UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

INSTITUTO DE PATOLOGÍA ANIMAL

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE ADN EN CORMORÁN YECO (Phalacrocorax brasilianus)

Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO

NAOMI ARIYAMA TAKENAKA

VALDIVIA – CHILE

2017

PROFESOR PATROCINANTE ______Claudio Marcelo Verdugo Reyes

PROFESORES INFORMANTES ______Ángelo Ociel Espinoza Cabrera

______Francisco Javier Morera Galleguillos

FECHA DE APROBACIÓN: 29 de Junio de 2017

ÍNDICE

Capítulos Página

1. RESUMEN………………………………………………………………. 1

2. SUMMARY………………………………………………………………. 2

3. INTRODUCCIÓN………………………………………………………. 3

4. MATERIAL Y MÉTODOS……………...………………………………. 9

5. RESULTADOS…………………………...……………………………… 12

6. DISCUSIÓN……………………………………………………………... 17

7. REFERENCIAS...………………………………………………………... 21

8. ANEXOS………………………………………………………………… 24

9. AGRADECIMIENTOS…..……………………………………………… 29

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1. RESUMEN1

El estudio de las relaciones genéticas entre hospedero-patógeno ha ampliado el entendimiento de los mecanismos de adaptación mutua entre especies antagonistas. Dichas adaptaciones conllevan procesos coevolutivos y de especialización de patógenos con sus respectivos hospederos. Dentro de los patógenos en aves que pueden ser utilizados como modelo para el estudio de evolución molecular de los virus ADN de doble hebra, están las familias y .

El objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar molecularmente virus ADN de doble hebra infectando al cormorán yeco o neotropical, Phaacrocorax brasilianus. Se analizaron tórulas cloacales y traqueales de 100 individuos silvestres provenientes de Arica, Chillán, Los Ángeles y Valdivia, de las que se extrajo el material genético viral y se detectaron mediante partidores universales virus de las familias Adenoviridae y Herpesviridae amplificando el gen de la proteína hexona y de la ADN polimerasa, respectivamente. Se encontraron ocho muestras positivas a adenovirus y cuatro positivas a herpesvirus que, luego de secuenciar los respectivos productos de PCR, revelaron una posible nueva especie de adenovirus de cormorán neotropical dentro del género Aviadenovirus, mientras que el herpesvirus de cormorán neotropical está relacionado genéticamente con el virus de la laringotraqueitis infecciosa (GaHV-1) del género .

Los adenovirus y herpesvirus tienden a infectar un rango de hospederos restringido y a tener baja patogenicidad, indicando procesos coevolutivos. En este trabajo se evaluó a P. brasilianus como modelo de estudio de relaciones hospedero-patógeno, evidenciando que el adenovirus encontrado posiblemente ha coevolucionado con P. brasilianus. Sin embargo, debido a la cercanía genética del herpesvirus de cormorán con virus que infectan aves de producción, sugiere una reciente transmisión de este herpesvirus desde aves domésticas a aves silvestres.

Es importante el monitoreo de patógenos que afectan la fauna silvestre, debido a su rol como reservorio de enfermedades que afectan el ecosistema y la salud animal, de animales domésticos y silvestres. Por lo que requieren más estudios de ambos virus detectados, en términos de prevalencia, virulencia, patogénesis y efectos en el sistema inmune del hospedero P. brasilianus, así como de su origen, distribución y rango de hospederos.

Palabras clave: adenovirus, herpesvirus, filogenética, cormorán.

Fuente de financiamiento: Proyecto FONDECYT 11130305

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2. SUMMARY1

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF DNA FROM THE NEOTROPIC CORMORANT (Phalacrocorax brasilianus)

The study of the genetic interactions of host-pathogens has allowed a better understanding of the mechanisms of mutual adaptation between antagonistic species. Such adaptations involve coevolutionary processes and pathogens specialization to their respective hosts. Among the pathogens that infect birds and can be used as a model for studying the molecular evolution of double-stranded DNA viruses are the families Adenoviridae and Herpesviridae.

The objective of this study was to identify and molecularly characterize double-stranded DNA viruses infecting the Neotropic cormorant or Yeco, Phalacrocorax brasilianus. Cloacal and tracheal swabs were obtained of 100 wild individuals from Arica, Chillán, Los Ángeles and Valdivia. The viral genetic material was extracted to detect viruses of the families Adenoviridae and Herpesviridae by using universal primers targeting the hexon and DNA polymerase gene, respectively. Eight samples were positive to adenovirus, whereas four samples were positive to herpesvirus. Sequences revealed a possible new species of cormorant adenovirus within the genus Aviadenovirus; whereas the herpesviruses detected were genetically related to the infectious laryngotracheitis virus (GaHV-1) of the genus Iltovirus.

Adenoviruses and herpesviruses tend to infect a restricted host range with a low pathogenicity, indicating potential coevolutionary processes. In this work, P. brasilianus was evaluated as a model of host-pathogen interactions, evidencing that the adenovirus found has possibly coevolved with P. brasilianus. However, because the cormorant herpesviruses are highly related to poultry viruses, a recent transmission from poultry to wild birds is suggested.

It is important the surveillance of pathogens that affect wildlife, due to their role as a reservoir of diseases that may affect the ecosystem and animal health, in domestic and wild animals. Therefore, more studies of both viruses detected, in terms of prevalence, virulence, pathogenesis and effects on the immune system of the host P. brasilianus, as well as their origin, distribution and range of hosts are required.

Key words: adenovirus, herpesvirus, phylogenetics, cormorant.

Fuente de financiamiento: Proyecto FONDECYT 11130305

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3. INTRODUCCIÓN

Las interacciones hospedero - patógeno han sido objeto de estudio debido a su importancia en el entendimiento de los diversos mecanismos recíprocos de adaptación y persistencia. Algunos ejemplos de estas interacciones entre antagonistas son la infectividad del patógeno y la resistencia del hospedero, las vías de ingreso de patógenos y los mecanismos de defensa de los hospederos, la capacidad del patógeno para evadir o suprimir el sistema inmune y la habilidad del hospedero de montar una respuesta inmune y eliminar una infección (Woolhouse y col 2002). El proceso recíproco de cambios genéticos adaptativos entre dos o más especies que interactúan se denomina coevolución. Otra definición más descriptiva de coevolución es la evolución que implica una serie de cambios recíprocos en dos o más poblaciones que no se reproducen entre sí, los cuales tienen una estrecha relación ecológica y actúan como agentes de la selección natural una respecto de la otra (Thompson 1994).

A nivel de patógeno-hospedero, la coevolución es de particular interés para el área biomédica ya que puede ser estudiada en términos de caracteres fenotípicos pareados (ej. infectividad- resistencia), en términos de moléculas que interactúan entre el hospedero y el patógeno (ej. Receptores de las células T y antígenos bacterianos) o directamente en términos de genes o secuencias de nucleótidos (ej. Genes del MHC del hospedero y de proteínas de superficie virales) (Woolhouse y col 2002). Es más, estudios experimentales demuestran que una consecuencia de dichos mecanismos coevolutivos entre hospederos y patógenos es la diversificación genética, contribuyendo al mantenimiento de la diversidad biológica (Brockhurst y Koskella 2013).

Una evidencia del proceso coevolutivo es el fenómeno de adaptación local, donde la compatibilidad, que en el sistema hospedero-patógeno podría ser la infectividad, entre poblaciones simpátricas es más alta que en poblaciones alopátricas (Woolhouse y col 2002). Esta adaptación se produce incluso en ausencia de una respuesta de evasión concreta del hospedero (ej. en casos de patógenos con baja virulencia) ya que el patógeno se adapta a las características específicas de éste, disminuyendo su rango de hospederos potenciales (Antonovics y col 2013), es decir, aumentando su especificidad por determinados hospederos.

Los virus ADN de doble hebra presentan tasas de mutación bajas (ej. Herpes simple tipo 1 con 1.8 x 10–8 mutaciones por nucleótidos por replicación genómica (mut/nt/rep)) debido a que poseen una ADN polimerasa de alta fidelidad en comparación a virus ADN de hebra simple o virus ARN (ej. el fago ႷX174 de ADN de hebra simple presenta 7.4 x 10-6 mut/nt/rep y el fago Qβ1 de ARN 1.5 x 10–3 mut/nt/rep). Además, los virus ADN presentan genomas largos (ej. hasta 1,260 kilo pares de bases (kpb) en Megavirus chilensis), que junto a las bajas tasas de mutación producen que los cambios evolutivos sean más lentos que en los virus ARN y ADN de hebra simple, manteniendo señales filogenéticas por más tiempo que otros virus (Duffy y col 2008). Estas bajas tasas de mutación se asemejan a las que se estiman en los hospederos (ej. En humanos de 1.3 a 2.7 x 10–8 mut/nt/generación (Nachman y Crowell, 2000)) posibilitando la codivergencia y el proceso coevolutivo entre estos virus y sus hospederos.

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Dentro de los virus ADN de doble hebra, se encuentran las familias Adenoviridae y Herpesviridae, se caracterizan por tener un rango de hospederos restringido y baja patogenicidad al infectar, sugiriendo procesos de adaptación local a hospederos específicos con los que han coevolucionado por prolongados periodos de tiempo (Harrach y col 2011, Pellet y col 2011). Por lo anterior, y por su amplia distribución y trazabilidad estos virus han sido utilizados como modelo para el estudio de evolución molecular de virus ADN.

3.1. ADENOVIRUS

Los virus de la Familia Adenoviridae corresponden a más de 50 especies, clasificadas dentro de 5 géneros: Atadenovirus que infecta aves, reptiles y mamíferos, Aviadenovirus que infecta aves, Ichtadenovirus que infecta peces, Mastadenovirus que infecta mamíferos y Siadenovirus que infecta anfibios y aves. Presentan un genoma linear no segmentado de doble hebra de ADN de entre 26,163 y 48,395 pares de bases (pb) que codifica cerca de 40 polipéptidos. La parte central del genoma corresponde a 16 genes conservados entre los virus de toda la familia, cuyas funciones principales son la replicación de ADN viral (pol: ADN polimerasa, pTP: proteína preterminal y DBP: proteína de unión a ADN), la encapsulación de ADN (proteínas de encapsulación 52K y IVa2) y la formación y estructura del virión (pIIIa: proteína de cápside, III: proteína de la base pentona, pVII: proteína nuclear, pX: proteína nuclear, pVI: proteína de la cápside, hexon, protease, 100K: proteína de ensamblaje de la hexona, 33K: proteína de empaquetamiento de ADN, pVIII: proteína de la cápside y fiber) (Davison y col 2003). En contraste, los extremos del genoma son de alta variabilidad entre los distintos géneros (Figura 1). En el extremo derecho la mayoría de los genes no han sido caracterizados en detalle y tienen funciones no estructurales, como la proteína GAM-1 que tiene un efecto antiapoptótico y activa la respuesta de choque térmico de la célula infectada. En el extremo izquierdo se encuentra el gen que codifica la dUTPasa que interviene en la replicación de ADN y se codifican proteínas que presentan homología con otros virus, como la proteína no estructural NS1 de parvovirus y la triacilglicerol lipasa del herpesvirus aviar Gallid alphaherpesvirus 2 (Enfermedad de Marek) (Harrach y col 2011).

Figura 1. Ilustración esquemática de la organización del genoma de virus del género Aviadenovirus. Las flechas negras representan genes conservados en todos los géneros de la familia Adenoviridae, las grises representan genes encontrados en más de un género y las de color morado representan genes únicos dentro del género (Harrach y col 2011).

De acuerdo al ICTV1 , siglas en inglés del Comité Internacional de Taxonomía de Virus, a la fecha se han descrito 19 especies de adenovirus que infectan a las aves, de las cuales doce son

1 FUENTE: “Lista Maestra de especies 2016 del ICTV Ver 1.2”. Disponible en: https://talk.ictvonline.org/files/master-species-lists/m/msl. Consultado el 20 de mayo de 2017.

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clasificadas dentro del género Aviadenovirus, infectando principalmente aves domésticas del orden Galliformes (ej. gallos, pavos, faisanes y codornices), sin embargo, la mayoría también se ha reportado infectando aves silvestres (Cuadro 1). Dentro del género Atadenovirus las 2 especies de virus han sido detectadas tanto en aves domésticas como en silvestres, mientras que la mayoría (4 de 5) de las especies de Siadenovirus, han sido reportadas infectando aves silvestres.

Cuadro 1. Especies de virus de la familia Adenoviridae descritos a la fecha infectando hospederos aviares, indicando si se han descrito en especies silvestres y con su respectivo número de acceso a la base de datos GenBank2. El ítem hospedero(s) corresponde a los órdenes de aves infectados por cada virus y entre paréntesis el único hospedero descrito a la fecha del virus correspondiente.

Género Especie Hospedero(s) Silvestres N° de acceso Atadenovirus Duck atadenovirus A Anseriformes y Galliformes Si KU053281 Psittacine atadenovirus A Psittaciformes (Amazona farinosa) Si KJ675568 Aviadenovirus Duck aviadenovirus B Anseriformes (Cairina moschata) No KJ469653 Falcon aviadenovirus A Falconiformes Si AY683555 Fowl aviadenovirus A Galliformes y Struthioniformes Si AC_000014 Fowl aviadenovirus B Galliformes y Columbiformes Si AF508952 Fowl aviadenovirus C Galliformes y Psittaciformes Si GU188428 Fowl aviadenovirus D Galliformes, Columbiformes y Si AF339915 Struthioniformes Fowl aviadenovirus E Galliformes, Columbiformes y Si AF508954 Struthioniformes Goose aviadenovirus A Anseriformes No JF510462.1 Pigeon aviadenovirus A Columbiformes (Columba livia Si FN824512 domestica) Turkey aviadenovirus B Galliformes (Meleagris gallopavo) No GU936707 Turkey aviadenovirus C Galliformes (Meleagris gallopavo) No KF477312 Turkey aviadenovirus D Galliformes (Meleagris gallopavo) No KF477313 Siadenovirus Great tit siadenovirus A Passeriformes (Parus major) Si FJ849795 Penguin siadenovirus A Sphenisciformes (Pygoscelis Si KP144329 antarctica, Pygoscelis papua) Raptor siadenovirus A Strigiformes (Bubo bubo) y Si EU715130 Accipitriformes (Parabuteo unicinctus) Skua siadenovirus A Charadriiformes (Catharacta Si HM585353 maccormicki) Turkey siadenovirus A Galliformes No AC_000016 Cuadro basado en la lista ICTV 2016 Master Species List (MSL31) Ver 1.2 (9 de mayo 2017)

2 FUENTE: “Base de datos GenBank”. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/. Consultado el 01 de junio de 2017.

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Las infecciones por adenovirus en aves se caracterizan por ser de transmisión horizontal y, al igual que en humanos, en su mayoría son subclínicas aparentando poca importancia. Sin embargo, se han reportado brotes asociados a estos virus causando gran mortalidad y con diversos patrones de enfermedad. Por ejemplo, la hepatitis infecciosa con cuerpos de inclusión por FAdV-6 (Fowl aviadenovirus E) que causa entre 10 a 30% de mortalidad en gallinas domésticas, la bronquitis de la codorniz por FAdV-1 (Fowl aviadenovirus A) con mortalidad de 10 a 100% en codornices domésticas, el síndrome de hidropericardio por FAdV-4 (Fowl aviadeovirus C) con mortalidad de 20 a 70% en gallinas domésticas, el síndrome de caída de postura por DAdV-1 (Duck atadenovirus A), y la enteritis hemorrágica por TAdV-3 (Turkey siadenovirus A) con mortalidad de <1 a 60% en pavos domésticos (Swayne y col 2013). En aves silvestres, también se ha descrito adenovirus causando mortalidades como el FaAdV-1 (Falcon Aviadenovirus A), que ha causado fatalidades en diferentes especies de halcones (Harrach y col 2011), el DAdV-1 en patos y gansos silvestres, y el FAdV-1 en la codorniz de Virginia (Colinus virginianus) silvestres (Fitzgerald 2007).

3.2. HERPESVIRUS

Los virus de la familia Herpesviridae se clasifican en las subfamilias que infecta reptiles, aves y mamíferos, y infectando sólo mamíferos. La subfamilia Alphaherpesvirinae incluye 5 géneros: Iltovirus y que infecta aves, y que infectan mamíferos y Scutavirus que infecta reptiles (Pellet y col 2011).

Los virus de la familia Herpesviridae corresponden a virus grandes y complejos, con un genoma lineal de doble hebra de ADN de 125-295 kpb, un alto número de marcos abiertos de lectura u ORFs (sigla del inglés Open Reading Frame) desde 70 a más de 200 (Pellet y col 2011). Además, se describen entre 11 a 35 genes de microARN que expresan transcripciones de función desconocida, aunque hay estudios que sugieren que regulan mecanismos de patogénesis y de latencia vírica (Cullen 2011). Entre los virus la familia Herpesviridae se conserva un subconjunto de aproximadamente 40 genes codificadores de proteínas de la cápside, componentes de la replicación y empaquetamiento de ADN, enzimas modificadoras de nucleótidos, proteínas de membrana y de tegumento y proteínas de control, sugiriendo que los herpesvirus comparten características en las estrategias de replicación (Pellet y col 2011).

De acuerdo al ICTV, a la fecha se han descrito siete especies de herpesvirus que infectan aves, cinco de ellas clasificadas dentro del género Mardivirus y al igual que en los adenovirus aviares, se han descrito principalmente en especies domésticas del orden Galliformes, y se han reportado infectando aves silvestres (Cuadro 2). Los herpesvirus producen una variedad de enfermedades en las aves que al recuperarse tienden a establecer infecciones latentes. Las principales enfermedades causadas por estos virus en aves domésticas son la laringotraqueitis infecciosa por Gallid alphaherpesvirus 1 (GaHV-1) que presenta una morbilidad de 90%-100% y una mortalidad de 5% a 70% en gallinas domésticas, la enfermedad de Marek por Gallid alphaherpesvirus 2 y 3 (GaHV-2 y GaHV-3) con mortalidad en gallinas antes del desarrollo de vacunas de hasta 60%, la enteritis viral del pato causada por Anatid alphaherpesvirs1 (AHV-1) con mortalidad en patos de 5% a 100%, la enfermedad de Pacheco por Psittacid alphaherpesvirus 1 (PsHV-1) (Swayne y col 2013).

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Cuadro 2. Especies de virus de la familia Herpesviridae descritos a la fecha infectando hospederos aviares con su respectivo número de acceso a la base de datos GenBank. El ítem hospedero(s) corresponde a los órdenes de aves infectados por cada virus.

Género Especie Hospedero(s) Silvestres N° de acceso Iltovirus Gallid alphaherpesvirus 1 Galliformes No NC_006623 Psittacid alphaherpesvirus 1 Psittaciformes Si AY372243 Mardivirus Anatid alphaherpesvirus 1 Anseriformes Si EU082088 Columbid alphaherpesvirus 1 Columbiformes, Strigiformes Si NC_034266.1 y Falconiformes Gallid alphaherpesvirus 2 Galliformes Si NC_002229 Gallid alphaherpesvirus 3 Galliformes Si NC_002577 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Galliformes No NC_002641 Cuadro basado en la lista ICTV 2016 Master Species List (MSL31) Ver 1.2 (9 de mayo 2017)

Para ambas familias de virus, Adenoviridae y Herpesviridae, existe escaso conocimiento sobre las infecciones en aves silvestres. No obstante, debido a los avances en técnicas de detección molecular, en los últimos años ha aumentado la descripción y secuenciación de nuevos virus (Marek y col 2014) que todavía no han sido reconocidos como especies. Según las Cuadros 1 y 2, se observa la tendencia de que cada especie de virus infecta aves de uno o dos órdenes (sólo en tres casos infectan tres órdenes distintos). Esto reafirma la idea de que los virus de ambas familias generalmente son específicos en cuanto a sus hospederos, por lo que es posible que hayan coevolucionado.

3.3. CORMORANES COMO MODELO DE ESTUDIO

Los cormoranes corresponden a 41 especies de aves acuáticas pertenecientes a tres géneros (Microcarbo, Phalacrocorax y Leucocarbo) de la familia Phalacrocoracidae, orden Suliformes, distribuidas en todos los continentes. Los cormoranes han sido descritos como portadores de enfermedades infecciosas virales de importancia en salud animal, como el caso del cormorán guanay (Phalacrocorax bougainvillii) en 2007 en la Región del Maule, Chile, donde se presentó el primer foco descrito de Enfermedad de Newcastle (Paramixovirus Aviar Tipo 1) en aves silvestres marinas en Chile (SAG 2009). En Canadá y Estados Unidos está demostrado que los cormoranes orejudos (P. auritus) son de reservorios del Paramyxovirus Aviar Tipo 1, siendo asintomáticos los animales mayores a 16 semanas (Kuiken 1998). Igualmente hay estudios por serología que demuestran que los cormoranes han sido expuestos a virus ADN de doble hebra como Adenovirus aviar tipo 1 y a bacterias como Salmonella pullorum y Chlamydophila spp (Gallo y col 2013).

En Chile habitan 6 especies de cormoranes, Phalacrocorax atriceps (Cormorán imperial), Phalacrocorax bougainvillii (Guanay), Phalacrocorax bransfieldensis (Cormorán antártico), Phalacrocorax brasilianus (Yeco), Phalacrocorax gaimardi (Lile) y Phalacrocorax magellanicus (Cormorán de las rocas). El más abundante es el Yeco o cormorán neotropical (Figura 2), el cual se distribuye en el continente americano desde Texas, Estados Unidos, hasta Cabo de Hornos, Chile. El yeco es una de las aves marinas más numerosas de América del Sur utilizando hábitats tanto de agua dulce como de agua salada. Anida en grandes árboles al lado de las masas de agua, en bandadas o solo, y a diferencia

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de otras especies de cormoranes chilenos, a menudo vuela alto por encima del agua y tierra., es versátil en la elección de hábitat, y también en la elección de alimento, ya que consume las presas más abundantes de la temporada y posee una dieta oportunista (Telfair y Morrison 1995, Jaramillo y col 2005). Debido a la abundancia de individuos, a su amplia distribución, a la diversidad de hábitats que utiliza y a su cercanía con asentamientos humanos es interesante considerar al cormorán yeco como posible modelo de estudio de la relación hospedero-patógeno y como reservorio de enfermedades que afectan la actividad humana y su ecosistema.

Figura 2. Individuos de Phalacrocorax brasilianus en feria fluvial de Valdivia, Chile.

3.4 OBJETIVOS

3.4.1 Objetivo General Identificar y caracterizar molecularmente virus ADN doble hebra infectando Phalacrocorax brasilianus silvestres.

3.4.2 Objetivos Específicos Determinar molecularmente la presencia de virus de las familias Adenoviridae y Herpesviridae en Phalacrocorax brasilianus.

Estimar las relaciones filogenéticas de los virus detectados con respecto a otras especies pertenecientes a los géneros de ambas familias virales.

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4. MATERIAL Y MÉTODOS

4.1. MUESTRAS BIOLÓGICAS Se analizaron 95 tórulas cloacales y 100 tórulas traqueales obtenidas de 100 cormoranes de las especies Phalacrocorax atriceps (n=1), P. brasilianus (n=98) y P. gaimardi (n=1). Las muestras fueron colectadas de individuos capturados aleatoriamente durante temporada de caza en Arica, Chillán, Los Ángeles y Valdivia, individuos juveniles capturados en una colonia reproductiva ubicada en Río Cruces (Valdivia) y de animales recibidos en el Centro de Rehabilitación de Fauna Silvestre de la Universidad Austral de Chile (CEREFAS, Valdivia), entre los años 2015 y 2016. Inmediatamente tomada la muestra, cada tórula fue colocada en un medio de transporte viral (UTM-RT, Copan, Italia) y depositada en nitrógeno líquido para su traslado al laboratorio, donde fueron mantenidas a -20ºC hasta su posterior procesamiento. En la Figura 3 se presenta un esquema que resume la estrategia utilizada para cumplir los objetivos de este estudio.

Figura 3. Esquema de los métodos utilizados para la detección y caracterización de los virus de las familias Adenoviridae y Herpesviridae en P. brasilianus. 1) Individuos silvestres de P. brasilianus. 2) Tórulas traqueales y cloacales de P. brasilianus en medio de transporte viral. 3) Extracción de ADN viral desde el medio de transporte. 4) Amplificación por PCR del gen Dpol de herpesvirus y gen de la proteína hexona de adenovirus. 5) Secuenciación de los productos de PCR positivos. 6) Análisis filogenético de las secuencias.

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4.2. EXTRACCIÓN DE ADN VIRAL, PCR Y SECUENCIACIÓN.

Para extraer el material genético viral suspendido en el medio de transporte se utilizó QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, USA) de acuerdo a las indicaciones del fabricante, y luego se almacenó a -80°C. Para la detección de virus de la familia Adenoviridae, se realizó la amplificación de aproximadamente 800 pares de bases (pb) del gen de la proteína hexona, utilizando los partidores universales HexF1: 5’-GAYRGYHGGRTNBTGGAYATGGG-3’ y HeXR1: 5’- TACTTATCNACRGCYTGRTTCCA-3’, previamente descritos (Mase y col. 2009). El protocolo fue modificado para obtener patrones de amplificación más específicos. Para un volumen total de 25 μl, se utilizaron en 12.5 μl de 1 x SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Takara Bio, Ohtsu, Japón), 1.3 μl de cada partidor a 10mM y 10 μl de ADN extraído de las muestras. El PCR se ejecutó con una temperatura inicial de desnaturalización de 94°C por 5 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos, y una temperatura de extensión final de 72°C por 8 minutos.

Para la detección de virus de la familia Herpesviridae se realizó una amplificación de entre 400 a 700 pb del gen de la ADN polimerasa (Dpol), utilizando un PCR anidado previamente descrito VanDevanter y col (1996), el cual fue modificado para obtener patrones de amplificación más específicos. Los partidores utilizados para el PCR primario fueron dos en dirección 5’ DFA: 5’- GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC-3’ e ILK: 5’-TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA -3’, y uno en dirección 3’ KG1: 5’-GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT-3’. Para el PCR secundario se utilizaron los partidores TGV: 5’-TGTAACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNG T-3’ e IYG: 5’-CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT-3’. Para un volumen total de 25 μl, se utilizaron 12.5 μl de 1 x SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Takara Bio, Ohtsu, Japan), 2.5 μl de cada partidor a 10mM y 5 μl de ADN extraído de las muestras. En el caso del PCR secundario para un volumen total de 25 μl, se utilizaron 2.5 μl de cada partidor a 10mM y 2.5 μl del producto del PCR primario en lugar del ADN de las muestras. Ambos se ejecutaron con temperatura de desnaturalización inicial de 94°C por 5 minutos, 45 ciclos de 94°C por 30 segundos, 46°C por 60 segundos y 72°C por 60 segundos, y una temperatura de extensión final de 72°C por 7 minutos.

Para todos los experimentos de PCR se incluyeron una muestra de agua destilada estéril, en lugar de ADN, como control negativo y una muestra de ADN viral extraído de vacunas comerciales (Canigen® MHA2PPi/L, Virbac, Francia, para Adenoviridae y la Vacuna viva contra Laringotraqueitis Aviar, Virus vivo modificado, Zoetis, USA, para Herpesviridae) como controles positivos. Los productos de PCR fueron evaluados mediante electroforesis en gel agarosa al 2%. Aquellos productos dentro del tamaño esperado fueron purificados usando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, USA), de acuerdo a lo indicado por el fabricante, y luego secuenciados en ambas direcciones con los partidores de amplificación utilizando el analizador genético ABI3500 (AustralOmics, UACh, Chile).

4.3. ANÁLISIS FILOGENÉTICO

Las secuencias obtenidas fueron editadas con el programa BioEdit para eliminar segmentos ambiguos y/o de mala calidad del cromatograma y para generar secuencias consenso. Las secuencias editadas fueron utilizadas para una búsqueda en la base de datos GenBank utilizando el programa BLAST con el objetivo de encontrar secuencias de virus relacionados y confirmar su

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identificación. Posteriormente, se eligieron las secuencias de virus homólogas que resultaron de interés para este estudio y se creó un set de datos para realizar los análisis filogenéticos de cada familia de virus. El set de datos para los virus de la familia Adenoviridae consistió en 28 secuencias de 5 géneros, incluyendo Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus y Siadenovirus (Anexo 1). Mientras que el set de datos para los virus de la familia Herpesviridae consistió en 23 secuencias pertenecientes a 5 géneros de la subfamilia Alphaherpesvirinae, incluyendo Iltovirus, Mardivirus, Scutavirus, Simplexvirus y Varicellovirus (Anexo 2). Las secuencias de cada set de datos fueron alineadas utilizando MAFFT versión 7 (Katoh y Standley 2013). Los mejores modelos de sustitución de nucleótidos fueron definidos con Mega6 (Tamura y col 2013). La inferencia filogenética se realizó utilizando el método de Máxima verosimilitud (ML). Al mismo tiempo, se evaluó el ancho de cada rama o nodo mediante el método de bootstrap con 1,000 replicaciones, para determinar el nivel de confiabilidad de los árboles obtenidos. Por último, se crearon matrices de distancia genética pareadas de las secuencias de aminoácidos, con 1,000 replicaciones bootstrap para estimar la diferencia genética entre las secuencias obtenidas y las bases de datos correspondientes utilizando Mega6 (Tamura y col 2013).

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5. RESULTADOS

5.1. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS VIRALES

Del total de 100 individuos muestreados, 8 fueron positivos a adenovirus, resultando en una prevalencia de 0.08 con un intervalo de confianza (IC) de 95% de 0.027 a 0.133. En cuanto a los herpesvirus, 4 muestras fueron positivas, con una prevalencia de 0.04 y un IC de 95% de 0.002 a 0.078. La lista completa de las muestras analizadas se encuentra detallada en Anexo 3.

5.2. CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA DE ADENOVIRUS

Las ocho secuencias de adenovirus (AdV) encontradas en este estudio fueron 100% idénticas. Un total de 262 aminoácidos predichos fueron alineados con secuencias representativas de la familia Adenoviridae, presentando 46 aminoácidos conservados entre todas las secuencias, 205 variables y 67 con patrón singleton (Figura 4).

Figura 4. Alineamiento de ocho secuencias de 262 aminoácidos codificados en el gen de la proteína hexona de virus representativos del set de datos de la familia Adenoviridae. Los puntos (.) representan repeticiones y los guiones (-) insertos/deleciones. En azul los virus del género Aviadenovirus (Cor: AdV de cormorán, Gull: Gull Adv, NAF: Northen Aplomado Falcon AdV), en verde Atadenovirus (Bov: Bovine adenovirus D, Liz: Lizard AdV-2), en morado Mastadenovirus (Can: Canine AdV-2) y en amarillo Siadenovirus (Sku: Skua AdV-1, Rap: Raptor adenovirus). El análisis filogenético reveló que las secuencias de adenovirus detectadas en el cormorán yeco corresponden al género Aviadenovirus, compartiendo un ancestro en común con Gull AdV (AdV de gaviota, número de acceso KC309439.1) (Figura 5).

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Figura 5. Árbol filogenético de secuencias del gen hexona de la familia Adenoviridae, inferido mediante Máxima verosimilitud (ML) y el modelo de sustitución de nucleótidos GTR+G+I. Los números indican valores de probabilidades posteriores de cada nodo. Este AdV del cormorán presentó una distancia genética de 37.1 ± 3.7% con todos los virus del género Aviadenovirus, mientras que la distancia con sólo el clado que contiene secuencias virales que infectan aves productivas (ej. gallinas y pavos) fue de un 45.8 ± 4.2%. Con respecto a los otros géneros, la distancia genética de los AdV fue mayor (95.6 ± 9.2%) respecto de Ichtadenovirus cuyos hospederos (ej. peces), son igualmente lejanos a los cormoranes (Cuadro 3). Cuadro 3. Estimaciones de divergencia evolutiva entre los géneros de virus del set de datos de Adenoviridae. Los porcentajes sobre la diagonal en color gris representan el error estándar estimado con replicaciones bootstrap.

CorAdV Avi Sia Ata Masta Ichta CorAdV 3.7% 7.2% 7.4% 8.3% 9.2% Avi 37.1% 6.7% 6.8% 8.1% 8.3% Sia 83.6% 84.2% 6.4% 6.7% 8.0% Ata 89.6% 87.9% 84.7% 6.5% 8.1% Masta 93.4% 93.3% 83.4% 78.3% 9.0% Ichta 95.6% 93.5% 100.4% 94.3% 110.4% CorAdV: AdV de cormorán, Avi: Aviadenovirus, Sia: Siadenovirus, Ata: Atadenovirus, Masta: Mastadenovirus e Ichta: Ichtadenovirus

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Finalmente, las estimaciones de diversidad dentro de cada género demostraron que la menor diversidad intra-género fue de Aviadenovirus (aproximadamente 34%), mientras que la diversidad de los Sia-, Ata- y Mast-adenovirus presentaron una divergencia mayor a 40% (Cuadro 4).

Cuadro 4. Estimaciones de diversidad genética intra-géneros de virus del set de datos de Adenoviridae y el error estándar estimado con replicaciones bootstrap.

Género adenovirus Diversidad genética Error estándar Taxón de Hospederos Aviadenovirus 33.8% 3.2% Aves Siadenovirus 40.8% 4.1% Aves, Anfibios Atadenovirus 41.2% 4.3% Aves, Mamíferos, Reptiles Mastadenovirus 42.2% 4.5% Mamíferos

5.3. CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA DE HERPESVIRUS

Un total de 80 aminoácidos predichos fueron alineados con secuencias representativas de la familia Herpesviridae presentando 28 aminoácidos conservados entre todas las secuencias, 50 variables y 7 con patrón singleton (Figura 6).

Figura 6. Alineamiento de once secuencias de 80 aminoácidos codificados en el gen de la polimerasa Dpol de virus representativos del set de datos de Herpesviridae, los puntos (.) representan repeticiones y los guiones (-) insertos/deleciones. En morado los virus del género Iltovirus (Cor: HV de Cormorán, Psi: Psittacid alphaherpesvirus 1, Ga1: Gallid alphaherpesvirus 1), en azul Mardivirus (Ga2: Gallid alphaherpesvirus 2, Col: Columbid alphaherpesvirus 1, Ga3: Gallid alphaherpesvirus3), en amarillo Scutavirus (FibT: Fibropapilloma-associated turtle herpesvirus), en verde Simplexvirus (HS1: , HS2: ), y en rosado Varicellovirus (Sui: Suid alphaherpesvirus 1 y Eq: ).

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El análisis filogenético de las secuencias de herpesvirus reveló que el herpesvirus de cormorán neotropical se identificó dentro del género Iltovirus y que está relacionado con GaHV-1, agente de la laringotraqueitis infecciosa aviar (Figura 7), con una distancia genética de 2% entre clados.

Figura 7. Árbol filogenético de secuencias del gen de la polimerasa Dpol de la subfamilia Alphaherpesvirinae, inferido mediante Máxima verosimilitud (ML) y el modelo de sustitución de nucleótidos GTR+G+I. Los números indican valores de probabilidades posteriores al nodo. El herpesvirus de cormorán neotropical presentó la menor distancia genética respecto de los Iltovirus (28.4 ± 6%) y distancias mayores de 50% respecto de los demás géneros de la familia, siendo la mayor (60.3 ± 12.6%) respecto de los Scutavirus, que infectan tortugas marinas.

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Cuadro 5. Estimaciones de divergencia evolutiva entre los géneros de virus del set de datos de Herpesviridae. Los porcentajes sobre la diagonal en color gris representan el error estándar estimado con replicaciones bootstrap.

CorHV Iltovirus Simplexvirus Varicellovirus Mardivirus Scutavirus CorHV 6.0% 11.5% 12.4% 12.3% 12.6% Iltovirus 28.4% 10.6% 10.4% 11.1% 11.7% Simplexvirus 54.3% 52.7% 7.5% 9.5% 9.2% Varicellovirus 61.4% 54.8% 31.0% 8.3% 8.2% Mardivirus 63.8% 59.8% 44.4% 41.6% 9.5% Scutavirus 60.3% 57.9% 35.4% 34.6% 44.5% CorHV: Herpesvirus de cormorán neotropical

Finalmente, En la Cuadro 6 se muestra que dentro de los herpesvirus de cormorán hubo una baja diversidad genética (1.9 ± 1.9%), seguida por los Simplexvirus (5.1 ± 2.7%) que infectan sólo mamíferos, principalmente primates, y la mayor diversidad se presentó dentro de los Iltovirus.

Cuadro 6. Estimaciones de diversidad genética intra-géneros de virus del set de datos de Herpesvirdae y el error estándar estimado con replicaciones bootstrap.

Taxón Diversidad genética Error estándar Taxón de Hospederos Herpesvirus de Cormorán 1.9% 1.9% Aves Simplexvirus 5.1% 2.7% Mamíferos Varicellovirus 20.3% 5.0% Mamíferos Mardivirus 27.3% 6.4% Aves Iltovirus 29.5% 6.2% Aves

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6. DISCUSIÓN

Este estudio corresponde a la primera descripción de virus ADN de doble hebra detectados por métodos moleculares en cormoranes silvestres. Estudios previos han demostrado sólo exposición a adenovirus mediante estudios serológicos en Phalacrocorax harrisi (31% de positivos) en Ecuador (Travis y col 2006), y en P. atriceps y P. magellanicus (67% y 40% de individuos positivos respectivamente) en Argentina (Gallo y col 2013). En este último estudio se descartó la exposición de P. atriceps y P. magellanicus al herpesvirus GaHV-1, el virus de la Laringotraqueitis infecciosa. De forma similar, se ha reportado un herpesvirus llamado Lake Victoria cormorant virus (LVC) o Phalacrocoracid herpesvirus 1, descrito en P. melanoleucos durante un brote en Australia (French y col 1973). Sin embargo, la información genética de este virus no está disponible, y la especie tampoco está aprobada por el ICTV3.

En el caso de las nuevas secuencias de adenovirus de cormorán descubiertas en este estudio (100% idénticas), según los resultados del análisis filogenético, se clasificarían dentro del género Aviadenovirus. Respecto del clado de los adenovirus que afectan a aves domésticas, como FAdV-1 y TAdV-3, presentaron una distancia genética de 45.8%. Esto permite inferir que este adenovirus de cormorán no se originó a partir de la transmisión de adenovirus que infectan aves domésticas, sino más bien, este virus es específico para cormoranes. Es más, este virus se encuentra posicionado en un clado de adenovirus que infectan especies de aves silvestres (ej. adenovirus de gaviota, adenovirus de paloma y adenovirus de halcón aplomado). No obstante, se requieren estudios genéticos más amplios, como la secuenciación del genoma completo, para determinar de manera más precisa las relaciones filogenéticas y determinar si este adenovirus de cormorán se trataría de una nueva especie.

En términos de diversidad genética intra-género los resultados demuestran una menor diversidad (33.8%) en el género Aviadenovirus, que utiliza sólo aves como hospederos. Mientras que, en el resto de los géneros, que infectan una mayor variedad de taxones, resultó una diversidad mayor al 40%. Lo que puede deberse a que la especialización de los virus en sus hospederos, genera un aumento de la distancia genética entre éstos, que pertenecen a un mismo género, pero que utilizan hospederos de distintos taxones.

Con respecto al potencial de virulencia de este AdV encontrado en cormoranes, se podría inferir basándose en las características de los virus ubicados en los clados cercanos. En este sentido, el virus genéticamente más cercano, el AdV de gaviota fue descrito a partir de lesiones de la bolsa de Fabricio en gaviotas silvestres (Larus argentatus y Larus fuscus) encontradas muertas en los Países Bajos (Bodewes y col 2013), mientras que el adenovirus de halcón aplomado se describió durante un brote de muerte masiva de halcones en cautiverio (Falco femoralis septentrionalis y Falco peregrinus) en Estados Unidos (Schrenzel y col 2007). Esto podría indicar que el adenovirus de cormorán

3FUENTE: “Virus que podrían pertenecer a la familia Herpesviridae pero no han sido aprobados como especie”. Disponible en: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report/dsdna- viruses-2011/w/dsdna_viruses/301/other-related-viruses. Consultado el 26 de abril de 2017.

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tendría un alto potencial virulento. Sin embargo, a excepción de algunos AdV como los causales de la enteritis hemorrágica del pavo, la bronquitis de la codorniz y el síndrome de caída de postura o EDS (del inglés “Egg Drop Syndrome”) que son patógenos primarios, la mayoría de los adenovirus se han descrito como patógenos oportunistas que causan daño cuando otros factores, principalmente infecciones concurrentes, afectan el estado de salud del hospedero (Swayne y col 2013). En el caso del AdV de gaviota, se cree que al afectar la bolsa de Fabricio el virus generó una inmunosupresión que aumentó la sensibilidad a infecciones por otros patógenos que causaron la muerte de las gaviotas (Bodewes y col 2013), y los halcones afectados por adenovirus igualmente podrían haber presentado una inmunosupresión por estrés, al ser mantenidos en cautiverio (Schrenzel y col 2007).

Los AdV descritos en Chile son el virus de la enteritis hemorrágica del pavo (TAdV-3) (Donoso y col 1999) y el virus del EDS (DAdV-1) (Cubillos y col 1982) afectando aves de producción. Por tal motivo, en Chile están autorizados el uso y la distribución de vacunas contra ambos virus por el Servicio Agrícola y Ganadero 4 . Las vacunas para DAdV-1 son inactivadas por lo que se descartan como fuente directa de infección para los cormoranes, no obstante, la del TAdV-3 es una vacuna viva que podría infectar aves silvestres expuestas. Adicionalmente, estos dos virus han sido registrados en otras partes del mundo infectando aves silvestres de los órdenes Passeriformes, Psittaciformes, Falconiformes y Strigiformes para TAdV-3 y del orden Anseriformes para DAdV-1 (Swayne y col 2013). Sin embargo, TAdV-3 corresponde a un Siadenovirus mientras que DAdV-1 corresponde a un Atadenovirus, siendo de géneros distintos al adenovirus secuenciado en este estudio.

Respecto a la detección de virus de la familia Herpesviridae, se detectaron cuatro animales positivos y el análisis filogenético reveló que dichos virus corresponden al género Iltovirus compartiendo un ancestro común con GaHV-1, el virus de la Laringotraqueitis infecciosa. La identidad genética entre ambos clados fue de un 98%, sugiriendo una reciente transmisión entre ambas especies. Este hallazgo resulta inesperado debido al rango de hospederos limitado que caracteriza a los herpesvirus. En particular, GaHV-1 es considerado altamente especie-específico, siendo las gallinas los hospederos primarios y principal reservorio. A la fecha, no se han descrito reservorios silvestres (Swayne y col 2013). En Chile, la laringotraqueitis infecciosa es una enfermedad de presentación esporádica y de notificación obligatoria para la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal). Está dentro del sistema de vigilancia pasiva basado en denuncias que son recogidas por el Servicio Agrícola y Ganadero 5 en conjunto con información obtenida desde plantas faenadoras y laboratorios privados. Sin embargo, no existen estudios moleculares ni epidemiológicos publicados sobre los

4 FUENTE: “Sistema Medicamentos Veterinarios SAG”. Disponible en http://medicamentos.sag.gob.cl/ConsultaUsrPublico/BusquedaMedicamentos_1.asp. Consultado el 5 de junio de 2017.

5 FUENTE: “Sistema de vigilancia pasiva SAG”. Disponible en http://www.sag.cl/ambitos-de- accion/vigilancia-pasiva. Consultado el 8 de mayo de 2017.

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virus causales de brotes de esta enfermedad en la avicultura dentro del país. El SAG6 recomienda la vacunación contra la laringotraqueitis infecciosa sólo en zonas endémicas o cuando se ha diagnosticado el virus durante un brote con el objetivo de disminuir su diseminación y duración de la enfermedad. Las vacunas aprobadas para su uso en Chile7 son únicamente basadas en virus vivos. En Estados Unidos se han descrito brotes de laringotraqueitis infecciosa en aviculturas causados por virus de vacunas vivas atenuadas que se reactivan en los hospederos durante periodos de inmunosupresión (Swayne y col 2013). Además, en un estudio experimental se demostró que los virus de vacunas vivas sobreviven hasta 21 días adheridos al biofilm de las tuberías de agua de bebida, que es una de las vías por la que se administran estas vacunas, incluso después de un proceso de desinfección (Ou y col 2011). Por las razones anteriores se puede sospechar que las infecciones por herpesvirus en los cormoranes podrían haberse causado por desechos de la avicultura. El herpesvirus de cormorán neotropical descrito en este estudio pareciera no haber coevolucionado en esta especie, ya que los hospederos de los herpesvirus genéticamente más cercanos infectan a especies de un orden lejano (Galliformes), lo que indicaría que la infección en P. brasilianus ha dependido de su cercanía geográfica con herpesvirus provenientes de la avicultura. En contraste, el adenovirus de cormorán descrito acá presenta características filogenéticas que permiten inferir mayor grado de especificidad por lo que podría utilizarse para futuros estudios como modelo coevolutivo de hospederos-patógenos. El estudio coevolutivo podría generar evidencias poderosas para demostrar los mecanismos de susceptibilidad y patogenicidad en las relaciones hospedero-patógeno, así como el origen de enfermedades emergentes y reemergentes. Sin embargo, se dificulta explicar este proceso en vertebrados debido a factores como: la falta de conocimiento de las bases moleculares de las interacciones de hospederos-patógenos, las interacciones simultáneas con múltiples hospederos o múltiples patógenos, a las grandes escalas de tiempo necesarias para estudiar este proceso, etc. (Woolhouse y col 2002). Debido a lo anterior una aproximación práctica para el estudio de estas relaciones podría ser identificar polimorfismos recíprocos en genes involucrados directamente en las interacciones hospedero-patógeno (ej. genes del sistema inmune del hospedero y genes de proteínas antigénicas del virus), lo que sería el siguiente paso para determinar si es que existe coevolución entre el cormorán y el adenovirus identificado en este estudio. Igualmente, se requieren más estudios de ambos virus detectados, en términos de prevalencia, virulencia, patogénesis y efectos en el sistema inmune del hospedero P. brasilianus, así como de su origen, distribución y rango de hospederos, para poder determinar el rol y la importancia de estos virus en el ecosistema y en salud animal, tanto de aves silvestres como domésticas.

6 FUENTE: “Ficha técnica de Laringotraqueitis aviar”. Disponible en http://www.sag.gob.cl/sites/default/files/f_tecnica_laringotraq_aviar_v2-2016_0.pdf. Consultado el 10 de mayo de 2017.

7 FUENTE: “Sistema Medicamentos Veterinarios SAG”. Disponible en http://medicamentos.sag.gob.cl/ConsultaUsrPublico/BusquedaMedicamentos_1.asp. Consultado el 27 de mayo de 2017.

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6.1. CONCLUSIÓN

Por primera vez, se detectaron y caracterizaron molecularmente virus ADN de doble hebra en cormoranes.

Se detectó por primera vez en Phalacrocorax brasilianus, un adenovirus que podría considerarse como nueva especie, y que está genéticamente vinculado con otros adenovirus patogénicos descritos en aves silvestres. Igualmente, se detectó por primera vez en P. brasilianus, un herpesvirus con 98% de identidad con GaHV1 (virus de la laringotraqueitis infecciosa).

Según las estimaciones filogenéticas y las características propias de las familias Adenoviridae y Herpesviridae (ej. rango de hospederos reducido), el adenovirus de cormorán pudo haber coevolucionado con su hospedero P. brasilianus, mientras que el herpesvirus parece ser de origen avícola.

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7. REFERENCIAS

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8. ANEXOS

8.1 ANEXO 1 SET DE DATOS PARA ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE ADENOVIRIDAE

N° de Acceso Especie o Serotipo Género Referencia KC309439.1 Gull adenovirus Aviadenovirus Bodewes y col 2013 HM592286.1 Fowl aviadenovirus A Aviadenovirus Pizzuto y col 2010 EF685497.1 Fowl aviadenovirus E Aviadenovirus Ojkic y col 2007 AF339925.1 Fowl adenovirus 12 Aviadenovirus Meulemans y col 2001 AF508959.2 Fowl aviadenovirus 11 Aviadenovirus Meulemans y col 2004 AF339914.1 Fowl aviadenovirus 1 Aviadenovirus Meulemans y col 2001 AY683541.1 Northern Aplomado falcon Aviadenovirus Schrenzel y col 2005 adenovirus HQ117902.1 Fowl aviadenovirus D Aviadenovirus Joubert y col 2010 * DQ323985.1 Fowl aviadenovirus 8 Aviadenovirus Alvarado y col 2007 KX121164.1 Pigeon adenovirus 2 Aviadenovirus Teske y col 2016 NC_031503.1 Pigeon adenovirus 2 Aviadenovirus Teske y col 2016 FN824512.2 Pigeon adenovirus 1 Aviadenovirus Hess y col 1998 U46933.1 Fowl aviadenovirus 1 Aviadenovirus Chiocca y col 1996 NC_001720.1 Fowl aviadenovirus A Aviadenovirus Chiocca y col 1996 NC_014564.2 Turkey adenovirus 1 Aviadenovirus Kajan y col 2010 NC_015323.1 Fowl aviadenovirus C Aviadenovirus Griffin y Nagy 2011 NC_017979.1 Goose adenovirus 4 Aviadenovirus Kajan y col 2012 NC_024486.1 Duck adenovirus 2 Aviadenovirus Marek y col 2014 NC_002501.1 Frog adenovirus 1 Siadenovirus Davison y col 2000 NC_015455.1 Raptor adenovirus 1 Siadenovirus Kovacs y Benko 2009 NC_009989.1 Snake adenovirus 1 Atadenovirus Farkas y col 2012 NC_024684.1 Lizard adenovirus 2 Atadenovirus Penzes y col 2014 NC_002685.2 Bovine adenovirus D Atadenovirus Dan y col 2001 NC_016437.1 Skua adenovirus 1 Siadenovirus Park y col 2012 NC_000942.1 Murine mastadenovirus A Mastadenovirus Song y col 1996 NC_029899.1 Bat mastadenovirus WIV10 Mastadenovirus Tan y col 2016 AC_000020.1 Canine adenovirus 2 Mastadenovirus Davison y col 2003 AJ495768.1 White sturgeon adenovirus Ichtadenovirus Kovacs y col 2003 ° *no publicado °outgroup

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8.2 ANEXO 2 SET DE DATOS PARA ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE HERPESVIRIDAE

N° de Acceso Especie Género Referencia JX458823 Gallid alphaherpesvirus 1 Iltovirus Kong y col 2012 * JX458822 Gallid alphaherpesvirus 1 Iltovirus Zhao y col 2013 AY623125 Psittacid alphaherpesvirus 1 Iltovirus Styles y col 2005 AY623124 Psittacid herpesvirus 2 Iltovirus Styles y col 2005 AY114170 Human alphaherpesvirus 1 Simplexvirus Sakulwira y col 2002 * EU939311 Human alphaherpesvirus 2 Simplexvirus Gafarova y col 2008 * EU717146 Equid alphaherpesvirus 9 Varicellovirus Schrenzel y col 2008 KJ191538 Beluga whale alphaherpesvirus 1 Varicellovirus* Nielsen y col 2014 * EU527336 Lacerta viridis herpesvirus 1 Sin clasificación Robesova 2008 * KJ847330 Human alphaherpesvirus 1 Simplexvirus Bondre 2014 * JQ352199 Human alphaherpesvirus 2 Simplexvirus Sauerbrei y col 2011 GU130289 Gaviid herpesvirus 1 Iltovirus Quesada y col 2009 * AF141890 Columbid alphaherpesvirus 1 Mardivirus Ehlers y col 1999 AY665713 Equid alphaherpesvirus 1 Varicellovirus Telford y col 1992 AY644454 Fibropapilloma-associated turtle Scutavirus Herbst y col 2004 herpesvirus DQ530348 Gallid alphaherpesvirus 2 Mardivirus Spatz y col 2007 AB049735 Gallid herpesvirus 3 Mardivirus Mizumiya y col 2001 X14112 Human alphaherpesvirus 1 Simplexvirus McGeoch y col 1985 AF282130 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Mardivirus Kingham y col 2001 AF520812 Passerid herpesvirus 1 Iltovirus Wellehan y col 2003 AY372243 Psittacid alphaherpesvirus 1 Iltovirus Thureen y Keeler 2006 BK001744 Suid alphaherpesvirus 1 Varicellovirus Klupp y col 2004 AY236869 Iguanid herpesvirus 2 Sin clasificación Wellehan y col 2003 ° *no publicado °outgroup

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8.3 ANEXO 3 LISTADO DE MUESTRAS POSITIVAS Y NEGATIVAS A LA AMPLIFICACION POR PCR PARA LA DETECCIÓN DE ADENOVIRUS Y HERPESVIRUS.

ID Especie Procedencia Fecha Muestra AdV HV IPAFCV15030 P. brasilianus Nebuco - Chillán 2015/7/18 C 0 0 IPAFCV15032 P. brasilianus Huape - Chillán 2015/7/16 C 0 0 IPAFCV15033 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2015/7/19 C 0 0 IPAFCV15034 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2015/7/19 C 0 0 IPAFCV15035 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2015/7/19 C 0 0 IPAFCV15045 P. brasilianus Los Ángeles 2015/7/30 C 0 1 IPAFCV15046 P. gaimardi CEREFAS 2015/8/13 C 0 0 IPAFCV15047 P. brasilianus Los Ángeles 2015/7/30 C 0 1 IPAFCV15048 P. brasilianus Los Ángeles 2015/7/30 C 0 0 IPAFCV16001 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16002 P. brasilianus Arica 2015/9/24 C 0 0 IPAFCV16003 P. brasilianus Arica 2015/9/24 C 0 0 IPAFCV16010 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16011 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16012 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 1 0 IPAFCV16013 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16014 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 T 0 0 IPAFCV16015 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16016 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16017 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16018 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16019 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/6 TC 0 0 IPAFCV16020 P. atriceps CEREFAS 2016/2/24 TC 0 0 IPAFCV16022 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16023 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 T 0 0 IPAFCV16024 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16025 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 T 0 0 IPAFCV16026 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16027 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16028 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16029 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16030 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 T 0 0 IPAFCV16031 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16032 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16033 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16034 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 C 0 0

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IPAFCV16035 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 T 0 0 IPAFCV16036 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 TC 0 0 IPAFCV16037 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 CT 0 0 IPAFCV16038 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 CT 0 0 IPAFCV16039 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/11 CT 0 0 IPAFCV16050 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16051 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16052 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16053 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16054 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16055 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16056 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16057 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16058 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16059 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16060 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16061 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/4/17 CT 0 0 IPAFCV16062 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16063 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16064 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16065 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16066 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16067 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16068 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16069 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16070 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16071 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16072 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16073 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16074 P. brasilianus Río Valdivia 2016/4/21 CT 0 0 IPAFCV16075 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 1 0 IPAFCV16076 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 0 0 IPAFCV16077 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 1 0 IPAFCV16078 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 0 0 IPAFCV16079 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 1 0 IPAFCV16080 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 0 0 IPAFCV16081 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/19 C 1 0 IPAFCV16082 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16083 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16084 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16085 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 1

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IPAFCV16086 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16087 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16088 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16089 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 1 0 IPAFCV16090 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/24 TC 0 0 IPAFCV16092 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 1 1 IPAFCV16093 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16094 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16095 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16096 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16097 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16098 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/1/27 TC 0 0 IPAFCV16099 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/2/1 TC 0 0 IPAFCV16100 P. brasilianus Colonia Valdivia 2016/2/1 TC 1 0 IPAFCV16101 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16102 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16103 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16104 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16105 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16106 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16107 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16108 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 IPAFCV16109 P. brasilianus Río Cato - Chillán 2016/5/1 CT 0 0 AdV= adenovirus, HV= herpesvirus, C= tórula cloacal, T= tórula traqueal, CT= tórula cloacal y traqueal en el mismo medio de transporte viral, TC= traqueal y cloacal en medios separados, 0= negativo, 1= positivo.

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9. AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi familia, en especial a mi padre Hiroki y mi madre Mariko, por apoyarme en este proyecto de venir a Chile a estudiar lo que tanto deseé desde la infancia. Al igual que a mis amigos en Rep. Dominicana y en Chile que me acompañaron sin importar que tan lejos estuviese. A la UACh por brindarme las herramientas necesarias para desarrollar mi formación profesional, al Ministerio de Educación de Chile por la ayuda en el financiamiento de mis estudios y a la asistente social la Sra. Claudia Toledo por toda su orientación. A todos los grandes maestros que conocí en esta casa de estudios, en especial a mi profesor patrocinante el Dr. Claudio Verdugo y a Carlos Hernández por su gran disposición a orientarme como tesista en los procesos del laboratorio. Al profesor Alejandro Bravo y la Dra. Sara Rodríguez que me permitieron ser su ayudante en prácticos durante gran parte de la carrera. A mis compañeros del E3lab que me ayudaban y alegraban los días de trabajo en el laboratorio y a la CONICYT que entregó los fondos para la realización de mi tesis. Al CEREFAS, a su encargado Ángelo Espinoza y al Policlínico Móvil Veterinario que me acogieron como voluntaria y que, aunque no pude permanecer en ambas agrupaciones durante todo el transcurso de la carrera, me permitieron adquirir habilidades y fortalecer el sentido de la responsabilidad social que no hubiese conseguido en otras instancias. Finalmente, agradezco a mi hijo Kotaro por motivarme día a día y a mi cónyuge y compañero de vida Francisco por todo el cariño y el apoyo que hicieron posible que lograra terminar esta etapa tan importante para mí.