UNIVERSITE DE ROUEN FACULTE MIXTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE

Année 2018 N°

THESE POUR LE DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE

Mémoire valant lieu de thèse pour l’obtention du titre de docteur en médecine et du diplôme d’études spécialisées en biologie médicale

Présentée et soutenue publiquement le 21 juin 2018

Par

BLONDEL Gaëtan Né le 19 octobre 1990 à Mont Saint Aignan

Etude des principaux paramètres de la phase préanalytique pouvant affecter la qualité du résultat de prélèvements urinaires, respiratoires, de selles et de liquides de ponction

Présidente du jury : Madame le Professeur Soumeya BEKRI

Directrice de thèse : Madame le Docteur Sophie BOYER Membres du jury : Madame le Professeur Martine PESTEL-CARON Monsieur le Docteur Gérard BUCHONNET Monsieur le Docteur François GUERIN

Par délibération en date du 3 mars 1967, la faculté a arrêté que les opinions émises dans les dissertations qui lui sont présentées doivent être considérées comme propres à leurs auteurs et qu’elle n’entend leur donner aucune approbation ou désapprobation. ANNEE UNIVERSITAIRE 2017 - 2018 U.F.R. DE MEDECINE ET DE-PHARMACIE DE ROUEN ------

DOYEN : Professeur Pierre FREGER

ASSESSEURS : Professeur Michel GUERBET Professeur Benoit VEBER Professeur Pascal JOLY Professeur Stéphane MARRET

I - MEDECINE

PROFESSEURS DES UNIVERSITES – PRATICIENS HOSPITALIERS

Mr Frédéric ANSELME HCN Cardiologie Mme Gisèle APTER Havre Pédopsychiatrie Mme Isabelle AUQUIT AUCKBUR HCN Chirurgie plastique Mr Fabrice BAUER HCN Cardiologie Mme Soumeya BEKRI HCN Biochimie et biologie moléculaire Mr Ygal BENHAMOU HCN Médecine interne Mr Jacques BENICHOU HCN Bio statistiques et informatique médicale Mr Olivier BOYER UFR Immunologie Mme Sophie CANDON HCN Immunologie Mr François CARON HCN Maladies infectieuses et tropicales Mr Philippe CHASSAGNE (détachement) HCN Médecine interne (gériatrie) – Détachement Mr Vincent COMPERE HCN Anesthésiologie et réanimation chirurgicale Mr Jean-Nicolas CORNU HCN Urologie Mr Antoine CUVELIER HB Pneumologie Mr Pierre CZERNICHOW (surnombre) HCH Epidémiologie, économie de la santé Mr Jean-Nicolas DACHER HCN Radiologie et imagerie médicale Mr Stéfan DARMONI HCN Informatique médicale et techniques de communication Mr Pierre DECHELOTTE HCN Nutrition Mr Stéphane DERREY HCN Neurochirurgie Mr Frédéric DI FIORE CB Cancérologie

Mr Fabien DOGUET HCN Chirurgie Cardio Vasculaire Mr Jean DOUCET SJ Thérapeutique - Médecine interne et gériatrie Mr Bernard DUBRAY CB Radiothérapie Mr Philippe DUCROTTE HCN Hépato-gastro-entérologie Mr Frank DUJARDIN HCN Chirurgie orthopédique - Traumatologique Mr Fabrice DUPARC HCN Anatomie - Chirurgie orthopédique et traumatologique Mr Eric DURAND HCN Cardiologie Mr Bertrand DUREUIL HCN Anesthésiologie et réanimation chirurgicale Mme Hélène ELTCHANINOFF HCN Cardiologie Mr Manuel ETIENNE HCN Maladies infectieuses et tropicales Mr Thierry FREBOURG UFR Génétique Mr Pierre FREGER HCN Anatomie - Neurochirurgie Mr Jean François GEHANNO HCN Médecine et santé au travail Mr Emmanuel GERARDIN HCN Imagerie médicale Mme Priscille GERARDIN HCN Pédopsychiatrie M. Guillaume GOURCEROL HCN Physiologie Mr Dominique GUERROT HCN Néphrologie Mr Olivier GUILLIN HCN Psychiatrie Adultes Mr Didier HANNEQUIN HCN Neurologie Mr Fabrice JARDIN CB Hématologie Mr Luc-Marie JOLY HCN Médecine d’urgence Mr Pascal JOLY HCN Dermato – Vénéréologie Mme Bouchra LAMIA Havre Pneumologie Mme Annie LAQUERRIERE HCN Anatomie et cytologie pathologiques Mr Vincent LAUDENBACH HCN Anesthésie et réanimation chirurgicale Mr Joël LECHEVALLIER HCN Chirurgie infantile Mr Hervé LEFEBVRE HB Endocrinologie et maladies métaboliques Mr Thierry LEQUERRE HB Rhumatologie Mme Anne-Marie LEROI HCN Physiologie Mr Hervé LEVESQUE HB Médecine interne Mme Agnès LIARD-ZMUDA HCN Chirurgie Infantile Mr Pierre Yves LITZLER HCN Chirurgie cardiaque Mr Bertrand MACE HCN Histologie, embryologie, cytogénétique M. David MALTETE HCN Neurologie Mr Christophe MARGUET HCN Pédiatrie Mme Isabelle MARIE HB Médecine interne Mr Jean-Paul MARIE HCN Oto-rhino-laryngologie Mr Loïc MARPEAU HCN Gynécologie - Obstétrique

Mr Stéphane MARRET HCN Pédiatrie Mme Véronique MERLE HCN Epidémiologie Mr Pierre MICHEL HCN Hépato-gastro-entérologie M. Benoit MISSET HCN Réanimation Médicale Mr Jean-François MUIR (surnombre) HB Pneumologie Mr Marc MURAINE HCN Ophtalmologie Mr Philippe MUSETTE HCN Dermatologie - Vénéréologie Mr Christophe PEILLON HCN Chirurgie générale Mr Christian PFISTER HCN Urologie Mr Jean-Christophe PLANTIER HCN Bactériologie - Virologie Mr Didier PLISSONNIER HCN Chirurgie vasculaire Mr Gaëtan PREVOST HCN Endocrinologie Mr Jean-Christophe RICHARD (détachement) HCN Réanimation médicale - Médecine d’urgence Mr Vincent RICHARD UFR Pharmacologie Mme Nathalie RIVES HCN Biologie du développement et de la reproduction Mr Horace ROMAN HCN Gynécologie - Obstétrique Mr Jean-Christophe SABOURIN HCN Anatomie - Pathologie Mr Guillaume SAVOYE HCN Hépato-gastrologie Mme Céline SAVOYE–COLLET HCN Imagerie médicale Mme Pascale SCHNEIDER HCN Pédiatrie Mr Michel SCOTTE HCN Chirurgie digestive Mme Fabienne TAMION HCN Thérapeutique Mr Luc THIBERVILLE HCN Pneumologie Mr Christian THUILLEZ (surnombre) HB Pharmacologie Mr Hervé TILLY CB Hématologie et transfusion M. Gilles TOURNEL HCN Médecine Légale Mr Olivier TROST HCN Chirurgie Maxillo-Faciale Mr Jean-Jacques TUECH HCN Chirurgie digestive Mr Jean-Pierre VANNIER (surnombre) HCN Pédiatrie génétique Mr Benoît VEBER HCN Anesthésiologie - Réanimation chirurgicale Mr Pierre VERA CB Biophysique et traitement de l’image Mr Eric VERIN HB Service Santé Réadaptation Mr Eric VERSPYCK HCN Gynécologie obstétrique Mr Olivier VITTECOQ HB Rhumatologie Mme Marie-Laure WELTER HCN Physiologie

MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES – PRATICIENS HOSPITALIERS

Mme Noëlle BARBIER-FREBOURG HCN Bactériologie – Virologie Mme Carole BRASSE LAGNEL HCN Biochimie Mme Valérie BRIDOUX HUYBRECHTS HCN Chirurgie Vasculaire Mr Gérard BUCHONNET HCN Hématologie Mme Mireille CASTANET HCN Pédiatrie Mme Nathalie CHASTAN HCN Neurophysiologie Mme Sophie CLAEYSSENS HCN Biochimie et biologie moléculaire Mr Moïse COEFFIER HCN Nutrition Mr Serge JACQUOT UFR Immunologie Mr Joël LADNER HCN Epidémiologie, économie de la santé Mr Jean-Baptiste LATOUCHE UFR Biologie cellulaire Mr Thomas MOUREZ HCN Virologie Mr Gaël NICOLAS HCN Génétique Mme Muriel QUILLARD HCN Biochimie et biologie moléculaire Mme Laëtitia ROLLIN HCN Médecine du Travail Mr Mathieu SALAUN HCN Pneumologie Mme Pascale SAUGIER-VEBER HCN Génétique Mme Anne-Claire TOBENAS-DUJARDIN HCN Anatomie Mr David WALLON HCN Neurologie

PROFESSEUR AGREGE OU CERTIFIE Mr Thierry WABLE UFR Communication Mme Mélanie AUVRAY-HAMEL UFR Anglais

II - PHARMACIE

PROFESSEURS

Mr Thierry BESSON Chimie Thérapeutique Mr Roland CAPRON (PU-PH) Biophysique Mr Jean COSTENTIN (Professeur émérite) Pharmacologie Mme Isabelle DUBUS Biochimie Mr Loïc FAVENNEC (PU-PH) Parasitologie Mr Jean Pierre GOULLE (Professeur émérite) Toxicologie Mr Michel GUERBET Toxicologie Mme Isabelle LEROUX - NICOLLET Physiologie Mme Christelle MONTEIL Toxicologie Mme Martine PESTEL-CARON (PU-PH) Microbiologie Mr Rémi VARIN (PU-PH) Pharmacie clinique Mr Jean-Marie VAUGEOIS Pharmacologie Mr Philippe VERITE Chimie analytique

MAITRES DE CONFERENCES

Mme Cécile BARBOT Chimie Générale et Minérale Mr Jérémy BELLIEN (MCU-PH) Pharmacologie Mr Frédéric BOUNOURE Pharmacie Galénique Mr Abdeslam CHAGRAOUI Physiologie Mme Camille CHARBONNIER (LE CLEZIO) Statistiques Mme Elizabeth CHOSSON Botanique Mme Marie Catherine CONCE-CHEMTOB Législation pharmaceutique et économie de la santé Mme Cécile CORBIERE Biochimie Mr Eric DITTMAR Biophysique Mme Nathalie DOURMAP Pharmacologie Mme Isabelle DUBUC Pharmacologie Mme Dominique DUTERTE- BOUCHER Pharmacologie Mr Abdelhakim ELOMRI Pharmacognosie Mr François ESTOUR Chimie Organique Mr Gilles GARGALA (MCU-PH) Parasitologie Mme Nejla EL GHARBI-HAMZA Chimie analytique

Mme Marie-Laure GROULT Botanique Mr Hervé HUE Biophysique et mathématiques Mme Laetitia LE GOFF Parasitologie – Immunologie Mme Hong LU Biologie M. Jérémie MARTINET (MCU-PH) Immunologie Mme Marine MALLETER Toxicologie Mme Sabine MENAGER Chimie organique Mme Tiphaine ROGEZ-FLORENT Chimie analytique Mr Mohamed SKIBA Pharmacie galénique Mme Malika SKIBA Pharmacie galénique Mme Christine THARASSE Chimie thérapeutique Mr Frédéric ZIEGLER Biochimie

PROFESSEURS ASSOCIES Mme Cécile GUERARD-DETUNCQ Pharmacie officinale Mr Jean-François HOUIVET Pharmacie officinale

PROFESSEUR CERTIFIE Mme Mathilde GUERIN Anglais

ATTACHES TEMPORAIRES D’ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE Mme Anne-Sophie CHAMPY Pharmacognosie M. Jonathan HEDOUIN Chimie Organique Mme Barbara LAMY-PELLETER Pharmacie Galénique

LISTE DES RESPONSABLES DES DISCIPLINES PHARMACEUTIQUES

Mme Cécile BARBOT Chimie Générale et minérale Mr Thierry BESSON Chimie thérapeutique Mr Roland CAPRON Biophysique Mme Marie-Catherine CONCE-CHEMTOB Législation et économie de la santé Mme Elisabeth CHOSSON Botanique Mme Isabelle DUBUS Biochimie Mr Abdelhakim ELOMRI Pharmacognosie Mr Loïc FAVENNEC Parasitologie Mr Michel GUERBET Toxicologie Mr François ESTOUR Chimie organique Mme Isabelle LEROUX-NICOLLET Physiologie Mme Martine PESTEL-CARON Microbiologie Mr Mohamed SKIBA Pharmacie galénique Mr Rémi VARIN Pharmacie clinique Mr Philippe VERITE Chimie analytique

III – MEDECINE GENERALE

PROFESSEUR

Mr Jean-Loup HERMIL (PU-MG) UFR Médecine générale

MAITRE DE CONFERENCE Mr Matthieu SCHUERS (MCU-MG) UFR Médecine générale

PROFESSEURS ASSOCIES A MI-TEMPS – MEDECINS GENERALISTE

Mr Emmanuel LEFEBVRE UFR Médecine Générale Mme Elisabeth MAUVIARD UFR Médecine générale Mr Philippe NGUYEN THANH UFR Médecine générale

Mme Marie Thérèse THUEUX UFR Médecine générale

MAITRE DE CONFERENCES ASSOCIE A MI-TEMPS – MEDECINS GENERALISTES

Mr Pascal BOULET UFR Médecine générale Mr Emmanuel HAZARD UFR Médecine Générale Mme Marianne LAINE UFR Médecine Générale Mme Lucile PELLERIN UFR Médecine générale Mme Yveline SEVRIN UFR Médecine générale

ENSEIGNANTS MONO-APPARTENANTS

PROFESSEURS

Mr Serguei FETISSOV (med) Physiologie (ADEN) Mr Paul MULDER (phar) Sciences du Médicament Mme Su RUAN (med) Génie Informatique

MAITRES DE CONFERENCES

Mr Sahil ADRIOUCH (med) Biochimie et biologie moléculaire (Unité Inserm 905) Mme Gaëlle BOUGEARD-DENOYELLE (med) Biochimie et biologie moléculaire (UMR 1079) Mme Carine CLEREN (med) Neurosciences (Néovasc) M. Sylvain FRAINEAU (med) Physiologie (Inserm U 1096) Mme Pascaline GAILDRAT (med) Génétique moléculaire humaine (UMR 1079) Mr Nicolas GUEROUT (med) Chirurgie Expérimentale

Mme Rachel LETELLIER (med) Physiologie Mme Christine RONDANINO (med) Physiologie de la reproduction Mr Antoine OUVRARD-PASCAUD (med) Physiologie (Unité Inserm 1076) Mr Frédéric PASQUET Sciences du langage, orthophonie Mme Isabelle TOURNIER (med) Biochimie (UMR 1079)

CHEF DES SERVICES ADMINISTRATIFS : Mme Véronique DELAFONTAINE

HCN - Hôpital Charles Nicolle HB - Hôpital de BOIS GUILLAUME

CB - Centre Henri Becquerel CHS - Centre Hospitalier Spécialisé du Rouvray

CRMPR - Centre Régional de Médecine Physique et de Réadaptation SJ – Saint Julien Rouen

REMERCIEMENTS

Madame le Professeur Soumeya Bekri, je vous remercie de me faire l’honneur de présider cette thèse. Je vous suis également reconnaissant pour vos enseignements de maladies métaboliques et pour la coordination du DES de biologie médicale. Je vous prie de trouver ici l’expression de ma profonde reconnaissance.

Madame le Professeur Martine Pestel-Caron, je vous remercie de faire partie du jury de cette thèse. Merci pour vos enseignements, votre bienveillance et votre confiance. Veuillez trouver ici l’expression de mon profond respect.

Madame le Docteur Sophie Boyer, je vous remercie d’avoir encadré ce travail, du choix du sujet à la relecture. Merci pour vos conseils avisés, vos enseignements et le partage de votre savoir. Veuillez trouver ici l’expression de ma gratitude la plus sincère.

Monsieur le Docteur Gérard Buchonnet, je vous remercie d’avoir accepté de faire partie du jury de cette thèse. Merci de m’accueillir de nouveau en hématologie. Veuillez trouver ici l’expression de mon profond respect.

Monsieur le Docteur François Guerin, je vous remercie d’avoir accepté de faire partie du jury de cette thèse. Merci pour votre disponibilité et votre expertise de la qualité. Veuillez trouver ici l’expression de ma respectueuse considération.

1 A Mesdames les Docteurs Frébourg et Skalli et Monsieur le Docteur Lemée, merci pour le partage de votre expérience et pour vos enseignements dispensés au cours de ces mois en bactériologie. Merci a Sandrine et Anaïs pour votre disponibilité et votre bonne humeur. Je vous souhaite le meilleur pour la suite.

Au personnel de l’IBC, merci pour toutes ces années d’internat. Merci en particulier aux techniciens de bactériologie pour ces trois semestres. Merci notamment à Patricia pour son aide dans ce travail.

Aux biologistes et techniciens du laboratoire de Dieppe, merci pour le semestre passé chez vous, riche en enseignements ; merci également à tous les autres biologistes que j’ai pu rencontrer au cours de l’internat.

Merci à Ana, Cédric, Céline, Elise, Justine, Valentin pour ces soirées microbiologie avec Ismaël, merci à Guillaume l’ancien externe, à Wassim, aux Marion, à Abdulaziz. Merci à mes co-internes de promotion : Aurélie et Aurélie, Ferdi, Mustapha.

Merci aux jeunes chefs d’hématologie pour leur présence : Elsa, Paul, Victor. Merci aussi à Stéphanie et Benoît.

Merci à mes co-internes du dernier semestre de bactériologie pour votre compréhension et coopération au cours de ces mois d’analyses. C’était plutôt pratique. Merci à DJ Fiston, Pierre DLVG et Tangal « spirochète » pour l’identité audiovisuelle de ce semestre et les rendez vous « team Café » intemporels. Merci à François et Pauline pour leur exemplarité et avant-gardisme dans le bon usage du SHA. Merci également à Albane, à Isabelle, à Louis. Merci à Nicolas, pour ces innombrables semestres d’externat passés ensemble, merci aux autres cliniciens hématologues ou infectiologues rencontrés à l’IBC (Juliette, Mathilde, Pierre). Merci à mes co- internes de DUCAI (Aurélie, Céline, Marion) et à tous nos jeunes internes : Anaïs, Charles, Ella, Emilie, Louise, Maria, Thomas, Tania, Louise, Vincent...

Merci à ma belle famille pour votre accueil et votre hospitalité, merci à mes parents pour votre présence, votre confiance et votre soutien sans faille depuis toutes ces années, merci à mes frères Quentin et Thibaud, à mes sœurs Aurélie et Clarence, merci à Hava et Nicolas. Merci à ma tendre épouse Melissa pour m’épauler au quotidien. Merci pour ta personnalité exceptionnelle. Chaque jour en ta compagnie est un bonheur.

2 SOMMAIRE

Introduction 7 1 Les coprocultures 8 2 Les prélèvements respiratoires 9 2.1 Prélèvements respiratoires non protégés 10 2.2 Prélèvements respiratoires protégés 11 3 Principaux pathogènes étudiés au sein des prélèvements 12 3.1 Pathogènes entériques 12 3.2 Pathogènes respiratoires 16 4 Conditions préanalytiques et numérations d’éléments 18 4.1 Numérations des éléments urinaires 18 4.2 Numérations des liquides de ponctions 18 4.3 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux 19 5 Objectifs de l’étude 20

Matériel et méthodes 21 1 Matériel 21 1.1 Selles 21 1.2 Prélèvements respiratoires 21 1.3 Urines sur tube boraté 22 1.4 Liquides de ponctions sur tube EDTA K2 22 2 Méthodes 22 2.1 Impact des délais sur les cultures de selles 22 2.2 Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires 23 2.3 Impact des délais sur les numérations d’éléments 25 2.4 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux 25 3 Analyses statistiques 26

Résultats 27 1 Impact des délais avant ensemencement sur les cultures de selles 27 2 Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires 29 2.1 Prélèvements respiratoires non protégés 33 2.2 Prélèvements respiratoires protégés 36 3 Impact des délais de recompte sur les numérations des éléments urinaires 37 3.1 Leucocytes 37 3.2 Hématies 41 4 Impact des délais de recompte sur les numérations de liquides de ponctions 43 4.1 Leucocytes 44 4.2 Hématies 45 5 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux 45

Discussion 48

Conclusion 55

Bibliographie 56

3 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Légende des boites à moustaches. 26 Figure 2 : Répartition des différents pathogènes entériques dans les échantillons de selles étudiés (n = 87). 27 Figure 3 : Délais d’acheminement et de réensemencement des selles étudiées. 28 Figure 4 : Courbes de survie des souches étudiées lors des repiquages après différents délais de conservation (n = 87). 28 Figure 5 : Comparaison des délais d’acheminement et des délais avant réensemencement des germes issus des prélèvements respiratoires étudiés (n = 459). 30 Figure 6 : Stabilité des numérations bactériennes lors des réensemencement des prélèvements respiratoires étudiés (n = 459). 32 Figure 7 : Survie bactérienne après réensemencement des prélèvements respiratoires étudiés (n = 459). 33 Figure 8 : Impact des délais avant réensemencement sur la positivité des cultures des prélèvements respiratoires non protégés (n = 297). 35 Figure 9 : Variations de dilution (en Log10 UFC/mL) des numérations de germes par rapport aux numérations initiales des prélèvements protégés pour différents délais de réensemencement (n = 162). 36 Figure 10 : Impact du temps sur la détection des germes des prélèvements respiratoires protégés pour un seuil de détection de 102 UFC/mL (variations exprimées en Log10 UFC/mL, n = 162). 37 Figure 11 : Comparaison des délais initiaux et des délais avant recompte des numérations leucocytaires des urines prélevées sur tubes boratés BD. 38 Figure 12 : Variation de numération leucocytaire observée lors des recomptes après différents délais de conservation sur tubes boratés BD pour des numérations initiales ≤ 50 /mm3. 39 Figure 13 : Variation de numération leucocytaire observée lors des recomptes après différents délais de conservation sur tubes boratés BD pour des numérations initiales ≤ 20 /mm3. 39 Figure 14 : Numérations leucocytaires obtenues après recompte en fonction de la numération initiale : intérêt d’une zone grise (« Grayzone ») entre 10 et 12 leucocytes/mm3. 40 Figure 15 : Comparaison des délais initiaux et des délais avant recompte des numérations érythrocytaires des urines prélevées sur tubes boratés BD (n = 108). 41 Figure 16 : Variation de numération érythrocytaire observée lors des recomptes après différents délais de conservation sur tubes boratés BD pour des numérations initiales ≤ 50 /mm3. 42 Figure 17 : Variation de numération érythrocytaire observée lors des recomptes après différents délais de conservation sur tubes boratés BD pour des numérations initiales ≤ 20 /mm3. 42 Figure 18 : Part de chaque type de liquide de ponction dans la population étudiée (n = 53). 43 Figure 19 : Comparaison des délais initiaux et des délais avant recompte des numérations des liquides de ponctions prélevés sur tubes BD EDTA K2. 43 Figure 20 : Variations (exprimées en rapport) entre les numérations initiales des leucocytes et les numérations recomptées après conservation sur tube BD EDTA K2 des liquides de ponctions en fonction des délais de recompte et des types de liquides. 44 Figure 21 : Variations (exprimées en rapport) entre les numérations initiales des hématies et les numérations recomptées après conservation sur tube BD EDTA K2 des liquides de ponctions en fonction des délais de recompte et des types de liquides. 45 Figure 22 : Etapes composant la prise en charge urgente des LCS : rappel des définitions et vue globale des délais. 46

4 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Critères de Bartlett, Murray et Washington. 10 Tableau 2 : Seuils de significativité des prélèvements respiratoires. 11 Tableau 3 : Interprétation des cultures des expectorations, aspirations bronchiques et aspirations pharyngées. 24 Tableau 4 : Interprétation des brosses et PBDP dilués au dixième. 24 Tableau 5 : Interprétation des brosses et PBDP dilués au centième. 24 Tableau 6 : Pathogènes, nombre et types de selles étudiées. 27 Tableau 7 : Nombre et type d’échantillons respiratoires étudiés en fonction du nombre d’espèces pathogènes isolées. 29 Tableau 8 : Répartition (nombre de souches) des différents germes retrouvés selon le type de prélèvement. 31 Tableau 9 : Variations de numération des germes des prélèvements respiratoires non protégés. 34 Tableau 10 : Significativité du seuil de 48 heures et 55 heures pour la détection et la numération des germes retrouvés dans les prélèvements respiratoires non protégés. 35 Tableau 11 : Effectif des recomptes de numérations leucocytaires d’urines boratées (sur tube BD) selon leur intervalle initial et le délai avant recompte. 38 Tableau 12 : Evolution des numérations leucocytaires des urines boratées (sur tube BD) comprises initialement entre 10 et 50 leucocytes/mm3, selon le délai avant recompte. 40 Tableau 13 : Effectif des recomptes de numérations érythrocytaires d’urines boratées (sur tube BD) selon leur intervalle initial et le délai avant recompte. 41 Tableau 14 : Médianes et 90e percentiles des délais de prise en charge des LCS. 46

5 ABBREVIATIONS

AET : aspiration endo-trachéale BPCO : bronchopneumopathie chronique obstructive CDC : center for disease control and prevention COFRAC : comité français d’accréditation ECBC : examen cytobactériologique des crachats ECBU : examen cyto-bactériologique des urines EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ISO : international organization for standardization LCS : liquide cérébro-spinal LBA : lavage broncho-alvéolaire MALDI-TOF : matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight NABM : nomenclature des actes de biologie médicale PAT : proportion de tests acceptables PBDP : prélèvement bronchique distal protégé PCR : polymerase chain reaction SFBC : société française de biologie clinique SFM : société française de microbiologie SHU : syndrome hémolytique et urémique SIDA : syndrome de l’immunodéficience acquise SIL : système informatique de laboratoire TAT : turnaround time TIAC : toxi-infection alimentaire collective UFC : unité formant colonie VIH : virus de l’immunodéficience humaine VNC : viable non cultivable

6 Introduction

La phase préanalytique, qui va du prélèvement de l’échantillon jusqu’à l’analyse de celui-ci est une étape cruciale en biologie médicale pour la qualité des résultats rendus. Avec l’accréditation des laboratoires et l’application de la norme ISO 15189, cette phase doit être maîtrisée au même titre que les autres pour éliminer des sources d’erreurs. Les erreurs constatées en biologie médicale (en quantité bien inférieures à celles d’autres types de spécialités) concernent particulièrement la phase préanalytique (31 à 75 % des erreurs). Cette phase peut comporter des étapes échappant au contrôle du laboratoire, mais reste néanmoins sous la responsabilité du biologiste.55 Avec la restructuration des laboratoires de biologie médicale, la diminution du nombre de plateaux techniques a augmenté la distance physique séparant le patient et son prélèvement du site d’analyse et, par conséquent, la durée de transport de l’échantillon.30 Ainsi, la gestion des conditions d’acheminement et de conservation des échantillons avant analyse doit être maîtrisée.26 Par ailleurs, certains prélèvements peuvent être reçus par des laboratoires en période de permanence de soins et n’être pris en charge qu’en jour ou horaire ouvré (par exemple : les coprocultures, les examens cyto-bactériologiques des crachats (ECBC) ou les examens cyto-bactériologiques des urines (ECBU)). Un délai excessif avant analyse peut donc avoir un impact sur les résultats qu’il est nécessaire d’évaluer. La microbiologie est un domaine qui devient plus complexe avec les nouvelles méthodes de génomique et protéomique. Les conditions préanalytiques sont cependant toujours critiques comme la qualité du recueil, les conditions de transport et de stockage ainsi que le délai avant analyse. Le dialogue clinico-biologique reste essentiel car les besoins du laboratoire (urgences biologiques) et du clinicien (urgences médicales) se doivent d’être communiqués afin d’assurer la bonne prise en charge du prélèvement et du patient.6 L’ouvrage de référence principal en microbiologie médicale est le Rémic,56 qui décrit en particulier les critères préanalytiques d’acceptation des échantillons biologiques ainsi que leur conservation. Définie comme la capacité d’un produit ou d’un service à satisfaire les besoins et attentes d’un client, l’analyse de la qualité s’applique aux aspects techniques (analytiques), préanalytiques mais également aux délais de rendu de résultats et de leur interprétation contextuelle (post- analytique). Les cliniciens désirent un service rapide, fiable et efficient à bas coût. Parmi ces caractéristiques, la vitesse est particulièrement importante36, notamment pour des prélèvements critiques tels les liquides cérébro-spinaux (LCS). Notre étude porte sur différents prélèvements et recherches de pathogènes spécifiques afin de définir les paramètres de la phase préanalytique susceptibles d’affecter le résultat final, notamment concernant les délais d’acheminement et les conditions de conservation des échantillons. Les examens concernés sont les cultures de selles, de prélèvements respiratoires protégés et non protégés, les numérations de liquides de ponctions et les numération d’urines.

7 1 Les coprocultures

La coproculture reste l’examen de référence pour le diagnostic étiologique des diarrhées infectieuses, deuxième cause de mortalité et de morbidité au niveau mondial. Le résultat d’une exploration bénéficie au patient mais aussi à la santé publique par l’impact collectif d’une coproculture positive.35, 37 Le diagnostic biologique en routine des gastroentérites bactériennes est réalisé par la culture de selles avant toute introduction d’antibiothérapie,21 (à l’exception de la recherche de Clostridium difficile).37 Ainsi, en 2015, plus de 500’000 examens microbiologiques de matières fécales (code 5207 de la NABM) ont été réalisés en France.10 Les infections gastro-intestinales peuvent avoir des présentations variées7 et il n’y a pas d’indication à des examens complémentaires si la diarrhée est non invasive ou en cas de gastro- entérite aiguë. En effet, majoritairement virale,56 toutes les diarrhées ne sont pas infectieuses, toutes les diarrhées infectieuses ne sont pas bactériennes et toutes les diarrhées bactériennes ne sont pas dues à des bactéries spécifiques.23 La coproculture doit donc être envisagée après avoir éliminé une cause non infectieuse de diarrhée à l’examen clinique. Elle est par ailleurs inutile en cas de diarrhée chronique, en dehors d’un contexte d’immunodépression.56 Quand il est indiqué, le prélèvement de choix est une selle diarrhéique (prenant la forme du pot) voire purulente, muqueuse et hémorragique.23 Une selle moulée ou recueillie sur un écouvillon n’est pas optimale. Un échantillon unique présente une sensibilité suffisante chez l’enfant. En cas d’analyse de selles sur écouvillon chez cette population, le mode de recueil doit être satisfaisant : effectuer une insertion jusqu’à 2 à 3 cm au-delà du sphincter anal, puis procéder à une rotation de l’écouvillon. La présence visible de matières fécales doit être vérifiée, et un milieu de transport doit accompagner l’écouvillon37 afin d’éviter la dessiccation.27 Chez l’adulte, un second prélèvement peut être discuté en proscrivant les écouvillons rectaux7, 21, 68 qui ont de plus l’inconvénient de ne pas renseigner sur l’aspect macroscopique de la selle.37 Au total, 0,5 à 2 grammes de selles doivent être récupérés en cas de selles solides. En cas de selles liquides, 5 mL devront être acheminés.37 Les recommandations préconisent une prise en charge immédiate avec un acheminement au laboratoire inférieur à 2h. Une conservation est possible à +4°C, sans dépasser 12 heures.23 Au-delà (48 à 72 heures), une conservation dans un milieu de transport de type Cary-Blair est recommandée.21, 56 Néanmoins, la viabilité des Campylobacter spp et spp dans les milieux de transport n’a pas été validée.30 C’est tout particulièrement pour Campylobacter spp et Shigella spp que le délai de prise en charge est critique.37 Les espèces du genre Yersinia spp pouvant se multiplier à basse température, la conservation à +4°C pourrait à l’inverse constituer un moyen d’enrichissement pour cette espèce.4, 23 Les souches de Shigella spp ne supportent pas les délais prolongés60 dans les selles en raison de l’acidification du prélèvement par la flore associée,19, 21, 59, 65 notamment par les bactéries anaérobies46 ce qui explique leur survie diminuée par rapport aux autres entéropathogènes.66 Leur recherche doit cependant être systématique.27 Par ailleurs,

8 aucune méthode d’enrichissement n’existe pour ce genre bactérien, à la différence des espèces du genre Salmonella spp (bouillon sélénite).4 De plus, leur croissance est meilleure sur les milieux gélosés sélectifs non inhibiteurs (Hektoen, Drigalski, Mac Conkey) : le milieu SS est à déconseiller car il ne permet pas la croissance de certaines souches de Shigella spp. Au même titre que les Salmonella spp, la recherche des Campylobacter spp par coproculture doit être systématique27 devant une diarrhée aiguë de plus de 48 heures, surtout chez le jeune de moins de 5 ans.11

2 Les prélèvements respiratoires

Les infections respiratoires sont les infections les plus fréquentes et peuvent survenir à tout âge.23 Les agents les plus fréquemment incriminés sont les virus. Néanmoins, les causes bactériennes ne pouvant être éliminées à l'examen clinique, un traitement peut être indiqué sans prélèvement bactériologique en ambulatoire.18, 50 En effet, les prélèvements respiratoires ne sont indiqués que s’ils sont susceptibles de modifier la prise en charge du patient56 et malgré des explorations approfondies, aucune étiologie n’est en effet retrouvée dans plus de 40 % des cas de pneumopathie aiguë communautaire.7, 50 Ainsi, le nombre d’examens microbiologiques des sécrétions broncho-pulmonaires et des expectorations (code 5210 de la NABM) était de l’ordre de 95’000 actes en France en 2015.10 Chez le patient hospitalisé, les prélèvements non invasifs seront réalisés pour les pneumopathies aigues, les prélèvements invasifs (code 5230 de la NABM, soit environ 30’000 actes en France en 201510) ayant une place en seconde intention pour les patients de réanimation ou en première intention pour les patients immunodéprimés. En cas de suspicion de pneumopathie acquise par ventilation mécanique, les analyses bactériologiques quantitatives des prélèvements respiratoires ont un rôle diagnostic important et permettent de diminuer l’exposition aux antibiotiques par rapport à des stratégies diagnostiques cliniques.15 De grandes variabilités de performances peuvent être retrouvées pour un même type de prélèvements. Une répartition non uniforme des bactéries dans le prélèvement (dans les expectorations par exemple69) peut expliquer ces variations. Quand ils sont indiqués, les prélèvements respiratoires devront être réalisés sans retard, avant toute antibiothérapie.2 Les recommandations préconisent une prise en charge préanalytique rapide (transport et conservation avant ensemencement).23, 44, 53, 56 Une prise en charge dans les 2h est en effet recommandée pour éviter la perte de viabilité de Streptococcus pneumoniae ou influenzae et la prolifération d’autres germes (bacilles à Gram négatif). En effet, une perte de viabilité des germes fragiles a été décrite au-delà de 4 heures (en liaison avec la présence d’enzymes lysosomales dans le prélèvement).7 Si le prélèvement ne peut être pris en charge dans les 2 heures, une conservation à +4°C pendant 24h est possible.30

9 2.1 Prélèvements respiratoires non protégés

L’examen cytobactériologique des crachats (ECBC) présente l’avantage d’être non invasif et d’être facile de réalisation. Néanmoins, de grandes variabilités de performances sont observées et une contamination d’origine salivaire est retrouvée dans 50 % des cas.18 Afin d’éviter la contamination par la flore oropharyngée, des conditions strictes de recueil doivent être observées : la prélèvement doit être fait après 1 à 2 heures de jeûne (idéalement le matin), après rinçage de la bouche au sérum physiologique (ou eau distillée) stérile et lors d’une toux productive profonde, aidée si besoin d’un kinésithérapeute.13 Avant ensemencement, un examen direct par lecture au microscope optique après coloration de Gram est réalisé pour éliminer les prélèvements les plus à risque de contamination salivaire, définis par les critères de Bartlett, Murray et Washington (cf Tableau 1). Ces critères ne s'appliquent cependant pas à la culture des légionelles et des mycobactéries pour lesquels la présence est nécessairement pathologique.18 La présence de bactéries à l’examen direct pourra également être renseignée, bien que son utilité soit controversée.28, 39, 43, 45, 47, 48, 52, 57

Tableau 1 : Critères de Bartlett, Murray et Washington. Cellules/champs au grossissement x100 Indication à la culture Cellules épithéliales Leucocytes > 25 < 10 Non > 25 10 à 25 Non > 25 > 25 Non 10 à 25 < 10 Non 10 à 25 10 à 25 Non 10 à 25 > 25 Oui < 10 < 10 Non < 10 10 à 25 Oui < 10 > 25 Oui

Le lavage broncho-alvéolaire (LBA) est un prélèvement invasif réalisé par fibroscopie d’une bronche sous segmentaire (de 3e ou 4e génération). Du sérum physiologique est injecté puis ré- aspiré et analysé. La quantité de liquide récupérée (150 mL environ) permet d’étudier un vaste territoire pulmonaire. Une variante, le mini-LBA permet de documenter les patients instables en ne récupérant que 2 à 3 mL d’échantillon à l’aveugle.18 L’aspiration endo-trachéale (AET) est une technique alternative réalisable chez les patients intubés ou trachéotomisés pour lesquels les techniques invasives sont contre-indiquées.18 Le risque de contamination par la flore commensale est également élevé et seuls les prélèvements de bonne qualité seront ensemencés.

10 2.2 Prélèvements respiratoires protégés

Le brossage bronchique (brosse) est un prélèvement invasif sous fibroscopie consistant à s’affranchir du risque de contamination salivaire par un système de double cathéter, la brosse n’étant exposée que dans les derniers centimètres. Un volume de 1 à 10 μL d’échantillon peut être récupéré et homogénéisé dans 1 mL de sérum physiologique.18 Le prélèvement bronchique distal protégé (PBDP) est une variante de la technique précédente. Réalisé à l’aveugle sans fibroscope, un volume de 1 mL de liquide stérile est injecté puis ré-aspiré. Plus simple et moins couteux, il présente des performances comparables avec le brossage bronchique avec moins d’effets indésirables.18 Les prélèvements respiratoires pouvant être sujets à des contaminations par la flore oropharyngée, des seuils de significativité ont été établis afin de distinguer les bactéries commensales des bactéries impliquées dans des processus infectieux. Les seuils de significativité des prélèvements respiratoires sont donnés par le Tableau 2.18, 23

Tableau 2 : Seuils de significativité des prélèvements respiratoires. Type de prélèvement Seuil de significativité (UFC/mL) Expectoration ≥10⁷ LBA et AET ≥10⁴ Mini-LBA, PBDP, brosse ≥10³ AET ≥10⁵

Néanmoins, dans les prélèvements des voies respiratoires inférieures chez les patients intubés, ces seuils peuvent être pris en défaut. Une croissance inférieure au seuil de significativité peut indiquer une contamination ou colonisation, mais aussi une antibiothérapie préalable (dans les 72 heures,6 même si le germe présente des résistances à l’antibiotique utilisé7) ou une réelle infection à la phase précoce.2, 7 Les prélèvements présentant une croissance à la limite du seuil de positivité peuvent ainsi présenter des problèmes d’interprétation.15 En cas d’antibiothérapie préalable ou de forte suspicion d’infection respiratoire, l’utilisation de seuils inférieurs peut être licite.2 A l’inverse, des faux positifs peuvent être retrouvés en cas de prélèvements hors contexte de suspicion de pneumopathie.7 En effet, l’incidence des colonisations est importante, surtout en cas d’intubation endotrachéale. Le traitement antibiotique des colonisations est fortement déconseillé. En revanche, une culture négative en l’absence de modification d’antibiotique récente (dans les 72 heures) permet d’écarter l’infection respiratoire bactérienne (Legionella spp exceptée)2 et doit faire rechercher une autre cause de fièvre. Cependant, en cas de forte suspicion clinique de pneumopathie, la négativité des culture doit faire évoquer un faux négatif et l'arrêt des antibiotiques expose le patient à une hausse de mortalité et morbidité.7

11 3 Principaux pathogènes étudiés au sein des prélèvements

3.1 Pathogènes entériques

Les bactéries du genre Salmonella spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies, souvent mobiles, appartenant à la famille des , pouvant coloniser le tractus intestinal des vertébrés.27 Certains sérotypes sont exclusivement humains (exemple : Salmonella Typhi = subsp. enterica sérotype Typhi).37 Leur présentation clinique est large : allant du portage asymptomatique à la fièvre typhoide létale.21 Les salmonelloses correspondent à deux entités selon leur appartenance à un sérovar typhoïde ou non typhoïde. La première présentation (sérovars Typhi et Paratyphi : A, B ou C37) est celle d’une atteinte systémique avec bactériémie définissant la fièvre typhoïde menaçant le pronostic vital et pouvant persister dans le système lymphatique mésentérique, la moelle osseuse et la vésicule biliaire avec des rechutes ultérieures chez 5 à 10 % des patients (après 2 à 3 semaines typiquement). La seconde présentation est celle d’une diarrhée fébrile avec douleurs abdominales, 12 à 72 heures après l’infection, spontanément résolutive en 4 à 7 jours. En cas d’immunodépression (SIDA) ou d’altération de la phagocytose (drépanocytose37), certaines souches peuvent néanmoins présenter un passage systémique et atteindre d’autres organes. La coproculture peut rester longtemps positive (convalescence, porteur sain).27 Les formes les plus répandues dans les pays développés sont les gastro-entérites et les entérocolites survenant après intoxication alimentaire (TIAC). L’impact mondial sur la santé publique est important avec une incidence annuelle de 25 millions de cas, dont plus de 200’000 décès. Les bactéries du genre Shigella spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies appartenant à la famille des Enterobacteriaceae49, immobiles, non encapsulés. Dotées d’un pouvoir invasif caractéristique au niveau recto-colique, leur seul hôte naturel est Homo sapiens.27 Adaptées aux humains, les espèces du genre Shigella spp peuvent être rarement retrouvées chez le chien et le primate. Au total, 4 groupes sérologiques sont décrits49 : (groupe A), (groupe B, touchant les pays en voie de développement), (groupe C, retrouvée davantage en Inde), (groupe D, prédominant dans les pays développés). La similarité génétique et protéique des espèces du genre Shigella spp avec rend leur identification délicate et fait préférer les critères biochimiques. Associée au péril fécal, l’infection de fait par ingestion d’aliments ou d’eau contaminée avec une recrudescence estivale. La mouche commune (Musca domestica) peut constituer un vecteur.37 Une transmission interhumaine est possible (relation sexuelle oro-anale) ainsi que lors d’accidents de laboratoire.37 La dose infectieuse est en effet très faible : 10 à 100 organismes sont suffisants pour provoquer une infection.37, 49 Les Shigella spp peuvent survivre dans l’environnement et dans les aliments : 3 jours dans l’eau de mer et 30 jours dans le lait et le fromage.9 12 Associées au bas niveau d’hygiène, à la malnutrition et au manque d’accès aux soins (favorisés par les guerres, les déplacements de population et les cataclysmes naturels9), les épidémies de shigelloses sont responsables de fortes morbidité et mortalité chez la population pédiatrique des pays en voie de développement du tiers-monde. En effet, 165 millions de cas annuels sont estimés au niveau mondial dont plus d’un million d’évolution fatale. Les patients de moins de 5 ans représentent 60 % des cas de décès.49 Chez les populations affaiblies, malnutries et massivement contaminées, la mortalité peut atteindre 10 à 30 %9 lors d’infections à S. dysenteriae. Les infections à Shigella spp entraînent des symptômes principalement digestifs21 (diarrhée aqueuse fébrile, crampes abdominales douloureuses, myalgies avec de possibles céphalées et raideur de nuque37). La durée d’incubation est variable : de quelques heures à 4 jours et jusqu’à 8 jours pour S. dysenteriae.9, 49 La phase d’état est caractérisée par la survenue d’une diarrhée glairo-sanglante en 2 à 3 jours avec altération de l’état général, résolutive le plu souvent en 5 à 7 jours. Il peut exister une bactériémie avec de possibles manifestations extra-intestinales : SHU (retrouvé dans 13 % des cas d’infection à S. dysenteriae37), arthrites réactionnelles (associées aux infections à S. flexneri37), syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter49). Dans de rares cas, une atteinte méningée, pulmonaire ou du tractus urinaire peuvent être présentes.37 Après un épisode non traité, des Shigella spp peuvent être retrouvées dans les selles jusqu’à 3 mois, voire pendant plusieurs années en cas de dénutrition.9 Les bactéries du genre Yersinia spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies appartenant à la famille des Enterobacteriaceae21, présentant une croissance préférentielle entre 25 et 32°C. Une culture sélective est possible sur milieu CIN (cefsulodin-irgasan-novobiocin), comme les Aeromonas spp. Il s’agit de bactéries environnementales avec un réservoir large (sol, eau, égout, végétaux) pouvant également être retrouvée chez les animaux (porcins, bovins, caprins, ovins, rongeurs, félins, canins).23, 37 Parmi les 18 espèces inclues dans le genre Yersinia spp, 4 sont pathogènes pour l’homme56 : , Yersinia wautersii, et Yersinia pseudotuberculosis. Cette dernière espèce présente une proximité génétique importante avec Yersinia pestis21 qui partage 90 % de ses gènes.23 Les infections à Yersinia spp. constituent la troisième cause de diarrhées bactériennes en Europe, dépendantes d’un mécanisme toxinique et invasif.27 L’infection se fait par transmission féco-orale suite à l’ingestion d’aliments contaminés, par contact avec des animaux domestiques porteurs de Yersinia spp ou par contact avec un sujet atteint ou convalescent d’une yersiniose.9 Ces transmissions sont facilitées par la capacité des bactéries du genre Yersinia spp à se multiplier à basse température.21 La survenue des cas est sporadique ou en faible nombre. L’incidence annuelle des infections à Yersinia spp est comprise entre 2 et 16 cas pour 100’000 habitants. Ces infections sont probablement sous-estimées en raison de la recherche inconstante de ces bactéries dans les selles diarrhéiques.

13 L’espèce principale en cause dans les infections à Yersinia spp est Y. enterocolitica, avec une recrudescence saisonnière discutée.21, 37 Après une incubation de 4 à 7 jours, la présentation clinique typique est celle d’une entérite aigüe fébrile, prédominant chez l’enfant de moins de 10 ans, éventuellement associée à une iléite terminale et une lymphadénite21 pouvant mimer une appendicite. Les symptômes sont souvent modérés et spontanément résolutifs en 1 à 3 semaines. Les infections à Y. pseudotuberculosis, responsables de moins de 2 % des yersinioses, prédominent en saison froide et entraînent majoritairement une adénite mésentérique mimant une appendicite.21, 37 La population à risque est le sujet âgé de plus de 60 ans chez qui l’évolution peut être péjorative avec des formes généralisées souvent mortelles (28 % à 100 % de décès pour les formes traitées et non traitées respectivement37). Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et les dysthyroïdies sont des facteurs de risques, de même que la surcharge en fer (hémochromatose, thalassémie ou traitement par deferoxamine). Des séquelles immunologiques peuvent survenir à distance des yersinioses : érythème noueux dans 3 % des cas et arthrites réactionnelles dans 7 % des cas37 (de survenue dans les 3 semaines et plus fréquent chez l’immunodéprimé, une association avec le HLA-B27 a été décrite21, 37). Des syndromes de Fiessinger-Leroy-Reiter, cardites, glomérulonéphrites et thyroïdites ont été décrits occasionnellement.4 Une persistance de Y. enterocolitica dans les selles peut être observée plusieurs semaines, voire plusieurs mois, après la guérison.9, 23 A l’inverse, Y. pseudotuberculosis n’est plus retrouvé dans les selles une fois les ganglions mésentériques envahis. Les bactéries du genre Campylobacter spp sont des bacilles à Gram négatif microaérophiles (croissance idéale dans une atmosphère comprenant, entre autres, 5 % de dioxygène9), parfois thermotolérantes3, spiralées ou incurvées (du grec campylo : incurvé), mobiles par un flagelle polaire.56 L’environnement aquatique constitue un réservoir38 ainsi que les animaux domestiques : volailles, bovins, porcins, petits ruminants, animaux de compagnie (chats, chiens) et animaux sauvages (oiseaux, rongeurs). Les Campylobacter spp appartiennent à la classe des regroupant 4 genres : Campylobacter spp, Arcobacter spp, Helicobacter spp et Wolinella spp. Parmi les 17 espèces du genre Campylobacter spp, les principales sont , Campylobacter coli et Campylobacter fetus.23 Adaptées à la vie dans le tractus digestif de l’homme et des animaux3, 5 d’élevages et domestiques37, les espèces du genre Campylobacter spp sont retrouvées chez les oiseaux et les mammifères.23 Le poulet en particulier peut être considéré comme le principal réservoir naturel de C. jejuni avec une concentration de 10⁶ UFC par gramme de matières fécales au niveau du cloaque. Selon les études, 40 à 80 % des carcasses de poulet de grande distribution sont contaminées à Campylobacter spp (la viande étant inoculée lors de l’abattage de l’animal par dissémination à partir du tractus digestif).23, 37 Par ailleurs, l’emballage des aliments sous vide favorise la microaérophilie et la croissance des Campylobacter spp.4 L’infection, zoonose de recrudescence estivale, se fait par ingestion de viande peu cuite ou par contamination croisée (consommation crus d’aliments souillés). Pouvant toucher tous les âges, les personnes à risque sont les nourrissons, les jeunes enfants3, 11 et les jeunes adultes.29 Il s’agit 14 de la première cause d’infection intestinale bactérienne dans les pays développés16, 23 (sous- estimée en raison d’une sous-déclaration27, 29, 37) mais la prévalence est également importante dans les pays en voie de développement.11 Il existe une augmentation importante du nombre de cas d’infections à Campylobacter spp, non explicable par l’amélioration des systèmes de détection. Lors de grandes épidémies (TIAC), l’eau et le lait cru furent les principales sources de contamination. Pour les cas sporadiques (plus fréquents37), un lien de causalité fort a été retrouvé avec la consommation de viande de poulet pour C. jejuni3, 5, 11 et la viande de porc pour C. coli.29 Après une phase d’invasion de durée variable (probablement liée à la dose infectante9 : au minimum 3 jours et pouvant aller jusqu’à 10 jours11, 23, 29, 37), la présentation clinique de l’infection à Campylobacter spp est une entérite aiguë fébrile avec diarrhée, crampes abdominales et adénite mésentérique.11 L’atteinte gastrique est rare. L’épisode est spontanément résolutif en 7 jours, mais la bactérie peut persister plusieurs semaines dans les selles3, 9, 29, voire plusieurs mois.23 Dans certains pays en voie de développement, près de 40 % des enfants de moins de 2 ans excrètent Campylobacter jejuni dans leurs selles.9 Dans 5 à 25 % des cas, une rechute est observée.9, 23 L’espèce dominante en pathologie humaine est C. jejuni, représentant 80 % à 90 % des cas de campylobactérioses.3 Les infections à C. fetus (responsable de 4 % des cas de campylobactérioses29) peuvent être bactériémiques avec des localisations secondaires et une atteinte endovasculaire (endocardites ou anévrysmes de l’aorte), surtout en cas de pathologie sous-jacente (VIH, pathologie maligne ou hépatique37). Les infections à Campylobacter spp (surtout C. jejuni) peuvent entraîner des syndromes post – infectieux immunologiques (par mimétisme entre les antigènes bactériens et certains composants des gaines de myéline)3 : arthrite réactionnelle dans 2 à 4 % des cas (atteinte des genoux préférentielle37, pouvant survenir dans les 3 à 40 jours après la diarrhée), érythème noueux, syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter 9, urticaire ou syndrome de Guillain-Barré dans 1 à 3 cas pour 1000 (pouvant survenir dans les 2 à 21 jours après la diarrhée37).3, 11 L’hospitalisation est requise dans 5 à 10 % des cas et la mortalité est de 5 pour 10’000 cas.29 Sous l’influence d’une basse température, des formes viables non cultivables (VNC) de Campylobacter spp ont été décrites3, 16, 19, 38, 42, 65, conservant leur pouvoir infectant5 mais non retrouvables en culture. Néanmoins, la conservation à +4°C semble meilleure qu’à température ambiante.46, 64 Ne se multipliant pas dans les aliments (à la différence des salmonelles), il a été montré dans des études agro-alimentaires que la quantité de C. jejuni dans les aliments décroissait avec le temps, quelque que soit la température, l’atmosphère et le pH.3 Néanmoins, leur survie est possible dans l’eau et le lait pendant plusieurs semaines à des températures proches de +4°C.9, 23 Les bactéries du genre Aeromonas spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies mobiles, à oxydase positive. Une culture sélective est possible sur milieu CIN (cefsulodine-irgasan- novobiocine), comme les Yersinia spp.23 Plus de 26 espèces différentes d’Aeromonas spp ont été décrites, mais la grande majorité n’ont qu’une importance clinique limitée, les 3 espèces principales en pathologie humaine étant , Aeromonas caviae et Aeromonas 15 veronii sp sobria.23, 27, 37 Les bactéries du genre Aeromonas spp sont ubiquitaires. Retrouvées en surface des sites aquatiques souillés et stagnants, des pics de concentration estivaux sont visibles lors des hausses de températures. Les bactéries du genre Aeromonas spp peuvent persister plusieurs mois à années dans l’eau et le sol ainsi que dans des amibes. De nombreuses souches peuvent se multiplier et synthétiser leurs facteurs de virulence lors d’une réfrigération à +4°C.27 Les sources potentielles d’infections sont la consommation d’eau contaminée ou de viande de bœuf, de porc, de volaille, d’agneau ou de veau ainsi que des coquillages ou poissons infectés. Des eaux contaminées peuvent également infecter l’homme au niveau cutané par exposition de plaies ou brûlures ainsi qu’au niveau pulmonaire lors de noyades.23 La présentation clinique des infections digestives à Aeromonas spp varie de la diarrhée aqueuse à sanglante. Très rarement, elle peut mimer une diarrhée aqueuse profonde semblable à celle du choléra. Des SHU sont également possibles. Des complications secondaires peuvent survenir, incluant colites ou MICI. En cas de comorbidités (chimiothérapies anticancéreuses27), une translocation bactérienne d’origine digestive peut survenir avec une bactériémie d’évolution péjorative (32 % à 45 % de mortalité). D’autres agents peuvent être impliqués dans des diarrhées aigües bactériennes : Bacillus cereus, Clostridium perfringens et Staphylococcus aureus. Ces pathogènes ne sont pas recherchés en routine : les symptômes courts qu’ils entraînent ne donnent que rarement lieu à une consultation médicale.37

3.2 Pathogènes respiratoires

La flore oropharyngée est constituée de bactéries commensales pouvant être impliquées dans des infections respiratoires bactériennes : S. pneumoniae, H. influenzae, ,1 certaines espèces du genre Corynebacterium et Staphylococcus ainsi que des bactéries anaérobies.23 Les patients atteints de BPCO peuvent présenter une flore contenant des entérobactéries, et des souches de peuvent être retrouvées avec des résistances acquises par sélection au cours d’antibiothérapies. Lors du recueil d’expectorations, des conditions strictes doivent donc être observées pour minimiser le risque de contamination par la flore salivaire. A l’inverse, certaines bactéries d’origine orale ne doivent pas être prises en compte dans la recherche d’étiologie de processus infectieux : streptocoques oraux, Staphylococcus non aureus, Neisseria spp, Haemophilus non influenzae.18 S. pneumoniae (pneumocoque) est un cocci à Gram positif, organisé en diplocoque, lancéolé et encapsulé, essentiellement humain.4 Fragile, cette bactérie doit arriver rapidement au laboratoire où sa culture nécessite des facteurs de croissance et une atmosphère enrichie en

9, 23 CO2. De distribution mondiale, S. pneumoniae est responsable de multiples pathologies humaines et représente une des principales causes de mortalité et de morbidité en infectiologie9, 31 avec une incidence annuelle en Europe de 800 infections/100’000 habitants dont 20 décès/100’000 habitants.4 Il s’agit en effet de la première cause de pneumonies communautaires

16 bactériologiquement documentées27 (50 % des cas4). Souvent isolé de flores commensales des voies respiratoires de populations saines, la colonisation s’observe à un stade précoce au cours de la vie avec un taux de colonisation de 40 à 60 % chez l’enfant, qui diminue à 6 % chez l’adulte sans enfant.4, 9 H. influenzae est un bacille à Gram négatif de petite taille, immobile, aéro-anaérobie facultatif. Exigente, sa croissance est favorisée par une atmosphère enrichie en CO2 après un acheminement rapide23 sur gélose au sang (haemo : sang et philo : amour en grec), cuit de préférence, et associé à des facteurs de croissance.59 Un passage des bactéries en forme VNC est possible.42 Comme les autres espèces du genre Haemophilus spp (à l’exception d’Haemophilus aegyptius et ),4 il fait partie de la flore normale des voies aériennes supérieures et de la cavité buccale chez 50 à 80 % de la population, mais peut aussi être présent au niveau génital voire digestif.9, 27 M. catarrhalis est un cocco-bacille à Gram négatif23 exclusivement humain,27 normalement présent dans le tractus respiratoire supérieur de 5 % de la population adulte et 66 à 100 % de la population pédiatrique.27 Il peut également être retrouvé dans des prélèvements d’origine génitale ou conjonctivale. Fragile, son transport doit être rapide et sa culture est favorisée par une atmosphère enrichie en CO2. S. aureus est un cocci à Gram positif, organisé en tétrades voire en amas, à coagulase positive. Bactérie commensale de la peau et des muqueuses de l’homme dès la naissance, le portage chez l’adulte est fréquent en particulier au niveau nasopharyngé (20 à 40 % de la population) et vaginal (10 % de la population).9, 23 S. aureus est l’agent infectieux responsable de la plus grande variété de pathologies chez l’homme,27 dont des infections pulmonaires (rares et graves, pouvant compliquer la grippe4, 27), et son pouvoir pathogène est majoré par de nombreuses toxines et enzymes.59 Résistant dans l’environnement, aucune précaution particulière lors du transport n’est requise23 mais des formes VNC ont cependant été décrites.42 P. aeruginosa est un bacille à Gram négatif non fermentant, aérobie strict, mobile, ubiquitaire. Présent à l’état naturel dans l’environnement (eaux douces et eaux de mer, sol, végétaux), il se multiplie dans les endroits humides et présente peu d’exigences nutritives mais des formes VNC ont été décrites.42 Pathogène opportuniste, il est fréquemment retrouvé dans le tractus respiratoire des patients atteints de maladies pulmonaires chroniques (BPCO, mucoviscidose), ainsi qu’au niveau du tube digestif, de la gorge, du nez, de la peau et du tractus urinaire.27 Deux autres espèces peuvent être retrouvées dans des prélèvements d’origine humaine : Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas putida. Contaminants fréquents des prélèvements, leur croissance possible à +4°C favorise leur isolement.23

17 4 Conditions préanalytiques et numérations d’éléments

4.1 Numérations des éléments urinaires

Les ECBU sont les examens de microbiologie les plus réalisés (code 5201 de la NABM) avec plus de 9 millions d’actes en France en 2015, soit environ 2 % des actes de biologie médicale.10 Les conditions préanalytiques sont critiques. En effet, le délai avant l’analyse et la présence de conservateur peuvent affecter la concentration urinaire en bactérie et en cellules (hématies et leucocytes). La numération bactérienne est importante pour conclure à une infection ou à une contamination par la flore périnéale. De même, la conservation des leucocytes et des hématies est essentielle afin de ne pas méconnaitre une leucocyturie et/ou hématurie significatives, définies par une concentration supérieure ou égale à 10 éléments/mm³ (ou 10’000/mL). La prise en charge d’urines sans conservateur doit être réalisée dans les 2 heures afin d’éviter la prolifération bactérienne et la dégradation des éléments. Au-delà, une réfrigération à +4°C permet de conserver les bactéries jusqu’à 24 heures mais n’assure pas la conservation des leucocytes.23 L’adjonction d’acide borique, agent bactériostatique, permet la conservation à température ambiante des urines sans modification de la concentration bactérienne. Néanmoins, il semble raisonnable que chaque laboratoire effectue sa propre évaluation du risque de dégradation des leucocytes en fonction des récipients utilisés et du délai maximal entre le prélèvement et l’analyse.56 En effet, les résultats contradictoires sur les effets cytologiques des conservateurs imposent la prudence au-delà de 8 heures de contact.30 Plus précisément, la stabilité des hématies et des leucocytes est dépendant de l’osmolalité et du pH : un pH supérieur à 7,5 et une osmolalité inférieure à 300 mosm/kg peuvent entraîner une dégradation rapide des cellules urinaires.22, 34, 61

4.2 Numérations des liquides de ponctions

Normalement stériles, les liquides corporels contenus dans les séreuses (liquide pleural, liquides articulaires et liquide d’ascite) peuvent s’infecter et faire l’objet d'explorations microbiologiques. Avec les analyses du LCS (cf infra), ces analyses représentaient plus de 95’000 actes en France en 2015 (code 5231 de la NABM)10. Ce sont des urgences médicales et leur prise en charge est immédiate après réception au laboratoire. Idéalement, leur analyse devrait être réalisée dans la demi-heure suivant le prélèvement33 et dans tous les cas avant 2 heures de conservation à température ambiante.56 Néanmoins, les délais préanalytiques peuvent être allongés en cas d’échantillons prélevés dans des établissements éloignés. Parmi les échantillons envoyés au laboratoire pour explorations, l’utilisation de tubes BD vacutainer avec EDTA K2 est fréquente. Adaptés à la conservation du sang, la stabilité des numérations de liquides de ponctions sur tube EDTA K2 n’est cependant pas garantie par le

18 fournisseur. L’utilisation d’un anticoagulant est néanmoins judicieuse pour éviter la formation de caillot rendant la numération impossible et la formule approximative. La numération leucocytaire des liquides d’ascite est en effet indispensable au diagnostic et au suivi des infections de liquide d’ascite, définies par une concentration supérieure à 250 polynucléaires /mm³ dans le liquide d’ascite.33 La numération et la formule des liquides articulaires sont des arguments importants dans le diagnostic des arthrites septiques (un liquide mécanique ou inflammatoire étant défini par une concentration en leucocytes inférieure à 1000/mm3 ou supérieure à 2000/mm3, respectivement)33 et l’étude des liquides pleuraux permet d’orienter le diagnostic étiologique d’un épanchement liquidien (les seuils de concentration en leucocytes étant fixés à 1000 et 10’000/mm3).33 Ces échantillons précieux ne sont pour la plupart pas reprélevables et la présence d’un coagulum dans l’échantillon risque de perturber de façon irréversible le diagnostic en rendant la numération impossible.33 La validation de la stabilité des numérations leucocytaires et érythrocytaires sur ces contenants est donc primordiale.

4.3 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux

Les méningites sont des urgences médicales absolues susceptibles de menacer le pronostic vital à court terme. L’analyse microbiologique du LCS est cruciale pour le diagnostic biologique des méningites, définies par une concentration rachidienne de leucocytes supérieure ou égale à 5 éléments/mm3. Le cas échéant, un examen direct en microscopie optique d’un frottis coloré par la coloration de Gram est précieux. En cas de présence de (diplocoque « en grain de café » à Gram négatif), il existe un bénéfice individuel évident mais également collectif par la mise en place de mesures d’isolement renforcées et par le traitement prophylactique de cas contacts. Ainsi, le CDC recommande un délai maximal de transport de 1 heure de l’échantillon au laboratoire. Les recommandations britanniques préconisent un délai idéal inférieur à 10 minutes et dans tous les cas inférieur à 2 heures. La SFM recommande que l’examen direct du LCS soit disponible dans l’heure qui suit sa réception au laboratoire.30 Les recommandations de la SFBC mentionnent des délais maximaux de 1 heure pour la numération et de 4 heures pour l’examen direct.63 Plusieurs indicateurs peuvent être utilisés pour évaluer les délais de réponse (« turnaround time », ou TAT). Pour les laboratoires avec de grandes marges d’améliorations, la moyenne de délai de rendu est pertinente ainsi que la médiane. Pour les laboratoires avec de bonnes performances, ces marqueurs ne sont pas adaptés car ils sont peu impactés par les exceptions des distributions. Pour cette deuxième catégorie de laboratoires, le 90e percentile et le pourcentage de test acceptables (PAT) sont plus pertinents.62 Il est donc recommandé d’utiliser au moins deux de ces indicateurs pour suivre les performances de TAT : la moyenne ou la médiane de délais de réponse (permettant d’évaluer les performances globales) associée au 90e percentile ou au PAT (pour les exceptions).

19 5 Objectifs de l’étude

L’application de la norme ISO 15189 demande à chaque laboratoire de définir ses exigences préanalytiques, en particulier les instructions relatives aux modalités de recueil et de transport ainsi que de conservation des échantillons avant analyse. Ceci est particulièrement important en cas de regroupement de plusieurs laboratoires monosites en des entités multisites composées de sites de prélèvements périphériques et de plateaux techniques. En effet, il y a un risque d’allongement de la phase préanalytique : cela requiert l’existence de navettes permettant d’acheminer les échantillons entre les sites de prélèvements et les sites d’analyse. Le CHU de Rouen est un établissement composé de plusieurs sites dont certains sont distants de quelques kilomètres du site principal où se trouve le laboratoire de bactériologie. Des navettes assurent le ramassage des prélèvements en différents points de collecte, plusieurs fois par jour. En dehors de ces passages, il peut donc y avoir un délai plus ou moins prolongé avant l’analyse des échantillons prélevés, en plus du délai lié à l’acheminement. L’objectif principal de notre étude était d’établir un délai acceptable avant analyse pour la détection et la numération des bactéries retrouvées lors d’examens microbiologiques de selles et de prélèvements respiratoires en l’absence de milieu de transport. Ce délai permettra de s’affranchir d’un milieu de transport systématique pour ces prélèvements sans risque de perte de viabilité des germes et sans impact sur le résultat. Le deuxième objectif de cette étude était d’établir un délai avant analyse acceptable pour la stabilité des numérations leucocytaires et érythrocytaires des urines conservées sur tubes boratés à température ambiante et des liquides de ponctions conservés sur tube EDTA K2. Enfin, le troisième objectif de cette étude était d’évaluer les délais d’acheminement et de réalisation des numérations et examens directs de LCS réalisés au CHU de Rouen et de confronter ces résultats aux recommandations. En cas d’anomalie, nous proposerons des axes d’amélioration.

20 Matériel et méthodes

1 Matériel

1.1 Selles

Au cours d’un recueil exhaustif réalisé de façon prospective, les selles ayant présenté une culture positive à Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter spp, Yersinia spp et Aeromonas spp ont été retenues pour l’étude du délai de conservation. Afin d’augmenter l’effectif de l’étude et de s’affranchir de la rareté de certains genres bactériens (Shigella spp en particulier), des selles négatives furent artificiellement inoculées avec des entéropathogènes d’origine digestive obtenus à partir du souchier du laboratoire. Ces souches congelées avaient été conservées à -80°C. Un repiquage initial a été effectué sur gélose adaptée, puis 1 mL d’une selle liquide fraiche négative en culture fut enrichie avec 0,1 mL d’une solution de NaCl 0,85 % chargée à 0,5 ± 0,1 mcFarland de la bactérie pathogène. Pour les Shigella spp., 1 mL d’une selle liquide fraiche négative en culture fut enrichie avec 0,5 mL d’une solution de NaCl 0,85 % chargée à 4 ± 1 mcFarland. Dès l’inoculation, un contrôle de la positivité de la selle ainsi enrichie était réalisé par ensemencement en quadrant sur gélose adaptée spécifique. Des courbes de survie ont été établies pour chaque pathogène en fonction du délai de réensemencement afin de déterminer un délai maximal garantissant la survie des germes.

1.2 Prélèvements respiratoires

Les prélèvements respiratoires étudiés étaient des expectorations, aspirations bronchiques, aspirations pharyngées, PBDP, brosse, lavage broncho-alvéolaire, recueillis de façon prospective en fonction du résultat de leur culture. Les prélèvements négatifs ont été éliminés. Les prélèvements présentant une culture positive à au moins un pathogène possible (Acinetobacter spp, Achromobacter spp, Enterococcus spp, Enterobacteriaceae, H. influenzae, M. catarrhalis, P. aeruginosa, S. aureus, Stenotrophomonas maltophilia, S. pneumoniae) ont été retenus pour un réensemencement après conservation à +4°C.

21 1.3 Urines sur tube boraté

Seules les urines dont la numération initiale avait été effectuée par l’automate de routine UF-1000 (Sysmex) étaient incluables. Étaient donc exclues les urines sur sonde, les urines troubles ou en faible volume (numération initiale effectuée manuellement ou non effectuée). Pour l’évaluation de la stabilité de la leucocyturie sur tube BD vacutainer boraté, les urines ayant présenté une numération leucocytaire initiale proche du seuil décisionnel de 10 leucocytes /mm3 (soit entre 10 et 50 leucocytes/mm3) ont été sélectionnées de façon préférentielle. D’autres urines présentant des niveaux de concentrations variables ont néanmoins été inclues afin de représenter une large gamme de leucocyturie. Pour l'évaluation de la stabilité de l’hématurie sur tube boraté BD vacutainer et pour l’évaluation des tubes Sarstedt, aucune sélection particulière n’a été réalisée. Les urines prélevées sur tube BD furent inclues de façon prospective sur une durée de 15 jours pour l’analyse des leucocytes et sur une durée de 10 jours pour l’analyse des hématies. Les urines prélevées sur tubes Sarstedt furent inclues de façon prospective et exhaustive sur une durée de 3 semaines. Elles étaient communes à l’analyse de la stabilité des hématies et des leucocytes. Avant recompte, toutes les urines furent conservées à température ambiante, à l’abri de la lumière.

1.4 Liquides de ponctions sur tube EDTA K2

Seuls les liquides de ponctions prélevés sur tube BD EDTA K2 ayant été numérés initialement étaient incluables. Étaient donc exclus les prélèvements coagulés, les prélèvements purulents ou les prélèvements en quantité insuffisante. Les liquides de ponctions ont été inclus de façon prospective et exhaustive sur 3 semaines. Ils étaient communs à l’analyse de la stabilité des hématies et des leucocytes. Avant recompte, tous les liquides de ponctions furent conservés à +4°C.

2 Méthodes

2.1 Impact des délais sur les cultures de selles

Après conservation à +4°C, seules des selles fraîches ou artificiellement inoculées, sans milieu de transport, ne présentant pas de signes macroscopiques de dessication furent réensemencées sur milieu adapté à intervalles réguliers (tous les 1 à 3 jours) après détection de la bactérie pathogène.

22 Pour les selles liquides, un anse calibrée de 10 μL de selle fut déchargée sur des géloses sélectives : Hektoen (Biomérieux) incubée en aérobiose à 37°C, Campylosel (Biomérieux) incubée en atmosphère microaérophilie à 37°C (GasPak EZ Campy Pouch System, BD) et CIN (Thermoscientific) incubée en aérobiose à 30°C. La présence ou l’absence de bactérie était établie après une durée de culture de 1 à 4 jours. L’identification était réalisée par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Brucker) ou carte Vitek 2 GN. Pour les selles non liquides, un volume équivalent à celui d’un petit pois fut déchargé dans 1 mL de sérum physiologique. Après agitation mécanique de type vortex, une anse de 10 μL fut déchargée sur les géloses sélectives. Lors des repiquages effectués dans cette étude, seule la gélose permettant l’isolement du (ou des) germe(s) d'intérêt fut utilisée : Hektoen (Biomérieux) pour les Salmonella spp et les Shigella spp, Campylosel (Biomérieux) pour les Campylobacter spp et CIN (Thermoscientific) pour les Aeromonas spp et Yersinia spp. La date de prélèvement, la date d’enregistrement et les dates de réensemencement ont été enregistrées. Le délai d’acheminement a été défini comme la période de temps comprise entre la date de prélèvement et la date d’enregistrement. Le délai avant réensemencement (délai de conservation) a été défini comme la période de temps comprise entre la date d’enregistrement et la date maximale de réensemencement (dernier repiquage positif pour les souches ayant résisté à la conservation, ou premier repiquage négatif pour les souches ayant disparu au cours de la conservation).

2.2 Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires

Après conservation à +4°C, les prélèvements respiratoires présentant une culture positive à au moins un pathogène ont été réensemencés. Le réensemencement a été réalisé après identification de la (ou des) espèce(s) pathogène(s) identifiée(s), soit un délai compris entre 1 et 3 jours après l'ensemencement initial, voire 5 jours en cas de week-end. Pour l’ensemencement des expectorations, aspirations bronchiques et aspirations pharyngées, le prélèvement était mélangé à un réactif fluidifiant à base de dithiothréitol (Digest- EUR®, Eurobio) dans un ratio 1/1 conformément au protocole standard proposé par la notice fournisseur (protocole par ailleurs ancien24, 54). Cent microlitres d’une dilution au 10’000e (deux dilutions successives de 100 μL dans 10 mL de sérum physiologique) du mélange obtenu furent ensemencés au râteau sur gélose au sang (COH, Biomérieux) et/ou gélose chocolat PolyViteX (PVX, Biomérieux) et/ou gélose chromogène (CPS, Biomérieux). L’identification des bactéries après 24 à 48 heures de culture aérobie à 35°C (en atmosphère éventuellement enrichie en CO2) était établie par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Brucker), et sensibilité à l’optochine pour les S. pneumoniae. Le seuil de détection pour ces analyses était de 105 UFC/mL. Le dénombrement des espèces bactériennes est donné par le Tableau 3.

23 Tableau 3 : Interprétation des cultures des expectorations, aspirations bronchiques et aspirations pharyngées. Nombre de colonies en culture Numération dans le prélèvement (UFC/mL) 1 à 10 10⁵⁶ à 10 10 à 50 10⁶⁷ à 10 > 50 10⁷⁸ à 10

Pour l’ensemencement des PBDP ou des brosses, le cathéter ou la brosse était vortexé dans 1 mL de sérum physiologique. Une dilution au 10e de l’échantillon (100 μL dans 1 mL de sérum physiologique) fut ensemencée au râteau sur gélose au sang (COH, Biomérieux) et/ou gélose chocolat PolyViteX (PVX, Biomérieux) et/ou gélose chromogène (CPS, Biomérieux). L’identification des bactéries après 24 à 48 heures de culture aérobie à 35°C (en atmosphère

éventuellement enrichie en CO2) était établie par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Brucker), et sensibilité à l’optochine pour les S. pneumoniae. Le seuil de détection pour ces analyses était de 102 UFC/mL. Le dénombrement des espèces bactériennes des brosses et PBDP en cas de dilution au dixième est donné par le Tableau 4.

Tableau 4 : Interprétation des brosses et PBDP dilués au dixième. Nombre de colonies en culture Numération dans le prélèvement (UFC/mL) 1 102 10 103 100 104

En cas d'examen direct positif avec plus de 1 germe par champ (« quelques germes »), une deuxième dilution fut effectuée (au 1’000e par dilution de 10 μL de la solution initiale dans 10 mL de sérum physiologique). Un volume de 100 μL de ce mélange fut ensemencée au râteau sur les mêmes milieux. Le dénombrement des espèces bactériennes des brosses et PBDP en cas de dilution au centième est donné par le Tableau 5.

Tableau 5 : Interprétation des brosses et PBDP dilués au centième. Nombre de colonies en culture Numération dans le prélèvement (UFC/mL) 1 104 10 105 100 106

Lors des repiquages après conservation, les deux dilutions furent effectuées afin de permettre la mise en évidence d’une baisse ou d’une hausse de la numération bactérienne. Une comparaison des numérations bactériennes obtenues avant et après réensemencent a été effectuée en fonction des délais de conservation. Le délai maximum avant ensemencement

24 garantissant soit une stabilité de la numération bactérienne soit une absence de négativation de la culture a été déterminée pour un un risque α < 5 %.

2.3 Impact des délais sur les numérations d’éléments

Toutes les urines inclues furent comptées initialement par l’automate UF-1000 (Sysmex). La valeur exacte des numérations fut arrondie à l’entier le plus proche. Les recomptes des urines ainsi que tous les comptes des liquides de ponctions furent réalisés de façon manuelle en cellule de comptage (Kova Slide). Pour les urines, un délai maximum avant numération a été déterminé pour des valeurs proches du seuil diagnostique de 10 éléments /mm3, garantissant une absence de négativation sous le seuil de significativité. La stabilité des éléments urinaires a été évaluée en comparant les variations de numérations en fonction du délai de conservation. Pour les liquides articulaires, visqueux, une dilution au préalable dans du sérum physiologique fut réalisée. La date de prélèvement, la date d’analyse initiale et la date de recompte ont été enregistrées. Le délai de compte initial a été défini comme la période de temps comprise entre la date de prélèvement et la date d’analyse initiale. Le délai de recompte a été défini comme la période de temps comprise entre la date d’analyse initiale et la date de recompte.

2.4 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux

Un recueil de données fut réalisé de façon prospective et exhaustive entre le 1er novembre 2017 et le 31 décembre 2017. Les LCS obtenus par ponction lombaire ou par dérivation ventriculaire externe furent inclus. Au total, 5 indicateurs ont été évalués dans cette étude : le délai d’acheminement de l’échantillon, le délai de vérification analytique de la numération, le délai de validation biologique de la numération, le délai de vérification analytique de l’examen direct, et le délai de validation biologique de l'examen direct. Le délai d’acheminement de l’échantillon a été défini comme la durée comprise entre l’heure de prélèvement renseignée sur la feuille de prescription et l’heure d’enregistrement informatique de l’échantillon dans le SIL. Le délai de vérification analytique de la numération a été défini comme la durée comprise entre l’heure d’enregistrement informatique de l’échantillon et l’heure de saisie informatique du résultat de la numération dans le SIL par le technicien. Le délai de validation biologique de la numération a été défini comme la durée comprise entre l’heure de saisie informatique du résultat et l’heure de validation biologique, permettant la visibilité informatique du résultat par le prescripteur.

25 Le délai de vérification analytique de l’examen direct a été défini comme la durée comprise entre l’heure d’enregistrement informatique de l’échantillon et l’heure de saisie informatique du résultat de l’examen direct dans le SIL par le technicien. Le délai de validation biologique de l'examen direct a été défini comme la durée comprise entre l’heure de saisie informatique de l’examen direct et l’heure de validation biologique du dans le SIL par le biologiste, permettant la visibilité informatique du résultat par le prescripteur. La validation biologique automatique immédiate programmée pour certains résultats normaux (numérations et examens directs, générant un délai de validation biologique de 0 minutes) n’a pas été prise en compte dans les calculs. Pour chaque étape du processus, la médiane et le 90e percentile des délais furent évalués.

3 Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées en R (logiciel Rstudio Desktop Open Source Licence pour MacOS ou Linux).58 Les graphiques ont été réalisés grâce à la bibliothèque ggplot2,67 la courbe de survie des entéropathogènes a été réalisée grâce à la fonction ggsurvplot de la bibliothèque survminer. Les boites à moustaches représentent les outliers, médianes, minimum (hors outliers), maximum (hors outliers), 1er et 3e quartile (cf Figure 1). L’analyse des délais seuils pour les prélèvements respiratoires a été réalisée par le test du χ2 avec correction de Yates. Compte tenu des résultats des études décrites dans la littérature,12 l’analyse de la stabilité des leucocytes et des hématies sur les urines et les liquides de ponctions a été effectuée en faisant l’hypothèse d’une décroissance de type exponentielle (régression linéaire du logarithme des numérations). La comparaison des délais médians de rendu de résultats pour les LCS selon la période de la journée a été réalisée par le test de Wilcoxon, de même que la comparaison des délais d’acheminement des selles positives et négatives. Une valeur de p inférieure à 5 % a été considérée comme statistiquement significative. Dans le respect de la protections des données à caractère personnel, aucune donnée personnelle ne fut collectée, enregistrée ou analysée.

Figure 1: Légende des boîtes à moustaches.

26 Résultats

1 Impact des délais avant ensemencement sur les cultures de selles

L’impact du délai préanalytique et de la conservation des selles sur la viabilité des pathogènes a été évalué à partir de : - 24 selles positives (4 Aeromonas spp, 8 Campylobacter spp, 10 Salmonella spp et 2 Yersinia spp) repiquées tous les 2 à 3 jours de façon prospective. - 63 selles négatives inoculées artificiellement (1 Aeromonas spp, 19 Yersinia spp, 30 Shigella spp, 9 Campylobacter spp, 4 Salmonella spp) et repiquées tous les 1 à 3 jours. Des repiquages supplémentaires plus précoces ont été réalisés pour les Shigella spp, compte tenu de leur survie plus brève rapportée dans la littérature. Au total, la stabilité de 87 souches de pathogènes entériques a été évaluée après conservation de selles à +4°C. Le nombre et la proportion d’échantillons étudiés pour chaque genre bactérien sont récapitulés dans le Tableau 6 et la Figure 2. Les délais d’acheminement et de conservation avant réensemencement sont représentés dans la Figure 3.

Tableau 6 : Pathogènes, nombre et types de selles étudiées. Pathogène Selles naturelles Selles reconstituées Aeromonas spp (n = 5) 4 1 Campylobacter spp (n = 17) 8 9 Salmonella spp (n = 14) 10 4 Shigella spp (n = 30) 0 30 Yersinia spp (n = 21) 2 19 Total 24 63

Tous types de selles confondus, la population étudiée comprenait majoritairement des Shigella spp (34 % des souches étudiées). Toutes ces Shigella spp (30 souches) avaient été obtenues par enrichissement de selles négatives après décongélation Figure 2: Répartition des différents pathogènes de souches conservées entériques dans les échantillons de selles étudiés (n = 87). antérieurement. Le deuxième 27 entéropathogène le plus représenté dans cette étude était le genre Yersinia spp (24 % des souches étudiées) : 2 selles naturelles furent inclues et 19 selles artificielles furent reconstituées à partir de souches congelées. Puis venaient les Campylobacter spp (20 % des souches étudiées) et les Salmonella spp (16 % des souches étudiées) avec respectivement 17 et 14 souches étudiées. Les Aeromonas spp furent les entéropathogènes les moins retrouvés (6 % des souches) avec 5 échantillons.

Le délai médian d’acheminement des selles naturelles était de 7 heures (minimum = 1 heure, maximum = 32 heures, avec 5/24 selles acheminées dans les 2 heures après réalisation du prélèvement). Ce délai est comparable au délai médian observé pour les 563 selles négatives prises en charge au cours des 4 mois d’inclusion (délai d’acheminement médian des selles négatives : 8 heures, p = 0,94). Le délai médian de conservation (délai compris entre la date d’enregistrement et la date du dernier repiquage positif pour les souches ayant résisté à la conservation, ou du premier repiquage négatif pour les souches ayant disparu au cours de la conservation) de toutes les selles (naturelles et Figure 3: Délais d’acheminement et de reconstituées) était de 110 heures (minimum = 22 réensemencement des selles étudiées. heures, maximum = 168 heures).

La survie des 87 souches étudiées est récapitulée dans la Figure 4. Chaque souche retrouvée en repiquage (73 souches, soit 84 %) y est symbolisée par un bâtonnet vertical. Les 5 souches de Aeromonas spp et les 14 souches de Salmonella spp ont toutes été retrouvées en culture jusqu’à leur dernier repiquage, à plus de 160 heures pour certaines. Parmi les 17 selles positives à Campylobacter spp, 4 se sont négativées

Figure 4: Courbes de survie des souches étudiées lors des en culture au cours de la repiquages après différents délais de conservation (n = 87). période de conservation. 28 Dans 2 cas, il s’agissait de selles naturelles (négativation en 100 et 156 heures). Dans 2 autres cas, il s’agissait de selles reconstituées (négativation au bout de 96 heures). Parmi les 30 souches de Shigella spp étudiées, 5 n’ont pas été retrouvées lors des repiquages après conservation. Une souche a disparu après 22 heures de conservation et une autre au bout de 48 heures. Les trois derniers prélèvements ont été retrouvés négatifs après 63 heures de conservation. Parmi les 21 souches de Yersinia spp étudiées, 5 souches n’ont pas été obtenues après repiquage. Il s’agissait dans les 5 cas de selles reconstituées. Un prélèvement a été retrouvé négatif au bout de 50 heures et les 4 autres après la 120e heure. Finalement, au seuil de 48 heures, seule une seule souche n’a pu être retrouvée, soit un taux de survie de 99 %.

2 Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires

Dans ce travail, 269 prélèvements respiratoires ont été sélectionnés : 83 prélèvements respiratoires protégés (80 PBDP et 3 brosses) et 185 prélèvements respiratoires non protégés (81 aspirations bronchiques, 15 aspirations pharyngées, 89 expectorations). Le nombre d’échantillons étudiés et d’espèces retrouvées dans les différents types d’échantillons ainsi que le nombre d’échantillons ayant présenté une flore sont récapitulés dans le Tableau 7. Tableau 7 : Nombre et type d’échantillons respiratoires étudiés en fonction du nombre d’espèces pathogènes isolées.*

Nombre d’espèces pathogènes isolées Type d’échantillon 0 1 2 3 Total Aspiration bronchique 12(12) 48(15) 19(1) 2(0) 81(28) Aspiration pharyngée 2(2) 10(4) 3(0) 0(0) 15(6) Brosse 0(0) 1(1) 0(0) 2(0) 3(1) Expectoration 5(5) 64(45) 20(0) 1(0) 90(50) PBDP 1(1) 42(14) 21(6) 16(1) 80(22) Total 20(20) 165(79) 63(7) 21(1) 269(107) *Le nombre de prélèvements pour lesquels une flore a été retrouvée est inscrit entre parenthèses.

Parmi les 269 prélèvements étudiés, 20 ne comportaient qu’une flore sans pathogène prédominant. Le nombre de pathogènes retrouvés variait de 1 (165 cas) à 2 (63 cas) voire 3 (21 cas), associés à une flore dans respectivement 79, 7 et 1 cas. Parmi les 90 expectorations étudiées, 50 échantillons (56%) présentaient une flore. Ce taux diminuait à 40 % dans les aspirations pharyngées (6 échantillons sur les 15 étudiés), 35 % dans les aspirations bronchiques

29 (28/81) et 28 % dans les PBDP (22/80). Tous prélèvements confondus, une flore était retrouvée dans 107 des 269 échantillons (soit 40%). Pour ces prélèvements, la stabilité au total de 459 germes a pu être étudiée. L’ensemencement initial a été réalisé après un délai médian d’acheminement de 2 heures (minimum = 0 heures, maximum = 61 heures). Le délai médian d’ensemencement à distance était de 54 heures (minimum : 19 heures, maximum = 153 heures). Ces délais sont représentés dans la Figure 5.

Figure 5: Comparaison des délais d’acheminement et des délais avant réensemencement des germes issus des prélèvements respiratoires étudiés (n = 459).

30 Le Tableau 8 présente les différents germes retrouvés selon le type de prélèvement, en culture pure ou dominante. Tableau 8 : Répartition (nombre de souches) des différents germes retrouvés selon le type de prélèvement. Type de prélèvement Aspiration Aspiration Genre ou espèce Brosse ECBC PBDP Total bronchique pharyngée Achromobacter spp. 0 0 0 0 1 1 Acinetobacter spp. 1 0 0 0 3 4 Chryseobacterium spp. 0 0 0 0 1 1 Citrobacter spp. 0 0 0 2 2 4 Enterobacter spp. 2 3 0 4 10 19 Escherichia coli 1 0 1 6 10 18 19 0 1 33 15 68 Hafnia alvei 0 0 0 1 3 4 Klebsiella spp. 3 0 0 2 10 15 Moraxella catarrhalis 4 4 0 4 1 13 Morganella morganii 1 0 0 0 1 2 Neisseria meningitidis 0 0 0 0 1 1 Proteus spp. 2 0 0 2 0 4 Providencia rettgeri 0 0 0 1 1 2 Pseudomonas aeruginosa 11 2 2 8 12 35 3 0 1 0 6 10 Stenotrophomonas maltophilia 2 0 1 4 4 11 Alloscardovia spp. 0 0 0 0 1 1 Corynébactérie 4 0 0 2 1 7 Enterococcus spp. 5 0 0 1 3 9 Staphylococcus aureus 13 4 0 7 20 44 Staphylocoque à coagulase négative 3 0 0 2 3 8 Streptococcus pneumoniae 12 2 0 11 8 33 Streptococcus pyogenes 0 0 0 0 1 1 Streptocoque commensal 5 0 0 9 4 18 Levure 1 1 1 6 10 19 Flore 28 6 1 50 22 107 Total 120 22 8 155 154 459

Au total, 26 genres ou espèces bactériennes différents ont été retrouvés dans les prélèvements respiratoires étudiés. H. influenzae fut le pathogène le plus fréquemment isolé (dans 68 prélèvements), suivi de P. aeruginosa (35 prélèvements) et S. pneumoniae (33 prélèvements). Une flore était présente dans 107 prélèvements, comportant principalement de H. influenzae, M. catarrhalis et des streptocoques oraux.

La stabilité des cultures bactériennes a été évaluée en comparant la numération bactérienne obtenue lors du réensemencement à celle obtenue lors de la primoculture du prélèvement. Les résultats sont présentés sur la Figure 6 qui prend en compte le délai d’acheminement du prélèvement et le délai de réensemencement. Chaque prélèvement est

31 représenté par un point de couleur bleue si la numération bactérienne est inchangée par rapport à celle obtenue lors de la primoculture, et rouge dans le cas contraire.

Des variations de numération (augmentation ou baisse) ont été observées dès un réensemencement à la 22e heure après primoculture : il s’agissait d’un H. influenzae dans un PBDP (dont la numération a chuté de 106 à 105 UFC/mL) et d’une flore dans un PBDP (dont la numération a cru de 2.103 à 6.104 UFC/mL). Le délai d’acheminement ne semble pas influer de façon significative sur la survie des espèces : certaines numérations étaient conservées après un délai de conservation supérieur à 24 heures, pour des prélèvements ayant des délais Figure 6: Stabilité des numérations bactériennes lors des réensemencement des prélèvements respiratoires étudiés d’acheminement pouvant aller (n = 459). jusqu’à 40 heures. Le point le plus extrême sur l’axe des abscisses de la Figure 6 concerne une souche de S. pneumoniae retrouvée dans un prélèvement acheminé en 61 heures avec une numération stable après une conservation de 58 heures avant repiquage, soit 119 heures après la réalisation du prélèvement. Au total, 230 des 459 souches étudiées (50%) avaient été retrouvées avec une numération inchangée.

32 Les délais de réensemencement ayant entraîné une perte de souches (cultures en quantité inférieure aux seuils de détection) sont représentés dans la Figure 7. Chaque prélèvement est représenté par un point de couleur bleue si le germe était retrouvé lors du réensemencement, et rouge dans le cas contraire. Si les cultures restent stables majoritairement, des disparitions de souches (baisse de l’inoculum sous le seuil de détection) ont pu toutefois être observées dès la 24e heure : H. influenzae dans un PBDP initialement à 10⁴ UFC/mL, corynébactérie dans un PBDP initialement à 2.10³ UFC/mL, streptocoque commensal dans un PBDP initialement à 10⁵ UFC/mL et flore oropharyngée dans un PBDP initialement à 10⁶ UFC/mL. Au total, 360 des 459 souches étudiées ont été retrouvées lors du réensemencement, soit un taux de 22 % de négativation des cultures (inoculum passé

Figure 7: Survie bactérienne après réensemencement des sous le seuil de détection), prélèvements respiratoires étudiés (n = 459). quel que soit le délai de réensemencement.

2.1 Prélèvements respiratoires non protégés

Le délai de prise en charge initiale des prélèvements non protégés a été compris entre 0 et 61 heures (médiane = 2 heures). Les repiquages des prélèvements non protégés ont été réalisés entre 26 et 153 heures (médiane = 56 heures). Le Tableau 9 décrit les variations de numération des germes issus de prélèvements respiratoires non protégés.

33 Tableau 9 : Variations de numération des germes des prélèvements respiratoires non protégés. Numération initiale (UFC/mL) Numération du repiquage (UFC/mL) 10⁵⁶ à 10 10⁶⁷ à 10 10⁷⁸ à 10 Négatif (< 105, n = 63) 40 16 7 10⁵⁶ à 10 (n = 83) 50 26 7 10⁶⁷ à 10 (n = 66) 6 46 14 10⁷⁸ à 10 (n = 85) 1 11 73 Total (n = 297) 97 99 101

Pour 169 des 297 souches (57 %, en vert sur le Tableau 9), l’inoculum était inchangé après réensemencement. Cette stabilité a pu s’observer notamment pour des prélèvements repiqués après plus de 120 heures de conservation. Toutefois, 63 souches n’ont pas été retrouvées en culture après repiquage (quantité inférieure au seuil de détection de 105 UFC/mL, en rouge sur le Tableau 9). La plupart du temps, il s’agissait de souches présentes en faible quantité initiale (10⁵⁶ à 10 UFC/mL), soit 40 des 97 souches présentes avec un inoculum de 10⁵⁶ à 10 UFC/mL et une négativation a été retrouvée dès la 27e heure (H. influenzae dans une aspiration bronchique initialement à 10⁵⁶ à 10 UFC/mL). Après repiquage, 7 H. influenzae, 9 streptocoques commensaux et 17 flores n’ont pas été retrouvées. Des baisses d’inoculum de 1 à 2 Log10 avec persistance de détection du germe ont pu être observées dans 47 cas (en orange sur le Tableau 9). Par ailleurs, 18 cultures ont été retrouvées avec une numération supérieure à la numération initiale (en jaune sur le Tableau 9). Pour 17 de ces 18 prélèvements, la différence de numération était égale à 1 Log10 et concernait : un Citrobacter spp, deux Enterobacter spp, un Enterococcus spp, sept flores, un H. influenzae, un Proteus spp, une Providencia spp, un S. aureus, un S. maltophilia, un S. pneumoniae. Une hausse de 2 Log10 à été observée pour une souche de H. alvei initialement présente entre 105 et 106 UFC/mL après une conservation de 95 heures avant réensemencement. La Figure 8 décrit la variation de numération des germes (en variation de Log10 de l’inoculum initial) selon les délais avant réensemencement, pour les prélèvements respiratoires non protégés (avec un seuil de détection de 105 UFC/mL). Les points rouges indiquent que le germe n’a pas été retrouvé lors du réensemencement, correspondant à une concentration inférieure au seuil de détection de 105 UFC/mL. Des variations (en hausse ou en baisse) sont observées pour des délais avant réensemencement inférieurs à 30 heures. Toutefois, on retrouve une majorité de numérations stables ainsi que de nombreux germes toujours détectés dans les 48 heures de conservation avant réensemencement.

34 Figure 8: Impact des délais avant réensemencement sur la positivité des cultures des prélèvements respiratoires non protégés (n = 297).

Le Tableau 10 présente les résultats des analyses statistiques évaluant le niveau de significativité de la stabilité des cultures pour les seuils de 48 et 55 heures avant réensemencement.

Tableau 10 : Significativité du seuil de 48 heures et 55 heures pour la détection et la numération des germes retrouvés dans les prélèvements respiratoires non protégés. Délai avant réensemencement ≤ 48 heures (n = 97) > 48 heures (n = 200) P Numération stable (n = 169) 57 112 0,74 Numération différente (n = 128) 40 88 Germe retrouvé (n = 234) 76 158 1 Germe non retrouvé (n = 63) 21 42 ≤ 55 heures (n = 145) > 55 heures (n = 152) P Numération stable (n = 169) 91 78 0,06 Numération différente (n = 128) 54 74 Germe retrouvé (n = 234) 123 111 0,02 Germe non retrouvé (n = 63) 22 41

L’analyse statistique n’a pas mis en évidence de différence statistiquement significative sur la détection ou la stabilité de la numération des prélèvements respiratoires non protégés pour un ensemencement effectué jusqu’à 48 heures. En revanche, une différence statistiquement significative a été retrouvée pour un seuil égal à 55 heures, avec une variation significative de la détection des germes (p = 0,02).

35 2.2 Prélèvements respiratoires protégés

Le délai de prise en charge initiale des prélèvements protégés était compris entre 0 et 3 heures (médiane = 1 heure). Le délai de repiquage des prélèvements respiratoires protégés était compris entre 19 et 144 heures (médiane = 42 heures). La Figure 9 décrit la variation (en Log10 UFC/mL) entre les numérations initiales des germes et les numérations retrouvées lors des réensemencements à différents délais après la primoculture. Des variations de numération allant de -6 à +2,4 Log10 UFC/mL ont été observées, la majorité étant comprise entre -1 et +1 Log10 UFC/mL (pour 110 souches, soit 68%), quel que soit le délai avant réensemencement. Une disparition des souches correspond aux points sur la droite en pointillés.

Figure 9: Variations de dilution (en Log10 UFC/mL) des numérations de germes par rapport aux numérations initiales des prélèvements protégés pour différents délais de réensemencement (n = 162).

La Figure 10 décrit l’impact du délai avant réensemencement en terme de variations de numération des germes pour un seuil de détection de 102 UFC/mL, les souches se retrouvant en dessous de ce taux sont représentées par un point rouge. En comparaison avec les prélèvements respiratoires non protégés, les germes des prélèvements respiratoires protégés ont présenté une survie plus précaire. Dans près d’un quart des cas (36 cultures sur les 162 étudiées), une disparition des souches fut observée : majoritairement des H. influenzae (6 cas), des S. aureus (5 cas) et des flores (4 cas). Il s’agissait en particulier de la perte en 24 heures d’un H. influenzae initialement à 1.104 UFC/mL, d’une corynébactérie à 2.103 UFC/mL, d’un streptocoque oral à 1.105 UFC/mL et d’une flore à 1.106 UFC/mL.

36

Figure 10: Impact du temps sur la détection des germes des prélèvements respiratoires protégés pour un seuil de détection de 102 UFC/mL (variations exprimées en Log10 UFC/mL, n = 162).

L’analyse statistique des délais avant réensemencement n’a pas mis en évidence de seuil statistiquement significatif sur l’intervalle étudié, pour la détection des germes comme pour la variation de leur numération. Pour la détection des germes, la valeur de p minimale trouvée fut observée pour un délai avant réensemencement de 44 heures, mais cette valeur n’était pas statistiquement significative (p = 0,093).

3 Impact des délais de recompte sur les numérations des éléments urinaires

3.1 Leucocytes

Dans cette étude, 226 numérations leucocytaires d’urines boratées conservées sur tubes BD ont été recomptées à distance. Les délais entre recueil et compte initial s’échelonnaient de 1 à 63 heures (médiane = 12 heures) et 74 % des prélèvements étaient comptés dans les 18 premières heures. Les délais de recompte s’échelonnaient de 8 à 100 heures (médiane = 54 heures) après la première numération, soit un délai de 11 à 113 heures (médiane = 64 heures) après le prélèvement. La Figure 11 décrit les délais d’analyses initiales et les délais de conservation avant recompte.

37 Par ailleurs, la stabilité de la numération de 31 urines boratées conservées sur tubes Sarstedt a été vérifiée. Les délais de compte initiaux, comparables à ceux des tubes BD, s’échelonnaient de 2 à 34 heures (médiane = 14 heures) et 77 % des urines étaient comptées initialement dans un délai inférieur ou égal à 18 Figure 11: Comparaison des délais initiaux et des délais avant recompte des numérations heures. Les délais de recompte leucocytaires des urines prélevées sur tubes s’échelonnaient quant à eux de 2 à 129 boratés BD (n = 226). heures (médiane = 54 heures). Les numérations leucocytaires initiales des urines boratées conservées sur tubes BD allaient de 1 à 968 éléments/mm3 (médiane = 18/mm3, moyenne = 42/mm3). Nous avons porté une attention particulière aux numérations leucocytaires situées autour du seuil pathologique de 10 éléments/mm3 afin d’évaluer le risque de faux négatif lié à un délai (d’acheminement ou de conservation) prolongé avant numération. Le Tableau 11 décrit la population d’échantillons étudiée selon les niveaux de leucocyturie initiale et les délais de recompte : 46 échantillons présentaient une numération initiale inférieure à 10 leucocytes/mm3, 24 échantillons présentaient une numération initiale supérieure à 50 leucocytes/mm3 et 156 échantillons présentaient une numération comprise entre 10 et 50 leucocytes/mm3. Parmi ces 156 échantillons, 19 ont été recomptés dans les 24 premières heures après réalisation du prélèvements, 43 ont été recomptés dans les 24 à 48 heures, 39 ont été recomptés dans les 48 à 72 heures et 55 ont été recomptés au-delà de 72 heures après réalisation du prélèvement.

Tableau 11 : Effectif des recomptes de numérations leucocytaires d’urines boratées (sur tube BD) selon leur intervalle initial et le délai avant recompte. Numération initiale (leucocytes/mm3) Délai avant recompte < 10 10 à 50 > 50 < 24 heures (n = 29) 10 19 0 24 à 48 heures (n = 74) 18 43 13 48 à 72 heures (n = 60) 10 39 11 > 72 heures (n = 63) 8 55 0 Total (n = 226) 46 156 24

Lors des recomptes, tous échantillons et tous délais confondus, 118 échantillons (soit 52%) ont été recomptés avec une numération supérieure à la valeur initiale, 99 échantillons (soit 44%) avec une numération inférieure et 9 échantillons (soit 4%) ont été recomptés avec une valeur inchangée. 38 Les Figures 12 et 13 présentent les variations des numérations leucocytaires après différents délais de conservation en fonction de leur numération initiale, pour des urines dont la concentration en leucocytes était faible : ≤ 50 leucocytes/mm3 et ≤ 20 leucocytes/mm3 respectivement. Les lignes en pointillés correspondent à la disparition totale des leucocytes présents initialement. Toutes urines confondues, aucun effet significatif du temps n’a été mis en évidence sur la numération leucocytaire des urines prélevées sur tubes boratés BD (p = 0,23). Des variations allant de -41 à +80 leucocytes/mm3 ont été observées pour des numérations initiales comprises entre 10 et 50 leucocytes/mm3. Toutefois, à l’exception d’un échantillon aberrant Figure 12: Variation de numération leucocytaire compté initialement à 48 observée lors des recomptes après différents délais 3 de conservation sur tubes boratés BD pour des leucocytes/mm et recompté à 7 3 numérations initiales ≤ 50 /mm . leucocytes/mm3 après 38 heures de conservation, aucune variation en-dessous du seuil de 10 leucocytes/mm3 pour des valeurs initiales supérieures à 25 leucocytes/mm3 n’a été observée, quel que soit le délai de recompte.

Figure 13: Variation de numération leucocytaire observée lors des recomptes après différents délais de conservation sur tubes boratés BD pour des numérations initiales ≤ 20 /mm3.

39 Pour des faibles valeurs initiales de leucocytes (< 25/mm3), on observe des différences plus marquées lors des recomptes. Des valeurs initialement inférieures à 5 leucocytes/mm3 (exclusivement) ont été retrouvée nulles lors de quelques recomptes. Certaines urines comptées initialement supérieures à 10 leucocytes/mm3 furent recomptées inférieures et vice-versa. Kouri et al40 ont décrit une zone grise entre 8 et 12 leucocytes/mm3 (« Grayzone ») catégorisant la Figure 14: Numérations leucocytaires obtenues après recompte en fonction de la numération numération leucocytaire comme initiale : intérêt d’une zone grise (« Grayzone ») douteuse. Sur notre population, nous entre 10 et 12 leucocytes/mm3. avons estimé plus judicieux d’utiliser une zone grise entre 10 et 12 leucocytes/mm3 (cf Figure 14), valeurs pour lesquelles la numération est susceptible d’être discordante lors d’un recompte (par changement d’interprétation).

Le Tableau 12 présente le nombre d’urines ayant une concentration en leucocytes initialement comprise entre 10 et 50/mm3 pour lesquelles le recompte est retrouvé dans la zone grise, en concentration inférieure ou supérieure : une baisse des éléments sous le seuil de 10 leucocytes/mm3 fut observée dans 21 cas (soit 13%), quel que soit le délai avant recompte.

Tableau 12 : Evolution des numérations leucocytaires des urines boratées (sur tube BD) comprises initialement entre 10 et 50 leucocytes/mm3, selon le délai avant recompte. Numération après recompte (leucocytes/mm3) Délai avant recompte < 10 10 à 12 > 12 < 24 heures (n = 19) 6 2 11 24 à 48 heures (n = 43) 5 5 33 48 à 72 heures (n = 39) 7 4 28 > 72 heures (n = 55) 3 9 43 Total (n = 156) 21 20 115

L’analyse de la stabilité des leucocytes pour les urines boratées conservées sur tubes Sarstedt a retrouvé des résultats en concordance avec les tubes BD. La numération initiale des leucocytes s’échelonnait de 0 à 4’969 éléments/mm3 (médiane = 10 leucocytes/mm3), et aucun effet significatif du temps n’a été mis en évidence (p = 0,63).

40 3.2 Hématies

Les numérations érythrocytaires de 108 urines boratées conservées sur tubes BD ont été recomptées à distance. Les délais de comptes initiaux s’échelonnaient de 1 à 66 heures (médiane = 12,5 heures) après le prélèvement. Au total, 72 % des urines étaient comptées initialement avec un délai inférieur ou égal à 18 heures. Les délais de recompte s’échelonnaient de 2 à 97 heures (médiane = 54 heures) après la numération initiale, soit un délai de 4 à 119 heures (médiane = 73 heures) après le prélèvement. La Figure 15 décrit les délais Figure 15: Comparaison des délais initiaux d’analyses initiales et les délais de conservation et des délais avant recompte des numérations érythrocytaires des urines avant recompte. prélevées sur tubes boratés BD (n = 108).

Les numérations érythrocytaires initiales s’échelonnaient de 4 à 2’088 éléments/mm3 (médiane = 20 /mm3, moyenne = 57 mm3). Le Tableau 13 décrit la population d’échantillons étudiée selon les niveaux d’hématurie initiale et les délais avant recompte. Notamment, 22 échantillons comportaient moins de 10 hématies/mm3, 19 échantillons comportaient plus de 50 hématies/mm3 et 67 comportaient entre 10 et 50 hématies/mm3.

Tableau 13 : Effectif des recomptes de numérations érythrocytaires d’urines boratées (sur tube BD) selon leur intervalle initial et le délai avant recompte. Numération initiale (hématies/mm3) Délai avant recompte < 10 10 à 50 > 50 < 24 heures (n = 10) 0 7 3 24 à 48 heures (n = 16) 2 12 2 48 à 72 heures (n = 45) 10 30 5 > 72 heures (n = 37) 10 18 9 Total (n = 108) 22 67 19

41 Les Figures 16 et 17 décrivent les variations de numérations érythrocytaires après conservation selon les valeurs initiales d’hématurie (pour les faibles valeurs initiales : ≤ 50 hématies/mm3 et ≤ 20 hématies/mm3 respectivement) en fonction des délais de conservation. Les lignes en pointillés correspondent à la disparition Figure 16: Variation de numération érythrocytaire complète des hématies observée lors des recomptes après différents délais de conservation sur tubes boratés BD pour des comptées initialement. numérations initiales ≤ 50 /mm3. Toutes urines confondues, il n’a pas été retrouvé de délai au-delà duquel on observe une variation significative de numération érythrocytaire des urines prélevées sur tubes boratés BD (p = 0,19). Indépendamment du temps, de nombreuses numérations érythrocytaires ont été retrouvées négatives lors du recompte avec 77 échantillons Figure 17: Variation de numération érythrocytaire (71%) recomptés avec une observée lors des recomptes après différents délais de numération inférieure à la conservation sur tubes boratés BD pour des numérations initiales ≤ 20 /mm3. numération initiale, possiblement en raison d’une surévaluation des numérations initiales par l’automate UF-1000 (absence de linéarité avec le comptage manuel pour les numérations érythrocytaires inférieures à 25/mm3). Néanmoins, on observe une tendance à la lyse des hématies au cours du temps. L’analyse de la stabilité des hématies pour les urines boratées conservées sur tubes Sarstedt a retrouvé des résultats en concordance avec les tubes BD. La numération initiale des hématies s’échelonnait de 3 à 2’768 éléments/mm3 (médiane = 14 hématies/mm3) sans effet du temps mis en évidence (p = 0,44). Cependant, il existe également une tendance à la baisse des hématies au cours du temps aboutissant à une négativation dans certains cas pour les faibles valeurs initiales (≤ 50/mm3). 42 4 Impact des délais de recompte sur les numérations de liquides de ponctions

Dans ce travail, 53 liquides de ponctions furent recomptés à distance (10 liquides articulaires, 41 liquides d’ascite et 2 liquides pleuraux). La Figure 18 décrit la part relative de chaque type de liquide de Figure 18: Part de chaque type de liquide de ponction dans la population étudiée (n = 53). ponction dans la population étudiée.

Le délai médian de comptage initial des numérations était de 3 heures (minimum = 1 heure, maximum = 6 heures). Le délai médian de recompte était de 42 heures (minimum = 2 heures, maximum = 121 heures). La Figure 19 décrit les délais initiaux et les délais avant recompte des numérations de liquide de ponction sur tube BD EDTA K2 étudiés.

Figure 19: Comparaison des délais initiaux et des délais avant recompte des numérations des liquides de ponctions prélevés sur tubes BD EDTA K2.

Tous liquides confondus la numération initiale médiane des leucocytes était de 378 éléments/mm3 (minimum = 48 leucocytes/mm3, maximum = 85’500 leucocytes/mm3). La numération initiale médiane des hématies était de 432 éléments/mm3 (minimum = 1 hématie/mm3, maximum = 16’110 hématies/mm3).

43 4.1 Leucocytes

Sur la durée et sur les niveaux de concentration en leucocytes étudiés, aucun effet significatif du temps n’a été mis en évidence sur la stabilité des leucocytes (p = 0,24). La Figure 20 décrit les variations relatives de numérations leucocytaires (exprimées en rapport) selon leurs niveaux initiaux exprimés en Log10 et selon les délais de conservation. Chaque valeur de leucocyte est représentée par un point de forme différente selon le type de liquide de ponction : triangle pour les liquides d’ascites, disque pour les liquides articulaires et carré pour les liquides pleuraux. La valeur médiane du rapport des numérations était égale à 0,98 (écart-type : 0,64) soit 51 % des échantillons ayant été recomptés avec une valeur inférieure à la valeur initiale. Enfin, 40 échantillons (75%) étaient recomptés avec un rapport compris entre 0,5 et 1,5 par rapport à la numération initiale. A l’exception d’un cas, aucun changement d’interprétation (passage en dessous ou au dessus d'un seuil normal et/ou pathologique) n’a été constaté, quel que soit le type de prélèvement et le délai de conservation. Il s’agissait d’un liquide d’ascite initialement compté avec 7’570 leucocytes/mm3 dont 4% de polynucléaires neutrophiles (soit 303 polynucléaires neutrophiles/mm3), recompté à 5’760 leucocytes/mm3 (soit 230 polynucléaires neutrophiles/mm3) après 2 heures de conservation. Le point le plus bas sur l'axe des ordonnées correspond à un liquide d'ascite compté initialement avec une numération égale à 3’960 leucocytes/mm3 (dont 85% de polynucléaires neutrophiles), recompté à 1’080 leucocytes/mm3 (soit un rapport de 0,27) au bout de 121 heures après la première numération. Le point le plus haut sur l'axe des ordonnées correspond à un liquide d'ascite compté initialement avec une numération égale à 430 leucocytes/mm3 (dont 10% de polynucléaires neutrophiles), recompté

Figure 20: Variations (exprimées en rapport) entre les 3 numérations initiales des leucocytes et les à 1’530 leucocytes/mm (soit un rapport numérations recomptées après conservation sur tube de 3,6) 25 heures après la première BD EDTA K2 des liquides de ponctions en fonction numération. des délais de recompte et des types de liquides.

44 4.2 Hématies

Sur la durée et sur les niveaux de concentration en hématies étudiés, aucun effet significatif du temps n’a été mis en évidence sur la stabilité des hématies (p = 0,32). La Figure 21 décrit les variations de numérations érythrocytaires selon le Log10 de leurs niveaux initiaux et selon les délais de conservation. La valeur médiane du rapport des numérations était égale à 1,00 (écart-type : 0,64) soit 50 % des échantillons ayant été recomptés avec une valeur inférieure à la valeur initiale ) et 37 échantillons (70%) étaient recomptés avec un rapport compris entre 0,5 et 1,5 par rapport à la numération initiale. Le point le plus bas sur l'axe des ordonnées correspond à un liquide articulaire compté initialement avec une numération égale à 90 hématies/mm3, recompté à 11 hématies/mm3 après 97 heures de conservation. Le point le plus haut sur l'axe des ordonnées correspond à un liquide d'ascite compté initialement avec une numération égale à 1 hématie/mm3, recompté à 4 Figure 21: Variations (exprimées en rapport) entre hématies/mm3 après 23 heures de les numérations initiales des hématies et les conservation. Aucune de ces variations numérations recomptées après conservation sur tube BD EDTA K2 des liquides de ponctions en n'a été considérée comme ayant un fonction des délais de recompte et des types de impact clinique significatif. liquides.

5 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux

Dans ce travail, 470 LCS ont été inclus : 272 échantillons obtenus par ponction lombaire (58%) et 198 échantillons obtenus par dérivation ventriculaire (42%). Toutes étapes confondues et tous prélèvements pris en compte, la durée totale médiane de prise en charge (de l’acheminement à la validation biologique) était de 185 minutes (minimum = 27 minutes, maximum = 5945 minutes soit 99 heures) avec un 90e percentile de 406 minutes, soit près de 7 heures. Les médianes et 90e percentiles des délais de prise en charge des LCS sont récapitulés dans le Tableau 14.

45 Tableau 14 : Médianes et 90e percentiles des délais de prise en charge des LCS. Médiane (minutes) 90e percentile (minutes) Délai d’acheminement 34 97 Délai de la numération : vérification analytique 61 137 Délai de la numération : validation biologique 73 294 Délai de l’examen direct : vérification analytique 77 147 Délai de l’examen direct : validation biologique 66 290

Les médianes de délai de vérification analytique (entre la réception du prélèvement et la saisie informatique des résultats par le technicien) étaient de 61 minutes pour la numération et de 77 minutes pour l’examen direct. Les médianes de délai de validation biologique (après vérification analytique) étaient de 73 minutes pour la numération et de 66 minutes pour l’examen direct. La Figure 22 donne un rappel des définitions et une vue d’ensemble de la répartition des délais de prise en charge des LCS.

Figure 22: Etapes composant la prise en charge urgente des LCS : rappel des définitions et vue globale des délais.

Le paramétrage du SIL a permis une validation biologique automatique instantanée (délai = 0 minutes) pour la numération de 117 LCS (25%) et pour l’examen direct de 280 LCS (60%) ayant des résultats normaux. Des disparités des délais de prise en charge selon l’heure de prélèvement étaient observées. Ainsi, les étapes de vérification analytique étaient significativement plus longues pour les LCS enregistrés sur la période de midi (2 heures de 12h00 à 14h00) et autour de l’astreinte (4 46 heures de 16h00 à 20h00). La durée médiane de vérification analytique de la numération dans ces deux périodes (midi et astreinte, soit 6 heures) était de 77,5 minutes contre 51 minutes sur les 18 autres heures de la journée (soit une hausse relative de 52 %, p = 4,3.10-6). La durée médiane de vérification analytique de l’examen direct dans ces deux périodes (midi et astreinte, soit 6 heures) était de 90 minutes contre 68 minutes aux autres périodes de la journée (+32 %, p = 4,2.10-5). Parallèlement, les étapes de validation biologique étaient significativement plus longues pour les LCS enregistrés au cours de la matinée (8h30 à 14h00). La durée médiane de validation biologique de la numération dans la matinée était de 154 minutes contre 42 minutes à partir de 14h00 jusqu’au lendemain matin (+267 %, p = 4,4.10-14). La durée médiane de validation biologique de l’examen direct dans la matinée était de 117,5 minutes contre 48 minutes aux autres périodes de la journée (+145 %, p = 6,8.10-5). Enfin, il est à noter que 6 LCS successifs enregistrés le 04 décembre 2017 au cours de l’après midi présentaient tous des délais analytiques augmentés (délais analytiques variant de 137 à 286 minutes) et ont pu perturber le 90e percentile, en raison probablement d’un problème informatique.

47 Discussion

L'application de la norme ISO 15189 à la qualité en biologie médicale impose aux laboratoires la maîtrise et la gestion des risques pouvant avoir un impact sur le résultat de leurs analyses. La phase préanalytique est particulièrement impliquée dans les erreurs en biologie médicale.30, 55 Parmi les éléments préanalytiques, le délai avant analyse est critique : critique car il est susceptible de perturber les résultats de paramètres dont la stabilité est précaire. Critique aussi car il est nécessairement plus long depuis l’organisation des laboratoires en structures composées de sites périphériques de prélèvements d’une part et de plateaux techniques d’autre part.30 La viabilité des pathogènes entériques et respiratoires ainsi que la stabilité des hématies et leucocytes dans les liquides biologiques sont réputées précaires. Notre étude a porté sur la phase préanalytique de différents prélèvements (selles, prélèvements respiratoires, liquides de ponctions et urines) afin de déterminer quels délais avant analyse pouvaient être tolérés (en l’absence de milieu de transport) sans entraîner d’impact sur la viabilité des germes recherchés ou la numération des éléments.

Le Rémic recommande que les selles soient acheminées et prises en charge dans les 2 heures après réalisation du prélèvement, à température ambiante, pour les coprocultures. Si ces délais sont impossibles à tenir, une réfrigération à +4°C pendant 12 heures est recommandée. Au- delà, le Rémic préconise l’emploi de milieux de transport de type Cary-Blair. Dans notre étude, nous avons voulu évaluer s’il était possible de dépasser ces délais sans risque de perte de détection de pathogènes. Sur les 24 selles naturelles étudiées, seules 5 ont été acheminées dans les 2 heures suivant le prélèvement. Par conséquent, rejeter les prélèvements acheminés en plus de 2 heures aurait entraîné l’annulation de presque 80 % des coprocultures positives étudiées (Figure 3). Par ailleurs, nous n’avons retrouvé aucune différence significative entre les délais d’acheminement des selles positives et des selles négatives (7 heures et 8 heures respectivement, p = 0,94), ce qui tend à indiquer que le délai d’acheminement n’est peut-être pas un facteur crucial dans la détection des entéropathogènes. On peut toutefois se demander si ces délais ont pu avoir un impact quant aux types de pathogènes retrouvés. Notons que 563 selles négatives ont été retrouvées sur la période d’inclusion, soit un taux de positivité des coprocultures de 4 %. Cette faible proportion de selles positives est probablement due à la période hivernale de l’étude, avec de nombreuses coprocultures prescrites à tort dans le cadre de gastro-entérites virales. Quelle que soit la tranche d’âge de patients étudiée dans la littérature, les étiologies bactériennes des diarrhées sont dominées par les Salmonella spp et les Campylobacter spp.35 Les principaux pathogènes retrouvés de façon prospective sur selles naturelles dans notre travail sont en accord avec ces étiologies, avec 10 Salmonella spp et 8 Campylobacter spp (Tableau 6). A l’inverse, les pathogènes les moins retrouvés de façon prospective étaient les Shigella spp (aucune selle naturelle n’ayant pu être incluse au cours de la période étudiée). Pour évaluer la survie des pathogènes au sein des selles maintenues à +4°C, nous avons repiqué des selles 48 positives tous les 1 à 3 jours jusqu’à un délai maximal de conservation de 7 jours. Une bonne survie a été retrouvée dans notre étude pour les pathogènes issus de selles naturelles. L’analyse de la stabilité des Shigella spp a nécessité le recours à des selles artificielles créées à partir de souches inoculées dans des selles négatives de patients. Notons que la survie des pathogènes entériques inoculés dans des selles saines a été décrite dans la littérature comme étant mauvaise avec une baisse rapide (dès les 48 premières heures) du pathogène inoculé suivie d’une viabilité stable.65 Ceci pourrait expliquer la disparition d’une souche de Shigella spp en 22 heures dans une de ces selles artificielles. Les principaux pathogènes ayant été décrits dans la littérature comme sensibles aux délais préanalytiques étaient Campylobacter spp et Shigella spp. Premièrement en raison d’une survie précaire, deuxièmement en raison d’un passage possible en forme viable non cultivable (VNC), décrite chez Campylobacter spp et Shigella spp, mais aussi chez Salmonella spp.42 Aucune observation de ce type n’a été notée dans notre étude avec une survie satisfaisante (proche de 99%) pour les 5 pathogènes entériques étudiés (Aeromonas spp, Campylobacter spp, Salmonella spp, Shigella spp et Yersinia spp) lors d’une conservation à +4°C des selles sans milieu de transport pendant les premières 48 heures (Figure 4). De plus, au cours d’études agro- alimentaires, des souches humaines et vétérinaires de Campylobacter spp ont montré une capacité à survivre de façon prolongée (plusieurs semaines à mois) dans les aliments25 et l‘environnement16 à une température proche de +4°C.38 Par ailleurs, une conservation à +4°C sans milieu de transport a été décrite dans d’autres études comme étant satisfaisante pour la culture de ces 5 pathogènes dans des prélèvements d’origine humaine,19, 30 ce qui est en concordance avec nos résultats. D’autres méthodes ont été décrites pour conserver les selles avant ensemencement : la congélation à -20°C ou -70°C d’un prélèvement sans milieu de transport a été étudiée mais avec une survie médiocre des souches de Campylobacter spp et des résultats contradictoires pour les autres espèces.19, 65 L’utilisation d’un milieu de transport de type Cary-Blair permettrait de conserver les entéropathogènes pendant des durées prolongées à température ambiante (jusqu’à 49 jours pour Shigella spp),14 mais avec une perte importante de l’inoculum allant jusqu’à 6 Log10 en 2 jours,65 et un fort risque de perte de viabilité de Shigella spp66 et Campylobacter spp.46, 65 L’emploi de bouillon glycérol-trypticase soja a été décrit pour la congélation à -70°C de selles, mais la survie à 7 jours des salmonelles est aléatoire (63 % de survie dans ce milieu) et les espèces du genre Campylobacter spp et Shigella spp furent perdues. Finalement, il n’existe pas de mode de conservation idéal permettant de préserver l’intégralité des pathogènes entériques tout en inhibant la flore digestive. Dans notre expérience, la conservation à +4°C des selles sans milieu de transport comme testée dans notre étude semble être un compromis satisfaisant dans la recherche conjointe des 5 pathogènes étudiés. Cette conservation est en effet assez inhibitrice pour limiter la prolifération de la flore en permettant la survie des Shigella spp et des Campylobacter. Par ailleurs, ce mode de conservation bénéficie d’une logistique simple, conserve

49 l’aspect macroscopique de la selle et permet la réalisation d’autres analyses sur le même prélèvement (recherche de toxine de C. difficile, analyses de virologie ou de parasitologie). Compte tenu des résultats obtenus dans notre étude et de la littérature (Dan et al19, Galinier et al30), nous pensons qu’il est possible de tolérer un délai préanalytique maximal de 48 heures à +4°C avant ensemencement pour les selles recueillies sans milieu de transport, incluant la phase d’acheminement qui se fait à température ambiante.

Le Rémic recommande que les prélèvements respiratoires soient pris en charge après un délai maximal à température ambiante de 2 heures, ou de 24 heures de réfrigération à +4°C. Dans notre étude, nous constatons des délais d’acheminement en accord avec ces recommandations (délai médian d’acheminement de 2 heures tous prélèvements confondus, cf Figure 5). L’écologie retrouvée est variée (Tableau 8), en accord avec la littérature avec une majorité de souches de H. influenzae, P. aeruginosa et S. pneumoniae, seules ou au sein d’une flore. Concernant la survie des germes au sein des prélèvements respiratoires non protégés nous avons observé une différence statistiquement significative de la détection (avec une baisse d’inoculum inférieur au seuil de détection de 105 UFC/mL), et tous types de germes confondus pour un délai égal à 55 heures (cf Figure 8 et Tableau 10). Ceci nous amène à proposer 48 heures comme seuil maximal de conservation, délai pour lequel nous n’avons pas observé de différence significative concernant la numération de l’inoculum bactérien. Dans la littérature, une réfrigération pendant 24 heures51 voire 48 heures32, 53, 69 a été décrite comme satisfaisante pour préserver les résultats des cultures et des numérations de P. aeruginosa, S. pneumoniae, H. influenzae et S. aureus.69 Au vu de nos résultats et de la littérature, une conservation à +4°C des prélèvements respiratoires non protégés peut être considérée comme acceptable jusqu’à 48 heures. Au-delà, le prélèvement devra être rejeté en raison d’une possible croissance excessive de contaminants tels que les entérobactéries, les Pseudomonas spp ou d’autres bacilles à gram négatif non fermentants comme rapporté également dans la littérature23, 68 ainsi qu’une perte de viabilité des pathogènes fragiles. Une des limites de notre étude concerne les LBA : peu prescrits, ils avaient tous présenté des cultures négatives ou contaminées par la flore oropharyngée. Ce faible taux de positivité des LBA est toutefois concordant avec la littérature.20 Pour les prélèvements respiratoires protégés, bien qu’aucune différence statistiquement significative n’ait été mise en évidence pour les cultures sur l’intervalle des repiquages étudiés (19 à 144 heures, cf Figure 10), il nous semble raisonnable de suivre les recommandations du Rémic et de refuser tout prélèvement dont la conservation aura dépassé 24 heures à +4°C. En effet, les inocula retrouvés sont plus faibles que dans les prélèvements respiratoires non protégés et les modalités de quantification sont différentes. Ainsi, du fait de la numération des germes en culture répondue avec des valeurs quantitatives (et non semi-quantitatives comme pour les prélèvements respiratoires non protégés), une faible variation de concentration en germes était fréquemment observée (68 % de variation à ±1 Log10 UFC/mL par rapport à la numération initiale). Par ailleurs, le sérum physiologique (dans lequel le cathéter des PBDP est acheminé) a été décrit comme étant 50 un inhibiteur potentiel de croissance des germes comme S. pneumoniae et H. influenzae.7, 53 Enfin, ces prélèvements respiratoires protégés sont réalisés notamment chez des patients de soins intensifs pouvant être exposés à des antibiothérapies susceptibles d’impacter rapidement la viabilité des bactéries. Au total, les prélèvements respiratoires protégés (brosses, PBDP) doivent donc être pris en charge dès leur réception au laboratoire en raison de l’urgence médicale et biologique qu’ils représentent sans dépasser 24 heures de conservation à +4°C (recommandations du Rémic). En revanche, les prélèvements respiratoires non protégés (expectorations, aspirations bronchiques et aspirations pharyngées) peuvent être conservés à +4°C pendant au maximum 48 heures avant leur mise en culture, sans nécessiter de milieu de transport.

En l’absence de consensus, le Rémic recommande que chaque laboratoire effectue sa propre évaluation du risque de dégradation des leucocytes urinaires en fonction des récipients utilisés et du délai maximal entre le prélèvement et l’analyse. Les récipients utilisés au CHU de Rouen et dans notre étude sont les tubes boratés. Les données fournisseurs garantissent une stabilité des bactéries urinaires pendant 48 heures, et une stabilité des éléments urinaires pendant 18 heures à température ambiante sur les tubes boratés BD vacutainer. Dans notre travail, nous retrouvons que près des trois quarts des urines sont prises en charge dans les 18 heures après le recueil du prélèvement (Figures 11 et 15) et conservées à température ambiante. En effet, la conservation des urines boratées à température ambiante (20 à 25°C) semble meilleure qu’à +4°C.22 Toutefois, le risque décrit dans la littérature est la lyse d’une partie des leucocytes avec un risque de faux négatif en cas de délai préanalytique allongé et/ou de numération leucocytaire initiale proche du seuil décisionnel de 10 leucocytes/mm3. Afin d’évaluer ce risque, nous avons recompté une majorité d’échantillons ayant des numérations d’éléments proches du seuil décisionnel et allant de 10 à 50 éléments/mm3 (soit 156/226 échantillons pour les leucocyturies et 67/108 pour les hématuries, Tableaux 11 et 13 respectivement). Quel que soit le délai de conservation, nous n’avons pas observé de diminution significative des leucocytes, y compris pour les valeurs proches du seuil décisionnel. En effet, il n’a été retrouvé un taux inférieur à 10 leucocytes/mm3 lors des recomptes (faux négatif) que pour 21 échantillons sur les 156 présentant une numération initiale comprise entre 10 et 50 leucocytes/mm3 (soit 13 %, valeur non significative). Une bonne conservation des leucocytes à température ambiante jusqu’à 72 heures a été décrite dans la littérature pour des prélèvements d’adulte, les urines d’enfants semblant plus sujettes à l’instabilité des leucocytes.22 Ainsi, à température ambiante, la stabilité des leucocytes dans les urines conservées dans sur tubes BD vacutainer C&S (borate de sodium) était bonne,40 permettant une analyse différée à 24 voire 48 heures26 ce qui est concordant avec notre étude. Des résultats similaires ont été retrouvés par d’autres études décrivant une bonne stabilité à 20°C pendant 24 heures sur ces même tubes.41 En revanche, des résultats contradictoires avec une baisse de 30 % des leucocytes après 48 heures de conservation sont rapportés dans l’étude de Cocquerelle et al17 voire une perte plus importante : 30 % des leucocytes après 8 heures et 80 % 51 des leucocytes après 24 heures dans l’étude de Canis et al.12 Notons que ces résultats contradictoires sont obtenus sur des effectifs faibles, sans tests statistiques et sans prendre en compte l’existence d’une éventuelle zone grise. Par ailleurs, ces études avaient retrouvé une stabilité érythrocytaire supérieure à la stabilité leucocytaire ce qui n’est pas le cas dans notre travail où une tendance à la baisse des hématies a été retrouvée sans délai critique identifié. Au total, sur la population et les délais étudiés, une bonne conservation des leucocytes et des hématies dans une moindre mesure a été retrouvée sur les tubes boratés BD vacutainer conservés à température ambiante. Compte tenu des délais médians de recompte proches de 48 heures et de l’absence de baisse significative quel que soit le délai (p = 0,23 pour les leucocytes et p = 0,19 pour les hématies), nous proposons un délai maximal de 48 heures avant analyse, à température ambiante pour les numérations d’éléments urinaires. Ce délai a l’avantage d’être le même que le délai de stabilité bactérienne garanti par le fournisseur, ce qui simplifie la prise en charge au laboratoire. Cette stabilité de 48 heures a également été validée sur les tubes boratés Sarstedt (p = 0,63 pour les leucocytes et p = 0,44 pour les hématies) permettant de les utiliser comme contenant alternatif (« back up ») en cas de rupture des tubes boratés BD. En pratique, une urine prélevée un samedi matin pourra donc être prise en charge jusqu’au lundi matin après 48 heures de conservation à température ambiante. En cas de week-end prolongé (par exemple : lors du lundi de Pentecôte), les analyses devront être réalisées le dimanche ou le lundi pour ne pas dépasser les 48 heures de conservation, pour des ECBU prélevés le samedi ou le vendredi soir et n’ayant pas été acheminés immédiatement. Autour du seuil décisionnel de 10 leucocytes/mm3, des risques de faux négatifs existent (13 % de recompte négatif parmi les urines initialement comptées entre 10 et 50 leucocytes/mm 3), quel que soit le délai. Kouri et al40 ont décrit une zone grise entre 8 et 12 leucocytes/mm3 entourant le seuil diagnostique et permettant de minorer des éventuelles discordances lors des recomptes. Dans ce travail, nous avons retenu une zone grise entre 10 et 12 leucocytes/mm3 permettant une diminution de près de 50 % de ces discordances en considérant comme « douteuse » une numération leucocytaire retrouvée entre 10 à 12 leucocytes/mm3 (cf Tableau 12 et Figure 14). En cas de résultat limite, un contrôle peut être discuté : repasse, contrôle par une autre technique, voire contrôle sur un nouveau prélèvement. Cette zone grise n’est toutefois pas pertinente pour la numération des hématies. En effet, un biais possible de notre étude est une surestimation des valeurs d’hématurie par l’automate UF-1000 présent au laboratoire dans les faibles valeurs (≤ 25 hématies/mm3), ainsi qu’une absence de corrélation avec les résultats obtenus par la méthode manuelle. Ceci peut expliquer que de nombreuses hématuries n’ont pas été retrouvées lors du recompte manuel, pour les tubes BD comme pour les tubes Sarstedt. Enfin, le Rémic n’émet des recommandations que pour la stabilité des leucocyturies. Les hématuries ne sont pas mentionnées comme devant faire l’objet d’une validation,56 car non prises en compte dans le diagnostic des infections urinaires. En conclusion, les numérations leucocytaires et érythrocytaires sur tube boraté BD vacutainer et Sarstedt peuvent être considérées comme stables à température ambiante pendant 52 48 heures après le recueil sans impact sur le diagnostic d’infection urinaire. Ce délai de 48 heures correspond par ailleurs aux recommandations fournisseur pour la stabilité des numérations bactériennes urinaires.

Concernant les liquides de ponction, le Rémic recommande qu’ils soient acheminés en 2 heures à température ambiante. Dans notre étude, nous retrouvons des délais d’acheminement légèrement supérieurs avec une médiane de 3 heures après réalisation du prélèvement (Figure 19). Peu de données existent dans la littérature sur la stabilité des éléments en fonction des températures et des tubes de conservation. Nos résultats de stabilité des numérations leucocytaires et érythrocytaires réalisées sur liquides de ponctions conservés sur tube BD vacutainer EDTA K2 ne trouvent aucun impact statistiquement significatif concernant les délais préanalytiques sur les résultats des numérations (p = 0,24 pour les leucocytes et p = 0,32 pour les hématies). En particulier, aucun changement d’interprétation n’a été observé lors des recomptes, par rapport aux seuils diagnostiques respectifs des différents liquides considérés. Une des limites de notre étude est le faible effectif des liquides de ponctions étudié (Figure 18) et seules les variations de numérations ont été analysées, sans tenir compte d’éventuelles variations de formule. Toutefois, les ascites analysées majoritairement présentaient un large intervalle de valeurs leucocytaires, correspondant à des infections de liquide d’ascite et des ascites non infectées. Elles n’ont pas présenté de variations des leucocytes et on peut supposer que les formules aussi. Si les tubes EDTA K2 permettent d’assurer la stabilité de la numération des liquides de ponctions, ils ne permettent pas d’effectuer de culture bactérienne (n’étant pas stériles) et peuvent être des inhibiteurs de PCR. A contrario, des prélèvements sur fioles d’hémocultures fréquemment utilisés ne permettent que la culture. Notons que la conservation d’un liquide articulaire sur tube EDTA K2 ne permet pas non plus la recherche de cristaux.33 Un liquide de ponction ne devrait donc pas être prélevé uniquement sur tube EDTA K2. Idéalement, l’association d’un échantillon conservé sur tube EDTA K2 et d’un échantillon sans milieu de transport (contenant sec) permettrait la réalisation d’un maximum d’examens complémentaires (numération et formule, PCR, culture bactérienne et fongique, voire recherche de mycobactéries). Les liquides articulaires et liquides pleuraux, peu représentés ici, sont parfois prélevés sur contenant sec exposant le prélèvement à un risque de coagulum. Compte tenu de l’absence d’impact significatif des délais de conservation sur les numérations leucocytaires et érythrocytaires des liquides de ponctions et du délai médian proche de 48 heures avant recompte dans notre étude, nous considérons comme tolérable une conservation à +4°C pendant 48 heures sur la numération des liquides de ponctions. Notons que ce délai est très large par rapport aux délais effectivement constatés car étant considérés comme des urgences, les liquides de ponctions sont pris en charge dès leur réception au laboratoire, 24 heures sur 24.

53 Les LCS sont des liquides précieux à prendre en charge dès réception en raison de l’urgence médicale et biologique qu’ils représentent : ils sont indispensables au diagnostic biologique des méningites bactériennes, infections potentiellement mortelles à court terme. Par ailleurs, la qualité du prélèvement est susceptible de s’altérer lors de l’allongement des délais préanalytiques avec un risque de perte de souches de N. meningitidis et de lyse des éléments. Le CDC recommande un délai maximal d’acheminement de 1 heure.30 Les délais médians d’acheminement observés dans notre étude sont en adéquation avec ces recommandations (délai médian d’acheminement constaté dans notre étude : 34 minutes avec cependant 10 % des échantillons acheminés en plus de 1h30). La SFM recommande un délai maximal de 1 heure pour le rendu de l’examen direct 30 et la SFBC recommande un délai maximal de 1 heure pour la numération.63 Dans l’étude de Hawkins36, les délais médians cibles mentionnés pour la numération et l’examen direct des LCS sont proches de ceux des recommandations de la SFM et SFBC, avec un délai médian de 60 minutes le plus souvent utilisé comme cible. En pratique, les délais médians effectifs de réalisation étaient de 32 minutes pour les numérations et de 45 minutes pour les colorations de Gram mais aucune donnée concernant les 90e percentiles n’était renseignée, ni les délais des étapes de validation biologique (la littérature datant d’avant la mise en place de la norme ISO 15189), l’appel téléphonique de résultats pathologiques par le biologiste constituant probablement la validation biologique. Les délais médians observés dans notre étude concernant la réalisation des numérations et des examens directs de LCS (vérification analytique) sont supérieurs aux délais médians renseignés dans la littérature : 61 contre 32 minutes et 77 contre 45 minutes respectivement, soit des délais 1,5 à 2 fois supérieurs (cf Tableau 14 et Figure 22). Néanmoins, ces délais sont comparables avec les cibles habituelles considérées comme acceptables par les laboratoires de microbiologie. Enfin, il a été décrit dans la littérature que les TAT (« Turnaround time », délai entre la réception du prélèvement et le rendu des résultats au prescripteur) étaient d’autant plus longs que les structures étaient grandes, ce qui est le cas du CHU de Rouen.36 De plus, nous avons observé des disparités dans les délais en fonction de l’heure d’enregistrement des prélèvements. En effet, un allongement des délais de vérification analytique est constaté à des plages horaires de sous-effectif relatif : de 12h00 à 14h00 incluant l’heure du midi, et de 16h00 à 20h00 incluant la période de fin de journée où l’activité peut par ailleurs être augmentée. L’ajout de personnel au secteur préanalytique entre 17h00 et 19h00 depuis la fin d’année 2017 devrait corriger cette tendance. A l’inverse, un allongement des délais de validation biologique est observé sur une plage horaire de forte activité : de 8h30 à 14h00 correspondant à la période de lecture et d'interprétation des antibiogrammes. La mise en place d’une validation biologique systématique à 10h00 et à 12h00 permettrait de raccourcir les délais de réponse. Un outil informatique d’extraction de données (calculant les délais d'acheminement, de vérification analytique et de validation biologique des numérations et examens directs) est en cours de mise en place pour les LCS et permettrait de suivre ces délais et d’en faire un indicateur qualité. Enfin, notons que le biologiste de validation est systématiquement informé dès la positivité d’un examen 54 direct, avant la vérification analytique, et que les résultats anormaux sont téléphonés par le biologiste au médecin prescripteur le plus rapidement possible.

Conclusion

Dans cette étude visant à évaluer l’impact de la phase préanalytique sur les résultats de culture nous avons montré que les délais avant traitement peuvent être allongés par rapport à ceux actuellement recommandés pour les selles et les prélèvements respiratoires non protégés, sans impact sur la viabilité et la numération des germes. Concernant la numération des éléments figurés, celle-ci peut être différée au-delà de 24 heures, pour les urines sur tubes boratés ou les liquides de ponctions sur tubes EDTA sans impact sur l’interprétation diagnostique. Au total, nous proposons les modifications de recommandations préanalytiques suivantes : - les selles et les prélèvements respiratoires non protégés peuvent être conservés à +4°C pendant 48 heures avant ensemencement et ne devront être traités en permanence de soins qu’en cas de week-end prolongé de 3 jours. - les urines sur tubes boratés peuvent être conservées à température ambiante pendant 48 heures avant analyse et les liquides de ponctions sur tube EDTA à +4°C. En cas de week-end prolongé, les urines devront être traitées également sur la permanence de soins, à l’instar des liquides de ponctions. - Enfin, une validation biologique des LCS pourrait être réalisée toutes les 2 heures afin d’assurer de meilleurs délais de rendu de résultat.

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Introduction : Les laboratoires doivent établir les conditions de conservation et délais acceptables avant l'analyse des échantillons. Nous avons évalué l’impact de ces délais sur le résultat de cultures de selles et de prélèvements respiratoires ainsi que des numérations des éléments d'urines boratées et de liquides de ponctions sur tubes EDTA. Matériel et méthodes : Des courbes de survie de Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia et Aeromonas ont été établies après repiquages successifs de selles conservées à +4°C. La stabilité des pathogènes respiratoires a été évaluée par repiquages après 1 à 6 jours de conservation à +4°C. La stabilité des numérations a été évaluée après recompte de 365 urines boratées conservées à température ambiante et de 53 liquides de ponctions conservés à +4°C. Résultats : Au total, 87 souches d’entéropathogènes ainsi que 459 souches issues de prélèvements respiratoires ont été inclues. Les selles et les prélèvements respiratoires non protégés ont présenté une stabilité des bactéries satisfaisante pour un délai inférieur ou égal à 48 heures. Pour les prélèvements respiratoires protégés, un délai maximal de 24 heures a été retenu. Aucun effet significatif du temps n’a été mis en évidence sur la stabilité des numérations leucocytaires et érythrocytaires en moins de 48 heures. Conclusion : Les selles et les prélèvements respiratoires non protégés peuvent être conservés jusqu’à 48 heures à +4°C sans impact significatif sur la culture. Les urines boratées peuvent être conservées pendant 48 heures à température ambiante et les liquides de ponctions sur tube EDTA pendant 48 heures à +4°C sans risque significatif de dégradation des éléments.

Mot-clés : acheminement, crachat, délai, numération, ponction, préanalytique, selles, urines.