DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Clonagem Do Cdna Codificante
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DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® e expressão da proteína recombinante. Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas Thiago Mafra Batista Ouro Preto, julho de 2009. Universidade Federal de Ouro Preto Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO ® e expressão da proteína recombinante. Thiago Mafra Batista ORIENTADOR: PROF. DR. IESO DE MIRANDA CASTRO Dissertação apresentada ao programa de pós- graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Molecular Ouro Preto, julho de 2009. ii Dedicatória Aos meus pais João Batista e Florentina Ao meu irmão Phillipe À minha melhor tia, Ivone (em memória) Com todo meu amor. iii Agradecimentos À CAPES pelo auxílio financeiro. À Universidade Federal de Ouro Preto, pelo ensino gratuito e de qualidade. À histórica cidade de Ouro Preto, pelos incríveis momentos vividos e que estarão guardados pra sempre em minha memória. Ao meu orientador Prof. Dr. Ieso de Miranda Castro , pelo exemplo de responsabilidade e seriedade com a ciência. Ao Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão , botafoguense, exemplo de profissionalismo e comprometimento com a educação. Ao amigo/irmão de infância, companheiro em todos os momentos, João Victor , só nós dois sabemos como foram esses dois anos, muita história pra contar! Amigo pra vida toda. Fusca azul! À minha namorada Juliana , por todo carinho, amor e compreensão durante esse tempo longe um do outro, obrigado por tudo, eu amo você! Aos amigos pensionistas do LBCM, Filippe “Ariscu” Gadiolli e Anderson “Ploust” pelos ótimos momentos de risadas, café na cantina e boas histórias, valeu “dimais” da conta e lembrem-se sempre: “Dápáfazê”! Aos colegas de pós graduação que se tornaram amigos , em especial Tiago “Listerine”, Larissa, Ramon “Mamona”, Nilza “Banzai”, Roenick, Matheus, Manoel, Eduardo (cruzeirense) e Auffy. À Zezé Trópia, por todo carinho e por ser a simpatia do LBCM. À galera do LBCM , doutoras Anamaria e Gilzeane obrigado por tudo, Prof. Dr. Tótola obrigado pelo incentivo e boas idéias, Igor “Água-móli” valeu demais, Carol, Renata, Natália, Érica, Simone, Wesley, Sr. Bráz, enfim, a todos que passaram por aqui, meu muito obrigado! Aos diversos amigos conquistados no Laboratório de Imunoparasitologia (LIP), Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM), Laboratório de Fisiologia Cardiovascular (LFC), Laboratório de Doença de Chagas, e no Laboratório de Enzimologia e Biofísica, obrigado pelo ótimo convívio durante este trabalho. iv À Cida , alma do NUPEB, obrigado por ser tão prestativa e amiga! Ao professor Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pelas valiosas idéias e discussões científicas que muito me ajudaram em minha busca pela LTx5. Obrigado! À professora Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto, pela simpatia e por estar sempre bem disposta a ajudar, mesmo que via e-mails. Ao professor Dr. William Borges, pelas valorosas discussões científicas. Ao professor Dr. Luiz Carlos Crocco Afonso, botafoguense, obrigado pela ajuda nos experimentos de Western e Dot Blot. À professora Dra. Renata Guerra de Sá, obrigado pela amizade e carinho. Ao amigo professor Dr. Luciano Gonçalves Fernandes, outro botafoguense, futuro pescador! Viva o Nag Champa, Peperone! Ao professor Dr. Leonardo Máximo Cardoso, obrigado pelo Reference Manager e por toda ajuda com as referências bibliográficas. Ao Sr. Milton, Dona Iraci e toda família, por me acolherem tão bem durante esses 2 anos e 5 meses em Ouro Preto! E finalmente, à minha família , minha mãe Florentina , meu pai João Batista e meu irmão Phillipe , flamenguistas como eu, minha origem, meu passado, meu presente e meu futuro. Amor não se agradece, se valoriza, e vocês são tudo pra mim! Amo vocês! v A luta pela vitória nem sempre é vantajosa aos fortes nem aos espertos. Mais cedo ou mais tarde quem cativa a vitória é aquele que crê plenamente: “EU CONSEGUIREI!” Napoleon Hill vi Resumo O estudo de toxinas presentes em venenos de animais vem apresentando crescimento contínuo. O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, popularmente conhecida como caranguejeira, ainda é pouco explorado. Neste trabalho, nós sub clonamos a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-HIS-TOPO ® (Invitrogen) em fusão com um V5 epitope e uma cauda de histidina. A LTx5 foi previamente identificada através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp. Após confirmação da clonagem por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição, realizamos o sequenciamento de ambas as fitas do DNA e verificamos que o inserto foi inserido no frame correto. A expressão da proteína recombinante foi realizada utilizando células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A. Alcançamos uma melhor expressão da proteína recombinante LTx5 quando as células foram pré-cultivadas em meio contendo rafinose, e induzidas em meio contendo 4% de galactose (p/v). A imunodetecção da proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina utilizando anticorpo monoclonal anti His-Tag só foi possível em ensaios de Dot Blot. O tratamento no qual as proteínas são submetidas em um ensaio de Western Blot parece interferir na ligação antígeno- anticorpo. Não alcançamos sucesso nos procedimentos de purificação testados devido ao baixo rendimento de expressão da proteína. A presença de códons raros na sequencia codificante para a toxina LTx5 e a toxicidade da molécula para as células de Saccharomyces cerevisiae parecem afetar negativamente o rendimento da expressão da proteína. Sugerimos que os estudos futuros com esta toxina sejam realizados utilizando um sistema mais eficiente para a expressão da proteína. vii Abstract The study of toxins present in venoms of animals has shown continuous growth. The venom of the spider genus Lasiodora sp, popularly known as caranguejeira is still little explored. In this study, we sub-cloned the coding sequence for the mature toxin LTx5 at the expression vector pYES2.1/V5-HIS-TOPO ® (Invitrogen) in fusion with a V5 epitope and a histidine tag. The LTx5 was previously identified through the screening of a cDNA library of the spider Lasiodora sp venom gland. The presence of the appropriate insert was determined using colonies PCR, digestion with restriction endonucleases and sequencing of both DNA strands. The expression of recombinant protein was performed using Saccharomyces cerevisiae W303-1A cells. Improved expression levels of recombinant protein LTx5 were reached when the cells were pre- cultured in medium containing raffinose, and induced in medium containing 4% galactose (w/v). The recombinant protein LTx5 containing the histidine tag by using monoclonal anti His-tag was only detected in of Dot Blot assay. The treatment in which proteins are subjected during a Western blot test appears to negatively interfere in the antigen-antibody binding. Success in the purification procedures was not achieved due to the low expression of the protein. The presence of rare codons in coding sequence for the LTx5 toxin and its toxicity to the Saccharomyces cerevisiae cells appear to negatively affect the efficiency of the protein expression. We suggest that further studies must take in consideration the use of more efficient system for the expression of the peptide. viii Índice RESUMO vii ABSTRACT viii LISTA DE ABREVIATURAS xiii LISTA DE FIGURAS xv 1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Aspectos gerais 1 1.2 Estudo de toxinas animais 5 1.3 Toxinas de aranhas 9 1.3.1 Ação na liberação de neurotransmissores 10 1.3.2 Ação em canais de sódio voltagem-dependentes 11 1.3.3 Ação em canais de cloreto 12 1.3.4 Ação em canais de potássio 13 1.3.5 Ação em canais de cálcio voltagem-sensíveis 14 1.4 Estudos com o veneno da aranha Lasiodora sp 15 2. OBJETIVOS 18 2.1 Objetivo geral. 18 2.2 Objetivos específicos. 18 3. MATERIAL E MÉTODOS. 19 3.1 Microorganismos. 19 3.2 Meios de cultura. 19 3.2.1 Meio LB (Luria-Bertani) 19 ix 3.2.2 Meio LB-XIA 19 3.2.3 Meio YP 19 3.2.4 Meio seletivo SD 19 3.2.5 Meio 2XYP 20 3.3 Vetor de clonagem e expressão. 20 3.4 Sub clonagem da sequência codificante para a LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-His-TOPO ®. 21 3.4.1 PCR para amplificação da sequência codificante para a toxina madura. 22 3.4.2 Purificação do produto de PCR. 23 3.4.3 Ligação do produto de PCR no vetor de clonagem. 23 3.5 Preparo de células competentes de E. coli TOP10F’. 24 3.6 Transformação de bactérias. 24 3.7 PCR das colônias provenientes da transformação de E. coli TOP10F’ com o produto de ligação pYES2.1/V5-His-TOPO-LTx5. 25 3.8 Eletroforese em gel de agarose. 26 3.9 Extração de DNA plasmidial de bactéria. 26 3.10 Digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição. 27 3.11 PCR para confirmação da orientação do inserto no vetor pYES2.1/V5- His-TOPO ®. 27 3.12 Sequenciamento do DNA. 30 3.12.1 Mini prep para sequenciamento. 30 3.12.2 PCR para reação de sequenciamento. 31 3.12.3 Precipitação da reação de sequenciamento. 32 3.13 Preparo de células competentes de Saccharomyces cerevisiae. 32 3.14 Transformação de leveduras. 33 3.15 Expressão da proteína recombinante. 33 x 3.16 Extração de proteínas totais. 34 3.17 Solubilização da fração insolúvel. 34 3.18 Dosagem de proteínas totais. 35 3.19 SDS-PAGE (Laemmli, 1970).