Bioprocesso, Purificação E Caracterização Das Peptidases Produzidas Pelos Fungos Eupenicillium Javanicum E Myceliophthora Th
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO Bioprocesso, purificação e caracterização das peptidases produzidas pelos fungos Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila e avaliação da produção de peptídeos biologicamente ativos Youssef Ali Abou Hamin Neto Ribeirão Preto 2017 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO Bioprocesso, purificação e caracterização das peptidases produzidas pelos fungos Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila e avaliação da produção de peptídeos biologicamente ativos Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Produtos Naturais e Sintéticos. Orientado: Youssef Ali Abou Hamin Neto Orientador: Prof. Dr. Hamilton Cabral Versão corrigida da Tese de Doutorado apresentado ao apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas em 29/03/2017. A versão original encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP. Ribeirão Preto 2017 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Hamin Neto, Youssef Ali Abou Bioprocesso, purificação e caracterização das peptidases produzidas pelos fungos Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila e avaliação da produção de peptídeos biologicamente ativos. Ribeirão Preto, 2017. 193 p.; 30cm. Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Produtos Naturais e Sintéticos. Orientador: Cabral, Hamilton. 1. Peptídeos bioativos. 2. Peptidases fúngicas. 3. Bioprocesso. FOLHA DE APROVAÇÃO Youssef Ali Abou Hamin Neto Bioprocesso, purificação e caracterização das peptidases produzidas pelos fungos Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila e avaliação da produção de peptídeos biologicamente ativos Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Produtos Naturais e Sintéticos. Orientador: Prof. Dr. Hamilton Cabral Aprovado em: Banca Examinadora Prof.Dr._________________________________________________________ Instituição:____________________________ Assinatura:____________________ Prof. Dr._________________________________________________________ Instituição:_____________________________ Assinatura:____________________ Prof.Dr._________________________________________________________ Instituição:_____________________________ Assinatura:____________________ Prof.Dr._________________________________________________________ Instituição:_____________________________ Assinatura:____________________ Prof.Dr._________________________________________________________ Instituição:_____________________________ Assinatura:____________________ Dedico este trabalho aos meus pais Zalfa e Ali (in memoriam), e ao meu irmão Amir. Agradecimentos Agradeço a todos aqueles que contribuíram diretamente e indiretamente para a conclusão deste trabalho. Aos meus pais, Ali (in memoriam) e Zalfa, por proporcionarem todo o alicerce para eu alcançar meus objetivos, e ao meu irmão Amir pelo apoio e companheirismo. Aos meus companheiros de laboratório e orientador Prof. Dr. Hamilton Cabral, que se tornaram grandes amigos e contribuíram de forma ativa para esta pesquisa, sem eles não conseguiria finalizar este trabalho, em especial à Ana Claúdia Rodrigues de Siqueira, Luciana Barbosa Coitinho e Nathália Gonsales da Rosa Garzon. Aos meus amigos, por sempre incentivarem o meu crescimento e vibrarem junto comigo a cada conquista. Aos colaboradores do projeto, Prof.ª Dr.ª Niege Araçari Jacometti Cardoso Furtado, Prof. ª Dr.ª Andreia Machado Leopoldino, Maria Angélica dos Santos Cunha Chellegatti e Lays Martin Sobral. À fonte de fomento FAPESP bela bolsa concedida, Processo: 2012/18278-2. i RESUMO HAMIN NETO, Y. A. A. Bioprocesso, purificação e caracterização das peptidases produzidas pelos fungos Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila e avaliação da produção de peptídeos biologicamente ativos. 2017. 217f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. O Câncer é uma doença responsável pelos maiores índices de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A ocorrência do câncer é relacionada com vários fatores, entre eles, ambientais, nutricionais, genéticos, infecções virais e estilo de vida. Devido a complexidade da doença, há uma busca incessante em novos tratamentos. Atualmente, os medicamentos conhecidos, além de danificar células anormais prejudicam células saudáveis, o que causa efeitos colaterais e toxicidade. Algumas moléculas, por exemplo peptídeos, possuem a capacidade de interagir com proteínas de membrana de células cancerígenas, atuando diretamente nestas células. Estes peptídeos podem ser obtidos a partir da hidrólise de diferentes fontes de proteínas com a utilização de peptidases de origem microbiana. O objetivo do presente estudo foi produzir e purificar peptidases de dois fungos, Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila, realizar ensaios de caracterização bioquímica e eficiência catalítica destas enzimas, aplica las na obtenção de peptídeos bioativos a partir de proteínas do leite, ovo e gelatina, e avaliar a atividade antioxidante (in vitro) e atividade antitumoral (in vitro e in vivo) destes peptídeos. Foram produzidas e purificadas duas peptidases, uma metalopeptidase (E. javanicum) e uma serinopeptidase (M. thermophila), o ensaio de cinética enzimática mostrou maior eficiência catalítica na utilização de substratos com alanina na posição P’2 e tirosina na posição P’1 da cadeia polipeptídica, respectivamente para cada uma das enzimas. Os peptídeos, produzidos a partir de caseína, apresentaram maior atividade de sequestro de radicais e de quelar ferro. Peptídeos de soro de leite e gelatina inibiram o crescimento de células tumorais de câncer oral e melanoma (in vitro). Peptídeos de soro de leite produzidos por ambas as peptidases reduziram o volume tumoral (células Cal27) em camundongos imunodepriminidos. Ensaios proteômicos destes tumores, com comparação entre grupos tratados e sem tratamento, mostraram que algumas vias envolvidas com a apoptose podem estar envolvidas na redução do volume dos tumores do camundongos tratados com peptídeos obtidos de soro de leite. Palavras chaves: atividade antitumoral, Eupenicillium javanicum, Myceliophthora thermophila, peptidases, peptídeos bioativos. ii ABSTRACT HAMIN NETO, Y. A. A. Bioprocess, purification and characterization of the peptidases produced by the fungi Eupenicillium javanicum and Myceliophthora thermophila and evaluation of the production of biologically active peptides. 2017. 217f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. The cancer is a disease responsible to the higher levels of mortality and morbity around the world. This disease is related to many factors, as environment, nutrition, genetic, virus infection and life style.The complexity of this disease increases the research of new treatments. Currently, the medicines damage both, normal and cancer cells, it promotes side effects and toxicity. Some molecules present specificity and bind to proteins from membranes of cancer cells, some examples are peptides. Peptides can be obtained from proteins by hydrolisys with microrbial proteases. The aim of this study was to produce and purify two proteases from fungi, Eupenicillium javanicum and Myceliophthora thermophila. Biochemical characterization and kinetic assays of these enzymes were evaluated. And then, the proteases were applied on obtention of peptides from milk, egg and gelatin proteins, and the antioxidant (in vitro) and antitumoral activity (in vitro e in vivo) of these peptides were evaluated. The purified enzymes belong to metalo (E. javanicum) and serine (M. thermophila) protease classes, the kinetic assay showed higher catalytic efficiency with tyrosine at P’1 position and alanine at P’2 position of polypeptide chain of substrate, to metalo and serine protease, respectively. The peptides from casein presented capacity to scavenge free radicals and to quelate iron. Peptides derived from whey and gelatin inhibited the grown of oral cancer and melanoma cells (in vitro). Peptides obtained from whey decreased the tumor volume of immunosupressed mice. Proteomic assays of these tumors, when compared treatment and control group, showed that peptides can be envolved in some apoptosys pathway and it influences the tumor volume, cosequently, it is decreased on treatment with peptides derived from milk whey. Keywords: antitumor activity, bioactive peptides, Eupenicillium javanicum, Myceliophthora thermophila, peptidases. iii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Panorama geral de todas as etapas realizadas no estudo, desde a produção 18 das peptidases até a aplicação na produção de peptídeos, seguido da avaliação de atividade biológica. Figura 2. Esquema da funcionalidade do substrato peptídico com supressão 26 intramolecular de fluorescência demonstrando as diferenças de fluorescência na forma íntegra (intacta) do substrato e na forma hidrolisada por ação enzimática (SANTOS, 2009). Figura 3. Esquema proposto por Schechter e Berger (1967) no qual o sítio 32 catalítico da peptidase é dividido em subsítios, e cada subsítio