UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESTUDIOS FILOGENETICOS MOLECULARES DEL GÉNERO CARYODAPHNOPSIS (LAURACEAE) Y SINOPSIS DE LAS ESPECIES COLOMBIANAS
CATALINA OLANO MARIN
BOGOTÁ D.C, 2007 UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESTUDIOS FILOGENETICOS MOLECULARES DEL GÉNERO CARYODAPHNOPSIS (LAURACEAE) Y SINOPSIS DE LAS ESPECIES COLOMBIANAS
CATALINA OLANO MARÍN
Tesis de pregrado para optar al título de biólogo
DIRECTOR: SANTIAGO MADRIÑÁN RESTREPO
CO-DIRECTORES:
ALFREDO NAVAS CUERVO ÁLVARO COGOLLO
BOGOTÁ D.C, 2007
ii TABLA DE CONTENIDO
Tabla de Contenido...... iii Agradecimientos ...... iv Resumen...... v Introducción ...... 1 La familia Lauraceae...... 1 El género Caryodaphnopsis Airy-Shaw...... 2 Distribución...... 2 Descripción ...... 2 Historia taxonómica...... 3 Posición sistemática de Caryodaphnopsis ...... 5 Justificación ...... 9 Objetivos...... 11 General...... 11 Específicos ...... 11 Materiales y Métodos...... 12 Análisis filogenéticos de Caryodaphnopsis con evidencia molecular ...... 12 Muestreo taxonómico...... 12 Extracción de ADN...... 12 Amplificación ...... 12 Secuenciación ...... 13 Alineamiento y edición...... 13 Análisis filogenéticos...... 14 Descripción morfológica de las especies colombianas de Caryodaphnopsis ...... 14 Análisis de Resultados ...... 15 Estudios filogenéticos de Caryodaphnopsis con evidencia molecular...... 15 psbA-trnH ...... 15 matK...... 17 trnT-trnL ...... 18 rpl16 ...... 20 ITS...... 22 26S ...... 24 Descripción morfológica de las especies colombianas de Caryodaphnopsis ...... 26 Discusión...... 27 Conclusiones...... 30 Bibliografía ...... 31 Tablas y figuras Apéndice
iii AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Santiago Madriñán, director de esta tesis, por facilitarme material indispensable para los análisis, por su continuo interés en la realización del trabajo, por sus valiosos comentarios, consejos, compañía y ayuda en el momento oportuno y sobretodo por su paciencia cuando el camino no estaba claro.
A Alfredo Navas, co-director de esta tesis, por su constante interés y por transmitirme la claridad que a veces brillaba por su ausencia. A Álvaro Cogollo, segundo co-director por su amabilidad y valiosos aportes al trabajo.
Agradezco a NYBG, JAUM, COL, COAH, MEDEL y MOBOT por su colaboración indispensable para la realización de este trabajo. Al LANFU por la facilitación de equipos
A Juan Guillermo Garcés por su amabilidad y ayuda prestada para la colección de material en la reserva “El Refugio” en Río Claro, Antioquia. A Juan Carlos Penagos por su ayuda, comentarios invaluables y por su motivación contagiosa. A Álvaro Duque por su amabilidad. A mis compañeros del Laboratorio de Botánica & Sistemática: Juliana y
Oscar por entrenarme, enseñarme y encaminarme, a María Camila, Nelsy, Camilo,
Camila, Mauricio, Simón, Ricardo (asistente de campo), Carlos y Libardo por su ayuda,
ánimo, compañía y paciencia. A todos mis amigos por acompañarme durante toda la carrera y apoyarme.
Por último, agradezco especialmente a mis papás por hacer que todo sea posible, por su apoyo y amor incondicional, a mi hermana por estar siempre ahí y por sus comentarios siempre brillantes, a mis tías y primas por su cariño y soporte. Dedico este trabajo a ellos y a los que ya no están.
iv RESUMEN
La familia Lauraceae cuenta con aproximadamente 50 géneros y entre 2500 y 3500 especies. Es una de las familias más importantes presentes en el neotrópico tanto ecológica como económicamente. Comparada con otras familias de plantas, la taxonomía de Lauraceae es poco conocida debido a su gran diversidad, dificultad de identificación, reducido trabajo taxonómico y poca información molecular entre otras razones.
El género Caryodaphnopsis se encuentra dentro de esta familia y características como su distribución geográfica, morfología, anatomía de madera y posición sistemática dentro de
Lauraceae, hacen de éste un género enigmático.
Previas hipótesis sobre la filogenia de Lauraceae y la posición de Caryodaphnopsis realizadas por Rohwer (2000) y Chanderbali et al. (2001) fueron contempladas para inferir las relaciones de este género con los otros géneros de la familia.
Se realizaron análisis con los marcadores psbA-trnH, matK, trnT-trnL, rpl16, 26S e ITS , con el fin de evaluar las hipótesis iniciales sobre la posición sistemática del género y su monofilia, al igual que la separación del clado asiático con respecto al clado americano, y las relaciones existentes entre de las especies de Caryodaphnopsis.
Se encontró que la presencia de Caryodaphnopsis como un grupo monofilético es un elemento común a las filogenias generadas con los diferentes genes, situación que se ve soportada con la evidencia morfológica existente. El clado americano se diferencia con respecto al clado asiático y se pueden vislumbrar relaciones dentro del grupo americano, congruentes con tendencias morfológicas reportadas por van der Werff (1988). ITS fue un marcador efectivo como diagnóstico molecular para identificación a nivel de especie, por
v esta razón puede ser propuesto para la inclusión en el proyecto de Códigos de Barra de la
Vida.
Con respecto a la posición sistemática de Caryodaphnopsis dentro de la filogenia de
Lauraceae, se presentaron bajos soportes y politomías, lo que impedía hacer inferencias sobre este punto de la investigación. Solo el marcador matK ofreció buenos soportes y ausencia de politomías, lo que sugiere que este marcador es efectivo para la construcción de filogenias a nivel de clados profundos en Lauraceae.
vi INTRODUCCIÓN
LA FAMILIA LAURACEAE
La familia Lauraceae pertenece al orden de las Laurales, con aproximadamente 50 géneros y entre 2500 a 3500 especies. Es una familia pantropical con algunas especies distribuidas en zonas temperadas (Rohwer, 1994). Los centros principales de diversidad de Lauraceae son la región Indomalaya, América Central y Sur América, mientras que
Africa tropical es pobre en especies (Rohwer, 1994). Lauraceae se considera como una de las familias de plantas más importantes presentes en el trópico (Gentry, 1988). En los trópicos Americanos, las Lauraceae representan los componentes prominentes de bosques de tierras bajas y son frecuentemente elementos dominantes en la vegetación montana
(Chanderbali et al. 2001).
En Colombia, esta familia está representada por 18 géneros y aproximadamente 232 especies reportadas (Madriñán, 2004). Comparada con otras familias de plantas, la taxonomía de Lauraceae es poco conocida debido a su gran diversidad, dificultad de identificación, reducido trabajo taxonómico y poca información molecular entre otras razones (Madriñán, 2004). Es por esto que parece prometedora la inclusión de evidencia molecular en estudios que intenten esclarecer las relaciones dentro de la familia.
El género Caryodaphnopsis está incluido en la familia Lauraceae , y debido a características poco convencionales como su distribución, morfología, anatomía y posición sistemática única dentro de la familia, hacen de éste un género enigmático y merecedor de investigación, con el fin de dar posibles explicaciones a las incertidumbres que envuelven al género y que lo hacen ser un caso de estudio tan interesante. EL GÉNERO CARYODAPHNOPSIS AIRY -SHAW
Distribución El género Caryodaphnopsis , cuenta actualmente con 15 especies. Es un género tropical anfi-Pacífico (van der Werff & Richter, 1985), que presenta una marcada disyunción geográfica. Esta ocurre entre el Sudeste Asiático (Sur de China, Vietnam, Laos,
Cambodia, Indonesia y Filipinas) y América tropical (Brasil, Perú, Ecuador, Colombia,
Venezuela y Costa Rica) (Aymard & Romero-González, MS) (Figura 2)
Gracias al descubrimiento de una especie de Trigonobalanus (actualmente
Colombobalanus ) , perteneciente a la familia Fagaceae en Colombia, género anteriormente reportado exclusivamente para Asia y que presentaba un claro ejemplo de disyunción anfi-pacífica, Van der Hammen y Cleef (1983) concluyeron que los taxa que presentan este tipo de distribución, en el pasado tenían una distribución mucho más amplia en el hemisferio norte durante el cálido Terciario y posteriormente fueron forzados a migrar hacia el sur debido al enframiento generalizado durante el Terciario tardío y los periodos glaciales.
Descripción El género Caryodaphnopsis se caracteriza dentro de la familia Lauraceae por sus hojas opuestas, usualmente trinervadas (caracteres excepcionales en la familia), raramente peninervias; inflorescencias tirsopaniculadas, flores trímeras, bisexuales (Kubitzki, 1994) y seis tépalos marcadamente desiguales, siendo los externos mucho más pequeños que los internos (van der Werff & Richter, 1996).
Adicionalmente, la mayoría de las especies de Caryodaphnopsis poseen anteras de 4 locelos (en 2 especies anteras de 2 locelos), sacos polínicos arreglados en arco; nueve
2 estambres fértiles (raramente 6), el tercer verticilo con glándulas, filamentos más largos o más cortos que las anteras, los estaminodios del cuarto verticilo conspicuos, de cordados a sagitados. Además presenta un receptáculo muy pequeño y aplanado, pedicelo no ensanchado y tépalos deciduos o subpersistentes (Kubitzki, 1994).
Algunas de las características de este género como anteras de 4 lóculos, nueve estambres fértiles y hojas trinervadas, distinguen a Caryodaphnopsis entre la familia Lauraceae, ya que la mayoría de géneros poseen anteras de 2 lóculos, seis estambres fértiles y hojas peninervias (van der Werff & Richter, 1985). Adicionalmente, Caryodaphnopsis posee una estructura anatómica de madera única dentro de la familia Lauraceae (van der Werff
& Richter, 1985). Sin embargo, se ha enfatizado en las hojas opuestas, los tépalos desiguales y la estructura única de la madera (van der Werff & Dao, 1999), como caracteres diagnósticos a nivel genérico, que determinan la monofilia de
Caryodaphnopsis dentro de la familia Lauraceae (van der Werff & Richter, 1996).
Historia taxonómica Este género, reportado originalmente para Asia, fue descrito por Airy Shaw en 1940, quien creó el nombre del género debido a similitudes entre las hojas de éste con las hojas de algunas especies de Cryptocarya (= Caryodaphne ) (Kostermans, 1974). En el caso de las especies C. tonkinensis y C. baviensis fueron descritas originalmente por Lecomte
(1913) bajo el género Notaphoebe, hasta 1940 cuando A. Shaw las incluyó dentro de
Caryodaphnopsis, y que Kostermans las ratificó dentro de éste género en 1964 , después de haber pasado por otros géneros. Posteriormente fueron añadidas al género
Caryodaphnopsis las especies C. latifolia y C. laotica por W.F Wang y A. Shaw en 1957 y 1960 respectivamente (Kostermans, 1974).
3 En 1952 el género Caryodaphnopsis fue ubicado en sinonimia bajo el género Persea, junto con los géneros Alseodaphne y Notaphoebe , debido a la relación cercana que existe entre estos. Sin embargo, las diferencias que se encuentran entre estos géneros fueron lo suficientemente fuertes para que Caryodaphnopsis fuera delimitado como un género separado, en 1974 por Kostermans. Este último incluyó en su monografía del género siete especies, cuyo rango de distribución iba de Yunnan a Borneo y Filipinas
(Kostermans, 1974).
Hasta 1985 este género sólo estaba reportado para Asia Tropical, pero van der Werff y
Richter, transfirieron dos especies Suramericanas de Persea al género Caryodaphnopsis
(Zamora et al, 1988). Esta transferencia entre géneros se dio debido a evidencias que soportaban la presencia de las especies Persea theobromifolia Gentry y Persea inaequalis
A.C Smith en el género Caryodaphnopsis , ya que éstas diferían de otras especies del género Persea en cuanto a morfología (foliar y floral) y estructura de la madera (Van der
Werff & Richter, 1985), siendo éstas características más congruentes con el género
Caryodaphnopsis.
Actualmente el género Caryodaphnopsis cuenta con 15 especies, de las cuales 8 son asiáticas y 7 son americanas:
LISTA DE LAS ESPECIES DE CARYODAPHNOPSIS POR REGIONES
• Asia
Caryodaphnopsis baviensis (Lecomte) Airy-Shaw
Caryodaphnopsis bilocellata van der Werff & Dao
Caryodaphnopsis henryi Airy Shaw
4 Caryodaphnopsis laotica Airy Shaw
Caryodaphnopsis latifolia W.T Wang
Caryodaphnopsis metallica Kostermans
Caryodaphnopsis poilanei Kostermans
Caryodaphnopsis tonkinensis (Lecomte) Airy-Shaw
• América
Caryodaphnopsis burgeri N. Zamora & Poveda
Caryodaphnopsis cogolloi van der Werff
Caryodaphnopsis fieldii Aymard & G.A Romero
Caryodaphnopsis fosteri van der Werff
Caryodaphnopsis inaequalis (A.C. Smith) van der Werff & H.G Richter
Caryodaphnopsis theobromifolia (A.H. Gentry) van der Werff & H.G. Richter
Caryodaphnopsis tomentosa van der Werff
• Colombia
Caryodaphnopsis cogolloi van der Werff
Caryodaphnopsis fosteri van der Werff
Caryodaphnopsis inaequalis (A.C. Smith) van der Werff & H.G Richter
Caryodaphnopsis theobromifolia (A.H. Gentry) van der Werff & H.G. Richter
Caryodaphnopsis sp. nov1 (Cogollo, com. pers.)
Caryodaphnopsis sp. nov2 (Cogollo, com. pers.)
POSICIÓN SISTEMÁTICA DE CARYODAPHNOPSIS
Estudios sobre la posición filogenética del género Caryodaphnopsis dentro de la familia
Lauraceae sugieren tres diferentes escenarios:
5 1. Según Chanderbali et al. (2001), Caryodaphnopsis es el género más enigmático de la familia Lauraceae, junto con Neocinnamomum y Cassytha, ya que con base en análisis combinados de los genes trnL-trnF y psbA-trnH , estos tres géneros constituyen un clado, cercanamente relacionado al clado Cryptocaryeae y más aún al clado Chlorocardium-
Mezilaurus y al clado Perseeae-Laureae (Figura 2a).
2. Con un segundo análisis combinado de los genes trnL-trnF, psbA-trnH, trnT-trnL, rpl16 y 26S realizado en el mismo estudio de Chanderbali et al. (2001) , estos géneros ya no forman un clado, pero su posición dentro del árbol de la familia se mantiene, con un alto soporte de bootstrap (Figura 2b). Sin embargo las relaciones que puedan existir entre estos géneros aún no son bien entendidas debido a que morfológicamente existen diferencias muy pronunciadas. Con Neocinnamomum excluido del análisis, Cassytha y
Caryodaphnopsis constituyen un clado. Siendo Cassytha el único género de plantas parásito de la familia, lo único que tiene en común con Caryodaphnopsis es el verticilo externo de tépalos extremadamente reducido, lo cual no puede ser considerado como una característica determinante, ya que se presenta constantemente dentro de la familia. Hasta el momento, no se han encontrado otros caracteres que soporten la relación entre estos dos géneros (Chanderbali et al. 2001). Con respecto a Neocinnamomum , éste género comparte una morfología similar con el género Caryodaphnopsis , ambos teniendo venación trinervada y anteras de 4 locelos dispuestos en arco (raramente anteras con 2 locelos en Caryodaphnopsis). Sin embargo, existen características que no comparten, como por ejemplo la disposición de las hojas, perianto y cúpula: Caryodaphnopsis presenta hojas opuestas, posee un perianto con tépalos fuertemente desiguales y carece de cúpula, mientras que Neocinnamomum presenta hojas alternas, un perianto con tépalos
6 casi iguales, y presenta una cúpula con tépalos persistentes (Chanderbali et al. 2001). Por lo tanto, las relaciones encontradas dentro del clado Caryodaphnopsis-Neocinnamomum-
Cassytha , no presentan un fuerte soporte morfológico, contrariamente a lo que ocurre con la ubicación basal de este clado dentro del árbol de la familia, ya que su posición entre el clado Cryptocaryeae y el clado Chlorocardium-Mezilaurus, se ve fuertemente soportada por afinidades anatómicas que existen entre Neocinnamomum y Caryodaphnopsis , con
Chlorocardium y Cryptocaryeae, respectivamente (Richter, 1981).
3. Al remitirse a estudios previos como el de Rohwer del 2000, en el que se analizan evidencias moleculares basadas en secuencias obtenidas del gen matK (cloroplasto), se puede observar una posición sugerida de Caryodaphnopsis entre el clado Cryptocaryeae y los clados Chlorocardium-Mezilaurus- Williamodendron y Perseeae-Laureae (Figura
2c) . Los resultados encontrados en este estudio se complementan con los encontrados por
Chanderbali et al. (2001), con el género Williamodendron como un componente nuevo del clado. Sin embargo difieren en la posición del género Cassytha, que en el estudio de
Rohwer (2000) presenta una posición basal en el árbol de Lauraceae, un poco alejada de
Caryodaphnopsis. Con respecto a Neocinnamomum, género que se agrupaba con
Caryodaphnopsis en el estudio de Chanderbali et al. (2001), no fue incluído en los análisis de Rohwer (2000), sin embargo este último autor sugiere que morfológicamente estos dos géneros están cercanamente relacionados. Según los resultados obtenidos por
Rohwer (2000), el grupo hermano de Caryodaphnopsis presenta un fuerte soporte de bootstrap.
Los anteriores acercamientos a la posición sistemática de Caryodaphnopsis, son las 3 hipótesis iniciales en las que se basa el presente estudio, que tiene como propósito la
7 determinación de la posición de este enigmático género dentro de la filogenia de la familia Lauraceae.
8 JUSTIFICACIÓN
La familia Lauraceae presenta un gran vacío de información en cuanto a géneros y especies, debido a la dificultad que representa esta familia en cuanto a la delimitación de generos y la identificación de especies, que se basa principalmente en medidas morfológicas y anatómicas.
En la actualidad se ha empezado a hacer énfasis en la evidencia molecular, que resulta ser una herramienta bastante útil pero que actualmente se encuentra en la búsqueda de aquellas regiones del ADN que permitan hacer una determinación objetiva de los especimenes a estudiar. Recientemente el mega proyecto del Código de Barras de la Vida ha surgido como un intento de desarrollar nuevas técnicas que usen secuencias cortas de
ADN estandarizadas y universales, con el fin de producir diagnósticos moleculares de identificación a nivel de especies (CBOL, 2008).
Debido al gran atractivo del género Caryodaphnopsis , no sólo por su anatomía y morfología única dentro de la familia Lauraceae, su distribución y su posición sistemática dentro de la familia, sino por su reciente reconocimiento en la región Neotropical, se pretende hacer un estudio sobre la filogenia del género, incluyendo tanto las especies americanas como las asiáticas. También se busca tener en cuenta todos los caracteres morfológicos posibles de las especies, para poder llegar a unas conclusiones más sólidas.
Ya que se cuenta con poca información sobre las especies de Caryodaphnopsis , se espera ampliar un poco más su conocimiento para así poder hacer un aporte en el esclarecimiento de las relaciones dentro del género, y su posición dentro de la familia
Lauraceae. Adicionalmente, se procurará presentar los datos obtenidos como un enlace de la página de Internet de Botánica & Sistemática de la Universidad de los Andes,
9 Lauraceae Columbianae (botanica.uniandes.edu.co/lauraceae/generos), con el fin de disponibilidad absoluta para cualquier persona interesada en el género y las especies presentes en Colombia. En la página de internet habrá disponibilidad de herramientas como mapa de distribución, descripciones morfológicas, información obtenida con datos moleculares, imágenes de herbario y de los especimenes en campo, estado de conservación de las especies, notas de campo, entre otros.
10 OBJETIVOS
GENERAL
Establecer las relaciones entre las especies del género Caryodaphnopsis y su ubicación dentro de la filogenia de la familia Lauraceae, ampliando el muestreo existente, y utilizando herramientas tanto morfológicas como moleculares, con el fin de aportar información sobre las características más importantes del género y así poder contribuir en la ampliación del conocimiento y el esclarecimiento de las relaciones dentro de
Lauraceae.
ESPECÍFICOS
• Probar monofilia de las especias americanas y asiáticas de Caryodaphnopsis.
• Establecer relaciones filogenéticas dentro del género.
• Determinar la posición sistemática del género dentro de la filogenia de Lauraceae.
• Contribuir con el proyecto de Códigos de Barra de la Vida por medio de la
secuenciación de regiones específicas del ADN.
• Revisar características morfológicas y datos de colecta de los especimenes de los
herbarios visitados y de los especímenes colectados en campo.
• Publicar los resultados obtenidos en la página Lauraceae Columbianae
(http://botanica.uniandes.edu.co/lauraceaecolumbianae ), con el fin de
disponibilidad total para los interesados en el género Caryodaphnopsis.
11 MATERIALES Y MÉTODOS
ANÁLISIS FILOGENÉTICOS DE CARYODAPHNOPSIS CON EVIDENCIA MOLECULAR
Muestreo taxonómico Se muestrearon 8 especies de Caryodaphnopsis: 5 suramericanas, 1 centroamericana y 2 asiáticas, más 10 especímenes no determinados (sp. nov, sp, cf, aff) (Tabla 1). Los otros géneros utilizados para el estudio se obtuvieron de GenBank, y como grupo externo se usó Hernandia y Siparuna, géneros pertenecientes a Hernandiaceae y a Siparunaceae respectivamente, familias cercanas a Lauraceae.
En la Tabla 2 se encuentra un resumen de las especies de Caryodaphnopsis y los géneros obtenidos de GenBank utilizados para los análisis llevados a cabo.
Extracción de ADN El ADN total se extrajo de 0.2 gr de tejido de hoja tanto de muestras frescas preservadas en silica gel como de muestras de herbario. Las muestras de herbario fueron maceradas con nitrógeno líquido y posteriormente almacenadas a -80ºC. Para el proceso de extracción, se utilizó el kit DNeasy™ de QIAGEN, siguiendo las instrucciones del fabricante. Por último, el ADN total extraído fue visualizado en un gel de Agarosa 1%, teñido con bromuro de etidio.
Amplificación Se usaron 2 genes; 1 gen del cloroplasto psbA-trnH y 1 gen nuclear ITS . Tabla 2
Por medio de una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), las regiones de cada gen fueron amplificadas, usando BSA, primers (forward y reverse ), ADN, ddH2O, DMSO
12 (sólo para ITS) y GoTaq Green Master Mix de Promega (ver Usage Information). Para algunas secuencias de ITS fue necesario usar primers internos.
El perfil térmico para ITS consistió de 28 ciclos, cada uno con 2 minutos de prefundición a 94°C, 1 minuto de denaturación a 94°C, 1 minuto de anillamiento a 50°C, 3 minutos de extensión a 72°C y 7 minutos de extensión final a 72°C.
Para psbA-trnH consistió de 35 ciclos, cada uno con 2 minutos 30 segundos de prefundición a 95°C, 30 segundos de denaturación a 95°C, 30 segundos de anillamiento a
56°C, 45 segundos de extensión a 72°C y 40 segundos de extensión final a 72°C.
Los productos de PCR fueron visualizados mediante una electroforesis de gel de Agarosa al 1.5%, y luego purificados usando SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega).
Secuenciación Las reacciones de secuencia en ambas direcciones ( forward y reverse ) se llevaron a cabo usando BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc.).
Para esta reacción, se añadía una alícuota del PCR purificado que iba de 2.5 ul a 3 µl, dependiendo de la concentración de ADN, buffer de secuencia, más uno de los primers
(forward y reverse ) marca IDT.
Las reacciones de secuencia consistieron de 26 ciclos con 10 segundos de denaturación a
96°C, 5 segundos de anillamiento a 50°C y 4 minutos de extensión a 60°C.
Las muestras fueron analizadas en un secuenciador ABI prism 377-96 (Applied
Biosystems, Inc.) (Universidad de los Andes)
Alineamiento y edición Las secuencias obtenidas de cada especie para cada gen fueron editadas y ensambladas en el programa Genious Pro 3.0.6 (Drummond et al, 2007). Luego las secuencias consenso
13 fueron alineadas automáticamente usando el programa de alineamiento MUSCLE (Edgar,
2004) y MacClade version 4.08 (Maddison & Maddison, 2005); posteriormente fueron revisadas manualmente. Las secuencias que eran problemáticas en el alineamiento después de muchos intentos, se excluyeron del estudio.
Análisis filogenéticos Los análisis filogenéticos se llevaron a cabo usando PAUP* versión 4.0b10, para
Macintosh™ (Swofford, 2002). Se realizó un análisis de parsimonia por medio de una búsqueda heurística, en la que se utilizaron los caracteres desordenados y con igual peso; los espacios fueron codificados como datos ausentes. Se estimó el soporte de bootstrap por medio de una búsqueda heurística con 1000 réplicas, reteniendo los grupos con una frecuencia de aparición mayor al 50% (árbol consenso MajRule).
DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA DE LAS ESPECIES COLOMBIANAS DE CARYODAPHNOPSIS
Las descripciones morfológicas se llevaron a cabo por medio de observaciones realizadas en diferentes Herbarios (COL, JAUM, MEDEL, COAH) y con ayuda de literatura para las descripciones realizadas por diferentes autores de los especimenes tipo de cada especie. Se hizo énfasis en la consulta bibliográfica debido a la falta de material fértil en los herbarios, ya que elementos como flores y frutos ofrecen información crucial para la descripción morfológica de las especies colombianas de Caryodaphnopsis .
14 ANÁLISIS DE RESULTADOS
ESTUDIOS FILOGENÉTICOS DE CARYODAPHNOPSIS CON EVIDENCIA MOLECULAR
Las especies de Caryodaphnopsis que fueron extraídas, amplificadas y posteriormente secuenciadas con los marcadores ITS y psbA-trnH, algunas no fueron incluidas en los análisis con estos marcadores, debido a mala calidad en las secuencias.
La mayoría del material vegetal utilizado para los análisis moleculares, fue material proveniente de herbario. Esto representó un gran inconveniente en la extracción de ADN, en la amplificación y en la secuenciación, debido a que el material de esta naturaleza ha sufrido diferentes procesos de secado y de conservación, lo que implica la posible denaturación del ADN.
Los Árboles obtenidos para cada gen se describen a continuación. psbA-trnH Se obtuvieron en un análisis de parsimonia por medio de una búsqueda heurística 194
árboles. De un total de 616 caracteres utilizados para el análisis, 88 fueron informativos,
389 fueron constantes y 139 fueron no informativos.
Se presenta aquí un filograma para uno de los árboles más parsimoniosos obtenidos en el análisis (Figura 4); un árbol consenso de la Regla de la mayoría (L:327; IC:0.87; IR:0.86)
(Figura 5) y un árbol del consenso Estricto (Figura 6). En el árbol del consenso Estricto y en el filograma se presentan los valores de bootstrap obtenidos mediante una búsqueda heurística con 1000 réplicas.
En el árbol de la regla de la mayoría se puede observar una filogenia congruente a la primera hipótesis de Chanderbali et al (2001) donde Caryodaphnopsis y Cassytha forman
15 un clado, con un valor bajo según la regla de la mayoría. Sin embargo, Neocinnamomum queda excluido del clado, con una posición más externa a la esperada.
El clado Caryodaphnopsis-Cassytha presenta una posición cercana a dos grupos que se conformaron en el consenso. Se trata del clado Chlorocardium-Mezilaurus y el clado
Perseeae-Laureae (con Cinnamomum , Persea y Laurus como representantes), que a su vez conforman un grupo con un valor de 100 según la regla de la mayoría. Con respecto al clado Cryptocaryeae, éste presenta una posición más externa dentro del árbol comparada con la primera hipótesis de Chanderbali et al. (2001), estando Hypodaphnis y
Neocinnamomum ubicados internamente a este clado, situación no contemplada en la hipótesis antes mencionada . Acerca de Caryodaphnopsis se puede observar que las especies muestreadas forman un clado y dentro de este clado se diferencia el grupo de las especies asiáticas con respecto a las especies americanas.
Por otro lado, al revisar el árbol del consenso Estricto, la topología cambia abruptamente con respecto al árbol de la Regla de la mayoría. La mayoría de ramas que denotaban relaciones resueltas en el árbol de la Regla de la mayoría, colapsaron en el consenso estricto debido a falta de soporte, lo que se puede constatar posteriormente con los valores obtenidos mediante el análisis de bootstrap.
En el consenso estricto se resuelven varios clados como el de Caryodaphnopsis,
Cryptocaryeae, Chlorocardium-Mezilaurus y Perseeae-Laureae, con un soporte de bootstrap de 86, 86, 96 y 99 respectivamente. Con respecto a las relaciones que puedan existir entre estos clados y otros géneros como Cassytha (que en el árbol consenso de la
Regla de la mayoría se agrupaba con Caryodaphnopsis ), no se puede inferir nada debido
16 a que el árbol presenta muchas politomías, por lo tanto no se puede definir cuál de las tres hipótesis iniciales se soporta con este gen.
Las politomías presentes se dan debido a la poca variabilidad que puede presentar este gen. Sin embargo, el gen ofreció un mínimo de variabilidad para poder diferenciar dentro del clado de Caryodaphnopsis el grupo de las especies asiáticas (soporte >70) con respecto a las americanas, aunque de éstas últimas no es posible esclarecer las relaciones debido a politomías presentes dentro del género. matK Para este gen se obtuvo por medio de un análisis de Parsimonia mediante una búsqueda heurística, un único árbol. De un total de 2618 caracteres utilizados para el análisis, 243 fueron informativos, 1957 fueron constantes y 418 fueron no informativos. Se presenta aquí un filograma del árbol más parsimonioso (Figura 7), con los valores de bootstrap obtenidos mediante una búsqueda heurística con 1000 réplicas.
En el filograma obtenido por Parsimonia se puede observar la conformación de varios clados: el clado Caryodaphnopsis con un soporte de bootstrap de 100, el clado
Chlorocardium-Mezilaurus-Williamodendron con un soporte de bootstrap de 77, el clado
Perseeae-Laureae con un soporte de bootstrap de 100, el clado Cryptocaryeae con un soporte de bootstrap de 100 y por último un clado conformado por Neocinnamomum y
Cassytha con un soporte de bootstrap de 78.
La filogenia encontrada en este árbol es congruente con la segunda hipótesis de
Chanderbali et al. (2001), donde Caryodaphnopsis se encuentra en una posición entre el clado Cryptocaryeae y el clado Neocinnamomum-Cassytha, y a su vez conforma un
17 grupo con los clados Chlorocardium-Mezilaurus-Williamodendron y Perseeae-Laureae, con un soporte de bootstrap de 81.
Esta hipótesis difiere de las otras dos planteadas, en la posición de Cassytha con respecto a Caryodaphnopsis ya que los dos géneros no conforman un clado, junto con
Neocinnamomum como en la primera hipótesis de Chanderbali et al. (2001), pero tampoco se encuentra Cassytha en una posición tan externa a Caryodaphnopsis como en la filogenia sugerida por Rohwer (2000).
Al concentrarse en Caryodaphnopsis, se puede observar la conformación de un clado con un alto soporte, como se había mencionado anteriormente. Adicionalmente, dentro del género se diferencia el clado asiático, con respecto a la contraposición americana, presentando un valor de bootstrap de 80.
En representación del clado asiático se encuentran dos especies: C. tonkinensis y C. bilocellata; y como único representante americano se tiene a C. tomentosa. Sin embargo, sería interesante ampliar el muestreo de las especies de Caryodaphnopsis, tanto asiáticas como americanas para poder contemplar las relaciones dentro del grupo y ver la eficacia de matK en la resolución de filogenias a un nivel taxonómico bajo.
A simple vista este gen parece ser lo suficientemente variable como para poder inferir relaciones intergenéricas y quizás intragenéricas, sin embargo concluir esto puede ser un poco prematuro. trnT-trnL Para este gen se obtuvo por medio de un análisis de Parsimonia mediante una búsqueda heurística, un único árbol. De un total de 705 caracteres usados en el análisis, 136 fueron informativos, 442 fueron constantes y 127 fueron no informativos.
18 Se presenta aquí el árbol más parsimonioso (L: 395; IC: 0.82; IR: 0.7) (Figura 9) y un filograma del mismo árbol (Figura 8), cada uno con los valores de bootstrap obtenidos mediante una búsqueda heurística con 1000 réplicas.
Al remitirse al árbol obtenido por Parsimonia se puede observar la conformación del clado Caryodaphnopsis con un soporte de 100 , el clado Cassytha-Neocinnamomum con un soporte de 53, el clado Cryptocaryeae con un soporte de 65 y por último el clado
Perseeae-Laureae con un soporte de 97.
Con respecto a Chlorocardium y Mezilaurus , se presenta una situación no esperada ya que no forman un grupo natural, contrario a lo que ocurre en los análisis con los demás genes, en donde siempre habían formado un clado bien diferenciado, separado de
Perseeae-Laurae. Sin embargo, la posición problemática del género Mezilaurus más cercana a Perseeae-Laureae que a Chlorocardium no posee un soporte alto, por lo que esta ubicación puede ser considerada como incierta.
Tal y como se pude observar en la primera hipótesis de Chanderbali et al. (2001), la cual se ve soportada con el análisis realizado con trnT-trnL , los géneros Caryodaphnopsis ,
Cassytha y Neocinnamomum forman un clado, aunque con un soporte de bootstrap muy bajo (no mostrado), lo que indica que la relación entre estos géneros es imprecisa y debe ser puesta a prueba con análisis adicionales. Este clado presenta una relación cercana al grupo conformado por Perseeae-Laureae, y a Chlorocardium y Mezilaurus, al igual que en la hipótesis de Chanderbali et al. (2001), no obstante, presentando un bajo soporte de bootstrap , por lo que esta relación debe ser reconsiderada.
Con respecto al clado Cryptocaryeae y a su relación con Caryodaphnopsis, al igual que en la hipótesis de Chanderbali muestra una posición externa en la filogenia, siendo
19 hermano del grupo conformado por el clado Caryodaphnopsis-Neocinnamomum-
Cassytha y el clado Perseeae-Laureae más Chlorocardium y Mezilaurus. Al igual que en el resto de relaciones descritas en el análisis con trnT-trnL, la ubicación del clado
Cryptocaryeae recibe un bajo soporte de bootstrap, lo que no permite determinar las verdaderas relaciones existentes.
En este análisis se presenta constantemente la situación de bajo soporte de las ramas que representan relaciones entre las entidades incluidas en el mismo, lo que se puede constatar en el filograma como ramas colapsadas. Por lo tanto, no es posible determinar con certeza las relaciones existentes entre los clados y por consiguiente, debe ponerse en discusión la efectividad de trnT-trnL para la reconstrucción filogenética de la familia
Lauraceae. rpl16 Para este gen se obtuvieron por medio de un análisis de Parsimonia mediante una búsqueda heurística, 3 árboles. De un total de 1160 caracteres usados en el análisis, 123 fueron informativos, 915 fueron constantes y 122 fueron no informativos.
Se presenta aquí un filograma para uno de los árboles más parsimoniosos obtenidos en el análisis (Figura 10) y un árbol del consenso Estricto (L: 308; IC: 0.89; IR: 0.8) (Figura
11), donde se presentan los valores de bootstrap obtenidos mediante una búsqueda heurística con 1000 réplicas.
Al remitirse al árbol del consenso Estricto, se puede observar la formación de los clados
Caryodaphnopsis, Cryptocaryeae y Chlorocardium-Mezilaurus , con un soporte de bootstrap de 100, 100 y 82 respectivamente. Con respecto al clado Perseeae-Laureae presente en los análisis realizados con los otros genes, para este gen no hubo la suficiente
20 disponibilidad de los géneros representantes del clado, a excepción de Cinnamomum. Sin embargo, éste último género, como representante del clado Perseeae-Laureae, presenta una posición muy cercana al clado Chlorocardium-Mezilaurus , situación que se ve soportada por las filogenias obtenidas para el resto de genes analizados.
Por otro lado, la filogenia obtenida con éste gen es más congruente con la hipótesis de
Rohwer (2000), donde la posición de Cassytha es determinante, ya que a diferencia de las demás hipótesis, éste género se encuentra en una posición muy externa en el árbol. En las otras dos hipótesis la posición de Cassytha es más interna a la del género Cryptocaryeae, mientras que en la filogenia de Rohwer y en la encontrada en el análisis con rpl16 la posición de Cassytha es más externa a la del clado antes mencionado. Otro factor que difiere con las dos hipótesis de Chanderbali et al. (2001) es la posición de
Neocinnamomum que en éste análisis no se agrupa con Cassytha ni con
Caryodaphnopsis, sino que se sitúa externamente en la filogenia. Esto no se puede comparar con la hipótesis de Rohwer (2000) ya que éste género no fue incluido en el análisis de éste autor.
Al concentrarse en las relaciones de Caryodaphnopsis con los géneros cercanos se puede observar una agrupación de los clados Cryptocaryeae, Caryodaphnopsis , Chlorocardium-
Mezilaurus y Cinnamomum (como representante de Perseeae-Laureae)con un soporte de bootstrap de 80, sin embargo no es posible concluir nada determinante debido a politomías causadas por falta de variabilidad en el gen o porque es necesario reconsiderar los datos utilizados en el análisis.
Por último, es de destacar la monofilia encontrada para Caryodaphnopsis con un alto soporte de bootstrap, no obstante el muestreo para este género es bastante reducido,
21 constando de sólo dos especies representantes: C. bilocellata (asiática) y C. tomentosa
(americana) . Es por esto, que sería de gran interés ampliar el muestreo de las especies de
Caryodaphnopsis , tanto las americanas como las asiáticas para poder evaluar la eficacia de este gen en la resolución de filogenias a nivel específico y así, poder examinar las relaciones existentes entre las especies de Caryodaphnopsis.
ITS Para esta región, se encuentran todos los representantes secuenciados de
Caryodaphnopsis y Cassytha , más las secuencias obtenidas de GenBank de los géneros representativos de los clados Chlorocardium-Mezilaurus y Perseeae-Laureae, y por
último la secuencia de Siparuna (Siparunaceae), género que para este análisis fue utilizado como outgroup. El inconveniente principal con la región 5.8S fue la falta de disponibilidad de secuencias de los géneros representantes del clado Cryptocaryeae, indispensables para la inferencia de la posición de Caryodaphnopsis dentro de la filogenia de la familia Lauraceae.
Para este análisis, se obtuvieron por medio de un análisis de Parsimonia mediante una búsqueda heurística, 15 árboles. De un total de 727 caracteres usados en el análisis, 160 fueron informativos, 380 fueron constantes y 187 fueron no informativos.
Se presenta un filograma para uno de los árboles más parsimoniosos obtenidos (Figura
12) y un árbol del consenso Estricto (L: 627; IC: 0.78; IR:0.67) (Figura 13), cada uno con los valores de bootstrap obtenidos mediante una búsqueda heurística con 1000 réplicas.
Al remitirse al árbol consenso se puede observar la formación del clado de
Caryodaphnopsis con un alto soporte de bootstrap (98) y la formación del clado
Perseeae-Laureae (con Persea excluído) con un soporte de bootstrap de 61. Al incluir
22 Persea dentro del último clado mencionado, esta conformación pierde soporte. Con respecto a Chlorocardium y Mezilaurus se presenta una situación similar a la encontrada en el análisis realizado con trnT-trnL, donde Mezilaurus presenta una ubicación más cercana al clado Perseeae-Laureae, que a Chlorocardium . Sin embargo, esta relación no obtuvo un soporte de bootstrap significativo, por lo que puede considerarse como incierta. En este análisis no se puede determinar cual de las hipótesis iniciales se ve soportada debido a la ausencia de los géneros representantes de Cryptocaryeae, los cuales son determinantes para esta labor y para poder inferir la posición de Caryodaphnopsis en la filogenia. No obstante, aspectos como la fuerte monofilia de Caryodaphnopsis y su relación cercana con Perseeae-Laureae y Chlorocardium-Mezilaurus se pueden vislumbrar y son congruentes con el resto de análisis realizados.
Al mirar de cerca al género Caryodaphnopsis , se puede observar la formación del clado de las especies americanas con un soporte de bootstrap de 85 y Caryodaphnopsis bilocellata (especie asiática) como especie hermana del clado americano. Dentro del grupo americano existen dos subclados: el primero conformado por C. burgeri, C.fosteri,
C. aff fosteri y C. sp.nov 2, y el segundo conformado por C. cogolloi y C. theobromifolia.
El clado C. burgeri-C.fosteri presenta como sinapomorfias la pubescencia en el envés de las hojas y la forma globosa del fruto, características morfológicas que soportan la agrupación de estas especies obtenida por medio de evidencia molecular.
El clado C.cogolloi-C. theobromifolia presenta como sinapomorfias la venación peninervia y la forma obovoide del fruto y adicionalmente muestra tendencias como longitudes similares de las hojas, de la panícula y pubescencia en el ovario.
23 Según van der Werff (1988), las especies neotropicales de Caryodaphnopsis tienden a dividirse en dos grupos morfológicos. El primero incluye las especies con hojas peninervias y fruto en forma de aguacate: C. cogolloi, C .inaequalis y C. theobromifolia.
El segundo grupo incluye las especies con hojas fuertemente trinervadas y frutos pequeños y redondos: C. fosteri y tres especies no descritas para la época, pero probablemente una de las especies es C. burgeri (van der Weff, 1988).
Los dos clados obtenidos del género Caryodaphnopsis mediante evidencia molecular con la región 5.8S del gen ITS están soportados por caracteres morfológicos, es por esto que el uso de este marcador para identificación de especies parece ser prometedor.
26S Para esta región, se encuentran las secuencias obtenidas en GenBank de los representantes de los clados Cryptocaryeae, Perseeae-Laureae, un representante de
Chlorocardium-Mezilaurus, un representante de Caryodaphnopsis, más Cassytha,
Neocinnamomum e Hypodaphnis y por último Hernandia (Hernandia) , género utilizado como outgroup para este análisis.
Para este análisis, se obtuvieron por medio de un análisis de Parsimonia mediante una búsqueda heurística, 9 árboles. De un total de 615 caracteres usados en el análisis, 54 fueron informativos, 488 fueron constantes y 73 fueron no informativos.
Se presenta aquí un filograma para uno de los árboles más parsimoniosos obtenidos en el análisis (Figura 14) y un árbol del consenso Estricto (L: 202; IC: 0.79; IR: 0.68) (Figura
15). En ambos se presentan los valores de bootstrap obtenidos mediante una búsqueda heurística con 100 réplicas.
24 El filograma obtenido muestra unas relaciones poco esperadas y no congruentes con los demás análisis realizados. Se observa la conformación del clado Cryptocaryeae con un soporte de 99, con Caryodaphnopsis como género hermano, con bajo soporte. Los géneros Litsea, Kubitzkia, Ocotea y Cinnamomum como representantes de Perseeae-
Laureae forman un grupo no natural con 26S , contrariamente a lo encontrado con los demás genes, donde siempre habían conformado un grupo monofilético.
Representando a Chlorocardium-Mezilaurus se utilizó el género Sextonia , el cual se agrupó con Neocinnamomum . Esta situación no se contempla en ninguno de los análisis realizados, sin embargo la relación recibe un soporte de bootstrap muy bajo (no mostrado), por lo que hay incertidumbre rodeando la cercanía de estos géneros.
Por otro lado, Cassytha quedó en una posición externa al grupo conformado por los demás géneros, característica común a la hipótesis planteada por Rohwer (2000), ya que
éste género no se agrupa con Caryodaphnopsis ni con Neocinnamomum , como ocurre en la primera hipótesis sugerida por Chanderbali et al. (2000). Tampoco se conforma el clado Neocinnamomum-Cassytha , con Caryodaphnopsis como género hermano, situación que ocurre en la segunda hipótesis del último autor. Sin embargo, la posición externa de
Cassytha es lo único compartido con la hipótesis de Rohwer (2000), ya que en ésta se observa una clara posición de Caryodaphnopsis entre Cryptocaryeae y los clados
Chlorocardium-Mezilaurus y Perseeae-Laureae, situación que no se presenta en éste análisis con 26S .
Respecto al árbol del consenso Estricto, se mantiene la conformación del clado
Cryptocaryeae con un alto soporte, la agrupación de Neocinnamomum-Sextonia, con un bajo soporte y la posición externa de Cassytha en la filogenia. La agrupación de
25 Caryodaphnopsis con los representantes de Perseeae-Laureae, Chlorocardium-
Mezilaurus y Cryptocaryeae se mantiene, con un bajo soporte. Desafortunadamente, en el consenso estricto las ramas colapsaron dentro de este grupo, lo que conllevó a la presencia de politomías, condición que impide hacer inferencias sobre las relaciones existentes entre los clados y peor aún, no permite establecer la posición de
Caryodaphnopsis dentro de la filogenia de Lauraceae.
DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA DE LAS ESPECIES COLOMBIANAS DE CARYODAPHNOPSIS
Para la descripción de las especies colombianas del género, fue necesario hacer consultas bibliográficas, al igual que visitar las colecciones de los diferentes herbarios como COL,
SINCHI, JAUM y MEDEL. Desafortunadamente, la representación de Caryodaphnopsis en los herbarios es muy pobre o incluso nula.
Con la información recogida de la literatura y de los pocos especimenes disponibles en los herbarios, se presentan las descripciones de las especies colombianas (Apéndice), que posteriormente serán incluidas en la página de Lauraceae Columbianae
26 DISCUSIÓN
La presencia de Caryodaphnopsis como un grupo monofilético es un elemento común a las filogenias generadas con los diferentes genes. La conformación del género como un clado bien soportado, se apoya con los caracteres morfológicos usados para la clasificación de Caryodaphnopsis a nivel genérico. Una buena clasificación demanda que los caracteres usados sean confiables, lo que significa que no hay o hay pocas excepciones en las condiciones características de un taxón. El análisis de los caracteres usados para la clasificación permite estimar qué tan bien fundamentado se encuentra un taxón (van der Werff & Richter, 1996). Caracteres que son muy variables dentro de los géneros de Lauraceae sólo pueden ser utilizados en géneros que son definidos por otros caracteres (van der Werff & Richter, 1996). Tal es el caso de Caryodaphnopsis , que a nivel genérico se define por su disposición opuesta de las hojas, sus tépalos desiguales y su estructura única de la madera, y que a pesar de presentar variabilidad en características como número de estambres y número de locelos en los estambres, puede considerarse como un género monofilético (van der Werff & Richter, 1996). El caso de
Caryodaphnopsis es un claro ejemplo de monofilia soportada por evidencia molecular y morfológica, lo que quiere decir que con total seguridad es un género muy bien fundamentado.
En los análisis realizados con los marcadores psbA-trnH , matK e ITS , donde el muestreo de Caryodaphnopsis fue mayor a dos especies, se pudo observar la diferenciación del grupo americano con respecto al grupo asiático.
Contrario a psbA-trnH, la variabilidad ofrecida por la región 5.8S del gen ITS fue muy valiosa para resolver las relaciones filogenéticas de las especies de Caryodaphnopsis.
27 Teniendo en cuenta que ITS parece ser un marcador efectivo como diagnóstico molecular para identificación a nivel específico, puede ser propuesto para la inclusión en el actual proyecto de Códigos de Barra de la Vida.
A pesar de ser un análisis preliminar debido a la falta de muestreo de algunas especies, el marcador ITS resolvió relaciones dentro del grupo de las especies americanas de
Caryodaphnopsis, siendo consistentes con evidencia morfológica reportada por van der
Werff en 1988. Este autor sostiene que existe una tendencia de las especies neotropicales a agregarse en dos grupos definidos por caracteres morfológicos como nerviación de las hojas y forma del fruto.
Estas características determinan la conformación del clado C. burgeri-C.fosteri que presenta sinapomorfias como hojas trinervadas y frutos pequeños y globosos. En este clado se incluyeron dos especies no determinadas: Caryodaphnopsis sp. nov2 y
Caryodaphnopsis aff. fosteri.
En el caso de C. sp. nov2 se trata de un nuevo registro para Río Claro, Antioquia
(Colombia) y con base en descripciones morfológicas se presumía que era el primer registro para el país de Caryodaphnopsis burgeri (Cogollo, com. pers) . Según los resultados obtenidos con evidencia molecular de la región 5.8S se sugiere que C.sp.nov2 se trata en efecto de C. burgeri. Acerca de C. aff. fosteri se evidencia en los análisis una cercanía con C. fosteri , por lo tanto esto apunta a que estos dos especimenes pertenecen a la misma especie.
Adicionalmente, la conformación del clado C. cogolloi-C. theobromifolia con base en la evidencia molecular, se apoya con las observaciones de van der Werff (1988), el cual sostiene que este grupo tiene como sinapomorfias las hojas peninervias y los frutos con
28 forma de aguacate (obovoide). Debido a problemas de amplificación y secuenciación no fue posible incluir el tercer miembro de este grupo, C. inaequalis , lo cual hubiera sido muy interesante para seguir evaluando la efectividad de 5.8S y ver si se mantenía la congruencia entre la evidencia morfológica con respecto a la evidencia molecular.
Con respecto de la posición de Caryodaphnopsis dentro de la familia Lauraceae al evaluar las hipótesis iniciales y las filogenias obtenidas mediante los diferentes genes muestra cierta tendencia, no obstante no se puede inferir nada determinante.
La relación cercana entre Caryodaphnopsis y los clados Chlorocardium-Mezilaurus y
Perseeae-Laureae, es un elemento planteado en las hipótesis evaluadas inicialmente, y es una situación que se presenta en los análisis realizados con los genes psbA-trnH, matK, rpl16, 5.8S y trnT-trnL. No obstante existen factores como bajos soportes de bootstrap y creación de politomías por colapso de ramas, que le añaden incertidumbre a las relaciones filogenéticas obtenidas con los diferentes genes evaluados.
La posición de Caryodaphnopsis con respecto al clado Cryptocaryeae fue variable en los análisis ya que Cassytha y Neocinnamomum eran determinantes para esto y se pudo ver que a través de todos los análisis la posición de estos géneros fue muy variable.
Al examinar los genes utilizados en los análisis, se pudo determinar que matk fue el único gen que presentó soportes de bootstrap altos y en donde no se presentaron politomías.
Además ofreció una filogenia congruente con la segunda hipótesis inicial, lo que sugiere que este marcador es efectivo para la construcción de filogenias a nivel de clados profundos en las Lauraceae.
29 CONCLUSIONES
• Caryodaphnopsis presentó una fuerte monofilia para todos los análisis realizados
con evidencia molecular, situación que se apoya profundamente con las
observaciones morfológicas del género. Sin embargo, debido a problemas de
muestreo no fue posible incluir en el estudio la totalidad de las especies
representativas, lo cual, sería muy interesante de hacer a futuro, con el fin de
hacer un análisis más exhaustivo sobre este interesante grupo.
• Los grupos morfológicos representativos de Caryodaphnopsis propuestos en la
literatura, fueron congruentes con los resultados moleculares obtenidos para la
región 5.8S del espaciador ITS . Es por esto que este marcador parece ser efectivo
como diagnóstico molecular para identificación a nivel específico, y por lo tanto
puede ser sugerido para la inclusión en el CBOL.
• La posición sistemática de Caryodaphnopsis dentro de la filogenia de la familia
Lauraceae no pudo ser resuelta con los genes incluidos en este estudio, debido a
bajo soporte y presencia de politomías que no permitieron hacer inferencias
determinantes. Sin embargo, el gen de cloroplasto matK ofreció una filogenia con
buena resolución y buen soporte, lo que sugiere que es un marcador efectivo para
la construcción de filogenias dentro de la familia Lauraceae.
• Es necesario continuar buscando aquellas regiones del ADN que permitan hacer
inferencias más determinantes, a diferentes niveles taxonómicos.
• Es necesario aumentar la representatividad de Caryodaphnopsis en los herbarios
nacionales e internacionales.
30 BIBLIOGRAFÍA
AYMARD, G.A, G.A ROMERO-GONZÁLEZ. Caryodaphnopsis fieldii (Lauraceae) a
new species from the Coastal Cordillera of Venezuela, M.S.
CBOL. 2008. Consortium for the Barcode of Life. http://barcoding.si.edu .
CHANDERBALI, A.S, H. VAN DER WERFF, S.S RENNER.2001. Phylogeny and
historical biogeography of Lauraceae: evidence from the chloroplast and nuclear
genomes. Ann. Missouri Bot.Gard. 88: 104-134.
DRUMMOND, A.J, B. ASHTON, M. CHEUNG, J. HELED, M. KEARSE, R. MOIR, S.
STONES-HAVAS, T. THIERER, A. WILSON. 2007. Geneious v.3.5, Biomaters
Ltd.
EDGAR, R. C, 2004. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and
high throughput. Nucleic Acids Research 35(5), 1792-1797.
GENTRY, A. H, 1977. New species of Leguminosae, Lauraceae and Monimiaceae, and a
new combinations in Bignoniaceae from western Ecuador. Selbyana 2(1): 39-45.
GENTRY, A. H, 1988. New Species and a New Combination for Plants from Trans-
Andean South America. Ann. Missouri Bot. Gard., 75 (4): 1429-1439.
HAMMEN, T. VAN DER, A. M. CLEEF, 1983. Trigonobalanus and the tropical amphi-
pacific element in the North Andean forest. J.Biogeogr. 10: 437-440
KOSTERMANS, A.J, 1974. Reinwardtia, a journal on taxonomic botany, plant sociology
and ecology. A monograph of Caryodaphnopsis A. Shaw. 123-137. Volume 9,
1974-1980. Editors: M.A. Rifai, K. Kartawinata & N. Wulijarni-Soetjipto.
MADRIÑÁN, S, 2004. Flowering plants of the Neotropics. Lauraceae (Avocado family).
204-206. Princeton University Press.
31 ROHWER, J.G, 1994. The families and genera of Vascular Plants, II Flowering Plants-
Dicotyledons (Magnoliid, Hamamelid and Caryophyliid families). Volume
editors: K. Kubitzki, J.G Rohwer & V. Bittrich.
ROHWER, J.G, 2000. Toward a phylogenetic classification of the Lauraceae: Evidence
from matK sequences. Systematic Botany 25 (1): 60-71.
SMITH, A.C, 1935. Plantae Krukovianae IV. Phytologia 1: 113-126.
STEVENS, P. F, 2001. Angiosperm Phylogeny Website. Versión 8, June, 2007.
http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb .
SWOFFORD, D. L. 2002. PAUP*. Phylogenetic Análisis Using Parsimony (*and other
Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
WERFF, H. VAN DER, 1986. A new species of Caryodaphnopsis (Lauraceae) from
Perú. Systematic Botany 11 (3): 415-418.
WERFF, H. VAN DER, 1988. Eight new species and one new combination of
neotropical Lauraceae. Ann. Missouri Bot. Gard. 75: 402-419.
WERFF, H. VAN DER, H.G. RICHTER. 1985. Caryodaphnopsis Airy-Shaw
(Lauraceae) a Genus New to the Neotropics. Systematic Botany 10(2): 166-173.
WERFF, H. VAN DER, H.G. RICHTER. 1996. Toward an improved classification of
Lauraceae. Ann. Missouri Bot. Gard. 83 (3): 409-418.
WERFF, H. VAN DER, N.K. DAO, 1999. A new species of Caryodaphnopsis
(Lauraceae) from Vietnam. Novon 9 (4): 584-586.
ZAMORA, N., L. POVEDA., E. CANESSA. 1988. Una nueva especie de
Caryodaphnopsis Airy-Shaw (Lauraceae) para la región Neotropical. Ann.
Missouri Bot. Gard. 75 (3): 1160-1166.
32 TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1.
Especie Extracción Colector Número de colecta Fecha de colecta País de colección Instituto Caryodaphnopsis burgeri E3-3 R. Aguilar 4791 Dic.24-1996 Costa Rica NY Botanical Garden Caryodaphnopsis tonkinensis E3-4 D.G Frodin 2073 Dic.16-1989 Borneo NY Botanical Garden Caryodaphnopsis bilocellata E3-5 Soejarto 11604 May.24-2000 Vietnam NY Botanical Garden Caryodaphnopsis fosteri E3-6 H.van der Werff 9901 Ago.1-1988 Perú NY Botanical Garden Caryodaphnopsis fosteri E3-7 SEF 8965 May-Jun-1982 Ecuador NY Botanical Garden Caryodaphnopsis theobromifolia E3-8 D. Neil 9888 Sept.7-1991 Ecuador NY Botanical Garden Caryodaphnopsis tomentosa E3-9 D. Neil 10134 Sept.17-1992 Ecuador NY Botanical Garden Caryodaphnopsis aff. fosteri E3-10 R. Pérez 821 Nov.6-1997 Panamá NY Botanical Garden Caryodaphnopsis sp E3-11 M. Rimachi 5544 Ene.27-1981 Perú NY Botanical Garden Caryodaphnopsis sp. nov E3-12 C. Figueiredo Jun.13-1995 Brasil NY Botanical Garden Caryodaphnopsis sp. nov E3-13 D. Neil 6864 Sept.21-1985 Ecuador NY Botanical Garden Caryodaphnopsis sp E3-14 H.T Beck 2332 Ecuador NY Botanical Garden Caryodaphnopsis sp E3-15 M.S Bass 365 Sept.15-1996 Ecuador NY Botanical Garden Caryodaphnopsis sp. nov1 E1-3 C.Olano 13 Jul.11-2007 Colombia ANDES Caryodaphnopsis sp.nov1 E1-5 C.Olano 15 Jul.11-2007 Colombia ANDES Caryodaphnopsis sp.nov1 E3-6 C.Olano 16 Jul.11-2007 Colombia ANDES Caryodaphnopsis cogolloi E1-1 C.Olano 17 Jul.13-2007 Colombia ANDES Caryodaphnopsis inaequalis E4-2 A.Cogollo 6774 Ago.28-1993 Colombia JAUM Caryodaphnopsis sp.nov2 E3-1 A.Cogollo Ago.18-2007 Colombia ANDES Cassytha E3-2 S. Madriñán Jul.-2007 USA ANDES
Tabla 2.
Género o Especie psbA-trnH matK trnT-trnL rpl16 ITS 26S 5,8S Caryodaphnopsis burgeri x x Caryodaphnopsis tonkinensis x GB Caryodaphnopsis bilocellata x / GB GB GB GB GB x Caryodaphnopsis fosteri x x Caryodaphnopsis theobromifolia x x Caryodaphnopsis tomentosa x / GB GB GB GB Caryodaphnopsis aff. fosteri x x Caryodaphnopsis cogolloi x x Caryodaphnopsis sp.nov2 x Beilschmiedia GB GB GB GB GB Cryptocaryeae Cryptocarya GB GB GB GB GB Endiandra GB GB GB Potameia GB Chlorocardium-Mezilaurus Chlorocardium GB GB GB GB GB Williamodendron Mezilaurus GB GB GB GB GB Sextonia GB Williamodendron GB Cinnamomum GB GB GB GB GB GB Laurus GB GB GB Perseeae-Laureae Persea GB GB GB GB Litsea GB GB Kubitzkia GB Ocotea GB GB Lindera GB Cassytha x GB GB GB GB x Neocinnamomum GB GB GB GB GB Hypodaphnis GB GB GB GB Outgroups Hernandia GB GB GB GB GB Siparuna GB
Figura 1. Mapa de distribución de Caryodaphnopsis. Especies asiáticas del género. Mapa de distribución de Caryodaphnopsis. Especies americanas del género.
a
b
c
Figura 2. a. Hipótesis 1. Filogenia resumida y modificada de Chanderbali et al. (2001) con análisis combinados de trnL-trnF y psbA-trnH ; b. Hipótesis 2. Filogenia resumida y modificada de Chanderbali et al. (2001) con análisis combinados de trnL-trnF, psbA-trnH, trnT-trnL, rpl16 y 26S ; c. Hipótesis 3. Filogenia resumida y modificada de Rohwer (2000) con análisis del gen matK.
Figura 4. Filograma obtenido por análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el marcador psbA-trnH. Valores de bootstrap indicados enciam de las líneas.
Figura 5. Arbol consenso de la Regla de la mayoría. Análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el marcador psbA-trnH.
Figura 6. Arbol del consenso Estricto de análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el marcador psbA-trnH. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 7. Filograma obtenido por análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el gen matK. Valores de bootstrap indicados encima de las líneas.
Figura 8. Filograma obtenido por análisis de Parsimonia, según búsqueda heurísitca para el marcador trnT-trnL. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 9. Arbol más parsimonioso de análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el marcador trnT-trnL. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 10. Filograma obtenido por análisis de Parsimonia, según búsqueda heurísitca para el gen rpl16. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 11. Arbol del consenso Estricto de análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el gen rpl16. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 12. Filograma obtenido por análisis de Parsimonia, según búsqueda heurísitca para el marcador ITS. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 13. Arbol del consenso Estricto de análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el marcador ITS.
Figura 14. Filograma obtenido por análisis de Parsimonia, según búsqueda heurísitca para el marcador 26S. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
Figura 15. Arbol del consenso Estricto de análisis de Parsimonia, según búsqueda heurística para el marcador 26S. Los valores de bootstrap se indican encima de las líneas.
APÉNDICE
Descripcion de las especies colombianas.
Caryodaphnopsis cogolloi. Imagen tomada de van der Werff (1988)
Caryodaphnopsis cogolloi van der Werff
Árbol de 30 m, DAP 50 cm. Hojas cartáceas, opuestas, decusadas, peninervias, láminas elípticas de 15-20 cm de largo, 5-8 cm de ancho, ápice acuminado, base aguda, verdes y glabras en la haz, glaucas y glabras en el envés. Peciolos de 1.5-2 cm de largo, con pubescencia ferrugínea diminuta. Inflorescencias axilares, de 8 cm de longitud. Flores amarillas, pedicelos de 2-3 mm de largo, 6 tépalos desiguales, los tres externos de 1.5 mm de longitud, los tres internos de 4 mm de largo. 9 estambres, con 4 locelos cada uno; los 6 estambres más externos glabros de 2 mm de longitud, filamentos de 0.6 mm de longitud y anteras de 1.3 mm de longitud. Los 3 estambres más internos glabros de 2 mm de longitud, filamentos de 1.2 mm de longitud con 2 glándulas pequeñas, globosas y basales, y anteras de 0.6 mm de longitud. 3 estaminodios glabros de 1 mm de longitud. Ovario globoso de 0.5 mm de diámetro, la parte superior con pelos cafés, estilo de
1.2 mm de longitud. Fruto ovoboide.
Distribución: Esta especie presenta una distribución restringida a Río Claro, Municipio de San
Luis, Antioquia, Colombia, entre 325-500 m.
Caryodaphnopsis fosteri. Imagen tomada de van der Werff (1986)
Caryodaphnopsis fosteri van der Werff
Árbol de 50 m, DAP 50 cm. Hojas cartáceas, opuestas, fuertemente trinervadas, láminas elípticas de 5-10 cm de largo, 3-5 cm de ancho, ápice acuminado o redondeado, base subacuminada o redondeada aguda, verdes oscuras y glabras en la haz, verdes claras y pilosas en el envés. Peciolos de 1 cm de largo, divididos en la base de la lámina en las tres venas principales. Inflorescencias axilares, entre 3-6 cm de longitud. Flores verde amarillentas con pedicelos de 5 mm de largo. 6 tépalos desiguales, los tres externos de 1 mm de longitud, los tres internos entre 5-6 mm de largo. 9 estambres, con 4 locelos cada uno. Filamentos entre 3-4 mm de longitud, densamente pilosos. Los filamentos del tercer verticilo presentan cada uno 2 glándulas grandes unidas 1 mm arriba de la base de los filamentos. 3 estaminodios con filamentos densamente pubescentes de 1 mm de longitud. Ovario glabro, de 1 mm de longitud; estilo de 2 mm de longitud. Fruto drupa redonda, con aproximadamente 1 cm de diámetro.
Notas de campo: Frutos verdes cuando jóvenes, rojos al madurar.
Distribución: Se encuentran registros de esta especie para Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia.
Para Colombia los registros son de Amazonas y Antioquia.
Caryodaphnopsis inaequalis. Imagen tomada de van der Werff & Richter (1985)
Caryodaphnopsis inaequalis (A.C. Smith) van der Werff & H.G Richter
Árbol de 30 m, DAP 30 cm. Hojas coriáceas, opuestas, decusadas, peninervias con venación terciaria inconspicua, láminas oblongas de 12-16 cm de largo, 5-7 cm de ancho, ápice obtuso o redondeado, base cuneada, glabras en la haz, glaucas y glabras en el envés. Peciolos de 1-1.5 cm de largo, con pubescencia ferrugínea diminuta. Inflorescencias axilares, entre 2-4 cm de longitud. Flores con pedicelos de 1.5 mm de largo, 6 tépalos desiguales, los tres externos de 0.5 mm de longitud, los tres internos de 1.8 mm de largo. 9 estambres, con 2 locelos cada uno y filamentos glabros; los estambres del tercer verticilo con 2 glándulas basales. 3 estaminodios de
0.8 mm de longitud. Ovario glabro de 0.8 mm de diámetro. Fruto ovoboide.
Distribución: Se encuentran registro de esta especie para Brasil, Perú y Colombia. En Colombia los registros son de Amazonas y Putumayo.
Caryodaphnopsis theobromifolia. Imagen tomada de van der Werff & Richter (1985)
Caryodaphnopsis theobromifolia (A.H. Gentry) van der Werff & H.G. Richter
Árbol de 30-40 m, DAP 50 cm. Hojas opuestas, decusadas, subtrinervadas con venación terciaria conspicua, láminas elípticas de 10-22 cm de largo, 4-12 cm de ancho, ápice obtuso, base obtusa, glaucas en el envés. Peciolos de 1-2.5 cm de largo. Inflorescencias axilares, de 8 cm de longitud. Flores verde grisáceas, 6 tépalos desiguales, los tres externos de 1mm de longitud, los tres internos de 2.5 mm de largo. 9 estambres, con 4 locelos cada uno; con filamentos pubescentes y anteras de 0.5 mm de longitud. Pistilo de 1 mm de largo, ovario globoso con pubescencia corta. Fruto ovoboide, 8.5-10 cm de largo y 5.5 cm de ancho.
Notas de campo: Hojas por la haz verde limón opaco, envés glauco. Frutos marrón oscuro.
Distribución: Se encuentran registros de esta especie para Ecuador y Colombia. En Colombia los registros son de Isla Gorgona, Cauca.
Caryodaphnopsis burgeri. Imagen tomada de Zamora et al. (1988)
Caryodaphnopsis burgeri N. Zamora & Poveda
Árbol de 30 m, DAP 80 cm. Hojas cartáceas, opuestas, trinervadas, láminas oblongo-elípticas de
5-16.3 cm de largo, 1.9-7.3 cm de ancho, ápice agudo, acuminado o cuspidado, base cuneada; brillantes, lisas y glabras en la haz, glabras en el envés. Peciolos de 0.5-1.4 cm de largo.
Inflorescencias axilares de 1-3 cm de largo. Flores color crema, con pedicelos de 2.5-9 mm de largo. 6 tépalos desiguales, los tres externos de 1.9 mm de longitud, los tres internos entre 7-10 mm de largo. 9 estambres densamente pilosos, con 4 locelos cada uno. Los estambres del tercer verticilo presentan cada uno 2 glándulas bien desarrolladas unidas cerca a la base de los filamentos. 3 estaminodios en el cuarto verticilo de 2-2.8 mm de largo, sagitados y con filamentos cortos, densamente pilosos. Ovario de 1.9 mm de longitud; estilo de 3 mm de longitud. Frutos globosos de 18-20 mm de largo y hasta 17 mm de ancho.
Distribución: Se encuentran registros de esta especie para Costa Rica y Panamá.
En el caso de Colombia se trata de un nuevo registro ( C. sp. nov 2 ), encontrado en Río Claro,
Municipio de San Luis, Antioquia. Con base en análisis morfológicos y moleculares se sugiere que este nuevo registro se trata de Caryodaphnopsis burgeri.