ETUDE CHIMIQUE, ACTIVITES ANTIPLASMODIALE ET ANTIOXYDANTE DE Mussaenda Erectiloba Wernham (Rubiacées)

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES Mention CHIMIE

Mémoire d’étude pour l’obtention du

DIPLOME DE MASTER II EN CHIMIE

Parcours : CHIMIE DES SUBSTANCES NATURELLES

ETUDE CHIMIQUE, ACTIVITES ANTIPLASMODIALE ET ANTIOXYDANTE DE Mussaenda erectiloba Wernham (Rubiacées)

Présenté par : FELANARISOA Sandra

Le 20 Décembre 2017

Président du Jury : Madame Bakolinirina ANDRIAMIHAJA Professeur Titulaire Rapporteurs : Monsieur Andrianambinina A. RAZAKARIVONY Maître de Conférences Madame Vahinalahaja E. RAZAFINTSALAMA Maître de Recherches Examinateurs : Monsieur David RAMANITRAHASIMBOLA Professeur Madame Lovasoa RABESIAKA Maître de Conférences

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES Mention CHIMIE

Mémoire d’étude pour l’obtention du

DIPLOME DE MASTER II EN CHIMIE

Parcours : CHIMIE DES SUBSTANCES NATURELLES

ETUDE CHIMIQUE, ACTIVITES ANTIPLASMODIALE ET ANTIOXYDANTE DE Mussaenda erectiloba Wernham (Rubiacées)

Présenté par : FELANARISOA Sandra

Le 20 Décembre 2017

Remerciements

Ce travail a été réalisé suivant la collaboration du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) et le Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP).

Tout d’abord, nous souhaitons adresser nos plus vifs remerciements pour les membres du Jury :

− Madame Bakolinirina ANDRIAMIHAJA Professeur Titulaire à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, rattachée au Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN)

Vous nous faîtes honneur d’avoir accepté de présider ce Jury malgré vos multiples occupations. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’enseignement et la formation que vous nous avez dispensés, pour l’accueil chaleureux, pour la confiance et les soutiens que vous nous avez accordés dans votre laboratoire, pour les conseils, les remarques constructives, les encouragements et la bienveillance dont vous nous avez accompagné tout au long de ce travail.

− Monsieur Andrianambinina A. RAZAKARIVONY Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo Directeur du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN)

Vous avez accepté d’être le Rapporteur de ce mémoire. Nous avons eu le privilège de travailler parmi votre équipe. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’accueil chaleureux dans votre laboratoire, pour les savoir-faire et expériences que vous nous avez partagés, pour votre exigence qui a grandement stimulé nos réflexions, pour vos encouragements et pour votre bienveillance qui nous a permis de travailler dans les meilleures conditions ainsi qu’à votre grande disponibilité malgré vos multiples occupations.

− Madame Vahinalahaja E. RAZAFINTSALAMA Maître de Recherches à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo Responsable du Département Pharmacodynamie au Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques

Vous avez accepté d’être le Rapporteur de ce mémoire. Vous nous avez réservé un meilleur accueil malgré vos obligations professionnelles et guidé à chaque étape des études biologiques. Votre participation à l’élaboration de ce mémoire nous a été essentielle. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour nous avoir initiés aux tests biologiques, pour les compétences et conseils vivement qualitatifs que vous nous avez partagés et pour votre bienveillance qui nous a permis d’arriver au terme de ce travail.

− Madame Lovasoa RABESIAKA Maître de Conférences à la Facultés des Sciences de l’Université d’Antananarivo Responsable du Parcours Chimie des Substances Naturelles

Vous avez accepté d’être l’Examinateur de ce mémoire. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’enseignement et la formation en Chimie que vous nous avez donnés, pour le temps que vous avez consacré sur ce travail pour le rendre meilleur, vos remarques et vos conseils nous ont été précieux.

− Monsieur David RAMANITRAHASIMBOLA Professeur à la Faculté de Médecine de l’Université d’Antananarivo Responsable au Laboratoire de Pharmacologie de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA)

Vous avez accepté avec bienveillance d’être l’Examinateur de ce mémoire. Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’enseignement de Pharmacodynamie que vous nous avez donnée en Chimie des Substances Naturelles, pour l’intérêt porté sur ce travail, pour les conseils et les critiques constructives dans le but d’améliorer ce travail. Votre participation à ce travail nous a été précieuse.

Notre profonde gratitude et sincère reconnaissance vont aussi à

− Madame Reine-Dorothée RAZAFIMAHEFA-RAMILISON

Professeur à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antanananrivo, rattachée au Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN)

Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’enseignement que vous nous avez dispensés en Chimie, pour l’accueil chaleureux et la confiance dont vous nous avez accordés dans votre laboratoire, pour vos soutiens et votre bienveillance dans la réalisation de ce travail.

− Docteur Michel RATSIMBASON Directeur du Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques (CNARP). Nous tenons à vous exprimer notre profonde gratitude et notre sincère reconnaissance pour l’aimable accueil et la collaboration dont vous nous avez accordés. Ce qui nous a permis de réaliser les tests biologiques au Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques et d’arriver au terme de ce mémoire. − Une pensé particulière est pour Professeur Bakonirina RAZANAMAHEFA Ancienne Directeur du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN)

Elle nous accueillie dans son laboratoire et nous a accordée ses soutiens. Elle nous a quittés bien trop tôt mais elle nous a énormément apprise durant ces quelques années en la côtoyant avec sa gentillesse qui nous a beaucoup marquée.

Nous adressons notre sincère et respectueuse reconnaissance

− A Monsieur le Doyen de la Faculté des Sciences qui nous a permis d’arriver au terme de ce jour. − A Monsieur Dimby RALAMBOMANANA, Maître de Conférences, Responsable de la Mention Chimie et Directeur du Laboratoire de Chimie Organique « Produits Naturels » et Biotechnologie (LPNB), pour sa collaboration qui nous a permis d’arriver en ce jour. − A tous les professeurs qui ont participé à nos enseignements et formations durant ces années d’étude universitaire. − A la Comité de lecture pour l’intérêt porté et le temps consacré sur ce travail.

Nos sincères remerciements vont aussi :

− A Monsieur Rivoarison RANDRIANASOLO, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences, Responsable du Parcours Chimie Biologie, Membre du Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et Chimie Organique Biologique (LCSN/COB), pour la récolte sur terrain − A Docteur Franck RAKOTONASOLO, botaniste au Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza, pour l’identification de la plante. − A Docteur Sylvie ANDRIAMBOLOLONERA, Coordinatrice de l’Unité Recherche au sein du Programme Madagascar du Missouri Botanical Garden, pour avoir acceptée avec

amabilité de collaborer pour l’étude botanique de la plante malgré ses multiples occupations. − A Monsieur Jesuka R. RASOLOFOMANANA, Membre du Département Pharmacodynamie au Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques, pour les tests antipaludiques, les conseils et aides précieux qu’il m’a accordée. − A Madame Rojoniaina A. RAKOTOARISON et notre collègue de paillasse Njara pour nous avoir aidés dans les tests antioxydants. − A Monsieur Maonja F. RAKOTONDRAMANGA, Maître de Conférences, pour le transport des produits à l’étranger qui a permis d’obtenir les spectres RMN et pour le moteur de recherche qu’il nous a partagé. − A Monsieur Faly RANDRIAMIALINORO, Maître de Recherches au Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques, pour les aides qu’il nous a apportés. − A Monsieur Ralinandrianina RANDRIAMIARAMISAINA, Enseignant-chercheur et membre de l’équipe LaCASN pour ses aides pratiques en laboratoire. − A Monsieur Hariliva RAMIARISON, Enseignant-chercheur et membre de l’équipe LaCASN pour les moteurs de recherches. − A Madame N. J. Patricia RAMANANTSOA, membre de l’équipe LaCASN pour ses aides dans la réalisation des diapositives. − A tous les membres de l’équipe du laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) pour leurs interventions afin de rendre ce travail meilleur, pour l’ambiance et la convivialité. − A tous les membres du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques pour l’aimable accueil, l’ambiance et la convivialité. − A mes collègues de promotions pour leurs aides. Je souhaite remercier mes parents pour la confiance qu’ils m’ont accordée et les soutiens qu’ils m’ont donnés tout au long de mes études. Un grand merci à Ravo, Dina, Herizo et Telina qui par leurs présences m’ont donnée de grande motivation. Je n’oublie pas mes deux grand-mères qui n’ont cessé de m’encourager, merci. Je remercie aussi Ranto pour ses encouragements sans relâches et son soutien. A ma famille, mes amis et tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail, merci.

Table des matières

Liste des tableaux ...... i

Liste des figures...... ii

Liste des schémas ...... iii

Liste des abréviations et sigles ...... iv

INTRODUCTION ...... 1

PREMIERE PARTIE : GENERALITES ...... 1

CHAPITRE I : PALUDISME ...... 2

I.1. Définition ...... 2

I.2. Cycle évolutif du Plasmodium ...... 2

I.2.1. Chez l’Homme : multiplication asexuée ...... 3

I.2.2. Chez l’Anopheles : multiplication sexuée ...... 3

I.3. Manifestation du paludisme chez l’homme ...... 3

I.4. Plasmodium falciparum...... 3

I.5. Antipaludiques ...... 4

I.5.1. Quinine ...... 4

I.5.2. Chloroquine ...... 5

I.5.3. Artémisinine ...... 5

CHAPITRE II : ANTIOXYDANTS ...... 6

II.1. Définition ...... 6

II.2. Radicaux libres ...... 6

II.3. Stress oxydatif ...... 6

II.4. Rôle et sources des antioxydants ...... 6

II.5. α-Tocophérol ...... 6

CHAPITRE III : PLANTE Mussaenda erectiloba Wernham ...... 8

III.1. Classification botanique ...... 8

III.2. Famille Rubiacées ...... 8

III.3. Genre Mussaenda ...... 8

III.4. Espèce : Mussaenda erectiloba Wernham ...... 11

III.4.1. Description botanique de l’espèce ...... 11

III.4.2. Distribution dans le monde ...... 12

III.4.3. Ecologie ...... 13

III.4.4. Utilisations et noms vernaculaires ...... 13

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES ...... 2

CHAPITRE I : ETUDE CHIMIQUE DE Mussaenda erectiloba ...... 14

I.1. Matériel végétal ...... 14

I.2. Collecte et préparation du matériel végétal ...... 14

I.3. Criblage phytochimique ...... 14

I.4. Méthodes d’extraction ...... 16

I.4.1. Macération ...... 16

I.4.2. Extraction par partage liquide-liquide ...... 16

I.5. Fractionnement et isolement ...... 18

I.5.1. Chromatographie sur couche mince ...... 18

I.5.2. Chromatographie sur colonne ouverte ...... 19

I.5.3. Fractionnement et isolement des constituants chimiques de l’extrait acétate d’éthyle . 20

I.6. Résonance Magnétique Nucléaire ...... 20

I.6. 1. Spectre RMN du proton monodimensionnelle « classique »...... 20

I.6. 2. Spectre RMN du carbone « Broadband decoupling » ...... 21

I.6. 3. Spectre DEPT 135 (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) ...... 21

I.6. 4. Spectre COSY (COrrelation SpectroscopY) ...... 21

I.6. 5. Spectre HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) ...... 21

I.6. 6. Spectre HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)...... 22

CHAPITRE II : ETUDE BIOLOGIQUE DE Mussaenda erectiloba ...... 23

II.1. Etude de l’activité antiplasmodiale in vitro de Mussaenda erectiloba ...... 23

II.2. Etude de l’activité antioxydante de Mussaenda erectiloba ...... 24

II.2.1. Méthode qualitative : Méthode bioautographie ...... 24

II.2.2. Méthode quantitative : Méthode de DPPH par dosage mesuré au spectrophotomètre UV/visible ...... 25

TROISIEME PARTIE : RESULTATS –DISCUSSIONS ...... 14

CHAPITRE I : ETUDE CHIMIQUE ...... 27

I.1. Criblage phytochimique ...... 27

I.2. Rendements des extractions ...... 28

I.2.1. Rendement de l’extraction par macération ...... 28

I.2.2. Rendements des extractions par partage liquide-liquide ...... 28

I.3. Fractionnement de l’extrait AcOEt ...... 28

I.4. Isolement des molécules contenues dans les fractions F1 et F2 actives selon le test antioxydant ...... 29

I.5. Identification de D6 ...... 31

1 I.5.1. Analyse du spectre RMN H-1D « classique » du composé D6 ...... 32

I.5.2. Analyse du spectre RMN 13C « Broadband decoupling » et du spectre DEPT du composé D6 ...... 34

I.5.3. Analyse du spectre HSQC du composé D6 ...... 36

I.5.4. Analyse du spectre HMBC du composé D6 ...... 38

I.5.5. Analyse du spectre COSY du composé D6 ...... 41

CHAPITRE II: DISCUSSION DE L’ETUDE CHIMIQUE ...... 45

CHAPITRE III : ETUDE BIOLOGIQUE ...... 46

III.1. Tests antipaludiques sur les extraits de Mussaenda erectiloba ...... 46

III.2. Analyse qualitative de l’activité antioxydante des extraits et des fractions de Mussaenda erectiloba ...... 46

III.2.1. Analyse qualitative des extraits ...... 47

III.2.2. Analyse qualitative des fractions de l’extrait acétate d’éthyle ...... 47

III.3. Analyse quantitative de l’activité antioxydante de l’extrait AcOEt et des fractions F1 et F2 ...... 48

CHAPITRE IV : DISCUSSION DE L’ETUDE BIOLOGIQUE ...... 50

CONCLUSION ...... 51

Références ...... 53

Webographie ...... 57

Annexe I : Criblage phytochimique ...... a

Annexe II : Préparation des réactifs ...... b

Annexe III : Préparation des étalons de l’α-tocophérol ...... c

Liste des tableaux

Tableau 1 : Activités et produits isolés dans le genre Mussaenda ...... 10

Tableau 2 : Récapitulatif du criblage phytochimique ...... 15

Tableau 3 : Résultats du criblage phytochimique ...... 27

Tableau 4 : Rendement de l´extraction ...... 28

Tableau 5 : Rendement du partage liquide-liquide de l´extrait brut de Mussaenda erectiloba ...... 28

Tableau 6 : Interprétation du chromatogramme de F1 ...... 30

Tableau 7 : Caractéristiques du produit D6 ...... 31

Tableau 8 : Types de carbone selon les valeurs de  ...... 35

Tableau 9 : Types de sites 13C ...... 36

Tableau 10 : Corrélation homonucléaire vue sur le spectre COSY ...... 42

Tableau 11 : Comparaison des valeurs de déplacements chimiques de D6 avec ceux de la littérature . 43

Tableau 12 : Activité antiplasmodiale des extraits de Mussaenda erectiloba ...... 46

Tableau 13 : Codage des extraits ...... 46

Tableau 14 : Activité antioxydante de l’extrait AcOEt et les fractions F1 et F2 en équivalent α- tocophérol ...... 49

Liste des figures

Figure 1 : Cycle évolutif du Plasmodium ...... 2

Figure 2 : Distribution mondiale de l'espèce Plasmodium falciparum ...... 4

Figure 3 : Quinine...... 4

Figure 4 : Chloroquine ...... 5

Figure 5 : Artémisinine ...... 5

Figure 6 : α-Tocophérol ...... 7

Figure 7 : Mussaenda erectiloba ...... 8

Figure 8 : Mussaenda erectiloba ou Bremeria erectiloba ...... 11

Figure 9 : Distribution de Mussaenda erectiloba dans le monde ...... 12

Figure 10 : Macération ...... 16

Figure 11 : Partage ...... 16

Figure 12 : Colonne chromatographique ...... 19

Figure 13 : Test antiplasmodial des extraits ...... 23

Figure 14 : Chromatogramme de la fraction F1 ...... 30

Figure 15 : Chromatogramme du produit D6 ...... 31

1 Figure 16 : Spectre RMN H-1D du composé D6 ...... 32

Figure 17 : Spectre RMN 13C « Broadband decoupling » (en haut) et spectre DEPT 135 (en bas) du composé D6 ...... 34

Figure 18 : Spectre HSQC du composé D6 ...... 36

Figure 19 : Spectre HMBC du composé D6 ...... 38

Figure 20 : Spectre COSY du composé D6 ...... 41

Figure 21 : CCM de l’activité antioxydante des extraits ...... 47

Figure 22 : CCM de l’activité antioxydante des fractions de l’extrait AcOEt ...... 47

Figure 23 : Courbe standard du 1er étalon de l’ α- tocophérol (150 µM – 600 µM) ...... 48

Figure 24 : Courbe standard du 2ème étalon de l’ α- tocophérol (6,25µM – 100 µM) ...... 49

Liste des schémas

Schéma 1 : Modification du genre Mussaenda en Bremeria...... 9

Schéma 2 : Protocole d’extraction et partage liquide-liquide ...... 17

Schéma 3 : Fractionnement de l’extrait AcOEt ...... 29

Schéma 4 : Isolement de produits dans F1 ...... 29

Schéma 5 : Isolement de produit dans F2 ...... 30

Schéma 6 : Iridane ou cyclopenta[c]pyrane ...... 33

Schéma 7 : Corrélation 1H-13C en HMBC conduisant à un noyau pyrane ...... 39

1 13 Schéma 8 : Corrélation H- C en HMBC du proton H5,53 ...... 39

Schéma 9 : Corrélation 1H-13C en HMBC conduisant à un pyranone ...... 40

Schéma 10 : Squelette de base d’un sécoiridoïde ...... 40

Schéma 11 : Corrélation 1H-13C en HMBC au niveau du glucose ...... 41

1 1 Schéma 12 : Corrélation H- H en COSY du composé D6 ...... 42

Schéma 13 : Vogeloside ...... 44

Schéma 14 : Numérotation systématique de vogeloside ...... 44

iii

Liste des abréviations et sigles

Abs : Absorbance

AcOEt : Acétate d’éthyle

ADN : Acide Désoxyribo-Nucléique

CCM : Chromatograhie sur Couche Mince

CI50 : Concentration minimale inhibitrice de 50 pourcents

CNARP : Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques

COSY : COrrelation SectroscopY

DCM : Dichlorométhane

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPPH : 2,2-dihényl-1-picryl-hydrazyle

EtOH : Ethanol

FeCl3 : Chlorure ferrique

Hz : Hertz

HCl : Acide chlorhydrique

Hex : Hexane

HMBC : Heteronuclear Multile Bond Correlation

HSQC : Heteronulear Single Quantum Correlation

H2SO4 : Acide acétique

J : Constante de couplage

LaCASN : Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles

M : Concentration molaire

MeOD : Méthanol deutéré

MeOH : Méthanol

Mg : Magnésium

MHz : Mégahertz

mM : Millimolaire

NaCl : Chlorure de sodium

NH4OH : Hydroxyde d’ammonium nm : Nanomètre ppm : Partie par million

Rf : Rapport frontal

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

UV : Ultraviolette

13C : Carbone 13

1H : Proton

1D : A une dimension

2D : A deux dimensions

µM : Micromolaire

 : Déplacement chimique

INTRODUCTION

Le paludisme et le stress oxydatif constituent des problèmes importants pour la santé publique. D’une part, le paludisme est une maladie grave potentiellement mortelle en absence d’une prise en charge rapide et appropriée [1]. En 2015, l’Organisation Mondiale de la Santé a enregistrée environ 212 millions de cas et 429 000 décès dus au paludisme dans le monde [W1]. D’autre part, le stress oxydatif est impliqué dans le vieillissement et dans le déclenchement et la progression de plusieurs maladies telles que l’athérosclérose et le cancer. En effet, le stress oxydatif est défini par le déséquilibre entre la génération des espèces oxygénées réactives et la capacité du corps à les neutraliser et à réparer les dommages oxydatifs [2].

A Madagascar, la médecine traditionnelle occupe une place importante dans la résolution des problèmes sanitaires vus que les médicaments de synthèse ne sont pas toujours accessibles par tous les ménages.

Dans le cadre de valorisation des plantes médicinales malgaches, les travaux de recherches sur Mussaenda erectiloba sont entrepris. Cette plante est utilisée traditionnellement pour traiter le paludisme. Mussaenda erectiloba Wernham est une Rubiacée endémique de Madagascar. Elle est aussi connue sous le nom de Bremeria erectiloba Razafimandimbison & Alejandro [W2]. La réputation de la famille Rubiacée comme source de molécules antipaludiques [3] et la forte potentialité thérapeutique des espèces du genre Mussaenda déjà étudiées [4] constituent les raisons du choix de Mussaenda erectiloba pour cette étude. Cette étude a alors pour but de corroborer l’utilisation traditionnelle et de fournir des informations sur les propriétés antioxydantes de cette espèce à travers ses constituants chimiques.

Le présent travail comprend trois grandes parties : la première concerne les généralités sur le paludisme, les antioxydants et la plante à étudier. La deuxième partie fournit des renseignements sur les matériels et méthodes chimiques et biologiques utilisés. La troisième partie présente les résultats obtenus et les discussions. Elles seront suivies par une conclusion avec présentation de perspectives.

PREMIERE PARTIE : GENERALITES

CHAPITRE I : PALUDISME

I.1. Définition

Du latin palu qui signifie marais, le paludisme est aussi appelé malaria, tiré du latin mal aria qui signifie mauvais air, ou fièvre des marais [5].

Le paludisme est une maladie parasitaire causée par un hématozoaire de la famille des Plasmodideae, du genre Plasmodium. Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale et Plasmodium knowlesi sont des espèces qui peuvent affecter l’homme. L’anophèle femelle qui est le vecteur responsable de la transmission de cette maladie est un moustique du genre Anopheles. Il peut aussi se transmettre par du sang infecté lors d’une transfusion sanguine [6].

I.2. Cycle évolutif du Plasmodium

Le cycle de développement, illustré dans la figure 1, du Plasmodium se déroule dans deux hôtes : l’Homme et le moustique Anopheles [6].

Figure 1 : Cycle évolutif du Plasmodium

I.2.1. Chez l’Homme : multiplication asexuée

Elle comprend deux phases : la phase hépatique ou exo-érythrocytaire et la phase sanguine ou érythrocytaire.

La phase exo-érythrocytaire est une phase asymptomatique. Lors du repas sanguin, le moustique infecté injecte des sporozoïtes avec sa salive à l’Homme. Les sporozoïtes envahissent les cellules hépatiques où ils vont se multiplier pour former des schizontes hépatiques qui, à leur maturité, provoquent l’éclatement des cellules hépatiques libérant des mérozoïtes dans le sang [6].

Lors de la phase érythrocytaire, les mérozoïtes envahissent les globules rouges, se transforment en trophozoïtes qui se différentient en schizontes pour ensuite libérer des mérozoïtes après la lyse des hématies. L’éclatement des hématies est l’origine des poussées de fièvres. Les mérozoïtes libérés sont des initiateurs de nouveaux cycles érythrocytaires. Au bout de plusieurs cycles, en présence de conditions favorables, certains parasites se transforment en gamétocytes males ou microgamétocytes et gamétocytes femelles ou macrogamétocytes [6].

I.2.2. Chez l’Anopheles : multiplication sexuée

Lors du repas sanguin, le moustique ingère les gamétocytes qui après fécondation donnent un zygote ou ookinète. L’ookinète se développe en oocyste qui libère des sporozoïtes à sa maturation. Les sporozoïtes migrent dans les glandes salivaires du moustique pour infecter l’Homme par une nouvelle piqûre perpétuant le cycle parasitaire [6].

I.3. Manifestation du paludisme chez l’homme

Le paludisme se manifeste par une fièvre à laquelle des nausées voire des vomissements et diarrhées peuvent être associés. Il peut évoluer en alternant frissons, chaleurs et transpirations. Lorsque la maladie se complique, elle peut conduire à l’anémie et au neuropaludisme qui est caractéristique du Plasmodium falciparum [5].

I.4. Plasmodium falciparum

Plasmodium falciparum est l’espèce responsable du paludisme grave en neuropaludisme qui peut entrainer la mort. En effet, les hématies parasitées s’adhèrent à l’endothélium des capillaires cérébraux et les obstruent [5].

Elle est présente dans les zones tropicales et subtropicales surtout en Afrique, y compris Madagascar, comme le montre la figure 2, et présente une résistance aux traitements classiques [6].

Figure 2 : Distribution mondiale de l'espèce Plasmodium falciparum

I.5. Antipaludiques

Un antipaludique est un produit naturel ou un produit de synthèse qui sert à bloquer la croissance du parasite ou le détruire.

I.5.1. Quinine

La quinine, connue sous le nom de (5-éthényl-1-azabicyclo[2.2.2]oct-2-yl)-(6- méthoxyquinolin-4-yl)-méthanol, qui est présentée par la figure 3 est l’alcaloïde principal isolé de l’écorce de quinquina, genre Cinchona de la famille des Rubiacées. Elle est efficace pour traiter les fièvres sans complication du paludisme [7].

Figure 3 : Quinine

I.5.2. Chloroquine

La chloroquine, connue sous le nom de 4N-(7-chloroquinolin-4-yl)-1N,1N- diéthylpentane-1,4-diamine, qui est présentée par la figure 4 est une 4-aminoquinoléine, antipaludique qui agit sur les formes sanguines du parasite surtout au stade de schizonte. Elle est utilisée pour le traitement du paludisme non compliqué. Cependant, l’apparition d’une résistance du Plasmodium falciparum à la chloroquine s’intensifie surtout en Afrique [7].

Figure 4 : Chloroquine

I.5.3. Artémisinine

L’artémisinine, connue sous le nom de 3,6,9-triméthyloctahydro-3,12- époxy[1,2]dioxépino[4,3-i]isochromén-10(3H)-one, est une lactone sesquiterpénique, présentée par la figure 5, isolée principalement de l’Artemisia annua L. Elle est efficace contre les parasites résistantes aux autres antipaludiques en usage. C’est un schizonticide sanguin puissant [7].

Figure 5 : Artémisinine

CHAPITRE II : ANTIOXYDANTS

II.1. Définition

Un antioxydant est défini comme toute substance qui lorsque à faible concentration comparée à celle d’un substrat oxydable retarde de manière significative ou prévient l’oxydation de ce substrat [8].

Une insuffisance en antioxydant dans l’organisme est un facteur d’apparition de pathologies dont les radicaux libres sont les précurseurs.

II.2. Radicaux libres

Les radicaux libres sont des espèces chimiques possédant un ou plusieurs électrons célibataires qui leurs confèrent une grande réactivité due à leur instabilité et peuvent entraîner des dommages oxydatifs aux lipides, protéines et ADN lorsqu’ils sont à des concentrations élevées dans l’organisme [9].

II.3. Stress oxydatif

La pollution, la consommation de tabac et d’alcool, l’obésité, l’exercice physique intense ainsi qu’une mauvaise alimentation peuvent entraîner une surproduction de radicaux libres ou espèces réactives de l’oxygène dans l’organisme. Ce déséquilibre entre prooxydant et antioxydant dans l’organisme, en faveur des radicaux libres, est appelé stress oxydatif qui est à l’origine de maladies comme le cancer, les maladies cardio-vasculaires et inflammatoires [10].

II.4. Rôle et sources des antioxydants

En principe, les rôles des antioxydants sont de prévenir la formation des radicaux libres ou de les neutraliser [10]. Les plantes sont des sources d’antioxydants que l’on peut acquérir par l’alimentation. En effet les fruits et légumes sont riches en antioxydants naturels [11].

II.5. α-Tocophérol

α-Tocophérol (Figure 6) aussi connu par le terme vitamine E est un antioxydant naturel que l’on trouve généralement dans les huiles végétales et les céréales [12].

Figure 6 : α-Tocophérol

Il est constitué d’un noyau chromanol et d’une chaîne latérale saturée à 16 atomes de carbones, de nom scientifique 2,5,7,8-tetramethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)chroman-6-ol

α-Tocophérol est un antioxydant hydrophobe inhibiteur de la propagation de la peroxydation lipidique. Il protège les membranes riches en acide gras polyinsaturés en piégeant le radical peroxyle ROO• selon la réaction:

TOH + ROO• → TO• + ROOH

CHAPITRE III : PLANTE Mussaenda erectiloba Wernham

III.1. Classification botanique

Mussaenda erectiloba, montré par la figure 7, fait partie des Rubiacées de Madagascar [W3].

Règne : Plantae

Division : Magnoliophyta

Classe : Magnoliopsida

Ordre : Gentianales

Famille : Rubiacées

Sous-famille : Ixoroïdeae

Tribu : Mussaendae Figure 7 : Mussaenda erectiloba Genre : :Mussaenda

Espèce : Mussaenda erectiloba

Synonyme : Bremeria erectiloba

Nom vernaculaire : Fatora

III.2. Famille Rubiacées

Les Rubiacées comptent environ 637 genres, 13 000 espèces et sont abondantes dans les zones tropicales [3]. Ce sont des arbres, des buissons, des lianes ou des plantes herbacées [W4]. La famille des Rubiacées est généralement répartie an trois sous-familles : Rubioideae, Cinchonoideae and Ixoroideae qui sont divisées en 43 tribus [3]. Les genres Coffea, Cinchona et Psychotria appartiennent aux tribus Coffeeae, Cinchoneae et Psychotrieae sont de cette famille [3] [13].

III.3. Genre Mussaenda

Le genre Mussaenda appartient à la tribu Mussaendae des Ixoroïdeae [3]. D’après de récentes études, la dénomination Bremeria est attribuée aux espèces du genre Mussaenda qui se trouvent dans les îles de l’Océan Indien comprenant Madagascar et les îles Mascareignes. On compte 28 espèces appartenant au Bremeria [14]. Parmi ces espèces, 18 d’entre elles sont endémiques de Madagascar y compris Bremeria erectiloba [15].

Le schéma 1 présente le changement de nomenclature dans le genre Mussaenda en Bremeria [14].

Schéma 1 : Modification du genre Mussaenda en Bremeria

Etudes antérieures sur le genre Le genre Mussaenda est un genre riche en produits naturels ayant de nombreuses propriétés pharmacologiques notamment d’iridoïdes, de flavonoïdes et triterpènes. Des études antérieures ont montré que la plupart de ses espèces sont constituées principalement de flavonoïdes, hétérosides, terpénoïdes et saponines [16].

Le tableau 1 regroupe des études ayant été faites sur quelques espèces et montre des exemples de leurs activités biologiques et molécules qui ont été isolées.

Tableau 1 : Activités et produits isolés dans le genre Mussaenda

Espèces Activités Produits isolés pharmacologiques Mussaenda Antioxydante kaempférol-3-O-β-D-rutinoside arcuata [16]

Mussaenda Traitement de 3-palmitoyllupéol incana [16] l’ulcère [17]

mussaenoside ou 1-(-D-glucopyranosyloxy)-7-hydroxy- 7-méthyl-1,4a,5,6,7,7a-hexahydrocyclopentacpyran-4- carboxylate de méthyle

Mussaenda Antioxydante 1-(-D-glucopyranosyloxy)-5,7-dihydroxy-7-méthyl- hainanensis 1,4a,5,6,7,7a-hexahydrocyclopentacpyran-4-carboxylate [16] de méthyle

Mussaenda Antioxydante 4-((1E)-3-hydroxypropényl)-2-méthoxyphénol frondosa [16] [18]

Espèces Activités Produits isolés pharmacologiques Mussaenda Antibactérienne 5,7,4’-trihydroxy-3’-méthoxyflavone philippica Protection du foie [16] [19]

6-méthoxymussaenoside ou 1-(-D-glucopyranosyloxy)-7- hydroxy-5-méthoxy-7-méthyl-1,4a,5,6,7,7a-hexahydro cyclopentacpyran-4-carboxylate de méthyle

III.4. Espèce : Mussaenda erectiloba Wernham

Bremeria erectiloba Razafimandimbison & Alejandro est le synonyme de Mussaenda erectiloba Wernham. Elle est présentée par la figure 8.

Figure 8 : Mussaenda erectiloba ou Bremeria erectiloba

III.4.1. Description botanique de l’espèce

Bremeria erectiloba est un arbuste à arbre de 5-10 m de haut, assez ramifié, à branches sarmenteuses (non érigées), tige à écorce lisse, gris blanchâtre, avec des petites lenticelles blanches. Les stipules sont moyennement persistantes. Les jeunes feuilles sont vert rougeâtre, les feuilles adultes sont à limbe vert sombre dessus, vert un peu foncé dessous, brillant sur les deux faces, elliptique, apex aigue, base subaigüe acumine, glabre à bord

subrevoluté, 5-7-8 nervures secondaires ; la réticulation est très saillantes dessous; la pétiole est glabre, 1—1,5 cm de long. Avec inflorescence terminale, corymbiforme, à 9 fleurs , les boutons floraux sont vert jaunâtre sauf la partie apicale qui est rougeâtre ; un peu velu, le tube velu est vert jaunâtre sur la partie inferieure devenant rose sur la partie distale, la calice est à lobe subulé , aigue, velu; la corolle est à tube cylindrique vert jaunâtre sur la partie proximale devenant rose sur la partie distale au-dessus du point d’insertion des étamines qui est rougeâtre et enflée, le lobe ovale est longuement acuminé, la partie apicale est recourbée sur la face inférieure, la face supérieure est blanche, la face inférieure est rose-rougeâtre avec de poils rouges au milieu. La Gynécée est à ovaire conique vert, glabre, avec 5 striés et stigmate vert. L’anthère est jaune brun. Le fruit est oblong, vert moyen, légèrement strié, 1,5—1.8 cm de long, 0,8-1cm de large, exocarpe moyennement ligneux, mesocarpe mince [20].

III.4.2. Distribution dans le monde

La localisation de Mussaenda erectiloba dans le monde est présentée par la figure 9 [W2].

Figure 9 : Distribution de Mussaenda erectiloba dans le monde

Mussaenda erectiloba est une espèce endémique de Madagascar distribuée dans les forêts humides et subhumides [W2].

III.4.3. Ecologie

Mussaenda erectiloba est principalement rencontrée le long du corridor forestier oriental entre Ranomafana et Ihosy, dans les forêts humides de moyenne altitude (800-1600 m d’altitude) d’Ampamaherana, Andrambovato, Ifanadiana et des formations secondaires et des lieux ouverts ( bord de forêt, bord de route, pente thalweg , au bord de marais) [20].

La floraison commence au mois de novembre ; des fruits en voie maturation sont visibles en mars [20].

III.4.4. Utilisations et noms vernaculaires

Les jeunes feuilles rougeâtres sont consommées par le lémurien Propipithecus diadema edwardsii . Fatora, Fatoralahy, lelamenarana sont les appelations locales de l’espèce dans la région de Ranomafana et Ambalavao [20].

Le jus obtenu à partir des feuilles de Mussaenda erectiloba est utilisé à Madagascar pour traiter le paludisme. Il est aussi utilisé pour les personnes ayant trop bues de l’alcool pour ses propriétés émétiques.

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES

CHAPITRE I : ETUDE CHIMIQUE DE Mussaenda erectiloba

I.1. Matériel végétal

Basée sur l’utilisation traditionnelle de Mussaenda erectiloba, les parties de la plante employées dans l’étude sont les feuilles. Le matériel végétal est alors constitué de poudre de feuilles séchées de la plante.

I.2. Collecte et préparation du matériel végétal

Les feuilles de Mussaenda erectiloba ont été récoltées au mois d’Avril à Ranomafana en collaboration avec un botaniste du Centre Valbio. Un herbier a été réalisé et l’identification de la plante a été effectuée par Docteur RAKOTONASOLO Franck, botaniste au Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza.

Séchées à l’abri de la lumière et à température ambiante, les feuilles sont ensuite réduites en poudre à l’aide d’un mixeur ELEKTA EMG-1535.

I.3. Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique est une analyse chimique qualitative utilisée pour détecter les diverses familles de substances naturelles présentes dans l’échantillon de plante. Il est constitué de tests qui utilisent des réactifs appropriés pour chaque famille.

La méthode utilisée est celle de FONG et ses collaborateurs [21].

Les tests de criblage phytochimiques sont détaillés dans l’annexe I et les préparations des réactifs sont présentées dans l’annexe II.

La récapitulation des différents tests de criblage phytochimique est consignée dans le tableau 2.

Tableau 2 : Récapitulatif du criblage phytochimique Classes de Observations Tests et réactifs Signification produits naturels attendues Réactif de Mayer Alcaloïdes Réactif de Wagner Précipité Présence d’alcaloïdes Réactif de Dragendorff Présence de flavones Test de Wilstater rouge

HCl conc + tournures Présences de flavonols de Mg Rouge pourpre

Coloration Rouge Présence de

violacée flavanones et flavanols

Test de Wilstater Présence de flavones Rouge Flavonoïdes et modifié leucoanthocyanes HCl conc + tournures Présence de flavonols de Mg + eau + alcool Rouge pourpre isoamylique Coloration Test de BatsMith Coloration rouge Présence de  HCl conc à chaud violacée leucoanthocyanes Coloration rouge Présence des  HCl conc à froid anthocyanes Gélatine 1% Précipité Présence de polyphénols Gélatine salée Précipité Présence de tanins Tanins et

polyphénols Présence de tanins Bleu-vert condensés FeCl dans MeOH 3 Présence de tanins Noir-bleuâtre

Coloration hydrolysables Coloration rouge Quinones NH OH Présence de quinones 4 violacée

Presence de Test de Liebermann Pourpre Burchard triterpénoïdes Anhydride acétique + Violet ou bleu- Presence de stéroïdes

H2SO4 conc Coloration vert Test de Salkowski Anneau de Présence de stérols Stéroïdes et H2SO4 séparation en rouge insaturés terpénoïdes Test de Badjet Kedde Présence de stéroïdes Coloration rouge Acide picrique lactoniques Test de Keller-Killiani Anneau de Présence de desoxy-2- FeCl 10 % + acide séparation en rouge 3 sucre acétique glacial pourpre HCl concentré à chaud Coloration bleue Présence d’iridoïdes Eau + agitation pendant Mousses persistantes Saponines Présence de saponines 30 sec après 30 mn Présence de Polysaccharides Eau/ Ethanol Précipité polysaccharides

I.4. Méthodes d’extraction

I.4.1. Macération

La macération est une méthode d’extraction qui se fait à température ambiante. Elle consiste à mettre le matériel végétal en contact direct et prolongé avec le solvant d’extraction. L’extraction est basée sur la solubilité des substances vis-à-vis du solvant.

Une cuve munie d’un couvercle, un agitateur électrique et un évaporateur rotatif ont servi pour l’extraction par macération.

Figure 10 : Macération

Une masse de 370g de matériel végétal est mis en suspension dans une solution éthanolique 90° pendant 72 heures, répétées deux fois, sous agitation avec un agitateur électrique KIKA LABORTECHNIK RW16 basic, ce qui est présenté par la figure 10.

Le macérât obtenu est filtré sur Büchner pour éliminer le marc. Le filtrat recueilli est une solution hydroalcoolique qui est soumise à l’évaporateur rotatif HEIDOLPH Laborota 4010-digital sur 47°C pour obtenir de l’extrait brut ou extrait hydroalcoolique.

I.4.2. Extraction par partage liquide-liquide

L’extraction liquide-liquide est une méthode basée sur la distribution du soluté entre deux solvants non miscibles mis en contact. La distribution du soluté repose sur son affinité par rapport aux solvants [22].

L’extraction par partage liquide-liquide a été réalisée au moyen d’une ampoule à décanter et d’un évaporateur rotatif.

La figure 11 présente l’extraction par partage.

Figure 11 : Partage

Il consiste à extraire les produits contenus dans une solution aqueuse par les solvants organiques non miscibles à celle-ci, un à un. L´extrait brut a été solubilisé dans de l´eau, puis il est mis dans une ampoule à décanter avec un volume de solvant d’extraction. Le mélange

est agité vigoureusement puis on le laisse décanter. Deux phases sont obtenues: une phase aqueuse et une phase organique.

Cette méthode permet de séparer grossièrement les produits par gradient de polarité selon les solvants. L’extraction par l’hexane est faite en premier, puis celle avec le dichlorométhane à et enfin celle de l’acétate d’éthyle.

Chaque phase est récupérée puis séchée sur l’évaporateur rotatif qui élimine rapidement le solvant d’extraction. L’hexane est éliminé sous pression réduite à 43°C, le dichlorométhane à 37°C, l’acétate d’éthyle à 45°C et l’eau à 50°C.

Le schéma 2 suivant représente le protocole d’extraction

Schéma 2 : Protocole d’extraction et partage liquide-liquide

Rendement d’extraction

Le rendement d’une extraction est donné par:

Rendement (%)= X 100 é é é é

I.5. Fractionnement et isolement

I.5.1. Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince est une chromatographie d’adsorption solide- liquide. Cette méthode permet de séparer les constituants d’un mélange [22]. Elle est utilisée pour purifier un produit ou pour déterminer l’éluant adapté pour la chromatographie sur colonne, de suivre l’efficacité de la séparation des produits au cours du fractionnement et déterminer la pureté d’un produit.

La chromatographie sur couche mince a été effectuée au moyen d’une plaque de silice

60 F254, d’une cuve chromatographique, d’un tube capillaire, d’une lampe UV, d’un pulvérisateur et d’un pistolet chauffante EH5141 Matsushita Electric Works qui sert de séchoir.

Dépôt de l’échantillon

Une solution de d’extrait ou de fraction est déposée, à l’aide d’un tube capillaire, à une distance de 1cm du bord inférieur de la plaque en gel de silice avec une dimension voulue.

Développement de la plaque chromatographique

La plaque chromatographique est ensuite déposée dans une cuve saturée de vapeurs de l’éluant dans laquelle l’éluant recouvre environ 5mm de sa hauteur. L’éluant migre vers le haut par capillarité le long de la plaque. La plaque est retirée lorsque l’éluant atteint une distance de 1 cm du bord supérieur de celle-ci.

Révélation par visualisation sous la lumière ultraviolette

La plaque est placée sous une lampe UV à 254 nm. Les produits qui absorbent les UV apparaissent en taches sombres sur un font vert fluorescent. Sous une lampe UV à 365 nm, les taches apparaissent sous formes de fluorescence.

Révélation par pulvérisation de réactif

La plaque est pulvérisée avec la vanilline sulfurique puis chauffée à l’aide d’un séchoir électrique. Les constituants apparaissent sous formes de taches colorées.

Calcul du rapport frontal Rf

Le rapport frontal est caractéristique de chaque constituant de l’échantillon qui peut être monotache ou multitaches. Il est donné par la formule suivante :

Rf =

I.5.2. Chromatographie sur colonne ouverte

La chromatographie sur colonne ouverte est une chromatographie d’adsorption solide- liquide. Elle est une chromatographie descendante. L’écoulement en continu de l’éluant permet la séparation des constituants d’un mélange en fonction de leur polarité [15].

Une colonne, du gel de silice 60 (0,063 – 0,200 µm) et du sable ont servi pour la chromatographie sur colonne.

Figure 12 : Colonne chromatographique La colonne, présentée par la figure 12, est remplie, par voie humide avec le solvant non polaire qui constitue l’éluant, d’une quantité de silice ayant une masse 40 fois supérieure à celle de l’échantillon à chromatographier.

L’extrait AcOEt est dissout dans une petite quantité de solvant puis mélangé avec de la silice de masse 3 fois supérieure à celui-ci. Le mélange est séché sous hôte puis déposé sur la surface de la colonne. Une fine couche de sable est déposée au dessus du dépôt.

L’élution se fait dans des conditions basées sur des analyses en CCM de même que le rassemblement des fractions.

I.5.3. Fractionnement et isolement des constituants chimiques de l’extrait acétate d’éthyle

Une masse de 2505 mg d’extrait AcOEt a été fractionnée sur une colonne chromatographique avec 100,2 g de gel de silice. L’élution a été réalisée avec gradient croissant de système DCM/MeOH pour obtenir 10 fractions de F1 à F10 par analyse CCM.

La fraction F1 et la fraction F2 ont été utilisées pour isoler des produits.

La fraction F1 de masse 440 mg a été éluée sur colonne de gel de silice 18 g avec un gradient de solvant de système binaire Hexane/AcOEt.

La fraction F2 de masse 137 mg a été chromatographiée sur colonne de gel de silice

7 g avec un gradient croissant de système Hexane/AcOEt.

I.6. Résonance Magnétique Nucléaire

La Résonance Magnétique Nucléaire est une méthode spectroscopique utilisée pour l’analyse structurale d’une molécule organique [23]. Le principe de la RMN repose sur le magnétisme nucléaire. En effet, certains noyaux présents dans la molécule, exposés à un champ magnétique dans le domaine des radiofréquences, peuvent absorber de l’énergie. Cette absorption d’énergie est enregistrée sous forme de spectre RMN [24].

Pour l’élucidation structurale, la RMN porte sur la mesure des déplacements chimiques et sur la détermination des constantes de couplage [23]. Les déplacements chimiques () sont exprimés en parties par million (ppm) et les constantes de couplage (J) sont en hertz (Hz).

Les spectres RMN ont été réalisés sur un spectromètre Brüker BioSpin GmbH. Le solvant utilisé est le méthanol deutéré (MeOD). Les noyaux considérés dans cette étude sont le proton (1H) et le carbone (13C).

L’enregistrement du spectre RMN 1H est effectué à une fréquence de 400 MHz et celui du spectre RMN 13C est à 100 MHz.

I.6. 1. Spectre RMN du proton monodimensionnelle « classique »

Le spectre RMN 1H-1D « classique » est caractérisé par le domaine de déplacement chimique qui est compris entre 0 et 15 ppm, la présence de singulets et de multiplets et la présence de courbe d’intégration.

Il donne ainsi des informations sur l’environnement chimique du groupe auquel appartient le proton, l’enchaînement des sites protoniques et le nombre de protons sur chaque site.

I.6. 2. Spectre RMN du carbone « Broadband decoupling »

Le spectre RMN 13C-1D « Broadband decoupling » ne présente pas de courbe d’intégration et les signaux n’apparaissent que sous forme de singulets.

Il permet alors de voir le nombre de carbone dans la structure moléculaire s’il n’y a pas superposition de signaux.

I.6. 3. Spectre DEPT 135 (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)

Le spectre DEPT 135 est un type de spectre RMN 13C caractérisé par des signaux positifs et négatifs.

Il permet d’identifier les types de carbones : les carbones primaires et tertiaires qui sont au dessus de la ligne de base et les carbones secondaires sont au dessous. Les carbones qui n’y sont pas présentés mais qui apparaissent dans le spectre RMN 13C « Broadband decoupling » sont des carbones quaternaires.

I.6. 4. Spectre COSY (COrrelation SpectroscopY)

Le spectre COSY est un spectre bidimensionnel qui concerne la corrélation entre protons. C’est un spectre de corrélation homonucléaire 1H-1H. Les taches sur la diagonale correspondent au spectre RMN 1H-1D et les taches de corrélation sont symétriques à cette diagonale.

Il renseigne sur les types de protons : géminés ou viscinaux. Il permet ainsi d’enchaîner les sites protoniques voisins [25].

Protons géminés Protons viscinaux I.6. 5. Spectre HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) Le spectre HSQC est un spectre bidimensionnel, le spectre RMN 1H-1D occupe l’axe des abscisses et le spectre RMN 13C occupe l’axe des ordonnées. Il s’agit alors d’un spectre en mode inverse.

Il indique le carbone et l’(les) hydrogène(s) qui sont directement liés. On peut donc avoir un carbone primaire, un carbone secondaire et un carbone tertiaire [25].

Corrélation directe 1H-13C

I.6. 6. Spectre HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Le spectre HMBC est un spectre bidimensionnel, de corrélation hétéronucléaire dont le mode est identique à celui de HSQC.

Il donne des informations sur les 1H et 13C distants de 2 ou 3 liaisons. On peut aussi voir la corrélation entre 1H et 13C quaternaire à partir de ce spectre [25].

Corrélation distante de 2 liaisons Corrélation distante de 3 liaisons

CHAPITRE II : ETUDE BIOLOGIQUE DE Mussaenda erectiloba

II.1. Etude de l’activité antiplasmodiale in vitro de Mussaenda erectiloba

Matériels

L’étude de l’activité antiplasmodiale des extraits brut, hexane, DCM, AcOEt et aqueux de feuilles de Mussaenda erectiloba a été effectuée sur la souche de FCM29 de Plasmodium falciparum qui est chloroquino-résistante. Elle consiste à déterminer la concentration inhibitrice de 50% de la croissance parasitaire (CI50). Elle a été suivie au moyen de SYBR-Green I [26].

SYBR Green I est un colorant qui lorsqu’il se lie à l’ADN du Plasmodium, émet une fluorescence. La lecture de fluorescence est effectuée à partir d’un lecteur « Microplate

Fluorescence Reader » FLX 800 à une longueur d’onde 518 nm et permet de déterminer les pourcentages d’inhibition d’une gamme de concentrations allant de 50 µg/ml à 0,39 µg/ml de chaque extrait à tester. La valeur d’CI50 est obtenue en procédant à la méthode de régression linéaire. Les médicaments témoins utilisés sont la quinine et la chloroquine.

Un extrait est dit actif si son CI50 est inférieur à 20 µg/ml.

Méthodes

Le test antiplasmodial (figure 13) a été réalisé dans des microplaques à 96 puits. Une solution d’hématies parasitées ayant un taux d’hématocrite de 2 % et une parasitémie de 6,1% a servie pour le test comme témoin positif. Des hématies non parasitées ont été considérées comme témoins négatifs. La suspension parasitaire a été testée avec une série de concentrations de chaque extrait. Après 72 heures d’incubation, la microplaque où un mélange fluorescent contenant le SYBR Green I a été ajouté a été mise dans l’obscurité pendant 5 à 30 min. Ensuite, la lecture des résultats a été effectuée par mesure de fluorescence par laquelle la concentration inhibitrice de 50 % de parasite a été déterminée.

Figure 13 : Test antiplasmodial des extraits

II.2. Etude de l’activité antioxydante de Mussaenda erectiloba L’étude de l’activité antioxydante de Musssaenda erectiloba a été effectuée selon deux méthodes qui sont décrites dans les paragrahes II.2.1. et II.2.2. [27].

II.2.1. Méthode qualitative : Méthode bioautographie

Une poudre de DPPH (2,2-dihényl-1-picryl-hydrazyle SIGMA) solubilisée dans du méthanol (25%) et une plaque de gel de silice 60 F254 ont été utilisées pour la méthode bioautographie.

Principe

C’est une technique d’analyse qui permet à la fois de séparer par chromatogramme les composants organiques d’un extrait et d’étudier leurs effets biologiques. Elle facilite l’isolement et l’identification des différents constituants actifs d’un extrait brut testé

On localise sur le chromatogramme une ou plusieurs bandes actives parmi les constituants d’un extrait testé.

Préparation de la plaque CCM

La plaque CCM a été préparée de la manière ci-après :

-Une concentration égale à 1mg/dépôt de 10µl d’extrait à étudier a été déposée sur une plaque chromatographique de silice gel 60 F254 de dimension égale à 5x7 cm.

-La plaque a été développée dans une cuve contenant le système de solvant approprié aux extraits testés.

-Une fois séchée sous la hotte, la plaque a été révélée par une solution de DPPH à 25 % de méthanol.

- 10 à 30 minutes après la pulvérisation, les extraits testés ont un pouvoir antioxydant si des zones claires sont apparues sur la plaque CCM, soit au niveau des dépôts et/ou au niveau des taches de migration des composants des extraits. Aucune activité n’est observée dans le cas contraire.

II.2.2. Méthode quantitative : Méthode de DPPH par dosage mesuré au spectrophotomètre UV/visible

Une poudre de DPPH (SIGMA) solubilisée dans du méthanol (4,5 %) et un spectrophotomètre (Varian DMS 100S) avec une longueur d’onde de 517 nm ont été utilisées pour quantifier le pouvoir antioxydant des produits analysés.

Principe

Le DPPH est un radical libre stable ayant au centre de sa molécule deux atomes d’azote. Il peut être inhibé par transfert d’atome d’hydrogène, par transfert d’électrons (équations) ou par perte séquentielle du proton.

L’addition du radical DPPH à une solution éthanolique (ou méthanolique) contenant un composé potentiellement antioxydant et pouvant céder un atome d’hydrogène entraine donc une diminution de la coloration violette caractéristique de la forme oxydée du DPPH qui peut être facilement suivie par un spectrophotomètre à la longueur d’onde de 517 nm. La rapidité de la perte de couleur est directement proportionnelle à l’activité antioxydante du donneur d’hydrogène.

Test de quantification

- 25mg de DPPH sont dissous dans 100 ml de méthanol et gardés à -20 °C à l’abri de la lumière avant utilisation.

-Dans des tubes secs, 200 μl de la solution à tester sont introduits, puis 3800 µl de la solution de DPPH à 25 % sont ajoutés.

-Pour chaque concentration, un blanc constitué de 3800 μl de DPPH, additionné de 200 µl de méthanol est préparé.

-Après 30 min d’incubation à l’obscurité à la température ambiante, l’absorbance à

517 nm est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’activité antioxydante qui exprime la capacité de piéger le radical libre est estimée par le pourcentage de décoloration du DPPH en solution dans le méthanol.

Elle est donnée par:

Inhibition (%) =

Où Abs désigne l’absorbance à la longueur d’onde de 517 nm.

Les résultats ont été exprimés par la moyenne de 3 mesures +/- écart type.

Le pourcentage d’inhibition ainsi calculé a été comparé à des courbes d’étalonnage de l’α- tocophérol entre 6,25-100 µM et 150-600 µM. La préparation des étalons sont dans l’annexe III.

TROISIEME PARTIE : RESULTATS –DISCUSSIONS

CHAPITRE I : ETUDE CHIMIQUE

I.1. Criblage phytochimique

Les résultats du criblage phytochimique sont consignés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Résultats du criblage phytochimique

Familles chimiques Résultats Alcaloïdes - - - Flavonoïdes - Leucoanthocyanes + Tanins et polyphénols + + + Quinone - Stéroïdes + Triterpénoïdes - Stérols insaturés - Stéroïdes lactoniques - Désoxy-2-sucre + Iridoïdes + Saponines + Polyssacharides +

+ : Test positif

- : Test négatif

Le criblage phytochimique a permis de mettre en évidence la présence de leucoanthocyanes, tanins et polyphénols, stéroïdes, désoxy-2-sucre, iridoïdes, saponines et polyssacharides dans le matériel végétal. Par contre, les alcaloïdes, flavonoïdes, quinone, triterpénoïdes, stérols insaturés, stérols lactoniques ne sont pas détectés.

Comme les autres espèces du genre Mussaenda étudiées antérieurement, des composés phénoliques, terpénoïdes et iridoïdes ont été detéctées dans Mussaenda erectiloba.

I.2. Rendements des extractions

I.2.1. Rendement de l’extraction par macération

Le solvant d’extraction utilisé a été l’éthanol 90°. Après filtration du macérât et évaporation du solvant dans le filtrat, le rendement en extrait brut ou extrait hydroalcoolique obtenu est présenté dans le tableau 4.

Tableau 4 : Rendement de l´extraction

Matériel végétal Masse poudre en Masse extrait Rendements Aspect et g en g en % couleur Mussaenda Pâteux 370,00 80,00 21,6 erectiloba Vert

I.2.2. Rendements des extractions par partage liquide-liquide

Une masse de 71,91g extrait brut a été soumis à une extraction par partage liquide- liquide par utilisation successive de solvants allant du moins polaire jusqu’au plus polaire.

Les résultats du partage liquide – liquide sont rassemblés dans le tableau 5.

Tableau 5 : Rendement du partage liquide-liquide de l´extrait brut de Mussaenda erectiloba

Extrait Masse en mg Rendements en % Aspect et couleur

Poudre Hexane 2580,0±0,1 3,5 Blanche Sirupeux DCM 740,0±0,1 1,0 Vert Sirupeux AcOEt 2700,0±0,1 3,7 Marron Sirupeux Aqueux 9880,0±0,1 13,7 Marron

I.3. Fractionnement de l’extrait AcOEt

L’extrait AcOEt, de masse 2505 mg a été fractionné par chomatographie sur colonne en phase normale de gel de silice. L’éluant utilisé est un système binaire de solvant composé de dichlorométhane et méthanol. L’élution se fait par gradient de solvant DCM/MeOH de (100/0 à 0/100-V/V). 10 fractions ont été obtenues après des analyses en CCM.

Le fractionnement de l´extrait AcOEt est présenté sur le schéma 3.

Extrait AcOEt 2505,0±0,1 mg

2 Chromatographie sur colonne de gel de silice

DCM/MeOH en gradient (V/V)

F F F F F 1 3 5 7 9 446,0±0,1 mg 142,0±0,1 mg 248,0±0,1 mg 14,0±0,1 mg 142,0±0,1 mg

F2 F4 F6 F8 F10 137,0±0,1 mg 65,0±0,1 mg 123,0±0,1 mg 86,0±0,1 mg 204,0±0,1 mg

Schéma 3 : Fractionnement de l’extrait AcOEt

I.4. Isolement des molécules contenues dans les fractions F1 et F2 actives selon le test antioxydant

Les fractions F1 et F2 possèdent une activité antioxydante selon l’étude biologique. Elles ont alors été utilisées pour isoler des produits. Le premier fractionnement par chromatographie sur colonne de silice de la fraction F1 par élution par gradient de solvant

(Hexane/AcOEt) a permis d´obtenir 3 produits (codés D2, D4 et D6) qui se présentent en CCM par des monotaches. Le schéma 4 montre l’étape d’isolement de produits dans F1.

400,0±0,1 mg

Chromatographie sur colonne de gel de silice

400 Hexane/AcOEt en gradient (V/V)

A1 D2 A 3 D4 A5 D6 3,0±0,01 mg 1,0±0,01 mg 1,0±0,01 mg 1,0±0,01 mg 3,0±0,01 mg 10,0±0,01 mg

Schéma 4 : Isolement de produits dans F1

Le chromatogramme de la fraction F1 est donné par la figure 14 et son interprétation est dans le tableau 6.

La fraction F1 a été soumise à une chomatographie sur couche mince. L’éluant utilisé est un système de solvant Hexane/AcOEt 9/1 V/V.

Figure 14 : Chromatogramme de la fraction F1

Tableau 6 : Interprétation du chromatogramme de F1

Observation après N° tache R Observation à 254 nm Observation à 365 nm f révélation 1 0,02 - - Gris 2 0,05 - - Vert-gris 3 0,07 Brun Bleu Violet 4 0,15 - - Gris

5 0,20 Brun Bleu Vert

6 0,31 - - Gris 7 0,40 Brun - Bleu

A partir de la fraction F2, on a pu isoler un produit codé E2. Le schéma 5 présente l’isolement de produit dans F2.

F2 137,0±0,1 mg

Chromatographie sur colonne de gel de silice 400 Hexane/AcOEt en gradient (V/V)

Z1 Z2 E1 Z4 Z5 Z6 2,0±0,01 mg 1,0±0,01 mg 2,0±0,01 mg 3,0±0,01 mg 3,0±0,01 mg 7,0±0,01 mg

Schéma 5 : Isolement de produit dans F2

I.5. Identification de D6

Le produit D6 de masse 10 mg a été isolé à partir de la fraction F1. Il a été analysé en

CCM avec le même système d’éluant qu’avec F1 ( Hexane/AcOEt 1/9 V/V).

Le chromatogramme ainsi que ses caractéristiques sont présentés dans la figure 15 et le tableau 7.

Figure 15 : Chromatogramme du produit D6

Tableau 7 : Caractéristiques du produit D6

Rf 0,07

Observation à 254 nm Brun

Observation à 365 nm Bleu

Observation après révélation Violet

L’élucidation structurale du composé D6 a été faite par analyse des spectres RMN où 5 types de spectre ont été utilisés : le spectre RMN 1H-1D, le spectre RMN 13C « Broadband decoupling », le spectre DEPT, le spectre HSQC, le spectre HMBC et le spectre COSY et interprétés.

Le MeOD est utilisé pour solubiliser le produit. Les signaux de MeOD et D2O apparaissent à = 3,34 ppm et = 4,80 ppm dans le spectre RMN 1H. Le MeOD sort à = 48,0 ppm dans le spectre RMN 13C.

1 I.5.1. Analyse du spectre RMN H-1D « classique » du composé D6

1 La figure 16 présente le spectre RMN H du composé D6.

1 Figure 16 : Spectre RMN H-1D du composé D6

D’un point de vue général, le spectre RMN 1H (figure 16) montre des caractéristiques d’un hétéroside [24] :  Des signaux de 0 à 3 ppm : attribués aux protons de la génine  Des signaux entre 3 ppm et 4,5 ppm : attribués aux protons osidiques et aux protons de la génine situés sur des carbones hydroxylés  Des doublets qui se situent entre 4 à 6 ppm : attribués à des protons anomères osidiques et à des protons éthyléniques de la génine

La vue détaillée du spectre RMN 1H suppose que le composé en question est un hétéroside dont le sucre est le glucose. En effet, il présente des doublets à =4,70 ppm et =5,57 ppm qui sont caractéristiques d’un squelette d’hétéroside fréquemment rencontré. Le doublet situé à =4,70 ppm avec une constante de couplage J=7,6 Hz correspond au proton anomérique du sucre ayant une configuration. Et par comparaison avec les données de la littérature, nous pouvons dire que notre sucre est le -D-glucose et le doublet situé à =5,57 ppm correspond au carbone en position 1 de la génine [28] [29].

Il a été remarqué que la structure du composé ne comporte pas de noyaux aromatiques dont les signaux apparaissent habituellement entre 6,5 ppm et 9 ppm. Par comparaison avec des données de la littérature [30] [31] [32] [33], des renseignements ont pu être obtenus :

 La présence d’un doublet à =7,64 ppm avec J=2 Hz est caractéristique d’un proton oléfinique en H-3 d’un iridoïde.

 Les protons H5,34 et H5,29 sont assignés à des protons de méthylène en C-10 et le proton

oléfinique H5,53 en C-8 composant un groupe vinyle.  Le triplet à =5,36 ppm est assigné à un proton d’un carbone ternaire en H-7.  Des multiplets relatifs à deux protons à =3,90 ppm et =3,68 ppm qui sont attribués aux

protons du groupe –CH2−OH du glucose.  Un singulet à =3,53 ppm est assigné à des protons d’un groupe méthoxyle.  Entre 3,36 ppm et 3,21 ppm se trouvent 5 protons sont attribués au proton du carbone ternaire en H-5 et aux protons osidiques.  Le quadruplet à 2,67 ppm est attribué à un proton de CH en H-9 correspondant au carbone rattaché au groupe vinyle.  Les multiplets relatifs à 1,89 ppm et 1,74 ppm qui correspondent à deux protons de méthylène en H-6.

Ces informations supposent que le produit D6 est un hétéroside d’iridoïde dont le sucre est le glucose. Il est rattaché sur C-1 à la génine.

La numérotation adoptée à la maille de l’iridoïde est celle du squelette de base, iridane, indiquée dans le schéma 6.

Schéma 6 : Iridane ou cyclopenta[c]pyrane

I.5.2. Analyse du spectre RMN 13C « Broadband decoupling » et du spectre DEPT

du composé D6

13 La figure 17 présente les spectres RMN C du composé D6.

Figure 17 : Spectre RMN 13C « Broadband decoupling » (en haut) et spectre DEPT 135 (en

bas) du composé D6

On compte, à partir du spectre RMN 13C « Broadband decoupling » (figure 17), 17 signaux correspondant à 17 carbones dans la molécule s’il n’y a pas superposition de signal. En se référant à ce spectre, on remarque que les carbones situés à =166,1 ppm et =103,9 ppm n’apparaissent pas dans le spectre DEPT 135 (figure 13). Ils sont alors des carbones quaternaires.

Il montre aussi 5 signaux, positifs dans le spectre DEPT 135, correspondant à un sucre entre 60 et 90 ppm. Ce sucre est donc un hexose étant donné que le carbone anomérique se situe au-delà de 90 ppm [34]. Ces données confirme l’identification de cet ose à partir du spectre RMN 1H-1D (figure 8). En outre, comme pour la majorité des hétérosides, le sucre est un glucose relié à la génine par une liaison osidique entre l‘hydroxyle en C1 de la génine avec l‘hydroxyle porté par le carbone anomérique du sucre [34].

Les spectres 13C ci-dessus ont menés aux autres informations suivantes [26] [30] [34] [35] [36]:

 Le singulet à =166,1 ppm indique la présence de carbonyle (C=O) en C-11 dans la génine.  Le signal à 153,1 ppm est attribué au carbone du groupe =CH−O− en C-3 d’un iridoïde.  La présence des signaux à =131,9 ppm et =119,7 ppm est caractéristique de la structure d’un sécoiridoïde où un groupe vinyle est rattaché sur C-9. Ces signaux sont attribués respectivement à un carbone éthylénique =CH− et un carbone méthylénique terminal

=CH2.  Les trois signaux à 101,9 ppm, 98,9 ppm et 97,1 ppm sont des carbones CH liés à des atomes d’oxygène. On y retrouve le carbone anomérique du glucose puisque les carbones anomériques des sucres sont localisé entre 90 ppm et 110 ppm.  Les signaux à 77,0 ppm, 76,6 ppm, 73,2 ppm, 70,0 ppm et 61,2 ppm sont attribués aux carbones des fonctions alcooliques secondaires et primaires.

 Le signal à =55,6 ppm est attribué à un groupement méthoxyle –OCH3.  Le site 13C à =42,2 ppm correspond à un carbone tertiaire en C-9 d’un sécoiridoïde.

 Le signal à =28,8 ppm est celui méthylène –CH2−.  On a un carbone tertiaire à =21,4 ppm en C-5 d’un iridoïde.

Toutes ces informations retiennent la supposition que le produit D6 est un hétéroside d’iridoïde. En outre, il se peut qu’il soit un sécoiridoïde lié à un glucose.

La distribution des déplacements chimiques selon le type de carbone est consignée dans le tableau suivant.

Tableau 8 : Types de carbone selon les valeurs de 

13C Valeurs des déplacements chimiques (ppm)

CIV 166,1 103,9

CH 153,1 131,9 101,9 98,9 97,1 77,0 76,6 73,2 70,0 42,2 21,4

CH2 119,7 61,2 28,8

CH3 55,6

I.5.3. Analyse du spectre HSQC du composé D6

La figure 18 présente le spectre HSQC du composé D6.

Figure 18 : Spectre HSQC du composé D6

Le spectre HSQC (figure 18) révèle les 1H et 13C qui sont directement liés. les carbones quaternaires n’ont pas de tâches de corrélation. L’attribution des protons sur les sites 13C ainsi que les carbones quaternaires sont présentés dans le tableau 9.

Tableau 9 : Types de sites 13C

Domaine de   (ppm) du site  (ppm) du 13C (ppm) du signal Type de site Groupe du site 1H porteur 1H

7,64 - 7,63 7,64 153,1 CH =CH−O−

5,57 - 5,57 5,57 97,1 CH

5,55 - 5,50 5,53 131,9 CH =CH−

Domaine de   (ppm) du site  (ppm) du 13C (ppm) du signal Type de site Groupe du site 1H porteur 1H

5,37 - 5,36 5,36 101,9 CH

5,34 5,34 119,7 CH2 =CH2

5,31 - 5,28 5,29

4,71 - 4,69 4,70 98,9 CH

3,92 - 3,89 3,90 61,2 CH2 −CH2−O− 3,70 - 3,66 3,68

3,53 3,53 55,6 CH3 −O−CH3

3,36 3,36 77,0 CH

3,36 3,36 76,6 CH

3,36 3,36 21,4 CH

3,33 3,33 70,0 CH

3,23 - 3,19 3,21 73,2 CH

2,68 - 2,66 2,67 42,2 CH

1,93 - 1,86 1,89 28,8 CH2 −CH2− 1,79 - 1,69 1,74

- - 103,9 CIV

- - 166,1 CIV

I.5.4. Analyse du spectre HMBC du composé D6

La figure 19 présente le spectre HMBC du composé D6.

Figure 19 : Spectre HMBC du composé D6

Le spectre HMBC (figure 19) permet de voir les corrélations entre 1H et 13C distants de deux ou plusieurs liaisons. Il permet d’établir l’enchainement des sites 13C dans la molécule.

Pour la formation d’un noyau pyrane (schéma 7)

 Le proton H5,57 corrèle avec son carbone porteur C97,1 et avec les carbones C153,1,

C131,9, C98,9 et C21,4.

 Le proton H7,64 présente des taches de corrélation avec les carbones C166,1, C103,9,

C97,1 et C21,4. Il présente aussi des taches de corrélation symétriques suivant sa

verticale. Elles correspondent à son carbone porteur qui est le carbone C153,1.

 Les deux protons H5,34 et H5,29 portés par C119,7 corrèlent avec les carbones C131,9 et

C42,2.

 Le proton H2,67 qui est porté par le carbone C42,2 présente des taches de corrélation

avec les carbones C131,9, C119,7, C103,9, C97,2 et C21,4.

Les corrélations respectives de H5,6, H7,64, H2,67 avec C21,4 ont permis de fermer un cycle pyrane. La fonction ester du carbone C166,1 est placé sur C103,9 selon les corrélations de

H7,64. Le déblindage du proton oléfinique H7,64 est expliqué par la présence de la fonction ester

à son voisinage. La corrélation de H5,57 a montré que C97,1 est rattaché avec le carbone anomérique du glucose par une liaison C−O.

Schéma 7 : Corrélation 1H-13C en HMBC conduisant à un noyau pyrane

Les corrélations du protons H5,53 (schéma 8) avec C119,7et C42,2 corroborent la substitution de ce deuxième cycle sur C42,2 par un groupe vinyle. D’ailleurs, les deux protons portés par C119,7 sont corrélés avec C42,2.

1 13 Schéma 8 : Corrélation H- C en HMBC du proton H5,53

Pour la formation d’un pyranone (schéma 9)

 Les deux protons de méthylène H1,89 et H1,73, portés par C28,8, corrèlent avec les

carbones C103,9, C101,9 et C21,4.

 Le protons H5,36 qui est porté par C101,9 corrèle avec les carbones C166,1, C55,6 et C21,4.

 Les protons H3,5 –OCH3 sont corrélés avec C101,9.

Ces corrélations ont permis de placer C28,8 entre les carbones C21,4 et C101,9 d’une part et de rassembler C101,9 avec la fonction ester conduisant à la formation d’une lactone d’autre

part. Ainsi, on a obtenu un deuxième cycle, pyranone, accolé au premier cycle. En outre, on a pu rattacher le groupement méthoxyle C55,56 sur C101,9.

Schéma 9 : Corrélation 1H-13C en HMBC conduisant à un pyranone

L’assemblage des deux cycles a mené à un sécoiridoïde (schéma 10) caractérisé par l’ouverture du noyau cyclopentanique de l’iridane (schéma 6) au niveau de la liaison C-7−C-8, la présence de groupe vinyle en C-9 et la forme lactone.

Schéma 10 : Squelette de base d’un sécoiridoïde

nommé 3,4-diethyl-5-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrane

Pour la formation du -D-glucose

Le spectre HMBC corrobore la présence du sucre -D-glucose dans la molécule avec

C98,9(C-1’), C73,2(C-2’), C76,6 (C-3’), C70,0 (C-4’), C77,0 (C-5’) et C61,2 (C-6’). Les corrélations sont présentés dans le schéma 11.

Schéma 11 : Corrélation 1H-13C en HMBC au niveau du glucose

L’assemblage de ces enchaînements en HMBC a mené à un hétéroside composé d’un sécoiridoïde et d’un glucose.

I.5.5. Analyse du spectre COSY du composé D6

La figure 20 présente le spectre COSY du composé D6.

Figure 20 : Spectre COSY du composé D6

Le spectre COSY (figure 20) montre les corrélations homonucléaires 1H-1H. Ces corrélations sont résumées dans le tableau 10.

Tableau 10 : Corrélation homonucléaire vue sur le spectre COSY

5,57 5,53 5,36 5,34 5,29 4,70 3,90 3,68 3,53 3,36 3,33 3,21 2,67 1,89 1,73 1H 7,64 7,64 5,57 F 5,53 F F 5,36 F F 5,34 F 5,29 F 4,70 F 3,90 F m 3,68 F m 3,53 3,36 m m m F F F 3,33 3,21 F m 2,67 F F 1,89 F F F 1,73 F F F F : corrélation forte m : corrélation moyenne Les corrélations obtenues à partir du spectre COSY sont présentées dans le schéma 12.

1 1 Schéma 12 : Corrélation H- H en COSY du composé D6

Le spectre COSY montre les corrélations 1H – 1H. Il permet d’enchainer les sites protoniques et donc complète et confirme les informations tirées du spectre HMBC.

Les valeurs de déplacements chimiques de ses carbones 13C sont comparées avec celles des données de la littérature.

Le tableau 11 suivant résume les attributions des valeurs de déplacements chimiques 13 aux sites C du composé D6 et ceux de vogeloside selon la littérature [37] [38].

Tableau 11 : Comparaison des valeurs de déplacements chimiques de D6 avec ceux de la littérature

 ppm 13C de Littérature  ppm 13C de Littérature Position  ppm 13C de D 6 [37] [38]

1 97,1 98,6 97,2

3 153,1 154,5 152,8

4 103,9 105,3 104,3

5 21,4 22,8 24,7

6 28,8 30,2 30,9

7 101,9 103,3 103,5

8 131,9 133,3 132,2

9 42,2 43,5 42,8

10 119,7 121,1 120,4

11 166,1 167,4 164,5

−O−CH3 55,6 57,0 56,5

1’ 98,9 100,3 100,4

2’ 73,1 74,6 74,9

3’ 76,6 78,0 78,4

4’ 70,0 71,4 71,3

5’ 77,0 78,3 79,7

6’ 61,2 62,6 62,5

D´après cette comparaison, le composé D6 est donc identifié comme étant le vogeloside ou 5-éthényl-6-(-D-glucopyranosyloxy)-3-méthoxy-4,4a,5,6-tetrahydro- pyrano3,4-cpyran-1(3H)-one [37][38]. Sa formule brute est C17H24O10 et sa masse moléculaire est 388 g/mol. Ce produit est isolé pour la première fois à partir du genre Mussaenda.

Le schéma 13 représente la structure du composé isolé D6.

Schéma 13 : Vogeloside

La numérotation adoptée pour la nomenclature systématique est celle présentée dans le schéma 14.

Schéma 14 : Numérotation systématique de vogeloside

CHAPITRE II: DISCUSSION DE L’ETUDE CHIMIQUE

L’étude chimique de Mussaenda erectiloba contribue aux investigations phytochimiques et pharmacologiques sur les espèces appartenant au genre Mussaenda. Du fait que Mussaenda erectiloba n’est rencontrée qu’à Madagascar, cette étude a aussi apportée des informations sur le genre Bremeria. Comme le changement de nomenclature décrit dans le paragraphe III.3 l’indique, Mussaenda erectiloba est aussi appelée Bremeria erectiloba.

Le criblage phytochimique a révélé la présence de leucoanthocyanes, tanins et polyphénols, saponines, stéroïdes et iridoïdes et polyssacharides.

Partant de 370 g de matériel végétal, un extrait hydroalcoolique est obtenu avec un rendement de 21,6 % par macération. Elle a été suivie de partage liquide-liquide qui a servi à extraire les constituants de cet extrait selon leur polarité par utilisation de divers solvants du moins polaire au plus polaire. Ce qui a permis d’obtenir des extraits hexane, DCM, AcOEt et aqueux dont l’extrait aqueux a le plus fort rendement de 13,7 % suivi de l’extrait AcOEt avec 3,7 %.

Des tests biologiques notamment des tests sur l’étude d’activité antiplasmodiale et l’étude d’activité antioxydante ont été réalisés avec ces extraits.

Le profil intéressant antioxydant de l’extrait AcOEt a permis de poursuivre la démarche de l’étude chimique par le fractionnement de cet extrait. Les tests antioxydants effectués sur les 10 fractions obtenues a permis de choisir F1 et F2 pour isoler des produits par chromatographie sur colonne. Nous avons pu obtenir 4 produits parmi lesquels le produit codé

D6 a passé des enregistrements spectrales.

L’identification du produit D6 a conclu l’étude chimique de Mussaenda erectiloba après analyses des spectres RMN 1D (1H ,13C « Broadband decoupling » et DEPT 135) et 2D (HSQC, HMBC et COSY) et comparaison avec des données de littérature concernant un iridoïde nommé vogéloside. Ce résultat est en accord avec le criblage phytochimique où nous avons pu mettre en évidence la présence d’iridoïde dans le matériel végétal utilisé au cours de cette étude.

CHAPITRE III : ETUDE BIOLOGIQUE

III.1. Tests antipaludiques sur les extraits de Mussaenda erectiloba

L’évaluation de l’activité antiplasmodiale des extraits de plante a été basée sur la détermination de la concentration minimale inhibitrice de 50% (CI50) de la croissance parasitaire dans le sang. Une CI50 inférieure à 20 µg/ml signifie que l’extrait possède une activité antiplasmodiale intéressante.

Les résultats obtenus lors des tests antipaludiques sont consignés dans le tableau 12.

Tableau 12 : Activité antiplasmodiale des extraits de Mussaenda erectiloba

Extrait CI50 µg/ml

Brut 44,00

Hexane Non actif

DCM 17,20

AcOEt 31,84

Aqueux Non actif

Une activité antiplasmodiale des feuilles de Mussaenda erectiloba a été localisée dans l’extrait DCM avec une CI50= 17,20 µg/ml.

III.2. Analyse qualitative de l’activité antioxydante des extraits et des fractions de Mussaenda erectiloba

La méthode bioautograghie selon la méthode décrite au paragraphe II.2.1 de la deuxième partie a été utilisée pour qualifier l’activité antioxydante des extraits et des fractions de Mussaenda erectiloba. Pour mieux interpréter les résultats, nous avons adapté les codages inscrits dans le tableau 13.

Tableau 13 : Codage des extraits

Code Extrait P1 Extrait aqueux P2 Extrait AcOEt P3 Extrait DCM

III.2.1. Analyse qualitative des extraits

Les extraits brut, hexanique, DCM, AcOEt et aqueux ont été élués à partir d’une CCM en utilisant comme système d’éluant DCM/MeOH 9/1. Ensuite, la plaque a été pulvérisée avec une solution de DPPH 25% de couleur violette. La décoloration de celle-ci met en évidence le pouvoir antiradicalaire des constituants des extraits.

Figure 21 : CCM de l’activité antioxydante des extraits

La figure 21 a révélé que la décoloration du violet de DPPH est intense pour les trois extraits P1, P2 et P3. Ils présentent des pouvoirs antiradicalaires.

L’importante capacité antioxydante de l’extrait acétate d’éthyle (P2) ainsi que son profil CCM intéressant nous a permis de choisir cet extrait pour la suite de notre travail.

III.2.2. Analyse qualitative des fractions de l’extrait acétate d’éthyle

L’analyse qualitative de l’activité antioxydante des fractions de l’extrait AcOEt a été faite à partir de deux CCM en utilisant deux systèmes d’éluant dont le système Hex/AcOEt

V/V 1/9 pour les fractions F1, F2, F3, F4, F5 et le système DCM/MeOH V/V 6/4 pour les fractions F6, F7, F8, F9, F10. Après pulvérisation de la plaque avec une solution de DPPH à 25% de MeOH, on observe des zones claires sur les plaques (Figure 22).

Figure 22 : CCM de l’activité antioxydante des fractions de l’extrait AcOEt

On observe des taches claires au niveau du dépôt et au niveau de la zone de migration des composants pour F1. Les fractions F2, F3, F4, F5, F6 présentent toutes des taches claires au niveau des dépôts. Elles sont alors capables de piéger le radical libre DPPH. Les taches sont intenses pour F2 et F4. Il se peut qu’elles aient un fort pouvoir antioxydant. Par contre, les fractions F7, F8, F9, F10 sur lesquelles aucune zone claire n’est apparue n’ont pas d’activité antioxydante.

III.3. Analyse quantitative de l’activité antioxydante de l’extrait AcOEt et des fractions F1 et F2

Le pouvoir antioxydant de l’extrait AcOEt et les fractions F1 et F2 dont la quantité est largement suffisante pour un test de quantification a été quantifié selon la méthode décrite au paragraphe II.2.2. de la deuxième partie. Ils ont été testés à une concentration de 1mg /ml pour déterminer leurs capacités à inhiber le radical DPPH (tableau 14). Des courbes standards de l’ α-Tocophérol ont été utilisées pour comparer leur pouvoir antioxydant avec celui de l’ α-Tocophérol testé à des concentrations comprises entre 6,25–100 µM et 150−600 µM (figure 23 et figure 24).

700

l l 600 y = -826,93x + 626,59 500 R² = 0,9951

400

Tocophéro

) 300 µM ( 200 100 0

Concentration Concentration en 0 0,2 0,4 0,6 Absorbance

Figure 23 : Courbe standard du 1er étalon de l’ α- tocophérol (150 µM – 600 µM)

120 - α 100

y = -74,18x + 121,17 80 R² = 0,9999

40 Tocophérol(µM)

20 Concentration molaire en molaire Concentration 0 0 0,5 1 1,5 2 Absorbance

Figure 24 : Courbe standard du 2ème étalon de l’ α- tocophérol (6,25µM – 100 µM)

Tableau 14 : Activité antioxydante de l’extrait AcOEt et les fractions F1 et F2 en équivalent α- tocophérol

Echantillon c° mg/ml Inhibition % Equivalent α-tocophérol µM/mg/ml

Extrait AcOEt 1 83,21 501,63

F1 1 27,53 72,75

F2 1 89,60 517,98

A une concentration de 1mg/ml, l’extrait AcOEt et les fractions F1 et F2 piègent le radical libre DPPH entre 27,53 % et 89,60% équivalent aux effets de l’ α tocophérol variant de 72,75 à 517,98 µM/mg/ml d'extrait. L’activité antioxydante que possèdent l’extrait

AcOEt et la fraction F2 est forte car presque la totalité du DPPH est inhibée. Par contre, la fraction F1 a une faible activité antioxydante.

CHAPITRE IV : DISCUSSION DE L’ETUDE BIOLOGIQUE

L’évaluation des activités biologiques de Mussaenda erectiloba, une plante endémique de Madagascar a montré ses importances activités antiplasmodiale et antioxydante.

L’activité antiplasmodiale de l’extrait DCM avec une CI50 de 17,20 µg/ml confirme l’utilisation de cette plante dans la médecine traditionnelle malgache pour traiter le paludisme. Des études antérieures ont montré que Mussaenda parviflora dont les constituants chimiques sont principalement composés de triterpénoïdes est utilisée pour traiter la fièvre qui apparait lors du paludisme [16]. Comme l’investigation des composés issus de l’extrait DCM de Mussaenda erectiloba n’a pas encore été effectuée, nous ne pouvons qu’apporter une hypothèse sur l’origine de cette activité antiplasmodiale qui serait dans les composés de la famille des terpènes.

Les propriétés antioxydantes de Mussaenda erectiloba ont été mises en évidence par la méthode bioautographie et quantifiées par la méthode de DPPH. L’activité antioxydante de cette espèce est localisée dans les extraits DCM, AcOEt et aqueux. La méthode de DPPH a permis de démontrer le fort pouvoir antioxydant de la fraction F2 et de l’extrait AcOEt. Selon Othman et ses collaborateurs, le pouvoir antioxydant est fort si le pourcentage d’inhibition est supérieur à 70 %, intermédiaire s’il se trouve entre 40 % et 70 % et faible s’il est inférieur à

40 % [39]. En effet, à une concentration de 1 mg/ml, la fraction F2 et l’extrait AcOEt inhibent le radical DPPH à des pourcentages de 83,21% et de 89,60 % respectifs. Par contre, celui de la fraction F1 est de 27,53 %.

Le genre Mussaenda par ses composés chimiques entre autres les iridoïdes, les flavonoïdes et les triterpènes, est très connu par ses propriétés antioxydante et antimicrobienne [16]. En plus, des activités antioxydantes provenant de composés phénoliques isolés à partir des autres espèces végétales ont été rapportées sur d’autres études [40].

Cette plante possède aussi bien une activité antiplasmodiale qu’une activité antioxydante.

CONCLUSION

Le présent travail a été réalisé suivant la collaboration du Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) et le Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP) portant sur l’étude chimique et activités antiplasmodiale et antioxydante de Mussaenda erectiloba Wernham aussi appelée Bremeria erectiloba Razafimandimbison & Alejandro, une rubiacée endémique de Madagascar, utilisée traditionnellement pour traiter le paludisme.

Dans le cadre d’une initiation à la recherche, ce travail a permis de nous familiariser avec les différentes méthodologies de recherches en Chimie des Substances Naturelles et d’acquérir les bonnes pratiques en laboratoire. En outre, il a été une initiation à des méthodes biologiques notamment sur les tests d’activités antiplasmodiale et antioxydante.

D’après le criblage phytochimique, des leucoanthocyanes, tanins et polyphénols, stéroïdes, désoxy-2-sucre, iridoïdes, saponines et polyssacharides sont présentes dans les feuilles de Mussaenda erectioba. Il corrobore les principaux constituants chimiques du genre Mussaenda [16].

Les procédés d’extraction ont permis d’obtenir 05 extraits (hydroalcoolique, hexane, DCM, AcOEt et aqueux). Le fractionnement de l’extrait AcOEt a obtenu 10 fractions

(F1-F10). La purification de la fraction F1 a permis d’isoler le produit D6. L’élucidation structurale de D6 a été réalisée par spectroscopie RMN. Il a été identifié sous le nom de vogeloside par comparaison avec les données de la littérature.

L’analyse de l’activité antiplasmodiale de ces extraits a montré une activité intéressante de l’extrait DCM.

Pour le test antioxydant, la méthode bioautographie a présenté la capacité des extraits DCM, AcOEt et aqueux à piéger le radical libre. La quantification du pouvoir antioxydant de l’extrait AcOEt et des fractions F1 et F2 par la méthode de DPPH a montré la forte activité antioxydante de l’extrait AcOEt et la fraction F2. Elle a également mise en

évidence la faible pouvoir antioxydant de la fraction F1 à l’origine du produit D6.

Les travaux menés sur Mussaenda erectiloba constituent une première investigation chimique et biologique de cette espèce. Les résultats ont pu fournir des informations sur ses constituants chimiques, de corroborer son utilisation traditionnelle pour traiter le paludisme et de fournir des informations sur les propriétés antioxydantes de ses extraits et fractions.

La suite des travaux de recherches entreprises sur Mussaenda erectiloba sera basée sur l’identification des 2 autres produits isolés de F1 et du produit isolé de F2, l’isolement et l’identification des produits de l’extrait DCM ainsi que les études des activités antiplasmodiale et antioxydante de ces produits isolés.

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Webographie

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Annexe I : Criblage phytochimique

− Criblage des alcaloïdes

Une masse de 5g de poudre sèche est macérée dans 20 ml de HCl 12% pendant 15 min. Le mélange est filtré sur coton. Le filtrat obtenu est divisé dans 4 tubes à essais pour faire les tests.

Tube n°1 : sert de témoin

Tube n°2 : + 5 gouttes de Réactif de Wagner

Tube n°3 : + 5 gouttes de Réactif de Mayer

Tube n°4 : + 5 gouttes de Réactif de Dragendorff

L’apparition de précipité indique un test positif.

− Criblage des flavonoïdes et des leucoanthocyanes

Un volume de 10ml de solution hydroalcoolique sont évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. Après refroidissement, les pigments sont éliminés par épuisement avec l’hexane. Le résidu est dissous dans l’éthanol. La solution obtenue est filtrée sur coton. Le filtrat est réparti dans 5 tubes à essais :

Tube n°1 : témoin

 Test de Wilstater

Tube n°2 : + 0,5 ml de HCl concentré et quelques tournures de Mg

Après 10 min, si la coloration est :

 Rouge  présence de flavone  Rouge pourpre  présence de flavonols  Rouge violacée  présence de flavanones et flavanols  Test de Wilstater modifié

Tube n°3 : + 0,5ml de HCl concentré et quelques tournures de Mg

Et après dissolution de Mg, additionner 1 ml d’eau et 1 ml d’alcool isoamylique.

Après 10 min, si la coloration de la phase supérieure est

 Rouge  présence de flavone  Pourpre  présence de flavonols  Test de Bate-Smith

Tube n°4 : + 0,5 ml de HCl concentré

La solution est chauffée pendant 30 min au bain-marie.

On la laisse se refroidir.

Si la coloration est rouge violacée  présence de leucoanthocyanes

Tube n°5 : + 0,5 ml de HCl concentré à froid

Si la coloration est rouge  présence d’anthocyanes

− Criblage des tanins et polyphénols

Un volume de 10 ml de solution hydroalcoolique est évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. On y verse ensuite 15 ml d’eau distillée. Le mélange est chauffé et agité. 4 gouttes de solution de NaCl 10 % y sont ajoutées. Après filtration, le filtrat est réparti en 4 tubes à essais :

Tube n°1 : témoin

Tube n°2 : + 4 gouttes de gélatine à 1%

Si on observe un précipité  présence de polyphénols

Tube n°3 : + 4 gouttes de gélatine salée

Si on observe un précipité  présence de tanins

Tube n°4 : + 4 gouttes de FeCl3 10 % dans MeOH

Si la coloration est

 Bleu-vert  présence de tanins condensés (catéchiques ou flavan-3-ols condensés et leucoanthocyanes ou flavan-3,4-diols)  Noir bleuâtre  présence de tanins hydrolysables (galliques ou ellagiques)  Incolore  absence de tanins

− Criblage des quinones

Un volume de 10 ml de solution hydroalcoolique est évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. Le résidu est dissout dans 15 ml d’eau distillée puis le mélange est filtré sur coton. Le filtrat est extrait avec un mélange hexane/dichlorométhane 3/1 (V/V) dans une ampoule à décanter. La phase supérieure est recueillie dans un tube à essais puis 5 ml de

NH4OH y sont versés. Le mélange est ensuite agité.

Si la coloration de la phase alcaline (phase inférieure) est rouge violacée  présence de quinones.

− Criblage des stéroïdes et terpénoïdes

Un volume de 10 ml de solution hydroalcoolique est évaporé dans un cristallisoir au bain-marie. Après refroidissement, le résidu est dépigmenté par ajout répétitif de 5 ml hexane. 10 ml de dichlorométhane sont ajoutés. Après une agitation de 5 min, le mélange est décanté puis séchés avec Na2SO4 anhydre. Le mélange est ensuite filtré et le filtrat est réparti dans 5 tubes à essais :

Tube n°1 : témoin

 Test de Liebermann Burchard

Tube n°2 : + 4 gouttes d’anhydride acétique

+ 4 gouttes de H2SO4 concentré

Si la coloration est

 Pourpre  présence de triterpénoïdes  Violet ou bleu-vert  présence de stéroïdes  Test de Salkowski

Tube n°3 : + 1 ml de H2SO4 concentré

Si l’anneau de séparation est rouge  présence de stérols insaturés

 Test de Badjet Kedde

Tube n°4 : + quelques grains d’acide picrique

Si la coloration est rouge  présence de stéroïdes lactoniques

 Test de Keller-Killiani

Tube n°5 : + quelques gouttes de FeCl3 10 %

+ quelques gouttes d’acide acétique glacial

Le tube est incliné de 45°.

Si l’anneau de séparation est rouge pourpre  présence de désoxy-2-sucre

− Criblage des iridoïdes

Un millilitre de HCl concentré est ajouté à 1ml d’extrait aqueux. L’apparition d’une coloration bleue après 30 min d’ébullition montre la présence d’irridoïdes.

− Criblage des saponines

1 g de poudre est mis dans un tube à essais avec 10 ml d’eau distillée. Après agitation vigoureuse pendant 30 sec, le tube est placé verticalement pendant 30 min.

Si la hauteur de la mousse est supérieure ou égale à 3 cm  présence de saponines

− Criblage des polyssacharides

Une masse de 5g de poudre est utilisée pour préparer un décocté. Après filtration, 3 volumes d’alcool sont ajoutés au filtrat.

Si on observe un précipité  présence de polyssacharides

Annexe II : Préparation des réactifs

− Réactif de Dragendorff

Solution A : 1,7 g de sous-nitrate de bismuth et 20 g d’acide tartrique sont dissoutes dans 30 ml d’eau.

Solution B : 16 g d’iodure de potassium sont dissoutes dans 40 ml d’eau.

Au moment de l’emploi, 2,5 ml de A et 2,5 ml de B sont mélangés. 10 g d’acide tartrique préalablement dissous dans 50 ml d’eau distillée sont versés dans le mélange.

− Réactif de Wagner

On mélange 2 g d’iodure de potassium et 1,27 g d’iode dans un erlenmeyer de 250 ml et on ajoute 100 ml d’eau distillée. On agite le mélange jusqu’à dissolution complète du soluté.

− Réactif de Meyer

Une masse de 1,35 g de chlorure mercurique (II) est dissoute dans 94 ml d’eau. On y ajoute 5 g d’iodure de potassium pour dissoudre complètement le soluté. Le volume total de l’au est ensuite ramené à 100 ml d’eau.

− Gélatine

On met en suspension 1 g de gélatine dans 100 ml d’eau.

Chlorure de sodium 10 %

10 g de chlorure de sodium sont dissoutes dans 100 ml d’eau.

− Gélatine salée

On mélange un volume de gélatine à un volume égal de la solution de chlorure de sodium à 10 %.

− Réactif de Kedde

2 g d’acide 3,5-dinitrobenzoïque sont dissoutes dans 100 ml de méthanol.

5,6 g de potasse sont dissoutes dans 100 ml.

Au moment de l’emploi, on mélange à un volume égal la solution d’acide et de potasse.

− Réactif de Keller-Killiani

10 g de chlorure ferrique sont dissoutes dans 100 ml d’eau. On moment de l’emploi, on mélange 0,3 ml de la solution précédente de chlorure ferrique dans 50 ml d’acide acétique glacial. On prélève 3 ml du mélange pour le test de Keller-Killiani.

Chlorure ferrique à 10 % dans le méthanol

On dissout 1 g de chlorure ferrique dans 10 ml de méthanol en agitant et en chauffant au bain-marie jusqu’à dissolution complète.

− Vanilline sulfurique

Solution A : 3 ml d’acide sulfurique concentré et 50 ml d’éthanol sont mélangés.

Solution B : 3 g de vanilline sont dissoutes dans 50 ml d’éthanol.

Au moment de l’emploi, on mélange à un volume égal les solutions A et B.

Annexe III : Préparation des étalons de l’α-tocophérol

− Préparation de solution de α-tocophérol à 600µM

On a :

o Concentration molaire : mol/l= M

masse = concentration molaire x masse molaire x volume

1 mM= 10-3 M

1 µM= 10-6M

o Masse molaire de l’α- tocophérol : 430 g/mol o Volume à préparer 20 ml= 0,02 l (cette quantité varie selon le volume nécessaire pour chaque test)

D’où

m= 600.10-6 M * 430 g/mol *0.02 l

m= 0,00516 g= 5,16 mg

Soit une masse de 5.16 mg de l’α- tocophérol est à mettre dans 20 ml de MeOH pour avoir une solution de concentration égale à 600 µM.

− Préparation des gammes étalons à partir de 600 µM : 6,25-100 µM et 150-600 µM o Pour le premier étalon : 150-600 µM.

Dilutions 13* ; 20* ; 40* ; 60* ;

13* : concentration : 450 µM : (750 µM de 600µM dans 250 µl de MeOH)

20* : concentration : 300 µM : (500 µM de 600 µM dans 500 µl de MeOH)

40* : concentration : 150 µM : (250 µM de 600 µM dans 750 µl de MeOH)

60* : concentration : 100µM : (166 µM de 600 µM dans 8350 µl de MeOH)

o Pour le 2ème étalon : 6,25-100 µM

A partir du 100 µM, des dilutions en cascade à raison 2 ont été effectuées pour obtenir la gamme étalon suivante : 6,25 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 100 µM.

Auteur Sandra FELANARISOA E-mail [email protected] Téléphone 0330325202 Titre Etude chimique, activités antiplasmodiale et antioxydante de Mussaenda erectiloba Wernham (Rubiacées) Nombre de page : 57 Nombre de tableaux : 14 Nombre de figures : 24 Nombre de schémas : 14 Nombre d’annexes : 3 Résumé Dans le cadre de la valorisation des plantes médicinales malgaches, les études chimique et biologique sur Mussaenda erectiloba aussi appelée Bremeria erectiloba ont été effectuées. Mussaenda erectiloba est une rubiacée endémique de Madagascar, utilisée traditionnellement pour traiter le paludisme. Les objectifs de ce travail sont de corroborer cet usage et de fournir les propriétés antioxydantes de cette espèce à travers ses constituants chimiques. La macération et le partage liquide-liquide ont été utilisés pour obtenir des extraits hydroalcoolique, hexanique, dichlorométhane, acétate d’éthyle et aqueux. Le fractionnement et l’isolement des produits de l’extrait acétate d’éthyle ont été réalisés par chromatographie sur colonne. Un produit a été identifié par analyse des spectres RMN 1D et 2D. Des tests antipaludiques et antioxydants ont été effectués pour caractériser les activités biologiques de cette espèce. Le criblage phytochimique a montré que ses feuilles contiennent des leucoanthocyanes, tanins, polyphénols, saponines, stéroïdes, iridoïdes et polysaccharides. Le fractionnement de l’extrait AcOEt a conduit à 10 fractions dont le produit identifié sous le nom de vogeloside est isolé de la fraction F1. L’extrait dichlorométhane a montré une activité antiplasmodiale intéressante avec une CI50 égale à 17,20 µg/ml. Les extraits dichlorométhane, acétate d’éthyle et aqueux ont révélés des activités antioxydantes par la méthode bioautographie et les pouvoirs antioxydants de l’extrait AcOEt et des fractions F1 et F2 ont été quantifiés par la méthode de DPPH. Mots-clés Mussaenda erectiloba, Bremeria, criblage, vogeloside, antipaludique, antioxydant, RMN Title Chemical study, antimalarial and antioxidant activities of Mussaenda erectiloba Wernham (Rubiaceae) Abstract As part of the valorization of malagasy medicinal plants, chemical and biological studies on Mussaenda erectiloba also called Bremeria erectiloba were carried out. Mussaenda erectiloba is a rubiaceae endemic to Madagascar, traditionally used to treat malaria. The aims of this study are to corroborate that traditional utilization and to provide antioxidant properties of this plant through its chemical constituents. Maceration and liquid-liquid partitioning were used to obtain hydroalcoholic, hexane, dichloromethane, ethyl acetate and aqueous extracts. Fractionation and isolation of the products of the ethyl acetate extract were carried out by column chromatography. One product was identified by analysis of its 1D and 2D NMR spectra. Antimalarial and antioxidant tests were performed to characterize the biological activities of this specie. Phytochemical screening has shown that its leaves contain leucoanthocyanins, tannins, polyphenols, saponins, steroids, iridoids and polysaccharides. Fractionation of the AcOEt extract resulted in 10 fractions whose product identified as vogeloside was isolated from the F1 fraction. The dichloromethane extract showed interesting antiplasmodial activity with an IC50 equal to 17.20 μg/ml. The dichloromethane, ethyl acetate and aqueous extracts revealed antioxidant activities by the bioautography method and the antioxidant activity of the AcOEt extract and fractions F1 and F2 were quantified through DPPH method. Key words Mussaenda erectiloba, Bremeria, screening, vogeloside, antimalarial, antioxidant, NMR Rapporteurs Andrianambinina A. RAZAKARIVONY, Maître de Conférences Laboratoire de Chimie Appliquée aux Substances Naturelles (LaCASN) Vahinalahaja E. RAZAFINTSALAMA, Maître de Recherches Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP)