Dissertação-Ana-Paula-Watermark

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, BIODIVERSIDADE E CONSERVAÇÃO

DELIMITAÇÃO DE ESPÉCIES NO GÊNERO Phyllodytes (AMPHIBIA, ANURA, HYLIDAE): UM CASO DE TAXONOMIA INTEGRATIVA

PPGGBC

Jequié Março, 2015

ANA PAULA BARBOSA NASCIMENTO

DELIMITAÇÃO DE ESPÉCIES NO GÊNERO Phyllodytes (AMPHIBIA, ANURA, HYLIDAE): UM CASO DE TAXONOMIA INTEGRATIVA

Dissertação de mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, como requisito finalpara aobtenção do grau de Mestre em Genética, Biodiversidade e Conservação.

Orientadora: Profº Dra. Caroline Garcia Co-orientadora: Profº Dra. Juliana Zina Co-orientadora: Dra. Lorena Nunes PPGGBC

Jequié Março, 2015

Jequié, 27 de Março de 2015.

BANCA EXAMINADORA

Profa. Drª. Caroline Garcia (Orientadora) – UESB / Jequié ______

Profa. Dra. Soraia Barreto A. Fonteles–UFRB / Cruz das Almas ______

Profa. Dra. Débora Diniz – UESB / Jequié ______

PPGGBC

À minha família pelo amor incondicional.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, À UESB e ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, pela oportunidade, em especial agradeço aos motoristas Valdisnei, Reinaldo (Show), Tiago e Jhon pelas divertidas saídas de campo e pelas histórias mais inusitadas; AoPrograma de Formação de Recursos Humanos – Petrobras 211 pela concessão da bolsa; Às minhas orientadoras Profa. Dra. Caroline Garcia, Profa. Dra. Juliana Zina e Profa. Dra. Lorena Nunes, pelo exemplo de profissionais, por me ensinarem a trilhar o caminho científico e pelo cuidado muitas vezes de “mãe”. As palavras nunca serão suficientes para descrever minha gratidão. À minha família, em especial minha MÂE por todo esforço depositado a mim privando das suas vontades para que as minhas prevalecessem, a minha irmãzinha, aos meus tios, primos e avós por entenderem minhas ausências, pelo incentivo e por me ensinarem a ser uma pessoa melhor com as palavras mais humildes e sábias possíveis. A Daniel, por extrair de mim os melhores risos e despertar em mim sonhos esquecidos, pela companhia e por silenciar meu turbilhão de pensamentos cantando lindamente pra mim. Aos meus colegas/irmãos de laboratório e de campo, especialmente: Gabriel Novais (pelas enumeras ajudas), Fernando Silva (que segue a risca a palavra “Irmão”), Vanderlan, Marcelle, Luciana, Ramon, Isabella e Michael. À Profa Maria Cecília por mediar minhas saídas de campo no PESC sempre tão solícita, aos salva-parque por me auxiliarem tanto no PESC quanto na Reserva da Natura. Ao diretor do Museu de Biologia Prof. Mello Leitão o senhor Hélio de Queiroz Boudet Fernandes, a curadora do museu Luisa Maria Sarmento Soares e o estagiário do setor de zoologiaAlexander Tamanini MônicoPPGGBC por disponibilizares os exemplares de Phyllodytes luteolus. Aos professores e colegas do programa, pelos ensinamentos e bons exemplos e por tornar meus dias em Jequié mais leves. A Deus, acima de tudo, pois sem Ele, a concretização de mais um plano seria impossível. Enfim, a todos que participaram direta ou indiretamente desse trabalho, muito obrigada!

BIOGRAFIA

Ana Paula Barbosa Nascimento, filha de Paulo da Cruz Pereira Nascimento e Maria da Piedade Barbosa Nascimento, nasceu em Bom Jesus da Lapa-Bahia aos 11 dias do mês de Setembro de 1990. Estudou nas escolas Batista e no Centro Integrado de Ensino Continuado, onde concluiu o ensino médio, no ano de 2007, aos 17 anos. A inquietude de criança misturada à curiosidade exacerbada a fizeram bióloga desde criança, aos 18 anos quando foi aprovada na Faculdade de Ciências Biológicas na Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia parte desse sonho começou a se concretizar. Desde então, passou a morar no município de Jequié-Bahia. Já no ensino superior, participou do Grupo de Herpetologia, nos laboratórios de Vertebrados e Citogenética da UESB, onde os primeiros alicerces científicos foram construídos para a elaboração de trabalhos e produção da monografia intitulada: Biologia reprodutiva, caracterização cromossômica e morfológica de Hypsiboas crepitans (Anura: Hylidae) do sudoeste baiano, orientada pela Profa. Drª. Juliana Zina. Em 2013 formou-se Bacharel em Ciências Biológicas com Ênfase em Genética. Em seguida, foi aprovada no Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, onde, em conjunto com Profa. Dra. Caroline Garcia, desenvolveu projeto de pesquisa relacionado à taxonomia integrativa como ferramenta de identificação em anuros. Está concluindo, em 2015, o mestrado, aos 24 anos de idade.

PPGGBC

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima”.

Louis Pasteur

RESUMO

Atualmente, a taxonomia está passando por um contexto crítico devido ao enorme contingente de espécies que por algum motivo foram categorizadas erroneamente. Assim, a taxonomia integrativa, na qual diferentes ferramentas são aplicadas com o intuito de melhor definir as espécies, vem se tornando atrativa. Diante de propostas taxonômicas controversas e presença de poucos dados para uma análise diagnóstica robusta testamos o potencial de evidências múltiplas utilizando dados citogenéticos, morfométricos e bioacústicos na distinção de espécies do gênero Phyllodytes. As coletas foram realizadas em cinco localidades do estado da Bahia e fotografias foram tiradas de machos depositados em museu no Espírito Santo, sendo que no total foram analisados quatro espécies de Phyllodytes(P. luteulos, P. melanomystax, Phyllodystessp.1 e Phyllodytes sp. 2) totalizando 100 exemplares. Para as análises morfométricas seis marcos anatômicos foram utilizados e permitiram visualizar diferenças intra e interespecíficas. Com relação às análises citogenéticas as espécies Phyllodytes sp.1 e P. melanomystax diferiram quanto ao número diploidee posicionamento das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)deP.luteolus e Phyllodytes sp.2. Além disso, o bandamento C apresentou padrões diferenciados permitindo ainda a identificação de três padrõespara o gênero. Osparâmetros acústicos analisadosdiferenciaram as espécies quanto à duração do canto, número de notas e estrutura do canto. Os resultados obtidos permitiram caracterizar e diferenciar com confiança as espécies de Phyllodytes analisadas. Embora cada ferramenta apresente limitações em algum nível, uma abordagem integrativa utilizando ferramentas citogenéticas, bioacusticas e morfométricas mostrou-se efetiva na delimitação das espécies estudadas. Dessa forma, sugerimos que estudos dessa natureza sejam expandidos tanto para outros grupos de anuros, como para outros grupos animais.

Palavras-chave: Bioacústica,PPGGBC diversidade criptica e morfometria geométrica.

ABSTRACT

Currently, the taxonomy is going through a critical context due to the huge number of species that for some reason were categorized incorrectly. Thus, the integrative taxonomy, in which different tools are applied in order to better define the species, is becoming attractive. Before controversial taxonomic proposals and presence of few data for a robust diagnostic analysis tested the potential of multiple evidence using cytogenetic, morphometric data and bioacoustic the distinction of Phyllodytes genus. Samples were collected at five locations in the state of Bahia and photographs were taken of males deposited in museum in the Espírito Santo, and in total we analyzed four species Phyllodytes (P. luteulos, P. melanomystax, Phyllodystes sp.1 and Phyllodytes sp.2) totaling 100 copies. For morphometric analyzes six anatomical landmarks were used and allowed us to visualize intra and interspecific differences. Regarding cytogenetic analyzes the Phyllodytes sp.1 species and P. melanomystax differed on the diploid number and positioning of the Regions Organising of nucleoli (RONs) of P.luteolus and Phyllodytes sp.2. Furthermore, the C-banding showed different patterns still allowing the identification of three patterns for the genre. The acoustic parameters analyzed differentiate the species as the length of the corner, number of notes and structure of the corner. The results allowed to characterize and differentiate with confidence species Phyllodytes analyzed. Although each tool displays limitations on some level, an integrative approach using cytogenetic tools, bioacoustic and morphometric proved to be effective in the delimitation of species. Thus, we suggest that such studies are expanded to other frogs both groups, as forother animal groups.

Keywords: Diversity bioacoustic, diversity ciptica e morphometric geometric, PPGGBC

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Marcos anatômicos utilizados nas análises morfométricas. Em evidência um exemplar de Phyllodytes luteolus.

Figura 2.Cariótipos submetidos a coloração convencional com Giemsa: a) P.luteolus - Ilhéus b) Phyllodytes sp.2 c) P. luteolus – Barragem d) Phyllodytes sp.1 - PESC e) Phyllodytes sp.1 – Reserva Particular da Natura f) Phyllodytes sp.1 – Barra Grande g) Phyllodytes melanomystax - Reserva Particular da Natura. Em destaque os cromossomos nucleolares submetidos à impregnação por nitrato de prata.

Figura 3.Cariótipos submetidos a bandamento C de: a) P.luteolus - Ilhéus b) Phyllodytes sp.2 - PESC c) Phyllodytes sp.1 - PESC d) Phyllodytes sp.1 – Reserva Particular da Natura e) Phyllodytes melanomystax - Reserva Particular da Natura.

Figura 4.Representação dos dados obtidos através da análise dos índices de variância de cada Componente Principal (PCA) entre as quatro espécies do gênero Phyllodytes. Em destaque as grades de deformação evidenciando o sentido e a origem das alterações, ao lado tracejado a forma mediana apresentada pelos machos de Phyllodytes e em linha contínua as alterações cranianas a esse modelo.

Figura 5.Representação dos dados obtidos através da análise dos índices de variância de cada Componente Principal (PCA) entre os machos de Phyllodytesluteolus coletados na Barragem de Pedra, Ilhéus municípios da Bahia e do Espírito Santo.

Figura 6. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de Phyllodytes luteolusPPGGBC, gravado na Barragem de Pedra, município de Jequié, estado da Bahia.

Figura 7. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de Phyllodytes melanomystax, gravado na Reserva Particular da Natura, município de Serra Grande, estado da Bahia.

Figura 8. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de Phyllodytes sp.1, gravado em Barra Grande, Península de Maraú, estado da Bahia.

Figura 9. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de Phyllodytes sp.2, gravado no Parque Estadual Serra do Condurú, Distrito de Serra Grande, estado da Bahia.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Número de exemplares por espécie e suas respectivas localidade de coleta, bem como as metodologias aplicadas. Os vouchers subscritos com asteriscos referem-se aos machos gravados em campo.

Tabela 2. Parâmetros acústicos analisados nos cantos de anúncios emitidos por machos de Phyllodytes referente a diversas localidades da Bahia.

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ACP - Análise de Componentes Principais 2n – Número diplóide

Ba(OH)2 – Hidróxido de bário DNA– Ácido desoxirribonucléico DNAr – Ácido desoxirribonucléico ribossomal FISH - hibridação in situ fluorescente HCl – Ácido clorídrico m - metacêntrico Mp – Megapixels NF – Número fundamental PAST - Palaeontological Statistics PESC – Parque Estadual Serra do Conduru RB - Relação de braços RON – Região organizadora de nucléolo sm - submetacêntrico st - subtelocêntrico -- dado ausente * machos gravados em campo

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SUMÁRIO RESUMO ...... 8 ABSTRACT ...... 9 LISTA DE FIGURAS ...... 10 LISTA DE TABELAS ...... 11 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS...... 12 1. INTRODUÇÃO...... 14 2. REVISÃO DE LITERATURA ...... 15

2.1. FAMÍLIA HYLIDAE E O GÊNERO PHYLLODYTES ...... 15

2.2. CITOGENÉTICA DE ANURA COM ÊNFASE EM HYLIDAE ...... 17

2.3. ESTUDOS MORFOMÉTRICOS EM ANURA ...... 19

2.4. ESTUDOS BIOACÚSTICOS EM ANURA ...... 21

2.5. TAXONOMIA INTEGRATIVA COMO FERRAMENTA DE IDENTIFICAÇÃO ...... 23 3. OBJETIVOS ...... 25

3.1. OBJETIVO GERAL ...... 25

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 25 4. MATERIAL E MÉTODOS...... 25

4.1. COLETA DE MATERIAL ...... 25

4.2. ANÁLISES CITOGENÉTICAS ...... 26

4.3. ANÁLISES MORFOMÉTRICAS ...... 31

4.4.ANÁLISE DO CANTO...... 31 5. RESULTADOS ...... 32

5.1. ANÁLISES CITOGENÉTICAS ...... 32

5.2. ANÁLISES MORFOMÉTRICAS ...... 34

5.3. ANÁLISE DO CANTO ...... 37 6. DISCUSSÃOPPGGBC ...... 42 6.1. ANÁLISES CITOGENÉTICAS ...... 42

6.2. ANÁLISE MORFOMÉTRICA ...... 45

6.3. ANÁLISE DO CANTO ...... 46 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 48 8. REFERÊNCIAS ...... 50

1. INTRODUÇÃO A delimitação precisa de espécies atualmente vem se tornando um dos principais esforços da taxonomia, visto que o perfeito delineamento destas determina o futuro de boa parte dos estudos relativos à biologia, uma vez que a maioria deles dependem de conhecimentos básicos sobre elas. Novas ferramentas foram anexas aos estudos taxonômicos a fim de melhor pontuar as variações existentes, com o advento de técnicas citogenéticas e moleculares novas espécies foram reveladas e propostas de novos grupos foram sugeridas. Vale ressaltar que os dados gerados por essas ferramentas apresentam taxas evolutivas diferenciadas podendo gerar informações enviesadas. Por outro lado, as caracterizações de espécies baseado apenas em caráteres morfológicos tendem a limitar o perfeito delineamento do grupo estudado, pois essas análises apresentam limitações quanto arepresentação fidedigna da forma/tamanho e suas variantes. Análises utilizando parâmetros acústicos tem se tornado frequente em muitos grupos animais dado a sua especificidade, porém problemas relacionados à obtenção e análise dos cantos tem limitado a aplicação da técnica em algumas espécies. Nesse contexto, o conceito de taxonomia torna-se especialmente interessante, uma vez que a confusão gerada por ferramentas quando utilizadas separadamente nessa perspectiva é abolida, pois as espécies passam a ser delimitada sob diferentes aspectos permitindo que as mudanças sejam melhor pontuadas. Embora os anuros sejam um grupo diverso, ainda são incipientes os trabalhos que unam diferentes ferramentas na tentativa de elucidar questões taxonômicas problemáticas. Um exemplo de grupos taxonomicamente complexos são os representantes do gênero Phyllodytes,quesob diferentes aspectos utilizando diversas ferramentas propostas de grupos foram sugeridos, porém dados moleculares não confirmaram a precisão destes agrupamentos. Nessa perspectiva,PPGGBC e diante de propostas taxonômicas confusas aliado a ausência de diagnóstico preciso, o objetivo geral deste trabalho é verificar o potencial de dados citogenéticos, morfométricos e bioacústicos na distinção de espécies do gênero Phyllodytes.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1.Família Hylidae e o gênero Phyllodytes

A família Hylidae é constituída por três subfamílias: Phyllomedusinae, Pelodryadinae e Hylinae, sendo esta última a maior delas com 667 espécies, agrupadas em quatro tribos: Cophomantini, Lophiohylini, Hylini e Dendrospsophini (Faivovich et al., 2005; Frost, 2013). E atualmente é a família mais numerosa dentre os anuros, composta por 926 espécies (Frost, 2013). De forma geral, os hilídeos apresentam comportamento arborícola e são extremamente variáveis em relação ao tamanho (1,7-14 cm de comprimento) e características morfológicas. A subfamília Lophiohylini é composta por oito gêneros com 81 espécies (Frost, 2010), sinapomorfias do grupo só foram revelados baseados em estudos moleculares realizados porFaivovich et al.(2005), a presença de pelo menos quatro fileiras de dentes labiais posteriores no disco oral larval indicam uma possível sinapomorfia morfológica (Faivovich et al. 2005). Dados cariológicos sobre a tribo são incipientes contando apenas com dados disponíveis para 12 espécies (Duellman e Cole, 1965; Rabello, 1970; Bogart, 1973; Schmid, 1978; Anderson, 1996; Morando e Hernando, 1996; Kasahara et al., 2003; Nunez e Fagundes, 2008). Trabalhos anteriores descreveram apenas o número diplóide (2n= 24 cromossomos e NF= 48) e a morfologia cromossômica, posteriormente novos estudos foram anexados a tribo revelando que a morfologia cromossômica, bem como o número diplóide pode ser diferenciado entre as espécies. Além disso, já é documentada uma descontinuidade entre os cinco primeiros pares cromossomos e os demais para a tribo exceto em Osteocephalus taurinus (Anderson, 1996; Kasahara et al, 2003; et al., Faivovich,2005). O gênero Phyllodytes, pertencente à família Hylidae e subfamília Lophiohylini é popularmente conhecidoPPGGBC como “perereca das bromélias” e reúne 11 espécies distribuídas pelo Brasil e Trinidad e Tobago,sendo estas caracterizadasprincipalmente pela presença de odontóides na mandíbula, característica que as distingue dos demais hilídeos(Peixoto e Cruz, 1988; Cruz et al., 2006; Frost, 2013). Formado por animais de pequeno e médio porte, os representantes do gênero Phyllodytes apresentam, de modo geral, coloração típica amarelo- esverdeada, sendo que na região dorsal esse padrão é bastante variado (e.g. Eterovick, 1999; Peixoto et al., 2003; Caramaschi et al., 2004). Este gênero possui o desenvolvimento intrinsecamente relacionado às axilas de bromélias (Bromeliaceae), pois estas fornecem 15

refúgio, local para postura de ovos e desenvolvimentos de girinos (Teixeira et al., 1997.;Caramaschi et al., 2004). O alto grau de dependência destes animais para completar seu ciclo de vida nas bromélias os categoriza como espécies bromelígenas (Peixoto, 1995). Tidos como animais típicos de Mata Atlântica, eventuais ocorrências de exemplares em domínios morfoclimáticos mais secos, como a Caatinga, foram recentemente descritas (Caramaschi e Peixoto, 2004; Freire e Peixoto 2004). A taxonomia e a sistemática do gênero são complexas e permanecem em discussão, uma vez que diferentes autores propuseram classificações baseando-se em diferentes características diagnósticas. Caracteres relativos à reprodução e ecologia sugerem evidências convincentes da monofilia de Phyllodytes (Silva, 1998). No entanto, os escassos trabalhos realizados na tentativa de elucidar questões evolutivas e taxônomicas dentro do grupo são pouco explicativos (Peixoto et al., 2003; Caramaschiet al.,2004; Roberto e Ávila, 2013), uma vez que as poucas espécies analisadas foram avaliadas sob um único aspecto ou por ferramentas que não pontuam o real cenário das modificações. Caramaschiet al.(2004), considerando os padrões de coloração do dorso apresentado pelas espécies do gênero Phyllodytes propôs um arranjo composto por quatro grupo de espécies. O grupo P. luteolus seria composto pelas espécies P. acuminatus, P. brevirostris, P. edelmoi, P. kautskyi, P. luteolus, eP. melanomystax, enquanto que o grupo P. tuberculosus incluiria apenas a espécie que intitula o grupo, por outro lado o grupo P.auratus agruparia as espécies P. auratus eP. wuchererie por último o grupo composto apenas por P. gyrinaethes. Dados genéticos utilizados por (Faivovich et al., 2005) reforçam a ausência de ausência de monofilia destes grupos. Considerando o parafiletismo do gênero aliado a ausência de unidades genéticas que reflitam o grupo Jowers et al.(2008) baseado no sequenciamento gene mitocondriais (12S,16S e citocromo b) propôsPPGGBC um novo gênero (Phytotriades)para Phyllodytes auratus. Faivovich et al. (2005) utilizando dados morfológicos e sequenciamento de genes mitocondriais (12S, 16S e citocromo b), propõem o monofiletismo do gênero, recuperando-o como grupo mais basal para a tribo Lophiohylini. Wiens et al. (2010) em estudos mais recentes, baseados apenas em dados sequenciais de genes mitocondriais (12S e 16S) não confirmou o monofiletismo de Phyllodytes, alocando P. auratus mais próximo filogeneticamente de Itapotihyla do que das demais espécies do gênero. Os dados obtidos por Jowers et al.(2008) reforçam que a divergência existente entre P. auratusendêmico de 16

Trinidade e Tobago quando comparado aos exemplares brasileiros (P. luteolus e Phyllodytes sp.) é maior que as distâncias dentro da tribo Lophiohylini. Além disso, P. auratus apresenta caracteres comportamentais únicos que o difere das demaisespécies do gênero, uma vez que possui associação a uma planta específica que está distribuída em uma área restrita. A análise de citocromo b realizada entre duas populações de P. auratus apontou baixa divergência genética entre elas o que indica isolamento recente entre as duas localidades. Levando-se em consideração o pequeno número de espécies analisadas no estudo de Wiens (2010) ou Faivovich (2005) (P. auratus, P, luteoluse Phyllodytessp.) as relações evolutivas dentro do gênero permanecem pouco esclarecidas.

2.2.Citogenética de Anura com ênfase em Hylidae

Grande parte dos estudos citogenéticos em anfíbios referem-se à ordem Anura, apesar dos inúmeros trabalhos realizados desde 1990, período a partir do qual muitas espécies tiveram seus cariótipos estudados e descritos, ainda existem muitos anfíbios que não apresentam descrição cariotípica e são poucos os que possuem dados sobre bandeamento cromossômico(Nunes e Fagundes, 2008a). Apenas 17% das espécies de Anura apresentam dados citogenéticos descritos, sendo que a maioria destes estudos caracterizam a macroestrutura cariotípica utilizando apenas coloração convencional (King, 1990). Esta realidade também se repete para os representantes da família Hylidae. Apesar da família Hylidae ser considerada a maior em composição de espécies o número de espécies cariotipadas é relativamente reduzido sendo que 35% delas já apresentam esses dados (Catroli e Kasahara, 2008). A presença de 24 cromossomos tem sido documentada em boa parte dos representantes da família, embora esse número possa variar de 2n=18 cromossomos (ex.: Aplastodiscus leucopygius) (Catroli, 2008) até 2n=30 cromossomos (ex.: DendropsopusPPGGBC ruschii) (Nunes, 2006). Além disso, já foi documentado a presença de cromossomo B em Bokermannohyla luctuosa com 2n= 25 (Baldissera Jr. et al.,1993), bem como heteromorfismo no cariótipo de machos de Dendropsophus ruschii sugerido por Nunes (2006) se tratar de cromossomo sexual do tipo XX/XY, enquanto que o tipo ZZ/ZW foi documentado em Hyla squirella e Pseudis tocantins, porém esses dados devem ser confirmados por análises mais robustas(Yosida, 1957; Anderson, 1991). Análises moleculares de sequenciamento nuclear e mitocondrial realizados porWiens (2010) ou Faivovich (2005) aliados a morfologia cromossômica sugerem que 2n= 24

cromossomos seja sinapomorfia dos gêneros basais Myersiohyla e Phyllodytes pertencentes as tribos Cophomantini e Lophiohylini, respectivamente. Embora para este último já tenha sido documentado 2n = 22 cromossomos (Gruber, 2012). Estes autores sugerem ainda que 2n= 26 cromossomos observados nas subfamílias Pelodryadinae e Phylomedusinae seja uma plesiomorfia. Os anuros apresentam-se como um grupo interessante devido a sua abundância, grande distribuição e heterogeneidade cariotípica, estimulando assim inúmeras pesquisas a fim de determinar os mecanismos de evolução cromossômica. Dessa forma, estudos citogenéticos para o grupo despontam-se como uma ferramenta integrativa que auxiliam no estabelecimento taxonômico e o esclarecimento das relações filogenéticas entre as espécies do grupo. E à medida que as análises cromossômicas são aperfeiçoadas ao longo dos anos, a utilização destas tornam-semais necessárias e relevantes (Catroli, 2008). Os estudos citogenéticos são largamente utilizados nas investigações sistemáticas de vários organismos, pois por meio das análises destas variações é possível inferir sobre a filogenia, bem como os rearranjos cromossômicos ocorridos durante a evolução desses grupos, além de possibilitar a formulação de hipóteses populacionais (Lourenço, 1996). As primeiras descrições cariotípicas realizadas por Bogart (1973) evidenciaram que anuros morfologicamente mais primitivos apresentam cariótipos com número cromossômico maior, e que espécies mais derivadas possuem cariótipos com poucos cromossomos resultados de longos processos evolutivos. Utilizandodados citogenéticos, Bogart (1973) sugeriu que os indivíduos de famílias derivadas como Dendrobatidae, Hylidae, Leptodactilydae e Ranidae tenham surgido a partir de um cariótipo com 26 cromossomos que provavelmente sofreu redução, originando cariótipos com 24 e 22 cromossomos. As reduções ocorridas ao longo do processo evolutivo em Anura podem ser resultantes de fusões cêntricas, ou de fusão “in tandem”, apesar de existirem casos em que há uma escassez de informaçõesPPGGBC que apontem para a real causa da transformação em questão, o que inviabiliza a determinação correta da redução ou aumento do número cromossômico (Bogart, 1973, 1991; Beçak et al., 1970; e Morescalchi, 1973; Miura et al., 1995). Outros autores consideram ainda que translocações, inversões, adições, deleções e amplificações possam ter ocorrido na evolução cariotípica do grupo, mesmo que estas não estejam relacionadas com as mudanças de números cromossômicos (Bogart, 1973, 1991; Miura, 1995). As relações cariotípicas passaram a ser melhor compreendidas a partir da utilização de 18

técnicas citogenéticas mais robustascomo o bandamento-C, o método de Ag-RON, e as colorações com fluorocromos e hibridação in situ, que permitiram a determinação de homologias dos cromossomos bem como a compreensão das relações entre gêneros e espécies, por meio da detecção de rearranjos cromossômicos que podem estar envolvidos na evolução cariotípica dos anuros (Bogart 1981; King, 1990; Siqueira et al., 2004).

2.3.Estudos morfométricos em Anura

O termo morfometria se refere ao estudo que avalia quantitativamente as alterações morfológicas detectadas nos organismos (Blackith, 1965). Esta representa uma ferramenta fundamental para o entendimento da estruturação populacional e suas modificações, principalmente em estudos relacionados a descrições quantitativas, análise e interpretação da forma e suas variantes (Rohlf, 1990), poispermitem entender se as diferenças populacionais são resultantes de isolamento (geográfico ou por seleção sexual ou natural) contribuindo para o entendimento estrutural e morfológico destas populações (Ohmer et al., 2008). Além disso, permiti o entendimento taxonômico das espécies (Lee 1982, Bernal e Clavijo 2009), sendo ainda um importante mecanismo para diferenciação de espécies crípticas (Laurent 1969, 1975). Na literatura são reconhecidos dois tipos de morfometria os dados ditos convencionais em que são fornecidos informações sobre comparações entre várias medidas lineares permitindo estimar apenas o tamanho dos organismos analisados, porém pelo fatodestes serem multidimensionais estas variáveis não amostravam com precisão a forma como um todo (Adams et al., 2004). Por outro lado, os dados morfométricos fundamentados na chamada morfometria geométrica que ao invés de trabalhar com distâncias lineares baseia-se na utilização de coordenadas cartesianasPPGGBC de pontos (landmarks), os quais informam precisamente sobre as posições relativas, sendo possívelreconstruir a forma estudada e assim detectar diferenças, até então, sutis (Rohlf e Marcus, 1993). Segundo Bookstein (1991) os marcos anatômicos são classificados em três tipos: 1. Justaposição de tecidos, que são pontos onde três estruturas se encontram; 2. Ponto de máxima curvatura, que são pontos localizados nas extremidades de processos e são menos precisos devendo, por isso, serem evitados; e 3. Pontos extremos que são pontos localizados na maior distância que pode ser medida, porém são imprecisos quanto à homologia.

Os estudos morfométricos podem ser realizados utilizando diversas estruturas como asa de abelhas sem ferrão Melipona quadrifasciata (Nunes et al., 2008), crânios de Rodentia (Fornel, 2005),desde que estas sejam homólogas entre os organismos. Estudos com espécies e populações de anuros têm sido realizados utilizando análises multivariadas (Prado e Pombal, 2008; Narvaes e Rodrigues, 2009; Napoli et al., 2009), a fim de detectar diferenças sutis entre elas (Reyment et al., 1981).Em anura, os estudos utilizando a morfometria geométrica ainda são incipientes. Dados obtidos utilizando tanto a morfometria geométrica quanto convencional da estrutura craniana larval deRana sylvaticapor Larson (2002) permitiu inferir que as estruturas cranianas não permanecem imutáveis durantes os estágios de metamorfose e que os padrões alométricos estão de acordo com os previstos para o desenvolvimento craniano em tretrápodes. Por outro lado, estudos realizados por Clemente-Carvalho et al.(2008), ao analisar variação geográfica na forma do crânio em populações de Brachycephalus ephippium verificou que o conservadorismo morfológico ou a ausência deste está condicionado a metodologia utilizada. Estudos utilizando a morfometria geométrica realizados por Rozo (2012) ao analisar a forma da cabeça e do corpo em Pseudis paradoxareconhecida como um complexo de espécies foi eficiente em discriminar os exemplares oriundos de diferentes localidades, a autora reforça ainda a precisão da técnica como ferramenta para elucidar questões taxonômicas cujo a distribuição é ampla. Dentre as técnicas multivariadas mais comumente utilizadas estão as Análises de Componentes Principais (ACP) que promovem a ordenação dos dados morfométricos para que estes sejam mais facilmente interpretados (Blackith e Reyment, 1971; Reis 1988). Os estudos morfométricos durante muito tempo auxiliaram nos estudos taxonômicos clássicos, porém os dados gerados por essas análises não amostram, por exemplo, os diferentes níveis PPGGBC dos estágios de vida, bem como as mudanças relativas a plasticidade fenotípica apresentada por algumas espécies (Hebert et al., 2003). Embora, a técnica seja um procedimento de baixo custoquando comparado a outras técnicas o tempo utilizado para as análises pode ser bastante extenso e deve-se ainda se certificar de que as mudanças detectadas são da espécie em análise e não resultantes de erro do pesquisador ao inserir os marcos anatômicos.

2.4. Estudos bioacústicos em Anura

As vocalizações têm sido documentadas em muitos grupos animais, a exemplo das aves, insetos, mamíferos e anfíbios, que ao longo dos anos aprimoraram mecanismos para emissão e recepção (Gerhardt e Huber, 2002; Popple et al., 2008). A comunicação acústica entre as espécies apresenta um caráter específico adequado funcionalmente para atender as peculiaridades impostas pelo ambiente na propagação do som, bem como no intercâmbio de informações (Vielliard, 2005). Sinais acústicos provavelmente surgiram no início da história evolutiva dos anuros, dado que para a maioria das espécies é o principal mecanismo no comportamento reprodutivo (Gerhardt, 1994a; Gerhardt e Huber, 2002). De modo geral, os anurosapresentam um repertório vocal bastante variadoe são categorizados baseado no contexto em que são emitidos, os mais conhecidos são o canto de anúncio, canto agressivo (comumente utilizado durante interações agonística entre machos) e o canto de corte (emitido por machos ao detectar fêmeas nas proximidades).(Duellman e Trueb, 1986; Narins et al. 2007; Wells, 2007). O canto de anúncio (sensu Wells, 1977) mais comumente utilizado pelos machos durante as agregações reprodutivas visa a atração de parceiras reprodutivas, além de garantir a defesa de territórios (Duellman e Trueb, 1994, Poughet al. 2004). De maneira geral, as vocalizações emitidas pelos anuros afetam diretamente o sucesso reprodutivo, sendo a seleção sexual um dos principais mecanismos que condicionam a escolha de parceiros reprodutivos (Gerhardt, 1994b; Ryan, 2009). Durante a corte as fêmeas, geralmente, não emitem sons (Schlapfer e Figueroa-Sandí, 1998). A emissão do canto de anúncio é um dimorfismo sexual e embora tenha sido documentada a produção de sons por fêmeas, estes apresentam forma, amplitude e/ou função diferenciado entrePPGGBC os sexos (Ryan, 2001). Vários autores descreveram a estrutura e função do sistema fonador em anuros (Littlejohn, 1977). O canto de anúncio emitido por machos foi considerado como um dos exercícios mais custosos energeticamente quando comparado a outros vertebrados ectotérmicos. Os sons produzidos são resultantes da contração da musculatura na parede corporal, uma vez que as cordas vocais atuam com osciladores, a cavidade bucal como ressonadora e o saco vocal, embora possa atuar como irradiador sonoro, sua função primordial é a ressonância, a fim de evidenciar algumas frequências do canto (Ryan, 2001).

Machos podem apresentar alterações nasordens de magnitude devido a diferenças fisiológicas e de massa causando variação intra e interespecífica nos parâmetros acústicos. Além disso, fatores abióticos como temperatura do ar e tamanho corpóreo quando mantidos constantes podem modificar a taxa de repetição do pulso, a intensidade do canto e a duração deste (Emerson, 2001). A escolha realizada pelas fêmeas pode estar tendenciada pelas particularidades exibidas pelo canto (Kirkpatric, 1987; Abt e Reyer, 1993; Given, 1999), uma vez que este pode estar associado a performance genética do macho (Klump e Gerhardt, 1987; Pomiankowski, 1987; Kirkpatrick e Ryan, 1991; Castellano e Giacoma, 1998). Na literatura é bem documentado que em diversas espécies a frequência dominante está inversamente associada com o tamanho do corpo (Duellman e Pyles, 1983; Rand, 1985), assim as fêmeas podem verificar diferentes machos e acasalar com machos de tamanhos coespecíficos (Halliday e Verrel, 1986; Morris, 1989). Outros autores reforçam que as fêmeas podem ser atraídas por cantos mais longos (Márquez & Bosch, 1997; Castellano e Giacoma, 1998), com maiores taxas de repetição (Wöllerman, 1998), maior intensidade (Klump e Gerhardt, 1987) e mais complexos (Ryan, 1985; Kime et al., 1998). Outros autores sugerem que as fêmeas tendem a escolher baseado não apenas em características específicas, mas em atributos que evitam a hibridação ou revelem gasto energético dispensado pelo macho na corte (Wagner, 1998; Wöllerman, 1998). Uma vez que, quanto maior o investimento mais eficiente será a qualidade do sinal na difusão de uma mensagem mais nítida (Zahavi, 1991). Comumente a escolha da fêmea está associada as propriedades do canto e performance, porém o significado biológico para as preferências ainda são obscuros (Ryan, 2001). Características relativas ao tamanho corporal e distância entre machos (Pough et al. 2004),bem como a diferenciação entre machos vizinhos ou intrusos podem ser detectados por machos e fêmeasPPGGBC baseado nas peculiaridades dos cantos de anúncio dos emissores (Bee; Gerhardt, 2001). Dessa forma, os anuros possuem estratégias que minimizam ou evitam a sobreposição sonora inter ou intraespecífica (Bastos e Haddad, 1995; Given, 1999). Por sua especificidade, o canto de anúncio é considerado um mecanismo de isolamento reprodutivo pré-zigótico (Duellman e Trueb, 1994) que tem sido utilizado como ferramenta taxonômica na elucidação de espécies crípticas, bem como na descoberta de novas espécies (Pough et al.2004; Wells, 2007). No entanto, os elementos dos parâmetros acústicos podem

variar tanto individualmente quanto popularmente (Gerhardt, 1991; Giacoma e Castellano, 2001; Gerhardt e Huber, 2002). Em táxons delimitados acusticamente, o perfeito delineamento sobre as modificações sonoras intra e interpopulacional são necessários para a eficiente estimativa da posição taxonômica, bem como detectar a função da seleção sexual em gerar divergência na atividade reprodutiva (Sullivan, 1989). Estudos taxonômicos utilizando a bioacústica tem se tornado frequentes dado ao baixo custo quando comparado a outras técnicas, embora seja um método não invasivo (Nelson et al., 2005), implicações associadas a obtenção das gravações a exemplo de problemas na identificação da espécie, associado a dificuldade na identificação dos cantos contexto- dependentes algumas análises bioacústicas podem se tornar inviáveis para dados comparativos devido a diferenças na obtenção das gravações ou nos parâmetros analisados (Vielliard e Silva in press; Pombal et al.1995b).

2.5.Taxonomia integrativa como ferramenta de identificação

Atualmente, muitos cientistas vêm ressaltando que a taxonomia está em crise (Gewin, 2002; Godfray, 2002; Mallett e Willmott, 2003; Wilson, 2003; Wheeler et al.,2004). Na prática, a forma como as espécies são descritas pode ser considerado um fator determinante para o futuro da taxonomia, visto que, apesar de algumas espécies serem de difícil caracterização, existe uma necessidade de que estas sejam bem delimitadas, uma vez que são fundamentais não apenas para a manutenção de estoques precisos de espécies, mas também, porque boa parte dos assuntos relativos à ecologia, biologia e outros, são dependentes dos conhecimentos básicos sobre as espécies (Dayrat, 2005). Com o advento de novas técnicas de identificação taxonômica, a exemplo da citotaxonomia e taxonomiaPPGGBC molecular, verificou-se que estas podem compor uma importante ferramenta para o entendimento e estabelecimento de padrões geográficos de diversificação fenotípica presente em populações de anfíbios (Alexandrino et al., 2005; Arif et al., 2007; Clemente-Carvalho et al., 2008). Dessa forma, constatou-se uma aceleração na descoberta de novas espécies bem como propostas de modificações na composição de grupos (Bickford et al.,2007). No entanto, deve-se ressaltar que as informações obtidas a partir apenas de sequenciamento gênico, ou apenas oriundos de dados cromossômicos, não são suficientes para solucionar muitos dos problemas enfrentados pela taxonomia tradicional, uma vez que os

diferentes marcadores utilizados possuem taxas evolutivas distintas podendo resultar na delimitação de relações filogenéticas discordantes, principalmente em grupos de divergência recente (Russo et al.,2001). O uso exclusivo de dados morfológicos em trabalhos taxonômicos também tem mostrado limitações (Packer et al., 2009), visto que carácteres com plasticidade fenotípica e estágios imaturos são muitas vezes difíceis de serem amostrados nessas análises (Hebert et al., 2003). Em adição a essas análises trabalhos utilizando a bioacústica tem se tornado frequente em estudos taxonômicos de anuros, sendo considerada um mecanismo de isolamento pré- zigótico (Duellman e Trueb, 2004), permitindo a distinção entre espécies crípticas (Heyer et al., 1996; Ângulo e Icochea 2010) e a detecção de variações intra-específicas (Ryan e Wilcznski, 1991; Castellano et al.; 1999) e co-específicas (Cocroft e Ryan 1995). Apesar de ser uma técnica de baixo custo quando comparada a outras metodologias e de ser um método não invasivo (Nelson et al., 2005), como as demais metodologias já citadas, as análises bioacústicas também apresenta limitações, uma vez que sons de baixa intensidade podem passar despercebidos, e há dificuldade na identificação de qual contexto social o canto foi emitido (Vielliard e Silva, in press). Baseado na percepção de que em taxonomia qualquer princípio utilizado para a exclusão de outro inviabilizará o perfeito delineamento espécies é que Dayrat (2005) e Will et al., (2005), propuseram a utilização de evidências múltiplas a fim de delimitar espécies. O conceito de taxonomia integrativa torna-se especialmente mais eficiente quando comparado à desordem provocada por dados gerados por fontes individuais (Will et al., 2005). Uma abordagem multidisciplinar permite, por exemplo, desvendar espécies crípticas ou até mesmo erroneamente classificadas, bem como distinguir os complexos de espécies, uma vez que a utilização de dados morfológicos aliados a outras ferramentas como a genética e a bioacústica tendem a fornecer dados que melhor pontuam as modificações entre as espécies o que auxiliamPPGGBC na distinção entre elas,uma vez que ambas as metodologias sinalizariam sob diferentes aspectos as alterações evolutivassofridas (Fisher e Smith 2008, Wiedenbruget al. 2009).

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

O objetivo principal é verificar o potencial de dados citogenéticos, morfométricos e bioacústicos na diferenciação de espécies do gênero Phyllodytes.

3.2. Objetivos específicos

1. Analisar exemplares de Phyllodytes coletados em fragmentos de Mata Atlântica e Caatinga,por meio da aplicação de técnicas de citogenética básica e molecular (coloração convencional, bandamento C, detecção das regiões organizadoras de nucléolos, hibridação in situ fluorescente utilizando sondas de DNAr 18S);

2. Realizar uma análise citogenética e morfométrica comparativa, dentro e entre as populações amostradas, utilizando para tal marcos anatômicos aplicados na identificação de espécies de anuros;

3. Investigar os padrões de variabilidade nos parâmetros do canto de anúncio emitido por machos de Phyllodytes;

4. Através de uma análise integrativa, englobando os dados obtidos pelas diferentes metodologias utilizadas, diferenciar as espécies de Phyllodytes e suas possíveis variantes geográficas.

4. MATERIAL E MÉTODOS PPGGBC 4.1. Coleta de Material

Para a coleta de exemplares realizamos saídas noturnas quando, por meio de busca ativa visual e/ou acústica em sítio reprodutivo, os indivíduos das espécies de Phyllodytes foram localizados e coletados (Heyer et al., 1994). As coletas foram realizadas em localidades do estado da Bahia, além disso, fotografias foram tiradas da face dorsal de exemplares depositados no Museu de Biologia Prof. Mello Leitão – Santa Teresa, Espírito Santo, sendo

que no total foram analisados 100 exemplares de Phyllodytes.As localidades de amostragem selecionadas foram o Parque Estadual da Serra do Condurú - PESC (Serra Grande); Barragem de Pedra (Jequié), município de Acuípe (Ilhéus) e Reserva Particular da Natura (Serra Grande), todos situados no estado da Bahia, Brasil conforme tabela 1. Os exemplares foram eutanasiados pelo uso de lidocaína 5%. Posteriormente, realizamos a retirada de tecidos que foram preservados em álcool PA. Os exemplares foram fixados em formol 10% e, preservados em álcool etílico 70% e tombados na Coleção Zoológica da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Jequié (Licença permanente para coleta de material zoológico - Sisbio/ICMBio Nº 35068-1).

4.2. Análises Citogenéticas

Analisamos 78 indivíduos, sendo eles das espécies Phyllodytes sp.1, Phyllodytes sp.2, P. luteolus e P. melanomystax conforme tabela 1. Após a estimulação da divisão celular por meio da inoculação de agentes mitogênicos nos indivíduos por 24-48 horas (King e Rofe, 1976), cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da raspagem do epitélio intestinal. A obtenção da suspensão celular seguiu o protocolo de Schmid (1978). Para a determinação do número e morfologia dos cromossomos, foi utilizada a coloração convencional por Giemsa. A classificação cromossômica seguiu a proposta por Levan et al. (1964) adotando-se os seguintes limites para a relação de braços (RB): RB= 1,00- 1,70, metacêntrico (m); RB= 1,71-3,00, submetacêntrico (sm); RB= 3,01-7,00, subtelocêntrico (st); RB= maior que 7,00, acrocêntrico (a). Para o cálculo do número de braços cromossômicos (Número Fundamental = NF), adotamos cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como portadores de dois braços cromossômicos,PPGGBC e os cromossomos acrocêntricos como portadores de apenas um braço, posteriormente os cromossomos foram dispostos em pranchas, separados de acordo com seu tamanho. Após cariotipagem, foi analisada a distribuição da heterocromatina constitutiva pelo bandamento C (Sumner, 1972) com modificações (Hidróxido de bário (Ba(OH)2) – 35s; ácido clorídrico (HCl )13 min). .A determinação das regiões organizadoras de nucléolo foi feita por meio da impregnação pelo nitrato de prata, seguindo o protocolo de Howell e Black (1980).

A hibridação in situ fluorescente (FISH) seguiu o protocolo descrito por Pinkel et al. (1986), com algumas modificações para amplificação do gene de DNAr 18S a partir do DNA da espécie em estudo. As preparações convencionais (Giemsa, banda-C e RONs) foram analisadas em microscópio óptico. As contagens cromossômicas e observações mais detalhadas foram feitas com a objetiva de imersão, num aumento de 1000 vezes. As lâminas de FISH foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência sob filtro apropriado. As melhores metáfases foram capturadas utilizando sistema de análise de imagens e, posteriormente, os cariótipos foram montados levando-se em conta o tamanho e a posição do centrômero dos cromossomos.

PPGGBC

Espécies Sexo Número do voucher Locais de coleta Técnicas aplicadas

Phyllodytes luteolus 16♂5♀ 765*,766-769,857-860*,915-919 Barragem de Pedra, Jequié- BA. Citogenética e 13°54'21.49"S;0°15'2.74"W morfometria Phyllodytes luteolus 1♂ 4♀ 925-929 Condomínio Águas de Olivença, Ilhéus-BA. Citogenética e 15°0.5'19.3S;38°59'55.7"W morfometria

Phyllodytes luteolus 5♂ 1♀ 930,931*-934*-936 Estacionamento Pousada Ilha do desejo, Ilhéus-BA. Citogenética e 15°0.5'19.3S; 38°59'55.7"W morfometria

Phyllodytes luteolus 8♂ 1♀ 930-937,938*,939*,940* Estacionamento da Pousada 935 Morro dos Navegantes, Ilhéus- Citogenética e BA. morfometria 15°0.5'19.3S; 38°59'55.7"W

Phyllodytes luteolus 2♂ 1802,1679 APA da restinga de Guriri, São Mateus-ES. Morfometria 18°42'58"S; 39°51'32"W Phyllodytes luteolus 6♂ 1254,745,748,1262,5304,5302. Parque Municipal do Goapaba- Açu, Fundão –ES. Morfometria 19°55'57,5"S ;40°24'24"W

PPGGBC

Phyllodytes luteolus 2♂ 746,742 Médio Goiapaba-Açu, Fundão- ES. Morfometria 19°55'57,5"S; 40°24'24"W

Phyllodytes luteolus 2♂ 628,4906 Conceição da Barra, Itaúnas- ES. Morfometria 18º35'36"S 39°43'56"w Phyllodytes luteolus 6♂ 1788,295,5296,5300,5542,5543 Restinga da Setiba, Guarapari- ES. Morfometria 20º40'00"S 40°29'51"W Phyllodytes luteolus 1♂ 5573 Setiba- Parque Estadual Paulo Morfometria César Vinha,Guarapari-ES. 20º40'00"S 40°29'51"W Phyllodytes luteolus 1♂ 871 Arquipélago das Ilhas.APA,Guarapari-ES. Morfometria 20º40'00"S;40°29'51"W Phyllodytes 6♂ 5 ♀ 632*,956-965 Reserva Particular da Natura, melanomystax Serra Grande-BA. Citogenética e 14°25'57,4''S;39°01'22.3''W morfometria Phyllodytes sp.1 8♂ 4♀ 829,831,832,835,861-864 Parque Estadual Serra do Conduru, Serra Grande-BA. Citogenética e 14°29'42,5"S; 39°08'1,6"W morfometria

Phyllodytes sp.1 8♂ 3♀ 747*-749,828,830,833,834,967,968, Reserva Particular da Natura, 970,971 Serra Grande-BA. Citogenética e 14°25'57,4''S;39°01'22.3''W morfometria

Phyllodytes sp.1 11♂ 1♀ 886,887*,888,889*,890*,891- Barra Grande, Península de 895*,896*897 Maraú –BA. Citogenética e 13°59'14,1"S;38°56'49,6"W morfometria

PPGGBC

Phyllodytes sp.2 1♂ 914* Parque Estadual Serra do Citogenética e Conduru, Serra Grande-BA. morfometria 14°29'42,5"S;39°08'1,6"W

PPGGBC

4.3. Análises Morfométricas

Para as análises morfométricas analisamos 89 exemplares machos pertencentes às espécies Phyllodytes sp.1, Phyllodytes sp.2, P. luteolus e P. melanomystax conforme tabela 1. As imagens da face dorsal dos exemplares foram obtidas com auxílio de uma câmera digital Nikon P510 (16.1 megapixels), com escala métrica. Posteriormente, com o auxílio do softwaretpsDig2 versão 2.16 (Rohlf, 2010) inserimos nas imagens seis marcos anatômicos do tipo I (Figura 1),. Os marcos anatômicos foram então alinhadas segundo a sobreposição de Procrustes. Posteriormente, realizamos uma Análise de Componentes Principais (ACP) utilizando o programa MorphoJversão 1.02 (Klingenberg, 2011), e o software PAST (Palaeontological Statistics) versão 2.17c (Hammer et al., 2001) para verificar a variação da forma entre as espécies.

Figura 1. Marcos anatômicos utilizados nas análises morfométricas. Em evidência umexemplar de PhyllodytesPPGGBC luteolus.

4.4.Análise do canto

Machos em atividade de vocalização foram gravados em campo com gravador digital Marantz e microfone direcional Sennheiser. Em laboratório, analisamos as gravações através do software Raven 1.4. (frequência amostral 44 kHz e 16 bits de resolução) com as seguintes

configurações window type = Hann, window size = 1024 overlap = 50%), por meio do qual espectogramas e sonogramas foram construídos. Para cada canto de anúncio analisamos os seguintes parâmetros acústicos das espécies: duração do canto (período de tempo entre o início e o término de cada canto), intervalo entre cantos (período de tempo entre o final de um canto e o início do canto posterior), frequência dominante (faixa de frequência com maior intensidade), número de notas por canto (quantidade de unidades individuais do som), duração das notas (tempo gasto na emissão das unidades individuais do som). Analisamos no total de 361 cantos de anúncio emitidos por machos de Phyllodytes conforme tabela 1.

5. RESULTADOS

5.1.Análises citogenéticas

As espécies estudadas de Phyllodytes apresentaram uma variação de número diploide, sendo que Phyllodytes sp. 2 e P. luteolus apresentaram 2n= 22 e NF= 44 e Phyllodytes sp.1 e P. melanomystax apresentaram 2n=24 e NF= 48. Os cariótipos obtidos mostraram-se bastante semelhantes, diferindo quanto a morfologia de alguns pares cromossômicos (Figura 2). Para todas as espécies os pares 1, 9, 10, 11 e 12 mostraram-se metacêntricos, e o par 4 subtelocêntrico. Por outro lado, os pares 2, 3, 6 e 8 variaram entre metacêntricos e submetacêntricos e os pares 5 e 7 variaram entre submetacêntricos e subtelocêntricos. Pode-se ainda observar a ocorrência de uma constrição secundária em um dos cromossomos do par 7 de P. melanomystax e no segundo par cromossômico de P. luteolus coletado em Ilhéus responsável por um heteromorfismo de tamanho entre os homólogos. O bandamentoPPGGBC C (figura 3) revelou a presença de blocos de heterocromatina constitutiva, localizados na região pericentromérica em boa parte dos cromossomos para todas as espécies. Blocos banda C positivos também puderam ser observados intersticialmente no cromossomo 4 da espécies Phyllodytes sp. 1 coletado no Parque Estadual Serra do Conduru e terminais nos cromossomos 7 e 2 em P. melanomystax e P. luteolus coincidentes com a marcação das RONs, respectivamente. Com relação ao número e localização das RONs, P.melanomystax apresentou RONs na posição terminal dos braços longos do par 7, coincidente com um bloco de heterocromatina

e com a constrição secundária em um dos homólogos do par.Phyllodytes luteolus e Phyllodytes sp.2 apresentaram RONs no braço curto dos cromossomos do par 2, enquanto que Phyllodytessp.1 apresentou RONs terminais localizadas nos braços longos do par 8.A técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) confirmou as RONs localizadas nos cromossomos 8 e 2 para Phyllodytes sp.1 oriundos do Parque Estadual Serra do Conduru eP. luteolus coletados na Barragem de Pedra, respectivamente.

Figura 2.Cariótipos submetidos à coloração convencional comGiemsa:a) P.luteolus - Ilhéus b) Phyllodytes sp.2 PPGGBC c) P. luteolus – Barragem de Pedra d) Phyllodytes sp.1 - PESC e) Phyllodytes sp.1 – Reserva Particular da Natura f) Phyllodytes sp.1 – Barra Grande g) Phyllodytes melanomystax - Reserva Particular da Natura. Em destaque os cromossomos nucleolares submetidos à impregnação por nitrato de pratae a hibridação in situ fluorescente (FISH).

Figura 3.Cariótiposde:a) P.luteolus - Ilhéus b) Phyllodytes sp.2 - PESC c) Phyllodytes sp.1 - PESC d) Phyllodytes sp.1 – Reserva Particular da Natura e) Phyllodytes melanomystax - Reserva Particular da Natura, submetidos a bandamento C.

5.2. Análises morfométricas

Os dois primeiros componentes principais foram suficientes para acumular 83.1% da variação existente entre as espécies coletadas do gênero Phyllodytes.Sendo que no primeiro componente principal (53,15%) a espécie Phyllodytes sp.1 difere das demais espécies quanto a forma da cabeçaPPGGBC, sendo que este apresenta a cabeça mais alongada e focinho proeminente, enquanto que P. luteoluse P. melanomystax possuem a cabeça mais curta e focinho mais curto, por outro lado Phyllodytes sp.2 possui a cabeça mais curta em relação aos demais e o focinho curto, por outro lado no segundo componente principal (29,95%) a espécie Phyllodytes sp.2 foi distinguida das demais (figura 4). Considerando a variabilidade morfológica apresentada pelos machos de P. luteolus foi realizada uma ACP (figura 5) entre as localidades amostradas (tabela 1). Os dois primeiros

componentes acumularam cerca de 84% da variação total, distribuídos no primeiro componente 55,2% e no segundo componente 28,8%. Os machos coletados na Barragem de Pedra apresentaram formas da cabeça distinta das demais localizadas.

Figura 4.Representação dos dados obtidos através da análise dos índices de variância de cada Componente Principal (ACP) entre as quatro espécies do gênero Phyllodytes. Em destaque as grades de deformação evidenciando o sentido e a origem das alterações, ao lado tracejado a forma mediana apresentada pelos machos de Phyllodytes e em linha contínua as alterações cranianas a esse modelo.PPGGBC

Figura 5.Representação dos dados obtidos através da análise dos índices de variância de cada Componente Principal (PCA) entre os machos de Phyllodytesluteolus coletados na Barragem de Pedra de Pedra, Ilhéus (municípios da Bahia) e do Espírito Santo.

Além disso, as espécies diferiram quanto o padrão de coloração, sendo que os exemplares de P. luteolus apresentam coloração palha esverdeado e o ventre amarelado com presença de uma linha estreita negra posicionada lateralmente que parte do canto do olho até o meio dos flancos (PPGGBCBokermann, 1966), enquanto que a espécie P.melanomystax apresenta uma lista marrom escuro no focinho e o dorso verde amarelado (Caramaschi,1992), já a espécie Phyllodytes sp.1 apresenta coloração uniforme amarelo alaranjada e por fim a espécie Phyllodytes sp.2 apresenta o dorso amarelado, com uma faixa negra que vai do canto dos olhos até os flancos, sendo o que o dorso possui vários pontos pretos . Considerando o padrão de coloração até recentemente as espécies Phyllodytes sp.1 e P. luteolus foram confundidas.

5.3. Análise do canto

Os dados referentes aos parâmetros acústicos analisados estão sumarizados na tabela 2.

Phyllodytes luteolus

Machos de P. luteolus quando em atividade de vocalização executaram dois tipos de cantos, ambos pulsionados. Para nossas análises consideramos apenas o canto que Weygoldt (1981) classificou como canto de anúncio. O canto de anúncio emitido por machos P. luteolus provenientes da Barragem de Pedra de Pedra (figura 6) diferiram quanto alguns parâmetros quando comparados com os machos oriundos de Ilhéus, por isso ambos serão analisados separadamente. Os machos oriundos da Barragem de Pedra de Pedra apresentaram maior duração do canto 4.72s (DP=3.02;4.93-4.50;n=40) em relação aos cantos emitidos pelos machos de Ilhéus 4.54s (DP=1.88;7.92-1.43;n=55). Por outro lado, o intervalo entre os cantos é menor nos emitidos pelos machos da Barragem de Pedra de Pedra 0.14 (DP=0.01;0,15-0,12;n=40) quando comparado aos de Ilhéus 0.16 (DP=0.07;0,25-0.04;n=55). Os machos provenientes da Barragem de Pedra emitiram em média 20 notas por canto, enquanto que os de Ilhéus emitiram apenas 12. A frequência dominante apresentada pelos machos de Ilhéus foi maior 3055.4kHz (DP=100.8;3648.8-3356.0;n=55) que a exibida pelos machos da Barragem de Pedra de Pedra 3008.1kHz(DP=170.4;3602.06-2414.2;n=40). Os machos de Ilhéus apresentaram duração média das notas do canto de 0.17s (DP=0.02;0.22-0.15;n=55), enquanto que os da Barragem de Pedra foram de 0.09s (DP=0.0; 0.09;n=40).

PPGGBC

A mp litu de (K u)

Fre qu ênc ia (H z)

Figura 6. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de Phyllodytes luteolus, gravado na Barragem de Pedra de Pedra, município de Jequié, estado da Bahia.

Phyllodytes melanomystax

O canto de anúncio executado pelo macho de P. melanomystax(Figura 8)é composto por uma única nota harmônica. A duração média foi de 0,07s (DP=0.002;0.07-0.06;n=8), e frequência dominante média de 2756.2 kHz (DP=786.0; 3359.2-1765.7;n=8). O canto foi emitido em um intervalo de 12.39 (DP=13.9;32.9-1.44;n=8). PPGGBC

A mp litu de (K u)

Fre qu ênc ia (H z)

Phyllodytes sp.1

A descrição do canto de anúncio da espécie (Figura 9) baseia-se em amostras de sinais acústicos emitidos por sete machos conforme tabela 1. O canto de anúncio é composto por uma série de 6 a 15 notas simples e apresenta frequência dominante média de 1259.5khz (DP=504.7;2710.3-2940.0;n=227), e duração média de 6,72s (DP=196.5;108.6-2.354;n=227). A duração média das notas do canto é de 101,5s (DP=545.8;2939.9-0.19;n=227). O canto foi emitido em intervalos de 0.57s (DP=311.5;1.67-0.21). PPGGBC

A mp litu de (K u)

Fre qu ênc ia (H z)

Figura 8. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de Phyllodytes sp.1, gravado em Barra Grande, Península de Maraú, estado da Bahia

Phyllodytes sp.2

Um único macho de Phyllodytes sp.2 foi gravado vocalizando em uma bromélia epífita. O canto de anúncio da espécie (figura 10) é composto por uma única nota harmônica e apresenta duração média de 11,04s (DP= 37.4;11.06-11.01;n=31).Os cantos foram emitidos num intervalo de 0,28s (DP=0.004;0.28;n=31) e frequência dominante de 2117.1khz (DP=491.1;2151.9-2082.4;n=31). A duração média das notas do canto foi de 0.43 (DP=0.49;0.78-0.08;n=31). O canto foi emitido em intervalos de 0.28 (DP=0.004;0.28;n=31).

PPGGBC

Tabela 2. Parâmetros acústicos analisados nos cantos de anúncios emitidos por machos de Phyllodytes referente a diversas localidades da Bahia.

Phyllodytes luteolus Phyllodytes luteolus Phyllodytes Phyllodytes sp.1 Phyllodytes sp.2 (n=1) Barragem de Pedra (n=2) Ilhéus (n=5) melanomystax (n=1) (n=7)

Duração do canto (s) 4.72 4.54 0.07 6.72 11.04 (DP=3.02;4.93-4.50) (DP=1.88;7.92-1.43) (DP=0.002;0.07-0.06) (DP=196.5;108.6-2.354 (DP= 37.4;11.06- 11.01) Número de notas por canto 20 12 8 8 31 (DP=4.24;23-17) (DP=5.10;21-4) (DP=1,82;15-6)

Duração das Notas (s) 0.09 0.17 - 101.5 0.43 (DP=0.0; 0.09) (DP=0.02;0.22-0.15) (DP=545.8;2939.9-0.19) (DP=0.49;0.78-0.08)

Intervalo entre cantos (s) 0.14 0.16 12.39 0.57 0.28 (DP=0.01;0,15-0,12) (DP=0.07;0,25-0.04) (DP=13.9;32.9-1.44) (DP=311.5;1.67-0.21) (DP=0.004;0.28)

Frequência dominante (kHz) 3008.1 3055.4 2756.2 1259.5 2117.1 (DP=170.4;3602.06-2414.2) (DP=100.8;3648.8- (DP=786.0;3359.2-1765.7 (DP=504.7;2710.3-2940.0 (DP=491.1;2151.9- 3356.0) 2082.4 Estrutura do Canto Pulsionado Pulsionado Harmônico Pulsionado Harmônico

PPGGBC

A mp litu de (K u)

Fre qu ênc ia (H z)

Figura 9. Oscilograma (acima) e espectrograma (abaixo) representando o canto de anúncio de

Phyllodytes sp.2, gravado no Parque Estadual Serra do Condurú, Distrito de Serra Grande,

estado da Bahia.

6. DISCUSSÃO

6.1. Análises citogenéticas

O número diplóide 2n=24 cromossomos é considerado uma das características citogenéticas mais marcantes da família Hylidae, apesar de já haverem sido descritas variações que vão de 2n=18 cromossomos (ex.: Aplastodiscus leucopygius) (Catroli, 2008) até 2n=30 cromossomos (ex.: Dendropsopus ruschii) (Nunes, 2006). Os cariótipos reduzidos com 2n=22 cromossomos de alguns indivíduos de Phyllodytes, de acordo com Gruber et al. (2012) provavelmente se originaram de um evento de fusão, a partir de um ancestral com 2n=24 cromossomos. Estes autores, propõem ainda que esta fusão em tandem tenha ocorrido entre o par de cromossomosPPGGBC da NOR e um algum outro par de cromossomo. Os autores supracitados sugerem ainda que o número diplóide 2n=22 cromossomos seja uma sinapomorfia do gênero, porém nossos resultados reforçam a necessidade do melhor delineamento citogenético para o gênero, uma vez que esse número pode variar entre as espécies. De acordo Bogart (1973) os cariótipos de todas ou quase todas as espécies com número diplóide diferente do número diplóide modal para a família são, provavelmente, derivados de um ancestral comum que apresentava 2n=26 cromossomos. Essa proposta foi corroborada pelos resultados dos estudos de Faivovich et al. (2005), que propõem filogenia

para os hilídeos utilizando dados moleculares, porém não deixando de levar em consideração o número cromossômico das espécies. De acordo com Gruber et al. (2012), Phyllodytes apresenta cinco pares cromossômicos (1, 9, 10, 11 e 12) com morfologia conservada e outros sete (2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8) de morfologia variada, padrão este que corrobora com nossos estudos. Analisando essas fórmulas cariotípicas, pode-se inferir que as semelhanças entre essas espécies é resultado de sua ancestralidade comum, já as diferenças na macroestrutura resultantes do posicionamento do centrômero devem-se, provavelmente à inversões pericêntricas como sugerido para espécies dos gênero Dendropsophus (Medeiros, 2005), Hypsiboas (Carvalho et al., 2009) e Phyllomedusa (Barth, 2008), as quais possivelmente constituam o principal mecanismo de evolução cariotípica para o grupo. O bandamento C revelou uma maior diferenciação entre as espécies analisadas, identificando três padrões de distribuição e quantidade dos blocos de heterocromatina. A diminuição do número e do tamanho de blocos heterocromáticos em regiões pericentroméricas, em muitos casos está associada a presença de blocos banda C positiva em regiões intesticiais e/ou terminais, como pode ser observado para P. melanomystax e P. luteolus. Esse fato parece indicar que a ocorrência de heterocromatina intersticial e/ou terminal possivelmente resulta de eventos de inversão pericêntrica envolvendo os blocos proximais à região centromérica, resultando no novo posicionamento (Medeiros, 2005; Carvalhoet al., 2009). Considerando as RONs, estas são simples e localizadas terminalmente nos braços longos dos pares 7 e 8 em P. melanomystaxe Phyllodytes sp.1 respectivamente. Esses pares cromossômicos apresentam a mesma morfologia nas duas espécies indicando que eles possam ter uma ancestralidade comum e sua localização esteja dependente de rearranjos que tenham ocorrido em outros pares adjacentes durante a evolução cromossômica do grupo. A existência de homeologias entrePPGGBC pares de diferentes espécies pode ser confirmada em estudos dos gêneros Physalaemus (Quinderé, 2007) e Phyllomedusa (Bruschi, 2010). Como nos exemplares analisados por Gruber et al. (2012) e em P. luteolus e Phyllodytes sp.2 as RONs se revelaram no par 2 do complemento cromossômico, é possível sugerir que este seja um marcador para os indivíduos com 2n=22 cromossomos e que as RONs terminais nos braços longos de um par submetacêntrico, sejam marcadores para os de 2n=24 cromossomos.

Alguns autores propuseram que a presença da NOR localizada em um único par ( Schmid 1978 , Green e Sessions 2007 ,Schmid et al. 2010 ) seja uma particularidade comum à maior parte das espécies da tribo Lophiohylini, este fato também tem sido observado em representantes da subfamília Hylinae pertencentes aos gêneros Bokermannohyla (Faivovichet al., 2005), Hyla (Laurenti, 1768), Hypsiboas (Wagler, 1830) e Scinax (Wagler, 1830) ( Catroli et al. 2011 , Cardozo et al. 2011 ). Embora descrito na literatura, alguns autores sugerem que os pares 10,11 e 12 sejam portadores da NOR e há indícios de que na verdade se trate do mesmo par cromossômico dentro da tribo como os observados para P. melanomystaxe Phyllodytes sp.1(Kasahara et al., 2003, Gruber et al., 2012). Embora a presença da NOR em um pequeno cromossomo seja considerada uma plesiomorfia para a subfamília em nossos estudos essa marcação diferiu quanto ao par, apesar da marcação aqui observada ser em um cromossomo de pequeno porte (Cardozo et al.,2011). Os resultados indicam que essa condição pode variar entre as espécies. Condições divergentes a essa como o observado por Gruber et al. (2012) para Argenteohylasiemersi e em Phyllodytes, seria uma condição derivada. O heteromorfismo de tamanho observado tanto em P. melanomystaxquanto em P. luteolus, bem como a marcação da NOR em apenas um dos pares cromossômicos para todas as espécies exceto em P. luteolus coletado na Barragem de Pedra de Pedra pode ser resultado de atividade diferencial do gene ribossomal. Embora translocações/transposições e inversões pericêntricas sejam os eventos mais prováveis de terem ocorrido no grupo em questão, acarretando nas diferenças entre as espécies, não podemos afirmar que estes foram os únicos eventos envolvidos na evolução cromossômica do grupo, pois sabe-se que esses podem ser mais complexos, como observado por Ventura (2009), através de pintura cromossômica, em roedores do gênero Akodon. Os resultados obtidos reforçam as contribuições da citogenética como ferramenta taxonômica, uma PPGGBCvez que os marcadores utilizados permitiram a descriminação correta das espécies inclusive como marcadores específicos para cada uma delas, uma vez que a evolução cromossômica pode ser considerada independente das modificações morfológicas e/ou molecular, já que as taxas de mudança entre esses marcadores são muito diferenciadas. Não há dúvida, entretanto, de que os cromossomos são caracteres poderosos para inferências de relações filogenéticas e que seria difícil discutir sobre mudanças evolutivas sem um bom entendimento da estrutura dos cromossomos (Bertolloto, 2006) e suas homologias, que podem ser acessadas por bandamentos ou FISH (Dobigny et al., 2004). 44

No entanto, vale ressaltar que apesar do baixo custo apresentado pela técnica quando comparado a outras ferramentas o tempo para execução associado ao método invasivo em alguns casos limita aplicação da técnica.

6.2. Análise morfométrica

A morfometria geométrica, por detectar diferenças sutis permitiu a distinção não somente entre espécies, mas também ao nível populacional medindo a diversidade intra e interespecificamente entre uma mesma espécie. A separação observada entre as espécies isolando o Phyllodytes sp.2 se deve ao maior tamanho apresentado por ele quando comparado as demais. Embora seja reconhecido que os anuros apresentem morfologia conservada dentro e entre as espécies (Heyer, 1979; Austin et al., 2002; Lougheed et al., 2006), Clemente- Carvalho et al,.2008, em um estudo de variação geográfica na forma do crânio em populações de Brachycephalus ephippium verificou que o conservadorismo morfológico ou a ausência deste está condicionado a metodologia utilizada. Estudos realizados por Ohmer et al.(2008), utilizando populações distintas de Dendropsophus ebraccatus demonstraram que apesar dos caracteres fenotípicos serem variáveis entre populações e regiões biogeográficas, não são preditos por filogenética ou distância geográfica, o que evidencia um papel neutro desses eventos na diversificação destas características. A discordância entre a história das linhagens e evolução do fenótipo demonstra que outros mecanismos microevolutivos como seleção (Sandoval, 1994; Sandoval e Nosil, 2005; Rosenblum, 2006; Richards e Knowles, 2007) deriva genética (Hoffman et al.; 2006.; Abbott et al., 2008), ou ambos (Slatkin, 1985), podem contribuir para a diversificação fenotípica entre as populações (Gillespie e Oxford, 1998; Abbott et al., 2008). A diferenciaçãoPPGGBC morfológica apresentada por machos de P. luteolus entre as diferentes localidades corroboram com as diferenças nos parâmetros acústicos. A diferença na forma craniana apresentada pelas espécies pode ter acarretado diferenças significativas nas características espectrais dos cantos. Além disso, já é documentado na literatura que machos de menor tamanho corpóreo tendem a vocalizarem em frequências mais altas ao passo que machos maiores executam o canto em frequências mais baixas (Loftus-Hills 1973 e DuellmanePyles 1983). Porém, em nossas análises as frequências apresentada pelos machos

não apresentaram valores discrepantes, embora a frequência executada pelos machos de Ilhéus seja maior. Baseado nos padrões de coloração do dorso das espécies do gênero Phyllodytes Peixoto et al.(2003) propôs três padrões de cores que resultaria em três categorias distintas de espécies. Posteriormente, anexando novos estudos Caramaschiet al.(2004) sugeriu um novo rearranjo originando quatro grupos de espécies. Embora, o padrão de coloração tenha sido o caráter distintivo utilizado pelos autores supracitados vale ressaltar que a espécie Phyllodytes sp.1 era até recentemente confundida com P. luteolus quando o critério para distinção baseava-se apenas na coloração, o mesmo padrão polimórfico pode ser observado quando comparado ao exemplar Phyllodytes sp.2 com P.kautsky. Nesse contexto, aliado as fortes evidências sobre ausência de monofilia destes grupos (Faivovich et al., 2005), trabalhos sob a perspectiva da taxonomia integrativa seriam eficientes na elucidação de incertezas taxonômicas e evolutivas dentro do gênero.

6.3. Análise do canto

Os parâmetros analisados nos cantos de anúncio das espécies do gênero Phyllodytes assim como observado por Lima et al.,2008 ao descrever o canto de P. edelmoi diferiram quanto a duração do canto e número de notas sendo que as de P. luteolus, e P. melanomystax apresentaram notas mais curtas e menores quando comparados as demais espécies, além disso P. melanomystax e Phyllodytes sp.2 possuem cantos harmônicos diferindo das demais que são pulsionados. Baseado nas estruturas do canto Gerhardt (1991, 2002), observou que algumas propriedades deste variavam individualmente e as denominou de propriedades dinâmicas, enquanto as menos variáveis as chamou de propriedades estáticas. Em 1992, esse mesmo autor propôs que PPGGBCo canto de anúncio codificava ambas as mensagens de caracterização das espécies, assim como, os atributos do macho. Dessa forma, as características do cantopodem estar sob pressões seletivas diferentes e por este motivo apresentam níveis de variação distintos (Reinhold, 2009). Além disso, alterações relacionadas à parâmetros acústicos como frequência dominante, número de pulsos, duração, taxa de repetição de várias espécies estão relacionados à escolhas realizadas pelas fêmeas (Klump e Gerhardt, 1987; Gerhardt,1991; Ryan e Keddy- Hector, 1992). Alguns autores propõem ainda que variáveis ambientais e sociais exercem

influência sobre o canto (Wells, 1988; Wagner, 1992; Wilczynski e Ryan, 1999), outros reforçam que a origem dessas variações estejam relacionadas a características fenotípicas (Loftus-Hills e Littlejohn, 1971; Rand,1985; Wagner, 1989; Bastos e Haddad, 1999). Diferenças relacionadas aos parâmetros acústicos como sugerido por Pombal et al.(1995), podem não estar associada a alterações biológicas, mas sim ser resultado de diferenciação populacional e/ou geográfica. Por outro lado, as diferenças nos parâmetros acústicos apresentados pelos machos de P. luteolus em diferentes localidades pode estar associada ao sítio de vocalização analisado, ao contrário dos exemplares da Barragem de Pedra da Pedra em que os bromeliais estavam localizados em área de Caatinga distante de centros urbanos, os exemplares de Ilhéus foram coletados em ambientes urbanos em bromeliais de pousadas, por exemplo. Amaral (2009), ao comparar populações de Hypsiboas albopunctatus em uma abordagem morfológica e bioacústica verificou que as populações urbanas executaram uma menor taxa de repetição de notas quando comparado ao ambiente urbano, dado também observado em nossas análises. O autor sugere que essa alteração esteja associada aos tamanhos populacionais reduzidos, aliado a mudanças comportamentais dos machos e da estrutura dos coros em ambientes urbanos. Embora, não tenha sido estimado o tamanho populacional em ambos as localidades estes podem estar submetidos a pressões seletivas distintas. Sun e Narins (2005) ao testar o efeito de playback do barulho de aviões e motocicletas em uma assembleia de anuros na Tailândia observaram que as espécies Microhyla butleri, Rana nigrovittata e Kaloula pulchra diminuíram significativamente a taxa de canto ao passo que a espécie Rana taipehensis aumentou consideravelmente a taxa de repetição de canto. Para o gênero Phyllodytes, atualmente apenas sete espécies apresentam dados relativos ao canto descritos na literatura sendo eles: P. luteolus (Weygoldt 1981), P. melanomystax (Nunes, et al.2007)PPGGBC, P.edelmoi (Lima et al. 2008), P. gyrinaethes (Roberto e Ávila 2013), P.kautsky (Simon e Peres 2012), P.tuberculosus (Juncá, et al.2012)e P. wuchereri (Cruz, et al.2014). Ainda assim algumas questões permanecem incertas dentro do gênero. Baseado na estrutura do canto executado pelas espécies do gênero, Roberto e Ávila (2013) propuseram dois grupos os que emitiam notas não pulsionadas com estrutura harmônica como P.kautsky eP. melanomystax e estasseriam espécies do grupo P.kautsky, enquanto as que apresentassem notas pulsionadas como P.edelmoi, P. luteolus e P.gyrinaethes seriam do grupo P. luteolus.

Segundo esse critério a espécie Phyllodytes sp.2 estaria alocada no grupo primeiro grupo, ao passo que Phyllodytes sp.1 no segundo. Embora, os parâmetros acústicos sejam um importante mecanismo de isolamento reprodutivo pré-zigótico utilizado como ferramenta em estudos taxonômicos e sistemáticos a fim de distinguir espécies morfologicamente semelhantes (De la Riva et al. 1996, Garcia et al. 2001), a restrição a um dos sexos aliado ao número amostral reduzido tendem a gerar diagnósticos imprecisos sobre a real variabilidade da espécie (Glaw et al., 2010). Apesar disso, trabalhos bem sucedidos têm sido realizados e questões taxonômicas inclusive em grupos de difícil delimitação têm sido esclarecidos baseados em dados acústicos. Pombal Jr e Bastos (2003) apontam a importância da utilização de parâmetros acústicos em abordagens taxonômicas, destacando que o grupo S. perpusillus baseado nessas abordagens pode ser corretamente classificado como um grupo monofilético. Dessa forma, análises multifacetadas tais como a combinação de dados acústicos, variação geográfica e morfométrica tendem a esclarecer a forma como os processos microevolutivos atuam nessas populações (Foster e Cameron, 1996).

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A partir das análises citogenéticas em Phyllodytes pode-se inferi que as semelhanças cariotípicas entre as espécies Phyllodytessp.1 e P. melanomystax são provavelmente resultado de uma ancestralidade comum, e que as diferenças apresentadas por Phyllodytes sp.2 e P.luteolus são resultantes do posicionamento do centrômero, provavelmente devido à inversões pericêntricas. Os resultados reforçam ainda a necessidade do melhor delineamento citogenético para o gênero, uma vez que esse número pode variar entre as espécies. Por detectar diferenças sutis, a morfometria foi eficiente na separação das espécies inclusive diagnosticandoPPGGBC diferenças populacionais. Estas diferenças reforçaram os dados observados pelas análises acústicas que por sua especificidade evidenciou diferenças que sugerem que estes animais podem estar submetidos a pressões seletivas distintas a fatores geográficos.

Embora, nos últimos anos uma gama enorme de ferramentas ditas integrativas tenham surgido a fim de otimizar a identificação das espécies, porém o sucesso não dependerá apenas do surgimento de novas temáticas, mas principalmente o incentivo à produção de inventários

de espécies e fornecimento de dados básicos sobre as espécies são mecanismos utilizados para minimizar o chamado “impedimento taxonômico” (Evenhuis,2007).

É reconhecido que os procedimentos tradicionais continuarão necessários em muitos episódios, porém a taxonomia precisa ser multifacetada e incluir novos enfoques para que a definição de espécie se torne melhor caracterizada de modo que o conceito de taxonomia integrativa dissipe conflitos passados entre as mais diversas áreas e haja integração não apenas de metodologias, mas principalmente de profissionais. Dessa forma, a escolha de animais modelos como os exemplares do gênero Phyllodytes, a identificação correta dos exemplares e a delimitação correta de sua ocorrência são essenciais na definição de áreas prioritárias para a conservação (Wheeler, 2008).

PPGGBC

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