Conformation of Met5-enkephalin determined by high field PMR spectroscopy

Roques BP, Garbay-Jaureguiberry C, Oberlin R, Anteunis AK & Lala AK, Nature (1976) 262, 778-779.

2 Potency of opioid peptides to inhibit the binding of [3H]DAGO and [3H]DTLET from rat brain tissue at 35°C.

Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr (DSLET) Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Thr (DTLET)

(DPLPE) (DPDPE)

3 Individual examples of autoradiograms showing the binding of 3 nM [3H]DAMGO (MOR) and 3 nM [3H]DTLET (DOR) at two weeks post-lesion in the L4 lumbar segment of rat spinal cord

Time-related modifications in 3 nM [3H]DAMGO and 3 nM 3 The four different examples correspond to rats with: a [ H]DTLET specific binding in laminae I and II of the L4 sham operation on the left sciatic nerve (sham), a loose segment for intact rats, shamA rats with a right sciatic nerve ligation of the right sciatic nerve and a sham operation on section. the left one (lig.), a section of the right sciatic nerve (sec.) 4 and a right T13-S2 dorsal rhizotomy (rhiz.). From Besse D, Lombard M.C., Perrot S. & Besson J.M., Neurosci. (1992) 50 921-933. Autoradiographic study of µ and ∂ opioid binding sites and neutral endopeptidase-24.11 in rat dorsal root rhizotomy

[3H]DAGO (µ)

[3H]DTLET ( )

[3H]HACBO-Gly (NEP)

From J.M. Zajac, M.C. Lombard, M. Peschanski, J.M. Besson & B.P. Roques. 5 Brain Research (1989) 477, 400-403. RB101(S), a dual inhibitor of enkephalinases does not induce antinociceptive tolerance, or cross-tolerance with morphine: a c-Fos study at the spinal level

Photomicrographs illustrating carrageenin-evoked c-Fos protein immunoreactivity in frontal sections (40 µm) of the dosal horm at the level of l4-L5 segments.

From Le Guen S., Noble F., Fournié-Zaluski, MC., Roques BP, Besson JM. & Buritova J.. 6 Eur. J. Pharmacol. (2002) 441, 141-150. Travaux effectués en collaboration entre nos deux unités

1 • concernant la distribution des récepteurs mu, delta, kappa, et inhibiteurs d’enzyme

1987. J.M. ZAJAC, P. DELAY-GOYET, M. PESCHANSKI, N. SALES, Y. CHARNAY, G. GUILBAUD, Y. AGID and B.P. ROQUES. Proceedings of Colloquim of Protides of Biological Fluids, H. Peeters, Ed., Pergamon Press Oxford, 1987, 35, pp. 157-160. "Distribution in the brain spinal cord (rat and human of enkephalin targets (mu, delta opioid receptors and enekphalinase) in various physiophathological conditions ».

1988. J.M. ZAJAC, M. PESCHANSKI, J.M. BESSON and B.P. ROQUES. in Pain Res. Clinical Management, .R. Dubner, G.F. Gebhart and M.R. Bond Eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1988, vol. 3, 436-441. "High resolution autoradiography of opioid receptors and enkephalinase in the rat spinal cord".

1989. J.M. ZAJAC, M.C. LOMBARD, M. PESCHANSKI, J.M. BESSON and B.P. ROQUES. Brain Res., 1989, 477, 400-403. "Autoradiographic study of mu and delta opioid binding sites and neutral endopeptidase 24-11 in rat after dorsal root rhizotomy".

1989. J.M. BESSON, M.C. LOMBARD, J.M. ZAJAC, D. BESSE, M. PECHANSKI and B.P. ROQUES. Proc. of Sensory Information in the Superficial Dorsal Horn of the Spinal Cord, F. Cervero, G.J. Bennett and P.M. Headlay Eds., Plenum Publishing Corporation, 1989, pp. 415-428. "Opioid receptors in the dorsal horn of intact and deafferented rats : autoradiographic and electrophysiological studies".

1990. D. BESSE, M.C. LOMBARD, J.M. ZAJAC, B.P. ROQUES and J.M. BESSON. International Narcotic Research Conference 1989, Progress in Clinical and Biological Research, vol. 328, A.L. Liss Inc., New York, 1990, 179-182. "The use of [3H]DAGO to label projections of this primary afferent fibres at the super ficial dorsal horn level of the rat spinal cord".

1990. D. BESSE, M.C. LOMBARD, J.M. ZAJAC, B.P. ROQUES and J.M. BESSON. International Narcotic Research Conference 1989, Progress in Clinical and Biological Research, vol. 328, A.L. Liss Inc., New York, 1990, 183-186. "Pre- and post-synaptic location of mu, delta and kappa opioid receptors in the superficial layers of the dorsal horn of the rat spinal cord ».

7 Travaux effectués en collaboration entre nos deux unités

2 • utilisation de cFos

1994. C. ABBADIE, P. HONORE, M.C. FOURNIE-ZALUSKI, B.P. ROQUES and J.M. BESSON. Eur. J. Pharmacol., 1994, 258, 215-227. "Effects of opioids and non-opioids on c-Fos-like immunoreactivity induced in rat lumbar spinal cord neurons induced by noxious heat stimulation".

1997. P. HONORE, J. BURITOVA, M.C. FOURNIE-ZALUSKI, B.P. ROQUES and J.M. BESSON. J. Pharm. Exp. Ther., 1997, 281 (1), 208-217. "Antinociceptive effects of RB 101, a complete inhibitor of enkephalin-catabolizing enzymes, are enhanced by a CCK-B receptor antagonist as revealed by noxiously-evoked spinal C-Fos expression in the rat".

1999. S. LE GUEN, P. HONORÉ, G. CATHELINE, M.C. FOURNIÉ-ZALUSKI, B.P. ROQUES, & J.M. BESSON. Brain Res. 1999, 834(1-2), 200-206. "The effects of RB 101, a complete inhibitor of enkephalin-catabolizing enzymes, on carrageenin-induced spinal c-Fos expression are completely blocked by ß-funaltrexamine, a selective µ-opioid receptor antagonist".

2002. S. LE GUEN, F. NOBLE, M.-C. FOURNIÉ-ZALUSKI, B.P. ROQUES, J.-M. BESSON, & J. BURITOVA. Eur. J. Pharmacol., 2002, 441(3), 141-150. "RB 101(s), a dual inhibitor of enkephalinases does not induce antinociceptive tolerance, or cross-tolerance with morphine : a c-Fos study at the spinal level »

2003. S. LE GUEN, G. CATHELINE, M.-C. FOURNIÉ-ZALUSKI, B.P. ROQUES, J.-M. BESSON & J. BURITOVA. Brain Res. 2003, 967, 106-112. Further evidence for the interaction of m- and d-opioid receptors in the antinociceptive effects of the dual inhibitor of enkephalin catabolism, RB 101(S). A spinal c-Fos protein study in the rat under carrageenin inflammation.

2003. J. BURITOVA, S. LE GUEN, M.-C. FOURNIÉ-ZALUSKI, B.P. ROQUES & J.M. BESSON. Eur. J. Pain 2003, 7(3), 241-249. Antinociceptive effects of RB 101(S), a complete inhibitor of enkephalin-catabolizing enzymes, are enhanced by (+)-HA966, a functional NMDA receptor antagonist : A c-Fos study in the rat spinal cord.

8 Travaux effectués en collaboration entre nos deux unités

3 • études pharmacologiques des opioïdes sélectifs et des inhibiteurs d’enképhalinases sélectifs ou mixtes

1986. J.M. BENOIST, V. KAYSER, G. GACEL, J.M. ZAJAC, M. HAUTRON, B.P. ROQUES and G. GUILBAUD. Brain Res., 1986, 398, 49-56. "Differential depressive action of two mu and delta opioids ligands on neuronal responses to noxious stimuli in the thalamic ventrobasal complex of rat ».

1986. A. NEIL, V. KAYSER, G. GACEL, J.M. BESSON and G. GUILBAUD. Eur. J. Pharmacol., 1986, 130, 203-208. "Opioid receptor types and antinociceptive activity in chronic inflammation: both kappa and mu opiate agonistic effects are enhanced in arthritic rats".

1989. V. KAYSER, M.C. FOURNIE-ZALUSKI, G. GUILBAUD and B.P. ROQUES. Brain Res., 1989, 497, 94-101. "Potent antinociceptive effects of kelatorphan (a highly efficient inhibitor of multiple enkephalin degrading enzymes) systemically administered in normal and arthritic rats".

1989. P. DELAY-GOYET, V. KAYSER, J.M. ZAJAC, G. GUILBAUD, J.M. BESSON and B.P. ROQUES. Neuropharmacol., 1989, 28(12), 1341-1348. "Lack of significant changes in mu, delta opioid binding sites and neutral endopeptidase EC 3.4.24.11 in the brain and spinal cord of arthritic rats".

1993. J.A. DESMEULES, V. KAYSER, G. GACEL, G. GUILBAUD and B.P. ROQUES Brain Res., 1993, 611, 243-248. "The highly selective delta agonist BUBU induces an analgesic effect in normal and arthritic rat and this action in not affected by repeated administration of low doses of morphine.

1993. S. PERROT, V. KAYSER, M.C. FOURNIE-ZALUSKI, B.P. ROQUES and G. GUILBAUD. Eur. J. Pharmacol., 1993, 241, 129-133. "Antinociceptive effect of systemic PC 12, a prodrug mixed inhibitor of enkephalin-degrading enzymes, in normal and arthritic rats ».

9 Travaux effectués en collaboration entre nos deux unités

1991. B.P. ROQUES. in Towards a New Pharmacotherapy of Pain, DAHLEM Conference report, A.I. Basbaum and J.M. Besson, Eds, Chichester, J. Wiley & Sons Ltd., 1991, 257-277. "What are the relevant features of the distribution, selective binding and metabolism of opioid peptides and how can these be applied to drug design ?".

1992. J.M. BESSON et B.P. ROQUES. La Douleur : Au-delà des Maux, Editions des Archives Contemporaines, 1992, 39-48. "Stratégie moderne dans le développement de nouveaux analgésiques : de l'opium aux endomorphines".

1992. J.M. BESSON and B.P. ROQUES. The Puzzle of PAIN, Gordon and Breach Art International , 1992, 38-48. "Modern strategies in the development of new analgesics : from opium to endogenous opioids".

10 11 La suppression de la douleur : un objectif loin d’être atteint … Depuis des décennies aucun analgésique innovant aussi puissant que la morphine mais dépourvu de ses effets indésirables majeurs n’a été mis sur le marché. Le besoin de nouveaux analgésiques est urgent aussi bien pour traiter les douleurs aigües permanentes (cancers, accidents graves, etc) que les douleurs neuropathiques (allodynie, hyperalgésie) dues à des lésions ou affections les produisant au niveau des terminaisons et fibres périphériques avec projection centrale. Pas de traitement réellement efficace, nombreux effets secondaires pour les anticonvulsivants et les antidépresseurs.

From D.L. Donnelly-Roberts, Abbott Laboratories.

La découverte des récepteurs opioïdes et de leurs agonistes endogènes, les enképhalines, avait laissé espérer le développement d’une « endomorphine idéale » … ! Les raisons de l’échec, les moyens de le surmonter. Three levels of pain control by endogenous opioid system (EOS) and endogenous cannabinoids system (ECS)

EOS ECS

EOS, ECS

Attacking pain at EOS its source ECS

. Relieving or reducing pain at its source . More than 50% of MO effects are attributable to peripheral neurons (nociceptors)

13 (From Roques, B.P., Fournié-Zaluski, M.C. and Wurm, M., Nature Reviews Drug Discovery, 2012)) Contrôle de la douleur par exaltation de l’action des morphines endogènes

Effets indésirables Opioid signaling

Hyperstimulation ubiquitaire de tous les récepteurs opioïdes (ORs) MOR, DOR même ceux qui ne sont pas impliqués dans le contrôle de la douleur.

Extended synaptic area

(Exogènes) Morphine ENKs

Récepteurs opioïdes MOR DOR YGG Y YGGFM(L) + FM(L) + GGPM(L) YFGGFM(L)

Enképhalines Tyr – Gly – Gly – Phe – Met (Leu) DENKI DENKI (Endogènes) NEP Zn Zn APN APN NEP

Stimulation restreinte aux sites où les ENKs sont Plasma membrane ENKs secrétées en quantité suffisante sous l’effet d’un SV stimulus (ex. douleur). Idée : développer des cytosol inhibiteurs mixtes (DENKIs) bloquant NEP et APN qui agiront sélectivement sur un nombre limité de ORs. PENK

Absence d’effet indésirable

Roques, B.P., Fournié-Zaluski, M.C. and Wurm, M., Nature Reviews Drug Discovery, 2012, 11, 292-311. The two leading families of DENKIs

Cascade PL 265 -9 PL 37 Cascade ester (*) -9 8x10 M carbamate (*) 3x10 M PL800 PL804 -9 Ki = 8 nM -9 4x10 M Ki = 22x10 nM M Ki = 3 nM Ki = 4 nM PL PL800 PL804 PL 254 254

APN NEP APN NEP

Tyr -Gly -Gly -Phe -Met(Leu) Tyr -Gly -Gly -Phe -Met(Leu)

Enkephalins Enkephalins

(*) Increases bio -availability (*) Increases bio -availability

+ PL254 : R1 = CH3 ; R2 = CH3 ; NH3

+ PL265 : R1 = CH3 ; R2 = CH3 ; NH3 = -NH-COO-CH(CH3)-OCOIPr

PL37 : R1 = H ; R2 = -CH(CH3)OCOOEt Effect of DENKIs on the extracellular efflux of Met-enkephalin in the nucleus accumbens, periaqueductal grey (PAG) and cerebrospinal fluid (CSF) Microdialysis or superfusion in awake and freely moving rats

Nucleus accumbens PAG

Sub-arachnoidal artificial CSF

Bourgoin S. et al., JPET, 1986. Potentiation de l’action de la Met-enkephaline (ME) sur les neurones du locus coeruleus par le kélatorphan. Absence d’effet propre du kélatorphan.

Le locus coeruleus est une structure cérébrale impliquée dans le contrôle de la respiration et du rythme cardiaque ainsi que dans les phénomènes addictifs.

  

Exogenous ME (or MO) applied by pressure pulse () on slice containing the LC, leads to hyperpolarization. The response is amplified by kelatorphan (J.T. Williams et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 243(1), 397-401, 1987)

Le Kelatorphan seul est inactif indiquant l’existence d’une libération basale très faible des ENKs dans cette structure

De ce fait les DENKIs n’ont pas d’effet indésirable sur la respiration tant chez l’animal (E. Boudinot et al., Pain 90, 7-13 (2001) que chez l’homme (étude clinique du PL37)

17 Puissance analgésique similaire de la morphine et des enképhalines par voie i.v. dans les modèles des douleurs aiguës.

i.c.v. in mice ED50 MO : 0.63 nmol/mouse; ED50 Met-E : 330 nmol/mouse (Interussi, PNAS 1980) ED50 Met-E+kelatorphan (50 µg) : 1.2 nmol/mouse (Fournié-Zaluski, EJP 1984)

Comparison between i.v. morphine and i.v. PL37 in the Hot Plate Test (HPT)

vehicle (EtOH/cremophor/H2O) improving BBB crossing 100 ***

Toutes les PL37 ED50 par remplacement réponses sont *** du chrémophor ou du tween inhibées par pré- 80 par une cyclodextrine administration de utilisable chez l’homme *** naloxone 75 i.v. perf douleur aigüe ?

MO, ED50 1.6 mg/kg

% analgesia PL37, ED 1.8 mg/kg 50 ** 50 *** % analgesia = 100 x (test latency – control ** p<0.01 ** vs. vehicle latency) / (cut-off time *** p<0.001 – control latency) Dunnett’s t test 25 1 mg/kg 2 mg/kg 3 mg/kg Morphine PL37 Analgesic effects of morphine or PL37 injected i.v. 10 min before the test in the hot plate test in mice (jump response). Points represent the percentage of analgesia for n = 8 mice Control group corresponds to i.v. administration of vehicle. 18 EOS and neuropathic pain

Schwann cell NORMAL STATE (intact Blood Nerve Barrier) Blood capillary Oligodendrocyte non noxious to spinal stimuli cord Ex. tactile

Fast myelinated fibers Aa, Aß

non noxious to spinal stimuli cord

Slow weakly myelinated (∆ds) and unmyelinated (C) fibers

(Alteration of Blood Nerve Barrier with transfert of NEUROPATHIC STATE pronociceptive compounds; TNF, interleukins, cytokines, …) ( ) Hyperexpression of ORs Sites of enrichment in ENKs DENKIs action Final State

Induction of peripheral noxious to spinal nociceptors hyperexcitability central stimuli cord (allodynia) Pain modulation by descending systems

sensitization noxious to spinal stimuli cord Hyperactivation of Glu Induction of peripheral (hyperalgesia) system. nociceptors hyperexcitability Reduction of GABA system.

Spontaneous discharges by experexpression of Na+ 19 channels in injured nerves PL37 reduction of neuropathic pain (allodynia and thermal hyperalgesia) induced by partial ligation of sciatic nerve in mice

10 mg/kg/po 20 mg/kg/po 40 mg/kg/po

IPSILATERAL, sham-operated 1.3

IPSILATERAL, sciatic nerve injury 0.6

***p<0.001 versus baseline values; ###p<0.001, #p<0.05 versus vehicle (post injection). 2-way ANOVA followed by Bonferroni’s multiple comparison test. Seltzer’s model (s) # # 7 vehicle  # 6 PL37, 10 mg/kg/po Plantar test 5 4 3

von Frey Test withdrawal 2 1 paw 0 Before admin. 20-40 mn of PL37 **p<0.001; *p<0.05 versus baseline values;after ##p<0.01 gavage; #p<0.05 versus vehicle (post injection). 2 way ANOVA followed by Bonferroni’s multiple comparison test.

20 The effect of PL37 is reversed by prior administration of naloxone methiodide (not shown here) PL37 is active per os at the peripheral level in a model of inflammatory pain.

Antinociceptive effects of PL37 (100 mg/kg/po) on vocalization threshold to paw pressure in rats with carrageenan-induced hindpaw inflammation

vehicle 400 500 PL37/NaCl PL37/Nlxe-MET  400 Administration of the  300 peripherally selective opioid 300 antagonist naloxone # # # methiodide (i.p.) antagonized 200 200 antinociception elicited by oral administration of PL37 100 (100 mg/kg). 100 Vocalization threshold (g) threshold Vocalization BaselinevehiclePL37 0 inflamed paw 0 20 40 60 Time, mn PL37 activates peripheral opioid receptors Synergistic antihyperalgesic effects of oral PL37 and gabapentin in murine tibial osteosarcoma

First demonstration of synergistic interaction between gabapentin and DENKI-protected endogenous opioids in neuropathic pain alleviation (thermal hyperalgesia).

PL37 antihyperalgesic effect is Synergistic effects of PL37 combined reversed by naloxone with gabapentin, both at subactive methiodide. doses. Isobolographic analysis

Computed ED50 without synergy : 12.8

Experimental ED50 (with synergy) : 7.03

PL37 - 25 - 25 - 25 - 25 NAL-MET - - 2 2 - - 2 2 Peripheral analgesia. Menendez et al. Eur. J. Pharmacol., 2008

PL265 and gabapentin show the same synergistic effects in this model Other synergistic effects are observed between PL37 or PL265 and P2X3R, CCKBR antagonists and CB2R agonists

22 Collaboration with Ana Baamonde, Universidad de Oviedo, Spain PL37 Phase 2a p.o.: en résumé

• Efficacité démontrée du PL37 en addition à la prégabaline (Lyrica®)

• Efficacité illustrée par la baisse concomitante des scores de douleur après 4 semaines de traitement, ainsi que par les questionnaires de Qualité de Vie et de douleur neuropathique

• L’amélioration observée de -1,2 sur les scores de douleur semble indiquer plutôt un effet additif (et non synergique) du PL37 et de la prégabaline (expérience de pharmaco animale en cours pour confirmation)

• La sécurité et la tolérance du PL37 sont excellentes

Résultats préléminaires présentés par le Dr Michel WUR (Pharmaleads) à un mini symposium sur la douleur à Montpellier. Egalement présentés officiellement au prochain congrès du IASP cette semaine au Japon par le Dr Michel WURM Résultats : Preuve de concept obtenue en addition à la prégabaline

Les patients sous prégabaline et PL37 voient leur score de douleur diminuer de façon régulière au cours du temps

Pregabalin + Placebo

Pregabalin + PL37

Run-in period Treatment period

Evolution du score de douleur pour les patients sous prégabaline

Résultats préléminaires présentés par le Dr Michel WUR (Pharmaleads) à un mini symposium sur la douleur à Montpellier. Egalement présentés officiellement au prochain congrès du IASP cette semaine au Japon par le Dr Michel WURM 25 From Rice A.S.C. et al. The Lancet (2014) 383, 1637-1647.