Archive of SID

2 and Biosystematics, 11th Year, No. 39, Summer 2019

The First Report of Olivaceus and Panaeolus Guttulatus from Iran

Elham Seidmohammadi 1, Saeed Abbasi 2*, Mohammad Reza Asef 3 1 MSc Graduate of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Razi University, Kermanshah, Iran. 2 Associate Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Razi University, Kermanshah, Iran 3 Assistant Professor, Department of Botany, Iranian Research Institute of Plant Protection, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, Iran

Abstract During macrofungal surveys continually undertaken from 2014 to 2017 at different locations of Eslamabad-e Gharb and Gilan-e Gharb, Kermanshah Province, a large number of agaric fungi including two specimens belonging to the genus Panaeolus were collected. At the collection site, while recording geographical coordinates, habitat characteristics, growth patterns, and macroscopic morphological features were recorded and photographed. Microscopic features including basidiospores, basidia, and cystidia were observed, measured, and illustrated using a light microscope, OLYMPUS BX51. Also, the DNA sequence of the rDNA-ITS region was amplified and sequenced using ITS1 and ITS4 primers. The phylogenetic analysis and the determination of species relationships were performed by the Maximum Likelihood method with 1000 repetitions of 1000 bootstrap replicates using the MEGA6 software. Based on the results obtained from morphological examinations along with data obtained from ITS- rDNA sequences, two species including Panaeolus olivaceus and Panaeolus guttulatus were identified. According to the literature, both species were new records for mycobiota of Iran. In the present paper, the morphological description of the mentioned species is presented. Key words: Eslamabad-e Gharb, Agaric, Macrofungi, Kermanshah.

* [email protected] Copyright©2019, University of Isfahan. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4.0), which permits others to download this work and share it with others as long as they credit it, but they cannot change it in any way or use it commercially.

www.SID.ir

Archive of SID

تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال یازدهم، شماره سی و نهم، تابستان 1398، صفحه 30-23 دریافت مقاله: 23/04/1398 پذیرش نهایی: 1399/04/18

اولین گزارش از Panaeolus olivaceus و Panaeolus guttulatus در ایران

3 2 1 الهام صید محمدی ، سعید عباسی *، محمدرضا آصف 1 دانش آموخته کارشناسی ارشد گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران 2 دانشیار گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران 3 استادیار بخش تحقیقات رستنیها، مؤسسۀ تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران

چکیده طی نمونه برداری های مستمر انجامشده از سال 1393 تا 1396 در مناطق مختلفف شهرسفتان هفای اسف م آبفاد رفرو و گی ن ررو واقع در استان کرمانشفاه، تعفداد زیفادی از قفار هفای ک هفک دار ازجملفه دو نمونفه متعلفق بفه جفن Panaeolus جمع آوری شد. در محل نمونه برداری، ضمن ثبت مختصات جغرافیایی، ویژگفی هفای زیسفتگاه و نحفوۀ رویش، ویژگیهای ریختشناختی ماکروسکوپی ثبت و از آنهفا عکف بفرداری شفد. ویژگفی هفای ریخفت شفناختی میکروسکوپی شامل بازیدیوسپور، بازیدیوم و سیستیدیوم بفا اسفتفاده از میکروسفکوو نفوری مفدل BX51 مشفاهده، اندازهگیری و عک برداری شد؛ همچنین توالی DNA مربوط به ناحیۀ ITS-rDNA با استفاده از آرازگرهفای ITS1 و ITS4 تکثیففر و تعیففین تففوالی شففد. تجزیففه و تحلیففل تبففارشففناختی و تعیففین روابففن گونففههففا بففه روش Maximum Likelihood با 1000 تکرار بوت استراو و با نرمافزار MEGA6 انجام شد. براساس نتفایج ماالعفات ریخفت شفناختی، در کنار دادههای حاصل از توالیهفای ناحیفۀ ITS-rDNA، دو گونفۀ P. olivaceus و P. guttulatus شناسفایی شفد. طبق منابع موجود، هر دو گونه برای بیوتای قارچی ایران، جدید هستند. در پژوهش حاضر، توصیف ریخفت شفناختی این گونهها ارائه شده است. واژههای کلیدی: اس مآباد ررو، آگاریک، قار های ماکروسکوپی، کرمانشاه.

مقدمه بلففوآ آنهففا ریریکنواخففت اسففت؛ بففه همففین دلیففل در Panaeolus (Fr.) Quél جفففن دربرگیرنفففدۀ بخش هایی از تیغه که اسپور ها بالغ شده انفد، رنف تیغفه گونففههففای آگاریففک سففاپروترون بففا انففدام بففار دهی نسبت به قسمت هفایی کفه اسفپورها هنفوز نابفالغ هسفتند، کوچک تا متوسن و اسپورهای تیفره اسفت. ایفن جفن تیره تر است و تیغه هفا افاهری خفال دار دارنفد. برخفی از Kirk, 2019 شامل حدود 77 گونه میشود) (. گونههفای گونه های این جفن دارای ترکیف هفای سیلوسفایبین و Panaeolus جن بیشتر کو ددوست هسفتند و تعفدادی درنتیجه توهمزا هستند)Webster and Weber, 2007(. از آنها در مراتع رشد می کننفد. اسفپور هفا، سفیاه رنف و گونه هفای جفن Panaeolus کفه در گذشفته در زمفرۀ * [email protected]

www.SID.ir Archive of SID

24 تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال یازدهم، شماره سی و نهم، تابستان 1398

اعضففای تیففرۀ Coprinaceae طبقففهبنففدی مففی شففدند در خانوادهای جدید و در موقعیتی بین و )Singer, 1986(، با تغییراتفی کفه در طبقفه بنفدی انجفام Psathyrellaceae قرار گیرند)Tóth et al., 2013(. شد، در خانوادۀ Psathyrellaceae قفرار گرفتنفد؛ حفال تاکنون هشت گونه از ایفن جفن از ایفران گفزارش آنکففه برخففی قففار شناسففان ایففن جففن را در خففانوادۀ شففده اسففت )جففدول 1(. در ایففن ماالعففه، ضففمن ارائففۀ Bolbitiaceae طبقهبندی کفرده انفد ) ,.Matheny et al ارزیابی هفای تبارشفناختی، توصفیف ریخفت شفناختی دو 2006(؛ بفا ایفن حفال موقعیف ت سیسفتمات یک ایفن جفن گونۀ جدیدی ارائه شده است که پفیش از ایفن از ایفران هنفوز معلفوم نیسفت )Kirk, 2019(. براسفاس دادههفا ی گزارش نشدهاند. موجود، Panaeolus و آرایه های وابستۀ آن بهتفر اسفت

جدول 1- گونههای گزارششدۀ جن Panaeolus از ایران Speices Locality References

Panaeolus fimicola Arasbaran (Asef, 2007)

P. sphinctrinus Ahar (Watling and Sweeney, 1974)

P. papilionaceus Tonekabon, (Saber, 1995)

P. phalaenarum Chalus (Watling and Sweeney, 1974) P. rickenii Mashhad (Zokaei, 2001)

P. serotinus - (Saber, 1994)

P. stipticus - (Saber, 1994)

P.subbalteatus Golestan (Arefipour et al., 2006)

P. subfirmus - (Saber, 1994)

P. teutonicus Amol (Watling and Gregory, 1977)

مواد و روشها مختصات جغرافیایی، از دستگاه مکان یاو GPS استفاده نمونهبرداری و شناسایی ریختشناختی شد. در محل نمونه بفردار ی، ضفمن ثبفت ویژگفی هفا، از جمعآوری نمونههای قارچی طی سال های 1393 تفا تمامی نمونه هفا از زوایفای مختلفف، بفه کمفک دوربف ین 1396 با نمونه برداری هفای مسفتمر و در فصفول مختلفف دیجیتال Samsung S6 عک برداری شفد. نمونفه هفا در سال بهویژه فصل بهار و پاییز انجام شفد؛ بفه ایفن منرفور پاکففتهففای کارففذی بففه آزمایشففگاه منتقففل شففدند. در مناطق مختلف ارتفاعات ق جه و دشتهای اطفران، در آزمایشگاه از نمونه ها برش های میکروسکوپی تهیه شفد. حد فاصل شهرهای اس مآباد ررو و گی ن ررو واقفع برش های میکروسکوپی در آو مقار و معرن ملفزر بفا در اسففتان کرمانشففاه بازدیففد شففد. بففرای ثبففت ارتفففا و اسففففتفاده از میکروسففففکوو Olympus مففففدل BX51

www.SID.ir Archive of SID

اولین گزارش از Panaeolus olivaceus و Panaeolus guttulatus در ایران 25

بررسی شدند. بهمنرور ثبت ویژگی هفای میکروسفکوپی توالی های به دستآمفده بفرا ی هفر یفک از نمونفه هفا، بفا و سایر ساختارهای میکروسکوپی، از حفداکثر 20 مفورد اسففتفاده از نسففخۀ هفففت نففرمافففزار BioEdit، ویففرایش با عدسی چشفمی Dino eye lens 30 mm و نفرم اففزار شدند. توالیهای نوکلئوتیدی ویرایششده در مجموعف ۀ Dino capture عک برداری و ابعاد اسفپور بفه کمفک دادههففففای ژنففففی http://www.ncbi.nlm. NCBI) همففین نففرمافففزار انففدازهگیففری شففد. بففهمنرففور شناسففایی (nih.gov/genbank ثبفففت و شفففمار ۀ دسترسفففی آنهفففا آرایففههففا از کلیففدهای شناسففایی معتبففر ) ,Gerhardt دریافت شد. Hansen and Knudsen, 1992; 2008( و مقالف ههفای تخصصی مرتبن استفاده شد. ارزیابیهای تبارشناختی توالی های نوکلئوتیدی با استفاده از نرمافزار استخراج DNA و تکثیر ناحیۀ ITS-rDNA جستجوی BLAST استخراج DNA نمونهها با استفاده از کیت استخراج (http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) با DNA شرکت دنازیست )Denazist Asia( انجفام شفد . دیگر توالی های موجود در مجموعۀ دادههای ژنی توالی نوکلئوتیدی DNA ناحیۀ ترانویس یشفوند ۀ داخلف ی )NCBI, USA( مقایسه و نزد یکترین توالی ها ریبوزومی (ITS1-5.8S-ITS2) با آرازگرهفا ی ITS1 و شناسایی شد. رد یفچینی چندگانه با نرمافزار Clustal ITS4 تکثیر شد. واکنش زنجیفر ه ای پلیمفراز بفا دسفتگاه W انجام شد. تجزیه و تحلیل تبارشناختی و تعیین روابن ترموسففففففففایکلر (مففففففففدل Biometra، شففففففففرکت گونهها به روش Maximum Likelihood با تکرار Analytic Jena، آلمان( انجام شد. مخلوط واکفنش در 1000 بوتاستراو با استفاده از نرمافزار MEGA6 حجفم نهفایی 50 میکرولیتفر، شفامل 25 میکرولیتفر 2X انجام شد)Tamura et al., 2013(. PCR Master Mix )شفففرکت سفففیناکلون(، یفففک میکرومول از هرکدام از پرایمرهفا و 50 نفانوگرم DNA نتایج و بحث ژنومی بود. واکنش زنجیره ای پلیمراز براساس برنامفه ای بین گونه های شناسایی شده در این ماالعه، دو نمونفه P.olivaceus Panaeolus زمففانی شففامل واسرشففتگی ابتففدایی در دمففای 90 درجففۀ از جففففففن شففففففامل P.guttulatus (MH592651) (MH593015) سانتیگراد به مدت دو دقیقفه و بفه دنبفال آن 35 چرخفه و برپایۀ شففامل واسرشففتگی در دمففای 95 درجففۀ سففانتیگففراد بففه ویژگی های ریختشناختی شناسایی شدند. دربارۀ گونفۀ DNA P.olivaceus مدت 40 ثانیه، همجوشی در دمای 57 درجۀ سانتیگراد ، درصففد تشففابه تففوالی بففا دیگففر بفففه مفففدت 40 ثانیفففه، گسفففترش در دمفففای 72 درجفففۀ توالی های همفین گونفه در بانفک دادههفای ژنف ی، تشفابه سانتیگراد به مدت 50 ثانیه و گسترش نهفایی در دمفای بیش از 99 درصدی نشفان داد؛ امفا براسفاس جسفتجوی P.guttulatus 72 درجۀ سانتیگراد به مدت ده دقیقه، انجام شد. ب سفففت دربفففارۀ ، بفففا وجفففود انابفففا محصوالت واکنش زنجیفره ای پلیمفراز بفرای تعیفین ویژگی های ریختشناختی نمونۀ موجفود بفا ایفن گونفه، DNA ترادن به شرکت ماکروژن کفر ۀ جنفوب ی ارسفال شفدند. نمونۀ حاضر ازنرر تفوالی دارای قرابفت کفافی بفا

www.SID.ir Archive of SID

26 تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال یازدهم، شماره سی و نهم، تابستان 1398

توالیهای موجود P.guttulatus در بانک دادههای ژنی اسففت. ابعففاد اسففپور 8/12-6/10 × 1/9-2/7 میکرومتففر نیست؛ از این رو به نرر می رسد که گونۀ P.guttulatus است )شفکل c-1(. بازیفدیوم هفا، گفرزی شفکل و دارای گونه ای کمپلک است؛ با این حفال تفکیفک گونفه هفا، چهار استریگمای بزرگ است که بفا فاصفله از یکفدیگر نیازمند دسترسی به تفوالی هفای چنفد ژن بفرای تجزیفه و قففرار دارنففد )شففکلb-1(. سیسففتیدیومهففای لبففۀ تیغففه تحلیل تبارشناختی اسفت کفه در حفال حاضفر داده هفای به صورت استوانه ای تا گرزی شفکل هسفتند. ایفن گونفه، کافی دربارۀ این گونه در بانفک داده هفای ژنفی موجفود روی خاک، بهصورت گروهی جمعآوری شد. نیسففت؛ بنففابراین نمونففۀ حاضففر بففه اسففتناد ویژگففیهففای نمونه های بررسی شفده: اسفتان کرمانشفاه، شهرسفتان ریخففتشناسففی بففا نففام گونففۀ P.guttulatus گففزارش اسفف م آبففاد رففرو – روسففتا ی داربففادام ، E631749، میشود. IRAN 16962 F) 95/1/31 ،N3765171). براساس داده های موجود این دو گونه، پفیش از ایفن Panaeolus guttulatus Bres., Fung. trident. از ایران گزارش نشده اند. توصیف ریخفت شفناختی ایفن 1(3): 36 (1883) دو گونه به شرح زیر است: (Agariceles)

Panaeolus olivaceus F.H. Møller, Fungi of the ک هک، در ابتدای رشد مخروطی است و سپ تفا Faeröes, Part I: Basidiomyceten: 171 (1945) (Agariceles) حدودی مساح مفی شفود. رنف ک هفک، خاکسفتری مایل بفه سفیاه و در حاشفیه روشفن تفر اسفت. در شفراین ک هک، در ابتدای رشد محدو اسفت و سفپ تفا مرطوو، ک هک حالت خی خورده به خود میگیفرد. حدودی مساح می شود. رن ک هک قهوه ای است و ساح ک هک صان است و حدود دو سفانتی متفر قافر در شففراین مرطففوو، حالففت خففی خففورده بففه خففود دارد )شکلa-2(. تیغه هفا، تفا حفدودی متفراکم و نحفوۀ مففیگیففرد. سففاح ک هففک صففان اسففت و حففدود دو اتصال آنها به پایه از نفو adnate اسفت. رنف تیغفه هفا سانتی متفر قافر دارد )شفکل a-1(. تیغفه هفا، تفا حفدودی خاکسففتری تیففره و در حاشففیه روشففنتففر اسففت. در بففین متففراکم و نحففوۀ اتصففال آنهففا بففه پایففه از نففو adnexed تیغه ها، تیغک ها هم دیده مفی شفوند )شفکل b-2(. نقفش است. رن تیغه هفا، قهفوه ای تیفره اسفت و در بفین آنهفا اسففپور، قهففوهای مایففل بففه سففیاه اسففت. پایففه، توخففالی، تیغک هم دیده می شود. نقش اسفپور، قهفوه ای مایفل بفه استوانه ای و به رنف خاکسفتری اسفت. اتصفال پایفه بفه سیاه است. پایه، استوانه ای، به رن قهوه ای و فاقد حلقه ک هک به صورت مرکزی است. ارتفا پایه، حدود سه اسففت و بففهصففورت مرکففزی بففه ک هففک اتصففال دارد. سانتی متر و قار آن یک سانتیمتر است. پایه، فاقد حلقفه ارتفففا پایففه، حففدود چهففار سففان تیمتففر و قاففر آن یففک و در ساح خود دارای پوشفش آردی اسفت. اسفپور هفا، سانتی متر و در سفاح خفود دارای پوشفش آردی اسفت. بیضوی، صان و دارای سوراخ تنفدش مرکفزی هسفتند. اسپور ها، بیضوی تا لیمویی شکل دارای سفاحی صفان، ارل دو قارۀ رورنی در داخل اسپور ها دیده مفی شفود. دارای سوراخ تندش مرکزی و رن آنها قهفوه ای تیفره ابعفففاد اسفففپور 9/8-7/7 × 1/5-7/4 میکرومتفففر اسفففت

www.SID.ir Archive of SID

اولین گزارش از Panaeolus olivaceus و Panaeolus guttulatus در ایران 27

)شکلe-2(. بازیفدیوم هفا، گفرزی شفکل و دارای چهفار قارههای چسبناک زردرنگی دیده می شود)شکلd-2(. اسفففتریگما هسفففتند )شفففکلc-2(. ایفففن گونفففه فاقفففد نمونه های بررسی شده: استان کرمانشاه، شهرستان گف ی ن سیستیدیوم های دو طرن تیغه است. سیستیدیومهفای لبفۀ رفففرو - مناقفففۀ میففف اندار، N3771431 ،E587462، تیغففه، از نففو گففرزیشففکل هسففتند کففه در نففوک آنهففا IRAN 16961 F) 95/1/30).

شکل 1- ریختشناسی گونۀ a ،Panaeolus olivaceus: ک هک، b: بازیدیوم و c: اسپورها )مقیاس: ده میکرومتر(

www.SID.ir Archive of SID

28 تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال یازدهم، شماره سی و نهم، تابستان 1398

شکل 2- ریختشناسی گونۀ a ،Panaeolus guttulatus: بازیدیوکارو، b: ت یغهها و پایه، c: بازیدیوم، d: سیستیدیومها و e: اسپورها )مقیاس: ده میکرومتر(

در آنففالیز فیلففوژنتیکی براسففاس تففوالی نوکلئوتیففدی P.guttulatus گففزارش مففیشففود. انابففا ویژگففیهففای DNA ناحیففۀ ترانویسفف یشففوندۀ داخلففی ریبففوزومی-ITS ریختشفناختی نمونفۀ حاضفر بفا گونفۀ P.guttulatus و (rDNA (ITS1-5.8S-ITS2، گونههفای شناسفایی شفده همچنین درصد تشابه ناکافی توالی DNA ایفن نمونفه بفا در گروههای تک نیایی همراه با سایر گونه های معتبفر از توالی های موجود در بانک داده های ژنی نشان مفی دهفد دیگر مناطق دنیفا قفرار گرففت )شفکل 3(؛ بفا ایفن حفال گونۀ P.guttulatus گونفه ای کمفپلک اسفت؛ بفا ایفن دربارۀ P.guttulatus، نمونۀ حاضر ازنرفر تفوالی DNA وجود در حال حاضر، پاسخ گفویی بفه ابهامفات موجفود دارای قرابت کافی با توالیهفای موجفود P.guttulatus دربارۀ این گونه، با توجه به ناکافی بفودن داده هفای ژنفی در بانک دادههای ژنی نبود؛ از این رو نمونفۀ حاضفر بفه موجود در بانک دادههای ژنی میسر نیست. اسففتناد ویژگففی هففای ریخففت شففناختی بففا نففام گونففۀ

www.SID.ir Archive of SID

اولین گزارش از Panaeolus olivaceus و Panaeolus guttulatus در ایران 29

شکل 3- درخت فایلوژنتیکی ترسیمشده براساس توالی ناحیۀ ITS نمونههای منتخ Panaeolus با استفاده از نرمافزار Mega ver. 6.0 به روش Maximum Likelihood با تکرار 1000 بوتاستراو. نمونههای ایرانی با مثلث سیاهرن مشخص شدهاند . منابع Arefipour, M. R., Askary, H., Salari, A. N., Hamzehzarghani, H., Boujari, J., Zahedi, M. and Zeinali, S. (2006) Introduction of hallucinogenic mushrooms new to Iran mycoflora from north and west forests of Iran. In: Proceedings of 17th Iranian Plant Protection Congress, 2-5 September, Karaj, Iran (in Persian). Asef, M. R. (2007) Agaric flora of northwest forests of Iran. In: Proceedings of 15th Congress of European Mycologists, 16-21 September, Saint Petersburg, Russia. Gerhardt, E. (2008) Panaeolus (Fr.) Quél. In: H. Knudsen & J. Vesterholt (eds), Funga nordica. Agaricoid, boletoid and cyphelloid genera, pp. 646-651. Nordsvamp, Copenhagen. Hansen, L. and Knudsen, H. (1992) Nordic Macromycetes: Vol. 2. Polyporales, Boletales, , Russulales. Nordsvamp. p. Kirk, P. M. (2019) Species Fungorum (version Oct 2017). In: Species 2000 & ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist (Roskov Y., Ower G., Orrell T., Nicolson D., Bailly N., Kirk P.M., Bourgoin T., DeWalt R.E., Decock W., Nieukerken E. van, Zarucchi J., Penev L., eds.). Digital resource at www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019. Species 2000: Naturalis, Leiden, the Netherlands. ISSN 2405-884X.

www.SID.ir Archive of SID

30 تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال یازدهم، شماره سی و نهم، تابستان 1398

Matheny, P. B., Curtis, J. M., Hofstetter, V., Aime, M. C., Moncalvo, J.-M., Ge, Z.-W., Yang, Z.-L., Slot, J. C., Ammirati, J. F. and Baroni, T. J. (2006) Major clades of Agaricales: A multilocus phylogenetic overview. Mycologia 98: 982-995. Saber, M. (1994) Contribution to the knowledge of Coprinaceae (Agaricales) collected in Iran. In: Proceedings of 5th International Mycological Congress, 14-21 August, Vancouver, British Colombia, Canada. Saber, M. (1995) New records of Agaricales from Iran. In: Proceedings of 12th Iranian Plant Protection Congress, 2–7 Sept, Karaj, Iran (in Persian). Singer, R. (1986) The Agaricales in modern taxonomy. Koenigstein, Germany: Koeltz Scientific Books. Koenigstein, Germany. 88 p. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. and Kumar, S. (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular biology and evolution 30: 2725-2729. Tóth, A., Hausknecht, A., Krisai-Greilhuber, I., Papp, T., Vágvölgyi, C. and Nagy, L. G. (2013) Iteratively refined guide trees help improving alignment and phylogenetic inference in the mushroom family Bolbitiaceae. PLoS One 8: e56143. Watling, R. and Gregory, N. M. (1977) Larger fungi from Turkey, Iran and neighbouring countries. Karstenia 17. Watling, R. and Sweeney, J. (1974) Larger fungi from Iran. Notes from the Royal Botanic Garden, Edinburgh. Webster, J. and Weber, R. (2007) Introduction to fungi. Cambridge, UK; New York: Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York. p. Zokaei, M. (2001) Identification of Agaricales collected in Mashhad area. Rostaniha 2: 7-14 (in Persian).

www.SID.ir