Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)

Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition (PATOGEN)

Ali SALEM mercredi 14 novembre 2012

Stomoxys calcitrans (L. 1758) : morphologie, biologie, rôle vecteur et moyens de lutte

Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)

Laboratoire de Parasitologie et Maladies Parasitaires , INP-ENVT

M. Michel FRANC : Professeur, INP-ENVT, TOULOUSE M. Emmanuel LIENARD: Maitre de Conférences, INP-ENVT, TOULOUSE

M. Gérard DUVALLET: Professeur émérite, Université Paul Valéry, MONTPELLIER M. Philippe LOISEAU: Professeur, Université Paris Sud, PARIS

M Gilles BOURDOISEAU : Professeur, VetAgro Sup, LYON Mme Marie Laure DARDE : Professeur, Université de Limoges, LIMOGES M Alexis VALENTIN : Professeur, Université Paul Sabatier, TOULOUSE SALEM A. 2012

À

Un des plus anciens et fascinants foyers de civilisation au monde, qui représente le berceau et l’origine de l'humanité. Le pays du premier alphabet, de la première note de musique, de la plus ancienne ville habitée au monde et des cultures sophistiquées… Qui fait face au terrorisme, à l'intégrisme et à l’hypocrisie mondial pour défendre le monde libre et civilisé, La Syrie Toute ma fidélité

SALEM A. 2012

Remerciements

Cette étude a été réalisée grâce : - au ministère d’enseignement supérieur et ministère de l’agriculture en Syrie qui m’ont accordé l’opportunité de continuer mes études en France. - à l’École Nationale Vétérinaire de Toulouse, qui m’a accueilli pendant ces années d’étude.

Je tiens à exprimer en premier lieu mes remerciements les plus sincères à mon directeur de thèse, Monsieur le professeur Michel FRANC, pour m'avoir fait confiance, conseillé, encouragé et soutenu au cours de ces années. Je lui adresse ma gratitude non seulement pour ses qualités professionnelles, mais aussi pour sa gentillesse, sa générosité et ses qualités humaines.

Je souhaite remercier vivement, Monsieur le docteur Emmanuel LIÉNARD, qui a encadré ma thèse, pour tous les conseils et les idées qu'il m'a donnés ainsi que pour sa disponibilité, ses remarques et commentaires qui m’ont aidé à progresser dans ce travail.

J’adresse mes vifs remerciements à, Monsieur le professeur Gérard DUVALLET et Monsieur le professeur Philippe LOISEAU, pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail. Je tiens également à remercier, Monsieur le professeur Gilles BOURDOISEAU, Madame Marie Laure DARDE et Monsieur Alexis VALENTIN, de m’avoir fait l’honneur de participer à ce jury de thèse.

Je remercie très sincèrement, Monsieur le professeur Philippe DORCHIES, qui m’a donné la chance de travailler et de réaliser mes premiers pas d’études et de recherche en France.

Je remercie chaleureusement, Monsieur le professeur Philippe JACQUIET, pour leurs conseils qu'il m'a donnés depuis mon arrivée au laboratoire. Il n’a jamais cessé de s’intéresser à ce travail ; avec lui j’ai beaucoup appris au cours de nombreuses discussions.

Je remercie tout particulièrement ma collègue de travail, Émilie BOUHSIRA, avec tous mes encouragements pour la fin de sa thèse. Je témoigne toute ma gratitude aux techniciennes animalières, Martine ROQUES, Solange VERMOT et Sonia GOUNAUD, pour leur soutien, leur bonne humeur et leur aide à mon travail quotidien au laboratoire.

J’adresse aussi un grand merci à Christelle GRISEZ, Françoise PRÉVOT et Jean Paul BERGEAUD, avec qui j’ai commencé mes premiers travaux de laboratoire en France. Toute ma gratitude pour leurs sentiments sincères.

Je tiens également à remercier, Monsieur le professeur Alain BOUSQUET MELOU, pour son aide précieuse.

Remerciements II

SALEM A. 2012

J’adresse également mes remerciements à Monsieur Bruno PAYRE et Madame Isabelle FOURQUAUX, du Centre de Microscopie Électronique Appliquée à la Biologie - Faculté de Médecine de Rangueil, pour m’avoir permis d’aborder la microscopie électronique à balayage, pour leur énergie et leur disponibilité.

Je remercie, Mme Béatrice BLANCHARD, de la société AES-Adiagène, les membres de la famille CATALA, Monsieur CABANAC et le Pr. Jérome HOGSETTE.

Je voudrais exprimer mes plus profonds remerciements à toute ma famille pour leur soutien et leur encouragement au cours de ces longues années d'études; À mes parents, grâce auxquels je suis là aujourd’hui, À mes frères et ma sœur, qui me manquent beaucoup, À ma belle famille, qui trouve ici les sentiments de mon affection, À vous, tout mon amour.

Je vois tout l'avenir dans ces petits yeux innocents. L’enchantement de ma vie, mes anges Julia et Maria, que j’aime de tout mon coeur.

À celle qui m’a accompagné et m’a épaulé pour supporter la fatigue que nous avons vécue ensemble pendant une période aussi longue et sans qui rien n’aurait été possible. Mon extraordinaire femme, je te remercie infiniment ma chérie pour partager mes soucis, m’écouter et m’aider. Mai, cette thèse t’est dédiée.

À tous ceux qui me sont chers.

Remerciements III

SALEM A. 2012

TABLE DES MATIÈRES

Remerciements ...... II Table des matières ...... IV Liste des figures ...... VII Liste des tableaux ...... VIII Liste d’abréviations ...... IX

Résumé ...... X

Abstract ...... XI

Introduction ...... 1

1- Importance économique ...... 2 2- Importance médicale ...... 3 2-1- Rôle pathogène direct ...... 3 2-2- Effets pathogènes indirects ...... 4 2-2-1- Vecteur biologique ...... 4 2-2-2- Vecteur mécanique ...... 4

Objectifs et présentation du travail ...... 7

Chapitre I Stomoxys calcitrans : systématique et morphologie des différents stades de développement - Synthèse bibliographique et données personnelles ...... 9

1- Position systématique ...... 10 2- Morphologie générale ...... 13 3- Morphologie de l’imago ...... 16 3-1- Tête et appendices ...... 16 3-1-1- Yeux ...... 16 3-1-2- Antennes ...... 20 3-1-3- Pièces buccales ...... 20 3-2- Thorax, ailes et pattes ...... 22 3-3- Abdomen ...... 25 4 - Morphologie des stades pré imaginaux ...... 27 4-1- Œufs ...... 27 4-2- Larves ...... 28 4-3- Nymphe et Pupe ...... 30

Table des matières IV

SALEM A. 2012

Chapitre II Biologie de Stomoxys calcitrans ...... 31

1- Élevage ...... 33 1-1- Adultes et ponte ...... 33 1-2- Larves ...... 34 1-3- Difficulté rencontrée ...... 36 2- Comportement trophique ...... 37 3- Cycle évolutif ...... 39

Article 1 Feeding and breeding aspects of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) under laboratory conditions (Parasite, 2012) ...... 42

4- Dynamique des populations de Stomoxys calcitrans ...... 52 4-1- Sites de ponte, recherche des hôtes et prise alimentaire ...... 52 4-2- Matériels et méthodes - le piège Vavoua ...... 53

Article 2 Population dynamics of Stomoxys calcitrans (Linneaus) (Diptera: Muscidae) in the South - West of France (En préparation) ...... 55

Chapitre III Implications de Stomoxys calcitrans dans la transmission de la besnoitiose bovine ...... 68

Article 3 A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France (Veterinary Parasitology, 2011) ...... 72

Article 4 Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) to transmit Besnoitia besnoiti (Henry, 1913) (Apicomplexa: Sarcocystidae) (Parasitology Research, 2012) ...... 81

Chapitre IV Contrôle des stomoxes Étude expérimentale de la sensibilité de Stomoxys calcitrans aux insecticides (cyperméthrine, deltaméthrine, fenvalérate, λ-cyhalothrine, perméthrine et phoxim) ... 90

1- Moyens mécaniques ...... 91 1.1- Gestion des lieux de reproduction ...... 91 1.2- Piégeage des adultes ...... 91 2- Moyens biologiques ...... 92

Table des matières V

SALEM A. 2012

3- Moyens chimiques ...... 93 3.1- Insecticides utilisés en élevage ...... 93 3-1-1- Insecticides neurotoxiques ...... 93 3.1.2- Régulateurs de croissance des insectes ...... 96 3-2- Application des insecticides dans le milieu extérieur ...... 97 3-2-1- Traitement des supports ...... 97 3-2-2- Attractifs insecticides ...... 98 3-2-3- Traitement des lieux de reproduction ...... 98 3-3- Application des insecticide sur les bovins ...... 100

Article 5 Susceptibility of two European strains of Stomoxys calcitrans (L.) to Cypermethrin, Deltamethrin, Fenvalerate, λ-cyhalothrin, Permethrin and Phoxim (International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, 2012) ...... 103

Conclusion générale et perspectives ...... 113

Références bibliographiques ...... 117

Table des matières VI

SALEM A. 2012

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Imagos de la famille des Muscidae ...... 14 Figure 2 : Proboscis de type piqueur de S. calcitrans et de type lécheur de M. domestica ..... 14 Figure 3 : Têtes de Stomoxyinés ...... 15 Figure 4 : Tergites abdominaux de 5 espèces de Stomoxys ...... 15 Figure 5 : Tête de S. calcitrans ...... 16 Figure 6 : Yeux de S. calcitrans femelle ...... 17 Figure 7 : Stomoxys calcitrans : mâle et femelle ...... 18 Figure 8 : Mesures nécessaires au calcul de l’index frontal ...... 18 Figure 9 : Antennes de S. calcitrans ...... 20 Figure 10 : Proboscis de S. calcitrans ...... 21 Figure 11: Détail des pièces buccales de Stomoxys calcitrans ...... 21 Figure 12 : Thorax de muscidé adulte en vue latérale ...... 22 Figure 13 : Morphologie de l’aile de différentes espèces de muscidés ...... 23 Figure 14 : Aile de S. calcitrans ...... 23 Figure 15 : Patte II de S. calcitrans, détail de l’extrémité d’une patte ...... 24 Figure 16 : Pattes I, II et III de S. calcitrans ...... 24 Figure 17 : Détails des organes génitaux externes de S. calcitrans ...... 25 Figure 18 : Abdomen femelle en vue ventrale et détail de l’oviscapte ...... 26 Figure 19 : Grappe d’œufs de Stomoxys calcitrans ...... 27 Figure 20 : Œuf de Stomoxys calcitrans, avant et après l’éclosion ...... 27 Figure 21 : Extrémité antérieures d’une larve au stade III de Stomoxys calcitrans ...... 28 Figure 22 : Extrémité postérieure d’une larve au stade III de S. calcitrans ...... 29 Figure 23 : Plaques stigmatiques de LIII de six espèces de la famille de Muscidae ...... 29 Figure 24 : Pupe de S. calcitrans...... 30 Figure 25 : Schéma du système d’alimentation des stomoxes adultes ...... 34 Figure 26 : Schéma du cycle d’élevage des stomoxes ...... 35 Figure 27 : Macrocheles muscaedomestica ...... 36 Figure 28 : Photographie de S. calcitrans se nourrissant sur la patte de bovin ...... 38 Figure 29 : Répartition préférentielle de S. calcitrans sur un bovin ...... 38 Figure 30 : Femelle de S. calcitrans gorgée et non gorgée de sang ...... 38 Figure 31 : Cycle évolutif de S. calcitrans ...... 41 Figure 32: Piège mono-conique « Vavoua » de Laveissière ...... 54

Liste des figures VII

SALEM A. 2012

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Valeurs de la longueur totale du corps de l’imago pour les 2 populations étudiées à l’ENVT, et de l’index frontal de différentes populations ...... 19

Tableau 2 : Valeurs de la durée du développement de S. calcitrans de l’œuf à l’imago en fonction de la température ...... 41

Liste des tableaux VIII

SALEM A. 2012

LISTE D’ABRÉVIATIONS

ADN Acide désoxyribonucléique. am Complexe antenno-maxillaire. AMM Autorisation de mise sur le marché. CMEAB Centre de Microscopie Électronique Appliquée à la Biologie. CSMA Chemical specialities manufacturers association. Ct Cycle threshold. DL50 Dose létale de 50% des individus. DL90 Dose létale de 90% des individus. EDTA Un sel de l’acide éthylène diamine tétraacétique. ENVT École Nationale Vétérinaire de Toulouse. FCO Fièvre catarrhale ovine. GABA Acide gamma-aminobutyrique. GMQ Gains moyens quotidiens. HR L’humidité relative. dFAT D irect fluorescent antibody test. IGR Régulateurs de croissance des insectes. LI Lar ve de premier stade. LII Larve de deuxième stade. LIII Larve de troisième stade. (L:D) Photopériode, (Light : Dark). Ocl Ocelles. Ocp Yeux composés. pMx Palpe maxillaire. qPCR Une méthode particulière de réaction en chaîne par polymérase permettant de mesurer la quantité initiale d'ADN. Sh Sclérite hypostomal. Stp Stigmates prothoracique. UPS Université Paul Sabatier. WB Western Blot.

Liste d’abréviations IX

SALEM A. 2012

Résumé

Stomoxys calcitrans (L. 1758): morphologie, biologie, rôle vecteur et moyens de lutte

La mouche charbonneuse, Stomoxys calcitrans (L.) est une des espèces les plus nuisibles en élevage. Elle est responsable de pertes directes et indirectes : piqûres douloureuses, spoliation sanguine et transmission d’agents pathogènes. Afin de mieux étudier ce parasite, nous avons mis en place un élevage dans notre laboratoire comprenant deux souches issues de stomoxes sauvages capturés respectivement à l’ENVT et dans un élevage bovin biologique. Le protocole d’élevage est décrit. Nous avons comparé les caractères morphologiques externes des différents stades évolutifs obtenus à partir de notre élevage aux données bibliographiques. Nous avons montré les capacités de transmission mécanique par S. calcitrans de Besnoitia besnoiti, agent de la besnoitiose bovine. Nous avons mis en évidence également des différences de sensibilité entre les deux souches à six insecticides dues probablement à une exposition plus grande à ces derniers de la souche ENVT.

Mots clés: Diptera, Muscidae, Stomoxes, Élevage, Besnoitia besnoiti, Insecticides, Résistance

Résumé X

SALEM A. 2012

Abstract

Stomoxys calcitrans (L. 1758): morphology, biology, vector role and control methods

Stable fly, Stomoxys calcitrans (L.) is one of the most commonly pest of livestock with direct and indirect sides effects: painful bites, blood loss and transmission of pathogens. To better study this parasite, we have established two strains in our laboratory isolated from two geographical origins: the National Veterinary School of Toulouse and an organic cattle farm. We described the rearing protocol in the laboratory. We compared the external morphological characters of the different developmental instars observed in our rearing to data literature. We have demonstrated the ability of S. calcitrans to mechanically transmit Besnoitia besnoiti, responsible of the cattle besnoitiosis. We have also highlighted differences in susceptibility between the two strains to six insecticides probably due to records of higher exposure to them for the ENVT strain.

Key words: Diptera, Muscidae, Stable fly, Laboratory rearing, Besnoitia besnoiti, Insecticides, Resistance

Abstract XI

SALEM A. 2012

Introduction

Introduction 1

SALEM A. 2012

Plusieurs familles de diptères hématophages parasitent le bétail: Culicidae, Ceratopogoinidae, Simuliidae, Tabanidae et Muscidae. Dans la famille des Muscidae, les trois espèces principales en Europe sont Haematobia irritans (Mouche des cornes, Horn fly), Musca autumnalis (Mouche de la face, Face fly) et Stomoxys calcitrans (Mouche d’étable ou Mouche charbonneuse, Stable fly). Le genre Stomoxys, originaire de l’Ancien Monde, compte au moins 18 espèces (Zumpt, 1973) présentes pour la plupart en régions tropicales. Douze espèces sont exclusivement africaines, quatre sont asiatiques et une espèce, Stomoxys sitiens est signalée à la fois sur le continent africain et asiatique (Zumpt, 1973). Une seule espèce, Stomoxys calcitrans, anthropophile, est cosmopolite. Elle a bénéficié des déplacements humains et des troupeaux pour se répandre dans le monde entier (Marquez et al., 2007; Dsouli-Aymes et al., 2011). Elle a été signalée au Canada dès 1898 (Brues, 1913 cité par Lysyk, 2011). Zumpt (1973) suggère une origine orientale de cette espèce. Cette hypothèse n’a pas été clairement démontrée ou infirmée par les apports récents de la génétique des populations combinant des marqueurs mitochondriaux et nucléaires (Dsouli-Aymes et al., 2011). Cette espèce a fait l’objet d’un grand nombre d’études, en nombre largement supérieur aux espèces du même genre et même de la tribu des Stomoxyini. Mâles et femelles sont hématophages et piquent les animaux domestiques et sauvages préférentiellement sur les pattes (Hansens, 1951; Apperson & Axtell, 1981; Berry & Campbell, 1985 ; Mullens & Meyer, 1987; Meyer & Shultz, 1990; Thomas et al., 1990; Skoda et al., 1991; Campbell et al., 2001; Veer et al., 2002; Jeanbourquin & Guirin, 2007; Taylor & Berkebile, 2008). L’oviposition se déroule essentiellement sur les matières organiques en décomposition, mélange de foin, paille et matières fécales (Meyer & Petersen, 1983; Hogsette et al., 1987; Broce et al., 2005). L’élevage des animaux , intensif ou extensif, offre ainsi à S. calcitrans un environnement idéal fournissant les ressources pour l’alimentation des imagos et le développement des stades immatures (Broce et al., 2005). Stomoxys calcitrans est un agent de nuisance responsable de pertes économiques directes et indirectes par la transmission biologique ou mécanique de différents agents pathogènes pouvant entraîner des mortalités et des baisses de performance dans les élevages.

1- Importance économique La spoliation sanguine et les piqûres douloureuses des stomoxes sont responsables de perte de poids et d’une baisse de production lactée (Campbell et al., 1977; Hall et al., 1983; Catangui et al., 1993).

Introduction 2

SALEM A. 2012

Pour les bovins à viande, des différences de gains moyens quotidiens (G.M.Q.) de l’ordre de 20 à 600 g par animal sont rapportées par différents auteurs (Campbell et al., 1977; Berry et al., 1983; Campbell et al., 1987; Catangui et al., 1997; Campbell et al., 2001). Bruce et Decker (1958) ont montré une baisse de production lactée de 0,7%, ainsi qu’une diminution de 0.65% du taux butyreux par stomoxe et par mois. Ces baisses de production sont partiellement expliquées par le dérangement des animaux entrainant une consommation alimentaire moindre (Campbell et al., 1987). Aux Etats Unis, l’impact de S. calcitrans a été estimé à plus de 400 millions de dollars par an pour la filière viande bovine (Dougherty et al., 1995; Taylor & Berkebile, 2006) et à plus d’un billion de dollars pour la filière lait (Roeder & Bolton, 2007; Taylor et al., 2012). En outre, cette espèce constitue également une nuisance pour les humains, dans les zones côtières touristiques, dont l’impact économique n’est pas clairement établi (Williams & Rogers, 1976; Fye et al., 1980; Hogsette & Ruff, 1985; Isard et al., 2001).

2- Importance médicale 2-1- Rôle pathogène direct La salive de S. calcitrans est dépourvue de molécules anesthésiantes (Cortinas & Jones, 2006). Sa piqûre douloureuse perturbe les animaux pouvant entrainer une diminution du temps de pâture (Hall et al., 1983) ou au contraire une légère augmentation du temps de pâture comme cela a été observé par Dougherty et al. (1995) pour des infestations expérimentales en pâtures de 0 à 100 mouches par bovin. Des modifications comportementales sont également observées en présence des stomoxes. Les bovins se regroupent sur le pâturage pour se protéger mutuellement des mouches par des battements de queue, ce qui est à l’origine de perte d’herbe par piétinement. En outre, ils dépensent de l’énergie pour se défendre comme cela a été rapporté par Dougherty et al. (1995) sur des bovins infestés par 100 mouches. Ils ont compté par minute en moyenne 3.3 mouvements de tête, 3.7 mouvements d’oreilles, 14 contractions cutanées et surtout 36 coups de queue. Des résultats semblables sont rapportés par Vitela et al. (2007). Cela expliquerait au moins en partie les baisses de production de lait et de viande observées par Campbell et al. (1987) lors d’infestations massives. En revanche Mullens et al. (2006) rapportent que de faibles infestations (moins de 2 mouches / patte pendant 2 min) n’ont pas d’incidence sur la production lactée.

Introduction 3

SALEM A. 2012

Les piqûres sont également responsables de perturbations physiologiques. Schwinghammer et al. (1987) ont observé chez des bovins à l’engraissement infestés par 100 Haematobia irritans + 25 Stomoxys calcitrans ou 500 H. irritans + 50 S. calcitrans: une augmentation de la fréquence respiratoire (20,3 et 23 respirations / minute respectivement) une augmentation du rythme cardiaque (13,1 et 22,6 battements / minute respectivement), une élévation de la cortisolémie et une augmentation de la température corporelle (0,3 et 0,4°C respectivement). Ces modifications sont des témoins du stress. Enfin, les lésions cutanées provoquées par les stomoxes vont de simples plages œdémateuses sur la peau des chevaux et des bovins (observations personnelles) à des lésions nécrotiques aussi bien sur les chevaux, que sur les bovins et les chiens (Yeruham & Braverman, 1995).

2-2- Effets pathogènes indirects Stomoxys calcitrans est un vecteur soit biologique soit mécanique de différents agents pathogènes, parasitaires, viraux ou bactériens.

2-2-1- Vecteur biologique Les stomoxes ont un rôle important en tant qu’hôte intermédiaire d’ Habronema microstoma (Nematoda : Spirurida). Ce ver parasite à l’état adulte l’estomac des équidés. Les femelles sont vivipares, les larves au stade 1 (LI) sont éliminées avec les crottins dans l’environnement. Elles sont ingérées par les larves de stomoxes au sein desquels elles se développent en stade larve 2 (LII). La larve 3 (LIII) est présente chez la pupe. Les LIII présentes dans la cavité générale du stomoxe adulte envahissent le labium. Lorsqu’un stomoxe se pose sur les lèvres d’un cheval, elles quittent activement le labium puis migrent sur les lèvres puis dans la cavité buccale. Elles sont avalées et acquièrent la maturité sexuelle après deux mues dans l’estomac du cheval. Lorsque le stomoxe se pose sur une plaie, les larves peuvent alors évoluer localement. Les lésions observées sont alors bourgeonnantes, granuleuses et prurigineuses : il s’agit de l’habronémose cutanée (Rebhun, 1996; Ahmed et al., 2005; Traversa et al., 2008).

2-2-2- Vecteur mécanique Helminthes Dermatobia hominis Linné, 1781 est une espèce largement distribuée dans toute l’Amérique latine. Les adultes dépourvus de pièces buccales fonctionnelles ne se nourrissent pas.

Introduction 4

SALEM A. 2012

Les femelles pratiquent la phorésie c'est-à-dire la ponte d’œufs sur d’autres diptères généralement hématophages et attrapés en plein vol. Les stomoxes peuvent ainsi assurer le transport de 15 à 20 œufs, et permettre l’infestation de vertébrés (herbivores, humains, rongeurs oiseaux). Les œufs éclosent au contact de la chaleur de l’hôte. Les larves LI pénètrent activement au niveau d’un follicule. Elles évoluent alors dans le derme jusqu’au stade LIII au sein d’un nodule furonculeux dont elles ont provoqué la formation (Rodriguez & Leite, 1997 ; Da Silva Junior et al., 1999).

Protozoaires Les stomoxes et les tabanidés sont les vecteurs mécaniques de Trypanosoma vivax, qui a également les glossines comme vecteurs biologiques (D’Amico, 1996; Jones & Davila, 2001). Trypanosoma evansi responsable du Surra affecte une grande variété d’hôtes (bovidés, équidés, camélidés, porcins, chat chien). Il est transmis mécaniquement par les tabanidés et les stomoxes (Zumpt, 1973; Carn, 1996; Veer et al., 2002). Des cas ont été observés dans l’Aveyron sur des dromadaires importés des Iles Canaries en 2007 (Jacquiet, communication personnelle).

Bactéries L’anaplasmose bovine, due à Anaplasma marginale (Rickettsiales : Anaplasmataceae) est transmise par des tiques et des insectes piqueurs comme les stomoxes, les Tabanidés et les moustiques (Potgieter et al., 1981; Hawkins et al., 1982; Barré & Morel, 1983; Scoles et al., 2008). Scoles et al. (2005) ont montré par des essais in vivo que la transmission biologique par les tiques est deux fois plus efficace que la transmission mécanique par les stomoxes. Turell et Knudson (1987) ont montré que S. calcitrans pouvaient transmettre mécaniquement Bacillus anthracis d’un cobaye ou d’une souris en phase de bactériémie à un cobaye ou une souris indemne à condition que la durée entre le repas contaminant de l’insecte et celui infectant le receveur ne dépasse pas 4 heures. L’importance de cette transmission par les stomoxes et les Tabanidés a été démontrée au Tchad lors d’une épizootie touchant les ânes, les chevaux ainsi que les humains dont 33 sont morts (Lamarque et al., 1989). Dermatophilus congolensis peut être véhiculé par les stomoxes adultes. Les lésions occasionnées par les piqures peuvent favoriser leur multiplication à l’origine de croûtes (Lefèvre et al., 2003; Ahmed et al., 2005).

Introduction 5

SALEM A. 2012

L’ADN d’autres bactéries a été identifié dans des stomoxes capturés sur le terrain, mais l’importance épidémiologique des stomoxes comme vecteur reste à confirmer : Bartonella henselae de type M (Chung et al., 2004), Mycobacterium fortuitum et M. scrofulaceum (Fischer et al., 2001). Les larves de S. calcitrans se développant dans les matières fécales animales, des bactéries entériques peuvent être retrouvées comme les Campylobacter spp. (Szalanski et al., 2004) ou Escherichia coli qui sont également retrouvées dans les pupes issues des larves infectées (Rochon et al., 2004; 2005). Enterobacter sakazakii, est une entérobactérie pouvant être responsable chez les très jeunes enfants, les personnes âgées ou immunodéprimées de méningites, de septicémies ou d’entérocolites nécrosantes. Après infestation expérimentale cette bactérie persiste chez les mouches contaminées pendant 20 jours (Mramba et al., 2007).

Virus Stomoxys calcitrans est un vecteur efficace du virus de l’anémie infectieuse équine (Lentivirus - F. Retrovirida) (Foil et al., 1983; Eigen et al., 2002). Il serait également impliqué comme agent secondaire de la transmission mécanique des virus de la leucose bovine (Deltarétrovirus - famille des Retroviridae) (Buxton et al., 1985), de la fièvre de la Vallée du Rift (Phlebovirus - F. Bunyaviridae) (Hoch et al., 1985), de la peste porcine africaine (Pestivirus - F. Flaviridae) (Mellor et al., 1987), de la variole caprine à Capripoxvirus (F. Poxviridae) (Mellor et al., 1987), de la diarrhée virale bovine à Pestivirus (F. Flaviridae) (Tarry et al., 1991) et vraisemblablement du virus West Nile (F. Flaviridae) (Johnson et al., 2010; Doyle et al., 2011). Dans ce dernier cas la contamination peut se faire par inoculation ou bien par ingestion de mouches contaminées. Eigen et al. (2002) émettent l’hypothèse d’une transmission possible du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) des grands singes à l’homme en considérant le mode de prise de repas interrompu de l’insecte, la survie du virus dans les produits de régurgitation des stomoxes et la démonstration de la transmission du virus de la leucose équine.

Des bactéries comme Aeromonas sp., Pseudomonas aeruginosa et Serratia marcescens sont pathogènes pour S. calcitrans (Lysyk et al., 2002). L’utilisation de ces pathogènes comme méthode de lutte contre les stomoxes nécessite des études supplémentaires.

Introduction 6

SALEM A. 2012

Objectifs et présentation du travail

Il ressort que les études concernant le rôle mécanique des stomoxes dans la transmission de pathogènes ainsi que celles concernant l’étude des moyens de lutte en Europe sont peu nombreuses. L’équipe du laboratoire de Parasitologie de l’ENVT s’intéressant à la besnoitiose bovine, maladie en pleine expansion en Europe, et au rôle des stomoxes dans sa transmission nous avons participé aux suivis épidémiologiques des populations de stomoxes sur le terrain et à l’apparition des cas de besnoitiose bovine. Pour apporter des informations sur le rôle des stomoxes dans la transmission il fallait disposer d’un élevage sur membrane. C’est ce que nous avons réalisé et qui nous a permis de préciser certaines données biologiques, d’envisager des essais de transmission expérimentale et de tester la sensibilité des stomoxes à différents insecticides sur des mouches gorgées ou non ayant approximativement le même âge. Dans un esprit de clarté, la présentation de nos travaux ne suit pas exactement l’ordre chronologique. Chapitre I : Systématique et morphologie : Nous rapportons ici les données de la littérature complétées par la mesure de l’Index frontal de 2 populations du Sud ouest de la France et par des clichés réalisés en microscopie à balayage de différents stades évolutifs.

Chapitre II : Biologie : Dans ce chapitre nous rapportons la technique d’élevage des adultes sur membrane et la production des larves, nous étudions le repas sanguin, le cycle évolutif (Article publié en Parasite, 2012) et la dynamique d’une population de stomoxes sur le site de l’ENVT, (Publication en préparation).

Chapitre III : Rôle des stomoxes dans la transmission de la besnoitiose : Une enquête entomologique pendant un an sur le terrain a été associée au suivi clinique et sérologique des animaux pour essayer de mettre en évidence une corrélation entre l’abondance des stomoxes et les séroconversions et ou l’apparition de cas cliniques, (Publication en Veterinary Parasitology, 2011). Un essai de transmission expérimentale en faisant se gorger des stomoxes sur un nourrisseur contenant du sang renfermant des tachyzoïtes obtenus en culture puis sur un

Objectifs et présentation du travail 7

SALEM A. 2012

nourrisseur contenant du sang indemne. Le parasite est mis en évidence par PCR quantitative. Après avoir fait gorger des stomoxes sur un bovin atteint cliniquement d’une forme chronique de besnoitiose, nous avons recherché les besnoitia ou leur ADN sur leur pièce buccale et dans le contenu de l’abdomen d’un premier lot d’insectes à l’aide de la PCR quantitative et de l’immunofluorescence directe. Après avoir fait gorger le second lot sur un nourrisseur renfermant du sang indemne, nous avons recherché les besnoitia ou leur ADN (Publication en Parasitology Research, 2012).

Chapitre IV : Contrôle des stomoxes : Après avoir fait l’analyse des publications concernant les moyens de lutte mécanique, biologique et chimique nous avons étudié la sensibilité de deux souches du Sud Ouest de la France à six insecticides. La méthodologie et les résultats sont rapportés dans l’article publié en International Journal of Applied Research in Veterinary Medicin, 2012.

Objectifs et présentation du travail 8

SALEM A. 2012

Chapitre I

Stomoxys calcitrans : systématique et morphologie des différents stades de développement

Synthèse bibliographique et données personnelles

Chapitre I- Systématique et morphologie 9

SALEM A. 2012

Dans ce chapitre, nous rapportons les données bibliographiques concernant la morphologie des différents stades évolutifs qui sont complétées par nos observations faites au Laboratoire de Parasitologie de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT) et au Centre de Microscopie Electronique Appliqué à la Biologie (CMEAB), de l’Université Paul Sabatier Toulouse III (UPS). Les photographies originales ont été réalisées avec un microscope électronique à balayage (Hitachi S450).

1- Position systématique

Règne : Animalia

Embranchement : Arthropoda (80% des espèces animales connues, Urquhart et al., 1996) - Métazoaires. - Symétrie bilatérale. - Métamérisés. - Appendices articulés. - Exosquelette chitineux.

Sous-embranchement : Mandibulata - Antennes, mandibules, mâchoires.

Classe : Insecta - Respiration trachéenne. - Une paire d’antennes. - Corps composé de trois parties distinctes : tête, thorax, abdomen. - 3 paires d’appendices locomoteurs. - 2 paires d’ailes chez l’adulte. - Certains éléments peuvent être atrophiés ou avoir disparus secondairement.

Sous-classe : Pterygota - Insectes normalement pourvus de deux paires d’ailes portées par le mésothorax et le métathorax, ailes parfois absentes (adaptation à un parasitisme permanent ou intermittent), la seconde paire peut être atrophiée (balanciers ou haltères).

Chapitre I- Position systématique 10

SALEM A. 2012

- 10 ordres faisant une métamorphose complète : coléoptères, lépidoptères, trichoptères et diptères…. - 14 ordres ayant une métamorphose incomplète: orthoptères, hémiptères…..

Ordre : Diptera - Une seule paire d’ailes mésothoraciques bien développées, les ailes métathoraciques transformées en balanciers. - Pièces buccales de différents types : piqueur, lécheur, broyeur, parfois absentes. - Femelles généralement ovipares parfois larvipares ou pupipares. - Métamorphoses complètes : holométabole. - Nymphes de deux types : à tégument mince et mobile ou à tégument dur et immobiles (pupes).

Sous-ordre : Brachycera - Antennes courtes (du grec brachy signifiant "court" et ceros "corne") formées de 3 articles dont le dernier peut être subdivisé (Urquhart et al., 1996). - Corps trapu de type mouche avec pattes courtes. - Deux sections définies notamment à partir du mode d’émergence de l’imago : . Orthorrhapha (déchirure en T dorsal du tégument nymphal). . Cyclorrhapha.

Section : Cyclorrhapha - Déhiscence circulaire antérieure du tégument nymphal.

Famille : Muscidae - Adultes de couleur terne. - Antenne à arista velue sur toute sa longueur ou nue. - Pièces buccales de type piqueur ou lécheur. - Absence de mandibules et de mâchoires. - Labre et hypopharynx logés dans la concavité du labium. - L3 à plaques stigmatiques postérieures avec 3 fentes sinueuses.

Chapitre I- Position systématique 11

SALEM A. 2012

Sous-famille : Stomoxyinae - Ailes forment un angle aigu au repos. - Trompe piqueuse (mâles et femelles) trapue, puissante, rigide, saillante en avant de la tête, formée d’un labium corné, perforant, contenant 2 stylets (labrum et hypopharynx), latéralement une paire de palpes maxillaires (pMx). - Ovipares.

Genre : Stomoxys - pMx beaucoup plus court que la trompe. - Arista velue uniquement sur la face dorsale. - Thorax présentant quatre bandes longitudinales sombres. - Ailes claires, plus longues que l’abdomen et non croisées au repos. Ce genre originaire de l’ancien monde, comprend 18 espèces la plus commune est Stomoxys calcitrans qui est cosmopolite. Les 17 autres espèces se distribuent comme suit : - Quatre espèces asiatiques: Stomoxys indicus Picard 1908, Stomoxys pullus Austen 1909, Stomoxys bengalensis Picard 1908 et Stomoxys uruma Shinonaga & Kano 1966. - Douze espèces africaines: Stomoxys inornatus Grünberg 1906, Stomoxys transvittatus Villeneuve 1916, Stomoxys omega Newstead 1907, Stomoxys xanthomelas Roubaud 1937, Stomoxys pallidus Roubaud 1911, Stomoxys niger Macquart 1851 (S. niger niger et S. niger bilineatus), Stomoxys boueti Roubaud 1911, Stomoxys stigma Van Emden 1939, Stomoxys varipes Bezzi 1907, Stomoxys taeniatus Bigot 1888, Stomoxys ochrosoma Speiser 1910 et Stomoxys luteolus Villeneuve 1934. - Une espèce afroasiatique: Stomoxys sitiens Rondani, 1873 (Zumpt, 1973; Steyskal, 1975; Gilles et al., 2007; Duvallet & Pont, 2008).

Espèce : Stomoxys calcitrans (Linné, 1758) - 6-8 mm de long. - Thorax avec quatre bandes dorsales noires. - Damier de taches brunes et grises sur la face dorsale de l’abdomen. - Index frontal deux fois plus grand que chez S. niger (0.42 contre 0.26) surtout chez les mâles (Zumpt, 1973; Garros et al. 2004). - Palpes maxillaires plus court chez S. calcitrans que chez S. niger (0.44 contre 0.73) (Garros et al. 2004).

Chapitre I- Position systématique 12

SALEM A. 2012

2- Morphologie générale

L’imago de Stomoxys calcitrans (Linné, 1758) mesure 4 à 7 mm de longueur (Zumpt, 1973). Nous avons retrouvé ces valeurs en mesurant 470 stomoxes capturés sur le terrain (GAEC du Péré, Le Fossat, Ariège). Les longueurs ont varié de 4.4 à 7.6 mm avec une moyenne de 6.3 ± 0.6 mm. L’adulte possède une morphologie proche de celle de la mouche domestique Musca domestica L. (Hewitt, 1909; Mavoungou et al., 2008a,b). Il s’en distingue toutefois facilement par sa trompe piqueuse ou proboscis bien visible qui dépasse largement à l’avant de la tête (Pageau, 1955; Zumpt, 1973; Troncy, 1989) (Figures 1 et 2). Son proboscis est 2 fois plus long que les palpes maxillaires ce qui le différencie des autres espèces de stomoxynés comme Haematobosca stimulans et Haematobia irritans (Figure 3). En outre, les palpes maxillaires mesurent environ un tiers de la longueur du proboscis à la différence des genres Haematobia et Haematobosca pour qui ces palpes sont de longueur égale à la trompe (Figure 3). L’arista porte des soies dorsalement dans les genres Stomoxys et Haematobia alors qu’il est velu sur les deux faces pour le genre Haematobosca (Figure 3). Le thorax porteur des organes de locomotion est ornementé dorsalement de quatre bandes noires longitudinales (Zumpt, 1973). L’abdomen plus large que long porte des taches sombres disposées en damier. La forme et la disposition des taches permettent de distinguer les différentes espèces (Figure 4). Les sexes sont peu différenciables macroscopiquement.

Chapitre I- Morphologie générale 13

SALEM A. 2012

Stomoxys calcitrans Musca domestica

Figure 1 : Imagos de la famille des Muscidae : Stomoxys calcitrans et Musca domestica, (photographie originale)

A B

Figure 2: Proboscis de type piqueur de S. calcitrans (A) et de type lécheur de M. domestica (B), (photographies originales)

Chapitre I- Morphologie générale 14

SALEM A. 2012

Figure 3: Têtes de Stomoxyinés (A) Stomoxys calcitrans (Linné, 1758), (B) Haematobosca stimulans (Meigen, 1824) et (C) Haematobia irritans (Linné, 1758), (d’après Zumpt, 1973)

Figure 4: Tergites abdominaux de Stomoxys calcitrans (A), S. niger niger Macquart. (B), S. indicus Picard (C), S. sitiens Rondani (D), S. niger bilineatus Grünberg (E), (d’après Zumpt, 1973)

Chapitre I- Morphologie générale 15

SALEM A. 2012

3- Morphologie de l’imago

3-1- Tête et appendices La tête porte les organes sensoriels (yeux composées, ocelles et antennes) ainsi que les pièces buccales de type piqueur (Figure 5).

Figure 5: Tête de S. calcitrans (pMx) palpes maxillaires, (A) antennes situées entre les deux yeux composés (Ocp), (I, II, III) segments antennaires, (P) proboscis, (photographies originales)

3-1-1- Yeux Stomoxys calcitrans possède les deux types d’yeux des insectes: deux grands yeux composés placés à la partie antérieure de chaque côté de la tête (Figures 5 et 6), et trois ocelles dorsaux sur le sommet et le front (Peterson et al., 1916; Ranade, 1970) (Figures 6). La juxtaposition des ommatidies forme un réseau régulier de mailles hexagonales (Houlbert, 1920) (Figure 6). Les yeux composés sont complètement développés lors de l’émergence de l’imago (Ranade, 1970).

Chapitre I- Morphologie de l’imago 16

SALEM A. 2012

Figure 6: Yeux de S. calcitrans femelle (Ocl) ocelles, (Ocp) œil composé, les ommatidies formant un maillage hexagonales, (photographie originale)

Chez les stomoxes femelles, les yeux composés sont nettement séparés comparé à ceux des mâles (Zumpt, 1973) (Figure 7). Le sexage peut être réalisé à partir de l’index frontal. Il s’agit du rapport entre la largeur de l’espace interoculaire au vertex et la plus grande longueur de l'œil (Figure 8). Cet index avait été mesuré par Garros et al. (2004) sur trois populations de S. calcitrans à différentes altitudes à la Réunion et par Masmeatathip et al. (2006) sur des colonies thaïlandaises. Dans notre étude, nous avons mesuré la longueur des insectes et l’index frontal. Ces valeurs ont été réalisées à partie de 420 stomoxes (382♂, 38♀) capturés dans un élevage laitier en Ariège (Gaec du Péré, Le Fossat, France) avec des pièges Vavoua mis au point pour la capture des glossines en Afrique (Laveissière et al., 1990). Ces pièges capturent plus facilement les mâles que les femelles ce qui explique le biais dans le sex ratio. Nous avons également effectué ces mesures sur 100 stomoxes (50♂, 50♀) issus de l’élevage du laboratoire (souche capturée à l’ENVT, plus de détails concernant cet élevage sont fournis dans le chapitre 2). Les mesures ont été effectuées sur la mouche entière en vue dorsale et de profil (décubitus droit) à l’aide d’une loupe binoculaire au grossissement 12,5 (ZEISS, Stemi 2000-C) avec un micromètre oculaire. Les valeurs sont rapportées dans le tableau (1).

Chapitre I- Morphologie de l’imago 17

SALEM A. 2012

Figure 7: Stomoxys calcitrans : mâle (A) et femelle (B), (modifiée d’après Zumpt 1973, photographies originales)

Figure 8 : Mesures nécessaires au calcul de l’index frontal qui est le rapport EO/LO : (EO) largeur de l’espace interoculaire au vertex et (LO) la plus grande longueur de l’œil, (Lane & Crosskey, 1993)

Chapitre I- Morphologie de l’imago 18

SALEM A. 2012

Nombre Longueur (mm) Index frontal ± Stomoxys calcitrans d’individus Moyenne ± écart-type écart-type

Population ♂ 382 6,1 ± 0,54 0,37 ± 0,02 ariégeoise ♀ 38 6,3 ± 0,62 0,55 ± 0,03 Population issue de ♂ 50 6,5 ± 0,54 0,37 ± 0,01 l’ENVT Haute Garonne ♀ 50 6,5 ± 0,58 0,56 ± 0,02 Population ♂ 30 - 0,42 ± 0,02 réunionnaise Altitude : 50 m* ♀ 30 - 0,64 ± 0,05 Population ♂ 30 - 0,42 ± 0,03 réunionnaise Altitude : 850 m* ♀ 30 - 0,64 ± 0,04 Population ♂ 30 - 0,38 ± 0,02 réunionnaise Altitude : 1300 m* ♀ 30 - 0,62 ± 0,03

Population ♂ 49 - 0,33 ± 0,03 thaïlandaise** ♀ 43 - 0,55 ± 0,04

Tableau 1 : Valeurs de la longueur totale du corps de l’imago pour les 2 populations étudiées à l’ENVT, et de l’index frontal de différentes populations

* Garros et al., 2004 ; ** Masmeatathip et al., 2006

Les comparaisons des valeurs des tailles moyennes et de l’index frontal entre les sexes, et entre les populations d’origine (Ariège et ENVT) ont été réalisées avec le test exact de permutation implémenté dans le logiciel StatXact® release -3.1 (Cytel Software Corporation, USA). Au cours de notre étude les tailles moyennes ne se sont pas révélées significativement différentes entre les deux sexes et entre l’origine des mouches (p > 0,05). Les valeurs de l’index frontal sont significativement différentes entre les deux sexes pour les 2 souches (p < 0,001). Ces valeurs ne montrent pas des différences significatives entre les deux populations étudiées (p > 0.05). Nos valeurs de l’index frontal sont proches des quatre populations observées par Garros et al. (2004) et Masmeatathip et al. (2006) ainsi que de celles publiées par Zumpt (1973) : 0,37 à 0,4 pour les mâles et 0,5 à 0,6 pour les femelles. Aucun test statistique n’a pu être effectué car les données brutes pour ces trois études ne sont pas accessibles.

Chapitre I- Morphologie de l’imago 19

SALEM A. 2012

3-1-2- Antennes Les antennes de couleur noir brunâtre à presque noir sont identiques dans les deux sexes. Comme pour tous les diptères brachycères, chaque antenne se compose de trois segments : le scape, le pédicelle et le flagelle portant l’arista (Sukontason et al., 2004), le troisième segment est d'environ 2,5 fois plus long que le second, et l’arista porte des soies dorsales longues (Zumpt, 1973; Veer et al., 2002; Masmeatathip et al., 2006) (Figure 9). Les soies sensorielles ou sensilles sont situées sur le troisième segment comme chez tous les brachycères cyclorraphes. (Giannakakis & Fletcher, 1985; Rahal et al., 1996; Kelling, 2001). Chez Stomoxys calcitrans, sept types de sensilles ont été décrites : deux trichoïdes, trois basiconiques, une claviforme et une styloconique (Giannakakis & Fletcher, 1985).

A

Figure 9: Antennes de S. calcitrans (AR) arista, (I, II, III) segments antennaires, (photographies originales)

3-1-3- Pièces buccales Le proboscis rigide est non rétractile. Il est porté horizontalement vers l’avant dans l’axe du corps et est de couleur noire. Il est composé de trois longues pièces fortement sclérifiées, non rétractiles (Figure 10): le labium ou lèvre inférieure terminé par de courtes labelles porteurs de dents préstomales développées (Figure 10 et 11), le labre ou lèvre supérieure et l’hypopharynx. L’hypoharynx en forme de gouttière contient le canal salivaire. Par coaptation avec la partie infère du labre, il constitue le canal alimentaire par lequel le sang est aspiré (Zumpt, 1973). Le labre et l’hypoharynx sont entourés par le labium (Figure 11). Les palpes maxillaires plus courts que le proboscis ne le recouvrent pas (John & New Brunswick, 1903; Veer et al., 2002; Couri, 2007) (Figure 11).

Chapitre I- Morphologie de l’imago 20

SALEM A. 2012

Figure 10 : Proboscis de S. calcitrans: (A) vue ventrale (dents préstomales et soies), (B) vue dorsale, (photographies originales)

Figure 11: Détail des pièces buccales de Stomoxys calcitrans (I) Tête vue de profil, (II) Proboscis en coupe transversale, (III) Pièces buccales en vue latérale : (L) labium, (H) hypopharynx, (Lb) labre, (Ts) palpes, (V) membrane entre le proboscis et la capsule céphalique,(A)apodème, (F) fulcrum, (Sp) glande salivaire, (O) œsophage, (T) trachée, (J) endosquelette, (S) tendon des labelles,(M) muscles, (d’après Zumpt, 1973)

Chapitre I- Morphologie de l’imago 21

SALEM A. 2012

3-2- Thorax, ailes et pattes Le thorax est composé de trois segments : le prothorax, le mésothorax et le métathorax, portant chacun une paire de pattes. Le second segment porteur de la première paire d’ailes membraneuses est le plus développé. Le troisième porte la deuxième paire d’ailes, réduites à des balanciers ou haltères. Comme chez tous les muscidés l'hypopleuron est nu (Moon, 2002) (Figure 12).

Figure 12 : Thorax de muscidé adulte en vue latérale, (d’après Moon, 2002)

Les stomoxes ont des ailes hyalines semblables à celles des autres Muscidae. Au repos, elles sont disposées en lettre V majuscule inversée au-dessus de l'abdomen (Troncy, 1989). La nervation des ailes constitue un critère de diagnose des espèces de Muscidae (Zumpt, 1973; Grabovac & Petric, 2003; Masmeatathip et al., 2006) (Figures 13 et 14). La première cellule postérieure est rétrécie à l’extrémité comme chez tous les membres de la Sous-Famille des Stomoxyinae. Les pattes sont de couleur sombre (brun foncé à noirâtre), avec une teinte plus pâle parfois jaunâtre de la base des tibias (Masmeatathip et al., 2006) (Figure 15). Les fémurs de la première paire de pattes (ou pattes I) portent des soies raides et longues sur les parties dorsale et ventrale, le tibia est sans soie médiane et les métatarses sont simples (Figure 16-A). Le fémur des pattes II possède des soies uniquement sur la face ventrale et le tibia est dépourvu de soie médiane (Figure 16-B). Le fémur des pattes III arrière porte des soies ventrales courtes, seule la terminale est longue (Figure 16-C). Le tibia est sans soie médiane qui se trouve chez Haematobosca stimulans (tibia II et III) et Haematobia irritans (tibia II) (Zumpt, 1973).

Chapitre I- Morphologie de l’imago 22

SALEM A. 2012

Figure 13 : Morphologie de l’aile de différentes espèces de muscidés : (A) Musca domestica, (B) Stomoxys calcitrans, (C) Haematobia irritans, (D) Stomoxys sitiens, (E) Muscina levida, (F) Fannia canicularis, (G) Hydrotaea ignava, (H) Stomoxys niger, (d’après Moon, 2002 et Zumpt, 1973)

Figure 14 : Aile de S. calcitrans (R) première cellule basale, (R1) cellule marginale, (R3) cellule submarginale, (R5) première cellule postérieure, (M) deuxième cellule basale, (M2) deuxième cellule postérieure ou discale, (r1) premier nervure longitudinale, (r2+3) deuxième nervure longitudinale, (r4+5) troisième nervure longitudinale, (m1) quatrième nervure longitudinale (media), (r-m) nervure transversale discale, (photographie originale) Chapitre I- Morphologie de l’imago 23

SALEM A. 2012

Figure 15 : (A) patte II de S. calcitrans; (B et C) détail de l’extrémité d’une patte («A et B» photographies originales, «C» modifié d’après Grassé, 1951)

Figure 16 : Pattes de S. calcitrans : (A) patte I, (B) patte II, (C) patte III, (photographies originales)

Chapitre I- Morphologie de l’imago 24

SALEM A. 2012

3-3- Abdomen L’abdomen est divisé en 2 parties: Le pré-abdomen constitué de cinq segments, nettement visibles sur la face dorsale et le post-abdomen constitué de sept segments transformés en un appareil reproducteur. Le mâle possède un aedeagus, ou organe d’intromission, qui au repos est partiellement enfermé dans la poche génitale (Figure 17-A). Chez la femelle, les segments terminaux forment un oviscapte tubulaire télescopique (Figures 17-B et 18).

Figure 17 : Détails des organes génitaux externes de S. calcitrans (A) appareil copulateur du mâle, (B) oviscapte de la femelle, (photographies originales)

Chapitre I- Morphologie de l’imago 25

SALEM A. 2012

Figure 18 : (A) abdomen femelle en vue ventrale, (B) détail de l’oviscapte, (d’après Zumpt 1973)

Chapitre I- Morphologie de l’imago 26

SALEM A. 2012

4 - Morphologie des stades pré imaginaux

4-1- Œufs Une seule femelle peut pondre quelques centaines d'œufs au cours de sa vie par dépôt de grappes d’environ 25 à 50 œufs (Meyer et al., 1991; Urquhart et al., 1996). Les œufs de couleur blanche, mesurent environ 0,9 à 1,0 mm de longueur sur 0,3 mm de largeur (Figure 19). Ils sont allongés, coniques à une extrémité, convexes en face ventrale, légèrement concaves en face dorsale avec deux côtes longitudinales qui correspondent aux zones de déhiscence de l’œuf lors de l’éclosion de la larve (Figure 20). La distance entre les 2 côtes est égale au quart de la largeur de l’œuf (Hinton, 1960 ; Skidmore, 1985).

Figure 19 : Grappe d’œufs de Stomoxys calcitrans, (photographie originale)

Figure 20 : Œuf de Stomoxys calcitrans, avant (A) et après (B) l’éclosion, (photographies originales)

Chapitre I- Morphologie des stades pré imaginaux 27

SALEM A. 2012

4-2- Larves Les larves de muscidés ou asticots évoluent sous trois stades : LI, LII et LIII. La LI translucide, mesure 1,5 à 2,5 mm de long. La LII de couleur blanc crème mesure 2,6 à 4,4 mm de long. La LIII mesure entre 4,8 et 12 mm de longueur, est de couleur jaune pâle à blanc crème (Skidmore, 1985; Meyer et al., 1991). De forme cylindrique, elle présente 12 segments visibles. Les deux premiers peuvent difficilement être distingués l’un de l’autre (Zumpt, 1973) et contiennent un squelette cephalopharyngé sclérifié noir visible à travers le tégument et des dents qui permettent de broyer les aliments. Les crochets buccaux (mandibules modifiées) aident à ramper, à creuser, à se cacher. La larve dépourvue d’yeux possède une paire d’antennes (Figure 21). Le thorax des larves est apode, il possède pour les LII et les LIII une paire de stigmates latéraux pro-thoraciques digités (Figure 21-A). L’abdomen comprend huit segments, portant des rangées transversales d'épines (Moon, 2002).

Figure 21 : Extrémité antérieures d’une larve au stade III de Stomoxys calcitrans. (A) détail de l’extrémité antérieure, (B) extrémité de l’antenne (c) un des deux crochets, (stp) stigmates prothoracique, (am) complexe antenno-maxillaire, (sh) sclérite hypostomal, (photographies originales)

Les deux plaques stigmatiques postérieures sont portées en surface par le dernier segment abdominal. Chacune de ces plaques se compose d'un péritrème complet, de deux (LI et LII) ou trois fentes sinueuses (LIII) qui permettent les échanges gazeux et d’une cicatrice marque de la mue précédente (Zumpt, 1973; Moon, 2002) (Figures 22 et 23).

Chapitre I- Morphologie des stades pré imaginaux 28

SALEM A. 2012

La forme et le nombre des digitations prothoraciques, la forme des plaques stigmatiques du dernier segment et celle des fentes stigmatiques constituent des critères de diagnose des larves (Moon, 2002) (Figure 23).

Figure 22 : Extrémité postérieure d’une larve au stade III de S. calcitrans : (A) vue du dernier segment, (B) plaque stigmatique postérieure triangulaires avec (stg) trois fentes sinueuses, (ss) soies sensorielles, (cs) cicatrice du stigmate du stade précédent, (photographies originales)

Figure 23 : Plaques stigmatiques de LIII de six espèces de la famille de Muscidae (A) Musca autumnalis, (B) Stomoxys calcitrans, (C) Haematobia irritans, (D) Muscina stabulans, (E) Hydrotaea ignava (F) Hydrotaea sp. Chaque barre noire mesure 0,2 mm, (d’après Skidmore, 1985)

Chapitre I- Morphologie des stades pré imaginaux 29

SALEM A. 2012

4-3- Nymphe et Pupe La pupe est formée par l’exuvie de la LIII. Elle a la forme d’un tonnelet dur et résistant qui conserve la segmentation larvaire. Elle contient la nymphe évoluant en imago (Figure 24) (Meyer et al., 1991; Moon, 2002). Les détails du cycle évolutif seront donnés dans le chapitre suivant. La longueur des pupes de S. calcitrans est d’environ 6 mm, sa couleur au cours du développement varie du blanc crème au marron foncé (Skidmore, 1985; Meyer et al., 1991). Dans notre étude, 100 pupes de la souche ENVT ont été mesurées. La longueur est comprise entre 4 et 6,7 mm (5±1 mm), et la largeur entre 1,3 et 2 mm (1,7 ± 0,4 mm). Elles pèsent entre 9,4 et 16,6 mg (13±3,9 mg). Ces valeurs sont conformes à celles disponibles dans la littérature (Bridges & Spates, 1983; Skidmore, 1985).

Figure 24: Pupe de S. calcitrans (A) vue dorsale de la pupe, (B) stigmates anaux, (photographies originales)

Chapitre I- Morphologie des stades pré imaginaux 30

SALEM A. 2012

Chapitre II

Biologie de Stomoxys calcitrans

Chapitre II- Biologie 31

SALEM A. 2012

Dans ce chapitre, nous rapportons les données bibliographiques concernant la biologie des adultes et les données concernant le cycle évolutif. L’élevage de 2 souches de S. calcitrans au Laboratoire de l’ENVT a permis d’apporter des informations sur la chronologie du cycle, la durée de survie des adultes, le nombre de repas effectués par les adultes, et le poids de sang ingéré. Ces résultats ont fait l’objet d’une publication dans Parasite intitulée : « Feeding and breeding aspects of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) under laboratory conditions ». Nous détaillerons ici les données de biologie et les éléments de la technique d’élevage non décrits dans l’article. Ensuite, nous étudions l’impact des facteurs abiotiques sur la dynamique des populations de Stomoxys calcitrans dans le Sud-Ouest de la France afin de connaître les périodes de pullulation de ces vecteurs et donc, de proposer des moyens de lutte adéquats. Nous étudierons les profils hebdomadaires des captures de stomoxes réalisées pendant une année ainsi que l’attractivité des espèces hôtes (bovinse et ovins ou équins), présentes sur le site de l’École Nationale Vétérinaire de Toulouse. Ces résultats ont fait l’objet d’une publication préparé pour être soumise à Journal of Economic Entomology intitulée: « Population dynamics of Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae) in the South - West of France ».

Chapitre II- Biologie 32

SALEM A. 2012

1- Élevage

1-1- Adultes et ponte Campau et al. (1953), élèvent les stomoxes adultes dans une grande cage qui contient 4000 à 8000 adultes. Deux plats en porcelaine contenant du sang sont fournis quotidiennement. Ils renferment une boule de coton d’environ 6,4 cm de diamètre préalablement humidifiée avec de l'eau froide, pressée presque à sec, et sur lequel on a versé le sang de bovin citraté (citrate de sodium 3,2 g / litre). Cette méthode d'alimentation est similaire à celle rapportée par Ashrafi (1964) et Christmas (1970). Les femelles commencent à pondre dans les plats de nourriture lorsque le niveau du sang baisse (Campau et al., 1951). Les œufs récoltés par lavage sont déposés sur le substrat d’élevage larvaire. Les pots sont couverts d’un voile au cours du développement larvaire. Le quatorzième jour, les nymphes regroupées à proximité des bords du pot sont transférées pour émerger dans une cage d’élevage d’adultes. Schoof (1964) a démontré que les femelles de S. calcitrans peuvent pondre sur une éponge humidifié d'eau (Champlain et al., 1954), ou dans le substrat de CSMA (Doty, 1937). Christmas (1970) élève à 18°C 250 stomoxes adultes dans une cage de 50.8 x 50.8 x 38 cm. Ils sont nourris deux fois par jour (à 8:30 et à 16 :00) avec du sang citraté. Pour l’oviposition, il utilise de l’herbe préalablement coupée et fermentée pendant 3-5 jours dans une armoire humide à 25°. Les œufs déposés sur l’herbe fermentée sont récoltés toutes les 24 heures et transférés sur le substrat d’élevage larvaire. Gilles et al. (2005a,b) ont utilisé des cages (30 x 30 x 30 cm) contenant environ 1000 stomoxes placées à 25± 1°C, 70±10% d’humidité et 12:12 (L:D) de photopériode. Les cages sont placées sur un substrat d’oviposition composé d’herbe hachée. Les mouches sont nourries quotidiennement avec du sang de bovin citraté à 6 g / l. Pour ce faire, des éponges gorgées de sang chauffé à 38 °C sont posées sur la paroi supérieure de la cage pendant 45 min. Ils ont montré que la température minimale d’activité est de 10,7°C valeur rapportée également par Lysyk (1998) et par Bishopp 1913 (Dougherty et al., 1995). Selon Sutherland (1980), 66% des S. calcitrans adultes exposés à un gradient de température préfèrent une température comprise entre 20,1 et 32,5 °C, avec une moyenne préférée de 26°C. Les adultes ont une longévité maximum de 40 jours à 17.3 °C (Lysyk, 1998).

Chapitre II- Biologie - élevage 33

SALEM A. 2012

Dans cette étude, l’élevage des stomoxes a été réalisé dans un local maintenu à 25 ± 2°C avec une humidité relative de 50±10% et éclairée 12h par jour. Un système de nourrisseurs à travers une membrane a été utilisé (Figure 25). Dans ce système l’eau maintenue à 38°C circule dans la chambre extérieure du nourrisseur. La chambre intérieure du nourrisseur fermée en partie basse par la membrane contient le sang. Les stomoxes piquent la membrane pour se gorger de sang. Les adultes disposent également de miel, d’eau et pondent sur un mélange d’herbe préalablement stérilisé (250°C pendant 30 minutes) puis macéré dans l’eau. Les œufs sont ensuite déposés sur le milieu d’élevage des larves.

Figure 25 : Schéma du système d’alimentation des stomoxes adultes: (A) eau chauffé à 38 °C, (P) membrane- parafilm, (S) sang dans la chambre intérieure du nourrisseur, (M) miel, (E) coton imbibé d’eau

1-2- Larves Parr (1959) a utilisé un mélange fermenté de bouse de vache séchée (255 g), de sang séché (142 g), et de sucre (28 g). Le substrat de CSMA (Chemical Specialities Manufacturers Association), utilisé par Campau et al. (1951) et par Ashrafi (1964) contient un mélange de farine de luzerne (375 g), de la levure de bière sèchée (3,5 g), du cholestérol (1,35 g), du malt (10 ml) et de l’eau (500 ml). McGregor & Driess (1955) ont ajouté 5 parties de copeaux de bois à une partie du milieu CSMA, sans levure et sans malt. Goodhue & Cantrel (1958) ont mélangé le milieu CSMA enrichi en levure et en malt avec de la vermiculite imprégnée d’eau (Schoof, 1964).

Chapitre II- Biologie - élevage 34

SALEM A. 2012

Christmas (1970) utilise comme milieu d’élevage un mélange constitué de pulpe de canne à sucre (264 g), de farine de blé (100 g), de farine de poisson (24 g) et de bicarbonate de sodium (6 g). L’élevage larvaire est réalisé à 23±2 °C et 45-55% d’humidité. Sutherland (1980) rapporte que les stades larvaires préfèrent une température comprise entre 19,5 et 33,2°C et une humidité comprise entre 26% et 40%.

Dans cette étude nous avons utilisé un mélange de vermiculite, d’un broyat de croquettes destinées aux chiens, de levure de bière, et de farine de sang. Les références des produits utilisés et les proportions sont indiquées dans l’article. L’inclinaison du bac d’élevage permet l’obtention d’un gradient d’humidité, ainsi les larves III vont remonter pour trouver la zone la plus adéquate pour la pupaison. L’eau est ajoutée quotidiennement en bas du bac et du substrat nutritif est rajouté régulièrement sur la partie médiane. Les pupes formées sont récoltées et placées sur de la vermiculite imbibée d’eau dans les cages destinées aux adultes (Figure 26).

Figure 26 : Schéma du cycle d’élevage des stomoxes: (T) tissu à ponte, (V) vermiculite, formant le milieu d’élevage larvaire, (H) herbe

Chapitre II- Biologie - élevage 35

SALEM A. 2012

1-3- Difficulté rencontrée L’un des principaux problèmes rencontrés lors de la mise en place de notre élevage a été une mortalité des stomoxes et des larves liées à la présence d’acariens de la famille des Macrochelidae comme cela avait été déjà décrit par Niogret & Nicot (2008) et Beresford1 & Sutcliffe (2009). Les stades larvaires ainsi que des adultes de Macrocheles muscaedomestica parasitent les œufs et les larves de premier stade (Axtell, 1963; Kinn, 1966; Williams & Rogers, 1976; De Jesus, 1988; Beresford1 & Sutcliffe, 2009). L’acarien adulte s’attache à la face ventrale de l’abdomen des mouches adultes (Figure 27). La durée du cycle de l’acarien est d’environ 60 heures. Une femelle adulte est capable de détruire en moyenne 11.88 œufs et larves de premier stade de Musca domestica par jour (De Jesus, 1988). Pour limiter son incidence nous avons examiné individuellement les stomoxes capturés avant de les mettre dans les cages d’élevage. Tout insecte parasité était éliminé. Nous avons dans un deuxième temps utilisé des bandes imprégnées d’amitraz (Apivar ™, Veto- Pharma, Villebon-sur-Yvette, France) destinées à la lutte contre Varroa jacobsoni dans les ruches. Une demi lanière a été suspendue dans chaque cage, les mouches ont été en contact avec ces lanières ce qui a entrainé la chute des acariens au fond de la cage. Elles ont permis de contrôler ce parasite.

Figure 27 : Macrocheles muscaedomestica, (photographies originales)

Chapitre II- Biologie - élevage 36

SALEM A. 2012

2- Comportement trophique

Les stomoxes ont une activité diurne, ils passent la quasi-totalité de leur temps posés sur des supports : murs, fils électriques, poteaux des bâtiments, arbres …. Ils ne parasitent les animaux et l’homme que le temps du repas. Ils sont capables de voler sur de grandes distances afin de se nourrir et de migrer vers des conditions plus favorables (Bailey et al., 1973). Hogsette et al. (1987) a noté que S. calcitrans peut parcourir 5 km ou plus à la recherche d’une source de repas de sang et certaines mouches marquées ont même été retrouvées jusqu’à plus de 100 km de leur lieu de marquage. Les stomoxes peuvent prendre un ou plusieurs repas de sang par jour (Hafez & Gamal- Eddin, 1959; Harris et al., 1974; Berry & Campbell, 1985; Carn, 1996). Le premier repas peut avoir lieu dans les heures qui suivent l'émergence (Skidmore, 1985). Ils se nourrissent sur des hôtes variés tels que les bovidés, les équidés les chiens et les humains. Ainsi les stomoxes ont constitué une véritable nuisance sur les plages de Floride (Fye et al., 1980; Hogsette et al., 1981; Isard et al., 2001; Mavoungou et al., 2008). Mavoungou et al. (2008) ont trouvé que 33 % des S. calcitrans récoltés au Gabon avaient pris leur repas sur l’homme. Chez ses hôtes, S. calcitrans préfère se nourrir sur les parties inférieures des membres, telles que les antérieurs des chevaux et des bovins, les chevilles de l’homme alors que chez les chiens les mouches piquent préférentiellement sur les oreilles (Geden & Hogsette, 1994; Dougherty et al., 1995; Yeruham & Braverman, 1995; Vetela et al., 2007) (Figures 28 et 29). Les stomoxes se nourrissent également de nectar, mais les repas de sang sont indispensables pour la production d’œufs et améliorent la longévité des adultes (Moobola & Cupp, 1978).

Dans notre étude 73.3 % des jeunes adultes se gorgent de sang au cours des premières 24 heures qui suivent l’émergence. La majorité font un repas par jour, et ingèrent 11.1± 3.8 mg de sang (Figure 30). La durée moyenne des repas est de 126± 42 secondes.

Chapitre II- Biologie - comportement trophique 37

SALEM A. 2012

Figure 29 : Répartition préférentielle de S. calcitrans sur un bovin

Figure 28 : Photographie de S. calcitrans se nourrissant sur la patte de bovin

Figure 30 : Femelle de S. calcitrans gorgée de sang (A), non gorgée (B), (photographies originales)

Chapitre II- Biologie - comportement trophique 38

SALEM A. 2012

3- Cycle évolutif

Le cycle est constitué de plusieurs stades : l’œuf, 3 stades larvaires, la pupe et l'adulte (Zumpt, 1973; Skidmore, 1985) (Figure 31). Le passage d’un stade à l’autre est fonction de la température et de l'humidité (Lysyk, 1998). Le premier accouplement est plus fréquent quand les deux sexes sont âgés de 4 à 5 jours (observation personnelle). La copulation dure en moyenne 5min : 40 sec (Anderson, 1978). Un repas sanguin est nécessaire à la maturation des organes reproducteurs et à la production de chaque nouvelle série d’œufs (Moobola & Cupp, 1978; Skidmore, 1985; Foil & Hogsette, 1994). Le mâle doit avoir digéré au moins un repas de sang avant qu’il soit capable d’inséminer une ou plusieurs femelles (Anderson, 1978). Chez la femelle, la maturation de la première ponte exige au moins trois repas de sang (Venkatesh & Morrison, 1980). En fait, 5 à 6 follicules ovariens se développent simultanément. Quand le premier follicule a achevé son développement au stade V, le second se trouve déjà au stade III et le troisième au stade II. Chaque repas de sang permet d'augmenter d'un degré le développement de la première série d'œufs et des follicules qui la surmontent. Ashrafi (1964) rapporte que la ponte dure 20 jours, elle débute lorsque les femelles sont âgées de 5 jours et est maximale à 8 jours. Sutherland (1979; 1980) a montré que la durée de pré-oviposition dépend de la température: elle était de 4,3 jours à 30°C et de 11,7 jours à 20°C. Il n’a pas observé de pontes pour des températures inférieures à 15°C ou supérieures à 40°C. La viabilité des œufs dépasse 84% à des températures comprises entre 10 et 40°C, avec une température optimale de 30°C et une température létale de 45 °C. Les nymphes et les adultes de Stomoxys calcitrans ont une durée de vie optimale à des températures comprises entre 20°C et 30°C (Sutherland, 1979). La fécondité des femelles de S. calcitrans dépend de la température. A 15°C une femelle pond un total de moins de 30 œufs alors qu’à 25,3°C elle pond jusqu’à 700 œufs (Lysyk, 1998). Elles pondent 10-11 fois des grappes d’environ 35 œufs (Schoof, 1964).

Dans notre étude nous avons observé les premières pontes par des mouches âgées de 7 j et ce pendant 14 jours avec une moyenne de 33.4 œufs par mouche. Ces observations sont en accord avec celles de Gilles et al. (2005 b) pour le nombre d’œufs pondus mais pas pour la durée de ponte.

Chapitre II- Biologie - cycle évolutif 39

SALEM A. 2012

Gilles et al. (2005 b) ont trouvé que les femelles de S. calcitrans peuvent pondre pendant 44 jour à 20°C et pendant 32 jours à la température optimale de 25°C. Le nombre d’œufs varie de 63 à 20°C jusqu’à 19 œufs à 30°C (Gilles et al., 2005b). Les sites de ponte et de développement larvaire dans la nature sont très variés, et sont souvent associés à une mauvaise gestion des élevages (gestion des fourrages, des ensilages, des déchets alimentaires, des effluents…..) (Meyer & Petersen, 1983; Berkebile et al., 1994; Broce et al., 2005; Campbell, 2006). La matière organique végétale en décomposition, éventuellement mélangée à des déjections animales (fumier, herbe ou autres végétaux coupés, restes et refus d’aliments du bétail en décomposition) et les balles de foin stockées dans les champs constituent des sites de ponte favorables (Zumpt, 1973; Hall et al., 1983; Hogsette et al., 1987; Skoda et al., 1991; Lysyk, 1993; Berkebile et al., 1994; Foil & Hogsette, 1994). Certaines bactéries sont nécessaires pour permettre le développement larvaire (Lysyk, 2011). Il a été démontré que les femelles sont attirées par des substrats renfermant certaines espèces bactériennes, telles que Citrobacter freundii, qui favorisent le développement des larves (Romero et al., 2006). Selon Simmons (1944), les œufs éclosent entre 19 et 120 heures à 28°C (Zumpt, 1973). Skidmore (1985) a montré que les œufs éclosent au bout de 20-80 heures. L’obtention des adultes dure 2-3 semaines dans des conditions favorables, mais les conditions météorologiques défavorables peuvent l'étendre jusqu’à 80 jours (Skidmore, 1985). Les valeurs de la durée du développement de l’œuf à l’imago en fonction de la température publiées par différents auteurs sont rapportées dans le tableau (2). Nous avons trouvé en moyenne 19.2± 1.7 j, valeur proche de celle publiée par Gilles et al. (2005).

A 25°C, la longévité moyenne des adultes nourris avec du miel et de l’eau a été plus élevée que celle des mouches recevant en plus du sang (10.7± 3.9 jours). La durée de vie maximale est plus courte pour les mouches ne recevant pas de sang (17 jours pour les males et 18 jours pour les femelles) que pour celles disposant de sang, de miel et d’eau (23 jours pour les males et 24 jours pour les femelles). Notre technique d’élevage, facile à réaliser dans une seule pièce permet d’obtenir 11.8 générations par an et 16.2 descendants femelles par femelle.

Chapitre II- Biologie - cycle évolutif 40

SALEM A. 2012

Durée moyenne de développement de l'œuf à l'adulte en jours T°C 15 20 23,9 25 29,4 30 35 Kunz et al. - - 16.6 - 11.6 - 12.1 (1977) Lysyk 62 29 - - - 12 - (1998) Gilles et al. 70.66 32.36 - 16.65 - 12.92 13.17 (2005) Salem et al. - - - 19.2 - - - (2012)

Tableau 2 : Valeurs de la durée du développement de S. calcitrans de l’œuf à l’imago en fonction de la température

Figure 31 : Cycle évolutif de S. calcitrans, (photographies originales)

Chapitre II- Biologie - cycle évolutif 41

SALEM A. 2012

Article 1

Feeding and breeding aspects of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) under laboratory conditions

(Parasite, 2012, 19, N°4: 309-317)

Chapitre II- Biologie - article 1 42

FEEDING AND BREEDING ASPECTS OF STOMOXYS CALCITRANS (DIPTERA: MUSCIDAE) UNDER LABORATORY CONDITIONS SALEM A.*, FRANC M.*, JACQUIET P.*, BOUHSIRA E.* & LIÉNARD E.*

Summary: Résumé : ÉLEVAGE ET ALIMENTATION EN LABORATOIRE DE STOMOXYS CALCITRANS (DIPTERA : MUSCIDAE) Bionomic aspects of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) were studied under laboratory conditions. For this reason, Les aspects bionomiques de Stomoxys calcitrans (Linné, 1758) laboratory-rearing techniques were optimized at the National (Diptera : Muscidae) ont été étudiés en laboratoire à l’École Veterinary School of Toulouse. The colony was maintained at 25 ± Nationale Vétérinaire de Toulouse. Une colonie de S. calcitrans a 2 °C, 50 ± 10 % RH under a 12-hour light cycle and observed daily. été élevée dans des cages de 30 x 30 x 30 cm contenant entre 500 The size of each adult cage is 30 x 30 x 30 cm and designed to et 1 000 adultes par cage, à une température de 25 ± 2 °C, une house about 500-1,000 flies. The average cycle from egg to adult humidité relative de 50 ± 10 % et avec une alternance de 12 heures was 19.2 ± 1.7 days. The mean longevity of imagos was 9.3 ± d’éclairage et 12 heures d’obscurité. Dans ces conditions, la durée 5.8 days and not significantly different between sexes. Stable flies du cycle évolutif de l’œuf à l’adulte a été de 19,2 ± 1,7 jours en were split into two groups; the first was fed with blood, honey moyenne. La longévité moyenne des imagos a été de 9,3 ± 5,8 jours and water, and the second was fed only with honey and water. et n’était pas significativement différente entre les deux sexes. The mean weight of a blood meal was 11.1 ± 3.8 mg with no Les mouches adultes ont été divisées en deux groupes après significant differences between males and females. The mean l’émergence : le premier a été alimenté avec du sang, du miel et longevity of non-blood fed flies was found to be significantly de l’eau, pendant que le second a été nourri exclusivement avec du higher (10.4 ± 3.9 days) than those fed with blood. The maximum miel et de l’eau. Le poids moyen du repas de sang a été de 11,1 ± lifespan was shorter for non-blood fed males (17 days) and females 3,8 mg sans différence significative entre mâles et femelles. La (18 days) than for those fed with blood (females: 24 days, males: longévité moyenne a été significativement plus élevée (10,4 ± 3,9 23 days). Under these laboratory conditions, S. calcitrans rearing jours) dans le second groupe. Toutefois, l’espérance de vie maximale was successfully established. In the end, the number of expected était plus courte pour les mâles (17 jours) et les femelles (18 jours) generations of S. calcitrans and the net reproduction rate were sans repas sanguin en comparaison du premier groupe (mâles : estimated to be 11.8 generations/year and 16.2 living females per 23 jours, femelles : 24 jours). Le nombre attendu de générations female respectively. annuelles de S. calcitrans a été estimé à 11,8 générations et le taux de reproduction à 16,2 femelles vivantes par femelle. KEY WORDS: Stomoxys calcitrans, stable fly, rearing, blood, sugar, survivorship. MOTS-CLÉS : Stomoxys calcitrans, mouche des étables, élevage, sang, sucre, survie.

INTRODUCTION (Cortinas & Jones, 2006). Preferred biting sites are the lower legs of horses and cattle, the ears of dogs and the ankles of humans, sometimes leading to the he blood-feeding cosmopolitan stable fly, Sto- development of necrotic dermatitis (Geden & Hog- moxys calcitrans (Linnaeus, 1758), is a major sette, 1994; Yeruham & Braverman, 1995). S. calcitrans pest of cattle and horses. Berry et al. (1983) T have also been shown to transmit various pathogens calculated that the average daily and seasonal weight such as Anaplasma marginale (Potgieter et al., 1981), losses due to the stable fly were 0.02 and 2.3 kg/animal, West Nile Virus (Doyle et al., 2011), Enzootic Bovine respectively. A ratio of one fly per animal was enough Leukosis Virus after experimental infection (Weber et to reduce milk production by 0.7 % (Bruce & Decker, al., 1988), and Bacillus anthracis (Turell & Knudson, 1958; Rodriguez et al., 2005). Eventually, the economic 1987). The female human bot fly, Dermatobia hominis, loss for the U.S. cattle industry is estimated to reach lays her eggs on the thorax and abdomen of S. calci- $ 2,211 million per year (Taylor et al., 2012). Adults trans. Larvae of D. hominis hatch and penetrate the of both sexes are blood-feeders, inflicting painful bites skin of the warm-blooded host while being bitten with their long piercing proboscis, exacerbated by by the stable fly (Rodríguez-Batista & Leite, 1997). the absence of anesthetic components in the saliva S. calcitrans is also one of the intermediate hosts of * Laboratoire de Parasitologie, Université de Toulouse, INP, ENVT, Habronema muscae and H. microstoma (Hogsette & 31076 Toulouse, France. Farkas, 2000; Rodríguez-Batista et al., 2005). Correspondence: Emmanuel Liénard. Tel.: 33 (0)5 61 19 39 48 – Fax: 33 (0)5 61 19 39 71. The immature stages of the stable fly develop in any E-mail: [email protected] wet, decaying organic matter, preferentially in animal

Parasite, 2012, 19, 309-317 Original contribution 309 Chapitre II- Biologie - article 1 43 SALEM A., FRANC M., JACQUIET P. ET AL.

waste mixed with soil, straw, hay or silage where 15 cm in diameter. Each cage was suited to hold 500 females can lay their eggs (Broce et al., 2005; Meyer to 1,000 adult flies. Adult flies were fed daily with & Petersen, 1983; Hogsette et al., 1987). There are a double-chambered glass feeder made by a local many reports indicating successful completion of the glassblower. The water was heated (38.5 °C) with entire life cycle of S. calcitrans under laboratory con- an electric heat pump (ED-5 Heating Circulator with ditions (see for example Schoof, 1964 and Christmas, Open Bath, Julabo, Seelbach, Germany) and circulated 1970). Sutherland (1980), Lysyk (1998) and Gilles et through the outer chamber. The inner chamber con- al. (2005a, b; 2007) described in depth the effects of taining bovine blood was sealed with a thin synthetic temperature on adult longevity and life cycle chrono- membrane (Parafilm 3M, Pechiney Plastic Packaging, logy. The objective of this project was to develop a Chicago, IL), which was placed in contact with the simple and repeatable method for laboratory breeding upper side of the cage. Stable flies fed by piercing of S. calcitrans adapted from previous works (Schoof, the membrane through the mesh of the cage. Blood 1964; Christmas, 1970; Lysyk, 1998; Gilles et al., 2005a, was collected weekly in 4-mL tubes containing 60 b). The rearing yield parameters, the life cycle timing USP U Lithium Heparin (Terumo Europe N.V., Leuven, and dietary characteristics of the adult fly as well as Belgium) to prevent coagulation (Berkebile et al., the consequences of the absence of blood from the 2009). Blood was stored at 4 °C for up to a week. diet on longevity and fertility, were recorded in order The blood was provided by a 14-month-old calf reared to assess the impact of our laboratory conditions on at the E.N.V.T. that was not treated against flies with stable fly biology. topical or systemic insecticides within three months before the start of the study. The 8-mL heparinized blood meal and the membrane were changed daily to MATERIALS AND METHODS prevent microbial development and blood depletion. Moreover, a cotton ball of 3 g soaked in 30 mL of tap water and 1 mL of liquid honey (Miel Mille Fleurs, La STOMOXYS CALCITRANS REARING Générale des Miels, Château-Renard, France) were also • Colony origins changed and provided daily. A colony of S. calcitrans was established in the Laboratory of Parasitology at the Veterinary National • Egg collection School of Toulouse (E.N.V.T.). Adult stable flies were A 40 × 50 × 15 cm plastic receptacle containing a manually removed from cattle or caught by using six 2- to 3-cm layer of 100 g of vermiculite (Vermex Vavoua traps for 12 hours in May 2009 at the campus M, Efisol, Nanterre, France) and a 2- to 3-cm grass of the E.N.V.T. This trap was initially developed in layer saturated with 300 mL of water was prepared West Africa for the control of tsetse flies (Laveissière to induce oviposition. Fresh green grass including a & Grébaut, 1990), but is now also used to capture homogeneous blend of one-third of meadow fescue S. calcitrans (Gilles et al., 2007; Liénard et al., 2011). (Festuca pratensis Huds.), one-third of cocksfoot (Dac- S. calcitrans were able to be identified according to tilis glomerata L.) and one-third of ryegrass (Lolium Zumpt (1973). Each stable fly was examined indivi- perenne L.), was collected from the fields around the dually under a magnifying glass to discard individuals E.N.V.T. Sterilization of 100 g of grass was performed with phoretically-attached macrochelid mites. These at high temperature (250 °C for 30 minutes). The mites are predators of eggs and larvae (Beresford & grass was left for fermentation at room temperature Sutcliffe, 2009). Eventually, 53 adult stable flies formed for six days before use. Grass and vermiculite layers a group of 29 males and 24 females. Christmas (1970) were dampened with 300 mL of water. A thin piece and Berkebile et al. (2009) reared immature and adult of black cloth (30 × 30 cm) was moistened and placed stable flies at 23 ± 2 °C, 30-50 % relative humidity (RH), between the mesh bottom of the fly cages and the under a 12 Light:12 Dark (L:D) photoperiod. Better oviposition medium. The moisture content of the ovi- results were obtained by Lysyk (1998) at 25 °C. Thus, position medium was maintained by the daily addition based on these previous data, the stable fly colonies of 50 ml of water. Eggs were collected from the black at the E.N.V.T. and the various experimentations were cloth by rinsing it with fresh water using a pipette and held in a dedicated room at 25 ± 2 °C, 50 ± 10 % RH transferred to the larval rearing pan. and under a 12L:12D photoperiod. Humidity and tem- perature are checked daily and adjusted if necessary. • Larval rearing The vermiculite provided an adequate ventilated envi- • Adult fly cage and feeding ronment for S. calcitrans larvae (Goodhue & Cantrell, Adult stable flies were maintained in mesh cages (30 × 1958; Schoof, 1964). It also allowed for free larval 30 × 30 cm), with a small circular door measuring movement and facilitated the removal of pupae from

Parasite, 2012, 19, 309-317 310 Original contribution Chapitre II- Biologie - article 1 44 FEEDING AND BREEDING ASPECTS OF STOMOXYS CALCITRANS the medium. The larval medium (100 g of vermiculite • Longevity according to the type of diet and 160 g of larval food mixture) was placed in 30 × Two groups of 100 newly emerged stable flies were 40 × 10 cm pans. The pan was tilted 30° to which maintained in two adult cages. Each group received 300 mL of water was added to dampen the substrate one type of diet ad libitum: one was given blood, through capillar action. The larval food mixture was honey and water and the other honey and water only. initially prepared with 125 g of crushed dry dog food Treatments were replicated three times. The number of (23 % protein, 16 % fat, 6.6 % ash, and 1.4 % fiber, dead females and males was recorded daily and used Royal Canin Medium Adult, Royal Canin, Aimargues, to compute Kaplan-Meier survival curves (Kaplan & France), 10 g of beer yeast (Saccharomyces sp.) and Meier, 1958). 25 g of blood meal (Sang desséché, Solabiol, Marseille, France), manually mixed with vermiculite. A piece • Fecundity and fertility of gauze covered the basin to prevent larvae from The parameters used to define the rearing performance escaping. Then, 25 g of vermiculite with 15 g of the included: net reproduction rate, mean generation time, larval food mixture were daily sprinkled on top of the intrinsic and finite rates of natural increase. Under existing medium. Every day, 100 mL of tap water were controlled rearing conditions, 100 newly emerged poured into the bottom of the pan. stables flies (sex ratio close to 1:1) were placed in adult cages and continuously fed with blood, honey • Pupation and adult emergence and water. The number of eggs laid in the cages Every 24 hours, the larval rearing medium was stirred was counted daily until the death of all females. with a spatula and pupae were manually collected. Then, based on observed mortality rates from egg to Pupae were kept daily in 12 × 8 × 5 cm plastic flasks, imago and sex ratio at emergence, the life table was each containing 5 g of vermiculite and 15 mL of computed including these corrections to determine x water, covered with a piece of gauze. After emer- (the age in days from egg hatching to adult death), gence, imagos were transferred to the adult cage as X (age in days of adults from emergence), mx (ave- previously described. rage number of potential adult females with a female aged X with an observed mortality rate of 0.468 and REARING YIELD PARAMETERS an observed sex ratio of 0.486) and lx (percentage of • Timing and cycle productivity surviving females from birth to age X). Reproductive To assess the life cycle in our laboratory conditions, and population parameters were defined using the net 100 newly laid eggs were collected. Developmental reproduction rate (R0 = ∑ lx.mx), mean generation time stages were monitored daily and the survival of eggs, (T = ∑ lx.mx.x / ∑ lx.mx), intrinsic rate of natural pupae and adults were recorded to assess the overall increase (r = ln R0 / T) and finite rate of natural r breeding performance. The experiments were conti- increase (λ = e ). Four replicates of 100 stable flies nued until the death of all stable flies of the cohort. were used. The test was replicated ten times. STATISTICAL ANALYSIS • Characteristics of blood meal The permutation test with exact inference was used Characteristics of the first meal: just after the emer- to compare both sexes in terms of emergence delay, gence of imagos, a first group of 60 stable flies (30 body weights, duration of blood meal, and lifespan males and 30 females) was isolated. Each fly was indi- according to the type of diet. It was also used to vidually put in 7 × 4 cm flasks, which were sealed with compare the mean weight of ingested blood between netting. Blood was given on a one-time basis as the a single meal and two meals a day. The Spearman’s only food source to this cohort. Blood intake for the coefficient r2 was computed to assess the correlation first meal was recorded by evaluating the fly’s weight between the weight of ingested blood and that of S. difference before and after the blood meal, and the calcitrans before feeding and between the duration duration of the meal. of a blood meal and amount of blood intake. Com- Characteristics of the different meals during lifetime: parisons between weights of ingested blood over time a second group of 60 stable flies (30 males and 30 were made with the Friedman’s test. Kaplan-Meier females) was followed until the death of all indivi- survival curves regarding sex and diet compositions duals. Blood was given twice a day: the first time on the survivorship of S. calcitrans were constructed between 8:00 and 10:00 a.m. and the second time (Kaplan & Meier, 1958). Significances of differences between 16:00 and 18:00 p.m. Flies were weighed between curves were estimated by Log-Rank tests before and after each blood meal. The number of assuming a proportional hazard model. Statistical observed blood meals and amount of blood intake as analyses were carried out using the software package well as adult longevity were also recorded. StatXact® release 3.1 (CytelSoftware Corporation, USA),

Parasite, 2012, 19, 309-317 Original contribution 311 Chapitre II- Biologie - article 1 45 SALEM A., FRANC M., JACQUIET P. ET AL.

Microsoft® Excel 2007 (Microsoft Corporation, USA) of intake (y, mg) was linearly and significantly related and R package release 2.14 (available at http://www. to the stable fly’s weight before feeding (x, mg) (y = r-project.org) with Rcmdr Survival Plug-In version 1.0 1.405 + 1.355x, r2 = 0.623, p < 0.0001). The mean (Leucuţa & Achimaș Cadariu, 2008). The significance duration of a blood meal was 126 ± 42 s and was not threshold for overall analysis was 0.05. significantly different between males and females (p = 0.287). Duration was not significantly correlated with the quantity of blood ingested (r2 = 0.004, p < 0.979). RESULTS In the second group of 60 stable flies (sex ratio 1:1), the number of blood meals was taken into account for each fly until death and varied from one to nine EARING YIELD RESULTS R (Fig. 1). All flies fed at least once. The median number able I shows the chronology of the life cycle of intakes was four and the mean delay between two of S. calcitrans under our laboratory conditions. meals was 1 d 7 h 33 min ± 7 h 3 min. When fed TThe absence of heterogeneity between the ten only with blood, the maximum longevity observed for replicates was checked and data from all replicates stable flies was 13 days and the median survivorship were pooled. The total duration of development from was seven days for males and 6.5 days for females. egg to imago was 19.2 ± 1.7 days. Table II presents The difference between both sexes was not signifi- percentages of successful production at each develo- cant (p = 0.472). Eight flies were fed two meals per pmental stage. The survival rate from egg to adult is day corresponding to a total of 16 meals. The mean 46.8 ± 11.9 % with the highest mortality rates before weight of those 16 blood meals was 8.5 ± 3.6 mg and pupation. All imago emergences occurred between was significantly lower than the mean weight of the seven to ten days after pupation and the mean sex 263 single meals ingested by the other 53 stable flies

ratio (males: females) is close to unity with a value (12.2 ± 4.3 mg, punilateral < 0.0001). Only two stable of 1.1:1. Based on a final number of 467 hatching flies were fed nine times (Fig. 1). A cohort of 11 stable pupae after ten replicates, males emerged earlier than flies that took eight meals was defined. An increase in females, 8.1 ± 0.8 and 8.4 ± 0.8 days, respectively (p < mean quantity of ingested blood was observed from 0.0001). After day 8, the sex ratio reverses in favor of meal one to meal five. A decrease from meal five to females. The first observed mating occurred at 5.5 ± meal seven was reported (Fig. 1). However, the dif- 1 days (from day 4 to day 7) and the first egg laying ference of blood intake was not significant between was observed 7.8 ± 0.8 days (ranging from day 7 to meals from meal one to meal eight (p = 0.35). For day 9) after emergence. Eventually, the life cycle from overall meals and both virgin males and females, the egg to egg under our laboratory conditions was 27 ± mean intake was 12.4 ± 4.2 mg and ranged from 3.2 1.9 days with a range of 23 to 32 days. mg to 22.6 mg.

CHARACTERISTICS OF BLOOD MEAL SURVIVAL ACCORDING TO THE TYPE OF DIET The mean weights of male and female S. calcitrans No heterogeneity was highlighted in survival patterns after emergence and before the first blood meal were between replicates within the same diet group (com- not significantly different (p = 0.212): 6.8 ± 2.3 mg plete diet: blood, honey and water in one hand and (males, n = 30) and 7.5 ± 2.1 mg (females, n = 30). honey and water only in the other hand). No signi- The mean weight of the first blood meal was 11.1 ± ficant heterogeneity was observed in male or female 3.8 mg and ranged from 3.2 to 18.7 mg. The weight survival patterns within the group fed with blood,

Duration (days) Percentage Life cycle stages Range Mean (± S.D.) Life cycle stages Range Mean (± S.D.)

Egg 1 - 2 1.4 (0.5) Pupae (from egg) 26.0 - 65.0 50.2 (12.8) Adult (from pupae) 86.2 - 100 93.3 (4.3) Larval instars 8 - 11 9.6 (0.9) Adult (from egg) 24.0 - 59.0 46.8 (11.9) Pupae 7 - 10 8.2 (0.9) Male adult 40.5 - 64.2 51.4 (7.6) From egg to adult 16 - 23 19.2 (1.7) Female adult 35.8 - 59.5 48.6 (7.6)

Table I. – Range and mean with standard deviation (S.D.) of Stomo- Table II. – Range and mean percentage production with standard xys calcitrans developmental time in days under laboratory condi- deviation (S.D.) of Stomoxys calcitrans pupae and adults, by total tions (25 ± 2 °C, 50 ± 10 % RH, 12L:12D) based on ten replicates and by sex under laboratory conditions (25 ± 2 °C, 50 ± 10 % RH, of 100 eggs. 12L:12D) based on ten replicates of 100 eggs.

Parasite, 2012, 19, 309-317 312 Original contribution Chapitre II- Biologie - article 1 46 FEEDING AND BREEDING ASPECTS OF STOMOXYS CALCITRANS honey and water (three comparisons between three and 23 days for males under laboratory conditions. replicates within each sex, male set and female set res- The survivorship curves between both sexes fed with pectively). Similarly, there was no significant difference honey and water only were not significantly different in survivorship patterns for males or females fed only (χ2 = 0.1; p = 0.771). The mean lifespan of females with honey and water. Statistical assumptions required and males was 10.4 ± 4.1 days and 10.5 ± 3.8 days, for pooling data were met, thus, the replicates were respectively, and the difference was not significant pooled for further analysis. The survivorship curves (p = 0.787). The maximum life expectancy of adults between both sexes fed on a complete meal were was shorter with this type of diet than with the blood-, not significantly different (χ2 = 3.3; p = 0.068). The honey- and water-based diet: 18 days for females and mean longevities of female and male S. calcitrans 17 days for males. Fig. 2 illustrates the two survivor- were 9.9 ± 5.9 days and 8.7 ± 5.6 days, respectively, ship curves between both groups according to their and were not significantly different (p = 0.083). The diet. The proportional hazards assumption over time is maximum lifespan of imagos was 24 days for females not verified because the two curves cross. Therefore,

Fig 1. – Mean quantity of ingested blood by meal and by adult stable fly with stan- dard deviation (mg – black squares) and survivorship curve percentage of Stomoxys calcitrans (black crosses) according to the number of blood meal in laboratory condi- tions (25 ± 2 °C, 50 ± 10 % RH, 12L:12D).

Fig 2. – Survivorship curves of adult Sto- moxys calcitrans fed on blood, honey and water (solid line), on honey and water only (dashed line) in laboratory conditions (25 ± 2 °C, 50 ± 10 % RH, 12L:12D).

Parasite, 2012, 19, 309-317 Original contribution 313 Chapitre II- Biologie - article 1 47 SALEM A., FRANC M., JACQUIET P. ET AL.

the log-rank test cannot be computed to compare the a total of 196 females, 204 males and 6,545 eggs were curves. The survivorship curve of S. calcitrans fed with deposited during the oviposition period of 14 days honey and water (group 1) shows that most deaths (Table III). Data were pooled to assess the fecundity occur in later life with an increase of the hazard ratios of females since no significant heterogeneities were (Fig. 2). The survivorship curve of S. calcitrans with observed between the four replicates. At the first ovi- a diet based on blood, honey and water (group 2) position (day 7), 146 females were alive. A decrease is characterized by a higher life expectancy for older was observed for all replicates at day 13 between both individuals, after the risky juvenile period (Fig. 2). The peaks of 11 eggs/female/day (Table III). The average median of group 2 (nine days) is lower than that of mortality rate from egg to adult (0.468) and the mean group 1 (11 days, p = 0.0006). Despite the maximum sex ratio (0.486) were included in the computation

longevity of group 2, the mean lifespan of group 1 of mx defined in our study as the number of living (10.4 ± 3.9 days) was significantly higher than that of adult females coming from females at pivotal age X.

group 2 (9.3 ± 5.8 days, p = 0.0041). No eggs were Using these data, the net reproduction rate (R0), the reported in group 1. intrinsic rate of natural increase (r), the finite rate of natural increase (λ) and the mean generation time (T) FECUNDITY AND FERTILITY of S. calcitrans were 16.2 living females/female, 0.09 -1 -1 To estimate the potential yield of our colony, the life female/female.d , 1.1 female/female.d and 31 (30.6- table was established (Table III). The sex ratio was 31.8) days respectively. Under laboratory conditions, maintained close to 1:1 during all four replicates with the expected number of S. calcitrans generations was estimated to be 11.8 generations per year.

X (days) Number of eggs/female/day m l x x DISCUSSION 1 0.00 0.00 1.00 2 0.00 0.00 0.97 ccording to previous works (Ashrafi, 1964; 3 0.00 0.00 0.90 Christmas, 1970; Gilles et al., 2005a, b; Ber- 4 0.00 0.00 0.86 kebile et al., 2009), our adaptations of bree- 5 0.00 0.00 0.81 A ding procedures have allowed the achievement of 6 0.00 0.00 0.77 a complete life cycle and reproduction of S. calci- 7 0.21 0.05 0.74 trans since May 2009. The protocol is quite simple 8 1.83 0.42 0.70 and all stages can be reared in one room. Data on 9 7.77 1.77 0.64 life cycle chronology and percentage of production 10 9.20 2.09 0.58 under these laboratory conditions ranged within 11 10.71 2.43 0.48 mean values according to Lysyk (1998) and Gilles et 12 11.00 2.50 0.39 al. (2005a). High mortality occurred before pupation 13 8.11 1.85 0.32 probably partly due to the accidental introduction of 14 10.96 2.49 0.26 15 10.67 2.43 0.23 macrochelids from adult stable flies. Indeed, despite 16 10.85 2.47 0.17 the individual examination, Macrocheles sp. mites 17 9.13 2.08 0.12 completed their life cycle in our rearing conditions. 18 7.88 1.79 0.09 They are one of the greatest predators of eggs, larvae 19 6.46 1.47 0.07 and pupae of S. calcitrans (Smith et al., 1989). After 20 5.40 1.23 0.05 the collection of data for this study, the eradication 21 0.00 0.00 0.04 of mites in the stable fly rearing was performed with 22 0.00 0.00 0.04 amitraz-impregnated plastic strips registered for the 23 0.00 0.00 0.03 control of Varroa jacobsoni Oud. 1904 in honey bees 24 0.00 0.00 0.01 (Apivar™, Veto-Pharma, Villebon-sur-Yvette, France) 25 0.00 0.00 0.00 in cages of adults. No mortality peak of S. calcitrans was observed following the introduction of amitraz. X: age of females in days since emergence; mx: average number of potential adult females by a female aged x (from birth to death However, the impact on the stable fly’s life cycle including mean immature developmental time as computed in the should be assessed. Table I) and computed with mortality rate of 46.8 % and sex ratio Male imagos of S. calcitrans emerged before females of 48.6 % (Table II); lx: percent female survivors to age X; total number of females = 196. but the weights of females and males were not signi- ficantly different after emergence. Thus, a possible Table III. – Life fertility table of Stomoxys calcitrans under labora- tory conditions (25 ± 2 °C, 50 ± 10 % RH, 12L:12D) based on four explanation lied in the fact that the developmental replicates. time of female larval instars and pupae were longer

Parasite, 2012, 19, 309-317 314 Original contribution Chapitre II- Biologie - article 1 48 FEEDING AND BREEDING ASPECTS OF STOMOXYS CALCITRANS than those of males since more time and energy were extended mean longevity for both sexes fed only with required for the complete development of the genital honey and water. Moreover, the maximum lifespan tract (Aguiar-Valgode & Milward-de-Azevedo, 1992). was considerably greater than seven days as reported The mean weight of a blood meal was positively by previous studies (Moobola & Cupp, 1978). Females and linearly correlated to the body weight of stable of Aedes albopictus that fed on sucrose and blood did flies (Dougherty et al., 1995). Complete feeding was not live significantly longer than females fed only with achieved in 1.4 to 2.8 min without disturbance. This sucrose (Xue et al., 2010). Then, the relation between duration was close to the time range of 2 to 5 min the survivorship and nutrition of S. calcitrans remains for stable flies that fed on grazing cattle (Dougherty et relatively blurred and requires further studies. Some al., 1995). The mean amount of blood intake was also points could be suggested from this study. Firstly, no close to that of a previous study (Smith & Hansens, high mortality rates were observed in the early life of 1975; Dougherty et al., 1995). Eventually, the blood adults as reported by Gilles et al. (2005b). This could meal characteristics were not different in our labora- be due to the high quality of our larval food which tory conditions in comparison with a natural blood allows for the accumulation of reserves during larval meal taken from cattle (Smith & Hansens, 1975). instars that reached the adult stage (Gadelhak et al., 1995) in comparison with elephant grass alone (Gilles The kinetics of blood meal weights was similar to et al., 2005a, b). Secondly, the full completion of those published by Venkatesh & Morrison (1980) reproduction required energy and nutrients (Venkatesh regarding the weight of blood meals of unmated & Morrison, 1980). No reproduction occurred without females: an increase of weight for each blood meal blood feeding as observed by Moobola & Cupp (1978). until the fifth meal was followed by a decrease for the All larval reserves and ingested honey could be used next meals. The lack of mating activity could explain to maintain the basal metabolism. Indeed, a sucrose- our observed results characterized by insignificant based diet did not trigger triacylglycerol synthesis as variations in blood intake with age. For female S. calci- the source of energy for lipogenesis (Venkatesh & trans, oogenesis follows the ingestion of blood but no Morrison, 1980). When reserves were not available or egg laying can occur and nor can a new oocyte mature provided by carbohydrates, the mortality increased as in absence of mating activity (Venkatesh & Morrison, suggested by the shape of the survivorship curve of 1980). For male S. calcitrans, Anderson (1978) shows S. calcitrans fed with honey and water (Fig. 1). This that a blood meal is required for the maturation of curve showed an increase of mortality occurring in the accessory gland essential to sperm transfer and later life with an increase of the hazard ratios. The female insemination. After each insemination, the size survivorship curve of S. calcitrans fed with blood, of the accessory gland decreased (Anderson, 1978). honey and water was more uniform during the adult Then, mating activity for both sexes required addi- life, probably due to the regular protein supply of tional energy inducing an increase in ingested blood the blood. (Venkatesh & Morrison, 1982). In our laboratory conditions, the lifetime egg pro- Most stable flies ate only once a day. Some of them duction was 14 days which is slightly shorter than took two meals per day. In this case, the weight that indicated in recent reports (Lysyk, 1998; Gilles of those meals was significantly lower than that of et al., 2005b) but lifetime fecundity and egg produc- single meals. This suggests that the first ingestion of tion ranges are variable according to various studies a blood meal was insufficient to complete the daily (Foil & Hogsette, 1994). Interestingly, the life-history food intake. According to these results, it may be parameters of our rearing, including reproductive necessary to provide fresh blood either ad libitum or performances, fell in ranges of values of the net at least twice a day in order to maintain effectively reproduction rate (R0 = 16.23 living females/female), the stable fly rearing. the intrinsic rate of natural increase (r = 0.09 female/ The mean longevities of males and females were not female.d-1,), the finite rate of natural increase (λ = significantly different regardless of the diet. Those 1.09 female/female.d-1) and the mean generation time values are close to those reported by Gilles et al. (T = 31.04 days) computed by other authors for an (2005b) for blood-fed adults reared at 25 °C. The optimal temperature of 25 °C (Lysyk, 1998; Gilles et maximum longevity was observed for females fed al., 2005a). with the complete diet (bovine blood, honey and To conclude, entire life cycles were able to be com- water) without reaching 40 days as previously reported pleted in a single room with a rather simple protocol (Lysyk, 1998; Gilles et al., 2005b). Those longevity that could be adapted in various countries. Given the variations were also reported by Lysyk (1998) between significant reproduction results, S. calcitrans may be populations from Texas and South Africa. The most used in further studies involving either insecticide striking result is the discrepancy concerning the sensitivity, which lacks dramatically for this species

Parasite, 2012, 19, 309-317 Original contribution 315 Chapitre II- Biologie - article 1 49 SALEM A., FRANC M., JACQUIET P. ET AL.

or vector competence for the transmission of various CRUZ-VAZQUEZ C., VITELA M. I., RAMOS P. M. & GARCIA-VAZ- pathogens such as Besnoitia besnoitia or Trypanosama QUEZ Z. Influence of temperature, humidity and rainfall evansi under controlled conditions. on field population trend of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) in a semiarid climate in Mexico. Parasitología latinoamericana, 2004, 59, 99-103. ACKNOWLEDGEMENTS DOUGHERTY C.T., KNAPP F.W., BURRUS P.B., WILLIS D.C. & COR- NELIUS P.L. Behaviour of grazing cattle exposed to small population of stable flies (Stomoxys calcitrans L.). Applied li Salem benefits from a Ph.D. grant of Ministry Animal Behaviour Science, 1995, 42, 231-248. of Higher Education (Damascus, Syria) and the A DOYLE M.S., SWOPE B.N., HOGSETTE J.A., BURKHALTER K.L., E.N.V.T. The authors wish to thank gratefully Prof. SAVAGE H.M. & NASC R.S. Vector competence of the stable G. Duvallet (University of Montpellier, France) for fly (Diptera: Muscidae) for West Nile Virus. Journal of providing the Vavoua traps, Martine Roques, Solange Medical Entomology, 2011, 48, 656-668. Vermot and Sonia Gounaud for their technical assis- FOIL L.D. & HOGSETTE J.A. Biology and control of tabanids, tance. stable flies and horn flies. Scientific and Technical Review of the Office International des Epizooties, 1994, 13, 1125-1158. GADELHAK G.G., PEDIBHOTLA V.K., ROSARIO R.M.T., THOMAS REFERENCES G.D. & STANLEY-SAMUELSON D.W. The influence of blood meals on accumulation of arachidonic acid by adult stable AGUIAR-VALGODE M. & MILWARD-DE-AZEVEDO E.M.V. Determi- flies. Comparative Biochemistry and Physiology, 1995, nacao das exigências térmicas de Stomoxys calcitrans 110B, 613-621. (L.) (Diptera, Muscidae), em condicöes de laboratório. GEDEN C.J. & HOGSETTE J.A. Research and extension needs [Portuguese]. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 1992, for integrated pest management for arthropods of veteri- 87, 11-20. nary importance. Proceedings of a Workshop in Lincoln, ANDERSON J.R. Mating behavior of Stomoxys calcitrans: Nebraska, 1994, 56-64. Effects of a blood meal on the mating drive of males and GILLES J., DAVID J.-F. & DUVALLET G. Temperature effects on its necessity as a prerequisite for proper insemination development and survival of two stable flies, Stomoxys of females. Journal of Economic Entomology, 1978, 71, calcitrans and Stomoxys niger niger (Diptera: Muscidae), 379-386. in La Reunion Island. Journal of Medical Entomology, ASHRAFI S.H. The cultivation and nutritional requirements of 2005a, 42, 260-265. Stomoxys calcitrans. Bulletin of the World Health Organi- GILLES J., DAVID J.-F. & DUVALLET G. Effects of temperature on zation, 1964, 31, 519-520. the rate of increase of Stomoxys calcitrans and Stomoxys BERESFORD D.V. & SUTCLIFFE J.F. The effect of Macrocheles niger niger (Diptera: Muscidae) from La Reunion Island. muscaedomesticae and M. subbadius (Acarina: Macro- Journal of Medical Entomology, 2005b, 42, 959-965. chelidae) phoresy on the dispersal of Stomoxys calcitrans GILLES J., DAVID J.-F., DUVALLET G., DE LA ROCQUE S. & TILLARD (Diptera: Muscidae). Systematic & Applied Acarology Spe- E. Efficiency of traps for Stomoxys calcitrans and Stomoxys cial Publications, 2009, 23, 1-30. niger niger on Reunion Island. Medical and Veterinary BERKEBILE D.R., WEINHOLD A.P. & TAYLOR D.B. A new method Entomology, 2007, 21, 65-69. for collecting clean stable fly (Diptera: Muscidae) pupae GOODHUE L.D. & CANTREL K.E. The use of vermiculite in of known age. Southwestern Entomologist, 2009, 34, medium for stable fly larvae. Journal of Economic Ento- 469-476. mology, 1958, 51, 250. BERRY I.L., STAGE D.A. & CAMPBELL J.B. Populations and eco- HOGSETTE J.A. & FARKAS R. Secretophagous and hemato- nomic impacts of stable flies on cattle. Transactions of the phagous higher Diptera. Contributions to a Manual of ASAE, 1983, 873-877. Palaearectic Diptera, 2000, 1, 769-792. BROCE A.B., HOGSETTE J. & PAISLEY S. Winter feeding sites HOGSETTE J.A., RUFF J.P. & JONES C.J. Stable fly biology and of hay in round bales as major developmental sites of control in Northwest Florida. Journal of Agricultural Ento- Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) in pastures in mology, 1987, 4, 1-11. spring and summer. Journal of Economic Entomology, KAPLAN E.L. & MEIER P. Nonparametric estimation from incom- 2005, 98, 2307-2312. plete observations. Journal of the American Statistical BRUCE W.N. & DECKER G.C. The relationship of stable fly Association, 1958, 53, 457-481. abundance to milk production in dairy cattle. Journal of LAVEISSIÈRE C. & GRÉBAUT P. Recherche sur les pièges à glos- Economic Entomology, 1958, 52, 269-274. sine (Diptera : Glossinidae). Mise au point d’un modèle CHRISTMAS P.E. Laboratory rearing of the biting fly Stomoxys économique : le piège Vavoua [French]. Tropical Medicine calcitrans (Diptera: Muscidae). New Zealand Entomologist, and Parasitology, 1990, 41, 185-192. 1970, 4, 45-49. LEUCUŢA D.C. & ACHIMAȘ CADARIU A. Statistical graphical user CORTINAS R. & JONES C.J. Ectoparasites of cattle and small interface plug-in for survival analysis in R statistical and ruminants. Veterinary Clinics Food Animal Practice, 2006, graphics language and environment. Applied Medical 22, 673-693. Informatics, 2008, 23, 57-62.

Parasite, 2012, 19, 309-317 316 Original contribution Chapitre II- Biologie - article 1 50 FEEDING AND BREEDING ASPECTS OF STOMOXYS CALCITRANS

LIÉNARD E., SALEM A., GRISEZ C., PRÉVOT F., BERGEAUD J.P., FRANC Stomoxys calcitrans. Journal of Comparative Physiology, M., GOTTSTEIN B., ALZIEU J.P., LAGALISSED Y. & JACQUIET P. 1982, 147, 49-52. A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and WEBER A.F., MOON R.D., SORENSEN D.K., BATES D.W., MEISKE seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy J.C., BROWN C.A., ROHLAND N.L., HOOKER E.C. & STRAND cattle farm of southwest France. Veterinary Parasitology, W.O. Evaluation of the stable fly (Stomoxys calcitrans) as 2011, 177, 20-27. a vector of enzootic bovine leukosis. American Journal LYSYK T.J. Relationships between temperature and life-history of Veterinary Research, 1988, 49, 1543-1549. parameters of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). XUE R., BARNARD D.R. & MULLER G.C. Effects of body size and Journal of Medical Entomology, 1998, 35, 107-119. nutritional regimen on survival in adult Aedes albopictus MEYER J.A. & PETERSEN J.J. Characterization and seasonal dis- (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology, 2010, tribution of breeding sites of stable flies and house flies 47, 778-782. (Diptera: Muscidae) on eastern Nebraska feedlots and dai- YERUHAM I. & BRAVERMAN Y. Skin lesions in dogs, horses and ries. Journal of Economic Entomology, 1983, 76, 103-108. calves caused by the stable fly Stomoxys calcitrans (L.) MOOBOLA S.M. & CUPP E.W. Ovarian development in the (Diptera: Muscidae). Revue d’Élevage et de Médecine Vété- stable fly, Stomoxys calcitrans, in relation to diet and rinaire des Pays Tropicaux, 1995, 48, 347-349. juvenile hormone control. Parasitological Entomology, ZUMPT F. The Stomoxyinae biting flies of the world. 1978, 3, 317-321. Taxonomy, biology, economic importance and control POTGIETER F.T., SUTHERLAND B. & BIGGS H.C. Attempts to measures. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany, transmit Anaplasma marginale with Hippobosca rufipes 1973. and Stomoxys calcitrans. Journal of Veterinary Research, Received on March 19th, 2012 1981, 48, 119-122. Accepted on June 26th, 2012 RODRÍGUEZ-BATISTA B.Z. & LEITE R.C. Ocurrence of biological vectors of Dermatobia hominis (L. Jr., 1781) (Diptera: Cuterebridae), captured by Magoom trap in the metal- lurgic region, Minas Gerais, Brazil. Ciência Rural Journal, 1997, 27, 645-649. RODRÍGUEZ-BATISTA B.Z., LEITE R.C., OLIVEIRA P.R., LOPES C.M.L. & BORGES L.M.F. Populational dynamics of Stomoxys calci- trans (Linneaus) (Diptera: Muscidae) in three biocenosis, Minas Gerais, Brazil. Veterinary Parasitology, 2005, 130, 343-346. SCHOOF H.F. Laboratory culture of Musca, Fannia, and Sto- moxys. Bulletin of the World Health Organization, 1964, 31, 539-544. SMITH C.W. & HANSENS E.J. The effect of temperature and humidity on the amount of blood ingested by the stable fly, Stomoxys calcitrans L. (Diptera: Muscidae). Journal of the New York Entomological Society, 1975, 83, 235-240. SMITH J.P., HALL R.D. & THOMAS G.D. A review of natural mor- tality and enemies of the stable fly (Diptera: Muscidae) in Missouri. The Florida Entomologist, 1989, 72, 351-360. SUTHERLAND B. The temperature preferences of the motile stages of Stomoxys calcitrans Linnaeus (Diptera: Mus- cidae). Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 1980, 47, 7-11. TAYLOR D.B., MOON R.G. & MARK D.R. Economic impact of stable flies (Diptera: Muscidae) on dairy and beef cattle production. Journal of Medical Entomology, 2012, 49, 198-209. TURELL M.J. & KNUDSON G.B. Mechanical transmission of Bacillus anthracis by stable flies (Stomoxys calcitrans) and mosquitoes (Aedes aegypti and Aedes taeniorhyn- chus). Infection and Immunity, 1987, 55, 1859-1861. VENKATESH K. & MORRISON P.E. Some aspects of oogenesis in the stable fly Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). Journal of Insect Physiology, 1980, 26, 711-715. VENKATESH K. & MORRISON P.E. Blood meal as a regulator of triacylglycerol synthesis in the haematophagous stable fly,

Parasite, 2012, 19, 309-317 Original contribution 317 Chapitre II- Biologie - article 1 51 SALEM A. 2012

4- Dynamique des populations de Stomoxys calcitrans

4-1- Sites de ponte, recherche des hôtes et prise alimentaire Certaines substances comme les végétaux fermentés et les fumiers attirent spécifiquement les femelles de S. calcitrans qui viennent alors y déposer leurs œufs. Cela constitue un milieu favorable pour les larves au moment de leur éclosion. Jeanbourquin & Guerin (2007) ont étudié les facteurs olfactifs qui pourraient intervenir dans le choix des sites de ponte des stomoxes. La dégradation des glucides, des lipides et des protéines grâce à l'activité microbienne libère des composés volatils dont le dioxyde de carbone (CO2), qui attirent les stomoxes (Vale, 1980; Mihok et al., 1996). L’odeur des matières fécales de cheval ou de vache est suffisante pour attirer les stomoxes pour la ponte. Toutefois, lorsque Stomoxys calcitrans a le choix entre ces deux substrats, les mouches choisissent plutôt le crottin de cheval que la bouse de vache. Des niveaux de dioxyde de carbone plus élevés ont été enregistrés dans le crottin de cheval par rapport à la bouse de vache, c’est un facteur qui peut contribuer à la préférence manifestée par S. calcitrans pour ce substrat de ponte (Jeanbourquin & Guerin, 2007). Les principaux composés chimiques attractifs dans les deux substrats sont les acides carboxyliques (acide butanoïque), des alcools (oct-1-en-3-ol), des aldéhydes (décanal), des cétones (octan-3-one), des phénols (p-crésol), des indoles (scatole), des terpènes (ß-caryophyllène), des sulfures (diméthyl trisulfure) et l’acide valérianique, tous ces composés stimulant le dépôt des œufs de Stomoxys calcitrans (Leroy, 1987; Jeanbourquin & Guerin, 2007). Stomoxys calcitrans est sensible à certaines émanations volatiles de son hôte et c’est par le biais d’une communication chimique que cet ectoparasite peut se déplacer pour retrouver son hôte de préférence. L’étude de Birkett et al. (2004) a montré que l'attractivité différentielle naturelle des troupeaux de génisses d’Holstein-Freisian pour les mouches du bétail ; Musca autumnalis, Haematobia irritans, Hydrotaea irritans, Wohlfahrtia magnifica et Stomoxys calcitrans était due- en partie - à des différences dans les écomones volatils émis par l'hôte. Plusieurs auteurs ont signalé les réponses comportementales et électro-physiologiques de Stomoxys calcitrans aux composants de l’odeur de l’hôte, comme les émissions de CO2, d'acétone, du 1-octène-3-ol, du 3-méthylphénol et différents alcools (Warnes & Finlayson, 1985; 1986; Holloway & Phelps, 1991; Mihok et al., 1995; Schofield et al., 1995; Schofield et al., 1997). Des tests ont été réalisés par Alzogaray & Carlson (2000) avec différentes odeurs:

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations 52

SALEM A. 2012

La peau de la main et l’expiration humaine, CO2 et une analogue d’acide lactique. L’odeur produite par la peau de l’homme avait attiré 15% des femelles de S. calcitrans.

4-2- Matériels et méthodes - le piège Vavoua Notre étude de la dynamique des populations de Stomoxys calcitrans sur le site de l’ENVT a été réalisée du 01 janvier au 31 décembre 2009. Le piège Vavoua (Laveissière & Grébaut, 1990) (Figure 32) est le piège utilisé pour le suivi des populations de stomoxes. Il est dérivé des pièges pyramidaux et biconiques mis au point en Afrique de l'Ouest pour le contrôle de la mouche tsé-tsé (Challier & Laveissière, 1973), mais il est maintenant largement utilisé pour la capture des stomoxes (Holloway & Phelps 1991; Milhok et al., 1995; Gilles et al., 2005a, 2007). Lors d'une étude comparative entre différents pièges, le piège Vavoua s'est avéré être le plus efficace dans la capture de stomoxes à La Réunion (Gilles et al., 2007). Au Gabon, Mavoungou et al. (2008) ont démontré que les stomoxes représentaient plus de 73 % des insectes capturés, ce piège apparait donc relativement spécifique. De plus, contrairement aux pièges à colle qui entraînent un noircissement de la cuticule, le piège Vavoua facilite la détermination spécifique, le sexage des stomoxes capturés et même l’établissement de colonies de laboratoire à partir des mouches piégées. Enfin, ce piège a une efficacité constante au cours du temps et il demande peu d'entretien. Le piège Vavoua comprend trois écrans radiaux cousus à 120°, de couleur bleu phtalogène (la partie externe, 75 X 30 cm) et noir (la partie interne, 75 X 15 cm). Les stomoxes sont attirés par le bleu phtalogène, se posent sur le tissu noir à l’intérieur du piège et sont capturés par le récipient fixé à l’extrémité du cône de tulle moustiquaire lorsqu’ils s’envolent. Les adultes de Stomoxys calcitrans volent à 2 ou 3 pieds au-dessus du sol, et sont attirés par les couleurs sombres (Hansens, 1951). Le piège doit donc être bien en évidence dans une prairie et placé au soleil pour que la couleur bleue phtalogène soit la plus efficace possible.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations 53

SALEM A. 2012

Figure 32: Piège mono-conique « Vavoua » de Laveissière (Les glossines. Guide de formation et d'information. Série Lutte antivectorielle 1988, Image modifié d’après Cuisance et al. 1994)

La station météorologique de l’aéroport de Toulouse-Blagnac, située à moins de deux kilomètres des sites de piégeage, a fourni un certain nombre de paramètres climatiques durant l’étude: - les températures minimale et maximale sur la période de dépôt des pièges (de 7h à 18h). - un relevé de températures disponibles sur le site météo: www.infoclimat.fr, toutes les 2 heures, de 7h à 18h, permettant d’évaluer une température moyenne sur toute la période de temps où les pièges étaient mis en place. - un relevé de l’humidité relative (%) toutes les 2 heures disponibles, de 7h à 18h, permettant d’effectuer une moyenne la plus représentative sur toute la période de temps où les pièges étaient mis en place. - les précipitations en millimètres par tranche d’heures, à partir de laquelle nous calculons la pluviométrie quotidienne. - un relevé de la vitesse du vent (km/h) toutes les 2 heures, de 7h à 18h, permettant d’effectuer une moyenne à la fin de la journée. Ces données étaient disponibles sur toute la période d’étude.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations 54

SALEM A. 2012

Article 2

Population dynamics of Stomoxys calcitrans (Linneaus) (Diptera: Muscidae) in the South -West of France

(En préparation)

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 55

SALEM A. 2012

Title: Population dynamics of Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae) in the South - West of France.

Authors: Salem A.1, Rouet D.1, Liénard E.1, Franc M.1, Jacquiet P.1*

Addresses: 1: Laboratoire de Parasitologie, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Université de Toulouse, 23, Chemin des Capelles. BP 87 614, 31 076 Toulouse Cedex 03, France.

*Corresponding author: P. Jacquiet

To be submitted to Journal of Economic Entomology, 2012

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 56

SALEM A. 2012

Abstract:

The seasonal dynamics of a Stomoxys calcitrans population was evaluated, using Vavoua traps, in a semi-urban area located in the South-West of France (campus of the National Veterinary School of Toulouse). Differential host attractiveness was checked as the campus provide horses and cattle-sheep paddocks. A bimodal pattern of stable fly population dynamics was observed, the two peaks occurring in early summer and in autumn. Stable fly activity was inexistent in winter and very low during summer when reduced precipitations, low relative humidity and high temperatures probably inhibit the developmental stages and increase the adult mortality. Minimal daily temperature variations explained about 40% of the variation of capture levels in the traps and a minimal value of 15°C is necessary to observe significant stable fly activity. No differential host attractiveness was recorded during the whole study excepted during summer when horses seem to attract more stable flies than cattle. The long duration of stable fly activity in this area (a total of eight months during the year) makes the control of this pest difficult.

Key words: Stomoxys calcitrans, stable fly, population dynamics, climate, horse, cattle.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 57

SALEM A. 2012

Introduction

Stable flies, Stomoxys calcitrans (L.) are among the most important arthropod pests of livestock worldwide. Stable flies affect cattle and horses in a variety of ways. High levels of biting activity lead to substantial reductions in cattle weight gains and milk productions (Campbell et al., 2001; Taylor et al., 2012). Furthermore, these flies may mechanically transmit various pathogens as Besnoitia besnoiti or West Nile Virus (Bigalke, 1968; Doyle et al., 2011), two emergent diseases in the South of France in cattle and horses respectively (EFSA 2010; Durand et al., 2002). Limited data on stable flies population dynamics are available in some countries such as Denmark (Skovgard and Nachman, 2012), New Zealand (Heath, 2002), Brazil (Rodriguez-Batista et al., 2005), Ethiopia (Sinshaw et al., 2006) or Thaïland (Masmeatathip et al., 2006) whereas more detailed studies have been carried out in La Réunion Island in the Indian Ocean (Gilles, 2005) or in the U.S (Taylor et al., 2007). All these studies highlight the role of climatic factors such as temperatures, relative humidity and rainfalls in the dynamics of stable fly populations. In our knowledge, despite their economic importance, no study on the dynamics of S. calcitrans populations has been performed in the South West of Europe. To control vector populations and reduce their pathogenic and economic importance, knowledge of their ecology and biology is necessary. Threrefore, a research project has been set up in the South-West of France (Toulouse, Midi-Pyrénées region) : 1) to determine the seasonal dynamics of stable fly populations and the periods of maximal fly activity, 2) to evaluate the role of climatic parameters on this dynamics and 3) to assess the relative attractinevess of horses and cattle in field conditions.

Materials and methods

Study area A stable fly seasonal survey based upon adult trapping was conducted at the National Veterinary School of Toulouse (NVST), located in a semi-urban area, close to the Toulouse- Blagnac Airport, South-West France (43°36'N; 1°26'E; 189 m a.s.l). In this area, the year could be divided into four seasons: winter from January to March, spring from April to June, summer from July to September and fall from October to December. Usually, maximal rainfalls are observed in spring and autumn, hot temperatures and absence of rains characterize the summers of this area.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 58

SALEM A. 2012

Winter conditions are not highly severe in the South West of France as minimal temperatures rarely decrease below 0°C. Climate data were obtained from Meteo France (Toulouse- Blagnac Airport Station, located at two kilometers from the study area). Mean, minimal and maximal daily temperatures, relative humidity; daily rainfall and wind speed were monitored each trapping day during the whole survey. Appreciatively one-quarter of the NVST property is composed of pasturelands which are equally divided into horses and cattle-sheep paddocks (about ten horses in one hand and twelve cattle and around 100 ewes in the other hand). Minimal distances between cattle-sheep and horses paddocks are 50 m. Cattle-sheep and horses paddocks contain feeding sites of hay in round bales. A manure area close to the cattle hospital center, 300 m apart from the paddocks, is available on the NVST site.

Traps and experimental design Vavoua traps were used in this study. According to Gilles et al. (2007), this phtalogen blue cloth trap is highly efficient for studying the dynamics of stable fly populations. In 2009, a total of five Vavoua traps were placed: two traps in proximity to horses’ paddocks, and three traps near cattle-sheep paddocks. These traps were installed at least 50 m from each other. A sixth trap was located close to the manure area. These three locations were chosen to evaluate i) the respective attractiveness of horses and cattle-sheep, and ii) to monitor adult emergence from the cattle manure (sixth trap). Traps were placed weekly from the beginning of January (W1: week 1) to the end of December (W52). Within each week, the trapping day was chosen to avoid wind and rains as Vavoua traps are known to catch very few stable flies under these climatic conditions. On each trapping day, traps were installed early in the morning (7: 30 am) and removed in the evening (6: 30 pm) as the stable fly activity is known to be diurnal. All flies captured in the traps were killed (- 80°C, 10 minutes), then stable flies were identified according to Zumpt et al. (1973) and counted trap by trap. Apparent densities per trap were calculated for horse paddocks traps (total of the captures in two traps divided by two), cattle-sheep paddocks (total of the captures in three traps divided by three) and manure.

Data analysis Correlations between apparent densities and climatic parameters (minimal, maximal and mean daily temperatures, relative humidity and wind speed) were evaluated by multiple correlation analysis (Systat software, v9.0). Apparent densities between horses and cattle- sheep traps were compared by variance analysis with repeated data (Systat software v9.0).

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 59

SALEM A. 2012

Results

Climatic parameters

The main climatic parameters recorded at the Toulouse-Blagnac Airport during 2009 are summarized in Figures 1 and 2. Minimal, maximal and mean daily temperatures during trapping days increased gradually from week 0 to week 37 then declined until W51. The annual mean of minimal temperatures in 2009 was 9.6°C whereas the annual mean of minimal temperatures for the three decades (1981-2010) was 9.1°C. In the same vein, the annual mean of maximal temperatures in 2009 was 19.2°C (18.5°C for the three decades mentioned above). The total rainfalls in 2009 reached 586 mm which is close to the annual mean of rainfalls calculated for the three decades (638 mm). The rainfalls were irregularly distributed during the year with two peaks, in spring (April, W13 to W16) and in the late fall (November and December, W45 to W52). Summer 2009 (W27 to W37) was characterized by high temperatures (above 25°C), low relative humidity (less than 40%) and scarce rainfalls (below 40 mm per month). As windy days were avoided for trapping, the mean +/- SD of the wind speed recorded during the trapping days was 15 km/h +/- 7 and the maximal value was 30 km/h.

Population fluctuations

The weekly captures with Vavoua traps, located at proximity of horses and cattle/sheep paddocks respectively, are shown in Figure 3. No significant captures were observed from week 1 to week 16 (late April) and during weeks 51 and 52 (late December). Populations increased rapidly in May to reach more than 30 stable flies per trap and per day at the end of May. During this period, apparent densities were similar in traps located at proximity of horses and cattle/sheep paddocks. Thereafter, the apparent densities diverged according to the host species at proximity of the traps, with a discontinuous but significant increase from W24 to W30 (end of July) for traps close to horses and a slight decrease observed in cattle/sheep traps during this period. Very low numbers of captured stable flies were recorded in summer (from W30 to W45) in cattle/sheep traps. Captures in horse’s traps were low but slightly higher than in catle/sheep traps.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 60

SALEM A. 2012

This period (W30 to W45) corresponded to high temperatures, low relative humidity and absence of rains. A second peak of stable fly activity was shown in autumn (late November) in both kinds of traps. This peak exceeded the early summer peak for cattle/sheep traps and reached the values observed at this period in horse’s traps. At the beginning of winter, very low values of captures (W49-W50) or no captures at all (W51-W52) succeeded rapidly to the second peak. Finally, substantial stable fly activity was recorded during eight months in the campus of the Veterinary School of Toulouse. Apparent densities observed in cattle/sheep traps in one hand and in horse’s traps in the other hand were not significantly different excepted during the period W25 to W36 (P < 0.001). Multiple correlations analyses showed that apparent densities were significantly correlated with temperatures (adjusted R2 values of 0.39, 0.23 and 0.255 for minimal, maximal and mean temperatures respectively) whereas no significant correlations were found with relative humidity or wind speed. Minimal temperatures seemed to be a determinant factor for stable fly activity explaining about 40% of the variability of the total number of captured stable flies in Vavoua traps. Apparent densities recorded in the traps closely located to manure were dedicated to evaluate the seasonal pattern of emergence of adult stable flies. Stable fly emergences from manure were observed from W21 to W50 with two peaks in early summer and several smaller ones in fall. It is noteworthy that very low values were shown in summer during the hot and dry period.

Discussion

One of the most striking results of this study is the bimodal pattern of stable fly activity in the climatic conditions of the South West of France. Similar bimodal pattern has been observed in Eastern Nebraska (Taylor et al., 2007) whereas unimodal patterns have been recorded in tropical countries where a succession of rainy and dry seasons occurs (Masmeatathip et al., 2006; Sinshaw et al., 2006) or in the North of Europe (Skovgard and Nachmann, 2012) where a long and harsh winter likely inhibits any larval development and adult fly activity. Temperatures and precipitations seem to account for most of the variation observed in stable fly activity measured by Vavoua traps. During winter, minimal temperatures are too low to permit larval development and adult fly activity. It is noteworthy that the minimal daily temperature should reach 15°C to observe significant captures in the traps.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 61

SALEM A. 2012

Furthermore, high temperatures (above 30°C) and very low precipitations (below 40 mm per month) during the hot and dry summer probably induce increased mortality of developmental stages and adult flies as well as decreased females’ fecundity (Lysyk, 1998; Gilles et al., 2005; Mullens and Peterson, 2005). Finally two periods of the year provide adequate conditions for both larval development and adult fly activity which explains the bimodal pattern of stable fly activity. However, autumn stable fly populations are more variable than spring and early summer populations, some high peaks of activity are preceded and followed by periods without any captures. This was similarly observed in Nebraska (Taylor et al., 2007) and in a previous study in the Pyrenees mountains (Liénard et al., 2011). It seems that stable flies are highly adaptable, exploiting any favourable climatic conditions between spring and late autumn. In this study, significant emergences occurred during 30 weeks from late spring to late autumn with high variations especially in early summer. Very low values observed in summer are likely due to hot and dry climatic conditions avoiding any important larval development (Lysyk, 1998). Emergences could occur also in the feeding sites of hay in paddocks as observed by Broce et al., (2005) but these sites were not investigated in this study. To evaluate the differential host attractiveness was the second objective of this study. Taking the total duration of the study into account, there is no significant difference of apparent densities between traps located at proximity of cattle/sheep or horses. However, a tendency was observed in summer, indicating that horses could be more attractive than cattle. Nevertheless, our experimental design probably lacks power to address this question and further investigations are necessary before concluding. Finally, the long period of stable fly activity (eight months in this study) makes the control of this pest difficult. Transmission of diseases such as bovine besnoitiosis is clearly associated with stable fly activity in the South West of France (Liénard et al., 2011). It appears difficult to protect cattle from fly bites during a so long period for obvious cost and environmental purposes; therefore, vector control measures should focus during high activity periods in late spring and autumn.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 62

SALEM A. 2012

References

Bigalke R.D. (1968) New concepts on the epidemiological features of bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field investigations. Onderstepoort J. Vet. Res., 35, 3- 137.

Broce A.B., Hogsette J., Paisley S. (2005) Winter feeding sites of hay in round bales as major developmental sites of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) in pastures in spring and summer. J Econ Entomol., 98(6):2307-12.

Campbell J.B., Skoda S.R., Berkerile D.R., Boxler D.J., Thomas G.D., Adams D.C., Davis R. (2001) Effects of stable flies (Diptera: Oestridae) on weight gains of grazing yearling cattle. J. Econ. Entomol., 94: 780-783.

Doyle M.S., Swope B.N., Hogsette J.A., Burkhalter K.L., Savage H.M., Nasci R.S. (2011) Vector competence of the stable fly (Diptera: Muscidae) for West Nile Virus. J. Med. Entomol., 48: 656-668.

Durand B., Chevalier V., Pouillot R., Labie J., Marendat I., Murgue B., Zeller H., Zientara S. (2002) West Nile Virus outbreak in horses, Southern France, 2000: results of a serosurvey. Emerg. Inf. Dis., 8(8): 777-782.

EFSA (2010) Bovine besnoitiosis: an emerging disease in Europe. Scientific statement on bovine besnoitiosis of the European Food Safety Authority. EFSA Journal, 8: 1499.

Gilles J. (2005) Dynamique et génétique des populations d’insectes vecteurs. Les stomoxes, Stomoxys calcitrans et Stomoxys niger niger dans les élevages bovins réunionnais. PhD Thesis, University of La Réunion, 140pp.

Gilles J., David J.F., Duvallet G., De La Rocque S., Tillard E. (2007) Efficiency of traps for Stomoxys calcitrans and Stomoxys niger niger on Reunion Island. Med. Vet. Entomol., 21: 65-69.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 63

SALEM A. 2012

Heath A.C.G. (2002) Distribution, seasonality and relative abundance of Stomoxys calcitrans (stable fly)(Diptera: Muscidae) in New Zealand. N.Z. Vet. J., 50(3): 93-98.

Liénard E., Salem A., Grisez C., Prevot F., Bergeaud J.P., Franc M., Gottstein B., Alzieu J.P., Lagalisse Y., Jacquiet P. (2011) A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France. Vet. Parasitol. 177: 20-27.

Lysik T.J. (1998) Relationship between temperature and life-history parameters of Stomoxys calcitrans (Diptera: Oestridae). J. Med. Entomol. 35: 107-119.

Masmeatathip R., Gilles J., Ketavan C., Duvallet G. (2006) First survey of seasonal abundance and daily activity of Stomoxys spp. (Diptera: Muscidae) in Kamphaengsaen Campus, Nakornpathorn province, Thailand. Parasite, 13(3): 245-250.

Mullens B.A., Peterson N.G. (2005) Relationship between rainfall and stable fly (Diptera : Muscidae) abundance on California dairies. J. Med. Entomol., 42: 705-708.

Rodriguez-Batista Z., Leite R.C., Oliveira P.R., Lopes C.M.L., Borges L.M.F. (2005) Populational dynamics of Stomoxys calcitrans (Linneaus)(Diptera: Muscidae) in three biocenosis, Minas Gerais, Brazil. Vet. Parasitol., 130: 343-346.

Sinshaw A., Abebe G., Desquesnes M., Yoni W. (2006) Biting flies and Trypanosoma vivax infection in three highland districts bordering lake Tana, Ethiopia. Vet. Parasitol., 142: 35-46.

Skovgård H., Nachman G. (2012) Population dynamics of stable flies Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) at an organic dairy farm in Denmark based on mark-recapture with destructive sub-sampling. Environ. Entomol., 41(1):20-29

Taylor D.B., Berkebile D.R., Scholl P.J. (2007) Stable fly population dynamics in eastern Nebraska in relation to climatic variables. J. Med. Entomol., 44(5):765-771.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 64

SALEM A. 2012

Taylor D.B., Moon R.D., Mark D.R. (2012) Economic impact of stable flies (Diptera: Muscidae) on dairy and beef cattle production. J. Med. Entomol. 49(1): 198-209.

Zumpt F. (1973) The Stomoxyine biting flies of the world. Taxonomy, biology, economic importance and control measures. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 175 pp.

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 65

SALEM A. 2012

Captions of figures

Figure 1: Minimal, maximal and mean temperatures in the study site during the year 2009 (source Toulouse-Blagnac Airport).

Figure 2: Monthly total rainfalls (mm) and percentage of relative humidity in the study site during the year 2009 (source Toulouse-Blagnac Airport).

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 66

SALEM A. 2012

Figure 3: Apparent densities (AD) per trap according to the location of traps: traps closely located to horses (in blue) and cattle pastures (in yellow). X axis is the period of the year (from week 1 in January to week 52 at the end of December).

Figure 4: Apparent density (AD) observed for the trap closely located to the cattle manure. X axis is the period of the year (from week 1 in January to week 52 at the end of December).

Chapitre II- Biologie - dynamique des populations - article 2 67

SALEM A. 2012

Chapitre III

Implications de Stomoxys calcitrans dans la transmission de la besnoitiose bovine

Chapitre III- Rôle vecteur 68

SALEM A. 2012

Ce chapitre III est consacré à l’étude des capacités vectorielles de S. calcitrans pour Besnoitia besnoiti Henry, 1913 (Aplicomplexa : Sarcocystidae), protozoaire responsable de la besnoitiose bovine. Outre la spoliation sanguine directe et la perturbation des animaux (Dougherty et al., 1995; Taylor et al., 2012), S. calcitrans est une espèce vectrice avérée ou supposée de nombreux agents pathogènes comme nous l’avons présenté dans l’introduction de nos travaux. Parmi les protozoaires possiblement vectorisés par cet insecte, Besnoitia besnoiti Henry, 1913 revêt un intérêt particulier. Ce protiste de type coccidie appartient à la famille des Sarcocystidae. Il est proche de Toxoplasma gondii et de Neospora caninum (Basso et al., 2011). L’importance de la besnoitiose bovine est double. Elle est médicale du fait de la mortalité qu’elle peut entrainer principalement dans les zones d’extension récente (jusqu’à 10% d’un cheptel) et économique par la morbidité, le coût des traitements malheureusement inefficaces en phase chronique et par la non-valeur économiques des animaux en phase chronique. Cette maladie, également appelée éléphantiasis ou anasarque, est largement présente en Afrique, en Asie et dans le sud-ouest de l'Europe. En France, l’aire de répartition de la besnoitiose était autrefois très limitée dans les hautes vallées de l’Ariège et de l’Aude et dans le Sud-ouest de la France jusqu’à la fin des années 90 (Alzieu et al., 2007). Elle est en expansion en France vers le Centre et le Grand Ouest, en Espagne et au Portugal (Jacquiet et al., 2010) et des foyers ont été très récemment signalés en Allemagne (Mehlhorn et al., 2009; Schares et al., 2009) et en Italie (Gentile et al., 2012). Cette expansion demeure mal expliquée d’autant plus que le cycle évolutif n’est pas totalement connu. Les bovins sont des hôtes intermédiaires mais l’hôte définitif n’a pas encore été identifié (Diesing et al., 1988; Basso et al., 2011). Chez les bovins (hôte intermédiaire) nouvellement contaminés, ce parasite se localise dans un premier temps dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins et les macrophages où il se multiple activement sous la forme de tachyzoïtes. C’est la phase de parasitémie ou phase aiguë de la maladie pendant laquelle est observée une poussée fébrile (41 à 42°C) durant deux à 10 jours. Le jetage et l’épiphora sont marqués. Progressivement, la température redevient normale. Des œdèmes de la tête, du fanon, de l’extrémité des membres, du scrotum et en régions déclives se développent et persistent pendant une à deux semaines. La respiration est alors bruyante et la marche douloureuse. Puis, progressivement apparait la phase de sclérodermie, stade ultime de la maladie. La peau est épaissie, présente de l’hyperkératose, des crevasses et des escarres.

Chapitre III- Rôle vecteur 69

SALEM A. 2012

Des centaines de kystes contenant des milliers de bradyzoïtes se développent dans diverses cellules des muqueuses, dans la conjonctive, du tissu sous cutané et intermusculaire (fibroblastes) et parfois dans tout l’organisme (rate, cœur, reins, testicules…). Ils persistent plusieurs mois à plusieurs années. Cliniquement, la besnoitiose évolue en trois phases : une brève poussée fébrile, la phase des œdèmes et la phase de sclérodermie. Les sources possibles de parasites sont alors soit le sang avec les tachyzoïtes (phase aiguë) soit le derme avec les kystes à bradyzoïtes (phase chronique). Seule une faible proportion des animaux exposés et infectés développent cliniquement l’ensemble du cortège des symptômes. Nombreux sont les animaux qui demeurent asymptomatiques et séropositifs. D’autres encore peuvent présenter des kystes alors même que la phase aiguë et celle des œdèmes n’ont pas été clairement observées ou diagnostiquées. La présence de ces kystes dermiques constitue une originalité importante de la besnoitiose. La transmission vectorielle de bovin à bovin est probablement la voie la plus commune d’infection notamment par piqûres d’insectes hématophages comme les Tabanidés, les Stomoxyinés ou les Hippoboscidés. D’après Bigalke (1968), les Tabanidés seraient les vecteurs les plus efficaces de la besnoitiose : trois piqûres de Tabanus taeniola seraient suffisantes pour transmettre ce parasite d’un bovin à un autre quand des centaines de stomoxes seraient requis. Tout animal infecté en phase de parasitémie (Cuillé et al., 1936) ou porteur de kystes cutanés peut donc être une source potentielle de contamination à l’intérieur d’un même troupeau et il peut être à l’origine d’un nouveau foyer s’il est introduit dans une zone indemne. Face à l’expansion de la besnoitiose nous avons tout d’abord recherché si un lien existait entre la présence des stomoxes et l’incidence des cas cliniques de besnoitiose et les séroconversions dans un élevage laitier situé en zone d’endémie. Cette enquête a été conduite de mars 2008 à mai 2009. Le compte rendu de l’étude a fait l’objet d’une publication dans Veterinary Parasitology (article 3) sous le titre: « A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France ». Du fait de la méconnaissance des modes de contaminations, nous avons exploré la capacité de transmission de B. besnoiti par les stomoxes, renouvelant les études de Bigalke (1968) en les combinant avec des moyens modernes de détection (PCR quantitative). Toutefois, à la différence de Bigalke (1968), nous avons étudié uniquement le portage du parasite par S. calcitrans sans rechercher à reproduire la maladie chez un hôte réceptif.

Chapitre III- Rôle vecteur 70

SALEM A. 2012

Nous avons utilisé comme sources de parasites soit des tachyzoïtes cultivés sur cellules Véro dans notre laboratoire (souche isolée à partir d’un bovin de l’Ariège) soit des bradyzoïtes provenant d’une génisse en phase chronique de la maladie (sclérodermie). Nous avons mis au point un protocole d’essai de transmission depuis ces sources à un récepteur artificiel constitué d’un nourrisseur en verre dans lequel est introduit du sang d’une génisse indemne de besnoitiose élevée à l’ENVT. Dans un premier temps nous voulions simplement vérifier si les stomoxes pouvaient transmettre le parasite ou son ADN après s’être nourri soit sur un nourrisseur contenant du sang contaminé soit sur un bovin contaminé en phase de sclérodermie. Les méthodes mises en œuvre et les premiers résultats font l’objet d’un article (article 4) publié en Parasitology Research et intitulé: « Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) to transmit Besnoitia besnoiti (Henry, 1913) (Apicomplexa: Sarcocystidae ». Les résultats obtenus dans ces essais devraient être confirmés par des études complémentaires qui démontrant l’infection d’animaux receveurs.

Chapitre III- Rôle vecteur 71

SALEM A. 2012

Article 3

A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France

(Veterinary Parasitology, 2011, 177: 20-27)

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 72

Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27

Contents lists available at ScienceDirect

Veterinary Parasitology

journal homepage: www.elsevier.com/locate/vetpar

A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France

E. Liénard a, A. Salem a, C. Grisez a, F. Prévot a, J.P. Bergeaud a, M. Franc a, B. Gottstein b, J.P. Alzieu c, Y. Lagalisse d, P. Jacquiet a,∗ a Laboratoire de Parasitologie, Ecole Nationale Vétérinaire, BP 87 614, 31 076 Toulouse Cedex 03, France b Institute of Parasitology, Vetsuisse Faculty, University of Bern, Länggass•Strasse 122, CH•3012 Bern, Switzerland c Laboratoire Vétérinaire Départemental de l’Ariège, Rue de Las Escoumes, 09 008 Foix, CDIS, France d Intervet • Schering•Plough, Beaucouzé, France article info a b s t r a c t

Article history: Bovine besnoitiosis, caused by the cyst•forming apicomplexan Besnoitia besnoiti, is com• Received 19 October 2009 monly reported in some restricted regions of South•Western Europe, and in larger regions Received in revised form 29 October 2010 of Africa and Asia. This infection is thought to be transmitted by blood feeding insects and is Accepted 18 November 2010 responsible for major economic losses in cattle production. A recent emergence in Europe, notified in the Centre of France, Spain and Germany, has attracted more attention to this Keywords: disease. Clinical signs could appear in some animals; however, many infected cattle remain Besnoitia besnoiti asymptomatic or show scleral–conjunctival cysts (SCC) only. Recent development of sero• Seroprevalence ELISA logical methods allows carrying out seroepidemiological field studies. In this respect, a Western blot long•term investigation was performed in a dairy cattle farm localized in an enzootic area Stomoxys calcitrans of besnoitiosis of South•western France between March 2008 and May 2009. The objec• France tive was to estimate the seasonal pattern of B. besnoiti infections based on the presence of SCC and serology (ELISA and Western blot). In parallel, an entomological survey was conducted to describe population dynamics of Stomoxys calcitrans and Tabanidae species. The seroprevalence determined by Western blot in a cohort of 57 animals continuously present during the whole survey increased from 30% in March 2008 to 89.5% in May 2009 and was always higher than the prevalence based on clinically assessed SCC. New positive B. besnoitia seroconversions occurred throughout the year with the highest number in spring. In addition, many seroconversions were reported in the two months before turn•out and could be associated with a high indoors activity of S. calcitrans during this period. © 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction agent of bovine besnoitiosis (Pols, 1960). This parasitic disease is enzootic in several countries of Sub•Saharan Besnoitia besnoiti Henry, 1913, an apicomplexan proto• Africa (Pols, 1960; Bigalke et al., 1967), in Asia (Lee et al., zoan parasite of the Sarcocystidae family, is the causative 1970; Peteshev et al., 1974) and in Israel (Goldman and Pipano, 1983). In Europe, it was conventionally present in three countries of the Mediterranean basin only: south of Portugal (Cortes et al., 2005), Basque country and Navarra ∗ Corresponding author at: Laboratoire de Parasitologie, Ecole in Spain (Irigoien et al., 2000; Fernández•García et al., Nationale Vétérinaire, 23, Chemin des Capelles, 31076 Toulouse Cedex 2009a) and Southwest of France (Alzieu et al., 2007), where 3, France. Tel.: +33 56 119 3967; fax: +33 56 119 3943. E•mail address: [email protected] (P. Jacquiet). it was initially described for the first time at the National

0304•4017/$ – see front matter © 2010 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.vetpar.2010.11.030

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 73 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27 21

Veterinary School of Toulouse in the beginning of the 20th the historical enzootic area of besnoitiosis in France (Alzieu century (Besnoit and Robin, 1912). In France, there is evi• et al., 2007) and was selected because B. besnoiti clinical dence that the disease has considerably spread from focal cases have been regularly recorded by local veterinarians areas in the Pyrenees to neighbouring regions since the for many years. At the start of the study, 71 animals were 1990s (Alzieu et al., 2007; Jacquiet et al., 2010). In addi• in the dairy herd. As introductions and culling occurred all tion, severe outbreaks were recently reported in the centre around the survey, we focused the study on a cohort of and the south of Spain (Fernández•García et al., 2009a) and 57 adult animals continuously present from March 2008 to in the south of Germany (Mehlhorn et al., 2009; Schares May 2009. The age range within this cohort was 4–13 years et al., 2009). Since 2010, bovine besnoitiosis has been con• old in March 2008 (6.9 ± 2.7 years old). Most of them were sidered as an emergent disease of cattle in Europe by the Friesian dairy cattle but animals from other breeds (Limou• European Food Safety Agency. sine, Montbéliarde and Gasconne) were also present in low Bovine besnoitiosis is clinically characterized by the numbers. Topical treatments with deltamethrin (Butox® succession of three phases: (i) the initial febrile syndrome pour on, Intervet, Beaucouzé, France) were performed on with hyperesthesia of the skin; (ii) the second phase is asso• all cattle in June 19th, July 31st and August 31st, 2008. ciated with generalised oedema (Cortes et al., 2005); (iii) Blood samples were obtained from the caudal vein at the third phase, i.e. the chronic form, with scleroderma, seven occasions: March, June, July, September and Decem• hyperkeratosis, hyperpigmentation and extensive alope• ber 2008, March and May 2009. Sera were separated by cia. Despite recovery of appetite, weight loss becomes more centrifugation and stored frozen at −20 ◦C until use. A marked, death can occur in about 10% of cases (Bigalke, total of 399 serum samples (from the cohort of 57 ani• 1968). A large number of cysts containing bradyzoites mals) were available for serological analysis over the whole are formed in various mucous membranes and connective study. In the same time, careful clinical examinations for tissues including the eye’s sclera and conjunctiva. Thus, the presence of scleral–conjunctival cysts (SCC) in both the diagnosis is relatively easy at this phase of the dis• eyes were carried out by the same veterinary investiga• ease (Pols, 1960; Bigalke, 1968). However, only a small tor during the entire period of the survey. Eyelids were proportion of infected animals are developing the total wide opened and cysts were in relief on the sclera, look• set of clinical signs described above. Some infected cat• ing like grains of millet bulging out of the sclera (Bigalke, tle exhibit bilateral sclero•conjunctival cysts only and the 1968). Only animals exhibiting clear and bilateral SCC on most important part of infected cattle remains totally both eyes were considered as SCC positive. Main gross clini• asymptomatic (Bigalke, 1968; Goldman and Pipano, 1983). cal signs of bovine besnoitiosis were monitored during the Several serological methods have been improved and study: fever, serous bilateral nasal and ocular discharges, are currently used to confirm clinical suspicions or to generalised oedema and lymphadenopathy, thickening detect infected animals including asymptomatic cases: and folding of the skin, hyperkeratosis and alopecia with indirect fluorescent antibody test, ELISA and Western blot numerous cysts were checked. (Goldman and Pipano, 1983; Janitschke et al., 1984; Shkap et al., 1984; Cortes et al., 2006a,b; Fernández•García et al., 2.2. Cultivation of B. besnoiti in Vero cells 2009b; Schares et al., 2010). Thus, serological tools are now available to implement transversal and longitudinal epi• Vero cells and B. besnoiti cultures were main• demiological studies. tained as described in Cortes et al. (2006b). Briefly, It has been demonstrated that hematophagous arthro• B. besnoiti tachyzoites (Bb1Evora03 strain, kindly pro• pods such as Stomoxys calcitrans and Tabanidae species vided by H. Cortes), were cultured in Dulbecco’s Modified could act as mechanical vectors of B. besnoiti (Bigalke, Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with non•essential 1968). In consequence, the number of newly infected cattle amino acids, 100 U penicillin/ml, 100 ␮g/streptomycin/ml, in a farm should increase significantly after a seasonal peak 0.25 ␮g amphotericin B/ml and 10% foetal calf serum (pre• ◦ ◦ of hematophagous insect populations. viously inactivated at 56 C for 30 min) at 37 C and 5% CO2. Thus, the objectives of the current study, performed Infected cultures were examined daily with an inverted in an enzootic area of south west of France, were (i) to microscope to detect free tachyzoites. investigate the longitudinal seroprevalence of B. besnoiti infections by comparison with the prevalence assessed by 2.3. Serological analyses detection of scleral–conjunctival cysts and (ii) to establish a relationship between periods of positive seroconver• 2.3.1. Antigen extraction and Western blot (adapted sions in this cattle herd and the seasonal dynamics of from Cortes et al., 2006a) hematophagous insects, especially horse flies and stable Infected Vero cells and free tachyzoites were harvested flies. and passed through a 25•gauge needle to release para• sites. They were separated on a Sephadex G•25 column (GE 2. Materials and methods Healthcare Europe Gmbh, Ref 17•0851•01, Orsay, France) and centrifuged at 1200 × g for 10 min at 4 ◦C. Pellets of 2.1. Study design and sampling tachyzoites were frozen at −80 ◦C until use. Pellets were denatured by heating at 95 ◦C for 10 min and solubilized. The study was carried out in a dairy cattle farm located Electrophoresis was performed in SDS•PAGE (12.5%, w/v) in the Pyrenees Mountains, in the South•West of France, gels using 15 ␮l sample/cm of slot. Then, B. besnoiti antigens between March 2008 and May 2009. This farm is situated in were electrophoretically transferred to PVDF membranes

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 74 22 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27

(Immun•Blot® PVDF Membrane for Protein Blotting, Bio• 6–8, 9–11, 12–14, 15–17 years). Comparisons between rad, Ref 162•0177, Marne La Coquette, France). Bovine sera, seroprevalence by immunoblot analysis and prevalence diluted 1:50 in PBS, 0.05% [v/v] Tween 20 and 2% [w/v] assessed by bilateral scleral–conjunctival cysts were com• milk proteins were incubated for 60 min at 37 ◦C with puted by the McNemar’s test with exact procedure. strips previously blocked by skimmed milk. Strips were This test was also used to estimate the difference washed with PBS + Tween 20. Antibody reactions were between positive and negative seroconversion for cat• visualized with an anti•bovine IgG (H + L) peroxydase con• tle present at two sampling dates. The Western blot jugate (Sigma–Aldrich, Ref A 5295, St Quentin Fallavier, and the ELISA results were compared with the Cohen’s France) diluted in PBS + Tween 20 at 1:300 and using the kappa coefficient. The Cohen’s kappa values were inter• Opti 4CN substrate kit (Biorad, Ref 170•3932, Marne La preted according to Landis and Koch (1977): >0.81: almost Coquette, France). Molecular weights of the different anti• perfect agreement; 0.61–0.8: substantial agreement; and gens recognised by sera were determined by comparing 0.4–0.6: moderate agreement. Antibody levels between with respective molecular weight standards (Precision Plus each collection date for WB positive animals present Protein Dual Color Standards, Biorad, Ref 161 0374 S04, from March 2008 to May 2009 were compared with Marne La Coquette, France). A serum was considered posi• the exact procedure of permutation test with the Bon• tive when the three main antigenic domains were observed ferroni correction. Antibody levels were also compared (as documented in Cortes et al., 2006a): domain I ranging between WB positive animals exhibiting SCC and WB posi• between 12 and 20 kDa, domain II ranging between 23 and tive animals without SCC with the permutation test with 38 kDa and domain III ranging between 60 and 90 kDa with exact procedure. All statistical analyses were performed at least a set of four bands within each of them. This West• with the software package StatXact® release•3.1 (Cytel ern blot (WB) technique exhibited a diagnostic sensitivity Software Corporation, USA) and Microsoft® Excel 2007 of 91.3% and a specificity ranging between 96.4% and 100% (Microsoft Corporation, USA) with a significant threshold (Cortes et al., 2006a). of 0.05.

2.3.2. ELISA A commercially available indirect ELISA (PrioCHECK® 3. Results Besnoitia Ab ELISA, Prionics, Schlieren, Switzerland) was used according to the instructions of the manufacturer 3.1. Serological prevalence and age repartition of B. to determine B. besnoiti antibody levels. This assay has besnoiti infection in March 2008 a reported sensitivity of 97.8% and a specificity of 98.1%. Obtained optical densities (ODs) were transformed into At the beginning of the study (March 2008), twenty• a percentage of antibodies (% Ab) according to the four (among a total of 71) animals were positive formula: % Ab = OD sample/OD positive control × 100. Val• by Western blot, yielding an initial serological preva• ues over the 20% cut•off were considered positive in lence of 33.80% in the whole herd. Positive cases were ELISA. observed in all age categories except for animals older than 15 years (N = 2) and younger than 2 years (N = 2) which were all negative by WB. The highest infec• 2.4. Entomological survey tion rate (66.7%) was observed in 12–14 years old animals (Fig. 1), however, no significant difference of preva• According to Gilles et al. (2007), the Vavoua trap was lence was observed between all other age groups (P = 0.75, used to monitor the dynamics of blood feeding insects Chi•square, exact inference). All breeds, present in this including stable flies and Tabanids. Six Vavoua traps were herd, showed positive animals. installed at 8:30 a.m. and were removed at 6:00 p.m. once a month, between May 2008 and May 2009. Trapping days were selected such as to avoid rainy and windy days. Tem• peratures were recorded at installation and removal of 35 traps. The six locations of Vavoua traps were chosen to 30 cover all grazing pastures around the cowshed and to be as close as possible to the dairy herd. The distances between 25 different traps were at least 50 m to avoid competition 20 between traps (Gilles et al., 2007). Captured insects were 15 killed by freezing at −70 ◦C, identified and counted trap 10 by trap. S. calcitrans specimens were identified accord• Number of cattle ing to Zumpt (1973). Presence of S. calcitrans and other 5 hematophagous arthropods was also observed indoors on 0 [0-2] [3-5] [6-8] [9-11] [12-14] [15-17] cattle but were not quantified. Cattle age (years) WB + WB - Prevalence (%) 0 40.6 25 33.3 66.7 0 2.5. Data analysis CI (95 %) - 21.8-59.5 5.5-57.2 13.3-59 - -

Fig. 1. Number of WB positive cattle in the whole dairy herd (71 animals) The exact Chi•square test was applied to assess associa• according to age classes in March 2008. Positive Western blot in black; tions between seroprevalence and age groups (0–2, 3–5, negative Western blot in white, and CI = confidence interval.

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 75 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27 23

3.2. Serological and clinical survey of besnoitiosis from March 2008 to May 2009

The estimation of the besnoitiosis prevalence in the cohort of 57 animals was performed by Western blot <0.0001 05/12/09 at each sampling date and compared with prevalence assessed by the presence of cysts on sclera and conjunc• tiva of cattle (Table 1). The serological prevalence increased sharply from 29.82% in March 2008 to 71.93% in June 2008, remains relatively stable from July to September and increased again between September 2008 and May 2009 to reach 89.47% at the end of the study (Table 1). Cattle <0.0001 03/16/09 carrying bilateral SCC were detected at all sampling dates. In the whole herd, only animals older than 4 years of age exhibited SCC. In three cattle, ocular cysts were found one time only, and their presence could not be confirmed later (one animal in March 2008 and two others in June 2008). The proportion of animals showing bilateral SCC was lower than that of animals with positive WB (P < 0.05) at each <0.0001 12/04/08 sampling date (Table 1), and varied from 10.53% in March 2008 up to 22.81% in June 2008. A decrease of this propor• tion was noticed between September 2008 and December 2008, followed by stabilization until May 09. Within the cohort of animals present from March 2008 to May 2009, positive seroconversions were observed dur• ing all the 14•months survey. In June 2008, a peak of 09/23/08 24 positive seroconversions occurred without observation of seronegative conversion (P < 0.0001, Table 2). A new increase of positive seroconversions occurred in March and May 2009 (respectively 8 and 6). Finally, forty•six positive seroconversions were reported during the whole period (Table 2). Despite of 13 negative seroconversions P •value is significant below 0.05 and estimated by McNemar’s test, exact inference. reported from July 2007 to May 2009 (Table 2), the preva• 07/22/08 lence in this cohort achieved 89.47% in May 2009 (Table 1). Interestingly, those negative seroconversions are linked to antibody levels fluctuating around the 20% cut•off value of the ELISA (data not shown). All 57 animals have been also tested by a Besnoitia–ELISA. Comparisons of findings obtained by the commercial ELISA (with the recommended 20% cut•off 06/05/08 value) and those obtained by Western blot showed high Cohen’s kappa values (>0.8) in June and September 2008 and low values in March 2008 (0.48) and March 2009 (0.16) (Table 3). The average Cohen’s kappa value (with the 20% ELISA cut•off) was 0.6 ± 0.23. No improvement of Cohen’s kappa values was obtained by decreasing man• 0.0011 <0.0001 <0.0001 <0.0001 10.53 (1.6–19.4) 22.81 (10.9–34.7) 17.54 (6.7–28.4) 21.05 (9.5–32.6) 8.77 (0.5–17.1) 12.28 (2.8–21.8) 12.28 (2.8–21.8) 29.82 (17–42.7) 71.93 (59.3–84.6) 70.18 (57.3–83) 73.68 (61.3–86) 73.68 (61.3–86) 82.46 (71.6–93.3) 89.47 (80.6–98.4) Date of examination 03/26/08 ufacturer’s recommended ELISA cut•off to 10% except in March 2009 with an average value of 0.53 ± 0.10 (Table 3). The best average of Cohen’s kappa values was computed with 15% cut•off value (0.64 ± 0.20) with better values at each examination date than the 20% cut•off value (except in June 2008). The Besnoitia–ELISA was used to follow B. besnoiti antibody levels of 15 continuously Western blot•positive animals (within the cohort of the 57 cattle). Variations of antibody levels occurred during all the study (Fig. 2). Between March and June 2008, a significant increase of antibody levels was observed and corresponded to the highest number of positive seroconversions (Table 2, Fig. 2). The most striking finding was a significant decrease Prevalence (%) estimated by WB+ (95% CI) Prevalence (%) estimated by presence of SCC (95% CI) Difference of prevalence established by WB and presence of SCC probability

Table 1 Besnoitiosis prevalence assessed by Western blot and presence of scleral–conjunctival cysts (SCC) in 57 cattle continuously present in the herd from March 2008 to May 2009. WB+ = positive Western blot, SCC = bilateral sclero•conjunctival cysts, CI = confidence interval, and between June and July 2008 followed by stabilization dur•

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 76 24 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27

Table 2 Number of seroconversions assessed by Western blot in the cohort of 57 animals continuously present from March 2008 to May 2009.

Period

From From From From From From 03/26/08 to 06/05/08 to 07/22/08 to 09/23/08 to 12/04/08 to 03/16/09 to 06/05/08 07/22/08 09/23/08 12/04/08 03/16/09 05/12/09

Seropositive conversions 24 2 4 2 8 6 Seronegative conversions 0 3 3 2 3 2 P <0.0001 0.36 0.73 0.69 0.11 0.15

P•value is significant below 0.05 and estimated by McNemar’s test, exact inference.

Table 3 Cohen’s kappa values estimated at each sampling date between Western blot and PrioCheck Besnoitia Ab ELISA Kit among 57 animals present from March 2008 to May 2009.

Date of examination

03/26/08 06/05/08 07/22/08 09/23/08 12/04/08 03/16/09 05/12/09

K (20% cut off value) 0.48 0.83 0.62 0.80 0.57 0.16 0.77 K (15% cut off value) 0.51 0.77 0.65 0.84 0.57 0.30 0.84 K (10% cut off value) 0.38 0.49 0.64 0.65 0.47 0.52 0.56 ing late summer, autumn and the housing period (from The fluctuations of these antibody levels were similar to December 2008 to March 2009). Finally, a significant the other WB positive cattle during the winter 2008–2009 increase of antibody levels was observed between March and the spring 2009. Bilateral SCC were firstly observed and May 2009 with new high scores of positive serocon• in September 2008, seven weeks after the onset of clinical versions (respectively 8 and 6) at turn out (Table 2, Fig. 2). signs. Respective clinical recovery was achieved at the fol• All cattle exhibiting bilateral SCC were positive either lowing early fall after two treatments with sulphonamides in WB or ELISA, except one animal at one sampling date. at fifteen days interval. Despite large standard deviations of antibody levels in ELISA, animals showing both positive WB and bilateral SCC 3.3. Entomological survey from May 2008 to May 2009 had significant higher antibody levels than WB positive animals without perceptible ocular cysts (Fig. 3). The grazing period extended from late April 2008 to Besnoitiosis•associated clinical signs (febrile syndrome late December 2008. Turn•out occurred in the beginning and oedema) were observed at the end of July 2008 in a of May 2009 and the last visit of the farm took place one limousine bull (4 years old), previously negative in WB and week later. Temperatures at 8:30 and 18:00 h are reported ELISA one week before. This bull belonged to the cohort of 57 animals. Nineteen days after the onset of the clin• ical phase, this animal showed clear positive reaction in Mean % of antibody in SC-C+ animals Mean % of antibody in SC-C-animals 140 WB and in ELISA (semi•quantified antibody level of 46%). In 6 December 2008, the antibody level increased to reach 106%. * ** *** ************ 120 5 10 10 5 7 100 Mean % of antibody in WB + animals 9

100 ** * 80 90 31 12 60 44 80 41 31 32 37 70 40 60

50 20 40 30 0 Percentage of Antibody / positive control = 100 20 03/26/08 06/05/08 09/23/08 12/04/08 03/16/09 05/12/09 10 07/22/08 0 Examination date 03/26/08 06/05/08 07/22/08 09/23/08 12/04/08 03/16/09 05/12/09 Examination date Fig. 3. Comparison of B. besnoiti antibody levels (±standard deviation) Percentage of antibody / positive control = 100 assessed by PrioCHECK® Besnoitia Ab ELISA between Western blot posi• Fig. 2. B. besnoiti specific antibody levels assessed by PrioCHECK® tive cattle exhibiting bilateral sclero•conjunctival cysts (SCC+) in black or Besnoitia Ab ELISA for 15 Western blot positive cattle within the cohort not (SCC−) in white among the cohort of 57 animals continuously present of 57 animals from March 2008 to May 2009. P•values were computed by at each sampling date. P•value was computed by permutation test, exact permutation test on paired samples with the Bonferroni correction, exact inference. *: significant <0.05, **: significant <0.025, and ***: significant inference. *: significant <0.01. <0.001. Numbers of SCC+ and SCC− cattle are reported on histograms.

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 77 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27 25

Table 4 Number of insects and Stomoxys calcitrans captured outdoors by six Vavoua traps from May 2008 to May 2009 and reported temperatures.

Date of trapping

2008 2009

05/06 06/05 07/02 07/22 08/19 09/05 09/23 10/14 12/04 02/05 03/16 04/16 05/12

Total number of trapped insects 193 252* 140 199** 71 114 259 163 26 0 51 84*** 455 Number of S. calcitrans 26 31 17 58 47 24 161 82 0 0 0 0 30 Temperature at 8:30 (◦C) 13 13 15 20 18 20 16 15 4 7 12 13 13 Temperature at 18:00 (◦C) 20 18 26 24 19 28 21 19 5 11 15 13 21

Other trapped hematophagous insects: * = two Tabanidae, ** = one Tabanidae, and *** = two Culicidae, one Simuliidae. in Table 4. The lowest temperatures were reported from ELISA were not rare, especially at the end of winter: for December 2008 to March 2009 and were associated with example, the best Cohen’s kappa value is assessed with a the absence of stable flies in the traps (Table 4). Captures cut off value of 10% at this date. of S. calcitrans specimens occurred when temperatures at As expected, B. besnoiti infection was widespread 8:30 and 18:00 h were above or equal to 13 ◦C and 18 ◦C among the studied dairy farm (up to 89.47% of seropos• respectively, from late spring to autumn (Table 4). A total itive animals) which is usual in other Besnoitia•enzootic of 476 stable flies were caught during the study period areas as South Africa (Bigalke, 1968) or Israel (Goldman with the six Vavoua traps. High abundances of S. calcitrans and Pipano, 1983). A major concept of B. besnoiti infec• did not match with high total numbers of trapped insects tion within an endemic zone is its large distribution among (Table 4). Few other hematophagous insect species were the cattle affected population (Pols, 1960; Bigalke, 1968). caught by Vavoua traps: three horse flies (two Tabanus sp. Clinical cases constitute the iceberg’s tip of besnoitiosis and one Chrysops sp.) in May and July 2008 and two Culi• and are relatively sporadic. A second subset of a herd con• cidae and one Simuliidae. The highest numbers of trapped sists of seropositive animals exhibiting SCC. Among all S. calcitrans were observed in September and October (161 infected animals, a third subset including totally asymp• and 82 respectively, Table 4). Moreover, two lower peaks tomatic seropositive animals is probably the largest one. (31 and 58) of stable fly captures were reported in June and Why an animal belongs to one or another subset is not July 2008. yet known. Repeated exposures to the parasite, infection Direct examination of animals showed many Hip• doses or individual variability of innate or specific immune pobosca equina, and Haematobia irritans until the first responses are likely factors responsible for different infec• insecticide treatment in June, these species were no more tion outcomes. Finally, a fourth subset must be considered recovered in the following visits. In addition, numerous S. about seronegative animals. All these four groups were calcitrans were noticed on cattle in March and April 2009 present in this study. For example, only one bull (1.3%) i.e. before turn•out. Their numbers could not be quantita• developed clinical signs. Nine animals (15.8%) showed SCC, tively evaluated and were unscheduled. Nevertheless, they 31 (54.4%) were seropositive without any sign of infec• showed a high blood feeding activity. This period matched tion and 15 (26.3%) were negative in serology. According the time span when eight new positive seroconversions to Cortes et al. (2006a) and Schares et al. (2010), some ani• were observed (Table 2). mals with clinical signs of besnoitiosis remain serologically negative. We did not observe this subset in our survey. 4. Discussion Sulphonamide treatment was administered to the sick bull during seven days and was repeated 15 days later due For the first time a longitudinal study has been carried to a relapse. Despite these two treatments, appearance of out to assess seasonal kinetics of B. besnoiti•infections in an cysts seven weeks after the onset of clinical phase and per• enzootic area/herd of France. A combination of serological sistence of high antibody levels in this animal throughout analyses (Western blots and ELISA), clinical examinations the rest of the study confirmed that this therapy was not and entomological survey was used. The Western blot, sterilizing (Pols, 1960; Shkap et al., 1987) and lead to a adapted from Cortes et al. (2006a), had been published to chronic and persistent Besnoitia infection. have a sensitivity of 91.3% and a specificity of 96.4%, based The SCC prevalence was always significantly lower than upon assessment with parasitologically and clinically man• the seroprevalence determined by Western blot. Lack of ifest/proven cases. According to the manufacturer, the sensitivity of this macroscopic diagnostic approach was sensitivity and the specificity of the PrioCHECK® Besnoitia also pointed out by Bigalke (1968). Prevalences based on Ab ELISA are both around 98%, also based primarily upon cyst examination were variable along the survey period testing of clinical cases. In the present study, address• of the present study, with a rise between March and June ing clinical and non•clinical cases, some divergences were 2008, and the highest decrease in the beginning of win• observed between results of both tests especially in late ter. The decrease of SCC prevalence is difficult to explain. winter (three Cohen’s kappa values were below 0.6 in Despite the well known morphological characteristics of March 2008, December 2008 and March 2009). Global ocular cysts and careful examination by the same person improvement of Cohen’s kappa values was observed with during the whole study, misidentification is always pos• a cut•off value of 15%. Animals showing a positive WB and sible. Bigalke (1968) suggested that the best conditions to fluctuating antibody levels around the threshold value in investigate for SCC in animals should be under outdoor con•

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 78 26 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27 dition. In winter, all observations were performed indoors, nificant decrease of antibody levels in July 2008 and the thus putatively including a methodological observational low level of positive seroconversions. No blood feeding flies bias. A disappearance of cysts on initially positive animals have been observed between December 2008 and February is not likely to occur, as B. besnoiti infection is thought to 2009. This period corresponded to lowest antibody lev• last at least nine years without any recontamination (Pols, els, suggesting that continuous parasite transmission via 1960; Bigalke, 1968). arthropod bites could be necessary to maintain high levels Interestingly, the presence of SCC was always associated of antibodies. This phenomenon is also reported for bovine with a marked antibody response. We can hypothesize that babesiosis. Increase of Babesia divergens specific antibody cattle exhibiting SCC could have a greater parasite burden levels occurred after turn•out when high Ixodes ricinus than animals without ocular cysts, involving an active and infections are observed (L’Hostis et al., 1997). Many S. cal• permanent stimulation of the immune system. They could citrans were observed indoor in March and April 2009 but also be a great source of contamination in a cattle herd. they could not be quantified. This endophilic activity could Among the factors influencing the dynamics of B. explain the observed seroconversions and the significant besnoiti infections, the breed of cattle seemed not to be elevations of antibody levels in early spring (in 2008 and significant as animals of all breeds were infected in the 2009), before turn•out. Thereby, mechanical transmission farm. The influence of sex and age was not evaluated in by these insects could take advantage of the promiscuity this study due to the very low number of recruited males between infected and uninfected cattle at that time. and because no young animals less than four years of age In conclusion, this is the first field study combining a could be recruited in the cohort. A seasonal pattern of longitudinal study of besnoitioisis seroprevalence in dairy clinical cases of bovine besnoitiosis had been previously cattle with an entomological survey of biting flies in an reported in both enzootic and epizootic areas (Alzieu et al., enzootic area in South•Western France. No clear relation• 2007) with 80–90% of clinical cases occurring in summer. ship between peaks of positive seroconversions or antibody Nevertheless, the present follow up of the cohort of 57 ani• levels and stable fly activity measured by Vavoua traps mals clearly demonstrated that positive seroconversions was found. However, low antibody levels were noticed occurred all around the year even if the highest number during winter when no biting fly activity was reported. of seropositive conversions was observed during springs More investigations are required to demonstrate the role of 2008 and 2009. In parallel, a low number of seroconver• biting flies in the transmission of bovine besnoitiosis. Ade• sions from positive to negative occurred all over the survey quate programs of insecticide treatments should be defined period. Negative seroconversions and other fluctuations of since stable flies seem to be very active indoors, before antibody levels have been reported in Neospora caninum turn out, in order to avoid early contaminations in enzootic infections (Caetano•da•Silva et al., 2004; Chanlun et al., areas. 2007). It was discussed that the use of tachyzoite•antigens in serological analyses instead of bradyzoite•antigens could Acknowledgements putatively lead to false negative results in chronically infected animals (Fernández•García et al., 2009b). However The authors wish to thank Dr. H. Cortes (University of no respective experimental evidence has been documented Evora, Portugal) for his excellent help in B. besnoiti culture so far. and Prof. G. Duvallet (University of Montpellier, France) Dynamics of hematophagous insects’ populations could for providing the Vavoua traps and for fruitful discussions explain variations of besnoitiosis prevalence and seasonal about biting flies. We are very grateful to the farmers for incidences. Mechanical transmission of besnoitiosis by their compliance. We wish to acknowledge T. Beuscart blood feeding insects was confirmed by Bigalke (1968) for his technical assistance. Finally, some financial support with Tabanids being more efficient than stable flies for from Intervet was greatly appreciated. Besnoitia transmission. It is interesting to note that the unique clinical case reported in this study occurred when some Tabanids were caught in the Vavoua traps. Only References three Tabanids specimens were captured during summer Acapovi, G., Yao, Y., N’Goran, E., Dia, M.L., Desquesnes, M., 2001. Abon• 2008, this could not reflect the true Tabanids activity as dance relative des tabanidés dans la région des savanes de Côte Vavoua traps are not the most efficient trap to these species d’Ivoire. Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop 54, 109–114. (Acapovi et al., 2001). Conversely, there was no clear asso• Alzieu, J.•P., Cortes, H., Gottstein, B., Jacquiet, P., Dorchies, P., Schelcher, F., L’Hostis, M., 2007. La besnoitiose bovine: actualités épidémi• ciation between the number of new infections and the ologiques et diagnostiques. Bull. G.T.V.—Hors•série parasitisme des peak of S. calcitrans abundance. Outdoor captures of S. cal• bovins, 41–49. citrans occurred from May to October 2008. The greatest Besnoit, C., Robin, V., 1912. Sarcosporidiose cutanée chez une vache. Rev. numbers of caught stable flies occurred in September and Med. Vet. (Toulouse) 37, 649–663. Bigalke, R.D., 1968. New concepts on the epidemiological features of October 2008 i.e. before limitation of activity by low tem• bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field investiga• peratures (Lysyk, 1993, 1995). Surprisingly, this peak was tions. Onderstepoort J. Vet. Res. 35, 3–137. not followed by a sharp increase of positive seroconver• Bigalke, R.D., van Niekerk, J.W., Basson, P.A., McCully, R.M., 1967. Studies on the relationship between Besnoitia of blue wildebeest and impala, sions or increase of antibody levels. However, the topical and Besnoitia besnoiti of cattle. Onderstepoort J. Vet. Res. 34, 7–28. treatments administered to the dairy cows in June, July Caetano•da•Silva, A., Ferre, I., Aduriz, G., Álvarez•García, G., del•Pozo, and August could have seriously affected insect popula• I., Atxaerandio, R., Regidor•Cerrillo, J., Ugarte•Garagalza, C., Ortega• Mora, L.M., 2004. Neospora caninum infection in breeder bulls: tions and could have protected cattle from stable fly bites. seroprevalence and comparison of serological methods used for diag• Thus, this may suggest a possible explanation of the sig• nosis. Vet. Parasitol. 124, 19–24.

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 79 E. Liénard et al. / Veterinary Parasitology 177 (2011) 20–27 27

Chanlun, A., Emanuelson, U., Frossling, J., Aiumlamai, S., Bjorkman, C., Lee, H.S., Bak, U.B., Moon, M.H., Shin, J.U., 1970. Studies on bovine 2007. A longitudinal study of seroprevalence and seroconversion of besnoitiosis in Korea. II. A survey on incidence in the enzootic region. Neospora caninum infection in dairy cattle in northeast Thailand. Vet. Korean J. Parasitol. 8, 76–80. Parasitol. 146, 242–248. L’Hostis, M., Chauvin, A., Valentin, A., Precigout, E., Gorenflot, A., 1997. Sur• Cortes, H., Leitao, A., Vidal, R., Vila•Vicosa, M.J., Ferreira, M.L., Caeiro, V., vey of Babesia divergens antibody kinetics in cattle in western France. Hjerpe, C.A., 2005. Besnoitiosis in bulls in Portugal. Vet. Rec. 157, Vet. Res. 28, 481–488. 262–264. Lysyk, T.J., 1993. Seasonal abundance of stable flies and house flies Cortes, H.C.E., Nunes, S., Reis, Y., Staubli, D., Vidal, R., Sager, H., Leitao, A., (Diptera: Muscidae) in dairies in Alberta. Can. J. Med. Entomol. 30, Gottstein, B., 2006a. Immunodiagnosis of Besnoitia besnoiti infection 888–895. by ELISA and Western blot. Vet. Parasitol. 141, 216–225. Lysyk, T.J., 1995. Temperature and population density effects on feeding Cortes, H.C.E., Reis, Y., Waap, H., Vidal, R., Soares, H., Marques, I., da Fon• activity of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) on cattle. J. Med. seca, I.P., Fazendeiro, I., Ferreira, M.L., Caeiro, V., Shkap, V., Hemphill, Entomol. 32, 508–514. A., Leitao, A., 2006b. Isolation of Besnoitia besnoiti from infected cattle Mehlhorn, H., Klimpel, S., Schein, E., Heydorn, A.O., Al•Quraishy, S., Sel• in Portugal. Vet. Parasitol. 141, 226–233. mair, J., 2009. Another African disease in Central Europa: besnoitiosis Fernández•García, A., Risco•Castillo, V., Pedraza•Díaz, S., Aguado• of cattle. I. Light and electron microscopical study. Parasitol. Res. 104, Martínez, A., Álvarez•García, G., Gómez•Bautista, M., Collantes• 861–868. Fernández, E., Ortega•Mora, L.M., 2009a. First isolation of Besnoitia Peteshev, V.M., Galuzo, I.G., Polomoshnov, A.P., 1974. Cats—definitive besnoiti from a chronically infected cow in Spain. J. Parasitol. 95, hosts of Besnoitia (Besnoitia besnoiti). Izvest. Akad. Nauk. Kazakh. Ser. 474–476. Biol. 1, 33–38 (in Russian). Fernández•García, A., Alvarez•García, G., Risco•Castillo, V., Aguado• Pols, J.W., 1960. Studies on bovine besnoitiosis with special reference to Martínez, A., Marugán•Hernández, V., Ortega•Mora, L.M., 2009b. the aetiology. Onderstepoort J. Vet. Res. 28, 265–356. Pattern of recognition of Besnoitia besnoiti tachyzoite and brady• Schares, G., Basso, W., Majzoub, M., Cortes, H.C.E., Rostaher, A., Selmair, J., zoite antigens by naturally infected cattle. Vet. Parasitol. 164, 104– Hermanns, W., Conraths, F.J., Gollnick, N.S., 2009. First in vitro isolation 110. of Besnoitia besnoiti from chronically infected cattle in Germany. Vet. Gilles, J., David, J.F., Duvallet, G., De La Rocque, S., Tillard, E., 2007. Efficiency Parasitol. 163, 315–322. of traps for Stomoxys calcitrans and Stomoxys niger niger on Reunion Schares, G., Basso, W., Majzoub, M., Rostaher, A., Scharr, J.C., Langenmayer, Island. Med. Vet. Entomol. 21, 65–69. M.C., Selmairg, J., Dubey, J.P., Cortes, H.C., Conraths, F.J., Gollnick, N.S., Goldman, M., Pipano, E., 1983. Serological studies on bovine besnoitiosis 2010. Comparative evaluation of immunofluorescent antibody and in Israel. Trop. Anim. Health Prod. 15, 32–38. new immunoblot tests for the specific detection of antibodies against Irigoien, M., Del Cacho, E., Gallego, M., Lopez•Bernad, F., Quilez, J., Sanchez• Besnoitia besnoiti tachyzoites and bradyzoites in bovine sera. Vet. Par• Acedo, C., 2000. Immunohistochemical study of the cyst of Besnoitia asitol. 171, 32–40. besnoiti. Vet. Parasitol. 91, 1–6. Shkap, V., Ungar•Waron, H., Pipano, E., Greenblatt, C., 1984. Enzyme linked Jacquiet, P., Liénard, E., Franc, M., 2010. Bovine besnoitio• immunosorbent assay for detection of antibodies against Besnoitia sis: epidemiological and clinical aspects. Vet. Parasitol., besnoiti in cattle. Trop. Anim. Health Prod. 16, 233–238. doi:10.1016/j.vetpar.2010.08.013. Shkap, V., Pipano, E., Greenblatt, C., 1987. Cultivation of Besnoitia besnoiti Janitschke, K., De Vos, A.J., Bigalke, R.D., 1984. Serodiagnosis of bovine and evaluation of susceptibility of laboratory animals to cultured par• besnoitiosis by ELISA and immunofluorescence tests. Onderstepoort asites. Vet. Parasitol. 23, 169–178. J. Vet. Res. 51, 239–243. Zumpt, F., 1973. The Stomoxyine Biting Flies of the World—Diptera: Landis, J.R., Koch, G.G., 1977. The measurement of observer agreement for Muscidae. Taxonomy, Biology, Economic Importance and Control categorical data. Biometrics 33, 159–174. Measures. Gustav Fisher Verlag, Stuttgart, p. 175.

Chapitre III- Rôle vecteur - article 3 80 SALEM A. 2012

Article 4

Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) to transmit Besnoitia besnoiti (Henry, 1913) (Apicomplexa: Sarcocystidae)

(Parasitology Research, 2012)

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 81

Parasitol Res DOI 10.1007/s00436-012-3157-6

ORIGINAL PAPER

Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) to transmit Besnoitia besnoiti (Henry, 1913) (Apicomplexa: Sarcocystidae)

E. Liénard & A. Salem & P. Jacquiet & C. Grisez & F. Prévot & B. Blanchard & E. Bouhsira & M. Franc

Received: 20 September 2012 /Accepted: 27 September 2012 # The Author(s) 2012. This article is published with open access at Springerlink.com

Abstract Cattle besnoitiosis due to the cyst-forming cocci- respectively, in the blood recipient, the mouthparts, and the dian parasite Besnoitia besnoiti has recently been reported in gut contents of S. calcitrans at two time intervals: 1 and 24 h expansion in Europe since the end of the twentieth century. after the interrupted blood meal. Parasite DNA was detected The B. besnoiti life cycle and many epidemiological traits at both time intervals (1 and 24 h) in all samples (blood are still poorly known. Hematophagous flies, including the recipient, mouthparts, and gut contents of stable flies) while worldwide-distributed Stomoxys calcitrans, could be me- entire parasites by dFAT were only found in the abdominal chanical vectors in the contamination of mouthparts after compartment 1 h after the interrupted blood meal. Then, S. the puncture of cutaneous cysts or ingestion of infected calcitrans were able to carry B. besnoiti from chronically blood. In this study, a protocol is presented to assess more infected cattle to an artificial recipient in the conditions of deeply the role of S. calcitrans, reared in laboratory con- the protocol. ditions, in parasite transmission. A preliminary trial showed that stable flies could transmit tachyzoites from bovine artificially parasite-enriched blood to B. besnoiti-free blood Introduction using glass feeders. Evidence of transmission was provided by the detection of parasite DNA with Ct values ranging Besnoitia besnoiti (Henry, 1913), a cyst-forming apicom- between 32 and 37 in the blood recipient. In a second time, a plexan parasite, is the causative agent of cattle besnoitiosis. B. besnoiti-infected heifer harboring many cysts in its der- This disease, widely distributed in Africa, Asia, and in mis was used as a donor of B. besnoiti. An interruption of southwestern Europe, has spread in Portugal (Cortes et al. the blood meal taken by 300 stable flies from this heifer was 2005), in Spain (Fernández-García et al. 2009), from south- performed. Immediately after the blood meal was interrup- ern France to central and western France since the end of the ted, they were transferred to a glass feeder containing B. twentieth century (Alzieu et al. 2007) with recent and lim- besnoiti-free blood from a non-infected heifer. Quantitative ited outbreaks in Germany (Mehlhorn et al. 2009) and Italy PCR and modified direct fluorescence antibody test (dFAT) (Agosti et al. 1994) probably due to importation of infected were used to detect B. besnoiti DNA and entire parasites, cattle (Olias et al. 2011). Since 2010, cattle besnoitiosis is considered a reemerging disease according to the European * : : : : : E. Liénard ( : ) A. Salem P. Jacquiet C. Grisez F. Prévot Food Safety Authority (http://www.efsa.europa.eu/en/ E. Bouhsira M. Franc scdocs/doc/1499.pdf). Severe economic losses are observed Laboratoire de Parasitologie, Université de Toulouse, INP, ENVT, in infected farms due to definitive or transient sterility in F-31076 Toulouse, France bulls, abortions, decline in milk production, mortality, and e-mail: [email protected] low body conditions, resultingindepreciatingslaughter values and skin quality (Pols 1960;Cortesetal.2005). B. Blanchard Adiagène, 38 rue de Paris, The course of the disease is well described (Jacquiet et al. 22000 Saint-Brieuc, France 2010). During the acute stage of the disease, tachyzoites

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 82 Parasitol Res multiply quickly within bovine macrophages and endothe- Source of B. besnoiti-free blood lial cells of blood vessels. The chronic stage is characterized by the formation of numerous cysts containing thousands of The uninfected blood was provided by a 14-month-old bradyzoites in various tissues including the skin. However, heifer reared at the ENVT, which has not been treated with the life cycle of B. besnoiti and the routes of contamination are insecticides within 3 months prior to the study. The blood not yet clearly elucidated (Diesing et al. 1988;Kiehletal.2010; was collected in 4-ml tubes containing 60 USP U Lithium Basso et al. 2011; Olias et al. 2011). The cattle-to-cattle trans- Heparin (Terumo Europe N.V., Leuven, Belgium) to prevent cutaneous contamination is probably the most common way of coagulation at the day of experiment. infection via hematophagous insects. Experimentally, tachy- zoites in blood or cutaneous bradyzoites have been successfully Source of B. besnoiti-infected blood and skin transmitted from an infected animal to a susceptible one by, respectively, the transfusion of large volumes of infected bovine The source of bradyzoites, used in transmission experiments 3 blood or through the mechanical transmission by biting flies and 4 (see below), was a second 14-month-old heifer with such as tabanids and Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) chronic besnoitiosis. The infected heifer was reared at the commonly named stable fly (Cuillé et al. 1936;Pols1960; ENVT under the same conditions as the uninfected cow. It Bigalke 1968). Since the survey of Bigalke (1968) showing came from an infected farm in Dordogne (France). Regarding the mechanical vector role of those flies, these works, to our both heifers, the presence or absence of B. besnoiti cutaneous knowledge, have not been repeated to assess the epidemiolog- cysts were checked clinically, and at least two biopsies ical importance of S. calcitrans, one of the most serious pests of (Biopsy Punch 8 mm, Kruuse, Langeskov, Denmark) were herds (Taylor et al. 2012), in the transmission of besnoitiosis. taken from the right forelimb and the neck. This was then Mechanical transmission may occur when a stable fly is inter- followed by direct observation and quantitative PCR (see rupted during blood feeding by host defensive behavior or other below). Their serological status against bovine besnoitiosis flies (Schofield and Torr 2002) and completes its blood meal on was also evaluated by Western blot (see below). nearby animals (Doyle et al. 2011). A large proportion of animals exposed to and infected by B. besnoiti only become Serological analysis of heifers seropositive without developing clinical signs (Bigalke 1968; Jacquiet et al. 2010). Then, the use of an artificial host recipient, Purified B. besnoiti tachyzoites from a strain isolated in the such as a blood glass feeder, to estimate the parasite carriage in French Pyrenees were used as antigen for the Western blot S. calcitrans could eliminate the bias of cattle susceptibility (WB) and to infect the blood in experiment 2 (see below). (Doyle et al. 2011). The aim of this study was to establish a Vero cells and B. besnoiti tachyzoites are maintained at the technical protocol to assess the role of S. calcitrans,fedwith ENVT since 2008 as described by Cortes et al. (2006a). WB blood from a glass feeder, as a mechanical vector of B. besnoiti procedures were adapted from Cortes et al. (2006a)andwere from infected cattle harboring cutaneous cysts. performed as described by Liénard et al. (2011). A serum was considered positive if the three main antigenic domains (low, medium, and high molecular weights) were observed with a set Material and methods of at least four bands within each of them (Cortes et al. 2006a).

Source and maintenance of S. calcitrans Experimental design

A colony of stable flies is established at the ENVT (France) For all experiments, the sex ratio of S. calcitrans was close to since May 2009. More details about rearing methods are 1:1. Experiments were achieved in November 2011 and in provided by Salem et al. (2012). Adult stable flies required January 2012 when wild adult stable flies were not present in for the experimental purpose were 2 to 5 days old. They cattle facilities. were fed only with water and honey ad libitum after emer- gence and before experiments. To study the ability of B. Experiment 1: control group besnoiti to be transmitted, one or two sterilized glass feeders (according to the protocol used) were placed in contact with It was firstly necessary to assess whether some organisms pres- the upper side of the mesh cages (30×30×30 cm). A syn- ent within S. calcitrans would interact with further analyses. thetic membrane (Parafilm 3M, Pechiney Plastic Packaging, Moreover, it was also necessary to confirm that laboratory-bred Chicago, IL) sealed the inner chamber containing bovine S. calcitrans were free from B. besnoiti contamination. Two blood of the glass feeder. Stable flies fed on blood by control groups were then defined. A first group of 50 S. calci- piercing the membrane through the mesh of the cage with trans were fed on 8 ml uninfected blood from the B. besnoiti- their mouthparts. free heifer contained in a glass feeder during 1 h while a second

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 83 Parasitol Res group was exposed to the same blood for 24 h (Fig. 1a). At the end, all stable flies were treated as previously described for the end of the exposure, they were immediately knocked down at control groups (dFATand qPCR). The test was replicated once −20 °C for 1 h and dissected. For each group, mouthparts were more. manually removed under a magnifying glass with a needle and pooled into a grinding tube containing 1.4 ml of PBS (Bio-Rad, Experiment 4: experimental transmissions with short exposure Marnes-la-Coquette, France). Abdomens of engorged flies were time to a chronically infected heifer as a source of parasites also opened with a needle, and abdominal contents were col- lected and pooled into the same sterile 4-ml tube containing 3 ml The aim of this trial was to assess the ability of S. calcitrans of PBS. Two tubes were eventually available for each control to transfer parasites from a chronically infected heifer to B. group. After mixing, both 3-ml tubes were equally divided to besnoiti-free bovine blood contained in an artificial glass assess the presence of B. besnoiti by direct fluorescent antibody feeder. A group of 300 stable flies was placed on the rump test (dFAT, entire parasites) and quantitative PCR (qPCR, para- of the chronically infected heifer according to the same site DNA). Blood samples of the B. besnoiti-free heifer before conditions as experiment 3. The duration of the heifer ex- and after exposures (1 and 24 h) to S. calcitrans in glass feeders posure was interrupted after 5 min (Dougherty et al. 1995). were also analyzed with both of these methods. Immediately, all stable flies were allowed to achieve their blood meal on a glass feeder providing the B. besnoiti-free Experiment 2: experimental transmissions blood for 1 h (Fig. 1d). One hour later, 100 stable flies and with tachyzoite-enriched blood as a source of parasites 2 ml blood from the glass feeder recipient were removed to be treated as previously described for the control group. The This step was a preliminary trial of transmission before remaining 200 stable flies were left to feed on the same using a chronically infected heifer as a source of parasites. bovine blood for 24 h before analyses already presented. The aim was to assess the opportunity of B. besnoiti trans- Dead or non-blood-engorged flies were discarded. This trial mission from infected blood to uninfected blood by S. was replicated once again with 400 S. calcitrans (150 flies calcitrans using artificial tachyzoite-enriched blood as a after 1 h and 250 after 24 h). source of parasites and recipient. A group of 100 stable flies was maintained in mesh cages (30×30×30 cm). A first Detection of B. besnoiti double-chambered glass feeder was placed in contact with the upper side of the cage for 3 h. The inner chamber of this The dFATwas essentially achieved as described by Schares et glass feeder contained 8 ml of blood from the uninfected al. (2010) and was adapted to detect entire parasites from the heifer mixed with 108 B. besnoiti culture tachyzoites. After blood glass feeder, as well as the mouthparts and abdominal 3 h, the first glass feeder was removed, and a second glass contents of stable flies. Briefly, before the suspension in a 4 % feeder with B. besnoiti-free blood from the same heifer was formaldehyde solution in PBS and the fixation on slides, red set up for 24 h (Fig. 1b). Quantitative PCR was used to blood cells were hemolyzed by adding nine volumes of sterile detect parasite DNA in 2 ml of blood from both glass water to one volume of blood during 5 min. Parasites were not feeders (donor and recipient). This experiment was replicat- crushed throughout this step. For each test, one immunofluo- ed three times. rescence glass slide, to which were added eight drops, was prepared. Tachyzoites from culture were used as positive Experiment 3: experimental transmissions with long exposure control slides. The parasite suspension was distributed in 15- time to a chronically infected heifer as a source of parasites μl drops on slides, dried at 37 °C, and fixed in ice-cold acetone (−20 °C) for 10 min. Moreover, a highly positive serum The aim of this trial was to assess the ability of S. calcitrans sample from a chronically infected cow (seven drops to ingest B. besnoiti bradyzoites contained in cutaneous per slide) and a negative serum (one drop per slide) cysts via bites. A group of 100 stable flies were transferred were used at 1:200 dilution. This dilution (1:200) was into a 15×15×15-cm cage enclosed by thin wire mesh used as a positive cutoff value (Gentile et al. 2012). allowing them to bite after being placed on bovine skin. Rabbit anti-bovine IgG (whole molecule)–FITC (Sigma- Sedative xylazine hydrochloride (0.1 mg/kg) (Rompun 2 %, Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) was used as a Bayer Inc., Puteaux, France) was administered to the chron- conjugate at a 1:300 dilution according to the manufac- ically infected heifer via intramuscular injection. A 20×20- turer's recommendations. The reading was performed cm2 area of skin on the right side of the rump was washed under a fluorescence microscope at ×400 magnification with water and shaved. An external antiseptic and antifungal (Axio Scope.A1, Carl Zeiss, Le Pecq, France). The presence solution of 10 % povidone iodine (Vétoquinol Vétédine of an entire parasite was confirmed when a complete and Solution, Vétoquinol, Tarare, France) was applied and rinsed. peripheral bright fluorescence of the parasite membrane was The cage was manually maintained for 1 h (Fig. 1c). At the observed (Schares et al. 2010).

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 84 Parasitol Res

Fig. 1 Diagrams of the A – Experiment 1: control group experimental design. a Experiment 1: control group. b Experiment 2: experimental Glass feeder Cattle B. besnoiti-free blood transmission with tachyzoite- enriched blood as a source of Mesh cage Stable flies parasites. c Experiment 3: (n=100) experimental transmissions with long exposure time to a chronically infected heifer as Exposure time = 1 hour (n=50), 24 hours (n=50) a source of parasites. d Ex- 1 replicate periment 4: experimental transmissions with short B – Experiment 2: experimental transmission with tachyzoite-enriched blood as a source of exposure time to a chronical- parasites ly infected heifer as a source of parasites

B. besnoiti-enriched blood Glass feeder 6 B. besnoiti-free blood (12.5.10 tachyzoites per ml)

Mesh cage Stable flies (n=100) Stable flies (n=100)

Step1 Step 2 Exposure time = 3 hours Exposure time = 24 hours 3 replicates

C – Experiment 3: experimental transmissions with long exposure time to a chronically infected heifer as a source of parasites

Stable flies (n=100) Mesh cage

Chronically infected heifer

Bradyzoite cysts

Exposure time = 1hour 2 replicates

Quantitative PCR was used to detect B. besnoiti MX3005P thermal cycler (Agilent Technologies, La Jolla, DNA from bovine skin and blood samples of the two CA), and results were analyzed using the MxPro QPCR heifers, from mouthparts and abdominal contents of S. version 4.10 software (Agilent Technologies, La Jolla, CA). calcitrans and from blood of glass feeders before and A threshold cycle (Ct) value of 40 corresponded to a negative after transmission trials. Before DNA extraction with the result. QIAmp® DNA Mini Kit (Qiagen, Courtabœuf, France) commercial kit, mouthparts of stable flies were previ- ously ground with the TeSeE™ Purification Kit (Bio- Results Rad, Marnes-la-Coquette, France) according to the man- ufacturer's recommendation. B. besnoiti ITS-1 amplifica- Experiment 1. The serum of the B. besnoiti-free heifer was tion was performed with the commercial PCR kit negative for B. besnoiti infection as determined by WB. Its AdiaVet™ Besnoitia (AES Chemunex, Bruz, France). The blood and skin biopsies were qPCR-negative. None of the S. quantitative PCR was performed with the Stratagene calcitrans from both control groups that fed on the blood of

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 85 Parasitol Res

Fig. 1 (continued) D – Experiment 4: experimental transmissions with short exposure time to a chronically infected heifer as a source of parasites

Interruption of blood meal

Cattle B.besnoiti-free blood Stable flies

Step 2 Exposure time Replicate 1: 1 hour (n = 100) 24 hours (n = 200) Replicate 2: 1 hour (n = 150) 24 hours (n = 250)

Step 1 Exposure time = 5 minutes Replicate 1: n = 300 stable flies Replicate 2: n = 400 stable flies this heifer were found positive by the B. besnoiti-specific Experiment 3. The serum of the chronically infected heifer qPCR (Table 1)ordFAT. was clearly positive by WB. Parasite DNA was detected in blood (Ct value of 33) and in two skin biopsy punches from the Experiment 2. This trial showed that S. calcitrans trans- neck and the forelimb with Ct values of 16 and 18, respective- mitted B. besnoiti DNA from highly infected blood to ly. Experiment 3 showed that stable flies could ingest parasites uninfected blood. Indeed, Ct values for the glass feeder from cutaneous cysts after 1 h of exposure. qPCR tests containing tachyzoite-enriched blood were very low in (Table 1) were positive in both replicates with a higher Ct all three replicates (16 and twice 17), which was to be value for the mouthparts than that of the abdominal contents. expected. Parasite DNA was detected in the glass feeder The dFATwas only positive for the gut contents of stable flies. recipient with Ct values of 32 and twice 37 after a 24- h exposure. This checking step allowed the following Experiment 4. DNA was detected in the intestinal contents experiments involving a living heifer acting as a source and mouthparts of S. calcitrans 1 h after the blood meal was donor. interrupted. The Ct values of abdominal contents were lower

Table 1 Cycle threshold values (Ct) of B. besnoiti ITS-1 in S. calcitrans or in blood glass feeders according to experiments

Experiment Replicate Duration of exposure to Number of stable Ct of B. besnoiti ITS-1 flies used per Skin of B. besnoiti- Blood of B. besnoiti- replicate and per In S. calcitrans In recipient blood infected heifer free heifer experiment from glass feeder Mouthparts Abdominal contents

Experiment 1 1 None 1 h 50 No Ct No Ct No Ct 24h 50 NoCt NoCt NoCt Experiment 3 1 1 h None 100 39 34 N.D. 2 100 36 24 N.D. Experiment 4 1 5 min 1 h 100 35 29 34 24 h 200 39 34 32 2 1 h 150 39 27 No Ct 24 h 250 No Ct 33 39

Results of experiment 2 were reported directly in the text No Ct negative Ct values are ≥40; N.D. not determined

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 86 Parasitol Res than Ct values of mouthparts (Table 1). Twenty-four hours or chronically infected cattle as a source of parasites. In after feeding on the infected heifer, the Ct values of the experiment 2, the parasite burden in the blood was signifi- abdominal contents of stable flies were higher (34 and 33 cantly high, which increases the probability of ingestion by according to the replicates) than those obtained after 1- S. calcitrans since no data were previously available. h feeding (29 and 27, respectively, Table 1). No Ct and a Moreover, this level of infection most likely did not occur very high value (39) were recorded from mouthparts 24 h naturally. As shown with experiments 3 and 4, stable flies after feeding according to replicates 1 and 2. The blood in were able to ingest parasites while blood feeding on chron- the glass feeder was positive in the first replicate only, at 1 h ically infected cattle, which has never been demonstrated (Ct034) and 24 h (Ct032) of exposure. Results of dFAT since the survey of Bigalke (1968). Using qPCR for exper- revealed some discrepancy with qPCR. B. besnoiti tachy- iment 4, we did not observe a decrease in Ct values between zoites isolated from Vero cell culture were clearly observed 1 and 24 h after exposure in the abdominal contents of stable on the control slides (Fig. 2a). Entire parasites were clearly flies, suggesting that no effective parasite multiplication had identified in the abdominal contents of the stable flies occurred within the gut of stable flies. Conversely, the (Fig. 2b). No entire B. besnoiti could be observed by dFAT increase of Ct values could imply the death of parasites on the slides in the mouthparts nor in the blood from the and destruction of parasite DNA. One possible explanation glass feeder after any of the exposure times (experiment 3 could be the presence of stomoxyn, a defense helical peptide and 4). of 42 amino acids secreted by the anterior part of the gut after the blood meal, which demonstrated a trypanolytic activity (Boulanger et al. 2002). Stomoxyn probably had a wide range of antimicrobial activities (Boulanger et al. Discussion 2002) that could also include B. besnoiti,giventhatno entire parasite was observed by dFAT after 24 h in the Cattle besnoitiosis has been neglected until its recent geo- abdominal contents of stable flies. graphic expansion in Europe (Olias et al. 2011). Some The parasite burden in the mouthparts was probably very strains have been isolated in various European countries: low. The volume of blood retained in the mouthparts of S. Portugal (Cortes et al. 2006b), Germany (Schares et al. calcitrans was close to 0.4 nl (Scoles et al. 2005), which is 2009), Spain (Fernández-García et al. 2009), Italy (Gentile smaller than the volume of blood contained in the tabanids' et al. 2012), and for the first time in France. mouthparts evaluated at 12.5 nl (Scoles et al. 2008). Bigalke The contamination of mouthparts and abdominal con- (1968) estimated that 52,000 to 292,500 stable fly bites were tents of stable flies was achieved with our protocol using a required to cause infection in cattle whereas only three horse living and chronically infected heifer as a source of B. fly bites were sufficient. Ct values of mouthparts for both besnoiti. The use of laboratory colonies of stable flies has experiments 3 and 4 were very high, which highlighted the the advantage of preventing previous B. besnoiti infections, presence of a low burden of parasite DNA. Indeed, dFAT as also demonstrated by Bigalke (1968). It was about the analysis on this stable fly compartment remained negative in 15th generation of stable flies that was used in November both experiments. The survival time of a parasite in the 2011 (Salem et al. 2012), and no evidence has been collect- mouthparts of S. calcitrans is probably very short, as sug- ed showing that B. besnoiti could pass through the eggs of gested by Bigalke (1968), who did not obtain successful stable flies (Bigalke 1968). contaminations with stable flies 3 h after their interrupted The use of glass feeders with a thin membrane was also and infected blood meal. Firstly, some B. besnoiti parasites efficient for studying the transmission ability of S. calcitrans could have been destroyed by some components of S. calci- by using an artificial and highly tachyzoite-enriched blood trans saliva (Scoles et al. 2005). Secondly, the adapted dFAT

Fig. 2 Positive dFAT for AB tachyzoite culture (a) and for abdominal contents of S. calcitrans (b) after 1-h exposure on blood glass feeder preceded by 5 min of exposure to the heifer's skin (experiment 4). White rows indicate B. besnoiti parasites

10 µm 10 µm

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 87 Parasitol Res probably suffered from low sensitivity. Those facts could also Basso W, Schares G, Gollnick NS, Rütten M, Deplazes P (2011) explain why no entire parasite was detected by dFAT in the Exploring the life cycle of Besnoitia besnoiti—experimental in- fection of putative definitive and intermediate host species. Vet blood of the glass feeder in experiment 4. However, parasite Parasitol 178:223–234 DNA was detected by qPCR and turned out to be positive in Bigalke RD (1968) New concepts on the epidemiological features of recipient blood, suggesting that it was possible to transfer a bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field inves- parasite from a living donor to another host, either by probos- tigations. Onderstepoort J Vet Res 35:3–137 Boulanger N, Munks RJL, Hamilton JV, Vovelle F, Brun R, Lehane cis flushing or by regurgitation (Doyle et al. 2011). MJ, Bulet P (2002) Epithelial innate immunity. A novel antimi- Non-hematophagous arthropods, e.g., Musca domestica crobial peptide with antiparasitic activity in the blood-sucking and Musca autumnalis, which feed on lachrymal secretions, insect Stomoxys calcitrans. J Bio Chem 277:49921–49926 on blood from skin injuries or on other exudative liquids, Cortes HCE, Leitao A, Vidal R, Vila-Vicosa MJ, Ferreira ML, Caeiro V, Hjerpe CA (2005) Besnoitiosis in bulls in Portugal. Vet Record have been suspected to transmit B. besnoiti mechanically. 157:262–264 This has never been confirmed (Bigalke 1968). In this case, Cortes HCE, Nunes S, Reis Y, Staubli D, Vidal R, Sager H, potential routes of mechanical transmission may include Leitao A, Gottstein B (2006a) Immunodiagnosis of Besnoitia bes- parasite transfer from wounds of infected animals to wounds noiti infection by ELISA and Western blot. Vet Parasitol 141:216– 225 of susceptible ones, for example by direct contact of legs, Cortes HCE, Reis Y, Waap H, Vidal R, Soares H, Marques I, da exoskeleton, and licking mouthparts of insects, but this Fonseca IP, Fazendeiro I, Ferreira ML, Caeiro V, Shkap V, could be probably extremely rare in field conditions. Hemphill A, Leitao A (2006b) Isolation of Besnoitia besnoiti To conclude, since the unique survey of Bigalke (1968), we from infected cattle in Portugal. Vet Parasitol 141:226–233 Cuillé J, Chelle PL, Berlureau F (1936) Transmission expérimentale de have collected some evidence with help of modern tools of la maladie dénommée “Sarcoporidiose cutanée” du boeuf parasite detection and proved that S. calcitrans could ingest B. (Besnoit et Robin) et déterminée par “Globidium besnoiti”. Bull besnoiti parasites from a chronically infected heifer harboring Acad Med 115:161–163 cutaneous cysts and could mechanically transmit these para- Diesing L, Heydorn AO, Matuschka FR, Bauer C, Pipano E, Dewaal DT, Potgieter FT (1988) Besnoitia besnoiti: studies on the defin- sites to a uniform recipient substrate. Several improvements itive host and experimental infections in cattle. Parasitol Res can be done on our protocol. For example, the increase of the 75:114–117 number of stable flies implied in these transmission experi- Dougherty CT, Knapp FW, Burrus PB, Willis DC, Cornelius PL ments to 500 or 1,000 could allow the detection of viable (1995) Behaviour of grazing cattle exposed to small population of stable flies (Stomoxys calcitrans L.). App Anim Behav Sci parasites by dFAT and decrease Ct values. Moreover, in epi- 42:231–248 demiological surveys, this protocol could also be applied to Doyle MS, Swope BN, Hogsette JA, Burkhalter KL, Savage HM, discriminate cattle that can be “suitable donors” of B. besnoiti Nasci RS (2011) Vector competence of the stable fly (Diptera: (Bigalke 1968) among a population of seropositive but Muscidae) for West Nile Virus. J Med Entomol 48:656–668 Fernández-García A, Risco-Castillo V, Pedraza-Díaz S, Aguado- asymptomatic animals. In other words, it would be interesting Martínez A, Álvarez-García G, Gómez-Bautista M, Collantes- to estimate the correlation between the Ct values obtained Fernández E, Ortega-Mora LM (2009) First Isolation of from the skin biopsy and the presence or absence of parasite Besnoitia besnoiti from a chronically infected cow in Spain. J and/or parasite DNA in the artificial recipient after the insects' Parasitol 95:474–476 Gentile A, Militerno G, Schares G, Nanni A, Testoni S, Bassi P, interrupted blood meals. Gollnick NS (2012) Evidence for bovine besnoitiosis being en- demic in Italy—first in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from Acknowledgments A. Salem benefits from a Ph.D. grant of the cattle born in Italy. Vet Parasitol 184:108–115 Ministry of Higher Education (Damascus, Syria) and the ENVT. The Jacquiet P, Liénard E, Franc M (2010) Bovine besnoitiosis: epidemio- authors wish to thank Martine Roques, Solange Vermot, and Sonia logical and clinical aspects. Vet Parasitol 174:30–36 Gounaud for their technical assistance. Kiehl E, Heydorn AO, Schein E, Al-Rasheid KAS, Selmair J, Abdel- Ghaffar F, Mehlhorn H (2010) Molecular biological comparison Open Access This article is distributed under the terms of the Creative of different Besnoitia species and stages from different countries. Commons Attribution License which permits any use, distribution, and Parasitol Res 106:889–894 reproduction in any medium, provided the original author(s) and the Liénard E, Salem A, Grisez C, Prévot F, Bergeaud JP, Franc M, source are credited. Gottstein B, Alzieu JP, Lagalisse Y, Jacquiet P (2011) A longitu- dinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abun- dance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France. Vet Parasitol 177:20–27 References Mehlhorn H, Klimpel S, Schein E, Heydorn AO, Al-Quraishy S, Selmair J (2009) Another African disease in Central Europa: besnoitiosis of cattle. I. Light and electron microscopical study. Agosti M, Belloli A, Morini M, Vacirca G (1994) Segnalazione di un Parasitol Res 104:861–868 focolaio di Besnoitiosi in bovini da carne importati. Praxis Vet 15:5–6 Olias P, Schade B, Mehlhorn H (2011) Molecular pathology, taxonomy Alzieu JP, Cortes HC, Gottstein B, Jacquiet P, Dorchies P, Schelcher F, and epidemiology of Besnoitia species (Protozoa: Sarcocystidae). L’Hostis M (2007) La besnoitiose bovine: actualités épidémiologiques Infect Genet Evol 11:1564–1576 et diagnostiques. Bull GTV Hors-série parasitisme des bovins : Pols JW (1960) Studies on bovine besnoitiosis with special reference to 41-–49 the aetiology. Onderstepoort J Vet Res 28:265–356

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 88 Parasitol Res

Salem A, Franc M, Jacquiet P, Bouhsira E, Liénard E (2012) Feeding Scoles GA, Lysyk TJ, Broce AB, Palmer GH (2005) Relative efficiency and breeding aspects of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: under laboratory conditions. Parasite (in press) Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni Stiles (Acari: Schares G, Basso W, Majzoub M, Cortes HCE, Rostaher A, Selmair J, Ixodidae) compared to mechanical transmission by Stomoxys Hermanns W, Conraths FJ, Gollnick NS (2009) First in vitro calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae). J Med Entomol 42:668– isolation of Besnoitia besnoiti from chronically infected cattle in 675 Germany. Vet Parasitol 163:315–322 Scoles GA, Miller JA, Foil LD (2008) Comparison of the efficiency of Schares G, Basso W, Majzoub M, Rostaher A, Scharr JC, Langenmayer biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: MC, Selmair J, Dubey JP, Cortes HC, Conraths FJ, Gollnick NS Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni Stiles (Acari: (2010) Comparative evaluation of immunofluorescent antibody and Ixodidae) with mechanical transmission by the horse fly, new immunoblot tests for the specific detection of antibodies against Tabanus fuscicostatus Hine (Diptera: Muscidae). J Med Entomol Besnoitia besnoiti tachyzoites and bradyzoites in bovine sera. Vet 45:109–114 Parasitol 171:32–40 Taylor DB, Moon RG, Mark DR (2012) Economic impact of stable Schofield S, Torr SJ (2002) A comparison of the feeding behaviour of flies (Diptera: Muscidae) on dairy and beef cattle production. J tsetse and stable flies. Med Vet Entomol 16:177–185 Med Entomol 49:198–209

Chapitre III- Rôle vecteur - article 4 89 SALEM A. 2012

Chapitre IV

Contrôle des stomoxes

Étude expérimentale de la sensibilité de Stomoxys calcitrans aux insecticides (cyperméthrine, deltaméthrine, fenvalérate, λ-cyhalothrine, perméthrine et phoxim)

Chapitre IV- Contrôle 90

SALEM A. 2012

Dans ce chapitre seront envisagés les moyens de lutte contre Stomoxys calcitrans. Ne disposant pas d’informations sur la sensibilité des souches présentes en France nous avons déterminé les DL 50 et 90 de deux souches du Sud Ouest de la France. Pour lutter contre les stomoxes nous disposons de moyens chimiques qui devraient être associés à des moyens mécaniques et ou biologiques.

1- Moyens mécaniques

1.1- Gestion des lieux de reproduction (Hogsette et al., 1987; Schmidtmann, 1991; Foil & Hogsette, 1994). Le contrôle des lieux de reproduction est une étape importante dans le programme de contrôle des stomoxes. Une bonne gestion du tas de fumier avec empilement régulier permet de limiter les lieux de reproduction et de détruire bon nombre de formes larvaires par le processus biothermique. Certains préconisent de brûler les résidus de foins et de paille apportés sur les pâturages (Hogsette et al., 1987). La crémation peut être remplacée par le recouvrement avec un film de polyéthylène noir sous lequel l’élévation de température associée à un défaut d’oxygénation entraine la mort des larves. Autre possibilité, le déplacement de la zone d’affouragement sur les pâtures pour que les restes de foin mélangés aux bouses se dessèchent rapidement, rendant le milieu dysgénésique pour les larves d’insectes mais aussi d’helminthes. L’élimination régulière des restes de foin et de paille constitue un moyen efficace de contrôle des stomoxes

1.2- Piégeage des adultes Les stomoxes sont des insectes diurnes pour lesquels les pièges électriques peuvent être intéressants à l’intérieur. Ils sont attirés comme les mouches domestiques par des radiations ultraviolettes puis électrocutés quand ils rentrent en contact avec les fils électrifiés (Weidhaas & Haile, 1978). Les pièges Nzi ou Vavoua, fabriqués en coton de couleurs bleu et noir, ont été utilisés en Afrique pour lutter contre les mouches tsétsé (Glossina spp.) et pour capturer Stomoxys calcitrans (Mihok et al., 1995; Mihok, 2002; Mihok & Carlson, 2007). En Europe ils sont utilisés uniquement pour effectuer des piégeages comme cela a été le cas pour monter notre élevage (Gilles, 2001). Les panneaux pièges imprégnés d’insecticide sont envisagés avec la lutte chimique.

Chapitre IV- Contrôle - moyens mécaniques 91

SALEM A. 2012

Des bandes collantes tendues sur les murs ou bien suspendues dans les bâtiments permettent de capturer bon nombre de stomoxes qui passent l’essentiel de leur temps posés sur des supports (Williams, 1973; Broce, 1988; Beresford & Sutcliffe, 2006; Taylor & Berkebile, 2006; Gilles et al., 2007). Des « fils à colle » placés au dessus des cornadis permettent de diminuer le nombre de stomoxes. A la Réunion les techniciens du programme POSEIDOM offrent aux éleveurs des conseils pour choisir et placer les différents pièges (Gilles, 2001 cité dans Bastien, 2008).

2- Moyens biologiques

Skovgard et Jespersen en (1999) ont identifié dix espèces parasites des pupes de Stomoxes, hyménoptères: Spalangia cameroni Perkins, S. nigripes Curtis, S. subpunctata Förster, Muscidifurax raptor Girault et Sanders, Pachycrepoideus vindemiae Rondani, Urolepis rufipes Ashmead et Nasonia vitripennis Walker, un Ichneumonidae, Phygadeuon fumator Gravenhorst, un Diapriidae, Trichopria sp., et un coléoptère : Staphylinidae, Aleochara sp. Des différentes études réalisées aux Etats-Unis et au Danemark il ressort que 12 à 20% des pupes récoltées dans la nature sont parasitées. Les agents les plus fréquemment observés appartiennent aux genres Spalangia et Muscidifurax (Meyer & Petersen, 1982; Greene et al., 1989; Foil & Hogsette, 1994; Skovgard & Jespersen, 1999; Olbrich & King, 2003; Romero et al., 2010). Un essai de lutte biologique dans une ferme « bio » a été conduit par Skovgard (2004) en utilisant des lâchers de Spalangia cameroni préalablement élevés sur pupes de Musca domestica. Des lâchers toutes les 2 semaines de 100 femelles par m2 de litière (pendant la saison froide) ou de 200 femelles (pendant la saison chaude) de S. cameroni ont permis de contrôler les populations de M. domestica et de S. calcitrans pour un coût moindre que lors d’utilisation d’un IGR, la cyromazine. Hogsette (1999) a obtenu de bons résultats avec un muscidé Hydrotaea aenescens. Ses larves prédatrices des larves de M. domestica et de S. calcitrans sont capables d’en détruire une vingtaine par jour. Beauveria bassiana, champignon entomopathogène, a été testé en spray ou en poudre en application sur les murs et sur la litière pour contrôler Musca domestica et Stomoxys calcitrans par Watson et al. (1995; 1996). Ils obtiennent des taux de mortalité supérieur à 90% pour M. domestica et de 70 à 84% pour S. calcitrans lorsqu’ils appliquen

Chapitre IV- Contrôle - moyens biologiques 92

SALEM A. 2012

108 conidies par cm² de support. Entomophthora muscae, autre champignon, a été testé avec succès uniquement sur M. domestica (Kramer & Steinkraus, 1987; Geden et al., 1993; Steinkraus et al., 1993). Tous ces moyens de lutte biologique contre S. calcitans ne sont pas pour l’instant commercialisés. Une des difficultés est la production de masse des parasitoïdes, la seconde est la nécessité d’élever l’espèce présente dans la région concernée.

3- Moyens chimiques

3.1- Insecticides utilisés en élevage Les antiparasitaires externes destinés à la lutte contre les mouches du bétail ont évolué du fait de l’apparition de nouveaux principes actifs et de nouvelles formes galéniques. De nouvelles familles de neurotoxiques ont remplacé les organochlorés, les organophosphorés et les carbamates progressivement interdits en Europe. Les régulateurs de croissance des insectes (IGR) sont apparus et utilisés soit seuls soit en association avec les insecticides. Il en existe deux catégories: les analogues de l’hormone juvénile et les inhibiteurs de synthèse de la chitine.

3-1-1- Insecticides neurotoxiques Organochlorés Découvert en 1912, très utilisé chez les animaux et dans l’environnement, le lindane est maintenant proscrit dans la plupart des pays du fait de sa toxicité et du risque d’accumulation dans l’environnement et dans les tissus animaux. Molécule intéressante pour son large spectre et sa persistance elle agit en inhibant l’action de l’acide gamma amino-butyrique et ou en stimulant l’ouverture des canaux sodiques situés sur les cellules nerveuses.

Organophosphorés Ces inhibiteurs des cholinestérases entrainent l’accumulation d’acétylcholine au niveau des synapses neuromusculaires, provoquant une paralysie tonique des arthropodes. Leur spectre est large (mouches, tiques) et de nombreux cas de chimiorésistances ont été décrits depuis le début de leur utilisation dans les années 1950. Les molécules qui ont été les plus utilisées pour le bétail ou les locaux d’élevage sont le coumaphos, le diazinon ou dympilate, le diméthoate le phoxim et le tétrachlorvinphos.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 93

SALEM A. 2012

Carbamates Esters de l’acide carbamique ils agissent comme les organophosphorés en bloquant la cholinestérase. Ils sont moins toxiques pour les vertébrés que les organophosphorés. Les produits utilisés en médecine vétérinaire sont le bendiocarb, le carbaryl et le propoxur.

Pyréthroïdes Les pyréthrines naturelles extraites de fleurs de crysanthème, et les pyrthroïdes de synthèse de première génération peu photo-stables (allethrine, bioalléthrine, tetramethrine, phénothrine, resmethrine et bioresmethrine) ont été peu ou pas utilisés pour le bétail. Les pyréthroïdes de seconde génération, photostables sont largement employés pour lutter contre les mouches du bétail à partir des années 1980. Les principaux sont la perméthrine, la cypermethrine, le fenvalérate, la deltaméthrine, le flucythrinate. Ce sont des insecticides et des acaricides de contact. La flumethrine est essentiellement acaricide. Les pyréthroïdes agissent sur la même cible que les organochlorés en bloquant les canaux sodiques ouverts, entrainant une paralysie tonique de l’insecte. Cela permet de comprendre les cas de résistance croisée organochlorés- pyréthroïdes. Ces produits ont un effet choc ou « Knock down » qui est due à leur action rapide sur le ganglion cérébral. L’insecte est alors paralysé, parfois de façon réversible. S’il récupère, apparait alors une deuxième phase de paralysie tonique liée à l’ouverture des canaux sodiques des nerfs périphériques. Les pyréthroïdes présentent une faible toxicité pour les mammifères mais sont très toxiques pour les poissons. Les délais d’attente sont nuls ou très courts pour le lait ce qui permet de comprendre leur utilisation dans les élevages laitiers.

Néonicotinoides ou chloronicotinyl guanidine Ils bloquent les récepteurs nicotiniques post-synaptiques entrainant une paralysie spastiques mortelle. Leur cible étant propres aux insectes explique leur très faible toxicité pour les mammifères. L’imidacloprid (Reiner, 2002; Reiner et al., 2005), le dinotefuran, et la nithiazine ont été utilisés en applications murales pour lutter contre les mouches domestiques et les stomoxes.

Phenylpyrazolés Le fipronil bloque les récepteurs GABA et glutamate, ce qui empêche l’ouverture des canaux chlore et donc entraine une paralysie tonique des arthropodes.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 94

SALEM A. 2012

C’est un insecticide de contact largement utilisé en agriculture et en médecine vétérinaire. Dès les années 1990 il a été utilisé dans le contrôle des ectoparasites du chien et du chat (puces, poux, tiques, Cheyletiella) (Beugnet & Franc, 2012) et dans celui des tiques du bétail et d’Haematobia irritans (Guglielmone et al., 2000; Alberti et al., 2001). Nous ne disposons pas d’informations concernant son utilisation dans la lutte contre les stomoxes. Aucune publication ne rapporte l’utilisation dans la lutte contre les mouches du bétail du pyriprole qui appartient à la même famille.

Semicarbazone La métaflumizone est un insecticide de contact (utilisé en spot-on chez le chien et le chat) qui bloque les canaux sodiques fermés ce qui conduit a la paralysie et la mort des insectes. Une publication rapporte son intérêt dans la lutte contre les mouches domestiques sous forme d’appât (Ahmad & Zurek, 2009). Un brevet européen, est déposé pour la métaflumizone sous forme de plaquette auriculaire destiné au bétail ou de colliers destiné aux carnivores pour le traitement des arthropodes ectoparasites (Albright et al., 2010). Un autre brevet concerne une forme gel (Fattohi et al., 2010).

Lactones macrocycliques du groupe des spinosynes Les spinosynes commercialisées par Dow AgroSciences LLC (Indianapolis, Indiana, U.S.A.) et utilisées en agriculture depuis 1997 (Thompson et al., 2000 cité dans Gosselin, 2008) sont les derniers insecticides apparus sur le marché vétérinaire dans la lutte contre les puces des carnivores. Produites par des actinomycètes comme Saccharopolyspora spinosa, elles agissent par contact ou par ingestion. L’insecte cesse alors de manger puis se paralyse et meurt. Les spinosynes entraînent une stimulation post synaptique et donc une paralysie, en s’associant et en stimulant les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine et secondairement par blocage du canal chlore du récepteur GABA (Salgado, 1998; Salgado et al., 1998). Le spinosad mélange de spynosyne A et de spinosyne D a été utilisé dans la lutte contre les larves de moustiques. En pulvérisation et sous forme de pour-on White et al. (2007) ont obtenu le contrôle des poux broyeurs et piqueurs des bovins. Davey et al. (2001) ont obtenu un bon contrôle de Boophilus microplus. Des appâts contenant des phéromones, du sucre et du spinosad sont commercialisés pour lutter contre les mouches domestiques. Des formulations sous forme de spray ou de peinture renfermant des spinosynes sont commercialisées dans certains pays pour traiter les murs

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 95

SALEM A. 2012

(SPY®, Novartis Animal Health UK Ltd). Elles mériteraient d’être retenues pour lutter contre les stomoxes dans les exploitations où ils sont devenus résistant aux pyréthroïdes.

Lactones macrocycliques du groupe des avermectines /milbémycines Utilisées sur le bétail depuis les années 1980, les lactones macrocycliques sont des produits de fermentation d’actinomycètes du genre Streptomyces. Ces principes actifs sont désignés endectocides car ils ont pour cible des parasites internes comme les Nématodes, les larves de diptères en migration (Hypoderma) mais aussi des parasites externes: les poux, certains diptères, les acariens des gales. Les lactones macrocycliques agissent en se liant au récepteur glutamate des canaux chlore, ce qui leur confère une activité GABA- mimétique engendrant une paralysie flasque irréversible. Les neurones concernés se situent au niveau de la jonction interneuronale chez les nématodes et au niveau de la jonction neuro-musculaire chez les arthropodes. Le blocage du ganglion pharyngien des nématodes conduit à la cessation de l'alimentation et à la mort des nématodes. L’action sur les jonctions neuromusculaires entraine une paralysie flasque des parasites. Chez Ascaris suum, Fellowes et al. (2000) rapportent une action délétère de l’ivermectine sur la ponte. Ces molécules sont administrées soit par injection soit en pour-on, mais dans ce cas une partie traverse la barrière cutanée et a une action également systémique.

3.1.2- Régulateurs de croissance des insectes Ils inhibent la reproduction des insectes soit en agissant comme un analogue de l’hormone juvénile soit en inhibant la synthèse de la chitine.

Analogues de l’hormone juvénile Ils agissent par contact ou par ingestion sur les stades qui physiologiquement ne contiennent pas (œufs) ou plus (Larve III) d’hormone juvénile. S’ils imprègnent les œufs qui viennent d’être pondus (soit via l’insecte adulte, soit par contact) ces œufs ne pourront pas éclore. Ils agissent également sur les larves III en fin d’évolution les empêchant de se transformer en pupe. Les molécules commercialisées en médecine vétérinaire sont le methoprène, le pyriproxyfène et le fenoxycarb. Le 8-31183 2-ll-methyl~2-(4·phel1oxyphcnoxy) ethoxy] pyridinc a été utilisé en complément alimentaire par Miller (1989) pour contrôler des populations de Musca domestica et de

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 96

SALEM A. 2012

M. autumnalis dans des élevages de porc, de volailles et de bovins. Le methoprène et 3 autres anlogues ont été appliqués par Wright et Smalley (1977) sur le milieu d’élevage des larves de S. calcitrans. Il a obtenu une inhibition de développement en adulte de 93 à 96% selon le produit utilisé.

Inhibiteurs de synthèse de la chitine Ces régulateurs de croissance agissent soit en bloquant la chitine synthétase (benzoylphenyl urées) soit en bloquant la synthèse des protéines de la paroi (triazines, dérivés de la pyrimidine) ce qui dans les deux cas empêche l’éclosion des œufs ou bien l’acquisition d’une nouvelle paroi après une mue. Les produits commercialisés en agriculture ou en médecine vétérinaire sont le flufenoxuron, le triflumuron, le diflubenzuron, le lufénuron et la cyromazine.

3-2- Application des insecticides dans le milieu extérieur

3-2-1- Traitement des supports Les stomoxes comme les mouches domestiques sont principalement posés sur les supports. L’application d’insecticides sur les murs des locaux ou bien sur des tissus tendus donne de bons résultats lorsqu’on utilise des formulations ayant un effet fulgurant et un effet rémanent. Foil et Younger (2006), Hogsette et al. (2008) ont montré l’intérêt de tissus de couleur bleu imprégnés d’insecticide (λ-cyhalothrine, cyperméthrine) comme pièges à stomoxes. Des panneaux d’environ 1 m2 peuvent être utiles à l’extérieur. Beresford et Sutcliffe (2010) au Canada ont placé des panneaux imprégnés de perméthrine dans 3 fermes laitières. Le comptage régulier des mouches sur des panneaux adhésifs a montré que les populations de stomoxes croissaient moins vite dans les 3 fermes traitées comparativement aux 2 fermes témoins, (Taux de croissance des populations par degrés au dessus de 10°C et par jour de 0.0088 pour les fermes traitées et 0.013 pour les fermes témoins, alors que l’année précédente en l’absence de traitement les taux de croissance étaient respectivement de 0.012 et 0.015). En Floride, Meifert et al. (1978) a utilisé des panneaux traités à la perméthrine (2.5g/m2) à raison d’un pour cinq bovins. Ils ont obtenu un contrôle de 84 à 90% des populations de S. calcitrans.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 97

SALEM A. 2012

Il est également utile de traiter les différents gites de repos, barrières, poteaux et murs des hangars. Il est préférable d’appliquer l’insecticide tôt le matin alors que les adultes sont peu actifs, et non aux heures chaudes de la journée. Pour limiter l’apparition de populations résistantes il est préférable d’alterner les pyréthroïdes et les organophosphorés (Gerry et al., 2007) mais aussi d’utiliser les nouvelles familles comme les néonicotinoides et les spinosynes.

3-2-2- Attractifs insecticides Bien que les stomoxes adultes soient des insectes piqueurs, ils peuvent également se nourrir de nectar. Il est inutile d’utiliser pour les stomoxes les attractifs insecticides développés pour les mouches lécheuses en milieu fermé. Vale (1988) au Zimbabwe a obtenu un bon contrôle (99.99%) d’un autre insecte piqueur Glossina morsitans par utilisation de tissus imprégnés d’attractif (1-octène-3-ol) et d’insecticide (deltaméthrine).

3-2-3- Traitement des lieux de reproduction [fumier, bouses, végétaux coupés en fermentation] Elle vise les insectes qui se reproduisent dans les excréments ou sur des végétaux en décomposition. Elle consiste à appliquer des insecticides sur les tas de fumier ou bien de les administrer aux animaux pour qu’ils soient présents dans les fèces.

Application sur les tas de fumier, sur les lieux de reproduction Le traitement des tas de fumier ne doit être envisagé qu’en dernier recours au risque de voir apparaitre rapidement des populations résistantes. Un apport suffisant, régulier avec un bon recouvrement assure la destruction des larves. Il faut également traiter tous les gites de reproduction. Les restes de foin mélangés aux urines et aux bouses sur les lieux de distribution constituent un excellent gite de reproduction des stomoxes. Une simple application en mai de cyromazine (NEPOREX®, Novartis Animal Health UK Ltd) sous forme de granulés a permis à Taylor et al. (2012) d’obtenir une réduction de 97% des émergences d’adultes de Stomoxys calcitrans pendant 65 jours. Bastien (2008) à la Réunion obtenu un effet larvicide en pulvérisant des huiles essentielles avec des efficacités de 88% pour le basilic, 73% pour le tea tree, 58% pour la citronelle et 48% pour le neem. Tobón et Qca Fcéutica (2011) ont utilisé des extraits de Melinis minutiflora qui est une graminée vivace originaire d’Australie.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 98

SALEM A. 2012

Il a observé un effet létal identique ou meilleur que celui de la cyperméthrine sur les larves et les adultes de S. calcitrans. Le triflumuron (BAYCIDAL®, Bayer Environmental Science, Lyon, France) est commercialisé en France pour être pulvérisé sur les fosses à déjection et les litières à la dose de 50 g de principe actif pour 100 m2 avec comme indication « empêche la mue des larves d’insectes »

Administration en additif alimentaire La fraction d’insecticide ou d’IGR éliminée par les fèces ou les urines détruit les larves ou bloque leur évolution. Wright et al. (1975) ont administré dans l’alimentation de 19 rhinocéros d’un parc zoologique un régulateur de croissance (Thomson-Hayward TH 6040 (N-(4-chlorophenyl)-N’-(2,6- difluorobenzoyl) urea), a une dose proche de 1 ou de 0,1 mg/kg d’animal. Les fèces récoltées n’ont pas permis le développement des larves de M. domestica et de S. calcitrans. Miller (1996) prévient le développement des larves de S. calcitrans sur la litière de bovins recevant quotidiennement 0.5 ou 1 mg de cyromazine par kg de poids vif dans l’aliment (LARVADEX®, Novartis Animal Health Inc., Basel, Switzerland, normalement destiné aux volailles). L’administration quotidienne de 5 µg/kg d’ivermectine assure la destruction de 60% des larves de S. calcitrans. L’efficacité atteint 90% a une posologie de 20 µg/kg et par jour. Les contraintes de l’administration quotidienne avaient été évitées par l’utilisation de bolus qui ont été retirés du marché du fait des risques éco-toxicologiques.

Administration par voie Intramusculaire d’insecticides systémiques L’administration d’ivermectine injectable à la dose recommandée (200 µg/kg) a une action sur le développement des larves d’H. irritans mais pas sur celles de S. calcitrans (Miller, 1981).

Administration en pour-on d’insecticides systémiques. Floate et al. (2001) ont comparé l’efficacité d’application de lactones macrocycliques sur le développement dans la litière des larves d’H. irritans, de M. domestica et de S. calcitrans au cours de 2 essais. Ils ont testé l’ivermectine (IVOMEC® Pour-on), la moxidectine (Cydectin), la doramectine (DECTOMAX® Pour-On) et l’éprinomectine (EPRINEX® Pour-On) à la dose recommandée de 500 µg/kg.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 99

SALEM A. 2012

Les insecticides du premier groupe (doramectine, eprinomectine et ivermectine) inhibent le développement des larves d’H. irritans pendant les 4 semaines du premier essai et l’ivermectine pendant 8 des 9 semaines du deuxième essai. Comparativement la moxidectine a une incidence faible sur le développement d’H. irritans. Dans les mêmes conditions on observe dès la deuxième semaine selon l’essai une survie des larves de Stomoxys calcitrans d’environ 10% avec la doramectine, 61% avec l’éprinomectine, 58 ou 80% avec l’ivermectine et 40 ou 74% avec la moxidectine. Ces études montrent une fois encore la différence d’activité entre les lactones macrocycliques des groupes avermectine et mylbémicyne.

3-3- Application des insecticide sur les bovins

Nous rapportons ici que l’utilisation des insecticides chez les bovins car nous n’avons pas trouvé des publications concernant la lutte contre les stomoxes chez les chevaux et les ovins. Le traitement des bovins présente l’avantage de les protéger quand ils sont au pâturage et a pour cible toutes les espèces diptères qui parasitent les bovins. Cette lutte est très efficace sur les espèces sédentaires, qui sont en contact prolongé avec l’insecticide appliqué sur les animaux. C’est le cas des H. irritans et des Hippobosca equina. Elle est moins efficace et moins durable sur les mouches lécheuses qui séjournent peu sur les animaux mais qui ne les piquent pas comme Musca autumnalis et Musca domestica. Elle est peu efficace pour les espèces qui ne sont sur les animaux qu’au moment des piqûres comme les stomoxes et les tabanidés. Cela explique le faible nombre d’études portant sur les stomoxes. L’insecticide peut être appliqué sur le tégument des animaux par l’éleveur ou bien par les bovins eux- mêmes avec des sacs à poudre ou des rubans frottoirs qui ne sont pas commercialisés en Europe et pour lesquels il n’y pas de publications concernant leur efficacité sur les stomoxes. La lutte contre les mouches du bétail a pris de l’importance avec l’apparition sur le marché des pyréthroïdes en pulvérisation. Ainsi 2 ou 3 applications de 200 à 500 ml de préparation insecticide permettent de contrôler les populations d’H. irritans et de Musca pendant la belle saison. Les principes actifs les plus fréquemment utilisés selon les pays sont la cyhalothrine, la cypermethrine, la deltaméthrine, le fenvalérate et la permethrine. Différentes publications rapportent des efficacités de 60 à 90% sur les populations d’H. irritans pendant 3 à 4 semaines et de 30 à 90% sur les Musca autumnalis. Les valeurs les plus élevées étant obtenues dans les jours qui suivent chaque application (Bailie & Morgan, 1980; Stubbs et al., 1982; Holroyd et al., 1984; Wright et al., 1984; Franc, 1986).

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 100

SALEM A. 2012

Peu de données concernent les stomoxes. Bailie (1980) rapporte que l’application de 500 ml d’une solution à 0.1% de permethrine permet un bon contrôle des stomoxes pendant une semaine. Les avantages des pulvérisations sont la responsabilisation de l’éleveur qui va traiter dès l’apparition des populations de stomoxes et le fait qu’il va pouvoir insister sur les pattes lieux de prédilection des stomoxes. Les produits utilisés sont lipophiles et de ce fait ne sont pas lessivés par la pluie. Les boucles ou plaquettes auriculaires (Ear tag) sont constituées d’une trame polyvinylique renfermant l’insecticide. Le principe actif lipophile libéré de la boucle diffuse peu à peu dans le film lipidique superficiel. Les frottements des animaux les uns contre les autres facilitent la migration de l’insecticide à la surface du tégument. La tête et les épaules sont les parties les plus imprégnées alors que les stomoxes se nourrissent habituellement sur les pattes. Les principes actifs utilisés qui ont fait l’objet de publications sont un organophosphoré « le tetrachlorvinphos » et des pyréthroïdes « cypermethrine, deltamethrine, fenvalérate, flucythrinate et permethrine » (Williams & Westby, 1980; Knapp & Herald, 1981; Williams et al., 1981; Lewis & Block, 1982; Williams & Westby, 1982; Harvey & Brethour, 1983; Kopp & Meyer, 1983 ; Kunz et al., 1983; Owen & Nelson, 1983; Burton et al., 1984; Hall & Fischer, 1984; Kopp et al., 1984; Miller et al., 1984a-b; Pecheur, 1985; Taylor et al., 1985). Les résultats sont bons avec les pyréthoïdes sur les H. irritans avec des efficacités de 70 à 100% selon les études pendant 12 à 17 semaines. Hogsette et Ruff (1986) ont obtenu avec des plaquettes auriculaires renfermant du flucythrinate ou de la perméthrine un contrôle des H. irritans pendant 15 à 17 semaines. Ils ont observé une diminution des populations d’adultes de S. calcitrans pendant 10 semaines.

Les pour-on à effet de surface, sont des préparations insecticides qui sont déposées sous un faible volume (10 à 40 ml/bovin) sur la ligne dorsolombaire. Le principe actif diffuse dans le film lipidique superficiel et se répand ainsi à la surface du tégument. Des formulations à base de pyréthroïdes (cypermethrine, deltaméthrine de cyfluthrine et de cypermethrine), sont commercialisées pour les bovins. Les cibles revendiquées pour les A.M.M. sont les mêmes que celles des produits destinés aux pulvérisations mais avec une rémanence plus grande. L’indication stomoxes n’est jamais proposée.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 101

SALEM A. 2012

Les pour-on mixtes, sont des préparations insecticides et anthelminthiques qui sont déposées sous un faible volume (10 à 40 ml/bovin) sur la ligne dorso-lombaire. Une partie du principe traverse le tégument et par voie sanguine peut atteindre des helminthes du poumon et du tube digestif, les larves d’hypoderme en migration, les ectoparasites hématophages (poux piqueurs, H. irritans) l’autre partie reste à la surface du tégument et a pour cibles les poux broyeurs, les acariens superficiels. Ils sont à base de lactones macrocycliques (eprinomectine, doramectine) et n’ont pas l’indication S. calcitrans.

Il ressort de cette synthèse que la lutte contre les stomoxes diffère de celle des autres mouches responsable de nuisance chez les bovins H. irritans, M. domestica et M. autumnalis. Le traitement des animaux doit être associé à des mesures mécaniques (déplacement des aires d’affouragement sur les pâturages) et des traitements des supports. Etant donné que les formulations destinées au traitement des bovins ou à celui des murs n’ont pas l’indication S. calcitrans il nous a semblé indispensable de disposer des DL50 et des DL90 de souches françaises ce qui a fait l’objet d’une publication dans l’International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine.

Chapitre IV- Contrôle - moyens chimiques 102

SALEM A. 2012

Article 5

Susceptibility of two European strains of Stomoxys calcitrans (L.) to Cypermethrin, Deltamethrin, Fenvalerate, λ-cyhalothrin, Permethrin and Phoxim

(International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, 2012, 10, 3: 249-257)

Chapitre IV- Contrôle - article 5 103

7,-%8!*#*$*!(&59&E:5&F7/58%"+&,!/"*+,&59& !5K5?(,&-"$-*!/"+,&=06>&!5&I(8%/K%!

2%?=@0$="0>$#%.#%A=$=+>"0)0B>#4%C!>D#$+>" %.#%F0G)0G+#4%H5,F4% 5A4%IJ%623KL%F0G)0G+#4%I$=!<# 7% 5*'4%C-*26624%F0:=)>94%*#+#=$!%I00.%F0:><0)0B;4%IJ6237K%F0G)0G+#4%I$=!<# 6%C!>D#$+>" %.#%F0G)0G+#4%H5,F4% 5A4%F0:=)>94%IJ%623KL%F0G)0G+#4%I$=!<# ON0$$#+(0!.>!B%=G"M0$ 91P$=!

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

!"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.%#%,0)1%234%501%64%73271 !" Chapitre IV- Contrôle - article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`&59&\*%,&9/5K&BT&G5/:%@*"+&9"/K,&:%/%& :<%+&!"X*+@&"&#$55.&K%"$&T26& ,!"#$%&\*%,6 f*,!5/*-"$$()&,!"#$%&\(&-5+!/5$&8/5@/"K,& 157@<%/!(&#"%=)6R&5#,%/O%.&-5:,&*+9%,!%.& <"O%&95-7,%.&5+&".7$!&8587$"!*5+,&:*!<& :*!<&3)&23)&"+.&B33&,!"#$%&\*%,6&E<%,%&\*%,& !<%&"88$*-"!*5+&59&*+,%-!*-*.%,&!5&-"!!$%&"+.& *+.7-%.&$*+%"/&*+-/%",%,&59&<%".&"+.&%"/& ,!"#$%&:"$$,6&f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b6 6&-"!!$%& *K8/%@+"!%.&8"8%/,&95/&B&<57/6&E<*,&K%!<5.& *+.7,!/(&/%"-<%.&"&!5!"$&59&cT)TBB&K*$$*5+&BR6 :",&"."8!%.&9/5K&!<5,%&,7@@%,!%.&.7/*+@&!<%& Z"$%&"+.&9%K"$%&8"090:;+%<=)<>"$=!+%"/%& U!<&a+!%/+"!*5+"$& (K85,*7K&5+&F-!58"/"C #*!*+@&\*%,6&G7K%/57,&"@%+!,&"/%&!/"+,K*!!%.& ,*!%,&59&W%!,&!5&!%,!&,"+.&\(&"+.&K5,A7*!5& K%-<"+*-"$$(&#(&,!"#$%&\*%,P&W=<>))G+%=!J ,7,-%8!*#*$*!(&!5&*+,%-!*-*.%,6& "M$=<>+4%W$G<#))=%,886)O*+%&.*"//<%"&O*/7,)& + #,$& -". ').+,#/()" F$;(=!0+09=%#D=!+>&"+.&8/5#"#$(&W#+!0>">=% @#+!0>">6&a+&"..*!*5+&!5&!<%&8"*+&!<%(&*+\*-!)& *+,-./0.01-,& ,!"#$%&\*%,&-"7,%&,X*+&$%,*5+,&"9!%/&#*!*+@& *?&+%7/5!5?*-&*+,%-!*-*.%,&:%/%&7,%.&*+&!<*,& ,8%-*[-&8"/!,&59&!<%&"+*K"$R,.(&B)&BLCBU6 ,!7.(P&[O%&8(/%!&"+.&5+%&5/@"+58<5,8<"!%&=8<5?*K>6& E<%(&7,7"$$(&.%"$&:*!<&V=#9="0@>=%>$$>"=!+)& Y$$&-5K857+.,&:%/%&8/5.7-%.&#(& & <5/,%&\*%,)&-G+<=%.09#+"><=)%-G+<=%=G"G9J WF EYGY0 &"+.&87/-<",%.&9/5K& *@K"& !=)>+&"+.&8"090:;+%<=)<>"$=!+%6B4CTL&e+$(&"& Y$./*-<&= "*+!Ci7%+!*+&;"$$"O*%/)&;/"+-%>6& 9%:&87#$*-"!*5+,&/%85/!&./7@&%99%-!*O%+%,,& Y$$&!<%&.5,%,&:%/%&%?8/%,,%.&*+&K@&59&"-!*O%& "@"*+,!&81%<=)<>"$=!+&"$5+%6&f5@,%!!%&#"%=)6&T2& *+@/%.*%+!&8%/&K(6&W7/%&"-%!5+%&:",&7,%.&!5&

#$ ,0)1%234%501%64%7327%#% !"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.1 Chapitre IV- Contrôle - article 5 105 .*$7!%&!<%,%&"-!*O%&*+@/%.*%+!,&7+!*$&/%A7*/%.& -5$$%-!%.&*+&T3B3&5+&"+&5/@"+*-&-"!!$%& -5+-%+!/"!*5+,&:%/%&/%"-<%.&"+.&"$,5&!5& 9"/K&:<%/%&!<%/%&<",&#%%+&+5&*+,%-!*-*.%& 5#!"*+&"&+%@"!*O%&!%,!&-5+!/5$6& ,8/"(*+@&*+&!<%&8",!&B3+&(%"/,6&E<*,&9"/K& E5&%,!"#$*,<&!<%&23`&$%!<"$&.5,%&=0123>& *,&$5-"!%.&S3&XK&,57!<:%,!&59&E57$57,%6 "+.&!<%&43`&$%!<"$&.5,%&=0143>)&*+,%-!,& &-2=0+?#@-/:81, :%/%&%?85,%.&!5&!%+&@/".7"$$(&*+-/%",*+@& [5!<&".7$!&\(&-5$5+*%,&:%/%&K"*+!"*+%.& .5,%,P&-(8%/K%!&"+.&:%/%&@*O%+& .%$!"K%!)&:<%/%",&!<%&,%-5+.& !<%&K"+79"-!7/%/&95/&-"!!$%&:",&:*!<*+&!<%& @/578&:",&9%.&:*!<&<5+%()&:"!%/)&"+.&#$55.& /"+@%&59&!%,!%.&.5,%,&"+.&-"$-7$"!%.&"--5/.C 7,*+@&"&.57#$%C-<"K#%/%.&@$",,&9%%.%/&K".%& *+@&!5&!<%.(&,7/9"-%&"/%"6TS& #(&"&$5-"$&@$",,#$5:%/&=#$55.C%+@5/@%.&

=KT>&l&36B&?&j[5.(g%*@636QU2& \*%,>6&E<*,&,(,!%K&"$$5:,&!<%&#$55.&!5&#%& ;5/&%?"K8$%)&!<%&/%-5KK%+.%.&.5,%&59&.%$C X%8!&"!&"&,!"#$%&!%K8%/"!7/%&59&RU6L I)&#(& !"K%!)&!<"!&*,&!5&,"(&RS62& 57!%/&-<"K#%/&7,*+@&"+&%$%-!/*-&<%"!&87K8& K@&M&K(&=S62&K@&MK$&95/&[7!5?&S62&W57/&5+&& =F1C2&f%"!*+@&I*/-7$"!5/&:*!<&e8%+&["!<)& a+!%/O%!)&[%"7-57_ )&;/"+-%&>6& ]7$"#5)& %%$#"-<)&p%/K"+(>6&&&&&& (/234-#546#7848+0-,#9,-1#0+#/:-# [5O*+%&#$55.&:",&857/%.&*+&!<%&*+C !;<-=0>-+/, +%/&-<"K#%/)&:<*-<&:",&,%"$%.&:*!<&"&!<*+& E:5&,!/"*+,&59&81%<=)<>"$=!+&:%/%&%,!"#C ,(+!<%!*-&K%K#/"+%&=W"/"[$K&RZ)&W%-<*+%(& $*,<%.&*+&!<%&0"#5/"!5/(&59&W"/",*!5$5@(&"!& W$",!*-&W"-X"@*+@)&I<*-"@5)&a0>6&E<%&@$",,& !<%&G"!*5+"$&H%!%/*+"/(& -<55$&59&E57$57,%& 9%%.%/&:",&8$"-%.&*+&-5+!"-!&:*!<&!<%&788%/& =FGHE>6& ,*.%&59&!<%&-"@%)&!<7,&%+"#$*+@&!<%&,!"#$%& \*%,&!5&8*%/-%&!<%&!<*+&K%K#/"+%&*+&5/.%/&!5& #&&FGHE&,!/"*+6&Y!&!<%&O%!%/*+"/(&,-<55$)& ./":&#$55.6&E<%&#$55.&:",&-5$$%-!%.&:%%X$(& -"!!$%&"+.&,!"#$%&:"$$,&:%/%&9/%A7%+!$(& 9/5K&"&#$55.&.5+5/&-"$96&E<*,&BLCK5+!<&5$.& !/%"!%.&:*!<&.%$!"K%!& K"+7"$$(&/%K5O%.&9/5K&-"!!$%&5/&-"7@)& Y9/*-"&95/&!<%&-5+!/5$&59&!,%!,%&\*%,&)TU!& 23`&=/B3`&rf>&<7K*.*!()&"+.&7+.%/&"&BT& *,&+5:&:*.%$(&7,%.&95/&!<%&-"8!7/%&59&81% 0*@"$=!+6&T4)R3&8"090:;+%<=)<>"$=!+%:%/%& !%/&%K%/@%+-%)&".7$!&8587$"!*5+,&9/5K&@/578& "#$%&!5&#%&*.%+!*[%.&"--5/.*+@&!5&n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

!"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.%#%,0)1%234%501%64%73271 #% Chapitre IV- Contrôle - article 5 106 :",&/%$%",%.&:*!<&!%+&.*99%/%+!&*+,%-!*-*.%& FK"?&*,&!<%&K"?*K7K&$%!<"$&%99%-!)&0123& -5+-%+!/"!*5+,6&E

"+.&I"#"+"->)&"+.&K%"$&-"!%@5/(&=#$55.C -7/O%6&;5/&%"-<&./7@)&!<%&0143&:",&-"$-7C

%+@5/@%.&M&+5+C#$55.C%+@5/@%.>&:%/%& $"!%.&7,*+@&!<%&%,!*K"!%.&O"$7%,&59&FK"?)&

8%/95/K%.&7,*+@&"&!5!"$&59&BL)L33&".7$!&\*%,& 0123&"+.& *+&!<*,&!/*"$6 &-,A4/,& !;<8,A=-#/8#*+,-./0.01-,& Y$$&B)LL3&,!"#$%&\*%,&=ST&-5+!/5$&@/578,& a+,%-!*-*.%&,%+,*!*O*!(&59&8"090:;+%<=)<>J 59&T3&\*%,&%"-<>&:%/%&"$*O%&"9!%/&B+%C<57/& "$=!+%:",&!%,!%.&*+&!<*,&,!7.(&#(&%?85,*+@& -5+!"-!&:*!<&87/%&"-%!5+%C*K8/%@+"!%.&8"C !<%K&!5&*K8/%@+"!%.&[$!%/&8"8%/,6&f"$9&[$!%/& 8%/,6&F"-<&./7@&/%"-<%.&"&K"?*K7K&%99%-!&

8"8%/&.*,-,&=g<"!K"+)&BU2&KK&.*"K%!%/>& =FK"?>&59&B33`&59&K5/!"$*!(6&E<%&0123&"+.&

:%/%&-7!)&95/K*+@&"&-5+%&:<%+&8/58%/$(& !<%&0143&:%/%&-"$-7$"!%.&95/&!<%&.*99%/%+!& 95$.%.6&E<%(&:%/%&*K8/%@+"!%.&:*!<&T&K$& ./7@,)!<&,!/"*+,&=FGHE&,!/"*+&"+.&I"C "-%!5+%&=-5+!/5$>&5/&:*!<&"+&*+,%-!*-*.%C #"+"-&,!/"*+>&"+.&95/!<&-"!%@5/*%,&59&\*%,& "-%!5+%&,5$7!*5+6&e+-%&./()&!<%(&:%/%&-5*$%.& =#$55.C%+@5/@%.&"+.&+5+C#$55.C%+@5/@%.& *+!5&"&-5+%&,<"8%&=;*@7/%&B>6&g<"!K"+& \*%,)&E"#$%&B>6&E<%&.5,%C/%,85+,%&-7/O%,&"/%& [$!%/&8"8%/&,%"$*+@&.*,-,&59&43&KK&.*"K%!%/& 8/%,%+!%.&95/&!&:%/%&!/%"!%.&*+&!<%&,"K%&:"(&:*!<&4L3& 5+$()&;*@7/%,&T&"+.&R&/%,8%-!*O%$(>&"+.& 3$&59&,5$7!*5+6&E<%&-5+%,&:%/%&8$"-%.&*+&"& 8<5?*K&=+5!&7,%.&"!&!<%&FGHE&95/&K5/%& -($*+./*-"$&8$",!*-&-5+!"*+%/&=2&-K&.*"K%!%/& !<"+&T3&(%"/,&"+.&*+&!<%&5/@"+*-&9"/K&95/& u&B3&-K&<%*@&-5O%/%.&:*!<&@$",,&9%"!7/C K5/%&!<"+&BR&(%"/,)&;*@7/%&L>6& *+@&"&BC-KC.*"K%!%/&<5$%6& r%@"/.*+@&!<%&%99%-!&59&#$55.&K%"$&5+&

E:%+!(&".7$!&81%<=)<>"$=!+&:%/%&!<%+& *+,%-!*-*.%&%9[-*%+-()&!<%&/"!*5,&59&0123&5/&

/%K5O%.&9/5K&"&-5$5+(&:*!<&"+&",8*/"!5/& 0143&95/&#$55.C%+@5/@%.&\*%,&5O%/&0123&

"+.&#$5:+&*+!5&!<%&-5+%&!

E<%&-5+%&:",&!<%+&-"/%97$$(&,%"$%.&:*!<&"& -"$-7$"!%.&95/&%"-<&,!/"*+6&E<%&0123&"+.&!<%&

[$!%/&8"8%/&.*,-6&E<%&@$",,&:",&/%K5O%.&"+.& 0143&:%/%&<*@<%/&95/&!<%&#$55.C%+@5/@%.& /%8$"-%.&#(&!<%&-5+!"*+%/&-"8&=;*@7/%&B>6& \*%,&!<"+&95/&!<%&+5+C#$55.C%+@5/@%.&\*%,6& E<%&\*%,&:%/%&+5!&"+%,!<%!*_%.&.7/*+@&!<%& E<*,&.*99%/%+-%&:",&5#,%/O%.&*+!<&,!/"*+,&

K"+*87$"!*5+6&;5$$5:*+@&BC<57/&%?85,7/%)& 59&81%<=)<>"$=!+6&E<%&/"!*5,&59&0123&95/& !<%&-5+%&:",&58%+%.&*+&"&@$",,&-"@%&"+.&!<%& #$55.C%+@5/@%.&5O%/&+5+C#$55.C%+@5/@%.& \*%,&:%/%&-57+!%.6&E<%&K5/!"$*!(&-/*!%/*"& \*%,&:%/%)&/%,8%-!*O%$(&95/&!<%&FGHE&,!/"*+& :%/%&#",%.&5+&!<%&gfe&-/*!%/*"P&\*%,&:%/%& "+.&I"#"+"-&,!/"*+&P&B6S&"+.&T6B&95/&8<5?*Kx& -5+,*.%/%.&O.%".P&:<%+&!<%(&:%/%&.%".)& R62&"+.&T62&95/&.%$!"K%!6& [%.&=E"#$%&B>6&a+.%%.)&!<%&/"!*5,&#%!:%%+& E<%&.5,%C%99%-!&/%$"!*5+,<*8,&:%/%&"+"$(_%.& !<%&0123&"+.&0143&59!<&,!/"*+,&=FGHEM I"#"+"->&/"+@%.&9/5K&2&!5&B3&95/&!&"+.&9/5K&R&!5&R6U&95/&!<%& (C-(<"$5!

# ,0)1%234%501%64%7327%#% !"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.1 Chapitre IV- Contrôle - article 5 107 !"#$%&'%8G+<#(">@>)>";%0P%"M#%"X0%+"$=>!+%0P%81%<=)<>"$=!+%"0%>!+#<"><>.#%$#+>.G#+%0!%[)"#$%(=J (#$+1

C8?H>(J G>?H>(J D'EF D'MF G/#(L'LJ 76<-=>-/:=0+#G=-.8>>-+1-1#18,-)#OPE#>?H>(J I"#"+"-&+5+C#$55.C%+@5/@%. BB62&=36L> R36R& C C C C 36TL I"#"+"-&#$55.C%+@5/@%. BU64&=364> 2L64& B6Q B6U C C 36LR FGHE&+5+C#$55.C%+@5/@%. 236L&=T6B> TBT6Q& C C L6L S B6S

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

81Z1%R%8"=!.=$.%Z#D>=">0! =%?ZS3%@)00.J#!B0$B#.%\>#+%\%?ZS3%!0!J@)00.J#!B0$B#.%\>#+ @%?ZT3%@)00.J#!B0$B#.%\>#+%\%?ZT3%!0!J@)00.J#!B0$B#.%\>#+ <%8G+<#(">@>)>";%$=">0%S3R%)#"M=)%.0+#%S3%D=)G#%0P%H5,F%+"$=>!%.>D>.#.%@;%)#"M=)%.0+#%S3%D=)G#%0P%N=@=!=<%+"$=>! .%8G+<#(">@>)>";%$=">0%T3R%)#"M=)%.0+#%T3%D=)G#%0P%H5,F%+"$=>!%.>D>.#.%@;%)#"M=)%.0+#%T3%D=)G#%0P%N=@=!=<%+"$=>! #%?ZT3%\%*#<099#!.#.%.0+#

!"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.%#%,0)1%234%501%64%73271 #& Chapitre IV- Contrôle - article 5 108 ()*+,$%&'%8

E<%&0123&"+.&0143&59&!<%&I"C #"+"-&,!/"*+&:%/%&,*K*$"/&!5&!<5,%& 87#$*,<%.&#(&Z"/ 5+&#"%=)6&RR&95/& 8%/K%!

\*%,&59&!<%&-5+!/5$&@/578,6& K*+7!%,&"+.&5#!"*+%.&"+&0123&59&R&K@MKT& ;$*%,&"/%&*+&-5+!"-!&:*!<&!<%&*+,%-!*-*.%& 95/&!<%&,7,-%8!*#$%&,!/"*+&9/5K&Z"7/*!*7,6& 5/&"-%!5+%C*K8/%@+"!%.&[$!%/&8"8%/&95/& E<%&%+@5/@%K%+!&,!"!%&*,&+5!&/%85/!%.6&a+& !<%&8/%,%+!&,!7.()&!<%&.%$!"K%!&"+.&S6T&=#$55.C T !"-!&:*!<&!<%&8"8%/&#(&8$"-*+@&!<%K&#%!:%%+& %+@5/@%.>&K@MK 6 !:5&!/%"!%.&9"#/*-,)&",&"$,5&.%,-/*#%.&#(& ;5/&"$$&./7@,)&!<%&*+,%-!*-*.%&.5,%,& RT f5@,%!!%&%&&"$6& &a!&:",&+5!&!<%&-",%&:*!<& 8/5.7-*+@&43`&K5/!"$*!(&=0143>&:%/%& Z"/ 5+&#"%=)6&RR&7,*+@&*K8/%@+"!%.&[$C !%/&8"8%/,&8$"-%.&*+&8$",!*-&W%!/*&.*,<%,6& ()*+,$%-'%FM#%90$"=)>";%$="#+%P0$%"M#%"X0%+"$=>!+%0P% a+&!<*,&,!7.()&!<%&\*%,&"/%&+5!&"+%,!<%C @)00.J#!B0$B#.%81%<=)<>"$=!+%=P"#$%0!#%M0G$%<0!J !*_%.&*+&5/.%/&!5&"O5*.&!<%&K5/!"$*!(& "=<"%X>"M%.#)"=9#"M$>!%$#+>.G#+%0!%[)"#$%(=(#$+1% /*,X6&g%&"/%&"#$%&!5&!%,!&,*K7$!"+%C 57,$(&.*99%/%+!&8/5.7-!,&"+.&.*99%/%+!& -5+-%+!/"!*5+,&5+&T3&\*%,&8%/&@/5786& E<%&K%!<5.&,7@@%,!%.&#(&F&:",&-<5,%+&,5&",&!5&8/%O%+!&85,C ,*#$%&O"/*"!*5+,&*+&*+.*O*.7"$&%?85,7/%& *+&-5//%$"!*5+&:*!<&!<%&/%A7*/%.&!*K%& !5&*+!/5.7-%&!<%&T3&*+,%-!,&*+!5&!<%& .%O*-%6&a!&*,&$5+@%/&!<"+&!<%&+"!7/"$& -5+!"-!&.7/"!*5+&:*!<&!<%&-5"!&59&-"!!$%& *+&!<%&[%$.6&a+.%%.)&,!"#$%&\*%,&-"+&!"X%& 5+%&R2)RQ&!5&!:5&5/&%O%+&!

#! ,0)1%234%501%64%7327%#% !"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.1 Chapitre IV- Contrôle - article 5 109 -5K8"/%.&!5&!<%&/%-5KK%+.%.&.5,%,6& ()*+,$%.'%FM#%90$"=)>";%$="#+%P0$%"M#%"X0%+"$=>!+%0P% g<%+&-5+,*.%/*+@&!<%&[O%&8(/%!"$=!+%=P"#$%0!#%M0G$%<0!J

0143&O"$7%,&95/&!<%&I"#"+"-&,!/"*+&:%/%& "=<"%X>"M%P#!D=)#$="#%$#+>.G#+%0!%[)"#$%(=(#$+1 :*!<*+&!<%&/%-5KK%+.%.&.5,%&/"+@%& 59&9%+O"$%/"!%&=E"#$%&B&"+.&;*@7/%&R>& #7!&:%/%&957/&!*K%,&$5:%/&!<"+&!<%& /%-5KK%+.%.&.5,%&59&-(8%/K%!)&K%"+*+@&!<"!&K"?*K7K&%99%-!*O%C +%,,&,<57$.&#%&"+!*-*8"!%.&95/&"$$&./7@,& "@"*+,!&!<*,&,!/"*+6&;5/&!<%&FGHE&,!/"*+&

=#$55.C%+@5/@%.&\*%,>)&!<%&0143&/%-5KC K%+.%.&.5,%&/"!*5&/"+@%.&9/5K&T6L&!5& TT6Q)&K%"+*+@&!<"!&/%-5KK%+.%.&.5,%,& 59&!<%&[O%&8(/%!)&!:5&-5KC K5+$(&7,%.&*+,%-!*-*.%,&5+&!<%&,*!%6& g<%+&-5+,*.%/*+@&!<%&%99%-!,&59& :*!<&8(/%!& 5!<%/&*+,%-!*-*.%&9"K*$*%,&,7-<&",&"O%/K%-C :",&-$5,%&!5&!<%&0123&=LR64&K@MKT)&E"#$%& !*+%,&=%8/*+5K%-!*+>)&&5/&5/@"+58<5,8<"!%,& B>&"+.&5#,%/O"!*5+,&59&;*@7/%&T&-5+[/K&!<"!& =8<5?*K>&5+&"+*K"$,&",&:%$$&",&*+,%-!& *!&:57$.&8/5.7-%&"#57!&L3C23`&K5/!"$*!(6& @/5:!<&/%@7$"!5/,&=-(/5K"_*+)&!/*\7K7/5+>& ;5/&9%+O"$%/"!%)&!<%&/%-5KK%+.%.&.5,%& *+&!<%&%+O*/5+K%+!&-57$.&#%&/%-5KK%+.%.& T =B3Q&K@MK >&:",&K7-<&$5:%/&!<"+&!<%&0123& *+&!<*,&"/%"&:<%/%&/%,*,!"+-%&*,&957+.6 =LBS6S&K@MKT)&E"#$%&B>&"+.&5#,%/O"!*5+,&59& %0'(1-,)2,+,'# ;*@7/%&R&-5+[/K&!<"!&*!&:57$.&8/5.7-%&+5& K5/%&!<"+&B3CB2`&K5/!"$*!(6 gY6& "$%K&#%+%[!,&9/5K&"&W<616&@/"+!&59& Z*+*,!/(&59&f*@<%/&F.7-"!*5+&=1"K",-7,)& a+&!<*,&,!7.()&!<%&0143&/"!*5&#%!:%%+&!<%& $%,,&,7,-%8!*#$%&,!/"*+&=FGHE&#$55.C%+C (/*">&"+.&!<%&FGHE6&E<%&"7!<5/,&:*,<&!5& @5/@%.&\*%,>&"+.&!<%&K5/%&,7,-%8!*#$%&,!/"*+& !<"+X&@/"!%97$$(&W/&p6&17O"$$%!&=b+*O%/,*!(& =I"#"+"-&#$55.C%+@5/@%.&\*%,>&/"+@%.&9/5K& 59&Z5+!8%$$*%/)&;/"+-%>&95/&8/5O*.*+@&!<%& 4&!5&B4&95/&-(8%/K%!)&!<%& RC&157@<%/!(&IE)&s+"88&;g)&[7//7,&W[)&g*$$*,&1I)& FGHE&,!/"*+&:",&/%,*,!"+!&!5&!<%&[O%&!%,!%.& I5/+%$*7,&W06&[%<"O*57/&& 59&@/"_*+@&-"!!$%&%?C 85,%.&!5&,K"$$&8587$"!*5+&59&,!"#$%&\*%,&=8"090:;+% 8(/%!"$=!+%06>6%'(()%'!>9%W#M=D%8<>&B442x<P&

!"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.%#%,0)1%234%501%64%73271 ## Chapitre IV- Contrôle - article 5 110 TRBCTLU6 T3C&s7+_& F)&s*+_%/&fp)&Z*$$%/&]Y6&Y/%":*.%&-"!!$%& LC&H*!%$"&Za)&I/7_CH"_A7%_&I)& 5$"+5&]])&e/*<7%$"&Y6& !/%"!K%+!,&5+&8587$"!*5+,&59&<5/+&\*%,&=1*8!%/"P& Y&G5!%&5+&!<%&",,5-*"!*5+,&#%!:%%+&!<%&8/%O"$%+-%& Z7,-*."%>6&&%H<0!%H!"090)&B4URx&SQP&2T2C2TU6 59&,!"#$%&\*%,&= !5K5?(,&-"$-*!/"+,>&"+.&!<%&#%<"OC TBC&f"/O%(&E0)&[/%!<57/&]r)&[/5-%&Y[6&05,,&*+&%99%-C *57/&59&."*/(&-5:,&7+.%/&,%K*C"/*.&-5+.*!*5+,6%&% !*O%+%,,&59&*+,%-!*-*.%&%"/&& !"@,&95/&<5/+&\(& '!>9%,#"%'.D%T33Sx&QP&BTULCBT436 =1*8!%/"P&Z7,-*."%>&I5+!/5$6%&%]=!+%H!"090)%80<&& 2C& -<:*+@<"KK%/&sY)&s+"88&;g)&[5$*+@&]Y6&W<(,*C B4U2x&2SP&SB2CSBS6& 5$5@*-"$&"+.&+7!/*!*5+"$&/%,85+,%&59&#%%9&,!%%/,&!5& TTC&;/"+-&Z6&F,,"*&.%&$7!!%&-5+!/%&$%,&K57-<%,&.7&# !"*$& -5K#*+%.&*+9%,!"!*5+,&59&f5/+&\(&"+.& !"#$%&\(& 8"/&.%,&87$O /*,"!*5+,&.%&;%+O"$ /"!%&j;/%+-6&&%H<0!%H!"090)&B4USx&U3P& -#.%,#"%B4UQ&x&QP&L3RCL3Q6&& BT3CBT26 TRC&;5*$&01)&f5@,%!!%&]Y6&[*5$5@(&"+.&-5+!/5$&59&!"#"C QC&I"K8#%$$&][)&g<*!%&rp)&g/*@1%F#_%B44Lx&BRP&BBT2CBB2U6& "+.&9%%.&%9[-*%+-(&59&-"$O%,&5+&@/5:*+@&5/&[+*,<%H!"090)% UC&I"!"+@7*&ZY)&I"K8#%$$&][)&E<5K",&p1)&[5?$%/& B4USx&LP&BCBB6 1]6&I"$-7$"!*+@&%-5+5K*-&*+z7/(&$%O%$,&95/&,!"#$%& TQC&;/"+-&Z)&r5A7%,&Z)&E57!"*+&W06&E<%&%O"$7"!*5+& \*%,&=1*8!%/"P&Z7,-*."%>&5+&9%%.%/&<%*9%/,6%&%H<0!% 59&.%$!"K%!&5+&:%*@6&Z*,%&"7&85*+!& \(&= !5K5?(,&-"$-*!/"+,>&"#7+."+-%&!5&K*$X& .R7+&K5. $%& -5+5K*A7%&P&$%&8* @%&H"O57"& 8/5.7-!*5+&*+&."*/(&-"!!$%6%&%H<0!%H!"090)&B42Ux& j;/%+-"%B443x&LBP&BU2CB4T6 2BP&TQ4CTSL6 T4C&p*$$%,&])&1"O*.&];)&17O"$$%!&p)&1%&0"&r5-A7%& )& BBC&Z5/@"+&1gE)&["*$*%&f16&Y&[%$.&!/*"$&!5&.%!%/K*+%& E*$$"/.&F6&F9[-*%+-(&59&!/"8,&95/%8"090:;+%<=)<>J !<%&%99%-!&59&\(&-5+!/5$&7,*+@&8%/K%!$;%8<>&B4UTx&Q2P&TBU4CTB4R6& {)&]"-A7*%!&W6&Y&$5+@*!7.*+"$&,!7.(&59&[%,+5*!*"& BRC&E"($5/&1[)&Z55+&r1)&Z"/X&1r6&F-5+5K*-&*K8"-!& #%,+5*!*&*+9%-!*5+,&"+.&,%",5+"$&"#7+."+-%&59& 59&,!"#$%&\*%,&=1*8!%/"P&Z7,-*."%>&5+&."*/(&"+.& 8"090:;+%<=)<>"$=!+%*+&"&."*/(&-"!!$%&9"/K&59&,57!"0)%T3BBx&BSSP&T3CTS6& B4UCT346 RBC& "$%K&Y)&;/"+-&Z)&]"-A7*%!&W)&[57<,*/"&F)&0* +"/.& BLC&E7/%$$&Z])&s+7.,5+&p[6&Z%-<"+*-"$&E/"+,K*,,*5+& F6&;%%.*+@&"+.&#/%%.*+@&",8%-!,&59&8"090:;+% 59&["-*$$7,&"+!"$=!+%=1*8!%/"P&Z7,-*."%>&7+.%/&$"#5/"!5/(& -"$-*!/"+,>&"+.&Z5,A7*!5%,&=Y%.%,&"%@(8!*&"+.& -5+.*!*5+,6&A=$=+>"#%T3BTx&B4P&*+&8/%,,6 Y%.%,&!"%+*5/<(+-<7,>6& !P#<"% 99G!&B4USx&22P& RTC&f5@,%!!%&]Y)&G"$$*&Y)&;5*$&016&FO"$7"!*5+&59&.*99%/C BU24CBUQB6& %+!&*+,%-!*-*.%,&"+.&9"#/*-&!(8%,&95/&.%O%$58K%+!& B2C&;5*$&016&E"#"+*.,&",&O%-!5/,&59&.*,%",%&"@%+!,6& 59&!/%"!%.&!"/@%!,&95/&,!"#$%&\(&=1*8!%/"P&Z7,-*."%>& A=$=+>"0)%F0.=;&B4U4x&2P&UUC4Q6 -5+!/5$6&&%H<0!%H!"090)%T33Ux&B3BP&B3RLCB3RU6 BQC&{%/7<"K&a)&[/"O%/K"+&{6& X*+&$%,*5+,&*+&.5@,)& RRC&Z"/ 5+&WIrp)&E<5K",&p1)& *%@9/*%.&[1)&I"K8C <5/,%,&"+.&-"$O%,&-"7,%.&#(&!<%&,!"#$%&\(&8"090:;+% #%$$&][6& 7,-%8!*#*$*!(&59&,!"#$%&\*%,&=1*8!%/"P& <=)<>"$=!+%=06>&=1*8!%/"P&Z7,-*."%>6&r%O7%&H)#D% Z7,-*."%>&9/5K&,57!<%",!%/+&G%#/",X"&#%%9&-"!!$%& -#.%,#"%A=;+%F$0(&B442x&LUP&RLSCRL46&& 9%%.$5!,&!5&,%$%-!%.&*+,%-!*-*.%,&"+.&-5K8"/*,5+&59& BSC&f5@,%!!%&]Y)&;"/X",&r6& %-/%!58<"@57,&"+.& R&#*5",,"(&!%-<+*A7%,6%&%H<0!%H!"090)%B44Sx&43P& <%K"!58<"@57,&<*@<%/&1*8!%/"6&I5+!/*#7!*5+,&!5&"& T4RCT4U6 Z"+7"$&59&W"$"%"/%-!*-&1*8!%/"&T333x&BP&SQ4CS4T6 RLC&F"$=!+% ,*,P&%8*.%K*5$5@*-"$&"+.&-$*+*-"$&",8%-!,6,#"%A=$=J &$"&r 7+*5+P&/ ,*,!"+-%&%!&/ K"+%+-%&j;/%+-"0)%T3B3x&BSLP&R3CRQ6 b+*O%/,*!(&59&E57$57,%&R)&T33Q6 B4C&f"/O%(&E0)&[/%!<57/&]r6&I5+!/5$$*+@&<5/+&\(&=1*8C R2C&f"9%_&Z)&p"K"$CF..*+&;Z6&e+&!<%&9%%.*+@&<"#*!,& !%/"P&Z7,-*."%>&*+&-5:-"$9&<%/.,&:*!<&*+,%-!*-*.%C 59&8"090:;+%<=)<>"$=!+%06&"+.&,*!%+,&r5+.)&:*!<& aK8/%@+"!%.&%"/&!"@&!/%"!K%+!&59&+7/,*+@&-"$O%,6&&% ,8%-*"$&/%9%/%+-%&!5&!<%*/&#*!*+@&-(-$%&*+&+"!7/%6& H<0!%H!"090)%B4URx&SQP&BBSCBBU6 WG))%80<%H!"%HB;("#&B424x&LRP&T4BCR3B6 RQC&[%//(&a0)&I"K8#%$$&][6&E*K%&"+.&:%"!<%/&%99%-!,&

#' ,0)1%234%501%64%7327%#% !"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.1 Chapitre IV- Contrôle - article 5 111

5+&."*$(&9%%.*+@&8"!!%/+,&59&,!"#$%&\*%,&=1*8!%/"P& R4C&0(,(X&E]6&E%K8%/"!7/%&"+.&8587$"!*5+&.%+,*!(& Z7,-*."%>6&H!D>$0!%H!"090)&B4U2x&BLP&RRQCRLT6 %99%-!,&5+&9%%.*+@&"-!*O*!(&59&8"090:;+%<=)<>"$=!+% RSC&f"//*,&r0)&Z*$$%/&]Y)&;/"_"/&F16&f5/+&\*%,&"+.& =1*8!%/"P&Z7,-*."%>6&&%-#.%H!"090)%&B442x&RTP& ,!"#$%&\*%,P&;%%.*+@&"-!*O*!(6&'!!%H!"090)%80<%'9& 23UC2BL6 B4SLx&QSP&U4BCU4L6 RUC&I"/+&HZ6&E<%&/5$%&59&.*8!%/57,&*+,%-!,&*+&!<%& K%-<"+*-"$&!/"+,K*,,*5+&59&"+*K"$&O*/7,%,6&W$%,#"% &%B44Qx&B2TP&RSSCR4R6

!"#$!%&%'(()%*#+%,#"%-#.%#%,0)1%234%501%64%73271 #( Chapitre IV- Contrôle - article 5 112 SALEM A. 2012

Conclusion générale et perspectives

Conclusion générale et perspectives 113

SALEM A. 2012

Stomoxys calcitrans est une espèce cosmopolite capable de pulluler en saison chaude. L’étude par piégeage des populations dans une ferme du Sud oust de la France et sur le site de l’ENVT nous a montré qu’ils étaient actifs à l’extérieur pendant près de 8 mois sur 12 lorsque la température est supérieure à 15°C. Deux pics d’activité sont observés un au début de l’été et l’autre en automne. Avec le réchauffement climatique la période d’activité pourrait s’étendre. « Population dynamics of Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera : Muscidae) in the South-West of France. En préparation - Journal of Economic Entomology, 2012 ». La mise au point d’un élevage avec prise de repas de sang sur nourrisseur a montré que 73% des mouches se gorgent dans les 24 h qui suivent leur émergence et qu’elles ingèrent 11.1 ± 3.8 mg de sang. Elles pondent lorsqu’elles sont âgées d’une semaine et ce pendant 2 semaines. Nous avons pu ainsi obtenir 11.8 générations par an et chaque mouche donne 16.2 descendants femelles. « Feeding and breeding aspects of Stomoxys calcitrans (diptera Muscidae) under laboratory conditions. Publié - Parasite, 2012 ». La besnoitiose bovine est une maladie en pleine extension en Europe. Nous avons participé au suivi d’une part les populations de stomoxes dans un élevage de bovins dans lequel sévit la besnoitiose, et d’autre part au suivi des animaux d’un point de vue clinique (recherche des kystes conjonctivaux) et sérologique par Western Blot et Elisa. Le suivi d’une cohorte de 57 animaux par WB montre une augmentation de la prévalence de 30% en mars 2008 à 89.5% en mai 2009. Ces valeurs sont toujours supérieures à celles obtenues par l’examen clinique de la sclère oculaire. La séroconversion est observée toute l’année avec un pic au printemps. Des séroconversions sont observées également l’hiver alors que les stomoxes sont inactifs à l’extérieur mais présents sur les animaux et les supports dans les étables. « A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France. Publié - Veterinary Parasitology, 2011». Les mouches de notre élevage indemnes de Besnoitia ont été utilisées pour essayer d’évaluer le rôle vecteur mécanique des stomoxes dans la transmission de la besnoitiose. Nous avons fait gorger des stomoxes avec du sang renfermant des tachyzoites de culture produits au laboratoire sur cellules véro dans le nourrisseur 1. Puis nous les avons fait se gorger sur un nourrisseur 2 contenant du sang indemne de besnoitia. Nous avons recherché l’ADN parasitaire par PCR quantitative dans le sang contaminant, et dans le sang du second nourrisseur avant et après gorgement des stomoxes supposés contaminés.

Conclusion générale et perspectives 114

SALEM A. 2012

Après 3 répétitions nous confirmons qu’il y a passage d’ADN parasitaire d’un nourrisseur contaminant à un nourrisseur indemne via les stomoxes. Dans un deuxième temps nous avons fait gorger des stomoxes indemnes de besnoitia sur un bovin atteint d’une forme chronique de besnoitiose (peau épaissie, avec nombreux kystes renfermant des bradyzoites). Après passage sur bovin nous avons récolté une partie des mouches pour rechercher les parasites ou leur ADN sur les pièces buccales et dans leur abdomen par Immunofluorescence directe et par PCR. Les autres mouches se sont gorgées sur nourrisseur renfermant du sang de bovin indemne. L’ADN de besnoitia a été retrouvé sur les pièces buccales et dans l’abdomen des mouches qui se sont gorgées sur bovin. Le parasite a été retrouvé par Immunofluorescence uniquement dans le contenu de l’abdomen des mouches 1 h après leur gorgement sur bovin parasité. Dans les 2 essais il y a eu passage d’ADN des stomoxes gorgés sur le bovin malade au nourrisseur contenant du sang indemne. Ces résultats vont dans le sens des travaux de Bigalke (1968) qui rapporte que la transmission par les Tabanidés gros suceurs de sang nécessite peu d’insectes comparativement aux stomoxes. Cet essai mériterait d’être refait avec un plus grand nombre d’insectes. Il serait aussi intéressant de démontrer que l’ADN retrouvé dans le nourrisseur correspond bien à des parasites vivants. Il faudrait donc inoculer le sang PCR positif à des espèces sensibles lapins, gerbille, souris… pour observer s’il y a ou non multiplication du parasite et apparition de la maladie. « Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) to transmit Besnoitia besnoiti (Henry, 1913) (Apicomplexa: Sarcocystidae). Publié - Parasitology Research, 2012». Il serait intéressant d’utiliser le même système pour évaluer le rôle potentiel des stomoxes dans la transmission du virus de la fièvre catarrhale ovine (FCO). Enfin nous avons abordé les moyens de lutte. Peu de publications concernent la lutte contre les stomoxes. Les moyens mécaniques par bandes ou fils adhésifs mériteraient d’être plus utilisés. Pour la lutte chimique nous ne disposions d’aucunes données chiffrées pour l’Europe. Nous avons élevé 2 souches de stomoxes : une provenant de l’ENVT dans laquelle les insecticides ont été largement utilisés et une provenant d’un élevage Bio n’utilisant pas d’insecticides depuis plus d’une dizaine d’années. Les déterminations des DL 50 et 90 pour 5 pyréthroïdes et 1 organophosphoré a permis de démontrer que la souche ENVT était résistante à tous les pyréthroïdes utilisés et sensible au phoxim non utilisé depuis de nombreuses années. La colonie provenant de l’élevage Bio a une sensibilité à la permethrine équivalente à la souche Kerrville de référence aux USA (Marçon et al., 1997).

Conclusion générale et perspectives 115

SALEM A. 2012

Cela permet de préconiser la mise en place d’un programme de lutte intégré associant des moyens mécaniques, des régulateurs de croissance des insectes et d’alterner les familles d’insecticides (pyréthroïdes, organophosphorés, spynosines). A l’heure actuelle aucun moyen de lutte biologique n’est immédiatement disponible en France. « Susceptibility of two European strains of Stomoxys calcitrans (L.) to Cypermethrin, Deltamethrin, Fenvalerate, λ-cyhalothrin, Permethrin and Phoxim. Publié - International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, 2012 ».

Conclusion générale et perspectives 116

SALEM A. 2012

Références bibliographiques (Hors articles)

Références bibliographiques 117

SALEM A. 2012

AHMED A.B., OKIWELU S.N., SAMDI S.M. Species diversity, abundance and seasonal occurrence of some biting flies in Southern Kaduna, Nigeria Afr. J. Biomed. Res., 2005, 8, 113-118.

AHMAD A., ZUREK L. Evaluation of metaflumizone granular fly bait for management of houseflies. Med. Vet. Entomol., 2009, 23, 2, 167-169.

ALBERTI H., ALBERTI A.L.L., RINALDI P.L.F., LAMBERTI D.D.G., RODRIGUEZ L.G., LIMA G.L. Avaliaçao da eficacia do fipronil e da deltametrina, formulaçao ‘‘pour-on’’, no control da Haematobia irritans, parasitando bovinos em regime de campo, na regiao oeste do Estado de Sao Paulo. A-Hora-Veterinaria, 2001, 20, 119, 48-51.

ALBRIGHT R.B., SABNIS S., ZUPAN J.A. Device and method for controlling insects European Pat. Application, 2010, EP 2151161A2

ALZIEU J.-P., CORTES H., GOTTSTEIN B., JACQUIET P., DORCHIES P., SCHELCHER F., L'HOSTIS M. La besnoitiose bovine: actualités épidémiologiques et diagnostiques. Bull. G.T.V. - Hors-série parasitisme des bovins, 2007, 41-49.

ALZOGARAY R., CARLSON D. Evaluation of Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae) behavioral response to human hand odor in a triple cage olfactometer with insect traps. J. Med. Entomol., 2000, 37, 308-315.

APPERSON C.S., AXTELL R.C. Arthropods associated with shoreline deposits of Eurasian water milfoil in the Currituck sound, North Carolina. J. Georgia Entomol. Soc., 1981, 16, 1, 53-59.

BAILIE H.D., MORGAN D.W. Field trials to assess the efficacy of permethrin for the control of flies on cattle. Vet. Rec., 1980, 106, 6, 124-127.

BARRÉ N., MOREL P.C. Tiques (Acariens, Ixodoidea) des Mascareignes (Océan Indien) et maladies transmises. Rev. Elev. Méd. Vét. Pays trop., 1983, 36, 4, 371-377.

BASSO W., SCHARES G., GOLLNICK N.S., RÜTTEN M., DEPLAZES P. Exploring the life cycle of Besnoitia besnoiti-Experimental infection of putative definitive and intermediate host species. Vet. Parasitol., 2011, 178, 223-234.

Références bibliographiques 118

SALEM A. 2012

BASTIEN, Fanny Effet larvicide des huiles essentielles sur Stomoxys calcitrans a la Réunion - 78p. Th : Vét. : Toulouse 3 : 2008 ; 4092.

BERESFORD D.V., SUTCLIFFE J.F. Studies on the effectiveness of Coroplast sticky traps for sampling stable flies (Diptera: Muscidae), including a comparison to Alsynite. J. Econ. Entomol., 2006, 99, 1025-1035.

BERESFORD D.V., SUTCLIFFE J.F. Assessing pest control using changes in instantaneous rate of population increase: Treated targets and stable fly populations case study. J. Dairy Sci., 2010, 93, 2517-2524.

BERRY I.L., STAGE D.A., CAMPBELL J.B. Populations and economic impacts of stable flies on cattle Trans. Am. Soc. Agric. Eng., 1983, 873- 877.

BERRY I.L., CAMPBELL J.B. Time and weather effects on daily feeding patterns of stable flies (Diptera: Muscidae) Environ. Entomol., 1985, 14, 3, 336-342.

BEUGNET F., FRANC M. Insecticide and acaricide molecules and/or combinations to prevent pet infestation by ectoparasites. Trends Parasitol., 2012, 28, 7, 267- 279.

BIGALKE R.D. New concepts on the epidemiological features on bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field investigations - Onderstopoort. J. Vet. Res., 1968, 35, 54-65.

BIRKETT M.A., AGELOPOULOS N., JENSEN K.-M.V., JESPERSEN J.B., PICKETT J.A., PRIJS H.J., THOMAS G., TRAPMAN J.J., WADHAMS L.J., WOODCOCK C.M. The role of volatile semiochemicals in mediating host location and selection by nuisance and disease-transmitting cattle flies. Med. Vet. Entomol., 2004, 18, 313-322.

BRIDGES A.C., SPATES G.E. Larval medium for the stable fly, Stomoxys calcitrans (L.). Southwest. Entomol., 1983, 8, 1, 6-10.

BROCE A.B. An improved alsynite cylinder trap for stable flies, (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol., 1988, 25, 5, 406-409.

Références bibliographiques 119

SALEM A. 2012

BROCE A.B., HOGSETTE J., PAISLEY S. Winter feeding sites of hay in round bales as major developmental sites of Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) in pastures in spring and summer. J. Econ. Entomol., 2005, 98, 6, 2307- 2312.

BRUCE, W.N., DECKER, G.C. The relationship of stable fly abundance to milk production in dairy cattle. J. Econ. Entomol., 1958, 52, 3, 269-274.

BURTON J.H., McMILLANT I., SURGEONER G. An evaluation of fenvalerate (Bovaid) eartags as an improvement in fly control methods for increased milk production in dairy herds. Can. J. Anim. Sci., 1984, 64, 1, 113-117.

BUXTON B.A., HINKLE N.C., SCHULTZ R.D. Role of insects in the transmission of bovine leukosis virus - potential for transmission by stable flies, horn flies, and tabanids. Am. J. Vet. Res., 1985, 46, 123-126.

CAMPAU E.J., BAKER G.J., MORRISON F.D. Proceedings of the Thirty-eighth Annual Meeting of the Chemical Specialities Manufacturer’s Association. New York: CSMA, 1951.- p. 83-85.

CAMPAU E.J., BAKER G.J., MORRISON F.D. Rearing stable fly for laboratory tests. J. Econ. Entomol., 1953, 46, 3, 524.

CAMPBELL J.B., WHITE R.G., WRIGHT J.E., CROOKSHANK R., CLANTON D.C. Effects of stable flies (Diptera-Muscidae) on weight gains and feed-efficiency of calves on growing and finishing rations. J. Econ. Entomol., 1977, 70, 592-594.

CAMPBELL J.B., BERRY I.L., BOXLER D.J., DAVIS R.L., CLANTON D.C., DEUTSCHER G.H. Effects of stable flies (Diptera-Muscidae) on weight gain and feed efficiency of feedlot cattle. J. Econ. Entomol., 1987, 80, 117-119.

CAMPBELL J.B., SKODA S.R., BERKERILE D.R., BOXLER D.J., THOMAS G.D., ADAMS D.C., DAVIS R. Effects of stable flies (Diptera: muscidae) on weight gains of grazing yearling cattle. J. Econ. Entomol., 2001, 94, 780-783.

CARN V.M. The role of dipterous insects in the mechanical transmission of animal viruses. Br. Vet. J., 1996, 152, 377-393.

Références bibliographiques 120

SALEM A. 2012

CATANGUI M.A., CAMPBELL J.B., THOMAS G.D., BOXLER D.J. Average daily gains of Brahman-Crossbred and English × Exotic feeder heifers exposed to low, medium, and high levels of stable flies (Diptera: Muscidae). J. Econ. Entomol., 1993, 86, 4, 1144-1150.

CATANGUI M.A., CAMPBELL J.B., THOMAS G.D., BOXLER D.J. Calculating economic injury levels for stable flies (Diptera: Muscidae) on feeder heifers. J. Econ. Entomol., 1997, 90, 1, 6-10.

CHALLIER A., LAVEISSIÈRE C. Un nouveau piège pour la capture des glossines (Glossina: Diptera, Muscidae) : description et essais sur le terrain. Cahiers ORSTOM, série Entomologie médicale et Parasitologie., 1973, 11, 251-262.

CHUNG, C.Y., KASTEN R.W., PAFF S.M., VAN HORN B.A., VAYSSIER-TAUSSAT M., BOULOUIS H., CHOMEL B.B. Bartonella spp. DNA Associated with biting flies from California. Emerg. Infect. Dis., 2004, 10, 7, 1311-1313.

CORTINAS R., JONES, C.J. Ectoparasites of cattle and small ruminants. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 2006, 22, 3, 673-693.

COURI M.S. A key to the Afrotropical genera of Muscidae (Diptera). Rev. Bras. Zool., 2007, 24, 1, 175-184.

CUILLÉ J., CHELLE P.L., BERLUREAU F. Transmission expérimentale de la maladie dénommée "Sarcoporidiose cutanée" du boeuf (Besnoit et Robin) et déterminée par "Globidium besnoiti". Bull. Acad. Med., 1936, 115, 161-163.

CUISANCE D., BARRÉ N., DE DEKEN R. Ectoparasites des animaux : méthodes de lutte écologique, biologique, génétique et mécanique. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 1994, 13, 1305-1356.

D’AMICO F., GOUTEUX J.P., LE GALL F., CUISANCE D. Are stable flies (Diptera: Stomoxyinae) vectors of Trypanosoma vivax in the Central African Republic? Vet. Res., 1996, 27, 161-170.

DA SILVA JUNIOR V.P., MOYA BORJA G.E., DE S. LEANDRO A. Oviposition capacity of Dermatobia hominis (Diptera: Cuterebridae) on four species of Muscidae and two species of Calliphoridae under laboratory conditions. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 1999, 8, 2, 99-101.

Références bibliographiques 121

SALEM A. 2012

DAVEY R.B., GEORGE J.E., SNYDER D.E. Efficacy of a single whole-body spray treatment of spinosad, against Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) on cattle. Vet. Parasitol., 2001, 99, 1, 41-52.

DIESING L., HEYDORN A.O., MATUSCHKA F.R., BAUER C., PIPANO E., DEWAAL D.T., POTGIETER F.T. Besnoitia besnoiti - Studies on the definitve host and experimental infections in cattle. Parasitol. Res., 1988, 75, 114-117.

DOUGHERTY C.T., KNAPP F.W., BURRUS P.B., WILLIS D.C., CORNELIUS P.L. Behaviour of grazing cattle exposed to small populations of stable flies (Stomoxys calcitrans L.). Appl. Anim. Behav. Sci., 1995, 42, 231-248.

DOYLE M.S., SWOPE B.N., HOGSETTE J.A., BURKHALTER K.L., SAVAGE H.M., NASCI R.S. Vector competence of the stable fly (Diptera: Muscidae) for West Nile Virus. J. Med. Entomol., 2011, 48, 3, 656-668.

DSOULI-AYMES N., MICHAUX J., DE STORDEUR E., COULOUX A., VEUILLE M., DUVALLET G. Global population structure of the stable fly (Stomoxys calcitrans) inferred by mitochondrial and nuclear sequence data Infect. Genet. Evol., 2011, 11, 334-342.

DUVALLET G., PONT A. Stomoxyine flies from Ethiopia. Vet. Parasitol., 2008, 153, 193-194.

EIGEN M., KLOFT W.J., BRANDNER G. Transferability of HIV by arthropods supports the hypothesis about transmission of the virus from apes to man. Naturwissenschaften., 2002, 89, 185-186.

FATTOHI N., GUIDO D.L., SABNIS S. Gel compositions for control of ecto-parasites U.S. Pat. 2010, US7749527B2

FELLOWES R.A., MAULE A.G., MARKS N.J., GEARY T.G., THOMPSON D.P., HALTON D.W. Nematode neuropeptide modulation of the vagina vera of Ascaris suum: in vitro effects of PF1, PF2, PF4, AF3 and AF4. Parasitology, 2000, 120, 1, 79-89.

FISCHER O., MATLOVA L., DVORSKA L., SVASTOVA P., BARTL J., MELICHAREK I., WESTON R.T., PAVLIK I. Diptera as vectors of mycobacterial infections in cattle and pigs.

Références bibliographiques 122

SALEM A. 2012

Med. Vet. Entomol., 2001, 15, 208-211.

FLOATE K.D., SPOONER R.W., COLWELL D.D. Larvicidal activity of endectocides against pest fies in the dung of treated cattle. Med. Vet. Entomol., 2001, 15, 117-120.

FOIL L.D., MEEK C.L., ADAMS W.V., ISSEL C.J. Mechanical transmission of equine infectious anemia virus by deer flies (Chrysops flavidus) and stable flies (Stomoxys calcitrans). Am. J. Vet. Res., 1983, 44, 155Ŕ156.

FOIL L.D., HOGSETTE J.A. Biology and control of tabanids, stable flies and horn flies. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 1994, 13, 4, 1125-1158.

FOIL L.D., YOUNGER C.D. Development of treated targets for controlling stable flies (Diptera: Muscidae). Vet. Parasitol., 2006, 137, 311-315.

FRANC M. Essais de lutte contre les mouches du bétail par un spray au Fenvalérate. Rev. Med. Vet., 1986, 137, 6, 403-406.

FYE R.L., BROWN J., RUFF J., BUSCHMAN L. A survey of Northwest Florida for potential stable flies breeding Florida Entomol., 1980, 63, 2, 246-251.

GARROS C., GILLES J., DUVALLET G. Un nouveau caractère morphologique pour distinguer Stomoxys calcitrans et S. niger (Diptera : Muscidae) comparaison de populations de l’île de la Réunion. Parasite, 2004, 11, 329-332.

GEDEN C.J., STEINKRAUS D.C., RUTZ D.A. Evaluation of two methods for release of Entomophthora muscae (Entomophthorales: Entomophthoraceae) to infect house flies (Diptera: Muscidae) on dairy farms. Environ. Entomol., 1993, 20, 1201-1208.

GENTILE A., MILITERNO G., SCHARES G., NANNI A., TESTONI S., BASSI P., GOLLNICK N.S. Evidence for bovine besnoitiosis being endemic in Italy-First in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from cattle born in Italy. Vet. Parasitol., 2012, 184, 108-115.

GERRY A.C., PETERSON N.G., MULLENS B.A. Predicting and controlling stable flies on California dairies. University of California, 2007, ANR Publication 8258. Disponible sur : http://anrcatalog.ucdavis.edu

Références bibliographiques 123

SALEM A. 2012

GIANNAKAKIS A., FLETCHER B. S. Morphology and distribution of antennal sensilla of Dacustryoni (Froggatt) (Diptera: Tephritidae). J. Aus. Ent. Soc., 1985, 24, 31-35.

GILLES J. Test d’efficacité de différents types de pièges dans la lutte contre les stomoxes. Introduction à l’étude de la biologie des stomoxes présents à l’île de la Réunion. Mémoire de stage, DEA de parasitologie, Montpellier I et II., 2001.

GILLES J., DAVID J.-F., DUVALLET G. Temperature Effects on Development and Survival of Two Stable Flies, Stomoxys calcitrans and Stomoxys niger niger (Diptera: Muscidae), in La Reunion Island. J. Med. Entomol., 2005a, 42, 260-265.

GILLES J., DAVID J.-F., DUVALLET G. Effects of Temperature on the Rate of Increase of Stomoxys calcitrans and Stomoxys niger niger (Diptera: Muscidae) from La Reunion Island. J. Med. Entomol., 2005b, 42, 959-965.

GILLES J., DAVID J.-F., DUVALLET G., DE LA ROCQUE S., TILLARD E. Efficiency of traps for Stomoxys calcitrans and Stomoxys niger niger on Reunion Island. Med. Vet. Entomol., 2007, 21, 65-69.

GOSSELIN M.-E. Potentiel du spinosad et de Beauveria bassiana comme agents de lutte contre le ver gris (Agrotis ipsilon).- 95p. M. Sc.: Biol.: Université de Montréal, 2008.

GRABOVAC S., PETRIC D. The fly fauna (Diptera: Cyclorrhapha) on animal farms. Acta Entomol. Serbica, 2003, 8, 63-72.

GRASSÉ P.-P. Traité de zoologie - Nevropteroides, Mecopteroides, Hymenopteroides (Symphytes, Apocrites Terebranta). Tome X, Fascicule I.- 1951, 975p.

GREENE G.L., HOGSETTE J.A., PATTERSON R.S. Parasites that attack stable flies and house flies (Diptera: Muscidae) puparia during the winter on dairies in Northwestern Florida. J. econ. Entomol., 1989, 82, 412-415.

GUGLIELMONE A.A., VOLPOGNI M.M., MANGOLD A.J., ANZIANI O.S., CASTELLI M.C. Evaluacion de una formulacion comercial ‘‘pour on’’ con fipronil al 1% para el control de Haematobia irritans en vaquillonas Holando naturalmente infestadas.

Références bibliographiques 124

SALEM A. 2012

Veterinaria Ŕ Argentina, 2000, 17, 108-113.

HALL D., THOMAS G.D., BERRY I.L., FISCHER F.J., FOEHSE M.C. Relative abundance of stable flies, Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae), at dairies, feedlots and Pastures in Missouri. J. Kans. Entomol. Soc., 1983, 56, 223-228.

HALL R.D., FISCHER F.J. Cattle ear tags containing amitraz and permethrin for the control of face flies and horn flies on pastured herds. J. Agric. Entomol., 1984, 1, 3, 282-286.

HANSENS E.J. The stable fly and its effect on seashore recreational areas in New Jersey. J. Econ. Entomol., 1951, 44, 4, 482-487.

HARVEY T.L., BRETHOUR J.R. Controlling horn fly (Diptera: Muscidae) in cow calf herds with insecticide-impregnated ear tag treatment of nursing calves. J. Econ. Entomol., 1983, 76, 1, 117-118.

HAWKINS J.A., LOVE J.N., HIDALGO R.J. Mechanical transmission of anaplasmosis by tabanids (Diptera: Tabanida). Am. J. Vet. Res., 1982, 43, 732-734.

HEWITT C.G. The structure, development, and bionomics of the house fly, Musca domestica Linn. Part I- The anatomy of the fly. University of Manchester, 1909.- p. 395-448.

HINTON H. E. The chorionic plastron and its role in the eggs of the Muscinae (Diptera). J. Micro. Scie., 1960, 101, 313-332.

HOCH A.L., GARGAN T.P., BAILAY C.L. Mechanical transmission of Rift Valley fever virus by hematophagous Diptera. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1985, 34, 188-193. HOGSETTE J.A., RUFF J.P. Stable fly (Diptera: Muscidae) migration in Northwest Florida. Environ. Entomol., 1985, 14, 2, 170-175.

HOGSETTE J.A., RUFF J.P. Evaluation of flucythrinate and fenvalérate impregnated ear tags and permethrin ear tapes for fly control on beef and dairy cattle in northwest Florida. J. Econ. Entomol., 1986, 79, 152-157.

HOGSETTE J.A., RUFF J.P., JONES C.J. Stable fly biology and control in Northwest Florida.

Références bibliographiques 125

SALEM A. 2012

J. Agric. Entomol., 1987, 4, 1, 1-11.

HOGSETTE J.A. Management of ectoparasites with biological control organisms. Int. J. Parasitol., 1999, 29, 147-151.

HOGSETTE J.A., NALLI A., FOIL L.D. Evaluation of different insecticides and fabric types for development of treated targets for stable fly (Diptera: Muscidae) control. J. Econ. Entomol., 2008, 101, 1034-1038.

HOLLOWAY M.T.P., PHELPS R.J. The responses of Stomoxys spp. (Diptera: Musicidae) to traps and artificial host odours in the field. Bul. Entomol. Res., 1991, 81, 51-55.

HOLROYD R.G., HIRST D.J., MERRIFIELD A.W., TOLEMAN M.A. The effect of spraying for buffalo fly (Haematobia irritans exigua) on infestations, growth rate and lesion development on Bos indicus × B. taurus cattle in the dry tropics of North Queensland. Aust. J. Agric. Res., 1984, 35, 4, 595-608.

HOULBERT C. Les insectes anatomie et physiologie générales.- 2e ed. Paris : Gaston DOIN, 1920.- p. 47-55, 166-167.- (Encyclopédie scientifique).

ISARD S.A., KRISTOVICH D.A.R., GAGE S.H., JONES C.J., LAIRD N.F. Atmospheric motion systems that influence the redistribution and accumulation of insects on the beaches of the Great Lakes in North America. Aerobiologia, 2001, 17, 275-291.

JACQUIET P., LIÉNARD E., FRANC M. Bovine besnoitiosis: clinical and epidemiological aspects. Vet. Parasitol., 2010, 174, 30-36.

JEANBOURQUIN P., GUERIN P.M. Chemostimuli implicated in selection of oviposition substrates by the stable fly Stomoxys calcitrans. Med. Vet. Entomol., 2007, 21, 3, 209-216.

JOHN B. S., NEW BRUNSWICK N. J. Notes on the structure and history of Haematobia Serrata. Psyche., 1903, 5, 343-347.

JOHNSON G., PANELLA N., HALE K., KOMAR N. Detection of West Nile Virus in stable flies (Diptera: Muscidae) parasitizing juvenile american white pelicans. J. Med. Entomol., 2010, 47, 6, 1205-1211.

Références bibliographiques 126

SALEM A. 2012

JONES T.W., DAVILA A.R.M. Trypanosoma vivax Ŕ out of Africa. Trends Parasitol., 2001, 17, 2, 99-101.

KELLING F.J. Olfaction in houseflies morphology and electrophysiology.- 144p. Th. D: University of Groningen: 2001.

KNAPP F.W., HERALD F. Face fly and horn fly reduction on cattle with fenvalérate ear tags. J. Econ. Entomol., 1981, 74, 295-296.

KOPP D.D., MEYER H.J. Livestocks insecticide ear tag trials, 1982. N. D. Farm Res., 1983, 40, 6, 19-21.

KOPP D.D., MEYER H.J., CARLSON R.B. North Dakota livestock insecticide ear tag trials, 1983. N. D. Farm Res., 1984, 41, 5, 7-11.

KRAMER J.P., STEINKRAUS D.C. Experimental induction of the mycosis caused by Entomophthora muscae in a population of house flies (Musca domestica) within a poultry building. J. New York Entomol. Soc., 1987, 95, 114-117.

KUNZ S.E., KINZER H.G., MILLER J.A. Areawide cattle treatments on populations of horn flies (Diptera: Muscidae). J. Econ. Entomol., 1983, 76, 3, 525-528.

LAMARQUE D., HAESSLER C., CHAMPION R. Anthrax in Chad, a continuing zoonosis. Méd. Trop., 1989, 49, 245-251.

LANE R.P., CROSSKEY R.W. Medical insects and arachnids. 1st ed. London: Chapman & Hall, 1993.-723p.

LAVEISSIÈRE C., GRÉBAUT P. Recherche sur les pièges à glossine (Diptera : Glossinidae). Mise au point d’un modèle économique : le piège Vavoua [French]. Trop. Med. Parasit., 1990, 41, 185-192.

LEFÈVRE P.-C., BLANCOU J., CHERMETTE R. Principales maladies infectieuses et parasitaires du bétail. Europe et régions chaudes. Tome 2, partie 3, maladies bactériennes, mycoses, maladies parasitaires- Dermatophilose. Paris : Lavoisier, 2003.-p. 977- 992.

Références bibliographiques 127

SALEM A. 2012

LEROY Y. L’univers odorant de l’animal. Les stimulations chimiques dans les communications et les comportements des animaux. Paris : Société Nouvelle des Éditions Boubée, 1987.- 375p.

LEWIS D.J., BLOCK E. Efficacy of tetrachlorvinphos-impregnated cattle ear-tags against livestock Diptera in Southern Quebec. Can. J. Anim. Sci., 1982, 62, 4, 1249-1252.

LYSYK T.J., KALISCHUK-TYMENSEN L.D., SELINGER L.B. Comparsion of selected growth media for culturing Serratia marcescens, Aeromonas sp., and Pseudomonas aeruginosa as pathogens of adult Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol., 2002, 39, 1, 89-98.

LYSYK T.J. Arthropods associated with livestock grazing systems. In: Arthropods of Canadian grasslands (Vol. 2): Inhabitants of a changing landscape. Edited by FLOATE K.D.- Biological survey of Canada. 2011.- p. 45-69. Disponible sur: http://doi:10.3752/9780968932155.ch3

MARQUEZ J.G., CUMMINGS M.A., KRAFSUR E.S. Phylogeography of stable fly (Diptera: Muscidae) estimated by diversity at ribosomal 16S and Cytochrome Oxidase I mitochondrial genes. J. Med. Entomol., 2007, 44, 6, 998-1008.

MARÇON P.C.R.G., THOMAS G.D., SIEGFRIED B.D., CAMPBELL J.B. Susceptibility of stable flies (Diptera: Muscidae) from southeastern Nebraska beef cattle feedlots to selected insecticides and comparison of 3 bioassay techniques. J. Econ. Entomol., 1997, 90, 293-298.

MASMEATATHIP R., KETAVAN C., DUVALLET G. Morphological studies of Stomoxys spp. (Diptera: Muscidae) in Central Thailand. Kasetsart J., 2006, 40, 872-881.

MAVOUNGOU J.F., JAY-ROBERT P., GILLES J., ATSAME EDDA A., DUVALLET G. Écologiedes stomoxes (Diptera : Muscidae) au gabon. I- Premier inventaire dans différentes zones écologiques. Parasite, 2008a, 15, 27-34.

MAVOUNGOU J.F., SIMO G., GILLES J., DE STORDEUR E., DUVALLET G. Écologie des stomoxes (Diptera : Muscidae) au gabon. II. Origine des repas de sang et conséquences épidémiologiques. Parasite, 2008b, 15, 611-615.

MEHLHORN H., KLIMPEL S., SCHEIN E., HEYDORN A.O., AL-QURAISHY S., SELMAIR J.

Références bibliographiques 128

SALEM A. 2012

Another African disease in Central Europa: Besnoitiosis of cattle. I. Light and electron microscopical study. Parasitol. Res., 2009, 104, 861-868.

MEIFERT D.W., PATTERSON R.S., WHITFIELD T., LABRECQUE G.C., WEIDHAAS D.E. Unique attractant-toxicant system to control stable fly populations. J. Econ. Entomol., 1978, 71, 290-292.

MELLOR P.S., KITCHING R.P., WILKINSON P.J. Mechanical transmission of capri-pox virus and African swine fever virus by Stomoxys calcitrans. Res. Vet. Sci., 1987, 43, 109-112.

MEYER J.A., PETERSEN J.J. Sampling stable fly and house fly pupal parasites on beef feedlots and dairies in eastern Nebraska. Southwest. Entomol., 1982, 7,119-123.

MEYER J.A., PETERSEN J.J. Characterization and seasonal distribution of breeding sites of stable flies and house flies (Diptera: Muscidae) on eastern Nebraska feedlots and dairies. J. Econ. Entomol., 1983, 76, 103-108.

MEYER J.A., SHULTZ T.A. Stable fly and house fly breeding sites on dairies. Calfornia Agric., 1990, 44, 1, 28-29.

MEYER H.J., CHRISTIE R.D., MCBRIDE D.K. Insect pests of horses. Extension Bulletin, 1991, 55, 1-12.

MIHOK S., KANG’ETHE E.K., KAMAU G.K. Trials of traps and attractants for Stomoxys spp. (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol., 1995, 32, 3, 283-289.

MIHOK S., MARAMBA O., MUNYOKI E., SALEH K. Phenology of Stomoxyinae in a Kenyan forest. Med. Vet. Entomol., 1996, 10, 305-316.

MIHOK S. The development of a multipurpose trap (the Nzi) for tsetse and other biting flies. Bull. Entomol. Res., 2002, 92, 385-403.

MIHOK S., CARLSON D.A. Performance of painted plywood and cloth Nzi traps relative to manitoba and greenhead traps for tabanids and stable flies. J. Econ. Entomol., 2007, 100, 613-618.

Références bibliographiques 129

SALEM A. 2012

MILLER J.A., KUNZ S.E., OEHLER D.D., MILLER R.W. Larvicidal activity of merck MK-933, an avermectin, against the horn fly, stable fly, faces fly, and house fly. J. Econ. Entomol., 1981, 74, 608-611.

MILLER R.W., HALL R.D., KNAPP F.W., WILLIAMS R.E., DOISY K.E., HERALD F., TOWEL C.A. Permethrin ear tags evaluated in four states for control of the horn fly and face fly. J. Agric. Entomol., 1984a, 1, 3, 264-268.

MILLER R.W., PICKENS K.G., SCHMIDTMANN E.T., KUNKLE W.E. Fenvalerate ear tags with and without stirofos oral larvicide for control of horn flies and face flies. Southwest. Entomol., 1984b, 9, 1, 79-83.

MILLER R.W. Evaluation of S-31183 for fly (Diptera: Muscidae) control as a feed-through compound for poultry, cattle, and swine J. Agric. Entomol., 1989, 6, 2, 77-81.

MILLER R.W., SCHMIDTMANN E.T., WAUCHOPE R.D., CLEGG C.M., HERNER A.E., WEBER H. Urine delivery of cyromazine for suppressing house and stable flies (Diptera: Muscidae) in outdoor dairy calf hutches. J. Econ. Entomol., 1996, 89, 689-94.

MOON R.D. Muscid flies (Muscidae) In: Medical and veterinary entomology/ ed. Par Gary MULLEN & Lance DURDEN Academic press: Elsevier, 2002.- p. 279-301.

MOULINIER C. Parasitologie et mycologie médicales: Éléments de morphologie et de biologie. Paris: Lavoisier, 2003.- p. 432-494.

MRAMBA F., BROCE A.B., ZUREK L. Vector competence of stable flies, Stomoxys calcitrans L. (Diptera: Muscidae), for Enterobacter sakazakii. J. Vector Ecol., 2007, 32, 1, 134-139.

MULLENS B.A., MEYER J.A. Seasonal abundance of stable flies (Diptera: Muscidae) on California dairies. J. Econ. Entomol., 1987, 80, 1039-1043.

MULLENS B.A., LII K.-S., MAO Y., MEYER J.A., PETERSON N.G., SZIJJ C.E. Behavioural responses of dairy cattle to the stable fly, Stomoxys calcitrans, in an open field environment.

Références bibliographiques 130

SALEM A. 2012

Med. Vet. Entomol., 2006, 20, 122-137.

OLBRICH D.L., KING B.H. Host and habitat use by parasitoids (Hymenoptera: Pteromalidae) of house fly and stable fly (Diptera: Muscidae) pupae. Great Lakes Entomol., 2003, 36, 179-190.

OWEN I.L., NELSON R.E. Use of insecticide-impregnated ear-tags to eradicate the buffalo fly from cattle. Aust. Vet. J., 1983, 60, 12, 382-383.

PAGEAU J. Insectes et autres arthropodes d'intérêt médical ou vétérinaire en Nouvelle-Calédonie et aux Iles Loyauté; Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-mer - Entomologie Médicale, 1955, cote 4614, p. 60-104.

PECHEUR M. Protection du bétail contre les mouches: Utilisation de boucles auriculaires imprégnées de cyperméthrine. Ann. Méd. Vét., 1985, 129, 215-218.

PETERSON A. The head-capsule and mouth-parts of diptera, with twenty-five plates.- 178p. Illinois Biological Monographs, Vol. 3, N° 2. Th. D: Entomology: university of Illinois: 1916.

POTGIETER F.T., SUTHERLAND B., BIGGS H.C. Attempts to transmit Anaplasma marginale with Hippobosca rufipes and Stomoxys calcitrans. Onderstepoort J. Vet. Res., 1981, 48, 2, 119-122.

RAHAL Y., BARRY P., HAWLITZKY N., RENOU M. Antennal olfactory sensilla of the parasitoid fly, Pseudoperichaeta Nigrolineata Walker (Diptera: Tachinidae). Int. J. Insect Morphol. & Embryol., 1996, 25, 145-152.

RANADE D.R. The development of the eyes in Stomoxys calcitrans Linn. (Diptera-Cyclorrhapha-Muscidae- Stomoxydinae). Plant Sci., 1970, 71, 145-149.

REBHUN W.C. Observations on habronemiasis in horses. Equine Vet. Educ., 1996, 8, 4, 188-191.

REINER P. Imidacloprid fly bait: a fast-acting formulation against flies in livestock. INTERNATIONAL CONFERENCE ON URBAN PESTS. (4th : 2002: USA)

Références bibliographiques 131

SALEM A. 2012

Charleston : S.C. Jones, J. Zhai & W.H. Robinson edirors, 2002.-457-458p.

REINER P., JUERGEN J., KARIN H. Control of house flies, Musca domestica (Diptera: Muscidae), with Imidacloprid wg 10 in pig farms (Germany). INTERNATIONAL CONFERENCE ON URBAN PESTS. (5th : 2005: Malaysia) Malaysia : Perniagaan Ph’ng @ P&Y Design Network, 2005.- 309-317p.

ROCHON K., LYSYK T.J., SELINGER L.B. Persistence of Escherichia coli in immature house fly and stable fly (Diptera: Muscidae) in relation to larval growth and survival. J. Med. Entomol., 2004, 41, 6, 1082-1089.

ROCHON K., LYSYK T.J., SELINGER L.B. Retention of Escherichia coli by house fly and stable fly (Diptera: Muscidae) during pupal metamorphosis and eclosion. J. Med. Entomol., 2005, 42, 3, 397-403.

RODRIGUEZ B.Z., LEITE R.C. Occurrence of biological vectors of Dermatobia hominis (L. Jr., 1781) (Diptera: Cuterebridae), captured by Magoom trap in the metallurgic region, Minas Gerais, Brazil. Cienc. Rural Santa Maria, 1997, 27, 4, 645-649.

ROEDER R., BOLTON H. Flies Impacting Livestock, Poultry and Food Safety S1030: 2007. Disponible sur: http://nimss.umd.edu/homepages/outline.cfm?trackID=8236#top

ROMERO A., HOGSETTE J.A., CORONADO A. Distribution and abundance of natural parasitoid (Hymenoptera: Pteromalidae) populations of house flies and stable flies (Diptera: Muscidae) at the university of Florida dairy research unit. Neotrop. Entomol., 2010, 39, 424-429.

SALGADO V.L. Studies on the mode of action of spinosad: Insect symptoms and physiological correlates. Pestic. Biochem. Physiol., 1998, 60, 91-102.

SALGADO V.L., SHEETS J.1., WATSON G.B., SCHMIDT A.L. Studies on the mode of action of spinosad: The internaI effective concentration and the concentration dependence of neural excitation. Pestic. Biochem. Physiol., 1998, 60, 103-110.

SCHARES G., BASSO W., MAJZOUB M., CORTES H.C.E., ROSTAHER A., SELMAIR J., HERMANNS W., CONRATHS F.J., GOLLNICK N.S. First in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from chronically infected cattle in Germany. Vet. Parasitol., 2009, 163, 315-322.

Références bibliographiques 132

SALEM A. 2012

SCHMIDTMANN E.T. Suppressing immature house and stable flies in outdoor calf hutches with sand, gravel, and sawdust bedding. J. Dairy Sci., 1991, 74, 3956-3960.

SCHOFIELD S., CORK A., BRADY J. Electroantennogram responses of the stable fly, Stomoxys calcitrans, to components of host odour. Physiol. Entomol., 1995, 20, 273-280.

SCHOFIELD S., WITTY C., BRADY J. Effects of carbon dioxide, acetone, and 1-octen-3-ol on the flight response of the stable-fly, Stomoxy calcitrans, in a wind tunnel. Physiol. Entomol., 1997, 22, 380-386.

SCHWINGHAMMER K.A., KNAPP F.W., BOLING J.A. Physiological and nutritional response of beef steers to combined infestations of horn fly and stable fly (Diptera: Muscidae). J. Econ. Entomol., 1987, 80, 120-125.

SCOLES G.A., BROCE A.B., LYSYK T.J., PALMER G.H. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol., 2005, 42, 4, 668- 675.

SCOLES G.A., MILLER J.A., FOIL L.D. Comparison of the efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni Stiles (Acari: Ixodidae) with mechanical transmission by the horse fly, Tabanus fuscicostatus Hine (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol., 2008, 45, 1, 109-114.

SKIDMORE P. The biology of the Muscidae of the world. Dordrecht: Dr W. Junk Publisher, 1985.-p. 2-274.- (Series entomologica, v. 29)

SKODA S.R., THOMAS G.D., CAMPBELL J.B. Developmental sites and relative abundance of immature stages of the stable fly (Diptera: Muscidae) in beef cattle feedlot pens in eastern Nebraska. J. Econ. Entomol., 1991,84, 1, 191-197.

SKOVGARD H., JESPERSEN J.B. Activity and relative abundance of hymenopterous parasitoids that attack puparia of Musca domestica and Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) on confined pig and cattle farms in Denmark. Bull. Entomol. Res., 1999, 89, 263-269.

Références bibliographiques 133

SALEM A. 2012

SKOVGARD H. Sustained releases of the pupal parasitoid Spalangia cameroni (Hymenoptera: Pteromalidae) for control of house flies, Musca domestica and stable flies Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) on dairy farms in Denmark. Biol. Control, 2004, 30, 288-297.

STEYSKAL G.C. The gender of the genus-name Stomoxys Geoffroy 1762 (Diptera: Muscidae). Proc. Ent. Soc. Wash., 1975, 77, 163.

STEINKRAUS D.C., GEDEN C.J., RUTZ D.A. Prevalence of Entomophthora muscae (Cohn) Fresenius (Zygomycetes: Entomophthoraceae) in house flies (Diptera: Muscidae) on dairy farms in New York and induction of epizootics. Biol. Control, 1993, 3, 93-100.

STUBBS V.K., WILSHIRE C., WEBBER L.G. Cyhalothrin a novel acaricidal and insecticidal synthetic pyrethroid for the control of the cattle tick (Boophilus microplus) and the buffalo fly (Haematobia irritans exigua). Aust. Vet. J., 1982, 59, 5, 152-155.

SUKONTASON K., SUKONTASON K.L., PIANGJAI S., BOONCHU N., CHAIWONG T., NGERN-KLUN R., SRIPAKDEE D., VOGTSBERGER R.C., OLSON J.K. Antennal sensilla of some forensically important flies in families Calliphoridae, Sarcophagidae and Muscidae. J. Micron., 2004, 35, 671-679.

SZALANSKI A.L., OWENS C.B., MCKAY T., STEELMAN C.D. Detection of Campylobacter and Escherichia coli O157:H7 from filth flies by polymerase chain reaction. Med. Vet. Entomol., 2004, 18, 241-246

TARRY D.W., BERNAL L., EDWARDS S. Transmission of bovine virus diarrhea virus by blood feeding flies. Vet. Rec., 1991, 128, 82-84.

TAYLOR S.M., MALLON T., ELLIOTT C.T., BLANCHFLOWER J. Effect of flucythrinate impregnated ear tags on fly attack in cattle. Vet. Rec., 1985, 116, 21, 566-567.

TAYLOR D.B., BERKEBILE D. Comparative Efficiency of Six Stable Fly (Diptera: Muscidae) Traps. J. Econ. Entomol., 2006, 99, 1415-1419.

TAYLOR D.B., BERKEBILE D.R. Sugar feeding in adult stable flies. Environ. Entomol., 2008, 37, 3, 625-629.

Références bibliographiques 134

SALEM A. 2012

TAYLOR D.B., MOON R.D., MARK D.R. Economic impact of stable flies (Diptera: Muscidae) on dairy and beef cattle production. J. Med. Entomol., 2012, 49, 198-209.

THOMAS G.D., BERRY I.L., SKODA S.R., BERKEBILE D.R. Seasonal ovipositional status of field populations of female stable flies (Diptera: Muscidae) in cattle feedlots as measured by two sampling methods. Environ. Entomol., 1990, 19, 5, 1597-1604.

THOMPSON G.D., DUTTON R., SPARKS T.C. Spinosad-a case of study: an example from a natural products discovery program. Pest Manag. Sci., 2000, 56, 696-702.

TOBÓN F.A., QCA FCÉUTICA M.S. Insecticidal activity of a Melinis minutiflora grass extracton Stomoxys calcitrans flies. Rev. Colom. Cienc. Pecua., 2011, 24, 123-130.

TRAVERSA D., OTRANTO D., IORIO R., CARLUCCIO A., CONTRI A., PAOLETTI B., BARTOLOINI R. GIANGASPERO A., Identification of the intermediate hosts of Habronema microstoma and Habronema muscae under field conditions. Med. Vet. Entomol., 2008, 22, 3, 283-287.

TRONCY P.M., ITARD J., MOREL P.C. Manual of tropical veterinary parasitology In: African animal trypanosomioses- The vectors of African trypanosomes/ French ed. par ITARD J., 1981 C.A.B. International, 1989,- p. 107-209.

TURELL M.J., KNUDSON G.B. Mechanical transmission of Bacillus anthracis by stable flies (Stomoxys calcitrans) and mosquitoes (Aedes aegypti and Aedes taeniorhynchus). Infect, Immun., 1987, 55, 1859-1861.

URQUHART G.M., ARMOUR J., DUNCAN J.L., DUNN A.M., JENNINGS F.W. Veterinary parasitology.- 2e ed. Glasgow: Blackwell publishing professional, 1996.- 320p.

VALE G.A. Field studies of the responses of tsetse flies (Glossinidae) and other Diptera to carbon dioxide, acetone and other chemicals. Bul. Entomol. Res., 1980, 70, 563-570.

VALE G.A., LOVEMORE D.F., FLINT S., COCKBILL G.F. Odour-baited targets to control tsetse flies, Glossina spp. (Diptera: Glossinidae), in Zimbabwe. Bul. Entomol. Res., 1988, 78, 31-49.

Références bibliographiques 135

SALEM A. 2012

VEER V., PARASHAR B.D., PRAKASH S. Tabanid and muscoid haematophagous flies, vectors of trypanosomiasis or surra disease in wild animals and livestock in Nandankanan biological park, Bhubaneswar (Orissa, India). Current Science, 2002, 82, 5, 500-503.

VITELA M.I., CRUZ-VAZQUEZ C., SOLANO J.J., ORIHUELA A. A note on the associations between the prevalence of stable flies (Stomoxys calcitrans) and the behaviour of dairy cows under semi-arid conditions. J. Anim. Vet. Adv., 2007, 6, 1284-1290.

WARNES M.L., FINLAYSON L.H. Responses of the stable fly, Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae) to carbon dioxide and host odours. II. Orientation. Bul. Entomol. Res., 1985, 75, 717-727.

WARNES M.L., FINLAYSON L.H. Electroantennogram responses of the stable fly, Stomoxys calcitrans, to carbon dioxide and other odours. Physiol. Entomol., 1986, 11, 469-473.

WATSON D.W., GEDEN C.J., LONG S.J., RUTZ D.A. Efficacy of Beauveria bassiana for controlling the house fly and stable fly (Diptera: Muscidae). Biol. Control, 1995, 5, 405-411.

WATSON D.W., RUTZ D.A., LONG S.J. Beauveria bassiana and sawdust bedding for the management of the house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae) in calf hutches. Biol. Control, 1996, 7, 221-227.

WEIDHAAS D.E., HAILE D.G. A theoretical model to determine the degree of trapping required for insect population control. Entomol. Soc. Am. Bull., 1978, 24, 18-20.

WHITE W.H., HUTCHENS D.E., JONES C., FIRKINS L.D., PAUL A.J., SMITH L.L., SNYDER D.E. Therapeutic and persistent efficacy of spinosad applied as a pour-on or a topical spray against natural infestations of chewing and sucking lice on cattle. Vet. Parasitol., 2007, 28, 143, 329-36.

WILLIAMS D.F. Sticky traps for sampling populations of Stomoxys calcitrans. J. Econ. Entomol., 1973, 66, 1279-1280.

WILLIAMS D.F., ROGERS A.J. Vertical and lateral distribution of stable flies in Northwestern Florida. J. Med. Entomol., 1976, 13, 1, 95-98. WILLIAMS R.E., WESTBY E.J.

Références bibliographiques 136

SALEM A. 2012

Evaluation of pyrethroids impregnated in cattle ear tags for control of face flies and horn flies (Diptera: Muscidae). J. Econ. Entomol., 1980, 73, 6, 791-792.

WILLIAMS R.E., WESTBY E.J., HENDRIX K.S., LEMENAGER R.P. Use of insecticide- impregnated ear tags for the control of face flies and horn flies on pastured cattle. J. Anim. Sci., 1981, 53, 5, 1159-1165.

WILLIAMS R.E., WESTBY E.J. Comparison of three insecticide-impregnated cattle ear tags for face fly and horn fly control (Diptera: Muscidae). J. Kans. Entomol. Soc., 1982, 55, 2, 335-338.

WRIGHT J.E., OEHLER D.D., JOHNSON J.H. Control of house fly and stable fly breeding in rhinoceros dung with an insect growth regulator used as a feed additive. J. Wildl. Dis., 1975, 11, 522- 524.

WRIGHT J.E., SMALLEY H.E. Biological activity of insect juvenile hormone analogues against the stable fly and toxicity studies in domestic animals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1977, 5, 2, 191-197.

WRIGHT C.L., TITCHENER R.N., HUGHES J. Insecticidal ear tags and sprays for the control of flies on cattle Vet. Rec., 1984, 115, 60-62.

YERUHAM I., BRAVERMAN Y. Skin lesions in dogs, horses and calves caused by the stable fly Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae). Revue Elev. Méd. Vét. Pays Trop., 1995, 48, 4, 347-349.

ZUMPT F. The Stomoxyine biting flies of the world. Taxonomy, biology, economic importance and control measures. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1973.- 175pp.

Références bibliographiques 137