Universidade Do Vale Do Itajaí

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

TALITA ELISA BERTÉ

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS COMPOSTOS TARAXEROL E ÁCIDO URSÓLICO: IMPLICAÇÕES SOBRE O PROCESSO DE MEMÓRIA

Itajaí - 2009

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

TALITA ELISA BERTÉ

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS COMPOSTOS TARAXEROL E ÁCIDO URSÓLICO: IMPLICAÇÕES SOBRE O PROCESSO DE MEMÓRIA

Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Dra. Márcia Maria de Souza Co-orientadora: Dra. Cristiani Bürger

Itajaí, Maio de 2009. 2

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS COMPOSTOS TARAXEROL E ÁCIDO URSÓLICO: IMPLICAÇÕES SOBRE O PROCESSO DE MEMÓRIA Talita Elisa Berté

‘Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’

Márcia Maria de Souza, Doutora Orientador

Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

Doutora Márcia Maria de Souza (Univali) Presidente

Doutora C ristiani Bürger (Univali) Co-orientador

Doutora Nara Lins Meira Quintão (Univali) Membro

Doutora Ana Lúcia Severo Rodrigues (UFSC) Membro externo

Itajaí (SC), 14 maio 2009 3

Dedico este trabalho aos meus pais os quais são meu alicerce. À Larissa minha irmã querida e também ao meu grande amor Eduardo. 4

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por estar sempre presente e nas horas mais difíceis ter me ajudado a escolher o caminho certo.

Agradeço aos meus familiares, em especial minha mãe Marizete, meu pai Silvino e minha irmã Larissa por serem a base de meus princípios e de minha formação. Um agradecimento especial para o meu grande amor e companheiro Eduardo pelo apoio, carinho e compreensão.

Às orientadoras, Márcia Maria de Souza e Cristiani Bürger, agradeço pelo apoio, incentivo e pela orientação científica.

Às professoras colaboradoras Christiane Meyre da Silva Bittencourt e Ângela Malheiros, pela contribuição na orientação dos ensaios fitoquimicos do presente trabalho.

Agradeço a professora Nara Lins Meira Quintão pelo apoio e incentivo, e acompanhamento do trabalho desde a fase de projeto.

Às amigas Maggie, Carla, Ticiana, Gislaine e Rosana pelo apoio, auxílio e amizade.

Agradeço também aos alunos da graduaçãoem Farmácia: Bruna, Fernanda, Patrícia,Taíse, Mauricio e Diogo.

Finalmente agradeço em especial a Profa. Dra. Daniela Marti Barros e Dra. Beatriz Moleta e suas equipes os quais foram responsaveis pela analise histológica e por parte da análise estatística dos dados. 5

“A MENTE QUE SE ABRE A UMA NOVA

ID ÉIA J AMAIS VOLTARÁ AO TAMANH O

NORMAL”

(Einstein) 6

TALITA ELISA BERTÉ Maio/2009

Orientador: Márcia Maria de Souza, Doutora Co-orientadora: Cristiani Bürger, Doutora Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas Número de página: 98

Nos últimos anos os compostos obtidos de plantas medicinais têm constituído alvos terapêuticos importantes para o tratamento de várias patologias neuropsiquiátricas e/ou neurodegenerativas. Os fitoconstituintes com atividade anticolinesterásica que possuem efeitos facilitatórios nos processos de memória atualmente estão sendo muito estudados. Este trabalho teve como objetivo isolar o composto taraxerol (TRX) da planta Eugenia umbelliflora e testá-lo, juntamente com o ácido ursólico (AU), em ensaios bioautográficos, ensaios in vitro e in vivo, verificando seus efeitos sobre atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) e sobre os processos de memória de longa duração (MLD) através do modelo de esquiva inibitória. A atividade anticolinesterásica do TRX e AU foi avaliada em testes bioautográficos e em seguida por teste in vitro com encéfalo e hipocampo de ratos Wistar através do método de Ellman e colaboradores (1961). A partir dos resultados in vitro, estes compostos foram avaliados in vivo infundidos diretamente no hipocampo de ratos, utilizando-se o teste de esquiva inibitória. Neste experimento, os animais sofreram estereotáxia (A= -4,2, L= ± 3,0, V= - 1,3) para implante de cânula-guia. Decorrido o tempo de recuperação dos animais, os mesmos foram treinados e testados avaliando-se os efeitos dos compostos sobre as etapas da memória (aquisição, consolidação e evocação). Para tanto, os animais foram infundidos (região CA1) com os compostos respectivamente 5 minutos antes do treino, imediatamente após o treino e 5 minutos antes do teste. Durante as sessões de treino os animais eram colocados sobre a plataforma do aparato, cronometrando-se a latência de descida. Após a descida, os animais levavam choques de 0,4 mA. Nas sessões de teste (24 horas após o treino) o mesmo procedimento era feito, desta vez com omissão dos choques. Também foi verificado se, os compostos em estudo produziam efeito reversor da amnésia induzida pela escopolamina (5 µg/sítio) no modelo de esquiva inibitória, sendo a escopolamina injetada diretamente no hipocampo 5 minutos antes da infusão dos compostos. Os resultados bioautográficos confirmaram a atividade anticolinesterásica de ambos os compostos, de 180 à 15 µg para TRX e 180 a 6 µg para o AU. Pelo método de Ellman, o TRX apresentou atividade anticolinesterásica somente no hipocampo nas concentrações de 0,89 e 1,77 µM (20,8 ± 1,99 e 23,9% ± 2.42, respectivamente). O AU produziu efeito inibitório no encéfalo de ratos na concentração de 0,27 µM (14,0% ± 1,76) e em hipocampo nas concentrações de 0,01, 0,08, 0,44 e 0,89 µM (14,84% ± 5,49, 18,3% ± 1,82, 29,94% ± 12,6 e 17,83% ± 3,36). No teste de esquiva inibitória o TRX produziu efeito facilitatório significativo no processo de consolidação da memória, revertendo a amnésia induzida pela escopolamina nos processos de aquisição, consolidação e evocação. O AU promoveu um efeito facilitatório da memória na etapa de consolidação e reverteu a amnésia induzida por escopolamina nas etapas de aquisição e consolidação da memória.

PALAVRAS-CHAVE: acetilcolinestese. ácido ursólico. memória. taraxerol. 7

TALITA ELISA BERTÉ Maio/2009

Advisor: Márcia Maria de Souza, Doutora Co-Advisor: Cristiani Bürger, Doutora Concentacion Area: Natural Productos and Bioactive Synthetic Substance Numbers pages: 98

In recent years, compounds obtained from medicinal plants have been constituted important therapeutic targets for the treatment of various neuropsychiatric and/or neurodegenerative pathologies. The phytoconstituent with anticholinesterasic activities that currently possess facilitatory effects in the memory processes are being very studied. This study seeks to isolate the taraxerol compound (TRX) from Eugenia umbelliflora plant and test it, together with ursolic acid (UA), in bioauthographic in vitro and in vivo assays, determining their effects on the acetylcholinesterase enzyme activity (AChE) and on of long-term memory (LTM) process, through the inhibitory avoidance model. The anticholinesterasic activity of TRX and UA was assessed in bioauthographic test and later by in vitro test with encephalon and hippocampus of Wistar rats by the method of Ellman et al. (1961). Based the in vitro results, these compounds were assessed in vivo, infusing them directly in the rats’ hippocampus, using the test of inhibitory avoidance. In this experiment, the animals underwent stereotactic surgery (A= - 4.2, L= ± 3.0, V= - 1.3) for the implantation of guide- cannulas. Once the recovery time of the animals had elapsed, they were trained and tested, assessing the effects of the compounds in the study of memory atages (acquisition, consolidation and retrieval). For this purpose, the animals were injected with the compounds respectively 15 minutes before training, immediately after training and 15 minutes before the test. During the training sessions, the animals were placed on the apparatus platform, and the etep-down latency was timed. Each time this occured, the animals received 0,4mA shocks. In the test sessions (24 hours after training), the same procedure was carried out, but this time omitting the shocks. It was also observed whether the compounds studied produced a escpolamine (5 µg/sítio) induced amnesia reserval effect in the inhibitory avoidance model, with the scopolamine being injected directly in the hippocampus 5 minutes before the infusion of compounds. The bioautographic results confirmed the anticholinesterasic activity of both compounds, from 180 to 15 g for TRX and 180 to 6 g for UA. By the method of Ellman, TRX presented anticholinesterasic activity only in the hippocampus in concentrations of 0.89 and 1.77 M (20,8 ± 1,99 and 23,9% ± 2,42 respectively). UA produced inhibitory effect on rats’ encephalon at concentrations of 0,27 M (14,0% ± 1,76) and in the hippocampus at concentrations the 0,017, 0,08, 0,44 e 0,89 µM (14,84% ± 5,49, 18,3% ± 1,82, 29,94% ± 12,6 e 17,83% ± 3,36 respectively). In the test of inhibitory avoidance, TRX produced significant facilitatory effect in the process of consolidation of memory, reverting amnesia induced by scopolamine in this process, as well as in the processes of acquisition and retrieval. UA promoted a facilitatory effect of memory in the consolidation step and reverted the amnesia induced by scopolamine in the steps of acquisition and consolidation of memory.

KEYWORDS: acetylcholinesterase. ursolid acid. memory. taraxerol. 8

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Processo de formação da memória. A- fase inicial, B-fase tardia...... 20 Figura 2 Representação esquemática do hipocampo e seus microcircuitos...... 22 Figura 3 Isoformas da AChE...... 24 Figura 4 Sítio catalítico da AChE...... 25 Figura 5 Estrutura química do TRX...... 30 Figura 6 a) Frutos maduros; b) Frutos verdes; c) Folhas; d) Partes aéreas de E.umbelliflora Berg...... 32 Figura 7 Estrutura química do AU ...... 32 Figura 8 Animal apoiado no equipamento de estereotaxia...... 38 Figura 9 Desenho esquemático de secções coronais dos pólos septal. Assinalados os campos CA1, CA3 e o giro denteado (GD) do hipocampo...... 39 Figura 10 Microinjeção intracerebral...... 40 Figura 11 Tarefa da esquiva inibitória...... 41 Figura 12 Esquema representativo da investigaçãodo efeito do AU sobre a deambulação dos animais através do MOF...... 43 Figura 13 Labirinto em Cruz Elevado...... 45 Figura 14 Espectro de RMN-1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX...... 48 Figura 15 Espectro de RMN-13C/ APT (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX...... 49 Figura 16 Método de bioautografia por CCD com TRX a) 1: 180 µg; 2: 150 µg; 3: 120 µg; 4: 90 µg; 5: 60 µg; 6: 30 µg b) 1: 90 µg; 2: 60 µg; 3: 30 µg; 4: 15 µg; 5: 6 µg...... 51 Figura 17 Método de bioautografia por CCD com AU A) 1: 180 µg; 2: 150 µg; 3: 120 µg; 4: 90 µg; 5: 60 µg; 6: 30 µg B) 1: 90 µg; 2: 60 µg; 3: 30 µg; 4: 15 µg; 5: 6 µg...... 52 Figura 18 Efeito do TRX (0,89 - 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em encéfalo...... 53 Figura 19 Efeito do TRX (0,89 – 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em hipocampo de ratos...... 53 Figura 20 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em encéfalo...... 54 Figura 21 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em hipocampo...... 54 Figura 22 Efeito da administração intrahipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a aquisição da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam as sessões de treino e as escuras o teste...... 56 Figura 23 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória...... 56 9

Figura 24 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a evocação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória...... 57 Figura 25 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a aquisição da memória de ratos na esquiva inibitória...... 58 Figura 26 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos na esquiva inibitória...... 59 Figura 27 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a evocação da memória de ratos na esquiva inibitória...... 60 Figura 28 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio)...... 61 Figura 29 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio)...... 62 Figura 30 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre evocação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio)...... 63 Figura 31 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do AU (4,54 mM) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio)...... 64 Figura 32 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0.5uL), e do AU (4,54uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio)...... 64 Figura 33 Efeito da administração aguda do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75 g/sítio), administrados pela via intracerebral (hipocampo) sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de atividade exploratória (rearings) (B)...... 66 Figura 34 Efeito da administração intra-hipocampal do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75 µg/sítio), em ratos submetidos ao modelo do LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D)...... 68

LISTA DE ABREVEATURAS

A – peptídeo beta-amilóide AU – ácido ursólico ACh - acetilcolina AChE – acetilcolinesterase AMG – amígdala AMPA – ácido -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazola-4-proprionico BChE – butirilcolinesterase CA – corno de Amon Ca2+ - cálcio cAMP – monofosfato de adenosina cíclico CaMKII – proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina cm - centímetro CCD – cromatografia em camada delgada CL – corpos de Lewy CREB – DA – Doença de Alzheimer DCL – demência com corpos de Lewy DH - Doença de Huntington DNA – ácido desoxirribonucléico DTNB – ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzóico) DFT – demência frontotemporal DV – demência vascular EPM – erro padrão da média ERK – proteína quinase regulada por sinal extra-celular FDA – Food and Drug Administration g - grama GABA – ácido gama-amino butírico GD – giro denteado HPN - hidrocefalia de pressão normal IAChE – inibidores da acetilcolinesterase IM – inibição máxima 11

LCE – labirinto em cruz elevado LTD – long-term depression (depressão de longo prazo) LTP – long-term potentiation (potenciação de longo prazo) MCD – memória de curta duração mg – miligramas min - minuto mL – mililitros mM - minimolar mGluR – receptor metabotrópico de glutamato MOF – Modelo de Open Field mRNA – ácido ribonucléico mensageiro MLD – memória de longa duração NMDA - N-metil-D-aspartato NOS – óxido nítrico sintetase PKA – proteína quinase depende de cAMP PKC – proteína quinase dependente de cálcio e fosfolipídeo RMN 13C – ressonância magnética nuclear de 13C RMN 1H – ressonância magnética nuclear de 1H SCPD – substância cinzenta parequedutal dorsal SNC – sistema nervoso central SNP – sistema nervoso periférico SWK - síndrome de Wernicke-korsakoff TRX – taraxerol 5HT – serotonina µg – micrograma µL - microlitro µM - micromolar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 14 2 OBJETIVOS...... 16 2.1 Objetivo Geral ...... 16 2.2 Objetivos Específicos ...... 16 3 REVISÃO DA LITERATURA ...... 17 3.1 Memória ...... 17 3.1.1 Classificação das memórias ...... 18 3.1.2 Mecanismos modulatórios de memórias ...... 19 3.3 Papel da neurotransmissão colinérgica na memória...... 22 3.3 Doenças que envolvem déficit de memória...... 25 3.5 Taraxerol...... 30 3.6 Ácido ursólico...... 32 4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 34 4.1 Obtenção dos compostos...... 34 4.2 Animais...... 35 4.4 Ensaios farmacológicos in vitro ...... 36 4.4.1 Avaliação da atividade anticolinesterásica em cérebro total e hipocampo de ratos ...... 36 4.4.2 Ensaio enzimático ...... 37 4.5 Ensaio farmacológico in vivo...... 37 4.5.1 Cirurgia-esteriotáxica e implantação de cânulas ...... 37 4.5.2 Microinjeção intracerebral dos compostos na região CA1 do hipocampo ...... 39 4.5.3 Avaliação da atividade dos compostos sobre as etapas da memória no do modelo de esquiva-inibitória...... 40 4.5. 4 Avaliação da atividade dos compostos sobre a amnésia induzida por escopolamina través do modelo de esquiva-inibitória ...... 41 4.5.5 Histologia ...... 42 4.5. 6 Testes complementares...... 42 4.5.6.1 Efeito dos compostos sobre a atividade exploratória dos animais submetidos ao teste do campo aberto (Open Field) ...... 42 4.5.6.2 Efeito dos compostos sobre a ansiedade de animais submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado...... 44 4.6 Drogas e/ou reagentes...... 45 13

4.6.1 Líquor artificial ...... 45 4.7 Análise estatística ...... 46 5 RESULTADOS...... 47 5.1 Obtenção e identificação do taraxerol ...... 47 5.2 Avaliação da atividade da AChE ...... 50 5.2.1 Bioautografia do TRX...... 50 5.2.2 Resultados da Bioautografia do AU ...... 51 5.3.1 Atividade anticolinesterásica do TRX...... 52 5.3.2 Atividade anticolinesterásica do AU...... 53 5.4 Resultados dos ensaios farmacológicos in vivo ...... 55 5.4.1 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais no modelo de esquiva inibitória...... 55 5.4.2 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais com amnésia induzida por escopolamina ...... 60 5.5 Testes complementares...... 65 5.5.1 Efeito do AU sobre a atividade exploratória dos animais submetidos ao teste do campo aberto (Open Field) ...... 65 5.5.2 Efeito do AU sobre a ansiedade dos animais submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado ...... 67 6 DISCUSSÃO ...... 69 8 REFERÊNCIAS...... 81 ANEXO 1...... 99

1 INTRODUÇÃO

Conceitualmente, a memória é a faculdade de conservar ou readquirir idéias ou imagens. Para a formação de uma memória é necessário que ocorra anteriormente o processo de aprendizado, que é a aquisição ou incorporação de novas informações. De uma forma simplificada a memória nada mais é do que a capacidade que possui os indivíduos de armazenar, conservar e evocar aprendizados anteriores (AMÁDIO et al., 2004). Por tratar-se de um processo biológico essencial à sobrevivência dos organismos vivos, os processos de plasticidade neural envolvidos na memória já foram detectados e estudados em varias espécies de animais, variando desde invertebrados até os seres humanos (IZQUIERDO, 2002). A memória pode ser modulada por vários sistemas de neurotransmissores como o sistema glutamatérgico, GABAérgico, serotonérgico, histaminérgico, dopaminérgico, oxidonitrérgico e colinérgico, dentre outros (IZQUIERDO et al, 2006). O comprometimento na memória pode ocorrer em várias doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas, destacando-se principalmente a doença de Alzheimer (DA). A acetilcolina (ACh) é um dos neurotransmissores mais estudados no sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico (SNP). Esse neurotransmissor é sintetizado a partir de acetil coenzima A (acetil CoA), a qual é formada durante o processo de respiração celular e a formação da colina, um importante produto do metabolismo dos lipídeos (TAYLOR; BROWN, 1999). Tem importância fundamental nas funções desempenhadas pelo SNC, sendo associada com as funções cognitivas, processamento de informações sensoriais, organização cortical do movimento e controle do fluxo sanguíneo cerebral (SCREMIN et al., 1997). A acetilcolinesterase (AChE) é uma serina hidrolase que desempenha papel essencial no mecanismo colinérgico. Ela é uma enzima que catalisa a hidrólise da ACh na transmissão do impulso nervoso na sinápse colinérgica entre neurônios colinérgicos. A enzima está ligada à membrana basal entre as membranas pré- e pós-sinápticas desempenhando seu papel fisiológico (STRYAER, 1995; RANG et al., 2004). Estudos e métodos que levam ao aumento da neurotransmissão colinérgica são extremamente importantes para a busca de substâncias com um potencial terapêutico contra doenças neurodegenerativas que possuem a neurotransmissão colinérgica diminuída, como na DA. Atualmente o tratamento farmacológico mais 15

utilizado para inibir os déficits cognitivos no início da doença consistem em aumentar a função colinérgica usando inibidores da AChE (DAVIES, 1982; ATTA-UR- RAHMAN, 2004; CUMMINGS, 2000; ELLIS, 2005). Os fármacos anticolinesterásicos de uso clínico aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos para o tratamento da DA são a tacrina, donepezil, rivastigmina e galantamina (EMRE; CUMMINGS; LANE, 2007). Entretanto, todos apresentam limitações clínicas quanto ao seu uso, devido tanto a meia-vida curta quanto aos seus efeitos colaterais indesejáveis (SUNG et al., 2002). Estudos continuam sendo realizados no sentido de buscar novos compostos com atividade anticolinesterásica com mais efetividade do que os existentes e/ou apresentando menos efeitos colaterais. Na maioria das vezes, os compostos selecionados com tal atividade farmacológica são oriundos de produtos naturais, principalmente de plantas. Neste contexto, dois compostos terpênicos, o taraxerol (TRX) e o ácido ursólico (AU) vem despertando interesse científico. Ambos apresentam atividade anticolinesterásica quando testados in vitro. Como somente a atividade enzimática in vitro não qualifica um composto como candidato potencial a um anticolinesterásico a ser terapeuticamente utilizado, o presente estudo se propõe a estudar a atividade anticolinesterásica dos compostos em modelo animal in vivo e seus efeitos sobre a memória (em suas várias etapas), utilizando-se o teste da esquiva inibitória.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral Investigar a atividade anticolinesterásica in vitro e in vivo dos compostos TRX e AU e analisar seus efeitos sobre o processo de memória de longa duração (MLD) de ratos através do modelo de memória o teste da esquiva inibitória.

2.2 Objetivos Específicos • Isolar o composto TRX a partir das folhas da planta Eugenia umbelliflora através da técnica de cromatografia em coluna aberta; • Avaliar o efeito inibitório do TRX e AU sobre a atividade da AChE através do ensaio bioautográfico por cromatografia em camada delgada (CCD); • Analisar a atividade anticolinesterárica do TRX e AU através de ensaios in vitro em encéfalo e hipocampo de ratos; • Avaliar os efeitos do TRX e do AU infundido diretamente no hipocampo de ratos sobre os processos de aquisição, consolidação e evocação da memória de ratos através do teste da esquiva inibitória; • Verificar se o TRX e AU revertem o déficit cognitivo induzido pela escopolamina nos animais. 17

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Memória

A memória é um processo dinâmico associado a modificações na morfologia, bioquímica e fisiologia do SNC que pode ser analisada em diferentes níveis de organização biológica (AMADIO et al., 2004). Para a formação de uma memória é fundamental que ocorra primeiramente umprocesso de aprendizado, que é a aquisição ou incorporação de novas informações, promovendo a modificação de um comportamento após uma experiência vivida. A memória nada mais é do que a capacidade de adiquirir, armazenar estas informações e recordar aprendizados anteriores (IZQUIERDO, 2002). A formação de uma nova memória é dependente de processos neuronais que iniciam com a aquisição de uma informação, seguido pelo seu armazenamento da informação (consolidação) e por fim o processo de evocação, quando a memória está pronta para ser recordada (ABEL; LATTAL, 2001). A aquisição, simplismente definindo é a apresentação ao indivíduo do evento a ser aprendido. Nos seres humanos pode ser a informação e nos animais uma tarefa. Este processo é praticamente automático e ocorre essencialmente através da associação de estímulos e respostas. A associação de estímulos é intensa e se manifesta como memória de uma experiência recém-vivida, que na maioria das vezes, é fiel e precisa ao estímulo que conduziu a sua criação. Entretanto, a intensidade e discernimento poderão diminuir com o passar do tempo. Armazenamos aquilo que nos parece ser necessário e suficiente, devido às circunstâncias ou indivíduos. Esse processo de filtração e fixação progressiva da informação adquirida é chamada de consolidação. Na consolidação a informação é armazenada e sua modulação é influenciada por fatores emocionais, sendo que, em situações de necessidade as informações adquiridas e consolidadas poderão ser evocadas pelo indivíduo (ABEL; LATTAL, 2001; AMÁDIO et al., 2004). A evocação, em inglês retrieval, é o processo no qual acontece o resgate das informações consolidadas. Estudos indicam que a evocação conta com processos individuais e que pode ser estudada independentemente das demais etapas do processo de formação de memória (EINSTEN et al., 2005). 18

A aprendizagem e a formação de um novo comportamento, ou modificação de um pré-existente, é a conseqüência dos processos envolvidos na memória. Porém, grande parte dos estudiosos do assunto restringe o processo de aprendizagem somente à aquisição de novos conhecimentos enquanto que a memória seria a retenção dos mesmos (IZQUIERDO, 1992; MORGADO, 1999; KESNER, 2007).

3.1.1 Classificação das memórias

As memórias podem ser classificadas de diferentes formas, dependendo o critério de classificação adotado. Entretanto, os critérios mais adotados referem-se quanto ao seu conteúdo e de acordo com seu tempo de duração. Pelo seu conteúdo as memórias podem ser divididas em declarativa e não declarativa. Quanto ao seu tempo de duração as memórias pode ser: imediata, de curta e de longa duração. A memória declarativa é aquela evocada pelo consciente e conseguimos verbalizá-la, é uma memória para fatos e eventos que ocorreram em nossa vida, como uma viagem ou um casamento. A memória não declarativa, também chamada de memória de procedimento, é aquela evocada pelo inconsciente e que não conseguimos verbalizar, é uma memória relacionada com hábitos, habilidades motoras e comportamentos, como andar de bicicleta ou dirigir um automóvel (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002). Dentre as memórias declarativas a memória pode ser dividida em memória imediata, na qual as informações são mantidas por apenas alguns segundos, não deixando traços ou produzindo arquivos, como por exemplo, a memória de um número de telefone que consultamos na lista telefônica e que logo esquecemos após o uso. Ela difere da memória de curta duração, onde o período de aquisição e evocação é um pouco mais demorado. A memória de curta duração dura minutos ou poucas horas, sendo a memória de trabalho (work memory) um exemplo. É o tipo de memória que utilizamos para estabelecer conexões de raciocínio quando estamos mantendo um diálogo ou quando estamos analisando uma situação e procedendo a julgamentos. Dependendo dos fatores, uma memória de curta duração pode se transformar em memória de longa duração. Entretanto, ambos os tipos de memórias são processos independentes (IZQUIERDO et al. 1998; AMÁDIO et al., 2004). A memória de longa duração dura meses ou anos, formando arquivos de memórias que são relativamente permanentes, podendo ser modulados ou alimentados durante os anos de nossa vida. Elas são as memórias de nossa infância, memórias 19

permanentes relacionadas com nossas atividades profisionais, o vocabulário básico da nossa língua, memórias de nossas relações de afeto, etc. Essas memórias geralmente são perdidas quando estruturas-chave do SNC são afetadas por doenças (IZQUIERDO, 2002; SQUIRE; KANDEL, 2003; PREDIGER et al., 2008).

3.1.2 Mecanismos modulatórios de memórias

Acredita-se que um aumento na liberação de neurotransmissores, principalmente glutamato, seja o primeiro passo para a formação da memória (McGAUGH, 2000; McGAUGH; IZQUIERDO, 2000). O glutamato liberado se liga aos receptores glutamatérgicos ácido-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico (AMPA), cainato, N-metil-D-aspartato (NMDA) e metabotrópicos (mGluR), provocando a abertura dos canais de cálcio voltagem dependente, e aumentando a concentração de cálcio intracelular. Como conseqüência disso, são ativadas enzimas como proteína quinase (PKC), proteína quinase cálcio-calmodulina dependente (CaMKII), proteína quinase A (PKA), etc, que por sua vez ativam mecanismos intracelulares que culminam com a síntese protéica, e no aumento da transmissão de informações entre neurônios. Tais alterações entre os neurônios têm sido denominadas "plasticidade sináptica" (McGAUGH, 2000; McGAUGH, 2002; McGAUGH; IZQUIERDO, 2000) (Figura 01). A plasticidade pode ocorrer sob a forma de curto e longo prazos. A plasticidade de curto prazo envolveria somente alterações covalentes de proteínas pré-existentes, ao passo que a plasticidade de longo prazo requer alterações na expressão gênica e síntese protéica para o estabelecimento de novas conexões (FREY; HUANG; KANDEL, 1993; BAILEY et al., 1999; SCHAFE et al., 2001). O possível mecanismo bioquímico para explicar a consolidação da memória é conhecido como potenciação de longo prazo, do inglês long-term potentiation (LTP). Assim a LTP, como também a LTD, depressão de longo prazo (long-term potentiation), são os principais mecanismos neurais subjacentes a formação de memórias por um longo período de tempo (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993). A LTP na região CA1 do hipocampo envolve e requer inicialmente uma ativação de receptores AMPA, mGluR e NMDA nas sinapses de células piramidais.

Essa indução é sensível para a inibição dos receptores GABAA. A ativação dos receptores AMPA despolariza os receptores NMDA, os quais ficam sensíveis a ação do glutamato e assim permite a entrada de Ca2+ na célula. O aumento da 20

concentração de Ca2+ próximo a membrana sináptica estimula a atividade local da CaMKII, que promove a fosforilação do AMPA e outros receptores de glutamato. Pré-sinapticamente, este aumento de Ca2+ também ocorre, o qual aumenta a atividade da PKC que fosforila a proteína GAP-43, aumentando ainda mais a transmissão glutamatérgica mobilizando as vesículas sinápticas. Pós- sinapticamente, a PKC aumenta a fosforilação dos receptores de glutamato e eventualmente também aumenta a fosforilação da PKA, um constituinte do fator de transcrição. A CaMKII fica ativa entre 2 à 3 horas. A PKC tem seu pico em 30 min e se extende por 1 a 2 horas. Entre 3 a 4 horas depois do início da consolidação da memória, o receptor dopaminérgico D1 fica estimulado e aumenta os níveis de AMPc, e conseqüentemente a PKA, que fosforila o CREB (Proteína de ligação dos elementos responsivos ao AMPc). Há também um aumento evidente de proteína quinase regulada por sinal (ERK) que é ativada por alguns tipos de PKAs, que são essenciais para a manutencao da LTP na região CA1, e CREB. O CREB importante para a síntese de mRNA e subseqüente síntese protéica (IZQUIERDO et al., 2008).

A NO CO PAF

PIP2

PLC DAG

γ IP3 β PKG α IP3 +

Glutamato

PKA P P P CREB GAP43 CaMKII

P PKC PPKC

Ca2+ Na+ B

PLC γ β PKG α

Glu

PKA P P CREB GAP43 CaMKII

P PKC MAPK PKC

Ca2+ Na+

Figura 1 Processo de formação da memória. A- fase inicial, B-fase tardia. Adaptado de De Souza, 2001.

3.2 Estruturas envolvidas na memória

Após o caso H.M. ocorrido em 1958, onde na tentativa de cura de processos epilépticos intensos refratário ao tratamento farmacológico optou-se pela lobotomia parcial do cérebro do paciente e a conseqüente incapacidade do mesmo em formar memórias de longa duração, os neurocientistas começaram a associar os diversos tipos de memória com as estuturas cerebrais (EICHENBAUM, 2004). Algumas estruturas do lobo temporal medial têm grande importância no aprendizado e no processo de memória, principalmente na etapa de consolidação. Dentre essas estruturas destaca-se o hipocampo (AHMED; FREY, 2005; IZQUIERDO et al., 2006; IZQUIERDO et al., 2008). O hipocampo (figura 2) é uma estrutura em forma de “cavalo-marinho” formada por duas camadas de neurônios, dobradas uma sobre a outra, sendo uma denominada Giro Denteado (GD) e a outra Corno de Amon (CA). O CA é dividido em quatro partes ou camadas celulares, sendo as camadas CA1 e CA3 as mais importantes (MILLER; O`CALLAGHA, 2005). Vários estudos bioquímicos e moleculares já foram e, continuam sendo realizados na região CA1 do hipocampo, inclusive estudos sobre o seu papel na consolidação da memória (AHMED; FREY 2005; IZQUIERDO et al., 2006). Os neurônios do GD projetam axônios, chamados de fibras musgosas, que estabelecem sinapses em células da região CA3, que por sua vez, projetam axônios, que se ramificam. Um ramo deixa o hipocampo pelo fórnix, e o outro ramo, chamado colateral de Schaffer, forma sinapses excitatórias em neurônios da região CA1 (figura 1). A informação neural é transmitida a partir da região CA1 para as outras áreas, constituindo uma saída da informação pré-processada no hipocampo (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002; WATTS; THOMSON, 2005). O hipocampo tem grande importância na formação da memória, uma vez que manipulações farmacológicas e bioquímicas nesta área alteram a memória em diferentes tarefas (IZQUIERDO; MEDINA, 1995; RUBIN et al., 2000; BERLESE et al., 2005). Além disso, é nessa região que se manifestam primeiramente os processos neurodegenerativos implicados com a DA (ELDER; GASPERI; SOSA, 2006).

Figura 2 Representação esquemática do hipocampo e seus microcircuitos. Fonte. GUERRA, 2006.

3.3 Papel da neurotransmissão colinérgica na memória

O sistema colinérgico tem papel fundamental nos processos de aprendizado e memória (WINKLER et al., 1995). A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor que tem efeitos principalmente excitatórios e são mediados por vários subtipos de receptores nicotínicos (ionotrópicos) e muscarínicos (metabotrópicos), sendo alguns desse último, inibitórios (ROUSE et al., 1999; KANDEL, 2000; RANG et al., 2004). O efeito facilitário da ACh na aprendizagem de novas informações e na memória já é bem conhecido, o qual foi verificado através de extensivos estudos e experimentos utilizando-se agonistas e antagonistas de receptores colinérgicos (KREMIN; HASSELMO, 2007; NIEWIADOMSKA; BAKSALERSKA-PAZERA; RIEDEL, 2009). A ACh encontra-se alojada em vesículas nas terminações nervosas, e quando há despolarização do neurônio colinérgico, as vesículas são liberadas nas extremidades dos nervos e a ACh liberada entra na sinapse podendo ligar-se a um receptor ou ser degradada (NIEWIADOMSKA; BAKSALERSKA-PAZERA; RIEDEL, 2009). Quando a ACh liga-se ao receptor muscarínico dispara um sinal da membrana ao citoplasma. O receptor estando ativado leva a proteína G a desacoplar suas subunidades (G, G e G), e isto ocorre devido a G que desliga- se do GDP e liga-se ao GTP, estimulando uma cascata de sinalização intracelular (SELBIE; HILL, 1998). O papel principal do sistema colinérgico muscarínico sobre a memória parece ser o de desempenhar um efeito modulatório (SEGAL; AUERBACH, 1997). Os 23

diferentes subtipos de receptores muscarínicos (M1, M2, M3, M4 e M5) são importantes para a regulação independente de respostas excitatórias ou inibitórias via outros neuromoduladores e segundos mensageiros (KIMURA; BAUGHMAN, 1997). A ACh possui uma meia-vida muito curta após sua liberação devido a presença da AChE que hidrolisa o éster ligado à molécula, conduzindo assim, à perda da atividade estimulatória da mesma (NIEWIADOMSKA; BAKSALERSKA- PAZERA; RIEDEL, 2009). A AChE é uma glicoproteína globular encontrada nos neurônios colinérgicos, nas proximidades das sinapses colinérgicas e em concentrações elevadas na junção neuromuscular, possuindo um papel regulatório na neurotransmissão colinérgica (MASSOULIÉ et al., 1993; MASSOULIÉ; BON, 2006). Esta enzima está amplamente distribuída no SNC e também é encontrada em eritrócitos, linfócitos e plaquetas de mamíferos (SILVA, 1998). Ela existe em duas classes de formas moleculares: como oligômeros homoméricos simples de subunidades catalíticas e como associações heteroméricas de subunidades catalíticas e subunidades estruturais. Os oligômeros homoméricos simples aparecem como: monômeros, dímeros e tetrâmeros, dando origem, assim, às formas globulares (G): G1, G2 e G4. As formas estruturais assimétricas (A) (A4, A8 e A12; figura 3) são conseqüências das associações heteroméricas de subunidades catalíticas e subunidades estruturais (MASSOULIÉ et al., 1993; MASSOULIÉ; BON, 2006; TELESA, 2001). As formas homoméricas são encontradas solúveis na célula, provavelmente com o intuito de exportação, ou então se apresentam associadas à membrana externa da célula por meio de uma seqüência de aminoácidos hidrofóbicos intrínsecos ou de um glicofosfolipídeo acoplado (TELESA, 2001). A AChE que se apresenta nas formas heteroméricas encontra-se associada com a lâmina basal externa na sinapse, esta por sua vez é particularmente abundante na junção neuromuscular (TAYLOR; BROWN, 1999). A maior parte da AChE encontrada no tecido nervoso é do tipo globular, predominantemente G4, ligada à membrana (MASSOULIÉ et al, 1993). O centro ativo da AChE, demonstrado pela estrutura tridimensional (figura 3), é formado por resíduos da chamada tríade catalítica: serina 203, histidina 447 e glutamato 334 (SHAFFERMAN et al., 1992). 24

Figura 3 Isoformas da AChE. Fonte.http://www.chemistry.emory.edu/justice/test/ach_inactivation.htm, aceso em: 27/03/09.

O centro ativo da AChE tem dois subsítios: um sítio carregado negativamente (aniônico), ao qual a cadeia de nitrogênio quaternário da ACh carregada positivamente se liga, e um sítio esterásico contendo os verdadeiros resíduos catalíticos, o qual aloja o grupamento éster e carbonila da ACh (Figura 4) (TAYLOR; BROWN, 1999). Com base nas ligações de compostos bi-quaternários foi proposto um segundo sítio aniônico que se tornou conhecido como sítio aniônico periférico (peripherical anionic site-PAS) (NUNES-TAVARES et al., 2002). A AChE é classificada como uma serina-hidrolase. Seu mecanismo catalítico assemelha-se ao de outras hidrolases, onde o grupamento hidroxila da serina torna- se altamente nucleofílico por um sistema de reposição de cargas que envolvem o grupamento carboxila do glutamato, o imidazol da histidina e a hidroxila da serina (TAYLOR et al., 1999). Quando ocorre o ataque enzimático sobre o éster, é formado um intermediário tetraédrico entre a enzima e o éster que se rompe e forma um conjugado acetil-enzima, com a liberação concomitante da colina. A acetil-enzima é passível de hidrólise e resulta na liberação de acetato e na regeneração da enzima ativa (TAYLOR et al., 1999). Como a diminuição da função colinérgica contribui para os sintomas da demência, as pessoas com DA são beneficiadas com terapias com agentes inibidores da enzima que degrada a acetilcolina conhecidos como IAChE 25

(anticolinesterásicos), os quais potencializam a transmisao colinérgica (ELLIS, 2005).

Figura 4 Sítio catalítico da AChE. Fonte. SOREQ; SEIDMAN, 2001.

3.3 Doenças que envolvem déficit de memória

A demência é uma síndrome clínica caracterizada por déficits cognitivos múltiplos, adquiridos e persistentes, capazes de interferir de maneira substancial nas atividades de vida diária da pessoa portadora da síndrome (TAVARES, 1992; CUMMINGS; REICHMAN, 1998). É mais prevalente nos segmentos da população com idade mais avançada, principalmente naqueles com mais de 75 anos (CUMMINGS; REICHMAN, 1998). A Doença de Alzheimer (DA) e a Demência com corpos de Lewy (DCL) são os principais representantes de demências neurodegenerativas (TAVARES; AZEREDO, 2003). A DCL se apresenta com declínio cognitivo, alucinações visuais recorrentes, flutuações no estado cognitivo, sinais parkinsonianos extrapiramidais e sensibilidade aumentada ao uso de neurolépticos. No exame neuropatológico há presença de corpos de Lewy (CL) em regiões corticais e subcorticais (TAVARES; AZEREDO, 2003). Os CL são formados especialmente por proteínas -sinucleína, por proteínas neurofilamentares e pela ubiquitina. Fatores genéticos e/ou epigenéticos são os 26

possíveis responsáveis pelo surgimento dos CL nos neurônios (SUNG et al., 2001; TROJANOWASKI et al., 1998). As pessoas com DCL apresentam boa resposta ao uso dos inibidores da AChE. Em muitos casos, apresentam melhor resposta terapêutica ao tratamento com esses medicamentos do que pacientes portadores de DA (McKEITH et al., 1992; WESNES et al., 2002). A DA é a demência mais comum que acomete idosos, sendo uma doença neurológica crônica e progressiva caracterizada por múltiplos distúrbios corticais na memória, julgamento, orientação, compreensão, aprendizagem e linguagem. A neurodegeneração na DA é irreversível, com perda de memória seguida de completa demência (FILLEY, 1995; BROOKMEYER; GRAY; KAWAS, 1998). Atualmente, devido ao aumento na espectativa de vida, o número de doenças que acometem os idosos vêm sofrendo acréscimo. Em relação a DA este número tem aumentado gradativamente no mundo. A DA afeta aproximadamente 1% a 3% das pessoas em torno de 60 anos, 3% a 12% das pessoas entre 70 à 80 anos, e sobe para 25% a 35% naquelas que têm 85 anos ou mais. A qualidade de vida dos idosos é afetada pela demência devido à degeneração dos neurônios cerebrais (CAMPS et al., 2000; AGARWAL et al., 2002; WALSH; SELKOE, 2004). O papel do depósito do peptídeo -amilóide (A) no cérebro como um fator que provocaria a DA teve sua sustentação científica crescente depois de sua descoberta por Glenner em 1984. O depósito de peptídeo A é considerado o primeiro evento da DA. Entretanto, placas contendo formas agregadas de fragmentos do peptídeo A podem ser encontradas no córtex normal de pessoas idosas, pois o depósito do mesmo no cérebro é uma conseqüência inevitável da idade. Assim, foi observado que uma fração significativa da população idosa deve apresentar essas placas niveladas na ausência de manifestações de demência, sendo discutida a idéia de que depósito amilóide é somente um dos maiores entre os diversos fatores causadores da doença, embora ele certamente contribua para o seu mecanismo fisiopatológico (TERRY et al., 1987; GOATE; CHATIER-HARLIN; MILLAN, 1991; BRAAK; BRAAK, 1997; NEVE; McPHIE, 2000; RANG et al., 2004). A classe terapêutica dos IAChE produz melhora de sintomas cognitivos, comportamentais e funcionais relacionados às demências hipocolinérgicas, que têm a DA como principal representante (LAKS; ENGELHARDT, 2003). A tacrina foi o primeiro fármaco aprovado para o tratamento da DA, conferindo ao usuário melhoras modestas da memória e da cognição em cerca de 27

40%. Entretanto não há melhoras de outras alterações funcionais que afetam a qualidade de vida do paciente com DA. A tacrina exige a posologia de quatro vezes ao dia e produz como efeitos colaterais os sintomas colinérgicos como náuseas, cólicas abdominais, diminuição da pressão arterial, bradicardia, aumento da micção e hepatotoxicidade (ALMEIDA, 1998; RANG et al., 2004). O donepezil, aprovado pela FDA em 1996, também tem sua eficácia limitada e é hepatotóxico, mas proporciona ao doente uma melhora na qualidade de vida. Entretanto tem uma meia-vida muito longa tornando-se uma desvantagem, principalmente pelo paciente ser idoso. A rivastigmina tem um efeito mais prolongado que os demais fármacos e, por ser mais seletivo para o SNC, possui menos efeitos colaterais periféricos. Já, a galantamina (disponível na Europa desde 1997 e liberado pela Anvisa em 2000), um alcalóide de plantas da família Amaryllidaceae (Galanthus nivalis), atua parcialmente na inibição da colinesterase e parcialmente na ativação alostérica dos receptores colinérgicos nicotínicos cerebrais (FREITAS et al., 2002; RANG et al., 2004). Devido aos muitos fatores que estão relacionados com a DA, várias formas de tratamento podem ser utilizadas além dos IAChE, tais como: bloqueio dos receptores NMDA, utilização de agentes antioxidantes, antilipidêmicos e antiinflamatórios (HELMUTH, 2002; SCARPINI; SCHELTENS; FELDMAN, 2003). A memantina, um antagonista não-competitivo com afinidade moderada pelo receptor NMDA, é recomendada para o tratamento das fases moderada a grave da DA. Este fármaco, que, no início foi testado no tratamento da doença de Parkinson devido ao seu potencial efeito dopamimético, mais tarde revelou-se eficaz no tratamento da DA, embora tenha efeito relativamente discreto (WINBLAD; PORITIS, 1999; REISBERG et al., 2003; TARIOT et al., 2004; AREOSA; SHERRIFF; McSHANE, 2005). Ainda, em conseqüência da melhor qualidade e ao aumento na expectativa de vida das pessoas, outros tipos de demência estão ganhando espaço no mundo. Hoje já estão bem conhecidas demências como a vascular, demência frontotemporal, Doença de Huntington (DH), Doença de Creutzfeldt-Jakob e outras demências do tipo reversíveis e infecciosas. O termo demência vascular (DV) compreende uma variedade de síndromes demenciais secundárias e comprometimento vascular do SNC. Essa denominação engloba quadros causados por múltiplas lesões tromboencefálicas (demência por múltiplos infartos), lesões únicas em territórios estratégicos (tálamo, giro angular 28

esquerdo), estados lacunares, alterações crônicas da circulação cerebral, lesões externas da substância branca (doença de Binswanger), angiopatia amilóde, e quadros decorrentes de acidente vascular cerebrais hemorrágicos (hemorragias sub- durais, sud-aracnóides ou intracerebrais) (NITRINI, 1995; VEGA; FACCIO, 1995). A demência fronto-temporal (DFT) manifesta-se especialmente no período pré-senil, entre 45 a 65 anos de idade, ocorrendo na mesma proporção em homens e mulheres. A história familiar de demência é observada em metade dos casos, sugerindo importante papel de fatores genéticos no desenvolvimento da DFT (SNOWDEN; NEARY; MANN, 2002; BOTTINO, 2000). A DFT caracteriza-se por siginificativa alteração da personalidade e do comportamento, com relativa preservação das funções cognitivas apraxia, gnosia e memória (TEIXEIRA Jr.; SALGADO, 2006). Ao contrário do que ocorre em outras demências primárias, como na DA e na DCL, estudos neuroquímicos não evidenciaram alterações do sistema colinérgico na DFT (FRANCIS et al., 1993). Desse modo, os inibidores da AChE utilizados no tratamento dessas demências primárias não beneficiam os pacientes com DFT (LITVAN, 2001; PERRY; MILLER, 2001; SNOWDEN; NEARY; MANN, 2002). A Doença de Huntington (DH) é uma doença autossômica dominante heterodegenerativa caracterizada por distúrbio do movimento, sintomas psiquiátricos e demência. É causada pela expansão do trinucleotídeo CAG no gene que codifica a proteína huntingtina, localizado no cromossomo 4 (4p.16.3). A demência torna-se usualmente aparente após o surgimento dos sintomas coréicos e psiquiátricos. A memória é afetada em todos os aspectos e o aparecimento de afasia, apraxia, agnosia e disfunção cognitiva global ocorrem mais tardiamente (QUINN; SCHREAG, 1998). A Doença de Creutzfeldt-Jacob é uma doença ocasionada por príons em humanos. Trata-se de uma enfermidade infecciosa e invariavelmente fatal, que atinge o SNC e caracteriza-se por demência rapidamente progressiva e envolvimento focal variável do córtex cerebral, gânglios da base, cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal. Embora a transmissão de humanos para animais tenha sido demonstrada experimentalmente, a transmissão entre seres humanos (por transplante de córnea, implantação de eletrodos corticais etc) parece ser rara (JOHNSON; GIBBS, 1998). As demências reversíveis são raras, porém de grande importância do ponto de vista diagnóstico, pois o tratamento adequado pode reverter o declínio cognitivo. 29

Entre as doenças ou condiçoões clínicas que podem gerar demências reversíveis estão: hidrocefalia de pressão normal (HPN), pelagra, deficiência de vitamina B12, hipotiroidismo e depressão (GALLUCCI NETO; TAMELINI; FORLENZA, 2005). Tanto a depressão quando a demência causam lentificação psíquica, apatia, irritabilidade, descuido pessoal, dificuldade de concentração e memória e também mudanças de comportamento e personalidade. Contudo, a depressão pode ser um sintoma da demência e não é rara a coexistência dessas (RASKIND, 1998). As infecções que fazem parte das demências infecciosas são: AIDS, sífilis, encefalite herpética e neurocisticercose. O alcoolismo também pode ocasionar demência. E por fim, tem-se ainda, a síndrome de Wernicke-korsakoff (SWK) que ocorre pela deficiência de tiamina associada ao uso crônico de álcool. A SWK é um transtorno neurológico agudo caracterizado por ataxia, disfunção vestibular, delírio e pela variedade de anormalidades da motricidade ocular. Se não tratada adequadamente pode evoluir para síndrome amnésica crônica (Síndrome de Korsakoff), onde há prejuízo grave de memória recente e aprendizado (GALLUCCI NETO; TAMELINI; FORLENZA, 2005).

3.4 Princípios ativos obtidos de plantas com atividade anticolinesterásica

Como relatado anteriormente, os agentes anticolinesterásicos comumente usados na terapêutica da DA possuem limitações de uso devido à meia-vida curta e aos efeitos indesejáveis (SUNG et al., 2002). Por isto, atualmente, muitas pesquisas estão sendo desenvolvidas para encontrar compostos com atividade anticolinesterásica em produtos naturais, principalmente em extratos de plantas (NINO et al., 2006). Em famílias já pesquisadas, como Amaryllidaceae (HOUGHTON; REN; HOWES, 2006; RHEE et al., 2004), Boraginaceae (AHMAD et al. 2003, Chenopodiaceae (FERHEEN et al., 2005), Lamiaceae (AHMAD et al., 2005. Liliaceae (ATTA-UR-RAHMAN et al. 2002), e Solanaceae (CHOUDHARY et al., 2004) foram encontrados vários compostos com atividade anticolinesterásica. O extrato da Thespesia populnea (Malvaceae) originária das regiões tropicais da Índia apresentou atividade anticolinesterásica em teste in vitro utilizando o método de Ellman e colaboradores (1961) modificado por Voss e Sachsse (1970), utilizando-se cérebro total de camundongos Swiss albino. Os animais tratados com o extrato apresentaram uma melhora significativa de memória (VASUDEVAN; PARLE, 2006). 30

Os alcalóides iperacina, forticina, delavina, persicanidina A e imperialina extraídos da Fritillaria imperialis (Liliaceae) apresentam atividade anticolinesterásica in vitro (tanto em AChE quanto em BChE) (ATTA-UR-RAHMAN et al., 2002). Recentemente, extratos metanólicos de vinte e sete plantas da flora colombiana foram testados. Entre as plantas que apresentaram atividade anticolinesterásica encontravam-se plantas das famílias Asteraceae, Euphorbiaceae, Malastomataceae, Rubiaceae e Solananceae (NINO et al., 2006). Diversas plantas com compostos alcalóides e terpenóides apresentaram atividade inibitória sobre a AChE, entre estas plantas está a Vaccinium aldhami (Ericaceae), da qual foi extraído o composto triterpeno TRX que apresentou atividade anticolinesterásica in vitro (LEE et al, 2004) e também o ácido triterpeno pentacíclico Ácido Ursólico (AU) que foi extraído da Origanum majorana L. (CHUNG et al., 2001).

3.5 Taraxerol

No universo científico, o TRX (figura 5), um composto triterpênico, não é um dos mais estudados, pois este, quando é solicitado na base de dados PUBMED, está presente em apenas 53 trabalhos, sendo 10 destes com estudos relacionados à atividade biológica, o restante são trabalhos que citam seu isolamento. Outro dado curioso é que este triterpeno desperta grande interesse na comunidade chinesa, os quais detem mais de 75% das publicações.

HO H Figura 5 Estrutura química do TRX

O TRX é referido pela primeira vez na literatura em 1963, em trabalho referente ao seu isolamento da planta Clitoria ternatea Linn por Banerjee e 31

Chakravarti (BANERJEE; CHAKRAVARTI, 1963). O composto está presente em várias partes das plantas, desde as raízes até as partes aéreas. Em raízes o composto foi isolado de plantas como Pseudostellaria heterophylla (LI; YANG, 2008) e Pterospermum heterophyllum (SHI et al., 2008). O TRX está presente nas partes aéreas de Vaccinium oldhami pertencente à família Ericaceae. É encontrado nas flores da Chrysanthemum morifolium, Matricaria matricarioides, Cosmos bininnatus, Carthamus tinctorius, Taraxacum platycarpum (AKIHISA et al., 1996; LEE et al., 2004). Nas folhas, o composto foi encontrado em plantas como Erythrophleum fordii (TSAO et al., 2008), Macaranga triloba (JANG et al., 2004) e Sebastiania adenophora (MACÍAS-RUBALCAVA et al., 2007). No caule o composto foi isolado de plantas como a Vepris punctata (CHARTUVEDULA et al, 2004). Encontramos o TRX nas cascas da Styrax japônica (KWON et al., 2008). Este triterpeno está presente ainda em todas as partes de Excoecaria agallocha (TIAN, et al., 2008), Vaccinium iteophyllum (WEI et al., 2007), Hietacium pilosella L (GAWRONSKA-GRZYWACZ; KRZACZEK, 2007), Strobilanthes callosus (SINGH; SAHU; SHARMA, 2002), Ventilago leiocarpa (LIN; CHOU; KUO, 2001) Crossostephium chinense, (YANG et al., 2008) e na planta Clitoria ternatea, a qual seu extrato é utilizado em formulações Ayurvédicas (KUMAR et al., 2008). Particularmente o TRX é encontrado ainda nas folhas da Eugenia umbelliflora Berg. (figura 6) (planta arrolada nesse estudo), a qual pertence à família Myrtaceae introduzida no Brasil e é utilizada na medicina popular no tratamento da diabetes. A E. umbelliflora Berg é conhecida popularmente como baguaçu, guapê e guamirim. Na ilha de Santa Catarina é popularmente pronunciado como “biguaçu” (REITZ, 1969; KUSKOSKI, 2000). Akihisa e colaboradores (1996) demonstraram em seus estudos que o composto TRX apresentou atividade antiinflamatória. Essa propriedade foi comprovada por Singh, Sahu e Sharma (2002) os quais evidenciaram o efeito anti- inflamatório deste triterpeno em modelo de edema de pata induzido por carragenina. Chaturvedula e colaboradores (2004) demonstraram que o TRX apresentou atividade citotóxica contra células cancerígenas de ovário humano. Tsao e colaboradores (2008) comprovaram que o TRX inibe potentemente (CI50 de 24,2 µM) a atividade da enzima óxido nítrico sintetase (NOS) das células gliais. Recentemente, Yang e colaboradores (2008) confirmaram a capacidade do

TRX de inibir o crescimento de células Hela e BGC-823, apresentando uma CI50 de 73,4 µmol x (-1) e 73,3 µmol x L(-1), respectivamente. 32

Quanto aos efeitos do composto com relação à atividade anticolinesterásica, Lee e colaboradores (2004) demonstraram que o TRX possui essa atividade. O composto foi encontrado em algumas plantas da flora catarinense já estudadas em nossos laboratórios.

c) d) b)

Figura 6 a) Frutos maduros; b) Frutos verdes; c) Folhas; d) Partes aéreas de E.umbelliflora Berg. Fonte: Delgado; Barbedo, 2007.

3.6 Ácido ursólico

Do ponto de vista científico, entre os compostos naturais mais estudados, o AU (figura 7) vem ocupando a segunda posição, perdendo somente para a quercetina.

Figura 7 Estrutura química do AU

Em revisão na base de dados PUBMED verificou-se que desde sua descoberta e isolamento da planta T. vulgaris por Rowe e colaboradores em 1949, mais de seiscentos artigos foram publicados, os quais relatam sua presença em 33

vários gêneros e famílias, bem como os estudos referentes à sua atividade biológica e farmacológica. O AU é um ácido triterpênico pentacíclico que já foi isolado de muitas plantas, sendo algumas delas Eriobotrya japonica, Rosmarinns officinalis, Glechoma hedeaceae, Origanum majorana L. (CHUNG et al., 2001), Prunela vulgaris (LEE et al., 2008), Ilex paraguariensis (PREDIGER et al., 2008), Helichrysum picardii (SANTOS ROSA et al., 2007), Clerodendrum serratum (VIDYA et al., 2007), Salvia sclareoides (RAUTER et al., 2007) e em nosso estudo Alamanda cathartica. Foram relatadas para o AU atividades antiinflamatória, anti-reumática, antiviral, antioxidante, anti-artrítica e anti-tumoral (SILVA et al., 2008; KANG et al., 2008), incluindo inibição de tumores de pele (HUANG et al., 1994). Ele também induz a diferenciação celular para regulação da expressão de genes específicos em camundongos F9 (LEE et al., 1994), e mostrou possuir um efeito anti-angiogênico (SOHN et al., 1993). Além disso, foi relatado que o AU apresenta uma atividade anti- invasiva sobre HT1080 em células fibrosarcoma humanas (CHA et al., 1996). Estudos realizados na China em 2009 por Tang e colaboradores revelaram que o AU é capaz de inibir mecanismos apoptóticos via bcl-2, isto é, o AU aumenta os níveis de bcl-2 (anti-apoptótica) ativado pela caspase-3 (TANG et al., 2009). Além disso, estudos anteriores na Korea mostraram que o AU tem moderada atividade citotóxica in vitro, especificamente nas células tipo A549, SK-OV-3, SK-MEL-2 e HCT15 (LEE et al., 2008). O AU também desperta interesse em outras áreas de estudos farmacológicos, como por exemplo, distúrbios metabólicos. Jang e colaboradores (2009) mostraram que o AU exibiu efeito anti-diabético e propriedades imunomodulatórias por aumentar os níveis de insulina com preservação das células beta-pancreáticas. Além disso, o AU também modula os níveis de glicose no sangue, proliferação de células T e produção de citocinas por linfócitos, em camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina e alimentados com uma dieta rica em gordura (JANG et al., 2009). O AU apresentou atividade antibacteriana significativa, embora limitada à bactérias Gram-positivas (FONTANAY et al., 2008). Em 2001, Chung e colaboradores relataram a atividade anticolinesterásica em células PC12. Além disso, Rauter et al (2007) demonstraram que o AU inibe a atividade colinesterásica tanto da enzima AChE quanto da Butirilcolinesterase (BuChE) (RAUTER et al., 2007). 34

Devido ao relato da atividade anticolinesterásica do AU em trabalhos anteriores da literatura, neste trabalho estudou-se o efeito do AU e do TRX utilizando metodologia diversificada das apresentadas anteriormente. Além disso, procurou-se estudar o efeito de ambos os compostos sobre a memória de animais através da infusão direta dos mesmos no cérebro dos animais.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Obtenção dos compostos

4.1.1 Obtenção do taraxerol

A extração do composto TRX foi realizada sob a orientação da Professora Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt. O composto foi extraído conforme descrito a baixo. As folhas da Eugenia umbelliflora foram coletadas no município de Porto Belo no mês de junho de 2007. A planta em estudo foi identificada pelo Professor Msc. Oscar Benigno Iza, cuja exsicata encontra-se depositada no Herbarium Barbosa Rodrigues, Itajaí-SC, sob o número VC Filho 50. As folhas da planta foram secas em estufa de circulação de ar na temperatura máxima de 40°C. O material vegetal foi triturado para aumentar a superfície de contato e melhorar o rendimento em relação à planta seca e submetido à extração utilizando Metanol (MeOH) durante 7 dias. Após este período o extrato foi concentrado à pressão reduzida em evaporador rotativo à temperatura de 50°C até um volume desejado. O extrato metanólico concentrado foi ressuspendido em solução de

Etanol:H2O (7:3) e submetido à partição com solventes de polaridade crescente iniciando com hexano e na seqüência diclorometano e acetato de etila. Considerando a presença do composto de interesse na fração de hexano, a mesma foi submetida à concentração para obtenção do resíduo seco. A fração hexânica foi submetida à purificação utilizando cromatografia em coluna aberta (CC) com sílica gel como fase estacionária e mistura de hexano e acetato de etila com aumento gradativo de polaridade como fase móvel. A obtenção do TRX, composto de interesse para os ensaios biológicos, foi monitorada por cromatografia em camada 35

delgada (CCD) com auxílio de padrão previamente identificado.

4.1.2 Obtenção do ácido ursólico

O AU foi isolado durante os experimentos realizados no Trabalho de Conclusão de Curso da aluna Viviane Nart, sob a orientação da professora Dr. Ângela Malheiros. A metodologia do isolamento do AU está descrita na monografia NART, V. Isolamento de princípios ativos de interesse farmacológico das partes aéreas da Allamanda cathartica. 2007, 90 f. Monografia – Bacharel em Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí SC, 2007.

4.2 Animais

Tanto os ensaios farmacológicos in vitro quanto in vivo foram utilizados ratos Wistar machos (250 a 300g). Os animais foram obtidos do Biotério Central da Univali e mantidos no biotério da farmacologia experimental, com ciclo claro/escuro de 12 horas e aclimatados a temperatura de 22 ± 2º C. Os animais foram tratados com água e ração ad libitum, exceto durante os experimentos. Para o processo de adaptação, os animais permaneceram no ambiente de realização dos testes 1h antes dos experimentos. Os protocolos experimentais foram apresentados ao Comitê de ética em Pesquisa da Univali, e os experimentos foram realizados mediante aprovação (número do protoloco 232/07) (anexo 01).

4.3 Avaliação da atividade anticolinesterásica (Bioautografia)

A utilização de métodos de detecção rápidos e eficientes de substâncias bioativas é uma etapa extremamente importante no processo de descoberta de novas moléculas (RATES, 2001). O screening para metabólitos bioativos a partir de um organismo vegetal pode envolver ensaios que permitem evidenciar atividade antibiótica, com inibição in vitro, farmacológica ou uso de modelos experimentais in vivo. O método de bioautografia deve fornecer resultados rápidos, com baixo custo, deve ser sensível e requerer pouco material de partida. O procedimento foi conduzido segundo metodologia anteriormente empregada por Marston, Kissling e Hostettmann (2002), com algumas modificações. O TRX e AU solubilizados em solvente apropriado foram aplicadas em placa cromatográfica de sílica gel e eluídas em mistura de solvente anteriormente 36

determinado (Diclorometano e Metanol). Após migração das amostras, a placa foi submetida à secagem com auxílio de secador. A placa foi borrifada com a solução da enzima (AChE da enguia elétrica em tris-hidroximetilaminometano pH 7,8) e submetida novamente à secagem. Para incubação da enzima a placa foi transferida para um tanque contendo água com o auxílio de uma pinça, mantendo a umidade atmosférica na temperatura de 37oC em estufa por 20 minutos de incubação. Decorrido os 20 minutos a placa foi borrifada com uma solução contendo acetato de 1-naftil e fast blue B promovendo a formação de coloração púrpura em toda a placa cromatográfica após 2 minutos. A atividade anticolinesterásica foi determinada pelo aparecimento de manchas brancas após 5 minutos em comparação à amostra padrão, demonstrando desta forma a ação inibitória das substâncias avaliadas sobre a atividade da enzima.

4.4 Ensaios farmacológicos in vitro

4.4.1 Avaliação da atividade anticolinesterásica em cérebro total e hipocampo de ratos

Neste experimento foram utilizados 20 animais: 10 animais foram sacrificados para a obtenção do encéfalo e 10 para a obtenção do hipocampo. Os animais foram sacrificados através de decaptação por guilhotina e o encéfalo foi removido. O encéfalo foi dissecado, pesado e homogeneizado em 10 volumes de Tris-HCl 10 mM, pH 7,2 contendo sacarose 160 mM. O homogenato foi submetido à centrifugação (1.000 g/10 min à 4ºC) e o sobrenadante obtido (fração S1) foi separado e armazenado à -20ºC até o momento dos ensaios enzimáticos. O hipocampo foi homogeneizado em 20 volumes do tampão Tris-HCl 10 mM. Para esta estrutura cerebral, o homogenenato foi submetido a 1.000 g/15 min à 4ºC. O sobrenadante obtido (fração S1) também foi armazenado à -20ºC até o momento dos ensaios enzimáticos (PEREIRA; ADAMS; SILVA, 2004).

4.4.2 Ensaio enzimático

A atividade específica da AChE de encéfalo e hipocampo foi determinada pelo método espectrofotométrico de Ellman e colaboradores (1961), modificado por Pereira, Adams e Silva (2004). Este método espectrofotométrico é um dos métodos mais utilizados para a análise das atividades da butirilcolinesterase e da acetilcolinesterase (FURLANELLO, 2006). O meio de análise continha 50 µL de ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB) 1mM, 990 µL de tampão fosfato de potássio 24 mM (pH 7,2), 50 µL de material enzimático e 10 µL da solução contendo os compostos. A reação foi iniciada pela adição de 25 µL de acetiltiocolina 0,8 mM (substrato), sendo monitorada durante 4 min a 412 nm em espectrofotômetro em temperatura ambiente (24 a 25˚C). A atividade da AChE foi expressa em µmol de acetiltiocolina hidrolisada/hora/miligrama de proteína (PEREIRA; ADAMS; SILVA, 2004). A concentração de proteína das amostras do homogeneizado de encéfalo e hipocampo foi determinada pelo método de azul Coomasine (BRADFORD, 1976), utilizando-se a albumina sérica bovina como padrão. O efeito inibitório dos compostos foi avaliado nas concentrações de 0,89, 1,77 e 3,6 µM para TRX e 0,017, 0,09, 0,27, 0,44, 0,89, 1,78 e 3,6 µM para AU.

4.5 Ensaio farmacológico in vivo

4.5.1 Cirurgia-esteriotáxica e implantação de cânulas

Para avaliar a atividade dos compostos sobre a memória, os compostos foram infundidos no hipocampo e, para tanto foi necessário o procedimento de estereotaxia. Todo o procedimento foi realizado segundo descrito por De Souza (2000) e Cammarota e colaboradores, (2005) com algumas modificações. Os ratos foram anestesiados com uma mistura de quetamina (80mg/kg, i.p.) e xilazina (75 mg/kg, i.p.) e fixados no equipamento estereotáxico (Insight®). Após a verificação da anestesia (evidenciado pela perda de todos os reflexos, principalmente o doloroso) foi realizada a tricotomia de toda a parte superior de sua cabeça e posterior adaptação ao aparelho. Em seguida foi realizada a assepsia da área com álcool 38

iodado 10% e uma solução de xilocaína com epinefrina (2%) foi infundida subcutaneamente por todo o campo cirúrgico. A calota craniana foi exposta numa área de 3 a 4 mm anteriores à sutura coronariana, através de remoção de uma área ovalada. O periósteo de toda a região foi raspado. Em seguida, o crânio foi reposicionado no aparelho estereotáxico de forma que o bregma e o lambda ficassem em um mesmo plano horizontal (De- SOUZA, 2001; CAMMAROTA et al., 2005). Para o implante das cânulas (obtidas de agulhas comuns 25x7) na região CA1 da região dorsal do hipocampo (CA1), as coordenadas obedecidas, segundo Paximos e Watson (1986) foram as seguintes: 1 mm acima da região CA1 da região dorsal do hipocampo (A= - 4.2, L= ± 3.0, V= - 1.3). Uma vez adaptadas as cânulas bilateralmente nas regiões do hipocampo (CA1), o osso craniano foi seco e a área aberta foi preenchida com uma prótese de polímero autopolimerisável que ao endurecer incorporou todas as peças em uma prótese sólida (De SOUZA, 2001; CAMMAROTA et al., 2005). Como tratamento pós-operatório os animais receberam paracetamol (200 mg/kg) por via oral. Esperaram-se no mínimo 48 horas após o procedimento cirúrgico para a realização do teste de esquiva inibitória.

Figura 8 Animal apoiado no equipamento de estereotaxia. Fonte. BERTÉ, 2009.

Figura 9 Desenho esquemático de secções coronais dos pólos septal. Assinalados os campos CA1, CA3 e o giro denteado (GD) do hipocampo. Adaptado. Fonte. http://www.scielo.br/img/revistas/prc/v19n1/31305f1.gif. Acesso em: 15/04/2009.

4.5.2 Microinjeção intracerebral dos compostos na região CA1 do hipocampo

Para a infusão dos compostos na região CA1 (figura 5 e figura 9) foram utilizadas agulhas de 13 mm de comprimento e 0,3 mm de diâmetro, adaptadas a partir de agulhas odontológicas, conectadas a microseringas (Hamilton®) de 0,5 µL, por um tubo de polietileno. As agulhas tinham 1 mm de comprimento a mais do que a cânula-guia de forma que o composto foi realmente microinjetado na região estudada. As seringas foram preenchidas com uma solução de TRX na concentração de 1,77 µM e AU 4,54 mM ambos diluídos em líquor artificial. Para a microinjeção, o animal foi mobilizado na altura do colo com o auxílio de um pano (figura 6) e com o alicate foi retirado o mandril adaptado à cânula durante o ato cirúrgico. Com o auxílio de agulhas odontológicas de 20 mm (K-FILE Colorinox), usadas para a desobstrução do canal dentário, as cânulas-guias foram limpas. Posteriormente a agulha foi adaptada ao tubo de polietileno contendo os compostos e, suavemente introduzida através da cânula. Ao final da injeção a agulha foi deixada no local por 15 segundos adicionais (De- Souza, 2001; MAZZAMBANI, 2005). 40

Figura 10 Microinjeção intracerebral. Fonte: MAZZAMBANI, 2005.

4.5.3 Avaliação da atividade dos compostos sobre as etapas da memória no do modelo de esquiva-inibitória

Na tarefa da esquiva inibitória o comportamento explorador habitual do animal é inibido pela aplicação de choques. Assim a aprendizagem se manifesta através da inibição do comportamento exploratório natural do animal. O aparelho utilizado consistiu de uma caixa automatizada medindo 50 cm de comprimento, 25 cm de largura e 25 cm de altura, com a face frontal em vidro (Albarsch®). O assoalho é constituído de uma grade de barras de bronze, com 1 mm de diâmetro, espaçada 1 cm umas das outras, através da qual é possível aplicar uma diferença de potencial regulável de 0 a 1 mA. Sobre o assoalho foi adaptado uma plataforma de madeira (regulável), sobre a qual cada animal é colocado (figura 7). Nas sessões de treino os animais foram colocados sobre a plataforma, cronometrando-se a latência de descida completa do animal da plataforma (com as quatro patas na grade de bronze), quando isso ocorria era aplicado choques de 0,4 mÅ por 2 segundos entrecortados até a reação de subida para a plataforma (IZQUIERDO et al., 1998; De SOUZA, 2001; CAMMAROTA et al., 2005). Para o teste da aquisição da memória os compostos foram injetados diretamente no hipocampo 5 min antes do treino na esquiva inibitória. Decorridas 24 h após o treino, o mesmo procedimento foi realizado, desta vez com omissão dos choques. No teste de consolidação da memória os animais foram treinados e imediatamente após o treino, foram injetados com os compostos, aguardando 24 h após o treino para a medida da memória. Na evocação da memória os compostos 41

foram injetados 5 min antes do teste, tendo os mesmos sido treinados conforme procedimento descrito. Durante o teste, o tempo máximo permitido para cada animal permanecer sobre a plataforma foi de 180 s (IZQUIERDO et al, 2000; PREDIGER et al., 2008). Os animais cuja diferença de latência ultrapassaram este limite, ficaram computados com este valor (IZQUIERDO et al., 2000). A latência para a descida entre o teste e o treino foi considerada como índice de retenção de memória.

Figura 11 Tarefa da esquiva inibitória. Fonte. BERTÉ, 2009.

4.5. 4 Avaliação da atividade dos compostos sobre a amnésia induzida por escopolamina través do modelo de esquiva-inibitória

Para verificar a influência dos compostos sobre a amnésia induzida por escopolamina (5 µg/sítio), antagonista muscarínico, durante aquisição da memória a escopolamina foi infundida diretamente no hipocampo 5 min antes da injeção dos compostos, os quais por sua vez, foram injetados 5 min antes do treino da esquiva inibitória. Decorrido 24 h após o treino, o teste foi realizado. Para verificar a influência dos compostos sobre a amnesia induzida por escopolamina durante consolição da memória a escopolamina foi infundida diretamente no hipocampo imediatamente após o treino e 5 min antes da injeção dos compostos. Aguardou-se 24 h após o treino para a medida da memoria. Na evocação da memória a escopolamina foi injetada no hipocampo também 5 min antes da injeção dos 42

compostos que foram por sua vez injetados 5 min antes do teste, tendo os mesmos sido treinados conforme procedimento descrito (HUNSAKER t al., 2007).

4.5.5 Histologia

Ao término de cada teste os animais foram sacrificados em câmara de CO2, em seguida foi infundida uma solução de azul de metileno 2% (0,5 µL) para demarcação do local da implantação das cânulas e então foram decapitados com guilhotina para a dissecação do encéfalo. Os encéfalos retirados foram fixados em uma solução de formaldeído 10% e enviados para a análise histológica. Os animais que não apresentaram a correta implantação da cânula nas regiões em estudo foram desprezados na análise estatística dos ensaios comportamentais. As análises histológicas foram realizadas na Universidade Federal do Rio Grande (FURG) sob orientação da Professora Dra. Beatriz Moleta.

4.5. 6 Testes complementares

Os testes complementares foram realizados pelos alunos de graduação em Farmácia Maurício Fracasso e Diogo Adolfo dos Santos.

4.5.6.1 Efeito dos compostos sobre a atividade exploratória dos animais submetidos ao teste do campo aberto (Open Field)

Como objetivo de verificar se a administração dos compostos poderia afetar o sistema motor dos animais e comprometer os resultados referentes ao comportamento de cada um no teste da esquiva inibitória, foi utilizado o teste do campo aberto ou Open field. Devido a escassez do TRX, somente o AU foi testado. Através do modelo do campo aberto pode-se verificar se os compostos em estudo exercem algum efeito sobre a memória, ansiedade ou sobre o sistema motor dos animais, conforme o protocolo experimental adotado (De-SOUZA, 2001 MAZZAMBANI, 2005, RODRIGUES et al., 2002). O teste foi realizado em um campo aberto circular (Insigth®) de acrílico com as paredes transparentes (figura 8). O chão do aparato era dividido em 8 quadrados iguais agrupados circularmente e um centro dividido em outras 4 partes. Os parâmetros comportamentais observados nesse 43

teste foram os números de cruzamentos (crossings) e o número de atividade exploratória (rearings). A redução dos parâmetros comportamentais relacionados à atividade exploratória e cruzamentos observados durante o experimento podem ser considerados indicativa de efeitos depressores com possível efeito sobre o sistema motor dos animais (MAZZAMBANI, 2005). Para realizar o experimento foram infundidas 1,0 µg/sítio (4,54 mM) de AU na região CA1 do hipocampo e posteriormente (5 min) os animais foram testados. Os animais foram colocados no centro do aparato e os parâmetros comportamentais foram registrados por um período de 6 minutos. Dois grupos foram utilizados como controle: um (controle negativo), onde os animais receberam o veículo (solução salina) e outro (controle positivo), onde os animais receberam midazolam (0,75 µg/sítio). Após a passagem pelo Open Field os animais utilizados nesse experimento foram imediatamente avaliados no teste do labirinto em cruz elevado.

Figura 12 Esquema representativo da investigaçãodo efeito do AU sobre a deambulação dos animais através do MOF. Fonte. Fracasso, 2008.

4.5.6.2 Efeito dos compostos sobre a ansiedade de animais submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado

Com o objetivo de verificar se o grau de ansiedade nos animais poderia influenciar nos efeitos do AU sobre a memória, os animais foram primeiramente testados no modelo do labirinto em cruz elevado. Conforme observação anterior, somente o AU foi testado. O labirinto em cruz elevado (LCE) foi adaptado do modelo de Montgomery criado em 1955 (figura 9). Este pesquisador desenvolveu um labirinto elevado no qual a intensidade do medo natural induzida poderia ser medida pela variação da proporção do comportamento exploratório entre os braços abertos e fechados do aparato. Em 1985 o modelo foi validado farmacologicamente, etologicamente e fisiologicamente por Pellow e colaboradores. Nesse teste, drogas com perfil ansiolítico como diazepam, midazolan, clordiazepóxido e fenobarbital tendem a aumentar a exploração e a tempo de permanência nos braços abertos, enquanto que, drogas com perfil ansiogênico como a picrotoxina, ioimbina, anfetamina e cafeína tendem a diminuir esses parâmetros comportamentais (PELOW et al., 1985; PELLOW; FILE, 1987; ARAGÃO et al., 2006). O LCE para ratos consiste de dois braços abertos (50 x 10 cm2) e dois braços fechados (50 x 10 x 15cm3 ). A área central (10 x 10 cm3) é elevada á 70 cm do chão (figura 9). As medidas comportamentais registradas foram: a freqüência de entradas e o tempo despendido nos braços abertos e fechados (RODGERS; COLE, 1994). Foram considerados como entradas em um dos braços do LCE quando o animal colocou as quatro patas dentro do respectivo braço.

Figura 13 Labirinto em Cruz Elevado. Fonte. Fracasso, 2008.

4.6 Drogas e/ou reagentes

Os reagentes (metanol, hexano, diclorometano e acetato de etila) utilizados na obtenção dos compostos são de grau comercial da marca VETEC e SYNTH. Foram utilizados Tris (Labsynth), sacarose (Cromato), ácido 5,5-ditio-bis-(2- nitrobenzóico (DTNB) (Sigma), fosfato de potássio (Cromato), acetiltiocolina (Across Orgawics), ketamina (Vetbrands), xilazina (Agener União), cloridrato de lidocaína + epinefrina 2% (Cristália), acrílico auto polimerizante (Clássico Indústria Brasileira), paracetamol (Medley) e escopolamina (Sigma-Aldrich), acetato de 1-naftil (Acros Organics), Sal Fast Blue B (Fluka), acetilcolinesterase da enguia elétrica (SIGMA C2888-1KU), ácido clorídrico HCl (Cromato) e álcool iodado 10% (Lifar).

4.6.1 Líquor artificial

Para diluição dos compostos foi utilizado líquor artificial preparado conforme descrito por File et al. (1999). Para 200 ml de líquor artificial foram utilizados: 147,6 mg de cloreto de Sódio NaCl (Merck), 460 mg de bicarbonato de sódio NaHCO3 (Merck), 35,6 mg cloreto de potássio KCl (Merck), 1,2 mg de fosfato de potássio

KH2PO4 (Cromato), 26,4 mg de cloreto de cálcio CaCl2 (Merck), 32,8 mg de cloreto de magnésio MgCl2 (Merck), 13,6 mg de fosfato de sódio NaHPO4 (Merck) e 257,2 mg de glicose (Cromato).

4.7 Análise estatística

Para os testes paramétricos os dados obtidos foram apresentados com médias seguidas pelos respectivos erro padrão da média (EPM). Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via, quando necessário, foram submetidos a testes de múltipla comparação a partir do modelo pos hoc de Dunnet, utilizando o software GrafhPad ® e INSTAT ®. Para os testes não paramétricos como o modelo da esquiva inibitória, foi utilizado o test de Mann-Whitney para comparações entre os grupos e Kruskal-Wallis e Wilcoxon para comparações entre treinos e testes. Os resultados foram apresentados como medianas seguidas dos intervalos interquartis. Foram considerados estatisticamente significantes os valores de p menor do que 0,05 (p<0,05).

5 RESULTADOS

5.1 Obtenção e identificação do taraxerol

O TRX foi isolado por Cromatografia de Coluna (CC) da fração hexano do extrato metanólico das folhas da Eugenia umbelliflora. Este composto apresentou-se como cristais brancos, solúvel em diclorometano. Sua estrutura foi confirmada através de análises de RMN 1H e RMN 13C e comparadas com dados da literatura (MAHATO; KUNDU, 1994). Algumas frações contendo TRX foram submetidas à lavagem com hexano para obtenção de sólido branco e reunidas ao composto puro isolado. No espectro de RMN 1H (figura 14) observa-se dois duplo-dubletos em 5,53 referentes ao hidrogênio olefínico H15 e em 3,19 referente ao H3. Na região de 1,10 a 0,80 observam-se oito sinais como simpletos referentes às metilas 23 a 30. No espectro de RMN de 13C/APT (figura 15) pode-se evidenciar treze sinais referentes à CH/CH3 e 17 sinais referentes a C/CH2. Observam-se em 158,1 e 116,9 os carbonos olefínicos C14 e 15, respectivamente. Em 79,1 sinal característico de carbono ligado à oxigênio atribuído para o C3. Observam-se ainda oito sinais característicos das metilas entre 15,4 e 33,3 ppm. As atribuições dos sinais de RMN 1H e 13C (figura 14 e 15) estão dispostas na Tabela 1 e encontram-se de acordo com os dados encontrados na literatura para o TRX (MAHATO; KUNDU, 1994; LAPHOOKHIEO; KARALAI; PONGLIMANONT, 2004; LEE et al., 2004).

Figura 14 Espectro de RMN-1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX.

Figura 15 Espectro de RMN-13C/ APT (300 MHz, CDCl3/TMS) do TRX.

Tabela 1 Valores de deslocamentos químicos (, ppm) de RMN 1H e 13C para o TRX e dados da literatura para o TRX.

Posição RMN-¹H Literatura* RMN-¹³C Literatura** Taraxerol / APT Taraxerol δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) δ ( ppm) 1 38,0 (CH2) 38,1 2 27,2 (CH2) 27,3 3 3,2 dd 3,19 dd 79,1(CH) 79,2 J= 13,6; 6,4 Hz J= 11,2; 4,4 Hz 4 - - 39,0 (C) 39,1 5 0,91m 0,90, m 55,6 (CH) 55,7 6 1,45, m 18,8 (CH2) 19,0 7 1,60, m 1,65, m 35,1 (CH2) 35,3 8 - - 38,8 (C) 38,9 9 0,92, m 48,8 (CH) 48,9 10 - - 37,7 (C) 37,9 11 1,45, m 17,5 (CH2) 17,7 12 1,30, m 35,8 (CH2) 35,9 13 - - 37,6 (C) 37,9 14 - - 158,1(C) 158,1 15 5,54, dd, J= 5,53, dd, J= 7,6, 116,9 (CH) 117,0 7,9, 3,0 HZ 3,6 Hz 16 2,0, m; 1,9, dd, 1,65, m; 1,94, 36,7 (CH2) 36,9 10,5; 3,6, Hz dd; 14,7; 2,7Hz 17 - - 37,7 (C) 38,1 18 1,45, m 49,3 (CH) 49,4 19 1,35, m; 2,05, m 41,4 (CH2) 41,4 20 - - 28,8 (C) 29,0 21 1,30, m 33,7(CH2) 33,9 22 1,62, m 33,1(CH2) 33,2 23 0,91, s 0,91, s 28,0 (CH3) 28,1 24 0,93, s 0,93, s 15,4 (CH3) 15,6 25 0,98, s 0,98, s 15,4 (CH3) 15,6 26 1,09, s 1,09, s 29,9 (CH3) 30,1 27 0,82, s 0,82, s 25,9 (CH3) 26,0 28 0,80, s 0,80, s 29,8 (CH3) 30,1 29 0,95, s 0,95, s 33,3 (CH3) 33,5 30 0,91, s 0,91, s 21,3 (CH3) 21,3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 300 MHz 300 MHz 75,5 MHz 100 MHz * LAPHOOKHIEO; KARALAI; PONGLIMANONT, 2004. ** LEE et al., 2004.

5.2 Avaliação da atividade da AChE

5.2.1 Bioautografia do TRX

O efeito do TRX sobre a atividade da AChE foi detectada após o aparecimento de halos brancos nas regiões onde continham o composto (figura 16). Nas concentrações usadas (180, 120, 90, 60, 30, 15 e 6 µg), o composto inibiu a enzima nas concentrações de 180 a 15 µg. Não foi observada efeito do TRX na 51

concentração de 6 µg. Como pode ser observado, o TRX apresentou um fator de retenção de 0,47 (Rf= 0,47) e reação positiva na biaoutografia. Nesta metodologia foi descartada a hipótese de interferências do solvente utilizado, uma vez que, o diclorometano foi evaporado antes da aplicação da solução de albumina contendo AChE.

a) b)

Figura 16 Método de bioautografia por CCD com TRX a) 1: 180 µg; 2: 150 µg; 3: 120 µg; 4: 90 µg; 5: 60 µg; 6: 30 µg b) 1: 90 µg; 2: 60 µg; 3: 30 µg; 4: 15 µg; 5: 6 µg. A pesquisa foi realizada em CCD sílica gel, eluído com H: AcOEt (8:2) e reagentes específicos.

5.2.2 Resultados da Bioautografia do AU

Da mesma forma que foi pesquisada a atividade anticolinesterásica do TRX foi pesquisada a atividade do AU sobre a atividade da AChE. Surgiu halos brancos nas regiões onde continham o composto e assim, foi detectada sua atividade em todas as concentrações utilizadas (180, 150, 120, 90, 60, 30, 15 e 6 µg) (figura 17). Como pode ser observado, o AU apresentou um fator de retenção de 0,58 (Rf= 0,58) e reação positiva na biaoutografia. Como anteriormente, foi descartada a hipótese de interferências do solvente utilizado, uma vez que, o diclorometano: metanol (1:1) foi evaporado antes da aplicação da solução de albumina contendo AChE.

A B B

Figura 17 Método de bioautografia por CCD com AU A) 1: 180 µg; 2: 150 µg; 3: 120 µg; 4: 90 µg; 5: 60 µg; 6: 30 µg B) 1: 90 µg; 2: 60 µg; 3: 30 µg; 4: 15 µg; 5: 6 µg. A pesquisa foi realizada em CCD sílica gel, eluído com H: AcOEt (7:3) e reagentes específicos.

5.3.1 Atividade anticolinesterásica do TRX

Na figura 18 estão representados os resultados obtidos com o TRX com relação a sua atividade anticolinesterásica em encéfalo. No ensaio enzimático realizado, nenhuma das concentrações do TRX utilizadas apresentaram inibição da atividade da AChE de forma significativa quando comparadas com o grupo controle. Entretanto, quando o ensaio enzimático foi realizado utilizando-se o hipocampo (Figura 19), verificou-se que o composto nas doses mais baixas produziu inibição da atividade da enzima de forma significantiva quando comparado com o controle. As IMs (percentagens de inibições máximas) calculadas para esse experimento foram de 20,8% ± 1,99 e 23,9% ± 2,42 respectivamente. 53

1750 )

a 1500 n i e t E 1250 o h r C p

g 1000 / e n d i a m d 750 / i v C i t T A A 500

M µ µ µ µ

( 250

0 Controle 0.89 1.77 3.6

Concentração (uM)

Figura 18 Efeito do TRX (0,89 - 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em encéfalo. Cada coluna representa a média de 5 experimentos (n=5) realizados em duplicata e, as barras verticais os ± EPM. ANOVA de uma via com teste de comparação múltipla de Dunnett.

750 a a n

í ** n

i ** e l t

o 500 o c r o p i

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d l o o 250 r m d i u h

0 Controle 0.89 1.77 3.6

Concentração (uM)

Figura 19 Efeito do TRX (0,89 – 3,6 µM) sobre a atividade da AChE em hipocampo de ratos. Cada coluna representa a média de 5 experimentos em duplicata (n=5) e as barras verticais os EPM. ANOVA de uma via com o teste de comparação múltipla de Dunnett. **p < 0,01 em relação ao controle.

5.3.2 Atividade anticolinesterásica do AU

Nos ensaios referentes aos efeitos do AU sobre a atividade colinesterásica no encéfalo (figura 20) foi observado que o composto promoveu inibição dessa 54

atividade (efeito anticolinesterásico) na concentração de 0,27 µM com IM de aproximadamente 14,0% ± 1,76. Entretanto, nos experimentos realizados com hipocampo (Figura 21) foram observados inibições da atividade enzimática da AChE nas concentrações de 0,017, 0,09, 0,44 e 0,89 µM com IM de aproximadamente 14,84% ± 5,49, 18,3% ± 1,82, 29,94% ± 12,6 e 17,83% ± 3,36, respectivamente.

1100 1000 900 a

a ** n í n 800 i l e t o o

c 700 r o p i

t l

g 600 i t m e /

c 500 h / a l

o 400 o r d m i

u 300 h

200 100 0 C 0.017 0.09 0.27 0.44 0.89 1.78 3.6

Concentração (uM)

Figura 20 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em encéfalo. Cada coluna representa a média de 7 experimentos (n=7) em duplicata e as barras verticais os ± EPM. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett. ** p < 0,01 em relação ao controle.

1000

a 750 ** * a ** n í n i l e t o o c r o p i

t l g i t 500 m e / c h / a l

l o o r d m i u h 250

0 C 0.017 0.09 0.26 0.44 0.89 1.78 3.60

Concentração (uM)

Figura 21 Efeito do AU sobre a atividade da AChE em hipocampo. Cada coluna representa a média de 7 experimentos (n=7) em duplicata e as barras verticais os ± EPM. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação múltipla de Dunnett. * p > 0,05 e ** p< 0,01 em relação ao controle. 55

5.4 Resultados dos ensaios farmacológicos in vivo

5.4.1 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais no modelo de esquiva inibitória

No presente estudo procurou-se estudar o efeito do TRX e AU sobre a memória da esquiva inibitória, avaliando somente a MLD e suas etapas (aquisição, consolidação e evocação). Como mostra a figura 22, no processo de aquisição da memória, houve aprendizagem da tarefa da esquiva inibitória pelos animais tratados com veículo (controle negativo) e TRX de forma significantiva. Quando se compara o efeito do composto na sessão de teste, observa-se que o tratamento dos animais com o mesmo, não promoveu alterações na aquisição da memória dos animais, uma vez que no teste os animais tratados e não tratados tiveram o mesmo comportamento Na figura 23 estão representados os resultados obtidos com o TRX sobre o processo de consolidação da memória dos animais testados na esquiva inibitória. Tais resultados demonstram que o tratamento dos animais com o composto TRX promoveu fascilitação do processo de consolidação da memória de forma significativa quando se compara controles e tratados na sessão de teste (p<0,05). Também se observa que os animais aprenderam a tarefa nos dois grupos de tratamento, uma vez que houve diferenças significativas quando se compara as sessões de treino com as de teste em cada um dos grupos estudado.

180 ** )

s Treino ( * a Teste d i c

s 120 e D

e d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo Taraxerol

Figura 22 Efeito da administração intrahipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a aquisição da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam as sessões de treino e as escuras o teste. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam diferenças significativas quando se compara treino e teste (* p<0,05 e ** p<0,01). Teste de Kruskal- Wallis.

180 ** )

s Treino (

a Teste d i c

s 120 e D

e ** d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo Taraxerol

Figura 23 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL ) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam a sessão de treino e as escuras o teste. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). ** denotam diferenças significativas quando se compara treino e teste (** p< 0,01). # denotam diferenças significativas quando se compara o tratamento com o controle na sessão de teste # p < 0,05. Teste de Kruskal-Wallis entre treino e teste e Mann-Whitney entre os grupos. 57

Com relação ao processo de evocação da memória (figura 24), o TRX não promoveu diferença estatísticamente significativas quando feita as comparações entre veículo e tratamento nas sessões de teste. Entretanto, em ambos os tratamentos observou-se o aprendizado da tarefa.

180 ** * )

s Treino (

a Teste d i c

s 120 e D

e d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo Taraxerol

Figura 24 Efeito da administração intra-hipocampal de veículo (líquor artificial/0,5uL) e do TRX 1,77 uM/sítio) sobre a evocação da memória de ratos testados na tarefa da esquiva inibitória. As colunas brancas representam a sessão de treino e as escuras o teste. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam diferenças significativas quando se compara treino e teste (* p<0,05 e ** p<0,01). Teste de Kruskal- Wallis.

Após a verificação dos efeitos do TRX sobre a memória da esquiva inibitória, investigou-se o efeito do AU com o mesmo modelo farmacológico, também avaliando separadamente seu efeito sobre a aquisição, consolidação e sobre a evocação. Na figura 25 observa-se que quando infundido diretamente no hipocampo, o AU promoveu aumento significativo e estatisticamente significante (P < 0,05) da latência de descida da plataforma na sessão de teste, facilitando a aquisição da memória dos animais. Também se observa na mesma figura que os animais tratados com AU não tiveram melhor aprendizagem da tarefa quando se compara com o grupo tratado com veículo . 58

180 * * )

s Treino (

a Teste d i c

s 120 e D

e d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo AU

Figura 25 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a aquisição da memória de ratos na esquiva inibitória. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos indicam diferenças significantes quando comparado treino e teste (* p<0,05). Teste de Kruskal-Wallis.

Na figura 26 estão representados os resultados obtidos com o AU sobre a consolidação da memória de animais submetidos ao teste da esquiva inibitória. Observa-se que o tratamento com o AU promoveu aumento da latência de descida da plataforma de forma estatisticamente significante (p<0,05), indicando que o mesmo é um agente facilitador da consolidação da memória nesses animais. 59

180 ) #

s Treino (

a * Teste d i c

s 120 e D

e d * a

i 60 c n ê t a L 0 Veículo AU

Figura 26 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM/sítio) sobre a consolidação da memória de ratos na esquiva inibitória. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). * indicam diferenças significantes quando se compara treino com teste e, # denotam diferenças estatísticas quando se compara tratados e controles na sessão de teste (p<0,05). Teste de Kruskal-Wallis quando comparado treino e teste e teste Mann-Whitney quando existe comparação entre os grupos.

Com relação a etapa de evocação da memória (figura 27), o tratamento dos animais com AU, quando infundido no hipocampo dos mesmos, não produziu nenhuma alteração na memória dos animais comparando-se com o grupo controle que recebeu veículo. Em ambos os casos, os animais tiveram o mesmo desempenho no teste da esquiva inibitória, não sendo detectados com o tratamento com o AU nem efeito amnésico nem efeito facilitatório. 60

90 )

s Treino (

a * Teste d i

c *

s 60 e D

a d

i 30 c n ê t a L 0 Veículo AU

Figura 27 Efeito da infusão intrahipocampal do AU (4,54 mM) sobre a evocação da memória de ratos na esquiva inibitória. Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). * indicam diferenças significativas quando se compara treino e teste (* p<0,05). ANOVA teste de Kruskal-Wallis.

5.4.2 Efeito dos compostos sobre a memória dos animais com amnésia induzida por escopolamina

No presente estudo, também nos propusemos a verificar o efeito do TRX e do AU sobre os processos de aquisição, consolidação e evocação da memória no modelo de esquiva inibitória em animais com amnésia induzida por escopolamina. Da mesma forma que nos testes anteriores, foi avaliado somente a MLD. Na figura 28, estão representados os resultados dos estudos com relação a aquisição. Pode-se observar que a escopolamina foi capaz de induzir amnésia nos animais de forma significativa (p <0,01) quando se compara com o grupo controle nas sessões de teste. Além disso, também pode ser observado que os animais pré- tratados com a escopolamina não exibem aprendizagem da tarefa por si só. Observa-se também que o TRX reverte o efeito amnésico da escopolamina de forma estatisticamente significante (p<0,05). Na etapa de consolidação (figura 29), percebe-se o mesmo perfil farmacológico dos tratamentos onde a escopolamina induziu amnésia de forma estatisticamente significante, sendo que o tratamento com o TRX produziu reversão deste quadro amnésico, também de forma significativa (p<0,05) quando comparado com os animais tratados somente com escoplamina, pode-se perceber que o TRX também melhorou a consolidação da memória. 61

# Treino Teste 180 ** * * ) s (

a d i c

s 120 e D

a d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo TRX Esc TRX + Esc

Figura 28 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e **p<0,01), # denotam diferenças estatísticas quando comparado os animais que receberam Esc+TRX na sessão de teste com os que receberam somente escopolamina (# p<0,05) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos. 62

Treino + # Teste 180 ** *

120 ** 60

** 0 Veículo TRX Esc TRX+Esc

Figura 29 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Astriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e ** p<0,01), + denotam diferenças estatísticas quando comparado teste do tratamento com controle (+ p<0,05) e # denotam diferenças estatísticas significativas quando comparado animais que receberam Esc+TRX com aqueles que recebram somente escopolamina (# p<0,05) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.

Quando avaliado o efeito do TRX e da escopolamina no processo de evocação de memória (figura 30), foi possível perceber que a escopolamina afetou a evocação da memória dos animais no modelo de esquiva inibitória de forma estatisticamente significante causando amnésia nos animais, e o tratamento com TRX foi capaz de reverter este processo amnésico (p<0,001). 63

# 180 ** * ) ** Teste s (

a Treino d i c

s 120 e d

e d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo TRX Esc TRX+Esc

Figura 30 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do TRX (1,77 uM/sítio) sobre evocação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e **p<0,01), # denotam diferenças estatísticas na sessão de teste quando se compara os animais que receberam TRX/escop com aqueles que receberam somente escopolamina (#p<0,5) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.

Depois de verificado o efeito do AU sobre as etapas da memória, também foi avaliado se esse composto poderia reverter a amnésia induzida pela escopolamina em animais submetidos ao teste da esquiva inibitória. O AU foi efetivo em reverter a amnéseia induzida por escopolamina de forma significativa no processo de aquisição (p<0,05) (Figura 31). No processo de consolidação da memória (figura 32) o mesmo perfil farmacológico foi observado com o AU. O composto facilita a consolidação da memória e quando testado em animais amnésicos, ele consegue reverter a amnésia induzida pela escopolamina. Neste processo o AU apresentou reversão total da amnésia, isto é percebido quando comparado testes do controle com AU+Esc, apresentando um p< 0,05. 64

# Treino 180 ** ** Teste ) s ( ** a d i c

s 120 e D

e d

i 60 c n ê t a L 0 Veículo AU Esc Esc+AU

Figura 31 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0,5uL), e do AU (4,54 mM) sobre aquisição da memória de animais com a amnésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). ** denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (**p<0,01), # denotam diferenças estatísticas na sessão de teste quando se compara os animais que receberam AU/escop com aqueles que receberam somente escopolamina (# p<0,05) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos.

# ## + Treino 180 ** * Teste ) s (

a d i c

s 120 e D

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i 60

c ** n ê t a L 0 Veículo AU Esc AU+Esc

Figura 32 Efeito da infusão intrahipocampal de veículo (líquor artificial/ 0.5uL), e do AU (4,54uM/sítio) sobre consolidação da memória de animais com a amésia induzida, por escopolamina (5 µg/sítio). Cada coluna representa a médiana de 8-13 animais e as barras verticais indicam os intervalos interquativos (25-75). Asteriscos denotam significâncias estatísticas quando se compara treino e teste com o mesmo tratamento (*p<0,05 e **p<0,01), + denotam diferenças estatísticas quando se compara os tratamentos na sessão de teste com o controle (+ p<0,01); # denotam diferenças estatísticas na sessão de teste quando se compara os animais que receberam AU/escop com aqueles que receberam somente escopolamina e quando comparado com o controle (# p< 0,05, ## p<0,01) ANOVA seguido de Kruskal-Wallis entre treinos e testes e teste de Mann-Whitney entre os grupos. 65

5.5 Testes complementares

5.5.1 Efeito do AU sobre a atividade exploratória dos animais submetidos ao teste do campo aberto (Open Field)

A figura 33 mostra o efeito do tratamento dos animais com AU (4,54 mM), administrado no hipocampo em animais testados no modelo Open Field. A que o tratamento com AU não produziu modificação nos números de cruzamentos (crossing), quando comparados com o grupo controle negativo (veiculo) (figura 33, A). Entretanto com relação ao número de rearings (Figura 33, B) o tratamento promoveu um aumento desse parâmetro de forma estatisticamente significante

(F(10.143) = 0, 7376, p < 0,01). No mesmo experimento observa-se também que o tratamento dos animais com midazolan, um benzodiazepínico, (controle positivo) (0,75µg/sitio) produziu aumento do número rearings de forma estatisticamente significante quando comparado com o veículo (F(10.143) = 0, 7064, p < 0,01).

s 80 A

o Veículo t n

e Àcido ursólico m

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N 0 Veículo Àcido ursólico Midazolan ** ** 20 B s g n i r a e R

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o r e m ú N 0 Veículo Àcido ursólico Midazolan

Tratamento (1ug/sítio)

Figura 33 Efeito da administração aguda do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75 g/sítio), administrados pela via intracerebral (hipocampo) sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de atividade exploratória (rearings) (B). Cada coluna representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01 ).

5.5.2 Efeito do AU sobre a ansiedade dos animais submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado

Os resultados representados neste modelo (Figura 34) demonstraram que o

AU, promoveu um aumento significativo (F(6.348) = 6,07, p < 0,01) na freqüência de entradas nos braços abertos (Figura 34, A), quando comparados ao grupo controle (veiculo). Também se pode observar que o tempo de permanência nos braços abertos (Figura 34, B), foi aumentado de forma significativa (F(17,794) = 5,13, p < 0,01) com o tratamento com o AU. Da mesma forma, verificou-se que o AU diminuiu

(Figura 34, C) significativamente o número de entradas nos braços fechados (F(33,378) = 2,30, p < 0,01). Com relação ao tempo de permanência nos braços fechados (Figura 34, D), o AU também promoveu uma diminuição significativa desse parâmetro comportamental (F (17.794) = 5,13, p < 0,01). Também foi observado nesse experimento o clássico efeito ansiolítico do midazolam. O fármaco produziu respectivamente um aumento da freqüência e do tempo de permanência nos braços abertos do aparato (Figura 34 C e D) (F (15,610) =

3,19, p < 0,05; F (17,794) = 3,54, p < 0,01).

Veículo Àcido ursólico Midazolan

100 A 100 B a

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0 T Veículo Àcido ursólicoMidazolan 0 Veículo Àcido ursólicoMidazolan

Figura 34 Efeito da administração intra-hipocampal do AU (4,54 mM/sítio) e do Midazolam (0,75 µg/sítio), em ratos submetidos ao modelo do LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteríscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (** p < 0,01).

6 DISCUSSÃO

As plantas superiores representam uma rica fonte de novas moléculas com propriedades farmacológicas para o desenvolvimento de novas drogas. Durante as últimas décadas, o interesse na investigação de produtos naturais levou à introdução na terapêutica de vários fármacos importantes, tais como os agentes antitumorais vinblastina e taxol ou o agente antimalária artemisinina (QUEIROZ, WOLFENDER, HOSTETTMAN, 2009). O sucesso obtido com a investigação dos produtos naturais é condicionado pela cuidadosa seleção vegetal, a qual se baseia em diversos critérios, tais como, os dados quimiotaxinômicos e as informações de medicina tradicional. Uma estratégia primordial que está sendo utilizada na obtenção de novos compostos é o chamado isolamento bioatividade-guiados, no qual ensaios farmacológicos ou biológicos são utilizados para orientar o isolamento de compostos bioativos de um extrato obtido de uma planta. Registros na literatura reportaram o uso da técnica pela primeira vez em 1987 por Duch e colaboradores os quais obtiveram do extrato de Stizophyllum riparium cinco terpenos com propriedades citotóxicas contra células tumorais leucêmicas do tipo P-388. Nos anos subseqüentes até os dias de hoje a técnica do estudo de isolamento bioatividade- guiados tem sido efetivamente aplicada pelos profissionais químicos-farmacêuticos oferecendo aos farmacologistas compostos com as mais diversas propriedades, dentre as quais se pode destacar propriedade tripanossomicida (Da SILVA MOTA et al., 2009), antifúngica (SCHUFFLER et al., 2009), analgésicas (ZHENG et al., 2009), anti-osteoporótica (WU et al., 2009), antiplaquetária (CHIA et al., 2008), ansiolítica (AGUIRRE-ERNÁNDEZ et al., 2007), anticolinesterásica (ROLLINGER et al., 2006; SUNG et al., 2002) , anticonvulsivante (AWAD et al. 2009), dentre outras. No presente estudo os compostos AU e TRX foram obtidos respectivamente de extratos de plantas como Alamanda cathartica e Eugenia umbeliflora. Após o isolamento e a comprovação da estrutura de ambos os compostos iniciou-se o estudo com a bioautografia, que se fundamenta na desacetilação do acetato de 1- naftil para gerar o 1-naftol por ação da enzima AChE, o qual reage com o reativo Fast Blue B, para produção de coloração púrpura pela formação do corante azóico na placa cromatográfica (MARSTON; KISSLING; HOSTETTMANN, 2002). A bioautografia por CCD é uma técnica relativamente simples e de baixo custo, considerando sua fácil execução, rapidez e reprodutibilidade (COLLINS; 70

BRAGA; BONATO, 2006), embora seja um teste qualitativo (TREVISAN et al., 2006). Este método vem sendo utilizado para a localização de compostos com propriedades antifúngicas, antibacterianas e antioxidantes a partir de matrizes vegetais que após procedimentos de purificação, identificação e ensaios complementares vem a contribuir para a descoberta de interessantes compostos líderes para o desenvolvimento de medicamentos de uso clínico (PIETERS; VLIETINCK, 2005). O efeito do TRX sobre a atividade da AChE foi detectado após o aparecimento de halos brancos nas regiões onde continham o composto nas concentrações de 180, 120, 90, 60, 30 e 15 µg. Já com o AU foi percebido halos brancos em todas as concentrações testadas (180, 150, 120, 90, 60, 30, 15 e 6 µg). Os dados obtidos no presente estudo confirmam a atividade anticolinesterásica dos compostos AU e TRX, conforme descrito Chung et al. (2001) e Lee et al. (2004). Uma vez que a atividade anticolinesterásicas dos compostos em estudo foi confirmada por ensaio de bioatividade-guiada, procedeu-se novo experimento para verificar o efeito dos compostos sobre a enzima quando esta se encontra em seu local de origem, ou seja, nas sinapses colinérgicas. Para tanto, o método de Ellman foi realizado em tecido cerebral. Trata-se de um experimento simples, onde a enzima contida na amostra (nesse caso, o encéfalo e hipocampo) hidrolisa a acetiltiocolina, gerando como produto a tiocolina, a qual reage com o reagente de Ellman (DTNB) tornando a reação de cor amarelada (TREVISAN; MACEDO, 2003; ELLMAN, 1961). Estudos realizados por Lee e colaboradores (2004) demonstraram que o TRX exibiu atividade anti-AChE (inibição de 80%) quando avaliado na região mesolímbica do cérebro de camundongos na concentração de 400 µM. Com o objetivo de confirmar estes resultados e avaliar se, este composto exerce sua ação na área cerebral envolvida no processo de memória (o hipocampo), o mesmo foi submetido à análise utilizando como fonte da enzima o encéfalo e hipocampo de ratos. Nossos resultados demonstraram que o TRX não tem efeito inibitório sobre a atividade da AChE no encéfalo, entretanto houve inibição da atividade enzimática no hipocampo, e esse efeito foi observado utilizando-se concentrações variando entre 0,89 a 3,6. µM. Ou seja, doses muito menores do que a utilizada por Lee e colaboradores. Embora tenha sido tentado no presente estudo utilizar as mesmas concentrações utilizadas por Lee et al. (2004) para verificar o efeito do TRX sobre a atividade da enzima, não fora obtido sucesso, uma vez que a reação ocorre em meio polar e o 71

TRX é um composto apolar, precipitando em concentrações mais elevadas. Lee e colaboradores não esclarecem qual solvente fora utilizado em seus experimentos, entretanto, sabe-se que solventes orgânicos podem desnaturar a enzima por diminuírem a constante dielétrica do meio (MARZZOCO; TORRES, 2007). No ensaio enzimático realizado com o AU, houve inibição da AChE na concentração de 0,27 µM no encéfalo, já em hipocampo a atividade enzimática foi inibida com as concentrações de 0,01, 0,09, 0,44 e 0,89 µM. Não foi observado inibição enzimática em todas as concentrações em hipocampo, apesar de ser encontrado nessa estrutura feixes colinérgicos bastante caracterizados (DASHNIANI et al., 2009). Além disso, no presente trabalho, durante os experimentos não foi possível determinar que tipo de isoformas da AChE poderiam estar sendo inibidas pelos compostos TRX ou AU, o que explicaria efeitos diferentes desses compostos no hipocampo. Das e colaboradores (2005) demonstraram a presença de três isoformas, (G1, G2 e G4) as quais são distribuídas de diferentes formas por todo o SNC. Chung e colaboradores (2001) avaliaram o efeito do AU sobre a atividade enzimática utilizando cultura de células PC12. Neste trabalho foi observado que o

AU apresenta uma CI50 de 7,5 nM, que é sete vezes maior quando comparado com a tacrina (1nM), tais resultados sugerem que o AU é eficaz com relação a inibição enzimática, entretanto, a tacrina (droga de referência na terapêutica do Alzheimer) mostrou-se mais potente. A variabilidade da inibição da AChE no ensaio inibitório com TRX e AU pode ser também explicada pela diferenças da densidade colinérgica encontrada nas estruturas cerebrais. Maior densidade reflete em atividade enzimática aumentada, e menor densidade em atividade diminuída quando comparada com amostras diferentes. Em estudos sobre a atividade anti-AChE em ratos diabéticos induzidos com aloxano, Milatovic e Dettbarn (1996) demonstraram que no estriado, que é rico em vias colinérgicas a atividade enzimática é aumentada, já no hipocampo não foi encontrado nenhuma variação significativa (MAZZANTI et al., 2004). Com relação ao sistema colinérgico e sua relação com a memória, várias revisões foram encontradas na literatura e a maioria delas enfatiza a importância desse sistema nos processos de memória, sem, entretanto especificar em qual (is) etapa (s) o sistema é mais importante (JELTSCH-DAVID; KOENIG; CASSEL, 2008; AMENTA; TAYEBATI , 2008; MUSIAL; BAJDA; MALAWSKA, 2007). Foi verificado recentemente, que a ingesta prolongada e deficiente de colina pode produzir 72

distúrbios cognitivos causados por uma redução dos níveis ACh, bem como da memória, além de distúrbios de crescimento de várias regiões cerebrais (LIAPI et al., 2009). Esses dados confirmam com outros resultados anteriores obtidos por Meck e colaboradores (2008) onde foi verificado que a disponibilidade de colina durante períodos críticos do desenvolvimento cerebral influencia o desempenho cognitivo na idade adulta e velhice, bem como enfatiza a importância da nutrição para o sucesso cognitivo perinatal (MECK et al., 2007). Outro fato que corrobora com a crença de que a liberação de ACh é importante nos processos de memória é a de que o papel dos receptores muscarínicos na LTP em muitas áreas do SNC, incluindo o hipocampo, tem sido extensivamente estudado (LUO et al., 2008). A LTP é bloqueada por antagonistas muscarínicos e, considerada um processo de plasticidade sináptica e modelo natural de memória (BLISS; COLIGRIDGE, 1993; IZQUERDO, 1993). O enfoque principal dos atuais estudos de memória em seres humanos é direcionado aos efeitos da ACh sobre ela e sua relação com a DA, uma vez que os principais medicamentos utilizados na terapêutica da doença são os anticolinesterásicos, os quais por inibição da AChE promovem aumento dos estoques de ACh no sistema nervoso central. Estudos de imagem realizados por Shinotoh e sua equipe (2003) mediram a quantidade de AChE em pacientes com a doença e encontraram uma redução siginicativa da enzima na amigdala (-33%), no hipocampo (-14%) e neocortex (-20%). Para esclarecer se os depósitos do peptídeo -amilóide encontrados nos cérebros de portadores de DA eram realmente responsáveis pelos distúrbios colinérgicos e, estes por sua vez, por prejuízos de memória Watanabe e colaboradores (2009) utilizaram animais transgênicos (Tg 2576) os quais superexpressam o percussor mutante da proteína β-amilóide e, são descritos como modelos de memória. Nesses animais e em camundongos normais foi medida a liberação de ACh e sua relação com a idade dos mesmos. Esses autores verificaram que o prejuízo da memória foi detectado em animais mais velhos tanto nos normais quanto nos trangêbicos e, esse déficit estava claramente ligados a diminuição da liberação de ACh. Mas as disfunções das sinapses colinérgicas podem não ser causadas predominantemente por depósito das placas neuríticas, uma vez que o prejuízo de memória ocorreu em ambos os grupos de animais (WATANABE et al, 2009). 73

Após ter-se confirmado a atividade anti-AChE dos compostos TRX e AU, iniciou-se o estudo do processo de memória de longa duração, nas três etapas principais, aquisição, consolidação e evocação através do modelo de esquiva inibitória. Grande parte do que se conhece atualmente a respeito dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos nos fenômenos de plasticidade neuronal deve-se à descrição do fenômeno da LTP feito por Bliss e Lomo (1973). A LTP (long term potentiation) ou potenciação de longa duração consiste em um aumento na eficiência da transmissão sináptica em neurônios de estruturas cerebrais como o hipocampo, em resposta a um estímulo de alta freqüência. Ao longo dos anos demonstrou-se que a LTP compartilha inúmeras e importantes características do aprendizado e novas memórias, sendo apontado pela grande maioria dos estudiosos do assunto como o mecanismo de memória neuronal (BLISS; COLIGRIDGE, 1993; IZQUERDO, 1993; IZQUERDO, 1994; EICHENBAUM, 1997; RAO; FINKBEINER, 2007; McLEOD; SUNDRAM; DREAN, 2008; WOSTYN; AUDENAERT; DE DEYN, 2008). As características que a LTP possui elegendo-a como possível mecanismo de memória são: indução rápida (aquisição); grande labilidade durante o período pós- indução (consolidação), em que ocorre seu estabelecimento perdurável e permite sua manutenção, mantendo-se por longo período na ausência de estimulação; e, por último, expressão imediata da resposta quando é novamente aplicado o estímulo original (evocação) (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993; REYMANN, 1993; IZQUERDO, 1993; RAO; FINKBEINER, 2007; McLEOD; SUNDRAM; DREAN, 2008). No presente trabalho, os experimentos demonstraram que AU e TRX se mostraram como agentes facilitadores do processo de memória, porém com atuação diferente conforme a etapa do processo estudada. O tratamento com AU melhora a aquisição e consolidação da memória dos animais, e não afeta a evocação, enquanto que o TRX não afeta o processo de aquisição, porém afeta os processos de consolidação e evocação. Estudos farmacológicos bioquímicos e moleculares foram realizados ao longo desses anos, para tentar desvendar quais os mediadores envolvidos em cada etapa da memória. Hoje se sabe que o sistema GABAérgico é de fundamental importância para a formação da memória e a etapa de aquisição da memória conta também, com a participação do sistema glutamatérgico, principalmente dos receptores NMDA e ativação de PKA no hipocampo (BOURTCHOULADZE at al., 1998). De acordo 74

com Barros (2001) e Lin (2001 e 2003) com suas respectivas equipes, o IP3 tem papel fundamental na aquisição da memória, formação de MLD e MCD e PLD. O processo de consolidação da memória envolve inicialmente a ativação dos receptores de glutamato NMDA, AMPA/kainato e mGluRs, ativação de PKA, PKC e CaMKII na região CA1 do hipocampo (JERUSALINSKY et al., 1992; IZQUIERDO; MEDINA, 1997; CAMMAROTA et al., 1998; VIANNA et al., 2000). A expressão de genes e a síntese protéica é essencial para a formação da MLD (IGAZ et al., 2004). Segundo Cammarota e colaboradores (2000) 2 a 3 horas após o treino com animais, a atividade de PKA é aumentada na região CA1, e essa atividade depende da ativação prévia de receptores NMDA. Depois da ativação de PKA tem-se também a ativação de ERK (signal-regulated kinase) nesta região, que coincide com o aumento da fosforilação do fator de trancrição CREB e então tem-se a expressão de genes e síntese protéica (IGAZ et al., 2002). Receptores dopaminérgico D1 juntamente com receptor -noradrenérgico apresentam papel facilitatório da memória nesta etapa, entretanto receptores serotonérgicos como 5HT-A1 é deletério para a consolidação na região CA1, 6 horas após o treino (ARDENGHI et al., 1997). Ainda na consolidação da memória, etapa com mais mecanismos envolvidos, ocorre ativação de receptores dopaminérgicos D1 3 a 4 horas após o treino dos animais, melhorando a consolidação da memória através de uma estimulação indireta de PKA via adenilato ciclase (ARDENGHI et al., 1997). Também já é conhecida a participação dos receptores 1, 2 e 1 noradrénergicos na consolidação da memória (GIBBS; SUMMERS, 2001a; GIBBS; SUMMERS, 2001b; GIBBS; SUMMERS, 2002), como também dos receptores de histamina H1 e H2 (DE ALMEIDA; IZQUIERDO, 1986, 1988; XU et al., 2009). A etapa de evocação da memória é menos dependente do hipocampo (BONTEMPI et al., 1999; ANAGNOSTARAS; MAREN; FANSELOW, 1999). Segundo alguns estudos, os receptores NMDA e a ativação de PKA e PKC, são importantes para a aquisição, essenciais para a consolidação, mas desnecessárias para a evocação (STEELE; MORRIS, 1999; BOURTCHOULADZE et al., 1998; GOOSENS; HOLT; MAREN, 2000). Mansuy e colaboradores (1998) encontraram a superexpressão de CaMKII e serina/treonina fosfatase após evocação da memória espacial. A evocação também requer PKA e ERK na região CA1, basolateral da amigdala, córtex entorrinal e parietal, e córtex circular anterior, indicando que a 75

evocação não acontece somente no hipocampo, desta forma, esta etapa está distante de ser um evento passivo (BARROS et al., 2003). Os resultados do presente trabalho não só enfatizam que o AU e o TRX produzem a melhora da cognição dos animais, atuando de forma diferente nos processos de aquisição e a consolidação e evocação da tarefa da esquiva-inibitória, como também estabelecem uma relação entre o seus mecanismos de ação com o sistema colinérgico, ou seja, a capacidade desses compostos de inibir a ação da AChE, o que leva ao aumento das concentrações de ACh e, a alteração da amésia induzida por escopolamina, um antagonista muscanínico. Os resultados sugerem que o bloqueio competitivo de receptores muscarínicos cerebrais pela escopolamina é revertido pelo aumento da demanda de ACh nas sinapses, induzida pelo efeito de ambos os compostos sobre a atividade da AChE. Dados farmacológicos demonstram claramente o papel dos receptores colinérgicos, tanto muscarínicos quanto nicotínicos, na codificação de novas memórias. Estudos realizados com lesões localizadas de neurônios colinérgicos ou infusões de antagonistas demostram a importância desde sistema nos processo de cognição. Além disso, modelos computacionais ajudam a esclarecer a função da modulação colinérgica com efeitos celulares específicos em regiões cerebrais importantes nos processos de memória (HASSELMO, 2006). As similaridades entre alterações relacionadas à memória de pacientes portadores da DA e animais tratados com escopolamina já foram relatados por Rubio (2007). Devido a esse fator, a escopolamina tem sido utilizada como ferramenta farmacológica para se produzir um dos primeiros modelos animais dessa desordem, ou pelo menos sua sintomatologia primordial, o défict de memória. Ainda com relação a possíveis mecanismos de ação dos compostos em estudo, relacionando ACh, AU e DA, Lu et al. (2007) demonstraram que o composto produz melhora da cognição de animais idosos tratados com D-galactose, a qual produz neurotoxidade em regiões hipocampais e é considerado um dos melhores modelos animais atuais de DA. Os autores demonstraram que efeito o do AU contra a neurotoxidade induzida pela D-galactose pode estar relacionado com a produção de enzimas com propriedades antioxidantes, além da redução do processo de peroxidação lipídica. De fato, a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) tem sido apontada nos últimos anos, como um dos fatores envolvidos na morte celular em vários processos neurodegenerativos, como ocorre nas DP e DA (OLANOW, 1994; CASTEGNA et al., 2002; DE LULLIS et al., 2005; ZHANG et al., 76

2005; JUN LU et al. 2007). Por outro lado, como ressaltado anteriormente, estudos têm recentemente sugerindo que o AU inibe a indução da formação do peptídeo - amilóide, o que diminui a produção de radicais livres e a peroxidação lipídica em células neurais, ocorrendo desta maneira uma redução dos efeitos neurotóxicos, da apoptose e da morte celular neste grupo (HARKANY, 1999; HEO et al., 2002; DAN LIU et al., 2008). Os resultados obtidos por Lu et al. (2007) reforçam outros dados descritos anteriormente por Shih e colaboradores (2002), os quais mostram que o efeito antioxidante do AU protege o hipocampo de animais contra a neurotoxidade produzida por aminoácidos excitatórios como o cainato via receptores AMPA. De fato, Shih e colaboradores (2002) verificaram que culturas de células isoladas do hipocampo e submetidas a um tratamento com cainato, quando incubadas com o AU, tiveram redução dos efeitos neurotóxicos do cainato. Os autores sugeriram que o AU poderia estar exercendo seus efeitos por: (i) modulação dos receptores AMPA afetando o sítio de ligação do kainato com esses receptores, (ii), promover a proteção das mitocôndrias das células hipocampais e, (iii) produzir a diminuição da produção de radicais livres. Os autores também referem que o efeito anti-radicais livres do AU pode ser observado em outros tecidos como, por exemplo, os hepatócitos, e que podem também estar relacionado com os efeitos tanto antiinflamatórios (MARTIN-ARAGON, et al, 2001), quanto anti-tumorais (YOU et al., 2001) já detectados com o AU. O AU é um composto bastante estudado e, desde seu isolamento e identificação por Rowe e colaboradores (1949) o triterpeno AU vem sendo constantemente estudado, tendo apresentado as mais variadas propriedades farmacológicas variando entre efeitos periféricos e centrais. O interesse no composto como possível candidato a medicamento é tamanho, que só perde para o flavonóide quercetina, o qual é considerado como o fitoconstituinte com maior número de estudos. Os possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos do TRX detectados nesse trabalho não são tão óbvios e correlacionados, como visto com o AU. O composto foi isolado pela primeira vez de flores de várias plantas da família das Compositae como, por exemplo, Calendula officinalis, onde foi descrito seu primeiro efeito farmacológico, o efeito antiinflamatório (AKIHISA et al., 1996). O composto também apresenta efeitos centrais em células gliais reduzindo a atividade de óxido nítrico, (TSAO et al., 2008) é antiinflamatório (SINGH, SAHU, SHARMA, 2002), e 77

antitumoral (JANG et al., 2004; CHATURVEDULA et al., 2004). Seus efeitos centrais como atividade ansiolítica, antidepressiva, anticonvulsivante, antioxidante e, até mesmo sua relação com a peptídeo β-amiloide ainda merecem ser estudados. E talvez não tenham sido feitos devido ao baixo rendimento do composto e da sua presença como fitoconstituinte em menor escala nas plantas quando comparamos com o AU. Portanto, a única hipótese relacionada ao seu efeito facilitador da memória até o momento identificado, resulta exclusivamente na sua capacidade de inibir a enzima AChE. Relacionando a estrutura química de ambos os compostos utilizado no presente estudo, pode-se observar uma diferença estrutural entre os triterpenos AU e o TRX, principalmente no que se refere a presença de grupo carboxílico no C-17 do AU, não observado no TRX e, em relação a posição da dupla ligação, no AU encontra-se entre os carbonos 11 e 12 e no TRX nos carbonos 14 e 15. Apesar destes compostos pertencerem a mesma classe química dos triterpenos, as pequenas diferenças supracitadas podem alterar a conformação espacial da molécula contribuindo ou não de maneira efetiva à ligação com receptores endógenos. Entretanto, os experimentos realizados no presente estudo, não fornecem subsídios suficientes para uma extrapolação entre os efeitos biológicos encontrados com ambos os compostos e uma correlação entre a estrutura e a atividade de ambos. Durante esse trabalho alguns experimentos farmacológicos adicionais foram requeridos para verificar se os efeitos dos compostos sobre a memória poderiam ter sofrido interferências de traços de ansiedade dos animais ou de possíveis interferências sobre o sistema motor dos mesmos. Conforme dito anteriormente, nestes experimentos foram utilizados somente o AU. O MOF é um teste utilizado para analisar comportamentos baseados em situações de conflito natural. Normalmente o conflito no animal é a exploração e a aversão a ambientes abertos e claros. O número total de cruzamentos (crossings) durante o teste é considerado um índice de atividade locomotora, enquanto que o numero de levantadas (rearings) é considerado um índice de atividade exploratória (LOTUFO et al., 2004). Dessa forma, o modelo pode descriminar se a substância- teste exibe efeito ansiolítico ou efeito depressor inespecífico atuando em regiões cerebrais envolvidas também coma atividade exploratória do animal (SILVA et al., 2006). Os resultados apresentados demonstram que o AU não produziu efeito sobre o sistema motor dos animais, uma vez que o número de cruzamentos não foi 78

alterado quando comparado com o grupo controle. Entretanto, a atividade exploratória foi significativamente aumentada, o que sugere que o AU possa ter um efeito estimulante inespecífico sobre o SNC ou efeito ansiol’itico semelhante ao midazolam. O fato de não produzir alteração significativa no número de cruzamentos foi de fundamental importância, uma vez que, em outros modelos animais como o labirinto em cruz elevado e o teste da esquiva inibitória, poderíamos obter resultados “falsos-positivos”. Os resultados também demonstraram que o tratamento com midazolan produziu um aumento no número de rearings. Tal resultado já era esperado uma vez que o fármaco realmente causa ansiólise. O midazolam é um medicamento derivado do grupo das imidazobenzodiazepinas utilizado para o tratamento da insônia (AMORIN; ARAÚJO; MONTENEGRO; SILVA, 2008). Em nossos estudos, também foi analisado o efeito do AU infundido no hipocampo, sobre a ansiedade dos animais uma vez que traços de ansiedade podem modular positiva ou negativamente memórias, dependendo do tipo (TRYON; McKAY, 2008). Além disso, o sistema septo-hipocampal interage nesses processos juntamente com outras estruturas cerebrais como a substância cinzenta periaquedutal (SCPD) e a amígdala (AMG) (IZQUIERDO, 2002; PAUL et al., 2008). Com esse intuito foi utilizado como modelo experimental o labirinto em crus elevado (LCE). O LCE é o modelo animal de ansiedade mais utilizado no mundo. Um levantamento feito através do site da internet, web of science (a partir do portal CAPES: www.periodicos.capes.gov.br), mostrou que, de 1987 até o ano de 2008, foram produzidos aproximadamente 15.200 trabalhos científicos indexados utilizando ou citando o LCE, dos quais mais de 250 deles realizados no Brasil. Ao longo desses anos, os resultados obtidos em experimentos que utilizaram este modelo têm contribuído não só para o desenvolvimento de novos compostos ansiolíticos, como também para o conhecimento das bases neurobiológicas da ansiedade e, mais recentemente, na avaliação da idade emocional de animais submetidos a técnicas de deleção gênica. O modelo do LCE assenta-se no comportamento exploratório espontâneo de roedores em um ambiente com dois níveis de maior (braços abertos) ou menor (braços fechados com paredes) característica aversiva. Esse fato gera inicialmente um conflito aproximação-esquiva aos braços abertos, resultado da tendência 79

exploratória do roedor e do medo/novidade. Handley e Mithani (1984) mostraram que este tipo de labirinto era sensível a drogas ansiolíticas (maior atividade nos braços abertos) e ansiogênicas (menor atividade nos braços abertos), o que foi confirmado por vários pesquisadores. Alguns fatos notáveis mostram que neste modelo os animais apresentam aumento dos níveis de corticosterona plasmática; analgesia bloqueada por drogas ansiolíticas, aprendizado de uma resposta de esquiva; e aumento na atividade de neurônios em áreas envolvidas com as respostas de medo/ansiedade, tais como AMG, hipotálamo e SCPD, entre outras (CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005). Quando os animais permanecem nos braços abertos, manifestam comportamentos de medo espontâneo, tais como congelamento, defecação e micção. Nestas mesmas superfícies altas e estreitas apresentam posturas de estiramento e imersão da cabeça abaixo do piso na lateral da superfície (head- diping). Para evitar essa situação ansiogênica, os animais permanecem maior tempo nos braços fechados (BELZUNG; GRIEBEL, 2001; CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005; WITKIN, 2008). O comportamento animal natural é caracterizado por evitar a entrada nos braços do aparelho. Essa tendência é diminuída quando administrada-se fármacos ansiolíticos, como por exemplo, o midazolam ou diazepam, com o tratamento há tendência em aumentar a freqüência e o tempo de permanência dos animais nos braços abertos, enquanto que substâncias ansiogênicas, como a ioimbina, tende a um aumento da freqüência de entrada e o tempo de permanência dos animais nos braços fechados (PELLOW et al., 1985; ARAGÃO et al., 2006). Justifica-se o uso do midazolam como controle positivo, por ser um benzodiazepínico e aumentar a percentagem de entradas e tempo de permanência dos animais nos braços abertos, diminuindo esses parâmetros comportamentais nos braços fechados. O efeito do AU no modelo LCE foi semelhante aos efeitos obtidos pelo tratamento com midazolam na concentração de 0,75µg/sitio. Esse resultado foi observado quando os animais aumentaram a freqüência de entrada nos braços aberto permanecendo maior tempo nesses braços, bem como, diminuíram a freqüência de entrada e o tempo de permanência nos braços fechados. Tais resultados demonstraram que o AU não só apresenta efeito ansiolítico quando administrado por via sistêmica com demonstrado por Taviano e colaboradores (2007) como também apresenta efeito ansiolítico quando administrado centralmente no hipocampo. 80

7 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam os dados já existentes na literatura sobre a atividade anticolinesterásicas dos compostos AU e TRX. Os resultados do AU sobre a memória estendem resultados obtidos anteriormente e indicam que o AU pode interferir no processo de memória atuando na consolidação. Com relação ao TRX, os resultados obtidos indicam que o composto pode interferir nos processo de memória, tanto na consolidação e evocação. Entretanto ambos os compostos revertem a amnésia induzida por escopolamina, sendo que o AU reverteu o quadro amnésico durante os processos de aquisição e consolidação, enquanto que com o tratamento com o TRX esses efeitos foram observados nas três etapas da memória. Estes resultados indicam parcialmente que um dos possíveis efeitos destes compostos podem ser mediados via sistema colinérgico, uma vez que ambos revertem a amnésia induzida por escopolamina além de terem atividade anticolinesterásica. Os resultados em conjunto também apontam que ambos os compostos, (mas principalmente o AU) possuem potencial farmacológico como candidato a fármaco para tratamento de doenças neuropsiquiátricas e/ou neurodegenerativas relacionadas com déficit de memória.

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ANEXO 1