Filogeografia De Bombus Morio E B. Pauloensis (Hymenoptera, Apidae

Elaine Françoso

Filogeografia de Bombus morio e B. pauloensis (Hymenoptera,

Apidae)

Phylogeography of Bombus morio and B. pauloensis

(Hymenoptera, Apidae)

Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo,

para a obtenção de Título de Doutora em Ciências, na Área de Biologia/Genética.

Orientadora: Dra. Maria Cristina Arias

RESUMO

A Filogeografia é um dos campos mais multidisciplinares da Biologia, e agrega diferentes áreas como sistemática filogenética, genética de populações, geologia, modelos paleogeográficos e paleoclimáticos, demografia e conservação. Assim, além da Filogeografia comparada, apresento resultados importantes para a conservação das espécies estudadas e a descrição de uma espécie críptica. Bombus morio e B. pauloensis são espécies simpátricas que ocupam uma grande área em dois importantes biomas brasileiros, Mata Atlântica e Cerrado. Exceto pelas diferenças na dispersão, maior em B. morio, possuem comportamento e nicho ecológico semelhantes. Os resultados gerados a partir de marcadores moleculares e modelagem de distribuição sugerem que as alterações climáticas do final do Pleistoceno influenciaram a estrutura populacional das duas espécies, e que a maior capacidade de dispersão foi responsável pela ausência de estruturação em B. morio. O leste do estado de São Paulo, no qual foram encontradas diferentes quebras filogeográficas para vários organismos, mostrou-se mais uma vez complexo e com mais um diferente cenário filogeográfico. Além disso, essa região por ser o centro da diversidade genética em B. pauloensis e ter sido estável ao longo da mudanças climáticas para ambas espécies, é prioritária para a conservação das mesmas.

ABSTRACT

Phylogeography is one of the most multidisciplinary fields in Biology and joins different areas such as phylogenetic systematics, population genetics, geology, paleogeographic and paleoclimatic models, demography, and conservation. Thus, besides comparative Phylogeography, I also present important results concerning the conservation of the species studied and the description of a cryptic species. Bombus morio and B. pauloensis are sympatric species, occupying a large area in two important Brazilian biomes, Atlantic forest and Brazilian savanna. Except for differences in dispersal, which is greater in B. morio, both species have similar behavior and ecological niches. The results obtained by molecular data and distribution models suggest that climatic oscillations in the late Pleistocene influenced the population structure of both species, and that a greater dispersal capacity was responsible for the absence of genetic structure in B. morio. Eastern São Paulo state, in which different phylogeographic breaks have been found for many organisms, seems to be complex and to have a new phylogeographic scenario. Furthermore, this region, because it is the center of genetic diversity for B. pauloensis and it was stable throughout periods of climatic change for both species, is a priority for their conservation.

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO GERAL

1.1 FILOGEOGRAFIA 1.1.1 Definição

A Filogeografia é definida como o estudo dos princípios e processos que determinam a distribuição geográfica de linhagens genealógicas (Avise, 2000). Como o nome indica, a Filogeografia analisa as relações filogenéticas de um organismo a partir de dados genéticos junto com os fatores históricos responsáveis pela distribuição espacial das linhagens (Hickerson et al., 2010) para testar hipóteses sobre as relações entre fenômenos geográficos, distribuição de espécies e mecanismos que tenham atuado na especiação (Avise, 2000). O intuito final é verificar quais eventos geológicos e paleo-ecológicos podem estar associados à história da espécie juntamente com seu ambiente (Riddle, 1996; Avise, 1998; Hickerson et al., 2010). Estudos filogeográficos podem fornecer uma maior compreensão da biodiversidade, modos de dispersão, tempo de diversificação, extinção, áreas de refúgios e outros processos em nível específico ou populacional. Os primeiros trabalhos com essa abordagem foram realizados por Avise (1979, 1987) e foram responsáveis por cunhar o termo “Filogeografia” e por estabelecê-la como disciplina. Nessa época, o estudo filogeográfico era focado, basicamente, em uma única espécie, no uso do DNA mitocondrial como marcador molecular e em métodos empíricos de análise. Originalmente, a Filogeografia era uma ponte entre a filogenética e a genética de população, e hoje evoluiu para uma das disciplinas mais integrativas em toda a Biologia, pois agregou diversos campos como análises geoespaciais, geologia, climatologia e bioinformática. Além disso, as tendências atuais nessa área incluem métodos estatísticos de análise (Knowles e Maddison, 2002; Nielsen e Beaumont, 2009), análises multilocus e comparação dos padrões filogeográficos entre diferentes taxa (Avise, 2009; Hickerson et al., 2010), embora ainda não sejam amplamente aplicados (Beheregaray, 2008; Turchetto-Zolet et al., 2013).

1.1.2 Filogeografia comparada

Uma das tendências da Filogeografia atual é a Filogeografia comparada, que parte do pressuposto de que espécies com a mesma distribuição geográfica compartilham a mesma história. Sendo assim, espécies co-distribuídas atualmente teriam estado juntas no passado e, portanto, os mesmos eventos ecológicos e físicos as teriam afetado de forma sincrônica (Avise, 2009). A Filogeografia comparada pode fornecer informações importantes sobre geografia, geologia e/ou fenômenos climáticos responsáveis pela distribuição da biodiversidade observada (Avise, 1987; Bermingham e Moritz, 1998; Arbogast e Kenagy, 2001). A comparação dos padrões filogeográficos entre espécies co-distribuídas pode fornecer indícios da história de toda uma comunidade. Assim, espera-se encontrar entre espécies que ocorrem em simpatria congruências topológicas, temporais e demográficas.

A congruência topológica ocorre quando existem padrões filogeográficos semelhantes entre espécies (Sullivan et al., 2000). No entanto, estudos mostram que a congruência topológica parece não ser frequente (Turner et al., 1996; Kelemen e Moritz, 1999; Rocha et al., 2002; Lourie et al, 2005; Roberts, 2006; Bell et al., 2007; Kirchman e Franklin, 2007; Guzik et al., 2009; Moussalli et al., 2009, Qu et al., 2010) e pode ser explicada pelas diferenças ecológicas entre espécies, pela ausência de simpatria histórica ou por diferenças quanto à seleção natural, taxa de mutação, Ne, capacidade de dispersão, fatores demográficos, diferenças sutis entre distribuição, extinções locais e aleatoriedade implícita no processo de coalescência dos genes (Hugall et al., 2002; Garrick et al., 2008; Avise, 2009). A congruência temporal é encontrada quando duas espécies compartilham um mesmo padrão filogeográfico decorrente de um mesmo evento histórico que as afetou ao mesmo tempo. Ela tem sido feita estimando tempos de divergência para as linhagens de cada espécie e examinando se as datações das diferentes espécies estão dentro de um período semelhante. Por fim, a congruência demográfica pode ser verificada se for encontrado indícios de mudanças históricas populacionais, como expansão ou retração (Kuhner, 2008). Essa congruência pode ser encontrada, inclusive, entre espécies que não apresentam estrutura filogeográfica (Zink, 2002).

1.1.3 Filogeografia no Neotrópico

Existem diversas teorias que tentam explicar a grande biodiversidade e a forma com que ela se organiza no Neotrópico, a seguir: a) teoria dos refúgios pleistocênicos (segunda metade do período Quaternário) (Hafer, 1969; Brown e Ab`Saber, 1979): É a mais citada nos estudos filogeográficos neotropicais, caracterizado por alternância entre períodos glaciais e inter-glaciais. Nos períodos de glaciação, houve fragmentação de florestas em “ilhas” cercadas por regiões mais secas (Hooghiemstra e van der Hammen, 1998), resultando em diferenciação de linhagens entre os refúgios. Em períodos inter-glaciais, o oposto teria ocorrido e espécies florestais recém diferenciadas expandiriam suas distribuições, entrando em contato, enquanto que espécies de áreas abertas teriam suas distribuições fragmentadas e passariam a se diferenciar pelo isolamento. Esses refúgios foram utilizados para explicar a biodiversidade principalmente na região amazônica (Haffer, 1969, 2008). Hoje essa teoria é controversa (Colinvaux, 2000; Bush e de Oliveira, 2006), pois diversos estudos demonstraram a grande influência que o período Terciário, caracterizado por intenso tectonismo, teve na diversificação da biodiversidade (Pennington et al., 2004; Hoorn et al., 2010; Rull, 2011); b) teoria das placas tectônicas (Clapperton, 1993): os eventos geotectônicos, principalmente aqueles que ocorreram no Terciário tardio e início do Pleistoceno, teriam alterado a paisagem biótica e abiótica e gerado barreiras ao fluxo gênico. A separação dos continentes, vulcanismo, soerguimento e rebaixamento de grandes áreas ocorridos por longos períodos de tempo são elementos que, associados ou não, influenciaram e influenciam até hoje a história geológica no Neotrópico. Como exemplo, a atividade tectônica que formou o vale do rio Paraíba do Sul deve ter tido importante papel na separação e evolução de populações (Silva e Straube, 1996); c) teoria dos rios (Wallace, 1849): os rios também podem funcionar como barreira ao fluxo gênico e promover divergência alopátrica. Os efeitos mais estudados são os rios da bacia Amazônica (Hayes e Sewlal, 2004; Ribas et al., 2012), do rio São Francisco e do rio Doce (Pellegrino et al., 2005; Cabanne et al., 2007; Ribeiro et al., 2011), este último apontado como barreira para diversos organismos, como mamíferos (Costa, 2003), lagartos (Pellegrino et al., 2005), aves (Costa et al., 2000; Cabanne et al, 2007, 2008), sapos (Thomé et al., 2010) e plantas (Ribeiro et al., 2010); d) teoria do soerguimento de morros e montanhas (Vanzolini 1973; Dixon 1979; Simpson 1979): embora os casos mais estudados estejam nos Andes, outros soerguimentos como a Serra do Mar e a Serra da Mantiqueira podem ter sido importantes barreiras para o fluxo gênico para vários organismos (Souza et al., 2003; Torres e Ribeiro, 2009); e) teoria do gradiente ecológico (Endler, 1977): sugere que a diversificação pode ocorrer em parapatria, na qual em algumas situações a divergência entre organismos é mediada por diferentes pressões seletivas atuantes em ambientes diferentes e contíguos (Haffer, 1969; Brown e Ab`Saber, 1979; Haffer e Prance, 2001; Moritz et al., 2000; Smith et al., 1997, 2001), sem necessariamente a presença de uma barreira física. O modelo considera que a seleção constante sobre caracteres relacionados à aptidão biológica pode, ao longo do tempo e do espaço, resultar em isolamento reprodutivo entre organismos presentes nos distintos ambientes.

1.1.4 Filogeografia e conservação

A Filogeografia tem sido cada vez mais associada à conservação (Zamudio e Greene, 1997; Moritz e Faith, 1998; Fouquet et al., 2010, Karl et al., 2011; D`Amen et al., 2012; Gugger et al., 2011; Kodandaramaiah et al., 2012). Os estudos filogeográficos permitem identificar linhagens que necessitam conservação, mostrar cenários de prioridades na conservação, estudar os efeitos da hibridação na biologia e conservação de espécies raras e identificar espécies crípticas (Hickerson, 2010). Ainda, através da Filogeografia, de acordo com Moritz e Faith (1998), é possível conservar não só a diversidade mas o processo que gerou essa diversidade, um dos critérios atualmente mais utilizados para definir áreas de conservação.

Uma das metodologias mais utilizadas na associação da Filogeografia à conservação é a Modelagem de Nicho Ecológico (MNE). Esse método tem se tornado uma ferramenta de importante aplicação, pois permite prever a distribuição geográfica das espécies (Kremen et al., 2007), predizer mudanças na distribuição em consequência de eventos climáticos passados ou futuros (Hijmans e Graham, 2006) e investigar padrões de especiação e divergência de nicho (Wiens e Graham, 2005; Warren et al., 2008). Associada à Filogeografia, a MNE é capaz de encontrar áreas estáveis (ou refúgios) ao longo das mudanças climáticas que ocorreram no passado, como as que ocorreram no período glacial (~21.000 anos). Essas áreas estáveis podem ser reconhecidas através da alta variabilidade genética verificada pela análise filogeográfica. Além disso, é possível acompanhar a dinâmica de linhagens ao longo de mudanças climáticas futuras e inferir se existe alguma linhagem prioritária para a conservação (Wilson e Pitts, 2012; D`Amen et al., 2012).

Capítulo 1 – Introdução Geral – Modelos biológicos | 9

1.2 OS MODELOS BIOLÓGICOS

1.2.1 O gênero Bombus

As abelhas do gênero Bombus (o único gênero da tribo Bombini) são conhecidas popularmente por mamangavas. Junto com Euglossini (abelhas das orquídeas tropicais), Apini (abelhas melíferas) e Meliponini (abelhas sem ferrão), Bombini compõe o grupo das abelhas corbiculadas, cuja característica morfológica é a presença da corbícula no par de pernas posterior, que é utilizada para o transporte de pólen e resina (Michener, 2007). O comportamento social apresentado pela maioria das espécies de Bombus é denominado de “primitivamente eussocial”, pois seria menos elaborado e complexo do que o das abelhas do gênero Apis e das abelhas sem ferrão, denominado “altamente eussocial” (Michener, 2007). Entretanto, o fato de algumas espécies temperadas regularem minuciosamente a temperatura do ninho e a descoberta de que as operárias se comunicam no forrageamento podem sugerir que o termo “primitivamente eussocial” não esteja sendo empregado corretamente no grupo (Goulson, 2010).

Bombus é um grupo bastante homogêneo em termos de morfologia (Moure e Sakagami, 1962; Williams, 1998; Michener, 1990; Michener, 2007; Murray, 2008), porém muito rico em número de espécies, estimado em 250, divididas atualmente em 15 subgêneros (Williams, 2008). Vivem em sociedade e constroem seus grandes ninhos com detritos vegetais no chão ou em cavidades (Moure e Sakagami, 1962; Michener, 2007). A maioria das espécies possui ciclo de vida anual, com rainhas fecundadas emergindo da hibernação no final do inverno ou começo da primavera e fundando os ninhos (Sakagami, 1976; Goulson, 2010).

O gênero Bombus é tipicamente Holártico, bem adaptado ao clima frio e com maior diversidade de espécies e subgêneros no Paleártico do que no Neártico e Neotrópico (Williams, 1998; Michener, 2007). Essas abelhas robustas e pilosas possuem adaptações termorregulatórias que envolvem endotermia facultativa (Heinrich, 1996), o que possibilita a vida em elevadas altitudes e em lugares frios. A riqueza de espécies de Bombus é alta em áreas montanhosas ou em latitudes elevadas do Oriente e Paleoártico (~175 espécies), declina na América do Norte (~60 espécies) e reduz fortemente na América do Sul (~22 espécies), onde ocupam áreas não montanhosas (Williams, 1996). Capítulo 1 – Introdução Geral – Modelos biológicos | 10

No Brasil, uma característica marcante do gênero Bombus é o baixo número de espécies, apenas seis: Bombus bellicosus Smith (1879), B. brasiliensis Lepelitier (1836), B. brevivillus Franklin (1913), B. morio Swederus (1787), B. pauloensis Friese (1913) e B. transversalis Olivier (1789). Todas pertenciam ao subgênero Fervidobombus. Entretanto, como esse grupo mostrou-se parafilético por análises moleculares (Cameron et al., 2007), esse subgênero foi sinonimizado em Thoracobombus (Williams et al., 2008). O padrão de distribuição dessas espécies no Brasil é bastante distinto, com áreas bem delimitadas (Figura 1.1).

Figura 1.1 – Mapa de distribuição das espécies brasileiras do gênero Bombus (Adaptado de Moure e Sakagami, 1962). Capítulo 1 – Introdução Geral – Modelos biológicos | 11

1.2.2 Bombus morio e B. pauloensis, de acordo com Moure e Sakagami (1962)

Bombus morio são abelhas completamente pretas e bastante pilosas e as mais fáceis de identificar, por serem mais distantes morfologicamente e molecularmente (Cameron et al., 2007) das demais espécies brasileiras. Têm hábito preferencialmente florestal, sendo mais comuns em matas ao longo de rios, apesar de ocorrerem em uma região ampla no sul e sudeste do Brasil (do Rio Grande do Sul até Minas Gerais e Espírito Santo) e alcança com menor abundância o sul da Bahia, Goiás e Mato Grosso.

Bombus pauloensis é a espécie mais politípica do Brasil, com uma alta variação de cores e de habitats. Ocupa praticamente a mesma área de B. morio, apesar do hábito mais generalista. Uma característica interessante é a variação do padrão de cor ao longo da distribuição, sendo que no sul os indivíduos são mais amarelos e ao norte, mais escuros (Figura 1.2).

Figura 1.2 – Bombus pauloensis e algumas variações no padrão de cor

Bombus morio e B. pauloensis, e provavelmente as demais espécies brasileiras de Bombus, são exceções em relação ao comportamento geral observado no gênero. Como essas espécies habitam regiões tropicais, não hibernam e encontram alimento disponível o ano todo (Camillo e Garófalo, 1989), o que lhes permite realizar dois ciclos de vida por ano (Zuchi, 1973).

Capítulo 1 – Introdução Geral – Modelos biológicos | 12

1.2.3 A escolha dos modelos biológicos

Existe um conflito na literatura quanto à proximidade filogenética e ecológica dos modelos utilizados na Filogeografia comparada. Alguns autores dizem que os estudos de Filogeografia comparada devem limitar taxonômica e ecologicamente as espécies estudadas para poder encontrar padrões compartilhados, dado que fatores que influenciam no formato das genealogias, como taxa de mutação e tamanho efetivo populacional, provavelmente são similares. Por outro lado, outros autores argumentam que quanto maior a disparidade entre as espécies, as congruências encontradas terão maior significado (Cartens et al., 2005).

Bombus morio e B. pauloensis são espécies proximamente relacionadas e pertencem ao mesmo subgênero, Thoracobombus. Ocorrem em simpatria em uma grande área (do Rio Grande do Sul até Minas Gerais e Espírito Santo, de acordo com Moure e Sakagami, 1962) e possuem nicho trófico e comportamento semelhantes (Camillo e Garófalo, 1989; Cortopassi-Laurino et al., 2003). São espécies com ampla e bem documentada distribuição, abundantes na natureza e em coleção de museus, fáceis de serem coletadas e possuem ainda uma distribuição natural, não influenciada pela comercialização e transporte de ninhos no Brasil. Como B. morio e B. pauloensis se distribuem em muitos tipos de florestas e diversas áreas de transição com biomas abertos, podem existir diferentes pressões seletivas e a hipótese de diversificação em parapatria é interessante para ser testada.

As abelhas do gênero Bombus atuam como importantes polinizadores tanto para a flora natural quanto para plantas de interesse econômico (Corbet et al., 1991; Kevan, 1991; Goulson, 2003; Memmott et al., 2004; Pywell et al., 2006; Goulson et al., 2008), e o declínio dessas espécies pode acarretar em sérios prejuízos a vários setores da economia (Corbet et al., 1991; Biesmeijer et al., 2006; Carvell et al., 2006). Diversos estudos na Europa e nos Estados Unidos documentaram o recente declínio de muitas espécies de Bombus (Williams, 1982, 1986; Carvell, 2002; Biesmeijer et al., 2006; Goulson, 2006; Fitzpatrick et al., 2007; Kosior et al., 2007; Grixti et al., 2009), observado principalmente em áreas nas quais ocorreram mudanças no habitat por ação antrópica, como intensificação da agricultura e urbanização (Pywell et al., 2006). No Brasil e na América do Sul, pouco se sabe sobre o status das populações das abelhas desse gênero e, como consequência, não há uma política de proteção e manejo para esses polinizadores. Capítulo 1 – Introdução Geral – Objetivos gerais | 13

1.3 OBJETIVOS GERAIS

Os objetivos propostos no projeto de doutorado foram: a. correlacionar quais das hipóteses de diversificação do Neotrópico melhor explicariam os padrões filogeográficos encontrados em B. morio e B. pauloensis e os fenômenos que influenciaram as populações, eventuais linhagens e a distribuição; b. testar a hipótese de que diferentes capacidades de dispersão, apesar da simpatria e comportamento semelhantes, podem gerar diferentes padrões filogeográficos. As predições seriam encontrar incongruência topológica e congruências temporal e demográfica; c. testar a hipótese de que B. morio e B. pauloensis estão em declínio e as predições seriam encontrar baixa variabilidade genética e retração na distribuição atual e futuras em relação às distribuições passadas; d. se forem encontradas evidências de declínio, avaliar e estabelecer metas para a conservação.

1.4 BIBLIOGRAFIA

Arbogast BS, Kenagy GJ (2001) Comparative phylogeography as an integrative approach to historical biogeography. Journal of Biogeography, 28, 819-825. Avise JC (1998) The history and purview of Phylogeography: A personal reflection. Molecular Ecology, 7, 371-379. Avise JC (2000) Phylogeography: the history and formation of species. Harvard University Press, London, UK. Avise JC (2009) Phylogeography: retrospect and prospect. Journal of Biogeography, 36, 3-15. Avise JC, Arnold J, Ball RM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA, Saunders NC (1987) Intraspecific Phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 18, 489-522. Avise JC, Giblin-Davidson C, Laerm J, Patton JC, Lansman A (1979) Mitochondrial DNA clones and matriarchal phylogeny within and among geographic populations of the pocket gopher, Geomys pinetis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76, 6694-6698. Beheregary LB (2008) Twenty years of phylogeography: the state of the field and the challenges for the Southern hemisphere. Molecular Ecology, 17, 3754-3774. Bell KL, Moritz C, Moussalli A, Yeates DK (2007) Comparative Phylogeography and speciation of dung beetles from the Australian wet tropics rainforest. Molecular Ecology, 16, 4984-4998. Bermingham E, Moritz C (1998) Comparative phylogeography: concepts and applications. Molecular Ecology, 7, 367-369. Biesmeijer JC, Roberts SPM, Reemer M, Ohlemüller R, Edwards M, Peeters T, Schaffers AP, Potts SG, Kleukers R, Thomas CD, Settele J, Kunin WE (2006) Parallel declines in pollinators and insect- pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science, 313, 351-354. Brown KS, Ab`Saber AN (1979) Ace-age forest refuges and evolution in Neotropics: correction of paleoclimatological, geomorphological and pedological data with biological endemism. Paleoclimas, 5, 1-30. Bush MB, de Oliveira PE (2006) The rise and fall of the refugial hypothesis of Amazonian speciation: a paleoecological perspective. Biota Neotropica, 6, 1-17. Cabanne GS, d’Horta FM, Sari EHR, Santos FR, Miyaki CY (2008) Nuclear and mitochondrial phylogeography of the Atlantic forest endemic Xiphorhynchus fuscus (Aves: Dendrocolaptidae): biogeography and systematics implications. Molecular Phylogenetics and Evolution, 49, 760-773. Cabanne GS, Santos FR, Miyaki CY (2007) Phylogeography of Xiphorhynchus fuscus (Passeriformes, Dendrocolaptidae): vicariance and recent demographic expansion in southern Atlantic forest. Biological Journal of the Linnean Society, 91, 73-84. Cameron SA, Hines HM, Williams PH (2007) A comprehensive phylogeny of the bumble bees (Bombus). Biological Journal of the Linnean Society, 91, 161-188. Camillo E, Garógalo CA (1989) Analysis of the niche of two sympatric species of Bombus (Hymenoptera, Apidae) in southeastern Brazil. Journal of Tropical Ecology, 5, 81-92. Cartens BC, Brunsfeld SJ, Demboski JR, Good JM, Sullivan J (2005) Investigating the evolutionary history of the Pacific Northwest mesic forest ecosystem: hypothesis testing within a comparative phylogeographic framework. Evolution, 59, 1639-1652. Carvell C (2002) Habitat use and conservation of bumblebees (Bombus spp.) under different grassland management regimes. Biological Conservation, 103, 33-49.

Carvell C, Roy DB, Smart SM, Pywell RF, Preston CD, Goulson D (2006) Declines in forage availability for bumblebees at a national scale. Biological Conservation, 132, 481-489. Clapperton CM (1993) Quaternary Geology and Geomorphology of South America. Elsevier, Amsterdam. Colinvaux PA, de Oliveira PE, Bush MB (2000) Amazonian and neotropical plant communities on glacial time-scales: the failure of the aridity and refuge hypotheses. Quaternary Science Reviews, 19, 141-169. Corbet SA, Williams IH, Osborne JL (1991) Bees and the pollination of crops and wildflowers in the European Community. Bee World, 72, 47-49. Cortopassi-Laurino M, Knoll FRN, Imperatriz-Fonseca VL (2003) Nicho trófico e abundância de Bombus morio e Bombus atratus em diferentes biomas brasileiros. In Melo GAR, Alves-dos-Santos I, Apoidea Neotropica: Homenagem aos 90 Anos de Jesus Santiago Moure. Editora UNESC, Criciúma. Costa LP (2003) The historical bridge between the Amazon and the Atlantic Forest of Brazil: a study of molecular phylogeography with small mammals. Journal of Biogeography, 30, 71-86. Costa LP, Leite YLR, Fonseca GAB, Fonseca MT (2000) Biogeography of South American mammals: endemism and diversity in the Atlantic Forest. Biotropica, 32, 872-881. D`Amen M, Zimmermann NE, Pearman PB (2012) Conservation of phylogeographic lineages under climate change. Global Ecology and Biogeography, 22, 93-104. Dixon JR (1979) Origin and distribution of reptiles in lowland tropical rainforests of South America. In Duellman WE (ed.), The South American Herpetofauna: Its origin, evolution, and dispersal. Monograph 7. Museum of Natural History, University of Kansas, Lawrence, 217-240. Endler JA (1977) Geographic variation, speciation, and clines. Princeton University, Princeton, NJ. Fitzpatrick U, Murray MG, Paxton RJ, Breen J, Cotton D, Santorum V, Brown MJF (2007) Rarity and decline in bumblebees - A test of causes and correlates in the Irish fauna. Biological Conservation, 136, 185-194. Fouquet A, Green DM, Waldman B, Bowsher JH, McBride KP, Gemmell NJ (2010) Phylogeography of Leiopelma hochstetteri reveals strong genetic structure and suggests new conservation priorities. Conservation Genetics, 11, 907-919. Garrick RC, Rowell DM, Simmons CS, Hillis DM, Sunnucks P (2008) Fine-scale phylogeographic congruence despite demographic incongruence in two low mobility saproxylic springtails. Evolution, 62, 1103-1118. Goulson D (2003) Bumblebees: their behaviour and ecology. Oxford University Press, Oxford, UK. Goulson D (2010) Bumblebees: behavior, ecology, and conservation, second edition. Oxford University Press, Oxford, UK. Goulson D, Lye GC, Darvil B (2008) Decline and conservation of bumble bees. Annual Review of Entomology, 53, 191-208. Goulson D (2006) The demise of the bumblebee in Britain. Biologist, 53, 294-299. Grixti JC, Wong LT, Cameron SA, Favret C (2009) Decline of bumble bees (Bombus) in the North American Midwest. Biological Conservation, 142, 75-84. Gugge PF, González-Rodríguez A, Rodríguez-Correa H, Sugita S, Cavender-Bares J (2011) Southward Pleistocene migration of Douglas-fir into Mexico: phylogeography, ecological niche modeling, and conservation of rear edge populations. New Phytologist, 189, 1185-1199. Guzik MT, Cooper SJB, Humphreys WF, Austin AD (2009) Fine-scale comparative phylogeography of

a sympatric sister species triplet of subterranean diving beetles from a single calcrete aquifer in Western Australia. Molecular Ecology, 18, 3683-3698. Haffer J (1969) Speciation in Amazonian forests birds. Science, 165, 131-137. Haffer J (2008) Hypotheses to explain the origin of species in Amazonia. Brazilian Journal of Biology, 68, 917-947. Haffer J, Prance GT (2001) Climate forcing of evolution in Amazonia during the Cenozoic: on the refuge theory of biotic differenciation. Amazoniana, 16, 579-607. Hayes FE, Sewlal JN (2004) The Amazon River as a dispersal barrier to passerine birds: effects of river width, habitat and taxonomy. Journal of Biogeography, 31, 1809-1818. Heinrich B (1996) The hot-blooded insects. Springer-Verlag, New York. Hickerson MJ, Carstens BC, Cavender-Bares J, Crandall KA, Graham CH (2010) Phylogeography’s past, present, and future: 10 years after Avise. Molecular Phylogenetics and Evololution, 54, 291- 301. Hijmans RJ, Graham CH (2006) The ability of climate envelope models to predict the effect of climate change on species distributions. Global Change Biology, 12, 1-10. Hooghiemstra H, van der Hammen T (1998) Neogene and Quaternary development of the neotropical rain forest: the forest refugia hypothesis, and a literature overview. Earth- Science Reviews, 44, 147- 183. Hoorn C, Wesselingh FP, ter Steege H, Bermudez MA, Mora A, Sanmartín I, Sanchez-Meseguer A, Anderson CL, Figueiredo JP, Jaramillo C, Riff D, Negri FR, Hooghiemstra H, Lundberg J, Stadler T, Särkinen T, Antonelli A (2010) Amazonia through time: Andean uplift, climate change, landscape evolution and biodiversity. Science, 330, 927-931. Hugall A, Moritz C, Moussalli A, Stanisic J (2002) Reconciling paleodistribution models and comparative Phylogeography in the wet tropics rainforest land snail Gnarosophia bellendenkerensis (Brazier 1875). Proceedings of the National Academy of Sciences, 99, 6112-6117. Karl SA, Castro ALF, Lopez JA, Charvet P, Burgess GH (2011) Phylogeography and conservation of the bull shark (Carcharhinus leucas) inferred from mitochondrial and microsatellite DNA. Conservation Genetics, 12, 371-382. Kelemen L, Moritz C (1999) Comparative Phylogeography of a sibling pair of rainforest Drosophila species (Drosophila serrata and D. birchii). Evolution, 53, 1306-1311. Kevan PG (1991) Pollination: keystone process in sustainable global productivity. Acta Horticulturae, 288, 103-110. Kirchman JJ, Franklin JD (2007) Comparative Phylogeography and genetic structure of Vanuatu birds: Control region variation in a rail, a dove, and a passerine. Molecular Phylogenetics and Evolution, 43, 14-23. Knowles LL, Maddison WP (2002) Statistical phylogeography. Molecular Ecology, 11, 2623-2635. Kodandaramaiah U, Konvicka M, Tammaru T, Wahlberg N, Gotthard K (2012) Phylogeography of the threatened butterfly, the woodland brown Lopiga achine (Nymphalidae: Satyrinae): implications for conservation. Journal of Insect Conservation, 16, 305-313. Kosior A, Celary W, Olejniczak P, Fijat J, Król W, Solarz W, Plonka P (2007) The decline of the bumble bees and cockoo bees (Hymenoptera: Apidae: Bombini) of the Western and Central Europe. Oryx, 41, 79-88. Kremen C, Cameron A, Moilanen A, Phillips SJ, Thomas CD, Beentje H, Dransfield J, Fisher BL, Glaw F, Good TC, Harper GJ, Hijmans RJ, Lees DC, Louis E Jr, Nussbaum RA, Raxworthy CJ,

Razafimpahanana A, Schatz GE, Vences M, Vieites DR, Wright PC, Zjhra ML (2007) Aligning conservation priorities across taxa in Madagascar with high-resolution planning tools. Science, 320, 222-226. Kuhner MK (2008) Coalescent genealogy samplers: Windows into population history. Trends in Ecology & Evolution, 24, 86-93. Lourie SA, Green DM, Vincent ACJ (2005) Dispersal, habitat differences, and comparative phylogeography of Southeast Asian seahorses (Syngnathidae: Hippocampus). Molecular Ecology, 14, 1073-1094. Memmott J, Waser NM Price MV (2004) Tolerance of pollination networks to species extinctions. Proceedings of the Royal Society B, 271, 2605-2611. Michener CD (1990) Classification of Apidae (Hymenoptera). University of Kansas Science Bullettin, 54, 75-164. Michener CD (2007). The bees of the world, second edition. Johns Hopkins University Press, Baltimore. Moritz C, Faith D (1998) Comparative Phylogeography and the identification of genetically divergent areas for conservation. Molecular Ecology, 7, 419-429. Moritz C, Patton J, Schneider CJ, Smith TB (2000) Diversification of rainforest faunas: an integrated molecular approach. Annual Review of Ecology and Systematics, 31, 533-563. Moure JS, Sakagami SF (1962) As mamangabas sociais do Brasil (Bombus Latreille) (Hymenoptera, Apoidea). Studia Entomologica, 5, 65-194. Moussalli A, Moritz C, Williams SE, Carnaval AC (2009) Variable responses of skinks to a common history of rainforest fluctuation: concordance between Phylogeography and palaeo-distribution models. Molecular Ecology, 18, 483-499. Murray TE, Fitzpatrick U, Brown MFF, Paxton RJ (2008) Cryptic species diversity in a widespread bumble bee complex revealed using mitochondrial DNA RFLPs. Conservation Genetics, 9, 653- 666. Nielsen R, Beaumont MA (2009) Statistical inferences in phylogeography. Molecular Ecology, 18, 1034-1047. Pellegrino KCM, Rodrigues MI, Waite AN, Morando M, Yassuda YY, Sites JW (2005) Phylogeography and species limits in the Gymnodactylus darwinii complex (Gekkonidae, Squamata): genetic structure coincides with river systems in the Brazilian Atlantic Forest. Biological Journal of the Linnean Society, 85, 13-26. Pennington RT, Lavin M, Prado DE, Pendry CA, Pell SK, Butterworth CA (2004) Historical climate change and speciation: neotropical seasonally dry forest plants show patterns of both tertiary and quaternary diversification. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 359, 515- 537. Pywell RF, Warman EA, Hulmes L, Hulmes S, Nuttall P, Sparks TH, Critchley CNR, Sherwood A (2006). Effectiveness of new agri-environment schemes in providing foraging resources for bumble bees in intensively farmed landscapes. Biological Conservation, 129, 192-206. Qu Y, Lei F, Zhang R, Lu X (2010) Comparative Phylogeography of five avian species: Implications for Pleistocene evolutionary history in the Qinghai–Tibetan plateau. Molecular Ecology, 19, 338-351. Ribas CC, Aleixo A, Nogueira ACR, Miyaki CY, Cracraft J (2012) A palaeobiogeographic model for biotic diversification within Amazonia over the past three million years. Proceedings of the Royal Society B, 279, 681-689. Ribeiro RA, Lemos JP, Ramos ACS, Lovato MB (2011) Phylogeography of the endangered rosewood Dalbergia nigra (Fabaceae): insights into the evolutionary history and conservation of the Brazilian

Atlantic Forest. Heredity, 106, 46-57. Riddle BR (1996) The molecular phylogeographic bridge between deep and shallow history in continental biotas. Trends in Ecology & Evolution, 11, 207-211. Roberts TE (2006) History, ocean channels, and distance determine phylogeographic patterns in three widespread Philippine fruit bats (Pteropodidae). Molecular Ecology, 15, 2183-2199. Rocha LA, Bass AL, Robertson DR, Bowen BW (2002) Adult habitat preferences, larval dispersal, and the comparative Phylogeography of three Atlantic surgeonfishes (Teleostei: Acanthuridae). Molecular Ecology, 11, 243-252. Rull V (2011) Neotropical biodiversity: timing and potential drivers. Trends in Ecology & Evolution, 26, 508-513. Sakagami SF (1976) Species differences in the bionomic characters of bumblebees. A comparative review. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, ser.6, Zoology, 20, 390-447. Silva JMC, Straube FC (1996) Systematics and biogeography of scaled woodcreepers (Aves: Dendrocolaptidae). Studies on Neotropical Fauna and Environment, 31, 3-10. Simpson B (1979) Quaternary biogeography of the high montane regions of South America. In Duellman WE (ed.), The South American Herpetofauna: Its origin, evolution, and dispersal. Monograph7. Museum of Natural History, University of Kansas, Lawrence, 157- 188. Smith TB (2001) Biodiversity hotspots and beyond: the need for preserving environmental transitions. Trends in Ecology & Evolution, 16, 431. Smith TB, Wayne RK, Girman DJ, Bruford MW (1997) A role for ecotones in generating rainforest biodiversity. Science, 276, 1855-1857. Souza FL, Cunha AF, Oliveira MA, Pereira GAG, Dos Reis SF (2003) Preliminary phylogeographic analysis of the neotropical freshwater turtle Hydromedusa maximiliani (Chelidae). Journal of Herpetology, 37, 427-433. Sullivan J, Arellano E, Rogers DS (2000) Comparative Phylogeography of Mesoamerican highland rodents: Concerted versus independent response to past climatic fluctuations. The American Naturalist, 155, 755-768. Thomé MTC, Zamudio KR, Giovanelli JGR, Haddada CFB, Baldissera FA, Alexandrino J (2010) Phylogeography of endemic toads and post-Pliocene persistence of the Brazilian Atlantic Forest. Molecular Phylogenetics and Evolution, 55, 1018-1031. Torres RA, Ribeiro J (2009) The remarkable species complex Mimagoniates microlepis (Characiformes: Glandulocaudinae) from the Southern Atlantic Rain forest (Brazil) as revealed by molecular systematic and population genetic analyses. Hydrobiologia, 617, 157-170. Turchetto-Zolet AC, Pinheiro F, Salgueiro F, Palma-Silva C (2013) Phylogeographical patterns shed light on evolutionary process in South America. Molecular Ecology, 22, 1193-1213. Turner TF, Trexler JC, Kuhn DN, Robison HW (1996) Life-history variation and comparative Phylogeography of darters (Pisces: Percidae) from the North American central highlands. Evolution, 50, 2023-2036. Vanzolini PE (1973) Distribution and differentiation of animals along the coast and in continental islands of the State of São Paulo, Brasil. I. Introduction to the area and problems. Papéis Avulsos de Zoologia, 26, 281-294. Wallace AR (1849) On the monkeys of the Amazon. Proceedings of The Zoological Society of London, 20, 107-110. Warren DL, Glor RE, Turelli M (2008) Environmental niche equivalency versus conservatism:

quantitative approaches to niche evolution. Evolution, 62, 2868-2883. Wiens JJ, Graham CH (2005) Niche conservatism: integrating evolution, ecology, and conservation biology. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics, 36, 519-539. Williams PH (1982) The distribution and decline of British bumble bees (Bombus Latr.) Journal of Apicultural Research, 21, 236-245. Williams PH (1986). Environmental change and the distribution of British bumble bees (Bombus Latr.). Bee World, 67, 50-61. Williams PH (1996) Mapping variations in the strength and breadth of biogeographic transition zones using species turnover. Proceedings of the Royal Society of London B, 263, 579-588. Williams PH (1998) An annotated checklist of bumble bees with an analysis of patterns of description (Hymenoptera: Apidae, Bombini). Bulletin of the Natural History Museum (Entomology), 67, 79- 152. Available on http://www.nhm.ac.uk/research- curation/research/projects/bombus/subgenericlist.html Williams PH, Cameron SA, Hines HM, Cederberg B, Rasmont P (2008) A simplified subgeneric classification of the bumblebees (genus Bombus). Apidologie, 39, 46-74. Wilson JS, Pitts JP (2012) Identifying Pleistocene refugia in North American cold deserts using phylogeographic analyses and ecological niche modelling. Diversity and Distribution, 18, 1139- 1152. Zamudio KR, Greene HW (1997) Phylogeography of the bushmaster (Lachesis muta: Viperidae): implications for neotropical biogeography, systematics, and conservation. Biological Journal of Linnean Society, 62, 421-442. Zink RM (2002) Methods in comparative Phylogeography, and their application to studying evolution in the North American aridlands. Integrative and Comparative Biology, 42, 953-959. Zucchi R (1973) Aspectos bionômicos de Exomalopsis aureopilosa e Bombus atratus incluindo considerações sobre a evolução do comportamento social (Hymenoptera, Apoidea). Tese de doutoramento - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto.

CAPÍTULO 2 – FILOGEOGRAFIA COMPARADA DE B. MORIO E B. PAULOENSIS - CONSIDERAÇÕES GERAIS

Nesse capítulo, apresento o artigo principal da tese sobre a Filogeografia comparada, além de dois trabalhos relativos às bibliotecas de microssatélites feitas para cada uma das espécies estudadas. Como o artigo principal tem muitas análises e ficou extenso, seguem algumas informações que considero relevantes e que foram excluídas:

1. Nem todos as amostras obtidas foram utilizadas nas análises filogeográficas. Foram excluídos 43 espécimes de B. morio e 40 de B. pauloensis. Optei por usar somente os espécimes que tivessem todas as quatro regiões mitocondriais sequenciadas, dado que as amostras incompletas estavam dando ruídos nas análises filogenéticas, o que refletia nos baixos valores de probabilidade posterior encontrados. Ainda assim, o número amostral obtido para cada espécie ficou muito além do previsto no projeto inicial (150 amostras por espécie). 2. Alguns espécimes coletados no estado de Mato Grosso do Sul e obtidos na coleção da UFMS parecem constituir uma linhagem muito distante de B. morio e B. pauloensis, e pode se tratar de uma nova espécie de Bombus. Como não foram obtidas as sequências das quatro regiões mitocondriais desses exemplares e, por ter esse trabalho como foco principal uma abordagem intra-específica, essas amostras foram excluídas. Entretanto devem ser melhor estudadas. 3. Os mapas da distribuição atual de B. morio e B. pauloensis feitos a partir da MNE possuem limites diferentes daquele apresentado na Figura 1.1, adaptado de Moure e Sakagami (1962). Esses autores demostraram insatisfação com o mapa, sendo então sugerido seu uso como uma ideia da distribuição das espécies brasileiras de Bombus. Os meus pontos de distribuição foram feitos a partir de coletas recentes (desde 1990, já que mudanças ambientais podem ter alterado a distribuição das espécies) e a partir de espécimes identificados e confirmados por mim através da morfologia e marcadores mitocondriais. 4. O principal marcador molecular utilizado em trabalhos de Filogeografia é o DNA mitocondrial (Moritz e Faith, 1998; Avise, 1987, 2000, 2009; Beheregay, 2008; Turchetto-Zolet et al., 2013), basicamente pela alta taxa de mutação, pela herança predominantemente materna e por ser haploide. Dessa forma, a monofilia recíproca

entre populações com baixo ou nenhum fluxo gênico é atingida em cerca de um quarto do tempo do que o DNA nuclear (Moore, 1995). Entretanto, o uso exclusivo desse marcador tem algumas limitações, principalmente por só recuperar a linhagem materna e por conter taxas de introgressão muito mais altas do que se esperava (Avise, 2009). Assim, associar marcadores mitocondriais com marcadores nucleares é de suma importância (Maddison, 1997). Testei então 17 pares de primers para diferentes genes, todos eles contemplando uma região intrônica, além de primers para 8 regiões de microssatélites com a intenção de utilizar as regiões flanqueadoras que poderiam ser informativas para estudos populacionais. Para testar a variação intra-específica, foram analisados 8 indivíduos de B. pauloensis e 8 indivíduos de B. morio que representavam os extremos da distribuição (tabela 2.1). Embora o sucesso na amplificação das regiões pela técnica de PCR tenha sido relativamente alto, para muitas a qualidade das sequências não foi satisfatória, provavelmente pela não- especificidade dos primers. Dentre as regiões que apresentaram boa qualidade das sequências, destaco Arginina quinase (ArgK), Fator de elongação-1α (EF-1α), íntron 8 do CAD (carbamoyl-phosphate synthetase) e íntron 1 do Defensin, porém não apresentaram variabilidade nucleotídica intra-específica, mesmo em se tratando de regiões intrônicas. Entretanto, mostraram ser bom marcadores nucleares para estudos entre espécies proximamente relacionadas. Dessa forma, apesar do esforço empregado, não foi possível encontrar uma região intrônica para a realização desse trabalho, e os únicos marcadores nucleares possíveis de serem utilizados foram os microssatélites. Apesar desses marcadores não assegurarem a ancestralidade, e portanto devem ser usados com cautela, eles podem fornecer importantes informações sobre a demografia histórica e conservação. Assim, para maior especificidade dos primers e melhores resultados com esse marcador, desenvolvi uma biblioteca genômica enriquecida de microssatélites para cada uma das espécies estudadas neste trabalho, além de padronizar e testar cada locus.

Nesse capítulo, apresento o artigo principal dessa tese (“Comparative Phylogeography in Atlantic forest and Brazilian Savanna: Pleistocene fluctuations and dispersion shaping the patterns of two bumblebees”), em preparação, e os dois artigos das bibliotecas de microssatélites (“Microsatellite loci for Bombus morio (Hymenoptera, Apidae, Bombini” e “Characterization of microsatellite loci for Bombus pauloensis (Hymenoptera, Apidae, Bombini)”, já publicados.

Tabela 2.1 – Genes nucleares e primers para amplificação de regiões intrônicas testados. PCR: amplificação do fragmento; Seq.: obtenção da sequência de DNA; Var.: variação intra-específica; (+): resultado positivo; (-): resultado negativo

Primers Tamanho Resultados Referência Genes Nome Sequência (5`- 3`) esperado PCR Seq. Var. PeriodF CTCGATTTCGAGAAACAGCAACCGCTCT Cintia Yamashita 180pb + - - PeriodR GACGGCGACGTTATAAGACACGGCTTCTG (comunicação pessoal) Per2612F ATTCATGGGAAGGAGATGCC Period (Per) 157pb + - - Per3105R AABGACATGGGTTGGTACATC Barr et al. (2005) Per2612Fdeg ATTCWTGGGARGGRGATGCC 157pb + - - Per3105R AABGACATGGGTTGGTACATC ArgKF GTT GACCAA GCY GTY TTG GA 620pb - - - Arginina quinase ArgKR CAT GGA AATAAT ACG RAG RTG Kawakita (2003) (ArgK) ArgKF2 GA CAG CAA RTCTCT GCT GAA GAA 620pb + + - ArgKR2 GGT YTT GGCATC GTT GTG GTA GAT Fator de F2-ForH GGRCAYAGAGATTTCATCAAGAAC elongação-1α 720pb + + - Hines (2006) F2-RevH2 TTGCAAAGCTTCRKGATGCATTT (EF-1α) BA2F GCGAAACGCGACGGTCCAAC 217pb + - - BA2R ATTCGCGTGTCGGAAGCACG Molecular Ecology BA3F AGGCAACGTCGGAAGGGGGT 205pb + - - Resources Primer BA3R GTACACGCAGCCTGCAGACGA Development BA7F TCGTTGCTCTGCGTCGCTCA 204pb + - - Consortium (2012a) ACGTTCGGTGTTTCGAACGTGT BA7R BA8F GGCCCGAGGTGTCGAATGCC Microssatélites 198pb + - - BA8R GCTCGTCCGGATATCTGTTCTCG (regiões BM3F ATGCGCGGCCGGATCGAAAT flanqueadoras) 228pb + - - BM3R CCATCGGCGTTCCTGGCGAA BM4F CGTGGTTACGCCGGTCGGG Molecular Ecology 244pb + - - BM4R GCGGAGAAGTGTGGCAAACGGA Resources Primer BM5F TGCACCAGCAGTGCACGTTA Development 249pb + - - BM5R ACAGCTGTTGGTATCGAGCAAAGG Consortium (2012b) BM10F AGCCAGAGCAAACAGAAAGCCGA 213pb + - - BM10R CCGAGCAGAGCCGAACGGAC apCADfor1 GGWTATCCCGTDATGGCBMGWGC 800pb - - - Ap835rev1 GCATHACYTCHCCCACRCTYTTC apCADfor1 GGWTATCCCGTDATGGCBMGWGC 800pb - - - apCADrev1mod GCCATYRCYTCBCCYACRCTYTTCAT ap787for2 TGCTTYGARCCDAGYCTHGATTAYTG Danforth (2011) CAD 1500pb - - - ap1098rev2 ATATTRTTKGGCARYTGDCCKCCC apCADfor2mod GATGGGAYCTNRGNAARTTYC 1500pb - - - ap1098rev2 ATATTRTTKGGCARYTGDCCKCCC apCADfor3 CTCHGTKGARTTYGATTGGTGYGC 500pb + + - apCADrev3a CARGGRTARCCRACYTCYTCRCAAAATTC HymenoptaecinF ATGAAATTCATCGTACTGGCTCTC 1201pb - - - Choi et al. (2008) HymenoptaecinR TTAGAATCTGAATCCACCACCCAC HymF_íntron CRTACGCCGCTGCCCAAGAA Elaine Françoso (não 885pb - - - HymR_íntron CCCTTGCGGGTCAGCGTGTC publicado) Hymenoptaecin HymenoptaecinF ATGAAATTCATCGTACTGGCTCTC - - - Choi et al. (2008) 922pb HymR_íntron CCCTTGCGGGTCAGCGTGTC - - - Elaine Françoso (não HymF_íntron CRTACGCCGCTGCCCAAGAA publicado) 1003pb - - - HymenoptaecinR TTAGAATCTGAATCCACCACCCAC Choi et al. (2008) DefF_íntron1 CCATCATGGCAGCACCCGTGG 716pb + + - DefR_íntron1 CGGCACGTTCCTCGATACCAGC Elaine Françoso (não Defensin DefF_íntron2 GCTGCGAGAACGGAGTCTGCC publicado) 1092pb + + - DefR_íntron2 ACCGAAACGTTTGTCCCAGAGATCC

Bibliografia

Avise JC (2000) Phylogeography: the history and formation of species. Harvard University Press, London. Avise JC (2009) Phylogeography: retrospect and prospect. Journal of Biogeography, 36, 3-15. Avise JC, Arnold J, Ball RM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA, Saunders NC (1987) Intraspecific Phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 18, 489-522. Barr NB, Cui L, McPheron BA (2005) Molecular Systematics of nuclear gene period in genus Anastrepha (Tephritidae). Systematics, 98, 173-180. Beheregary LB (2008) Twenty years of phylogeography: the state of the field and the challenges for the Southern Hemisphere. Molecular Ecology, 17, 3754-3774. Choi YS, Choo YM, Lee KS, Yoon HJ, Sohn HD, Jin BR (2008) Cloning and expression profiling of four antibacterial peptide genes from the bumblebee Bombus ignitus. Comparative Biochemistry and Physiology, 150, 141-146. Danforth BN (2011) CAD primers for bees (7/11/2011), disponível em http://www.danforthlab.entomology.cornell.edu/files/all/cad_primers_1.pdf Hines HM, Cameron SA, Williams PH (2006) Molecular phylogeny of the bumble bee subgenus Pyrobombus (Hymenoptera: Apidae: Bombus) with insights into gene utility for lower-level analysis. Invertebrate Systematics, 20, 289-303. Kawakita A, Sota T, Ascher JS, Ito M, Tanaka H, Kato M (2003) Evolution and phylogenetic utility of alignment gaps within intron sequences of three nuclear genes in bumble bees (Bombus). Molecular Biology and Evolution, 20, 87-92. Maddison W (1997) Gene trees in species trees. Systematic Biology, 46, 523-536. Molecular Ecology Resources Primer Development Consortium, Andris M, Arias MC et al. (2012a) Permanent Genetic Resources added to Molecular Ecology Resources Database 1 February 2012 – 31 March 2012. Molecular Ecology Resources, 12, 779-781. Molecular Ecology Resources Primer Development Consortium, Arias M C, Arnoux E et al. (2012b), Permanent Genetic Resources added to Molecular Ecology Resources Database 1 December 2011 – 31 January 2012. Molecular Ecology Resources, 12, 570-572. Moore WS (1995) Inferring Phylogenies from mtDNA Variation: Mitochondrial-Gene Trees Versus Nuclear-Gene Trees. Evolution, 49, 718-726. Moritz C, Faith D (1998) Comparative Phylogeography and the identification of genetically divergent areas for conservation. Molecular Ecology, 7, 419-429. Moure JS, Sakagami SF (1962) As mamangabas sociais do Brasil (Bombus Latreille) (Hymenoptera, Apoidea). Studia Entomologica, 5, 65-194. Turchetto-Zolet AC, Pinheiro F, Salgueiro F, Palma-Silva C (2013) Phylogeographical patterns shed light on evolutionary process in South America. Molecular Ecology, 22, 1193-1213.

CAPÍTULO 3 – FILOGEOGRAFIA E CONSERVAÇÃO - CONSIDERAÇÕES GERAIS

Estudos de conservação e de definição do status de conservação consideram a espécie-foco como um todo. Importantes informações sobre as linhagens intraespecíficas não são consideradas, a menos que essas linhagens sejam elevadas ao status de subespécies, o que pode ser uma decisão arbitrária. Em geral, de acordo com a IUCN, somente critérios como redução populacional, distribuição geográfica restrita, fragmentação e pequeno tamanho populacional são considerados.

Diversos fatores, intrínsicos e extrínsicos, têm sido considerados como causa do declínio generalizado das abelhas, causando enormes impactos ecológicos e econômicos. No gênero Bombus, especificamente, tem sido reportado tanto o declínio quanto a expansão de espécies. Se analisadas como um todo, B. morio e B. pauloensis parecem ser espécies estáveis, com alta variabilidade genética e em expansão. Entretanto, a estrutura filogeográfica dessas espécies acrescentaram informações relevantes. Bombus morio parece ser uma espécie panmítica, e a linhagem de Teodoro Sampaio pode se tratar de uma subespécie ou até uma espécie nova e deve ser melhor investigada. Embora o clado principal tenha apresentado excesso de homozigoto, o alto fluxo gênico pode estar repondo a perda da variabilidade genética através dos imigrantes. Já B. pauloensis, analisando as linhagens separadamente, parece propensa a sofrer forte redução na distribuição nos clados N e S.

Nesse capítulo, apresento o artigo sobre conservação (em preparação), que é basicamente uma continuação do artigo principal de Filogeografia comparada. Embora fizesse mais sentido para mim uní-los num único artigo, isso não foi possível simplesmente porque como o artigo principal possui muitas análises, o número de palavras excedeu em muito o permitido pela revista na qual pretendo submetê-lo, e assim tive que fragmentá-lo. Nesse artigo, discutimos a importância de usar as informações sobre a constituição intra-específica das espécies e sobre os processos que geraram essa diversificação obtidos através dos estudos filogeográficos para que uma espécie, a sua diversidade e os fatores geradores dessa diversidade sejam igualmente conservados.

CAPÍTULO 4 – FILOGEOGRAFIA E A IDENTIFICAÇÃO DE UMA ESPÉCIE NOVA - CONSIDERAÇÕES GERAIS

A Filogeografia pode revelar múltiplas linhagens (filogrupos), o que normalmente significa espécies crípticas, principalmente quando os modelos biológicos são amostrados nos extremos de distribuição. Entretanto, definir o que é espécie é um trabalho delicado que requer sempre um bom taxonomista e ferramentas de identificação. De acordo com Turchetto-Zolet et al. (2013), em 125 artigos de Filogeografia na América do Sul nos quais foram encontrados filogrupos, apenas 13 discutem a possibilidade de especiação críptica. Segundo Beheregaray (2008), muitos táxons neotropicais permanecem pouco definidos do ponto de vista taxonômico, filogenético e geográfico.

O gênero Bombus é reconhecidamente um grupo problemático quanto a identificação morfológica, e inúmeras espécies crípticas têm sido descritas somente com a auxílio de ferramentas moleculares (Ellis et al. 2005; Ellis et al. 2006; Murray et al. 2008; Williams et al. 2011, 2012). Logo no início do Doutorado, verifiquei que alguns espécimes apresentavam um haplótipo mitocondrial com uma divergência genética muito alta em relação aos demais. Depois de 2 anos, coletei vários indivíduos no sul da Bahia que compartilhavam esse mesmo haplótipo. Morfologicamente eles se assemelhavam a B. brevivillus (encontrada no nordeste do Brasil) ou B. pauloensis, mas eram bem maiores. Como não tenho experiência em taxonomia e a morfologia do grupo é complexa, tive que recorrer a ferramentas moleculares para a identificação de espécies. O objetivo principal desse capítulo foi então saber se a linhagem encontrada principalmente no nordeste do Brasil seria ou não uma espécie nova.

O DNA barcode (Hebert, 2004) já estava sendo utilizado com sucesso na identificação de espécies em diferentes grupos, inclusive abelhas. Como eu já trabalhava com uma região do COI, sabia que os sinais filogenéticos obtidos em abelhas poderiam ser empregados com finalidade taxonômica. O projeto inicial proposto pelos idealizadores do DNA barcode era criar primers conservados, universais para todos os animais. Entretanto, num primeiro teste com esses primers universais em abelhas, observei que não havia muita especificidade e que eu teria problemas em amplificar essa região. Além disso, começaram a ser descritos na literatura problemas com o uso desses primers universais, como a

amplificação inespecífica de endoparasitas e numts. Assim, achei melhor desenhar primers novos e específicos para as abelhas corbiculadas, bem como primers internos que pudessem ser usados em material de coleção, que com o passar do tempo possui o DNA cada vez mais degradado. Consegui padronizar as condições de amplificação chegando a um consenso aplicável para vários grupos de abelhas utilizando esses novos primers.

Padronizado o método, apliquei-o nessa linhagem divergente. Essa linhagem formou um grupo monofilético irmão do grupo composto por todas as outras espécies brasileiras, exceto B. morio e B. pauloensis. Testei ainda dois marcadores nucleares para excluir a possibilidade de introgressão, e a hipótese de que realmente se tratava de uma espécie nova foi corroborada. Além disso, os resultados sugeriram que B. brasiliensis é polifilética e que, assim como as outras espécies de Bombus presentes no Brasil, deveriam ser melhor estudadas.

Nesse capítulo apresento então o artigo que descreve os novos primers para DNA Barcode de abelhas corbiculadas (“Cytochrome c oxidase I primers for corbiculate bees: DNA barcode and mini-barcode”), já publicado, e o “An integrative approach identifies a cryptic species of bumblebee (Hymenoptera: Apidae: Bombini) in northeastern Brazil”, em preparação, no qual é descrita a espécie B. (Thoracobombus) applanatus Oliveira, Françoso & Arias sp. nov.

Bibliografia

Beheregary LB (2008) Twenty years of phylogeography: the state of the field and the challenges for the Southern Hemisphere. Molecular Ecology, 17, 3754-3774. Ellis JS, Knight ME, Goulson D (2005) Delineating species for conservation using mitochondrial sequence data: the taxonomic status of two problematic Bombus species (Hymenoptera: Apidae). Journal of Insect Conservation, 9, 75-83. Ellis JS, Knight TM, Carvell C, Goulson D (2006) Cryptic species identification: a simple diagnostic tool for discrimination between two problematic bumblebee species. Molecular Ecology Notes, 6, 540-542. Hebert PDN, Penton EH, Burns JM, Janzen DH, Hallwachs W (2004) Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proceedings of the National Academy of Sciences, 101, 14812-14817. Murray TE, Fitzpatrick U, Brown MFF, Paxton RJ (2008) Cryptic species diversity in a widespread bumble bee complex revealed using mitochondrial DNA RFLPs. Conservation Genetics, 9, 653-666. Turchetto-Zolet AC, Pinheiro F, Salgueiro F, Palma-Silva C (2013) Phylogeographical patterns shed light on evolutionary process in South America. Molecular Ecology, 22, 1193-1213. Williams PH, An J, Huang J (2011) The bumblebees of the subgenus Subterranobombus: integrating evidence from morphology and DNA barcodes (Hymenoptera, Apidae, Bombus). Zoological Journal of the Linnean Society, 163, 813-862. Williams PH, Brown MJF, Carolan JC, An J, Goulson D, Aytekin AM, Best LR, Byvaltsev AM, Cederberg B, Dawson R, Huang J, Ito M, Monfared A, Raina RH, Schmid-Hempel P, Sheffield CS, Šima P, Xie Z (2012) Unveiling cryptic species of the bumblebee subgenus Bombus s. str. worldwide with COI barcodes (Hymenoptera: Apidae). Systematics and Biodiversity, 10, 21-56.

CONCLUSÕES

1. As oscilações climáticas do final do Pleistoceno influenciaram diretamente a estrutura populacional das duas espécies.

2. A congruência topológica não foi observada, provavelmente devido a alta dispersão de B. morio e/ou presença de heteroplasmia no DNA mitocondrial.

3. Bombus morio é uma espécie morfológica e geneticamente homogênea, o que sugere panmixia. Gargalo populacional durante o Inter Glacial (IG), seguido de intensa expansão demográfica no Último Máximo Glacial (UMG) e alto fluxo gênico é o cenário demográfico mais plausível para essa espécie.

4. Os três clados encontrados em B. pauloensis podem ser explicados por expansão populacional do leste do estado de São Paulo para o sul no IG, seguido de uma segunda expansão para o norte durante o UMG. Diversificação em parapatria, com diferentes condições climáticas aliadas a altitudes mais elevadas é o que parece moldar e limitar a distribuição atual dos três clados.

5. Um novo cenário evolutivo é aqui proposto para explicar a grande diversificação de espécies neotropicais no estado de São Paulo, no qual os refúgios teriam se formado no IG e não somente no UMG, dado que Bombus é adaptado ao frio.

6. O leste do estado de São Paulo, por ser o centro de diversidade de B. pauloensis e por permanecer estável ao longo de mudanças climáticas para as duas espécies, deve ser considerado como uma região prioritária para a conservação.

7. Uma nova espécie de Bombus foi descrita, B. (Thoracobombus) applanatus Oliveira, Françoso & Arias sp. nov., a partir de uma abordagem integrativa usando DNA barcode, dados nucleares e morfológicos.