UNIVERSIDAD CENTRAL ´´ MARTHA ABREU ´´ DE LAS VILLAS INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS

Tesis presentada en opción al grado académico de Master en Biotecnología Vegetal

Transformación genética de purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens y análisis de genes candidatos para la sobreprodución de cardenólidos

Autor: Lic. Yovanny Izquierdo Núñez Tutor: Dr. Elio Jiménez González

Santa Clara 2010 Resumen

RESUMEN

Los cardenólidos son metabolitos secundarios, producidos por las plantas del género Digitalis, que se utilizan ampliamente en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. El fracaso de los intentos por potenciar la producción de los mismos a partir de técnicas de cultivo in vitro, ha señalado a la transformación genética como una estrategia promisoria para la obtención de plantas altamente productoras. A pesar de contar con un sistema de regeneración de plantas, los intentos para transformar han sido infructuosos. Es por ello que el objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema de transformación de esta especie mediado por Agrobacterium tumefaciens y analizar desde un enfoque comparativo la regulación de los genes candidatos para la transformación. Se transformaron discos de hojas de plantas cultivadas in vitro con las cepas de A. tumefaciens EHA101 y C58C1-pMP90, con el vector de transformación pTJK136 que contenía al gen nptII como marcador de selección y uidA como gen reportero. Ambas cepas desarrollaron altos niveles de expresión transitoria del gen uidA, aunque sin diferencias significativas entre ambas. Sin embargo, a partir de la transformación con la cepa C58C1-pMP90 la inducción de callos y la regeneración de plantas fueron significativamente mayores respecto a la cepa EHA101. No hubo diferencias significativas en cuanto a la expresión estable de uidA en las plantas regeneradas a partir de la transformación con ambas cepas. La presencia de los transgenes fue detectada en las líneas de plantas regeneradas y el número de copias insertadas osciló entre una y dos. Para el estudio de los genes candidatos se detectaron los motivos reguladores en los promotores de los genes P5βR y P5βR2, codificantes para la enzima clave de la biosíntesis de cardenólidos en D. purpurea, a partir de su ortólogo VEP1 en y genes coexpresados con él. Como resultado, se predice que el gen P5βR está regulado principalmente por motivos de unión a factores de transcripción DOF, mientras que P5βR2 lo está por motivos de factores de respuesta a etileno. Estos resultados en combinación con los presentados por otros autores indican a

P5βR2 como el mejor candidato a la transformación de D. purpurea para obtener plantas sobreproductoras de cardenólidos. En su conjunto los resultados de este trabajo contribuyen al conocimiento sobre la biosíntesis de cardenólidos y permitirán obtener plantas transformadas altamente productoras de estos metabolitos de tanta importancia económica y social.

1 Índice

ÍNDICE

Sección...... Página

1. INTRODUCCIÓN...... 4

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...... 8

2.1 Digitalis purpurea L. Origen y clasificación...... 8

2.2 Descripción botánica...... 8

2.3 Importancia farmacológica...... 9

2.4 Cardenólidos...... 10

2.4.1 Estructura y propiedades farmacológicas...... 10

2.4.2 Mecanismo de acción...... 11

2.4.3 Metabolismo...... 12

2.4.4 Flexibilidad de la ruta...... 15

2.5 Cultivo in vitro de Digitalis...... 17

2.6 Producción de cardenólidos in vitro...... 18

2.7 Transformación genética. Agrobacterium...... 19

2.8 Factores que influyen en la eficiencia de la transformación con A. tumefaciens...... 21

2.9 Transformación genética en Digitalis...... 22

2.10 Chequeo de plantas transformadas...... 23

2.11 Selección de genes candidatos para transformación de D. purpurea...... 25

2.12 Análisis comparativo de regulación de genes...... 27

3. MATERIALES Y MÉTODOS...... 29

3.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas...... 30

3.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A.

tumefaciens...... 30

3.1.2 Análisis moleculares de las líneas de plantas regeneradas...... 34

2 Índice

3.2 Análisis comparativo de la regulación de los genes P5βR y P5βR2...... 39

3.2.1 Análisis de expresión del gen VEP1 de A. thaliana...... 39

3.2.2 Detección de motivos reguladores en P5βR y P5βR2...... 40

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...... 41

4.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas...... 41

4.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A. tumefaciens...... 41

4.1.2 Análisis molecular de las líneas de plantas regeneradas...... 46

4.2 Análisis comparativo de la regulación de los genes P5βR y P5βR2...... 49

4.2.1 Expresión del gen VEP1 de A. thaliana...... 50

4.2.2 Detección de motivos reguladores en P5βR y P5βR2...... 58

4.2.3 P5βR y P5βR2 como candidatos a transformación para el incremento de la síntesis de cardenólidos...... 62

5. CONCLUSIONES...... 64

6. RECOMENDACIONES...... 65

7. ANEXOS...... 66

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 69

3 1. Introducción

1. INTRODUCCIÓN

La transformación genética es una herramienta de especial interés para el mejoramiento genético, en particular de plantas productoras exclusivas de compuestos de interés farmacéutico tales como los glicósidos cardiotónicos o cardenólidos (Giddings et al., 2000). Estos metabolitos secundarios constituyen los medicamentos más extensamente tratados a nivel mundial en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca (Gavidia et al., 2007). Hasta la fecha, las plantas del género

Digitalis son las únicas fuentes viables desde el punto de vista económico para la producción de cardenólidos a escala industrial, de ahí que haya existido siempre un gran interés en el desarrollo de estrategias para fomentar la producción de estos metabolitos (Hagimori et al., 1980; Sales et al., 2007).

El cultivo in vitro ha sido extensamente explorado en este sentido, tratando sin éxito de lograr la producción de cardenólidos en biorreactores de suspensiones celulares (Hagimori et al., 1980). Más tarde fue descubierto que la biosíntesis de estos glicósidos se produce sólo en tejidos verdes diferenciados (Stuhlemmer y Kreis 1996), por lo que solo mediante la propagación de plantas en sistemas de inmersión temporal se obtienen niveles apreciables, aunque todavía menores que los obtenidos en condiciones de campo (Pérez-Alonso et al., 2009).

La ingeniería metabólica permite la manipulación de rutas biosintéticas de interés para modificar los niveles de determinados metabolitos, ya sea por adición de precursores, modificación de condiciones de cultivo o transformación genética (Venepoorte et al., 1999). Respecto a la biosíntesis de cardenólidos, la adición de precursores como la progesterona al medio de cultivo produce un aumento significativo de la biosíntesis (Hagimori et al., 1982b), pero su alto costo hace esta estrategia inviable. Como consecuencia, la transformación genética con un gen involucrado en la biosíntesis de este precursor o su canalización hacia la ruta de biosíntesis de los cardenólidos aparece como una alternativa promisoria para obtener plantas con una productividad elevada. Como ventaja adicional, este enfoque permitiría, en combinación con las técnicas de cultivo in vitro, propagar masivamente plantas transformadas con una productividad más uniforme que la registrada en condiciones naturales

4 1. Introducción

(Neczypor 1969). Esta estrategia ha sido empleada con éxito en la manipulación de otras rutas metabólicas secundarias en plantas, como los flavonoides (Ververidis et al., 2007) y alcaloides

(Hughes y Shanks 2002).

Para el desarrollo de una estrategia para el desarrollo de plantas genéticamente modificadas para la sobreproducción de compuestos de interés, son necesarios un sistema de regeneración de plantas, un protocolo de transformación y un gen (o varios genes) que potencie(n) la biosíntesis del metabolito en cuestión.

Para Digitalis purpurea no existe hasta la fecha un sistema de transformación descrito. Sólo se han publicado trabajos de este tipo en la especie relacionada Digitalis minor por Sales et al., (2003), quienes utilizan A. tumefaciens en la transformación de discos de hojas de plantas cultivadas in vitro.

Con anterioridad fue desarrollado un protocolo para la regeneración vía embriogénesis somática de D. purpurea, a partir de explantes foliares de plantas cultivadas in vitro (Occeguera 2006). Además se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias de varios agentes selectivos para cada fase del proceso (Occeguera 2006). Se hace necesario, por tanto, el desarrollo de un sistema de transformación en esta especie que permita la introducción de genes que potencien la biosíntesis de cardenólidos. Estas plantas transgénicas podrían ser empleadas con fines industriales, a través de la propagación masiva de biomasa en ambientes controlados o de su cultivo en condiciones de invernadero..

En cuanto a los genes candidatos para la transformación, varios autores apuntan a la

Progesterona 5β-reductasa como la enzima clave de la ruta de biosíntesis de cardenólidos (Seitz y

Gärtner 1994; Gavidia et al., 2007). Sin embargo, estudios recientes revelan la existencia de dos genes que codifican para esta actividad enzimática en D. purpurea: P5BR y P5BR2, con patrones de expresión diferentes (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Por otra parte, otros trabajos señalan que VEP1

(del inglés: vein patterning 1), el gen ortólogo de ambos en Arabidopsis thaliana, está asociado con la morfogénesis de los tejidos foliares (Jun et al., 2002), lo cual sugiere que esta actividad enzimática

5 1. Introducción pudiera también estar asociada a otros procesos fisiológicos en Digitalis, en adición a su rol en la biosíntesis de cardenólidos.

Por tanto, el estudio de la regulación de P5BR y P5BR2 es importante para poder decidir cuál de ellos es un mejor candidato para la transformación y bajo qué señales reguladoras. Sin embargo, la carencia de datos genómicos y de microarreglos en Digitalis es una limitante en este sentido. Es por eso que se requieren estudios comparativos a partir de especies modelo como A. thaliana para predecir cuáles son las vías de regulación de ambos genes en D. purpurea, mientras que el desarrollo de un sistema de transformación a través del cual se introduzca el transgén seleccionado permitirá la obtención de plantas transgénicas de D. purpurea con una productividad alta y uniforme de cardenólidos.

De ahí que la hipótesis sobre la que se basa este trabajo es: “Es posible desarrollar un sistema de transformación de D. purpurea mediado por A. tumefaciens y predecir la regulación de los posibles genes candidatos a partir de análisis de genómica y transcriptómica comparativas, como etapas previas al desarrollo de plantas transgénicas sobreproductoras de cardenólidos”.

El objetivo general de este trabajo es, por tanto:

- Desarrollar un sistema de transformación de D. purpurea mediado por Agrobacterium tumefaciens y predecir la regulación de posibles genes candidatos para la transformación

Este puede ser desglosado en los siguientes objetivos específicos:

- Desarrollar un sistema de transformación de D. purpurea mediado por Agrobacterium

tumefaciens

- Predecir la regulación de P5BR y P5BR2 a partir de análisis de genómica y transcriptómica

comparativa

La novedad científica de este trabajo radica en que se desarrollará por primera vez un sistema de transformación de D. purpurea y se estudiarán las señales de regulación de los genes VEP1, de A. thaliana; y P5BR y P5BR2, de D. purpurea. Los resultados podrán ser aplicados al diseño de

6 1. Introducción estrategias de transformación de D. purpurea para la obtención de plantas con una productividad alta y uniforme de cardenólidos.

El aporte práctico fundamental es que la producción in vitro y a gran escala de biomasa con un contenido de cardenólidos elevado y estable permitiría reducir los costos de producción de estos metabolitos ampliamente usados en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca.

7 2. Revisión Bibliográfica

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Digitalis purpurea L. Origen y clasificación

La planta D. purpurea es nativa de Europa occidental, el mediterráneo y el noroeste de África; aunque se ha naturalizado en otras regiones subtropicales o templadas de Europa, Asia, África,

América del Sur, Nueva Zelanda, Canadá y Estados Unidos (Hultén 1968). Debido a sus propiedades medicinales, se ha intentado introducir en Cuba junto a otras especies del género. En nuestro país su crecimiento en condiciones de campo se produce de manera rápida en otoño e invierno, sin embargo la llegada del verano por lo general ocasiona la muerte de la planta por la ocurrencia de altas temperaturas y abundantes lluvias (Roig 1974).

La planta es conocida en español con nombres comunes como Dedalera, Digital o Calzones de zorra. Su ubicación taxonómica fue dada a conocer por Linnaeus y en la actualidad se acepta de la siguiente forma (según NCBI , disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov):

Reino: Viridiplantae

Phylum: Strptophyta

División: Magnoliophyta

Subclase:

Orden:

Familia:

Tribu: Digitalideae

Género: Digitalis

2.2 Descripción botánica

Esta planta es una hierba bienal o perenne, de hasta 2,5 m de altura. Las hojas son alternas, las basales reunidas en una roseta, pecioladas con limbo ovado-lanceolado y margen dentado, densamente pilosas sobre todo por el envés, que tiene una coloración grisácea. Presenta una inervación reticular (reticulódromas) muy saliente por el envés e inflorescencia en un largo racimo

8 2. Revisión Bibliográfica terminal. Las flores son pedunculadas y algo péndulas, muy vistosas. El cáliz pentámero, verde, corola de 40-55 mm de longitud, en forma de tubo ancho apenas lobulado en la porción distal, de color en el rango desde el púrpura hasta el blanco con manchas oscuras en su interior. Su androceo está formado por 4 estambres didínamos de longitud desigual, fusionados a la corola y cuyas anteras se disponen en la parte superior del tubo de la corola. El gineceo es bicarpelar, con ovario súpero que fructifica en una cápsula de dehiscencia valvar. Florece entre la primavera y el verano. El fruto es una cápsula que al madurar se abre desprendiendo numerosas semillas de 0,1 a 0,2 mm de diámetro (Renobales

2001). En el primer año de crecimiento produce únicamente las hojas basales, ovales, dentadas y de peciolo largo mientras que durante el segundo año se desarrolla un tallo largo y cubierto de hojas sésiles y rugosas.

2.3 Importancia farmacológica

D. purpurea ha sido empleada desde la antigüedad como planta medicinal en el tratamiento de enfermedades cardíacas de manera empírica. Sin embargo, no fue hasta 1785 que William Withering describió sus propiedades medicinales en el tratamiento de la hidropesía, enfermedad caracterizada por la acumulación excesiva de líquido en los tejidos y que en la medicina moderna se reconoce como una consecuencia de la insuficiencia cardíaca (Withering 1785). En este mismo trabajo también se describían por primera vez los efectos tóxicos derivados de dosis elevadas de preparaciones de la planta. No fue hasta 1799, sin embargo, que la acción farmacológica de D. purpurea fue relacionada con su efecto sobre el corazón (Ferriar 1799). Estudios posteriores demostraron que la digital contiene una serie de sustancias cardiotónicas muy activas de naturaleza esteroideo-glicosídica conocidas comúnmente como glicósidos cardiotónicos, o más formalmente cardenólidos. Además, la planta produce otros compuestos no glicosídicos como la digitoflavina, el ciclohexanol, taninos, ácidos málico y succínico, los cuales complementan la acción de aquellos (Melero et al., 2000). En la actualidad varios cardenólidos, principalmente la digoxina y sus derivados, son utilizados en la terapia cardíaca.

9 2. Revisión Bibliográfica

Su importancia es tal que no han podido ser sustituidos hasta la fecha, al menos en el tratamiento a gran escala (Gavidia et al., 2007).

2.4 Cardenólidos

2.4.1 Estructura y propiedades farmacológicas

Los cardenólidos son moléculas caracterizadas por un núcleo esteroideo (genina o aglicona) que cuenta con un grupo hidroxilo en la posición C14β y un anillo lactónico insaturado de cinco miembros en la posición C17β. Varias de las demás posiciones de la fracción genina pueden tener además sustituyentes como grupos hidroxilo, formilo o acetilo (Kreis et al., 1998; Herl et al., 2005). A la posición C3β se une una cadena de oligosacáridos típicamente de hasta cinco unidades dentro de las cuales es usual encontrar azúcares poco comunes (Melero et al., 2000) (Figura 1). En cuanto a sus patrones de glicosilación, los cardenólidos se clasifican en primarios, si el azúcar terminal es la glucosa, o secundarios en caso contrario. El núcleo esteroideo tiene además la característica peculiar de tener sus cuatro anillos fusionados en la secuencia cis-trans-cis desde el A hasta el D (Figura 2), lo cual les confiere su actividad farmacológica a estos compuestos (Melero et al., 2000).

Figura 1. Estructura química de los cardenólidos. Como ejemplo, la digoxina (I) está formada por un núcleo esteroideo (aglicona) y tres unidades de digitoxosa. Las variaciones en el patrón de glicosilación de la aglicona dan lugar a los núcleos esteroideos de la digitoxina (II) y la gitoxina (III)

10 2. Revisión Bibliográfica

Figura 2. Estereoquímica cis-trans-cis de los cardenólidos (a) comparada con otras conformaciones del núcleo esteroideo (b).

Las relaciones estructura-actividad han sido ampliamente estudiadas en los cardenólidos. Al respecto se han determinado tres regiones importantes en el reconocimiento por el receptor: el núcleo esteroideo, a través de interacciones hidrofóbicas; el anillo lactónico de la posición C17β y los residuos de azúcares, estos últimos por interacciones electrostáticas y puentes de hidrógeno (Thomas et al.,

1990). De los tres, el núcleo esteroideo con su característica conformación parece ser el determinante, ya que la unión de las otras dos regiones al receptor depende de la unión previa de la genina (Melero et al., 2000). La farmacocinética de los cardenólidos también depende en gran parte de su estructura. En cuanto al número de restos de azúcares enlazados, la potencia farmacológica varía en el orden monosacárido-aglicona > disacárido-aglicona > trisacárido-aglicona >> aglicona. En cuanto a la velocidad de absorción, esta es inversamente proporcional a la cantidad de restos de azúcares enlazados (Chiu y Watson 1985 ).

2.4.2 Mecanismo de acción

En cuanto a su mecanismo de acción, los glicósidos cardiotónicos pueden ser definidos como inhibidores alostéricos de la bomba Na+-K+, que se unen de manera no covalente a la misma (Repke et al., 1989). La bomba Na+-K+ (E.C. 3.6.1.37) es una enzima transportadora presente en casi todos los

11 2. Revisión Bibliográfica tipos de célula del reino animal. Su función es movilizar iones sodio hacia en exterior celular a la vez que transporta iones potasio a la célula, a costa de la hidrólisis de ATP. La bomba mueve ambos iones en contra de su gradiente de concentración, de manera que es la encargada de mantener dicho gradiente que es, por una parte, responsable de la polarización de la membrana plasmática y por otra, utilizado como fuente de energía para el transporte de otros iones y moléculas necesarias para el funcionamiento celular (Skou 1965).

De acuerdo con el mecanismo de acción de los glicósidos cardiotónicos (Thomas et al., 1990), estos inhiben la bomba Na+-K+ (alrededor del 30% con dosis terapéuticas) causando un incremento intracelular de Ca2+ en el músculo cardíaco y por consiguiente un aumento en la fuerza de la contracción.

Las dosis elevadas de estos glicósidos provocan la paralización en cadena de numerosos procesos de transporte secundario de iones y nutrientes que dependen de la bomba Na+-K+, lo cual conduce a la muerte celular y es la base de la toxicidad de estos compuestos. Este hecho, unido a la ubicuidad de la bomba Na+-K+ en el reino animal justifica que se haya propuesto que la función natural de los cardenólidos sea como repelentes de herbívoros que traten de alimentarse de las hojas de plantas del género Digitalis (Malcolm y Zalucki 1996).

2.4.3 Metabolismo

Debido al potencial farmacológico de los cardenólidos, se han hecho consistentes esfuerzos por dilucidar sus rutas de biosíntesis y posterior degradación. Sin embargo, las limitaciones técnicas derivadas de la escasez de datos genómicos de esta especie combinadas con la complejidad de la red metabólica en la que se encuentran inmersos los cardenólidos, ha provocado que el conocimiento de dichas vías metabólicas sea aún incompleto.

La biosíntesis de los cardenólidos puede decirse que comienza a partir de la degradación oxidativa de la cadena lateral de los fitosteroles (colesterol, campesterol, sitosterol, estigmasterol) por la enzima colesterol monooxigenasa (EC 1.14.15.6) o enzima degradadora de cadenas laterales

(SCCE, del inglés: side chain cleaving enzyme) (Figura 3). El producto de esta reacción es la

12 2. Revisión Bibliográfica

Figura 3. Biosíntesis de cardenólidos (color negro) y su relación con otras rutas metabólicas (color gris). Los nombres de las enzimas se destacan en letra cursiva. Tomado de Fisterbusch et al. (1999), con modificaciones. pregnenolona, la cual es oxidada reversiblemente a pregn-5-eno-3,20-diona por la enzima Δ5-3β- hidroxiesteroide deshidrogenasa (EC 1.1.1.145) (3βHSD, siglas en inglés). Este último compuesto se transforma rápidamente en su isómero pregn-4-eno-3,20-diona (progesterona). No queda claro si la actividad Δ5- Δ4 cetoesteroide isomerasa reside en la propia 3βHSD, en otra enzima asociada o si la

13 2. Revisión Bibliográfica reacción ocurre espontáneamente por vía no enzimática debido a la mayor estabilidad del producto Δ4

(Lindemann y Luckner 1997; Finsterbusch et al., 1999).

La próxima reacción de la ruta es la reducción del doble enlace de la progesterona para dar 5β- pregnano-3,20-diona, primer compuesto en el que aparece la conformación 5β característica de los cardenólidos y que por consiguiente se considera el primer paso comprometido absolutamente con la producción de estos compuestos (Gavidia et al., 2007). La reacción es catalizada por la progesterona-

5β-reductasa, actividad codificada por al menos dos genes en D. purpurea (Pérez-Bermúdez et al.,

2010). A continuación, la 5β-pregnano-3,20-diona es reducida en su posición C3 a 5β-pregnano-3β-ol-

20-ona por la propia 3βHSD (Finsterbusch et al., 1999). La ruta continúa por derivados de pregnano a partir de las hidroxilaciones en C14 y C20 hasta la condensación en esta última posición con Acetil-

CoA y la formación del anillo lactónico (Kreis et al., 1998). La sucesión de enzimas en esta porción de la ruta, sin embargo, no se encuentra descrita.

En general se asume que la adición de azúcares a la posición C3 se produce luego de la formación de la aglicona, aunque no existen evidencias definitivas acerca de la secuencia relativa de los eventos de glicosilación e hidroxilación. La glicosilación de los glicósidos secundarios a primarios es catalizada por la enzima citosólica y soluble UDP-glucosa:digitoxina 16'-O-glucosiltransferasa (DGT,

EC 2.4.1.-) en Digitalis lanata (Kreis et al., 1986). Estos glicósidos primarios son considerados la forma fundamental de almacenamiento en la vacuola central (Hoelz et al., 1992). Otra enzima relacionada con la biosíntesis tardía de los cardenólidos es la también soluble y citosólica Acetil-CoA:digitoxina 15'-

O-acetil transferasa (DAT, EC 2.3.1.-) que cataliza la formación de los lanatósidos a partir de sus precursores no acetilados (Sutor et al., 1990). Este grupo de cardenólidos se denomina de esta forma por ser los más abundantes en D. lanata.

El metabolismo de degradación y movilización de los cardenólidos también ha sido estudiado.

Al respecto, se han descrito las cardenólido glucohidrolasas (CGH) I y II. CGH-I es una enzima de membrana, mientras que CGH II es soluble en el citosol (May y Kreis 1997; Hornberger et al., 2000).

Ambas hidrolizan rápidamente los glicósidos primarios vacuolares una vez que la compartimentación

14 2. Revisión Bibliográfica celular es eliminada, aunque sus especificidades de substrato difieren. En particular, CGH II sólo acepta glicósidos no acetilados, de manera que no puede hidrolizar lanatósidos, que sí son procesados por CGH I. De manera general, ambas enzimas se relacionan con la movilización de cardenólidos desde la vacuola presumiblemente ante ataques de herbívoros (Hornberger et al., 2000).

Además se ha descrito una lanatósido 15'-O-acetilasa, supuestamente vinculada a los mismos procesos de CGH-I y CGH-II (Sutor et al., 1990).

2.4.4 Flexibilidad de la ruta

Los esteroides son sustancias estructuralmente relacionadas con muchas y muy diversas funciones en la fisiología de las plantas. Estas pueden ser estructurales, hormonales, de defensa, etc.

Como consecuencia de esto las rutas metabólicas que se involucran son a menudo complejas. En el caso de la biosíntesis de cardenólidos, la primera parte de la ruta hasta la formación de progesterona se ramifica hacia otras vías metabólicas en plantas (Mueller et al., 2003). De hecho, el suministro de colesterol o pregnenolona al medio de cultivo de D. purpurea no se traduce en un aumento de la producción de cardenólidos según resultados publicados por Hagimori et al., (1983) y atribuidos al hecho de que estos esteroles son precursores de otras rutas metabólicas. Sin embargo, Sales et al.,

(2007) han logrado obtener líneas transgénicas de Digitalis minor que sobreexpresan el dominio catalítico de la enzima hidroximetil glutaril CoA reductasa (HMGCoA reductasa) de Arabidopsis thaliana y presentan mayor contenido de cardenólidos que las plantas no transformadas. HMGCoA reductasa es una enzima clave en la ruta de síntesis de esteroles que desemboca en la síntesis del colesterol, por lo que en principio su sobreexpresión debe afectar a todos los esteroles derivados de este, incluidos los cardenólidos.

Existe por tanto una aparente contradicción con los experimentos de suministro de colesterol de

Hagimori y colaboradores (1983), que puede explicarse al considerar, por una parte, la diferente naturaleza de inducción metabólica que existe entre suministrar un metabolito y sobreexpresar un gen; y por otra, la aleatoriedad de los eventos de transformación genética que puede provocar activación o

15 2. Revisión Bibliográfica represión de otros genes de manera que el efecto observado pueda no sólo deberse al transgén en sí, sino además, al lugar donde se inserte. Una evidencia de esto último es el hecho de que de las líneas transgénicas obtenidas en el mencionado trabajo no todas mostraron un incremento en el contenido de cardenólidos.

Más adelante en la ruta, la enzima 3βHSD es un buen ejemplo de plasticidad por cuanto cataliza varias reacciones tanto dentro de la biosíntesis de los cardenólidos como la de los pregnanos

5α-derivados (Finsterbusch et al., 1999).

Sólo a nivel de la progesterona es que se observa una respuesta de síntesis de glicósidos ante la administración del substrato, lo cual soporta la hipótesis de que su reducción en 5β es la primera reacción específica de la ruta (Gärtner y Seitz 1993). No obstante, la progesterona se encuentra relacionada con otros procesos fisiológicos vegetales, aunque el conocimiento al respecto es limitado.

Ylstra et al., (1995) demostraron que varias hormonas animales incluida la progesterona estimulaban la germinación y el crecimiento del tubo del polen en tabaco (Nicotiana tabacum). Además se ha demostrado que puede inducir floración o desarrollo generativo en trigo (Hordeum vulgare) (Janeczko y Filek 2002) y A. thaliana (Janeczko et al., 2003).

La reducción de la progesterona para dar lugar a la 5α-pregnano-3,20-diona es el camino alternativo a la síntesis de los cardenólidos que puede seguir esta sustancia, para dar lugar a una ruta que desemboca en la síntesis de los brasinoesteroides (Clouse y Sasse 2003; Iino et al., 2007). Estos son fitohormonas a las que se les atribuyen una variedad de funciones como la elongación celular, división celular, diferenciación vascular y modulación de respuestas a estrés (Clouse y Sasse 2003).

Por último, el hallazgo de que la actividad progesterona 5β-reductasa está codificada por al menos dos genes (P5βR y P5βR2) en D. purpurea, reafirma la complejidad del contexto de la ruta de los cardenólidos (Pérez-Bermúdez et al., 2010). De estos dos genes, P5βR2 parece estar relacionado directamente con la biosíntesis en respuesta a condiciones de estrés, mientras que P5βR mantiene una expresión basal que pudiera estar relacionado con otras funciones desconocidas (Pérez-

Bermúdez et al., 2010). Esto concuerda con el hecho de que su ortólogo en A. thaliana (VEP1, del

16 2. Revisión Bibliográfica inglés Vein Patterning 1) fue inicialmente involucrado en la diferenciación vascular (Jun et al., 2002), y sólo después se demostró su actividad enzimática (Herl et al., 2009) lo cual pone en tela de juicio el argumento de que la reducción 5β de la progesterona es una reacción absolutamente comprometida con la síntesis de glicósidos cardiotónicos.

Todos estos elementos demuestran la relación de la biosíntesis de cardenólidos con otros procesos fisiológicos. Tal interconexión implica una fina regulación por parte de la planta, pero además entraña un reto en las proyecciones de ingeniería metabólica para incrementar la producción de estos fármacos en el género Digitalis.

2.5 Cultivo in vitro de Digitalis

Por su importancia en la industria farmacéutica las especies del género Digitalis han sido objeto de estudio en cuanto a sus potencialidades en el cultivo in vitro, casi siempre ligadas a la producción de cardenólidos. Para algunas de estas especies, se han descrito considerables fluctuaciones de productividad y composición de los componentes activos, así como variaciones morfológicas entre individuos. Estas variaciones son atribuidas al relativamente corto tiempo de cultivo de estas especies

(a pesar de su extensivo uso a lo largo de la historia) así como la variación en el número de cromosomas y la formación espontánea de híbridos (Neczypor 1969). De manera que, en los inicios, la exploración del cultivo in vitro en dicho género tuvo como finalidad la propagación de líneas de elevada productividad y el desarrollo de métodos de producción de cardenólidos a escala industrial. En

1975 Corduan y Spix desarrollaron un protocolo de regeneración de plantas a partir de cultivo de anteras de D. purpurea. En este trabajo se establecían las condiciones para obtención de callos haploides así como la regeneración y conversión de plantas diploides y tetraploides (Corduan y Spix

1975).

A principios de los 80, Hagimori y colaboradores realizaron una serie de trabajos en los que se desarrollaban diferentes etapas del cultivo in vitro de D. purpurea. (Hagimori et al., 1980). Este mismo grupo de investigadores logró desarrollar suspensiones celulares en condiciones de luz y oscuridad

17 2. Revisión Bibliográfica

(Hagimori et al., 1982a). Otros trabajos dan cuenta de la restauración del potencial regenerativo de cultivos prolongados de brotes de D. purpurea por acción del ácido giberélico (Chaturvedi y Jain 1994).

Para otras especies del género también han sido desarrollados protocolos de regeneración in vitro. Pérez-Bermúdez et al. (1984) estudiaron la morfogénesis a partir de explantes foliares de

Digitalis obscura. Un estudio similar desarrollado por Cacho et al. (1991) estableció el potencial morfogenético in vitro de explantes de hojas, hipocótilos y raíces de Digitalis thapsi. En D. lanata han sido establecidos protocolos tanto de organogénesis como de embriogénesis somática (Tewes et al.,

1982; Diettrich et al., 1986), mientras que en D. minor se han establecido protocolos de regeneración vía organogénesis a partir tanto de tratamiento con reguladores del crecimiento como de la infección de explantes foliares con Agrobacterium tumefaciens (Sales et al., 2002).

En D. purpurea, sin embargo, además de los trabajos de morfogénesis mencionados, solo se ha descrito un protocolo completo de regeneración por embriogénesis somática (Occeguera 2006). En este mismo trabajo se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias de los agentes selectivos higromicina B y geneticina en la fase de inducción de callos.

2.6 Producción de cardenólidos in vitro

El cultivo in vitro comenzó a desarrollarse en especies de Digitalis desde hace varias décadas, por el entusiasmo que representaba la posibilidad de utilizar sus facilidades de automatización para la producción de cardenólidos. Sin embargo, dentro de los métodos de producción de biomasa, los intentos de producción mediante cultivos celulares en biorreactores fracasaron visiblemente (Hagimori et al., 1980; Hagimori et al., 1982a). El estudio de las condiciones necesarias para incrementar la producción de cardenólidos se convirtió, por tanto, en una prioridad.

Varios trabajos desde finales de la década del 70 ya daban cuenta de la baja productividad de las células indiferenciadas (Hirotani y Furuya 1977; Garve et al., 1980; Hagimori et al., 1980). Estos resultados, conjuntamente con el hecho de que las partes verdes de la planta sean las de mayor producción de cardenólidos (Stuhlemmer y Kreis 1996), condujeron al estudio del efecto de la luz, la

18 2. Revisión Bibliográfica presencia de cloroplastos y la diferenciación celular en la productividad de D. purpurea (Hagimori et al.,

1982b). Estos investigadores encontraron que la organogénesis era el factor primario que determinaba la síntesis de estos metabolitos, mientras que la luz estimula la biosíntesis una vez que los tejidos productores ya están formados. Estudios posteriores en D. lanata corroboraron estas observaciones al demostrar la síntesis de novo de cardenólidos en brotes cultivados en la oscuridad, la cual se incrementaba considerablemente al trasponer los brotes a la luz (Eisenbeiß et al., 1999).

Como consecuencia de todo esto, la producción de biomasa de D. purpurea a partir de sistemas de inmersión temporal ha surgido como la estrategia más viable que combine las bondades del cultivo in vitro y los requerimientos de diferenciación celular necesarios para obtener niveles razonablemente altos de cardenólidos (Pérez-Alonso et al., 2009).

También ha sido estudiada la influencia de los nutrientes del medio de cultivo sobre la productividad de suspensiones celulares de D. purpurea llevando a optimizar los niveles de sales y vitaminas (Hagimori et al., 1982a), calcio, magnesio y varios microelementos (Hagimori et al., 1983).

Otros factores relacionados con la producción de cardenólidos en Digitalis son el genotipo

(Gavidia et al., 1996; Nebauer et al., 1999), la concentración de CO2, el estrés hídrico (Stuhlfauth et al.,

1987) y la estación del año (Roca-Pérez et al., 2004). Además, se ha encontrado una correlación positiva con la biomasa (Kosinski 1996) y la respuesta defensiva ante herbívoros (Malcolm y Zalucki

1996).

2.7 Transformación genética. Agrobacterium

La transformación genética es la metodología mediante la cual se inserta ADN foráneo de manera estable dentro de un genoma hospedero, y resulta una técnica de mejoramiento con amplias potencialidades de uso en ingeniería metabólica. Esto radica en el hecho de que seleccionando adecuadamente genes reguladores de alguna ruta en particular se puede lograr aumentar la producción de metabolitos de interés a partir de la sobreexpresión o silenciamiento de aquellos (Gelvin

19 2. Revisión Bibliográfica

2003b). En el caso de los cardenólidos, su estatus de producto final de una ruta los hace un blanco atractivo para la transformación.

Existen varias metodologías de transformación de plantas. Las más utilizadas han sido la biobalística y sobre todo la mediada por bacterias del género Agrobacterium. Estas últimas son componentes ubicuos de la microbiota del suelo, siendo la mayoría bacterias saprofíticas cuyo hábitat es la materia orgánica en descomposición (Escobar y Dandekar 2003). Sin embargo, algunas de estas especies causan enfermedades neoplásicas en plantas. Por ejemplo, Agrobacterium rhizogenes, causante de la formación de raíces adventicias; Agrobacterium rubi (enfermedad de la agalla de la caña), A. tumefaciens (enfermedad de la agalla de la corona) y Agrobacterium vitis (agalla de la corona de la uva) (Chilton et al., 1977). Estas enfermedades han sido descritas como una forma de

“colonización genética”, debido a que se caracterizan por la transferencia y expresión de un conjunto de genes hacia las células de la planta que causan un crecimiento celular incontrolado y la producción por estas células de sustancias nutritivas para la bacteria. Estas sustancias, conocidas como opinas, son aminoácidos de bajo peso molecular y derivados fosfatados de azúcares (Schell et al., 1979).

Aunque ha sido principalmente utilizado en ingeniería de plantas (Gelvin 2003b), Agrobacterium puede transformar virtualmente cualquier tipo celular, desde otros procariontes (Kelly y Kado 2002), pasando por levaduras y hongos (Piers et al., 1996; De Groot et al., 1998), hasta incluso células humanas

(Kunik et al., 2001).

Las características de las enfermedades causadas por especies de Agrobacterium son resultado de la transferencia de un segmento de ADN (ADN-T) del plasmidio inductor de tumores (Ti) hacia la célula hospedera, su integración en el genoma y la expresión de los genes que contiene. El plasmidio Ti contiene dos componentes necesarios para la transformación: los genes vir y la región

ADN-T (Gelvin 2003a).

Los genes vir codifican la mayor parte de las proteínas necesarias para el procesamiento, transporte y entrada al núcleo del ADN-T (Tzfira y Citovsky 2000). La región ADN-T contiene dos clases de genes: oncogenes y genes del metabolismo de opinas. Los oncogenes codifican proteínas

20 2. Revisión Bibliográfica para la síntesis de reguladores del crecimiento como auxinas y citocininas, así como para la modificación del efecto de estas substancias en la célula (Gaudin et al., 1994; Zhu et al., 2000). Los genes del metabolismo de opinas codifican funciones de síntesis, captación y catabolismo de estos compuestos. Existen más de 20 clases de opinas descritas, de manera que cada cepa de

Agrobacterium induce la producción y luego metaboliza un conjunto específico de estas. Estos conjuntos varían entre especies y solo unas pocas opinas son encontradas en varios a la vez (Escobar y Dandekar 2003).

La región ADN-T, sin embargo, no contiene ninguna secuencia señal ni codifica ninguna función de transporte o integración. De hecho, solo los bordes de este fragmento, que contienen repeticiones directas de 25 pares de bases, son necesarios como substrato de la integración, lo cual permite la substitución de los genes del ADN-T por genes de interés sin afectar el proceso de transformación (Scheiffele et al., 1995). Precisamente aquí radica la clave del uso tan extendido de

Agrobacterium en ingeniería genética.

2.8 Factores que influyen en la eficiencia de la transformación con A. tumefaciens

Existe una serie de factores que influyen en la eficiencia de la transformación de tejidos vegetales por A. tumefaciens. Uno de los más importantes es la virulencia de la cepa bacteriana utilizada (Grant et al., 2003). De manera general existen cepas con virulencia baja, moderada o alta

(Maheswaran et al., 1992). Varios autores refieren las ventajas de cepas altamente virulentas en cuanto a la eficiencia de la transformación (Lulsdorf et al., 1991; Nadolska-Orczyk y Orczyk 2000), sin embargo otros trabajos demuestran la ventaja del uso de cepas menos virulentas cuando la planta desarrolla naturalmente una respuesta necrótica a Agrobacterium (Wroblewski et al., 2005).

Otro factor estudiado y muy relacionado con la virulencia de la cepa es la adición de acetosiringona al medio de cocultivo. Esta sustancia de naturaleza fenólica induce la expresión de los genes vir (Rogowsky et al., 1987) por lo que en muchos casos aumenta la eficiencia de la transformación por Agrobacterium.

21 2. Revisión Bibliográfica

También influyen el rango de hospederos de la cepa de Agrobacterium (Torregrosa et al.,

2002), las condiciones de oscuridad durante el cocultivo (Cervera et al., 1998), la densidad óptica del cultivo de A. tumefaciens utilizado (Archilletti et al., 1995), el explante inicial y el genotipo de la planta

(Li et al., 1992).

En los trabajos previos de transformación de Digitalis minor (Sales et al., 2003) desarrollaron un sistema de transformación en el que utilizaban la cepa EHA105 (Hood et al., 1993) de alta virulencia, con la adición de acetosiringona al medio de cocultivo. Sin embargo, en un trabajo posterior en el que utilizaron dicho sistema para la introducción de un gen metabólicamente relevante estos mismos investigadores utilizaron la cepa ambiental de virulencia moderada C58 (Sales et al., 2007).

En este trabajo se compara la eficiencia de transformación con las cepas EHA101 (Hood et al.,

1986) y C58C1-pMP90 (Koncz y Schell 1986). Ambas cepas tienen el mismo fondo genético cromosomal correspondiente a la cepa ambiental C58, por lo que la diferencia de virulencia entre ambas está determinada por el plasmidio auxiliar que contiene los genes vir en cada una (Lee y Gelvin

2008).

2.9 Transformación genética en Digitalis

Las plantas del género Digitalis son bien conocidas por la producción de glicósidos cardiotónicos de gran demanda farmacéutica, por lo que muchos trabajos se han enfocado en las diferentes vías de aumentar la productividad de las plantas. A medida que se ha ampliado el conocimiento de las rutas de biosíntesis de cardenólidos, también ha ido aumentando el interés por incluir la transformación genética dentro de las alternativas de mejoramiento en este género. Sin embargo hasta el momento existen solo unos pocos antecedentes de transformación en Digitalis.

Los trabajos más sostenidos de transformación en este género han sido realizados en la especie D. minor. En un primer intento, Sales et al. (2002) describieron la regeneración eficiente de la planta a partir de explantes de hojas infectadas con la cepa 82.139 de A. tumefaciens. Durante el proceso de infección, el transgén reportero codificante para la subunidad A de la glucuronidasa (gusA)

22 2. Revisión Bibliográfica fue detectado en los tumores inducidos por la bacteria. Sin embargo, ni los brotes y raíces regenerados, ni las plantas obtenidas resultaron transformadas. Posteriormente este mismo grupo de investigadores publicó un sistema de transformación mediado por A. tumefaciens en esta misma planta, pero esta vez utilizando las cepas EHA105 y AGL1 que contenían el transgén reportero gusA y genes marcadores de selección. En esta ocasión, una vez más los explantes de partida utilizados fueron discos de hojas de plantas cultivadas in vitro empleando acetosiringona como estimulante de la virulencia de Agrobacterium en las fase de cocultivo (Sales et al., 2003). Dicho sistema de transformación fue utilizado para obtener plantas de D. minor que sobreexpresaban el dominio catalítico de HMGCoA reductasa de A. thaliana (Sales et al., 2007). Algunas de las líneas obtenidas presentaron un mayor contenido de cardenólidos (hasta un 40%) tanto in vitro como en condiciones de invernadero. Sin embargo, los efectos pleiotrópicos de esta enzima sobre el metabolismo esteroideo ponen en duda su aplicabilidad en la transformación de otras especies del género.

En cuanto a D. purpurea, ya en 1990 Saito y colaboradores lograron la transferencia de un vector T al genoma de esta especie a través de la transformación de discos de hojas de la planta con la bacteria A. rhizogenes. Esta bacteria es capaz de inducir la rizogénesis por lo que estos investigadores lograron la generación y el cultivo de raíces transgénicas, sin embargo no lograron la regeneración de plantas completas a partir de estas (Saito et al., 1990). Este es el único antecedente de transformación genética de D. purpurea, por lo que no existe hasta el momento ningún trabajo que describa un protocolo de transformación completo en esta especie.

2.10 Chequeo de plantas transformadas

Mediante la transgénesis de plantas es posible obtener individuos transformados que expresen un fenotipo diferente, con características deseables en cuanto a productividad, resistencia a patógenos, a la desecación, etc. Dentro de las estrategias de obtención de plantas transformadas, la infección con A. tumefaciens que contenga un transgén en su ADN-T ha sido una de las más utilizadas

23 2. Revisión Bibliográfica por la capacidad de estas bacterias de transformar un amplio rango de tipos celulares y especies vegetales.

El desarrollo de un protocolo de transformación por Agrobacterium requiere invariablemente un método de selección de las plantas regeneradas (Birch 2003). Es por tanto muy común la utilización de marcadores de selección en los vectores de transformación, que confieran resistencia a herbicidas, antibióticos, u otras condiciones de toxicidad o estrés para la planta (Gelvin 2003b). Otra forma de selección fenotípica es la utilización de genes reporteros, esto es, que bajo determinada condición o ensayo sencillo pueda determinarse su presencia por expresión de alguna característica fenotípica o actividad enzimática (Gelvin 2003b). Dentro de los más utilizados se encuentran los genes gusA, lucFF, gfp y grp. El gen gusA codifica una glucuronidasa que al actuar sobre el sustrato 5-bromo-4- chloro-3-indolil-β-D-glucurónido forma un producto azul fácilmente visible (Jefferson et al., 1987). El ensayo puede ser realizado de manera muy sencilla por exposición del tejido vegetal supuestamente transformado a una solución del sustrato en condiciones óptimas de reacción. El gen lucFF codifica la luciferasa, una enzima aislada a partir de la luciérnaga (Photinus pyralis) que oxida a su substrato, la luciferina, liberando energía en forma de luz. Los genes gfp y grp codifican para las proteínas fluorescentes verde y roja, respectivamente. Estas dos proteínas fluorescen espontáneamente, por lo que al igual que la luciferina en presencia de su substrato pueden ser detectadas al observar un corte del tejido vegetal en condiciones de oscuridad (Hakkila et al., 2002). En Digitalis se han descrito protocolos de transformación que utilizan gusA como gen reportero, y varios genes de resistencia a antibióticos como marcadores de selección (Sales et al., 2003; Sales et al., 2007). En los últimos años, sin embargo, la utilización de estos marcadores ha generado interrogantes sobre si estos genes pudieran ser transferidos hacia otras plantas u organismos en general, con las consecuencias ecológicas, bioéticas y sobre la salud humana que este hecho pudiera tener. Es por eso que se han desarrollado métodos de trasformación mediante los cuales se elimina el marcador de selección por acción de enzimas recombinasas o transposasas contenidas en los vectores de transformación, o por

24 2. Revisión Bibliográfica la técnica de co-transformación, de manera que se escindan estos genes marcadores ante la activación por algún estímulo (Scutt et al., 2002).

Los métodos de selección fenotípica son muy útiles ya que constituyen un primer y rápido tamizaje de las plantas regeneradas. Sin embargo, es necesario además verificar la inserción de la construcción transgénica en el genoma hospedero. La técnica más utilizada para esto es la amplificación de los transgenes basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) sobre ADN de la planta transformada (Gachet et al., 1998). Otras técnicas, que además permiten saber el número de copias insertadas, son la hibridación por Southern Blot y el PCR cuantitativo (Anand et al., 2003). El conocimiento del número de copias de un transgén es importante por cuanto puede influir directamente en los niveles de expresión, además de que está relacionado con el nivel de alteración del resto del genoma (Bejar et al., 2002). Generalmente es deseable la inserción de una sola copia del transgén para minimizar ambos efectos. Tanto el PCR como Southern blot han sido utilizados para comprobar la transformación de D. minor (Sales et al., 2003; Sales et al., 2007).

También es importante conocer el lugar exacto donde los transgenes se insertan.

Especialmente si se quiere estudiar desde el punto de vista básico qué secuencia fue interrumpida por la inserción o si se quiere validar una línea transgénica con fines comerciales. La técnica de PCR invertido permite determinar el sitio de inserción a partir de la amplificación de las secuencias flanqueantes del inserto y su posterior secuenciación (Hoshi et al., 2004).

2.11 Selección de genes candidatos para transformación de D. purpurea

La selección de genes candidatos para la transformación genética no es una tarea fácil. El análisis de la siempre creciente cantidad de datos biológicos generados en la actualidad ha revelado una relación compleja entre los diferentes loci y los caracteres fenotípicos, de manera que varios loci pueden tener diferentes grados de influencia en cada carácter (Mcmullen et al., 1998). Esta realidad ha impulsado el desarrollo de enfoques que abarcan diferentes fuentes de datos para resolver el problema, como la búsqueda de genes candidatos para la caracterización de loci con influencia

25 2. Revisión Bibliográfica fenotípica cuantitativa (QTL, del inglés quantitative trait loci) (Pflieger et al., 2001). Este tipo de enfoques, sin embargo, requieren de un volumen de datos genómicos y/o fenotípicos con los que no se cuenta por el momento para la especie D. purpurea en relación con su producción de cardenólidos.

La selección del candidato óptimo para obtener plantas transformadas altamente productivas debe basarse, por lo tanto, en el conocimiento existente sobre los pocos genes conocidos que influyen en las rutas de biosíntesis y degradación de estos metabolitos.

Ya ha sido referido que la mayoría de los autores coinciden en señalar a la actividad

Progesterona 5-β-reductasa como el paso clave de la ruta de biosíntesis, por lo que en principio un gen codificante para esta enzima sería el candidato más promisorio a sobreexpresar en D. purpurea para aumentar su productividad. Sin embargo, la existencia de al menos dos isoformas de este gen con funciones presuntamente diferentes genera dudas sobre los efectos que su sobreexpresión podría traer.

La función del ortólogo de esta pareja de genes en A. thaliana fue descrita hace años como

“influencia en el patrón de venación” debido al fenotipo anormal mostrado por una línea mutante de este gen (locus At4g24220), denominado entonces VEP1 (del inglés Vein patterning 1) (Jun et al.,

2002). Posteriormente, Herl et al. (2009) demostraron que VEP1 en efecto codifica una proteína con actividad progesterona 5-β reductasa. Es posible, por lo tanto, que alguno de los dos ortólogos de

Digitalis (P5βR y P5βR2) tenga también influencia en la morfogénesis u otro proceso fisiológico, y su sobreexpresión pueda traer consigo alguna alteración fisiológica no deseable. Esta hipótesis es además soportada por el hecho de que estos dos genes tienen patrones de expresión diferentes:

P5βR aparece como constitutivo ante diversas condiciones de estrés mientras que P5βR2 presenta una expresión basal mínima y es altamente inducido por etileno y H2O2 (Pérez-Bermúdez et al., 2010).

Curiosamente, el patrón de expresión de VEP1 en Arabidopsis se aproxima a la superposición de los patrones de expresión de estos dos genes en D. purpurea en las mismas condiciones (Gavidia y colaboradores, resultados no publicados) lo cual sugiere una subfuncionalización de esta actividad enzimática durante la evolución. Además, la expresión de P5βR2 está directamente correlacionada

26 2. Revisión Bibliográfica con los niveles de cardenólidos, a diferencia de P5βR. En consecuencia, estos autores proponen que

P5βR2 es el responsable de la producción de glicósidos mientras que P5βR pudiera tener otras funciones fisiológicas.

Dada la escasez de datos genómicos y de expresión en D. purpurea, los estudios comparativos a partir de datos de otras especies modelo como A. thaliana para el análisis de los promotores de estos dos genes (secuenciados por Gavidia y colaboradores, resultados no publicados) aparecen como una alternativa viable para estudiar las diferencias funcionales entre estos. Lo anterior proveería de información adicional para decidir si alguno de ellos sería un buen candidato para transformar D. purpurea.

2.12 Análisis comparativo de regulación de genes

Los avances tecnológicos aplicados a las ciencias biológicas han permitido la acumulación creciente de grandes volúmenes de datos de todo tipo: secuencia, expresión, estructura tridimensional, etc. Como consecuencia, la Bioinformática surge como la disciplina que se ocupa del procesamiento de esta información y la extracción de conclusiones biológicas. Casi inmediatamente se desarrollaron los enfoques comparativos cuyo principal objetivo es aplicar los datos existentes en especies modelo a la predicción de características de otras menos estudiadas (Davey et al., 2009).

La genómica y la transcriptómica comparativas son dos de las metodologías más empleadas en la predicción de funciones de genes por su utilidad para el estudio de la regulación de los mismos

(Schulze y Downward 2001).

A través de la comparación de promotores de varios genes pueden descubrirse motivos de regulación, que no son más que pequeñas secuencias de ADN a las que se unen los factores de transcripción que controlan la expresión génica. Debido a su importancia, estos motivos están altamente conservados entre distintas especies, por lo que pueden ser determinados por comparación de las secuencias de los promotores de genes ortólogos, o de genes diferentes dentro de la misma especie que estén regulados por los mismos factores de transcripción (Conlon et al., 2003). Existen

27 2. Revisión Bibliográfica bases de datos públicas y privadas de motivos reguladores en diferentes especies vegetales, principalmente A. thaliana (Steffens et al., 2004) y Oryza sativa (Morris et al., 2008). Estas bases de datos permiten determinar a qué factor de transcripción corresponde cada motivo, lo cual permite asignarle una implicación funcional a este último.

Otro enfoque para estudiar la regulación génica es determinando cuáles genes se coexpresan ante diferentes condiciones experimentales, utilizando datos de microarreglos. Los microarreglos constituyen una tecnología que permite la medición de los niveles de ARNm de decenas de miles de genes (que pueden ser todos los de la especie) a la vez (Schulze y Downward 2001). Esto permite establecer patrones de expresión a través de diferentes condiciones experimentales para cada gen, que pueden ser comparados y agrupados (Ihmels et al., 2004). Existen varias bases de datos públicas de experimentos de microarreglos, así como diferentes herramientas disponibles para su procesamiento (Edgar et al., 2002; Parkinson et al., 2007).

Sin embargo, cada uno de estos tipos de datos tiene sus propias fuentes de error, lo cual se acentúa en el caso de enfoques comparativos debido a la diferencia entre especies. Varios autores sugieren por tanto la combinación del análisis de motivos reguladores con los análisis de expresión de genes. Al ser tecnologías y aproximaciones biológicamente diferentes con distintas fuentes de error, las conclusiones a que se arribe a partir del análisis combinado son más fiables que las de los enfoques individuales (Holtorf et al., 2002; Lemmens et al., 2009).

Teniendo en cuenta todo lo anterior, una manera de abordar el problema de la regulación diferencial de P5βR y P5βR2 puede ser el estudio de datos de microarreglos de A. thaliana para determinar los genes coexpresados con VEP1 y comparar los promotores de estos genes con los de

P5βR y P5βR2 con el fin de buscar motivos reguladores en cada uno de estos. La determinación de los factores de transcripción asociados a estos motivos permitiría predecir características funcionales de cada gen que complementen los estudios experimentales realizados por otros autores.

28 3. Materiales y métodos

3. MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se llevó a cabo en los laboratorios de Ingeniería metabólica, Biología

Molecular y Bioinformática del Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) en el período comprendido desde enero de 2008 hasta enero de 2009.

Procedimientos generales del cultivo in vitro

Los instrumentos utilizados para la manipulación aséptica del material vegetal fueron esterilizados en estufa a una temperatura de 180°C durante dos horas antes de cada sesión de trabajo. Dichos instrumentos se mantuvieron en condiciones de asepsia mediante la inmersión en soluciones de NaOCl al 1% (m/v) siguiendo la metodología propuesta por (Agramonte et al., 1993).

Todas las operaciones de disección y transferencias de los explantes se realizaron en cabinas de flujo laminar horizontal. Los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave vertical a 121°C y 1,2 Kg/cm2 de presión durante 20 min.

Medios de cultivo

Se empleó como medio de cultivo basal la siguiente formulación: sales minerales del medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog (1962) (MS) con 4,0 mg/L de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/L de mioinositol, 30 g/L de sacarosa y 3,0 g/L de Gelrite® (Merck y Co., Inc.) como agente gelificante. El pH fue ajustado a 5,7 antes de la esterilización, con KOH 0,5 N o HCl 0,5 N antes de la esterilización.

Material vegetal

En este trabajo se utilizó como material inicial semillas de Digitalis purpurea L. var Rotter

Berggold (Farmasaat GmbH, Alemania). Las plantas fueron germinadas y cultivadas in vitro en medio de cultivo semisólido siguiendo la metodología descrita por (Pérez-Alonso et al., 2009).

Inducción de callos y regeneración de plantas

La formación de callos fue inducida a partir de segmentos de hojas de 1,0 cm2 de área, obtenidos a partir de las plantas cultivadas in vitro después del cuarto subcultivo, y colocados en el medio de cultivo semisólido sobre la superficie adaxial. Los callos obtenidos fueron cultivados en

29 3. Materiales y métodos medio de cultivo basal con 4,5 µM de ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 D) (Occeguera 2006). Los cultivos fueron mantenidos en condiciones de oscuridad a una temperatura de 28 ± 2 °C durante 30 días. Los callos obtenidos fueron divididos y subcultivados dos veces en el mismo medio de cultivo de inducción (en lo adelante medio de cultivo de proliferación de callos, MPC).

Cuatro fragmentos de callos de aproximadamente 0,7 g de masa fresca cada uno fueron transferidos a medio de cultivo basal con 0,5 µM de ácido indolacético (AIA) y 4,4 µM de 6- bencilaminopurina (6-BAP) para la regeneración de plantas. Los cultivos fueron incubados en cámara de crecimiento con luz solar y temperatura controlada de 27 ±2 °C (Occeguera 2006). Después de 30 días los de brotes fueron transferidos a frascos con 70 mL de medio de cultivo semisólido de multiplicación de brotes (Pérez-Alonso et al., 2009).

3.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas

3.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A. tumefaciens

Cepas bacterianas y plasmidios empleados

Se utilizaron dos cepas de A. tumefaciens para probar su capacidad de transformación: EHA

101 y C58C1RfR, esta última con el plasmidio auxiliar pMP90 (Koncz y Schell 1986). En ambas cepas se introdujo el plasmidio pTJK136 como vector de transformación (Figura 4). El ADN-T de pTJK136 contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptII) (EC 2.7.1.95) bajo el control del promotor de la nopalina sintetasa (nos) y el terminador y las señales de poliadenilación de la octopina sintetasa.

Este gen confiere resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y geneticina al inactivarlos por fosforilación (Flavell 1992). Además, la construcción contiene el gen de la β-glucuronidasa de

Escherichia coli (uidA) (Jefferson et al., 1987) con el intrón st-ls1 de la papa (Solanum tuberosum), lo cual permite que este gen se exprese sólo en células vegetales. uidA se encuentra bajo el control del

30 3. Materiales y métodos

Figura 4 Vector de transformación pTJK136. nptII: gen de la neomicina fosfatidil-transferasa (marcador de selección); Pnos: promotor de la nopalina sintetasa; 3’OCS: terminador y señales de poliadenilación del gen de la octopina sintetasa. Gus: gen reportero uidA que codifica la β-glucuronidasa de E. coli; P35S: promotor del virus del mosaico de la coliflor; 3’nos: terminador y señales de poliadenilación de la nopalina sintetasa; gusint: intrón st-ls1(Solanum tuberosum). LB y RB: bordes izquierdo y derecho, respectivamente, del ADN-T.

promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV-35S) y el terminador y las señales de poliadenilación del gen nos.

Transformación de A. tumefaciens

Las cepas de A. tumefaciens EHA 101 y C58C1-pMP90 fueron transformadas con el vector de transformación pTJK136. La transformación se realizó a partir de células competentes preparadas según la metodología de (Hofgen y Willmitzer 1988). A 500 μl de cultivo de células competentes se añadieron 100 μl de agua y 10 μl del plasmidio (1 μg). Luego de homogenizar con cuidado se sometió la mezcla a la siguiente secuencia de choques térmicos: 5 min en hielo, 5 min en N2 (l) y 5 min a 37

°C. Este procedimiento se realizó por duplicado.

El cultivo se dejó enfriar por 10 min en hielo, se le añadió 1 mL de medio de cultivo Luria-

Bertani (LB, 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl) y se incubó a 28 °C por

31 3. Materiales y métodos

4 h. Posteriormente, de 100 a 600 μl del cultivo se inocularon en placas con medio de cultivo semisólido LB con los antibióticos adecuados. Se incubaron a 28 °C toda la noche y se seleccionaron colonias aisladas al azar para chequear la transformación mediante el aislamiento de ADN plasmídico y la digestión con enzimas de restricción.

Infección y Cocultivo

Antes de la transformación, se aisló una colonia de cada cepa de A. tumefaciens crecida en medio de cultivo semisólido LB con 100 mg/L de espectinomicina y 300 g/L de estreptomicina y se inoculó cada una en 3 mL de medio de cultivo LB líquido con los mismos antibióticos (precultivo). Los precultivos se incubaron por 24 a 48 h a 28 °C y luego se inocularon por separado en 50 mL de medio de cultivo líquido YEP (10 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de bactopeptona, 5 g/L de NaCl, pH 7,0) con el mismo suplemento de antibióticos y se mantuvieron toda la noche en zaranda orbital (Retomed) a 150 rpm. Después de 20 a 24 h, las células fueron colectadas por centrifugación a 3000 g a 4 °C por

10 min y el precipitado fue resuspendido en medio de cultivo de infección (sales MS al 100%, 2% (m/v) de sacarosa, 1,98g/L de D(+)-glucosa, 3,9 g/L de ácido 2-[N-morfolino]etano sulfónico (MES), 200 µM de acetosiringona, pH 5,5) de tal modo que la densidad óptica (DO) final a 600 nm fue de 0,7.

Los segmentos de hojas fueron sumergidos en la suspensión de Agrobacterium por 15 min y posteriormente se secaron por contacto con papel de filtro (Waltman®). A continuación fueron transferidos a placas de Petri con medio de cocultivo (MPC con 200 µM de acetosiringona). Todas las placas fueron selladas con Parafilm y colocadas en la oscuridad por 5 días a 21 °C.

Selección y regeneración de plantas

Los explantes co-cultivados fueron lavados en MPC líquido con 500 mg/L de cefotaxima y 200 mg/L de timentina y luego secados por contacto con papel de filtro. Posteriormente fueron transferidos a MPC semisólido con 50 mg/L de geneticina G148 como agente selectivo y 200 mg/L de timentina para eliminar las células de Agrobacterium remanentes en la superficie (Occeguera 2006). El cultivo se mantuvo por dos meses con subcultivos cada 14 días. Los callos formados fueron transferidos individualmente al medio de cultivo de regeneración descrito en Inducción de callos y regeneración de

32 3. Materiales y métodos plantas. Las plantas regeneradas fueron mantenidas en medio de cultivo de multiplicación como fue descrito por (Pérez-Alonso et al., 2009).

Determinación histoquímica de la β-glucuronidasa (Ensayo GUS)

A partir del ensayo histoquímico GUS (Jefferson et al., 1987) se determinó la expresión transitoria de la β- glucuronidasa en los fragmentos de hojas a las 72 h luego de la infección, y la expresión estable de esta enzima en los callos y plantas regeneradas. Los tejidos analizados fueron incubados a 37 °C en una solución tampón que contenía 1 mM de la sal de cyclohexilamonio del ácido

5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico (substrato de la enzima; comercialmente XGluc, Duchefa,

Haarlem, Países bajos), 100 mM de Na3PO4 (pH 7,0), 0,5 mM K4Fe(CN)4 y 0,1 % (v/v) de Tritón X-100.

Simultáneamente se sometieron al mismo tratamiento explantes no transformados que fueron usados como control negativo.

Posterior a la incubación todas las muestras fueron sumergidas en etanol al 70 % (v/v) durante

2 h para eliminar las clorofilas y otros pigmentos foliares. El análisis del ensayo fue realizado por evaluación visual y fotográfica al microscopio óptico (Olympus), 100x. Para comparar la expresión transitoria de explantes en cocultivo con cada una de las dos cepas de A. tumefaciens se contaron por separado los puntos azules y las manchas con más de 2 mm de diámetro (De Clercq et al., 2002). La expresión estable se determinó de forma cualitativa, clasificándose como positiva si se observaba alguna porción del tejido teñido de azul.

Diseño experimental y análisis estadístico

Para el analizar el proceso de transformación se evaluaron, para cada tratamiento, la cantidad de explantes sobre los que se indujeron callos, el promedio de callos por explante y el número de plantas regeneradas. Los tratamientos considerados para la inducción de callos fueron: la infección y cocultivo con ambas cepas de A. tumefaciens, un control no infectado sometido a inducción sin geneticina (control positivo) y un control no infectado sometido a inducción con geneticina (control negativo). Los callos fueron contados tres semanas después del inicio de la fase de inducción. Para

33 3. Materiales y métodos ambos controles se emplearon siete explantes, mientras que para la transformación con cada cepa se utilizaron 25 explantes. El experimento se realizó por triplicado.

Los datos fueron procesados con el paquete SPSS versión 16 para Sistema operativo

Windows. Se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Walis previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.

Para evaluar la expresión transitoria de la β-glucuronidasa se computaron los puntos azules y manchas mayores de 2 mm de diámetro resultantes del ensayo GUS, a partir de 11 explantes cocultivados con ambas cepas de A. tumefaciens. La expresión estable se analizó a partir de la fracción de callos o plantas GUS-positivas regeneradas a partir de la transformación con ambas cepas bacterianas. Estos datos de expresión de la β-glucuronidasa fueron procesados con el paquete SPSS versión 16 para sistema operativo Windows. Se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Witney previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.

3.1.2 Análisis moleculares de las líneas de plantas regeneradas

Las soluciones empleadas en este acápite se describen en el anexo 1.

Extracción de ADN plasmídico

El plasmidio pTJK136, utilizado como control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa y la hibridación Southern blot, fue extraído a partir de cultivos de la cepa de E. coli DH5α- pTJK136, donada por Geert Angenon (IMOL, VUB). Las células fueron cultivadas toda la noche en tubos de ensayo con 3 mL de medio de cultivo LB (precultivo), a 37°C y en condiciones de agitación.

Cada precultivo se centrifugó a 3000 g por 5 min en viales de 1,5 mL, se eliminó sucesivamente el sobrenadante y se añadió más cultivo celular hasta obtener en cada vial un precipitado de células correspondiente a 6 mL de cultivo. Posteriormente dichos precipitados fueron lavados con 500 μl de tampón Tris-EDTA y resuspendidos en 150 μL de la misma solución. Las células resuspendidas se incubaron 20 min en hielo y posteriormente se les añadieron 200 μl de solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) alcalino. Después de invertir los viales varias veces hasta lograr una solución clara y viscosa, estos fueron nuevamente incubados en hielo, esta vez por 5 min. Transcurrido este tiempo se

34 3. Materiales y métodos añadieron 150 μl de KAc 5/3, pH 4,8, se invirtieron varias veces y se colocaron en hielo nuevamente por 10 min.

El lisado celular así obtenido se centrifugó a 10 000 g para precipitar las proteínas, ADN genómico y fragmentos de células. Luego se transfirió cuidadosamente hacia un vial limpio, se le añadió 250 μl de isopropanol y se dejó reposar 10 min a TPEA para precipitar el ADN plasmídico. La precipitación se concluyó por centrifugación a 10 000 g por 2 min. El precipitado fue lavado por adición de 400 μl de etanol al 70 % (v/v) y agitación enérgica. El ADN fue de nuevo precipitado por 5 min de centrifugación a la misma velocidad. El precipitado se dejó secar en campana por 15 min y se resuspendió en 20 μl de H2O desionizada.

Extracción de ADN genómico vegetal

Las líneas de plantas regeneradas a partir del protocolo de transformación fueron sometidas a la extracción de ADN genómico. La metodología de extracción de ADN descrita a continuación se basó en la propuesta por (Dellaporta et al., 1983) con algunas modificaciones.

Por cada línea de plantas regeneradas, se maceró 1 g de material vegetal en nitrógeno líquido en un mortero con pistilo hasta lograr un polvo fino. El macerado fue transferido a un tubo de centrífuga de 35 ml de volumen preenfriado para evitar la descongelación, se le añadieron 5 mL de tampón de extracción frío y se agitó vigorosamente. A la mezcla se añadieron 330 μl de SDS al 20%

(m/v), se volvió a agitar vigorosamente y se colocó en un baño termostatado a 55 °C por 10 min. A continuación se transfirió a otro baño termostatado a 37 °C y se trató con RNAsa (200 µg/ µL de concentración final) por 20 min.

Transcurrido este tiempo se añadieron 1,6 mL de KAc 5M, se agitó fuertemente la mezcla y se centrifugó por 10 min a 10 000 g. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se repitió la centrifugación y colección de la fase líquida para eliminar completamente las partículas precipitadas. Al sobrenadante obtenido se adicionó igual volumen de isopropanol frío, se mezcló suavemente y se

35 3. Materiales y métodos

Tabla 1 Cebadores utilizados en la detección por PCR de los genes uidA y nptII. Las secuencias están escritas en el sentido 5’ a 3’ (leído de izquierda a derecha)

Gen Secuencia Talla del Amplicón (pb) Directo Reverso nptII ATGATTGAACAAGATGGATTG CCGCATTGCATCAGCCATGAT 488 CACGC GG uidA TCTCTGCCGACAGTGGTCCC GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA 1200 AAAGATGGAC

colocó a -20 °C por 5 min para precipitar el ADN. La precipitación se completó por centrifugación a 10 000 g por 10 min. El precipitado se lavó por adición de 2 mL de etanol frío al 70 %

(v/v) y agitación enérgica. Se repitió la centrifugación por 5 min a la misma velocidad para colectar el precipitado, el cual fue secado en campana por 15 min y resuspendido en 50 μl de H2O desionizada.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La transformación de las plantas regeneradas fue comprobada por PCR empleando ADN genómico extraído de las mismas. Como control positivo de las reacciones de PCR se utilizó ADN plasmídico extraído a partir de la cepa DH5α-pTJK136.

Se realizaron reacciones de PCR para amplificar fragmentos de los genes nptII y uidA. Las secuencias de los cebadores empleados se relacionan en la tabla 1

La amplificación fue realizada en un volumen de reacción final de 25 µL, que contenía 100 ng de ADN genómico, 0,4 µM de cada cebador, 1,5 mM de MgCl2, 200 µM de cada desoxirribonucleótido,

0,25 unidades de Taq polimerasa (Fermentas, Lituania) y tampón de reacción de esta enzima

(Fermentas, Lituania). Los ciclos de amplificación se llevaron a cabo en el equipo de control térmico programable Mastercycler (Eppendorf, Alemania).

La secuencia de reacciones para amplificación del fragmento del gen uidA comenzó con 5 min de desnaturalización a 94 ºC, seguida por 35 ciclos del bloque siguiente: 94 ºC por 30 s, 62 ºC por 45 s y 72 ºC por 1,5 min. Luego se realizó un paso final de extensión a 72 ºC por 7 min. Para la amplificación del fragmento del gen nptII se siguió una secuencia similar a la de uidA, pero con las

36 3. Materiales y métodos siguientes modificaciones en el bloque de 35 ciclos: 94 ºC por 30 s, 55 ºC por 30 s y 72 ºC por 30 s.

Los fragmentos amplificados fueron analizados visualmente por electroforesis a 100 V por 1 h en gel de agarosa al 1 % (m/v) y tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) seguida de tinción con solución 5 µg/mL de bromuro de etidio y transiluminación con luz ultravioleta (UV).

Análisis de hibridación por Southern blot

La integración y el número de copias del ADN-T fue analizada por hibridación Southern blot.

Los fragmentos resultantes de la digestión de 20 µg de ADN con la enzima de restricción SacII fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % con tampón Tris-Acetato-EDTA durante 12 h con un voltaje de 25 V. Los fragmentos de ADN fueron transferidos desde el gel hacia una membrana plástica Hybond (RPN203B; GE Healthcare) por fuerzas de capilaridad ascendentes usando tampón

SSC 20 X (NaCl 3M, citrato de sodio 0.3 M, ph 7.0) toda la noche a temperatura ambiente.

Prehibridación

Se realizó la prehibridación de la membrana para bloquear sitios de unión no específicos del

ADN sobre la membrana, que puedan resultar en uniones inespecíficas de la sonda. Para lograrlo, se colocó la membrana en un frasco de hibridación que contenía 20 mL tampón de prehibridación y se dejó toda la noche a 68 ºC en un horno de hibridación (Stuart Scientific) en condiciones de agitación

(45 rpm). Al finalizar, la solución de prehibridación fue trasvasada para su conservación a -20 ºC, quedando solo la membrana en el frasco.

Hibridación

El fragmento de 488 pb del gen nptII amplificado a partir del plasmidio pTJK136 con los cebadores descritos en la tabla 1 fue marcado con DIG-dUTP usando un kit DIG-High Prime DNA

Labeling and Detection (Roche, Alemania) y usado como sonda para la hibridación.

La sonda se desnaturalizó por inmersión durante 10 min en agua hirviendo y luego se colocó inmediatamente en hielo. Posteriormente se procedió a su dilución en 6 mL de tampón de hibridación hasta una concentración final de 20 ng/mL.

37 3. Materiales y métodos

La solución de hibridación así preparada se calentó hasta 68 ºC, se añadió al frasco de hibridación con la membrana y se dejó hibridar por 4 h.

Luego de la hibridación, la membrana fue lavada dos veces por 5 min mediante inmersión en

100 mL de solución de lavado 2X y agitación a 70 rpm en una bandeja de cristal esterilizada. El proceso se repitió, pero esta vez utilizando solución de lavado 0,1X precalentada para eliminar el exceso de sonda no enlazada.

Detección

Luego de la eliminación de la solución de lavado se adicionaron 20 mL de tampón 1 con 0,3 %

(v/v) de Tween 20 para equilibrar la membrana. Posteriormente, esta fue transferida hacia otra bandeja de cristal con 120 mL de tampón 2 en la que se sometió a agitación por 60 min a 30 rpm en el horno de hibridación. Paralelamente, el anticuerpo conjugado anti-digoxina / fosfatasa alcalina fue diluido 10

000 veces en un volumen final de 30 mL de tampón 2.

Se descartó el tampón 2 de la bandeja con la membrana, y en su lugar se añadieron 30 mL de solución del anticuerpo conjugado. La membrana se dejó en contacto con esta solución exactamente

30 min, luego de lo cual fue sacada y lavada tres veces por 45 min cada una en 75 mL de tampón 1 con 0,3 %(v/v) de Tween 20.

Luego de los lavados, la membrana fue equilibrada por 2 min en 20 mL de tampón 3.

Paralelamente, se diluyó el reactivo de detección, CSPD, a razón de 50 μl en 4,95 mL del mismo tampón.

A continuación se esparcieron 2 mL de CSPD diluido en una lámina plástica y encima se colocó la membrana de manera que la cara donde se adsorbió el ADN estuviese en contacto con la solución.

Luego de 5 min se escurrió la membrana y rápidamente se selló en una bolsa plástica, la cual se incubó a 37 ºC por 30 min y luego fue revelada por contacto con una placa sensible a rayos X.

38 3. Materiales y métodos

3.2 Análisis comparativo de la regulación de los genes P5βR y P5βR2

3.2.1 Análisis de expresión del gen VEP1 de A. thaliana

Para el análisis de expresión del gen VEP1 se seleccionaron 39 experimentos de microarreglos

(Anexo 2) realizados sobre la plataforma Affymetrix® cuyos datos fueron descargados desde las bases de datos públicas ArrayExpress (Parkinson et al., 2007) (AE, disponible en http://www.ebi.ac.uk/microarray/~as/ae) y Gene Expression Omnibus (Edgar et al., 2002) (GEO, disponible en http://ncbi.nlm.nih.gov/geo). Los experimentos se dividieron en dos grupos: el primero que incluyó condiciones de estrés biótico, abiótico, o tratamiento con sustancias que activen mecanismos de respuesta a estos procesos (en lo adelante “Estrés”); y el segundo que incluyó una serie de experimentos que estudia el desarrollo morfogenético de embriones de la planta (en lo adelante “Morfogénesis”).

El procesamiento de los datos se realizó con el mega-paquete de programas Bioconductor

(Gentleman et al., 2004), disponible en http://bioconductor.org.

Específicamente, se usó el paquete ArrayQualityMetrics (Kauffmann et al., 2009) para el análisis de calidad de los datos. Los microarreglos fuera de tipo fueron excluidos del análisis. La corrección de fondo, normalización y resumen de los datos de expresión se realizó según el algoritmo

RMA (Irizarry et al., 2003) implementado en el paquete Affy (Gautier et al., 2004). Una vez normalizados los valores de expresión de los genes, se detectaron los genes diferencialmente expresados a través del paquete Limma (Smyth 2005). Este paquete implementa un algoritmo que ajusta un modelo lineal de expresión logaritmizado para cada gen y calcula un valor de significación de expresión diferencial para cada comparación de condiciones experimentales. Se consideró un gen diferencialmente expresado entre dos condiciones experimentales para p<0.01.

Del grupo de experimentos “Estrés” se seleccionaron para el análisis de motivos reguladores los genes que resultaron coexpresados con VEP1 en todas las condiciones en que este resultó expresado diferencialmente. Del grupo de experimentos “Morfogénesis” se seleccionaron para este

39 3. Materiales y métodos mismo análisis los 10 genes más significativamente expresados en la condición experimental en que

VEP1 resultó expresado diferencialmente.

3.2.2 Detección de motivos reguladores en P5βR y P5βR2

Una vez seleccionados los genes coexpresados en las condiciones de “Estrés” y

“Morfogénesis” se obtuvieron sus regiones promotoras (disponibles en http://ppdbgene.nagoya- u.ac.jp/cgibin/search_result.cgi). A cada conjunto de promotores se añadió cada uno de los promotores de genes codificantes para progesterona 5-β-reductasa de D. purpurea. De esta manera se construyeron cuatro grupos de promotores:

Estrés-P5βR

Estrés- P5βR2

Morfogénesis- P5βR

Morfogénesis- P5βR2

El objetivo fue determinar cuáles motivos reguladores se encuentran relacionados a cada uno de estos procesos fisiológicos.

La detección de los motivos a partir de estos grupos de promotores se llevó a cabo con el paquete de programas MEME (Bailey y Elkan 1993). Los motivos más significativos estadísticamente fueron comparados con la base de datos de predicción in silico de motivos reguladores AthaMap (Uuml et al., 2006) para predecir su reconocimiento por factores de transcripción.

40 4. Resultados y discusión

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens y análisis molecular de líneas regeneradas

4.1.1 Transformación genética de de D. purpurea mediada por A. tumefaciens

Las cepas de A. tumefaciens EHA101 y C58C1-pMP90 fueron transformadas con el plasmidio pTJK136 según se describe en el epígrafe 3.1.1. La presencia del plasmidio pTJK136 fue corroborada en ambas cepas por extracción del ADN plasmídico y digestión con la enzima de restricción SalI. En ambos casos se obtuvieron fragmentos de 3.2 y 9.5 kpb aproximadamente que concuerdan con el mapa de restricción del plasmidio (resultados no mostrados).

Expresión transitoria del gen uidA en fragmentos de hojas infectados con A. tumefaciens

La expresión transitoria de los transgenes durante un protocolo de transformación mediada por

A. tumefaciens es un indicativo de la transferencia del vector de ADN-T hacia las células hospederas durante el cocultivo. En este trabajo se utilizó como reportero el gen uidA codificante para la β- glucuronidasa, con el intrón st-ls1 de S. tuberosum, lo cual restringe su expresión a células vegetales.

En todos los explantes ensayados se detectó expresión transitoria de uidA (Figura 5A), sin embargo no se detectaron diferencias significativas entre ambas cepas en cuanto a la cantidad de puntos y manchas azules (tabla 2).

Tabla 2 Expresión transitoria de la β-glucuronidasa en fragmentos de hojas cocultivados con dos cepas de A. Tumefaciens a las 72 h después de la infección. Se relaciona el promedio de puntos y manchas azules en cada caso.

Zonas de expresión Cepa Puntos Manchas EHA101 14.5 4.8 C58C1-pMP90 9.5 5.7

*Se definen como manchas las mayores de 2 mm de diámetro

41 4. Resultados y discusión

Figura 5. Expresión de la β-glucuronidasa durante las diferentes fases del protocolo de transformación de D. purpurea. Expresión transitoria en fragmentos de hojas a las 72 h luego de la infección (A). Expresión estable en callos inducidos a las ocho semanas (B), embriones somáticos (C) y plantas regeneradas (D)

La evaluación de la expresión transitoria es difícil por cuanto varios autores difieren en cuanto a la manera en que la realizan: ya sea por conteo de puntos y manchas azules (De Clercq et al., 2002), por conteo de zonas teñidas en general (De Bondt et al., 1994) u otros métodos (Charest et al., 2004).

En este caso, además, resulta imposible comparar los niveles de expresión transitoria obtenidos con otros trabajos en el género Digitalis debido a que estos no fueron determinados en el protocolo de transformación de D. minor, el único publicado (Sales et al., 2003). Sin embargo, por inspección visual de los explantes transformados (Figura 5A) y comparación con resultados obtenidos en otras especies

(De Bondt et al., 1994) puede concluirse que los niveles de expresión transitoria observados son aceptables.

Inducción de callos

Como se muestra en la figura 6, la infección con la cepa C58C1-pMP90 indujo la formación de callos en un porcentaje mayor de explantes respecto a EHA101. Un resultado similar se obtuvo al analizar la cantidad de callos inducidos por explante.

La expresión estable de la β-glucuronidasa fue determinada en los callos y brotes regenerados.

La expresión en callos es un indicador utilizado para estimar la capacidad de desdiferenciación de las

42 4. Resultados y discusión

células transformadas. En este estudio se analizaron diez callos elegidos al azar e inducidos a partir de

explantes foliares infectados y cocultivados con cada cepa. En todos los casos se detectó expresión

del gen uidA (Figura 5B).

Resulta notable que al comparar la expresión de la β-glucuronidasa durante el proceso de

transformación con ambas cepas se pase de la no existencia de diferencias significativas durante la

expresión transitoria a diferencias significativas en la expresión en callos. De Bondt et al. (1994)

encontraron diferencias similares entre la expresión transitoria y la estable durante la transformación

del manzano (Malus x domestica Borkh.) las cuales atribuyen a que ambos fenómenos dependen de

condiciones esencialmente diferentes. La expresión transitoria depende de la adquisición del ADN-T

donde se encuentra el gen codificante para la β-glucuronidasa, mientras que la estable depende de la

integración funcional del vector en el genoma hospedero.

Regeneración de plantas

En cuanto a la regeneración de plantas se observó una marcada diferencia a favor de C58C1-

pMP90. Sólo 19 líneas fueron regeneradas a partir de EHA101, en comparación con las 495

IncidenciaExplantes de explantesque formaron con calloscallos IncidenciaCallos de formadoscallos porpor explante explante a 100 50 a 80 A 40 B b Explantes% 60 NúmeroNo. de 30 con callos c callos por (%) 40 explante 20 20 d 10 b c d 0 0 control C58C1- EHA101 control control C58C1- EHA101 control positivo pMP90 negativo positivo pMP90 negativo Tratamiento Tratamiento

Figura 6 Inducción de callos a partir de fragmentos de hojas cocultivados con dos cepas de A. tumefaciens, contados tres semanas después del inicio de la inducción. (A) Porcentaje de explantes con formación de callos. (B) Número promedio de callos formados por explante. Control positivo: Explantes no transformados en MPC sin geneticina. Control negativo: Explantes no transformados en MPC con 50 mg/L de geneticina. Sobre las barras dentro de cada figura: letras diferentes corresponden a valores estadísticamente diferentes según prueba de Kruskal Wallis (p < 0,05)

43 4. Resultados y discusión

Tabla 3. Relación de plantas regeneradas y por explante a partir de la transformación con ambas cepas de A .tumefaciens. En cada columna, letras diferentes se corresponden con valores estadísticamente diferentes según la prueba de Mann-Witney, p < 0,05

Cepa EHA101 C58C1-pMP90 Número de líneas regeneradas 19 495 Número de explantes 25 25 Promedio de líneas por 0,76a 19,8b explante

regeneradas a partir de C58C1-pMP90 lo cual representa una diferencia significativa de acuerdo a la cantidad de plantas regeneradas por explante transformado (tabla 3). Aunque no existen trabajos comparables en D. purpurea, estos resultados son muy superiores a los obtenidos en D. minor por Sales et al. (2003) de alrededor de una planta regenerada por cada cinco explantes infectados, con un protocolo similar a partir de discos de hojas y utilizando la cepa EHA105. Por otra parte, estos resultados son comparables a los obtenidos en especies modelo para la transformación como

Solanum lycopersicum (Mccormick et al., 1986) y Nicotiana tabacum (Burow et al., 1990).

Varios autores refieren la influencia de la virulencia de la cepa de A. tumefaciens utilizada en la eficiencia de la transformación. En algunas especies cepas más virulentas incrementan la eficiencia de la transformación (Nadolska-Orczyk y Orczyk 2000) mientras que en otras ocurre lo contrario

(Wroblewski et al., 2005). En general este último efecto ocurre debido a la muerte de la célula vegetal por la infección con cepas “súper-virulentas” que inducen una respuesta necrótica en algunas especies de plantas, como se ha observado en A. thaliana y Nicotiana tabacum (Wroblewski et al., 2005).

EHA101 es una cepa altamente virulenta debido a sus elevados niveles de expresión de virG, cuyo producto es necesario para la expresión de genes de virulencia inducibles (De Bondt et al., 1994). La diferencia en la cantidad de líneas regeneradas a partir de la transformación con ambas cepas pudiera deberse a este factor.

44 4. Resultados y discusión

Tabla 4. Expresión estable del gen uidA codificante para la β-glucuronidasa en las líneas regeneradas a partir de la transformación con ambas cepas de A .tumefaciens.

Cepa EHA101 C58C1-pMP90 Número de líneas ensayadas 19 328 No. de líneas GUS-Positivas 6 145 Porcentaje de positivas 31.6 % 44.2 %

Como puede observarse en la tabla 4, el 31.6 % de las plantas regeneradas a partir de explantes cocultivados con EHA101 fueron GUS-positivas (Figura 5D), mientras que el 44.2 % lo fue para las correspondientes a C58C1-pMP90. No existen diferencias significativas entre ambos valores.

En ambos casos la incidencia de plantas con expresión de la β-glucuronidasa fue muy inferior al 100

% obtenido para los callos de los que estas plantas se derivaron. La razón puede ser el hecho de que dentro de un mismo callo inducido pueden coexistir células transformadas y no transformadas. Las células transformadas pueden contribuir a la degradación del agente selectivo permitiendo que las células no transformadas adyacentes se expongan a niveles subletales del mismo, y por tanto puedan proliferar. La regeneración de plantas a partir de estos callos se realiza en medio de cultivo sin agente selectivo para que este no intervenga en el proceso, por lo que las células no transformadas presentes en los callos pueden dar lugar a plantas durante el proceso de regeneración. Este fenómeno se ha descrito como “efecto protector” de las células no transformadas por las transformadas (Cervera et al.,

1998). Por otra parte, es conocido el efecto de silenciamiento que tienen algunos promotores fuertes usados en la transgénesis de plantas sobre genes vecinos (Elliott et al., 1998; Domínguez et al., 2004), además de las inserciones incompletas del ADN-T en los protocolos de transformación por

Agrobacterium (Gelvin 2003a). Ambos factores pueden anular la expresión de los transgenes reporteros en líneas transformadas, de manera que se subestima la eficiencia de la transformación partir de estimaciones histoquímicas. De cualquier manera, la incidencia de plantas GUS-positivas es

45 4. Resultados y discusión

A

500 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (-) (+) M

B

1031 pb

M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Figura 7. Análisis por PCR utilizando ADN genómico de líneas regeneradas seleccionadas al azar. (A) Amplificación de fragmento del gen nptII (B) Amplificación de fragmento del gen uidA. Carriles 1 al 3 corresponden a líneas transformadas con la cepa EHA101, carriles 4 al 16 corresponden a C58C1-pMP90. (+): ADN pasmídico de pTJK136. (-): Planta no transformada. (M): Patrón de peso molecular. A excepción del carril 12, todas las líneas fueron GUS-positivas. En cada caso se señalan las bandas del patrón de peso más cercanas al fragmento amplificado.

un indicativo del porcentaje de líneas transformadas con transgenes funcionales, dentro del total de líneas regeneradas.

4.1.2 Análisis molecular de las líneas de plantas regeneradas

Las líneas regeneradas que fueron GUS-positivas, y una muestra de las negativas, se subcultivaron en medio de cultivo de multiplicación. De estas, se seleccionaron al azar 15 líneas positivas y ocho negativas, regeneradas a partir de la transformación con ambas cepas de A. tumefaciens para determinar la presencia o no de los transgenes en su genoma. Se extrajo el ADN genómico de cada una de ellas y se determinó la presencia de los transgenes uidA y nptII por PCR

(Figura 7). En todas las líneas GUS-positivas se detectó la presencia de los genes uidA y nptII. De las

GUS-negativas, en una de ellas (Figura 7, carril 12) se detectó la presencia de nptII, mientras que en el resto no se detectó ninguno de los dos genes (resultados no mostrados). Esta línea en particular

(Figura 7, carril 12) pudiera ser un ejemplo de rearreglo en la inserción del ADN-T dando lugar a una transgénesis incompleta como ya ha sido discutido. La confirmación de la presencia de ambos genes en las líneas GUS-positivas, así como la expresión de la β-glucuronidasa en toda la planta (Figura 5D)

46 4. Resultados y discusión

1 2 3 4 5 6 7 8 9 (-) (+) M

8.6 6.1 4.8 3.6 2.7 1.9 1.5

Figura 8. Hibridación (Southern blot) de fragmento del gen nptII sobre ADN genómico de líneas regeneradas, PCR-positivas, seleccionadas al azar. Carriles 1 al 3 corresponden a líneas transformadas con la cepa EHA101. Carriles 4 al 9 corresponden a la cepa C58C1-pMP90. (+): ADN plasmídico de pTJK136 linealizado. (-): Planta no transformada. (M): Patrón de peso molecular. Al margen, algunos valores de longitud de la bandas del patrón (kpb).

demuestran la funcionalidad de los promotores empleados en este sistema de transformación para D. purpurea, lo cual sugiere que estos mismos promotores serían también funcionales al ser utilizados en vectores de transformación con genes de interés.

Un factor importante a analizar en un sistema de transformación es el número de insertos. Por lo general es deseable la inserción de una sola copia debido a que se minimiza así la probabilidad de que el inserto interrumpa alguna secuencia funcional y por tanto afecte alguna otra función de la planta. Además, el uso de promotores fuertes como CaMV-35S y el del gen de la nopalina sintetasa

(nos) puede alterar los niveles de expresión de genes cercanos físicamente (Vaucheret y Fagard 2001) lo cual reafirma la preferencia por plantas transformadas con el mínimo de transgenes insertados en su genoma. En este trabajo se determinó por Southern blot el número de copias insertadas para 9 de las líneas PCR-positivas a los genes uidA y nptII, seleccionadas al azar (Figura 8). Se utilizó como sonda para la hibridación un fragmento de 500 pb del gen nptII obtenido como se describe en el epígrafe

3.1.2. Todas las líneas analizadas resultaron positivas a la presencia del gen nptII. De ellas, siete dieron lugar a una sola banda de hibridación mientras que dos líneas dieron lugar a dos bandas.

Usualmente cada banda corresponde a una inserción del vector, sin embargo pueden ocurrir

47 4. Resultados y discusión

Figura 9. Protocolo de transformación de D. purpurea mediada por A. tumefaciens. MC: medio de cultivo. MPC: medio de cultivo de proliferación de callos.

ocasionalmente inserciones de más de un elemento en tándem donde alguno de ellos pierda el sitio de corte de la enzima de restricción utilizada en el Southern blot, en cuyo caso puede subestimarse la cantidad de cassettes integrados. Es conocido que la transformación por A. tumefaciens genera mayoritariamente transformantes con bajo número de inserciones, por lo que estos resultados concuerdan con los obtenidos en otros cultivos como el trigo (Cheng et al., 1997), maíz (Ishida et al., 1996), arroz (Hiei et al., 1997) y especies modelo como A. thaliana (Akama et al.,

1992).

A modo de resumen, el protocolo de transformación propuesto se muestra en la figura 9. Hasta el momento sólo se habían descrito protocolos de transformación para la especie D. minor (Sales et

48 4. Resultados y discusión al., 2003), mientras que los esfuerzos por transformar D. purpurea habían sido infructuosos (Saito et al., 1990). En otras especies del género sólo se han descrito metodologías de regeneración (Pérez-

Bermúdez et al., 1984; Diettrich et al., 1986). Este es, por tanto, el primer trabajo que describe un protocolo de transformación de D. purpurea. El mismo podrá ser utilizado para la introducción de genes que incrementen la producción de cardenólidos de esta planta, para lo cual es necesario previamente estudiar los genes candidatos para la transformación.

4.2 Análisis comparativo de la regulación de los genes P5βR y P5βR2

Se considera que la enzima progesterona 5β-reductasa cataliza la etapa clave del proceso de síntesis de los cardenólidos en D. purpurea (Gärtner y Seitz, 1993). Los genes P5βR y P5βR2, codificantes para la misma, presentan patrones de expresión diferentes en respuesta a condiciones experimentales relacionadas con estrés biótico y abiótico. En específico, P5βR2 resulta inducible por daño mecánico a la planta, choque de frío y NaCl, etileno y H2O2, mientras que P5βR no varía su expresión ante estas mismas condiciones (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Además, es conocido que el gen ortólogo en A. thaliana, VEP1, está involucrado en la morfogénesis de los tejidos foliares de esa planta (Jun et al., 2002). Por tanto, para seleccionar uno de estos genes como candidato para la transformación de D. purpurea, cuya sobreexpresión no comprometa la viabilidad de las plantas transformadas, es necesario conocer la regulación a que están sometidos y en qué otros procesos fisiológicos pudieran estar involucrados. Sin embargo, la escasez de datos genómicos y de expresión para las especies del género Digitalis constituye una gran limitante en este sentido.

En este epígrafe se describe un enfoque comparativo a partir de un conjunto de datos de experimentos de microarreglos en A. thaliana, disponibles en bases de datos internacionales, para estudiar las condiciones de expresión del gen VEP1 e identificar los genes coexpresados con él en determinadas condiciones de interés. A partir de los promotores de estos genes se predijeron los motivos reguladores que controlan la expresión de VEP1 así como las de los genes de D. purpurea

P5βR y P5βR2.

49 4. Resultados y discusión

4.2.1 Expresión del gen VEP1 de A. thaliana

La expresión de VEP1 se estudió a partir de los datos de 39 experimentos de microarreglos en los que se midió la expresión génica en tejidos de esta planta ante una gran variedad de condiciones relacionadas con estrés biótico y abiótico así como desarrollo morfogenético. Los experimentos analizados se relacionan en el anexo 2. De estos, VEP1 resultó inducido en algunas condiciones estudiadas en los experimentos GSE5627, GSE10670, E-MEXP-475 y GSE12404; mientras que su expresión resultó reprimida en el experimento GSE13739. La tabla 5 resume las condiciones experimentales contempladas en estos experimentos.

Tabla 5. Relación de experimentos de microarreglos en los que VEP1 resultó diferencialmente expresado.

Experimento Condiciones experimentales Contrastes analizados GSE5627 Daño mecánico por cortes a brotes Brotes y raíces en cada tiempo y raíces de plantas in vitro 16 días respecto a 15 min después del después de germinadas. Se daño tomaron muestras de cada tejido a los 15 y 30 min y a las 1, 3, 6, 12 y 24 h GSE10670 Sometimiento a siete días de 1. Plantas estresadas respecto a estrés hídrico de plantas no estresadas para cada genotipo transformadas con un gen de 2. Plantas transformadas respecto inositol polifosfato 5-fosfatasa en a no transformadas en condiciones dos vectores diferentes, en casa de buena humedad de cultivo 3. Diferencia de respuesta de plantas transformadas y no transformadas ante estrés hídrico E-MEXP-475 Respuesta de plantas in vitro al Para cada tratamiento con agente ácido abscísico (ABA), en osmótico: presencia de manitol o glucosa. Plantas tratadas con ABA en cada Las plantas se dividieron en dos tiempo respecto a plantas no grupos respecto al agente tratadas osmótico. Las muestras de brotes fueron colectadas a las 0, 2, 4 y 6h después de la adición de ABA GSE13739 Curso temporal de la infección con Para cada genotipo: el hongo Golovinomyces orontii de Plantas infectadas en cada tiempo plantas silvestres y mutantes respecto a plantas no infectadas defectivas de la isocorismato sintasa, en casa de cultivo GSE12404 Análisis del transcriptoma de los Para cada compartimiento se diferentes compartimientos de la comparó el transcriptoma de cada semilla durante las diferentes fases fase con la fase que le antecede del desarrollo morfogenético del embrión cigótico

50 4. Resultados y discusión

Figura 10. Expresión relativa del gen VEP1 en respuesta a ABA, en plantas de A. thaliana cultivadas in vitro y sometidas condiciones de simulación de estrés hídrico. Los tratamientos fueron: glucosa 3% (m/v), glucosa 3% (m/v) + ABA 10 µM, manitol 3% (m/v), manitol 3% (m/v) + ABA 10 µM, siempre adicionados al medio de cultivo. En cada punto se compara la expresión del gen en el tratamiento con ABA respecto al tratamiento sin ABA. E / Eo: Razón entre la expresión del gen en presencia de ABA y la expresión en ausencia de ABA. Las barras en color oscuro indican expresión diferencial para p < 0.01.

Las condiciones experimentales que condujeron a una variación de la expresión de VEP1 pueden agruparse en cuatro conjuntos: asociadas a estrés hídrico, al daño mecánico, a defensa contra patógenos y a la morfogénesis.

Inducción asociada a estrés hídrico

Las condiciones en que se induce VEP1 en los experimentos E-MEXP-475 y GSE10670 tienen como denominador común la relación directa o indirecta con procesos de estrés hídrico.

El experimento E-MEXP-475 recoge la respuesta de los genes al ácido abscísico (ABA, 10 μM) en presencia de los agentes osmóticos glucosa (3%, m/v) y manitol (3%, m/v). En este caso, VEP1 se induce a partir de las 4h después del tratamiento con ABA en presencia de glucosa, y a partir de las

6h en presencia de manitol (Figura 10).

En GSE10670, VEP1 resulta inducido en respuesta a condiciones prolongadas de estrés hídrico por regado insuficiente tanto de las plantas silvestres como de dos líneas de plantas transformadas que sobreexpresaban la inositol polifosfato-5-fosfatasa. Sin embargo, no se observó una diferencia en la expresión basal de este gen en los distintos genotipos. Tampoco se registró una

51 4. Resultados y discusión respuesta diferente de cada genotipo transformado al estrés hídrico, en comparación con las plantas silvestres (resultados no mostrados).

Inducción asociada a daño mecánico

En el experimento GSE5627 se analiza el transcriptoma de A. thaliana ante daño mecánico por cortes a brotes y raíces. En estas condiciones VEP1 es inducido rápidamente sólo en los brotes, 1 h después del daño, con máximo a las 3 h, descendiendo a las 6 h hasta no haber diferencias significativas de expresión a las 12 h respecto al momento inicial (Figura 11). Este patrón de inducción rápida y transitoria se asemeja al mostrado por P5βR2 en D. purpurea ante daño mecánico, si bien los tiempos en que ocurre el máximo inicial difieren. P5βR2, además, exhibe una segunda fase de sobreexpresión (tardía) que no se observa en VEP1 probablemente debido a la duración del experimento en A. thaliana, de solo 24h. De la misma manera concuerda el hecho de que VEP1 no responde al daño mecánico en las raíces de Arabidopsis con la baja expresión de P5βR2 en las raíces de D. purpurea, donde su presencia fue apenas detectada (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Por otra parte, es conocido que los tejidos foliares y las flores son los principales sitios de síntesis de cardenólidos (Stuhlemmer y Kreis 1996), lo cual es otro indicio de la conexión funcional y evolutiva existente entre VEP1 y P5βR2.

Figura 11. Expresión relativa del gen VEP1 en brotes y raíces de plantas de A. thaliana cultivadas in vitro sometidos a daño mecánico por cortes. E / Eo: Razón entre la expresión en el tiempo en cuestión y la expresión inicial. Las barras en color oscuro indican expresión diferencial para p < 0.01.

52 4. Resultados y discusión

El daño mecánico es una de las consecuencias del ataque a la planta por un hervíboro, y produce una serie de señales locales como la liberación de oligosacáridos desde las paredes celulares así como la desecación del tejido (Schilmiller y Howe 2005). Estos cambios son percibidos por la planta, que produce especies reactivas de oxígeno y H2O2 (ROS, del inglés reactive oxygen species) a nivel local (Orozco-Cardenas y Ryan 1999), mientras que desarrolla una respuesta sistémica mediada por H2O2 (Orozco-Cardenas y Ryan 1999), ABA y ácido jasmónico (AJ) (Peña-Cortés et al., 1995). El etileno puede estar asociado a la señalización local o sistémica de la respuesta, en dependencia de la especie (Bouquin et al., 1997). Existe por tanto una conexión entre las condiciones experimentales antes analizadas que evidencia una relación funcional entre la inducción de VEP1 ante estrés hídrico o daño mecánico en A. thaliana.

Represión asociada a la infección con Golovinomyces orontii

La expresión de VEP1 disminuyó significativamente en hojas de A. thaliana después de 6h de inoculación de esta planta con el hongo fitopatógeno Golovinomyces orontii, tanto en plantas silvestres como en el mutante eds16-1 (del inglés: enhanced disease susceptibility) (Figura 12). Este mutante es defectivo de la enzima isocorismato sintasa, la cual participa en una de las ruta de biosíntesis del ácido salicílico (AS).

Figura 12. Expresión relativa del gen VEP1 en plantas de A. thaliana silvestres y mutantes defectivas de la enzima isocorismato sintasa, infectadas con el hongo fitopatógeno Golovinomyces orontii hasta 7 días posteroires a la inoculación (dpi). E / Eo: Razón entre la expresión del gen en el tiempo en cuestión en plantas infectadas y no infectadas. Las barras en color oscuro indican expresión diferencial para p < 0.01.

53 4. Resultados y discusión

Golovinomyces orontii es un hongo biotrófico obligado, que induce respuestas mediadas por AS en esta planta (Chandran et al., 2009). Es de suponer entonces que la represión, en ambos casos, de la expresión de VEP1 esté asociada a las cascadas de señales que se desatan en respuesta a la infección. Además, es interesante que en la interacción tardía (7 días post-inoculación) VEP1 se induce en el mutante eds16-1 a diferencia de las plantas silvestres. Este hecho pudiera ser indicativo de una regulación negativa de este gen por el AS.

Esta conclusión es, sin embargo, muy arriesgada dado que el mutante en cuestión no es completamente deficiente de AS al tener bloqueada sólo una de tres rutas de biosíntesis de este compuesto (Mueller et al., 2003), además de la complejidad de las rutas de señalización de las plantas en respuesta a patógenos, que pueden variar de acuerdo al estadio de la interacción.

Inducción durante el desarrollo morfogenético

El gen VEP1 debe su nombre a su relación con el patrón de nervadura de las hojas de

Arabidopsis, descrita por Jun et al. (2002). De ahí que se propusiera que este gen jugaba algún papel en el desarrollo morfogenético de los tejidos vasculares de esta planta. Posteriormente fue confirmado que VEP1 codificaba para la progesterona 5-β-reductasa de A. thaliana (Herl et al., 2009). Es conocido además el rol de la progesterona en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Janeczko y Filek 2002) al menos indirectamente como precursora de los brasinoesteroides (Clouse y Sasse 2003; Iino et al.,

2007). De ahí que resulte importante estudiar las implicaciones que pudieran tener sus ortólogos P5βR y P5βR2 en la morfogénesis de D. purpurea.

El experimento GEO12404 comprende la expresión del genoma de A. thaliana en los diferentes compartimientos de la semilla cigótica a lo largo de cinco estadios del desarrollo embrionario: pre- globular, globular, corazón, cotiledonal temprano y cotiledonal tardío o maduro. Las comparaciones se hicieron siempre entre cada estadio y su predecesor, para el mismo compartimiento. VEP1 resultó inducido solamente en el embrión durante la transición de estado cotiledonal temprano a tardío

(embrión maduro, verde) (Figura 13). Esta es precisamente la etapa en que culmina la diferenciación de los haces vasculares (Mayer et al., 1991), confirmando el rol de este gen en la morfogénesis.

54 4. Resultados y discusión

Figura 13. Expresión relativa del gen VEP1 en los distintos compartimientos de la semilla de A. thaliana durante el desarrollo morfogenético del embrión cogótico. En cada punto se compara la expresión del gen, para un compartimiento específico, respecto a la etapa morfogenética anterior. E / Eo: Razón entre la expresión en la fase en cuestión y la fase anterior. Las barras en color oscuro indican expresión diferencial para p < 0.01.

Es significativo además que el período de inducción de VEP1 coincida con la formación de los tejidos verdes. En Digitalis ha sido establecido por varios autores que la expresión del gen P5βR y la producción de los cardenólidos son dependientes de la morfogénesis de los tejidos verdes de la planta

(Stuhlemmer y Kreis 1996), lo cual descubre nuevamente el vínculo funcional de esta actividad enzimática entre ambas especies.

Genes coexpresados con VEP1

Para analizar cuáles fueron los genes más consistentemente coexpresados con VEP1 se analizaron, por separado, los experimentos que involucraban estrés biótico/abiótico y el mega- experimento en el que se mide el transcriptoma durante el desarrollo embrionario. En el primer caso, se seleccionaron los genes que fueron coexpresados con VEP1 en todas las condiciones en las que este se expresó diferencialmente, mientras que en el segundo caso se eligieron los nueve que más significativamente fueron inducidos en la condición en que VEP1 también lo hizo. Ambos conjuntos de genes se describen en la tabla 6.

55 4. Resultados y discusión

El análisis de los genes coexpresados con VEP1 en condiciones de estrés revela el predominio de proteínas relacionadas con la respuesta al frío, estrés hídrico y ABA, como era de esperar teniendo en cuenta las condiciones experimentales analizadas. Una vez más se constata la relación con el patrón de expresión de P5βR2 en D. purpurea, como ya ha sido discutido.

Resulta además interesante la presencia en este conjunto de genes presuntamente involucrados con la ruta de señalización del ABA. El gen At5g61810 codifica una proteína transportadora dependiente de calcio y localizada en la membrana mitocondrial interna. Es conocido que el ABA provoca la síntesis de ADP-ribosa, un segundo mensajero que controla la liberación de depósitos intracelulares de calcio en las plantas (Wu et al., 1997). El gen At3g05640 codifica una hipotética proteína fosfatasa 2-C relacionada con el estrés hídrico. Este tipo de fosfatasas participan en la retroalimentación negativa de la ruta de señalización del ABA (Merlot et al., 2001).

El análisis de los genes coexpresados con VEP1 durante la transición del embrión del estado cotiledón lineal al estado maduro revela el predominio de genes relacionados con la maduración del embrión cigótico, entre ellos un gen codificante para una proteína con un dominio LEA (del inglés late embriogenesis abundant). Estas son proteínas estructuralmente relacionadas que aparecen fundamentalmente en estadios tardíos de la embriogénesis, y se supone que estén relacionadas con la mitigación de pérdida de agua y mantenimiento de la estabilidad celular de la semilla (Manfre et al.,

2006).

La expresión de estas proteínas está también regulada por el ABA (Galau et al., 1986). Otro gen relacionado con el balance hídrico que se induce en el tránsito hacia el embrión maduro codifica una de las isoformas de la enzima málica. Esta enzima cataliza la descarboxilación oxidativa del malato a piruvato, y juega un rol importante en el mecanismo de apertura y cierre estomático mediado por el ABA (Raschke 2003). También resultó inducido un supuesto factor de transcripción perteneciente a la superfamlia MYB, la cual está relacionada con diversos procesos procesos de desarrollo y defensa de la planta (Martin y Paz-Ares 1997).

56 4. Resultados y discusión

Tabla 6. Genes de A. thaliana coexpresados con VEP1 en condiciones de estrés o durante el desarrollo morfogenético del embrión cigótico, según base de datos TAIR (Rhee et al., 2003).

Gen (locus tag) Anotación del producto Coexpresados en condiciones de estrés At1g29395 Similar a proteína de aclimatación al frío WCOR413 en trigo. Expresión inducida por frío, estrés hídrico y ABA. Posiblemente asociada a membrana del tilacoide At5g61810 Transportador peroxisomal dependiente de calcio. At5g40390 Similar a rafinosa sintasa At2g15970 Similar a proteína de aclimatación al frío WCOR413 en trigo. Expresión inducida por frío, estrés hídrico y ABA. At3g50970 Dehidrina Xero2 At1g13740 Proteína hipotética At2g17840 Supuesta proteína asociada a la senescencia. Inducida por luz, sequía, frío y estrés salino At3g05640 Supuesta proteína fosfatasa 2C At3g11420 Proteína desconocida Coexpresados durante la morfogénesis

At4g21020 Supuesta proteína asociada a la desecación. Contiene dominio LEA (late abundant embryogenesis) At2g38465 Proteína expresada At3g25160 Receptor de retención de proteínas del lumen del Retículo endoplasmático. At2g19900 Malato oxidorreductasa (Enzima málica) At5g45690 Proteína hipotética At3g12960 Proteína hipotética, similar a proteína de maduración de semillas PM28 GB:AAD30427 de Glycine max At5g10580 Proteína hipotética At3g09600 Factor de transcripción MYB hipotético At5g66110 Proteína similar a atfp6, similar a proteína asociada a metales pesados (chaperona dependiente de cobre)

Resulta especialmente relevante que varios de estos genes también estén íntimamente relacionados con la señalización por ABA. Esto sugiere que la regulación por esta fitohormona es el punto de contacto entre las funciones de VEP1 en la morfogénesis de los tejidos vasculares y una supuesta implicación en las respuestas a estrés en Arabidopsis. Desde el punto de vista evolutivo, parece probable que esta conexión preexistente en especies con una sola copia de la progesterona

57 4. Resultados y discusión

5β-reductasa, como A. thaliana, haya sido aprovechada en la evolución de la biosíntesis de cardenólidos en especies del género Digitalis debido a la relación existente entre la señalización ante el estrés hídrico y el ataque de un herbívoro.

4.2.2 Detección de motivos reguladores en P5βR y P5βR2

Los motivos reguladores son pequeñas secuencias de ADN ubicadas en los promotores de los genes a las cuales se unen los factores de transcripción que gobiernan la expresión génica. La búsqueda de motivos reguladores en regiones promotoras, en combinación con el análisis de las condiciones de expresión de los genes, es una herramienta poderosa en la dilucidación de programas de regulación transcripcionales. La combinación de ambos enfoques aumenta la robustez de las predicciones en este sentido, al combinar datos con fuentes de error diferentes (Lemmens et al.,

2009). De ahí que se determinara en este trabajo la ocurrencia de motivos reguladores en los promotores de P5βR y P5βR2 a partir del análisis comparativo con los promotores de los genes coexpresados con VEP1 en diferentes escenarios.

Para llevar a cabo el análisis, se formaron cuatro conjuntos de promotores por combinación de los correspondientes a P5βR y P5βR2 con los de VEP1 y los genes coexpresados con él en condiciones de estrés y morfogénesis. Los cuatro grupos de promotores fueron analizados en busca de motivos reguladores conservados, resumiéndose los resultados en la tabla 7.

Motivos reguladores detectados a partir de condiciones de estrés

Al analizar los motivos que regulan la expresión de VEP1 en condiciones de estrés, aparecen varios motivos de unión a factores de transcripción relacionados con respuesta a condiciones de frío o estrés salino (Tabla 7), como ALFIN1 (Medicago sativa) (Winicov 2000), TaNAC69 (Triticum aestivum)

(Wan et al., 2008) y RAV1 (Arabidopsis thaliana) (Kagaya et al., 1999) lo cual está en concordancia con la anotación funcional de los genes coexpresados con VEP1 así como las condiciones en que estos se inducen. Además aparecen predichos dos motivos de unión al factor de transcripción DOF2

(Zea mays). La familia de factores de transcripción DOF es muy amplia, y sus miembros están

58 4. Resultados y discusión

Tabla 7. Motivos reguladores predichos para los promotores de VEP1 (A. thaliana), P5βR y P5βR2 (D. purpurea). Las posiciones de los motivos se reflejan relativas al sitio de inicio de la transcripción

Gen Secuencia del motivo Posición Cadena Factor de transcripción predicho

A partir de genes de A. thaliana coexpresados en condiciones de estrés

VEP1 AAAAGACAAACC -100 Directa DOF2 CCCACACGGCT -89 Complementaria ALFIN1 AAAAGACAAACCCCACACGGCTCT -100 Directa TaNAC69 TGTCATTTTCTTTTTTTAT -412 Complementaria DOF2 TCTGTCGGATCCAG -617 Directa ZmHOX2a/RAV1

P5βR GGTTTCTTTCCTTCTCTCT -189 Complementaria DOF2 ACAAGCACAAAATCGACAA -44 Directa DOF2

P5βR2 TTTTTTTTTTGTTTTTTATA -216 Complementaria DOF2 GCCTTGCAGCGCCTCGTGC -237 Directa TEIL/NtERF2

A partir de genes de A. thaliana coexpresados durante la morfogénesis del embrión cigótico

VEP1 TTTGTCATTTTCTTTTTTTA -412 Complementaria DOF2 TTTGTTCATCTTTTTTGGTA -188 Complementaria DOF2 AAGAAAGA -386 Complementaria DOF2 TTTGTTCATCTTTTTTGGTA -178 Complementaria DOF2 /AG/AGL1

P5βR CCTTCTCTCTT -180 Complementaria DOF2 CTTTCTAACTC -716 Complementaria DOF2 AAAACAAATAAATGCAGAGT -496 Directa DOF2 TTTGGCAGCCA -896 Complementaria DOF2 TTTGGCGTCCC -702 Directa NtERF2

P5βR2 ATATACAGAGAAAAGAAAAG -372 Directa DOF2 /TEIL CCTTGCAGCGCCTCGTGC -236 Directa TEIL/NtERF2 CCTTGCAGCGCCTCGTGC -279 Directa TEIL/NtERF2

59 4. Resultados y discusión

relacionados con una gran variedad de funciones (Yanagisawa 2002). En particular, DOF2 ha sido relacionado con el metabolismo de carbono C4 en maíz, mientras que en A. thaliana se han descrito genes de esta familia relacionados con respuesta a H2O2 (Chen et al., 1996) y germinación

(Gualberti et al., 2002).

Es precisamente este factor de transcripción el único de los reguladores predichos para VEP1 que tiene motivos de unión en los promotores de P5βR y P5βR2 (Tabla 7). En el caso de P5βR aparecen dos sitios de unión predichos, mientras que para P5βR2 se predice uno solo, junto con otro para TEIL y NtERF2 (Nicotiana tabacum). NtERF2 es un factor de transcripción involucrado en la cascada de señalización de respuesta a etileno (Suzuki et al., 1998). TEIL es el homólogo en tabaco del factor de respuesta a etileno EIN3 de A. thaliana que participa en la cascada de señalización de esta fitohormona (Kosugi y Ohashi 2000).

Motivos reguladores detectados en la morfogénesis

El análisis de los motivos reguladores predichos para VEP1 relacionados con la morfogénesis revela la existencia de cuatro sitios de unión a DOF2. Además resulta muy interesante la presencia de un motivo de unión a AG y AGL1 (A. thaliana), proteínas relacionadas con la lignificación y con la morfogénesis de los órganos florales (Ma et al., 1991). Este hecho es consistente con la inducción de

VEP1 al final del desarrollo embrionario de A. thaliana, momento en el que se completa la diferenciación de los tejidos vasculares por medio de la lignificación y muerte programada de las células precursoras (Fukuda 2000).

En cuanto a los genes de D. purpurea, el promotor de P5βR contiene cuatro motivos de unión a

DOF2 más uno a NtERF2 (Tabla 7). P5βR2 por el contrario aparece con sólo un motivo de unión a

DOF2, que además está predicho como de unión a TEIL. Además de estos, el promotor de P5βR2 presenta otros dos motivos que responden a los factores de transcripción TEIL y NtERF2.

Papel de los motivos detectados en D. purpurea

El análisis de los promotores de P5βR y P5βR2 en ambos escenarios apunta como regla general a la conservación en P5βR de los motivos de unión a DOF2 presentes en VEP1, mientras que

60 4. Resultados y discusión

Figura 14. Modelo propuesto para la evolución de la regulación de la actividad progesterona 5β- reductasa en A. thaliana y D. purpurea.

en P5βR2 se aprecia una tendencia a la sustitución de estos reguladores por motivos de respuesta a etileno. También es notable que otros factores de respuesta a estrés (ALFIN1, TaNAC69,

RAV1, ZmHOX2a) no conservan sus sitios de unión en los promotores de los genes de Digitalis.

Sería muy difícil predecir la función de los motivos de unión a DOF en P5βR y P5βR2 debido a la diversidad de funciones con que estos factores de transcripción han sido relacionados en otras especies (Yanagisawa 2002). Sin embargo, la presencia de cuatro de estos motivos de unión en el promotor de P5βR y la no inducción de este gen ante estrés hídrico, daño mecánico o H2O2 sugiere que estas secuencias no son funcionales en Digitalis. Pudiera pensarse de acuerdo a las funciones de factores de transcripción DOF en la germinación de Arabidopsis (Gualberti et al., 2002) que estos son la base de una función morfogenética de P5βR en Digitalis, análoga a la de VEP1 en Arabidopsis. Sin embargo el hecho de que el motivo de unión a AG y AGL1 esté presente en el promotor de VEP1 y no

61 4. Resultados y discusión en el de P5βR, pone en duda esta posibilidad. Recuérdese que AG y AGL1 son factores de transcripción directamente relacionados con la morfogénesis de tejidos vasculares (Ma et al., 1991).

En el caso de P5βR2, sin embargo, parece muy clara la estrategia evolutiva de sustitución de los motivos de unión a DOF por motivos de respuesta a etileno (NtERF2, TEIL). Este hecho indica un cambio en regulación de P5βR2 en respuesta a condiciones de estrés, con respecto a VEP1 en A. thaliana que evolucionó hacia la adquisición de otras señales de respuesta a estrés mediante los factores de transcripción ALFIN1, TaNAC69, ZmHOX2a y RAV1. Por tanto la adquisición por P5βR2 de señales de respuesta a etileno puede haber estado relacionada con el surgimiento y la especialización de la síntesis de cardenólidos en el género Digitalis (Figura 14).

El número elevado de motivos de respuesta a etileno en P5βR2 está además en concordancia con la inducción rápida del gen en respuesta a esta fitohormona (Pérez-Bermúdez et al., 2010).

Además, la señalización por etileno se encuentra asociada a la respuesta ante el daño mecánico en relación con otras rutas señalizadoras como las del ABA y el AJ (León et al., 2001). En particular el etileno aparece asociado a respuestas locales en A. thaliana (León et al., 2001). Estos motivos reguladores pudieran por tanto estar asociados a la inducción rápida y local de la biosíntesis de cardenólidos en respuesta a ataques de herbívoros.

4.2.3 P5βR y P5βR2 como candidatos a transformación para el incremento de la síntesis de cardenólidos

Los resultados alcanzados indican que VEP1 es un gen relacionado con respuestas a estrés, además de su relación previamente descrita con la morfogénesis de tejidos vasculares. La existencia de dos copias de este gen en Digitalis con patrones de expresión diferentes sugiere la subfuncionalización de la actividad progesterona 5-β-reductasa hacia dos isoformas con funciones diferentes. Ya ha sido establecido que P5βR2 es el responsable de la inducción rápida de la síntesis de cardenólidos ante daño mecánico y tratamiento con elicitores (Pérez-Bermúdez et al., 2010). En este trabajo se han detectado motivos reguladores en el promotor de este gen que concuerdan con

62 4. Resultados y discusión estos resultados e indican la esta especialización de P5βR2 hacia esta función, mediada por la ruta de señalización del etileno.

P5βR no es inducible ante las condiciones a que sí responde P5βR2, aunque presenta en su promotor varios motivos predichos de unión a DOF2. En consecuencia estas secuencias deben o bien no ser funcionales o estar relacionadas con otros procesos fisiológicos, como el desarrollo morfogenético tal como ocurre con VEP1 en A. thaliana. Sin embargo, a partir de estos resultados es muy difícil establecer si alguno de estos genes tiene alguna implicación en la morfogénesis de D. purpurea. Este aspecto debe ser tenido en cuenta en el diseño de vectores de transformación con alguno de estos genes para aumentar la síntesis de cardenólidos de D. purpurea, ya que puede dar al traste con la viabilidad de la planta o la producción de biomasa. Por otra parte, al considerar la regulación específica a la que está sometido P5βR2 además de sus bajos niveles de expresión basal detectados por Pérez-Bermúdez et al. (2010) hacen de este gen el candidato más promisorio para la transformación.

En cualquier caso estos resultados podrán servir de guía para estudios de expresión in vivo de ambos genes, así como estudios funcionales a través del protocolo de transformación genética aquí descrito, que permitan determinar con más precisión sus funciones y regulación, especialmente en el caso de P5βR.

Resultan muy interesantes los vectores de transformación en los que el gen de interés pertenece a la propia especie y es inducible ante determinadas condiciones. Dicho gen se coloca bajo el control de su propio promotor precedido por una fracción de un promotor fuerte como el CaMV-35S, logrando el mismo patrón de expresión inducible pero amplificado (Yoshida y Shinmyo 2000). El uso de este tipo de vectores de transformación aprovechando el promotor inducible y altamente específico de P5βR2 parece una alternativa promisoria para la obtención de plantas transgénicas de D. purpurea con elevada producción de cardenólidos y mínimos efectos pleiotrópicos que pudieran presenatrse por la sobreexpresión constante de esta actividad enzimática.

63 5. Conclusiones

5. CONCLUSIONES

1. Se desarrolló un sistema de transformación eficiente de Digitalis purpurea mediado por la cepa C58C1-pMP90 de Agrobacterium tumefacien

2. Se comprobó por análisis histoquímicos y moleculares la actividad y estabilidad de los transgenes.

3. El gen VEP1 de Arabidopsis thaliana se induce en condiciones de estrés hídrico, daño mecánico y estadios tardíos de la embriogénesis, a través de la regulación por varios motivos de regulación de respuesta a estrés abiótico.

4. El gen P5βR de D. purpurea está regulado mayormente por motivos de unión a factores de transcripción DOF, mientras que P5βR2 está regulado por motivos de unión a factores de transcripción de la cascada de respuesta a etileno.

5. Debido a su regulación altamente específica por factores de respuesta a etileno y sus bajos niveles de expresión basal, el gen P5βR2 es el mejor candidato para la transformación de D. purpurea con el objetivo de incrementar la producción de cardenólidos.

64 6. Recomendaciones

6. RECOMENDACIONES

1. Optimizar las condiciones del protocolo de transformación para maximizar el número de plantas transformadas a través del estudio de la influencia de otros factores como el medio de cultivo de inducción, el tiempo de cocultivo y el explante inicial.

2. Determinar experimentalmente los patrones de expresión de los genes P5βR y P5βR2 en respuesta a otras condiciones experimentales como la administración de ácido abscísico.

3. Realizar estudios funcionales de P5βR y P5βR2 mediante su sobreexpresión y silenciamiento en D. purpurea que permitan, sobre la base de los resultados obtenidos, esclarecer su rol durante la morfogénesis de u otros procesos fisiológicos de esta planta.

4. Transformar D. purpurea con en gen P5βR2 bajo el control de su propio promotor precedido por el promotor fuerte CaMV35S, para obtener plantas con una productividad incrementada de cardenólidos al ser sometidas a las condiciones de inducción de este gen.

65 7. Anexos

ANEXO 1: Soluciones empleadas en este trabajo

En extracciones de ADN

Tris-EDTA 0,01 M Tris-HCl, 0,001 M EDTA, pH 8.

Tampón de extracción: 0,1 M Tris-HCl, 0,05 M EDTA, 0,5 M NaCl, β-mercaptoetanol 0.07%

(añadido justo antes de usarse el tampón) pH 8

SDS alcalino: SDS 1%, NaOH 0,04 M

KAc 5/3 M 3 M KAc, 2 M HAc

En hibridación por Southern blot

SSC:0,15 M NaCl, 0,015 M Citrato de sodio, pH 7,0

Tampón de prehibridación: 5X SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio, pH 7,0) , 1% (m/v) agente bloqueador, 0,1 % Na-lauroilsarcosina, 0,02 % SDS.

Agente bloqueador (stock 10%): 10 g de Reactivo bloqueador (Roche) en 100 ml de tampón 1 por sucesiones de calentamiento y agitación sin llegar a bullir.

Tampón de hibridación: Tampón de prehibridación con 50 μg/ml de ARN-t de levadura

Solución de lavado 2 X: 2 X SSC, 0,1 % SDS.

Solución de lavado 0.1 X: 0.1 X SSC, 0,1 % SDS.

Tampón 1: 100 mM ácido maleico, 150 mM NaCl, pH 7,5

Tampón 2: 1 % reactivo bloqueador disuelto en tampón 1.

Tampón 3: 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl

66 7. Anexos

ANEXO 2: Relación de experimentos de microarreglos analizados en este estudio

ID Base de Datos* Título E-GEOD-537 ArrayExpress Transcription profiling of wild Arabidopsis seedlings treated with ethylene E-GEOD-911 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis LEAFY mutant seedlings treated with dexamethasone and/or cycloheximide E-GEOD-1491 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis seedlings treated with inhibitors of auxin transcriptional response identified using chemical genetics E-GEOD-3326 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis wild type and ice1 mutant exposed to cold treatment E-GEOD-3350 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis slr1 mutant and wild type lateral root segments treated with auxin E-GEOD-4733 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis male-sterile opr3 mutant stamens treated with jasmonate or its precursor, 12-oxophytodienoic acid E-GEOD-6153 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis short day grown hypocotyls to identify genes involved in secondary cell wall development E-MEXP-173 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis wild type, 35S:mks1 and mpk4 plants E-MEXP-174 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis mutants mpk4 and ctr1 E-MEXP-449 ArrayExpress Transcription profiling of control and catalase-deficient Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) plants E-MEXP-509 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis treated with sugars (glucose, mannose) and abcissic acid E-MEXP-547 ArrayExpress Transcription profiling of elicitor treatment over time (0, 30, 60 min) in Arabidopsis Landsberg (wt) and fls2-17 (flagellin receptor mutant) E-MEXP-728 ArrayExpress Transcription profiling of potent induction of flowering in A. thaliana by elevated temperature E-MEXP-739 ArrayExpress Transcription profiling of powdery mildew infected A. thaliana treated with Syringolin A E-MEXP-883 ArrayExpress Transcription profiling of wild type and myc2 mutant Arabidopsis plants treated with methyl jasmonate E-MEXP-901 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis plants treated with monoterpene followed by wounding or insect stress E-MEXP-1443 ArrayExpress Transcription profiling of Arabidopsis guard cells and mesophyll cells in response to ABA treatment E-TABM-209 ArrayExpress Transcription profiling of wild type and RAP2.2 over- expressing Arabidopsis leaves GSE5627 GEO AtGenExpress: Stress Treatments (Wounding stress) GSE7961 GEO affy_aba_ath1-Characterization of aba3-1 suppressor mutants GSE8951 GEO A light-independent allele of phytochrome B faithfully

67 7. Anexos

recapitulates photomorphogenic transcriptional networks GSE9955 GEO MILDEW-INDUCED LESIONS 4 encodes a novel regulator of the salicylic acid defense response GSE9956 GEO Expression profiling of the overexpression of MILDEW- INDUCED LESIONS 4 GSE10019 GEO Identification of RGA downstream genes by using steroid- inducible system GSE10247 GEO Transcriptome analysis of the Arabidopsis phloem GSE10248 GEO Gene expression analysis of Arabidopsis pvip1 pvip2 seedlings GSE10643 GEO Transcription profiling of Arabidopsis dor mutant and wild- type plants in response to drought stress GSE10670 GEO Global expression profiling of wild type and transgénic Arabidopsis plants in response to water stress GSE10719 GEO Response of Arabidopsis cell culture to phytoprostane A1 GSE10732 GEO Identification of TGA-regulated genes in response to phytoprostane A1 and OPDA GSE11216 GEO Brassinazole treatment of arf2 and wild-type dark-grown seedlings GSE11505 GEO The Arabidopsis BRAHMA Chromatin Remodelling ATPase Is Involved in Direct Repression of Embryonic Traits in Leaves GSE12029 GEO NFYA5, a CCAAT binding transcription factor important for drought resistance in Arabidopsis GSE12404 GEO Expression data from Arabidopsis Seed Compartments at 5 discrete stages of development GSE12729 GEO Microarray analysis of MINI ZINC FINGER 1 (MIF1) overexpression transgénic Arabidopsis seedlings GSE13739 GEO Golovinomyces orontii time course with Col-0 and eds16-1 GSE14091 GEO Identification of ANAC059 and ANAC092 early target genes GSE14420 GEO Global gene expression of Arabidopsis lines with altered ANAC102 expression under normal and low oxygen conditions GSE14961 GEO Expression data from Arabidopsis Seedlings treated with Salicylic Acid

* GEO: Gene Expression Omnibus. Disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

ArrayExpress: Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/

68 8. Referencias bibliográficas

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