Universidade Do Estado Do Rio De Janeiro Centro Biomédico Faculdade De Ciências Médicas Edgard De Freitas Vianna Identifica

Universidade do Estado do Rio de Janeiro Centro Biomédico Faculdade de Ciências Médicas

Edgard de Freitas Vianna

Identificação das espécies do Complexo Burkholderia cepacia em pacientes com fibrose cística: comparação entre as técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry e o sequenciamento do gene recA

Rio de Janeiro 2017 Edgard de Freitas Vianna

Dissertação apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao programa de Pós- graduação em Microbiologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Microbiologia Médica Humana.

Orientadora: Prof.a Dra. Elizabeth de Andrade Marques

Rio de Janeiro 2017 UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A

CATALOGAÇÃO NA FONTE

V617 Vianna, Edgard de Freitas. Identificação das espécies do Complexo Burkholderia cepacia em pacientes com fibrose cística: comparação entre as técnicas de Matrix- Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry e o sequenciamento do gene recA. / Edgard de Freitas Vianna. – 2017. 81 f.

Orientadora: Elizabeth de Andrade Marques.

Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. Pós-graduação em Microbiologia.

1. Complexo Burkholderia cepacia. 2. Fibrose Cística. 3. Matrix Assisted Laser Desorption-Ionization - Teses. I. Marques, Elizabeth de Andrade. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências III. Título. Médicas.

CDU 616-008.87

Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, desde que citada a fonte.

______Assinatura Data

Edgard de Freitas Vianna

Aprovada em 30 de março de 2017.

Orientadora: Prof.a Dra. Elizabeth de Andrade Marques Faculdade de Ciências Médicas - UERJ

Banca Examinadora: Prof.ª Dra. Mara Lucia Penna Queiroz Faculdade de Ciências Médicas - UERJ

Prof.ª Dra.Vania Lucia Carreira Merquior Faculdade de Ciências Médicas – UERJ

Prof.ª Dra. Mônica de Cassia Firmida Hospital Universitário Pedro Ernesto - UERJ

Rio de Janeiro 2017

DEDICATÓRIA

À Deus, por mostrar que é Ele quem efetua tanto o querer quanto o realizar, de acordo com a boa vontade dEle e que seus pensamentos são maiores que os meus.

AGRADECIMENTOS

A minha esposa Maristela, por ser mais que sonhava, meu amor, minha companheira, minha amiga, por possibilitar a construção deste sonho, entender e acreditar em mim em todos os momentos. A minha família, por toda a dedicação depositada em mim, fazendo-me alcançar voos mais altos e por entender a minha ausência. A minha orientadora Prof.ª Dra. Elizabeth Marques, por me conceder a honra de ser seu aluno, um exemplo de dedicação e profissionalismo, um exemplo de vida. Obrigado por todo ensinamento transmitido ao longo dessa jornada. Ao professor Robson Leão e aos meus amigos do Laboratório 2, Meyvianne, Mila, Leonardo, Márcia, Géssica, Daniele Lima, Daniele Pacheco, Daiana, pela atenção, amizade e por todo ensinamento transmitido. A minha “equipe CBc”, Cassiana, Flávia, Jéssica, Elisa, Anne e Érica, por todo companheirismo, ensinamento e ajuda nos momentos que precisei. Aos amigos da minha turma de mestrado, Fabiane, Ohana, Deise, Luciana e Bruno pelo prazer de conhecê-los. Aos meus Colegas e amigos do Hospital Rios D’or, Laboratório Richet e do Genoma- UERJ pelo incentivo durante todo o projeto. Aos professores do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da UERJ que contribuíram para minha formação profissional e pessoal. A toda a equipe técnica da Disciplina de Microbiologia e Imunologia, em especial aos técnicos Rose e Denilson. À secretária Carla, pela atenção, dedicação e amor com que conduz seu trabalho e nos auxilia nas questões burocráticas. A todos aqueles que torceram por mim e que contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho alcançasse seus objetivos. Muito obrigado!

A personalidade humana é uma construção sofisticada, cedo ou tarde não sobra pedra sobre pedra. Recolher nossos fragmentos e nos reinventar é o que nos diferencia. Augusto Cury

RESUMO

VIANNA, Edgard de Freitas. Identificação das espécies do Complexo Burkholderia cepacia em pacientes com fibrose cística: comparação entre as técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry e o sequenciamento do gene recA. 2017. 81 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) compreende 20 espécies intimamente relacionadas que se destacam como patógenos oportunistas na Fibrose Cística (FC) e estão associadas a um impacto considerável na morbimortalidade desses pacientes. As espécies e subtipos filogenéticos dentro da espécie Burkholderia cenocepacia variam entre si em relação a transmissibilidade e a virulência. Devido a inconsistências na correta identificação das espécies do CBc por métodos fenotípicos, os métodos moleculares são recomendados. Entretanto não existe uma metodologia molecular universal que possa ser aplicada para todos os micro-organismos, especialmente em laboratórios clínicos. Nesse sentido, a metodologia baseada em espectrometria de massa surge como uma alternativa. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) comparado à identificação das espécies do CBc através do sequenciamento do gene recA em pacientes com FC. Foram analisadas 43 amostras obtidas de diferentes espécimes clínicos no período de janeiro de 2014 a fevereiro de 2016. Um total de 18 (41,86%) amostras de Burkholderia vietnamiensis, 14 (32,55%) Burkholderia cenocepacia subtipo IIIB, oito (18,6%) Burkholderia cenocepacia subtipo IIIA, duas (4,65%) Burkholderia contaminans e uma (2,32%) Burkholderia cepacia foram identificadas pelo sequenciamento do gene recA. A identificação pelo MALDI-TOF MS foi avaliada considerando o cultivo prévio em Ágar Sangue de Carneiro (ASC) e Columbia Ágar Base (CAB). 81,39% das amostras provenientes do ASC foram identificadas a nível de gênero (log ≥1.70-1.99) e 41,86% a nível de espécie (log ≥2.00), correspondendo a 11 amostras de B. vietnamiensis (61,11%), quatro de B. cenocepacia IIIB (28,57%) e duas de B. cenocepacia IIIA (25%). Apenas 39,53% das amostras cultivadas em CAB foram identificadas a nível de gênero e 16,27% em espécie: B. vietnamiensis (n=4; 22,22%) e B. cenocepacia IIIB (n=2; 14,28%). A amostra de B. cepacia foi identificada a partir de ambos os meios e as duas amostras de B. contaminans não foram identificadas. O desempenho do MALDI- TOF MS variou com a utilização de diferentes meios de cultura e a identificação a nível de espécie foi inferior a 50% considerando os pontos de corte estabelecidos pelo fabricante. Assim, avaliamos se a redução dos pontos de corte aumentaria a acurácia da identificação. Com a minoração do escore para ≥1.70-1.99 (considerado como identificação confiável a nível de gênero), foram identificadas mais três amostras de B. vietnamiensis, quatro de B. cenocepacia IIIA e sete de B. cenocepacia IIIB, correspondendo a um aumento de 32,55% (em relação ao escore ≥ 2.00). Entretanto o número de amostras analisadas não permite que esse critério seja utilizado sendo necessário estudos adicionais. Apesar da limitação do MALDI-TOF MS como método para tipagem, a utilização de ferramentas de bioinformática para análise dos espectros de massa obtidos no MALDI-TOF MS permitiu o agrupamento de 96% dos subtipos filogenéticos IIIA e IIIB de cepas B. cenocepacia. Observamos também através dos nós formados na árvore filogenética a proximidade das amostras relacionadas ao mesmo paciente, porém a ausência de comparação com um método de tipagem de referência não permite inferir a sua utilização para fins epidemiológicos.

Palavras-chave: Complexo Burkholderia cepacia. Fibrose Cística. Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry. Sequenciamento do gene recA.

ABSTRACT

VIANNA, Edgard de Freitas. Identification of Burkholderia cepacia complex species isolated from patients with cystic fibrosis: performance ofMatrix-Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry compared to recA sequencing. 2017. 81 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

Burkholderia cepacia Complex (CBc) comprises 20 closely related species that stand out as opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis (CF) and are associated with a considerable impact on the morbimortality of these patients. Phylogenetic species and subtypes within the Burkholderia cenocepacia species vary in relation to transmissibility and virulence. Due to inconsistencies in the correct identification of CBc species by phenotypic methods, molecular methods are recommended. However, there is no universal molecular methodology that can be applied to all microorganisms, especially in clinical laboratories. In this sense, the methodology based on mass spectrometry appears as an alternative. The aim of this study was to evaluate the performance of the Matrix Associated Laser Desorption-Ionization (MALDI-TOF MS) compared to Bcc species identification by recA gene sequencing in CF patients. We analyzed 43 samples obtained from different clinical specimens from January 2014 to February 2016. A total of 18 (41.86%) samples of Burkholderia vietnamiensis, 14 (32.55%) Burkholderia cenocepacia subtype IIIB, eight (18.6%) Burkholderia cenocepacia subtype IIIA, two (4.65%) Burkholderia contaminans and one (2.32%) Burkholderia cepacia were identified by sequencing the recA gene. Identification by MALDI-TOF MS was evaluated considering prior culture in Sheep Blood Agar (SBA) and Columbia Agar Base (CAB). 81.39% of the SBA samples were identified at the genus level (log ≥1.70-1.99) and 41.86% at the species level (log ≥2.00), corresponding to 11 samples of B. vietnamiensis (61.11%), four of B. cenocepacia IIIB (28,57%) and two of B. cenocepacia IIIA (25%). Only 39.53% of the samples cultured in CAB were identified at the genus level and 16.27% in species: B. vietnamiensis (n = 4, 22.22%) and B. cenocepacia IIIB (n = 2; 14,28%). B. cepacia sample was identified from both media and the two B. contaminans samples were not identified. Performance of MALDI-TOF MS varied with the use of different culture media and the identification at the species level was less than 50% considering the cut-off points established by the manufacturer. Thus, we evaluated whether the reduction of cut-off points would increase the accuracy of the identification. With the reduction of the escore to ≥1.70-1.99 (considered as reliable identification at genus level), another three samples of B. vietnamiensis, four of B. cenocepacia IIIA and seven of B. cenocepacia IIIB were identified, corresponding to an increase of 32.55% (in relation to the escore ≥ 2.00). However, the number of samples analyzed does not allow this criterion to be used and additional studies are required. Despite the limitations of MALDI-TOF MS as a typing method, the use of bioinformatics tools to analyze the mass spectra obtained in MALDI-TOF MS allowed the clustering of 96% of the phylogenetic subtypes IIIA and IIIB of B. cenocepacia strains. We also observed the proximity of samples related to the same patient through the nodes formed in the phylogenetic tree, but the absence of comparison with a reference typing method does not allow to infer their use for epidemiological purposes.

Keywords: Burkholderia cepacia complex. Cystic fibrosis. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. recA sequencing.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura do Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator...... 18 Figura 2 - Classificação das mutações do CFTR...... 19 Figura 3 - Prevalência de micro-organismos isolados por idade em pacientes com Fibrose Cística...... 23 Figura 4 - Fluxo do processamento das amostras no MALDI-TOF MS...... 41 Figura 5 - Árvore de similaridade das amostras do CBc pelo método de agrupamento Neighbor joining, de acordo com os espectros de massa obtidos pelo MALDI-TOF MS em meio Ágar Sangue de Carneiro...... 55 Figura 6 - Árvore de similaridade das amostras do CBc pelo método de agrupamento Neighbor joining, de acordo com os espectros de massa obtidos pelo MALDI-TOF MS em meio Columbia Ágar Base...... 56 Figura 7 - Dendograma de alinhamento das amostras do CBc obtidas pelo sequenciamento do gene recA com as sequências de referência do GenBank® ...... 58

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Percentual de identificação pelo MALDI-TOF MS das amostras do CBc cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro ...... 51 Gráfico 2 - Classificação de acordo com escore (log) de identificação pelo MALDI-TOF MS das amostras do CBc cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro ...... 52 Gráfico 3 - Percentual de identificação de espécies do CBc pelo MALDI-TOF MS das amostras previamente cultivadas nos meios Ágar Sangue de Carneiro e Columbia Ágar Base ...... 53 Gráfico 4 - Distribuição das amostras por escore obtidos dos espectros de massa pelo MALDI-TOF MS em meio Ágar Sangue de Carneiro..... 63

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Lista de espécies do Complexo Burkholderia cepacia ...... 26 Tabela 2 - Perfil de caracterização fenotípica das espécies do Complexo Burkholderia cepacia, B. gladioli e Pandoraea spp...... 3 2 Tabela 3 - Sequências do GenBank® para comparação com as obtidas das amostras do CBc para fins de identificação das espécies...... 46 Tabela 4 - Distribuição dos pacientes em relação ao registro da amostra, data da coleta, origem e espécime clínico...... 47 Tabela 5 - Identificação das amostras do CBc pelo MALDI-TOF MS previamente cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro...... 49 Tabela 6 - Identificação das amostras do CBc por meio do sequenciamento do gene recA...... 57 Tabela 7 - Identificação das espécies do CBc de amostras previamente cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro pelo MALDI-TOF MS comparativamente aos resultados do sequenciamento do gene recA...... 59 Tabela 8 - Comparação entre a identificação das amostras do CBc obtidas pelo MALDI-TOF MS em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro, e o sequenciamento do gene recA...... 62

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATP Adenosina Trifosfato BCSA Meio Ágar seletivo para Burkholderia cepacia BGNNF Bacilo Gram Negativo Não Fermentador da Glicose BHI Brain Heart Infusion Broth BLAST Basic Local Alignment Search Tool CAB Columbia Ágar Base CBc Complexo Burkholderia cepacia CFC Cystic Fibrosis Canada CFF Cystic Fibrosis Foundation CFMD Cystic Fibrosis Mutation Database CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator CIM Micro Diluição em Caldo CLED Cystine Lactose Electrolyte Deficient CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DGC Doença Granulomatosa Crônica DMIP Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia DNTP Desoxinucleotídeo trifostatado FC Fibrose Cística FCM Faculdade de Ciências Médicas FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz HUPE Hospital Universitário Pedro Ernesto IFF Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueiras IRT Tripsina Imunorreativa LABACT Laboratório de Bacteriologia LPS Lipopolissacarídeo LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature MALDI-TOF MS Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry

MDR-PA Pseudomonas aeruginosa Multirresistentes MLST Multilocus Sequence Typing MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina PCR Reação em Cadeia da Polimerase PFGE Pulsed-field Gel Electrophoresis PHDC Philadelphia-Washington PPC Policlínica Piquet Carneiro RBFC Relatório do Registro Brasileiro de Fibrose Cística RFLP Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição TSS Tipos de Sistemas de Secreção TTC Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro VEF-1 Volume Expiratório Forçado no Primeiro Segundo

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem °C Grau Celsius ≥ Maior ou igual a < Menor que > Maior que + Adição ou positivo - Negativo ± Mais ou menos Kb Kilobase KDa Kilodalton Mb Milhões de pares de bases ou Megabases mEq/L Milésima parte de um equivalente grama por litro de solução rpm Rotação por minuto m/z Massa/carga mL Mililitro L ou l Litro G ou g Grama µL Microlitro µg Micrograma U Unidade µM Micrômetro V Volts x Multiplicação pb Pares de base s Segundo

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...... 17 1 OBJETIVOS ...... 35 1.1 Geral ...... 35 1.2 Específicos ...... 35 2 METODOLOGIA ...... 36 2.1 Seleção da amostragem...... 36 2.2 Reativação das amostras e caracterização por provas fenotípicas ...... 37 2.2.1 Verificação do metabolismo ...... 38 2.2.2 Verificação da motilidade ...... 38 2.2.3 Utilização de aminoácidos ...... 39 2.2.4 Verificação da atividade da Citocromo-oxidase...... 39 2.3 Identificação por espectrometria de massa...... 40 2.3.1 Processamento das amostras...... 40 2.3.2 Análise dos espectros de massa ...... 41 2.4 Identificação molecular das espécies do CBc pelo sequenciamento do gene recA ...... 42 2.4.1 Extração do DNA bacteriano por lise térmica ...... 42 2.4.2 Quantificação e amplificação do gene recA ...... 42 2.4.3 Análise do DNA bacteriano por eletroforese em gel de agarose ...... 43 2.4.4 Purificação da amostra ...... 43 2.4.5 Sequenciamento do gene recA ...... 44 2.4.6 Análise das sequências do gene recA ...... 45 3 RESULTADOS...... 47 3.1 Características da amostragem...... 47 3.2 Caracterização fenotípica do CBc ...... 49 3.3 Identificação do CBc por espectrometria de massa ...... 49 3.4 Identificação das espécies do CBc pelo sequenciamento do gene recA ...... 57 3.5 Comparação entre a identificação das amostras do CBc obtidas pelo MALDI-TOF MS e o sequenciamento do gene recA...... 59

4 DISCUSSÃO ...... 64 4.1 Da ocorrência das espécies do CBc ...... 64 4.2 Das variações do perfil de identificação das amostras no MALDI-TOF MS ...... 67 4.3 Desempenho do MALDI-TOF MS comparado ao sequenciamento do gene recA para identificação das espécies do CBc ...... 68 CONCLUSÕES ...... 72 REFERÊNCIAS ...... 73 ANEXO - Folha de Rosto para Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa ...... 81 17

INTRODUÇÃO

Fibrose cística

Descrita pela primeira vez por Dorothy Andersen em 1938, a Fibrose Cística (FC) também denominada mucoviscidose é uma doença genética diretamente relacionada à disfunção do gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), localizado no cromossomo 7, no locus 7q31 (MASSIE et al., 2016; PESSOA et al., 2015). Austera patologia autossômica recessiva que acomete predominantemente caucasianos, de acordo com o registro anual de pacientes da Cystic Fibrosis Foundation (CFF) em 2015, atingindo mais de 30.000 pessoas nos Estados Unidos, sendo diagnosticados por ano 1.000 novos casos e 75% dos casos a partir de 2 anos de idade, estimando que no mundo um total de 70.000 indivíduos sejam portadores de FC. Segundo o Relatório do Registro Brasileiro de Fibrose Cística (RBFC) em 2014, 166 novos casos foram diagnosticados, onde a triagem neonatal foi responsável por cerca de 70% dos novos diagnósticos no país, possuindo um total de 3.511 pacientes registrados. Pela falta de recursos diagnósticos poucas crianças chegavam até um ano de idade, na década 60 a sobrevida média era de 10 anos, aumentando para 16, 18 e 27 anos, respectivamente, nos anos 70, 80 e 90 (PESSOA et al., 2015). A partir de melhorias contínuas no diagnóstico precoce, tratamento e no aprofundamento do conhecimento sobre a fisiopatologia desta doença, a média de vida dos pacientes tem alcançado a sobrevida de 40 a 50 anos (CASTELLANI; ASSAEL, 2016; MASSIE et al., 2016). O gene CFTR codifica uma proteína (Figura 1) que exerce função predominantemente como canal de cloreto em células epiteliais exócrinas (LUBAMBA et al., 2012). Classificada como um transportador tipo ABC, membro do cassete de ligação de adenosina trifosfato (ATP), que utiliza energia da hidrólise de ATP para transportar ativamente ânions, como bicarbonato e cloreto. Com aproximadamente 170 kDa é formada por 2 domínios transmembrânicos hidrofóbicos, que contribuem para a formação do poro do canal de cloreto, cada um com 6 subunidades, 2 domínios de ligação a nucleotídeos e um domínio regulatório citoplasmático que contém múltiplos sítios-alvos para fosforilação por proteínas cinases (REZNIKOV, 2016). 18

Apresenta aproximadamente 250 Kb e 27 éxons que é traduzida em uma proteína composta por 1.480 aminoácidos (PESSOA et al., 2015).

Figura 1 - Estrutura do Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

Fonte: LOMMATZSCH; ARIS, 2009.

Os padrões de expressão de CFTR no feto são mantidos após o nascimento, diferentemente no sistema respiratório, onde altos níveis de expressão são encontrados nos pulmões de fetos divergentes à baixa expressão detectada em pulmões adultos (MCCARTHY; HARRIS, 2005). Conforme a Cystic Fibrosis Mutation Database (CFMD) em 2016 foram descritas 2.009 mutações no gene CFTR. As mutações não correspondem a mesma gravidade da doença, nem todas as mutações afetam a função do transportador equitativamente. Sendo a mais comum, uma deleção de três pares de bases, resultando na perda de uma fenilalanina na posição 508. A mutação ΔF508 prejudica a capacidade da CFTR de sair do retículo endoplasmático reduzindo a expressão na superfície celular (REZNIKOV, 2016). Foi desenvolvido um sistema de classificação das mutações do CFTR (Figura 2) segmentado em seis classes baseadas nos mecanismos moleculares, tentando simplificar a complexidade e facilitar o desenvolvimento de terapias. A classe I corresponde à ausência da 19

expressão da proteína, classe II a degradação prematura da proteína, classe III apresenta mutações de desregulação, classe IV está relacionada à atenuação na condutância do canal, classe V a minoração da produção da proteína e classe VI a desestabilização do CFTR na superfície celular. Dentre estas, 90% dos pacientes com FC são inseridos nos defeitos da classe II e resultam em síntese imatura da proteína e liberação inadequada pelo retículo endoplasmático (HELTSHE et al., 2016).

Figura 2 - Classificação das mutações do CFTR

Fonte: LOPES-PACHECO, 2016.

A disfunção da CFTR acarreta um estreitamento na permeabilidade da membrana celular ao cloreto propiciando bloqueios ao transporte e à secreção de íons. Pela CFTR estar presente em vários órgãos, os déficits funcionais são apresentados de formas variadas conforme a sensibilidade de cada um deles, portanto a expressão clínica da FC é multivariada (PEZZULO et al., 2012; PESSOA et al., 2015). As complicações que afetam os pulmões, pâncreas e outros órgãos, manifestam-se como doença sinopulmonar crônica e supurativa, insuficiência respiratória progressiva, déficits na 20

absorção intestinal e no crescimento, atraso na puberdade, e redução da densidade óssea, susceptibilidade à insuficiência renal devido à formação de cálculos, hepatopatias, insuficiência pancreática exócrina, azoospermia em até 95% dos homens e infertilidade em 20% das mulheres (STOLTZ et al., 2015; CASTELLANI; ASSAEL, 2016). Apesar de ser uma doença multissistêmica, o acometimento pulmonar é responsável pela maior morbimortalidade dos pacientes. O acúmulo de muco nas vias aéreas inferiores é uma das características-chave da fisiopatogenia da doença pulmonar, assim como a presença de reação inflamatória predominantemente neutrofílica e infecção bacteriana (PEZZULO et al., 2012; PROESMANS, 2016). As alterações pulmonares iniciam nas vias aéreas menores e são progressivas, evoluindo para o surgimento de bronquiectasias, fibrose pulmonar e cor pulmonale (FIRMIDA et al., 2011; SLY; WAINWRIGHT, 2016). A FC é uma patologia manifesta por insuficiência pancreática, bronquiectasia e perda extra renal de sódio na infância, reconhecida como “a grande simuladora”. As manifestações evocativas incluem tosse produtiva, esteatorreia, e suor salgado (CASTELLANI; ASSAEL, 2016). A maioria dos pacientes apresenta-se clinicamente sintomática nos primeiros anos de vida, sendo o sintoma mais frequentemente relacionado ao trato respiratório a tosse persistente, inicialmente seca, posteriormente com produção de escarro espesso, mucoide a fracamente purulento, de difícil expectoração. Pela radiografia apresentando sinais de hiperinsuflação e espessamento peribrônquico inicial, podendo com o decorrer do tempo, surgir atelectasias segmentares ou lobares. Até 60 a 80% das crianças com FC têm evidências radiológicas de bronquiectasias antes de atingirem a idade escolar (SLY; WAINWRIGHT, 2016). A nível gastrintestinal, a disfunção da CFTR, reduz o teor de água das secreções do sistema pancreático, levando a diminuição do pH, promovendo aumento da viscosidade do conteúdo luminal causando obstrução, destruição e inflamação progressiva, formando cistos e fibrose. Distensão abdominal presente, evacuações com gordura e baixo ganho de peso são sinais e sintomas sugestivos de má-absorção intestinal que, na maioria dos casos, deve-se à insuficiência pancreática exócrina (CASTELLANI; ASSAEL, 2016; SOMARAJU; SOLIS- MOYA, 2016). O diagnóstico da FC é predominantemente clínico é confirmado pela detecção de níveis elevados de cloreto e sódio no suor e por estudo genético com a identificação das mutações para 21

fibrose cística. O padrão do diagnóstico da FC é a análise iônica quantitativa do suor estimulado por pilocarpina, procedimento padronizado, conhecido como método de Gibson-Cooke, estabelecido em 1959. Consideram-se positivos os valores de cloreto e sódio no suor maiores que 60 mEq/L em pelo menos duas aferições. Embora a capacidade de testar as mutações no gene CFTR seja uma nova dimensão ao diagnóstico da FC, o teste de dosagem de cloreto no suor continua sendo o procedimento padrão para confirmar o diagnóstico de FC (DE BOECK et al., 2006; QUINTON, 2007; FARRELL et al., 2008). Os exames da função pulmonar, como a espirometria, mostram predominantemente distúrbio ventilatório obstrutivo. Considera-se o volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF-1) o melhor parâmetro da função pulmonar para monitorização da doença respiratória, com exceção em crianças na fase pré-escolar, não sendo realizada facilmente nesta faixa etária (PROESMANS, 2016). A despeito do avanço sobre o conhecimento pertinente à FC, a terapêutica utilizada na doença é baseada no tratamento sintomático e na correção das disfunções orgânicas, sendo aplicadas múltiplas terapias com abordagem holística (DALCIN; SILVA, 2008; BISHAY; SAWICKI, 2016).

Perfil microbiológico na fibrose cística

No sistema respiratório, devido às disfunções da CFTR, um menor teor de água é gerado no sistema periciliar, promovendo um acúmulo de muco anormalmente denso. Além, de ocasionar uma disfunção no canal de sódio na região apical das células epiteliais brônquicas, que resulta em consequente hiperreabsorção de sódio, reduz intensamente a hidratação e intensifica a densidade do muco brônquico (CASTELLANI; ASSAEL, 2016). As secreções com viscosidade elevada acabam dificultando a atividade ciliar e seu mecanismo de depuração, o que resulta na formação de placas mucosas que conjuntamente com micro-organismos infectantes e inflamação das vias aéreas, levam a um declínio da função pulmonar. Assim como, no tráfego transmembranar de bicarbonato que está envolvido e relacionado com a capacidade autoimune de destruição de micro-organismos. Tais adventos 22

permitem a colonização das vias aéreas por patógenos microbianos (SYED et al., 2016; BHAGIRATH et al., 2016). As bronquiectasias, dilatações e distorções permanentes dos brônquios, em regra, secundárias a um processo infeccioso, representam um grave problema para os pacientes com FC demonstrando em 90% dos casos ser o comprometimento da função pulmonar o principal responsável pela morbidade e mortalidade (CFF, 2015). A microbiota pulmonar na FC apresenta-se diferenciada de indivíduos não portadores de FC e sofrem alterações significativas ao longo da vida que permitem determinar as interações microrganismo-hospedeiro modulando a progressão da doença. As infecções crônicas das vias respiratórias por bactérias Gram negativas e Gram positivas são reconhecidamente características da doença pulmonar. Portanto, é de suma importância compreender o perfil microbiológico, como o papel e o espectro dos organismos envolvidos (SALVATORE et al., 2016; SYED et al., 2016). Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans e o Complexo Burkholderia cepacia (CBc) são tipicamente os micro-organismos mais predominantemente isolados na infecção pulmonar na FC, podendo observar uma sequência temporal na colonização de acordo com a faixa etária e uma predisposição particular a um micro-organismo (MARQUES, 2011; CUTHBERTSON et al., 2015). Bactérias anaeróbicas, tais como membros dos gêneros Streptococcus, Prevotella, Actinomyces e Veillonella, também são frequentemente identificadas em FC, mas o papel destes micro-organismos na doença pulmonar ainda permanece incerto (CRIBBS; BECK, 2017). S. aureus encontra-se mais frequentemente isolado na primeira década de vida, podendo ser encontrados de forma intermitente outros micro-organismos como H. influenzae e P. aeruginosa (MARQUES, 2011; BHAGIRATH et al., 2016). A prevalência de micro-organismos Gram negativos multirresistentes, incluindo S. maltophilia, A. xylosoxidans e o CBc, demonstra um aumento com a idade dos pacientes (SAIMAN et al., 2014). 23

Figura 3 - Prevalência de micro-organismos isolados por idade em pacientes com Fibrose Cística

Legenda: MDR-PA: Pseudomonas aeruginosa multirresistentes; e MRSA: Staphylococcus aureus resistente à jjjjjjjjjjjjjjmeticilina. Fonte: CYSTIC FIBROSIS FOUNDATION PATIENT REGISTRY 2015. Annual Data Report, 2016.

Segundo Dados da Cystic Fibrosis Foundation (Figura 3) em 2015, S. aureus e H. influenzae continuam sendo os primeiros micro-organismos observados em crianças. Na população adulta, uma diminuição na prevalência de P. aeruginosa vêm sendo observada, podendo em parte estar relacionada à implementação de terapias para erradicação na fase inicial. Em contrapartida, tem-se observado o aumento de S. aureus podendo ser devido a melhoras na prática microbiológica de identificação de micro-organismos Gram positivos. Assim como, a detecção de S. aureus resistente à meticilina (MRSA) e de cepas de P. aeruginosa multirresistentes (MDR-PA). P. aeruginosa é classificada como bacilo Gram negativo não fermentador, aeróbio, presente no meio ambiente e clinicamente oportunista de alta relevância no contexto da infecção hospitalar conhecida por causar infecções persistentes crônicas (BHAGIRATH et al., 2016). Possui um numeroso repertório de virulência, tais como sistemas de secreção de toxinas para superar as defesas do hospedeiro, competição de outros colonizadores, resistência a antimicrobianos e capacidade de formar biofilme (LORENZ et al., 2016). Sendo detectada em mais de 20% dos lactentes e quase 80% dos adultos com FC, apresenta-se como uma ameaça que proporciona um declínio progressivo da função pulmonar (SURRETE, 2014). Ao longo do 24

tempo, a maioria dos indivíduos com FC torna-se cronicamente infectadas com P. aeruginosa, e um fenótipo mucoide frequentemente passa a ser a forma predominante (CRULL et al., 2016). Como patógeno oportunista nosocomial, particularmente entre pacientes imunocomprometidos e que necessitam de apoio ventilatório em unidades de terapia intensiva, a incidência da infecção por S. maltophilia na FC aumentou nos últimos anos, apresentando-se como um dos mais comuns patógenos emergentes resistentes a múltiplas drogas encontrados na microbiota pulmonar desses pacientes, a presença de bombas de efluxo, baixa permeabilidade de membrana e beta-lactamases, coadjuvam para sua grande resistência intrínseca aos antimicrobianos, podendo adquirir novos mecanismos de resistência por transferência horizontal, através de plasmídeos, transposons e integrons (POMPILIO et al., 2016). Inicialmente sugerido que S. maltophilia colonizava apenas vias aéreas na FC e não afetava diretamente a função pulmonar, novos estudos demonstraram ser fator de risco independente à exacerbação pulmonar (WATERS et al., 2011). Embora evidências para a transmissão ocasional entre pacientes possa ser encontrada, acredita-se que a maioria das infecções por S. maltophilia em FC resulta da aquisição independente, provavelmente de fontes ambientais (LIPUMA, 2010). Similar à S. maltophilia, o A. xylosoxidans é um patógeno oportunista associado a uma variedade de infecções humanas, incluindo bacteremia, meningite, pneumonia, endocardite, peritonite, osteomielite e infecção do trato urinário (LIPUMA, 2010). Sendo cada vez mais isolado em pacientes adultos com FC, onde o curso clínico da doença pulmonar apresenta-se dependente da natureza e do grau de resposta à infecção bacteriana, denota níveis de inflamação semelhantes aos de P. aeruginosa. Suas propriedades patogênicas e mecanismos que promovem a sobrevivência, colonização e progressão para a infecção pulmonar na FC são escassas e relativamente pouco difundidas. Estudos recentes demonstraram a virulência através da formação de biofilme, mobilidade e resistência antimicrobiana (PEREIRA et al., 2016). Quanto mais adequada for a coleta das amostras, seja escarro, swab nasal ou lavado bronco-alveolar, maior o aumento da sensibilidade das culturas, proporcionando demonstrar a complexidade do microbioma pulmonar de pacientes com FC, permitindo incluir anaeróbios, vírus e fungos que podem promover exacerbações afetando a progressão da doença pulmonar (SURRETE, 2014; CAVERLY et al., 2015). 25

A maioria das complicações fúngicas em pacientes com FC, foram relatadas por serem causadas por fungos filamentosos, que contribuem para a resposta inflamatória local e causa deterioração progressiva da função pulmonar (BHAGIRATH et al., 2016). O complexo microbioma pulmonar dos pacientes com FC relaciona-se diretamente com a progressão da doença, desafiando a compreensão da exacerbação e sucessão de micro- organismos infectantes. Concomitantemente, torna-se um desafio para laboratórios de microbiologia clínica quanto a precisa identificação dos micro-organismos presentes na FC (MARQUES, 2011; BHAGIRATH et al., 2016).

O Complexo Burkholderia cepacia na fibrose cística

Originalmente descrito por Walter H. Burkholder em 1950, Pseudomonas cepacia, bacilo Gram-negativo, foi descrito como agente bacteriano responsável pela decomposição de bulbos de cebolas e por muitos anos identificado esporadicamente em associação com infecções humanas, tipicamente envolvendo pacientes debilitados com doenças subjacentes (LIPUMA et al., 2001). Em 1973, devido a heterogeneidade taxonômica, o gênero Pseudomonas foi classificado em cinco grandes grupos de espécies de acordo com a homologia do rRNA (hibridização DNA- rRNA). Os rearranjos nomenclaturais do gênero Pseudomonas implicou na criação de vários gêneros novos, que incluíam a falta da homologia completa ou parcial de rRNA (LIPUMA et al., 2010b). Em 1992, P. cepacia e outras seis espécies pertencentes à classe das Gammaproteobacteria e classificadas por homologia rRNA ao grupo II do gênero Pseudomonas (Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas pickettii, Pseudomonas gladioli, Pseudomonas mallei, Pseudomonas pseudomallei e Pseudomonas caryophylli) foram reclassificadas para o novo gênero Burkholderia (LIPUMA et al., 2010; RHODES; SCHWEIZER, 2016). Desde então a taxonomia do gênero Burkholderia sofreu mudanças consideráveis e constantes incluindo atualmente 99 espécies, de acordo com List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature (LPSN), das quais a maioria é encontrada em ambientes naturais, comumente no solo e na água subterrânea e não patogênicas aos seres humanos saudáveis. São 26

também utilizadas na área agrícola como promotores de crescimento, biopesticidas e biorremediadores (MARQUES, 2011; ABBOTT et al., 2016). O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) é um subgrupo dentro do gênero Burkholderia formado por espécies intimamente relacionadas com elevado nível de similaridade do gene 16S RNA (≥ 97,7%), grandes genomas (7 a 9 Mb) e moderados valores de hibridização DNA-DNA (30 a 60%), mas fenotipicamente indistinguíveis sendo assim por convenção taxonômica denominados genomovares, adquirindo após estudos polifásicos subsequentes no início do ano 2000 a designação binomial formal (LIPUMA et al., 2001; TEGOS et al., 2012; LEWIS; TORRES, 2016). Atualmente o CBc é integrado por 20 espécies conhecidas (Tabela 1), formado por patógenos oportunistas, causadores de infecções respiratórias em pacientes com FC e presentes na Doença Granulomatosa Crônica (DGC) (VANDAMME; DAWYNDT, 2011; PRADENAS et al, 2016).

Tabela 1 - Lista de espécies do Complexo Burkholderia cepacia (continua) Espécies Referência (s) B. pyrrocinia (genomovar IX) (Imanaka et al., 1965; Vandamme et al., 1997; e Vandamme et al., 2002) B. cepacia (genomovar I) (J. and Holmes, 1981) B. vietnamiensis (genomovar V) (Gillis et al., 1995) B. multivorans (genomovar II) (Vandamme et al., 1997) B. stabilis (genomovar IV) (Vandamme et al., 2000) B. ubonensis (genomovar X) (Yabuuchi et al., 2000) B. ambifaria (genomovar VII) (Coenye et al., 2001) B. anthina (genomovar VIII) (Vandamme et al., 2002) B. cenocepacia (genomovar III) (Vandamme et al., 2003) B. dolosa (genomovar VI) (Vermis et al., 2004) B. arboris (Vanlaere et al., 2008) B. diffusa (Vanlaere et al., 2008) B. latens (Vanlaere et al., 2008) B. metallica (Vanlaere et al., 2008) B. seminalis (Vanlaere et al., 2008) B. contaminans (Vanlaere et al., 2009) B. lata (Vanlaere et al., 2009) 27

B. pseudomultivorans (Peeters et al., 2013) B. stagnalis (De Smet et al., 2015) B. territorii (De Smet et al., 2015) Fonte: Adaptado de DEVI et al., 2012 e LEWIS; TORRES, 2016. O relato de infecção por estirpes do CBc em pacientes com FC foi descrito pela primeira vez em 1972 e reconhecido como patogênico nos anos 80, quando observado um aumento na prevalência da infecção entre pacientes em tratamento na CF Clinic at The hospital for Sick Children, em Toronto, Canadá, ocorrendo rápida e progressiva deterioração da função pulmonar, caracterizada por pneumonia necrotizante, bacteremia e sepse, até então incomuns na FC (apud NASH et al., 2011). As espécies encontradas mais frequentemente em pessoas com FC são: B. cenocepacia, B. multivorans, B. vietnamiensis, B. dolosa e B. cepacia (BERNHARDT et al., 2003; SAIMAN et al., 2014; CFF, 2015). Segundo o Registro de Pacientes do CFF em 2015, a colonização por CBc representa 2,6% da população registrada, com idade média de 19,9 anos na primeira infecção. Entre pacientes colonizados pelo CBc nos Estados Unidos, 664 pessoas com FC tiveram uma cultura positiva para B. cepacia representando 93,6%, juntamente com B. multivorans, as espécies mais frequentemente recuperadas, apesar dos dados não serem mutuamente exclusivos, pois alguns indivíduos apresentavam mais de uma espécie isolada em 2015. Equiparado aos anos anteriores, não houve significativo aumento da prevalência de espécies do CBc na população de FC. De acordo com o Relatório do RBFC (2014), espécies do CBc foram isoladas em 231 pacientes pelo menos uma vez no ano, representando 9% do total de micro-organismos identificados em FC no Brasil, com idade média dos pacientes variando em 25 a 30 anos na infecção primária, não apresentando dados de identificação por espécies. Comparativamente a P. aeruginosaas infecções por CBc representam um risco maior aos pacientes colonizados, pois experimentam uma fase acelerada de rápido declínio clínico, associada a mau prognóstico e a um impacto considerável na morbidade e mortalidade em pacientes com FC (PRADENAS et al, 2016). B. cenocepacia é uma das principais espécies do CBc responsáveis pela pneumonia necrotizante e septicemia, muitas vezes fatal conhecida como "síndrome cepacia" e sua aquisição é frequentemente considerada uma contraindicação para o transplante de pulmão (ABBOTT et al., 2016). 28

As espécies do CBc apresentam uma variedade de fatores de virulência possuindo capacidade de adesão e sobrevivência dentro das células epiteliais das vias aéreas, como em macrófagos. A formação de biofilmes in vitro está bem documentada para B. cenocepacia e tem mostrado ser favorecidas por vários sistemas, tais como quorum sensing, fator sigma alternativo (como, RpoE que controla a expressão de regulação de genes necessários para que respondam ao estresse extracitoplasmático na resistência à polimixina), síntese de exopolissacarídeos, motilidade e disponibilidade de ferro. Além, da produção de catalases e proteases que podem auxiliar na evasão das defesas do hospedeiro e a sobreviver em ambientes hostis (HORSLEYet al., 2016). Os sistemas de secreção especializados estão entre os fatores de virulência mais interessantes, utilizados para o desenvolvimento de vacinas. No CBc, vários Tipos de Sistemas de Secreção (TSS 2, 3, 4 e 6) têm desempenhado papéis diferentes na virulência. O TSS 2 (ZmpA e ZmpB) são necessários para a sobrevivência intra-macrófagos, de modo semelhante, o TSS 3 tem se mostrado essencial para a sobrevivência bacteriana no modelo murino de infecção crônica. O TSS 4 é necessário para a fuga bacteriana de endossomas e evidências sugerem que o TSS 6 presente em B. cenocepacia possa ter um papel na patogênese (PRADENAS et al., 2016). Exibem resistência inata a muitos antimicrobianos e desinfetantes, frequentemente apresentadas a β-lactâmicos e aminoglicosídeos. Algumas espécies são capazes de usar a penicilina G como fonte de carbono, o emprego de bombas de efluxo, porinas restritivas, mutações alvo no DNA bacteriano e modificação do alvo do fármaco. As estirpes do CBc são tipicamente resistentes às polimixinas, acreditando-se que seja parcialmente atribuível à estrutura de lipopolissacarídeo (LPS) única que inibe a ligação da polimixina à membrana (HORSLEY et al., 2016; RHODES; SCHWEIZER, 2016). A resistência a múltiplos fármacos é comum in vitro e in vivo e dados de um estudo realizado na Universidade de Columbia, em Nova Iorque, com 2.621 amostras do CBc isoladas de 1.257 pacientes, correlacionaram cerca de 50% de isolados resistentes a 10 antimicrobianos usados. Devido à sua elevada virulência, o tratamento de exacerbações pulmonares em pacientes infectados por CBc, baseia-se na utilização de ceftazidima, doxaciclina, sulfametoxazol+trimetoprima, carbapenêmicos como meropenem, piperacilina+tazobactam, ticarcilina+clavulanato, e outros como aztreonam e a tobramicina, onde os testes de suscetibilidade devem, portanto, orientar a escolha da terapêutica com múltiplas associações 29

geralmente recomendando pelo menos o uso de três agentes antimicrobianos (DÖRING et al., 2012; RHODES; SCHWEIZER, 2016). A escolha da terapia antimicrobiana depende de uma série de fatores, como toxicidade e interações com outros medicamentos. Atualmente, há poucas orientações sobre as terapias a serem utilizadas em pacientes com CBc, sendo na intervenção do curso clínico o tempo de tratamento um fator importante (HORSLEY et al., 2016). Devido as espécies do CBc estarem entre os micro-organismos com maior perfil de resistência aos antimicrobianos na clínica laboratorial, os critérios interpretativos dos testes específicos de susceptibilidade disponíveis são apenas para um número limitado de antimicrobianos. Em geral, os testes de micro diluição em caldo (CIM) ou testes de difusão em gradiente antimicrobiano em ágar para determinação da sensibilidade da amostra bacteriana são preferidos para este grupo de micro-organismos. Conforme preconizado em 2016 pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), testes de sensibilidade por disco-difusão poderão ser utilizados para os seguintes antimicrobianos: ticarcilina+clavulanato, ceftazidima, meropenem, minociclina, levofloxacino, sulfametoxazol+trimetoprima e cloranfenicol. Podem ser dadas as possibilidades de testar o sinergismo com combinações duplas ou triplas de antimicrobianos em laboratórios de referência (LIPUMA et al., 2010b). A fisiopatologia exata do CBc permanece incerta e a aceleração da deterioração pulmonar apresenta um padrão heterogêneo, em quase 30% dos pacientes, acarretando a perda da função pulmonar como um dos principais contribuintes à mortalidade na FC (FOLESCU et al., 2015). O transplante pulmonar é uma opção viável para muitos pacientes com doença pulmonar, que resultou na melhoria da sobrevivência mediana para pacientes com FC. A sobrevida mediana para indivíduos com FC após o transplante excede àqueles de indivíduos submetidos a um transplante devido a outras doenças pulmonares em estágio terminal (MORRELL; PILEWSKI, 2016). Centros de transplantes consideram a colonização por cepas do CBc como fator de mau prognóstico comparados a outros patógenos na FC caracterizando, portanto, uma contraindicação. Sendo eticamente apropriado a exclusão de pacientes colonizados por B. cenocepacia do transplante pulmonar, acredita-se que somente centros especializados em FC que estão dispostos a assumir o risco devem oferecer transplante para este grupo desafiador de pacientes (CHAPARRO; KESHAVJEE, 2016). 30

Vários métodos têm sido utilizados para definir a epidemiologia das infecções pelo CBc na FC, com a utilização de ferramentas moleculares foi possível expandir as evidências de que pacientes com FC podem adquirir patógenos de outros pacientes com FC (SAIMAN et al., 2014). Estudos de genotipagem no final da década de 1980 identificaram estirpes que eram comuns a múltiplos pacientes atendidos no mesmo Centro de Referência. Posteriormente, surgiram evidências de que certas estirpes são relativamente mais virulentas em pacientes com FC, como a cepa epidêmica B. cenocepacia ET12 (tipo eletroforético 12) comumente encontrada no leste do Canadá e Reino Unido, as cepas B. cenocepacia do clone Midwest e B. cenocepacia PHDC (Philadelphia–Washington, DC) encontradas predominante entre os pacientes com FC na região do Médio Atlântico, Estados Unidos (LIPUMA et al., 2010). Embora a espécie B.cenocepacia seja mais frequentemente associada a maior virulência e transmissibilidade, entre 1997 e 2003, os clones de B. dolosa SLC6 e Glasgow de B. multivorans, foram identificadas na rotina de cuidados de saúde de pacientes com FC em um centro de tratamento nos Estados Unidos, demonstrando que tais cepas são compartilhadas por vários pacientes, sugerindo a concepção de medidas de controle de infecção (BIDDICK et al., 2003). Com a instituição de medidas rigorosas de controle de infecção hospitalar como por exemplo, medidas de segregação, observou-se uma diminuição da aquisição de espécies consideradas mais transmissiveis, incluindo os clones ET12 de B. cenocepacia e SLC6 de B. dolosa (LIPUMA et al., 2001). Por outro lado, a incidência de infecção por algumas cepas como o clone PHDC e Midwest diminuiu, mas não foi totalmente eliminado com melhores práticas de controle e restrição de contato entre indivíduos com FC através de políticas de segregação. Cepas do PHDC foram recuperadas do solo agrícola nos Estados Unidos, incluindo campos de cebola, e de pessoas com FC em diversos locais nos Estados Unidos e na Europa, sugerindo que esta estirpe é amplamente distribuída no meio ambiente, servindo como fonte de aquisição contínua (LIPUMA et al., 2001; SAIMAN et al., 2014). Ressalta-se que apesar da importância das cepas epidêmicas descritas em numerosos surtos associados à assistência médica, infecção por dispositivos médicos contaminados, como nebulizadores e produtos, incluindo colutórios, géis de ultrassom, antissépticos entre outros, na epidemiologia da Burkholderia, deve-se enfatizar que a maioria dos indivíduos com FC 31

infectados envolvem atualmente a aquisição de linhagens por fontes ambientais naturais, sendo a inalação de bactérias do ambiente uma via de infecção comum (LEWIS; TORRES, 2016). As medidas de segregação adotadas à nível mundial promoveram uma redução da prevalência de B. cenocepacia, provavelmente como resultado dessas medidas, porém o surgimento de estirpes não clonais de espécies do CBc como B. multivorans, B. contaminans e B. dolosa são agora aparentes (SOUSA et al., 2017).

Identificação do Complexo Burkholderia cepacia

As características fenotípicas gerais do gênero Burkholderia incluem: bacilos Gram- negativos, não-formadores de esporos, aeróbicos, móveis, tipicamente catalase positivo e oxidase variável, produtoras ou não de pigmentos (dependentes do meio de cultura), hemólise variável e possui temperatura ideal para o crescimento entre 30°C e 35°C (VANDAMME et al., 1996; LIPUMA et al., 2010). Para o cultivo e identificação das espécies do CBc, geralmente utiliza-se uma combinação de meios seletivos como Pseudomonas cepacia Ágar (PCA), Ágar base oxidação-fermentação com polimixina, bacitracina e lactose (OFPBL) e ágar seletivo para Burkholderia cepacia (BCSA), análises bioquímicas ou sistemas de testes comerciais (LIPUMA et al., 2001) (Tabela 2). Muitos relatos descrevem a imprecisão da maioria dos sistemas comerciais para identificação do CBc que demonstram sensibilidade e especificidade insuficientes, com isolados erroneamente identificados como Burkholderia gladioli, Pandoraea spp., R. pickettii, A. xylosoxidans, e S. maltophilia. No entanto, há um consenso de que os isolados presumivelmente identificados como pertencentes ao CBc, com base em resultados de sistemas comerciais devem ser testados quanto ao crescimento em meio BCSA, presença de lisina e ornitina descarboxilase, oxidação da sacarose, presença de atividade da enzima oxidase, hemólise, produção de pigmentos e crescimento a 42°C. Além das dificuldades com estes sistemas outras também são apresentadas, como crescimento lento de organismos, variabilidade fenotípica dos isolados e bancos de dados inadequados do sistema (LIPUMA et al., 2001; ANTONOV et al., 2008). 32

Tabela 2 - Perfil de caracterização fenotípica das espécies do Complexo Burkholderia cepacia, B. gladioli e jjjjjjjjjjjjjjjjjjjPandoraea spp.

Legenda: a +, >90% dos isolados são positivos; V, 10 a 90% são positivos; –, <10% dos isolados são positivos; b Número de amostras de cada espécie testada: B. ambifaria, 51; B. anthina, 24; B. arboris, 16; B. cenocepacia, 928; B. cepacia, 181; B. contaminans, 54; B. difusa, 16; B. dolosa, 57; B. lata, 25; B. latens, 6; B. metallica, 7; B. multivorans, 715;B. pseudomultivorans, 11;B. pyrrocinia, 85; B. seminalis, 19; B. stabilis, 73; B. ubonensis, 2; B. vietnamiensis, 145; B. gladioli, 280; e Pandoraea spp., 75. c Número de amostras de cada espécie testada: B. ambifaria, 18; B. anthina, 16; B. arboris, 13; B. cenocepacia, 139; B. cepacia, 23; B. contaminans, 7; B. diffusa, 6; B. dolosa, 12; B. lata, 11; B. latens, 6; B. metallica, 3; B. multivorans, 109; B. pseudomultivorans, 11; B. pyrrocinia, 5; B. seminalis, 13; B. stabilis, 27; B. ubonensis, 2; B. vietnamiensis, 36; B. gladioli, 27; e Pandoraea spp., 9. d Hemólise em sangue de carneiro; β, beta-hemólise; e As provas de oxidação foram registradas após 2-7 dias de incubação; f PNPG, p-nitrofenil-b-d-glicosídeo; g Os resultados apresentados foram obtidos com o API 20NE test strip. Fonte: LIPUMA et al., 2015.

Devido às inconsistências na identificação das espécies do CBc por métodos fenotípicos, os métodos moleculares apresentam maior confiabilidade neste campo. Para identificação fundamentada na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) vários ensaios foram baseados na diversidade dentro das sequências nucleotídicas do rDNA 16S, descritos antes do reconhecimento do CBc ser composto por várias espécies e baseando-se em dados de sequências de DNA advindas de análises de coleção de culturas pouco representativas da diversidade total do 33

Complexo. Estes ensaios foram direcionados para o desenvolvimento de iniciadores específicos de espécies, genomovares ou análise do Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição (RFLP) do rRNA 16S amplificado por PCR (LIPUMA et al., 2001; NAVRÁTILOVÁ et al., 2013). Embora amplamente utilizado para a sistemática bacteriana, resultados demonstram que o gene16S rDNA apresenta capacidade limitada de diferenciar as espécies do CBc. Após observada a variação constante nos operons de algumas espécies com a possibilidade de uma discriminação maior, foi desenvolvido um novo ensaio de identificação baseado em PCR do gene recA (proteína essencial para reparação e recombinação do DNA). O gene recA mostra 94% a 95% de similaridade entre os diferentes genomovares, e tipicamente 98 a 99% de similaridade pode ser encontrada dentro dos genomovares (LIPUMA et al., 2001; MAHENTHIRALINGAM et al., 2000; MEDINA-PASCUAL et al., 2012). Embora as técnicas em biologia molecular sejam consideradas de referência para identificação de um amplo número de micro-organimos, a complexa padronização dada a variação metodológica e custo, impedem que essas técnicas sejam aplicadas universalmente em laboratórios de Microbiologia Clínica. Dentro deste contexto, para atender às necessidades clínicas é preciso estabelecer um método de diagnóstico rápido e fidedigno ao padrão molecular para identificação rotineira destes patógenos (WANG et al., 2014). Recentemente foi introduzido em laboratórios clínicos a identificação de micro- organismos por Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), que consiste em técnica automatizada analisada por espectrometria de massa, através da qual uma amostra constituída por um analito (uma colônia bacteriana, concentrado de hemocultura ou deposição de uma solução de proteínas obtidas por prévia extração) em uma matriz é irradiada e seu peso molecular é determinado utilizando como base o tempo de voo. A matriz absorve a energia do laser e transfere para o analito que é dessorvido na placa, a relação massa/carga (m/z) é então medida e detectada pelo tempo entre os pulsos de laser. As proteínas detectadas no sensor, cria um espectro que representa a composição de certas proteínas de cada amostra. Comparando o espectro de uma amostra particular com uma grande base de dados de espectros de bactérias caracterizados de forma precisa, as identificações podem ser feitas a nível de gênero e espécie (PASTERNAK, 2012). 34

MALDI-TOF MS é atualmente considerado uma ferramenta importante em laboratórios de microbiologia pela rapidez dos resultados. O tempo médio para a identificação bacteriana é de 15 minutos após obter um material enriquecido. Além da rapidez, oferece a possibilidade de precisão na identificação dos patógenos associados a FC, e não usuais em outro contexto, quando comparado com a identificação por métodos bioquímicos, testes comerciais e moleculares (PASTERNAK, 2012). É uma metodologia de relativa simplicidade de manuseio, requerendo conhecimento relacionado ao programa de análise, levando cerca de 6 minutos como tempo de processamento por placa (BURNS; ROLAIN, 2013). Embora os custos iniciais de um espectrômetro de massa sejam relativamente altos, o custo de identificação se mantêm baixo em comparação aos métodos aplicados atualmente (HRABÁK et al., 2013). Recentemente grupos de pesquisa independentes têm redirecionado a função original do MALDI-TOF MS, visando discriminar cepas bacterianas de uma mesma espécie, como novo método de tipagem, apresentando vantagens aos métodos de referência como Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) e Multilocus sequence typing (MLST). Embora essas técnicas sejam amplamente reconhecidas, elas continuam a ser demoradas, onerosas e intensivas em mão-de- obra. Entretanto, ainda são necessários estudos que validem a aplicação do MALDI-TOF MS como método que permita o reconhecimento de clones epidemiológicos com patogenicidade específica, considerando-o como ferramenta epidemiológica de primeira linha (KARGER, 2016; SAUGET et al., 2017). A infecção pulmonar pelo CBc é sabidamente associada a um considerável impacto na morbimortalidade em pacientes com FC. A caracteristica de multirresistência e as diferenças na infectividade dentre as espécies tornam o manejo dessas infecções um desafio clínico. Não menos desafiora é a caracterização laboratorial das espécies não só pela similaridade fenotípica e genotípica entre elas como pela rapidez com que novas espécies são descritas nesse grupo. O monitoramento, por meio da vigilância epidemiológica, e a precisa identificação das espécies faz- se extremamente necessários através de técnicas que apresentem alto grau de precisão, rapidez e aplicabilidade aos laboratórios clínicos de rotina e que sejam equiparados ao método molecular de referência.

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo geral

Avaliar o desempenho da metodologia Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) comparado à identificação das espécies do Complexo Burkholderia cepacia através do sequenciamento gene recA.

1.2 Objetivos específicos

a) Identificar as amostras como pertencentes ao CBc por testes fenotípicos; b) Identificar as espécies das amostras incluídas no CBc pelo sequenciamento do gene recA; c) Identificar as espécies das amostras incluídas no CBc por espectrometria de massa; d) Avaliar as variações do perfil de identificação das amostras identificadas por espectrometria de massa a partir da utilização de diferentes meios de cultura; e) Avaliar a aplicabilidade dos critérios recomendados para caracterização do CBc na amostragem estudada por espectometia de massa e a redução dos pontos de corte; f) Comparar os resultados obtidos na identificação das espécies do CBc nas diferentes metodologias; e g) Empregar algoritmos em análises dos espectros de massa obtidos no MALDI-TOF e avaliar sua utilização como ferramenta de agrupamento das espécies do CBc.

2. METODOLOGIA

2.1 Seleção da amostragem

Foram selecionadas 125 amostras bacterianas do Complexo Burkholderia cepacia (CBc) da coleção de bactérias do Laboratório 2 do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia (DMIP) da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), compreendendo o período de coleta de janeiro de 2014 a fevereiro de 2016. As amostras em estoque foram oriundas de diversificados espécimes clínicos (secreção de orofaringe, escarro e sangue) processados no Laboratório de Bacteriologia (LABACT) do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE), de acordo com protocolos microbiológicos específicos utilizados por este laboratório (ITA-BAC-010/2015 FC/LABACT/HUPE). As amostras bacterianas utilizadas no estudo foram provenientes de pacientes com FC assistidos no Ambulatório de Fibrose Cística, localizado na Policlínica Piquet Carneiro (PPC), pertencente ao Departamento de Doenças do Tórax, Disciplina de Pneumologia do HUPE e também do Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueiras (IFF) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Ambos centros referências em FC no estado do Rio de Janeiro, no tratamento de pacientes adultos e pediátricos, respectivamente. A partir do levantamento de dados da coleção de bactérias do Laboratório 2 do DMIP, foram obtidas as amostras bacterianas em estoque e coletadas as informações referentes às culturas selecionadas, como: nome do paciente, centro de referência, número de matrícula do paciente na instituição de saúde, data da coleta, número de registro interno atribuído a amostra, espécime clínico e identificação prévia dos micro-organismos realizadas por métodos fenotípicos e submissão a testes de susceptibilidade a antimicrobianos, quando aplicável pelo LABACT do HUPE. O presente estudo foi submetido ao comitê de ética do Hospital Universitário Pedro Ernesto através da Plataforma Brasil (Ministério da Saúde - Conselho Nacional de Saúde) 37

conforme Folha de Rosto para Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (ANEXO A). As amostras bacterianas foram obtidas a partir de um banco provenientes de espécimes clínicos encaminhados para culturas de rotina no Laboratório de Bacteriologia do HUPE e para o Laboratório 2 da Disciplina de Microbiologia. Assim, os exames bacteriológicos foram executados independentes deste estudo. Em nenhum momento foi solicitado aos pacientes algum exame extra. Os dados foram divulgados através de códigos que não identificaram os indivíduos. Deste modo, não foi necessária a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

2.2 Reativação das amostras e caracterização por provas fenotípicas

As amostras bacterianas foram obtidas da coleção de bactérias, onde foram conservadas a -70°C em meio Skim Milk (DIFCO, Hants, Inglaterra), acrescido de 20% de glicerol. Uma alíquota de aproximadamente 100 µL foi retirada e semeada em Caldo Infuso de Cérebro e Coração - Brain Heart Infusion Broth – BHI (Becton Dickinson/BD®, Heidelberg, Alemanha), incubadas sob agitação por 20 a 24 horas a 35 ±2ºC, em aerobiose. Para as amostras bacterianas que não obtiveram crescimento nova alíquota foi semeada no meio líquido Luria Bertani (Becton Dickinson/BD®, Heidelberg, Alemanha), sob agitação por 20 a 24 horas a 35 ±2ºC, em aerobiose. Após crescimento em meio líquido, alíquotas foram semeadas por esgotamento em ágar Cystine Lactose Electrolyte Deficient – CLED (BD®) com a finalidade de serem observadas quanto a viabilidade e pureza das amostras, iniciando a identificação através da análise morfológica das colônias. As placas foram incubadas por 48 a 72 horas a 35 ±2ºC em estufa bacteriológica. Posterior ao crescimento em CLED, foram selecionadas colônias de cada amostra e semeadas em Columbia Agar Base - CAB (BD®, Heidelberg, Alemanha), incubadas por 24 a 48 horas a 35 ±2ºC em estufa bacteriológica, para realização das provas bioquímicas/fenotípicas. Após a obtenção de cultura pura recente em meio sólido, foram realizados os testes fenotípicos utilizando os seguintes meios de triagem para a identificação: Motility (BD®) 38

acrescido de 1% da solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) (INLAB, São Paulo, Brasil), meio de oxidação/fermentação (OF) acrescido de glicose a 1% (BD®, Heidelberg, Alemanha), descarboxilação da lisina (BD®, Heidelberg, Alemanha), desaminação da arginina (BD®), descarboxilação da ornitina (BD®) e para realização da prova de verificação da citocromo-oxidase foram utilizadas tiras comerciais. (NEWPROV®, Paraná, Brasil). Como referência para identificação fenotípica foi observado o preconizado pela American Society of Microbiology na 11ª edição do Manual de Microbiologia Clínica (Tabela 2) (LIPUMA et al., 2015).

2.2.1 Verificação do metabolismo

Tubos de ensaio contendo OF-glicose (BD®), com e sem óleo mineral, foram inoculados com agulha bacteriológica, repicando-se de 3 a 5 vezes em até 2/3 de sua profundidade. Após incubação por 24h a 48h a 35 ºC ±2ºC em aerobiose, foram procedidas as interpretações das provas fenotípicas. Como controle foram utilizadas as cepas Escherichia coli ATCC® 25922 (metabolismo fermentativo) e P. aeruginosa ATCC® 27853 (metabolismo oxidativo).

2.2.2 Verificação da motilidade

O teste na base motility (BD®, Heidelberg, Alemanha) acrescido de 1% da solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) (INLAB, São Paulo, Brasil), na proporção de 1mL para cada 100mL de meio base, foi realizado pela semeadura única e central em até 2/3 da profundidade do meio e incubados por 24 a 48 horas em aerobiose a 35 ±2ºC. A adição da solução de TTC otimiza a interpretação do teste através da detecção da motilidade, pois bactérias do CBc são capazes de reduzir o TTC e gerar a coloração avermelhada no meio (LEVY et al., 2004). A motilidade positiva foi evidenciada através da visualização de crescimento bacteriano 39

além da linha de inoculação. As cepas Escherichia coli ATCC® 25922 e Acinetobacter baumanii ATCC® 19606 foram utilizadas como controle positivo e negativo, respectivamente.

2.2.3 Utilização de aminoácidos

Para observação das provas de utilização de aminoácidos, foi utilizada a base Moeller de descarboxilação (BD®) acrescida de lisina 1%, arginina 1% e ornitina 1% (BD®), em tubos distintos e a mesma base sem o acréscimo de aminoácidos para controle negativo. Foi realizada a inoculação dos meios líquidos com alça bacteriológica e incubação por 24h a 48 h em estufa bacteriológica a 35 ±2ºC, em aerobiose. Como controle de utilização de arginina, foi utilizada a cepa P. aeruginosa ATCC® 27853, para lisina, a cepa S. maltophilia ATCC® 13637 e, para ornitina, a cepa de E. coli ATCC® 25922.

2.2.4 Verificação da atividade da Citocromo-oxidase

Para realização da prova de verificação da atividade da citocromo-oxidase a partir da cultura pura em meio CAB, foi transferida uma pequena quantidade de colônias através de alça bacteriológica para tiras impregnadas com reativo de indofenol-oxidase (N-N-dimetil-p-fenileno- diamina 2,5 g/L, alfa-naftol 2,5g/L e álcool etílico 500 mL/L) (NEWPROV®, Paraná, Brasil), previamente umedecidas com água purificada estéril, friccionada a colônia na tira e observado o desenvolvimento de cor dentro de alguns segundos (15 a 20 seg), podendo apresentar reações tardias ou fracas. A prova foi considerada positiva mediante a observação da cor roxa. Foram utilizadas as cepas P. aeruginosa ATCC® 27853 e E. coli ATCC® 25922 como controles positivo e negativo, respectivamente.

2.3 Identificação por espectrometria de massa

2.3.1 Processamento das amostras bacterianas

As amostras bacterianas selecionadas foram semeadas em CAB (BD) e em ágar sangue de carneiro 5% (ASC) (PlastLabor®, Rio de Janeiro, Brasil) incubadas por 24 h a 48 h a 35 ºC ±2ºC, em estufa bacteriológica. Uma colônia de cada amostra bacteriana foi aplicada com o auxílio de palito de madeira à placa de aço inoxidável. Após aplicação da colônia, adicionou-se 1 μL de ácido fórmico a 98%, posteriormente foi adicionado 1,0 μL solução matricial saturada de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha). Utilizando o instrumento Microflex LT - Bruker Daltonics MALDI Biotyper (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha), os espectros de massa foram determinados pelo programa MALDI Biotyper versão 3.1 (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha), adquiridos em modo de íons positivos lineares a uma frequência de laser de 60 Hz através de uma relação massa/carga (m/z) de 2.000 a 20.000 Da. realizada por análise automatizada e interativa dos dados pelo Módulo FlexControlTM v. 3.3 (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha), os espectros de massa por meio dos valores de eescore (pontuação) atribuídos são eletronicamente transformados em uma lista de picos comparados a um banco de dados de referência, obtendo um eescore (log) calculado entre 0.00 e 3.00. O calibrador padrão de massa Bruker Bacterial Test Standard (Bruker Daltonics GmbH®) composto do extrato de alfa peptídeo de E. coli DH5 e proteínas adicionais foi utilizado como calibrador dos espectros de massa do equipamento, assim como as cepas controles de B. cepacia ATCC® 25608, P. aeruginosa ATCC® 27853 e E. coli ATCC® 25922. O fluxo do processamento das amostras está demonstrado na Figura 4.

Figura 4 - Fluxo do processamento das amostras no MALDI-TOF MS

Fonte: Adaptado do manual do usuário do MALDI Biotyper CA System.

2.3.2 Análise dos espectros de massa

Os espectros de massa das amostras foram analisados através do Módulo flexAnalysisTM v. 3.3 (Bruker Daltonics GmbH®). De acordo com os critérios interpretativos padronizados pelo fabricante, amostras que obtiveram picos com eescore entre 2.00 e 3.00 apresentam identificação de alta confiança, permitindo sua caracterização a nível de espécie; amostras com eescore entre 1.70 e 1.99 apresentam identificação de baixa confiança, permitindo sua caracterização a nível de gênero; amostras com eescore inferior a 1.70 apresentam identificação não confiável e amostras com escore inferior a zero quando nenhum espectro de massa (pico) foi encontrado. Posteriormente foi utilizado o programa Bionumerics v. 6.6 (Applied Maths®, Sint Marten Letem, Bélgica) através do módulo de geração e análise de árvores filogenéticas e dendogramas.

2.4 Identificação molecular das espécies do CBc pelo sequenciamento do gene recA

2.4.1 Extração do DNA bacteriano por lise térmica

Das amostras selecionadas semeadas no meio CAB (BD®), alíquotas por meio de alça bacteriológica foram ressuspensas em 600 µL de água deionizada, posteriormente aquecidas por 10 min à 100ºC e submetidas a centrifugação por 30 seg em 16.000 rotações por minuto (RPM). O sobrenadante contendo DNA obtido por lise térmica (SAMBROOK et al., 1989) foi armazenado em tubo de polipropileno e utilizado para realização da PCR.

2.4.2 Quantificação e amplificação do gene recA

O DNA bacteriano obtido através da extração por lise térmica foi quantificado pelo fluorímetro Qubit® v. 2.0 (Invitrogen™, Eugene, OR, USA). A reação de PCR para o gene recA foi realizado conforme desenvolvido por Mahenthiralingam e colaboradores (2000), com adaptações. Foram utilizados 10 ng do produto de extração adicionados a 50 µL de mix para PCR, contendo 0,2 U/µL de Platinum Taq DNA polimerase, 1 µL (250 µM) de cada desoxinucleotídeo trifosfatado - dNTP, 1,5 µL (1,5 µM) de MgCl2 e 5 µL de tampão 5X para PCR (Invitrogen®, Carisbad, EUA). Vinte picomoles de cada iniciador foi adicionado à reação e água deionizada qsp 100 µL. A amplificação foi realizada em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems®, Califórnia, USA), utilizando desnaturação inicial por 5 minutos a 95ºC, seguida por 35 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 58ºC (temperatura de hibridação dos iniciadores) e 90 segundos a 72ºC. Uma extensão final de 10 minutos a 72ºC foi aplicada ao término dos ciclos. Para obtenção do produto de amplificação (1040 bp), foram utilizados os iniciadores BCR1 (5´-TGACCGCCGAGAAGAGCAA-3´) e BCR2 (5´-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC- 43

3´) (MAHENTHIRALINGAM et al., 2000). O tamanho do produto e a posição dos iniciadores são em relação a B. multivorans ATCC® 17616 recA sequence U70431. 2.4.3 Análise do DNA bacteriano por eletroforese em gel de agarose

A partir da amplificação, o resultado foi confirmado através da eletroforese em gel de agarose ultrapura (Invitrogen®, Carlsbad, EUA) a 1,5% em tampão de borato de sódio (SB buffer), 1 a 10 mM, pH 8.0, 1X. O gel de agarose foi vertido em cuba Horizon® 11 x 14 cm (Life Technologies®, Gaithersburg, EUA). Após a solidificação, foi adicionado tampão SB buffer 1X e aplicado 2 µL do DNA amplificado de cada amostra em conjunto com 1 µL de GelRed™ (Biotium®, Califórnia, EUA) e 1 µL de corante azul de bromofenol e xileno cianol. A corrida eletroforética foi realizada à 100V por 15 minutos. O gel foi visualizado e a imagem capturada (fotografia) realizada através de um transiluminador de luz ultravioleta e um sistema digital de captação de imagens DigiDoc-It™ Imaging System (UVP®, Califórnia, EUA). O tamanho das sequências foi estimado através da comparação com padrão de peso molecular ladder 100pb (Invitrogen®, Carlsbad, EUA) utilizado na corrida.

2.4.4 Purificação da amostra

Após constatação da banda correspondente à amplificação do gene recA (1040 pb), a amostra foi submetida à purificação em coluna, utilizando kit de purificação de DNA por centrifugação da Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega®, Madison, WI, USA). De acordo com as especificações do fabricante, foi realizado o processamento das amostras: adicionando 10 µL de solução de ligação à membrana e inserida a mini coluna no tubo de coleta, o produto de PCR preparado foi transferido para a montagem da minicoluna. Foi incubado à temperatura ambiente por 1 minuto, centrifugado a 16.000 rpm durante 1 minuto. Posteriormente o fluxo foi descartado e reinserida a mini coluna no tubo da coleção, adicionado 700 µL de solução de lavagem de membrana e centrifugado a 16.000 rpm por 1 minuto. Foi descartado o 44

fluxo restante, reinserida a mini coluna e repetido o processo de lavagem da membrana com 500 μL da solução de lavagem de membrana e realizada nova centrifugação a 16.000 rpm durante 5 minutos. O tubo foi esvaziado e centrifugado o conjunto da coluna durante 1 minuto, com a tampa da centrífuga aberta para permitir a evaporação de resíduos de etanol. Foi transferida a mini coluna para um tubo de micro centrífuga limpo de 1,5 mL, adicionado 50 µL de água ultrapura à mini coluna. Foi incubado por 1 minuto, centrifugado a 16.000 rpm durante 1 minuto e descartada a mini coluna. O DNA purificado foi submetido a eletroforese em gel de agarose, seguindo as mesmas especificações anteriormente descritas. Em seguida, visualizado em transiluminador de luz ultravioleta e um sistema digital de captação de imagens DigiDoc-It™ Imaging System (UVP®, Califórnia, USA), para confirmação da pureza, manutenção e qualidade do DNA purificado. Posteriormente foi conservado a -20°C até a realização da reação de sequenciamento.

2.4.5 Sequenciamento do gene recA

Foram preparadas as reações de sequenciamento utilizando o BigDye™ Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems®, Foster City, EUA), confome orientações do fabricante. Em uma placa de microtitulação de polipropileno de 96 poços para PCR, foram utilizados 4 iniciadores por amostra: BCR1 (5´-TGACCGCCGAGAAGAGCAA-3´); BCR2 (5´- CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3´); BCR3 (5´-GTCGCAGGCGCTGCGCAA-3´); e BCR4 (5´-GCGCAGCGCCTGCGACAT-3´), cujas posições (5´-3´) no gene recA do CBc correspondem, 2-20, 1044-1024, 513-530 e 528-511, nucleotídeos respectivamente. As temperaturas de hibridação dos referidos iniciadores correspondem à 58ºC. Para cada reação, foram adicionados 2 μL do DNA purificado (correspondendo a 20 ng) à 8 μL do mix de PCR (volume de reação de 10 μL), contendo 5 μL de água estéril, 1,5 μL de tampão de sequenciamento 5X, 1 μL da solução contendo o iniciador (3,2 pmol) e 0,5 μL do Big- dye (Applied Biosystems®, Foster City, EUA). A reação foi realizada em quadruplicata para cada iniciador, em termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems®, Foster 45

City, EUA), utilizando 1 minuto de desnaturação inicial a 96ºC, seguidos de 35 ciclos de 15 segundos a 96ºC, 15 segundos a 50ºC e 2 minutos a 60ºC. Não foi aplicada extensão final. Seguindo as orientações do fabricante, a rampa de temperatura foi ajustada, no intuito de impedir mudança brusca de temperatura (>1°C/seg), evitando assim a geração de ruídos na leitura dos nucleotídeos. Em seguida, o DNA (volume de 10 μL) foi precipitado, utilizando o seguinte protocolo: 2,5 μL de EDTA 0,125 M, 30 μL de etanol absoluto, misturado por inversão, deixando 15 minutos a temperatura ambiente, centrifugado a 4.000 rpm a 4°C por 45 minutos, descartado o sobrenadante por inversão, centrifugado rapidamente com a placa invertida, adicionado 30 μL de etanol 70%, centrifugado a 4.000 rpm a 4°C por 15 min, descartado o sobrenadante por inversão da placa, centrifugada a placa invertida a 4.000 rpm por 1 minuto. Em seguida foi realizada a desnaturação em termociclador (60°C por 20 min) e adicionado 10 μL de formamida. A placa foi novamente colocada em termociclador (95° por 5 min) e imediatamente no gelo por 5 min e injetada no sequenciador Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems®, Foster City, EUA), onde os eletroferogramas foram obtidos na medida em que as amostras passavam por capilares contendo Polímero de Performance Otimizada (Applied Biosystems®).

2.4.6 Análise das sequências do gene recA

Através das sequências obtidas, os contigs (sequencias únicas de DNA) foram dispostos no programa Geneious 7.1.5 (Biomatters®, Auckland, New Zealand) e alinhados junto as sequências de referência para cada espécie do CBc com ajuda do programa Mega v.7.0 (KUMAR et al., 2016). O alinhamento foi usado para construção das árvores filogenéticas no mesmo programa (THOMPSON et al, 1997). Regiões homólogas e variáveis entre as sequências obtidas do gene recA das amostras de referência e das clínicas também foram avaliadas comparativamente entre si com auxílio da ferramenta Basic Local Alignment Search Tool ® (BLAST), presente na base de dados GenBank (NCBI, Bethesda, EUA) (Tabela 3).

Tabela 3 - Sequências do GenBank® para comparação com as obtidas das amostras do CBc para fins de jjjjjjjjjjjjjjjjidentificação das espécies Espécies do Complexo Burkholderia cepacia Referência (s) GenBank

Burkholderia ambifaria VII AF323985

Burkholderia anthina VIII AF456060

Burkholderia arboris HE981731

Burkholderia arboris XIII AM748100, AM748095, AM748104

Burkholderia cenocepacia IIIA AF143782, AF143781, AF143780, AF143779

Burkholderia cenocepacia IIIB AF143783, AF143784, AF143785

Burkholderia cepacia AF143786, AF143787, AF143788

Burkholderia contaminans XVI AM922303, AM905036, AM922301, AM922302

Burkholderia dolosa VI AF323971, AF456033

Burkholderia lata HE981732

Burkholderia lata XVII AM905033

Burkholderia latens XI AM922300, AM748099

Burkholderia metallica HE981733

Burkholderia metallica XV AM748094

Burkholderia multivorans AF143778, AF143774, HE981730

Burkholderia pyrrocinia XIX AF456032, AF143794

Burkholderia seminalis XIV AM748096, AM748098

Burkholderia stabilis AF143789, AF143790

Burkholderia ubonensis X AY780511

Burkholderia vietnamiensis AF143791, AF143792, AF143793

Fonte: Adaptado do GenBank® (NCBI, Bethesda, EUA).

3. RESULTADOS

3.1 Características da amostragem

No período de janeiro de 2014 a fevereiro de 2016, foram selecionadas 125 amostras bacterianas caracterizadas pelo LABACT como cepas do CBc. Destas, 78 amostras não obtiveram crescimento nos meios de cultura utilizados, classificadas como inviáveis para o estudo. Das 47 amostras que obtiveram crescimento, 43 foram caracterizadas como pertencentes ao CBc e quatro identificadas através do MALDI-TOF MS como: S. maltophilia (02), P. aeruginosa (01) e Pandoraea apista (01). Estas foram excluídas das demais etapas deste estudo. As 43 amostras viáveis ao estudo e identificadas como pertencentes ao CBc eram provenientes de 22 pacientes: 39 (90,4%) amostras de 18 pacientes atendidos no IFF e quatro (9,3%) de quatro pacientes da PPC. O número de amostras por paciente variou de uma (2,32%) a 11 (25,58%). Considerando os espécimes clínicos, foram obtidas 31 (72,09%) amostras de escarro, 11 (25,58%) orofaringe e uma (2,32%) de sangue (Tabela 4).

Tabela 4 - Distribuição dos pacientes em relação ao registro da amostra, data da coleta, origem e espécime clínico jjjjjjjjjjjjjjjjj(continua) Paciente Número da Data da coleta Origem Espécime Clínico amostra 1 17412 27/01/2014 IFF Orofaringe 18269 04/08/2014 IFF Escarro 18651 03/11/2014 IFF Orofaringe 2 17485 06/02/2014 IFF Orofaringe 17486 06/02/2014 IFF Orofaringe 3 17556 20/02/2014 IFF Sangue 4 18470 12/03/2014 IFF Escarro 18652 20/10/2014 IFF Escarro 5 18222 23/07/2014 IFF Orofaringe 6 18271 30/07/2014 IFF Escarro 18645 13/10/2014 IFF Escarro Tabela 4 - Distribuição dos pacientes em relação aoregistro da amostra, data da coleta, origem e espécime clínico 48

jjjjjjjj jjjjj(conclusão) 7 18242 01/08/2014 HUPE/PPC Escarro 20143 09/10/2015 HUPE/PPC Escarro 8 18261 04/08/2014 IFF Escarro 20309 11/01/2016 IFF Escarro 9 18640 06/10/2014 IFF Escarro 18634 27/10/2014 IFF Escarro 10 18649 20/10/2014 IFF Orofaringe 11 18650 03/11/2014 IFF Orofaringe 18268 04/08/2014 IFF Orofaringe 20223 26/10/2016 IFF Escarro 12 18880 05/01/2015 IFF Escarro 13 18977 30/01/2015 HUPE/PPC Escarro 14 19249 23/02/2015 IFF Orofaringe 19250 26/02/2015 IFF Escarro 15 19677 09/06/2015 IFF Escarro 19678 09/06/2015 IFF Escarro 19679 09/06/2015 IFF Escarro 19680 12/06/2015 IFF Escarro 19681 24/06/2015 IFF Escarro 19682 24/06/2015 IFF Escarro 20244 03/12/2015 IFF Escarro 20246 08/12/2015 IFF Escarro 20308 06/01/2016 IFF Escarro 20310 04/01/2016 IFF Escarro 16 19251 02/03/2015 IFF Orofaringe 17 19444 26/03/2015 IFF Escarro 19450 13/04/2015 IFF Orofaringe 18 19446 06/04/2015 IFF Escarro 19 19448 10/04/2015 HUPE/PPC Escarro 20 20120 28/09/2015 IFF Escarro 21 20313 06/01/2016 IFF Escarro 22 20430 22/02/2016 IFF Escarro Legenda: IFF - Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da criança e do adolescente Fernandes Figueira; e HUPE/PPC -- Hospital Universitário Pedro Ernesto na Policlínica Piquet Carneiro. Fonte: O autor, 2017.

3.2 Caracterização fenotípica do CBc

Todas as amostras (100%) apresentaram metabolismo por via oxidativa da glicose, atividade da lisina descarboxilase e atividade da citocromo oxidase. Dezoito amostras (41,86%) apresentaram atividade da ornitina descarboxilase e nenhuma apresentou atividade da arginina dehidrolase.

3.3 Identificação do CBc por espectrometria de massa

A partir da metodologia aplicada através do instrumento Microflex LT - Bruker Daltonics MALDI Biotyper (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha), as seguintes identificações foram obtidas considerando o cultivo prévio em Columbia Ágar Base (CAB) e Ágar Sangue de Carneiro (ASC) (Tabela 5).

Tabela 5 - Identificação das amostras do CBc pelo MALDI-TOF MS previamente cultivadas em meios Columbia jjjjjjjjjjjjjjjjÁgar Base e Ágar Sangue de Carneiro (continua) Número da Cultivo em Escore Cultivo em Ágar Escore Amostra Columbia Ágar Base (log) Sangue de Carneiro (log) 17412 Burkholderia vietnamiensis 1.701 Burkholderia vietnamiensis 2.114 17485 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 1.943 17486 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 2.141 17556 Burkholderia cepacia 2.071 Burkholderia pyrrocinia 2.051 18470 Identificação não confiável 1.65 Burkholderia vietnamiensis 2.191 18222 Identificação não confiável 1.549 Nenhum pico encontrado <0 18271 Nenhum pico encontrado <0 Nenhum pico encontrado <0 18242 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.722 18261 Burkholderia vietnamiensis 2.14 Burkholderia vietnamiensis 2.317 18268 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 2.022 18269 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 1.993 18640 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 1.969 Tabela 5 - Identificação das amostras do CBc pelo MALDI-TOF MS previamente cultivadas em meios Columbia jjjjjjjjjjjjjjjjÁgar Base e Ágar Sangue de Carneiro (conclusão) 50

18645 Burkholderia cenocepacia 1.776 Nenhum pico encontrado <0 18652 Burkholderia vietnamiensis 1.758 Burkholderia vietnamiensis 2.162 18649 Burkholderia vietnamiensis 2.108 Burkholderia vietnamiensis 2.017 18634 Burkholderia vietnamiensis 2.156 Burkholderia vietnamiensis 2.209 18651 Burkholderia vietnamiensis 2.032 Burkholderia vietnamiensis 2.131 18650 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.944 18880 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 2 18977 Burkholderia cepacia 1.908 Nenhum pico encontrado <0 19249 Identificação não confiável 1.65 Burkholderia cenocepacia 1.714 19250 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 2.118 19251 Burkholderia vietnamiensis 1.891 Nenhum pico encontrado <0 19444 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 2.026 19446 Burkholderia cepacia 2.054 Burkholderia cepacia 2.037 19448 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.769 19450 Burkholderia vietnamiensis 1.762 Burkholderia vietnamiensis 1.88 19677 Burkholderia cenocepacia 1.781 Burkholderia cenocepacia 1.801 19678 Burkholderia cenocepacia 2.226 Burkholderia cenocepacia 2.21 19679 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 2.088 19680 Nenhum pico encontrado <0 Nenhum pico encontrado <0 19681 Burkholderia cenocepacia 1.92 Burkholderia cenocepacia 2.199 19682 Identificação não confiável 1.576 Burkholderia cenocepacia 1.958 20120 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.894 20143 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.965 20223 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.802 20244 Nenhum pico encontrado <0 Nenhum pico encontrado <0 20246 Burkholderia cenocepacia 2.154 Burkholderia cenocepacia 1.937 20308 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 1.91 20309 Nenhum pico encontrado <0 Nenhum pico encontrado <0 20310 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia cenocepacia 2.057 20313 Burkholderia cenocepacia 1.901 Burkholderia cenocepacia 2.105 20430 Nenhum pico encontrado <0 Burkholderia vietnamiensis 2.092 Nota: Conforme critérios interpretativos padronizados pela Bruker Daltonics®: escore <0 - Nenhum pico encontrado; < 1.7 - Identificação não confiável; 1.70-1.99 – Identificação de baixa confiança; e 2.00 – 3.00 - Identificação de alta confiança. Fonte: O autor, 2017.

Quanto ao perfil de identificação das amostras oriundas do cultivo em meio ASC: 35 (81,39%) foram identificadas e oito (18,6%) não apresentaram picos para identificação. Dezessete (40,5%) amostras provenientes do cultivo em meio CAB foram identificadas, porém 22 (51,16%) não apresentaram picos para identificação e quatro (9,3%) apresentaram eescore inferior a 1.70 caracterizadas como identificação não confiável. Apenas uma (2,32%) amostra (17556) apresentou discordância na identificação nos meios utilizados e cinco (11,62%) amostras não foram identificadas em nenhum dos meios (Gráfico 1).

Gráfico 1 - Percentual de identificação pelo MALDI-TOF MS das amostras do jjjjjjjjjjjjjjjjCBc cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de jjjjjjjjjjjjjjjjCarneiro 100,00% 81,39% 80,00% 60,00% 51,16% 40,50% 40,00% 18,60% 20,00% 9,30% 0% 0,00% Amostras identificadas Nenhum pico Identificação não encontrado confiável

Identificação em meio Columbia Ágar Base Identificação em meio Ágar Sangue de Carneiro

Nota: Conforme critérios interpretativos padronizados pela Bruker Daltonics®: escore < 1.7 - Identificação não confiável; 1.70-3.00 – Amostras Identificadas; e <0 - Nenhum pico encontrado Fonte: O autor, 2017.

Com os espectros de massa obtidos, as identificações foram classificadas em conformidade com as pontuações (log) pelo Módulo FlexControlTMv. 3.3 (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha), permitindo a avaliação quanto ao nível de caracterização e confiança das amostras. Foi observado um aumento de 27,91% no perfil das amostras identificadas a nível de espécie e 41,86% a nível de gênero, conforme critérios de interpretação (eescore) estabelecidos pelo fabricante, nas amostras semeadas em meio ASC comparativamente ao meio CAB (Gráfico 2).

Gráfico 2 - Classificação de acordo com escore (log) de identificação pelo MALDI-TOF MS das amostras do CBc cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro 50,00% 46,51% 45,00% 40,00% 34,88% 35,00% 30,00% 25,00% 20,93% 18,60% 20,00% 15,00% 9,30% 10,00% 5,00% 0,00% 0,00% <1.7 1.70 - 1.99 2.00 - 3.00

Identificação em meio Columbia Ágar Base Identificação em meio Ágar Sangue de Carneiro

Nota: Conforme critérios interpretativos padronizados pela Bruker Daltonics®: escore < 1.7 - Identificação não confiável; 1.70-1.99 – Identificação de baixa confiança; e 2.00 – 3.00 - Identificação de alta confiança. Fonte: O autor, 2017.

Quanto ao perfil de identificação das amostras por espécie (Gráfico 3), considerando a semeadura em meio ASC, dezoito (51,42%) amostras foram caracterizadas como B. cenocepacia, 15 (42,85%) B. vietnamiensis, uma (2,85%) B. cepacia e uma (2,85%) B. pyrrocinia. Em meio CAB: oito (47,05%) amostras foram caracterizadas como B. vietnamiensis, seis (35,29%) B. cenocepacia, e três (17,64%) B. cepacia.

Gráfico 3 - Percentual de identificação de espécies do CBc pelo MALDI-TOF MS das amostras previamente cultivadas nos meios Ágar Sangue de Carneiro e Columbia Ágar Base Amostras identificadas em meio Amostras identificadas em meio Ágar Sangue de Carneiro (n=35) Columbia Ágar Base (n=17) 2,85%

47,05% 35,29% 42,85% 51,42% 17,64%

2,85% Burkholderia cenocepacia (n=18) Burkholderia cenocepacia (n=6) Burkholderia cepacia (n=1) Burkholderia cepacia (n=3) Burkholderia vietinamiensis (n=15) Burkholderia vietinamiensis (n=8) Burkholderia pyrrocinia (n=1) Legenda: n – número de amostras. Fonte: O autor, 2017.

Através do Módulo flexAnalysisTM v. 3.3 (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha) foram obtidos os espectros de massa das amostras e transferidos para análise no programa Bionumerics v. 6.6 (Applied Maths®, Sint Marten Letem, Bélgica) possibilitando criar as árvores (Figuras 5, 6), demonstrando a partir dos valores de similaridade uma inspeção da coerência dos perfis de espectro entre as amostras, através do coeficiente de similaridade e método de agrupamento pelo algoritmo Neighbor joining. Foram construídas árvores filogenéticas sem raiz, a partir de uma matriz de distâncias e de acordo com o princípio da evolução mínima, supondo-se aditividade da matriz de distâncias tomadas como argumento, onde a eficiência deste método tem demonstrado superioridade a outras formas de reconstrução de árvores (SAITOU; NEI, 1987; LI, 2015). Através dos nós formados na árvore filogenética que compartilham um nó interno comum, chamada de junção de vizinhos, foram observadas a segregação das amostras quanto a identificação das espécies obtidos nos dois meios de culturas utilizados (CAB e ASC), independente do escore obtidos pelo MALDI-TOF MS. Em meio ASC onde foram obtidos o maior número de identificação das amostras, ocorrendo uma segmentação das amostas pertencentes à espécie B. cenocepacia IIIA (18650, 19448, 20120, 18268, 18242) em nós diferentes da espécie B. cenocepacia IIIB (20223, 20143, 54

19249, 20310, 19677, 19679, 19678, 20306, 20246, 19681), comparadas as expressões de pico em meio CAB. Com exceção de apenas uma amostra do subtipo IIIA (20313) observada no grupamento das amostras do subtipo IIIB. Podemos observar também uma proximidade das amostras relacionadas ao mesmo paciente, conforme constatado nas amostras de B. cenocepacia IIIB pertencentes ao paciente número 15 (20310, 19250, 19677, 19679, 19678, 20308, 20246, 19681, 19682), B. vietnamiensis do paciente 17 (19450, 19444) e B. cenocepacia IIIA do paciente 11 (18650, 18268).

Figura 5 - Árvore de similaridade das amostras do CBc pelo método de agrupamento Neighbor joining, de acordo com os espectros de massa obtidos pelo MALDI-TOF MS em meio Ágar Sangue de Carneiro

Paciente 17

Legenda: AS - amostras isoladas em meio Ágar Sangue de Carneiro. Fonte: O autor, 2017.

Figura 6 - Árvore de similaridade das amostras do CBc pelo método de agrupamento Neighbor joining, de acordo com os espectros de massa obtidos pelo MALDI-TOF MS em meio Columbia Ágar Base

Legenda: AC - amostras isoladas em meio Columbia Ágar Base. Fonte: O autor, 2017.

3.4 Identificação das espécies do CBc pelo sequenciamento do gene recA

Os resultados da identificação das espécies do CBc pelo sequenciamento do gene recA estão discriminados na Tabela 6. Dezoito (41,86%) amostras foram caracterizadas como B. vietnamiensis, 14 (32,55%) B. cenocepacia IIIB, oito (18,6%) B. cenocepacia IIIA, duas (4,65%) B. contaminans e uma (2,32%) B. cepacia.

Tabela 6 - Identificação das amostras do CBc por meio do sequenciamento do gene recA Número da Identificação pelo Número da Identificação pelo sequenciamento do gene recA sequenciamento do gene recA Amostra Amostra 17412 Burkholderia vietnamiensis 19251 Burkholderia vietnamiensis 17485 Burkholderia vietnamiensis 19444 Burkholderia vietnamiensis 17486 Burkholderia vietnamiensis 19446 Burkholderia cepacia 17556 Burkholderia contaminans 19448 Burkholderia cenocepacia IIIA 18470 Burkholderia vietnamiensis 19450 Burkholderia vietnamiensis 18222 Burkholderia vietnamiensis 19677 Burkholderia cenocepacia IIIB 18271 Burkholderia cenocepacia IIIA 19678 Burkholderia cenocepacia IIIB 18242 Burkholderia cenocepacia IIIA 19679 Burkholderia cenocepacia IIIB 18268 Burkholderia cenocepacia IIIA 19680 Burkholderia cenocepacia IIIB 18269 Burkholderia cenocepacia IIIB 19681 Burkholderia cenocepacia IIIB 18261 Burkholderia vietnamiensis 19682 Burkholderia cenocepacia IIIB 18640 Burkholderia vietnamiensis 20120 Burkholderia cenocepacia IIIA 18645 Burkholderia cenocepacia IIIA 20143 Burkholderia cenocepacia IIIB 18652 Burkholderia vietnamiensis 20223 Burkholderia cenocepacia IIIB 18649 Burkholderia vietnamiensis 20244 Burkholderia cenocepacia IIIB 18634 Burkholderia vietnamiensis 20246 Burkholderia cenocepacia IIIB 18651 Burkholderia vietnamiensis 20308 Burkholderia cenocepacia IIIB 18650 Burkholderia cenocepacia IIIA 20309 Burkholderia vietnamiensis 18880 Burkholderia vietnamiensis 20310 Burkholderia cenocepacia IIIB 18977 Burkholderia contaminans 20313 Burkholderia cenocepacia IIIA 19249 Burkholderia cenocepacia IIIB 20430 Burkholderia vietnamiensis 19250 Burkholderia vietnamiensis Fonte: O autor, 2017.

Conforme a metodologia aplicada, através do programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis v. 7 (MEGA7) (KUMAR et al., 2016) foi construído o dendograma (Figura 7) permitindo a identificação das amostras comparativas à base de dados GenBank®

(NCBI, Bethesda, USA).

Figura 7 - Dendograma de alinhamento das amostras do CBc obtidas pelo sequenciamento do gene recA com as sequências de referência do GenBank®

Fonte: O autor, 2017. 59

3.5 Comparação entre a identificação das amostras do CBc obtidas pelo MALDI-TOF MS e o sequenciamento do gene recA.

A partir da identificação das amostras obtidas pelo MALDI-TOF MS comparado aos resultados do sequenciamento do gene recA, os resultados foram consolidados na tabela 7.

Tabela 7 - Identificação das espécies do CBc de amostras previamente cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro pelo MALDI-TOF MS comparativamente aos resultados do sequenciamento do gene recA (continua) Nº da Cultivo em Columbia Escore Cultivo em Ágar Escore recA Amostra (log) (log) Ágar Base Sangue de Carneiro 17412 Burkholderia 1.701 Burkholderia 2.114 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis 17485 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.943 Burkholderia encontrado vietnamiensis vietnamiensis 17486 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.141 Burkholderia encontrado vietnamiensis vietnamiensis 17556 Burkholderia 2.071 Burkholderia 2.051 Burkholderia cepacia pyrrocinia contaminans 18470 Identificação não 1.650 Burkholderia 2.191 Burkholderia confiável vietnamiensis vietnamiensis 18222 Identificação não 1.549 Nenhum pico <0 Burkholderia confiável encontrado vietnamiensis 18271 Nenhum pico <0 Nenhum pico <0 Burkholderia encontrado encontrado cenocepacia IIIA 18242 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.722 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIA 18261 Burkholderia 2.140 Burkholderia 2.317 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis 18269 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.993 Burkholderia encontrado vietnamiensis cenocepacia IIIB 18268 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.022 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIA 18640 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.969 Burkholderia encontrado vietnamiensis vietnamiensis 18645 Burkholderia 1.776 Nenhum pico <0 Burkholderia cenocepacia encontrado cenocepacia IIIA 18652 Burkholderia 1.758 Burkholderia 2.162 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis 18649 Burkholderia 2.108 Burkholderia 2.017 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis 18634 Burkholderia 2.156 Burkholderia 2.209 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis 18651 Burkholderia 2.032 Burkholderia 2.131 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis Tabela 7 – Identificação das espécies do CBc de amostras previamente cultivadas em meios Columbia Ágar 60

Base e Ágar Sangue de Carneiro pelo MALDI-TOF MS comparativamente aos resultados do sequenciamento do gene recA (continuação) 18650 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.944 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIA 18880 Nenhum pico <0 Burkholderia 2 Burkholderia encontrado vietnamiensis vietnamiensis 18977 Burkholderia 1.908 Nenhum pico <0 Burkholderia cepacia encontrado contaminans 19249 Identificação não 1.650 Burkholderia 1.714 Burkholderia confiável cenocepacia cenocepacia IIIB 19250 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.118 Burkholderia encontrado cenocepacia vietnamiensis 19251 Burkholderia 1.891 Nenhum pico <0 Burkholderia vietnamiensis encontrado vietnamiensis 19444 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.026 Burkholderia encontrado vietnamiensis vietnamiensis 19446 Burkholderia 2.054 Burkholderia 2.037 Burkholderia cepacia cepacia cepacia 19448 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.769 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIA 19450 Burkholderia 1.762 Burkholderia 1.880 Burkholderia vietnamiensis vietnamiensis vietnamiensis 19677 Burkholderia 1.781 Burkholderia 1.801 Burkholderia cenocepacia cenocepacia cenocepacia IIIB 19678 Burkholderia 2.226 Burkholderia 2.210 Burkholderia cenocepacia cenocepacia cenocepacia IIIB 19679 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.088 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIB 19680 Nenhum pico <0 Nenhum pico <0 Burkholderia encontrado encontrado cenocepacia IIIB 19681 Burkholderia 1.920 Burkholderia 2.199 Burkholderia cenocepacia cenocepacia cenocepacia IIIB 19682 Identificação não 1.576 Burkholderia 1.958 Burkholderia confiável cenocepacia cenocepacia IIIB 20120 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.894 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIA 20143 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.965 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIB 20223 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.802 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIB 20244 Nenhum pico <0 Nenhum pico <0 Burkholderia encontrado encontrado cenocepacia IIIB 20246 Burkholderia 2.154 Burkholderia 1.937 Burkholderia cenocepacia cenocepacia cenocepacia IIIB 20308 Nenhum pico <0 Burkholderia 1.910 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIB 20309 Nenhum pico <0 Nenhum pico <0 Burkholderia encontrado encontrado vietnamiensis 20310 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.057 Burkholderia encontrado cenocepacia cenocepacia IIIB 20313 Burkholderia 1.901 Burkholderia 2.105 Burkholderia cenocepacia cenocepacia cenocepacia IIIA Tabela 7 – Identificação das espécies do CBc de amostras previamente cultivadas em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro pelo MALDI-TOF MS comparativamente aos resultados do sequenciamento do gene recA (conclusão) 61

20430 Nenhum pico <0 Burkholderia 2.092 Burkholderia encontrado vietnamiensis vietnamiensis Nota: Conforme critérios interpretativos padronizados pela Bruker Daltonics®: escore <0 - Nenhum pico encontrado; < 1.7 - Identificação não confiável; 1.70-1.99 – Identificação de baixa confiança; e 2.00 – 3.00 - Identificação de alta confiança. Fonte: O autor, 2017.

As análises comparativas dos resultados da identificação das espécies do CBc obtidos nas duas metodologias foram descritas na Tabela 8, considerando o cultivo prévio em ASC e CAB e os critérios de interpretação padronizados pelo fabricante quanto ao escore para caracterização a nível de gênero e espécie. Foi observado uma maior identificação das amostras em meio ASC, caracterizando 35 (81,39%) a nível de gênero e 18 (41,86%) a nível de espécie comparadas a identificação de 17 (39,53%) amostras a nível de gênero e sete (16,27%) ao nível de espécie obtidas em meio CAB. Considerando a mesma análise em relação as espécies obtivemos: Onze (61,11%) amostras de B. vietnamiensis em ASC, comparativamente a quatro (22,22%) em CAB; duas (25%) amostras de B. cenocepacia IIIA em ASC e nenhuma em CAB; quatro (28,57%) amostras de B. cenocepacia IIIB em ASC, comparativamente a duas (14,28%) em CAB; 100% de identificação da amostra de B. cepacia em ambos os meios; e identificação incorreta das duas amostras de B. contaminans nos dois meios utilizados.

Tabela 8 - Comparação entre a identificação das amostras do CBc obtidas pelo MALDI-TOF MS em meios Columbia Ágar Base e Ágar Sangue de Carneiro, e o sequenciamento do gene recA Identificação recA Cultivo em Columbia Cultivo em Ágar Sangue de Carneiro Ágar Base (n/%) (n/%) B. vietnamiensis(n=18) ≥ 2.00 4/22 11/61 1.70 a 1.99 4/22 3/17 <1.70 2/11 0/0 Sem pico 8/44 3/17 Identificação incorreta 0/0 1/6 (B. cenocepacia, escore>2.00) B. cenocepacia IIIA(n=8) ≥ 2.00 0/0 2/25 1.70 a 1.99 2/25 4/50 <1.70 0/0 0/0 Sem pico 6/75 2/25 Identificação incorreta 0/0 0/0 B.cenocepacia IIIB(n=14) ≥ 2.00 2/14 4/28 1.70 a 1.99 2/14 7/50 <1.70 2/14 0/0 Sem pico 8/57 2/14 Identificação incorreta 0/0 1/7 (B. vietnamiensis, escore1.70 a 1.99) B. cepacia(n=1) ≥ 2.00 1/100 1/100 1.70 a 1.99 0/0 0/0 <1.70 0/0 0/0 Sem pico 0/0 0/0 Identificação incorreta 0/0 0/0 B. contaminans (n=2) ≥ 2.00 0/0 0/0 1.70 a 1.99 0/0 0/0 <1.70 0/0 0/0 Sem pico 0/0 1/50 Identificação incorreta 2/100 1/50(B. pyrrocinia, escore>2.00) Nota: Conforme critérios interpretativos padronizados pela Bruker Daltonics®: 1.70-1.99 – Identificação correta a nível de gênero; ≥2.00 - Identificação correta a nível de espécie; e <0 - Sem identificação. Legenda: n – número. Fonte: O autor, 2017.

Através do gráfico de dispersão (Gráfico 4), analisamos a distribuição da amostragem de acordo com a variação dos eescores obtidos no MALDI-TOF MS pela regressão e relacionamento médio linear. Para essa análise consideramos os resultados das amostras cultivadas em meio ASC. Observamos um escore médio de 1.51 para B. vietnamiensis, 1.49 para B. cenocepacia IIIA, e 1.20 para B. cenocepacia IIIB. 63

Considerando uma minoração do escore para ≥1.70-1.99 (classificado pelo fabricante como identificação confiável apenas ao nível de gênero) houve concordância de 74,41% a nível de espécie, sendo 14 (77,77%) amostras de B. vietnamiensis, 11 (78,57%) de B. cenocepacia IIIB e seis (75%) de B. cenocepacia IIIA.

Gráfico 4 - Distribuição das amostras por escore obtidos dos espectros de massa pelo MALDI-TOF MS em meio Ágar Sangue de Carneiro

Nota: Conforme critérios interpretativos padronizados pela Bruker Daltonics®: 1.70-1.99 – Identificação correta a nível de gênero; ≥2.00 - Identificação correta a nível de espécie; e <0 - Sem identificação. Fonte: O autor, 2017.

4. DISCUSSÃO

4.1 Da ocorrência das espécies do CBc

A caracterização das espécies do CBc na colonização do trato respiratório de pacientes com FC tem assumido particular importância nos últimos anos, na medida em que foi estabelecida a concepção de utilizá-la como caráter preditivo na evolução clínica do paciente, relacionado ao impacto na morbidade e mortalidade e na capacidade de transmissão, preconizando medidas de intervenção através de políticas de segregação (MARQUES, 2011; PRADENAS et al, 2016). O CBc tem uma complexa organização taxonômica e sua identificação é um desafio para os laboratórios de microbiologia. A não identificação ou identificação errônea dessas espécies representam um problema na epidemiologia e tratamento desses pacientes (MARTINUCCI et al., 2016). O progresso realizado nos últimos anos no aperfeiçoamento da taxonomia dessas bactérias forneceu a base para uma melhor identificação. No entanto, uma diferenciação de gêneros relacionados, tais como Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Achromobacter, Brevundimonas, Comamonas e Delftia continuam a ser um desafio. A diferenciação das espécies dentro do CBc pode ser particularmente problemática, devido a sua similaridade fenotípica, mesmo com a utilização de um painel amplo de testes bioquímicos. Além disso, a maioria dos sistemas comerciais automatizados também falham na identificação, não só devido a semelhança fenotípica entre elas, como também devido a ausência de amostras de referência de todas as espécies nos bancos de dados (LIPUMA et al., 2010). Utilizamos um painel fenotípico restrito que teve como finalidade uma abordagem de triagem inicial dos BGNNF oriundos da coleção de bactérias, para então procedermos a identificação por espectrometria de massa e pelo método molecular. Os resultados dos testes fenotípicos permitiram incluir 43 amostras no CBc. Uma vez que a maioria das 20 espécies do CBc é positiva para o teste da lisina, a sua inclusão em paineis de identificação é fundamental e 65

nossos resultados corroboraram a sua utilização como marcador importante para inclusão das amostras suspeitas no CBc. Em nosso estudo, através do método molecular de sequenciamento do gene recA (método de referência) observamos a maior ocorrência das espécies B. vietnamiensis caracterizando 41,86% (n=18) das amostras e B. cenocepacia com 51,16% (n=22) conseguindo ainda através desta técnica a divisão em subgrupos filogenéticos IIIA 18,6% (n=8) e IIIB 32,55% (n=14). Resultados similares foram observados por Vicenzi e colaboradores (2016) com 44 amostras do CBc obtidas na Clínica de Fibrose Cística do Departamento de Pediatria da Universidade Federal do Paraná (UFPR), isolados de 46 pacientes. As espécies mais comumente identificadas foram: B. cenocepacia IIIA (33,4%), B. vietnamiensis (30,6%) e B. cenocepacia IIIB (27,8%). Segundo dados divulgados pela Cystic Fibrosis Canada (CFA) através do Annual Report 2014, B. cenocepacia e B. multivorans eram as espécies mais frequentemente encontradas. Em 156 pacientes atendidos anteriormente ao ano de 1995, a maioria das infecções por Burkholderias foi causadas por clones epidêmicos de B. cenocepacia. Após este período, com a implementação de novas medidas de controle de infecção, B. multivorans tornou-se a espécie mais prevalente. Em nosso estudo apenas uma amostra (2,32%) foi identificada como B. cepacia apresentando divergência quanto ao padrão apresentado por pacientes com FC colonizados por CBc nos Estados Unidos. Dados coletados pela CF Foundation B. cepacia Research Laboratory and Repository da Universidade de Michigan e divulgados pela Cystic Fibrosis Foundation no Annual Report 2015, mostram a espécie B. cepacia prevalente em 93,6% (n=664) dos isolados. Não foi possível comparar nossos resultados com os dados do Registro Brasileiro de Fibrose Cística uma vez que os mesmos não contemplam a identificação por espécies do CBc. B. multivorans não foi encontrada em nosso estudo, por outro lado B. vietnamiensis foi a segunda espécie de maior ocorrência. Resultados similares ao estudo de Vicenzi e colaboradores (2016). B. vietnamiensis torna-se particularmente interessante pela capacidade de fixação de nitrogênio que a liga fortemente a reservatórios ambientais, podendo ser considerada um excelente modelo para investigação quanto a aquisição na comunidade e sua adaptação pulmonar (CESCUTTI et al., 2013). Outra característica importante de B. vietnamiensis é a sua maior susceptibilidade a aminoglicosídeos como à tobramicina e também a azitromicina 66

comparativamente a outras espécies do CBc, especialmente aquelas associadas a infecção crônica em FC (JASSEM et al., 2014). Historicamente, a análise de sobrevivência de pacientes com FC colonizados por B. cenocepacia tem demostrado resultados significativamente piores do que aqueles portadores de outras espécies do CBc, como B. multivorans (ZLOSNIK et al., 2015). Algumas cepas de B. cenocepacia são altamente transmissíveis e resistentes a quase todos os antibióticos. Aproximadamente um terço dos pacientes com FC infectados com B. cenocepacia desenvolve a síndrome cepacia e quase todas as estirpes de B. cenocepacia têm a capacidade de sobreviver e replicar intracelularmente tanto nas células epiteliais das vias respiratórias como nos macrófagos, expressam pili e adesinas associadas de 22 kDa, capazes de transmigrar através do epitélio pulmonar (GANESAN; SAJJAN, 2012). Como tópico relevante, cabe ressaltar a análise crítica quanto aos benefícios do transplante nestes pacientes, por vezes, apresentando inviabilidade ao transplante pulmonar, devido a sobrevivência comprometida do enxerto e um início mais rápido de bronquiolite obliterante causada por respostas inflamatórias aumentadas no pulmão (SURETTE et al., 2016). Evidências atuais mostram que uma triagem cuidadosa de todos os pacientes com FC e gerenciamento multidisciplinar consciente do risco devem ser alcançados antes de listar os pacientes para o transplante (OLLAND et al., 2011). Tais variabilidades das distribuições das espécies entre os pacientes com FC podem ser cada vez mais observadas e atribuídas a um perfil epidemiológico diferente para cada centro de tratamento. Como demostrando em nosso estudo, foi observada uma maior ocorrência das espécies B. cenocepacia e B. vietnamiensis como corroborado com estudo nacional mencionado, apresentando um perfil diferenciado das populações europeias e norte-americanas. Tais disparidades podem ser resultantes das diferentes terapêuticas antimicrobianas utilizadas, devido a não padronização, como medidas de segregação e controle implementadas pelas clínicas, ocasionando um aumento de espécies outrora consideradas ambientais (SCHWEIZER, 2016). Analisando a ocorrência das espécies por paciente (considerando uma amostra por paciente) observamos que 12 (54,54%) pacientes foram colonizados por B. vietnamiensis, seis (27,27%) por B. cenocepacia IIIA, cinco (11,62%) por B. cenocepacia IIIB, dois (4,65%) por B. contaminans e um (2,32%) por B. cepacia, permanecendo igualitária a ocorrência de B. vietnaminesis como micro-organismo em maior número de isolados por paciente, porém entre os pacientes com isolados de B. cenocepacia, constatou-se um maior percentual de pacientes 67

colonizados pelo subtipo B. cenocepacia IIIA comparado a B. cenocepacia IIIB (VICENZI et al., 2016).

4.2 Das variações do perfil de identificação das amostras no MALDI-TOF MS

A identificação das 43 amostras do CBc por MALDI-TOF MS mostrou diferenças importantes quando as amostras eram semeadas previamente em ASC ou CAB. A partir da semeadura em ASC, obtivemos a identificação de 81,39% das amostras comparativamente a identificação de 40,5% em CAB e um aumento de 27,9% no percentual de identificação para B. cenocepacia e 16,27% para amostras de B. vietnamiensis. Resultados similares foram observados por Plongla e colaboradores (2016), com 102 amostras de Burkholderia spp. e 93 de outros BGNNF de pacientes com FC. No meio ASC o percentual de identificação foi maior 19,8% em comparação ao meio ágar MacConkey (MAC) e 7% ao meio ágar seletivo para Burkholderia cepacia (BCSA). Possivelmente a otimização no percentual de identificação das amostras previamente cultivadas no ASC esteja relacionada, em parte, por tratar-se de micro-organismos fastidiosos que requerem potencias nutricionais elevados para seu desenvolvimento in vitro, onde a composição do meio é fundamental. Além disso, sua suplementação com sangue (5–10%) fornece fatores de crescimento adicionais para micro-organismos exigentes. Cinco amostras (11,62%) não foram identificadas independentes de terem sido cultivadas em ASC ou CAB o que pode ser decorrente de variabilidades causadas pelas condições de crescimento, como a utilização do método direto (isolado de uma pequena colônia). Melhores resultados têm sido obtidos com o método de extração proteica. Variações também podem ser decorrentes das diferentes soluções matriz, pois a qualidade do espectro adquirido é altamente dependente deste fator, assim como, na escolha e padronização dos solventes utilizados na solubilização da matriz que permitem o aumento da reprodutibilidade a cada disparo do laser (CARBONNELLE et al., 2011; CLARK et al., 2013; PATEL, 2015). De acordo com alguns autores as identificações ausentes ou erradas podem também ser atribuídas à deposição de informações incorretas no banco de dados e para os quais não há espectro de referência presente no momento da análise (BIZZINI; GREUB, 2010; HRABÁK et al., 2013). 68

4.3 Desempenho do MALDI-TOF MS comparado ao sequenciamento do gene recA para identificação das espécies do CBc

Estudos apresentados por Vanlaere e colaboradores (2008), e também por Vandamme & Dawyndt (2011) evidenciam que análises pelos dados de sequenciamento do gene recA possuem maior confiabilidade discriminatória comparada ao sequenciamento do 16S rDNA, por permitir a diferenciação das principais espécies do CBc, caracterizando aquela técnica como padrão ouro (MAHENTHIRALINGAM et al., 2000). O MALDI-TOF MS emergiu como uma ferramenta rápida e sensível na caracterização microbiana. Entretanto, há necessidade da proficiência desta metodologia em relação a sua precisão, em diferentes micro-organismos (CROXATTO et al., 2012). O uso deste método pode contribuir na deliberação de estratégias terapêuticas guiando a escolha da antibioticoterapia na FC, especialmente importante para caracterização das espécies dentro do CBc, uma vez que não possuem a mesma patogenicidade e, portanto, requerem uma conduta clínica diferenciada (LAMBIASE et al., 2013). Estudos realizados com o MALDI-TOF MS tem demonstrado bom desempenho na identificação de BGNNF isolados em FC (ALBYet al., 2013; PLONGLA et al., 2016). Para o CBc os resultados apresentam alto grau de variação na concordância do MALDI- TOF MS com o sequenciamento recA. Em estudo realizado com 91 amostras do CBc coletadas de diferentes espécimes clínicos, provenientes de dois hospitais, localizados no Rio de Janeiro e São Paulo, semeadas previamente em BCSA, e realizada extração proteica, a concordância entre os dois métodos foi de 100% na identificação a nível de gênero e 76,9% a nível de espécie. O maior percentual de erros foi na identificação da espécie B. contaminans (FEHLBERG et al., 2013). Vizenci e colaboradores (2016) encontraram percentuais de concordância de 100% a nível de gênero e 97,22% a nível de espécie também entre os dois métodos, em 36 amostras do CBc de pacientes com FC, semeadas em BCSA, e realizada extração proteica. Apenas uma amostra foi identificada como B. vietnamiensis pelo sequenciamento do gene recA e incorretamente pelo MALDI-TOF MS como B. cenocepacia. 69

Em estudo prévio realizado por nosso grupo, entre janeiro de 2008 a dezembro de 2011, com 31 amostras de Burkholderia spp. provenientes de hemoculturas de pacientes atendidos no HUPE, cultivadas previamente em ASC e realizada a aplicação direta das colônias, apresentaram índices de concordância de 84% para gênero e 16% para espécie. Dentre as amostras com maior percentual de erro nas identificações foram B. contaminans, a mais frequente neste levantamento (BARRANDAS, 2013). No presente estudo consideramos para esta análise apenas os resultados da identificação pelo MALDI-TOF MS Biotyper v. 3.1 das amostras cultivadas em ASC e utilizando a metodologia de aplicação direta da colônia, que mostrou concordância com o método molecular de 81,39% a nível de gênero e de 41,86% ao nível de espécie. Onze (61,11%) amostras de B. vietnamiensis, seis (27,27%) de B. cenocepacia IIIA/IIIB e a amostra de B. cepacia foram identificadas corretamente. Uma amostra de B. contaminans não apresentou pico de espectro de massa, e uma foi incorretamente identificada como B. pyrrocinia, uma amostra de B. vietnamiensis foi caracterizada como B. cenocepacia e uma amostra de B. cenocepacia IIIB foi identificada como B. vietnamiensis. Consideramos que a aplicação direta da colônia, pode ter sido um fator importante para o menor percentual de concordância em nosso estudo, assim como o número de amostras utilizadas, incorretas identificações podem ser atribuídas ao alto grau de homologia genética compartilhada pelas espécies do CBc, resultando em perfis de espectro de massa muito semelhantes. Também a ausência do perfil de espectro de massa de algumas espécies nas versões do programa MALDI Biotyper pode explicar os resultados, enfatizando a necessidade, de melhorias continua na inclusão dos espectros de espécies menos usuais (BURNS; ROLAIN, 2013; VICENZI et al., 2016). Embora não exista validação para alterações nos pontos de corte estabelecidos pelo fabricante, alguns estudos têm sido desenvolvidos com esse objetivo, especialmente para micro- organismos de difícil identificação. Conforme observado por Barberis e colaboradores (2014), o MALDI-TOF MS pelo método direto de aplicação foi utilizado para identificação de 202 amostras de Corynebacterium spp., associado aos métodos do sequenciamento do gene 16S rRNA e do gene rpoB. Considerando um escore entre 1.70 e 2.00 para caracterização a nível de espécie, foram aditadas 49 amostras às 153 já classificadas a nível de espécie conforme os critérios do fabricante (escore ≥2.00), perfazendo um total de 100% de identificação. 70

Em nosso estudo observamos que com a minoração do escore para ≥1.70-1.99 (considerado pelo fabricante como identificação confiável apenas ao nível de gênero) houve concordância ao nível de espécie de 74,41% (correspondendo a um aumento 32,55% em relação ao escore ≥ 2.00). Considerando a análise por espécie foram identificadas mais três amostras de B. vietnamiensis, aumentando de 61% para 72% o percentual de amostras identificadas, mais quatro amostras de B. cenocepacia IIIA, aumentando de 25% para 75%, e mais sete de B. cenocepacia IIIB, aumentando de 29% para 79%. Entretanto, o pequeno número de amostras analisadas não permite a recomendação da minoração dos pontos de cortes para identificação das espécies do CBc. Em estudos epidemiológicos a caracterização dos subtipos de B. cenocepacia é fundamental para as intervenções de controle e tratamento. O MALDI-TOFMS ainda não é capaz de identificar esses subtipos. Contudo, através da elaboração da árvore filogenética pelo coeficiente de similaridade e método de agrupamento utilizando o algoritmo Neighbor joining, observamos um agrupamento das amostas pertencentes a espécie B. cenocepacia IIIA em nós diferentes do agrupamento da espécie B. cenocepacia IIIB. Com exceção de apenas uma amostra do subtipo IIIA observada no grupamento das amostras do subtipo IIIB. A utilização do MALDI-TOF MS como ferramenta de tipagem ainda é restrita ao campo de pesquisa. Estudo apresentado por Sauget e colaboradores (2016), utilizando 326 isolados de S. aureus (MRSA) permitiram a identificação de 94% das amostras relacionadas a estirpe do complexo clonal 398 a partir da identificação de 15 biomarcadores (picos que diferenciam dois grupos de bactérias) pelo MALDI-TOF MS associados ao programa ClinProTools (Bruker Daltonik). Comparativamente aos métodos de PFGE e MLST, 77 amostras de Enterococcus faecium de diferentes grupos filogenômicos (53 nosocomiais e 24 comunitárias) apresentaram 95% a 99% de precisão nos resultados obtidos pelo MALDI-TOF MS associados a análise quimiométrica pelo programa Matlab v. 8.3 (MathWorks, Natick, MA, US) e pelo PLS Toolbox v. 7.5 para Matlab (Eigenvector Research, Wenatchee, WA, US) (FREITAS et al., 2017). Observamos também através dos nós formados na árvore filogenética a proximidade das amostras relacionadas ao mesmo paciente. Nove amostras de B. cenocepacia IIIB do paciente número 15, duas amostras de B. vietnamiensis do paciente 17 e duas de B. cenocepacia IIIA do paciente 11. Entretanto, a ausência de comparação com um método de tipagem de referência 71

não permite inferir que esses resultados sejam fidedignos e possam ser usados para fins epidemiológicos. Embora resultados promissores têm sido alcançados, incluindo um estudo recente com a proposta de diretrizes para a utilização do MALDI-TOF MS como método de tipagem para os subgrupos de Escherichia coli e S. aureus (SAUGET et al., 2017), ainda há necessidade de validação de critérios interpretativos que permitam a comparação dos dados do MALDI-TOF MS com os dados das técnicas moleculares como, por exemplo, o estabelecimento de biomarcadores e a sua variabilidade dentro de cada espécie.

CONCLUSÕES

A partir do conjuntode provas fenotípicas selecionadas, foi possível a inserção das amostras dentro do CBc. Todas as amostras foram positivas no teste da lisina, corroborando a sua utilização como um importante marcador fenotípico para o CBc e acessível a laboratórios de microbiologia clínica. A utilização do meio Ágar Sangue de Carneiro para o cultivo prévio das amostras em comparação com o meio Columbia Ágar Base, aumentou o número de amostras do CBc identificadas através no MALDI-TOF MS. O MALDI-TOF MS provou ser uma ferramenta útil para identificação do CBc, com melhor desempenho para a caracterização a nível de gênero (81,39%). Entretanto a identificação a nível de espécie foi inferior a 50% considerando os pontos de corte estabelecidos pelo fabricante. Considerando a identificação das espécies, o melhor desempenho foi para B. vietnamiensis, onde 61% foram corretamente identificadas pelo MALDI-TOF MS, assim como a única amostra de B. cepacia. As duas amostras de B. contaminans não foram identificadas. A minoração dos pontos de corte aumentou a acurácia da identificação das espécies de 61% para 72% das amostras identificadas de B. vietnamiensis, de 25% para 75% de B. cenocepacia IIIA e 29% para 79% de B. cenocepacia IIIB. Entretanto, o pequeno número de amostras analisadas não permite que este critério seja recomendado para identificação das espécies do CBc. O sequenciamento do gene recA, demonstrou vantagem quanto a identificação dos subtipos filogenéticos IIIA e IIIB de cepas B. cenocepacia, sendo ainda uma limitação ao MALDI-TOF MS. Com a utilização de ferramentas de bioinformática para análise dos espectros de massa obtidos no MALDI-TOF MS foi possível o agrupamento de 96% dos subtipos filogenéticos pertencentes a B. cenocepacia. Foi observado também, através dos nós formados na árvore filogenética, a proximidade das amostras relacionadas ao mesmo paciente, porém a ausência da comparação com um método de tipagem de referência não permite utilizar esses dados para fins de análises epidemiológicas. 73

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ANEXO A- Folha de Rosto para Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Comissão Nacional de jÉtica em Pesquisa