Rôles Des Récepteurs Nucléaires Nur77 Et Nor-1 Et Des

Home , Kelatorphan

Rôles des récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 et des neuropeptides enképhaline et dynorphine dans les comportements médiés par la dopamine et induits par les psychostimulants

Thèse

Céline Hodler

Programme de doctorat en Neurobiologie Philosophiae doctor (Ph.D.)

Faculté de médecine

Québec, Canada

RÉSUMÉ

Cette thèse démontre que les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 ainsi que les neuropeptides dynorphine (DYN) et enképhaline (ENK) sont des facteurs déterminants de la régulation du système dopaminergique. Notre premier manuscrit démontre d’une part que Nur77 et Nor-1 sont très clairement impliqués dans la régulation de l’homéostasie du système dopaminergique et qu’ils y jouent des rôles distincts, voire opposés, dans les conditions basales et dans les réponses comportementales et biochimiques aux psychostimulants. La délétion génétique de Nur77 augmente la proportion des récepteurs D2 en haute affinité (D2high), supprime les stéréotypies et perturbe la persistance de la préférence de place induites par l’administration répétée de psychostimulants. À l’inverse, la délétion de Nor-1 diminue la proportion des récepteurs D2high, atténue les comportements moteurs en réponse à l’amphétamine et supprime la sensibilisation comportementale. La délétion de Nor-1 module également l’expression de la DYN et de l’ENK favorisant ainsi une diminution de la réponse comportementale alors que celle de Nur77 induit l’effet inverse. Ainsi, Nor-1 et Nur77 jouent des rôles opposés, la délétion de Nor-1 tempère les comportements moteurs, celle de Nur77 les exacerbe. Notre second manuscrit démontre d’autre part que la DYN et l’ENK sont toutes deux nécessaires et ont des rôles opposés dans la manifestation des comportements de base médiés par la dopamine. Par contre, dans les conditions d’une exposition répétée aux psychostimulants, la DYN et l’ENK agissent de concert en potentialisant l’exacerbation de l’activité locomotrice et sont donc toutes deux indispensables à la sensibilisation comportementale. Nos travaux révèlent également l’existence d’interactions entre les neurotransmissions enképhalinergique et dynorphinergique et donc entre les deux voies de sortie indirecte et directe des ganglions de la base. Aussi, les neuropeptides DYN et ENK sont modulés différentiellement par la délétion de Nur77 et de Nor-1 et inversement leur délétion régule de manière différente l’expression de ces facteurs de transcription. Ceci suggère l’existence d’une relation de régulation réciproque entre les récepteurs nucléaires et ces neuropeptides. Nur77 et Nor-1 sont donc des régulateurs clés de la transmission dopaminergique et des réponses comportementales aux psychostimulants et ce, principalement via la modulation des récepteurs dopaminergiques et des neuropeptides striataux.

ABSTRACT

This present study demonstrates that the nuclear receptors Nur77 and Nor-1 and the neuropeptides dynorphin (DYN) and enkephalin (ENK) are crucial in dopaminergic system regulation. On one hand, our first manuscript shows that Nur77 and Nor-1 are deeply involved in the homeostatic regulation of the dopaminergic system and play distinct, mostly opposite roles, in basal dopaminergic neurotransmission and in psychostimulants-induced behavioral and biochemical effects. In particular, Nur77 deletion exacerbates the behavioral effects of both acute and chronic amphetamine (AMPH) administrations while Nor-1 deletion has the opposite effect. In fact, Nur77 deletion favors the upregulation of the proportion of D2 receptors in high affinity state (D2high) and suppress AMPH-induced stereotyped behavior. On the contrary, Nor-1 deletion downregulates the D2high receptors proportion, attenuates locomotor activity in response to chronic AMPH administration and consequently suppresses the development of behavioral sensitization. Nor-1 deletion modulates DYN and ENK expression in a way that promotes decreased behavioral responses to psychostimulants and that is opposite to the effects of Nur77 deletion on these very same neuropeptides. Also, Nur77 deletion suppresses the persistance of cocaine- induced place preference wherese Nor-1 deletion has no effect. Thus, Nor-1 and Nur77 mostly play opposite roles, Nor-1 deletion dampens ambulatory activity whereas Nur77 deletion exacerbates it. On the other hand, our second manuscript shows that DYN and ENK are both necessary and play opposite roles in dopamine-mediated basal behaviors. However, during chronic psychostimulants exposure, DYN and ENK both contribute to the exacerbation of locomotor activity and they are consequently both essential for the expression of behavioral sensitization. Besides, our results highlight a cross-talk between ENK and DYN neurotransmissions and thus between the indirect and direct output pathways of the basal ganglia. Interestingly, we also show that the striatal DYN and ENK deletions could differentially modulate Nur77 et Nor-1 expression. This suggests that the nuclear receptors and the neuropeptides ENK and DYN share an intimate reciprocal regulation relationship. Collectively, our results strongly establish that Nur77 and Nor-1 are key regulators of the dopaminergic neurotransmission and of behavioral responses to psychostimulants and this, mostly via the modulation of dopaminergic receptors and striatal neuropeptides.

AVANT-PROPOS

Je tiens à remercier, en premier lieu, mon directeur et mon co-directeur de recherche, les Drs Claude Rouillard et Daniel Lévesque. Ce fut un privilège d'avoir pu travailler avec ces chercheurs compétents, passionnés et généreux. Merci pour votre soutien, vos encouragements, votre confiance, votre précieuse expérience et votre disponibilité.

Avant tout, Claude, merci de m’avoir accordé ta confiance et de m'avoir donné la chance de travailler à tes côtés à la maîtrise puis au doctorat. Merci aussi pour ton soutien financier qui m'a permis de m'investir pleinement dans mes études. Merci pour ton encadrement bienveillant. J'ai tiré un grand plaisir de nos discussions au laboratoire, et je tiens en particulier à t’exprimer ma gratitude pour tes conseils avisés, tes encouragements, ton réconfort et ta compréhension lors de mes moments de fragilité et d’incertitude. Tu as contribué à rendre plus lumineuses et prometteuses mes années au Québec grâce à ton écoute et à ton soutien dans mes projets professionnels.

Un immense merci à Brigitte Paquet, premièrement pour m'avoir assistée et formée pendant toutes ces années. Deuxièmement, et de façon encore plus significative à mes yeux, merci pour toutes ces petites attentions qui ont su égailler mes journées. Merci à tous mes amis et collaborateurs, je pense à, Joanie Baillargeon, Aurore Voisin, Emmanuelle Bourhis, Cécile Vue, Jérôme Maheux, Michel st-Hilaire, François Gilbert, Marc Cloutier. Un merci tout spécial à Emmanuelle Berret et Antoine Hone-Blanchet, vos personnalités joyeuses et votre esprit plaisantin ont su me motiver dans les moments de découragement. Merci pour votre aide précieuse et votre amitié. Vous avez tous été d’une aide essentielle pour l’élaboration et l’aboutissement de mon projet de recherche.

J'aimerais aussi remercier mes parents, Marie-Claire et Jürg, pour m’avoir soutenu financièrement pendant mes études. Merci surtout à mes frères, David et Manuel, pour leur présence réconfortante, leur complicité, leur humour imparable et leur amour inconditionnel qui m’ont été indispensables et salutaires dans les moments difficiles.

III

Bien que je sois première auteure des deux articles composant les chapitres 2 et 3 de cette thèse, j'ai bénéficié de la collaboration de plusieurs de mes collègues et, bien évidemment, des Drs Claude Rouillard et Daniel Lévesque.

Le chapitre 2 de ma thèse, « Distinct roles for the nuclear receptors Nur77 and Nor- 1 in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors », est un article en voie de soumission dans un journal international de haut calibre. J'ai été directement impliqué dans toutes les étapes qui ont menées à la réalisation de cette étude. J'ai effectué tous les traitements et quantifications des comportements chez les souris. J'ai également réalisé les perfusions et prélèvements des cerveaux. J’ai aussi effectué toutes les hybridations in situ. J'ai également procédé à la quantification et l'analyse statistique des résultats. La rédaction de l'article a été réalisée par moi-même et révisée par le Dr. Claude Rouillard. Antoine Hone-blanchet, est présenté comme second auteur car il m’a fourni les données biochimiques concernant l’expression de la DYN suite à l’administration aigüe d’amphétamine chez les souris Nur77 (-/-). Joanie Baillargeon et Brirgitte Paquet, nos deux assistantes de recherche, ont aidé à la quantification de certains protocoles et m’ont assistée lors des chirurgies. Le Dr. Philip Seeman m’a fourni les données concernant le pourcentage d’expression des récepteurs D2 en haute affinité. Le Dr. Daniel Lévesque a, avec le Dr. Claude Rouillard, participé à l'élaboration des hypothèses de recherche, à la mise sur pied des protocoles expérimentaux, ainsi qu’à la correction de l'article. Le chapitre 3, «Implication of the endogenous striatal neuropeptides Enkephalin and Dynorphin in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors.», est un article en voie de soumission dans un journal international. Dans cette étude, Brigitte Paquet m’a assistée pour la réalisation des expériences comportementales, et notamment lors de l'administration des traitements. J’ai réalisé les techniques d'hybridation in situ, la quantification, l'analyse et l'interprétation des résultats. Joanie Baillargeon m’a prêté son assistance pour une partie des quantifications ainsi que pour la perfusion des animaux. Emmanuelle Bourhis a réalisé le protocole de colocalisation de Nur77 avec la substance P et l’enképhaline (figure 3.4). J'ai aussi rédigé la totalité de l'article qui a été, par la suite, révisé par le Dr. Rouillard. Le Dr. Claude Rouillard et le Dr. Daniel Lévesque ont participé à l'élaboration des hypothèses de recherche, à la mise sur pied des protocoles expérimentaux, ainsi qu’à la correction de l'article.

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ...... I ABSTRACT ...... II AVANT-PROPOS ...... III TABLE DES MATIÈRES ...... V LISTE DES FIGURES ...... X LISTE DES ABRÉVIATIONS ...... XIV

CHAPITRE 1. INTRODUCTION GENERALE ...... 1 1.1 Introduction ...... 1 1.2 La transmission dopaminergique ...... 4 1.2.1 Métabolisme de la dopamine ...... 4 1.2.2 Les récepteurs de la dopamine ...... 6 1.2.2.1 Localisation tissulaire et cellulaire ...... 6 1.2.2.2 Voies de signalisation ...... 7 1.2.2.3 Propriétés des récepteurs dopaminergiques ...... 12 1.2.3 Les circuits dopaminergiques ...... 14 1.2.3.1 Le circuit mésocorticolimbique ...... 15 1.2.3.2 Le circuit nigro-strié ...... 22 1.3 Modulation de la transmission dopaminergique ...... 28 1.3.1 Les neuropeptides striataux endogènes ...... 28 1.3.1.1 Définition et caractéristiques de la dynorphine striatale...... 29 1.3.1.2 Définition et caractéristiques de l’enképhaline striatale ...... 31 1.3.1.3 Sélectivité relative des récepteurs opioïdes ...... 32 1.3.2 Les psychostimulants ...... 33 1.3.2.1 Caractéristiques et mode d’action des psychostimulants ...... 33 1.3.2.2 Comportements induits par les psychostimulants ...... 35 1.3.2.3 Effets des psychostimulants sur les neuropeptides endogènes ...... 41 1.3.2.4 Neuroadaptations induites par les psychostimulants ...... 48 1.4 Les récepteurs nucléaires ...... 59 1.4.1 Caractéristiques générales des récepteurs nucléaires...... 61 1.4.1.1 Définition...... 61 1.4.1.2 Structure ...... 62 1.4.1.3 Modulation de l’activité des récepteurs nucléaires ...... 64 1.4.2 Les récepteurs nucléaires de la sous-famille NR4A ...... 65 1.4.2.1 Définition...... 65 1.4.2.2 Structure ...... 66 1.4.2.3 Liaison à l’ADN ...... 68 1.4.2.4 Modulation de l’activité des membres de la famille NR4A ...... 68

1.4.3 Rôles périphériques et centraux de la sous-famille NR4A ...... 70 1.4.3.1 Rôles en périphérie ...... 70 1.4.3.2 Rôles au niveau du système nerveux central ...... 76 1.5 Phénotypes des souris déficientes pour les gènes préproenképhaline, prodynorphine, Nur77 ou Nor-1...... 95 1.5.1 Phénotypes connus des souris Nur77 (-/-) et Nor-1 (-/-) ...... 96 1.5.2 Phénotypes connus des souris ENK (-/-) et DYN (-/-) ...... 97 1.5.2.1 Phénotypes connus des souris ENK (-/-) ...... 97 1.5.2.2 Phénotypes connus des souris DYN (-/-) ...... 99 1.6 Les objectifs de la thèse ...... 101

CHAPITRE 2 ...... 106 Distinct roles for the nuclear receptors Nur77 and Nor-1 in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors ...... 106 2.1 RÉSUMÉ ...... 107 2.2 ABSTRACT ...... 109 2.3 INTRODUCTION ...... 110 2.4 MATERIALS AND METHODS ...... 112 2.4.1 Animals ...... 112 2.4.2 Basal activity and AMPH-induced behaviors ...... 112 2.4.2.1 Basal locomotor activity ...... 112 2.4.2.2 Acute AMPH and chronic AMPH-induced behaviors ...... 113 2.4.3 Conditioned place preference...... 114 2.4.3.1 Place preference conditioning apparatus ...... 114 2.4.3.2 Behavioral conditioning procedure ...... 115 2.4.4 In situ hybridizations ...... 116 2.4.5 D2high States ...... 117 2.4.6 Quantification analysis ...... 118 2.4.7 Statistical analysis ...... 119 2.5 RESULTS ...... 119 2.5.1 Basal locomotor activity in Nur77 and Nor-1knockout mice: ...... 119 2.5.1.1 Locomotor activity measured in the home cage ...... 119 2.5.1.2 Spontaneous locomotor activity measured in a new environment ...... 120 2.5.2 Striatal D2 receptors in Nur77 and Nor-1 knockout mice: ...... 121 2.5.3 Acute AMPH-induced activity in Nur77 and Nor-1 knockout mice: ...... 121 2.5.4 Effect of acute AMPH administration on ENK and DYN mRNA expression in Nur77 and Nor-1 knockout mice: ...... 122

2.5.4.1 ENK mRNA expression after acute AMPH administration ...... 122 2.5.4.2 DYN mRNA expression after acute AMPH administration ...... 123 2.5.5 Chronic AMPH-induced activity in Nur77 and Nor-1 knockout mice: ...... 124 2.5.5.1 Repeated injection of a 5 mg/kg AMPH dose in Nur77 knockout mice ...... 124 2.5.5.2 Repeated injection of a 2.5 mg/kg AMPH dose in Nur77 knockout mice ...... 125 2.5.5.3 Repeated injection of a 2.5 mg/kg AMPH dose in Nor-1 knockout mice ...... 126 2.5.6 Effect of chronic AMPH administration on ENK and DYN mRNAs in Nur77 and Nor- 1 knockout mice: ...... 127 2.5.6.1 ENK mRNA expression after repeated AMPH administration ...... 127 2.5.6.2 DYN mRNA expression after repeated AMPH administration ...... 128 2.5.7 Effect of chronic AMPH administration on Nor-1 and Nur77 mRNAs in respectively Nur77 and Nor-1 knockout mice: ...... 129 2.5.7.1 Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration ...... 129 2.5.7.2 Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration ...... 129 2.5.8 Cocaine-induced conditioned place preference in Nur77 and Nor-1 knockout mice: ...... 130 2.5.9 Expression of Nur77 mRNA, after acute or chronic cocaine administration in the hippocampus of wild-type mice: ...... 131 2.6 DISCUSSION ...... 131 2.6.1 Opposing roles of Nur77 and Nor-1 in basal and spontaneous activity: ...... 131 2.6.2 Distinct roles of Nur77 and Nor-1 in acute AMPH-induced activity: ...... 132 2.6.3 Distinct roles of Nur77 and Nor-1 in chronic AMPH-induced activity: ...... 133 2.6.4 Distinct roles of Nur77 and Nor-1 in conditioned preference place: ...... 137 2.7 CONCLUSION ...... 139 2.8 FIGURES AND LEGENDS ...... 140 2.9 SUPPLEMENTAL MATERIALS ...... 168

CHAPITRE 3 ...... 178 Implication of the endogenous striatal neuropeptides Enkephalin and Dynorphin in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors ...... 178 3.1 RÉSUMÉ ...... 179 3.2 ABSTRACT ...... 181 3.3 INTRODUCTION ...... 183 3.4 MATERIALS AND METHODS ...... 187 3.4.1 Animals ...... 187 3.4.2 Basal locomotor activity and AMPH-induced behaviors ...... 188 3.4.2.1 Basal locomotor activity ...... 188 3.4.2.2 Acute and chronic amphetamine-induced behaviors ...... 188

VII

3.4.3 Conditioned place preference...... 190 3.4.3.1 Place preference conditioning apparatus ...... 190 3.4.3.2 Behavioral conditioning procedure ...... 190 3.4.4 In situ hybridizations ...... 191 3.4.5 Double labeling of Nur77 with SP or ENK mRNA transcripts after acute AMPH administration ...... 192 3.4.6 Quantification analysis ...... 194 3.4.7 Statistical analysis ...... 195 3.5 RESULTS ...... 196 3.5.1 Basal locomotor activity in ENK and DYN knockout mice: ...... 196 3.5.2 Acute AMPH-induced activity in ENK and DYN knockout mice: ...... 196 3.5.3 Effect of acute AMPH administration on Nur77 and DYN mRNAs in ENK and DYN knockout mice: ...... 198 3.5.3.1 Nur77 mRNA expression after acute AMPH administration ...... 198 3.5.3.2 DYN mRNA expression after acute AMPH administration ...... 198 3.5.4 Chronic AMPH-induced activity in ENK and DYN knockout mice: ...... 199 3.5.4.1 Effect of repeated AMPH administration in ENK knockout mice ...... 199 3.5.4.2 Effect of repeated AMPH administration in DYN knockout mice ...... 200 3.5.5 Effect of chronic AMPH administration on Nur77 and Nor-1 mRNAs in ENK and DYN knockout mice: ...... 202 3.5.5.1 Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration ...... 202 3.5.5.2 Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration ...... 202 3.5.6 Effect of chronic AMPH administration on DYN and ENK mRNAs in respectively ENK and DYN knockout mice: ...... 203 3.5.6.1 DYN mRNA expression after chronic AMPH administration ...... 203 3.5.6.2 ENK mRNA expression after chronic AMPH administration ...... 203 3.5.7 Cocaine-induced conditioned place preference induced in ENK and DYN knockout mice: ...... 204 3.6 DISCUSSION ...... 205 3.6.1 Effect of DYN and ENK deletion on basal motor activity ...... 205 3.6.2 Effect of acute AMPH in DYN and ENK knockout mice ...... 206 3.6.3 Effect of chronic AMPH in ENK and DYN knockout mice ...... 209 3.6.3.1 Behavioral consequences ...... 209 3.6.3.2 Biochemical consequences and implications ...... 212 3.6.4 Cocaine-induced conditioned place preference in ENK and DYN knockout mice: ... 217 3.7 CONCLUSION ...... 219 3.8 FIGURES AND LEGENDS ...... 220 3.9 SUPPLEMENTAL MATERIALS ...... 242

VIII

CHAPITRE 4. DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS ...... 250 4.1 Activité basale médiée par la dopamine ...... 251 4.1.1 Rôles opposés de Nur77 et Nor-1 ...... 251 4.1.2 Effets de la délétion de l’ENK ou de la DYN sur l’activité locomotrice de base ...... 255 4.2 Effets aigus des psychostimulants ...... 258 4.2.1 Rôles de Nur77 et Nor-1 dans les effets aigus des psychostimulants ...... 258 4.2.2 Rôles de l’ENK et de la DYN dans les effets aigus des psychostimulants ...... 262 4.3 Effets chroniques des psychostimulants ...... 267 4.3.1 Rôles de Nur77, Nor-1, DYN et ENK dans la sensibilisation comportementale ...... 267 4.3.1.1 Rôles opposés de Nur77 et Nor-1 dans la sensibilisation comportementale ...... 267 4.3.1.2 Rôles de l’ENK et de la DYN dans la sensibilisation comportementale ...... 281 4.3.2 Rôles de Nur77, Nor-1, DYN et ENK dans la préférence de place ...... 289 4.3.2.1 Rôles de Nur77 et Nor-1 dans la préférence de place ...... 289 4.3.2.1 Rôles de l’ENK et de la DYN dans la préférence de place ...... 294 CONCLUSION GÉNÉRALE ...... 298 RÉFÉRENCES ...... 300

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE 1

Figure 1.1: Le ciblage pharmaceutique de la transmission dopaminergique. 2

Figure 1.2: Les étapes de la biosynthèse de la dopamine. 4

Figure 1.3: Les récepteurs de la dopamine et leurs effets sur une de leur principale voie de signalisation, celle de l’adénylate cyclase. 11

Figure 1.4: Schéma du circuit de la « récompense » ou circuit mésocorticolimbique. 18

Figure 1.5: Schéma des ganglions de la base. 24

Figure 1.6: Circuits neuronaux impliqués dans les comportements planifiés et automatisés. 27

Figure 1.7: Mécanismes d’action des psychostimulants. 34

Figure 1.8: Accumulation graduelle de ∆FosB versus l’induction rapide et transitoire des autres protéines de la famille Fos dans le cerveau. 51

Figure 1.9: La dynorphine est une cible potentielle de ∆FosB. 53

Figure 1.10: Régulation de CREB par les drogues d’abus. 56

Figure 1.11: Distribution des récepteurs nucléaires dans le SNC de souris adultes. 60

Figure 1.12: Schéma de la structure des récepteurs nucléaires. 63

Figure 1.13: A. Structure d’un récepteur nucléaire et représentation schématique des séquences qui correspondent aux gènes des membres de la sous-famille NR4A. 67

B. Illustration de la structure tertiaire du domaine de LBD de Nurr1. 67

Figure 1.14: Mécanismes de l’activité transcriptionnelle des membres de la sous-famille NR4A. 69

Figure 1.15: A. Divers stimuli peuvent induire l’expression des membres de la sous-famille NR4A. 71

B. Effets spécifiques de la sous-famille des Nurs (NR4A) sur certains organes et tissus. 71

Figure 1.16: (a) Relation entre l’isoforme RXRγ1 du récepteur rétinoïde RXR, les récepteurs Nurs et la neurotransmission DAergique. 77

(b) Voies dopaminergiques et maladies neurologiques et psychiatriques possiblement influencées par l’expression des Nurs. 77

Figure 1.17: La cascade de signalisation AMPc–PKA CREB, qui est cruciale pour la formation de la mémoire, induit l’expression des gènes codant pour les récepteurs nucléaires NR4A. 88

CHAPITRE 2

Figure 2.1: Basal locomotor activity measured in Nur77 and Nor-1 knockout mice. 140

Figure 2.2: Comparison of “flex field” spontaneous activities and adaptation in Nur77 knockout mice versus Nor-1 knockout mice. 142

Figure 2.3: Proportion of striatal high affinity D2 receptors expression in Nur77 and Nor-1 knockout mice. 144

Figure 2.4: Comparison of activities after acute AMPH administration (2.5 mg/kg) in Nur77 and Nor-1 knockout mice. 146

Figure 2.5: ENK mRNA expression after acute AMPH administration in Nur77 knockout mice and in Nor-1 knockout mice. 148

Figure 2.6: DYN mRNA expression after acute AMPH administration in A: Nur77 knockout mice and in B: Nor-1 knockout mice. 150

Figure 2.7: Chronic AMPH (5 mg/kg/day) administration-induced activities in Nur77 knockout mice. 152

Figure 2.8: Chronic AMPH (2.5 mg/kg/day) administration-induced activities in Nur77 knockout mice. 154

Figure 2.9: Chronic AMPH (2.5 mg/kg/day) administration-induced activities in Nor-1 knockout mice. 156

Figure 2.10: ENK mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nur77 and Nor-1 knockout mice. 158

Figure 2.11: DYN mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nur77 and Nor-1 knockout mice. 160 Figure 2.12: Nor-1 and Nur77 mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nur77 knockout mice and Nor-1 knockout mice. 162

Figure 2.13: Cocaine-induced conditioned place preference in Nur77 and in Nor-1 knockout mice. 164

Figure 2.14: Nur77 mRNA expression after repeated cocaine (15 mg/kg/day) administration in the hippocampus of wild-type mice. 166

Figure S2.1: The three components of activity during the 120 minutes-recording period of the 5 mg/kg AMPH dose challenge in Nur77 knockout mice. 168

Figure S2.2: The three components of activity during the 120 minutes-recording period of the 2.5 mg/kg AMPH dose challenge in Nur77 knockout mice. 170

Figure S2.3: The three components of activity during the 120 minutes-recording period of the 2.5 mg/kg AMPH dose challenge in Nor-1 knockout mice. 172

Figure S2.4: Nor-1 mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in the ventral striatum of Nur77 knockout mice. 174

CHAPITRE 3

Figure 3.1: Basal locomotor activity measured in ENK and DYN knockout mice. 220

Figure 3.2: Comparison of acute AMPH induced activities in ENK and DYN knockout mice. 222

Figure 3.3: Nur77 mRNA expression after acute AMPH administration in A: ENK knockout mice and in B: DYN knockout mice. 224

Figure 3.4: Nur77 mRNA colocalization with SP or ENK after acute AMPH administration in wild-type mice. 226

Figure 3.5: DYN mRNA expression after acute AMPH administration in ENK knockout mice. 228

Figure 3.6: Chronic AMPH administration-induced activities in ENK knockout mice. 230

Figure 3.7: Chronic AMPH administration-induced activities in DYN knockout mice. 232

Figure 3.8: Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration in ENK and in DYN knockout mice. 234

Figure 3.9: Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration in ENK and in DYN knockout mice. 236

XII

Figure 3.10: DYN and ENK mRNA expression after chronic AMPH administration in ENK and in DYN knockout mice. 238

Figure 3.11: Cocaine-induced conditioned place preference in ENK and in DYN knockout mice. 240

Figure S3.1: Spontaneous activities and adaptation in ENK and DYN knockout mice. 242

Figure S3.2: The three components of activity during the 120 minutes-recording period that followed AMPH challenge in ENK knockout mice. 244

Figure S3.3: The three components of activity during the 120 minutes-recording period that followed AMPH challenge in DYN knockout mice. 246

CHAPITRE 4

Figure 4.1: Schéma de l’effet de la délétion de Nur77 et de Nor-1 sur l’affinité des récepteurs D2 et sur l’activité locomotrice de base. 254

Figure 4.2: Schéma de l’effet de l’administration chronique d’AMPH chez les souris sauvages. 271

Figure 4.3: Hypothèse explicative de l’effet de Nur77 sur la synthèse de l’ENK dans différentes conditions (aigüe, chronique, chronique avancée) 275

Figure 4.4: Administration chronique d’AMPH chez les souris Nur77 knockout et Nor-1 knockout. 279

XIII

LISTE DES ABRÉVIATIONS

AADC : Décarboxylase des acides amines aromatiques (L-aromatic amino acid decarboxylase) AC : Adénylate cyclase ACTH : Corticotropine (Adrenocorticotropic hormone) ADN : Acide désoxyribonucléique AF-1 : Domaine d’activation de la transcription 1 AF-2 : Domaine d’activation de la transcription 2 AMPc : Adénosine monophosphate cyclique AMPH : Amphétamine ANOVA : Analysis of variance AP-1 : Complexe d’activation de la transcription 1(Activating Protein 1) ARNm : Acide ribonucléique messager ATV : Aire tegmentale ventrale Bcl-2: B-cell lymphoma 2 BDNF: Brain-derived neurotrophic factor BG : Basal ganglia CA1: Corne d’Ammon 1 CA2: Corne d’Ammon 2 CA3: Corne d’Ammon 3 CAMK : Ca2+/Calmoduline-dependent kinase CAMKII : Ca2+/Calmoduline-dependent kinase II COMT : Catéchol-o-méthyltransférase CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité CNS : Central nervous system CPP : Conditionned place preference CRE : Cyclic AMP response element CREB : Facteur de transcription CREB (Cyclic AMP response element-binding protein) CRH : Hormone de libération de la corticotropine (Corticotropin –Releasing Hormone) CRM : Complexe de remodelage de la chromatine Csn-B : Cytosporone B CTAP : D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2 CTOP : D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2 DA : Dopamine DAergique : Dopaminergique DAT : Transporteur de la dopamine (Dopamine transporter) DBD : Domaine de liaison à l’ADN (DNA-binding domain) DHA : Acide docosahexaénoïque DMI: Désipramine DNA: Acide désoxyribonucléique (Desoxyribo nucleic acid) DOR : Récepteur opioïde δ (δ opioid receptor) DR-5: Direct repeat spaced by 5 nucleotides

XIV

DYN: Dynorphine END: Endorphine ENK: Enképhaline ER: Élément de réponse ERK: Extracellular signal-regulated kinases GABA : Acide γ-amino-butyrique GPe : Segment externe du globus pallidus GPi : Segment interne du globus pallidus GRK 6 : G protein-coupled receptor kinase 6 HAT : Histone acétyltransferase HDAC : Histone déacétylasee HHS : Hypothalamo-hypophyso-surrénalien HRE : Élément de réponse aux hormones (Hormone Response Element) i. c. v. : Intracérébroventriculaire IEGs: Gènes à induction précoce (Immediate Early Genes) IL-1β : Interleukine 1β INF-γ : Interféron gamma i. p. : Intrapéritonéal KO : Knock out KOR : Récepteur opioïde κ (κ opioid receptor) LBD : Domaine de liaison du ligand (Ligand-binding domain) L-DOPA : L-3,4-dihydroxy-phénylalanine LTD : Dépression à long terme (Long Term Depression) LTP : Potentialisation à long terme (Long Term Potentiation) MAO : Monoamine oxydase MAPK : Protéine kinase associée aux mitogènes (Mitogen Activated Protein Kinase) MARCKS : Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate MEF2 : Myocyte enhancer factor 2 MOR : Récepteur opioïde μ (μ opioid receptor) MP : Maladie de Parkinson MPTP : 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine MSNs : Neurones moyens épineux (Medium Spiny Neurons) NAc : Noyau Accumbens NBRE : NGFI-B response element NF-κB : nuclear factor-kappa B NMDA : N-methyl-D-aspartate NR : Nuclear hormone receptor NR4A : Nuclear receptors 4A subgroup NST : Noyau sous-thalamique NT : Neurotensine NurRE : Nur-responsive element PFA : Paraformaldéhyde PI3K : Phosphatidylinositol-3-kinase PKA : Protéine kinase A

PKB : Protéine kinase B PKC : Protéine kinase C POMC : Pro-opiomélanocortine PPC : Préférence de place conditionnée RCPGs : Récepteurs couplés aux protéines G RGS9 : Regulator of G-protein-signaling 9 RM : Repeated mesures RNA : Acide ribonucleique (Ribonucleic acid) RPTPs : Receptor protein tyrosine phosphatases RXR : Récepteur X de l’acide rétinoïque SD : Sprague –Dawley rat strain SLN : Signal de localisation nucléaire SN : Substance noire SNC : Système nerveux central SNc : Substance noire pars compacta SNr : Substance noire pars réticula SP : Substance P STDL : Striatum dorsolatéral STDM : Striatum dorsomédial STVL: Striatum ventrolatéral STVM : Striatum ventromédial TCR: T-cell antigen receptor TDAH: Troubles de deficit de l’attention/hyperactivité TH: Tyrosine hydroxylase TNF-α: Tumor necrosis factor alpha UFAs : Unsaturated fatty acids VEH: Vehicle (solution saline 0.9%) VMAT : Transporteur vésiculaire des monoamines (Vesicular Monoamine Transporter) VMAT2 : Transporteur vésiculaire de type 2 des monoamines (Vesicular Monoamine Transporter 2) VTA: Ventral Tegmental area WKY: Wistar-Kyoto rat strain 6-OHDA: 6-hydroxy-dopamine

XVI

Chapitre 1 INTRODUCTION GENERALE

CHAPITRE 1. INTRODUCTION GENERALE

1.1 Introduction

La neurotransmission dopaminergique (DAergique) revêt une importance capitale au sein du système nerveux central (SNC). Elle est en effet, impliquée dans de nombreux mécanismes physiologiques tels que la mémoire, la cognition, l’apprentissage, la prise alimentaire, la production hormonale, le contrôle des fonctions motrices et les comportements motivationnels. Lorsque défectueuse, elle est aussi impliquée, plus ou moins directement, dans diverses maladies neurologiques et psychiatriques comme : la maladie de Parkinson (MP), la schizophrénie, les troubles de la consommation alimentaire (anorexie, boulimie, obésité) ainsi que la dépendance aux drogues d’abus (pour revue : Bjorklund et Dunnett, 2007b).

De nos jours, il existe différentes manières de cibler pharmacologiquement la transmission DAergique : soit en amont en augmentant ou en diminuant le métabolisme de la dopamine (DA), soit en aval en bloquant la recapture de la DA ou en utilisant des agonistes ou des antagonistes DAergiques (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2009). Cependant, si l’on a réussi, jusqu’à présent, à développer des thérapies ciblant la neurotransmission DAergique pour le traitement de la MP (agonistes DAergiques, L-3,4- dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ou de la schizophrénie (antipsychotiques : antagonistes DAergiques), on peine à trouver un moyen d’intervention pour contrer les addictions (fig. 1.1A). En effet, l’instauration d’une dépendance implique des neuroadaptations de la neurotransmission DAergique qui rendent inefficaces les traitements classiques basés sur la reconnaissance d’un ligand agoniste/antagoniste DAergique par les récepteurs DAergiques situés à la surface des cellules (fig. 1.1B). Or, ces neuroadaptations semblent faire intervenir les cascades signalétiques déclenchées par la stimulation des récepteurs DAergiques et la modification de la transcription des gènes et ce, via l’activité d’une diversité de facteurs de transcription dont certains appartiennent à la grande famille des récepteurs nucléaires.

De fait, jusqu’à présent les cibles pharmacologiques utilisées pour contrer les

A. Le ciblage pharmacologique de la neurotransmission DAergique jusqu’à présent

En amont : - Métabolisme de la DA Ex : L-DOPA Ö Augmentation des niveaux de DA

DOPAMINE En aval : - Recapture de la DA (ex : Cocaïne) - Agonistes DAergiques (ex : Pramipexole) - Antagonistes DAergiques (ex : Halopéridol)

Schizophrénie Maladie de Parkinson Addiction

Antagonistes DAergiques Substitution de la DA et/ou Pas de traitement agonistes DAergiques

B. Avons-nous besoin de nouvelles cibles pharmacologiques pour le système DAergique?

Cibles actuelles : - les récepteurs situés à la surface de la cellule. Cibles futures : - les récepteurs nucléaires.

Figure 1.1 : A. Ciblage pharmacologique actuel pour le traitement des pathologies associées à la transmission dopaminergique. B. Les récepteurs nucléaires : une nouvelle cible potentielle ? Jusqu’à présent les cibles pharmacologiques utilisées pour contrer les pathologies liées au système DAergique sont limitées aux récepteurs situés à la surface de la cellule, les récepteurs nucléaires pourraient constituer une nouvelle alternative et procurer de nouvelles cibles, cette fois, intranucléaires, pour le traitement des pathologies associées à la transmission DAergique (Adapté de la revue : Lévesque et Rouillard, 2009).

pathologies associées à la transmission DAergique sont limitées aux récepteurs situés à la surface de la cellule. On considère désormais que les récepteurs nucléaires exprimés au sein du système DAergique pourraient constituer une nouvelle alternative et procurer de nouvelles cibles, cette fois, intranucléaires, pour le traitement des ces pathologies (fig. 1.1B).Nous nous sommes intéressés en particulier à la sous-famille de récepteurs nucléaires Nurs (NR4A) qui sont étroitement associés à la transmission DAergique (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2007). Effectivement, parmi les membres de cette sous-famille, il a été démontré que Nurr1 était impliqué dans le développement des neurones DAergiques et que Nur77 et Nor1 étaient exprimés dans les structures cibles du système DAergique. Ces récepteurs nucléaires ont d’ailleurs fait l’objet d’un intérêt croissant dans la communauté scientifique au cours des dix dernières années (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006). En effet, leur rôle physiologique et leur potentiel thérapeutique a été bien défini en périphérie mais il reste à en faire de même au niveau du SNC (pour revue : Gofflot et coll., 2007; Pearen et Muscat, 2010). Selon les dernières découvertes, au niveau central, ces récepteurs nucléaires/facteurs de transcription pourraient être impliqués dans l’adaptation du système DAergique et dans le maintien de son homéostasie. Ils représenteraient dès lors une nouvelle cible pharmacologique de choix pour le traitement des pathologies associées à la transmission DAergique. En outre, l’un des intérêts majeurs de ces récepteurs nucléaires réside dans le fait qu’ils entretiennent une relation de régulation réciproque avec le système DAergique. Ils sont non seulement capables de moduler, en amont, la transmission DAergique mais ils font également partie, en aval, de la cascade moléculaire induite par les systèmes DAergiques (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2009).

Cette introduction a donc pour objectif de poser les bases pour la compréhension des rôles particuliers de deux de ces récepteurs nucléaires dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants. Dans un premier temps, on présentera le système DAergique. Puis, une section sera consacrée à la présentation des effets comportementaux, de la plasticité et des neuroadaptations induits par les psychostimulants par leur action sur le système DAergique. Enfin, nous présenterons les récepteurs nucléaires de la sous-famille Nurs et leur possible implication dans la régulation et la plasticité de la transmission DAergique. Pour finir, un court exposé des objectifs de la thèse sera réalisé.

1.2 La transmission dopaminergique

La DA est un neurotransmetteur de la famille des catécholamines, agissant sur une grande partie de l’encéphale. La transmission DAergique est, en effet, impliquée dans une grande diversité de fonctions centrales notamment dans la cognition, la mémoire et l’apprentissage, les comportements motivés, le contrôle moteur ainsi que dans la production neuroendocrine (pour revue : Bjorklund et Dunnett, 2007a).

1.2.1 Métabolisme de la dopamine

L’essentiel de la synthèse de la DA se déroule au niveau des terminaisons axonales. La tyrosine hydroxylase (TH) est l’enzyme clé de cette synthèse, elle transforme la tyrosine circulante en L-DOPA, laquelle sera ensuite décarboxylée en DA par l’enzyme DOPA- décarboxylase des acides aminés (AADC ; fig. 1.2). À la différence des enzymes décarboxylases, la TH est spécifiquement assignée à la synthèse des catécholamines (DA, adrénaline et noradrénaline). Dès lors, la TH constitue un excellent marqueur des populations neuronales DAergiques. Il faut toutefois signaler qu’elle n’est pas un marqueur exclusif des neurones DAergiques, puisque la DA sert de précurseur à la noradrénaline et à l’adrénaline. Fonctionnant d’emblée au maximum de son potentiel catalytique, l’action de la TH définit une étape limitante dans la production de DA (Zigmond et coll., 1989; pour revue : Constentin, 1990).

Figure 1.2 : Les étapes de la biosynthèse de la dopamine (tiré du site http://www.wormatlas.org/neurotransmitterstable.htm)

Suite à sa synthèse, la DA est stockée dans des vésicules au niveau des terminaisons présynaptiques par le biais d’une unité de transport vésiculaire des monoamines (VMAT2). Ce transporteur permet donc de diminuer la concentration intracellulaire de DA sans avoir recours à son inactivation enzymatique (Peter et coll., 1995). La libération de la DA dans le milieu extracellulaire se fera par exocytose en réponse à l’arrivée d’un potentiel d’action. Au niveau de la fente synaptique, la DA interagit avec ses récepteurs situés sur les membranes post- et présynaptiques (Zucker et coll., 1999).

Pour permettre la succession rapide des informations, il est nécessaire qu’un neurotransmetteur agisse brièvement dans la fente synaptique. L’action transitoire de la DA est assurée par trois mécanismes qui contribuent à l’élimination de la DA de l’espace synaptique (pour revue : Samadi et coll., 2007): 1) la DA peut être recaptée par les terminaisons présynaptiques et pourra ainsi être réutilisée. Cette recapture constitue le mécanisme le plus important car il concerne 80 % de la DA libérée. Elle est réalisée via un système très efficace de transporteurs membranaires. Et ce, en particulier par le transporteur à haute affinité pour la dopamine (DAT) qui assure une fonction régulatrice en réduisant la durée et l’amplitude du signal DAergique dans la synapse (Mortensen et Amara, 2003); 2) Les cellules gliales avoisinantes capturent elles aussi une partie de la DA ; 3) enfin, l’inactivation de la DA peut être effectuée par diverses enzymes dont la Catéchol-o- méthyltransferase (COMT) qui transforme la DA en acide homovanillique mais aussi par des monoamines oxydases (MAO) et en particulier la MAO-B. La MAO est principalement exprimée dans les astrocytes alors que la COMT est située majoritairement sur les neurones postsynaptiques (pour revue : Constentin, 1995; Samadi et coll., 2007).

Au niveau du striatum et du noyau accumbens (NAc), c’est le transporteur DAT qui effectue la plus grande partie du travail de recapture (Sacchetti et coll., 2001). Dans le cortex préfrontal, le DAT n’est présent qu’en faible densité dans la synapse (pour revue : Bannon et coll., 2001), c’est donc la COMT qui devient le protagoniste le plus efficace pour l’élimination de la DA (pour revue : Tunbridge et coll., 2006).

1.2.2 Les récepteurs de la dopamine

La DA exerce son action dans le cerveau par le biais de différents sous-types de récepteurs (pour revue : Jaber et coll., 1996). Ces récepteurs DAergiques sont tous des récepteurs métabotropiques couplés à des protéines G (RCPGs) qui vont transmettre le message à l’intérieur de la cellule. La dopamine est définie comme un neurotransmetteur à action lente. En effet, contrairement aux neurotransmetteurs à action rapide, comme le glutamate, qui peuvent influencer directement l’excitabilité électrique des neurones en activant des récepteurs ionotropiques, la dopamine se fixant aux RCPGs fait intervenir des cascades de signalisations intracellulaires via des seconds messagers qui ralentissent la transmission du signal. Ces récepteurs sont au nombre de cinq, classés en deux grandes familles selon leurs caractéristiques structurales et leurs propriétés pharmacologiques: la famille de récepteurs D1 (comprenant les sous-types D1 et D5) et la famille D2 (incluant les sous-types D2, D3, D4). Afin de simplifier le présent ouvrage, les termes « récepteurs D1 » et « récepteurs D2 » seront utilisés pour faire référence aux deux familles de récepteurs (pour revue : Vallone et coll., 2000).

1.2.2.1 Localisation tissulaire et cellulaire

En ce qui a trait à l’expression des différents sous-types des récepteurs DAergiques dans le noyau accumbens et le striatum (les deux structures plus particulièrement étudiées dans cette thèse), les plus nombreux restent les sous-types D1 et D2. En effet, l’expression des récepteurs D3 est un peu moins abondante et serait restreinte au noyau accumbens (pour revue : Beaulieu et Gainetdinov, 2011). Celle des récepteurs D5 est très faible et répartie à travers le striatum (Rivera et coll., 2002). Enfin, celle des récepteurs D4 n’est pas détectée dans ces structures (Noain et coll., 2006). Aussi, les sous-types majoritaires D1 et D2 présentent la caractéristique d’être fortement ségrégés dans les deux principales populations neuronales GABAergiques (GABA pour acide γ-aminobutyrique) de ces structures qui expriment sélectivement la dynorphine ou l’enképhaline (voir parties 1.2.3). En effet, les récepteurs D1 sont localisés en majorité sur les neurones GABAergiques qui co-expriment

la dynorphine alors que les D2 sont situés plus spécifiquement sur les neurones GABAergiques qui co-expriment l’enképhaline (Gerfen et coll., 1990 ; Bertran-Gonzalez et coll., 2008 ; Surmeier et coll., 2010). Cependant, il semblerait que cette ségrégation, bien que très marquée, ne soit pas aussi nette car une population neuronale co-exprimant les deux récepteurs a été mis en évidence par certaines études au niveau notamment du striatum (≈5%) et de la coquille du noyau accumbens (≈20%) (Bertran-Gonzalez et coll., 2008; Perreault et coll., 2010).

Concernant leur distribution au niveau synaptique, les récepteurs DAergiques peuvent être exprimés soit sur l’élément présynaptique, soit sur l’élément postsynaptique. Les récepteurs de la famille D1 sont uniquement présents au niveau postsynaptique. Les récepteurs de la famille D2, sont, quant à eux, localisés aussi bien au niveau postsynaptique dans les structures cibles des différentes voies DAergiques qu’au niveau présynaptique sur les neurones DAergiques et sur les afférences glutamatergiques des structures cibles du système DAergique (pour revue : Vallone et coll., 2000; Dani et Zhou, 2004; Samadi et coll., 2007). En effet, il existe, par exemple deux isoformes pour le sous-type D2: le récepteur D2 court (D2s) et une version plus longue, le récepteur D2 long (D2L), qui possède

29 acides aminés en plus. Cette extension dans le D2L pourrait servir à déterminer la localisation cellulaire du récepteur car des études ont montré que son expression était confinée au niveau postsynaptique alors que le D2S est situé au niveau présynaptique sur les terminaisons dopaminergiques et glutamatergiques (Usiello et coll., 2000; De Mei et coll., 2009).

1.2.2.2 Voies de signalisation

1.2.2.2.1 Signalisation induite par les récepteurs postsynaptiques

Au niveau postsynaptique, les deux grandes familles de récepteurs peuvent activer diverses voies signalétiques intracellulaires. Parmi, celles-ci, nous décrirons la plus connue pour illustrer la fonction globale de chacune des deux familles. Au niveau postsynaptique, l’une des principales différences entre les deux familles tient au fait qu’elles sont couplées à

7 des protéines G différentes, qui ont des effets opposés sur les voies signalétiques intracellulaires (fig. 1.3; pour revue : Vallone et coll., 2000).

En effet, les récepteurs DAergiques de la famille D1 sont couplés positivement à l'adénylate cyclase (AC) via la protéine Gs et permettent la production d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) qui déclenche de nombreuses réponses métaboliques dépendantes de la protéine kinase A (PKA) et facilite notamment la dépolarisation du neurone cible (pour revue : Vallone et coll., 2000; Surmeier et coll., 2010). De fait, l’activation de la PKA conduit à la phosphorylation de diverses protéines dans la cellule (Huff et coll., 1997). Au niveau du striatum, les principales cibles de la PKA sont DARP- 32 (pour dopamine and cyclic AMP-regulated phosphoprotein, 32 KDa), CREB (pour Cyclic AMP Response Element Binding protein) et certains canaux ioniques voltage ou chimio-dépendants impliqués dans la modulation de l’excitabilité neuronale (Neve et coll., 2004). Ainsi, l’activation par le récepteur D1 de cette cascade d'événements intracellulaires mène à la phosphorylation de facteurs de transcription nucléaires tels que CREB. Or, la phosphorylation de ce dernier conduit à l'augmentation de l’expression de gènes d’induction précoces comme c-fos et zif268 mais aussi à celle des ARNm de neuropeptides endogènes tels que la prodynorphine et la substance P (Svenningsson et coll., 2000b; Nestler, 2001b; pour revue : Waltereit et Weller, 2003). Cette cascade de signalisation interviendrait dans la consolidation de l'information au niveau du SNC (pour revue : Bozon et coll., 2003). Aussi, cette voie active la protéine DARP-32 qui ultimement active MEK et la voie des ERK (pour Extracellular signal-regulated kinases).

En outre, l’activation des récepteurs D1 induit également la voie des kinases associées aux mitogènes (MAPK, mitogen-activated protein kinases). De fait, l’administration de psychostimulants favorise la phosphorylation de cette voie de signalisation par le récepteur D1 (Beaulieu et coll., 2006; Valjent et coll., 2005). Cependant, selon certaines études, l’activation de cette voie D1-dépendante nécessiterait également l’activation concomitante des récepteurs N-méthyl-d-aspartate (NMDA) par le glutamate ainsi que de certaines voies de signalisation par les phosphatases, elles-mêmes capables de solliciter l’activation de la voie AMPc/PKA (Valjent et coll., 2005). Ainsi,

suite à l’activation du récepteur D1 plusieurs voies convergent vers la phosphorylation des ERK.

À l’inverse, les récepteurs de la famille D2 sont couplés à une protéine G inhibitrice (la protéine Gi/o) qui bloque la synthèse d'AMPc et par conséquent inhibe la PKA (Strange, 1993; Beaulieu et Gainetdinov, 2011). Son activation aura donc l’effet inverse par rapport à celui des récepteurs D1. En effet, cette inhibition aura un effet globalement hyperpolarisant sur la cellule cible car elle facilite l’inhibition des courants calciques et l'ouverture des canaux K+ hyperpolarisants. La stimulation des récepteurs D2 active également des cascades de signalisation menant à une induction de l’expression de neuropeptides endogènes mais cette fois : l’enképhaline (ENK) et la neurotensine (Engber et coll., 1992; pour revue : Constentin, 1995; Steiner et Gerfen, 1998).

En outre, les récepteurs D2 médient des voies signalisation comme celle des MAPK, les transporteurs Na+/H+ ainsi que des canaux ioniques calciques et potassiques via la sous-unité Gβγ de la protéine G inhibitrice. En effet, la sous-unité Gβγ semble tout particulièrement impliquée dans la modulation de la concentration cytoplasmique de calcium. Elle peut, d’une part, activer la phospholipase C (PLC) et provoquer une libération de calcium dans le cytoplasme à partir des réserves endoplasmiques intracellulaires augmentant ainsi la concentration cytoplasmique de calcium. Curieusement, elle peut, d’autre part, agir à l’inverse en régulant à la baisse l’entrée de calcium extracellulaire en bloquant les canaux calciques voltage-dépendant (Yan et coll., 1997 ; Hernandez-lopez et coll., 2000).

Enfin, selon de récentes études, les RCPGs pourraient également induire des voies de signalisations indépendantes des protéines G. Par exemple, il a été démontré que les récepteurs D2 pouvaient activer des cascades de signalisation par l’entremise d’une protéine d’ancrage, la β-arrestine qui induirait l’intervention d’effecteurs tels que Akt et GSK-3 (pour Glycogen synthase kinase 3) (Beaulieu et coll., 2009, 2011; pour revue : Beaulieu, 2012). Ces données sont intéressantes puisque Akt a récemment été identifié

9 comme un potentiel intervenant dans la plasticité des systèmes DAergiques (Tian et coll., 2010). Ainsi, la liaison de la DA à ses deux familles de récepteurs provoque la transduction du signal via des cascades de réactions intracellulaires différentes dont les effets sont globalement opposés. En somme, la stimulation des récepteurs D1 a un effet excitateur et celle des récepteurs D2 a un effet inhibiteur (pour revue : Surmeier et coll., 2007; Surmeier et coll., 2010).

1.2.2.2.2 Signalisation induite par les récepteurs D2 présynaptiques

Au niveau présynaptique, les récepteurs D2 présynaptiques, sont exprimés sur les corps cellulaires, les dendrites et les terminaisons des neurones DAergiques; cette particularité leur confère le statut d’autorécepteurs (Usiello et coll., 2000). Au niveau des corps cellulaires et des dendrites, les autorécepteurs ont pour fonction de réguler négativement le taux de décharge des cellules DAergiques. Ils peuvent, en effet, moduler l’amplitude et la durée du signal DAergique via la régulation de canaux calciques (pour revue : Schmitz et coll., 2003). Au niveau des terminaisons DAergiques, les récepteurs D2 régulent négativement la synthèse de la DA (Jackson et Westlind-Danielsson, 1994). Ainsi, les autorécepteurs permettent d’assurer l’autorégulation du système DAergique via une boucle de rétroaction qui va contrôler la libération et la synthèse de la DA (pour revue : Schmitz et coll., 2003).

D’autre part, certaines structures cibles des voies DAergiques comme le striatum et le NAc reçoivent également des afférences glutamatergiques en provenance du cortex. Or, on a aussi relevé la présence de récepteurs D2 au niveau présynaptique sur les terminaisons axonales de ces afférences glutamatergiques. Ces récepteurs permettraient donc de moduler l’influx glutamatergique issu du cortex (Bamford et coll., 2004; pour revue : Dani et Zhou, 2004). Ainsi, ces divers mécanismes de rétroaction permettent aux voies DAergiques de maintenir leur homéostasie via des mécanismes d’adaptation rapides (pour revue : Grace, 2000; Grace et coll., 2007). Dans le registre adaptatif, une autre intervention des récepteurs DAergiques peut être soulevée. En effet, il a été proposé que la libération répétée de DA

DA DA

Ext. D1-like D2-like Membrane Int.. AC Gs Gi + - + - PKA AMPc AMPc PKA

Phosphorylation Pas de phosphorylation des canaux K+ et Na+ des canaux K+ et Na+ (et autres protéines)

Facilitation des courants Na+ Facilitation des courants K+ (et autres réponses cellulaires)

Dépolarisation Hyperpolarisation

Excitation du neurone Inhibition du neurone

Figure 1.3 : Les récepteurs de la dopamine et leurs effets sur une de leur principale voie de signalisation, celle de l’adénylate cyclase.

La DA agit sur deux grandes familles de récepteurs "D1-like" et "D2-like". Elles sont toutes deux métabotropiques, mais provoquent des effets parfois opposés : les récepteurs de la famille D1 (D1 et D5) sont couplés via la protéine Gs à l'adénylate cyclase (AC) activant ainsi la production d'AMPc qui déclenche de nombreuses réponses métaboliques dépendantes de la protéine kinase A (PKA) ; citons en particulier la phosphorylation des canaux ioniques qui active les conductances Na+ et inhibe les courants K+, ce qui résulte en une augmentation de l’excitabilité neuronale. Les récepteurs de la famille D2 (D2, D3, D4) sont couplés à la protéine Gi/o et inhibent la synthèse d'AMPc ; ce qui en particulier facilite l'ouverture de canaux K+ hyperpolarisant et donc inhibe les neurones. Ainsi, selon la nature de son récepteur, la DA stimule ou inhibe les neurones ; on ne peut donc pas lui attribuer un rôle global de neurotransmetteur inhibiteur ou excitateur.

11 menait à des adaptations qui correspondraient à une réponse physiologique compensatoire à la surstimulation du système (pour revue : Robinson et Berridge, 2003). Or, un des exemples d’adaptations est justement la modification de la concentration des récepteurs DAergiques à la surface des membranes cellulaires.

1.2.2.3 Propriétés des récepteurs dopaminergiques

Les récepteurs D1 et D2, peuvent exister soit dans un état de faible affinité pour la DA (D1low et D2low) soit dans un état de haute affinité pour la DA (D1high et D2high). La proportion des récepteurs en haute et basse affinité est liée au couplage du récepteur avec les protéines G. Par exemple, le récepteur D2high représente celui qui est couplé alors que le D2low est la portion non couplée du récepteur. Les récepteurs à haute affinité ont une affinité environ 1000 fois plus grande que celle des récepteurs à basse affinité. L’état fonctionnel des récepteurs DAergiques est considéré comme correspondant aux récepteurs sous leur forme D1high et D2high (McDonald et coll., 1984; George et coll., 1985; Shuto et coll., 2008). En effet, lors d’une faible libération, la DA se fixe préférentiellement sur les récepteurs à haute affinité, ce n’est que lors d’une libération massive de DA, comme sous l’action de psychostimulants, que les récepteurs à basse affinité sont éventuellement recrutés. De base, les récepteurs D1high et D2high à haute affinité sont présents au niveau du striatum dans une proportion d’environ 20% par rapport au nombre total de récepteurs D1 et D2 (Seeman, 2008). De manière intéressante, il a été démontré que l’hypersensibilité comportementale à la DA était toujours associée avec une augmentation majeure de la concentration des récepteurs D2high dans le striatum (Seeman et coll., 2002; Seeman et coll., 2005; Sacchetti et coll., 2006; Seeman et coll., 2006; Seeman, 2009).

Selon le modèle tonique/phasique de la libération de DA (pour revue : Grace, 2000), les deux familles de récepteurs possèdent des modes d’actions distincts et antagonistes. La comparaison de l’affinité relative des deux familles D1 et D2, montre que les récepteurs D2 présentent une affinité pour la DA beaucoup plus grande que les récepteurs D1 (pour revue : Hikida et coll., 2010). Il a par conséquent été suggéré que ce sont les récepteurs D2,

qui assurent la régulation du taux de base de la DA (i.e. le niveau tonique) reflétant ainsi l’activité basale des neurones DAergiques. Quant aux récepteurs de type D1, ils ne peuvent être stimulés que par une concentration relativement haute de DA et seraient plutôt impliqués dans la médiation de la libération phasique de DA. Cette libération phasique dépend de la fluctuation de l’activité des neurones DAergiques en réponse à une stimulation particulière (Schultz, 2007a, 2007b). Plus que le taux absolu de DA, c’est l’équilibre entre ces deux niveaux, tonique et phasique, qui assure le bon fonctionnement du système. Un dysfonctionnement de cette balance serait la cause des phénomènes de dépendance (Bertran-Gonzalez et coll., 2008; Perez et coll., 2011; Grieder et coll., 2012; pour revue : Grace et coll., 2007).

En outre, parmi les récepteurs de la famille D2, le sous-type D3 aurait un rôle particulier à jouer dans la réponse aux drogues d’abus, et en particulier aux psychostimulants. Il est en effet, comme on l’a décrit plus haut, exprimé sélectivement et en forte densité dans le noyau accumbens; structure cible du système DAergique méso- limbique impliquée dans la modulation des comportements motivés. De base, l’activité locomotrice chez les rongeurs serait régulée principalement par les influences opposées des différents sous-types de récepteurs DAergiques D1, D2 et D3 (Sibley et coll., 1999; pour revue : Beaulieu et Gainetdinov, 2011). Dans ce contexte, la stimulation du récepteur D3 aurait pour effet de s’opposer à l’activation concurrente des récepteurs D1 et D2. Les récepteurs D3 exerceraient une action inhibitrice modérée sur l’activité locomotrice et ce, en faisant intervenir soit ses populations pré- ou postsynaptiques (Joseph et coll., 2002).

Bien qu’il ne soit présent qu’à une échelle d’un récepteur D3 pour deux récepteurs D2 dans le noyau accumbens et le striatum, il a été démontré que ce sous-type D3 (pour revue : Cho et coll., 2010) avait une affinité pour la DA 200 fois plus importante que le récepteur D2 et

70 fois plus élevée que les récepteurs D2 et D1 combinés (Richtand et coll., 2001a, 2001b). Ce déséquilibre dans l’affinité pour la DA implique par conséquent une plus forte probabilité de liaison aux récepteurs D3 lors d’une stimulation de la libération de la DA induite par les psychostimulants. Selon certaines études, cela résulterait en une désensibilisation sélective des récepteurs D3 comparativement aux récepteurs D2 et D1. Par conséquent la sensibilisation comportementale observée suite à l’administration répétée de

13 psychostimulants pourrait être due à l’essoufflement du système de freinage qu’exerce normalement le récepteur D3 sur la transmission DAergique (Cho et coll., 2001). Le rôle inhibiteur du récepteur D3 sur l’activité locomotrice est supporté par une étude montrant que les souris déficiente pour le gène de ce récepteur présentent une vulnérabilité accrue à la cocaïne. Le ciblage sélectif du récepteur D3 est actuellement considérer comme une avenue intéressante pour traiter les addictions aux psychostimulants (pour revue : Newman et coll., 2012).

1.2.3 Les circuits dopaminergiques

Les corps cellulaires des neurones DAergiques sont principalement situés dans le mésencéphale et le diencéphale. Ils peuvent être regroupés en quatre noyaux principaux, un noyau diencéphalique à savoir le noyau arqué (A12 ; selon la terminologie de Dahlstroem et Fuxe, 1964) et trois noyaux mésencéphaliques : l’aire rétrorubrale (A8), la substance noire (A9) et l’aire tegmentale ventrale (A10).

Les circuits qui prennent leur origine des noyaux mésencéphaliques A10 et A9 feront l’objet d’une description plus détaillée dans les parties subséquentes. Il s’agit respectivement du circuit mésocorticolimbique qui est constitué des projections DAergiques de l’aire tegmentale ventrale (ATV) ainsi que le circuit nigro-strié qui est constitué des projections de la substance noire (SN) et appartient au réseau des ganglions de la base (Wise, 2004). En effet, ce sont les deux principaux circuits étudiés dans cette thèse de par leur implication centrale dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants. Le troisième noyau mésencéphalique, l’aire rétrorubrale (A8), favoriserait simplement la coordination des deux systèmes en permettant la communication entre la SN pars compacta et l’ATV (Arts et coll., 1996). Pour finir, la voie DAergique tubéro-infundibulaire a pour origine le noyau arqué de l’hypothalamus (A12) et projette vers l’hypophyse. Cette voie est davantage impliquée dans la régulation hormonale caractéristique de l’hypothalamus et en particulier dans la régulation de la libération de la prolactine par l’hypophyse antérieure (pour revue: Samadi et coll., 2007; Bolam et coll., 2008).

1.2.3.1 Le circuit mésocorticolimbique

Le circuit mésocorticolimbique est un circuit correspondant au système neuronal de récompense (pour revue : Volkow et coll., 2012). En effet, les structures appartenant au circuit de la récompense sont spécifiquement impliquées dans le renforcement des comportements indispensables à la survie de l’individu et de l’espèce (manger, boire, se reproduire). Ces régions cérébrales, interconnectées entre elles, sont chargées de récompenser l’exécution de ces comportementaux vitaux par l’apparition d’une sensation agréable ou d’empêcher la reproduction de comportements néfastes en produisant une réaction aversive (pour revue : Bromberg-Martin et coll., 2010; fig. 1.4).

1.2.3.1.1 Structure

Les projections DAergiques de l’ATV innervent le cortex (surtout la partie antérieure) et le système limbique (NAc, septum, hippocampe et amygdale). Ces projections constituent le circuit mésocorticolimbique impliqué dans le traitement d'informations d'ordre cognitivo-affectif et notamment dans la régulation de l’attention, de la mémoire, des émotions, de la motivation et de la récompense (Schultz et coll., 1997; Wise, 2004; pour revue : Volkow et coll., 2012). Il est lui-même constitué de deux voies distinctes : la voie mésocorticale et la voie mésolimbique (Wise, 2009).

La voie mésocorticale est composée des projections DAergiques de l’ATV vers les régions corticales : préfrontale (principalement), cingulaire et entorhinale. Elle est impliquée dans le contrôle inhibiteur, dans la prise de décisions, la motivation, la régulation des émotions, dans l’attribution d’une valeur motivationnelle (salience) et dans l’intégration et l’évaluation des situations potentiellement stressantes (pour revue : Volkow et coll., 2012). Elle serait d’autre part impliquée dans les conséquences cognitives de l’imprégnation émotionnelle de la prise de drogues, le « craving » ainsi que la recherche compulsive de drogues (Goldstein et coll., 2001; Maldonado, 2003).

La voie mésolimbique est quant à elle constituée des projections de l’ATV vers plusieurs noyaux sous-corticaux qui font partie du système limbique. Cette voie projette donc principalement vers le NAc, mais aussi vers l’amygdale, l’hippocampe, le septum, le tubercule olfactif ainsi que vers les régions ventrales du striatum (caudé putamen) (pour revue : Maldonado, 2003). Les afférences de l’ATV sont ces mêmes aires, en plus du thalamus. La voie mésolimbique, encore appelée système de récompense, est impliquée dans la motivation, le désir et la récompense. Elle serait le siège des processus de renforcement et de dépendance associés à la prise de drogues d’abus. Sachant que la DA est le substrat commun impliqué dans l’abus et les propriétés addictives des drogues (pour revue : Maldonado, 2003; Kalivas et Volkow, 2005; Nestler, 2005; Bromberg-Martin et coll., 2010; Volkow et coll., 2012), on peut en déduire que l’ATV possèderait un impact fonctionnel unique sur le système de récompense. En effet, elle est la seule, parmi les structures du système de récompense, à produire de la DA. L’ATV contient environ 80% de neurones DAergiques et se situe en continuité de la SN pars compacta.

La principale cible du circuit mésolimbique est le NAc. Cette voie de signalisation ATV-NAc est le substrat le plus important expliquant l’effet de récompense de la majorité des drogues d’abus (fig. 1.4) aussi elle s’intègre dans le réseau des ganglions de la base et constitue le point d’entrée de la partie ventrale de ce réseau. Le NAc présente des caractéristiques structurales communes à celles du striatum (voir section 1.2.3.2.2). Il est constitué, essentiellement, à 90% de neurones de projections GABAergiques. Du fait de leur morphologie caractéristique, ces neurones sont encore appelés neurones épineux moyens (MSNs pour medium spiny neurons) et envoient des projections vers le thalamus, le striatum et le mésencéphale, mais également vers l’ATV assurant ainsi un rétrocontrôle des influx reçus de l’ATV (Wilson, 2004).

Le NAc peut être subdivisé en deux parties distinctes ayant chacune des propriétés neurochimiques et des connexions différentes. Ainsi, on distingue deux composantes fonctionnelles différentes (pour revue : Kalivas et Volkow, 2005) : une partie ventromédiale ou « coquille » du NAc strictement relié aux structures limbiques désignées sous le vocable l’amygdale étendue « extended amygdala » et une partie dorsolatérale ou

« corps » du NAc considérée comme partie intégrante du complexe striatopallidal. De fait, la coquille jouerait un rôle dans les fonctions motivationnelles et émotionnelles alors que le corps serait plutôt impliqué dans les fonctions somatomotrices (Cadoni et coll., 2000; Ito et Hayen, 2011). De même que le striatum, les MSNs du NAc peuvent être ségrégés en deux populations différentes exprimant des récepteurs DAergiques et des neuropeptides distincts (voir section 1.2.3.2.1). Alors que les récepteurs D2, la neurotensine (NT) et le neuropeptide ENK sont fortement exprimés dans les neurones de la partie corps du NAc, les neurones exprimant les récepteurs D1, la substance P (SP) et la dynorphine (DYN) sont distribués de façon égale dans les deux parties du NAc (Lu et coll., 1998). L’innervation DAergique émise par l’ATV est régulée par des neuropeptides endogènes (DYN, ENK) qui peuvent agir soit au niveau du NAc sur les terminaisons présynaptiques pour contrôler le taux de libération de la DA, soit sur les corps cellulaires au niveau de l’ATV (pour revue : Steiner et Gerfen, 1998; Samadi et coll., 2007).

1.2.3.1.2 Fonction

Le circuit de la récompense définit à chaque instant l’état de satisfaction physique et psychique dans lequel se trouve le sujet. L’activité des neurones DAergiques augmente à l’occasion de récompenses telles que la prise de nourriture (pour revue : Volkow et coll., 2012). L’apprentissage conduit à ce que ce ne soit plus la récompense qui active les neurones DAergiques mais les signaux annonçant l’arrivée de cette récompense (pour revue : Kalivas et Volkow, 2005).

La libération de DA signale au circuit mésolimbique d’initier les réponses comportementales adaptées aux stimuli motivationnels perçus. Ce faisant, elle facilite les changements cellulaires qui établissent les associations apprises liées à ces stimuli (pour revue : Ikemoto, 2010). L’organisme peut ainsi émettre une réponse comportementale adaptative plus efficace face à l’événement motivationnel au cas où ce dernier viendrait à se reproduire. Toutefois, tout comme dans le cas d’une administration répétée de drogues, quand un événement naturellement motivationnel devient familier, la libération de la DA n’est plus induite par cet événement particulier (pour revue : Volkow et coll., 2012). Dans

Figure 1.4: Schéma du circuit de la « récompense » ou circuit mésocorticolimbique (bleu). Cette figure illustre les voies dopaminergiques abordées dans cette thèse. La voie nigro-striée (en rouge) est constituée de la projection des neurones dopaminergiques de la substance noire vers le striatum. Elle est impliquée dans le contrôle de la motricité. La voie mésolimbique ou circuit de la récompense (en bleu) correspond aux projections des neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale vers le noyau accumbens, le cortex préfrontal et l’hippocampe. Cette voie est impliquée dans les comportements motivés, la récompense et l’apprentissage. Le pallidum ventral sert d’interface entre les territoires limbiques et sensori-moteurs. Ainsi, le striatum et le noyau accumbens pourraient jouer des rôles importants dans la régulation des comportements moteurs et des comportements motivés. Les flèches pointillées indiquent des régions cérébrales spécifiques alors que les flèches tracées de manière continue indiquent les principales voies dopaminergiques (Adapté de Knab et Lightfoot, Int J Biol Sci. 2010).

ce cas, bien que la réponse comportementale reste dirigée vers un but, elle est bien apprise et les changements neuroplastiques induits par la DA ne sont plus nécessaires.

Cependant, il est important de noter qu’un stimulus conditionnel annonçant la venue imminente de l’événement, continue à induire la libération de DA (Sutton et Beninger, 1999; pour revue : Schultz, 2010b; Schultz, 2010a). Il faut en effet savoir qu’actuellement, on prête à la DA mésolimbique un rôle majeur dans l’apprentissage, précisément dans l’acquisition par le stimulus, de propriétés renforçantes (pour revue : Schultz et coll., 1997; Berridge et Robinson, 2003; Schultz, 2010b; Schultz, 2010a). Dans cette perspective, la DAn’est pas la récompense mais plutôt un signal indiquant qu’un apprentissage est nécessaire en rapport avec la valeur du stimulus (German et Fields, 2007a; German et Fields, 2007b; Owesson-White et coll., 2008). Elle pourrait même peut-être médier cette fonction car on sait qu’elle module la LTP « long-term potentiation » ou la LTD « long- term depression » par le biais des récepteurs NMDA du glutamate (Jentsch et Taylor, 1999; Zweifel et coll., 2008; Zweifel et coll., 2009; pour revue : Kauer et Malenka, 2007).

De ce fait, la DA s’est vue attribuer, à tort, le titre de neurotransmetteur du plaisir (Wise, 1998). On sait maintenant que la DA n’est qu’une composante, certes principale, de la médiation de l’affect positif. En effet, sa libération survient suite à des stimuli aussi bien positifs que négatifs (pour revue : Rolls, 2000; Ashby et coll., 2002). Ainsi, elle ne peut expliquer à elle seule la sensation de plaisir puisqu’elle véhicule également les signaux liés à des événements aversifs. On pense actuellement que les neurones du noyau A10 représentent plutôt une interface entre le système limbique et les systèmes moteurs (pour revue : Bromberg-Martin et coll., 2010). Ils opèrent dans les phénomènes de motivation et leur bon fonctionnement contribue à la flexibilité des réponses comportementales. Ainsi, la DA aurait plutôt pour rôle d’encoder la prédiction d’une récompense, d’attribuer une valeur hédonique à un stimulus et de faciliter l’apprentissage des associations stimulus- récompense (conditionnement) via son rôle de modulateur des régions sous-corticales (incluant le NAc et l’hippocampe) et corticales (pour revue : Ikemoto, 2010).

Les bases de l’intégration de l’aversion et de la motivation ont pour siège les structures limbiques (hippocampe, amygdale) et le cortex préfrontal qui reçoivent des influx nerveux de l’ATV et du NAc (pour revue : Kalivas et Volkow, 2005). En retour, le complexe cortico-limbique projette des axones glutamatergiques sur le NAc et les neurones DAergiques de l’ATV sont innervés par des terminaisons glutamatergiques du cortex préfrontal (pour revue : Surmeier et coll., 2007). Cette innervation assure le contrôle cortical/conscient des comportements hédonistes et aversifs, évitant ainsi les conduites abusives et les déviances. Pour ce qui est des manifestations somatiques de l’aversion/motivation, c’est l’hypothalamus qui les déclenche en stimulant les systèmes autonome (neurovégétatif) et endocrinien (pour revue : Schultz et coll., 1997 ; Nestler, 2005).

Le NAc reçoit des inputs principalement depuis les aires temporales (y compris la formation hippocampique), limbiques et orbitofrontales, ainsi que du noyau amygdalien basolatéral et de l’ATV. En retour, il projette vers le pallidum ventral (pour revue : Surmeier et coll., 2007). L’information nerveuse est alors transférée, via le thalamus, aux cortex préfrontal, orbitofrontal et cingulaire, et à l’ATV (pour revue : Kalivas et Volkow, 2005). De plus, la circuiterie ventrale est parallèle à celle du striatum dorsal, ce qui confère à cette structure sous-corticale un rôle de passage par lequel le système limbique influence les régions motrices. En effet, le striatum ventral appartient également aux ganglions de la base impliqués dans la réalisation des mouvements (voir section 1.2.3.2.2 ; fig. 1.5 et 1.6).

De par la multiplicité des influx qui convergent vers lui, le NAc constitue le substrat cérébral pour les interactions entre les associations stimuli-récompense et le contrôle inhibiteur cortical (Haber et coll., 2000; pour revue : Jentsch et Taylor, 1999 ; Volkow et coll., 2012). Son activation par les stimuli découlerait surtout des « inputs » provenant de l’amygdale, du cortex préfrontal et de l’hippocampe. Il servirait ainsi de relais pour que les stimuli conditionnés, appris au niveau de l’amygdale, puissent moduler le comportement, en fonction du contexte (hippocampe). L’amygdale aurait pour rôle d’associer des propriétés aversives ou appétitives à un stimulus et régulerait la projection nigro-striée en fonction de ces associations (Lintas et coll., 2012; pour revue : Gardner, 2011).

L’hippocampe serait, quant à lui, impliqué dans l’association d’un environnement avec le stimulus. C’est notamment au niveau des aires CA1 et CA3, cibles des projections DAergiques de l’ATV, que se produiraient ces apprentissages associatifs (Colon-Cesario et coll., 2006; Ji et Maren, 2008; Datson et coll., 2011; pour revue : Volkow et coll., 2012). Ainsi, c’est la fonction de relais du NAc qui expliquerait en bonne partie divers phénomènes de la dépendance aux drogues, et plus particulièrement le fait que les stimuli associés à la drogue puissent parfois diriger les conduites compulsives du toxicomane (pour revue : Ikemoto et coll., 2010).

En somme, deux conclusions peuvent être tirées de cette description. D’une part, deux fonctions principales peuvent être assignées à la DA dans le circuit de la récompense : 1) elle alerte l’organisme de l’apparition de nouveaux stimuli appétitifs et ainsi favorise l’apprentissage ; 2) elle prévient l’organisme de l’arrivée imminente d’un événement motivationnel significatif sur la base des associations apprises faites à partir des indices prédisant l’événement récompensant (pour revue : Keitz et coll., 2003; Schultz, 2010a).

Et d’autre part, le rôle clé accordé au NAc dans le système de récompense ne dériverait pas d’une capacité d’appréciation des renforcements mais plutôt de sa fonction d’entonnoir ou de filtre des influences comportementales. Il médie le désir (incentive value), dissocié du plaisir (hedonic value) (pour revue : Volkow et coll., 2012). D’un point de vue fonctionnel, le NAc sert d’interface entre le cortex préfrontal/système limbique (impliqué dans la cognition, les émotions, l’apprentissage et la mémoire) et le système moteur (cortex frontal, striatum et SN pars reticulata) afin de permettre la conversion de la motivation en une action ou l’aversion en la répression d’une action (Mogenson et coll., 1987; Kelley, 1999; pour revue : Volkow et coll., 2012).

1.2.3.1.3 Pathologies associées

En ce qui à trait aux neuropathologies, le NAc est le site d’action privilégié des drogues d’abus (pour revue : Nestler, 2005). De fait, le circuit de motivation est «détourné» par les drogues car en produisant du plaisir, elles incitent l’individu à développer un comportement de consommation compulsive où l’usage de drogues remplace les

21 comportements de survie. Les drogues pourraient donc perturber le fonctionnement de ce système en modifiant le rapport de force qui existe entre les divers « inputs », corticaux et sous-corticaux (pour revue : Volkow et coll., 2012). Les stimuli conditionnés seraient alors susceptibles de surpasser des « inputs » plus réfléchis et ainsi initier les réponses conditionnées associées, de manière automatique.

En outre, le circuit mésocorticolimbique serait également impliqué dans la production des symptômes de la schizophrénie. Les symptômes positifs résultent d’un excès d’activité de la voie mésolimbique alors que les symptômes négatifs sont le reflet d’une hypoactivité de la voie mésocorticale. En effet, un dysfonctionnement de la voie mésocorticale serait responsable de l’apparition des symptômes cognitifs de la schizophrénie (Davis et coll., 2001 ; Abi-Dargham et coll., 1998). Les antipsychotiques, traitement principal de cette pathologie, ciblent particulièrement les neurones DAergiques de la voie mésolimbique (Stahl, 2005).

1.2.3.2 Le circuit nigro-strié

Le deuxième noyau mésencéphalique d’intérêt est la SN qui émet des axones vers le striatum (qui fait référence chez l’homme aux noyaux caudé et putamen). Ces projections constituent le circuit nigro-strié qui participe au contrôle des comportements moteurs (pour revue : Surmeier et coll., 2010). Ce circuit est reconnu depuis longtemps comme une voie stratégique dans la circuiterie des ganglions de la base. Les ganglions de la base peuvent en effet être divisés en une partie ventrale dont la voie d’entrée correspond aux projections de l’ATV vers le NAc et une partie dorsale dont la voie d’entrée est constituée des projections de la SN vers le striatum.

1.2.3.2.1 Structure et intégration de ce circuit au sein des ganglions de la base

La partie dorsale des ganglions de la base comprend un regroupement de six noyaux sous-corticaux où la DA joue un rôle central (pour revue : Surmeier et coll., 2010). Ces noyaux incluent: le striatum, le globus pallidus (segments interne et externe, GPi et GPe), le

noyau sous-thalamique (NST) ainsi que les parties compacte et réticulée de la substance noire (SNc et SNr; fig. 1.5).

Le striatum représente l’élément central de l’organisation des ganglions de la base. Il est constitué à 90% de MSNs GABAergiques (Kawaguchi, 1997). Ces neurones striataux reçoivent des afférences glutamatergiques issues du cortex et du thalamus et des afférences DAergiques provenant de la SNc (nigro-striées). Les MSNs du striatum peuvent être ségrégés en deux populations en fonction de leurs cibles de projection et de leurs propriétés biochimiques distinctes. La première de ces populations projette directement au complexe GPi/SNr et constitue ainsi la voie de sortie directe ou voie striatonigrale (pour revue : Gerfen, 1993; Samadi et coll., 2007; Bateup et coll., 2010; Surmeier et coll., 2010). De plus, les neurones striataux appartenant à cette voie expriment sélectivement les récepteurs D1 ainsi que la DYN et la SP. La deuxième population, quant à elle, communique également au GPi/SNr mais indirectement par l’intermédiaire de deux autres structures, le GPe et le NST. Elle constitue, par conséquent la voie de sortie indirecte ou voie striatopallidale. Les neurones striataux de cette voie expriment spécifiquement les récepteurs D2, l’ENK et la NT (pour revue : Samadi et coll., 2007). Il est toutefois important de noter que la ségrégation des voies directe et indirecte n’est pas totale. Il existe un chevauchement pouvant aller de 5-10% (Surmeier et coll., 1992; Surmeier et coll., 1993; Surmeier et coll., 1996) à 30% selon certains auteurs (Lévesque et Parent, 2005; Perreault et coll., 2012; pour revue : Parent et coll., 2000).

C’est au niveau de ce complexe GPi/SNr que s’effectue l’intégration des signaux issus des deux voies de sortie du striatum. Ce complexe GPi/SNr constitue donc la porte de sortie des ganglions de la base. Il envoie des efférences GABAergiques au thalamus qui, à son tour, envoie des projections glutamatergiques au cortex, ce qui complètera la boucle cortico-striato-thalamo-corticale impliquée dans l’initiation et la production des mouvements. Comme les projections du GPi/SNr sont GABAergiques, elles ont la capacité d’inhiber les neurones glutamatergiques du thalamus. Dès lors, le complexe GPi/SNr peut être envisagé comme un système de freinage ou un interrupteur intervenant pour contrôler l’initiation des patrons moteurs stockés au niveau des régions motrices du cortex (pour revue : Parent et Hazrati, 1995; Wolf et coll., 2004).

Cortex Influx cortico-striatal (glutamate)

VOIE DIRECTE VOIE INDIRECTE

GABA GABA D1 D2 DYN STRIATUM ENK SP Noyau accumbens NT Nur77/Nor-1 Nur77/Nor-1

DOPAMINE GPe GABA Thalamus SNc/ATV

NST Glutamate

GPi/SNr GABA Inhibitrice

Excitatrice Voie nigro-striée et voie mésolimbique Figure 1.5: Schéma des ganglions de la base. En rouge, les projections glutamatergiques (excitatrices), en noir les projections GABAergiques (inhibitrices) et enfin en mauve les deux voies dopaminergiques mésolimbique et nigro-striée qui projettent respectivement de l’ATV vers le noyau accumbens et de la SNc vers le striatum (ATV : aire tegmentale ventrale, D1 : récepteur dopaminergique de la famille D1, D2 : récepteur dopaminergique de la famille D2, DYN : dynorphine, ENK : enképhaline, GABA : acide γ- aminobuty rique, GPe : globus pallidus externe, GPi : globus pallidus interne, NT : Neurotensine, NST : noyau sous-thalamique, SNc : substance noire pars compacta, SNr; substance noire pars reticulata, SP : substance P).

1.2.3.2.2 Fonction des ganglions de la base

Le système des ganglions de la base décrit à la figure 1.5 représente un circuit parallèle au circuit pyramidal moteur. C’est d’ailleurs pour cette raison qu’on l’appelle le système extrapyramidal. Son rôle est alors de moduler l’activité du système pyramidal qui est le seul à posséder une connexion directe à la mœlle épinière. Ce faisant, le système extrapyramidal joue un rôle dans la régulation des mouvements volontaires.

En effet, le striatum dorsal, composante centrale des ganglions de la base, est important pour l’initiation, la production et le séquençage du comportement. Pour preuve, la MP, caractérisée par la dégénérescence des neurones DAergiques de la voie nigro-striée, conduit à une bradykinésie et, son traitement par substitution avec de la L-DOPA, produit à long terme des mouvements involontaires appelées dyskinésies. Ceci confirme que le maintien de l’intégrité des projections DAergiques de la voie nigro-striée est indispensable au bon fonctionnement de la boucle de régulation des ganglions de la base (pour revue : Samadi et coll., 2007; Anderson, 2008).

Le striatum peut être subdivisé en sous compartiments limbique (ventral), associatif (central) et sensorimoteur (dorsal) en fonction de leurs différentes afférences corticales (pour revue : Haber et coll., 2000). Des études récentes suggèrent en effet que les ganglions de la base interviennent dans des fonctions motrices hétérogènes allant de simples automatismes et de réflexes sensorimoteurs à des comportements délibérés, dirigés vers un but (pour revue : Balland et Lüscher, 2009; Shiflett et Balleine, 2011). Le striatum joue ainsi un rôle important dans l’organisation des répertoires cognitifs et moteurs pour l’exécution de tâches orientées vers un objectif à court ou long terme.

Les ganglions de la base jouent surtout un rôle particulièrement important dans l’automatisation et l’apprentissage des séquences motrices. Ainsi l’activité pallidale augmente lors de l’apprentissage d’une tâche motrice (Brotchie et coll., 1991; pour revue Balland et Lüscher, 2009). Au sein des circuits des ganglions de la base, la DA permettrait de réguler les phénomènes de neuroplasticité corticostriatale (LTP et LTD) et participerait, par ce biais, à l’apprentissage ainsi qu’à la mémorisation de séquences motrices (pour revue : Morris et coll., 2010; Surmeier et coll., 2010; Shiflett et Balleine, 2011).

Le striatum dorsal est progressivement recruté pendant l’apprentissage de tâches motrices (pour revue : Wickens et coll., 2007; Balland et Lüscher, 2009; fig. 1.6). Des humains entraînés à exécuter une séquence de mouvements, montrent, en effet, une augmentation de l’activité striatale dorsale concomitante à une diminution de l’activité des neurones du striatum ventral (Lehericy et coll., 2005). Le recrutement progressif de régions plus dorsales pourrait être dû à une régulation par la DA de la plasticité neuronale médiée par le glutamate (Pulipparacharuvil et coll., 2008; Tian et coll., 2010; pour revue : Surmeier et coll., 2010). L’implication de la DA dans ce phénomène de recrutement progressif de régions striatales toujours plus dorsales est suggérée par l’organisation topographique des projections qui connectent réciproquement le striatum à son innervation DAergique dans l’ATV et la SN.

En effet, ces projections décrivent une boucle ascendante des régions ventromédiales vers les régions dorsolatérales (Haber et coll., 2000; pour revue : Balland et Lüscher, 2009; fig. 1.6). La translation de l’activité cérébrale vers des aires striatales dorsales lors de l’exécution d’une tâche pourrait correspondre à une adaptation du système de telle manière que la réalisation de tâches bien apprises ne nécessite plus un accès au système striatal cortico-frontal qui médie les processus de l’attention. Dès lors, le système striatal cortico-frontal est libéré pour être utilisé dans des tâches non-apprises ou plus pressantes (Lehericy et coll., 2005).

Ainsi, dans les premiers temps ce serait le striatum ventral (le NAc) qui serait affecté, puis, à mesure que l’habitude s’installe et que le comportement devient automatique et routinier, ce serait plutôt au niveau du striatum que s’opèreraient les modifications qui sous-tendent le phénomène d’automatisation (Wickens et coll., 2007).

Orbito-frontal Cortex Pariétal Pré-limbique préfrontal Infra-limbique

Hippocampe

Médial Thalamus Latéral

Comportements Comportements Planifiés Automatisés

Medio- Globus Ventral Pallidum Pallidus

Striatum Striatum Ventral (NAc) Striatum Dorsal

Substance ATV Mésen céphale Noire

Figure 1.6: Circuits neuronaux impliqués dans les comportements planifiés et automatisés.

Les comportements planifiés impliquent une boucle neuronale striato-pallido-thalamo-corticale, médio-ventrale (gris clair), régulée par les projections DAergiques issues de l’aire tegmentale ventrale (ATV). Les projections DAergiques de la substance noire modulent une boucle striato- pallido-thalamo-corticale (noir) située latéro-dorsalement à la précédente. Cette boucle médie les comportements automatisés. Des résultats récents suggèrent que l’activation excessive de la boucle médio-ventrale renforcerait la connectivité entre les deux systèmes. Ce processus se traduirait sur le plan comportemental par une implication croissante du système régissant les comportements automatiques, au détriment du système régissant les comportements motivés (flèche rouge). NAc: Nucleus Accumbens (Adapté de la revue Balland et Lüscher, 2009).

1.3 Modulation de la transmission dopaminergique

1.3.1 Les neuropeptides striataux endogènes

Les neuropeptides striataux endogènes et en particulier l’expression sélective des neuropeptides DYN et ENK dans les voies de sorties directe et indirecte des ganglions de la base issues du striatum et du NAc joue un rôle particulièrement important dans la régulation de la neurotransmission DAergique (pour revue : Steiner et Gerfen, 1998; Nestler, 2005; Samadi et coll., 2007).

Les neuropeptides appartiennent à une classe particulière de messagers du SNC. La plupart présentent des niveaux d’expression plus marqués dans les ganglions de la base (pour revue : Graybiel, 1996). Ces neuropeptides ne sont synthétisés qu’au niveau des corps cellulaires des neurones et sont entreposés sous la forme de précurseurs dans des vésicules synaptiques plus grandes que les neurotransmetteurs classiques. Les précurseurs sont ensuite clivés par diverses enzymes pour former les neuropeptides qui seront libérés par exocytose. De hautes fréquences de stimulation sont nécessaires pour la libération des neuropeptides. En effet, la libération des vésicules est conditionnelle à une augmentation importante de la concentration intracellulaire de calcium. Par conséquent, plusieurs dépolarisations sont requises pour observer la libération des vésicules (pour revue : Pritchard et Alloway, 2002). Il n’existe pas de mécanisme de recapture et de recyclage des neuropeptides contrairement aux neurotransmetteurs classiques. Leur activité est interrompue par l’internalisation de leurs récepteurs ou la lente dégradation du peptide par des enzymes protéolytiques (pour revue : Samadi et coll., 2007). En outre, le remplacement des neuropeptides est un processus relativement lent comparé aux neurotransmetteurs conventionnels car il est dépendant d’une nouvelle synthèse dans les corps cellulaires et du transport axonal vers les terminaisons. En conséquence, des stimulations rapprochées ou prolongées épuiseront plus rapidement les réserves de neuropeptides. Ainsi, l’initiation, tout comme la terminaison de la transmission d’informations via les neuropeptides se fait par le biais d’un mécanisme plus lent à mettre en place que la neurotransmission classique (pour revue : Samadi et coll., 2007).

1.3.1.1 Définition et caractéristiques de la dynorphine striatale

La DYN est exprimée dans le corps cellulaire, dans les terminaisons axonales ainsi que dans les collatérales des MSNs de la voie de sortie directe (D1) des ganglions de la base exprimant les récepteurs de la DA de type D1 dans le NAc et le striatum (Gertler et coll., 2008; pour revue : Steiner et Gerfen, 1998; Bruijnzeel, 2009). Son expression est induite par la liaison de la DA sur les récepteurs D1 (Svenningsson et coll., 2000a).

Une fois libérée dans la fente synaptique, la DYN se fixe préférentiellement sur les récepteurs opioïdes κ (KOR pour κ opioid receptor) qui sont localisés sur les terminaisons nerveuses DAergiques et glutamatergiques dans le NAc et le striatum (Chavkin et coll., 1982; Hjelmstad et Fields, 2001; pour revue: Shippenberg et coll., 2001; Shippenberg et coll., 2007; Schwarzer et coll., 2009). Aussi, la DYN libérée par les terminaisons nerveuses exerce un rétrocontrôle négatif sur les neurones DAergiques de l’ATV et de la SN pour réguler la libération de DA dans leurs structures cibles i.e. le NAc et le striatum (Svingos et coll., 1999; Margolis et coll., 2003; Chefer et coll., 2005).

L’activation de ces récepteurs inhibe la libération de DA et de glutamate (Spanagel et coll., 1990; Svingos et coll., 1999). En effet, les KOR jouent un rôle dans la régulation des courants calciques. Le KOR est couplé à un canal calcique de type N et sa stimulation inhibe les courants calciques (Tallent et coll., 1994). Les canaux calciques de type N qui sont, eux-aussi, situés sur les terminaisons présynaptiques des neurones glutamatergiques et DAergiques, sont impliqués dans la libération des neurotransmetteurs (pour revue : Evans et Zamponi, 2006). Par conséquent, la DYN peut inhiber la libération des neurotransmetteurs, DA et glutamate, en inhibant les canaux calciques de type N. De plus, il a été démontré que ces KOR stimulaient également les canaux K+ voltage-dépendant de la rectification retardée (pour revue : Lewin et coll., 2007). Or, ce canal facilite l’influx d’ions K+ de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule (pour revue : Lu, 2004) et joue un rôle important dans le maintien du neurone à son potentiel de repos. Il favorise donc une inhibition du neurone. Enfin une étude confirme que l’activation des KOR présynaptiques diminue les courants calciques de type N-, L- et P/Q (Rusin et coll., 1997), résultant en une

29 réduction de la libération du glutamate. Ainsi, la DYN permet de réguler la transmission DAergique via un mécanisme de rétrocontrôle négatif et permet de juguler les influx glutamatergiques cortico-striataux (pour revue: Shippenberg et coll., 2007; Schwarzer et coll., 2009; Bruijnzeel, 2009).

De plus, des études ont démontré que l’injection d’un antagoniste spécifique des KOR dans le NAc ou une délétion constitutive des KOR, augmentaient le niveau de DA dans le dialysat obtenu par microdialyse au niveau du NAc. Ceci suggère l’existence d’un processus actif tonique médié par les KOR qui inhiberait l’activité des neurones DA mésolimbiques (Spanagel et coll., 1992; Chefer et coll., 2005; Margolis et coll., 2003). Ces mêmes effets de rétrocontrôle sont observés au niveau de la voie nigro-striée. En effet, les neurones striataux appartenant à la voie D1 exercent un rétrocontrôle négatif via la DYN sur les neurones de la SN (pour revue : Nestler, 2001b; Shippenberg et coll., 2007).

La DYN pourrait également exercer des effets dits « non-opioïdes » c'est-à-dire non-médiés par une fixation aux KOR (pour revue : Schwarzer et coll., 2009). En effet, en forte concentration, elle peut aussi interagir avec les récepteurs NMDA du glutamate situés sur les MSNs du NAc et du striatum (Woods et coll., 2006). Dans ce contexte, elle aurait un effet opposé à celui qu’elle exerce via les KOR. En effet, elle potentialise la fonction de ce récepteur et favorise donc l’activation des MSNs (Shukla et Lemaire, 1994). Cette action non-opioïde ne s’exercerait cependant qu’en réponse à une surstimulation DAergique répétée des MSNs (voir partie 1.3.2.3.1).

Ainsi, l’ensemble de ces données souligne le rôle régulateur de la DYN dans le système DAergique. En effet, une stimulation DAergique induit la production de DYN dans le striatum et le NAc, et, en retour, la DYN régule la libération de la DA et l’excitabilité des MSNs (pour revue : Samadi et coll., 2007).

1.3.1.2 Définition et caractéristiques de l’enképhaline striatale

L’ENK est un neuropeptide endogène exprimé sélectivement dans les neurones GABAergiques striataux appartenant à la voie de sortie indirecte (D2) des ganglions de la base ainsi que dans certains neurones du NAc qui expriment également les récepteurs D2 (Wang et coll., 2006; Gertler et coll., 2008; pour revue : Steiner et Gerfen, 1998; McGinty, 2007; Samadi et coll., 2007). Son expression est induite en réponse à la liaison de la DA sur les récepteurs D2 (Jiang et coll., 1990; pour revue : Samadi et coll., 2007) et elle peut également être induite par l’administration d’antagonistes dopaminergiques D2 (Ethier et coll., 2004). Suite à sa libération dans la fente synaptique, l’ENK se fixe préférentiellement sur les récepteurs opiacés de type μ et G (MOR pour μ opioid receptor et DOR pour G opioid receptor).

L’activation de ces récepteurs a un effet globalement hyperpolarisant sur la cellule cible. En effet, elle induit l'ouverture des canaux potassiques, l'inhibition de l'AC et l'inhibition des canaux Ca2+ voltage-dépendants (Simonds, 1988). Au niveau du striatum et du NAc, ces récepteurs sont exprimés sur les terminaisons glutamatergique des neurones cortico-striataux (Wang et Pickel, 2001; Boyes et Bolam, 2007; Blomeley et Bracci, 2011) et ils sont également colocalisés avec les récepteurs D2 sur les dendrites des MSNs (Ambrose et coll., 2004). À ce niveau, l’activation de ces récepteurs par l’ENK aurait respectivement pour effet : 1) d’inhiber l’influx glutamatergique (Jiang et North, 1992; Miura et coll., 2007; Blomeley et Bracci, 2011) et 2) de favoriser l’hyperpolarisation des MSNs régulant ainsi l’activité des MSNs dans lesquels elle est exprimée (Blomeley et Bracci, 2011; pour revue : Samadi et coll., 2007).

Au niveau de la SN et de l’ATV, l’ENK est capable, comme les morphiniques, d'augmenter la vitesse de renouvellement de la DA (Algeri et coll., 1978; Rawls et McGinty, 2000). Ces effets s'exercent par l’action de ce peptide sur ses récepteurs, localisés aussi bien sur les corps cellulaires que sur les terminaisons des interneurones inhibiteurs des neurones DAergiques (issus de la SN ou de l’ATV). Ainsi, en inhibant l’activité de ces interneurones, la fixation de l’ENK sur ses récepteurs favoriserait une désinhibition des neurones DAergiques et une augmentation de la libération de DA (Herz, 1998; pour revue : Nestler, 2005).

Ainsi l’ENK assurerait d’une part la rétroinhibition des MSNs l’exprimant et aurait d’autre part pour effet d’augmenter la libération de DA par les neurones DAergiques et d’inhiber les afférences glutamatergiques des MSNs. Réciproquement, la stimulation, par des agonistes DAergiques, des récepteurs D2 qui sont exprimés sur les neurones enképhalinergiques striataux entraîne une augmentation de la libération et de la synthèse des ENKs (Jiang et coll., 1990; pour revue : Samadi et coll., 2007).

Ces précédentes données suggèrent donc une forte interaction entre ENKs et neurones DAergiques (nigro-striés et méso-cortico-limbiques). Ce faisant, cette interaction pourrait être impliquée dans certaines pathologies comme la MP, la schizophrénie, la dépression et l’addiction (pour revue : Steiner et Gerfen, 1998). En effet, il a été démontré, par exemple, qu’un système enképhalinergique striatal anormal était directement corrélé avec une augmentation de la vulnérabilité aux drogues d’abus (Petkov et coll., 1985; Raab et coll., 1985; Kreek, 1987; Teskey et Kavaliers, 1988; Froehlich et Li, 1994; Herz, 1998).

1.3.1.3 Sélectivité relative des récepteurs opioïdes

Il existe trois principaux types de récepteurs opioïdes : μ, κ et δ (MOR, KOR et DOR). Tous appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, partagent une homologie de séquence de 61 % et ont pour effet d’inhiber l’AC (pour revue : Samadi et coll., 2007). Cependant, du fait de leur forte homologie, ces récepteurs ne sont pas sélectifs. Ainsi, bien qu’on ait mentionné ci-avant, que l’ENK se fixe préférentiellement aux MOR et DOR et, que la DYN est associée aux KOR, il peut se produire des interactions croisées (Mansour et coll., 1995), et ce, en particulier lors d’une déficience de l’un des neuropeptides opioïdes. Seuls les KOR présentent une préférence marquée en ayant une affinité 1000 fois plus importante pour la DYN que pour l’ENK. En comparaison, les MOR et les DOR ont une affinité seulement 10 fois plus grande pour l’ENK versus pour la DYN (Akil et coll., 1998). Ceci suggère que les interactions croisées favoriseraient un plus grand spectre d’action pour la DYN.

1.3.2 Les psychostimulants

Les psychostimulants comme la cocaïne et l’amphétamine (AMPH) ont pour effet de stimuler la transmission DAergique et produisent, chez les rongeurs, des modifications mesurables du comportement. On les emploie en laboratoire pour étudier les effets biochimiques et comportementaux de la stimulation de la transmission DAergique.

1.3.2.1 Caractéristiques et mode d’action des psychostimulants

Les psychostimulants stimulent la neurotransmission DAergique en favorisant la libération ou en inhibant la recapture de la DA par les terminaisons axonales (pour revue : Sulzer, 2011). En effet, l’administration de psychostimulants comme l’AMPH et la cocaïne a pour effet d’augmenter la concentration de DA dans la fente synaptique et ce au niveau des structures cibles du système DAergique : striatum, NAc, cortex, hippocampe, amygdale. L’intensité de cet effet dépend de la dose administrée (Vezina et coll., 1992; Schechter, 1997; Olausson et coll., 2001).

L’AMPH assure cette augmentation via différents mécanismes : (1) elle peut se lier à la membrane présynaptique des neurones DAergiques et induire la libération de DA par les terminaisons nerveuses ; (2) l’AMPH peut interagir avec les vésicules synaptiques contenant la DA et libérer la DA dans la terminaison nerveuse ; et (3) l’AMPH peut se lier au transporteur responsable de la recapture de la DA (le DAT) et causer un inversement de sa fonction en transportant la DA du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire (fig. 1.7). Dans le cas de fortes doses, l’AMPH peut également inhiber l’enzyme de dégradation de la DA (la MAO) dans les neurones DAergiques et empêcher ainsi la dégradation de la DA. En conséquence, elle augmente la quantité de DA libre dans la terminaison synaptique (pour revue : Fleckenstein et coll., 2007; Zahniser et Sorkin, 2009; Sulzer, 2011).

La cocaïne, quant a elle, augmente également la concentration de la DA dans le milieu extracellulaire mais via un mécanisme légèrement différent de celui de l’AMPH. Elle agit en inhibant le transporteur DAT, l’empêchant ainsi d’effectuer la recapture de la

Influx nerveux (1,2) (4)

(3)

Figure 1.7 : Mécanismes d’action des psychostimulants. L’AMPH augmente la concentration de DA dans la fente synaptique selon différents mécanismes : (1) elle peut se lier à la membrane présynaptique des neurones DAergiques et induire la libération de DA par les terminaisons nerveuses ; (2) l’AMPH peut interagir avec les vésicules synaptiques contenant la DA et libérer la DA dans la terminaison nerveuse ; et (3) l’AMPH peut se lier au transporteur responsable de la recapture de la DA (DAT) et causer un inversement de sa fonction en transportant la DA du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. (4) Dans le cas de fortes doses, l’AMPH peut également inhiber l’enzyme de dégradation de la DA (la monoamine oxydase (MAO)) dans les neurones DAergiques et empêche ainsi la dégradation de la DA. Elle laisse ainsi de la DA libre dans la terminaison synaptique. La cocaïne, elle, inhibe la recapture de la DA en bloquant le transporteur DAT (Tiré de Stahl, 2005).

DA (pour revue : Williams et Galli, 2006; Zahniser et Sorkin, 2009; Sulzer, 2011). Ce faisant, la DA s’accumule dans la fente synaptique et son action est prolongée. Ces modifications du milieu extracellulaire, intervenant de façon répétée, peuvent causer des neuroadaptations et des modifications à long terme du fonctionnement du SNC. Ce phénomène de plasticité neuronale joue un rôle crucial dans l’adaptation comportementale puisqu’il permet à l’organisme de modifier son comportement en fonction d’expériences antérieures. Néanmoins, dans certains cas, ce phénomène peut être la source de désadaptations lorsque les capacités d’ajustement de l’organisme sont dépassées (stress, prise de drogue, etc.).

1.3.2.2 Comportements induits par les psychostimulants

La sensibilisation comportementale et la préférence de place conditionnée induites par les psychostimulants sont de bons exemples de ces phénomènes adaptatifs pathologiques.

1.3.2.2.1 La sensibilisation comportementale

Le phénomène dit de sensibilisation comportementale mis en évidence dans la neurobiologie de l’addiction, est une caractéristique des effets comportementaux des psychostimulants (pour revue : Koob et Le Moal, 2001; Tirelli et coll., 2003). La sensibilisation comportementale se caractérise par une exacerbation de la réponse comportementale suite à l’administration successive d’une même quantité de psychostimulants. Ce phénomène a été particulièrement bien étudié chez les rongeurs. En effet, l’effet des psychostimulants peut être détecté très facilement en plaçant l’animal dans une cage munie de cellules photoélectriques. Le nombre de coupures des faisceaux permet de quantifier le comportement ambulatoire et les effets de la drogue sur ce comportement. Chez les rongeurs, les psychostimulants induisent une hyperlocomotion qui s’accroît avec la répétition des doses pour finalement produire des comportements stéréotypés anormaux. (pour revue : Azorin et coll., 2004; Wolf et coll., 2004). Normalement, l’administration répétée d’une drogue à des animaux sains devrait se traduire par une diminution de la

35 réponse consécutivement au développement d’un phénomène de tolérance. Cette réponse inverse, de sensibilisation, parfois appelée tolérance inverse, est particulière aux psychostimulants. De façon remarquable, une exposition répétée à un psychostimulant comme l’AMPH ou la cocaïne suffit à provoquer une sensibilisation de longue durée. En effet, l’hypersensibilité est maintenue même après de longues périodes d’abstinence, ce qui suggère le développement d’une vulnérabilité à la sensibilisation dans le SNC de l’animal, possiblement via des mécanismes de neuroplasticité (pour revue : Robinson et Becker, 1986; Wolf et coll., 2004; Dietz et coll., 2009). D’autre part, cette observation chez l'animal est transposable à l'homme car on peut observer ce même phénomène de sensibilisation chez les personnes qui consomment des psychostimulants comme les AMPHs et la cocaïne.

La sensibilisation comportementale est caractérisée par deux phases distinctes que sont la phase de sensibilisation ou d’induction/d’initiation, durant laquelle la drogue est consommée de façon répétée, et la phase d’expression, durant laquelle les effets de la drogue sont accrus en comparaison de ses effets aigus (pour revue : Azorin et coll., 2004). L’induction de la sensibilisation comportementale est définie comme la cascade transitoire d’événements moléculaires et cellulaires provoqués par l’administration de psychostimulants. C’est la répétition de ces événements moléculaires qui mène aux changements persistants dans la fonction neuronale responsables de l’exacerbation du comportement. Ce dernier stade, caractérisé par une sensibilité accrue persistante, correspond à la phase d’expression. En effet, pendant cette phase, une seule injection de psychostimulant réalisée après une période de sevrage provoque une activité locomotrice accrue par rapport à l’activité mesurée après la toute première prise.

Ainsi, les animaux deviennent hypersensibles pour ces agents en raison des neuroadaptations qui se sont produites de façon graduelle et incrémentée en réponse à l’administration répétée de psychostimulants. La sensibilisation comportementale serait, en effet, associée à des modifications morphologiques et à l’altération à long terme de l’activité de différentes voies DAergiques innervant à la fois le corps (core) et la coquille (shell) du NAc, le striatum, le système limbique et certains territoires corticaux, comme le cortex préfrontal et le cortex cingulaire (Vezina et coll., 1992; Cadoni et coll., 2000; Brown et Kolb, 2001; Shim et coll., 2001). Par exemple, au niveau du striatum et du NAc, les

psychostimulants augmentent l’arborisation dendritiques des neurones ainsi que la densité des épines synaptiques dans la partie distale de l’arborisation dendritique (Robinson et Kolb, 1999). Des mécanismes glutamatergiques et sérotoninergiques seraient également responsables de l’altération de l’activité des neurones DAergiques (pour revue : Trujillo et Akil, 1995; Schmidt et Pierce, 2010; Surmeier et coll., 2010; Miszkiel et coll., 2011).

Les mécanismes qui sous-tendent les phénomènes de sensibilisation comportementale semblent différents selon les phases, même si certains neuromédiateurs, et en particulier la DA, jouent un rôle clé dans l’ensemble du processus. En effet, l’induction de la sensibilisation comportementale aux psychostimulants nécessite l’activation des neurones DAergique de l’ATV (Borgland et coll., 2004; pour revue : Vezina, 2004). Au niveau des structures cibles, la phase de développement ou d’induction semble sous la dépendance de l’action de la DA libérée sur les récepteurs D1. En effet, l’injection d’un antagoniste sélectif des récepteurs D1, le SCH-23390, concomitamment à celle d’un psychostimulant, bloque l’induction, ce qui n’est pas le cas avec un antagoniste des récepteurs D2 (pour revue : Azorin et coll., 2004). Suite au processus d’induction, des altérations neuronales se produisent en particulier au niveau du NAc et du striatum, structures cibles du système DAergiques. Ce sont ces altérations qui vont engendrer l’augmentation de la réponse comportementale, qui est définie comme l’expression de la sensibilisation. Cette phase d’expression serait médiée, quant à elle, par les récepteurs D2 puisqu’elle peut être induite par des agonistes sélectifs des récepteurs D2 mais ne l’est pas par des agonistes sélectifs des récepteurs D1 (pour revue : Pierce et Kalivas, 1997; Berke et Hyman, 2000; Hyman et Malenka, 2001; Azorin et coll., 2004).

Cette sensibilisation comportementale semble donc avant tout dépendante de la libération chronique de DA dans le NAc et le striatum. Elle se manifeste, comme mentionné précédemment, par une activité locomotrice accrue et des stéréotypies (Randrup et Munkvad, 1966; Pickens et Harris, 1968; Ferrario et coll., 2005). Or, l’effet locomoteur et les stéréotypies semblent être, eux-aussi, médiés par des mécanismes différents et indépendants; l’augmentation de l’activité locomotrice est observée pour de faibles doses de psychostimulants tandis que les stéréotypies apparaissent lors de l’administration de fortes doses (Randrup et Munkvad, 1969; Kalivas and Stewart, 1991; Ben-Shahar et coll.,

2004; Nordquist et coll., 2008; Hadamitzky et coll., 2012) ou suite à un accès prolongé (Ferrario et coll., 2005).

D’autre part, l’administration répétée de psychostimulants provoque des altérations qui progressent des régions ventrales du striatum vers les régions dorsales qui sont impliquées dans le développement des stéréotypies (Tanimura et coll., 2009). En effet, l’induction de la sensibilisation locomotrice serait surtout attribuée à une augmentation de l’activité biochimique des neurones DAergiques de l’ATV alors que la phase d’expression serait plutôt due à l’activation DAergique dans le NAc et le striatum (Nordquist et coll., 2008; pour revue : Bordet, 2002). Les stéréotypies dépendraient quant à elles plus de l’activation DAergique dans le striatum dorsolatéral (Tanimura et coll., 2009 ; pour revue : Lewis et coll., 2007). Cette hypothèse est corroborée par des études réalisées sur des modèles animaux de la MP. Dans ce cadre, il a été montré qu’une dénervation DAergique sélective du NAc atténue la réponse locomotrice à l’AMPH alors que la dénervation du striatum atténue les stéréotypies (Joyce et coll., 1983). À l’inverse, la réinnervation DAergique du NAc qui aurait été initialement privé de DA restitue les réponses locomotrices, alors que la réinnervation du striatum rétablit les stéréotypies (Dunnett et coll., 1981; Dunnett et coll., 1983; Chartoff et coll., 2001). Cependant une étude plus récente utilisant des souris mutantes, aphakia, dépourvues de la voie DAergique nigrostriée mais conservant une voie mésolimbqiue intacte, montre que cette ségrégation des rôles n’est pas aussi nette. En effet, elle montre que le striatum est aussi indispensable à la sensibilisation locomotrice puisque les effets activateurs de la cocaïne sur l’activité locomotrice, dont la sensibilisation, ne peuvent avoir lieu que si la voie DAergique nigrostriée est intacte (Beeler et coll., 2009).

L’intensité de la sensibilisation comportementale dépend de facteurs intrinsèques, comme la souche (Kosten et coll., 1994; Iyaniwura et coll., 2001) ou le sexe (les femelles étant plus sensibles que les mâles ; Booze et coll., 1999; Becker et coll., 2001; Segarra et coll., 2010; Van Swearingen et coll., 2012), et de facteurs environnementaux comme le stress (Kita et coll., 1999; Leao et coll., 2012). Un autre aspect essentiel de ces études est que les effets des psychostimulants sont conditionnés au contexte. En effet, la sensibilisation comportementale ne s’exprimera que dans un nouvel environnement où

l’animal a l’habitude de recevoir le psychostimulant. Ces résultats montrent que les animaux sont conditionnés aux signaux associés à la procédure d’injection. En effet, la seule injection de solvant produit une activation comportementale chez des rats placés dans un environnement où ils ont préalablement reçu un psychostimulant de façon répétée (effet placebo). Enfin, l’administration chronique de fortes doses de psychostimulants semble être anxiogène (Walsh et coll., 2009).

Ainsi, la sensibilisation comportementale se traduit par une augmentation progressive des réponses comportementales aux stimulants psychomoteurs. Elle se déroule au moment de l’administration chronique de ces substances et persiste pour de longues périodes. Des adaptations structurelles et fonctionnelles au niveau de la neurotransmission DAergique et notamment dans le NAc et le striatum sont donc à l’origine de ces effets comportementaux à long terme. La compréhension des effets de ces drogues dans ces structures du cerveau lorsqu'elles sont administrées de façon aigüe ou répétée pourrait donc permettre d'expliquer les mécanismes par lesquels la première prise de drogue peut, dans certains cas, entrainer la recherche des suivantes conduisant à la dépendance. Ce phénomène de sensibilisation comportementale est d’ailleurs utilisé comme modèle d’étude en addictologie. En effet, des études récentes ont démontré l’importance de la sensibilisation comportementale comme modèle pour mesurer indirectement l’intensification du désir pour la drogue qui devrait se produire parallèlement aux changements moteurs (pour revue : Nestler, 2004).

1.3.2.2.2 La préférence de place conditionnée

Le conditionnement de place permet d’investiguer soit les effets appétitifs (préférence de place conditionnée), soit les effets aversifs (aversion de place conditionnée) d’une substance. Parmi les diverses approches employées pour étudier les effets appétitifs des psychostimulants, la mesure de la préférence de place semble être fort pertinente. Cette technique permet d’évaluer le niveau hédonique de la substance injectée à la souris et de tester les propriétés renforçantes de ces drogues d’abus. Le protocole expérimental consiste à associer l’administration de la drogue avec un environnement donné. Pour cela, on emploie généralement un dispositif muni de deux compartiments distincts (texture du sol, motifs des murs) : l’un sera considéré comme le compartiment neutre et sera donc apparié à

39 l’injection d’une solution saline, l’autre sera systématiquement apparié à l’administration de la drogue. Pendant la période de conditionnement, on effectue des injections répétées de la drogue et de la solution saline en respectant ces appariements. Suite au conditionnement, les animaux disposent d’un accès libre aux deux compartiments dans le dispositif. Si, lors de ce test, l’animal montre une préférence pour l’environnent associé à l’administration de la drogue, on pourra en conclure qu’il y a eu développement d’une préférence de place conditionnée, signe que l’apprentissage associatif drogue/environnement a bien eu lieu (pour revue : Tzschentke, 2007).

Chez les rongeurs, l’administration d’AMPH ou de cocaïne induit systématiquement une préférence pour l’environnement associé à la consommation. Une souris reviendra de façon préférentielle dans le compartiment où elle a reçu la drogue. Ceci reste vrai plusieurs mois après la dernière injection révélant ainsi la durabilité des effets de cette drogue (Brabant et coll., 2005). Ainsi, le paradigme de la préférence de place conditionnée est fréquemment utilisé pour étudier les comportements addictifs et en particulier les mécanismes qui sous-tendent la création du lien entre prise de drogue et environnement associé. En effet, chez l’humain, le risque de rechute est fortement augmenté par l’exposition à des indices environnementaux précédemment associés à la prise d’une drogue (Ludwig et Stark, 1974; O'Brien, 1997). Cette réponse conditionnée a lieu même après des années d’abstinence (O'Brien et coll., 1992) et représente un défi majeur pour le traitement des addictions.

Plusieurs études ont révélé que les mécanismes et les systèmes de la mémoire jouaient un rôle crucial dans l’addiction (Landauer, 1969; White, 1996; Hyman et Malenka, 2001; Nestler, 2002; Robbins et Everitt, 2002). De fait, comme l’expérience des drogues d’abus créée de nouveaux souvenirs, ces drogues peuvent être vues comme des modulateurs ou des stimulateurs de la mémoire (Landauer, 1969; White, 1996). De plus, un nombre croissant de données indique que la mémoire et l’addiction partagent les mêmes circuits neuronaux et mécanismes moléculaires (Vorel et coll., 2001; Nestler, 2002; Fuchs et coll., 2009). Ainsi, ce serait en particulier au niveau des structures cibles du circuit DAergique mésocorticolimbique que pourraient s’opérer les apprentissages associatifs responsables du développement d’une préférence de place conditionnée aux

psychostimulants. Ces apprentissages associatifs s’effectueraient en effet au niveau des aires associatives CA1 et CA3 de l’hippocampe ainsi que dans celles du NAc et du striatum (pour revue : Volkow et coll., 2012). Par exemple, le NAc est impliqué dans l’apprentissage des associations environnement/prise de drogue ainsi que dans l’attribution d’une valeur hédonique à la drogue (Shibata et coll., 2001; German et Fields, 2007b).

C’est pourquoi, dans cette thèse, nous nous sommes penchés en particulier sur les effets des psychostimulants dans les structures cibles du système DAergique que l’on sait impliquées dans les processus d’apprentissage : NAc, Striatum et Hippocampe. De fait, étant donné que de nombreux aspects de l’addiction dépendent de processus mnémoniques induits par l’expérience de la drogue, nous avons investigué plus avant les structures impliquées ainsi que les mécanismes de plasticité qui sous-tendent l’installation de telles associations.

1.3.2.3 Effets des psychostimulants sur les neuropeptides endogènes

1.3.2.3.1 Effets des psychostimulants et dynorphine

Une augmentation de l’expression du gène de la DYN et des niveaux tissulaires de DYN ont été observées dans le NAc et le striatum à la suite d’une administration répétée de psychostimulants (Cole et coll., 1995; Turchan et coll., 1998). Ces augmentations seraient la résultante de l’induction des IEGs dans les structures cibles DAergiques (pour revue : Steiner et Gerfen, 1998). De plus, il a été montré que des agonistes de synthèse des KOR atténuent les altérations du comportement et de la neurotransmission de la DA qui interviennent en réponse à l’administration aigüe ou chronique de cocaïne ou d’AMPH (Heidbreder et coll., 1995; Shippenberg et coll., 1996; Schenk et Partridge, 2001; Tzaferis et McGinty, 2001). À l’inverse, l’administration d’un antagoniste spécifique des KOR ou la délétion constitutive de ce récepteur peuvent accentuer les réponses comportementales et DAergiques à la cocaïne (Chefer et coll., 2005). L’ensemble de ces résultats indiquent que la DYN est induite en réponse aux psychostimulants et exercerait un rétrocontrôle négatif

41 sur les neurones de l’ATV et de la SN pour inhiber l’hyperstimulation DAergique induite par les psychostimulants (voir fig. 1.9 et 1.10).

Considérant l’effet de rétrocontrôle inhibiteur des agonistes des KOR sur la libération de DA (Spanagel et coll., 1990), une hypothèse a été formulée selon laquelle la sensibilisation comportementale serait la résultante d’un dérèglement sélectif de la voie directe D1. En effet, il a été proposé que ce serait l’augmentation des niveaux extracellulaires de DA et l’activation subséquente des récepteurs D1 dans le NAc et le striatum qui sous-tendraient les propriétés activatrices sur la locomotion et les effets renforçants des psychostimulants (Wise et Bozarth, 1985; Koob, 1992). Dans ce contexte, il a été suggéré que l’augmentation des niveaux de DYN dans les MSNs de la voie D1, dérèglerait le fonctionnement de cette voie et pourrait contribuer au développement de la sensibilisation comportementale induite par l’administration répétée de psychostimulant (pour revue : Steiner et Gerfen, 1998; Nestler, 2004). Selon cette hypothèse, l’administration répétée de psychostimulants induit une augmentation des niveaux de DYN, ce qui pourrait produire une sur-activation du rétrocontrôle négatif exercé par la DYN. Ceci aurait pour effet de créer un dérèglement dans la dynamique de la voie de sortie directe des ganglions de la base.

Cette hypothèse peut sembler contradictoire étant donné que les études mentionnées plus haut montrent que l’induction de la DYN, ligand endogène préférentiel des KOR, aurait plutôt un effet inhibiteur sur l’activité locomotrice (Wise et Bozarth, 1985; Koob, 1992; Heidbreder et al., 1995; pour revue: Shippenber et coll., 2007). Cependant, d’autres études apportent une explication à cette apparente contradiction. En effet, il a été montré que la neurotransmission médiée par les KOR subissait des modifications après l’administration de psychostimulants. Certaines études montrent que l’expression des KOR augmente suite à l’administration de psychostimulants (Shippenberg et coll., 2001). D’autres études montrent au contraire qu’après des administrations aigües ou chroniques de psychostimulants, les niveaux d’expression de la DYN augmentent mais la densité des KOR diminue ainsi que le pourcentage de liaison de la DYN à ce récepteur (Turchan et coll., 1998; Liu-Chen, 2004). Cette diminution de la liaison de la DYN aux KOR est

expliquée par une autre étude qui montre que l’exposition à l’AMPH désensibilise sélectivement, pour une très longue durée, les KOR présynaptiques situés sur les afférences glutamatergiques des MSNs dans le NAc sans affecter les KOR postsynaptiques (Xia et coll., 2008). Selon cette étude l’augmentation de la DYN induite par l’hyperstimulation DAergique entraînerait une diminution de la fonction du KOR. De manière congruente avec cette étude, McLaughlin et son équipe (2004) ont montré que l’administration répétée d’un agoniste des KOR produisait une tolérance à long terme (47 jours) aux effets antinociceptifs de ce récepteur concomitante avec une augmentation de la phosphorylation de ces récepteurs sur leur résidu sérine à l’extrémité carboxy-terminale (McLaughlin et coll., 2004). Or, la phosphorylation de ce site est connue pour avoir un effet de désensibilisation du récepteur (Appleyard et coll., 1999; McLaughlin et coll., 2003). Ainsi, ces données suggèrent que l’administration chronique de psychostimulants pourrait mener à une désensibilisation des KOR, favorisant l’excitabilité des MSNs de la voie directe et l’apparition de la sensibilisation comportementale.

Cette hypothèse est corroborée par diverses études mettant en évidence une relation entre l’augmentation de la fonction de la DYN et la sensibilisation comportementale. En effet, de manière congruente avec l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de la DYN serait responsable du développement de la sensibilisation comportementale, il a été démontré que la DYN pouvait induire des effets moteurs au lieu de les inhiber (Walker et coll., 1982; Nakazawa et coll., 1989; Zhang et coll., 2004; Kuzmin et coll., 2006). En effet, il a été montré que des injections de DYN en i.c.v. (pour intracérébroventriculaire) entrainaient des effets moteurs dose-dépendants (Shukla et coll., 1997). De plus, il a été démontré que, si des agonistes des KOR administrés en aigu exerçaient un effet inhibiteur sur la libération de DA et sur l’activité motrice induite par les psychostimulants, l’administration chronique et/ou de fortes doses d’agonistes des KOR entraînait l’effet inverse et pouvait contribuer à potentialiser les effets moteurs et récompensants des psychostimulants (Gehrke et coll., 2008; pour revue : Wee et Koob, 2010). Cet effet pourrait être expliqué par des études qui montrent que la densité du DAT et son efficacité de transport sont réduites durant au minimum 3 jours après la fin d’un traitement répétée avec des agonistes des KOR (Thompson et coll., 2000; Collins et coll., 2001;). Ceci

43 suggère que contrairement à l’activation en aigu des KOR, la régulation à la baisse du DAT pourrait être une conséquence de l’exposition répétée aux agonistes KOR et pourrait ainsi potentialiser les effets locomoteurs des psychostimulants.

En outre, une autre étude a démontré l’importance de la DYN dans les effets comportementaux des psychostimulants en utilisant des souris déficientes pour le gène de la DYN. Cette étude montre que la délétion constitutive de la DYN est assortie d’une libération moins marquée de la DA par les psychostimulants au niveau du NAc ainsi que d’une réponse locomotrice réduite à un challenge aigu de cocaïne. Par conséquent, l’absence de DYN diminuerait la réponse locomotrice observée lors d’une administration de psychostimulants (Chefer et Shippenberg, 2006). Comment expliquer ce fait sachant que l’activation des KOR aurait plutôt un effet inhibiteur sur l’activité locomotrice? Il semblerait que les effets moteurs de la DYN soient de nature non-opioïdes c’est à dire non- médiés par les KOR. En effet, les effets moteurs des psychostimulants observés par Shukla et coll. (1997) n’étaient pas affectés par un prétraitement au naxolone (antagoniste des récepteurs opioïdes). Partant de ce constat, des études ont montré qu’il y aurait plutôt une implication des récepteurs NMDA dans les effets moteurs de la DYN (Shukla et Lemaire, 1994). En effet, de nombreuses études montrent que la DYN pourrait faciliter la fonction du récepteur NMDA favorisant ainsi une plus forte activation de la voie D1 et donc une exacerbation de l’activité motrice (Walker et coll., 1982; Massardier et Hunt, 1989; Shukla et coll., 1992; Skilling et coll., 1992; Shukla et Lemaire, 1994; Hauser et coll., 2005). Ce fait est d’autant plus intéressant car il a été démontré que l’activation des récepteurs NMDA jouait un rôle particulièrement important dans l’induction de la sensibilisation comportementale (Pulvirenti et coll., 1994).

Ainsi, selon que l’activation de la transmission DAergique soit ponctuelle ou répétée, la DYN semble exercer deux rôles distincts. Après une administration ponctuelle de psychostimulants, elle exerce un rétrocontrôle négatif via sa fixation sur les KOR et atténue la sur-activation du système DAergique. À l’inverse, suite à une administration répétée, il se produirait une désensibilisation des KOR et la fixation de la DYN sur les KOR serait moins importante. Dès lors, la DYN agirait plutôt sur ses cibles non-opioïdes

comme le récepteur NMDA et jouerait, dans ce contexte, un rôle excitateur en potentialisant les effets des influx glutamatergiques sur les neurones du striatum ou du NAc, ce qui résulterait en une sur-activation de la voie D1 et en des effets moteurs accrus. L’attribution d’un rôle inhibiteur ou activateur à la DYN reste cependant controversée et demande donc à être éclaircie (pour revue : Wee et Koob, 2010).

Enfin, concernant les apprentissages associatifs que la prise répétée de psychostimulants suscite (voir section 1.3.2.2.2), les données de la littérature suggèrent une implication de la DYN. En effet, la DYN, comme nous l’avons montré, assure la régulation de la fonction du système DAergique et est exprimée dans les structures cibles du système de la récompense. Or, les structures cibles du système DAergique peuvent être le siège d’apprentissages associatifs liés à la prise de drogue (hippocampe, NAc, amygdale). Par exemple, le NAc assure l’apprentissage de l’environnement associé à la prise de drogue ainsi que l’attribution d’une valeur hédonique à la drogue (German et coll., 2007). D’autre part il a été montré que, la préférence de place conditionnée par l’injection répétée de cocaïne, est bloquée par un agoniste sélectif des KOR (U-50,488H) (Suzuki et coll., 1992). Ces données nous indiquent donc une possible implication de la DYN dans cette composante de l’effet comportemental des psychostimulants.

Ainsi, d’après ces données, la DYN et les neurones l’exprimant spécifiquement dans le striatum et le NAc, subiraient de fortes modifications en réponse aux psychostimulants et joueraient un rôle déterminant dans leurs effets comportementaux.

1.3.2.3.2 Effets des psychostimulants et enképhaline

Il a été démontré, au cours des dernières années, que la sensibilisation comportementale induite par l’administration répétée de psychostimulants, de type AMPH ou cocaïne, résultait d’une augmentation sélective de la DYN dans la voie de sortie directe des ganglions de la base (Steiner et Gerfen, 1998; Nestler, 2001a). Au contraire, le rôle de l’ENK, exprimée dans la voie de sortie indirecte du striatum, a longtemps été jugé négligeable dans la réponse comportementale aux psychostimulants (Vezina, 1996; Marquez et coll., 2006; pour revue : Steiner et Grefen, 1998). Pourtant des données plus

45 récentes semblent lui attribuer un rôle plus important notamment dans la sensibilisation comportementale (Schroeder et coll., 2007).

Peu d’études ont investigué le rôle de l’ENK dans la sensibilisation comportementale. Les premières études réalisées au cours des années 1980 suggèrent pourtant que la voie indirecte serait primordiale dans ce phénomène. Par exemple, il a été observé que chez l'animal, les inhibiteurs de la dégradation des ENKs, injectés dans le striatum, produisaient une hypermotricité qu’il était possible de bloquer par des antagonistes spécifiques des DOR et des antagonistes des récepteurs D2, inhibiteurs de la transmission de la DA (Dauge et coll., 1988; Dauge et coll., 1989). En outre, injectés dans l'ATV, ces inhibiteurs du catabolisme des ENKs produisaient une activation comportementale due à l'activation des neurones DAergiques. Ces effets, dus à la stimulation des DOR, sont analogues à ceux qui sont produits par les psychostimulants comme la D-AMPH et disparaissent après une lésion de ces neurones DAergiques. D’autres études, datant de la même époque, ont contribué à souligner un rôle possible de l’ENK dans la sensibilisation comportementale. Il a en effet été montré que le blocage des récepteurs opioïdes spécifiques à l’ENK par un antagoniste empêchait le développement de la sensibilisation comportementale (Kalivas et coll., 1985; Kalivas et coll., 1986). Ces résultats sont d’autant plus intéressants lorsque mis en lien avec une étude ultérieure qui montre que l’administration chronique de cocaïne produit une up-régulation des MOR (Unterwald et coll., 1994). Ces données suggèrent donc que la sensibilisation comportementale pourrait être la résultante d’une augmentation de la fixation de l’ENK sur les MOR situés sur les MSNs de la voie D2.

D’autres études plus récentes s’opposent toutefois à ces premières démonstrations (Lesscher et coll., 2005; Marquez et coll., 2006; pour revue : Steiner et Gerfen, 1998). Elles suggèrent en effet que le rôle de l’ENK exprimée dans la voie de sortie indirecte du striatum est négligeable. Par exemple, l’équipe de Marquez (2006) a démontré que la sensibilisation comportementale et la préférence de place conditionnée à la morphine (agoniste des MOR) n’étaient pas affectées chez des souris déficientes pour l’ENK. Cependant, le fait qu’ils aient utilisé justement la morphine, un agoniste des MOR qui sont activés normalement par l’ENK, ne permet pas d’étudier efficacement l’effet de la délétion

de l’ENK. De manière plus pertinente, il a été avancé qu’un antagoniste sélectif des MOR (CTOP) injecté en i.p. (pour intra-péritonéal) n’affectait pas le développement de la sensibilisation comportementale aux psychostimulants (Lesscher et coll., 2005).

Depuis de nouvelles données parues ces dernières années réattribuent à l’ENK un rôle potentiel dans les comportements induits par les psychostimulants. De fait, l’administration de cocaïne ou d’AMPH entraine une augmentation des niveaux d’ENK dans le striatum et la liaison de l’ENK aux MOR serait responsable de l’hyperactivité induite par les psychostimulants (Assis et coll., 2006; Soderman et Unterwald, 2008). En effet, il a été démontré qu’un antagoniste sélectif des MOR (CTAP) administré en i.c.v. bloquait la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne (Schroeder et coll., 2007). De surcroît, des souris knock-down pour le gène des MOR ne développent pas de sensibilisation comportementale à la cocaïne (Hummel et coll., 2006). Enfin, l’équipe de Assis (2006) ainsi que celle de Morales-Mulia (2007) ont démontré que l’ENK pouvait participer au phénomène de sensibilisation comportementale. Ainsi, ces données plus récentes suggèrent que l’ENK pourrait avoir un rôle déterminant dans la sensibilisation comportementale. De plus, elles permettent de relativiser les résultats obtenus précédemment par l’équipe de Lesscher (2005). On comprend dès lors que leur choix d’adopter une voie d’administration i.p. a probablement pu fausser les résultats en limitant l’efficacité de l’antagoniste à atteindre ses cibles au niveau du SNC (traversée de la barrière hémato-encéphalique). Cependant, le rôle exact de l’ENK dans la sensibilisation comportementale demeure controversé et donc à définir.

Enfin, l’ENK semble elle-aussi impliquée dans les apprentissages associatifs induits par la consommation de psychostimulants. En effet, tout comme la DYN, elle est exprimée dans le NAc qui est impliqué dans cette fonction (German et coll., 2007). De plus, la préférence de place conditionnée par l’injection répétée de cocaïne, est bloquée par des antagonistes: 1) non sélectifs des récepteurs opioïdes (naxolone et naltrexone) (Houdi et coll., 1989; Bilsky et coll., 1992); 2) sélectifs des DOR (naltrindole) (Suzuki et coll., 1994b); 3) sélectifs des MOR (Schroeder et coll., 2007). Ces différents résultats suggèrent donc une possible implication de l’ENK, ligand endogène de ces divers récepteurs dans les phénomènes d’apprentissage associatif.

Ainsi, l’ENK, tout comme la DYN, aurait un rôle crucial à jouer dans les effets comportementaux des psychostimulants.

1.3.2.4 Neuroadaptations induites par les psychostimulants

Les psychostimulants, AMPH et cocaïne, exercent leurs effets comportementaux et addictifs persistants en activant des voies de signalisation de seconds messagers dans les ganglions de la base et le circuit de la récompense (pour revue : Dietz et coll., 2009; Robison et Nestler, 2011). L’ATV est le noyau primaire sur lequel agissent l’AMPH et la cocaïne pour activer la neurotransmission (Vezina, 1996; pour revue : Bonci et coll., 2003) alors que le NAc et le striatum sont les sites au niveau desquels sont consolidées les adaptations moléculaires à la suite d’un arrêt de la consommation (pour revue : Pierce et Kalivas, 1997; Berke et Hyman, 2000; Hyman et Malenka, 2001). Ce sont ces adaptations qui sous-tendraient les altérations à long terme du comportement observées chez les modèles animaux de la dépendance et qui pourraient également se produire chez l’humain (pour revue : Robinson et Berridge, 2003). La persistance des comportements altérés qui définit l’addiction, suggère que la modulation de l’expression des gènes pourrait jouer un rôle important dans ce processus. Selon cette hypothèse, l’exposition répétée aux psychostimulants perturberait la quantité ainsi que le type de gènes exprimés dans le circuit de la récompense. Ces changements pourraient contribuer aux anomalies comportementales observées chez les individus dépendants (pour revue : Pierce et Kalivas, 1997; Berke et Hyman, 2000; Hyman et Malenka, 2001; Olson et coll., 2005; Robison et Nestler, 2011).

Il existe de nombreux mécanismes par lesquels la consommation chronique de psychostimulants peut modifier l’expression des gènes dans le cerveau. Ces mécanismes incluent : la perturbation du taux de transcription des gènes, l’altération de la transformation des ARN primaires en ARNm matures, un problème dans la translation de ces ARNm en protéine, un défaut dans le traitement de ces protéines et enfin, une altération du trafic des protéines matures vers leurs sites d’action (pour revue: Robison et Nestler, 2011).

De tous ces mécanismes plausibles, le mieux connu, et celui qui a été le plus étudié jusqu’à présent, est la régulation de la transcription des gènes. Durant les dix dernières années, il a été démontré que les psychostimulants pouvaient modifier l’expression d’une grande variété de gènes dans diverses régions cérébrales et ce via l’induction de facteurs de transcription (pour revue : McGinty et coll., 2008; Niwa et coll., 2008; Robison et Nestler, 2011). Aussi, les chercheurs commencent également à se pencher sur des mécanismes de régulation de la transcription des gènes via des facteurs épigénétiques (Romieu et coll., 2011; pour revue : Maze et Nestler, 2011). On présentera donc en particulier ces deux modes de régulation de la transcription.

1.3.2.4.1 Facteurs de transcription connus dans ces neuroadaptations

Dans cette partie, nous porterons notre attention en particulier sur deux protéines dont l’implication dans la sensibilisation comportementale et dans les neuroadaptations induites par la prise répétée de psychostimulants a été démontrée. Il s’agit des facteurs de transcription ∆FosB et CREB.

Le facteur de transcription ∆FosB

Le facteur de transcription ∆FosB est un membre de la famille Fos (cFos, ∆FosB, Fra1 et 2) dont l’expression est rapidement induite dans la cellule après la stimulation par des molécules extracellulaires (neurotransmetteurs, facteurs de croissances, hormones). Les gènes codant pour de telles protéines sont qualifiés de gènes d’induction précoce (« immediate early gene » (IEG)) et sont impliqués dans tous les phénomènes fondamentaux de la cellule tels que la prolifération cellulaire, la migration, la survie et la différenciation. L’activation de gènes d’induction précoce constitue l’une des étapes initiales des mécanismes de la transformation des stimuli arrivant au niveau de la membrane cellulaire en des réponses neuronales à court, moyen ou long terme. L’activité transcriptionnelle des protéines de la famille Fos s’exerce via la formation d’un complexe protéique (Curran et Morgan, 1995; McClung et coll., 2004). En effet, ces protéines se dimérisent avec un membre des facteurs de transcription de la famille Jun pour former le

49 complexe d’activation AP-1 (« activator protein 1 »). Ce complexe AP-1 se fixe au niveau de l’ADN sur les éléments de réponse AP-1 situés sur les régions régulatrices de certains gènes (Morgan et Curran, 1995). A l’hétérodimère AP-1 s’ajoutent ensuite diverses autres protéines impliquées dans la régulation de la transcription et permettant le recrutement d’ARN polymérases de la « TATA box » du gène cible. Fos et son complexe protéique assurent une double régulation sur le génome : Fos peut induire la synthèse d’un ARNm donné ou réprimer la production d’un autre ARNm dans une même cellule (Curran et Morgan, 1995; McClung et coll., 2004).

L’administration aigüe de la plupart des psychostimulants entraîne une induction rapide et transitoire de plusieurs protéines Fos et Jun dans le NAc et le striatum (Graybiel et coll., 1990; Young et coll., 1991; Nestler et coll., 2001). La nature transitoire de cette induction est due au fait que les ARNms de ces protéines et les protéines elles-mêmes sont hautement instables. La production de ces facteurs de transcription est transitoire car en l’espace de 12 heures, les protéines ont disparu (comme dans les cellules au repos). Cependant, parmi ces protéines, ∆FosB fait figure d’exception car il est, d’une part, très faiblement induit en réponse aux expositions initiales à la drogue et d’autre part, ∆FosB est une protéine extrêmement stable. En conséquence, au cours d’une administration chronique de psychostimulants, ∆FosB s’accumule graduellement et après un certain temps devient la protéine Fos prédominante dans le NAc et le striatum et en particulier dans la portion dorsolatérale (Hope et coll., 1994; Chen et coll., 1995; Moratalla et coll., 1996; Hiroi et coll., 1997; fig. 1.8).

Au niveau cellulaire, l’accumulation de ∆FosB dans les neurones du NAc et du striatum est spécifique aux neurones GABAergiques de la voie de sortie directe (D1) des ganglions de la base qui expriment la DYN, c'est-à-dire un des acteurs cruciaux du contrôle motivationnel et moteur. L’autre grande sous-population de neurones GABAergiques appartient à la voie indirecte (D2), utilise comme neuromodulateur le neuropeptide ENK, et ne subit pas l’influence qu’exerce, à long terme, l’expression des protéines Fos en réponse aux psychotropes. Le facteur de transcription ∆FosB est également induit dans la même région par la consommation chronique de récompenses dites « naturelles », telles que des

Figure 1.8: Accumulation graduelle de ∆FosB versus l’induction rapide et transitoire des autres protéines de la famille Fos dans le cerveau. En haut: Les différentes vagues d’induction des protéines de la famille Fos induites dans les neurones par des stimuli aigus (i.e. injection unique de drogue). c-Fos est induit rapidement et est dégradé en quelques heures après le stimulus, alors que d’autres protéines FOS aigües (FosB, ∆FosB, et les antigènes reliés à Fos Fra-1 et -2) sont induites un peu plus tard et persistent plus longtemps que c-Fos. Les isoformes stables de ∆FosB sont également induits mais à un niveau très bas à la suite d’un seul stimulus aigu mais cette induction persiste dans le cerveau pendant de très longues périodes. Dans un complexe avec des protéines Jun, ces vagues d’induction des protéines Fos forment des complexes AP-1 dont la composition est interchangeable avec le temps. En bas: Avec une stimulation répétée (deux fois par jour), comme par exemple une exposition répétée à une drogue, chaque stimulus isolé (flèche) entraîne une faible induction de l’expression de l’isoforme stable ∆FosB. Le résultat est une augmentation graduelle, indiquée par la progression en paliers, du niveau total d’expression de ∆FosB avec la stimulation répétée durant un traitement chronique. Les niveaux croissants de ∆FosB avec la stimulation répétée résulteraient ainsi en une induction graduelle de niveaux significatifs et durables du complexe de transcription AP-1, lequel sous-tendrait les formes persistantes de plasticité dans le cerveau (Tiré de Nestler et coll., 2001).

51 niveaux d’activité spontanée importants dans une roue d’activité (« Wheel Running ») ou l’absorption de sucrose. Il y a actuellement de nombreuses preuves indiquant que l’accumulation de ∆FosB dans les neurones du NAc contribue à un état de sensibilisation (Nestler, 2001a; Nestler et coll., 2001; McClung et coll., 2004). Par exemple, la surexpression de ∆FosB dans le NAc augmente la réponse comportementale à la cocaïne et aux opiacés ainsi qu’au sucrose et à l’activité motrice volontaire (« Wheel-running »).

Une hypothèse formulée par l’équipe de Nestler (2005) suggère que l’induction de ∆FosB médie de nombreux aspects communs aux addictions « naturelles » et aux drogues d’abus en régulant une série de gènes-cibles. Du fait de sa forte stabilité, une fois que ∆FosB est induit, il persiste dans ces régions pendant des semaines voire des mois après l’arrêt de l’exposition aux drogues d’abus. L’accumulation de ∆FosB représente, dès lors, un nouveau mécanisme par lequel la consommation chronique de drogues d’abus peut mener à des changements dans l’expression de gènes. Changements qui persistent, alors, longtemps après l’arrêt de la consommation de la substance (Nestler, 2001a). Ainsi, l’accumulation de ∆FosB semble suffisante pour réguler à long terme l’expression de gènes dont les produits seraient impliqués dans l’établissement et le maintien de la dépendance.

La DYN représente une cible potentielle de ∆FosB. Elle assure un rétrocontrôle négatif sur les neurones DAergiques de l’ATV et est codée par un gène possédant un site de liaison pour AP-1 dans son promoteur. Sous l’effet de ∆FosB, la synthèse de cet opiacé endogène est réduite. Le mécanisme de rétrocontrôle négatif du circuit de récompense perdant ainsi de son efficacité (fig. 1.9), l’impact des drogues sur ce circuit et la dépendance s’en trouveraient amplifiés, à l’instar des effets de la surexpression de ∆FosB. Il est à noter que dans le cas précis de la production de DYN, ∆FosB et CREB jouent des rôles de régulateurs antagonistes (voir plus bas pour CREB).

Ainsi, il a été montré que l’accumulation de ∆FosB, induite par les drogues et en particulier par les psychostimulants, dans le NAc et le striatum pourrait contribuer au mécanisme de sensibilisation prolongée observée suite à une exposition chronique aux drogues d’abus (pour revue : Nestler, 2004).

Figure 1.9: La dynorphine est une cible potentielle de ∆FosB. La figure montre un neurone DAergique de l’ATV innervant un neurone de projection GABAergique du NAc qui exprime la DYN. La DYN exerce un rétrocontrôle négatif dans ce circuit : la DYN libérée par les terminaisons des neurones du NAc agit sur les KOR localisés sur les terminaisons nerveuses et les corps cellulaires des neurones DAergiques (DA) pour inhiber leur fonctionnement. ∆FosB inhibant l’expression de la DYN, il se produit une atténuation « down- regulation » de cette boucle de rétrocontrôle, ce qui augmente les propriétés renforçantes des drogues d’abus. GABA : acide γ-aminobutyrique ; DR : récepteur de la DA ; OR : récepteur opioïde (Tiré de Nestler et coll., 2001).

Le facteur de transcription CREB

La protéine CREB est un facteur de transcription exprimé dans le noyau des cellules. Il est activé par phosphorylation via l’action de kinases appartenant à divers systèmes de transduction (Shaywitz et Greenberg, 1999; Mayr et Montminy, 2001). Certaines sont activées par des neurotransmetteurs : la PKA et la Ca2+-calmoduline kinase (CAMK). D’autres sont induites par des facteurs de croissance et des neurotrophines : la MAPK et la phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K). Une fois phosphorylées, les protéines CREB s’associent pour former des homodimères. Ce dimère représente la forme active du facteur de transcription et peut se lier dès lors à l’ADN pour activer la transcription de gènes cibles. Cette liaison s’effectue au niveau du promoteur des gènes cibles sur une séquence spécifique appelée séquence CRE (« cyclic AMP response element ») Ainsi, ce facteur de transcription peut interagir avec le complexe transcriptionnel basal pour induire la transcription de divers gènes cibles (pour revue : Nestler, 2004).

L’implication de CREB dans les mécanismes de plasticité liés à l’administration chronique de psychostimulants a été mise en évidence par diverses études montrant que l’induction de CREB se produit en réponse à l’administration de drogues d’abus dans les régions appartenant au circuit de la récompense (Cole et coll., 1995; Nestler, 2001b). Il a été démontré qu’une augmentation de l’activité de CREB dans le NAc résultait en une diminution de la sensibilité aux effets de récompense de la morphine et des psychostimulants et qu’inversement, une diminution de l’activité de CREB engendrait l’effet opposé (Carlezon et coll., 1998; Barrot et coll., 2002).

Ces résultats suggèrent que l’induction de CREB par les drogues au niveau du NAc, pourrait correspondre à une adaptation homéostatique via un rétrocontrôle négatif qui diminuerait la sensibilité d’un individu à la suite d’une exposition chronique à une drogue d’abus. Il a été clairement démontré que l’activation de CREB par la voie de signalisation AMPc/PKA est perturbée dans la toxicomanie (Chao et Nestler, 2004).

Selon ces données, suite à une administration chronique de drogues d’abus, il se développe une réponse compensatoire au niveau cellulaire se traduisant par une élévation

du niveau endogène de fonctionnement du système AMPc/CREB. Ce changement compensatoire est assuré via une expression basale accrue de l’AC et de CREB. Le gène codant pour la DYN étant doté d’un promoteur à séquence CRE, l’activation du système AMPc/CREB qui suit l’activation des récepteurs D1, stimule la libération de DYN par les neurones GABAergiques appartenant à la voie de sortie directe des ganglions de la base. Ces neurones envoient des collatérales récurrentes dans le NAc et dans l’ATV. Dès lors, l’action de la DYN s’en trouve renforcée au niveau des terminaisons et du soma des neurones DAergiques de l’ATV. La DYN se fixe alors sur des KOR qui inhibent la libération de DA dans le NAc, par les neurones de l’ATV.

Le rétrocontrôle du NAc sur l’ATV, ainsi augmenté, freine le circuit de récompense et produit une aversion qui explique la réduction de l’effet hédoniste et la dysphorie observée lors de toxicomanies chroniques. L’hyperfonctionnement du système AMPc/CREB ayant un effet dépresseur, ce système de signalisation intracellulaire serait impliqué dans le syndrome de sevrage et la dysphorie survenant lors de l’abstinence (pour revue : Nestler, 2004). L’analyse des modifications moléculaires induites par l’augmentation de la production de CREB suggère que l’effet aversif (anti-hédoniste) et la dysphorie, mentionnés ci-dessus, pourraient être provoqués par une élévation de la synthèse de DYN dans le NAc (fig. 1.10).

1.3.2.4.2 Mécanismes épigénétiques responsables des neuroadaptations

Plusieurs études récentes ont souligné l’importance des régulations épigénétiques de la transcription des gènes dans certains troubles psychiatriques incluant l’addiction (Cassel et coll., 2006; pour revue : Peter et Akbarian, 2011; Renthal et Nestler, 2008; Maze et Nestler, 2011; Robison et Nestler, 2011). En effet, l’addiction aux drogues est une maladie neurologique chronique caractérisée par un constant risque de rechute, et ce, même après de longues périodes de sevrage. Une hypothèse actuelle stipule que cette propension tenace à la rechute serait le résultat de neuroadaptations durables induites en réponse à la prise répétée de drogues d’abus.

Figure 1.10 : Régulation de CREB par les drogues d’abus. La figure montre un neurone DAergique de l’ATV innervant un neurone de projection GABAergique du NAc qui exprime la dynorphine (DYN). La DYN exerce un rétrocontrôle négatif dans ce circuit : la DYN libérée par les terminaisons des neurones du NAc agit sur les KOR localisés sur les terminaisons nerveuses et les corps cellulaires des neurones DAergiques (DA) pour inhiber leur activité. L’exposition chronique aux psychostimulants ou aux opiacés favorise l’augmentation de l’activité de cette boucle de rétrocontrôle négatif en stimulant la voie de signalisation de l’AMPc menant à l’activation de CREB et ainsi à l’induction de la DYN (Tiré de Chao et Nestler, 2004).

Dans ce même cadre, certains comportements induits par les psychostimulants seraient le résultat de neuroadaptations persistantes. Or, ces adaptations nécessitent l’expression de certains gènes qui sont sous le contrôle de régulations épigénétiques stables (Malvaez et coll., 2009; Sanchis-Segura et coll., 2009; Anier et coll., 2010; Malvaez et coll., 2010; Malvaez et coll., 2011).

Ces régulations contrôlent la condensation/décondensation de la chromatine. Ce faisant, elles contrôleraient l’accès aux gènes responsables de la plasticité neuronale. Et donc, tout élément influençant l’accès à l’ADN, pourrait réguler les neuroadaptations induites par la prise chronique de drogues d’abus. Un des complexes protéiques responsables de la condensation de la chromatine et donc du « silencing » des gènes est l’histone déacétylase (HDAC).

À l’inverse, l’acétylation des histones par l’enzyme « histone acétyltransferase » (HAT) entraîne une décondensation de la chromatine et favorise l’expression des gènes situés sur les parties de l’ADN qu’elles auront ciblées. Ce phénomène de décondensation de l’ADN serait possiblement impliqué dans la régulation des comportements induits par les psychostimulants (Impey, 2007). En effet, il a été montré que l’administration de psychostimulants, selon un dosage entrainant normalement la préférence de place conditionnée et la sensibilisation comportementale, résultait en une hyperacétylation des histones au niveau de gènes significativement impliqués dans le développement des comportements addictifs (Levine et coll., 2005; Renthal et coll., 2007; Renthal et Nestler, 2008). De manière congruente, une réduction de l’activité de l’HDAC augmente les réponses comportementales induites par les psychostimulants comme la préférence de place et la sensibilisation comportementale (Kalda et coll., 2007; Sanchis-Segura et coll., 2009; Malvaez et coll., 2010).

D’autre part, fait qui nous intéresse particulièrement, il a été démontré tout récemment que ce complexe HDAC pouvait réguler le turnover de Nur77, un récepteur nucléaire agissant comme facteur de transcription (Kang et coll., 2010). Or, ce facteur de transcription fait partie de la sous-famille des récepteurs nucléaires NR4A et est

57 spécifiquement impliqué dans l’homéostasie de la neurotransmission DA (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2009). C’est pourquoi il devient d’autant plus pertinent de se pencher sur le rôle précis de ce récepteur nucléaire dans les comportements et les neuroadaptations induits par les psychostimulants : d’une part pour sa qualité de facteur de transcription agissant au niveau du système DA et d’autre part pour sa qualité de cible potentielle de la régulation épigénétique de la transcription des gènes.

Ainsi, les psychostimulants provoquent des neuroadaptations durables de la transmission DAergique. Et ce, en modulant la transcription de gènes par le biais de divers mécanismes tels que l’activation de facteurs de transcription et la modulation de facteurs épigénétiques. De récentes études, réalisées au sein de notre laboratoire, indiquent que la famille des facteurs de transcription NR4A est également impliquée dans les modifications à long terme de la transmission DAergique qui sous-tendent les comportements induits par les psychostimulants. Ces facteurs de transcription, jusqu’alors peu étudiés, appartiendraient également à la famille des récepteurs nucléaires.

1.4 Les récepteurs nucléaires

La grande famille des récepteurs nucléaires comprend une grande diversité de récepteurs possiblement impliqués dans une myriade de fonctions développementales et physiologiques comme la différenciation, la reproduction, la morphogenèse, et la croissance (pour revue : Gronemeyer et coll., 2004). Ces récepteurs sont également impliqués dans une vaste panoplie de maladies comme le cancer, le diabète, l’obésité (pour revue : Olefsky, 2001; Robinson-Rechavi et coll., 2003).

Malgré le fait que 94 % des récepteurs nucléaires soient exprimés dans le SNC (Bookout et coll., 2006), très peu d’informations sont, jusqu’à présent, disponibles en ce qui concerne leur implication dans les comportements et dans les perturbations neurologiques et psychiatriques. Leur distribution dans divers circuits neuronaux et structures cérébrales suggère pourtant qu’ils pourraient être impliqués dans un large spectre de fonctions centrales. En effet, au moins 28 récepteurs nucléaires sont exprimés dans l’hypothalamus, 26 dans l’hippocampe et un sous-type particulier est exprimé également dans l’amygdale. Ceci indique possiblement qu’ils auraient un rôle à jouer dans la régulation centrale du métabolisme, dans l’apprentissage et la mémoire et dans le contrôle des comportements émotionnels (pour revue : Gofflot et coll., 2007; fig. 1.11).

De récentes études, réalisées au sein de notre laboratoire, indiquent qu’une famille particulière de facteurs de transcription serait impliquée dans la régulation de la transmission DAergique (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2009). Ces facteurs de transcription, jusqu’alors peu investigués, appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires.

Figure 1.11: Distribution des récepteurs nucléaires dans le SNC de souris adultes. (A) Le nombre de récepteurs nucléaires exprimés selon les différents patrons d’expression proposés est indiqué dans les diagrammes circulaires sur la gauche et leur nom sont inscrits dans le tableau. Les récepteurs nucléaires ont été regroupés en 4 catégories selon l’étendue de leur distribution dans les différents tissus du système nerveux central: Absente (jaune), Restreinte (bleu clair: exprimé dans moins de 50% des tissus), Répandue (bleu foncé: exprimé dans plus de 50% des tissus), et ubiquitaire (violet: exprimé dans 100% des tissus) (B) Le niveau d’expression des récepteurs nucléaires dans les diverses régions du cerveau est indiqué par le diagramme circulaire et leur nom est inscrit dans les tableaux adjacents, Les niveaux d’expression a été défini comme: Absent (jaune), bas(bleu clair), moyen (bleu foncé), haut (violet) ( Tiré de Gofflot et coll., 2007).

1.4.1 Caractéristiques générales des récepteurs nucléaires

1.4.1.1 Définition

Comme leur nom l’indique, les récepteurs nucléaires sont des récepteurs qui sont situés non pas à la surface des cellules mais bien directement dans le noyau. Ce sont des facteurs de transcription dont l’activité peut être induite par des stimuli physiologiques, environnementaux et développementaux (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006). En réaction à ces divers stimuli, ils peuvent se fixer sur les régions promotrices et régulatrices des gènes dont ils vont moduler l’expression. Ainsi, les récepteurs nucléaires exercent leur fonction au niveau du noyau cellulaire via la régulation de l’expression de gènes cibles et, leur double rôle de récepteur nucléaire/facteur de transcription, leur confère la propriété particulière de pouvoir assurer une liaison directe et rapide entre les stimuli environnementaux et la régulation de la transcription des gènes.

Les récepteurs nucléaires sont exprimés, pour la plupart, de manière constitutive dans le noyau des cellules. De plus, certains de ces récepteurs ont la particularité de se lier à l’ADN en l’absence de ligand. Par contre, quelques récepteurs stéroïdiens sont préférentiellement exprimés dans le cytoplasme, sous une forme inactive liée à des protéines de choc thermique. Dans ce cas la translocation du complexe dans le noyau nécessite la liaison d’un ligand (Pratt et Toft, 1997; Beato et Klug, 2000).

Les récepteurs nucléaires peuvent être actifs de façon constitutive ou activés par la fixation d’un ligand. Les ligands connus, associés à ces récepteurs, sont des molécules hydrophobes, comme les acides gras et les hormones, capables de traverser successivement les membranes cytoplasmique et nucléaire (Bourquet et coll., 2000). On recense, en particulier, les hormones stéroïdiennes et thyroïdiennes, les rétinoïdes et la vitamine D. Cependant, pour une grande part de ces récepteurs, aucun ligand n’a encore été identifié : ce sont des récepteurs dits orphelins (Wang et coll., 2003, pour revue : Maxwell et Muscat, 2006; Lévesque et Rouillard, 2007).

1.4.1.2 Structure

Les récepteurs nucléaires partagent une organisation structurelle commune (pour revue : Gronemeyer et coll., 2004; fig. 1.12) constituée de quatre domaines fonctionnels distincts : la région modulatrice (A/B), la région C de liaison à l’ADN (DBD: pour DNA binding Domain), la région charnière (D), le domaine E de liaison au ligand (LBD: pour Ligand Binding Domain), et l’extrémité carboxyterminale (F).

La région modulatrice située à l’extrémité N-terminale (A/B) est extrêmement polymorphique et contient au moins une région d’activation de la transcription (AF-1) active de manière constitutive. Par conséquent, c’est via cette région que serait assurée l’activité transcriptionnelle constitutive, indépendante de la fixation d’un ligand, des récepteurs nucléaires (pour revue : Robinson-Rechavi et coll., 2003). La région A/B est également la cible de diverses voies de signalisation qui assure la phosphorylation/déphosphorylation des récepteurs modulant ainsi leur activité transcriptionnelle (Shao et Lazar, 1999; Kang et coll., 2000).

La région C, la mieux conservée, est encore appelée le domaine de liaison à l’ADN (DBD) et permet la fixation du récepteur sur ses éléments de réponses cibles sur l’ADN. En effet, pour initier la transcription, les récepteurs nucléaires reconnaissent et se fixent sur des séquences spécifiques d’ADN situées sur les régions promotrices et régulatrices qu’on appelle les éléments de réponse aux hormones (Hormone Response Elements ; HREs). Les récepteurs nucléaires peuvent se lier aux HREs sous la forme de monomères, d’homodimères ou d’hétérodimères. Chaque type de configuration adoptée ciblera des séquences différentes de HREs sur l’ADN. Le grand nombre de combinaisons potentielles pour un même récepteur nucléaire implique la possibilité d’un large spectre d’action. Un seul récepteur peut ainsi influencer la régulation de plusieurs gènes différents, et ce, dans divers tissus cellulaires. La région D (hinge region) sert quant a elle de charnière en conférant aux dimères une flexibilité structurelle qui leur permet d’interagir avec de multiples HREs.

Enfin, la région E/F de liaison du ligand (LBD) est fonctionnellement unique puisqu’elle intervient à la fois dans la reconnaissance des ligands potentiels, dans la dimérisation des récepteurs, dans l’interaction avec les cofacteurs ainsi que dans le contrôle de la localisation nucléaire. Cette région contient également un domaine d’activation de la transcription AF-2 dont la fonction, cette fois, est dépendante du ligand, et dont l’activation dépend du recrutement de coactivateurs ou de corépresseurs (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006; Lévesque et Rouillard, 2009; Green et Han, 2011).

SLN (ligand-dépendant)

Fonctions Dimérisation (forte) SLN Hélice H12 A/B D F Régions AD AD AD AD C E AD

AF-1 (activité ligand-indépendante) DBD LBD

Dimérisation AF-2 Fonctions (faible ; induite par la (activité ligand-dépendante) liaison à l’ADN)

Figure 1.12: Schéma de la structure des récepteurs nucléaires. Les récepteurs nucléaires sont constitués de domaines indépendants qui incluent le domaine de liaison à l’ADN (DBD) et le domaine de liaison au ligand (LBD). Les récepteurs nucléaires possèdent en général deux régions d’activation de la transcription AF-1 et AF-2 localisées respectivement sur les extrémités N- et C-Terminale. Le domaine A/B correspond à une région modulatrice et comprend la région AF-1. C représente la région DBD. D correspond à une région charnière entre DBD et LBD. E/F correspondent à la région LBD et comprend le site AF-2 et l’extrémité C-terminale de la protéine. Les fonctions des différents domaines sont indiquées au- dessus et en-dessous de la structure. A, domaine d’activation; AF-1, domaine d’activation de la transcription indépendant du ligand; AF2, domaine d’activation de la transcription dépendant du ligand; SLN, signal de localisation nucléaire (Adapté de Gronemeyer et coll., 2004).

1.4.1.3 Modulation de l’activité des récepteurs nucléaires

Le polymorphisme de la région LBD permet de ségréger les récepteurs nucléaires selon trois catégories distinctes : 1) dans la première catégorie, le LBD peut être activé par un ligand lipophile comme les stéroïdes, les rétinoïdes et les acides gras ; 2) la seconde catégorie de récepteurs a un LBD en conformation active indépendamment de la fixation d’un ligand ce qui rend ces récepteurs actifs de manière constitutive ; 3) enfin, dans la troisième catégorie, la structure du LBD ne permet pas l’interaction avec un coactivateur ce qui confine cette catégorie de récepteurs à un rôle de répresseurs de la transcription (pour revue : Bridgham et coll., 2010).

Concernant la première catégorie, le LBD adopte également une configuration particulière selon les ligands activateurs (agonistes) ou répresseurs (antagonistes) qui viennent s’y fixer. De fait, le LBD est constitué de 11 hélices formant la cavité de liaison du ligand et d’une douzième hélice (H-12) qui, en configuration non-activée, en bloque l’entrée. En effet, la conformation de cette dernière hélice se modifie à l’approche d’un ligand. En absence de ligand ou lors de la fixation d’un ligand répresseur, le LBD a une affinité plus grande pour les corépresseurs et adopte une configuration qui favorise la formation d’un complexe corépresseur inhibant la transcription des gènes cibles. Par exemple, l’enzyme de déacétylation des histones (HDAC pour histone déacétylase) qui appartient à ce complexe est activée et entraîne la condensation de la chromatine autour des régions promotrices des gènes cibles. Leurs promoteurs étant devenus inaccessibles, l’expression des gènes cibles est réprimée (Bourguet et coll., 2000; Francis et coll., 2003; pour revue : Gronemeyer et coll., 2004). A l’inverse, lors de la liaison d’un ligand activateur, la conformation qu’adopte le récepteur entraîne la dissociation du complexe corépresseur et le recrutement d’un complexe coactivateur. Ce complexe coactivateur constitué d’une acétyltransferase d’histone (HAT) et d’un complexe de remodelage de la chromatine (CRM), entraîne l’acétylation des histones ce qui permet la décondensation de la chromatine et la préparation du promoteur pour la fixation du récepteur et la transactivation (Bourguet et coll., 2000).

La phosphorylation des récepteurs nucléaires constitue également une voie de signalisation propre et un mécanisme clé dans la régulation de leur activité transcriptionnelle. En effet, en plus de la région AF-1 (voir section 1.4.1.2), les régions LBD et DBD peuvent également être la cible d’une phosphorylation par les protéines kinases comme la MAPK, la PKA, la protéine kinase C (PKC), Akt, C-Jun N-Terminal kinase (Rochette-Egly, 2003). Selon le site phosphorylé et l’action de ces diverses kinases, on pourra soit encourager la formation du complexe coactivateur, soit au contraire favoriser le détachement du récepteur de son HRE et l’interruption de la transcription.

1.4.2 Les récepteurs nucléaires de la sous-famille NR4A

1.4.2.1 Définition

Les récepteurs nucléaires de la famille des Nurs (ou NR4A) représentent un sous groupe (classe IV) de la superfamille des récepteurs nucléaires. Cette classe de récepteurs nucléaires, aussi exprimée en périphérie, est étroitement associée à la transmission DAergique (voir fig. 1.16) et comprend Nur77 (NR4A1 ; aussi appelé NGFI-B, TR, N10, DRH38, NAK-1, 3CH77, TIS1), Nurr1 (NR4A2 ; aussi appelé HZF-3, RNR-1, TINUR et NOT) et Nor-1 (NR4A3 ; aussi appelé MINOR, TEC et CHN). Les membres de cette sous- famille sont classés comme étant des récepteurs orphelins car ils ne possèdent pas de domaine hydrophobe qui permettrait la fixation d’un ligand (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006). Ils sont exprimés préférentiellement dans le noyau et sont actifs de façon constitutive. Par conséquent, ils représentent un mode de médiation plus direct que les voies de signalisations classiques qui nécessitent la liaison d’un ligand aux récepteurs situés à la surface de la cellule ainsi que l’activation de longues cascades de signalisation intracellulaires. Ces récepteurs sont dès lors considérés comme des IEGs et aussi comme des facteurs de transcription, c'est-à-dire qu’ils sont capables de répondre de manière rapide et transitoire à une grande variété de stimuli (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006).

1.4.2.2 Structure

Concernant la structure des membres de la sous-famille NR4A, l’organisation structurelle est relativement identique à celle des membres de la grande famille des récepteurs nucléaires. Cependant, elle présente quelques différences non négligeables au niveau des domaines LBD et A/B. Dans le modèle classique des récepteurs nucléaires présenté plus haut, une clé hydrophobe située sur le domaine LBD assure le recrutement des cofacteurs qui fonctionnent comme coactivateurs ou corépresseurs de la transcription. Chez les Nurs, la région LBD adopte une conformation inhabituelle (Paulsen et coll., 1992; Wansa et coll., 2003) qui entraîne, d’une part, la perte des sites de liaison de ces cofacteurs et prive, d’autre part, le récepteur de sa cavité de liaison pour le ligand. En effet, il a été démontré, par exemple, pour Nurr1, que des résidus hydrophobes occupaient cette cavité de liaison et en bloquaient l’accès (Renaud et Moras, 2000; Wang et coll., 2003; Benoit et coll., 2004; fig.1.13B). En compensation, la région AF-1 sur le domaine A/B des Nurs aurait une efficacité accrue et permettrait également de recruter des cofacteurs (Maira et coll., 2003; Wansa et coll., 2003; Kang et coll., 2010). Ces différences suggèrent que les Nurs auraient plutôt une activité transcriptionnelle constitutive, indépendante de la fixation d’un ligand, dont l’efficacité serait déterminée par le domaine AF-1.

Par contre, entre eux, les membres de la famille Nurs ont une structure bien conservée (fig. 1.13A). En effet, les régions de liaison à l’ADN (DBD) et de liaison au ligand (LBD) des différents récepteurs Nurr1, Nor-1 et Nur77, présentent respectivement 91-95% et 60% d’homologie. C’est plutôt leur domaine A/B contenant la séquence AF-1 qui présente le plus de disparités (20% d’homologie chez les humains; Maruyama et coll., 1998), ce qui pourrait signifier qu’il y existe une différence entre les Nurs dans leur efficacité (pouvoir d’activation d’AF-1 différent) et leur fonction relative (activation par des cofacteurs différents) (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006).

Figure 1.13 : A. Structure d’un récepteur nucléaire et représentation schématique des séquences qui correspondent aux gènes des membres de la sous-famille NR4A. L’alignement des séquences d’acides aminés des Nurs et le pourcentage d’homologie des acides aminés avec les régions correspondantes de Nur77 sont indiqués en A. Le domaine A/B est le plus polymorphe : ceux de Nurr1 et Nor-1 présentent respectivement 26 % et 28 % d’homologie avec celui de Nur77. Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) est le mieux conservé : ceux de Nurr1 et Nor-1 présentent respectivement 95% et 94% d’homologie avec celui de Nur77. Enfin, le domaine de liaison au ligand (LBD) est également relativement variable d’un membre à l’autre puisque Nurr-1 et Nor-1 y présentent respectivement 65% et 58% d’homologie avec Nur77. B. Illustration de la structure tertiaire du domaine de LBD de Nurr1. Le blocage de la cavité de liaison du ligand est expliqué par la présence de 4 résidus phénylalanine qui empêchent les ligands potentiels de se fixer (en bleu). La région d’activation de la transcription AF-2 située à l’extrémité C-terminale est stabilisée dans la conformation « active » (A est tiré de Martinez-Gonzalez et Badimon, 2005) et B est tiré de Benoit et coll., 2004).

1.4.2.3 Liaison à l’ADN

Ces récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription qui se lient à des séquences spécifiques de l’ADN appelés éléments de réponse (ER). Ils peuvent se lier à l’ADN au niveau de différents ER sur les régions régulatrice et promotrice des gènes dont ils modulent l’expression (fig.1.14; Lévesque et Rouillard 2007). Ils se lieront à différents ER en fonction de la forme qu’ils adoptent: monomérique, homodimérique ou hétérodimérique (avec le récepteur de l’acide rétinoïque (RXR)). Précision importante, seuls Nur77 et Nurr1 peuvent former des dimères avec RXR (Perlmann et Jansson, 1995; Maira et coll., 1999). Nor-1 présente donc une caractéristique importante qui le différencie de Nur77 et Nurr1, l’incapacité à former un hétérodimère avec RXR (Forman et coll., 1995). Ainsi les Nurs peuvent initier la transcription, en se liant sous forme de monomères à l’élément de réponse NBRE (NGFI-B response element). Une autre séquence de liaison à l’ADN, encore plus réactive aux Nurs, a été identifiée. Il s’agit de l’élément de réponse Nur (NurRE pour Nur Responsive Element) qui ne lie les Nurs que sous forme homodimérique. Enfin, tel qu’abordé plus haut, les Nurs peuvent s’hétérodimériser avec RXR et activer la transcription en se liant à l’élément de réponse DR-5 spécifique aux rétinoïdes (pour Direct Repeat spaced by 5 nucleotides). Dans ce cas, Nur77 ou Nurr1 restent des partenaires silencieux et l’activité transcriptionnelle du complexe sera modulée via la fixation ou non d’un ligand au récepteur RXR comme l’acide docosahexaénoïque (DHA) et l’acide rétinoïque-9-cis (Perlmann et Jansson, 1995; de Urquiza et coll., 2000). Par exemple, la fixation de ligands rétinoïdes à RXR permet la formation de l’hétérodimère Nurr1-RXR impliqué dans le développement des neurones DA (Saucedo-Cardenas et coll., 1998). Chaque type d’ER affecte différemment la transcription et l’expression de différents gènes est modulée par le biais de ces complexes.

1.4.2.4 Modulation de l’activité des membres de la famille NR4A

De façon encourageante, bien que ces récepteurs orphelins ne possèdent pas de ligands endogènes connus, plusieurs petites molécules agonistes ou coactivatrices ont été

Figure 1.14 : Mécanismes de l’activité transcriptionnelle des membres de la sous-famille NR4A. (a) Les membres de la sous-famille des Nurs peuvent agir par le biais de multiples mécanismes. Ils peuvent interagir comme monomères sur l’élément de réponse du « nerve-growth-factor inducible gene B » (NBRE) (i), comme homodimères sur l'élément de réponse réactif aux Nurs (NurRE) (ii), ou comme hétérodimères en se liant avec les récepteurs des rétinoïdes X (RXR) (iii). Les deux parties des hétérodimères Nur-RXR se lient au « retinoic acid (RA) direct-repeat 5 (DR-5) responsive element », alors que, seule, la composante Nur se lie au site NBRE. Les récepteurs RXR sont des récepteurs pour les ligands rétinoïdes. Notez que le facteur de transcription Nor-1 appartenant aux Nurs ne peut pas former un hétérodimère avec RXR (Forman et coll., 1995). (b) Séquences d’ADN des différents éléments de réponse aux Nurs. NurRE comprend deux sites NBRE canoniques. La séquence NurRE montrée ici correspond à la séquence du promoteur de la pro-opiomélanocortine précédemment caractérisée (Philips et coll., 1997). Le site DR-5 spécifique aux rétinoïdes comprend deux moitiés de sites séparées par cinq nucléotides aléatoires (n) (Tiré de Lévesque et Rouillard, 2007).

69 récemment identifiées telles que la 6-mercaptopurine (Wansa et coll., 2003), le 1,1-bis (3’- indolyl)-1-(p-methoxyphényl) méthane (Chintharlapalli et coll., 2005; Cho et coll., 2008), la cytosporone B (Csn-B ; Zhan et coll., 2008) et les acides gras non-saturés (UFAs pour unsaturated fatty acids; Vinayavekhin et Saghatelian, 2011). De nombreuses études, répertoriées par Pearen et Muscat (2010), suggèrent ainsi qu’une exploitation thérapeutique des Nurs pourrait être envisageable notamment dans le traitement de certaines maladies comme la dyslipidémie, l’obésité, le diabète et les maladies cardiovasculaires (pour revue : Fu et coll., 2007; Pearen et Muscat, 2010; Veum et coll., 2012).

1.4.3 Rôles périphériques et centraux de la sous-famille NR4A

La capacité de détecter et de réagir rapidement aux changements dans l'environnement cellulaire semble être une caractéristique importante des récepteurs nucléaires appartenant à la sous-famille des Nurs. En effet, ils sont induits par des signaux variés incluant des facteurs de croissance, des acides gras, des cytokines, des hormones peptidiques, des phorbol esters, le stress, le calcium, des neurotransmetteurs, et certains stimuli de nature physique tels que les champs magnétiques, l’agitation mécanique et la dépolarisation membranaire (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006; fig. 1.15A). Ils sont, par conséquent, impliqués dans un large éventail de mécanismes physiologiques au niveau de la périphérie et du SNC.

1.4.3.1 Rôles en périphérie

Les membres du sous-groupe Nur interviennent en effet dans trois grandes fonctions physiologiques au niveau du système périphérique: 1) la régulation du cycle cellulaire : apoptose, carcinogenèse, prolifération, différentiation (pour revue : Pols et coll., 2007); 2) la régulation du métabolisme (pour revue : Pearen et Muscat, 2010; Zhao et Bruemmer, 2010); 3) le contrôle neuroendocrinien : réponse inflammatoire, stéroïdogenèse (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006; McMorrow et Murphy, 2011; fig. 1.15B).

Figure 1.15 : A. Divers stimuli peuvent induire l’expression des membres de la sous-famille NR4A. Nur77, Nor-1 et Nurr1, IEGs qui détectent et répondent à des changements dans l’environnement cellulaire, sont induits par des stimuli physiologiques et physiques. B. Effets spécifiques de la sous-famille NR4A sur certains organes et tissus. Schéma résumant l’effet pleïotropique et spécifique à certains tissus et/ou organes de cette sous-famille de récepteurs nucléaires. Ces récepteurs fonctionnent comme des gènes d’induction précoce dans une grande variété de conditions pathologiques (Tiré de Maxwell et Muscat, 2006).

1.4.3.1.1 Régulation du cycle cellulaire

Concernant le cycle cellulaire, les membres de la famille des Nurs jouent un rôle dans la régulation des processus apoptotiques, dans la carcinogenèse et dans la prolifération et la différentiation cellulaires.

L’implication des récepteurs nucléaires NR4A dans l’apoptose a pu être décelée au sein de tumeurs de la région mammaire, de la prostate, des poumons et dans les cancers gastro-intestinaux (Pour revue : Maxwell et Muscat, 2006). Cependant, selon le contexte et la voie de signalisation sollicitée, on a observé qu’ils pouvaient exercer un rôle soit pro- apoptotique soit anti-apoptotique. En ce qui à trait à leur activité pro-apoptotique, il a été démontré que Nur77 et Nor-1 étaient des acteurs clés de la sélection négative des thymocytes, précurseurs des lymphocytes T (Thompson et Winoto, 2008). Cette sélection se déroule pendant le développement embryonnaire et vise à éliminer, par apoptose, les lymphocytes T immatures qui reconnaissent (anormalement) les antigènes du soi (Winoto et Littman, 2002; Parham, 2003). C’est la liaison d’un complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) présentant un peptide du soi avec le récepteur TCR (pour T- Cell antigen Receptor) qui enclenche la cascade apoptotique. Or, la stimulation des récepteurs TCR, qui constitue un signal pro-apoptotique, est suivie par une forte expression des récepteurs Nur77 et Nor-1 (Liu et coll., 1994). Ce signal pro-apoptotique entraînerait une translocation de Nur77 et de Nor-1 du noyau vers la mitochondrie. C’est à ce niveau, dans la mitochondrie, que Nur77 et Nor-1 peuvent interagir avec Bcl-2, un modulateur de la mort cellulaire. Ce faisant, ils vont activer son domaine BH3 pro-apoptotique et ainsi induire la mort cellulaire. Enfin, il semblerait que l'exportation nucléaire de Nur77 soit également importante dans la cascade apoptotique Bcl-2-dépendante dans le contexte spécifique des cellules cancéreuses (Lin et coll., 2004; Wingate et coll., 2006; Thompson et Winoto, 2008). Ainsi, les Nurs ont des propriétés pro-apoptotiques, indépendamment de leur faculté de régulateurs transcriptionnels lorsqu’ils exercent leur action au niveau de la mitochondrie.

À l’opposé, il a été démontré que Nur77 pouvait revêtir un rôle protecteur, favorisant la survie cellulaire, en réponse à la voie de signalisation du TNF-α (pour Tumor Necrosis Factor alpha), un facteur pro-apoptotique. En effet, suite à l’activation de cette

voie de signalisation, Nur77 ne subit pas de translocation. En restant dans le noyau, il peut exercer sa fonction de régulateur de la transcription génique. Or, dans ce contexte, il intervient en tant que facteur de survie et bloque l’activation des caspases 3 et 6 et ce, via la répression potentielle de leur transcription (pour revue: Hsu et coll., 2004; Wingate et Arthur, 2006).

D’autre part, les membres de la famille des Nurs sont également impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la différentiation cellulaire. En effet, dans le système cardiovasculaire, l’action de différents facteurs de croissance entraînent une augmentation marquée de l’expression des Nurs. Cette induction est impliquée dans la fonction des cellules vasculaires via la régulation de l'activation des cellules endothéliales et de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (Martinez-Gonzalez et Badimon, 2005; pour revue : Zhao et Bruemmer, 2010).

1.4.3.1.2 Régulation du métabolisme

Les récepteurs de la sous-famille des Nurs interviennent également dans la régulation du métabolisme. En effet, l’expression des Nurs est induite par des stimuli associés à la fonction métabolique, tels que des agonistes des adrénorécepteurs β, le froid, les acides gras, le glucose, l’insuline, le cholestérol, et les thiazolidinédiones. En effet, des études de gain ou de perte de fonction effectuées in vitro et in vivo sur les principaux tissus métaboliques (tissus adipeux, cellules hépatiques et muscles squelettiques) ont spécifiquement associé le sous-groupe des Nurs aux mécanismes de régulation énergétique et à l’homéostasie des lipides et des carbohydrates (Pols et coll., 2007; Chao et coll., 2008; Pearen et coll., 2008; Veum et coll., 2012; Wang et coll., 2011). Par exemple, au niveau des muscles squelettiques, il a été démontré que l’expression des Nurs augmentait fortement pendant la période de repos après un effort physique. De la même manière, l’expression des Nurs dans les muscles squelettiques est induite par les agonistes des adrénorécepteurs β et inhibée par leurs antagonistes. Or, ces adrénorécepteurs β jouent un rôle crucial dans la régulation du métabolisme puisque c’est par leur entremise qu’est assurée la régulation des lipides et du glucose musculaires (pour revue : Pearen et Muscat, 2010). Enfin, les Nurs

73 sont également induits suite à un jeûne prolongé ou une expérience de restriction calorique (Oita et coll., 2009). Aussi, ces diverses études suggèrent qu’une exploitation thérapeutique des Nurs pourrait s’avérer utile dans le traitement de certaines maladies comme la dyslipidémie, l’obésité, le diabète et les maladies cardiovasculaires (Fu et coll., 2007; Veum et coll., 2012; pour revue : Pearen et Muscat, 2010; Zhao et Bruemmer, 2010).

1.4.3.1.3 Contrôle neuroendocrinien

Au niveau de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS), les membres de la famille des Nurs influencent de manière importante l’expression de divers gènes associés en particulier à l’inflammation et la stéroïdogenèse. Par exemple, au niveau de l’hypothalamus, Nur77 et Nurr1 induisent tous deux, l’expression du gène codant pour l’hormone de libération de la corticotropine (CRH pour Corticotropin releasing hormone; Murphy et coll., 2001; Martens et coll., 2005) qui une fois sécrétée assure l’activation de l’axe HHS. En réponse à la CRH, les Nurs situés dans l’adénohypophyse stimulent l’expression du gène de la pro-opiomélanocortine (POMC), un précurseur de l’hormone adrénocorticotropique (ACTH) (Philips et coll., 1997; Kovalovsky et coll., 2002). Enfin, dans la glande surrénale, Nur77 contrôle l’expression de l’enzyme stéroïdienne 21α- hydroxylase qui est indispensable à la biosynthèse des hormones stéroïdiennes (Wilson et coll., 1993). Enfin, les trois gènes Nur77, Nurr1 et Nor-1 sont exprimés dans les testicules (Zetterstrom et coll., 1996a). Or, il a été démontré que Nur77 jouait un rôle important dans la synthèse d’hormones stéroïdiennes dans les cellules de Leydig des testicules et qu’il était exprimé dans les testicules durant leur développement postnatal, période correspondant à la puberté (Song et coll., 2001; Song et coll., 2002). De la même manière, Nur77 semble impliqué dans la régulation de la transcription d’hormones stéroïdiennes-clés au niveau des ovaires. En effet, à ce niveau, une surexpression de Nur77 entraînerait une augmentation de la production de testostérone (Li et coll., 2010).

Dans le contexte de l’inflammation, il a été montré que Nur77, Nor-1 et Nurr1 étaient rapidement induits dans les macrophages par la stimulation de lipopolysaccharides (Barish et coll., 2005; Pei et coll., 2006). En outre, des cytokines inflammatoires telles que le TNF-α, l’interleukine 1β (IL-1β) et l’interféron gamma (INF-γ) ont également la capacité

d’induire l’expression des Nurs dans divers contextes inflammatoires (Murphy et coll., 2001; Gruber et coll., 2003; Pei et coll., 2006; pour revue : McMorrow et Murphy, 2011).

1.4.3.1.4 Redondance fonctionnelle ou rôles distincts ?

La distribution anatomique dans le système périphérique des membres de la famille des Nurs illustre bien leur implication dans ces divers processus physiologiques. De manière intéressante, on constate que les différents récepteurs membres sont souvent colocalisés dans les mêmes tissus. En effet, Nur77 est exprimé dans les poumons, le foie, le thymus, les muscles squelettiques, les muscles lisses, les glandes surrénales, les testicules et la prostate. Nor-1 est quant à lui représenté dans le cœur, le thymus, les muscles squelettiques, les muscles lisses, les glandes surrénales, les testicules, la glande pituitaire et le rein. Enfin, Nurr1 est exprimé dans le foie, le thymus, les muscles lisses, les testicules, la glande pituitaire et les ostéoblastes. Ce chevauchement de leurs patrons d’expression semble favoriser, en périphérie, une certaine redondance fonctionnelle. C’est le cas, en particulier, pour Nur77 et Nor-1 puisqu’on a constaté qu’ils y exercent souvent une fonction identique (Cheng et coll., 1997; Martinez-Gonzalez et Badimon, 2005).

Par exemple, Nor-1 peut compenser la délétion de Nur77 dans l’apoptose médiée par les lymphocytes T (Lee et coll., 1995; Cheng et coll., 1997). En effet, la surexpression constitutive de Nur77 ou de Nor-1 entraînent toutes les deux l’apoptose des lymphocytes T (Calnan et coll., 1995; Cheng et coll., 1997). De la même manière, les fonctions de la glande surrénale, dont l’expression de la 21α-hydroxylase, ne semblent pas affectées chez la souris déficiente pour Nur77 (Crawford et coll., 1995). Ces observations suggèrent également une redondance fonctionnelle exercée en partie par le récepteur nucléaire Nor-1, lequel est également exprimé dans l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS). Enfin, on a exposé précédemment que Nur77 était impliqué dans la régulation de la production des hormones stéroïdiennes au niveau des testicules. Or, le fait qu’on observe un développement normal des testicules chez les souris déficientes pour Nur77 suggère une redondance fonctionnelle. En effet, la seule présence des autres récepteurs Nor-1 et Nurr1 semble suffisante pour générer un phénotype normal.

Cependant, dans certains tissus Nur77 et Nor-1 peuvent exercer des rôles opposés. C’est le cas par exemple dans les parois vasculaires. En effet, il a été démontré que Nor-1 y encourageait la prolifération des cellules musculaires lisses alors que Nur77 et Nurr1 en inhibait plutôt la croissance (van Tiel et de Vries, 2011; pour revue Zhao et Bruemmer, 2010).

Ainsi les Nurs sont impliqués en périphérie dans divers processus physiologiques et semblent y jouer majoritairement un rôle redondant. Qu’en est-il au niveau central ?

1.4.3.2 Rôles au niveau du système nerveux central

Malgré l’existence de quelques études sur le sujet, le rôle des Nurs dans le SNC reste largement inexploré. Cependant, on a pu associer les récepteurs de la sous-famille Nur à quelques fonctions centrales en effectuant une analyse approfondie de leur distribution spatiale et temporelle au niveau cérébral. En effet, ils jouent un rôle déterminant pendant le développement du SNC et contribuent activement aux réponses adaptatives lors de changements dans l’environnement des cellules neuronales ainsi qu’après l’administration de drogues d’abus qui affectent les systèmes de neurotransmission dans le SNC mature (Olson et coll., 1998; Werme et coll., 2000; Ethier et coll., 2004a; Maheux et coll., 2005; Schaffer et coll., 2010; Hawk et Abel, 2011; pour revue : Gofflot et coll., 2006). Enfin, les Nurs semblent tout particulièrement associés à la fonction DAergique dans le cerveau (Maheux et coll., 2005; Gilbert et coll., 2006; Bourhis et coll., 2008; Bourhis et coll., 2009; Novak et coll., 2010; Novak et coll., 2010c; Eells et coll., 2012; pour revue : Lévesque et Rouillard, 2007). En effet, concernant leur distribution dans le SNC, la famille des Nurs et le sous groupe des récepteurs rétinoïdes RXR (leurs partenaires potentiels d’hétérodimérisation) sont étroitement associés à la transmission DAergique (fig. 1.16a). Ainsi du fait de leur expression ciblée dans le système DAergique, les Nurs pourraient être impliqués dans les pathologies associées à une déficience de la DA: addiction, schizophrénie et MP (fig. 1.16b). Il reste cependant à y définir leur fonction exacte et déterminer s’ils y exercent plutôt des rôles redondants, complémentaires ou opposés. On

Figure 1.16: (a) Relation entre l’isoforme RXRγ1 du récepteur rétinoïde RXR, les récepteurs Nurs (NR4A) et la neurotransmission DAergique. La distribution de RXRγ1 est représentée par le marquage bleu sur une section sagittale du cerveau adulte sur une souris RXRγ1 (+/-). Nur77 et Nor-1 sont exprimés dans les régions qui reçoivent des afférences DAergiques, telles que le striatum (Str) et le noyau accumbens (NAc), alors que Nurr1 est exprimé dans les neurones DAergiques de la substance noire et de l’aire tegmentale ventrale (SN-ATV). (b) Voies dopaminergiques et maladies neurologiques et psychiatriques possiblement influencées par l’expression des Nurs. Il est intéressant de souligner les similarités entre la distribution de RXRγ1 et des Nurs dans les voies nigro-striée (associée au contrôle des comportements moteurs et à la maladie de Parkinson), mésolimbique et mésocorticale (impliquées dans les fonctions limbiques et associatives ainsi que dans la schizophrénie et l’addiction aux drogues d’abus). A9 et A10 sont des neurones DAergiques qui ont été identifiés par Dahlström et Fuxe (1964). On retrouve les cellules A9 dans la SN pars compacta (SNc) et les cellules A10 dans l’ATV; c’est pourquoi on se réfère respectivement aux noyaux A9 et A10 pour parler de la SNc et de l’ATV. (c) Induction de Nur77 dans le complexe SN/VTA par des antagonistes des récepteurs D2. Nur77 n’est normalement pas exprimé dans le complexe SN-VTA, mais nous avons récemment montré que son expression pouvait être induite par des antagonistes D2 (Tiré de la revue : Lévesque et Rouillard, 2007).

77 focalisera notre attention, plus particulièrement, sur les récepteurs nucléaires Nor-1 et Nur77 qui sont l’objet de cette thèse et dont la fonction au niveau du système DAergique reste à préciser.

1.4.3.2.1 Nurr1 dans le système nerveux central

L’expression de Nurr1 dans le SNC commence au stade embryonnaire et se maintient à l’âge adulte. Dans les conditions basales, ce récepteur nucléaire est exprimé dans l’hippocampe, l’hypothalamus, le cortex, le bulbe olfactif et de manière très marquée dans les noyaux DAergiques du mésencéphale : la SN et l’ATV (Zetterström et coll., 1996; pour revue : Perlmann et Wallen-Mackenzie, 2004).

En lien avec son expression dans les neurones DAergique au cours du développement embryonnaire, il a été montré que Nurr1 était nécessaire au développement et à la survie des neurones DAergiques du mésencéphale (Zetterstrom et coll., 1997; Saucedo-Cardenas et coll., 1998; Le et coll., 1999b; Wallen et coll., 1999; Kadkhodaei et coll., 2009). En effet, en l’absence de Nurr1, les cellules précurseures des neurones DAergiques mésencéphaliques adoptent une localisation et un phénotype neuronal normaux mais ne peuvent se différencier en neurones DAergiques comme l’atteste la perte d’expression de l’enzyme limitante TH chez les souris Nurr1 déficientes (Zetterström et coll., 1997). Les effets neuroprotecteurs de Nurr1 pendant le développement, s’exerceraient par le biais de la formation d’un hétérodimère avec RXR. En effet, des ligands endogènes de RXR auraient été détectés au niveau du SNC embryonnaire et l’activation, par ces ligands, de l’hétérodimère RXR/Nurr1 favoriserait la survie des cellules DAergiques. En outre, l’effet neuroprotecteur de ce complexe ne serait pas confiné aux seuls neurones DAergiques mésencéphaliques mais s’étendrait à toutes les régions exprimant Nurr1, et en particulier dans le cortex et dans l’hippocampe (Wallen-Mackenzie et coll., 2003).

Il a été montré, en outre, que Nurr1 jouait un rôle central dans la fonction DAergique. En effet, Nurr1 peut activer la transcription des enzymes de biosynthèse de la

DA, telles que la TH et l’AADC dans des lignées cellulaires en culture (Hermanson et coll., 2003; Kim et coll., 2003). De plus, Nurr1 peut moduler l’expression du transporteur de la DA (DAT) et celle du transporteur vésiculaire des monoamines (VMAT) (Sacchetti et coll., 2001; Hermanson et coll., 2003).

D’autre part, Nurr1 peut également exercer un rôle neuroprotecteur dans le SNC mature. En effet, il a été montré que Nurr1 pouvait favoriser la survie des neurones, contribuant ainsi au maintien des neurones DAergiques dans le cerveau adulte (Le et coll., 1999). En accord avec cette théorie, il a été montré que les neurones DAergiques des souris hétérozygotes pour le gène Nurr1 (Nurr1 (+/-)) présentaient une vulnérabilité accrue à un stress neurotoxique (Le et coll., 1999a; Le et coll., 1999b; Eells et coll., 2012). A l’inverse, l’expression de Nurr1 dans la SN augmente en réponse à l’injection d’une neurotoxine dirigée contre les neurones DAergiques (Ojeda et coll., 2003). Ceci suggère que l’induction de Nurr1 interviendrait à titre cytoprotectrice.

Constatant son rôle neuroprotecteur dans les neurones DAergique, de nombreuses études se sont penchées sur l’éventuel rôle d’une déficience de Nurr1 dans l’étiologie des neuropathologies associés à la transmission DAergique telles que la MP, l’addiction à la cocaïne et la schizophrénie (Bannon et coll., 2002; Jankovic et coll., 2005; Chu et coll., 2006; Eells et coll., 2012). En effet, des analyses génétiques récentes effectuées sur des patients atteints de la forme familiale de la MP ont souligné l’importance de Nurr1 dans le maintien des cellules DAergique dans le SNC. En effet, au moins 3 mutations ponctuelles sur le gène de Nurr1 ont été associés à la MP (Le et coll., 1999a; Hering et coll., 2004; Nichols et coll., 2004; Jacobsen et coll., 2008). De plus, il a été démontré que Nurr1 pouvait réguler à la hausse l’expression de VIP (pour Vasoactive intestinal peptide), un puissant neuropeptide anti-inflammatoire et un facteur neurotrophique exprimé dans les noyaux DAergiques qui atténue leur dégénérescence dans un modèle murin de la MP (Delgado et Ganea, 2003; Federoff, 2009). Enfin, chez l’homme, les patients atteints de la MP montrent une diminution des niveaux d’expression de Nurr1 dans les lymphocytes périphériques et dans la SN comparativement à des sujets sains (Chu et coll., 2006; Le et coll., 2008; Zhang et coll., 2011). En ce qui concerne la schizophrénie, des études ont

79 montré que les patients atteints avaient des niveaux d’expression réduits de Nurr1 et les souris Nurr1 (+/-) ont été proposées pour modéliser la maladie (Xing et coll., 2006; Rojas et coll., 2007). Enfin, des études génétiques ont répertorié des polymorphismes et des mutations du gène de Nurr1 associés à la schizophrénie, aux TDAH et à la bipolarité (Chen et coll., 2001; Carmine et coll., 2003; Iwayama-Shigeno et coll., 2003; Feng et coll., 2005; Ancin et coll., 2012). En ce qui a trait à l’implication de Nurr1 dans l’addiction, il a été démontré que les consommateurs réguliers de cocaïne présentaient une diminution marquée des niveaux d’expression de Nurr1 dans les neurones DAergiques, ce qui entraînerait la diminution de l’expression du transporteur DAT sensible à la cocaïne, un de ses gènes cible. Nurr1 serait alors impliqué dans les neuroadaptations qui suivent la prise répétée de cocaïne (Bannon et coll., 2002).

Enfin, il a été également démontré que Nurr1 était exprimé dans l’hippocampe (Xiao et coll., 1996; Zetterstrom et coll., 1996a; Zetterstrom et coll., 1996b; Beaudry et coll., 2000; Akiyama et coll., 2008). Or, l’hippocampe et en particulier la région CA3, lieu d’expression privilégié de Nurr1, sont profondément impliqués dans la mémoire et dans les apprentissages associatifs. Dans ce contexte, il a été démontré que l’expression de Nurr1 augmentait dans les régions CA1 et CA3 de l’hippocampe à la suite d’une tâche d’apprentissage de discrimination spatiale (Pena de Ortiz et coll., 2000). De plus, l’injection d’oligodésoxynucléotides antisens ciblant Nurr1 altère la mémoire spatiale à long terme, révélant une participation de Nurr1 dans les processus cognitifs normaux de la mémoire et en particulier dans les tâches d’apprentissage de discrimination spatiale (Colon- Cesario et coll., 2006). En accord avec ces résultats, les souris Nurr1 (+/-) présentent une altération de la mémoire à long terme (Rojas et coll., 2007). D’autre part, la formation de la mémoire à long terme est régulée par l’activation de protéines kinases comme la MAPK et la PKA qui appartiennent aux voies de signalisation AMPc-dépendante des Nurs (Kovalovsky et coll., 2002; fig. 1.16). En outre, le Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) qui est un facteur neurotrophique intervenant dans la régulation de la mémoire à long terme, a été identifié comme étant une cible de Nurr1 dans l’hippocampe, ce qui vient conforter l’hypothèse d’une implication de Nurr1 dans les processus mnésiques (Volpicelli et coll., 2007; pour revue : Hawk et Abel, 2011). Enfin, l’expression de Nurr1 dans les

régions CA1 et CA3 de l’hippocampe est fortement induite par l’exposition aux psychostimulants (Akiyama et coll., 2008). Ces données suggèrent, dès lors, que Nurr1 pourrait être impliqué dans les apprentissages associatifs induits par l’exposition aux drogues agonistes DAergiques.

1.4.3.2.2 Nur77dans le système nerveux central

L’expression de Nur77 dans les structures cérébrales débute plus tardivement que celle de Nurr1. Elle est retrouvée exclusivement dans les tissus cérébraux matures. En effet, elle est détectée seulement à partir du 14ème jour postnatal chez le rat et on la retrouve principalement dans le bulbe et le tubercule olfactif, le cortex, le striatum, le NAc, l’hippocampe, l’hypothalamus, l’amygdale et le cervelet (Zetterstrom et coll., 1996b; Beaudry et coll., 2000; Werme et coll., 2000). Par conséquent, contrairement à Nurr1, l’expression de Nur77, dans les conditions basales, semble surtout confinée aux structures cibles des neurones DAergiques. En effet, les niveaux d’expression basaux des ARNm de Nur77 (NR4A1) sont extrêmement bas dans la SN et dans l’ATV (Zetterström et coll., 1996b).

Ainsi, de par sa localisation majoritaire dans les structures recevant des afférences DAergiques, Nur77 a été identifié comme l’un des facteurs potentiellement impliqués dans la régulation de l’homéostasie du système DAergique. Dans ce contexte, on a constaté que Nur77 et la transmission DAergique entretenaient une relation de régulation réciproque c’est-à-dire que la modification de l’un entraînait une réaction compensatoire de l’autre. De fait, la délétion de Nur77 ou la modulation de son expression modifient les comportements médiés par la DA, à l’inverse, la modulation pharmacologique de la neurotransmission DAergique perturbe l’expression de Nur77 dans le système DAergique (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2007).

Une indication du rôle physiologique de Nur77 dans la transmission DAergique peut être obtenue par l’étude du phénotype des souris déficientes pour le gène de Nur77. En effet, les souris déficientes pour le gène Nur77 (Nur77 (-/-)) affichent des activités biochimiques et comportementales anormales suggérant que Nur77 pourrait être impliqué

81 dans le contrôle des comportements médiés par la DA. De fait, l’activité biochimique des neurones DAergiques et le « turnover » de la DA sont altérés chez les souris Nur77 (-/-) via la modification de l’expression la TH et de la COMT. Une augmentation de l’activité de la TH ainsi qu’une diminution des niveaux d’expression de l’ARNm et de la protéine de la COMT sont effectivement observées chez les souris Nur77 (-/-) comparées à leurs congénères Nur77 (+/+). D’autre part, ces souris Nur77 (-/-) étaient spontanément hyperactives et plus sensibles à une faible dose d’agoniste DAergique du récepteur D2 (quinpirole) qui agit principalement sur les autorécepteurs présynaptiques (Gilbert et coll., 2006). Cela suggère que l’activité des neurones DAergiques pourrait être altérée chez ces souris car la délétion de Nur77 semble favoriser le développement d’une hypersensibilité du système DAergique. Ainsi, une modification dans l’expression de Nur77 entraîne des compensations par la neurotransmission DAergique qui se manifestent par des modifications dans les comportements médiés par la DA.

À l’inverse, des études menées entre autre dans notre laboratoire, ont montré que l’expression de Nur77 pouvait être modulée par l’administration d’agonistes et d’antagonistes DAergiques. Une administration aigüe d’un agoniste D2 ou D1 diminuera son expression tandis que la combinaison des deux : quinpirole (D2) et SKF82958 (D1) induit une très forte augmentation de son expression dans le striatum (St-Hilaire et coll., 2003). Il en est de même pour une administration aigüe de psychostimulants comme la cocaïne et l’AMPH qui stimulent son expression dans le NAc, le striatum et le cortex préfrontal (Werme et coll., 2000; Gonzalez-Nicolini et McGinty, 2002; Bhardwaj et coll., 2003; St-Hilaire et coll., 2003; St-Hilaire et coll., 2006). Aussi, bien que l’expression de Nur77 soit quasi nulle dans la SN et l’ATV, il est intéressant de souligner que l’administration d’antipsychotiques, notamment le raclopride et l’olanzapine, des antagonistes des récepteurs D2, perturbe l’activité transcriptionnelle des neurones DAergiques et induit l’expression de Nur77 dans le complexe SN/ATV (fig. 1.16c). Ceci suggère, par ailleurs, que son expression dans cette région du cerveau est toniquement réprimée dans les conditions basales (Maheux et coll., 2005; Eells et coll., 2012; Maheux et coll., 2012; pour revue : Lévesque et Rouillard, 2007). En outre, les antagonistes des récepteurs DAergiques D2 comme l’halopéridol (D2) et le raclopride (D2/D3), des antipsychotiques, provoquent une forte induction de Nur77 au niveau du striatum dans les

MSNs exprimant les ENKs (Beaudry et coll., 2000). Au niveau comportemental, l’administration aigüe d’antipsychotiques provoque normalement un symptôme extrapyramidal, la catalepsie, similaire aux symptômes extrapyramidaux observés chez les patients schizophrènes. Or, il est intéressant de constater que chez les souris Nur77 (-/-) cette état cataleptique est diminué, ce qui suggère que l’induction Nur77 aurait un rôle à jouer dans les effets comportementaux des antipsychotiques. Ainsi, hormis les agonistes DAergiques administrés seuls, toutes ces molécules entrainent une induction de Nur77 dans les structures cibles DAergiques.

La modification de son patron d'expression en réponse à l'administration de drogues susceptibles d'altérer à long terme le comportement, telles que les psychostimulants (St- Hilaire et coll., 2003; Bourhis et coll., 2009) et les antipsychotiques (Beaudry et coll., 2000; Maheux et coll., 2005), suggère que Nur77 pourrait jouer un rôle dans les neuroadaptations induites par ces psychotropes. Par conséquent, des études se sont penchées sur l’implication de Nur77 dans les effets à long terme des antipsychotiques, des traitements antiparkinsoniens et des drogues d’abus.

Concernant, les effets des antipsychotiques, une série d'investigations suggère que certains mécanismes neuroadaptatifs résultant de l'administration chronique d'antipsychotiques typiques pourraient s'exprimer par le biais de l’hétérodimère Nur77/RXR (Ethier et coll., 2004a, 2004b; Maheux et coll., 2005; pour revue : Lévesque et Rouillard, 2007). En effet, Nur77, tout comme Nurrl et contrairement à Nor-1, est en mesure de s'hétérodimériser avec RXR (Wallen-Mackenzie et coll., 2003). Or, l’administration aigüe et l’administration chronique d’antipsychotiques induisent une forte augmentation de Nur77 dans le striatum dans les neurones exprimant l’ENK. Cette induction de Nur77 se fait sélectivement dans les neurones striataux exprimant également RXR, ce qui favorise la colocalisation de Nur77 avec RXR (Éthier et coll., 2004a, 2004b). En outre, le traitement répétée avec des antipsychotiques engendre à long terme des mouvements involontaires, appelés dyskinésies tardives, qui se traduisent, chez les modèles murins, par le développement progressif de mouvements involontaires de mâchonnement (Turrone et coll., 2002). Or, suite à un traitement chronique à l’halopéridol, les souris déficientes pour le gène Nur77 présentent une exacerbation de ces mouvements

83 dyskinétiques (Éthier et coll., 2004a, 2004b). De surcroit, le même phénomène est observé chez leurs congénères sauvages suite à l'administration de HX531, un antagoniste de RXR (Éthier et coll., 2004a, 2004b). À l’inverse, l'administration concomitante de DHA, un agoniste de RXR avec le traitement répété à l’halopéridol diminue de manière drastique les dyskinésies chez les souris sauvages mais n’a aucun effet sur celles des Nur77 (-/-). Ainsi, ces données renforcent l’hypothèse d’une intervention de l’hétérodimère Nur77/RXR dans la régulation des effets néfastes induits, à long terme, par les antipsychotiques typiques puisque la présence de Nur77 semble être indispensable pour observer l’action anti- dyskinétique des ligands rétinoïdes.

De plus, Nur77 n’interviendrait pas uniquement dans les effets secondaires induits par les antipsychotiques mais aurait également un rôle à jouer dans l’étiologie même de la schizophrénie. Ainsi, une série d’études a mis en évidence une éventuelle corrélation entre les niveaux d’expression de Nur77 et l’hypoactivité préfrontale et l’hypersensibilité sous- corticale aux psychostimulants qui sont des symptômes communs retrouvés chez les patients schizophrènes (Lipska et coll., 2002; Ujike et coll., 2002). En effet, il a été observé que les niveaux d’expression de Nur77 étaient réduits dans le cortex préfrontal et dans le cortex cingulaire de rats adultes portant une lésion néonatale de l’hippocampe (ou lésion nVH), l'un des modèles animaux reproduisant efficacement les principaux symptômes associés à la schizophrénie (Bhardwaj et coll., 2003). De manière similaire, chez l'humain, des études sur des tissus post-mortem ont montré des diminutions de Nur77 dans le cortex préfrontal des schizophrènes (Xing et coll., 2006). D’autre part, ces animaux lésés nVH présentaient également une sensibilité accrue à l’AMPH, ce qui est en accord avec l’hypersensibilité sous-corticale aux psychostimulants observée chez les schizophrènes. En outre, ces observations sont congruentes avec les données de notre laboratoire qui ont montré que les souris Nur77 (-/-) étaient spontanément hyperactives et avaient une sensibilité accrue à l’administration d’une faible dose d’agonistes DAergiques (Gilbert et coll., 2006). Ainsi, ces observations suggèrent que Nur77 pourrait jouer un rôle dans la manifestation des symptômes associés à la schizophrénie.

D’autres investigations, certaines menées dans notre laboratoire, suggèrent également une association entre Nur77 et la MP (Samadi et coll., 2006; St-Hilaire et coll.,

2006; Novak et coll., 2010). En effet, partant du constat que l’hétérodimère Nur77/RXR était impliqué dans les dyskinésies induites par les antipsychotiques, on a voulu étudier le rôle possible de ces récepteurs, Nur77 et RXR, dans les dyskinésies induites cette fois par le traitement répété à la L-DOPA. Par exemple, une étude sur un modèle murin de la MP a montré que les souris Nur77 (-/-) développaient une sensibilisation comportementale accrue suite à une dénervation DAergique et à l’administration répétée de L-DOPA (St-Hilaire et coll., 2006). De manière intéressante l’administration d’agonistes des récepteurs D1 et D2 ou le traitement chronique à la L-DOPA chez des souris lésées à la toxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) induisent également une augmentation de l’expression de Nur77 mais cette fois sélectivement dans les MSNs contenant de la DYN. De la même manière sur un modèle simien de la MP, lésé à la neurotoxine 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6- tétrahydropyridine (MPTP), on a étudié les effets du DHA sur les dyskinésies induites à la L-DOPA. Et, de manière identique aux résultats obtenus sur les effets des antipsychotiques, l’administration de DHA permettait de réduire la sévérité des dyskinésies induites par la L- DOPA ou de retarder leur apparition (Samadi et coll., 2006). Ainsi, ces données viennent étayer l’hypothèse d’une implication de l’hétérodimère Nur77/RXR dans les dyskinésies induites, à long terme, par l’administration chronique des traitements antiparkinsoniens à la L-DOPA.

Suite à l’exposé des données concernant les effets délétères des antipsychotiques et des antiparkinsoniens, on peut observer que Nur77 est modulé de manière différente dans les neurones striataux ciblés. En effet, on peut observer que la modulation de Nur77 dans les neurones striataux exprimant l’ENK est associée avec l’hypokinésie, la catalepsie et les dyskinésies tardives induites par les antipsychotiques alors que la modulation de Nur77 dans les neurones striataux exprimant la DYN est associée aux dyskinésies et à la sensibilisation comportementale induites par le traitement répétée à la L-DOPA chez les modèles animaux de parkinson (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2007). Or, le fait, d’une part, que la modulation de Nur77 intervient sélectivement dans différentes populations cellulaires, exprimant soit l’ENK, soit la DYN et notre connaissance, d’autre part, du rôle modulateur attribué à ces neuropeptides endogènes dans la transmission DA, font de ces neuropeptides des candidats idéals à étudier comme potentielles cibles de Nur77. Dans ce cadre, il a déjà été démontré que l’augmentation de l’ENK induite

85 normalement par l’halopéridol est réduite chez les souris Nur77 (-/-), ce qui suggère un rôle potentiel de Nur77 dans la régulation de l’expression de l’ENK (Éthier et coll., 2004). Ainsi, il est maintenant important d’étudier les interactions entre Nur77 et ces neuropeptides endogènes afin de déterminer si le rôle de régulateur de l’homéostasie des systèmes DAergiques assuré par Nur77 implique la régulation de l’expression de ces neuropeptides.

En ce qui a trait aux effets à long terme des drogues d’abus, peu d’études ont investigué le rôle potentiel de Nur77 dans le système de la récompense. Toutefois, une étude menée par Werme et coll. (2000) a démontré une implication de Nur77 dans la réponse comportementale aux drogues d’abus. Dans cette étude il était question de comparer les patrons d’expression de Nur77 et de Nor-1 suite à l’administration répétée de drogues d’abus (cocaïne et morphine) sur deux souches de rats : Fischer et Lewis. Or, les rats Lewis sont connus comme étant plus susceptibles de développer une addiction aux drogues d’abus que les rats Fischer (Suzuki et coll., 1988; Kosten et coll., 1994; Horan et coll., 1997; Werme et coll., 1999). De plus, les rats Lewis présentent une sensibilisation comportementale accrue après l’administration de methamphétamine et de cocaïne par rapport aux rats Fischer (Camp et coll., 1994; Kosten et coll., 1994). Partant de ce constat, l’équipe de Werme et coll. (2000) a pu établir une corrélation entre ces réponses comportementales différentes et les patrons d’expression distincts de Nur77 et de Nor-1 dans le système de la récompense. En effet, après l’administration chronique de cocaïne, l’expression de Nur77 augmentait uniquement chez la souche Fischer alors que Nor-1 augmentait uniquement chez la souche Lewis. Comme Nur77 est induit uniquement chez la souche de rat Fischer qui présente une sensibilité moindre à la drogue, ces résultats suggèrent que Nur77 aurait un potentiel rôle protecteur et permettrait de contrer/compenser l’effet des drogues d’abus. Dans le même ordre d’idée, il a été démontré que Nur77 et RXR participaient aux comportements moteurs induits par l’administration répétée d’AMPH à savoir, la sensibilisation comportementale pour des faibles doses et les stéréotypies pour des hautes doses (Bourhis et coll., 2009). Dans cette étude, il a été démontré que l’administration d’un antagoniste RXR, le HX531, inhibait la sensibilisation comportementale chez les souris sauvages mais n’avait aucun effet sur les souris Nur77 (-/- ), montrant ainsi que Nur77 est indispensable à l’observation des effets du ligand RXR. En

outre, suite à l’administration de fortes doses d’AMPH, les souris Nur77 (-/-) ne développaient pas de stéréotypies. Ce qui implique que Nur77 est indispensable à l’observation de cet effet moteur induit par l’administration chronique de fortes doses de psychostimulants. Ainsi, l’ensemble de ces données suggèrent que Nur77 pourrait possiblement atténuer le développement de la sensibilisation comportementale induite par les drogues d’abus. Cette hypothèse est d’ailleurs en accord avec son rôle présumé de régulateur de l’homéostasie des systèmes DAergiques.

Finalement, comme Nurr1 et Nor-1, Nur77 est exprimé dans l’hippocampe (Xiao et coll., 1996; Zetterstrom et coll., 1996b; Beaudry et coll., 2000; Akiyama et coll., 2008). Dans ce contexte, il a été démontré que Nur77 était impliqué dans les processus mnésiques. En effet, Nur77 jouerait un rôle dans la consolidation de la mémoire (von Hertzen et Giese, 2005b). Son expression augmente significativement dans la région CA1 de l’hippocampe à la suite d’une tâche nécessitant l’apprentissage de l’association d’un contexte spatial avec un stimulus aversif (Malkani et Rosen, 2000; Maren, 2008). De manière intéressante, chez la souris déficiente pour le gène de la CAMKII, cette augmentation ne se produit pas et l’apprentissage n’a pas lieu. Or, Nur77 est une cible de phosphorylation de la voie de signalisation de la CAMKII, ce qui implique que l’augmentation de Nur77 nécessite l’activation de cette voie de signalisation (pour revue : Hawk et Abel, 2011). Ces données suggèrent donc que les Nurs et en particulier, Nur77 et Nurr1 (voir la section 1.4.3.2.1), pourraient être impliqués dans les apprentissages associatifs et la mémoire à long terme (fig. 1.17).

En somme, ces observations suggèrent que Nur77 serait impliqué dans la régulation de la transmission DAergique et pourrait jouer un rôle important dans les neuropathologies liées à une déficience de la transmission DAergique. Malgré ces indices, d’importantes questions concernant la relation entre le système DAergique et Nur77 n’ont pas encore trouvé de réponses.

Figure 1.17 : La cascade de signalisation AMPc–PKA CREB, qui est cruciale pour la formation de la mémoire, induit l’expression des gènes codant pour les récepteurs nucléaires Nurs (NR4A), Les protéines Nurs (NR4A) nouvellement traduites subissent une translocation dans le noyau et vont diriger la transcription des gènes cibles des Nurs (NR4A). La signalisation par la MAPK est capable d’activer la transcription médiée par les Nurs ou de réduire son activité par l’exportation nucléaire de ces protéines en fonction du contexte cellulaire. L’exportation nucléaire est contrée par la signalisation dépendante de la PKA. Plusieurs gènes cibles des Nurs (NR4A), incluant le BDNF, c-REL et les tyrosine-phosphatases des récepteurs protéiques (RPTPs, pour receptor protein tyrosine phosphatases), sont connus pour être impliqués dans la formation de la mémoire (Tiré de Hawk et Abel, 2011).

1.4.3.2.3 Nor-1 dans le système nerveux central

De même que Nurr1 et contrairement à Nur77, l’expression de Nor-1 commence dès le stade embryonnaire mais suit un patron d’expression différent (Zetterstrom et coll., 1996b). Chez la souris, Nor-1 est détecté au jour E11.5 du développement embryonnaire. Il est d’abord décelé dans le plancher et le plafond du tube neural. Chez le rat, au jour E16.5, Nor-1 est fortement exprimé dans le cortex cérébral. L’ARNm de Nor-1 est plus précisément confiné à la couche de neurones en différentiation, externe aux cellules neuroépithéliales en prolifération. De façon générale, le messager Nor-1 est détecté dans le néocortex, la moelle épinière, la glande surrénale et l’oreille interne. On le retrouve également, mais en plus faible quantité, dans l’hippocampe, le thalamus, le cervelet et le noyau amygdalien. Au niveau du cerveau mature, par contre, on retrouve une forte colocalisation avec Nur77, puisque Nor-1 est exprimé dans les structures cibles du système DAergique. En effet, Nor-1 est fortement exprimé dans le bulbe olfactif, l’hippocampe, le subiculum, le noyau habenulaire, le noyau amygdalien et le cervelet. Le gène Nor-1 est également transcrit, mais plus faiblement, dans le néocortex, le striatum et le NAc (Zetterström et coll., 1996b; Beaudry et coll., 2000; Werme et coll., 2000). Cependant la fonction de Nor-1 dans ces structures cibles est encore peu claire.

Aussi, de même que Nur77, l’expression de Nor-1 est modulée par l’administration de drogues ciblant le système DAergique : antagonistes ou agonistes des récepteurs D1 et D2. Concernant, les effets des antipsychotiques, l’augmentation de l’expression de Nor1 dans le striatum et le NAc, suite à une administration d’halopéridol chez la souris, suggère un rôle potentiel de ce récepteur nucléaire dans la régulation des gènes responsables de la réponse pharmacologique à cette drogue (Ethier et coll., 2004a, 2004b; Maheux, et coll. 2005).

D’autre part, tout comme Nur77, Nor-1 peut être induit par des agonistes DAergiques et en particulier par l’administration chronique de psychostimulants (Werme et coll., 2000; Maheux et coll., 2005 ; Bourhis et coll., 2008). Dans l’étude, précédemment citée, menée par Werme et coll. sur le rôle potentiel de Nur77 et Nor-1 dans les effets comportementaux des drogues d’abus, il a par exemple été suggéré que ce serait l’augmentation du niveau d’expression de Nor-1 dans le striatum suite à des

89 administrations répétées de psychostimulants qui serait responsable des neuroadaptations menant à une sensibilité accrue à ces drogues (Werme et coll., 2000). En effet, tel que mentionné précédemment, dans cette étude, on comparait deux souches de rats (les Lewis versus les Fischer) pour essayer de déterminer la cause de la plus grande vulnérabilité aux drogues de la souche Lewis (Ortiz et coll., 1995). Les analyses biochimiques réalisées sur les deux souches de rats révélèrent que, suite à l’administration répétée de cocaïne, les rats Lewis présentaient une augmentation des niveaux striataux de Nor-1 qui n’avait pas lieu chez les Fischer. Cette induction de Nor-1 spécifiquement chez les rats ayant une vulnérabilité accrue aux drogues d’abus serait selon les auteurs à l’origine de cette vulnérabilité. Ces données semblent suggérer que l’induction de Nor-1 aurait un effet contraire à celle de Nur77 en favorisant le développement d’une sensibilité accrue du système DAergique alors que Nur77 interviendrait plutôt pour temporiser les effets des psychostimulants.

De surcroît, la contribution de Nor-1 dans certains comportements addictifs a également été démontrée récemment par l’équipe de Novak et coll. (2010a). En effet, ils ont réalisé une étude comparative sur une cohorte de patients schizophrènes fumeurs et non-fumeurs pour déterminer si le polymorphisme des gènes de Nor-1, Nur77 ou Nurr1 pouvait être associé à la consommation de tabac (Novak et coll., 2010b; Novak et coll., 2010c). Leurs résultats montrèrent que seul le polymorphisme du gène Nor-1 était associé à la quantité de tabac fumée et que la présence de certains allèles du gène de Nor-1 prédisposait les fumeurs de la cohorte au tabagisme lourd.

Dans le même ordre d’idée, d’autres données viennent corroborer le rôle potentiel de Nor-1 dans les effets des drogues d’abus. En effet, suite à la consommation chronique de drogues d’abus, il se produit une adaptation du système DAergique : il devient moins sensible, entre les prises de drogues, aux stimuli récompensants naturels. Le seuil hédonique des consommateurs réguliers en est, dès lors, diminué, ce qui induirait un comportement de recherche active de drogues. Or, il a été montré que Nor-1 était induit dans le striatum en réponse à une inhibition du système DAergique par des antagonistes DAergiques (Werme et coll., 2000; Maheux et coll., 2005) et que l’induction de son expression était associée avec le rétablissement d’un comportement de recherche active de

drogues après une période d’abstinence (Koya et coll., 2006; Novak et coll., 2010c). Ceci, suggère donc une implication de Nor-1 dans la réponse comportementale associée aux drogues d’abus.

Malgré ces quelques indices, une étude approfondie du rôle de Nor-1 et de sa fonction au sein du système DAergique semble indispensable afin d’obtenir une meilleure compréhension des mécanismes de neuroadaptations de la neurotransmission DAergique qui sous-tendent les comportements médiés par la prise de drogues d’abus.

En outre, il a été également démontré que Nor-1, tout comme Nur77 et Nurr1, était exprimé dans l’hippocampe (Xiao et coll., 1996; Zetterstrom et coll., 1996b; Beaudry et coll., 2000; Akiyama et coll., 2008). Toutefois, si Nur77 et Nurr1 semblent y jouer un rôle respectivement dans les apprentissages associatifs et la mémoire à long terme, il est important de noter que, malgré son expression dans les mêmes structures, on peine encore à identifier le rôle potentiel que pourrait y jouer Nor-1 dans le cerveau mature. Toutefois, une équipe de chercheurs a montré que Nor-1 aurait un rôle à y jouer pendant le développement embryonnaire (Ponnio et Conneely, 2004). En effet, leurs résultats indiquent que Nor-1 jouerait un rôle critique dans la survie des cellules pyramidales et dans le guidage axonal dans l’hippocampe en développement et que l’agénésie hippocampale observée chez les souris Nor-1 (-/-) pourrait être une cause sous-jacente de leur vulnérabilité à développer des crises épileptiques. Leurs observations approfondies révèlent, en effet, une désorganisation des cellules pyramidales des régions CA1 et CA3 de l’hippocampe chez les souris Nor-1 (- /-). De même, chez ces souris déficientes, la mortalité par apoptose des cellules pyramidales de la portion CA1 serait significativement plus élevée pendant les cinq jours suivant la naissance. Enfin, ils ont observé, chez ces mêmes souris et à partir du 7e jour postnatal, une diminution de la densité des projections des fibres moussues au niveau de la région CA3. Cette perte des fibres moussues ne serait pas attribuable à une perturbation de la différentiation des neurones mais bien à un problème dans la migration des axones. En effet, la proportion des corps cellulaires de neurones moussus dans l’hippocampe ventral, serait identique entre les souris Nor-1(-/-) et (+/+). Enfin, cette perturbation morphologique entraînerait une susceptibilité des souris à des crises convulsives provoquées notamment par l’acide kaïnique, un agoniste des récepteurs du glutamate (Pönniö et Conneely 2004).

Étant donné son rôle dans le guidage axonal pendant le stade embryonnaire et le maintien de sa forte expression au niveau des régions CA1 et CA3 de l’hippocampe à l’âge adulte, le rôle de Nor-1 dans l’hippocampe mature pourrait être intéressant à étudier en particulier dans le contexte de la plasticité synaptique nécessaire aux processus mnésiques.

Enfin, Nor-1, tel que mentionné précédemment, est également exprimé dans l’amygdale (Zetterström et coll., 1996b). Or, cette structure est impliquée dans la régulation des émotions. Dans ce contexte, une étude récente menée par l’équipe de Schaffer et coll. (2010) a démontré que Nor-1 pouvait contribuer à la manifestation de comportements dépressifs dans un modèle animal de la dépression: le rat Wistar-Kyoto (Pare et Redei, 1993; Solberg et coll., 2004; Schaffer et coll., 2010). En effet, ils ont constaté que les niveaux d’expression basaux de Nor-1 dans l’amygdale étaient significativement plus élevés chez les rats Wistar-Kyoto (WKY) comparés aux rats contrôles Sprague-Dawley (SD). Ils ont par conséquent formulé l’hypothèse que ces niveaux accrus de Nor-1 pourraient être liés aux comportements dépressifs manifestés par cette souche de rat. Pour vérifier leur hypothèse, cette équipe a voulu étudier les effets d’un traitement prolongé d’un antidépresseur, le désipramine (DMI) sur l’expression de Nor-1 dans l’amygdale. Ils ont montré que le traitement entrainait une diminution de l’ARNm de Nor-1 chez la souche WKY concomitante avec une diminution de l’immobilité dans le test de nage forcée utilisé pour jauger les comportements dépressifs. Pour confirmer leurs résultats, ils ont administrés de petits ARNs interférents pour inhiber l’expression de Nor-1 et ont constaté, de la même façon, une amélioration du score des rats WKY dans le test de nage forcée et une diminution des niveaux d’expression de Nor-1 dans l’amygdale. Ainsi, un niveau d’expression élevé de Nor-1 dans l’amygdale contribue au phénotype dépressif observé dans le modèle animal de la dépression (chez les rats WKY). À l’inverse, chez leurs rats SD, le traitement répété à la DMI provoquait l’effet inverse, c'est-à-dire une augmentation des niveaux d’expression de Nor-1 dans l’amygdale. De la même manière, chez des individus sains, il a été démontré que Nor-1 pouvait être induit par un choc électro- convulsif, un traitement que l’on sait efficace contre la dépression (Sun et coll., 2007). Ainsi, on constate que l’expression de Nor-1 est modulée suite à des traitements aux effets antidépresseurs connus. De plus, chez des individus sains, les antidépresseurs régulent l’expression de Nor-1 à la hausse tandis que chez des modèles animaux de la dépression,

l’administration d’antidépresseurs régule Nor-1 à la baisse. On peut en déduire que Nor-1 intervient à titre d’agent régulateur de l’humeur : sa diminution chez les modèles animaux de la dépression aurait des effets antidépresseurs tandis que son augmentation favoriserait les comportements dépressifs.

Finalement, toutes ces données suggèrent que Nor-1 est impliqué dans les fonctions DAergiques, mais également dans certaines fonctions cognitives du cerveau adulte. Son rôle reste cependant relativement inexploré au regard de sa potentielle fonction de régulateur de la transmission DAergique.

1.4.3.2.4 Redondance fonctionnelle ou rôles distincts ?

Tel qu’indiqué dans la partie 1.4.3.1.4, l’analyse du rôle des membres de la sous- famille NR4A est perturbée, en périphérie, par leur redondance fonctionnelle (pour revue : Maxwell et Muscat, 2006; Pearen et Muscat, 2010). Cependant, la redondance fonctionnelle de Nur77 et Nor-1 n'a pas été observée jusqu'à présent dans les systèmes DAergiques.

Les rôles respectifs de Nur77 et Nor-1 dans les structures cibles DAergiques ont été peu décrits, mais, le fait que Nur77, et non Nor-1, ait la capacité de former des hétérodimères avec RXR suggère que ces deux récepteurs y exerceraient des rôles distincts (Zetterstrom et coll., 1996a). En effet, dans le contexte des réponses aux antipsychotiques, la contribution de Nur77 dans l’apparition de l’état cataleptique et des dyskinésies tardives, était médiée par l’hétérodimère Nur77/RXR et modulée par les rétinoïdes (Ethier et coll., 2004a, 2004b). Or, ceci exclue la possibilité d’une redondance fonctionnelle par Nor-1, qui est incapable de former un complexe avec RXR. En somme, malgré un patron d’expression comparable de Nur77et Nor-1 dans le cerveau en réponse aux antipsychotiques, des fonctions distinctes seraient exercées par ces deux récepteurs nucléaires en réponse aux antipsychotiques. De la même manière, le rôle de Nur77 dans les dyskinésies induites par les traitements antiparkinsoniens semble s’exercer via l’hétérodimère Nur77/RXR (Samadi et coll., 2006). Le rôle potentiel que pourrait y jouer Nor-1 n’est pas connu, bien que les données précédentes présupposent déjà un rôle distinct.

En ce qui a trait aux effets comportementaux de la prise répétée de psychostimulants, on a vu que l’expression striatale de Nur77 aurait plutôt un rôle modérateur alors que celle de Nor-1 aurait un rôle excitateur sur les comportements induits par ces drogues. Cette tendance à exercer un rôle opposé reste cependant à confirmer. Dans ce contexte également, l’hétérodimère Nur77/RXR a été identifié comme acteur potentiel dans les comportements induits par les psychostimulants (Bourhis et coll., 2009). Ce qui renforce l’hypothèse d’un rôle distinct de Nur77 et Nor-1 dans les structures affectées par la prise répétée de psychostimulants.

Concernant leur implication dans les processus mnésiques hippocampaux, seuls les rôles de Nur77 et Nurr1 ont été définis et semblent distincts (pour revue : Hawk et Abel, 2011). Nurr1 interviendrait dans la mémoire à long terme alors que Nur77 serait impliqué dans la consolidation de la mémoire et dans les apprentissages associatifs. Nor-1, quant à lui, semble être uniquement impliqué dans la plasticité des structures hippocampales pendant le développement embryonnaire (Pönniö et Conneely, 2004). Cependant, sa fonction dans le cerveau mature n’a pas fait l’objet d’études poussées bien qu’il soit exprimé dans les mêmes structures que Nur77 et Nurr1. Elle gagnerait donc à être éclaircie.

D’autre part Nur77 et Nor-1 sont tous deux exprimés dans l’amygdale. Or, seul Nor- 1 a fait, pour le moment, l’objet d’études pour identifier sa fonction dans cette structure (Schaffer et coll., 2010). D’autres études seront donc nécessaires pour déterminer s’il existe une potentielle redondance fonctionnelle de ces deux récepteurs dans cette structure.

En résumé, ces résultats suggèrent que Nor-1 et Nur77 ont des fonctions distinctes dans les effets médiés par la DA. Cela pourrait expliquer pourquoi les activités des récepteurs RXR liées aux Nurs dans le cerveau semblent impliquer de façon sélective Nur77. Il serait donc pertinent d’étudier l’implication de ces deux facteurs de transcription Nur77 et Nor-1 dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants afin de déterminer s’ils y jouent des rôles redondants, complémentaires ou distincts.

1.5 Phénotypes des souris déficientes pour les gènes préproenképhaline, prodynorphine, Nur77 ou Nor-1.

Le phénotype d’animaux génétiquement modifiés résulte d’une interaction de la manipulation génétique avec le bagage génétique et les facteurs environnementaux. Nos souris ENK (-/-), DYN (-/-) et Nur77 (-/-) ont été générées à partir de la souche C57BL/6. Seules les souris Nor-1 (-/-) ont été générées à partir de souches différentes i.e. 129S4/SV. Cependant comme nous allons toujours comparer nos souris (-/-) à leurs congénères (+/+) (en comparant donc des souris de souches identiques), l’influence du bagage génétique de la lignée des souris Nor-1 (-/-) ne sera pas un biais dans l’interprétation de nos données. Il est toutefois intéressant de noter que de nombreuses études ont montré de grandes variations entre les diverses souches de souris dans la plupart des paradigmes comportementaux incluant la nociception, les comportements émotionnels et l’effet des opioïdes et des psychostimulants (Crawley et coll., 1997; Mogil et coll., 1999).

Le phénotype de la souche C57BL/6 a surtout été comparé à celui de la souche DBA/2 : ce sont les 2 souches distinctes les plus communément utilisées pour effectuer des tests comportementaux. Il est intéressant de noter que les souris C57BL/6 ont été identifiées comme l’une des souches les plus sensibles à la douleur parmi 11 autres souches testées (Mogil et coll., 1999). Par contre, les souris C57BL/6 présentent un niveau d’anxiété inférieur dans une arène ouverte (« open field ») comparé à la souche DBA/2 (Griebel et coll., 2000). Enfin, ces deux souches diffèrent également de façon marquée dans leurs réponses à l’administration de psychostimulants. En effet, les souris C57BL/6 s’auto- administrent (consomment volontairement) plus de cocaïne que la souche DBA/2 (Crawley et coll., 1997). Ces diverses observations indiquent que la souche C57BL/6 est idéale pour l’étude des comportements addictifs.

1.5.1 Phénotypes connus des souris Nur77 (-/-) et Nor-1 (-/-)

Les données concernant le phénotype comportementaux et biochimiques des souris Nur77 (-/-) et des souris Nor-1 (-/-) ont surtout été exposées par les études antérieures de notre équipe. Les souris Nur77 (-/-) et Nor-1(-/-) présentent un phénotype d’apparence normal (Lee et colll., 1995 ; Ponnio et coll., 2002). Seule une étude isolée a démontré que la délétion de Nor-1 pouvait avoir un effet létal (De Young et coll., 2003). Nos travaux ne semblent pas confirmer cette hypothèse puisque nos souris Nor-1 (-/-) sont viables (pour revue : Lévesque et Rouillard, 2009). Les seules données que l’on a actuellement sur le phénotype des souris Nor-1 (-/-) au niveau des comportements médiés par la DA sont ceux, contenus dans cette thèse. En outre, des travaux réalisés au sein de notre laboratoire et non encore publiés ont mis en évidence que les souris Nor-1 (-/-) présentaient des niveaux d’anxiété accrus par rapport aux souris sauvages dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer l’anxiété : le labyrinthe en T surélevé (« elevated plus maze » ; Chénard-Poirier et coll., données non publiées).

En ce qui a trait aux souris Nur77 (-/-), elles affichent une augmentation de l’activité locomotrice spontanée ainsi qu’une augmentation de la sensibilité à une faible dose d’agonistes DAergiques D2 (Gilbert et coll., 2006). En outre, elles présentent une altération de l’activité biochimique des neurones DAergiques et une perturbation de la neurotransmission DAergique dans le cortex préfrontal. En effet, ces souris manifestent une exacerbation de la transmission DAergique via une augmentation de l’activité de la tyrosine hydroxylase ainsi qu’une diminution de l’activité de la COMT (Gilbert et coll., 2006). Il est intéressant de noter, dans ce contexte, que les polymorphismes des gènes qui réduisent l’activité de cette enzyme de dégradation de la DA sont corrélés à un risque plus élevé de développer la schizophrénie. Cette observation suggère que Nur77 pourrait jouer un rôle dans la régulation de la voie DAergique mésocorticolimbique et pourrait être impliqué dans la genèse des symptômes psychotiques.

On retiendra donc que le phénotype des souris Nur77 (-/-) reflète une hypersensibilité du système dopaminergique et que celui des souris Nor-1 (-/-) est marqué

par une exacerbation des symptômes d’anxiété. Les travaux présentés dans cette thèse devraient permettre de préciser l’influence de la délétion de ces deux gènes sur les comportements de base médiés par la DA et sur les effets biochimiques et comportementaux des psychostimulants.

1.5.2 Phénotypes connus des souris ENK (-/-) et DYN (-/-)

1.5.2.1 Phénotypes connus des souris ENK (-/-)

Concernant l’effet de la délétion du gène de la préproenképhaline (précurseur de l’ENK), il a été observé que les souris ENK (-/-) étaient généralement en bonne santé, fertiles, et prenaient soin de leur progéniture (Ragnauth et coll., 2001), mais présentaient de comportements significativement anormaux (Bilkei-Gorzo et coll., 2004). Par exemple, des tests comportementaux ont révélé que les souris ENK (-/-) exhibaient des réponses nociceptives supra-spinales accrues ainsi qu’une élévation des niveaux d’anxiété par rapport aux souris ENK (+/+) (Kung et coll., 2010). De plus, les souris ENK (-/-) mâles sont plus agressives que leurs congénères ENK (+/+). Enfin, en absence d’ENK, les souris semblent présenter des réponses exacerbées aux stimuli environnementaux stressants comme l’ « elevated-O-maze » (Konig et coll., 1996 ; Ragnauth et coll., 2001). Ainsi, au niveau comportemental, les souris ENK (-/-) présentent un plus haut niveau d’anxiété, une sensibilité accrue à la douleur et un comportement plus agressif, comparées à leurs congénères ENK (+/+) (pour revue : Kieffer et Gavériaux-Ruff., 2002).

Il a été également observé que les souris ENK (-/-) présentaient un niveau d’activité locomotrice réduit par rapport au ENK (+/+) dans une arène ouverte (« open field ») (Bilkei-Gorzo et coll., 2004). Ces données sont en accord avec une étude précédente qui montrait que la délétion de l’ENK entraînait une diminution de l’activité horizontale dans une arène ouverte mais aucun changement de l’activité verticale (König et coll., 1996). De manière contradictoire, une étude plus récente montre que l’activité locomotrice de base des souris ENK (-/-) ne diffère pas par rapport aux souris sauvages

(Bilkei-Gorzo et coll., 2007). Cette diminution de l’activité horizontale pourrait être, selon certaines études, la conséquence de leur niveau d’anxiété exacerbé (pour revue : Kieffer et Gavériaux-Ruff, 2002). Aussi, comme l’ENK a normalement un effet appétitif et qu’elle module le niveau hédonique de base chez les souris (Skoubis et coll., 2005), on s’attendrait à observer une anhédonie ou des symptômes dépressifs chez les souris ENK (-/-). Or, fait intéressant, une étude a démontré que les effets des antidépresseurs, tels que l’imipramine ou la fluoxetine, étaient les mêmes chez les souris sauvages et chez les souris ENK (-/-) ; et ce, quel que soit le bagage génétique DBA/2 ou C57/BL6. Cette étude montre donc que la délétion de l’ENK n’entraîne pas un phénotype dépressif comme on pourrait s’y attendre (Bilkei-Gorzo et coll., 2007). Toutefois une autre étude, plus récente démontre que les souris ENK (-/-) développent des symptôme dépressifs et anxieux accentués après avoir été exposé à un traumatisme (i.e choc électrique) (Kung et coll., 2010). En outre, une étude a permis de mettre en évidence que les souris ENK (-/-) sont moins aptes à développer une dépendance aux drogues et en particulier à la nicotine. En effet, les effets récompensants ainsi que la dépendance physique induits normalement par la nicotine sont amoindris chez les ENK (-/-) (Berrendero et coll., 2005).

En ce qui a trait aux effets biochimiques et aux éventuelles compensations de la délétion de l’ENK par un changement d’expression des autres peptides opioïdes, une étude montre, qu’au contraire les souris ENK (-/-) ne montrent aucun changement dans l’immuno-réactivité striatale de la DYN ou de l’endorphine (βEND) par rapport à leurs congénères sauvages (König et coll., 1996 ; pour revue : Kieffer et Gavériaux-Ruff, 2002). Cependant, ces souris ENK (-/-) présentent une très forte augmentation de l’expression basale des MOR et DOR (jusqu’à 300 %) au niveau notamment de régions impliquées dans les aspects émotionnels de la fonction des opioïdes. Par exemple, les souris ENK (-/-) affichent une augmentation marquée des MOR dans le noyau central de l’amygdale. En outre, il a été observé une augmentation de l’expression des DOR au niveau des structures limbiques (Clarke et coll., 2003 ; pour revue : Noble et coll., 2008) ainsi qu’au niveau du pallidum ventral (Brady et coll., 1999) ; une des structures cibles des MSNs co-exprimant l’ENK. Toutefois, malgré cette augmentation compensatoire drastique des DOR et MOR, une étude a démontré que les souris ENK (-/-) présentaient une diminution de la libération

de la DA induite par les drogues d’abus dans le NAc et, notamment par la nicotine (Berrendero et coll., 2005 pour revue : Bilkei-Gorzo et coll., 2007). Elles afficheraient, par conséquent, une moindre sensibilité du système DAergique aux drogues d’abus; ce qui a été confirmé par une étude démontrant par exemple que la délétion de l’ENK menait à la réduction de la consommation d’alcool (Blednov et coll., 2006).

Ainsi, ces études semblent indiquer que la délétion de l’ENK perturbe certaines fonctions associées au système dopaminergique mais la réponse des souris ENK (-/-) aux psychostimulants n’a pas encore été explorée.

1.5.2.2 Phénotypes connus des souris DYN (-/-)

Concernant l’effet de la délétion du gène de la prodynorphine (précurseur de la DYN), peu de données sont disponibles pour décrire le phénotype des souris DYN (-/-). Au niveau comportemental, ces souris exhiberaient une activité motrice de base normale et ce, à la fois pour l’activité horizontale et verticale (Zimmer et coll., 2001 ; Chefer et Shippenberg 2006). Dans un autre registre, il a été démontré, qu’à long terme, ces souris développent une sensibilité moindre à la douleur par rapport à leurs congénères sauvages. En effet, une étude réalisée sur la douleur neuropathique persistante montre que les souris DYN (-/-) réagissent de la même manière que les souris sauvages à une douleur aigue mais deviennent insensibles à la douleur chronique (Wang et coll., 2010).

Aussi, l’équipe de Chefer et Shippenberg (2006) a étudié les effets de la délétion de la DYN sur l’activité biochimique constitutive du système DAergique, sur les comportements de base médiés par la DA et sur la réponse comportementale et biochimique induits par une seule injection de cocaïne. Elle mettait en exergue le fait que le phénotype observé chez leurs souris DYN (-/-) (issues d’une lignée C57BL6) n’est pas uniquement dû à la perte de l’expression de la DYN mais reflète aussi des compensations développementales qui ont eu lieu au niveau de l’expression des récepteurs opioïdes. En effet, leurs souris DYN (-/-) montraient une diminution de la libération de DA constitutive au niveau du NAc ainsi qu’une diminution de la réponse comportementale et biochimique

évoquée par une injection de cocaïne. Ces résultats sont contradictoires compte tenu du rôle normalement inhibiteur de la DYN endogène sur les comportements induits par les psychostimulants (Schenk et coll., 2001 ; Gehrke et coll., 2008). Aussi, elle démontre que la délétion constitutive de la DYN s’accompagne d’une régulation fonctionnelle à la hausse des KOR dans le noyau accumbens (Chefer et Shippenberg, 2006); augmentation confirmée par une étude antérieure effectuée sur une autre lignée de souris DYN (-/-) (Clarke et coll., 2003).Cependant, comparativement à ce qu’on observe à la suite de la délétion de l’ENK, la délétion de la DYN n’entraîne pas non plus d’augmentation compensatoire du niveaux d’expression des autres neuropeptides opioïdes, seule une légère diminution de l’activité de la COMT semble avoir été détectée et demande à être vérifiée (Sharifi et coll., 2001).

Enfin, l’étude la plus récente sur le phénotype des souris DYN (-/-) étaient focalisée sur les effets de la délétion de la DYN sur la DA striatale lors du vieillissement normal mais aussi dans la réponse au MPTP (Nguyen et coll., 2009). Pour cela, les niveaux de DA et de ses différents métabolites ont été mesurés à différents stades de développement (à 3, 12 et 20 mois) chez les souris DYN (-/-) versus leurs congénères sauvages. Selon cette étude, la délétion de la DYN favoriserait une augmentation de la concentration de DA striatale qui serait tributaire du stade de développement/de l’âge atteint par la souris. En effet, à 10 et 20 mois, les souris DYN (-/-) présentaient des niveaux de DA striatale significativement accrus par rapport aux souris âgées seulement de 3 mois alors que les souris sauvages conservaient les mêmes niveaux de DA quel que soit leur âge.

Ainsi, ces études apportent déjà un éclairage particulier quant à l’effet de la délétion de la DYN sur le système dopaminergique. Cependant, des études complémentaires restent à être menées pour décrire son influence suite à une exposition répétée aux psychostimulants.

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1.6 Les objectifs de la thèse

L’objectif général de mes travaux de thèse est de déterminer le rôle joué par les facteurs de transcription Nur77 et Nor-1 ainsi que par les neuropeptides endogènes DYN et ENK dans les comportements médiés par la DA et dans les effets biochimiques et comportementaux des psychostimulants. Concernant l’aspect comportemental, nous avons étudié en particulier : l’activité locomotrice de base, la sensibilisation comportementale, et la préférence de place. Une seconde étape consistait à déterminer la nature des éventuelles interactions entre les Nurs et les neuropeptides. Pour établir cet objectif nous sommes partis de deux hypothèses de travail précises que nous avons tenté de vérifier par nos travaux :

1. Nur77 et Nor-1 jouent un rôle distinct dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants et ce via une possible modulation des neuropeptides DYN et ENK.

2. La DYN et l’ENK sont importantes dans la régulation des comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants.

Tel que mentionné précédemment, de nombreuses études démontrent qu’il existe une relation de réciprocité entre les Nurs et la transmission DAergique. Nur77 et Nor-1 sont en effet exprimés dans les structures cibles du système DAergique et notamment dans des structures impliquées dans le contrôle moteur (striatum, NAc) ainsi que dans les apprentissages associatifs (NAc, hippocampe). Ils peuvent être modulés par l’administration d’agonistes et d’antagonistes DAergiques et à l’inverse ils peuvent moduler la transmission DAergique (voir section 1.4.2). Or, si les rôles de Nur77 et Nor-1 sont bien connus et tendent vers la redondance fonctionnelle en périphérie, les rôles respectifs de ces deux facteurs de transcription dans la modulation de la transmission DAergique sont encore peu clairs. C’est pourquoi le premier objectif de cette thèse est consacré à l’étude du rôle précis de ces deux protagonistes dans les comportements médiés par la DA. Étant donné que ces deux récepteurs nucléaires sont des récepteurs orphelins, nous n’avions pas la possibilité d’utiliser des drogues pour stimuler ou bloquer directement ces récepteurs. Nous avons donc eu recours à des psychostimulants, agonistes DAergiques

101 indirects qui sont capables de réguler indirectement l’expression de ces facteurs de transcription. De plus, pour investiguer leurs rôles respectifs, nous avons utilisé des souris transgéniques déficientes pour le gène de Nur77 ou de Nor-1 que nous avons comparé à leurs congénères sauvages. Nous avons étudié ainsi l’effet de la délétion constitutive de Nur77 et Nor-1 sur le comportement locomoteur basal et les comportements induits par l’administration aigüe puis chronique d’AMPH ainsi que sur la préférence de place conditionnée induite par l’administration répétée de cocaïne.

Une seconde étape consistait à analyser les variations dans l’expression de marqueurs spécifiques tels que Nur77, Nor-1, l’ENK, la DYN ainsi que les formes D2high et D2low des récepteurs D2. Ces facteurs sont connus pour interagir avec les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 et/ou la modulation de la transmission DAergique. On analysera leur expression dans les conditions basales et dans les effets aigus et chroniques des psychostimulants.

Partant du constat que la délétion de Nur77 ou de Nor-1 entrainait des modifications dans l’expression des neuropeptides DYN et ENK, notre second objectif était de clarifier les rôles respectifs des neuropeptides endogènes DYN et ENK dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants. Dans ce contexte, nous avions également comme but de mettre en évidence des interactions potentielles entre ces neuropeptides et les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1. Comme nous l’avons exposé dans la partie 1.3, ces deux neuropeptides peuvent être modulés par la DA et inversement ils exercent un rôle de régulation de la transmission DAergique. De plus, ils sont fortement modulés par l’administration de psychostimulants et pourraient jouer un rôle dans les neuroadaptations subséquentes de la transmission DAergique. Or, si le rôle de la DYN a fait l’objet de nombreuses investigations, celui de l’ENK reste encore nébuleux. Afin de mieux cerner leurs fonctions respectives, nous avons donc comparé l’effet de la délétion constitutive de la DYN et de l’ENK sur les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants.

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Par ailleurs, pour déterminer s’il existe de potentielles interactions entre les neuropeptides endogènes et les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1, nous allons également analyser l’effet de la délétion des deux neuropeptides DYN et ENK sur l’expression de ces facteurs de transcription.

Enfin, on comparera l’expression de la DYN et de l’ENK chez les souris déficientes pour les gènes Nur77 ou Nor-1 et leurs congénères sauvages pour mettre en évidence des interactions éventuelles entre ces neuropeptides ou des mécanismes de compensation suite aux délétions génétiques.

Ainsi, mes objectifs de recherche se résument aux deux points suivants :

x Mettre en évidence les rôles respectifs des récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 dans les comportements de base médiés par la DA et induits par les psychostimulants et démontrer leur éventuelle implication dans la régulation des neuropeptides endogènes DYN et ENK ainsi que dans la modulation de l’affinité des récepteurs DAergique D2 (Chapitre 2)

x Mettre en évidence le rôle des neuropeptides endogènes dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants et confirmer l’existence d’interactions entre ces neuropeptides et les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor- 1(Chapitre 3).

Le chapitre 2 de cette thèse consistera à explorer spécifiquement l’effet de la délétion des gènes Nur77 et Nor-1 alors que le chapitre 3 sera consacré à l’étude des effets de la délétion des neuropeptides ENK et DYN.

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Chapitre 2 Distinct roles for the nuclear receptors Nur77 and Nor-1 in dopamine-mediated and psychostimulant- induced behaviors

CHAPITRE 2

Distinct roles for the nuclear receptors Nur77 and Nor-1 in dopamine-mediated and psychostimulant- induced behaviors

Céline Hodler 1, Antoine Hone-Blanchet 1, Joanie Baillargeon 1, Brigitte Paquet 1, Philip Seeman 2, Daniel Lévesque 3 & Claude Rouillard 1.

1 Psychiatry and Neurosciences, Laval University, Quebec, Canada, 2 Department of pharmacology, University of Toronto, Canada, 3 Faculty of pharmacy, University of Montreal, Canada.

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2.1 RÉSUMÉ

Les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 sont principalement exprimés dans les structures cibles du système dopaminergique (DAergique) où ils sont impliqués dans l'adaptation et l'homéostasie de la neurotransmission DAergique. En utilisant des souris knockout (-/-), nous avons étudié et comparé l’influence de ces récepteurs nucléaires/facteurs de transcription dans les comportements induits par la dopamine (DA) et les psychostimulants. Les souris Nur77 (-/-) et Nor-1(-/-) présentent respectivement une exacerbation versus une diminution de l’activité locomotrice de base comparée à celle de leur congénères (+/+). Elles diffèrent quant au niveau d’expression des récepteurs D2 à haute affinité pour la DA. Ces récepteurs sont en effet plus abondants chez les souris Nur77 (-/-) et moins nombreux chez les souris Nor-1 (-/-) comparativement à leurs congénères (+/+) respectifs. Lorsqu'elles sont exposées à de multiples administrations d’amphétamine (AMPH) avec une dose de 5 mg/kg, les souris Nur77 (-/-) affichent une activité ambulatoire journalière croissante contrairement aux Nur77 (+/+) qui, présentent plutôt une sensibilisation des stéréotypies. À une dose plus faible de 2,5 mg/kg, aussi bien les souris Nur77 (+/+) que les (-/-) développent une sensibilisation de l’activité locomotrice. En revanche, les Nor-1(-/-) ne développent pas de sensibilisation de l’activité ambulatoire, elles affichent plutôt une sensibilisation des stéréotypies. Fait intéressant, après une injection unique d’AMPH, l’expression de l’ARNm de la dynorphine (DYN) striatale et accumbale est régulée à la hausse chez les (+/+) et les Nor-1 (-/-) alors qu’elle est régulée à la baisse chez les souris Nur77 (-/-) et ce, sans qu’il y ait de changements dans l’expression de l’enképhaline (ENK). À l’inverse, suite à l’administration répétée d’AMPH, il se produit une augmentation de l’expression de l’enképhaline (ENK) chez les souris Nur77 (-/-) et une diminution de son expression chez les souris Nor-1 (-/-) versus leurs (+/+) respectives. On n’observe aucun changement dans l’expression de la DYN. Toutes les souches de souris ont acquis une préférence de place conditionnée (PPC) pour le compartiment associé à l’administration de cocaïne. Néanmoins, chez les souris Nur77 (-/-), cette préférence de place ne persiste pas au delà de 7 jours de sevrage et revient à son niveau initial après 14 jours contrairement aux autres groupes de souris. Nos résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression de Nur77 dans la région CA1 de l'hippocampe est cruciale

107 pour le maintien de la PPC et la consolidation de la mémoire. Nos travaux démontrent que Nur77 et Nor-1 jouent un rôle distinct et parfois opposé dans l’activité locomotrice de base mais aussi dans le développement et la persistance de la sensibilisation comportementale et de la PPC. Leur implication dans l’homéostasie des systèmes limbiques et DAergiques consiste probablement en une régulation très complexe, de l’affinité des récepteurs D2, de l’expression de la DYN et de l’ENK dans les structures cibles DAergiques ainsi que de la plasticité synaptique dans la région CA1 de l'hippocampe. Dans leur ensemble, nos résultats démontrent que Nur77 et Nor-1 sont de puissants modulateurs de la neurotransmission DAergique.

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2.2 ABSTRACT

Nur77 and Nor-1 nuclear receptors are mainly expressed in target structures of dopamine (DA) systems where they are involved in adaptation and homeostasis of DA neurotransmission. Using knockout (-/-) mice, we investigated the respective roles of these nuclear receptors/transcription factors in DA-mediated and psychostimulants-induced behaviors. In untreated animals, Nur77 (-/-) and Nor-1 (-/-) mice respectively showed an enhanced versus decreased basal activity compared to their (+/+) littermates. This observation is associated with an up-regulated level of high affinity striatal D2 receptors in Nur77 (-/-) mice and a reduced level in Nor-1 (-/-) respectively. When exposed to multiple amphetamine (AMPH) administrations, with a dose of 5 mg/kg treatment, Nur77 (-/-) mice displayed an enhanced response at every time point compared to Nur77 (+/+) which instead developed stereotyped behaviors sensitization. Following a lower dose (2.5 mg/kg), both (+/+) and Nur77 (-/-) mice developed locomotor sensitization. In contrast, Nor-1 (-/-) mice had a lower response to AMPH compared to (+/+) mice and failed to demonstrate behavioral sensitization. Instead, they displayed sensitization of stereotyped behaviors. Interestingly, following acute AMPH, striatal and accumbal (DYN) mRNA is up-regulated in (+/+) and Nor-1 (-/-) whereas it is downregulated in Nur77 (-/-) mice with no changes in enkephalin (ENK) expression. Inversely, ENK mRNA is up-regulated in (+/+) and Nur77 (- /-) mice by AMPH chronic treatment whereas it is down-regulated in Nor-1 (-/-) animals with no changes in DYN. All groups acquired significant cocaine conditioned place preference (CPP). Nevertheless, in Nur77 (-/-) mice it persisted for 7 days but returned to its initial level after 14 days. We subsequently observed that Nur77 increase in the CA1 area of the hippocampus is crucial to CPP retention and memory consolidation. This study demonstrates that Nur77 and Nor-1 play distinct and sometimes opposing roles in basal locomotor activity, development and maintenance of behavioral sensitization and CPP. Their involvement in homeostatic regulation of DAergic and limbic systems probably consists in a complex regulation of D2 receptors affinity state, DYN and ENK expressions in DA target structures as well as involvement in synaptic plasticity in the hippocampus CA1 area. Collectively, these results strongly suggest that Nur77 and Nor-1 are powerful modulators of DA neurotransmission.

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2.3 INTRODUCTION

Until now pharmacological targets used to treat dopamine-related pathologies such as Parkinson’s disease, schizophrenia and addiction are limited to receptors located at the cell surface. Nuclear receptors and particularly the NR4A subfamily (also called Nurs) could constitute a new alternative and become new targets for the treatment of these diseases. This subfamily is closely associated to dopaminergic transmission (for review: Lévesque and Rouillard, 2007, 2009) and is characterized by its capacity to quickly respond to various changes in the extracellular environment (Perlmann and Jansson, 1995; Zetterstrom et al., 1996b). Members of this subfamily are expressed in the central nervous system (CNS) as well as in many peripheral tissues. This broad action spectrum underlines their powerful potential as transcription factors having a determining role to play in various cellular adaptations to environmental changes (Maxwell and Muscat, 2006). In periphery, studies of Nor-1 and Nur77 role revealed that they mainly have redundant functions (Cheng et al., 1997; Martinez-Gonzalez and Badimon, 2005). However, their respective roles in the CNS may be different and still need clarification.

The first indication of their close association to dopaminergic transmission is their brain distribution. Indeed, Nurr1 is mainly expressed in midbrain dopaminergic neurons whereas Nur77 and Nor-1 are expressed in a complementary way in dopaminergic target structures. Members of this nuclear receptors subfamily are recognized for being involved in the adaptation and homeostatic regulation of dopamine (DA) transmission and hedonic system (Levesque and Rouillard, 2007). Nor-1 and Nur77 are also expressed in the DA- innervated structures implicated in motivation, decision and in the regulation of emotion and memory (NAc, striatum, prefrontal cortex, amygdala and hippocampus). The relation between Nurs and DA neurotransmission seems to follow a yin-yang dynamic. Studies from our laboratory showed that various dopaminergic drugs could modulate Nur77 and Nor-1 expression (Maheux et al., 2005) whereas the deletion of Nur77 have profound impact on DA neurotransmission and DA-mediated behaviors (Gilbert et al., 2006; St- Hilaire et al., 2006). Numerous data support a prominent role for Nur77 in DA-mediated

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neuroadaptations (Levesque and Rouillard, 2007) and in psychostimulants-induced behavioral sensitization (Bourhis et al., 2009). We have previously demonstrated that Nur77 exerts many of its effects via specific modulation of striatal neuropeptides; namely the endogenous opioid enkephalin (ENK). Selective expression of the striatal neuropeptides ENK and dynorphin (DYN) characterizing the two basal ganglia output pathways in the NAc and striatum neurons is important in DA systems modulation and in behavioral response to drugs of abuse (Boutrel, 2008). Although the role of Nur77 in various conditions has been investigated (for review: Lévesque and Rouillard, 2007), the precise role of Nor-1 has not yet thoroughly characterized.

Nur77, Nor-1 and Nurr1 are also expressed in DA-innervated structures known to mediate associative learning related to drug-intake cues (Akiyama et al., 2008; Beaudry et al., 2000; Owesson-White et al., 2008; Xiao et al., 1996; Zetterstrom et al., 1996b). The amygdala and hippocampus play a crucial role in drugs-consumption behaviors since they are deeply involved in reward, learning, memory and inhibitory control. It has been recently demonstrated that Nur77 and Nurr1 are implicated in memory process in the hippocampus (Colon-Cesario et al., 2006) and Nur77 is involved in consolidation memory (von Hertzen and Giese, 2005b). Interestingly, it has been shown that lesion of neonatal ventral hippocampus leads to a reduction in Nur77 mRNA in the prefrontal cortex and to an increased response to amphetamine (AMPH) in the NAc and dorsal striatum (Bhardwaj et al., 2003). In addition, preliminary data of our laboratory indicate that Nurr1 expression is strongly modulated in hippocampus by exposure to psychostimulants. Again, the role of Nor-1 has not been investigated yet. We hypothesize that Nur77 and Nor-1 may play a role in cocaine-induced place preference by modulating long-term associative learning mechanisms.

The main objective of our study was to investigate and compare using knockout mice the respective roles of Nur77 and Nor-1 in DA-mediated and psychostimulants- induced behaviors.

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2.4 MATERIALS AND METHODS

2.4.1 Animals

Nur77 knockout (Nur77(-/-)) were developed and graciously provided by Dr Jeff Milbrandt from the University of Washington in St-Louis, Missouri, USA (Lee et al., 1995). These mice are healthy and reproduce normally. They were produced in a mixed background and have been backcrossed in the C57BL/6 strain for at least 10 generations to reduce genetic background heterogeneity. The Nor-1 knockout (Nor-1(-/-)) were provided by Yves Labelle from the St-François d’Assise Hospital in Quebec. They have been backcrossed in the 129S4/SV strain for at least 10 generations to reduce genetic background heterogeneity. We maintain Nur77 (-/-), (+/+) and Nor-1 (-/-), (+/+) mouse colonies at the animal care facility of our research center. Young adult male mice weighing 20-25 g were used for the present experiments. The mice were housed three to four per cage in a temperature-controlled environment (held at a constant temperature of 20qC), on a 12h-light/dark cycle (lights on at 7:00 A.M.) with ad libitum access to food and water. All experiments were performed in accordance to the Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory animals, and all procedures were approved by the Institutional Animal Care Committee of Laval University. Efforts were made to minimize animal suffering and to reduce the number of animals used.

2.4.2 Basal activity and AMPH-induced behaviors

2.4.2.1 Basal locomotor activity

Spontaneous activity in a novel environment was measured in Nur77 (-/-) and Nor-1 (-/-) mice and their wild-type littermates (n=11 per group). Mice were placed in Plexiglas chambers equipped with photoelectric cells (« Flex field system», San Diego Instruments, Inc.) and their movements were recorded during a 90 minutes period for 3 consecutive

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days. We evaluated three components of their spontaneous activity during the exploratory (day 1) and adaptation phases (day 2 to day 3): ambulatory movements (horizontal activity), vertical activity (rearing) and non-ambulatory activity (stereotyped behaviors). We then compared the spontaneous locomotor activity in the mice home cages using a "wheel running system" apparatus (« Wheel running system » Single Activity Wheel Chamber System for mice, Lafayette Instrument Co.) in Nur77 (+/+), Nor-1 (+/+), Nur77 (- /-) and Nor-1 (-/-) mice (n=8 per group). Basal nocturnal locomotor activity was monitored 3 consecutive days during an 18-hours period (from 4 p.m. to 10 a.m.). Computer software (Activity Wheel Monitor Starter and Expander Interface, Lafayette Instrument Co.) recorded the number of wheel turns every 5 min. Data were then expressed in meters.

2.4.2.2 Acute AMPH and chronic AMPH-induced behaviors

In this experiment, mice received a single administration or repeated administrations of either 2.5 or 5 mg/kg of d-amphetamine sulfate (AMPH, i.p.) dissolved in sterile 0.9% NaCl (vehicle) or the vehicle (NaCl 0.9%, i.p.). Before being engaged in one of the two treatment protocols, animals were habituated to the activity chambers fort three consecutive days (2h per session). The following week, adult Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) mice (n=10 per group) or Nur77 (+/+) and Nur77 (-/-) mice (n=8 per group) were taken from their home cage, and immediately put in these activity chambers equipped with photoelectric cells («Flex Field System», San Diego Instruments, Inc.). Animals received their treatment 30 minutes after the beginning of the recording. Three components of their activity in the Flex Field System were then recorded during the 90 minutes that followed the daily vehicle or AMPH treatment: ambulatory activity (horizontal activity), vertical activity (rearing) and non-ambulatory activity (stereotyped behaviors). After each test session (2h), animals were brought back to their home cage.

For the single AMPH injection, all groups of animals were either injected with AMPH or vehicle (n=5 per group) and the previous protocol was performed during one day only. For the repeated administration mice were treated for five consecutive days with AMPH or vehicle (VEH) (sensitization phase: day 1 to 5) and received the same dose of

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AMPH or vehicle after 5 days of drug withdrawal (expression phase: day 11). For each experiment, we had 12 groups of mice, each consisting of either four (5 mg/kg AMPH protocol) or nine mice (2.5 mg/kg AMPH protocol) and formed depending on their genotype and their treatment. Groups of mice were: (a) Nur77(+/+)/VEH-VEH(n=9), Nur77(+/+)/AMPH-VEH(n=9), Nur77(+/+)/AMPH-AMPH(n=9), Nur77(-/-)/VEH-VEH, Nur77(-/-)/AMPH-VEH(n=9) and Nur77(-/-)/AMPH-AMPH(n=9) (b) Nor-1(+/+)/VEH- VEH(n=9), Nor-1(+/+)/AMPH-VEH(n=9), Nor-1(+/+)/AMPH-AMPH(n=9), Nor-1(-/- )/VEH-VEH(n=9), Nor-1(-/-)/AMPH-VEH(n=9) and Nor-1(-/-)/AMPH-AMPH(n=9). The group VEH-VEH served as control group and received 5 days of saline injections, (day 1 to 5) then five days after the last injection the mice received a final 6th saline administration on day 11. The group AMPH-VEH received 5 days of AMPH injections (day 1 to 5), then five days after the last injection they received a final 6th saline administration on day 11. The group AMPH-AMPH received 5 days of AMPH injections (day 1 to 5), then five days after the last injection they received a final 6th AMPH administration on day 11. These groups were used for locomotor evaluation in basal conditions and following saline or AMPH administration. Behavioral analyses of the activity measured in the Flex Field system apparatus were performed as previously described (Bourhis et al., 2009).

Two hours after the AMPH or VEH challenge, animals were killed by decapitation under CO2 anesthesia. Following sacrifice, brains were rapidly removed from the skull and immediately immersed into cold isopentane (-40°C) for a few seconds and stored at –80°C until further processing.

2.4.3 Conditioned place preference

2.4.3.1 Place preference conditioning apparatus

114

compartment had white walls with 1-in-wide diagonal black stripes and a light grey floor. The opposite compartment had black walls with white dots and a dark grey floor. Indeed, the central corridor had transparent walls and a black floor and allowed free movement between the two outer compartments unless barred by two sliding doors, which restricted movement between compartments during conditioning sessions. A video-tracking system, consisting of a camera connected to a computer using the ANY-maze tracking software (Stoeling Co., Woodale, USA), recognized the animal, and tracked its every move in each compartment of the apparatus. This computer device enabled us to record the distance, time and trajectory performed by the animal in each compartment.

2.4.3.2 Behavioral conditioning procedure

On day 1 of the procedure, animals were allowed to explore both sides of the apparatus for 45 minutes, and the time spent on each side was recorded to asses each animal's initial preference. Conditioning occurs on days 2-6 of the procedure. Animals received identical treatments each day: in the morning (from 9 a.m. to 12 a.m.) animals were injected with saline (NaCl 0.9%, i.p.) and then confined to the initially preferred side whereas in the afternoon, they were administered a 15 mg/kg (i.p.) dose of cocaine and were confined in the initially non-preferred side. For our procedure, animals were divided into two groups according to their genotype Nor-1 (-/-) (n=10) and Nor-1 (+/+) (n=10) for the first experiment or Nur77 (-/-) (n=10) and Nur77 (+/+) (n=10) for the second. Animals were placed into the conditioning chamber immediately after the i.p. injection (saline 1mg/kg or cocaine 15 mg/kg) and maintained in it for 30 minutes.

Testing occurred on day 7 during which time mice were allowed to freely explore both compartments in a drug-free state for 45 minutes, and the time spent in each compartment was recorded and used to determine the degree of conditioned place preference (CPP) (the percentage of time spent in the paired compartment compared to the percentage of time spent in the unpaired compartment on test day (Cabib et al., 1996). We also tested CPP persistence one and two weeks after conditioning (on day 14 and 21 respectively) using day 7 testing procedure (Airavaara et al., 2007).

115

2.4.4 In situ hybridizations

Frozen brains were sectioned at 12 μm using a sliding Cryostat (-23°C) in the coronal plane. Cryostat-cut brain sections were collected from the prefrontal cortex to the substantia nigra, mounted on Snowcoat X-traTM slides (Surgipath, Richmond, IL, U.S.A) and stored at -80°C. Specific [35S]UTP-labeled complementary RNA (cRNA) probes were used on cryostat-cut brain sections and preparation of Nur77 (Gervais et al., 1999; Tremblay et al., 1999), DYN, ENK (Levesque et al., 1995; Tremblay et al., 1997) and Nor- 1 (Bourhis et al., 2008, 2009) probes was performed as described previously. The antisense cRNA probe for Nur77 (663 bp, from nucleotide 167 to 830) stems from a 2.4-kb EcoRI fragment of a full-length mouse Nur77 cDNA subcloned into pBluescript SK1 and linearized with BamHI. The single-stranded riboprobe complementary to the RNA of interest was synthesized and labeled using Promega riboprobe kit (Promega, Madison, WI), [35S]UTP (Perkin Elmer Inc., Canada), and the RNA polymerase T3. For the mouse DYN mRNA precursor, a cloned fragment (356 bp, from nucleotide 390 to 747) was introduced into pGEM-4Z plasmid. The DYN cDNA template was linearized with BamHI restriction enzyme, and the antisense probe was synthesized with [35S]UTP and T7 RNA polymerase. The ENK probe (935 bp, from nucleotide 104 to 830) was generated from the linearized rat cDNA contained in pSP64 (antisense) and pSP65 (sense) plasmids (Yoshikawa et al., 1984). The ENK cDNA template was linearized with SacI restriction enzyme, and the antisense probe was synthesized with [35S]UTP and SP6 RNA polymerase. The Nor-1 probes preparation followed the same steps and has been described in details elsewhere (Maheux et al., 2005).

The hybridization technique was performed as previously described (Beaudry et al., 2000; Langlois et al., 2001). All solutions and buffers were prepared with distilled water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC) (Sigma) to inhibit RNase and autoclaved. Briefly, brain sections were fixed in a 20-min paraformaldehyde bath (4% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M borax buffer (pH 9.5)) and then rinsed twice in phosphate buffer (PBS 100 mM) for 5 min. Subsequently, a triethanolamine incubation (TEA 100 mM, pH 8.0) and a 10-min acetylation bath (0.25% acetic anhydride, TEA 100 mM) followed. Slides were finally rinsed in standard saline citrate (SSC) (300 mM NaCl,

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30 mM sodium citrate) and dehydrated in increasing concentrations of ethanol. The 35S- labeled riboprobe was added to a concentration of 2.106 cpm/ml in hybridization mix (Denhart’s solution, dextran sulfate, and 50% deionized formamide) and heated at 65°C for 5 min. Each slide was covered up with 95 μl of the hybridization solution and coverslipped. The hybridization took place overnight at 58°C on a slide warmer. After hybridization, slides were soaked in SSC (600 mM NaCl, 30 mM sodium citrate) for 30 min to remove coverslips and then washed in four subsequent SSC baths. Afterward, slides spent 30 minutes in a 37°C incubation buffer with RNAse A (2 mg/100 ml). A series of SSC baths with dithiothreitol 1% (1 mM) followed, one of which was at 55°C for 30 min. Finally, tissues were dehydrated in ethanol, dried up, and disposed on a Biomax MR film (Kodak). Autoradiograms were developed approximately 48 h later.

2.4.5 D2high States

One striatum from each mouse was homogenized in 1 ml of buffer of 50 mM Tris-

HCl (pH 7.4 at 20◦C),1 mM EDTA, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2; 120 mM NaCl), using a Teflon-glass homogenizer. The homogenate was washed thrice by centrifugation at 10,000 rpm at 4◦C for 10 min and the pellet was resuspended in 15 ml buffer. The dopamine D2 receptors in the mouse striatal tissue were measured with [3H]domperidone (2 nM final concentration; custom synthesized as [phenyl-3- H(N)]domperidone; 41.4 Ci/mmol; made by Moravek Biochemicals and Radiochemicals, Brea, CA). The proportion of D2high receptors in the striata was measured by the competition of dopamine with [3H]domperidone, as described previously (Seeman et al., 2003, 2006 and 2009). Briefly, each incubation tube received, in the following order, 0.5 ml buffer (containing dopamine at various concentrations, and with or without a final concentration of 10 μM S-sulpiride to define nonspecific binding to the dopamine D2 receptors), 0.25 ml [3H]domperidone, and 0.25 ml tissue homogenate. The tubes, containing a total volume of 1 ml, were incubated for 2 hr at room temperature (20◦C), after which the incubates were filtered, using a 12-well cell harvester (Titertek, Skatron, Lier, Norway) and buffer-presoaked glass fiber filter mats (Whatman GF/C). The filter mat was

117 rinsed with buffer for 15 s (7.5-ml buffer). The filters were placed in scintillation polystyrene minivials (7 ml, 16 × 54 mm; Valley Container Inc., Bridgeport, CT), 4 ml of scintillant was added to each (Research Products International Corp., Mount Prospect, IL). After 6 hr they were monitored for tritium in a Beckman LS5000TA scintillation spectrometer at 55% efficiency. The specific binding of [3H]domperidone was defined as total binding minus that in the presence of 10 μM S-sulpiride.The Cheng–Prusoff equation was used to derive the dissociation constant (Ki value) of dopamine from the concentration that inhibited 50% of the high-affinity component (IC50) or 50% of the low-affinity component in the dopamine/[3H]domperidone competition curve. The form of the Cheng– Prusoff equation used was Ki = IC50/(1 + C/Kd), where C was the final concentration of the ligand and Kd was the dissociation constant of [3H]domperidone, as determined directly by independent experiments of saturation binding to the tissue (i.e., Scatchard plot).

2.4.6 Quantification analysis

Levels of radioautographic labeling on films were quantified by computerized densitometry. Digitized brain images were obtained with a CCD camera Model XC-77 (Sony) equipped with a 60mm f/2.8D (Nikon) magnification lens. Images were analyzed on a MacIntosh computer using the Image software (Image 1.61, W. Rasband, NIH). Optical density of the autoradiograms was translated in μCi/g of tissue using 14C radioactivity standards (ARC 146- 14C standards, American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis (PCi/g) et RPA 504-14C standards, Amersham International, UK (KCi/g)). D2 receptors, Nur77, Nor-1, ENK and DYN mRNA labeling were measured in the core (NAc core) and shell (NAc shell) of the NAc and in the dorso-lateral (STDL), dorso-medial (STDM) portions of the striatum for analysis. Nor-1 expression levels induced by chronic AMPH administration were also measured in ventro-medial (STVM) and ventro-lateral (STVL) striatum (see supplemental fig. S2.4). In CPP experiments, Nur77 mRNA labeling after acute and chronic cocaine was also measured in the CA1, CA2 and CA3 regions of the hippocampus. The average level of labeling for each area was calculated from four adjacent brain sections of the same animal. Averages of the signals collected from both brain hemispheres were made. Background intensity was subtracted from every measure.

118

2.4.7 Statistical analysis

Statistical analyses were performed with SigmaPlot 11.0 (Systat Sofware Inc., San Jose, CA, USA). All data were expressed as group mean r SEM. Homogeneity of variances was first determined with Bartlett’s Chi-Square test, and square root or log data transformation was performed to increased homogeneity when necessary. Behavioral data used to compare spontaneous activity and acute AMPH were analyzed using a two-way analysis of variance (ANOVA) on repeated measures followed by a Holm-Sidak’s post hoc test. To compare the effect of repeated AMPH or vehicle treatment in each mouse genotype on the different treatment days we used a three-way ANOVA followed by Holm-Sidak’s post-hoc tests. Statistical analyses on data collected with the CPP paradigm were also performed using a two-way ANOVA on repeated measures and Holm-Sidak’s post-hoc analyses. Statistical analyses of mRNA level variances were performed using three-way ANOVA except for the comparison of D2high receptors proportion in basal conditions where analyses were assessed using a two way ANOVA. When a significant variance analysis was observed, a Tukey’s test or a Holm-Sidak’s was performed as post hoc analysis to determine statistical significance. P values below or equal to 0.05 were considered statistically significant.

2.5 RESULTS

2.5.1 Basal locomotor activity in Nur77 and Nor-1knockout mice:

2.5.1.1 Locomotor activity measured in the home cage

Nur77 (-/-) mice had a significantly higher basal activity as compared to their (+/+) littermates (Fgenotype(1,28)=14.600, p=0.002; Fday(2,28)=9.073, p<0.001 and

Finteraction(2,28)=14.090, p<0.001; two-way ANOVA RM; fig. 2.2A) especially during the first and second testing days but not on the third day (day 1: p<0.001, day 2 : p=0.004, day 3: p= 0.502; Holm-Sidak’s post hoc test; fig. 2.1A).

119

Contrary to Nur77 (-/-) animals, Nor-1 (-/-) mice displayed a significantly lower basal activity as compared to their (+/+) counterparts (Fgenotype(1,24) = 6.204, p=0.028; two- way ANOVA RM). Indeed Nor-1 (-/-) spontaneous locomotor activity is significantly lower than (+/+) at day 1 (p=0.004; Holm-Sidak’s post hoc test) but is similar to (+/+) at day 2 and 3 (day 2: p=0.176 and day 3: p=0.253; Holm-Sidak’s post hoc test; fig. 2.1B).

2.5.1.2 Spontaneous locomotor activity measured in a new environment

In this part of the study, we evaluated three components of spontaneous locomotor activity during the exploratory (day 1) and adaptation phases (day 1 to day 3) of mice using a "Flex Field Apparatus". Measurements included horizontal locomotor activity or ambulatory activity, vertical activity (rearing) and non-ambulatory activity corresponding to repetitive movements that can be assimilated to stereotyped-like behaviors (Miyamoto et al., 2004; Niculescu et al., 2005). Nur77 (-/-) mice displayed a higher spontaneous ambulatory activity compared to Nur77 (+/+) mice (fig. 2.2A), an observation consistent with our previous report (Gilbert et al., 2006; Bourhis et al., 2009). We also observed that, contrary to Nur77 (+/+) mice, the ambulatory activity of Nur77(-/-) does not decrease at day 3 which could mean that this mice maintain a high level of exploratory activity even after 3 days in the same environment. Indeed Nur77 (-/-) mice had significant higher horizontal activity than their (+/+) counterparts (Fgenotype(1,40) = 41.767, p<0.001; two-way ANOVA RM) within the 3 days of recording (Nur77 (-/-) vs. Nur77 (+/+) within day 1, 2 and 3, p<0.001; Holm-Sidak’s post hoc test). However, non-ambulatory and vertical (rearings) activity scores were similar in Nur77 (+/+) and (-/-) mice. These two activity scores decreased across days in both Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice (vertical activity:

Fday(2,40)= 13.603, p<0.001; non-ambulatory activity : Fday(2,40)= 6.715; p=0.003; two- way ANOVA RM; fig. 2.2B-2.2C).

On the contrary, Nor-1 (-/-) mice had decreased horizontal (Fgenotype x day (2,40) =

3.791, p=0.031; two way ANOVA RM) and non-ambulatory activity (Fgenotype x day (2,40) = 6.146, p=0.005; two way ANOVA RM) compared to their (+/+) counterparts especially on day 1 (genotype within day 1 in horizontal activity: p=0.008 and non-ambulatory activity:

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p=0.018; Holm-Sidak's post hoc test; fig. 2.2D-F). This is consistent with our observations in which our two mouse strains displayed a different behavior on the first adaptation day (fig. 2.1D and 1E). In addition, there were no significant change in spontaneous vertical activity in both Nor-1 (-/-) and Nor-1 (+/+) mice during the 3 days. Nevertheless, Nor-1(-/-) mice tend to display lower vertical activity scores than their (+/+) ones on day 1 (fig. 2.2F).

2.5.2 Striatal D2 receptors in Nur77 and Nor-1 knockout mice:

In this part of the study, we investigated the proportion of high affinity D2 receptors in striatum of Nur77 and Nor-1 knockout mice and their wild-type littermates. Our data indicate Nur77 (-/-) mice have a significant higher proportion of striatal high affinity D2 receptors (Nur77 (-/-): 40.7 +/- 4%; Nur77 (+/+): 17.5 +/- 2.7%; fig. 2.3). On the contrary, Nor-1 (-/-) mice had a significant lower proportion of high affinity striatal D2 receptors (12.4 +/- 1.2%) compared to their wild-type littermates (24.3 +/- 0.4%). These difference were not due to the mouse strain since there were no difference between Nor-1 and Nur77 strain within the (+/+) genotype. A two way ANOVA yielded a statistically significant effect of the factor "mouse strain" (Fstrain(1,22)=10.596, p=0.004) and of the interaction between mouse strains and genotype (Fstrain x genotype(1,22)=28.417, p<0.001). Tukey’s post hoc comparisons confirmed a significant difference between (-/-) and (+/+) genotypes within the Nur77 strain (p<0.001), a significant difference between (-/-) and (+/+) genotypes within the Nor-1 strain (p=0.025) and a significant difference between Nor-1 and Nur77 mouse strains within the (-/-) genotype (p<0.001) but no differences between Nor-1 and Nur77 strains within the (+/+) genotype.

2.5.3 Acute AMPH-induced activity in Nur77 and Nor-1 knockout mice:

After acute AMPH, both Nur77 (-/-) and (+/+) mice displayed an increase of horizontal activity when compared to their VEH-treated mice (Ftreatment(1,28)=46.609,

121 p<0.001; two-way ANOVA). Non-ambulatory activity scores were similar in Nur77 (+/+) and (-/-) mice and did not change significantly after acute AMPH (fig. 2.4C). Vertical activity scores (rearings) were similar in Nur77 (+/+) and (-/-) mice following both VEH and AMPH treatment (fig. 2.4E). Indeed acute AMPH induced a significant decrease of vertical activity (Ftreatment(1,28)=17.965, p<0.001; two-way ANOVA) in both Nur77 (-/-) (p=0.018) and Nur77 (+/+) mice (p=0.002).

On the contrary, Nor-1 (-/-) mice horizontal locomotor activity did not increase after

AMPH administration contrary to their (+/+) counterparts (Ftreatment(1,34)=7.814, p=0.08;

Fgenotype x treatment(1,34)=4.581, p=0.04; two-way ANOVA; fig. 2.4B). Indeed, post hoc tests showed a significant difference between genotypes within the treatment AMPH (p=0.027) and a significant effect of the treatment but only in the Nor-1 (+/+) mice (p=0.001). As for the non-ambulatory activity, acute AMPH induced a significant increase of non-ambulatory activity (Ftreatment(1,34)=30.431, p<0.001; two-way ANOVA; fig. 2.4D) in both Nor-1 (-/-) (p=0.008) and Nor-1 (+/+) mice (p<0.001). Interestingly, after AMPH treatment Nor-1 (-/-) mice vertical exploratory activity significantly decreased compared to their VEH-treated counterparts (p=0.036 test), an effect which did not occurred in Nor-1 (+/+) mice as their vertical activity scores remained the same in VEH versus AMPH-treated animals (Fgenotype x treatment(1,34)=7.412, p=0.010; two-way ANOVA; fig. 2.4F).

2.5.4 Effect of acute AMPH administration on ENK and DYN mRNA expression in Nur77 and Nor-1 knockout mice:

2.5.4.1 ENK mRNA expression after acute AMPH administration

VEH-treated Nur77 (-/-) mice had similar higher basal level of ENK mRNA than Nur77 (+/+) mice. However, acute AMPH treatment induced a significant ENK mRNA increase in the dorsal striatum of Nur77 (-/-) mice whereas it had no effect in Nur77 (+/+)

(STDM: Fgenotype x treatment(1,7)=17.923, p=0.004; STDL: Fgenotype x treatment(1,7)=11.595,

122

p=0.011; two-way ANOVA; fig. 2.5A et B). Indeed, post hoc tests confirmed that ENK induction only occurred within Nur77 (-/-) mice in the STDM (p= 0.001) and in the STDL (p=0.004). In addition, Nur77 (-/-) mice had significant higher ENK expression levels than (+/+) mice after the acute AMPH treatment in this region (STDM: p= 0.002; STDL: p=0.013; fig 2.5A).

Interestingly, acute AMPH administration had no effect on ENK mRNA levels in the striatum and accumbens in Nor-1 (-/-) compared to Nor-1 (+/+) mice (fig. 2.5C, N=5 per group).

2.5.4.2 DYN mRNA expression after acute AMPH administration

Following acute AMPH, Nur77 (+/+) mice displayed a significant increase of DYN expression in the dorso-medial striatum (# p=0.039 versus VEH) but no changes of DYN expression in the other tested areas when compared to VEH-treated animals. In addition, DYN levels where significantly higher than in (-/-) mice in the STDM after acute AMPH administration (p=0.002; fig. 2.6A). Indeed, their AMPH-treated (-/-) littermates displayed no response to AMPH when compared to (+/+) mice in the STDM (p=0.002). In fact, DYN expression remains at pre-injection levels and was significantly lower compared to their (+/+) counterparts. Moreover, Nur77 (-/-) mice exhibited decreased levels of DYN versus VEH-treated animals in the NAc shell (p=0.025; fig. 2.6A). Thus, Nur77 (-/-) mice showed an opposite response to acute-AMPH compared to (+/+) mice.

After acute AMPH treatment, Nor-1 (+/+) mice displayed a slight increase of DYN expression in the dorso-medial striatum (p=0.016) but no changes in the NAc (fig. 2.6B). Intriguingly, AMPH-treated Nor-1 (-/-) mice also showed a significant increase of DYN mRNA expression in the NAc core (p=0.03), the STDM (p< 0.001) and the STDL (p=0.041). This increase was greater in Nor-1 (-/-) mice than in their (+/+) counterparts especially in the STDM (p=0.017) and in the STDL (p=0.038).

123

2.5.5 Chronic AMPH-induced activity in Nur77 and Nor-1 knockout mice:

2.5.5.1 Repeated injection of a 5 mg/kg AMPH dose in Nur77 knockout mice

Repeated treatment with an AMPH dose of 5 mg/kg seemed to induce a progressive increase of horizontal ambulatory activity in Nur77 (-/-) mice from the second to the eleventh day of the administration protocol mice whereas (+/+) mice showed no change in their horizontal ambulatory activity (fig. 2.7A and 2.7B). In fact, in AMPH-treated animals, the ambulatory activity of Nur77 (-/-) mice became significantly higher than their (+/+) counterparts from the fourth to the sixth injection (fig. 2.7A and 2.7B). Indeed a three way

ANOVA showed a statistically significant effect of the genotype (Fgenotype(1,120)=27.720, p<0.001), of the treatment (Ftreatment(1,120)=591.561, p<0.001) and of their interaction

(Fgenotype x treatment(1,120)=11.114, p=0.001) and a Holm-Sidak's post hoc test with multiple comparison procedures showed a significant difference between the Nur77 (+/+) and Nur77 (-/-) genotypes within the AMPH treatment (p<0.001). This post-hoc test also confirmed significant differences between the Nur77 (+/+) and Nur77 (-/-) genotypes within injection #4 (p=0.018), within injection #5 (p=0.002) and within injection #6 (p=0.019).

However, non-ambulatory activity scores did not change with repeated AMPH administration in Nur77 (-/-) whereas it progressively increased in Nur77 (+/+) mice (Fig. 2.7C and 2.7D). Indeed a three way ANOVA displayed a significant effect of the factor genotype (p<0.001), treatment (p<0.001) and “genotype X treatment” (p<0.001). A Holm- Sidak's post hoc test showed a significant difference between VEH treatment and AMPH treatment within Nur77 (+/+) mice (p<0.001) but no differences between treatments within Nur77 (-/-) mice (p>0.05). It also showed a significant effect for the factor genotype within the AMPH treatment (p<0.001).

Furthermore, following the AMPH treatment, vertical activity scores (rearings) seemed to evolve similarly in Nur77 (+/+) and (-/-) mice. These scores decreased when compared to the VEH-treated counterparts. However, the differences between VEH and

124

AMPH treatment were only significant in Nur77 (-/-) mice (fig. 2.7E and 2.7F). Indeed repeated AMPH induced a significant decrease of vertical activity in Nur77 (-/-) mice which was confirmed by a three way ANOVA showing a statistically significant difference between the VEH and the AMPH treatment (p<0.001) and a significant effect of the interaction “genotype X treatment” (p=0.002). A Holm-Sidak's post-hoc test revealed a significant effect of the treatment within Nur77 (-/-) mice (p<0.001) but not within Nur77 (+/+) mice (p>0.05).

In order to decipher what is happening following the last AMPH challenge, we analyzed the three components of locomotor activity during the 120 minutes-recording period of the last day (see supplemental fig. S2.1). The last injection of AMPH confirmed that, immediately after the 5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of Nur77 (+/+) mice increased during the first 15 minutes that followed the injection but rapidly dropped to retrieve pre-injection levels. Comparatively, Nur77 (-/-) horizontal activity also increased but did not drop. It stayed at a higher level during the rest of the recording session (p<0.05 (-/-) versus (+/+)). Interestingly, the stereotyped behavior of Nur77 (-/-) showed no change whereas, for the Nur77 (+/+) mice, the stereotyped movements increased 15 minutes after the AMPH injection and stayed statistically different and higher compared to Nur77 (-/-) mice (p<0.05 (-/-) versus (+/+)).

2.5.5.2 Repeated injection of a 2.5 mg/kg AMPH dose in Nur77 knockout mice

Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) exhibited similar ambulatory and vertical activities responses to repeated treatment with an AMPH dose of 2.5 mg/kg (fig. 2.8). Indeed, considering ambulatory activity, both Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice developed a behavioral sensitization following repeated AMPH treatment when compared to VEH- treated animals (Ftreatment x number of injections(5,144)=4.804, p<0.001, three-way ANOVA; treatment within Nur77 (+/+): p<0.001, treatment within Nur77 (-/-): p<0.001, genotype within AMPH: p>0.05, Holm-Sidak’s post hoc test). In fact, following the 6th injection their horizontal activity was significantly higher than following the first injection (p=0.002) and the second injection (p<0.001).

125

For the non-ambulatory scores, AMPH chronic administration have no effects on non ambulatory activity for both Nur77 (-/-) and (+/+) mice. However, Nur77 (+/+) had a higher level of non-ambulatory activity than their (-/-) counterparts (p=0.009). Those differences between (+/+) and (-/-) mice were especially important within injection #1 (p=0.002), within injection #2 (p=0.023) and within injection #6 (p=0.008).

The observation of the 6th AMPH injection confirmed that there are no differences between Nur77 (-/-) and (+/+) mice activity except in non-ambulatory activity where Nur77 (+/+) seemed to develop a higher level of stereotyped movements (see supplemental fig. S2.2). Indeed a two way ANOVA on repeated measures performed on the AMPH-treated animals revealed an effect of the factor “genotype” (p=0.004).

2.5.5.3 Repeated injection of a 2.5 mg/kg AMPH dose in Nor-1 knockout mice

On the contrary, Nor-1 (-/-) mice horizontal locomotor activity did not increase after repeated administrations of a 2.5 mg/kg dose of AMPH when compared to their (+/+) counterparts whose ambulatory activity began to rise after the third injection (fig. 2.9A). Indeed, a two way ANOVA RM performed on the horizontal activity of AMPH-treated mice yielded a statistically significant effect of the factors: “genotype”

(Fgenotype(1,50)=5.004, p=0.049),“number of injections” (Fnumber of injections(5,50)=5.424, p<0.001) and the interaction (Fgenotype X number of injections(5,50)=3.877, p=0.005). A Holm- Sidak's post hoc test with multiple comparison procedures showed a significant difference between genotypes within the injections: #3 (p=0.048), #4 (p= 0.041), #5 (p=0.007) and #6 (p=0.005).

Interestingly, in AMPH treated-animals it is the non-ambulatory activity which progressively increased in Nor-1 (-/-) compared to Nor-1 (+/+) mice (fig. 2.9 C and D). Indeed repeated injections of a 2.5 mg/kg dose of AMPH induced a significant increase of non-ambulatory activity in Nor-1(-/-) especially on day 5 (injection #5: p= 0.012) and day 11 (injection #6: p<0.001) compared to their (+/+) counterparts.

126

Finally, after a repeated AMPH treatment, the vertical activity of both Nor-1 (+/+) mice (p<0.001) and Nor-1 (-/-) mice (p=0.027) slightly increased compared to their VEH- treated counterparts (fig. 2.9 E and F). Indeed a two way ANOVA on repeated measures performed on the AMPH-treated animals also showed no effect of the genotype (p=0.42) but did display significant differences between the number of injections (p=0.026). Thus, both genotypes showed an increase of their vertical activity following AMPH repeated treatment.

The last injection of AMPH confirmed that, immediately after the 2.5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of Nor-1 (+/+) mice increased whereas it stayed at pre- injection levels in Nor-1 (-/-) mice (p<0.05 (-/-) versus (+/+) mice). Interestingly, for the stereotyped movements (i.e. non-ambulatory activity) it is the opposite, Nor-1 (-/-) mice displayed a higher increase of their stereotyped activity compared to the (+/+) (see supplemental fig. S2.3; p<0.05 (-/-) versus (+/+) mice).

2.5.6 Effect of chronic AMPH administration on ENK and DYN mRNAs in Nur77 and Nor-1 knockout mice:

2.5.6.1 ENK mRNA expression after repeated AMPH administration

Following a repeated AMPH pre-treatment (group AMPH-VEH), Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice both showed a significant increase of ENK basal mRNA expression in every tested areas of the NAc and the striatum that is maintained after the last AMPH challenge (group AMPH-AMPH; fig. 2.10A; # p< 0.05 versus VEH-VEH). Indeed a two way ANOVA yielded a statistically significant effect of the factor “treatment” (NAc core and shell: p< 0.001; StDM: p< 0.001; StDL: p< 0.001). Holm-Sidak's post hoc tests performed on every tested areas showed a significant difference between ENK basal expression before AMPH pre-treatment (group VEH-VEH) and after it (group AMPH- VEH) within both Nur77 (-/-) mice (p<0.001) and Nur77 (+/+) mice (p<0.001). Post hoc tests also confirmed that this significant increase in ENK expression was maintained after the last AMPH challenge since there was no differences between the ENK mRNA levels

127 measured after the pre-treatment and after the last AMPH challenge (AMPH-AMPH versus AMPH-VEH: p>0.05 in every tested area).

Interestingly, Nor-1 (-/-) mice tended to display an opposite effect on ENK expression compared to their (+/+) littermates. Indeed, in the NAc shell and the STDM of Nor-1 (-/-) mice, ENK mRNAs levels did not increase after the AMPH pre-treatment (AMPH-VEH) and they decreased significantly after the last AMPH challenge (NAc shell: p<0.001; STDM: p=0.020; Holm-Sidak’s post hoc test). On the contrary, their (+/+) littermates did not display any changes in ENK expression following repeated AMPH in every tested areas (fig. 2.10B). In addition, in the NAc shell, ENK expression, of Nor-1(-/-) mice was significantly lower compared to Nor-1 (+/+) mice within the treatment AMPH- AMPH (NAc shell: p= 0.041 versus (+/+)). This was confirmed by a two way ANOVA that displayed a statistically significant effect of the factor “treatment” in the NAc shell (p=0.009) and STDM (p=0.025) and of the interaction “genotype X treatment” in the NAc shell (Fgenotype x treatment(2,24) =6.624, p=0.005).

2.5.6.2 DYN mRNA expression after repeated AMPH administration

Our results showed that, following repeated AMPH injections, there were no significant changes in DYN mRNA expression in the striatum or the NAc core of neither Nur77 (-/-) nor Nur77 (+/+) mice. However, in the shell of the NAc, Nur77 (-/-) mice displayed higher DYN mRNA levels than their (+/+) littermates regardless of the treatment

(Fgenotype(1,19) =4.400, p=0.050; fig. 2.11A).

On the contrary, after repeated AMPH pre-treatment, Nor-1 (+/+) mice displayed a significant increase of DYN basal expression in the NAc shell whereas DYN mRNA levels decreased in their (-/-) littermates (fig. 2.11B). Indeed, in the NAc shell, statistical analysis showed a significant difference in DYN mRNA expression between the two genotypes

Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) especially within the AMPH-AMPH treatment (Fgenotype(1,19) =4.595, p=0.045, two-way ANOVA; p=0.036, Holm-Sidak’s post hoc test).

128

2.5.7 Effect of chronic AMPH administration on Nor-1 and Nur77 mRNAs in respectively Nur77 and Nor-1 knockout mice:

2.5.7.1 Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration

Our results showed an effect of the treatment on Nor-1 mRNA expression levels in the NAc shell and in the STDM (NAc shell: Ftreatment(2,14) =6.709, p=0.009; STDM:

Ftreatment(2,17) =6.273, p=0.009; two-way ANOVA). In both Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+), AMPH-VEH treated animals displayed higher Nor-1 mRNA levels than VEH-VEH treated animals. Furthermore, following AMPH-AMPH repeated treatment Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice both showed a significant increase of Nor-1 expression in the NAc shell when compared to AMPH-VEH treated animals (p=0.009). Yet, in the STDM we observed decreased levels of Nor-1 in AMPH-AMPH treated animals when compared to the AMPH- VEH treated one (fig. 2.12A; p=0.009 versus AMPH-VEH).

2.5.7.2 Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration

A two way ANOVA comparing AMPH-VEH and AMPH-AMPH treatments showed a significant effect of the factors “treatment” and “genotype X treatment” on Nur77 mRNA expression levels in the StDM (Ftreatment(1,14)=11.396,p=0.006;

FgenotypeXtreatment(1,14)=11.631, p=0.006) and in the StDL (Ftreatment(1,14) =12.604, p=0.005;

FgenotypeXtreatment(1,14)=30.429, p<0,001). Following AMPH-VEH treatment, post-hoc tests revealed significant differences in Nur77 expression in Nor-1 (-/-) compared to Nor-1 (+/+) mice in the STDM (p=0.02) and STDL (p<0,001) (fig. 2.12B). Indeed, Nor-1(-/-) mice displayed higher levels of Nur77mRNA expression compared to (+/+) mice after the AMPH-VEH treatment which certainly contributed to the Nor-1 (-/-) mice’s early development of stereotyped behaviors. Also, there was a significant decreased of Nur77 levels in AMPH-AMPH treated animals when compared to the AMPH-VEH treated ones in the StDM (p<0,001) and the StDL (p<0,001). Interestingly, in the Core of the NAc statistical analysis showed an effect of the interaction “genotype X treatment” (FgenotypeXtreatment(1,14)=10.528, p=0.008). Indeed, in

129

Nor-1 (+/+) mice, we observed an increase of Nur77 expression in the NAc Core of AMPH-AMPH treated animals compared to the AMPH-VEH treated ones (p=0.029). And, Nur77 levels in Nor-1 (+/+) mice were significantly higher than those of Nor-1 (-/-) mice (p=0.023) after this AMPH-AMPH treatment.

2.5.8 Cocaine-induced conditioned place preference in Nur77 and Nor-1 knockout mice:

We also investigated conditioned preference place (CPP) induced by 5-days conditioning treatment with cocaine (15 mg/kg/day) and evaluated its expression and persistence 1, 7 and 14 days after the conditioning session (fig. 2.13). All mouse type develop a preference for the drug-paired side following the conditioning session since we observed an increase of the percentage of time spent in the drug-paired compartment compared to the pre-conditioning test (day 7 versus day 1). Indeed all mice displayed a significant difference in the percentage of time spent on drug-paired side between the pre- test (day 1) and the first post-conditioning test-phase (day 7) as confirmed by Holm-Sidak’s post-hoc test (for all genotypes day 7 was different than day 1, p<0.001).

Interestingly, we could observe a significant difference between Nur77 (-/-) mice and the other mouse types in the CPP persistence after 2 weeks of withdrawal. Indeed CPP acquired in Nur77 (+/+), Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) mice is maintained for at least 14 days after the conditioning treatment whereas cocaine CPP acquired in Nur77 (-/-) mice (day 1) is still present after 7 days (day 14) but returns to its initial level after 14 days (day 21). Indeed a two way ANOVA RM followed by post-hoc tests confirmed a significant difference between Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) within day 21 (p=0.038). Our statistics also endorsed our results showing that the CPP for the drug-paired compartment is maintained at day 21 in the Nor-1(-/-) mice (p=0.004), in the Nor-1 (+/+) mice (p=0.002) and in the Nur77 (+/+) mice (p=0.002) since it remained significantly higher than in the pre-test phase (day 1). In addition, statistics also validated the fact that for Nur77 (-/-) mice, the preference for the drug-associated compartment returns to its initial level. Indeed, there was no difference between the pre-test phase (day 1) and the day 21 (p=0.891).

130

2.5.9 Expression of Nur77 mRNA, after acute or chronic cocaine administration in the hippocampus of wild-type mice:

Interestingly, in the CA1 area of the hippocampus, (+/+) mice displayed a significant increase of Nur77 mRNA levels only after a repeated cocaine injection

(Ftreatment(1,14) =11.140, p=0.005; Fnumber of injections(1,14) =12.820, p=0.003; two way ANOVA; fig. 2.14). Indeed, post hoc tests confirmed a significant difference between one and 5 injections within the cocaine treatment (p=0.003; Holm-Sidak’s post-hoc test) and a significant difference between cocaine and vehicle treatment within 5 injections (p=0.004).

2.6 DISCUSSION

2.6.1 Opposing roles of Nur77 and Nor-1 in basal and spontaneous activity:

Nur77 and Nor-1 are orphan/nuclear receptors/transcription factors mainly expressed in dopaminoreceptive areas where they are involved in adaptation and homeostasis of DA neurotransmission (Zetterstrom et al., 1996a; Beaudry et al., 2000; Werme et al., 2000). Both are constitutively expressed in the striatal and accumbal medium spiny neurons (MSNs) under basal conditions (Werme et al., 2000; for review: Lévesque and Rouillard, 2009). Although the role of Nur77 in various conditions has been thoroughly investigated (for review: Lévesque and Rouillard, 2007), the precise role of Nor-1 has not yet been discovered. Previous work from our laboratory has shown that Nur77 (-/-) mice are spontaneously hyperactive and that Nur77 deletion alters dopamine neurons biochemical activity and dopamine turnover. Indeed, Nur77 deletion was shown to trigger a marked increase of tyrosine hydroxylase (TH) activity and a decrease in catechol-O- methyltransferase (COMT) expression. It clearly demonstrates that Nur77 is involved in the modulation of DA function and in dopamine (DA) mediated behaviors (Gilbert et al., 2006).

131

In addition, we show here that the deletion of Nur77 gene in mice results in enhanced basal locomotor activity which correlates with higher proportion of striatal dopamine D2high receptors. Conversely, mice lacking the Nor-1 gene showed a lower basal activity concomitant with lower proportion of D2high receptors than their (+/+) counterparts. Interestingly, it has been shown that an increased sensitivity to DA and psychostimulant is associated with a marked elevation of D2high receptors proportion (Seeman et al., 2005). Indeed, in Nur77 (-/-) mice, the over-expression of D2high receptors could lead to a greater activation of D2 receptors by DA and results in basal locomotor activity exacerbation. Inversely, in Nor-1 (-/-) which under-express D2high receptors, we would have a decrease D2 receptor activation which results in decreased basal activity.

Our results demonstrate that both Nur77 and Nor-1 are involved in the regulation of DA-mediated behaviors and exert opposite role on the D2 receptor function, possibly via complex regulation of D2 receptors affinity state. The mechanism by which these nuclear receptors could modulate the affinity of D2 receptors is currently unknown. However, we could suggest that Nor-1 and Nur77 exert an opposing regulation role on the genes of proteins responsible for the shift from D2 receptors in low-affinity state to D2 receptors in high-affinity state. Consequently, it could be of interest to further investigate the molecular mechanisms responsible for the switch in D2 receptors affinity induced by Nur77 or Nor-1 deletion.

Functionally, we can hypothesize that the up-regulation of Nur77 will lead to a decrease of the density of D2high receptors with an opposite effect for Nor-1 up-regulation.

2.6.2 Distinct roles of Nur77 and Nor-1 in acute AMPH-induced activity:

Deletion of Nur77 has no effect on the response to acute administration of AMPH whereas Nor-1 (-/-) mice failed to show an increase of ambulatory activity. A decreased sensitivity to AMPH in mice lacking Nor-1 is consistent with their lower striatal level of D2high receptors.

132

Interestingly, in every strain tested, except in Nur77 (-/-) which displayed a marked increase of ENK expression, we did not see any modifications in ENK levels after the acute AMPH administration but rather changes in DYN striatal and accumbal expression. Indeed, acute AMPH induced an increase of DYN in (+/+) mice, an even stronger increase of DYN in Nor-1 (-/-) (especially in Accumbens Core) but no increase in mice lacking Nur77. These biochemical data rather suggest that, in intact animals, acute AMPH administration induces changes selectively in the D1 receptors-expressing direct pathway. Indeed, it has been earlier demonstrated that acute psychostimulants administrations induce an increase of DYN expression with no changes in ENK expression (Jiang et al., 1990; for review: Yano and Steiner, 2007). We could also infer that Nur77 and Nor-1 exert opposing roles on DYN expression; Nur77 seems to promote DYN expression whereas Nor-1 inhibits it. Thus, an explanation of our results could be that an acute AMPH administration produces an increase of Nur77 and a decreased of Nor-1 in D1 containing MSNs. This hypothesis is congruent with studies which have shown that a single injection of cocaine induces a down- regulation of Nor-1 in the Accumbens Core (Werme et al., 2000). It is also consistent with the fact that acute administration of a combination of DA agonists induces Nur77 mRNA levels in DYN-containing cells (St-Hilaire et al., 2003). Moreover, it has been demonstrated that the D1 receptors signaling is implicated in the locomotor response following acute psychostimulants administration whereas D2 receptors signaling is rather implicated in opposing the locomotor activity induced by repeated psychostimulants administrations (Bateup et al., 2010). This would explain why we observe changes in D1 pathway after acute AMPH and changes in D2 pathway only after chronic AMPH administrations.

2.6.3 Distinct roles of Nur77 and Nor-1 in chronic AMPH-induced activity:

Following chronic administration of a 5 mg/kg-AMPH dose, Nur77 (+/+) mice did not show locomotor sensitization but rather displayed increased stereotyped behaviors. In contrast, Nur77 (-/-) mice exhibited exacerbated locomotor sensitization with no increase of

133 stereotyped behaviors. Interestingly with a lower AMPH dose (2.5 mg/kg) both (+/+) and Nur77 (-/-) mice displayed locomotor activity sensitization. Indeed, following chronic injections of a 2.5 mg/kg-AMPH dose, stereotyped behaviors did not increase either in Nur77 (-/-) mice but began to increase in (+/+) mice following the fifth and sixth injection. Thus sensitized stereotyped behaviors tend to occur only in particular conditions when Nur77 is present, when the number of injections is important or/and for stronger AMPH doses. Our results correlate with a study which has shown that extended access to cocaine fails to produce locomotor sensitization (Ben-Shahar et al., 2004) but does produce a sensitized stereotyped behaviors response (Ferrario et al., 2005). This could mean that Nur77 is essential to the development of stereotyped behaviors. We suggest that Nur77 acts as a buffer to counter an over-stimulation of locomotor activity. This could explain why Nur77 (-/-) mice developed behavioral sensitization even at higher AMPH doses whereas (+/+) mice developed stereotyped behaviors sensitization. Interestingly, our protocol of repeated 5 mg/kg-dose AMPH administration was difficult to handle since three of our Nur77 (-/-) mice died during the first experiment probably due to exhaustion after sustained higher levels of locomotor activity. Correspondingly, we could hypothesize that Nur77 (+/+) did not exhibit locomotor activity sensitization because they rapidly develop stereotyped behaviors. Thus, Nur77 could exert a protective role via a buffering mechanism which inhibits a further increase of locomotor activity by inducing stereotyped behaviors.

An explanation of this phenomenon could be that Nur77 induction in the striatum is due to the mechanism of synaptic ‘scaling’ which occurs specifically in D2 receptors expressing MSNs. In reaction to an over-stimulation of the dopaminergic system, an increase of MEF2 occurs, which in turn stimulates Nur77 and Arc expression (Surmeier et al., 2010). Indeed, both Nur77 and Arc are up-regulated by MEF2-dependant signaling following depolarization of striatopallidal MSNs (Tian et al., 2010). It has been demonstrated that Nur77 inhibits postsynaptic dendritic differentiation and synapse formation (Shalizi et al., 2006). Interestingly, manipulation of MEF2 activity or expression influences psychostimulant sensitization (Pulipparacharuvil et al., 2008). It suggests that Nur77 is implicated in synaptic scaling through downregulation of D2 receptors affinity but

134

also down-regulation of corticostriatal synapses by inducing activity-dependent spine loss in striatopallidal MSNs.

Inversely, Nor-1 (-/-) mice did not developed behavioral sensitization after repeated AMPH administration but immediately displayed increased stereotyped behaviors after the first AMPH administration compared to (+/+) mice. This suggests that Nor-1 is necessary for the development of behavioral locomotor sensitization. In situ hybridization performed on our animals provided insights of what could be responsible for these behavioral observations. First biochemical analysis performed on Nor-1(-/-) mice might explain the increased stereotyped behaviors. Indeed, following repeated AMPH treatment, Nur77 expression increases in Nor-1 (-/-) compared to Nor-1 (+/+) mice in the dorsal striatum (fig. 2.12B). This supports our hypothesis that Nur77 is necessary to induce stereotyped behaviors and indicates that the strong Nur77 induction observed in Nor-1 (-/-) mice could be responsible for their early development of stereotyped behaviors. Then, biochemical analysis performed on Nur77 (+/+) and (-/-) mice might provide a better understanding of Nor-1 implication in locomotor sensitization. Indeed, following the AMPH-VEH and AMPH-AMPH treatments, we observed an induction of Nor-1 mRNA expression in Nur77 (+/+) and in Nur77 (-/-) mice in the nucleus accumbens shell and in the dorso-medial striatum (fig. 2.12A). This induction is concomitant with the induction of behavioral sensitization in those mice. It suggests that Nor-1 increase might be involved in locomotor sensitization.

Our data indicate that behavioral sensitization not only involve plasticity in the indirect D2-mediated pathway but also involve the D1 direct pathway. Indeed, Nor-1 induction in Nur77 (+/+) mice, especially in the shell of the NAc and in caudal areas of the dorsal striatum, is correlated with the induction in the very same regions of ENK expression following AMPH-VEH and AMPH-AMPH treatments and of DYN levels especially during the expression phase of behavioral sensitization. Interestingly, Nur77 and Nor-1 seemed to exert opposite effect on DYN expression. Nur77 deletion tends to potentiate the DYN up-regulation induced by chronic AMPH whereas the deletion of Nor-1 results in a decrease of striatal and accumbal DYN expression. As for ENK expression, all

135 mice that displayed behavioral sensitization, i.e. Nur77 (+/+), Nur77 (-/-) and Nor-1 (+/+) mice, displayed an increase of ENK expression during expression phase. Conversely, Nor-1 (-/-) mice, which showed no behavioral sensitization, exhibited a decrease in ENK expression during expression phase. Taken together, this suggests that during the expression phase both DYN and ENK inductions are necessary for behavioral sensitization. Noteworthy, following chronic AMPH, Nor-1 deletion influences both ENK and DYN expression whereas Nur77 deletion can only affect DYN expression.

This is in accordance with our hypothesis that Nor-1 up-regulation could possibly result in an increase of D2 receptors affinity and consequently, in an increase of locomotor activity. A study by Werme et al. (2000) also suggest that, after a chronic psychostimulants administration, it is the increased levels of Nor-1 expression in the striatum which reflect a neuronal adaptation to a sensitized state to addictive drugs. Indeed, in their study they compared two inbred Fischer and Lewis rat strains. The Lewis rats are known to be addiction-prone whereas Fischer rats aren’t. Lewis rats for instance display more sensitized response after repeated administration of methamphetamine and cocaine as compared to Fischer rats (Camp et al., 1994; Kosten et al., 1994; Ortiz et al., 1995). Following repeated cocaine administrations, Nor-1 increase in the striatum of addiction-prone Lewis rats. In contrast, the Fischer rats, less susceptible, displayed an increase of Nur77 striatal levels of but no increase in Nor-1. Hence, the increased levels of Nur77 after chronic cocaine in Fischer, but not in Lewis, rats suggest that increased Nur77 levels could possibly prevent the behavioral sensitization to addictive drugs (Werme et al., 2000). This is further supported by the fact that Nor-1 was shown to respond to inhibition of the DA system (Werme et al., 2000). Furthermore its expression is associated with reinstatement of drug seeking (Koya et al., 2006; Novak et al., 2010c), implicating this gene in the DA response associated with drug of abuse.

These results correlate with our hypothesis that Nor-1 induction exacerbates the locomotor activity and, thus induced locomotor activity sensitization whereas Nur77 attenuates it. To conclude, all these data emphasize the fact that in the context of chronic AMPH treatment, Nor-1 induction could be one of the key factors responsible for the

136

induction of ambulatory activity sensitization. And, they also suggest that Nor-1 exerts this crucial role by potentially eliciting different mechanisms involving both the direct and indirect pathways of the BG: 1) by inducing the switch toward D2high receptors activation; 2) by up-regulating ENK to match a minimal constitutive expression level and 3) by inducing a progressive up-regulation of DYN. Taken together, these data suggest that Nor- 1 plays a critical role in behavioral sensitization acquisition and exacerbation and exerts its effect possibly before the intervention of Nur77 whose induction occurred only to counter over-stimulation of the system. Thus, Nor-1 and Nur77 play an opposite role in the brain contrary to the periphery where they mostly have redundant functions.

Following AMPH-VEH and AMPH-AMPH treatment, we observe an opposite modulation of DYN levels in Nur77 (-/-) and Nor-1 (-/-) mice. DYN is up-regulated in mice lacking Nur77 and down-regulated in mice lacking Nor-1. This strongly suggests that Nur77 and Nor-1 play distinct role in the regulation of this neuropeptide. Noteworthy, we observed a shift in Nur77 and Nor-1 regulation of the DYN compared to what we observed after a single administration of AMPH. Indeed, it seems that in the context of repeated AMPH exposition these two transcriptional factors switch their roles. The mechanism responsible for this reversion in their regulatory or transcriptional activity toward DYN expression is currently unknown. Also, the deletion of Nor-1 blocks the induction of ENK normally witnessed after the AMPH challenge. Considering what occurs following their deletion, we could hypothesize that in intact mice, Nur77 exerts a down-regulation of DYN expression whereas Nor-1 up-regulates both DYN and ENK. This supports our previous observations that Nur77 and Nor-1 might supply distinct function in the mesoaccumbal and nigrostriatal dopamine systems (Lévesque and Rouillard, 2007).

2.6.4 Distinct roles of Nur77 and Nor-1 in conditioned preference place:

Our results seem to indicate that Nur77 increase in the CA1 area of the hippocampus is crucial for retention of the association between contextual cocaine-paired

137 cues and cocaine administration. Indeed CPP acquired in Nur77 (+/+), Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) mice is maintained for at least 14 days after the conditioning treatment whereas cocaine CPP acquired in Nur77 (-/-) mice is still present after 7 days but returns to its initial level after 14 days. Our hypothesis was further confirmed by our biochemical results which showed that chronic cocaine administration elicits an increase of Nur77 expression in the hippocampus CA1 area of wild-type mice, an effect that can’t occur in Nur77 (-/-) mice. The likelihood that Nur77 activation in the hippocampus CA1 area is needed to retain associations between cues and drugs of abuse is suggested by research in other areas of learning and memory. Training in contextual fear conditioning, a hippocampus-specific training context and an aversive foot-shock (Maren, 2008), increases expression of Nur77 in area CA1 of the dorsal hippocampus (Malkani and Rosen, 2000; von Hertzen and Giese, 2005a; von Hertzen and Giese, 2005b). Furthermore, memory stimulation by intrahippocampal injection of inhibitors of the histone deacetylase (HDAC) is followed by enhanced expression of both Nur77 and Nurr1 (Vecsey et al., 2007).

The Nurs subfamily nuclear receptors are involved in the regulation of genes implicated in memory formation (Hawk and Abel, 2011; Hawk et al., 2011). Thus, the expression of different components of the Nfk-B signalling pathway has been shown to increase upon an over-expression of Nurs subfamily receptors (Pei et al., 2006). For example, C-Rel (a member of the Nfk-B family) is a downstream target of the Nurs nuclear receptors and is required for the hippocampus-dependent memory formation (Levenson et al., 2004; Ahn et al., 2008). Furthermore, other targets of Nurr1 and Nur77 were identified as implicated in memory formation: two receptors protein tyrosine phosphatase (RPTPs) implicated in formation of excitatory synapse and the protein kinase C target MARCKS involved in hippocampus-dependant learning and synaptic plasticity (McNamara et al., 2005; Timofeeva et al., 2010) as well as maintaining of dendritic spines morphology (Calabrese and Halpain, 2005).

However, another hypothesis for Nur77 action in the CA1 area could be proposed. Both MEK and PKC activities also participate in the modulation of Nur77 mRNA levels induced by dopamine receptor agonists (Bourhis et al., 2008). Consequently, ERK is a possible candidate for the signaling pathway which could activate Nur77 in the striatum

138

and it could probably play the same role in the hippocampus. Indeed, ERK is implicated in the hippocampus long term potentiation (LTP) (English and Sweatt, 1996; English and Sweatt, 1997), in learning and, in particular, in long term memory storage mechanisms in a fear-conditioning context (Atkins et al., 1998), in spatial memory (Selcher et al., 1999), in behavioral sensitization (Kelly et al., 2003) and in objects recognition (Sharma et al., 2003). Finally, it has been showed that AMPH self-administration leads to increased spine density in the CA1 region of the hippocampus (Crombag et al., 2005).

Thus, we have demonstrated that Nur77 is necessary to observe CPP retention following drug withdrawal. A hypothesis that is consistent with the fact that Nur77 has been shown to be regulated during memory consolidation and that this consolidation- specific regulation occurs in hippocampal area CA1 (von Hertzen and Giese, 2005b). To conclude, our results suggest that Nor-1 and Nur77 play distinct role in CPP, Nur77 is necessary to memory consolidation whereas Nor-1 seems to be not involved in CPP phenomenon.

2.7 CONCLUSION

Taken together, our results demonstrate that the nuclear receptors/transcription factors Nur77 and Nor-1 play crucial and distinct roles in basal locomotor activity, in the development and maintenance of AMPH-induced behavioral sensitization and in cocaine- induced place preference. This is the first demonstration that Nur77 and Nor-1 have distinct and sometimes opposing roles in the regulation of dopamine neurotransmission. Our results also suggest that Nur77 and Nor-1 are involved in the regulation of DA-mediated behaviors via complex regulation of D2 receptors affinity state and neuropeptides gene expression in DA target structures.

139

2.8 FIGURES AND LEGENDS

A. * 15000 Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) * 10000

5000

Distance (m/18hrs -period) 0 Day #1 Day #2 Day #3

15000 Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-)

10000 #

5000

Distance (m/18 hrs -period) 0 Day #1 Day #2 Day #3

Figure 2.1

140

Figure 2.1: Basal locomotor activity measured in Nur77 and Nor-1 knockout mice. A. Basal locomotor activity of Nur77 (-/-) versus wild-type mice: Nur77 (-/-) mice showed a significantly higher basal activity as compared to their wild-type littermates (*p< 0.05, N=8 per group). There is a significant difference in their behavior according to the factor day (p=0.03) and an effect of the interaction factor (genotype by day, p < 0.05). B. Basal locomotor activity of Nor-1 (-/-) versus wild-type mice: Nor-1 (-/-) mice displayed a significantly lower basal activity as compared to their wild-type counterparts (#p< 0.05, N=8 per group). There is a significant difference in their behavior according to the factor day (p=0.03). Nor-1 (-/-) spontaneous locomotor activity is significantly lower than Nor-1 (+/+) at day# 1 but is similar to Nor-1 (+/+) at day #2 and #3.

141

A. B. Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nor-1(+/+) Nor-1(-/-)

12000 * * * 12000

9000 9000

6000 6000

3000 3000 * Horizontal activity activity Horizontal Horizontal activity Horizontal activity

0 0 Day #1 Day #2 Day #3 Day #1 Day #2 Day #3 C. D.

1500 1500 # 1000 1000 *

500 500 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

0 0 Day #1 Day #2 Day #3 Day #1 Day #2 Day #3

E. F.

1000 1000

750 750 #

500 500 * Vertical activity 250 activity Vertical 250

0 0 Day #1 Day #2 Day #3 Day #1 Day #2 Day #3

Figure 2.2

142

Figure 2.2: Comparison of "flex field" spontaneous activities and adaptation in Nur77 knockout mice versus Nor-1 knockout mice. Wild-type (+/+) and Nur77-deficient (-/-) mice were placed individually in the Flex-Field apparatus, and their locomotor activity was recorded for a 1h30- period. We evaluated ambulatory activity (A and B) or horizontal locomotor activity, non- ambulatory activity (C and D), and vertical activity (rearings; E and F). These results indicate that Nur77 (-/-) and Nor1 (-/-) have a different behavior than their (+/+) littermates toward environmental novelty. Indeed on day #1, Nur77 (-/-) are more active than their (+/+) littermates whereas Nor1 (-/-) are less active. They also showed that Nur77 (-/-) mice have significantly higher basal horizontal activity than their (+/+) counterparts within the 3 days of recording. Histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period (# p<0.05 day #3 versus day #1, * p<0.05 (-/-) versus (+/+) mice, N=11 per group).

143

50 *** *

0 High affinity D2 receptors (%) D2 receptors affinity High (+/+) (-/-) (+/+) (-/-) Nur77 Nor-1

Figure 2.3

144

Figure 2.3: Proportion of striatal high affinity D2 receptors expression in Nur77 and Nor-1 knockout mice. Nur77 (-/-) mice (N=9) have a significant higher proportion of striatal high affinity D2 receptors compared to their wild-type littermates (N=6) (***p< 0.001 versus (+/+)). On the contrary, Nor-1 (-/-) mice have a significant lower proportion of high affinity D2 receptors in the striatum compared to their (+/+) counterparts (*p< 0.05 versus (+/+), N=5 per group). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

145

A. B.

30000 10000

# # 7500 20000 # 5000 10000 2500 * Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity 0 0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-)

C. D.

1400 1400 # # 1050 1050

700 700

350 350

Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory 0 0 VEH AMPH VEH AMPH activity Non-ambulatory VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-)

E. F.

800 800

600 600

# 400 # 400

200 200 Vertical activity * Vertical activity # 0 0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-)

Figure 2.4

146

Figure 2.4: Comparison of activities after acute AMPH administration (2.5 mg/kg) in Nur77 and Nor-1 knockout mice. Wild-type (+/+) and Nur77-deficient (-/-) mice were placed individually in the Flex-Field apparatus, and their locomotor activity was recorded during the 1h30-period that followed the AMPH injection. We evaluated ambulatory activity (A and B) or horizontal locomotor activity, non-ambulatory activity (C and D), and vertical activity (rearings; E and F). Histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective locomotor activity scores average for the 1h30 period that directly followed the injection (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=8 per group for Nur77 (-/-) vs.Nur77 (+/+) mice, N=9 per VEH group and N=10 per AMPH group for Nor-1 (-/-) vs. Nor-1 (+/+) mice ; # p<0.05 AMPH vs. VEH). These results indicate that Nur77 (-/-) and (+/+) mice both show an increase of ambulatory activity after the AMPH injection. However, directly following AMPH administration, Nur77 (-/-) mice mean ambulatory activity is greater than their (+/+) littermates. Furthermore, Nur77 (-/-) and (+/+) mice do not show an increased of non-ambulatory activity compared to what we observed in Nor-1 (-/-) and (+/+) mice. In response to AMPH injection, Nor-1 (-/-) mice failed to show an increase of their mean ambulatory activity as compared to their (+/+) littermates. Nor-1 (-/-) mice also display a lower level of vertical activity than their (+/+) counterparts when exposed to vehicle and show a decrease of vertical activity compared to (+/+) mice following AMPH treatment.

147

A. Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) VEH AMPH VEH AMPH

Striatum

B. Accumbens Core Accumbens Shell

4 4

3 3 Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g

μ 2

2 μ

1 1

0 0 ENK mRNA ENK mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH ENK mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nur77 (+/+) Nur77 (-/-)

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 0,8 * 0,8 * # # 0,6 0,6 Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ 0,4 μ 0,4

0,2 0,2

0,0 ENK mRNA ENK mRNA ( ENK mRNA ENK mRNA ( 0,0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nur77 (+/+) Nur77 (-/-)

C. Striatum Striatum Accumbens Core Accumbens Shell dorso-medial dorso-lateral 0,8 0,8 0,8 0,8

0,6 0,6 0,6 0,6 Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ μ 0,4 0,4 μ 0,4 μ 0,4

0,2 0,2 0,2 0,2

0,0 0,0 0,0 0,0 ENK mRNA ENK mRNA ( ENK mRNA ENK mRNA ( ENK mRNA ENK mRNA ( AMPH AMPH AMPH ENK mRNA ( AMPH Nor-1 Nor-1 Nor-1 Nor-1 Nor-1 Nor-1 Nor-1 Nor-1 (+/+) (-/-) (+/+) (-/-) (+/+) (-/-) (+/+) (-/-)

Figure 2.5

148

Figure 2.5: ENK mRNA expression after acute AMPH administration in Nur77 knockout mice and in Nor-1 knockout mice. A. Example of ENK mRNA in situ hybridization staining after both VEH or AMPH treatment on brain sections of Nur77 (+/+) and Nur77 (-/-) mice. B. ENK mRNA expression in Nur77 knockout mice: Nur77 (-/-) mice (N=5) showed a significant increase of ENK expression in the striatum dorsal (# p< 0.05 versus VEH) but no changes of ENK expression in the nucleus accumbens. On the contrary, their (+/+) littermates (N=5) did not display any changes in ENK expression following acute AMPH in every tested areas when compared to VEH-treated animals. C. ENK mRNA expression in Nor-1 knockout mice: Nor-1 (-/-) mice showed no significant difference in ENK expression following acute AMPH when compared to their (+/+) counterparts (N=5 per group). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

149

A. Accumbens Core Accumbens Shell 0,6 0,6

0,4 0,4 # ci/g of of ci/g tissue) ci/g of of ci/g tissue) μ μ * 0,2 0,2

0 DYN mRNA ( 0 DYN mRNA DYN mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nur77 (+/+) Nur77 (-/-)

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 0,3 0,3 #

0,2 0,2 ci/g of of ci/g tissue) ci/g of of ci/g tissue) μ μ

0,1 * 0,1 DYN mRNA DYN mRNA (

DYN mRNA DYN mRNA ( 0 0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) B. Accumbens Core Acumbens Shell 0,6 0,6

0,4 0,4 ci/g of tissue) ci/g of tissue) ci/g of of ci/g tissue) μ μ # 0,2 0,2

DYN mRNA mRNA DYN ( 0,0

DYN mRNA DYN mRNA ( 0,0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-)

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 0,3 0,3 * # 0,2 0,2 ci/g of of ci/g tissue) ci/g of tissue)

# μ * μ # 0,1 0,1

0,0 DYN mRNA ( 0,0 DYN mRNA DYN mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nor-1(+/+) Nor-1(-/-) Nor-1(+/+) Nor-1(-/-)

Figure 2.6

150

Figure 2.6: DYN mRNA expression after acute AMPH administration in A: Nur77 knockout mice and in B: Nor-1 knockout mice. A. Nur77 (+/+) mice (N=5) showed a significant increase of DYN expression in the dorso-medial striatum following acute AMPH (# p< 0.05 versus VEH) but no changes of DYN expression in the nucleus accumbens (NAc). On the contrary, their (-/-) littermates (N=5) showed significant decrease in DYN expression following acute AMPH in the NAc shell compared to VEH-treated animals (# p< 0.05 versus VEH). Following acute AMPH, DYN levels remain at pre-injection levels and were significantly lower in the dorso-medial striatum compared to their (+/+) littermates (* p< 0.05 versus (+/+)). So Nur77 (-/-) mice displayed an opposite response to acute-AMPH compared to (+/+) mice. B. Following acute AMPH treatment, Nor-1 (+/+) mice showed an increase of DYN expression in the dorso-medial striatum but no change in the NAc core or in the striatum dorso- lateral. Interestingly, Nor-1 (-/-) mice also displayed significant increase of DYN expression following acute AMPH in the NAc core and in the dorsal striatum (in both dorso-medial and dorso- lateral areas; # p< 0.05 versus VEH) and higher levels of DYN expression after acute AMPH in the dorsal striatum when compared to their (+/+) counterparts (N=5 per group; * p< 0.05 versus (+/+)). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

151

A. B. Sensitization phase Expression phase Nur77 (+/+) - AMPH (5mg/kg) Inj #6 Nur77 (+/+) - VEH Nur77 (-/-) - AMPH (5mg/kg) 50000 * 50000 Nur77 (-/-) - VEH # *# 40000 # *# 40000 # # 30000 # 30000 # # # 20000 # 20000 # Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity 10000 10000

0 0 VEH AMPH VEH AMPH Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 (5mg/kg) (5mg/kg) Nur77 (+/+) Nur77(-/-) C. D. Sensitization phase Expression phase * Inj #6 3000 # 3000 *# *# *# # 2000 *# 2000 * 1000 1000 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

0 0 Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 VEH AMPH VEH AMPH (5mg/kg) (5mg/kg) Nur77 (+/+) Nur77(-/-)

E. F. Sensitization phase Expression phase Inj#6 800 800

600 600

400 400 Vertical activity activity Vertical Vertical activity activity Vertical 200 200 #

0 0 VEH AMPH Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 VEH AMPH (5mg/kg) (5mg/kg)

Nur77 (+/+) Nur77(-/-)

Figure 2.7

152

Figure 2.7: Chronic AMPH (5 mg/kg/day) administration-induced activities in Nur77 knockout mice. Graphs and histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period that followed each injection (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=4 per group for Nur77 (- /-) vs.Nur77 (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH). A. and B. Ambulatory activity - sensitization and expression phase: Nur77 (-/-) mice displayed a behavioral sensitization whereas Nur77 (+/+) mice did not. Moreover, in AMPH-treated animals, the ambulatory activity of Nur77 (-/-) mice became significantly higher than their (+/+) counterparts from the fourth to the sixth injection. C. and D. Non-ambulatory activity - sensitization and expression phase: Non-ambulatory activity scores did not change in Nur77 (-/-) with repeated AMPH administration whereas it progressively increased in Nur77 (+/+) mice. E. and F. Vertical activity - sensitization and expression phase: Vertical activity scores (rearings) had a tendency to evolve similarly in Nur77 (+/+) and (-/-) mice. These scores decreased when compared to the VEH-treated animals. However, the differences between VEH and AMPH treatment were only significant in Nur77 (-/-) mice.

153

A. B. Sensitization phase Expression phase Inj #6 Nur77 (+/+)-VEH Nur77(-/-)-VEH Nur77(+/+)-AMPH 2.5 mg/kg Nur77(-/-)-AMPH 2.5 mg/kg # 30000 30000 # # # #

20000 # 20000 # # # 10000 10000 Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity

0 0 VEH AMPH VEH AMPH Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 (2.5mg/kg) (2.5mg/kg) Nur77 (+/+) Nur77(-/-) C. D. Sensitization phase Expression phase Inj #6 2400 2400

1800 1800 # 1200 1200 *

600 * * 600 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

0 0 VEH AMPH VEH AMPH Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 (2.5mg/kg) (2.5mg/kg) Nur77 (+/+) Nur77(-/-) E. F. Sensitization phase Expression phase Inj #6 1000 1000

800 800

600 600

400 400 Vertical activity Vertical activity 200 200

0 0 VEH AMPH VEH AMPH Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 (2.5 mg/kg) (2.5mg/kg) Nur77 (+/+) Nur77(-/-)

Figure 2.8

154

Figure 2.8: Chronic AMPH (2.5 mg/kg/day) administration-induced activities in Nur77 knockout mice. Wild-type (+/+) and Nur77-deficient (-/-) mice were placed individually in the Flex-Field apparatus, and their locomotor activity was recorded for 5 consecutive days during the 1h30-period that followed each AMPH injection and also during the 1h30-period that followed AMPH administration on the protocol last day after the 5 days of withdrawal. We evaluated horizontal activity (A and B), non-ambulatory activity (C and D), and vertical activity (E and F). Repeated treatment with an AMPH dose of 2.5 mg/kg induced no differences in the ambulatory and vertical activities of Nur77 (-/-) versus Nur77 (+/+). Indeed, considering ambulatory activity, Nur77 (-/-) mice and Nur77 (+/+) mice both developed a behavioral sensitization following repeated AMPH treatment when compared to VEH-treated animals (treatment within Nur77 (+/+): p<0.001; treatment within Nur77 (-/-): p<0.001, genotype within AMPH: p>0.05). For the non-ambulatory scores, there were no changes following AMPH repeated treatment in both mouse types but still, Nur77 (+/+) had a higher level of non-ambulatory activity than their (-/-) counterparts (p=0.009). Those differences between (-/-) and (+/+) are especially important within injection #1 (p=0.002), within injection #2 (p=0.023) and within injection #6 (p=0.008). Graphs and histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for each 1h30 period that followed the injection (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=9 per group for Nur77 (-/-) vs.Nur77 (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH). .

155

A. B. Sensitization phase Expression phase Inj #6 Nor-1 (+/+)-VEH 30000 Nor-1(-/-)-VEH 30000 Nor-1(+/+)-AMPH 2.5 mg/kg # Nor-1(-/-)-AMPH 2.5 mg/kg

20000 # 20000 # #

10000

Horizontal activity 10000

Horizontal activity activity Horizontal * * * * 0 0 Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 VEH AMPH VEH AMPH (2.5mg/kg) (2.5mg/kg) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-)

C. D. Sensitization phase Expression phase Inj #6

2400 # 2400 *

1800 * 1800

# 1200 1200

600 600 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

0 0 Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 VEH AMPH VEH AMPH (2.5mg/kg) (2.5mg/kg) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) E. F. Sensitization phase Expression phase Inj #6 1000 1000

800 800 # #

600 600

400 400 Vertical activity activity Vertical Vertical activity activity Vertical

200 200

0 0 VEH AMPH Inj #1 Inj #2 Inj #3 Inj #4 Inj #5 VEH AMPH (2.5mg/kg) (2.5mg/kg) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) Figure 2.9

156

Figure 2.9: Chronic AMPH (2.5 mg/kg/day) administration-induced activities in Nor-1 knockout mice. Graphs and histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period that followed each injection (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=9 per group for Nor-1 (- /-) vs. Nor-1 (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH). A. and B. Ambulatory activity - sensitization and expression phase: Nor-1 (-/-) mice horizontal locomotor activity did not increase after repeated administrations of a 2.5 mg/kg dose of AMPH when compared to their (+/+) counterparts whose ambulatory activity began to rise after the third injection. C. and D. Non-ambulatory activity - sensitization and expression phase: In AMPH-AMPH treated-animals it is the non-ambulatory activity which progressively increased in Nor-1 (-/-) compared to Nor-1 (+/+) mice. Indeed repeated injections of a 2.5 mg/kg dose of AMPH induced a significant increase of non-ambulatory activity in Nor-1(-/-) especially on day #5 and day #11. E. and F. Vertical activity - sensitization and expression phase: The vertical activity of both Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) mice slightly increased compared to their VEH-treated counterparts.

157

A. Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 3 # 3 #

2 2 Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ μ

1 1 ENK mRNA ENK mRNA (

0 ENK mRNA ( 0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral

3 3 # #

2 2 Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) μ μ

1 1 ENK mRNA ENK mRNA ( ENK mRNA ENK mRNA ( 0 0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

B. Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 1,5 1,5 # ¤ 1,0 1,0 * Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ

Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g * 0,5 μ 0,5

ENK mRNA ENK mRNA ( 0,0 0,0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph ENK mRNA ENK mRNA ( Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral # 1,5 1,5 ¤

1,0 1,0

* of tissue) Ci/g μ Ci/g of tissue) Ci/g μ

0,5 0,5 ENK mRNA ENK mRNA (

ENK mRNA ENK mRNA ( 0,0 0,0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph Figure 2.10

158

Figure 2.10: A. ENK mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nur77 knockout mice. Following repeated AMPH administrations, Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice (N=5) both showed a significant increase of ENK expression in every tested areas of the nucleus accumbens (NAc) and the striatum (# p< 0.05 versus VEH-VEH). Indeed there was a significant difference between treatments VEH-VEH and AMPH-VEH within the genotype (-/-) and within the genotype (+/+) (p< 0.001) and a significant difference between treatments VEH-VEH and AMPH-AMPH both within (- /-) genotype and within (+/+) genotype (p< 0.001). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

B. ENK mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nor-1 knockout mice. In the shell of the NAc and in the dorso-medial striatum of Nor-1 (-/-) mice, there were significant decrease of ENK expression following AMPH-AMPH treatment when compared to Nor-1 (+/+) mice (* p< 0.05 versus (+/+)). However, there were no significant changes of ENK expression in the other tested areas. We observed a significant effect of the factor “treatment” in the NAc shell and in the STDM. Indeed there were significant differences between treatments AMPH-VEH and AMPH-AMPH within the genotype Nor-1 (-/-) (¤ p< 0.05 versus AMPH-VEH) and a significant difference between treatments VEH-VEH and AMPH-AMPH within the genotype Nor-1 (-/-) (# p< 0.05 versus VEH-VEH). In the NAc shell, Nor-1 (-/-) ENK expression is higher than that of Nor-1 (+/+) mice within the treatment AMPH-VEH but it is interestingly lower than that of Nor-1 (+/+) mice within the treatment AMPH-AMPH (* p< 0.05 versus (+/+)). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

159

A. Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell

0,5 0,5

0,4 0,4 *

0,3 0,3 ci/g of of ci/g tissue) ci/g of of ci/g tissue) μ μ 0,2 0,2

0,1 0,1 DYN mRNA DYN mRNA ( 0 DYN mRNA ( 0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral

0,2 0,2 ci/g of tissue) of ci/g tissue) of ci/g tissue) μ μ 0,1 0,1

DYN mRNA DYN mRNA ( 0,0 DYN mRNA ( 0,0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

B. Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell * 0,5 0,5 #

0,4 0,4

ci/g of of ci/g tissue) 0,3 0,3 ci/g of tissue) of ci/g tissue) μ

μ 0,2 0,2

0,1 0,1

DYN mRNA DYN mRNA ( 0 0 DYN mRNA DYN mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral

0,2 0,2 ci/g of tissue) of ci/g tissue) ci/g of tissue) of ci/g tissue)

μ μ 0,1 0,1 DYN mRNA DYN mRNA ( DYN mRNA DYN mRNA ( 0 0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Figure 2.11

160

Figure 2.11: A. DYN mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nur77 knockout mice. Following repeated AMPH injections there were no significant changes in DYN mRNA expression in the striatum or in the core of the NAc of neither Nur77 (-/-) nor Nur77 (+/+) mice (N=5 per group). However, in the shell of the NAc, Nur77 (-/-) mice displayed higher DYN mRNA levels than that of their (+/+) littermates (* p< 0.050 versus (+/+)) whatever treatment they received. Histogram bars represent mean ± S.E.M. B. DYN mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nor-1 knockout mice. After repeated AMPH treatment, Nor-1 (+/+) mice displayed a significant increase of DYN expression in the shell of the NAc whereas DYN mRNA levels remain the same in their (-/-) littermates (D, * p< 0.050 versus (+/+))). Indeed there was a significant difference in the DYN mRNA expression between the two genotypes Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) especially within the AMPH-AMPH treatment in the NAc shell (* p< 0.050 versus (+/+)). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

161

A. Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 0,3 0,3 #

0,2 0,2 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g μ μ

0,1 0,1 Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( 0 Nor-1 mRNA ( 0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 0,3 # 0,3

0,2 ¤ 0,2 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g μ μ

0,1 0,1

0 Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( 0,0 Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

B. Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 1,2 1,2

0,8 0,8 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g μ ¤ μ 0,4 * 0,4

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( sal-sal amph-sal amph-amph sal-sal amph-sal amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 1,2 * 1,2 *

0,8 0,8

Ci/g of tissue) ¤¤ Ci/g of Ci/g tissue) μ μ ¤¤ 0,4 0,4

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( sal-sal amph-sal amph-amph sal-sal amph-sal amph-amph

Figure 2.12

162

Figure 2.12: A. Nor-1 mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nur77 knockout mice. Following AMPH-VEH repeated treatment Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice (N=5 per group) both showed a significant increase of Nor-1 expression in several areas of the NAc and the striatum (# p< 0.05 versus VEH-VEH; ¤ p< 0.05 versus AMPH-VEH). There was a statistically significant effect of the factor “treatment” in the NAc shell (p= 0.009) and the STDM (p=0.009). However, in the STDM and the STDL we observed decreased levels of Nor-1 in AMPH-AMPH treated animals when compared to the AMPH-VEH treated one (¤ p< 0.05 versus AMPH-VEH).

B. Nur77 mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in Nor-1 knockout mice. Following repeated AMPH-VEH treatment, statistical analysis revealed significant difference in Nur77 expression in Nor-1 (-/-) compared to Nor-1 (+/+) mice in the STDM (p=0.02)and STDL(p<0.001). Indeed, we can clearly see that Nor-1(-/-) mice display higher levels of Nur77mRNA expression compared to (+/+) mice after the AMPH-VEH treatment which certainly contributes to their early development of stereotyped behaviors. Also, there was a significant decreased of Nur77 levels in AMPH-AMPH treated animals when compared to the AMPH-VEH treated ones in the STDM (p<0.001) and the STDL (p<0.001). Interestingly in the Core of the nucleus accumbens statistical analysis showed an increase of Nur77expression in (+/+) mice after the AMPH-AMPH treatment compared to AMPH-VEH treated animals (p=0.029) and Nur77 levels were significantly higher than those of Nor-1(-/-) mice (p=0.023) after AMPH-AMPH treatment (¤ p< 0.05 versus AMPH-VEH; (¤¤ p<0.001 versus AMPH-VEH; * p< 0.05 versus AMPH-VEH, N=5 per group ).

163

A. B. Cocaine-induced conditioned Cocaine-induced conditioned place preference place preference

Nur77 (+/+) Nur77 (-/-) Nor-1 (+/+) Nor-1 (-/-) 50 50 #

# 25 # 25 # versus on vehicle-pairedside versus on vehicle-paired side vehicle-pairedversus on

0 0

-25 * -25

Day #1 Day #7 Day #14 Day #21 Day #1 Day #7 Day #14 Day #21 Pre-test Post-conditioning Pre-test Post-conditioning

spent %Time on drug-paired side % Time spent on drug-paired side on drug-paired spent Time % -50 -50

C. D.

100 100

75 75

50 50 -paired side - vehicle paired side -paired side - vehicle paired side

25 25 * Postconditioning versus versus preconditioning Postconditioning Postconditioning versus versus preconditioning Postconditioning 0 0 %Time on drug %Time %Time on %Time drug ∆ ∆ Day #7 Day #14 Day #21 Day #7 Day #14 Day #21

Figure 2.13

164

Figure 2.13: Cocaine-induced conditioned place preference in Nur77 and in Nor-1 knockout mice. Cocaine-induced CPP acquired in Nur77 (+/+), Nor-1 (+/+) and Nor-1 (-/-) mice is maintained for at least 14 days after the conditioning treatment whereas cocaine-induced CPP acquired in Nur77 (-/-) mice is still present after 7 days but returns to its initial level after 14 days (cocaine, 15 mg/kg, i.p.). Graphs A and B represent mean ± S.E.M. of respective difference between the percentage of time spent in the drug-paired side of the apparatus and the percentage of time spent in the vehicle- paired side. Graphs C and D were obtained by subtracting the values of the post-conditioning phase to the values of the pre-test phase. They might help to further reveal eventual differences between the (-/-) and the (+/+) mice. (N=10 per group, * p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, # p<0.05 versus pre-test).

165

A. B. C. CA1 CA2 CA3 Nur77 (+/+) mice Nur77 (+/+) mice Nur77 (+/+) mice ¤ 0,5 # 0,5 0,5

0,4 0,4 0,4 Ci/g of of Ci/g tissue)

0,3 of tissue) Ci/g 0,3 0,3 Ci/g of of Ci/g tissue) μ μ μ 0,2 0,2 0,2

0,1 0,1 0,1

0,0 0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( Nur77 mRNA Nur77 mRNA (

Figure 2.14

166

Figure 2.14: Nur77 mRNA expression after repeated cocaine (15 mg/kg/day) administration in the hippocampus of wild-type mice. In the CA1 area of the hippocampus, (+/+) mice (n=5 per group) displayed a significant increase of Nur77 mRNA levels after repeated cocaine treatment (# p< 0.05 versus VEH; ¤ p< 0.05 versus 1 inj.). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

167

2.9 SUPPLEMENTAL MATERIALS

A. Injection #6 (AMPH 5 mg/kg; Day #11)

* * * * * * * * Horizontal activity scores scores activity Horizontal

* * * * Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

C. Vertical activity scores activity Vertical

Supplemental figure S2.1

168

Supplemental figure S2.1: The three components of activity during the 120 minutes-recording period of the 5 mg/kg AMPH dose challenge in Nur77 knockout mice (A. Ambulatory activity; B. Non-ambulatory activity; C. Vertical activity) Graphs represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for each 5 minutes of the 2h period (p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=4 per group for Nur77 (-/-) vs.Nur77 (+/+) mice, # p<0.05 AMPH-AMPH vs. VEH-VEH). A. The last injection of AMPH confirmed that, immediately after the 5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of Nur77 (+/+) mice increased during the first 15 minutes that followed the injection (i.e. from t=30 min to t=45 min) then it decreased and it returned to pre-injection levels (from t=50 min to t=85 min) and finally re-increased to retrieve Nur77 (-/-) activity levels (from t= 90 min to t= 120 min). Comparatively, Nur77 (-/-) horizontal activity also increased but did not drop after the 45th minute. It stayed at a higher level during the rest of the recording session. Indeed, taking only the AMPH-treated animals, we performed a two way ANOVA on repeated measures which revealed a statistically significant effect of the interaction “genotype X time” (p=0.029) and of the factor time (p<0.001). A Holm-Sidak's post-hoc test underlined a significant difference between Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) genotypes within the 50th to the 85th minutes (p≤0.05) which confirmed that the horizontal activity of Nur77 (+/+) dropped 15 minutes after the AMPH injection during a 35 minutes period. B. Interestingly, the non-ambulatory activity scores (stereotyped behaviors) of Nur77 (-/-) did not change whereas, for the Nur77 (+/+) mice, the stereotyped movements increased 15 minutes after the AMPH injection (from t=50 minutes) and stayed statistically different and higher than the non- ambulatory activity of the (-/-) until the 70th minute where they decreased to match the (-/-) scores. A two way ANOVA on repeated measures performed on the AMPH-treated animals confirmed our observations because it revealed a statistically significant effect of the interaction “genotype X time” (p=0.008). A Holm-Sidak's post-hoc test displayed a statistically significant difference between Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) genotypes within the 50th to the 65th minutes (p≤0.05) which confirmed that the stereotyped movements of Nur77 (+/+) increased 15 minutes after the AMPH injection during a 15 minutes period. C. Finally, after the sixth injection, there were no significant differences in vertical activity.

169

A. Injection #6 (AMPH 5 mg/kg; Day #11)

# Horizontal activity scores scores activity Horizontal

Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

C. Vertical activity scores activity Vertical

Supplemental figure S2.2

170

Supplemental figure S2.2: The three components of activity during the 120 minutes-recording period of the 2.5 mg/kg AMPH dose challenge in Nur77 knockout mice (A. Ambulatory activity; B. Non-ambulatory activity; C. Vertical activity) Graphs represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for each 5 minutes of the 2h period (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=9 per group for Nur77 (-/-) vs.Nur77 (+/+) mice, # p<0.05 AMPH-AMPH vs. VEH-VEH). A and B. There are no differences between Nur77 (-/-) and (+/+) mice locomotor activity scores except in non-ambulatory activity where Nur77 (+/+) seemed to develop a higher level of stereotyped movements (p<0.05). Indeed a two way ANOVA on repeated measures performed on the AMPH-treated animals revealed an effect of the factor “genotype” for the stereotyped behaviors (p=0.004). C. There is no significant change in vertical activity

171

A. Injection #6 (AMPH 5 mg/kg; Day #11)

* Horizontal activity scores scores activity Horizontal

# * Non-ambulatory activity scores scores activity Non-ambulatory

C. Vertical activity scores scores activity Vertical

Supplemental figure S2.3

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Supplemental figure S2.3: The three components of activity during the 120 minutes-recording period of the 2.5 mg/kg AMPH dose challenge in Nor-1 knockout mice (A. Ambulatory activity; B. Non-ambulatory activity; C. Vertical activity) Graphs represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for each 5 minutes of the 2h period (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=9 per group for Nor-1 (-/-) vs.Nor-1 (+/+) mice, # p<0.05 AMPH-AMPH vs. VEH-VEH).

A. After the 2.5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of Nor-1 (+/+) mice immediately increased whereas it stayed at pre-injection levels in Nor-1 (-/-) mice. So, the last injection of AMPH confirmed that, immediately after the 2.5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of Nor-1 (+/+) mice increased whereas it stayed at pre-injection levels in Nor-1 (-/-) mice. Indeed, taking only the AMPH-treated animals, a two way ANOVA performed on repeated measures showed an significant effect of the genotype (p=0.047), of the time (p<0.001) and of the interaction “genotype X time” (p<0.001).

B. For the stereotyped movements (i.e. non-ambulatory activity) it is the opposite, Nor-1 (-/-) mice displayed a higher increase of their stereotyped activity compared to the (+/+). The differences between Nor-1 (-/-) and Nor-1 (+/+) genotypes became significant within the 65th to the 100th minutes (p≤0.05). Then, the non-ambulatory activity of Nor-1 (-/-) mice returned to the same activity level than the (+/+) from the 105th to the 120th minute (p>0.05). Indeed, a two way ANOVA on repeated measures was conducted on AMPH-treated animals and confirmed our data by showing a significant effect of the factor “genotype X time” (p<0.001). And, a Holm-Sidak’s post- hoc test showed that Nor-1 (-/-) stereotyped activity began to be higher than the (+/+) one directly after the AMPH injection. The differences between Nor-1 (-/-) and Nor-1 (+/+) genotypes became significant within the 65th to the 100th minutes (p≤0.05). Then, the non-ambulatory activity of Nor-1 (-/-) mice returned to the same activity level than the (+/+) from the 105th to the 120th minute (p>0.05).

C. There were no significant change in vertical activity in Nor-1(-/-) when compared to their (+/+) counterparts.

173

A. B. Nur77 (+/+) Nur77 (-/-)

Striatum ventro-medial Striatum ventro-lateral * 0,12 ¤ 0,12

0,09 0,09 Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g * μ μ 0,06 0,06 ¤ 0,03 0,03

0 0 Nor-1 mRNA mRNA Nor-1 ( Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Supplemental figure S2.4

174

Supplemental figure S2.4: Nor-1 mRNA expression after repeated AMPH (2.5 mg/kg) administration in the ventral striatum of Nur77 knockout mice. Following AMPH-VEH repeated treatment Nur77 (-/-) and Nur77 (+/+) mice (N=5) showed a significant difference in ventral striatum Nor-1 expression. Indeed, in the striatum ventro-medial and ventro-lateral there were significant increases in Nor-1 mRNA expression when we switch between AMPH-VEH to AMPH-AMPH treatment within the (-/-) genotype (STVM: p< 0.001; STVL: p=0.011) but not within the (+/+) genotype (STVM: p=0.590; STVL: p=0.421). Histogram bars represent mean ± S.E.M. (* p< 0.050 versus (+/+); ¤ p< 0.050 versus AMPH-VEH treatment).

175

176

Chapitre 3 Implication of the endogenous striatal neuropeptides Enkephalin and Dynorphin in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors

CHAPITRE 3

Implication of the endogenous striatal neuropeptides Enkephalin and Dynorphin in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors

Céline Hodler 1, Joanie Baillargeon 1, Brigitte Paquet 1, Daniel Lévesque 2 & Claude Rouillard 1.

1 Psychiatry and Neurosciences, Laval University, Quebec, Canada, 2 Faculty of pharmacy, University of Montreal, Canada.

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3.1 RÉSUMÉ

L’enképhaline (ENK) et la dynorphine (DYN) striatales jouent un rôle important dans la régulation de la transmission dopaminergique (DAergique). En outre, Nur77 et Nor- 1, des récepteurs nucléaires agissant comme facteurs de transcription seraient impliqués dans la régulation homéostatique des systèmes DAergiques. En utilisant des souris déficientes pour le gène de l’ENK (ENK (-/-)) et des souris déficientes pour le gène de la DYN (DYN (-/-)) et en les comparant à leurs congénères sauvages (+/+), notre objectif est d’étudier le rôle respectif de ces deux neuropeptides dans les comportements médiés par la dopamine (DA) et induits par les psychostimulants. Pour ce faire, nous avons testé l’effet d’un traitement aigu puis d’un traitement chronique à la d-amphétamine sulfate (AMPH) sur des échantillons de ces souris. Pour le traitement chronique, les souris (+/+), ENK (-/-) et DYN (-/-) ont reçu un traitement de 5 jours consécutifs avec une dose journalière d’AMPH (2,5 mg/kg/jour) suivi d’un dernier challenge 5 jours plus tard. Les activités motrices basales et induites par l’AMPH ont été enregistrées. Puis les niveaux d’expression des ARNm de l’ENK, de la DYN, de Nor-1 et Nur77 ont été mesurés par hybridation in situ. Au niveau comportemental, nous avons observé que l’activité basale des souris ENK (-/-) et DYN (-/-) était inférieure à celle des (+/+). Suite au traitement aigu à l’AMPH, toutes les souris présentaient une exacerbation des comportements ambulatoires. En outre, la délétion de la DYN potentialisait cet effet d’induction de l’activité locomotrice. En réponse au traitement chronique, les souris ENK (-/-) et DYN (-/-) ne développaient pas de sensibilisation comportementale à l’AMPH. Par contre, elles ne présentaient pas de perturbations notables de la préférence de place induite par la cocaïne (15 mg/kg). Au niveau biochimique, nous avons observé que les niveaux d’expression basale de Nur77 étaient supérieurs chez les souris DYN (-/-) et ENK (-/-) comparé aux (+/+). Suite au traitement aigu à l’AMPH, la délétion de la DYN provoque une diminution des niveaux de Nur77 alors que ceux-ci augmentent chez les (+/+) et de manière plus marquée encore chez les ENK (-/-). En outre, la délétion de l’ENK suscite une augmentation de la DYN après le traitement aigu d’AMPH. Dans le cadre du protocole d’administration chronique d’AMPH, le prétraitement à l’AMPH induit une augmentation plus marquée des niveaux d’expression de Nor-1 ainsi qu’une diminution de la DYN chez les souris ENK (-/-) comparé aux ENK

179

(+/+). Chez les souris DYN (-/-), il provoque une diminution de l’expression de Nur77 et un maintien de l’expression de Nor-1 à son niveau de base. En outre suite à ce prétraitement chronique à l’AMPH, l’effet d’un challenge à l’AMPH est perturbé par la délétion de l’ENK qui diminue l’expression de Nur77 et de la DYN. Ces données confirment que l’induction de Nor-1 intervient dans la sensibilisation comportementale mais que cette induction ne se produit qu’en présence de la DYN. Cependant chez les souris ENK (+/+) et (-/-), l’induction de Nor-1 a bien lieu mais les souris ENK (-/-) ne développent pas de sensibilisation comportementale. Ceci signifierait que l’augmentation de Nor-1 n’a un effet excitateur sur l’activité locomotrice qu’en présence de l’ENK. L’ensemble de ces données suggère aussi que Nor-1 agirait en amont de la synthèse de l’ENK pour moduler sa fonction. Pour conclure, ces résultats démontrent que l’ENK et la DYN striatales sont toutes deux indispensables pour le développement de la sensibilisation comportementale. Toutefois leur délétion ne supprime pas la préférence de place conditionnée. Ces résultats suggèrent également que l’ENK et la DYN peuvent moduler l’expression de Nor-1 et de Nur77. Enfin, ils nous donnent une preuve de l’existence d’interactions entre les voies de sortie directe et indirecte des ganglions de la base qui expriment respectivement la DYN et l’ENK.

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3.2 ABSTRACT

Striatal enkephalin (ENK) and dynorphin (DYN) are important for the regulation of dopaminergic neurotransmission. Nuclear receptors acting as transcription factors are involved in the regulation of dopaminergic pathways and could possibly regulate DYN and ENK expression. Among them, Nur77 and Nor-1 seems implicated in adaptation and homeostatic regulation of dopaminergic systems. Therefore, by using ENK knockout (ENK (-/-)) and DYN knockout mice (DYN (-/-)) versus their wild-type littermates (ENK (+/+) and DYN (+/+)), we investigated the respective role of these two neuropeptides in dopamine-mediated and psychostimulant-induced behaviors. Therefore, we tested the effect of an acute and a repeated treatment with d-amphetamine sulfate (AMPH) treatment on these mice. For the repeated treatment, all mice received a five-day AMPH pre-treatment and were challenged five days later with the same AMPH dose (2.5 mg/kg/day). Both basal and AMPH-induced locomotor activities were recorded. Levels of ENK, DYN, Nor-1 and Nur77 mRNA were measured by in situ hybridization. Basal activity was lower in ENK (-/- ) and DYN (-/-) mice compared to their (+/+) littermates. Every mouse strains displayed increased activity following acute AMPH but with DYN (-/-) mice being hyperactive compared to their (+/+) littermates. In response to repeated AMPH injections, ENK (-/-) and DYN (-/-) mice failed to show behavioral sensitization. Biochemical analysis in mice brains showed a decreased basal expression levels for DYN in ENK (-/-) mice, whereas Nur77 basal expression was higher in ENK (-/-) and DYN (-/-) mice compared to their (+/+) littermates. Following acute AMPH treatment, ENK (-/-) mice showed an exacerbated increase of Nur77 and of DYN mRNA expression compared to (+/+) mice whereas DYN (- /-) mice displayed a decrease of Nur77 expression. Following the chronic AMPH pre- treatment, ENK(-/-) mice displayed an increase of Nor-1 expression concomitant to a decrease expression of DYN, whereas DYN(-/-) mice showed decreased Nur77 expression. After the acute-AMPH challenge, administered one week after the chronic AMPH pre- treatment, ENK (+/+) and DYN (+/+) mice showed an increase of Nur77, Nor-1 and DYN expression. In contrast ENK (-/-) mice showed no increase of Nur77 and a decrease of DYN expression. And, contrary to the DYN (+/+), DYN (-/-) mice demonstrate a decrease of Nur77 expression and no induction of Nor-1 or DYN compared to (+/+) mice. So we

181 observed an induction of Nor-1 expression in DYN (+/+), ENK (+/+) and ENK (-/-) mice but not in the DYN deficient ones in the Striatum and NAc. This confirmed that Nor-1 induction favours behavioral sensitization but further underlined that Nor-1 induction is conditioned to the presence of DYN. Interestingly, even if Nor-1 induction occurred in both ENK (+/+) and ENK (-/-) mice, the deficient ENK mice did not display behavioral sensitization. This could mean that Nor-1 induction effects could only be effective if ENK is expressed. This also confirmed that Nor-1 could act upstream from ENK biosynthesis to directly or indirectly modulate its function. Thus we could hypothesise that Nor-1 could possibly regulate ENK function but this regulation could only happen in mice which do not lack the DYN gene. All groups of mice acquired significant cocaine conditioned place preference (CPP). Taken together, these results demonstrated that striatal ENK and DYN are both necessary to develop behavioral sensitization but are not crucial to observe cocaine CPP. They also suggested that DYN and ENK could possibly modulate Nur77 and Nor-1 expression. Finally, they supplied strong evidence of an interaction between the direct and indirect dopaminergic pathways which respectively expressed DYN and ENK.

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3.3 INTRODUCTION

Selective expression of the accumbal and striatal neuropeptides, enkephalin (ENK) and dynorphin (DYN), respectively in the indirect and direct output pathways of the basal ganglia is important for the regulation of dopaminergic (DAergic) neurotransmission (for review : Steiner and Gerfen, 1998; Nestler, 2005; Samadi et al., 2007). Indeed, the nucleus accumbens (NAc) and the striatum share a common neuronal population organization. Projection neurons in the striatum and in the NAc give rise to two output systems, the « direct » and « indirect » pathways, which antagonistically regulate basal ganglia output. While all striatal projection neurons utilize GABA as their principal neurotransmitter, they express different peptide co-transmitters and also different dopamine receptor subtypes. Neurons of the direct pathway express DYN, substance P (SP) and the D1 dopamine receptor, whereas indirect pathway neurons express ENK, neurotensin (NT) and the D2 receptor. It has long been recognized that the striatum and the NAc contain the opioid peptides DYN and ENK and their binding sites, kappa (KOR), mu (MOR), and delta opioid receptors (DOR).

Concerning DYN function, it is known that it preferentially binds to the KOR which has an inhibitory effect on the D1 pathway and on DAergic neurotransmission (Chavkin et al., 1982; Steiner and Gerfen, 1998; Schwarzer, 2009). As for ENK, it is known to preferentially bind to the MOR and DOR via a hyperpolarizing effect on the striatal and accumbal neurons of the D2 pathway (Jiang and North, 1992, Miura et al, 2007; Blomeley and Bracci, 2011; for review: Samadi et al., 2007) and excitatory effect on VTA and SN neurons (Algeri et al., 1978; Rawls and McGinty, 2000). Ultimately ENK has a stimulating effect on DA transmission which leads to an increase of DA turnover (Hertz, 1998; for review: Nestler, 2005). In accordance, infusion of ENK-degradation inhibitors in the striatum results in hypermotricity (Dauge et al., 1988).

Little information is available on ENK and DYN hypothetic role in basal condition, especially for ENK. Insights on DYN role in basal conditions have been found. Indeed, it has been demonstrated that the injection of KOR antagonists in the NAc or the constitutive

183 deletion of this receptor, increased DA extracellular levels in the NAc. This suggests the existence of a KOR-mediated constitutively active mechanism which inhibits mesolimbic DAergic neurons activity (Spanagel et al., 1992; Chefer et al., 2005; Chefer and Shippenberg, 2006). However, the functional role of ENK in basal conditions remains to be clarified.

DYN and ENK function has mostly been investigated in response to acute and chronic psychostimulant exposure. In the context of acute psychostimulant exposure, it has been hypothesized that these two neuropeptides act as negative feedback to regulate the GABAergic striatal neurons they are expressed in (for review: Samadi et al., 2007). It has been hypothesized that DYN most important function is to prevent an overstimulation of DAergic neurotransmission. For example, it has been reported that DYN is induced following acute psychostimulant administration (Hanson et al., 1988; Daunais and McGinty, 1994) possibly to counteract subsequent DAergic activation (for review: Steiner and Gerfen, 1998; Nestler, 2004). In fact, DYN exerts an inhibiting feedback on the VTA and the SN dopaminergic neurons to regulate DA release in DA target structures i.e. the NAc and the striatum (Spanagel et al., 1990; Svingos et al., 1999; Chefer et al., 2005). As for the effect of acute psychostimulant on ENK expression, in vivo microdialysis revealed that AMPH caused an increase of ENK release (starting 1 hour after injection) in the globus pallidus (GP), which is the major target of GABA/ENK accumbal and striatal medium spiny neurons (MSNs). In addition, ENK participates in signaling by inhibiting GABA and disinhibiting DA in the globus pallidus (GP) to sustain locomotion (Mabrouk et al., 2011). This is consistent with a previous study which has reported acute AMPH-induced increases in ENK mRNA expression in striatal MSNs (Wang and McGinty, 1996) possibly to maintain ENK stores following the release of ENK by psychostimulant. Thus it has been hypothesized that AMPH-induced release of ENK in the GP facilitates DA release and locomotor activity (Schad et al., 1995; Mabrouk et al.2011). This remains to be further confirmed.

As for chronic psychostimulant exposure, several studies suggest that striatal ENK and DYN are important for neuroadaptations following chronic psychostimulant

184

administration. Repeated exposure to psychostimulant induces behavioral and neural alterations that may lead to addictive behavior. Sensitization also known as inverse tolerance is one of the most peculiar phenomenons that result from these neuroadaptations. It could be defined as exacerbated response to psychostimulant with successive drug exposures. Behavioral sensitization is characterized by a progressive increase of locomotor response that persists even after long periods of abstinence (Robinson and Becker, 1986; Paulson et al., 1991; Koob et al., 2004). This effect is thought to be due to the enhanced DA release in the ventral striatum (NAc) after repeated psychostimulant administration (Robinson et al., 1988; Boileau et al., 2006).

It is generally thought that the selective regulation of DYN expression induced by repeated cocaine administration in the basal ganglia direct output pathway plays an important role in behavioral sensitization (Steiner and Gerfen, 1996; for review: Steiner and Gerfen, 1998). Indeed, repeated administration of indirect or direct dopamine agonists results in increased synthesis of DYN in the NAc and the striatum (Hanson et al., 1988; Li et al., 1988; Trujillo et al., 1990; Gerfen et al., 1991; Hurd et al., 1992; Daunais et al., 1993; Cole et al., 1995; Turchan et al., 1998). In addition, high doses of DYN agonists enhanced the sensitivity of animals to low doses of psychostimulants (Kuzmin et al., 1997). Congruently, it has been demonstrated that 3 to 5 repeated injections of DYN agonists had either no effect or increased psychostimulants-evoked DA release (Heidbreder et al., 1995; Fuentealba et al., 2006; Gehrke et al., 2008; Blomeley and Bracci, 2011). These data could seem contradictory knowing the usual function of the KOR which is to attenuate the locomotor activity. However, numerous studies report that DYN could also have excitatory effects which are not mediated by KOR (non-opioid effects; for review: Wee and Koob, 2010). Thus, despite an undeniable contribution in the modulation of DA neurotransmission, the exact role of DYN in DA mediated behaviors and especially in the etiology of behavioral sensitization remains unclear.

As for the ENK function, very few studies have focused their interest on its role in chronic psychostimulant-induced behaviors. Literature data are contradictory on this subject. On one hand, ENK expression in the indirect striatal output pathway have been

185 thought to have a negligible role in psychostimulant-induced behavioral sensitization (for review: Steiner and Gerfen, 1998). On the other hand, a few studies suggested that ENK expression in the indirect pathway participate in this phenomenon. The blockade of ENK- specific opioid receptors prevents the development of behavioral sensitization (Kalivas, 1985; Kalivas et al., 1986). Mice deficient for the MOR gene does not develop cocaine- induced behavioral sensitization (Hummel et al., 2006). Chronic administration of cocaine produces an upregulation of MOR (Unterwald et al., 1994). And, according to a recent study, ENK could be a participative agent in the behavioral sensitization phenomenon (Shi and McGinty, 2006). Thus the role of ENK in the response to chronic psychostimulant administration is still a point of controversy which needs to be further investigated.

Numerous evidence indicate that nuclear receptors acting as transcription factors are involved in the regulation of dopaminergic pathways. Among them, Nur77 and Nor-1, belonging to the Nurs family, are involved in adaptation and homeostatic regulation of dopaminergic systems (for review: Lévesque and Rouillard, 2007). Moreover, Nur77 and Nor-1 are both expressed in GABA/DYN and GABA/ENK neurons of the NAc and the striatum. In addition, recent studies performed in our laboratory have shown that both Nur77 and Nor-1 could possibly be involved in the regulation of DYN and ENK expression (Ethier et al, 2004a, 2004b; Hodler et al., unpublished data). Thus, the fact that the Nurs are able to regulate the expression of a striatal neuropeptides, such as ENK and DYN, represents a serious interest since the opioid system is also strongly implicated in the feedback-control of DAergic transmission (Algeri et al., 1978; Steiner and Gerfen, 1998).

We also investigate the role of ENK and DYN in the associative learning that psychostimulant could trigger. Several lines of evidence in this field reported an involvement of the endogenous opioid ENK and DYN and of the transcription factors Nur77 and Nor-1. It has been shown that cocaine-induced CPP is blocked by non-selective antagonist of the opioid receptors (naxolone and naltrexone) (Houdi et al., 1989; Bilsky et al., 1992), by selective DOR (naltrindole) or MOR antagonists (Suzuki et al., 1994a; Schroeder et al., 2007) and by selective agonists of the KOR (U-50488H; Suzuki et al., 1992). Those different results suggest a robust implication of the opioid system in the

186

associative-learning mechanisms underlying drug-addiction. This brought us to further investigate the role of DYN and ENK in cocaine-induced CPP.

Thus, very few studies have simultaneously investigated the role of ENK and DYN in DA-mediated and psychostimulants-induced behaviors. Both DYN and ENK functional roles in DA neurotransmission are still a point of controversy. Also, nuclear receptor and neuropeptides interactions remain to be clarified. Therefore, by using ENK knockout (ENK (-/-)) and DYN knockout mice (DYN (-/-)) versus their wild-type counterparts (ENK (+/+) and DYN (+/+) mice), we investigated the respective role of these two neuropeptides in DA-mediated and psychostimulants-induced behaviors. And by performing in situ hybridization of Nur77, Nor-1, ENK and DYN mRNAs, we attempted to further study 1) their respective roles in DA-mediated behaviors 2) and the existence of potential interactions between neuropeptides and nuclear receptors.

3.4 MATERIALS AND METHODS

3.4.1 Animals

All experiments were performed in accordance to the Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory animals, and all procedures were approved by the Institutional Animal Care Committee of Laval University. Efforts were made to minimize animal suffering and to reduce the number of animals used. ENK knockout mice (ENK (-/-)) were purchased from The Jackson Laboratory. To obtain ENK mutant mice on an inbred congenital genetic background, they mated heterozygous ENK (+/-) mice from a C57BL/6J genetic background (Konig et al., 1996) to wild-type C57BL/6J mice (Jackson Laboratories, USA) for ten generations. ENK (+/-) mice from the F10 generation were then intercrossed to obtain homozygous ENK (-/-) animals. ENK (-/-) mice used for behavioral studies were derived from these homozygous animals. Their wild-type littermates (male

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ENK (+/+) mice) were also provided by the Jackson Laboratory and came from the same strain of C57/BL6J. The DYN knockout (DYN (-/-)) and their wild-type littermates (DYN (+/+)) were provided by The Jackson Laboratory (strain B6.129S4-Pdyntm1Ute/J). This strain originated on a B6;129 background, and has been backcrossed for 8 generations on the C57BL/6J background (Sharifi et al., 2001). We have maintained an ENK (-/-) and a DYN (-/-) mice colony, as well as a colonies of their respective wild-type littermates, at the animal care facility of our research center. The mice were housed three to four per cage in a temperature-controlled environment (held at a constant temperature of 20qC), on a 12h- light/dark cycle (lights on at 7:00 A.M.) with ad libitum access to food and water. All the mice used weighed approximately 25 g before the testing sessions.

3.4.2 Basal locomotor activity and AMPH-induced behaviors

3.4.2.1 Basal locomotor activity

Spontaneous locomotor activity of ENK (+/+), DYN (+/+), ENK (-/-) and DYN (-/-) mice (n=8 per group) was measured in the mice home cages using a "wheel running system" apparatus (Single Activity Wheel Chamber System for mice, Lafayette Instrument Co.). Basal nocturnal locomotor activity was monitored 3 consecutive days during a 18- hour period (from 4 p.m. to 10 a.m.). Distance in the wheel was counted in meters using “Activity Wheel Monitor Starter and Expander Interface” (Lafayette Instrument Co.).

3.4.2.2 Acute and chronic amphetamine-induced behaviors

In this experiment, mice received a single administration or repeated administrations of either of d-amphetamine sulfate (AMPH, 2.5 mg/kg, i.p.) dissolved in sterile 0.9% NaCl or vehicle (VEH; NaCl 0.9%, i.p.). Before being engaged in one of the two treatment protocol, animals were habituated to the activity chambers fort three consecutive days (2h per session). The following week, adult ENK (+/+) and DYN (-/-) mice or ENK (+/+) and DYN (-/-) mice (n=5 per group) were taken from their home cage, and immediately put in

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these activity chambers equipped with photoelectric cells («Flex Field System», San Diego Instruments, Inc.). Animals were then treated 30 minutes after the beginning of the recording. Three components of their activity in the Flex Field System were then recorded during the 90 minutes that followed the daily vehicle or amphetamine treatment: ambulatory activity (horizontal activity), vertical activity (rearing) and non-ambulatory activity (stereotyped behaviors). After each test session (2h), animals were brought back to their home cage.

For the single AMPH injection, all groups of animals were either injected with AMPH or VEH (n=5 per group) and the previous protocol was performed during one day only. For the repeated administration mice were pre-treated for five consecutive days with AMPH or VEH (sensitization phase: day 1 to 5) and received the same dose of AMPH or vehicle after 5 days of drug withdrawal (expression phase: day 11). For each experiment, we had 6 groups of mice, each consisting of five mice depending on their genotype ((DYN (-/-), ENK (-/-), DYN (+/+), ENK (+/+)) and their treatment (VEH-VEH; AMPH-VEH and AMPH-AMPH). Groups of mice were: (a) ENK(+/+)/VEH-VEH (n=5); ENK(-/-)/VEH- VEH (n=5); ENK(+/+)/AMPH-VEH (n=5), ENK(-/-)/AMPH-VEH (n=5), ENK(+/+)/AMPH-AMPH (n=5) and ENK(-/-)/AMPH-AMPH (n=5). (b) DYN(+/+)/VEH- VEH (n=5); DYN(-/-)/VEH-VEH (n=5); DYN(+/+)/AMPH-VEH (n=5) and DYN(-/- )/AMPH-VEH (n=5); DYN(+/+)/AMPH-AMPH (n=5) and DYN(-/-)/AMPH-AMPH (n=5). The group VEH-VEH served as control group and received 5 days of saline injections, (day 1 to 5) then five days after the last injection they received a final 6th saline administration on day 11. The group AMPH-VEH received 5 days of AMPH injections (day 1 to 5), then five days after the last injection they received a final 6th saline administration on day 11. The group AMPH-AMPH received 5 days of AMPH injections (day 1 to 5), then five days after the last injection they received a final 6th AMPH administration on day 11. These groups were used for locomotor evaluation in basal condition and following saline or AMPH administration. Behavioral analyses of the activity measured in the Flex Field system apparatus were performed as previously described (Bourhis et al., 2009).

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Animals were sacrificed and perfused two hours after the last AMPH or VEH administration. Brains were quickly removed, further fixed with paraformaldehyde (PFA 4%) for 24 hours, cryopreserved and then later cut in thin sections of 20 microns with a microtome.

3.4.3 Conditioned place preference

3.4.3.1 Place preference conditioning apparatus

Place-conditioning studies were performed in a three-compartment apparatus (Spatial place preference Box, Panlab, S.L., Lab. Neuropharmacology, Univ. Pompeu Fabra, Barcelona, Spain). The two larger, outer compartments (20 X 18 X 25 cm) were separated by a central corridor (20 X 7 X 25 cm) and differed in visual cues. One compartment had white walls with 1-in-wide diagonal black stripes and a light grey floor. The opposite compartment had black walls with white dots and a dark grey floor. Indeed, the central corridor had transparent walls and a black floor and allowed free movement between the two outer compartments unless barred by two sliding doors, which restricted movement between compartments during conditioning sessions. A video-tracking system, consisting of a camera connected to a computer using the ANY-maze tracking software (Stoeling Co., Woodale, USA), recognized the animal, and tracked its every move in each compartment of the apparatus. This computer device enabled us to record: the distance, time and "pathway" performed by the animal in each compartment.

3.4.3.2 Behavioral conditioning procedure

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and whereas in the afternoon, they were administered a 15 mg/Kg (i.p.) dose of cocaine and were confined in the initially non-preferred side. For our procedure, animals were divided into two groups according to their genotype ENK (-/-) (n=5) and ENK (+/+) (n=5) for the first experiment or DYN (-/-) (n=5) and DYN (+/+) (n=5) for the second. Animals were placed into the conditioning chamber immediately after the i.p. injection (saline 1mg/kg or cocaine 15 mg/kg) and maintained in it for 30 minutes. Testing occurred on day 6 during which time rats were allowed to freely explore both compartments in a drug-free state for 45 minutes, and the time spent in each compartment was recorded and used to determine the degree of conditioned place preference (CPP) (the percentage of time spent in the paired compartment compared to the percentage of time spent in the unpaired compartment on test day).

3.4.4 In situ hybridizations

Microtome-cut brain sections were collected from the prefrontal cortex to the substantia nigra, mounted on Snowcoat X-traTM slides (Surgipath, Richmond, IL, U.S.A) and stored at -80°C. Specific [35S]UTP-labeled complementary RNA (cRNA) probes were used on microtome-cut brain sections and preparation of Nur77 (Gervais et al., 1999; Tremblay et al., 1999), DYN, ENK (Levesque et al., 1995; Tremblay et al., 1997) and Nor- 1 (Bourhis et al., 2008, 2009) probes was performed as described previously. The antisense cRNA probe for Nur77 (663 bp, from nucleotide 167 to 830) stems from a 2.4-kb EcoRI fragment of a full-length mouse Nur77 cDNA subcloned into pBluescript SK1 and linearized with BamHI. The single-stranded riboprobe complementary to the RNA of interest was synthesized and labeled using Promega riboprobe kit (Promega, Madison, WI), [35S]UTP (Perkin Elmer Inc., Canada), and the RNA polymerase T3. For the mouse DYN mRNA precursor, a cloned fragment (356 bp, from nucleotide 390 to 747) was introduced into pGEM-4Z plasmid. The DYN cDNA template was linearized with BamHI restriction enzyme, and the antisense probe was synthesized with [35S]UTP and T7 RNA polymerase. The ENK probe (935 bp, from nucleotide 104 to 830) was generated from the linearized rat cDNA contained in pSP64 (antisense) and pSP65 (sense) plasmids (Yoshikawa et al., 1984). The ENK cDNA template was linearized with SacI restriction enzyme, and the

191 antisense probe was synthesized with [35S]UTP and SP6 RNA polymerase. The Nor-1 probes preparation followed the same steps and has been described in details elsewhere (Maheux et al., 2005). The hybridization technique was performed as previously described (Beaudry et al., 2000; Langlois et al., 2001). All solutions and buffers were prepared with distilled water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC) (Sigma) to inhibit RNAse and autoclaved. Briefly, brain sections were fixed in a 20-min paraformaldehyde bath (4% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M borax buffer (pH 9.5)) and then rinsed twice in phosphate buffer (PBS 100mM) for 5 min. Subsequently, a triethanolamine incubation (TEA 100 mM, pH 8.0) and a 10-min acetylation bath (0.25% acetic anhydride, TEA 100 mM) followed. Slides were finally rinsed in standard saline citrate (SSC) (300 mM NaCl, 30 mM sodium citrate) and dehydrated in increasing concentrations of ethanol. The 35S- labeled riboprobe was added to a concentration of 2.106 cpm/ml in hybridization mix (Denhart’s solution, dextran sulfate, and 50% deionized formamide) and heated at 65°C for 5 min. Each slide was covered up with 95 μl of the hybridization solution and coverslipped. The hybridization took place overnight at 58°C on a slide warmer. After hybridization, slides were soaked in SSC (600 mM NaCl, 30 mM sodium citrate) for 30 min to remove coverslips and then washed in four subsequent SSC baths. Afterward, slides spent 30 minutes in a 37°C incubation buffer with RNAse A (2 mg/100 ml). A series of SSC baths with dithiothreitol 1% (1 mM) followed, one of which was at 55°C for 30 min. Finally, tissues were dehydrated in ethanol, dried up, and apposed to a Biomax MR film (Kodak). Autoradiograms were developed approximately 48 h later.

3.4.5 Double labeling of Nur77 with SP or ENK mRNA transcripts after acute AMPH administration

To evaluate the proportion of colocalization of the Nur77 transcript with neuropeptides of vehicle- and AMPH-treated animals, we have performed simultaneous double in situ hybridization with the 35S-UTP-labeled Nur77 probe described above and nonradioactive digoxigenin(DIG)-labeled neuropeptide probes. Double in situ hybridization was performed with the substance P or enkephalin probe and the Nur77 probe on adjacent

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brain sections. The substance P probe (198 bp, from nucleotide 79 to 276) was generated from the rat preprotachykinin contained in pGEM-4Z plasmid, as previously described (Beaudry et al., 2000). The preprotachykinin cDNA template was linearized with EcoRI restriction enzyme, and the antisense probe was synthesized with T7 RNA polymerase. The preproenkephalin probe (935 bp, from nucleotide 2104 to 830) was generated from the linearized rat cDNA contained in pSP64 (antisense) and pSP65 (sense) plasmids (courtesy of Dr. S. Sabol, National Institute of Mental Health) (Yoshikawa et al., 1984). The preproenkephalin cDNA template was linearized with SacI restriction enzyme, and the antisense probe was synthesized with SP6 RNA polymerase. Neuropeptide cRNA probes were labeled with Dig using the Promega Riboprobe System with the Dig-RNA labeling mix (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada). Labeled probes were separated from free nucleotides on mini QuickSpin RNA columns (Roche Diagnostics). Efficiency of the labeling was evaluated using Dig Control Test Strips (Roche Diagnostics). Double in situ hybridizations were performed in the same conditions as described above for the Nur77 probe. The Dig-cRNA probe (10 ng) was simply added in the same hybridization solution with the radioactive (4 3 106 cpm) cRNA probe for Nur77. An additional step was performed using a 50% formamide solution in 23 saline–sodium citrate buffer (30 min at 60°C) after hybridization to reduce nonspecific Dig labeling. To reveal the Dig labeling, slides were blocked with 2% bovine serum albumin and 0.3% Triton X-100 in buffer A [100 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl] for 30 min at room temperature before incubation overnight at 4°C with an anti-Dig antibody (conjugated to alkaline phosphatase; Boehringer Mannheim) diluted 1:100 in buffer A containing bovine serum albumin (1%) and Triton X-100 (0.3%). Slides were washed three times in buffer A for 10 min and then equilibrated in buffer B [100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, and 50 mM MgCl2] for 10 min. The conjugated antibody was visualized by incubating the sections in a chromogen solution (buffer B containing 330 mg/ml nitro blue tetrazolium chloride, 165 mg/ml 5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, and 1 mM levamisole) previously filtered (pore size, 0.22 mm). After washing in buffer B, each slide was covered with 500 ml of the chromogen solution and placed in humidified plastic boxes. After completion of the reaction (20 min–4 h at room temperature in the dark), the reaction was stopped in buffer C [10 mM Tris-HCl (pH 8) and 1 mM EDTA] for 30 min. Slides were extensively rinsed in distilled water and

193 dried with a stream of cold air. Following these steps, slides were dipped in LM-1 photographic emulsion (Amersham) melted at 43°C, air-dried for 3 h, and stored in the dark for 12 days at 4°C. The emulsion was then developed (2.5 min) in D-19 developer (Kodak), rinsed in deionized water, and fixed (10 min) in Rapid Fixer solution from Kodak. Slides were rinsed in deionized water for 1 h and then coverslipped using a water-soluble mounting medium (Permafluor; Lipshaw Immunon, Pittsburgh, PA, U.S.A.). Single- or double-labeled cells were visualized and manually counted under bright-field illumination with a Zeiss photomicroscope at a magnification of 3400. Numbers of silver grains per cell were determined using the NIH Image software after background subtraction. Neuron counting was performed on three or four different sections obtained from a total of three or four animals per group investigated. Fields for quantification were taken within accumbal and striatal regions as presented hereafter.

3.4.6 Quantification analysis

Levels of radioautographic labeling on films were quantified by computerized densitometry. Digitized brain images were obtained with a CCD camera Model XC-77 (Sony) equipped with a 60mm f/2.8D (Nikon) magnification lens. Images were analyzed on a MacIntosh computer using the Image software (Image 1.61, W. Rasband, NIH). Optical density of the autoradiograms was translated in μCi/g of tissue using 14C radioactivity standards (ARC 146- 14C standards, American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis (PCi/g) et RPA 504-14C standards, Amersham International, UK (KCi/g)). For the quantification analyses, all investigated brain regions were divided in 4 sections. Nur77, Nor-1, ENK and DYN mRNA labeling were measured in the core (NAc core) and shell (NAc shell) of the nucleus accumbens and in the dorso-lateral (STDL) and dorso-medial (STDM) portions of the striatum for analysis. The average level of labeling for each area was calculated from four adjacent brain sections of the same animal. Averages of the signals collected from both brain hemispheres were made. Background intensity was subtracted from every measure.

194

3.4.7 Statistical analysis

To compare the effect of repeated AMPH or vehicle treatment in each mouse genotype on the different treatment days we used a three-way ANOVA followed by multiple comparison Holm-Sidak’s post-hoc tests to determine statistical significance. In the same context, we also used a two-way ANOVA for repeated measures (two-way ANOVA RM) on data limited to the chronic AMPH-treated animals to study more precisely the effects of the two factors: “genotype” and “number of injections”.

Statistical analyses on data collected with the conditioned place preference paradigm were performed using a two-way ANOVA RM to determine if there were significant effects of the two factors (genotype and test phase) in the mean preference for the drug-paired compartment. Holm-Sidak’s post-hoc analyses were performed after significance has been determined by ANOVA. Statistical analyses of mRNA level variances were performed using two-way ANOVAs. When a significant variance analysis was observed, a Tukey’s test or a Holm-Sidak’s was performed as post hoc analysis to determine statistical significance. P values bellow 0.05 were considered statistically significant.

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3.5 RESULTS

3.5.1 Basal locomotor activity in ENK and DYN knockout mice:

ENK (-/-) mice had a significantly lower basal activity as compared to their (+/+) littermates (fig. 3.1A). Moreover ENK (+/+) basal activity decreased from day 1 to day 2 whereas ENK (-/-) basal activity remains low but did not change according to the factor day. Our results were proved statistically significant by a two way ANOVA RM which showed a significant difference in the mice behavior according to the factor genotype

(Fgenotype(1,28) =8.172, p=0.013) and to the factor day (Fday(2,28) =10.208, p<0.001). A Holm-Sidak's post hoc test with multiple comparison procedures showed a significant difference between genotype within day 1 (p= 0.007) within day 2 (p= 0.044) and within day 3 (p= 0.021) (fig. 3.1A).

DYN (-/-) mice also displayed a significantly lower basal activity than their (+/+) counterparts but only at day 1. A two way ANOVA RM revealed a significant effect of the interaction “genotype x day” (Finteraction(2,28) = 7.457, p =0.003). Indeed we could observe that DYN (+/+) mice displayed a progressive daily decrease of spontaneous activity whereas DYN (-/-) had immediate lower basal activity at day 1. Indeed DYN (-/-) spontaneous locomotor activity is significantly lower than (+/+) at day 1 (p=0.006; Holm- Sidak’s post hoc test) but is similar to (+/+) at day 2 and day 3 (fig. 3.1B).

3.5.2 Acute AMPH-induced activity in ENK and DYN knockout mice:

After acute AMPH, ENK (-/-) and (+/+) mice both displayed an increase of horizontal ambulatory activity when respectively compared to the VEH-treated mice

(Ftreatment(1,11) = 15.433, p =0.002; two way ANOVA; fig. 3.2A). Indeed post hoc tests showed a significant difference between VEH and AMPH treatments within both ENK

196

(+/+) (p=0.006) and ENK (-/-) mice (p=0.048). However, non-ambulatory activity scores were different in ENK (+/+) and (-/-) mice. Interestingly, ENK (-/-) mice significantly develop a greater increase of stereotyped behaviors than (+/+) mice after the AMPH treatment (Fgenotype x treatment(1,11) =9.503, p=0.010; Ftreatment(1,11) =155.459, p<0.001; two way ANOVA; fig. 3.2C). Indeed a single AMPH injection induced a significant increase of non-ambulatory activity in both in both ENK (-/-) (p<0.001; Holm-Sidak’s post hoc test) and ENK (+/+) mice (p<0.001) but with a greater impact in ENK (-/-). Furthermore, ENK (-/-) and (+/+) mice did not differ in vertical activity and AMPH treatment had no effect on it fig. 3.2E).

Following AMPH administration, the mean ambulatory activity of DYN (-/-) mice displayed a greater increase compared to the DYN (+/+) counterparts (Fgenotype(1,11)=8.253, p=0.015; Ftreatment(1,11) =82.341, p<0.001; Fgenotype x treatment(1,11) =7.729, p=0.018; two way ANOVA; fig. 3.2B). Indeed post hoc tests showed a significant difference between DYN (- /-) and (+/+) within the treatment AMPH (p=0.003) and a significant effect of AMPH treatment within both DYN (+/+) mice (p<0.001) and DYN (-/-) mice (p<0.001). As for the non-ambulatory and the vertical activity, acute AMPH induced a significant increase in both DYN (-/-) (non-ambulatory: p<0.001, vertical: p=0.002) and DYN (+/+) mice (non- ambulatory: p=0.004; vertical: p=0.001) (fig. 3.2D-F).

Hence, these results indicate that ENK (-/-), DYN (-/-) and (+/+) mice all show an increase of ambulatory activity after the AMPH injection. However, following AMPH administration, DYN (-/-) mice mean ambulatory activity is further increased compared to their (+/+) littermates. Furthermore, ENK (-/-), DYN (-/-) and (+/+) mice do show an increased non-ambulatory activity compared to VEH-treated animals. Interestingly, ENK (- /-) mice develop significantly more stereotyped behavior after the AMPH treatment. ENK (-/-) and (+/+) mice did not differ in vertical activity and AMPH treatment had no effect on it. However, DYN (-/-) and their (+/+) littermates did display an increase of their vertical activity following AMPH-treatment.

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3.5.3 Effect of acute AMPH administration on Nur77 and DYN mRNAs in ENK and DYN knockout mice:

3.5.3.1 Nur77 mRNA expression after acute AMPH administration

ENK (-/-) mice showed significant higher levels of Nur77 compared to ENK (+/+) mice in every tested areas both following VEH and AMPH treatment (NAc core: p= 0.05; NAc shell: p= 0.031; STDM: p<0.001; STDL: p<0.001; fig. 3.3A). There was a significant increase of Nur77 mRNA expression after the AMPH treatment in the dorsal striatum of both ENK (-/-) (STDM: p=0.002; STDL: p<0.001) and ENK (+/+) mice (STDM: p=0.035; STDL: p=0.004).

Interestingly, DYN (-/-) mice also showed significant difference in Nur77 expression in VEH-treated animals, its level is significantly higher than in (+/+) mice in the dorsal striatum (STDM: p=0.037; STDL: p=0.006; fig. 3.3B). Furthermore, we witnessed an induction of Nur77 following acute AMPH in the STDM of DYN (+/+) mice (STDM: # p<0.05 (+/+)/AMPH versus (+/+)/VEH; fig. 3.3B). On the contrary, DYN (-/-) mice displayed a significant decrease of Nur77 expression after acute AMPH administration in the dorsal striatum (STDM: p=0.034; STDL: p=0.004). In addition, Nur77 expression levels in DYN (-/-) were also significantly lower than in DYN (+/+) after the AMPH- treatment (STDM: p=0.046).

In wild-type mice Nur77 mRNA induction following acute AMPH only takes place in the GABA/SP neurons of the dorsal striatum which co-express DYN and D1 receptors (# p<0.05 versus VEH; fig. 3.4).

3.5.3.2 DYN mRNA expression after acute AMPH administration

In the STDM and in the NAc core and shell, VEH-treated ENK (+/+) mice have a significant higher basal level of DYN than ENK (-/-) mice (STDM: p=0.027; NAc core:

198

p=0.035; NAc shell: p=0.017; fig. 3.5). Following acute AMPH, only ENK (-/-) mice displayed a robust increase of DYN expression in every tested areas when compared to VEH-treated animals (# p<0.05 versus VEH). And, in the very same structures, AMPH- treated ENK (-/-) mice showed a significantly higher level of DYN than their (+/+) littermates (genotype X treatment, p<0.05; AMPH-treatment: p<0.05; fig. 3.5).

3.5.4 Chronic AMPH-induced activity in ENK and DYN knockout mice:

3.5.4.1 Effect of repeated AMPH administration in ENK knockout mice

Repeated treatment with an AMPH dose of 2.5 mg/kg induced a progressive increase of horizontal ambulatory activity in ENK (+/+) but not in ENK (-/-) mice

(Fgenotype(1,215)=4.575, p=0.034; Ftreatment(1,215)=211.003, p<0.001; Fgenotype x treatment(1,215)=7.565, p=0.006; N= 18; three way ANOVA). Hence, in AMPH-treated ENK (+/+) mice the horizontal activity significantly rose during the sensitization phase from the first injection to the fifth and also after the expression phase (sixth injection), whereas in ENK (-/-) it seemed to rise only between the first and the second injection and then reached a plateau with no further increase for the following recording sessions. In fact, in AMPH- treated animals, the ambulatory activity of ENK (+/+) mice became significantly higher than their (-/-) counterparts from the fifth to the sixth injection (Fnumber of injections(4,116)=13.439, p<0.001; two-way ANOVA RM; fig.3.6A and 3.6B). Indeed a Holm-Sidak's post hoc test showed a significant difference between the ENK (+/+) and ENK (-/-) genotypes within the AMPH treatment (p<0.001). Post hoc tests also specifically confirmed significant differences between the ENK (+/+) and ENK (-/-) genotypes within injection #5 (p=0.027) and within injection #6 (p=0.014).

In contrast, non-ambulatory activity scores were not affected by the repeated AMPH administration in both ENK (+/+) and ENK (-/-) mice. There were no significant changes compared to VEH-treated animals (fig. 3.6C and 3.6D).

199

Furthermore, following the AMPH treatment, vertical activity scores (rearings) seemed to evolve similarly in ENK (+/+) and (-/-) mice. These scores decreased when compared to the VEH-treated counterparts (fig. 3.6E and 3.6F). Indeed repeated AMPH induced a significant decrease of vertical activity in both genotypes which was confirmed by a three way ANOVA showing a statistically significant difference between the VEH and the AMPH treatment (p<0.05).

3.5.4.2 Effect of repeated AMPH administration in DYN knockout mice

Similarly, repeated AMPH treatment elicited locomotor activity sensitization in DYN (+/+) mice but not DYN (-/-). Indeed, DYN (-/-) mice ambulatory activity increased only following the 4 first injections but then dropped abruptly after the fifth injection and in the expression phase (sixth injection) (fig. 3.7A and 3.7B). Furthermore, DYN (+/+) mice horizontal activity is significantly higher than the (-/-) ones after the fifth and especially in the expression phase after the last AMPH challenge. Indeed, a two way ANOVA RM performed on the horizontal activity of AMPH-treated mice (N=8 per group) yielded a statistically significant effect of the factors: “genotype” (Fgenotype(1,56) =5.090, p=0.041) and "number of injections" (Fnumber of injections(4,56) =19.544, p<0.001). A Holm-Sidak's post hoc test showed a significant difference between genotypes within the injections: #2 (p=0.02), #5 (p=0.011) and #6 (i.e. within the AMPH challenge injection: p<0.001). In fact, especially during the expression phase (after the AMPH challenge), DYN (-/-) mice

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showed significant lower horizontal activity compared to (+/+) (Fgenotype(1,14) =53.452, p<0.001; Fgenotype x treatment(1,14) =39.695, p<0.001; two way ANOVA).

However, in AMPH treated-animals there were no significant difference between the non-ambulatory activity scores of DYN (+/+) and DYN (-/-) mice (fig. 3.7C and 3.7D).

Finally, after a repeated AMPH treatment, the vertical activity of both DYN (+/+) and DYN (-/-) mice slightly decreased compared to their VEH-treated counterparts. However there was no difference between the AMPH-induced vertical activity of (+/+) and (-/-) mice (fig. 3.7E and 3.7F). Indeed a two way ANOVA on repeated measures performed on the AMPH-treated animals also showed no effect of the genotype (p=0.733) but did display an effect of the number of injections (Fnumber of injections(4,56) =7.085, p<0.001). Thus, both genotypes showed a decrease of their vertical activity with the successive AMPH administrations.

The last injection of AMPH confirmed that, immediately after the 2.5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of both DYN (+/+) and (-/-) mice increased to reach a higher activity level and then slowly decrease to reach their initial level. However, in DYN (+/+) mice this increased activity reached a level that was 46.4% higher than the (-/-) one from the 40th to the 100th minutes. Then after the 105th minute the scores of both (-/-) and (+/+) mice retrieved their initial levels and were similar. There were no differences between DYN (-/-) and (+/+) mice in non-ambulatory activity and vertical activity (Supplemental fig. S3.3A).

201

3.5.5 Effect of chronic AMPH administration on Nur77 and Nor-1 mRNAs in ENK and DYN knockout mice:

3.5.5.1 Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration

Following repeated AMPH administrations, ENK (+/+) mice (N=5) showed an increase of Nur77 expression in the NAc core and shell (fig. 3.8A; # p< 0.001 versus VEH- VEH). In contrast, there were no changes in Nur77 expression following repeated AMPH administrations in ENK (-/-) mice. Furthermore, looking at animals that have received the last AMPH challenge (AMPH-AMPH treatment), ENK (-/-) mice displayed significant lower levels of Nur77 than their (+/+) littermates in the nucleus accumbens and in the striatum dorso-medial (p< 0.05 (-/-) versus (+/+)).

Interestingly, the DYN deletion had quite the same effect on Nur77 expression after a repeated AMPH-treatment. Indeed, differences in Nur77 expression levels between DYN (-/-) mice and DYN (+/+) mice were essentially seen in the nucleus accumbens and the dorsal striatum. Thus, in these regions DYN (-/-) mice displayed a significant lower expression of Nur77 following AMPH-AMPH treatment when compared to DYN (+/+) mice (fig. 3.8B; p< 0.05 (-/-) versus (+/+); p< 0.05 AMPH-AMPH versus AMPH-VEH). And, there were no significant changes of Nur77 expression in the other tested areas. A two way ANOVA yielded a significant effect of the factor “genotype” in the STDL (p=0.023) and in the STDM (p=0.023). Furthermore, a Holm-Sidak's post hoc test confirmed that Nur77 expression is lower in DYN (-/-) than in DYN (+/+) mice in these former regions after the last AMPH challenge. There were significant differences between genotypes within the AMPH-AMPH treatment in all these regions (p< 0.05 (-/-) versus (+/+)). 3.5.5.2 Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration

Our results showed that following the AMPH-AMPH treatment there were significant changes in Nor-1 mRNA expression in the striatum and the nucleus accumbens of both ENK (-/-) and ENK (+/+) mice (fig. 3.9A). They both displayed a significant increase of Nor-1 expression after the expression phase of the behavioral sensitization

202

protocol. Indeed a two way ANOVA showed a significant effect of the treatment in the NAc core (p=0.007), the NAc shell (p=0.024) and the STDM (p=0.014). In addition, in the STDM Nor-1 increase seemed to occur preferentially after the AMPH-AMPH treatment except in ENK (-/-) mice where it also increased following an AMPH-VEH treatment (p=0.05).

Interestingly, when comparing AMPH-AMPH treated animals to VEH-VEH ones, we observed a significant induction of Nor-1 mRNA expression within DYN (+/+) but not within DYN (-/-) mice in the NAc shell, the STDM and the STDL (p<0.05 AMPH-AMPH vs. VEH-VEH; fig. 3.9B).

3.5.6 Effect of chronic AMPH administration on DYN and ENK mRNAs in respectively ENK and DYN knockout mice:

3.5.6.1 DYN mRNA expression after chronic AMPH administration

Following the last AMPH challenge (AMPH-AMPH-treatment; fig. 3.10A), ENK (- /-) mice showed significant lower levels of DYN compared to ENK (+/+) in the NAc core (p=0.001), the NAc shell (p=0.014), in the STDM (p=0.002) and in the STDL (p=0.003). Furthermore, in the STDM of ENK (-/-) mice, we found a decrease of DYN mRNA when comparing AMPH-AMPH treated animals to VEH-VEH treated ones (p=0.008).Thus, the acute AMPH challenge that followed the chronic AMPH pre-treatment had no effect on DYN expression in ENK (+/+) mice but did decrease DYN expression in ENK (-/-) mice.

3.5.6.2 ENK mRNA expression after chronic AMPH administration

Following repeated AMPH administrations, no significant changes were observed in ENK expression in both DYN (-/-) and DYN (+/+) mice (Fig. 3.10B; N=5).

203

3.5.7 Cocaine-induced conditioned place preference induced in ENK and DYN knockout mice:

We also investigated conditioned preference place (CPP) induced by 4-days of conditioning treatment with cocaine (15 mg/kg/day) and evaluated its expression 1 day after the conditioning session (see fig. 3.11A and B). All mouse types developed a preference for the drug-paired side following the conditioning session i.e. we observed an increase of the percentage of time spent in the drug-paired compartment compared to the vehicle-paired compartment (day 6). Indeed all mice displayed a significant increase in the percentage of time spent on drug-paired side between the pre-conditioning (day 1) and the post-conditioning test-phase (day 6) as confirmed by Holm-Sidak’s post-hoc test (for all genotypes day 6 was different than day 1, p<0.05).

Interestingly, we could observe significant differences between (+/+) and (-/-) genotypes in the amplitude of the response. For example, when compared to ENK (+/+), ENK (-/-) mice seemed to have a higher tendency to switch their preference from the vehicle-side to the cocaine-paired side. De facto, there was a more robust and significant increase of the time spent in drug-paired side between the pre-conditioning and post- conditioning phase in ENK (-/-) than in ENK (+/+) mice as illustrated on the figure 3.11C. (p=0.026). Conversely, DYN (-/-) mice displayed a milder increase of the time spent in the drug-paired compartment compared to their (+/+) littermates (Fgenotype x test phase(1,4)

=10.300, p=0.033; Ftest phase(1,4) =59.327, p=0.002; two way ANOVA RM; fig. 3.11D). Indeed, a Holm-Sidak’s post hoc test confirmed a significant difference between DYN (-/-) and DYN (+/+) within post-conditioning (p=0.008).

204

3.6 DISCUSSION

3.6.1 Effect of DYN and ENK deletion on basal motor activity

In the wheel running system apparatus, our results demonstrated that ENK deficient mice had a significant lower basal voluntary locomotor activity than (+/+) mice. Consistently, in the flex field system, the three monitored basal motor activity components (ambulatory activity, rearing and stereotyped behavior) were also found to be slightly but not significantly lower than those of (+/+) mice for each 3 days of the experiment (see supplemental fig. S3.1). These data are concordant with previous studies showing that ENK (-/-) mice displayed a reduced locomotor activity level compared to ENK (+/+) mice in an open field (Bilkei-Gorzo et al., 2004). This could be explained at least in part by our knowledge of the ENK peptide function. It has been demonstrated that ENK stimulate DA neurotransmission thus promoting motor signal (Wood et al., 1980; Wood, 1982). ENK deficient mice locomotor activity is consequently reduced compared to wild-type mice. Consistent with our results, MOR agonists are known to induce an increase of extracellular DA levels in the NAc (Di Chiara and Imperato, 1988; Devine et al., 1993) and induce locomotor activity when injected in the VTA, the NAc or the striatum (Dauge et al., 1988; Cunningham and Kelley, 1992b; Cunningham and Kelley, 1992a; Cunningham and Kelley, 1993; Druhan et al., 1993). It has been also demonstrated that administration of the MOR antagonist CTAP into the NAc core, the striatum or the VTA attenuated cocaine-induced reward and hyperactivity (Soderman and Unterwald, 2008). These results might explain why ENK deficient mice have reduced basal locomotor activity compared to their wild-type counterparts.

In the wheel running system DYN (-/-) mice also displayed lower basal voluntary locomotor activity on day 1 as compared to their (+/+) littermates. Noteworthy, a recent study showed that the constitutive deletion of prodynorphin is associated with decreased basal extracellular DA levels and reduced cocaine-induced DA levels in the NAc as well as a reduced locomotor activity response to an acute cocaine challenge (Chefer and

205

Shippenberg, 2006). Paradoxically it is known that infusion of a selective KOR antagonist into the NAc, a subregion of the ventral striatum, or constitutive deletion of KOR increases dialysate DA levels in the NAc suggesting the existence of a tonically active KOR- mediated system that inhibits the basal activity of mesoaccumbal neurons (Spanagel et al., 1992; Chefer et al., 2005). Knowing that increased extracellular DA levels in the NAc and the subsequent activation of D1 DA receptors underlie the locomotor activation and reinforcing properties of psychostimulant (Wise and Bozarth, 1985; Koob, 1992), these data would rather suggest that KOR agonists (like DYN) have an inhibiting effect on locomotor activity. Thus these data are not in line with our observations since DYN deficient mice displayed a lower locomotor activity than wild-type mice. Chefer and Shippenberg (2006) explain this discrepancy by the fact that constitutive deletion of prodynorphin is associated with functional up-regulation of KOR in DYN (-/-) animals since inhibitory effects of the selective KOR agonist U-6953 on dialysate DA levels in the NAc were augmented in DYN (-/-) mice as compared with (+/+) controls. They hypothesized that decreased basal locomotor activity in DYN deficient mice could be due to the binding of ENK or endorphin (END) to the upregulated KOR in the striatum and NAc since it has been demonstrated that ENK and END could bind to KOR with a lower affinity than DYN. Conveniently, it has been demonstrated that recurrent axon collateral connections in-between MSNs enable an electric communication from the MSNs coexpressing ENK and MOR toward the MSNs coexpressing DYN and KOR (Taverna et al., 2008). Thus in absence of DYN, it could be the upregulation of KOR in the striatum and the NAc and the binding of endogenous ENK or END on this receptor that might explain the lower basal activity observed in our DYN (-/-) mice when compared to (+/+).

3.6.2 Effect of acute AMPH in DYN and ENK knockout mice

The constitutive deletion of ENK or DYN seems to have no major effect on AMPH- induced behavioral activation. Indeed, for an acute AMPH administration, ENK deletion has no influence on the behavioral effects of the drug. Both ENK (-/-) and (+/+) mice displayed an increase of horizontal and vertical motor activity following acute AMPH administration. However the increase in vertical activity is slightly more important in ENK

206

(-/-) mice. The DYN constitutive deletion produced the same results. Both DYN (-/-) and (+/+) mice showed augmented stereotyped behaviors and increased ambulatory and vertical activity after acute AMPH administration. Noteworthy, in DYN (-/-) mice the increase of ambulatory activity is further exacerbated when compared to (+/+) mice.

This could mean that neither the enkephalinergic nor the dynorphinergic opioid systems are involved in the exacerbation of behavioral activity observed after an acute AMPH administration. In the literature, it has been indeed hypothesized that the opioid system neuropeptides intervene only as negative feedbacks to regulate the activation of the pathways in which they are expressed (for review: Steiner and Gerfen, 1998). So, they have no immediate effect after acute AMPH stimulation but will certainly influence the dopaminergic system for the subsequent AMPH administrations.

Consistently with this hypothesis, a large body of evidence showed that acute psychostimulant administration is correlated with an induction of DYN expression in the striatum (Wang and McGinty, 1995; Wang and McGinty, 1996; Turchan et al., 1998). These changes in gene expression have been considered to contribute to the altered responsiveness of striatal neurons to subsequent administration of dopamine stimulants (Nestler and Aghajanian, 1997; Wang and McGinty, 1999). Contrary to the literature there was no increase of DYN in our ENK (+/+) mice. However, acute AMPH induced an increase in DYN expression in the striatum of ENK (-/-) mice. This suggests a form of cross-talk between the two opioid systems.

Thus, the common hypothesis is that psychostimulants-induced increase of DYN acts only to dampen subsequent DA system hyper-activations. Curiously, our DYN (-/-) mice also directly displayed an immediate stronger activation of locomotor activity than DYN (+/+) mice in response to a first acute AMPH injection. This suggests: 1) that DYN constitutive deletion favors an increased sensitivity to acute psychostimulant administration or 2) that DYN induction not only inhibits subsequent activations of the DA system but has also immediate dampening effect on the locomotor activity induced by acute AMPH. This second hypothesis is also confirmed by a study of Mao et al. (2001) which demonstrate that

207 impaired or blocked DYN system contributes to an augmentation of motor stimulation in response to acute administration of psychostimulant. Interestingly since our DYN (-/-) mice displayed lower basal activity, we had previously hypothesized that this decreased activity was due to the binding of other neuropeptides to the up-regulated KOR. However, this could no longer explain why we observed exacerbated locomotor activation following acute AMPH in DYN (-/-). So, there is an apparent contradiction between the lower basal activity and the higher AMPH- induced activity observed in DYN (-/-) mice. However, an explanation of this discrepancy could be brought by the contrasting pattern of Nur77 expression. Indeed the nuclear receptor Nur77, which is also an immediate early gene and a transcriptional factor, is known to be involved in dopaminergic neurotransmission plasticity and in the regulation of D2 receptor affinity (Lévesque and Rouillard, 2007). Its deletion produced increased basal activity and increased AMPH-induced behavioral activity (Gilbert et al., 2006; Bourhis et al., 2009). Interestingly, our present work showed that DYN constitutive deletion induces an increase of Nur77 basal expression in the striatum. And, we have recently shown that Nur77 expression favors a decrease in D2high receptors proportion leading to a dampening of basal locomotor activity (Hodler et al., unpublished data). Thus upregulated Nur77 basal expression could be responsible for the decreased basal activity observed in DYN (-/-) mice. Inversely, acute AMPH provokes a decrease in Nur77 expression in DYN (-/-) compared to (+/+) mice. This decrease in Nur77 expression could favor exacerbated locomotor activity and be responsible for the enhanced locomotor activity observed in DYN (-/-) mice after acute AMPH. DYN could also attenuate the activity induced by acute AMPH induced (Mao et al., 2001) so its deletion consistently exacerbated it.

Noteworthy, both ENK and DYN constitutive deletion alters the expression of Nur77. For example, both ENK (-/-) and DYN (-/-) mice displayed higher basal expression of Nur77 mRNA in the NAc and the striatum dorsal compared to their (+/+) counterparts. So the deletion of either DYN or ENK had the same effect in basal conditions. However, following acute AMPH, the deletion of DYN or ENK seemed to exert opposite effect on Nur77 expression. Indeed, DYN deletion induces a decrease of Nur77 whereas ENK deletion exacerbates acute AMPH-induced Nur77 up-regulation. Considering our results,

208

we could hypothesize that DYN presence is crucial to observe an induction of Nur77 following acute AMPH whereas ENK is not essential to its expression but could influence the amplitude of Nur77 induction.

Interestingly our results also showed that, in wild-type mice, Nur77 induction in response to acute AMPH administration takes place in the MSNs co-expressing DYN. This suggests that ENK deletion could accentuate Nur77 induction that occurs in the GABA/DYN neurons. In addition, the fact that ENK deletion provokes an increased induction of DYN following acute AMPH also strongly suggests a form of cross-talk between the two populations of striatal MSNs, which co-expressed either ENK or DYN.

3.6.3 Effect of chronic AMPH in ENK and DYN knockout mice

3.6.3.1 Behavioral consequences

Repeatedly administered, psychostimulants induce a phenomenon commonly known as behavioral sensitization. This sensitization actually occurred in our wild-type mice but failed to develop in ENK (-/-) and DYN (-/-) mice. In both ENK (-/-) and DYN (-/-) mice, the locomotor activity remained steady after the third AMPH injection. The difference between the (+/+) and the (-/-) mice was particularly important after the 6th injection (day 11). The fact that we observe a difference between the (+/+) and (-/-) mice after a chronic AMPH treatment suggests an implication of both ENK and DYN in the behavioral response to chronic AMPH and in long-term plasticity mechanisms inducing behavioral sensitization. Indeed, our results clearly demonstrate that ENK and DYN are both indispensable to the expression behavioral sensitization since their respective constitutive deletion is sufficient to suppress this phenomenon.

Few studies have investigated the role of ENK in behavioral sensitization. However, it has been suggested that the indirect dopaminergic pathway expressing ENK neuropeptide could play a crucial role in the establishment of this phenomenon. Indeed it has been

209 demonstrated that MOR blockade in the striatum prevent behavioral sensitization to happen (Kalivas et al., 1985; Kalivas et al., 1986). Thus, considering that the ENK neuropeptide is exclusively expressed by the neurons belonging to the basal ganglia indirect output pathway, the integrity of this pathway seems to be crucial to behavioral sensitization. Nevertheless, the results observed in our ENK (-/-) mice contrast robustly with literature data on this subject which rather attribute a preeminent or exclusive role for the direct pathway (and thus for DYN) in drugs sensitization phenomenon (for review: Steiner and Gerfen, 1998; Nestler, 2004).

But, even if previously mentioned studies denied a role for ENK expression in behavioral sensitization, our results strongly indicate that it is needed to observe this phenomenon. Moreover, consistently with our data, Hummel et al. (2006) reported that an antisense oligonucleotide of the MOR attenuated cocaine-induced behavioral sensitization and conditioned reward (Hummel et al., 2006). Furthermore tremendous body of evidence converges in our way showing that ENK opioid system might play a key role in the development of behavioral sensitization. Indeed, it has been shown that MOR agonists augmented the intracellular DA levels in the Nac (Di Chiara and Imperato, 1988; Devine et al., 1993) and induced locomotor activity when injected in the VTA and the NAc (Dauge et al., 1988; Cunningham and Kelley, 1992b; Druhan et al., 1993). In addition, Morales-Mulia et al. (2007) showed that AMPH induces changes in ENK neurotransmission could be linked to the neuroadaptations underlying behavioral sensitization (Morales-Mulia et al., 2007).

However, a large body of evidence has occulted ENK role in behavioral sensitization because its expression was not altered after repeated AMPH treatment (for review: Steiner and Gerfen, 1998). In accordance with these studies, in our DYN (+/+) and ENK (+/+) mice, we did not observe any changes in ENK expression following chronic AMPH administration. This seems contradictory with ENK postulated role in behavioral sensitization. However, even if ENK expression does not exhibit changes when exposed to chronic AMPH, this doesn’t mean that ENK function is not involved in behavioral sensitization. Indeed ENK function could be upregulated or downregulated depending on

210

the expression levels of its receptors. In fact, numerous studies have demonstrated that ENK-selective MOR and DOR are up-regulated in the VTA or in the NAc shell of animals exhibiting behavioral sensitization to psychostimulants (Unterwald, 2001; Unterwald et al., 2001; Magendzo and Bustos, 2003; Mathon et al., 2005a; Mathon et al., 2005b). It has also been demonstrated that the DOR are probably selectively implicated in the induction of behavioral sensitization whereas the MOR are more specifically involved in the expression phase (Heidbreder et al., 1995; Sala et al., 1995; Balcells-Olivero and Vezina, 1997). This suggests that, following chronic AMPH, ENK basal/constitutive expression have a greater excitatory effect on DA neurotransmission thanks to its receptors upregulation. Thus, the increased binding probability of ENK to its receptors insured by MOR and DOR chronic AMPH-induced over-expression, could contribute to the sensitization of locomotor activity induced by psychostimulants. Therefore, we may hypothesize that ENK expression is necessary for the development of behavioral sensitization.

We also found that DYN deficient mice did not show behavioral sensitization. This could be contradictory given that several studies rather suggest that KOR agonist (like DYN) have an inhibiting effect on locomotor activity (Wise and Bozarth, 1985; Koob, 1992). Nevertheless, other studies may bring another explanation for our results. Indeed, the KOR-mediated DYN neurotransmission undergoes adaptations following psychostimulants administration (Shippenberg et al., 2001). For example, following acute or repeated injections of AMPH, DYN mRNA levels usually increase in (+/+) mice, while KOR receptors binding is decreased (Turchan et al., 1998). Furthermore, acute AMPH exposure selectively desensitizes KOR in the NAc (Xia et al., 2008).

Moreover, the fact that our DYN deficient mice had lower locomotor activity following AMPH chronic administrations, suggests that, in this context, DYN expression or induction exerts excitatory effect on locomotor activity. Consistently, it has been demonstrated that DYN could elicit motor effects instead of dampening them (Walker et al., 1982; Nakazawa et al., 1989; Shukla et al., 1997; Wollemann and Benyhe, 2004; Kuzmin et al., 2006). It has also been showed that i.c.v administration of DYN in mice provoked marked dose-dependent motor effects characterized by wild running, jumping,

211 circling and/or barrel rolling (Shukla et al., 1997). Indeed, in case of repeated DAergic overstimulation, a switch intervenes in DYN function. DYN could bind on NMDA and potentiate its function which results in the stimulation of MSNs (Shukla et al., 1997). Moreover, Chefer and Shippenberg (2006) obtained similar results since their DYN (-/-) mice displayed decreased locomotor activity in response to chronic cocaine administration. Thus, DYN was shown to produce both inhibitory (Wagner et al., 1993) and stimulatory (Walker et al., 1982) effects on the central nervous system. The inhibitory effects require the participation of KOR, whereas the stimulatory effects may involve non-opioid mechanisms. These findings are noteworthy as they add to a growing body of evidence indicating that the locomotor-activating effects of psychostimulants are mediated, at least in part, by DA-independent mechanisms (Trujillo and Akil, 1995; Wolf, 1998; Zweifel et al., 2008). One of the non-opioid mechanisms related to DYN is thought to be mediated by its binding to NMDA receptor and to the potentiation of this receptor excitatory function (Massardier and Hunt, 1989; Bakshi and Faden, 1990; Shukla and Lemaire, 1994; Shukla et al., 1997; Lai et al., 1998; Hauser et al., 1999; Wollemann and Benyhe, 2004; Kuzmin et al., 2006; Voorn et al., 2007; Schwarzer, 2009). Interestingly it has been hypothesized that NMDA receptor activation could mediate the locomotor-activating effects of cocaine and the sensitization that develops to its effect (Pulvirenti et al., 1994). Therefore, we could hypothesized that, in DYN (-/-) mice, the decreased NMDA function resulting from loss of DYN, might also be a possible candidate mechanism to explain the decreased locomotor response to chronic AMPH and the non-development of behavioral sensitization observed in our mice.

3.6.3.2 Biochemical consequences and implications

3.6.3.2.1 Role of Nur77 in AMPH-induced sensitization

Recent works in our laboratory underlined Nur77 participation in the homeostasis of DAergic system. Indeed Nur77 deletion provokes exacerbated behavioral response to DA agonists (Bhardwaj et al., 2003; St-Hilaire et al., 2003; Ethier et al., 2004a, 2004b). Also, Nur77 (-/-) mice are spontaneously hyperactive and more sensitive to DA agonists (Gilbert

212

et al., 2006; St-Hilaire et al., 2006). As a consequence, we hypothesized that Nur77 could be one of the different factors implicated in behavioral sensitization and could possibly be affected by the deletion of DYN or ENK and by AMPH treatment.

Interestingly, ENK (+/+) and DYN (+/+) mice, which develop chronic AMPH-induced exacerbated locomotor activity, present an induction of Nur77 expression in the dorso- medial striatum and the NAc following expression phase (AMPH-AMPH) compared to their (-/-) counterparts. This is in line with recent works in our laboratory showing that Nur77 induction intervenes in case of exaggerated DAergic stimulation to dampen subsequent DAergic activation (Hodler et al., unpublished data). Indeed, these related studies showed that Nur77 deletion potentiates AMPH-induced locomotor activity sensitization. Nur77 deletion also blocks the occurrence of stereotyped behavior which usually takes place after longer period of repeated AMPH exposure (Bourhis et al., 2009; Hodler et al, unpublished data). Consequently, Nur77 seemed to be essential to the dampening of DAergic activation but also to the development of stereotyped behaviors. Hence, it has been hypothesized that induction of stereotyped behavior has a protective role. It could prevent further excessive increase of locomotor activity, and accordingly exhaustion, in case of prolonged repeated psychostimulants exposition (Randrup and Munkvad, 1969; Ferrario et al., 2005; Bourhis et al., 2009). Thus, we could also hypothesize that in our DYN (+/+) and ENK (+/+) mice, Nur77 levels increase intervenes following the expression phase to counter a subsequent over-stimulation of the DA system. In ENK (-/-) and DYN (-/-) we did not observe such increase perhaps because they did not develop exacerbated locomotor activity. Interestingly, following chronic AMPH, ENK deletion tends to block Nur77 induction whereas DYN deletion induces a decrease of Nur77 expression. Thus, our results demonstrate for the first time that Nur77 expression could be modulated by the presence or absence of ENK and DYN.

3.6.3.2.2 Role of Nor-1 in AMPH-induced sensitization

Recent work in our laboratory had shown a positive correlation between Nor-1 expression and the development of excessive ambulatory activity (Hodler et al. unpublished

213 data). Indeed, in this work, wild-type mice display an induction of Nor-1 during the sensitization phase of behavioral sensitization. In contrast, mice deficient for Nor-1 gene did not display a progressive increase of locomotor activity following repeated AMPH treatment contrary to wild-type mice. Consequently, we hypothesized that Nor-1 induction could be responsible for the development of behavioral sensitization (Hodler et al, unpublished data). In addition a study on rodents by Werme et al. (2000) also suggests that, after a chronic psychostimulant administration, it is the increased levels of Nor-1 expression in the striatum which reflects a neuronal adaptation to a sensitized state to addictive drugs (Werme et al., 2000).

In this study we also established that there was a close relationship between Nor-1 induction and the trigger of ENK biosynthesis.

Consistent with these data, our DYN (+/+) and ENK (+/+) mice, which displayed locomotor activity sensitization, also show an induction of Nor-1 expression in the dorso- medial striatum and the NAc. This confirmed that Nor-1 induction might be involved in behavioral sensitization. Consistently, following chronic AMPH, our DYN (-/-) mice exhibit neither behavioral sensitization nor augmented expression of Nor-1. This suggests that Nor-1 induction is conditioned to the presence of DYN and is necessary to the induction of locomotor activity sensitization.

However, in our ENK (-/-), which also do not exhibit behavioral sensitization, we nonetheless observed an induction of Nor-1. This could mean that the deletion of ENK blocks the behavioral effects of Nor-1 induction. This could mean that behavioral consequences of Nor-1 induction could only be effective if ENK is expressed.

This also further suggests that Nor-1 could act upstream from ENK to directly or indirectly modulate its function. Thus we could hypothesize that Nor-1 regulate ENK expression. However in (+/+) mice which over-expressed Nor-1 following the expression phase, we did not observe any changes in ENK expression. This means that Nor-1 did not affect ENK expression. However, studies had shown that an upregulation of MOR and

214

DOR in response to chronic AMPH (see above). Therefore we could hypothesize that Nor- 1 exerts its modulation on ENK function by regulating MOR and/or DOR expression. As a consequence, it would be of great interest to find out whether the promoters of MOR and DOR genes contain specific response elements for the Nurs.

Thus, our data seemed to indicate that DYN is essential to Nor-1 upregulation and that Nor-1 induction effects (i.e. the expression of behavioral sensitization) could only happen conditionally to the presence of DYN. As a consequence these data further confirmed the interaction between the striatal neuropeptide and the nuclear receptor Nor-1 but also between DYN and ENK neurotransmission.

3.6.3.2.3 Relationship between DYN and ENK expression

A consensus has emerged that DYN modulation had a crucial role in behavioral sensitization. It has been demonstrated that repeated administration of indirect or direct dopamine agonists results in increased synthesis of the opioid peptide preprodynorphin (PDYN) in the NAc and the striatum (Hanson et al., 1988; Li et al., 1988; Trujillo et al., 1990; Gerfen et al., 1991; Hurd et al., 1992; Daunais et al., 1993; Cole et al., 1995; Turchan et al., 1998). Similarly, it is now known that KOR agonists could inhibit the behavioral activation and DA neurotransmission induction which normally take place after acute or chronic cocaine administrations (Heidbreder et al., 1995; Shippenberg et al., 1996; Schenk and Partridge, 2001). In addition, these KOR agonists provoke a decrease of the neurochemicals effects of AMPH (Tzaferis and McGinty, 2001). Also, recent studies have shown that the administration of a KOR antagonist or the constitutive deletion of this receptor could accentuate the behavioral and dopaminergic responses to acute cocaine administration (Chefer et al., 2005; Chefer and Shippenberg, 2006).

Taken together, these data suggest that DYN exerts a negative feedback on the VTA and SN neurons to down-regulate the function of the neurons which synthesize it. The commonly admitted thesis is that the increase of DYN mRNA levels induced by repeated psychostimulants administration would provoke a hyperactivation of the negative feedback ensured by DYN which would progressively leads to a loss of its efficiency. According to

215

Nestler et al (2004), the DYN feedback malfunction could be due to the ∆FosB-induced down-regulation of DYN and would be responsible for behavioral sensitization. In fact, they have demonstrated that the transcription factor ∆FosB progressively accumulates in the NAc and the striatum in response to repeated psychostimulants exposure. They consequently thought that a down-regulation of DYN is responsible for locomotor activity sensitization (for review: Nestler et al., 2001).

However, our data are in contradiction with this view. Our results show that following chronic AMPH treatment, ENK (-/-) mice displayed no behavioral sensitization and showed a decrease of DYN mRNA levels. In contrast, in our (+/+) mice, which exhibited behavioral sensitization, there was an increase of DYN in the striatum and the NAc. We also show that DYN deletion blocks the development of behavioral sensitization. This rather suggests that, in the context of chronic psychostimulant exposure, DYN induction promotes the increase of locomotor behavior and not its inhibition. All these data suggest that DYN increase is necessary for the development of incremented locomotor activity observed in wild-type mice. Indeed, contrary to what is commonly hypothesized, our results suggest that it is the induction of DYN and not its decrease that is responsible for behavioral sensitization. As a consequence, our results further confirmed the hypothesis of an excitatory role of DYN in the context of repeated DAergic overstimulation. As previously discussed, this could be explained by the non-opioid mechanism of action of DYN (Shukla et al., 1997).

Consequently, the reason why our ENK deficient mice did not display behavioral sensitization could be also explained by the fact that in these mice DYN expression remained at its basal level following repeated AMPH administration. This also suggests a form of cross-talk between the ENK and the DYN neurotransmission. Indeed, the presence of ENK seems to be necessary to observe this DYN induction. Hence, it means that ENK could modulate DYN expression via a certain mechanism left to determine. On the contrary, ENK expression is not modulated by DYN expression since DYN (-/-) mice showed no changes in ENK basal and AMPH-induced expression. Accordingly, it has been demonstrated that recurrent axon collaterals connections in-between MSNs enable an

216

important electric communication from the MSNs coexpressing D2 receptor, ENK and MOR toward the MSNs coexpressing D1 receptor, DYN and KOR but not in the opposite direction. Indeed, this study revealed that unidirectional connections were common between both D1 receptor-expressing MSNs (D1 MSN) pairs (26%) and D2 receptor- expressing MSNs (D2 MSNs) pairs (36%). D2 MSNs also commonly formed synapses on D1 MSNs (27% of pairs). Conversely, only 6% of the D1 MSNs formed detectable connections with D2 MSNs (Taverna et al., 2008). Our results showed that these anatomical characteristics could also be extended to the transcriptional activity.

3.6.4 Cocaine-induced conditioned place preference in ENK and DYN knockout mice:

Appetitive and hedonic states are modulated by MOR and KOR. MOR agonists are usually rewarding whereas KOR agonists given acutely produce aversive effects (Kreek, 1987; Skoubis et al., 2005; Carey et al., 2007; Wee and Koob, 2010). This is corroborated by experiments performed on ENK deficient mice investigating the development of dependence following a chronic treatment with a drug of abuse belonging to the cannabinoid family (Δ9-tetrahydrocannabinol). Moreover, it has been hypothesized that MOR play a role in the maintenance of drug use, as well as craving and relapse (Gerrits et al., 2003; Lesscher et al., 2003). ENK action on MOR and DOR produces rewarding actions in several brain region including the VTA and the NAc (McBride et al., 1999) whereas inactivation of genes coding for MOR or ENK attenuates reward elicited not only by opioid drugs but also by alcohol and nicotine (Gieryk et al., 2010). Consistently, it has been shown that cocaine-induced CPP is blocked by selective DOR (naltrindole) or MOR antagonists (Suzuki et al., 1994a; Schroeder et al., 2007). Thus, CPP to addictive drugs and the normal function of the reward circuitry seem to be altered in ENK deficient mice. As for DYN function, its aversive role has been further confirmed by studies which demonstrate that pre-treatment with KOR agonists prevents the development of cocaine- induced CPP in mice and rats (Suzuki et al., 1992; Zhang et al., 2004; Bruijnzeel, 2009).

217

Considering these facts, we should have observed no behavioral sensitization in ENK (- /-) mice and a marked CPP for DYN (-/-). Consistent with these data, our results showed that in absence of DYN, we observed the development of a CPP for cocaine. However, this CPP was less marked than in (+/+) mice. In fact, even if acute administrations of KOR agonists suppress cocaine self-administration and CPP, recent reports have shown that chronic administrations paradoxically potentiate cocaine reward in a manner prevented by KOR antagonists (Negus, 2004; McLaughlin et al., 2006; Carey et al., 2007). Thus DYN deletion effect could be easily explain by the fact that it is only the appetitive signals produced by ENK binding to its MOR that intervene and had reinforced the preference for the cocaine-associated compartment in our DYN (-/-) mice but since DYN was absent the further potentiation of cocaine reward did not occurred. This could explain why both DYN (-/-) and (+/+) mice develop a CPP for cocaine but with (+/+) mice having a greater preference for the cocaine-paired side than DYN (-/-) mice.

Nevertheless, the most conflicting results were obtained with our ENK deficient mice. Indeed we saw no real difference between (+/+), DYN (-/-) and ENK (-/-) mice in place conditioned preference to cocaine since all mouse strains did develop a preference for the drug-associated compartment following cocaine conditioning. Surprisingly, our ENK (-/-) mice did display CPP for cocaine in a more marked way than (+/+) mice. Nevertheless, it has been demonstrated that an abnormal striatal enkephalinergic system was directly correlated with an augmented vulnerability to drugs of abuse (Petkov et al., 1985; Raab et al., 1985; Teskey and Kavaliers, 1988; Froehlich and Li, 1994; Kreek, 1996; Herz, 1998). We could hypothesize that this could either be due to compensatory effects consequent to the constitutive deletion of the neuropeptide ENK and/or to the chronic KOR agonists’ appetitive effects reported previously. Thus, this suggests that in the absence of ENK, DYN would bind more efficiently on MOR and partially replace ENK function. Also given that chronic KOR agonists enhanced cocaine reward, the concomitant action of DYN on both MOR and KOR produced an exacerbated preference for cocaine in ENK (-/-) mice. This might explain why both ENK (-/-) and DYN (-/-) mice displayed CPP for the drug- associated compartment.

218

This also shows that DYN could influence ENK function directly or indirectly. On the contrary, the reciprocal effect seems to be improbable since the absence of DYN seemed not to be compensated by a hypothetic binding of ENK on KOR. Also, we know that following repeated administration of psychostimulant there is an increase in DYN expression and no perceptible change in ENK expression. Thus, we could hypothesized that after repeated psychostimulant administration DYN neuropeptides finally outnumbered ENK neuropeptides and can act on MOR but inversely the fact that ENK is poorly enhanced does not authorized an equivalent reciprocal effect.

3.7 CONCLUSION

To conclude, both ENK and DYN seem to play a role in basal locomotor activity since their deletion results in reduced locomotor activity levels. In addition, DYN seemed to have opposite effects in response to acute versus chronic AMPH administration. It has inhibitory effect on acute-AMPH induced locomotor activity whereas it has excitatory effect on locomotor activity after chronic AMPH. Indeed its deletion exacerbates acute- AMPH behavioral activation whereas it prevents chronic AMPH-induced behavioral sensitization. In contrast, ENK is not involved in the acute effects of AMPH since its deletion does not alter acute-AMPH induced behavioral activation. However, contrary to commonly accepted hypothesis, this study strongly suggests that striatal ENK expression plays an essential role in psychostimulant-induced sensitization. Similarly to DYN, ENK presence is indispensable to observe AMPH-induced behavioral sensitization. Since ENK is mainly expressed in the indirect, dopamine receptors D2-mediated striatal output pathway it also suggests that the biochemical integrity of this pathway might be essential for the development of behavioral sensitization by psychostimulants. Our results also suggest a form of cross-talk between the indirect and the direct striatal output pathways. Also, since Nur77 and Nor-1 are differentially modulated in ENK (-/-) and DYN(-/-) mice, this suggests that the expression of these transcription factors belonging to the nuclear receptors superfamily might also play an important role in behavioral sensitization. Thus, this study demonstrate that the neuropeptides DYN, ENK and the nuclear receptor Nur77 and Nor-1 expression shared an intimate relationship and are all crucial actors in the molecular cascade leading to psychostimulant-induced behavioral sensitization.

219

3.8 FIGURES AND LEGENDS

A. 10000 ENK (+/+) * ENK (-/-)

7500 * *

5000

2500 Distance (m)/18 Distance (m)/18 hrs -period

0 Day #1 Day #2 Day #3

B. 10000 DYN (+/+) DYN (-/-) # 7500

5000

2500 Distance(m)/18 hrs Distance(m)/18 -period

0 Day #1 Day #2 Day #3

Figure 3.1

220

Figure 3.1: Basal locomotor activity measured in ENK and DYN knockout mice. A. Basal locomotor activity of ENK knockout mice: ENK (-/-) mice showed a significantly lower basal activity as compared to their (+/+) littermates (*p< 0.05, N=8 per group). There is a significant difference in their behavior according to the factor day (p< 0.001) and an effect of the factor genotype (p= 0.013). B. Basal locomotor activity of DYN knockout mice: DYN (-/-) mice displayed a significantly lower basal activity as compared to their (+/+) counterparts at day #1 (# p=0.006, N=8 per group) but is similar to DYN (+/+) at day #2 and #3.

221

A. B.

15000 15000 # # * # 10000 10000 #

5000 5000 horizontal activity activity horizontal Horizontal activity 0 0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH ENK (+/+) ENK (-/-) DYN (+/+) DYN (-/-)

C. D.

1400 * 1400 # # # 1050 1050 #

700 700

350 350

0 0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Non-ambulatory activityNon-ambulatory Non-ambulatory activityNon-ambulatory ENK (+/+) ENK (-/-) DYN (+/+) DYN (-/-)

E. F.

300 300

200 200 # #

100 100 Vertical activity Vertical activity

0 0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH DYN (+/+) DYN (-/-) ENK (+/+) ENK (-/-)

Figure 3.2

222

Figure 3.2: Comparison of acute AMPH induced activities in ENK and DYN knockout mice. We evaluated horizontal locomotor activity (A and B), non-ambulatory activity (C and D) and vertical activity (rearings) (E and F). Histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH; N=4 per group). These results indicate that ENK (-/-), DYN (-/-) and (+/+) mice all show an increase of ambulatory activity after the AMPH injection. However, following AMPH administration, DYN (-/-) mice mean ambulatory activity increase is exacerbated compared to their (+/+) littermates. Furthermore, ENK (-/-), DYN (-/-) and (+/+) mice do show an increased non-ambulatory activity compared to VEH-treated animals. Interestingly, ENK (-/-) mice displayed a significantly higher increase of stereotyped behavior after the AMPH treatment. ENK (-/-) and (+/+) mice did not differ in vertical activity and AMPH treatment had no effect on it. However, DYN (-/-) and their (+/+) littermates did display an increase of their vertical activity following AMPH-treatment.

223

A. Accumbens Core Accumbens Shell

1,5 1,5 * * 1,0 1,0 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of Ci/g tissue) μ μ 0,5 0,5

0,0 0,0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( ENK (+/+) ENK (-/-) Nur77 mRNA ( ENK (+/+) ENK (-/-)

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral * 1,5 # 1,5 * # # 1,0 1,0 # Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g μ μ

0,5 0,5

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH ENK(+/+) ENK(-/-) ENK(+/+) ENK(-/-) B. Accumbens Core Accumbens Shell 1,5 1,5

1,0 1,0 Ci/g of tissue) of Ci/g tissue) Ci/g of tissue) of Ci/g tissue) μ μ

0,5 0,5

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH Nur77 mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH DYN (+/+) DYN (-/-) DYN (+/+) DYN (-/-)

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 1,5 1,5 * # 1,0 1,0

Ci/g of tissue) of Ci/g tissue) # * Ci/g of tissue) of Ci/g tissue) μ μ # 0,5 0,5

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( DYN(+/+) DYN(-/-) DYN(+/+) DYN(-/-)

Figure 3.3

224

Figure 3.3: Nur77 mRNA expression after acute AMPH administration in A: ENK knockout mice and in B: DYN knockout mice. A. ENK (-/-) mice (N=5) showed significant higher levels of Nur77 compared to ENK (+/+) mice in every tested areas both following VEH and AMPH treatment (* p< 0.05 versus (+/+)). There was a significant effect of the AMPH treatment in the dorsal striatum for both ENK (-/-) and ENK (+/+) (# p< 0.05 versus VEH). B. Interestingly, DYN (-/-) mice also showed significant difference in Nur77 expression in VEH-treated animals, its level is significantly higher than in (+/+) mice in the dorsal striatum (* p< 0.05 versus (+/+)). Furthermore, we observed an induction of Nur77 following acute AMPH in the STDM of DYN (+/+) mice (# p< 0.05 versus VEH). On the contrary, DYN (-/-) mice displayed a significant decrease of Nur77 expression after acute AMPH administration in the dorsal striatum (# p< 0.05 versus VEH). In addition, Nur77 expression levels in DYN (-/-) were also significantly lower than in DYN (+/+) after the AMPH-treatment treatment in the dorsal striatum (* p< 0.05 versus (+/+)).

225

AB StDM StDL 125 VEH 125 AMPH 100 * 100 * 75 75

50 50 (% of control) mRNA co-expression 25 25

Nur77 0 0 ENK SP ENK SP

Figure 3.4

226

Figure 3.4: Nur77 mRNA colocalization with SP or ENK after acute AMPH administration in wild-type mice. In basal conditions Nur77 is preferentially expressed in the MSNs that co-expressed D1 receptors, DYN and SP than in the MSNs co-expressing D2 receptors, ENK and NT. In addition, following AMPH administration, Nur77 induction also occurs in the MSNs co-expressing D1 receptors, DYN and SP (* p<0.05 versus VEH).

227

A. ENK (+/+) ENK (-/-) VEH AMPH VEH AMPH

NAc

Striatum

B. Accumbens Core Accumbens Shell * 1,8 1,8 #

1,2 * 1,2 # Ci/g of tissue) of Ci/g μ Ci/g of tissue) μ 0,6 0,6

0,0 DYN mRNA ( 0,0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH DYN mRNA DYN mRNA ( ENK (+/+) ENK (-/-) ENK (+/+) ENK (-/-)

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral

0,9 0,9 * 0,6 # 0,6 * # Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) μ μ 0,3 0,3

0,0 0,0 VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH VEH AMPH DYN mRNA DYN mRNA ( DYN mRNA DYN mRNA ( ENK (+/+) ENK (-/-) ENK (+/+) ENK (-/-)

Figure 3.5

228

Figure 3.5: DYN mRNA expression after acute AMPH administration in ENK knockout mice. A. Example of DYN mRNA in situ hybridization staining after both VEH or AMPH treatment on brain sections of ENK (+/+) and ENK (-/-) mice. B. DYN mRNA expression after acute AMPH administration in the NAc (Core and Shell) and Striatum (Striatum dorso-medial and dorso-lateral) of ENK knockout mice and ENK (+/+) mice. ENK (+/+) mice have a significant higher basal level of DYN than ENK (-/-) mice in the NAc core and shell and the striatum dorso-medial (* p<0.05 versus (+/+)). Following acute AMPH, only ENK (-/-) mice displayed a robust increase of DYN expression in every tested areas when compared to VEH-treated animals (# p<0.05 versus VEH. And, considering the same regions, AMPH-treated ENK (-/-) mice showed a significantly higher level of DYN than their (+/+) littermates (* genotype X treatment, p<0.05).

229

A. B. Sensitization phase Expression phase ENK(+/+)-AMPH (2,5mg/kg) Inj #6 ENK(-/-)-AMPH (2,5mg/kg) 40000 ENK(+/+)-VEH # * 40000 ENK(-/-)-VEH ¤ 30000 30000 # * 20000 20000 # Horizontal activity activity Horizontal 10000 activity Horizontal 10000

0 0 inj #1 inj #2 inj #3 inj #4 inj #5 VEH AMPH VEH AMPH ENK (+/+) ENK (-/-)

C. D. Sensitization phase Expression phase Inj #6 1 500 1500

1 000 1000

500 500 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory 0 0 VEH AMPH VEH AMPH inj #1 inj #2 inj #3 inj #4 inj #5 ENK (+/+) ENK (-/-)

E. F. Sensitization phase Expression phase Inj #6 600 # 600 #

400 400 #

200 200 Vertical activity Vertical activity # #

0 0 inj #1 inj #2 inj #3 inj #4 inj #5 VEH AMPH VEH AMPH ENK (+/+) ENK (-/-)

Figure 3.6

230

Figure 3.6: Chronic AMPH administration-induced activities in ENK knockout mice. Graphs and histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period that followed each injection (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice; # p<0.05 AMPH vs. VEH, ¤ p<0.05 vs. inj #5). Sensitization phase: ENK (-/-)-AMPH: N=17; ENK (+/+)-AMPH; ENK (-/-)- VEH and ENK (+/+)-VEH: N=8. Expression phase: N=8 per group. A. and B. Ambulatory activity - sensitization and expression phase: ENK (+/+) mice displayed a behavioral sensitization whereas ENK (-/-) mice did not. Moreover, in AMPH-treated animals, the ambulatory activity of ENK (+/+) mice became significantly higher than their (-/-) counterparts after the fifth and the sixth injection. C. and D. Non-ambulatory activity - sensitization and expression phase: Following repeated AMPH treatment, non-ambulatory activity scores did not change in both ENK (-/-) and ENK (+/+) mice. E. and F. Vertical activity - sensitization and expression phase: Vertical activity scores (rearings) had a tendency to evolve similarly in ENK(+/+) and (-/-) mice. The vertical activity scores robustly decreased following an AMPH treatment when compared to VEH-treated animals. And, the differences between VEH and AMPH treatment were stronger in ENK (-/-) mice. However, in (+/+) mice this decrease is only slightly incremented by the repeated AMPH injections from inj #1 to inj #5 whereas AMPH-treated (-/-) mice present a significant decrease of their activity compared to inj #1. Finally, in the expression phase of AMPH-treated animals, ENK (-/-) had a significant lower vertical activity than their (+/+) counterparts.

231

A. B. Expression phase Sensitization phase Inj #6 DYN(-/-)-AMPH (2,5mg/kg) DYN(+/+)-AMPH (2,5mg/kg) DYN(+/+)-VEH 40000 40000 * DYN(-/-)-VEH # 30000 # 30000 ¤

20000 20000 #

* Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity 10000 * # 10000

0 0 inj #1 inj #2 inj #3 inj #4 inj #5 VEH AMPH VEH AMPH DYN (+/+) DYN (-/-)

C. D. Sensitization phase Expression phase Inj #6 1 500 # 1500 * 1 000 1000

500 500 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

0 0 VEH AMPH VEH AMPH inj #1 inj #2 inj #3 inj #4 inj #5 DYN (+/+) DYN (-/-)

E. F. Sensitization phase Expression phase Inj #6 # 500 500 #

400 400 #

300 300

200 200 Vertical activity Vertical activity 100 100

0 0 inj #1 inj #2 inj #3 inj #4 inj #5 VEH AMPH VEH AMPH DYN (+/+) DYN (-/-)

Figure 3.7

232

Figure 3.7: Chronic AMPH administration-induced activities in DYN knockout mice. Graphs and histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period that followed each injection (* p<0.05 (-/-)-AMPH vs. (+/+)-AMPH mice, N=5 per VEH group and N=8 per AMPH group for DYN (-/-) vs. DYN (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH, ¤ p<0.05 vs. inj #5). A. and B. Ambulatory activity - sensitization and expression phase: DYN (+/+) mice displayed a behavioral sensitization whereas DYN (-/-) mice did not. Indeed, DYN (-/-) ambulatory activity did increase only following the 4 first injections but then dropped abruptly after the fifth injection and in the expression phase (sixth injection). Moreover, in AMPH-treated animals, the ambulatory activity of DYN (+/+) mice was significantly higher than their (-/-) counterparts for the second, the third, the fifth and the sixth injection. C. and D. Non-ambulatory activity - sensitization and expression phase: Following repeated AMPH treatment, non-ambulatory activity scores did not change in both DYN (-/-) and DYN (+/+) mice. E. and F. Vertical activity - sensitization and expression phase: Following repeated AMPH injection, the vertical activity of both DYN (+/+) and DYN (-/-) mice significantly decreased compared to their VEH-treated counterparts but there was no difference between the AMPH-induced vertical activity of (+/+) and (-/-).

233

A. ENK (+/+) ENK (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 1,2 1,2 # * # *

0,8 0,8 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) μ μ

0,4 0,4 Nur77 mRNA Nur77 mRNA (

0,0 Nur77 mRNA ( 0,0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 1,8 1,8

1,2 * 1,2 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ μ 0,6 0,6

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA (

veh-veh amph-veh amph-amph Nur77 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

B. DYN (+/+) DYN (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell

1,2 1,2 ¤ * * 0,8 0,8 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g ¤ * μ μ

0,4 0,4

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 1,8 1,8 ¤ * ¤ * 1,2 1,2 Ci/g of Ci/g tissue) of Ci/g tissue) μ μ

0,6 0,6

0,0 0,0 Nur77 mRNA Nur77 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph Nur77 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

Figure 3.8

234

Figure 3.8: A. Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration in ENK knockout mice. Following repeated AMPH administrations, ENK (+/+) mice (N=5) showed an increase of Nur77 expression in every tested areas but especially in the nucleus accumbens (# p< 0.05 versus VEH- VEH). Indeed there was a significant difference between treatments AMPH-VEH and AMPH- AMPH within the genotype (-/-) (p< 0.001). Furthermore, when we compared animals that have received the last AMPH challenge (treatment AMPH-AMPH), ENK (-/-) mice displayed significant lower levels of Nur77 in every regions of the nucleus accumbens and in the dorso-medial striatum (# p< 0.05 versus (+/+)). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

B. Nur77 mRNA expression after chronic AMPH administration in DYN knockout mice. In the NAc and the dorsal striatum of DYN (-/-) mice, there were significant lower levels of Nur77 expression following AMPH-AMPH treatment when compared to DYN (+/+) mice (* p< 0.05 versus (+/+); ¤ p< 0.05 versus AMPH-VEH). However, there were no significant changes of Nur77 expression in the other tested areas. We observed a significant effect of the factor “genotype” in the STDM (p=0.023) and in the STDL (p=0.023). Indeed there were significant differences between genotypes within the AMPH-AMPH treatment in this region, which confirmed that Nur77 expression is lower in DYN (-/-) than in DYN (+/+) mice after the last AMPH challenge (* p< 0.05 versus (+/+)). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

235

A. ENK (+/+) ENK (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 0,4 # 0,4 ¤ ¤ 0,3 0,3 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g μ 0,2 0,2 μ

0,1 0,1

0,0 0,0 Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph Nor-1 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 0,4 ¤ 0,4

0,3 * 0,3 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g μ μ 0,2 0,2

0,1 0,1

Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( 0,0

Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( 0,0 veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

B. DYN (+/+) DYN (-/-)

Accumbens Core Accumbens Shell 0,4 0,4 # 0,3 0,3 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) μ μ 0,2 0,2

0,1 0,1

0,0 0,0 Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( Nor-1 mRNA mRNA Nor-1 ( veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral # 0,4 0,4

0,3 0,3 # Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) Ci/g of Ci/g tissue) μ

μ 0,2 0,2 * 0,1 0,1

0,0 0,0 Nor-1 mRNA mRNA Nor-1 ( Nor-1 mRNA Nor-1 mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph veh-veh amph-veh amph-amph

Figure 3.9

236

Figure 3.9: A. Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration in ENK knockout mice. Following AMPH-AMPH treatment, ENK (-/-) and ENK (+/+) mice (N=5) both showed a significant induction of Nor-1 expression in several areas of the nucleus accumbens and the striatum (# p< 0.05 versus VEH-VEH; ¤ p< 0.05 versus AMPH-VEH). There was a statistically significant effect of the factor “treatment” in the NAc core (p=0.007), the NAc shell (p=0.024) and the STDM (p=0.014). Moreover, in the STDM we observed increased levels of Nor-1 within ENK (- /-) mice, but not within the (+/+) genotype, in AMPH-VEH treated animals when compared to the VEH-VEH treated ones (*p< 0.05 versus (+/+)). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

B. Nor-1 mRNA expression after chronic AMPH administration in DYN knockout mice. Following the AMPH-AMPH treatment and compared to VEH-VEH treated animals, we observed a significant induction of Nor-1 mRNA expression within DYN (+/+) in the NAc shell, the STDM and the STDL. In comparison, the AMPH-AMPH treatment did not induce a significant increase of Nor- 1 mRNA within DYN (-/-) mice especially in the dorsal striatum (N=5; # p< 0.05 versus VEH-VEH; * p< 0.05 versus (+/+) mice). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

237

A. ENK (+/+) ENK (-/-)

Accumbens Core Accumbens Shell 0,8 * * * 1,8 * 0,6 # 1,2

Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ 0,4 Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ 0,6 0,2

DYN mRNA DYN mRNA ( 0,0 0,0

veh-veh amph-veh amph-amph DYN mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 0,8 0,3 0,6 * 0,2 Ci/g of tissue) of tissue) Ci/g

μ 0,4 * Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g # μ 0,1 0,2

DYN mRNA DYN mRNA ( 0,0 0,0 veh-veh amph-veh amph-amph DYN mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

B. DYN (+/+) DYN (-/-) Accumbens Core Accumbens Shell 5 5 4 4 3 3 Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ

2 μ 2 1 1

0 0 ENK mRNA ENK mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph ENK mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

Striatum dorso-medial Striatum dorso-lateral 5 5

4 4

3 3 Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) Ci/g of tissue) tissue) of Ci/g μ μ 2 2

1 1

0 0 ENK mRNA ENK mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph ENK mRNA ( veh-veh amph-veh amph-amph

Figure 3.10

238

Figure 3.10: A. DYN mRNA expression after chronic AMPH administration in ENK knockout mice. There was a significant difference in DYN mRNA expression between ENK (-/-) and ENK (+/+) mice following AMPH-AMPH treatment in every tested areas (N=5 per group). ENK (+/+) mice displayed a higher level of DYN expression compared to ENK (-/-) mice following the AMPH- AMPH treatment (expression phase of the behavioral sensitization) (* p< 0.050 versus (+/+)). And, in the STDM of ENK (-/-) mice, we even observed a decrease of DYN expression when comparing AMPH-AMPH treated animals to the VEH-VEH treated ones (# p< 0.050 versus VEH-VEH). Histogram bars represent mean ± S.E.M.

B. ENK mRNA expression after chronic AMPH administration in DYN knockout mice. There were no significant differences in ENK expression between DYN (-/-) and DYN (+/+) mice and no effect of the treatment on ENK expression in both DYN (+/+) and DYN (-/-) mice. Histogram bars represent mean ± S.E.M.

239

A. B. Cocaine-induced conditioned Cocaine-induced conditioned place preference place preference

ENK (+/+) ENK ( -/-) DYN (+/+) DYN (-/-)

30 30 e-paired side 20 20 #

10 # 10 # # side vs.on vehicl sidevehicle-pairedside vs.on 0 0

-10 -10

-20 -20

Day #1 : Day #6: Day #1 : Day #6: Pre-conditioning Post-conditioning Pre-conditioning Post-conditioning % of time spent on drug-paired of time spent % -30 -30 % of time spent on drug-paired on spent of time %

C. D.

30 * 30

20 20

vs.vehiclepaired side *

10 10

0 0 %Time spent spent %Time on drug-paired side %Time spent spent %Time on drug-paired side vs.vehicle paired side

Post-conditioning versus pre-conditioning Δ Post-conditioning versus pre-conditioning Δ

Figure 3.11

240

Figure 3.11: Cocaine-induced conditioned place preference in ENK and in DYN knockout mice. All the tested genotypes developed a preference for the drug-paired side after 4-days of conditioning with repeated cocaine administrations. However, there were some difference between (+/+) and (-/-) genotypes in the amplitude of the response. For example, when compared to ENK (+/+), ENK (-/-) mice seemed to have a higher tendency to switch their preference from the vehicle- side to the cocaine-paired side (cocaine 15 mg/kg, i.p.). De facto, there was a more robust and significant increase of the time spent in drug-paired side between the pre-conditioning and post- conditioning phase in ENK (-/-) than in ENK (+/+) mice (n=5 per group). Conversely, DYN (-/-) mice displayed a milder increase of the time spent in the drug-paired compartment compared to their (+/+) littermates (n=4 per group). Graphs A and B represent mean ± S.E.M. of respective difference between the percentage of time spent in the drug-paired side of the apparatus and the percentage of time spent in the vehicle-paired side. Graphs C and D were obtained by subtracting the values of the post-conditioning phase to the values of the pre-conditioning phase. They might help to further reveal eventual differences between the (-/-) and the (+/+) mice (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice; # p<0.05 versus pre-conditioning).

241

3.9 SUPPLEMENTAL MATERIALS

A. B. ENK (+/+) ENK (-/-) DYN (+/+) DYN (-/-)

12000 12000

8000 8000 *

4000 4000 Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity Horizontal activity

0 0 Day #1 Day #2 Day #3 Day #1 Day #2 Day #3

C. D.

1200 1200 * * 800 800

400 400 Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory Non-ambulatory activity activity Non-ambulatory

0 0 Day #1 Day #2 Day #3 Day #1 Day #2 Day #3

E. F.

1000 1000

750 750

500 500 Vertical activity Vertical activity Vertical activity Vertical activity 250 250

0 0 Day #1 Day #2 Day #3 Day #1 Day #2 Day #3

Supplemental figure S3.1

242

Supplemental figure S3.1: Spontaneous activities and adaptation in ENK and DYN knockout mice. In this figure, we evaluated three components of spontaneous locomotor activity during the exploratory (Day 1) and adaptation phases (Day 1 to Day 3) of mice using a "Flex Field Apparatus". Measurements included horizontal locomotor activity or ambulatory activity, vertical activity (rearing) and non-ambulatory activity corresponding to repetitive movements that can be assimilated to stereotyped-like behaviors (Miyamoto et al., 2004; Niculescu et al., 2005). Wild-type (+/+) and ENK-deficient (-/-) mice were placed individually in the Flex-Field apparatus, and their activity was recorded for a 1h30-period. We evaluated horizontal locomotor activity (A and B), non-ambulatory activity (C and D), and vertical activity (E and F). Histogram bars represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for the 1h30 period (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=8 per group).

These results indicate that ENK (-/-) and DYN (-/-) have no different behavior than their (+/+) littermates toward environmental novelty, except in stereotyped behavior where DYN (-/-) mice were significantly less active than (+/+) mice on day #2 and day #3. Thus, DYN (-/-) mice may be less prone to develop stereotyped behaviors.

Indeed, DYN (-/-) mice had decreased non-ambulatory activity on day #2 and day #3 compared to their (+/+) counterparts. A two way repeated measures ANOVA yielded a statistically significant effect of then factor "genotype" (p=0.010) and a Holm-Sidak's post hoc test with multiple comparison procedures showed a significant difference between genotype within day #2 (p=0.034) and within day #3 ( p=0.003).

Nevertheless, ENK (-/-) mice seemed to display a slightly lower spontaneous activity compared to ENK (+/+) mice. Indeed, for each day and for each three components measured, we observed that ENK (-/-) are less active. However, two way repeated measures ANOVA failed to show a statistically significant effect of the factor "genotype" (p>0.05).

243

A. Injection #6 (AMPH 2,5mg/kg ; Day #11)

ENK (+/+) -VEH ENK(+/+)-AMPH ENK(-/-)-VEH ENK (-/-)-AMPH 2500 * * * 2000 *

1500

# 1000

Ambulatory activity scores scores activity Ambulatory 500

Inj #6 1h30 post-inj B.

Non-ambulatory activity scores activity Non-ambulatory 0

Inj #6 1h30 post-inj C.

60 #

40 *

20 Vertical activity Vertical activity scores 0

Inj #6 1h30 post-inj

Supplemental figure S3.2

244

Supplemental figure S3.2: The three components of activity during the 120 minutes-recording period that followed AMPH challenge in ENK knockout mice (A. Ambulatory activity; B. Non- ambulatory activity; C. Vertical activity) In order to decipher what is happening following the last AMPH challenge, we analyzed the three components of locomotor activity during the 120 minutes-recording period of the protocol last day (30 min pre-injection + 90 post-injection). Graphs represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for each 5 minutes of the 2h period (* p<0.05 (-/-)-AMPH vs. (+/+)-AMPH mice, N=8 per group for ENK (-/-) vs. ENK (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH).

A. Immediately after the 2.5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of both ENK (+/+) and (-/-) mice increased to reach a higher activity level. However, in ENK (+/+) mice this activity stayed at a 20% higher threshold than the (-/-) one during the rest of the recording session. Indeed, taking only the AMPH-treated animals, we performed a two way ANOVA on repeated measures which revealed a statistically significant effect of the genotype (p<0.05) and of the time factor (p<0.001). A Holm-Sidak's post-hoc test underlined a significant difference between ENK (-/- ) and ENK (+/+) genotypes within the 45th to the 120th minutes (p≤0.05) which confirmed that the horizontal activity of ENK (-/-) is lower than the ENK (+/+) one.

B. There was no significant changes in non-ambulatory activity scores (stereotyped behaviors).

C. There was a significant drop in vertical activity of both ENK (-/-) and (+/+) mice after the sixth AMPH injection. Indeed, the first ten minutes that followed the injection were marked by a robust decrease of vertical activity in both ENK (-/-) and (+/+) mice. Then, both ENK (-/-) and ENK (+/+) had no more vertical activity during the next 30 minutes (from the 40th minute to the 70th minute). However, in ENK (+/+) we observed that vertical activity began to progressively increase after the 70th minutes to finally match the vertical activity of the VEH-treated animal whereas in ENK (-/-) the absence of vertical activity lasted until the end of the recording session. Indeed, a two way ANOVA on repeated measures revealed a statistically significant effect of the genotype (p=0.03) and of the time factor (p<0.001). A Holm-Sidak's post-hoc test underlined a significant difference between ENK (-/-) and ENK (+/+) genotypes especially within the 110th and the 120th minutes (p≤0.05) which confirmed that there was no reinstatement of the vertical activity in ENK (- /-) at the end of the session.

245

A. Injection #6 (AMPH 2,5mg/kg ; Day #11)

DYN (+/+) -VEH DYN (+/+)-AMPH DYN (-/-)-VEH DYN (-/-)-AMPH 3000 # * 2500

2000

1500

1000

500 Ambulatory activity scores scores activity Ambulatory

Inj #6 1h30 post-inj

B. 100 # 90 * 80 70 60 50 40 30 20 10 Non-ambulatory activity scores activity Non-ambulatory 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120

Inj #6 1h30 post-inj

60 # 50 * 40

Vertical activity Vertical activity scores 10

1h30 post-inj Inj #6 Supplemental figure S3.3

246

Supplemental figure S3.3: The three components of activity during the 120 minutes-recording period that followed AMPH challenge in DYN knockout mice (A. Ambulatory activity; B. Non- ambulatory activity; C. Vertical activity) Graphs represent mean ± S.E.M. of respective activity scores average for each 5 minutes of the 2h period (* p<0.05 (-/-) vs. (+/+) mice, N=4 per group for DYN (-/-) vs. DYN (+/+) mice, # p<0.05 AMPH vs. VEH).

A. Immediately after the 2.5 mg/kg-AMPH injection, the horizontal activity of both DYN (+/+) and (-/-) mice increased to reach a higher activity level and then decrease to retrieve its initial level. However, in DYN (+/+) mice this activity stayed at a 40% higher threshold than the (- /-) one until the 105th minutes where the scores of (-/-) and (+/+) mice reached their initial levels and were similar. Indeed, taking only the AMPH-treated animals, a two way repeated measures ANOVA showed an significant effect of the genotype (p<0.001), of the time (p<0.001) and of the interaction “genotype X time” (p<0.001).

B. Following the AMPH injection DYN (-/-) mice displayed higher non-ambulatory activity scores (stereotyped behaviors) compared to the DYN (+/+).Indeed, a two way ANOVA on repeated measures was conducted on AMPH-treated animals and confirmed our data by showing a significant effect of the factor “time” (p=0.002) and of the factor “genotype X time” (p<0.001). And, a Holm-Sidak’s post-hoc test showed that DYN (-/-) stereotyped activity began to be higher than the (+/+) one directly after the AMPH injection (At time=40 minutes: p=0.026). The differences between DYN (-/-) and DYN (+/+) genotypes became significant within the 60th to the 90th minutes (p≤0.05). Then, the non-ambulatory activity of DYN (-/-) mice returned to the same activity level than the (+/+) from the 100th to the 120th minute (p>0.05).

C. There is a significant drop in vertical activity in both DYN (-/-) and (+/+) mice after the sixth AMPH injection. Indeed, during the first ten minutes that followed the injection both DYN (-/-) and (+/+) mice vertical activity quickly decreased then during the next 35 minutes (from the 40th minute to the 75th minute) both DYN (-/-) and DYN (+/+) remained with no vertical activity. However, whereas in DYN (+/+) the absence of vertical activity lasted until the end of the recording session, in DYN (-/-) we observed that vertical activity began to slightly and progressively increase after the 75th minutes but did not reach pre-injection scores.

247

248

Chapitre 4 DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS

CHAPITRE 4. DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS

L’objectif principal de la présente thèse était de clarifier le rôle joué par les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 ainsi que les neuropeptides DYN et ENK dans la fonction DAergique et dans les comportements induits par les psychostimulants. Nous avons pour cela étudié l’effet de la délétion des gènes codant pour ces divers protagonistes et avons caractérisé leurs patrons d’expression en réponse à des traitements aigus et chroniques de psychostimulants. Ce faisant, nous souhaitions également mettre en évidence les éventuelles interactions existant entre ces différents acteurs. Les résultats présentés dans cette thèse indiquent que Nur77 et Nor-1 sont très clairement impliqués dans la régulation de l’homéostasie du système DAergique et qu’ils y jouent des rôles distincts, voire opposés, dans les conditions basales et dans les réponses comportementales et biochimiques aux psychostimulants. En cela, ils mettent avant tout en exergue, le rôle prépondérant de Nor-1 dans la détermination des comportements de base et dans l’induction de la sensibilisation comportementale alors que celui-ci n’avait fait l’objet que de peu d’études jusqu’alors. En outre, ils confirment le rôle modérateur présumé de Nur77 en soulignant son caractère indispensable pour tempérer l’hyperactivité induite par les psychostimulants et pour la manifestation des comportements stéréotypés. De ces données, on peut conclure que l’expression de Nor-1 et celle de Nur77 jouent des rôles opposés, Nor-1 exacerbe les comportements moteurs, Nur77 les tempère. En outre, nos résultats montrent également que les neuropeptides DYN et ENK peuvent être modulés de manière directe ou indirecte par Nur77 et Nor-1 et qu’inversement leur délétion pouvait influencer l’expression de ces facteurs de transcription. Ils démontrent également que ces neuropeptides sont tous deux nécessaires et jouent des rôles opposés dans la manifestation de comportements de base équilibrés. Par contre, dans les conditions d’une exposition prolongée aux psychostimulants, la DYN et l’ENK semblent agir de concert en potentialisant l’exacerbation de l’activité locomotrice et seraient donc tous deux indispensables dans la sensibilisation comportementale. Enfin, ces travaux apportent les preuves de l’existence d’interactions entre les systèmes dynorphinergiques et enképalinergiques et par conséquent entre les deux voies de sortie directe et indirecte des ganglions de la base qui co-expriment respectivement l’ENK et la DYN.

250

4.1 Activité basale médiée par la dopamine

4.1.1 Rôles opposés de Nur77 et Nor-1

Les résultats présentés au chapitre 2 suggèrent que Nur77 et Nor-1 sont impliqués dans la régulation des comportements médiés par la DA et qu’ils exercent, dans ce contexte, un rôle opposé, et ce, possiblement par le biais de la régulation de l’affinité des récepteurs DAergiques D2. En effet, ces deux facteurs de transcription sont exprimés dans les MSNs du striatum et du noyau accumbens (Zetterstrom et coll., 1996a; Beaudry et coll., 2000; Werme et coll., 2000; Gofflot et coll., 2007). Or, de nos résultats nous avons pu déduire que la délétion de Nur77 favorisait l’augmentation de la densité des récepteurs D2 en haute affinité (D2high) et qu’à l’inverse, la délétion de Nor-1 pouvait en diminuer l’expression. En outre, des données de la littérature ont confirmé l’existence d’une corrélation positive entre l’affinité des récepteurs D2 et l’hypersensibilité à la DA et l’intensité des comportements moteurs observés dans les conditions basales (Seeman et coll., 2005; Seeman, 2009). En effet, les souris Nur77 (-/-) sur-exprimant les récepteurs D2 en haute affinité sont hypersensibles à la DA et exhibent des comportements moteurs exacerbés et, à l’inverse, les souris Nor-1 (-/-) ayant des niveaux restreints en D2high présentent une hypo-sensibilité DAergique et des niveaux d’activité locomotrice réduits.

De fait, si l’on considère l’organisation des ganglions de la base décrite au chapitre 1, il devient évident que, chez nos souris Nur77 (-/-) sur-exprimant les récepteurs D2high, les niveaux de base de DA n’auront pas un effet équilibré sur les deux voies de sorties des ganglions de la base. En effet, une plus forte activation des récepteurs D2 par la dopamine aura pour effet d’inhiber les neurones GABAergiques de la voie indirecte, favorisant une levée d’inhibition sur leurs neurones cibles dans le GPe. L’effet inhibiteur plus restreint sur les neurones du GPe mènera ultimement à une moins forte inhibition du thalamus par la voie indirecte D2. L’amoindrissement de cette inhibition résultera alors en un accroissement des comportements observables. À l’opposé, chez nos souris Nor-1 (-/-) sous-exprimant les récepteurs D2high, on observera l’effet inverse, avec une plus forte inhibition du thalamus et donc une activité locomotrice de base réduite par rapport aux

251 souris sauvages (fig 4.1). Ainsi, la délétion des gènes codant pour les facteurs de transcription Nur77 et Nor-1 affecte l’expression des récepteurs D2high et par voie de conséquence les comportements moteurs dépendants de la DA.

En conclusion, on peut supposer que Nur77 et Nor-1 exercent une régulation opposée sur les gènes responsables du changement d’affinité des récepteurs D2 et, que le maintien du ratio Nur77/Nor-1 dans les MSNs co-exprimant les récepteurs D2 est crucial pour assurer un fonctionnement, équilibré, de cette voie de sortie indirecte des ganglions de la base. En outre, des données non publiées de notre laboratoire suggèrent que dans les conditions normales, Nor-1 pourrait occuper un rôle prédominant. En effet, nous avons découvert que le phénotype des souris ayant une délétion de cinq des six allèles codant pour les gènes de la famille NR4A (souris Nur77 (-/-)/Nor-1 (-/-)/Nurr1 (+/-)), indique une nette prédominance de l’effet de la délétion de Nor-1 car cette lignée de souris est caractérisée du point de vue comportemental par l’expression d’une immobilité très importante. Cela suggère que l’expression de Nor-1 pourrait être prépondérante dans le ratio Nur77/Nor-1, et que c’est avant tout les niveaux d’expression de Nor-1 qui déterminent l’activité locomotrice de base.

Partant du constat que Nur77 et Nor-1 jouent un rôle dans la régulation de l’affinité des récepteurs D2, il serait pertinent d’identifier les facteurs responsables du changement d’affinité du récepteurs D2 afin de déterminer si leurs gènes sont sous le contrôle de ces deux facteurs de transcription. Quelques potentiels candidats ont été identifiés. Le niveau d’affinité des récepteurs couplés aux protéines (RCPGs), tels que les récepteurs D1 et D2, peuvent être modulés par divers mécanismes, incluant les changements conformationnels induits par l’association à différentes protéines G et la coopération négative de complexes oligomériques de RCPGs (Seeman et coll., 2006). Par exemple, le régulateur de la signalisation associée aux protéines G (RGS9 pour regulator of G-protein-signaling 9) stimule l’hydrolyse du GTP lié à la sous-unité Gα et régule à la baisse la signalisation DAergique (Rahman et coll., 2003). De façon intéressante, la délétion de RGS9 augmente la proportion des récepteurs D2high en haute affinité, suggérant ainsi que RGS9 pourrait être un modulateur de l’affinité des récepteurs D2 (Seeman et coll., 2006). De plus, la

252

protéine kinase 6 des RCPGs (GRK6 pour G protein-coupled receptor kinase 6) qui phosphoryle la région C-terminale des RCPGs induit la fixation de l’arrestine et la désensibilisation du récepteur. La délétion de la GRK6 mène à une augmentation de la proportion des récepteurs D2high et pourrait donc elle aussi être impliquée dans la régulation de l’affinité des récepteurs D2 (Seeman et coll., 2006). Pour conclure, les récepteurs D2 peuvent former des complexes oligomériques avec d’autres RCPGs tels que le récepteur A2a de l’adénosine (Fuxe et coll., 2005). En effet, le récepteurs A2a de l’adénosine est fortement exprimé dans les ganglions de la base, en particulier dans les neurones GABAergiques striatopallidaux co-exprimant les récepteurs D2. Par conséquent, ils pourraient revêtir un rôle important dans la fonction de la voie de sortie indirecte des ganglions de la base. Dans ces neurones, les récepteurs A2a interagissent structurellement et fonctionnellement avec les récepteurs DAergiques D2. Les récepteurs A2a et D2 forment des hétéromères et ciblent des cascades intracellulaires communes. Ils présentent, dans ce contexte, des interactions antagonistes réciproques qui sont cruciales dans le fonctionnement de la voie indirecte et donc dans le contrôle du mouvement, l’apprentissage moteur et l’effet de récompense médiés par les ganglions de la base (Schiffmann et coll., 2007; Brown et Short, 2008). De manière intéressante, la délétion du gène du récepteur A2a induit une diminution de la proportion des récepteurs D2high suggérant que ce récepteur régule l’affinité des récepteurs D2. Ainsi, RGS9, GRK6 et le récepteurs A2a de l’adénosine pourraient tous trois moduler l’affinité des récepteurs D2. Par conséquent leurs gènes pourraient représenter, dès lors, des cibles potentielles de l’activité transcriptionnelle de Nur77 et Nor-1. Il serait donc intéressant d’étudier les séquences promotrices de ces gènes afin de déterminer si elles contiennent des éléments de réponses spécifiques aux récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1. En outre, il conviendrait d’identifier plus précisément les mécanismes responsables du changement d’affinité des récepteurs D2 induits par la délétion de Nur77 ou de Nor-1.

Cependant nos travaux présentent une limite certaine car nous n’avons pas exploré l’effet de la délétion de ces deux facteurs de transcription sur l’expression et l’affinité des récepteurs D1. Pour parfaire notre analyse de la fonction basale de Nur77 et Nor-1, il serait donc judicieux, d’étudier également ce qui pourrait se produire dans cette voie de sortie des ganglions de la base.

253

Activité basale Neurones glutamatergiques Neurones GABAergiques Afférences excitatrices Afférences inhibitrices

D2high Cortex D2high Cortex D2high Cortex

D2 Striatum /NAc D1 D2 Striatum /NAc D1 D2 Striatum /NAc D1

SNc /ATV SNc /ATV SNc /ATV

GPe GPe GPe

NST GPi/SNr NST GPi/SNr NST GPi/SNr

Thalamus Thalamus Thalamus

Activité locomotrice: NORMALE EXACERBÉE INHIBÉE

Souris (+/+) Souris Nur77 (-/-) Souris Nor-1 (-/-)

Concentration des Augmentation des D2high Diminution des D2high D2high normale = =

Voie directe D1 Voie directe D1 Voie directe D1 activatrice activatrice normale mais (activatrice) et voie normale mais voie indirecte voie indirecte D2 indirecte D2 (inhibitrice) D2 inhibitrice moins inhibitrice plus robuste normales robuste

ÉTAT SENSIBILISÉ

= Activité locomotrice de Activité locomotrice de base Activité locomotrice de base normale accrue base amoindrie

Figure 4.1 Schéma de l’effet de la délétion de Nur77 et de Nor-1 sur l’affinité des récepteurs D2 et sur l’activité locomotrice de base

254

4.1.2 Effets de la délétion de l’ENK ou de la DYN sur l’activité locomotrice de base

Le chapitre 3 nous a permis de mettre en évidence l’importance de l’ENK et de la DYN dans les comportements médiés par la DA. Nous avons pu voir notamment que la délétion de l’ENK entraînait une diminution de l’activité locomotrice de base. La délétion de la DYN, quant à elle, entrainait les mêmes effets mais seulement pour le premier jour d’enregistrement.

Concernant la délétion de l’ENK, nos données concordent avec les connaissances que l’on a de la fonction du neuropeptide ENK (voir introduction). L’ENK est connue en effet pour son effet stimulateur sur la transmission DAergique (Wood et coll., 1980; Wood, 1982). Il est par conséquent logique que sa délétion se manifeste par une diminution de la motricité DA-dépendante. L’équipe de Bilkei-Gorzo et al (2004) a d’ailleurs observée les mêmes comportements chez leurs souris ENK (-/-) c’est-à-dire une diminution de l’activité locomotrice dans un dispositif comparable au notre (« openfield »). De plus, il est également connu que les agonistes des MOR (dont l’ENK fait partie) induisent une augmentation de la concentration extracellulaire de DA dans le NAc (Di Chiara et Imperato, 1988; Devine et coll., 1993) ainsi que l’exacerbation de l’activité locomotrice lorsqu’injectés dans l’ATV, le striatum ou le NAc (Dauge et coll., 1988; Cunningham et Kelley, 1992b; Druhan et coll., 1993). À l’inverse, l’administration d’un antagoniste des MOR tel que CTAP dans le cœur du NAc, dans le striatum ou dans l’ATV atténue l’effet de récompense et l’hyperactivité induites par la cocaïne (Soderman et Unterwald, 2008). Ceci indique qu’un antagoniste des MOR diminue la sensibilité du système DAergique. Ainsi ces données expliquent pourquoi les souris déficientes pour l’ENK ont des niveaux d’activité locomotrice réduits. Elles permettent en outre de proposer que l’effet activateur de l’ENK sur la transmission DAergique s’opèrerait via la fixation de l’ENK sur les MOR.

Les effets de la fixation de l’ENK sur les MOR concordent avec le rôle activateur attribué à l’ENK. En effet, au niveau de l’ATV, les MOR sont situés sur les interneurones inhibiteurs des neurones DAergiques et la fixation de l’ENK entraine une levée d’inhibition de neurones DAergiques. Au niveau du striatum et du NAc, les MOR sont situés sur les

255 neurones GABAergiques de la voie indirecte (D2) et, dans ce cas, la fixation de l’ENK sur les MOR favorise l’hyperpolarisation des neurones GABAergiques de la voie indirecte et par conséquent entraîne une levée d’inhibition du thalamus et une augmentation de l’activité motrice. En outre, le fait que les niveaux d’activité soient diminués chez les souris ENK (-/-) aussi bien au premier comme au deuxième et troisième jour d’habituation comparé aux (+/+), suggèrent que, dans les conditions normales, le système enképhalinergique est activé de manière constitutive et participe au maintien de l’homéostasie basale du système DAergique. De plus, d’après certaines études portant sur l’affinité relative des différents récepteurs opioïdes pour l’ENK ou la DYN, la DYN devrait pouvoir être en mesure de compenser le déficit en ENK et se fixer sur les MOR (Mansour et coll., 1995; Akil et coll., 1998). Or, si cela avait été le cas on aurait observé une augmentation de l’activité locomotrice et non une diminution. Ceci nous indique que le neuropeptide DYN synthétisé dans la voie directe ne semble pas agir sur les récepteurs exprimés par les neurones de la voie indirecte. Nos travaux suggèrent que l’expression de la DYN ne peut compenser pour la délétion de l’ENK dans les paramètres de notre étude.

Concernant la délétion de la DYN, on observait avant tout une diminution de l’activité spontanée seulement lors du premier jour d’enregistrement dans notre dispositif comportemental. Cela suggère que, particulièrement pendant le premier jour de test qui correspond également à la phase d’exploration de ce nouvel environnement, nos souris déficientes pour la DYN ont été moins actives. Il pourrait s’agir plutôt d’une diminution de la réaction à un nouvel environnement plutôt qu’une réelle diminution du niveau d’activité locomotrice. Par ailleurs, une étude récente a démontré que la délétion constitutive de la DYN était associée à une diminution des niveaux extracellulaires de DA (Chefer et Shippenberg, 2006). Ces données sont donc en accord avec les nôtres. Cependant, nos résultats, comme ceux de l’équipe de Chefer et Shippenberg, sont en contradiction avec le rôle que l’on attribue communément à la DYN.

En effet, de manière paradoxale, il est connu que l’infusion d’un antagoniste sélectif des KOR dans le NAc ou la délétion constitutive des KOR augmente les niveaux de DA dans le NAc. Ces dernières données suggèrent plutôt l’existence d’un système médié par les KOR, activé de manière constitutive, qui inhiberait l’activité basale des neurones

256

mésoaccumbaux (Spanagel et coll., 1992; Chefer et coll., 2005). Par conséquent, les agonistes du KOR tels que la DYN auraient un effet inhibiteur sur l’activité locomotrice de base.

Ainsi on constate que la fonction initialement attribuée à la fixation de la DYN sur les KOR, c’est-à-dire la rétroinhibition des MSNs de la voie directe D1, ne permet pas d’expliquer pourquoi nos souris DYN (-/-) présente une diminution de l’activité locomotrice spécifiquement pendant la phase d’exploration. L’équipe de Chefer et Shippenberg (2006) explique ces contradictions par le fait que la délétion constitutive de la DYN entrainerait une augmentation compensatoire de l’expression des KOR. En effet, chez leurs souris DYN (-/-), l’injection d’un agoniste des KOR provoquait une plus forte inhibition des comportements moteurs par rapport aux souris sauvages. Par conséquent, ils ont émis l’hypothèse que la diminution des comportements locomoteurs basaux observée chez les souris DYN (-/-) serait simplement due à une compensation par les autres neuropeptides striataux et qui impliquerait la fixation de l’ENK et/ou de l’END aux KOR présents en plus grand nombre (Chefer et Shippenberg, 2006).

De fait, tel que mentionné dans l’introduction l’ENK et l’END peuvent elles aussi se fixer aux KOR bien qu’avec une affinité moins grande que la DYN. Ainsi en l’absence de DYN, ce serait la régulation à la hausse de l’expression des KOR au niveau du striatum et du NAc et la liaison de l’ENK ou de l’END endogènes qui pourraient expliquer les niveaux d’activité basale réduits chez nos souris DYN (-/-). En outre, ceci nous montre aussi, qu’il existe potentiellement un moyen pour les peptides de la voie de sortie indirecte de compenser la délétion des neuropeptides exprimés dans la voie directe, ce qui ne semblait pas être le cas dans la situation inverse.

Par contre, nos données indiquent que l’activité locomotrice de base n’est affectée par la délétion de la DYN que pendant le premier jour de nos différents tests (activité volontaire et spontanée) ce qui pourrait suggérer que la DYN aurait un rôle plus spécifique à jouer dans l’intensité de la réponse locomotrice à un nouvel environnement et invaliderait également l’hypothèse d’une surexpression constitutive des KOR. Ce point reste donc nébuleux.

257

4.2 Effets aigus des psychostimulants

4.2.1 Rôles de Nur77 et Nor-1 dans les effets aigus des psychostimulants

Pour approfondir notre compréhension du rôle de Nur77 et Nor-1 dans les comportements médiés par la DA, nous avons testé l’effet d’une administration aiguë d’amphétamine, un psychostimulant ayant un effet agoniste DAergique indirect. Dans ce cadre, nous avons observé que les souris Nur77 (-/-) tout comme les souris sauvages présentaient une forte induction des comportements locomoteurs suite au traitement à l’AMPH. Chez les souris Nor-1 (-/-), à l’inverse, l’administration d’amphétamine entrainait une augmentation de l’activité locomotrice moins marquée que chez les souris (+/+). Ces résultats semblaient confirmer notre hypothèse selon laquelle se serait respectivement la surexpression et la sous-expression des récepteurs D2high qui serait à l’origine d’une hypersensibilité et d’une hypo-sensibilité à la DA et donc aux psychostimulants.

Par ailleurs, nous avons exposé dans l’introduction que les neuropeptides striataux ENK et DYN ont pour rôle de réguler la transmission DAergique en inhibant les neurones qui les synthétisent (pour revue : Samadi et coll., 2007). Il a été démontré par l’équipe de Jiang (1990) que la stimulation des récepteurs D1 entraînait une augmentation de la DYN et une inhibition tonique de la synthèse de l’ENK. À l’inverse la stimulation des récepteurs D2 entraîne une stimulation de la synthèse de l’ENK et un maintien des niveaux de base de la DYN. Cependant dans le cas d’une stimulation conjointe des récepteurs D1 et D2, ils ont montré que les récepteurs D1 avaient un effet dominant par rapport à l’effet des récepteurs D2. En effet dans le cas d’une stimulation de ces deux récepteurs, on observe avant tout une induction de la DYN et un maintien des niveaux d’expression de l’ENK (Jiang et coll., 1990; Willuhn et Steiner, 2006; pour revue : Yano et Steiner, 2007) . C’est justement ce qu’on obtient chez nos souris sauvages, l’administration d’AMPH induit une augmentation de la DYN mais aucun changement dans l’expression de l’ENK (chapitre 2). Ceci confirme donc que la DYN est induite en réponse à une stimulation importante du système DAergique. Selon certaines hypothèses, cette augmentation de l’expression de la DYN se

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ferait afin d’atténuer les effets des stimulations subséquentes. Toutefois, en ce qui a trait à l’expression de l’ENK, on ne constate aucun changement de ses niveaux d’expression et l’on ne peut donc pas conclure qu’elle pourrait jouer un rôle particulier dans la réponse à l’administration aigüe de psychostimulants.

De manière intéressante, chez nos souris Nur77 (-/-), on observe une induction significative de l’ENK mais pas d’augmentation de l’expression de la DYN. Ceci suggère que la délétion de Nur77 bloque l’effet de la stimulation des récepteurs D1 en favorisant plutôt la prédominance des effets de la stimulation des récepteurs D2 c'est-à-dire l’induction de l’ENK sans modification de la DYN. Cet effet prédominant de la stimulation des récepteurs D2 pourrait être dû au fait que les souris Nur77 (-/-) sur-expriment les récepteurs D2high. Ainsi, l’augmentation de la proportion des récepteurs D2 en haute affinité chez les souris Nur77 (-/-), permettrait de contrer l’effet normalement dominant des récepteurs D1 rapporté par Jiang et coll. (1990). En effet, dans ce cas l’effet de la stimulation des récepteurs D2 prédomine par rapport à celui des récepteurs D1. Nos souris Nur77 (-/-) présentent donc une induction de l’ENK qui pourrait expliquer l’activité locomotrice exacerbée de ces souris par rapport à leur congénères sauvages lors des administrations subséquentes d’AMPH.

À l’opposé, chez nos souris Nor-1 (-/-), on observait une induction plus marquée de la DYN sans changements dans l’expression de l’ENK. En accord avec l’hypothèse précédente, on constate une potentialisation des effets prépondérants de la stimulation des récepteurs D1. Cette potentialisation pourrait être due à la diminution de la proportion des récepteurs D2 en haute affinité observée chez ces souris dans les conditions basales. Il en résulterait une neurotransmission plus faible via les récepteurs D2 chez les souris Nor-1(-/-) et une exacerbation des effets médiés par la stimulation des récepteurs D1 à savoir une induction de la DYN et un maintien de l’ENK à des niveaux de base.

Ce qu’on peut en conclure, c’est que dans les conditions normales, une administration ponctuelle d’AMPH affecte avant tout les MSNs de la voie D1 qui co- expriment ce neuropeptide. Une hypothèse quant au rôle possible de l’induction de la DYN

259 a été proposée par de nombreuses études (Jiang et coll., 1990; Cole et coll., 1995; Turchan et coll., 1998). Elle serait destinée à contrer la surstimulation DAergique. On peut également déceler ici un rôle opposé de Nor-1 et de Nur77 dans l’expression de ce neuropeptide puisque la délétion de Nor-1 semble favoriser l’induction de la DYN alors que la délétion de Nur77 a l’effet inverse. Ainsi dans les conditions normales Nor-1 aurait pour rôle de tempérer l’induction de la DYN et ses effets inhibiteurs alors que Nur77 aurait pour rôle de favoriser l’induction de la DYN et donc de stimuler le rétrocontrôle négatif de la DYN sur le système DAergique.

Ces données nous permettent de proposer une explication pour les effets d’une stimulation unique du système DAergique par les psychostimulants. En nous appuyant sur les données de la littérature ainsi que sur notre travail, nous émettons l’hypothèse que l’administration aigüe d’AMPH entraîne, chez des souris normales, une induction de Nur77 et une diminution concomitante de Nor-1 et ce spécifiquement dans les neurones striataux de la voie directe D1 qui co-expriment la DYN. Cet effet aurait comme objectif de contrer l’hyperstimulation DAergique. Cette explication est corroborée par certaines études qui ont démontré que l’administration aigüe de psychostimulants, tels que la cocaïne, induit après quelques heures une régulation à la baisse de l’expression de Nor-1 (Werme et coll., 1999, 2000). En effet, bien qu’il ait été démontré que Nor-1 est d’abord fortement et rapidement induit dans le striatum et le NAc après une injection aiguë de cocaïne (Werme et coll., 2000) ou après l’administration unique d’une combinaison d’un agoniste D1 (SKF82958) et d’un agoniste D2 (quinpirole; Bourhis et coll., 2008). Il se produit ensuite une diminution de Nor-1 qui interviendrait de manière compensatoire à l’excès d’activité locomotrice générée et qui est observable 20h après l’injection de psychostimulants et ce, en particulier dans le NAc; une structure fortement impliquée dans les réponses initiales lors de l’administration de psychostimulants (Werme et coll., 1999, 2000). Cependant, cette diminution ne se produirait pas chez les rats Lewis connus pour leur propension à développer une dépendance et une sensibilité accrue aux psychostimulants (Werme et coll., 1999, 2000; voir introduction). De plus, les résultats du chapitre 3 portant sur la colocalisation de Nur77 avec la substance P ou l’ENK, montrent que, suite à une administration aiguë d’AMPH, l’expression de Nur77 augmente sélectivement dans les

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neurones striataux co-exprimant la DYN, la substance P et les récepteurs D1 (figure 3.4). En outre, ce résultat est corroboré par une autre étude réalisée au sein de notre laboratoire qui indique que la stimulation concomitante des récepteurs D1 et D2 par des agonistes DAergiques entraine une augmentation sélective de Nur77 dans les neurones striataux de la voie D1 exprimant la DYN (St-Hilaire et coll., 2003). Enfin, des études ont bien confirmé que la réponse locomotrice induite par l’administration aiguë de psychostimulants impliquait spécifiquement la voie de signalisation D1 alors que les effets qui suivent l’administration chronique impliquaient une plasticité qui faisait intervenir également des changements dans la voie D2 (Bateup et al, 2010 ; pour revue : Chen et coll., 2009).

Les conclusions que l’on peut tirer quant au rôle de Nor-1 et de Nur77 dans les effets aigus des psychostimulants sont relativement claires. Dans un premier temps, l’augmentation de l’activité locomotrice qui suit normalement toute injection de psychostimulant est conditionnelle à la présence de Nor-1 qui favorise d’une part la configuration des récepteurs D2 en haute affinité et d’autre part tempère l’expression de la DYN, atténuant ainsi son potentiel inhibiteur. Dans un second temps, Nur77 semble simplement intervenir comme agent de temporisation de cette réponse locomotrice et ce, en assurant à la fois une hausse de l’expression basale des récepteurs D2high, le maintien de l’expression de l’ENK en dessous d’un certain seuil et l’augmentation de l’expression de la DYN, encourageant ainsi son activité rétroinhibitrice sur le système DAergique. L’hypothèse du rôle potentiel de Nur77 dans l’induction de la synthèse de la DYN est d’autant plus renforcée par le fait que sous l’effet de l’AMPH, Nur77 augmente sélectivement dans les neurones striataux co-exprimant ce neuropeptide. Ainsi, dans le cas d’une administration aigüe d’AMPH, on distingue clairement que Nur77 est indispensable pour observer une induction de la DYN alors que la présence de Nor-1 semble au contraire semble favoriser une expression à la baisse. Par ailleurs, puisque Nur77 et Nor-1 semblent influencer de manière inverse les niveaux d’expression de la DYN, il devient d’autant plus urgent d’étudier si cette modulation se fait de manière directe ou s’effectue par le biais de la modulation de l’affinité des récepteurs D1.

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4.2.2 Rôles de l’ENK et de la DYN dans les effets aigus des psychostimulants

La délétion constitutive de l’ENK ou de la DYN ne semble pas avoir d’effet sur l’activation comportementale induite par une administration aigüe d’AMPH. En effet, les souris ENK (-/-), DYN (-/-) et (+/+) présentaient toutes une augmentation de l’activité locomotrice suite à l’injection d’AMPH. Ceci pourrait signifier que ni le système enképhalinergique ni le système dynorphinergique ne sont impliqués dans l’exacerbation de l’activité locomotrice observée après une seule prise de psychostimulants. Ce fait est d’ailleurs en accord avec le rôle attribué aux neuropeptide striataux endogènes dans la littérature c'est-à-dire un rôle indirect de rétroinhibition des neurones accumbaux et striataux dans lesquels ils sont respectivement exprimés (Steiner et Gerfen, 1998). Ainsi, les neuropeptides n’auraient pas d’effets immédiats sur la transmission DAergique après une stimulation aigüe à l’AMPH mais on peut supposer qu’ils exercent une influence sur le système DAergique lors des administrations subséquentes. Les données de la littérature montrent que l’administration aigüe de psychostimulants (methAMPH, AMPH, cocaïne) est corrélée avec l’induction de l’expression de la DYN dans les régions ventrales et dorsales du striatum (Wang et coll., 1995; Wang et McGinty, 1996; Turchan et coll., 1998). Cette induction aurait pour effet d’amortir les sur-activations subséquentes du système DAergique.

Curieusement, on observe que nos souris DYN (-/-) présentent une induction de l’activité locomotrice plus marquée que les souris sauvages suite à l’injection d’AMPH. Ceci achève d’invalider l’hypothèse émise précédemment quant à l’existence d’une augmentation compensatrice des KOR pour expliquer l’activité basale diminuée chez ces souris. Nos résultats suggèrent plutôt que la délétion de la DYN entraînerait une augmentation de la sensibilité aux effets à court terme des psychostimulants. Là encore, une explication de cette activité basale moindre contrastant avec la génération d’une plus forte activation locomotrice suite à l’administration aiguë d’AMPH, peut être fournie par l’étude du patron d’expression de Nur77. En effet, de manière intéressante, les souris DYN (-/-) présentent une expression basale accrue de Nur77, mais exhibent une diminution marquée

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de ce même facteur de transcription suite à l’injection aiguë d’AMPH. Ces données concordent avec les hypothèses posées au chapitre 2 quant au rôle de Nur77. Ainsi, si l’on suit notre raisonnement précédent, l’expression basale plus marquée de Nur77 favoriserait une diminution de la proportion des récepteurs D2 à haute affinité pour la DA, ce qui expliquerait la faible activité basale de ces souris. Cependant lors d’une administration aigüe d’AMPH, la délétion de la DYN semble entraîner une sensibilité accrue, ce qui est en accord avec l’idée que l’expression basale de la DYN exerce une inhibition de la libération de DA. Cependant, on constate que cet effet inhibiteur de la DYN constitutive ne s’exerce qu’en réponse à une stimulation excessive du système dopaminergique. Fait qui est supporté également par une revue de littérature récente (pour revue: Tejeda et coll., 2102). Cette inhibition n’étant plus assurée chez nos souris DYN (-/-), cela explique pourquoi l’effet locomoteur d’une administration d’AMPH sur la libération de DA est plus importante.

Les données biochimiques mesurées chez nos souris sauvages semblent, par contre, contredire les études démontrant une induction systématique de la DYN en réponse à une administration aigüe d’AMPH. En effet, nous n’avons observé aucun changement dans l’expression de la DYN chez nos souris ENK (+/+). Sachant que l’induction de la DYN intervient normalement pour contrebalancer une stimulation DAergique excessive, on peut supposer que la dose administrée par notre équipe (2,5 mg/kg) est trop faible pour entraîner une induction de la DYN. Toutefois, les résultats présentés au chapitre 2 montrent que chez les souris sauvages Nur77 (+/+) et Nor-1 (+/+), il se produit bien une induction de la DYN même avec cette faible dose. Comment expliquer cette apparente contradiction ? Il a été démontré dans la littérature que le pic d’induction de la DYN intervenait environ 2 à 3 heures après l’injection de psychostimulants. Or, nous avons justement sacrifié nos différents groupes de souris 2h après la dernière injection. Ainsi, il se peut que pour certain groupe l’induction de la DYN se soit fait plus tardivement et que nos sacrifices aient été réalisés juste avant son induction ou au moment où cette induction n’était pas maximale. Cependant, hormis les souris ENK (+/+), toutes nos souris sauvages montrent une augmentation de la DYN. Il nous est donc très difficile pour le moment d’expliquer précisément les résultats particuliers obtenus avec ces souris.

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En effet, si l’on compare uniquement les souris ENK (+/+) et ENK (-/-), qui ont été sacrifiés à la même heure, on voit que, chez les ENK (-/-), l’induction de la DYN se produit bien et que celle-ci est très accentuée. Ceci pourrait signifier que la délétion de l’ENK favorise une synthèse plus rapide de la DYN. Aussi, cela suggère que l’ENK influence l’amplitude de l’expression de la DYN et que sa délétion encourage la surexpression de la DYN en réponse à l’AMPH et amplifie ainsi la rétroaction inhibitrice exercée par la DYN. Il est intéressant de souligner cette induction très marquée de la DYN chez nos souris ENK (-/-). En effet, comme la DYN agit pour tempérer les effets des éventuelles stimulations subséquentes du système DAergique, sa plus forte induction chez les souris ENK (-/-) pourrait également expliquer le fait que lors d’injections répétées d’AMPH les souris ENK (-/-) affichent une activité locomotrice plus faible que leurs congénères (+/+). On peut également en conclure qu’il existe une forme d’interaction croisée entre les deux systèmes opioïdes et donc entre les deux populations neuronales du striatum qui expriment spécifiquement les récepteurs D1 ou D2 et qui appartiennent à des voies de sortie différentes des ganglions de la base. Cette hypothèse d’une possible interaction entre les deux voies de sortie des ganglions de la base est également évoquée par les études de Parent et coll. (2000) et de Taverna et coll. (2008) qui ont mis en évidence des collatérales reliant les voies directe et indirecte.

De manière intéressante, la délétion constitutive de l’ENK affecte également l’expression de Nur77. En effet, les souris ENK (-/-) présentent des niveaux de base accrus de Nur77 dans le striatum et dans le NAc comparées aux souris sauvages. Encore une fois cette augmentation des niveaux de base favorise selon notre hypothèse une diminution de l’expression des D2high. Ce qui contribue également à la manifestation des comportements de base amoindris exposés au point 4.1.2.

De façon similaire, la délétion de l’ENK modifie le niveau d’expression de Nur77 après une administration aigüe d’AMPH. L’expression de Nur77 augmente chez les deux types de souris mais cette augmentation est plus marquée chez les ENK (-/-). Cette induction se déroule plutôt dans la région dorso-médiale du striatum. Ce fait est particulièrement intéressant dans la mesure où l’on a vu que les modifications de la

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plasticité neuronale en réponse aux psychostimulants touchent d’abord les régions rostrales puis affectent progressivement les régions dorso-médiales du striatum (Haber et coll., 2000; pour revue : Balland et Lüscher, 2009; voir introduction 1.2). Le fait que Nur77 soit induit dans les régions dorso-médiales chez les souris ENK (-/-) suggèrent que cette induction pourrait perturber la plasticité induite par les administrations subséquentes de psychostimulants. D’après nos conclusions précédentes Nur77 aurait pour rôle de tempérer l’effet d’exacerbation de la locomotion par l’AMPH en favorisant la synthèse de la DYN. Le fait que chez nos souris ENK (-/-), l’induction de Nur77 et de la DYN sont toutes deux plus marquées confirme encore une fois le rôle potentiel de Nur77 dans l’induction de ce neuropeptide. Ainsi, l’induction plus prononcée de Nur77 chez les souris ENK (-/-) dans les régions du striatum impliquées dans la manifestation de la sensibilisation comportementale suggère qu’une délétion de l’ENK favorise un phénotype moins sensible aux injections subséquentes d’AMPH c’est à dire doté d’un mécanisme tampon plus puissant.

Cependant, tel que mentionnée plus haut, et contrairement aux souris ENK (-/-), l’administration aiguë d’AMPH entraîne une diminution des niveaux d’expression de Nur77 chez les souris déficientes pour le gène de la DYN surtout dans les régions latérales du striatum. Si l’on considère l’ensemble de nos résultats on peut formuler l’hypothèse que la présence de la DYN est indispensable pour observer l’induction de Nur77 en réponse à une injection d’AMPH. À l’inverse l’ENK semble favoriser une atténuation de l’expression de Nur77.

En résumé, l’administration aiguë d’AMPH produit le même effet comportemental chez les souris sauvages (+/+), ENK (-/-) et DYN (-/-) à savoir une exacerbation de l’activité locomotrice. Chez les souris ENK (-/-) et (+/+) on observe également une induction de l’expression de Nur77 et de la DYN dans le striatum et le NAc. Cette induction étant plus marquée chez les souris ENK (-/-), elle présage un mécanisme de protection renforcé contre les éventuelles hyperstimulations DAergiques subséquentes. A l’inverse les souris DYN (-/-) présentent une expression basale accrue de Nur77, mais exhibent une diminution marquée de Nur77 suite à l’injection aiguë d’AMPH.

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Le fait que Nur77 soit induit chez les souris sauvages de façon marquée après un traitement aigu à l’AMPH pourrait signifier que ce facteur de transcription joue un rôle dans l’exacerbation du comportement moteur induite par l’injection aigüe de psychostimulants. En effet, d’autre études ont également tenté de valider cette hypothèse par des résultats similaires montrant que l’administration aigüe d’AMPH ou de cocaïne provoquait une augmentation de Nur77 dans le striatum (Bhardwaj et coll., 2003; St-Hilaire et coll., 2003). Toutefois, comme nous l’avons vu plus haut, la délétion de la DYN supprime ou atténue l’induction de Nur77 dans le NAc et le striatum et potentialise par ailleurs la stimulation de l’activité locomotrice induite par les psychostimulants. Par conséquent, ce fait suggère plutôt que l’induction de Nur77 n’est pas responsable de l’exacerbation du comportement. Au contraire, cela confirme que son expression de base et son éventuelle induction interviennent plutôt comme un mécanisme tampon pour contrer une hyperstimulation subséquente éventuelle du système DAergique.

Nous démontrons également que la délétion de l’ENK et de la DYN affecte l’expression de Nur77 de manière opposée. Réciproquement, les résultats obtenus au chapitre 2 montraient que la délétion du facteur de transcription Nur77 entraînait une perturbation inverse de l’expression de la DYN et de l’ENK. Nous mettons aussi en évidence une relation de réciprocité entre ces facteurs de transcription et les neuropeptides ENK et DYN. Concernant Nor-1, on a également vu qu’il pouvait moduler l’expression de la DYN et de l’ENK mais de manière opposée à celle de Nur77. Nous n’avons malheureusement pas pu évaluer l’effet de la délétion de la DYN et de l’ENK sur l’expression de Nor-1 dans les conditions d’une injection simple d’AMPH du fait de l’épuisement de nos échantillons de cerveaux. Il serait par conséquent intéressant de compléter notre analyse pour confirmer également une réciprocité entre la synthèse de Nor- 1 et celle des neuropeptides DYN et ENK.

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4.3 Effets chroniques des psychostimulants

4.3.1 Rôles de Nur77, Nor-1, DYN et ENK dans la sensibilisation comportementale

L’administration répétée de psychostimulants entraine un phénomène particulier ; la sensibilisation comportementale. Elle se traduit par une exacerbation des comportements locomoteurs pour des faibles doses et par l’exacerbation des comportements stéréotypés lors d’une exposition prolongée ou à plus fortes doses (Ben-Shahar et coll., 2004). Or, nos travaux ont permis de mettre en évidence l’importance de Nur77, Nor-1, de la DYN et de l’ENK dans ce phénomène.

4.3.1.1 Rôles opposés de Nur77 et Nor-1 dans la sensibilisation comportementale

4.3.1.1.1 Rôles opposés de Nor-1 et Nur77 dans la réponse comportementale à l’administration chronique de psychostimulants

Dans un premier temps, on a pu constater que la délétion de Nur77 ne semble exacerber les comportements moteurs que dans les conditions d’une stimulation aigüe pour de faibles doses d’AMPH (2,5 mg/kg) alors qu’elle exerce cet effet à la fois en réponse à des stimulations aigües et chroniques pour de plus fortes doses (5 mg/kg). En effet, après une injection aigüe d’AMPH (2,5 mg/kg), on observait une activité accrue chez les souris Nur77 (-/-) et, après l’injection répétée de cette dose d’AMPH, on n’observait aucune différence notable entre l’exacerbation de l’activité locomotrice observées chez nos souris Nur77 (-/-) et celle des souris Nur77 (+/+). Toutefois avec une dose plus élevée (5 mg/kg), on observait un maintien de la sensibilisation locomotrice chez les souris Nur77 (-/-) alors que les souris (+/+) développaient plutôt des stéréotypies.

Par conséquent, on peut en déduire que l’apparition de stéréotypies nécessite l’expression de Nur77 et a plus de probabilité de se produire lorsque le nombre d’injections

267 d’AMPH et/ou la dose d’AMPH administrée sont importants. D’autre part, observant qu’une délétion de Nur77 favorisait une exacerbation accrue des comportements moteurs et la disparation des stéréotypies à fortes doses, nous avons émis l’hypothèse que l’induction de Nur77 exerçait un rôle protecteur selon un mécanisme tampon qui permettrait d’inhiber une activité locomotrice trop intense en générant des mouvements stéréotypés.

Le développement des stéréotypies semble se manifester, en effet, pour contrer une hyperstimulation de l’activité locomotrice et l’on peut poser l’hypothèse que la fonction de tampon de Nur77 ne s’exprime que dans le cas de l’atteinte d’une activité locomotrice excessive qui semble graviter autour d’un score ambulatoire de 20000/1h30 d’enregistrement chez les souris (+/+) (voir fig. 2.7). La délétion de Nor-1, et donc la seule expression de Nur77, semble abaisser de 80 % ce seuil maximal et à l’inverse la délétion de Nur77 semble en supprimer l’existence (voir fig. 2.7 et 2.9). En effet, on constate que, dans le cas d’une exposition répétée à de fortes doses d’AMPH, l’expression de Nur77 conduit à l’établissement, chez les souris Nur77 (+/+), d’un seuil d’activité locomotrice maximale et permet de stopper l’augmentation croissante de l’activité locomotrice induite par chaque nouvelle injection d’AMPH et ce, au profit du développement progressif des stéréotypies. Ainsi, l’induction de Nur77 n’aurait d’effet que dans le cas d’un emballement excessif de l’activité locomotrice pour contrer l’hyperactivation du système DAergique.

Corroborant notre hypothèse, une étude récente réalisée par l’équipe de Tian et coll. (2010) a mis en évidence que, lors d’une stimulation répétée, le système DAergique subissait des modifications persistantes. Ces modifications seraient la résultante d’un phénomène qu’ils appellent le « scaling » synaptique et qui se produirait spécifiquement dans les neurones GABAergiques striataux de la voie de sortie indirecte des ganglions de la base exprimant les récepteurs D2. Or, ces résultats combinés aux nôtres suggèrent fortement que Nur77 est impliqué dans le scaling synaptique dépendant de MEF2 (pour myocyte enhancer factor 2; Surmeier et coll., 2010; Tian et coll., 2010). Dans ce contexte, Nur77 serait induit après une hyperstimulation du système DAergique et pourrait être impliqué dans la diminution de l’affinité des récepteurs D2 mais également dans l’inhibition de la formation des synapses cortico-striatales en induisant une perte des épines

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dendritiques chez les neurones striatopallidaux (Tian et al, 2010). Ainsi, nous avons démontré que Nur77 jouait un rôle dans l’induction des stéréotypies et ce possiblement via la modulation de la plasticité synaptique de la voie de sortie indirecte (D2) des ganglions de la base.

À l’inverse, la délétion de Nor-1, et donc la seule expression de Nur77, semble supprimer l’exacerbation des comportements locomoteurs et favorise directement l’expression des stéréotypies et ce même à de faibles doses d’AMPH (2,5 mg/kg). Nos résultats suggèrent que Nor-1 est indispensable au développement de la sensibilisation de l’activité locomotrice. Nous proposons que c’est l’augmentation des niveaux d’expression de Nor-1 suite à l’administration chronique de psychostimulants qui serait responsable de la sensibilisation locomotrice. De fait, l’expression de Nor-1 est fortement induite par le traitement chronique à l’AMPH (AMPH-VEH et AMPH-AMPH) chez les souris Nur77 (+/+) et les souris Nur77 (-/-) et cette induction semble être corrélée avec le niveau d’activité locomotrice observé. D’après les patrons d’expression observés au chapitre 2 (voir fig. 2.10 et 3.9), on peut clairement identifier que cette augmentation des niveaux d’expression de Nor-1 se produit en particulier au niveau de deux structures : la coquille du NAc et le striatum dorso-médial. Ce faisant, l’induction de Nor-1 qui suit un traitement répété à l’AMPH devrait favoriser une augmentation du pourcentage de récepteurs D2 en haute affinité et une exacerbation du comportement locomoteur chez les souris Nur77 (-/-) et les souris (+/+). Par ailleurs, chez les souris Nur77 (-/-) cette induction de Nor-1 est encore plus prononcée après le challenge à l’AMPH (6e injection) alors que chez les souris (+/+) on n’observe pas cette différence. Ceci pourrait par conséquent expliquer pourquoi on observe le maintien de la sensibilisation locomotrice chez les souris Nur77 (-/-) alors que les souris sauvages commencent plutôt à développer des stéréotypies. De plus, cette induction de Nor-1 est corrélée dans les mêmes structures au maintien, après sevrage, des niveaux d’expression de l’ENK (phase d’expression) et à l’augmentation de l’expression de la DYN (phase d’induction) (voir fig. 2.10, 2.11 et 2.12). Or, nous avons montré justement au chapitre 3 que l’augmentation de la DYN et le maintien de niveaux élevés d’expression de l’ENK contribuaient au développement de la sensibilisation comportementale.

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D’autres études viennent d’ailleurs confirmer l’implication d’une augmentation de l’expression de Nor-1 dans l’acquisition de la sensibilisation induite par les psychostimulants et les drogues d’abus. En effet, il a été suggéré que l’augmentation sélective de Nor-1 dans le NAc favorisait l’exacerbation des comportements locomoteurs et une sensibilité accrue aux psychostimulants (Werme et coll., 2000). D’autre part, tel que mentionné dans l’introduction, le polymorphisme de ce gène est corrélé avec des cas de sensibilité accrue aux drogues d’abus (Koya et coll., 2006; Novak et coll., 2010c).

Ainsi, ces résultats sont en accord avec notre hypothèse selon laquelle l’induction de Nor-1 pourrait exacerber l’activité locomotrice et ainsi induire la sensibilisation locomotrice alors que Nur77 aurait plutôt pour rôle de l’atténuer. Par conséquent, là encore, Nur77 et Nor-1 jouent des rôles opposés dans la sensibilisation comportementale induite par les psychostimulants.

Nos recherches nous permettent de poser une hypothèse quant aux mécanismes qui sous-tendent le développement de la sensibilisation comportementale. A faibles doses, celle-ci se déroulerait selon deux phases successives. Dans la première phase, on observe un accroissement de l’activité locomotrice qui pourrait être lié à une augmentation des niveaux d’expression de Nor-1. Puis, lorsque le nombre d’injections devient trop important, une seconde phase intervient lors de l’atteinte d’un seuil maximal d’activation du système DAergique, il se développe alors des stéréotypies qui seraient dues, cette fois, à une augmentation de l’expression de Nur77. Cette induction de Nur77 entrerait donc en jeu pour tempérer les effets de l’hyperstimulation DAergique. À plus fortes doses, on n’observerait pas la première phase car le dépassement du seuil d’activation se produirait plus rapidement et l’administration répétée de psychostimulants entrainerait donc directement la manifestation de comportements stéréotypés (fig. 4.2).

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SOURIS (+/+) PHASE 1 : SENSIBILISATION PHASE 2 : STÉRÉOTYPIES

Nor-1 Nur77 D2high Cortex Cortex D2high ENK DYN DYN ENK

D2 Striatum /NAc D1 D2 Striatum /NAc D1

SNc /ATV SNc/ATV

GPe GPe

NST GPi/SNr NST GPi/SNr

Neurones glutamatergiques Neurones GABAergiques Thalamus Afférences excitatrices Thalamus Afférences inhibitrices

Activité locomotrice Stéréotypies

Deux possibilités : PHASE 1 : sensibilisation locomotrice x Si administration répétée d’une faible dose (2.5 mg/kg) x Augmentation de la proportion des récepteurs D2High

HYPOTHÈSE : La sensibilisation locomotrice pourrait être due à l’augmentation de Nor-1 et donc de D2high, de la DYN et de l’ENK. En outre, l’induction de l’ENK pourrait être due à la formation de

l’hétérodimère Nur77-RXR qui favorise la régulation à la hausse de l’ENK. Puis/ou

PHASE 2 : stéréotypies x Si dose importante (5 mg/kg) ou faible dose mais sur une plus grande période x Diminution de la proportion des récepteurs D2High

HYPOTHÈSE : Les stéréotypies pourraient être dues à l’augmentation croissante de Nur77 et donc à la diminution des D2high, de l’ENK et de la DYN.

Figure 4.2 : Schéma de l’effet de l’administration chronique d’AMPH chez les souris sauvages.

271

4.3.1.1.2 Nur77 et Nor-1 et la régulation de l’affinité des récepteurs D2

Le rôle potentiel de Nor-1 et Nur77 dans le changement d’affinité des récepteurs D2 et dans la modulation concomitante de l’activité locomotrice est confirmé par nos données. En effet, chez les souris Nor-1 (-/-) on n’observe aucune sensibilisation locomotrice et un passage plus rapide en stéréotypie à des doses plus faibles que pour nos souris (+/+), ce qui indique que la délétion du gène de Nor-1 favorise la diminution de la densité des récepteurs D2high et le développement immédiat des stéréotypies.

À l’inverse, la délétion du gène de Nur77 favorise une augmentation de la proportion des récepteurs D2 en haute affinité et celle-ci pourrait être exacerbée par l’augmentation des niveaux de Nor-1 dans le striatum après l’administration chronique d’AMPH. Cette combinaison pourrait expliquer la sensibilité accrue aux psychostimulants, le maintien, à forte doses, de la sensibilisation locomotrice ainsi que l’absence de stéréotypies.

L’hypothèse d’une corrélation entre une forte densité des récepteurs D2high et la sensibilisation locomotrice est corroborée par une étude de Seeman (2009) qui montre une élévation des niveaux d’expression du récepteur D2high chez des animaux sensibilisés à l’AMPH. En effet, suite à une administration répétée d’AMPH, il se produit une augmentation drastique de 360% de la densité des récepteurs D2high dans le striatum (Seeman et coll., 2002; Seeman et coll., 2003). De la même manière, chez des animaux entraînés à s’auto-administrer de la cocaïne, on observe une augmentation de 150% des récepteurs D2high dans le striatum dorsal (Briand et coll., 2008) qui persiste après l’arrêt du traitement (Volkow et coll., 1990; Martinez et coll., 2004). Ces données, combinées aux nôtres démontrant une induction marquée de Nor-1 suite au traitement chronique d’AMPH, nous confirment, en outre, que l’induction de Nor-1 pourrait moduler à la hausse l’affinité des récepteurs D2 et, par ce biais, induire une augmentation de l’activité locomotrice.

Bien que nous n’ayons pas mesuré nous-mêmes la proportion des récepteurs D2high et D2low suite à l’administration chronique d’AMPH, nous avons observé des changements significatifs dans l’expression de l’ENK. Or, comme nous l’avons mentionnée

272

précédemment, la stimulation des récepteurs D2 induit la synthèse d’ENK (Jiang et coll., 1990). Par conséquent, mesurer les niveaux d’expression de ce neuropeptide, revient à nous fournir une mesure indirecte du niveau d’activité des récepteurs D2. Dans ce cadre, nos mesures concordaient avec nos hypothèses. En effet, chez les souris Nur77 (-/-) et les souris (+/+) nos données suggéraient une exacerbation de l’activité des récepteurs D2 puisqu’elles manifestaient une forte induction de l’ENK striatale et accumbale.

À l’inverse, chez les souris Nor-1 (-/-) on observait plutôt une diminution de l’ENK, ce qui concorde avec l’hypothèse d’une diminution de la densité des récepteurs D2high.

4.3.1.1.3 Rôles opposés de Nur77 et Nor-1 dans la modulation de l’ENK

Ainsi, on constate que l’administration répétée de psychostimulants entraine une modulation opposée de l’expression de l’ENK chez les souris ayant subi une délétion de Nur77 ou de Nor-1. L’ENK est régulée à la hausse chez les souris Nur77 (-/-) et Nur77 (+/+) et à la baisse chez les souris Nor-1 (-/-). Ceci suggère que Nur77 et Nor-1 jouent des rôles opposés dans la régulation de ce neuropeptide. L’expression de Nur77 aurait pour effet de diminuer les niveaux d’ENK alors que Nor-1 en favoriserait plutôt l’expression. Or, des expériences préliminaires menées dans notre laboratoire montrent que la séquence promotrice du gène de la proENK contient divers éléments de réponses spécifiques des récepteurs nucléaires de la sous-famille NR4A : 1) NBRE sur lequel peuvent se fixer les monomères Nur77 ou Nor-1, ainsi que l’hétérodimère Nur77/RXR en l’absence de ligands rétinoïdes et 2) DR-5 sur lequel se fixe l’hétérodimère Nur77/RXR en présence de ligands rétinoïdes (Lévesque et coll., données non publiées).

La présence de ces éléments de réponse montre que la régulation de l’ENK par Nur77 et Nor-1 pourrait s’opérer de manière directe en modulant l’expression de son gène. Leur rôle opposé pourrait, par ailleurs, être expliqué par le fait que Nor-1, contrairement à Nur77, ne peut former d’hétérodimère avec RXR et a donc un spectre d’action différent de Nur77 sur l’expression du gène de l’ENK. On voit en effet que Nor-1 ne peut se fixer à l’élément de réponse NBRE que sous la forme de monomère alors que Nur77 a, quant à lui, deux modes d’interaction possibles avec cet élément de réponse : sous la forme de

273 monomère ou sous la forme d’un hétérodimère avec RXR. Par conséquent selon la forme qu’il adopte (monomère ou hétérodimère), Nur77 peut affecter la transcription de l’ENK de manière différente au niveau de ce site.

Ce que l’on peut déjà conclure de nos observations, c’est que la délétion de Nor-1 entraîne une diminution des niveaux d’ENK suite au challenge à l’AMPH. À l’opposé, chez les souris sauvages, le traitement répété à l’AMPH entraine une augmentation de Nor-1 qui est corrélée avec une augmentation de l’ENK dans les mêmes structures. Ceci nous suggère que la fixation de Nor-1 sur son élément de réponse NBRE aurait alors un rôle activateur sur la transcription de ce neuropeptide.

À l’inverse, la délétion de Nur77 favorise une augmentation des niveaux d’ENK dans le cas d’une injection aigüe. Toutefois, elle n’affecte pas l’induction de l’ENK en réponse à un traitement répété à l’AMPH avec une dose de 2,5 mg/kg. Ainsi, on peut suggérer justement que Nur77 est capable de limiter la synthèse d’ENK et l’activité locomotrice après une injection aigüe mais pas dans le cas de l’injection répétée de faibles doses d’AMPH. Qu’est-ce qui nous amène à formuler cette hypothèse ?

C’est justement l’existence de deux modes potentiels d’interaction de Nur77 avec le promoteur NBRE (monomère, hétérodimère) qui nous invite à poser cette réflexion. Par exemple, des données de la littérature nous permettent, dans un premier temps, de voir que la perte, suite à des injections répétées de faibles doses d’AMPH, de l’effet tampon de Nur77 sur la synthèse de l’ENK et sur l’activité locomotrice pourrait être due à l’activation de l’hétérodimère Nur77/RXR. En effet, une étude récente menée par nos collègues (Bourhis et coll., 2009) a montré qu’un prétraitement systématique avec HX531, un antagoniste des récepteurs RXR avant chaque injection d’AMPH entraînait une atténuation de l’activité locomotrice chez les souris sauvages, un effet qui était absent chez leurs souris Nur77 (-/-). En outre, ils ont montré que cet effet d’atténuation de l’activité locomotrice par l’antagoniste RXR n’était visible qu’à partir de la 3ème journée de traitement (Bourhis et coll., 2009). Par conséquent, on peut en conclure qu’en l’absence d’antagoniste RXR, la formation de l’hétérodimère Nur77/RXR encouragerait les comportements moteurs et hypothétiquement la synthèse d’ENK lors d’administration répétée de faibles doses

274

d’AMPH. En outre, le fait que l’antagoniste HX531 ne peut être efficace qu’après 3 injections suggère que l’effet excitateur de l’hétérodimère Nur77/RXR n’est pas présent pour les injections précédentes. Ce délai dans l’activation de l’hétérodimère Nur77/RXR peut s’expliquer par le fait que, dans les conditions basales, RXR forme un hétérodimère avec RAR, un partenaire pour lequel il a une très forte affinité (Krezel et coll., 1999; Zetterstrom et coll., 1999; pour revue : Lévesque et Rouillard 2007).

Ainsi, ce ne serait qu’au terme d’une accumulation de Nur77 dans la cellule que la compétition entre Nur77 et RAR deviendrait suffisamment forte pour que la formation des hétérodimères Nur77/RXR puisse se produire. En effet, on peut supposer que de faibles stimulations répétées entraînent une induction de Nur77 mais que son rôle inhibiteur serait peu à peu masqué par son hétérodimérisation avec RXR. En conclusion, cela nous suggère que Nur77 n’a un rôle inhibiteur sur la locomotion et sur la synthèse d’ENK que sous la forme monomérique (pour revue : Lévesque et Rouillard 2007). Ceci pourrait d’ailleurs expliquer pourquoi son effet inhibiteur sur l’activité locomotrice n’apparait que lors d’administrations aigües (fig. 4.3).

Nur77 augmente et entre en compétition avec RAR pour former un hétérodimère avec RXR.

Nur77 / RXR-RAR >>>>>>>>>>>>>>>>>> RXR-Nur77 / RAR

AMPH aigüe AMPH chronique Faibles doses Faibles doses

x Le monomère Nur77 prédomine par x L’hétérodimère RXR-Nur77 prédomine rapport à l’hétérodimère RXR-Nur77 par rapport au monomère Nur77

x Inhibition de l’expression de l’ENK x Stimulation de l’expression de l’ENK

x Inhibition de la transmission DAergique x Stimulation de l’activité locomotrice lors de stimulations subséquentes

Figure 4.3 : Hypothèse explicative de l’effet de Nur77 sur la synthèse de l’ENK dans différentes conditions (aigüe, chronique)

275

Par conséquent, cela suggèrerait que la fixation des récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 sur l’élément de réponse NBRE affecte la transcription de manière opposée. La fixation de Nur77, sous sa forme monomérique, à NBRE diminuerait la transcription de l’ENK alors que la fixation du monomère Nor-1, ou la formation de l’hétérodimère Nur77/RXR induirait une augmentation de l’ENK. Cette régulation opposée du niveau d’ENK vient corroborer l’hypothèse selon laquelle Nur77 et Nor-1 jouent des rôles distincts dans la fonction des systèmes DAergiques sous-corticaux (pour revue: Lévesque et Rouillard, 2007).

4.3.1.1.4 Rôles opposés de Nur77 et Nor-1 dans la modulation de la DYN

Les rôles opposés de Nur77 et Nor-1 dans les effets comportementaux des psychostimulants pourraient également se faire via leur capacité à réguler la synthèse de la DYN. En effet, c’est à ce niveaux que nous avons observé les différences les plus marquées chez nos souris Nur77 (-/-) et Nor-1(-/-). De fait, suite au traitement répété avec l’AMPH, la délétion de Nur77 semble favoriser une expression accrue de la DYN alors qu’à l’opposé, la délétion de Nor-1 entraîne une diminution de son expression. Or, nous avons justement démontré au chapitre 3, qu’une augmentation de l’expression de la DYN favorisait l’exacerbation des comportements moteurs et participait à la manifestation de la sensibilisation de l’activité locomotrice. Par contre, on peut constater une inversion des rôles respectifs de Nur77 et Nor-1 dans le contrôle de l’expression de la DYN en comparaison des effets observés à la suite d’une administration unique d’AMPH. En effet, dans les conditions d’une administration ponctuelle d’AMPH, la délétion de Nur77 encourageait plutôt une diminution de l’expression de la DYN et celle de Nor-1 entraînait au contraire une augmentation de sa synthèse. Comment expliquer ce changement radical ?

Notre hypothèse sur ce point repose justement sur le fait qu’on a constaté également, au chapitre 3, un changement du rôle joué par la DYN dans les conditions basales versus dans la réponse à l’administration chronique de psychostimulants.

276

Il est important de noter que, si l’induction de la DYN peut sembler en contradiction avec notre hypothèse initiale notamment eu égard au rôle que nous avons attribué à Nor-1 dans la régulation négative de ce neuropeptide suite à une injection aigüe d’AMPH, une analyse simple nous permet d’expliquer cette apparente discordance. Effectivement, la possibilité que Nor-1 puisse réguler la DYN tantôt à la baisse tantôt à la hausse selon les conditions aigües ou chroniques d’exposition à l’AMPH n’est pas à écarter. Tel que mentionné dans l’introduction, de multiples voies de signalisation ainsi que divers cofacteurs, tantôt corépresseurs, tantôt coactivateurs, peuvent influencer l’activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires tels que Nor-1 et Nur77 (voir introduction partie 1.4.1.3). Les récepteurs nucléaires ont également de multiples sites de phosphorylation. Les différentes formes phosphorylées de ces protéines pourraient aussi conduire à des réponses différentes. Par conséquent, ce changement d’activité des récepteurs Nor-1 et Nur77 ne fait que confirmer plus avant leur rôle crucial dans la régulation de l’homéostasie du système DAergique. En effet, leur malléabilité et leur capacité à répondre rapidement aux changements des signaux extracellulaires pour assurer le suivi et/ou la mise en place des neuroadaptations du système DAergique sont parfaitement illustrés ici. L’exposition répétée suscite donc une inversion des rôles dans l’activité de ces récepteurs.

De plus, on pourrait également sourciller considérant le rôle prêté à la DYN dans les effets aigus de l’AMPH puisqu’alors sa fixation aux KOR favorisait l’inhibition de l’activité locomotrice. Cependant, concernant ce second point, nous avons exposé dans l’introduction et dans le chapitre 3 des données de la littérature montrant que la DYN acquiert un potentiel excitateur sur l’activité locomotrice suite à une stimulation intense et répétée du système DAergique par les psychostimulants. Cet effet excitateur serait médié non plus par les KOR mais par la potentialisation de la fonction motrice excitatrice du récepteur NMDA (Massardier et Hunt, 1989; Shukla et coll., 1997; Voorn et coll., 2007; pour revue : Schwarzer, 2009). Il pourrait être intéressant, dans des recherches ultérieures, d’identifier les nouvelles voies de signalisation induites par la DYN de par sa fixation sur ce récepteur différent. Une perspective intéressante de recherche, serait d’identifier si l’une d’elle n’interagirait pas avec Nor-1 et/ou Nur77 expliquant possiblement le changement de leur activité transcriptionnelle.

277

Pour conclure, constatant que, suite à une administration chronique d’AMPH, la délétion de Nor-1 diminuait l’expression de la DYN et que celle de Nur77 l’augmentait, nous en avons déduit que dans les conditions normales Nor-1 et Nur77 jouaient des rôles opposés dans la régulation de la transcription de la DYN suite à une exposition chronique d’AMPH. Nor-1 semble exacerber son expression alors que Nur77 a l’effet inverse.

4.3.1.1.5 Conclusions sur Nur77 et Nor-1 dans la sensibilisation comportementale

En somme, toutes ces données consolident notre postulat initial : dans le contexte de l’administration répétée de psychostimulants, Nor-1 joue un rôle crucial dans l’induction de la sensibilisation comportementale et dans l’exacerbation des comportements locomoteurs. Il exercerait ses effets via de multiples mécanismes aussi bien au niveau de la voie de sortie directe D1, qu’au niveau de la voie de sortie indirecte D2: la modulation à la hausse de l’affinité des récepteurs D2, le maintien de l’expression de l’ENK à des niveaux élevés ainsi que l’induction de la DYN désormais stimulatrice de l’activité locomotrice. En effet, sa délétion, au contraire, entraîne l’apparition d’un phénotype hyporéactif à l’exposition chronique aux psychostimulants, marqué par la suppression de la sensibilité comportementale au profit des stéréotypies, par l’augmentation de l’expression de Nur77, la diminution de la proportion des récepteurs D2high, et diminution de l’expression de l’ENK et de la DYN (fig. 4.4).

Aussi, ces données nous permettent d’affirmer que l’expression de Nur77 est indispensable au développement des stéréotypies lors d’une exposition à une forte dose d’AMPH (5 mg/kg). Aussi, on a pu en déduire que son action globale avait pour but de temporiser l’activation du système DAergique et favorisait un phénotype moins sensible aux effets des psychostimulants. En effet, sa délétion, à l’inverse, favorise l’apparition d’un phénotype hypersensible imputable à divers facteurs. En réponse à l’administration chronique de psychostimulants, sa délétion favorise, en effet, une augmentation des niveaux d’expression de Nor-1, une augmentation de l’expression de la DYN et de l’ENK ainsi qu’une hausse de la proportion des récepteurs D2 en haute affinité (fig. 4.4).

278

Souris Nur77 (-/-) Souris Nor-1 (-/-)

Nor-1 Cortex Cortex D2high D2high ENK DYN ENK DYN

D2 Striatum /NAc D1 D2 Striatum /NAc D1

SNc/ATV SNc/ATV

GPe GPe

NST GPi/SNr NST GPi/SNr

Thalamus Neurones glutamatergiques Thalamus Neurones GABAergiques Activité locomotrice Afférences excitatrices Afférences inhibitrices Stéréotypies

Proportion de D2high très ÉLEVÉE Proportion de D2high très FAIBLE Car il y un effet cummulé de la délétion de Car il n’y a pas d’expression de Nor-1 et

Nur77 et de l’augmentation de Nor-1 induction de Nur77

x Augmentation de l’ENK et induction accrue x Expression de l’ENK et de la DYN moindre de la DYN par rapport aux souris Nur77 (+/+). par rapport aux Nor-1(+/+).

x Activation du thalamus par la voie D1 x Activation du thalamus par la voie D1 encore plus grande que chez les Nur77 (+/+) moins importante que chez les Nor-1 (+/+)

et inhibition par la voie D2 encore mois et inhibition par la voie D2 encore plus robuste et moins rapide. robuste que dans les conditions basales.

ÉTAT SUR-SENSIBILISÉ STÉRÉOTYPIES ET ET

PAS DE STÉRÉOTYPIES PAS DE SENSIBILISATION

MORT dans le cas de trop fortes doses ou si le protocole de prise répétée d‘AMPH est prolongé

Figure 4.4 : Administration chronique d’AMPH chez les souris Nur77 knockout et Nor-1 knockout.

279

Là encore, cela suggère que l’importance de l’effet moteur observé est déterminée par le ratio Nur77/Nor-1. Dans le cas d’une prédominance de Nor-1 on aura une activité locomotrice exacerbée et des niveaux d’expression des D2high et d’ENK élevés alors que dans le cas d’une prédominance de Nur77 on observera un développement des stéréotypies lié à des niveaux d’expression des D2high et d’ENK plus faibles.

Une autre hypothèse pourrait être que Nur77 et Nor-1 sont régulés de manière différente dans les deux voies de sortie directe et indirecte du striatum en réponse aux divers traitements à l’AMPH (aigu versus chronique) dans le cas d’une délétion de l’ENK ou de la DYN. Les travaux de notre laboratoire démontrent en effet que Nur77 et Nor-1 peuvent être exprimés de façon plus ou moins sélective tantôt dans les neurones de la voie directe ou indirecte en fonction de différentes conditions : lésions des systèmes DAergiques, traitement avec des agonistes ou des antagonistes DAergiques (St-Hilaire et coll., 2003; Maheux et coll., 2005; pour revue : Lévesque et Rouillard, 2009).

À la lumière des résultats obtenus, on peut proposer plusieurs améliorations qui auraient pu être apportées à notre étude. Dans un premier temps, il aurait été intéressant de tester la dose de 5 mg/kg chez les souris Nor-1 (-/-) versus Nor-1 (+/+) pour évaluer si nos souches sauvages 129S4/SV (Nor-1 (+/+)) sont aussi sensibles à l’AMPH que les C57/BL6 (Nur77 (+/+)) et voir si avec une plus forte dose les Nor-1 (+/+) développent également des stéréotypies. Aussi, il nous manque des données biochimiques suite au traitement de 5 mg/kg. Il faudrait également mesurer, pour cette dose plus élevée, les niveaux d’expression de Nur77 et Nor-1 en réponse à des expositions ponctuelles et répétées d’AMPH pour confirmer qu’il se produit bien une induction exacerbée de Nur77 dans les deux conditions.

D’autre part, certaines études ont avancé que les stéréotypies se développaient en réponse à l’administration de très fortes doses ou suite à des protocoles plus longs d’administration répétée d’AMPH (Ben-Shahar et coll., 2004; Ferrario et coll., 2005). Aussi, pour étudier si l’induction de Nur77 intervient également dans le cas de faibles doses mais seulement après un nombre d’injections plus important, il aurait été pertinent d’une part de prolonger la phase d’induction et de faire d’autre part des sacrifices plus

280

fréquemment, après chaque injection, et ce pour mieux illustrer l’évolution du ratio d’expression de Nur77 et Nor-1 en fonction du nombre d’injections. En outre, pour confirmer le lien entre la dose de psychostimulant administrée et l’induction de ces deux récepteurs nucléaires, il serait pertinent de préciser nos résultats par l’édification d’une courbe dose-réponse. Et ce, pour illustrer la relation entre la dose administrée et l’expression des deux récepteurs nucléaires mais aussi la relation entre la dose administrée et l’accroissement de l’activité locomotrice ou des stéréotypies. On pourrait ainsi établir plus directement un lien entre la dose d’AMPH administrée et 1) l’expression concomitante de Nur77 et des stéréotypies ou 2) l’expression de Nor-1 et l’exacerbation de l’activité locomotrice.

4.3.1.2 Rôles de l’ENK et de la DYN dans la sensibilisation comportementale

4.3.1.2.1 Rôles de l’ENK et de la DYN dans la réponse comportementale à l’administration chronique de psychostimulants

Nos données ont permis de mettre en évidence l’importance de l’expression de l’ENK et de la DYN dans la manifestation de la sensibilisation comportementale induite par l’administration répétée d’AMPH. En effet, la délétion de l’un ou l’autre de ces neuropeptides atténue l’induction et l’expression de la sensibilisation comportementale. Ceci suggère donc une implication de ces deux neuropeptides dans la réponse comportementale induite par l’administration répétée d’AMPH et en particulier dans les mécanismes de plasticité à long terme responsables de l’installation de la sensibilisation comportementale.

Tel que nous l’avons mentionné dans l’introduction, peu d’études se sont intéressées à l’implication de l’ENK dans la sensibilisation comportementale. Les recherches réalisées jusqu’à présent ont surtout mis en exergue le rôle de la DYN dans l’induction de la sensibilisation locomotrice par les psychostimulants. Si ce rôle est en effet confirmé pour la DYN, nos données montrent que l’expression de l’ENK est tout aussi indispensable pour observer cette réponse comportementale exacerbée. Certaines études soutiennent par

281 ailleurs notre hypothèse puisqu’il a été démontré que la voie de sortie indirecte des ganglions de la base exprimant sélectivement l’ENK pouvait, elle aussi, être impliquée dans l’instauration de ce phénomène. Par exemple, il a été prouvé que le blocage des MOR dans le striatum empêchait le développement de la sensibilisation comportementale (Kalivas et coll., 1985; Kalivas et coll., 1986). Approfondissant cette découverte, certaines études réalisées au courant des dernières décennies soulignent également l’implication de la voie de sortie indirecte des ganglions de la base dans la sensibilisation comportementale. En effet, selon ces études, les agonistes des MOR augmentent le niveau de DA dans le NAc (Di Chiara et Imperato, 1988; Devine et coll., 1993) et stimulent l’activité locomotrice lorsqu’injectés dans l’ATV ou dans le NAc (Dauge et coll., 1988; Cunningham et Kelley, 1992b; Druhan et coll., 1993). Renforçant ce constat, il a également été démontré que l’inactivation du gène de ce même récepteur par un oligonucléotide antisens atténuait la sensibilisation comportementale ainsi que la préférence de place conditionnée induites par l’administration répétée de cocaïne (Hummel et coll., 2006). Enfin, l’équipe de Morales- Mulia et coll. (2007) a suggéré que l’AMPH induisait des changements dans la neurotransmission enképhalinergique qui seraient responsables des neuroadaptations qui sous-tendent la sensibilisation comportementale (Morales-Mulia et coll., 2007).

Toutefois, fait intéressant, même si la délétion de l’ENK atténue la sensibilisation comportementale, on a pu observer qu’une augmentation des niveaux d’ENK n’était pas systématique et nécessaire au développement et à l’expression de la sensibilisation comportementale. En effet, hormis les souris Nur77 (+/+), ni les souris DYN (+/+), ni les souris Nor-1 (+/+) qui développaient une sensibilisation, ne présentaient de modifications dans l’expression de l’ENK suite au traitement chronique à l’AMPH. Cependant, nous avons vu que l’exacerbation des effets de l’ENK, ne nécessitait pas forcément une augmentation de sa libération et de sa synthèse mais pourrait impliquer une augmentation de l’expression des MOR et DOR sélectifs de l’ENK. En effet, leur expression est induite à la hausse dans la VTA et le NAc des animaux présentant une sensibilisation comportementale aux psychostimulants (Unterwald, 2001; Unterwald et coll., 2001; Magendzo et Bustos, 2003; Mathon et coll., 2005b). Les DOR seraient en particulier impliqués dans l’initiation de la sensibilisation comportementale alors que les MOR

282

joueraient plus spécifiquement un rôle dans l’expression de la sensibilisation comportementale. Par conséquent, on peut en conclure que le maintien de l’expression constitutive de l’ENK et l’augmentation de l’expression de ses récepteurs suffiraient à garantir l’apparition de la sensibilisation comportementale.

Ainsi, ces données combinées aux nôtres confirment que l’ENK est bien indispensable au développement et à l’expression de la sensibilisation comportementale induite par les psychostimulants. Elles suggèrent également que l’ENK exercerait un effet excitateur sur l’activité locomotrice via la stimulation des récepteurs DOR et MOR.

Concernant le rôle de la DYN, nous avons montré que la délétion constitutive de la DYN atténuait la sensibilisation comportementale. Cela pourrait sembler surprenant au regard des nombreuses études qui ont clairement montré l’effet inhibiteur des agonistes des KOR sur l’activité locomotrice (Wise et Bozarth, 1985; Koob, 1992). Néanmoins, d’autres études permettent d’apporter une explication à cette apparente contradiction. En effet, il a été démontré que la neurotransmission opioïdergique médiée par les KOR présentait des adaptations à la suite d’une exposition répétée aux psychostimulants (Shippenberg et coll., 2001). Curieusement, il a été montré que, si l’injection répétée d’AMPH entraînait une induction des niveaux d’expression de la DYN, on observait une diminution concomitante de la liaison aux KOR (Turchan et coll., 1998). Selon une autre étude, l’exposition à l’AMPH aurait pour effet de désensibiliser sélectivement les KOR dans le NAc (Xia et coll., 2008). De plus, en accord avec le fait que les souris DYN (-/-) ne développent pas de sensibilisation comportementale suite à l’administration chronique d’AMPH, des études ont mis en évidence que la DYN pouvait, contre toute attente, stimuler la motricité au lieu de l’inhiber (Walker et coll., 1982; Nakazawa et coll., 1989). En effet, selon l’équipe de Shukla (1997), l’administration i.c.v de la DYN et de ses dérivés provoquerait une forte induction des comportements moteurs chez la souris et ce, proportionnellement à la dose administrée (Shukla et coll., 1997). En outre, il semblerait que les effets excitateurs de la DYN ne soient pas médiés par la fixation aux KOR car un prétraitement au naxolone, un antagoniste des KOR, n’affecte pas les effets moteurs de la DYN. Par quel mécanisme, la DYN pourrait-elle alors provoquer cette induction de l’activité locomotrice ?

283

Les effets moteurs de la DYN pourraient être médiés par son action sur le récepteur NMDA (pour revue : Schwarzer et coll., 2009). En effet, une étude suggère que le récepteur NMDA pourrait être impliqué dans les effets dits non-opioïdes de la DYN et de ses dérivés (Shukla et Lemaire, 1994). Par exemple, il été découvert que l’administration d’antagonistes non-compétitifs des récepteurs NMDA tels que le metaphit, le dextromethorphan ou la kétamine altérait les effets moteurs induits par la DYN (Shukla et coll., 1992). Ainsi, l’activation motrice causée par la DYN serait due à son interaction avec le récepteur NMDA au niveau de son site de liaison aux acides aminés excitateurs. En outre, cette interaction pourrait possiblement potentialiser l’action de l’acide glutamique ou de l’acide aspartique endogènes (Hauser et coll., 2005). Cependant, une étude plus récente montre que cet effet de potentialisation du récepteur NMDA pourrait être plus particulièrement être attribuée à l’action du neuropeptide appelé Big DYN qui est un dérivé du peptide proDYN et qui serait constitué à la fois de la DYN A et de la DYN B (avant clivage). En effet, selon une étude l’administration en i.c.v de Big DYN entraine une augmentation de l’activité locomotrice qui peut être inhibée par MK 801, un antagoniste du récepteur NMDA. À l’inverse la DYN A et B n’ont aucun effet moteur et leurs autres effets comportementaux sont bloqués spécifiquement par des antagonistes des KOR (Kuzmin et coll., 2006). Enfin, une étude plus récente montre que la DYN A pourrait, elle aussi, être impliquée dans les effets non-opioïdes excitateurs du système dynorphinergique puisqu’elle démontre que des injections de DYN A engendrent des comportements qui s’apparentent aux stéréotypies. De plus, elle démontre que ces comportements sont inhibés de manière dose-dépendante par l’administration de MK 801 mais ne sont pas perturbés par le naxolone, un antagonistes des récepteurs opioïdes. Toutes ces données confortent notre hypothèse qu’une forte dose de DYN ou son accumulation suite à des administrations répétées de psychostimulants peut provoquer une exacerbation de la sensibilisation comportementale puis des stéréotypies (Watanabe et coll., 2012).

En résumé, la DYN peut produire des effets à la fois inhibiteurs (Wagner et coll., 1993) et stimulateurs (Walker et coll., 1982) sur le SNC. Les effets inhibiteurs de la DYN nécessitent la participation des KOR, alors que ses effets stimulateurs reposent sur son interaction avec le récepteur NMDA et la potentialisation des effets moteurs induits par la

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stimulation de ce récepteur (Massardier et Hunt, 1989; Skilling et coll., 1992). Confirmant cette thèse, l’équipe de Chefer et Shippenberg (2006) a montré que, chez les souris DYN (- /-), le blocage pharmacologique des KOR permettait de rétablir l’augmentation des niveaux de DA normalement induite par la cocaïne sans pour autant rétablir la sensibilisation comportementale. Ces résultats démontrent, en outre, que la suppression, observée chez les souris DYN (-/-), des effets activateurs des psychostimulants sur l’activation locomotrice n’est pas médiée par les KOR.

Ainsi, l’ensemble de ces données nous permet de formuler une explication quant aux mécanismes contribuant à la manifestation de la sensibilisation comportementale. Celles-ci nous suggèrent que l’administration chronique de psychostimulants, en désensibilisant progressivement les KOR, favoriserait alors la fixation de la DYN sur le récepteur NMDA. Ce serait donc la potentialisation, par la DYN, des effets excitateurs de ce récepteur sur l’activité locomotrice, combinée aux effets excitateurs de l’ENK via les récepteurs MOR et DOR, qui serait responsable de l’exacerbation de l’activité locomotrice induite par les psychostimulants.

4.3.1.2.2 Rôles de l’ENK et de la DYN dans la modulation de Nur77 et Nor-1

Les résultats présentés au chapitre 2 confrontés à ceux obtenus au chapitre 3 démontrent clairement l’implication des facteurs de transcription Nur77 et de Nor-1 dans les effets comportementaux induits par la consommation à long terme des psychostimulants. Nous avons démontré que l’induction de Nur77 était fortement impliquée dans l’apparition des comportements stéréotypés qui se manifestent après une exposition excessive aux psychostimulants. Nous avons, en outre, formulé l’hypothèse que son expression interviendrait pour contrer l’hyperstimulation du système DAergique et l’exacerbation des comportements locomoteurs. À l’inverse, l’induction de Nor-1 contribuerait à l’exacerbation des comportements locomoteurs. En outre, nous avons posé l’hypothèse que Nur77 et Nor-1 exerceraient un rôle opposé sur l’expression de l’ENK ainsi que sur celle de la DYN.

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Les données biochimiques obtenues chez nos souris ENK (-/-) confirment nos hypothèses. En effet, dans les conditions basales ces souris présentaient des niveaux d’expression de Nur77 accrus dans le NAc. Ce qui, selon notre hypothèse initiale favoriserait une diminution de l’expression des récepteurs D2high et contribuerait également à l’activité basale réduite observée chez les souris ENK (-/-). Cependant, suite à la phase d’expression, après le dernier challenge à l’AMPH, nous avons observé une forte induction de Nur77 dans le STDM et le NAc des souris ENK (+/+) mais aucun changement chez les souris ENK (-/-). Ces résultats suggèrent que dans les conditions d’une exposition chronique, l’ENK peut aussi moduler les niveaux d’expression de Nur77 à la hausse. Connaissant le rôle inhibiteur de Nur77 sur l’activité locomotrice, le fait que la délétion de l’ENK supprime l’induction de Nur77 lors de la phase d’expression, suggère qu’il existe un système efficace de rétroaction réciproque entre l’ENK et Nur77.

Cependant chez les souris ENK (-/-), l’hypothèse d’un déséquilibre du ratio d’expression entre Nur77 et Nor-1 dans la détermination des effets comportementaux ne semble plus être valide. En effet, de manière intéressante, on observe également une induction de Nor-1 aussi bien chez les souris ENK (-/-) que chez les souris (+/+). Nous pouvons en tirer deux conclusions intéressantes. Premièrement, ces données nous confirment que l’expression de Nor-1 augmente bien en réponse à une administration chronique d’AMPH. Deuxièmement, elles nous indiquent que l’exacerbation des comportements moteurs à laquelle nous nous attendrions suite à une induction de Nor-1 ne peut se produire en l’absence d’ENK. Ceci supporte notre hypothèse selon laquelle Nor-1 agit bien en amont de l’ENK dont il régule la fonction à la hausse favorisant ainsi l’exacerbation des comportements moteurs. Nous avons posé l’hypothèse que cette modulation interviendrait soit par la modulation directe de la synthèse de l’ENK et/ou la modulation la hausse de l’expression des MOR et des DOR. La délétion de l’ENK ne permettant pas cette modulation, l’exacerbation des comportements moteurs n’a pas lieu chez les souris ENK (-/-).

Les données obtenues pour nos souris DYN (-/-) quant à l’expression de Nur77 et Nor-1 nous permettent d’affiner plus avant notre compréhension du rôle respectif de ces deux facteurs de transcription. Dans un premier temps, nos résultats montrent que les

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injections répétées d’AMPH entraînent une induction sensiblement plus forte de l’expression de Nor-1 chez les souris sauvages que chez les souris déficientes pour la DYN, et ce, en particulier dans les régions latérales du striatum et dans la coquille du NAc. Ceci suggère donc qu’une induction marquée de Nor-1 est indispensable pour observer l’exacerbation des comportements locomoteurs induite par les psychostimulants chez les souris sauvages. Nous pouvons, d’autre part, en conclure que cette induction, plus forte, de Nor-1 et la manifestation de la sensibilisation comportementale sont toutes deux conditionnelles à la présence de la DYN. D’autre part, on a pu observer que l’administration répétée de psychostimulants induisait également une augmentation de l’expression de Nur77 dans le striatum et le NAc des souris DYN (+/+) en particulier lors de la phase d’expression de la sensibilisation comportementale c'est-à-dire après le challenge à l’AMPH mais qu’elle n’avait pas lieu chez les souris DYN (-/-). Ceci renforce également notre hypothèse selon laquelle l’induction de Nur77 ne se produirait qu’en réponse à une stimulation excessive de l’activité locomotrice. Ainsi, on pourrait formuler l’hypothèse suivante : comme les souris DYN (-/-) n’ont pas développé, contrairement à leur congénères sauvages, une sensibilité accrue à l’AMPH suite au traitement chronique, l’induction temporisatrice de Nur77 ne se produit pas.

Ces données nous indiquent donc que Nor-1 pourrait possiblement réguler l’expression de l’ENK mais que cette régulation ne peut se produire que si la DYN est présente. Par conséquent l’expression de la DYN pourrait possiblement influencer celle de Nor-1. L’expression de Nur77 semble quant à elle être régulée à la hausse en présence d’ENK puisque les souris ENK (-/-) présentent des niveaux d’expression moindre de Nur77. En outre nous avons vu dans la section 4.3.1.1.4 que la délétion de Nur77 ou de Nor-1 influençait l’expression de la DYN suite à un traitement chronique d’AMPH. Ainsi, on pourrait s’avancer à proposer qu’il existe une relation de modulation réciproque des Nurs sur l’expression des neuropeptides et des neuropeptides sur celle des Nurs. Or, à partir des connaissances existantes, on peut aisément concevoir que les récepteurs nucléaires/facteurs de transcription Nur77 et Nor-1 pourraient moduler l’expression des neuropeptides. En effet, pour exemple, nous avons déjà évoqué à la section 4.3.1.1.3 que la séquence promotrice du gène de la proENK contenait des éléments de réponse spécifiques

287 des Nurs ce qui indique que Nor-1 et Nur77 peuvent directement agir sur l’expression de ce gène. Il reste cependant à déterminer si de telles séquences existent également sur le gène de la proDYN. Néanmoins, il est plus difficile de suggérer comment s’effectue la régulation réciproque de l’expression des Nurs par la DYN ou l’ENK puisque ces dernières ne sont pas, contrairement aux facteurs de transcription, directement vouées à la fonction de modulateurs de la transcription génétique. En effet, on ne connait pas les mécanismes qui pourraient intervenir dans la régulation des Nurs par les neuropeptides et il serait intéressant d’étudier les voies de signalisations induites par la DYN et l’ENK pour déterminer si elles ont une influence sur l’expression de ces facteurs de transcription.

4.3.1.2.3 Interactions entre les voies de sorties directe et indirecte

Enfin, nos résultats nous ont également permis de mettre en évidence que, suite à un traitement chronique à l’AMPH, la délétion de l’ENK favorisait une diminution de l’expression striatale et accumbale de la DYN alors qu’on observait une induction chez les souris ENK (+/+). Ainsi, lorsque la sensibilisation comportementale ne se produit pas, comme c’est le cas pour les souris ENK (-/-), on n’observe pas d’induction de l’expression de la DYN. Par conséquent, on pourrait en déduire que ces souris ne développent pas de sensibilisation car les niveaux d’expression de DYN restent peu élevés. Confirmant les résultats obtenus précédemment, nos résultats suggèrent également qu’il existe des interactions croisés entre la voie directe et la voie indirecte qui seraient médiées par les systèmes opioïdergiques : enképhalinergique et dynorphinergique. Cela suggère, en particulier, que l’ENK pourrait éventuellement réguler l’expression de la DYN et ce, selon un mécanisme qu’il reste encore à déterminer.

4.3.1.2.4 Conclusions sur l’ENK et la DYN dans la sensibilisation comportementale

Ainsi, les résultats obtenus aussi bien au chapitre 2 qu’au chapitre 3, montrent que l’augmentation de la DYN dans les neurones du striatum et du NAc de la voie de sortie directe des ganglions de la base est directement impliquée dans la sensibilisation comportementale. Notre travail a également confirmé l’intervention indispensable du

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système enképhalinergique dans la sensibilisation comportementale puisque la délétion de l’ENK, exprimée par les neurones du striatum et du NAc appartenant à la voie de sortie indirecte des ganglions de la base, peut atténuer la sensibilisation comportementale et ce possiblement en bloquant l’induction de DYN. Ce faisant, nos résultats suggèrent également l’existence d’interactions entre les deux voies de sortie des ganglions de la base qui seraient médiées par les opioïdes DYN et ENK. En outre, nos données soulignent une relation de régulation réciproque entre les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 et les neuropeptides DYN et ENK dans la réponse aux psychostimulants. En effet, au chapitre 2 nous avions vu que l’ENK et la DYN pouvaient être régulées toutes deux à la baisse par la délétion de Nor-1 et à la hausse par la délétion de Nur77 dans les conditions d’une exposition chronique à l’AMPH. Au chapitre 3, à l’inverse on a vu que la délétion de la DYN modulait l’expression de Nor-1 à la baisse et celle de Nur77 à la hausse. Alors que la délétion de l’ENK régule l’expression de Nur77 à la baisse sans affecter l’expression de Nor-1. Par conséquent les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 et les neuropeptides DYN et ENK, sont intimement reliés et interviennent tous dans la modulation de la transmission DAergique induite par l’administration répétée d’AMPH.

4.3.2 Rôles de Nur77, Nor-1, DYN et ENK dans la préférence de place

4.3.2.1 Rôles de Nur77 et Nor-1 dans la préférence de place

Les résultats présentés au chapitre 2 nous confèrent également une meilleure compréhension de l’implication de Nur77 et Nor-1 dans la préférence de place et donc dans les apprentissages associatifs qui ont lieu lors de l’administration chronique de psychostimulants. On a pu voir ainsi que Nor-1 et Nur77 semblent jouer encore une fois des rôles distincts. Nur77 est clairement impliqué dans la rétention de l’association des indices contextuels liés à la prise de cocaïne. Dans un premier temps, nous avons observé, chez les souris sauvages, une induction de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe suite à un conditionnement avec des injections répétées de cocaïne. Dans un second temps, nos résultats montrent que la délétion de Nur77 compromet la rétention à long terme de la

289 préférence pour le compartiment associé à l’administration de cocaïne. Ainsi, à partir des effets mesurés de la délétion de Nur77, nous avons déduit que l’expression de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe était nécessaire pour observer un maintien de la préférence de place conditionnée 14 jours après l’arrêt du traitement. La délétion de Nor-1 étant quant à elle sans effets notables sur ce comportement, on peut en déduire que son rôle y est négligeable. De plus, contrairement à Nur77, on n’observe aucune modulation de l’activité de Nor-1 dans l’hippocampe chez les souris sauvages suite à l’administration chronique de psychostimulants.

L’hypothèse de la nécessité d’une induction de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe pour observer un maintien de l’apprentissage des associations entre la prise de drogue et l’environnement est également appuyée par des études portant sur la mémoire et l’apprentissage. En effet, il a par exemple été démontré que dans le cadre d’un conditionnement de peur associé au contexte (« contextual fear conditioning »), un contexte d’apprentissage faisant intervenir spécifiquement l’hippocampe et réalisé via l’utilisation de chocs électriques aversifs (Maren, 2008), on observait un accroissement des niveaux d’expression de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe dorsal (Malkani et Rosen, 2000; von Hertzen et Giese, 2005). Confirmant plus avant cette suggestion, on observe qu’une injection intra-hippocampale d’un inhibiteur de l’HDAC qui stimule la mémoire, suscite une augmentation de l’expression de Nur77 et Nurr1 dans l’hippocampe (Vecsey et coll., 2007). Ainsi, une molécule favorisant la mémorisation induit de manière concomitante l’expression de Nur77 et Nurr1 dans l’hippocampe. Ceci suggère une implication de ces facteurs de transcription dans la plasticité neuronale de l’hippocampe responsable de la mémorisation des associations drogues/environnement.

La sous-famille des récepteurs nucléaires NR4A est d’ailleurs impliquée dans la régulation de gènes intervenant dans la formation de la mémoire (pour revue: Hawk et Abel, 2011; Hawk et coll., 2011). De fait, il a été démontré que des composantes de la voie de signalisation de NF-κB (pour nuclear factor-kappa B) augmentaient suite à l’induction de certains membres de la sous-famille NR4A (Pei et coll., 2006). Par exemple, C-Rel (un des membres de la famille NF-κB) serait une cible des récepteurs nucléaires NR4A et serait

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requis pour la formation de la mémoire dépendante de l’hippocampe (Levenson et coll., 2004; Ahn et coll., 2008). D’autre cibles de Nur77 et Nurr1 ont été identifiées comme étant impliquées dans la formation de la mémoire (pour revue: Hawk et Abel, 2011): 1) deux protéines-tyrosine phosphatases de type récepteurs (RPTPs pour Receptors Protein Tyrosine Phosphatases) qui interviennent dans la neuromorphogenèse et en particulier dans la formation de synapses excitatrices et 2) la protéine MARCKS (pour Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate) cible de la protéine kinase C qui serait quant à elle impliquée dans la plasticité synaptique et l’apprentissage dépendant de l’hippocampe (Calabrese et Halpain, 2005; McNamara et coll., 2005; Timofeeva et coll., 2010).

Quelles sont les voies de signalisations qui pourraient être impliquées ? De manière intéressante, il a été suggéré que Nur77 pourrait être une cible de CREB. En effet, l’induction de la cascade de signalisation de la CAMK qui est requise pour l’activation de CREB dans le cadre du conditionnement de peur associé au contexte (Wei et coll., 2002) est capable de réguler l’expression de Nur77 (Inuzuka et coll., 2002). En outre, deux autres études réalisées dans le cadre d’un protocole de conditionnement de peur ont démontré que chez des souris déficientes pour le gène de la CAMKII, on observait une altération de la mémoire à long terme ainsi que l’abolition de l’induction de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe (Irvine et coll., 2005; von Hertzen et Giese, 2005). Il a été ensuite précisé que l’autophosphorylation de la CAMKII alpha était requise non seulement pour provoquer l’induction de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe mais aussi pour observer la LTP dépendante des récepteurs NMDA au niveaux des synapses glutamatergiques de la région CA1 (Giese et coll., 1998). Or, selon certains auteurs la régulation à la hausse de Nur77 serait médiée justement par la plasticité synaptique dépendante du récepteur NMDA (von Hertzen et Giese, 2005).

En outre, une étude récente portant sur la sensibilité aux psychostimulants a permis de mettre en évidence une différence dans l’expression de certains gènes chez les animaux hypersensibles (high responders) versus les animaux hyposensibles (low responders). Or, la majorité de ces différences ont été localisées plus particulièrement dans la région CA1 de l’hippocampe. Les gènes concernés appartiendraient, pour la plupart, à la famille des gènes

291 régulés par le promoteur CRE (pour cyclic AMP response element) et seraient les cibles de facteurs de transcription tels que le récepteur des glucocorticoïdes (GR) et MEF2. Par exemple, une augmentation marquée de GR, MEF2 et des gènes régulés par le promoteur CRE a été observée dans la région CA1 des animaux hypersensibles. De manière intéressante, Nur77 a été identifié comme l’un des gènes d’induction précoce dont l’expression basale est plus fortement augmentée dans la région CA1 chez les high responders (Datson et coll., 2011).

L’expression hippocampale plus marquée de MEF2 chez les high responders est particulièrement intéressante. Connaissant son implication dans le « scaling » synaptique et dans la modulation de Nur77 au niveau du striatum suite à l’administration chronique de psychostimulant, on peut proposer une hypothèse quant aux mécanismes qui sous-tendent, au niveau hippocampal, la rétention de l’association drogue/environnement Nur77- dépendante. On peut en effet supposer que, suite à l’administration répétée de psychostimulant, il se produit une activation de MEF2 dans la région CA1 qui entraîne comme au niveau striatal une induction de Nur77 (Flavell et coll., 2006; Datson et coll., 2011). Si l’on suit cette idée, le phénomène de « scaling » synaptique s’étendrait à la région CA1 de l’hippocampe et provoquerait, à l’instar de ce qui se produit au niveau striatal (Tian et coll., 2010), une régulation à la baisse des influx glutamatergiques vers la région CA1 et ce via l’induction de Nur77. L’induction de Nur77 dans la région CA1 pourrait, par conséquent, induire une LTD dans les neurones CA1 de l’hippocampe. Or, la LTD dans l’hippocampe n’a pas le même effet qu’au niveau striatal. De fait, une LTD se produisant dans la région CA1 de l’hippocampe aurait pour effet de favoriser la consolidation de la mémoire spatiale (Ge et coll., 2010). En effet, comme les synapses hippocampales sont actives de manière constitutive, l’information peut être consolidée en inhibant de façon persistante certaines synapses via une LTD. Ainsi, cela suggère que Nur77 pourrait être impliqué dans la LTD indispensable à la consolidation de la mémoire spatiale. Cette hypothèse concorderait ainsi avec les résultats obtenus au chapitre 2 et expliquerait pourquoi la délétion de Nur77 écourte la maintenance à long terme de la préférence de place conditionnée. Ceci signifie qu’en l’absence de Nur77, la rétention de l’association entre les indices environnementaux et la prise de drogue est moins solide et suggère un rôle de Nur77 dans la consolidation de la mémoire.

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Cependant les mécanismes expliquant la consolidation de l’information par Nur77 semblent encore peu clairs. En effet d’autres études suggèrent une autre hypothèse quant aux mécanismes sous-tendant l’action de Nur77. De fait, il est connu qu’au niveau striatal, la MEK et la PKC participent aux cascades de signalisation induites par la stimulation des récepteurs DAergiques et menant à la modulation des niveaux d’expression de Nur77 (Bourhis et coll., 2008). Par conséquent, ERK pourrait également être une candidate possible pour la voie de signalisation menant à l’induction de Nur77 dans la région CA1. De manière congruente avec cette idée, il a été justement montré que ERK était impliquée : 1) dans la LTP hippocampale (English et Sweatt, 1996; English et Sweatt, 1997) ; 2) dans l’apprentissage et en particulier dans les mécanismes de stockage de la mémoire à long terme dans un contexte de conditionnement de peur ; 3) dans la mémoire spatiale (Selcher et coll., 1999) ; 4) dans la sensibilisation comportementale (Kelly et coll., 2003) et 5) dans les tâches de reconnaissance d’objets (Sharma et coll., 2003). En accord avec l’hypothèse d’une LTP (plutôt que d’une LTD), il a été démontré que l’auto-administration d’amphétamine menait à une augmentation de la densité des épines synaptique dans la régions CA1 de l’hippocampe (Crombag et coll., 2005).

Toutefois, selon Fricks-Gleason et coll. (Fricks-Gleason et Marshall, 2011), l’activation d’ERK par des indices contextuels associés à la prise de drogue se ferait préférentiellement dans les MSNs du cœur (core) du NAc co-exprimant D1/DYN. Là encore, l’expression d’ERK dans les neurones D1 du cœur du NAc semble indispensable à la rétention des associations drogues/environnement. En effet, une étude de Miller et Marshall (Miller et Marshall, 2005) confirmerait cette hypothèse. De fait, suite à un protocole expérimental de CPP, ils ont montré qu’une infusion d’un inhibiteur d’ERK dans le cœur du NAc administré après la phase d’acquisition entraînait une anomalie de la mémoire pour la préférence dans les tests suivants (de rétention). Par conséquent, le fait que les souris Nur77 ne présentent pas un maintien aussi persistant de la préférence de place conditionnée, pourrait être également la résultante d’une augmentation de l’expression de Nur77 dans la voie D1 conséquemment à l’activation de la voie ERK. Ainsi, il reste à déterminer dans quelle région l’induction de Nur77 est fondamentale pour observer une consolidation de la mémoire associative mais aussi à identifier plus précisément les mécanismes et voies de signalisation impliquées.

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Ainsi, les résultats présentés au chapitre 2 nous ont permis de mettre en évidence que l’induction de Nur77 dans la région CA1 de l’hippocampe était associée au maintien à long terme de la préférence de place conditionnée. Cependant si Nur77 est impliqué dans le maintien à long terme des apprentissages associatifs entre drogue et environnement, il ne semble pas être indispensable à leur simple formation/acquisition. Selon notre analyse, l’induction de Nur77 dans la région CA1 serait possiblement impliquée dans la consolidation de la mémoire. Une hypothèse d’ailleurs étayée par une étude démontrant que Nur77 est régulé pendant la phase de consolidation de la mémoire et que cette régulation se produisait dans la région CA1 (von Hertzen et Giese, 2005). Toutefois, les voies de signalisation menant à l’induction de Nur77 et aux mécanismes impliqués dans la consolidation de la mémoire spatiale Nur77-dépendante restent à être plus clairement identifiées. Nous avons relevé deux potentielles candidates, l’une passant par l’activation de MEF2 et induisant une LTD, l’autre passant par l’activation d’ERK et provoquant une LTP. En outre, concernant la voie de signalisation passant par l’activation d’ERK, nous avons vu qu’elle pourrait influencer la préférence de place non seulement au niveau de l’hippocampe mais également au niveau du NAc. Il reste par conséquent à déterminer l’importance relative de ces deux structures dans la rétention de la préférence de place.

Par conséquent, nous avons, là encore, une preuve que Nur77 et Nor-1 n’exercent pas des rôles redondants au niveau du SNC. Nur77 est impliqué dans la rétention de l’information au niveau de la région CA1 alors que Nor-1 ne semble pas du tout impliqué dans l’expression du phénomène de CPP.

4.3.2.1 Rôles de l’ENK et de la DYN dans la préférence de place

Les résultats présentés au chapitre 3 nous ont également permis d’identifier le rôle de l’ENK et de la DYN dans la préférence de place conditionnée et donc dans les apprentissages associatifs liés à la prise répétée de drogues d’abus. Dans ce cadre, nous avons montré que la délétion de la DYN ou de l’ENK ne supprimait pas le développement d’une préférence pour le compartiment associé à la cocaïne. Cependant, on a vu que la délétion de l’ENK augmentait le temps passé après conditionnement dans le compartiment

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associé à la drogue alors que celle de la DYN semblait minimiser cette préférence.

Les données de la littérature ont montré que les récepteurs DOR, MOR et KOR modulaient les états appétitifs et hédoniques. Les agonistes des MOR et DOR provoquent généralement des effets appétitifs alors que l’administration ponctuelle d’agonistes des KOR produit un effet aversif (Kreek, 1987; Skoubis et coll., 2005; Carey et coll., 2007; Wee et Koob, 2010). La fixation de l’ENK sur les MOR et les DOR entraîne un effet de récompense dans diverses régions notamment dans l’ATV et le NAc (McBride et coll., 1999). En outre, l’inactivation des gènes codants pour les MOR ou l’ENK atténue l’effet de récompense normalement induit par diverses drogues d’abus (Gieryk et coll., 2010). Renforçant ce fait, il a également été démontré que l’inactivation du gène du MOR par un oligonucléotide antisens atténuait la préférence de place conditionnée induite par l’administration répétée de cocaïne (Hummel et coll., 2006). De manière congruente, il a été démontré que la préférence de place conditionnée induite par la cocaïne pouvait être bloquée par le naltrindole, un antagoniste sélectif des récepteurs DOR (Suzuki et coll., 1994a) et par des antagonistes sélectifs des MOR (Schroeder et coll., 2007). En ce qui concerne la fonction de la DYN, son effet aversif a été rapporté notamment par des études démontrant qu’un prétraitement avec des agonistes des KOR empêchait le développement de préférence de place induite par la cocaïne chez les rongeurs (Suzuki et coll., 1992; Zhang et coll., 2004; Bruijnzeel, 2009).

Ainsi, si l’on se fie à ces données, la préférence de place conditionnée devrait être bloquée chez des souris déficientes pour le gène de l’ENK et exacerbée chez les souris DYN (-/-). Or, contre toute attente, on observait plutôt la tendance inverse.

En effet, en accord avec la littérature, nos souris DYN (-/-) ont développé une préférence de place pour la cocaïne. Toutefois, cette préférence était moins marquée que pour les souris (+/+). Pour expliquer cette apparente contradiction, on a exposé au chapitre 3 que la DYN pouvait exercer des rôles opposés selon les conditions d’administration ponctuelles ou chroniques de psychostimulants. En effet, une administration ponctuelle d’agonistes des KOR est aversive et supprime la préférence de place et l’auto- administration induite par la prise de cocaïne (Kreek, 1987; Suzuki et coll., 1992; Zhang et

295 coll., 2004; Skoubis et coll., 2005; Carey et coll., 2007; Bruijnzeel, 2009; Wee et Koob, 2010). Toutefois, de manière paradoxale, il a été démontré qu’une administration répétée d’agonistes des KOR potentialisait l’effet de récompense des drogues d’abus : potentialisation qui pouvait être justement bloquée par des antagonistes des KOR (Negus, 2004; McLaughlin et coll., 2006; Carey et coll., 2007). Or, on vu dans les parties précédentes que la DYN était fortement induite dans le NAc suite à l’administration chronique de psychostimulants chez les souris sauvages. Ainsi, l’effet de la délétion de la DYN sur la préférence de place induite par la cocaïne peut être facilement expliqué. Dans ce cas, seul le signal appétitif produit par la fixation de l’ENK sur les MOR et DOR est présent mais comme la DYN est absente on n’observe pas de potentialisation de l’effet de récompense de la cocaïne. Par conséquent, cela clarifie pourquoi les souris DYN (-/-) et DYN (+/+) développement toutes deux une préférence de place mais aussi pourquoi chez les DYN (-/-) cette préférence est moins accentuée.

Néanmoins, les résultats les plus troublants que nous ayons obtenus concernent nos souris ENK (-/-). En effet, sachant que l’ENK a normalement un effet appétitif, sa délétion aurait dû bloquer ou amoindrir la préférence de place conditionnée induite par la cocaïne. Or, nous avons observée une préférence de place accrue chez ces souris comparativement à leurs congénères sauvages. On pourrait formuler l’hypothèse que cet effet contradictoire est dû à une augmentation de l’expression des MOR et des DOR pour compenser la délétion constitutive de l’ENK. En effet, dans diverses études portant sur la délétion des neuropeptides, une augmentation compensatoire de leur récepteur a été observée (Chefer et Shippenberg, 2006). Or, on a vu dans l’introduction que les récepteurs opioïdes MOR, et DOR n’étaient que très peu sélectifs pour l’ENK et que la DYN pouvait également facilement se fixer sur chacun d’eux (Mansour et coll., 1995; Akil et coll., 1998). Aussi, on a démontré au chapitre 2 et au chapitre 3 que l’administration répétée de psychostimulants induisait surtout une forte augmentation de la DYN tandis qu’elle entraînait une induction de l’ENK mais beaucoup moins marquée et systématique. Donc, dans le cas d’une délétion de l’ENK, ce serait la fixation de la DYN sur les récepteurs MOR et DOR excédentaires ainsi que l’effet appétitif de la stimulation chronique des KOR par la DYN qui expliquerait la préférence accrue chez les souris ENK (-/-).

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Ainsi, nos résultats suggèrent que la DYN peut compenser la délétion de l’ENK en se fixant sur les récepteurs MOR et DOR alors qu’à l’inverse l’ENK ne semble pas pouvoir compenser le déficit en DYN en se fixant aux KOR. Ceci peut être expliqué d’une part par le fait que l’administration chronique de psychostimulants induit surtout une très forte augmentation de la DYN et des changements peu perceptibles de l’expression de l’ENK; mais aussi par la plus forte sélectivité des KOR par rapport aux MOR et DOR. En effet, nous avons exposé dans l’introduction que les KOR avaient une affinité beaucoup plus grande pour la DYN que les deux autres récepteurs n’en avaient pour leur ligand de prédilection l’ENK (Mansour et coll., 1995; Akil et coll., 1998). Par conséquent, le fait que l’ENK ne soit que faiblement induite par l’administration chronique de psychostimulants et que les KOR soient très sélectifs pour la DYN ne permet pas l’effet réciproque c’est-à-dire la compensation de la délétion de la DYN par l’ENK.

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CONCLUSION GÉNÉRALE

Pour conclure, cette thèse démontre que les récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 jouent des rôles distincts voire opposés dans la régulation des systèmes DAergiques et en particulier dans les comportements médiés par la DA et induits par les psychostimulants. En effet, on a vu qu’ils étaient impliqués dans la régulation de l’activité locomotrice de base, dans le développement et le maintien de la sensibilisation comportementale induite par les psychostimulants et dans la préférence de place conditionnée à la cocaïne. Nos données confirment donc nos précédentes hypothèses selon lesquelles Nur77 et Nor-1 assurent des fonctions distinctes dans les systèmes DAergiques mesoaccumbal et nigro- strié (Lévesque et Rouillard, 2007). Elles suggèrent également que Nur77 et Nor-1 sont impliqués dans la régulation des comportements médiés par la DA via la régulation de l’affinité des récepteurs D2 mais aussi en assurant une modulation opposée des neuropeptides DYN et ENK. Concernant les neuropeptides ENK et DYN, on a vu que leur expression était indispensable à la manifestation de comportements de base normaux puisque leur délétion induit une diminution des niveaux d’activité locomotrice. Aussi, on a vu que la DYN pouvait exercer des rôles opposés selon les conditions ponctuelle ou chronique d’administration de l’AMPH. Elle a un effet inhibiteur en réponse à une administration aigüe et un effet excitateur en réponse aux traitements chroniques à l’AMPH. En effet, sa délétion exacerbe l’augmentation de l’activité locomotrice en réponse à une administration ponctuelle d’AMPH alors qu’elle empêche la manifestation de la sensibilisation comportementale dans le cas d’une administration chronique d’AMPH. À l’inverse l’ENK ne semble pas impliquée dans les effets aigus de l’AMPH puisque sa délétion n’affecte pas l’activation comportementale induite par une stimulation ponctuelle d’AMPH. Toutefois, contrairement aux hypothèses communément admises, cette thèse démontre que l’expression de l’ENK striatale joue un rôle crucial dans la sensibilisation comportementale. Tout comme la DYN, la présence d’ENK est nécessaire au développement de la sensibilisation locomotrice induite par les psychostimulants. En outre, nous avons mis en évidence l’existence d’interactions entre les voies de sortie directe et indirecte des ganglions de la base qui expriment respectivement la DYN et l’ENK. En effet, le fait que l’expression de la DYN dans le NAc et le striatum dorsal soit significativement

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réduite chez les souris ENK (-/-) après un traitement chronique à l’AMPH suggère que l’ENK exprimée dans la voie indirecte peut réguler l’expression de la DYN exprimée dans la voie directe. De plus, nous avons démontré que l’ENK et la DYN pouvaient moduler l’expression de Nur77 et Nor-1 et qu’à l’inverse leur expression pouvait être modulée par Nur77 et Nor-1. Il existe donc une relation de régulation réciproque entre ces divers facteurs qui semble jouer un rôle central dans la régulation du système DAergique.

Par conséquent cette thèse démontre que les facteurs de transcription/récepteurs nucléaires Nur77 et Nor-1 sont de puissants modulateurs de la neurotransmission DAergique grâce à la relation de régulation réciproque qu’ils entretiennent avec les neuropeptides DYN et ENK et à leur aptitude à moduler l’affinité des récepteurs DAergiques D2.

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