Purification and Characterization of Cysteine Proteinase from Some Vegetables and Fruits

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CYSTEINE PROTEINASE FROM SOME VEGETABLES AND FRUITS

MRS. RATCHANEE SAIPRAJONG ASSISTANT PROFESSOR DR.SURAPONG PINITGLANG ASSOCIATE PROFESSOR DR.KHANOK RATANAKHANOKCHAI

THE RESEARCH WAS FINANCIALLY SUPPORTED BY UNIVERSITY OF THE THAI CHAMBER OF COMMERCE 2009

การทา ให้บริสุทธ์ิและลักษณะจา เพาะของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรตเิ นส จากผักและผลไม้ บางชนิด Purification and characterization of cysteine proteinase from some vegetables and fruits

โดย

รัชนี ไสยประจง สุรพงษ์ พินิจกลาง กนก รัตนะกนกชัย

รายงานการวิจัยนี้ได้รับทุนส่งเสริมงานวิจัยจากมหาวิทยาลัยหอการค้าไทย พ.ศ. 2552

ก ชื่อเรื่อง : การท าให้บริสทุ ธิ์และลกั ษณะจ าเพาะของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรตเิ นส จากผกั และผลไม้บางชนิด ผู้วิจัย : รัชนี ไสยประจง สาขาวิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยหอการค้าไทย ผู้วิจัยร่วม : ผศ.ดร.สุรพงษ์ พินิจกลาง และ รศ.ดร.กนก รัตนะกนกชัย ปีที่แล้วเสร็จ : 2552 จ านวน 62 หน้า ค าส าคัญ : ซีสเตอีน โปรติเนส, Ficus hispida, ficain

บทคัดย่อ*

งานวิจัยมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส ในผักและ ผลไม้บางชนิด ท าการศึกษาในผลไม้จ านวน 42 ตัวอย่าง และผักจ านวน 73 ตัวอย่าง พบว่าผลไม้ ให้ผลบวก จ านวน 17 ตัวอย่าง และผักให้ผลบวก จ านวน 39 ตัวอย่าง เมื่อท าการตรวจสอบชนิด ของเอนไซม์โปรติเนสด้วยสารยับยั้ง พบว่าเอนไซม์โปรติเนสที่พบในตัวอย่างสามารถแบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือ เซรีน โปรติเนส และซีสเตอีน โปรติเนส ในงานวิจัยนี้ได้สนใจที่จะน าเอนไซม์ไฟเซนจาก มะเดื่อปล้อง (Ficus hispida L.) มาศกึ ษาแยกให้บริสทุ ธิ์ และลักษณะจ าเพาะบางส่วนเนื่องจากมี รายงานการศึกษาที่ยังไม่แพร่หลายมาก โดยน าไฟเซนจาก Ficus hispida มาแยกให้บริสทุ ธิ์โดย ตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตร้อยละ 80 และแยกให้บริสทุ ธิ์ในขนั้ ตอนเดียวด้วยเทคนิค covalent chromatography ผ่านคอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B เอนไซม์ที่แยกได้จาก มะเดื่อปล้องถูกยับยั้งด้วย 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS) และ iodoacetamide แสดงว่าอยู่ ในกลุ่มซีสเตอีน โปรติเนส เมื่อน ามาหาน ้าหนักโมเลกุลโดยวิธี sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) พบว่าซีสเตอีน โปรติเนส จากมะเดื่อปล้อง ให้แถบโปรตีน 4 แถบที่มีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 23,000 ถึง 45,000 ดาลตัน เอนไซม์ที่แยกได้ เป็นไกลโคโปรตีนเนื่องจากให้ผลบวกกับชุดทดสอบ GelCode® glycoprotein staining ทั้ง 4 แถบ แสดงว่าเอนไซม์จากมะเดื่อปล้องเป็นไกลโคโปรตีนและอยู่ในรูป multiple form เมื่อน า โปรตีนขนาด 23,000 ดาลตัน ไปวิเคราะห์กรดอะมิโนโดย Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) พบกรดอะมิโน จ านวน 55 ตัว ที่มีความคล้ายคลึงกับ Chain A จาก Carica papaya chymopapain และได้ท านายโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ chymopapain โดยใช้โปรแกรม Discovery Studio® Visualizer Version 2.01, Accelrys Software และน ากรดอะมิโนทั้ง 55 ตัวมาเปรียบเทียบพบว่าบริเวณ catalytic sites มีความ

ข

เหมือนกับ chymopapain แสดงว่ามีความใกล้เคียงกันอย่างยิ่ง เมื่อท าการศึกษาการย่อย ซับส เตรตสังเคราะห์ของเอนไซม์ไฟเซนจาก Ficus hispida พบว่าเอนไซม์ไฟเซนสามารถย่อย ซับส เตรตสังเคราะห์คือ Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, N-Benzoyl-L-Arginine-p- nitroanilide hydrochloride, Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p- nitroanilide และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide ได้ดีตามล าดับ แสดงให้เห็นว่า

ต าแหน่ง subsite P1 เอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องมีความจ าเพาะส าหรับกรดอะมิโน arginine

* ผลงานวิจัยเรื่องนี้ได้รับทุนส่งเสริมการวิจัย ส าหรับพนักงานประจ ามหาวิทยาลัยหอการค้าไทย

ค Title : Purification and characterization of cysteine proteinase from some vegetables and fruits Researcher : Ratchanee Saiprajong Department of Food Science and Technology School of Science University of the Thai Chamber of Commerce Co-researcher : Assit.Prof.Dr.Surapong Pinitglang and Assoc.Prof.Dr.Khanok RatanaKhanokchai Year of Accomplishment : 2009 No. of Pages : 62 Pages Key words : cysteine proteinase, Ficus hispida, ficain

Abstract*

The aim of this study is to screen source of cysteine proteinase from some vegetables and fruits. The fruit sample showed positive result on AZCL-casein plate 17 from 42 samples and vegetable showed 39 from 73 samples. The enzyme from fruit and vegetable can be classified into two types proteinase; serine and cysteine proteinases by using specific inhibitors. In this study we focus in ficain from Ficus hispida L. because it has been a very few studies. Ficain (EC3.4.22.3), cysteine proteinase from latex of Ficus hispida was purified by 80% saturated ammonium sulphate precipitation and single-step Thiopropyl Sepharose 6B covalent chromatography. The enzyme activity was completely inhibited by 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS) and iodoacetamide, indicating that the purified enzyme is a member of cysteine proteinase. The molecular weight of purified enzyme was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The cysteine proteinase from Ficus hispida had four major bands with molecular weight range of 23,000 to 45,000 dalton. The purified multiple form enzymes were glycoprotein because each band showed positive with GelCode® glycoprotein staining kit. Major band from SDS-PAGE at 23,000 dalton was determined for amino acid residue by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS/MS). The major band of purified enzyme had 55 amino acids matched to Chain A from Carica papaya chymopapain . The three-dimensional structure of chymopapain was generated by Discovery Studio® Visualizer Version 2.01, Accelrys

ง Software. A comparison of the short amino acid sequences around the catalytic sites of the chymopapain indicates a high degree of similarity. In investigating the ficain from Ficus hispida L. can rapidly catalyze the hydrolysis of Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride, Ala-Ala-Phe-p- nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, and N-succinyl-L-Phenylalanine-p- nitroanilide. This result indicated that P1 subsite of ficain specifics for amino acid arginine.

* The research was financially supported by University of the Thai Chamber of Commerce

จ

กิตติกรรมประกาศ

คณะผู้วิจัยขอขอบคุณ มหาวิทยาลัยหอการค้าไทย ที่ให้ทุนอุดหนุนและสนับสนุนการท า วิจัยในครั้งนี้ ขอขอบคุณคณะวิทยาศาสตร์ ที่ให้การส่งเสริมในการท าวิจัยโดยให้ความสะดวกใน การใช้อาคารสถานที่ วัสดุอุปกรณ์และเครื่องมือต่างๆ และขอขอบคุณอาจารย์ ครูปฏิบัติการ และเจ้าหน้าที่ สาขาวิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหารที่อ านวยความสะดวกในการท า วิจัยในครั้งนี้ให้ส าเร็จลุล่วงไปด้วยดี ท้ายสุด ขอขอบพระคุณ ทุกก าลังใจที่ให้การสนับสนุนการท างานในครั้งนี้ส าเร็จลุล่วงเป็น อย่างดี

คณะผู้ท าวิจัย มกราคม 2553

ฉ

สารบัญ

หน้า

บทคัดย่อภาษาไทย ก บทคัดย่อภาษาอังกฤษ ค กิตติกรรมประกาศ จ สารบัญ ฉ สารบัญตาราง ช สารบัญรูป ซ บทที่ 1. บทน า 1 2. เอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 3 3. ระเบียบวิธีวิจัย 11 4. ผลการทดลอง 24 5. สรุปการวิจัยและข้อเสนอแนะ 40 เอกสารอ้างอิง 42 ภาคผนวก 45

ช

สารบัญตาราง

ตารางที่ หน้า

ตารางที่ 2.1 ชนิดและแฟมิลี่ของซีสเตอีน โปรติเนส และแหล่งที่มา 5 ตารางที่ 3.1 ตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ และส่วนที่ใช้ในการทดลอง 12 ตารางที่ 3.2 ตัวอย่างผักชนิดต่างๆ และส่วนที่ใช้ในการทดลอง 14 ตารางที่ 4.1 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจาก 25 ตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate ตารางที่ 4.2 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจาก 27 ตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate ตารางที่ 4.3 ผลการท าปฏิกิริยากับตัวยับยั้งชนิดต่าง ๆ บน AZCL-casein plate 30 ตารางที่ 4.4 ผลของสารยับยั้งที่มีต่อเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากมะเดื่อปล้อง 38

ซ

สารบัญรูป

รูปท่ี หน้า

รูปท่ี 3.1 AZCL-casein agar plate 17 รูปท่ี 3.2 การหยดสารสกัดเอนไซม์จากตัวอย่างชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate 18 รูปท่ี 3.3 ขั้นตอน covalent chromatography by thiol-disulphide interchange 20 รูปท่ี 4.1 blue zone ที่เกิดจากการย่อยโปรตีนของเอนไซม์บน AZCL-casein plate 24 รูปท่ี 4.2 ลักษณะของมะเดื่ออุทุมพร (Ficus racemosa) ผลสุก 31 รูปท่ี 4.3 รูปแบบของโปรตีนที่ได้จากมะเดื่ออุทุมพร แยกโดยใช้วิธี SDS-PAGE 33 รูปท่ี 4.4 ลักษณะของมะเดื่อปล้อง (Ficus hispida L.) ผลมีขนาดเล็ก 34 และล าต้นเป็นปล้องๆ รูปท่ี 4.5 รูปแบบของโปรตีนที่ได้จากมะเดื่อ แยกโดยใช้วิธี SDS-PAGE 35 รูปท่ี 4.6 SDS-PAGE ของเอนไซม์ซีสเตอีนโปรติเนสที่ผ่านการท าให้บริสุทธ์ 36 จาก Thiopropyl Sepharose 6B covalent column รูปท่ี 4.7 ล าดับของกรดอะมิโนจากไฟซินจากมะเดื่อปล้องที่ Matched 37 กับ Chain A จาก Carica papaya Chymopapain (ตัวอักษรสีแดง) รูปท่ี 4.8 โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ Chymopapain 37

บทที่ 1

บทน ำ

ปัจจุบันได้มีการน าเอาเอนไซม์มาประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมอาหารมากขึ้น เพื่อพัฒนา ผลิตภัณฑ์อาหาร เช่น กลิ่น รส เนื้อสัมผัส เป็นต้น ให้ได้ตรงตามความต้องการของผู้บริโภคมาก ยิ่งขึ้น เอนไซม์ที่น ามาใช้ในอุตสาหกรรมอาหารได้แก่ เอนไซม์โปรติเนส (Proteinase) อะไมเลส (Amylase) อินเวอร์เทส (Invertase) เป็นต้น ซึ่งเอนไซม์ที่มีความส าคัญที่สุดส าหรับการน ามา ประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมอาหารคือ เอนไซม์โปรติเนส ซึ่งได้แก่เอนไซม์ในกลุ่ม เปปซิน ทริปซิน ไคโมทริปซิน คาร์บอกซีเปปติเดส และอะมิโนเปปติเดส โดยจะได้มาจากแหล่งต่าง ๆ กัน เช่น สัตว์ พืชผักผลไม้ และจุลินทรีย์ เป็นต้น โดยน ามาใช้ในอุตสาหกรรมอาหารหลายประเภทได้แก่ อุตสาหกรรมเนยแข็ง อุตสาหกรรมเบียร์ และไวน์ อุตสาหกรรมการแปรรูปเนื้อสัตว์ อุตสาหกรรม ธัญพืช อุตสาหกรรมสารปรุงรส และอุตสาหกรรมการผลิตโปรตีนไฮโดรไลเซท โดยประโยชน์ ส าคัญของเอนไซม์โปรติเนสนั้น จะเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่เกิดในสิ่งมีชีวิต (Biocatalyst) ท าให้ อัตราเร็วของปฏิกิริยาเพิ่มสูงขึ้นได้ 108-1014 เท่าของปฏิกิริยาเดิมที่ไม่มีเอนไซม์เป็นตัวเร่ง ดังนั้นใน อุตสาหกรรมอาหารจึงนิยมใช้เอนไซม์โปรติเนสเป็นอย่างมาก แต่จากผลการศึกษาข้อมูลพบว่าใน ประเทศไทยมีการผลิตหรือสกัดเอนไซม์โปรติเนสในปริมาณที่น้อยมาก ส่วนใหญ่ทางโรงงาน อุตสาหกรรมจะสั่งซื้อจากต่างประเทศเป็นส่วนใหญ่ ประเทศไทยเป็นภูมิประเทศที่เหมาะแก่การท าเกษตรกรรม จึงท าให้ประเทศไทยมีอาชีพ เกษตรกรรมเป็นส่วนใหญ่ ซึ่งส่งผลให้ผักและผลไม้ในบางฤดูกาลมีปริมาณและการผลิตสูงจึงท า ให้ผักและผลไม้นั้นเกิดผลผลิตล้นตลาดซึ่งส่งผลท าให้ผักและผลไม้มีมูลค่าทางการค้าต ่า ท าให้ เกษตรกรเกิดภาวะขาดทุน ดังที่ได้กล่าวข้างต้นแล้วว่าแหล่งที่ใช้ในการผลิตเอนไซม์นั้นจะได้มา จากแหล่งต่างๆ กัน เช่น สัตว์ พืช ผัก ผลไม้และจุลินทรีย์ ดังนั้นจึงได้มีความสนใจที่จะศึกษา แหล่งของเอนไซม์โปรติเนสแหล่งใหม่ๆ จากผักและผลไม้ เพื่อใช้เป็นแหล่งในการผลิตเอนไซม์ โปรติเนสในระดับอุตสาหกรรม เพื่อเป็นการเพิ่มมูลค่าทางการค้าของผักและผลไม้ให้เพิ่มสูงขึ้น และท าให้ผักและผลไม้นั้นไม่เกิดสภาวะล้นตลาด และท าให้เกษตรกรมีรายได้เพิ่มมากขึ้นกว่าเดิม และเพื่อเป็นการเพิ่มองค์ความรู้ทางด้านเอนไซม์ ซีสเตอีน โปรติเนสชนิดใหม่ที่แยกได้จากพืช

1 ในงานวิจัยนี้จึงได้ท าการคัดเลือกแหล่งในการผลิตเอนไซม์โปรติเนสจากผักและผลไม้ ท า การแยกเอนไซม์โปรตเิ นสให้บริสทุ ธิ์ด้วยวิธีการ covalent chromatography ศึกษาสมบัติทางเคมี และทางกายภาพบางส่วนของเอนไซม์ และรวมทั้งวิเคราะห์โปรตีนที่ได้ด้วยเครื่อง MALDI-TOF Mass Spectrometry และ Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC/MS-MS) เพื่อน า ผลการทดลองที่ได้มาศึกษากรดอะมิโนและเปปไทด์ของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสที่แยกได้และ พัฒนาน าเอนไซม์โปรติเนสนี้ไปใช้ในอุตสาหกรรมต่อไป นอกจากนี้ยังเป็นการสร้างองค์ความรู้ใหม่ เกี่ยวกับเอนไซม์โปรติเนสชนิดใหม่จากผักและผลไม้

วัตถุประสงค์ของโครงการวิจัย 1) เพื่อคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสในผักและผลไม้ 2) เพื่อท าการแยกเอนไซม์ ซีสเตอีน โปรติเนสชนิดใหมใ่ ห้บริสทุ ธิ์โดยวิธี covalent chromatography 3) เพื่อศึกษาสมบัติทางเคมีของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส

บทที่ 2

เอกสารและผลงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง

ชนิดและสมบัติของเอนไซม์โปรติเอส โปรติเอสเป็นเอนไซม์ที่ย่อยสลายพันธะเปปไทด์ของโปรตีนให้เป็นกรดอะมิโนและ โอลิโกเปปไทด์ต่างๆ โปรติเอสชนิด endopeptidase สามารถเรียกได้อีกชื่อหนึ่งว่าโปรติเนส ซึ่ง โปรติเนสผลิตได้จากพืช สัตว์ และจุลินทรีย์ โดยในระยะแรกๆ นั้นศึกษาการผลิตโปรติเนสในพืช และสัตว์เป็นส่วนใหญ่ โปรติเนสที่ผลิตจากพืช เช่น โบรมีเลนจากสับปะรด ปาเปนจากยาง มะละกอ โปรติเนสที่ผลิตจากสัตว์ เช่น เรนนิน จากกระเพาะลูกวัว อย่างไรก็ตามโปรติเนสที่มี บทบาทส าคัญที่สุดคือ โปรติเนสที่ผลิตจากจุลินทรีย์ ซึ่งจุลินทรีย์ที่สามารถผลิตโปรติเนสได้มีทั้ง เชื้อแบคทีเรียและรา โปรติเนสเป็นเอนไซม์ที่มีบทบาทมากในอุตสาหกรรมหลายประเภท เช่น อุตสาหกรรมอาหาร อุตสาหกรรมทอผ้า อุตสาหกรรมฟอกหนัง อุตสาหกรรมเยื่อกระดาษ อุตสาหกรรมเคมี อุตสาหกรรมยา อุตสาหกรรมถ่ายรูป การบ าบัดของเสีย และโดยเฉพาะ อุตสาหกรรมสารซักล้าง มีปริมาณการใช้และคิดเป็นมูลค่ามากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับ อุตสาหกรรมอื่นๆ (Helle และ Boyce, 1990; Kumar และ Takagi, 1999) ได้มีการจัดแบ่งชนิด ของโปรติเนสไว้หลายวิธี เช่น แบ่งตามจุดก าเนิดได้เป็นสามชนิดคือ จากพืช สัตว์ และจุลินทรีย์ หรือแบ่งตามลักษณะการตัดบนสายโพลีเปปไทด์ได้เป็นสองชนิดคือ exopeptidase ซึ่งท าหน้าที่ ตัดที่ปลายสายโพลีเปปไทด์ และ endopeptidase ซึ่งท าหน้าที่ตัดภายในระหว่างสายโพลีเปปไทด์ หรือถ้าแบ่งตามลักษณะบริเวณเร่งของเอนไซม์สามารถแบ่งได้เป็นสี่ชนิด และทุกชนิดเป็น endopeptidase ดังนั้นอีกชื่อหนึ่งที่ใช้เรียกเอนไซม์ที่เป็น endopeptidase นี้ว่า proteinase ได้แก่ metalloproteinase, acid proteinase, cystein proteinase และ serine proteinase สามารถแบ่งโปรติเนสออกเป็น 4 กลุ่ม โดยอาศัยความแตกต่างของสภาวะในการท างาน ของเอนไซม์ ได้แก่ 1. Metalloproteinase (EC 3.4.24) เป็นโปรติเนสที่อิออนของโลหะกระตุ้นการท างานของ เอนไซม์ และพบอิออนของโลหะที่บริเวณเร่ง แบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม คือ 1.1 Neutral proteinase เป็นเอนไซม์ที่มีอะตอมของสังกะสี (Zn) อยู่ที่บริเวณเร่ง ท างานได้ดีที่ pH เป็นกลางเมื่อใช้ซับสเตรตสังเคราะห์ FAGLA (furylacrolylglycylleucinamide) และถูกยับยั้งการท างานได้ด้วยสารพวก chelating agent เช่น ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) และ 1,10-phenantroline โมเลกุลของเอนไซม์จะมีเสถียรภาพเพิ่มขึ้นเมื่อมี

แคลเซียม ตัวอย่างของนิวทรัลโปรติเนสที่ส าคัญ ได้แก่ thermolysin ที่ผลิตจาก Bacillus นิวทรัล โปรติเนสนิยมน าไปใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร อุตสาหกรรมฟอกหนัง และอุตสาหกรรมยา 1.2 Alkaline-metalloproteinase เป็นเอนไซม์ที่มีโลหะเป็นส่วนประกอบที่บริเวณเร่ง ท างานได้ดีในช่วง pH 7.0 ถึง 9.0 ในการยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์ด้วย EDTA นั้น ต้องใช้ EDTA ที่มีความเข้มข้นมากกว่า 10-2 โมลาร์ จึงสามารถยับยั้งการท างานของเอนไซม์ได้ เหมาะที่ จะน าไปใช้ในอุตสาหกรรมสารซักฟอก 2. Acid proteinase (EC 3.4.23) หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า aspartic proteinase เนื่องจากมี หมู่คาร์บอกซิลของกรดอะมิโนแอสปาร์ติกอยู่ที่บริเวณเร่งของเอนไซม์ จุลินทรีย์ที่ผลิตเอนไซม์นี้ ส่วนใหญ่เป็นพวกราและยีสต์ แต่มีแบคทีเรียบางชนิดผลิตได้ด้วย เอนไซม์มี pH ที่เหมาะสมใน การท างานอยู่ในช่วง 2.0 ถึง 4.0 เอนไซม์ในกลุ่มนี้ ได้แก่ เรนนิน และเปปซิน ซึ่งถูกยับยั้งการ ท างานด้วยสาร diazoketone แต่ไม่ถูกยับยั้งด้วยสาร EDTA และ diisopropyl fluorophosphate (DFP) น ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 30 ถึง 40 kDa สามารถเกิดปฏิกิริยาจ าเพาะได้ดีกับกรดอะมิโน ที่มีโครงสร้างแบบ aromatics การใช้ประโยชน์ของเอนไซม์ส่วนใหญ่ใช้ในอุตสาหกรรมการผลิต ผลิตภัณฑ์โปรตีนจากถั่วเหลือง เช่น ซีอิ๊ว และเต้าเจี้ยว เป็นต้น นอกจากนี้ยังใช้ในอุตสาหกรรม ขนมอบและเนยแข็งด้วย 3. Cysteine proteinase (EC 3.4.22) หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า sulphydryl proteinase เป็น เอนไซม์ที่ท างานได้ดีในช่วง pH ค่อนข้างเป็นกลาง ถูกเร่งปฏิกิริยาได้ดีเมื่อมีสารรีดิวซ์ ได้แก่ HCN หรือ กรดอะมิโน ซีสเตอีน และถูกยับยั้งปฏิกิริยาโดยสารจ าพวก sulphydryl reagent ได้แก่ p-chloromercury benzoate (PCMB) ส่วนสาร DFP มีผลยับยั้งปฏิกิริยาเพียงเล็กน้อยเท่านั้น มีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 30 ถึง 50 kDa ซีสเตอีน โปรติเนส สามารถแบ่งออกเป็น 6 แฟมิลี่ ไ ด้ แ ก่ clostripain, calpain, papain, interleukin-1--converting, piconavirus cysteine proteinase และ streptococcal proteinase แหล่งของซีสเตอิน โปรติเนส มีหลายชนิด เช่น พบ ใน พืช สัตว์ และจุลินทรีย์ (ดังแสดงในตารางที่ 2.1) (Surapong, 1996) เอนไซม์ที่จัดอยู่ในกลุ่มนี้ ส่วนใหญ่ได้จากพืชชั้นสูง เช่น ปาเปน และโบรมีเลน และผลิตได้จากจุลินทรีย์บางชนิด เช่น Clostridium spp. และ Streptococcus spp. 4. Serine proteinase (EC 3.4.21) เอนไซม์กลุ่มนี้มีกรดอะมิโนเซรีน และฮีสทิดีนอยู่ที่ บริเวณเร่ง ถูกยับยั้งปฏิกิริยาด้วยสาร DFP และ phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) โดยทั่วไปเอนไซม์มีช่วง pH ที่เหมาะสมในการท างานค่อนข้างกว้างระหว่าง 4.0 ถึง 11.0 อะตอมของโลหะแคลเซียมอิออนอาจช่วยท าให้เอนไซม์มีเสถียรภาพมากขึ้น มีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ ในช่วง 15 ถึง 30 kDa อัลคาไลน์ โปรติเนสส่วนใหญ่ผลิตจาก Bacillus sp. ได้ แก่ B. licheniformis, B. subtilis และ alkaliphilic Bacillus sp. โดยเอนไซม์จะถูกสร้างและปล่อย

ออกอย่างอิสระในน ้าเลี้ยงเชื้อ และอาจรวมกับโปรติเนสชนิดอื่นด้วย เช่น นิวทรัลโปรติเนส โดย อาจมีการสร้างอัลคาไลน์โปรติเนสไปพร้อมๆ กับนิวทรัลโปรติเนส หรืออาจสร้างนิวทรัลโปรติเนส ก่อนอัลคาไลน์โปรติเนสก็ได้

ตารางที่ 2.1 ชนิดและแฟมิลี่ของซีสเตอีน โปรติเนส และแหล่งที่มา Family Enzyme (EC number) Source Plants Papain Papain (3.4.22.2) Carica papaya Papain Caricain (3.4.22.30) Carica papaya Papain Chymopapain A (3.4.22.6) Carica papaya Papain Chymopapain M (3.4.22.25) Carica papaya Papain Actinidin (3.4.22.14) Actinidin chinensis Papain Asclepain (3.4.22.7) Asclepias syriaca Papain Ficin (3.4.22.3) Ficus glabata Papain Ananain (3.4.22.31) Ananas comosus Papain Stem bromelain (3.4.22.32) Ananas comosus Papain Fruit bromelain (3.4.22.33) Ananas comosus Papain Legumain (3.4.22.34) Vigna nadiata Microbial Streptococcal proteinase Stretopain (3.4.22.10) Haemolytic streptococci Clostripain Clostripain (3.4.22.10) Clostridium histolyticum Clostripain Gingipain R (3.4.22.37) Porphyrmonas gingivalis Clostripain Der pl (NA) Dermatophagoides piconavirus cysteine Picornain 3C (3.4.22.28) pteronyssinus proteinase Picornain 2A (3.4.22.29) Picornavirus piconavirus cysteine Histolysain (3.4.22.35) Picornavirus proteinase Entamaeba histolytica papain

ตารางที่ 2.1 (ต่อ) Family Enzyme(EC number) Source Animal papain Cathepsin B (3.4.22.1) Rat liver, Human Liver papain Cathepsin H (3.4.22.16) Rat liver, Human Liver papain Cathepsin L (3.4.22.15) Bovine spleen papain Cathepsin S (3.4.22.27) Chicken skeletal muscle papain Cathepsin T (3.4.22.24) Bovine spleen Calpain Calpain (3.4.22.17) Pig kidney interleukin-1--converting interleukin-1--converting Human blood monocytes enzyme enzyme ที่มา : Surapong, 1996

ยังมีรายงานการศึกษาเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากแหล่งต่างๆ รวมถึงเทคนิคในการ แยกให้บริสทุ ธิ์ ดงั นี ้ - Williams และ Whitaker 1969 ได้ศึกษาเอนไซม์ไฟซิน (ficin) จาก Ficus glabrata โดยใช้ CM-cellulose chromatography พบว่าเอนไซม์จาก Ficus glabrata เป็น multiple molecular form ประกอบไปด้วย 6 component ที่มี peptide map เหมือนกัน - Brocklehurst และคณะ 1973 ได้รายงานเกี่ยวกับการใช้เทคนิค covalent chromatography ในการแยกให้บริสทุ ธิ์เอนไซม์ในกลมุ่ ซีสเตอีน โปรติเนส โดยอาศัยหลักการที่ เอนไซม์ในกลุ่มนี้บริเวณเร่งจะมีหมู่ thiol อยู่ เมื่อน ามาแยกให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิค covalent chromatography เอนไซม์จะเข้าไปจับกับเจลด้วยพันธะโควาเลนท์ หลังจากนั้นท าการชะออกมา ด้วยบัฟเฟอร์ โดยในรายงานนี้ได้ท าการแยกเอนไซม์ปาเปนจากยางมะละกอโดยใช้ Sepharose – glutathione-2-pyridyl disulphide gel พบว่าเมื่อท าการย่อย -N-benzoyl-L-arginine ethyl -1 ester ที่ pH 6.0 พบว่าให้ค่า Km = 18.2<0.1 มิลลิโมลาร์ และ kcat=16.40.5s - Lowe 1976 ได้รายงานว่าเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส เป็นเอนไซม์ที่มีหมู่ thiol ของ เอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส อยู่บนบริเวณเร่ง พบในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน ้านม พืช และแบคทีเรีย รายงานนี้ได้มองไปที่โปรติเนสจากพืช เช่น ปาเปน ไฟซิน และstem bromelain และ streptococcal proteinase haemolytic streptococci โดยรายงานว่าเอนไซม์ปาเปนเป็นเอนไซม์ ที่มีการศึกษาอย่างกว้างขวาง

- Paul และคณะ 1976 ได้ศึกษาเอนไซม์ไฟซิน (ficin) จาก Ficus glabrata โดยใช้เทคนิค covalent chromatography และศึกษาลักษณะของ active centre โดยใช้ 2,2-Dipyridyl Disulphide โดยน ายางของ Ficus glabrata มาแยกให้บริสทุ ธิ์โยใช้เทคนิค covalent chromatography ในคอลัมน์ Sepharose –glutathione-2-pyridyl disulphide gel - Abe และคณะ 1987 ได้ศกึ ษาการแยกให้บริสทุ ธิ์และสมบตั ขิ องเอนไซม์ซีสเตอีน

โปรติเนส จากเมล็ดข้าวที่ก าลงั งอกได้โดยแยกให้บริสทุ ธิ์ ตามขนั้ ตอนดงั นี ้ (NH4)2SO4 CM-Sephadex Chromatography, Sephadex G-100 gel filtration, Phenyl-Sepharose CL- 4B Chromatography และ Chromatofocusing พบว่าซีสเตอีน โปรติเนส มีน ้าหนักโมเลกุล 23 kDa มีค่า isoelectric point ที่ pH 5.15 และมีค่า pH ที่เหมาะสมเท่ากับ 5.5 และ 5.75 เมื่อใช้ -N-benzoyl-DL-arginine-2-naphthylamide และ casein ตามล าดับ นอกจากนี้พบว่าเอนไซม์ นี้ถูกยับยั้งการท างานโดย leupeptin antipain และE-64 ดังนั้นจึงจัดเอนไซม์นี้อยู่ในกลุ่ม ซีสเตอีน โปรติเนส (cysteine proteinase (EC3.4.22)) - Buttle และคณะ 1989 ได้ท าการศึกษาเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจากยางมะละกอ (Carica papaya) โดยน ายางมะละกอมาท าให้แห้งโดยวิธี spray-dried จากนั้นน ามาท าให้ บริสทุ ธิ์โดยเทคนิค affinity chromatography บน Gly-Phe-aminoacetonitrile เชื่อมต่อกับ CH- Sepharose 4B และท าการชะด้วย 2-hydroxyethyl disulphide pH 4.5 ได้ papain และ papaya cysteine IV น ามาแยกโดยเทคนิค cation-exchange chromatography และจาก การศึกษาลักษณะจ าเพาะเบื้องต้นพบว่ามีความใกล้เคียงกับ chymopapain ทั้งขนาดโมเลกุล และประจุ - Rowan และคณะ 1990 ได้ท าการศึกษาแยกเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากสับประรด (Ananas comosus) โดยใช้วิธีที่เกี่ยวข้องกับ active-site directed affinity chromatography พบว่าซีสเตอีน โปรติเนสในส่วน crude pineapple stem extract มี 4 ชนิด ได้แก่ stem bromelain (major component) ananain comosain และ fruit bromelain - Jiang และคณะ 1994 ได้แยกให้บริสทุ ธิ์และศกึ ษาลกั ษณะเฉพาะของ cysteine proteinase จากปลา Mackerel (Scomber australasicus) เมื่อน าเอนไซม์มาแยกให้บริสทุ ธิ์โดย HiLoad DEAE-Sepharose, HiLoad S Sepharose และ FPLC Superdex 75 chromatography พบว่า มีน ้าหนักโมเลกุลประมาณ 99 kDa เมื่อใช้ Superose 12 Gel filtration เมื่อน ามา ตรวจสอบความบริสุทธิ์โดยวิธี SDS-PAGE พบ แถบโปรตีน 2 แถบ มีน ้าหนักโมเลกุลเท่ากับ 35 และ 23 kDa ตามล าดับ สามารถไฮโดรไลซ์ Z-Phe-Arg-MCA และ Z-Arg-Arg-MCA ได้แต่ไม่ สามารถไฮโดรไลซ์ Z-Arg-MCA และ L-Arg-MCA ได้ pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมเมื่อไฮโดรไลซ์ Z-Arg-Arg-MCA เท่ากับ 6.0 และ 35 องศาเซลเซียส ตามล าดับ

- Walker และคณะ 1998 ได้ศึกษาความสามารถในการไฮโดรไลซ์ โปรตีนใน crop, digestive gland และ salivary gland extract จาก Field Slug (Deroceras reticulatum) พบว่า มี proteolytic เอนไซม์อยู่หลายชนิด ทั้ง aspartic acid proteinase, metalloproteinases หรือ serine proteinase พบว่าเอนไซม์ที่เป็นชนิดหลักที่พบคือ เอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส มีน ้าหนัก โมเลกุลประมาณ 40 kDa โดยวิธี SDS-PAGE - Kundu และคณะ 2000 ได้ศึกษาเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากพืชสมุนไพร Ervatamia coronaria พบว่าประกอบด้วยเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส 3 ชนิด เรียกว่า Ervatamin เมื่อน า Ervatamin B มาแยกให้บริสทุ ธิ์โดยใช้ ion-exchange chromatography และ crystallization พบว่ามีน ้าหนักโมเลกุล 26 kDa โดยวิธี SDS-PAGE และ Gel filtration และเมื่อไฮโดรไลซ์

ซับสเตรตสังเคราะห์ N-succinyl-alanine-alanine-alanine-p-nitroanilide พบว่ามีค่า Km และ 2 -1 Kcat เท่ากับ 6.6 0.5 มิลลิโมลาร์ และ1.87 x 10 s ตามล าดับ มีค่า pH ที่เหมาะสมเท่ากับ 6.0- 6.5 เมื่อใช้ azocasine เป็นซับสเตรต และมีค่าเท่ากับ 7.0-7.5 เมื่อใช้ azoalbumin เป็นซับสเตรต มีอุณหภูมิที่เหมาะสมเท่า 50-55 องศาเซลเซียส - Freitas และคณะ 2007 ได้ศึกษาแอคติวิตีของเอนไซม์และรูปแบบโปรตีนของน ้ายาง จาก Calotropis procera โดยวิธี 1D และ 2D electrophoresis Mass Spectrometry(MALDI- TOF) และศึกษาถึงความสามารถในการไฮโดรไลซ์โปรตีน จากการศึกษาพบว่าในน ้ายางของ มี เอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส อย่างน้อย 4 ชนิด - Vallés และคณะ 2007 ได้ศึกษาลักษณะเฉพาะของเอนไซม์ย่อยโปรตีนชนิดใหม่จาก ripe fruits ของ Bromelia antiacantha โดยน า crude extract มาแยกให้บริสทุ ธิ์บางสว่ นโดยใช้ อะซีโตน พบว่าสารสกัดดังกล่าวให้กิจกรรมของเอนไซม์ >80% ที่ pH 5.0-9.0 และถูกยับยั้งอย่าง สมบูรณ์ ด้วย E-64 trans-epoxysuccinyl-leucyl-amido (4-guaidino)-butane และ iodoacetic acid เมื่อท าการศึกษา IEF-zymogram พบว่ามีแถบโปรตีน 5 แถบ - Kyndt และคณะ 2007 ได้ศึกษาการแยกให้บริสทุ ธิ์และลกั ษณะจ าเพาะของเอนไซม์ซีส เตอีน โปรติเนส จากยาง Vasconcellea spp. 3 สายพันธุ์เทียบกับ Carica papaya จากการ ทดลองพบว่าเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากยาง Vasconcellea spp. มีความใกล้เคียงกับ เอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจาก Carica papaya

การวิเคราะห์โปรตีนด้วยเครื่อง MALDI-TOF Mass Spectrometry การวิเคราะห์โปรตีนเพื่อจ าแนกว่าเป็นโปรตีนชนิดใดบ้างนั้น ต้องใช้วิธีการหาน ้าหนัก โมเลกุล (molecular weight) เพื่อน าไปเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลของโปรตีนมาตรฐาน ซึ่งการหา น ้าหนักโมเลกุลของโปรตีนสามารถท าได้หลายวิธีเช่น SDS-PAGE เปรียบเทียบกับโปรตีน

มาตรฐาน ปัจจุบันเครื่องมือที่นิยมมาใช้คือ Mass Spectrometer โดยใช้หลักการยิงแสงเลเซอร์ลง ไปบนตัวอย่างโปรตีนให้เกิดการแตกตัวของอิออน (ion) แล้วเคลื่อนที่ไปตามท่อสุญญากาศที่มี สนามไฟฟ้า ภายใต้ภาวะดังกล่าวสารที่มวลโมเลกุลน้อยจะเคลื่อนที่ไปได้เร็วกว่าสารที่มีมวล โมเลกุลมาก และตกกระทบกับตัวตรวจจับ (detector) ส่งเป็นสัญญาณไปยังระบบคอมพิวเตอร์ เพื่อวิเคราะห์ผลต่อไป สามารถวิเคราะห์โปรตีนที่มีปริมาณน้อยมาก และให้ผลที่ถูกต้องแม่นย า นอกจากนี้ยังสามารถเชื่อมโยงกับระบบฐานข้อมูลในอินเตอร์เน็ตได้อีกด้วย

การทานายโครงสร้าง 3 มิติ ความสาคัญของโครงสร้าง 3 มิติ การศึกษาโครงสร้าง 3 มิติของเอนไซม์ จะท าให้เข้าใจถึงการม้วนตัวของสายโพลีเปปไทด์ ที่จะน าเอา side chain ของกรดอะมิโนต่างๆ ที่ท าหน้าที่ส าคัญในการเร่งปฏิกิริยาให้มาอยู่ใกล้ชิด กันเกิดเป็นบริเวณเร่งปฏิกิริยา (active site) ของเอนไซม์ซึ่งเป็นบริเวณที่ซับสเตรต โคเอนไซม์ โคแฟกเตอร์ หรือ สารที่มีโครงสร้างคล้ายซับสเตรต (substrate analogue) เข้าจับกับเอนไซม์ โครงสร้าง 3 มิติของเอนไซม์ช่วยในการศึกษาโครงสร้างของบริเวณเร่งปฏิกิริยา และการท า ปฏิกิริยาของซับสเตรตกับบริเวณเร่งปฏิกิริยา ซึ่งเมื่อน าผลนี้มาประกอบกับการศึกษาจากการใช้ เทคนิคอื่นๆ จะช่วยให้เข้าใจถึงวิธีการท างานของเอนไซม์ได้ดีขึ้น การศึกษาโครงสร้าง 3 มิติของ เอนไซม์นั้นจะใช้วิธี X-ray diffraction เพื่อดูการหักเหและการกระจายของแสงรังสี X-ray ที่เกิดต่อ ผลึกของเอนไซม์ ซึ่งสามารถบอกถึงต าแหน่งของอะตอมต่างๆ ของเอนไซม์ จากข้อมูลเหล่านี้เมื่อ น ามาประกอบกับข้อมูลการเรียงล าดับกรดอะมิโน (amino acid sequence) จะท าให้สร้างภาพ 3 มิติของเอนไซม์ได้ (Drenth และคณะ, 1970) ปัจจุบันการหาล าดับกรดอะมิโนหรือล าดับเบส เป็นงานที่ท ากันเป็นประจ าใน ห้องปฏิบัติการ Molecular Biology จึงท าให้มีข้อมูลเกี่ยวกับล าดับกรดอะมิโนลงตีพิมพ์จ านวน มากและเพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ ในแต่ละปี ในขณะที่การหาโครงสร้าง 3 มิติของเอนไซม์ยังมีจ านวนน้อย จึงได้มีการพัฒนาเทคนิค X-ray crystallography และ multidimensional nuclear magnetic resonance (NMR) เพื่อศึกษาโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีนโดยเฉพาะ แต่ทั้ง 2 วิธียังมีขีดจ ากัดทั้ง ความยุ่งยากซับซ้อนของเทคนิคและความยุ่งยากในการเตรียมโปรตีนเพื่อน ามาวิเคราะห์ นอกจากนี้แล้วเทคนิคนี้ยังต้องการผู้เชี่ยวชาญในการแปลผลของข้อมูลที่ได้จากการ วิเคราะห์ และยังต้องใช้ระยะเวลานานเป็นปี จึงท าให้ข้อมูลโครงสร้าง 3 มิติต่างๆ ยังมีจ านวนไม่ มากนัก ดังนั้นจึงมีผู้คิดค้นวิธีการใหม่ในการท านายโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีน โดยใช้โปรแกรม คอมพิวเตอร์ ซึ่งเป็นการท านายโครงสร้างของโปรตีนที่ใช้ระยะเวลาน้อย จึงช่วยประหยัดเวลาใน การหาโครงสร้างของโปรตีน การท านายโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีนมี 3 วิธี คือ Comparative

(homology) modeling, Fold recognition (threading) และ Abinitio method ซึ่งวิธีที่เป็น ที่นิยมและมีความถูกต้องแม่นย าสูง คือ Comparative (Homology) modeling โดยอาศัย หลักการของความคล้ายคลึงกันของล าดับของโปรตีนที่ไม่ทราบโครงสร้าง (Unknown Protein หรือ Model Protein) กับโปรตีนที่ทราบล าดับกรดอะมิโน (Reference Protein หรือ Templated) ซึ่งสมมติให้ลักษณะโครงสร้างของ โปรตีนทั้ง 2 เหมือนกัน เมื่อมีเปอร์เซ็นต์ความคล้ายคลึงกันอยู่ ในระดับที่ยอมรับได้ (>25%) ดังนั้นสามารถท านายโครงสร้าง 3 มิติของ Unknown Protein จาก Reference Protein ได้ สิ่งที่ส าคัญที่สุดในการท านายโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีนด้วยวิธี Comparative (homology) modeling คือการเลือก Reference Protein ที่จะน ามาเป็นต้นแบบ ซึ่งถ้าเลือกได้ถูกต้องจะท าให้การท านายโครงสร้างเกิดความแม่นย าและถูกต้อง

บทที่ 3

อุปกรณ์และวิธีการทดลอง

3.1 อุปกรณ์ เครื่องมือ และสารเคมีที่ใช้ 3.1.1 อุปกรณ์และเครื่องมือหลักที่ใช้ในงานวิจัย 3.1.1.1 คอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B (GE HealthCare, USA) 3.1.1.2 ชุดทดสอบ Glycoprotein GelCode Glycoprotein Staining Kit (ThermoScientific, USA) 3.1.1.3 ชุดสกัดโปรตีน Ezway PAG Protein Elution Kit (Komabiotech, Korea) 3.1.1.4 เครื่อง MALDI-TOF MS (Reflex IV, BRUKER) 3.1.1.5 เครื่อง Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC/MS-MS) รุ่น Finnigan LTQ Linear Ion Trap Mass Spectrometer 3.1.1.6 ชุดเครื่องมือ Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE Mighty Small II SE 250/SE 260, Hofer Scientific Instruments Ltd., USA) และเครื่อง power supply ส ำหรับให้กระแสไฟฟ้ำ (Bucher Instruments) 3.1.1.7 อุปกรณ์และเครื่องมือพื้นฐำนที่ใช้ในห้องปฏิบัติกำร (ภำคผนวก ก) 3.1.2 สารเคมีที่จาเป็นในการทดลอง 3.1.2.1 Acrylamide (Phamacia Biotechnology) 3.1.2.2 AZCL-casine (Megazyme, Ireland) 3.1.2.3 Molecular weight standard marker (GE HealthCare, USA) 3.1.2.4 L-Tyrosine (Sigma -Aldrich, USA) 3.1.2.5 Thiopropyl Sepharose 6B (GE HealthCare, USA) 3.1.2.6 ซับสเตรตสังเครำะห์ (Sigma-Aldrich, USA) 3.1.2.6.1 Gyl-Arg p-nitroanilide dihydroxy chloride 3.1.2.6.2 Ala-Ala-Phe p-nitroanilide 3.1.2.6.3 N-succinyl-Gly-Gly-Phe- p-nitroanilide 3.1.2.6.4 N-succinyl-L-Phenylalanine- p-nitroanilide 3.1.2.6.5 N-Benzoyl-L-Arginine 4-p-nitroanilide hydrochloride

11 3.1.2.7. สำรยับยั้ง 3.1.2.7.1 2, 2 Dipyridyl disulphide (2PDS) 3.1.2.7.2 Iodoacetamide 3.1.2.7.3 phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF) 3.1.2.7.4 -Mercaptoethanol (ME) 3.1.2.8 สำรเคมีพื้นฐำนในห้องปฏิบัติกำร (ภำคผนวก ก)

3.2 การคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส (Cysteine Proteinase) 3.2.1 วัตถุดิบที่ใช้ในการทดลอง แหล่งของวัตถุดิบที่น ำมำใช้ในกำรคัดเลือกเอนไซม์ ตัวอย่ำงผลไม้ จ ำนวน 42 ชนิด ดัง แสดงในตำรำงที่ 3.1 และตัวอย่ำงผักจ ำนวน 73 ตัวอย่ำง ดังแสดงในตำรำงที่ 3.2 โดยส่วนที่ น ำมำใช้ในกำรทดสอบจะใช้ทั้งส่วนที่กินได้และกินไม่ได้ ตัวอย่ำงที่ใช้ในกำรทดลองจะซื้อจำก ตลำดสด หรือ ซุปเปอร์มำเก็ต และแหล่งอื่นๆ

ตารางที่ 3.1 ตัวอย่ำงผลไม้ชนิดต่ำงๆ และส่วนที่ใช้ในกำรทดลอง ลาดับ ตัวอย่าง ส่วนที่ใช้ 1 ขนุน เนื้อ 2 ซังขนุน ซัง 3 เมล็ดขนุน เมล็ด 4 พุทรำ เนื้อ 5 แก้วมังกรพันธุ์สีขำว เนื้อ 6 มะม่วงเขียวเสวย เนื้อ 7 เสำวรส เนื้อ 8 กล้วยน ้ำว้ำ เนื้อ 9 กล้วยน ้ำว้ำดิบ เนื้อ 10 ฝรั่งแป้นสีทอง เนื้อ 11 มะเฟือง ทั้งผล 12 ละมุดไทย เนื้อ 13 ละมุดมำเลย์ เนื้อ 14 สำเก เนื้อ

12 15 ชมพู่มะเหมี่ยว เนื้อ 16 ชมพู่แก้มแหม่ม เนื้อ 17 ชมพู่ทับทิมจันทร์ เนื้อ 18 มันแกว เนื้อ 19 มะดัน เนื้อ 20 มะกอกน ้ำ เนื้อ 21 มะขำม ทั้งผล 22 สมอเทศ เนื้อ 23 แคนตำลูป (ซันเลดี้) เนื้อ 24 แคนตำลูป (ซันเลดี้) เปลือก 25 แคนตำลูป (Japanese Melon) เนื้อ 26 แคนตำลูป (เขียวมรกต) เนื้อ 27 แคนตำลูป (เมลอนสีทอง) เนื้อ 28 แคนตำลูป (นีออน) เนื้อ 29 สำลี่ ทั้งผล 30 ส้มโอ เนื้อ 31 องุ่น ทั้งผล 32 มะขำมป้อม เนื้อ 33 ลูกพลับ ทั้งผล 34 แตงไทยอ่อน เนื้อ 35 แตงไทยอ่อน เปลือก 36 เงำะโรงเรียน เนื้อ 37 เงำะโรงเรียน เปลือก 38 ลำงสำด เนื้อ 40 ลำงสำด เปลือก 41 มะเดื่อปล้อง ทั้งผล 42 มะเดื่ออุทุมพร ทั้งผล 43 สับปะรด เนื้อ (positive control) 44 กีวี เนื้อ (positive control)

ตารางที่ 3.2 ตัวอย่ำงผักชนิดต่ำงๆ และส่วนที่ใช้ในกำรทดลอง ลาดับ ตัวอย่าง ส่วนที่ใช้

1 มะเขือเทศ ทั้งผล 2 ฟักทอง เนื้อ 3 ฟักแม้ว ทั้งผล 4 ฟักเขียว เนื้อ 5 ฟักเขียว เปลือก 6 น ้ำเต้ำ เนื้อ 7 น ้ำเต้ำ เปลือก 8 น ้ำเต้ำ ทั้งผล 9 มะระจีน ทั้งผล 10 ใบบัวบก ใบ 11 มะเขือสีม่วงใหญ่ ทั้งผล 12 มะระขี้นก ทั้งผล 13 บวบเหลี่ยม เปลือก 14 บวบเหลี่ยม เนื้อ 15 ผักปรัง เนื้อ 16 พริกชี้ฟ้ำ ทั้งผล 17 กระเจี๊ยบเขียว ทั้งผล 18 มะเขือเหลือง ทั้งผล 19 มะกรูด เนื้อ 20 มะกรูด เปลือก 21 สะระแหน่ ใบ 22 แตงล้ำน ทั้งผล 23 แตงกวำ เนื้อ 24 แตงกวำ เปลือก 25 แครอท ทั้งหัว

14 26 มะนำว เนื้อ 27 บวบงู ทั้งผล 28 มะเขือม่วงเล็ก ทั้งผล 29 มะเขือม่วงใหญ่ผลรี ทั้งผล 30 ข้ำวโพดอ่อน ทั้งฝัก 31 ถั่วแขก ทั้งฝัก 32 เปลือกมะละกอ เปลือก 33 ถั่วงอก ทั้งต้น 34 ใบชะพลู ใบ 35 ใบยี่หร่ำ ใบ 36 ใบกระเจี๊ยบ ใบ 37 ใบแขยง ใบ 38 ใบแมงลัก ใบ 39 ผักบุ้งไทย ใบและก้ำน 40 ผักป้วยเล้ง ใบและก้ำน 41 ผักแผ้ว ใบ 42 ผักชีไทย ใบและก้ำน 43 ผักโขมเล็ก ใบและก้ำน 44 ผักสลัด (ผักกำดหอม) ใบ 45 มะกอกป่ำ เนื้อ 46 หอมหัวใหญ่ เนื้อ 47 มันฝรั่ง เนื้อ 48 หัวไชเท้ำ เนื้อ 49 หัวไชเท้ำ เปลือก 50 ผักบุ้งไทย ใบและก้ำน 51 ใบโหระพำ ใบ 52 ใบผักกำดกวำงตุ้ง ใบ 53 บวบหอม ทั้งผล 54 บวบหอม เนื้อ

15 55 บวบหอม เปลือก 56 มะแว้ง ทั้งผล 57 ถั่วฝักยำว ทั้งฝัก 58 กะหล ่ำปลี ใบ 59 ดอกแค ทั้งดอก 60 ดอกหอม ทั้งต้น 61 บล็อกโคลี ดอก 62 ขึ้นฉ่ำย ใบและก้ำน 63 ต ำลึง ใบและก้ำน 64 บ๊อกไซ ใบและก้ำน 65 ฮ่องเต้ ใบและก้ำน 66 คะน้ำฮ่องกง ใบ 67 คะน้ำฮ่องกง ล ำต้น 68 มะเขือเปรำะ (สีเขียว) ทั้งผล 69 ถั่วลันเตำหวำน ทั้งผล 70 กรีนโอ๊ค (green oak) ใบ 71 สลัดคอส (salad cos) ใบ 72 เรดคลอเรล (red coral) ใบ 73 กรีน คอส (green cos) ใบ 74 สับปะรด เนื้อ (positive control) 75 Phosphate buffer (negative control)

3.2.2 การคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส (Cysteine Proteinase) ท ำกำรคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจำกผักหรือผลไม้ต่ำงๆ โดยน ำ ตัวอย่ำงผักและผลไม้ชนิดต่ำงๆ มำสกัดเอนไซม์ด้วย ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0 ในอัตรำส่วน 1:1 น ำตัวอย่ำงบดให้ละเอียดด้วยเครื่องปั่นน ้ำผลไม้ กรองเอำกำกทิ้ง จะได้ส่วนใส หรือ crude enzyme จำกนั้นน ำ crude enzyme ที่ได้มำทดสอบประสิทธิภำพกำรย่อยโปรตีน บน AZCL-casein plate ด้วยเทคนิค agar plate diffusion สังเกต blue zone ที่เกิดขึ้น (รูปที่ 3.1) กำรเกิด blue zone สำมำรถสังเกตได้อย่ำงชัดเจนเนื่องจำกใช้ซับสเตรตจ ำเพำะคือ AZCL-casein (Azurine-

16 Crosslinked-Casein), (Megazyme, Ireland) โดยเตรียมจำกสี azurine จับกับโปรตีนคือ เคซีน หรืออำจจะให้จับกับโพลีแซคคำไรค์ชนิดอื่นๆ เช่น AZCL-xylan แล้วแต่จุดประสงค์ของงำนวิจัย AZCL-casein เป็น insoluble substrate และเป็นซับสเตรตที่มีควำมจ ำเพำะต่อเอนไซม์โปรติเนส เมื่อท ำกำรทดสอบควำมสำมำรถในกำรไฮโดรไลซ์โปรตีน พบว่ำถ้ำในตัวอย่ำงที่น ำมำศึกษำมี เอนไซม์โปรติเนสจะไฮโดรไลซ์โปรตีนท ำให้ปลดปล่อยสีน ้ำเงินออกมำ เป็น blue zone ดังแสดงใน รูปที่ 1 ซึ่งมีควำมกว้ำง ควำมเร็วในกำรเกิดปฏิกิริยำต่ำงกันแปรตำมปริมำณของเอนไซม์ที่มีอยู่ใน ในผักและผลไม้ ท ำกำรทดลองดังนี้

A B รูปท่ี 3.1 AZCL-casein agar plate : A คือ AZCL-casein plate ก่อนท ำกำรทดสอบควำมสำมำรถ ในกำรย่อยโปรตีน, B คือ AZCL-casein plate หลังท ำกำรทดสอบ จะเกิด blue zone ขึ้นรอบๆ หลุม

3.2.2.1 กำรทดสอบบน AZCL-casein plate เตรียมสำรละลำยวุ้นให้มีควำมเข้มข้นร้อยละ 1.5 (w/v) ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0 จำกนั้นน ำไปต้มจนเดือดน ำมำเติมซับสเตรต AZCL – casein ควำมเข้มข้นร้อยละ 0.1 คนให้ AZCL – casein กระจำยทั่วสำรละลำย เทใส่จำนเลี้ยงเชื้อ ปริมำตร 25 มิลลิลิตร เพื่อให้มีควำม หนำของวุ้นเท่ำกันทุกจำนทิ้งให้วุ้นแข็งตัว จำกนั้นเจำะวุ้นให้เป็นหลุมเส้นผ่ำนศูนย์กลำง 6 มิลลิเมตร น ำ crude enzyme ที่สกัดได้มำหยดในหลุมๆ ละ 100 ไมโครลิตร (รูปที่ 3.2) น ำไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศำเซลเซียส ตรวจผลกำรทดลองโดยดูกำรเกิด blue zone ทุก 30 นำที ในกำรทดลองจะใช้ crude enzyme จำกสับประรด และกีวี เป็น positive control และใช้สำรละลำยฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0 เป็น negative control

รูปท่ี 3.2 กำรหยดสำรสกัดเอนไซม์จำกตัวอย่ำงชนิดต่ำงๆ บน AZCL-casein plate

3.3 การตรวจสอบชนิดของเอนไซม์โปรติเนส จำกผลกำรคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส พบว่ำมีตัวอย่ำงที่น่ำสนใจที่จะ น ำมำศึกษำต่อหลำยตัวอย่ำง เช่น แคนตำลูป มะเดื่ออุทุมพร มะเดื่อปล้อง และบวบงู เป็นต้น เนื่องจำกให้ blue zone กว้ำง ดังนั้นจึงท ำกำรตรวจสอบว่ำเป็นเอนไซม์ในกลุ่มใด โดยน ำมำท ำ ปฏิกิริยำกับตัวยับยั้ง ชนิดต่ำงๆ ได้แก่ 2,2 Dipyridyl disulphide (2PDS), phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), Iodoacetamide และ -Mercaptoethanol (-ME) ทดสอบ ควำมสำมำรถในกำรย่อยโปรตีนบน AZCL-casein plate เพื่อจะได้คัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ จำกผักและผลไม้มำศึกษำต่อเพียง 1 ชนิด

3.4 แยกเอนไซม์ซีสเตอีน โปรตเิ นสให้บริสุทธ์ิโดยเทคนิค Covalent Chromatography คัดเลือกแหล่งของเอนไซม์จำกผักและผลไม้ที่มีแอคติวิตีสูงที่สุดมำ 1 ชนิด ในที่นี้ คณะผู้วิจัยมีควำมสนใจ มะเดื่ออุทุมพร และมะเดื่อปล้อง เนื่องจำกกำรศึกษำซีสเตอีน โปรติเนส ในผลไม้ชนิดนี้มำบ้ำงในต่ำงประเทศ แต่ในเมืองไทยยังไม่มีรำยงำนกำรศึกษำ รวมทั้งผลไม้ทั้ง สองชนิดนี้มีปลูกทั่วไปทั้งภำคกลำง ภำคอีสำน ภำคใต้และภำคเหนือ ออกผลทั้งปี ดังนั้นในกำร ทดลองครั้งแรกได้คัดเลือกมะเดื่ออุทุมพรมำท ำกำรศึกษำ ดังนี้ 3.4.1 การเตรียมเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส น ำผลมะเดื่ออุทุมพรมำแช่ในน ้ำกลั่นที่มี 1 มิลลิโมลำร์ EDTA เป็นเวลำ 1 ชั่วโมง จำกนั้นน ำมำปั่นรวมกับ 0.1 โมลำร์ ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0 ที่มี 20 มิลลิโมลำร์ ซีสเตอีน ใน

18 ปริมำตรที่น้อยที่สุด ในเครื่องปั่นน ้ำผลไม้ แยกกำกออกด้วยกำรกรองด้วยผ้ำขำวบำง ทิ้งกำกและ น ำน ้ำปั่นจำกมะเดื่ออุทุมพรที่กรองได้ไปปั่นเหวี่ยง ที่ควำมเร็ว 8000 รอบต่อนำที เป็นเวลำ 30 นำที ที่อุณหภูมิ 4 องศำเซลเซียส น ำส่วนใสที่ได้มำตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัว ควำมเข้มข้นร้อยละ 80 น ำไปปั่นเหวี่ยงแยกตะกอนที่ควำมเร็ว 10000 รอบต่อนำที เป็นเวลำ 15 นำที ที่อุณหภูมิ 4 องศำเซลเซียส น ำตะกอนโปรตีนที่ได้ มำท ำ dialysis เป็นเวลำ 24 ชั่วโมง ด้วย 0.1 โมลำร์ ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0 จำกนั้นละลำยใน 0.1 โมลำร์ โซเดียม อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 4.4 และน ำไปแยกให้บริสทุ ธิ์ด้วยเทคนิค covalent chromatography ต่อไป 3.4.2 การแยกให้บริสุทธ์ิด้วยเทคนิค Covalent Chromatography หลักกำรกำรแยกให้บริสทุ ธิ์โดยเทคนิค covalent chromatography โดยใช้เจล Thiopropyl Sepharose 6B ดังแสดงในรูปที่ 3.3 3.4.2.1 น ำตะกอนที่ละลำยใน 0.1 โมลำร์ โซเดียม อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 4.4 ปริมำตร 100 มิลลิลิตร ท ำกำรแยกให้บริสทุ ธิ์ โดยน ำสำรละลำยเอนไซม์ใสใ่ น Thiopropyl Sepharose 6B ปริมำตร 50 มิลลิลิตร ซึ่งได้ผ่ำนกำร equilibrated ด้วย อะซิเตทบัฟเฟอร์ pH 4.4 ทิ้งไว้ค้ำงคืนที่อุณหภูมิ 4 องศำเซลเซียส 3.4.2.2 ท ำกำรล้ำงโปรตีนที่ไม่จับกับ Thiopropyl Sepharose 6B ด้วยน ้ำกลั่น จนกระทั่งได้ค่ำกำรดูดกลืนแสงที่ควำมยำวคลื่น 280 นำโนเมตร เท่ำกับ 0.012 และล้ำงด้วย 0.1 โมลำร์ ทริส ไฮโดรคลอไรด์ บัฟเฟอร์ pH 8.0 ปริมำตร 2 คอลัมน์ 3.4.2.3 น ำเจลมำแพคใส่ในคอลัมน์ และ equilibrated ด้วย 0.1 โมลำร์ ทริส ไฮโดร คลอไรด์ บัฟเฟอร์ pH 8.0 3.4.2.4 ชะเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส ด้วย 0.1 โมลำร์ ทริส ไฮโดรคลอไรด์ บัฟเฟอร์ pH 8.0 ที่มี 20 มิลลิโมลำร์ ซีสเตอีน และ 1 มิลลิโมลำร์ DTT 3.4.2.5 ท ำกำรเก็บสำรละลำยที่ผ่ำนคอลัมน์ออกมำ fraction ละ 10 มิลลิลิตร และ น ำมำวัดแอคติวิตีโดยใช้ L-BAPNA เป็นซับสเตรตและวัดปริมำณโปรตีนที่ควำมยำวคลื่น 280 นำโนเมตร 3.4.2.6 น ำ fraction ที่ให้แอคติวิตีมำรวมกันและน ำมำเติม 2PDS ที่อิ่มตัวเพื่อยับยั้ง ปฏิกิริยำของเอนไซม์ใน 0.1 โมลำร์ ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.0 และท ำให้เข้มข้น เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศำเซลเซียส และน ำไปศึกษำต่อไป

รูปท่ี 3.3 ขั้นตอน Covalent chromatography by thiol-disulphide interchange

3.5 การตรวจวัดกิจกรรมเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส (ดัดแปลงจากวิธีของ Anson, 1938) 3.5.1 กำรเตรียมกรำฟมำตรฐำนของ L-Tyrosine เตรียมสำรละลำย L-Tyrosine ที่มีควำมเข้มข้น 0, 10, 20, 30, 40, 50, และ 60 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร บรรจุในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มิลลิลิตร เติม 0.4 โมลำร์ โซเดียม คำร์บอเนต หลอดละ 1.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ำกัน หลังจำกนั้นเติมสำรฟอลินรีเอเจนต์ (Folin- ciocalteu reagent) ลงไปหลอดละ 0.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ำกัน ทิ้งไว้นำน 10 นำที หลังจำกนั้น น ำไปวัดค่ำกำรดูดกลืนแสงที่ควำมยำวคลื่น 660 นำโนเมตร ด้วยเครื่องวัดกำรดูดกลืนคลื่นแสง สร้ำงกรำฟมำตรฐำนระหว่ำงค่ำกำรดูดกลืนแสงกับควำมเข้มข้นของสำรละลำย L-Tyrosine ที่ ควำมเข้มข้นต่ำงๆ (ภำคผนวก ข) 3.5.2 กำรวิเครำะห์กิจกรรมของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจำกสำรละลำยตัวอย่ำง เติมเอนไซม์ 0.25 มิลลิลิตร ลงในเคซีนร้อยละ 0.5 ใน 50 มิลลิโมลำร์ คำร์บอเนต-ไบ คำร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 10.0 จ ำนวน 1.25 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 50 องศำเซลเซียส นำน 10 นำที จำกนั้นหยุดปฏิกิริยำด้วย 0.4 โมลำร์ กรดไทรคลอโรอะซีติก จ ำนวน 1.25 มิลลิลิตร ผสมให้ เข้ำกัน น ำไปปั่นด้วยควำมเร็ว 12,000 รอบต่อนำที นำน 10 นำที แล้วน ำสำรละลำยส่วนใสบรรจุ ในหลอดทดลอง หลอดละ 0.25 มิลลิลิตร หลังจำกนั้นท ำกำรทดลองเช่นเดียวกับข้อ 3.5.1 เมื่อวัด ค่ำกำรดูดกลืนแสงแล้วน ำไปเปรียบเทียบกับกรำฟมำตรฐำนเพื่อหำกิจกรรมของเอนไซม์โปรติเนส ก ำหนดให้ 1 หน่วยของเอนไซม์ หมำยถึงปริมำณเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสที่ย่อย สลำยเคซีนร้อยละ 0.5 ให้ผลิตภัณฑ์ไทโรซีน 1 ไมโครโมล ที่ pH 10.0 อุณหภูมิ 50 องศำเซลเซียส ภำยในเวลำ 1 นำที

20 3.5.3 การวิเคราะห์ปริมาณโปรตีน (Lowry และคณะ 1951) 3.5.3.1 กำรเตรียมกรำฟมำตรฐำนของโปรตีน เตรียมสำรละลำย bovine serum albumin (BSA) ที่ควำมเข้มข้น 0, 50, 100, 150, 200 และ 250 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร บรรจุในหลอดทดลองหลอดละ 1 มิลลิลิตร เติม reagent C หลอดละ 5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ำกันทิ้งไว้เป็นเวลำ 10 นำที หลังจำกนั้นเติมสำร ฟอลินรีเอเจนต์ (Folin-ciocalteu reagent) ลงไปหลอดละ 0.5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ำกัน ทิ้งไว้ 30 นำที จำกนั้นน ำไปวัดค่ำกำรดูดกลืนแสงที่ควำมยำวคลื่น 660 นำโนเมตร ด้วยเครื่องวัดกำร ดูดกลืนคลื่นแสง สร้ำงกรำฟมำตรฐำนระหว่ำงค่ำกำรดูดกลืนแสงกับควำมเข้มข้นของสำรละลำย BSA ที่ควำมเข้มข้นต่ำงๆ (ภำคผนวก ข) 3.5.3.2 กำรวิเครำะห์ปริมำณโปรตีนจำกสำรละลำยตัวอย่ำง น ำตัวอย่ำงของสำรละลำยที่ต้องกำรทดสอบมำบรรจุในหลอดทดลองหลอดละ 1 มิลลิลิตร หลังจำกนั้นท ำกำรทดลองเช่นเดียวกับข้อ 3.5.3.1 เมื่อวัดค่ำกำรดูดกลืนแสงแล้วน ำไป เปรียบเทียบกับกรำฟมำตรฐำนเพื่อหำปริมำณโปรตีน

3.6 การตรวจสอบความบริสุทธ์ิของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส โดยวิธี Sodium Dodecyl Sulfate –Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 3.6.1 การเตรียมและเทคนิคการทดสอบ SDS-PAGE 3.6.1.1 ยึดแม่แบบที่ประกอบด้วยแผ่นกระจกและแผ่นเซรำมิกกับแท่นที่ใช้ส ำหรับ เตรียมเจลให้แน่น โดยมีแผ่นพลำสติกบำงขนำดเล็กสอดที่ข้ำงๆ ระหว่ำงกระจกและแผ่นเซรำมิก เพื่อให้เกิดช่องว่ำงส ำหรับเทเจล 3.6.1.2 ผสม separating gel (ร้อยละ 12 (w/v)) เทลงในแม่แบบให้มีพื้นที่ส่วนบน เหลืออยู่ประมำณ 1 นิ้ว ปล่อยทิ้งไว้ให้เจลแข็งที่อุณหภูมิห้อง 3.6.1.3 ผสม stacking gel (ร้อยละ 5 (w/v)) เททับลงบน separating gel ในแบบจน สุดขอบด้ำนบนของแม่แบบ จำกนั้นสอดพลำสติกบำงที่มีลักษณะเป็นซี่ฟันลงใน stacking gel ที่ ยังไม่แข็งตัว เพื่อให้เกิดช่องว่ำงส ำหรับใส่ตัวอย่ำงที่ต้องกำรทดสอบ ปล่อยทิ้งไว้ให้เจลแข็งตัวที่ อุณหภูมิห้อง 3.6.1.4 ถอดแผ่นพลำสติกบำงที่มีลักษณะเป็นซี่ฟันออกจำกเจล จำกนั้นน ำเจลที่ แข็งตัวในแม่แบบออกจำกแท่นยึดและติดตั้งเข้ำกับชุด electrophoresis โดยให้ด้ำนล่ำงของ เจลจุ่มอยู่ใน electrode buffer และเติม electrode buffer จนท่วมผิวด้ำนบนของเจล

21 3.6.1.5 เติมตัวอย่ำงโปรตีนที่ต้องกำรทดสอบหำขนำด จ ำนวน 20 ไมโครกรัม ซึ่งต้ม ร่วมกับสำรละลำย SDS (sample buffer) ลงในช่องว่ำงส ำหรับใส่ตัวอย่ำงส่วนบนของ stacking gel โดยท ำพร้อมกับโปรตีนมำตรฐำนที่ทรำบขนำดโมเลกุล 3.6.1.6 ต่อขั้วไฟฟ้ำของชุดทดสอบเข้ำกับหม้อแปลงไฟฟ้ำกระแสตรงปรับให้มี กระแสไฟฟ้ำประมำณ 10 มิลลิแอมแปร์ต่อเจล 3.6.1.7 ปล่อยให้ตัวอย่ำงโปรตีนเคลื่อนที่ภำยในเนื้อเจลจนสีน ้ำเงินของ bromphenol blue ที่เติมใน sample buffer เคลื่อนที่ลงไปจนสุดขอบล่ำงของเจล 3.6.1.8 ปิดกระแสไฟฟ้ำ น ำเจลออกจำกชุดทดสอบค่อยๆ ลอกเนื้อเจลออกจำกแม่แบบ น ำเจลที่ได้ไปย้อมด้วยชุดสีย้อม silver stain หรือ Coomassie Brilliant Blue G-250 3.6.1.9 น ำเจลที่ผ่ำนกำรย้อมแล้วมำล้ำงด้วย destain 1 และ 2 3.6.1.10 ตรวจสอบควำมบริสทุ ธิ์และขนำดของโปรตีนโดยเปรียบเทียบกบั โปรตีน มำตรฐำน

3.7 การวิเคราะห์ไกลโคโปรตีน (glycoprotein) น ำเอนไซม์ที่ผ่ำนคอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B มำตรวจสอบชนิดของโปรตีน โดย ใช้ชุดทดสอบ GelCode® Glycoprotein Staining ท ำกำรทดลองโดยน ำตัวอย่ำงเอนไซม์ที่ต้องกำร ตรวจสอบไปตรวจสอบบน SDS-polyacrylamide gels จำกนั้นเติมรีเอเจนท์ตำมขั้นตอนที่ก ำหนด จะพบว่ำ glycols ที่พบในกลุ่มไกลโคโปรตีน จะถูกออกซิไดส์เป็น aldehydes และเมื่อน ำมำย้อม สีจะได้สีชมพู

3.8 การตรวจวิเคราะห์โปรตีนโดย เครื่อง MALDI-TOF Mass Spectrometry น ำเอนไซม์ที่มีน ้ำหนักโมเลกุล 23,000 ดำลตัน จำก SDS-PAGE ไปวิเครำะห์โปรตีนโดย ใช้เครื่อง MALDI-TOF mass spectrometry ที่ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภำพแห่งชำติ ส ำนักงำนพัฒนำวิทยำศำสตร์และเทคโนโลยีแห่งชำติ (สวทช.) โดยใช้เครื่อง MALDI-TOF MS (Reflex IV, BRUKER) ในกำรตรวจวิเครำะห์

3.9 การตรวจวิเคราะห์โปรตีนโดย เครื่อง Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC/MS-MS) น ำเอนไซม์ที่มีน ้ำหนักโมเลกุล 23,000 ดำลตัน จำก SDS-PAGE ไปวิเครำะห์โปรตีนโดย ใช้ Liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS-MS) รุ่น Finnigan LTQ Linear Ion

22 Trap Mass Spectrometer ที่ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภำพแห่งชำติ ส ำนักงำนพัฒนำ วิทยำศำสตร์และเทคโนโลยีแห่งชำติ (สวทช.)

3.10 การวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส ท ำกำรวิเครำะห์กรดอะมิโนจำกเอนไซม์ไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จำกมะเดื่อปล้อง โดยน ำ chymopapain มำท ำกำรสร้ำงโครงสร้ำงสำมมิติโดยใช้โปรแกรม Discovery Studio Visualizer 2.01 จำก Accelrys® จำกนั้นน ำล ำดับกรดอะมิโนที่วิเครำะห์ได้จำกมะเดื่อปล้องมำเทียบเคียงกับ โครงสร้ำงสำมมิติของเอนไซม์ chymopapain ที่ได้

3.11 ผลของสารยับยั้งการทางานของ เอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้อง น ำสำรละลำยเอนไซม์มำท ำปฏิกิริยำกับตัวยับยั้ง ชนิดต่ำงๆ ได้แก่ 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS), phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), iodoacetamide และ -mercaptoethanol (-ME) จำกนั้นทดสอบควำมสำมำรถในกำรย่อยโปรตีนบน AZCL-casein plate

3.12 การศึกษาการย่อยซับสเตรตสังเคราะห์ของเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้อง น ำเอนไซม์ไปตรวจวัดกิจกรรมของเอนไซม์ซีสเตอีนโปรติเนส โดยใช้ซับสเตรตสังเครำะห์ คือ Gyl-Arg-p-Nitroanilide dihydroxychloride, Ala-Ala-Phe-p-Nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-Nitroanilide, N-succinyl-L-Phenylalanine-p-Nitroanilide และ N-Benzoyl-L-Arginine-p- Nitroanilide (Sigma-Aldrich, USA) ที่ควำมเข้มข้นต่ำงๆ กัน เป็น ซับสเตรต วัดกำรท ำงำนของเอนไซม์โดยกำรวัดค่ำดูดกลืนคลื่นแสงที่ควำมยำวคลื่น 410 นำโน เมตร

บทที่ 4

ผลการทดลอง

4.1 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส (Cysteine Proteinase) จากการน าตัวอย่างผลไม้ จ านวน 42 ตัวอย่าง และตัวอย่างผักจ านวน 73 ตัวอย่าง มาตรวจสอบประสิทธิภาพการย่อยโปรตีนบน AZCL-casein plate พบว่าตัวอย่างจากผลไม้ทั้ง ส่วนที่กินได้ และกินไม่ได้ ที่ให้ผลบวกเกิด blue zone ขึ้นบริเวณรอบๆ หลุมที่หยดตัวอย่าง (รูปที่ 4.1) จ านวน 17 ตัวอย่าง ได้แก่ ขนุน ซังขนุน เมล็ดขนุน ละมุดไทย ละมุดมาเลย์ สาเก แคนตาลูปซันเลดี้ (เนื้อ) แคนตาลูปซันเลดี้ (เปลือก) แคนตาลูป (เขียวมรกต) แคนตาลูป (Japanese melon) แคนตาลูป (เมลอนสีทอง) แคนตาลูป (นีออน) แตงไทยอ่อนทั้งเนื้อและ เปลือก เงาะโรงเรียน(เนื้อ) มะเดื่อปล้อง และมะเดื่ออุทุมพร ดังแสดงในตารางที่ 4.1 ตัวอย่าง ผักที่ให้ผลบวก จ านวน 39 ตัวอย่างจากทั้งหมด 73 ตัวอย่าง ตัวอย่างผักที่ให้ blue zone กว้าง ได้แก่ บวบงู ผักสลัด ผักกาดกวางตุ้ง บวบหอม มะเขือเหลือง มะเขือม่วง และมะแว้ง เป็นต้น

รูปท่ี 4.1 blue zone ที่เกิดจากการย่อยโปรตีนของเอนไซม์บน AZCL-casein plate

24 ตารางที่ 4.1 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจากตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate ลาดับ ตัวอย่าง ส่วนที่ใช้ ผลการทดสอบ

1 ขนุน เนื้อ + 2 ซังขนุน ซัง + 3 เมล็ดขนุน เมล็ด + 4 พุทรา เนื้อ - 5 แก้วมังกรพันธุ์สีขาว เนื้อ - 6 มะม่วงเขียวเสวย เนื้อ - 7 เสาวรส เนื้อ - 8 กล้วยน ้าว้า เนื้อ - 9 กล้วยน ้าว้าดิบ เนื้อ - 10 ฝรั่งแป้นสีทอง เนื้อ - 11 มะเฟือง ทั้งผล - 12 ละมุดไทย เนื้อ + 13 ละมุดมาเลย์ เนื้อ + 14 สาเก เนื้อ + 15 ชมพู่มะเหมี่ยว เนื้อ - 16 ชมพู่แก้มแหม่ม เนื้อ - 17 ชมพู่ทับทิมจันทร์ เนื้อ - 18 มันแกว เนื้อ - 19 มะดัน เนื้อ - 20 มะกอกน ้า เนื้อ - 21 มะขาม ทั้งผล - 22 สมอเทศ เนื้อ - 23 แคนตาลูป (ซันเลดี้) เนื้อ ++ 24 แคนตาลูป (ซันเลดี้) เปลือก ++ 25 แคนตาลูป (Japanese Melon) เนื้อ ++

25 26 แคนตาลูป (เขียวมรกต) เนื้อ ++ 27 แคนตาลูป (เมลอนสีทอง) เนื้อ ++ 28 แคนตาลูป (นีออน) เนื้อ ++ 29 สาลี่ ทั้งผล - 30 ส้มโอ เนื้อ - 31 องุ่น ทั้งผล - 32 มะขามป้อม เนื้อ - 33 ลูกพลับ ทั้งผล - 34 แตงไทยอ่อน เนื้อ + 35 แตงไทยอ่อน เปลือก + 36 เงาะโรงเรียน เนื้อ + 37 เงาะโรงเรียน เปลือก - 38 ลางสาด เนื้อ - 40 ลางสาด เปลือก - 41 มะเดื่อปล้อง ทั้งผล ++ 42 มะเดื่ออุทุมพร ทั้งผล ++ 43 สับปะรด เนื้อ ++ (positive control) 44 กีวี เนื้อ ++ (positive control) 45 Phosphate buffer (negative control) - หมายเหตุ + หมายถึง blue zone ที่มีความกว้างเท่ากับ 6-10 มิลลิเมตร ++ หมายถึง blue zone ทีมีความกว้างเท่ากับ 10-20 มิลลิเมตร _ หมายถึง ไม่เกิด blue zone

ส่วนตัวอย่างผักที่น ามาทดสอบทั้งหมด 73 ตัวอย่าง มีจ านวน 39 ตัวอย่าง ที่ให้ blue zone บน AZCL-casein ได้แก่ ฟักเขียว น ้าเต้า ใบบัวบก มะเขือม่วงผลรี มะเขือม่วงผลใหญ่ และเล็ก มะกรูด สาระแหน่ เปลือกมะละกอ มะนาว บวบเหลี่ยม ใบยี่หร่า ผักป้วยเล้ง ผักฮ่องเต้ หอมหัวใหญ่ และ มันฝรั่ง เป็นต้น ที่น่าสนใจได้แก่ บวบงู ผักสลัด ผักกาดกวางตุ้ง บวบหอม มะเขือเหลือง และมะแว้ง เนื่องจากให้ blue zone กว้าง ผลการทดลองแสดงในตารางที่ 4.2

26 ตารางที่ 4.2 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจากตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate ลาดับ ตัวอย่าง ส่วนที่ใช้ ผลการทดสอบ

1 มะเขือเทศ ทั้งผล - 2 ฟักทอง เนื้อ - 3 ฟักแม้ว ทั้งผล - 4 ฟักเขียว เนื้อ + 5 ฟักเขียว เปลือก + 6 น ้าเต้า เนื้อ + 7 น ้าเต้า เปลือก - 8 น ้าเต้า ทั้งผล + 9 มะระจีน ทั้งผล - 10 ใบบัวบก ใบ + 11 มะเขือสีม่วงใหญ่ ทั้งผล ++ 12 มะระขี้นก ทั้งผล - 13 บวบเหลี่ยม เปลือก +/- 14 บวบเหลี่ยม เนื้อ +/- 15 ผักปรัง เนื้อ - 16 พริกชี้ฟ้า ทั้งผล + 17 กระเจี๊ยบเขียว ทั้งผล + 18 มะเขือเหลือง ทั้งผล ++ 19 มะกรูด เนื้อ + 20 มะกรูด เปลือก + 21 สะระแหน่ ใบ + 22 แตงล้าน ทั้งผล - 23 แตงกวา เนื้อ - 24 แตงกวา เปลือก - 25 แครอท ทั้งหัว -

27 26 มะนาว เนื้อ + 27 บวบงู ทั้งผล ++ 28 มะเขือม่วงเล็ก ทั้งผล + 29 มะเขือม่วงใหญ่ผลรี ทั้งผล + 30 ข้าวโพดอ่อน ทั้งฝัก - 31 ถั่วแขก ทั้งฝัก - 32 เปลือกมะละกอ เปลือก ++ 33 ถั่วงอก ทั้งต้น - 34 ใบชะพลู ใบ - 35 ใบยี่หร่า ใบ + 36 ใบกระเจี๊ยบ ใบ - 37 ใบแขยง ใบ - 38 ใบแมงลัก ใบ - 39 ผักบุ้งไทย ใบและก้าน - 40 ผักป้วยเล้ง ใบและก้าน + 41 ผักแผ้ว ใบ - 42 ผักชีไทย ใบและก้าน - 43 ผักโขมเล็ก ใบและก้าน - 44 ผักสลัด (ผักกาดหอม) ใบ ++ 45 มะกอกป่า เนื้อ - 46 หอมหัวใหญ่ เนื้อ + 47 มันฝรั่ง เนื้อ + 48 หัวไชเท้า เนื้อ + 49 หัวไชเท้า เปลือก + 50 ผักบุ้งไทย ใบและก้าน - 51 ใบโหระพา ใบ - 52 ใบผักกาดกวางตุ้ง ใบ ++ 53 บวบหอม ทั้งผล ++ 54 บวบหอม เนื้อ ++

28 55 บวบหอม เปลือก - 56 มะแว้ง ทั้งผล ++ 57 ถั่วฝักยาว ทั้งฝัก - 58 กะหล ่าปลี ใบ - 59 ดอกแค ทั้งดอก - 60 ดอกหอม ทั้งต้น + 61 บล็อกโคลี ดอก - 62 ขึ้นฉ่าย ใบและก้าน + 63 ต าลึง ใบและก้าน + 64 บ๊อกไซ ใบและก้าน + 65 ฮ่องเต้ ใบและก้าน + 66 คะน้าฮ่องกง ใบ + 67 คะน้าฮ่องกง ล าต้น + 68 มะเขือเปราะ (สีเขียว) ทั้งผล + 69 ถั่วลันเตาหวาน ทั้งผล - 70 กรีนโอ๊ค (green oak) ใบ - 71 สลัดคอส (salad cos) ใบ + 72 เรดคลอเรล (red coral) ใบ - 73 กรีน คอส (green cos) ใบ - 74 สับปะรด เนื้อ (positive control) ++ 75 Phosphate buffer (negative control) - หมายเหตุ + หมายถึง blue zone ที่มีความกว้างเท่ากับ 6-10 มิลลิเมตร ++ หมายถึง blue zone ทีมีความกว้างเท่ากับ 10-20 มิลลิเมตร _ หมายถึง ไม่เกิด blue zone

4.2 ผลการตรวจสอบชนิดของเอนไซม์โปรติเนส จากผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากตัวอย่างผลไม้และผักชนิด ต่างๆ พบว่ามีตัวอย่างที่ให้ผลบวกโดยสามารถย่อยเคซีนบน AZCL-casein plate ได้หลาย ตัวอย่าง ซึ่งคณะผู้วิจัยได้มีความสนใจตัวอย่างที่จะน ามาศึกษาต่อหลายตัวอย่างจากผลไม้ ได้แก่

29 ขนุน แคนตาลูปสายพันธุ์ต่างๆ มะเดื่อสายพันธุ์ต่างๆ ส าหรับตัวอย่างจากผัก ได้แก่ บวบงู ผัก สลัด มะแว้ง เป็นต้น โดยพิจารณาจากเส้นผ่านศูนย์กลางของ blue zone รวมถึงอัตราเร็วในการ เกิดปฏิกิริยาซึ่งในผักหรือหรือผลไม้ที่เกิดปฏิกิริยาเร็ว แสดงว่ามีปริมาณเอนไซม์ในปริมาณที่สูง กว่าผักหรือผลไม้ที่เกิดปฏิกิริยาช้า ก่อนที่จะน าไปศึกษาได้ท าการตรวจสอบยืนยันเอนไซม์โปรติ เนสในตัวอย่างเหล่านี้จัดเป็ นเอนไซม์โปรติเนสในกลุ่มซีสเตอีน โปรติเนสหรือไม่ เนื่องจากการ ตรวจสอบโดยใช้ AZCL-casein plate เป็นการตรวจสอบเบื้องต้นว่าเป็นเอนไซม์ในกลุ่มโปรติ เนสหรือไม่เท่านั้น จึงต้องท าการตรวจสอบโดยท าปฏิกิริยากับสารยับยั้งชนิดต่างๆ เพื่อดูว่าเป็น เอนไซม์โปรติเนสในกลุ่มใด ผลการทดลองแสดงในตารางที่ 4.3

ตารางที่ 4.3 ผลการท าปฏิกิริยากับตัวยับยั้งชนิดต่าง ๆ บน AZCL-casein plate ตัวอย่าง สารยับยั้ง ผลการทดสอบ 1. phosphate buffer pH 6.0 - - 2. บวบงู - + 3. บวบงู 2PDS + 4. บวบงู 2PDS + PMSF - 5. บวบงู 2PDS + PMSF + ME - 6. แคนตาลูป 2PDS +++ 7. แคนตาลูป 2PDS + PMSF ++ 8. แคนตาลูป 2PDS + PMSF+ME ++ 9. มะเดื่ออุทุมพร 2PDS - 10. มะเดื่ออุทุมพร PMSF + 11. มะเดื่ออุทุมพร Iodoacetamide - 12. มะเดื่อปล้อง 2PDS - 13. มะเดื่อปล้อง PMSF + 14. มะเดื่อปล้อง Iodoacetamide - 15. โบรมีเลน - + 16. โบรมีเลน 2PDS - หมายเหตุ + หมายถึงให้ผลบวกบน AZCL-casein plate เกิด blue zone - หมายถึงให้ผลลบบน AZCL-casein plate ไม่เกิด blue zone

30 จากผลการทดสอบกับสารยังยั้งทั้ง 3 ชนิด ได้แก่ 2,2 Dipyridyl disulphide (2PDS) และ Iodoacetamide ซึ่งเป็นสารยับยั้งเอนไซม์ในกลุ่มซีสเตอีน โปรติเนส ส่วน phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF) เป็นสารยับยั้งเอนไซม์ในกลุ่มเซรีน โปรติเนส พบว่า เมื่อน า crude เอนไซม์จากตัวอย่างชนิดต่างๆ มาท าปฏิกิริยากับสารยับยั้ง crude เอนไซม์จากบวบงูและแคนตา ลูปไม่ถูกยับยั้งด้วย 2PDS และ iodoacetamide แต่จะถูกยับยั้งด้วยสาร PMSF แสดงว่า เอนไซม์ โปรติเนสที่พบในบวบงูและแคนตาลูปจัดอยู่ในกลุ่มเซรีน โปรติเนส ซึ่งสอดคล้องกับรายงานวิจัย ของ Noda และคณะ ในปี 1994 ได้รายงานว่าเอนไซม์โปรติเนสที่แยกได้จาก melon fruit (Cucumis melo L.) อยู่ในกลุ่มเซรีน โปรติเนส เนื่องจากถูกยับยั้งด้วย diisopropyl phosphofluoridate (DFP) ซึ่งเป็นสารยับยั้งเอนไซม์เซรีน โปรติเนสชนิดหนึ่ง และ Yamagata และคณะ ในปี 1994 ได้รายงานว่าใน Cucumis melo L. จะพบเอนไซม์ thermostable alkaline เซรีน โปรติเนส ในขณะที่ crude เอนไซม์จากมะเดื่ออุทุมพรและมะเดื่อปล้อง จะถูกยับยั้งด้วย 2PDS และ iodoacetamide และไม่ถูกยับยั้งด้วย PMSF จึงจัดอยู่ในกลุ่มเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติ เนส ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงได้เลือกมะเดื่อทั้งสองสายพันธุ์มาศึกษาโดยในระยะแรกได้ท าการศึกษา ในมะเดื่ออุทุมพร เนื่องจากหาได้ง่ายพบได้ทั่วไปและมีผลขนาดใหญ่ และเป็นช่วงที่ออกผลพอดี ลักษณะของมะเดื่ออุทุมพรดังแสดงในรูปที่ 4.2 โดยการศึกษาในครั้งแรกได้น ามะเดืออุทุมพรผล สุกซึ่งอยู่ในฤดูกาลนั้นมาท าการแยกเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส

รูปท่ี 4.2 ลักษณะของมะเดื่ออุทุมพร (Ficus racemosa) ผลสุก

4.4 การแยกเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสให้บริสุทธ์ิโดยเทคนิค Covalent Chromatography ในมะเดื่ออุทุมพรผลสุก 4.4.1 การตกตะกอนโปรตีนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต เมื่อน าผลมะเดื่ออุทุมพรสุกมาสกัดเอนไซม์โดยใช้ ฟอสเฟต บัฟเฟอร์ pH 6.0 จากนั้น น า crude เอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส มาตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวร้อยละ 80 พบว่ามีสารชนิดอื่นมีลักษณะเหมือนวุ้นเจือปนเป็นจ านวนมาก และมีผลรบกวนต่อการตกตะกอน เอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส แต่อย่างไรก็ตามสามารถแยกตะกอนโปรตีนออกมาได้ในปริมาณหนึ่ง 4.4.2 การทาให้เอนไซม์ ซีสเตอีน โปรตเิ นสบริสุทธ์ิโดย Covalent Chromatography เมื่อน าตะกอนของเอนไซม์มาละลายด้วย ฟอสเฟต บัฟเฟอร์ pH 6.0 และน าเอนไซม์ มาท าให้บริสทุ ธิ์ในขั้นตอนเดียวในคอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B ชะด้วย 0.1 โมลาร์ ทริส ไฮโดรคลอไรด์ บัฟเฟอร์ pH 8.0 ที่มี 20 มิลลิโมลาร์ ซีสเตอีน และ 1 มิลลิโมลาร์ DTT น า fraction ที่ให้แอคติวิตีมารวมกันและน ามาเติม 2PDS ที่อิ่มตัวใน 0.1 โมลาร์ ฟอสเฟต บัฟเฟอร์ pH 6.0 และน าไปวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส และปริมาณโปรตีน รวมถึง SDS-PAGE พบว่ากิจกรรมของเอนไซม์และปริมาณโปรตีนที่ได้ต ่ามาก ซึ่งไม่สอดคล้องกับตะกอนที่ได้ใน ขั้นตอนการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวร้อยละ 80 ที่มีปริมาณมาก และเมื่อน าไป ตรวจสอบความบริสทุ ธิ์ด้วย SDS-PAGE พบว่าไม่พบแถบโปรตีน (รูปที่ 4.3) แสดงให้เห็นว่า ปริมาณโปรตีนมีน้อยมาก ตะกอนที่ได้เป็นสารชนิดอื่นที่ปนเปื้อนมา เนื่องจากเป็นผลสุกจึงอาจท า ให้มีคาร์โบไฮเดรตในปริมาณสูงโปรตีนมีปริมาณน้อยมาก และเนื่องจากในฤดูกาลนั้นมะเดื่อ อุทุมพรอยู่ในช่วงผลสุกไม่มีผลดิบ จึงไม่ได้ท าการศึกษาในผลดิบซึ่งในผลดิบจะมีน ้ายางมากกว่า คาดว่าน่าจะมีปริมาณเอนไซม์สูงกว่าในผลสุก ซึ่งเสนอแนะว่าควรท าการศึกษาเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสในมะเดื่ออุทุมพรผลดิบต่อไป เนื่องจากในระยะนั้นมีมะเดื่อปล้องผลดิบเป็นจ านวนมาก ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงได้น ามะเดื่อปล้องผลดิบมาท าการศึกษาในระยะที่สอง

รูปท่ี 4.3 รูปแบบของโปรตีนที่ได้จากมะเดื่ออุทุมพร แยกโดยใช้วิธี SDS-PAGE 1 หมายถึง โปรตีนมาตรฐาน bovine serum albumin 2 หมายถึง โปรตีนมาตรฐาน ที่ molecular weight ต่างๆ 3 หมายถึง crude เอนไซม์จากมะเดื่ออุทุมพร 4 หมายถึง เอนไซม์ที่ผ่าน covalent chromatography

4.5 การแยกเอนไซม์ซีสเตอีน โปรตเิ นสให้บริสุทธ์ิโดยเทคนิค Covalent Chromatography ใน มะเดื่อปล้องผลดิบ มะเดื่อ (fig) เป็นพืชที่อยู่ในแฟมิลี Moraceae มีสมาชิกประมาณ 850 สปีชีส์ พบได้ทั่วไป มะเดื่อมีความส าคัญทางยาและอาหาร พบว่ามีองค์ประกอบอยู่หลายชนิด เช่น ยาง น ้าตาล ฟลาโวนอยด์ วิตามินเอ วิตามินซี กรดและเอนไซม์ โดยเฉพาะเอนไซม์ไฟเซน (fician หรือ ficin) ในประเทศไทยพบมะเดื่อหลายสายพันธุ์ทั้งที่เป็นพันธุ์พื้นเมืองดังเดิมได้แก่ มะเดื่ออุทุมพร (Ficus racemosa) และมะเดื่อปล้อง (Ficus hispida) และสายพันธุ์ที่น าเข้ามาปลูกที่เรียกว่ามะเดื่อฝรั่ง ได้แก่สายพันธุ์ Ficus grabrata และ Ficus carica ในปัจจุบันงานวิจัยเกี่ยวกับเอนไซม์ไฟเซนใน มะเดื่อจะเป็นงานวิจัยในกลุ่มของมะเดื่อ Ficus grabrata และ Ficus carica ในขณะที่ในมะเดื่อ ปล้องมีรายงานค่อนข้างน้อย ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงมีความสนใจที่จะท าท าการศึกษาเอนไซม์ไฟเซน ซึ่งเป็นเอนไซม์ในกลุ่มซีสเตอีน โปรติเนสในมะเดื่อปล้องโดยท าการแยกให้บริสทุ ธิ์โดยใช้เทคนิค covalent chromatography และท าการศึกษาลักษณะเฉพาะบางส่วนของเอนไซม์ไฟเซน

33 มะเดื่อปล้อง มีชื่อวิทยาศาสตร์คือ Ficus hispida L. เป็นสายพันธุ์ที่พบในประเทศไทย โดยพบได้ทั่วไปทุกภาค ลักษณะของผลจะมีขนาดเล็กกว่ามะเดื่ออุทุมพร (รูปที่ 4.4 ก) ผลและใบ จะมีขนเล็กๆ เมื่อจับจะรู้สึกสาก ล าต้นมีลักษณะเป็นปล้องๆ ดังแสดงในรูปที่ 4.4 ข เอนไซม์ที่พบ ในมะเดื่อคือเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส ที่เรียกว่า ไฟเซน (fician หรือ ficin)

ก ข

รูปท่ี 4.4 ลักษณะของมะเดื่อปล้อง (Ficus hispida L.) ผลมีขนาดเล็กและล าต้นเป็นปล้องๆ

เมื่อน ามะเดื่อปล้องผลดิบทั้งผลมาแยกเอนไซม์ พบว่าปริมาณของ crude เอนไซม์และ โปรตีนที่แยกได้มีปริมาณน้อยมาก ประกอบกับมีรายงานวิจัยหลายฉบับได้รายงานว่าเอนไซม์ ไฟเซนในมะเดื่อจะพบในส่วนของน ้ายาง ดังเช่นในรายงานวิจัยของ Devaraj และคณะ, 2008 ได้ท าการศึกษา thermostable aspartic protease จากยางของ Ficus racemosa L.; Chetia และ คณะ ในปี 1998 ได้ท าการศึกษาเอนไซม์โปรติเนสจากยางของ Ficus hispida L. ดังนั้น คณะผู้วิจัยจึงได้ท าการทดลองสกัดยางจากผลมะเดื่อปล้องหลายวิธี ดังนี้ กรีดยางจากผลบีบเอา ยางออกมา กรีดยางแล้วแช่ในฟอสเฟต บัฟเฟอร์ pH 6.0 และเปรียบเทียบกับน าทั้งผลมาสกัด เอนไซม์ พบว่าในยางของมะเดื่อปล้องจะมีเอนไซม์โปรติเนสในปริมาณสูงกว่าในผลมะเดื่อปล้อง เมื่อน ามาตรวจวิเคราะห์บน SDS-PAGE (รูปที่ 4.5) พบว่าใน crude เอนไซม์จากมะเดื่อปล้องจะ ให้แถบโปรตีนมากกว่า 1 แถบมีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 23,000 ถึง 45,000 ดาลตัน จึงได้น า ยางจากมะเดื่อปล้องมาท าการศกึ ษาท าให้บริสทุ ธิ์ตอ่ ไป

รูปท่ี 4.5 รูปแบบของโปรตีนที่ได้จากยางมะเดื่อและผลมะเดื่อ แยกโดยใช้วิธี SDS-PAGE 1 โปรตีนมาตรฐาน 2 crude enzyme จากผลมะเดื่อตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต 3 crude enzyme จากผลมะเดื่อตกตะกอน ด้วย acetone 4 crude enzyme จากยางมะเดื่อ 5 crude enzyme จากยางมะเดื่อ ตกตะกอนด้วย acetone 6 โปรตีนมาตรฐาน

4.5 การตรวจสอบความบริสุทธ์ิของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส โดยวิธี Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) เมื่อน าเอนไซม์ไฟเซนจากยางของมะเดื่อปล้องมาท าให้บริสทุ ธิ์โดยใช้เทคนิค covalent chromatography ผ่านคอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B และน าไปตรวจสอบความบริสทุ ธิ์ ด้วยวิธี SDS-PAGE (รูปที่ 4.6) พบว่าเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องให้โปรตีน 4 แถบน ้าหนัก โมเลกุลอยู่ในช่วง 23,000 ถึง 45,000 ดาลตัน ซึ่งสอดคล้องกับรายงานวิจัยที่รายงานว่า องค์ประกอบเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อจะอยู่ในรูปของ multiple forms (Chetia และคณะ 1998; Devaraj และคณะ 2008; Williams และคณะ 1968; Williams และ Whitaker 1969) และมี รายงานว่าเอนไซม์ไฟเซนเป็นโปรตีนในกลุ่มไกลโคโปรตีน (Friedenson และ Liener, 1974; Misenheimer และคณะ, 2001) จึงน าเอนไซม์จากมะเดื่อปล้องไปตรวจสอบไกลโคโปรตีนต่อไป

35 รูปท่ี 4.6 SDS-PAGE ของเอนไซม์ซีสเตอีนโปรติเนสที่ผ่านการท าให้บริสุทธ์จาก Thiopropyl Sepharose 6B covalent column 1 โปรตีนมาตรฐาน 2 purified fraction from Thiopropyl Sepharose 6B column

3 glycoprotein staining 4.6 การต

4.6 ผลการวิเคราะห์ไกลโคโปรตีน (glycoprotein) เมื่อน าเอนไซม์ที่ผ่านคอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B มาตรวจสอบไกลโคโปรตีน โดย ใช้ชุดทดสอบ GelCode® Glycoprotein Staining พบว่าโปรตีนทั้ง 4 แถบ มีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ ในช่วง 23,000 ถึง 45,000 ดาลตัน และเมื่อน ามาย้อมสีจะได้สีชมพูแสดงว่าโปรตีนทั้ง 4 แถบเป็น ไกลโคโปรตีน แสดงว่าเอนไซม์ซีสเตอีนโปรติเนสที่อยู่ในมะเดื่อปล้องอยู่ในรูป multiple forms จากนั้นได้คัดเลือกโปรตีนที่มีน ้าหนักโมเลกุล 23,000 ดาลตัน ไปวิเคราะห์โปรตีนโดยเครื่อง MALDI-TOF MS และ LC/MS-MS ต่อไป เนื่องจากมีรายงานวิจัยหลายฉบับที่รายงานว่าเอนไซม์ ไฟเซนในมะเดื่อจะมีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วงนี้ (Devaraj และคณะ 2008)

4.7 ผลการตรวจวิเคราะห์โปรตีนโดยเครื่อง MALDI-TOF MS และ LC/MS-MS เมื่อน าโปรตีนที่มีน ้าหนักโมเลกุลเท่ากับ 23,000 ดาลตัน ไปวิเคราะห์โปรตีนด้วยเครื่อง MALDI-TOF MS และ LC/MS-MS พบว่าเมื่อท าการวิเคราะห์ MALDI-TOF MS เอนไซม์ไฟเซน จากมะเดื่อปล้อง ไม่สามารถเทียบเคียงกับข้อมูลในฐานข้อมูลได้ จึงท าการวิเคราะห์โปรตีนโดย เครื่อง LC/MS-MS พบว่าเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องมีล าดับของกรดอะมิโน จ านวน 55 ตัว ที่ ความคล้ายคลึงกับ Chain A จาก Carica papaya chymopapain (รูปที่ 4.7)

YPQSIDWRAKGAVTPVKNQGACGSXWAFSTIATVEGINKIVTG NLLELSEQELVDCDKHSYGCKGGYQTTSLQYVANNGVHTSKVY PYQAKQYKCRATDKPGPKVKITGYKRVPSNXETSFLGALANQP LSVLVEAGGKPFQLYKSGVFDGPCGTKLDHAVTAVGYGTSDGK NYIIIKNSWGPNWGEKGYMRLKRQSGNSQGTCGVYKSSYYPFK GFA

รูปท่ี 4.7 ล าดับของกรดอะมิโนจากไฟเซนจากมะเดื่อปล้องที่ Matched กับ Chain A จาก Carica papaya chymopapain (ตัวอักษรสีแดง)

จึงได้น าล าดับกรดอะมิโนของ chymopapain มาท านายโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ chymopapain โดยใช้โปรแกรม Discovery Studio Visualizer 2.01, Accelrys® ได้โครงสร้าง สามมิติดังแสดงในรูปที่ 4.8 ข เพื่อที่จะได้เป็นแม่แบบในการน ากรดอะมิโนจ านวน 55 ตัวที่ได้จาก เอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องมาเทียบเคียง ผลจากการเทียบเคียงพบว่า กรดอะมิโนจากมะเดื่อ ปล้อง(รูปที่ 4.8 ก) มีความใกล้เคียงในบริเวณ A B และ C จากข้อมูลดังกล่าวแสดงว่าเอนไซม์ไฟ เซนมีบริเวณที่มีโครงสร้างสามมิติที่คล้ายคลึงกับ chymopapain เนื่องจากว่า catalytic site ของ เอนไซม์ไฟเซน มีโครงสร้างเหมือนกับโครงสร้างของ chymopapain

ก ข

รูปท่ี 4.8 การเปรียบเทียบการเรียงล าดับกรดอะมิโนของเอนไซม์ไฟเซน (A, B และ C) ที่มีชนิด ของกรดอะมิโนที่เหมือนกับเอนไซม์ chymopapain ซึ่งแสดงด้วยบริเวณสีเขียว น ้าเงินและเหลือง ตามล าดับ ก; คือ กรดอะมิโนจากไฟเซนจากมะเดื่อปล้อง บริเวณสี เขียว น ้าเงินและเหลือง ข; โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ chymopapain;α-helices และ β-strands แสดงด้วย สีน ้าเงิน

37 4.8 ผลของสารยับยัง้ การทา งานของเซรีนโปรตเิ นสบริสุทธ์ิ จากการศึกษาเบื้องต้นผลของสารยับยั้งต่อการท างานของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จาก มะเดื่อปล้อง พบว่าสาร 2PDS และ iodoacetamide ที่ความเข้มข้น 1 และ 10 มิลลิโมลาร์ สามารถยับยั้งการท างานของเอนไซม์ได้โดยไม่เกิด blue zone ในขณะที่สาร PMSF ที่ความ เข้มข้น 1 และ 10 มิลลิโมลาร์ ไม่สามารถยับยั้งการท างานของเอนไซม์ได้โดยสังเกตจาก blue zone ที่เกิดขึ้น (ตารางที่ 4.4) แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องเป็นเอนไซม์ในกลุ่ม ซีสเตอีน โปรติเนส เนื่องจาก 2PDS และ iodoacetamide เป็นสารยับยั้งที่ยับยั้งเฉพาะเอนไซม์ใน กลุ่มซีสเตอีน โปรติเนส ในขณะที่ PMSF เป็นสารยับยั้งเอนไซม์เซรีน โปรติเนส

ตารางที่ 4.4 ผลของสารยับยั้งที่มีต่อเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากมะเดื่อปล้อง Inhibitor Concentration proteinase activity on* (mM) AZCL-Casein plate None - + PMSF 1 + 10 + 2PDS 1 - 10 - Iodoacetamide 1 - 10 - หมายเหตุ +, positive with AZCL-casein plate -, negative with AZCL-casein plate

4.9 การศึกษาการย่อยซับสเตรตสังเคราะห์ของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส เมื่อตรวจวัดแอคติวิตีของเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้อง ด้วยซับสเตรตสังเคราะห์ 5 ชนิด คือ Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl- Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide และ N-Benzoyl-L- Arginine-p-nitroanilide hydrochloride (LBAPNA) พบว่าเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้อง สามารถย่อย ซับสเตรตสังเคราะห์ ทั้ง 5 ชนิดได้แตกต่างกัน โดยสามารถย่อย Gyl-Arg-p- nitroanilide dihydroxychloride และ LBAPNA ได้ดีที่สุด รองลงมาซับสเตรต Ala-Ala-Phe- p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p- nitroanilide สามารถย่อยได้ดีตามล าดับ จากผลการย่อยซับสเตรตสังเคราะห์แสดงให้เห็นว่า

38 ต าแหน่ง subsite P1 ของเอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องมีความจ าเพาะส าหรับกรดอะมิโน arginine มากกว่า phenylalanine เนื่องจากสามารถย่อยได้ดีกว่า แสดงถึงเอนไซม์มีความจ าเพาะ กับซับสเตรตมากกว่า สามารถเข้าจับได้ดีกว่าจึงมีการย่อยซับสเตรตในปริมาณสูง

บทที่ 5

สรุปการวิจัยและข้อเสนอแนะ

จากทดลองสามารถสรุปผลการทดลองได้ดังนี้ 1. จากการน าตัวอย่างผลไม้ จ านวน 42 ตัวอย่าง และตัวอย่างผักจ านวน 73 ตัวอย่าง มาตรวจสอบประสิทธิภาพการย่อยโปรตีนบน AZCL-casein plate เพื่อคัดเลือกแหล่ง ของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส พบว่าตัวอย่างจากผลไม้ให้ผลบวก จ านวน 17 ตัวอย่าง ได้แก่ ขนุน ซังขนุน เมล็ดขนุน ละมุดไทย ละมุดมาเลย์ สาเก แคนตาลูปซันเลดี้ (เนื้อ) แคนตาลูป ซันเลดี้ (เปลือก) แคนตาลูป (เขียวมรกต) แคนตาลูป (Japanese melon) แคนตาลูป (เมลอน สีทอง) แคนตาลูป (นีออน) แตงไทยอ่อนทั้งเนื้อและเปลือก เงาะโรงเรียน (เนื้อ) มะเดื่อปล้อง และมะเดื่ออุทุมพร 2. ตัวอย่างผักให้ผลบวก จ านวน 39 ตัวอย่างจากทั้งหมด 73 ตัวอย่าง ตัวอย่างผักที่ให้ blue zone กว้าง ได้แก่ บวบงู ผักสลัด ผักกาดกวางตุ้ง บวบหอม มะเขือเหลือง มะเขือม่วง และ มะแว้ง 3. ตัวอย่างที่ให้ความสนใจน ามาศึกษาต่อ เช่น ตัวอย่างจากผลไม้ได้แก่ ขนุน แคนตาลูปสายพันธุ์ต่างๆ มะเดื่อสายพันธุ์ต่างๆ ส าหรับตัวอย่างจากผัก เช่น บวบงู ผักสลัด มะแว้ง เป็นต้น 4. การตรวจสอบชนิดของเอนไซม์โปรติเนส โดยใช้สารยับยั้งชนิดต่างๆ ผลการทดลอง พบว่าเอนไซม์จากมะเดื่ออุทุมพรและมะเดื่อปล้องอยู่ในกลุ่มซีสเตอีน โปรติเนส เนื่องจากถูกยับยั้ง ด้วย 2,2 Dipyridyl disulphide (2PDS) และ iodoacetamide จึงเลือกมะเดื่อมาท าการศึกษา เนื่องจากโปรตีนจากตัวอย่างอื่นจะเป็นเอนไซม์ในกลุ่มเซรีน โปรติเนส 5. จากการศึกษาเอนไซม์จากผลมะเดื่อได้ท าการทดลองเป็น 2 ระยะ ดังนี้ ระยะที่ 1 ท าการศึกษาเอนไซม์ในผลมะเดื่ออุทุมพรผลสุก พบว่ามีปริมาณ เอนไซม์น้อยมาก มีสารจ าพวกคาร์โบไฮเดรตจ านวนมาก ระยะที่ 2 ศึกษาเอนไซม์ในผลและยางของมะเดื่อปล้องผลดิบ พบว่าในยางของ มะเดื่อปล้องผลดิบมีปริมาณเอนไซม์มากกว่าในมะเดือปล้องทั้งผล จึงได้ศึกษาเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจากยางมะเดื่อปล้อง

40 6.เมื่อน ายางจากมะเดื่อปล้อง มาแยกให้บริสทุ ธิ์โดยตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียม ซัลเฟตอิ่มตัวร้อยละ 80 และน ามาแยกให้บริสทุ ธิ์ด้วยเทคนิค covalent chromatography ผ่าน คอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B เมื่อน าไปตรวจสอบความบริสทุ ธิ์ด้วย SDS-PAGE พบ โปรตีน 4 แถบ น ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 23,000 ถึง 45,000 ดาลตัน 6. เมื่อวิเคราะห์ glycoprotein พบว่าโปรตีนทั้ง 4 แถบ ให้แถบสีชมพูแสดงว่าเป็นไกลโค โปรตีน แสดงว่าเอนไซม์ที่แยกได้จากมะเดื่อปล้องน่าจะเป็นเอนไซม์ในกลุ่มไฟเซน เนื่องจากมี รายงานว่าเอนไซม์ไฟเซนมีสมบัติเป็นไกลโคโปรตีน และอยู่ในรูปของ multiple forms 7. เมื่อตัดเอนไซม์จากแถบโปรตีนที่ประมาณ 23000 ดาลตัน จาก SDS-PAGE ส่งไป วิเคราะห์โปรตีนด้วยเครื่อง MADTI- TOF MS และ LC/MS-MS พบว่า เอนไซม์ไฟเซน จากมะเดื่อ ปล้องมี ล าดับของกรดอะมิโน 55 ตัว ที่ความคล้ายคลึงกับ Chain A จาก Carica papaya chymopapain 8. เมื่อน าล าดับของกรดอะมิโน 55 ตัว ที่ได้จากโปรตีน 23}000 ดาลตัน ไปเทียบเคียงกับ โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ Chymopapain เพื่อท านายการขดตัวม้วนตัวของไฟเซน ผลที่ได้ จากการเทียบเคียง พบว่ากรดอะมิโนจากเอนไซม์ไฟเซนมีบริเวณที่มีโครงสร้างสามมิติที่คล้ายคลึง กับเอนไซม์ Chymopapain 9. เอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องสามารถย่อยซับสเตรตสังเคราะห์คือ Gyl-Arg-p- nitroanilide dihydroxychloride และ N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride ได้

ดีทีสุด แสดงให้เห็นว่าต าแหน่ง subsite P1 เซรีน โปรติเนสมีความจ าเพาะส าหรับกรดอะมิโน arginine ในขณะที่พบว่าสามารถย่อย Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe- p-nitroanilide และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide ได้ดีตามล าดับ

เอกสารอ้างอิง

Abe, K., Kondo, H. and Arai, S. 1987. Purification and proteinase of a cysteine proteinase from germinating rice seeds. Agric.Biol.Chem. 51(6) : 1509-1514. Aehle, W., Sobek, H. and Schomburg, D. 1995. Evaluation of protein 3-D structure prediction: comparison of modelled and X-ray structure of an alkaline serine protease. J. Biotechnol. 41 : 211-219. Anson, M.L. 1938. Estimation of pepsin, papain and cathepsin with hemoglobin. Journal of General Physic. 22 : 79- 89. Brocklehurst, K., Carlsson, J., Kierstan, M.P.J. and Crook, E.M. 1973. Preparation of fully active papain from dried papaya latex. Biochem.J. 133 : 573-584. Buttle, D.J., Kembhavi, A.A., Sharp, S.L., Shute, R.E., Rich, D.H. and Barrett, A.J. 1989. Affinity purification of the novel cysteine proteinase papaya proteinase IV, and papain from papaya latex. Biochem J. 261(2):469-476. Chetia, D., Nath, L.K. and Dutta, S.K. 1999. Extraction, purification and physic-chemical properties of proteolytic enzyme from the latex of Ficus hispida Linn. Indain Journal of Phamaceutical Sciences. 61 : 29-33. Cormier, F., Charest, C. and Dufresne, C. 1989. Partial purification and properties of proteases from fig Ficus carica callus cultures. Biotechnology Letters. 11 : 797-802. Devaraj, K.B., Kumar, P.R. and Prakash, V. 2008. Purification, characterization, and solvent- induced thermal stabilization of ficin from Ficus carica. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 : 11417-11423. Drenth, J., Jansonius, J.N., Koekoek, K., Sluyterman, L.A.A., Wolthers, B.G. 1970. The structure of the papain molecule. Philos.Trans.R.Soc.London,Ser.B. 257:231. Freitas, C.D.T., Oliveira, J.S., Miranda, M.R.A., Macedo, N.M.R., Sales, M.P., Villas-Boas, L.A., and Ramos, M.V. 2007. Enzymatic activities and protein profile of latex from Calotropis procera. Plant Physiology and Biochemistry. 45: 781-789.

42 Friedenson, B. and Liener, I.E. 1974. Evidence that ficin is a glycoproteine. Biochim Biophys Acta. 342(1) : 209-212. Grudkowska, M. and Zagdanska. 2004. Multifunctional role of plant cysyeine proteinases. Acta Biochimica Polonica. 51(3): 609-624. Helle, O. and Boyce, C.O., 1990, “Microbial proteinase and biotechnology”. Microbial Enzyme and Biotechnology, 2nd ed., New York, USA : Elsevier Applied Science, pp. 240- 241 Jiang, S-T., Lee, J-J. and Chen, H-C. 1994. Purification and characterization of a novel cysteine proteinase from Mackerel (Scomber australasicus). J. Agric. Food Chem. 42:1639-1646. Kramer, D.E. and Whitaker J.R. 1969. Ficin-catalyzed reactions. hydrolysis of α-N-benzoyl-L- arginine-ethyl ester and -N-benzoyl-L-argininamide. Plant Physiol. 43 : 609-614. Kumar, C.G. and Takagi, H. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnology Advances. 17:561-594. Kundu, S., Sundd, M. and Jagannadham, M.V. 2000. Purification and characterization of a stable cysteine protease Ervatamin B with two disulfide bridges, from the latex of Ervatamia coronaria. J. Agric. Food Chem. 48(2):171-179. Kyndt, T., Van Damme, E.J.M., Beeumen, J.V. and Gheysen. 2007. Purification and characterization of the cysteine proteinases in the latex of Vasconcellea spp. FEBS Journal. 274:451-462. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685. Maes, D., Bouckaert, J., Poortmans, F., Wynns, L. and Looze, Y. 1996. Structure of chymopapain at 1.7 Å resolution. Biochemistry. 35(50) : 16292-16298. Misenheimer, T.M., Hahr, A.J., Harms, A.C., Annis, D.S. and Mosher, D.F. 2001. Disulfide connectivity of recombinant c-terminal region of human thrombospondin. J. Biol. Chem. 276: 45882 – 45887. Noda, K., Koyanagi, M. and Kamiya, C. 1994. Purification and characterization of an endoprotease from melon fruit. J. of Food Science. 59(3):585-587.

43 Paul, J., Malthouse, G. and Brocklehurst, K. 1976. Preparation of fully from Ficus glabrata by covalent chromatography and characterization of its active centre by using 2,2- dipyridyl disulphide as a reactivity probe. Biochem. J. 159 : 221-234. Person, M.D., Chaimbault, P. and Elfakir C. 2007. Analysis of native amino acids by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry: comparative study between two sources and interfaces. Journal of Mass Spectrometry. 43(2) : 204-215. Rowan, A.D., Buttle, D.J. and Barrett, A.J. 1990. The cysteine proteinase of the pineapple plant. Biochem J. 266:869-875. Surapong, P. 1996. Gradation in active centre characteristics of four cysteine proteinase variants of the papain family. Thesis for the degree of Doctor of Philosophy of the University of London. Vallés, D., Furtado, S. and Cantera, A.M.B. 2007. Characterization of news proteilytic enzymes from ripe fruits of Bromelia antiacantha Bertol.(Bromeliaceae). Enzyme and Microbial Technology. 40:409-413. Walker, A.J., Glen, D.M., and Shewry, P.R. 1998. Purification and characterization of a digestive cysteine proteinase from the field slug(Deroceras reticulatum): A potential target for slug control. J. Agric. Food Chem. 46(7):2873-2881. Williams, D.C., Sgarbieri, V.C., and Whitaker J.R. 1968. Proteolytic activity in the genus ficus. Plant Physiol. 43 :1083-1088. Williams, D.C. and Whitaker J.R. 1969. Mutiple molecular forms of Ficus glabrata ficin. Their separation and relative physical, chemical, and enzymatic properties. Plant Physiol. 44:1574-1583. Yamagata, H., Masuzawa, T., Nagaoka, Y., Ohnishi, T. and Iwassaki, T. 1994. Cucumsin, a serine protease from melon fruits, shares structural homology with subtilisin and is generated from a large precursor. Journal of Biological Chemistry. 269 : 32725-32731.

ภาคผนวก ก

1. สารเคมีที่ใช้ในการทดลอง 1. Acetic acid(Carlo Erba) 2. Acrylamide(Phamacia Biotechnology) 3. Agar (Difco Laboratories) 4. Ammonium persulfate (Carlo Erba) 5. Ammonium sulfate (Carlo Erba) 6. Bovine serum albumin (Sigma Chemical Co.,) 7. Bromphenol Blue(Sigma Chemical Co.,) 8. Casein (Sigma Chemical Co.,) 9. Coomassie Brilliant Blue G-250(GE HealthCare, USA) 10. Dialysis bag (Spectrum Laboratories) 11. Dimethylsulfoxide(Merck KGaA) 12. Ethylenediaminetetraacetic acid (Fluka Chemical) 13. Ethanol (Merck KGaA) 14. Folin-Ciocalteu’s reagent (Sigma Chemical Co.,) 15. Glycine (Sigma Chemical Co.,) 16. Hydrochloric acid (Merck KGaA) 17. Hydrogen peroxide (Merck KGaA) 18. Iodoacetamide (Fluka Chemical) 19. 2-Mercaptoethanol (Sigma Chemical Co.,) 20. Methanol (Merck KGaA) 21. N, N'-Methylene-bis acrylamide (Phamacia Biotechnology) 22. Molecular weight standard marker (Pierce, USA) 23. Phenylmethylsulfonyl fluoride (Fluka Chemical) 24. Potassium sodium tartrate(Carlo Erba) 25. Silver stain kits(Phamacia Biotechnology)

26. Sodium carbonate (Merck KGaA) 27. Sodium chloride (Merck KGaA) 28. Sodium dodecyl sulfate (Sigma Chemical Co.,) 29. Sodium hydrogen carbonate (Merck KGaA) 30. Sodium hydrogen phosphate (Merck KgaA) 31. Sodium hydroxide (Carlo Erba) 32. Sodium phosphate (Carlo Erba) 33. N,N,N',N'-tetramethyethylenediamine (TEMED)(Phamacia Biotechnology) 34. Trichloroacetic acid (Carlo Erba) 35. Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (Merck KGaA)

ภาคผนวก ข

การเตรียมสารเคมี และวิธีการทดสอบ 1. การวิเคราะห์ปริมาณโปรตีน ตามวิธีของ Lowry (1951) สารเคมี 1. รีเอเจนท์ (Reagent) รีเอเจนท์ A โซเดียมคาร์บอนเนต 10 กรัมในสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ ความเข้มข้น 0.1 นอร์มอล ปริมาตร 500 มิลลิลิตร รีเอเจนท์ B คอปเปอร์ซัลเฟต 0.5 กรัม ในสารละลายโพแทสเซียมโซเดียมตราเตรท (ร้อยละ 1) ปริมาตร 100 มิลลิลิตร รีเอเจนท์ C ผสม reagent A กับ reagent B ในอัตราส่วน 50:1 (เมื่อต้องการใช้ภายใน 1 วัน) 2. Folin-ciocalteu reagent น ามาเจือจางด้วยน ้ากลั่นอัตราส่วน 1:1 3. bovine serum albumin (BSA) วิธีทดลอง 1.1 การเตรียมกราฟมาตรฐานของโปรตีน เตรียมสารละลาย bovine serum albumin (BSA) ที่ความเข้มข้น 0, 50, 100, 150, 200 และ 250 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร บรรจุในหลอดทดลองหลอดละ 1.0 มิลลิลิตร เติมสารรี เอเจนท์ C หลอดละ 5.0 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันทิ้งไว้เป็นเวลา 10 นาที หลังจากนั้นเติมสารโฟลิ นรีเอเจนต์ลงไปหลอดละ 0.5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันทิ้งไว้ นาน 30 นาที จากนั้นน าไป วัดค่าการ ดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 660 นาโนเมตร ด้วยเครื่องสเปคโตรโฟโตมิเตอร์ (Spectrophotometer) สร้างกราฟมาตรฐานระหว่างค่าการดูดกลืนแสงกับความเข้มข้นของ สารละลาย BSA ที่ความเข้มข้นต่างๆ ดังกล่าวข้างต้น 1.2 การวิเคราะห์ปริมาณโปรตีนของสารละลายตัวอย่าง 1. น าสารตัวอย่างปริมาตร 1.0 มิลลิลิตรในหลอดทดลอง 2. เติม รีเอเจนท์ C ปริมาตร 5.0 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันตั้งทิ้งไว้ 10 นาที 3. เติม Folin-ciocalteu reagent ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันตั้งทิ้งไว้ 30 นาที

4. น าไปวัดค่าการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่น 660 นาโนเมตร โดยวัดเปรียบเทียบ กับ blank ที่ใช้น ้ากลั่นแทนสารตัวอย่าง อ่านค่าความเข้มข้นของโปรตีนจากกราฟ มาตรฐาน

2. การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์โปรติเนสดัดแปลงจากวิธีของ Anson (1938) สารเคมี 1. 0.4 M Trichloroacetic acid (TCA) : กรดไตรคลอโรอะซีติก 16.35 กรัม ละลายใน น ้ากลั่น ปรับปริมาตรเป็น 250 มิลลิลิตร

2. 0.4 M Na2CO3 : โซเดียมคาร์บอเนต 10.60 กรัม ละลายในน ้ากลั่น ปรับปริมาตรเป็น 250 มิลลิลิตร 3. 50 มิลลิโมลาร์ คาร์บอเนต-ไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 10.0 : A : 50 mM solution of anhydrous sodium carbonate : แอนไฮดรัสโซเดียม คาร์บอเนต 1.32 กรัม ละลายในน ้ากลั่น ปรับปริมาตรเป็น 250 มิลลิลิตร B : 50 mM solution of sodium bicarbonate :โซเดียมไบคาร์บอเนต 1.05 กรัม ละลายในน ้ากลั่น ปรับปริมาตรเป็น 250 มิลลิลิตร ดูดสารละลาย A มา 27.5 มิลลิลิตร และสารละลาย B มา 22.5 มิลลิลิตร ผสมให้ เข้ากัน 4. Casein ร้อยละ 0.5 : เคซีน 0.5 กรัม ละลายใน 50 มิลลิโมลาร์ คาร์บอเนต-ไบ คาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 10.0 แล้วอุ่นด้วยความร้อน พร้อมทั้งคนเบาๆ เพื่อให้เคซีนละลาย แล้ว ปรับปริมาตรเป็น 100 มิลลิลิตร 5. Folin-ciocalteu reagent น ามาเจือจางด้วยน ้ากลั่น ในอัตราส่วน 1:1 6. L-Tyrosine ความเข้มข้น 100 g/ml : ไทโรซีน 0.01 กรัม ละลายในน ้ากลั่น 7-8 มิลลิลิตร ค่อยๆ เติม 0.1 N NaOH กวนจนไทโรซีนละลายหมด ปรับปริมาตรเป็น 10 มิลลิลิตร แล้วเจือจางความเข้มข้นลง 10 เท่า วิธีการทดลอง 1.1. การเตรียมกราฟมาตรฐานของ L-Tyrosine เตรียมสารละลาย L-Tyrosine ที่มีความเข้มข้น 0, 10, 20, 30, 40, 50, และ 60 ไมโครกรัม ต่อมิลลิลิตร บรรจุในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มิลลิลิตร เติม 0.4 โมลาร์ โซเดียมคาร์บอเนต หลอดละ 1.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน หลังจากนั้นเติมสารฟอลินรีเอเจนต์ (Folin-ciocalteu

reagent) ลงไปหลอดละ 0.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน ทิ้งไว้นาน 10 นาที หลังจากนั้นน าไปวัดค่า การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 660 นาโนเมตร ด้วยเครื่องวัดการดูดกลืนคลื่นแสง สร้างกราฟ มาตรฐานระหว่างค่าการดูดกลืนแสงกับความเข้มข้นของสารละลาย L-Tyrosine ที่ความเข้มข้น ต่างๆ

1.2. การวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์โปรติเนสจากสารละลายตัวอย่าง 1. บรรจุสารละลายเคซีนในหลอดทดลองหลอดละ 1.25 มิลลิลิตร ตั้งแช่ไว้ในอ่างน ้าร้อน อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส แล้วเติมเอนไซม์ลงในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มิลลิลิตร ใช้น ้า กลั่นเป็น blank แทนสารละลายเอนไซม์ 2. บ่มเอนไซม์ไว้ในอ่างน ้าร้อนอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที 3. หยุดปฏิกิริยาด้วยกรดไทรคลอโรอะซีติก (0.4 M TCA) 1.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน วางทิ้งไว้นาน 5 นาที 4. น าไปปั่นที่ความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที 5. น าสารละลายส่วนใสบรรจุในหลอดทดลองหลอดละ 0.25 มิลลิลิตร 6. เติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (0.4 M) ปริมาตร 1.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน 7. เติม Folin reagent (1:1) ปริมาตร 0.25 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันตั้งทิ้งไว้ 10 นาที 8. น าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 660 นาโนเมตร โดยวัดเปรียบเทียบกับ blank ที่ใช้น ้ากลั่นแทนสารละลายเอนไซม์ อ่านค่าความเข้มข้นของ L-Tyrosine จากกราฟ มาตรฐาน

3. การเตรียมสารที่ใช้สาหรับทดสอบด้วยเทคนิค electrophoresis 3.1 SDS-PAGE ชุด Electrophoresis ของบริษัท Hoefer scientific instruments ประเทศสหรัฐอเมริกา สารเคมี 1. Seperating gel (ร้อยละ 12) Acrylamide (ร้อยละ 30) 5.0 มิลลิลิตร Tris-HCl (1.5 โมลาร์ pH 8.8) 3.8 มิลลิลิตร SDS (ร้อยละ 10) 160.0 ไมโครลิตร น ้ากลั่น 6.0 มิลลิลิตร ไล่อากาศ 10 นาที

แอมโมเนียมเปอร์ซัลเฟต(ร้อยละ30) 20.0 ไมโครลิตร N,N,N’,N’ -tetramethylenediamine (TEMED) 20.0 ไมโครลิตร 2. Stacking gel (ร้อยละ 5) Acrylamide (ร้อยละ 30) 0.825 มิลลิลิตร Tris-HCl (0.5 โมลาร์ pH 6.8) 0.625 มิลลิลิตร SDS (ร้อยละ 10) 50.0 ไมโครลิตร น ้ากลั่น 3.45 มิลลิลิตร แอมโมเนียมเปอร์ซัลเฟต (ร้อยละ 30) 10.0 ไมโครลิตร TEMED 10.0 ไมโครลิตร 3. Sample buffer น ้ากลั่น 3.8 มิลลิลิตร Tris-HCl (0.5 โมลาร์ pH 6.8) 1.0 มิลลิลิตร กลีเซอรอล 0.8 มิลลิลิตร SDS (ร้อยละ 10) 1.6 มิลลิลิตร -mercaptoethanol 0.4 มิลลิลิตร Bromophenol blue 0.4 มิลลิลิตร 4. Electrode buffer เข้มข้น 5 เท่า Tris 45.0 กรัม ไกลซีน 216.0 กรัม SDS 15.0 กรัม น ้ากลั่น 3.0 ลิตร เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ก่อนน าไปใช้เจือจาง electrode buffer (5X) ปริมาตร 70 มิลลิลิตร ด้วยน ้ากลั่นให้มีปริมาตรเป็น 350 มิลลิลิตร 5. ชุดสีย้อม Silver stain kits protein (Amersham Bioscience, Sweden) ประกอบด้วย

- EDTA-Na2 - Glutadialdehyde 25% - Sodium carbonate - Silver nitrate 2.5%

- Sodium acetate - Sodium Thiosulphate 5% วิธีทดลอง 1. ยึดแม่พิมพ์ที่ประกอบด้วยแผ่นกระจกและแผ่นเซรามิคกับแท่นเตรียมเจลให้แน่น โดยมี แผ่นพลาสติกบางขนาดเล็กสอดด้านข้างระหว่างแผ่นกระจกและแผ่นเซรามิค เพื่อให้เกิดช่องว่าง ส าหรับเทเจล 2. ผสม seperating gel (ร้อยละ 12) เทลงในแม่พิมพ์ ให้มีพื้นที่ส่วนบนเหลืออยู่ประมาณ 1 นิ้ว ปล่อยทิ้งไว้ให้เจลแข็งตัวที่อุณหภูมิห้อง 3. ผสม stacking gel (ร้อยละ 5) เททับลงบน seperating gel ในแม่พิมพ์จนสุดขอบ ด้านบนของกระจก สอดแผ่นพลาสติกบางที่มีลักษณะเป็นซี่ฟันลงใน stacking gel ที่ยังไม่แข็งตัว เพื่อให้เกิดช่องว่างส าหรับใส่ตัวอย่างโปรตีนที่ต้องการทดสอบ ปล่อยทิ้งไว้ให้เจลแข็งตัวที่ อุณหภูมิห้อง 4. ถอดแผ่นพลาสติกบางที่มีลักษณะเป็นซี่ฟันออกจากเจล น าเจลรวมทั้งแม่พิมพ์ออก จากแท่นยึด ติดตั้งเข้ากับชุดทดสอบโดยให้ด้านล่างของเจลจุ่มอยู่ใน electrode buffer เติม electrode buffer ลงในช่องว่างระหว่างเจลสองแผ่นจนท่วมผิวด้านบนของเจล 5. เตมิ ตวั อยา่ งโปรตีนที่ต้องการทดสอบความบริสทุ ธิ์และหาขนาดโมเลกลุ ที่ต้มด้วย สารละลาย sample buffer ที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส นาน 3 นาที ทิ้งให้เย็นแล้วเติมลงใน ช่องว่างส าหรับใส่ตัวอย่างโปรตีนบริเวณส่วนบนของ stacking gel โดยท าพร้อมกับโปรตีน มาตรฐานที่ทราบขนาดโมเลกุล 6. ต่อขั้วไฟฟ้าของชุดทดสอบเข้ากับหม้อแปลงไฟฟ้ากระแสตรง ปรับให้มีความต่างศักย์ 100 โวลท์ และกระแสไฟประมาณ 10-15 มิลลิแอมแปร์ 7. ปล่อยให้ตัวอย่างโปรตีนเคลื่อนที่ไปภายในเจล จนสีของ bromophenol blue ที่เติมใน sample buffer เคลื่อนที่ลงไปจนสุดขอบล่างของเจล 8. ปิดกระแสไฟฟ้า น าเจลและแม่พิมพ์ออกจากชุดทดสอบ 9. ลอกเนื้อเจลออกจากแม่พิมพ์ 10. น าเจลที่ได้ไปย้อมด้วยสีย้อม silver stain 11. ล้างสีส่วนเกินออกโดยใช้ destain I นานประมาณ 1 ชั่วโมง 12. แช่เจลต่อใน destain II จนกระทั่งส่วนที่เป็น background ใส

5. กราฟมาตรฐานโปรตีนขนาดต่างๆ สาหรับ SDS-PAGE การตรวจสอบขนาดโมเลกุลของโปรตีนโดยเทคนิค SDS-PAGE สามารถค านวณได้จากค่า

Rf ซึ่งค านวณจากการวัดระยะทางจากแถบโปรตีนที่เคลื่อนที่จากหลุมด้านบนลงสู่เจลด้านล่างต่อ

ระยะทางที่ marker dye เคลื่อนที่ (แสดงดังสูตรข้างล่าง) จากนั้นจึงเขียนกราฟระหว่างค่า Rf กับ ค่า Log Molecular weight เพื่อค านวณหาขนาดโมเลกุลของแถบโปรตีนที่ปรากฏขึ้น

รปที่ ข.2 ค่า Rf ของโปรตีนมาตรฐาน

ภาคผนวก ค

ตารางที่ ค.1 การเตรียมแอมโมเนียมซัลเฟตที่มีความเข้มข้นอิ่มตัวร้อยละต่างกัน ณ อุณหภูมิ 0 องศาเซลเซียส

ภาคผนวก ง งานวิจัยที่น าเสนอผลงานวิจัยในงานประชุมสัมมนาวิชาการระดับนานาชาติ The 21st Annual Meeting and International Conference of Thai Society for Biotechnology (TSB) ในหัวข้อ”Biotechnology: A Solution to the Global Economic Crisis?” ในระหว่างวันที่ 24-25 กนั ยายน 2552 ณ ศนู ย์การประชมุ แหง่ ชาตสิ ิริกิติ์