DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Clonagem Do Cdna Codificante

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® e expressão da proteína recombinante.

Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Thiago Mafra Batista Ouro Preto, julho de 2009.

Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® e expressão da proteína recombinante.

Thiago Mafra Batista ORIENTADOR: PROF. DR. IESO DE MIRANDA CASTRO

Dissertação apresentada ao programa de pós- graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Molecular

Ouro Preto, julho de 2009.

Dedicatória

Aos meus pais João Batista e Florentina Ao meu irmão Phillipe À minha melhor tia, Ivone (em memória) Com todo meu amor.

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Agradecimentos

À CAPES pelo auxílio financeiro.

À Universidade Federal de Ouro Preto, pelo ensino gratuito e de qualidade.

À histórica cidade de Ouro Preto, pelos incríveis momentos vividos e que estarão guardados pra sempre em minha memória.

Ao meu orientador Prof. Dr. Ieso de Miranda Castro , pelo exemplo de responsabilidade e seriedade com a ciência. Ao Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão , botafoguense, exemplo de profissionalismo e comprometimento com a educação. Ao amigo/irmão de infância, companheiro em todos os momentos, João Victor , só nós dois sabemos como foram esses dois anos, muita história pra contar! Amigo pra vida toda. Fusca azul! À minha namorada Juliana , por todo carinho, amor e compreensão durante esse tempo longe um do outro, obrigado por tudo, eu amo você! Aos amigos pensionistas do LBCM, Filippe “Ariscu” Gadiolli e Anderson “Ploust” pelos ótimos momentos de risadas, café na cantina e boas histórias, valeu “dimais” da conta e lembrem-se sempre: “Dápáfazê”! Aos colegas de pós graduação que se tornaram amigos , em especial Tiago “Listerine”, Larissa, Ramon “Mamona”, Nilza “Banzai”, Roenick, Matheus, Manoel, Eduardo (cruzeirense) e Auffy. À Zezé Trópia, por todo carinho e por ser a simpatia do LBCM. À galera do LBCM , doutoras Anamaria e Gilzeane obrigado por tudo, Prof. Dr. Tótola obrigado pelo incentivo e boas idéias, Igor “Água-móli” valeu demais, Carol, Renata, Natália, Érica, Simone, Wesley, Sr. Bráz, enfim, a todos que passaram por aqui, meu muito obrigado! Aos diversos amigos conquistados no Laboratório de Imunoparasitologia (LIP), Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM), Laboratório de Fisiologia Cardiovascular (LFC), Laboratório de Doença de Chagas, e no Laboratório de Enzimologia e Biofísica, obrigado pelo ótimo convívio durante este trabalho.

À Cida , alma do NUPEB, obrigado por ser tão prestativa e amiga! Ao professor Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pelas valiosas idéias e discussões científicas que muito me ajudaram em minha busca pela LTx5. Obrigado! À professora Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto, pela simpatia e por estar sempre bem disposta a ajudar, mesmo que via e-mails. Ao professor Dr. William Borges, pelas valorosas discussões científicas. Ao professor Dr. Luiz Carlos Crocco Afonso, botafoguense, obrigado pela ajuda nos experimentos de Western e Dot Blot. À professora Dra. Renata Guerra de Sá, obrigado pela amizade e carinho. Ao amigo professor Dr. Luciano Gonçalves Fernandes, outro botafoguense, futuro pescador! Viva o Nag Champa, Peperone! Ao professor Dr. Leonardo Máximo Cardoso, obrigado pelo Reference Manager e por toda ajuda com as referências bibliográficas. Ao Sr. Milton, Dona Iraci e toda família, por me acolherem tão bem durante esses 2 anos e 5 meses em Ouro Preto! E finalmente, à minha família , minha mãe Florentina , meu pai João Batista e meu irmão Phillipe , flamenguistas como eu, minha origem, meu passado, meu presente e meu futuro. Amor não se agradece, se valoriza, e vocês são tudo pra mim! Amo vocês!

A luta pela vitória nem sempre é vantajosa aos fortes nem aos espertos. Mais cedo ou mais tarde quem cativa a vitória é aquele que crê plenamente: “EU CONSEGUIREI!”

Napoleon Hill

Resumo

O estudo de toxinas presentes em venenos de animais vem apresentando crescimento contínuo. O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, popularmente conhecida como caranguejeira, ainda é pouco explorado. Neste trabalho, nós sub clonamos a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-HIS-TOPO ® (Invitrogen) em fusão com um V5 epitope e uma cauda de histidina. A LTx5 foi previamente identificada através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp. Após confirmação da clonagem por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição, realizamos o sequenciamento de ambas as fitas do DNA e verificamos que o inserto foi inserido no frame correto. A expressão da proteína recombinante foi realizada utilizando células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A. Alcançamos uma melhor expressão da proteína recombinante LTx5 quando as células foram pré-cultivadas em meio contendo rafinose, e induzidas em meio contendo 4% de galactose (p/v). A imunodetecção da proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina utilizando anticorpo monoclonal anti His-Tag só foi possível em ensaios de Dot Blot. O tratamento no qual as proteínas são submetidas em um ensaio de Western Blot parece interferir na ligação antígeno- anticorpo. Não alcançamos sucesso nos procedimentos de purificação testados devido ao baixo rendimento de expressão da proteína. A presença de códons raros na sequencia codificante para a toxina LTx5 e a toxicidade da molécula para as células de Saccharomyces cerevisiae parecem afetar negativamente o rendimento da expressão da proteína. Sugerimos que os estudos futuros com esta toxina sejam realizados utilizando um sistema mais eficiente para a expressão da proteína.

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Abstract

The study of toxins present in venoms of animals has shown continuous growth. The venom of the spider genus Lasiodora sp, popularly known as caranguejeira is still little explored. In this study, we sub-cloned the coding sequence for the mature toxin LTx5 at the expression vector pYES2.1/V5-HIS-TOPO ® (Invitrogen) in fusion with a V5 epitope and a histidine tag. The LTx5 was previously identified through the screening of a cDNA library of the spider Lasiodora sp venom gland. The presence of the appropriate insert was determined using colonies PCR, digestion with restriction endonucleases and sequencing of both DNA strands. The expression of recombinant protein was performed using Saccharomyces cerevisiae W303-1A cells. Improved expression levels of recombinant protein LTx5 were reached when the cells were pre- cultured in medium containing raffinose, and induced in medium containing 4% galactose (w/v). The recombinant protein LTx5 containing the histidine tag by using monoclonal anti His-tag was only detected in of Dot Blot assay. The treatment in which proteins are subjected during a Western blot test appears to negatively interfere in the antigen-antibody binding. Success in the purification procedures was not achieved due to the low expression of the protein. The presence of rare codons in coding sequence for the LTx5 toxin and its toxicity to the Saccharomyces cerevisiae cells appear to negatively affect the efficiency of the protein expression. We suggest that further studies must take in consideration the use of more efficient system for the expression of the peptide.

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Índice

RESUMO vii

ABSTRACT viii

LISTA DE ABREVIATURAS xiii

LISTA DE FIGURAS xv

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 Aspectos gerais 1

1.2 Estudo de toxinas animais 5

1.3 Toxinas de aranhas 9

1.3.1 Ação na liberação de neurotransmissores 10

1.3.2 Ação em canais de sódio voltagem-dependentes 11

1.3.3 Ação em canais de cloreto 12

1.3.4 Ação em canais de potássio 13

1.3.5 Ação em canais de cálcio voltagem-sensíveis 14

1.4 Estudos com o veneno da aranha Lasiodora sp 15

2. OBJETIVOS 18

2.1 Objetivo geral. 18

2.2 Objetivos específicos. 18

3. MATERIAL E MÉTODOS. 19

3.1 Microorganismos. 19

3.2 Meios de cultura. 19

3.2.1 Meio LB (Luria-Bertani) 19

3.2.2 Meio LB-XIA 19

3.2.3 Meio YP 19

3.2.4 Meio seletivo SD 19

3.2.5 Meio 2XYP 20

3.3 Vetor de clonagem e expressão. 20

3.4 Sub clonagem da sequência codificante para a LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-His-TOPO ®. 21

3.4.1 PCR para amplificação da sequência codificante para a toxina madura. 22

3.4.2 Purificação do produto de PCR. 23

3.4.3 Ligação do produto de PCR no vetor de clonagem. 23

3.5 Preparo de células competentes de E. coli TOP10F’. 24

3.6 Transformação de bactérias. 24

3.7 PCR das colônias provenientes da transformação de E. coli TOP10F’ com o produto de ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5. 25

3.8 Eletroforese em gel de agarose. 26

3.9 Extração de DNA plasmidial de bactéria. 26

3.10 Digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição. 27

3.11 PCR para confirmação da orientação do inserto no vetor pYES2.1/V5- His-TOPO ®. 27

3.12 Sequenciamento do DNA. 30

3.12.1 Mini prep para sequenciamento. 30

3.12.2 PCR para reação de sequenciamento. 31

3.12.3 Precipitação da reação de sequenciamento. 32

3.13 Preparo de células competentes de Saccharomyces cerevisiae. 32

3.14 Transformação de leveduras. 33

3.15 Expressão da proteína recombinante. 33

3.16 Extração de proteínas totais. 34

3.17 Solubilização da fração insolúvel. 34

3.18 Dosagem de proteínas totais. 35

3.19 SDS-PAGE (Laemmli, 1970). 35

3.20 SDS-Tricina-PAGE (Schagger et al ., 1987). 35

3.21 Coloração de gel de poliacrilamida por nitrato de prata. 36

3.22 Dot Blot. 36

3.23 Western Blot. 37

3.24 Cromatografia de filtração molecular. 37

3.25 Cromatografia de troca aniônica. 38

3.26 Purificação da proteína recombinante utilizando resina Ni-NTA. 38

3.27 Fracionamento do extrato protéico utilizando sistema Microcon ® YM- 50K Millipore. 39

4. RESULTADOS. 40

4.1 Amplificação da região codificante para a toxina madura LTx5. 40

4.2 Clonagem da sequência codificante para LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-His-TOPO ®. 41

4.3 Digestão do DNA plasmidial com as endonucleases Pvu II e Xba I. 42

4.4 Sequenciamento do DNA. 43

4.5 Análise da sequencia de aminoácidos da LTx5 recombinante. 43

4.6 Expressão da proteína recombinante LTx5 com 2% de galactose. 44

4.7 Dot Blot. 45

4.8 Expressão da proteína recombinante LTx5 com 4% de galactose. 46

4.9 Dot Blot. 47

4.10 Western Blot. 48

4.11 Dot Blot em condições desnaturantes. 49

4.12 Tentativa de purificação da proteína recombinante usando a resina Ni- NTA. 51

4.13 Cromatografia de filtração molecular e cromatografia de troca aniônica. 52

4.14 Tentativa de fracionamento do extrato protéico utilizando sistema Microcon ® YM-50K Millipore. 52

5. DISCUSSÃO. 53

6. CONCLUSÕES. 60

7. COMENTÁRIOS FINAIS. 61

8. BIBLIOGRAFIA. 62

9. ANEXO. 80

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Lista de Abreviaturas

Abs Absorbância cDNA DNA complementar

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (Brometo de Cetil-Trimetilamônio) dNTP’s Desoxiribonucleotídeos

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra Acético

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorvente ligado à enzima)

Gal Galactose

GET Glicose/EDTA/Tris

IgG Imunoglobulina G

IPTG Isopropil-β-D-thiogalactopiranoside

Lqh Toxina isolada do veneno do escorpião L. quinquestriatus hebraeus

LTx Toxina isolada do veneno da aranha Lasiodora sp. mRNA RNA mensageiro

NEM N-Ethilmaleimide

NMDA N-metil-D-aspartato

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

PEG Polietilenoglicol pI Ponto isoelétrico

PLA 2 Fosfolipase A 2

PMSF Phenylmethylsulphonylfluoride (Fenil-Metil-Sulfonil-Fluoreto)

RNAse Ribonuclease

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS

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TAE Tampão Tris/Acetato/EDTA

TE Tampão Tris/EDTA

TEMED N,N,N' ,N' -tetramethil-etano-1,2-diamino

THP Tris(hidroxipropil)phosphine tRNA RNA transportador

TTX Tetrodotoxina

X-GAL 5-Bromo-4-Cloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

α-LTx α-latrotoxina

xiv

Lista de figuras

Figura 1 - Aranha do gênero Lasiodora sp ...... 3 Figura 2 – Dendograma das toxinas presentes no veneno da aranha Lasiodora sp ...... 16 Figura 3 - Mapa do vetor de clonagem e expressão pYES2.1/V5-His-TOPO ® ...... 20 Figura 4 – Sequencia de nucleotídeos e aminoácidos da LTx5 ...... 21 Figura 5 - Desenho esquemático representando a PCR-A ...... 28 Figura 6 - Desenho esquemático representando a PCR-B ...... 29 Figura 7 - Amplificação da região codificante para a toxina madura LTx5 ...... 40 Figura 8 - PCR das colônias transformadas com o produto de ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5 ...... 41 Figura 9 – Digestão da construção pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5 com as endonucleases de restrição Pvu II e Xba I ...... 42 Figura 10 – Análise da sequencia primária de aminoácidos da LTx5 recombinante...... 43 Figura 11 - SDS-Tricina-PAGE dos diferentes tempos de indução com 2% de gal...... 44 Figura 12 - Dot Blotting das amostras induzidas com 2% de galactose ...... 45 Figura 13 – SDS-Tricina-PAGE dos diferentes tempos de indução, com 4% de gal ..... 46 Figura 14 - SDS-Tricina-PAGE dos diferentes tempos de indução, com 4% de gal ...... 47 Figura 15 - Dot Blotting ...... 48 Figura 16 - Western Blotting ...... 49 Figura 17 - Dot Blotting em condições desnaturantes ...... 50 Figura 18 – SDS-Tricina-PAGE da tentativa de purificação da proteína recombinante utilizando a resina de afinidade Ni-NTA ...... 51

1. INTRODUÇÃO.

1.1 Aspectos gerais.

As aranhas pertencem à ordem Araneae, classe Arachnida, subfilo Chelicerata e juntamente com a classe Tracheata (lacraias, diplópodes e insetos) compreendem um dos grupos de artrópodes que mais se adaptaram à vida terrestre com aproximadamente 40.000 espécies já descritas em mais de 100 famílias e 3.000 gêneros. Estima-se a existência de 170.000 espécies de aranhas no mundo (Ruppert et al ., 2005; King, 2004). As aranhas são animais exclusivamente carnívoros, bem adaptados ao ambiente terrestre e encontrados em todos os continentes com exceção da Antártida. As aranhas podem ser encontradas em diferentes tamanhos, medindo de 0,5 mm até 9 cm de comprimento, e apresentam o corpo segmentado em cefalotórax e abdômen ligados por um pedículo. Na parte posterior do abdômen encontram-se os apêndices tecedores de seda, inovação que confere destaque às aranhas em relação aos demais aracnídeos (King, 2004; Ruppert et al ., 2005; Saucier, 2004; Rash et al ., 2002). A ordem Araneae é subdividida em três subordens: Mesothelae (com apenas uma família descrita), Mygalomorphae (aranhas primitivas) e Araneomorphae (aranhas contemporâneas). Esta última compreende cerca de 93% das espécies conhecidas. As araneomorfas desenvolveram ao longo da evolução um par de pulmões e uma eficiente traquéia, aumentando as trocas gasosas e conferindo uma vida mais ativa quando comparadas às migalomorfas, porém são menores em tamanho. As araneomorfas vivem de 1 a 2 anos, e são excelentes tecedeiras de seda, como as espécies argiope , nephila e araneus (King, 2004; Ruppert et al ., 2005). As migalomorfas se destacam pelo tamanho e longevidade, chegando a viver até 25 anos e atingindo envergadura de até 25 cm. Neste grupo se destacam as aranhas da família Theraphosidae com cerca de 860 espécies descritas no mundo todo, com destaque para as espécies do gênero Lasiodora (figura 1). As aranhas da família Theraphosidae são conhecidas como tarântulas na América do Norte e Europa e como caranguejeiras na América do Sul (King, 2004; Saucier, 2004; Escoubas et al ., 2004). As aranhas caranguejeiras são encontradas em uma grande diversidade de nichos ecológicos, com preferência para regiões tropicais e

1 semi tropicais. Estas aranhas se adaptaram bem ao convívio com o homem, e algumas espécies são utilizadas como animais domésticos (King, 2004). A atividade predatória das aranhas terafosídeas conta com uma diversidade de presas vertebrados e invertebrados (Escoubas et al ., 2004). Essas aranhas desenvolveram habilidade de captura utilizando suas quelíceras ortognatas dotadas de grandes aguilhões, que se movem no plano longitudinal, capazes de ferir e matar presas como pequenos pássaros e vertebrados de pequeno porte (Ruppert et al ., 2005). A principal forma de defesa destas aranhas são os pêlos urticantes localizados em seu abdômen, que são lançados quando elas se sentem ameaçadas, causando irritação na pele e em mucosas (Waggoner et al ., 1997; Isbister et al ., 2002). Mesmo apresentando uma aparência amedrontadora devido ao seu tamanho, a picada das aranhas caranguejeiras não apresenta risco clínico ao ser humano (Lucas, 1988). Embora seu veneno não cause graves efeitos em humanos, há relatos de picadas de aranhas terafosídeas na América do Sul, África, Ásia e Austrália (Lucas et al ., 1994; Schmidt, 1989; Isbister et al ., 2003). A picada desta aranha, na maioria dos casos, causa dores locais moderadas, coceiras, edema, ardência e rigidez no local da injúria. Em casos mais graves, as picadas podem provocar espasmos musculares por algumas horas (Escoubas et al ., 2004; Isbister et al ., 2002), causados principalmente pelo baixo pH do veneno (pH 5.0) e pela ação de aminas biogênicas como serotonina, histaminas, adenosina, poliaminas e ATP (Chan et al ., 1975; Schanbacher et al ., 1973a; Cabbiness et al ., 1980; Schanbacher et al ., 1973b). Dentre as aranhas com importância médica, devido a acidentes em humanos causados por picadas, destacam-se as araneomorfas Phoneutria (aranha armadeira), Latrodectus (viúva-negra), Loxosceles (aranha marrom) e Atrax (aranha teia de funil) com casos de óbitos documentados (Escoubas et al ., 2000b).

Figura 1 - Aranha do gênero Lasiodora sp

As aranhas do gênero Phoneutria , são popularmente conhecidas no Brasil como aranhas-armadeiras (Ministério da Saúde do Brasil, 2001). Estas aranhas são muito agressivas e quando se sentem ameaçadas armam imediatamente o bote, apoiando-se nas patas traseiras, levantando as patas dianteiras e os palpos, abrindo as quelíceras e deixando à mostra os ferrões. No Brasil, já foram descritas quatro espécies de aranhas Phoneutrias (Phoneutria nigriventer, P. fera, P. keyserfingi, e P. reidyi ). Estas espécies podem ser encontradas em todas as regiões brasileiras exceto na região Nordeste. São animais de hábitos errantes, podem medir até 15 cm de envergadura, não constroem grandes teias e caçam preferencialmente à noite. É neste período que concentram a maioria dos acidentes dentro de residências e em suas proximidades (Bucaretchi et al ., 2000; Ministério da Saúde do Brasil, 2001; Lucas, 1988). Conhecidas no Brasil como aranhas-marrom, as aranhas do gênero Loxosceles são pequenas, chegando a medir até 3 cm de envergadura e se escondem ao abrigo da luz em pequenas fendas, em telhas, cascas de árvores, barrancos, roupas e constroem teias irregulares (Ministério da Saúde do Brasil, 2001). Acidentes com aranhas deste

3 gênero são muito perigosos, devido à ação dermonecrótica de seu veneno. A picada destas aranhas causa lesões cutâneas que se espalham ao redor da ferida e manifestações clínicas como insuficiência renal, coagulação intravascular disseminada e hemólise intravascular (da Silva et al ., 2004; Swanson et al ., 2006; Wasserman et al ., 1983). A evolução do quadro de envenenamento para os demais sistemas é menos comum do que as manifestações cutâneas, mas podem acarretar complicações levando à morte das vítimas (Felicori et al ., 2006). As aranhas do gênero Latrodectus, popularmente conhecidas no Brasil como viúvas-negras, são encontradas em todo o mundo, com incidências das espécies Latrodectus curacaviensis, L. gemetricus e L. mactans principalmente na região litorânea do nordeste e sudeste do Brasil (Ministério da Saúde do Brasil, 2001; Lucas, 1988). Estas aranhas possuem abdômen globular negro, com uma mancha vermelha distinta em seu ventre. As fêmeas chegam a medir 1 cm de comprimento, enquanto os machos medem em média 3 mm de comprimento, o que facilita a ação canibal da fêmea após a cópula, motivo este responsável pelo nome popular desta aranha. A picada desta aranha, causada apenas pelas fêmeas, geralmente é indolor, porém os sintomas são graves e dolorosos, causados pela ação do veneno altamente neurotóxico, levando a dores abdominais e em membros inferiores, náuseas, espasmos musculares, sudorese, elevação da pressão do fluido cérebro-espinhal e paralisia respiratória (Ministério da Saúde do Brasil, 2001; Rash et al ., 2002; Lucas, 1988; Ruppert et al ., 2005; Timms et al ., 1986). O tratamento de acidentes com viúvas-negras é feito com soro e anti-veneno (Heard et al ., 1999; Isbister et al ., 2003; Peterson, 2006; Timms et al ., 1986; Vetter et al ., 2008). Embora não haja relato de morte em humanos causada por picada de aranhas caranguejeiras (Escoubas et al ., 2004; Schmidt, 1989), Isbister e colaboradores, em 2003, mostraram que a ação do veneno da tarântula Stromatopelma sp em cães e em humanos levou ao óbito sete animais e causou disritmia cardíaca nos humanos (Isbister et al ., 2003). O veneno das tarântulas parece afetar invertebrados e vertebrados com diferente intensidade, provavelmente relacionado aos hábitos alimentares naturais destas espécies (Escoubas et al ., 2004).

1.2 Estudo de toxinas animais.

Organismos venenosos estão distribuídos em todo o reino animal, com mais de 100.000 espécies distribuídas nos principais filos, como cordata (répteis, peixes, anfíbios, mamíferos), equinoderma (ouriço-do-mar, estrela-do-mar), molusca (caracóis, polvos), anelídea (sanguessugas), artrópoda (aracnídeos, insetos, miriápodes), cnidária (anêmonas, águas vivas, corais) e são encontrados em praticamente todos os ecossistemas. A manutenção da vida em diferentes habitats, a busca por alimentação e a necessidade de defesa possibilitou uma grande diversidade de organismos peçonhentos e venenosos (Calvete et al ., 2009; Menez et al ., 2006). A biodiversidade de organismos vegetais e animais resulta em uma grande diversidade de venenos e peçonhas, os quais compreendem um enorme leque bioquímico de moléculas pequenas, aminoácidos e proteínas complexas. As moléculas tóxicas podem apresentar grande variabilidade de estrutura e função entre indivíduos, espécies, gêneros e famílias (Mebs, 2001). O processo evolutivo permitiu aos animais peçonhentos desenvolverem um complexo arsenal de neurotoxinas que atuam em receptores celulares com alta especificidade e seletividade (Escoubas et al ., 2000b), tornando-as importantes para o estudo de mecanismos biológicos complexos (Gwee et al ., 2002). Os venenos são formados por uma biblioteca de peptídeos e proteínas, seletivamente adaptadas para atuarem nos sistemas vitais de suas vítimas e presas, interrompendo a atividade de enzimas vitais, agindo em receptores e canais iônicos, desarranjando os sistemas nervoso central e periférico, cardiovascular e neuromuscular, agindo na coagulação sanguínea e na homeostase celular (Calvete et al ., 2009). O estudo de toxinas é de interesse humano por várias razões. Primeiramente por ser uma fonte rica de ferramentas básicas para o estudo de processos fisiológicos, incluindo os sistemas nervoso central e periférico, o sistema cardiovascular, o sistema hormonal e o sistema imunológico. Em segundo lugar, constitui uma importante ferramenta para estudos farmacológicos, com diversos produtos farmacêuticos disponíveis no mercado e dezenas de outros em fase de testes clínicos. Em terceiro lugar, a compreensão de seus mecanismos de ação é importante para favorecer o

5 desenvolvimento de uma melhor proteção contra a ação destas toxinas (Menez et al ., 2006). Atualmente são estimadas cerca de 700 espécies de caracóis, 750 espécies de serpentes peçonhentas, 1.500 espécies de escorpiões e 40.000 espécies de aranhas, abrindo um enorme e inexplorado reservatório de componentes bioativos que podem trazer a cura para diversas doenças que não respondem aos métodos terapêuticos disponíveis. Por outro lado, os envenenamentos são uma questão de saúde pública em escala mundial, uma vez que estes animais são encontrados em todos os continentes e em quase todos os países, com predominância de habitat em regiões de clima tropical e semi-tropical (Calvete et al ., 2009). O primeiro relato científico de estudos de toxinas animais foi descrito em 1949, por Rocha e Silva e colaboradores, que descobriram um peptídeo que pode ser usado no controle da pressão arterial. Ao injetar o veneno da serpente brasileira Bothrops jararaca na corrente sanguínea de mamíferos, os autores observaram um acúmulo de bradicinina no organismo do animal. O acúmulo da bradicinina se dá devido à inibição da enzima ECA (enzima conversora da angiotensina), causada pela ação do veneno da serpente (Rocha e Silva et al ., 1949). A bradicinina exerce efeito hipotensor quando acumulada no organismo. Os medicamentos conhecidos como inibidores das ECA’s (Capitopril, Enalapril, Benazepril), são igualmente responsáveis por inibir a degradação da bradicinina, causando assim, vasodilação e consequentemente, queda na pressão arterial (Ferreira et al ., 1970). Alvos de pesquisas há mais de duas décadas, os caracóis marinhos do gênero Conus, com aproximadamente 500 espécies descritas, e mais de 100.000 conotoxinas estimadas em seus venenos, são os animais peçonhentos mais estudados até o momento (Han et al ., 2008). Os componentes do veneno dos caracóis deste gênero são utilizados principalmente no tratamento da dor crônica (Gray et al ., 1988). As conotoxinas são divididas em duas super famílias: as conotoxinas ricas em pontes dissulfeto com ação em receptores de glutamato do tipo NMDA (neurotensina, vasopressina) e as conotoxinas pobres em pontes dissulfeto, com ação em canais iônicos de Ca 2+ , Na +, K + e em receptores nicotínicos de acetilcolina (Terlau et al ., 2004). Estudos recentes sugerem o uso das conotoxinas no tratamento contra o câncer, distúrbios neuromusculares e psiquiátricos. Além do mais, as conotoxinas possuem ação cardioprotetora,

6 neuroprotetora, antiepiléptica e analgésica em modelos animais (Han et al ., 2008; Terlau et al ., 2004). Recentemente aprovada pelo US Food and Drug Administration dos EUA, a ziconotida é outro exemplo de toxina animal utilizada para fins médicos. A ziconotida é um forte anestésico utilizado para o tratamento de dor crônica. A forma sintética do peptídeo ω-conotoxina M-VII-A derivado do caracol Conus magus atua bloqueando canais de cálcio tipo-N (Calvete et al ., 2009; McIntosh et al ., 1982). Braud e colaboradores, em 2000, trabalhando com as serpentes das famílias Viperidae (víboras) e Crotalidae, através de experimentos realizados in vitro e in vivo , observaram que várias etapas de complexos processos fisiológicos, tais como coagulação sanguínea, ativação plaquetária e fibrinólise podem ser afetados pela ação das proteínas que compõem o veneno destas serpentes (Braud et al ., 2000). Trabalhos relativos à estrutura molecular destas proteínas mostraram uma grande similaridade estrutural entre as diferentes famílias de proteínas que compõem estes venenos (serino proteases, metaloproteases, PLA 2, lectinas tipo-C, desintegrinas) embora com diferentes alvos de ação (Markland, Jr., 1997; Ogawa et al ., 1992; Nobuhisa et al ., 1997; Ogawa et al ., 1996; Nakashima et al ., 1995; Nakashima et al ., 1993). A ação do veneno dos escorpiões se dá através de polipeptídeos altamente seletivos que interagem com canais iônicos excitáveis de membranas (Froy et al ., 1999). O veneno dos escorpiões é constituído por uma mistura aquosa contendo muco, sais inorgânicos, moléculas orgânicas de baixo peso molecular, serotoninas, inibidores de proteases e peptídeos neurotóxicos, que variam em estrutura e função, e são seletivos a 2+, + - diferentes canais iônicos (Ca Na , K + e Cl ) de mamíferos, insetos e crustáceos (Mebs, 2001; Muller, 1993). Dentre as várias espécies de escorpiões que apresentam riscos a humanos se destacam Titus serratus, Buthus martensi Karsch, Mesobutus tamulus e Leiurus quinquestriatus , causando acidentes letais principalmente em crianças (Gwee et al ., 2002). Em 1998, Tytgat e colaboradores purificaram a toxina PBITx1 do veneno do escorpião Parabuthus schlechteri e observaram que esta toxina apresenta alta similaridade com as pequenas insetotoxinas I 1, I 5 e I 5A presentes no veneno do escorpião B. eupeus (44, 64 e 64% de respectivamente), 56% de similaridade com a insetotoxina AmmP2 do escorpião Androctonus mauretanicus , 88% de similaridade com o peptídeo I do escorpião B. sindicus , 60% de similaridade com a clorotoxina do veneno do escorpião L. quinquestriatus quinquestriatus e 66% de similaridade com a toxina Lqh-

8/6 do escorpião L. quinquestriatus hebraeus. Todas estas toxinas são seletivas a canais de K + e Cl - (Tytgat et al ., 1998). O estudo destes peptídeos abre possibilidades para sua utilização como ferramenta bioinseticida, uma vez que são altamente seletivos, biodegradáveis e não tóxicos a mamíferos (du Plessis et al ., 2008; Gordon et al ., 2007; Gurevitz et al ., 2007).

Rotineiramente utilizada para tratamentos faciais, em clínicas de dermatologia, a toxina botulínica (BTX) é um exemplo de utilização médica de toxinas animais. Extraída da bactéria Clostridium botulinum, a BTX possui 7 sorotipos distintos identificados como A, B, C, D, E, F e G, sendo os subtipos BTX-A e BTX-B utilizados comercialmente (Carruthers et al ., 2005). A BTX quando injetada intramuscularmente, em doses terapêuticas, causa uma quimiodesnervação temporária do músculo, resultando em uma redução localizada da atividade muscular (Carruthers et al ., 2005).

1.3 Toxinas de aranhas.

Embora seja o grupo de animais peçonhentos com maior numero de espécies já descritas, o estudo de toxinas de aranhas ainda é pouco explorado (Escoubas et al ., 2000b). Os estudos de peptídeos tóxicos presentes em venenos animais, principalmente aranhas e escorpiões, com alta especificidade de ação no sistema nervoso de insetos tem crescido a cada ano (De Lima et al ., 2007). A utilização de peptídeos tóxicos com ação bioinseticida já vem sendo sugerida desde a década de 90 (Maeda et al ., 1991; McCutchen et al ., 1991; Stewart et al ., 1991). Em estudos recentes, a especificidade de ação de peptídeos tóxicos de venenos de aranhas vem sendo estudada em diferentes organismos, sugerindo aplicações agroquímicas contra larvas de Spodoptera litura e Helicoverpa armigera (Bloomquist, 2003; de Castro et al ., 2004; Rajendra et al ., 2006; Corzo et al ., 2000) e também contra insetos de importância médica da ordem díptera (como moscas e mosquitos) como relatado em estudos com o veneno das aranhas australianas Atrax e Hadronyche (Maggio et al ., 2002). A atividade inseticida do veneno de aranhas tem sido comparada em experimentos “in vivo” contra insetos e camundongos, onde a alta toxicidade/letalidade do veneno para insetos não ocorre em camundongos (Corzo et al ., 2000; Zhang et al ., 2003; Lipkin et al ., 2002; De Lima et al ., 2002). A descoberta de toxinas de aranhas seletivas à ação em insetos tem gerado diversas patentes para aplicação no controle inseticida (De Lima et al ., 2007). Embora os dados farmacológicos sejam limitados, os peptídeos tóxicos atuam principalmente em canais de sódio (Brown et al ., 1988; Corzo et al ., 2000; De Lima et al ., 2007; Sheumack et al ., 1985), de cálcio (Liang, 2004; Escoubas et al ., 2000a; Dutra et al ., 2008; Cassola et al ., 1996; Wang et al ., 2001) e de potássio (Maggio et al ., 2002; Tedford et al ., 2004; Wang et al ., 2000). As toxinas de aranhas são misturas complexas de componentes biologicamente ativos, contendo diversos peptídeos neurotóxicos de baixa massa molecular (entre 4 e 10 kDa) com grande número de resíduos de cisteína (entre 6 e 14) (Grishin, 1999), toxinas dermonecróticas de alta massa molecular (acima de 10 kDa) (da Silva et al .,

2004) e de componentes “inativos”, como ácidos nucléicos, aminoácidos livres, neurotransmissores, íons e sais inorgânicos como Ca 2+ , Na +, Mg 2+ , Cl - que atuam, na maioria dos casos, potencializando a ação das neurotoxinas (Cabbiness et al ., 1980; Corzo et al ., 2003a; Escoubas et al ., 2000b; Escoubas et al ., 2004; Rash et al ., 2002). De acordo com sua especificidade farmacológica, as toxinas de aranhas podem ser classificadas em toxinas que afetam (a) a liberação de neurotransmissores, (b) canais de sódio voltagem-dependentes, (c) canais de cloreto, (d) canais de potássio, (e) bloqueadores de receptores colinérgicos pós-sinápticos e (f) canais de cálcio voltagem- sensível (Rash et al ., 2002).

1.3.1 Ação na liberação de neurotransmissores.

Os neurotransmissores são responsáveis pelo envio e propagação de todo impulso nervoso entre os neurônios. O veneno da aranha do gênero Latrodectus possui um peptídeo extremamente neurotóxico, a α-latrotoxina ( α-LTx), que provoca uma grande liberação de neurotransmissores nas fendas sinápticas de vertebrados e invertebrados (Pinto et al ., 1974; Cull-Candy et al ., 1973). A liberação destes neurotransmissores resulta no bloqueio da transmissão nervosa, levando à paralisia muscular (Henkel et al ., 1999; Harvey, 1990; Tzeng et al ., 1978). Estudos com o veneno da aranha Steatoda paykulliana , comumente confundida com aranhas do gênero Latrodectus devido à grande semelhança física, mostraram que em baixa concentração, o veneno foi capaz de aumentar a condutância da membrana lipídica e em alta concentração estimulou a liberação de neurotransmissores em células neuronais do tipo PC12, mas seu veneno não possui as α-latrotoxinas (Cavalieri et al ., 1987). O glutamato (ácido glutâmico) é o neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central mais comum em mamíferos. É armazenado nas vesículas sinápticas e é liberado por exocitose cálcio-dependente nas fendas pré-sinápticas, onde se liga a seus receptores (Greenamyre et al ., 1994). Os receptores de glutamato são classificados em receptores ionotrópicos e receptores metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos são subdivididos em NMDA e não-NMDA, e são seletivos a canais iônicos de Na 2+ , Ca + e

K+ (Dingledine et al ., 1999), enquanto os receptores metabotrópicos são ligados às proteínas G e atuam através de um segundo mensageiro (Rash et al ., 2002). Figueiredo e colaboradores em 1995, trabalhando com o veneno da aranha Phoneutria nigriventer relataram a ação da toxina Tx4(6-1) no sistema nervoso periférico de insetos. Segundo os autores, a toxina Tx4(6-1) estimula a liberação de glutamato nas junções neuromusculares (Figueiredo et al ., 1995). Estudos in vivo com a toxina Tx4(5-5), isolada e purificada a partir da fração PhTx4 do veneno da aranha P. nigriventer, mostraram que esta toxina possui uma alta ação inseticida contra Musca domestica (mosca doméstica), Periplaneta americana (baratas) e Acheta domesticus (grilos), com efeitos neurotóxicos observados em doses muito baixas. Entretanto, quando administrada no hipocampo do cérebro de ratos, a toxina não apresentou nenhum efeito, sugerindo assim, uma especificidade em canais iônicos de insetos, apresentando portanto, um potencial bioinseticida (de Figueiredo et al ., 2001). Trabalhando com o veneno das aranhas Argiope trifasciata e Argiope florida , Usherwood e colaboradores, na década de 80, identificaram vários antagonistas de receptores de glutamato, chamados de argiotoxinas (Usherwood et al ., 1984). Um ano mais tarde, Usmanov e colaboradores descobriram que a inibição pós sináptica na junção neuromuscular é uma propriedade comum do veneno de oito aranhas da família Araneidae (Usmanov et al ., 1985).

1.3.2 Ação em canais de sódio voltagem-dependentes.

Os canais de sódio voltagem-dependentes estão presentes na maioria dos neurônios e músculos esqueléticos. Os canais de sódio voltagem-dependentes podem ser classificados em canais sensíveis à TTX (tetrodotoxina), presentes no cérebro e nos músculos esqueléticos, e em canais resistentes à TTX, presentes no coração e em neurônios sensoriais periféricos da glia (Weiss et al ., 1986). A maioria das toxinas com ação inseticida atua em canais de sódio voltagem- dependentes, que são os responsáveis por gerar o potencial de ação e transmitir toda a informação aos nervos, músculos e coração (De Lima et al ., 2007). Uma pequena

11 alteração na homeostase iônica destes canais resulta em consequências significativas para a excitabilidade da membrana, causando a paralisia do organismo (Martin-Moutot et al ., 2006). Os primeiros peptídeos tóxicos com ação em canais de sódio foram descobertos a partir do veneno da aranha Agelenopsis aperta e nomeados µ-agatotoxinas (µ-Aga-I a µ-Aga-VI) (Skinner et al ., 1989). Estes peptídeos possuem alta similaridade entre si, são constituídos de 36 e 38 aminoácidos respectivamente, sendo oito resíduos de cisteína, e apresentam quatro pontes dissulfeto. As µ-agatotoxinas apresentam similaridade com as curtatoxinas (Ct-I e Ct-II) do veneno da aranha Hololena curta (Stapleton et al ., 1990) e com as toxinas Tx1 e Tx2-9 do veneno da aranha Phoneutria nigriventer (Cordeiro et al ., 1992). Essas toxinas promovem o aumento do influxo de sódio através da membrana, por meio dos canais de sódio voltagem-dependentes, despolarizando de forma duradoura as células e induzindo um estimulo neuronal pré sináptico, causando uma intensa liberação de neurotransmissores, o que leva a paralisia da presa (Escoubas et al ., 2000b). Estudos eletrofisiológicos realizados em sapos, utilizando o peptídeo tóxico PhTx2, purificado do veneno da aranha Phoneutria nigriventer , mostrou uma ação deste peptídeo em canais de sódio voltagem-dependentes (Araujo et al ., 1993). Todos os peptídeos tóxicos de aranhas que atuam em canais de sódio apresentam o mesmo mecanismo de ação, semelhante àqueles descritos para as α-toxinas de escorpiões e para as toxinas de anêmonas-do-mar (Escoubas et al ., 2000b).

1.3.3 Ação em canais de cloreto.

Os canais de cloreto estão envolvidos em diversos processos fisiológicos como no transporte transepitelial, controle do volume celular, acidificação de organelas intracelulares e regulação da excitabilidade celular (Jentsch et al ., 2002). Embora importante, os canais de cloreto não apresentam um papel crucial na propagação do potencial de ação. Embora poucas toxinas apresentem ação em canais de cloreto, Sutton e colaboradores, utilizando a técnica de patch clamp, mostraram a ação de poliaminas inibindo canais de Ca 2+ e Cl - em cultura de neurônios glanglionares da espinha dorsal de ratos neonatais (Sutton et al., 1998).

1.3.4 Ação em canais de potássio.

Os canais de potássio representam o maior e mais diversificado subgrupo de canais iônicos e desempenham um papel central na regulação do potencial de membrana da célula, bem como na regulação da liberação de neurotransmissores, na frequência cardíaca, na secreção de insulina, na excitabilidade neuronal e na contração muscular (Corzo et al ., 2003a; Shieh et al., 2000). Os canais de potássio possuem um poro central que determina a seletividade iônica, circundado por quatro domínios voltagem-sensíveis que se movem em resposta às mudanças de voltagem na membrana e promovem a abertura do poro (Milescu et al., 2007). Os canais de K + são classificados em três diferentes tipos de canais, sendo (a) canais de potássio retificadores de entrada, (b) canais de potássio voltagem dependente e (c) canais de potássio com domínio de dois poros (Corzo et al ., 2003a). Entre os componentes ativos nos venenos de aranhas, os peptídeos que atuam em canais de potássio são os menos abundantes (Grishin, 1999). Entretanto, algumas toxinas animais já descritas atuam em canais de potássio, como as toxinas homólogas Hanatoxina 1 e 2 (HaTx1 e HaTx2), isoladas do veneno da tarântula chinesa Grammostola spatulata , que bloqueiam canais Kv2.1, em concentrações nano molares (Swartz et al ., 1995). As heteropodatoxinas (HpTx1 e HpTx2), isoladas do veneno da aranha Heteropoda venatoria, apresentam alta similaridade com as toxinas HaTx1 e HaTx2, e em experimentos com miócitos ventriculares isolados do coração de ratos prolongaram o potencial de ação, sugerindo que estes peptídeos bloqueiam canais de K + (Sanguinetti et al ., 1997). Estudos com o veneno da tarântula chilena Phrixotrichus auratus mostraram que as pirotoxinas (PaTxs) purificadas bloqueiam exclusivamente os canais de potássio voltagem dependentes Kv4.2 e Kv4.3 (Diochot et al ., 1999). As hanatoxinas, as heteropodatoxinas e as pirotoxinas apresentam uma estrutura peptídica similar, variando entre 28 e 32 aminoácidos e com grande homologia entre si (Corzo et al ., 2003a).

1.3.5 Ação em canais de cálcio voltagem-sensíveis.

O cálcio livre que entra na célula através dos canais de Ca2+ voltagem-sensíveis é responsável por diversos processos fisiológicos, incluindo a liberação de neurotransmissores, neurosecreção, excitação neuronal, sobrevivência de neurônios e regulação da expressão gênica (Deng et al ., 2008). Atualmente existem pelo menos cinco canais de cálcio descritos em vertebrados, que podem ser divididos em dois grupos, os canais de cálcio de baixa voltagem, compreendendo os canais do tipo-T, e os canais de cálcio de alta voltagem, compreendendo os canais do tipo-L, N, P/Q e R (Wheeler et al ., 1994; Zhang et al ., 1993; Llinas et al ., 1989). Enquanto os canais do tipo-T são ativados por pequenas despolarizações e possuem atividade modulatória do tipo marcapasso, em células cardíacas e neuronais, os demais canais de cálcio são ativados por despolarizações mais intensas e estão essencialmente ligados à liberação de neurotransmissores (Tsien et al ., 1991). Os canais do tipo-L são encontrados em células cardíacas e são alvos das dihidropiridinas usadas no tratamento de doenças cardiovasculares, como a hipertensão. Os canais do tipo-P, tipo-N, tipo-Q e tipo-R estão ligados ao sistema nervoso central e periférico (Escoubas et al ., 2000b). Uma grande variedade de peptídeos tóxicos com ação em canais de cálcio voltagem-sensíveis já foram encontrados em diversos venenos de aranhas, como as toxinas PhTx do veneno da aranha Phoneutria nigriventer (Araujo et al ., 1993; Cassola et al ., 1996; Guatimosim et al ., 1997), as toxinas da aranha Hololena curta (Lundy et al ., 1993), as ω-atracotoxinas da aranha Hadronyche sp. (Fletcher et al ., 1997) e a ω- grammotoxina do veneno da aranha Grammostola spatulata (McDonough et al ., 1997; Piser et al ., 1994).

1.4 Estudos com o veneno da aranha Lasiodora sp.

Estudos realizados com o veneno bruto da aranha Lasiodora sp, mostraram a ação do veneno em canais iônicos de invertebrados e em pequenos vertebrados (Kalapothakis et al ., 2003; Kushmerick et al ., 2001; de Deus, 2003). Utilizando técnicas de imagens de Ca 2+ , patch clamp e células GH3, na presença da Tetodrotoxina (TTX), um antagonista específico capaz de bloquear canais de Na +, Kushmerick e colaboradores, em 2001, mostraram que o veneno desta aranha aboliu as oscilações de Ca 2+ normalmente presentes em nível basal nestas células e reduziu o nível de Ca 2+ intracelular. Na ausência da TTX, o mesmo veneno causou um aumento lento nos níveis de Ca 2+ intracelular, sugerindo a participação de outras moléculas presentes no veneno da aranha no bloqueio de canais de cálcio tipo-L (Kushmerick et al ., 2001). Em 2003, Kalapothakis e colaboradores, estudando a ação do veneno da aranha Lasiodora sp em corações isolados de ratos, obtiveram dados que sugerem que o veneno da aranha ocasiona um aumento na liberação vesicular de acetilcolina na extremidade de nervos parassimpáticos através da ativação de canais de Na + resistentes a TTX (Kalapothakis et al ., 2003). Ainda no ano de 2003, de Deus e colaboradores fracionaram o veneno bruto da aranha Lasiodora sp, trabalhando com cromatografia de filtração molecular (Sephadex G-50 Fine - Pharmacia), e obtiveram três frações que foram denominadas P1, P2 e P3. As três frações foram submetidas a testes para determinar sua atividade em vertebrados e em invertebrados. Os resultados obtidos sugerem que as três frações possuem atividade tóxica em mamíferos, porém apenas as frações P2 e P3 apresentam ação contra organismos invertebrados, sendo que a fração P3 apresentou maior toxicidade nas condições testadas (de Deus, 2003). Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir do mRNA extraído da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp com o objetivo de identificar os peptídeos tóxicos presentes no veneno desta aranha. A varredura da biblioteca de cDNA foi realizada utilizando a técnica de ELISA (Engvall et al ., 1971), utilizando anticorpo anti-veneno total. Quatro toxinas que compõem o veneno foram caracterizadas por sequenciamento e nomeadas LTx1, LTx2, LTx3 e LTx5 (Vieira, 2005).

Simultaneamente, foi realizada uma varredura da biblioteca de cDNA utilizando anticorpos anti fração P3 do veneno da aranha (de Moura, 2004). Neste trabalho foram identificados 7 clones codificantes para a toxina LTx1, que apresenta similaridade com diversas toxinas de aranhas já descritas e com ação inseticida comprovada, como as toxinas HWTX-II da aranha Selenocosmia huwena (Shu et al ., 1999), a toxina ESTX da aranha Eurypelma californicum (Savel-Niemann, 1989; Kaiser et al ., 1994) e com a toxina TXP1 da aranha Brachypelma smithii (Kaiser et al ., 1994). A similaridade entre a LTx1 e as toxinas descritas com ação inseticida, sugere uma possível ação da LTx1 em invertebrados. Nesta varredura, também foram identificados 4 clones codificantes para a toxina LTx4, que apresenta similaridade com toxinas com ação comprovada em organismos vertebrados, como as toxinas Magi 1 e Magi 4 (Corzo et al ., 2003b) isoladas da glândula de veneno da aranha Macrothele gigas , com a conotoxina Vx-VIb isolada do molusco marinho Conus vexillum , e com a neurotoxina Tx3-2 da aranha Phoneutria Negriventer (Cordeiro et al ., 1993) isolada da glândula de veneno da aranha Phoneutria nigriventer , sugerindo assim uma possível ação da LTx4 em vertebrados. Um alinhamento baseado na similaridade entre as cinco toxinas identificadas pelas varreduras da biblioteca de cDNA do veneno da aranha Lasiodora sp foi realizado utilizando o programa ClustalW, sugerindo a existência de três famílias de proteínas codificadas pela glândula de veneno desta aranha (figura 2).

Figura 2 – Dendograma das toxinas presentes no veneno da aranha Lasiodora sp simulado utilizando o programa de alinhamento ClustalW, sugerindo a presença de três famílias de proteínas codificadas pela glândula de veneno desta aranha. Adaptado de Vieira, 2005.

A sequencia codificante para a toxina LTx2, foi sub-clonada no vetor de expressão pET11a (Novagen). O peptídeo foi expresso em células de E. coli (BL21 DE3) e purificado por cromatografia liquida de fase reversa de alta performance (HPLC) (Dutra, 2006). Experimentos eletrofisiológicos em células musculares BC3H1, mostraram que a toxina recombinante LTx2 bloqueou canais de cálcio tipo-L e inibiu a recarga de Ca 2+ dos estoques intracelulares, eliminando as oscilações de cálcio livre promovido pelo receptor InsP3. A alta similaridade da LTx2, uma das cinco toxinas previamente identificadas no veneno total da aranha Lasiodora sp, com as toxinas LTx1 e LTx3 sugere um mecanismo de ação semelhante para estas três toxinas (Dutra et al ., 2008). Neste trabalho, nós amplificamos a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 a partir do clone 19 obtido na varredura da biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp, sub clonamos a sequencia no vetor pYES2.1/V5-His- TOPO ®, procedemos a expressão da proteína recombinante utilizando células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A, e realizamos tentativas de purificação do peptídeo.

2. OBJETIVOS.

2.1 Objetivo geral.

Sub clonar a sequência codificante para a toxina madura LTx5 no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ®, induzir a expressão da proteína recombinante e purificá-la.

2.2 Objetivos específicos.

2.2.1 Amplificar a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 a partir do clone 19 isolado da biblioteca de cDNA; 2.2.2 Proceder a ligação no vetor pYES 2.1/V5 His-TOPO ®; 2.2.3 Transformar células de Escherichia coli TOP10F’ com o produto de ligação; 2.2.4 Verificar a presença do fragmento por PCR de colônia e através do uso de endonucleases de restrição; 2.2.5 Verificar por sequenciamento do DNA se o inserto encontra-se no frame correto; 2.2.6 Transformar células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A; 2.2.7 Induzir a expressão da proteína recombinante; 2.2.8 Identificar a proteína por imunoblotting; 2.2.9 Purificar a proteína recombinante.

3. MATERIAL E MÉTODOS.

3.1 Microorganismos.

Para amplificação do DNA plasmidial, a cepa utilizada foi Escherichia coli TOP10F’. Genótipo: F’, mcr A, D (mrr-hadRMS – mcrBC) Ø 80DlacZ DM15, Dlacx74, deoR, recD1, araD139,D, 7697, galIU, galK, l-,rs1p,end D1,nupG. Para expressão do gene codificante para a toxina madura LTx5 foi utilizada a cepa Saccharomyces cerevisiae W303-1A. Genótipo: MATa; ura3-52; trp1 ∆2; leu2- 3_112; his3-11; ade2-1; can1-100.

3.2 Meios de cultura.

3.2.1 Meio LB (Luria-Bertani).

1% de triptona (p/v), 0.5% de extrato de levedura (p/v), 1% de NaCl (p/v), ajustar pH para 7.5 com NaOH. Para meio sólido adicionar 1.5% de agar (p/v).

3.2.2 Meio LB-XIA.

O meio LB é suplementado com 20 µg/mL de X-GAL, 1mM de IPTG e 20µg/mL de ampicilina.

3.2.3 Meio YP.

1% de extrato de levedura (p/v), 2% de peptona bacteriológica (p/v). A este meio foi adicionado 2% de glicose (p/v) e 2% de galactose (p/v).

3.2.4 Meio seletivo SD.

0.67% (p/v) de base nitrogenada sem aminoácidos, 0.08% (p/v) de mistura de aminoácidos sem uracila, ajustar pH para 5.5. Como fonte de carbono foi utilizada 2% de glicose (p/v), ou 2% de rafinose (p/v). Para indução da proteína recombinante foi

19 utilizado 2% e 4% de galactose (p/v) ao meio. Para meio sólido adicionar 1.5% (p/v) de ágar e ajustar o pH para 6.5.

3.2.5 Meio 2XYP.

1,6% de bactopeptona (p/v), 1% de extrato de levedura (p/v) e pH 7.5.

3.3 Vetor de clonagem e expressão.

O sistema utilizado para clonagem e expressão da proteína recombinante foi o pYES2.1/V5-His-TOPO ® TA Expression Kit (Figura 3).

Figura 3 - Mapa do vetor de clonagem e expressão pYES2.1/V5-His-TOPO ® (disponível em www.invitrogen.com ). Em destaque o gene de resistência de bactérias à ampicilina, o gene URA3 para seleção de leveduras em meio de cultura sem o aminoácido uracila, origem de replicação procariótica, origem de replicação eucariótica, o promotor de expressão GAL1 e o sítio de clonagem para a proteína LTx5, em fusão com o V5 epitope e a cauda de poli histidina.

3.4 Sub c lonagem da sequência codific ante para a LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5 -His-TOPO ®.

O procedimento de clonagem foi desenvolvido com o intuito de inserir apenas a sequência codificante para a toxina madura LTx5 (figura 4), amplificada a partir d o clone 19 selecionado da bibliote ca de cDNA da aranha Lasiodora sp (Vieira et al. , 2005).

Figura 4 – Sequencia de nucleotídeos e aminoácidos da LTx5 . Em maiúsculo são representadas as regiões traduzidas para o peptídeo sinal, peptídeo intermediário e peptídeo maduro, mostradas em vermelho, verde e azul, respectivamente. As regiões 5' e 3' não traduzidas estão represent adas em minúsculo.

21 3.4.1 PCR para amplificação da sequência codificante para a toxina madura.

Os iniciadores desenhados para amplificação da região correspondente à toxina madura da LTx5 estão descritos abaixo:

Iniciadores Sequências Direto (F1) 5’ – CA ATG GCA GAA AAG GGA AAA GAC – 3’ Reverso (R1) 5’ – CTC ACA CCG AAA TGA AGA – 3’

O DNA extraído do clone 19 da biblioteca de cDNA na forma de fagemídeo foi usado como molde na reação. A mistura de reação usada na PCR está descrita a seguir:

• 2,0 µL de DNA fagemídeo • 2,5 µL de dNTP’s (2,5 mM) • 2,5 µL de tampão Taq 10X

• 0,75 µL de MgCl 2 (50 mM) • 0,5 µL do iniciador F1 (40 pmoles/µL) • 0,5 µL do iniciador R1 (40 pmoles/µL) • 0,6 µL de Taq DNA polimerase • 15,65 µL de água Milli-Q estéril

Procedeu-se a reação em termociclador, conforme o programa descrito:

1. 94°C por 4 minutos 2. 94°C por 1 minuto 3. 54°C por 1 minuto 4. 72°C por 1 minuto 5. Etapa 2 a 4 (29 vezes) 6. 72°C por 5 minutos 7. Redução da temperatura a 4°C

3.4.2 Purificação do produto de PCR.

Após a amplificação da região correspondente à sequencia codificante para a toxina madura LTx5, o produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% por 50 minutos a 100 volts. O gel foi corado utilizando brometo de etídio em tampão TAE 1X (40 mM de Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8.0). A banda correspondente à sequência codificante para a toxina madura LTx5 foi extraída com auxílio de um estilete, cortada em fatias, e estas transferidas para tubo de microcentrífuga e adicionada de 500 µL de solução TAE 1X contendo 1M de NaCl. A mistura foi agitada com auxílio de um agitador de tubos e imediatamente incubada a 37°C por 2 horas. Após incubação, as amostras foram centrifugadas a 15.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo de microcentrífuga, adicionado 400 µL de PCI (fenol/clorofórmio/isoamílico 25:24:1) e a mistura agitada novamente. Após agitação as amostras foram centrifugadas a 15.000 g por 10 minutos e a camada aquosa transferida para novo tubo de microcentrífuga, e adicionada de dois volumes de etanol 100%. A mistura foi mantida a -80°C por 15 minutos. Posteriormente, o tubo foi centrifugado a 15.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado (DNA) lavado com 800 µL de etanol 70%. Após nova centrifugação a 15.000 g por 10 minutos, o sobrenadante foi desprezado e o DNA foi seco a 65°C, e posteriormente suspenso em 20 µL de H 2O Milli-Q estéril.

3.4.3 Ligação do produto de PCR no vetor de clonagem.

O produto de PCR purificado foi inserido no vetor de expressão pYES2.1/V5- His-TOPO ® conforme protocolo a seguir:

• 2,0 µL de DNA purificado (produto de PCR) • 1,0 µL de salt solution • 0,5 µL do vetor

• 2,5 µL de H 2O Milli-Q estéril

A reação foi mantida à temperatura ambiente por 20 minutos.

3.5 Preparo de células competentes de E. coli TOP10F’.

Para o preparo de células competentes foi utilizado o método de cloreto de cálcio. Células de Escherichia coli linhagem TOP10F’ foram inoculadas em 3 mL de meio LB contendo estreptomicina (20 µg/mL) e tetraciclina (15 µg/mL) e crescidas por 16 horas à 37°C, sob agitação constante a 200 RPM. Após crescimento o pré inóculo foi utilizado para inocular em 100 mL de meio LB. A cultura foi incubada nas mesmas condições de crescimento descritas anteriormente até atingir um valor de absorbância a 600 nm entre 0.6 e 0.8. Atingido o crescimento ideal as células foram submetidas à centrifugação a 1.000 g por 8 minutos, resuspensas em 40 mL de CaCl 2 0.1 M gelado e incubadas em gelo por 1 hora. Após incubação, as células foram novamente centrifugadas e resuspensas em 1 mL de CaCl 2 0.1 M. Alíquotas de 100µL foram estocadas em tubos de microcentrífuga na presença de 30% de glicerol estéril, à -80°C.

3.6 Transformação de bactérias.

Células competentes de E. coli TOP10F’ foram incubadas com o produto de ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5, mantidas em gelo por 30 minutos e submetida a choque térmico a 42°C por 2 minutos, e novamente transferida para o gelo por 2 minutos. Para minimizar o estresse celular, foi adicionado 1 mL de LB e a mistura incubada a 37°C por 45 minutos. Após incubação, as células foram centrifugadas a 3.000 g por 3 minutos, resuspensas em 100 µL de LB, e plaqueadas com auxílio de pérolas de vidro em meio LB-agar contendo 100 µg/mL de ampicilina e incubadas a 37°C por 16 horas.

3.7 PCR das colônias provenientes da transformação de E. coli TOP10F’ com o produto de ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5.

Colônias de bactérias, provenientes da transformação, foram inoculadas em 3 mL de meio LB suplementado com 100 µg/mL de ampicilina para crescimento por 16 horas. Após crescimento, as colônias foram submetidas à reação em cadeia da polimerase para confirmar a presença do fragmento codificante para a toxina madura LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-His-TOPO ®. Os iniciadores utilizados nessa reação foram:

Iniciadores Sequências Direto (F2) 5’ – CGG TTT GTA TTA CTT CTT – 3’ Reverso (R2) 5’ – ACC GGT ACG CGT AGA – 3’

Os iniciadores acima anelam no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® e acompanham o kit pYES 2.1 TOPO ® TA usado para expressão da proteína recombinante. Como molde da reação foi utilizado 1,0 µL de cultura dos clones provenientes da transformação. O programa da PCR encontra-se abaixo:

• 1,0 µL do iniciador F2 (20 pmoles/µL) • 1,0 µL do iniciador R2 (20 pmoles/µL) • 2,5 µL de tampão Taq 10X • 2,5 µL de dNTP’s (2,5 mM)

• 0,75 µL de MgCl 2 (25 mM) • 0,6 µL de Taq DNA polimerase • 1,0 µL da cultura

• 10,65 µL de H 2O Milli-Q estéril

Procedeu-se a reação em termociclador conforme o programa descrito:

1. 94°C por 4 minutos 2. 94°C por 1 minuto

3. 54°C por 1 minuto 4. 72°C por 1 minuto 5. Etapa 2 a 4 (29 vezes) 6. 72°C por 5 minutos 7. Redução da temperatura a 4°C

3.8 Eletroforese em gel de agarose.

Para verificar a presença do inserto, após a PCR o material foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% por 90 minutos a 80 volts. Para visualização das bandas, o gel foi corado com brometo de etídio.

3.9 Extração de DNA plasmidial de bactéria.

Para extração do DNA plasmidial de bactérias foi utilizado o método CTAB. Colônias isoladas de E. coli TOP10F’ , transformadas com o produto de ligação, foram inoculadas em 3 mL de LB contendo 100 µg/ml de ampicilina para crescimento a 37°C, sob agitação constante, a 200 RPM. Após crescimento, as culturas foram transferidas para tubos de microcentrífuga e centrifugadas a 3.000 g por 4 minutos. As células foram resuspensas em 200 µL de STET (8% p/v de sacarose, 0.1% v/v de Triton-X100, 50 mM de EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8.0), e foram adicionados 5 µL de lisozima (50 mg/mL) à mistura. As suspensões foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. A lisozima foi inativada a 95°C por 1 minuto. As suspensões foram centrifugadas a 15.000 g por 10 minutos e o resíduo celular foi removido com auxílio de palito estéril. Ao sobrenadante foi adicionado 8 µL de CTAB (5% p/v de cetil trimetil brometo de amônio) e realizada nova centrifugação a 15.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao precipitado foi adicionado 300 µL de NaCl 1.2 M. O DNA plasmidial foi precipitado com 750 µL de etanol 100% gelado e incubação a - 80°C por 30 minutos. Logo após, foi realizada nova centrifugação a 15.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o DNA foi lavado com 800 µL de etanol 70%.

Para secagem do DNA o tubo foi incubado a 65°C. Posteriormente o DNA foi resuspenso em 20 µL de H 2O Milli-Q estéril.

3.10 Digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição.

O DNA plasmidial contendo, a priori, a sequência codificante para a toxina madura LTx5 foi digerido com as endonucleases de restrição Pvu II e Xba I para confirmação da presença do inserto. Inicialmente o DNA plasmidial extraído conforme descrito no item 3.8 foi incubado com 1 µL de RNAse (10 mg/mL) por 30 minutos, a 37°C. Posteriormente a RNAse foi inativada a 65°C por 5 minutos, e a digestão procedeu-se utilizando o seguinte protocolo:

• 5,0 µL de H 2O Milli-Q estéril • 4,0 µL de tampão universal Tango (Fermentas) • 1,0 µL de Pvu II • 1,0 µL de Xba I • 9,0 µL de DNA plasmidial

A mistura de reação foi incubada por 90 minutos a 37°C. Para verificar a presença do inserto, após digestão o material foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% por 90 minutos a 80 volts. Para visualização das bandas o gel foi corado com brometo de etídio como descrito anteriormente.

3.11 PCR para confirmação da orientação do inserto no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ®.

Para verificar a orientação correta da sequência codificante da toxina madura da LTx5 inserida no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® foram realizadas 2 reações em cadeia da polimerase (PCR-A e PCR-B). Os iniciadores destas reações foram os utilizados na clonagem (F1 e R1) e os iniciadores que se anelam no vetor pYES2.1-V5-His-TOPO ®

(F2 e R2). Na PCR-A (figura 5) os iniciadores utilizados foram o F2 e R1 e na PCR -B (figura 6) foi utilizados os iniciadores F1 e R2, conforme descrito:

PCR-A:

• 1,0 µL do iniciador F2 (20 pmoles/µL) • 1,0 µL do iniciador R1 (20 pmoles/µL) • 2,5 µL de tampão Taq 10X • 2,5 µL de dNTP’s (2,5 mM)

• 0,75 µL de MgCl 2 (50 mM) • 1,0 µL de DNA plasmidial • 0,5 µL de Taq DNA polimerase

• 10,75 µL de H 2O Milli-Q estéril

Figura 5 - PCR-A: Desenho esquemá tico representando a PCR-A. A seta em azul representa o iniciador direto F2, e a seta em vermelho representa o iniciador reverso R1. A sequencia em azul representa a toxina madura LTx5, com o códon de inicialização sublinhado. Em verde está representada a sequencia codificante para a cauda de histidina, e o códon de parada está representado em vermelho.

28 PCR-B:

• 1,0 µL do iniciador F1 (20 pmoles/µL) • 1,0 µL do iniciador R2 (20 pmol es/µL) • 2,5 µL de tampão Taq 10X • 2,5 µL de dNTP’s (2,5 mM)

• 0,75 µL de MgCl 2 (50 mM) • 1,0 µL de DNA plasmidia l • 0,5 µL de Taq DNA polimerase

• 10,75 µL de H 2O Milli-Q estéril

Figura 6 - PCR-B: Desenho esquemá tico representando a PCR-B. A seta em azul representa o iniciador direto F1, e a seta em vermelho representa o iniciador reverso R2. A sequencia em azul representa a toxina madura LTx5, com o códon de inicialização sublinhado. Em verde está representada a sequencia codificante para a cauda de histidina, e o códon de parada está representado em vermelho.

Procedeu-se a reação em termociclador, conforme o programa descrito:

1. 94°C por 4 minutos 2. 94°C por 1 minuto 3. 54°C por 1 minuto

29 4. 72°C por 1 minuto 5. Etapas 2 a 4 (29 vezes) 6. 72°C por 5 minutos 7. Redução da temperatura a 4°C

As amostras amplificadas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% por 90 minutos a 80 volts. Para visualização das bandas, o gel foi corado com brometo de etídio como descrito anteriormente.

3.12 Sequenciamento do DNA.

3.12.1 Mini prep para sequenciamento.

Inicialmente, células de E. coli TOP10F’ transformadas com a ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5 foram repicadas em 1,2 mL de meio 2XYT suplementado com 100 µg/mL de ampicilina para crescimento por 16 horas. Nesta etapa foi utilizado crescimento em placa contendo 96 poços. Posteriormente, as culturas foram centrifugadas a 1.000 g por 10 minutos e as células lavadas com 240 µL de GET gelado. Após nova centrifugação nas condições descritas anteriormente, foram adicionados 80 µL de GET, 2 µL de RNAse (10 mg/mL) e a mistura agitada vigorosamente por 2 minutos. Após agitação foram adicionados 80 µL da solução 0,2 N NaOH/SDS 1% e procedeu-se nova incubação por 10 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se 80 µL de acetato de potássio 3 M, e a mistura homogeneizada por inversão da placa. Após incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, as suspensões foram centrifugadas a 1.000 g por 2 minutos e incubadas em estufa a 90°C por 20 minutos. Após resfriamento em gelo, a placa foi centrifugada a 1.000 g por 10 minutos. Cerca de 120 µL do sobrenadante foram transferidos para uma placa de filtro Millipore, e a mesma centrifugada por 6 minutos a 1.000 g. A placa Millipore foi descartada e ao filtrado foram adicionados 100 µL de isopropanol. A placa foi selada com adesivo e misturada cuidadosamente 30 vezes por inversão. Após nova centrifugação a 1.000 g por 45 minutos, a 20°C, o adesivo foi retirado e o sobrenadante

30 descartado, por inversão da placa. O DNA foi lavado usando 190 µL de etanol 70%, gelado, e a placa centrifugada por 10 minutos a 1.000 g. Descartado o sobrenadante, a placa foi seca à temperatura ambiente por 1 hora. O DNA foi resuspenso em 12 µL de

H2O Milli-Q. A placa contendo o DNA foi novamente selada com adesivo e mantida à 4°C, até o momento do uso.

3.12.2 PCR para reação de sequenciamento.

O DNA plasmidial extraído de células de E. coli TOP10F’ como descrito no item 3.9 foi submetido a sequenciamento de acordo com o método descrito por Sanger et al. (1977), utilizando o Kit de Sequenciamento DYEnamic ET DYE Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBace DNA Analysis System (Amersham Biosciences). Os iniciadores F2 e R2 utilizados de forma independente, para sequenciamento de ambas as fitas do DNA, estão descritos abaixo:

Iniciadores Sequências Direto (F2) 5’ – CGG TTT GTA TTA CTT CTT – 3’ Reverso (R2) 5’ – ACC GGT ACG CGT AGA – 3’

A reação de amplificação foi preparada como descrito:

• 4,0 µL de Mix (Kit do sequenciamento) • 1,0 µL do iniciador (F2 ou R2) (5 pmoles/µL) • 3,0 µL de DNA plasmidial

• 2,0 µL de H 2O deionizada

Procedeu-se as reações em termociclador conforme o programa:

1. Rápida elevação da temperatura a 95°C 2. 95°C por 25 segundos 3. 50°C por 20 segundos 4. 60°C por 1 minuto

5. Etapas 2 a 4 (30 vezes) 6. Redução da temperatura a 4°C

3.12.3 Precipitação da reação de sequenciamento.

Após a reação da PCR, adicionou-se ao produto da reação 1 µL de acetato de amônio 7,5 M e 28 µL de etanol 100%. Após homogeneização, a mistura foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente na ausência de luz. Após incubação, a mistura foi centrifugada a 1.000 g por 45 minutos. O sobrenadante foi descartado e o produto da PCR precipitado foi lavado com 100 µL de etanol 70%. A suspensão foi submetida à nova centrifugação a 1.000 g por 10 minutos, o sobrenadante descartado, e o DNA resuspenso em 10 µL de loading buffer (Amersham Biosciences) e mantido a 4°C na ausência de luz até o momento da injeção no sequenciador.

3.13 Preparo de células competentes de Saccharomyces cerevisiae.

Para o preparo de células competentes de levedura foi utilizado o método de Ito modificado (Ito et al ., 1983). Células de S. cerevisiae W303-1A foram inoculadas em 5 mL de meio YPD 2% para crescimento a 28°C, sob agitação constante a 200 RPM, por 24 horas. Após crescimento as células foram transferidas para 100 mL de YPD 2% para crescimento até atingirem o valor de Abs 600nm 0.8 (aproximadamente 6 horas). Atingido o crescimento ideal as células foram centrifugadas a 1.000 g por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado assepticamente, e as células resuspensas em 20 mL de TE 1X (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8.0) e submetidas a nova centrifugação nas mesmas condições. Após o descarte do sobrenadante as células foram resuspensas em 5 mL de TE 1X, adicionados de 250 µL de acetato de lítio 2.5 M e incubadas a 28°C por 1 hora.

3.14 Transformação de leveduras.

Cerca de 300 µL de suspensão de células competentes de S. cerevisiae foram transferidas para tubos de microcentrífuga. A esta suspensão de células adicionou-se 20 µL de DNA de esperma de salmão (10 mg/mL), previamente desnaturado a 95°C por 5 minutos, e 3 µL da construção pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5. Após incubação por 30 minutos, a 28°C, foram adicionados 700 µL de PEG 4.000 50% (p/v), e procedeu-se nova incubação, por 1 hora, a 28°C. Em seguida as suspensões foram submetidas a 42°C por 10 minutos, e então centrifugadas a 3.000 g por 4 minutos. O sobrenadante foi descartado assepticamente, as células resuspensas em 1 mL de sorbitol 1 M e novamente centrifugadas a 3.000 g por 4 minutos. Após descarte do sobrenadante, as células foram resuspensas no sobrenadante residual, plaqueadas com auxílio de pérolas de vidro em meio seletivo SD-URA e incubadas a 30°C para crescimento por 72 horas. Após crescimento, as colônias positivas foram estriadas em placa contendo meio seletivo SD-URA.

3.15 Expressão da proteína recombinante.

Uma colônia isolada de S. cerevisiae W303-1A transformada com a construção pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5 foi inoculada em 5 mL de meio seletivo SD-URA com 2% de glicose, e incubada a 28°C para crescimento por 20 horas. Após este tempo, as células foram centrifugadas a 1.000 g por 5 minutos, lavadas em meio de cultura sem fonte de carbono, e então transferidas para 100 mL de meio SD-URA, desta vez, suplementado com 2% de rafinose, para crescimento nas mesmas condições anteriores. Após crescimento, as células foram centrifugadas a 1.000 g por 5 minutos e transferidas para 300 mL de meio de indução SD-URA suplementado com 2% de rafinose e 2% ou 4% de galactose. Alíquotas de 50 mL de cultura foram coletadas em intervalos de 12 horas ao longo do processo de indução, para determinar o melhor tempo de expressão da proteína recombinante (entre 0 a 60 horas). No momento da coleta, a Abs 600nm foi mensurada e, após centrifugação, as células foram congeladas a -80°C. Como controle da expressão heteróloga, células de S. cerevisiae W303-1A não transformadas com a

33 ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5 foram crescidas em meio YPD 2% e submetidas às mesmas condições de lise e análise em SDS-Tricina-PAGE. As soluções estoque de rafinose 10% (p/v) e galactose 40% (p/v) foram esterilizadas por filtração.

3.16 Extração de proteínas totais.

Para extração de proteínas totais foi utilizado o protocolo descrito pelo kit YeastBuster™ Protein Extraction Reagent (Novagen). As células foram descongeladas, e o peso úmido determinado. Para cada 1 grama de peso úmido celular foi utilizado 5 mL de YeastBuster™ e 50 µL do agente redutor THP Solution. Foram adicionados inibidores de serino protease (PMSF 1mM) e cisteíno protease (NEM 20 µM) ao tampão de lise. Após serem incubadas com o tampão de lise por 20 minutos, a 28°C, sob agitação constante, as misturas foram centrifugadas a 15.000 g por 20 minutos. A fração solúvel foi coletada e dialisada utilizando membrana benzoilada, capaz de reter moléculas acima de 2.000 Da, contra tampão contendo 50 mM de Tris HCl pH 7.4 para posterior análise em SDS-Tricina-PAGE.

3.17 Solubilização da fração insolúvel.

Para solubilização das proteínas insolúveis, os pellets das amostras dos diferentes tempos de indução foram incubados com tampão contendo 0.1 M de Tris- HCl, 6 M de cloridrato de guanidina, pH 8.0, por 1 hora, a 30°C, sob agitação constante. A quantidade de tampão utilizada nas diferentes amostras foi a mesma utilizada para lise celular, tendo como parâmetro 5 mL de tampão para cada 1 grama de célula. Após incubação as amostras foram centrifugadas a 15.000 g por 20 minutos. Os sobrenadantes foram coletados em novos tubos, diluído 10X em H 2O Milli-Q e incubados a 4°C por 72 horas para renaturação das proteínas.

3.18 Dosagem de proteínas totais.

Para a dosagem de proteínas totais das frações solúveis e insolúveis foi utilizado o método descrito por Bradford (Bradford, 1976) e/ou Lowry (Lowry et al ., 1951), utilizando albumina bovina como padrão.

3.19 SDS-PAGE (Laemmli, 1970).

Inicialmente, para verificação da expressão da proteína recombinante foi utilizado o método de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes proposto por Laemmli (Laemmli, 1970). As concentrações utilizadas para a confecção do gel foram de 18% para o gel de separação e 4% para gel de concentração. As amostras protéicas foram tratadas com tampão de amostra na presença de β- mercaptoetanol, fervidas por 5 minutos e aplicadas no gel. A eletroforese foi conduzida em tampão de corrida 1X (Tris 0.025 M, glicina 0.96 M e 0.1% de SDS), sob corrente constante de 100 V, até a total migração do corante pelo gel de separação.

3.20 SDS-Tricina-PAGE (Schagger et al ., 1987).

O método de eletroforese em condições desnaturantes proposto por Schagger e von Jagow foi utilizado para melhor visualização de bandas de baixo peso molecular (Schagger et al ., 1987). Neste método foi utilizado gel de três fases. As concentrações para o gel separador foram de 16,5% T (acrilamida) e 3% C (bis acrilamida), para o gel espaçador 10% T e 3% C e para o gel empilhador 4% T e 3% C. As amostras foram tratadas com tampão da amostra contendo o agente redutor β-mercaptoetanol, fervidas por 10 minutos e aplicadas no gel. A eletroforese procedeu a 30 V até a migração do corante pelo gel espaçador, e posteriormente foi mantida corrente contínua de 50 mA até a total migração do corante pelo gel separador.

3.21 Coloração de gel de poliacrilamida por nitrato de prata.

Após a separação eletroforética, o gel foi fixado em solução fixadora (50% de metanol e 12% de ácido acético) por 1 hora. Após ser lavado três vezes com H 2O por 20 minutos o gel foi sensibilizado com solução de tiossulfato de sódio 0,04% por 1 minuto, novamente lavado três vezes com H 2O por 20 minutos e submerso em solução de impregnação contendo 0,1% de nitrato de prata e 0,0075% de formaldeído. Após rinsagem por 1 minuto, o gel foi revelado em solução contendo 6% de carbonato de sódio, 0,01% de formaldeído e 0,2% da solução de tiossulfato de sódio. A revelação foi interrompida com solução de parada (50% de metanol e 12% de ácido acético).

3.22 Dot Blot.

A membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences, poros de 0,45 µm) foi sensibilizada por sucção a vácuo, em sistema Bio-Dot™ Apparatus (Biorad), com os extratos protéicos dos diferentes tempos de indução e bloqueada com solução de bloqueio PBS-T 0.05% (Na 2HPO 4 0.05 M, NaCl 0.15 M, 0.05% de Tween-20, pH 7.4 contendo 5% de leite em pó desnatado), por 16 horas, sob agitação. Após bloqueio a membrana foi lavada com PBS-T 0.05%, por 20 minutos, e incubada com anticorpo primário anti His-Tag (Novagen) diluído 1:2.000 em solução de bloqueio, por 3 horas, sob agitação constante. Após incubação com o anticorpo primário, a membrana foi novamente lavada com PBS-T 0.05% por 20 minutos e incubada por 2 horas com anticorpo secundário anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase (Zymed/Invitrogen), diluído 1:2.000 em solução de bloqueio. Após nova lavagem, a reação imunológica foi revelada utilizando as soluções de revelação (6 mg de diaminobenzidina diluída em 6 mL de PBS, 3 mg de 4-cloronaftol diluído em 1 mL de metanol e adicionado 5 mL de PBS). As duas soluções foram misturadas e à mistura adicionou-se 10 µL de H 2O2 30% (p/v) para visualização da reação.

3.23 Western Blot.

Após desenvolvimento da eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences, poros de 0,45 µm) . A transferência foi conduzida a 50 V, 65 mA, por 1 hora, em sistema semi seco Hoefer Semiphor (Pharmacia Biotech) usando-se como tampão de transferência uma solução contendo Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% de metanol v/v, SDS 0.1% p/v, pH 8.3. Após transferência, a membrana foi bloqueada com solução de bloqueio PBS-T 0.05%

(Na 2HPO 4 0.05 M, NaCl 0.15 M, 0.05% de Tween-20, pH 7.4), contendo 5% de leite em pó desnatado, por 16 horas, sob agitação. Após bloqueio, a membrana foi lavada com PBS-T 0.05% por 20 minutos e incubada com anticorpo primário anti His-Tag (Novagen) diluído 1:2.000 em solução de bloqueio, por 3 horas, sob agitação constante. Após incubação com o anticorpo primário, a membrana foi novamente lavada com PBS-T 0.05% por 20 minutos e incubada por 2 horas com anticorpo secundário anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase (Zymed/Invitrogen) diluído 1:2.000 em solução de bloqueio. Após nova lavagem, a reação imunológica foi revelada utilizando o kit ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences). O filme foi exposto por 1 minuto à membrana de nitrocelulose e revelado utilizando as soluções de revelação e fixação comercializadas pela Kodak.

3.24 Cromatografia de filtração molecular.

Com o objetivo de fracionar o extrato protéico contendo, a priori, a proteína recombinante LTx5 com massa molecular aparente de 11.8 kDa, foi realizada uma cromatografia de filtração molecular utilizando a resina Sephadex G50 Medium. A coluna de cromatografia medindo 25 cm de comprimento foi montada utilizando 10 mL de resina previamente inchada com H 2O destilada. A coluna foi equilibrada com tampão contendo 10 mM de acetato de amônio, pH 7.2. O extrato protéico proveniente da amostra de 60 horas de indução em 4% de galactose, foi aplicado na coluna e a eluição foi feita com o mesmo tampão de equilíbrio. Frações de 2 mL foram coletadas manualmente e analisadas em espectrofotômetro à 230 nm e à 280 nm.

3.25 Cromatografia de troca aniônica.

Na tentativa de excluir as proteínas carregadas negativamente (com ponto isoelétrico abaixo de 7.20), foi realizada uma cromatografia de troca aniônica utilizando resina Q-Sepharose (Sigma). Uma coluna cromatográfica com 4 mL de resina, previamente inchada, foi montada e equilibrada com tampão acetato de amônio 10 mM, pH 7.2. O extrato protéico proveniente da amostra de 60 horas de indução em 4% de galactose foi carregado na coluna Q-Sepharose e frações de 1 mL foram coletadas manualmente. Para eluição das proteínas que se ligaram à resina, foi utilizado tampão acetato de amônio 10 mM contendo 1 M de NaCl. As leituras das frações coletadas foram feitas em espectrofotômetro, à 230 nm e à 280 nm.

3.26 Purificação da proteína recombinante utilizando resina Ni-NTA.

Para purificação da proteína recombinante contendo a cauda de histidina foi utilizada a resina HIS-Select ® High Flow Nickel Affinity Gel (Sigma). Inicialmente, a resina foi lavada com 2 volumes de H 2O deionizada e equilibrada com 4 volumes de tampão de equilíbrio (50 mM de fosfato de sódio, 0.3 M de NaCl, pH 8.0). Uma vez equilibrada, a resina foi incubada com o extrato protéico contendo a proteína recombinante com a cauda de histidina, respeitando a capacidade da resina de 15 mg/mL de proteína contendo o his-tag. Foi utilizado extrato protéico proveniente da amostra de 60 horas de indução em 4% de galactose. Após incubação, a resina foi lavada com 2 volumes de tampão de lavagem sem imidazol (50 mM de fosfato de sódio, 0.3 M de NaCl, pH 8.0), e depois lavada com tampão de lavagem contendo baixas concentrações de imidazol (5 mM e 10 mM). Para eluir a proteína alvo foi utilizado 1 volume de tampão de eluição (50 mM de fosfato de sódio, 0.3 M de NaCl, pH 8.0) contendo concentrações crescentes de imidazol (50 mM, 100 mM, 200 mM e 400 mM). Todas as frações (lavagens e eluições) foram coletadas para análise posterior em SDS- Tricina-PAGE.

3.27 Fracionamento do extrato protéico utilizando sistema Microcon ® YM-50K Millipore.

Na tentativa de fracionar o extrato protéico contendo a proteína recombinante LTx5, foi utilizado o sistema Microcon ® YM-50K, que possui uma membrana com limite de corte molecular nominal de 50.000 Da. Foi utilizado extrato protéico proveniente da amostra de 60 horas de indução em 4% de galactose. Conforme recomendações do fabricante foram adicionados 500 µL de extrato protéico no reservatório de amostra do sistema YM-50K, e procedeu-se a centrifugação em microcentrífuga a 14.000 g por 12 minutos. A fração filtrada foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga e a fração retida no reservatório de amostra foi invertida e centrifugada, em um novo reservatório, a 5.000 g por 3 minutos. Ambas as frações, filtrada e retida, foram coletadas e analisadas em SDS-Tricina-PAGE.

4. RESULTADOS.

4.1 Amplificação da região codifica nte para a toxina madura LTx5 .

Para amplificação do fragmento codificante para a toxina LTx5 o DNA fagemídeo obtido do clone 19 foi utilizado como molde e os iniciadores desenhados a partir da região codificante para a toxina madura. Os produtos obtidos através da reação em cadeia da po limerase foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%. A figura 7 mostra o produto da amplificação do fragmento correspondente à toxina madura LTx5 clonadas no vetor pBK -CMV. Nas canaletas 1, 2 e 3 são apresentados os produtos de PCR do fragmento a mplificado que possui 213 pares de bases. Como padrão foi utilizado 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Figura 7 - Amplificação da região codificante para a toxina madura LTx5. A toxina madura LTx5 foi amplificada a partir do clo ne 19 da biblioteca de cDNA e apresenta 213 pb. Como padrão de pares de base foi utilizado 10 µL de Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

40 4.2 Clonagem da sequência codificante para LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-His -TOPO ®.

Após a amplificação da toxina mad ura LTx5, o produto da PCR foi purificado e inserido no vetor pYES2.1/V5 -His-TOPO ®. Células de E. coli TOP10F’ foram transformadas com o produto da ligação. As colônias transformadas foram utilizadas para fornecer o molde da PCR para verificação da presenç a do fragmento. Os iniciadores utilizados se anelavam no 360° nucleotídeo ( primer direto) e no 593° nucleotídeo ( primer reverso) do vetor, adicionando assim 235 nucleotídeos aos 213 correspondentes à toxina madura, totalizando um produto de amplificação co m 448 pares de base na reação da PCR (figura 8). Como padrão de pb foi utilizado uma alíquota de Generuler™ 1 Kb DNA Ladder (Fermentas) .

Figura 8 - PCR das colônias transformadas com o produto de ligação pYES2.1/V5 -His-TOPO- LTx5. O produto de amplificação apresenta 448 pb. Como padrão de pares de base foi utilizado 10 µL do Generuler™ 1 Kb DNA Ladder (Fermentas).

41 4.3 Digestão do DNA plasmidial com as endonucleases Pvu II e Xba I.

Células de E. coli TOP10F’, transformadas com a construção pYES2.1/V5 -His- TOPO-LTx5, foram crescidas em meio seletivo por 16 horas. O DNA plasmidial foi extraído e então digerido com as endonucleases de restrição Pvu II e Xba I na presença do tampão Tango . O vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® possui 5886 pb e duas timidinas (T) livres nas extremidades 5’ de ambas as fitas do DNA. Na reação de PCR, a Taq polimerase adiciona uma deoxiadenosina (A) nas extremidades 3’ do produto de PCR facilitando a ligação do gene de interesse ao vetor. Quando digerido pelas endonucleases Pvu II e Xba I a construção pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5 libera dois fragmentos, um de 360 pb correspondente à sequência da toxina madura e parte da sequência do vetor e um fragmento de 5.739 pb correspondente a sequencias do vetor (figura 9).

Figura 9 – Digestão da construção pYES2.1/V5 -His-TOPO-LTx5 com as endonucleases de restrição Pvu II e Xba I. Dois fragmentos, um de 5739 pb correspondente à sequencias do vetor, e um fragmento de 360 pb contendo a sequencia codificante para a LTx5 e parte da sequência do vetor. Como padrão de pares de base foi utilizado 10 µL de Generuler™ 1 Kb DNA Ladder (Fe rmentas).

42 4.4 Sequenciamento do DNA .

Para verificar se a sequencia codificante para a to xina LTx5 encontra va-se no frame correto (janela aberta de leitura), os DNA’s plasmidiais das colônias que apresentaram a inserção do fragmento de 448 pb na orientação cor reta foram seqüenciados seguindo o método descrito por Sanger e colaboradores (Sanger et al ., 1977) . A análise dos resultados obtidos nos permitiu identificar o códon de iniciação e a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 inseridos no frame correto, bem como identificar a sequencia codific ante para o V5 epitope, a cauda de poli -histidina e o códon de parada (Anexo).

4.5 Análise da sequencia de aminoácidos da LTx5 recombinante .

A região codificante para a LTx5 recombinante, mais a região codificante para o V5 epitope e a sequencia codificante para a cauda de histidina possui 315 pares de base, totalizando 105 aminoácidos. A massa molecular da proteína é de aproximadamente 11.8 kDa e a mesma deve apresentar um pI 8.25, simulados utilizando a ferramenta Compute pI/Mw tool (figura 10) disponível em www.expasy.org .

Figura 10 – Análise da sequencia primária de aminoácidos da LTx5 recombinante . A predição realizada pela ferramenta Compute pI/Mw (www.expasy.org ) nos mostra uma proteína com massa molecular de 11829.62 Da e um pI de 8.25.

43 4.6 Expressão da proteína recombinante LTx5 com 2% de galactose .

Para análise da expressão da LTx5 as amostras protéicas de diferentes tempos de indução foram submetidas à separação eletroforética em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes. A figura 1 1 refere-se ao processo de indução com 2% de galactose. Em uma das canaletas foram aplicados 2 µL do padrão de massa molecular (Amersham Biosciences) e nas demais canaletas foram aplicados 30 µg de proteína total. Nestas condições não foi possível identificar diferença de expressão da proteína recombinante nos diferentes tempos de indução.

Figura 11 - SDS-Tricina-PAGE dos diferen tes tempos de indução com 2% de galactose. 30 µg de proteína total foram aplicados em cada canaleta. Como padrão de massa molecular foi utilizado 2 µL de Low Molecular Weight (Amersham Biosciences). Como controle da expressão heteróloga foi utilizado extra to protéico de W303 -1A não transformada. A seta azul indica a possível localização da proteína recombinante com massa molecular de 11.8 kDa.

44 4.7 Dot Blot.

Com o objetivo de identificar a expressão da proteína recombinante nos extratos induzidos com 2% de galactose foi realizado um Dot Blotting no qual a membrana de nitrocelulose foi sensibilizada com 100 µg de proteínas dos extratos totais dos diferentes tempos de indução. Como controle po sitivo foi utilizado 1 µL de Bench mark™ His- tagged Protein Standard (Invitrogen), e como controle negativo foi utilizado 100 µg de extrato protéico de W303-1A não transformada. Na figura 1 2 observamos uma possível expressão da proteína recombinante a parti r de 48 horas de indução com 2% de galactose.

Figura 12 - Dot Blotting das amostras induzidas com 2% de galactose . A membrana de nitrocelulose foi sensibilizada com extrato s protéicos dos diferentes tempos de indução , por sucção a vácuo, em um sistema Bio-Dot ™ Apparatus (Biorad) . Posteriormente, a membrana foi bloqueada em solução PBS-T 0,05% contendo 5% de leite em pó e incubada com anticorpo anti His -Tag (Novagen) diluído 1:2000 e com anticorpo anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase diluído 1:2000 (Zymed/Invitrogen). Foram aplicados 100 µg de proteína total em cada ponto. Como controle positivo foi utilizado 1 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standard (Invitrogen) . Como controle negativo foi utilizado 100 µg de extrato protéico de W303-1A não transformada. A expressão da proteína recombinante contendo a cauda de histidina pode ser identificada, embora em baixo nível de expressão, a partir de 48 horas de indução com 2% de galactose.

45 4.8 Expressão da proteína re combinante LTx5 com 4% de galactose .

Na tentativa de obter uma melhor expressão da LTx5 recombinante, nós tentamos expressá-la em meio SD -URA contendo 4% de galactose. Na figura 1 3 pode- se observar uma possível proteína com uma massa molecular aparente pr óxima a 11.8 kDa sendo expressa principalmente no tempo 60 horas de indução. Na figura 1 4, quando aplicados 50 µg de proteína total em um gel de maior dimensão, possibilitando assim uma maior separação das proteínas, observamos sutilmente , embora em baixo nível, a expressão de uma proteína a partir de 36 horas de indução com 4% de galactose.

Figura 13 – SDS-Tricina-PAGE dos extratos protéicos obtidos em culturas em diferentes tempos de indução, com 4% de galactose . Foram aplicados 30 µg de proteína total em cada canaleta. Como padrão de massa molecular foi utilizado 2 µL de Low Molecular Weight (Amersham Biosciencess). Para controle da expressão heteróloga foi utilizado extrato protéico de W303 -1A não transformada. A seta em azul indica uma proteína com massa proxima a 11.8 kDa sendo expressa com 60 horas de indução.

Figura 14 - SDS-Tricina-PAGE dos extratos protéicos obtidos em culturas em diferentes tempos de indução, com 4% de galactos e. Foram aplicados 50 µg de proteína total. Como padrão de massa molecular foi utilizado 2 µL de Low Molecular Weight (Amersha m Biosciencess) . Como controle da expressão heteróloga foi utilizado extrato protéico de W303 -1A não transformada. A seta em azul indica uma proteína com massa molecular proxima a 11.8 kDa sendo expressa a partir de 36 horas de indução.

4.9 Dot Blot.

A figura 15 nos mostra o Dot Blotting referente ao processo de indução com 4% de galactose. A figura nos mostra uma expressão basal da pr oteína recombinante (tempo 0h) e um pequeno aumento da expressão ao longo do tempo. A expressão basal da proteína na presença da rafinose como fonte de carbono se deve ao fato do promotor GAL1 não estar reprimido nesta condição. Como controle positivo foi utilizado 1 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standard (Invitrogen). Como controle negativo foi utilizado extrato protéico de W303 -1A não transformada.

Figura 15 - Dot Blotting. A membrana de nitrocelulose foi sensibilizada com 30 µg de extratos protéicos dos diferentes tempos de indução, com 4% de galactose, por sucção a vácuo em sistema Bio-Dot™ Apparatus (Biorad). Posteriormente a membrana foi bloqueada em solução PBS-T 0,05% contendo 5% de leite em pó, e incubada com anticorpo anti His-Tag (Novagen) diluído 1:2000 e com anticorpo anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase diluído 1:2000 (Zymed/Invitrogen). Como controle positivo foi utilizado 1 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standard (Invitrogen). Como controle negativo foi utilizado 30 µg de extrato protéico de W303-1A não transformada. A expressão da proteína recombinante LTx5 pode ser identificada, embora em baixo nível de expressão, a partir de 36 horas de indução.

4.10 Western Blot.

Com o intuito de identificar a proteína recombinante por Western Blotting, 100 µg de proteínas do extrato correspondente a 60 horas de indução em meio contendo 4% de galactose foram aplicados na eletroforese. Uma alíquota de 5 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standard (Invitrogen) foi utilizada como controle positivo. Após as devidas incubações com os anticorpos primário e secundário, a membrana foi revelada utilizando o método ECL (figura 16). O tratamento ao quais os extratos são submetidos antes da eletroforese (tampão da amostra contendo SDS e β-mercaptoetanol, e aquecimento a 95°C por 10 minutos) parece interferir no reconhecimento da cauda de histidina pelo anticorpo anti His-Tag.

Figura 16 - Western Blotting do extrato protéico correspondente a cultura de 60 horas de indução em 4% de galactose . As proteínas foram separadas por SDS -Tricina-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada com solução PBS-T 0,05% contendo 5% de leite em pó, incubada com anticorpo anti His -Tag (Novagen) diluído 1:2000 e com anticorpo anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase diluído 1:2000 (Zymed/Invitrogen). A reação foi visualizada utilizando o método ECL. Foram aplicados 100 µg de proteína total em duas canaletas. Como controle positivo foi utilizado 5 µL de Benchmark™ His-tagg ed Protein Standard (Invitrogen). Não foi possível o reconhecimento da cauda de histidina pelo anticorpo anti His -Tag.

4.11 Dot Blot em condições desnaturantes .

Realizamos um Dot Blotting para verificarmos se a imunodetecção da proteína recombinante aconteceria após o tratamento dos extratos protéicos com tampão da amostra contendo o agente redutor β-mercaptoetanol e SDS, e p osteriormente fervidos a 95°C por 10 minutos. Foram aplicados 30 µg de extrato total dos diferentes tempos de indução com 4% de galactose em cada ponto. Como controle positivo da reação foi utilizado 1 µL de Benchma rk™ His-tagged Protein Standard (Invitrog en), não

49 submetido ao tratamento. Como controle negativo foi utilizado 30 µg de extrato protéico de W303-1A não transformada. Após as devidas incubações com os anticorpos a membrana foi revelada (figura 17 ). Observamos que apenas o controle positivo foi de tectado pelo anticorpo, que não foi capaz de reconhecer as amostras induzidas e que foram tratadas com SDS, β-mercaptoetanol, e aquecidas a 95°C por 10 minutos, embora ele tenha reconhecido as amostras em condições nativas, como descrito no item 4.10.

Figura 17 - Dot Blotting em condições desnaturantes: os extratos protéicos dos diferentes tempos de indução foram tratados com tampão da amostra 1X na presença de β-mercaptoetanol, fervidas por 10 minutos e aplicadas na membrana de nitrocelulose por sucção a vácuo em sistema Bio -Dot™ Apparatus (Biorad) . Posteriormente a membrana foi bloqueada em solução PBS -T 0,05% contendo 5% de leite em pó, e incubada com anticorpo anti His -Tag (Novagen) diluído 1:2000 e com anticorpo anti IgG de camundongo conjugado à peroxidase diluído 1:2000 (Zymed/Invitrogen). Foram aplicados 30 µg de proteína total em cada ponto. Como controle positivo foi utilizado 1 µL de Benchmark™ His-tagged Protein Standard (Invitrogen) . Como controle negativo foi utilizado 30 µg de extrato protéico de W303 -1A não transformada. A proteína recombinante LTx5 não foi identificada quando submetida ao tratamento desnaturante.

50 4.12 Tentativa de p urificação da proteína recombinante usando a resina Ni-NTA.

Na tentativa de purificar a proteína recombinante contendo a cauda de histidina, o extrato de 60 horas de indução com 4% de galactose foi incubado com a resina de afinidade Ni-NTA. A figura 1 8 mostra o perfil protéico das diferentes frações. A canaleta 1 refere-se à fração não ligada à resina. A canaleta 2 refere -se à lavagem com tampão sem imidazol. As canaletas 3 e 4 referem -se às frações de lavagens com tampão contendo 5 mM e 10 mM de imidaz ol, respectivamente. As canaletas 5 a 8 referem -se às frações eluídas com tampão contendo concentrações crescente s de imidazol (50 a 400 mM respectivamente). O baixo nível de expressão da proteína recombinante, aliado ao alto nível de ligantes não específi cos à resina de afinidade, impossibilitou a purificação da proteína alvo nestas condições experimentais.

Figura 18 – SDS-Tricina-PAGE da tentativa de p urificação da proteína recombinante contendo a cauda de histidina utilizando a resina de afinidade Ni-NTA . Foram aplicados 2 µL de Low Molecular Weight (Amersha m Biosciences). Canaleta 1: extrato protéico não ligado à resina. Canaleta 2: lavagem com tampão sem imidaz ol. Canaleta 3 e 4: lavagens em tampão contendo 5 mM e 10 mM de imidazol, respectivamente. Canaleta 5 a 8: eluições em tampão contendo 50 mM, 100 mM, 200 mM e 400 mM de imidazol, respectivamente. W303: extrato protéico de células não transformadas.

51 4.13 Cromatografia de filtração molecular e cromatografia de troca aniônica.

Realizamos uma cromatografia de filtração molecular utilizando resina Sephadex G-50, no intuito de fracionar o extrato protéico e excluir proteínas com massa molecular acima de 30 kDa. Uma cromatografia de troca aniônica utilizando resina Q- sepharose foi realizada no intuito de eliminar do extrato protéico as proteínas com carga positiva, em tampão pH 7.2. Ambos os experimentos de cromatografia visavam enriquecer o extrato com proteína recombinante, para posteriormente utilizar cromatografia de afinidade para purificação da mesma. Após leitura em espectrofotômetro e análise do perfil cromatográfico das frações coletadas (dados não mostrados), as amostras foram concentradas em Speedvac e submetidas a ensaios de imunodetecção por Dot Blotting conforme descrito no item 3.22. Entretanto, não foi possível identificar a proteína recombinante LTx5 em nenhuma das frações coletadas nas cromatografias realizadas, devido ao baixo nível de expressão da proteína alvo.

4.14 Tentativa de fracionamento do extrato protéico utilizando sistema Microcon ® YM-50K Millipore.

Na tentativa de fracionamento do extrato protéico contendo a proteína recombinante, foi utilizado o sistema Microcon ® YM-50K. O sistema YM-50K, segundo informações do fabricante, possibilita o fracionamento de 90% de proteínas com massa molecular em torno de 12.4 kDa, e retenção de 10% das mesmas. Entretanto, a utilização de extrato total impossibilita a utilização deste recurso, uma vez que a alta concentração protéica satura os poros da membrana, impossibilitando assim, o fracionamento das proteínas. Uma alternativa criada foi a diluição do extrato protéico, entretanto, não obtivemos um melhor resultado devido ao baixo nível de expressão da proteína LTx5 recombinante neste sistema de expressão.

5. DISCUSSÃO.

Com o advento comercial de pesticidas sintéticos, a partir da década de 40, os produtos químicos se tornaram a principal forma de controle de pragas urbanas, em produtos agrícolas, e do controle de pragas de importância médica (Tedford et al ., 2004). No entanto, o desenvolvimento de resistência das pragas aos pesticidas, juntamente com a maior conscientização dos impactos que esses produtos químicos trazem à saúde e ao meio ambiente, tem estimulado a busca de compostos bioinseticidas. Atualmente, os bioinseticidas constituem apenas de 2 a 3% dos pesticidas disponíveis para comercialização (Whetstone et al ., 2007).

O estudo de toxinas presentes em venenos de animais para utilização como bioinseticidas é muito promissor (Gershburg et al ., 1998; Regev et al ., 2003). A alta toxicidade e principalmente, a seletividade de peptídeos tóxicos presentes no veneno de diversos organismos como aranhas (Rash et al ., 2002), escorpiões (Gurevitz et al ., 2007), cobras (Gomes et al ., 2005) e caracóis (Terlau et al ., 2004) torna cada vez mais atrativo o uso de biopesticidas de origem animal para controle biológico de pragas. O estudo de toxinas animais vem apresentando crescimento contínuo (Moran et al ., 2009).

O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, objeto deste trabalho, ainda é pouco explorado. Alguns trabalhos publicados na literatura científica mostram a ação do veneno total da aranha Lasiodora sp em organismos vertebrados e invertebrados (de Deus, 2003; Kalapothakis et al ., 2003; Kushmerick et al ., 2001). A varredura de uma biblioteca de cDNA construída a partir do mRNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp permitiu a identificação de quatro peptídeos tóxicos presentes no veneno desta aranha, que foram nomeados LTx1, LTx2, LTx3 e LTx5 (Vieira, 2005). A toxina LTx5, alvo de nosso estudo, é sintetizada como um pré-pró-peptídeo composto por um peptídeo hidrofóbico composto por 17 resíduos de aminoácidos, um peptídeo intermediário com 28 resíduos de aminoácidos e o peptídeo maduro composto por 71 resíduos de aminoácidos. Escoubas e Rash, em 2004, caracterizaram o perfil molecular de peptídeos presentes no veneno de 55 tarântulas utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF e encontraram uma distribuição bimodal de massa molecular, com peptídeos pertencentes à classe central, com massa molecular entre 3000-5500 Da e

53 com peptídeos pertencentes à classe secundária, com massa molecular entre 6500-7000 Da (Escoubas et al ., 2004). De acordo com o perfil de massa molecular descrito por Escoubas e Rash, a LTx5 pertence à classe secundária de peptídeos encontrados no veneno de tarântulas, representando os peptídeos longos, formados por cadeias maiores de aminoácidos e estabilizados por várias pontes dissulfeto.

A manipulação genética de linhagens hospedeiras de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae permite a expressão heteróloga de proteínas de interesse em larga escala, facilitando o estudo de genes, seja de interesse farmacológico, seja de interesse comercial, ou de interesse terapêutico (Huang et al ., 2008). Diversos atrativos tornam as Saccharomyces cerevisiae um excelente modelo para expressão de proteínas heterólogas, uma vez que seguem o padrão geral de modificações pós traducionais de organismos eucariotos, apresentando correta formação de pontes dissulfeto, glicosilação, e alterações em aminoácidos, como fosforilação e acetilação, possibilitando maior atividade e estabilidade à proteína de interesse, quando comparadas com a expressão em sistema procarioto (Gellissen et al ., 1992).

Em nosso trabalho, o gene codificante para a toxina madura LTx5 foi amplificado por PCR e inserido no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® (Invitrogen) para expressão da proteína utilizando células de Saccharomyces cerevisiae (W303-1A). O sistema TOPO ® utilizado em nosso trabalho, inclui um vetor linearizado com uma timina (T) livre nas extremidades 5’ de ambas as fita do DNA. Em uma reação de PCR, a Taq polimerase insere uma deoxiadenosina (A) nas extremidades 3’ do produto de PCR, facilitando a ligação do gene ao vetor. O gene de interesse foi inserido no vetor

TOPO em fusão com um V5 epitope e uma cauda de poli histidina (His6) em sua porção C-terminal para facilitar a detecção e purificação da proteína recombinante. O vetor possui um sítio de origem de replicação bacteriano e um gene de resistência à ampicilina para seleção das células de E. coli transformadas. A seleção das células de levedura é feita pelo gene marcador URA3 , que seleciona as células que expressam o aminoácido uracila em meio sem a presença deste aminoácido. Após transformarmos células de Escherichia coli TOP10F’ com a construção pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5, a eficiência da clonagem foi confirmada por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição. Após confirmarmos a clonagem, realizamos

54 o sequenciamento de ambas as fitas do DNA plasmidial, e verificamos que a sequencia codificante para a LTx5 estava inserida no frame correto. Procedemos então a expressão da proteína recombinante. A indução da proteína recombinante neste sistema de expressão é controlada pelo promotor GAL1 que é reprimido na presença de glicose (West, Jr. et al ., 1984) e induzido quando é fornecido galactose como fonte de carbono às células (Giniger et al ., 1985). Inicialmente, as células de S. cerevisiae W303-1A transformadas com a construção contendo a sequencia codificante para a LTx5 foram crescidas em meio seletivo SD-URA contendo glicose, e então transferidas para novo meio de cultura contendo rafinose como fonte de carbono, uma vez que, na presença de rafinose, o promotor GAL1 não está reprimido e nem induzido, o que possibilita uma expressão mais rápida da proteína recombinante após a adição de galactose ao meio de cultura. O processo de indução inicialmente foi realizado conforme recomendações do fabricante do sistema de expressão, que sugere trabalhar com 2% de galactose para expressão da proteína e com densidade ótica entre 0.4 e 0.6 no momento da indução (tempo 0h). Os resultados obtidos do perfil eletroforético dos diferentes tempos de indução, não mostraram indução da proteína com massa molecular de 11.8 kDa, como seria esperado. Para a detecção da proteína recombinante LTx5 em ensaios de Dot Blotting, inicialmente foram utilizados 30 µg de proteína total. Entretanto, a detecção da LTx5 recombinante induzida com 2% de galactose só foi possível quando utilizamos 100 µg de proteína total para sensibilizar a membrana de nitrocelulose. Procedemos então com um novo processo de indução, utilizando 4% de galactose e iniciando a expressão com uma densidade ótica 10 vezes maior do que a recomendada pelo fabricante (entre 4 e 6), no intuito de obter um melhor nível de expressão. O perfil eletroforético dos diferentes tempos de expressão da proteína recombinante nestas condições, sugere a expressão de uma proteína com massa aparente de 11.8 kDa, sobretudo, a partir de 36 horas de indução. Nesta condição, identificamos uma expressão basal (tempo 0h) da proteína LTx5 em ensaio de Dot Blot, uma vez que o promotor GAL1 não está reprimido, devido ao fato das células terem sido cultivadas em meio contendo rafinose como fonte de carbono. Com o objetivo de purificar e caracterizar a LTx5 recombinante, inicialmente, as células foram lisadas utilizando pérolas de vidro e/ou ruptura por ultra som, em tampões contendo inibidores de proteases. Inibidores de metaloproteases, como EGTA e EDTA,

55 que possivelmente nos trariam problemas no processo de purificação por afinidade à resina de Ni-NTA não foram utilizados. Na expectativa de melhorar o rendimento na extração protéica, optamos por utilizar um tampão de extração de proteínas de células de leveduras, conforme descrito no item 3.16. Obtivemos aproximadamente o dobro de rendimento protéico na extração das proteínas totais, entretanto, a alta concentração iônica do tampão utilizado (cerca de 250 mM) tornou necessária a diálise das amostras antes de procedermos com as análises do perfil protéico em eletroforese. Para análise eletroforética do perfil protéico dos diferentes tempos de indução, utilizamos o método clássico de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE), descrito por Laemmli. Entretanto, a visualização de proteínas com baixa massa molecular (<10 kDa) não estava sendo eficiente nas condições experimentais estabelecidas. Utilizamos então o método de SDS-PAGE proposto por Schagger e colaboradores, que utiliza tampão contendo tris e tricina, o que possibilitaria uma melhor visualização de proteínas abaixo de 30 kDa (Schagger et al ., 1987). Este método se mostrou mais eficiente para visualização das proteínas de baixa massa molecular. Com o intuito de identificar a proteína recombinante por imunoblotting, utilizamos 100 µg de extrato protéico proveniente da cultura com 60 horas de indução em 4% de galactose em um ensaio de Western Blotting. Apenas o padrão de proteínas recombinante com cauda de histidina reagiu à imunodetecção. A possibilidade de perda de proteínas com baixa massa molecular no momento da transferência foi descartada utilizando-se de duas membranas sobrepostas na transferência das proteínas e testando tempos menores de transferência (30 a 60 minutos). Para avaliar se o tratamento de desnaturação ao qual as amostras protéicas são submetidas na eletroforese poderia estar influenciando na ligação antígeno-anticorpo, procedemos um Dot Blotting nas mesmas condições desnaturantes de um Western Blotting. O resultado nos mostrou que, as condições em que os extratos protéicos foram submetidos (tratamento com tampão da amostra contendo agente redutor, SDS e alta temperatura) interferiram no reconhecimento da proteína recombinante pelo anticorpo anti His-Tag. Dimitriadis relata que a ligação antígeno-anticorpo, na presença do detergente iônico SDS em concentrações acima de 0.2%, é inibida em até 90%, enquanto que a ação de detergentes não-iônicos não interfere nesta ligação (Dimitriadis, 1979). Visando investigar se o SDS

56 estaria interferindo na ligação do anticorpo com a cauda de histidina da proteína recombinante, procedemos com novos ensaios de imunoblotting (Dot e Western Blot), submetendo os extratos protéicos a tratamento com tampão da amostra 1X e desnaturação a 95°C, e lavando as membranas com solução contendo 2.5% de Triton-X 100 por 2 horas, antes da incubação com solução de bloqueio, na expectativa de retirar o SDS das amostras. Os resultados obtidos nos sugerem que o tratamento ao qual as amostras protéicas foram submetidas (SDS, agentes redutores e alta temperatura) impediu o reconhecimento da cauda de histidina pelo anticorpo anti His-Tag. A expressão de proteínas recombinantes em fusão com caudas de afinidade é uma ferramenta útil para a detecção e purificação de proteínas. A cauda de poli histidina

(His 6) está entre as caudas de afinidade mais utilizadas na expressão de proteínas recombinantes (Debeljak et al ., 2006; Lichty et al ., 2005). A purificação de proteínas por afinidade se baseia na interação de determinados resíduos de aminoácidos por íons metálicos imobilizados em um suporte sólido (Porath, 1992). A estratégia de utilização de caudas de histidina nas extremidades N-terminal e C-terminal para facilitar a purificação de proteínas de interesse expressas em diferentes sistemas como, bactérias (Liu et al ., 2009; Kwon et al ., 2005), leveduras (Wetterholm et al ., 2008; Lanfermeijer et al ., 1998), células de mamíferos (Janknecht et al ., 1992) e células de insetos (Andersen, 2004), vem sendo empregada com sucesso. Embora universalmente aplicável, a purificação de proteínas com cauda de His 6 apresenta limitações, especialmente a ligação não específica de proteínas ricas em resíduos de cisteína e histidina (Westra et al ., 2001). Com o intuito de purificar a proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina, realizamos uma cromatografia de afinidade utilizando uma resina acoplada ao ácido nitrilotriacético (NTA) carregada com íons níquel (Ni 2+ ). O extrato total do melhor tempo de indução (60 horas) em 4% de galactose foi incubado com a resina e as eluições foram feitas em tampão com concentrações crescentes do quelante imidazol. Não obtivemos sucesso neste processo de purificação, principalmente devido à ligação inespecífica de proteínas da levedura à resina Ni-NTA e à baixa concentração da proteína alvo no extrato protéico. Realizamos então novas etapas de purificação, no intuito de enriquecer o extrato protéico com a proteína LTx5, antes de submetê-la à nova cromatografia de afinidade. Obtivemos sucesso na separação das proteínas nos dois métodos cromatográficos testados (dados não mostrados),

57 entretanto, não foi possível identificar a proteína alvo em ensaios de Dot Blot, devido ao baixo nível de expressão da proteína recombinante neste sistema de expressão. As caudas de afinidade podem trazer efeitos positivos nas propriedades bioquímicas da proteína alvo. A literatura nos relata que caudas de afinidades podem melhorar a expressão da proteína (Rajan et al ., 1998; Sun et al ., 2005), evitar proteólise (Tang et al ., 1997), facilitar a renaturação da proteína (Kou et al ., 2007) e aumentar a solubilidade da proteína (Chen et al ., 2005; Dyson et al ., 2004; Hammarstrom et al ., 2002; Nallamsetty et al ., 2006). Por outro lado, a inserção de uma cauda de afinidade pode trazer efeitos negativos à proteína alvo, como mudanças na conformação (Chant et al ., 2005), afetar negativamente a expressão (Goel et al ., 2000), inibir a atividade enzimática (Kim et al ., 2001; Cadel et al ., 2004), alterar a atividade biológica (Fonda et al ., 2002; Halliwell et al ., 2001) e conferir toxicidade à proteína (de Vries et al ., 2003). Diversos trabalhos relatam dificuldades na expressão de proteínas recombinantes com cauda de histidina na porção C-terminal da proteína alvo. No entanto, a decisão sobre qual o melhor posicionamento da cauda de afinidade depende da sequencia primária e de conhecimento prévio a respeito da conformação da proteína a ser estudada (Goel et al ., 2000). A maioria dos aminoácidos são codificados por mais de um códon. Entretanto, a utilização de códons raros para transcrição de certos aminoácidos, como arginina (AGA, AGG, CGG e CGA), isoleucina (AUA), leucina (CUA), glicina (GGA) e prolina (CCC), pode diminuir o rendimento de expressão de proteínas heterólogas, devido a baixa disponibilidade de tRNA para a transcrição dos respectivos códons (Kurland et al ., 1996; Kurland, 1991). Dados da literatura nos mostram que o uso freqüente de códons raros codificando para o aminoácido arginina, pode trazer graves efeitos no rendimento da expressão de proteínas heterólogas, e o impacto parece ser maior quando estes códons aparecem consecutivamente e presentes junto à extremidade N-terminal da proteína (Brinkmann et al ., 1989; Calderone et al ., 1996; Hua et al ., 1994; Schenk et al ., 1995; Zahn, 1996). A proteína recombinante LTx5 possui 105 aminoácidos, e apresenta 8 códons raros em sua sequencia de nucleotídeos, sendo que quatro códons raros codificam para o aminoácido arginina, um códon raro codifica para o aminoácido isoleucina e três códons raros codificam para o aminoácido glicina, sendo que, sete destes códons estão presentes na toxina madura, portanto, mais próximos à extremidade

N-terminal da proteína, o que possivelmente afeta a expressão da proteína LTx5. Diversos trabalhos mostram que o rendimento na expressão de proteínas heterólogas pode ser aumentado, quando códons raros são trocados por códons mais freqüentes na população de tRNA (Brinkmann et al ., 1989; Rosenberg et al ., 1993; Seidel et al ., 1992). Geralmente o processo de indução de proteínas heterólogas causa um estresse às células de levedura devido às interferências metabólicas causadas pelas condições desfavoráveis ao seu crescimento, o que possivelmente traz efeitos negativos ao processo de produção da proteína de interesse (Mattanovich et al ., 2004). Embora a Saccharomyces cerevisiae seja utilizada como modelo de diferentes estudos fisiológicos, devido à abundância de informações disponíveis a respeito da sua genética e fisiologia, outros microorganismos se mostram mais eficientes para a expressão de proteínas heterólogas (Mattanovich et al ., 2004)

6. CONCLUSÕES.

Diante das evidências experimentais obtidas neste trabalho, concluímos que:

• O procedimento de clonagem da sequencia codificante para a toxina madura no vetor de expressão eucarioto pYES2.1/V5-His-TOPO ® foi realizado com sucesso; • A expressão da proteína recombinante LTx5 é mais eficiente quando se utiliza galactose em concentração 4% (p/v) e quando o pré-cultivo ocorre em meio contendo rafinose; • A imunodetecção da proteína recombinante só foi possível em condições nativas (Dot Blot); • O baixo rendimento de expressão da proteína recombinante neste sistema de expressão impossibilita sua purificação.

7. COMENTÁRIOS FINAIS.

Embora na literatura científica haja relatos de sucesso na obtenção de proteínas heterólogas utilizando organismos eucariotos para expressão do peptídeo alvo, a expressão da toxina recombinante LTx5 utilizando o sistema pYES2.1/V5-HIS-TOPO ® e células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A não foi obtida em rendimento satisfatório para a sua purificação. Sugerimos assim, que os estudos futuros com este peptídeo sejam realizados utilizando sistema procarioto para expressão heteróloga em células de Escherichia coli , uma vez que este tipo de sistema já vem sendo empregado com sucesso na literatura.

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9. ANEXO.

Cromatograma referente ao sequenciamento da LTx5 recombinante. Em destaque está representado o start códon, o V5 epitope, a cauda de histidina e o códon de parada.