Determinación De La Dósis Letal Media De Aislados Bacterianos
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Compendio de Investigación Los Mochis, Sinaloa, México Academia Journals Los Mochis 2018 © Academia Journals 2018 Octubre 24 al 26, 2018 Determinación de la dósis letal media de aislados bacterianos relacionados con el Síndrome de Mortalidad Temprana (EMS/AHPND) en larvas de camarón blanco (Litopenaues vannamei) LB. Osmar Alfredo Salazar Osorio1, Dra. Martina Hilda Gracia Valenzuela2, Dr. César Marcial Escobedo Bonilla3, MC. Lázaro Félix Armendáriz 4 y Dr. Joe Luis Arias Moscoso5 Resumen- En México, el cultivo de camarón es una actividad primaria importante, sobre todo en el noroeste, ya que produce proteína animal de alta calidad y es una fuente de ingreso para poblaciones vulnerables. No obstante, ésta actividad se ha visto afectada por varias enfermedades principalmente por virus y bacterias; siendo estas últimas las de gran impacto desde En el 2013, aparece en México una nueva enfermedad en camarones cultivados denominada “La Enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND) o Síndrome de la Muerte Temprana en camarón provocada por la bacteria Vibrio parahaemolyticus. El objetivo del presente proyecto, fue determinar la dósis letal media de aislados bacterianos que provocan la muerte temprana (EMS/HPND) en larvas de camarón blanco (Litopenaeus vannamei). Se tomaron muestras de camarones infectados de diferentes granjas acuícolas; posteriormente se obtuvieron aislados y se identificaron realizando las técnicas de extracción, PCR y electroforesis para la identificación del patógeno. Una vez identificados se realizaron bioensayos para conocer la dosis letal media en camarones sanos. Los resultados obtenidos muestran que la dosis letal media (DL50) fue la concentración 103, registrándose el 50 % de mortalidad de la población. Por lo anterior, la industria acuícola debe tomar medidas preventivas para generar estrategias que disminuyan los efectos de Vibrios durante los cultivos. Palabras clave: Enfermedad, Vibrios, AHPND. Introducción La Enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND) fue reportada por primera vez en China en 2009, causando grandes mortalidades en los cultivos de camarón y serias pérdidas a la industria camaronícola en ese país (NACA, 2012). Posteriormente la enfermedad se extendió a otros países asiáticos como Vietnam, Malacia, Tailandia, donde también causó altas mortalidades (NACA, 2012). En México, la AHPND ha afectado a la producción de camarón blanco en el noroeste del país (Nayarit, Sinaloa y Sonora) desde el año 2013 (Nunan, 2014), con una disminución de la producción entre el 30 y 66% (Lightner, 2013). En México, el cultivo de camarón es una actividad primaria importante, sobre todo en el noroeste, ya que produce proteína animal de alta calidad y es una fuente de ingreso para poblaciones vulnerables. De acuerdo a los datos obtenidos en un estudio de la Universidad de Arizona, la llegada del EMS a México repercutió en la producción camaronera y la disminución de empleos en el 2012; las granjas camaroneras contrataban a siete mil personas y un año después, a sólo 2,500. La producción camaronícola en 2012 había alcanzado 100,321 toneladas de peso vivo, mientras que al finalizar el año 2013, ésta no superó las 60,292 ton (SAGARPA, 2013). Siendo combatidos principalmente con antibióticos como oxitetraciclina o florfenicol (Serrano 2005), y probióticos pertenecientes principalmente a bacterias del genero Bacillus (Weng Alemán et al. 2005). AHPND es una enfermedad severa, causada por Vibrio parahaemolyticus. Esta bacteria normalmente es oportunista, pero se vuelve virulenta cuando adquiere un plásmido de 70 mil pares de bases (pVA1) el cual tiene dos genes que codifican para las toxinas PirA y PirB, muy semejantes a las toxinas entomopatogénicas PirA/PirB de Photorhabdus luminescens, siendo estas el principal factor tóxico que en camarones provoca la enfermedad AHPND causando la destrucción del epitelio del tracto digestivo, disfunción de los órganos de este sistema y la muerte del camarón, ocasionando enormes pérdidas en la producción (Cuellar, 2013). La enfermedad afecta camarones juveniles tempranos (30 - 35 días post siembra). Los signos clínicos incluyen crecimiento lento, exoesqueleto blando y 1 LB. Osmar Alfredo Salazar Osorio es egresado de la carrera de Licenciatura en Biología en el Instituto Tecnológico del Valle del Yaqui, Municipio de Bácum, Sonora. [email protected]. 2 Martina Hilda Gracia Valenzuela es Profesora investigadora en el Instituto Tecnológico del Valle del Yaqui, Municipio de Bácum, Sonora. [email protected] (autor corresponsal). Ebook Online 907 ISBN: 978-1-939982-41-4 Compendio de Investigación Los Mochis, Sinaloa, México Academia Journals Los Mochis 2018 © Academia Journals 2018 Octubre 24 al 26, 2018 quebradizo, coloración pálida, inactividad, estómago e intestino vacío y hepatopáncreas atrofiado pálido. En la etapa temprana de AHPND, las células epiteliales del hepatopáncreas se han desprendido masivamente y están presentes en los túbulos de hepatopáncreas sin evidencia de un agente causal (Tran, 2013). Los signos clínicos de estas tres patologías comparten similitudes; como lo son una marcada palidez del hepatopáncreas, el cual presenta atrofia, el intestino de los animales infectados se muestra vacío o con contenido entrecortado, anorexia, letargia, y ocasionalmente infestaciones por parasitologías secundarias, siendo común la presencia de aves cazando en los estanques afectados (Lightner, 1996; Bradley-Dunlop et al., 2004; Vincent et al., 2004; Morales-Covarrubias, 2008; Cuéllar- Ángel et al., 2012; Varela y Peña, 2015). Descripción del Método Purificación y aislados bacterianos de Vibrio Se prepararon medios de cultivo bacterianos (TSA, TSB, TCBS, APW), en una campana de flujo laminar. Las cajas Petri preparadas fueron empacadas en bolsas bajo condiciones estériles rotuladas con los datos de fecha y medio y fueron almacenados a 4 °C hasta su uso. Para la reactivación de los aislados de vibrios provenientes de granjas camaronícola del estado de Sinaloa se tomaron 20 µL del aislado y se inocularon en 3 mL de caldo soya tripticaseina (TSB). Posteriormente fueron incubados de forma inclinada a 200 rpm y 30°C por 24 - 48 horas en una incubadora de agitación orbital (SIGMA, USA), monitoreándose mañana y tarde. Se prosiguió a realizar la siembra en agar soya tripticaseina (TSA) + 2% de NaCl y agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS) incubando a 37 °C por 48 horas en una incubadora (Binder, USA). Posteriormente, se determinaron los tipos de colonias bacterianas resultantes por color en medio TCBS: amarillas o verdes y la morfología de las colonias en TSA. Las diferentes bacterias se resembraron por estría cruzada al menos dos veces para obtener cultivos puros. Una vez purificados los aislados se procedió a un crecimiento final en caldo TSB agregando 3 mL de caldo en tubos falcón y con ayuda de palillos estériles se seleccionó una colonia y se incubaron inclinados a 200 rpm y 30°C por 24 -48 horas en una incubadora de agitación orbital (SIGMA, USA). Los cultivos fueron monitoreados por densidad óptica en un espectrofotómetro de placa a 600 nm esperando un rango de 0.5-0.7 OD, obteniendo variaciones de crecimiento dependiendo del tiempo de incubación y tipo de aislado. Enseguida, se usaron los cultivos para hacer extracción de ADN (Gómez-Gil, et al., 2009), PCR y electroforesis. Preparación de cuentas de vidrio. Se lavan las cuentas de vidrio con agua destilada y detergente neutro libre de fosfatos para enjuagar con abundante agua destilada, después se sumergen en ácido clorhídrico (HCl) al 2% durante 2 horas con el fin de producir poros y eliminar la alcalinidad, se enjuagan con agua destilada hasta tener un pH neutro y se meten a la incubadora Binder a 80 ºC hasta que se le retire toda la humedad, después las cuencas se colocan en tubos crioviales ¾ partes aproximadamente con las tapas ligeramente flojas y se autoclavan a 121ºC por 15 min., y se asegura la tapa para evitar contaminación y se almacena a 4ºC. (Gomez-Gil, et al., 2009). Preparación de stocks con cuentas de vidrio. Se realizaron cultivos bacterianos en caldo TSB con NaCl 2% dando una densidad óptica 0.5–0-7, asegurando que las bacterias estuvieran en fase exponencial; enseguida se agrega la suspensión bacteriana al tubo con las cuentas de vidrio hasta cubrir por completo las cuentas, agitar el tubo dejando reposar por 10 min y al final eliminar toda la suspensión bacteriana con una micropipeta, rotular y almacenar en el ultracongelador (-70ºC) (Gomez-Gil, et al., 2009). Preparación de stocks glicerol 20% Se realizaron cultivos bacterianos en caldo TSB con NaCl 2% danto una densidad óptica 0.5–0-7 puesto que las bacterias debían estar en fase exponencial, se agrega 1125µL la suspensión bacteriana al tubo y 375µL de Glicerol al 80%, se agita por pipeteo y por inversión, rotular y almacenar en el ultracongelador (-70ºC). (Gomez-Gil, et al., 2009). Bioensayos: Se siembran las bacterias en caldo TSB + 2% de NaCl 30ºC y 200 rpm hasta tener una densidad óptica de 1, se utilizan 10 camarones colocados en pareja con un intervalo mayor o igual a 0.5 g y menor o igual a 3 g en peceras con un volumen total de 1000 mL. Para la inoculación por inmersión se realizara en las concentraciones 106, 105, 104, 103, y 102 UFC/mL, realizando el experimento por triplicado. Ebook Online 908 ISBN: 978-1-939982-41-4 Compendio de Investigación Los Mochis, Sinaloa, México Academia Journals Los Mochis 2018 © Academia Journals 2018 Octubre 24 al 26, 2018 Resumen de resultados Purificación de aislados bacterianos provenientes de granjas con mortalidad asociadas a EMS El proceso de purificación se inició con siete aislados bacterianos de los cuales se obtuvieron 28 muestras como producto final. De cada aislado se tomaron colonias distintas de color verdes en agar TCBS y amarillas en agar TSA con las cuales se realizaron 2 resiembras con la finalidad de obtener una cepa purificada de cada una de las muestras. B C A B Imagen 1. Aislamiento bacteriano de muestras obtenidas durante el muestreo. purificadas provenientes de 7 aislados bacterianos.