JULIANA BARROS MENDES
Investigação da eficácia terapêutica de compostos com
atividade anti-fosfodiesterásica em um modelo murino
de aderência intra-peritoneal
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Belo Horizonte 2009
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JULIANA BARROS MENDES
Investigação da eficácia terapêutica de compostos com
atividade anti-fosfodiesterásica em um modelo murino
de aderência intra-peritoneal
Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor. Área de concentração: Fisiologia
Orientadora: Profa. Dra. Sílvia Passos Andrade
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Belo Horizonte 2009
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Angiogênese do Departamento de Fisiologia e Biofísica, do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
Apoio Financeiro: CNPq e Capes
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Dedico este trabalho aos meus pais e ao Bruno, por todo carinho e incentivo.
4 AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida.
Especialmente, à minha orientadora Profa. Sílvia Passos Andrade, por tantos ensinamentos de ciência e de vida, pela orientação sempre tão atenciosa e pelo apoio e incentivo dados a este trabalho. Obrigada por todos esses anos de amizade!
Ao Bruno, meu Bei, por tanto amor, dedicação e por nunca ter desistido de me incentivar. Obrigada!
Aos meus pais, pelo apoio incondicional, amor, carinho e pelo exemplo de alegria e entusiamo de viver!
À minha irmã Marina e ao pequeno Lucas, pela complicidade e pelos momentos de alegria.
À amiga Monaliza, pela dedicação e colaboração no transcorrer desse trabalho e pelo exemplo de vida que é para mim, prova de que com vontade e esforço tudo é possível!
Às colegas e amigas de laboratório Fernanda e Sandra, pelo auxílio valioso no decorrer desses anos, pelos agradáveis momentos de descontração, pelo incentivo e apoio nas horas difíceis.
Às professoras Lucíola e Mônica, pela convivência agradável no laboratório, por me salvarem tantas vezes com ajudas valiosas durante a realização desse trabalho.
Às minha grandes amigas Érica, Laura, Dadá e Mafê, pelo apoio, incentivo e pela presença tão carinhosa nos bons e nos maus momentos.
5 À coordenação da Pós-graduação, professores e servidores, pela dedicação aos alunos.
A todos que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho, me apoiando e torcendo por mim.
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“Minha mãe achava estudo a coisa mais fina do mundo.
Não é.
A coisa mais fina do mundo é o sentimento. Aquele dia de noite, o pai fazendo serão, ela falou comigo:
"Coitado, até essa hora no serviço pesado". Arrumou pão e café, deixou tacho no fogo com água quente, Não me falou em amor.
Essa palavra de luxo.”
Adélia Prado
7 Resumo
As aderências constituem complicações importantes na cicatrização peritoneal depois de cirurgia, infecção ou introdução de material estranho no abdômen. Uma classe de compostos que tem emergido com potencial ação inibitória nas aderências é a família dos inibidores das fosfodiesterases (PDEs), devido a sua larga escala de efeitos em tecidos com atividade proliferativa.
Neste estudo, quatro compostos com atividade inibidora de PDEs, cilostazol
(40 e 400 mg/kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/kg), rolipram (0,2 e 2 mg/kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/kg) administrados oralmente foram usados para investigar seus efeitos em aderências induzidas por discos de esponja implantados intraperitonealmente (i.p) em camundongos Balb/c anestesiados.
Neovascularização, inflamação e fibrose são componentes que caracterizaram o tecido recém formado fibrovascular neste modelo. A angiogênese foi avaliada pelo conteúdo de hemoglobina, de VEGF e pelo número de vasos. A inflamação foi determinada pelos níveis de TNF-α e pela atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e n-acetilglicosaminidase (NAG). O conteúdo de colágeno e de TGF-β1 foram usados para determinar a fibrose nos implantes.
Todos os quatro compostos reduziram o peso úmido dos implantes, porém apenas os compostos cilostazol, pentoxifilina e dipiridamol inibiram a angiogênese (aproximadamente 45%). Todos os compostos foram eficazes em inibir o componente fibrogênico avaliado através dos níveis de TGF-β1 e de colágeno (60 e 80% respectivamente). Interessantemente só o rolipram diminuiu a atividade das enzimas MPO e NAG, embora os níveis intraimplante de TNF-α tenham sido inibidos por todos os quatro compostos. Estes
8 resultados mostram que estes compostos com atividade anti-fosfodiesterásicas exercem potentes efeitos anti-angiogênico, anti-inflamatório e anti-fibrótico neste modelo de aderência peritoneal através da modulação de fatores de crescimento e podem ter valor terapêutico na prevenção de aderências humanas.
9 Abstract
Adhesion formation following abdominal intervention is an abnormal peritoneal healing process. Our aim was to investigate the effects of controlling adhesion development by inhibiting its key components (angiogenesis, inflammation and fibrosis) using phosphodiesterase (PDE) inhibitors. The PDE inhibitor family has emerged as potential inhibitor of these lesions, because of their wide range of actions in tissue proliferation activities. In this study, four PDE compounds, cilostazol, pentoxifylline, rolipram and dipyridamole given orally were used to investigate their effects on adhesion components induced by sponge matrix implanted intraperitonealy (i.p) in anaesthetized Balb/c mice. Angiogenesis was assessed by hemoglobin, VEGF content and vessel number, inflammation was determined by TNF-α levels and by myeloperoxidase (MPO) and n- acetylglucosaminidase (NAG) activities. Collagen and TGF-β1 contents were used as markers for fibrosis. All compounds reduced adhesion wet weight, cilostazol, pentoxifylline and dipyridamole caused inhibition of angiogenesis
(about 45%) and rolipram failed to exert this activity. The compounds were able to decrease fibrosis (TGF β1 and collagen levels, 60% and 80%, respectively).
Interestingly, only rolipram attenuated the activities of the enzymes (MPO or
NAG) although the intraimplant levels of TNF-α were inhibited by all four compounds. These results show that PDEs inhibitors exhibit potent anti- angiogenic, anti-fibrogenic and anti-inflammatory activities in this model of peritoneal adhesion through modulation of growth factors and may be of therapeutic value in prevent human adhesion.
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11 Lista de Figuras
PÁG. FIGURA 1 Cortes histológicos e número de vasos...... 54
FIGURA 2 Peso úmido dos implantes...... 55
FIGURA 3 Dosagem de hemoglobina nos implantes...... 57
FIGURA 4 Concentração de VEGF nos implantes...... 58
FIGURA 5 Atividade de MPO nos implantes ...... 60
FIGURA 6 Atividade de NAG nos implantes...... 61
FIGURA 7 Concentração de TNF-α nos implantes...... 62
FIGURA 8 Concentração de TGF-β nos implantes...... 64
FIGURA 9 Conteúdo de colágeno nos implantes...... 65
12 Lista de Abreviaturas e siglas
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA Análise de variância bFGF Fator de crescimento b derivado de fibroblasto
CEBIO Centro de Bioterismo
CS Sulfato de condroitina
CT Cilostazol
DIP Dipiridamol
DMSO Dimetil sulfoxido
ECM Matrix extracelular
EGF Fator de crescimento epidermal
ELISA Do inglês “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”
GMPc Guanosina monofosfato cíclico
Hb Hemoglobina
HE Hematoxilina-eosina
HPMC Células mesoteliais humanas
HS Heparam sulfato
HSPGs Proteoglicanos heparan sulfate
HTAB Hexa-1,6-bisdecyltrimethylammonium bromide
IC Claudicação intermitente
ICB Instituto de Ciências Biológicas
KC Quimiocina derivada de queratinócito
MCP-1 Do inglês “Monocyte chemotactic protein-1”
MMP-9 Metaloproteinase 9
MMPs Metaloproteinases
MPO Mieloperoxidase
13 mRNA Do inglês “ Messenger Ribonucleic Acid ”
Na 3PO 4 Fosfato de sódio
NaCl Cloreto de sódio
NaEDTA Do inglês “disodium ethylene diamine tetra acetate”
NAG N-acetil-β-glucosaminidase
NaOH Hidróxido de sódio
NK Natural Killer
OD Do inglês “ Optical Density ”
PDE Fosfodiesterase pH Potencial hidrogeniônico
PTX Pentoxifilina
ROL Rolipram
SCAR Surgical and Clinical Adhesions Research
TGF-β Do inglês “ Transforming Growth Factor beta ”
TGF-β1 Do inglês “ Transforming Growth Factor beta ”
TIMPs Inibidores teciduais de metaloproteases
TMB Tetrametibenzidina
TNF-α Do inglês “ T umor Necrosis Factor ” tPA Plasminogênio tecidual
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais uPA Uroquinase ativadora de plasminogênio
VEC Célula endotelial vascular
VEGF Do inglês “ Vascular Endothelial Growth Factor ”
14 Sumário
Página
1. INTRODUÇÃO...... 17 1.1. A cavidade abdominal...... 17 1.2. As aderências………………………………...... 20 1.2.3. Consequências da formação de aderências...... 22 1.2.4. Prevenção da formação de aderências...... 23 1.3. Angiogênese...... 26 1.3.1. Angiogênese e aderência peritoneal ...... 27 1.4. Inflamação…………...... 28 1.5. Fibrose...... 31 1.6 – Citocinas pró-angiogênicas, pró-inflamatórias e pró-fibrogênicas...... 32 1.7. Modelo de implante de esponja...... 35 1.8. As fosfodiesterases……………………………………...... 37 1.8.1. Pentoxifilina...... 37 1.8.2. Cilostazol...... 38 1.8.3. Rolipram...... 39 1.8.4. Dipiridamol...... 40
2- OBJETIVOS...... 42 2.1- Objetivo geral...... 42 2.2- Objetivos específicos...... 42
3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 43 3.1. Animais...... 43 3.2. Técnica de implantação...... 43 3.2.1. Implantes de esponjas...... 43 3.2.2. Técnica de implantação em camundongos...... 43 3.3. Remoção dos implantes...... 44 3.4. Dosagem de hemoglobina...... 44 3.5. Avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO)...... 45
15 3.6. Avaliação da atividade da N-acetil-β-glucosaminidase (NAG)...... 46 3.7. Quantificação das citocinas (VEGF, TNF-α, TGF-β1) intra-implantes...... 47 3.8. Avaliação histológica...... 48 3.9. Quantificação do colágeno...... 49 3.10. Análise estatística...... 50 3.11. Protocolo experimental...... 51
4. RESULTADOS...... 52 4.1. Avaliação histológica dos implantes……...... 52
4.2. Avaliação da angiogênese...... 56
4.3. Avaliação da inflamação...... 59
4.4. Avaliação da fibrose...... 63
5. DISCUSSÃO...... 66
6. CONCLUSÕES...... 74
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 75
8. ANEXOS...... 94 8.1. Artigos publicados...... 94
16 1 – INTRODUÇÃO
1.1 -A cavidade abdominal
Com uma área média de superfície de 1.7 m 2 a cavidade peritonial representa a maior cavidade do corpo humano (Gandawidjaja & Hau, 1997). O mesotélio peritoneal é composto por uma única camada de células epiteliais especializadas que se estendem ao longo de toda a superfície da cavidade abdominal (Cronauer et al., 1999). Classicamente, três principais funções são atribuídas ao mesotélio: a) prover uma barreira anatômica de proteção; b) interface de não fricção para o movimento de órgãos e tecidos, e c) estar envolvido na formação e movimentação do fluido abdominal (Runyon, 1993;
Carter et al ., 1997).
Nos últimos anos tem sido demonstrado que o mesotélio peritoneal tem um papel importante no transporte de células e tecidos, iniciação e resolução de inflamação, reparação tecidual, lise em depósitos de fibrina prevenindo a formação de aderências e possivelmente proteção contra disseminação de tumores (Mutsaers, 2002). O peritônio pode ser considerado uma membrana semipermeável bidirecionalmente com alta capacidade absortiva (Robinson,
1962). Em circunstâncias normais Henderson (1969) mostrou que menos que
100 mL de fluido estão presentes na cavidade peritoneal. Este fluido em indivíduos normais é caracterizado pelo baixo conteúdo celular e protéico, sua quantidade pode aumentar e sua composição ser alterada consideravelmente em diferentes condições patológicas (Beelen, 1991), além de apresentar propriedades bactericidas e bacteriostáticas. Na cavidade peritoneal, a ativação
17 do sistema complemento leva a amplificação da resposta inflamatória e a eliminação dos agentes patógenos (Melichar & Freedman, 2002).
Monócitos/macrófagos, leucócitos polimorfonucleares e células NK estão presentes na cavidade peritoneal de sujeitos normais bem como em pacientes com diferentes desordens (Dunn et al., 1987).
Injúria na cavidade peritoneal é um fenômeno comum. Ela pode ser decorrente de trauma, implantes, cirurgia, infecção ou vários processos malignos e está associada com a inflamação da serosa. Distúrbios inflamatórios que comprometem as células mesoteliais desencadeiam uma série de processos de reparação que podem resultar em cicatrização, fibrose peritoneal ou aderências intra-abdominais. Frequentemente estes eventos estão associados à complicações sérias ou mesmo fatais, como obstrução intestinal, aderências de órgãos internos (Runyon, 1993; Carter et al., 1997) e infertilidade em mulheres (Diamond et al., 1987; Sekiba, 1992).
As células inflamatórias e imunes que residem ou migram para dentro da cavidade peritoneal, as células mesoteliais do peritôneo visceral e parietal, os fibroblastos que residem dentro do tecido submesotelial, e seus produtos de secreção são a chave na regulação da resposta peritoneal à infecção, inflamação ou injúria celular ou tecidual (Raftery, 1979; Topley et al., 1995;
Holmdahl & Ivarsson, 1999). A indução de uma reação inflamatória devido a infiltração de neutrófilos e monócitos vindos da circulação periférica é uma importante característica de uma reparação tecidual normal (Clark, 1996).
Estes monócitos tornam-se ativados e diferenciam-se em macrófagos que são as maiores fontes de fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e proteases (Blobe et al., 2000; Iwamoto & Mekada, 2000).
18 Inflamação peritoneal, isquemia, infecção e trauma pós-cirurgia podem facilmente danificar ou remover permanentemente estas células, expondo o tecido conectivo submesotelial. O início do dano celular e tecidual está associado com marcadas alterações morfológicas e bioquímicas as quais promovem o reparo da região afetada. No entanto, quando este processo não está regulado, o resultado da cicatrização está associado com formação de fibroses (Clark, 1996).
Muitas evidências sugerem que as células mesoteliais do peritônio humano têm um papel chave na iniciação e controle de doenças que afetam a cavidade abdominal (Topley et al., 1994). Cronauer et al., (1999) mostraram que as células mesoteliais regulam eventos celulares na cavidade peritoneal e são importantes fontes de citocinas e fatores de crescimento, como bFGF e
VEGF (Jayne et al ., 2000; Lee et al., 2002). A existência de correlação entre o aumento de níveis séricos de VEGF em pacientes portadores de doenças inflamatórias ativas (doença intestinal inflamatória, doença de Crohn e colite ulcerativa) mostram a importância desta citocina na inflamação em doenças crônicas. O mecanismo de ação proposto é o aumento da permeabilidade e/ou do processo cicatricial através de efeitos angiogênicos (Bousvaros et al., 1999).
A identidade e a precisa natureza das moléculas que estão envolvidas no processo de reparo peritoneal não são ainda conhecidos. No entanto, evidências a partir de estudos que examinam a ferida e o fluido peritoneal durante a cicatrização e a analogia com a cicatrização do tecido cutâneo levam a hipótese de que a expressão local de fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, proteases, moléculas de adesão e matriz extracelular, têm um papel crítico nestes eventos (Cheghini, 2002).
19 1.2 – As aderências
Aderências são conexões patológicas entre superfícies dentro das cavidades do corpo. Estas conexões ou pontes podem ser constituídas por fina lâmina de tecido conjuntivo, por lâmina tecidual mais espessa contendo vasos sanguíneos e nervos ou representar um contato direto entre a superfície de dois órgãos. Podem ser encontradas nas cavidades peritonial, pericárdica, pleural, uterina, no interior de articulações ou das câmaras oculares. Na cavidade abdominal são conhecidas como aderências peritoniais, uma vez que o peritônio está sempre envolvido. Sua incidência após operações é elevada, podendo ocorrer em até 93% das laparatomias (Menzies & Ellis, 1990).
Aderências intraperitoniais podem ser benéficas, promovendo revascularização de superfícies isquêmicas como anastomoses intestinais.
Entretanto, podem determinar obstrução intestinal e ser causa de aproximadamente 70% das reinternações por obstrução de intestino delgado
(Menzies, 1992). São responsáveis por 15-20% dos casos de infertilidade secundária em mulheres e estão associadas a dor crônica abdominal e pélvica
(Soules et al., 1982, Stovall et al., 1989). Além disso, prolongam o tempo operatório em relaparotomias, levando a enterotomias inadvertidas em aproximadamente 20% dos casos, o que acarreta maior incidência de complicações pós-operatórias, necessidade de cuidados intensivos e internação hospitalar prolongada (Van Der Krabben et al., 2000).
As operações abdominais representam a maior causa conhecida de formação de aderências, embora elas ocorram em até 10% de pacientes nunca submetidos a operações abdominais prévias (Ellis, 1997). Entende-se que a
20 vídeo-cirurgia possa levar a menor formação de aderências quando comparada
à via convencional, como resultado de menores incisões, manipulação tecidual e sangramento.
Apesar de intuitiva, a fisiopatologia da formação de aderências é complexa, o que pode em parte explicar o porquê de sua relativa impresivibilidade no que se refere ao local onde se formarão ou com qual intensidade. Sua formação se inicia a partir de uma infecção, irritação química e trauma direto, e inclui os sistemas de coagulação e fibrinolítico (Gutt et al.,
2004).
A cavidade abdominal é revestida pelo peritônio, que consiste em uma camada única de células mesoteliais sustentada por uma membrana basal e uma camada subjacente de tecido conjuntivo. O trauma peritoneal resulta em dano mesotelial, desencadeando uma resposta inflamatória local. As células mesoteliais se desprendem da membrana basal, criando áreas desnudas, desencadeando a produção de um amplo espectro de proteínas biologicamente ativas e de exsudato rico em proteínas. O exsudato peritoneal contém altas concentrações de fibrinogênio. A cascata da coagulação é ativada na cavidade peritoneal, resultando na formação de trombina que ativa a conversão de fibrinogênio em fibrina. Devido à ativação do sistema fibrinolítico, qualquer depósito intra-abdominal de fibrina pode sofrer lise. Entretanto, após cirurgia abdominal e infecção, o equilíbrio entre coagulação e fibrinólise é afetado em favor do sistema de coagulação (Holmdahl et al., 1996, Ivarsson et al., 1998).
Desse modo, a fibrina forma depósitos que servirão de matriz para a proliferação de tecido fibro-colagenoso e, portanto, levando à formação de aderências.
21 1.2.3 - Consequências da formação de aderências
As principais conseqüências da formação de aderências são infertilidade, obstrução intestinal, dor pélvica crônica e o maior risco associado
às reoperações (perfusão de vísceras ocas e de vasos intra-abdominais)
(Milingos et al., 2000; Vrijland et al., 2003). A torção tubária, a estenose do suprimento ovariano e aderências intra-uterinas estão entre as maiores conseqüências das aderências e estima-se que estas possam representar causa da infertilidade em até 40% dos casos (Nagata et al., 1998).
Em estudo prospectivo envolvendo 224 pacientes que sofriam de dor abdominal crônica revelou-se que 82% possuíam apenas aderências e nenhuma outra doença associada. Estes pacientes foram submetidos a lise de aderências por laparoscopia. Após três meses, 74% dos pacientes estavam sem dor ou apresentaram melhora da dor (Swank et al., 2003).
Aderências intraperitoneais representam a causa mais importante de obstrução intestinal, sendo responsáveis por 40% de todos os casos (De la
Garza-Villasenor, 2001; Wysocki & Krzywon, 2001) e até 70% dos casos de obstrução de intestino delgado (Ellis, 1998). Estudo publicado pelo Surgical and
Clinical Adhesions Research (SCAR) Group (Parker et al., 2004) envolvendo pacientes submetidos à cirurgia colorretal aberta demonstrou que a necessidade de reinternação atinge 9% no primeiro ano após a cirurgia abdominal (2,1% como causa diretamente relacionada e 6,9% como causa provavelmente relacionada às aderências). As taxas de reoperação relacionadas às aderências após laparotomia variam de 1% até 2,6% ( Beck et al., 1999; Milingos et al., 2000).
22 Estes resultados traduzem significatica morbidade associada às numerosas operações abdominais realizadas por via convencional. Ressalte-se uma das conclusões do estudo SCAR, em que a grande maioria das reinternações por obstrução intestinal não é conduzida pelo cirurgião responsável pela operação que originou as aderências, o que gera uma subestimativa coletiva da intensidade do problema e, como resultado, maior dificuldade de se entender a necessidade de encontrar formas eficazes de evitá-lo.
1.2.4 - Prevenção da formação de aderências
As duas maiores estratégias na prevenção ou redução da formação de aderências são representadas por ajustes na técnica cirúrgica e pelo uso de adjuvantes.
Vários estudos usando aderências humanas ou em modelos experimentais têm mostrado que este novo tecido formado é altamente diferenciado, vascularizado, inervado e infiltrado por muitos tipos celulares, os quais produzem uma grande variedade de moléculas pró-inflamatórias, pró- angiogênicas e pró-fibrogênicas (Luijendijk et al., 1996; Cheong et al., 2001;
Epistein et al., 2006). A atenuação ou inibição de um ou mais componentes desses processos responsáveis pela formação de fibrose neste tipo de lesão, representa ponto estratégico no desenvolvimento de estratégias para prevenir a formação de aderência intra-peritoneal. Assim, compostos com propriedade anti-inflamatória, anti-angiogênica e/ou anti-fibrogênica são de grande interesse e relevância clínica.
23 As modificações na técnica operatória fazem parte do treinamento do bom cirurgião e dela fazem parte todas as medidas utilizadas com a finalidade de reduzir o trauma cirúrgico, ou seja: controlar ou evitar a introdução de material estranho (talco de luvas cirúrgicas, por exemplo), prática de hemostasia cuidadosa, redução da exposição e ressecamento da superfície peritoneal com o emprego de compressas úmidas, uso de incisões adequadas, emprego de material cirúrgico delicado, cuidado no afastamento e manipulação das estruturas, controle e diminuição da contaminação.
Em 1886, Muller sugeriu o uso de solução salina para prevenir a ocorrência de aderências. Desde então, inúmeros agentes foram investigados para a prevenção de aderências intra-abdominais. Eles são baseados na ativação da fibrinólise, alteração da coagulação, diminuição da resposta inflamatória, inibição da síntese de colágeno ou criação de uma barreira entre superfícies de feridas adjacentes.
A ativação do sistema fibrinolítico é considerada benéfica na prevenção de aderências intra-abdominais. No final do século XIX preconizava-se o uso de agentes com capacidade fibrinolítica (tais como tiosinamina presente em bebida alcoólica), salicilato de sódio (Boys, 1942) e fósforo oral (Wiseman,
1999). A estreptoquinase e estreptodornase foram os primeiros agentes com propriedades fibrinolíticas comprovadas que se mostraram eficazes em prevenir a formação de aderências em modelos experimentais (Wright et al.,
1950; James et al., 1965), embora sua eficácia nunca tenha sido comprovada em humanos. O fator ativador de plasminogênio tecidual (tPA) foi também estudado neste sentido. Embora tenha se provado a eficácia do tPA (Lai et al.,
1998; Buckenmaier et al., 1999), o risco de hemorragia tem sido o principal
24 obstáculo para seu uso rotineiro. Anticoagulantes como heparina também são efetivos na prevenção de aderências (Vela et al., 1999), embora o uso local de heparina em cirurgia abdominal permaneça controverso devido ao risco de hemorragia.
Drogas antiinflamatórias foram testadas na prevenção de aderências, incluindo corticosteróides e inibidores da síntese de prostaglandinas (Siegler et al., 1980, Celebioglu et al., 1999). A alteração do equilíbrio entre síntese e degradação de fibrina leva à persistência de aderências fibrinosas, que serão preenchidas por fibroblastos com deposição subsequente de colágeno, resultando na formação de aderências fibrosas permanentes. Nagler e cols
(1998 e 1999) demonstraram que o tratamento com halofugina (um inibidor da síntese de colágeno tipo I) diminui a formação de aderências cirúrgicas induzidas experimentalmente. Testes clínicos ainda são aguardados.
Recentemente foram desenvolvidos novos métodos na prevenção de aderências que incluem barreiras físicas (barreiras mecânicas sólidas, barreiras bioabsorvíveis em forma de gel ou filmes) e soluções macromoleculares. A criação de uma barreira mecânica entre as superfícies das feridas é outro método promissor. A camada peritoneal se regenera 5 a 7 dias após a cirurgia, independente da extensão do dano. A separação mecânica das superfícies das feridas durante este período pode prevenir a formação de aderências entre superfícies danificadas.
25 1.3 – Angiogênese
A neovascularização é uma resposta natural e necessária à injúria nos processos de reparação e cicatrização e é um mecanismo de importância considerável em vários processos fisiológicos e patológicos do organismo
(Griffioen & Molema, 2000).
A angiogênese consiste na formação de novos vasos sanguíneos por brotamento, a partir de pequenos vasos pré-existentes em adultos ou em tecidos embrionários (angiogênese por brotamento), ou por subdivisão intravascular (intussuscepção) (Risau, 1997). J. Folkmam deu início, há 30 anos, ao estudo sistemático da angiogênese, e progressivamente, foram desenvolvidos modelos de estudo da angiogênese in vitro e in vivo , que tem possibilitado amplos estudos à cerca dos mecanismos moleculares envolvidos no processo, sua regulação e sua importância em processos fisiológicos e patológicos (Folkman & Brem, 1992). A manutenção do sistema vascular é baseada na coexistência de sinais angiogênicos (ativadores) e angiostáticos
(inibidores) em um equilíbrio dinâmico de concentrações estritamente controladas (D’Amore & Thompson, 1987).
O processo de angiogênese é regulado por diversos fatores ativadores angiogênicos, incluindo o bFGF e o VEGF (Fachinger et al., 1999; Yancopoulos et al., 2000). Esses fatores interagem com glicosaminoglicanos e proteoglicanos, tais como HSPGs ( proteoglicanos heparan sulfate ), presentes na matriz extracelular, na lâmina basal e em receptores de superfície celular, regulando o crescimento, a proliferação, a migração, a diferenciação e a
26 sobrevivência das células endoteliais entre uma variedade de tipos celulares
(Solimene et al., 1999; Chipperfield et al ., 2002).
A atividade angiogênica depende, em grande parte, da disponibilidade de VEGF, que deve ser resgatado da matriz extracelular por ação de metaloproteinases, como a MMP-9 (Soeda et al ., 1993; Soeda et al., 2000;
Egeblad & Werb, 2002). Portanto, a disponibilidade de VEGF deve ser criteriosa, uma vez que, em presença desse fator,os vasos recapitulam a atividade angiogênica em taxa similar à do desenvolvimento embrionário e, na ausência de VEGF, as células destituídas de adesão entram em apoptose, e os vasos consequentemente regridem. A inibição ou a perda de atividade do
VEGF induz apoptose (Bergers et al., 1998).
Desequilíbrios, entre o suprimento de oxigênio e a demanda metabólica das células podem resultar em indução da angiogênese em diferentes tecidos
(Agocha et al., 1997).
1.3.1 – Angiogênese e Aderência Peritoneal
No estágio inicial da angiogênese, a indução de proteases tais como metaloproteinases (MMPs) e proteases com serina (sistema fibrinolítico; ativadores de plasminogênio) nas células endoteliais são necessárias para degradar os componentes da matriz extracelular, incluindo fibronectina e laminina (Pellegrini et al, 1998; Holly et al., 2000 & Kim et al, 1995). O peritônio parietal e as células mesoteliais expressam MMPs, tPA, uPA, TIMPs e PAIs, e como em outros sistemas, esta expressão é regulada por várias citocinas e fatores de crescimento (Müller et al., 2001; Lijnen, 2001; Blobe et al., 2000 &
27 Sharpe-Timms et al., 1998). As células endoteliais das arteríolas e dos capilares peritoneais expressam VEGF e outros fatores angiogênicos (Wiczyk et al., 1998) que podem regular estas enzimas proteolíticas e seus inibidores.
Embora muitos aspectos da neovascularização no peritôneo ainda não foram investigadas, a expressão destes fatores no tecido peritoneal e sua presença no fluido peritoneal implicam que direta ou indiretamente estas moléculas podem alterar a angiogênese durante a cicatrização peritoneal e a formação de aderências. Um grande número de fatores anti-angiogênicos vem sendo investigado e o resultado destes estudos tem revelado que estes fatores podem ser usados para interferir no processo angiogênico (Liekens et al.,
2001). O tratamento pré-cirúrgico com TNP-470, um potente inibidor de células endoteliais, mostrou uma redução no crescimento de vasos e uma sustentada redução na formação de aderências na cavidade abdominal de ratos (Chiang et al., 2000). Estes compostos podem ser usados como potentes agentes no tratamento da injúria peritoneal por limitarem a fibrose tecidual e assim as aderências.
1.4 – Inflamação
A inflamação é uma complexa reação dos tecidos vascularizados do organismo expressando resposta à uma agressão. É de suma importância que o organismo responda a injúria eliminando sua fonte, bem como reparando os danos teciduais (Clark, 1996).
Em condições fisiológicas os tecidos e órgãos internos de mamíferos encontram-se em homeostase. Esta homeostasia é mantida por barreiras
28 naturais, como fatores mecânicos, químicos e biológicos, que isolam o interior do organismo. Em situações especiais, essas barreiras naturais podem ser quebradas por fatores de origem endógena, exógena ou pela invasão de microorganismos que tentam se estabelecer no organismo. Quando isso acontece, os tecidos e órgãos possuem mecanismos de proteção capazes de detectar, diferenciar e combater os agentes invasores. Esta reação complexa, ocorrida no tecido conjuntivo vascularizado é denominada de inflamação
(Siqueira Junior & Dantas, 2000).
Modificações na microcirculação, tais como os fenômenos angiogênicos, migração de leucócitos através do leito vascular e liberação de moléculas solúveis nos tecidos danificados são as principais características da inflamação.
O processo inflamatório pode ser classificado em inflamação aguda e inflamação crônica. A inflamação aguda é uma resposta imediata e precoce a um agente agressor nocivo. Ela faz parte de uma imunidade inata induzida, de caráter inespecífico, cuja seqüência de eventos geralmente independem do tipo de agente agressor. A fase aguda tem curta duração (horas ou um a dois dias) e é caracterizada por alteração da permeabilidade vascular com exsudação de líquidos e proteínas plasmáticas (edema), liberação de mediadores inflamatórios e emigração de leucócitos polimorfonucleares, predominantemente neutrófilos, para o sítio da lesão. Caso os leucócitos envolvidos nesta etapa do processo inflamatório consigam resolver o estímulo inflamatório, ocorrerá a reparação tissular através da resolução da inflamação.
Caso o estímulo inflamatório persista, recrutamento contínuo e ativação de células mononucleares serão necessários, com o estabelecimento de uma
29 lesão inflamatória crônica (Wahl et al., 1992; Kubes, 2002). Embora a transição da inflamação aguda para a crônica muitas vezes seja difícil de se detectar, as respostas crônicas possuem características singulares. O processo inflamatório crônico pode ser caracterizado como de duração prolongada
(semanas a meses) no qual a inflamação ativa, a destruição tecidual e a tentativa de reparação estão ocorrendo simultaneamente. Os pontos principais são infiltração por células mononucleares, principalmente macrófagos, linfócitos e plasmócitos, proliferação de fibroblastos e de pequenos vasos sanguíneos, aumento do tecido conjuntivo e destruição tissular. Embora os neutrófilos sejam a marca da inflamação aguda, muitas formas de inflamação crônica continuam a mostrar grandes quantidades de neutrófilos, atraídos pela produção de mediadores químicos derivados de macrófagos ou de células necróticas
(Barcelos et al., 2004). A ativação contínua de células mononucleares provoca um aumento da produção e secreção de citocinas inflamatórias, as quais amplificam e perpetuam a resposta à lesão (Kubes, 2002).
Leucócitos e células vasculares podem se influenciar reciprocamente de várias maneiras. Os leucócitos são capazes de produzir uma grande quantidade de moléculas reguladoras da angiogênese, incluindo proteinases, citocinas, VEGF, TGF-β, angiostatina, TNF-α e quimiocinas. É interessante ressaltar que, além de sustentar a indução do crescimento de novos vasos sanguíneos, os quais sustentam o recrutamento de mais leucócitos para o local inflamado, os leucócitos também exercem importante papel na inibição do crescimento dos novos vasos sanguíneos, uma vez que podem secretar mediadores que contribuem para a regressão dos vasos neoformados (Benelli et al., 2002; Crowther et al., 2001; Lingen, 2001; McCourt et al., 1999). Essas
30 informações indicam que, em uma variedade de condições patológicas, a angiogênese e a inflamação estão presentes ao mesmo tempo, atuando juntas para a manutenção da doença.
1.5 – Fibrose
A fibrose pode ser definida como uma deposição excessiva de componentes da matriz que resulta em alteração da arquitetura normal do tecido e comprometimento da função tecidual. O desenvolvimento da fibrose parece seguir uma via similar aquela da cicatrização normal de feridas.
Contudo, em muitos casos há uma progressão crônica da doença, a qual resulta em deposição excessiva de componentes da matriz extracelular sem resolução. A fibrose geralmente se desenvolve após um insulto inicial, o qual leva à lesão celular e aumento na deposição de matriz ao redor do compartimento celular comprometendo a função e eventualmente levando à morte celular (Mutsaers et al., 1997; Mohammed et al ., 2003).
Portanto, a resposta fibrótica parece ser determinada por 3 fatores: 1) um estímulo ou insulto contínuo, sugerindo que o processo fibrótico é um evento em curso; 2) síntese excessiva de colágeno e outros componentes da matriz extracelular; e 3) diminuição da resolução devido a uma baixa regulação das enzimas degradativas envolvidas na remoção do tecido cicatricial. Agentes ambientais como amianto, sílica, infecções bacterianas e virais e insultos físicos, também podem estimular o desenvolvimento de fibrose em vários
órgãos (Mutsaers et al., 1997).
31 Apesar de apresentarem diferentes manifestações etiológicas e clínicas, muitas desordens fibróticas crônicas têm em comum um irritante persistente que sustenta a produção de fatores de crescimento, enzimas proteolíticas, fatores angiogênicos e citocinas fibrogênicas, as quais estimulam a deposição de elementos conectivos que progressivamente remodelam e destroem a arquitetura normal do tecido (Wynn, 2008)
1.6 – Citocinas pró-angiogênicas, pró-inflamatórias e pró-fibrogênicas
As citocinas são polipeptídeos mediadores locais, envolvidos em vários processos biológicos importantes tais como imunidade e inflamação. As citocinas participam da imunidade inata, apresentação de antígeno, diferenciação de células da medula óssea, ativação e recrutamento celular, expressão de moléculas de adesão, regulação do crescimento e diferenciação celular, influenciam na implantação do embrião e o desenvolvimento fetal, e podem ser importantes em doenças não imunológicas (Feldman et al., 1996;
Muller, 2002; Borish & Steinke, 2003).
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma citocina, considerada como um dos mais importantes fatores pró-angiogênicos. Ele, também potencia o aumento da permeabilidade microvascular que pode preceder ou acompanhar a angiogênese (Hoeben et al., 2004).
O VEGF possui atividade mitogênica de células endoteliais com grande afinidade por seus sítios de ligação, pelos receptores nas células endoteliais flk-1 e flt-1 (Leung et al., 1989; DeVries et al., 1992) e pode ser expresso por diferentes tecidos, incluindo cérebro, rim, fígado e baço, além de muitos tipos
32 celulares (Veikkola & Alitalo, 1999; Hoeben et al., 2004). Os níveis de VEGF liberados são regulados, principalmente, pela tensão de oxigênio no tecido.
Condições geradoras de hipóxia induzem, rapidamente, um aumento da produção e secreção de VEGF local (Ferrara & Alitalo, 1999).
Em experimentos realizados in vivo o VEGF mostrou atuar na regulação da permeabilidade vascular, importante passo para a iniciação do processo angiogênico. Durante a embriogênese, o VEGF também está presente promovendo a diferenciação e proliferação de células endoteliais e a formação de vasos imaturos (Dvorak et al., 1995). Além de sua função durante a angiogênese, o VEGF possui papel crucial em algumas condições fisiológicas do organismo. Ele é detectado no ovário durante a formação do corpo lúteo, no
útero durante proliferação endometrial e no sítio de implantação do endométrio
(Ferrara et al., 1999). Elevados níveis de VEGF são detectados durante a fase proliferativa de processos de cicatriazação de feridas (Nissen et al., 1998). O
VEGF é igualmente detectável em áreas onde as células endoteliais permanecem quiescentes, tais como pulmão, fígado, coração e cérebro, sugerindo que esta citocina possui papel de fator de sobrevivência nestes tecidos (Liekens et al., 2001).
O fator de necrose tumoral (TNF) é representado por dois polipeptídeos homólogos derivados de fagócitos mononucleares e linfócitos (TNF-α e TNF-β).
O TNF também é produzido e secretado por neutrófilos, células natural killers
(NK), células endoteliais, mastócitos e algumas células tumorais (Sherry &
Cerami, 1988; Borish & Steinke, 2003).
O TNF é um dos principais mediadores das reações inflamatórias, imunológicas, e parasitológicas (Fiers, 1991). É um potente ativador de
33 neutrófilos, mediando a aderência, quimiotaxia, degranulação e a explosão respiratória. É responsável pela caquexia observada em infecções crônicas e no câncer, além de induzir permeabilidade vascular, têm efeito inotrópico negativo e, é um importante mediador do choque séptico (Sedgwick et al.,
2000; Borish & Steinke, 2003). Fràter-Schroder et al., 1987 demonstraram in vitro que o TNF-α inibe a proliferação de células endoteliais de aorta e de capilares cerebrais e as células musculares lisas. Entretanto, em ensaios na córnea de coelhos e na membrana corion-alantoica esta citocina demonstrou um efeito estimulador da angiogênese (Leibovich, 1987).
O TNF-α aumenta a expressão de VEGF e dos receptores desta citocina nas células endoteliais (Balkwill & Mantovani, 2001). Usando implantes subcutâneos de esponja em animais geneticamente deficientes para o receptor
TNFR1, foi observada também a diminuição da angiogênese e dos níveis de
VEGF (Barcelos et al., 2005). Estes achados exemplificam as propriedades angiogênicas atribuídas ao TNF.
A família do fator de crescimento transformante beta (TGF-β) possui mais de 30 diferentes membros, incluindo 3 isoformas de TGF-β. Tem sido mostrado que o TGF-β está envolvido em diferentes processos celulares tais como proliferação, diferenciação, migração, adesão e apoptose (Dennler et al.,
2002). As três isoformas de TGF-β (β1, β2 e β3), têm uma grande sequência homóloga. O TGF-β é um potente ativador e quimiotático de macrófagos, fibroblastos e polimorfonucleares, além de promover a produção e secreção de componentes da matriz extracelular (Crowe et al., 2000).
O TGF-β1 é produzido por vários tipos celulares, incluindo plaquetas, macrófagos e células mesoteliais. Ele é um fator chave na cicatrização normal
34 de feridas e é um potente indutor de fibrose tecidual em cicatrização de ferida peritoneal (Border and Noble, 1994). Na literatura tem sido mostrado que a elevada expressão de TGF-β1 no peritônio, na superfície de órgãos pélvicos e sua alta concentração no fluido peritoneal tem sido associada com aumento na incidência de formação de aderências em humanos e animais e ainda que ele aumenta a expressão de inibidor de plasminogênio e diminui a de ativador de plasminogênio tecidual nas células mesoteliais, diminuindo assim a atividade fibrinolítica (Chegini et al., 1994; 1997; 1999).
1.7 – Modelo de Implante de Esponja
O modelo de implantação subcutânea de esponjas em animais foi inicialmente descrito por Grindlay & Waugh (1951) e modificado por Andrade et al. (1987). Em 2007, Mendes et al. caracterizaram a neovascularização e o processo inflamatório em implantes de esponja (poliéster-poliuretano) alojados na cavidade abdominal, com ênfase na participação de citocinas pró- inflamatórias e pró-angiogênicas (KC, MCP-1, VEGF, TNF).
A implantação de matrizes sintéticas, inicialmente acelulares, induz uma reação inflamatória com consequente formação de tecido de granulação rico em novos vasos sanguíneos, representando um sistema que tem se mostrado apropriado para o estudo da angiogênese inflamatória. Assim, processos naturais como a vascularização de feridas em cicatrização podem ser mimetizados utilizando-se esse modelo. Uma vez que o estímulo inflamatório é persistente, é presumível o estudo de processos inflamatórios crônicos.
35 Além disso, o modelo permite o estudo temporal do infiltrado inflamatório, a análise bioquímica dos fluidos coletados, os efeitos de drogas sobre o processo, além de estudos histológicos e morfométricos (Andrade et al ., 1987; Barcelos et al., 2004; Jain et al., 1997;). Utilizando-se esta abordagem metodológica tem sido possível caracterizar vários componentes envolvidos na neoformação vascular bem como sua associação com eventos inflamatórios (recrutamento e ativação de leucócitos).
O mecanismo da resposta peritoneal à injúria e os fatores que determinam os processos de restabelecimento e reparação do peritônio não estão completamente definidos (Topley et al., 1994). Tanto os processos de neoplasias quanto os processos inflamatórios, como as aderências, que afetam a cavidade abdominal estão associados com neoangiogênese e formação de estroma (Runyon, 1993; Nagy et al., 1995; Hasebe et al., 1997). Em processos de cicatrização de feridas e em reações a corpos estranhos, bem como após a realização de implantes de materiais biomédicos, também se percebe a presença da neovascularização como passo importante do processo inflamatório (Witte & Barbul, 1997). Estudos realizados em nosso laboratório mostraram que a implantação cirúrgica de matrizes esponjosas na cavidade peritoneal induzia intensa aderência de vários órgãos da cavidade peritoneal ao implante (particularmente fígado e intestino). A análise do tecido que infiltrou a matriz esponjosa revelou intensa atividade angiogênica, inflamatória e fibrogênica. Além disso, foi detectada neste tecido fibrovascular, a produção de fatores angiogênicos e citocinas inflamatórias (Mendes et al., 2007).
36 1.8 – As fosfodiesterases
Uma classe de compostos que tem emergido com potencial inibitório na prevenção de aderências pertence à família das fosfodiesterases (PDE) devido a sua larga escala de ações envolvidas em tecidos com atividade proliferativa
(Netherton & Maurice, 2005).
As fosfodiesterases são enzimas que degradam os nucleotídeos cíclicos
GMPc e AMPc nas suas formas inativas. São conhecidas 11 famílias de enzimas (PDE1 - PDE11) que diferem com relação ao padrão distribuição, especificidade de substrato, regulação pelas PKs e proteínas ligantes (Favot et al, 2003).
. Elas estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos, tais como ereção peniana, asma, hipertensão pulmonar, aterosclerose, insuficiência cardíaca e diabetes. Consequentemente, os inibidores seletivos de fosfodiesterases são interessantes e promissores alvos farmacológicos.
Eles impedem a degradação do AMPc e do GMPc, elevando seus níveis intracelulares. A regulação destes segundos mensageiros intracelulares cAMP e cGMP, têm importante papel na modulação da migração e proliferação de vários tipos celulares, incluindo as células endoteliais vasculares (VECs) (Favot et al, 2003).
1.8.1 –Pentoxifilina
A pentoxifilina (PTX) um inibidor não seletivo de PDE (1-5) que diminui a degradação de cAMP /cGMP tem sido largamente usada clinicamente para o
37 tratamento de desordens vasculares (Lin et al., 2002). Tem sido mostrado que este composto diminui a proliferação de células mesoteliais peritoneais in vitro, atenua fibrose renal e peritoneal (Hung et al, 2003). A pentoxifilina também inibe vários mecanismos inflamatórios, incluindo a cascata do complemento, a aderência dos neutrófilos, a produção de citocinas e a proliferação de fibroblastos dérmicos. Estudos in vitro com fibroblastos têm mostrado que a pentoxifilina reduz potencialmente a proliferação celular, estimula a atividade da colagenase intersticial e inibe a síntese, secreção e deposição de fibrilas de colágeno tipos I e III, proteoglicanos e fibronectina (Chasin & Harris, 1976;
Duncan et al. 1995). Ueda et al. 1997 demonstraram que o crescimento de vasos e a produção de TNF-α foram inibidos pela administração de pentoxifilina, mostrando assim, mais uma vez, a ligação deste componente com a formação de vasos. Experimentos com anticorpos neutralizadores têm indicado que o TNF-α é importante na neovascularização induzida por macrófagos (Leibovich et al, 1987) e é um dos vários fatores intrínsecos responsáveis pela formação de vasos em modelos de implantes de esponja
(Hu et al, 1995).
1.8.2 – Cilostazol
Outro composto, o cilostazol, é um derivado da 2-oxo-quinolone com propriedades antitrombótica, vasodilatadora, antimitogênica e cardiopática. É um potente inibidor seletivo da fosfodiesterase 3 e tem sido usado para o tratamento de sintomas da claudicação intermitente (IC) e outras indicações relacionadas (Kambayashi et al., 2003; Liu et al, 2001). Suas ações anti-
38 plaquetária e vasodilatadora são devido principalmente a inibição da PDE 3 e subsequente elevação dos níveis intracelulares de cAMP. Este aumento de cAMP é também reportado como um mecanismo inibidor da proliferação de células musculares lisas e da adesão plaquetária e leucocitária in vitro
(Netherton & Maurice, 2005; Otsuki et al., 2001). Cilostazol inibe fator de crescimento epidermal (EGF) em macrófagos e em células musculares lisas. O
EGF é um dos mais potentes mitogênicos para células musculares lisas e a inibição da sua expressão é claramente importante para inibição da mitogênese dessas células (Kayanoki et al, 1997). Assim, o cilostazol pode atuar como um agente antimitogênico por vários mecanismos: aumento de cAMP e interferência com o ciclo celular, e interferência direta com vários fatores de crescimento. Em um modelo animal de injúria na carótida, uma única aplicação local de cilostazol resultou em uma intensa e expressiva inibição da proliferação da camada íntima (Ishizaka et al., 1999).
1.8.3 – Rolipram
Durante a última década, numerosos estudos tem demonstrado a modulação da ativação de células inflamatórias através de inibidores seletivos de PDE4. Já é estabelecido que a elevação nos níveis de cAMP é capaz de inibir vários processos inflamatórios. Tem sido mostrado que o Rolipram, um inibidor seletivo da PDE4, diminui o influxo de células inflamatórias no sítio inflamatório induzido por vários estímulos (Lagente et al., 1995; Teixeira et al.,
1997). Um dos maiores efeitos anti-inflamatório dos inibidores das PDE 4 é sua habilidade em diminuir a produção de citocinas tanto in vivo quanto in vitro .
39 Como a inibição de TNF-α pelo rolipram (Corbel et al., 2002). Além disso tem sido demonstrado a inibição da quimiotaxia de fibroblastos, que pode levar a fibrose, e a concentração de colágeno mediada por fibroblasto pelo rolipram
(Kohyama et al., 2002).
1.8.4 – Dipiridamol
Um dos compostos que apresenta, entre outras ações, atividade inibidora das PDEs (PDE5 e PDE6) é o dipiridamol. Este composto exerce atividade antiplaquetária com mecanismos de ação ainda não totalmente caracterizados, embora com efeitos terapêuticos já descritos em uma série de condições patológicas como claudicação intermitente e obstrução vascular
(Fitzgerald, 1987). Acredita-se que o dipiridamol atue inibindo a degradação de cAMP mediada por PDE5 e PDE 6 (Hennekens, 1997). Além disso, tem sido mostrado que o dipiridamol exerce efeitos antiproliferativos na taxa de célula musculares lisas (Iimura et al, 1996), células mesangiais humanas (Hillis et al,
1998) e também inibição no crescimento de células mesoteliais peritoneais humanas (Hung et al, 2001). Em modelos de fibrose peritoneal em ratos foi mostrado que o dipiridamol exerce efeito antifribrogênico em células mesangiais por inibir a proliferação celular e por reduzir a expressão celular de mRNA de colágeno tipo I (TSAI et al, 1995). Hung et al (2001) demonstraram que o dipiridamol inibe o crescimento de células mesoteliais humanas (HPMC), além de suprimir a síntese de colágeno total das HPMC e atenuar os níveis de mRNA de colágeno tipo I e colágeno tipo III por 24 hs. Estes efeitos in vitro e in vivo do dipiridamol mostraram que ele tem potencial terapêutico para fibroses
40 peritoneais in vivo .
Assim, uma vez que os segundos mensageiros intracelulares cAMP/cGMP têm um importante papel na modulação da migração e proliferação de vários tipos celulares, incluindo células inflamatórias e endoteliais (Favot, 2003; Netherton and Maurice, 2005), nosso objetivo neste trabalho foi analisar os efeitos do cilostazol, da pentoxifilina, do rolipram e do dipiridamol nos vários componentes das aderências induzidas por implante de esponja. O estudo concomitante destes três componentes (inflamatório, angiogênico e fibrótico) em aderências e seu tratamento por estes agentes inibidores das fosfodiesterases ainda não foi descrito na literatura. Além disso, estes compostos disponíveis comercialmente e usados clinicamente para o tratamento de condições vasculares, já possuem sua farmacodinâmica, farmacocinética e seus efeitos colaterais bem determinados. Os resultados deste estudo podem contribuir para o avanço no entendimento e prevenção de aderências na cavidade peritoneal e participação de fosfodiesterases na formação destas lesões.
41 2- OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Investigar a eficácia terapêutica de compostos com atividade anti- fosfodiesterásica (cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol) nos componentes angiogênico, inflamatório e fibrogênico de aderências induzidas por implantes intra-peritoneais.
2.2- Objetivos específicos
Caracterizar através de parâmetros bioquímicos e morfológicos os componentes do tecido fibrovascular induzidos por matrizes sintéticas alojadas na cavidade abdominal.
Avaliar o efeito dos compostos com atividade anti-fosfosfodiesterásica
(cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol) na angiogênese, inflamação e fibrose das aderências intra-peritoneais induzidas pelo implante de esponja.
Avaliar o efeito destes compostos na produção de citocinas angiogênicas, inflamatórias e fibrogênicas (VEGF, TNF-α e TGF-β) no modelo de aderência intra-peritoneal.
42 3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Animais
Foram utilizados camundongos Balb-c machos, pesando aproximadamente 25 gramas, provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.
3.2- Técnica de implantação
3.2.1- Implantes de esponjas
Previamente confeccionados discos de esponjas de poliéster poliuretano de 8 mm, 4 mm de espesssura e com 1.2cm de diâmetro (Vitafoam Ltd
Manchester) eram conservados em álcool 70% v/v, por 24 horas anteriores à implantação e, posteriormente, fervidos em água destilada por 30 minutos
(Andrade et al ., 1987). Estes implantes foram utilizados para induzir a inflamação, angiogênese e aderências intraperitoneais (Mendes et al., 2007).
3.2.2- Técnica de implantação em camundongos
Para o procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados intraperitonealmente com Ketamina/Xilazina (8 mg/Kg e 60 mg/Kg, respectivamente), e submetidos à tricotomia e à assepsia da região ventral com álcool 70% v/v, dispostos em mesa cirúrgica e realizada uma incisão
43 mediana ventral de aproximadamente 1 cm na pele e no músculo peritoneal, e assim o disco de esponja foi introduzido na cavidade abdominal. A sutura da incisão foi feita com fio de nylon 3.0 usando ponto Donati. Após recuperação da anestesia os animais foram colocados em gaiolas individuais com água e ração
“ad libitum ” (Mendes et al., 2007).
3.3- Remoção dos implantes
No 8º dia pós-implantação uma overdose de anestésico era aplicada para o sacrifício do animal e retirada dos implantes. Estes eram removidos, pesados e processados para estudos bioquímicos e histológicos.
3.4- Dosagem de hemoglobina
A dosagem do conteúdo de hemoglobina intraimplante quantifica indiretamente a neovascularização presente nos tecidos e tem sido utilizada como índice de vascularização em modelos de angiogênese. Esta técnica utiliza o método do reagente de Drabkin desenvolvido em 1932 e adaptado como índice de vascularização (Plunkett et al., 1990; Passaniti et al., 1992; Hu et al ., 1995; Ferreira et al ., 2004; Belo et al., 2005).
Os implantes eram homogeneizados (Tekmar TR-10, Ohio, USA) em 2,0 mL de um reagente cromogênico específico para hemoglobina (Reagente de
Drabkin- Kit de Dosagem de Hemoglobina Labtest). As amostras eram
44 centrifugadas por 30 minutos a 15000 rpm e os homogenatos filtrados em membranas GV Durapore de 0,22 µm (Millipore). Posteriormente, as amostras eram colocadas em placas de 96 poços e a leitura espectrofotométrica em comprimento de onda de 540nm realizada em leitor de microplaca
(Thermoplate). A concentração de hemoglobina de cada amostra foi calculada a partir de uma curva padrão conhecida e os resultados expressos em concentração de hemoglobina (microgramas por miligrama de peso úmido de implante).
3.5- Avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO)
O acúmulo de neutrófilos é uma característica marcante do processo inflamatório e, junto com os macrófagos, eles constituem as primeiras linhagens celulares presentes nos sítios de injúria. Em 1982, Bradley et al, desenvolveram um ensaio enzimático para a detecção do acúmulo de neutrófilos, utilizando a enzima mieloperoxidase como marcador quantitativo de neutrófilos.
Esta técnica foi adaptada para o modelo de implante de esponja. (Bailey,
1988; Ferreira et al., 2004; Belo et al., 2005).
Após a dosagem de hemoglobina, o sobrenadante foi desprezado e uma parte do sedimento foi pesado, homogeneizado, ressuspendido em 2,0 mL de tampão fosfato, pH 4,7 (0,1M NaCl, 0,02M Na 3PO 4, 0,015M de NaEDTA) e centrifugado a 12,000 xg durante 20 minutos. São retirados 300 µL do sobrenadante e adicionados 600 µL de tampão de fosfato de sódio 0.05M (pH
45 5,4) contendo 0,5% de hexa-1,6-bisdecyltrimethylammonium bromide (HTAB,
Sigma). Esta mistura foi novamente centrifugada a 10,000xg durante 10 min. A atividade da enzima MPO no sobrenadante resultante foi mensurada pela mistura de 100 µL de tetrametibenzidina (TMB, Sigma), preparado em dimetil sulfoxido (DMSO, Merck) em uma concentração de 1,6mM, e 100 µL do substrato H 2O2 na concentração 0,3mM, dissolvida em tampão fosfato (pH 5,4).
A reação era paralisada com a adição de 100 µL de H 2SO 4 e quantificada colorimetricamente em 450nm em leitor de microplaca (Thermoplate). Os resultados foram expressos como densidade óptica (OD) por g de tecido úmido
(implante).
3.6- Avaliação da atividade de n-acetilglicosaminidase (NAG)
A enzima lisossômica N-acetil-β-glicosaminidase se encontra presente em macrófagos ativados (Bailey, 1988). Parte do sedimento remanescente após a dosagem de Hb era pesado e utilizado para este ensaio visando detectar os níveis dessa enzima. Os sedimentos foram homogeneizados em uma solução de NaCl (0,9% v/v) contendo 0,1% v/v Triton X-100 (Promega) e centrifugado (3000 xg; 10min 4 °C). Amostras do sobrenadante resultante
(100 µL) foram incubadas por 10 min com 100 µL p-nitropenyl-N-acetyl-β- glucosaminide (Sigma), preparado em tampão de citrato/fosfato (pH 4,5) em uma concentração final de 2.24 mM. A reação foi paralisada pela adição de
100 µL 0,2M tampão glicina pH 10.6.
46 Para realização do ensaio, adicionou-se 100 µL das amostras em duplicata a uma placa de 96 poços. Às amostras, foram adicionados 100 µL do substrato (p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminida) (Sigma), diluído em tampão citrato/fosfato pH = 4,5. Seguiu-se uma incubação a 37º C durante 30 minutos.
Por último, foram adicionados 100 µL de tampão glicina 0,2M, pH = 10,6. A absorbância foi medida por leitor de microplaca (Thermoplate) em comprimento de onda de 400nm. A hidrólise do substrato foi determinada pela mensuração da absorção em 400nm e a atividade enzimática expressa como densidade
óptica (OD) por grama de tecido úmido (implante).
3.7- Quantificação das citocinas (VEGF, TNF-ααα, TGF-βββ1) intra-implantes
Para a determinação destas citocinas nos implantes foi utilizado 80µL do sobrenadante restante da dosagem de Hemoglobina. O ensaio enzimático foi realizado seguindo-se os passos do protocolo padronizado pelo fornecedor do
Kit DuoSet Murine Immunoassay (R&D Systems).
Diluições de sobrenadantes livres de células foram adicionadas em duplicada a placa de ELISA que tinham uma anticorpo monoclonal especifico para camundongo contra a citocina, seguido da adição de um segundo anticorpo de detecção contra a citocina. Após lavagem para remover anticorpos que não se ligaram, uma solução de substrato foi adicionada à placa de ELISA
(50µL de uma solução na proporção de 1:1 de peróxido de hidrogênio e tetramethylbenzidine 10mg/mL em DMSO). A reação foi paralisada após 20 minutos de incubação com 2N de ácido sulfúrico (50 µL) e a intensidade da cor
47 foi quantificada a 540nm em leitor de microplaca (Thermoplate). Os padrões foram diluições das citocinas recombinantes de camundongos de 7.5 pg a 1000 pg mL-1 (100 µL). Os resultados foram expressos como pg citocina por mg peso úmido.
3.8- Avaliação histológica
Os implantes reservados para técnica histológica foram imediatamente fixados em solução formol/salina 1:3 durante 24 horas e colocados em álcool
70% v/v até o processamento histológico que incluiu desidratação, diafanização, banho e inclusão em parafina. Após estes procedimentos, foram feitas a microtomia e a coloração com hematoxilina-eosina (HE). Os cortes foram examinados e fotografados utilizando-se microscópio óptico, usando-se ocular de 10x e objetivas de 10x, 20x e 40x, e fotografados.
A análise morfométrica foi realizada no Laboratório de Morfometria do
Departamento de Patologia – ICB/UFMG. As imagens foram obtidas de 15 campos por lâmina (53.333 µm2/campo), digitalizadas utilizando-se uma microcâmera JVC TK-1270/JGB e transferidas para um analizador de imagens
(Kontron Eletronics, Carl Zeiss – KS300 versão 2). O parâmetro morfométrico avaliado foi o número de vasos de cada campo definido como estruturas com lúmen com ou sem hemácias.
48 3.9- Quantificação do colágeno
A quantidade de colágeno solúvel total (tipos I-V) foi quantificada colorimetricamente baseada na reação do Picrossirius Red . Esta técnica foi desenvolvida por Phillips (2004) como um método de ligação ao [GLY-X-Y]n das sequências de tripla hélices de todos os colágenos nativos. Sucintamente, as amostras de esponja foram homogeneizadas com tampão (salina 0.1%
Triton X-100) depois da homogenização os debris foram removidos pela centrifugação. Cinquenta µL do reagente picrossirius red foram adicionados a
50 µL da amostra. Após 30 min de incubação em temperatura ambiente o complexo colágeno- picrossirius red foi separado por centrifugação a 10000xg durante 15 minutos, em seguida lavado com etanol e o complexo colágeno- corante reconstituído em 1mL de reagente alcalino (NaOH 0,5M). A absorbância foi quantificada a 540nm em um leitor de microplacas
(Thermoplate). A quantidade de colágeno em cada amostra foi determinada através da comparação de uma curva padrão utilizando padrões de colágeno
(Merck) e os resultados expressos em µg de colágeno por mg de implante.
49 3.10- Análise estatística
Os resultados foram apresentados como média ± e.p.m. Todos os dados foram submetidos ao exame de normalidade utilizando-se o teste de
Kolmogorov-Smirnov. A comparação entre os grupos foi realizada pelo teste da análise de variância (Anova) seguida do teste de Newlman Keuls. Foram considerados significativos os valores com p <0,05, utilizando-se o programa
GraphPad Prism 4.0.
50 3.11- Protocolo experimental
Depois de implantados os camundongos foram divididos em grupos conforme o tratamento utilizado, que foi iniciado 24 horas após a implantação.
Os animais receberam tratamento diário por via oral, por gavagem.
Para facilitar a descrição dos resultados obtidos, utilizaremos as seguintes descrições dos grupos experimentais:
• 40 CT = animais tratados com Cilostazol na dose de 40 mg/Kg
• 400 CT = animais tratados com Cilostazol na dose de 400 mg/Kg
• 50 PTX = animais tratados com Pentoxifilina na dose de 50 mg/Kg
• 500 PTX = animais tratados com Pentoxifilina na dose de 500
mg/Kg
• 0,2 ROL = animais tratados com Rolipram na dose de 0,2 mg/Kg
• 2,0 ROL= animais tratados com Rolipram na dose de 2,0 mg/Kg
• 10 DIP = animais tratados com Dipiridamol na dose de 10 mg/kg
• 100 DIP = animais tratados com Dipiridamol na dose de 100
mg/Kg
• Controle = animais tratados com água (300 µL)
O cilostazol (Vasogard 100mg; Biosintética), a pentoxifilina (Vascer
400mg; União Química), o Rolipram (Sigma) e o dipiridamol (Persantin 75mg;
Boehringer Ingelhein) foram adquiridos comercialmente.
As doses administradas foram estabelecidas através da coleta de dados da literatura e de estudos pilotos realizados no laboratório.
Os tratamentos foram mantidos até o sétimo dia pós-implantação, e os animais sacrificados para remoção dos implantes no oitavo dia.
51 4 – RESULTADOS
A implantação de discos de esponja em camundongos foi utilizada como modelo experimental de indução de aderências peritoneais para a caracterização dos processos angiogênico, inflamatório e fibrogênicos, seus principais componentes. Este procedimento foi bem tolerado pelos animais.
Não foram observados sinais de infecção ou rejeição no local do implante ou da incisão durante os 8 dias do período experimental. A administração sistêmica dos compostos cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol, em todas as dose admistradas, não mostrou sinais clínicos de toxicidade, tais como perda de peso, sedação, ou alterações na atividade motora dos animais.
Os implantes foram envolvidos por uma cápsula fibrosa e estavam fortemente aderidos em órgãos como fígado e intestino no oitavo dia.
4.1 - Avaliação histológica dos implantes
A análise dos cortes histológicos dos implantes, após coloração com HE, mostrou que o implante de esponja induziu uma resposta fibrovascular que levou a formação de um novo tecido. A análise do grupo controle revelou a presença de um infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear com predominância de células polimorfonucleares, células tipo mesoteliais, células endoteliais formando microvasos com hemácias em seu interior e fibroblastos.
A histologia dos implantes tratados apresentou a mesma constituição do grupo controle, porém com menor quantidade de vasos sanguíneos e/ou menor celularidade em seu estroma (FIG.1A- E).
52 Os implantes do grupo controle mostraram-se bastante vascularizados e com características típicas de inflamação. O estroma apresentou infiltrado inflamatório mono e polimorfonuclear, células epitelióides e vários vasos sanguíneos (FIG. 1A). Atenuação desses componentes foi observada nos implantes dos animais tratados. Nos implantes tratados com cilostazol (400 mg/Kg), pentoxifilina (500 mg/Kg) e dipiridamol (100 mg/Kg) pode ser visto uma redução na vascularização, porém o infiltrado inflamatório não foi afetado quando comparado ao grupo controle (FIG.1A- D). Já no grupo tratado com rolipram (2 mg/Kg), o número de células inflamatórias está menor, mas nenhuma diferença na quantidade de vasos sanguíneos foi observada quando comparada ao grupo controle (FIG.1E).
A infiltração celular e a deposição de matriz extracelular nos implantes também foram avaliadas quantitativamente a partir do peso úmido desses implantes. Os implantes tratados cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e
500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) apresentaram menor peso quando comparados ao grupo controle, o que reforça as alterações observadas nos cortes histológicos, que mostram uma menor infiltração de tecido conjuntivo fibrovascular nos implantes de todos os grupos tratados (FIG.2).
53 A B
D C D
Número de vasos 9 8 7 6 5 *** 4 *** 3 *** 2 F 1 E 0 controle CT PTX ROL DIP
FIGURA 1 A-F – Cortes histológicos (5 µm, HE) e Número de vasos: representativos dos implantes de esponja dos grupos controle (A) e tratados com cilostazol 400mg/Kg
(B), pentoxifilina 500mg/Kg (C), rolipram 2mg/Kg (D) e dipiridamol 100mg/Kg (E). No gráfico (F) encontra-se o resultado da morfometria para número de vasos das respectivas histologias. objetiva de 40x. CT: cilostazol; PTX: pentoxifilina; ROL: rolipram e DIP: dipiridamol.
54
A B cilostazol pentoxifilina 0.20 0.20 ** ** 0.15 *** 0.15 ***
0.10 0.10
0.05 0.05 peso úmido mg úmido peso mg úmido peso
0.00 0.00 controle 40 400 controle 50 500
C D rolipram dipiridamol 0.20 0.20
0.15 * 0.15 *** ***
0.10 *** 0.10 peso úmido peso 0.05 0.05 peso úmido mg úmido peso
0.00 0.00 controle 0.2 2 controle 10 100
FIGURA 2: PESO ÚMIDO DOS IMPLANTES – Comparação do peso úmido dos implantes de animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
55 4.2 - Avaliação da angiogênese
A análise da angiogênese foi realizada através da avaliação do conteúdo de hemoglobina (Hb) intraimplante, da morfometria de cortes histológicos dos implantes e da dosagem de VEGF, citocina pró-angiogênica. A dosagem de hemoglobina realizada pelo método de Drabkin avalia indiretamente a formação de vasos sanguíneos (índice vascular).
As doses diárias de cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg) e de dipiridamol (10 e 100mg/Kg) administradas por gavagem para os diferentes grupos de camundongos reduziram o conteúdo de hemoglobina dos implantes, aproximadamente 40%, indicando uma diminuição do número de vasos (FIG. 3). A diferença entre o grupo controle e os grupos tratados
(cilostazol, pentoxifilina e dipiridamol) foram ainda confirmados pela análise morfométrica dos implantes que mostrou um números de vasos marcadamente menor nos grupos tratados (FIG. 1F).
Tendo em vista que o VEGF é considerado um marcador molecular da angiogênese, foram avaliados os níveis dessa citocina nos implantes. Os resultados desses experimentos são consistentes com a associação feita entre os níveis de VEGF e a formação de novos vasos, uma vez que esses níveis foram diminuídos nos implantes após tratamento com o cilostazol, pentoxifilina e dipiridamol (FIG. 4).
O tratamento com rolipram em ambas as doses (0,2 e 2 mg/Kg) não foi eficaz em diminuir os níveis de Hb, o número de vasos e a concentração de
VEGF (FIG. 3C, 1F e 4C).
56
A B Hb cilostazol Hb pentoxifilina 7 7 6 6 5 5 * ** * 4 *** 4 3 3 g/mg peso úmido) peso g/mg g/mg peso úmido) peso g/mg µ µ µ µ µ µ 2 µ µ 2 Hb ( Hb 1 ( Hb 1 0 0 controle 40 400 controle 50 500
C D Hb Rolipram Hb Dipiridamol 7 7 6 6 5 5 * 4 4 ** 3 3 g/mg peso úmido) peso g/mg úmido) peso g/mg µ µ µ µ µ µ 2 µ µ 2
Hb ( Hb 1 ( Hb 1 0 0 controle 0.2 2.0 controle 10 100
FIGURA 3: DOSAGEM DE Hb NOS IMPLANTES - Avaliação da resposta angiogênica em animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e
500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
57
A B VEGF cilostazol VEGF pentoxifilina 60 60
50 50
40 40 * 30 ** 30
20 20 ** 10 10 VEGF (pg/mg peso peso úmido) (pg/mg VEGF peso úmido) (pg/mg VEGF 0 0 control 40 400 control 50 500
C D
VEGF Rolipram VEGF Dipiridamol 250 60
200 50 40 150 30 * 100 20 50 10 VEGF (pg/mg peso úmido) peso (pg/mg VEGF VEGF (pg/mg peso peso úmido) (pg/mg VEGF 0 0 controle 0.2 2.0 controle 10 100
FIGURA 4: CONCENTRAÇÃO DE VEGF NOS IMPLANTES - Avaliação dos níveis de VEGF, importante citocina pró-angiogênica, em animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg). Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
58 4.3 - Avaliação da inflamação
Os componentes inflamatórios do tecido fibrovascular induzidos pelo implante de esponja foram avaliados através de ensaios que correlacionam a atividade enzimática com a quantidade de células inflamatórias recrutadas na lesão durante a inflamação, e da concentração da citocina inflamatória TNF-α.
A quantidade de neutrófilos recrutada, avaliada como atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) não foi afetada pelo tratamento com os compostos cilostazol, pentoxifilina e dipiridamol (FIG. 5 A,B e D). Já o tratamento com rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) foi eficaz em diminuir essa população celular.
Entretanto, o recrutamento de macrófagos, avaliado como atividade da enzima N-acetil-glicosaminidase (NAG) teve seu conteúdo diminuído pelas doses mais altas dos compostos pentoxifilina e rolipram (500 e 2 mg/Kg respectivamente) (FIG. 6 B e C).
Os níveis de TNF-α, citocina presente em processos inflamatórios e que atua recrutando células inflamatórias para o tecido lesado, foi menor nos grupos tratados com cilostazol e pentoxifilina em suas doses mais altas (400 e
500mg/Kg respectivamente) e pelas duas doses dos compostos rolipram
(aproximadamente 80% de redução) e dipiridamol (0,2 e 2 mg/kg; 10 e 10 mg/Kg respectivamente)(FIG. 7).
59
A B MPO cilostazol MPO pentoxifilina 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 Atividade MPO (OD/mg peso úmido) (OD/mgpeso MPO Atividade 0 úmido) (OD/mgpeso MPO Atividade 0 Control 40 400 Control 50 500
C D MPO Rolipram MPO Dipiridamol 12.5 7 6 10.0 5 7.5 4 *** 5.0 ** 3 2 2.5 1 Atividade MPO (OD/mg Atividade MPO úmido) peso 0.0 úmido) (OD/mg peso MPO Atividade 0 controle 0.2 2.0 controle 10 100
FIGURA 5: ATIVIDADE DE MPO NOS IMPLANTES - Avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase, importante marcador inflamatório, em animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
60
A B NAG cilostazol NAG pentoxifilina 6 6
5 5
4 4 3 3 *** 2 2
1 1
0 0 Atividade NAG (OD/mg peso úmido) controle 40 400 Atividade NAG (OD/mg peso úmido) controle 50 500
C D NAG Rolipram NAG Dipiridamol 10.0 6
5 7.5 4 * 5.0 3
2 2.5 1 0.0
Atividade (OD/mg NAG pesoúmido) 0 controle 0.2 2.0 Atividade NAG (OD/mg peso úmido) controle 10 100
FIGURA 6: ATIVIDADE DE NAG NOS IMPLANTES - Avaliação da atividade da enzima N-acetil-glicosaminidase, importante marcador inflamatório, em animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média
± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
61
A B TNF- ααα cilostazol TNF- ααα pentoxifilina 40 40
30 30
20 * 20 *
(pg/mg peso úmido) peso (pg/mg 10 úmido) peso (pg/mg 10 α α α α α α α α
TNF- 0 TNF- 0 Controle 40CT 400CT Controle 50 500
C D TNF- ααα Rolipram TNF- ααα Dipiridamol 40 40
30 30
20 20 * * * (pg/mg peso úmido) peso (pg/mg (pg/mg peso úmido) peso (pg/mg 10 10 α α α α α α α α * TNF- TNF- 0 0 controle 0.2 2.0 controle 10 100
FIGURA 7: CONCENTRAÇÃO DE TNF-ααα NOS IMPLANTES - Avaliação dos níveis de TNF-α, importante citocina pró-inflamatória, em animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
62 4.4 - Avaliação da fibrose
A fibrose, componente fundamental na formação de aderências, foi determinada pelos níveis da citocina pró-fibrogênica TGF-β1 e pelo conteúdo de colágeno nos implantes. Em todos os grupos tratados foi verificado claramente uma diminuição, de aproximadamente 80%, dos níveis de TGF-β1 quando usadas as maiores doses dos compostos estudados cilostazol
400mg/Kg, pentoxifilina 500mg/Kg, dipiridamol 100mg/Kg e rolipram 2mg/Kg
(FIG. 8). O conteúdo de colágeno, avaliado pelo método colorimétrico do picrossirius red , também apresentou significativa redução, próximo a 80%, em todos os grupos tratados, cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) (FIG. 9).
63 A B TGF- βββ1 cilostazol TGF- βββ1 pentoxifilina 70 70 60 60 50 50 40 40 30 * 30 * 20 20 * 1 (pg/mg peso úmido) peso 1(pg/mg úmido) peso 1(pg/mg β β β β β β β β 10 10
TGF- 0 TGF- 0 controle 40 400 controle 50 500
C D TGF- βββ1 rolipram 9 TGF- βββ1 dipiridamol 70 8 60 7 6 50 5 40 4 *** *** 30 * 3
1 (pg/mg peso úmido) peso 1(pg/mg 20 1 (pg/mg peso úmido) peso 1(pg/mg
β β 2 β β β β β β 1 10 TGF- 0 TGF- 0 controle 0.2 2.0 controle 10 100
FIGURA 8: CONCENTRAÇÃO DE TGF-βββ NOS IMPLANTES - Avaliação dos níveis de TGF-β, importante citocina fibrogênica, em animais tratados com cilostazol
(40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
64
A Colágeno cilostazol B colágeno pentoxifilina 5 5
4 4
3 3
g/mg peso úmido) peso g/mg 2 úmido) peso g/mg 2 µ µ µ µ µ µ ** µ µ ** ** 1 *** 1
Colágeno ( Colágeno 0 ( Colágeno 0 controle 40 400 controle 50 500
C D Colágeno Rolipram Colágeno Dipiridamol 5 5
4 4
3 3 g/mg peso úmido) peso g/mg 2 úmido) peso g/mg 2 µ µ µ µ µ µ µ µ ** * 1 1 *** *** Colágeno ( Colágeno 0 ( Colágeno 0 controle 0.2 2.0 controle 10 100
FIGURA 9: CONTEÚDO DE COLÁGENO NOS IMPLANTES - Avaliação do conteúdo de colágeno, componente fundamental da fibrose, em animais tratados com cilostazol (40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg) . Os valores mostrados representam Média ± e.p.m. de grupos de 8 a 10 animais. * diferença significativa entre os grupos tratados e o controle. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
65 5 - DISCUSSÃO
O presente estudo teve por objetivo investigar a eficácia terapêutica dos compostos com atividade anti-fosfodiesterásica (cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol) nos componentes angiogênico, inflamatório e fibrogênico de aderências induzidas por implantes intra-peritoneais. As alterações ocorridas nos implantes de esponja foram avaliadas por métodos bioquímicos, histológicos e morfométricos.
A medida do conteúdo de hemoglobina e os níveis de VEGF utilizados como índices de atividade angiogênica têm sido extensivamente utilizados em vários estudos que utilizam modelos de angiogênese in vivo, incluindo o modelo de implante de esponjas (Passaniti et al., 1992; Lage & Andrade, 2000;
Mendes et al., 2007). A detecção da atividade do MPO e do NAG em fluidos biológicos juntamente com os níveis de citocinas inflamatórias podem ser utilizados como marcadores de neutrófilos e macrófagos, respectivamente, em uma variedade de tecidos em ratos e camundongos, incluindo implantes de esponja inseridos nestes animais (Bailey, 1988; Belo et al., 2004, Mendes et al., 2007; Araújo et al, 2010). Assim como os níveis da citocina pró-fibrogênica
TGF-β1 e o conteúdo de colágeno, que têm sido usados para determinar a fibrose em modelos in vivo (Araújo et al., 2009).
Nós reportamos previamente um modelo de aderência intra-peritoneal baseado na técnica de implantação de um implante de esponja de poliéster- poliuretano na cavidade abdominal. Os implantes intra-peritoneais apresentavam-se aderidos a alguns órgãos (fígado, intestino), altamente vascularizados, infiltrados por células inflamatórias, fibroblastos e células tipo
66 mesoteliais. Além disso, foi observada a produção de citocinas pró- angiogênicas e pró-inflamatórias no tecido fibrovascular recém-formado
(Mendes et al., 2007). Utilizando-se este modelo de aderência peritoneal neste estudo, nós investigamos os efeitos da inibição seletiva e não seletiva de fosfodiesterases no desenvolvimento destas lesões. Tem sido demonstrado que os segundos mensageiros intracelulares (cAMP e cGMP) atuam como reguladores da migração, crescimento e diferenciação de uma variedade de células, tanto normais como malignas (Chen et al., 2002; Tsai et al., 1995;
Favot et al., 2003; Netherton and Maurice, 2005). Neste contexto, a formação de aderências é uma condição patológica que tem como componentes chaves, migração, proliferação e diferenciação celular (Cheong et al., 2001). A hipótese de que a inibição desses processos pode resultar em prevenção da formação de aderências foi testada usando inibidores de fosfodiesterases como o cilostazol (inibidor de PDE 3), pentoxifilina (inibidor PDE 1-5), rolipram (inibidor de PDE 4) e dipiridamol (inibidor de PDE 5). Embora estes compostos tenham sido primeiramente usados em outros propósitos farmacológicos, tais como tratamento da claudicação intermitente, doença vascular periférica oclusiva, arterosclerose e asma, outros efeitos tais como anti-agregante plaquetário, vasodilador, anti-angiogênico, anti-inflamatório e anti-fibrogênico têm sido reportados em uma variedade de células e tecidos (Chen et al., 1999;
Kambayashi, 2003; Netherton and Maurice 2005). No entanto, a avaliação das ações destes quatro compostos, cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol em componentes importantes (angiogênese, inflamação e fibrose) de aderências em um mesmo tecido ainda não havia sido realizada.
67 Os experimentos que avaliaram os efeitos desses compostos mostraram que a técnica de implantação induziu a formação de um estroma fibrovascular que diferiu importantemente do grupo controle quanto ao desenvolvimento da inflamação, angiogênese, produção de citocinas e deposição de matriz extracelular. Trabalhos prévios em nosso laboratório estabeleceram a cinética da angiogênese, inflamação e a produção de citocinas e quimiocinas em implantes de esponja subcutâneos e abdominais (Machado et al. 2000; Ferreira et al. 2004; Belo et al. 2004; Mendes et al. 2007). Além disso, neste modelo o desenvolvimento de sistemas de regulação de mediadores vasoativos e a reatividade farmacológica da neovasculatura em uma variedade de condições fisiológicas e patológicas já foram descritas (Andrade et al. 1992; Andrade et al.
1997; Machado et al. 2001).
O tecido fibrovascular ocupou os poros da matriz esponjosa preenchendo os implantes com células inflamatórias, vasos sanguíneos, fibroblastos e fibras colágenas. O tecido de granulação nos implantes do grupo controle era mais denso quando comparado a todos os grupos tratados. Isto refletiu no peso úmido dos implantes que foi mais leve também em todos os grupos tratados. Os resultados obtidos estão de acordo com o trabalho de outros autores, que utilizando outros modelos, mostraram uma diminuição no recrutamento celular após o tratamento com inibidores de fosfodiesterases
(Tsai et al. 1995; Préaux et al. 1997; Fang et al. 2003; Sim et al. 2004; Fugita et al. 2008)
A angiogênese está associada a várias condições patológicas como a formação de aderências peritoneais, crescimento de tumores e nas metástases, hemangiomas e processos inflamatórios crônicos (Folkman &
68 Brem, 1992; Chegini, 2002; Carmeliet, 2003). Em reações a corpos estranhos, bem como após a realização de implantes de materiais biomédicos, também se percebe a presença da neovascularização como passo importante do processo inflamatório (Witte & Barbul, 1997). Esses aspectos, aliados ao fato de a angiogênese desempenhar um papel crucial na formação de aderências, despertam uma crescente atenção endereçada ao desenvolvimento de novas estratégias e abordagens de estudo desse processo (Epstein et al. 2006).
Neste estudo, a avaliação da angiogênese inflamatória nos implantes abdominais foi realizada através da dosagem do conteúdo de Hb, da contagem do número de vasos neoformados e dos níveis de VEGF, importante fator angiogênico presente nos processos de neovascularização. Nossos resultados mostram que os tratamentos com cilostazol (inibidor de PDE 3), pentoxifilina
(inibidor de PDE 1 a 5) e dipiridamol (inibidor de PDE 5) tiveram sucesso em inibir a angiogênese, uma vez que o conteúdo de hemoglobina, os níveis de
VEGF e o número de vasos foram marcadamente diminuídos nesses grupos.
Interessantemente, o tratamento com pentoxifilina na dose mais alta
(500mg/kg) levou a uma considerável redução (80%) nos níveis de VEGF
(importante marcador angiogênico). Estes resultados estão de acordo com trabalhos já publicados em que os inibidores de fosfodiesterases exibem ações anti-VEGF que resultam em diminuição da vasculogênese em retina de rato neonatal (Hasebe et al., 2000), diminuição da angiogênese em membrana córion –alontóide (Favot et al., 2003) e inibição da proliferação de células endoteliais em angiogênese induzida por tumor em modelo intra-dermal (Gude et al., 2001). Porém, o tratamento com o rolipram (inibidor de PDE 4) não foi eficaz em diminuir a angiogênese nesse modelo. Embora seja amplamente
69 aceito que a expressão de PDE 4 esteja presente nas células endoteliais
(Hashimoto et al. 2006; Nishio et al., 1997), a falta de efeito anti-angiogênico do rolipram nesse modelo de implantes abdominal, pode indicar que os vasos neoformados nessa cavidade expressam outros tipos de fosfodiesterases não sensíveis à inibição de PDE 4.
O componente inflamatório foi avaliado pela medida da atividade das enzimas MPO e NAG e pelos níveis da citocina TNF-α. Os neutrófilos quando ativados por mediadores do processo inflamatório liberam fatores importantes que atuam como efetores da resposta neutrofílica. Um desses produtos secretados é a enzima mieloperoxidase (MPO) (Bradley et al. 1982; Burg et al.
2001). A especificidade da dosagem de MPO como técnica de quantificação indireta da população de neutrófilos tem sido utilizada em vários ensaios descritos na literatura (Bradley et al. 1982; Kuebler et al. 1996; Baldus et al.
2002). A enzima N-acetil-glicosaminidase (NAG), presente em grânulos lisossômicos de macrófagos é utilizada para avaliar indiretamente a população de macrófagos presentes em sítios inflamatórios (Bradley et al., 1982). O TNF-
α, importante citocina inflamatória, que atua recrutando células inflamatórias e fibroblastos para o tecido lesado é produzido e secretado principalmente por fagócitos mononucleares ativados, embora os linfócitos T, as células NK e os mastócitos também possam secretar tal citocina (Dunlop & Campbell, 2000).
Aqui, apenas o composto rolipram foi capaz de inibir o número de neutrófilos (atividade de MPO) e novamente somente o rolipram e a pentoxifilina nas doses mais altas (2 e 500 mg/kg, respectivamente) inibiram a atividade de NAG. Estes resultados sugerem que o recrutamento e ativação de células inflamatórias neste modelo de aderência não estão ligados às ações de
70 todas fosfodiesterases que foram utilizadas nesse trabalho. Dentre a família das fosfodiesterases, a PDE 4 é conhecida como a principal fosfodiesterase presente em células imunes e inflamatórias (Lagente et al. 2005). Tem sido mostrado que o rolipram, um inibidor seletivo da PDE 4, diminui o influxo de células inflamatórias em locais de injúria por diferentes estímulos (Lagente et al. 2005; Teixeira et al. 1997). Nossos resultados dos efeitos do cilostazol na atividade das enzimas inflamatórias são contraditórios aos resultados reportados por Ohba et al. (2006) que mostraram uma redução da atividade de
MPO em inflamação gástrica em ratos por este composto. Esta diferença pode ser atribuída à diferenças intrínsecas entre os modelos utilizados. No entanto, os níveis da potente citocina pró-inflamatória TNF-α foram diminuídos pelos quatro compostos, cilostazol e pentoxiflina novamente nas doses mais altas e rolipram e dipiridamol nas duas doses. Quanto a esses efeitos na produção de
TNF-α, nossos resultados são consistentes com a literatura, que mostra que estes quatro compostos inibem os níveis desta citocina (Omi H., 2004; Ohba et al., 2006; Teixeira et al., 1997; Souza et al., 2001; Poturoglu et al., 2009).
O componente fibrogênico induzido pelo implante abdominal foi avaliado através da produção de TGF-β1 e do conteúdo de colágeno. As citocinas e os fatores de crescimento liberados pelas células mesoteliais (Lee et al. 2002;
Haslinger et al. 2001) e inflamatórias ativam e atraem fibroblastos. Estes fibroblastos migram, proliferam e depositam colágeno, participando da formação do novo tecido fibrótico que tem grande importância na formação das aderências (Grinnell, 1994; Desmoulière et al. 1997). Além disso, tem sido mostrado que as células mesoteliais estimulam a proliferação e quimiotaxia de fibroblastos na cavidade abdominal (Nagy et al. 1995).
71 A produção de TGF-β1 e do conteúdo de colágeno foram significativamente diminuído pelo tratamento com os quatro diferentes inibidores de fosfodiesterases, cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol.
Em todos os grupos tratados foi verificado claramente uma diminuição, de aproximandamente 80 %, dos níveis de TGF-β1 intra-implante quando usadas as maiores doses dos compostos estudados cilostazol 400mg/Kg, pentoxifilina
500mg/Kg, dipiridamol 100mg/Kg e rolipram 2mg/Kg. O conteúdo de colágeno, avaliado pelo método colorimétrico do picrossirius red , também apresentou significativa redução, próximo a 80%, em todos os grupos tratados, cilostazol
(40 e 400 mg/Kg), pentoxifilina (50 e 500 mg/Kg), rolipram (0,2 e 2 mg/Kg) e dipiridamol (10 e 100 mg/Kg). Nossos resultados são consistentes com os efeitos antifibrogênicos destes compostos testados em outros modelos e tipos celulares. Como o rolipram que mostrou efeitos antifibrogênicos em vários outros modelos experimentais in vivo e in vitro (Ross et al. 1997; Videla et al.
2006; Lagente et al. 2005). Já foi mostrado, por exemplo, que a pentoxifilina inibe proliferação e síntese de colágeno em fibroblastos dérmicos, células mesangiais e miofibroblastos hepáticos (Berman et al., 1998; Tsai et al., 1995;
Préaux et al., 1997). Similarmente, a espessura da parede vascular e a fibrose perivascular na dura-máter foram significativamente atenuadas pelo tratamento com cilostazol (Fujita et al., 2008). Estudos com o dipiridamol mostraram inibição da proliferação de células mesoteliais humanas in vitro e atenuação de fibrose peritoneal em ratos (Kuan-Yu et al. 2001) e também redução da formação de aderências peritoneais (Rodgers et al. 1998).
Na análise histológica, foi verificado que todos os compostos diminuíram o tecido fibrovascular que infiltra o implante. Estes resultados corroboram
72 aqueles das dosagens bioquímicas e são ainda confirmados pelos valores dos pesos dos implantes, que foram diminuídos por todos os tratamentos. Estes dados nos mostram que todos os quatro compostos são capazes de atenuar a formação de aderências.
Este trabalho demonstra que o cilostazol, a pentoxifilina, o rolipram e o dipiridamol diminuem os principais componentes da formação de aderências
(neovascularização, inflamação e fibrose) induzidas por implante de esponja em camundongos. Estes achados confirmam e estendem os efeitos benéficos dos inibidores de fosfodiesterases na modulação do crescimento de tecido fibrovascular em uma variedade de condições patológicas por inibir a produção de citocinas pró-angiogênicas, inflamatórias e fibrogênicas. Embora nós não tenhamos mostrado evidências diretas da elevação nos níveis de cAMP/cGMP produzida pelos compostos com a atenuação na formação de aderências em nosso estudo, nossos experimentos sugerem evidências dessa associação, pelo menos em parte. Aumento nos níveis de cAMP/cGMP modulam agregação plaquetária (Sim et al. 2004), inibe VEGF e bFGF (D'Angelo et al.
1997), suprime hipóxia induzida por expressão de VEGF (Amirkhosravi et al.
1998), diminui a permeabilidade vascular à proteínas, e inibe a adesão celular de monócitos ao endotélio vascular (Yang et al. 2006). Todos estes eventos estão envolvidos na formação de aderências (Chiang et al. 2000).
Nossos resultados indicam que o bloqueio das atividades das fosfodiesterases através de inibidores seletivos ou não, resulta em inibição de componentes chaves deste modelo de aderências e possibilitam especular que, pelo menos em parte, as fosfodiesterases estão envolvidas em processos patológicos angiogênese-dependentes.
73 6 - CONCLUSÕES
A implantação de matriz esponjosa na cavidade abdominal revelou ser um modelo experimental útil para investigação dos eventos e mecanismos associados à formação de aderências peritoneais.
Os compostos, cilostazol, pentoxifilina, rolipram e dipiridamol que apresentam efeitos inibidores sobre as fosfodiesterases foram eficazes em reduzir de modo geral os componentes angiogênico, inflamatório e fibrogênico das aderências intraperitoneais.
O rolipram foi o único inibidor que não interferiu nos parâmetros angiogênicos avaliados (conteúdo de Hb, número de vasos e níveis intraimplante de VEGF), mas foi o principal inibidor da resposta inflamatória.
Os demais compostos cilostazol, pentoxifilina e dipiridamol foram menos eficazes em alterar o componente inflamatório mas potentes inibidores da angiogênese.
Embora estes compostos tenham sido formulados para o uso em vários processos patológicos, nosso trabalho amplia seus efeitos benéficos como anti- angiogênico, anti-inflamatório e anti- fibrogênico neste modelo de aderências.
74 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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93 8 – ANEXOS
8.1 – Artigos Publicados
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