Diversity of Purple Nonsulfur Bacteria in Shrimp Ponds and Mercury Resistant Mechanisms of Selected Strains Kanokwan Mukkata
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
i Diversity of Purple Nonsulfur Bacteria in Shrimp Ponds and Mercury Resistant Mechanisms of Selected Strains Kanokwan Mukkata A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Microbiology Prince of Songkla University 2016 Copyright of Prince of Songkla University i Diversity of Purple Nonsulfur Bacteria in Shrimp Ponds and Mercury Resistant Mechanisms of Selected Strains Kanokwan Mukkata A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Microbiology Prince of Songkla University Copyright of Prince of Songkla University 2016 ii Thesis Title Diversity of Purple Nonsulfur Bacteria in Shrimp Ponds and Mercury Resistant Mechanisms of Selected Strains Author Miss Kanokwan Mukkata Major Program Microbiology _____________________________________________________________________ Major Advisor Examining Committee: ...................................................... ................................................Chairperson (Assoc. Prof. Dr. Duangporn Kantachote) (Asst. Prof. Dr. Pimonsri Mittraparp-Arthorn) Co-advisor: ..................................................Committee (Assoc. Prof. Dr. Duangporn Kantachote) ...................................................... (Assoc. Prof. Dr. Banjong Wittayaweerasak) ..................................................Committee (Assoc. Prof. Dr. Wanna Choorit) ...................................................... (Prof. Dr. Megharaj Mallavarapu) ...................................................... (Prof. Dr. Ravi Naidu) The Graduate School, Prince of Songkla University, has approved this thesis as partial fulfillment of the requirements for the Doctor of Philosophy Degree in Microbiology ........................................................... (Assoc. Prof. Dr. Teerapol Srichana) Dean of Graduate School iii This is to certify that the work here submitted is the result of the candidate‘s own investigations. Due acknowledgement has been made of any assistance received. .....................................................Signature (Assoc. Prof. Dr. Duangporn Kantachote) Major Advisor .....................................................Signature (Miss Kanokwan Mukkata) Candidate iv I hereby certify that this work has not been accepted in substance for any degree, and is not being currently submitted in candidature for any degree. ...................................................Signature (Miss Kanokwan Mukkata) Candidate v ชื่อวิทยานิพนธ ์ ความหลากหลายของแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วงกลุ่มไม่สะสม ซัลเฟอร์ในบ่อกุ้งและกลไกการต้านทานปรอทของเชื้อที่คัดเลือกได้ ผู้เขียน นางสาวขนกวรรณ มุขตา สาขาวิชา จุลชีววิทยา ปีการศึกษา 2558 บทคดั ย่อ เพื่อตรวจสอบปริมาณการปนเปื้อนปรอทและแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วง กลุ่มไม่สะสมซัลเฟอร์ (purple nonsulfur bacteria; PNSB) สายพันธุ์ที่ต้านทานปรอทในบ่อกุ้ง บริเวณแหลมทองในประเทศไทย จึงเก็บตัวอย่างน้าและตะกอนดินจ านวน 35 ตัวอย่างจากบ่อ กุ้ง ณ สถานที่ต่างๆ เพื่อน ามาตรวจสอบปริมาณปรอททั้งหมด (HgT) และเพื่อคัดแยก PNSB สายพันธุ์ที่ต้านทานปรอทเพื่อความเป็นไปได้ในการน าไปใช้บ าบัดทางชีวภาพ ปริมาณปรอท ทั้งหมดในตัวอย่างน้ามีค่าอยู่ ในช่วง <0.0002-0.037 ไมโครกรัมต่อลิตร ขณะที่ในตะกอนดินมี ค่าอยู่ระหว่าง 30.73-398.84 ไมโครกรัมต่อกิโลกรัมน้าหนักแห้ง โดยปริมาณปรอททั้งหมดที่ ตรวจวัดได้ในตัวอย่างทั้งสองชนิดมีค่าต่ากว่าค่ามาตรฐานตามเกณฑ์ก าหนดของฮ่องกง ประเทศไทยและแคนาดา จากนั้นได้มีการเก็บตัวอย่างน้าและตะกอน ดินจานวน 16 ตัวอย่างที่ เป็นตัวแทนกลุ่มจากบ่อกุ้งต่างๆ อีกครั้งเพื่อตรวจสอบความหลากหลายของ PNSB และผลของ ความเข้มข้นของปรอทในบ่อกุ้งต่อความหลากหลายของ PNSB ในบ่อเหล่านั้น โดยความ หลากหลายของ PNSB ตรวจสอบจากการตรวจหายีน pufM ซึ่งตรวจพบในตัวอย่างน้าจ านวน vi 13 บ่อ และในตัวอย่างตะกอนดินจานวน 10 บ่อ นอกจาก PNSB แล้วยังตรวจพบแบคทีเรีย สังเคราะห์แสงที่ไม่ให้ออกซิเจน (anoxygenic phototrophic bacteria; APB) กลุ่มอื่นๆ ด้วยใน ตัวอย่างทั้งสองชนิด ซึ่งได้แก่แบคทีเรียสังเคราะห์แสงที่ไม่ให้ออกซิเจนกลุ่มใช้ออกซิเจน (aerobic anoxygenic phototrophic bacteria; AAPB) และแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วงกลุ่ม สะสมซัลเฟอร์ (purple sulfur bacteria; PSB) โดยแบคทีเรียสังเคราะห์แสงกลุ่ม AAPB PSB และ PNSB ที่ตรวจพบในตัวอย่างน้ามีค่าเท่ากับ 25.71 11.43 และ 8.57 เปอร์เซ็นต์ ขณะที่ใน ตัวอย่างตะกอนดินมีค่าเท่ากับ 27.78 11.11 และ 22.22 เปอร์เซ็นต์ ผลจากการเทียบเคียง ล าดับเบสพบว่า Roseobacter denitrificans (AAPB) พบมากที่สุดในตัวอย่างทั้งสองชนิด ตามมาด้วย Halorhodospira halophila (PSB) อย่างไรก็ตามไม่พบความสัมพันธ์ระหว่าง ปริมาณปรอททั้งหมด (ตัวอย่างน้า อยู่ในช่วง <0.002-0.03 ไมโครกรัมต่อลิตร และตัวอย่าง ตะกอนดินอยู่ในช่วง 35.40-391.60 ไมโครกรัมต่อกิโลกรัมของน้าหนักแห้ง ) กับความ หลากหลายของ APB โดยเฉพาะกับ PNSB ในบ่อกุ้ง จากนั้นได้คัดเลือก PNSB ที่ต้านทาน ปรอทสามสายพันธุ์คือ Rhodovulum sulfidophilum สายพันธุ์ SRW1-5 และ Afifella marina สายพันธุ์ SSS2-1 และ SSW15-1 จากความสามารถในการลดความเป็นพิษของปรอทด้วย กลไก volatilization โดยเปลี่ยน Hg2+ เป็น Hg0 ด้วยเอนไซม์ mercuric reductase และค่า กิจกรรมของเอนไซม์ดังกล่าวในสภาวะมีอากาศมีค่าสูงกว่าในสภาวะมีแสงอย่างมีนัยส าคัญทาง สถิติ ซึ่งค่ากิจกรรมของเอนไซม์ของสายพันธุ์ SSW15-1 SRW1-5 และ SSS2-1 มีค่าเท่ากับ 15.75 12.62 และ 12.16 ยูนิตต่อมิลลิกรัมของโปรตีน ตามล าดับ นอกจากนี้ค่าความเข้มข้น ต่าสุดของปรอทที่ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรีย (MIC) ของทั้งสามสายพันธุ์มีค่าสูงกว่าความ เข้มข้นของปรอทที่พบในบ่อกุ้งมาก จึงยืนยันผลกลไกการต้านทานปรอทของแบคทีเรียทั้งสาม สายพันธุ์โดยการตรวจหายีนที่เกี่ยวข้องกับการต้านทานปรอท (mer operon) โดยมีการตรวจ พบยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีน MerR และโปรตีนเพื่อการส่งผ่านสาร (transporter permease vii protein) รวมทั้งพบยีนที่ต าแหน่งระหว่าง merA (mercuric reductase enzyme) และ merD (secondary regulatory protein) ในแบคทีเรียทั้งสามสายพันธุ์ ในขณะที่การตรวจหายีน merR (mercuric resistance operon regulatory protein) และ merT (transporter protein) พบเฉพาะ ใน A. marina ทั้งสองสายพันธุ์ ซึ่งยีนดังกล่าวนี้มีความเหมือนกับยีนของแบคทีเรียที่เป็นสมาชิก ใน Family Sphingomonadaceae นอกจากนี้โปรตีน MerR และ MerT ของแบคทีเรียทั้งสอง สายพันธุ์มีความแตกต่างจากโปรตีนของแบคทีเรียอื่นในกลุ่ม α-Proteobacteria นอกจากนี้ยัง ได้ตรวจสอบความเป็นพิษของปรอทต่อเซลล์ของ PNSB พบว่าการสัมผัสปรอท (HgCl2) ที่ ความเข้มข้นในช่วง 1-4 มิลลิกรัมต่อลิตรเป็นระยะเวลา 9 ชั่วโมง ท าให้อัตราการขนส่ง อิเล็กตรอนสูงสุด (ETRmax) ของสายพันธุ์ SRW1-5 และ SSS2-1 ลดลงอย่างมีนัยส าคัญทาง สถิติ (P < 0.05) โดยลดลงประมาณ 37 และ 48 เปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับชุดควบคุม ในขณะที่การทดสอบผลการสัมผัสระยะยาวในสภาวะที่มี HgCl2 (1-3 มิลลิกรัมต่อลิตร) โดย เฉพาะที่ความเข้มข้น 3 มิลลิกรัมต่อลิตรเป็นระยะเวลา 96 ชั่วโมง มีผลลดปริมาณแบคเทอริโอ คลอโรฟีลล์เออย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ (P < 0.05) ซึ่งส่งผลต่ออัตราการขนส่งอิเล็คตรอนสูงสุด ด้วย อย่างไรก็ตามเซลล์สามารถตอบสนองต่อสภาวะกดดันดังกล่าวโดยการเปลี่ยนแปลงรูปร่าง เซลล์ให้ยืดยาวขึ้นเพื่อลดความเป็นพิษ ขณะที่ HgCl2 ที่ความเข้มข้น 4 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถฆ่าแบคทีเรียทั้งสามสายพันธุ์ได้ นอกจากนี้ยังได้มีการศึกษาศักยภาพของเซลล์เป็นและ เซลล์ตายของ PNSB ทงั้ สามสายพนั ธุ์ในการก าจดั ปรอทและปจั จยั ท่เี ก่ยี วขอ้ งกบั การดูดซบั ปรอท พบว่าเซลล์ตายของแบคทีเรียทั้งสามสายพันธุ์มีประสิทธิภาพในการก าจัด Hg2+ มากกว่า เซลล์เป็นอย่างมีนัยสาคัญทางสถิติ แต่สภาวะการเจริญที่แตกต่างกันของสายพันธุ์ SSS2-1 และ SSW15-1 ไม่มีผลต่อการก าจัด Hg2+ และผลการทดลองของทั้งสามสายพันธุ์พบว่าสายพันธุ์ SSS2-1 ในการเลี้ยงทั้งสองสภาวะมีประสิทธิภาพในการก าจัด Hg2+ สูงสุด โดยในสภาวะที่ เหมาะสมในการก าจัด Hg2+ โดยใช้เซลล์ปริมาณ 5 มิลลิกรัมของน้าหนักเซลล์แห้งต่อลิตร และ viii ความเข้มข้นเริ่มต้นของ HgCl2 เท่ากับ 4 มิลลิกรัมต่อลิตร ส าหรับเซลล์เป็นคือการใช้เซลล์จาก ช่วง log และ late log phases พีเอชเท่ากับ 7 อุณหภูมิเท่ากับ 35°C และใช้ระยะเวลา 90 นาที ซึ่งสามารถก าจัดปรอทได้ 87 เปอร์เซ็นต์ ส่วนกรณีของเซลล์ตายคือเซลล์จากทุกช่วงของการ เจริญ พีเอชเท่ากับ 7 อุณหภูมิช่วง 35-40°C ระยะเวลา 15 นาที ซึ่งสามารถก าจัดปรอทได้ 95 เปอร์เซ็นต์ การดูดซับ Hg2+ ของเซลล์เป็นจากการเจริญทั้งสองสภาวะเป็นไปตามแบบจาลอง Freundlich ส่วนการดูดซับของเซลล์ตายเป็นไปตามแบบจาลอง Langmuir ขณะที่แบบจาลอง จลนพลศาสตร์ของการดูดซับ Hg2+ ของเซลล์ทั้งสองชนิดเป็นไปตามแบบจาลองจลนพลศาสตร์ pseudo-second order จากผลการศึกษาในภาพรวมพบว่า PNSB ทั้งสามสายพันธุ์ที่คัดเลือก ได้มีศักยภาพสูงมากในการน าไปบาบัดทางชีวภาพในพื้นที่บ่อกุ้งที่ปนเปื้อนปรอท คาส าคัญ : การบ าบัดทางชีวภาพ ปรอท เมอร์โอเปอรอน แบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วงกลุ่มไม่ สะสมซัลเฟอร์ บ่อกุ้ง ความเป็นพิษ ix Thesis Title Diversity of Purple Nonsulfur Bacteria in Shrimp Ponds and the Mercury Resistance Mechanisms of Selected Strains Author Miss Kanokwan Mukkata Major Program Microbiology Academic Year 2015 ABSTRACT To investigate mercury (Hg) contamination and Hg resistant strains of purple nonsulfur bacteria (PNSB) in shrimp ponds along the Thailand peninsular coast, 35 samples of water and sediment from various shrimp pods were collected to detect total Hg (HgT) and isolate Hg resistant PNSB strains for the possibility to use in bioremediation. HgT levels in samples of water ranged from <0.0002 to 0.037 μg/L while in sediment were between 30.73 to 398.84 μg/kg dry weight. All of these, HgT levels were lower than the Thai, Hong Kong, and Canadian standard guidelines. Representative samples of sixteen water and sediment samples were re-collected for investigating the diversity of PNSB and the effect of Hg concentrations on PNSB diversity in shrimp ponds. The diversity of PNSB in shrimp ponds were amplified using pufM gene; and the detection was found in 13 and 10 samples of water and sediment. In addition of PNSB, other anoxygenic phototrophic bacteria (APB), aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB) and purple sulfur bacteria (PSB) were detected in both sample types. Among identified groups; AAPB, PSB and PNSB in the samples of water and sediment were 25.71, 11.43 and 8.57%; and 27.78,