Etudes Chimique Et Biologique Des Extraits D'albizia Masikororum, Une

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIES

ECOLE DOCTORALE : SCIENCES DE LA VIE ET DE L’ENVIRONNEMENT

Thèse de Doctorat Spécialité : Biodiversité et Santé ( Biochimie )

Etudes chimique et biologique des extraits d’Albizia masikororum, une FABACEE endémique de

Madagascar

Présentée et soutenue publiquement par :

RAZAFINDRAKOTO Anjarasoa Ravo Titulaire de DEA en Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales

Le 20 février 2018

Devant le jury composé de :

Président : Pr. Charlotte RALISON Rapporteur interne : Pr. Danielle Aurore Doll RAKOTO Rapporteur externe : Pr. Heriniaina RAMANANKIERANA Examinateurs : Pr. Julia Louisette RAZANAMPARANY Pr. Arsène RATSIMBASOA Directeur de thèse : Pr. Victor JEANNODA

REMERCIEMENTS Le présent travail n’aurait pu se faire sans le concours de nombreuses personnes tant physiques que morales, auxquelles nous devons toute notre reconnaissance. Ce travail a été réalisé : - au LABASM (Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales) de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences de l’Universitéd’Antananarivo. - au laboratoire d’anatomie-cytopathologie (ACP) de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM). - à l’Institut Malagasy de Recherches Appliquées (IMRA). - au laboratoire du Silo National de Graines Forestières (SNGF). - à l’unité Molécules de Communication et Adaptation des Microorganismes (MCAM) du Muséum National d’Histoire Naturelle (MNHN) de Paris Nous adressons nos plus vifs remerciements à Monsieur le Professeur Victor JEANNODA, Directeur de thèse et Directeur de l’Ecole doctorale Sciences de la vie et de l’Environnement, pour son encadrement efficace, sa grande disponibilité et sa patience. Malgré ses multiples responsabilités, il a toujours trouvé le temps de prodiguer ses conseils et son appui à chaque étape de cette thèse, nous faisant bénéficier de sa riche expérience. Ce travail ne serait pas ce qu’il est sans son implication et nous lui en exprimons toute notre gratitude. Nous adressons toute notre reconnaissance à Madame le Professeur Danielle Aurore Doll RAKOTO, Responsable de l’équipe d’accueil Biodiversité et Santé, qui nous a fait le grand honneur d’accepter d’être le rapporteur interne de cette thèse. Malgré ses nombreuses occupations, elle nous a toujours accordé une aide précieuse tout au long de ce travail. En particulier, sa grande rigueur et son sens du détail ont largement contribué à donner sa forme actuelle à ce manuscrit. Nous la remercions vivement pour le temps qu’elle a consacré à corriger les erreurs sur le fond et la forme. Nos chaleureux remerciements vont à Monsieur le Professeur Heriniaina RAMANANKIERANA qui a aimablement accepté d’être le rapporteur externe en mettant sa compétence à contribution. Il nous est agréable d'exprimer nos sincères remerciements à Madame le Professeur Charlotte RALISON qui a bien voulu présider le jury de cette thèse malgré ses multiples engagements. Qu’elle trouve ici l’expression de notre gratitude. Nous remercions vivement Madame le Professeur Julia Louisette RAZANAMPARANY et Monsieur le Professeur Arsène RATSIMBASOA, qui ont si

aimablement accepté de juger ce travail. Qu’ils trouvent ici l’expression de notre reconnaissance. Toute notre gratitude va à Monsieur le Professeur Hanitra Ranjàna RANDRIANARIVO pour son aide inestimable, ses nombreux conseils et ses encouragements constants, tout au long de ce travail. Nous adressons nos vifs remerciements à Madame le Professeur Clara RAJEMIARIMOELISOA pour son aide précieuse dans la réalisation des études anatomopathologiques et pour tous ses bons conseils. Nous exprimons toute notre reconnaissance à Madame le Docteur Vahinalahaja Eliane RAZAFINTSALAMA dont les conseils avisés nous ont beaucoup aidés. Tous nos remerciements vont également aux chercheurs du MNHN, notamment à Monsieur le Professeur Bernard BODO pour leur collaboration efficace dans la réalisation des travaux sur la chimie. Nous exprimons tous nos remerciements à Madame le Docteur Clairette RAHARISOLO du Service anatomopathologie de la CBC de l’IPM et toute son équipe, qui nous ont si bien accueillie dans leur laboratoire pour la réalisation des travaux sur l’anatomo-pathologie. Nous tenons également à remercier Monsieur le Professeur David RAMANITRAHASIMBOLA du laboratoire de l’IMRA, toute son équipe et le doctorant Zo RAZAFINDRAKOTO qui ont eu la bienveillance de nous accueillir dans leur laboratoire. Que Madame le Professeur Lolona RAMAMONJISOA, qui a gracieusement fourni les graines d’A. masikororum et nous a également acceuillie dans les laboratoires du SNGF, trouve ici l’expression de notre gratitude. Nous ne saurions oublier de remercier les responsables et personnel des institutions, instituts et centres de recherche qui nous ont accueillie pour leur implication dans ce travail, avec une mention particulière pour le personnel technique de la mention Biochimie Fondamentale et appliquée, qui ont toujours accueilli nos requêtes avec bienveillance et gentillesse. Nous adressons notre affectueuse reconnaissance à nos compagnons de paillasse, Holy, Maholy, Mihaja, Herizo, Lova, Mamihery, Henintsoa, Herimanana, Lily et Jonathan pour toute l’aide, les conseils, les encouragements, la bonne ambiance et surtout l’amitié qu’ils ont apportés, merci infiniment. Nous leur souhaitons une belle carrière scientifique et une vie familiale réussie. Enfin, un grand merci à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce travail. MERCI

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE ...... i LISTE DES ABREVIATIONS ...... ii LISTE DES FIGURES ...... iii LISTE DES TABLEAUX ...... iv INTRODUCTION GENERALE ...... 1 CHAPITRE I : SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 3 I.1 INTRODUCTION ...... 3 I.2 GENERALITES SUR LES ORGANISMES NUISIBLES...... 3 I.2.1 DEFINITION ...... 3 I.2.2 EXEMPLES DE DEGATS CAUSES PAR LES ORGANISMES NUISIBLES ...... 3 I.2.3 MOYENS DE LUTTE CONTRE LES ORGANISMES NUISIBLES ...... 4 I.3 GENERALITES SUR LES PHYTOTOXINES ...... 5 I.3.1 NATURES ET ROLES BIOLOGIQUES ...... 5 I.3.2 UTILISATIONS EMPIRIQUES DES TOXINES ...... 5 I.3.3 UTILISATIONS A DES FINS DE RECHERCHE OU THERAPEUTIQUES ...... 6 I.3.4 UTILISATIONS EN TANT QUE PESTICIDES ...... 7 I.4 GENERALITES SUR LE GENRE Albizia ...... 7 I.4.1 DONNEES BOTANIQUES SUR LE GENRE Albizia ...... 7 I.4.2 USAGES TRADITIONNELS DE QUELQUES ESPÈCES D’Albizia ...... 8 I.4.3 LES FAMILLES CHIMIQUES RENCONTREES DANS LE GENRE ...... 10 I.4.3.1 Les espèces malgaches ...... 10 I.4.3.2 Les espèces étrangères ...... 10 I.4.4 PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES DES Albizia ...... 13 I.4.4.1 Propriétés pharmacologiques des espèces malgaches ...... 13 I.4.4.2 Propriétés pharmacologiques des espèces étrangères ...... 13 I.5 GENERALITES SUR LES PRINCIPAUX CONSTITUANTS D’Albizia masikororum ... 15 I.5.1 GENERALITES SUR LES SAPONOSIDES ...... 15 I.5.1.1 Définition ...... 15 I.5.1.2 Classification ...... 16 I.5.1.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques ...... 18 I.5.1.4 Applications industrielles des saponosides d’origine végétale ...... 19 I.5.2 GENERALITES SUR LES FLAVONOÏDES ...... 21 I.5.2.1 Définition ...... 21 I.5.2.2 Classification ...... 21 I.5.2.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques ...... 21 CHAPITRE II : PREPARATION ET CHIMIE DES EXTRAITS ...... 23 II.1 INTRODUCTION ...... 23 II.2 LE MATERIEL UTILISE ...... 23 II.2.1 DESCRIPTION BOTANIQUE D’ALBIZIA MASIKORORUM R. Vig...... 23 II.2.2 LES PRODUITS CHIMIQUES ...... 25 II.3 METHODES DE PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS...... 25

II.3.1 PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL ...... 25 II.3.2 METHODE D’EXTRACTION ...... 25 II.4 METHODES ANALYTIQUES ...... 26 II.4.1 METHODES DE DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES ...... 26 II.4.1.1 Détection des alcaloïdes ...... 26 II.4.1.2 Détection des triterpènes et des stéroïdes ...... 27 II.4.1.3 Détection des stérols insaturés ...... 27 II.4.1.4 Détection des tanins et des polyphénols ...... 27 II.4.1.5 Détection des saponosides ...... 27 II.4.1.6 Détection des anthraquinones ...... 28 II.4.1.7 Détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes ...... 28 II.4.1.8 Détection des iridoïdes ...... 28 II.4.1.9 Détection des coumarines ...... 28 II.4.1.10 Détection des cardénolides ...... 29 II.4.2 ANALYSE DE L’HOMOGENEITE : chromatographie sur couche mince (CCM) .... 29 II.5 METHODES DE PURIFICATION ...... 29 II.5.1 FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL ...... 29 II.5.2 EXTRACTION DES SAPONOSIDES TOTAUX ...... 30 II.5.3 ISOLEMENT DES PRINCIPES ACTIFS PAR LES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES ...... 30 II.5.3.1 Filtration sur gel Sephadex LH20 ...... 30 II.5.3.2 Chromatographie flash sur colonne sèche ...... 31 II.6 METHODES D’EVAPORATION ...... 31 II.7 CALCUL DES RENDEMENTS ...... 31 II.8 RESULTATS ...... 32 II.8.1 RENDEMENTS D’EXTRACTION DES DIFFERENTS EXTRAITS ET FRACTIONS ...... 32 II.8.2 LES FAMILLES CHIMIQUES PRESENTES DANS LA PLANTE ...... 32 II.8.3 LES DIFFERENTS EXTRAITS ET FRACTIONS OBTENUS A PARTIR DE EMG ...... 33 II.8.4 RENDEMENTS DES DIFFERENTS EXTRAITS ET FRACTIONS OBTENUS A PARTIR DE EMG ...... 36 II.8.4.1 Rendements d’extraction des phases butanoliques et aqueuses ...... 36 II.8.1.2 Rendements d’extraction des saponosides totaux et de ses fractions ...... 36 II.9 DISCUSSION ...... 37 CHAPITRE III : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX ...... 41 III.1 INTRODUCTION ...... 41 III.2 MATERIEL ...... 41 III.2.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION ...... 41 III.2.1.1 Les souris ...... 41 III.2.1.2 Les cobayes ...... 42 III.2.1.3 Les poussins ...... 42 III.2.1.4 Les alevins ...... 42 II.4.1.5 Les têtards ...... 42

II.4.1.6 Les puces ...... 42 III.3 METHODES ...... 42 III.3.1 ETUDES TOXICOLOGIQUES SUR SOURIS ...... 42 III.3.1.1 Les différentes voies d’administration testées ...... 42 III.3.1.2 Détermination de la DL50 (24 h) de l’extrait ...... 43 III.3.1.3 Etude anatomo-pathologique ...... 44 III.3.1.4 Etude des effets de l’extrait sur les fonctions rénale et hépatique ...... 46 III.3.2 ETUDE DES EFFETS DE L’EXTRAIT SUR L’OREILLETTE ISOLEE DE COBAYE ...... 46 III.3.3 ETUDE DE L’ACTIVITE HEMOLYTIQUE ...... 47 III.3.3.1 Préparation de la suspension érythrocytaire normalisée ...... 47 III.3.3.2 Détermination de la dose hémolytique 50 % (DH50) ...... 47 III.3.4 ETUDE DES EFFETS SUR LES AUTRES ANIMAUX ...... 47 III.3.4.1 Etude des effets sur les poussins ...... 47 III.3.4.2 Etude des effets sur les animaux à sang froid ...... 48 III.4 RESULTATS ...... 49 III.4.1 EFFETS SUR LA SOURIS ...... 49 III.4.1.1 Estimation de la DL50 (24 h) de EMG par voie ip ...... 49 III.4.1.2 Les symptômes d’intoxication selon la voie d’administration pour EMG ... 50 III.4.1.3 Les effets toxiques des fractions de EMG ...... 52 III.4.1.4 Les lésions tissulaires causées par EMG ...... 52 III.4.1.5 Les effets de EMG sur les fonctions rénales et hépatiques ...... 58 III.4.2 EFFETS DE EMG SUR L’OREILLETTE ISOLEE DE COBAYE ...... 59 III.4.2.1 Effets sur la fréquence cardiaque ...... 59 III.4.2.2 Effets sur la contractilité cardiaque ...... 60 III.4.3 LA DOSE HEMOLYTIQUE 50 % (DH50) ...... 60 III.4.4 EFFETS DE EMG SUR LES AUTRES ANIMAUX ...... 61 III.4.4.1 Effets sur les poussins ...... 61 III.4.4.2 Effets sur les animaux à sang froid ...... 61 III.5 DISCUSSION ...... 62 CHAPITRE IV : EFFETS DE EMG SUR LES VEGETAUX ...... 67 IV.1 INTRODUCTION ...... 67 IV.2 MATERIELS UTILISES DANS L’ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LES VEGETAUX ...... 67 IV.3 METHODES ...... 68 IV.3.1 ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES ...... 68 IV.3.2 ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES ...... 70 IV.4 RESULTATS ...... 70 IV.4.1 EFFETS DE EMG SUR LA GERMINATION DES GRAINES ...... 70 IV.4.1.1 Effets sur les espèces potagères ...... 70 IV.4.1.2 Effets sur les espèces indésirables ...... 71 IV.4.2 EFFETS DE EMG SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES ...... 71

IV.5 DISCUSSION ...... 75 CHAPITRE V : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES...... 78 V.1 INTRODUCTION ...... 78 V.2 MATERIELS UTILISES ...... 78 V.2.1. LES MICROORGANISMES ...... 78 V.2.2 LES MILIEUX DE CULTURE ...... 78 V.2.3 LES ANTIBIOTIQUES DE REFERENCE ...... 78 V.2.4 LES EXTRAITS TESTES ...... 79 V.3 METHODES ...... 79 V.3.1 TESTS D’ANTIBIOGRAMME EN MILIEU SOLIDE ...... 79 V.3.2 DETERMINATION DES CMI, CMB et CMB/CMI ...... 80 V.3.2.1 DETERMINATION DE LA CMI ...... 80 V.3.2.2 DETERMINATION DE LA CMB ...... 81 V.3.2.3 DETERMINATION DE LA NATURE DE L’ACTION ANTIBACTERIENNE D’UN EXTRAIT ...... 81 V.4. RESULTATS ...... 81 V.4.1 ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES DIFFERENTS EXTRAITS BRUTS .... 81 V.4.1.1 Résultats des tests d’antibiogramme ...... 81 V.4.1.2 CMI et CMB de EMG et EMF ...... 83 V.4.2 ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DE STG ET DES FRACTIONS OBTENUES A PARTIR DE STG ...... 84 V.4.2.1 Résultats des tests d’antibiogramme ...... 84 V.4.2.2 CMI et CMB de STG et de ses fractions ...... 85 V.5 DISCUSSION ...... 88 CHAPITRE VI : DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES, PERSPECTIVES .... 89 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 89

GLOSSAIRE

Analgésique : Substance qui prévient ou diminue la sensation de douleur Anti-angiogéniques : Qui empêchent l'angiogenèse, c'est-à-dire la fabrication des vaisseaux sanguins qui irriguent les tumeurs cancéreuses Anti-appétent : Qui, après ingestion, empêche un insecte de se nourrir, momentanément ou pour toujours Antithrombotique : Qui prévient ou limite la formation ou l’extension d’une thrombose, c’est-à-dire un caillot de sang qui se forme dans une veine ou une artère Antitussif : Ayant la capacité de lutter contre les toux sèches et d'irritation

. Anxiolytique : Substance psychotrope agissant sur l'anxiété et ses composantes somatiques Astringent : Qui resserre et assèche les tissus, et peut faciliter leur cicatrisation Dyspnée : Difficulté à respirer Emétique : Substance qui fait vomir Enophtalmie : Enfoncement anormal du globe oculaire dans l'orbite Erysipèle : Infection cutanée aiguë provoquée par des bactéries du groupe des streptocoques Fasciculation : Contraction spontanée et anormale d'une partie des faisceaux musculaires d'un muscle Hyperhémie : Accroissement du flux sanguin dans une zone de l'organisme Hypoactivité : Etat où le sujet a une activité physique et nerveuse inférieure à la normale Inflammation : Ensemble de phénomènes de défense de l'organisme contre une agression (traumatisme, infection, etc.), pouvant se manifester par des signes divers (douleur, tuméfaction, chaleur, rougeur, etc.) Inflorescence : Ensemble des fleurs regroupées et disposées d'une façon précise sur une tige Infrutescence : Ensemble des fruits résultant du développement d'une inflorescence Nootropique : Qui permet d'améliorer les fonctions cognitives Piloérection : Erection des poils Spasmolytique : Qui soulage ou élimine les spasmes musculaires Ulcère : Rupture de la peau ou d'une muqueuse provoquée par un processus inflammatoire ou infectieux

LISTE DES ABREVIATIONS

ALAT : ALanine AminoTransférase ATCC : American Type Culture Collection CCM : Chromatographie sur Couche Mince CL50 : Concentration Létale 50% CMB : Concentration Minimale Bactéricide CMI : Concentration Minimale Inhibitrice DL50 : Dose Létale 50% EMG : Extrait Méthanolique des Graines FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA : Food and Drugs Administration IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées INT : para-IodoNitroTétrazolium ip : intrapéritonéale IPM : Institut Pasteur de Madagascar LABASM : LAboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales OF1 : Oncins France 1 OMS : Organisation Mondiale de la Santé p/p : poids/poids p/v : poids/volume PBS : Phosphate Buffered Saline SNGF : Silo National de Graines Forestières STG : Saponosides Totaux des Graines UFC : Unité Formant Colonie v/v : volume/volume γ-GT : gamma-Glutamyl Transférase

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Alcaloïdes d’A. schimperana ...... 11 Figure 2 : Albiziatrioside A d’A. submidiata ...... 12 Figure 3 : Acide acacique d’A. versicolor ...... 12 Figure 4 : 5-déoxyflavones d’A. odoratissima ...... 13 Figure 5 : Les principaux squelettes des saponosides dans la littérature ...... 17 Figure 6 : Albizia masikororum ...... 24 Figure 7 : Etapes de purification de l’extrait méthanolique des graines d’A. masikororum ...... 34 Figure 8 : Chromatogrammes des différentes fractions obtenues avec l’extrait EMG ...... 36 Figure 9 : Courbes des totaux cumulatifs des animaux morts et survivants ...... 49 Figure 10 : Lésions causées par EMG au niveau du rein (5h, 12 mg/kg, ip) ...... 54 Figure 11 : Lésions causées par EMG au niveau du poumon (12 mg/kg, ip) ...... 56 Figure 12 : Lésions causées par EMG au niveau du poumon (30 jours) ...... 58 Figure 13 : Tests de EMG sur la fréquence cardiaque ...... 59 Figure 14 : Effets de EMG sur la contraction cardiaque ...... 60 Figure 15 : Déroulement des tests sur la germination ...... 68 Figure 16 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du riz du haricot ...... 72 Figure 17 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du maïs ...... 72 Figure 18 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du riz ...... 73 Figure 19 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du petit pois ...... 74 Figure 20 : Croissance de Staphyloccus aureus en présence des extraits...... 82 Figure 21 : CMI de EMG et STG sur Streptococcus pyogenes ...... 83 Figure 22 : Croissance des différents germes en présence de STG et de ses fractions ...... 85 Figure 23 : CMI des fractions LH1 à LH4 sur Streptococcus pyogenes ...... 87

iii

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Estimation des pertes dues aux organismes nuisibles pour quelques cultures majeures ...... 4 Tableau 2 : Usages traditionnels des Albizia ...... 8 Tableau 3 : Les rendements moyens d’extraction (%, p/p)...... 32 Tableau 4 : Résultats du criblage phytochimique ...... 33 Tableau 5 : Liste des fractions obtenues à partir de EMG ...... 35 Tableau 6 : Rendements de purification des fractions des saponosides totaux (%, p/p) ... 37 Tableau 7 : Rendements de purification des fractions LH3 (%, p/p) ...... 37 Tableau 8 : Rendements de purification des fractions LH4 (%, p/p) ...... 37 Tableau 9 : Liste des extraits bruts utilisés pour les investigations biologiques ...... 39 Tableau 10 : Liste des extraits purifiés issus des graines utilisés pour les investigations biologiques ...... 40 Tableau 11 : Les doses et traitements appliqués aux souris avant les prélèvements d’organes ...... 45 Tableau 12 : Résultats de la détermination de la DL50 (24 h) de EMG par voie ip ...... 49 Tableau 13 : Les symptômes observés lors d’une intoxication par EMG à 30 mg/kg par voie intrapéritonéale ...... 50 Tableau 14 : Les symptômes observés lors d’une intoxication par EMG à 120 mg/kg par voie sous-cutanée ...... 50 Tableau 15 : Les symptômes observés lors d’une intoxication par EMG à différentes doses par voie orale ...... 51 Tableau 16 : Mortalité due aux fractions de EMG (dose = 16,92 mg/kg) ...... 52 Tableau 17 : Les lésions observées chez les souris traitées avec EMG (12 mg/kg, voie ip) en fonction du temps ...... 53 Tableau 18 : Les lésions observées chez les souris traitées avec EMG (24 h, voie ip) en fonction des doses ...... 55 Tableau 19 : Les lésions observées chez les souris traitées par voie orale avec EMG après 30 jours ...... 57 Tableau 20 : Effets de EMG sur les fonctions hépatique et rénale ...... 58 Tableau 21 : La fréquence cardiaque moyenne (nombre de battements/min) ...... 59 Tableau 22 : Amplitudes moyennes des battements cardiaques (mm) ...... 60 Tableau 23 : Effets hémolytiques de EMG sur les hématies de mouton ...... 61 Tableau 24 : Effets de EMG sur les alevins ...... 61 Tableau 25 : Effets de EMG sur les têtards ...... 62 Tableau 26 : Liste des espèces potagères testées ...... 67 Tableau 27 : Liste des plantes indésirables testées ...... 67 Tableau 28 : Déroulement des tests sur la germination des graines de plantes indésirables .. 69 Tableau 29 : Taux d’inhibition de la germination par EMG à 1 mg/ml chez les espèces potagères (15ème jour) ...... 70 Tableau 30 : Taux d’inhibition de la germination par EMG à 1 mg/ml chez les espèces indésirables (15ème jour) ...... 71 Tableau 31 : Pourcentage d’inhibition (%) de la croissance des jeunes plantules (15ème jour) à différentes concentrations de EMG ...... 74 Tableau 32 : Liste des souches utilisées ...... 78

Tableau 33 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques ...... 79 Tableau 34 : Normes utilisées pour l’interprétation des résultats obtenus par la méthode de microdilution ...... 81 Tableau 35 : Diamètres des halos d’inhibition (mm), obtenus avec les différents extraits à 1000 µg/disque ...... 82 Tableau 36 : CMI et CMB de EMG et EMF sur les souches sensibles (µg/ml) ...... 83 Tableau 37 : Rapport CMB/CMI de EMF et EMG ...... 84 Tableau 38 : Diamètres des halos d’inhibition (mm), quantité d’extrait : 1000µg/disque ..... 84 Tableau 39 : CMI de STG, ses fractions et sous-fractions (µg/ml) ...... 86 Tableau 40 : CMB de STG et de ses fractions (µg/ml) ...... 87 Tableau 41 : Rapport CMB/CMI de STG et de ses fractions ...... 88

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

La biodiversité constitue une ressource naturelle très importante pour l’humanité. Elle nous procure entre autres des aliments et des médicaments, des matériaux pour la confection de nos vêtements et la fabrication de nos maisons. Cependant, certains organismes animaux, végétaux et microbiens nuisent directement (pathogènes, organismes toxiques, ravageurs de culture etc.) ou indirectement (réservoirs et/ou vecteurs de maladies etc.) à notre santé, notre sécurité alimentaire et notre bien-être (destructeurs de biens et services etc.).

Ces organismes nuisibles constituent un dangereux fléau partout dans le monde surtout dans les pays où l’accès aux médicaments et pesticides pour les combattre est limité. Des données complémentaires sur ces organismes, les problèmes qui leur sont associés ainsi que les moyens pour les combattre seront fournies plus loin dans le chapitre relatif de la synthèse bibliographique (cf. p. 3).

Si les pesticides de synthèse ont constitué le moyen le plus efficace pour combattre les organismes nuisibles, de nombreux effets négatifs sur les êtres vivants et leurs milieux leurs sont imputés. A titre d’illustration, ils sont à l’origine de l’apparition de nouvelles souches de microbes pathogènes multi-résistantes (GEORGHIOU et MELLON, 1983). Aussi, la recherche d’alternatives avec peu ou pas d’effets secondaires et plus respectueuses de l’environnement a été préconisée par différentes instances nationales et internationales comme l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (FAO). C’est dans un tel contexte que les travaux de recherche sur les biopesticides notamment ceux d’origine végétale se sont multipliés dans de nombreux laboratoires.

Pour ces différentes raisons, l’Unité de recherche « Toxicologie » du Laboratoire de Biochimie appliquée aux Sciences médicales (LABASM), de l’équipe d’accueil Biodiversité et Santé de l’Ecole doctorale Sciences de la Vie et de l’Environnement, a développé divers programmes de recherche sur des plantes endémiques de Madagascar dont le programme Albizia. Le principal objectif visé dans ces programmes consiste à mener des investigations sur les plans chimique et biologique et à exploiter les propriétés qui s’avèrent intéressantes, en particulier les propriétés pesticides.

Partout où elles poussent les espèces d’Albizia connaissent de multiples usages notamment en médecine traditionnelle. En général, à Madagascar, leurs utilisations se limitent à la construction et à la menuiserie ou même comme bois de chauffe. Cependant, des propriétés biologiques intéressantes ont été mises en évidence chez toutes les espèces malgaches déjà étudiées dans le cadre du programme Albizia (RAKOTO et coll., 2011 et 2012 ;

Introduction générale

RANDRIAMAMPIANINA et coll., 2013 ; RANDRIANARIVO et coll., 2014a et 2014b ; RAJEMIARIMOELISOA et coll., 2015a ; RANDRIAMAMPIANINA, 2016 ; RATSIMANOHATRA, 2017).

L’étude de l’espèce Albizia masikororum, une plante du sud et de l’ouest de Madagascar, nous a été confiée. Nos travaux ont porté sur divers organes de la plante, en l’occurrence les cosses de fruits, les écorces de tronc, les feuilles et plus particulièrement les graines.

Nous nous sommes fixé comme principal objectif d’évaluer les potentialités de la plante dans le contrôle des organismes nuisibles. Nos objectifs spécifiques ont donc consisté essentiellement à :

 préparer divers extraits et des produits purifiés et à déterminer leur nature chimique et leurs propriétés physico-chimiques ;

 étudier leurs effets sur différents modèles expérimentaux animaux, végétaux et microbiens.

Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse seront présentés dans six chapitres. Pour bien cadrer ce travail et faciliter l’appréhension des résultats obtenus, le chapitre 1 sera consacré à une synthèse des connaissances sur les espèces d’Albizia aussi bien étrangères que malgaches, les toxines végétales, les organismes nuisibles et enfin sur les saponosides et les flavonoïdes, métabolites secondaires trouvés en quantité importante dans le matériel d’étude. Nous décrirons dans le chapitre 2 la préparation et l’étude chimique des extraits utilisés pour les investigations biologiques. Les effets de ces extraits sur différents modèles animaux, végétaux et microbiens feront l’objet des chapitres 3, 4 et 5 respectivement. Enfin, le chapitre 6 comprendra la discussion et la conclusion générales ainsi que les perspectives.

Les résultats que nous avions obtenus ont fait l’objet de 2 articles scientifiques, 2 communications orales et 1 communication affichée qui seront présentées en Annexes a, b et c respectivement.

CHAPITRE I :

SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

I.1 INTRODUCTION

Pour mieux cadrer ce travail, un état des connaissances sur les organismes nuisibles, les phytotoxines ainsi que des données sur les travaux antérieurs sur le genre Albizia seront présentés dans ce chapitre. Un paragraphe sera consacré à des généralités sur les saponosides et les flavonoïdes qui sont les métabolites secondaires majoritaires dans notre matériel d’étude.

I.2 GENERALITES SUR LES ORGANISMES NUISIBLES

I.2.1 DEFINITION

Un organisme nuisible pourrait être défini comme étant toute espèce nuisible ou potentiellement nuisible pour l'homme, ses biens, ses produits végétaux ou ses animaux domestiques (VAN EMDEN et SERVICE, 2004). Il peut s’agir d’organismes végétaux (mauvaises herbes et plantes invasives), animaux (rongeurs, insectes,…) ou microbiens (bactéries, champignons, …) (OERKE, 2005).

I.2.2 EXEMPLES DE DEGATS CAUSES PAR LES ORGANISMES NUISIBLES

Ces organismes peuvent causer des dommages importants par leur simple présence ou bien en vivant au détriment d’un autre être vivant. Ils peuvent le faire de différentes manières : par la diffusion de maladies ou en induisant d’importantes baisses des rendements de production agricole et la détérioration de l’environnement (cas des espèces invasives) (MACK et coll., 2000).

Ainsi, ces nuisibles peuvent irriter ou blesser les hommes et les animaux en s'installant sur la peau. Ils peuvent piquer, mordre, aspirer du sang, causer des éruptions cutanées et des allergies; Ils peuvent également envahir le corps et les tissus (par exemple, les muscles) ou pénétrer dans les organes, y compris le tube digestif.

Quant aux ravageurs de cultures, ils peuvent endommager toute partie de la plante par mastication, aspiration de la sève ou création de déformations des tissus végétaux. Les insectes (par exemple, les termites, les fourmis coupeuses de feuilles) peuvent enlever des parties de plantes pour construire leurs abris et/ou se nourrir. De cette manière, ils causent des dégâts importants sur les grandes cultures, au champ et dans les lieux de stockage.

Ils peuvent également servir de réservoirs et de vecteurs de transmission à des microorganismes pathogènes qui sont à l’origine de maladies dont certaines sont devenues des problèmes de santé publique. Ainsi, les protozoaires sont responsables d’infections entériques, de parasitoses comme la trypanosomiase, la leishmaniose et la malaria. Les bactéries et les virus sont les causes de nombreuses maladies aussi bien chez les animaux que chez les végétaux (VAN EMDEN et SERVICE, 2004).

Synthèse bibliographique

A titre d’illustration, le tableau 1 montre les pertes agricoles dues aux organismes nuisibles dans le monde. Les données les plus récentes montrent que les pertes n’ont pas diminué depuis les 20 dernières années (JOZSEF et KRISZTINA, 2011).

Tableau 1 : Estimation des pertes dues aux organismes nuisibles pour quelques cultures majeures

Espèces Pertes moyennes (%) 1988-90 1996-98 2001-03 Blé 34 29 28 Coton 38 29 29 Maïs 38 33 31 Pommes de terre 41 39 40 Soja 32 28 26 Riz 51 39 37

I.2.3 MOYENS DE LUTTE CONTRE LES ORGANISMES NUISIBLES

Le combat mené contre les organismes nuisibles est d’une grande importance et pourrait même être l’une des conditions pour la survie de l’homme. Les moyens pour combattre ce fléau sont nombreux et diversifiés bien qu’à ce jour, il n’existe toujours pas de solution qui soit vraiment satisfaisante. Cependant, il existe tout un arsenal de lutte, entre autres :

 la lutte chimique par épandage de pesticides est la plus répandue actuellement et elle a permis de grandes avancées pour repousser ou éliminer les nuisibles. Par contre, elle a l’inconvénient de représenter un grave danger pour l’environnement et la santé humaine, sans parler des phénomènes de résistance. C’est pour cela que des recherches sont menées activement pour lui trouver des alternatives tout aussi efficaces mais moins nocives ;  l’utilisation d’appâts empoisonnés et de répulsifs qui constitue d’autres moyens de lutte chimique ;  l’utilisation de moyens physiques (barrières, pièges,…) et manuels (chasse, désherbage) pour éliminer les nuisibles et contrôler les ravageurs ;  la lutte biologique comme l’utilisation des prédateurs naturels des nuisibles, l’élimination de leurs sites de reproductions ou l’utilisation de mâles stériles ;  la lutte culturale qui consiste à modifier l’environnement naturel des adventices et des ravageurs pour freiner ou empêcher leur développement. Elle comprend entre autres :  le travail du sol,  la rotation des cultures qui permet de rompre le cycle biologique de ravageurs, de plantes parasites, d’agents pathogènes,

Synthèse bibliographique

 l’emploi de cultures-pièges qui servent à attirer les ravageurs habituels comme les insectes et ainsi les tenir à l’écart d’une culture principale,  l’emploi de paillis qui permet de protéger les cultures contre certains insectes et oiseaux ;  la lutte intégrée qui est définie comme étant « Un processus décisionnel impliquant l'utilisation coordonnée de tactiques multiples pour optimiser le contrôle de toutes les classes de parasites (insectes, agents pathogènes, mauvaises herbes, vertébrés) d'une manière écologiquement et économiquement rationnelle ». Elle comprend la mise en œuvre combinée de plusieurs techniques de lutte, en tenant compte des paramètres propres à chaque situation (EHLER, 2006).

I.3 GENERALITES SUR LES PHYTOTOXINES

I.3.1 NATURES ET ROLES BIOLOGIQUES

Les phytotoxines sont des toxines produites par des plantes. Elles appartiennent à différentes classes de métabolites secondaires, notamment des composés azotés dont des alcaloïdes, des composés terpénoïdes et des composés phénoliques. Elles peuvent aussi être de nature protéique ou glycosidique. Elles assurent souvent une fonction de défense contre les agents pathogènes (bactéries, champignons) et les prédateurs (insectes phytophages, herbivores vertébrés comme les oiseaux et les mammifères et dans certains cas contre d'autres plantes concurrentes (fonction allélochimique). Elles peuvent être répulsives sans être particulièrement nocives, mais aussi extrêmement toxiques vis-à-vis d’une grande variété d'organismes. (HODGSON, 2012).

I.3.2 UTILISATIONS EMPIRIQUES DES TOXINES

Depuis les temps les plus reculés, les hommes se sont servis des toxines végétales de bien de manières. Elles sont employées pour la chasse et la guerre, dans la lutte contre les organismes nuisibles, et même à des fins thérapeutiques ou criminelles.

Prenons l’exemple des Indiens d’Amérique qui se servaient d’une plante qu’ils appelaient ‘ourari’ pour extraire un poison de chasse bien connu sous le nom de curare. Ce produit est obtenu à partir de plantes des genres Chondrodendron et Strychnos, notamment l’espèce C. tomentosum (HODGSON, 2012). Les toxines végétales étaient également utilisées comme poison de pêche, comme c’est le cas de l’arbre au papillon (Buddleja lindleyana) en Chine, de la badiane japonaise (Illicium anisatum) au Japon ou de l’euphorbe d’Irlande (Euphorbia hybernia) dans les Iles britanniques (WICKENS, 2001).

Malheureusement, les toxines sont également employées à des fins moins pacifiques telles que les homicides et les ordalies. En Afrique de l’Ouest, la fève de Calabar était administrée aux 5

Synthèse bibliographique criminels et aux personnes accusées de sorcelleries. La plante, Physostigma venenosum est une légumineuse toxique dont le principe actif, physostigmine ou ésérine, est un alcaloïde. Aujourd’hui, il est largement utilisé en ophtalmologie dans le traitement de certains glaucomes et il sert aussi d'antidote contre l'empoisonnement à l'atropine (WICKENS, 2001).

I.3.3 UTILISATIONS A DES FINS DE RECHERCHE OU THERAPEUTIQUES

La connaissance de ces produits naturels est très avantageuse pour l’homme car ils peuvent servir dans de nombreux domaines, s’ils sont bien maîtrisés. En effet, ils peuvent être utilisés directement ou non en tant que médicaments, produits pesticides ou cosmétiques.

Par exemple, un certain nombre de toxines végétales possèdent des propriétés thérapeutiques à faible dose :  les alcaloïdes de la belladone (Atropa belladonna), c’est-à-dire l’atropine et la scopolamine sont respectivement utilisés comme spasmolytique et antiémétique ;  la morphine et ses dérivés sont des antalgiques puissants employés contre les douleurs modérées à intenses. Ces alcaloïdes sont obtenus à partir du pavot (Papaver spp.) ;  le docétaxel, commercialisé sous le nom de taxotere, est un diterpène obtenu par hémisynthèse à partir de l’if commun (Taxus baccata). Il est utilisé pour le traitement des cancers du sein, du poumon, de l’estomac, du pancréas et de la prostate (HODGSON, 2012) ;  beaucoup de têtes de séries pour la préparation de nouveaux médicaments, en particulier les anticancéreux, proviennent de plantes toxiques, pour ne citer que la vinblastine, la vincristine et la camptothécine (QU et coll., 2013).

Les toxines sont également de précieux outils moléculaires dans l’étude du fonctionnement des organismes vivants. Elles ont permis d’expliquer des voies biochimiques par l’étude de leurs modes d’action. A titre d’exemple, citons la swainsonine, un alcaloïde toxique qui se retrouve dans plusieurs espèces d’Astragalus, Oxytropis et Swainsona (Fabaceae) (COOK et coll., 2014). Etant un inhibiteur de l’α-mannosidase, elle a été utilisée afin d’étudier le rôle de la glycosylation dans la synthèse des glycoprotéines (ARUMUGHAM et TANZER, 1983).

La ricine, une lectine de Ricinus communis ou ricin, est couramment utilisée en biologie moléculaire pour élucider les mécanismes impliqués dans le transport des protéines depuis les endosomes vers l’appareil de Golgi. Avec d’autres toxines protéiques, elle a notamment permis de savoir qu’il existait plusieurs voies endocytaires, même si elles ne sont pas encore bien connues (SANDVIG et coll., 2010).

Synthèse bibliographique

Dans le domaine de la recherche agronomique, le traitement avec la colchicine a été signalé comme étant un excellent outil pour induire et améliorer la variabilité génétique dans certaines cultures vivrières (AJAYI et coll., 2014). Cet alcaloïde tricyclique se retrouve dans des Liliaceae : le colchique d’automne (Colchicum autumnale) et le lis glorieux (Gloriosa superba). Ces effets mutagènes seraient dus à la perturbation de la fonction des microtubules suite à la liaison de la colchicine à la sous-unité protéique des microtubules, empêchant la polymérisation de ces derniers (BARCELOUX, 2008).

I.3.4 UTILISATIONS EN TANT QUE PESTICIDES

Il est de plus en plus nécessaire de produire des pesticides moins dangereux pour la santé et plus respectueux de l'environnement. Pour être acceptables, les pesticides ne doivent pas avoir une forte toxicité vis-à-vis des organismes non ciblés, en particulier les humains, et les phytotoxines répondent souvent à ce besoin.

Dans le domaine de l’agriculture, une classe majeure d'herbicides, les tricétones, ont été développés à partir du leptospermone, un β-tricétone allélochimique contenu dans l’huile essentielle de Leptospermum scoparium (DUKE et coll., 2010). Il existe ainsi aujourd’hui plusieurs herbicides à base de phytotoxines qui visent le marché de l’agriculture biologique, pour ne citer que l’huile essentielle de citronnelle (FERNANDEZ et coll., 2009).

Par ailleurs, un certain nombre de toxines végétales ont donné naissance à des rodenticides, des herbicides ou des insecticides. Citons par exemple les principes actifs des espèces Azadirachta indica, A. excelsa et A. siamensis. Les graines de ces plantes renferment l’azadirachtine, un triterpène du groupe des limonoïdes qui possède des propriétés anti-appétente et inhibitrice de la croissance sur les insectes. Non toxique pour les vertébrés, cet insecticide est utilisé pour protéger les cultures contre les ravages des insectes.

Il en est de même des toxines telles que : la roténone (dans les genres Derris, Lonchocarpus et Tephrosia), les pyréthrines de Tanacetum cinerariifolium, ou les hormones cyastérone et ecdystérone isolés d’Ajuga remota (WICKENS, 2001).

I.4 GENERALITES SUR LE GENRE Albizia

I.4.1 DONNEES BOTANIQUES SUR LE GENRE Albizia

Albizia est un genre botanique très cosmopolite d'environ 150 espèces se présentant comme des petits arbres et arbustes, tropicaux ou subtropicaux, à croissance rapide. Il se rencontre dans toutes les régions tropicales. A Madagascar, il existe 30 espèces de ce genre dont 24 sont endémiques, 3 sont natives non endémiques et 3 introduites (DU PUY et coll., 2002).

Synthèse bibliographique

Voici les caractéristiques botaniques du genre : - inflorescences en capitules, avec 1–2 fleur(s) centrale(s) modifiée(s), fonctionnellement mâle(s) et pourvue(s) d’un tube staminal plus grand et nectarifère. - fleurs petites et en pompon, avec des étamines souvent spectaculaires et plus longues que les pétales. - étamines généralement deux fois plus nombreuses que les pièces de la corolle. - fruit déhiscent ou indéhiscent, à péricarpe sec, membraneux, coriace ou ligneux. - graines non arillées. - feuilles finement découpées, composées de petites folioles qui se replient sur elles-mêmes lorsque la plante manque de lumière. - rameaux inermes.

I.4.2 USAGES TRADITIONNELS DE QUELQUES ESPÈCES D’Albizia

Le genre Albizia est couramment utilisé par les tradipraticiens dans diverses parties du monde. Ceux-ci les préconisent dans le traitement de maladies et affections telles que la malaria, la fièvre typhoïde, la diarrhée, etc… Le tableau 2 récapitule quelques utilisations de ces plantes dans la médecine traditionnelle.

Tableau 2 : Usages traditionnels des Albizia

Organe Références Nom de l’espèce Pays Utilisation utilisé bibliographique

Traitement des maladies de la TAMOKOU et coll. peau, des bronchites, des maux (2012) de tête, de la sinusite, des Centre et Feuilles, douleurs abdominales, de la A. adianthifolia Ouest de fruits fièvre typhoïde, des infections l’Afrique respiratoire et urinaire, de la diarrhée et la gonorrhée, des blessures et des maux d'estomac.

Employées pour soigner la RAJKUMAR et diarrhée, la lèpre, la malaria, la coll. (2012) gonorrhée, l’érysipèle, les Graines, abcès, les ulcères et les A. amara Inde feuilles et éruptions cutanées. fleurs Possèdent des propriétés émétique, antitussive et astringente.

Synthèse bibliographique

Tableau 2 (suite) : Usages traditionnels des Albizia

Organe Références Nom de l’espèce Pays Utilisation utilisé bibliographique

Utilisées pour soigner les maux KOKO et coll. d’estomac, la dysenterie (2000) Ecorces de A. anthelmintica Soudan amibienne et la malaria. tiges Possèdent des propriétés vermifuges.

Utilisées pour soigner la lèpre. AKINTAYO et Graines A. benth Nigeria ADEBOWALE (huile) (2004)

Employées contre la malaria, la RUKUNGA et toux et la gonorrhée. WATERMAN Ecorces de A. gummifera Kenya (1996) ; tiges RUKUNGA et coll. (2007)

Appliquées en externe pour JUNG et coll. l’ulcération de la peau, (2004) ; Chine l’inflammation et les blessures. Ecorces de LIANG et coll. A. julibrissin Japon tiges, fleurs Utilisées contre l’insomnie, (2005) ; Corée l’amnésie, le mal de gorge et YAHAGI et coll. les contusions. (2012) Indiquées pour les désordres MA et coll. (1997) ; psychologiques et les KASTURE et coll. insomnies et verrues. (2000) ; Vietnam Graines, Employé pour traiter BESRA et coll. écorces de l’hémorroïde, la dysenterie la A. lebbeck Inde (2002) ; tiges diarrhée, l’asthme, l’œdème, SHASHIDHARA Chine les empoisonnements et la et coll. (2008) ; bronchite. BABU et coll. Possèdent des propriétés (2009) astringente et expectorante.

Employées contre l’ulcère, la RAO et coll. (2002) A. odoratissima Inde lèpre et la toux.

Utilisée comme remède contre MIYASE et coll. A. procera Egypte Ecorces les maux d’estomac. (2010)

Synthèse bibliographique

Tableau 2 (suite) : Usages traditionnels des Albizia Organe Références Nom de l’espèce Pays Utilisation utilisé bibliographiques

Utilisé contre les infections RUKUNGA et bactériennes et parasitaires WATERMAN (1996 (pneumonie, plaies infectées, et 2001) A. schimperana Kenya malaria). Possède des propriétés analgésiques.

Employée pour le traitement RUKUNGA et Ecorces de A. versicolor Kenya des maladies vénériennes, de la WATERMAN tiges toux, des douleurs articulaires, (2001) de la fièvre et des vers.

I.4.3 LES FAMILLES CHIMIQUES RENCONTREES DANS LE GENRE

I.4.3.1 Les espèces malgaches (RAKOTO et coll., 2011 et 2012 ; RANDRIANARIVO, 2015 ; RAJEMIARIMOELISOA, 2016 ; RANDRIAMAMPIANINA, 2016)

Des investigations phytochimiques sur les Albizia malgaches ont montré que les familles chimiques les mieux représentées sont : - les alcaloïdes (A. arenicola, A. polyphylla) ; - les saponosides (A .bernieri, A. tulearensis) ; - les triterpènes et les stéroïdes (A. arenicola, A. boivini, A. bernieri, A. tulearensis) ; Des produits phénoliques tels que les tanins, les anthocyanes et les flavonoïdes ont aussi été mis en évidence.

I.4.3.2 Les espèces étrangères

De nombreux auteurs ont décrit une grande variété de composés dans le genre Albizia. Comme chez les autres espèces malgaches, les alcaloïdes, les saponosides, les flavonoïdes et les terpénoïdes sont les familles chimiques les plus fréquemment rencontrées. Toutefois, les quinones, les tanins ou les flavonoïdes ont aussi été observées.

I.4.3.2.1 Les alcaloïdes

Des alcaloïdes, souvent de type spermine ont été identifiés dans plusieurs espèces telles que : - A. inopinata : dans les feuilles (ASSIS et coll., 2001) ;

Synthèse bibliographique

- A. adinocephala : la budmunchiamine L4 et L5 dans les écorces de tiges et la budmunchiamine L5 dans les feuilles (OVENDEN et coll., 2002) ; - A. gummifera : la budmunchiamine K(1), la 6-hydroxybudmunchiamine K(2), la 5- norméthylbudmunchiamine K(3), la 6-hydroxy-5-norméthylbudmunchiamine K(4) et la 9- norméthylbudmunchiamine K(5) dans les écorces de racine (RUKUNGA et coll., 2007) ; - A. schimperana : la 5-norméthylbudmunchiamine-K (1) et la budmunchiamine-A (2), la 6ε'-hydroxybudmunchiamine-C (3), la 6ε'-hydroxy-5-norméthylbudmunchiamine-K (4) et la 14- norméthylbudmunchiamine-K (5) dans les écorces de tiges (RUKUNGA et WATERMAN, 1996).

Composé n R R1 R2 1 8 H Me Me 2 4 H Me Me 3 6 OH Me Me 4 8 OH H Me 5 8 H Me H

Figure 1 : Alcaloïdes d’A. schimperana

I.4.3.2.2 Les saponosides

De nombreuses espèces d’Albizia contiennent des saponosides, surtout de type triterpénique :

- chez A. gummifera, des saponosides ainsi qu’une génine lactonique ont été isolés des écorces de tiges (DEBELLA et coll., 2000) ; - chez A. julibrissin où des saponosides de type oléanane, les julibrosides J8, J21, J28, J29, J30, J31, J32, J35 et J36 ont été identifiés dans les écorces de tiges (LIANG et coll., 2005 ; ZOU et coll., 2006 ; HUA et coll., 2009 ; ZHENG et coll., 2006 et 2010) ; - chez A. lebbeck, dans l’extrait éthanolique d’écorces (BABU et coll., 2009) ; - chez A. inundata, des saponosides de type oléanane ont été mis en évidence (ZHANG et coll., 2011) ; - chez A. submidiata, deux saponosides dont l’albiziatrioside A (figure 2, p. 12) ont été identifiés dans les écorces et les infrutescences (ABDEL-KADER et coll., 2001).

Synthèse bibliographique

Figure 2 : Albiziatrioside A d’A. submidiata

I.4.3.2.3 Les triterpénoïdes

Cette famille chimique est également bien représentée chez les Albizia. Par exemple le lupéol et la lupénone ont été isolés à partir des écorces de tiges d’A .versicolor et d’A. schimperana. De plus, l’acide acacique a été isolé du premier et l’hédéragénine du second (RUKUNGA et coll., 2001).

Figure 3 : Acide acacique d’A. versicolor

I.4.3.2.4 Les flavonoïdes

Chez A. lebbeck, des études phytochimiques préliminaires ont montré la présence de flavonoïdes dans l’extrait éthanolique d’écorces (BABU et coll., 2009). Deux flavonols glycosidiques ont été identifiés dans l’extrait hydroéthanolique de ses feuilles (EL-MOUSALLAMY et coll., 1998).

Deux 5-déoxyflavones (figure 4, p. 13) ont été isolées à partir des écorces de racines d’A. odoratissima (RAO et coll., 2002).

Synthèse bibliographique

1 2

R OCH3 H

R1 H OCH3

R2 0-CH2-O H

R3 0-CH2-O OCH3

Figure 4 : 5-déoxyflavones d’A. odoratissima

I.4.4 PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES DES Albizia

I.4.4.1 Propriétés pharmacologiques des espèces malgaches (RAKOTO et coll., 2011 et 2012 ; RANDRIANARIVO, 2015 ; RAJEMIARIMOELISOA, 2016 ; RANDRIAMAMPIANINA, 2016)

La plupart des travaux publiés sur des Albizia malgaches ont été effectués au sein de notre laboratoire d’accueil. Ils ont mis en évidence : - des propriétés antimicrobiennes ; - une toxicité sur différents modèles animaux (rats, souris, cobayes, poussins, larves de moustiques, alevins…) ; - des effets sur le développement des végétaux (espèces potagères et espèces nuisibles).

I.4.4.2 Propriétés pharmacologiques des espèces étrangères

Il existe une littérature abondante qui décrit les propriétés biologique et pharmacologique des plantes du genre Albizia.

I.4.4.2.1 Propriétés cytotoxiques

Un grand nombre d’auteurs ont travaillé sur l’activé anti-cancéreuse des saponosides des Albizia (ZHENG et coll., 2006 ; LIU et coll., 2010 ; MIYASE et coll., 2010). Les deux saponosides albiziatriosides A et B isolés à partir de l'extrait méthanolique d’A. submidiata ont montré une cytotoxicité significative sur la lignée cellulaire A2780 (ABDEL-KADER et coll. ; 2001). De même, le coriarioside A isolé des racines de A. coriaria s’est révélée efficace contre deux lignées cellulaires du cancer colorectal humain, HCT 116 (CI50 : 4,2 µM) et HT-29 (CI50 : 6,7 µM) (NOTE et coll., 2009).

Chez A. julibrissin, le saponoside julibroside J8 possède des propriétés anti-angiogéniques et le julibroside J28 des propriétés antitumorales (LIANG, 2005 ; HUA et coll., 2009). Une activité

Synthèse bibliographique cytotoxique a également été mise en évidence chez A. inundata (ZHANG et coll., 2011). Plus récemment, l’étude des racines d’A. glaberrima a permis d’isoler trois nouveaux saponosides cytotoxiques : glaberrimosides A, B et C. Leurs effets ont été observés sur trois lignées cellulaires humaines (AsPC-1, THP-1 et BJ). Les trois molécules induisent spécifiquement une apoptose des cellules du carcinome pancréatique humain AsPC-1 alors qu’elles sont inactives sur les lignées monocytaires THP-1 et les fibroblastes humains normaux BJ (NOTE et coll., 2016).

I.4.4.2.2 Activité anti-inflammatoire

L'extrait éthanolique des racines d’A. amara a montré un effet anti-inflammatoire significatif chez les rats. A la dose de 200 mg/kg, un résultat comparable à celui de l’aspirine à 100 mg/kg a été observé (KHAN et coll., 2010).

Les extraits éthanolique et éther de pétrole de l'écorce d’A. lebbeck ont montré un effet anti- inflammatoire dose-dépendant significatif. A la dose de 400 mg/kg, les pourcentages d’inhibition de l’œdème étaient respectivement de 60,04 % et 50,82 % contre 70,87 % pour l’indométacine à 10mg/kg (BABU et coll., 2009).

I.4.4.2.3 Propriétés antiplasmodiales

Les Albizia sont également connues pour leurs activités antiplasmodiale et antimicrobienne : deux nouveaux alcaloïdes (budmunchiamines L4 et L5) isolés de l'écorce de la tige et des feuilles de A. adinocephala ont montré leur capacité à inhiber l’enzyme plasmepsine II de Plasmodium falciparum (OVENDEN et coll., 2002). Des propriétés antiplasmodiales ont également été mises en évidence chez A. gummifera (RUKUNGA et coll., 2007 ; MUREGI et coll., 2007).

I.4.4.2.4 Propriétés antimicrobiennes

Les extraits hydroéthanoliques des écorces de tiges et des feuilles d’A. ferruginea ont montré un effet antimicrobien contre Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger, et Penicillium notatum (AGYARE et coll., 2006).

Les budmunchiamines A, B et C isolées d’A. amara possèdent des activités antibactérienne et antifongique et peuvent empêcher l'agrégation plaquettaire (YADAVA et TRIPATHI, 2000 ; THIPPESWAMY et coll., 2015).

I.4.4.2.5 Propriétés antioxydantes

Les feuilles d’A. julibrissin contient un dérivé de la quercétine, l’hypéroside (quercétine-3- O-galactoside) et la quercitrine (quercétine-3-O-rhamnoside), qui ont montré une excellente activité antioxydante (LAU et coll., 2007).

Synthèse bibliographique

L’étude des extraits aqueux et éthanolique des feuilles et des racines d’A. antenusiana a révélé que presque tous les extraits possédaient un potentiel de piégeage des radicaux libres. L’extrait éthanolique des racines s’est montré particulièrement efficace avec une CI50 de 7,08μg/ml, contre 5,01 μg/ml et 5,62 μg/ml pour l’acide ascorbique et l’acide gallique, respectivement (CHIPITI et coll., 2013).

I.4.4.2.6 Activité analgésique

Chez les rats, l'extrait éthanolique aqueux des racines d’A. amara, à une dose de 200mg/kg, a montré un effet analgésique comparable à la dose standard d’aspirine (100 mg/kg). (KHAN et coll., 2010).

I.4.4.2.7 Propriétés nootropique et anxiolytique

La fraction n-butanolique de l'extrait méthanolique des feuilles d’A. lebbeck a montré une activité nootropique et anxiolytique à une dose de 25 mg/kg administrées chez les souris (UNE et coll., 2001).

I.4.4.2.8 Propriété reprotoxique

Des rats mâles ont reçu pendant 60 jours une fraction enrichie en saponines (50 mg/kg) obtenue à partir des écorces de tiges d’A. lebbeck. A la fin du test, les auteurs ont observé une diminution du poids des testicules, de l'épididyme, des vésicules séminales et de la prostate ventrale. Par ailleurs, la production de spermatocytes secondaires a été réduite de 73,41 % (GUPTA et coll., 2005).

I.4.4.2.9 Autres propriétés biologiques des Albizia

Diverses propriétés ont également été mises en évidence comme les propriétés hypotensives d’A. inopinata (PIRES et coll., 2000).

Au Nigéria, l’espèce A. chevalieri est utilisée comme poison de pêche. L’écorce de tige, seule ou avec les racines, est broyée avant d’être versée dans l’eau. Après 24 h, les poissons morts flottent à la surface de l'eau et sont récoltés à la main par les éleveurs de poissons locaux (IBIAM et coll., 2015).

I.5 GENERALITES SUR LES PRINCIPAUX CONSTITUANTS D’Albizia masikororum

I.5.1 GENERALITES SUR LES SAPONOSIDES

I.5.1.1 Définition

Les saponosides sont des hétérosides amphipathiques constitués d’un aglycone triterpénique (30C) ou stéroïdique (27C) lié de façon covalente à une ou plusieurs chaînes osidiques. Ils forment

Synthèse bibliographique un groupe structuralement diversifié de produits naturels que l'on trouve principalement dans les plantes, le plus souvent chez les Dicotylédones (Magnoliopsida). Ils existent également dans certains organismes marins, tels que les étoiles de mer (Asteroidae) et les concombres de mer (Holothuridae).

Leur nom vient du latin « sapo », qui signifie savon, car ils ont des propriétés tensioactives et forment des mousses stables en solution aqueuse. Les noms de certaines espèces de plantes contenant des saponosides reflètent d’ailleurs leur utilisation en tant que sources de savons naturels : l’herbe à savon, (Saponaria officinalis), le savonnier (espèces de Sapindus), ...

Dans la nature, les saponosides jouent apparemment un rôle de défense contre les pathogènes, les ravageurs et les prédateurs. Outre leur rôle dans la défense des plantes, ils sont d'un intérêt croissant pour la recherche sur les médicaments car ils sont des constituants actifs de plusieurs médicaments traditionnels et possèdent des propriétés pharmacologiques très diversifiées (OSBOURN et coll., 2011).

I.5.1.2 Classification

En général, les saponosides sont classés en saponosides triterpéniques et stéroïdiques selon la nature de l’aglycone. Cependant, certains auteurs considèrent que les glycoalcaloïdes stéroïdiques sont de la même famille que les saponosides (KALINOWSKA et coll., 2005).

Une classification plus détaillée basée sur la structure des sapogénines a été proposée depuis mais celle-ci exclut les glycoalcaloïdes. Les 11 squelettes carbonés représentés sur la figure 5 (p. 17), dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oléananes, taraxasteranes, ursanes, cucurbitanes, cycloartanes, lanostanes, et les stéroïdes, constituent les produits finaux des réactions de cyclisation, de réarrangement et de dégradation, qui couvrent les principaux squelettes de saponosides trouvés dans la littérature (VINCKEN et coll., 2007).

Synthèse bibliographique

Figure 5 : Les principaux squelettes des saponosides dans la littérature (VINCKEN et coll., 2007)

Synthèse bibliographique

I.5.1.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques

Les saponosides possèdent une grande diversité de structures et d’activités biologiques, ce qui leur donne un intérêt particulier dans le développement de nouveaux composés pour des applications industrielles, agricoles et pharmaceutiques. Voici quelques-uns des travaux concernant leurs effets biologiques.

I.5.1.3.1 Activité hémolytique

Les saponosides ont généralement la capacité de lyser les érythrocytes, ce qui fait que les tests hémolytiques sont utilisés pour détecter leur présence dans les extraits de plantes. Cette propriété est attribuée à l’interaction entre les saponosides et les stérols membranaires des érythrocytes. En conséquence, les membranes sont détruites, ce qui augmente leur perméabilité et provoque la sortie de l’hémoglobine (SPARG et coll., 2004).

I.5.1.3.2 Activité anti-inflammatoire

Des saponosides stéroïdiques isolés de Tacca vietnamensis appelés taccavietnamosides C, D et E ont inhibé la production de monoxyde d’azote (NO) chez les macrophages RAW 264.7 et les cellules BV2. Ces trois composés ont montré une activité inhibitrice modérée sur la production de NO avec des CI50 allant de 37,0 et 60,7 µM (YEN et coll., 2016).

I.5.1.3.3 Activité antifongique

Des saponosides stéroïdiques isolés à partir de bulbes d’oignon (Allium cepa), les ceposides A, B et C, ont inhibé la croissance de plusieurs souches de champignons in vitro (LANZOTTI et coll., 2012). Les saponosides totaux purifiés à partir de Camellia oleifera ont également montré des activités inhibitrices contre les champignons, en particulier contre Bipolaris maydis et Fusarium moniliforme Sheld (ZHANG et coll., 2014).

I.5.1.3.4 Activité antibactérienne

Plusieurs espèces du genre Medicago ont démontré une activité antibactérienne. Cette activité croit allant des mélanges de saponosides aux échantillons de sapogénines, ce qui a conduit les auteurs à supposer que le fragment osidique n'est pas important pour l'efficacité antimicrobienne. Cet effet est particulièrement remarquable chez Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis (AVATO et coll., 2006).

I.5.1.3.5 Activité cytotoxique et antitumorale

Les saponosides sont bien connus pour leur activité antitumorale (KOCZURKIEWICZ et coll., 2015). Chez Pithecellobium lucidum, des saponosides triterpéniques (pithelucoside B et C) ont

Synthèse bibliographique montré une cytotoxicité contre trois lignées de cellules tumorales humaines (HCT-8, BGC-823 et A2780) avec des valeurs de CI50 allant de 0,61 à 7,56 µg/ml (MA et coll., 2008).

I.5.1.3.6 Activité antiparasitaire

Un composé isolé de Pittosporum mannii a montré une activité marquée à la fois sur Plasmodium falciparum et Leishmania donovani avec des CL50 de 1,02 et 1,80 μg/ml, respectivement (NYONGBELA et coll., 2013.

I.5.1.3.7 Activité molluscicide

Des saponosides stéroïdiques isolées de Yucca desmettiana possède des propriétés molluscicides contre l’escargot Biomphalaria alexandrina. Les desmettianosides A et B ont montré une activité avec des CL100 de 6 ± 0,6 et 11 ± 0,7 mg/l, respectivement (DIAB et coll., 2012). L'essai biologique de Balanites aegyptiaca contre l'escargot terrestre, Monacha cartusiana, a montré l’activité des saponosides totaux. Ils ont causé des mortalités de 30, 53,3, 73,0 et 73,3 % à des concentrations de 0,125, 0,250, 0,500 et 1,00 %, respectivement. La valeur de la CL50 était de 0,256% (DAWIDAR et coll., 2012).

I.5.1.3.8 Activité antivirale

L’asprellanoside A, un saponoside triterpéniques soufré isolé d’Ilex asprella a montré une activité antivirale contre le virus Herpes simplex de type 1 (HSV-1) (ZHOU et coll., 2012).

I.5.1.4 Applications industrielles des saponosides d’origine végétale

Les propriétés physico-chimiques et biologiques des saponosides ont été exploitées avec succès dans différents secteurs industriels : agricole, alimentaire, cosmétique et pharmaceutique (GÜÇLÜ-ÜSTÜNDAĞ et MAZZA, 2007).

I.5.1.4.1 Applications dans l’industrie agroalimentaire

 Dans ce secteur, les saponosides sont utilisés principalement à cause de leur pouvoir moussant. Quillaja saponaria (bois de Panama) et Yucca schidigera sont les principales sources de saponosides dans le monde. Chez Q. saponaria, l’extrait aqueux obtenu à partir des écorces et du bois est employé comme agent moussant pour les boissons à base d’eau aromatisée (FAO, 2016). Y. schidigera est utilisé sous deux formes : soit la poudre obtenue par séchage et broyage du tronc, soit la poudre obtenue après évaporation du jus résultant de l’expression du tronc. Ces produits sont « généralement reconnus comme sûrs » par la US Food and Drugs Administration (FDA).

 L’industrie agroalimentaire se sert couramment de la réglisse et de ses dérivés pour aromatiser de nombreux produits (gomme à mâcher, bonbons, boissons, assaisonnements,…) (GÜÇLÜ-ÜSTÜNDAĞ et MAZZA, 2007). 19

Synthèse bibliographique

 Il existe aussi des procédés qui consistent à complexer le cholestérol des produits laitiers avec des saponosides. Le produit ainsi obtenu est allégé et permet de limiter l’apport en cholestérol dans l’alimentation humaine, ce qui donne un aliment plus sain (RICHARDSON et JIMENEZ-FLORES, 1994).

I.5.1.4.2 Applications dans l’industrie cosmétique

La propriété tensioactive des saponosides est largement exploitée dans la production de produits d’hygiène tels que les shampooings, les gels de douche, les lotions pour cheveux et les dentifrices. Il existe même des produits pour l’élimination des poux de tête et des lentes dont le principe actif est un saponoside (BAKER et coll., 2002). Des saponosides entrent également dans la formulation de produits de beauté qui stimulent la pousse des cheveux (MEYBECK et coll., 1997), traitent l’acné (BOMBARDELLI, 2002) ou freinent le vieillissement de la peau (BONTE et coll., 2003).

Les plantes utilisées comme sources de saponosides comprennent entre autres Medicago spp., Glycine max (soja), Sapindus mukorossi et bien sur Quillaja saponaria et Yucca shidigera (SHIRAKAWA et coll., 1986 ; CHAMBERS et TURNER, 1999 ; OLMSTEAD, 2002 ; SILBERSTEIN, 2016).

I.5.4.1.3 Applications dans l’industrie pharmaceutique

Dans l’industrie pharmaceutique, les saponosides sont surtout utilisés comme matière première pour la production d’hormones stéroïdes. Ainsi, la synthèse de la progestérone à partir du diosgénine de Dioscorea spp. a abouti à la production du premier contraceptif oral dans les années 50. Depuis, la diosgénine et certaines sapogénines de structure similaire comme l’hécogénine des agaves ont été largement utilisées dans ce secteur (GÜÇLÜ-ÜSTÜNDAĞ et MAZZA, 2007).

D’autre part, les saponosides ont donné des résultats prometteurs en tant qu’adjuvants dans des vaccins. Dans ce domaine, le saponoside QS-21 isolé de l'écorce de Quillaja saponaria (QS) s’est révélé être un adjuvant puissant en immunothérapie. QS-21 diffère des autres adjuvants par le fait qu’il stimule non seulement la réponse immunitaire TH1 (avec production de lymphocytes T cytotoxiques) mais également l’immunité TH2. Récemment, il a été évalué dans plus de 80 essais cliniques sur des vaccins (MASULLO et coll., 2017).

La complexité de leur structure et leur toxicité limite encore l’utilisation des saponosides dans les vaccins humains. Cependant des études supplémentaires conduisant à des composés ayant un profil activité/toxicité amélioré ainsi que des essais précliniques et cliniques bien conçus sont en cours (NETALA et coll., 2015).

Synthèse bibliographique

I.5.2 GENERALITES SUR LES FLAVONOÏDES

I.5.2.1 Définition

Les flavonoïdes sont des pigments végétaux synthétisés à partir de la phénylalanine, ils sont largement distribués dans les plantes. Cela en fait un groupe de métabolites secondaires biologiquement importants et chimiquement très diversifiés (TREUTTER, 2006). Ils montrent des couleurs remarquables qui se retrouvent notamment dans les pétales des fleurs. Ces composés émettent une fluorescence brillante lorsqu'ils sont excités par la lumière UV et ils sont présents dans les cellules des plantes vertes (HAVSTEEN, 2002).

I.5.2.2 Classification

Les flavonoïdes peuvent être classés en plusieurs sous-groupes comprenant les anthocyanidines, les flavonols, les flavones, les flavanols, les flavanones, les chalcones, les dihydrochalcones et les dihydroflavonols (TREUTTER, 2006).

I.5.2.3 Propriétés pharmacologiques et biologiques

Les flavonoïdes possèdent diverses activités biologiques et pharmacologiques, y compris les activités anticancéreuses, antimicrobiennes, antivirales, antiinflammatoires, immunomodulatrices et antithrombotiques (KIM et coll., 2004).

I.5.2.3.1 Activité antioxydante

Les propriétés antioxydantes des flavonoïdes ont fait l’objet de nombreuses études car elles seraient le principal support de leurs effets pharmacologiques (AMIC et coll., 2007). Ainsi, dans les parties aériennes de Teucrium polium L., l'extrait méthanolique, la rutine et l'apigénine se sont révélés être les fractions les plus actives avec des valeurs de CI50 de 20,1 ± 1,7, 23,7 ± 1,9 et 30,3 ± 2,1 µg/ml, respectivement (SHARIFIFAR et coll., 2009).

I.5.2.3.2 Activité anti-inflammatoire

De nombreux flavonoïdes végétaux présentent une activité anti-inflammatoire in vitro et in vivo. Ainsi, la rutine, la quercétine (flavonol) et l'hespéridine (flavanone), administrées à des rats, à des doses quotidiennes équivalentes à 80 mg/kg, ont inhibé les phases aiguë et chronique de l'inflammation. La rutine était la plus active dans la phase chronique (GUARDIA et coll., 2001).

I.5.2.3.3 Activité antimicrobienne

L’activité antimicrobienne des flavonoïdes a été largement étudiée, notamment leurs activités antifongique, antibactérienne et antivirale y compris contre des pathogènes résistants aux antibiotiques (BYLKA et coll., 2004 ; CUSHNIE et LAMB, 2005). Ainsi, les flavonoïdes de la peau

Synthèse bibliographique de la bergamote (Citrus bergamia) a montré un effet significatif sur différentes souches de bactéries et une levure (MANDALARI et coll., 2007). Au cours de leurs études sur les effets antimicrobiens des flavonoïdes de plusieurs plantes, des chercheurs ont découvert que les flavones, les quercétines et la naringénine étaient les plus actives sur les microorganismes (RAUHA et coll., 2000).

CHAPITRE II :

PREPARATION ET CHIMIE DES EXTRAITS

Préparation et chimie des extraits

II.1 INTRODUCTION

L’objectif des travaux rapportés dans ce chapitre consacré à l’étude phytochimique d’A. masikororum a été de préparer et caractériser les extraits et produits destinés aux investigations biologiques. Pour cela, les différentes étapes de cette étude sont :  la préparation d’extraits à partir de différents organes (feuilles, écorces de tige, cosses de fruit et graines) de la plante ;  le criblage phytochimique de tous les extraits obtenus ;  la purification de l’extrait méthanolique des graines qui constitue le principal extrait utilisé.

II.2 LE MATERIEL UTILISE

II.2.1 DESCRIPTION BOTANIQUE D’ALBIZIA MASIKORORUM R. Vig.

Albizia masikororum R. Vig. est un arbuste ou un petit arbre à port en parasol. Les feuilles sont groupées en bouquets sur les rameaux courts et alternes sur les jeunes rameaux longs. Les fleurs sont glabres sauf les sommets des lobes du calice et de la corolle. La fleur terminale est hétéromorphe et mâle. Les étamines blanches sont au nombre de 40 à 71, le tube staminal qui présente parfois un épaississement discal à sa base interne est plus ou moins découpé en éléments. Le fruit est le plus souvent faiblement comprimé, parfois presque cylindrique. Les graines, analogues à celles d’Albizia arenicola, sont ellipsoïdales ou obovales, parfois de section circulaire. Le plus souvent, elles sont nettement comprimées antéro-postérieurement et leurs téguments de couleur brune sont épais et durs (DU PUY et coll., 2002).

La classification botanique de la plante est la suivante (Catalogue of life, 2017) :

Règne : Plantae Embranchement : Tracheophyta Classe : Magnoliopsida Ordre : Fabales Famille : Fabaceae Genre : Albizia Espèce : masikororum R.Vig. Synonyme : Albizzia masikororum R. Vig. Noms vernaculaires : hatakataka, kidinala, tsikatakataka

Des photos de la plante et de certains de ses organes sont montrées sur la figure 6 (p. 24).

Préparation et chimie des extraits

Figure 6 : Albizia masikororum (source : auteur, SNGF) a) la plante entière; b) rameau feuillu ; c) fruits ; d et e) graines

La plante se rencontre dans le domaine du Sud de Madagascar, depuis le sud de Morondava jusqu’à Antanimora, mais également à l’est d’Ihosy, à une altitude pouvant s’élever jusqu’à 1000 m. Elle pousse dans les fourrés secs, le plus souvent sur des sols sableux. La période de floraison se situe entre juillet et septembre annuellement (DU PUY et coll., 2002).

Comme la plupart des espèces malgaches, A. masikororum est essentiellement utilisée pour la construction et la menuiserie, ou bien comme bois de chauffe.

Préparation et chimie des extraits

II.2.2 LES PRODUITS CHIMIQUES

Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés sont de qualité pure ou pour analyse (PROLABO et MERCK).

Pour la chromatographie sur couche mince (CCM), des plaques de gel de silice, (Kieselgel

60 F254 MERCK) sur un support en aluminium de 20 x 20 cm (épaisseur de la couche 0,2 mm) sont utilisées.

Pour les chromatographies liquides, les supports suivants ont été utilisés comme phase stationnaire : - du gel SEPHADEXTM LH20 (SIGMA-ALDRICH) ; - du gel de silice (ACROS ORGANICSTM , Fischer Scientific) dont la taille des particules est 60 -200 µm et le diamètre des pores 60 Å.

II.3 METHODES DE PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS

II.3.1 PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL

Les graines d’A. masikororum sont désinfectées par trempage dans l’eau de Javel à 10% pendant 5 min. Après rinçage, elles sont mises à sécher à l’ombre puis broyées à l’aide d’un broyeur (ROBOT COUPE BLENDER) jusqu’à obtention d’une poudre fine. Les autres organes (feuilles, cosses et écorces de tige), après séchage à l’abri du soleil, sont également broyés.

Les poudres obtenues sont conservées à température ambiante dans des récipients étiquetés et opaques, à l’abri de l’air et de l’humidité. Elles constituent le matériel d’étude.

II.3.2 METHODE D’EXTRACTION

Les poudres des graines, des cosses, des écorces et des feuilles ont été délipidées avec de l’hexane puis épuisées avec du méthanol. Pour cela, 100 g de poudre sont mis à macérer dans 500 ml d’hexane sous agitation magnétique pendant 12 h, à température ambiante. Après décantation et filtration, le surnageant est mis de côté tandis que le marc est repris 2 fois dans le même solvant. Tous les filtrats sont rassemblés et évaporés sous pression réduite (Cf. paragraphe II.6, p.31) pour donner l’extrait hexanique.

Le marc est ensuite mis à sécher avant de subir le même traitement avec du méthanol pour donner l’extrait méthanolique.

Préparation et chimie des extraits

II.4 METHODES ANALYTIQUES

II.4.1 METHODES DE DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES

Le criblage phytochimique a été effectué sur la poudre de graines et les extraits méthanoliques des différents organes végétaux étudiés (Cf. paragraphe II.3.1, p.25).

Pour préparer les différents extraits à analyser, 1 g de la poudre végétale ou 50 mg de résidu d’évaporation des extraits méthanoliques sont utilisés. Ce matériel est mis à macérer dans 10 ml d’éthanol (75 %), de chloroforme ou de HCl (2N). La macération dure une nuit à + 4° C pour la poudre végétale et 30 min à température ambiante pour les extraits. Après filtration, les extraits hydroéthanolique, chloroformique et acide sont respectivement obtenus.

Pour l’extrait aqueux, 1 g de la poudre végétale ou 50 mg de résidu d’évaporation des extraits méthanoliques est porté à ébullition pendant 30 min dans de l’eau distillée (10 ml) puis laissé macérer jusqu’à refroidissement. Le macérat filtré constitue l’extrait aqueux.

Les tests de détection des familles chimiques ont été réalisés sur ces différents extraits.

II.4.1.1 Détection des alcaloïdes

Les alcaloïdes sont recherchés dans l’extrait acide selon la méthode décrite par BRUNETON (1993). Pour cela, l’extrait est divisé en trois aliquotes dans des tubes à essais. Trois tests sont effectués à l’aide des réactifs spécifiques de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF (composition en Annexe II).

II.4.1.1.1 Test de Mayer

Quelques gouttes de réactifs de MAYER sont ajoutées dans le premier tube. L’apparition d’une floculation ou d’une précipitation indique que l’extrait contient des alcaloïdes.

II.4.1.1.2 Test de Wagner

Après ajout de 3 gouttes de réactif de WAGNER, l’apparition d’une floculation ou de précipité révèle la présence des alcaloïdes.

II.4.1.1.3 Test de Dragendorff

L’extrait est additionné de 3 gouttes de réactif de DRAGENDORFF. Les alcaloïdes sont présents si une floculation ou un précipité se forme.

Préparation et chimie des extraits

II.4.1.2 Détection des triterpènes et des stéroïdes (Test de LIEBERMAN- BURCHARD)

Trois gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées à 1 ml d’extrait chloroformique.

L’ensemble est agité légèrement, puis additionné d’un égal volume d’acide sulfurique (H2SO4) 36 N. Au bout d’une heure, si la coloration est bleu-vert, des stéroïdes sont présents. Par contre, l’apparition d’un anneau rouge-violet ou rose indique la présence des triterpènes.

II.4.1.3 Détection des stérols insaturés (Test de SALKOWSKI)

Dans un tube à essais incliné, 1 ml d’extrait chloroformique est mélangé à 1 ml de H2SO4 36N. L’apparition d’une coloration rouge au niveau de l’interface indique la présence de stérols insaturés.

II.4.1.4 Détection des tanins et des polyphénols

Trois types de tests sont effectués sur l’extrait aqueux, selon la méthode de MARINI- BETTOLO (1981).

II.4.1.4.1 Test à la gélatine 1 %

Cinq gouttes de gélatine à 1 % sont ajoutées à 0,5 ml d’extrait. L’apparition d’un précipité traduit la présence de tanins hydrosolubles de type catéchique.

II.4.1.4.2 Test à la gélatine salée

Le mode opératoire est identique à celui du test à la gélatine, mais cette fois-ci, de la gélatine salée est utilisée. Si des tanins condensés de type pyrogallique sont présents, un précipité se forme.

II.4.1.4.3 Test au chlorure ferrique

Quelques gouttes d’une solution méthanolique de chlorure ferrique sont ajoutées à 0,5ml d’extrait aqueux. La coloration bleu-vert ou bleu-noir traduit la présence de tanins de type catéchol, tandis que la coloration noir bleuâtre indique la présence de tanins de type pyrogallol.

Notons qu’une réaction négative à la gélatine salée associée à une réaction positive au chlorure ferrique signifie que l’extrait contient des composés phénoliques autres que les tanins.

II.4.1.5 Détection des saponosides

Un millilitre de l’extrait aqueux est agité vigoureusement pendant 30 s. La formation d’une mousse persistante d’une hauteur de 1 cm (pendant 30 min ou plus) indique la présence de saponosides (BRUNETON, 1993).

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II.4.1.6 Détection des anthraquinones (Test de BORNTRAGER)

Le test est effectué sur l’extrait aqueux (30 ml). Celui-ci est extrait avec 30 ml de benzène dans une ampoule à décanter. La phase benzénique, transférée dans un tube à essais, est mélangée à 5 ml d’ammoniaque. Après agitation, le virage au rouge de la phase alcaline (phase inférieure) révèle la présence d’anthraquinones (BRUNETON, 1987).

II.4.1.7 Détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes

Trois tests sont réalisés sur l’extrait hydroéthanolique, selon la méthode de FONG et coll. (1977) :

II.4.1.7.1 Test de WILLSTATTER (test à la cyanidine)

Trois millilitres d’extrait hydroéthanolique sont additionnés de quelques gouttes de HCl (12,07 N) et de deux portions de tournure de magnésium. Le changement de couleur apparaît au bout de 10 min. Le virage au rouge traduit la présence de flavones, au rouge pourpre celle de flavonols et au rouge violacé celle des flavonones.

L’opération précédente est répétée dans un autre tube à essais, ensuite, 1 ml d’eau distillée et 1 ml d’alcool isoamylique sont ajoutés à l’extrait. La lecture du résultat se fait comme précédemment.

II.4.1.7.2 Test de BATE-SMITH

Du HCl (12,07 N) de volume 0,5 ml est ajouté à 1 ml d’extrait hydroéthanolique. La solution acide ainsi obtenue est chauffée au bain-marie pendant 30 min. Après refroidissement, une coloration rouge violacé indique la présence de leucoanthocyanes.

II.4.1.8 Détection des iridoïdes

La détection des iridoïdes se fait selon la méthode décrite par BRUNETON (1987). L’extrait aqueux est additionné d’un volume égal de HCl (12,07 N) et le mélange est chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min. La formation d’un précipité noir permet de détecter la présence d’iridoïdes.

II.4.1.9 Détection des coumarines

Les coumarines sont détectées selon la méthode décrite par RIZK (1982). L’extrait chloroformique est chauffé pendant 5 min, puis il est soumis à une CCM (solvant de migration : toluène / acétate d’éthyle, 93/10). La visualisation du chromatogramme après migration se fait à

365 nm en absence et en présence de NH3. L’apparition d’une fluorescence indique la présence de coumarines.

Préparation et chimie des extraits

II.4.1.10 Détection des cardénolides

La présence des cardénolides est vérifiée selon la méthode décrite par MARINI- BETTOLO (1981). L’extrait hydroéthanolique est additionné de quelques gouttes de réactif de KEDDE, le test est positif si la couleur vire au mauve.

II.4.2 ANALYSE DE L’HOMOGENEITE : chromatographie sur couche mince (CCM)

La CCM est une méthode chromatographique simple et rapide qui permet de suivre l’homogénéité des extraits et fractions au cours de la purification. Elle repose sur les phénomènes d’adsorption des constituants d’un mélange sur une phase stationnaire et de leur affinité pour la phase mobile.

La phase stationnaire est constituée d’un gel de silice 60 F254 tandis que la phase mobile consiste en un système de solvants n-Butanol/Acide acétique/Eau (BAE), 6/2/2 (p/p/p).

Les différents extraits sont déposés à l’aide d’un capillaire en tirets d’environ 5 mm le long d’une ligne située à 0,5 cm du bord inférieur d’une plaque. Les dépôts sont espacés de 0,5cm les uns des autres. Après chaque dépôt, la plaque est séchée à l’aide d’un séchoir à main. Elle est ensuite placée dans la cuve à chromatographie (DESAGA) saturée en vapeurs du solvant de chromatographie par application de papier filtre imbibé du solvant contre les parois internes. La migration est arrêtée quand le front du solvant arrive à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque.

La révélation se fait par pulvérisation des plaques chromatographiques avecde la vanilline sulfurique (composition en Annexe VI). Après chauffage à 120 °C pendant 5 min, les bandes apparaissent sous forme de taches violettes.

II.5 METHODES DE PURIFICATION

II.5.1 FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL

La partition par le n-butanol est utilisée pour obtenir une fraction butanolique enrichie en saponosides.

Dans une ampoule à décanter, l’extrait à purifier est dissous dans de l’eau distillée (150ml) puis additionné d’un volume égal de n-butanol. Le tout est agité vigoureusement puis laisser décanter. La phase butanolique est récupérée une fois que les deux liquides forment deux phases distinctes. Cette opération est répétée 3 fois puis les fractions butanoliques sont rassemblées et évaporées, de même que la fraction aqueuse.

Préparation et chimie des extraits

II.5.2 EXTRACTION DES SAPONOSIDES TOTAUX

Dans un bain de glace, un mélange d’acétone et d’éther diéthylique (v/v) est versé petit à petit sur la fraction butanolique dissoute dans du méthanol, jusqu’à précipitation. Le tout est laissé macérer pendant quelques minutes puis centrifugé à 1000 tours/min pendant 10 min, à +4°C. Le culot est récupéré et le surnageant est traité à nouveau par le mélange jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de précipitation. Tandis que le surnageant est mis de côté, les culots contenant les saponosides totaux sont dissous dans de l’eau distillée. Le surnageant et les saponosides totaux sont ensuite évaporés sous pression réduite.

II.5.3 ISOLEMENT DES PRINCIPES ACTIFS PAR LES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES

Deux techniques chromatographiques ont été utilisées : la filtration sur gel Sephadex LH20 et la chromatographie flash sur gel de silice.

II.5.3.1 Filtration sur gel Sephadex LH20

Il s’agit d’une technique de chromatographie liquide, décrite par DETERMANN (1968), qui trie les molécules en fonction de leur taille et de leur forme. L’échantillon est introduit dans la colonne remplie d’un gel constitué de particules sphériques poreuses et il est élué par un solvant (phase mobile). Les plus grosses molécules ne pouvant pas passer à travers les pores des grains, sont exclues et donc rapidement éluées. Les petites molécules diffusent dans le gel, elles migrent plus lentement dans la colonne et sortent plus tardivement.

II.5.3.1.1) Préparation de la colonne

Le gel est mis à gonfler pendant 3 h dans le solvant d’élution (ou éluant) constitué d’un mélange de dichlorométhane et de méthanol (50/50, v/v). Après dégazage sous vide afin d’éviter la formation de bulles d’air, 68 ml de gel sont coulés dans une colonne de verre de 80 cm de hauteur et 15 cm de diamètre. Le gel est ensuite équilibré avec au moins 3 volumes de colonne du solvant d’élution.

II.5.3.1.2 Dépôt et élution de l’échantillon

Une fois que la colonne est prête, l’extrait à purifier (500 mg) est dilué dans 1 ml de solvant d’élution. La solution ainsi obtenue est déposée à la surface du lit de gel stabilisée avec une rondelle de papier filtre, puis éluée avec un volume suffisant d’éluant. Le débit est réglé à 0,7 ml/min.

Des fractions de 0,5 ml sont récupérées et celles ayant le même profil chromatographique sont rassemblées. 30

Préparation et chimie des extraits

II.5.3.2 Chromatographie flash sur colonne sèche

Cette technique chromatographique décrite par SHUSTERMAN et coll. (1997) est rapide et facile à mettre en œuvre.

II.5.3.2.1 Préparation de la colonne

La silice (25 g) est versée dans un entonnoir en verre fritté puis l’aspiration est appliquée tout en appuyant sur la surface pour tasser le support en éliminant les bulles d’air. Ce support de silice doit ensuite être testé pour éviter les cassures au cours de l’élution. Pour cela, du solvant est versé sur le lit de gel tout en aspirant. Le front du solvant doit descendre le long de la colonne selon une ligne horizontale. Si ce n’est pas le cas ou s’il se crée des vides, la silice doit être coulée et tassée à nouveau.

II.5.3.2.2 Dépôt de l’échantillon

Le dépôt se fait par préadsorption des échantillons sur un excès de gel de silice : les échantillons sont dissous dans un 1 ml de méthanol puis 5 équivalents de masse de silice sont rajoutés. Cette bouillie est ensuite évaporée sous vide, et le mélange d’extrait et de silice sec est déposé uniformément sur le lit de gel.

II.5.3.2.3 Elution

Après le dépôt de l’échantillon l’élution se fait par aspiration. Des séries discontinues de systèmes dichlorométhane-méthanol-eau (D/M/E, v/v/v) de polarité croissante a servi d’éluant.

II.6 METHODES D’EVAPORATION

Les opérations de réduction de volume des différents extraits sont effectuées au moyen d’un évaporateur rotatif à 40° C, sous pression réduite.

II.7 CALCUL DES RENDEMENTS

Les rendements d’extraction sont calculés par rapport aux extraits ou fractions à partir desquels l’extraction ou le fractionnement a été effectué. Ils sont exprimés en pourcentage (p/p) et calculés selon la formule:

푝표푖푑푠 푑푒 푙′푒푥푡푟푎푖푡 푝푢푟푖푓푖é (푔) R (%) = × 100 푝표푖푑푠 푑푒 푙′푒푥푡푟푎푖푡 푑푒 푑é푝푎푟푡 (푔)

Préparation et chimie des extraits

II.8 RESULTATS

II.8.1 RENDEMENTS D’EXTRACTION DES DIFFERENTS EXTRAITS ET FRACTIONS

Tous les rendements d’extraction sont exprimés en % (p/p) par rapport à l’extrait précédent.

L’extraction a permis d’obtenir deux types d’extraits bruts : hexanique et méthanolique. Les rendements moyens d’extraction sont présentés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Les rendements moyens d’extraction (%, p/p)

Cosses Ecorces Feuilles Graines Solvant Hexane MetOH Hexane MetOH Hexane MetOH Hexane MetOH Désignationd’extraction EHC EMC EHE EME EHF EMF EHG EMG Rendement 2,01 4,61 0,95 2,38 1,17 4,74 3,36 19,01 (%, p/p) Les rendements d’extraction varient selon les organes et les solvants d’extraction. En effet, le rendement le plus faible a été observé avec l’extrait hexanique des écorces et le plus élevé avec EMG. Concernant les organes, les meilleurs rendements d’extraction ont été obtenus avec les graines, que ce soit pour l’extrait hexanique ou méthanolique. Ce sont les extraits d’écorces qui ont les plus faibles rendements par rapport à ceux des 3 autres organes. Chez les feuilles et les cosses, les rendements sont similaires et presque 4 fois moins importants que pour les graines.

II.8.2 LES FAMILLES CHIMIQUES PRESENTES DANS LA PLANTE

Le criblage phytochimique de la poudre végétale des graines et des différents extraits méthanoliques a montré que les familles chimiques présentes dans la plante sont les saponosides, les triterpènes, les tanins, les flavonoïdes et les leucoanthocyanes. Ces résultats sont consignés dans le tableau 4 (p. 33).

D’après ces résultats, aucun des extraits méthanoliques des 4 organes étudiés ne contient des alcaloïdes ou des stéroïdes, par contre ils renferment tous des triterpènes.

Dans les graines, l’extraction a permis d’éliminer les tanins qui ont été détectés dans la poudre végétale mais pas dans l’extrait méthanolique. Contrairement aux feuilles, cosses et écorces, les graines contiennent des saponosides, des cardénolides et des stérols insaturés mais pas de produits phénoliques.

D’un autre côté, les extraits méthanoliques des cosses, des écorces et des feuilles présentent des profils chimiques similaires avec une présence marquée de produits phénoliques.

Préparation et chimie des extraits

Ce qui les différencie, c’est que les cosses, contrairement aux deux autres organes, ne contiennent pas de tanins.

Tableau 4 : Résultats du criblage phytochimique

Extraits méthanoliques Poudre Réactions de Famille chimique végétale détection Cosses Ecorces Feuilles Graines (graines) Test de Mayer - - - - - Test de Wagner - - - - - Alcaloïdes Test de - - - - - Dragendorff Test à la - + + - +

gélatine 1 % Tanins Test à la - - + - + gélatine salée

Test au FeCl3 - - + - + Flavonols + + + - - Flavonoïdes Flavones - - - - - Flavanones - - - - - Leucoanthocyanes + + + - - Composés phénoliques Composés Anthraquinones nd - nd - - Coumarines nd - nd - nd Test de Triterpènes Liebermann- - - + + +

Burchard Test de Stéroïdes Liebermann------Burchard

Terpénoïdes Stérols Test de - - - + + insaturés Salkowski Iridoïdes nd - - nd nd

Saponosides - - - + +

Cardénolidess nd nd nd + nd

Hété

rosides Glycosides cyanogénétiques nd nd nd - nd nd : non déterminé

II.8.3 LES DIFFERENTS EXTRAITS ET FRACTIONS OBTENUS A PARTIR DE EMG

Les saponosides qui sont majoritaires dans les graines ont été purifiés à partir de EMG. Celui-ci a subi un fractionnement par le n-butanol, donnant 2 phases, l’une butanolique et l’autre aqueuse. D’après l’analyse par CCM, seule la phase butanolique contenait des saponosides. Par conséquent, les saponosides totaux ont été extraits à partir de cette phase.

Les saponosides totaux de graines (STG) ont été ensuite chromatographiés sur une colonne de gel Sephadex LH20 (3 dépôts de 500 mg chacun) avec le système

Préparation et chimie des extraits

dichlorométhane/méthanol (D/M, 50/50, v/v) comme éluant. Quatre fractions (LH1 à LH4) ont été rassemblées selon leur comportement en CCM.

Seules les fractions LH3 et LH4 ont été soumises à une chromatographie flash sur colonne sèche car elles étaient disponibles en quantité suffisante.

L’élution de LH3 avec la série de systèmes D/M/E 70/30/3 ; 70/30/5 ; 65/35/5 ; 65/35/7 ;

60/40/7 ; 60/40/10 a permis d’obtenir les fractions Sil3-1 à Sil3-6, respectivement. L’élution de LH4 avec la série de systèmes D/M/E 70/30/3 ; 70/30/5 ; 65/35/5 ; 60/40/7 ; 60/40/10 a permis d’obtenir les fractions Sil4-1 à Sil4-5, respectivement.

Les différentes étapes de la purification sont résumées sur la figure 7.

Extrait méthanolique des graines (EMG)

Fractionnement par le n-butanol

Phase Fraction aqueuse butanolique

Précipitation avec un mélange acétone-diéthyl éther

Saponosides totaux des graines Fraction non- (STG) saponosidique

Filtration sur gel Sephadex (LH20, D/M, 50/50, v/v)

LH1 LH2 LH3 LH4

Chromatographie flash (SiO2, gradient D/M/E)

Sil Sil3-1 Sil3-2 3-3 Sil3-4 Sil3-5 Sil3-6 70/30/:3 70/30/5 65/35/5 65/35/7 60/40/7 60/40/10

Sil4-1 Sil4-2 Sil4-3 Sil4-4 Sil4-5 70/30/:3 70/30/5 65/35/5 60/40/7 60/40/10

Figure 7 : Etapes de purification de l’extrait méthanolique des graines d’A. masikororum

Préparation et chimie des extraits

Toutes les fractions obtenues à partir de EMG sont présentées dans le tableau 5. Toutes les étapes d’extraction et de purification ont été guidées par un test d’homogénéité par chromatographie sur couche mince (CCM) et par des tests de toxicité sur souris quand les quantités d’extrait le permettaient.

Tableau 5 : Liste des fractions obtenues à partir de EMG

Fraction de départ Etape de la purification Noms des fractions Partition liquide-liquide avec le Phase butanolique EMG n-butanol Phase aqueuse Saponosides totaux des Extraction des saponosides graines (STG) Phase butanolique totaux Fraction non- saponosidique LH1 Filtration sur gel Sephadex LH2 STG LH20 LH3 LH4 Sil3-1 Sil3-2 Chromatographie flash sur Sil3-3 LH3 colonne sèche (série discontinue Sil3-4 de 6 mélanges D/M/E) Sil3-5 Sil3-6 Sil4-1 Chromatographie flash sur Sil4-2 LH4 colonne sèche (série discontinue Sil4-3 de 5 mélanges D/M/E) Sil4-4 Sil4-5

La figure 8 (p. 36) montre les chromatogrammes des différentes fractions obtenues à partir de EMG.

Préparation et chimie des extraits

(a)

EMG : extrait méthanolique des graines ; Aq : phase aqueuse ; Org : phase organique ; STG : saponosides totaux des graines ; LH1 à LH4 : fractions de STG sur LH20

(b) (c)

Figure 8 : Chromatogrammes des différentes fractions obtenues avec l’extrait EMG (a) : EMG et ses fractions ; (b) : sous-fractions obtenues à partir de LH3 ; (c) : sous-fractions obtenues à partir de LH4

II.8.4 RENDEMENTS DES DIFFERENTS EXTRAITS ET FRACTIONS OBTENUS A PARTIR DE EMG

II.8.4.1 Rendements d’extraction des phases butanoliques et aqueuses

Les phases butanoliques et aqueuses ont été obtenues à partir de EMG avec des rendements de 70,07 % et 26,35 %, respectivement. Les CCM ayant révélé que les saponosides ont migré dans la phase butanolique, c’était sur cet extrait que l’extraction des saponosides totaux a été faite.

II.8.1.2 Rendements d’extraction des saponosides totaux et de ses fractions

Les saponosides totaux des graines (STG) ont été obtenus avec un rendement d’extraction moyen de 63,38 % (p/p) à partir de la phase butanolique, soit environ 8,44 % de la poudre végétale.

Préparation et chimie des extraits

Le fractionnement de STG par chromatographie sur gel Sephadex LH20 a donné 4 fractions LH1 à LH4 dont les rendements sont présentés dans le tableau 6.

Tableau 6 : Rendements de purification des fractions des saponosides totaux (%, p/p)

LH1 LH2 LH3 LH4 Rendement de purification 0,13 0,99 70,33 4,73 (p/p, %)

Le fractionnement par chromatographie flash de LH3 et LH4 a permis d’obtenir 6 sous- fractions Sil3-1 à Sil 3-6 pour LH3 et 5 sous-fractions Sil4-1 à Sil4-5 pour LH4.

Les rendements par rapport à LH3 sont présentés dans le tableau 7.

Tableau 7 : Rendements de purification des fractions LH3 (%, p/p)

Sil3-1 Sil3-2 Sil3-3 Sil3-4 Sil3-5 Sil3-6 Rendement de purification 3,3 19 22 13,6 8,2 3,6 (p/p, %)

Les rendements de purification des fractions obtenues à partir de LH4 sont présentés dans le tableau 8.

Tableau 8 : Rendements de purification des fractions LH4 (%, p/p)

Sil4-1 Sil4-2 Sil4-3 Sil4-4 Sil4-5 Rendement de purification 28,33 20 11,66 8,33 6,66 (p/p, %)

II.9 DISCUSSION

L’étude chimique a porté sur les cosses de fruit, les écorces de tige, les feuilles et les graines d’A. masikororum. Les racines n’ont pas été récoltées pour ne pas nuire à la plante.

Une des particularités d’A. masikororum est l’absence d’alcaloïdes dans tous les organes étudiés, alors que cette famille chimique est souvent retrouvée dans les autres espèces d’Albizia (ASSIS et coll., 2001 ; RAKOTO et coll., 2011 et 2012 ; THIPPESWAMY et coll., 2015 ; RANDRIAMAMPIANINA, 2016). Par contre, comme chez les autres espèces aussi bien malgaches qu’étrangères les saponosides sont bien représentés dans les graines la plante (HAN et coll., 2011 ; RANDRIANARIVO, 2015 ; RUNYORO et coll., 2015 ; SINGAB et coll., 2015 ; RAJEMIARIMOELISOA, 2016).

Il est apparu que l’extrait méthanolique des graines possède un profil chimique différent par rapport à ceux des 3 autres organes car, à l’inverse des autres organes, elles renferment des produits terpéniques mais pas de produits phénoliques.

Préparation et chimie des extraits

Les cosses, les écorces et les feuilles contiennent tous les trois des triterpènes, des flavonoïdes et des leucoanthocyanes. La seule différence est la présence de tanins dans les écorces et les feuilles mais pas dans les cosses. Nos résultats ne permettent pas encore de dire si les mêmes molécules se retrouvent dans ces trois organes ou s’ils ont chacun leurs propres gammes de produits.

Les graines sont riches en saponosides qui constituent environ 8 % de la poudre végétale et près de la moitié de l’extrait EMG. Ceci s’accorde avec le fait que chez les Légumineuses, les saponosides sont associées aux protéines et sont donc concentrées dans les organes riches en protéines comme les graines (KHARKWAL et coll., 2012).

Les graines contiennent également des cardénolides, des stérols insaturés ainsi que des triterpènes. La présence de ces derniers indique que les saponosides pourraient être de nature triterpénique, comme dans les autres espèces d’Albizia. Dans la littérature, les saponosides rencontrés chez les Albizia possèdent un squelette triterpénique de type oléanane (HAN et coll., 2008 ; NOTE et coll., 2010 ; ZHANG et coll., 2011 ; BARBOSA, 2014 ; SINGAB et coll., 2015), ce qui est aussi le cas d’une espèce rencontrée à Madagascar, A. gummifera (CAO et coll., 2007). Les saponosides d’A. masikororum pourraient être de même nature.

La suite de l’étude chimique s’est focalisée sur la purification des saponosides des graines. Rappelons que ces composés ont migré dans la phase butanolique au cours de la partition avec le n-butanol, ce qui permet de dire qu’A. masikororum ne contiendrait que des saponosides à courtes chaînes osidiques peu polaires (FRANCIS et coll., 2002).

Un tamisage moléculaire des saponosides totaux de la plante a permis d’obtenir 4 sous- fractions désignées LH1 à LH4, contenant des molécules dont le poids moléculaire décroît de la première à la dernière fraction. Ceci pourrait être lié à la taille et au nombre de chaînes osidiques attachées à la génine triterpénique. Ainsi, la fraction LH4 qui contient les plus petites molécules renferme probablement des saponosides monodesmosidiques, avec une seule chaîne osidique (AUGUSTIN et coll., 2011).

La dernière étape de la purification est la chromatographie sur gel de silice qui se base sur la polarité des produits. Elle a donné des sous-fractions de polarité croissante à partir de LH3 et de LH4, les seules fractions qui se trouvaient en quantité suffisante pour effectuer la manipulation. Il est probable que l’état de glycosylation des aglycones a également joué un rôle dans la séparation des différentes fractions car plus ils sont glycosylés, plus ils sont polaires.

La CCM a permis de distinguer au moins 22 bandes majeures pour LH3 et au moins 20 bandes majeures pour LH4, mais il est possible qu’il existe encore plus de molécules dans ces deux

Préparation et chimie des extraits fractions. Dans la littérature, le nombre de saponosides contenus dans un organe particulier d’une plante varie énormément, allant de quelques unités à plusieurs dizaines. A titre d’exemples, dans le cas des autres espèces d’Albizia, 9 nouvelles molécules ont été isolées d’A. inundata (SINGAB et coll., 2015) et au moins 6 chez A. gummifera (DEBELLA et coll., 2000 ; CAO et coll., 2007). Cinq nouveaux saponosides triterpéniques ont été découverts chez A. myriophylla (YOSHIKAWA et coll., 2002). Bien entendu, ces publications ne concernent que les molécules isolées par les auteurs, il est possible que les saponosides de ces plantes soient encore plus nombreux.

Un des objectifs visés dans cette étude consistait à isoler le ou les principes actifs contenus dans A. masikororum. Etant donné que les saponosides sont assez difficiles à séparer en raison de leur nombre élevé dans un organe ou dans un extrait, la similarité de leurs structures et leur relative fragilité, nous n’avions pas pu obtenir de produits purs mais des fractions purifiées contenant encore plusieurs saponosides.

En conclusion, 8 extraits bruts et 11 produits purifiés ont été obtenus et seront utilisés pour les investigations biologiques (tableaux 9 et 10, p. 40).

Tableau 9 : Liste des extraits bruts utilisés pour les investigations biologiques

Origine Solvant Désignation d’extraction Hexane EHG Graines Méthanol EMG Hexane EHF Feuilles Méthanol EMF Hexane EHE Ecorces de tige Méthanol EME Hexane EHC Cosses de fruit Méthanol EMC

Préparation et chimie des extraits

Tableau 10 : Liste des extraits purifiés issus des graines utilisés pour les investigations biologiques

Méthodes de purification Désignation Fractionnement par le n-butanol de EMG suivi d’une précipitation des saponosides totaux des STG graines par le mélange acétone/éther (v/v) à partir de la phase organique LH1 Chromatographie sur LH20 LH2 de STG LH3 LH4 Sil3-1 Sil3-2 Sil Chromatographie flash sur gel de silice de LH3 3-3 Sil3-4 Sil3-5 Sil3-6

Les fractions obtenues avec LH4 n’étaient pas disponibles en quantité suffisante pour effectuer les tests biologiques et ne figurent pas dans cette liste.

CHAPITRE III :

EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX

Effets des extraits sur les animaux

III.1 INTRODUCTION

Ce chapitre est consacré à l’étude des effets des extraits de graines d’A. masikororum (EMG) sur différents modèles animaux. Les principaux objectifs visés ont été :  d’étudier la toxicité in vivo et/ou in vitro de EMG et/ou de ses dérivés sur différents modèles expérimentaux et  d’explorer les possibilités de leurs utilisations dans le contrôle des animaux nuisibles.

Ainsi, les travaux ont porté essentiellement sur : - la souris (modèle de référence en toxicologie) :  les manifestations de la toxicité (symptômes, lésions au niveau des organes) dans les cas d’intoxication aiguë (24h) et subchronique (30 jours) ;  l’influence des différentes voies d’administration (intrapéritonéale, sous-cutanée et orale) sur la toxicité ;  les effets sur des fonctions physiologiques (rénale et hépatique) ; - d’autres animaux :  les effets sur les oreillettes isolées du cobaye ;  les propriétés hémolytiques et ;

 des tests de toxicité sur d’autres espèces animales (puces, poussins d’un jour, alevins de carpe et têtards de grenouille).

Sauf autrement indiqué, les expériences ont été réalisées avec EMG qui était disponible en quantité suffisante.

III.2 MATERIEL

III.2.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION

III.2.1.1 Les souris

Des souris albinos (Mus musculus) de race OF1 ont été utilisées pour les tests. Elles ont été fournies par l’animalerie de l’unité de Virologie de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM). Elles étaient élevées dans des pièces à température stable (24±2°C) où la photopériode est de 12 h. Les souris avaient un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture constituée de granulés (LFL Madagascar).

Effets des extraits sur les animaux

III.2.1.2 Les cobayes

Des cobayes (Cavia porcellus) ont été utilisés pour les essais sur organes isolés. Ils ont été fournis par des éleveurs agrées. Avant les tests, les animaux étaient acclimatés aux conditions de l’animalerie de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA) pendant 7 jours.

III.2.1.3 Les poussins

Des poussins (Gallus gallus) de race Hubbard classic et âgés d’un jour ont été choisis pour étudier les effets sur d’autres animaux à sang chaud. Ils ont été fournis par un éleveur agréé. A leur arrivée au laboratoire, ils étaient mis dans des cages chauffées avec une ampoule électrique.

III.2.1.4 Les alevins

Les alevins de carpe (Cyprinus carpio) ont été achetés auprès d’un éleveur agrée. Leurs tailles étaient comprises entre 3 et 5 cm. A leur arrivée au laboratoire, ils étaient placés dans de l’eau de rizière dans laquelle ils sont laissés 3 jours avant les tests, pour leur donner le temps de s’adapter à ces nouvelles conditions.

II.4.1.5 Les têtards

Les têtards sans patte de la grenouille Ptychadena mascareniensis ont été collectés dans les rizières aux alentours de l’Université d’Antananarivo. Tout comme les alevins, ils étaient d’abord placés dans de l’eau de rizière pendant 3 jours avant les tests, le temps qu’ils s’adaptent à leurs nouvelles conditions.

II.4.1.6 Les puces

Les puces, Xenopsylla cheopis, utilisées pour le test étaient issues de l’élevage à l’insectarium de l’IPM (ou de la récolte sur le terrain). Ce sont des puces de rat qui jouent un rôle essentiel dans la transmission de la peste.

III.3 METHODES

III.3.1 ETUDES TOXICOLOGIQUES SUR SOURIS

III.3.1.1 Les différentes voies d’administration testées

III.3.1.1.1. La voie intrapéritonéale

Différentes doses de EMG, allant de 9,36 mg/kg à 30 mg/kg ont été testées. Les souris étaient maintenues à jeun une nuit avant le test et les injections ont été faites avec une seringue

Effets des extraits sur les animaux

à insuline à raison de 0,3 ml d’extrait par souris de 25 g. Un lot homogène de 5 souris de 25 ± 2 g de même sexe a été utilisé pour chaque dose. Après l’injection, les souris avaient de nouveau libre accès à l’eau et à la nourriture.

Cette voie a été utilisée pour les tests de toxicité aiguë comprenant l’estimation de la DL50, l’examen histopathologique et le suivi de la toxicité au cours de la purification.

Pendant le suivi de la toxicité à chaque étape de purification, la dose testée est la même pour toutes les fractions : la DL50 (24 h) de EMG. Ainsi, des tests de toxicité ont été effectués sur les fractions obtenues à partir de EMG, en l’occurrence les phases aqueuse et butanolique, les saponosides totaux des graines (STG) et les fractions de STG issues de la colonne LH20

(LH1 à LH4).

III.3.1.1.2 La voie sous-cutanée

Pour cette voie, EMG a également été administré à des animaux à jeun, sur un lot homogène de 5 souris, à raison de 0,3 ml d’extrait pour une souris de 25 g.

La dose utilisée est cependant plus élevée que pour la voie ip : 120 mg/kg. Les souris traitées ont été observées durant 24 h après l’administration de l’extrait.

III.3.1.1.3 La voie orale

L’extrait a été administré à l’aide d’une aiguille de gavage à extrémité arrondie, à raison de 10 ml/kg de souris. La voie orale a été adoptée pour effectuer des traitements aigu et subchronique.

a) Tests de toxicité aiguë

Trois doses élevées de l’extrait (500 mg/kg, 1000 mg/kg et 4000 mg/kg) ont été administrées à trois lots de souris et l’observation a été faite sur 24 h.

b) Tests de toxicité subchronique

Les extraits à faible dose ont été administrés quotidiennement aux souris par voie orale pendant 30 jours et à heure fixe. La dose utilisée était de 3 mg/kg, les observations ont été faites tous les jours et le sang et les organes ont été prélevés à la fin de ces tests.

III.3.1.2 Détermination de la DL50 (24 h) de l’extrait

La DL50 est un indice qui permet d’évaluer la toxicité d’un produit et de la comparer avec celle d’autres produits. Son évaluation nécessite plusieurs tests préliminaires qui conduisent à l’estimation de la DL0 (dose la plus élevée qui ne provoque aucune mort) et de la DL100 (dose la plus faible qui cause 100 % de mortalité).

Effets des extraits sur les animaux

Entre ces deux doses, sept doses en progression géométrique de raison déterminée ont été administrées respectivement à 7 lots de 5 souris.

Deux méthodes ont permis d’estimer la valeur de la DL50 : la méthode de REED et MUENCH (1938) et celle de BOYD (1966).

III.3.1.2.1 La méthode de REED et MUENCH

Il existe deux variantes de cette méthode :

- La méthode graphique qui utilise les totaux cumulatifs : la DL50 est donnée par l’intersection des courbes des totaux cumulatifs des morts et des survivants ;

- La méthode algébrique qui utilise la formule suivante :

0.5 − 푁 log 퐷퐿50 = log 퐵 + log 푅 푀 − 푁

où : B = dose immédiatement inférieure à la DL50 M = mortalité provoquée par la dose supérieure à la DL50 N = mortalité provoquée par B R = raison de la progression géométrique

III.3.1.2.2 La méthode de régression linéaire

La valeur de la DL50 peut aussi être évaluée en utilisant la régression linéaire de la relation suivante : % mortalité = f (C), C étant la concentration de l’extrait à tester.

L’équation de la droite de régression est de la forme : Y = A + BX

où : Y = pourcentage de mortalité A = une constante B = coefficient de régression X = logarithme décimal de la concentration de l’extrait

III.3.1.3 Etude anatomo-pathologique

III.3.1.3.1 Administration de l’extrait et prélèvement d’organes

Des prélèvements d’organes ont été réalisés sur des souris sacrifiées après les tests de toxicité aiguë (voie ip, dose sublétale administrée en une seule fois) et subchronique (voie orale,

Effets des extraits sur les animaux dose faible administrée quotidiennement pendant 30 jours). Le tableau 11 donne les détails des doses et des traitements appliqués.

Tableau 11 : Les doses et traitements appliqués aux souris avant les prélèvements d’organes Traitement et voie Durée du traitement Dose (mg/kg) Prélèvement après d’administration Aigu (voie 24 h 9,36 24 h intrapéritonéale) 12 5h et 24 h 3 30 jours Subchronique 30 jours (voie orale) 6 30 jours 9,36 30 jours

III.3.1.3.2 Préparation des coupes minces

La préparation des lames a été réalisée selon une technique inspirée de celle de HOULD (1984) et DIEBOLD et coll. (1991).

Elle se fait suivant les étapes suivantes : 1) Fixation des organes dans du formol tamponné à 10 %; 2) Observation macroscopique et coupe grossière des organes ; les tissus sont ensuite placés dans des cassettes ; 3) Les cassettes sont placées dans un circulateur automatique. La circulation comporte une série de manipulations qui comprend : - la déshydratation des tissus dans de l’alcool de concentration croissante (90°, 96° puis 100°), - l’éclaircissement, c’est-à-dire que l’alcool est remplacé par le xylène qui est un solvant de la paraffine, - l’imprégnation des tissus par de la paraffine. 4) Le tissu ainsi imprégné est inclus dans un bloc de paraffine au moyen d’un moule : c’est l’enrobage ; 5) La coupe peut alors se faire au moyen d’un microtome, à une épaisseur de 4 µm ou 5 µm ; 6) Les coupes minces obtenues sont ensuite étalées sur des lames porte-objets ; 7) Les tissus sont déparaffinés avec du xylène, placés dans de l’alcool de concentrations décroissantes (100°, 96° puis 90°) avant d’être réhydratés. Ils sont alors prêts à être colorés.

Effets des extraits sur les animaux

8) La coloration se fait avec l’hématoxyline qui colore le noyau cellulaire en bleu et l’éosine qui colore le cytoplasme en rose ; 9) La dernière étape consiste à monter les lames avec de la colle EUKITT qui préserve les structures. 10) La lecture des lames et la prise de photographies se font sous microscope optique.

III.3.1.4 Etude des effets de l’extrait sur les fonctions rénale et hépatique

III.3.1.4.1 Traitements subchroniques

Des animaux de même sexe ont été répartis en deux lots de 10 individus chacun. Le groupe témoin a reçu de l'eau distillée et le groupe d'essai 3 mg/kg de l’extrait dissous dans de l’eau distillée. L'extrait a été quotidiennement administré par voie orale pendant 30 jours et des prélèvements de sang ont été effectués à la fin de cette période.

III.3.1.4.2 Evaluation des paramètres biochimiques

L’analyse a été réalisée selon la méthode décrite par TURGEON (2011). Le sang a été centrifugé à 600 × g pendant 10 min à +4 °C et le sérum a été récupéré pour faire les différents dosages. La fonction hépatique a été évaluée par le dosage des enzymes alanine aminotransférase (ALAT) et gamma-glutamyl transférase (γ-GT). La fonction rénale a été évaluée en dosant les taux sériques de la créatinine. Ces mesures ont été effectuées à l’aide d’un spectrophotomètre (MINDRAY BA 88) à 340 nm pour l’ALAT, 400 nm pour le γ-GT et 492nm pour la créatinine.

III.3.2 ETUDE DES EFFETS DE L’EXTRAIT SUR L’OREILLETTE ISOLEE DE COBAYE

Des cobayes adultes pesant entre 300 g et 400 g, sans distinction de sexe, ont été anesthésiés avec du chloroforme, exsanguinés, puis leur cœur a été rapidement isolé. Les oreillettes ont été délicatement prélevées avant d’être placées dans du milieu de Krebs.

L’organe a été plongé dans un bain contenant 20 ml de milieu de Krebs, une de ses extrémités étant reliée à un support tandis que l’autre était attachée à un capteur. Il a été soumis à une tension de 1 g et laissé pendant 15 min, le temps qu’il se stabilise.

Après cette période, l’extrait a été rajouté cumulativement dans le milieu à des concentrations de 5 μg/ml, 10 μg/ml et 20 μg/ml. La force et la fréquence des contractions ont été mesurées après 0 min, 1 min, 3 min et 5 min, grâce à un myographe. Celui-ci est constitué d’un transducteur isotonique (UGO BASILE 7006), d’un pré-amplificateur (UGO BASILE 7082) et d’un enregistreur (GEMINI 7070).

Effets des extraits sur les animaux

III.3.3 ETUDE DE L’ACTIVITE HEMOLYTIQUE

La méthode décrite par RAKOTOBE (1985) a été choisie pour étudier l’activité hémolytique de EMG.

III.3.3.1 Préparation de la suspension érythrocytaire normalisée

Du sang de mouton défibriné est centrifugé à 5000 x g à 4°C pendant 5 min puis le plasma est éliminé. Le culot est lavé 3 fois avec du PBS, puis il est repris dans ce tampon. La densité optique (DO) est ajustée à 0,2 à 541 nm une fois que la suspension a été diluée 30 fois avec de l’eau bidistillée. Cette DO correspond à une concentration de 6.108 cellules/ml.

III.3.3.2 Détermination de la dose hémolytique 50 % (DH50)

La dose hémolytique 50 % est la dose d’extrait nécessaire pour provoquer 50 % de lyse des hématies. La méthode utilisée pour sa détermination est la suivante :  La poudre d’extrait est dissoute dans de l’eau distillée stérile pour avoir une solution- mère de concentration de 17,35 µg/ml puis stérilisée par filtration.  Des volumes croissants d’extrait (0,1 à 0,9 ml) sont répartis dans 12 tubes à hémolyse puis ils sont ajustés à 1 ml avec du PBS. Les concentrations finales obtenues sont comprises entre 0,43 et 15,62 µg/ml. Ensuite 0,5 ml de suspension érythrocytaire est rajouté dans chaque tube.  Deux témoins sont utilisés : - un témoin négatif contenant 1 ml de PBS et 0,5 ml de suspension érythrocytaire, c’est le témoin de lyse 0 % ; - un témoin positif contenant 1 ml d’eau distillée et 0,5 ml de suspension érythrocytaire, c’est le témoin de lyse 100 %.

Les tubes sont agités doucement pour tout mélanger puis incubés à 37°C. Au bout de 45 min, les tubes sont centrifugés 5 min à 5000 x g et la quantité d’hémoglobine libérée est dosée au spectrophotomètre à 541 nm.

La valeur de la DH50 est obtenue graphiquement sur une courbe log-probit sur laquelle le pourcentage de lyse est fonction du logarithme du volume d’extrait mis dans chaque tube.

III.3.4 ETUDE DES EFFETS SUR LES AUTRES ANIMAUX

III.3.4.1 Etude des effets sur les poussins

Des lots de 3 poussins d’un jour ont reçu une dose unique (30 mg/kg) d’extrait par voies orale et intrapéritonéale. Ils ont ensuite été observés pendant 24 h.

Effets des extraits sur les animaux

Tout au long du test, les poussins sont gardés dans des cages chauffées grâce à une ampoule électrique.

III.3.4.2 Etude des effets sur les animaux à sang froid

III.3.4.2.1 Etude des effets de l’extrait sur les puces

La méthode utilisée pour l’étude des effets de l’extrait sur les puces est celle de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), (1982), appliquée à l’étude des effets des insecticides de synthèse sur les puces vecteurs de la peste.

Déroulement du test

1) Des bandelettes de papier Whatman n°1 sont découpées au format 1,5 cm x 6 cm et subdivisées en six cases de 1,5 cm x 1 cm. La concentration de l’extrait et la date d’imprégnation sont inscrites au verso de chaque bandelette. Chaque case est ensuite imprégnée de 11,5 µl d’extrait à 5 mg/ml. Les bandelettes imprégnées sont finalement mises à sécher à la température ambiante pendant 24 h avant d’être utilisées pour le test. 2) Des lots de dix puces sont placés dans des tubes à essais étiquetés de 18 cm de hauteur. Les bandelettes imprégnées sont placées dans chaque tube. Une bandelette non imprégnée mise en présence d’un autre lot de puces sert de témoin. 3) Le nombre de puces paralysées ou mortes est ensuite compté à des intervalles de temps bien définis. 4) Après 8 h d’exposition, les bandelettes imprégnées sont remplacées par des papiers vierges non imprégnés, puis elles sont laissées en observation pendant 24 h. 5) La lecture des résultats est effectuée et le pourcentage de mortalité calculé.

III.3.4.2.2 Etude des effets sur les alevins et les têtards

La CL50, c’est-à-dire la concentration qui provoque 50 % de mortalité, a été déterminée sur les têtards de grenouille et les alevins de carpe. Des lots de 5 animaux ont été placés dans 250 ml d’eau de source contenant différentes concentrations de l’extrait (sept concentrations en progression géométrique, allant de 2,68 à 10,23 μg/ml). Un lot placé dans de l’eau de source a servi de témoin. Les tests ont été effectués en triple et les résultats soumis à des analyses statistiques ANOVA avec le logiciel Graphpad prism 5.

Effets des extraits sur les animaux

III.4 RESULTATS

III.4.1 EFFETS SUR LA SOURIS

Les tests sur animaux ont d’abord été réalisés sur la souris qui est le modèle de référence en toxicologie. Ainsi, l’indice de toxicité aiguë (DL50 24 h) a été déterminé, puis les différentes manifestations de l’intoxication par traitements aigu et chronique ont été étudiées.

III.4.1.1 Estimation de la DL50 (24 h) de EMG par voie ip

Sept doses en progression géométrique de raison r = 1,2, allant de 9,36 mg/kg (DL0) à 27,84 mg/kg (DL100) ont été utilisées. Le tableau 12 et la figure 9 résument les résultats obtenus lors des essais.

Tableau 12 : Résultats de la détermination de la DL50 (24 h) de EMG par voie ip

Doses (mg/kg) Nombre de souris Totaux cumulatifs des animaux mortes survivantes morts survivants 9,36 0 5 0 18 11,16 1 4 1 13 13,44 1 4 2 9 16,08 2 3 4 5 19,32 4 1 8 2 23,28 4 1 12 1 27,84 5 0 17 0

La valeur de la DL50 de EMG par voie ip, est de 16,50 mg/kg par la méthode graphique, 16,81 mg/kg par la méthode algébrique et de 17,47 mg/kg par la méthode de régression linéaire.

20 18 16 14 Totaux cumulatifs des 12 morts 10 8 Totaux cumulatifs des 6 survivants 4 2 0 DL50 = 16,50 Totaux cumulatifs des animaux des cumulatifs Totaux 9 14 19 24 29 Doses (mg/kg)

Figure 9 : Courbes des totaux cumulatifs des animaux morts et survivants

Effets des extraits sur les animaux

III.4.1.2 Les symptômes d’intoxication selon la voie d’administration pour EMG

III.4.1.2.1 Symptômes observés lors d’une intoxication par voie intrapéritonéale

Les DL0 (dose la plus élevée qui n’est pas létale) et DL100 (dose la plus faible causant 100 % de mortalité) de EMG étaient d’environ 9,36 mg/kg et 30 mg/kg, respectivement. Une fois qu’elles ont reçu ces doses, les souris ont présenté des signes d’intoxication dont l’intensité croissait avec les doses. Ces symptômes étaient les suivants pour les deux doses de EMG :

 troubles du système nerveux se manifestant par l’hypoactivité, la piloérection et la passivité ;  troubles du système respiratoire, marqués par une dyspnée ;  troubles cardiovasculaires se traduisant par une hyperhémie ;  autres troubles comme l’énophtalmie. L’ordre d’apparition des symptômes provoqués par la dose 30 mg/kg est consigné dans le tableau 13.

Tableau 13 : Les symptômes observés lors d’une intoxication par EMG à 30 mg/kg par voie intrapéritonéale

Temps d’apparition des symptômes 5 min 30 min 60 min 24 h Hypoactivité, Hypoactivité, Hypoactivité, piloérection, dyspnée, piloérection, dyspnée, Passivité, mort énophtalmie hyperhémie hyperhémie énophtalmie énophtalmie

III.4.1.2.2 Symptômes observés lors d’une intoxication par voie sous-cutanée

Des symptômes ont été provoqués par injection par voie sous-cutanée de EMG à 120 mg/kg (4 fois la DL100 par voie ip). Le tableau 14 résume les symptômes avec leurs temps d’apparition.

Tableau 14 : Les symptômes observés lors d’une intoxication par EMG à 120 mg/kg par voie sous-cutanée

Temps d’apparition des symptômes 5 min 30 min 60 min 24 h Hypoactivité, Hypoactivité, Piloérection, piloérection, dyspnée, piloérection, dyspnée, Rémission excitabilité, irritabilité énophtalmie, pâleur énophtalmie, pâleur des oreilles des oreilles

Effets des extraits sur les animaux

Aucune modification de l’activité motrice n’a pu être observée pour cette voie, par contre d’autres symptômes neurologiques comme l’agressivité sont apparus Les souris ont également manifesté de l’énophtalmie.

III.4.1.2.3 Symptômes observés lors d’une intoxication par voie orale

L’administration par voie orale permet d’appliquer un traitement aigu et un traitement chronique.

a) Effets toxiques de l’extrait suite à un traitement aigu

Différents sypmptômes sont apparus par administration par voie orale de trois doses élevées (500 mg/kg, 1000 mg/kg et 4000 mg/kg) de EMG en une seule fois.

Un résumé de la chronologie d’apparition des symptômes est montré dans le tableau 15.

Tableau 15 : Les symptômes observés lors d’une intoxication par EMG à différentes doses par voie orale

Doses 5 min 30 min 60 min 24 h Hypoactivité, Hypoactivité, Hypoactivité, dyspnée, dyspnée, piloérection, 500 mg/kg énophtalmie, Rémission énophtalmie pâleur énophtalmie, pâleur hoquet, grattements des oreilles des oreilles du museau Hypoactivité, Hypoactivité, Hypoactivité, dyspnée, dyspnée, piloérection, 1000 mg/kg énophtalmie, Rémission énophtalmie, pâleur énophtalmie, pâleur hoquet, frottements des oreilles des oreilles du museau Fasciculation, Hypoactivité, Passivité, opisthotonos, énophtalmie, piloérection, 4000 mg/kg passivité, pâleur Mort hoquet, frottements énophtalmie, pâleur des oreilles, du museau des oreilles hémorragie nasale

Les symptômes développés par les souris étaient sensiblement les mêmes pour les doses 500 mg/kg, 1000 mg/kg et 4000 mg/kg. Cependant l’intensité avec laquelle ils se manifestaient augmentait avec les doses. Les seules différences constatées ont été l’apparition d’une hémorragie nasale et la mort à la dose la plus élevée. Ces symptômes étaient notamment :  l’hypoactivité, des fasciculations, la piloérection, l’opisthotonos et la passivité ;

Effets des extraits sur les animaux

 la dyspnée ;  des symptômes généraux comme l’énophtalmie, les hoquets, les grattements du museau et la pâleur marquée des oreilles.

b) Effets toxiques de l’extrait suite à un traitement subchronique

Seule une légère hypoactivité a pu être observée au cours de ces essais, elle durait environ 1 h après chaque administration.

III.4.1.3 Les effets toxiques des fractions de EMG

Le tableau 16 présente les taux de mortalité causés par chacune d’elles à une dose qui correspond à la DL50 de EMG, par voie ip.

Tableau 16 : Mortalité due aux fractions de EMG (dose = 16,92 mg/kg)

Phase aqueuse Phase butanolique STG LH1 LH2 LH3 LH4

Mortalité (%) 0 100 66,6 100 66,6 66,6 0

Les symptômes provoqués par toutes les fractions sont les mêmes que ceux qui ont été observés avec EMG, sauf pour la phase aqueuse qui n’a occasionné aucun symptôme visible.

III.4.1.4 Les lésions tissulaires causées par EMG

III.4.1.4.1 Observations macroscopiques

Aucune lésion n’a été observée pendant l’examen des organes à l’œil nu.

III.4.1.4.2 Les lésions microscopiques

Pour avoir une idée du site d’action de EMG, des études anatomo-pathologiques ont été effectuées en faisant varier les conditions (durée de l’exposition, doses et voies d’administration). L’observation des lésions a permis de tirer les conclusions suivantes :

 Les poumons étaient particulièrement atteints avec des destructions localisées des alvéoles,  Les principales lésions ont été observées au niveau des organes épurateurs, c’est-à-dire, le foie, les reins et les poumons. Cependant, les reins étaient les moins atteints des trois organes,  Dans tous les cas, les lésions étaient négligeables dans les autres organes examinés (cœur, cerveau et intestins),  Il s’agissait de lésions caractéristiques d’une réaction inflammatoire, avec des dilatations importantes des vaisseaux sanguins, des nappes hémorragiques, des œdèmes

Effets des extraits sur les animaux

et des infiltrats inflammatoires constitués de polynucléaires neutrophiles plus ou moins nombreux.

a) Evolution des lésions en fonction du temps

Le tableau 17 montre l’évolution des lésions en fonction du temps, à une dose unique, choisie de manière à permettre le développement progressif des symptômes.

Tableau 17 : Les lésions observées chez les souris traitées avec EMG (12 mg/kg, voie ip) en fonction du temps

Lésions observées 5 h 24 h *Veines centrolobulaires et capillaires *Veines centrolobulaires et capillaires sinusoïdes très dilatés sinusoïdes très dilatés * Parenchyme œdémateux * Parenchyme très œdémateux Foie *Infiltrat inflammatoire diffus constitué *Infiltrat inflammatoire constitué de très de quelques polynucléaires neutrophiles nombreux polynucléaires neutrophiles parfois périvasculaires *Nappes hémorragiques *Vaisseaux sanguins intertubulaires *Vaisseaux sanguins intertubulaires dilatés dilatés *Présence de très nombreux polynucléaires Reins *Infiltrat inflammatoire constitué de très neutrophiles nombreux polynucléaires neutrophiles parfois périvasculaires *Vaisseaux sanguins des espaces *Vaisseaux sanguins interalvéolaires dilatés interbronchioloalvéolaires dilatés *Destruction localisée des alvéoles qui sont Poumons *Infiltrat inflammatoire constitué de remplacés par un infiltrat inflammatoire quelques polynucléaires neutrophiles dans constitué de très nombreux polynucléaires le parenchyme neutrophiles *Aspect histologiquement normal *Quelques vaisseaux sanguins dilatés au Cœur niveau du myocarde *Vaisseaux sanguins légèrement dilatés *Quelques vaisseaux sanguins légèrement Cerveau au niveau de la méninge et du dilatés au niveau de la méninge et du parenchyme parenchyme *Légère dilatation des vaisseaux sanguins *Légère dilatation des vaisseaux sanguins au au niveau de la muqueuse et de la sous- niveau de la muqueuse et de la sous- Intestin muqueuse muqueuse grêle *Infiltrat inflammatoire diffus constitué *Infiltrat inflammatoire diffus constitué de de quelques polynucléaires neutrophiles quelques polynucléaires neutrophiles surtout au niveau de la muqueuse

D’après ces résultats, la gravité des lésions évoluait en fonction du temps. Elles étaient plus importantes après 24 h d’exposition qu’après 5 h. Ceci était particulièrement visible dans les reins où les polynucléaires neutrophiles se trouvaient en amas périvasculaires à 5 h avant de diffuser dans les tissus après 24 h.

Effets des extraits sur les animaux

La figure 10 illustre les dommages tissulaires observés au niveau des reins chez la souris.

Figure 10 : Lésions causées par EMG au niveau du rein (5h, 12 mg/kg, ip) (a) : rein non traité ; (b) : rein traité avec EMG (10 x et 40 x) (EI : espace intertubulaire ; G : glomérules ; T : tubules ; VS : vaisseaux sanguins ; VD : vaisseaux dilatés ; PNN : polynucléaires neutrophiles)

b) Evolution des lésions en fonction des doses

Deux doses ont été testées : la DL0 sur la souris (9,36 mg/kg) et une dose sublétale (12mg/kg).

Le tableau 18 (p. 55) résume ces résultats.

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 18 : Les lésions observées chez les souris traitées avec EMG (24 h, voie ip) en fonction des doses

Lésions observées 9,36 mg/kg 12 mg/kg *Veines centrolobulaires et capillaires *Veines centrolobulaires et capillaires sinusoïdes dilatés très dilatés sinusoïdes très dilatés * Parenchyme très œdémateux * Parenchyme très œdémateux Foie *Infiltrat inflammatoire diffus constitué *Infiltrat inflammatoire constitué de très de quelques polynucléaires nombreux polynucléaires neutrophiles neutrophiles parfois périvasculaires *Nappes hémorragiques *Nappes hémorragiques *Vaisseaux sanguins intertubulaires *Vaisseaux sanguins intertubulaires dilatés dilatés *Présence de très nombreux polynucléaires Reins *Infiltrat inflammatoire diffus constitué neutrophiles de quelques polynucléaires neutrophiles dans le parenchyme *Vaisseaux sanguins dilatés *Vaisseaux sanguins interalvéolaires dilatés *Infiltrat inflammatoire diffus constitué *Destruction localisée des alvéoles qui sont Poumons de quelques polynucléaires remplacées par un infiltrat inflammatoire neutrophiles au niveau du parenchyme constitué de très nombreux polynucléaires pulmonaire neutrophiles *Quelques vaisseaux sanguins dilatés *Quelques vaisseaux sanguins dilatés au Cœur au niveau du myocarde niveau du myocarde *Aspect histologiquement normal *Quelques vaisseaux sanguins légèrement Cerveau dilatés au niveau de la méninge et du parenchyme *Aspect histologiquement normal *Légère dilatation des vaisseaux sanguins au niveau de la muqueuse et de la sous- Intestin muqueuse grêle *Infiltrat inflammatoire diffus constitué de quelques polynucléaires neutrophiles

Un effet-dose a été observé. Les lésions étaient en effet plus importantes à 12mg/kg qu’à 9,36 mg/kg.

Au niveau du foie, notamment, une hémorragie est apparue à la dose la plus élevée. Cette différence est encore plus évidente dans les trois organes les moins touchés (cœur, cerveau et intestins). En effet, ils ont présenté un aspect histologique pratiquement normal à la dose la plus faible, mais des lésions sont apparues à la dose la plus élevée.

Tout ceci montre que même la DL0 par voie ip peut causer des dégâts importants au niveau des tissus.

Effets des extraits sur les animaux

A titre d’illustration, les lésions provoquées par l’extrait au niveau des poumons sont présentées dans la figure 11.

Figure 11 : Lésions causées par EMG au niveau du poumon (12 mg/kg, ip) (a) : poumon non traité ; (b) : poumon traité avec EMG (10 x et 40 x) (A : alvéoles ; B : bronchioles ; VS : vaisseau sanguin ; AD+PNN : alvéoles détruites remplacées par des polynucléaires neutrophiles ; VD : vaisseaux dilatés)

c) Les lésions dues au traitement subchronique

Les trois doses de EMG qui correspondaient respectivement à la DL0 (9,36 mg/kg) et à des dilutions 1/5 (6 mg/kg) et 1/10 (3 mg/kg) de la DL100 (30 mg/kg) ont été chacune administrées par jour par voie orale, pendant 30 jours. Le tableau 19 (p. 57) récapitule le détail des lésions observées.

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 19 : Les lésions observées chez les souris traitées par voie orale avec EMG après 30 jours

Lésions observées 3 mg/kg 6 mg/kg 9,36 mg/kg Foie *Veines *Veines centrolobulaires et * Veines centrolobulaires et centrolobulaires et capillaires sinusoïdes légèrement capillaires sinusoïdes légèrement capillaires sinusoïdes dilatées dilatées légèrement dilatées *Parenchyme œdémateux *Parenchyme œdémateux *Parenchyme *Infiltrat inflammatoire diffus *Infiltrat inflammatoire diffus œdémateux constitué de quelques constitué de nombreux de *Présence de rares polynucléaires neutrophiles polynucléaires neutrophiles, polynucléaires formant surtout de petits amas neutrophiles périvasculaires Reins *Vaisseaux sanguins *Vaisseaux sanguins *Vaisseaux sanguins intertubulaires dilatés intertubulaires dilatés intertubulaires dilatés *Présence de quelques *Infiltrat inflammatoire diffus *Infiltrat inflammatoire diffus polynucléaires constitué de quelques constitué de nombreux neutrophiles polynucléaires neutrophiles polynucléaires neutrophiles périvasculaires Poumons *Quelques vaisseaux *Nombreux vaisseaux sanguins *Vaisseaux sanguins sanguins dilatés dilatés interbronchiolaires et interalvéolaires très dilatés *Infiltrat *Infiltrat inflammatoire diffus inflammatoire diffus constitué de nombreux *Infiltrat inflammatoire diffus constitué de quelques polynucléaires neutrophiles constitué de nombreux polynucléaires polynucléaires neutrophiles *Quelques foyers de destruction neutrophiles des alvéoles qui sont remplacés *Quelques foyers de destruction par des amas de polynucléaires des alvéoles qui sont remplacés par neutrophiles des amas de polynucléaires neutrophiles Cœur *Quelques vaisseaux *Quelques vaisseaux sanguins *Quelques vaisseaux sanguins sanguins dilatés dans le dilatés au niveau du péricarde dilatés dans le myocarde myocarde Cerveau *Vaisseaux sanguins *Vaisseaux sanguins dilatés au *Vaisseaux sanguins dilatés au dilatés au niveau de la niveau de la méninge et du niveau de la méninge et du méninge et du parenchyme parenchyme parenchyme Intestin *Aspect *Aspect histologiquement *Aspect histologiquement normal grêle histologiquement normal normal

Les mêmes effets que pour le traitement aigu ont été observés mais les poumons étaient particulièrement atteints. Ici aussi, un effet-dose a été nettement observé.

A titre d’illustration, la figure 12 (p. 58) montre les lésions observées au niveau des poumons après 30 jours.

Effets des extraits sur les animaux

Figure 12 : Lésions causées par EMG au niveau du poumon (30 jours) (a) : poumon non traité ; (b) : poumon traité avec EMG (10 x et 40 x) (A : alvéoles ; AD+PNN : alvéoles détruites remplacées par des polynucléaires neutrophiles ; VD : vaisseaux dilatés ; B : bronchioles)

III.4.1.5 Les effets de EMG sur les fonctions rénales et hépatiques

Les paramètres mesurés, à savoir les taux sériques des enzymes hépatiques ALAT et γ-GT et de créatinine, sont des indicateurs du fonctionnement du foie et des reins. Les résultats obtenus chez les animaux testés et les animaux témoins sont donnés dans le tableau 20.

Tableau 20 : Effets de EMG sur les fonctions hépatique et rénale

Fonction hépatique Fonction rénale ALAT (UI/l) γ-GT (UI/l) (créatinine, mg/l) Témoin 81,86 ± 23,00 3,19 ± 0,6 3,60 ± 1,00 Souris traitées 112,37 ± 31,71 2,86 ± 2,35 3,56 ± 0,19

La créatinine étant un métabolite issu de la dégradation de la créatine pendant l’effort, un taux sérique normal est un indicateur du bon fonctionnement des reins. Il n’y a pas eu de différence significative (p<0,05) entre le niveau sérique de créatinine des souris témoins et des souris traitées, ce qui signifie que la filtration rénale n’a pas été affectée.

Effets des extraits sur les animaux

Le taux sérique de l’enzyme ALAT est un marqueur spécifique de destruction des cellules du foie. De même, le dosage des γ-GT sanguins permet d’apprécier l’activité hépatique. Les résultats obtenus montrent que l’extrait n’a pas eu d’effet significatif sur ces paramètres.

III.4.2 EFFETS DE EMG SUR L’OREILLETTE ISOLEE DE COBAYE

III.4.2.1 Effets sur la fréquence cardiaque

Différentes concentrations de EMG, allant de 5 à 20 µg/ml ont été testées.

Les nombres de battements moyens de l’oreillette de cobaye, en présence et en absence (témoin) de EMG sont montrés dans le tableau 21 et la figure 13.

Tableau 21 : La fréquence cardiaque moyenne (nombre de battements/min) Concentration Temps (min) (µg/ml) 0 1 3 5 0 267,5 ± 32 267,5 ± 32 267,5 ± 32 267,5 ± 32 5 300 ± 44 295 ± 39 295 ± 38 290 ± 42 10 264,2 ± 38 279,2 ± 40 287,5 ± 41 290 ± 38 20 303,7 ± 45 310 ± 48 323,7 ± 44 236,3 ± 64

Aucun effet significatif (p>0,05) sur la chronotropie n'a été enregistré aux concentrations testées, même après 5 min de contact.

400

300

200

100 Nombre Nombre des battements/mn 0 0 5 10 20 Concentration (µg/ml)

0 1min 3min 5min

Figure 13 : Tests de EMG sur la fréquence cardiaque

Effets des extraits sur les animaux

III.4.2.2 Effets sur la contractilité cardiaque

Différentes concentrations de EMG, allant de 5 à 20 µg/ml ont été testées.

Les résultats des tests sur la contractilité des muscles cardiaques sont présentés dans le tableau 22 et dans la figure 14.

Tableau 22 : Amplitudes moyennes des battements cardiaques (mm) Concentration Temps (min) (µg/ml) 0 1 3 5 0 14,3 ± 0,7 14,3 ± 0,7 14,3 ± 0,7 14,3 ± 0,7 5 18 ± 0,5 17,8 ± 0,4 19 ± 1,1 20 ± 1,2 10 19,2 ± 5 25,2 ± 4 25,6 ± 6 23,5 ± 7 20 27,6 ± 4 18,6 ± 5 10,6 ± 2 8,8 ± 2

EMG a montré un effet significatif (p<0,05) sur l’inotropie des oreillettes de cobayes. En effet, un pouvoir inotrope positif a été observé à partir de 5 μg/ml. A 20 μg/ml, cet effet est suivi d’un affaiblissement de l'amplitude de la contraction après 3 min de contact.

35 *** *** 30 ** ** * 25 * ** * * * 20 * * 15 * ** 10 *

5 Amplitudecontractionde (mm) 0 0 5 10 20 Concentration (µg/ml)

0 1min 3min 5min

Figure 14 : Effets de EMG sur la contraction cardiaque (n =3 ;* : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ;*** : p < 0,001)

III.4.3 LA DOSE HEMOLYTIQUE 50 % (DH50)

L’activité hémolytique de EMG a été mesurée et la DH50 déterminée en utilisant plusieurs concentrations.

Le tableau 23 (p.61) résume les résultats obtenus lors des essais.

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 23 : Effets hémolytiques de EMG sur les hématies de mouton Concentration (µg/ml) Taux d’hémolyse 0 (témoin négatif) 0 % 0,43 20,84 % 0,86 24,17 % 1,73 25,84 % 3,47 25,84 % 5,20 30,84 % 6,94 36,67 % 8,67 37,5% 10,41 45,84 % 12,14 53,34 % 13,88 54,17% 15,62 66,67% Eau distillée (témoin positif) 100 %

D’après ces résultats, la dose hémolytique 50 % de EMG est estimée à 11,52 µg/ml.

III.4.4 EFFETS DE EMG SUR LES AUTRES ANIMAUX

La toxicité de EMG sur quelques animaux non-cibles a été étudiée afin d’estimer l’impact qu’il aurait sur l’environnement, s’il était utilisé comme pesticide.

III.4.4.1 Effets sur les poussins

A la dose testée (30 mg/kg) qui correspond à la DL100 chez les souris, aucun symptôme visible n’a été constaté chez les poussins aussi bien par voie orale que par voie ip.

III.4.4.2 Effets sur les animaux à sang froid

III.4.4.2.1 Effets sur les puces

Aucune mort n’a été enregistrée à la concentration de 5 mg/ml de EMG.

III.4.4.2.2 Effets sur les alevins de la carpe

EMG a montré un pouvoir toxique vis-à-vis des alevins, avec une CL100 de moins de 10 μg/ml (tableau 24).

Tableau 24 : Effets de EMG sur les alevins

Concentration 0 2,68 3,35 4,19 5,24 6,55 8,19 10,23 (µg/ml) (témoin) Nombre A : 0/5 A : 0/5 A : 1/5 A : 2/5 A : 4/5 A : 4/5 A : 5/5 A : 5/5 d’animaux B : 0/5 B : 0/5 B : 1/5 B : 2/5 B : 4/5 B : 5/5 B : 5/5 B : 5/5 morts C : 0/5 C : 0/5 C : 1/5 C : 3/5 C : 5/5 C : 5/5 C : 5/5 C : 5/5 Cumul 0/15 0/15 3/15 7/15 13/15 14/15 15/15 15/15 Mortalité (%) 0 0 20 46,66 86,66 93,33 100 100 (n = 5 ; A, B et C : répétitions)

D’après ce tableau, la CL50 de EMG sur les alevins a été estimée à 4,15 μg/ml.

Effets des extraits sur les animaux

III.4.4.2.3 Effets sur les têtards de grenouille

Les têtards étaient également sensibles à EMG, à un niveau comparable à celui des alevins (tableau 25).

Tableau 25 : Effets de EMG sur les têtards Concentration 0 2,68 3,35 4,19 5,24 6,55 8,19 10,23 (µg/ml) (témoin) Nombre A : 0/5 A : 0/5 A : 1/5 A : 2/5 A : 2/5 A : 3/5 A : 4/5 A : 5/5 d’animaux B : 0/5 B : 0/5 B : 1/5 B : 2/5 B : 2/5 B : 4/5 B : 5/5 B : 5/5 morts C : 0/5 C : 0/5 C : 1/5 C : 2/5 C : 3/5 C : 4/5 C : 5/5 C : 5/5 Cumul 0/15 0/15 3/15 6/15 7/15 11/15 14/15 15/15 Mortalité (%) 0 0 20 40 46,66 73,33 93,33 100 (n = 5 ; A, B et C : répétitions)

La CL50 de EMG sur les têtards a été estimée à 4,54 μg/ml.

III.5 DISCUSSION

La DL50 (24 h) de EMG sur souris (voie ip) était de 16,92 mg/kg.

Selon NENE BI et coll. (2008), quelle que soit la voie d’administration utilisée, une substance pharmacodynamique peut être classée en fonction de la valeur de sa DL50 en ultra toxique (DL50 inférieure à 5 mg/kg), extrêmement toxique (DL50 comprise entre 5 et 50 mg/kg), très toxique (DL50 comprise entre 50 et 500 mg/kg), modérément toxique (DL50 comprise entre 500 à 5000 mg/kg), légèrement toxique (DL50 entre 5000 et 15000 mg/kg et non toxique (DL50 supérieure à 15000 mg/kg). D’après cette échelle, EMG est donc considéré comme extrêmement toxique par voie ip.

Les extraits méthanoliques des graines des espèces malgaches d’Albizia étudiées jusqu’à présent ont des DL50 sur souris comprises entre 1,13 mg/kg pour la plus toxique (A. greveana) et 55 mg/kg pour la moins toxique (A. bernieri) (RANDRIANARIVO et coll., 2014a). La DL50 de l’extrait méthanolique de graines d’A. mahalao est celle qui se rapproche le plus de la DL50 de EMG avec des valeurs comprises entre 22,23 et 24,4 mg/kg (RAKOTOARIVONY, 2012 ; RANDRIANARIVO et coll., 2014a).

Par rapport aux espèces étrangères, EMG est presque 5 fois plus toxique que l’extrait méthanol-eau des graines d’A. lebbeck (DL50 = 82 mg/kg) (BESRA et coll., 2002) et près de 24 fois plus toxique que l’extrait aqueux des feuilles d’A. glaberrima (DL50 = 398,11 mg/kg) (ADEBESIN et coll., 2015).

Par voie orale, il a fallu augmenter la dose de EMG jusqu’à 4000 mg/kg pour observer une mortalité. L’insuffisance quantitative de EMG n’a cependant pas permis de déterminer la

Effets des extraits sur les animaux

DL50 qui serait supérieure à 1000 mg/kg. Aussi, par voie orale EMG est modérément ou légèrement toxique (NENE BI et coll., 2008). Il est néanmoins plus toxique qu’A. glaberrima qui n’est pas létale à 5000 mg/kg (ADEBESIN et coll., 2015).

Cette faible toxicité orale associée à une forte toxicité par voie ip est une des caractéristiques des saponosides, ce qui appuie l’hypothèse selon laquelle ces composés seraient les responsables des propriétés toxiques de EMG (BRUNETON, 2008).

Les symptômes d’intoxication sont pratiquement les mêmes pour les trois voies d’administration testées (orale, intrapéritonéale et sous-cutanée). La plupart suggère une atteinte du système nerveux mais des signes cardiovasculaires (hyperhémie) et respiratoires (dyspnée) ont également été observés. L’observation des coupes histologiques donne à penser que ce sont les difficultés respiratoires qui sont à l’origine des symptômes nerveux. En effet, les lésions sont particulièrement sévères au niveau des poumons, même quelques heures après l’administration, alors que le cerveau n’en présentait pas.

Les organes les plus atteints sont les poumons, les reins et le foie, c’est-à-dire les trois principaux organes épurateurs par où passent tous les xénobiotiques introduits dans le corps. Les résultats montrent clairement qu’il y a un effet-dose et que les lésions s’aggravent en fonction du temps. Les dommages tissulaires observés ne changent pas quelle que soit la voie d’administration utilisée. Cependant, pour la voie orale, l’étude histo-pathologique a montré que de faibles doses (3 mg/kg et 6 mg/kg) administrées pendant 30 jours d’affilée suffisent pour provoquer des lésions.

L’examen histopathologique a également permis de voir que même après passage par le tractus digestif, les principes toxiques de l’extrait causaient des dommages tissulaires comparables à ceux qui ont été observés pour la voie ip. Cependant, comme l’extrait a été administré quotidiennement pendant une certaine période, ce résultat ne permet pas encore de savoir si ces lésions sont dues à un effet chronique (due à l’accumulation des toxines) ou aigu (après la dernière administration) de EMG.

Dans un traitement subchronique à la dose de 3 mg/kg, EMG n’a pas eu d’effet significatif sur les fonctions rénale et hépatique, malgré les importants dommages tissulaires observés dans ces organes. La créatinine est un métabolite issu de la dégradation de la créatine pendant l’effort et un taux sérique normal reflète le bon fonctionnement des reins. EMG n’a pas occasionné de destruction hépatocytaire, ce qui s’est traduit par un taux sérique normal en ALAT. Enfin, si un excès de γ-GT dans le sang permet de dépister une atteinte hépatique

Effets des extraits sur les animaux

(TURGEON, 2011), le dosage a montré que l’extrait n’influe pas sur la fonction hépatique des souris traitées.

Quant aux fractions, le suivi de la toxicité pendant les étapes de purification a montré qu’elles sont toutes plus toxiques que l’extrait brut, sauf la phase aqueuse et la fraction LH4.

En effet, la phase aqueuse n’a provoqué ni symptôme ni mort tandis que LH4 a provoqué des symptômes mais pas la mort. Pour la phase butanolique, la DL50 de EMG a causé la mort de toutes les souris testées, tandis que la toxicité est légèrement plus faible pour STG.

A propos des 4 fractions de STG, la toxicité diminue de LH1 à LH4. Rappelons que l’ordre d’élution des molécules dans la chromatographie sur LH20 est inversement proportionnel à la taille et au poids moléculaire. Il apparaît donc que la toxicité diminue avec le poids moléculaire. Ceci pourrait être dû au nombre des chaînes osidiques liées à la génine.

Chez les cobayes, alors qu’il n’affecte pas la chronotropie, EMG possède une propriété inotropes positive significative et à des doses plus faibles (à partir de 5 μg/ml) par comparaison à d’autres Albizia malgaches. A. viridis et A. bernieri ont les mêmes effets sur l’oreillette isolée de cobaye mais à des doses plus élevées (à partir de 10 μg/ml et 160 μg/ml, respectivement) (RANDRIANARIVO et coll., 2014a). Cette propriété pourrait être attribuée à la présence de cardénolides dans l’extrait. En effet, il est généralement admis que ces glycosides cardiaques présentent une action inotrope positive grâce à l'inhibition de la pompe Na+, K+ ATPase (QU et coll., 2013).

Malgré sa forte toxicité sur la souris, EMG n’affecte pas les poussins. En effet, la DL100 chez les souris (30 mg/kg) n’a causé ni la mort, ni même des symptômes d’intoxication chez les poussins. Les puces ont également résisté à l’extrait alors que la concentration testée était relativement élevée (5 mg/ml). Ceci n’exclut pas la toxicité de EMG envers d’autres insectes. En effet, les propriétés insecticides des saponosides sont bien connues (CHAIEB, 2010).

Les animaux à sang froid se sont révélés particulièrement sensibles à EMG avec des CL50 inférieures à 5 μg/ml. Cette propriété se retrouve d’ailleurs chez plusieurs Albizia malgaches telles que les extraits méthanoliques d’A. androyensis, A. divaricata et A. viridis (RANDRIANARIVO et coll., 2014). Cette forte toxicité de EMG sur les animaux à sang froid est un argument de plus en faveur de la nature saponosidique des principes toxiques de EMG.

A notre connaissance, il n’existe pas d’étude similaire à la nôtre faite sur les mêmes animaux à sang froid et dans les mêmes conditions avec des extraits d’espèces étrangères

Effets des extraits sur les animaux d’Albizia. Cependant, à titre d’illustration et sans tenir compte des espèces concernées, citons que l’extrait méthanolique des écorces d’A. zygia est très toxique sur Artemia salina, une espèce de crustacé vivant dans les lacs salés, les lagunes et les marais salants, avec une CL50 de 1,70 μg/ml (OLOYEDE et OGUNLADE, 2013) et que l’extrait brut méthanolique des écorces d’A. grandibracteata présente une forte activité anthelminthique sur le nématode Rhabditis pseudoelongata (DL50 = 25 μg/ml) (KRIEF, 2003).

EMG provoque l’hémolyse des globules rouges avec une DH50 estimée à 11,52 µg/ml. Cette propriété est partagée par d’autres espèces d’Albizia malgaches comme A. viridis (RATSIMANOHATRA, 2017), A. bernieri (RANDRIAMAMPIANINA, 2016), A. boinensis (ABDALLAH, 2009) et A. tulearensis (RAONIHARISOA, 2003). Les saponosides sont bien connus pour leur pouvoir hémolytique, dont le mécanisme n’est toujours pas bien connu (AUGUSTIN et coll., 2011) et ceci plaide encore pour la nature saponosidique des principes toxiques de EMG.

Plusieurs auteurs ont avancé des hypothèses qui impliquent que la partie aglycone serait le support de l'activité hémolytique. Cette activité varie énormément selon la structure des molécules mais généralement, la présence de groupements polaires semble diminuer fortement l’effet hémolytique (DE GROOT et MULLER-GOYMAN, 2016).

Cette propriété induit une toxicité chez la plupart des animaux, y compris les humains et elle constitue un inconvénient majeur pour le développement clinique des saponosides en tant qu'agents thérapeutiques (GAUTHIER et coll., 2009).

En conclusion, l’étude des effets de EMG sur les animaux a permis d’évaluer sa toxicité et de déterminer ses manifestions et son site d’action. Les saponosides sont probablement les principaux supports de ses propriétés toxiques étant donné qu’ils existent en quantité importante dans EMG et que les lésions observées sont celles qui sont souvent provoquées par ces composés. EMG exerce ses effets surtout au niveau des organes épurateurs où il cause des dégâts importants, surtout au niveau des poumons. Toutefois, des effets cardiaques intéressants à des doses relativement faibles ont été observés, alors que EMG n’est pas encore purifié. Cette propriété pourrait être exploitée à des fins thérapeutiques et/ou en recherche fondamentale, d’autant plus que les doses toxiques sont largement supérieures aux doses efficaces.

Cette étude a également permis d’avoir une idée du spectre d’activité de EMG notamment sur les animaux non-cibles tels que les animaux à sang froid aquatiques. L’extension des tests toxicologiques à d’autres espèces animales et la détermination des doses et conditions

Effets des extraits sur les animaux d’application optimales sont encore indispensables avant d’envisager l’utilisation de l’extrait en tant que pesticide afin d’éviter ou limiter les effets indésirables.

CHAPITRE IV :

EFFETS DE EMG SUR LES VEGETAUX

Effets de EMG sur les végétaux

IV.1 INTRODUCTION

Ce chapitre rapporte les effets de EMG sur les végétaux. Nos objectifs étaient de vérifier si cet extrait de graines toxique pour les animaux l’est également pour les végétaux et d'étudier comment il pourrait être utilisé dans le contrôle des plantes indésirables.

A ces fins, les effets de EMG ont été étudiés à des stades différents du développement des plantes :  à une phase précoce, pendant la germination des graines. Les tests étaient effectués sur des espèces potagères et des plantes indésirables (des mauvaises herbes et des plantes considérées comme invasives) ;  pendant la croissance des jeunes plantules, c’est-à-dire sur des plantes qui ont déjà germé. Pour ces tests, nous avons choisi des espèces potagères qui peuvent se cultiver en laboratoire et qui sont facilement accessibles.

IV.2 MATERIELS UTILISES DANS L’ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LES VEGETAUX

Les expériences ont porté sur les graines et/ou les jeunes plantules de 6 plantes potagères, Magnoliopsida (Dicotylédones) et Liliopsida (Monocotylédones) (tableau 26) et 8 plantes indésirables dont 3 espèces herbacées, 3 espèces arbustives envahissantes et 2 espèces arborescentes (tableau 27).

Tableau 26 : Liste des espèces potagères testées

Classe Famille Nom scientifique Nom usuel BRASSICACEAE Brassica sp Tissam blanc Dicotylédones CUCURBITACEAE Cucumis sativus Concombre FABACEAE Phaseolus vulgaris Haricot Pisum sativum Petit pois Monocotylédones POACEAE Oryza sativa Riz Zea mays Maïs

Tableau 27 : Liste des plantes indésirables testées

Port Famille botanique Nom scientifique Numéro national au SNGF Eragrostis pilosa MSB 3139 Herbacées POACEAE Eragrostis racemosa MSB 3636 Panicum subalbidum MSB 3008 FABACEAE Acacia dealbata 12189 Arbustives Cassia rotundifolia 13080 PROTEACEAE Grevillea banksii 13151 Arborescentes HYPERICACEAE Harungana madagascariensis 13139 PINACEAE Pinus kesyia 13099

Effets de EMG sur les végétaux

IV.3 METHODES

IV.3.1 ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES

La méthode utilisée est celle de RAKOTO (2012). Les graines ont été plongées dans l’eau de javel à 10 % pendant 5 min pour les stériliser, avant d’être abondamment rincées à l’eau de robinet.

Pour chaque espèce, les graines ont été réparties en 2 lots de 10 graines chacun, un lot a été mis à tremper dans de l’eau (témoin) et l’autre dans EMG à 1 mg/ml. Ils ont ensuite été placés à l’obscurité pendant 48 h. Finalement, chaque lot a été transféré sur un support de coton imbibé d’eau (témoin) ou d’extrait pour 24 h. L’essai a été effectué en double et à température ambiante.

Au bout de ces 72 h, les graines ayant germé ont été dénombrés pour évaluer le pourcentage d’inhibition. Le dénombrement et l’arrosage ont été poursuivis tous les deux jours pendant 15 jours supplémentaires. Le but était d’observer les effets d’une administration précoce de l’extrait sur le développement des plantes-tests.

La concentration de 1mg/mg a été choisie car des expériences préliminaires ont montré que la plupart des plantes-cibles y étaient sensibles.

L’expérience est résumée sur la figure 15 :

Trempage pendant • dans l'eau de robinet (2 lots-témoins) 48 h • dans l'extrait à 1 mg/ml (2 lots-tests)

Transfert sur un support de coton 24 h • arrosage avec de l'eau de robinet

Suivi pendant 15 • arrosage et dénombrement jours tous les 2 jours

Figure 15 : Déroulement des tests sur la germination

Les résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibition de la germination par comparaison avec les témoins. La formule (p. 69) permet de calculer le taux d’inhibition.

Effets de EMG sur les végétaux

푁표푚푏푟푒 푑푒 푔푟푎푖푛푒푠 푔푒푟푚é푒푠 (푡푒푠푡) 푃 = × 100 푁표푚푏푟푒 푑푒 푔푟푎푖푛푒푠 푔푒푟푚é푒푠 (푡é푚표푖푛) où P = pourcentage d’inhibition (%)

Les étapes du test étaient les mêmes pour les plantes indésirables. Cependant, les graines de certaines espèces indésirables ont nécessité un prétraitement avant le test proprement dit pour pouvoir germer.

Le prétraitement est un terme utilisé pour désigner les conditions ou les processus appliqués pour briser la dormance avant la germination. Il existe plusieurs types de dormance et le prétraitement appliqué dépend du genre de dormance de la graine (SCHMIDT, 2007).

Le tableau 28 ci-dessous décrit ces différentes conditions.

Tableau 28 : Déroulement des tests sur la germination des graines de plantes indésirables

Espèce Nom scientifique Support Température Prétraitement d’essai Eragrostis pilosa Papier buvard 30°C Aucun

Eragrostis racemosa Papier buvard 30°C Aucun

EES Panicum subalbidum Papier buvard 30°C Aucun

HERBAC Trempage dans l’eau Acacia dealbata Sable 30°C bouillante, refroidissement pendant 24 h

Trempage dans l’eau Cassia rotundifolia Sable 25°C bouillante, refroidissement pendant 24 h

ARBUSTIVES Trempage dans l’eau froide Grevillea banksii Sable 30°C pendant 24 h

Harungana Sable 25°C Aucun madagascariensis

Pinus kesyia Sable 25°C Aucun

ARBORESCENTS

Effets de EMG sur les végétaux

IV.3.2 ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES

La méthode décrite par RANDRIANARIVO et coll. (2014b) a permis de suivre les effets de EMG sur la croissance des jeunes plantules. Le haricot, le petit pois, le maïs et le riz ont été choisis comme plantes d’essai car leurs graines sont relativement grandes et elles germent assez rapidement, ce qui facilite la mesure de leurs hypocotyles et épicotyles. Les graines ont été trempées dans l’eau pendant 48 h, à 30 °C dans l’obscurité. Au bout de 3 jours, les graines ayant germé ont été transférées dans des boîtes de Petri tapissées de coton imbibé d’eau (contrôle négatif), de glyphosate (contrôle positif) ou de EMG à différentes concentrations. Sept concentrations en progression géométrique de raison 2 (0,1125, 0,225, 0,45, 0,9, 1,8, 3,6 et 7,2 mg/ml) ont été utilisées. Le glyphosate, qui est un désherbant non sélectif largement utilisé dans l’agriculture, a été utilisé comme témoin positif à la concentration de 7,2 mg/ml recommandée par le producteur.

Le test s’est poursuivi pendant 15 jours durant lesquels les épicotyles et les hypocotyles ont été mesurés tous les deux jours. Le substrat a été arrosé avec de l’eau de robinet après chaque mesure, le premier arrosage ayant été fait au 5ème jour. Les effets inhibiteurs de l’extrait ont été exprimés en termes de réduction de longueur des hypocotyles et épicotyles. Une analyse de variance (ANOVA) suivie du test de comparaison de Newman Keuls avec le logiciel Staticf® ont été réalisés pour l'analyse statistique des résultats. Les estimations statistiques ont été faites avec un intervalle de confiance de 95%.

IV.4 RESULTATS

IV.4.1 EFFETS DE EMG SUR LA GERMINATION DES GRAINES

IV.4.1.1 Effets sur les espèces potagères

A la concentration de 1 mg/ml, EMG a inhibé à des degrés différents la germination de toutes les graines des espèces potagères à l’exception du tissam blanc (tableau 29).

Tableau 29 : Taux d’inhibition de la germination par EMG à 1 mg/ml chez les espèces potagères (15ème jour) Nom scientifique Nom usuel Inhibition (%) Brassica sp. Tissam blanc 0 Cucumis sativus Concombre 58,3 Phaseolus vulgaris Haricot 42,1 Pisum sativum Petit pois 43,8 Oryza sativa Riz 21,4 Zea mays Maïs 47,4

Effets de EMG sur les végétaux

Les taux d’inhibition enregistrés au bout de 15 jours de traitement variaient de 0 % pour l’espèce la plus résistante (tissam) à 58,3 % pour l’espèce la plus sensible (concombre).

IV.4.1.2 Effets sur les espèces indésirables

Les différentes espèces se sont révélées sensibles à des degrés différents. Les résultats des expériences sont présentés dans le tableau 30.

Tableau 30 : Taux d’inhibition de la germination par EMG à 1 mg/ml chez les espèces indésirables (15ème jour) Nom scientifique Inhibition (%) Eragrostis pilosa 95 Panicum subalbidum 47,78 Acacia dealbata 25 Cassia rotundifolia 60 Harungana madagascariensis 97,5 Pinus kesyia 17,5

En ce qui concerne Eragrostis racemosa et Grevillea banksii, même les lots-témoins n’ont pas germé. EMG s’est avéré actif sur les autres plantes : les taux d’inhibition allaient de 17,5% à 97,5%. Cassia rotundifolia et plus particulièrement Harungana madagascariensis et Eragrostis pilosa étaient les plus sensibles à EMG avec des taux d’inhibition supérieurs à 94% et Pinus kesyia et Acacia dealbata les moins sensibles avec moins de 30 % d’inhibition. Ces deux dernières espèces sont répertoriées parmi les plantes envahissantes de Madagascar, et A. dealbata est mentionnée comme étant à risque élevé. (LISAN, 2014).

IV.4.2 EFFETS DE EMG SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES

En général, EMG a affecté la croissance des jeunes plantules et un effet-dose a été constaté, particulièrement au niveau de l’hypocotyle. Pour toutes les espèces testées, les effets sur la croissance de l’épicotyle étaient moins importants que pour l’hypocotyle. Ces effets devenaient visibles dès le 5ème jour.

Chez le haricot, un effet inhibiteur a été constaté pour les deux organes mais cet effet est plus marqué pour l’hypocotyle (figure 16, p.72). Cependant, une légère stimulation s’est manifestée dans l’épicotyle aux faibles concentrations (0,1125 et 0,225 mg/ml). La pourriture des graines de haricot a été observée au cours du test, surtout aux concentrations les plus élevées de EMG et en présence du glyphosate.

Effets de EMG sur les végétaux

Croissance de l'épicotyle de haricot en Croissance de l'hypocotyle de haricot en présence de EMG 300 présence de EMG 80 70 250 60 200 50 40 150 p > 0,05 p > 0,05

30 100 Longueur (mm) Longueur

20 (mm) Longueur 50 10 0 0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 Nombre de jours Nombre de jours

0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg) 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg)

Figure 16 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du riz du haricot

La figure 17 montre les effets de EMG sur la croissance du maïs. Un effet inhibiteur élevé a été constaté au niveau de l’hypocotyle à partir de 0,225 mg/ml. L’inhibition était pratiquement la même pour les 4 plus fortes concentrations, cependant elle était moins sévère que celle du glyphosate. Par contre, la croissance de l’épicotyle a connu une légère stimulation à la plus faible concentration (0,1125 mg/ml). Comparé à l’hypocotyle, cet organe était moins sensible à EMG.

Croissance de l'épicotyle de maïs en présence Croissance de l'hypocotyle de maïs en présence de EMG de EMG 140 70 120 60 100 50 80 40 60 p > 0,05 30 p < 0,01

40 20

Longueur (mm) Longueur Longueur (mm) Longueur 20 10 0 0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 Nombre de jours Nombre de jours

0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg) 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg)

Figure 17 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du maïs

Effets de EMG sur les végétaux

De toutes les espèces testées, le riz était le plus sensible. L’hypocotyle était particulièrement sensible avec des taux d’inhibition comparables à celui du glyphosate (herbicide de référence) pour les concentrations les plus élevées (figure 18). Aux concentrations de 3,6 et 7,2 mg/ml, l’effet était pratiquement le même que celui du témoin positif (glyphosate) et à partir de 1,8 mg/ml, il était beaucoup moins sévère et une légère stimulation était même constatée pour la concentration la plus faible. C’est d’ailleurs la seule espèce où une stimulation de l’hypocotyle a été observée. Par contre, l’épicotyle était beaucoup moins sensible à EMG.

Croissance de l'épicotyle du riz en présence de Croissance de l'hypocotyle du riz en présence 80 EMG de EMG 70 30 60 25

50 20 40 p > 0,05 15 30 p < 0,01 10

Longueur (mm) Longueur 20 Longueur (mm) Longueur 10 5 0 0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 Nombre de jours Nombre de jours

0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg) 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg)

Figure 18 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du riz

Pour le petit pois, les taux d’inhibition de la croissance de l’hypocotyle étaient moins élevés comparés aux autres plantes puisqu’ils varient autour de 30-40 % à partir de 0,225mg/ml. (figure 19, p. 74). C’est aussi la seule espèce où l’épicotyle est plus sensible que l’hypocotyle : au 15ème jour, les taux d’inhibition sont respectivement de 71,44 et 40,64 %.

Effets de EMG sur les végétaux

Croissance de l'épicotyle de petit pois en Croissance de l'hypocotyle de petit pois en présence de EMG présence de EMG 140 40 120 35 30 100 25 80 20 60 p > 0,05 15 p < 0,01

40 10

Longueur (mm) Longueur Longueur (mm) Longueur 20 5 0 0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 Nombre de jours Nombre de jours

0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0 mg/kg 0,1125 mg/kg 0,225 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 0,45 mg/kg 0,9 mg/kg 1,8 mg/kg 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg) 3,6 mg/kg 7,2 mg/kg Gly (7,2 mg/kg)

Figure 19 : Effets de différentes concentrations de EMG sur la croissance de l’épicotyle (a) et de l’hypocotyle (b) du petit pois

Le tableau 31 montre les taux d’inhibition de la croissance des épicotyles et des hypocotyles au dernier jour du test.

Tableau 31 : Pourcentage d’inhibition (%) de la croissance des jeunes plantules (15ème jour) à différentes concentrations de EMG HYPOCOTYLE EPICOTYLE Concentration de Petit Maïs Riz Petit EMG (mg/ml) Haricot Haricot Maïs Riz pois (*) (*) (*) Pois 0 (témoin) 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1125 10,69 4,32 12,46 -3,61 -33,15 19,21 -23,73 8,61 0,225 7,84 31,03 47,41 7,92 -3,58 35,69 19,19 13,36 0,45 13,51 34,98 61,21 15,69 1,54 40,33 23,24 11,64 0,90 23,34 29,18 69,60 21,29 5,52 51,52 21,96 17,59 1,80 45,23 34,36 73,14 54,46 46,18 64,24 20,63 15,98 3,60 57,17 38,42 76,53 89,11 50,44 65,97 36,56 19,57 7,20 63,80 40,64 78,16 97,44 50,61 71,44 36,67 29,50 Glyphosate (7,2) 91,43 71,00 92,22 95,15 91,67 98,71 92,00 97,04 (*) : p < 0,001 ; le signe – signifie qu’il y a stimulation En général, EMG a inhibé la croissance des plantes-tests bien qu’une stimulation ait été observée pour les concentrations 0,1125 et 0,225 mg/ml. D’autre part, un effet-dose a été constaté car l’inhibition augmentait avec la concentration pour toutes les plantes et les organes testés. Cet effet s’est fait remarquer en particulier chez le riz et un peu moins chez le maïs. Chez le petit pois, l’écart d’inhibition n’est pas très grand entre 0,225 et 7,2 mg/ml.

Effets de EMG sur les végétaux

IV.5 DISCUSSION

Nos résultats ont montré que EMG a influencé le développement de certaines plantes, en agissant sur la germination des graines et/ou sur la croissance des jeunes plantules.

A part les prétraitements, les espèces potagères et indésirables ont été soumises aux mêmes conditions expérimentales. Or les adventices de culture que sont Eragrostis pilosa et Panicum subalbidum se sont révélées bien plus sensibles que la plupart des espèces potagères testées. EMG pourrait donc contenir des principes qui seraient plus actifs contre les mauvaises herbes que sur certaines plantes cultivées.

Quatre parmi les espèces les moins sensibles au cours des tests sur la germination (haricot, petit pois, riz et maïs) ont vu leur croissance ralentie par l’extrait. Différentes raisons pourraient expliquer cet effet :  Soit la plante possède des défenses qui la protègent de l’extrait au stade de la germination (tégument des graines, enzymes ou métabolites capables de s’opposer aux effets de l’extrait),  Soit les principes actifs agissent sur une voie biochimique essentielle dans les jeunes plantules : inhibition de la respiration ou de la synthèse de métabolites, en particulier les protéines, inhibition de la division et de l’élongation cellulaire, diminution de la perméabilité membranaire (RICE, 1984), diminution de la disponibilité des substances de stockages, ce qui empêche le développement de la plante (YARNIA et al., 2009).

Au cours des tests sur la croissance des jeunes plantules, EMG a montré un effet inhibiteur sur les hypocotyles de toutes les plantes testées. D’autre part, il a été constaté que l’épicotyle était moins sensible que l’hypocotyle, sauf pour le petit pois où l’effet inverse a été observé. Ces résultats font penser que les principes phytotoxiques d’A. masikororum agirait principalement au niveau des racines, un effet qui a été souvent observé dans des expériences similaires. En effet, les racines sont les premiers organes exposés à l’action des composés toxiques présents dans le substrat (TEFERA, 2002 ; ASHRAFI et coll., 2008 ; AROWOSEGBE et AFOLAYAN, 2012).

En comparaison avec les extraits méthanoliques des graines d’autres espèces malgaches d’Albizia étudiées au LABASM dans des conditions similaires (extrait à 1mg/ml, mêmes plantes testées, etc.) celui de l’espèce A. masikororum est aussi actif sur le riz (91,44%) qu’A. bernieri (91,5 %) et plus actif qu’A. androyensis (82,7 %) et A. viridis (76,7 %). Chez le maïs, l’effet est également comparable à celle d’A. bernieri avec des taux de 78,16 % et 72,4

Effets de EMG sur les végétaux

%, respectivement. Par contre, le petit pois résiste mieux à EMG (40,64 %) qu’à l’extrait de graines des autres espèces où les taux d’inhibition varient de 68,7 % (A. viridis) à 97,3 % (A. androyensis) (RANDRIANARIVO et coll., 2014b).

Des propriétés phytotoxiques d’espèces étrangères d’Albizia sont connues :  Les extraits des écorces, des feuilles, des graines et des racines d’A. saman inhibent le développement du blé et du maïs, avec un effet plus prononcé de la part des graines. Pour ces dernières, les taux d’inhibition de la germination varient de 13,4 % à 70 % sur différentes variétés de blé et de maïs, à une concentration de 100 mg/ml. Les auteurs ont noté que le développement des hypocotyles est plus sensible comparé à celui des épicotyles, un résultat qui a également été observé avec EMG (NOOR et KHAN, 1994).  A. gummifera et A. adianthifolia possèdent également des propriétés phytotoxiques. L’extrait aqueux des feuilles d’A. gummifera a un effet inhibiteur sur Parthenium hysterophorus, une plante considérée comme une menace pour les cultures. A une concentration de 30 mg/ml, l’extrait réduit la germination, la longueur de la radicule et de la plumule de 60 %, 69 % et 44 %, respectivement (WAKJIRA et coll., 2011).  L’extrait aqueux des feuilles d’A. adianthifolia, n’a aucun effet significatif sur la germination alors qu’il inhibe la croissance des radicules et des plumules, à partir de 10 mg/ml (SUNMONU et VAN STADEN, 2014). Notons que EMG a été testé à une concentration de 1 mg/ml pour la germination et inférieure à 10 mg/ml pour la croissance. Il est donc de loin plus efficace que les différents extraits de ces trois espèces étrangères.

Ces résultats, bien que préliminaires, démontrent que EMG possède des propriétés phytotoxiques qui pourraient constituer un bon point de départ pour la mise au point d’herbicides.

Tout comme chez les animaux, les principes responsables de ces activités phytotoxiques pourraient être les saponosides qui sont les métabolites secondaires majoritaires de EMG. Plusieurs travaux ont déjà rapporté les effets négatifs de ces composés sur le développement d’autres plantes (SCOGNAMIGLIO et coll., 2012 ; PEREZ et coll., 2015).

En conclusion, les résultats obtenus ont montré que, en plus de ses effets toxiques sur les animaux, EMG a également des propriétés phytotoxiques. Ses effets sur la germination des graines, notamment celles des plantes nuisibles, et sur la croissance des jeunes plantules pourraient faire de lui un bon candidat pour la lutte contre les plantes indésirables. Cependant,

Effets de EMG sur les végétaux

ses éventuelles utilisations doivent être impérativement précédées d’une évaluation plus poussée des impacts sur l’environnement, en particulier sur les organismes non cibles.

CHAPITRE V : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES

MICROORGANISMES

Effets des extraits sur les microorganismes

V.1 INTRODUCTION

Le principal objectif des travaux rapportés dans ce chapitre a été d’évaluer le potentiel antimicrobien d’A. masikororum. Pour ce faire, tous les extraits bruts et purifiés d’organes de la plante (Cf. tableaux 9 et 10, p. 39 et p. 40) ont été testés sur des germes pathogènes pour l’homme par la méthode des disques en milieu solide. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et les concentrations minimales batéricides (CMB) des extraits actifs ont été déterminées sur les souches sensibles.

V.2 MATERIELS UTILISES

V.2.1. LES MICROORGANISMES

L’activité antimicrobienne des extraits a été testée sur des bactéries Gram (+) et Gram (-) ainsi que la levure Candida albicans (tableau 32).

Tableau 32 : Liste des souches utilisées Nom scientifique Référence de la souche Coloration Gram Bacillus cereus ATCC 14979 + Staphylococcus aureus ATCC 25923 + Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 + Streptococcus pyogenes ATCC 19615 + Clostridium perfringens ATCC 13124 - Enterobacter aerogenes ATCC 13048 - Enterobacter cloacae ATCC 13047 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 - Yersinia enterocolitica ATCC 23715 - Candida albicans ATCC 10231 ATCC : American Type Culture Collection

V.2.2 LES MILIEUX DE CULTURE

Les milieux de cultures utilisés étaient :  le milieu de Mueller-Hinton (LIOFILCHEM) pour les souches bactériennes, un milieu non sélectif qui convient à la plupart des bactéries ;  le milieu Sabouraud pour Candida albicans.

V.2.3 LES ANTIBIOTIQUES DE REFERENCE Les antibiotiques de référence étaient :  la néomycine (30 mg/disque) pour les bactéries ;  le miconasole (500 µg/ml) pour la levure.

Effets des extraits sur les microorganismes

V.2.4 LES EXTRAITS TESTES

Les extraits utilisés sont les extraits hexanique et méthanolique des cosses, des écorces, des feuilles et des graines, STG ainsi que ses fractions LH1 à LH4. Les fractions obtenues avec

LH4 n’ont pas été testées car elles n’étaient pas disponibles en quantité suffisante pour les besoins des tests.

V.3 METHODES

V.3.1 TESTS D’ANTIBIOGRAMME EN MILIEU SOLIDE

La méthode utilisée est inspirée de celle que préconise le Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 2015a). Une culture de 24 h de chacun des microorganismes étudiés est mise en suspension dans de l’eau physiologique (9 ‰) de manière à obtenir une turbidité correspondant à 0,5 Mac Farland. La suspension est diluée 10 fois avec de l’eau physiologique pour obtenir un inoculum contenant 1,5 x 107 UFC/ml.

L’ensemencement du milieu se fait par inondation : le milieu est recouvert avec l’inoculum qui est réparti sur toute la surface de la boîte. Quelques minutes sont nécessaires pour permettre aux germes d’adhérer au milieu et l’excédent d’inoculum est ensuite aspiré.

Les disques stériles sont imprégnés avec 10 μl d’extrait à 1 mg/disque, mis à sécher puis déposés à la surface de la culture avec une pince stérile. Les boîtes sont ensuite incubées à 37oC pendant 24 h pour les bactéries ET à 25oC pendant 72 h pour la levure. Chaque test est effectué en double.

Les résultats sont lus en mesurant les diamètres des halos d’inhibition (DHI). la moyenne des valeurs obtenues avec les deux tests constitue le résultat final et les résultats sont interprétés suivant l’échelle utilisée par MOREIRA et coll. (2005) (tableau 33).

Tableau 33 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques INHIBITION* TRANSCRIPTION SENSIBILITE ≤ 8 mm - Résistant 9-14 mm + Sensible 15-19 mm ++ Très sensible ≥ 20 mm +++ Extrêmement sensible

Effets des extraits sur les microorganismes

V.3.2 DETERMINATION DES CMI, CMB et CMB/CMI

La CMI et la CMB ont été déterminées selon la méthode dite de microdilution inspirée de celle que préconise le Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 2015b). Seuls les extraits actifs par la méthode des disques sur milieu solide ont été testés.

V.3.2.1 DETERMINATION DE LA CMI

Les différentes étapes de l’expérience sont les suivantes :

• Le produit à tester est dissous dans de l’eau distillée stérile pour avoir une concentration de 25 mg/ml pour les extraits bruts et de 2 mg/ml pour les extraits purifiés. La solution obtenue est ensuite stérilisée par filtration. • Dans chaque puits d’une microplaque, 100 μl d’extrait sont mélangés avec 95 μl de milieu liquide. Puis 5 μl d’inoculum préalablement préparé de la même façon que pour un test d’antibiogramme sont rajoutés. Des dilutions en cascade sont réalisées de façon à avoir des concentrations finales comprises entre 0,023 et 12500 µg/ml (20 concentration) pour les extraits bruts et entre 0,97 et 1000 µg/ml (10 concentrations) pour les extraits purifiés. • Deux témoins sont utilisés : - un témoin positif constitué de 200 μl de bouillon nutritif (pas de croissance des germes), - un témoin négatif constitué de 195 μl de milieu additionné de 5 μl d’inoculum (croissance des germes).

Les plaques sont ensuite recouvertes de papier aluminium stérile, puis incubées à 37°C, pendant 24 h.

Après 24 h, de l’INT (p-iodonitrotetrazolium chloride) à 0,2 mg/ml est rajouté dans chaque puits à raison de 40 μl/puits. Avec ce produit, les cellules vivantes se colorent en violet, ce qui permet de voir s’il y a eu croissance ou non dans le milieu. Les résultats sont lus après 30 min d’incubation : la CMI est la plus faible concentration où il n’y a pas de changement de coloration.

Les normes utilisées par DALMARCO et coll. (2010) et KUETE et coll. (2009) ont été choisies pour l’interprétation des résultats (tableau 34, p. 81).

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 34 : Normes utilisées pour l’interprétation des résultats obtenus par la méthode de microdilution CMI Effet CMI < 100 μg/ml Excellent 100 < CMI < 500 μg/ml Modéré 500 < CMI <1000 μg/ml Faible CMI> 1000 μg/ml Inactif

V.3.2.2 DETERMINATION DE LA CMB

Pour estimer la CMB, le contenu des puits où il n’y a pas eu de croissance apparente est réensemencé en lignes sur du milieu solide. Après 24 h d’incubation, la CMB est la plus faible concentration à laquelle il n’y aucune croissance microbienne.

V.3.2.3 DETERMINATION DE LA NATURE DE L’ACTION ANTIBACTERIENNE D’UN EXTRAIT

Le rapport CMB/CMI permet de déterminer la nature de l’action d’une substance sur les microbes (ODEYEMI et coll., 2014) : - si CMB/CMI est inférieur ou égal à 4, l’extrait est bactéricide ; - si CMB/CMI est supérieur 4, l’extrait est bactériostatique.

V.4. RESULTATS

V.4.1 ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES DIFFERENTS EXTRAITS BRUTS

V.4.1.1 Résultats des tests d’antibiogramme

Le tableau 35 (p. 82) montre les résultats des tests d’antibiogramme des extraits bruts hexaniques et méthanoliques, à 1 mg/disque qui est une dose couramment utilisée dans l’évaluation des activités antimicrobiennes d’extraits de plantes (SANDEEP et coll., 2010 ; GOVINDAPPA et coll., 2011 ; LINTHOINGAMBI et MUTUM, 2013 ; MARIMUTHU et coll., 2014 ; RANDRIAMAMPIANINA, 2016).

Seuls EMF et EMG ont montré une activité en milieu solide avec des DHI allant de 8 à 16,5 mm :

- EMF a inhibé la croissance de 3 bactéries Gram (+) sur les 4 testées et 1 des 5 bactéries Gram (-). - EMG était actif contre 3 bactéries Gram (+) sur 4 et 4 bactéries Gram (-) sur 5. - EMF et EMG étaient inefficaces contre Candida albicans.

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 35 : Diamètres des halos d’inhibition (mm), obtenus avec les différents extraits à 1000 µg/disque Souches EHC EMC EHE EME EHF EMF EHG EMG N M Bacillus 6 6 6 6 6 11,5 6 6 21 - cereus

Staphylococcus 6 6 6 6 6 13 6 10 18 - aureus Streptococcus 6 6 6 6 6 16,5 6 9 23 - Gram (+) Gram pneumoniae Streptococcus 6 6 6 6 6 7,5 6 15 24 - pyogenes Clostridium 6 6 6 6 6 7 6 13 22 - perfringens Enterobacter 6 6 6 6 6 6 6 8 19 -

aerogenes

)

- Enterobacter 6 6 6 6 6 7 6 12 27 - cloacae

Gram ( Gram Pseudomonas 6 6 6 6 6 6 6 6 18 - aeruginosa Yersinia 6 6 6 6 6 14,5 6 9 20 - enterocolitica Levure Candida 6 6 6 6 6 6 6 6 - 25 albicans EHG : extrait hexanique des graines ; EMG : extrait méthanolique des graines ; STG : saponosides totaux des graines ; EHC : extrait hexanique des cosses ; EMC : extrait méthanolique des cosses ; EHE : extrait hexanique des écorces ; EDE : extrait dichlorométhane des écorces ; EME : extrait méthanolique des écorces ; EHF : extrait hexanique des feuilles ; EDF : extrait dichlorométhane des feuilles ; EMF : extrait méthanolique des feuilles ; N : Néomycine (30 mg/disque) ; M : Miconasole (500 µg/ml) A titre d’illustration, la figure 20 montre les effets de EMF et EMG sur la croissance de Staphylococcus aureus.

Figure 20 : Croissance de Staphyloccus aureus en présence des extraits 2 : EMG ; 3 :EHC ; 4 : EMC ; 5 : EHF ; 6 : EME ; 7 : EMF

Effets des extraits sur les microorganismes

V.4.1.2 CMI et CMB de EMG et EMF

Pour EMG, les CMI variaient de 6,10 à 781,25 µg/ml et les CMB de 24,41 à 12500µg/ml. Pour EMF, les CMI s’étalaient de 97,65 à 781,25 µg/ml et les CMB de 97,65 à 1562,5 µg /ml.

Les CMI et les CMB de EMG et EMF sont présentées dans le tableau 36.

Tableau 36 : CMI et CMB de EMG et EMF sur les souches sensibles (µg/ml) Souches CMI CMB EMG EMF EMG EMF Bacillus cereus nd 781,25 nd 781,25 Gram (+) Staphylococcus aureus 195,31 781,25 12500 1562,5 Streptococcus pneumoniae 6,10 97,65 24,41 97,65 Streptococcus pyogenes 24,41 nd 48,82 nd Clostridium perfringens 195,31 nd 12500 nd Gram (-) Enterobacter aerogenes 195,31 nd 6250 nd Enterobacter cloacae 781,25 nd 12500 nd Yersinia enterocolitica 781,25 781,25 781,25 1562,5 nd : non déterminé

La figure 21 montre les résultats de la détermination de la CMI de EMG et de STG sur Streptococcus pyogenes.

EMG

STG

Figure 21 : CMI de EMG et STG sur Streptococcus pyogenes (T- : témoin négatif ; T+ : témoin positif)

Le tableau 37 (p. 84) présente les valeurs du rapport CMB/CMI pour EMG et EMF.

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 37 : Rapport CMB/CMI de EMF et EMG Souches EMG EMF Bacillus cereus nd 1 Gram (+) Staphylococcus aureus >4 2 Streptococcus pneumoniae 1 1 Streptococcus pyogenes 1 nd Clostridium perfringens >4 nd Gram (-) Enterobacter aerogenes >4 nd Enterobacter cloacae >4 nd Yersinia enterocolitica 1 16 nd : non déterminé

D’après ces résultats, EMG est bactériostatique sur 4 des 7 souches testées et bactéricide vis-à-vis des deux Streptococcus et de Yersinia enterocolitica. EMF est bactéricide sur toutes les souches testées à l’exception de Yersinia enterocolitica.

V.4.2 ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DE STG ET DES FRACTIONS OBTENUES A PARTIR DE STG

V.4.2.1 Résultats des tests d’antibiogramme

STG ainsi que les 4 fractions obtenues après sa chromatographie sur une colonne de LH20 (LH1 à LH4), ont été testés sur les souches qui étaient sensibles à EMG. Les fractions issues de la chromatographie de LH3 n’ont pas pu subir ces tests à cause de leur trop faible quantité. Bien que sensible à EMG, Streptococcus pneumoniae ne figure pas dans ces résultats car cette bactérie n’était pas disponible au moment du test.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 38.

Tableau 38 : Diamètres des halos d’inhibition (mm), quantité d’extrait : 1000µg/disque

Souches STG LH1 LH2 LH3 LH4 Gram (+) Staphylococcus aureus 11,5 6 6 12 12 Streptococcus pyogenes 16,5 6 11 16,5 19 Clostridium perfringens 11 6 6 11,5 12 Gram (-) Enterobacter aerogenes 9 6 6 9 9 Enterobacter cloacae 10,5 6 7 11,5 12 Yersinia enterocolitica 11,5 6 6 12 12

La croissance de tous les germes testés a été inhibée par STG et ses fractions LH3 et

LH4. Les souches étaient « sensibles » à « très sensibles », selon les normes de MOREIRA

(2005). LH1 n’a eu aucun effet sur les germes et LH2 était active uniquement sur Streptococcus pyogenes.

Effets des extraits sur les microorganismes

Streptococcus pyogenes a été la souche la plus sensible avec un halo d’inhibition de

19 mm avec LH4 et Enterobacter aerogenes la moins sensible avec les extraits actifs (STG, LH3 et LH4).

La figure 22 montre à titre d’exemple les effets antibactériens des saponosides totaux d’A. masikororum et de ses fractions.

Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus

Yersinia enterocolitica Enterococcus cloacae

Figure 22 : Croissance des différents germes en présence de STG et de ses fractions

V.4.2.2 CMI et CMB de STG et de ses fractions

Les CMI de STG, des fractions LH1 à LH4 et des sous-fractions de LH3 (Sil3-1 à Sil3-

6) ont été déterminées. Les résultats sont présentés dans le tableau 39 (p. 86). Rappelons que les sous-fractions de LH4 n’ont pas été testées car leur quantité était insuffisante pas pour le test.

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 39 : CMI de STG, ses fractions et sous-fractions (µg/ml)

Gram (+) Gram (-) S. aureus S. pneumoniae S. pyogenes C. perfringens E. aerogenes E. cloacae Y. enterocolitica STG 97,65 12,20 12,20 24,41 195,31 390,62 390,62

LH1 >1000 250 125 >1000 >1000 >1000 >1000

LH2 125 62,5 31,25 62,5 250 125 125 LH3 31,25 15,62 15,62 15,62 62,5 62,5 31,25 LH4 15,62 15,62 7,81 15,62 31,25 31,25 15,62 Sil3-1 >1000 500 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-2 >1000 62,5 >1000 >1000 >1000 500 >1000 Sil3-3 >1000 500 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-4 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-5 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-6 500 250 125 500 >1000 >1000 >1000

La sensibilité des souches n’était pas la même pour toutes les fractions. STG et les fractions LH1 à LH4 étaient plus actives que les fractions Sil3-1 à Sil3-6. Avec des valeurs inférieures à 100 µg/ml sur toutes les souches, les CMI les plus faibles étaient observées avec

LH3 et LH4, ce qui permettait de classer leurs activités comme étant excellentes, selon les normes adoptées. La fraction LH2 avait une excellente activité sur les deux Streptococcus et modérée sur les autres souches tandis que la fraction LH1 n’était active que sur les deux Streptococcus et son activité est modérée.

La souche la plus sensible était Streptococcus pyogenes, pour laquelle les CMI n’excédaient pas 125 µg/ml. Les souches Gram (–) étaient légèrement moins sensibles par rapport aux souches Gram (+), même si elles étaient toutes très sensibles aux fractions LH3 et

LH4.

L’activité des sous-fractions de LH3 (Sil3-1 à Sil3-6) était beaucoup plus faible par rapport à celle de la fraction LH3 elle-même. E. aerogenes et Y. enterocolitica étaient particulièrement insensibles à toutes les fractions. Sil3-6 est la seule sous-fraction qui possédait un effet sur 4 souches, bien que cet effet soit modéré. L’activité la plus forte était observée avec

Sil3-2 sur S. pneumoniae qui était également la souche la plus sensible. Sil3-4 et Sil3-5 étaient inactives sur toutes les souches.

Les CMB de STG, des fractions LH1 à LH4 et des sous-fractions Sil3-1 à Sil3-6 sont présentées dans le tableau 40 (p. 87).

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 40 : CMB de STG et de ses fractions (µg/ml)

Gram (+) Gram (-) S. aureus S. pneumoniae S. pyogenes C. perfringens E. aerogenes E. cloacae Y. enterocolitica STG >1000 12,20 12,20 >1000 >1000 >1000 >1000 LH1 >1000 250 125 >1000 >1000 >1000 >1000 LH2 >1000 62,5 31,25 >1000 >1000 >1000 500 LH3 500 15,62 15,62 >1000 250 >1000 500 LH4 250 15,62 7,81 >1000 31,25 62,5 >1000 Sil3-1 >1000 500 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-2 >1000 125 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-3 >1000 500 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-4 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-5 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Sil3-6 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

Les CMB de STG et des fractions LH1 à LH3 étaient du même ordre pour tous les germes. Par exemple, elles étaient assez faibles pour les deux Streptococcus et élevées pour les autres souches. Pour la fraction LH4, elles étaient inférieures à 100 µg/ml sauf pour S. aureus, C. perfringens et Y. enterocolitica.

La figure 23 montre les CMI des fractions LH1 à LH4 sur Streptococcus pyogenes.

LH1

LH2

LH3

LH4

Figure 23 : CMI des fractions LH1 à LH4 sur Streptococcus pyogenes Zone A : aucune croissance bactérienne se traduisant par l’absence de changement coloration Zone B : croissance bactérienne visible se traduisant par la coloration violette (T- : témoin négatif ; T+ : témoin positif)

Effets des extraits sur les microorganismes

Les valeurs des rapports CMB/CMI de STG et de ses fractions sont consignées dans le tableau 41.

Tableau 41 : Rapport CMB/CMI de STG et de ses fractions

Gram (+) Gram (-) S. aureus S. pneumoniae S. pyogenes C. perfringens E. aerogenes E. cloacae Y. enterocolitica STG >4 1 1 >4 >4 4 >4 LH1 >4 1 1 >4 >4 >4 >4 LH2 >4 1 2 >4 >4 >4 >4 LH3 >4 1 1 >4 4 >4 >4 LH4 >4 1 1 >4 1 2 >4 Sil3-1 >4 1 >4 >4 >4 >4 >4 Sil3-2 >4 2 >4 >4 >4 >4 >4 Sil3-3 >4 1 >4 >4 >4 >4 >4 Sil3-4 >4 >4 >4 >4 >4 >4 >4 Sil3-5 >4 >4 >4 >4 >4 >4 >4 Sil3-6 >4 >4 >4 >4 >4 >4 >4

Les 8 premières fractions sur les 11 testées étaient bactéricides pour la souche S. pneumoniae contre 5 fractions sur 11 pour S. pyogenes. Chez E. aerogenes, le rapport

CMB/CMI décroit de STG à LH4. Les deux dernières fractions étaient bactéricides alors que

STG était bactériostatique. LH4 était la fraction la plus active et elle était bactéricide sur 4 souches et bactériostatique sur les 3 autres. En ce qui concerne les fractions obtenues à partir de LH3, elles ont un effet bactériostatique sur presque toutes les souches. Seules les fractions

Sil3-1 à Sil3-3 ont montré un effet bactéricide sur S. pneumoniae.

Chez S. aureus, C. perfringens et Y. enterocolitica, l’effet restait bactériostatique à toutes les étapes de purification

V.5 DISCUSSION

Les tests d’antibiogramme ont révélé que seules les feuilles et les graines de la plante ont une propriété antimicrobienne et que les substances actives n’étaient pas extractibles avec l’hexane. L’extrait brut méthanolique de feuilles (EMF) et l’extrait brut méthanolique de graines (EMG), ainsi que les extraits dérivant de ce dernier, étaient actifs à l’exception de LH1.

Comme nous l’avons déjà signalé, les résultats des tests d’antibiogramme ont été intérprétés selon les normes de MOREIRA et coll. (2005) qui sont largement utilisés par les auteurs.

Pour la détermination des CMI en milieu liquide, il n’existe pas de consensus sur l’interprétation des niveaux d’activité des produits naturels (BENKO-ISEPPON et

Effets des extraits sur les microorganismes

CROVELLA , 2010). Les normes de KUETE et coll. (2009) et de DALMARCO et coll. (2010) que nous avons utilisées l’ont aussi été par d’autres auteurs (ISA et coll., 2014 ; SENTHIL- RAJAN et coll., 2013 ; COS et coll., 2006).

En ce qui concerne les feuilles, l’étude était limitée aux extraits bruts.

EMF était actif sur 4 souches parmi les 10 testées, dont une souche Gram (-). L’antibiogramme a permis de constater que Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Yersinia enterocolitica étaient sensibles et Streptococcus pneumoniae très sensible à l’extrait. Il s’est avéré que les niveaux d’activité n’étaient pas les mêmes pour la méthode de diffusion en milieu solide et la méthode des microdilutions en milieu liquide. En effet, l’activité était beaucoup moins importante en milieu liquide qu’en milieu solide. Par exemple, le DHI était de 14,5 mm sur Yersinia enterocolitica alors que la CMI était de 781,25 µg/ml. Par ailleurs, la détermination de la CMI a montré que EMF a un excellent effet sur S. pneumoniae et un faible effet sur toutes les autres souches.

EMF a exercé un effet bactéricide sur toutes les souches testées sauf Yersinia enterocolitica sur laquelle son effet est bactériostatique.

Le screening phytochimique a montré que EMF est riche en produits phénoliques tels que les leucoanthocyanes, les flavonoïdes et les tannins. Ces familles chimiques sont toutes bien connues pour leurs activités antimicrobiennes (SANDHAR et coll., 2011). Cependant, il n’est pas encore possible de dire si l’activitité antimicrobienne des feuilles est due à une famille chimique ou un composé particulier ou bien à un effet synergique entre plusieurs produits.

A propos des activités de l’EMG et de ses dérivés, EMG a montré un spectre d’activité plus large avec 7 souches sensibles sur les 10 testées, dont 4 souches Gram (-). Streptococcus pyogenes est la seule souche qui soit très sensible à l’extrait avec un DHI de 15 mm. Pour les autres germes, les DHI variaient de 8 à 13 mm. Les souches sensibles à EMG étaient toutes sensibles à STG et à ses fractions. Chez les souches Gram (+), l’activité augmentait au fur et à mesure que la purification avançait : STG était plus actif que EMG et les fractions LH étaient plus efficaces que STG. Chez les Gram (-), le même effet a été observé avec Y. enterocolitica, alors que pour les autres souches, l’activité restait au même niveau ou diminuait.

Contrairement à ce qui a été observé dans les feuilles, les niveaux d’activité de EMG étaient nettement plus élevés en milieu liquide qu’en milieu solide. Ceci serait du à une diffusion faible ou nulle des produits actifs en milieu solide.

Effets des extraits sur les microorganismes

En se basant sur les CMI, l’activité de EMG allait d’excellente (S. pneumoniae et S. pyogenes) à faible (E. cloacae et Y. enterocolitica) et pour STG, elle était d’excellente à modérée sur les mêmes souches. En général, les valeurs des CMI et des CMB montraient que l’activité de STG et de ses fractions était plus élevée que celle de EMG. Ceci indiquait que les saponosides, en majorité dans les graines, pourraient être les principes responsables de ses propriétés antimicrobiennes. Vis-à-vis de Clostridium perfringens surtout, la CMI était de 8 fois plus faible pour STG que pour EMG.

Comme pour les tests d’antibiogramme, l’activité augmentait sensiblement avec la purification des saponosides. En particulier, LH3 et LH4 avaientt une excellente activité sur toutes les souches testées, les CMI les plus élevées étant de 62,5 µg/ml. Cet effet était particulièrement marqué pour les deux espèces de Streptococcus.

Parmi les fractions de STG, une activité de plus en plus importante a été observée de la fraction LH1 à la fraction LH4. Ceci confirmait l’hypothèse selon laquelle LH4 serait constituée de monodesmosides à chaine courte (cf. paragraphe II.9, p. 38) car il est bien connu qu’ils sont souvent plus actifs que les bidesmosides correspondants (FRANCIS et coll., 2002).

Il serait intéressant d’approfondir l’étude de la fraction LH4 qui a montré un excellent pouvoir antimicrobien tout en étant moins toxique sur souris que les autres fractions et EMG.

La purification de LH3 a considérablement affaibli son activité puisque les fractions sont toutes devenues inactives, à l’exception de Sil3-6 qui possèdait une activité modérée sur 4 souches, de Sil3-1 à Sil3-3 dont l’activité était excellente à modérée sur Streptococcus pneumoniae et de Sil3-2 qui avait une activité modérée sur E. cloacae. Cette perte d’activité pourrait être due à une altération des molécules par hydrolyse par exemple.

EMG et STG ont montré une activité bactériostatique sur Staphylococcus aureus et Clostridium perfringens. Sur Y. enterocolitica, les deux extraits n’avaient pas le même effet : EMG était bactéricide pour cette souche alors que STG était bactériostatique. Cet effet était inversé chez Enterobacter cloacae : EMG était bactériostatique et STG bactéricide. Par contre, ils ont exercé un effet bactéricide sur les deux espèces du genre Streptococcus.

La nature de l’activité antibactérienne était sensiblement la même pour les fractions

LH. Cependant, un effet bactéricide était apparu chez LH3 et LH4 vis-à-vis de E. aerogenes et E. cloacae, confirmant que ces deux fractions étaient plus efficaces que EMG et STG.

Les deux espèces de Streptococcus étaient les souches les plus sensibles à EMG et à ses fractions. Ces deux germes pathogènes ont un impact considérable sur la santé humaine et

Effets des extraits sur les microorganismes

ils sont à l’origine d’une morbidité et d’une mortalité significatives. S. pneumoniae est la principale cause de maladie d’origine bactérienne dans le monde et elle peut causer une septicémie mortelle, une méningite ou une pneumonie. De son côté, S. pyogenes figure parmi les dix principales causes de mortalité humaine due à une maladie infectieuse (RICHARDS et coll., 2014). De plus, entre 20 et 50 % des souches du genre Streptococcus ont développé une résistance aux antibiotiques (https://www.antibio-responsable.fr/bacteries/pneumocoque).

En général, cette étude a montré que l’activité antimicrobienne était plus importante pour les graines que pour les feuilles d’A. masikororum.

Les propriétés antimicrobiennes de nombreuses espèces d’Albizia ont déjà fait l’objet d’études. Parmi les espèces malgaches étudiées au LABASM dans les mêmes conditions qu’A. masikororum, avec des CMI allant jusqu’à 1,95 µg/ml la fraction alcaloïdique Alk 2 des graines d’A. bernieri (RANDRIAMAMPIANINA et coll., 2017) est plus efficace que EMG sur S. pyogenes. Par contre, l’activité d’A. viridis est comparable avec des CMI comprises entre 48,82 et 12500 µg/ml (RATSIMANOHATRA, 2017). Et en comparaison avec les extraits de graines d’A. aurisparsa sur Bacillus cereus, (CMI = 1980 µg/ml), d’A. polyphylla sur Staphylococcus aureus (CMI = 2420 µg/ml) et surtout les feuilles d’A. arenicola sur Candida albicans (CMI = 15620 µg/ml) (RANDRIAMAMPIANINA et coll., 2017), A. masikororum est bien plus actif.

La comparaison avec des espèces étrangères est plus difficile car les souches concernées et les méthodes utilisées variaient d’une étude à l’autre. Cependant, nous rapportons ici quelques exemples, à titre indicatif. Les extraits bruts et les fractions des écorces d’A. gummifera ont une activité comparable à celle de EMG avec des CMI comprises entre 64 et 512 µg/ml sur quelques souches de Salmonella (ATSAFACK et coll., 2016). Les résultats d’études sur A. myriophylla montrent que les différents extraits et fractions sont bien plus actifs que ceux d’A. masikororum avec des CMI comprises entre 2 et 16 µg/ml sur Staphylococcus mutans (JOYCHARAT et coll. 2015).

Des auteurs se sont référés à d’autres normes dans leurs études. Ainsi, SADOWSKA et coll. (2014) ont estimé qu’avec des CMI comprises entre 750 et 1500 µg/ml les extraits de Vaccinium myrtillus et Frangula alnus étaient très actifs sur deux souches de Staphylococcus aureus. De même, ZUO et coll. (2008) ont considéré que les extraits ayant des CMI comprises entre 1250 et 3070 µg/ml sur des souches de S. aureus résistantes à la méthicilline sont actifs. Par comparaison, EMF et EMG sont encore plus actifs que ces extraits.

Effets des extraits sur les microorganismes

Les extraits d’A. masikororum étaient actifs à la fois sur les souches Gram (+) et Gram (-), ce qui permet de les classer parmi les agents antimicrobiens à large spectre. Généralement, les souches Gram (+) sont plus sensibles que les Gram (-) : ceci serait probablement lié à la différence de structure de leur paroi cellulaire, celle des Gram (-) serait moins perméable aux extraits d’A. masikororum.

Diverses familles chimiques sont impliquées dans l’activité antimicrobienne des Albizia : des alcaloïdes chez A. schimperiana (SAMOYLENKO et coll., 2009), des protéines chez A. lebbeck (LAM et NG, 2011), des flavonoïdes chez A. adianthifolia (TAMOKOU et coll., 2012). Chez A. adianthifolia, des composés non polaires extraits à l’hexane et au chloroforme du duramen (partie centrale des troncs d’arbre) ont manifesté une excellente activité antimicrobienne (ABUBAKAR et MAJINDA, 2016). Au contraire, chez A. masikororum, l’activité antimicrobienne était due à des produits polaires extraits avec le méthanol.

Comme dans le cas des graines d’A. lebbeck (SIROHI et coll., 2014), les fractions contenant les saponosides sont plus actives que l’extrait brut (EMG). Ceci appuie l’hypothèse selon laquelle les saponosides seraient les supports de l’activité antibactérienne dans cet organe. Ces composés sont en effet bien connus pour leur potentiel antimicrobien (AVATO et coll., 2006 ; LUNGA et coll., 2014 ; AYAZ et coll.., 2016).

En conclusion, A. masikororum contient dans ses feuilles des composés phénoliques et dans ses graines des saponosides doués d’une activité antimicrobienne. L’étendue de leur spectre d’activité et leur niveau d’efficatité pourraient faire de cette plante un bon candidat pour la recherche d’alternatives aux antibiotiques de synthèse.

CHAPITRE VI :

DISCUSSION ET CONCLUSION

GENERALES, PERSPECTIVES

Discussion et conclusions générales, perspectives

Rappelons que les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont surtout porté sur les graines d’A. masikororum et un peu moins sur les feuilles. Le choix de ces organes a été notamment dicté par les résultats des tests préliminaires qui ont révélé l’importance de la toxicité de leurs extraits par rapport à celle des extraits des autres organes testés, qui est faible ou inexistante.

En plus des commentaires spécifiques déjà fournis dans chacun des chapitres précédents, nous apportons ci-après des observations sur les travaux effectués et les résultats obtenus dans leur ensemble.

Nos travaux ont permis de 1) mettre en évidence la toxicité des extraits testés sur des modèles animaux, végétaux et microbiens 2) apporter des informations sur son intensité, ses différentes manifestations, ses mécanismes d’action possibles et des paramètres qui l’influencent et 3) identifier les principaux métabolites secondaires qui en sont responsables.

Les saponosides ont été considérés comme étant le support de la toxicité de la plante envers tous les organismes testés. En effet, leur présence en quantité importante dans les graines ainsi que la nature des effets qu’ils provoquent chez les organismes sensibles semblent le confirmer. Or, comme il a été déjà souligné dans le chapitre « Synthèse bibliographique », ces composés constituent dans un organe de plante où ils sont présents un mélange complexe de molécules dotées de multiples et diverses propriétés pharmacologiques. Notons que les procédés d’isolement et de purification mis au point dans ce travail ont abouti à des extraits purifiés de saponosides et non pas à des produits purs. Aussi, les résultats obtenus ne permettent pas encore de statuer :

 sur le nombre de saponosides différents que contiennent les graines ;  sur le nombre de saponosides toxiques ;  si les mêmes molécules ou des molécules différentes de saponosides sont responsables des effets sur les différents organismes sensibles ;  sur l’originalité des saponosides d’A. masikororum ;  sur les mécanismes d’action exacts des molécules actives chez les différents organismes sensibles.

En ce qui concerne les composés phénoliques présents dans les feuilles de la plante et qui sont à l’origine d’une activité antibactérienne intéressante, les tests ont été réalisés uniquement avec des extraits bruts. En conséquence, il faudra également attendre les résultats

Discussion et conclusions générales, perspectives

d’une étude chimique et toxicologique plus approfondie pour pouvoir répondre aux mêmes questions soulevées sur les saponosides.

Les données sur les effets toxiques ont démontré leur efficacité sur divers organismes nuisibles et donnent un aperçu sur leurs potentialités en tant qu’alternatives aux pesticides de synthèse. Cependant, étant donné le niveau élevé de leur toxicité et l’étendue de leur spectre d’activité, il faudra approfondir les études toxicologiques pour éviter ou au moins limiter les impacts indésirables sur la santé, les organismes non-cibles et l’environnement.

En conclusion,

Dans l’ensemble, les objectifs visés dans notre étude ont été atteints :

o la toxicité de la plante a été bien établie et caractérisée ; o la nature chimique des substances actives est connue ; o des données pertinentes sur les possibilités d’utilisation de la plante dans le contrôle des organismes nuisibles sont disponibles.

Sur un plan plus général, les résultats obtenus constituent les premières données relatives à la chimie et aux propriétés biologiques d’A. masikororum et bien qu’encore incomplets, ils enrichissent les connaissances sur 1) les Albizia malgaches et partant sur le genre Albizia en général et les plantes toxiques malgaches et 2) les potentialités de valorisation de la flore de Madagascar.

PERSPECTIVES

Afin d’approfondir et de compléter les résultats obtenus nous envisageons :

 d’isoler et de déterminer la structure des molécules responsables des activités biologiques de la plante ;  de tester les molécules isolées pour voir si les différents effets biologiques sont dus aux mêmes molécules ou à des molécules différentes qui agissent en synergie ;  de déterminer les mécanismes d’action des composés actifs ;  d’étendre les investigations à d’autres organismes animaux, végétaux et microbiens ;  de prospecter d’autres propriétés biologiques, surtout celles que possèdent d’autres espèces d’Albizia notamment celles qui sont en relation avec les saponosides ;

Discussion et conclusions générales, perspectives

 de discuter des premiers résultats obtenus avec les professionnels des secteurs concernés (agriculture, santé etc.), les populations et les agents de proximité (ONG, projets etc.) et d’identifier avec eux les activités qui pourraient être entreprises sur le terrain et d’étudier les conditions optimales pour les réaliser.

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annexes

Annexes

ANNEXE I Liste des publications  Articles

1. Razafindrakoto A. R., Razafintsalama V. E., Randriamampianina L. J., Randrianarivo H. R., Rakoto D. A. D., Jeannoda V. L. Potential antimicrobial activity of Albizia masikororum extracts (en soumission) 2. Randrianarivo H. R., Razafindrakoto A. R., Ratsimanohatra H. C., Randriamampianina L. J., Rajemiarimoelisoa C. F., Ramamonjisoa L., Ramanitrahasimbola D., Rakoto D. A. D., Jeannoda V. L. Toxic effects of seed methanolic extracts of endemic Albizia species (Fabaceae) from Madagascar on animals. Journal of Life Sciences, 2014 ; 8 (8) : 676-689 3. Randrianarivo H. R., Ratsimanohatra H. C., Razafindrakoto A. R., Rajemiarimoelisoa C. F., Randriamampianina L. J., Ramamonjisoa L., Rakoto D. A. D., Jeannoda V. L., Phytotoxic property of seed methanolic extracts from Albizia (Fabaceae) endemic species of Madagascar. Journal of Plant Sciences, 2014 ; 2(6) : 256-265

 Communications orales

1. Phytochemical and toxicological characterizations of Albizia masikororum, an endemic Fabaceae from Madagascar. Doctoriales 2016, Université de Toliara 2. Chemical and biological study of a Malagasy toxic plant, coded RAMS. NAPRECA 15th Summer School, 2012, IMRA, Antananarivo

 Poster

Potentialités d’Albizia masikororum (Fabaceae) pour la protection des cultures. Doctoriales 2016, Université de Toliara

ANNEXE II Composition des réactifs généraux pour les alcaloïdes Réactif de MAYER - Chlorure de mercure…… ……………………………………………………1,36 g - Iodure de potassium……………………………………………………………….5 g - Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml Réactif de WAGNER - Iodure de potassium………………………………………………………………2 g - Iode……………………………………………………………………………..1,27 g - Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml Réactif de DRAGENDORFF Il s’agit d’un mélange (v/v) de deux solutions, A et B.

Annexes

Solution A : - Nitrate de bismuth………………………………………………………………1,7 g - Acide tartrique concentré………………………………………………………...20 g - Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml Solution B : - Iodure de potassium………………………………………………………………10 g - Eau distillée qsp………………………………………………………………...40 ml

Le mélange est ensuite additionné de 10 g d’acide tartrique et son volume est ramené à 100 ml par de l’eau distillée.

ANNEXE III Composition du milieu de Krebs (en mole/l) - NaCl…………………………………………………………………………………1,17. 10-1 -2 - NaHCO3……………………………………………………………………………..2,48. 10 - KCl…………………………………………………………………….……………...4,6. 10-3 -3 - CaCl2…………………………………………………………………………..………1,9. 10 - MgSO4………………………………………………………………………….…...5,68. 10-4 -3 - KH2PO4……………………………………………………………………………..1,02. 10 - D-glucose……………………………………………………………………………1,11. 10-2 Cette solution de pH = 7,2 est aérée avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2.

ANNEXE IV A- Composition du milieu de MUELLER-HINTON Formule-type (g/l) - Extrait de viande...... 3 - Peptone...... 5 - Peptone trypsique de caséine...... 10 - Chlorune de sodium...... 5 - Glucose...... 2 - Agar...... 10 - Eau distillée...... q.s.q.1000 ml pH : 7,3 ± 0,1 à 25°C

B- Préparation à partir du milieu déshydraté (agar) - Dissoudre 36 g de milieu déshydraté dans de l’eau distillée. - Agiter lentement jusqu’à dissolution complète puis ajuster à 1 litre. - Chauffer le milieu sur une plaque chauffante toujours en remuant avec un agitateur magnétique. - Répartir en tubes ou en flacons. - Stériliser à l’autoclave à 121°C à 2 bars pendant 15 minutes.

Annexes

ANNEXE V Composition du réactif de Kedde Acide 3,5-dinitrobenzoique…………………………………………………………………1 g Ethanol (96°), qsp………………………………………………………………………100 ml

ANNEXE VI Composition du réactif à la vanilline sulfurique Vanilline………………………………………………………………………….…………..1 g H2SO4…………………………………………………………………………………….…2 ml Ethanol (96°), qsp………………………………………...…………………...…………100 ml

Name: RAZAFINDRAKOTO First name: Anjarasoa Ravo Title: Chemical and biological study of the extracts of Albizia masikororum, an endemic Fabaceae from Madagascar SUMMARY

The present work aimed at determining and characterizing the toxicity of Albizia masikororum, an endemic Fabaceae of Madagascar and assessing the potential uses of this plant in pest control. Methanolic extracts of leaves, fruits, seeds, stem barks and seed purified extracts were used for biological investigations. The phytochemical screening of the different organ powder revealed the presence of saponins, cardenolides, triterpenes and tannins in seeds, tannins, flavonoids and leucoanthocyanins and triterpenes in other organs. These same chemical families were all detected in the methanol extracts except for tannins. In mice, seed methanolic extract (SME) had an LD50 (24 h) between 16.50 and 17.47 mg/kg via intraperitoneal route. It caused respiratory, cardiovascular and nervous disorders. It caused tissue damages to liver, lungs, and kidneys. The main anomalies are edema, vasodilatation, haemorrhagic tissue and the presence of inflammatory infiltrates of neutrophilic polynuclear cells. Lungs, kidneys and liver were the most affected. In the heart, it induced a positive inotropic effect on guinea pig atria from 5 μg/ml. However, the renal and hepatic functions of the mice tested were not significantly affected. SME, which is rich in saponins, caused the lysis of sheep red blood cells with an HD50 of 11.52 μg/ml. It was also toxic to cold-blooded animals. It showed high toxicity in Cyprinus carpio fry (LC50 = 4.15 μg/ml) and tadpoles of Ptychadena mascarienensis (LC50 = 4.54 μg/ml). However, it had no effect on adult fleas (Xenopsylla cheopis). SME inhibited the seed germination of vegetable and invasive plants and slowed the seedling growth of bean, pea and corn and rice. Its high toxicity on the germination of seeds of undesirable plants makes it possible to consider its use as a potential alternative to synthetic herbicides. The leaf and seed extracts were very active against some pathogenic microorganisms (Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus). The main antimicrobial agents were flavonoids and leucoanthocyanins in leaf extract and saponins in seed extract. In conclusion, the results obtained highlighted the potential for using Albizia masikororum seed extract to control noxious animals, plants and microorganisms.

Key words: Albizia masikororum, seeds, methanol extract, toxicity, pests, saponins, phytotoxic activities, antimicrobial activities.

Supervisor: Professor Victor JEANNODA

Nom : RAZAFINDRAKOTO Prénoms : Anjarasoa Ravo Titre : Etudes chimique et biologique des extraits d’Albizia masikororum, une Fabacée endémique de Madagascar

RESUME

Le présent travail avait notamment pour objectifs d’évaluer les potentialités d’utilisation d’Albizia masikororum dans la lutte contre les organismes nuisibles de déterminer et de caractériser la toxicité de la plante. Des extraits méthanoliques de feuilles, de cosses de fruits, de graines et d’écorces de tige ainsi que des extraits purifiés de graines ont servi pour les investigations biologiques. Le criblage phytochimique réalisé sur la poudre des différents organes a révélé la présence de saponosides, de cardénolides, destriterpènes et de tanins dans les graines et de tanins, des flavonoïdes, des leucoanthocyanes et des triterpènes dans les autres organes. A l’exception des tanins, ces mêmes familles chimiques ont toutes été détectées dans les extraits méthanoliques. Chez la souris, l’extrait méthanolique de graines (EMG) avait une DL50 (24 h) comprise entre 16,50 et 17,47 mg/kg par voie ip. Il a entrainé notamment des troubles respiratoires, cardiovasculaires et nerveux. Il a provoqué des lésions tissulaires dont l’œdème, les vasodilatations, les nappes hémorragiques et la présence d’infiltrats inflammatoires formés de polynucléaire neutrophile sont les principales anomalies constatées. Les poumons, les reins et le foie sont les plus touchés. Les fonctions rénale et hépatique des souris testées ne sont pas significativement affectées. Par contre, EMG provoque un effet inotrope positif sur les oreillettes isolées de cobaye à partir de 5 μg/ml. EMG, riche en saponosides, provoque la lyse des hématies de moutons avec une DH50 de 11,52 µg/ml. EMG était également toxique pour les animaux à sang froid. Il a montré une forte toxicité chez les alevins de Cyprinus carpio (CL50 = 4,15 μg/ml) et les têtards de grenouille Ptychadena mascarienensis (CL50 = 4,54 μg/ml). Par contre, il n’a eu aucun effet sur la puce adulte (Xenopsylla cheopis). EMG a inhibé la germination de graines de plantes potagères et envahissantes et ralentit la croissance des jeunes plantules de haricot, de petit pois et de maïs et de riz. Sa toxicité élevée sur la germination des graines de plantes indésirables permet d’envisager son utilisation comme une alternative potentielle aux herbicides de synthèse. Les extraits des feuilles et des graines ont été très actifs contre des microorganismes pathogènes pour l’homme (Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus). Cette activité antimicrobienne est principalement due aux flavonoïdes et aux leucoanthocyanes pour les feuilles et aux saponosides pour les graines. En conclusion, les résultats obtenus ont bien établi et caractérisé la toxicité des extraits d’Albizia masikororum sur divers modèles biologiques et mis en évidence les possibilités d’utilisation des extraits de graines pour contrôler les animaux, les végétaux et les microorganismes nuisibles. Mots clés : Albizia masikororum, graines, extrait méthanolique, toxicité, organismes nuisibles, saponosides, activités phytotoxiques, activités antimicrobiennes.

Directeur de thèse : Professeur Victor JEANNODA