.000) bzw. β-Aktin- (Sigma #AC15, 1:10.000), gefolgt von PO-gekoppeltem Sekundärantikörper und chemilumineszentem Substrat analysiert. Die Abschätzung der relativen Tdp2-Niveaus erfolgte durch Quantifizierung der 55 kDa-Tdp2- und β-Aktin-Bandenstärken mittels MultiGauge wie in Abb. 11B beschrieben; das jeweilige Intensitätsverhältnis in den naiven Zellen wurde auf 100% gesetzt.

Wie erwartet ließen sich zwischen naiven Zellen und mit dem Kontroll-rAAV in CL-2Bsa behandelten Zellen keine substanziellen Unterschiede detektieren; dies belegt auch, dass weder das rAAV noch andere Komponenten des Roh-Lysates die Tdp2-Expression und/oder die Zellviabilität merklich beeinflussen. In den CL-shTdp2 transduzierten Zellen dagegen waren die Tdp2-Signale von Tag 4 bis Tag 8 nach Transduktion deutlich erniedrigt, mit maximaler Reduktion auf etwa 35% des Vergleichswertes an Tag 6. An Tag 10 war kein Unterschied zu den Kontrollen mehr nachweisbar (Abb. 52). Dieses temporäre silencing korreliert, mit einer leichten Verzögerung, mit der Abnahme der mCherry-positiven Zellpopulation über die Zeit (vgl. Abb. 51B). An Tag 4 nach Transduktion umfasste diese Population 40-50% der Zellen und sank über 20% an Tag 8 auf etwa 10% an Tag 12 ab. Falls die shRNA-Expression sich ähnlich verhält, wäre in der Gesamtpopulation eine maximale Tdp2-Reduktion von etwa 50% zu erwarten; abhängig von der Lebensdauer der schon vorhandenen Tdp2-Protein-Moleküle könnte das minimale steady-state level durch RNAi mit der Neusynthese dann zeitlich versetzt erreicht werden (Larsson et al., 2010), z.B. wie hier beobachtet an Tag 6.

124 Ergebnisse

Trotz dieser nicht idealen Voraussetzungen wurde als nächstes untersucht, ob auch eine nur temporäre Tdp2-Reduktion sich messbar auf die DHBV-Replikation auswirkt. Hierzu wurden die mit CL-shTDP2 bzw. mit dem Kontrolllysat CL-2Bsa transduzierten DHA_Cas9 #3-S TetOFF Zellen nach 14 Tagen Kultur in Dox-freiem, aber Blasticidin-haltigem (6 µg/ml) Medium geerntet, dann mittels NAGE/IB und ELISA auf Kapsid- und cccDNA-abhängige HAeAg-produktion getestet. Nicht transduzierte Zellen mit bzw. ohne Dox dienten als Referenz. Erwartungsgemäß zeigten die naiven Zellen mit Dox fast keine, ohne Dox dagegen deutliche Kapsid- und HAeAg-Produktion (Abb. 53A und B). Überraschenderweise ließen sich in beiden CL-transduzierten Ansätzen keine Hinweise auf DHBV-Expression finden. Triviale Ursachen (z.B. fälschliche Verwendung von Dox-haltigem statt Dox-freiem Medium) konnten weitestgehend ausgeschlossen werden, zudem wurde die Beobachtung mit weiteren CL-shRNA Ansätzen, die unter Blasticidin-Selektionsdruck gehalten wurden, bestätigt (z.B. CL-shRPA1; Daten nicht gezeigt). Somit schien Blasticidin mit der normalerweise durch Dox-Entzug vermittelten Initiation der DHBV-Replikation in den TetOFF DHA_Cas9 #3-S Zellen zu interferieren; nicht ausgeschlossen waren aber auch Effekte durch einen der vielen nicht-rAAV-Faktoren in den für die Transduktion eingesetzten HEK293T-CL.

Abb. 53. DHBV-Expression in den mit CL-shTdp2 transduzierten DHA_Cas9 #3-S Zellen DHA_Cas9 Zellen wurden wie in Abb. 51 beschrieben transduziert. Nach 14 Tagen Kultivierung in Dox-freiem bzw. Dox-haltigem Medium (+Dox) mit 6 µg/ml Blasticidin wurden die Zellen auf Kapsid-Synthese bzw. HAeAg im Überstand als Marker für DHBV-Replikation untersucht. (A) Kapsid-NAGE mit anschließendem IB. Der Nachweis erfolgte gemäß Abb. 23. (B) HAeAg-ELISA. Die Durchführung erfolgte wie in Abb. 27B beschrieben.

Zur Prüfung dieser Hypothese wurden DHA_Cas9 #3-S Zellen transient mit zwei der parentalen pSSV-Plasmid-Vektoren für die rAAV-Produktion, pSSV_mCherry-P2A- BsdR_U6-TDP2sh526 (kurz: pSSV_shTdp2) und pSSV_mCherry-P2A-BsdR_U6-RPA1_sh1 (kurz: pSSV_shRPA1), transfiziert, um den Zellen unabhängig von rAAV-CL Blasticidin- Resistenz zu vermitteln. Anschließend wurden die Zellen in Dox-freiem Medium für 14 Tage ohne Blasticidin, oder mit 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml und 2,0 µg/ml Blasticidin kultiviert. Bsd 125 Ergebnisse agiert am Ribosom und verhindert die ordnungsgemäße Translations-Termination (Svidritskiy et al., 2013). Als weitere Kontrolle wurden nicht-transfizierte ("naive") DHA_Cas9 #3-S Zellen gleichermaßen behandelt, wobei angesichts der fehlenden Blasticidin-Resistenz nur die geringste Konzentration von 0,5 µg/ml Blasticidin angewandt wurde. Wie exemplarisch in Abb. 54A gezeigt, waren alle Zellen zu konfluentem Wachstum befähigt und die an Tag 14 gewonnenen Zelllysate enthielten annähernd gleiche Konzentrationen an Gesamtprotein (Abb. 54B), was ausgeprägte toxische Effekte unwahrscheinlich macht. Trotzdem zeigte der HAeAg-ELISA in den transfizierten Zellen mit steigender Blasticidin-Konzentration zunehmend schwächere Signale, die bei 1 und 2 µg/ml im Bereich der Dox-reprimierten Zellen lagen. In den nicht-transfizierten Ansätzen war bereits 0,5 µg/ml Blasticidin für eine solche Reduktion ausreichend (Abb. 54C). Die bei gleicher Blasticidin-Konzentration geringere Suppression in den transfizierten Zellen dürfte auf die partielle Inaktivierung des Blasticidins durch die Plasmid-kodierte, als Resistenzfaktor wirkende Blasticidin-S- Deaminase zurückzuführen sein.

Abb. 54. Blasticidin-abhängige Suppression der DHBV-Expression DHA_Cas9 Zellen wurden mit 2,5 µg pSSV_shRPA1 oder 2,5 µg pSSV_shTdp2 transfiziert oder unbehandelt gelassen (naiv). Nach Kultivierung der Ansätze mit den angegebenen Blasticidinkonzentrationen für 14 Tage in Dox-freiem Medium wurden die Zellen zum Nachweis einer DHBV-Expression geerntet. (A) Lichtmikroskopische Aufnahme des konfluenten Zellrasens in den angegebenen Ansätzen. 10x Vergrößerung. (B) Bradford-Assay zur Validierung der Gesamtproteinmenge der Zelllysate. Die Durchführung erfolgte gemäß Herstellerprotokoll. (C) HAeAg-ELISA. Die Durchführung erfolgte wie in Abb. 27B beschrieben.

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Zusammenfassend bestätigen die Transduktionsexperimente die erfolgreiche Anwendbarkeit der rAAV-CL zur shRNA-vermittelten Reduktion eines Zielproteins, hier HBsAg und Tdp2. Insbesondere durch DMSO-Supplementation konnte die Transduktionseffizienz deutlich gesteigert werden. Um noch näher an 100% zu kommen, war eigentlich die Selektion der erfolgreich transduzierten Zellen mittels Blasticidin geplant. Dabei wurden aber zwei grundlegende Probleme aufgedeckt. Zum einen korrelierte die Lebensfähigkeit der transduzierten Zellen in Blasticidin-haltigem Medium nicht strikt mit der Expression des direkt sichtbaren mCherry Markerproteins, obwohl beide von einer Translations-Matrize abgelesen werden. Das nur temporäre Tdp2-silencing weist auf einen vergleichbaren Verlust der shRNA-Expression über die Zeit hin. Selbst bei 100%-iger Transduktionseffizienz ist daher nicht sicher, dass das jeweilige Zielprotein längerfristig unterdrückt werden kann. Zum anderen inhibierte Blasticidin unerwartet die DHBV-Replikation in den TetOFF DHA_Cas9 #3-S Zellen. Blasticidin war wegen seiner schnellen Wirksamkeit gewählt worden (1-2 Wochen zum Abtöten nicht resistenter Zellen), zudem sind für die TetOFF Cas9-DHBV- Reporterzelllinie bereits G418 (tTA2-Integrat), Hygromycin (TRE-kontrolliertes DHBV- Integrat) und Puromycin (Cas9-Integrat) in Anwendung. Versuche zur Klärung, ob Blasticidin direkt auf das Virus wirkt oder das TetOFF-System inhibiert, sind noch in Gang. Schon jetzt ist aber klar, dass mithilfe von Blasticidin-Selektion die avisierte, auf nahezu 100%-iger rAAV-Transduktionseffizienz ausgelegte KD-Strategie in der TetOFF DHBV Reporterzelllinie nicht realisierbar ist.

In einer vorläufig letzten Versuchsreihe mit rAAV als KD-Vektor wurde daher untersucht, ob mittels Iodixanol-gereinigter rAAVs in entsprechender Menge die angestrebte nahezu 100%- iger Transduktionseffizienz auch ohne Selektion erreichbar ist, und ob unter diesen Bedingungen ein länger anhaltendes Wirtsfaktor-silencing möglich ist. Hierzu wurden z.T. unter Verwendung der oben beschriebenen Konstrukte gereinigte rAAVs präpariert (dankenswerterweise durchgeführt von Carolin Schmelas, AG Grimm). Die rAAVs M4 und M9 basieren wie oben auf den Plasmiden pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-αTDPsh526 #2 (mit αTDP shRNA526) bzw. dem analogen Konstrukt mit der 2Bsa Linkersequenz unter U6- Promotor-Kontrolle. Zusätzlich wurden zwei neue Konstrukte mit shRNA-Sequenzen gegen RPA1 generiert; RPA1 war in der MS-Proteomanalyse der E4orf6-exprimierenden Zellen signifikant herabreguliert (Abb. 32 und Abb. 33). M5 unterscheidet sich von M4 und M9 nur durch die RPA1-spezifische shRNA sh2; M6 trägt die alternative RPA1 shRNA sh3 und die mCherry Kassette ist durch eine eGFP-Kassette ersetzt (Plasmid-Vektor: pSSV-GFP- P2A_BsdR_U6-RPA1sh3). Damit können auch Doppel-Transduktionen visualisiert werden. 127 Ergebnisse

Die Zellen wurden nach rAAV Transduktion mit einer MOI von 5x104 ohne oder mit 2% DMSO für 14 Tage ohne Blasticidin-Selektion kultiviert. Zur Bestimmung der Transduktionseffizienz wurde an den Tagen 6, 10 und 14 der Anteil mCherry- bzw. eGFP- positiver Zellen per FACS gemessen (Abb. 55A). Diese bestätigte sowohl die Effizienzerhöhung durch DMSO wie auch den starken Abfall der jeweils positiven Zellpopulation mit der Zeit. Auch die IB-Analyse bekräftigte die nur temporäre Reduktion der Tdp2 und RPA1 Abundanz (Abb. 55B, C). Für Tdp2 konnte an d6 ein starker, initialer KD von 80% erreicht werden. Für RPA1 ergab sich eine Reduktion des Proteinlevels nach M5- Transduktion von etwa 50%, nach M6 Transduktion von etwa 70%. Da beide rAAV- Konstrukte eine ähnliche Transduktionseffizienz aufwiesen (Abb. 55A), beruht der Unterschied wahrscheinlich auf einer effizienteren shRNA-Sequenz in den M6- als in den M5-rAAV-Partikeln. Im Einklang mit der Transduktionsverbesserung durch DMSO zeigen die M4 und M6 Ansätze mit DMSO einen stärkeren KD des entsprechenden Proteins. Allerdings ist im RPA1 IB eine DMSO abhängige Induktion der Proteinexpression zu sehen (Abb. 55C). DMSO kann in eine Vielzahl von zellulären Vorgängen eingreifen (Verheijen et al., 2019). Eine detailliertere Analyse des Einflusses von DMSO auf das RPA1 Proteinlevel wurde aber nicht untersucht. Auf jeden Fall führte aber auch die Verwendung von aufgereinigten rAAVs nicht zu einem langanhaltenden KD-Effekt, wie an einem starken Anstieg der Tdp2- bzw. RPA1-Signale im IB über die Zeit zu vermerken war, sodass an Tag 14 die ursprünglichen target-Proteinlevel praktisch wiederhergestellt waren.

128 Ergebnisse

Abb. 55 Transduktion von DHA_Cas9 #3-S Zellen mit gereinigten anti-Tdp2- und anti-RPA1 shRNA rAAVs 3,5x105 DHA_Cas9 #3-S Zellen wurden mit einer MOI von 5x104 mit oder ohne 2% DMSO transfiziert; nach 24 h wurde das DMSO-haltige durch DMSO-freies Medium ersetzt. M4: rAAV mit mCherry-Reporter plus shRNA gegen Tdp2; M5: rAAV mit mCherry-Reporter plus shRNA-sh2 gegen RPA1; M5: rAAV mit eGFP-Reporter plus shRNA-sh3 gegen RPA1; M9: rAAV mit mCherry-Reporter und leerer shRNA Kassette. (A) Graphische Auswertung der FACS-Analyse der Transduktionseffizienz an den angegebenen Tagen nach Transduktion. Fehlerbalken repräsentieren SD aus n=3. Es wurden je 10.000 Einzelzellen auf mCherry FL (M4, M5 und M9) oder eGFP FL (M6) analysiert. (B) IB Detektion von Tdp2. Die Ansätze wurden wie angegeben mit SDS lysiert und wie in Abb. 52 auf Tdp2 und β-Aktin (Sigma α-β-Aktin #AC-15. 1:10.000) getestet. Für Tdp2 ist jeweils nur die 55 kDa Bande gezeigt. Bandenstärken wurden mittels MultiGauge wie in Abb. 11B quantifiziert. Das Verhältnis von Tdp2:β-Aktin-Bandenstärke in den naiven Zellen wurde jeweils auf 100% gesetzt. (C) IB Detektion von RPA1. Die Analyse erfolgte analog (B) mit dem α-RPA1 Antikörper #RPA9 (Millipore; 1:1.000).

Um mögliche Auswirkungen des KD von Tdp2 bzw. RPA1 auf die DHBV Replikation zu untersuchen, wurden die DHA_Cas9 #3-S Zellen an d14 nach Dox-Entzug auf DHBV- Kapside, Nukleokapsid-DNA sowie nukleäre cccDNA untersucht. Dabei diente der Tdp2-KD (M4) als Positivkontrolle für eine Suppression der DHBV-Replikation (Königer et al., 2014). Die M9-Transduktionsansätze (mit leerer shRNA-Kassette) dienten wie die naiven Zellen als Negativ- sowie KD-Spezifitätskontrolle. Die DHBV-Signaldetektion an d14 ergab weder für 129 Ergebnisse die Kapsidsynthese noch für Nukleokapsid-DNA oder nukleäre cccDNA einen Tdp2- oder RPA1-KD abhängigen Phänotyp. Alle Signale waren den Negativkontrollen gleich oder überstiegen diese sogar (Daten nicht gezeigt). Da sich im IB ein relativ schneller Wiederanstieg der Tdp2- und RPA1-Proteinlevel bis d14 gezeigt hatte (Abb. 55B und C), war das Ausbleiben einer Tdp2-abhängigen Interferenz mit der DHBV-Replikation wenig überraschend. Dies verdeutlicht gleichzeitig, dass potenzielle Effekte von Wirtsfaktor-KD auf die DHBV-Replikation über Replikationskinetiken analysiert werden müssen, wofür die DHA2/3 und DHA_Cas9 #3-S Reporter-Zelllinien konzipiert worden waren. Nach Anschalten der DHBV-Replikation durch Dox-Entzug können sequenziell Kulturüberstände geerntet und die zeitabhängige Anreicherung von HAeAg als Marker für die cccDNA- Bildung im ELISA gemessen werden (s. Abb. 26 und Abb. 34). Hierzu wurden die Überstände der gemäß Abb. 55 transduzierten DHA_Cas9#3 Zellen an d9, d12 und d14 auf HAeAg-Signale im ELISA untersucht (Abb. 56), wobei die Überstände dazwischen für 2-3 Tage auf den Zellen belassen wurden, um eine Anreicherung des HAeAg zu erreichen. Für die Auswertung wurde das jeweilige Signal der naiven Zellen zu jedem Zeitpunkt auf 100% gesetzt (je +/- 2% DMSO) und mit den Messwerten der rAAV-Transduktionen verglichen. Die M9-Negativansätze zeigten mit leichter Schwankung an allen Messzeitpunkten zu naiven Zellen vergleichbare HA-Signale. Demgegenüber führte der Tdp2-KD von 80% an d6 und etwa 50% an d10 zu einer über 50% geringeren HAeAg-Akkumulation an d9, erreichte allerdings an d12 wieder das Niveau der M9 Kontrollen sowie der unbehandelten Zellansätze. Obwohl die M4-Transduktion mit DMSO einen 10% stärkeren KD verursachte (Abb. 55B), zeigte sich selbst nach DMSO Wegnahme über die Zeit ein stärkeres HAeAg Signal. Dies wurde mit Ausnahme der M6-Proben in allen Ansätzen beobachtet. Da DMSO die hepadnavirale Replikation auf unbekanntem Weg verstärkt (Sun & Nassal, 2006), führt DMSO in den rAAV-Transduktionsexperimenten wahrscheinlich zu gegenläufigen Effekten auf die DHBV-Replikation. Auch für RPA1 zeigte sich KD-abhängig eine Reduktion des HAeAg-Signals. Ein etwa 50%- iger RPA1-Expressionsverlust an d6 im M5 Transduktionsansatz korrelierte mit einer über 35% geringeren Akkumulation von HAeAg an d9, erreichte aber ähnlich den M4-Proben ab d12 wieder Niveau der Kontrollen. Auch die M6 RPA1-KD Ansätze zeigten an d9 geringere HAeAg-Werte als die Kontrollen, die Inhibition war jedoch trotz etwas stärkerer KD- Effizienz an d6 als in den M5-Proben nicht größer (vgl. Abb. 55C und Abb. 56). Auffällig war allerdings der deutlich langsamere Anstieg der HA-Signale in diesen Proben, die sich auch an d14 den Kontrollwerten der M9- sowie naiven Ansätze nur annäherte. Dies könnte

130 Ergebnisse mit der starken RPA1-KD-Effizienz von über 70% an d6 im Zusammenhang stehen (vgl. Abb. 55C). Anders als bei allen anderen Proben sank das HA-Level in den M6-DMSO- Ansätzen an d12 und d14 enorm und lag nur knapp über der PBS-Kontrolle. Zwar war in diesen Ansätzen das RPA1-Niveau im IB an d10 über 50% und an d14 immer noch etwa 30% reduziert, was für eine Rolle von RPA1 bei der DHBV-Replikation spricht (Abb. 55B). Allerdings müssten potenzielle toxische Effekte des RPA1 KD ausgeschlossen werden, was aber zugunsten der Anwendung von Lentivirus Vektoren (LVs) (s. Abschnitt 3.5.2.2) nicht weiterverfolgt wurde. Insgesamt deuten die Ergebnisse aus IB und HA-ELISA auf eine bisher unbekannte Beteiligung des zellulären DNA-Reparaturfaktors RPA1 an der DHBV- Replikation hin.

Abb. 56 HAeAg-Level nach Transduktion von DHA_Cas9 #3-S Zellen mit shRNA kodierenden rAAVs gegen Tdp2 oder RPA1 DHA_Cas9 #3-S Zellen wurden wie in Abb. 55 beschrieben transduziert. Die Zellen wurden für 14 Tage in Dox freiem Medium kultiviert und der Überstand zur Messung von sekretiertem HAeAg im ELISA an den angegebenen Tagen gesammelt. Die Durchführung des Assays erfolgte gemäß den Angaben in Abb. 28. Fehlerbalken repräsentieren SD aus n=2.

Die in diesem Abschnitt dargestellten Versuche mit shRNA-kodierenden rAAVs hatten die Erreichbarkeit einer hohen Transduktionseffizienz, insbesondere unter Verwendung von DMSO, in HepG2-abgeleiteten Hepatomzellen gezeigt, aber auch die nur transiente Dauer des resultierenden silencing-Effektes. Bereits aus früheren Versuchen war bekannt, dass klare phänotypische Effekte bezüglich DHBV-Replikation und rc- zu cccDNA Konversion wegen der langsamen Kinetik in den stabilen TetOFF DHBV HepG2-Zelllinien einer längerfristigen Depletion des fraglichen Wirtsfaktors bedürfen. Für den Nachweis einer Rolle von Tdp2 in der cccDNA-Bildung war dazu eine stabil mit einem Plasmid-basierten Vektor für die shRNA shTTRAP4 transfizierte, dann klassisch selektionierte Zelllinie eingesetzt worden (Königer et al., 2014). Ein Ziel dieser Arbeit war es, diesen langwierigen Prozess durch ein schnelleres

131 Ergebnisse und breit anwendbares Verfahren zu ersetzen. Die bisherigen Versuche ließen aber die Eignung von rAAV dafür fraglich erscheinen. Statt weiterer Optimierungsversuche und der Umstellung eines potenziellen Selektionsschemas von Blasticidin auf einen anderen, nicht mit der DHBV-Replikation in den TetOFF-Reporterzellen interferierenden Selektionsmarker wurden LVs zum Einschleusen von shRNA-Expressionskassetten in die Zellen eingesetzt.

3.5.2.2. Verwendung von Lentivirus Vektoren für einen stabilen KD-Effekt Lentiviren bilden eine Gattung innerhalb der Familie der Retroviren. Das sind behüllte Viren, die jeweils zwei Kopien eines einzelsträngigen (+) -RNA-Genoms tragen. Für die Infektion muss das RNA-Genom zunächst revers transkribiert und die neue DNA in das Wirtszellgenom integriert werden. Reverse Transkription und Integration werden von Virus- eigenen Enzymen (reverse Transkriptase und Integrase) katalysiert, während die Transkription und anschließende Translation des Integrats (Provirus) durch zelluläre Enzyme erfolgt. Da Lentiviren, anders als einfache Retroviren, auch sich nicht teilende Zellen (z.B Makrophagen, Neuronen, Leberzellen) infizieren können, stellen sie eines der effizientesten Vektorsysteme zum Einbringen externer Gene dar (Naldini et al., 2016). Eines der bestbekannten Beispiele ist das HIV-1, welches das erworbene Immunschwächesyndrom (Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS) auslöst. Aufgrund der Hüllproteine ist der Tropismus von HIV stark auf Zellen des Immunsystems eingeschränkt. Für die breitere Anwendung kann das HIV-Hüllprotein durch das Hüll-Glycoprotein (G) des Vesicular Stomatitis Virus (VSV) ersetzt werden (Pseudotypisierung). VSV infiziert eine breite Palette von Tieren (Insekten, Rinder, Pferde, Schweine), kann im Menschen aber eine Zoonose ausbilden (Bauer, 1997). Das VSV G Protein verleiht daher LVs ein breites Zell- Infektionsspektrum. Gleichzeitig vermittelt VSV G die Sekretion viraler Partikel aus einer Produzentenzelle in den Kulturüberstand und erlaubt damit eine relativ einfache Herstellung der LVs. LVs der zweiten und dritten Generation weisen zusätzliche Sicherheitsmodifikationen auf. So sind die viralen LTRs, welche Promoter-, Enhancer- und Poly-Adenylierungs-Funktion besitzen und auch für die Integration wichtig sind, durch sogenannte selbst-inaktivierende (self-inactivating, SIN) Sequenzen ersetzt. Dies minimiert die Entstehung von replikationskompetenten Proviren (Naldini et al., 2016). Aufgrund der Integration sollten shRNA kodierende LV sollte eine lange andauernde Suppression des Zielproteins gewährleisten. Inzwischen sind Vektoren für das shRNA-vermittelte silencing nahezu aller humanen Genprodukte kommerziell erhältlich.

132 Ergebnisse

In einem Pilotexperiment wurde die Expression eines LV-kodierten GFP (von der AG Prof. Dr. Thomas Baumert, Universität Strasbourg, erhalten) in DHA2/3 Zellen über 3 Wochen mit der mCherry-Expression von dem bereits beschriebenen, Iodixanol-gereinigten shRNA-losen M9 rAAV mittels FACS verglichen (Abb. 57). Wie zuvor waren an d6 nach M9 Transduktion ohne DMSO etwa 40% der Zellen, mit DMSO über 70% der Zellen Reporter-positiv; über d14 bis d21 sank dieser Anteil aber auf unter (-DMSO) bzw. knapp über 10% (+DMSO). Mittels Blasticidin-Selektion konnte tendenziell eine leichte Anreicherung erzielt werden, in Einklang mit den früheren Daten lag aber in der +DMSO-Probe auch nach Blasticidin- Selektion der Anteil FL-positiver Zellen an d21 nur noch bei ca. 20%. Demgegenüber blieb der Anteil GFP-positiver Zellen in den LV-transduzierten Zellen bis d21 konstant bei nahe 70%; die Selektion, hier mit Puromycin, zeigte einen leichten weiteren Anstieg in der d21 Probe, dessen Signifikanz aber nicht überprüft wurde. Jedenfalls erfüllte das GFP-Reporter- LV die Erwartung einer relativ effizienten und andauernden Transgen-Expression (Abb. 57).

Abb. 57 Vergleich der Langzeitexpression eines FL-Reporters nach Transduktion von DHA2/3 Zellen mit LV vs. rAAV-Partikeln Für die rAAV-Transduktion (M9) wurden 3x105 DHA2/3 Zellen mit einer MOI von 5x104 mit oder ohne 2% DMSO für 24 h behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit oder ohne 6 µg/ml Blasticidin (+BsdR) für 21 Tage weiterkultiviert. Die Transduktion mit dem GFP-kodierenden LV erfolgte durch Inkubation der Zellen mit 150 µl eines LV-haltigen Zell-Lysates mit unbekanntem Titer für 6 h. Anschließend wurden 350 µl Medium zupipettiert. Nach 24 h wurden die Zellen mit oder ohne 2 µg/ml Puromycin (+Puro) ebenfalls für 21 Tage weiterkultiviert. Die FACS-Messung der FL-Reporter mCherry (M9) bzw. GFP (LV) erfolgte an den angegebenen Tagen. Je Ansatz wurden 10.000 Einzelzellen analysiert.

Die Ergebnisse veranschaulichen die effizientere Langzeitexpression des jeweiligen Transgens in den LV vs. den rAAV transduzierten DHA2/3 Reporterzellen. Daher wurden sh#LVs mit shRNAs gegen mehrere Wirtsfaktor-Proteine mit potenzieller DHBV-Relevanz in Form infektiöser Partikel kommerziell erworben und zur Transduktion von DHA2/3 Zellen eingesetzt. Spezifisch kamen zum Einsatz Mission-Lenti-shRNA Vektoren (Sigma-Aldrich), die auf dem pLKO.1 bzw. dem nahe verwandten TRC2-pLKO System beruhen (Abb. 58); 133 Ergebnisse letzteres beinhaltet zusätzlich das Woodchuck-hepatitis-virus post-transcriptional regulatory element (WPRE), das einen effizienteren RNA-Export aus dem Kern bewirkt. Die wesentlichen HIV-1 abgeleiteten Elemente des pLKO.1 Vektors bestehen aus trunkierten Versionen des 5´-LTR und selbst-inaktivierendem (SIN) 3-LTR(ΔU3), dazwischen liegen das RNA-Verpackungssignal Ψ, das Rev-Response-Element (RRE) für den Kernexport ungespleißter RNA mittels Rev-Protein, zentraler Polypurin-Trakt und zentrale Terminationssequenz (cPPT/CTS); nicht-virale Elemente sind ein Puromycin-Resistenz- Marker unter Kontrolle des humanen Phosphoglycerat-Kinase 1 (hPGK) Promotors (ohne oder mit nachgeschaltetem WPRE) sowie eine U6-Promotor-Kassette zur Expression von shRNA oder sgRNA. Unter Kontrolle des dem 5´-LTR vorgeschalteten Rous-Sarkom-Virus (RSV) Enhancer/Promotors wird eine rekombinante LV Vektor-RNA transkribiert, die mittels Ko-Expression von HIV-1 Gag-, Gag-Pol- und Rev-Protein sowie VSV G-Protein in infektiöse, aber replikationsdefekte Pseudotyp-Partikel verpackt wird. Nach Eintritt in eine neue Wirtszelle wird die RNA in dsDNA revers transkribiert und durch die mitkodierte HIV- 1 Integrase an zufälliger Stelle ins Wirtsgenom integriert (Naldini et al., 2016). Aus einem solchen Transduktionsansatz resultiert daher üblicherweise ein pool an Zellen mit jeweils unterschiedlichem Integrationsort. Bei Bedarf können daraus Einzelklone selektioniert werden (analog Abschnitt 3.1.2, AAVS1-Integrat Zellen), oft zeigen aber schon die pools nachweisbare Phänotypen.

134 Ergebnisse

Abb. 58 Karte der shRNA tragenden pLKO.1-puro-Vektors Dargestellt ist der shRNA kodierende dsDNA-Vektor mit den wichtigsten Sequenzbereichen. Die shRNA wird über einen U6-Promoter von der zellulären Polymerase 3 transkribiert. Auf der resultierenden RNA ermöglicht der loop eine Basenpaarung zwischen sense- und antisense-Strang und damit die Formung einer shRNA. Der shRNA-kodierende Bereich liegt zwischen der 5´ und 3´ LTR-Sequenz, die Integration der Vektorkassette in das zelluläre Genom vermitteln. Bereiche außerhalb der LTRs werden nicht integriert. Cppt: zentraler Polypurin- Trakt; hPGK: humane Phosphoglycerat-Kinase 1 Promotor; puroR: Puromycinresistenz; SIN/3´ LTR: selbst- inaktivierendes 3-LTR(ΔU3); f1-, pUC ori (origin of replication): Replikationsursprung aus dem Phagen fi-, des pUC-Klonierungsvektors; ampR: Ampicilinresistenz; RSV/5´LTR: 5´-LTR- Rous-Sarkom-Virus (RSV) Enhancer/Promotor; Ψ: Psi- RNA Verpackungssignal; RRE: Rev-Response-Element; Genaue Erläuterungen sind im Text beschrieben. Die Abb. wurde aus www.sigmaaldrich.com entnommen.

3.5.2.2.1. Wirtsfaktor KD-Effizienzen nach lentiviraler shRNA Vektor Transduktion Als spezifische Wirtsfaktor-targets wurden anhand des MS-Proteom-screens in den hAdV5- E4orf6 exprimierenden Zellen (s. Abschnitt 3.3) und einer laut Angaben von Sigma hohen KD-Effizienz (bezogen auf eine ausgewählte Zelllinie, meist A549) die entsprechenden LV- Partikel mit shRNAs gegen ANP32A (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A), RPA1 (Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit), RPA2 (Replication protein A 32 kDa subunit), RPA3 (Replication protein A 14 kDa subunit), HSPB1/HSP27 (Heat shock protein beta-1; 27 kDa), SerpinA3 (Serpin Peptidase Inhibitor, Clade A (Alpha-1 Antiproteinase, Antitrypsin), Member 3), TAGLN2 (Transgelin-2), ANP32E (Acidic leucine- rich nuclear phosphoprotein 32 family member E), DDX41 (Probable ATP-dependent RNA helicase DDX41), HIC2 (Hypermethylated in cancer 2 protein) und NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) ausgewählt. Die genauen Klonbezeichnungen sowie die jeweiligen shRNA-Sequenzen sind im Anhang 7.4 aufgelistet. 135 Ergebnisse

Zur Generierung der entsprechenden KD-Zelllinien wurde die Reporterzelllinie DHA2/3 mit den jeweiligen LVs in 24-well Format mit einer MOI von 3 transduziert und mit 2 µg/ml Puromycin selektioniert. Mit Ausnahme der DDX41 Transduktion konnten mittels aller LVs resistente Zellpools generiert werden. Möglicherweise war die Integration der α-DDX41 shRNA aufgrund einer suboptimalen MOI für die Vermittlung der Puromycinresistenz nicht effizient genug, so dass die Zellen unter Selektionsdruk abstarben. Denkbar ist auch ein toxischer Effekt des DDX41-KD auf die HepG2-Zelllinie, wenn es sich um einen essentiellen Zellfaktor handelt. Für die anderen Ansätze erfolgte die Validierung des jeweiligen KD in den resistenten Zellpools im IB mit spezifischen Antikörpern gegen das entsprechende Protein (Abb. 59). Das jeweilige Signal wurde mit dem von DHA2/3 Zellen verglichen, die mit für eine Kontroll-shRNA (scrambled shRNA) kodierenden LV-Partikeln (bereitgestellt von Dr. Sabrina Schreiner) Puromycin-resistent gemacht wurden (shSCR). Die IB-Ergebnisse in Abb. 59 zeigten unterschiedliche KD-Effizienzen der verwendeten LVs. Für ANP32A und SerpinA3 konnte ein KD von etwas über 50% erzielt werden. Die stärkste Proteinreduktion zeigten die Zellpools von RPA1 (nahezu 70%), TAGLN2 (etwa 90%) und HSP27 (100%), wohingegen bei RPA2 und RPA3 nur ein etwa 20%-iger KD zu messen war. Der HIC2- Zellpool zeigte eine Proteinreduktion von etwa 34%. Leider führte der anti-ANP32E Antikörper (LANPL von Abcam #ab5993) zu unzähligen unspezifischen Banden ohne Intensitätsunterschiede zur shSCR-Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Der α-NAMPT Antikörper (NAMPT/visfatin von Novex #710115) ergab dagegen in keiner der untersuchten Zellproben überhaupt ein Signal (Daten nicht gezeigt). Die ANP32E und NAMPT-Ansätze wurden daher nicht weiterverfolgt.

Abb. 59 IB-Validierung des Protein-KD nach Transduktion von DHA2/3 Zellen mit shRNA-LV DHA2/3 Zellen im 24-well Format mit gereinigten LVs mit einer MOI von 3 transduziert und mit 2 µg/ml 136 Ergebnisse

Puromycin selektioniert; als Kontrolle diente jeweils der shSCR-DHA2/3 Zellpool nach Transduktion mit LV, die eine inaktive (scrambled) shRNA kodieren. Das jeweilige Protein in den resistenten Zellpopulationen wurde im IB nach SDS-PAGE (15% für ANP32A, HSP27, RPA2, RPA3 und TAGLN2, 10% Polyacrylamid für RPA1, SerpinA3 und HIC) nach Nassblot mit den folgenden Primärantikörpern detektiert: α-ANP32A, Santa Cruz #A- 2, 1:1.000; α-RPA1, Millipore #RPA9, 1-30, 1:500; α-HSP27/HSB1, Enzo Life Science #G3.1, 1:1.000; α- SerpinA3/PAI, Cell Signaling #D9C4, 1:250, α-RPA2, Millipore #RPA20, 1-6, 1:500; α-RPA3, Sigma #HPA005708, 1:250, α-TAGLN2, Santa Cruz #C-12, 1:1.00; α-HIC2, Invitrogen, 1:500; α-Aktin, Abcam #AC- 15, 1:10.000. Die Signale wurden mittels PO-gekoppeltem Sekundärantikörper und chemilumineszenten Substrat auf Röntgenfilm sichtbar gemacht. Bandenstärken wurden wie in Abb. 11B mittels MultiGauge quantifiziert. Das jeweilige Intensitätsverhältnis von Ziel-Protein zu β-Aktin in den shSCR Zellen wurde auf 100% gesetzt. Molekulargewicht der Proteine: ANP32A: 32 kDa, RPA1: 70 kDa, HSP27: 26 kDa, RPA2: 32 kDa, RPA3: 14 kDa, TAGLN2: 22 kDa, HIC2: 72 kDa.

3.5.2.2.2. Einfluss von Wirtsfaktor-KD auf die Kapsid-interne DHBV Replikation Ob der in Abb. 59 dargestellte KD von Wirtsfaktoren die virale Replikation beeinflusst, wurde nach Induktion der DHBV-Expression in allen Puromycin-resistenten DHA2/3- Reporterzellen untersucht. Die rAAV-Experimente (s. Abschnitt 3.5.2) hatten u.a. gezeigt, dass die Betrachtung einzelner später Endzeitpunkte keinen phänotypischen Nachweis KD- abhängiger Effekte auf die Bildung von Kapsiden, Nukleokapsid-DNA oder nukleärer DNA mehr erlaubte (vgl. Abb. 55B, C und Abb. 56). Dies hängt zum einen mit der nachlassenden KD-Effizienz zusammen, dazu könnte die Akkumulation stabiler viraler Produkte über die Zeit kommen, wenn der partielle KD eines Wirtsfaktors deren Bildung nur verlangsamt. Daher wurde die DHBV-Expression in den KD-Zellpopulationen über die Zeit verfolgt und mit der Expressionskinetik in naiven bzw. shSCR-behandelten DHA2/3 Zellen verglichen. Hierzu wurden je 3,3x105 Zellen in einem 6-well in Duplikaten für 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 und 14 Tage ohne Dox kultiviert und zu jedem Zeitpunkt die Synthese von DHBV-Kapsiden (Abb. 60), Nukleokapsid-DNA (Abb. 60) sowie cccDNA (Abb. 61 und Abb. 62) analysiert. Um für alle Ansätze zum Zeitpunkt der Ernte eine identische Zellzahl zu gewährleisten, wurde das Dox-freie Medium zunächst für den Zeitpunkt Tag 14, dann Tag 12, Tag 10, Tag 8 usw. auf die Zellen gegeben und alle Ansätze am selben Tag (d14) geerntet. Die Kapsid- und Nukleokapsid-DNA-Signale sind in Abb. 60A-J zusammengefasst. Um Varianzen zwischen individuellen Blots, z.B. durch unterschiedliche Effizienz von Transfer und/oder Detektion, auszugleichen, wurden für jede Replikationskinetik sogenannte Blot-Kontrollen (BK) als Standard mit aufgetragen. Hierzu dienten Proben von d6 und d12 aus separat gemessenen Kinetiken mit dem shSCR-Zellpool sowie naiven DHA2/3 Zellen. Die Intensitäten aller Signale wurden quantifiziert und sind rechts neben dem jeweiligen Blot graphisch dargestellt. Da die Signale der shSCR-Blot-Kontrolle durchweg über allen anderen Werten lagen (s. Abb. 60A), wurden die den eigentlichen Test-Kinetiken eher entsprechenden Signale der DHA2/3

137 Ergebnisse

Blot-Kontrolle an d12 jeweils als 100% Referenz gesetzt und aller anderen Werte darauf bezogen. So können die Replikationskinetiken besser untereinander verglichen werden.

Als Kontrolle auf Effekte von LV-Transduktion bzw. shRNA Expression per se diente eine mitgeführte Versuchsreihe mit dem shSCR-Zellpool. Der IB zeigte bereits an d3 schwache Kapsidsignale (eventuell durch eine Basal-Expression in Anwesenheit von Dox), deren Intensität von d6 auf d8 sprunghaft anstieg und etwa auf diesem Niveau verblieb (vgl. Abb. 60A); dies entspricht weitgehend dem Phänotyp naiver DHA2/3 und DHA_Cas9 #3-S Zellen (vgl. Abb. 34 und Abb. 42). Dementsprechend zeigte sich im SB eine zeitabhängige Akkumulation von Nukleokapsid-DNA, wobei die Intensität bis d14 weiter leicht anstieg; allerdings deuten die hellen Bereiche innerhalb der DNA-Signale auf Unregelmäßigkeiten bei Transfer und/oder Hybridisierung hin, die zu einer Unterschätzung der Werte führen könnten.

Die Replikationskinetiken in mehreren der LV-shRNA transduzierten Zellpools ähnelten der shSCR Kontrolle, mit starkem Anstieg der Kapsid- und Kapsid-DNA-Signale von d6 auf d8, gefolgt von weiterhin hohen Werten bis d14. Hierzu gehörten die drei Zellpools mit nicht nachweisbarem bzw. marginalem KD, nämlich shANP32E- (kein KD), shRPA2- (KD: 21%), und shRPA3- (KD: 23%). Zwar zeigten die beiden letzteren Ansätze eine Abnahme der Kapsid-DNA-Signale über die Zeit, angesichts der geringen KD-Effizienz ist aber ein ursächlicher Zusammenhang mit einer verringerten Abundanz dieser Proteine in den Zellen eher fraglich. Auch die shSerpinA3- (KD: 54%) und shHIC2- (KD: 44%) Zellpools ergaben ähnliche Verläufe, wobei auf Basis dieser Daten nicht zwischen einem zu geringen KD und einer fehlenden Rolle dieser Wirtsfaktoren in der DHBV Replikation zu unterscheiden ist.

Deutlichere Phänotypen ließen sich in vier der Zellpools sehen, alle mit KD-Effizienzen von ≥50% der jeweiligen Zielproteine, nämlich ANP32A (KD: >50%), RPA1 (KD: 75%) TAGLN2 (KD: ≥90%), und HSP27 (KD: ≥95%).

Im shTAGLN2-Zellpool zeigte sich nach einer sehr leichten Zunahme der Kapsidsignale von d3 auf d6 ebenfalls die bei den o.g. Proben deutliche Steigerung von d6 auf d8, war aber weniger ausgeprägt und das anschließende Plateau blieb durchgehend unterhalb der shSCR Zellen (s. Abb. 60G). Ein ähnliches Muster ergab der Kapsid-DNA Blot, wobei die Signalstärken im Vergleich zu den jeweiligen shSCR-Kontrollen von d10 bis d14 um 40% bis 60% reduziert waren.

In den IBs der Zellpools shANP23A, shRPA1 und shHSP27 waren vor d6 kaum Signale zu detektieren; ab d8 zeigte sich auch hier eine klare Anreicherung der Kapside. Für die shANP23A Zellen blieben die Intensitäten aber bis d10 20-30% unterhalb der jeweiligen 138 Ergebnisse shSCR-Kontrollen (s. Abb. 60H-J), glichen sich dann aber dem shSCR-Kontrollansatz an (s. Abb. 60H). Der shRPA1-Zellpool zeigte an d8 eine >50%-ige Reduktion des Kapsidniveaus relativ zur shSCR-Kontrolle, die an d10 nur noch 30% und an d12 etwa 10% betrug. Konform dazu zeigte sich im Kapsid-DNA Blot RPA1-KD-abhäng ein >50% vermindertes Nukleinsäure-Signal an d8. Auffällig war aber die weitere Zunahme dieses Signals über die Zeit, wobei bis d14 nicht die Signalstärke der d14 shSCR-Kontrolle (Abb. 60I) erreicht wurde. Ein ähnlicher Phänotyp war im shHSP27 Zellpool zu sehen, in dem das HSP27 Protein bis unter die Detektionsgrenze reduziert war. Damit einher ging ein auf 50% reduziertes Kapsidlevel an d8, dass auch bis d14 nicht mehr deutlich zunahm. Demgegenüber nahm die Kapsid-DNA wie in den shRPA1 Zellen beständig zu, blieb aber bis d14 ca. 30% unterhalb des entsprechenden shSCR-Kontrollansatzes (s. Abb. 60J). In beiden Fällen könnten die DNA-Werte aufgrund der hellen Bandenbereiche etwas unterschätzt werden (vgl. Abb. 60A, I, J), die Zunahme bis d14 gegenüber der Abnahme in vielen der anderen Zellpools ist jedoch eindeutig.

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Abb. 60 Kinetik der Kapsid- und Kapsid-DNA Synthese Puromycin-resistenten KD-Zellpools nach Induktion der DHBV-Replikation Je 3,3x105 Zellen der angegebenen Zellpools pro 6-well wurden in Duplikaten ausplattiert und für die angegebenen Tage (d) in Dox-freiem Medium kultiviert, an Tag 14 erfolgte die NP40-Lyse zur Gewinnung zytoplasmatischer Extrakte. Kapside und Kapsid-DNA wurden nach NAGE per IB bzw. Hybridisierung gemäß Abb. 23A detektiert. Als Standards wurden auf jeden Blot die d6 und d12 Proben aus separat mit shSCR- transduzierten bzw. naiven DHA2/3 Zellen aufgetragen (Blot-Kontrolle, BK). (A) shSCR (B) shANP32E (C) shRPA2 (D) shRPA3 (E) shSerpinA3 (F) shHIC2 (G) shTAGLN2 (H) shANP32A (I) shRPA1 (J) shHSP27. Die Graphiken rechts zeigen die Intensitäten der Kapsid- und DNA-Signale, gemessen mit MultiGauge, relativ zur auf 100% gesetzten DHA2/3 Blot-Kontrolle d12. Zusätzlich ist in jeder Graphik die Replikationskinetik der shSCR-Zellansätze (A) dargestellt. Die Graphik in (A) zeigt zudem die zusammengefassten Werte der shSCR- Blot-Kontrolle d6 und d12 aus allen Blots (A-J). Fehlerbalken repräsentieren SD aus n=2; shSCR-/DHA2/3- Blot-Kontrolle n=10.

Zusammen wären die Daten für den KD von RPA1, HSP27, TAGLN2 und möglicherweise ANP32A mit einer Rolle dieser Wirtsfaktoren in der DHBV-Replikation vereinbar, wobei insbesondere RPA1 und/oder HSP27 die Synthese DNA-haltiger Nukleokapside begünstigen würden. Ob es sich bei der verpackten DNA vorwiegend um rcDNA oder anderweitige Intermediate der reversen Transkription handelt, wurde zugunsten einer Analyse der nuklären DNA (s. Abb. 61 und Abb. 62) nicht weiter analysiert.

3.5.2.2.3. Einfluss von Wirtsfaktor-KD auf die nukleäre Virus-DNA Zur Untersuchung eines KD-abhängigen Effektes auf die cccDNA-Synthese wurde zunächst in den Überständen der Zellansätze d5, d6, d8, d10, d12 und d14 das HAeAg-Level als Surrogatmarker für die cccDNA-Menge im ELISA detektiert (Abb. 61). Die Messwerte der shSCR-Kinetik wurden zu jedem Zeitpunkt auf 100% gesetzt und die Werte aller anderen Proben relativ dazu in % berechnet. PBS diente als Spezifitätskontrolle. Im direkten 141 Ergebnisse

Vergleich aller Kontrollen untereinander war in den beiden Blot-Kontrollen shSCR und naive DHA2/3 Zellen zu jedem Zeitpunkt mehr HAeAg messbar als in der eigentlichen shSCR- Kinetik (s. Abb. 61A), in Einklang mit den zuvor gesehenen stärkeren Kapsid- sowie Kapsid- DNA Signalen. Allerdings können die Kapsid- und Kapsid-DNA-Level nicht direkt mit den HAeAg-Werten korreliert werden, da die erstgenannten DHBV-Produkte zunächst cccDNA- unabhängig von der chromosomal integrierten DHBV-Expressionskassette synthetisiert werden, während die für HAeAg erforderliche precore-RNA cccDNA als Matrize erfordert (s. Abb. 26). Dennoch spiegeln die ELISA-Messwerte tendenziell die Ergebnisse aus dem IB und SB wider. So zeigten die KD-Zellpools shANP32E, shRPA3 und shSerpinA3 ohne nachweisliche Reduktion der Kapsid- und Kapsid-DNA Synthese auch im ELISA kein vermindertes, sondern z.T. etwas höhere HAeAg-Signale als die jeweilige shSCR Kontrolle (Abb. 61B). Aus unverstandenen Gründen waren an d8 in allen Ansätzen mit Ausnahme von shSerpinA3 die Werte geringer als in der shSCR-Kontrolle; hier müssen zur Klärung möglicher „Ausreißer“ weitere Kontrollen durchgeführt werden. Auch die z.T unter und z.T über den Kontrollen liegenden Werte in den shHIC2- und shRPA2-Zellpools sprechen eher für Schwankungen des HA-ELISA Assays.

Dagegen wurde in den Zellpools shTAGLN2, shANP32A, shRPA1 und shHSP27 konform mit den IB/SB-Daten (s. Abb. 60G-J) ein zu Beginn (d5-d8) um 60-80% geringeres HAeAg- Level als in der shSCR-Kontrolle gemessen; ab d12 war dieser Unterschied aber nicht mehr nachweisbar. Somit scheint der KD dieser Wirtsfaktoren zu einer Verlangsamung der HAeAg Akkumulation zu führen, nicht aber zu einer kompletten Inhibition. Dies könnte daran liegen, dass die verwendeten Zellpools Mischpopulationen von Zellen mit starkem und andere mit schwachem KD enthalten, mit entsprechend unterschiedlichem Einfluss auf die DHBV- Replikation. Die Messwerte der Assays (Abb. 60 und Abb. 61) wären dann als ein durchschnittlicher KD-Effekt auf die DHBV-Replikation anzusehen. Selbst bei praktisch komplettem KD wie im Fall des shHSP27-Zellpools könnten u.U. andere, funktionell redundante Faktoren dessen Rolle übernehmen und den KD-Effekt kompensieren.

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Abb. 61 Kinetik der HAeAg Akkumulation im Überstand Puromycin-resistenter KD-Zellpools nach Induktion der DHBV Replikation Die Induktion der viralen Replikation erfolgte wie in Abb. 60 beschrieben, der HA-ELISA wurde gemäß Abb. 28 durchgeführt. Die Signale der shSCR-Zellpool-Ansätze wurden für jeden Zeitpunkt auf 100% gesetzt, alle anderen Signale am entsprechenden Zeitpunkt darauf bezogen (in %). PBS diente als Spezifitätskontrolle. (A) HA-ELISA der DHBV-Replikationskinetik des resistenten shSCR Zellpools sowie der in Abb. 60 beschriebenen Blot-Kontrollen shSCR und naive DHA2/3. (B) HA-ELISA der Wirtsfaktor KD-Zellpools im Vergleich zur shSCR-Kontrolle.

Im nächsten Schritt wurde, jeweils in Duplikaten, die nukleäre DNA aus den Zellansätzen d5, d6, d8, d10, d12 und d14 präpariert, um die aus dem HA-ELISA indirekt abzuleitende reduzierte bzw. verlangsamte cccDNA-Kinetik in den Zellpools shANP23A, shRPA1, shRPA2, shHSP27 und shTAGL2 im SB zu bestätigen. Zusätzlich wurde die Kern-DNAs der Ansätze shSerpinA3 und shRPA3 sowie der Blot-Kontrollen (BK) shSCR und DHA2/3 Abb. 60 isoliert; letztere dienten wie zuvor als Referenzen zur Normierung von Blot-zu-Blot Varianzen. Zusätzlich wurden vor der DNA-Präparation zu jedem Ansatz 150 pg des DHBV Plasmids pCD16+ zugegeben, dass bei der Agarosegelelektrophorese oberhalb der viralen rcDNA Bande läuft (Abb. 62). Das Plasmid dient hier als „Aufreinigungskontrolle“, die in jedem Ansatz im SB zu detektieren sein sollte (vgl. Abb. 34A). Fehlende oder schwächere Banden machen DNA-Verluste während der Aufarbeitung der Kern-DNA sichtbar; 143 Ergebnisse umgekehrt schließen vorhandene Plasmid-Signale bei Ausbleiben viraler Signale einen technischen DNA-Verlust aus. Nach der DNA-Präparation wurden die Proben mit Plasmid- Safe-ATP-dependent DNase (PSD; ds-DNA degradierende Exonuklease) behandelt, die lineare DNAs inklusive chromosomaler DNA degradieren sollte, nicht aber ccc und rc dsDNA.

Die Ergebnisse des SB sind in Abb. 62A-D dargestellt. Neben den erwarteten Banden von viraler cccDNA und rcDNA sowie der cccDNA-Form des pCD16+ Plasmids trat in unterschiedlichen Verhältnissen eine weitere, langsam wandernde Bande auf; höchstwahrscheinlich handelt es sich die rc-Form des Plasmids, was für vereinzelte Strangbrüche während der Präparation spricht. Dazu passt, dass in den meisten Proben mit hohem Verhältnis von vermuteter Plasmid rcDNA zu cccDNA auch das virale rcDNA zu cccDNA Verhältnis hoch war (z.B. Abb. 62, Duplikate von d10 und von d12); allerdings ist diese rcDNA-Entstehung durch nicking von cccDNA ein Unsicherheitsfaktor für die Einschätzung der Effizienz der cccDNA Bildung aus rcDNA. Dagegen ist klar, dass das Fehlen viraler DNA, z.B. in je einem Ansatz der Duplikate von d8 und d12 aus dem shRPA1- Zellpool, technisch bedingt ist, da auch die Plasmid DNA-Signale fehlen (Abb. 62B). Solche Proben wurden daher nicht in die Auswertung einbezogen.

Die Graphen unterhalb der SBs zeigen die quantifizierten Signalintensitäten jeweils für die virale rc- sowie cccDNA Bande an jedem Zeitpunkt, normiert auf die rc- und cccDNA Signale der shSCR BK an d12 auf demselben Blot. Für die Vergleichbarkeit der Blots sprechen die Werte der naiven DHA2/3 Zellen als zweite BK, die an d12 immer bei ca. 80% (rc) bzw. ca. 70% (ccc) der shSCR Kontrolle lagen; für beide BK-Sets waren die d6 Werte etwa halb so hoch. Somit sollten auch die eigentlichen Testwerte über die individuellen Blots hinweg vergleichbar sein. Allerdings zeigten sich dennoch z.T. deutliche Schwankungen zwischen den Duplikaten eines Zeitwertes oder zwischen sequenziellen Zeitwerten (z.B. bei den Ansätzen shSerpinA3, shRPA2 und shRPA3). Die nachfolgenden Beschreibungen geben daher nur Tendenzen an, deren Signifikanz erst durch Wiederholungsversuche bestätigt werden muss; aus Zeitgründen war dies im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich.

In der eigentlichen Test-Serie mitgeführten shSCR Kinetik (Abb. 62A rechts) zeigten sich schwache rc- und cccDNA Signale ab d6, die dann deutlich anstiegen und an d12 und d14 die Signale der BK überstiegen. Im shHSP27 Ansatz (>90% KD) waren alle Signale schwächer (Abb. 62A links), insbesondere fehlte der deutliche Anstieg nach d8. Ähnlich verhielt sich Ansatz shANPA32 (ca. 50% KD), wobei ein Anstieg der viralen DNA-Signale sichtbar, aber

144 Ergebnisse weniger ausgeprägt war als in Ansatz shSCR Abb. 62B links). Ansatz shRPA1 (Abb. 62B rechts) zeigte mit den stärksten Phänotyp mit fast völlig fehlendem Anstieg nach der erstmaligen Detektierbarkeit von cccDNA und rcDNA an d8; zu keinem Zeitpunkt erreichten die Signale die Stärken der BK oder die der mitgeführten shSCR Kontrolle (Abb. 62A rechts). Wie erwähnt, zeigten die Ansätze shSerpinA3 (Abb. 62C links; z.B. d6 vs. d8) und shRPA2 (Abb. 62C rechts; z.B. d10 vs. d12) sowie shRPA3 (Abb. 62D links; z.B. d8 vs. d10) teilweise erhebliche Schwankungen; zudem hatten die letztgenannten nur marginale KD- Effizienzen erzielt. Auf eine spezifische Interpretation wurde daher verzichtet. Demgegenüber zeigte Ansatz shTAGLN2 konsistent für alle Messpunkte einen ähnlichen Phänotyp wie die shRPA1 Proben, nämlich das Fehlen eines Signalanstiegs nach der erstmaligen Detektierbarkeit an d8 und insgesamt deutlich niedrigere Signalstärken als in der shSCR- Kontrollkinetik (Abb. 62D rechts).

Zusammengefasst unterstützen diese ersten direkten Southernblot-Daten eine Verlangsamung bzw. Interferenz mit der Akkumulation von cccDNA in den Zellpools mit deutlichem KD der Wirtsfaktoren ANP32A, RPA1, TAGLN2 und HSP27; in ebendiesen Zellpools waren die HAeAg-Kinetiken in vergleichbarer Weise betroffen (Abb. 61).

Somit deuten beide Datensätze konsistent darauf hin, dass diese vier Wirtsproteine für die hepadnavirale Replikation inklusive der Bildung und/oder Stabilität der cccDNA von Bedeutung sind. Für einen endgültigen Nachweis sind aber weitergehende Untersuchungen notwendig.

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Abb. 62 Kinetik der nukleären DHBV-DNA in Puromycin-resistenten KD-Zellpools nach Induktion der viralen Replikation Die Induktion der DHBV-Replikation in den jeweils benannten, mit Puromycin selektionierten KD-Zellpools erfolgte wie in Abb. 60, die Detektion viraler Nukleinsäure mittels SB wie in Abb. 27 beschrieben. Der Zusatz von je 150 pg DHBV Plasmid pCD16+ diente zur Kontrolle potenzieller DNA-Verluste während der Nukleinsäureextraktion; die oberste Bande entspricht der rcDNA Form des Plasmids. Die Mengen der Marker (M) für rcDNA und cccDNA betrugen je 100 pg pro Gel. (A) shHSP27 und shSCR (B) shANP23A und shRPA1 (C) shSerpinA3 und shRPA1 (D) shRPA3 und shTAGLN2. Die Proben shSCR-BK und DHA2/3-BK entsprechen den in Abb. 60 gezeigten BK (je d6 und d12), deren Kern-DNA auf jeden Blot als Standard aufgetragen wurde. Die Intensität der rc- sowie cccDNA-Bande wurde in allen Ansätzen mit MultiGauge gemessen und jeweils prozentual auf das d12 shSCR BK Signal (100%) normiert (Graphen unterhalb der Blots mit den Mittelwerten aus n=2 bzw. n=4 mit Standardabweichung).

In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse aus den Abb. 59 bis Abb. 62 für jeden KD- Zellpool zusammengefasst. Die DHBV-Signale aus der jeweiligen Replikationskinetik wurden mit „+++“ für keine- „++“ für eine schwache- und „+“ für eine starke -Reduktion der viralen Expression bewertet.

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Abb. 63 Tabellarische Zusammenfassung der DHBV-Replikationskinetik in den Puromycin-resistenten KD-Zellpools Die Tabelle fasst die Ergebnisse aus den Abb. 59 bis Abb. Abb. 62 zusammen. Als Referenzwert diente der shSCR -Zellpool, dessen DHBV-Signale alle mit „+++“ bewertet wurden. Im Vergleich dazu repräsentiert „+“ die stärkste Reduktion des entsprechenden DHBV-Signals. Die Proteinreduktion in der jeweiligen Zelllinie ist in % angegeben (KD in %).

148 Diskussion

4. Diskussion Die Konversion der rcDNA aus infektiösen Viruspartikeln in cccDNA ist ein essentieller Schritt im hepadnaviralen Infektionszyklus. Die cccDNA im Zellkern der Leberzelle sichert als persistierende Form des Virusgenoms die anhaltende Produktion von Virusnachkommen und ist somit ursächlich für die chronische Verlaufsform der Hepatitis B. Bisherige HBV- Therapieansätze scheitern an der Eliminierung der cccDNA, nicht zuletzt weil die Bildung der ccc- aus rcDNA weitgehend ungeklärt ist. Allerdings sprechen mehrere Studien für eine starke Abhängigkeit von zellulären Faktoren, insbesondere Komponenten der DDR (Schreiner & Nassal, 2017) (Gomez-Moreno & Garaigorta, 2017). Für einige Viren ist die wichtige Rolle der DDR bei der Infektion bereits gut dokumentiert (Weitzman & Weitzman, 2014) (Luftig, 2014) (Hollingworth & Grand, 2015). Eines der bestuntersuchten Beispiele ist hAdV5, dessen E4wt Protein essentiell zur Unterdrückung der für Adenoviren unerwünschten DDR beiträgt.

Hierauf basiert der Einsatz von E4wt in dieser Arbeit. Die transiente Kotransfektion humaner HepG2 Hepatomzellen mit DHBV- plus E4wt-Vektoren führte zu einer verminderten viralen Replikation, gleichzeitig konnte im SB keine cccDNA mehr nachgewiesen werden (s. Abb. 1A und B). Erstaunlicherweise äußerte sich dieser Phänotyp bereits mit E4wt alleine, ohne dessen viralen Kofaktor E1B55k und damit ohne die Degradation bekannter Zielproteine (u. a Mre11 s. Abb. 1C). Hieraus resultierte die Arbeitshypothese, dass bereits E4wt alleine andere, bislang unbekannte zelluläre Proteine degradieren kann, die für die hepadnavirale Replikation und/oder cccDNA Bildung wichtig sind. Ziel der Arbeit war es daher, mittels eines MS- basierten Proteom-Vergleichs von HepG2 Zellen mit vs. ohne E4wt Expression solche zellulären Kandidaten-Faktoren zu identifizieren. Anschließend sollten diese Kandidaten funktionell auf eine Beteiligung an der DHBV Replikation und/oder cccDNA-Bildung getestet werden, vorwiegend mittels KD oder KO der Wirtsfaktoren. Auf dem Weg dorthin mussten zahlreiche technische Hürden überwunden werden, die nachfolgend diskutiert werden. Im Anschluss erfolgt eine Diskussion der bisher am besten charakterisierten Kandidaten-Faktoren (RPA1, TAGLN2, HSP27, ANP32A) bezüglich des Einflusses auf die DHBV Replikation, sowie ein Ausblick auf künftige Strategie-Optionen zur weiteren Absicherung dieser und Identifizierung zusätzlicher Hepadnavirus-relevanter Wirtsfaktoren.

149 Diskussion

4.1. Herstellung stabil E4wt- und BCmut-exprimierende HepG2 Zellen mittels des episomalen pMEP4 Vektors sowie durch gerichtete Integration in den AAVS1 Lokus

4.1.1. Episomale Vektoren: EBV-basiert vs. nicht-viral Für sinnvolle Proteom-Vergleiche mussten möglichst homogene und sich lediglich in der An- vs. Abwesenheit von funktionellem E4wt unterscheidende Zellen generiert werden, die auch die HBV- bzw. DHBV-Replikation unterstützen. Ein erster Schritt war daher die Etablierung stabiler HepG2 Hepatomzelllinien, die E4wt bzw. dessen E3-Ubiquitin-Ligase-defiziente Variante BCmut in möglichst identischem Genomkontext exprimieren. Bislang wurde erst eine einzige, Kolon-Karzinom-basierte (RKO) E4wt-Zelllinie in der Literatur beschrieben (Hart et al., 2005b), vermutlich aufgrund cytotoxischer Effekte der E4wt Expression (Dr. S. Schreiner, persönliche Mitteilung). Da somit unklar war, ob stabil E4wt exprimierende HepG2 Zellen überhaupt zugänglich sind, wurden mehrere alternative Strategien verfolgt. Grundsätzlich führten alle Methoden zu stabilen Zelllinien, aber nur die Verwendung des episomalen viralen Vektors pMEP4 mit induzierbarem Promoter erlaubte letztlich den Nachweis der Funktionsfähigkeit des Zell-exprimierten E4wt Proteins und den anschließenden Proteomvergleich mit analogen BCmut exprimierenden Zellen.

Die klassische Herstellung stabiler Zelllinien durch Integration in das zelluläre Genom mit anschließender Selektion führt aufgrund unterschiedlicher Integrationsorte zu hier unerwünschten, Zellklon-spezifischen Unterschieden. Dies kann grundsätzlich durch episomale Vektoren (Lufino et al., 2008) oder durch ortsgerichtete Integration in einen spezifischen Genlokus umgangen werden; genetische und epigenetische Varianzen bleiben aber möglich. Episomale Systeme basieren auf viralen (z.B. OriP und EBNA-1 des EBV; virale Vektoren) (Reisman & Sugden, 1986) (Bashaw & Yates, 2001) oder chromosomalen Elementen (z.B. S/MAR; nichtvirale/alternative Vektoren) (Hagedorn et al., 2011), die eine an den Zellzyklus gekoppelte Replikation sowie eine Chromosom-assoziierte Verteilung der Vektor-Replikate in je eine Tochterzelle vermitteln. Für eine Einschätzung ihrer Eignung im HepG2 Zellsystem wurden FL-Protein-kodierende Derivate der EBV-basierten Vektoren pCEP4 und pMEP4 sowie der alternativen Vektoren pEPI (Lufino et al., 2008) (Hagedorn et al., 2013a) (De Rocco et al., 2018) und seines Derivates pEPI_UCOE eingesetzt (s. Abschnitt 3.1.1). Im pCEP4 Vektor wird die Transgen-Expression durch den CMV-IE Enhancer/Promotor kontrolliert, in pMEP4 durch den Me2+-induzierbaren Metallothionein- Promoter. In pEPI_UCOE kann das an den CMV-IE Promotor fusionierte regulatorische 150 Diskussion

UCOE-Element einer Stilllegung des Promotors durch CpG-Methylierung entgegenwirken (Moritz et al., 2015) (Maksimenko et al., 2015) (Benton et al., 2002) (Zhang et al., 2007). Auch das von den viralen Vektoren kodierte EBNA-1 kann als Transkriptionsverstärker agieren (Reisman & Sugden, 1986) (Castan et al., 2017). In IB Analysen auf Reporter- Expression führte tatsächlich pEPI_UCOE wie pCEP4 zu stärkeren Signalen als pEPI, diese wurden aber von pMEP4 nach Supplementation mit 200 nM Zn2+ noch übertroffen (s. Abb. 7). FL-Mikroskopie und FACS-Messungen zeigten aber auch deutliche Unterschiede in den jeweiligen Anteilen Reporter-positiver vs. -negativer Zellen, wozu wahrscheinlich auch unterschiedliche Transfektionseffizienzen beitrugen. Für alle vier Vektoren wurden daher die transfizierten Zellen der Selektion mit G418 (pEPI, pEPI_UCOE) bzw. Hygromycin (pCEP4, pMEP4) unterzogen. Wie erwartet starb hierbei jeweils ein Großteil der Zellen ab, die verbleibenden resistenten Zellen wiesen jedoch nur zu einem geringen Prozentsatz eine nachweisbare Reporterexpression auf; für die FACS-quantifizierten pEPI und pEPI-UCOE Ansätze ergaben sich Werte von 13,1% bzw. 2,4% positiver Zellen in den resistenten Populationen (s. Abb. 8).

Um dieser hohen Zell-zu-Zell-Variabilität zu begegnen, wurden schließlich von allen Ansätzen jeweils mehr als 20 Einzelzellklone isoliert und per FL-Mikroskopie und IB auf Transgen-Expression getestet. Dies bestätigte, dass jeweils nur ein Bruchteil der Klone nachweislich das Reporterprotein exprimierte, wobei dieser Anteil bei pEPI (3 aus 26) besonders gering ausfiel. Zum einen könnte in einem Teil der als negativ gewerteten Zellen das Expressionsniveau unterhalb der FACS-Detektionsgrenze liegen (Hagedorn 2011); zum anderen scheint nur ein Bruchteil der in eine Zelle transfizierten episomalen Plasmide tatsächlich in der Lage, sich stabil als autonomes Replikon zu etablieren (Hagedorn et al., 2011), was grundsätzlich auch für EBV-basierte Vektoren zutrifft (Leight & Sugden, 2001a) (Leight & Sugden, 2001b) (Castan et al., 2017). Beides hängt wahrscheinlich von der Assoziation des Episoms an unterschiedliche chromosomale Bereiche ab, was dann zu unterschiedlicher epigenetischer Regulation führt; z.B. fand sich in Zellen mit stabilem pEPI Replikon das Episom bevorzugt assoziiert an schwach kondensierte Chromatinbereiche (Interchromatin) und wies Histonmodifikationen auf, die typisch für aktiv-exprimierte Chromatin-Regionen sind (Rupprecht & Lipps, 2009) (Hagedorn et al., 2011) (De Rocco et al., 2018). Das Histon-Muster blieb über viele Passagen konstant und wurde so an die Nachkommen Zellen „vererbt“. Ähnliches gilt für EBV-basierte Vektoren (Bashaw & Yates, 2001). Da sich aus diesen Experimenten keine Vorteile der pEPI-Vektoren ableiten ließen,

151 Diskussion wurden für die Generierung stabiler E4wt- bzw. BCmut-Zelllinien nur noch die pCEP4 und pMEP4 Vektoren eingesetzt.

4.1.2. Etablierung E4wt- bzw. BCmut HepG2-Zelllinien mittels EBV-basierter Vektoren Die Versuche zur Herstellung E4wt- bzw. BCmut exprimierenden HepG2 Zelllinien mittels der pCEP4 und pMEP4 Vektoren erfolgte wie oben für die Reporter-Vektoren beschrieben durch Selektion von Einzelklonen (s. Abb. 9A). Auffälligstes Ergebnis war, dass trotz nachweislicher E4wt- und BCmut-Expression in den frisch pCEP4-transfizierten Zellen nicht einer von 30 selektionierten Einzelklonen eine E4wt Expression aufwies, während das BCmut Protein in 75% der Einzelklone nachweisbar war (s. Abb. 10A). Zusammen mit der erfolgreichen Etablierung stabiler E4wt Zelllinien auf Basis des induzierbaren pMEP4 Vektors (siehe unten) deutet dies auf einen starken negativen Selektionsdruck durch die hohe konstitutive Expression des E4wt in HepG2 Zellen hin, der durch die B/C-Box-Mutationen großteils aufgehoben wird.

Diese Ergebnisse sind in Einklang mit der geringen Anzahl zugänglicher Daten zur stabilen Expression des E4orf6 Protein. Nur eine einzige Publikation (Hart et al., 2005b) beschreibt die Generierung einer stabilen hAdV5 E4wt RKO Zelllinie. Die Zellen zeigten eine signifikante Radiosensibilisierung, die mit einer länger anhaltenden Autophosphorylierung der DNA-PKcs in Zusammenhang stand; dies könnte erstmals auf eine Interferenz mit DNA- Reparaturprozessen durch die alleinige Expression von E4wt Protein hinweisen. In transient mit E4wt-Vektor transfizierten U251 Glioblastomzellen war die Aktivität der PP2A Phosphatase inhibiert, die u.a. zur Dephosphorylierung des DDR-Markers γH2AX benötigt wird; dies führte zum Modell, dass E4wt-Überexpression die Dauer des DDR-Signals derart verlängert, dass der Zelltod induziert wird (Hart et al., 2007). Hinweise auf eine Zelltyp- abhängig unterschiedliche Zytotoxizität finden sich auch in einem US-Patent aus dem Jahr 2005 derselben Arbeitsgruppe, in dem eine Methode zur Herstellung rekombinanter E4orf6- defizienter hAdV-Vektoren in E4wt-produzierenden Helferzelllinien geschützt ist; hierzu wurden Expressionskassetten für mutierte E4orf6 Proteine mit angeblich verminderter Zytotoxizität plus Neomycin-Resistenz in verschiedene Zelllinien transfiziert und versucht, stabile Zellklone zu selektionieren (Orlando et al., 2005). In HEK293 Zellen ließen sich keine resistenten Zellkolonien generieren, wahrscheinlich wegen der dort schon vorhandenen E1A- und E1B-Sequenzen (Graham et al., 1977), die zur Expression des E4wt-Kofaktors E1B55k führen. Auch in der Epithelzelllinie HeLa führte die E4wt-Transfektion zum Zelltod.

152 Diskussion

Neomycin-resistente Kolonien wurden in den Zelllinien REF-52 (embryonale Fibroblasten- Zelllinie aus der Ratte), A549 (Adenokarzinom der Lunge) und SAOS-2 (Osteosarkom/ Knochentumor) -Zellen erhalten, allerdings werden keine weiteren Einzelheiten zur Intaktheit des E4wt Proteins und seinem jeweiligen Expressionsniveau mitgeteilt (Orlando et al., 2005).

Die Daten der vorliegenden Arbeit weisen stark darauf, dass auch die Hepatomzelllinie HepG2 keine längerfristige, vom CMV-Promoter konstitutiv getriebene E4wt-Expression toleriert (s. Abb. 10A). Somit scheint die Überexpression von E4wt per se Zellvorgänge zu manipulieren, die längerfristig Selektionsnachteile mit sich bringen. Kürzerfristig könnten solche E4wt-vermittelten Effekte auch dem negativen Einfluss von E4wt in transient DHBV- E4wt kotransfizierten HepG2 Zellen zugrundeliegen (s. Abb. 1A und B).

Andererseits gelang mit dem induzierbaren pMEP4-Vektor trotz basaler Transgenexpession die Etablierung stabiler HepG2 Zellen auch für E4wt; allerdings war E4wt nur in ca. 33%, die BCmut Variante dagegen in 80% der Einzelklone im IB nachweisbar (s. Abb. 10B). Daran gemessen scheint die geringere E4wt-Basalexpression vom pMEP4 Vektor immer noch einen gewissen negativen Selektionsdruck auszuüben. Die beiden repräsentativen Einzelklone E4wt #B11 und BCmut #F4 wiesen aber im Vergleich zu naiven HepG2 Zellen kein beeinträchtigtes Zellwachstum auf (s. Abb. 11C), wobei die Anwesenheit inaktivierender Mutationen in E4wt durch Sequenzierung der episomalen Expressionskassette ausgeschlossen wurde (s. Abb. 11E).

Für den avisierten Proteomvergleich zwischen E4wt- und BCmut Zellen war auch eine homogene Synthese der E4orf6 Proteine in möglichst allen Zellen wichtig, was mittels IF- Mikroskopie für die Einzelklone E4wt #B11 und BCmut #F4 bestätigt wurde (s. Abb. 11D). Im direkten Vergleich nach Induktion mit 100 µM Zn2+ zeigte Klon E4wt #B11 in IB und IF allerdings eine stärkere Proteinexpression als Klon BCmut #F4 (s. Abb. 11A, B und D), vermutlich aufgrund einer unterschiedlichen Anzahl Transkriptions-aktiver Episomen. Wie viele Episomen sich nach einer transienten Transfektion persistent etablieren, ist ein multifaktorieller und eher stochastischer Prozess (Leight & Sugden, 2001a), der bei EBV- basierten Vektoren bis zu 30 Episom-Kopien pro Zelle führen kann (Lufino et al., 2008). Für eine höhere Kopienzahl im Zellklon E4wt #B11 spricht auch die im Vergleich aller getesteten Zellklone stärkste Signalintensität des entsprechenden PCR-Amplikons (s. Abb. 11E).

Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die EBV-basierten Plasmide pCEP4 und pMEP4 beide für die Generierung stabiler HepG2 Zelllinien mit robuster Transgen- Expression einsetzbar sind, solange das Genprodukt sich nicht nachteilig auf die Zelle 153 Diskussion auswirkt. Im Fall des E4wt Proteins konnte diese Problematik mittels des Zn2+-induzierbaren pMEP4-Vektors gelöst und erfolgreich klonale HepG2 Zelllinien mit regulierbaren E4wt- bzw. BCmut-Expression generiert werden. Als Variable verblieb dabei das etwas unterschiedliche maximal erreichbare E4wt- vs. BCmut-Expressionsniveau in den ausgewählten Zellklonen. Um auch dieses potenzielle Problem zu minimieren, wurde alternativ die spezifische Integration von TetON Expressionskassetten für die hAdV5 Proteine in die AAVS1 Region auf dem humanen Chr. 19 durchgeführt.

4.1.3. CRISPR/Cas9 gerichtete Transgenintegration in den AAVS1 Lokus Die Integration von Transgenen in das zelluläre Chromosom verursacht häufig eine Disruption zelleigener Gene durch Insertionsmutagenese. Auch die "zufällige" Integration, beispielsweise von Lentiviren, erfolgt oft bevorzugt in transkriptionsaktive Regionen und verändert den Zielzell-Stoffwechsel bis hin zur Transformation (Chen et al., 2020). Auch AAVs integrieren gelegentlich, dann vorzugsweise in den sog. AAVS1 Lokus auf dem humanen Chr. 19. Obwohl dies mit der Expression von PPP1R12C interferiert, resultieren daraus keine distinkten Phänotypen, zudem gilt die Region als transkriptionell aktiv; hieraus leitet sich ihre Eignung als "safe harbour" für die Integration von Fremdsequenzen ab (Sadelain et al., 2011).

Die ineffiziente ortsgerichtete Integration über HR kann durch das Einführen eines DSB am Zielort gesteigert werden, wofür sich das CRISPR/Cas System mit einer AAVS1-Lokus spezifischen gRNA anbietet. Hier wurde das "AAVS1 Safe Harbor Targeting System" der Fa. System Biosciences (Palo Alto, USA) eingesetzt, wobei SpCas9 Enzym und AAVS1 sgRNA auf einem Plasmid kodiert sind, die zu integrierende DNA auf einem zweiten Plasmid ("AAVS1 DV"). Die gewünschte Kassette wird dabei beidseitig von 700-800 bp langen Sequenzen flankiert, die homolog zur chromosomalen DNA stromauf und stromab des AAVS1-DSB sind und als Reparaturvorlage für die HR dienen (s. Abschnitt 3.1.2). Die Methode findet inzwischen vielfach Anwendung bei der Generierung von Zelllinien, vor allem in Stammzellen (Oceguera-Yanez et al., 2016) (Yang et al., 2019) (Patterson et al., 2020) (Sun et al., 2020), Erfahrungen mit HepG2 Zellen lagen aber noch nicht vor. Für eine strikt regulierbare Expression wurde der kommerzielle, auch anderweitig eingesetzte AAVS1 DV (s. Abschnitt 3.4.1) für SpCas9 so modifiziert, dass die ORFs für E4wt bzw. BCmut unter Kontrolle des TRE3G Promotors stehen und zusätzlich vom selben Integrat der rtTA mittels eines 2A-Peptides gemeinsam mit der Puromycin-Resistenz exprimiert wird (s. Abb. 12); bei korrekter Integration erfolgt die Transkription der entsprechenden mRNA vom authentischen

154 Diskussion

PPP1R12C Promoter. Der rtTA würde zwar konstitutiv exprimiert, könnte aber seine Transaktivierungs-Aktivität nur in Anwesenheit von Tet oder Dox ausüben und sollte in dieser TetON Anordnung eine strikte Regulation der potenziell toxischen E4wt Expression ermöglichen; dies wurde in transient transfizierten Zellen bestätigt, auch mittels eines analogen eGFP-DV (s. Abb. 13A und B). Insgesamt war die Transgenexpression aber deutlich schwächer als von den episomalen Vektoren, zudem konnten nach Puromycin- Selektion jeweils nur wenige Transgen-exprimierende Einzelklone erhalten werden. Zum einen beruht dies wahrscheinlich auf der geringen Transfektionseffizienz der HepG2 Zellen, da nur in erfolgreich mit dem Cas9-Expressions-Vektor kotransfizierten Zellen ein AAVS1- spezifischer DSB und die nachfolgende HR-vermittelte Integration auftreten kann. Für eine limitierende Rolle AAVS1-spezifischer DSB spricht auch das Fehlen von Indels in der Zielsequenz, die alternativ zur HR durch NHEJ entstehen sollten (s. Abb. 16D). Zudem führt auch die korrekte Integration nur zu einer oder maximal zwei Kopien der Expressionskassette pro Zelle, während die pMEP4 Vektor-abgeleiteten Zellklone vermutlich mehrere Kopien des jeweiligen Episoms enthielten. Unabhängig davon konnte zumindest für einige der selektionierten Zellklone, z.B. E4wt #4 und #5 sowie BCmut #4 und 5, eine korrekte Integration mittels genomischer PCR nachgewiesen werden (s. Abb. 16B-C).

Insgesamt belegten diese Versuche die grundsätzliche Eignung der CRISPR/Cas-vermittelten ortspezifischen Integration auch komplexer Konstrukte in den AAVS1 Lokus von HepG2 Zellen, was auch zur Generierung SpCas9 exprimierender DHBV-Reporterzelllinien genutzt wurde (s. Abschnitt 3.4.1). Andererseits war die Etablierung der korrekten Zellklone sehr ineffizient und mit hohem Aufwand verbunden. Zudem erwies sich das vergleichsweise geringe Transgen-Expressionsniveau in Folgeexperimenten als unzureichend.

4.2. In der pMEP4 HepG2 Zelllinie #B11 exprimiertes E4wt hat vergleichbare Eigenschaften wie authentisches hAdV5 E4orf6 Protein

Zum Nachweis der Funktionalität des in den pMEP4_HepG2 Zellklonen exprimierten E4wt wurde die Fähigkeit der Zellen untersucht, die Infektion mit einem E4wt-defizienten hAdV5 zu komplementieren. Bei der wt hAdV5 Infektion assoziiert das virale E4wt mit zellulären Faktoren zu einer Cul5-abhängigen E3-Ubiquitin Ligase (s. Abb. 5), die mit E1B55k als Substratrezeptor zur proteasomalen Degradation von Zielproteinen wie p53 und Mre11 führt (Querido et al., 2001) (Stracker et al., 2002) (Woo & Berk, 2007). E4wt und E1B55k ersetzen dabei zelluläre Substratrezeptoren, meist SOCS-Box (suppressor of cytokine signalling) Proteine (Kamura et al., 1998), die mit Cul5 als Plattform (scaffold) und mittels ihrer BC- 155 Diskussion

Boxen mit Elongin B und C interagieren (s. Abb. 5). E4orf6 besitzt drei solcher BC Boxen, von denen zwei für die Elongin-Interaktionen essentiell sind (Cheng et al., 2007); in der BCmut Variante führen Mutationen in beiden Boxen zum Verlust der Elongin-Bindung und damit auch der Mre11 sowie p53 Degradation (Blanchette et al., 2004).

Demgemäß verhielten sich auch das in den pMEP4_HepG2 Zellen exprimierte E4wt Protein und die BCmut Variante. Wie durch Ko-IP gezeigt, unterstützte die E4wt #B11 Zelllinie unabhängig von weiteren hAdV5 Komponenten die Komplexbildung des E4orf6-Proteins mit Cul5, die BCmut #F4 Zelllinie tat dies nicht (s. Abb. 18A). In der E4wt #B11 Zelllinie führte die Infektion mit dem E4orf6 defizienten hAdVΔE4orf6 Virus zum Verlust der Signale für p53 und Mre11, in der BCmut #F4 kam es stattdessen zur Anreicherung von p53 (s. Abb. 21), wahrscheinlich weil die Proteinvariante die initiale, E1A-abhängige Akkumulation von p53 während der Infektion nicht durch die E4orf6/E1B55k induzierte Degradation kompensiert (Teodoro & Branton, 1997) (Turnell et al., 2000). E1B55k bindet E4wt-unabhängig an p53 (Kao et al., 1990) (Yew et al., 1990). Aufgrund seiner NLS und NES pendelt das virale Protein zwischen Nukleus und Zytoplasma, reichert sich aber spät in der Infektion im Zellkern nahe den viralen Replikationszentren an (Ornelles & Shenk, 1991) (Gonzalez & Flint, 2002). Hierfür ist die BC-Box-unabhängige Interaktion zwischen E1B55k und E4orf6 wichtig, da E4wt neben NLS und NES auch ein nuclear retention signal (NRS) trägt, das den Komplex im Zellkern hält (Orlando & Ornelles, 1999) (Joseph S Orlando & Ornelles, 2002). Die daraus resultierende Sequestrierung von p53 im Zellkern ließ sich in hAdVΔE4orf6 infizierten BCmut #F4 Zellen mittels IF bestätigen (s. Abb. 22). Nach Infektion mit wt hAdV5 verblieb in den BCmut #4 Zellen sogar mehr p53 und Mre11 als in den naiven Kontrollzellen, wahrscheinlich weil das zellkodierte BCmut Protein mit dem viruskodierten E4wt Protein um E1B55k kompetiert und so den Abbau von p53 und Mre11 partiell verhindert (s. Abb. 21); dies wäre auch in Einklang mit den in der IF beobachteten p53- Aggregaten im Zellkern (s. Abb. 22). Zusammengefasst sprechen diese Daten dafür, dass der Defekt der BCmut Variante auf die Elongin-Bindung beschränkt ist.

Eine weitere wichtige Beobachtung im Rahmen dieser Komplementations-Experimente ist die E1B55k-abhängige Neddylierung von Cul5 im E4wt-assoziierten E3-Ubiquitin Ligase- Komplex (s. Abb. 18A-20). Dass es sich bei der Modifikation um Neddylierung handelte, wurde u.a. mittels des Inhibitors MLN4924 nachgewiesen (s. Abb. 19), der die ähnlich der Ubiquitylierung über eine Enzymkaskade aus E1 (Heterodimer aus NAE1 und UBA3), E2 (UBE2M, UNE2F) und E3 (Rbx1, Rbx2) sowie zusätzlich einem „co-E3“ (DCN1)

156 Diskussion verlaufende Neddylierung blockiert. Wie oben gezeigt, assoziiert E4wt auch in Abwesenheit anderer hAdV5 Faktoren mit Cul5, eine verstärkte Nedd8-Modifikation war aber nur in hAdV5 infizierten Zellen zu beobachten (s. Abb. 18A). Da die Kotransfektion eines E1B55k Expressionsvektors in der E4wt #B11 Zelllinie, nicht aber in den BCmut #4 Zellen den gleichen Phänotyp erzeugte (s. Abb. 20), ist hiermit erstmals gezeigt, dass E4wt plus E1B55k für die verstärkte Neddylierung des Cul5 Komplexes hinreichend und notwendig sind. Dies steht nur scheinbar in Widerspruch zu einer neuen Studie, in der dem E4wt Protein alleine eine Verstärkung der Cul5-Neddylierung und als Folge ein erhöhter Abbau von p53 zugesprochen wurde (Haoran Guo et al., 2019). Diese Versuche wurden in HEK293T Zellen durchgeführt, die bekanntermaßen ohnehin E1B55k exprimieren (Graham et al., 1977), was von den Autoren nicht diskutiert wird. Die angeblich E4wt-abhängige Degradation von p53 beruht daher höchstwahrscheinlich auf dem klassischen "E4wt+E1B55k" Mechanismus.

Insgesamt belegten diese Daten, dass das in den pMEP4_E4wt Zellen produzierte E4orf6 Protein in allen getesteten Aspekten dem authentischen hAdV5 E4orf6 Protein entspricht, soweit diese auch E1B55k involvieren (s. Abb. 64A). Andererseits gab es ohne E1B55k keine verstärkte Cul5-Neddylierung, die ihrerseits als notwendig für die E3-Ubiquitinligase- Aktivität angesehen wird (Zhang and Sun 2020). Demnach sollte die für E4wt alleine beobachtete Interferenz mit DHBV Replikation und cccDNA Bildung nicht über denselben E3-Ligase Mechanismus ablaufen. Allerdings lag in allen getesteten Zellen ein gewisser Anteil des Cul5 bereits neddyliert vor (s. Abb. 20), in Einklang mit der Beteiligung von Cul5 E3-Ubiquitinligasen an vielfältigen zellulären Prozessen. Daher könnte E4wt auch ohne die E1B55k-vermittelte Verstärkung der Neddylierung diesen Pool aktiver Komplexe umfunktionieren (s. Abb. 64A). Auch könnte ein DHBV-eigenes Genprodukt die Aktivität des Cul5-E4wt Komplexes beeinflussen (s. Abb. 64B); gemäß der Interferenzdaten wäre dies für DHBV dann allerdings kontraproduktiv. Unabhängig von der Kenntnis des Mechanisms zeigte der nachfolgende MS-Vergleich (s. Abb. 32, Abschnitt 4.4 und 4.5) deutlich einen differenziellen Einfluss von E4wt vs. BCmut auf das Proteom der jeweiligen pMEP4 Zelllinie.

Eine analoge Evaluierung der durch Integration in den AAVS1 Lokus erhaltenen E4wt und BCmut Zelllinien erlaubte keine weitergehenden Aussagen, vor allem wegen des sehr geringen Expressionsniveaus, das auch massenspektrometrisch bestätigt wurde (s. Abb. 31).

157 Diskussion

Abb. 64 Vergleichbare Funktionalität von hAdV5- und pMEP4-kodiertem E4wt Protein. (A) Bekannte E4wt Aktivitäten in der hAdV5-Infektion (links) und untersuchte Aktivitäten in der HepG2 pMEP4_E4wt Zelllinie (rechts). Die hAdV5-Infektion führt zu verstärkter Cul5-Neddylierung und E1B55k- abhängig zur Degradation von Mre11, p53, LigIV, DAXX und BLM (Querido et al., 2001) (Stracker et al., 2002) (Orazio et al., 2011) (Schreiner et al. 2012). Die bisher einzig beschriebene E1B55k-unabhängige E4wt Aktivität ist die Inhibition von PP2A, die eine verstärkte Phosphorylierung von DDR-Markern wie γH2AX und DNA-PK induziert (Hart et al. 2005) (Hart, Ornelles, and Koumenis 2007). In pMEP4_E4orf6 #B11 Zellen führt E1B55k ebenfalls zu verstärkter Cul5-Neddylierung und konform der hAdV5-Infektion zur Degradation von Mre11 und p53. Ohne E1B55k bleiben verstärkte Neddylierung und der Abbau bekannter Zielproteine aus, dennoch wird die DHBV-Expression inhibiert (s. Abschnitt 4.3). Arbeitshypothese hierfür ist die Degradation mindestens eines unbekannten Zellfaktors. Der MS-Proteom-Vergleich identifizierte >100 in pMEP4_E4wt vs. _BCmut Zellen differenziell exprimierte Proteine. KD-Experimente der hieraus abgeleiteten Top-Kandidaten führten für ANP32A, RPA1, TAGLN2 und HSP27 zu verminderter DHBV-Expression (s. Abschnitt 4.7.2). (B) Nicht ausgeschlossen ist, dass DHBV-Komponenten im Komplex mit E4wt in der pMEP4_E4wt #B11 Zelllinie zu einer Cul5-Nedd8 E3-Ligase abhängigen Degradation Virus-relevanter Zellfaktoren beitragen.

4.3. Die DHBV-Replikation in der HepG2-Zelllinie pMEP4_E4wt #B11 ist signifikant reduziert

Die ursprüngliche Evidenz für eine Interferenz von hAdV5 E4wt mit DHBV-Replikation und cccDNA-Bildung stammt aus DHBV- plus E4orf6-Vektor kotransfizierten HepG2 Zellen. Zum Nachweis eines vergleichbaren Einflusses der zellkodierten E4orf6 Proteine wurden die pMEP4- und AAVS1-Zelllinien für E4wt und BCmut mit demselben Umhüllungs-defekten DHBV-Expressionsvektor transfiziert. Grundsätzlich ließ sich in allen Zelllinien die Bildung Virus-DNA-haltiger Kapside und der typischen replikativen DNA-Intermediate beobachten (s. Abb. 23A, Abb. 24 und Abb. 29A-C). Allerdings enthielt die E4wt #B11 Zelllinie nur etwa 50% der Kapsid- und Kapsid-DNA-Menge der BCmut #F4 Kontroll-Zelllinie (s. Abb. 23A). Diese E4wt-abhängige Reduktion trat in An- und Abwesenheit von Zn2+ auf, das zur verstärkten E4wt- bzw. BCmut-Expression von den MT-Promotor-kontrollierten pMEP4- 158 Diskussion

Vektoren eingesetzt wurde, andererseits aber auch zu einer Steigerung der DHBV Protein- und DNA-Signale führte (s. Abb. 23). Das deutet darauf hin, dass bereits das basale (ohne Zn2+) E4wt-Expressionsniveau der E4wt #B11 Zelllinie für eine moderate Unterdrückung der DHBV-Expression ausreicht. Wie Zn2+ die (D)HBV-Replikation stimulieren könnte, ist nicht bekannt. Etwa 10% aller humanen Proteine binden Zn2+ als Kofaktor, wodurch Struktur und/oder enzymatische Aktivität reguliert werden (Padjasek et al., 2020). Zn2+-bindende Motive beeinflussen auch die DNA-Bindefähigkeit und finden sich daher in gehäuft in Transkriptionsfaktoren (Andreini et al., 2006); auch der für die DNA-Reparatur wichtige hexamere MRN-Komplex aus je zwei Mre11, NBS1 und RAD50-Untereinheiten wird durch Zn2+-Bindemotive in RAD50 zusammengehalten (Kochanczyk et al., 2016). Andererseits wirkt Zn2+ möglicherweise auch direkt auf DHBV-Komponenten ein, was aber nicht weiter untersucht werden konnte. Wichtig bleibt für die Interpretation der mit den pMEP4-Zelllinien erhaltenen Daten, dass trotz der DHBV-stimulierenden Wirkung von Zn2+ E4wt eine signifikant stärker inhibitorische Wirkung besaß als die BCmut Variante.

Dies gilt auch für die nukleären Virus-DNA-Signale, wobei hier Zn2+ die Kern-Akkumulation von rcDNA plus cccDNA in Summe eher behinderte, das Verhältnis cccDNA zu rcDNA dagegen eher begünstigte (s. Abb. 27); insbesondere ließ sich in der E4wt Linie #B11 ohne Zn2+-Zugabe rcDNA, aber kein cccDNA Signal detektieren. Auch hier kann derzeit über Mechanismen nur spekuliert werden, der unabhängige HA-ELISA als Surrogatmarker für cccDNA bestätigte aber erneut die stärkere Inhibition durch E4wt als durch die BCmut Variante (s. Abb. 28). Die Anwesenheit der intakten B/C-Box-Motive im E4wt Protein scheint daher entscheidend für diese Interferenz zu sein. Trotz des Fehlens einer verstärkten Cul5-Neddylierung in Abwesenheit von E1B55k (s. oben) spricht dies grundsätzlich für die Beteiligung einer Cul5 E3-Ubiquitinligase Aktivität, welche die Abundanz eines oder mehrerer zellulärer Faktoren beeinflusst. Dies wurde im nachfolgenden MS-Proteomvergleich der E4wt vs. BCmut exprimierenden pMEP4 Zellklone experimentell bestätigt.

4.4. Der MS-Proteomvergleich zwischen den Zelllinien E4wt #B11 und BCmut #F4 gibt Aufschluss über eine Vielzahl unterschiedlich abundanter zellulärer Proteine

MS plus Bioinformatik können inzwischen durch "label-free quantification" (LFQ; d.h. ohne isotopenmarkierte Referenz) einen breiten Überblick über quantitative Proteom- Veränderungen unter veränderten Bedingungen geben (Aebersold & Mann, 2016), z.B. durch

159 Diskussion

Infektion mit einem Virus (Scaturro et al., 2018) (Scaturro et al., 2019). Hier wurde die Methodik (in der AG A. Pichlmair, TU München) zur Prüfung der Hypothese eingesetzt, dass das hAdV5 E4orf6 Protein über Bildung einer Cul5-E3-Ubiquitin-Ligase für DHBV relevante Zell-Proteine degradiert. Hierzu wurden die E4wt- bzw. BCmut exprimierenden stabilen pMEP4 und AAVS1-Zelllinien paarweise verglichen; dabei wurden jeweils ca. 6.500 Proteine und damit etwa die Hälfte des prinzipiell MS-detektierbaren Gesamt-Proteoms erfasst.

Ein E4orf6-Peptidvergleich identifizierte eindeutig E4wt- vs. BCmut-Protein in den jeweiligen Zelllinien (s. Abb. 30), die quantitative Auswertung bestätigte die früheren IB- Ergebnisse. In beiden pMEP4-Zelllinien war eine Basal-Expression detektierbar, die für E4wt etwas höher lag als für BCmut; nach Zn2+ Induktion stieg das jeweilige Proteinniveau um 2-3 log2-Stufen (d.h. bis 8-fach), im Einzelfall bis zu 5 oder 6 log2-Stufen (d.h. bis zu 64-fach) an. Dagegen war in den AAVS1-Zelllinien ohne Dox-Induktion keines der beiden Proteine nachzuweisen und nur an Tag 5 nach Induktion und nur für E4wt konnte konsistent in allen vier Proben des Zeitwertes das hAdV5 Protein eindeutig detektiert werden, blieb dabei aber unterhalb des basalen E4wt-Niveaus in der pMEP4 Zelllinie (s. Abb. 31). Diese Daten stützen daher die These, dass das Ausbleiben phänotypischer Konsequenzen in den AAVS1 Zellen hauptsächlich auf die sehr geringe Expression der E4-Proteine zurückgeht; auf eine weitere Auswertung dieser Proteomdaten wurde daher verzichtet.

Für die E4wt- vs. BCmut exprimierenden pMEP4 Zelllinien konnten dagegen weit über 100 zelluläre Proteine mit signifikant unterschiedlicher Abundanz in den E4wt- vs. BCmut- Zellen identifiziert werden (s. Abb. 32). Da der Abbau eines Proteins indirekt die Stabilität anderer Proteine erhöhen kann (Deller et al., 2016) (Garcia-Seisdedos et al., 2019), ist es nicht weiter überraschend, dass in der E4wt Zelllinie auch diverse Proteine abundanter waren als in der BCmut Kontrolle.

Um die Anzahl der Wirtsfaktoren für eine weitergehende Evaluierung einzugrenzen, wurde als Mindestunterschied ein LFQ-Wert von 0.7 log2 (~1,6-fach) in den Proben von Tag 5 nach Induktion zugrunde gelegt, wobei für die meisten dieser Wirtsproteine ein ähnlicher Unterschied auch schon an Tag 1 sichtbar war (s. Abb. 33). Als weiteres, subjektives Kriterium diente ein plausibler potenzieller Bezug des jeweiligen Faktors zu DHBV- Replikation und/oder cccDNA-Bildung; Grundlage hierfür waren Publikationen, die für eine Beteiligung des jeweiligen Faktors am Replikationszyklus von Hepadnaviren, anderen Viren und/oder der DNA-Reparatur sprechen. Hieraus resultierte eine short-list von 12 Kandidaten- Proteinen (s. Abb. 32 und Abb. 33), von denen die in der E4wt #B11 Zelllinie signifikant

160 Diskussion verminderten Faktoren ANP32A, ANP32E, DDX41, HIC2, HSP27, NAMPT, RPA1, RPA2, RPA3, SerpinA3 und TAGLN2 als erste Kandidaten näher auf eine mögliche Relevanz für DHBV untersucht wurden (s. Abschnitt 4.7.2). Etablierte Eigenschaften dieser Wirtsfaktoren werden im nächsten Abschnitt summarisch in alphabetischer Reihenfolge besprochen.

4.5. Bekannte physiologische Rollen ausgewählter Wirtsproteine mit E4wt- abhängig verminderter Abundanz

4.5.1. ANP32A (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A) ANP32A (pp32/LANP) ist ein Phosphoprotein aus der ANP32 (acidic-leucine rich nuclear phosphoprotein) Familie, benannt nach der N-terminalen Leucin-reichen LRR Protein- Protein-Interaktionsdomäne (Jiang et al., 2002). ANP32A hemmt die Serin/Threonin Phosphatase 2A (PP2A); PP2A ist neben PPP1 die abundanteste Protein-Phosphatase eukaryonter Zellen und an zahlreichen Prozessen wie Differenzierung, Apoptose, und MAP- Kinase (mitogen-activated protein)-Kinase- sowie PKC (Proteinkinase C) vermittelter Signal- Transduktion beteiligt (Santa-Coloma, 2003) (Costanzo et al., 2006). ANP32A reguliert auch Kern-Export und Stabilität von mRNAs mit AU-rich elements (AREs/Adenylat-Uridylat- reichen Elementen) (Santa-Coloma, 2003) (Costanzo et al., 2006), die sich hauptsächlich auf mRNAs für kurzlebige regulatorische Proteine wie Proto-Onkogene (z. B. c-fos, c-myc), Transkriptionsfaktoren oder Zytokine finden (Bakheet et al., 2018). Als inhibitory histone acetyltransferase (INHAT) inhibiert ANP32A im Komplex SET/TAF-1β (Santa-Coloma, 2003) die Acetylierung der Histone H2B, H3 und H4 (Saavedra et al., 2017) und beeinflusst so Chromatinstruktur und Transkriptionsaktivität.

Auch für unterschiedliche Viren scheint ANP32A wichtig zu sein. So wird die Aktivität der RNA-abhängigen RNA-Polymerase aviärer Influenzaviren durch direkte Interaktion mit aviärem ANP32A gefördert. Humanes ANP32A dagegen stimuliert nicht die geringe Aktivität der Vogel-Influenzavirus Polymerase in Säugerzellen und trägt so zur Speziesbarriere bei (Long et al., 2016) (Zhang et al., 2019) (Bi et al., 2019) (Park et al., 2020). Für Adenoviren wurde eine Bindung von ANP32A and hAdV5 E4orf6 Protein beschrieben, die über einen Komplex mit dem human antigen R (HuR Protein) einen aktiven Kernexport von ARE-mRNAs vermitteln soll, der ansonsten über den Kernrezeptor CRM1 (chromosomal maintenance 1; alternativer Name Exportin-1) erfolgt (Higashino et al., 2005). Allerdings wurde in einer neueren Arbeit ANP32A als E1B55k-Interaktionspartner identifiziert (Hung & Flint, 2017), die Bindung an E4orf6 könnte daher E1B55k-vermittelt

161 Diskussion sein. Auch das HIV-1 nutzt ANP32A in seinem Replikationszyklus, indem ANP32A (wie auch ANP32B) durch Interaktion mit dem HIV-1 Rev Protein und CRM1 den Kernexport nicht-gespleißter und unvollständig gespleißter viraler mRNA befördert (Wang et al. 2019).

4.5.2. ANP32E (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member E) Wie alle Proteine der ANP32-Familie hemmt auch ANP32E die Aktivität von PP2A (Santa- Coloma, 2003) (Costanzo et al., 2006). Zusätzlich fungiert es als Histon-Chaperon, das spezifisch die Histonvariante H2A.Z von Nukleosomen entfernt. H2A.Z spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Genexpression (Lamaa et al., 2020). In Zellen mit homozygotem ANP32E-KO wurde eine genomweite Umverteilung und Anreicherung von H2A.Z an spezifischen Kernregionen, insbesondere Enhancer und Insulatoren beobachtet (Obri et al., 2014). Daneben ist H2A.Z auch an der DNA-Reparatur beteiligt, indem es über den Ersatz von H2A die Reorganisierung von Nukleosomen an DNA-Bruchstellen gewährleistet (Gursoy-Yuzugullu et al., 2015). Die ANP32E vermittelte Entfernung von H2A.Z führt zur lokalen Lockerung des Chromatins und erleichtert so den Zugang von Reparaturfaktoren. In Abwesenheit von ANP32E wurde an Strangbrüchen auch eine Akkumulation von ssDNA- Bereichen beobachtet, die über den alternativen-NHEJ-Mechanismus (s. Einleitung 1.7.2) repariert werden (Gursoy-Yuzugullu et al., 2015).

Insbesondere machte die im MS-Proteomvergleich zu allen Zeitpunkten signifikant geringere Abundanz von ANP32E (LFQ d0: -2,7; d1: -2,7; d5: -3,2) in der E4wt- vs. der BCmut- Zelllinie (s. Abb. 32 und Abb. 33) das Histon-Chaperon zu einem attraktiven Kandidaten für die Validierung als potenziell DHBV-relevanter Wirtsfaktor.

4.5.3. DDX41 (Probable ATP-dependent RNA helicase) DDX41 gehört zur Familie der DEAD-Box RNA Helikasen und kann damit an nahezu allen RNA-involvierenden Prozessen beteiligt sein (Polprasert et al., 2015) (Jiang et al., 2017). Darüber hinaus kann DDX41 als cytosolischer DNA-Sensor wirken, der über den STING (Stimulator of interferon genes) Signalweg zur Aktivierung einer Typ I IFN-Antwort führt (Briard et al., 2020), u.a. bei Virus-Infektion mit Herpes Simplex Typ I (HSV-I) und Adenovirus (Zhang et al., 2011). HSV-I verfügt über einen RNAi-basierten anti-DDX41 Mechanismus (Duan et al., 2019). Die im MS-Proteomvergleich deutlich reduzierte DDX41 Abundanz in der E4wt Zelllinie wäre in Einklang damit, dass auch hAdV5 über E4orf6 den antiviralen DDX41/STING-Mechanismus unterdrücken kann. Studien an Retroviren zeigen, dass DDX41 primär frühe DNA/RNA-Zwischenprodukte während der reversen Transkription erkennt (Stavrou et al., 2018). Die DDX41/STING induzierte IFN-Antwort induziert dann 162 Diskussion u.a. die Expression von APOBEC3 (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3) (Stavrou et al., 2015), welches über seine Cytidin-Deaminase Aktivität zu Hypermutationen im viralen Genom führt. Eine ähnliche Wirkung von APOBEC3 ist auch gegen HBV beschrieben (Lucifora et al., 2014) (Gao et al., 2017); somit war auch DDX41 ein attraktiver Kandidat zur weiteren Validierung auf DHBV-relevante Funktionen.

4.5.4. HIC2 (Hypermethylated in Cancer 2) HIC2 ist ein zu HIC1 homologer Transkriptionssuppressor, der in vielen Tumoren epigenetisch stillgelegt ist (Deltour et al., 2001). Wie HIC1 wird auch HIC2 eine Rolle bei der Regulation des Zellwachstums sowie bei genotoxischem Stress zugesprochen (Rood & Leprince, 2013). Dennoch scheinen beide Proteine unterschiedliche Funktionen auszuüben. So reprimiert HIC1 die Transkription von SIRT1 (Sirtuin 1) als Antwort auf exzessive dsDNA-Brüche im Verlauf der DNA-Reparatur, was eine p53-abhängigen Apoptose induziert (Paget et al., 2017); HIC2 dagegen aktiviert die Transkription von SIRT1 (Song et al., 2019). SIRT1 gehört zur Familie der NAD+ abhängigen Histon-Deacetylasen (HDACs), kann aber auch Nichthiston-Proteine wie p53 modifizieren (Stunkel & Campbell, 2011). SIRT1 wird auch als Transkriptions-Aktivator für HBV diskutiert, wobei es zelluläre Transkriptionsfaktoren wie AP-1 HBx-abhängig zur cccDNA rekrutieren soll (Li et al., 2016) (Deng et al., 2017). DHBV kodiert zwar kein HBx-Protein, dies schließt aber nicht aus, dass auch für DHBV SIRT1-abhängige Vorgänge die Replikation beeinflussen. Das signifikant geringere HIC2-Level in E4wt exprimierenden Zellen könnte demzufolge indirekt die DHBV-Synthese beeinträchtigen.

4.5.5. HSP27 (Heat shock protein 27/ heat shock protein beta-1 (HSPB1)) HSP27 ist ein multifunktionales Protein aus der Familie der kleinen (small) heat shock Proteine (sHsp). Seine Hauptfunktion ist die Aufrechterhaltung der Zellintegrität unter Stressbedingungen wie UV-Licht, Nährstoffmangel oder viraler Infektion (Choi et al., 2019). Durch Bindung an misgefaltete Proteine verhindert das selbst ATP-unabhängige Chaperon deren Aggregatbildung, indem es sie zwecks Rückfaltung zu ATP-abhängigen Chaperonen wie HSP70 und HSP40 rekrutiert oder dem proteasomalen Abbau zuführt (Behdarvandy et al., 2020). Daneben ist Hsp27 in zahlreiche zelluläre Prozesse involviert, z.B. die Inhibition der Apoptose (Charette et al., 2000) (Concannon et al., 2003), Zellzyklus-Kontrolle (Venkatakrishnan et al., 2008), alternatives mRNA splicing (Sun et al., 2010) (Katsogiannou et al., 2014), Translationsregulation (Doerwald et al., 2006) und Organisation des Zytoskeletts (Mounier & Arrigo, 2002). Zum Teil erfolgt dies durch Induktion der NFκB Signalkaskade

163 Diskussion

(Zhang et al., 2020), wobei HSP27 primäre Komponenten der Signalkette durch Bindung stabilisiert. Ein spezifischer Bezug zur DNA-Reparatur ergibt sich aus der Bindung von HSP27 an Ku80, ein Sensorprotein des NHEJ. Die Interaktion mit HSP27 verhindert die Bindung von Ku80 an DNA-Bruchstellen und hat so einen negativen Effekt auf die DNA- Reparatur (Katsogiannou et al., 2014). Auch für einige Viren scheint HSP27 von Bedeutung zu sein. Für HSV-1 und Enteroviren geht der Verlust von HSP27 mit verminderter Virusproduktion bzw. Replikation einher (Mathew et al. 2009) (Dan et al., 2019). Andererseits wurde für die stabil HBV-exprimierende Zelllinie HepG2.2.15 ein im Vergleich zu HepG2 Zellen erhöhtes Level an HSP27 berichtet, das über die Induktion einer IFN- Antwort eher mit der viralen Replikation interferiert (Tong et al., 2013). Auch HSP27 war folglich ein interessanter Kandidat, um es auf eine aktivierende oder inhibierende Rolle für die DHBV-Replikation zu untersuchen

4.5.6. NAMPT (Nikotinamid Phosphoribosyl-Transferase) NAMPT (auch Visfatin oder pre-B-cell colony-enhancing factor 1 /PBEF1) ist ein pleiotrop agierendes Protein, das als Enzym, Zytokin und Wachstumsfaktor wirken kann (Dalamaga et al., 2018). Intrazellulär spielt es eine wichtige Rolle für die Energiegewinnung als Schlüsselenzym des Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) -Rückgewinnungsprozesses (Salvage-Pathways). Es katalysiert die Bildung von Nicotinamid Mononucleotid (NMN) aus Nicotinamid (NAM), das im weiteren Schritt wieder zu NAD+ umgewandelt wird (Revollo et al., 2007). Neben seiner Rolle im Energiemetabolismus (Estoppey et al., 2017), ist NAD+ als Kofaktor (zB. von SIRT1 s. o.) an diversen Prozessen inklusive Transkription und DNA- Reparatur beteiligt (Dalamaga et al., 2018) und könnte somit indirekt die DHBV Replikation und/oder cccDNA-Bildung beeinflussen.

4.5.7. RPA (Replication Protein A) und seine Untereinheiten RPA1, RPA2 und RPA3 Der trimere RPA Komplex mit den Untereinheiten RPA1, RPA2 und RPA3 ist das dominante ssDNA-Bindeprotein eukaryonter Zellen und an der Prozessierung nahezu aller ssDNA- Intermediate beteiligt (Krasikova et al., 2016). Bei der DNA-Replikation unterdrückt RPA Sekundärstrukturen und unterstützt die Rekrutierung von DNA-Polymerasen bei der lagging- Strang-Synthese (Bae et al., 2001) (Nguyen et al., 2017). Bei der DNA-Reparatur durch NER, BER, MMR und HR (s. Abschnitt 1.7) schützt RPA ssDNA-Bereiche vor Degradation und unterstützt die DNA-Reparatur durch Interaktion mit weiteren Proteinen (Deng et al., 2014) (Liu & Huang, 2016). RPA ist folglich essentiell für die Aufrechterhaltung genomischer 164 Diskussion

Stabilität. Die Bindung von RPA an ssDNA erfolgt über DNA-Bindungs-Domänen (DBD), welche mit jeweils 4-6 nt interagieren. RPA1 besitzt vier DBDs (A, B, C und F), wobei DBD- F primär als Rekrutierungsdomäne für andere Proteine angesehen wird (Chen & Wold, 2014). RPA2 verfügt über die DBD-D, eine C-terminale Protein-Interaktionsdomäne sowie eine N- terminale unstrukturierte Phosphorylierungsdomäne. Die DBD-E in RPA3 wird für die stabile Komplexbildung der drei Untereinheiten benötigt. Die DBDs können aufgrund von flexiblen Linkersequenzen unabhängig voneinander mit ssDNA-Bereichen interagieren (Chen & Wold, 2014), so dass der RPA Komplex unterschiedlich lange ssDNA-Bereiche binden und unterschiedliche Konformationen einnehmen kann. Wie die Bindung von RPA unterschiedliche Signalwege (DNA-Reparatur, Replikation oder Rekombination) einleitet, ist weitgehend unverstanden. Neben Konformationsänderungen könnten auch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und SUMOylierung eine Rolle spielen. Beispielsweise wird RPA in Folge eines DNA-Schadens von einer der drei checkpoint-Kinasen ATR, ATM oder DNA-PK phosphoryliert, wodurch seine Interaktionsfähigkeit mit DNA und Proteinen moduliert wird (Maréchal & Zou, 2015). Da hepadnavirale rcDNA typischerweise ssDNA- Bereiche enthält, erscheint eine Interaktion mit RPA plausibel; diese könnte insbesondere der rc- zu cccDNA Konversion eine Rolle spielen. Unterstützt wird eine solche Annahme durch die signifikant reduzierte Abundanz aller drei RPA-Untereinheiten in den E4wt- exprimierenden Zellen (s. Abb. 32 und Abb. 33).

4.5.8. SerpinA3 (alternativer Name: alpha-1-Antichymotrypsin/ α-1ACT) SerpinA3 ist ein Glykoprotein aus der Serin-Protease-Inhibitor (Serpin)-Familie. Als α-1ACT inhibiert es diverse Proteasen, insbesondere das Cathepsin G, das als Folge einer Pathogenabwehr von neutrophilen Granulozyten freigesetzt wird. Als „Akute-Phase Protein“ wird es in der Leber stark exprimiert und bei Entzündung verstärkt sekretiert (Baker et al., 2007). SerpinA3 wird aber auch im Nukleus detektiert, wo es als einziges Serpin über Lysin- Wiederholungsmotive an DNA binden kann (Naidoo et al., 1995); die biologische Relevanz dieser Bindung ist aber unklar. U.a. in Hepatomzelllinien (HepG2 und Huh7) führt SerpinA3 zu verstärkter Zellproliferation (Sun et al. 2002) (Santamaria et al., 2013), wahrscheinlich durch die Regulation des G2/M checkpoints (Yang et al., 2014). Auch induziert SerpinA3 die Expression von zellulären Transkriptionsfaktoren wie PPARγ (peroxisome proliferator- activated receptor-γ) und NFκB (Sun et al. 2002). Auch SerpinA3 war in E4wt vs. BCmut exprimierenden Zellen zu allen Zeitpunkten signifikant reduziert (LFQ d0: -4; d1: -2,4; d5: -

165 Diskussion

2,4; s. Abb. 33). Auch ohne Vorstellung eines konkreten Wirkmechanismus war daher SerpinA3 ein interessanter Kandidat für die Evaluierung auf eine mögliche DHBV-Relevanz.

4.5.9. TAGLN2 (Transgelin-2) TAGLN2 ist ein Aktin-Bindeproteinen. Es moduliert die Aktin-Polymerisation und ist an Aktin-abhängigen Signalkaskaden beteiligt (Na et al., 2015) (Jo et al., 2018) (Yin et al., 2019). Die Dimerisierung von TAGLN2 hilft Aktin-Filamente in "Bündel" (bundles) zu vereinigen. Gleichzeitig inhibiert die TAGLN2-Bindung den Zugang anderer Aktin- Bindeproteine und verhindert u.a. die Cofilin-abhängige Depolymerisation und die Arp2/3 (actin-related protein 2/3)-abhängige Aktin-Nukleation (Kim et al., 2018). Über seine Bindung an Ezrin, einen Schlüsselregulator der Aktin-assoziierten Weiterleitung von Signalen an der Zelloberfläche, moduliert TAGLN2 Signaltransduktionskaskaden (Kim et al., 2018) (Yin et al., 2019). Für HIV-I wurde gezeigt, dass Aktin-Bindeproteine wie TAGLN2 bei frühen Schritten der viralen Replikation eine Rolle spielen (Konig et al., 2008). Dabei induziert das virale Protein Vpr eine Hochregulierung von TAGLN2 (Barrero et al., 2013). Auch für HBV ist eine Rolle von TAGLN2 beschrieben; durch ektopische TAGLN2- Expression wurden virale Transkription und Replikation verstärkt, durch TAGLN2- Herabregulation geschwächt (Yu et al., 2016). Damit könnte TAGLN2 auch für DHBV einen wichtigen Wirtsfaktor darstellen, dessen reduzierte Abundanz in den E4wt-exprimierenden pMEP4 Zellen die DHBV-Replikation beeinträchtigt.

Zusammengefasst bildeten die oben beschriebenen, in Anwesenheit von hAdV5 E4wt Protein in ihrer Abundanz verminderten Zellproteine eine erste Kandidaten-Liste für die weitere Evaluierung ihrer möglichen Bedeutung für DHBV und, jenseits dieser Arbeit, auch für Adenovirus. Hierzu sollten die jeweiligen Wirtsproteine jeweils einzeln durch RNAi in ihrer Menge pro Zelle reduziert (KD) oder, falls möglich, durch Genom-Editierung mittels CRISPR/Cas System (KO) komplett ausgeschaltet werden.

4.6. Die Reporterzelllinie DHBV-HA_Cas9 ermöglicht eine cccDNA- abhängige Validierung von Wirtsfaktoren auf Relevanz für die hepadnavirale Replikation

Grundvoraussetzung für die Genom-Editierung mittels CRISPR/Cas ist die intrazelluläre Anwesenheit einer Cas-Nuklease und einer passenden (s)gRNA. Hierfür sind inzwischen mehrere Technologien im Einsatz, einschließlich der Transfektion von DNA- Expressionsvektoren für Nuklease plus gRNA, Transfektion von Nuklease mRNA plus gRNA 166 Diskussion oder Transfektion vorgeformter RNP-Komplexe aus rekombinanter Nuklease plus gRNA. Hier erschien es für ein mögliches KO-screening diverser Wirtsfaktoren vorteilhaft immer auf dasselbe Zellsystem zurückgreifen zu können und nur die gRNA an den jeweiligen Wirtsfaktor zu adaptieren. Daher wurde analog den oben beschriebenen AAVS1-E4orf6 Zellen eine SpCas9 Expressionskassette spezifisch in den AAVS1 Lokus der DHA2/3 Zelllinie integriert. Die HepG2-basierte TetOFF Zelllinie trägt stabil tTA2 (Sun and Nassal 2006) und ein Hüllprotein-defizientes DHBV-Genom, dessen pgRNA Transkription unter Kontrolle eines TRE-Promotors steht. Die Blockade der Nukleokapsid-Umhüllung verstärkt den intrazellulären cccDNA Amplifikationsweg, bis hin zu mehreren hundert cccDNA Kopien pro Zelle (Summers et al. 1990) (Guo et al. 2007) (Köck et al. 2010); dies ermöglicht den sicheren Nachweis von cccDNA neben anderen Virus-DNA Formen mittels SB (Nassal, 2015) (Li et al. 2017). Durch eine in die preC-Region integrierte Hämagglutinin- (HA-) tag Sequenz kann ein HA-tag modifiziertes eAg (HA-eAg) sekretiert werden, allerdings exklusiv von einer separaten precore-mRNA, die nur von cccDNA transkribiert werden kann. Sekretiertes HAeAg ist somit ein Surrogatmarker für cccDNA (s. Abb. 26) (Schreiner & Nassal, 2017). In einem typischen Experiment wird durch Dox-Entzug das TetOFF System induziert, der tTA2 aktiviert den TRE-Promotor des DHBV Integrats und pgRNA wird transkribiert. Wie authentische pgRNA dient auch die modifizierte pgRNA zunächst als Translationsmatrize für Core-Protein und Polymerase und wird dann im Komplex mit Polymerase in neue Kapside verpackt; dort erfolgt die reverse Transkription zu rcDNA, die dann im Zellkern in cccDNA konvertiert wird; diese kann nunmehr selbst als Transkriptionsmatrize dienen, u.a. für die HA-tag modifizierte precore-RNA. Die Depletion DHBV-relevanter Wirtsfaktoren unterbricht diesen Zyklus, erkennbar an verminderter HAeAg Sekretion. Über die Charakterisierung weiterer viraler Genprodukte kann dann auch der für potenzielle Inhibition verantwortliche Schritt identifiziert werden. Der gesamte Prozess nimmt mehrere Tage in Anspruch, wobei der Zeitrahmen vom experimentellen Maßstab abhängt; im 6-well Format lässt sich cccDNA ab Tag 6 bis 8 nach Dox-Entzug im SB detektieren. Für die Wirtsfaktor-Depletion mittels RNAi-KD durch shRNA ist bereits die parentale TetOFF DHA2/3 Linie geeignet, in der neu generierten DHA_Cas9 Zelllinie kann via Einbringen einer entsprechenden (s)gRNA grundsätzlich auch ein KO induziert werden. Tatsächlich belegte ein neu etablierter FL-basierter Transfektions-Assay die enzymatische Aktivität des zellkodierten Cas9 Enzyms. Hierzu wurde auf einem Reporter-Plasmid eine sgRNA-Zielsequenz so in den ORF für GFP integriert, dass erst mittels Cas9/sgRNA- vermitteltem Editieren via Indel-Bildung in einem Teil der Plasmide ein durchgängiges GFP-

167 Diskussion

Leseraster entsteht (s. Abb. 38). Ein auf demselben Plasmid kodiertes mCherry Protein erlaubt die Detektion aller transfizierten Zellen, der Anteil entstehender GFP-positiver Zellen ist ein Maß für die Anwesenheit von aktiver Cas9 Nuklease plus der auf die Zielsequenz passenden gRNA in derselben Zelle. Der Assay diente auch zur Generierung einer klonalen Linie mit aktivem Cas9, DHA_Cas9 #3-S, durch präparatives FACS-sorten auf GFP-positive Zellen (s. Abb. 41).

Zudem konnte durch Nucleofection einer bekannt effizienten gRNA aus FL-markierter tracrRNA plus HPRT1-spezifischer crRNA die grundsätzliche Eignung der DHA_Cas9 Zelllinie für das Editieren mittels synthetischer RNA demonstriert werden, wobei die durchflusszytometrische Unterscheidung zwischen tatsächlich aufgenommener und nur an den Zellen haftender tracrRNA schwierig blieb. Trotzdem gelang mit T7E1 Heteroduplex- Analyse bzw. mittels Sequenzierung Gen-spezifischer Amplifikate der gDNA der Nachweis eines Editing an der erwarteten Position des HPRT1-Gens (s. Abb. 45). Der laut Sequenzierung markant höhere Anteil editierter Zellen im Vergleich zum T7E1-Assay geht wahrscheinlich darauf zurück, dass das Haupteditier-Ereignis der Verlust eines einzigen nt war (s. Abb. 45B); entsprechende Heteroduplexe werden von der T7E1 Nuklease nicht erkannt. Ob bzw. zu welchem Anteil unter den ca. 30% editierten Genomen auch bi- bzw. all- allelische KOs waren (erforderlich für einen Komplett-KO des Ziel-Faktors), hätte die Isolierung von Einzelklonen ohne Selektionsmarker erfordert, was aus Zeitgründen nicht durchgeführt werden konnte.

Da RNAi auf mRNA-Ebene wirkt, ist die KD-Effizienz nicht gleichermaßen wie ein KO abhängig von der Anzahl DNA-Vorlagen pro Zelle. Auch hier erfordert aber ein phänotypisch nachweisbarer KD das möglichst effiziente Einbringen von siRNA in die Zelle; wegen deren begrenzter intrazellulärer Lebensdauer (C. Königer Dissertation, Universität Freiburg, 2014) im Vergleich zur langsamen DHBV Replikations- und cccDNA-Bildungskinetik in den DHA2/3 bzw. DHA_Cas9 Reporterzelllinien (s. Abb. 34 und Abb. 42) kam aber der Einsatz synthetischer siRNAs nicht in Frage. Da auch die mittels gRNA-Nucleofection erreichbare Editier-Frequenz limitiert blieb, wurde der Schwerpunkt auf virale sgRNA- und shRNA- Vektoren gelegt, die neben hoher Transduktionseffizienz auch den direkten Nachweis erfolgreich transduzierter Zellen mittels Vektor-kodierter fluoreszierender Reporter oder Selektionsmarker das "sorting" per FACS und/oder die Selektion dieser Zellpopulation mit vertretbarem Aufwand Zugang zu möglichst reinen Zellpopulationen ermöglichen sollten.

168 Diskussion

4.7. Virale Vektoren ermöglichen den stabilen KD von Wirtsfaktoren und deren Validierung bezüglich DHBV-Relevanz

Gegenüber synthetischer (s)gRNA bzw. siRNA bieten DNA-Vektoren die Option für eine anhaltende Neusynthese der jeweiligen RNA, was insbesondere für RNAi-Experimente einen länger andauernden KD erlaubt. Hier wurden zwei verbreitete virale DNA-Vektorsysteme auf ihre Eignung für das Einschleusen von Effektor-RNAs in Hepatomzellen evaluiert, nämlich rAAV-basierte (s. Abschnitt 4.7.1) und LV-basierte Vektoren (s. Abschnitt 4.7.2).

4.7.1. Einbringen von shRNA-Expressionskassetten mittels rAAV Da die obligatorische Integration von LV ins Wirtsgenom zu genetisch uneinheitlichen Zellpools führen kann, wurde das Hauptaugenmerk zunächst auf die meist episomal überdauernden rAAV gerichtet; zudem besteht eine Kollaboration mit einem führenden rAAV Labor, der AG von D. Grimm in Heidelberg.

Alle in dieser Arbeit verwendeten rAAV trugen die Kapsidvariante 9A2 (Grimm et al., 2008) des hepatotropen Serotyps AAV9 (Chen et al., 2015) (Singh et al., 2018), die eine effiziente Transduktion von HepG2 Zellen verspricht. Zur Verfolgbarkeit der Transduktion kodierten die rAAV neben der gewünschten Effektor-RNA mCherry oder GFP als Reporterprotein. Selbst mit den rAAV-typischen hohen MOIs von 7,5x104 bis 3x105 Iodixanol-gereinigten Viruspartikeln konnten maximal ca. 40% der Zellen als Reporter-positiv gemessen werden.

Ein neuer Befund war die deutliche Steigerung der Transduktionsrate durch Anwesenheit von DMSO. Insbesondere bei an sich niedrigen Transduktionsraten erhöhte 2% DMSO im Medium den Anteil transduzierter Zellen dramatisch bis zu >70% Reporter-positiven Zellpopulationen (s. Abb. 47). Da die verstärkende Wirkung bei DMSO-Entzug 24 h nach Inokulation erhalten blieb, scheint DMSO frühe Schritte des Transduktionsprozesses zu begünstigen. Hierzu zählen Virusaufnahme, Kernimport, Freilegung des Genoms sowie bei einzelsträngigen rAAV die Gegenstrang-DNA Synthese bis hin zur primären Transkription. Die Wichtigkeit der einzelnen Schritte müsste in zukünftigen Experimenten geklärt werden, der Befund einer massiven Transduktionsverstärkung durch DMSO an sich wurde aber von Carolin Schmelas in der AG Grimm inzwischen für diverse AAV-Kapsidtypen sowie unterschiedliche Zelllinien bestätigt (Manuskript in Vorbereitung).

DMSO (allerdings in Kombination mit Polyethylenglykol) unterstützt auch die HBV- Infizierbarkeit von primären humanen Hepatozyten, differenzierten HepaRG Zellen und NTCP-exprimierenden HepG2 Zellen in Zellkultur (Yan et al., 2012) (Ni et al., 2014) und

169 Diskussion scheint das Assembly viraler Partikel von Influenza A, New castle disease und Semliki Forest Viren zu verbessern (Scholtissek & Muller, 1988). Die Mechanismen sind allerdings ungeklärt, zumal DMSO angeblich Transkriptom, Proteom und Epigenetik beeinflussen soll (Verheijen et al., 2019); andererseits ist DMSO als universales Lösungsmittel im Wirkstoff- screening in breitem Einsatz.

Auf jeden Fall eröffnete die DMSO-vermittelte Transduktionsverstärkung die Möglichkeit, auch mit geringeren MOIs einen erheblichen Anteil der Zielzellen zu erreichen. Dies wiederum könnte die Herstellung von rAAV in kleinerem Maßstab als den üblichen sechs 10 cm Zellkulturschalen pro Konstrukt und ohne die aufwändige Reinigung über Iodixanol- Gradienten erlauben. Hierzu wurden die Transduktionsraten untersucht, die sich mit CL aus den zur rAAV Produktion transfizierten HEK293T Zellen erreichen ließen. Wie zu erwarten, lagen die Virustiter (als Genomäquivalente pro Volumen) mit ca. 107 vge/µl bis zu 103-fach unter denen der Iodixanol-Gradienten gereinigten rAAV-Präparate. Zudem enthielten die CL laut qPCR annähernd gleiche Anteile an rAAV-Genomen und transfizierten rAAV- Plasmiden, während letztere durch in den Gradienten-gereinigten rAAV nur noch maximal 2% der rAAV DNA ausmachten (s. Abb. 48B). Dennoch konnte auch für die CL mittels FL- Reporter-kodierender rAAV eine spezifische und rAAV-dosisabhängig sowie durch DMSO zu steigernde Transduktion von HepG2 Zellen gezeigt werden (s. Abb. 49). Somit schienen shRNA- bzw. sgRNA-rAAV mit einem Resistenzmarker vielversprechend, um durch entsprechende Selektion mit mäßigem Aufwand zu einheitlichen Zellpopulationen zu gelangen. Für den Einsatz in der DHA2/3 Zelle und ihren Derivaten diente BsdR als Resistenzmarker, da G418 (tTA), Hygromycin (TRE-DHBV) und Puromycin (SpCas9) bereits für die anderen Komponenten im Einsatz waren. Die BsdR-Sequenz wurde über ein P2A-Peptid direkt an das auf dem shRNA bzw. sgRNA-rAAV kodierte fluoreszierende Reporterprotein (mCherry bzw. GFP) fusioniert, so dass FL und Bsd-Resistenz immer zusammen auftreten sollten.

4.7.1.1. Unerwartete Entkopplung von Fluoreszenz-Reporter- und Resistenzmarker- Expression Für eine erste Validierung der Effizienz und Dauer eines rAAV-vermittelten KD diente ein rAAV, das für eine bereits gut charakterisierte shRNA gegen HBsAg kodiert (Sun und Nassal, 2006). Hierzu wurden TetOFF HepG2.117 Zellen mit unterschiedlichen Volumina entsprechender CL behandelt, dann FL-Reporter- und HBsAg-Expression über die Zeit verfolgt und zudem auf BsdR selektioniert. Zunächst bestätigte der initial hohe Anteil

170 Diskussion

Reporter-positiver Zellen die Eignung der CL für die effiziente rAAV-Transduktion, wie erwartet begleitet von einer deutlichen HBsAg-Reduktion und der Bildung eines Pools Bsd- resistenter Zellen (s. Abb. 49 und Abb. 50). Unerwarteterweise nahm jedoch der Anteil Reporter-positiver Zellen im resistenten Pool von Tag 4 zu Tag 16 deutlich ab, gleichzeitig stieg das HBsAg-Niveau im gleichen Zeitraum wieder auf das Ausgangsniveau an (s. Abb. 49 und Abb. 50). Somit fand augenscheinlich wie gewünscht eine Selektion der Zellen auf BsdR- Expression statt, während parallel trotz der genetischen Kopplung die Expression des Reporters und, wie aus dem abnehmenden HBsAg-KD zu schließen, auch die Expression der anti-HBsAg shRNA abnahm. Welcher Mechanismus diesem disparaten Verhalten zugrunde liegt, musste ungeklärt bleiben. Vorstellbar wäre eine genetische Entkopplung des BsdR-ORF vom Rest des ursprünglichen rAAV-Genoms, z.B. durch Integration einer funktionsfähigen BsdR-Kassette ins Wirtschromosom und Selektion der resistenten Zellen, ähnlich der klassischen Generierung stabiler Zelllinien. Eine spekulative, auf neuen Befunden zur Zell- Zell-Kommunikation beruhende Hypothese wäre der Transfer von BsdR aus wenigen tatsächlich resistenten Zellen mittels Exosomen oder Mikrovesikeln in benachbarte "Bystander Zellen" (van Niel et al., 2018) (Tang et al., 2019). Auch hier würde die anhaltende Anwesenheit von Blasticidin nur den Transfer von BsdR befördern. Solche mechanistischen Fragen könnten durch weitere Experimente geklärt werden, z.B. durch die Charakterisierung der nach 16 Tagen in den Zellen verbliebenen episomalen rAAV DNAs oder den Nachweis potentieller BsdR Integrate im Wirtsgenom. Von größter praktischer Bedeutung war aber der Befund, dass in den eingesetzten HepG2-basierten Zellen selbst die Selektion auf den im selben rAAV kodierten Resistenzmarker nicht zu einer Langzeit-Expression der shRNA führte, obwohl rAAV-vermittelte Transgen-Persistenz in der Literatur beschrieben ist (Nakai et al., 2001) (Penaud-Budloo et al., 2008). Eine mögliche Erklärung wäre die Abhängigkeit der rAAV-Persistenz von Wirtsfaktoren (Wang et al., 2019), die in HepG2 Zellen nicht oder nicht ausreichend vorhanden sind.

Ein potenzieller technischer Einwand war die komplexe Zusammensetzung der CL-Präparate und damit verbundene Probleme, wie z.B. der genauen rAAV-Titerbestimmung in Anwesenheit nicht abgetrennter Transfektionsplasmide oder unbekannter Effekte anderer im CL vorhandener Komponenten. Daher wurden in einer letzten rAAV Versuchsreihe Iodixanol-gereinigte rAAV eingesetzt, die shRNAs gegen humanes Tdp2, RPA1 oder keine shRNA kodierten. Hierbei bestätigten sich die CL-Ergebnisse, indem die Fraktion Reporter- positiver Zellen bis Tag 14 stetig geringer wurde und gleichzeitig der an Tag 6 über 90%-ige Tdp2 KD zunehmend schwächer wurde, bis an Tag 14 das Tdp2-Ausgangsniveau wieder 171 Diskussion erreicht war (s. Abb. 55). Nicht unerwartet, ergab eine Analyse der DHBV-Replikation zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede zur nicht-shRNA Kontrolle. Erst in der kinetischen Verfolgung der DHBV-Replikation mittels des nicht-invasiven HA-ELISA mit Zellkulturüberstand zeigten sich zu früheren Zeitpunkten negative Auswirkungen durch den KD von Tdp2 und erstmals auch von RPA1 (s. Abb. 56).

Insgesamt wurde jedoch weder mit CL noch mit Iodixanol-gereinigten shRNA-rAAV ein persistenter KD erreicht. Stattdessen nahm die KD-Effizienz über ca. 2 Wochen ebenso ab wie die Expression des fluoreszierenden Reporters, obwohl diese im rAAV ursprünglich genetisch an die Expression der Selektionsmarker-Resistenz gekoppelt war; eine Anreicherung shRNA-exprimierender Zellen war daher weder über FL-sorting noch über Resistenz-Selektion möglich. Diese Befunde wurden unabhängig in einem direkten Vergleich mit LV-Vektoren bestätigt (s. Abb. 57). Somit erwies sich die Dauer der rAAV-vermittelten shRNA-Expression in den HepG2-basierten Zellen nicht als ausreichend, um durch eine entsprechend lange Suppression einzelner Wirtsfaktoren deren Bedeutung für DHBV- Replikation und cccDNA-Bildung eindeutig zu charakterisieren.

Umgekehrt wäre für CRISPR/Cas KO-Studien die nur vorübergehende rAAV-vermittelte Expression einer sgRNA in Cas9-produzierenden Zellen wie der DHA_Cas9 Zelllinie ein wünschenswertes Ergebnis. Hier sollte die kurzfristige Anwesenheit der sgRNA zur Induktion Ziel-spezifischer DNA-Strangbrüche ausreichen und zusätzlich das Risiko von off-target Effekten vermindern. Für eine künftige CRISPR/Cas9-Anwendung in der DHA_Cas9 #3-S Reporterzelllinie sind gRNA-rAAVs demnach ein sehr attraktives Werkzeug.

4.7.1.2. Blasticidin interferiert mit der DHBV-Replikation in DHA2/3 Zellen Eine andere unerwartete Problematik ergab sich aus den obigen Versuchen zur Selektion shRNA-exprimierender TetOFF DHA2/3 Zellen nach Transduktion mit BsdR-kodierenden rAAV CL. Hier schien die Anwesenheit von Blasticidin mit der Induktion der DHBV- Synthese durch Dox-Entzug zu interferieren (s. Abb. 53), wie sich nach Zugabe von Blasticidin zum Dox-freien Wachstumsmedium durch eine konzentrationsabhängige Reduktion von sekretiertem HAeAg im ELISA zeigte (s. Abb. 54). Der Effekt trat bereits bei so geringen Blasticidin-Konzentrationen auf, dass er auch in nicht rAAV-transduzierten und daher nicht resistenten DHA2/3 Zellen nachweisbar war. Der Wirkmechanismus ist noch ungeklärt, direkte Zelltoxizität ist aber unwahrscheinlich, da alle analysierten Proben konfluentes Zellwachstum zeigten (s. Abb. 54A und B). Jedenfalls würde dieser Blasticidin- Effekt die Interpretation einer möglichen DHBV-Suppression nach Wirtsfaktor-KD 172 Diskussion erschweren. Ob Blasticidin direkt auf DHBV wirkt oder das TetOFF-System inhibiert, könnten analoge Experimente in der HBV TetOFF Linie HepG2.G117 zeigen. Dies wäre auch wichtig, um die Verwendbarkeit von Blasticidin in Experimenten mit dem humanen HBV einzuschätzen.

Da eine Selektion shRNA-exprimierender rAAV-transduzierter Zellen ohnehin nicht gelang (s.o.) und zudem Blasticidin als Selektionsmarker sich zumindest im Tet-kontrollierten DHBV System als problematisch erwies, stellte sich die Frage, ganz auf Selektion zu verzichten und stattdessen alles Augenmerk auf eine a priori hohe Transduktionseffizienz mit anhaltender shRNA-Expression zu legen; hierzu wurden schließlich lentivirale shRNA Vektoren eingesetzt.

4.7.2. shRNA-kodierende LV ermöglichen die funktionale Validierung von neuen Wirtsfaktoren auf ihre DHBV-Relevanz Da Lentiviren ihr eigenes Genom obligatorisch in Wirtsgenom integrieren, gewährleisten LV eine in der Regel langanhaltende mitotisch stabile Transgen-Expression. Die Pseudotypisierung mit einer VSV G-Protein-haltigen Hülle erlaubt ihre Anwendung in vielen unterschiedlichen Zellen, wie in dieser Arbeit in HepG2 und davon abgeleiteten Zellen. In der TetOFF DHA2/3 Zelllinie wurden mit GFP-kodierenden LV mehr als 65% Reporter-positive Zellpopulationen erreicht. Im Gegensatz zur Transduktion mit vergleichbaren rAAV blieb diese Population bis zum spätesten gemessenen Zeitpunkt von 21 Tagen auch unter Selektionsdruck erhalten (s. Abb. 57). Die LV erschienen damit besser als rAAV geeignet in der DHA2/3 Zelllinie mit ihrer langsamen DHBV Replikations- und cccDNA-Bildungs- Kinetik ein anhaltendes shRNA silencing von Wirtsfaktoren zu erreichen. Die potenziellen Nachteile der zufälligen LV-Integration in das Wirtsgenom wie die genetische Heterogenität des entstehenden Pools transduzierter Zellen wurden daher in Kauf genommen. Für die Interpretation bleibt zu beachten, dass dadurch das Ausmaß der Wirtsfaktorsuppression in individuellen Zellen des Pools unterschiedlich sein kann.

Für die Generierung der DHA2/3 KD Zellen wurden diese mit "Mission shRNA LV" (Sigma- Aldrich) auf Basis des pLKO-Systems transduziert, die jeweils eine gegen die Kandidaten- Faktoren ANP32A, ANP32E, DDX41, HIC2, HSP27, NAMPT, RPA1, RPA2, RPA3, SerpinA3 und TAGLN2 (s. Abschnitt 3.3 und 4.5) gerichtete und laut Hersteller in Modellzelllinien wie A594 (für HepG2 waren keine Angaben verfügbar) als effizient validierte shRNA sowie Puromycin-Resistenz als Selektionsmarker kodierten (s. Anhang 6.4 für die jeweilige LV Klon-Bezeichnung). Anders als für Blasticidin (s. Abschnitt 4.7.1.2) gab 173 Diskussion es keine Hinweise auf eine Interferenz von Puromycin mit der DHBV-Replikation in der DHA2/3 Zelllinie, daher konnte hier auch mittels Resistenz auf transduzierte Zellen selektioniert werden.

Dies gelang für alle Kandidaten-Faktoren mit Ausnahme von DDX41. Da der KD dieses Faktors in anderen Zelllinien und sogar in vivo toleriert wird, ist eine essentielle Rolle von DDX41 für die DHA2/3 Zellen nicht wahrscheinlich. Das Ausbleiben Puromycin-resistenter Zellen könnte daher eher technische Gründe haben. Für die anderen Faktoren wurde ein potenzieller KD durch Immunoblot evaluiert. Wegen fehlender bzw. sehr starker unspezifischer Signale der benutzten Antikörper war für ANP32E bzw. NAMPT keine Auswertung möglich; hier sollten künftig noch weitere, andere Antikörper eingesetzt werden. Für die anderen Wirtsfaktoren ergaben sich unterschiedliche KD-Effizienzen, von sehr gering bis nahezu vollständig: RPA2: 21%; RPA3: 23%; HIC2: 44%; ANP32A: 52%; SerpinA3: 54%; shRPA1: 77%; TAGLN2: 91% und HSP27: 100% (s. Abb. 59). Derartige Unterschiede sind nicht unerwartet, da zum einen die spezifische shRNA Sequenz einen Einfluss auf die silencing Effizienz hat; dies wird meist dadurch adressiert, dass mehrere (meist 4-5) shRNAs mit unterschiedlichen Zielregionen auf der target-mRNA eingesetzt werden, was aber im Rahmen dieser Arbeit nicht zu leisten war. Ein zweiter wichtiger Faktor ist das Expressionsniveau der shRNA, das gerade bei LVs auch vom chromosomalen Integrationsort beeinflusst wird, der wahrscheinlich in jeder Zelle ein anderer ist. Über Einzelzell-Techniken wie IF könnten solche Zell-zu-Zell Unterschiede in der silencing-Effizienz analysiert, dann durch Einzelzellklonierung die Zellen mit dem stärksten KD angereichert werden. Da auch dies im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich war, wurden alle der vorhandenen Zellpools mit nachweislich reduzierter Expression des jeweiligen Wirtsfaktors auf mögliche Auswirkungen auf DHBV-Replikation und cccDNA-Bildung untersucht.

Hierzu wurden nach Induktion der Virus-Replikation in den KD DHA2/3 Zellen die Kinetiken der Bildung von Kapsiden, Nukleokapsid-DNA und nukleärer cccDNA mit einer analogen, eine scrambled-shRNA (shSCR) exprimierenden Kontroll-Zelllinie verglichen (s. Abb. 60 bis Abb. 62). Grundsätzlich unterstützten alle untersuchten Zelllinien die Synthese der viralen Produkte, sodass -zumindest unter den Versuchsbedingungen- keinem der supprimierten Wirtsfaktoren eine unverzichtbare Rolle zuzuschreiben ist. Jedoch waren im Vergleich zu den shSCR-Kontrollzellen wie auch zu naiven DHA2/3 Zellen die Kapsid- und die Nukleokapsid-DNA Synthese in den KD Zellen mit klarem bis massivem KD, d.h. shANP32A (s. Abb. 60H), shRPA1 (s. Abb. 60I), shTAGLN2 (s. Abb. 60G) und shHSP27 (s.

174 Diskussion

Abb. 60J), deutlich verzögert. In den shSCR Zellen erreichten die Kapsid- und die Nukleokapsid-DNA Signale an Tag 8 und Tag 10 nach Induktion 80-100% der als Referenz dienenden BK-Signale der parentalen DHA2/3 Zellen von Tag 12 nach Induktion und blieben dann relativ konstant. Für die shANP32A und shTAGLN2 Zellen lagen die Werte an Tag 8 bei 50-60% der Referenzwerte, in den shRPA1 und shHSP27 Zellen bei nur 25-30% der Referenzwerte, mit jeweils langsamem weiterem Anstieg der Nukleokapsid-DNA-, aber kaum der Kapsid-Signale. Zusammengefasst ist daher der wesentliche Phänotyp bezüglich zytoplasmatischer Schritte der DHBV-Replikation eine verlangsamte Akkumulation DNA- haltiger Nukleokapside bei insgesamt reduzierter Kapsidbildung, insbesondere in den shHSP27 Zellen. Ob es sich bei der Nukleokapsid-DNA in allen Fällen um reife rcDNA handelte, müsste durch SB-Analyse nach Aufreinigung der DNA noch geklärt werden. Vorstellbar wären auch inhibitorische Einflüsse auf die reverse Transkription, die eine Anreicherung von ssDNA und/oder dlDNA zur Folge hätten. Dazu müsste sich allerdings das Fehlen des betreffenden Wirtsfaktors im Inneren des Kapsids auswirken, in dem die reverse Transkription von pgRNA zu den replikativen DNA-Intermediaten abläuft.

Die Zellpools shANP32E, shHIC2, shSerpinA3 und shRPA3 verhielten sich dagegen wesentlich ähnlicher zu den Kontrollen. Die einfachste Interpretation ist das relativ geringe Zielprotein-silencing von 20-30% in den meisten dieser Zellen, wobei allerdings der shSerpinA3 Zellpools mit 54% KD eine ähnliche Suppression aufwies wie der shANP32A Pool mit 52% KD.

Großteils übereinstimmende Ergebnisse ergaben sich aus den HAeAg-Assays der Zellkulturüberstände, die auf eine erfolgreiche Konversion von rcDNA in cccDNA schließen lassen; die Bildung der rcDNA setzt ihrerseits Replikation, d.h. die Bildung rcDNA-haltiger Nukleokapside aus pgRNA-haltigen Nukleokapsiden voraus. Für die Zellpools shANP32E, shRPA2, shRPA3, shSerpinA3 und shHIC2 schwankten die Messwerte um die der shSCR- Kontrolle, während sich für die Zellpools shTAGLN2, shANP32A, shRPA1 und shHSP27 früh nach Induktion deutlich verminderte HA-Signale zeigten, die sich ab Tag 12 wieder den Kontrollen annäherten (s. Abb. 61B).

Schließlich wurden die Daten auch durch direkte SB-Analysen der viralen Kern-DNAs grundsätzlich bestätigt. Wiederum fehlte in den shTAGLN2, shANP32A, shRPA1 und shHSP27 Zellpools der in den Kontrollen sichtbare Anstieg der cccDNA-Signale nach der erstmaligen Detektierbarkeit an Tag 8 nach Induktion, zudem verblieben die Signalstärken insgesamt deutlich unter denen der shSCR Kontrollzellen (vgl. Abb. 62B und D mit A).

175 Diskussion

In der Summe sprechen diese phänotypischen Ergebnisse für eine Rolle der Wirtsproteine ANP32A, TAGLN2, HSP27 und RPA1 in der Replikation einschließlich der rc- zu cccDNA Konversion von DHBV und vermutlich auch von anderen Hepadnaviren, inklusive HBV. Dies passt zum Ausgangsbefund, dass die ektopische Expression von hAdV5 E4orf6 Protein in HepG2 Zellen zu verminderter DHBV-Replikation und cccDNA-Bildung führt und alle genannten Wirtsproteine in den stabil E4orf6 exprimierenden Zellen herabreguliert waren. Daher wäre zu erwarten, dass der spezifische RNAi KD eines oder mehrerer der E4orf6 target-Proteine sich auf DHBV vergleichbar auswirkt wie die E4orf6 Expression selbst.

Für eine Einschätzung weiterer aus dem MS-Proteom-Vergleich zwischen E4wt bzw. BCmut exprimierenden Zellen hervorgegangenen Kandidaten-Faktoren müssten zunächst die technischen Voraussetzungen optimiert werden, nämlich der IB-Nachweis per se durch Einsatz alternativer Antikörper und insbesondere die jeweilige KD-Effizienz.

4.7.3. Potenzielle anti-DHBV Wirkmechanismen der Wirtsfaktoren ANPA32A, TAGLN2, HSP27 und RPA1 Eine detaillierte Diskussion der Wirkmechanismen der Wirtsfaktoren, deren KD detektierbare Einflüsse auf DHBV-Replikation und cccDNA-Bildung in der DHA2/3 Reporterzelllinie hat, bedarf zusätzlicher Untersuchungen. Dies betrifft die Absicherung vorhandener Daten durch Wiederholungen, zum anderen – wo möglich - die Bestätigung durch entsprechende KO- Experimente, um Unwägbarkeiten durch die auch bei effizientem KD praktisch unvermeidlichen Faktor-Restmengen zu minimieren.

Trotzdem erlauben bereits die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zumindest einige evidenzbasierte Spekulationen, auch wenn zwischen direkten Effekten auf das Virus und indirekten, über die Zelle vermittelten Effekten derzeit nicht unterschieden werden kann. Bekannte Funktionen der Wirtsfaktoren ANPA32A, TAGLN2, HSP27 und RPA1 sind bereits in Abschnitt 4.5 zusammengefasst.

Für die TetOFF DHA2/3 Reporterzelllinie sei daran erinnert, dass die pgRNA-Transkription mittels Dox-Entzug auf der chromosomal integrierten TRE-DHBV Kassette beruht, wodurch der intrazelluläre Replikationszyklus initiiert wird (s. Abschnitt 3.4.1 und Abb. 65). Dieser führt zunächst zur Bildung von pgRNA-, dann DNA-haltigen Nukleokapsiden und schließlich zu cccDNA, deren Kopienzahl durch den Umhüllungsdefekt massiv gesteigert wird (Köck et al., 2010); dies war auch im shSCR Kontroll-Zellpool sowie in den shRNA-Zellpools ohne deutlichen KD-Effekt zu sehen (s. Abb. 60-62). Einmal gebildete cccDNA kann dann als zusätzliche und nicht mehr Tet-kontrollierte Transkriptionsmatrize wirken, wobei die für die 176 Diskussion

HAeAg Bildung notwendige precore-RNA ausschließlich von cccDNA stammen sollte. Hieraus ergeben sich diverse Möglichkeiten, wie sich ein spezifischer Defekt an einem bestimmten Schritt in den durchgeführten Analysen quantitativ und/oder qualitativ auswirken kann. Z.B. würde das Fehlen eines Faktors, der ausschließlich für die Transkription vom TRE-Integrat gebraucht wird, die Initiation des Replikationszyklus und sämtliche downstream-Ereignisse verhindern. Fehlte ein Faktor, der nur für die Transkription von cccDNA notwendig ist, würden immer noch DNA-haltige Nukleokapside und nukleäre cccDNA gebildet; cccDNA-abhängige Genprodukte fielen aber weg und auch der HAeAg Assay würde nicht zwischen fehlender cccDNA und inhibierter cccDNA Transkription unterscheiden. In dieser Hinsicht bleibt der SB viraler Kern-DNAs der aussagekräftigste Assay. Insgesamt sollte sich die Interpretation künftig vereinfachen lassen, wenn nach der initialen Induktion der DHBV-Replikation durch Dox-Entzug durch erneute Dox-Zugabe die Transkription von der integrierten TRE-DHBV Kassette wieder unterbunden wird, so dass nur noch die cccDNA als Transkriptionsmatrize dients.

Die etwa 50%-ige Suppression von ANPA32A führte bei verlangsamter Bildung DNA- haltiger zytoplasmatischer Nukleokapside auch zu einer etwas langsameren Akkumulation von rcDNA im Kern als in den shSCR-Kontrollzellen (vgl. Abb. 62B mit A). Relativ zu den rcDNA Signalen blieben aber die cccDNA Signale deutlich schwächer, was sich auch im HA- ELISA widerspiegelte. Dieser Befund spricht für eine Rolle von ANP32A in der rcDNA zu cccDNA Konversion. Da hieran wahrscheinlich diverse, über transiente Phosphorylierung regulierte DNA-Reparaturmechanismen beteiligt sind, könnte ANP32A über seine Phosphatase-Inhibitor Aktivität wirken. Die verlangsamte DNA-Nukleokapsidbildung wäre mit einem negativen Einfluss von zu wenig ANP32A auf den Kern-Export von pgRNA und ihre Transkription von cccDNA vereinbar. Angesichts der beschriebenen ANP32A Interaktion mit dem hAdV5 E4orf6 Protein (Higashino et al., 2005) sollte diese Spur auf jeden Fall weiterverfolgt werden, auch wenn die Interaktion möglicherweise über E1B55k vermittelt wird (Hung & Flint, 2017).

Die über 90%-ige Reduktion des Aktinbindeproteins TAGLN2 im shTAGLN2 Zellpool ging ebenfalls einher mit verminderter Bildung DNA-haltiger zytoplasmatischer Nukleokapside (s. Abb. 60G), vor allem aber mit einer sehr geringen Akkumulation von rcDNA und cccDNA im Zellkern (s. Abb. 62D). Angesichts der Bedeutung des Zytoskeletts für den Kerntransport wäre dies vereinbar mit einem verminderten Kern-Import der Kapsid-assoziierten rcDNA, was zu weniger Substrat für die Konversion in cccDNA führen würde. Fortgeschrittene

177 Diskussion

Mikroskopie-Techniken könnten helfen, entsprechende Unterschiede in der intrazellulären Verteilung der Viruskapside nachzuweisen. Falls die publizierten Daten verlässlich sind, könnte damit TAGLN2 auch für andere Hepadnaviren als HBV (Yu et al., 2016) von Bedeutung sein.

Auch der nahezu vollständige Verlust von HSP27 im shHSP27 Zellpool war begleitet von einer verringerten Kern-Akkumulation von rcDNA, weiterhin war aber eine Zunahme des cccDNA Signals über die Zeit zu sehen, wenn auch geringer als in den shSCR Kontrollzellen. Spekulativ könnte HSP27 demnach eine Rolle bei Vorgängen nach der cccDNA Konversion spielen, z.B. indem es die Stabilität und Faltung viraler Proteine wie die des Core-Proteins oder auch des HAeAg sowie dessen Sekretion beeinflusst; andererseits sind Effekte auf die Zelle, die dann indirekt die DHBV-Replikation und/oder cccDNA-Bildung beeinflussen, nicht ausgeschlossen. Dass der massive HSP27 KD sich per se auf die Zellen nur moderat auswirkt, deutet darauf hin, dass andere Chaperone als Faltungshelfer einspringen könnten.

Am nächsten an die Start-Hypothese eines Einflusses der zellulären DDR auf die hepadnavirale Replikation und rcDNA zu cccDNA Konversion führen die Ergebnisse mit dem shRPA1 Zellpool. Bei ca. 70% reduzierter RPA1-Abundanz war die Bildung DNA- haltiger Nukleokapside deutlich verlangsamt, die rcDNA Signale im Kern waren reduziert und die in den shSCR Kontrollzellen typische Zunahme der cccDNA Signale ab Tag 10 nach Induktion blieb weitgehend aus. Für RPA1 als hauptsächliches ssDNA-Bindeprotein eukaryonter Zellen wäre rcDNA mit der aufgrund des unvollständigen (+) -DNA-Stranges (s. Einleitung 1.4) zum Teil einzelsträngigen (-)-DNA ein naheliegendes Substrat. RPA1 könnte anhand der ssDNA-Bereiche die rcDNA analog zu zellulären Replikations- bzw. DNA- Schadens-Intermediaten erkennen, vor Abbau schützen und DNA-Polymerasen und/oder andere Reparaturfaktoren zur Konversion in cccDNA rekrutieren. Ein Mangel an RPA1 könnte in diesem Modell eine verstärkte rcDNA Degradation und/oder verminderte cccDNA Bildung zur Folge haben, was wiederum den Beitrag der cccDNA zu pgRNA Transkription und Bildung neuer DNA-haltiger Nukleokapside verringern würde. Wie oben erwähnt, sollte sich die zugehörige Analytik durch Abschalten der Tet-abhängigen pgRNA-Synthese vereinfachen lassen.

Da RPA1 seine bekannten Funktionen im Komplex mit RPA2 und RPA3 ausübt (Krasikova et al., 2016), die im MS-Proteomvergleich in den E4wt exprimierenden Zellen ebenfalls herabreguliert waren (s. Abb. 32 und Abb. 33), wäre eine ähnlich verminderte DHBV- Replikation und cccDNA-Akkumulation in den shRPA2 und shRPA3 Zellpools eine

178 Diskussion

überzeugende Bestätigung für dieses Modell gewesen. Dies war nicht der Fall, was aber angesichts der geringen KD-Effizienzen (ca. 20%) für RPA2 und RPA3 nicht überrascht. Ein vordringliches Ziel künftiger Arbeiten sollte es daher sein, eine ähnliche KD-Effizienz wie für RPA1 auch für RPA2 und/oder RPA3 zu erreichen. In der Maus ist ein effizienter KD von RPA3 letal, ein transientes KD mittels induzierbarer shRNA Expression ist aber möglich (McJunkin et al., 2011); dies führt aber zu DNA-Reparaturdefekten und letztlich genomischer Instabilität, wenn die Restmenge RPA-Komplex ein Mindestmaß unterschreitet (RPA- exhaustion) (Chen & Wold, 2014). Ein RPA-KO unter Nutzung der DHA_Cas9 Zelllinie (s. Abb. 65) ist daher wahrscheinlich nicht möglich. Zumindest sollte aber der angestrebte RPA- KD so effizient wie möglich sein. Damit ließen sich unter Umständen auch potenziell kompensatorische Effekte anderer ssDNA-Bindeproteine (hSSB1, OBFC2B) (Croft et al., 2019) auf die DHBV-Replikation erfassen.

4.8. Schlussfolgerungen und Ausblick

Alle Viren sind auf Wirtsfaktoren angewiesen, die ihren Replikations- und Infektionszyklus ermöglichen, sie müssen sich aber auch mit den Verteidigungsmechanismen der Zelle in Form von Restriktionsfaktoren auseinandersetzen ("exploit or avoid"). Das gilt auch für die zelluläre DNA-Reparatur. Adenoviren inhibieren wichtige DNA-Reparaturmechanismen, für Hepadnaviren ist dagegen eine provirale Rolle von DNA-Reparaturfaktoren für die rcDNA und cccDNA Synthese sehr wahrscheinlich. Direkte Erkenntnisse hierzu sind aber noch sehr lückenhaft.

Experimenteller Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Suppression von DHBV Replikation und cccDNA-Bildung in transfizierten humanen HepG2 Zellen durch das hAd5V Protein E4orf6, das bekanntermaßen mit hAdV5 E1B55k als Kofaktor mehrere zelluläre DNA- Reparaturfaktoren via Ubiquitinylierung dem proteasomalen Abbau zuführt. Erstaunlicherweise war der anti-DHBV-Effekt von E4orf6 aber unabhängig von E1B55k. Hieraus resultierte die Hypothese, dass E4orf6 per se den Abbau weiterer, noch unbekannter Wirtsfaktoren induzieren könnte, von denen einer oder mehrere für die DHBV- und mutmaßlich auch die HBV-Replikation und cccDNA Bildung wichtig sind.

Als Strategie für eine möglichst umfassende Analyse potenzieller E4orf6 target-Proteine diente ein MS-Proteom Vergleich zwischen HepG2 Zellen, welche das E4wt Protein oder die Ubiquitin-E3-Ligase defiziente Variante BCmut exprimieren. Die Generierung klonaler E4wt Zelllinien war schwierig, gelang aber mittels des episomalen, Me2+-induzierbaren pMEP4

179 Diskussion

Vektorsystems. Die alternative ortsgerichtete Integration der E4orf6 Kassetten in einen "safe harbour" Lokus war prinzipiell möglich, die Expressionsniveaus waren aber zu niedrig für aussagekräftige Ergebnisse. Eine noch weitergehende Minimierung nicht E4wt betreffender Unterschiede zwischen den verglichenen Zellklonen war daher mit vertretbarem Aufwand nicht möglich.

Wichtigstes Zwischenergebnis war die vergleichbare Funktionalität des Zell-kodierten E4wt Proteins mit dem authentischen Virusprotein, gezeigt durch Komplementation eines E4orf6- defizienten hAdV5 wie auch in Assays auf Bildung einer funktionellen CRL5 E3-Ubitiquitin- Ligase; ein Nebenprodukt war der erstmalige Nachweis, dass die hAdV5 Proteine E4orf6 und E1B55k hinreichend für die Neddylierung und damit Aktivierung der E3-Ligase sind. Die als Referenz dienende BCmut Variante erwies sich in allen diesen Aspekten als inaktiv.

Der anschließende MS-Proteom Vergleich beruhte daher auf nachweislich funktionsfähigem E4wt Protein. Die bioinformatische Auswertung der MS-Daten erfolgte im Labor Pichlmair gemäß den dort gut etablierten Vorgaben und resultierte in über 100 Zellproteinen mit unterschiedlicher Abundanz in den beiden Zellklonen. Als Unwägbarkeiten verbleiben daher mögliche Unterschiede aufgrund unterschiedlicher Episomenanzahl sowie genetische und/oder epigenetische Unterschiede zwischen den Zellklonen, die z.B. während der Einzelklon-Selektionierung aufgetreten sein könnten; zudem wurde etwa die Hälfte des Gesamtproteoms methodisch nicht erfasst. Ansonsten sollte die unterschiedliche Abundanz spezifischer Wirtsproteine in den untersuchten Zellklonen substanziell auf die Anwesenheit von E3-Ligase-aktivem wt E4orf6 vs. E3-Ligase-defizientem BCmut Protein zurückgehen.

Wegen begrenzter Resourcen musste die Anzahl Kandidaten eingeschränkt und andererseits die Testung auf potenzielle Relevanz für DHBV auf einen größeren Probendurchsatz ausgerichtet werden. Für die Eingrenzung der Kandidatenzahl wurden nur die differenziell herabregulierten Faktoren berücksichtigt, zudem war ein literaturbekannter Bezug zu Viren und/oder DNA-Reparatur ein subjektives Auswahlkriterium. Unter den nicht einbezogenen Kandidaten könnten daher noch diverse für Hepadnaviren pro- und/oder antiviral wirksame Faktoren sein.

Mit den TetOFF DHBV Reporterzelllinien DHA2/3 und DHA2/3_Cas9 wurden die Voraussetzungen geschaffen, über den cccDNA-abhängigen HA-ELISA künftig auch eine größere Anzahl von Wirtsfaktoren mittels RNAi und/oder Genomeditierung auf ihre Bedeutung für DHBV zu testen (Abb. 56 und Abb. 65.). Die umfänglichen Versuche zum Einsatz von rAAV-Vektoren einerseits und LVs andererseits belegen deren unterschiedliche 180 Diskussion

Eignung für unterschiedliche Strategien zum Einschleusen von Effektor-RNAs. Beide Vektorsysteme erlauben die simultane Expression von Reporterproteinen und/oder Selektionsmarkern zur Anreicherung der transduzierten Zellen. Für lang-anhaltendes silencing durch shRNAs sind aber rAAV wegen ihrer nur transienten Reporter- und Effektor- RNA Expression weniger geeignet als analoge LVs. Umgekehrt lassen genau diese Eigenschaften die rAAV als besonders geeignet für die CRISPR/Cas-Genomeditierung mittels kurzfristiger Expression von gRNAs in Cas9 enthaltenden Zellen erscheinen (Abb. 65).

Virologisch konnte für die Wirtsfaktoren ANP32A, HSP27, TAGLN2 und RPA1 eine Rolle in der DHBV Replikation und/oder rcDNA zu cccDNA Konversion wahrscheinlich gemacht werden. Nächstes Ziel wäre die weitere Absicherung dieser Daten einschließlich Spezifitätskontrollen; so sollten ähnlich effektive shRNAs mit anderen Zielregionen auf der jeweiligen Wirtsfaktor mRNA eine ähnliche DHBV Suppression bewirken. Ein KO des Zielfaktors würde idealerweise die Suppression noch verstärken. Mehrere der ausgewählten Top-Kandidaten konnten wegen zu geringer KD-Effizienz nicht evaluiert werden, oder weil ein potenzieller KD mit den verfügbaren Antikörpern nicht nach nachweisbar war. Dies sollte sich durch alternative shRNAs, KO-Technologie und bessere Antikörper angehen lassen. Auch die bisher nicht berücksichtigten in den E4wt Zellen hoch-regulierten Wirtsproteine sind potenziell von Interesse; theoretisch könnten hierunter DHBV-Restriktionsfaktoren sein, auch wenn deren Induktion durch das E4wt-Protein nicht sehr wahrscheinlich ist. Ein weitergehender Schritt wäre die Aufklärung des Mechanismus, durch den der jeweilige Wirtsfaktor seine DHBV-supprimierende Wirkung ausübt. Ein möglicher Zugang wäre die Bestimmung, welcher Schritt des Replikationszyklus genau gehemmt ist, z.B. durch die Charakterisierung der Enden nukleärer rcDNA (Abb. 3), die bei depletiertem Faktor nicht in cccDNA umgewandelt wurde.

Über die Grundlagenforschung hinaus wäre zu prüfen, inwieweit ein für DHBV relevanter Wirtsfaktor auch für humanes HBV von Bedeutung ist. Mit dieser Perspektive waren die DHBV Reporterzelllinien auf humanen HepG2 Hepatomzellen basiert, die bekanntermaßen die HBV-Replikation aber auch die DHBV-Replikation (Köck et al., 2010) unterstützen. Angesichts des gleichartigen Replikationsmechanismus sollten beide Viren dafür auch dieselben Zellfaktoren benötigen. Andererseits zeigt die im Vergleich zu HBV massiv höhere DHBV cccDNA-Bildung, dass die jeweiligen Virus-Wirtszell-Interaktionen nicht strikt

181 Diskussion identisch sind. Daher wäre die weiterführende Validierung in einem auf primären Humanhepatozyten beruhenden HBV-Infektionssystem wichtig.

Längerfristig würden sich in ihrer Bedeutung für HBV bestätigte Wirtsfaktoren auch als Zielstrukturen für neue therapeutische Ansätze anbieten (Baumert et al., 2015). Zwar kann die Inhibition eines Wirtsfaktors offensichtlich zu Nebenwirkungen führen, andererseits ist die Selektion resistenter Virusvarianten viel weniger wahrscheinlich als bei direkt antiviralen Agenzien (direct acting antivirals). Ein illustratives Beispiel aus dem HBV-Gebiet ist Myrcludex B, ein aus der PräS1-Sequenz abgeleitetes Peptid, das die Bindung von HBV an den NTCP-Rezeptor und damit den Zelleintritt blockiert; die gleichzeitige Verminderung des Gallensäure-Transports hatte in bisherigen klinischen Studien keine negativen Auswirkungen (Blank et al., 2018) und die baldige Zulassung als Medikament wird erwartet.

Nicht zuletzt ist angesichts der hAdV5 E4orf6-basierten experimentellen Strategie von Interesse, inwieweit die identifizierten Wirtsfaktoren für Adenoviren selbst bedeutsam sind. Es ist plausibel, dass einige der durch E4wt differenziell regulierten Zellfaktoren auch pro- oder antivirale Wirkung auf hAdV5 ausüben. Analog dem Nachweis der Funktionalität des Zell-kodierten E4wt Proteins (s. Abschnitt 3.2.1) könnte hierzu geprüft werden, ob Zellen mit Depletion des entsprechenden Faktor durch KD oder KO einem E4orf6-defizienten hAdV5 einen Replikationsvorteil bieten. Falls ja, würden hierdurch auch neue Einsichten in den adenoviralen Replikations- bzw. Infektionszyklus eröffnet.

Abb. 65 Schematische Darstellung der Reporterzellsysteme DHA2/3 (i) und DHA_Cas9 (ii) und (iii) Die HepG2 Zellen tragen eine DHBV-Expressionskassette unter der Regulation eines TetOFF-Systems. Das

182 Diskussion

Genom ist defizient bezüglich des Hüllproteins und kodiert ein HA-markiertes precore-Protein, das als HAeAg sekretiert und mittels α-HA-Antikörpern von Core-Protein im Kulturüberstand unterschieden werden kann. Der TRE-Promoter des Integrates generiert ausschließlich die zur Replikations-Initiation erforderliche pgRNA; precore-RNA entsteht erst, nachdem cccDNA gebildet wurde. Somit dient der Nachweis von HAeAg als Surrogatmarker für cccDNA, was im SB zusätzlich validiert werden kann. (i) DHA2/3 Reporterzelllinie als Basis zur Herstellung von stabilen KD-Zelllinien mittels shRNA kodierenden LVs. Durch Integration der shRNA-Expressionskassette in das zelluläre Genom wird ein langzeit-RNAi-Mechanismus ermöglicht, der KD- Auswirkungen auf die virale Expression, spezifischer die cccDNA-Bildung ermöglicht. Erste Validierungen ergaben eine verlangsamte HAeAg Sekretion und/oder cccDNA-Kinetik für einen ANP32A-, HSP27-, RPA1- und TAGLN2-KD. (ii) und (iii) DHA_Cas9 Reporterzelllinie. DHA2/3 Zellen mit integriertem spcas9 im AAVS1-Lokus auf dem Chr. 19. Durch Einschleusen von sgRNA kodierenden DNA-Vektoren mittels rAAVs (ii) oder gRNA-Molekülen mittels Nucleofektion (iii) werden in den Zellen aktive RNP-Komplexe gebildet und eine Zielsequenz (Zellfaktor) auf dem Genom editiert. Die daraus entstandenen KO-Ereignisse können (nach Einzelklongenerierung) auf phänotypische Ausprägungen einer DHBV-Replikation untersucht werden. Modifiziert nach (Schreiner & Nassal, 2017).

183 Material

5. Material

5.1. Chemikalien und sonstige Reagenzien

Alle Standardchemikalien wurden von den Firmen Applichem, GE HealthCare, Invitrogen und Sigma-Aldrich bezogen. Die in dieser Arbeit speziell aufgeführten Reagenzien sowie dessen Herstellerfirma sind im Folgenden aufgelistet.

1 kb und 100 bp DNA-Leiter Peqlab Acrylamid 2 K Lösung 30%:(29:1) Applichem Agarose für analytische Gele und NAGE Serva Agarose für Southernblot Biozym Bradford-Färbelösung BioRad Coomassie FluorOrangeProteinGel Stain Molecular Probes DMEM/ RPMI Medium Life /gibco DMSO Santa Cruz Ethidiumbromid Roth FKS Sigma Kollagen Biochrom Milchpulver BioRad MLN492 MedChemExpress

Nano-GloTM Assay Substrat Promega Natriumdodecylsulfat Serva PBS Dulbecco Biochrom AG Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Proteingrößenmarker (Precision Plus Dual Color) BioRad QuickHyb Stratagene Ready to use TMB Sigma RPMI Medium Life ß-Mercaptoethanol Sigma TEMED Acros TransIT®-LT1 Transfektions Reagenz MirusBio Trypan Blue Soulution 0,4% Sigma Trypsin, Sequencing-Grade 0,05% gibco

5.2. Verbrauchsmaterialien

Zellkulturflaschen sowie Zellkulturplatten, Reaktionsgefäße und sonstige Standardmaterialien wurden von den Firmen Becton Dickinson, Greiner Bio-One, Eppendorf und Beckmann bezogen. Experimentspezifisches Material ist im Folgenden genannt.

184 Material

ELISA Platten 96 F MaxiSorp Thermo Scientific Lucent Blue X-ray Filme Advansta / BioRad Nylon-Membran Roche PVDF-Membran Roche

5.3. Bakterienstämme und Nährmedien

E. coli Top10 Stratagene (Invitrogen) NEB stable New England Bioscience (NEB)

Die Bakterien wurden in Luria Bertani Medium (Carl Roth) kultiviert. Je nach Resistenz wurde das Medium mit den jeweils benötigten Antibiotika supplementiert (Kanamycin 50 µg/ml, Chloramphenicol 34 µg/ml und Ampicillin 50 µg/ml).

Zum Gießen fester Nährböden wurde das Flüssigmedium mit 1,5% (w/v) Agar (Becton Dickinson) versetzt und aufgekocht. Nach Abkühlen auf max. 60 °C konnten die Antibiotika dem Medium zugegeben und die Nährflüssigkeit in entsprechende Platten gegossen werden.

5.4. Zelllinien

Alle in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien wurden in RPMI- oder DMEM- Medium (Life/ Gibco) nach Supplementation von 10% FKS und 1% Antibiotika (Penicillin, Streptomycin 100 I.E./ml) kultiviert. Dies wird als naives Medium bezeichnet. Herkunft und Eigenschaft aller in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien sowie weitere Komponenten des entsprechenden Wachstumsmediums sind in der nachfolgenden Tab. 1 aufgelistet

Tab. 1 Name, Eigenschaft/ Herkunft und Wachstumsmedium verwendeter Zelllinien Name der Zelllinie Eigenschaft/ Herkunft Wachstumsmedium Adhärent wachsende, humane embryonale Nierenzellen, die die AdV5 E1-Region sowie das HEK293T DMEM naiv Large T Antigen des SV40 (Simian Virus 40) stabil exprimieren Adhärent wachsende humane Hepatom-Zelllinie, HepG2 etabliert 1976 nach Leberresektion eines HBV RPMI naiv infizierten Patienten Mit pMEP4-episomalem Vektor stabil transfizierte HepG2 Zelllinie zur Expression von HepG2_pMEP4_E4of6wt DMEM naiv, zusätzlich hAdV5 E4orf6 wt bzw. BCmut (BoxB/C HepG2_pMEP4_BCmut 100 µg/ml Hygromycin Mutante) von einem induzierbaren Metallothionein-Promoter Stabil hAdV5 E4orf6 wt bzw. BCmut (BoxB/C Mutante) exprimierende HepG2 Zelllinie mit HepG2_AAVS1_E4orf6wt wie HepG2, zusätzlich 2 Integration der TetON- regulierten HepG2_AAVS1_BCmut µg/ml Puromycin Transkriptionskassette in dem AAVS1 Lokus auf dem Chr. 19 HepG2-Zelllinie mit 1,05x HBV Genom (Subtyp DMEM naiv, zusätzlich HepG2_tTA_HBV_117 ayw), stabil transfiziert und reguliert durch das 1,5 µg/ml Doxycyclin, 185 Material

TetOFF-System (Sun & Nassal, 2006) 200 µg/ ml G418, 80 µg/ml Hygromycin DMEM naiv, zusätzlich Mit einem Oberflächenprotein defizienten 1,5 µg/ml Doxycyclin, HepG2_DHBVenv- -#105 DHBV-Genom, stabil transfizierte und TetOFF 200 µg/ ml G418, 80 regulierte HepG2-Zelllinie µg/ml Hygromycin Mit einem Oberflächenprotein defizienten DMEM naiv, zusätzlich DHBV-Genom, stabil transfizierte und TetOFF HepG2_DHBV-HA #2/3 1,5 µg/ml Doxycyclin, regulierte HepG2-Zelllinie. Die PräC/C-Region (DHA2/3) 200 µg/ ml G418, 80 kodiert ein HA-markiertes precore-Protein µg/ml Hygromycin (Schreiner & Nassal, 2017) HepG2 Wie HepG2_DHBV-HA #2/3 mit integrierter wie DHA #2/3, _DHBV-HA #2/3_Cas9 spCas9 Expressionskassette in den AAVS1 Lokus zusätzlich 1,5 µg/ ml (DHA_Cas9) auf dem Chr. 19 Puromycin Adhärent wachsende humane Hepatom-Zelllinie Huh7 DMEM naiv (Nakabayashi et al., 1982)

5.5. Radiochemikalien

Die Radiochemikalie [α-32P] -dNTP (3000 Ci/mmol, N = A oder G) wurde von Perkin-Elmer (Niederlande) bezogen.

5.6. Puffer und Lösungen

Die verwendeten Puffer sowie Lösungen sind in dem entsprechenden Methodenteil (s. Abschnitt 6) beschrieben.

5.7. Plasmide pAAV-helper #10-1: Expressionsplasmid für die hAdV-Genprodukte E2A, E4 und VA-RNA zur Herstellung von rAAVs (s. Abb. 46B). Freundlicherweise überlassen von Prof. Dr. Dirk Grimm (BioQuant Heidelberg) pAAV-RepCap9A2 #Top10-1: Expressionsplasmid für die AAV Gene rep und cap zur Herstellung von rAAVs (s. Abb. 46B). Freundlicherweise überlassen von Prof. Dr. Dirk Grimm (BioQuant Heidelberg) pCD16+: Vektor mit dem 1,1-fachen Überlängengenom unter Kontrolle des CMV-Promotors pCD16+env-: Wie pCD16+ Vektor, enthält einen „G“ zu „A“ Austausch an Position 1165 zur Einführung eines Stopp-Codons im S-ORF. Dadurch Verhinderung der Virionen-Sekretion und Anreicherung von cccDNA im Zellkern (Summers et al., 1990) pCD16+env-_preC-HA2-5´#2: pCD16+env- Vektor, der einen Hämagglutinin (HA)-tag in der precore Region des DHBV Genoms trägt pcDNA3.1 (-): Eukaryotischer Expressionsvektor pcDNA3.1_E1B55K: Wie pcDNA3.1 mit E1B55k Expressionsgen. Freundlicherweise bereitgestellt von PD Dr. Sabrina Schreiner (Helmholzzentrum, München) pcDNA3.1_E4orf6 SpliceFix: Wie pcDNA3.1 mit hAdV5 E4orf6 Expressionsgen. Enthält

186 Material

Mutationen, die eine Expression des E4orf6/7-Spliceprodukts verhindern. Freundlicherweise bereitgestellt von PD Dr. Sabrina Schreiner (Helmholzzentrum, München) pCEP4: Eukaryotischer Expressionsvektor, der durch EBV-Elemente (EBNA1, OriP) eine persistierende Expression des Transgens unter einem CMV-Promoter erlaubt (Invitrogen). pCEP4_BCmut #3: Wie pCEP4 mit Expressionsgen einer hAdV5 E4orf6-BoxB/C-Doppelmutante (BCmut) pCEP4_E4orf6wt #1: Wie pCEP4 mit Expressionsgen für hAdV5 E4orf6 wt pCEP4_mCherry #1: Wie pCEP4 mit mCherry-Expressionsgen pCMV_Gaussia-Dura_Luc: Eukaryotischer Expressionsvektor zur Synthese von Gaussia Dura Luciferase unter einem CMV-Promoter. pCMVmCherryP2AGFPrepAAVS1sg: Reporterkonstrukt für einen fluoreszenzbasierten Cas9- Aktivitätsassay (s. Abb. 38). CMV-Promoter-regulierte Expressionskassette; kodiert mCherry, P2A- Peptid, ein eGFP-Segment β1-10, dessen eGFP-Segment β11 durch eine sgRNA-Zielsequenz (hier AAVS1-PAM) aus dem Leseraster gebracht wird; kodiert des Weiteren H1-Promoter abhängig für eine AAVS1 spezifische sgRNA. pCMVmCherryP2AGFPrepBsa: Wie pCMVmCherryP2AGFPrepAAVS1sg- enthält anstelle einer sgRNA mit der Zielsequenz für AAVS1 eine BsaI-Restriktionsschnittstelle pEPi_UCOE ex NEB stable #1: Eukaryotischer Expressionsvektor, der durch S/MAR und UCOE- Elemente eine persistierende Expression von eGFP unter einem CMV-IE-Promoter erlaubt. Freundlicherweise bereitgestellt von Frau Dr. Hagedorn (Universität Witten/Herdecke) pEPiX ex NEB stable #2: Eukaryotischer Expressionsvektor, der durch S/MAR-Elemente eine persistierende Expression von eGFP unter einem chimären CMV-Enhancer/chicken β-actin-Promoter erlaubt. Freundlicherweise bereitgestellt von Frau Dr. Hagedorn (Universität Witten/Herdecke) pMEP4: Eukaryotischer Expressionsvektor, der durch EBV-Elemente (EBNA1, OriP) eine persistierende Expression des Transgens unter einem Metallothionein-Promoter erlaubt (Invitrogen). pMEP4_BCmut #1: Wie pMEP4 mit Expressionsgen einer hAdV5 E4orf6-Mutationsvariante (BCmut) pMEP4_E4orf6wt #1: Wie pMEP4 mit Expressionsgen für hAdV5 E4orf6 wt pMEP4_mCherry #4: Wie pMEP4 mit mCherry-Expressionsgen pRSF AAVS1 Cas9 Donor L2-3: SpCas9-DV zur CRISPR/Cas9 Integration in den AAVS1-Lokus (s. Abb. 35). Erlaubt eine konstitutive SpCas9 Expression durch einen EF-1a Promoter. pRSF AAVS1 rTA TRE3G Ad5E4orf6 B/C #1: hAdV5 E4orf6-BCmut kodierende Integrationskassette zur CRISPR/Cas9 Integration in den AAVS1-Lokus. Die Transgenexpression erfolgt von einem TRE3G (TetON)-System (s. Abb. 12). pRSF AAVS1 rTA TRE3G Ad5E4orf6 wt #1: Wie pRSF AAVS1 rTA TRE3G Ad5E4orf6 B/C #1; kodiert statt hAdV5 E4orf6-BCmut das hAdV5 E4orf6 wt. pRSF AAVS1 rTA TRE3G GFP NUP50NL #L3-3: Wie pRSF AAVS1 rTA TRE3G Ad5E4orf6 B/C #1; kodiert statt hAdV5 E4orf6-BCmut eGFP pSSV-GFP-P2A_BsdR_U6-RPA1sh3 (M6): Vektor zur Herstellung von rAAVs; kodiert für eGFP, ein P2A-Peptid, Blasdicidinresistenzgen und eine U6-Promoter kontrollierte shRNA gegen RPA1

187 Material pSSVmCherryH1αGFPopt #1: Vektor zur Herstellung von rAAVs; kodiert für mCherry, ein P2A- Peptid, Blasdicidinresistenzgen und eine HI-Promoter kontrollierte sgRNA gegen GFP pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-2BSa: Vektor zur Herstellung von rAAVs; kodiert für mCherry, ein P2A-Peptid, Blasdicidinresistenzgen. Enthält 2BSa-Restriktionsschnittstellen zur Klonierung von sh/sgRNA Sequenzen unter der Kontrolle eines U6-Promoters. pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-RPA1sh2 (M5): Vektor zur Herstellung von rAAVs; kodiert für mCherry, ein P2A-Peptid, Blasdicidinresistenzgen und eine U6-Promoter kontrollierte shRNA gegen RPA1 pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-αHBVsh10SL#1: Vektor zur Herstellung von rAAVs; kodiert für mCherry, ein P2A-Peptid, Blasdicidinresistenzgen und eine U6-Promoter kontrollierte shRNA gegen HBsAg. pSSVmCherryP2A_BsdR_U6-αTDPsh526#2: Vektor zur Herstellung von rAAVs; kodiert für mCherry, ein P2A-Peptid, Blasdicidinresistenzgen und eine U6-Promoter kontrollierte shRNA gegen Tdp2 pTruf5: Expressionsplasmid zur eGFP Synthese unter einem CMV-Promoter SBI Cas9/gRNA-AAVS1: SpCas9 Expressionsplasmid; kodiert für eine gegen den AAVS1-Lokus gerichtete gRNA. Erworben von SBI

5.8. Primer

Sämtliche Oligonukleotide wurden von der Firma Apara Bioscience GmbH oder Microsynth AG synthetisiert.

Tab. 2 Name, Verwendung und Sequenz aller verwendeten Primer Name Verwendung Sequenz (5´-3´) PCR und Sequenzierung E4wt/ BCmut und AAV25002591(+) CCTCCGCCCAGAGCAGGGTC Cas9 in AAVS1 TD-PCR und Sequenzierung am rechten CTAGATCGGATCCCGTCGAC AAVS1_loxP-HAR+ AAVS1-Holologiearm TGA qPCR β-Laktamase (AmpR) auf pSSV - GGTCTGACAGTTACCAATGC bla- 3´end primer Plasmiden für rAAV Titerbestimmung TTAATCAG qPCR β-Laktamase (AmpR) auf pSSV - CTGGGGCCAGATGGGTAAG bla739-759+ Plasmiden für rAAV Titerbestimmung CCC CM (+)BG9657 PCR und Sequenzierung pCEP4 Insert TCGTAACAACTCCGCCCC GCGGTTTTGGVAGTACATCA CMVprom2+ qPCR für rAAV Titerbestimmung ATGGGC CMVrevNEW qPCR für rAAV Titerbestimmung CCCACCGTACACGCCTACCG TD-PCR und Sequenzierung der CRISPR/Cas9 CCAGGATCCTCTCTGGCTCC HL- Schnittstelle des wildtypischen AAVS1-Allels ATCGT TD-PCR und Sequenzierung am linken AAVS1-Homologiearm sowie der GCCATTGTCACTTTGCGCTG HL+ CRISPR/Cas9 Schnittstelle des wildtypischen CC AAVS1-Allels HPRT PCR und Sequenzierung HPRT HPRT Primermix von IDT CATGGCATCTTCCAGGGGTC HR+ TD-PCR der AAVS1-Integrationskassette C HRmn- TD-PCR und Sequenzierung am rechten ACCCCGAAGAGTGAGTTTGC

188 Material

AAVS1-Holologiearm C Umklonierung von mCherry aus pTRUF- GCATGCGGCCGCCATGGTG mCherry (+) Not 3xFLAG-NTCP-mCherry in pCEP4 und AGCAAGGGCGAGGAGG pMEP4 mit Not1/Bam Enden CAAGCTTGCTAGCGGCCGCT MEPAd5E4orf6+ Gibson Klonierung E4wt/BCmut CGAGATGACTACGTCCGGC Gibs GTTCCATTTG CAATGTATCTTATCATGTCT MEPAd5E4orf6-Gibs Gibson Klonierung E4wt/BCmut GGATCCTACATGGGGGTAG AGTCATAATC PCR und Sequenzierung E4wt/ BCmut in CTGCATTCTAGTTGTGGTTT pCEP4_MEP4_rev pCEP4 und pMEP4 GTCC D1414 26807 Sequenzierung pCD16+env- CCCTTTGGAGAACTGAGAG mCherry mit Not1/Bam Enden für Klonierung GGGCAAACAACAGATGGCT pTRUF_revseq (-) in pCEP4 und pMEP4 GGCAAC TD-PCR und Sequenzierung am linken PuroR- AAVS1-Homologiearm sowie der AAVS1- CCTTGCCGATGTCGAGCCCG Integrationskassette PCR und Sequenzierung E4wt/ BCmut in CTTTAGGCGTGTACGGTGGG TRE3G+ AAVS1 C

5.9. RNA crRNA gegen HPRT und die entsprechende ATTO-550 markierte tcRNA wurde von Integrated DNA-Technologies (IDT) erworben. Die Synthese einer gRNA aus beiden Komponenten erfolgte gemäß Herstellerangaben.

5.10. Enzyme

Sämtliche Restriktionsenzyme und die entsprechenden Puffer wurden, soweit nicht anders angegeben, von New England Biolabs (NEB) bezogen.

DNase I Novagen Micrococcus Nuklease (MN) USB Plasmid Safe DNase (PSD) Epi Centre Proteinase K Qiagen

5.11. Virale Partikel

5.11.1. rAAV CL-rAAV Partikel wurden durch eine Tripeltransfektion mit den im Abschnitt 5.7 angegebenen Plasmiden wie unter 6.5.2 beschrieben generiert. Die Herstellung Iodixanolgradient-gereinigter rAAVs wurde freundlicherweise von Carolin Schmelas am BioQuant in Heidelberg durchgeführt. Alle rAAVs wurden in Aliquots von 100 µl bei -80 °C gelagert.

189 Material

5.11.2. Lentivirus Vektoren Alle shRNA tragenden Lentivirus Vektoren wurden von MISSION® shRNA Merck KGaA/ Sigma erworben. Nicht aufgereinigte Lentiviren mit einer scrambled-shRNA (shSCR) wurden freundlicherweise von PD Dr. Sabrina Schreiner am Helmholzzentrum in München zur Verfügung gestellt. Nicht aufgereinigte Lentiviren mit einem GFP Transgen wurden freundlicherweise von Dr. Eloir Verrier von der Universität Straßburg überlassen. Alle Lentivirus Vektoren wurden bei -80 °C aufbewahrt.

5.12. Antikörper

5.12.1. Primäre Antikörper Tab. 3 Spezifität, Spezies, Hersteller und Verdünnung aller verwendeten Primärantikörper Spezifität (Klon) Spezies Hersteller Verdünnung ANP32A/B (A-2) Maus Santa Cruz 1:1.000 (IB) Cas9 (7A9) Maus Biolegend 1:1.000 (IB, IF) Cullin 5 Kaninchen Bethyl Laboratories. Inc; #A302-173A 1: 5.000 (IB, IP) DHBc (2. Gelege, #Ba09) Huhn Biogenes 1:1.000 (ELISA) DHBc (2B9-4F8) Maus Abnova: MM931100899 1:5.000 (IB) bereitgestellt von S. Schreiner, HPI, E1B55k (2A6) Maus 1:10 (IB) Hamburg bereitgestellt von S. Schreiner, E2A (B6-8) Maus 1:10 (IB) Helmholtz Zentrum, München bereitgestellt von S. Schreiner, E4orf6 (1807) Kaninchen 1:1000 (IP) Helmholtz Zentrum, München Maus, bereitgestellt von S. Schreiner, HPI, E4orf6 (RSA3, 1807) 1:10 (IB, IF) Kaninchen Hamburg GFP (3H9) Ratte Chromotek 1: 2.500 (IB) HA-PO (3F10) Ratte Roche 1:1.000 (ELISA) HBsAg (F-9H9) Maus #970403 (Heijtink et al., 1995) 1:1.000 (ELISA) HIC2 Kaninchen Invitrogen 1:500 (IB) HSPB1/HSP27 (G3.1) Maus Enzo Life Science 1:1.000 (IB) Lamin B1 (AB-1) Maus Calbiochem 1:750 (IB) LANPL/ANP32E Kaninchen Abcam #ab5993 1:500 (IB) Mre11 Kaninchen Novus Biologicals, NB 100-142 1:200 (IB) Myc (9B11) Mause Cell Signaling 1: 1.000 (IB) NAMPT/visfatin Kaninchen Novex #710115 1: 500 (IB) Nedd-8 Kaninchen Cell Signaling #2745 1:1.000 (IB) p53 (DO-1) Maus Santa Cruz 1:1.000 (IB) p53 (Fl393) Kaninchen Santa Cruz 1: (IF) PAI/SerpinA3 (D9C4) Kaninchen Cell Signaling 1:250 (IB) RFP (5F8) Ratte Chromotek 1:2.500 (IB) RPA1 (RPA9, 1-30) Maus Millipore 1:500 (IB) RPA2 (RPA20, 1-46) Maus Millipore 1:500 (IB) RPA3 Kaninchen Sigma #HPA005708 1:250 (IB) 190 Material

Strepatvidin-PO Dianova 016-030-084 1:500 (ELISA) TAGLN2 (C-12) Maus Santa Cruz 1:1.000 (IB) Tdp2 (6149) Kaninchen Biogenes #31574 (33117) 1: 10.000 (IB) β-Aktin (AC-15) Maus Sigma 1: 10.000 (IB) β-Aktin-PO (AC-15) Maus Abcam 1: 10.000 (IB)

5.12.2. Sekundäre Antikörper Tab. 4 Spezifität, Konjugat, Hersteller und Verdünnung aller verwendeten Sekundärantikörper Spezifität Konjugat Hersteller Verdünnung Kaninchen PO Dianova 1: 10.000 (IB) Kaninchen FITC Dianova 1: 100 (IF) Maus Cy3 Dianova 1: 500 (IF) Maus PO Dianova 1: 10.000 (IB) Ratte PO Dianova 1: 10.000 (IB)

5.13. Kommerzielle Kits

ECL und ECL-Plus IB Reagenz GE Healthcare Enzygnost® HBsAg 6.0 Siemens High Prime DNA Labeling Kit Roche KAPA-Hifi Polymerase Peqlab LightCycler® 480 SYBR Green I Master Kit Roche NucleoSpin 8 Plasmid Kit Macherey-Nagel NucleoSpin Gel and PCR Cleanup Macherey-Nagel QIAamp DNA-Mini Kit Qiagen QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen

5.14. Geräte

FACS Fortessa BD FACS-Sorter (Melody) BD FL Mikroskop Zeiss GS Gene Linker Bio-Rad IB- Röntgenfilm Entwicklermaschine AGFA CP100 Lichtmikroskop Zeiss QuiaXpert Fotometer Quiagen Tecan Microplate Reader Tecan Tischzentrifuge Hettich /Eppendorf Trans-Blot SD Semi-dry transfer cell BioRad Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Ultraspec 7000 Fotometer GE Healthcare UV-Detektor Peqlab Light Cycler 480-II Roche

5.15. Software

4Peaks Mek&Tosj DIVA BD DNA Strider Wsksnti Flowjo BD

191 Material

MultiGauge FujiFilm Prism5/Prism8 Graphpad SnapGene Viewer GSL Biotech Typhoon FLA 7000 Phosphoimager GE Healthcare Zen Zeiss

192 Methoden

6. Methoden

6.1. Zellkulturtechniken

6.1.1. Kultivierung von Zellen

Alle Zelllinien wurden in Einschicht-Kulturen bei 37 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die entsprechenden Wachstumsmedien sind in der Tab. 1 aufgelistet. Nach Erreichen der Konfluenz wurde der adhärente Zellrasen mit PBS gewaschen und mit 0,05% Trypsin vom Gefäßboden gelöst (5 min bis 10 min, 37 °C). Je nach Verwendungszweck wurden die Zellen in der gewünschten Verdünnung oder Zellzahl in ein neues Kultvierungsgefäß ausgesät. Zur Kultivierung aller HepG2 Zelllinien wurde der Gefäßboden zuvor mit 1% Kollagen für mind. 10 min beschichtet.

6.1.2. Kryokonservierung von Zellen Für die Lagerung der Zellen über einen längeren Zeitraum bei -80 °C, wurden 1x107 Zellen nach dreiminütiger Zentrifugation bei 1.200 rpm (Hettich, Rotina 380R) und RT in 1 ml Einfriermedium, bestehend aus 10% DMSO und 90% FKS, resuspendiert. Anschließend wurden diese in entsprechende Kryoröhrchen überführt und zunächst in speziellen Einfrierboxen über Nacht bei -80 °C eingefroren. Die weitere Lagerung erfolgte ohne Einfrierbox bei -80 °C. Zur erneuten Wiederaufnahme kryokonservierter Zellen in Kultur, wurden diese rasch aufgetaut und das Einfriermedium durch Zentrifugieren in 10 ml vorgewärmtem Medium für 3 min bei 1.200 rpm (Hettich, Rotina 380R) und RT von den Zellen gewaschen. Anschließend kultivierte man die Zellen in frischem Wachstumsmedium.

6.1.3. Bestimmung der Lebendzellzahl Um eine gewünschte Zellkonzentration einstellen zu können, wurde zuvor die Lebendzellzahl einer Zellsuspension mittels einer Trypanblau-Färbung bestimmt. Diese Vitalitätsfärbung beruht darauf, dass abgestorbene Zellen eine veränderte Membrandurchlässigkeit aufweisen und der Farbstoff Trypanblau, für den die Zellmembran vitaler Zellen nicht durchlässig ist, von abgestorbenen Zellen aufgenommen wird. Sie erscheinen folglich unter dem Lichtmikroskop blau, vitale Zellen hingegen klar. Die Zellsuspension wurde zunächst im Verhältnis 1:4 in einer 0,1%-igen Trypanblau-Lösung verdünnt und 10 µl in eine Neubauer- Zählkammer pipettiert. Unter dem Lichtmikroskop lassen sich 4 große Quadrate erkennen, die wiederum in 16 kleinere Quadrate unterteilt sind. Gezählt wurden alle klar aussehenden 193 Methoden

Zellen in den kleinen Quadraten (in L-Form). Die Lebendzellzahl pro Milliliter errechnet sich durch Multiplikation des Mittelwertes aus den 4 großen Quadraten mit dem Kammerfaktor von 1x104 und dem verwendeten Verdünnungsfaktor.

6.1.4. Generierung stabiler Zelllinien

6.1.4.1. Herstellung einer stabilen Zelllinie durch Verwendung episomaler Vektoren HepG2 Zellen wurden mit 1 µg der entsprechenden Expressionsvektoren pCEP4, pMEP4, pEPI oder pEPI_UCOE transfiziert, dann ab dem dritten Tag mit der Antibiotikaselektion begonnen. Hierzu wurden die Zellen in 200 µg/ml Hygromycin- (pMEP4 und pCEP4) oder in 400 µg/ml Geneticin (G418) - haltigem Wachstumsmedium (pEPI und pEPI_UCOE) für mindestens 3 Wochen kultiviert bis sich erneut ein konfluenter Zellrasen gebildet hat. Als Selektionskontrolle dienten naive HepG2 Zellen, die bei den entsprechenden Antibiotikakonzentrationen nach etwa einer Woche abgestorben sind. Zur Herstellung von Einzelklonen wurden 1.000 Zellen auf eine 10 cm Zellkulturschale ausgesät, sodass sich die Zellen vereinzelt auf dem Gefäßboden absetzten. Durch Teilung der Zellen entstehen sichtbare Zellkolonien, die mit einer 200 µl Pipettenspitze in ein 96-well überführt wurden (je well eine Kolonie). Nach Erreichen einer Konfluenz wurden die selektionierten Einzelklone in das nächstgrößere Zellkulturgefäß weiterpassagiert. Ab einer Zellkulturgröße eines 24-well wurden die Klone für einen entsprechenden Proteinnachweis im IB (s. Abschnitt 6.3.1) verwendet.

6.1.4.2. Generierung stabiler Zellen mittels CRISPR/Cas9 Für die gerichtete Integration des gewünschten Transgens in den AAVS1-Lokus wurde das CRISPR/Cas9 System angewandt. Hierzu wurde ein spCas9 Expressionsplasmid (SBI), dass zudem eine gegen den AAVS1-Lokus gerichtete sgRNA kodiert (SBI Cas9/gRNA-AAVS1), zusammen mit der Integrationskassette in die gewünschten Zellen kotransfiziert (je 1 µg). Nach einer Kultivierung von 3 Tagen erfolgte die Selektion positiv transfizierter Zellen mit Puromycin für mind. 3 Wochen. Zur Herstellung HepG2_AAVS1_E4orf6wt bzw. _BCmut Zellen wurde eine Puromycinkonzentration von 2 µg/ml verwendet. Die Selektion der spCas9 exprimierenden DHA_Cas9 Zellen erfolgte durch Supplementation des Wachstumsmediums mit 1,5 µg/ml Puromycin. Zur Herstellung monoklonaler Zelllinien wurden Einzelklone wie im Abschnitt 6.2.1 beschrieben bis zur 24-well expandiert und die Proteinexpression im IB bestätigt. Die Verifizierung der gewünschten Integration in den AAVS1 Lokus erfolgte durch

194 Methoden

Amplifikation der AAVS1-Schnittstellen an beiden Homologiearmen mittels TD-PCR (s. Abschnitt 6.2.4).

6.2. Molekularbiologische Standardmethoden

Alle in diesem Kapitel nicht ausführlich beschriebenen Methoden wurden nach bekannten Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., 1989).

6.2.1. Klonierung eines Transgens in die episomalen Vektoren pMEP4 und pCEP4

6.2.1.1. Klonierung von mCherry Das Gen für mCherry wurde aus dem Vektor pTRUF-3xFLAG-NTCP-mCherry mittels KAPA HiFi Polymerase amplifiziert und in die episomalen Vektoren zwischen Not1 und BamH1 kloniert. Kompatible Überhänge sowie ein eigenes Start-Codon für mCherry waren in den PCR-Primern mCherry (+) Not/ pTRUF_revseq (-) enthalten. Abschließend wurde das PCR-Integrat mit Not1 und Bcl1, dass dem BamH1 identische Schnittstellen generiert, verdaut. Um die Ligationseffizienz von Integrat und Vektor zu steigern, wurde das Vektorfragment mit Not1 und SgrA1 sowie mit BamH1 und SgrA1 in je zwei Teile geschnitten. Im finalen Schritt erfolgte eine Drei-Faktor-Ligation mit dem Integrat.

6.2.1.2. Klonierung von E4orf6 wt/ BCmut Das Gen für hAdV5 e4orf6 wt und für die BoxB/C Doppelmutante (bcmut) wurde aus dem pcDNA-E4orf6 SpliceFix Vektor durch Restriktionsverdaus mit Sac I und Xho I isoliert. Das Vektor pCEP4 wurde mit Bst BI linearisiert und in zwei getrennten Reaktionen je eine Sac I- oder eine Xho I-Schnittstelle generiert. Nach Aufreinigung der gewünschten DNA-Fragmente mittels NAGE, wurden diese mit dem entsprechenden e4orf6 oder bcmut Gen ligiert.

Das DNA-Rückgrat des pMEP4 Vektors ist dem des pCEP4 Vektors sehr ähnlich, allerdings fehlt dem Vektor die für die Klonierung in pCEP4 verwendete Sac1 Schnittstelle. Daher wurde das Gibson-Assembly Klonierungs-Kit von NEB verwendet, das überlappende Sequenzen an den Verbindungsstellen der zu ligierenden Fragmente voraussetzt. Hierzu wurde der Polylinker (multiple cloning site, MCS) von pMEP4 mit Xho1 und BamH1 verdaut und dem zu integrierenden Gen mit Überhang-Primern in einer PCR komplementäre Enden zugefügt (KAPA-Hifi-Polymerase gemäß Standardprotokoll; Primer: MEPAd5E4orf6(+) / (-) Gibs). In einer one-pot-Reaktion generiert eine 5´-3´ Exonuklease zunächst einzelsträngige Überhänge, wodurch die komplementären Enden von Integrat und Vektor hybridisieren

195 Methoden können. Entstandene Lücken werden anschließend durch eine DNA-Polymerase geschlossen. Im letzten Schritt vermittelt eine Ligase die kovalente Verbindung der aufgefüllten Stränge.

6.2.2. Sequenzierung Die Verifizierung aller klonierten Gene sowie alle sonstigen Sequenzanalysen erfolgten durch die Firma Seqlab GmbH oder Eurofins Genomics GmbH.

6.2.3. Isolierung genomischer DNA Die Aufreinigung der genomischen DNA erfolgte mit dem QIAamp-Kit von Qiagen nach Herstellerangaben.

6.2.4. Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) Alle PCR-Amplifikationen wurden mit der Kappa-Hifi-Polymerase Kit (Peqlab) unter Standardbedingungen durchgeführt. Der Nachweis einer korrekten Transgenintegration in den AAVS1-Lokus erfolgte in einer Touchdown-PCR. Das Programm ist in der Tab. 5 beschrieben. Die PCR-Produkte wurden in einem 1% TAE Agarosegel (s. Tab. 12) mit 0,5 µg/ ml Ethidiumbromid bei konstant 80 V für ≥30 min aufgetrennt und unter UV-Licht validiert. Wenn nötig wurden die entsprechenden Fragmente mit dem NucleoSpin Gel and PCR Cleanup Kit (Macherey Nagel) zur weiteren Verwendung aus dem Gel gereinigt.

Tab. 5 Reaktionsablauf der TD-PCR Schritt Temperatur [°C] Dauer Zyklen (Beginn) Vorgang 1 98 3 min Initiale Denaturierung 2 98 20 sec Denaturierung der Matrize 3 69 30 sec Primer Annealing 4 72 30 sec 4 (2) Elongation 5 98 20 sec Denaturierung der Matrize 6 68 30 sec Primer Annealing 7 72 30 sec 4 (5) Elongation 8 98 20 sec Denaturierung der Matrize 9 67 30 sec Primer Annealing 10 72 30 sec 4 (8) Elongation 11 98 20 sec Denaturierung der Matrize 12 66 30 sec Primer Annealing 13 72 30 sec 11 (11) Elongation 14 72 5 min Finale Elongation 15 4 ∞ Kühlung

6.2.5. Quantitative PCR (qPCR) Die Durchführung der qPCR erfolgte mit dem LightCycler® 480 SYBR Green I Master Kit (Roche) gemäß Herstellerangaben. Diese Methode ermöglicht eine Vervielfältigung von

196 Methoden

Nukleinsäuren mit gleichzeitiger Quantifizierung der amplifizierten DNA und wurde in dieser Arbeit zur Titration von enkapsidierten rAAV-Genomen verwendet. Die zu analysierende Probe wurde zunächst zum Aufschluss der rAAV-Kapside für 30 min bei 56 °C mit 1 M NaOH behandelt. Nach Neutralisation mit 1 M HCl wurden die Ansätze 1:10 in Wasser verdünnt und 5 µl mit je 1 µl der entsprechenden Primer (bla 739-759+/ bla- 3´endpr oder CMVprom 2+/ CMVrevNEW) und 10 µl SYBR Green PCR Master Mix in einem Gesamtvolumen von 20 µl gemischt. Das Standard PCR Programm ist in der Tab. 6 aufgeführt. Der Ct-Wert wurde aus zwei Messungen ermittelt. Für die Messung viraler Genome wurde die absolute Quantifizierung, unter Verwendung eines entsprechenden pSSV- Plasmid-Standards (s. Abschnitt 5.7) herangezogen.

Tab. 6 Reaktionsablauf der qPCR Schritt Temperatur [°C] Dauer Zyklen (Beginn) Vorgang 1 95 5 sec 1 Enzymaktivierung 2 95 15 sec Denaturierung der Matrize 3 57 30 sec Primer Annealing 4 72 30 sec 45 (2) Elongation

6.2.6. Transfektion und Nucleofection Für die Transfektion aller Hepatomzelllinien wurde das Reagenz TransIT®-LT1 (MirusBio) gemäß den Herstellerangaben verwendet. Die Transfektion von HEK293T Zellen zur Herstellung rAAVs erfolgte mit PEI und ist im Abschnitt 6.5.2 näher beschrieben. Die Durchführung der Nucleofektion erfolgte gemäß den Standardangaben von IDT. Es wurden 1x106 Zellen in 100 µl Nukleofektor-Puffer aufgenommen und mit 3,5 µl einer 100 µM gRNA-Lösung mit dem Zellprogramm (Programm 2) im Nucleofector (Lonza) behandelt.

6.2.7. Transduktion von HepG2 Zellen mit viralen Partikeln (rAAV / Lentiviren) Die rAAV Transduktion erfolgte in standardmäßig im 12-well Format. Pro well wurden 3x105 der gewünschten HepG2 Zellen ausgesät und am folgenden Tag mit einer MOI von 5x104 oder 50–100 µl CL transduziert. Hierzu wurde das entsprechende Virus-Volumen in das Medium auf die Zellen pipettiert. Zur Steigerung der Transduktionseffizienz wurde das Medium mit 2% DMSO versetzt. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel und die weitere Kultivierung bis zur Ernte der Ansätze in Wachstumsmedium (ohne DMSO).

Die Transduktion mit Lentivirus Partikeln erfolgte im 48-well Format. Zunächst wurden 1,5x105 Zellen pro well ausgesät und am folgenden Tag mit 150 µl eines Lentivirus Lysats oder im Falle der kommerziell erworbenen Lentivirus Vektoren (Sigma) mit einer MOI von 3 197 Methoden für 6 h in einem Gesamtvolumen von 250 µl transduziert. Anschließend wurde das Medium auf 500 ml mit Wachstumsmedium aufgefüllt. Nach 2-3 Tagen wurden die Zellen mit 2 µg/ml Puromycin selektioniert, bis alle naiven HepG2 Zellen (Negativkontrolle) abgestorben waren (≥7 Tage).

6.2.8. Southern Blot (SB) und DNA-Hybridisierung Die Herstellung radioaktiver (32P) Sonden erfolgte unter Verwendung des High Prime DNA Labeling Kit (Roche) gemäß Herstellerangaben; als Matrize diente ein 3 kb großes DHBV- Fragment, das durch Verdau des pCD16+ Vektors (s. Abschnitt 5.7) mit AlwN-I und Alf-II isoliert wurde.

Nachzuweisende virale DNA wurde in einem 1,2%-igen Agarosegel in 0,5x TBE Puffer (s. Tab. 7) elektrophoretisch aufgetrennt und über Nacht auf eine positive geladene Nylonmembran transferiert. Für eine genaue Zuordnung der DNA-Banden wurden stets ccc- und rc-DNA Marker mitgeführt (50- 100 pg, basierend auf dem pUC18-Vektor, 3023 bp), Zur Erleichterung des Kapillartransfers der DNAs wurden diese zunächst durch Schwenken des Agarosegels in 0,25 M HCl für 30 min partiell fragmentiert, , dann für 30 min in 0,5 M NaOH/ 1,5 M NaCl denaturiert. Die abschließende Neutralisation erfolgte für 30 min in Tris HCl pH 7,5/ 1,5 M NaCl. Nach Äquilibrieren des Gels für 20 min in 20x SSC (s. Tab. 7) erfolgte der Kapillartransfer über Nacht in Anwesenheit von 20x SSC. Abschließend wurde die Nukleinsäure durch UV-Bestrahlung (2x 150 mJoule) auf der Membran immobilisiert. Vor Zugabe der denaturierten 32P-markierten Sonde wurde die Membran für 1 h bei 60 °C im Drehinkubator mit QuickHyb-Lösung (Stratagen) vor-hybridisiert. Die eigentliche Sonden- Inkubation erfolgte in der Regel drehend über Nacht bei 60 °C. Es folgte ein Waschschritt mit 2x SSC/ 0,1% SDS für 30 min und ein Waschschritt mit 0,1x SSC/ 0,1% SDS für 10 min mit auf 60 °C vorgewärmten Lösungen. Die Detektion der radioaktiven Signale erfolgte im Phosphoimager und/oder durch Exposition eines Röntgenfilms bei -80 °C.

Tab. 7 Puffer für den SB Puffer Zusammensetzung 1x TBE 89 mM Tris Base; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA 1x SSC 150 mM NaCl; 15 mM Natriumcitrat; pH 7,0

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6.3. Immun-Biochemische Methoden

6.3.1. Immunoblot (IB) Im Anschluss an die SDS-PAGE (s. Abschnitt 6.4.3) wurden die separierten Proteine auf eine in Methanol aktivierte Membran aus PVDF immobilisiert. Dies erfolgte in der Semi-Dry Blotting Apparatur von Biorad, für 30 min bei 15 V. Für den Blot-Aufbau wurden zunächst 3 Whatman-Filterpapiere auf die Anode gelegt. Es folgte die Membran, das Gel und abschließend erneut 3 Filterpapiere. Alle Schichten wurden zuvor in Semi-Dry-Transferpuffer (s. Tab. 8) getränkt bzw. das Gel darin für mindestens 5 min äquilibriert. Der Transfer von Proteinen einer hohen molekularen Masse (>60 kDa) erfolgte mittels eines Nasstransfers in der Blotting-Kammer von Biorad in 1x Nasstransfer-Puffer (s. Tab. 8) für 1 h bei 100 V. Die gesamte Apparatur wurde zur Kühlung auf Eis gestellt. Anschließend wurde die Membran zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen für 1 h bei RT in Milchpuffer (s. Tab. 8) geblockt und anschließend über Nacht bei 4 °C mit dem jeweiligen Primärantikörper in Milchpuffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für je 5 min in 1x TTBS (s. Tab. 8) wurde die Membran mit einem geeigneten Meerettichperoxidase (PO) gekoppelten Sekundärantikörper bei RT für 1 h inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit 1x TTBS (3- mal für je 5 min) wurde der Antikörper-Proteinkomplex nach Zugabe einer ECL- Substratlösung durch Chemilumineszenz auf Röntgenfilm detektiert.

Tab. 8 Puffer für den IB Puffer Zusammensetzung Semi-Dry-Transferpuffer 48 mM Tris; 39 mM Glyzin; 20% (v/v) Methanol 10x Nasstransfer-Puffer Tris (60,6g), Glycin (288,2g), 20% (v/v) Methanol Milchpuffer 5% Magermilchpulver in 1x TTBS 1x TTBS 100 mM Tris-HCL pH 8,8; 150 mM NaCl; 0,2% (v/v) Tween20

6.3.2. Durchflusszytometrie (FACS) Zur quantitativen Auswertung der FL-Marker mCherry oder GFP wurden die Zellen zum gewünschten Zeitpunkt nach der Transduktion oder Transfektion 1x mit PBS gewaschen, mit 0,05% Trypsin gelöst und in 1% FKS/PBS aufgenommen. Zum Waschen wurden die Zellen bei 1.200 rpm (Hettich, Rotina 380R) für 3 min pelletiert, in PBS gelöst und erneut unter den genannten Bedingungen sedimentiert. Anschließend wurden die Zellen in einer Zelldichte von 3x105 pro 300 µl in 1% FKS/PBS aufgenommen. Zur lebend-tot Unterscheidung wurde der Farbstoff 7-AAD gemäß Herstellerangaben (BD #555816) verwendet.

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6.3.3. HA-ELISA Der Nachweis von HA-markiertem DHBeAg (HAeAg) in Zellkulturüberständen erfolgte mittels eines Sandwich-ELISA. Hierzu wurde eine 96-well Platte mit einem polyklonalen DHBc/DHBe-reaktiven Antikörper aus Huhn (Ba09) in einer Verdünnung von 1:1.000 in PBS beschichtet. Je well wurde stets ein Volumen von 350 µl pipettiert. Nach mindestens 3 h bei RT wurde die Lösung abgekippt und die Platte viermal mit Waschpuffer (PBS/ 0,05% Tween20) gewaschen. Nach dem Blocken unspezifischer Bindungsstellen mit Blockierungs- Puffer (PBS/0,05% Tween20 und 3% BSA) für mindestens 3 h bei RT wurde die Platte mit den entsprechenden Proben über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach 4-maligem Waschen wurde zur Detektion des HAeAg ein PO-gekoppelter HA-Antikörper (Roche #3F10) in einer Verdünnung von 1:1.000 in Blockierungs-Puffer verwendet. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C und erneutem Waschen wurde das Antigen mittels Tetramethylbenzidin (TMB) als chromogenem Substrat nachgewiesen. Hierzu wurden 300 µl TMB-Lösung (Sigma) in jedes well pipettiert und die Platte für 30 min im Dunkeln inkubiert. Nach einem ausreichend starken blauen Farbumschlag wurde die Reaktion durch die Zugabe von 50 µl 5 M H2SO4 gestoppt, dann die Absorption bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (TECAN SPARK) gemessen.

6.3.4. HBsAg-ELISA Zunächst wurde eine 96-well Platte mit dem monoklonalen humanen anti-HBsAg Antikörper F-9H9 1:1.000 in PBS für 3 h bei RT beschichtet. Nach 5-maligem Waschen mit PBS/0,05% Tween20 folgte das Blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit PBS/0,05% Tween20 und 3% BSA für 1 h. Die Blockierungslösung wurde abgekippt und 150 µl der zu analysierenden Probe je 96-well pipettiert. Nach einer Inkubation für 2 h bei RT wurden in jeden Ansatz 25 µl des anti-HBs-Biotinkonjugates (Konjugat 1) aus dem kommerziellen HBsAg Enzygnost- Kit (Siemens) zupipettiert. Nach 1 h bei RT wurde 5-mal gewaschen (PBS/0,05% Tween20), dann die wells mit PO-gekoppeltem Streptavidin (1:500 in PBS/0,05% Tween20, 3% BSA) für 30 min bei RT inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurde gebundenes HBsAg mittels TMB wie in Abschnitt 6.3.3 die Absorption bei 450 nm bestimmt.

6.3.5. Immunofluoreszenzfärbung (IF) Es wurden 3x105 Zellen auf ein mit Kollagen beschichtetes, steriles Glasplättchen ausgesät. Zur einfachen Handhabung erfolgte die Färbung in einer 12-well Platte. Es wurde stets ein Volumen von 500 µl pro 12-well verwendet. Nach Absetzen der Zellen über Nacht wurden diese mit 4% PFA/ PBS für 15 min bei RT fixiert. Anschließend wurde 4x mit PBS 200 Methoden gewaschen und die Zellen mit 0,2% TritonX100/ PBS für 30 min bei RT solubilisiert. Nach 4- maligem Waschen mit PBS folgte die Absättigung unspezifische Bindungsstellen mit 5% FKS/ PBS für 30 min bei 37 °C. Für die spezifische Färbung intrazellulärer Proteine wurde der primäre Antikörper in der entsprechenden Verdünnung in 0,1% FKS/ PBS auf die Zellen pipettiert und die Ansätze für 1 h bei 37 °C inkubiert. Alle verwendeten Antikörper sowie die jeweilige Verdünnung sind in der Tab. 3 und Tab. 4 aufgelistet. Nach 4-maligem Waschen mit PBS folgte die Inkubation der Ansätze mit einem FL-gekoppelten, sekundären Antikörper in der jeweiligen Verdünnung in 0,1% FKS/ PBS für 1 h bei 37 °C. Nach wiederholtem Waschen (4x PBS) folgte die Kernfärbung mit DAPI (1:750 einer 0,5 mg/ml Stock-Lösung) für 5 min bei RT im Dunkeln. Abschließend wurde erneut 4x mit PBS gewaschen und die Zellen mit Wasser überschichtet, um mögliche Salzrückstände aus PBS zu entfernen. Alle Ansätze wurden in Mowiol auf einem Objektträger eingebettet.

6.3.6. Immunopräzipitation (IP) Mittels einer IP können Proteine bzw. Proteinkomplexe isoliert und angereichert werden. Hierzu wird zunächst der gewünschte Protein-spezifische Antikörper an eine Sepharose- Matrix gekoppelt. Hier wurde meist Protein A-Sepharose benutzt, die den Fc-Teil von Maus- und Kaninchen-Immunglobulinen gut bindet. Pro Ansatz mit 1.000 µg Gesamtprotein wurden je 3 mg Protein A-Sepharose beads zum Aufquellen für 20 min bei 4 °C in eiskaltem RIPA- Puffer (s. Abschnitt 6.4.2.1) über Kopf rotiert. Nach Zentrifugation bei 6.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) für 2 min bei 4 °C wurden die beads mit der gewünschten Menge des primären Antikörpers für 1 h bei 4 °C über Kopf rotiert. Das Reaktionsgefäß wurde stets mit RIPA-Puffer aufgefüllt. Nach erneuter kurzer Zentrifugation wurde das Sediment 2x mit eiskaltem RIPA-Puffer gewaschen. Für die IP wurden je 1.000 µg Gesamt-Protein zugegeben und die Ansätze für 1 h bei 4 °C über Kopf rotiert. Ab hier wurde strikt darauf geachtet, dass der verwendete RIPA-Puffer eiskalt mit frischen Protease Inhibitoren versetzt war. Abschließend wurde wieder zentrifugiert, das Sediment 2x mit RIPA-Puffer gewaschen, in 25 µl 5x SDS Ladepuffer aufgenommen und für 5 min bei 95 °C gekocht. Dadurch gehen die gebundenen Proteine in Lösung; die Sepharose beads wurden vor der anschließenden SDS- PAGE durch Zentrifugation für 5 min bei 14.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) abgetrennt. Durch Ko-Immunpräzipitation ist es möglich, spezifische Proteinbindungen an dem vom Antikörper erkannten Protein nachzuweisen.

201 Methoden

6.4. Methoden zum Nachweis von Proteinen

6.4.1. Induktion der E4orf6 Proteinexpression In den pMEP4-Zelllinien wird die Transkription des wt e4orf6 bzw. der entsprechenden BC- Mutante (BCmut) durch die Bindung zweiwertiger Ionen an den Metallothionein Promoter des Episoms aktiviert. In den Versuchen erfolgte die Induktion der Proteinexpression, wenn nicht anders vermerkt, durch die Zugabe von 100 µM ZnSO4 für mindestens 24 h.

Für die Induktion der Proteinexpression in den TetON Zellen mit den AAVS1-integrierten E4orf WT und BCmut Kassetten wurde zur Aktivierung des Tetracyclin abhängigen TRE Promoters das Medium auf 1,5 µg/ml Dox eingestellt. Die Bindung von Dox erhöht stark die Affinität des reversen Tet-Transaktivators (rtTA) für den TRE Promoter und induziert so die Proteinexpression. Auch hier erfolgte die Induktion für mindestens 24 h.

6.4.2. Zelllyse und Proteinernte

6.4.2.1. Herstellung von Gesamtzellextrakten Zur Zellernte wurde der Zellrasen mit PBS gewaschen, die Zellen mit 0,05% Trypsin abgelöst, in 1% FKS/PBS aufgenommen und durch Zentrifugation bei 1.200 rpm (Hettich Rotina 380R) für 3 min sedimentiert. Nach erneutem Waschen mit PBS und anschließender Sedimentation erfolgte die Zelllyse durch Zugabe von 250 µl/6-well 1x SDS-Lysepuffer (s. Tab. 9), versetzt mit 10 mM DTT. Abschließend wurden die Proben bei 95 °C für 5 min denaturiert. Sollte in der sich anschließenden SDS-PAGE (s. Abschnitt 6.4.3) eine definierte Menge an Proteinextrakt verwendet werden, erfolgte die Zelllyse durch Inkubation des Zellsediments mit 100 µl /6-well RIPA-Puffer (s. Tab. 9) für 30 min auf Eis. Dabei wurden die Proben alle 10 min gevortext, um die Zell- wie auch die Kern-Membran zu zerstören. Für einen vollständigen Zellaufschluss wurden die Zelllysate für 80 s im Ultraschallbad behandelt. Der nach Zentrifugation bei 11.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) für 3 min gewonnene Überstand wurde für die Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford- Assay (Bio-Rad Proteinassay) gemäß Herstellerangaben herangezogen. Das zu verwendende Volumen wurde mit SDS Lysepuffer versetzt und bei 95 °C für 5 min gekocht.

Tab. 9 Puffer zur Herstellung von Gesamtzellextrakten Puffer Zusammensetzung 1x SDS- Lysepuffer 1% SDS; 31,25 mM Tris pH 6,8; 2,5% Glycerin; 2,5% ß- Mercaptoethanol; 0,005% Bromphenolblau RIPA-Puffer 50 mM Tris-HCL, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% SDS (w/v), 1% NP40 (v/v), 0,5% Natriumdeoxycholat (v/v)

202 Methoden

6.4.2.2. Herstellung von Kernextrakten aus Zelllinien Zur Anreicherung nukleärer Proteine wurde das zuvor mit PBS gewaschene Zellsediment in Lysepuffer resuspendiert und für 20 min auf Eis inkubiert. Um die Zellmembran zu zerstören, wurden die Ansätze zwischenzeitlich gevortext. Dabei bleibt die nukleäre Membran intakt, sodass die zytoplasmatische Zellfraktion durch Zentrifugation bei 12.000 rpm (Hettich Rotina 380R) und 4 °C für 10 min von den Zellkernen getrennt werden kann. Das verbleibende Sediment wurde in Kern-Extraktionspuffer resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Abschließend wurde der Kernextrakt durch Zentrifugation bei 12.000 rpm und 4 °C für 15 min geklärt und die verbleibende Kernfraktion mit 1x SDS Lysepuffer (s. Tab. 9) versetzt sowie bei 95 °C für 5 min denaturiert.

Tab. 10 Puffer zur Herstellung von Kernextrakten Puffer Zusammensetzung Lysepuffer 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 0,1 M EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NP40, PIC, 0,5 mM AEBSF Kern- Extraktionspuffer 20 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, PIC, 1 mM AEBSF

6.4.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht erfolgte mittels eindimensionaler SDS-PAGE. Durch den hohen SDS Überschuss im Lysepuffer lagert sich das negativ geladene SDS an die Proteine proportional ihrer Länge an; dank gleichem Masse/Ladungsverhältnis trennen sich im elektrischen Feld die nun universell negativ geladenen Protein-SDS-Komplexe in den Poren des SDS-Gels näherungsweise gemäß ihrer Molmassen auf. Für die hier eingesetzte diskontinuierlichen Elektrophorese wurde das je nach Größe der zu trennenden Proteine 7,5- 15%-ige Trenngel mit einem 5%-igen Sammelgel überschichtet. Dieses dient zur Fokussierung der Proteine an der Lauffront und gewährleistet ein nahezu gleichzeitiges Eintreten aller Proteine in das Trenngel. Beide Gelsystemen enthielten jeweils 0,1% (w/v) SDS. Die Elektrophorese erfolgte bei 30 mA je Gel für 45 min in einer mit 1x Laufpuffer (s. Tab. 11) befüllten Kammer (Biorad). Als Größenmarker diente eine Leiter vorgefärbter Proteine (PageRulerTM Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific). Die aufgetrennten Proteine wurden entweder mittels Coomassie Brillantblau Färbung (s. Tab. 11) sichtbar gemacht oder für den immunologischen Nachweis auf eine PVDF Membran transferiert (s. Abschnitt 6.3.1). Für die Coomassie Färbung wurde das Gel für 30 min in Coomassie-Blue schüttelnd inkubiert. Nicht gebundener Farbstoff wurde anschließend mittels Entfärberlösung (s. Tab. 11) ausgewaschen. 203 Methoden

Tab. 11 Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE Lösung/Puffer Zusammensetzung Trenngelpuffer 1,5 M Tris-HCL, pH 8,8 Sammelgelpuffer 1 M Tris-HCL, pH 6,8 1x SDS PAGE Laufpuffer 25 mM Tris; 192 mM Glyzin; 0,1% (w/v) SDS Coomassie Brillantblau Färbelösung 0,06% (w/v) Coomassie Brillantblau R250; 50% (v/v) Methanol; 10% (v/v) Essigsäure Entfärberlösung für Coomassie 5% (v/v) Methanol; 7,5% (v/v) Essigsäure

6.4.4. Native Gelelektrophorese (NAGE) zum Nachweis hepadnaviraler Kapside Die NAGE ermöglicht die Untersuchung von Proteinen im nativen Zustand und wurde in dieser Arbeit zur Detektion hepadnaviraler Kapside verwendet, die aufgrund ihrer negativen Gesamtladung im elektrischen Feld zur Katode wandern. Anschließend wurden die Proteine auf eine PVDF Membran transferiert und zur Detektion mittels IB (s. Abschnitt 6.3.1) mit spezifischen Antikörpern gegen das DHBV Kapsid, meist dem monoklonalen Maus- Antikörper 2B94F8 (Vorreiter et al., 2007) in 1:5.000 Verdünnung (Vorreiter et al., 2007), gefolgt von einem geeigneten Sekundär-Antikörper-Konjugat inkubiert. Im Detail wurden die zu analysierenden Zellen zunächst mit 0,05% Trypsin vom Kulturgefäßboden gelöst, einmal mit PBS gewaschen (500 µl, 1.200 rpm (Hettich Rotina 380R), 3 min) und das Zellsediment in 500 µl/6-well NP40 Lysepuffer (s. Tab. 12) resuspendiert. 20 µl des durch Zentrifugation für 5 min bei 4.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5425R) entstandenen Überstandes

(zytoplasmatische Fraktion) wurde mit 0,5 µl 0,1 M MgCl2 und 0,1 M CaCl2 sowie 1 µl 5 U/µl Micrococcus Nuclease versetzt und für 1 h bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Hierdurch werden nicht-enkapsidierte Nukleinsäuren degradiert, die das Laufverhalten der viralen Partikel im elektrischen Feld beeinflussen können. Anschließend wurde die Ansätze mit DNA-Ladepuffer (s. Tab. 12) versetzt und auf ein 1%-iges Agarosegel in 1x TAE Puffer (s. Tab. 12) für 1 h 30 min bei konstanten 90 V aufgetrennt. Nach Äquilibrieren des Gels in 1x TNE-150 Puffer (s. Tab. 12) für 10 min erfolgte der Transfer über Nacht in 1x TNE-150 Puffer. Die folgenden Schritte sind identisch mit den IB (s. Abschnitt 6.3.1).

Tab. 12 Puffer für die NAGE Lösung/Puffer Zusammensetzung 1x NP40- Lysepuffer 140 mM NaCl; 0,5% NP-40; 50 mM Tris-HCL pH 8,8 1x DNA-Ladepuffer 5% Glycerin; 8,3 mM EDTA pH 8,0; 0,025% Bromphenolblau; 0,025% Xylencyanol 1x TAE Puffer 40 mM Tris-Base; 40 mM Essigsäure; 1 mM EDTA 1x TNE-150 10 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA

204 Methoden

6.5. Experimentelle Methoden

6.5.1. Human Adenovirus 5 (hAdV5) Infektion Die Adenovirus-Infektionsexperimente wurden im Rahmen eines Laboraustausches am Helmholzzentrum München in der Forschungsgruppe von PD Dr. Sabrina Schreiner durchgeführt. Vor der eigentlichen Infektion der E4wt bzw. BCmut exprimierenden Zelllinien wurden 4x106 Zellen pro 10 cm Kulturschale über Nacht in Wachstumsmedium ausplattiert und anschließend für weitere 24 h in Protein-Induktionsmedium (s. Abschnitt 6.4.1) kultiviert. Die Infektion erfolgte entweder mit hAdV5-wt oder einer E4orf6-defizienten Mutante (hAdV5-ΔEforf6) mit einer MOI von 20. Hierzu wurde das entsprechende Volumen Virussuspension in 5 ml/10 cm-Schale Kulturmedium ohne FKS und andere Zusätze pipettiert und die Zellen für 2 h darin im Brutschrank inkubiert. Anschließend erfolgte die Kultivierung der Zellen in Protein-Induktionsmedium für weitere 72 h.

6.5.2. Herstellung von rAAVs in HEK293T Zellen Die rAAV-Virusproduktion erfolgte in HEK293T Zellen. Es wurden 8x106 Zellen pro 10 cm Kulturschale ausgesät, wobei pro zu verpackendes Transgen 6x 10 cm Platten verwendet wurden. Am folgenden Tag erfolgte die Dreifach-Transfektion mit (i) einem Plasmid für die viralen Komponenten cap und rep, (ii) einem Adeno-Helfer Plasmid, das die Gene e4, e1a und va des Adenovirus trägt, sowie (iii) dem AAV-Vektor, auf dem die gewünschte Transgen-Kassette von ITRs flankiert vorliegt. Die Transfektion erfolgte mit Polyethylenimin (PEI), einem polykationischen Polymer (25 kDa). Es bindet durch elektrostatische Wechselwirkung an die anionische DNA. Dank einer positiven Oberflächenladung binden die DNA-PEI Komplexe bei der Transfektion an die Zelloberfläche und gelangen dann durch Endozytose ins Zellinnere. PEI- und DNA-Lösung wurden gemäß Tab. 13 separat hergestellt. Die NaCl-Lösung sollte erst unmittelbar vor dem Mischen von PEI-Mix und DNA-Mix zupipettiert werden. Der vereinigte Ansatz wird gut gemischt und nach einer Inkubationszeit von 10 min bei RT tröpfchenweise auf die Zellen pipettiert. Nach Kultivierung für 72 h wurden die Transfektionsansätze geerntet. Hierzu wurden die Zellen im Medium von der Kulturschale abgeschabt, in einem 50 ml Reaktionsgefäß gesammelt und durch Zentrifugation für 10 min bei 4.000 rpm (Hettich Rotina 380R) sedimentiert. Im Folgenden wurden die Zellen 1x mit PBS gewaschen (10 min, 4.000 rpm) und in 500 µl/3x 10 cm Kulturschale in PBS aufgenommen. Die eigentliche Virusernte erfolgte in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß durch Aufschluss der Zellen mittels 5 wiederholten Einfrier- (in einem Ethanol/Trockeneis- Gemisch) und Auftauzyklen (37 °C- Wasserbad) mit anschließender Behandlung der Lysate 205 Methoden im Ultraschallbad für 80 s. Zelltrümmer wurden bei 13.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) für 10 min sedimentiert und die sich im Überstand befindenden rAAV-Partikel als Aliquots von 100 µl bei -80 °C gelagert. Diese nicht weiter aufgereinigten Virus-Überstände werden als Crude Lysate (CL) bezeichnet. Die Bestimmung viraler Genome (vge) (Titration) erfolgte mittels qPCR (s. Abschnitt 6.2.5).

Tab. 13 Lösungen für die Herstellung von rAAVs Lösung Zusammensetzung

PEI 1 mg/ml PEI in H2O, pH 7,2

PEI-Mix (3x 10 cm) 790 µl H2O 790 µl 300 mM NaCl 14,7 µg Helfer-Plasmid 14,7 µg cap/ rep-Plasmid 14,7 µg Transgene (AAV-Vektor) DNA-Mix (3x 10 cm) 350 µl PEI 790 µl 300 mM NaCl

440 µl H2O

6.5.3. T7 Endonuklease-Assay (Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) Zum Nachweis von Editier-Ereignissen wurde die Amplifikation jeweilige Zielregion mittels spezifischer Primer (für HPRT der Primermix von IDT) mit dem KAPA-Hifi Polymerase-Kit (Peqlab) unter Standardbedingungen amplifiziert. Anschließend wurden 200 ng des aufgereinigten PCR-Fragmentes (1083 bp) mit 1x NEB Puffer 2 und dH2O auf ein Gesamtvolumen von 18 µl gebracht und für 10 min bei 95 °C denaturiert. Ein langsames Abkühlen bei RT gewährleistet die Rehybridisierung von mutierten- und Wildtyp-DNA- Strängen. Enthalten die entstandenen Heteroduplexe 2 oder mehr nicht gepaarte Nt in Folge werden sie von der Endonuklease (E1) T7 (NEB) gespalten. Für den entsprechenden Verdau wurden die Ansätze mit 2 U/µl E1T7 versetzt und für 1 h bei 37 °C geschüttelt. Die entstandenen Spaltprodukte (872 bp und 256 bp) wurden abschließend in einem 1%-igen 1x TAE/ 0, 5µg/ml EtBr Agarosegel aufgetrennt und mittels UV-Licht sichtbar gemacht.

6.5.4. Aufarbeitung und Analyse hepadnaviraler DNA

6.5.4.1. Isolierung viraler DNA aus dem Zellkern Für die Detektion der hepadnaviralen cccDNA im SB (s. Abschnitt 6.2.8) wurde diese zunächst aus dem Zellkern transfizierter Zellen oder stabiler Zelllinien isoliert. Im Folgenden wird die Lyse anhand eines 6-wells beschrieben. Für größere Ansätze wurden die Volumina entsprechend angepasst. Die Zellen wurden zunächst mit 0,05% Trypsin vom Kulturgefäßboden gelöst, mit PBS gewaschen (500 µl, 1.200 rpm (Hettich Rotina 380R), 3 min) und das Zellsediment in 500 µl NP40-Lysepuffer (s. Tab. 12) resuspendiert. Der durch 206 Methoden

Zentrifugation für 5 min bei 4.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) und 4 °C entstandene Überstand bildet die zytoplasmatische Fraktion der Zellen und wurde zur Analyse viraler Replikationsintermediate (s. Abschnitt 6.5.4.2) wie auch zum Nachweis von Kapsiden (s. Abschnitt 6.4.4)- und Nukleokapsid-DNA (s. Abschnitt 6.5.4.3) eingesetzt. Die Aufreinigung der cccDNA erfolgte aus dem Sediment, der Kernfraktion, unter Verwendung der Silica- Membran basierten DNA-Aufreinigung mit dem QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Die Kerne wurden zunächst in 200 µl ATL Puffer resuspendiert, mit 10 µl Proteinase K versetzt und bei 56 °C über Nacht schüttelnd inkubiert. Um die Viskosität der Ansätze zu reduzieren, wurde das Lysat auf QIAshredder-Säulchen (QIAgen) überführt und durch Zentrifugation bei 13.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) für 1 min homogenisiert. Der Durchlauf wurde anschließend mit 200 µl AL Puffer versetzt und für 10 min bei 70 °C erhitzt. Nach Zugabe von 200 µl 100% Ethanol wurde die Bindung der DNA an die Silica-Säulchen durch Zentrifugation für 1 min bei 8.000 rpm ((Eppendorf centrifuge 5424R) vermittelt. Alle Zentrifugationsschritte erfolgten bei RT. Die Membran wurde im Folgenden zunächst mit 500 µl AW1 und Zentrifugation für 1 min bei 8.000 rpm, anschließend mit 500 µl AW2 und Zentrifugation bei 13.000 rpm für 3 min gewaschen. Restliche Flüssigkeit wurde durch Zentrifugation bei maximaler rpm für 1 min entfernt. Die Elution der DNA von der Säulchen- Membran erfolgte durch Zupipettieren von 200 µl AE Puffer und Zentrifugation bei 8.000 rpm für 1 min. Da auch chromosomale DNA und Transfektionsplasmid mit aufgereinigt werden, wurden die Ansätze nachfolgend zunächst über Na+-Acetat/Ethanol Fällung auf ein Volumen von 20 µl konzentriert, dann mit Dpn I sowie Plasmid Safe DNase (PSD) nach Herstellerangaben über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die so gewonnene cccDNA (Köck et al., 2010) wurde zum Nachweis im SB auf eine Nylonmembran immobilisiert und mit einer DHBV-spezifischen, 32P markierten Sonde (s. Abschnitt 6.2.8) markiert.

6.5.4.2. Isolierung viraler DNA-Replikationsintermediate aus dem Zytoplasma Zur Aufreinigung viraler DNA-Replikationsintermediate wurde das QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) verwendet. Als Startmaterial diente der lösliche zytoplasmatische Extrakt nach NP40 Lyse (s. Abschnitt 6.5.4.1). Je 200 µl Extrakt wurden mit 5 µl 0,1 M MgCl2 und

0,1 M CaCl2 sowie 10 µl 5 U/µl Micrococcus Nuclease versetzt und für 2- 3 h bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zupipettieren von 5 µl 0,5 M EDTA pH 8,0 gestoppt. Es folgte ein RNA-Verdau für 10 min bei RT mit 10 µl RNase A DNase free 10 mg/ml. Anschließend wurden die Ansätze mit 200 µl AL-Puffer versetzt und mit 20 µl Proteinase K (20 mg/ml) bei 56 °C für mind. 45 min schüttelnd inkubiert. Alle weiteren Aufreinigungsschritte für die Silica- basierte DNA-Aufreinigung erfolgten gemäß 207 Methoden

Herstellerangaben (Quiagen). Letztlich wurde die DNA mit 200 µl AE- Puffer von der Säulchen-Membran eluiert und das Volumen durch Ethanol-Fällung, nach Standardprotokoll, auf 25 µl konzentriert. Die so gewonnene DNA wurde im weiteren Experimentverlauf zur Analyse im SB (s. Abschnitt 6.2.8) verwendet.

6.5.4.3. Analyse enkapsidierter viraler DNA aus dem Zytoplasma Die Detektion Kapsid-assoziierter viraler DNA erfolgte gemäß SB-Protokoll (s. Abschnitt 6.2.8) mit einer DHBV-spezifischen 32P markierten Sonde. Hierzu wurde das zytoplasmatische Zelllysat über NAGE (s. Abschnitt 6.4.4) elektrophoretisch aufgetrennt und die nativen Proteine mittels Kapillartransfer über Nacht in 1x TNE-150 Puffer (s. Tab. 12) auf eine positiv geladene Nylon-Membran transferiert. Durch die Inkubation der Membran für 15 sec in 0,2 M NaOH/ 1,5 M NaCl mit anschließender Neutralisation für 15 sec mit 0,2 M Tris- HCl pH 7,5/ 1,5 M NaCl wurden die Kapside geöffnet. Die Membran wurde zum Waschen kurz in destilliertem Wasser geschwenkt und die DNA durch UV-Bestrahlung (2x150 mJoule) immobilisiert.

208 Anhang

7. Anhang

7.1. Nachweis von Mre11 und p53 in hAdV5 infizierten AAVS1_E4wt #4 und _BCmut #5 Zellen

Abb. 66 Degradation von Mre11 und p53 nach einer AdV5 Infektion der stabilen E4wt und BCmut Zelllinien IB hAdV5 infizierter AAVS1_E4wt #4 und _BCmut #5 Zellen. Die Infektion erfolgte mit AdVwt oder AdVΔE4orf6 mit einer MOI von 20. 24 h vor der Infektion wurde die E4orf6 Expression mit 1,5 µg/ml Dox induziert. Mock Zellen sind nicht infizierte Zellen. Nach 5 Tagen erfolgte die IB Analyse des Gesamtzelllysats; je nach nachzuweisendem Protein wurden die folgenden Mengen Gesamtprotein aufgetragen: E4orf6: 25 µg; E1B55k: 15 µg; p53: 30 µg; Mre11: 50 µg; E2A: 10 µg; β-Aktin: 15 µg. Nach Auftrennung per SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamid) wurde der IB mit Primärantikörpern gegen Mre11 (Novus Biologicals NB 100-142, 1:200); p53 (Santa Cruz #DO-1, 1:1.000), E4orf6 (RSA3, 1:10), E2A (#6B-10, 1:10), E1B55k (#2A6, 1:10), βAktin (#AC-15, 1:5.000), wie in Abb. 20 beschrieben, durchgeführt.

209 Anhang

7.2. E4orf6wt abhängige Reduktion von replikativen Intermediaten in pMEP4 Zellen nach DHBV-Transfektion

Abb. 67 DHBV Replikationsintermediate in den E4orf6 exprimierenden pMEP4-Zelllinien Stabile pMEP4 Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit 100 µM Zn2+ stimuliert oder unbehandelt gelassen. Die Transfektion erfolgte mit 2,5 µg/6-well pCD16+env- für 4 Tage. Oben: Die Zellen wurden in NP40- Lysepuffer geerntet und die Kerne vom Zytoplasma durch Zentrifugation voneinander getrennt. Nach Präparation der zytoplasmatischen DNA wurden je 5 µg in einem 1,2 % 1x TAE Agarosegel aufgetrennt, anschließend auf eine Nylonmembran transferiert. Der Nachweis DHBV-spezifischer DNA erfolgte wie in Abb. 23A beschrieben. Unten: IB-Nachweis einer Zn2+-abhängigen Induktion der E4orf6-Expression in den pMEP4- Zellansätzen. Der E4orf6 Nachweis erfolgte wie in Abb. 10 beschrieben.

210 Anhang

7.3. Vulkanplots des MS-Proteomvergleichs der stabilen E4wt- und BCmut exprimierenden HepG2 Zelllinien

211 Anhang

212 Anhang

Abb. 68 Vulkanoplots des Proteomvergleichs von E4wt und BCmut exprimierenden HepG2 Zelllinien Vulkanplot der d0, d1 oder d5 induzierten AAVS1- oder pMEP4-Zellansätze. Die Proben wurden zur MS- Analyse wie in Abb. 30 beschrieben behandelt. Graphisch dargestellt sind die LFQ-Werte (lable free quantitative values, Markierungsfreie massenspektrometrische Quantifizierung) auf der y-Achse und das Signifikanzlevel (p-Wert) auf der x-Achse. Die schwarzen Punkte (in der Mitte des plots) repräsentieren Proteine, die keinen signifikanten Unterschied im Expressionslevel aufweisen. FDR: Fold discovery range

7.4. Lentivirus Vektoren von Sigma: Mission Lenti-shRNAs

Alle Lentivirus Vektoren tragen einen shRNA kodierenden pLKO.1 TRC Version 2-Vektor (s. Abb. 58) und wurden als gefrorene Aliquots (100 µl) mit einem Titer von >1x107 virale Partikel pro ml von Sigma erworben. Die genaue Klonbezeichnung sowie die jeweilige shRNA-Sequenz ist im Folgenden genannt.

SerpinA3 (serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3)) Mission shRNA: SHCLNV-NM_001085 Sequenz: CCGGGTATGGGAAATGCCATGTTTGCTCGAGCAAACATGGCATTTCCCATACTTTT TG sense: NM_001085 nt 486-506 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.96/A549

HSPB1/HSP27 (Heat shock protein beta-1/ Heat shock protein beta-1;) Mission shRNA: SHCLNG-NM_001540 Sequenz: CCGGGATCACCATCCCAGTCACCTTCTCGAGAAGGTGACTGGGATGGTGATCTTTTTG 213 Anhang

sense: NM_001540 nt 689-710 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.9/HEK293T

RPA1 (replication protein A1, 70kDa) Mission shRNA: SHCLNV-NM_002945 Sequenz: CCGGCCCTAGAACTGGTTGACGAAACTCGAGTTTCGTCAACCAGTTCTAGGGTTTTTG sense: NM_002945.4 nt 791-811 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.94/ A549

RPA2 (replication protein A2, 32kDa) Mission shRNA: SHCLNV-NM_002946 Sequenz: CCGGAGTAGGTTTCATCTATCAAATCTCGAGATTTGATAGATGAAACCTACTTTTTTG sense: NM_002946.4 nt 1267-1287 (3´UTR)) Mean KD Level/Zelllinie: 0.91/MCF7

RPA3 (replication protein A3, 14kDa) Mission shRNA: SHCLNV-NM_002947 Sequenz: CCGGGATCTTGGACTTTACAATGAACTCGAGTTCATTGTAAAGTCCAAGATCTTTTTG sense: NM_002947.4 nt1455-1475 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.99/A549

TAGLN2 (Transgelin-2) Mission shRNA: NM-SHCLNV_003564 Sequenz: CCGGGAACGTGATCGGGTTACAGATCTCGAGATCTGTAACCCGATCACGTTCTTTTTT G sense: NM_003564.2 nt 634-654 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.99/A549

ANP32A (acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 family, member A) Mission shRNA: SHCLNV-NM_006305 Sequenz: CCGGCCTGAAGATGAGGGAGAAGATCTCGAGATCTTCTCCCTCATCTTCAGGTTTTT sense: NM_006305.3 nt 892-912 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.86/HEK293T

HIC2 (hypermethylated in cancer 2 (BLAST: HIC ZBTB transcriptional repressor 2)) Mission shRNA: SHCLNV-NM_015094 Sequenz: CCGGCGCCAGCAGCATCTATTTCAACTCGAGTTGAAATAGATGCTGCTGGCGTTTTTG sense: NM_015094.2 nt 425-445 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.57/A549

DDX41 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41) Mission shRNA: SHCLNV-NM_016222 Sequenz: CCGGGAGGAGATTGAGAACTATGTACTCGAGTACATAGTTCTCAATCTCCTCTTTTT

214 Anhang

sense: NM_016222.3 nt 1912-1933 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0.68/ A3

ANP32E (acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 family, member E) Mission shRNA: SHCLNV-NM_030920 Sequenz: CCGGGTATGGCTAATGTGGAACTAACTCGAGTTAGTTCCACATTAGCCATACTTTTTG T sense: NM_030920.4 nt 513-533 (CDS) Mean KD Level/Zelllinie: 0,86/HEK293T

NAMPT (nicotinamide phosphoribosyltransferase (aka: pre-B-cell colony enhancing factor 1)) Mission shRNA: SHCLNV-NM_005746 Sequenz: CCGGCCACCTTATCTTAGAGTTATTCTCGAGAATAACTCTAAGATAAGGTGGTTTTTG sense: NM_182790.1 ist nicht mehr aktuell; ersetzt durch: NM_005746.2 nt 1341-1361 Mean KD Level/Zelllinie: 0,94/A549

215 Literaturverzeichnis

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