PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CYSTEINE PROTEINASE FROM SOME VEGETABLES AND FRUITS MRS. RATCHANEE SAIPRAJONG ASSISTANT PROFESSOR DR.SURAPONG PINITGLANG ASSOCIATE PROFESSOR DR.KHANOK RATANAKHANOKCHAI THE RESEARCH WAS FINANCIALLY SUPPORTED BY UNIVERSITY OF THE THAI CHAMBER OF COMMERCE 2009 การทา ให้บริสุทธ์ิและลักษณะจา เพาะของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรตเิ นส จากผักและผลไม้ บางชนิด Purification and characterization of cysteine proteinase from some vegetables and fruits โดย รัชนี ไสยประจง สุรพงษ์ พินิจกลาง กนก รัตนะกนกชัย รายงานการวิจัยนี้ได้รับทุนส่งเสริมงานวิจัยจากมหาวิทยาลัยหอการค้าไทย พ.ศ. 2552 ก ชื่อเรื่อง : การท าให้บริสทุ ธิ์และลกั ษณะจ าเพาะของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรตเิ นส จากผกั และผลไม้บางชนิด ผู้วิจัย : รัชนี ไสยประจง สาขาวิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยหอการค้าไทย ผู้วิจัยร่วม : ผศ.ดร.สุรพงษ์ พินิจกลาง และ รศ.ดร.กนก รัตนะกนกชัย ปีที่แล้วเสร็จ : 2552 จ านวน 62 หน้า ค าส าคัญ : ซีสเตอีน โปรติเนส, Ficus hispida, ficain บทคัดย่อ* งานวิจัยมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส ในผักและ ผลไม้บางชนิด ท าการศึกษาในผลไม้จ านวน 42 ตัวอย่าง และผักจ านวน 73 ตัวอย่าง พบว่าผลไม้ ให้ผลบวก จ านวน 17 ตัวอย่าง และผักให้ผลบวก จ านวน 39 ตัวอย่าง เมื่อท าการตรวจสอบชนิด ของเอนไซม์โปรติเนสด้วยสารยับยั้ง พบว่าเอนไซม์โปรติเนสที่พบในตัวอย่างสามารถแบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือ เซรีน โปรติเนส และซีสเตอีน โปรติเนส ในงานวิจัยนี้ได้สนใจที่จะน าเอนไซม์ไฟเซนจาก มะเดื่อปล้อง (Ficus hispida L.) มาศกึ ษาแยกให้บริสทุ ธิ์ และลักษณะจ าเพาะบางส่วนเนื่องจากมี รายงานการศึกษาที่ยังไม่แพร่หลายมาก โดยน าไฟเซนจาก Ficus hispida มาแยกให้บริสทุ ธิ์โดย ตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตร้อยละ 80 และแยกให้บริสทุ ธิ์ในขนั้ ตอนเดียวด้วยเทคนิค covalent chromatography ผ่านคอลัมน์ Thiopropyl Sepharose 6B เอนไซม์ที่แยกได้จาก มะเดื่อปล้องถูกยับยั้งด้วย 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS) และ iodoacetamide แสดงว่าอยู่ ในกลุ่มซีสเตอีน โปรติเนส เมื่อน ามาหาน ้าหนักโมเลกุลโดยวิธี sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) พบว่าซีสเตอีน โปรติเนส จากมะเดื่อปล้อง ให้แถบโปรตีน 4 แถบที่มีน ้าหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 23,000 ถึง 45,000 ดาลตัน เอนไซม์ที่แยกได้ เป็นไกลโคโปรตีนเนื่องจากให้ผลบวกกับชุดทดสอบ GelCode® glycoprotein staining ทั้ง 4 แถบ แสดงว่าเอนไซม์จากมะเดื่อปล้องเป็นไกลโคโปรตีนและอยู่ในรูป multiple form เมื่อน า โปรตีนขนาด 23,000 ดาลตัน ไปวิเคราะห์กรดอะมิโนโดย Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) พบกรดอะมิโน จ านวน 55 ตัว ที่มีความคล้ายคลึงกับ Chain A จาก Carica papaya chymopapain และได้ท านายโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ chymopapain โดยใช้โปรแกรม Discovery Studio® Visualizer Version 2.01, Accelrys Software และน ากรดอะมิโนทั้ง 55 ตัวมาเปรียบเทียบพบว่าบริเวณ catalytic sites มีความ ข เหมือนกับ chymopapain แสดงว่ามีความใกล้เคียงกันอย่างยิ่ง เมื่อท าการศึกษาการย่อย ซับส เตรตสังเคราะห์ของเอนไซม์ไฟเซนจาก Ficus hispida พบว่าเอนไซม์ไฟเซนสามารถย่อย ซับส เตรตสังเคราะห์คือ Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, N-Benzoyl-L-Arginine-p- nitroanilide hydrochloride, Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p- nitroanilide และ N-succinyl-L-Phenylalanine-p-nitroanilide ได้ดีตามล าดับ แสดงให้เห็นว่า ต าแหน่ง subsite P1 เอนไซม์ไฟเซนจากมะเดื่อปล้องมีความจ าเพาะส าหรับกรดอะมิโน arginine * ผลงานวิจัยเรื่องนี้ได้รับทุนส่งเสริมการวิจัย ส าหรับพนักงานประจ ามหาวิทยาลัยหอการค้าไทย ค Title : Purification and characterization of cysteine proteinase from some vegetables and fruits Researcher : Ratchanee Saiprajong Department of Food Science and Technology School of Science University of the Thai Chamber of Commerce Co-researcher : Assit.Prof.Dr.Surapong Pinitglang and Assoc.Prof.Dr.Khanok RatanaKhanokchai Year of Accomplishment : 2009 No. of Pages : 62 Pages Key words : cysteine proteinase, Ficus hispida, ficain Abstract* The aim of this study is to screen source of cysteine proteinase from some vegetables and fruits. The fruit sample showed positive result on AZCL-casein plate 17 from 42 samples and vegetable showed 39 from 73 samples. The enzyme from fruit and vegetable can be classified into two types proteinase; serine and cysteine proteinases by using specific inhibitors. In this study we focus in ficain from Ficus hispida L. because it has been a very few studies. Ficain (EC3.4.22.3), cysteine proteinase from latex of Ficus hispida was purified by 80% saturated ammonium sulphate precipitation and single-step Thiopropyl Sepharose 6B covalent chromatography. The enzyme activity was completely inhibited by 2,2 dipyridyl disulphide (2PDS) and iodoacetamide, indicating that the purified enzyme is a member of cysteine proteinase. The molecular weight of purified enzyme was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The cysteine proteinase from Ficus hispida had four major bands with molecular weight range of 23,000 to 45,000 dalton. The purified multiple form enzymes were glycoprotein because each band showed positive with GelCode® glycoprotein staining kit. Major band from SDS-PAGE at 23,000 dalton was determined for amino acid residue by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS/MS). The major band of purified enzyme had 55 amino acids matched to Chain A from Carica papaya chymopapain . The three-dimensional structure of chymopapain was generated by Discovery Studio® Visualizer Version 2.01, Accelrys ง Software. A comparison of the short amino acid sequences around the catalytic sites of the chymopapain indicates a high degree of similarity. In investigating the ficain from Ficus hispida L. can rapidly catalyze the hydrolysis of Gyl-Arg-p-nitroanilide dihydroxychloride, N-Benzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide hydrochloride, Ala-Ala-Phe-p- nitroanilide, N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide, and N-succinyl-L-Phenylalanine-p- nitroanilide. This result indicated that P1 subsite of ficain specifics for amino acid arginine. * The research was financially supported by University of the Thai Chamber of Commerce จ กิตติกรรมประกาศ คณะผู้วิจัยขอขอบคุณ มหาวิทยาลัยหอการค้าไทย ที่ให้ทุนอุดหนุนและสนับสนุนการท า วิจัยในครั้งนี้ ขอขอบคุณคณะวิทยาศาสตร์ ที่ให้การส่งเสริมในการท าวิจัยโดยให้ความสะดวกใน การใช้อาคารสถานที่ วัสดุอุปกรณ์และเครื่องมือต่างๆ และขอขอบคุณอาจารย์ ครูปฏิบัติการ และเจ้าหน้าที่ สาขาวิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหารที่อ านวยความสะดวกในการท า วิจัยในครั้งนี้ให้ส าเร็จลุล่วงไปด้วยดี ท้ายสุด ขอขอบพระคุณ ทุกก าลังใจที่ให้การสนับสนุนการท างานในครั้งนี้ส าเร็จลุล่วงเป็น อย่างดี คณะผู้ท าวิจัย มกราคม 2553 ฉ สารบัญ หน้า บทคัดย่อภาษาไทย ก บทคัดย่อภาษาอังกฤษ ค กิตติกรรมประกาศ จ สารบัญ ฉ สารบัญตาราง ช สารบัญรูป ซ บทที่ 1. บทน า 1 2. เอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 3 3. ระเบียบวิธีวิจัย 11 4. ผลการทดลอง 24 5. สรุปการวิจัยและข้อเสนอแนะ 40 เอกสารอ้างอิง 42 ภาคผนวก 45 ช สารบัญตาราง ตารางที่ หน้า ตารางที่ 2.1 ชนิดและแฟมิลี่ของซีสเตอีน โปรติเนส และแหล่งที่มา 5 ตารางที่ 3.1 ตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ และส่วนที่ใช้ในการทดลอง 12 ตารางที่ 3.2 ตัวอย่างผักชนิดต่างๆ และส่วนที่ใช้ในการทดลอง 14 ตารางที่ 4.1 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจาก 25 ตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate ตารางที่ 4.2 ผลการคัดเลือกแหล่งของเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนสจาก 27 ตัวอย่างผลไม้ชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate ตารางที่ 4.3 ผลการท าปฏิกิริยากับตัวยับยั้งชนิดต่าง ๆ บน AZCL-casein plate 30 ตารางที่ 4.4 ผลของสารยับยั้งที่มีต่อเอนไซม์ซีสเตอีน โปรติเนส จากมะเดื่อปล้อง 38 ซ สารบัญรูป รูปท่ี หน้า รูปท่ี 3.1 AZCL-casein agar plate 17 รูปท่ี 3.2 การหยดสารสกัดเอนไซม์จากตัวอย่างชนิดต่างๆ บน AZCL-casein plate 18 รูปท่ี 3.3 ขั้นตอน covalent chromatography by thiol-disulphide interchange 20 รูปท่ี 4.1 blue zone ที่เกิดจากการย่อยโปรตีนของเอนไซม์บน AZCL-casein plate 24 รูปท่ี 4.2 ลักษณะของมะเดื่ออุทุมพร (Ficus racemosa) ผลสุก 31 รูปท่ี 4.3 รูปแบบของโปรตีนที่ได้จากมะเดื่ออุทุมพร แยกโดยใช้วิธี SDS-PAGE 33 รูปท่ี 4.4 ลักษณะของมะเดื่อปล้อง (Ficus hispida L.) ผลมีขนาดเล็ก 34 และล าต้นเป็นปล้องๆ รูปท่ี 4.5 รูปแบบของโปรตีนที่ได้จากมะเดื่อ แยกโดยใช้วิธี SDS-PAGE 35 รูปท่ี 4.6 SDS-PAGE ของเอนไซม์ซีสเตอีนโปรติเนสที่ผ่านการท าให้บริสุทธ์ 36 จาก Thiopropyl Sepharose 6B covalent column รูปท่ี 4.7 ล าดับของกรดอะมิโนจากไฟซินจากมะเดื่อปล้องที่ Matched 37 กับ Chain A จาก Carica papaya Chymopapain (ตัวอักษรสีแดง) รูปท่ี 4.8 โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ Chymopapain 37 บทที่ 1 บทน ำ ปัจจุบันได้มีการน าเอาเอนไซม์มาประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมอาหารมากขึ้น เพื่อพัฒนา ผลิตภัณฑ์อาหาร เช่น กลิ่น รส เนื้อสัมผัส เป็นต้น ให้ได้ตรงตามความต้องการของผู้บริโภคมาก ยิ่งขึ้น เอนไซม์ที่น ามาใช้ในอุตสาหกรรมอาหารได้แก่ เอนไซม์โปรติเนส (Proteinase) อะไมเลส (Amylase) อินเวอร์เทส (Invertase) เป็นต้น ซึ่งเอนไซม์ที่มีความส าคัญที่สุดส าหรับการน ามา ประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมอาหารคือ เอนไซม์โปรติเนส ซึ่งได้แก่เอนไซม์ในกลุ่ม เปปซิน ทริปซิน ไคโมทริปซิน คาร์บอกซีเปปติเดส และอะมิโนเปปติเดส โดยจะได้มาจากแหล่งต่าง ๆ กัน เช่น สัตว์ พืชผักผลไม้ และจุลินทรีย์ เป็นต้น โดยน ามาใช้ในอุตสาหกรรมอาหารหลายประเภทได้แก่ อุตสาหกรรมเนยแข็ง อุตสาหกรรมเบียร์ และไวน์ อุตสาหกรรมการแปรรูปเนื้อสัตว์ อุตสาหกรรม ธัญพืช อุตสาหกรรมสารปรุงรส และอุตสาหกรรมการผลิตโปรตีนไฮโดรไลเซท โดยประโยชน์ ส าคัญของเอนไซม์โปรติเนสนั้น จะเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่เกิดในสิ่งมีชีวิต (Biocatalyst) ท าให้ อัตราเร็วของปฏิกิริยาเพิ่มสูงขึ้นได้ 108-1014 เท่าของปฏิกิริยาเดิมที่ไม่มีเอนไซม์เป็นตัวเร่ง ดังนั้นใน อุตสาหกรรมอาหารจึงนิยมใช้เอนไซม์โปรติเนสเป็นอย่างมาก แต่จากผลการศึกษาข้อมูลพบว่าใน ประเทศไทยมีการผลิตหรือสกัดเอนไซม์โปรติเนสในปริมาณที่น้อยมาก ส่วนใหญ่ทางโรงงาน อุตสาหกรรมจะสั่งซื้อจากต่างประเทศเป็นส่วนใหญ่ ประเทศไทยเป็นภูมิประเทศที่เหมาะแก่การท าเกษตรกรรม จึงท าให้ประเทศไทยมีอาชีพ เกษตรกรรมเป็นส่วนใหญ่ ซึ่งส่งผลให้ผักและผลไม้ในบางฤดูกาลมีปริมาณและการผลิตสูงจึงท า ให้ผักและผลไม้นั้นเกิดผลผลิตล้นตลาดซึ่งส่งผลท าให้ผักและผลไม้มีมูลค่าทางการค้าต ่า ท าให้ เกษตรกรเกิดภาวะขาดทุน ดังที่ได้กล่าวข้างต้นแล้วว่าแหล่งที่ใช้ในการผลิตเอนไซม์นั้นจะได้มา